-DOCSTART- -X- O
Introduction -X- _ O
The -X- _ O
persistence -X- _ O
of -X- _ O
replication-competent -X- _ O
, -X- _ O
but -X- _ O
transcriptionally -X- _ O
inhibited -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
proviral -X- _ O
DNA -X- _ O
in -X- _ O
long-lived -X- _ O
, -X- _ O
latent -X- _ O
cellular -X- _ O
reservoirs -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
significant -X- _ O
barrier -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
development -X- _ O
of -X- _ O
a -X- _ O
functional -X- _ O
cure -X- _ O
[ -X- _ O
1,2 -X- _ O
] -X- _ O
Even -X- _ O
after -X- _ O
long-term -X- _ O
, -X- _ O
suppressive -X- _ O
antiretroviral -X- _ O
therapy -X- _ O
( -X- _ O
ART -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
spontaneous -X- _ O
reactivation -X- _ O
of -X- _ O
proviral -X- _ O
gene -X- _ O
expression -X- _ O
from -X- _ O
the -X- _ O
latent -X- _ O
reservoir -X- _ O
is -X- _ O
sufficient -X- _ O
to -X- _ O
initiate -X- _ O
viral -X- _ O
rebound -X- _ O
shortly -X- _ O
after -X- _ O
ART -X- _ O
cessation -X- _ O
, -X- _ O
thus -X- _ O
requiring -X- _ O
life-long -X- _ O
adherence -X- _ O
[ -X- _ O
3–5 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Multifaceted -X- _ O
and -X- _ O
heterogenous -X- _ O
blocks -X- _ O
to -X- _ O
viral -X- _ O
gene -X- _ O
expression -X- _ O
establish -X- _ O
and -X- _ O
maintain -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
latency -X- _ O
at -X- _ O
the -X- _ O
epigenetic -X- _ O
, -X- _ O
transcriptional -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
post-transcriptional -X- _ O
levels -X- _ O
[ -X- _ O
2 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Several -X- _ O
strategies -X- _ O
to -X- _ O
either -X- _ O
reactivate -X- _ O
latent -X- _ O
proviruses -X- _ O
and -X- _ O
clear -X- _ O
infected -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
( -X- _ O
i.e. -X- _ O
, -X- _ O
“shock -X- _ O
and -X- _ O
kill” -X- _ O
) -X- _ O
or -X- _ O
reinforce -X- _ O
latency -X- _ O
to -X- _ O
prevent -X- _ O
spontaneous -X- _ O
reactivation -X- _ O
( -X- _ O
i.e. -X- _ O
, -X- _ O
“block -X- _ O
and -X- _ O
lock” -X- _ O
) -X- _ O
are -X- _ O
currently -X- _ O
under -X- _ O
investigation -X- _ O
[ -X- _ O
6,7 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
While -X- _ O
many -X- _ O
small -X- _ O
molecule -X- _ O
latency -X- _ O
reversing -X- _ O
agents -X- _ O
( -X- _ O
LRAs -X- _ O
) -X- _ O
have -X- _ O
been -X- _ O
described -X- _ O
that -X- _ O
reactivate -X- _ O
latent -X- _ O
proviruses -X- _ O
ex -X- _ O
vivo -X- _ O
, -X- _ O
they -X- _ O
have -X- _ O
had -X- _ O
little -X- _ O
success -X- _ O
in -X- _ O
clinical -X- _ O
trials -X- _ O
[ -X- _ O
8,9 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
This -X- _ O
failure -X- _ O
is -X- _ O
partly -X- _ O
due -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
latent -X- _ O
reservoir’s -X- _ O
heterogenous -X- _ O
nature -X- _ O
, -X- _ O
such -X- _ O
that -X- _ O
treatment -X- _ O
by -X- _ O
a -X- _ O
single -X- _ O
agent -X- _ O
that -X- _ O
acts -X- _ O
to -X- _ O
target -X- _ O
a -X- _ O
specific -X- _ O
block -X- _ O
may -X- _ O
only -X- _ O
ever -X- _ O
reactivate -X- _ O
a -X- _ O
small -X- _ O
fraction -X- _ O
of -X- _ O
proviruses -X- _ O
in -X- _ O
vivo -X- _ O
[ -X- _ O
10 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Even -X- _ O
if -X- _ O
transcriptional -X- _ O
reactivation -X- _ O
is -X- _ O
achieved -X- _ O
, -X- _ O
it -X- _ O
is -X- _ O
unlikely -X- _ O
this -X- _ O
is -X- _ O
sufficient -X- _ O
to -X- _ O
result -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
clearance -X- _ O
of -X- _ O
these -X- _ O
infected -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
without -X- _ O
additional -X- _ O
immune -X- _ O
augmentation -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
the -X- _ O
administration -X- _ O
of -X- _ O
antibodies -X- _ O
, -X- _ O
vaccines -X- _ O
, -X- _ O
or -X- _ O
immunotherapies -X- _ O
to -X- _ O
prime -X- _ O
the -X- _ O
immune -X- _ B-TISSUE
system -X- _ I-TISSUE
[ -X- _ O
6 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Given -X- _ O
these -X- _ O
limitations -X- _ O
, -X- _ O
much -X- _ O
research -X- _ O
is -X- _ O
now -X- _ O
focused -X- _ O
on -X- _ O
combinatorial -X- _ O
approaches -X- _ O
to -X- _ O
trigger -X- _ O
more -X- _ O
widespread -X- _ O
and -X- _ O
robust -X- _ O
reactivation -X- _ O
[ -X- _ O
11 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
For -X- _ O
example -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
recent -X- _ O
study -X- _ O
reported -X- _ O
synergistic -X- _ O
reactivation -X- _ O
potential -X- _ O
between -X- _ O
an -X- _ O
activator -X- _ O
of -X- _ O
non-canonical -X- _ O
NF-kB -X- _ O
signaling -X- _ O
( -X- _ O
AZD5582 -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
BET -X- _ O
bromodomain -X- _ O
inhibitors -X- _ O
that -X- _ O
act -X- _ O
to -X- _ O
lift -X- _ O
blocks -X- _ O
to -X- _ O
transcriptional -X- _ O
initiation -X- _ O
and -X- _ O
elongation -X- _ O
, -X- _ O
respectively -X- _ O
[ -X- _ O
12 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Blocks -X- _ O
to -X- _ O
transcriptional -X- _ O
elongation -X- _ O
are -X- _ O
major -X- _ O
contributors -X- _ O
to -X- _ O
establishing -X- _ O
and -X- _ O
maintaining -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
latency -X- _ O
[ -X- _ O
13,14 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
After -X- _ O
integration -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
proviral -X- _ O
DNA -X- _ O
, -X- _ O
RNA -X- _ O
Polymerase -X- _ O
II -X- _ O
( -X- _ O
RNA -X- _ O
Pol -X- _ O
II -X- _ O
) -X- _ O
is -X- _ O
recruited -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
transcription -X- _ O
start -X- _ O
site -X- _ O
by -X- _ O
transcription -X- _ O
factors -X- _ O
that -X- _ O
bind -X- _ O
cis-elements -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
promoter -X- _ O
region. -X- _ O
After -X- _ O
transcriptional -X- _ O
initiation -X- _ O
, -X- _ O
RNA -X- _ O
Pol -X- _ O
II -X- _ O
synthesizes -X- _ O
20–60 -X- _ O
nucleotides -X- _ O
before -X- _ O
stalling -X- _ O
through -X- _ O
a -X- _ O
well-conserved -X- _ O
process -X- _ O
known -X- _ O
as -X- _ O
promoter-proximal -X- _ O
pausing -X- _ O
[ -X- _ O
15 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Pausing -X- _ O
is -X- _ O
enforced -X- _ O
by -X- _ O
several -X- _ O
negative -X- _ O
elongation -X- _ O
factors -X- _ O
, -X- _ O
including -X- _ O
negative -X- _ O
elongation -X- _ O
factor -X- _ O
( -X- _ O
NELF -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
DRB -X- _ O
Sensitivity -X- _ O
Inducing -X- _ O
Factor -X- _ O
( -X- _ O
DSIF -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
the -X- _ O
RNA -X- _ O
Polymerase -X- _ O
II -X- _ O
Associated -X- _ O
Factor -X- _ O
1 -X- _ O
( -X- _ O
PAF1 -X- _ O
) -X- _ O
complex -X- _ O
[ -X- _ O
16–18 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Pause -X- _ O
release -X- _ O
is -X- _ O
regulated -X- _ O
by -X- _ O
positive -X- _ O
transcription -X- _ O
elongation -X- _ O
factor-b -X- _ O
( -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
heterodimeric -X- _ O
protein -X- _ O
complex -X- _ O
composed -X- _ O
of -X- _ O
cyclin-dependent -X- _ O
kinase -X- _ O
9 -X- _ O
( -X- _ O
CDK9 -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
cyclin -X- _ O
T1 -X- _ O
( -X- _ O
CCNT1 -X- _ O
) -X- _ O
[ -X- _ O
19–21 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
phosphorylates -X- _ O
the -X- _ O
C-terminal -X- _ O
tail -X- _ O
of -X- _ O
RNA -X- _ O
Pol -X- _ O
II -X- _ O
and -X- _ O
several -X- _ O
negative -X- _ O
elongation -X- _ O
factors -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
collectively -X- _ O
license -X- _ O
transcriptional -X- _ O
elongation -X- _ O
[ -X- _ O
22–24 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Recruitment -X- _ O
of -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
to -X- _ O
sites -X- _ O
of -X- _ O
nascent -X- _ O
transcription -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
highly -X- _ O
regulated -X- _ O
process -X- _ O
mediated -X- _ O
by -X- _ O
several -X- _ O
cellular -X- _ O
complexes. -X- _ O
The -X- _ O
majority -X- _ O
of -X- _ O
cellular -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
is -X- _ O
sequestered -X- _ O
in -X- _ O
an -X- _ O
inactive -X- _ O
state -X- _ O
by -X- _ O
the -X- _ O
7SK -X- _ O
ribonucleoprotein -X- _ O
( -X- _ O
RNP -X- _ O
) -X- _ O
complex -X- _ O
[ -X- _ O
25,26 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Diverse -X- _ O
extracellular -X- _ O
stimuli -X- _ O
and -X- _ O
intracellular -X- _ O
signals -X- _ O
can -X- _ O
induce -X- _ O
the -X- _ O
release -X- _ O
of -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
from -X- _ O
the -X- _ O
7SK -X- _ O
complex -X- _ O
[ -X- _ O
27–29 -X- _ O
] -X- _ O
where -X- _ O
it -X- _ O
can -X- _ O
be -X- _ O
recruited -X- _ O
to -X- _ O
sites -X- _ O
of -X- _ O
nascent -X- _ O
transcription -X- _ O
by -X- _ O
transcription -X- _ O
factors -X- _ O
( -X- _ O
i.e. -X- _ O
, -X- _ O
NF-kB -X- _ O
and -X- _ O
c-MYC -X- _ O
) -X- _ O
[ -X- _ O
30–32 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
epigenetic -X- _ O
regulators -X- _ O
( -X- _ O
i.e. -X- _ O
, -X- _ O
BRD4 -X- _ O
) -X- _ O
[ -X- _ O
33,34 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
or -X- _ O
super -X- _ O
elongation -X- _ O
complexes -X- _ O
( -X- _ O
SECs -X- _ O
) -X- _ O
composed -X- _ O
of -X- _ O
an -X- _ O
ARF4 -X- _ O
/ -X- _ O
FMR2 -X- _ O
( -X- _ O
AFF -X- _ O
) -X- _ O
family -X- _ O
scaffold -X- _ O
protein -X- _ O
in -X- _ O
complex -X- _ O
with -X- _ O
AF9 -X- _ O
, -X- _ O
ENL -X- _ O
, -X- _ O
an -X- _ O
eleven-nineteen -X- _ O
Lys-rich -X- _ O
leukemia -X- _ O
( -X- _ O
ELL -X- _ O
) -X- _ O
family -X- _ O
protein -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
an -X- _ O
ELL-associated -X- _ O
factor -X- _ O
( -X- _ O
EAF -X- _ O
) -X- _ O
protein -X- _ O
[ -X- _ O
35 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
To -X- _ O
circumvent -X- _ O
this -X- _ O
regulatory -X- _ O
step -X- _ O
, -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
encodes -X- _ O
a -X- _ O
trans-activator -X- _ O
protein -X- _ O
( -X- _ O
Tat -X- _ O
) -X- _ O
that -X- _ O
binds -X- _ O
to -X- _ O
and -X- _ O
recruits -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
specifically -X- _ O
to -X- _ O
sites -X- _ O
of -X- _ O
nascent -X- _ O
proviral -X- _ O
transcription -X- _ O
through -X- _ O
recognition -X- _ O
of -X- _ O
a -X- _ O
transactivation -X- _ O
response -X- _ O
( -X- _ O
TAR -X- _ O
) -X- _ O
RNA -X- _ O
stem -X- _ O
loop -X- _ O
produced -X- _ O
at -X- _ O
the -X- _ O
immediate -X- _ O
3’ -X- _ O
end -X- _ O
of -X- _ O
all -X- _ O
viral -X- _ O
RNA -X- _ O
transcripts -X- _ O
[ -X- _ O
36–38 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
distribution -X- _ O
of -X- _ O
and -X- _ O
competition -X- _ O
for -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
binding -X- _ O
among -X- _ O
different -X- _ O
complexes -X- _ O
is -X- _ O
an -X- _ O
area -X- _ O
of -X- _ O
active -X- _ O
investigation -X- _ O
, -X- _ O
with -X- _ O
several -X- _ O
strategies -X- _ O
to -X- _ O
enhance -X- _ O
the -X- _ O
biogenesis -X- _ O
or -X- _ O
availability -X- _ O
of -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
showing -X- _ O
promise -X- _ O
for -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
latency -X- _ O
reversal. -X- _ O
For -X- _ O
example -X- _ O
, -X- _ O
BET -X- _ O
bromodomain -X- _ O
inhibitors -X- _ O
( -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
JQ1 -X- _ O
) -X- _ O
have -X- _ O
been -X- _ O
shown -X- _ O
to -X- _ O
be -X- _ O
potent -X- _ O
LRAs -X- _ O
in -X- _ O
ex -X- _ O
vivo -X- _ O
models -X- _ O
by -X- _ O
releasing -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
from -X- _ O
BRD4 -X- _ O
[ -X- _ O
12 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Likewise -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
release -X- _ O
of -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
from -X- _ O
the -X- _ O
7SK -X- _ O
RNP -X- _ O
complex -X- _ O
has -X- _ O
been -X- _ O
shown -X- _ O
to -X- _ O
reactivate -X- _ O
latent -X- _ O
proviruses -X- _ O
in -X- _ O
ex -X- _ O
vivo -X- _ O
models -X- _ O
[ -X- _ O
39 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
That -X- _ O
being -X- _ O
said -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
release -X- _ O
of -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
from -X- _ O
the -X- _ O
7SK -X- _ O
RNP -X- _ O
complex -X- _ O
has -X- _ O
been -X- _ O
shown -X- _ O
to -X- _ O
directly -X- _ O
correlate -X- _ O
with -X- _ O
increased -X- _ O
BRD4 -X- _ O
binding -X- _ O
, -X- _ O
suggesting -X- _ O
that -X- _ O
release -X- _ O
from -X- _ O
any -X- _ O
one -X- _ O
complex -X- _ O
will -X- _ O
not -X- _ O
necessarily -X- _ O
increase -X- _ O
the -X- _ O
amount -X- _ O
of -X- _ O
unbound -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
or -X- _ O
the -X- _ O
amount -X- _ O
recruited -X- _ O
to -X- _ O
specific -X- _ O
sites -X- _ O
of -X- _ O
transcription -X- _ O
[ -X- _ O
33 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Furthermore -X- _ O
, -X- _ O
post-translational -X- _ O
modification -X- _ O
of -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
( -X- _ O
i.e. -X- _ O
, -X- _ O
through -X- _ O
phosphorylation -X- _ O
of -X- _ O
CDK9 -X- _ O
at -X- _ O
Serine -X- _ O
175 -X- _ O
) -X- _ O
has -X- _ O
been -X- _ O
shown -X- _ O
to -X- _ O
influence -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
distribution -X- _ O
in -X- _ O
certain -X- _ O
regulatory -X- _ O
complexes -X- _ O
, -X- _ O
again -X- _ O
highlighting -X- _ O
the -X- _ O
unique -X- _ O
properties -X- _ O
of -X- _ O
release -X- _ O
from -X- _ O
each -X- _ O
complex -X- _ O
[ -X- _ O
40 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
While -X- _ O
the -X- _ O
release -X- _ O
of -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
from -X- _ O
the -X- _ O
7SK -X- _ O
RNP -X- _ O
complex -X- _ O
and -X- _ O
BET -X- _ O
proteins -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
BRD4 -X- _ O
have -X- _ O
been -X- _ O
explored -X- _ O
as -X- _ O
strategies -X- _ O
for -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
latency -X- _ O
reversal -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
release -X- _ O
of -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
from -X- _ O
SECs -X- _ O
has -X- _ O
not -X- _ O
been -X- _ O
explored. -X- _ O
Previous -X- _ O
work -X- _ O
has -X- _ O
demonstrated -X- _ O
that -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
Tat -X- _ O
biochemically -X- _ O
co-purifies -X- _ O
with -X- _ O
several -X- _ O
SEC -X- _ O
proteins -X- _ O
[ -X- _ O
41,42 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
though -X- _ O
the -X- _ O
reason -X- _ O
for -X- _ O
this -X- _ O
is -X- _ O
unclear -X- _ O
as -X- _ O
they -X- _ O
seemingly -X- _ O
have -X- _ O
functionally -X- _ O
redundant -X- _ O
purposes -X- _ O
in -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
recruitment. -X- _ O
In -X- _ O
this -X- _ O
study -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
test -X- _ O
the -X- _ O
hypothesis -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
SEC -X- _ O
is -X- _ O
not -X- _ O
necessary -X- _ O
for -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
viral -X- _ O
transcription -X- _ O
and -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
release -X- _ O
of -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
from -X- _ O
cellular -X- _ O
SEC -X- _ O
complexes -X- _ O
can -X- _ O
serve -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
novel -X- _ O
strategy -X- _ O
to -X- _ O
reactivate -X- _ O
latent -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
proviruses. -X- _ O
Results -X- _ O
Discussion -X- _ O
In -X- _ O
this -X- _ O
study -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
demonstrate -X- _ O
a -X- _ O
potential -X- _ O
new -X- _ O
strategy -X- _ O
for -X- _ O
enhancing -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
latency -X- _ O
reversal -X- _ O
through -X- _ O
the -X- _ O
release -X- _ O
of -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
from -X- _ O
the -X- _ O
cellular -X- _ O
pool -X- _ O
of -X- _ O
SECs. -X- _ O
We -X- _ O
show -X- _ O
that -X- _ O
KL-2 -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
small -X- _ O
molecule -X- _ O
inhibitor -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
interaction -X- _ O
between -X- _ O
the -X- _ O
SEC -X- _ O
and -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
, -X- _ O
is -X- _ O
sufficient -X- _ O
to -X- _ O
enhance -X- _ O
viral -X- _ O
transcription -X- _ O
in -X- _ O
primary -X- _ B-CELL
CD4+ -X- _ I-CELL
T -X- _ I-CELL
cells -X- _ I-CELL
and -X- _ O
can -X- _ O
synergistically -X- _ O
enhance -X- _ O
the -X- _ O
activity -X- _ O
of -X- _ O
other -X- _ O
LRAs -X- _ O
in -X- _ O
certain -X- _ O
cell -X- _ B-CELL_LINE
line -X- _ I-CELL_LINE
models -X- _ O
of -X- _ O
latency. -X- _ O
Finally -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
demonstrate -X- _ O
that -X- _ O
KL-2 -X- _ O
can -X- _ O
increase -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
gag -X- _ O
expression -X- _ O
in -X- _ O
PBMCs -X- _ B-CELL
from -X- _ O
PLWH -X- _ O
on -X- _ O
suppressive -X- _ O
ART -X- _ O
, -X- _ O
most -X- _ O
notably -X- _ O
in -X- _ O
combination -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
non-canonical -X- _ O
NF-kB -X- _ O
agonist -X- _ O
, -X- _ O
AZD5582. -X- _ O
We -X- _ O
propose -X- _ O
a -X- _ O
model -X- _ O
in -X- _ O
which -X- _ O
KL-2 -X- _ O
release -X- _ O
of -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
from -X- _ O
the -X- _ O
cellular -X- _ O
pool -X- _ O
of -X- _ O
SECs -X- _ O
enhances -X- _ O
transcriptional -X- _ O
elongation -X- _ O
of -X- _ O
integrated -X- _ O
proviruses -X- _ O
, -X- _ O
akin -X- _ O
to -X- _ O
BET -X- _ O
bromodomain -X- _ O
inhibitors -X- _ O
and -X- _ O
7SK -X- _ O
RNP -X- _ O
inhibitors -X- _ O
( -X- _ O
Fig -X- _ O
6D -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
These -X- _ O
results -X- _ O
have -X- _ O
several -X- _ O
implications -X- _ O
for -X- _ O
our -X- _ O
understanding -X- _ O
of -X- _ O
viral -X- _ O
transcription -X- _ O
and -X- _ O
future -X- _ O
directions. -X- _ O
Latency -X- _ O
reversal -X- _ O
through -X- _ O
the -X- _ O
release -X- _ O
of -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
from -X- _ O
cellular -X- _ O
SECs -X- _ O
had -X- _ O
not -X- _ O
been -X- _ O
previously -X- _ O
explored -X- _ O
, -X- _ O
likely -X- _ O
due -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
perceived -X- _ O
dependency -X- _ O
of -X- _ O
viral -X- _ O
transcription -X- _ O
on -X- _ O
the -X- _ O
SEC. -X- _ O
This -X- _ O
effect -X- _ O
has -X- _ O
been -X- _ O
supported -X- _ O
by -X- _ O
biochemical -X- _ O
purifications -X- _ O
of -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
Tat -X- _ O
from -X- _ O
human -X- _ O
cell -X- _ B-CELL_LINE
lines -X- _ I-CELL_LINE
that -X- _ O
revealed -X- _ O
interactions -X- _ O
with -X- _ O
a -X- _ O
larger -X- _ O
SEC -X- _ O
[ -X- _ O
41,42 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
as -X- _ O
well -X- _ O
as -X- _ O
by -X- _ O
genetic -X- _ O
knock-down -X- _ O
experiments -X- _ O
in -X- _ O
cell -X- _ B-CELL_LINE
lines -X- _ I-CELL_LINE
showing -X- _ O
a -X- _ O
decrease -X- _ O
in -X- _ O
Tat-dependent -X- _ O
transcription -X- _ O
upon -X- _ O
SEC -X- _ O
component -X- _ O
depletion -X- _ O
[ -X- _ O
64,65 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
given -X- _ O
that -X- _ O
both -X- _ O
the -X- _ O
SEC -X- _ O
and -X- _ O
Tat -X- _ O
recruit -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
to -X- _ O
sites -X- _ O
of -X- _ O
nascent -X- _ O
transcription -X- _ O
, -X- _ O
they -X- _ O
share -X- _ O
some -X- _ O
functional -X- _ O
redundancy. -X- _ O
We -X- _ O
found -X- _ O
that -X- _ O
knock-out -X- _ O
of -X- _ O
SEC -X- _ O
components -X- _ O
from -X- _ O
activated -X- _ O
, -X- _ O
primary -X- _ B-CELL
CD4+ -X- _ I-CELL
T -X- _ I-CELL
cells -X- _ I-CELL
from -X- _ O
12 -X- _ O
independent -X- _ O
donors -X- _ O
did -X- _ O
not -X- _ O
inhibit -X- _ O
viral -X- _ O
replication -X- _ O
, -X- _ O
suggesting -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
SEC -X- _ O
is -X- _ O
not -X- _ O
required -X- _ O
in -X- _ O
this -X- _ O
cellular -X- _ O
context. -X- _ O
This -X- _ O
result -X- _ O
was -X- _ O
independently -X- _ O
verified -X- _ O
using -X- _ O
KL-2 -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
inhibits -X- _ O
the -X- _ O
interaction -X- _ O
between -X- _ O
CCNT1 -X- _ O
( -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
AFF1 -X- _ O
/ -X- _ O
4 -X- _ O
( -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
larger -X- _ O
SEC -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Notably -X- _ O
, -X- _ O
disruption -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
SEC -X- _ O
using -X- _ O
KL-2 -X- _ O
resulted -X- _ O
in -X- _ O
significant -X- _ O
increases -X- _ O
in -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
replication -X- _ O
in -X- _ O
primary -X- _ B-CELL
CD4+ -X- _ I-CELL
T -X- _ I-CELL
cells -X- _ I-CELL
whereas -X- _ O
genetic -X- _ O
knockout -X- _ O
of -X- _ O
most -X- _ O
SEC -X- _ O
members -X- _ O
had -X- _ O
minimal -X- _ O
to -X- _ O
no -X- _ O
impact -X- _ O
on -X- _ O
replication. -X- _ O
One -X- _ O
potential -X- _ O
explanation -X- _ O
for -X- _ O
this -X- _ O
difference -X- _ O
is -X- _ O
that -X- _ O
genetic -X- _ O
knockout -X- _ O
results -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
ablation -X- _ O
of -X- _ O
SEC -X- _ O
assembly -X- _ O
and -X- _ O
relocalization -X- _ O
of -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
into -X- _ O
other -X- _ O
complexes -X- _ O
at -X- _ O
steady-state -X- _ O
whereas -X- _ O
chemical -X- _ O
perturbation -X- _ O
by -X- _ O
KL-2 -X- _ O
results -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
release -X- _ O
of -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
from -X- _ O
SECs -X- _ O
that -X- _ O
are -X- _ O
continually -X- _ O
being -X- _ O
formed. -X- _ O
Understanding -X- _ O
the -X- _ O
dynamics -X- _ O
of -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
distribution -X- _ O
and -X- _ O
relocalization -X- _ O
upon -X- _ O
different -X- _ O
types -X- _ O
of -X- _ O
perturbation -X- _ O
is -X- _ O
an -X- _ O
ongoing -X- _ O
area -X- _ O
of -X- _ O
investigation. -X- _ O
While -X- _ O
we -X- _ O
expected -X- _ O
KL-2 -X- _ O
to -X- _ O
enhance -X- _ O
the -X- _ O
transcriptional -X- _ O
elongation -X- _ O
of -X- _ O
integrated -X- _ O
proviruses -X- _ O
due -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
release -X- _ O
of -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
from -X- _ O
cellular -X- _ O
SECs -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
also -X- _ O
saw -X- _ O
increases -X- _ O
in -X- _ O
transcriptional -X- _ O
initiation -X- _ O
as -X- _ O
measured -X- _ O
by -X- _ O
qRT-PCR -X- _ O
for -X- _ O
TAR -X- _ O
transcript -X- _ O
levels. -X- _ O
Likewise -X- _ O
, -X- _ O
in -X- _ O
J-Lat -X- _ B-CELL_LINE
5A8 -X- _ I-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
, -X- _ O
we -X- _ O
saw -X- _ O
increases -X- _ O
in -X- _ O
transcriptional -X- _ O
elongation -X- _ O
, -X- _ O
transcriptional -X- _ O
initiation -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
in -X- _ O
RNA -X- _ O
Pol -X- _ O
II -X- _ O
recruitment -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
proviral -X- _ O
promoter -X- _ O
when -X- _ O
KL-2 -X- _ O
was -X- _ O
added -X- _ O
, -X- _ O
even -X- _ O
though -X- _ O
KL-2 -X- _ O
addition -X- _ O
alone -X- _ O
was -X- _ O
not -X- _ O
sufficient -X- _ O
for -X- _ O
reactivation -X- _ O
as -X- _ O
measured -X- _ O
by -X- _ O
GFP -X- _ O
positivity -X- _ O
in -X- _ O
this -X- _ O
model. -X- _ O
This -X- _ O
finding -X- _ O
suggests -X- _ O
that -X- _ O
either -X- _ O
KL-2 -X- _ O
has -X- _ O
secondary -X- _ O
effects -X- _ O
not -X- _ O
mediated -X- _ O
by -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
or -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
redistribution -X- _ O
of -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
away -X- _ O
from -X- _ O
SECs -X- _ O
has -X- _ O
secondary -X- _ O
effects -X- _ O
that -X- _ O
could -X- _ O
impact -X- _ O
transcriptional -X- _ O
initiation -X- _ O
at -X- _ O
proviral -X- _ O
integration -X- _ O
sites. -X- _ O
BET -X- _ O
bromodomain -X- _ O
inhibitors -X- _ O
have -X- _ O
also -X- _ O
been -X- _ O
reported -X- _ O
to -X- _ O
increase -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
transcriptional -X- _ O
initiation -X- _ O
[ -X- _ O
12,13 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
though -X- _ O
these -X- _ O
effects -X- _ O
have -X- _ O
been -X- _ O
suggested -X- _ O
to -X- _ O
occur -X- _ O
through -X- _ O
modulation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
epigenetic -X- _ O
regulatory -X- _ O
functions -X- _ O
of -X- _ O
these -X- _ O
proteins -X- _ O
[ -X- _ O
66 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Other -X- _ O
reports -X- _ O
have -X- _ O
indicated -X- _ O
that -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
mediated -X- _ O
release -X- _ O
of -X- _ O
paused -X- _ O
RNA -X- _ O
Pol -X- _ O
II -X- _ O
can -X- _ O
result -X- _ O
in -X- _ O
enhanced -X- _ O
transcriptional -X- _ O
initiation -X- _ O
and -X- _ O
even -X- _ O
RNA -X- _ O
Pol -X- _ O
II -X- _ O
recruitment -X- _ O
simply -X- _ O
by -X- _ O
increasing -X- _ O
the -X- _ O
number -X- _ O
of -X- _ O
transcribing -X- _ O
polymerases -X- _ O
[ -X- _ O
67 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Still -X- _ O
, -X- _ O
this -X- _ O
connection -X- _ O
between -X- _ O
transcriptional -X- _ O
elongation -X- _ O
and -X- _ O
initiation -X- _ O
has -X- _ O
yet -X- _ O
to -X- _ O
be -X- _ O
fully -X- _ O
understood -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
context -X- _ O
of -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
transcription. -X- _ O
While -X- _ O
KL-2 -X- _ O
was -X- _ O
sufficient -X- _ O
to -X- _ O
boost -X- _ O
viral -X- _ O
replication -X- _ O
in -X- _ O
activated -X- _ O
, -X- _ O
primary -X- _ B-CELL
CD4+ -X- _ I-CELL
T -X- _ I-CELL
cells -X- _ I-CELL
, -X- _ O
in -X- _ O
and -X- _ O
of -X- _ O
itself -X- _ O
it -X- _ O
displayed -X- _ O
minimal -X- _ O
reactivation -X- _ O
potential -X- _ O
in -X- _ O
both -X- _ O
cell -X- _ B-CELL_LINE
line -X- _ I-CELL_LINE
models -X- _ O
of -X- _ O
latency -X- _ O
and -X- _ O
in -X- _ O
PBMCs -X- _ B-CELL
from -X- _ O
PLWH -X- _ O
on -X- _ O
suppressive -X- _ O
ART. -X- _ O
This -X- _ O
finding -X- _ O
is -X- _ O
similar -X- _ O
to -X- _ O
our -X- _ O
recent -X- _ O
report -X- _ O
of -X- _ O
a -X- _ O
novel -X- _ O
inhibitor -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
PAF1 -X- _ O
complex -X- _ O
( -X- _ O
iPAF1C -X- _ O
) -X- _ O
that -X- _ O
had -X- _ O
minimal -X- _ O
activity -X- _ O
on -X- _ O
its -X- _ O
own -X- _ O
, -X- _ O
but -X- _ O
greatly -X- _ O
enhanced -X- _ O
the -X- _ O
reactivation -X- _ O
potential -X- _ O
of -X- _ O
other -X- _ O
LRAs -X- _ O
[ -X- _ O
16 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Both -X- _ O
cases -X- _ O
highlight -X- _ O
the -X- _ O
multifaceted -X- _ O
nature -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
blocks -X- _ O
to -X- _ O
viral -X- _ O
gene -X- _ O
expression -X- _ O
that -X- _ O
underlie -X- _ O
the -X- _ O
latent -X- _ O
state -X- _ O
as -X- _ O
well -X- _ O
as -X- _ O
the -X- _ O
limitations -X- _ O
to -X- _ O
single -X- _ O
agent -X- _ O
drug -X- _ O
screening -X- _ O
to -X- _ O
identify -X- _ O
promising -X- _ O
, -X- _ O
next-generation -X- _ O
LRAs. -X- _ O
Combinatorial -X- _ O
approaches -X- _ O
to -X- _ O
dissect -X- _ O
the -X- _ O
genetic -X- _ O
underpinnings -X- _ O
of -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
latency -X- _ O
and -X- _ O
discover -X- _ O
new -X- _ O
, -X- _ O
synergistic -X- _ O
drug -X- _ O
interactions -X- _ O
should -X- _ O
be -X- _ O
prioritized. -X- _ O
While -X- _ O
KL-2 -X- _ O
alone -X- _ O
failed -X- _ O
to -X- _ O
significantly -X- _ O
increase -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
gag -X- _ O
transcript -X- _ O
levels -X- _ O
in -X- _ O
patient -X- _ O
PBMCs -X- _ B-CELL
, -X- _ O
in -X- _ O
combination -X- _ O
with -X- _ O
AZD5582 -X- _ O
it -X- _ O
resulted -X- _ O
in -X- _ O
a -X- _ O
16-fold -X- _ O
increase -X- _ O
over -X- _ O
AZD5582 -X- _ O
treatment -X- _ O
alone -X- _ O
and -X- _ O
a -X- _ O
53-fold -X- _ O
increase -X- _ O
over -X- _ O
the -X- _ O
DMSO -X- _ O
control. -X- _ O
Crosswise -X- _ O
dose -X- _ O
titrations -X- _ O
in -X- _ O
J-Lat -X- _ B-CELL_LINE
5A8 -X- _ I-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
showed -X- _ O
a -X- _ O
strong -X- _ O
synergistic -X- _ O
potential -X- _ O
between -X- _ O
AZD5582 -X- _ O
and -X- _ O
KL-2. -X- _ O
This -X- _ O
is -X- _ O
consistent -X- _ O
with -X- _ O
reports -X- _ O
of -X- _ O
robust -X- _ O
synergy -X- _ O
between -X- _ O
AZD5582 -X- _ O
and -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
release -X- _ O
through -X- _ O
BET -X- _ O
bromodomain -X- _ O
inhibition -X- _ O
[ -X- _ O
12 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Notably -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
BET -X- _ O
bromodomain -X- _ O
inhibitor -X- _ O
JQ1 -X- _ O
showed -X- _ O
minimal -X- _ O
reactivation -X- _ O
activity -X- _ O
in -X- _ O
our -X- _ O
patient -X- _ O
PBMCs -X- _ B-CELL
, -X- _ O
even -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
presence -X- _ O
of -X- _ O
KL-2 -X- _ O
, -X- _ O
in -X- _ O
contrast -X- _ O
to -X- _ O
our -X- _ O
cell -X- _ B-CELL_LINE
line -X- _ I-CELL_LINE
data. -X- _ O
This -X- _ O
finding -X- _ O
could -X- _ O
reflect -X- _ O
stochastic -X- _ O
differences -X- _ O
driven -X- _ O
by -X- _ O
variations -X- _ O
in -X- _ O
patient -X- _ O
characteristics -X- _ O
, -X- _ O
integration -X- _ O
site -X- _ O
, -X- _ O
chromatin -X- _ O
state -X- _ O
, -X- _ O
transcription -X- _ O
factor -X- _ O
availability -X- _ O
, -X- _ O
etc. -X- _ O
[ -X- _ O
13 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Future -X- _ O
work -X- _ O
will -X- _ O
compare -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
release -X- _ O
from -X- _ O
SECs -X- _ O
to -X- _ O
release -X- _ O
from -X- _ O
other -X- _ O
cellular -X- _ O
reservoirs -X- _ O
, -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
BRD4 -X- _ O
or -X- _ O
the -X- _ O
7SK -X- _ O
RNP. -X- _ O
Recent -X- _ O
studies -X- _ O
have -X- _ O
shown -X- _ O
that -X- _ O
post-translational -X- _ O
modifications -X- _ O
of -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
, -X- _ O
most -X- _ O
notably -X- _ O
phosphorylation -X- _ O
of -X- _ O
CDK9 -X- _ O
Serine -X- _ O
175 -X- _ O
and -X- _ O
Threonine -X- _ O
186 -X- _ O
, -X- _ O
can -X- _ O
drive -X- _ O
inclusion -X- _ O
into -X- _ O
different -X- _ O
complexes -X- _ O
and -X- _ O
may -X- _ O
strongly -X- _ O
influence -X- _ O
bioavailability -X- _ O
and -X- _ O
activity -X- _ O
[ -X- _ O
40 -X- _ O
, -X- _ O
68–70 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Therefore -X- _ O
, -X- _ O
it -X- _ O
is -X- _ O
possible -X- _ O
that -X- _ O
disruption -X- _ O
of -X- _ O
complexes -X- _ O
housing -X- _ O
‘active’ -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
more -X- _ O
direct -X- _ O
route -X- _ O
to -X- _ O
redirecting -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
activity. -X- _ O
This -X- _ O
is -X- _ O
not -X- _ O
to -X- _ O
say -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
SEC -X- _ O
is -X- _ O
never -X- _ O
required -X- _ O
for -X- _ O
viral -X- _ O
transcription. -X- _ O
In -X- _ O
latency -X- _ O
model -X- _ O
cell -X- _ B-CELL_LINE
lines -X- _ I-CELL_LINE
that -X- _ O
lacked -X- _ O
a -X- _ O
functional -X- _ O
Tat -X- _ O
( -X- _ O
U1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
) -X- _ O
or -X- _ O
TAR -X- _ O
stem -X- _ O
loop -X- _ O
( -X- _ O
ACH-2 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
) -X- _ O
, -X- _ O
KL-2 -X- _ O
inhibited -X- _ O
the -X- _ O
reactivation -X- _ O
potential -X- _ O
of -X- _ O
several -X- _ O
LRAs -X- _ O
, -X- _ O
suggesting -X- _ O
that -X- _ O
viral -X- _ O
transcription -X- _ O
may -X- _ O
be -X- _ O
more -X- _ O
dependent -X- _ O
on -X- _ O
the -X- _ O
SEC -X- _ O
when -X- _ O
Tat -X- _ O
is -X- _ O
either -X- _ O
defective -X- _ O
or -X- _ O
not -X- _ O
expressed. -X- _ O
We -X- _ O
attempted -X- _ O
to -X- _ O
test -X- _ O
this -X- _ O
by -X- _ O
inhibiting -X- _ O
Tat -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
J-Lat -X- _ B-CELL_LINE
5A8 -X- _ I-CELL_LINE
model -X- _ I-CELL_LINE
cell -X- _ I-CELL_LINE
line -X- _ I-CELL_LINE
using -X- _ O
two -X- _ O
previously -X- _ O
described -X- _ O
Tat-dependent -X- _ O
transcription -X- _ O
inhibitors -X- _ O
, -X- _ O
Triptolide -X- _ O
and -X- _ O
Spironolactone. -X- _ O
While -X- _ O
both -X- _ O
compounds -X- _ O
reduced -X- _ O
LRA -X- _ O
efficacy -X- _ O
, -X- _ O
KL-2 -X- _ O
still -X- _ O
boosted -X- _ O
the -X- _ O
activity -X- _ O
of -X- _ O
JQ1 -X- _ O
and -X- _ O
PMA -X- _ O
, -X- _ O
but -X- _ O
not -X- _ O
AZD5582. -X- _ O
This -X- _ O
suggests -X- _ O
that -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
can -X- _ O
be -X- _ O
recruited -X- _ O
to -X- _ O
proviral -X- _ O
integration -X- _ O
sites -X- _ O
in -X- _ O
a -X- _ O
Tat -X- _ O
and -X- _ O
SEC-independent -X- _ O
manner -X- _ O
upon -X- _ O
PMA -X- _ O
or -X- _ O
JQ1 -X- _ O
treatment -X- _ O
, -X- _ O
potentially -X- _ O
through -X- _ O
a -X- _ O
transcription -X- _ O
factor -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
NF-kB. -X- _ O
The -X- _ O
inability -X- _ O
of -X- _ O
AZD5582 -X- _ O
to -X- _ O
do -X- _ O
so -X- _ O
suggests -X- _ O
that -X- _ O
non-canonical -X- _ O
NF-kB -X- _ O
activation -X- _ O
does -X- _ O
not -X- _ O
recruit -X- _ O
the -X- _ O
same -X- _ O
milieu -X- _ O
of -X- _ O
transcription -X- _ O
factors -X- _ O
, -X- _ O
making -X- _ O
it -X- _ O
uniquely -X- _ O
Tat -X- _ O
or -X- _ O
SEC -X- _ O
dependent. -X- _ O
This -X- _ O
is -X- _ O
consistent -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
complete -X- _ O
lack -X- _ O
of -X- _ O
activity -X- _ O
of -X- _ O
AZD5582 -X- _ O
in -X- _ O
cell -X- _ B-CELL_LINE
line -X- _ I-CELL_LINE
models -X- _ O
lacking -X- _ O
functional -X- _ O
Tat -X- _ O
/ -X- _ O
TAR -X- _ O
activity -X- _ O
and -X- _ O
may -X- _ O
underlie -X- _ O
the -X- _ O
remarkable -X- _ O
synergy -X- _ O
between -X- _ O
non-canonical -X- _ O
NF-kB -X- _ O
agonists -X- _ O
and -X- _ O
agents -X- _ O
that -X- _ O
release -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
[ -X- _ O
12 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Additionally -X- _ O
, -X- _ O
triptolide -X- _ O
has -X- _ O
been -X- _ O
characterized -X- _ O
outside -X- _ O
of -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
transcription -X- _ O
in -X- _ O
its -X- _ O
ability -X- _ O
to -X- _ O
prevent -X- _ O
RNA -X- _ O
Pol -X- _ O
II -X- _ O
reinitiation -X- _ O
following -X- _ O
pausing -X- _ O
through -X- _ O
inhibition -X- _ O
of -X- _ O
xeoderma -X- _ O
pigmentosum -X- _ O
group -X- _ O
B-complementing -X- _ O
protein -X- _ O
( -X- _ O
XPB -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
is -X- _ O
often -X- _ O
used -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
tool -X- _ O
compound -X- _ O
for -X- _ O
measuring -X- _ O
the -X- _ O
fate -X- _ O
of -X- _ O
paused -X- _ O
RNA -X- _ O
Pol -X- _ O
II -X- _ O
at -X- _ O
different -X- _ O
time -X- _ O
points -X- _ O
[ -X- _ O
51,71 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
With -X- _ O
this -X- _ O
in -X- _ O
mind -X- _ O
, -X- _ O
it -X- _ O
is -X- _ O
possible -X- _ O
that -X- _ O
compounds -X- _ O
JQ1 -X- _ O
and -X- _ O
PMA -X- _ O
result -X- _ O
in -X- _ O
de -X- _ O
novo -X- _ O
recruitment -X- _ O
of -X- _ O
RNA -X- _ O
Pol -X- _ O
II -X- _ O
thereby -X- _ O
increasing -X- _ O
transcriptional -X- _ O
initiation -X- _ O
whereas -X- _ O
AZD5582 -X- _ O
may -X- _ O
be -X- _ O
more -X- _ O
reliant -X- _ O
on -X- _ O
RNA -X- _ O
Pol -X- _ O
II -X- _ O
pause-release. -X- _ O
To -X- _ O
further -X- _ O
explore -X- _ O
the -X- _ O
Tat -X- _ O
dependency -X- _ O
of -X- _ O
KL-2 -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
tried -X- _ O
to -X- _ O
rescue -X- _ O
Tat -X- _ O
function -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
U1 -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
line -X- _ I-CELL
using -X- _ O
a -X- _ O
Dox-inducible -X- _ O
system. -X- _ O
We -X- _ O
hypothesized -X- _ O
that -X- _ O
by -X- _ O
providing -X- _ O
Tat -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
SEC -X- _ O
would -X- _ O
no -X- _ O
longer -X- _ O
be -X- _ O
required -X- _ O
for -X- _ O
viral -X- _ O
gene -X- _ O
expression -X- _ O
such -X- _ O
that -X- _ O
SEC -X- _ O
disruption -X- _ O
by -X- _ O
KL-2 -X- _ O
would -X- _ O
enhance -X- _ O
reactivation -X- _ O
as -X- _ O
seen -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
J-Lat -X- _ O
models. -X- _ O
While -X- _ O
Tat -X- _ O
induction -X- _ O
itself -X- _ O
was -X- _ O
sufficient -X- _ O
for -X- _ O
reactivation -X- _ O
, -X- _ O
this -X- _ O
reactivation -X- _ O
was -X- _ O
completely -X- _ O
abolished -X- _ O
by -X- _ O
the -X- _ O
addition -X- _ O
of -X- _ O
KL-2. -X- _ O
Even -X- _ O
when -X- _ O
Tat -X- _ O
was -X- _ O
minimally -X- _ O
induced -X- _ O
and -X- _ O
other -X- _ O
LRAs -X- _ O
were -X- _ O
added -X- _ O
, -X- _ O
KL-2 -X- _ O
still -X- _ O
inhibited -X- _ O
reactivation -X- _ O
, -X- _ O
suggesting -X- _ O
that -X- _ O
additional -X- _ O
factors—such -X- _ O
as -X- _ O
steady-state -X- _ O
levels -X- _ O
of -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
, -X- _ O
integration -X- _ O
site -X- _ O
, -X- _ O
epigenetic -X- _ O
factors -X- _ O
, -X- _ O
or -X- _ O
transcription -X- _ O
factor -X- _ O
availability—may -X- _ O
drive -X- _ O
SEC -X- _ O
dependency -X- _ O
besides -X- _ O
just -X- _ O
the -X- _ O
presence -X- _ O
or -X- _ O
absence -X- _ O
of -X- _ O
Tat. -X- _ O
Indeed -X- _ O
, -X- _ O
SEC -X- _ O
disruption -X- _ O
by -X- _ O
KL-2 -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
original -X- _ O
report -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
inhibitor -X- _ O
demonstrated -X- _ O
an -X- _ O
outsized -X- _ O
impact -X- _ O
on -X- _ O
Myc-dependent -X- _ O
transcription -X- _ O
[ -X- _ O
32 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
suggesting -X- _ O
that -X- _ O
additional -X- _ O
factors -X- _ O
driving -X- _ O
the -X- _ O
SEC -X- _ O
dependency -X- _ O
of -X- _ O
proviral -X- _ O
transcription -X- _ O
have -X- _ O
yet -X- _ O
to -X- _ O
be -X- _ O
described. -X- _ O
Regardless -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
dual-acting -X- _ O
nature -X- _ O
of -X- _ O
KL-2 -X- _ O
in -X- _ O
enhancing -X- _ O
latency -X- _ O
reactivation -X- _ O
in -X- _ O
some -X- _ O
circumstances -X- _ O
( -X- _ O
i.e. -X- _ O
, -X- _ O
if -X- _ O
Tat -X- _ O
is -X- _ O
present -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
inhibiting -X- _ O
latency -X- _ O
reactivation -X- _ O
in -X- _ O
others -X- _ O
( -X- _ O
i.e. -X- _ O
, -X- _ O
when -X- _ O
the -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
state -X- _ O
dictates -X- _ O
SEC -X- _ O
dependency -X- _ O
) -X- _ O
presents -X- _ O
a -X- _ O
unique -X- _ O
opportunity -X- _ O
to -X- _ O
leverage -X- _ O
the -X- _ O
heterogenous -X- _ O
nature -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
latent -X- _ O
reservoir -X- _ O
to -X- _ O
both -X- _ O
reverse -X- _ O
and -X- _ O
promote -X- _ O
latency. -X- _ O
Taken -X- _ O
together -X- _ O
, -X- _ O
our -X- _ O
results -X- _ O
indicate -X- _ O
that -X- _ O
release -X- _ O
of -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
from -X- _ O
cellular -X- _ O
SECs -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
novel -X- _ O
mechanism -X- _ O
for -X- _ O
promoting -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
viral -X- _ O
transcription -X- _ O
during -X- _ O
both -X- _ O
active -X- _ O
and -X- _ O
latent -X- _ O
infection. -X- _ O
We -X- _ O
demonstrated -X- _ O
the -X- _ O
enhancement -X- _ O
of -X- _ O
latency -X- _ O
reversal -X- _ O
in -X- _ O
multiple -X- _ O
latent -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
line -X- _ I-CELL
models -X- _ O
and -X- _ O
in -X- _ O
primary -X- _ O
PBMCs -X- _ B-CELL
from -X- _ O
PLWH -X- _ O
on -X- _ O
suppressive -X- _ O
ART. -X- _ O
This -X- _ O
work -X- _ O
demonstrates -X- _ O
the -X- _ O
importance -X- _ O
of -X- _ O
increasing -X- _ O
the -X- _ O
production -X- _ O
or -X- _ O
availability -X- _ O
of -X- _ O
free -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
for -X- _ O
recruitment -X- _ O
to -X- _ O
viral -X- _ O
loci -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
powerful -X- _ O
strategy -X- _ O
for -X- _ O
bolstering -X- _ O
current -X- _ O
LRAs -X- _ O
, -X- _ O
most -X- _ O
notably -X- _ O
non-canonical -X- _ O
NF-kB -X- _ O
agonists. -X- _ O
Due -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
heterogeneity -X- _ O
of -X- _ O
blocks -X- _ O
to -X- _ O
viral -X- _ O
replication -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
latent -X- _ O
reservoir -X- _ O
, -X- _ O
it -X- _ O
is -X- _ O
likely -X- _ O
that -X- _ O
combinatorial -X- _ O
LRA -X- _ O
treatments -X- _ O
will -X- _ O
be -X- _ O
the -X- _ O
best -X- _ O
strategy -X- _ O
for -X- _ O
potent -X- _ O
latency -X- _ O
reversal -X- _ O
moving -X- _ O
forward. -X- _ O
Further -X- _ O
efforts -X- _ O
are -X- _ O
needed -X- _ O
to -X- _ O
understand -X- _ O
the -X- _ O
intracellular -X- _ O
distribution -X- _ O
of -X- _ O
active -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
to -X- _ O
characterize -X- _ O
the -X- _ O
most -X- _ O
critical -X- _ O
reservoir -X- _ O
to -X- _ O
target -X- _ O
to -X- _ O
enhance -X- _ O
transcription. -X- _ O
Additionally -X- _ O
, -X- _ O
our -X- _ O
work -X- _ O
demonstrates -X- _ O
that -X- _ O
disruption -X- _ O
of -X- _ O
SECs -X- _ O
could -X- _ O
enhance -X- _ O
latency -X- _ O
reversal -X- _ O
or -X- _ O
promote -X- _ O
the -X- _ O
maintenance -X- _ O
of -X- _ O
latency -X- _ O
depending -X- _ O
on -X- _ O
the -X- _ O
cellular -X- _ O
context. -X- _ O
Understanding -X- _ O
the -X- _ O
mechanism -X- _ O
that -X- _ O
controls -X- _ O
this -X- _ O
molecular -X- _ O
switch -X- _ O
would -X- _ O
aid -X- _ O
in -X- _ O
understanding -X- _ O
whether -X- _ O
SEC -X- _ O
disruptors -X- _ O
could -X- _ O
be -X- _ O
a -X- _ O
viable -X- _ O
dual-acting -X- _ O
molecule -X- _ O
to -X- _ O
aid -X- _ O
in -X- _ O
finding -X- _ O
a -X- _ O
functional -X- _ O
cure -X- _ O
for -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
infection. -X- _ O
Methods -X- _ O
Flow -X- _ O
cytometry -X- _ O
and -X- _ O
analysis -X- _ O
of -X- _ O
viability -X- _ O
/ -X- _ O
infection -X- _ O
/ -X- _ O
reactivation -X- _ O
data -X- _ O
Flow -X- _ O
cytometry -X- _ O
analysis -X- _ O
was -X- _ O
performed -X- _ O
on -X- _ O
an -X- _ O
Attune -X- _ O
NxT -X- _ O
acoustic -X- _ O
focusing -X- _ O
cytometer -X- _ O
( -X- _ O
Thermo -X- _ O
Fisher -X- _ O
Scientific -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
recording -X- _ O
all -X- _ O
events -X- _ O
in -X- _ O
a -X- _ O
40-μL -X- _ O
sample -X- _ O
volume -X- _ O
after -X- _ O
one -X- _ O
150 -X- _ O
μL -X- _ O
of -X- _ O
mixing -X- _ O
cycle. -X- _ O
Data -X- _ O
were -X- _ O
exported -X- _ O
as -X- _ O
FCS3.0 -X- _ O
files -X- _ O
using -X- _ O
Attune -X- _ O
NxT -X- _ O
Software -X- _ O
v3.2.0 -X- _ O
and -X- _ O
analyzed -X- _ O
with -X- _ O
a -X- _ O
consistent -X- _ O
template -X- _ O
on -X- _ O
FlowJo. -X- _ O
Briefly -X- _ O
, -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
were -X- _ O
gated -X- _ O
for -X- _ O
lymphocytes -X- _ B-CELL
by -X- _ O
light -X- _ O
scatter -X- _ O
followed -X- _ O
by -X- _ O
doublet -X- _ O
discrimination -X- _ O
in -X- _ O
both -X- _ O
side -X- _ O
and -X- _ O
forward -X- _ O
scatter. -X- _ O
Cells -X- _ B-CELL
with -X- _ O
equal -X- _ O
fluorescence -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
BL-1 -X- _ O
( -X- _ O
GFP -X- _ O
) -X- _ O
channel -X- _ O
and -X- _ O
the -X- _ O
VL-2 -X- _ O
( -X- _ O
AmCyan -X- _ O
) -X- _ O
channel -X- _ O
were -X- _ O
identified -X- _ O
as -X- _ O
autofluorescent -X- _ O
and -X- _ O
excluded -X- _ O
from -X- _ O
the -X- _ O
analysis. -X- _ O
A -X- _ O
consistent -X- _ O
gate -X- _ O
was -X- _ O
then -X- _ O
used -X- _ O
to -X- _ O
quantify -X- _ O
the -X- _ O
fraction -X- _ O
of -X- _ O
remaining -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
that -X- _ O
expressed -X- _ O
the -X- _ O
target -X- _ O
of -X- _ O
interest. -X- _ O
Analysis -X- _ O
of -X- _ O
hiv-specific -X- _ O
rna -X- _ O
transcripts -X- _ O
Following -X- _ O
cDNA -X- _ O
synthesis -X- _ O
, -X- _ O
viral -X- _ O
transcripts -X- _ O
were -X- _ O
assessed -X- _ O
by -X- _ O
qRT-PCR -X- _ O
as -X- _ O
described -X- _ O
previously -X- _ O
[ -X- _ O
13 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
For -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
TAR -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
following -X- _ O
primers -X- _ O
were -X- _ O
used -X- _ O
: -X- _ O
PF -X- _ O
: -X- _ O
5′-GTCTCTCTGGTTAGACCAG-3′ -X- _ O
; -X- _ O
PR -X- _ O
: -X- _ O
5′-TGGGTTCCCTAGYTAGCC-3′ -X- _ O
; -X- _ O
and -X- _ O
probe -X- _ O
: -X- _ O
5′-AGCCTGGGAGCTC-3′. -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
Long -X- _ O
LTR -X- _ O
levels -X- _ O
were -X- _ O
assessed -X- _ O
using -X- _ O
the -X- _ O
following -X- _ O
primers -X- _ O
: -X- _ O
PF -X- _ O
: -X- _ O
5′-GCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3′ -X- _ O
; -X- _ O
PR -X- _ O
: -X- _ O
5′-GGGCGCCACTGCTAGAGA-3′ -X- _ O
; -X- _ O
and -X- _ O
probe -X- _ O
: -X- _ O
5′-CCAGAGTCACACAACAGACGGGCACA-3. -X- _ O
For -X- _ O
expression -X- _ O
level -X- _ O
normalization -X- _ O
, -X- _ O
β-Actin -X- _ O
was -X- _ O
used -X- _ O
( -X- _ O
Thermo -X- _ O
Fisher -X- _ O
Scientific -X- _ O
, -X- _ O
catalog -X- _ O
no. -X- _ O
4331182 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Notably -X- _ O
, -X- _ O
β-Actin -X- _ O
is -X- _ O
an -X- _ O
RNA -X- _ O
Pol -X- _ O
II -X- _ O
controlled -X- _ O
gene. -X- _ O
To -X- _ O
ensure -X- _ O
that -X- _ O
β-Actin -X- _ O
levels -X- _ O
were -X- _ O
not -X- _ O
being -X- _ O
altered -X- _ O
by -X- _ O
KL-2 -X- _ O
induced -X- _ O
SEC -X- _ O
disruption -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
compared -X- _ O
β-Actin -X- _ O
expression -X- _ O
to -X- _ O
that -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
18S -X- _ O
ribosomal -X- _ O
subunit -X- _ O
, -X- _ O
an -X- _ O
RNA -X- _ O
Pol -X- _ O
I -X- _ O
controlled -X- _ O
gene -X- _ O
( -X- _ O
Thermo -X- _ O
Fisher -X- _ O
Scientific -X- _ O
, -X- _ O
catalog -X- _ O
no. -X- _ O
4331182 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
No -X- _ O
statistically -X- _ O
significant -X- _ O
changes -X- _ O
were -X- _ O
noted -X- _ O
between -X- _ O
the -X- _ O
two -X- _ O
housekeeping -X- _ O
genes -X- _ O
upon -X- _ O
KL-2 -X- _ O
treatment -X- _ O
, -X- _ O
so -X- _ O
β-Actin -X- _ O
was -X- _ O
used -X- _ O
as -X- _ O
the -X- _ O
normalization -X- _ O
gene -X- _ O
for -X- _ O
subsequent -X- _ O
qPCR -X- _ O
analyses. -X- _ O
The -X- _ O
reaction -X- _ O
was -X- _ O
performed -X- _ O
using -X- _ O
TaqMan -X- _ O
Fast -X- _ O
Advanced -X- _ O
Master -X- _ O
Mix -X- _ O
( -X- _ O
Thermo -X- _ O
Fisher -X- _ O
Scientific -X- _ O
, -X- _ O
catalog -X- _ O
no. -X- _ O
4444553 -X- _ O
) -X- _ O
according -X- _ O
to -X- _ O
manufacturer’s -X- _ O
instructions. -X- _ O
Briefly -X- _ O
, -X- _ O
10 -X- _ O
μL -X- _ O
of -X- _ O
reaction -X- _ O
was -X- _ O
mixed -X- _ O
using -X- _ O
5 -X- _ O
μL -X- _ O
of -X- _ O
Taqman -X- _ O
Master -X- _ O
Mix -X- _ O
, -X- _ O
0.5 -X- _ O
μL -X- _ O
of -X- _ O
20x -X- _ O
primer -X- _ O
probe -X- _ O
mix -X- _ O
( -X- _ O
18 -X- _ O
μM -X- _ O
of -X- _ O
primers -X- _ O
and -X- _ O
5 -X- _ O
μM -X- _ O
probe -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
2.5 -X- _ O
μL -X- _ O
water -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
2 -X- _ O
μL -X- _ O
of -X- _ O
template -X- _ O
cDNA. -X- _ O
The -X- _ O
PCR -X- _ O
cycles -X- _ O
were -X- _ O
as -X- _ O
follows -X- _ O
: -X- _ O
50 -X- _ O
°C -X- _ O
for -X- _ O
2 -X- _ O
minutes -X- _ O
, -X- _ O
95 -X- _ O
°C -X- _ O
for -X- _ O
20 -X- _ O
seconds -X- _ O
, -X- _ O
followed -X- _ O
by -X- _ O
40 -X- _ O
cycles -X- _ O
of -X- _ O
95 -X- _ O
°C -X- _ O
for -X- _ O
1 -X- _ O
second -X- _ O
and -X- _ O
60 -X- _ O
°C -X- _ O
for -X- _ O
20 -X- _ O
seconds. -X- _ O
Rna -X- _ O
sequencing -X- _ O
analysis -X- _ O
Sequencing -X- _ O
data -X- _ O
was -X- _ O
demultiplexed -X- _ O
and -X- _ O
trimmed -X- _ O
using -X- _ O
Trimmomatic -X- _ O
v0.36 -X- _ O
to -X- _ O
remove -X- _ O
adapters -X- _ O
and -X- _ O
low-quality -X- _ O
reads. -X- _ O
Trimmed -X- _ O
reads -X- _ O
were -X- _ O
aligned -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
Homo -X- _ O
sapiens -X- _ O
reference -X- _ O
genome -X- _ O
GRCh38 -X- _ O
and -X- _ O
transcripts -X- _ O
quantified -X- _ O
using -X- _ O
the -X- _ O
Hisat2-StringTie -X- _ O
pipeline -X- _ O
[ -X- _ O
76 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Differential -X- _ O
gene -X- _ O
expression -X- _ O
analysis -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
quantified -X- _ O
gene -X- _ O
transcripts -X- _ O
was -X- _ O
performed -X- _ O
with -X- _ O
DESeq2 -X- _ O
v.1.42.0 -X- _ O
R -X- _ O
package -X- _ O
using -X- _ O
R -X- _ O
v.4.3.2. -X- _ O
After -X- _ O
retaining -X- _ O
genes -X- _ O
with -X- _ O
nonzero -X- _ O
total -X- _ O
read -X- _ O
count -X- _ O
and -X- _ O
with -X- _ O
more -X- _ O
than -X- _ O
10 -X- _ O
reads -X- _ O
in -X- _ O
total -X- _ O
between -X- _ O
all -X- _ O
samples -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
fitted -X- _ O
a -X- _ O
model -X- _ O
that -X- _ O
included -X- _ O
all -X- _ O
treatments -X- _ O
to -X- _ O
account -X- _ O
for -X- _ O
overall -X- _ O
variability -X- _ O
and -X- _ O
identified -X- _ O
differentially -X- _ O
expressed -X- _ O
genes -X- _ O
( -X- _ O
DEGs -X- _ O
) -X- _ O
within -X- _ O
that -X- _ O
model -X- _ O
between -X- _ O
all -X- _ O
tested -X- _ O
conditions -X- _ O
against -X- _ O
DMSO-treated -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
( -X- _ O
i.e. -X- _ O
KL2 -X- _ O
vs -X- _ O
DMSO -X- _ O
, -X- _ O
AZD5582 -X- _ O
vs -X- _ O
DMSO -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
AZD5582+KL2 -X- _ O
vs -X- _ O
DMSO -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
To -X- _ O
define -X- _ O
DEGs -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
used -X- _ O
as -X- _ O
cut-offs -X- _ O
an -X- _ O
absolute -X- _ O
log2 -X- _ O
fold -X- _ O
change -X- _ O
> -X- _ O
1 -X- _ O
and -X- _ O
a -X- _ O
false -X- _ O
discovery -X- _ O
rate -X- _ O
( -X- _ O
FDR -X- _ O
) -X- _ O
compareCluster -X- _ O
function. -X- _ O
For -X- _ O
these -X- _ O
analyses -X- _ O
all -X- _ O
genes -X- _ O
whose -X- _ O
gene -X- _ O
symbols -X- _ O
could -X- _ O
be -X- _ O
mapped -X- _ O
to -X- _ O
ENTREZ -X- _ O
Ids -X- _ O
using -X- _ O
the -X- _ O
org.Hs.eg.db -X- _ O
v.3.18.0 -X- _ O
Bioconductor -X- _ O
annotation -X- _ O
package -X- _ O
were -X- _ O
included. -X- _ O
Statistical -X- _ O
analysis -X- _ O
All -X- _ O
statistical -X- _ O
analysis -X- _ O
was -X- _ O
performed -X- _ O
using -X- _ O
GraphPad -X- _ O
Prism -X- _ O
version -X- _ O
10.2.0 -X- _ O
( -X- _ O
392 -X- _ O
) -X- _ O
for -X- _ O
Windows -X- _ O
64-bit -X- _ O
, -X- _ O
GraphPad -X- _ O
Software -X- _ O
, -X- _ O
Boston -X- _ O
, -X- _ O
Massachusetts -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
( -X- _ O
www.graphpad.com -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Source -X- _ O
paper -X- _ O
: -X- _ O
PMC11419360 -X- _ O

2. -X- _ O
results -X- _ O
3. -X- _ O
discussion -X- _ O
Müller -X- _ B-CELL
glial -X- _ I-CELL
cells -X- _ I-CELL
play -X- _ O
fundamental -X- _ O
roles -X- _ O
in -X- _ O
retinal -X- _ B-TISSUE
tissue -X- _ I-TISSUE
functions. -X- _ O
Therefore -X- _ O
, -X- _ O
studies -X- _ O
into -X- _ O
their -X- _ O
biology -X- _ O
and -X- _ O
functions -X- _ O
may -X- _ O
contribute -X- _ O
to -X- _ O
understanding -X- _ O
the -X- _ O
causes -X- _ O
of -X- _ O
retinal -X- _ O
pathologies -X- _ O
and -X- _ O
to -X- _ O
develop -X- _ O
strategies -X- _ O
to -X- _ O
alleviate -X- _ O
their -X- _ O
outcomes. -X- _ O
The -X- _ O
aim -X- _ O
of -X- _ O
this -X- _ O
study -X- _ O
was -X- _ O
to -X- _ O
investigate -X- _ O
the -X- _ O
impact -X- _ O
of -X- _ O
high -X- _ O
glucose -X- _ O
and -X- _ O
glucose -X- _ O
fluctuations -X- _ O
on -X- _ O
critical -X- _ O
cellular -X- _ O
processes -X- _ O
, -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
gliosis -X- _ O
and -X- _ O
reprogramming -X- _ O
in -X- _ O
Müller -X- _ B-CELL
cells. -X- _ I-CELL
These -X- _ O
processes -X- _ O
are -X- _ O
of -X- _ O
pivotal -X- _ O
importance -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
onset -X- _ O
and -X- _ O
progression -X- _ O
of -X- _ O
retinal -X- _ O
neurodegeneration -X- _ O
and -X- _ O
diabetic -X- _ O
retinopathy. -X- _ O
In -X- _ O
the -X- _ O
present -X- _ O
study -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
observed -X- _ O
a -X- _ O
significant -X- _ O
increase -X- _ O
in -X- _ O
GFAP -X- _ O
expression -X- _ O
in -X- _ O
NG -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
exposed -X- _ O
to -X- _ O
sustained -X- _ O
high-glucose -X- _ O
and -X- _ O
GF -X- _ O
treatments -X- _ O
, -X- _ O
indicating -X- _ O
a -X- _ O
glucose -X- _ O
stress-induced -X- _ O
gliotic -X- _ O
response. -X- _ O
This -X- _ O
response -X- _ O
was -X- _ O
associated -X- _ O
with -X- _ O
other -X- _ O
markers -X- _ O
of -X- _ O
reactive -X- _ O
gliosis -X- _ O
, -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
the -X- _ O
morphological -X- _ O
changes -X- _ O
associated -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
transition -X- _ O
from -X- _ O
a -X- _ O
bipolar -X- _ O
to -X- _ O
a -X- _ O
radial -X- _ O
morphology -X- _ O
and -X- _ O
the -X- _ O
overexpression -X- _ O
/ -X- _ O
reorganization -X- _ O
of -X- _ O
vimentin -X- _ O
intermediate -X- _ B-TISSUE
filament. -X- _ I-TISSUE
These -X- _ O
findings -X- _ O
indicate -X- _ O
that -X- _ O
NG -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
are -X- _ O
sensitive -X- _ O
to -X- _ O
glucose -X- _ O
changes -X- _ O
in -X- _ O
their -X- _ O
surrounding -X- _ O
environment -X- _ O
, -X- _ O
potentially -X- _ O
functioning -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
protective -X- _ O
or -X- _ O
reactive -X- _ O
mechanism -X- _ O
in -X- _ O
response -X- _ O
to -X- _ O
metabolic -X- _ O
stress. -X- _ O
The -X- _ O
remarkable -X- _ O
sensitivity -X- _ O
to -X- _ O
glucose -X- _ O
stress -X- _ O
and -X- _ O
the -X- _ O
prompt -X- _ O
reactive -X- _ O
gliosis -X- _ O
observed -X- _ O
in -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
were -X- _ O
found -X- _ O
to -X- _ O
be -X- _ O
similar -X- _ O
to -X- _ O
those -X- _ O
observed -X- _ O
in -X- _ O
Müller -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
of -X- _ O
diabetic -X- _ O
subjects -X- _ O
[ -X- _ O
8 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
This -X- _ O
finding -X- _ O
confirms -X- _ O
the -X- _ O
suitability -X- _ O
of -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
as -X- _ O
an -X- _ O
in -X- _ O
vitro -X- _ O
model -X- _ O
to -X- _ O
study -X- _ O
Müller -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
response. -X- _ O
In -X- _ O
contrast -X- _ O
, -X- _ O
HG -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
maintain -X- _ O
a -X- _ O
basal -X- _ O
high -X- _ O
level -X- _ O
of -X- _ O
both -X- _ O
GFAP -X- _ O
and -X- _ O
Vimentin -X- _ O
together -X- _ O
to -X- _ O
less -X- _ O
organized -X- _ O
intermediate -X- _ B-TISSUE
filaments -X- _ I-TISSUE
across -X- _ O
the -X- _ O
different -X- _ O
glucose -X- _ O
treatments -X- _ O
, -X- _ O
suggesting -X- _ O
a -X- _ O
limited -X- _ O
and -X- _ O
static -X- _ O
response -X- _ O
to -X- _ O
sustained -X- _ O
high-glucose -X- _ O
and -X- _ O
GF -X- _ O
treatments. -X- _ O
These -X- _ O
findings -X- _ O
highlight -X- _ O
that -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
in -X- _ O
chronic -X- _ O
hyperglycemic -X- _ O
conditions -X- _ O
may -X- _ O
adapt -X- _ O
or -X- _ O
develop -X- _ O
enhanced -X- _ O
tolerance -X- _ O
over -X- _ O
time -X- _ O
due -X- _ O
to -X- _ O
constant -X- _ O
and -X- _ O
prolonged -X- _ O
exposure -X- _ O
to -X- _ O
high -X- _ O
glucose -X- _ O
levels. -X- _ O
The -X- _ O
adaptation -X- _ O
or -X- _ O
desensitization -X- _ O
of -X- _ O
HG -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
to -X- _ O
sustained -X- _ O
high-glucose -X- _ O
and -X- _ O
GFs -X- _ O
may -X- _ O
indicate -X- _ O
a -X- _ O
saturation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
gliotic -X- _ O
response -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
is -X- _ O
characteristic -X- _ O
of -X- _ O
prolonged -X- _ O
hyperglycemic -X- _ O
states -X- _ O
, -X- _ O
as -X- _ O
observed -X- _ O
in -X- _ O
uncontrolled -X- _ O
diabetes -X- _ O
[ -X- _ O
34 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
This -X- _ O
adaptation -X- _ O
or -X- _ O
desensitization -X- _ O
may -X- _ O
result -X- _ O
in -X- _ O
a -X- _ O
reduction -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
cellular -X- _ O
capacity -X- _ O
to -X- _ O
respond -X- _ O
to -X- _ O
additional -X- _ O
metabolic -X- _ O
challenges -X- _ O
or -X- _ O
stress. -X- _ O
To -X- _ O
understand -X- _ O
the -X- _ O
clinical -X- _ O
consequences -X- _ O
of -X- _ O
Müller -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
gliosis -X- _ O
it -X- _ O
is -X- _ O
essential -X- _ O
to -X- _ O
also -X- _ O
consider -X- _ O
the -X- _ O
reprogramming -X- _ O
process -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
may -X- _ O
include -X- _ O
dedifferentiation -X- _ O
of -X- _ O
Müller -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
and -X- _ O
regeneration -X- _ O
of -X- _ O
various -X- _ O
retinal -X- _ O
neurons -X- _ B-CELL
, -X- _ O
contributing -X- _ O
to -X- _ O
retinal -X- _ B-TISSUE
tissues -X- _ I-TISSUE
repair -X- _ O
under -X- _ O
certain -X- _ O
conditions. -X- _ O
In -X- _ O
species -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
birds -X- _ O
[ -X- _ O
35 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
zebrafish -X- _ O
[ -X- _ O
36,37 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
rodents -X- _ O
[ -X- _ O
38 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
Müller -X- _ B-CELL
glia -X- _ I-CELL
contribute -X- _ O
as -X- _ O
the -X- _ O
primary -X- _ O
source -X- _ O
of -X- _ O
retinal -X- _ O
regeneration. -X- _ O
When -X- _ O
the -X- _ O
retina -X- _ B-TISSUE
is -X- _ O
damaged -X- _ O
, -X- _ O
Müller -X- _ B-CELL
glia -X- _ I-CELL
can -X- _ O
dedifferentiate -X- _ O
into -X- _ O
Müller -X- _ B-CELL
glia-derived -X- _ I-CELL
progenitor -X- _ I-CELL
cells -X- _ I-CELL
( -X- _ O
MGPCs -X- _ B-CELL
) -X- _ O
, -X- _ O
acquiring -X- _ O
a -X- _ O
progenitor-like -X- _ O
phenotype -X- _ O
and -X- _ O
starting -X- _ O
to -X- _ O
proliferate -X- _ O
, -X- _ O
thus -X- _ O
contributing -X- _ O
to -X- _ O
retinal -X- _ O
repair -X- _ O
[ -X- _ O
39,40 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Notably -X- _ O
, -X- _ O
Müller -X- _ B-CELL
glia -X- _ I-CELL
in -X- _ O
lower -X- _ O
vertebrates -X- _ O
exhibit -X- _ O
a -X- _ O
remarkable -X- _ O
ability -X- _ O
to -X- _ O
regenerate -X- _ O
retinal -X- _ B-CELL
neurons -X- _ I-CELL
, -X- _ O
contrasting -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
limited -X- _ O
regenerative -X- _ O
capacity -X- _ O
seen -X- _ O
in -X- _ O
mammals -X- _ O
, -X- _ O
including -X- _ O
humans -X- _ O
[ -X- _ O
40 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
where -X- _ O
Müller -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
typically -X- _ O
respond -X- _ O
to -X- _ O
injury -X- _ O
with -X- _ O
reactive -X- _ O
gliosis -X- _ O
, -X- _ O
leading -X- _ O
to -X- _ O
scarring -X- _ O
rather -X- _ O
than -X- _ O
regeneration -X- _ O
[ -X- _ O
11,20 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
SHH -X- _ O
signaling -X- _ O
pathway -X- _ O
is -X- _ O
essential -X- _ O
for -X- _ O
the -X- _ O
proper -X- _ O
development -X- _ O
of -X- _ O
all -X- _ O
vertebrate -X- _ O
retinas -X- _ B-TISSUE
[ -X- _ O
41,42,43,44,45,46,47 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
several -X- _ O
studies -X- _ O
have -X- _ O
demonstrated -X- _ O
the -X- _ O
involvement -X- _ O
of -X- _ O
SHH -X- _ O
signaling -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
proliferation -X- _ O
and -X- _ O
differentiation -X- _ O
of -X- _ O
MGPCs -X- _ B-CELL
, -X- _ O
contributing -X- _ O
to -X- _ O
retinal -X- _ O
regeneration -X- _ O
in -X- _ O
lower -X- _ O
vertebrate -X- _ O
[ -X- _ O
18,19,31,32,34 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
in -X- _ O
mammals -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
SHH -X- _ O
pathway -X- _ O
alone -X- _ O
may -X- _ O
not -X- _ O
be -X- _ O
sufficient -X- _ O
to -X- _ O
overcome -X- _ O
the -X- _ O
intrinsic -X- _ O
limitations -X- _ O
of -X- _ O
Müller -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
to -X- _ O
regenerate -X- _ O
neuronal -X- _ B-CELL
cells. -X- _ I-CELL
In -X- _ O
our -X- _ O
study -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
observed -X- _ O
an -X- _ O
increase -X- _ O
in -X- _ O
SHH -X- _ O
expression -X- _ O
in -X- _ O
NG -X- _ O
MIO-M1cells -X- _ B-CELL_LINE
exposed -X- _ O
to -X- _ O
sustained -X- _ O
high-glucose -X- _ O
and -X- _ O
GF -X- _ O
treatments. -X- _ O
This -X- _ O
suggests -X- _ O
that -X- _ O
these -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
are -X- _ O
engaging -X- _ O
in -X- _ O
pathways -X- _ O
associated -X- _ O
with -X- _ O
cellular -X- _ O
dedifferentiation -X- _ O
and -X- _ O
potential -X- _ O
reprogramming -X- _ O
towards -X- _ O
a -X- _ O
progenitor -X- _ O
state. -X- _ O
The -X- _ O
increased -X- _ O
SHH -X- _ O
protein -X- _ O
expression -X- _ O
in -X- _ O
NG -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
was -X- _ O
accompanied -X- _ O
by -X- _ O
significant -X- _ O
changes -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
intracellular -X- _ O
localization -X- _ O
of -X- _ O
SHH -X- _ O
, -X- _ O
exhibiting -X- _ O
a -X- _ O
more -X- _ O
spotted -X- _ O
/ -X- _ O
punctate -X- _ O
pattern -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
cytoplasm -X- _ B-CELL_COMPONENT
and -X- _ O
in -X- _ O
close -X- _ O
proximity -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
plasma -X- _ B-CELL_COMPONENT
membrane. -X- _ I-CELL_COMPONENT
These -X- _ O
findings -X- _ O
suggest -X- _ O
an -X- _ O
enhanced -X- _ O
state -X- _ O
of -X- _ O
cellular -X- _ O
activity -X- _ O
with -X- _ O
increased -X- _ O
synthesis -X- _ O
and -X- _ O
potential -X- _ O
accumulation -X- _ O
of -X- _ O
SHH -X- _ O
, -X- _ O
aligning -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
findings -X- _ O
in -X- _ O
lower -X- _ O
vertebrates -X- _ O
and -X- _ O
rodents -X- _ O
, -X- _ O
where -X- _ O
increased -X- _ O
SHH -X- _ O
signaling -X- _ O
plays -X- _ O
a -X- _ O
role -X- _ O
in -X- _ O
Müller -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
reprogramming -X- _ O
and -X- _ O
retinal -X- _ O
regeneration -X- _ O
[ -X- _ O
18,48,49 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Furthermore -X- _ O
, -X- _ O
significantly -X- _ O
higher -X- _ O
levels -X- _ O
of -X- _ O
SHH -X- _ O
were -X- _ O
observed -X- _ O
in -X- _ O
HG -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
compared -X- _ O
to -X- _ O
NG -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
cells. -X- _ I-CELL_LINE
Conversely -X- _ O
, -X- _ O
HG -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
exposed -X- _ O
to -X- _ O
GF -X- _ O
treatments -X- _ O
showed -X- _ O
a -X- _ O
decrease -X- _ O
in -X- _ O
SHH -X- _ O
protein -X- _ O
expression -X- _ O
levels. -X- _ O
A -X- _ O
trend -X- _ O
toward -X- _ O
a -X- _ O
decrease -X- _ O
was -X- _ O
also -X- _ O
observed -X- _ O
in -X- _ O
response -X- _ O
to -X- _ O
sustained -X- _ O
high-glucose. -X- _ O
This -X- _ O
finding -X- _ O
is -X- _ O
consistent -X- _ O
with -X- _ O
a -X- _ O
previous -X- _ O
study -X- _ O
in -X- _ O
which -X- _ O
the -X- _ O
authors -X- _ O
observed -X- _ O
a -X- _ O
decrease -X- _ O
in -X- _ O
SHH -X- _ O
signaling -X- _ O
in -X- _ O
reactive -X- _ O
astrocytes -X- _ B-CELL
of -X- _ O
the -X- _ O
cerebral -X- _ B-TISSUE
cortex -X- _ I-TISSUE
after -X- _ O
acute -X- _ O
, -X- _ O
focal -X- _ O
injury -X- _ O
, -X- _ O
particularly -X- _ O
in -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
proximal -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
lesion -X- _ O
site -X- _ O
[ -X- _ O
50 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
This -X- _ O
highlights -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
negative -X- _ O
regulation -X- _ O
of -X- _ O
SHH -X- _ O
activity -X- _ O
in -X- _ O
astrocytes -X- _ B-CELL
is -X- _ O
context-dependent -X- _ O
and -X- _ O
varies -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
degree -X- _ O
of -X- _ O
cellular -X- _ O
damage. -X- _ O
In -X- _ O
our -X- _ O
study -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
decreased -X- _ O
SHH -X- _ O
levels -X- _ O
observed -X- _ O
in -X- _ O
HG -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
exposed -X- _ O
to -X- _ O
GFs -X- _ O
indicate -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
severity -X- _ O
of -X- _ O
metabolic -X- _ O
stress -X- _ O
may -X- _ O
influence -X- _ O
SHH -X- _ O
signaling -X- _ O
pathways -X- _ O
through -X- _ O
a -X- _ O
similar -X- _ O
mechanism. -X- _ O
These -X- _ O
observations -X- _ O
underscore -X- _ O
the -X- _ O
notion -X- _ O
that -X- _ O
glial -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
, -X- _ O
including -X- _ O
Müller -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
and -X- _ O
astrocytes -X- _ B-CELL
, -X- _ O
exhibit -X- _ O
differential -X- _ O
SHH -X- _ O
responses -X- _ O
depending -X- _ O
on -X- _ O
the -X- _ O
extent -X- _ O
of -X- _ O
glucose -X- _ O
stress -X- _ O
, -X- _ O
highlighting -X- _ O
the -X- _ O
dynamic -X- _ O
regulation -X- _ O
of -X- _ O
SHH -X- _ O
signaling -X- _ O
in -X- _ O
glial -X- _ B-CELL
cells. -X- _ I-CELL
Although -X- _ O
the -X- _ O
SHH -X- _ O
level -X- _ O
has -X- _ O
decreased -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
that -X- _ O
express -X- _ O
it -X- _ O
maintain -X- _ O
a -X- _ O
dot-like -X- _ O
distribution -X- _ O
of -X- _ O
SHH -X- _ O
inside -X- _ O
the -X- _ O
cells. -X- _ B-CELL
Our -X- _ O
findings -X- _ O
suggest -X- _ O
that -X- _ O
, -X- _ O
under -X- _ O
NG -X- _ O
condition -X- _ O
, -X- _ O
exposure -X- _ O
to -X- _ O
sustained -X- _ O
high-glucose -X- _ O
and -X- _ O
GFs -X- _ O
stimulates -X- _ O
SHH -X- _ O
expression -X- _ O
, -X- _ O
potentially -X- _ O
promoting -X- _ O
the -X- _ O
dedifferentiation -X- _ O
and -X- _ O
reprogramming -X- _ O
of -X- _ O
Müller -X- _ B-CELL
cells. -X- _ I-CELL
However -X- _ O
, -X- _ O
in -X- _ O
HG-adapted -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
, -X- _ O
additional -X- _ O
metabolic -X- _ O
stress -X- _ O
from -X- _ O
GF -X- _ O
treatments -X- _ O
leads -X- _ O
to -X- _ O
decreased -X- _ O
SHH -X- _ O
expression -X- _ O
, -X- _ O
possibly -X- _ O
impairing -X- _ O
regenerative -X- _ O
capacity -X- _ O
and -X- _ O
enhancing -X- _ O
gliotic -X- _ O
responses. -X- _ O
These -X- _ O
observations -X- _ O
indicate -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
severity -X- _ O
and -X- _ O
fluctuation -X- _ O
of -X- _ O
glucose -X- _ O
stress -X- _ O
influence -X- _ O
SHH -X- _ O
signaling -X- _ O
pathways -X- _ O
, -X- _ O
affecting -X- _ O
the -X- _ O
balance -X- _ O
between -X- _ O
neuroprotection -X- _ O
and -X- _ O
gliosis -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
retina. -X- _ B-TISSUE
A -X- _ O
previous -X- _ O
study -X- _ O
demonstrated -X- _ O
that -X- _ O
high-glucose -X- _ O
conditions -X- _ O
have -X- _ O
been -X- _ O
associated -X- _ O
with -X- _ O
increased -X- _ O
SOX2 -X- _ O
levels -X- _ O
in -X- _ O
human -X- _ O
Müller -X- _ B-CELL
glial -X- _ I-CELL
cells -X- _ I-CELL
, -X- _ O
which -X- _ O
may -X- _ O
support -X- _ O
cell -X- _ O
survival -X- _ O
and -X- _ O
regeneration -X- _ O
under -X- _ O
stress -X- _ O
conditions -X- _ O
[ -X- _ O
51 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
In -X- _ O
our -X- _ O
experiments -X- _ O
, -X- _ O
SOX2 -X- _ O
was -X- _ O
significantly -X- _ O
upregulated -X- _ O
in -X- _ O
HG -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
, -X- _ O
compared -X- _ O
to -X- _ O
NG -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
cells. -X- _ I-CELL_LINE
Furthermore -X- _ O
, -X- _ O
NG -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
have -X- _ O
the -X- _ O
capacity -X- _ O
to -X- _ O
modulate -X- _ O
this -X- _ O
gene -X- _ O
when -X- _ O
exposed -X- _ O
to -X- _ O
sustained -X- _ O
high-glucose -X- _ O
and -X- _ O
GF -X- _ O
treatments -X- _ O
, -X- _ O
exhibiting -X- _ O
a -X- _ O
consistent -X- _ O
upregulation -X- _ O
of -X- _ O
SOX2. -X- _ O
These -X- _ O
findings -X- _ O
are -X- _ O
consistent -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
observed -X- _ O
upregulation -X- _ O
of -X- _ O
SHH -X- _ O
in -X- _ O
NG -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
exposed -X- _ O
to -X- _ O
different -X- _ O
glucose -X- _ O
treatments. -X- _ O
Unlike -X- _ O
NG -X- _ O
MIO-M1cells -X- _ B-CELL_LINE
, -X- _ O
HG -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
exposed -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
same -X- _ O
glucose -X- _ O
treatments -X- _ O
do -X- _ O
not -X- _ O
show -X- _ O
variations -X- _ O
in -X- _ O
SOX2 -X- _ O
expression. -X- _ O
This -X- _ O
different -X- _ O
behavior -X- _ O
of -X- _ O
HG -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
, -X- _ O
with -X- _ O
regards -X- _ O
to -X- _ O
SOX2 -X- _ O
and -X- _ O
SHH -X- _ O
expression -X- _ O
, -X- _ O
may -X- _ O
be -X- _ O
due -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
different -X- _ O
roles -X- _ O
and -X- _ O
regulatory -X- _ O
mechanisms -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
glial -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
of -X- _ O
these -X- _ O
two -X- _ O
genes. -X- _ O
SOX2 -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
transcription -X- _ O
factor -X- _ O
crucial -X- _ O
for -X- _ O
maintaining -X- _ O
stemness -X- _ O
and -X- _ O
promoting -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
progenitor -X- _ O
proliferation -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
its -X- _ O
upregulation -X- _ O
could -X- _ O
be -X- _ O
a -X- _ O
response -X- _ O
to -X- _ O
cellular -X- _ O
stress -X- _ O
in -X- _ O
order -X- _ O
to -X- _ O
maintain -X- _ O
or -X- _ O
enhance -X- _ O
regenerative -X- _ O
capacity. -X- _ O
In -X- _ O
contrast -X- _ O
, -X- _ O
SHH -X- _ O
signaling -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
is -X- _ O
involved -X- _ O
in -X- _ O
cell -X- _ O
differentiation -X- _ O
and -X- _ O
tissue -X- _ O
patterning -X- _ O
, -X- _ O
may -X- _ O
be -X- _ O
more -X- _ O
sensitive -X- _ O
to -X- _ O
metabolic -X- _ O
perturbations -X- _ O
with -X- _ O
a -X- _ O
more -X- _ O
dynamic -X- _ O
regulation -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
can -X- _ O
lead -X- _ O
to -X- _ O
its -X- _ O
downregulation -X- _ O
under -X- _ O
glucose -X- _ O
fluctuations -X- _ O
treatments. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
despite -X- _ O
the -X- _ O
observed -X- _ O
upregulation -X- _ O
of -X- _ O
SHH -X- _ O
and -X- _ O
SOX2 -X- _ O
in -X- _ O
NG -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
, -X- _ O
the -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
rhodopsin -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
marker -X- _ O
of -X- _ O
mature -X- _ O
neuronal -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
, -X- _ O
was -X- _ O
not -X- _ O
detected. -X- _ O
This -X- _ O
indicates -X- _ O
that -X- _ O
, -X- _ O
although -X- _ O
the -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
possess -X- _ O
the -X- _ O
potential -X- _ O
to -X- _ O
differentiate -X- _ O
into -X- _ O
neuronal -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
, -X- _ O
the -X- _ O
conditions -X- _ O
employed -X- _ O
in -X- _ O
our -X- _ O
protocol -X- _ O
were -X- _ O
not -X- _ O
sufficient -X- _ O
to -X- _ O
fully -X- _ O
induce -X- _ O
this -X- _ O
differentiation. -X- _ O
The -X- _ O
lack -X- _ O
of -X- _ O
mature -X- _ O
neuronal -X- _ O
marker -X- _ O
expression -X- _ O
is -X- _ O
likely -X- _ O
due -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
timing -X- _ O
and -X- _ O
duration -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
experimental -X- _ O
conditions. -X- _ O
It -X- _ O
may -X- _ O
therefore -X- _ O
be -X- _ O
worthwhile -X- _ O
to -X- _ O
optimize -X- _ O
the -X- _ O
protocol -X- _ O
in -X- _ O
order -X- _ O
to -X- _ O
more -X- _ O
accurately -X- _ O
reflect -X- _ O
the -X- _ O
diabetic -X- _ O
conditions -X- _ O
in -X- _ O
humans -X- _ O
, -X- _ O
with -X- _ O
a -X- _ O
view -X- _ O
to -X- _ O
promoting -X- _ O
full -X- _ O
neuronal -X- _ O
differentiation. -X- _ O
Given -X- _ O
the -X- _ O
role -X- _ O
of -X- _ O
SHH -X- _ O
in -X- _ O
Müller -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
reprogramming -X- _ O
and -X- _ O
the -X- _ O
observed -X- _ O
upregulation -X- _ O
under -X- _ O
sustained -X- _ O
high-glucose -X- _ O
and -X- _ O
GF -X- _ O
treatments -X- _ O
, -X- _ O
future -X- _ O
experiments -X- _ O
could -X- _ O
investigate -X- _ O
the -X- _ O
effect -X- _ O
of -X- _ O
exogenous -X- _ O
SHH -X- _ O
treatment -X- _ O
on -X- _ O
human -X- _ O
Müller -X- _ B-CELL
cells. -X- _ I-CELL
This -X- _ O
approach -X- _ O
would -X- _ O
provide -X- _ O
insights -X- _ O
into -X- _ O
the -X- _ O
therapeutic -X- _ O
potential -X- _ O
of -X- _ O
modulating -X- _ O
SHH -X- _ O
signaling -X- _ O
to -X- _ O
mitigate -X- _ O
the -X- _ O
adverse -X- _ O
effects -X- _ O
of -X- _ O
reactive -X- _ O
gliosis -X- _ O
and -X- _ O
enhance -X- _ O
regenerative -X- _ O
processes -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
diabetic -X- _ O
retina. -X- _ B-TISSUE
Although -X- _ O
the -X- _ O
current -X- _ O
study -X- _ O
provides -X- _ O
important -X- _ O
insights -X- _ O
into -X- _ O
the -X- _ O
gliotic -X- _ O
and -X- _ O
reprogramming -X- _ O
potential -X- _ O
of -X- _ O
Müller -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
under -X- _ O
different -X- _ O
glucose -X- _ O
treatments -X- _ O
, -X- _ O
some -X- _ O
limitations -X- _ O
should -X- _ O
be -X- _ O
considered. -X- _ O
The -X- _ O
study -X- _ O
employed -X- _ O
the -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
cell -X- _ I-CELL_LINE
line -X- _ I-CELL_LINE
, -X- _ O
which -X- _ O
, -X- _ O
although -X- _ O
well -X- _ O
established -X- _ O
in -X- _ O
human -X- _ O
retinal -X- _ O
research -X- _ O
, -X- _ O
may -X- _ O
not -X- _ O
fully -X- _ O
capture -X- _ O
the -X- _ O
physiological -X- _ O
complexity -X- _ O
of -X- _ O
Müller -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
found -X- _ O
in -X- _ O
human -X- _ O
retina. -X- _ B-TISSUE
Future -X- _ O
research -X- _ O
could -X- _ O
benefit -X- _ O
from -X- _ O
using -X- _ O
primary -X- _ O
Müller -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
to -X- _ O
better -X- _ O
reflect -X- _ O
the -X- _ O
in -X- _ O
vivo -X- _ O
context -X- _ O
of -X- _ O
human -X- _ O
diabetic -X- _ O
retinopathy. -X- _ O
In -X- _ O
addition -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
effects -X- _ O
of -X- _ O
other -X- _ O
stressors -X- _ O
, -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
oxidative -X- _ O
stress -X- _ O
or -X- _ O
hypoxia -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
also -X- _ O
play -X- _ O
a -X- _ O
role -X- _ O
in -X- _ O
diabetic -X- _ O
retinal -X- _ O
damage -X- _ O
, -X- _ O
were -X- _ O
not -X- _ O
included -X- _ O
in -X- _ O
our -X- _ O
model. -X- _ O
Inclusion -X- _ O
of -X- _ O
these -X- _ O
factors -X- _ O
could -X- _ O
provide -X- _ O
a -X- _ O
more -X- _ O
comprehensive -X- _ O
understanding -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
cellular -X- _ O
mechanisms -X- _ O
involved. -X- _ O
Despite -X- _ O
these -X- _ O
limitations -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
current -X- _ O
study -X- _ O
contributes -X- _ O
important -X- _ O
insights -X- _ O
into -X- _ O
the -X- _ O
gliotic -X- _ O
and -X- _ O
reprogramming -X- _ O
potential -X- _ O
of -X- _ O
Müller -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
under -X- _ O
varying -X- _ O
glucose -X- _ O
conditions. -X- _ O
4. -X- _ O
materials -X- _ O
and -X- _ O
methods -X- _ O
4.5. -X- _ O
statistical -X- _ O
analysis -X- _ O
All -X- _ O
the -X- _ O
results -X- _ O
are -X- _ O
expressed -X- _ O
as -X- _ O
the -X- _ O
mean -X- _ O
± -X- _ O
SEM -X- _ O
( -X- _ O
standard -X- _ O
error -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
mean -X- _ O
) -X- _ O
of -X- _ O
at -X- _ O
least -X- _ O
three -X- _ O
independent -X- _ O
experiments. -X- _ O
Statistically -X- _ O
significant -X- _ O
differences -X- _ O
were -X- _ O
assessed -X- _ O
using -X- _ O
Prism -X- _ O
6.05 -X- _ O
( -X- _ O
GraphPad -X- _ O
PRISM -X- _ O
Software -X- _ O
, -X- _ O
Inc. -X- _ O
, -X- _ O
La -X- _ O
Jolla -X- _ O
, -X- _ O
CA -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
) -X- _ O
with -X- _ O
Student’s -X- _ O
t-test -X- _ O
for -X- _ O
statistical -X- _ O
comparison -X- _ O
between -X- _ O
groups. -X- _ O
Differences -X- _ O
between -X- _ O
means -X- _ O
were -X- _ O
considered -X- _ O
statistically -X- _ O
significant -X- _ O
when -X- _ O
p-values -X- _ O
were -X- _ O
at -X- _ O
least -X- _ O
***5. -X- _ O
Conclusions*** -X- _ O
The -X- _ O
results -X- _ O
showed -X- _ O
that -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
Müller -X- _ I-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
exhibit -X- _ O
distinct -X- _ O
responses -X- _ O
to -X- _ O
different -X- _ O
glucose -X- _ O
treatments -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
are -X- _ O
strongly -X- _ O
dependent -X- _ O
on -X- _ O
their -X- _ O
metabolic -X- _ O
environment. -X- _ O
This -X- _ O
differential -X- _ O
response -X- _ O
could -X- _ O
have -X- _ O
implications -X- _ O
for -X- _ O
the -X- _ O
onset -X- _ O
and -X- _ O
progression -X- _ O
of -X- _ O
diabetic -X- _ O
retinopathy. -X- _ O
The -X- _ O
increased -X- _ O
levels -X- _ O
of -X- _ O
activation -X- _ O
and -X- _ O
dedifferentiation -X- _ O
markers -X- _ O
observed -X- _ O
in -X- _ O
NG -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
in -X- _ O
response -X- _ O
to -X- _ O
different -X- _ O
glucose -X- _ O
treatments -X- _ O
suggest -X- _ O
a -X- _ O
protective -X- _ O
response -X- _ O
that -X- _ O
may -X- _ O
occur -X- _ O
in -X- _ O
early -X- _ O
or -X- _ O
well-controlled -X- _ O
diabetes. -X- _ O
In -X- _ O
contrast -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
lack -X- _ O
of -X- _ O
response -X- _ O
observed -X- _ O
in -X- _ O
HG -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
exposed -X- _ O
to -X- _ O
different -X- _ O
glucose -X- _ O
treatments -X- _ O
may -X- _ O
reflect -X- _ O
an -X- _ O
exhausted -X- _ O
gliotic -X- _ O
and -X- _ O
reprogramming -X- _ O
capacity -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
could -X- _ O
contribute -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
development -X- _ O
and -X- _ O
progression -X- _ O
of -X- _ O
diabetic -X- _ O
complications -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
retinal -X- _ O
neurodegeneration -X- _ O
and -X- _ O
diabetic -X- _ O
retinopathy -X- _ O
observed -X- _ O
in -X- _ O
uncontrolled -X- _ O
diabetic -X- _ O
patients -X- _ O
exposed -X- _ O
to -X- _ O
prolonged -X- _ O
metabolic -X- _ O
glucose -X- _ O
stress. -X- _ O
Although -X- _ O
our -X- _ O
results -X- _ O
provide -X- _ O
valuable -X- _ O
insights -X- _ O
, -X- _ O
further -X- _ O
in-depth -X- _ O
studies -X- _ O
are -X- _ O
needed -X- _ O
to -X- _ O
elucidate -X- _ O
the -X- _ O
mechanisms -X- _ O
involved -X- _ O
and -X- _ O
to -X- _ O
explore -X- _ O
the -X- _ O
potential -X- _ O
therapeutic -X- _ O
implications -X- _ O
for -X- _ O
mitigating -X- _ O
retinal -X- _ O
neurodegeneration -X- _ O
associated -X- _ O
with -X- _ O
diabetes. -X- _ O
Extending -X- _ O
these -X- _ O
studies -X- _ O
to -X- _ O
primary -X- _ B-CELL
Müller -X- _ I-CELL
cells -X- _ I-CELL
in -X- _ O
future -X- _ O
research -X- _ O
would -X- _ O
provide -X- _ O
a -X- _ O
more -X- _ O
physiologically -X- _ O
relevant -X- _ O
system -X- _ O
, -X- _ O
helping -X- _ O
to -X- _ O
validate -X- _ O
and -X- _ O
refine -X- _ O
our -X- _ O
findings. -X- _ O
This -X- _ O
approach -X- _ O
would -X- _ O
provide -X- _ O
a -X- _ O
deeper -X- _ O
understanding -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
cellular -X- _ O
response -X- _ O
to -X- _ O
sustained -X- _ O
high-glucose -X- _ O
and -X- _ O
glucose -X- _ O
fluctuations -X- _ O
and -X- _ O
could -X- _ O
improve -X- _ O
the -X- _ O
development -X- _ O
of -X- _ O
targeted -X- _ O
therapeutic -X- _ O
strategies -X- _ O
for -X- _ O
retinal -X- _ O
pathologies -X- _ O
in -X- _ O
human -X- _ O
patients. -X- _ O
Source -X- _ O
paper -X- _ O
: -X- _ O
PMC11641291 -X- _ O

Introduction -X- _ O
Antiretroviral -X- _ O
therapy -X- _ O
( -X- _ O
ART -X- _ O
) -X- _ O
has -X- _ O
been -X- _ O
highly -X- _ O
effective -X- _ O
at -X- _ O
suppressing -X- _ O
human -X- _ O
immunodeficiency -X- _ O
virus -X- _ O
( -X- _ O
HIV -X- _ O
) -X- _ O
replication -X- _ O
, -X- _ O
thus -X- _ O
significantly -X- _ O
reducing -X- _ O
disease -X- _ O
progression -X- _ O
and -X- _ O
mortality -X- _ O
in -X- _ O
infected -X- _ O
individuals. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
ART -X- _ O
is -X- _ O
not -X- _ O
curative -X- _ O
and -X- _ O
does -X- _ O
not -X- _ O
meaningfully -X- _ O
impact -X- _ O
persistent -X- _ O
viral -X- _ O
reservoirs -X- _ O
( -X- _ O
VRs -X- _ O
) -X- _ O
of -X- _ O
latently -X- _ O
infected -X- _ B-CELL_CONTEXT
cells -X- _ B-CELL
that -X- _ O
comprise -X- _ O
CD4+ -X- _ B-CELL
T -X- _ I-CELL
cells -X- _ I-CELL
and -X- _ O
myeloid -X- _ B-CELL
cells.1,2,3 -X- _ I-CELL
Indeed -X- _ O
, -X- _ O
upon -X- _ O
antiviral -X- _ O
treatment -X- _ O
interruption -X- _ O
( -X- _ O
ATI -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
virus -X- _ O
quickly -X- _ O
rebounds -X- _ O
after -X- _ O
several -X- _ O
weeks -X- _ O
, -X- _ O
highlighting -X- _ O
how -X- _ O
the -X- _ O
presence -X- _ O
of -X- _ O
VRs -X- _ O
obviates -X- _ O
an -X- _ O
HIV -X- _ O
cure.4,5,6 -X- _ O
Therefore -X- _ O
, -X- _ O
eliminating -X- _ O
or -X- _ O
controlling -X- _ O
VRs -X- _ O
remains -X- _ O
an -X- _ O
unwavering -X- _ O
priority -X- _ O
for -X- _ O
HIV -X- _ O
cure -X- _ O
research. -X- _ O
In -X- _ O
this -X- _ O
context -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
aim -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
“shock-and-kill” -X- _ O
strategy -X- _ O
is -X- _ O
to -X- _ O
reactivate -X- _ O
latently -X- _ O
infected -X- _ B-CELL_CONTEXT
cells -X- _ B-CELL
with -X- _ O
latency -X- _ O
reversal -X- _ O
agents -X- _ O
( -X- _ O
LRAs -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
render -X- _ O
them -X- _ O
vulnerable -X- _ O
to -X- _ O
cell -X- _ O
death -X- _ O
or -X- _ O
clearance -X- _ O
by -X- _ O
the -X- _ O
immune -X- _ O
system.7,8 -X- _ O
Previously -X- _ O
reported -X- _ O
approaches -X- _ O
to -X- _ O
HIV -X- _ O
reactivation -X- _ O
, -X- _ O
including -X- _ O
protein -X- _ O
kinase -X- _ O
C -X- _ O
( -X- _ O
PRKC -X- _ O
) -X- _ O
agonists -X- _ O
, -X- _ O
histone -X- _ O
deacetylase -X- _ O
( -X- _ O
HDAC -X- _ O
) -X- _ O
inhibitors -X- _ O
( -X- _ O
HDACi -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
toll-like -X- _ O
receptor -X- _ O
( -X- _ O
TLR -X- _ O
) -X- _ O
agonists,9 -X- _ O
have -X- _ O
been -X- _ O
highly -X- _ O
effective -X- _ O
in -X- _ O
in -X- _ O
vitro -X- _ O
models -X- _ O
of -X- _ O
latency -X- _ O
, -X- _ O
but -X- _ O
their -X- _ O
efficacy -X- _ O
is -X- _ O
only -X- _ O
moderate -X- _ O
when -X- _ O
tested -X- _ O
in -X- _ O
vivo.10,11,12,13 -X- _ O
Moreover -X- _ O
, -X- _ O
by -X- _ O
broadly -X- _ O
activating -X- _ O
cellular -X- _ O
pathways -X- _ O
, -X- _ O
these -X- _ O
compounds -X- _ O
elicit -X- _ O
significant -X- _ O
proinflammatory -X- _ O
effects -X- _ O
or -X- _ O
alter -X- _ O
the -X- _ O
function -X- _ O
and -X- _ O
fate -X- _ O
of -X- _ O
specific -X- _ O
immune -X- _ O
effector -X- _ O
cells,14,15 -X- _ O
hence -X- _ O
limiting -X- _ O
their -X- _ O
use -X- _ O
in -X- _ O
clinical -X- _ O
settings.16,17,18,19 -X- _ O
Similarly -X- _ O
, -X- _ O
promising -X- _ O
candidates -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
bryostatin-1 -X- _ O
and -X- _ O
analogs -X- _ O
, -X- _ O
phorbol -X- _ O
esters -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
phosphatidylethanolamine -X- _ O
binding -X- _ O
protein -X- _ O
1 -X- _ O
( -X- _ O
PEBP1 -X- _ O
) -X- _ O
agonists -X- _ O
reactivate -X- _ O
HIV -X- _ O
via -X- _ O
activation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
canonical -X- _ O
nuclear -X- _ O
factor -X- _ O
kappa -X- _ O
B -X- _ O
( -X- _ O
NFKB -X- _ O
) -X- _ O
pathway,13,20 -X- _ O
inadvertently -X- _ O
leading -X- _ O
to -X- _ O
uncontrolled -X- _ O
cytokine -X- _ O
release -X- _ O
and -X- _ O
overt -X- _ O
T -X- _ O
cell -X- _ O
activation.21,22 -X- _ O
Consequently -X- _ O
, -X- _ O
there -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
need -X- _ O
to -X- _ O
develop -X- _ O
alternative -X- _ O
approach -X- _ O
( -X- _ O
es -X- _ O
) -X- _ O
that -X- _ O
can -X- _ O
reactivate -X- _ O
latent -X- _ O
reservoirs -X- _ O
and -X- _ O
eliminate -X- _ O
infected -X- _ B-CELL_CONTEXT
cells -X- _ B-CELL
without -X- _ O
triggering -X- _ O
systemic -X- _ O
activation -X- _ O
, -X- _ O
inflammation -X- _ O
, -X- _ O
or -X- _ O
impairment -X- _ O
of -X- _ O
immune -X- _ O
clearance -X- _ O
mechanisms. -X- _ O
In -X- _ O
this -X- _ O
regard -X- _ O
, -X- _ O
small -X- _ O
molecules -X- _ O
known -X- _ O
as -X- _ O
mimetics -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
second -X- _ O
mitochondrial -X- _ O
activator -X- _ O
of -X- _ O
caspases -X- _ O
( -X- _ O
SMAC -X- _ O
mimetics -X- _ O
[ -X- _ O
SMs -X- _ O
] -X- _ O
) -X- _ O
were -X- _ O
originally -X- _ O
developed -X- _ O
as -X- _ O
cancer -X- _ O
therapeutics. -X- _ O
They -X- _ O
have -X- _ O
received -X- _ O
increasing -X- _ O
recognition -X- _ O
because -X- _ O
they -X- _ O
specifically -X- _ O
activate -X- _ O
the -X- _ O
non-canonical -X- _ O
NFKB -X- _ O
pathway,23,24,25 -X- _ O
which -X- _ O
naturally -X- _ O
exhibits -X- _ O
higher -X- _ O
functional -X- _ O
selectivity -X- _ O
and -X- _ O
more -X- _ O
confined -X- _ O
proinflammatory -X- _ O
effects -X- _ O
compared -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
canonical -X- _ O
NFKB -X- _ O
pathway.24,26 -X- _ O
Engagement -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
non-canonical -X- _ O
NFKB -X- _ O
pathway -X- _ O
by -X- _ O
SMAC -X- _ O
leads -X- _ O
to -X- _ O
degradation -X- _ O
of -X- _ O
cellular -X- _ O
inhibitor -X- _ O
of -X- _ O
apoptosis -X- _ O
( -X- _ O
cIAP -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
accumulation -X- _ O
of -X- _ O
NFKB-inducing -X- _ O
kinase -X- _ O
( -X- _ O
NIK -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
activation -X- _ O
of -X- _ O
component -X- _ O
of -X- _ O
inhibitor -X- _ O
of -X- _ O
NFKB -X- _ O
kinase -X- _ O
complex -X- _ O
( -X- _ O
CHUK -X- _ O
) -X- _ O
homodimer -X- _ O
, -X- _ O
culminating -X- _ O
in -X- _ O
cleavage -X- _ O
of -X- _ O
inactive -X- _ O
NFKB2 -X- _ O
p100 -X- _ O
to -X- _ O
active -X- _ O
p52.26 -X- _ O
An -X- _ O
association -X- _ O
between -X- _ O
RELB -X- _ O
and -X- _ O
p52 -X- _ O
induces -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
target -X- _ O
genes27 -X- _ O
and -X- _ O
, -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
context -X- _ O
of -X- _ O
HIV -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
pathway -X- _ O
reactivates -X- _ O
latently -X- _ O
infected -X- _ O
VRs.20 -X- _ O
The -X- _ O
non-canonical -X- _ O
NFKB -X- _ O
pathway -X- _ O
can -X- _ O
also -X- _ O
be -X- _ O
triggered -X- _ O
by -X- _ O
signaling -X- _ O
intermediates -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
apoptosis -X- _ O
cascade. -X- _ O
In -X- _ O
fact -X- _ O
, -X- _ O
cleavage -X- _ O
of -X- _ O
SMAC -X- _ O
/ -X- _ O
DIABLO -X- _ O
exposes -X- _ O
the -X- _ O
N-terminal -X- _ O
motif -X- _ O
Ala-Val-Pro-Ile -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
binds -X- _ O
specifically -X- _ O
to -X- _ O
baculovirus -X- _ O
intermediate -X- _ O
repeat -X- _ O
domains -X- _ O
2 -X- _ O
and -X- _ O
3 -X- _ O
of -X- _ O
IAP -X- _ O
proteins. -X- _ O
These -X- _ O
proteins -X- _ O
in -X- _ O
turn -X- _ O
trigger -X- _ O
downstream -X- _ O
events -X- _ O
that -X- _ O
ultimately -X- _ O
lead -X- _ O
to -X- _ O
degradation -X- _ O
of -X- _ O
baculoviral -X- _ O
IAP -X- _ O
repeat -X- _ O
containing -X- _ O
2 -X- _ O
( -X- _ O
BIRC2 -X- _ O
, -X- _ O
also -X- _ O
known -X- _ O
as -X- _ O
cIAP1 -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
baculoviral -X- _ O
IAP -X- _ O
repeat -X- _ O
containing -X- _ O
3 -X- _ O
( -X- _ O
BIRC3 -X- _ O
, -X- _ O
also -X- _ O
known -X- _ O
as -X- _ O
cIAP2 -X- _ O
) -X- _ O
28 -X- _ O
and -X- _ O
potentiation -X- _ O
of -X- _ O
apoptosis.29 -X- _ O
The -X- _ O
unique -X- _ O
ability -X- _ O
of -X- _ O
SMAC -X- _ O
to -X- _ O
degrade -X- _ O
IAPs -X- _ O
and -X- _ O
activate -X- _ O
apoptosis -X- _ O
pathway -X- _ O
( -X- _ O
s -X- _ O
) -X- _ O
makes -X- _ O
SMs -X- _ O
interesting -X- _ O
candidates -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
field -X- _ O
of -X- _ O
HIV -X- _ O
cure -X- _ O
research30,31 -X- _ O
because -X- _ O
latently -X- _ B-CELL_CONTEXT
infected -X- _ I-CELL_CONTEXT
CD4+ -X- _ B-CELL
T -X- _ I-CELL
cells -X- _ I-CELL
display -X- _ O
aberrant -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
cell -X- _ O
survival -X- _ O
factors -X- _ O
, -X- _ O
including -X- _ O
XIAP -X- _ O
, -X- _ O
BIRC2 -X- _ O
and -X- _ O
BCL2.8,32 -X- _ O
Pharmacological -X- _ O
activation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
non-canonical -X- _ O
NFKB -X- _ O
pathway -X- _ O
by -X- _ O
SMs -X- _ O
was -X- _ O
recently -X- _ O
found -X- _ O
to -X- _ O
induce -X- _ O
on-ART -X- _ O
plasma -X- _ B-TISSUE
viremia -X- _ O
in -X- _ O
animal -X- _ O
models -X- _ O
of -X- _ O
HIV -X- _ O
latency,24,25 -X- _ O
underscoring -X- _ O
the -X- _ O
potential -X- _ O
of -X- _ O
this -X- _ O
class -X- _ O
of -X- _ O
molecules -X- _ O
as -X- _ O
LRAs. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
it -X- _ O
remains -X- _ O
unclear -X- _ O
whether -X- _ O
induction -X- _ O
of -X- _ O
HIV -X- _ O
expression -X- _ O
by -X- _ O
SMs -X- _ O
leads -X- _ O
to -X- _ O
a -X- _ O
reduction -X- _ O
of -X- _ O
VRs -X- _ O
in -X- _ O
lymphoid -X- _ B-TISSUE
and -X- _ O
non-lymphoid -X- _ B-TISSUE
tissues -X- _ I-TISSUE
of -X- _ O
animal -X- _ O
models. -X- _ O
In -X- _ O
this -X- _ O
study -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
show -X- _ O
that -X- _ O
bivalent -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
, -X- _ O
currently -X- _ O
in -X- _ O
clinical -X- _ O
development -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
oncology -X- _ O
field -X- _ O
, -X- _ O
activates -X- _ O
the -X- _ O
non-canonical -X- _ O
NFKB -X- _ O
pathway -X- _ O
and -X- _ O
hence -X- _ O
, -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
potent -X- _ O
LRA. -X- _ O
By -X- _ O
degrading -X- _ O
IAPs -X- _ O
, -X- _ O
this -X- _ O
compound -X- _ O
also -X- _ O
induces -X- _ O
the -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
active -X- _ O
caspase -X- _ O
3 -X- _ O
( -X- _ O
CASP3 -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
key -X- _ O
component -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
execution -X- _ O
phase -X- _ O
of -X- _ O
apoptosis -X- _ O
, -X- _ O
in -X- _ O
latently -X- _ B-CELL_CONTEXT
infected -X- _ I-CELL_CONTEXT
cells. -X- _ B-CELL
Likewise -X- _ O
, -X- _ O
in -X- _ O
primary -X- _ B-CELL
CD4+ -X- _ I-CELL
T -X- _ I-CELL
cells -X- _ I-CELL
infected -X- _ O
with -X- _ O
a -X- _ O
dual -X- _ O
reporter-encoded -X- _ O
HIV -X- _ O
, -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
reduces -X- _ O
the -X- _ O
level -X- _ O
of -X- _ O
latent -X- _ B-CELL_CONTEXT
cells -X- _ B-CELL
without -X- _ O
notably -X- _ O
affecting -X- _ O
the -X- _ O
productively -X- _ O
infected -X- _ O
pool. -X- _ O
Accordingly -X- _ O
, -X- _ O
in -X- _ O
vivo -X- _ O
treatment -X- _ O
with -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
could -X- _ O
reactivate -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
latent -X- _ O
viruses -X- _ O
and -X- _ O
was -X- _ O
found -X- _ O
to -X- _ O
meaningfully -X- _ O
reduce -X- _ O
the -X- _ O
integrated -X- _ O
HIV-DNA -X- _ O
level -X- _ O
in -X- _ O
tissues -X- _ B-TISSUE
of -X- _ O
ART-suppressed -X- _ O
humanized -X- _ O
bone -X- _ B-TISSUE
marrow -X- _ I-TISSUE
liver -X- _ B-TISSUE
thymus -X- _ B-TISSUE
( -X- _ O
BLT -X- _ O
) -X- _ O
mice -X- _ O
, -X- _ O
without -X- _ O
assessable -X- _ O
immunotoxicity. -X- _ O
Upon -X- _ O
ART -X- _ O
interruption -X- _ O
, -X- _ O
APG-1387-treated -X- _ O
mice -X- _ O
rebounded -X- _ O
more -X- _ O
slowly -X- _ O
and -X- _ O
to -X- _ O
a -X- _ O
lower -X- _ O
set -X- _ O
point. -X- _ O
Overall -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
study -X- _ O
demonstrates -X- _ O
that -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
has -X- _ O
the -X- _ O
capacity -X- _ O
to -X- _ O
not -X- _ O
only -X- _ O
reverse -X- _ O
HIV -X- _ O
latency -X- _ O
but -X- _ O
also -X- _ O
potentiate -X- _ O
cell -X- _ O
apoptosis -X- _ O
, -X- _ O
thus -X- _ O
supporting -X- _ O
the -X- _ O
notion -X- _ O
that -X- _ O
bivalent -X- _ O
SMs -X- _ O
could -X- _ O
be -X- _ O
harnessed -X- _ O
to -X- _ O
reduce -X- _ O
VRs -X- _ O
without -X- _ O
causing -X- _ O
generalized -X- _ O
T -X- _ O
cell -X- _ O
activation. -X- _ O
Results -X- _ O
Discussion -X- _ O
Several -X- _ O
LRAs -X- _ O
have -X- _ O
shown -X- _ O
their -X- _ O
biological -X- _ O
activity -X- _ O
both -X- _ O
in -X- _ O
vitro -X- _ O
and -X- _ O
in -X- _ O
vivo -X- _ O
but -X- _ O
are -X- _ O
clinically -X- _ O
unsafe -X- _ O
for -X- _ O
further -X- _ O
evaluations.46,47 -X- _ O
The -X- _ O
most -X- _ O
potent -X- _ O
LRAs -X- _ O
, -X- _ O
including -X- _ O
HDACi -X- _ O
and -X- _ O
protein -X- _ O
kinase -X- _ O
C -X- _ O
( -X- _ O
PRKC -X- _ O
) -X- _ O
agonist -X- _ O
bryostatin-1 -X- _ O
, -X- _ O
activate -X- _ O
the -X- _ O
canonical -X- _ O
NFKB -X- _ O
pathway,46 -X- _ O
causing -X- _ O
explicit -X- _ O
T -X- _ O
cell -X- _ O
activation -X- _ O
and -X- _ O
broad -X- _ O
cytotoxicity -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
hence -X- _ O
eliciting -X- _ O
significant -X- _ O
collateral -X- _ O
damage -X- _ O
on -X- _ O
host -X- _ B-CELL
cells. -X- _ I-CELL
Reactivation -X- _ O
of -X- _ O
latent -X- _ O
HIV -X- _ O
by -X- _ O
PRKC -X- _ O
agonists -X- _ O
has -X- _ O
recently -X- _ O
been -X- _ O
demonstrated -X- _ O
to -X- _ O
induce -X- _ O
resistance -X- _ O
to -X- _ O
apoptosis -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
phenomenon -X- _ O
often -X- _ O
associated -X- _ O
with -X- _ O
phosphorylation -X- _ O
and -X- _ O
activation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
antiapoptotic -X- _ O
protein -X- _ O
BCL2.48 -X- _ O
Thus -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
failure -X- _ O
of -X- _ O
common -X- _ O
LRAs -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
PRKC -X- _ O
agonists -X- _ O
and -X- _ O
HDACi -X- _ O
to -X- _ O
safely -X- _ O
purge -X- _ O
HIV -X- _ O
and -X- _ O
effectively -X- _ O
reduce -X- _ O
VRs -X- _ O
in -X- _ O
people -X- _ O
living -X- _ O
with -X- _ O
HIV -X- _ O
necessitates -X- _ O
the -X- _ O
development -X- _ O
of -X- _ O
clinical -X- _ O
approaches -X- _ O
to -X- _ O
achieve -X- _ O
an -X- _ O
HIV -X- _ O
cure. -X- _ O
In -X- _ O
this -X- _ O
study -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
demonstrate -X- _ O
that -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
bivalent -X- _ O
SM -X- _ O
initially -X- _ O
developed -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
cancer -X- _ O
therapy -X- _ O
, -X- _ O
can -X- _ O
efficiently -X- _ O
reactivate -X- _ O
HIV -X- _ O
in -X- _ O
CD4+ -X- _ B-CELL_LINE
T -X- _ I-CELL_LINE
cell -X- _ I-CELL_LINE
line -X- _ I-CELL_LINE
models -X- _ I-CELL_LINE
of -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
latency -X- _ O
via -X- _ O
a -X- _ O
process -X- _ O
that -X- _ O
involves -X- _ O
activation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
noncanonical -X- _ O
NFKB -X- _ O
pathway. -X- _ O
Although -X- _ O
this -X- _ O
IAP -X- _ O
antagonist -X- _ O
modestly -X- _ O
increases -X- _ O
HIV -X- _ O
RNA -X- _ O
detection -X- _ O
in -X- _ O
virally -X- _ O
suppressed -X- _ O
hu-mice -X- _ O
, -X- _ O
it -X- _ O
has -X- _ O
the -X- _ O
capability -X- _ O
to -X- _ O
reduce -X- _ O
both -X- _ O
the -X- _ O
frequency -X- _ O
of -X- _ O
latently -X- _ B-CELL_CONTEXT
infected -X- _ I-CELL_CONTEXT
cells -X- _ B-CELL
and -X- _ O
the -X- _ O
level -X- _ O
of -X- _ O
viral -X- _ O
rebound -X- _ O
upon -X- _ O
ART -X- _ O
treatment -X- _ O
interruption. -X- _ O
Indeed -X- _ O
, -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
treatment -X- _ O
enhances -X- _ O
the -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
caspase-3 -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
marker -X- _ O
of -X- _ O
apoptosis -X- _ O
, -X- _ O
in -X- _ O
latently -X- _ B-CELL_CONTEXT
infected -X- _ I-CELL_CONTEXT
cells -X- _ B-CELL
from -X- _ O
T -X- _ B-CELL_LINE
cell -X- _ I-CELL_LINE
lines -X- _ I-CELL_LINE
or -X- _ O
in -X- _ O
T -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
from -X- _ O
certain -X- _ O
tissues -X- _ B-TISSUE
of -X- _ O
virally -X- _ O
suppressed -X- _ O
hu-mice. -X- _ O
In -X- _ O
the -X- _ O
context -X- _ O
of -X- _ O
productive -X- _ O
infection -X- _ O
, -X- _ O
in -X- _ O
vitro -X- _ O
stimulation -X- _ O
with -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
also -X- _ O
enhanced -X- _ O
cleavage -X- _ O
of -X- _ O
CASP3. -X- _ O
IAPs -X- _ O
are -X- _ O
overly -X- _ O
expressed -X- _ O
in -X- _ O
various -X- _ O
cancers -X- _ O
, -X- _ O
enabling -X- _ O
prolonged -X- _ O
survival -X- _ O
of -X- _ O
cancerous -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
[ -X- _ O
as -X- _ O
reviewed -X- _ O
by49 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Consequently -X- _ O
, -X- _ O
their -X- _ O
antagonists -X- _ O
are -X- _ O
thought -X- _ O
to -X- _ O
either -X- _ O
directly -X- _ O
induce -X- _ O
or -X- _ O
sensitize -X- _ O
cancerous -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
to -X- _ O
death -X- _ O
by -X- _ O
triggering -X- _ O
proapoptotic -X- _ O
pathways.50,51 -X- _ O
Interestingly -X- _ O
, -X- _ O
IAPs -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
BIRC2 -X- _ O
have -X- _ O
recently -X- _ O
been -X- _ O
shown -X- _ O
to -X- _ O
be -X- _ O
negative -X- _ O
regulators -X- _ O
of -X- _ O
HIV -X- _ O
transcription -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
their -X- _ O
expression -X- _ O
is -X- _ O
found -X- _ O
to -X- _ O
be -X- _ O
correlated -X- _ O
with -X- _ O
viral -X- _ O
latency.23,31,32 -X- _ O
Indeed -X- _ O
, -X- _ O
both -X- _ O
BIRC2 -X- _ O
/ -X- _ O
3 -X- _ O
and -X- _ O
XIAP -X- _ O
are -X- _ O
overexpressed -X- _ O
in -X- _ O
HIV -X- _ O
latently -X- _ B-CELL_CONTEXT
infected -X- _ I-CELL_CONTEXT
CD4+ -X- _ B-CELL
T -X- _ I-CELL
and -X- _ O
myeloid -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
, -X- _ O
and -X- _ O
the -X- _ O
SMs -X- _ O
which -X- _ O
induce -X- _ O
the -X- _ O
degradation -X- _ O
of -X- _ O
these -X- _ O
IAPs -X- _ O
can -X- _ O
reactivate -X- _ O
HIV. -X- _ O
We -X- _ O
demonstrate -X- _ O
herein -X- _ O
that -X- _ O
various -X- _ O
monovalent -X- _ O
and -X- _ O
bivalent -X- _ O
SMs -X- _ O
can -X- _ O
induce -X- _ O
efficient -X- _ O
viral -X- _ O
reactivation -X- _ O
in -X- _ O
different -X- _ O
T -X- _ B-CELL_LINE
cell -X- _ I-CELL_LINE
models -X- _ I-CELL_LINE
of -X- _ O
latency -X- _ O
and -X- _ O
that -X- _ O
some -X- _ O
are -X- _ O
more -X- _ O
potent -X- _ O
than -X- _ O
others. -X- _ O
Bivalent -X- _ O
SMs -X- _ O
are -X- _ O
more -X- _ O
effective -X- _ O
than -X- _ O
their -X- _ O
monovalent -X- _ O
counterparts -X- _ O
, -X- _ O
probably -X- _ O
because -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
presence -X- _ O
of -X- _ O
dimers -X- _ O
that -X- _ O
may -X- _ O
contribute -X- _ O
to -X- _ O
a -X- _ O
more -X- _ O
stable -X- _ O
and -X- _ O
enhanced -X- _ O
activation -X- _ O
via -X- _ O
interactions -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
two -X- _ O
adjacent -X- _ O
binding -X- _ O
domains -X- _ O
of -X- _ O
IAPs.52 -X- _ O
Among -X- _ O
the -X- _ O
bivalent -X- _ O
SMs -X- _ O
we -X- _ O
examined -X- _ O
, -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
is -X- _ O
most -X- _ O
effective -X- _ O
at -X- _ O
degrading -X- _ O
IAPs -X- _ O
, -X- _ O
facilitating -X- _ O
a -X- _ O
conversion -X- _ O
of -X- _ O
NFKB -X- _ O
p100 -X- _ O
to -X- _ O
p52 -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
reactivating -X- _ O
HIV -X- _ O
expression -X- _ O
through -X- _ O
an -X- _ O
NIK-dependent -X- _ O
process -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
hallmark -X- _ O
of -X- _ O
an -X- _ O
activated -X- _ O
non-canonical -X- _ O
NFKB -X- _ O
pathway.23,24 -X- _ O
In -X- _ O
CD4+ -X- _ B-CELL_LINE
T -X- _ I-CELL_LINE
cell -X- _ I-CELL_LINE
models -X- _ I-CELL_LINE
of -X- _ O
HIV -X- _ O
latency -X- _ O
, -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
treatment -X- _ O
is -X- _ O
associated -X- _ O
with -X- _ O
remarkable -X- _ O
viral -X- _ O
reactivation. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
in -X- _ O
primary -X- _ B-CELL
CD4+ -X- _ I-CELL
T -X- _ I-CELL
cells -X- _ I-CELL
infected -X- _ O
with -X- _ O
HI.fate.E -X- _ O
dual -X- _ O
reporter -X- _ O
virus -X- _ O
, -X- _ O
exposure -X- _ O
to -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
is -X- _ O
accompanied -X- _ O
by -X- _ O
a -X- _ O
reduction -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
frequency -X- _ O
of -X- _ O
latently -X- _ B-CELL_CONTEXT
infected -X- _ I-CELL_CONTEXT
cells -X- _ B-CELL
( -X- _ O
Figure -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
without -X- _ O
a -X- _ O
detectable -X- _ O
change -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
level -X- _ O
of -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
supporting -X- _ O
LTR-directed -X- _ O
transcription. -X- _ O
The -X- _ O
data -X- _ O
suggest -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
latent -X- _ B-CELL_CONTEXT
cells -X- _ B-CELL
might -X- _ O
be -X- _ O
preferentially -X- _ O
targeted -X- _ O
for -X- _ O
elimination -X- _ O
without -X- _ O
reactivation -X- _ O
in -X- _ O
contrast -X- _ O
to -X- _ O
PMA -X- _ O
and -X- _ O
ionomycin -X- _ O
stimulation. -X- _ O
This -X- _ O
said -X- _ O
, -X- _ O
given -X- _ O
the -X- _ O
intrinsic -X- _ O
properties -X- _ O
of -X- _ O
SMs -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
can -X- _ O
not -X- _ O
completely -X- _ O
exclude -X- _ O
the -X- _ O
possibility -X- _ O
that -X- _ O
there -X- _ O
was -X- _ O
no -X- _ O
change -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
frequency -X- _ O
of -X- _ O
reactivated -X- _ B-CELL_CONTEXT
cells -X- _ B-CELL
because -X- _ O
latently -X- _ B-CELL_CONTEXT
infected -X- _ I-CELL_CONTEXT
cells -X- _ B-CELL
rapidly -X- _ O
die -X- _ O
after -X- _ O
reactivation. -X- _ O
Consistent -X- _ O
with -X- _ O
previous -X- _ O
works -X- _ O
with -X- _ O
other -X- _ O
SMs -X- _ O
including -X- _ O
AZD5582 -X- _ O
24 -X- _ O
and -X- _ O
ciapavir,25 -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
induces -X- _ O
detection -X- _ O
of -X- _ O
viremia -X- _ O
, -X- _ O
albeit -X- _ O
modestly -X- _ O
, -X- _ O
in -X- _ O
ART-suppressed -X- _ O
hu-mice -X- _ O
as -X- _ O
early -X- _ O
as -X- _ O
48 -X- _ O
h -X- _ O
after -X- _ O
treatment. -X- _ O
Importantly -X- _ O
, -X- _ O
in -X- _ O
mice -X- _ O
treated -X- _ O
with -X- _ O
multiple -X- _ O
doses -X- _ O
of -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
proportion -X- _ O
of -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
carrying -X- _ O
the -X- _ O
integrated -X- _ O
HIV -X- _ O
DNA -X- _ O
was -X- _ O
meaningfully -X- _ O
reduced -X- _ O
, -X- _ O
suggesting -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
bivalent -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
might -X- _ O
preferentially -X- _ O
target -X- _ O
latently -X- _ B-CELL_CONTEXT
infected -X- _ I-CELL_CONTEXT
cells -X- _ B-CELL
directly -X- _ O
or -X- _ O
indirectly -X- _ O
for -X- _ O
death -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
4 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
In -X- _ O
addition -X- _ O
, -X- _ O
in -X- _ O
APG-1387-treated -X- _ O
mice -X- _ O
the -X- _ O
fact -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
viral -X- _ O
rebound -X- _ O
was -X- _ O
consistently -X- _ O
lower -X- _ O
throughout -X- _ O
the -X- _ O
ATI -X- _ O
and -X- _ O
plateaued -X- _ O
at -X- _ O
a -X- _ O
level -X- _ O
below -X- _ O
pre-ART -X- _ O
further -X- _ O
strengthens -X- _ O
the -X- _ O
notion -X- _ O
that -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
impacts -X- _ O
negatively -X- _ O
the -X- _ O
pool -X- _ O
of -X- _ O
VRs -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
6 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
It -X- _ O
is -X- _ O
conceivable -X- _ O
that -X- _ O
such -X- _ O
an -X- _ O
impact -X- _ O
is -X- _ O
significant -X- _ O
considering -X- _ O
the -X- _ O
modest -X- _ O
effect -X- _ O
of -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
on -X- _ O
latency -X- _ O
reversal -X- _ O
in -X- _ O
this -X- _ O
experimental -X- _ O
condition -X- _ O
and -X- _ O
the -X- _ O
limited -X- _ O
functional -X- _ O
immune -X- _ O
clearance -X- _ O
mechanisms -X- _ O
present -X- _ O
in -X- _ O
hu-BLT -X- _ O
mice. -X- _ O
This -X- _ O
said -X- _ O
, -X- _ O
further -X- _ O
experimentation -X- _ O
with -X- _ O
a -X- _ O
larger -X- _ O
group -X- _ O
of -X- _ O
animals -X- _ O
analyzed -X- _ O
at -X- _ O
endpoint -X- _ O
is -X- _ O
needed -X- _ O
to -X- _ O
confirm -X- _ O
the -X- _ O
modulatory -X- _ O
role -X- _ O
of -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
on -X- _ O
VRs. -X- _ O
A -X- _ O
more -X- _ O
detailed -X- _ O
analysis -X- _ O
gauging -X- _ O
the -X- _ O
effect -X- _ O
of -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
on -X- _ O
different -X- _ O
CD4+ -X- _ B-CELL
T -X- _ I-CELL
cell -X- _ I-CELL
subsets -X- _ O
revealed -X- _ O
a -X- _ O
potential -X- _ O
modulation -X- _ O
of -X- _ O
splenic -X- _ B-CELL
Th17-like -X- _ I-CELL
cells -X- _ I-CELL
and -X- _ O
FOXP3-expressing -X- _ B-CELL
CD4+ -X- _ I-CELL
T -X- _ I-CELL
cells. -X- _ I-CELL
We -X- _ O
observe -X- _ O
a -X- _ O
trend -X- _ O
toward -X- _ O
a -X- _ O
reduction -X- _ O
in -X- _ O
Th17-cell -X- _ B-CELL
frequency -X- _ O
in -X- _ O
both -X- _ O
ART-suppressed -X- _ O
mice -X- _ O
treated -X- _ O
in -X- _ O
vivo -X- _ O
with -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
and -X- _ O
in -X- _ O
ART-naïve -X- _ O
infected -X- _ O
mice -X- _ O
whose -X- _ O
splenocytes -X- _ B-CELL
were -X- _ O
stimulated -X- _ O
ex -X- _ O
vivo -X- _ O
with -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
5 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Since -X- _ O
Th17 -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
have -X- _ O
been -X- _ O
proposed -X- _ O
to -X- _ O
be -X- _ O
an -X- _ O
important -X- _ O
source -X- _ O
of -X- _ O
HIV -X- _ O
latent -X- _ O
reservoirs -X- _ O
[ -X- _ O
reviewed -X- _ O
in53 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
decrease -X- _ O
in -X- _ O
Th17 -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
might -X- _ O
suggest -X- _ O
a -X- _ O
reduction -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
level -X- _ O
of -X- _ O
integrated -X- _ O
HIV -X- _ B-CELL_CONTEXT
DNA-harboring -X- _ I-CELL_CONTEXT
cells -X- _ B-CELL
, -X- _ O
an -X- _ O
observation -X- _ O
that -X- _ O
was -X- _ O
made -X- _ O
with -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
treated -X- _ O
mice -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
4 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Regarding -X- _ O
FOXP3-expressing -X- _ B-CELL_CONTEXT
CD4+ -X- _ B-CELL
T -X- _ I-CELL
cells -X- _ I-CELL
in -X- _ O
the -X- _ O
spleen -X- _ B-TISSUE
, -X- _ O
there -X- _ O
was -X- _ O
no -X- _ O
significant -X- _ O
difference -X- _ O
between -X- _ O
ART-suppressed -X- _ O
mice -X- _ O
treated -X- _ O
with -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
or -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
vehicle -X- _ O
control. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
ex -X- _ O
vivo -X- _ O
stimulation -X- _ O
of -X- _ O
splenocytes -X- _ B-CELL
from -X- _ O
ART-naïve -X- _ O
, -X- _ O
HIV-infected -X- _ O
mice -X- _ O
with -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
modestly -X- _ O
decreased -X- _ O
the -X- _ O
number -X- _ O
of -X- _ O
p24-expressing -X- _ B-CELL_CONTEXT
FOXP3+ -X- _ B-CELL
CD4+ -X- _ I-CELL
T -X- _ I-CELL
cells -X- _ I-CELL
, -X- _ O
although -X- _ O
the -X- _ O
difference -X- _ O
was -X- _ O
not -X- _ O
statistically -X- _ O
significant. -X- _ O
Whether -X- _ O
the -X- _ O
non-canonical -X- _ O
NFKB -X- _ O
pathway -X- _ O
is -X- _ O
more -X- _ O
functional -X- _ O
in -X- _ O
certain -X- _ O
memory -X- _ B-CELL
CD4+ -X- _ I-CELL
T -X- _ I-CELL
cell -X- _ I-CELL
subsets -X- _ O
remains -X- _ O
to -X- _ O
be -X- _ O
fully -X- _ O
elucidated. -X- _ O
The -X- _ O
fact -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
central -X- _ O
memory -X- _ O
subset -X- _ O
has -X- _ O
been -X- _ O
shown -X- _ O
to -X- _ O
require -X- _ O
strong -X- _ O
TCR-mediated -X- _ O
signaling -X- _ O
for -X- _ O
maintenance -X- _ O
suggests -X- _ O
a -X- _ O
more -X- _ O
important -X- _ O
role -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
canonical -X- _ O
NFKB -X- _ O
pathway -X- _ O
in -X- _ O
this -X- _ O
context -X- _ O
[ -X- _ O
reviewed -X- _ O
in26,54,55 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Taken -X- _ O
together -X- _ O
, -X- _ O
these -X- _ O
results -X- _ O
highlight -X- _ O
the -X- _ O
importance -X- _ O
of -X- _ O
evaluating -X- _ O
the -X- _ O
potential -X- _ O
effects -X- _ O
of -X- _ O
SMs -X- _ O
on -X- _ O
various -X- _ O
immune -X- _ O
subsets -X- _ O
known -X- _ O
to -X- _ O
be -X- _ O
susceptible -X- _ O
to -X- _ O
HIV. -X- _ O
Our -X- _ O
study -X- _ O
shows -X- _ O
that -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
has -X- _ O
the -X- _ O
capability -X- _ O
to -X- _ O
reactivate -X- _ O
HIV -X- _ O
, -X- _ O
activate -X- _ O
markers -X- _ O
of -X- _ O
apoptosis -X- _ O
in -X- _ O
latently -X- _ B-CELL_CONTEXT
infected -X- _ I-CELL_CONTEXT
cells -X- _ B-CELL
, -X- _ O
and -X- _ O
reduce -X- _ O
VRs -X- _ O
without -X- _ O
causing -X- _ O
global -X- _ O
T -X- _ O
cell -X- _ O
activation. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
findings -X- _ O
also -X- _ O
underscore -X- _ O
the -X- _ O
need -X- _ O
to -X- _ O
combine -X- _ O
bivalent -X- _ O
SMs -X- _ O
with -X- _ O
other -X- _ O
therapeutics -X- _ O
to -X- _ O
improve -X- _ O
the -X- _ O
reactivation -X- _ O
and -X- _ O
elimination -X- _ O
of -X- _ O
VRs. -X- _ O
Indeed -X- _ O
, -X- _ O
recent -X- _ O
findings -X- _ O
have -X- _ O
shown -X- _ O
that -X- _ O
combined -X- _ O
panobinostat -X- _ O
and -X- _ O
pegylated -X- _ O
interferon -X- _ O
alpha -X- _ O
2 -X- _ O
can -X- _ O
transform -X- _ O
the -X- _ O
VR -X- _ O
landscape -X- _ O
through -X- _ O
latency -X- _ O
reversal -X- _ O
and -X- _ O
innate -X- _ O
immune -X- _ O
activation.56 -X- _ O
Star★methods -X- _ O
Experimental -X- _ O
model -X- _ O
and -X- _ O
study -X- _ O
participant -X- _ O
details -X- _ O
Experimental -X- _ O
design -X- _ O
No -X- _ O
randomization -X- _ O
and -X- _ O
/ -X- _ O
or -X- _ O
stratification -X- _ O
was -X- _ O
performed. -X- _ O
Hu-mice -X- _ O
with -X- _ O
variable -X- _ O
levels -X- _ O
of -X- _ O
human -X- _ O
CD45+ -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
were -X- _ O
equally -X- _ O
distributed -X- _ O
among -X- _ O
experimental -X- _ O
groups. -X- _ O
All -X- _ O
efforts -X- _ O
were -X- _ O
made -X- _ O
to -X- _ O
have -X- _ O
equal -X- _ O
or -X- _ O
comparable -X- _ O
number -X- _ O
of -X- _ O
mice -X- _ O
or -X- _ O
samples -X- _ O
( -X- _ O
i.e. -X- _ O
, -X- _ O
number -X- _ O
of -X- _ O
n -X- _ O
) -X- _ O
per -X- _ O
experimental -X- _ O
group -X- _ O
or -X- _ O
condition. -X- _ O
The -X- _ O
exact -X- _ O
number -X- _ O
of -X- _ O
n -X- _ O
was -X- _ O
provided -X- _ O
in -X- _ O
relevant -X- _ O
Figure -X- _ O
legends. -X- _ O
Experimenters -X- _ O
were -X- _ O
blinded -X- _ O
during -X- _ O
processing -X- _ O
biological -X- _ O
samples -X- _ O
, -X- _ O
conducting -X- _ O
experiments -X- _ O
and -X- _ O
analyzing -X- _ O
samples -X- _ O
in -X- _ O
different -X- _ O
assays. -X- _ O
No -X- _ O
inclusion -X- _ O
or -X- _ O
exclusion -X- _ O
criteria -X- _ O
were -X- _ O
applied -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
study. -X- _ O
No -X- _ O
statistical -X- _ O
methods -X- _ O
were -X- _ O
used -X- _ O
to -X- _ O
pre-determine -X- _ O
strategies -X- _ O
for -X- _ O
randomization -X- _ O
and -X- _ O
/ -X- _ O
or -X- _ O
stratification -X- _ O
, -X- _ O
population -X- _ O
size -X- _ O
, -X- _ O
inclusion -X- _ O
and -X- _ O
exclusion -X- _ O
of -X- _ O
any -X- _ O
data -X- _ O
or -X- _ O
subjects -X- _ O
, -X- _ O
or -X- _ O
whether -X- _ O
the -X- _ O
data -X- _ O
met -X- _ O
assumptions -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
statistical -X- _ O
approach. -X- _ O
Pharmacological -X- _ O
and -X- _ O
toxicity -X- _ O
analysis -X- _ O
Hu-BLT -X- _ O
mice -X- _ O
were -X- _ O
left -X- _ O
untreated -X- _ O
or -X- _ O
treated -X- _ O
via -X- _ O
intraperitoneal -X- _ O
route -X- _ O
( -X- _ O
IP -X- _ O
) -X- _ O
with -X- _ O
either -X- _ O
vehicle- -X- _ O
( -X- _ O
10 -X- _ O
% -X- _ O
sterile -X- _ O
Cremophor -X- _ O
dissolved -X- _ O
in -X- _ O
5 -X- _ O
% -X- _ O
polyethylene -X- _ O
glycol-400 -X- _ O
and -X- _ O
85 -X- _ O
% -X- _ O
PBS -X- _ O
) -X- _ O
or -X- _ O
20 -X- _ O
mg -X- _ O
/ -X- _ O
kg -X- _ O
( -X- _ O
100 -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
( -X- _ O
Ascentage -X- _ O
Pharma -X- _ O
, -X- _ O
China -X- _ O
) -X- _ O
every -X- _ O
third -X- _ O
day -X- _ O
( -X- _ O
maximum -X- _ O
100 -X- _ O
μL -X- _ O
injection -X- _ O
volume -X- _ O
) -X- _ O
for -X- _ O
up -X- _ O
to -X- _ O
4 -X- _ O
weeks. -X- _ O
Plasma -X- _ B-TISSUE
was -X- _ O
collected -X- _ O
at -X- _ O
different -X- _ O
intervals -X- _ O
and -X- _ O
white -X- _ B-CELL
blood -X- _ I-CELL
cells -X- _ I-CELL
isolated -X- _ O
by -X- _ O
treating -X- _ O
whole -X- _ B-TISSUE
blood -X- _ I-TISSUE
with -X- _ O
red -X- _ O
blood -X- _ O
cell -X- _ O
lysis -X- _ O
buffer -X- _ O
( -X- _ O
Invitrogen -X- _ O
, -X- _ O
U.S.A -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Cells -X- _ B-CELL
from -X- _ O
blood -X- _ B-TISSUE
and -X- _ O
tissues -X- _ B-TISSUE
were -X- _ O
analyzed -X- _ O
by -X- _ O
flow -X- _ O
cytometry -X- _ O
as -X- _ O
described -X- _ O
in -X- _ O
Section -X- _ O
‘flow -X- _ O
cytometry’ -X- _ O
below -X- _ O
for -X- _ O
the -X- _ O
effect -X- _ O
of -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
on -X- _ O
cell -X- _ O
proliferation -X- _ O
and -X- _ O
activation. -X- _ O
Proinflammatory -X- _ B-CELL
cytokines -X- _ I-CELL
were -X- _ O
evaluated -X- _ O
in -X- _ O
plasma -X- _ B-TISSUE
of -X- _ O
healthy -X- _ O
untreated -X- _ O
, -X- _ O
APG-1387- -X- _ O
and -X- _ O
vehicle-treated -X- _ O
hu-BLT -X- _ O
mice -X- _ O
using -X- _ O
Legend -X- _ O
Max -X- _ O
enzyme-linked -X- _ O
immunosorbent -X- _ O
assay -X- _ O
( -X- _ O
ELISA -X- _ O
) -X- _ O
kits -X- _ O
for -X- _ O
human -X- _ O
TNF -X- _ O
and -X- _ O
IL6 -X- _ O
( -X- _ O
both -X- _ O
from -X- _ O
BioLegend -X- _ O
, -X- _ O
U.S.A -X- _ O
) -X- _ O
as -X- _ O
per -X- _ O
the -X- _ O
manufacturer’s -X- _ O
protocol. -X- _ O
Data -X- _ O
analysis -X- _ O
was -X- _ O
performed -X- _ O
using -X- _ O
GraphPad -X- _ O
Prism -X- _ O
software -X- _ O
( -X- _ O
Version -X- _ O
8.0 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Quantification -X- _ O
and -X- _ O
statistical -X- _ O
analysis -X- _ O
Flow -X- _ O
cytometry -X- _ O
data -X- _ O
were -X- _ O
analyzed -X- _ O
using -X- _ O
FlowJo -X- _ O
( -X- _ O
Versions -X- _ O
9.9.3 -X- _ O
and -X- _ O
10.1 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Quantification -X- _ O
of -X- _ O
Western -X- _ O
blots -X- _ O
was -X- _ O
performed -X- _ O
using -X- _ O
ImageJ -X- _ O
software. -X- _ O
Data -X- _ O
analysis -X- _ O
and -X- _ O
presentation -X- _ O
was -X- _ O
done -X- _ O
using -X- _ O
GraphPad -X- _ O
Prism -X- _ O
( -X- _ O
Version -X- _ O
8.0 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Experimenters -X- _ O
were -X- _ O
blinded -X- _ O
during -X- _ O
data -X- _ O
analysis -X- _ O
of -X- _ O
samples. -X- _ O
Descriptive -X- _ O
measures -X- _ O
( -X- _ O
mean -X- _ O
, -X- _ O
median -X- _ O
, -X- _ O
minimum -X- _ O
/ -X- _ O
maximum -X- _ O
range -X- _ O
, -X- _ O
95 -X- _ O
% -X- _ O
confidence -X- _ O
intervals -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
percent -X- _ O
) -X- _ O
were -X- _ O
used -X- _ O
to -X- _ O
summarize -X- _ O
the -X- _ O
data -X- _ O
and -X- _ O
illustrate -X- _ O
in -X- _ O
graphical -X- _ O
presentations. -X- _ O
All -X- _ O
statistical -X- _ O
analysis -X- _ O
was -X- _ O
done -X- _ O
using -X- _ O
GraphPad -X- _ O
Prism -X- _ O
( -X- _ O
Version -X- _ O
8.0 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Nonparametric -X- _ O
( -X- _ O
unpaired -X- _ O
) -X- _ O
Mann-Whitney’s -X- _ O
U-test -X- _ O
( -X- _ O
two-tailed -X- _ O
) -X- _ O
was -X- _ O
conducted -X- _ O
to -X- _ O
compare -X- _ O
ranks -X- _ O
between -X- _ O
two -X- _ O
experimental -X- _ O
groups -X- _ O
( -X- _ O
e.g. -X- _ O
, -X- _ O
treated -X- _ O
with -X- _ O
vehicle -X- _ O
or -X- _ O
with -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Nonparametric -X- _ O
( -X- _ O
paired -X- _ O
) -X- _ O
Wilcoxon -X- _ O
test -X- _ O
was -X- _ O
performed -X- _ O
to -X- _ O
compare -X- _ O
the -X- _ O
ranks -X- _ O
of -X- _ O
two -X- _ O
matched -X- _ O
samples -X- _ O
( -X- _ O
e.g. -X- _ O
, -X- _ O
before -X- _ O
and -X- _ O
after -X- _ O
treatment -X- _ O
with -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
When -X- _ O
comparing -X- _ O
multiple -X- _ O
groups -X- _ O
, -X- _ O
non-parametric -X- _ O
tests -X- _ O
Kruskal-Wallis -X- _ O
or -X- _ O
Friedman -X- _ O
were -X- _ O
performed -X- _ O
and -X- _ O
followed -X- _ O
by -X- _ O
Dunn’s -X- _ O
multiple -X- _ O
comparison -X- _ O
test -X- _ O
( -X- _ O
e.g. -X- _ O
, -X- _ O
vehicle-treated -X- _ O
group -X- _ O
compared -X- _ O
to -X- _ O
those -X- _ O
treated -X- _ O
with -X- _ O
different -X- _ O
concentrations -X- _ O
of -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
or -X- _ O
combined -X- _ O
PMA -X- _ O
and -X- _ O
ionomycin -X- _ O
; -X- _ O
effect -X- _ O
of -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
on -X- _ O
viral -X- _ O
rebound -X- _ O
at -X- _ O
different -X- _ O
time -X- _ O
points -X- _ O
post -X- _ O
treatment -X- _ O
interruption -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
A -X- _ O
p -X- _ O
value -X- _ O
of -X- _ O
less -X- _ O
than -X- _ O
0.05 -X- _ O
was -X- _ O
considered -X- _ O
statistically -X- _ O
significant. -X- _ O
ns -X- _ O
, -X- _ O
∗ -X- _ O
, -X- _ O
∗∗ -X- _ O
, -X- _ O
∗∗∗ -X- _ O
, -X- _ O
signify -X- _ O
not -X- _ O
significant -X- _ O
, -X- _ O
Figure -X- _ O
2 -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
exact -X- _ O
p -X- _ O
values -X- _ O
were -X- _ O
∗p -X- _ O
= -X- _ O
0.026 -X- _ O
, -X- _ O
∗∗p -X- _ O
= -X- _ O
0.007 -X- _ O
, -X- _ O
∗∗∗p -X- _ O
= -X- _ O
0.0004. -X- _ O
In -X- _ O
the -X- _ O
two-tailed -X- _ O
Mann-Whitney -X- _ O
unpaired -X- _ O
rank -X- _ O
test -X- _ O
shown -X- _ O
in -X- _ O
Figure -X- _ O
3 -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
∗p -X- _ O
value -X- _ O
was -X- _ O
0.0286 -X- _ O
while -X- _ O
in -X- _ O
Figure -X- _ O
4 -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
p -X- _ O
values -X- _ O
were -X- _ O
as -X- _ O
follows -X- _ O
: -X- _ O
∗p -X- _ O
= -X- _ O
0.0317 -X- _ O
and -X- _ O
∗∗p -X- _ O
= -X- _ O
0.0043. -X- _ O
For -X- _ O
Figure -X- _ O
S6 -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
∗p -X- _ O
value -X- _ O
was -X- _ O
No -X- _ O
statistical -X- _ O
methods -X- _ O
were -X- _ O
used -X- _ O
to -X- _ O
pre-determine -X- _ O
strategies -X- _ O
for -X- _ O
randomization -X- _ O
and -X- _ O
/ -X- _ O
or -X- _ O
stratification -X- _ O
, -X- _ O
population -X- _ O
size -X- _ O
, -X- _ O
inclusion -X- _ O
and -X- _ O
exclusion -X- _ O
of -X- _ O
any -X- _ O
data -X- _ O
or -X- _ O
subjects -X- _ O
, -X- _ O
or -X- _ O
whether -X- _ O
the -X- _ O
data -X- _ O
met -X- _ O
assumptions -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
statistical -X- _ O
approach. -X- _ O
All -X- _ O
software -X- _ O
used -X- _ O
in -X- _ O
data -X- _ O
analysis -X- _ O
along -X- _ O
with -X- _ O
statistical -X- _ O
parameters -X- _ O
were -X- _ O
mentioned -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
appropriate -X- _ O
Figure -X- _ O
legends. -X- _ O
Details -X- _ O
about -X- _ O
the -X- _ O
statistical -X- _ O
tests -X- _ O
, -X- _ O
exact -X- _ O
values -X- _ O
of -X- _ O
n -X- _ O
and -X- _ O
definitions -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
n -X- _ O
were -X- _ O
as -X- _ O
indicated -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
legend -X- _ O
for -X- _ O
each -X- _ O
relevant -X- _ O
Figure. -X- _ O
When -X- _ O
applicable -X- _ O
, -X- _ O
definition -X- _ O
of -X- _ O
asterisks -X- _ O
and -X- _ O
descriptive -X- _ O
measures -X- _ O
were -X- _ O
indicated -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
Figure -X- _ O
legends -X- _ O
or -X- _ O
Results. -X- _ O
Drawing -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
chemical -X- _ O
structure -X- _ O
of -X- _ O
APG-1387 -X- _ O
shown -X- _ O
in -X- _ O
Figure -X- _ O
1 -X- _ O
was -X- _ O
done -X- _ O
using -X- _ O
the -X- _ O
ChemDraw -X- _ O
software. -X- _ O
Source -X- _ O
paper -X- _ O
: -X- _ O
PMC11699618 -X- _ O

2. -X- _ O
results -X- _ O
3. -X- _ O
discussion -X- _ O
Cell -X- _ O
surface -X- _ O
receptors -X- _ O
and -X- _ O
their -X- _ O
coupled -X- _ O
intracellular -X- _ O
signaling -X- _ O
pathways -X- _ O
have -X- _ O
been -X- _ O
intensively -X- _ O
studied -X- _ O
in -X- _ O
many -X- _ O
physiological -X- _ O
and -X- _ O
pathological -X- _ O
processes -X- _ O
over -X- _ O
five -X- _ O
decades. -X- _ O
Due -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
critical -X- _ O
feature -X- _ O
of -X- _ O
these -X- _ O
receptor-mediated -X- _ O
signaling -X- _ O
in -X- _ O
promoting -X- _ O
malignant -X- _ O
proliferation -X- _ O
, -X- _ O
invasion -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
metastasis -X- _ O
, -X- _ O
designing -X- _ O
/ -X- _ O
seeking -X- _ O
small -X- _ O
molecules -X- _ O
and -X- _ O
monoclonal -X- _ O
antibodies -X- _ O
that -X- _ O
target -X- _ O
receptors -X- _ O
and -X- _ O
downstream -X- _ O
pathways -X- _ O
has -X- _ O
become -X- _ O
a -X- _ O
pivotal -X- _ O
strategy -X- _ O
in -X- _ O
anti-cancer -X- _ O
drug -X- _ O
discovery. -X- _ O
Therefore -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
better -X- _ O
understanding -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
key -X- _ O
players -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
signaling -X- _ O
pathways -X- _ O
may -X- _ O
offer -X- _ O
opportunities -X- _ O
for -X- _ O
therapeutic -X- _ O
intervention. -X- _ O
This -X- _ O
study -X- _ O
reveals -X- _ O
a -X- _ O
positive -X- _ O
feedback -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
/ -X- _ O
MYT1L-CXCR1 -X- _ O
proliferative -X- _ O
signaling -X- _ O
loop -X- _ O
that -X- _ O
contributes -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
progression -X- _ O
of -X- _ O
glioblastoma -X- _ B-TISSUE
via -X- _ O
the -X- _ O
ERK1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
pathway -X- _ O
and -X- _ O
provides -X- _ O
a -X- _ O
novel -X- _ O
insight -X- _ O
into -X- _ O
the -X- _ O
role -X- _ O
of -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
MYT1L-mediated -X- _ O
transactivation -X- _ O
of -X- _ O
CXCR1. -X- _ O
MYT1L -X- _ O
is -X- _ O
predominantly -X- _ O
expressed -X- _ O
in -X- _ O
human -X- _ O
brains -X- _ B-TISSUE
, -X- _ O
in -X- _ O
particular -X- _ O
fetal -X- _ O
brains -X- _ B-TISSUE
[ -X- _ O
32 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Several -X- _ O
key -X- _ O
studies -X- _ O
have -X- _ O
demonstrated -X- _ O
the -X- _ O
pivotal -X- _ O
role -X- _ O
of -X- _ O
MYT1L -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
direct -X- _ O
conversion -X- _ O
of -X- _ O
human -X- _ O
non-neuronal -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
to -X- _ O
neurons -X- _ B-CELL
[ -X- _ O
33,34,35 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
contributing -X- _ O
role -X- _ O
of -X- _ O
MYT1L -X- _ O
in -X- _ O
carcinogenesis -X- _ O
remains -X- _ O
poorly -X- _ O
understood. -X- _ O
Our -X- _ O
previous -X- _ O
studies -X- _ O
have -X- _ O
uncovered -X- _ O
that -X- _ O
miR-141 -X- _ O
was -X- _ O
down-regulated -X- _ O
in -X- _ O
glioblastoma -X- _ B-TISSUE
and -X- _ O
was -X- _ O
able -X- _ O
to -X- _ O
suppress -X- _ O
cell -X- _ O
proliferation -X- _ O
by -X- _ O
directly -X- _ O
targeting -X- _ O
MYT1L -X- _ O
, -X- _ O
implicating -X- _ O
an -X- _ O
oncogenic -X- _ O
role -X- _ O
of -X- _ O
MYT1L -X- _ O
in -X- _ O
glioblastoma. -X- _ B-TISSUE
In -X- _ O
this -X- _ O
study -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
found -X- _ O
that -X- _ O
in -X- _ O
normal -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
glioblastoma -X- _ B-TISSUE
M059K -X- _ B-CELL_LINE
cell -X- _ I-CELL_LINE
lines -X- _ I-CELL_LINE
, -X- _ O
knockdown -X- _ O
of -X- _ O
MYT1L -X- _ O
attenuated -X- _ O
cell -X- _ O
proliferation -X- _ O
and -X- _ O
induced -X- _ O
apoptosis -X- _ O
and -X- _ O
S-phase -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
arrest -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
1A–D -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
In -X- _ O
contrast -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
ectopic -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
MYT1L -X- _ O
promoted -X- _ O
cell -X- _ O
proliferation -X- _ O
, -X- _ O
inhibited -X- _ O
apoptosis -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
shortened -X- _ O
the -X- _ O
S -X- _ O
phase -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
1E -X- _ O
, -X- _ O
F -X- _ O
, -X- _ O
H -X- _ O
, -X- _ O
J -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Similar -X- _ O
phenotypic -X- _ O
alterations -X- _ O
were -X- _ O
also -X- _ O
noted -X- _ O
in -X- _ O
HEK293 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
in -X- _ O
response -X- _ O
to -X- _ O
ectopic -X- _ O
MYT1L -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
1E–G -X- _ O
, -X- _ O
I -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
These -X- _ O
results -X- _ O
indicated -X- _ O
that -X- _ O
in -X- _ O
cooperation -X- _ O
with -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
, -X- _ O
MYT1L -X- _ O
may -X- _ O
function -X- _ O
as -X- _ O
an -X- _ O
oncogene -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
progression -X- _ O
of -X- _ O
glioblastoma. -X- _ B-TISSUE
However -X- _ O
, -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
loss-of-function -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
M059J -X- _ B-CELL_LINE
cell -X- _ I-CELL_LINE
line -X- _ I-CELL_LINE
, -X- _ O
the -X- _ O
knockdown -X- _ O
of -X- _ O
MYT1L -X- _ O
promoted -X- _ O
cell -X- _ O
proliferation -X- _ O
, -X- _ O
attenuated -X- _ O
apoptosis -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
shortened -X- _ O
the -X- _ O
S -X- _ O
phase -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
2A–D -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Conversely -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
enforced -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
MYT1L -X- _ O
inhibited -X- _ O
cell -X- _ O
proliferation -X- _ O
and -X- _ O
induced -X- _ O
a -X- _ O
G1 -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
arrest -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
2E–G -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
suggesting -X- _ O
a -X- _ O
tumor -X- _ O
suppressor -X- _ O
role -X- _ O
of -X- _ O
MYT1L -X- _ O
in -X- _ O
DNA-PK-deficient -X- _ B-CELL_STATE
glioblastoma -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
, -X- _ O
although -X- _ O
it -X- _ O
suppressed -X- _ O
apoptosis -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
2H -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Mechanically -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
sustained -X- _ O
activation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
AKT -X- _ O
pathway -X- _ O
in -X- _ O
both -X- _ O
HEK293 -X- _ B-CELL_LINE
and -X- _ O
M059K -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
and -X- _ O
the -X- _ O
activation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
ERK1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
pathway -X- _ O
in -X- _ O
M059K -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
( -X- _ O
Figure -X- _ O
1K -X- _ O
) -X- _ O
may -X- _ O
contribute -X- _ O
to -X- _ O
cell -X- _ O
proliferation -X- _ O
induced -X- _ O
by -X- _ O
ectopic -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
MYT1L -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
supports -X- _ O
the -X- _ O
key -X- _ O
role -X- _ O
of -X- _ O
these -X- _ O
two -X- _ O
well-studied -X- _ O
oncogenic -X- _ O
signaling -X- _ O
pathways -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
development -X- _ O
of -X- _ O
human -X- _ O
malignancies -X- _ O
[ -X- _ O
36 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
proliferative -X- _ O
inhibition -X- _ O
mediated -X- _ O
by -X- _ O
ectopic -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
MYT1L -X- _ O
in -X- _ O
M059J -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
may -X- _ O
not -X- _ O
be -X- _ O
attributed -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
activation -X- _ O
of -X- _ O
these -X- _ O
two -X- _ O
pathways -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
2I -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
A -X- _ O
total -X- _ O
of -X- _ O
13 -X- _ O
% -X- _ O
apoptotic -X- _ B-CELL_STATE
cells -X- _ B-CELL
were -X- _ O
also -X- _ O
found -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
negative -X- _ O
control -X- _ O
siRNA -X- _ O
group -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
1C -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
may -X- _ O
reflect -X- _ O
the -X- _ O
cytotoxic -X- _ O
effect -X- _ O
of -X- _ O
either -X- _ O
transfection -X- _ O
reagent -X- _ O
( -X- _ O
Lipofectamine -X- _ O
3000 -X- _ O
) -X- _ O
or -X- _ O
negative -X- _ O
control -X- _ O
siRNA. -X- _ O
The -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
is -X- _ O
tightly -X- _ O
regulated -X- _ O
by -X- _ O
cyclins -X- _ O
, -X- _ O
CDKs -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
CDK -X- _ O
inhibitors. -X- _ O
Although -X- _ O
cyclin -X- _ O
E1 -X- _ O
was -X- _ O
down-regulated -X- _ O
in -X- _ O
HEK293 -X- _ B-CELL_LINE
, -X- _ O
while -X- _ O
it -X- _ O
was -X- _ O
up-regulated -X- _ O
in -X- _ O
M059K -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
in -X- _ O
response -X- _ O
to -X- _ O
MYT1L -X- _ O
expression -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
1K -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
that -X- _ O
may -X- _ O
play -X- _ O
a -X- _ O
role -X- _ O
in -X- _ O
shortening -X- _ O
the -X- _ O
S -X- _ O
phase -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
1G -X- _ O
, -X- _ O
H -X- _ O
) -X- _ O
because -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
critical -X- _ O
requirement -X- _ O
of -X- _ O
cyclin -X- _ O
E -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
S -X- _ O
phase -X- _ O
progression -X- _ O
[ -X- _ O
37,38 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Furthermore -X- _ O
, -X- _ O
p21 -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
well-known -X- _ O
CDK -X- _ O
inhibitor -X- _ O
, -X- _ O
was -X- _ O
down-regulated -X- _ O
in -X- _ O
HEK293 -X- _ B-CELL_LINE
and -X- _ O
M059K -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
in -X- _ O
response -X- _ O
to -X- _ O
MYT1L -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
1K -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
may -X- _ O
also -X- _ O
contribute -X- _ O
to -X- _ O
shortening -X- _ O
the -X- _ O
S -X- _ O
phase. -X- _ O
Moreover -X- _ O
, -X- _ O
p21 -X- _ O
has -X- _ O
been -X- _ O
shown -X- _ O
to -X- _ O
promote -X- _ O
cell -X- _ O
death -X- _ O
in -X- _ O
cancer -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
via -X- _ O
the -X- _ O
activation -X- _ O
of -X- _ O
autophagy -X- _ O
[ -X- _ O
39,40,41 -X- _ O
] -X- _ O
; -X- _ O
the -X- _ O
down-regulated -X- _ O
p21 -X- _ O
may -X- _ O
be -X- _ O
a -X- _ O
causal -X- _ O
player -X- _ O
in -X- _ O
attenuating -X- _ O
apoptosis -X- _ O
in -X- _ O
HEK293 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
that -X- _ O
express -X- _ O
MYT1L -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
1I -X- _ O
, -X- _ O
J -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Interestingly -X- _ O
, -X- _ O
CDK6 -X- _ O
was -X- _ O
down-regulated -X- _ O
in -X- _ O
M059J -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
in -X- _ O
response -X- _ O
to -X- _ O
MYT1L -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
2I -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
may -X- _ O
play -X- _ O
a -X- _ O
role -X- _ O
in -X- _ O
a -X- _ O
G1 -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
arrest -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
2G -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Ectopic -X- _ O
MYT1L -X- _ O
induced -X- _ O
down-regulation -X- _ O
of -X- _ O
caspase -X- _ O
3 -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
1K -X- _ O
, -X- _ O
Supplementary -X- _ O
Figure -X- _ O
S1 -X- _ O
) -X- _ O
in -X- _ O
both -X- _ O
HEK293 -X- _ B-CELL_LINE
and -X- _ O
M509K -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
, -X- _ O
which -X- _ O
may -X- _ O
play -X- _ O
a -X- _ O
contributing -X- _ O
role -X- _ O
in -X- _ O
apoptotic -X- _ O
inhibition -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
1I -X- _ O
, -X- _ O
J -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
this -X- _ O
is -X- _ O
not -X- _ O
the -X- _ O
case -X- _ O
in -X- _ O
M059J -X- _ B-CELL_LINE
due -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
absence -X- _ O
of -X- _ O
caspase -X- _ O
3 -X- _ O
in -X- _ O
both -X- _ O
GFP- -X- _ B-CELL_STATE
and -X- _ O
MYT1L-M059J -X- _ B-CELL_STATE
cells -X- _ B-CELL_LINE
( -X- _ O
Figure -X- _ O
2I -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
As -X- _ O
a -X- _ O
transcription -X- _ O
factor -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
transcriptional -X- _ O
targets -X- _ O
of -X- _ O
MYT1L -X- _ O
, -X- _ O
unfortunately -X- _ O
, -X- _ O
remain -X- _ O
largely -X- _ O
unknown. -X- _ O
Here -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
discovered -X- _ O
that -X- _ O
MYT1L -X- _ O
could -X- _ O
directly -X- _ O
regulate -X- _ O
the -X- _ O
transcription -X- _ O
of -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
through -X- _ O
a -X- _ O
novel -X- _ O
cis-acting -X- _ O
element -X- _ O
( -X- _ O
−2114 -X- _ O
/ -X- _ O
−2103 -X- _ O
) -X- _ O
at -X- _ O
the -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
promoter. -X- _ O
We -X- _ O
noted -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
overexpression -X- _ O
of -X- _ O
MYT1L -X- _ O
correlated -X- _ O
with -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
mRNA -X- _ O
levels -X- _ O
in -X- _ O
4 -X- _ O
out -X- _ O
of -X- _ O
6 -X- _ O
brain -X- _ B-TISSUE
cancer -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
lines -X- _ I-CELL
( -X- _ O
Figure -X- _ O
3A -X- _ O
, -X- _ O
B -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
the -X- _ O
induction -X- _ O
of -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
normal -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
HEK293 -X- _ B-CELL_LINE
and -X- _ O
M059K -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
in -X- _ O
response -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
ectopically -X- _ O
expressed -X- _ O
MYT1L -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
3C -X- _ O
, -X- _ O
D -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
supporting -X- _ O
the -X- _ O
opinion -X- _ O
that -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
transcriptional -X- _ O
target -X- _ O
of -X- _ O
MYT1L. -X- _ O
Surprisingly -X- _ O
, -X- _ O
in -X- _ O
M059J -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
with -X- _ O
loss -X- _ O
of -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
function -X- _ O
( -X- _ O
Supplementary -X- _ O
Figure -X- _ O
S4 -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
enforced -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
MYT1L -X- _ O
failed -X- _ O
to -X- _ O
induce -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
transcription -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
3C -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
although -X- _ O
the -X- _ O
protein -X- _ O
levels -X- _ O
of -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
were -X- _ O
not -X- _ O
consistent -X- _ O
with -X- _ O
its -X- _ O
mRNA -X- _ O
levels -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
3C -X- _ O
, -X- _ O
D -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Taken -X- _ O
together -X- _ O
, -X- _ O
our -X- _ O
results -X- _ O
demonstrate -X- _ O
that -X- _ O
MYT1L -X- _ O
functionality -X- _ O
depends -X- _ O
on -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
activity. -X- _ O
Furthermore -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
ectopically -X- _ O
expressed -X- _ O
MYT1L -X- _ O
increased -X- _ O
the -X- _ O
luciferase -X- _ O
activity -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
wild-type -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
promoter -X- _ O
/ -X- _ O
luciferase -X- _ O
reporter -X- _ O
in -X- _ O
HEK-293 -X- _ B-CELL_LINE
and -X- _ O
M059K -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
with -X- _ O
the -X- _ O
normal -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
was -X- _ O
abolished -X- _ O
when -X- _ O
the -X- _ O
mutant -X- _ O
construct -X- _ O
was -X- _ O
used -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
3G -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
ectopic -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
MYT1L -X- _ O
suppressed -X- _ O
the -X- _ O
luciferase -X- _ O
activity -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
DNA-PK-deficient -X- _ O
M059J -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
( -X- _ O
Figure -X- _ O
3G -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Moreover -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
enforced -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
MYT1L -X- _ O
resulted -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
sustained -X- _ O
activation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
AKT -X- _ O
pathway -X- _ O
in -X- _ O
all -X- _ O
three -X- _ O
cell -X- _ B-CELL_LINE
lines -X- _ I-CELL_LINE
examined -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
1K -X- _ O
and -X- _ O
Figure -X- _ O
2I -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
ERK1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
pathway -X- _ O
was -X- _ O
activated -X- _ O
in -X- _ O
M059K -X- _ B-CELL_LINE
and -X- _ O
M059J -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
, -X- _ O
while -X- _ O
it -X- _ O
was -X- _ O
inhibited -X- _ O
in -X- _ O
HEK293 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
in -X- _ O
response -X- _ O
to -X- _ O
MYT1L -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
1K -X- _ O
and -X- _ O
Figure -X- _ O
2I -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
activation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
ERK1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
pathway -X- _ O
was -X- _ O
CXCR1-dependent -X- _ O
, -X- _ O
whereas -X- _ O
the -X- _ O
AKT -X- _ O
pathway -X- _ O
was -X- _ O
not -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
4J -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Based -X- _ O
on -X- _ O
these -X- _ O
findings -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
may -X- _ O
propose -X- _ O
that -X- _ O
under -X- _ O
non-stimulated -X- _ O
conditions -X- _ O
, -X- _ O
MYT1L -X- _ O
may -X- _ O
act -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
transcriptional -X- _ O
repressor -X- _ O
suppressing -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
transcription -X- _ O
; -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
may -X- _ O
function -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
coactivator -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
once -X- _ O
it -X- _ O
is -X- _ O
phosphorylated -X- _ O
by -X- _ O
the -X- _ O
CXCR1-dependent -X- _ O
activation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
ERK1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
kinase -X- _ O
, -X- _ O
it -X- _ O
, -X- _ O
in -X- _ O
turn -X- _ O
, -X- _ O
phosphorylates -X- _ O
MYT1L -X- _ O
; -X- _ O
the -X- _ O
phosphorylated -X- _ O
MYT1L -X- _ O
recruits -X- _ O
histone -X- _ O
acetyltransferases -X- _ O
( -X- _ O
HATs -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
transcription -X- _ O
factors -X- _ O
( -X- _ O
TFs -X- _ O
) -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
promoter -X- _ O
and -X- _ O
promotes -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
transcription -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
5 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
( -X- _ O
also -X- _ O
known -X- _ O
as -X- _ O
PRKDC -X- _ O
and -X- _ O
p350 -X- _ O
) -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
nuclear -X- _ O
serine -X- _ O
/ -X- _ O
threonine -X- _ O
protein -X- _ O
kinase -X- _ O
complex -X- _ O
that -X- _ O
is -X- _ O
composed -X- _ O
of -X- _ O
a -X- _ O
catalytic -X- _ O
subunit -X- _ O
of -X- _ O
DNA-PKcs -X- _ O
and -X- _ O
a -X- _ O
heterodimer -X- _ O
of -X- _ O
Ku -X- _ O
proteins -X- _ O
( -X- _ O
Ku70 -X- _ O
/ -X- _ O
Ku80 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Although -X- _ O
one -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
most -X- _ O
well-defined -X- _ O
functions -X- _ O
of -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
is -X- _ O
to -X- _ O
govern -X- _ O
the -X- _ O
repair -X- _ O
of -X- _ O
DNA -X- _ O
double-strand -X- _ O
breaks -X- _ O
through -X- _ O
both -X- _ O
non-homologous -X- _ O
end-joining -X- _ O
( -X- _ O
NHEJ -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
homologous -X- _ O
recombination -X- _ O
( -X- _ O
HR -X- _ O
) -X- _ O
[ -X- _ O
42 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
it -X- _ O
was -X- _ O
originally -X- _ O
identified -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
component -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
Sp1 -X- _ O
transcription -X- _ O
complex -X- _ O
in -X- _ O
which -X- _ O
it -X- _ O
may -X- _ O
modulate -X- _ O
the -X- _ O
transcriptional -X- _ O
activity -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
complex -X- _ O
by -X- _ O
phosphorylating -X- _ O
Sp1 -X- _ O
[ -X- _ O
43 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
For -X- _ O
the -X- _ O
first -X- _ O
time -X- _ O
, -X- _ O
our -X- _ O
findings -X- _ O
demonstrated -X- _ O
that -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
may -X- _ O
functionally -X- _ O
modulate -X- _ O
the -X- _ O
transcriptional -X- _ O
activity -X- _ O
of -X- _ O
MYT1L -X- _ O
by -X- _ O
phosphorylation -X- _ O
, -X- _ O
eventually -X- _ O
leading -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
transcriptional -X- _ O
activation -X- _ O
of -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
, -X- _ O
although -X- _ O
this -X- _ O
requires -X- _ O
further -X- _ O
validation -X- _ O
using -X- _ O
chromatin -X- _ O
immunoprecipitation -X- _ O
quantitative -X- _ O
PCR -X- _ O
( -X- _ O
ChIP-qPCR -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
the -X- _ O
electrophoretic -X- _ O
mobility -X- _ O
shift -X- _ O
assay -X- _ O
( -X- _ O
EMSA -X- _ O
) -X- _ O
when -X- _ O
a -X- _ O
ChIP-grade -X- _ O
antibody -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
phosphorylated -X- _ O
MYT1L -X- _ O
is -X- _ O
commercially -X- _ O
available. -X- _ O
Our -X- _ O
previous -X- _ O
work -X- _ O
demonstrated -X- _ O
that -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
may -X- _ O
also -X- _ O
function -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
repressor -X- _ O
of -X- _ O
MYT1L -X- _ O
, -X- _ O
resulting -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
transcriptional -X- _ O
inhibition -X- _ O
of -X- _ O
tumor -X- _ O
suppressor -X- _ O
p21 -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
transcriptional -X- _ O
target -X- _ O
of -X- _ O
MYT1L -X- _ O
[ -X- _ O
29 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Several -X- _ O
publications -X- _ O
support -X- _ O
the -X- _ O
dual -X- _ O
role -X- _ O
of -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
transcriptional -X- _ O
control -X- _ O
of -X- _ O
gene -X- _ O
expression. -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
inhibited -X- _ O
the -X- _ O
transcription -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
xanthine -X- _ O
oxidoreductase -X- _ O
gene -X- _ O
via -X- _ O
E-box -X- _ O
/ -X- _ O
TATA-like -X- _ O
elements -X- _ O
[ -X- _ O
44 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Simultaneously -X- _ O
, -X- _ O
Ku -X- _ O
proteins -X- _ O
may -X- _ O
also -X- _ O
act -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
transcriptional -X- _ O
recycling -X- _ O
coactivator -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
androgen -X- _ O
receptor -X- _ O
[ -X- _ O
45 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Chemokines -X- _ O
are -X- _ O
a -X- _ O
superfamily -X- _ O
of -X- _ O
small -X- _ O
( -X- _ O
about -X- _ O
8 -X- _ O
to -X- _ O
14 -X- _ O
kDa -X- _ O
) -X- _ O
cytokine-like -X- _ O
proteins -X- _ O
that -X- _ O
selectively -X- _ O
regulate -X- _ O
the -X- _ O
recruitment -X- _ O
and -X- _ O
trafficking -X- _ O
of -X- _ O
leukocytes -X- _ B-CELL
to -X- _ O
inflammatory -X- _ O
sites -X- _ O
through -X- _ O
chemoattraction -X- _ O
[ -X- _ O
46 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Members -X- _ O
of -X- _ O
this -X- _ O
family -X- _ O
have -X- _ O
been -X- _ O
divided -X- _ O
into -X- _ O
four -X- _ O
subfamilies -X- _ O
, -X- _ O
CXC -X- _ O
, -X- _ O
CC -X- _ O
, -X- _ O
C -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
CX3C -X- _ O
, -X- _ O
based -X- _ O
on -X- _ O
the -X- _ O
arrangement -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
first -X- _ O
two -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
four -X- _ O
conserved -X- _ O
cysteine -X- _ O
residues -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
amino -X- _ O
terminus -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
proteins -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
can -X- _ O
bind -X- _ O
CXCR -X- _ O
, -X- _ O
CCR -X- _ O
, -X- _ O
XCR1 -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
CX3CR1 -X- _ O
, -X- _ O
respectively. -X- _ O
Chemokines -X- _ O
play -X- _ O
a -X- _ O
critical -X- _ O
role -X- _ O
in -X- _ O
inflammatory -X- _ O
reactions. -X- _ O
IL-8 -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
well-characterized -X- _ O
ELR+ -X- _ O
CXC -X- _ O
chemokine -X- _ O
that -X- _ O
attracts -X- _ O
neutrophils -X- _ B-CELL
through -X- _ O
binding -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
and -X- _ O
CXCR2 -X- _ O
receptors -X- _ O
on -X- _ O
the -X- _ O
cell -X- _ B-CELL_COMPONENT
surface -X- _ I-CELL_COMPONENT
[ -X- _ O
47 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
It -X- _ O
is -X- _ O
suspected -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
signature -X- _ O
of -X- _ O
chemokines -X- _ O
that -X- _ O
persist -X- _ O
at -X- _ O
inflammatory -X- _ O
sites -X- _ O
may -X- _ O
be -X- _ O
important -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
development -X- _ O
of -X- _ O
chronic -X- _ O
diseases -X- _ O
and -X- _ O
can -X- _ O
contribute -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
development -X- _ O
of -X- _ O
malignancies -X- _ O
[ -X- _ O
48 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
There -X- _ O
is -X- _ O
sufficient -X- _ O
evidence -X- _ O
to -X- _ O
show -X- _ O
that -X- _ O
chemokines -X- _ O
also -X- _ O
play -X- _ O
a -X- _ O
significant -X- _ O
role -X- _ O
in -X- _ O
cancer -X- _ O
, -X- _ O
including -X- _ O
melanoma -X- _ O
[ -X- _ O
49 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
breast -X- _ O
[ -X- _ O
50 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
colon -X- _ O
[ -X- _ O
51 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
esophageal -X- _ O
[ -X- _ O
52 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
prostate -X- _ O
[ -X- _ O
53 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
non-small -X- _ O
cell -X- _ O
lung -X- _ O
[ -X- _ O
54 -X- _ O
] -X- _ O
cancers -X- _ O
, -X- _ O
in -X- _ O
addition -X- _ O
to -X- _ O
its -X- _ O
role -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
development -X- _ O
of -X- _ O
inflammatory -X- _ O
responses. -X- _ O
Here -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
showed -X- _ O
that -X- _ O
IL-8 -X- _ O
was -X- _ O
significantly -X- _ O
up-regulated -X- _ O
in -X- _ O
HEK293 -X- _ B-CELL_LINE
and -X- _ O
M059J -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
, -X- _ O
while -X- _ O
it -X- _ O
was -X- _ O
only -X- _ O
slightly -X- _ O
increased -X- _ O
in -X- _ O
M059K -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
in -X- _ O
response -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
ectopically -X- _ O
expressed -X- _ O
MYT1L -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
4A -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Unlike -X- _ O
IL-8 -X- _ O
, -X- _ O
GROα -X- _ O
more -X- _ O
selectively -X- _ O
binds -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
CXCR2 -X- _ O
receptor -X- _ O
, -X- _ O
while -X- _ O
the -X- _ O
affinity -X- _ O
to -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
is -X- _ O
significantly -X- _ O
lower -X- _ O
[ -X- _ O
55 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Since -X- _ O
the -X- _ O
CXCR2 -X- _ O
receptor -X- _ O
was -X- _ O
undetectable -X- _ O
in -X- _ O
HEK293 -X- _ B-CELL_LINE
and -X- _ O
M059K -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
( -X- _ O
Figure -X- _ O
3E -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
GROα -X- _ O
in -X- _ O
these -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
could -X- _ O
only -X- _ O
function -X- _ O
through -X- _ O
CXCR1. -X- _ O
The -X- _ O
enforced -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
MYT1L -X- _ O
caused -X- _ O
an -X- _ O
elevation -X- _ O
of -X- _ O
GROα -X- _ O
in -X- _ O
HEK293 -X- _ B-CELL_LINE
and -X- _ O
M059J -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
( -X- _ O
Figure -X- _ O
4B–E -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Although -X- _ O
GROα -X- _ O
mRNA -X- _ O
was -X- _ O
down-regulated -X- _ O
, -X- _ O
its -X- _ O
protein -X- _ O
level -X- _ O
was -X- _ O
unaffected -X- _ O
in -X- _ O
M059K -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
in -X- _ O
response -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
ectopically -X- _ O
expressed -X- _ O
MYT1L -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
4F -X- _ O
, -X- _ O
G -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
IL-8 -X- _ O
and -X- _ O
/ -X- _ O
or -X- _ O
GROα -X- _ O
bind -X- _ O
to -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
, -X- _ O
eventually -X- _ O
promoting -X- _ O
glioblastoma -X- _ O
proliferation -X- _ O
via -X- _ O
the -X- _ O
ERK1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
pathway -X- _ O
that -X- _ O
can -X- _ O
be -X- _ O
blocked -X- _ O
by -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
siRNA -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
4J -X- _ O
, -X- _ O
K -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
suggesting -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
activation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
proliferative -X- _ O
ERK1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
pathway -X- _ O
in -X- _ O
glioblastoma -X- _ B-TISSUE
is -X- _ O
, -X- _ O
at -X- _ O
least -X- _ O
in -X- _ O
part -X- _ O
, -X- _ O
CXCR1-dependent. -X- _ O
Although -X- _ O
this -X- _ O
is -X- _ O
the -X- _ O
first -X- _ O
report -X- _ O
regarding -X- _ O
the -X- _ O
critical -X- _ O
role -X- _ O
of -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
/ -X- _ O
MYT1L -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
proliferative -X- _ O
IL-8 -X- _ O
/ -X- _ O
GROα-CXCR1 -X- _ O
signaling -X- _ O
loop -X- _ O
in -X- _ O
glioblastoma -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
significant -X- _ O
contributing -X- _ O
role -X- _ O
of -X- _ O
IL-8-CXCR1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
axes -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
proliferation -X- _ O
and -X- _ O
angiogenesis -X- _ O
of -X- _ O
glioblastoma -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
has -X- _ O
been -X- _ O
demonstrated -X- _ O
before -X- _ O
[ -X- _ O
28 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Taken -X- _ O
together -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
propose -X- _ O
a -X- _ O
potential -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
/ -X- _ O
MYT1L-CXCR1 -X- _ O
signaling -X- _ O
loop -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
progression -X- _ O
of -X- _ O
glioblastoma -X- _ B-TISSUE
( -X- _ O
Figure -X- _ O
5 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
We -X- _ O
speculate -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
/ -X- _ O
MYT1L-CXCR1-ERK1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
might -X- _ O
be -X- _ O
up-regulated -X- _ O
at -X- _ O
WHO -X- _ O
grade -X- _ O
IV -X- _ O
and -X- _ O
/ -X- _ O
or -X- _ O
recurrent -X- _ O
glioblastomas -X- _ O
due -X- _ O
to -X- _ O
chemo- -X- _ O
or -X- _ O
radio-resistance. -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
key -X- _ O
player -X- _ O
in -X- _ O
DNA -X- _ O
damage -X- _ O
response -X- _ O
on -X- _ O
double-strand -X- _ O
breaks. -X- _ O
Activation -X- _ O
of -X- _ O
DNA -X- _ O
damage -X- _ O
response -X- _ O
facilitates -X- _ O
glioma -X- _ B-CELL
stem -X- _ I-CELL
cells -X- _ I-CELL
to -X- _ O
develop -X- _ O
radio-resistance -X- _ O
[ -X- _ O
56 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Furthermore -X- _ O
, -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
master -X- _ O
kinase -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
proliferative -X- _ O
/ -X- _ O
progenitor -X- _ O
subtype -X- _ O
of -X- _ O
glioblastoma -X- _ O
, -X- _ O
guiding -X- _ O
targeted -X- _ O
cancer -X- _ O
therapy -X- _ O
[ -X- _ O
57 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Immunohistochemical -X- _ O
staining -X- _ O
has -X- _ O
indicated -X- _ O
the -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
IL-8 -X- _ O
in -X- _ O
66.7–67.3 -X- _ O
% -X- _ O
of -X- _ O
WHO -X- _ O
grade -X- _ O
IV -X- _ O
glioblastoma -X- _ B-TISSUE
tissues -X- _ I-TISSUE
, -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
its -X- _ O
receptor -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
found -X- _ O
primarily -X- _ O
in -X- _ O
both -X- _ O
tumor-associated -X- _ O
vessels -X- _ B-TISSUE
and -X- _ O
grade -X- _ O
IV -X- _ O
glioblastomas -X- _ B-TISSUE
[ -X- _ O
28 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
supporting -X- _ O
the -X- _ O
previous -X- _ O
report -X- _ O
showing -X- _ O
a -X- _ O
crucial -X- _ O
role -X- _ O
of -X- _ O
IL-8 -X- _ O
/ -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
signaling -X- _ O
in -X- _ O
glioblastoma -X- _ B-CELL
stem -X- _ I-CELL
cells -X- _ I-CELL
[ -X- _ O
58 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Moreover -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
IL-8 -X- _ O
/ -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
/ -X- _ O
STAT3 -X- _ O
pathway -X- _ O
is -X- _ O
crucial -X- _ O
for -X- _ O
the -X- _ O
maintenance -X- _ O
of -X- _ O
glioblastoma -X- _ B-CELL
stem -X- _ I-CELL
cells -X- _ I-CELL
[ -X- _ O
59 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Glioblastoma -X- _ B-TISSUE
and -X- _ O
neuroblastoma -X- _ B-TISSUE
are -X- _ O
two -X- _ O
common -X- _ O
types -X- _ O
of -X- _ O
brain -X- _ B-TISSUE
tumors -X- _ I-TISSUE
that -X- _ O
occur -X- _ O
in -X- _ O
different -X- _ O
aged -X- _ O
populations. -X- _ O
Our -X- _ O
previous -X- _ O
studies -X- _ O
indicated -X- _ O
that -X- _ O
MYT1L -X- _ O
was -X- _ O
overexpressed -X- _ O
in -X- _ O
glioblastoma -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
lines -X- _ I-CELL
and -X- _ O
46.9 -X- _ O
% -X- _ O
of -X- _ O
malignant -X- _ O
glioma -X- _ B-TISSUE
tissue -X- _ I-TISSUE
samples -X- _ O
( -X- _ O
n -X- _ O
= -X- _ O
32 -X- _ O
) -X- _ O
[ -X- _ O
29 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
functioning -X- _ O
as -X- _ O
an -X- _ O
oncogene -X- _ O
in -X- _ O
glioblastoma -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
with -X- _ O
normal -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
activity. -X- _ O
To -X- _ O
see -X- _ O
whether -X- _ O
MYT1L -X- _ O
is -X- _ O
also -X- _ O
up-regulated -X- _ O
in -X- _ O
neuroblastoma -X- _ B-TISSUE
, -X- _ O
we -X- _ O
compared -X- _ O
its -X- _ O
expression -X- _ O
in -X- _ O
both -X- _ O
glioblastoma -X- _ B-CELL_LINE
and -X- _ O
neuroblastoma -X- _ B-CELL_LINE
cell -X- _ I-CELL_LINE
lines. -X- _ I-CELL_LINE
It -X- _ O
was -X- _ O
found -X- _ O
that -X- _ O
MYT1L -X- _ O
was -X- _ O
overexpressed -X- _ O
in -X- _ O
3 -X- _ O
out -X- _ O
of -X- _ O
7 -X- _ O
neuroblastoma -X- _ B-CELL_LINE
cell -X- _ I-CELL_LINE
lines -X- _ I-CELL_LINE
examined -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
3A -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
suggesting -X- _ O
that -X- _ O
MYT1L -X- _ O
up-regulation -X- _ O
may -X- _ O
be -X- _ O
a -X- _ O
common -X- _ O
event -X- _ O
in -X- _ O
both -X- _ O
glioblastoma -X- _ B-TISSUE
and -X- _ O
neuroblastoma. -X- _ B-TISSUE
Although -X- _ O
the -X- _ O
SH-SY5Y -X- _ B-CELL_LINE
cell -X- _ I-CELL_LINE
line -X- _ I-CELL_LINE
is -X- _ O
a -X- _ O
subclone -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
SK-N-SH -X- _ B-CELL_LINE
cell -X- _ I-CELL_LINE
line -X- _ I-CELL_LINE
, -X- _ O
the -X- _ O
global -X- _ O
gene -X- _ O
expression -X- _ O
microarray -X- _ O
showed -X- _ O
a -X- _ O
profound -X- _ O
differential -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
genes -X- _ O
in -X- _ O
these -X- _ O
two -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
lines -X- _ I-CELL
[ -X- _ O
60 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
mechanism -X- _ O
involved -X- _ O
is -X- _ O
unclear. -X- _ O
In -X- _ O
the -X- _ O
present -X- _ O
study -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
noted -X- _ O
that -X- _ O
MYT1L -X- _ O
was -X- _ O
up-regulated -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
SH-SY5Y -X- _ B-CELL_LINE
cell -X- _ I-CELL_LINE
line -X- _ I-CELL_LINE
at -X- _ O
both -X- _ O
mRNA -X- _ O
and -X- _ O
protein -X- _ O
levels -X- _ O
( -X- _ O
Figure -X- _ O
3A -X- _ O
, -X- _ O
B -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
while -X- _ O
in -X- _ O
its -X- _ O
parental -X- _ O
line -X- _ O
, -X- _ O
SK-N-SH -X- _ B-CELL_LINE
, -X- _ O
only -X- _ O
MYT1L -X- _ O
mRNA -X- _ O
was -X- _ O
up-regulated. -X- _ O
The -X- _ O
MYT1L -X- _ O
protein -X- _ O
was -X- _ O
undetectable -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
may -X- _ O
implicate -X- _ O
the -X- _ O
involvement -X- _ O
of -X- _ O
post-transcriptional -X- _ O
regulation -X- _ O
, -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
miRNA -X- _ O
( -X- _ O
s -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
in -X- _ O
MYT1L -X- _ O
expression. -X- _ O
Some -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
molecules -X- _ O
analyzed -X- _ O
in -X- _ O
this -X- _ O
manuscript -X- _ O
can -X- _ O
be -X- _ O
molecular -X- _ O
targets -X- _ O
in -X- _ O
cancer -X- _ O
therapy. -X- _ O
The -X- _ O
IL-8-CXCR1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
axis -X- _ O
has -X- _ O
been -X- _ O
proposed -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
potential -X- _ O
therapeutic -X- _ O
target -X- _ O
for -X- _ O
numerous -X- _ O
cancers -X- _ O
due -X- _ O
to -X- _ O
its -X- _ O
contributing -X- _ O
roles -X- _ O
in -X- _ O
proliferation -X- _ O
, -X- _ O
migration -X- _ O
/ -X- _ O
invasion -X- _ O
, -X- _ O
angiogenesis -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
tumor -X- _ B-TISSUE
immunosuppression -X- _ O
[ -X- _ O
61,62 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
tumor-produced -X- _ O
IL-8 -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
potent -X- _ O
chemoattractant -X- _ O
that -X- _ O
recruits -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
/ -X- _ O
2-expressing -X- _ O
human -X- _ O
myeloid-derived -X- _ B-CELL
suppressor -X- _ I-CELL
cells -X- _ I-CELL
to -X- _ O
tumor -X- _ B-TISSUE
foci -X- _ O
, -X- _ O
playing -X- _ O
a -X- _ O
crucial -X- _ O
role -X- _ O
in -X- _ O
immune -X- _ O
resistance -X- _ O
[ -X- _ O
63 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
IL-8 -X- _ O
receptor -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
may -X- _ O
be -X- _ O
a -X- _ O
biomarker -X- _ O
for -X- _ O
cancer -X- _ B-CELL
stem -X- _ I-CELL
cells -X- _ I-CELL
[ -X- _ O
64 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
including -X- _ O
glioblastoma -X- _ B-CELL
stem -X- _ I-CELL
cells -X- _ I-CELL
[ -X- _ O
58 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Targeting -X- _ O
myeloid -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
CXCR1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
enhances -X- _ O
antitumor -X- _ O
immunity -X- _ O
in -X- _ O
pancreatic -X- _ O
cancer -X- _ O
[ -X- _ O
65 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Neutralizing -X- _ O
IL-8 -X- _ O
or -X- _ O
inhibiting -X- _ O
its -X- _ O
receptor -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
potentiates -X- _ O
anti-PD-1-mediated -X- _ O
antitumor -X- _ O
immunotherapy -X- _ O
for -X- _ O
glioma -X- _ O
[ -X- _ O
66 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
These -X- _ O
findings -X- _ O
highlight -X- _ O
IL-8 -X- _ O
and -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
as -X- _ O
potential -X- _ O
therapeutic -X- _ O
targets -X- _ O
for -X- _ O
cancer. -X- _ O
McClelland -X- _ O
and -X- _ O
colleagues -X- _ O
have -X- _ O
summarized -X- _ O
numerous -X- _ O
inhibitors -X- _ O
developed -X- _ O
to -X- _ O
target -X- _ O
IL-8 -X- _ O
or -X- _ O
its -X- _ O
receptor -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
for -X- _ O
the -X- _ O
treatment -X- _ O
of -X- _ O
chronic -X- _ O
obstructive -X- _ O
pulmonary -X- _ O
disease -X- _ O
( -X- _ O
COPD -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
asthma -X- _ O
, -X- _ O
diabetes -X- _ O
, -X- _ O
pneumonia -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
solid -X- _ B-TISSUE
tumors -X- _ I-TISSUE
, -X- _ O
including -X- _ O
prostate -X- _ O
cancer -X- _ O
[ -X- _ O
62 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Phase -X- _ O
1 -X- _ O
and -X- _ O
2 -X- _ O
clinical -X- _ O
trials -X- _ O
in -X- _ O
prostate -X- _ O
cancer -X- _ O
with -X- _ O
Navarixin -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
small-molecule -X- _ O
inhibitor -X- _ O
of -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
, -X- _ O
have -X- _ O
been -X- _ O
completed. -X- _ O
Phase -X- _ O
1 -X- _ O
and -X- _ O
2 -X- _ O
clinical -X- _ O
trials -X- _ O
in -X- _ O
prostate -X- _ B-TISSUE
cancer -X- _ O
with -X- _ O
BMS-986253 -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
monoclonal -X- _ O
antibody -X- _ O
against -X- _ O
IL-8 -X- _ O
, -X- _ O
are -X- _ O
still -X- _ O
active. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
none -X- _ O
of -X- _ O
these -X- _ O
inhibitors -X- _ O
have -X- _ O
yet -X- _ O
been -X- _ O
approved -X- _ O
to -X- _ O
treat -X- _ O
cancer. -X- _ O
The -X- _ O
ERK1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
signaling -X- _ O
pathway -X- _ O
contributes -X- _ O
to -X- _ O
numerous -X- _ O
biological -X- _ O
and -X- _ O
pathological -X- _ O
processes. -X- _ O
Excessive -X- _ O
activation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
ERK1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
pathway -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
hallmark -X- _ O
of -X- _ O
human -X- _ O
malignancies -X- _ O
[ -X- _ O
67,68,69,70,71,72,73 -X- _ O
] -X- _ O
due -X- _ O
to -X- _ O
its -X- _ O
crucial -X- _ O
role -X- _ O
in -X- _ O
maintaining -X- _ O
sustained -X- _ O
cellular -X- _ O
proliferation -X- _ O
, -X- _ O
resistance -X- _ O
to -X- _ O
cell -X- _ O
death -X- _ O
, -X- _ O
angiogenesis -X- _ O
, -X- _ O
invasion -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
metastasis. -X- _ O
Many -X- _ O
FDA-approved -X- _ O
drugs -X- _ O
target -X- _ O
upstream -X- _ O
regulators -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
ERK1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
pathway -X- _ O
, -X- _ O
resulting -X- _ O
in -X- _ O
an -X- _ O
indirect -X- _ O
inhibition -X- _ O
of -X- _ O
ERK1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
kinase -X- _ O
[ -X- _ O
74 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
ERK1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
signaling -X- _ O
may -X- _ O
be -X- _ O
reactivated -X- _ O
upon -X- _ O
the -X- _ O
development -X- _ O
of -X- _ O
drug -X- _ O
resistance. -X- _ O
Liu -X- _ O
and -X- _ O
colleagues -X- _ O
have -X- _ O
described -X- _ O
10 -X- _ O
small-molecule -X- _ O
inhibitors -X- _ O
of -X- _ O
ERK1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
which -X- _ O
were -X- _ O
developed -X- _ O
recently -X- _ O
and -X- _ O
have -X- _ O
undergone -X- _ O
clinical -X- _ O
trials -X- _ O
in -X- _ O
cancer -X- _ O
patients -X- _ O
[ -X- _ O
75 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Some -X- _ O
of -X- _ O
them -X- _ O
have -X- _ O
shown -X- _ O
promising -X- _ O
results -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
treatment -X- _ O
of -X- _ O
cancers. -X- _ O
Surprisingly -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
large -X- _ O
body -X- _ O
of -X- _ O
evidence -X- _ O
also -X- _ O
indicates -X- _ O
a -X- _ O
contributing -X- _ O
role -X- _ O
of -X- _ O
ERK1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
activation -X- _ O
in -X- _ O
cancer -X- _ O
cell -X- _ O
apoptosis -X- _ O
primarily -X- _ O
induced -X- _ O
by -X- _ O
chemical -X- _ O
compounds -X- _ O
, -X- _ O
including -X- _ O
glioblastoma -X- _ B-TISSUE
, -X- _ O
bladder -X- _ B-TISSUE
, -X- _ O
breast -X- _ B-TISSUE
, -X- _ O
colon -X- _ B-TISSUE
, -X- _ O
endometrial -X- _ O
, -X- _ O
head -X- _ B-TISSUE
and -X- _ O
neck -X- _ B-TISSUE
, -X- _ O
lung -X- _ B-TISSUE
, -X- _ O
renal -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
, -X- _ O
and -X- _ O
testicular -X- _ B-CELL
germ -X- _ I-CELL
cell -X- _ I-CELL
carcinomas -X- _ O
[ -X- _ O
76,77,78,79,80,81,82,83,84,85 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
mechanically -X- _ O
, -X- _ O
through -X- _ O
activation -X- _ O
of -X- _ O
caspase -X- _ O
3 -X- _ O
and -X- _ O
induction -X- _ O
of -X- _ O
reactive -X- _ O
oxygen -X- _ O
species. -X- _ O
Both -X- _ O
oncogene -X- _ O
and -X- _ O
non-oncogene -X- _ O
addiction -X- _ O
have -X- _ O
been -X- _ O
demonstrated -X- _ O
as -X- _ O
fantastic -X- _ O
targets -X- _ O
for -X- _ O
cancer -X- _ O
therapy -X- _ B-CELL_LINE
due -X- _ I-CELL_LINE
to -X- _ I-CELL_LINE
their -X- _ I-CELL_LINE
crucial -X- _ I-CELL_LINE
role -X- _ I-CELL_LINE
in -X- _ I-CELL_LINE
supporting -X- _ I-CELL_LINE
cancer -X- _ I-CELL_LINE
progression -X- _ I-CELL_LINE
[ -X- _ I-CELL_LINE
86 -X- _ I-CELL_LINE
] -X- _ I-CELL_LINE
. -X- _ I-CELL_LINE
Using -X- _ I-CELL_LINE
a -X- _ I-CELL_LINE
unique -X- _ I-CELL_LINE
glioblastoma -X- _ I-CELL_LINE
cell -X- _ I-CELL_LINE
model -X- _ I-CELL_LINE
system -X- _ I-CELL_LINE
, -X- _ O
M059J -X- _ B-CELL_LINE
with -X- _ O
deficient -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
, -X- _ O
while -X- _ O
M059K -X- _ B-CELL_LINE
with -X- _ O
normal -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
demonstrate -X- _ O
in -X- _ O
vitro -X- _ O
that -X- _ O
MYT1L-overexpressing -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
show -X- _ O
non-oncogene -X- _ O
addiction -X- _ O
to -X- _ O
DNA-PK. -X- _ O
Genomic -X- _ O
instability -X- _ O
due -X- _ O
to -X- _ O
defects -X- _ O
in -X- _ O
DNA -X- _ O
repair -X- _ O
genes -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
key -X- _ O
hallmark -X- _ O
of -X- _ O
cancer -X- _ O
that -X- _ O
drives -X- _ O
the -X- _ O
development -X- _ O
of -X- _ O
human -X- _ O
malignancies -X- _ O
[ -X- _ O
87 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
these -X- _ O
defects -X- _ O
may -X- _ O
also -X- _ O
offer -X- _ O
cancer -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
opportunities -X- _ O
to -X- _ O
evolve -X- _ O
a -X- _ O
dependency -X- _ O
on -X- _ O
a -X- _ O
non-oncogene -X- _ O
addiction -X- _ O
gene. -X- _ O
For -X- _ O
instance -X- _ O
, -X- _ O
BRCA2-deficient -X- _ O
cancer -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
are -X- _ O
more -X- _ O
dependent -X- _ O
on -X- _ O
PARP1 -X- _ O
to -X- _ O
repair -X- _ O
DNA -X- _ O
for -X- _ O
survival -X- _ O
, -X- _ O
resulting -X- _ O
in -X- _ O
an -X- _ O
increased -X- _ O
sensitivity -X- _ O
to -X- _ O
PARP1 -X- _ O
inhibitors -X- _ O
[ -X- _ O
88 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
kill -X- _ O
the -X- _ O
cancer -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
through -X- _ O
the -X- _ O
genetic -X- _ O
concept -X- _ O
of -X- _ O
synthetic -X- _ O
lethality -X- _ O
[ -X- _ O
89 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Targeting -X- _ O
mediators -X- _ O
of -X- _ O
DNA -X- _ O
repair -X- _ O
has -X- _ O
become -X- _ O
a -X- _ O
state-of-the-art -X- _ O
strategy -X- _ O
for -X- _ O
cancer -X- _ O
[ -X- _ O
90 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
leading -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
development -X- _ O
of -X- _ O
inhibitors -X- _ O
of -X- _ O
key -X- _ O
mediators -X- _ O
of -X- _ O
DNA -X- _ O
repair -X- _ O
, -X- _ O
including -X- _ O
DNA-PK. -X- _ O
Interestingly -X- _ O
, -X- _ O
genetic -X- _ O
and -X- _ O
pharmacological -X- _ O
targeting -X- _ O
of -X- _ O
a -X- _ O
strong -X- _ O
non-oncogene -X- _ O
addiction -X- _ O
to -X- _ O
DNA-PKcs -X- _ O
( -X- _ O
DNA-dependent -X- _ O
protein -X- _ O
kinase -X- _ O
catalytic -X- _ O
subunit -X- _ O
) -X- _ O
leads -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
accumulation -X- _ O
of -X- _ O
DNA -X- _ O
double-strand -X- _ O
breaks -X- _ O
in -X- _ O
ATM-defective -X- _ O
cancer -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
, -X- _ O
which -X- _ O
triggers -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
apoptosis -X- _ O
via -X- _ O
the -X- _ O
proapoptotic -X- _ O
signaling -X- _ O
pathway -X- _ O
[ -X- _ O
91 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
These -X- _ O
results -X- _ O
are -X- _ O
supported -X- _ O
by -X- _ O
our -X- _ O
findings -X- _ O
showing -X- _ O
the -X- _ O
dependence -X- _ O
of -X- _ O
MYT1L-overexpressing -X- _ O
glioblastoma -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
on -X- _ O
DNA-PK. -X- _ O
VX-984 -X- _ O
and -X- _ O
M3814 -X- _ O
are -X- _ O
two -X- _ O
selective -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
inhibitors -X- _ O
[ -X- _ O
92,93 -X- _ O
] -X- _ O
that -X- _ O
profoundly -X- _ O
inhibit -X- _ O
tumor -X- _ O
growth -X- _ O
in -X- _ O
tumor -X- _ O
xenograft -X- _ O
models -X- _ O
by -X- _ O
enhancing -X- _ O
radiotherapy. -X- _ O
These -X- _ O
two -X- _ O
inhibitors -X- _ O
are -X- _ O
currently -X- _ O
in -X- _ O
ongoing -X- _ O
clinical -X- _ O
trials. -X- _ O
The -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
/ -X- _ O
MYT1L-CXCR1-ERK1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
proliferative -X- _ O
signaling -X- _ O
loop -X- _ O
we -X- _ O
proposed -X- _ O
here -X- _ O
was -X- _ O
primarily -X- _ O
based -X- _ O
on -X- _ O
data -X- _ O
obtained -X- _ O
from -X- _ O
glioblastoma -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
lines. -X- _ I-CELL
It -X- _ O
is -X- _ O
interesting -X- _ O
to -X- _ O
look -X- _ O
at -X- _ O
the -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
, -X- _ O
MYT1L -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
and -X- _ O
the -X- _ O
levels -X- _ O
of -X- _ O
phosphorylated -X- _ O
ERK1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
in -X- _ O
a -X- _ O
large -X- _ O
cohort -X- _ O
of -X- _ O
glioblastoma -X- _ O
tissue -X- _ B-TISSUE
samples -X- _ O
and -X- _ O
correlate -X- _ O
the -X- _ O
levels -X- _ O
of -X- _ O
these -X- _ O
molecules -X- _ O
to -X- _ O
clinicopathological -X- _ O
parameters -X- _ O
of -X- _ O
this -X- _ O
disease. -X- _ O
It -X- _ O
is -X- _ O
also -X- _ O
interesting -X- _ O
to -X- _ O
look -X- _ O
at -X- _ O
the -X- _ O
effect -X- _ O
of -X- _ O
MYT1L -X- _ O
on -X- _ O
tumor -X- _ O
growth -X- _ O
in -X- _ O
an -X- _ O
in -X- _ O
vivo -X- _ O
tumor -X- _ O
xenograft -X- _ O
animal -X- _ O
model -X- _ O
using -X- _ O
GFP- -X- _ O
/ -X- _ O
MYT1L-M059J -X- _ B-CELL
and -X- _ O
GFP- -X- _ O
/ -X- _ O
MYT1L -X- _ O
M059K -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
, -X- _ O
further -X- _ O
confirming -X- _ O
our -X- _ O
in -X- _ O
vitro -X- _ O
findings. -X- _ O
4. -X- _ O
materials -X- _ O
and -X- _ O
methods -X- _ O
4.5. -X- _ O
western -X- _ O
blot -X- _ O
analysis -X- _ O
The -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
were -X- _ O
rinsed -X- _ O
twice -X- _ O
with -X- _ O
ice-cold -X- _ O
PBS -X- _ O
and -X- _ O
scraped -X- _ O
off -X- _ O
the -X- _ O
plate -X- _ O
in -X- _ O
radioimmunoprecipitation -X- _ O
assay -X- _ O
buffer -X- _ O
( -X- _ O
RIPA -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
total -X- _ O
protein -X- _ O
lysate -X- _ O
prepared -X- _ O
from -X- _ O
human -X- _ O
adult -X- _ O
brain -X- _ B-TISSUE
normal -X- _ O
tissues -X- _ B-TISSUE
was -X- _ O
purchased -X- _ O
from -X- _ O
BioChain -X- _ O
( -X- _ O
Newark -X- _ O
, -X- _ O
CA -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
served -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
normal -X- _ O
control -X- _ O
for -X- _ O
human -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
lines. -X- _ I-CELL
The -X- _ O
whole -X- _ O
cellular -X- _ O
lysates -X- _ O
( -X- _ O
30–100 -X- _ O
µg -X- _ O
per -X- _ O
sample -X- _ O
) -X- _ O
were -X- _ O
electrophoresed -X- _ O
via -X- _ O
10 -X- _ O
% -X- _ O
SDS-PAGE -X- _ O
and -X- _ O
electrophoretically -X- _ O
transferred -X- _ O
to -X- _ O
PVDF -X- _ O
membranes -X- _ O
( -X- _ O
Amersham -X- _ O
HybondTM-P -X- _ O
, -X- _ O
GE -X- _ O
Healthcare -X- _ O
, -X- _ O
Chicago -X- _ O
, -X- _ O
IL -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
) -X- _ O
at -X- _ O
4 -X- _ O
°C -X- _ O
for -X- _ O
1.5 -X- _ O
h. -X- _ O
The -X- _ O
blots -X- _ O
were -X- _ O
incubated -X- _ O
for -X- _ O
1 -X- _ O
h -X- _ O
with -X- _ O
5 -X- _ O
% -X- _ O
nonfat -X- _ O
dry -X- _ O
milk -X- _ B-TISSUE
to -X- _ O
block -X- _ O
the -X- _ O
nonspecific -X- _ O
binding -X- _ O
sites -X- _ O
and -X- _ O
subsequently -X- _ O
incubated -X- _ O
with -X- _ O
polyclonal -X- _ O
/ -X- _ O
monoclonal -X- _ O
antibodies -X- _ O
specific -X- _ O
to -X- _ O
MYT1L -X- _ O
( -X- _ O
Abnova -X- _ O
, -X- _ O
Taipei -X- _ O
, -X- _ O
China -X- _ O
) -X- _ O
or -X- _ O
AKT1 -X- _ O
( -X- _ O
Abcam -X- _ O
, -X- _ O
Cambridge -X- _ O
, -X- _ O
GH -X- _ O
, -X- _ O
UK -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
CDK2 -X- _ O
( -X- _ O
Abcam -X- _ O
, -X- _ O
Cambridge -X- _ O
, -X- _ O
GH -X- _ O
, -X- _ O
UK -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
DNA-PKcs -X- _ O
( -X- _ O
Abcam -X- _ O
, -X- _ O
Cambridge -X- _ O
, -X- _ O
GH -X- _ O
, -X- _ O
UK -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
p21 -X- _ O
( -X- _ O
Abcam -X- _ O
, -X- _ O
Cambridge -X- _ O
, -X- _ O
GH -X- _ O
, -X- _ O
UK -X- _ O
) -X- _ O
or -X- _ O
CDK4 -X- _ O
( -X- _ O
Cell -X- _ B-CELL
Signaling -X- _ O
Technology -X- _ O
, -X- _ O
Danvers -X- _ O
, -X- _ O
MA -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
CDK6 -X- _ O
( -X- _ O
Cell -X- _ B-CELL
Signaling -X- _ O
Technology -X- _ O
, -X- _ O
Danvers -X- _ O
, -X- _ O
MA -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
cyclin -X- _ O
A2 -X- _ O
( -X- _ O
Cell -X- _ B-CELL
Signaling -X- _ O
Technology -X- _ O
, -X- _ O
Danvers -X- _ O
, -X- _ O
MA -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
cyclin -X- _ O
D1 -X- _ O
( -X- _ O
Cell -X- _ B-CELL
Signaling -X- _ O
Technology -X- _ O
, -X- _ O
Danvers -X- _ O
, -X- _ O
MA -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
cyclin -X- _ O
E1 -X- _ O
( -X- _ O
Cell -X- _ B-CELL
Signaling -X- _ O
Technology -X- _ O
, -X- _ O
Danvers -X- _ O
, -X- _ O
MA -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
ERK1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
( -X- _ O
Cell -X- _ B-CELL
Signaling -X- _ O
Technology -X- _ O
, -X- _ O
Danvers -X- _ O
, -X- _ O
MA -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
p27 -X- _ O
( -X- _ O
Cell -X- _ B-CELL
Signaling -X- _ O
Technology -X- _ O
, -X- _ O
Danvers -X- _ O
, -X- _ O
MA -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
pERK1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
( -X- _ O
Cell -X- _ B-CELL
Signaling -X- _ O
Technology -X- _ O
, -X- _ O
Danvers -X- _ O
, -X- _ O
MA -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
) -X- _ O
or -X- _ O
BAX -X- _ O
( -X- _ O
Santa -X- _ O
Cruz -X- _ O
Biotechnology -X- _ O
, -X- _ O
Dallas -X- _ O
, -X- _ O
TX -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
BCL2 -X- _ O
( -X- _ O
Santa -X- _ O
Cruz -X- _ O
Biotechnology -X- _ O
, -X- _ O
Dallas -X- _ O
, -X- _ O
TX -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
GROα -X- _ O
( -X- _ O
Santa -X- _ O
Cruz -X- _ O
Biotechnology -X- _ O
, -X- _ O
Dallas -X- _ O
, -X- _ O
TX -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
IL8RB -X- _ O
( -X- _ O
Santa -X- _ O
Cruz -X- _ O
Biotechnology -X- _ O
, -X- _ O
Dallas -X- _ O
, -X- _ O
TX -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
pAKT1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
/ -X- _ O
3 -X- _ O
( -X- _ O
Santa -X- _ O
Cruz -X- _ O
Biotechnology -X- _ O
, -X- _ O
Dallas -X- _ O
, -X- _ O
TX -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
or -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
( -X- _ O
LSBio -X- _ O
, -X- _ O
Lynnwood -X- _ O
, -X- _ O
WA -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
) -X- _ O
at -X- _ O
4 -X- _ O
°C -X- _ O
overnight. -X- _ O
Immunoreactivity -X- _ O
was -X- _ O
detected -X- _ O
using -X- _ O
a -X- _ O
peroxidase-conjugated -X- _ O
antibody -X- _ O
and -X- _ O
visualized -X- _ O
using -X- _ O
the -X- _ O
ECL -X- _ O
Plus -X- _ O
Western -X- _ O
Blotting -X- _ O
Detection -X- _ O
System -X- _ O
( -X- _ O
GE -X- _ O
Healthcare -X- _ O
, -X- _ O
Chicago -X- _ O
, -X- _ O
IL -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
blots -X- _ O
were -X- _ O
stripped -X- _ O
before -X- _ O
reprobing -X- _ O
with -X- _ O
an -X- _ O
antibody -X- _ O
against -X- _ O
actin -X- _ O
( -X- _ O
Abcam -X- _ O
, -X- _ O
Cambridge -X- _ O
, -X- _ O
GH -X- _ O
, -X- _ O
UK -X- _ O
) -X- _ O
or -X- _ O
GAPDH -X- _ O
( -X- _ O
Santa -X- _ O
Cruz -X- _ O
Biotechnology -X- _ O
, -X- _ O
Dallas -X- _ O
, -X- _ O
TX -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
4.9. -X- _ O
bioinformatics -X- _ O
analysis -X- _ O
The -X- _ O
MYT1L -X- _ O
binding -X- _ O
sites -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
promoter -X- _ O
were -X- _ O
predicted -X- _ O
using -X- _ O
Zinc -X- _ O
Finger -X- _ O
Protein-DNA -X- _ O
Scoring -X- _ O
Form -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
DNA -X- _ O
binding -X- _ O
site -X- _ O
predictor -X- _ O
for -X- _ O
Cys2His2 -X- _ O
zinc -X- _ O
finger -X- _ O
proteins -X- _ O
( -X- _ O
http -X- _ O
: -X- _ O
/ -X- _ O
/ -X- _ O
zf.princeton.edu -X- _ O
/ -X- _ O
form.php -X- _ O
, -X- _ O
accessed -X- _ O
on -X- _ O
14 -X- _ O
March -X- _ O
2025 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
Cancer -X- _ O
Genome -X- _ O
Atlas -X- _ O
( -X- _ O
TCGA -X- _ O
) -X- _ O
datasets -X- _ O
were -X- _ O
used -X- _ O
to -X- _ O
analyze -X- _ O
a -X- _ O
relationship -X- _ O
between -X- _ O
MYT1L -X- _ O
expression -X- _ O
and -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
expression -X- _ O
in -X- _ O
glioblastoma -X- _ O
and -X- _ O
neuroblastoma. -X- _ O
4.12. -X- _ O
statistical -X- _ O
analysis -X- _ O
The -X- _ O
Student’s -X- _ O
t-test -X- _ O
was -X- _ O
used -X- _ O
to -X- _ O
determine -X- _ O
the -X- _ O
statistical -X- _ O
significance -X- _ O
of -X- _ O
differences -X- _ O
in -X- _ O
GROα -X- _ O
expression -X- _ O
, -X- _ O
IL-8 -X- _ O
expression -X- _ O
, -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
growth -X- _ O
, -X- _ O
apoptosis -X- _ O
, -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
cycle -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
luciferase -X- _ O
activity -X- _ O
between -X- _ O
groups. -X- _ O
Luciferase -X- _ O
activity -X- _ O
was -X- _ O
measured -X- _ O
in -X- _ O
duplicate -X- _ O
, -X- _ O
while -X- _ O
other -X- _ O
experiments -X- _ O
were -X- _ O
performed -X- _ O
in -X- _ O
triplicate. -X- _ O
A -X- _ O
value -X- _ O
of -X- _ O
p -X- _ O
***5. -X- _ O
Conclusions*** -X- _ O
This -X- _ O
work -X- _ O
, -X- _ O
for -X- _ O
the -X- _ O
first -X- _ O
time -X- _ O
, -X- _ O
reveals -X- _ O
that -X- _ O
MYT1L -X- _ O
functions -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
transcription -X- _ O
factor -X- _ O
governing -X- _ O
the -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
CXC -X- _ O
chemokine -X- _ O
receptor -X- _ O
CXCR1. -X- _ O
The -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
signaling -X- _ O
promotes -X- _ O
proliferation -X- _ O
, -X- _ O
inhibits -X- _ O
apoptosis -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
shortens -X- _ O
the -X- _ O
S -X- _ O
phase -X- _ O
in -X- _ O
DNA-PK+ -X- _ O
glioblastoma -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
via -X- _ O
activation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
ERK1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
pathway -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
can -X- _ O
be -X- _ O
blocked -X- _ O
by -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
knockdown. -X- _ O
The -X- _ O
function -X- _ O
of -X- _ O
MYT1L -X- _ O
is -X- _ O
DNA-PK-dependent -X- _ O
, -X- _ O
highlighting -X- _ O
a -X- _ O
key -X- _ O
role -X- _ O
of -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
modulating -X- _ O
the -X- _ O
transcriptional -X- _ O
activity -X- _ O
of -X- _ O
MYT1L. -X- _ O
Our -X- _ O
findings -X- _ O
have -X- _ O
demonstrated -X- _ O
a -X- _ O
positive -X- _ O
feedback -X- _ O
DNA-PK -X- _ O
/ -X- _ O
MYT1L-CXCR1-ERK1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
proliferative -X- _ O
signaling -X- _ O
loop -X- _ O
in -X- _ O
glioblastoma -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
and -X- _ O
might -X- _ O
have -X- _ O
significant -X- _ O
therapeutic -X- _ O
implications. -X- _ O
In -X- _ O
the -X- _ O
future -X- _ O
, -X- _ O
our -X- _ O
studies -X- _ O
can -X- _ O
be -X- _ O
extended -X- _ O
by -X- _ O
analyzing -X- _ O
the -X- _ O
effect -X- _ O
of -X- _ O
CXCR1 -X- _ O
knockdown -X- _ O
in -X- _ O
M059J -X- _ B-CELL
cells -X- _ B-CELL
with -X- _ O
impaired -X- _ O
DNA-PK. -X- _ O
This -X- _ O
would -X- _ O
allow -X- _ O
us -X- _ O
to -X- _ O
understand -X- _ O
the -X- _ O
interlink -X- _ O
between -X- _ O
DNA-PK-MYT1L-CXCR1-pERK1 -X- _ O
/ -X- _ O
2. -X- _ O
Source -X- _ O
paper -X- _ O
: -X- _ O
PMC12072392 -X- _ O

Methods -X- _ O
The -X- _ O
cytotoxic -X- _ O
effects -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
A. -X- _ O
incana -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction -X- _ O
were -X- _ O
evaluated -X- _ O
in -X- _ O
a -X- _ O
dose-dependent -X- _ O
manner -X- _ O
using -X- _ O
the -X- _ O
MTT -X- _ O
assay -X- _ O
on -X- _ O
several -X- _ O
cancer -X- _ B-CELL_LINE
cell -X- _ I-CELL_LINE
lines -X- _ I-CELL_LINE
, -X- _ O
with -X- _ O
particular -X- _ O
emphasis -X- _ O
on -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL_LINE
cells. -X- _ I-CELL_LINE
Flow -X- _ O
cytometry -X- _ O
was -X- _ O
used -X- _ O
to -X- _ O
assess -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
arrest -X- _ O
and -X- _ O
apoptosis -X- _ O
, -X- _ O
while -X- _ O
RT-qPCR -X- _ O
quantified -X- _ O
changes -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
apoptotic -X- _ O
markers -X- _ O
( -X- _ O
Bax -X- _ O
, -X- _ O
Bcl-2 -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
p53 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Chemical -X- _ O
composition -X- _ O
analysis -X- _ O
was -X- _ O
conducted -X- _ O
using -X- _ O
gas -X- _ O
chromatography-mass -X- _ O
spectrometry -X- _ O
/ -X- _ O
flame -X- _ O
ionization -X- _ O
detection -X- _ O
( -X- _ O
GC-MS -X- _ O
/ -X- _ O
FID -X- _ O
) -X- _ O
to -X- _ O
identify -X- _ O
the -X- _ O
major -X- _ O
bioactive -X- _ O
compounds -X- _ O
within -X- _ O
the -X- _ O
fraction. -X- _ O
Results -X- _ O
The -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction -X- _ O
exhibited -X- _ O
dose-dependent -X- _ O
cytotoxicity -X- _ O
in -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
, -X- _ O
with -X- _ O
an -X- _ O
IC50 -X- _ O
value -X- _ O
of -X- _ O
135.6 -X- _ O
µg -X- _ O
/ -X- _ O
mL -X- _ O
and -X- _ O
a -X- _ O
selectivity -X- _ O
index -X- _ O
( -X- _ O
SI -X- _ O
) -X- _ O
of -X- _ O
2.72 -X- _ O
relative -X- _ O
to -X- _ O
normal -X- _ B-CELL_CONTEXT
cells. -X- _ B-CELL
Flow -X- _ O
cytometry -X- _ O
analysis -X- _ O
revealed -X- _ O
G0 -X- _ O
/ -X- _ O
G1 -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
arrest -X- _ O
, -X- _ O
significantly -X- _ O
hindering -X- _ O
progression -X- _ O
through -X- _ O
the -X- _ O
S -X- _ O
and -X- _ O
G2 -X- _ O
/ -X- _ O
M -X- _ O
phases. -X- _ O
Moreover -X- _ O
, -X- _ O
there -X- _ O
was -X- _ O
a -X- _ O
significant -X- _ O
increase -X- _ O
in -X- _ O
both -X- _ O
early -X- _ O
and -X- _ O
late -X- _ O
apoptotic -X- _ B-CELL_CONTEXT
cell -X- _ B-CELL
populations -X- _ O
, -X- _ O
correlating -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
upregulation -X- _ O
of -X- _ O
pro-apoptotic -X- _ O
genes -X- _ O
( -X- _ O
Bax -X- _ O
and -X- _ O
p53 -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
the -X- _ O
downregulation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
anti-apoptotic -X- _ O
gene -X- _ O
Bcl-2. -X- _ O
The -X- _ O
chemical -X- _ O
analysis -X- _ O
identified -X- _ O
22 -X- _ O
compounds -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
unsaponifiable -X- _ O
fraction -X- _ O
, -X- _ O
chiefly -X- _ O
terpenoids -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
phytol -X- _ O
( -X- _ O
65.74 -X- _ O
% -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
saponifiable -X- _ O
fraction -X- _ O
presented -X- _ O
a -X- _ O
balanced -X- _ O
composition -X- _ O
of -X- _ O
saturated -X- _ O
( -X- _ O
48.69 -X- _ O
% -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
unsaturated -X- _ O
( -X- _ O
51.29 -X- _ O
% -X- _ O
) -X- _ O
fatty -X- _ O
acids -X- _ O
, -X- _ O
with -X- _ O
palmitic -X- _ O
acid -X- _ O
, -X- _ O
linolenic -X- _ O
acid -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
linoleic -X- _ O
acid -X- _ O
as -X- _ O
the -X- _ O
predominant -X- _ O
compounds. -X- _ O
Conclusion -X- _ O
While -X- _ O
the -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction’s -X- _ O
relatively -X- _ O
high -X- _ O
IC50 -X- _ O
value -X- _ O
may -X- _ O
limit -X- _ O
its -X- _ O
utility -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
standalone -X- _ O
treatment -X- _ O
, -X- _ O
its -X- _ O
ability -X- _ O
to -X- _ O
induce -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
arrest -X- _ O
and -X- _ O
apoptosis -X- _ O
demonstrates -X- _ O
its -X- _ O
promise -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
co-therapeutic -X- _ O
agent -X- _ O
with -X- _ O
conventional -X- _ O
anticancer -X- _ O
drugs. -X- _ O
Further -X- _ O
research -X- _ O
is -X- _ O
essential -X- _ O
to -X- _ O
elucidate -X- _ O
its -X- _ O
precise -X- _ O
mechanisms -X- _ O
of -X- _ O
action -X- _ O
and -X- _ O
to -X- _ O
evaluate -X- _ O
its -X- _ O
efficacy -X- _ O
in -X- _ O
combination -X- _ O
therapies -X- _ O
, -X- _ O
potentially -X- _ O
advancing -X- _ O
its -X- _ O
role -X- _ O
in -X- _ O
cervical -X- _ O
cancer -X- _ O
treatment. -X- _ O
Methods -X- _ O
Cell -X- _ O
cycle -X- _ O
analysis -X- _ O
To -X- _ O
assess -X- _ O
the -X- _ O
impact -X- _ O
of -X- _ O
A. -X- _ O
incana -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction -X- _ O
on -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
progression -X- _ O
, -X- _ O
propidium -X- _ O
iodide -X- _ O
( -X- _ O
PI -X- _ O
) -X- _ O
staining -X- _ O
followed -X- _ O
by -X- _ O
flow -X- _ O
cytometry -X- _ O
was -X- _ O
employed -X- _ O
as -X- _ O
outlined -X- _ O
previously -X- _ O
[ -X- _ O
17 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
PI -X- _ O
( -X- _ O
Company -X- _ O
) -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
fluorescent -X- _ O
dye -X- _ O
that -X- _ O
binds -X- _ O
to -X- _ O
DNA -X- _ O
allowing -X- _ O
differentiation -X- _ O
of -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
phases -X- _ O
( -X- _ O
G0 -X- _ O
/ -X- _ O
G1 -X- _ O
, -X- _ O
S -X- _ O
, -X- _ O
G2 -X- _ O
/ -X- _ O
M -X- _ O
) -X- _ O
based -X- _ O
on -X- _ O
their -X- _ O
DNA -X- _ O
content. -X- _ O
Briefly -X- _ O
, -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
( -X- _ O
2 -X- _ O
× -X- _ O
105 -X- _ O
cells -X- _ O
/ -X- _ O
mL -X- _ O
) -X- _ O
were -X- _ O
cultured -X- _ O
overnight -X- _ O
and -X- _ O
then -X- _ O
treated -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction -X- _ O
at -X- _ O
its -X- _ O
IC50 -X- _ O
concentration -X- _ O
( -X- _ O
135.6 -X- _ O
µg -X- _ O
/ -X- _ O
mL -X- _ O
) -X- _ O
for -X- _ O
24 -X- _ O
h. -X- _ O
After -X- _ O
treatment -X- _ O
, -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
were -X- _ O
fixed -X- _ O
, -X- _ O
stained -X- _ O
with -X- _ O
a -X- _ O
PI -X- _ O
/ -X- _ O
RNase -X- _ O
solution -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
analyzed -X- _ O
using -X- _ O
a -X- _ O
FACSCalibur -X- _ O
Scan -X- _ O
flow -X- _ O
cytometer -X- _ O
( -X- _ O
BD -X- _ O
Biosciences -X- _ O
) -X- _ O
to -X- _ O
determine -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
distribution. -X- _ O
Apoptosis -X- _ O
analysis -X- _ O
using -X- _ O
annexin -X- _ O
v-fitc -X- _ O
/ -X- _ O
pi -X- _ O
assay -X- _ O
To -X- _ O
determine -X- _ O
the -X- _ O
mode -X- _ O
of -X- _ O
cell -X- _ O
death -X- _ O
induced -X- _ O
by -X- _ O
A. -X- _ O
incana -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
Annexin -X- _ O
V-FITC -X- _ O
apoptosis -X- _ O
detection -X- _ O
kit -X- _ O
( -X- _ O
BioVision -X- _ O
Inc. -X- _ O
, -X- _ O
CA -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
, -X- _ O
K101-25 -X- _ O
) -X- _ O
was -X- _ O
used -X- _ O
following -X- _ O
the -X- _ O
manufacturer’s -X- _ O
protocol. -X- _ O
This -X- _ O
assay -X- _ O
detects -X- _ O
phosphatidylserine -X- _ O
translocation -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
hallmark -X- _ O
of -X- _ O
early -X- _ O
apoptosis -X- _ O
, -X- _ O
by -X- _ O
Annexin -X- _ O
V-FITC -X- _ O
staining. -X- _ O
PI -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
viability -X- _ O
dye -X- _ O
excluded -X- _ O
by -X- _ O
healthy -X- _ O
and -X- _ O
early -X- _ B-CELL_CONTEXT
apoptotic -X- _ I-CELL_CONTEXT
cells -X- _ B-CELL
with -X- _ O
intact -X- _ O
membranes -X- _ O
, -X- _ O
stains -X- _ O
the -X- _ O
DNA -X- _ O
of -X- _ O
late -X- _ B-CELL_CONTEXT
apoptotic -X- _ I-CELL_CONTEXT
and -X- _ O
necrotic -X- _ B-CELL_CONTEXT
cells -X- _ B-CELL
with -X- _ O
compromised -X- _ O
membranes -X- _ O
, -X- _ O
allowing -X- _ O
for -X- _ O
their -X- _ O
identification. -X- _ O
Briefly -X- _ O
, -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
( -X- _ O
2 -X- _ O
× -X- _ O
105 -X- _ O
cells -X- _ O
/ -X- _ O
mL -X- _ O
) -X- _ O
were -X- _ O
cultured -X- _ O
for -X- _ O
24 -X- _ O
h -X- _ O
and -X- _ O
treated -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
extract -X- _ O
at -X- _ O
its -X- _ O
IC50 -X- _ O
concentration -X- _ O
( -X- _ O
135.6 -X- _ O
µg -X- _ O
/ -X- _ O
mL -X- _ O
) -X- _ O
for -X- _ O
an -X- _ O
additional -X- _ O
48 -X- _ O
h. -X- _ O
Following -X- _ O
treatment -X- _ O
, -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
were -X- _ O
stained -X- _ O
with -X- _ O
Annexin -X- _ O
V-FITC -X- _ O
and -X- _ O
PI. -X- _ O
Apoptosis -X- _ O
was -X- _ O
quantified -X- _ O
by -X- _ O
flow -X- _ O
cytometry -X- _ O
using -X- _ O
a -X- _ O
BD -X- _ O
FACSCalibur -X- _ O
Scan -X- _ O
system -X- _ O
( -X- _ O
BD -X- _ O
Biosciences -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
For -X- _ O
accurate -X- _ O
quantification -X- _ O
of -X- _ O
apoptotic -X- _ O
populations -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
specific -X- _ O
gating -X- _ O
strategy -X- _ O
was -X- _ O
applied. -X- _ O
Cells -X- _ B-CELL
were -X- _ O
initially -X- _ O
gated -X- _ O
based -X- _ O
on -X- _ O
forward -X- _ O
scatter -X- _ O
( -X- _ O
FSC -X- _ O
) -X- _ O
versus -X- _ O
side -X- _ O
scatter -X- _ O
( -X- _ O
SSC -X- _ O
) -X- _ O
to -X- _ O
exclude -X- _ O
debris -X- _ O
, -X- _ O
followed -X- _ O
by -X- _ O
gating -X- _ O
on -X- _ O
FSC-Height -X- _ O
( -X- _ O
FSC-H -X- _ O
) -X- _ O
versus -X- _ O
FSC-Area -X- _ O
( -X- _ O
FSC-A -X- _ O
) -X- _ O
to -X- _ O
exclude -X- _ O
doublets. -X- _ O
Apoptotic -X- _ O
populations -X- _ O
were -X- _ O
classified -X- _ O
by -X- _ O
gating -X- _ O
on -X- _ O
Annexin -X- _ O
V-FITC -X- _ O
versus -X- _ O
PI -X- _ O
as -X- _ O
follows -X- _ O
: -X- _ O
live -X- _ B-CELL_CONTEXT
cells -X- _ B-CELL
( -X- _ O
Q4 -X- _ O
) -X- _ O
were -X- _ O
Annexin -X- _ O
V- -X- _ O
/ -X- _ O
PI- -X- _ O
, -X- _ O
early -X- _ B-CELL_CONTEXT
apoptotic -X- _ I-CELL_CONTEXT
cells -X- _ B-CELL
( -X- _ O
Q3 -X- _ O
) -X- _ O
were -X- _ O
Annexin -X- _ O
V+ -X- _ O
/ -X- _ O
PI- -X- _ O
, -X- _ O
late -X- _ B-CELL_CONTEXT
apoptotic -X- _ I-CELL_CONTEXT
/ -X- _ I-CELL_CONTEXT
necrotic -X- _ I-CELL_CONTEXT
cells -X- _ B-CELL
( -X- _ O
Q2 -X- _ O
) -X- _ O
were -X- _ O
Annexin -X- _ O
V+ -X- _ O
/ -X- _ O
PI+ -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
dead -X- _ B-CELL_CONTEXT
/ -X- _ I-CELL_CONTEXT
necrotic -X- _ I-CELL_CONTEXT
cells -X- _ B-CELL
( -X- _ O
Q1 -X- _ O
) -X- _ O
were -X- _ O
Annexin -X- _ O
V- -X- _ O
/ -X- _ O
PI+. -X- _ O
The -X- _ O
percentage -X- _ O
of -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
in -X- _ O
each -X- _ O
quadrant -X- _ O
was -X- _ O
calculated -X- _ O
to -X- _ O
assess -X- _ O
the -X- _ O
extent -X- _ O
of -X- _ O
apoptosis -X- _ O
and -X- _ O
necrosis. -X- _ O
Statistical -X- _ O
analysis -X- _ O
Statistical -X- _ O
analysis -X- _ O
was -X- _ O
performed -X- _ O
using -X- _ O
SPSS -X- _ O
version -X- _ O
24.0. -X- _ O
Differences -X- _ O
between -X- _ O
the -X- _ O
means -X- _ O
of -X- _ O
two -X- _ O
independent -X- _ O
groups -X- _ O
were -X- _ O
analyzed -X- _ O
using -X- _ O
an -X- _ O
independent -X- _ O
t-test -X- _ O
, -X- _ O
with -X- _ O
p -X- _ O
***Results*** -X- _ O
Effect -X- _ O
of -X- _ O
a. -X- _ O
incana -X- _ O
dcm -X- _ O
fraction -X- _ O
on -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
analysis -X- _ O
To -X- _ O
investigate -X- _ O
the -X- _ O
effect -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
A. -X- _ O
incana -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction -X- _ O
on -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
progression -X- _ O
, -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
were -X- _ O
treated -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
IC50 -X- _ O
concentration -X- _ O
( -X- _ O
135.6 -X- _ O
µg -X- _ O
/ -X- _ O
mL -X- _ O
) -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
fraction -X- _ O
for -X- _ O
48 -X- _ O
h. -X- _ O
Cell -X- _ O
cycle -X- _ O
distribution -X- _ O
was -X- _ O
assessed -X- _ O
by -X- _ O
flow -X- _ O
cytometry -X- _ O
using -X- _ O
Propidium -X- _ O
Iodide -X- _ O
( -X- _ O
PI -X- _ O
) -X- _ O
staining -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
binds -X- _ O
to -X- _ O
DNA -X- _ O
and -X- _ O
allows -X- _ O
differentiation -X- _ O
of -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
phases -X- _ O
( -X- _ O
G0 -X- _ O
/ -X- _ O
G1 -X- _ O
, -X- _ O
S -X- _ O
, -X- _ O
G2 -X- _ O
/ -X- _ O
M -X- _ O
) -X- _ O
based -X- _ O
on -X- _ O
DNA -X- _ O
content. -X- _ O
As -X- _ O
illustrated -X- _ O
in -X- _ O
Fig. -X- _ O
2 -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
significant -X- _ O
increase -X- _ O
( -X- _ O
p -X- _ O
A. -X- _ O
incana -X- _ O
exerts -X- _ O
cytostatic -X- _ O
effects -X- _ O
on -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
by -X- _ O
inducing -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
arrest. -X- _ O
Fig. -X- _ O
2Flow -X- _ O
cytometric -X- _ O
analysis -X- _ O
of -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
distribution -X- _ O
in -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
treated -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
A. -X- _ O
incana -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction. -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
were -X- _ O
treated -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
IC50 -X- _ O
concentration -X- _ O
( -X- _ O
135.6 -X- _ O
µg -X- _ O
/ -X- _ O
mL -X- _ O
) -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
A. -X- _ O
incana -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction -X- _ O
for -X- _ O
48 -X- _ O
h -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
phase -X- _ O
distribution -X- _ O
was -X- _ O
analyzed -X- _ O
via -X- _ O
flow -X- _ O
cytometry. -X- _ O
Panels -X- _ O
: -X- _ O
( -X- _ O
a -X- _ O
) -X- _ O
Control -X- _ O
( -X- _ O
untreated -X- _ O
) -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
, -X- _ O
( -X- _ O
b -X- _ O
) -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
treated -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
( -X- _ O
c -X- _ O
) -X- _ O
A -X- _ O
graphical -X- _ O
comparison -X- _ O
of -X- _ O
cell -X- _ O
percentages -X- _ O
across -X- _ O
each -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
phase -X- _ O
between -X- _ O
treated -X- _ O
and -X- _ O
untreated -X- _ O
groups -X- _ O
Discussion -X- _ O
This -X- _ O
study -X- _ O
investigated -X- _ O
the -X- _ O
cytotoxic -X- _ O
potential -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction -X- _ O
from -X- _ O
the -X- _ O
leaves -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
medicinal -X- _ O
plant -X- _ O
A. -X- _ O
incana. -X- _ O
Given -X- _ O
the -X- _ O
documented -X- _ O
cytotoxic -X- _ O
activity -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
DCM -X- _ O
extract -X- _ O
from -X- _ O
the -X- _ O
related -X- _ O
subspecies -X- _ O
A. -X- _ O
rugosa -X- _ O
[ -X- _ O
8 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
hypothesized -X- _ O
that -X- _ O
A. -X- _ O
incana -X- _ O
might -X- _ O
exhibit -X- _ O
similar -X- _ O
effects. -X- _ O
Although -X- _ O
previous -X- _ O
studies -X- _ O
confirmed -X- _ O
the -X- _ O
cytotoxic -X- _ O
properties -X- _ O
of -X- _ O
its -X- _ O
methanol -X- _ O
extract -X- _ O
[ -X- _ O
10 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
effects -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction -X- _ O
remain -X- _ O
unexamined. -X- _ O
To -X- _ O
address -X- _ O
this -X- _ O
gap -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
fraction’s -X- _ O
cytotoxicity -X- _ O
was -X- _ O
evaluated -X- _ O
against -X- _ O
four -X- _ O
human -X- _ O
cancer -X- _ B-CELL_LINE
cell -X- _ I-CELL_LINE
lines -X- _ I-CELL_LINE
: -X- _ O
HepG2 -X- _ B-CELL_LINE
, -X- _ O
HCT116 -X- _ B-CELL_LINE
, -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL_LINE
, -X- _ O
and -X- _ O
MCF-7 -X- _ B-CELL_LINE
, -X- _ O
representing -X- _ O
diverse -X- _ O
cancer -X- _ O
types. -X- _ O
The -X- _ O
A. -X- _ O
incana -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction -X- _ O
demonstrated -X- _ O
IC50 -X- _ O
values -X- _ O
ranging -X- _ O
from -X- _ O
135.6 -X- _ O
to -X- _ O
273.1 -X- _ O
µg -X- _ O
/ -X- _ O
mL -X- _ O
, -X- _ O
with -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
( -X- _ O
a -X- _ O
cervical -X- _ O
cancer -X- _ O
model -X- _ O
) -X- _ O
showing -X- _ O
the -X- _ O
highest -X- _ O
sensitivity -X- _ O
( -X- _ O
IC50 -X- _ O
= -X- _ O
135.6 -X- _ O
µg -X- _ O
/ -X- _ O
mL -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Significantly -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction -X- _ O
exhibited -X- _ O
a -X- _ O
selectivity -X- _ O
index -X- _ O
( -X- _ O
SI -X- _ O
) -X- _ O
of -X- _ O
2.72 -X- _ O
against -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
, -X- _ O
indicating -X- _ O
preferential -X- _ O
cytotoxicity -X- _ O
toward -X- _ O
cancer -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
over -X- _ O
normal -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
and -X- _ O
highlighting -X- _ O
its -X- _ O
therapeutic -X- _ O
potential. -X- _ O
Although -X- _ O
the -X- _ O
IC50 -X- _ O
values -X- _ O
for -X- _ O
A. -X- _ O
incana -X- _ O
were -X- _ O
higher -X- _ O
than -X- _ O
those -X- _ O
reported -X- _ O
for -X- _ O
the -X- _ O
DCM -X- _ O
extract -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
related -X- _ O
subspecies -X- _ O
A. -X- _ O
rugosa -X- _ O
[ -X- _ O
8 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
this -X- _ O
difference -X- _ O
may -X- _ O
be -X- _ O
attributed -X- _ O
to -X- _ O
variations -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
concentration -X- _ O
or -X- _ O
composition -X- _ O
of -X- _ O
active -X- _ O
compounds -X- _ O
in -X- _ O
each -X- _ O
extract. -X- _ O
Despite -X- _ O
this -X- _ O
, -X- _ O
both -X- _ O
species -X- _ O
showed -X- _ O
their -X- _ O
most -X- _ O
potent -X- _ O
cytotoxic -X- _ O
effects -X- _ O
against -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
, -X- _ O
suggesting -X- _ O
a -X- _ O
potential -X- _ O
shared -X- _ O
mechanism -X- _ O
targeting -X- _ O
cervical -X- _ B-CELL
cancer -X- _ I-CELL
cells -X- _ I-CELL
specifically. -X- _ O
Additionally -X- _ O
, -X- _ O
prior -X- _ O
studies -X- _ O
have -X- _ O
reported -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
methanol -X- _ O
extract -X- _ O
of -X- _ O
A. -X- _ O
incana -X- _ O
leaves -X- _ O
has -X- _ O
a -X- _ O
pronounced -X- _ O
effect -X- _ O
on -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
( -X- _ O
IC50 -X- _ O
of -X- _ O
68.5 -X- _ O
µg -X- _ O
/ -X- _ O
mL -X- _ O
) -X- _ O
[ -X- _ O
10 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
selective -X- _ O
cytotoxicity -X- _ O
observed -X- _ O
in -X- _ O
both -X- _ O
A. -X- _ O
incana -X- _ O
and -X- _ O
A. -X- _ O
rugosa -X- _ O
DCM -X- _ O
extracts -X- _ O
, -X- _ O
alongside -X- _ O
the -X- _ O
methanol -X- _ O
extract’s -X- _ O
activity -X- _ O
, -X- _ O
indicates -X- _ O
the -X- _ O
presence -X- _ O
of -X- _ O
bioactive -X- _ O
compounds -X- _ O
within -X- _ O
these -X- _ O
species -X- _ O
that -X- _ O
may -X- _ O
preferentially -X- _ O
disrupt -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL_LINE
cell -X- _ I-CELL_LINE
function. -X- _ O
This -X- _ O
selective -X- _ O
activity -X- _ O
underscores -X- _ O
the -X- _ O
potential -X- _ O
of -X- _ O
Alnus -X- _ O
species -X- _ O
as -X- _ O
promising -X- _ O
candidates -X- _ O
for -X- _ O
developing -X- _ O
targeted -X- _ O
therapies -X- _ O
against -X- _ O
gynecological -X- _ O
cancers -X- _ O
, -X- _ O
particularly -X- _ O
cervical -X- _ O
cancer. -X- _ O
Given -X- _ O
the -X- _ O
substantial -X- _ O
cytotoxic -X- _ O
response -X- _ O
observed -X- _ O
, -X- _ O
further -X- _ O
investigation -X- _ O
into -X- _ O
the -X- _ O
active -X- _ O
compounds -X- _ O
and -X- _ O
mechanisms -X- _ O
of -X- _ O
action -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction -X- _ O
of -X- _ O
A. -X- _ O
incana -X- _ O
leaves -X- _ O
is -X- _ O
warranted. -X- _ O
To -X- _ O
explore -X- _ O
the -X- _ O
mechanisms -X- _ O
underlying -X- _ O
this -X- _ O
cytotoxicity -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
investigated -X- _ O
the -X- _ O
effects -X- _ O
of -X- _ O
A. -X- _ O
incana -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction -X- _ O
on -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
progression -X- _ O
and -X- _ O
apoptosis -X- _ O
in -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL_LINE
cells. -X- _ I-CELL_LINE
The -X- _ O
results -X- _ O
revealed -X- _ O
a -X- _ O
significant -X- _ O
accumulation -X- _ O
of -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
in -X- _ O
the -X- _ O
G0 -X- _ O
/ -X- _ O
G1 -X- _ O
phase -X- _ O
, -X- _ O
indicating -X- _ O
effective -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
arrest. -X- _ O
This -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
crucial -X- _ O
finding -X- _ O
science -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
arrest -X- _ O
at -X- _ O
key -X- _ O
checkpoints -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
well-established -X- _ O
therapeutic -X- _ O
strategy -X- _ O
for -X- _ O
inhibiting -X- _ O
cancer -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
proliferation. -X- _ O
The -X- _ O
mammalian -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
comprises -X- _ O
four -X- _ O
distinct -X- _ O
phases -X- _ O
: -X- _ O
G1 -X- _ O
, -X- _ O
S -X- _ O
, -X- _ O
G2 -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
M -X- _ O
, -X- _ O
where -X- _ O
RNA -X- _ O
and -X- _ O
protein -X- _ O
synthesis -X- _ O
occur -X- _ O
in -X- _ O
G1 -X- _ O
and -X- _ O
G2 -X- _ O
, -X- _ O
DNA -X- _ O
replication -X- _ O
in -X- _ O
S -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
chromosome -X- _ O
segregation -X- _ O
in -X- _ O
M -X- _ O
[ -X- _ O
18 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
By -X- _ O
halting -X- _ O
cells -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
G0 -X- _ O
/ -X- _ O
G1 -X- _ O
phase -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
A. -X- _ O
incana -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction -X- _ O
appears -X- _ O
to -X- _ O
block -X- _ O
progression -X- _ O
to -X- _ O
DNA -X- _ O
synthesis -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
could -X- _ O
lead -X- _ O
to -X- _ O
senescence -X- _ O
or -X- _ O
cell -X- _ O
death. -X- _ O
Several -X- _ O
plant-derived -X- _ O
anticancer -X- _ O
agents -X- _ O
, -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
taxanes -X- _ O
and -X- _ O
vinca -X- _ O
alkaloids -X- _ O
, -X- _ O
function -X- _ O
by -X- _ O
disrupting -X- _ O
key -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
regulators -X- _ O
[ -X- _ O
19 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
In -X- _ O
addition -X- _ O
to -X- _ O
inducing -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
arrest -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction -X- _ O
significantly -X- _ O
promoted -X- _ O
apoptosis -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
fundamental -X- _ O
mechanism -X- _ O
in -X- _ O
cancer -X- _ O
treatment. -X- _ O
Apoptosis -X- _ O
, -X- _ O
or -X- _ O
programmed -X- _ O
cell -X- _ O
death -X- _ O
, -X- _ O
is -X- _ O
triggered -X- _ O
by -X- _ O
many -X- _ O
natural -X- _ O
cytotoxic -X- _ O
agents -X- _ O
, -X- _ O
both -X- _ O
clinically -X- _ O
approved -X- _ O
and -X- _ O
experimental -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
is -X- _ O
essential -X- _ O
for -X- _ O
eliminating -X- _ O
cancer -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
[ -X- _ O
20 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Flow -X- _ O
cytometric -X- _ O
analysis -X- _ O
using -X- _ O
Annexin -X- _ O
V -X- _ O
and -X- _ O
propidium -X- _ O
iodide -X- _ O
staining -X- _ O
revealed -X- _ O
a -X- _ O
marked -X- _ O
increase -X- _ O
in -X- _ O
apoptotic -X- _ O
cell -X- _ O
death -X- _ O
( -X- _ O
40.67-fold -X- _ O
increase -X- _ O
, -X- _ O
18.71 -X- _ O
% -X- _ O
vs. -X- _ O
0.46 -X- _ O
% -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
control -X- _ O
) -X- _ O
induced -X- _ O
by -X- _ O
the -X- _ O
A. -X- _ O
incana -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction. -X- _ O
Early -X- _ O
apoptosis -X- _ O
rose -X- _ O
to -X- _ O
14.32 -X- _ O
% -X- _ O
from -X- _ O
0.37 -X- _ O
% -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
late -X- _ O
apoptosis -X- _ O
increased -X- _ O
to -X- _ O
4.39 -X- _ O
% -X- _ O
from -X- _ O
0.09 -X- _ O
% -X- _ O
. -X- _ O
Necrosis -X- _ O
also -X- _ O
increased -X- _ O
by -X- _ O
2.5-fold -X- _ O
( -X- _ O
2.84 -X- _ O
% -X- _ O
vs. -X- _ O
1.15 -X- _ O
% -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
control -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
indicating -X- _ O
a -X- _ O
broad -X- _ O
cytotoxic -X- _ O
effect -X- _ O
on -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL
cells. -X- _ B-CELL
These -X- _ O
findings -X- _ O
reinforce -X- _ O
the -X- _ O
potential -X- _ O
of -X- _ O
A. -X- _ O
incana -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction -X- _ O
as -X- _ O
an -X- _ O
effective -X- _ O
anticancer -X- _ O
agent -X- _ O
by -X- _ O
simultaneously -X- _ O
inducing -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
arrest -X- _ O
and -X- _ O
apoptosis. -X- _ O
To -X- _ O
elucidate -X- _ O
the -X- _ O
molecular -X- _ O
mechanisms -X- _ O
behind -X- _ O
these -X- _ O
effects -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
evaluated -X- _ O
the -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
apoptotic -X- _ O
regulators -X- _ O
, -X- _ O
including -X- _ O
p53 -X- _ O
, -X- _ O
Bcl-2 -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
Bax -X- _ O
, -X- _ O
through -X- _ O
RT-PCR. -X- _ O
The -X- _ O
intrinsic -X- _ O
apoptotic -X- _ O
pathway -X- _ O
is -X- _ O
regulated -X- _ O
by -X- _ O
the -X- _ O
balance -X- _ O
between -X- _ O
pro-apoptotic -X- _ O
Bax -X- _ O
and -X- _ O
anti-apoptotic -X- _ O
Bcl-2 -X- _ O
, -X- _ O
where -X- _ O
Bcl-2 -X- _ O
stabilizes -X- _ O
the -X- _ O
mitochondrial -X- _ O
membrane -X- _ O
and -X- _ O
prevents -X- _ O
cytochrome -X- _ O
c -X- _ O
release -X- _ O
, -X- _ O
whereas -X- _ O
Bax -X- _ O
promotes -X- _ O
apoptosis -X- _ O
by -X- _ O
facilitating -X- _ O
cytochrome -X- _ O
c -X- _ O
release -X- _ O
[ -X- _ O
21 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
p53 -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
critical -X- _ O
tumor -X- _ O
suppressor -X- _ O
, -X- _ O
enhances -X- _ O
Bax -X- _ O
expression -X- _ O
, -X- _ O
thus -X- _ O
its -X- _ O
stimulation -X- _ O
tipping -X- _ O
the -X- _ O
balance -X- _ O
towards -X- _ O
apoptosis -X- _ O
[ -X- _ O
22 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
In -X- _ O
our -X- _ O
study -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
A. -X- _ O
incana -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction -X- _ O
significantly -X- _ O
upregulated -X- _ O
Bax -X- _ O
and -X- _ O
p53 -X- _ O
while -X- _ O
downregulating -X- _ O
Bcl-2 -X- _ O
, -X- _ O
resulting -X- _ O
in -X- _ O
an -X- _ O
elevated -X- _ O
Bax -X- _ O
/ -X- _ O
Bcl-2 -X- _ O
ratio -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
key -X- _ O
indicator -X- _ O
of -X- _ O
apoptosis -X- _ O
activation. -X- _ O
Previous -X- _ O
research -X- _ O
reported -X- _ O
that -X- _ O
elevated -X- _ O
p53 -X- _ O
expression -X- _ O
and -X- _ O
a -X- _ O
higher -X- _ O
Bax -X- _ O
/ -X- _ O
Bcl-2 -X- _ O
ratio -X- _ O
correlate -X- _ O
with -X- _ O
increased -X- _ O
tumor -X- _ O
sensitivity -X- _ O
to -X- _ O
anticancer -X- _ O
therapies -X- _ O
[ -X- _ O
23 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
further -X- _ O
supporting -X- _ O
the -X- _ O
potential -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
A. -X- _ O
incana -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
therapeutic -X- _ O
agent. -X- _ O
Given -X- _ O
these -X- _ O
findings -X- _ O
, -X- _ O
it -X- _ O
is -X- _ O
essential -X- _ O
to -X- _ O
contextualize -X- _ O
the -X- _ O
anticancer -X- _ O
activity -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
A. -X- _ O
incana -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction -X- _ O
by -X- _ O
comparing -X- _ O
it -X- _ O
to -X- _ O
established -X- _ O
cervical -X- _ O
cancer -X- _ O
treatments -X- _ O
, -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
cisplatin -X- _ O
and -X- _ O
paclitaxel. -X- _ O
Cisplatin -X- _ O
exerts -X- _ O
its -X- _ O
cytotoxic -X- _ O
effects -X- _ O
primarily -X- _ O
through -X- _ O
DNA -X- _ O
cross-linking -X- _ O
, -X- _ O
causing -X- _ O
extensive -X- _ O
DNA -X- _ O
damage -X- _ O
that -X- _ O
leads -X- _ O
predominantly -X- _ O
to -X- _ O
G2 -X- _ O
/ -X- _ O
M -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
arrest -X- _ O
and -X- _ O
subsequent -X- _ O
apoptosis -X- _ O
induction -X- _ O
mainly -X- _ O
via -X- _ O
p53-dependent -X- _ O
pathways -X- _ O
[ -X- _ O
24 -X- _ O
, -X- _ O
25 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Despite -X- _ O
its -X- _ O
efficacy -X- _ O
, -X- _ O
cisplatin -X- _ O
is -X- _ O
often -X- _ O
limited -X- _ O
by -X- _ O
severe -X- _ O
adverse -X- _ O
effects -X- _ O
, -X- _ O
including -X- _ O
nephrotoxicity -X- _ O
, -X- _ O
neurotoxicity -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
drug -X- _ O
resistance -X- _ O
[ -X- _ O
25 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Paclitaxel -X- _ O
, -X- _ O
another -X- _ O
cornerstone -X- _ O
treatment -X- _ O
, -X- _ O
acts -X- _ O
by -X- _ O
stabilizing -X- _ O
microtubules -X- _ O
, -X- _ O
causing -X- _ O
prolonged -X- _ O
G2 -X- _ O
/ -X- _ O
M -X- _ O
mitotic -X- _ O
arrest -X- _ O
and -X- _ O
promoting -X- _ O
apoptosis -X- _ O
through -X- _ O
a -X- _ O
p53-independent -X- _ O
pathway -X- _ O
involving -X- _ O
cyclin -X- _ O
B1 -X- _ O
/ -X- _ O
CDC2 -X- _ O
activation -X- _ O
and -X- _ O
Bcl-2 -X- _ O
phosphorylation -X- _ O
[ -X- _ O
24 -X- _ O
, -X- _ O
26 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
paclitaxel -X- _ O
similarly -X- _ O
has -X- _ O
clinical -X- _ O
limitations -X- _ O
, -X- _ O
including -X- _ O
dose-dependent -X- _ O
toxicities -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
peripheral -X- _ O
neuropathy -X- _ O
and -X- _ O
myelosuppression -X- _ O
[ -X- _ O
27 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
In -X- _ O
contrast -X- _ O
, -X- _ O
our -X- _ O
findings -X- _ O
demonstrate -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
A. -X- _ O
incana -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction -X- _ O
distinctly -X- _ O
arrests -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
at -X- _ O
the -X- _ O
G0 -X- _ O
/ -X- _ O
G1 -X- _ O
phase -X- _ O
and -X- _ O
promotes -X- _ O
apoptosis -X- _ O
via -X- _ O
a -X- _ O
p53-dependent -X- _ O
pathway. -X- _ O
These -X- _ O
unique -X- _ O
molecular -X- _ O
characteristics -X- _ O
suggest -X- _ O
a -X- _ O
complementary -X- _ O
role -X- _ O
alongside -X- _ O
traditional -X- _ O
chemotherapeutics -X- _ O
, -X- _ O
potentially -X- _ O
reducing -X- _ O
toxicities -X- _ O
and -X- _ O
overcoming -X- _ O
drug -X- _ O
resistance -X- _ O
, -X- _ O
despite -X- _ O
its -X- _ O
relatively -X- _ O
high -X- _ O
IC50. -X- _ O
The -X- _ O
chemical -X- _ O
profile -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
A. -X- _ O
incana -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction -X- _ O
, -X- _ O
analyzed -X- _ O
via -X- _ O
GC-MS -X- _ O
/ -X- _ O
FID -X- _ O
detection -X- _ O
, -X- _ O
revealed -X- _ O
a -X- _ O
high -X- _ O
content -X- _ O
of -X- _ O
phytol -X- _ O
( -X- _ O
65.74 -X- _ O
% -X- _ O
) -X- _ O
in -X- _ O
unsaponifiable -X- _ O
matter -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
compound -X- _ O
known -X- _ O
for -X- _ O
its -X- _ O
broad-spectrum -X- _ O
biological -X- _ O
activities -X- _ O
, -X- _ O
particularly -X- _ O
in -X- _ O
cancer -X- _ O
therapy. -X- _ O
Phytol -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
diterpenoid -X- _ O
derived -X- _ O
from -X- _ O
chlorophyll -X- _ O
, -X- _ O
has -X- _ O
been -X- _ O
widely -X- _ O
recognized -X- _ O
for -X- _ O
its -X- _ O
anti-inflammatory -X- _ O
and -X- _ O
anticancer -X- _ O
properties -X- _ O
, -X- _ O
including -X- _ O
the -X- _ O
modulation -X- _ O
of -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
and -X- _ O
apoptosis -X- _ O
pathways -X- _ O
[ -X- _ O
28 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Previous -X- _ O
studies -X- _ O
have -X- _ O
demonstrated -X- _ O
its -X- _ O
ability -X- _ O
to -X- _ O
induce -X- _ O
apoptosis -X- _ O
across -X- _ O
various -X- _ O
cancer -X- _ B-CELL_LINE
cell -X- _ I-CELL_LINE
lines -X- _ I-CELL_LINE
, -X- _ O
including -X- _ O
lung -X- _ B-TISSUE
, -X- _ O
colon -X- _ B-TISSUE
, -X- _ O
and -X- _ O
breast -X- _ B-TISSUE
cancers -X- _ O
, -X- _ O
primarily -X- _ O
through -X- _ O
the -X- _ O
disruption -X- _ O
of -X- _ O
mitochondrial -X- _ O
membrane -X- _ O
potential -X- _ O
and -X- _ O
subsequent -X- _ O
activation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
intrinsic -X- _ O
apoptotic -X- _ O
pathway -X- _ O
[ -X- _ O
28 -X- _ O
, -X- _ O
29 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Our -X- _ O
findings -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
show -X- _ O
significant -X- _ O
G0 -X- _ O
/ -X- _ O
G1 -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
arrest -X- _ O
and -X- _ O
apoptosis -X- _ O
in -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
, -X- _ O
align -X- _ O
with -X- _ O
these -X- _ O
established -X- _ O
mechanisms -X- _ O
of -X- _ O
action -X- _ O
, -X- _ O
further -X- _ O
validating -X- _ O
phytol’s -X- _ O
role -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
potent -X- _ O
anticancer -X- _ O
agent. -X- _ O
In -X- _ O
addition -X- _ O
to -X- _ O
phytol -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
saponifiable -X- _ O
matter -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction -X- _ O
contained -X- _ O
palmitic -X- _ O
acid -X- _ O
( -X- _ O
31.27 -X- _ O
% -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
linolenic -X- _ O
acid -X- _ O
( -X- _ O
26.98 -X- _ O
% -X- _ O
) -X- _ O
as -X- _ O
the -X- _ O
major -X- _ O
components. -X- _ O
Both -X- _ O
fatty -X- _ O
acids -X- _ O
are -X- _ O
well-documented -X- _ O
for -X- _ O
their -X- _ O
apoptosis-inducing -X- _ O
capabilities. -X- _ O
Palmitic -X- _ O
acid -X- _ O
, -X- _ O
for -X- _ O
instance -X- _ O
, -X- _ O
has -X- _ O
been -X- _ O
reported -X- _ O
to -X- _ O
upregulate -X- _ O
pro-apoptotic -X- _ O
proteins -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
Bax -X- _ O
and -X- _ O
p53 -X- _ O
, -X- _ O
while -X- _ O
downregulating -X- _ O
anti-apoptotic -X- _ O
Bcl-2 -X- _ O
, -X- _ O
leading -X- _ O
to -X- _ O
enhanced -X- _ O
apoptosis -X- _ O
via -X- _ O
caspase -X- _ O
activation -X- _ O
in -X- _ O
colorectal -X- _ B-TISSUE
and -X- _ O
breast -X- _ B-TISSUE
cancer -X- _ O
models -X- _ O
[ -X- _ O
30 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Similarly -X- _ O
, -X- _ O
linolenic -X- _ O
acid -X- _ O
exerts -X- _ O
anticancer -X- _ O
effects -X- _ O
by -X- _ O
modulating -X- _ O
the -X- _ O
Bcl-2 -X- _ O
family -X- _ O
proteins -X- _ O
, -X- _ O
increasing -X- _ O
pro-apoptotic -X- _ O
Bax -X- _ O
expression -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
inducing -X- _ O
endoplasmic -X- _ O
reticulum -X- _ O
( -X- _ O
ER -X- _ O
) -X- _ O
stress -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
contributes -X- _ O
to -X- _ O
cancer -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
death. -X- _ O
Linolenic -X- _ O
acid -X- _ O
has -X- _ O
also -X- _ O
been -X- _ O
shown -X- _ O
to -X- _ O
inhibit -X- _ O
the -X- _ O
PI3K -X- _ O
/ -X- _ O
Akt -X- _ O
signaling -X- _ O
pathway -X- _ O
and -X- _ O
suppress -X- _ O
fatty -X- _ O
acid -X- _ O
synthase -X- _ O
( -X- _ O
FASN -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
an -X- _ O
enzyme -X- _ O
overexpressed -X- _ O
in -X- _ O
many -X- _ O
cancers -X- _ O
[ -X- _ O
31 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Our -X- _ O
study’s -X- _ O
findings -X- _ O
of -X- _ O
increased -X- _ O
Bax -X- _ O
expression -X- _ O
and -X- _ O
a -X- _ O
heightened -X- _ O
Bax -X- _ O
/ -X- _ O
Bcl-2 -X- _ O
ratio -X- _ O
in -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
are -X- _ O
consistent -X- _ O
with -X- _ O
these -X- _ O
mechanisms -X- _ O
, -X- _ O
suggesting -X- _ O
that -X- _ O
palmitic -X- _ O
and -X- _ O
linolenic -X- _ O
acids -X- _ O
likely -X- _ O
contribute -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
cytotoxic -X- _ O
effects -X- _ O
observed. -X- _ O
Despite -X- _ O
these -X- _ O
promising -X- _ O
results -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
study -X- _ O
possesses -X- _ O
limitations -X- _ O
typical -X- _ O
of -X- _ O
in -X- _ O
vitro -X- _ O
investigations. -X- _ O
Notably -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
biological -X- _ O
complexity -X- _ O
of -X- _ O
tumor -X- _ O
microenvironments -X- _ O
, -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
gene -X- _ O
expression -X- _ O
variability -X- _ O
, -X- _ O
signaling -X- _ O
heterogeneity -X- _ O
, -X- _ O
immune -X- _ O
interactions -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
stromal -X- _ O
influences -X- _ O
, -X- _ O
can -X- _ O
not -X- _ O
be -X- _ O
adequately -X- _ O
mimicked -X- _ O
using -X- _ O
isolated -X- _ O
cell -X- _ B-CELL_LINE
lines -X- _ I-CELL_LINE
like -X- _ O
HeLa. -X- _ B-CELL_LINE
Additionally -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
relatively -X- _ O
high -X- _ O
IC50 -X- _ O
necessitates -X- _ O
exploration -X- _ O
of -X- _ O
advanced -X- _ O
drug -X- _ O
delivery -X- _ O
systems -X- _ O
or -X- _ O
combination -X- _ O
therapies. -X- _ O
Future -X- _ O
research -X- _ O
should -X- _ O
incorporate -X- _ O
additional -X- _ O
cancer -X- _ B-CELL_LINE
cell -X- _ I-CELL_LINE
lines -X- _ I-CELL_LINE
, -X- _ O
normal -X- _ O
cell -X- _ O
toxicity -X- _ O
assessments -X- _ O
, -X- _ O
patient-derived -X- _ O
xenografts -X- _ O
( -X- _ O
PDX -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
innovative -X- _ O
delivery -X- _ O
strategies -X- _ O
, -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
nanoparticle -X- _ O
encapsulation -X- _ O
, -X- _ O
to -X- _ O
enhance -X- _ O
efficacy -X- _ O
, -X- _ O
reduce -X- _ O
toxicity -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
facilitate -X- _ O
clinical -X- _ O
translation. -X- _ O
These -X- _ O
steps -X- _ O
are -X- _ O
crucial -X- _ O
for -X- _ O
validating -X- _ O
the -X- _ O
preclinical -X- _ O
promise -X- _ O
and -X- _ O
advancing -X- _ O
the -X- _ O
clinical -X- _ O
applicability -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
Alnus -X- _ O
incana -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction. -X- _ O
Conclusion -X- _ O
This -X- _ O
study -X- _ O
demonstrates -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
A. -X- _ O
incana -X- _ O
DCM -X- _ O
fraction -X- _ O
, -X- _ O
rich -X- _ O
in -X- _ O
bioactive -X- _ O
compounds -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
phytol -X- _ O
, -X- _ O
palmitic -X- _ O
acid -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
linolenic -X- _ O
acid -X- _ O
, -X- _ O
exerts -X- _ O
notable -X- _ O
cytotoxic -X- _ O
effects -X- _ O
on -X- _ O
various -X- _ O
cancer -X- _ B-CELL_LINE
cell -X- _ I-CELL_LINE
lines -X- _ I-CELL_LINE
, -X- _ O
particularly -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL_LINE
cells. -X- _ I-CELL_LINE
These -X- _ O
effects -X- _ O
are -X- _ O
mediated -X- _ O
through -X- _ O
inducing -X- _ O
G0 -X- _ O
/ -X- _ O
G1 -X- _ O
cell -X- _ O
cycle -X- _ O
arrest -X- _ O
and -X- _ O
apoptosis -X- _ O
via -X- _ O
modulation -X- _ O
of -X- _ O
Bax -X- _ O
, -X- _ O
Bcl-2 -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
p53 -X- _ O
pathways. -X- _ O
Although -X- _ O
the -X- _ O
relatively -X- _ O
high -X- _ O
IC50 -X- _ O
value -X- _ O
( -X- _ O
135.6 -X- _ O
µg -X- _ O
/ -X- _ O
mL -X- _ O
) -X- _ O
limits -X- _ O
its -X- _ O
potential -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
standalone -X- _ O
therapy -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
fraction’s -X- _ O
selective -X- _ O
cytotoxicity -X- _ O
toward -X- _ O
cancer -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
suggests -X- _ O
a -X- _ O
potentially -X- _ O
favorable -X- _ O
safety -X- _ O
profile. -X- _ O
Its -X- _ O
unique -X- _ O
ability -X- _ O
to -X- _ O
activate -X- _ O
apoptotic -X- _ O
and -X- _ O
cell-cycle -X- _ O
arrest -X- _ O
pathways -X- _ O
supports -X- _ O
its -X- _ O
promise -X- _ O
as -X- _ O
an -X- _ O
adjunctive -X- _ O
therapy -X- _ O
, -X- _ O
particularly -X- _ O
in -X- _ O
combination -X- _ O
with -X- _ O
conventional -X- _ O
chemotherapeutic -X- _ O
agents -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
may -X- _ O
improve -X- _ O
treatment -X- _ O
outcomes -X- _ O
by -X- _ O
reducing -X- _ O
associated -X- _ O
toxicities -X- _ O
or -X- _ O
overcoming -X- _ O
resistance. -X- _ O
Further -X- _ O
in-depth -X- _ O
mechanistic -X- _ O
studies -X- _ O
, -X- _ O
along -X- _ O
with -X- _ O
rigorous -X- _ O
in -X- _ O
vivo -X- _ O
evaluations -X- _ O
using -X- _ O
clinically -X- _ O
relevant -X- _ O
models -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
patient-derived -X- _ O
xenografts -X- _ O
, -X- _ O
are -X- _ O
essential -X- _ O
to -X- _ O
validate -X- _ O
these -X- _ O
promising -X- _ O
findings -X- _ O
and -X- _ O
fully -X- _ O
realize -X- _ O
the -X- _ O
clinical -X- _ O
potential -X- _ O
of -X- _ O
this -X- _ O
natural -X- _ O
fraction. -X- _ O
Source -X- _ O
paper -X- _ O
: -X- _ O
PMC12105127 -X- _ O

Introduction -X- _ O
Hepatocellular -X- _ O
carcinoma -X- _ O
( -X- _ O
HCC -X- _ O
) -X- _ O
is -X- _ O
an -X- _ O
exceedingly -X- _ O
fatal -X- _ O
malignancies -X- _ O
, -X- _ O
with -X- _ O
mortalities -X- _ O
that -X- _ O
approximate -X- _ O
the -X- _ O
incidence -X- _ O
rates -X- _ O
worldwide -X- _ O
[ -X- _ O
1 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
HCC -X- _ O
is -X- _ O
usually -X- _ O
diagnosed -X- _ O
at -X- _ O
advanced -X- _ O
stages -X- _ O
owing -X- _ O
to -X- _ O
late -X- _ O
symptom -X- _ O
manifestations -X- _ O
with -X- _ O
limited -X- _ O
therapeutic -X- _ O
options -X- _ O
, -X- _ O
leading -X- _ O
to -X- _ O
ineffective -X- _ O
intervention -X- _ O
and -X- _ O
poor -X- _ O
prognosis -X- _ O
[ -X- _ O
2 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
An -X- _ O
increasing -X- _ O
number -X- _ O
of -X- _ O
studies -X- _ O
have -X- _ O
focused -X- _ O
on -X- _ O
the -X- _ O
progression -X- _ O
, -X- _ O
pathological -X- _ O
features -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
prognosis -X- _ O
of -X- _ O
liver -X- _ O
cancer -X- _ O
[ -X- _ O
3–5 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
HCC -X- _ O
epidemiology -X- _ O
is -X- _ O
rapidly -X- _ O
evolving -X- _ O
, -X- _ O
one -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
most -X- _ O
common -X- _ O
causes -X- _ O
is -X- _ O
non-alcoholic -X- _ O
fatty -X- _ O
liver -X- _ O
disease -X- _ O
[ -X- _ O
6 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
further -X- _ O
proving -X- _ O
that -X- _ O
lipid -X- _ O
metabolism -X- _ O
plays -X- _ O
a -X- _ O
crucial -X- _ O
role -X- _ O
in -X- _ O
HCC -X- _ O
occurrence. -X- _ O
Therefore -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
identification -X- _ O
of -X- _ O
novel -X- _ O
therapeutic -X- _ O
targets -X- _ O
is -X- _ O
urgently -X- _ O
needed -X- _ O
to -X- _ O
improve -X- _ O
the -X- _ O
treatment -X- _ O
of -X- _ O
patients -X- _ O
with -X- _ O
HCC -X- _ O
[ -X- _ O
7 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Phosphatidylethanolamine -X- _ O
( -X- _ O
PE -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
also -X- _ O
known -X- _ O
as -X- _ O
cephalin -X- _ O
, -X- _ O
is -X- _ O
the -X- _ O
most -X- _ O
abundant -X- _ O
lipid -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
cytoplasmic -X- _ O
layer -X- _ O
of -X- _ O
cell -X- _ B-CELL_COMPONENT
membranes -X- _ I-CELL_COMPONENT
and -X- _ O
is -X- _ O
involved -X- _ O
in -X- _ O
cellular -X- _ O
processes -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
membrane -X- _ O
fusion -X- _ O
[ -X- _ O
8 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
autophagy -X- _ O
and -X- _ O
apoptosis -X- _ O
[ -X- _ O
9–11 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
For -X- _ O
eukaryotic -X- _ O
PE -X- _ O
in -X- _ O
vivo -X- _ O
, -X- _ O
two -X- _ O
main -X- _ O
synthetic -X- _ O
pathways -X- _ O
exist -X- _ O
[ -X- _ O
12 -X- _ O
] -X- _ O
: -X- _ O
including -X- _ O
the -X- _ O
Kennedy -X- _ O
pathway -X- _ O
of -X- _ O
CDP-ethanolamine -X- _ O
( -X- _ O
CDP-Etn -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
mitochondrial -X- _ O
phosphatidylserine -X- _ O
decarboxylation -X- _ O
pathway -X- _ O
[ -X- _ O
13 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Phosphatidylethanolamine -X- _ O
cytidyltransferase -X- _ O
2 -X- _ O
( -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
) -X- _ O
is -X- _ O
the -X- _ O
rate-limiting -X- _ O
enzyme -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
CDP-Etn -X- _ O
pathway. -X- _ O
Previous -X- _ O
studies -X- _ O
have -X- _ O
shown -X- _ O
that -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
is -X- _ O
highly -X- _ O
specific -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
is -X- _ O
present -X- _ O
only -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
rough -X- _ B-CELL_COMPONENT
endoplasmic -X- _ I-CELL_COMPONENT
reticulum -X- _ I-CELL_COMPONENT
of -X- _ O
eukaryotes -X- _ O
[ -X- _ O
14 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
P-Eth -X- _ O
is -X- _ O
then -X- _ O
catalyzed -X- _ O
by -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
to -X- _ O
form -X- _ O
CDP-Etn -X- _ O
, -X- _ O
leading -X- _ O
to -X- _ O
PE -X- _ O
synthesis -X- _ O
[ -X- _ O
15 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Generally -X- _ O
, -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
expression -X- _ O
is -X- _ O
reduced -X- _ O
in -X- _ O
various -X- _ O
epithelial-derived -X- _ O
cancer -X- _ B-CELL_LINE
cell -X- _ I-CELL_LINE
lines -X- _ I-CELL_LINE
compared -X- _ O
to -X- _ O
normal -X- _ B-CELL_CONTEXT
cells -X- _ B-CELL
[ -X- _ O
16,17 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Compared -X- _ O
epithelial-derived -X- _ O
cancer -X- _ B-CELL_LINE
cell -X- _ I-CELL_LINE
lines -X- _ I-CELL_LINE
PCYT2 -X- _ O
activity -X- _ O
with -X- _ O
that -X- _ O
of -X- _ O
breast -X- _ B-CELL_LINE
epithelial -X- _ I-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
MCF-10A -X- _ B-CELL_LINE
showed -X- _ O
that -X- _ O
its -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
activity -X- _ O
was -X- _ O
inhibited -X- _ O
in -X- _ O
breast -X- _ B-CELL_LINE
cancer -X- _ I-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
( -X- _ O
MCF-7 -X- _ B-CELL_LINE
) -X- _ O
[ -X- _ O
16 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
expression -X- _ O
was -X- _ O
significantly -X- _ O
reduced -X- _ O
in -X- _ O
invasive -X- _ O
human -X- _ O
metastatic -X- _ O
colon -X- _ B-CELL_LINE
cancer -X- _ I-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
compared -X- _ O
to -X- _ O
that -X- _ O
in -X- _ O
primary -X- _ B-CELL_LINE
tumor -X- _ I-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
[ -X- _ O
17 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
previous -X- _ O
studies -X- _ O
have -X- _ O
shown -X- _ O
that -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
knockdown -X- _ O
under -X- _ O
nutrient-rich -X- _ O
conditions -X- _ O
significantly -X- _ O
facilitated -X- _ O
the -X- _ O
proliferation -X- _ O
of -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL_LINE
and -X- _ O
T98G -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
and -X- _ O
promoted -X- _ O
in -X- _ O
vivo -X- _ O
tumor -X- _ O
growth. -X- _ O
The -X- _ O
inhibition -X- _ O
of -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
increases -X- _ O
P-Etn -X- _ O
levels -X- _ O
in -X- _ O
cancer -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
and -X- _ O
stimulates -X- _ O
tumor -X- _ O
growth -X- _ O
[ -X- _ O
18 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
in -X- _ O
organoid -X- _ O
models -X- _ O
, -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
knockdown -X- _ O
inhibits -X- _ O
cell -X- _ O
growth -X- _ O
[ -X- _ O
19 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Despite -X- _ O
these -X- _ O
findings -X- _ O
, -X- _ O
no -X- _ O
evidence -X- _ O
exists -X- _ O
that -X- _ O
suggests -X- _ O
that -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
expression -X- _ O
is -X- _ O
associated -X- _ O
with -X- _ O
HCC -X- _ O
occurrence -X- _ O
and -X- _ O
development. -X- _ O
This -X- _ O
study -X- _ O
aimed -X- _ O
to -X- _ O
investigate -X- _ O
the -X- _ O
role -X- _ O
of -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
in -X- _ O
human -X- _ O
hepatocellular -X- _ B-CELL_LINE
carcinoma -X- _ I-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
( -X- _ O
HepG2 -X- _ B-CELL_LINE
) -X- _ O
by -X- _ O
inhibiting -X- _ O
their -X- _ O
proliferation -X- _ O
, -X- _ O
invasion -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
migration -X- _ O
abilities -X- _ O
and -X- _ O
promoting -X- _ O
cell -X- _ O
apoptosis. -X- _ O
Materials -X- _ O
and -X- _ O
methods -X- _ O
Cell -X- _ O
viability -X- _ O
analysis -X- _ O
HepG2 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
were -X- _ O
seeded -X- _ O
into -X- _ O
96-well -X- _ O
plates -X- _ O
and -X- _ O
incubated -X- _ O
with -X- _ O
a -X- _ O
Cell -X- _ O
Counting -X- _ O
kit -X- _ O
( -X- _ O
CCK-8 -X- _ O
) -X- _ O
solution -X- _ O
for -X- _ O
40 -X- _ O
min -X- _ O
at -X- _ O
37°C. -X- _ O
Absorbance -X- _ O
was -X- _ O
measured -X- _ O
at -X- _ O
450 -X- _ O
nm -X- _ O
using -X- _ O
a -X- _ O
Spectra -X- _ O
MAX -X- _ O
M5 -X- _ O
microplate -X- _ O
spectrophotometer -X- _ O
to -X- _ O
detect -X- _ O
cell -X- _ O
viability. -X- _ O
Invasion -X- _ O
experiment -X- _ O
Dilute -X- _ O
the -X- _ O
Matrigel -X- _ O
with -X- _ O
basal -X- _ O
medium -X- _ O
( -X- _ O
1:8 -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
lay -X- _ O
it -X- _ O
flat -X- _ O
on -X- _ O
a -X- _ O
Transwell -X- _ O
membrane -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
incubate -X- _ O
at -X- _ O
37°C -X- _ O
for -X- _ O
4 -X- _ O
h. -X- _ O
The -X- _ O
subsequent -X- _ O
experimental -X- _ O
steps -X- _ O
were -X- _ O
identical -X- _ O
to -X- _ O
those -X- _ O
used -X- _ O
for -X- _ O
the -X- _ O
migration -X- _ O
assay -X- _ O
, -X- _ O
including -X- _ O
cell -X- _ O
culture -X- _ O
, -X- _ O
paraformaldehyde -X- _ O
fixation -X- _ O
and -X- _ O
0.1 -X- _ O
% -X- _ O
crystal -X- _ O
violet -X- _ O
staining. -X- _ O
Animal -X- _ O
experiments -X- _ O
Five-week-old -X- _ O
BALB -X- _ O
/ -X- _ O
c -X- _ O
female -X- _ O
nude -X- _ O
mice -X- _ O
were -X- _ O
purchased -X- _ O
from -X- _ O
Jiangsu -X- _ O
Jicui -X- _ O
Pharmaceutical -X- _ O
Biotechnology -X- _ O
Co -X- _ O
, -X- _ O
passed -X- _ O
SPF -X- _ O
level -X- _ O
training -X- _ O
and -X- _ O
assessment -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
were -X- _ O
routinely -X- _ O
reared -X- _ O
using -X- _ O
standard -X- _ O
SPF -X- _ O
conditions. -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
overexpressed -X- _ O
HepG2 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
and -X- _ O
control -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
were -X- _ O
subcutaneously -X- _ O
injected -X- _ O
into -X- _ O
the -X- _ O
left -X- _ O
and -X- _ O
right -X- _ O
sides -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
nude -X- _ O
mice -X- _ O
( -X- _ O
approximately -X- _ O
1 -X- _ O
× -X- _ O
107 -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
on -X- _ O
each -X- _ O
side -X- _ O
, -X- _ O
n -X- _ O
= -X- _ O
6 -X- _ O
tumors -X- _ O
in -X- _ O
each -X- _ O
group -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Following -X- _ O
20–25 -X- _ O
d -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
tumors -X- _ O
achieved -X- _ O
a -X- _ O
certain -X- _ O
size -X- _ O
and -X- _ O
the -X- _ O
micewere -X- _ O
anesthetized -X- _ O
with -X- _ O
isopentane -X- _ O
and -X- _ O
sacrificed -X- _ O
; -X- _ O
the -X- _ O
tumors -X- _ O
were -X- _ O
collected -X- _ O
for -X- _ O
follow-up -X- _ O
evaluation. -X- _ O
The -X- _ O
animal -X- _ O
experiments -X- _ O
were -X- _ O
approved -X- _ O
by -X- _ O
the -X- _ O
Animal -X- _ O
Ethics -X- _ O
Committee -X- _ O
of -X- _ O
Anhui -X- _ O
Medical -X- _ O
University -X- _ O
and -X- _ O
conducted -X- _ O
in -X- _ O
accordance -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
guidelines -X- _ O
for -X- _ O
the -X- _ O
care -X- _ O
and -X- _ O
use -X- _ O
of -X- _ O
laboratory -X- _ O
animals. -X- _ O
Statistical -X- _ O
analysis -X- _ O
Data -X- _ O
were -X- _ O
analyzed -X- _ O
using -X- _ O
GraphPad -X- _ O
Prism -X- _ O
software -X- _ O
( -X- _ O
version -X- _ O
8.0 -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
the -X- _ O
results -X- _ O
were -X- _ O
expressed -X- _ O
as -X- _ O
mean -X- _ O
± -X- _ O
standard -X- _ O
deviation -X- _ O
( -X- _ O
SD -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
T-test -X- _ O
was -X- _ O
performed -X- _ O
to -X- _ O
determine -X- _ O
the -X- _ O
significant -X- _ O
of -X- _ O
differences -X- _ O
between -X- _ O
two -X- _ O
groups. -X- _ O
A -X- _ O
one-way -X- _ O
analysis -X- _ O
of -X- _ O
variance -X- _ O
was -X- _ O
used -X- _ O
for -X- _ O
comparison -X- _ O
across -X- _ O
groups. -X- _ O
Statistical -X- _ O
significance -X- _ O
was -X- _ O
set -X- _ O
at -X- _ O
P -X- _ O
***Results*** -X- _ O
Discussion -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
rate-limiting -X- _ O
enzyme -X- _ O
in -X- _ O
PE -X- _ O
synthesis -X- _ O
that -X- _ O
is -X- _ O
commonly -X- _ O
used -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
study -X- _ O
of -X- _ O
obesity-related -X- _ O
diseases -X- _ O
, -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
non-alcoholic -X- _ O
fatty -X- _ O
liver -X- _ O
disease -X- _ O
and -X- _ O
type -X- _ O
2 -X- _ O
diabetes -X- _ O
[ -X- _ O
12,20–22 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Recently -X- _ O
, -X- _ O
interest -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
role -X- _ O
of -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
in -X- _ O
cancer -X- _ O
has -X- _ O
been -X- _ O
growing -X- _ O
[ -X- _ O
18,23,24 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Previous -X- _ O
studies -X- _ O
show -X- _ O
that -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
has -X- _ O
different -X- _ O
roles -X- _ O
in -X- _ O
various -X- _ O
cancers -X- _ O
and -X- _ O
cancer -X- _ O
settings. -X- _ O
For -X- _ O
instance -X- _ O
, -X- _ O
in -X- _ O
metastatic -X- _ O
colorectal -X- _ O
cancer -X- _ O
( -X- _ O
CRC -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
is -X- _ O
significantly -X- _ O
downregulated -X- _ O
and -X- _ O
functions -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
tumor -X- _ O
metastasis -X- _ O
inhibitor -X- _ O
[ -X- _ O
25 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
In -X- _ O
human -X- _ O
breast -X- _ B-CELL_LINE
cancer -X- _ I-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
( -X- _ O
MCF-7 -X- _ B-CELL_LINE
) -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
level -X- _ O
of -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
in -X- _ O
cancer -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
is -X- _ O
elevated -X- _ O
in -X- _ O
response -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
stressful -X- _ O
environment -X- _ O
[ -X- _ O
26 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Our -X- _ O
findings -X- _ O
show -X- _ O
that -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
expression -X- _ O
is -X- _ O
abnormally -X- _ O
downregulated -X- _ O
in -X- _ O
HepG2 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
, -X- _ O
which -X- _ O
is -X- _ O
consistent -X- _ O
with -X- _ O
that -X- _ O
of -X- _ O
previous -X- _ O
studies -X- _ O
where -X- _ O
in -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
expression -X- _ O
was -X- _ O
downregulated -X- _ O
in -X- _ O
MCF-7 -X- _ B-CELL_LINE
and -X- _ O
invasive -X- _ O
human -X- _ O
metastatic -X- _ O
CRC -X- _ O
[ -X- _ O
16,17 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Although -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
regulates -X- _ O
several -X- _ O
human -X- _ O
cancers -X- _ O
[ -X- _ O
18,19,23 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
its -X- _ O
role -X- _ O
in -X- _ O
HCC -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
remains -X- _ O
unknown. -X- _ O
Based -X- _ O
on -X- _ O
the -X- _ O
literature -X- _ O
and -X- _ O
our -X- _ O
findings -X- _ O
, -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
in -X- _ O
human -X- _ O
cancers -X- _ O
appears -X- _ O
to -X- _ O
have -X- _ O
a -X- _ O
consistent -X- _ O
expression -X- _ O
profile -X- _ O
in -X- _ O
human -X- _ O
cancers -X- _ O
, -X- _ O
irrespective -X- _ O
of -X- _ O
tumor -X- _ O
origin -X- _ O
or -X- _ O
location -X- _ O
[ -X- _ O
27 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Regarding -X- _ O
the -X- _ O
mechanism -X- _ O
whereby -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
influences -X- _ O
cancer -X- _ O
development -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
previous -X- _ O
report -X- _ O
showed -X- _ O
that -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
downregulation-induced -X- _ O
phosphoethanolamine -X- _ O
( -X- _ O
PEtn -X- _ O
) -X- _ O
accumulation -X- _ O
correlated -X- _ O
with -X- _ O
tumor -X- _ O
growth -X- _ O
under -X- _ O
nutrient -X- _ O
starvation -X- _ O
, -X- _ O
thereby -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
overexpression -X- _ O
reduced -X- _ O
PEtn -X- _ O
levels -X- _ O
and -X- _ O
tumor -X- _ O
growth -X- _ O
[ -X- _ O
18 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
present -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
found -X- _ O
that -X- _ O
CDP-Etn -X- _ O
supplementation -X- _ O
inhibited -X- _ O
HCC -X- _ O
migration -X- _ O
, -X- _ O
invasion -X- _ O
and -X- _ O
proliferation. -X- _ O
In -X- _ O
our -X- _ O
previous -X- _ O
study -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
showed -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
levels -X- _ O
of -X- _ O
BAX -X- _ O
and -X- _ O
cleaved -X- _ O
caspase-3 -X- _ O
were -X- _ O
significantly -X- _ O
increased -X- _ O
whereas -X- _ O
Bcl-2 -X- _ O
was -X- _ O
significantly -X- _ O
reduced -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
livers -X- _ O
of -X- _ O
type -X- _ O
2 -X- _ O
diabetic -X- _ O
mice -X- _ O
and -X- _ O
L02 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
after -X- _ O
stimulation -X- _ O
with -X- _ O
high -X- _ O
glucose -X- _ O
and -X- _ O
free -X- _ O
fatty -X- _ O
acids -X- _ O
( -X- _ O
HG -X- _ O
& -X- _ O
FFA -X- _ O
) -X- _ O
( -X- _ O
12 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
CDP-Etn -X- _ O
( -X- _ O
100 -X- _ O
μM -X- _ O
) -X- _ O
protected -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
from -X- _ O
HG -X- _ O
& -X- _ O
FFA-induced -X- _ O
apoptosis -X- _ O
by -X- _ O
reducing -X- _ O
BAX -X- _ O
and -X- _ O
cleaved -X- _ O
caspase-3 -X- _ O
levels -X- _ O
as -X- _ O
well -X- _ O
as -X- _ O
and -X- _ O
increasing -X- _ O
Bcl-2 -X- _ O
levels -X- _ O
[ -X- _ O
12 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Whether -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
downregulation -X- _ O
induced -X- _ O
PEtn -X- _ O
accumulation -X- _ O
contributes -X- _ O
to -X- _ O
HCC -X- _ O
development -X- _ O
further -X- _ O
study. -X- _ O
Increasing -X- _ O
evidence -X- _ O
suggests -X- _ O
that -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
is -X- _ O
aberrantly -X- _ O
expressed -X- _ O
in -X- _ O
various -X- _ O
models -X- _ O
of -X- _ O
liver -X- _ O
disease -X- _ O
and -X- _ O
may -X- _ O
predict -X- _ O
clinical -X- _ O
outcomes -X- _ O
in -X- _ O
patients. -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
is -X- _ O
instrumental -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
deregulation -X- _ O
of -X- _ O
these -X- _ O
processes -X- _ O
leading -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
development -X- _ O
of -X- _ O
obesity -X- _ O
, -X- _ O
insulin -X- _ O
resistance -X- _ O
, -X- _ O
liver -X- _ O
steatosis -X- _ O
and -X- _ O
dyslipidemia -X- _ O
[ -X- _ O
28 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
CDP-Etn -X- _ O
supplementation -X- _ O
has -X- _ O
been -X- _ O
reported -X- _ O
to -X- _ O
alleviate -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
deficiency -X- _ O
engendering -X- _ O
age-dependent -X- _ O
and -X- _ O
insulin-resistant -X- _ O
non-alcoholic -X- _ O
steatohepatitis -X- _ O
to -X- _ O
improve -X- _ O
patient -X- _ O
prognosis -X- _ O
[ -X- _ O
20,29–31 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Chronic -X- _ O
administration -X- _ O
of -X- _ O
peroxisome -X- _ O
proliferators -X- _ O
can -X- _ O
increase -X- _ O
the -X- _ O
content -X- _ O
of -X- _ O
hepatic -X- _ O
PC -X- _ O
and -X- _ O
PE -X- _ O
for -X- _ O
hepatomegaly -X- _ O
and -X- _ O
proliferation -X- _ O
as -X- _ O
well -X- _ O
as -X- _ O
cause -X- _ O
liver -X- _ O
cancer -X- _ O
in -X- _ O
rodents -X- _ O
[ -X- _ O
32,33 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Based -X- _ O
on -X- _ O
the -X- _ O
current -X- _ O
studies -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
hypothesized -X- _ O
that -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
may -X- _ O
be -X- _ O
involved -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
regulation -X- _ O
of -X- _ O
cellular -X- _ O
processes -X- _ O
in -X- _ O
HCC. -X- _ O
Therefore -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
utilized -X- _ O
in -X- _ O
vivo -X- _ O
and -X- _ O
in -X- _ O
vitro -X- _ O
validation -X- _ O
methods -X- _ O
to -X- _ O
assess -X- _ O
the -X- _ O
expression -X- _ O
and -X- _ O
mechanistic -X- _ O
roles -X- _ O
of -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
in -X- _ O
liver -X- _ B-CELL
cancer -X- _ I-CELL
cells. -X- _ I-CELL
Herein -X- _ O
, -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
overexpression -X- _ O
was -X- _ O
determined -X- _ O
to -X- _ O
inhibit -X- _ O
HCC -X- _ O
cell -X- _ O
proliferation -X- _ O
, -X- _ O
migration -X- _ O
and -X- _ O
invasion -X- _ O
both -X- _ O
in -X- _ O
vitro -X- _ O
and -X- _ O
in -X- _ O
vivo. -X- _ O
And -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
number -X- _ O
and -X- _ O
morphology -X- _ O
of -X- _ O
mitochondria -X- _ B-CELL_COMPONENT
in -X- _ O
HCC -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
overexpressing -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
were -X- _ O
significantly -X- _ O
different -X- _ O
from -X- _ O
those -X- _ O
in -X- _ O
HCC -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
without -X- _ O
any -X- _ O
treatment -X- _ O
, -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
decrease -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
number -X- _ O
of -X- _ O
mitochondria -X- _ B-CELL_COMPONENT
and -X- _ O
swelling -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
mitochondria. -X- _ B-CELL_COMPONENT
These -X- _ O
changes -X- _ O
suggest -X- _ O
that -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
affects -X- _ O
the -X- _ O
mitochondrial -X- _ O
function -X- _ O
of -X- _ O
cells. -X- _ B-CELL
Notably -X- _ O
, -X- _ O
when -X- _ O
the -X- _ O
HepG2 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
received -X- _ O
CDP-Etn -X- _ O
supplementation -X- _ O
, -X- _ O
their -X- _ O
proliferation -X- _ O
, -X- _ O
migration -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
invasion -X- _ O
were -X- _ O
inhibited -X- _ O
in -X- _ O
vitro. -X- _ O
Notably -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
ATP -X- _ O
level -X- _ O
decreased -X- _ O
in -X- _ O
HCC -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
following -X- _ O
the -X- _ O
overexpression -X- _ O
of -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
the -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
were -X- _ O
found -X- _ O
to -X- _ O
be -X- _ O
accompanied -X- _ O
by -X- _ O
mitochondrial -X- _ O
damage -X- _ O
using -X- _ O
transmission -X- _ O
electron -X- _ O
microscopy. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
previous -X- _ O
reports -X- _ O
have -X- _ O
indicated -X- _ O
that -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
is -X- _ O
present -X- _ O
only -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
endoplasmic -X- _ B-CELL_COMPONENT
reticulum -X- _ I-CELL_COMPONENT
of -X- _ O
hepatocytes -X- _ B-CELL
[ -X- _ O
14,34 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Additionally -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
phenotype -X- _ O
of -X- _ O
liver -X- _ O
PCYT2- -X- _ O
/ -X- _ O
- -X- _ O
knockout -X- _ O
mice -X- _ O
showed -X- _ O
no -X- _ O
signs -X- _ O
of -X- _ O
liver -X- _ O
injury -X- _ O
, -X- _ O
however -X- _ O
, -X- _ O
they -X- _ O
experienced -X- _ O
massive -X- _ O
accumulation -X- _ O
of -X- _ O
liver -X- _ O
triglycerides -X- _ O
( -X- _ O
TAG -X- _ O
) -X- _ O
[ -X- _ O
35 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Therefore -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
hypothesized -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
influence -X- _ O
of -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
on -X- _ O
mitochondrial -X- _ O
function -X- _ O
is -X- _ O
mediated -X- _ O
by -X- _ O
metabolites -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
TAG -X- _ O
, -X- _ O
DAG -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
PE. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
further -X- _ O
studies -X- _ O
are -X- _ O
needed -X- _ O
to -X- _ O
clarify -X- _ O
whether -X- _ O
the -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
exerted -X- _ O
inhibition -X- _ O
of -X- _ O
HCC -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
alleviates -X- _ O
mitochondrial -X- _ O
damage. -X- _ O
As -X- _ O
understanding -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
mechanism -X- _ O
whereby -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
overexpression -X- _ O
causes -X- _ O
mitochondrial -X- _ O
damage -X- _ O
will -X- _ O
deepen -X- _ O
our -X- _ O
understanding -X- _ O
of -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
regulation -X- _ O
in -X- _ O
HCC -X- _ B-CELL
cells. -X- _ I-CELL
In -X- _ O
conclusion -X- _ O
, -X- _ O
this -X- _ O
study -X- _ O
provided -X- _ O
compelling -X- _ O
data -X- _ O
demonstrating -X- _ O
the -X- _ O
aberrant -X- _ O
expression -X- _ O
and -X- _ O
functional -X- _ O
role -X- _ O
of -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
in -X- _ O
HepG2 -X- _ B-CELL_LINE
cells. -X- _ I-CELL_LINE
PCYT2 -X- _ O
expression -X- _ O
levels -X- _ O
were -X- _ O
lower -X- _ O
in -X- _ O
HepG2 -X- _ B-CELL_LINE
than -X- _ O
in -X- _ O
L02. -X- _ B-CELL_LINE
Furthermore -X- _ O
, -X- _ O
PCYT2 -X- _ O
overexpression -X- _ O
in -X- _ O
HepG2 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
induced -X- _ O
mitochondrial -X- _ O
damage -X- _ O
; -X- _ O
inhibited -X- _ O
proliferation -X- _ O
, -X- _ O
invasion -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
migration -X- _ O
; -X- _ O
and -X- _ O
promoted -X- _ O
cell -X- _ O
apoptosis. -X- _ O
Source -X- _ O
paper -X- _ O
: -X- _ O
PMC12118871 -X- _ O

Results -X- _ O
IFN-γ -X- _ O
significantly -X- _ O
induced -X- _ O
STAT1 -X- _ O
phosphorylation -X- _ O
, -X- _ O
leading -X- _ O
to -X- _ O
a -X- _ O
time-dependent -X- _ O
upregulation -X- _ O
of -X- _ O
PD-L1 -X- _ O
expression. -X- _ O
Immunofluorescence -X- _ O
confirmed -X- _ O
that -X- _ O
p-STAT1 -X- _ O
is -X- _ O
translocated -X- _ O
to -X- _ O
nucleus. -X- _ O
Curcumin -X- _ O
treatment -X- _ O
inhibited -X- _ O
STAT1 -X- _ O
phosphorylation -X- _ O
by -X- _ O
68 -X- _ O
% -X- _ O
( -X- _ O
p -X- _ O
p -X- _ O
***Conclusion*** -X- _ O
Curcumin -X- _ O
effectively -X- _ O
inhibits -X- _ O
IFN-γ-induced -X- _ O
STAT1 -X- _ O
phosphorylation -X- _ O
and -X- _ O
PD-L1 -X- _ O
expression -X- _ O
, -X- _ O
downregulates -X- _ O
ISGs -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
enhances -X- _ O
IFN-γ-mediated -X- _ O
tumor -X- _ O
suppression. -X- _ O
These -X- _ O
findings -X- _ O
suggest -X- _ O
that -X- _ O
curcumin -X- _ O
may -X- _ O
serve -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
therapeutic -X- _ O
adjuvant -X- _ O
in -X- _ O
NSCLC -X- _ B-CELL
, -X- _ O
potentially -X- _ O
improving -X- _ O
immune -X- _ O
checkpoint -X- _ O
inhibitor -X- _ O
( -X- _ O
ICI -X- _ O
) -X- _ O
efficacy. -X- _ O
Material -X- _ O
and -X- _ O
methods -X- _ O
Western -X- _ O
blot -X- _ O
analysis -X- _ O
Total -X- _ O
protein -X- _ O
lysates -X- _ O
were -X- _ O
extracted -X- _ O
from -X- _ O
treated -X- _ O
A549 -X- _ B-CELL
cells -X- _ B-CELL
using -X- _ O
ice-cold -X- _ O
radioimmunoprecipitation -X- _ O
assay -X- _ O
( -X- _ O
RIPA -X- _ O
) -X- _ O
buffer -X- _ O
supplemented -X- _ O
with -X- _ O
protease -X- _ O
and -X- _ O
phosphatase -X- _ O
inhibitors -X- _ O
and -X- _ O
centrifuged -X- _ O
at -X- _ O
10,000 -X- _ O
× -X- _ O
g -X- _ O
for -X- _ O
10 -X- _ O
min -X- _ O
at -X- _ O
4◦C. -X- _ O
The -X- _ O
total -X- _ O
protein -X- _ O
concentrations -X- _ O
were -X- _ O
measured -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
bicinchoninic -X- _ O
acid -X- _ O
( -X- _ O
BCA -X- _ O
) -X- _ O
protein -X- _ O
assay -X- _ O
kit -X- _ O
( -X- _ O
Pierce -X- _ O
, -X- _ O
Thermo -X- _ O
Fisher -X- _ O
Scientific -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Equal -X- _ O
amounts -X- _ O
of -X- _ O
protein -X- _ O
( -X- _ O
20 -X- _ O
μg -X- _ O
per -X- _ O
sample -X- _ O
) -X- _ O
were -X- _ O
separated -X- _ O
on -X- _ O
10 -X- _ O
% -X- _ O
sodium -X- _ O
dodecyl -X- _ O
sulfate–polyacrylamide -X- _ O
gels -X- _ O
( -X- _ O
SDS-PAGE -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
transferred -X- _ O
onto -X- _ O
0.45 -X- _ O
μM -X- _ O
nitrocellulose -X- _ O
membranes -X- _ O
( -X- _ O
Merck -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Membranes -X- _ O
were -X- _ O
blocked -X- _ O
with -X- _ O
5 -X- _ O
% -X- _ O
BSA -X- _ O
in -X- _ O
Tris-buffered -X- _ O
saline -X- _ O
with -X- _ O
0.1 -X- _ O
% -X- _ O
Tween- -X- _ O
20 -X- _ O
( -X- _ O
TBST -X- _ O
) -X- _ O
for -X- _ O
1 -X- _ O
h -X- _ O
at -X- _ O
room -X- _ O
temperature -X- _ O
to -X- _ O
prevent -X- _ O
non-specific -X- _ O
binding -X- _ O
and -X- _ O
incubated -X- _ O
overnight -X- _ O
at -X- _ O
4 -X- _ O
°C -X- _ O
with -X- _ O
primary -X- _ O
antibodies -X- _ O
against -X- _ O
phospho-STAT1 -X- _ O
( -X- _ O
Tyr701 -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
total -X- _ O
STAT1 -X- _ O
, -X- _ O
PD-L1 -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
β-actin -X- _ O
( -X- _ O
Santa -X- _ O
Cruz -X- _ O
Biotechnology -X- _ O
, -X- _ O
Dallas -X- _ O
, -X- _ O
TX -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
After -X- _ O
washing -X- _ O
with -X- _ O
TBST -X- _ O
, -X- _ O
membranes -X- _ O
were -X- _ O
incubated -X- _ O
with -X- _ O
horseradish -X- _ O
peroxidase -X- _ O
( -X- _ O
HRP -X- _ O
) -X- _ O
-conjugated -X- _ O
secondary -X- _ O
anti-mouse -X- _ O
IgG -X- _ O
antibody -X- _ O
or -X- _ O
anti-rabbit -X- _ O
IgG -X- _ O
, -X- _ O
HRP-linked -X- _ O
antibody -X- _ O
, -X- _ O
for -X- _ O
1 -X- _ O
h -X- _ O
at -X- _ O
room -X- _ O
temperature. -X- _ O
Protein -X- _ O
bands -X- _ O
were -X- _ O
detected -X- _ O
using -X- _ O
enhanced -X- _ O
chemiluminescence -X- _ O
( -X- _ O
ECL -X- _ O
) -X- _ O
reagent -X- _ O
( -X- _ O
GE -X- _ O
Healthcare -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
visualized -X- _ O
using -X- _ O
a -X- _ O
ChemiDoc -X- _ O
imaging -X- _ O
system -X- _ O
( -X- _ O
Bio-Rad -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Analysis -X- _ O
of -X- _ O
protein -X- _ O
bands -X- _ O
was -X- _ O
performed -X- _ O
using -X- _ O
ImageJ -X- _ O
software -X- _ O
( -X- _ O
NIH -X- _ O
, -X- _ O
Bethesda -X- _ O
, -X- _ O
MD -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
primary -X- _ O
and -X- _ O
secondary -X- _ O
antibodies -X- _ O
are -X- _ O
listed -X- _ O
in -X- _ O
Table -X- _ O
1.Table -X- _ O
1The -X- _ O
description -X- _ O
of -X- _ O
primary -X- _ O
and -X- _ O
secondary -X- _ O
antibodies -X- _ O
AntibodySpeciesCloneDilutionCa -X- _ O
# -X- _ O
SourcePD-L1RabbitMonoclonal1:1000ab213524AbcamSTAT1MouseMonoclonal1:10009176Cell -X- _ O
Signaling -X- _ O
TechnologypSTAT1RabbitMonoclonal1:10009177SCell -X- _ O
Signaling -X- _ O
Technologyβ-actinMouseMonoclonal1:500047,778Santa -X- _ O
Cruz -X- _ O
Biotechnology -X- _ O
, -X- _ O
Dallas -X- _ O
, -X- _ O
TX -X- _ O
, -X- _ O
USAAnti-mouseHorse-1:10,0007076Cell -X- _ O
Signaling -X- _ O
, -X- _ O
Danvers -X- _ O
, -X- _ O
MA -X- _ O
, -X- _ O
USAAnti-RabbitGoat-1:10,0007074Cell -X- _ O
Signaling -X- _ O
, -X- _ O
Danvers -X- _ O
, -X- _ O
MA -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
Quantitative -X- _ O
real-time -X- _ O
pcr -X- _ O
( -X- _ O
qrt-pcr -X- _ O
) -X- _ O
analysis -X- _ O
Total -X- _ O
RNA -X- _ O
was -X- _ O
extracted -X- _ O
from -X- _ O
A549 -X- _ B-CELL
cells -X- _ B-CELL
using -X- _ O
the -X- _ O
RNeasy -X- _ O
Mini-Kit -X- _ O
( -X- _ O
Qiagen -X- _ O
, -X- _ O
# -X- _ O
74,104 -X- _ O
) -X- _ O
according -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
manufacturer’s -X- _ O
instructions -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
the -X- _ O
eluted -X- _ O
RNA -X- _ O
purity -X- _ O
and -X- _ O
concentration -X- _ O
were -X- _ O
assessed -X- _ O
using -X- _ O
a -X- _ O
NanoDrop -X- _ O
One -X- _ O
spectrophotometer -X- _ O
( -X- _ O
Thermo -X- _ O
Scientific -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
For -X- _ O
cDNA -X- _ O
synthesis -X- _ O
, -X- _ O
500 -X- _ O
ng -X- _ O
of -X- _ O
RNA -X- _ O
was -X- _ O
reverse -X- _ O
transcribed -X- _ O
using -X- _ O
the -X- _ O
RevertAid -X- _ O
First -X- _ O
Strand -X- _ O
cDNA -X- _ O
Synthesis -X- _ O
Kit -X- _ O
to -X- _ O
cDNA -X- _ O
as -X- _ O
per -X- _ O
the -X- _ O
manufacturer’s -X- _ O
instructions. -X- _ O
Quantitative -X- _ O
real-time -X- _ O
PCR -X- _ O
( -X- _ O
qRT-PCR -X- _ O
) -X- _ O
was -X- _ O
conducted -X- _ O
using -X- _ O
the -X- _ O
SYBR -X- _ O
Green -X- _ O
PCR -X- _ O
Master -X- _ O
Mix -X- _ O
( -X- _ O
Applied -X- _ O
Biosystems™ -X- _ O
) -X- _ O
on -X- _ O
a -X- _ O
QuantStudio -X- _ O
5 -X- _ O
Machine -X- _ O
( -X- _ O
Thermo -X- _ O
Fisher -X- _ O
Scientific -X- _ O
, -X- _ O
Inc. -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
relative -X- _ O
expression -X- _ O
levels -X- _ O
of -X- _ O
PD-L1 -X- _ O
, -X- _ O
STAT1 -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
ISGs -X- _ O
( -X- _ O
ISG15 -X- _ O
and -X- _ O
SOCS1 -X- _ O
) -X- _ O
were -X- _ O
normalized -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
housekeeping -X- _ O
gene -X- _ O
GAPDH -X- _ O
and -X- _ O
analyzed -X- _ O
using -X- _ O
the -X- _ O
2^ -X- _ O
− -X- _ O
ΔΔCt -X- _ O
method. -X- _ O
The -X- _ O
PCR -X- _ O
reactions -X- _ O
were -X- _ O
carried -X- _ O
out -X- _ O
in -X- _ O
duplicate -X- _ O
with -X- _ O
40 -X- _ O
cycles -X- _ O
of -X- _ O
denaturation -X- _ O
( -X- _ O
15 -X- _ O
s -X- _ O
at -X- _ O
95 -X- _ O
°C -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
annealing -X- _ O
( -X- _ O
20 -X- _ O
s -X- _ O
at -X- _ O
65 -X- _ O
°C -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
elongation -X- _ O
( -X- _ O
20 -X- _ O
s -X- _ O
at -X- _ O
72 -X- _ O
°C -X- _ O
) -X- _ O
after -X- _ O
an -X- _ O
initial -X- _ O
enzyme -X- _ O
activation -X- _ O
( -X- _ O
15 -X- _ O
min -X- _ O
at -X- _ O
95 -X- _ O
°C -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
primer -X- _ O
sequences -X- _ O
used -X- _ O
are -X- _ O
presented -X- _ O
in -X- _ O
Table -X- _ O
2.Table -X- _ O
2List -X- _ O
of -X- _ O
PCR -X- _ O
primers -X- _ O
designed -X- _ O
using -X- _ O
NCBI -X- _ O
/ -X- _ O
Primer-BLAST -X- _ O
program -X- _ O
PrimerPrimer -X- _ O
sequencesForwardReverseCD274 -X- _ O
( -X- _ O
PD−L1 -X- _ O
) -X- _ O
5′-TGGCATTTGCTGAACGCATTT- -X- _ O
3′5′-AGTGCAGCCAGGTCTAATTGT- -X- _ O
3′ISG155′-ATCACCCAGAAGATCGGCGT- -X- _ O
3′5′-TCGCATTTGTCCACCACCAG- -X- _ O
3′SOCS15’- -X- _ O
TTCGCCCTTAGCGTGAAGATGG- -X- _ O
3′5’- -X- _ O
TAGTGCTCCAGCAGCTCGAAGA- -X- _ O
3′GAPDH5′-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTC- -X- _ O
3′5′-TGAAGGGGTCATTGATGGCA- -X- _ O
3′ -X- _ O
Statistical -X- _ O
analysis -X- _ O
All -X- _ O
experiments -X- _ O
were -X- _ O
performed -X- _ O
in -X- _ O
triplicate -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
data -X- _ O
are -X- _ O
presented -X- _ O
as -X- _ O
mean -X- _ O
± -X- _ O
standard -X- _ O
deviation -X- _ O
( -X- _ O
SD -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Statistical -X- _ O
analyses -X- _ O
were -X- _ O
conducted -X- _ O
using -X- _ O
GraphPad -X- _ O
Prism -X- _ O
10 -X- _ O
( -X- _ O
GraphPad -X- _ O
Software -X- _ O
, -X- _ O
USA -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
One-way -X- _ O
analysis -X- _ O
of -X- _ O
variance -X- _ O
( -X- _ O
ANOVA -X- _ O
) -X- _ O
followed -X- _ O
by -X- _ O
Tukey’s -X- _ O
post-hoc -X- _ O
test -X- _ O
was -X- _ O
used -X- _ O
to -X- _ O
compare -X- _ O
multiple -X- _ O
groups -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
an -X- _ O
unpaired -X- _ O
Student’s -X- _ O
t-test -X- _ O
was -X- _ O
used -X- _ O
for -X- _ O
pairwise -X- _ O
comparisons. -X- _ O
Differences -X- _ O
were -X- _ O
considered -X- _ O
statistically -X- _ O
significant -X- _ O
at -X- _ O
p -X- _ O
***Results*** -X- _ O
Discussion -X- _ O
Immune -X- _ O
evasion -X- _ O
remains -X- _ O
a -X- _ O
significant -X- _ O
challenge -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
treatment -X- _ O
of -X- _ O
NSCLC -X- _ B-CELL
, -X- _ O
with -X- _ O
PD-L1 -X- _ O
upregulation -X- _ O
being -X- _ O
one -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
primary -X- _ O
mechanisms -X- _ O
by -X- _ O
which -X- _ O
tumors -X- _ O
escape -X- _ O
immune -X- _ O
surveillance -X- _ O
( -X- _ O
Cui -X- _ O
et -X- _ O
al. -X- _ O
2024 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
IFN-γ -X- _ O
/ -X- _ O
STAT1 -X- _ O
signaling -X- _ O
pathway -X- _ O
plays -X- _ O
a -X- _ O
crucial -X- _ O
role -X- _ O
in -X- _ O
PD-L1 -X- _ O
regulation -X- _ O
, -X- _ O
enabling -X- _ O
tumor -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
to -X- _ O
suppress -X- _ O
T-cell-mediated -X- _ B-CELL
immune -X- _ O
responses -X- _ O
and -X- _ O
resist -X- _ O
immune -X- _ O
checkpoint -X- _ O
blockade -X- _ O
therapy -X- _ O
( -X- _ O
Padmanabhan -X- _ O
et -X- _ O
al. -X- _ O
2022 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
In -X- _ O
this -X- _ O
study -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
investigated -X- _ O
how -X- _ O
IFN-γ-induced -X- _ O
STAT1 -X- _ O
phosphorylation -X- _ O
leads -X- _ O
to -X- _ O
PD-L1 -X- _ O
upregulation -X- _ O
in -X- _ O
A549 -X- _ B-CELL
cells -X- _ B-CELL
and -X- _ O
explored -X- _ O
the -X- _ O
potential -X- _ O
of -X- _ O
curcumin -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
bioactive -X- _ O
polyphenol -X- _ O
with -X- _ O
known -X- _ O
anti-inflammatory -X- _ O
and -X- _ O
anti-cancer -X- _ O
properties -X- _ O
, -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
therapeutic -X- _ O
agent -X- _ O
capable -X- _ O
of -X- _ O
modulating -X- _ O
this -X- _ O
pathway. -X- _ O
Our -X- _ O
findings -X- _ O
provide -X- _ O
strong -X- _ O
evidence -X- _ O
that -X- _ O
curcumin -X- _ O
inhibits -X- _ O
IFN-γ-induced -X- _ O
STAT1 -X- _ O
activation -X- _ O
, -X- _ O
thereby -X- _ O
reducing -X- _ O
PD-L1 -X- _ O
expression -X- _ O
and -X- _ O
enhancing -X- _ O
the -X- _ O
anti-proliferative -X- _ O
effects -X- _ O
of -X- _ O
IFN-γ -X- _ O
in -X- _ O
NSCLC. -X- _ B-CELL
Consistent -X- _ O
with -X- _ O
previous -X- _ O
studies -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
observed -X- _ O
that -X- _ O
IFN-γ -X- _ O
induces -X- _ O
a -X- _ O
robust -X- _ O
phosphorylation -X- _ O
of -X- _ O
STAT1 -X- _ O
at -X- _ O
Tyr701 -X- _ O
in -X- _ O
A549 -X- _ B-CELL
cells -X- _ B-CELL
, -X- _ O
leading -X- _ O
to -X- _ O
its -X- _ O
nuclear -X- _ O
translocation -X- _ O
and -X- _ O
subsequent -X- _ O
activation -X- _ O
of -X- _ O
target -X- _ O
genes -X- _ O
, -X- _ O
including -X- _ O
PD-L1. -X- _ O
The -X- _ O
kinetics -X- _ O
of -X- _ O
STAT1 -X- _ O
phosphorylation -X- _ O
followed -X- _ O
a -X- _ O
time-dependent -X- _ O
pattern -X- _ O
, -X- _ O
with -X- _ O
phosphorylation -X- _ O
detected -X- _ O
as -X- _ O
early -X- _ O
as -X- _ O
2 -X- _ O
h -X- _ O
, -X- _ O
peaking -X- _ O
at -X- _ O
6 -X- _ O
h -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
remaining -X- _ O
elevated -X- _ O
up -X- _ O
to -X- _ O
24 -X- _ O
h. -X- _ O
These -X- _ O
results -X- _ O
are -X- _ O
in -X- _ O
agreement -X- _ O
with -X- _ O
earlier -X- _ O
reports -X- _ O
that -X- _ O
demonstrated -X- _ O
a -X- _ O
similar -X- _ O
pattern -X- _ O
of -X- _ O
IFN-γ-induced -X- _ O
STAT1 -X- _ O
activation -X- _ O
in -X- _ O
various -X- _ O
cancer -X- _ O
models -X- _ O
, -X- _ O
including -X- _ O
melanoma -X- _ O
( -X- _ O
Schmitt -X- _ O
et -X- _ O
al. -X- _ O
2012 -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
colorectal -X- _ O
cancer -X- _ O
( -X- _ O
Zhao -X- _ O
et -X- _ O
al. -X- _ O
2020 -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
lung -X- _ B-TISSUE
adenocarcinoma -X- _ O
( -X- _ O
Gao -X- _ O
et -X- _ O
al. -X- _ O
2018 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
STAT1 -X- _ O
phosphorylation -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
prerequisite -X- _ O
for -X- _ O
its -X- _ O
dimerization -X- _ O
and -X- _ O
nuclear -X- _ O
translocation -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
is -X- _ O
required -X- _ O
for -X- _ O
the -X- _ O
transcriptional -X- _ O
activation -X- _ O
of -X- _ O
ISGs -X- _ O
( -X- _ O
Wang -X- _ O
et -X- _ O
al. -X- _ O
2017 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Immunofluorescence -X- _ O
analysis -X- _ O
confirmed -X- _ O
that -X- _ O
IFN-γ -X- _ O
treatment -X- _ O
led -X- _ O
to -X- _ O
a -X- _ O
marked -X- _ O
accumulation -X- _ O
of -X- _ O
p-STAT1 -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
nucleus -X- _ O
, -X- _ O
reinforcing -X- _ O
the -X- _ O
notion -X- _ O
that -X- _ O
STAT1 -X- _ O
plays -X- _ O
a -X- _ O
crucial -X- _ O
role -X- _ O
in -X- _ O
IFN-γ-mediated -X- _ O
transcriptional -X- _ O
regulation. -X- _ O
These -X- _ O
findings -X- _ O
align -X- _ O
with -X- _ O
studies -X- _ O
showing -X- _ O
that -X- _ O
sustained -X- _ O
STAT1 -X- _ O
activation -X- _ O
promotes -X- _ O
an -X- _ O
immunosuppressive -X- _ O
tumor -X- _ O
microenvironment -X- _ O
by -X- _ O
inducing -X- _ O
PD-L1 -X- _ O
expression -X- _ O
and -X- _ O
other -X- _ O
immune-regulatory -X- _ O
genes. -X- _ O
The -X- _ O
upregulation -X- _ O
of -X- _ O
PD-L1 -X- _ O
in -X- _ O
response -X- _ O
to -X- _ O
IFN-γ -X- _ O
was -X- _ O
confirmed -X- _ O
at -X- _ O
both -X- _ O
the -X- _ O
mRNA -X- _ O
and -X- _ O
protein -X- _ O
levels -X- _ O
, -X- _ O
as -X- _ O
demonstrated -X- _ O
by -X- _ O
qRT-PCR -X- _ O
and -X- _ O
Western -X- _ O
blotting. -X- _ O
The -X- _ O
increased -X- _ O
surface -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
PD-L1 -X- _ O
following -X- _ O
IFN-γ -X- _ O
treatment -X- _ O
highlights -X- _ O
the -X- _ O
functional -X- _ O
significance -X- _ O
of -X- _ O
this -X- _ O
regulation -X- _ O
, -X- _ O
as -X- _ O
surface -X- _ O
PD-L1 -X- _ O
interacts -X- _ O
with -X- _ O
PD- -X- _ O
1 -X- _ O
on -X- _ O
T -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
to -X- _ O
inhibit -X- _ O
anti-tumor -X- _ O
immune -X- _ O
responses -X- _ O
( -X- _ O
Arak -X- _ O
et -X- _ O
al. -X- _ O
2021 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
These -X- _ O
results -X- _ O
are -X- _ O
in -X- _ O
accordance -X- _ O
with -X- _ O
previous -X- _ O
reports -X- _ O
showing -X- _ O
that -X- _ O
IFN-γ -X- _ O
is -X- _ O
one -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
most -X- _ O
potent -X- _ O
inducers -X- _ O
of -X- _ O
PD-L1 -X- _ O
in -X- _ O
NSCLC -X- _ B-CELL
, -X- _ O
facilitating -X- _ O
immune -X- _ O
escape -X- _ O
and -X- _ O
tumor -X- _ O
progression -X- _ O
( -X- _ O
Pawelczyk -X- _ O
et -X- _ O
al. -X- _ O
2019 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Additionally -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
use -X- _ O
of -X- _ O
fludarabine -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
STAT1 -X- _ O
inhibitor -X- _ O
, -X- _ O
significantly -X- _ O
attenuated -X- _ O
IFN-γ-induced -X- _ O
PD-L1 -X- _ O
expression -X- _ O
, -X- _ O
confirming -X- _ O
that -X- _ O
STAT1 -X- _ O
is -X- _ O
the -X- _ O
primary -X- _ O
mediator -X- _ O
of -X- _ O
this -X- _ O
regulatory -X- _ O
axis. -X- _ O
This -X- _ O
finding -X- _ O
corroborates -X- _ O
prior -X- _ O
studies -X- _ O
demonstrating -X- _ O
that -X- _ O
STAT1-deficient -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
fail -X- _ O
to -X- _ O
upregulate -X- _ O
PD-L1 -X- _ O
in -X- _ O
response -X- _ O
to -X- _ O
IFN-γ -X- _ O
, -X- _ O
emphasizing -X- _ O
the -X- _ O
centrality -X- _ O
of -X- _ O
STAT1 -X- _ O
in -X- _ O
this -X- _ O
pathway. -X- _ O
One -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
most -X- _ O
significant -X- _ O
findings -X- _ O
of -X- _ O
this -X- _ O
study -X- _ O
is -X- _ O
the -X- _ O
ability -X- _ O
of -X- _ O
curcumin -X- _ O
to -X- _ O
inhibit -X- _ O
IFN-γ-induced -X- _ O
STAT1 -X- _ O
activation -X- _ O
and -X- _ O
PD-L1 -X- _ O
expression -X- _ O
in -X- _ O
A549 -X- _ B-CELL
cells. -X- _ B-CELL
Western -X- _ O
blot -X- _ O
analysis -X- _ O
revealed -X- _ O
that -X- _ O
curcumin -X- _ O
suppressed -X- _ O
STAT1 -X- _ O
phosphorylation -X- _ O
in -X- _ O
a -X- _ O
dose-dependent -X- _ O
manner -X- _ O
, -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
highest -X- _ O
concentration -X- _ O
( -X- _ O
50 -X- _ O
µM -X- _ O
) -X- _ O
reducing -X- _ O
phosphorylation -X- _ O
by -X- _ O
68 -X- _ O
% -X- _ O
. -X- _ O
This -X- _ O
effect -X- _ O
was -X- _ O
not -X- _ O
due -X- _ O
to -X- _ O
a -X- _ O
decrease -X- _ O
in -X- _ O
total -X- _ O
STAT1 -X- _ O
protein -X- _ O
levels -X- _ O
, -X- _ O
indicating -X- _ O
that -X- _ O
curcumin -X- _ O
selectively -X- _ O
inhibits -X- _ O
STAT1 -X- _ O
activation -X- _ O
rather -X- _ O
than -X- _ O
its -X- _ O
expression. -X- _ O
Previous -X- _ O
studies -X- _ O
have -X- _ O
reported -X- _ O
that -X- _ O
curcumin -X- _ O
can -X- _ O
interfere -X- _ O
with -X- _ O
JAK-STAT -X- _ O
signaling -X- _ O
in -X- _ O
other -X- _ O
cancer -X- _ O
types. -X- _ O
Curcumin -X- _ O
directly -X- _ O
inhibits -X- _ O
the -X- _ O
phosphorylation -X- _ O
of -X- _ O
STAT3 -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
key -X- _ O
component -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
JAK-STAT -X- _ O
signaling -X- _ O
pathway -X- _ O
in -X- _ O
breast -X- _ B-TISSUE
cancer -X- _ O
( -X- _ O
Golmohammadi -X- _ O
et -X- _ O
al. -X- _ O
2024 -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
prostate -X- _ B-TISSUE
cancer -X- _ O
( -X- _ O
Li -X- _ O
et -X- _ O
al. -X- _ O
2024 -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
as -X- _ O
well -X- _ O
as -X- _ O
the -X- _ O
downregulation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
STAT1 -X- _ O
in -X- _ O
melanoma -X- _ O
( -X- _ O
Xu -X- _ O
et -X- _ O
al. -X- _ O
2018 -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
but -X- _ O
its -X- _ O
specific -X- _ O
effect -X- _ O
on -X- _ O
STAT1 -X- _ O
in -X- _ O
IFN-γ-stimulated -X- _ O
NSCLC -X- _ B-CELL
cells -X- _ B-CELL
had -X- _ O
not -X- _ O
been -X- _ O
previously -X- _ O
explored. -X- _ O
Our -X- _ O
findings -X- _ O
extend -X- _ O
these -X- _ O
observations -X- _ O
by -X- _ O
demonstrating -X- _ O
that -X- _ O
curcumin -X- _ O
effectively -X- _ O
blocks -X- _ O
STAT1 -X- _ O
activation -X- _ O
in -X- _ O
lung -X- _ B-TISSUE
cancer -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
, -X- _ O
preventing -X- _ O
the -X- _ O
downstream -X- _ O
induction -X- _ O
of -X- _ O
PD-L1. -X- _ O
The -X- _ O
suppression -X- _ O
of -X- _ O
PD-L1 -X- _ O
expression -X- _ O
by -X- _ O
curcumin -X- _ O
was -X- _ O
observed -X- _ O
at -X- _ O
both -X- _ O
the -X- _ O
transcriptional -X- _ O
and -X- _ O
translational -X- _ O
levels -X- _ O
, -X- _ O
as -X- _ O
evidenced -X- _ O
by -X- _ O
qRT-PCR -X- _ O
and -X- _ O
Western -X- _ O
blotting. -X- _ O
This -X- _ O
finding -X- _ O
is -X- _ O
particularly -X- _ O
relevant -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
context -X- _ O
of -X- _ O
NSCLC -X- _ B-CELL
, -X- _ O
where -X- _ O
high -X- _ O
PD-L1 -X- _ O
expression -X- _ O
correlates -X- _ O
with -X- _ O
poor -X- _ O
prognosis -X- _ O
and -X- _ O
resistance -X- _ O
to -X- _ O
immunotherapy. -X- _ O
Previous -X- _ O
studies -X- _ O
have -X- _ O
reported -X- _ O
that -X- _ O
curcumin -X- _ O
downregulates -X- _ O
PD-L1 -X- _ O
in -X- _ O
other -X- _ O
cancer -X- _ O
models -X- _ O
, -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
melanoma -X- _ O
( -X- _ O
Xu -X- _ O
et -X- _ O
al. -X- _ O
2018 -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
hepatocellular -X- _ O
carcinoma -X- _ O
( -X- _ O
Guo -X- _ O
et -X- _ O
al. -X- _ O
2021 -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
but -X- _ O
the -X- _ O
specific -X- _ O
inhibition -X- _ O
of -X- _ O
IFN-γ-induced -X- _ O
PD-L1 -X- _ O
expression -X- _ O
in -X- _ O
NSCLC -X- _ B-CELL
had -X- _ O
not -X- _ O
been -X- _ O
thoroughly -X- _ O
investigated. -X- _ O
Our -X- _ O
study -X- _ O
provides -X- _ O
the -X- _ O
first -X- _ O
evidence -X- _ O
that -X- _ O
curcumin -X- _ O
can -X- _ O
effectively -X- _ O
suppress -X- _ O
IFN-γ-mediated -X- _ O
PD-L1 -X- _ O
upregulation -X- _ O
in -X- _ O
lung -X- _ B-TISSUE
cancer -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
via -X- _ O
STAT1 -X- _ O
pathway -X- _ O
, -X- _ O
highlighting -X- _ O
its -X- _ O
potential -X- _ O
as -X- _ O
an -X- _ O
immune-modulatory -X- _ O
agent. -X- _ O
In -X- _ O
addition -X- _ O
to -X- _ O
PD-L1 -X- _ O
, -X- _ O
STAT1 -X- _ O
regulates -X- _ O
the -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
multiple -X- _ O
ISGs -X- _ O
involved -X- _ O
in -X- _ O
immune -X- _ O
evasion -X- _ O
, -X- _ O
including -X- _ O
SOCS1 -X- _ O
( -X- _ O
Ilangumaran -X- _ O
et -X- _ O
al. -X- _ O
2024 -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
ISG15 -X- _ O
( -X- _ O
Desai -X- _ O
2015 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Our -X- _ O
results -X- _ O
demonstrated -X- _ O
that -X- _ O
IFN-γ -X- _ O
significantly -X- _ O
upregulated -X- _ O
both -X- _ O
SOCS1 -X- _ O
and -X- _ O
ISG15 -X- _ O
, -X- _ O
reinforcing -X- _ O
the -X- _ O
notion -X- _ O
that -X- _ O
IFN-γ -X- _ O
signaling -X- _ O
contributes -X- _ O
to -X- _ O
an -X- _ O
immunosuppressive -X- _ O
tumor -X- _ O
microenvironment. -X- _ O
Curcumin -X- _ O
pretreatment -X- _ O
, -X- _ O
however -X- _ O
, -X- _ O
led -X- _ O
to -X- _ O
a -X- _ O
significant -X- _ O
reduction -X- _ O
in -X- _ O
both -X- _ O
SOCS1 -X- _ O
and -X- _ O
ISG15 -X- _ O
expression -X- _ O
, -X- _ O
further -X- _ O
supporting -X- _ O
its -X- _ O
ability -X- _ O
to -X- _ O
interfere -X- _ O
with -X- _ O
IFN-γ-driven -X- _ O
STAT1 -X- _ O
signaling. -X- _ O
SOCS1 -X- _ O
is -X- _ O
known -X- _ O
to -X- _ O
act -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
feedback -X- _ O
inhibitor -X- _ O
of -X- _ O
JAK-STAT -X- _ O
signaling -X- _ O
( -X- _ O
Liau -X- _ O
et -X- _ O
al. -X- _ O
2018 -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
but -X- _ O
paradoxically -X- _ O
, -X- _ O
its -X- _ O
overexpression -X- _ O
in -X- _ O
tumors -X- _ O
has -X- _ O
been -X- _ O
associated -X- _ O
with -X- _ O
immune -X- _ O
escape -X- _ O
mechanisms. -X- _ O
By -X- _ O
suppressing -X- _ O
SOCS1 -X- _ O
expression -X- _ O
, -X- _ O
curcumin -X- _ O
may -X- _ O
enhance -X- _ O
the -X- _ O
responsiveness -X- _ O
of -X- _ O
tumor -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
to -X- _ O
immune-mediated -X- _ O
clearance. -X- _ O
Similarly -X- _ O
, -X- _ O
ISG15 -X- _ O
has -X- _ O
been -X- _ O
implicated -X- _ O
in -X- _ O
tumor -X- _ O
progression -X- _ O
and -X- _ O
resistance -X- _ O
to -X- _ O
therapy -X- _ O
( -X- _ O
Meng -X- _ O
et -X- _ O
al. -X- _ O
2024 -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
suggesting -X- _ O
that -X- _ O
its -X- _ O
downregulation -X- _ O
by -X- _ O
curcumin -X- _ O
may -X- _ O
have -X- _ O
additional -X- _ O
therapeutic -X- _ O
benefits. -X- _ O
Finally -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
observed -X- _ O
that -X- _ O
curcumin -X- _ O
enhances -X- _ O
the -X- _ O
anti-proliferative -X- _ O
effect -X- _ O
of -X- _ O
IFN-γ -X- _ O
in -X- _ O
A549 -X- _ B-CELL
cells. -X- _ B-CELL
While -X- _ O
IFN-γ -X- _ O
alone -X- _ O
resulted -X- _ O
in -X- _ O
a -X- _ O
modest -X- _ O
reduction -X- _ O
in -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
viability -X- _ O
( -X- _ O
21 -X- _ O
% -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
combination -X- _ O
of -X- _ O
IFN-γ -X- _ O
and -X- _ O
curcumin -X- _ O
led -X- _ O
to -X- _ O
a -X- _ O
significantly -X- _ O
greater -X- _ O
reduction -X- _ O
( -X- _ O
47 -X- _ O
% -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
suggesting -X- _ O
a -X- _ O
synergistic -X- _ O
effect. -X- _ O
These -X- _ O
findings -X- _ O
align -X- _ O
with -X- _ O
previous -X- _ O
reports -X- _ O
that -X- _ O
curcumin -X- _ O
enhances -X- _ O
the -X- _ O
anti-tumor -X- _ O
activity -X- _ O
of -X- _ O
cytokines -X- _ O
by -X- _ O
modulating -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
cycle -X- _ O
regulators -X- _ O
and -X- _ O
apoptotic -X- _ O
pathways -X- _ O
( -X- _ O
Hu -X- _ O
et -X- _ O
al. -X- _ O
2018 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
precise -X- _ O
mechanism -X- _ O
by -X- _ O
which -X- _ O
curcumin -X- _ O
sensitizes -X- _ O
NSCLC -X- _ B-CELL
cells -X- _ B-CELL
to -X- _ O
IFN-γ-induced -X- _ O
growth -X- _ O
suppression -X- _ O
remains -X- _ O
to -X- _ O
be -X- _ O
elucidated -X- _ O
, -X- _ O
but -X- _ O
it -X- _ O
may -X- _ O
involve -X- _ O
inhibition -X- _ O
of -X- _ O
survival -X- _ O
pathways -X- _ O
downstream -X- _ O
of -X- _ O
STAT1 -X- _ O
activation. -X- _ O
Given -X- _ O
that -X- _ O
STAT1 -X- _ O
has -X- _ O
been -X- _ O
implicated -X- _ O
in -X- _ O
both -X- _ O
pro-apoptotic -X- _ O
and -X- _ O
pro-survival -X- _ O
signaling -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
net -X- _ O
effect -X- _ O
of -X- _ O
its -X- _ O
inhibition -X- _ O
may -X- _ O
depend -X- _ O
on -X- _ O
the -X- _ O
cellular -X- _ O
context -X- _ O
and -X- _ O
additional -X- _ O
regulatory -X- _ O
factors. -X- _ O
In -X- _ O
conclusion -X- _ O
, -X- _ O
our -X- _ O
study -X- _ O
provides -X- _ O
novel -X- _ O
evidence -X- _ O
that -X- _ O
IFN-γ -X- _ O
induces -X- _ O
PD-L1 -X- _ O
expression -X- _ O
in -X- _ O
NSCLC -X- _ B-CELL
cells -X- _ B-CELL
via -X- _ O
STAT1 -X- _ O
activation -X- _ O
and -X- _ O
that -X- _ O
curcumin -X- _ O
effectively -X- _ O
inhibits -X- _ O
this -X- _ O
process -X- _ O
by -X- _ O
suppressing -X- _ O
STAT1 -X- _ O
phosphorylation -X- _ O
and -X- _ O
nuclear -X- _ O
translocation. -X- _ O
Furthermore -X- _ O
, -X- _ O
curcumin -X- _ O
downregulates -X- _ O
IFN-γ-induced -X- _ O
ISGs -X- _ O
and -X- _ O
enhances -X- _ O
IFN-γ-mediated -X- _ O
tumor -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
growth -X- _ O
suppression -X- _ O
, -X- _ O
highlighting -X- _ O
its -X- _ O
potential -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
therapeutic -X- _ O
adjuvant -X- _ O
in -X- _ O
NSCLC. -X- _ B-CELL
These -X- _ O
findings -X- _ O
suggest -X- _ O
that -X- _ O
curcumin -X- _ O
could -X- _ O
be -X- _ O
used -X- _ O
to -X- _ O
improve -X- _ O
the -X- _ O
efficacy -X- _ O
of -X- _ O
immune -X- _ O
checkpoint -X- _ O
inhibitors -X- _ O
by -X- _ O
reducing -X- _ O
tumor -X- _ O
immune -X- _ O
evasion. -X- _ O
Future -X- _ O
studies -X- _ O
should -X- _ O
focus -X- _ O
on -X- _ O
elucidating -X- _ O
the -X- _ O
precise -X- _ O
molecular -X- _ O
mechanisms -X- _ O
underlying -X- _ O
curcumin’s -X- _ O
effects -X- _ O
on -X- _ O
STAT1 -X- _ O
signaling -X- _ O
and -X- _ O
investigating -X- _ O
its -X- _ O
potential -X- _ O
synergistic -X- _ O
effects -X- _ O
with -X- _ O
existing -X- _ O
immunotherapies -X- _ O
in -X- _ O
preclinical -X- _ O
and -X- _ O
clinical -X- _ O
settings. -X- _ O
Source -X- _ O
paper -X- _ O
: -X- _ O
PMC12141184 -X- _ O

Materials -X- _ O
and -X- _ O
methods -X- _ O
Statistical -X- _ O
analysis -X- _ O
All -X- _ O
experiments -X- _ O
were -X- _ O
performed -X- _ O
at -X- _ O
least -X- _ O
three -X- _ O
times. -X- _ O
A -X- _ O
one-way -X- _ O
ANOVA -X- _ O
followed -X- _ O
by -X- _ O
a -X- _ O
Tukey -X- _ O
's -X- _ O
post-hoc -X- _ O
test -X- _ O
was -X- _ O
used -X- _ O
to -X- _ O
compare -X- _ O
the -X- _ O
RT-qPCR -X- _ O
signals -X- _ O
from -X- _ O
the -X- _ O
treated -X- _ B-CELL_CONTEXT
cells -X- _ B-CELL
and -X- _ O
the -X- _ O
ELISA -X- _ O
results. -X- _ O
For -X- _ O
comparison -X- _ O
of -X- _ O
RT-qPCR -X- _ O
signals -X- _ O
from -X- _ O
treated -X- _ B-CELL_CONTEXT
cells -X- _ B-CELL
to -X- _ O
the -X- _ O
hypothetical -X- _ O
value -X- _ O
of -X- _ O
1 -X- _ O
( -X- _ O
normalized -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
signal -X- _ O
of -X- _ O
control -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
) -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
one-sample -X- _ O
t-test -X- _ O
was -X- _ O
used -X- _ O
, -X- _ O
as -X- _ O
in -X- _ O
this -X- _ O
type -X- _ O
of -X- _ O
statistical -X- _ O
analysis -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
variability -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
values -X- _ O
obtained -X- _ O
from -X- _ O
control -X- _ O
cell -X- _ O
signals -X- _ O
is -X- _ O
taken -X- _ O
into -X- _ O
consideration -X- _ O
, -X- _ O
although -X- _ O
they -X- _ O
appear -X- _ O
without -X- _ O
standard -X- _ O
deviations -X- _ O
( -X- _ O
SD=0 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
P -X- _ O
# -X- _ O
x003C -X- _ O
; -X- _ O
0.05 -X- _ O
was -X- _ O
considered -X- _ O
to -X- _ O
indicate -X- _ O
a -X- _ O
statistically -X- _ O
significant -X- _ O
difference. -X- _ O
All -X- _ O
statistical -X- _ O
analyses -X- _ O
were -X- _ O
performed -X- _ O
in -X- _ O
GraphPad -X- _ O
Prism -X- _ O
version -X- _ O
9 -X- _ O
( -X- _ O
GraphPad -X- _ O
Software -X- _ O
, -X- _ O
Inc. -X- _ O
) -X- _ O
; -X- _ O
means -X- _ O
and -X- _ O
standard -X- _ O
deviations -X- _ O
are -X- _ O
provided -X- _ O
as -X- _ O
numbers -X- _ O
or -X- _ O
as -X- _ O
scatter -X- _ O
plots. -X- _ O
Results -X- _ O
Discussion -X- _ O
Confirming -X- _ O
previously -X- _ O
published -X- _ O
data -X- _ O
, -X- _ O
it -X- _ O
was -X- _ O
shown -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
human -X- _ O
cell -X- _ B-CELL_LINE
line -X- _ I-CELL_LINE
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
, -X- _ O
an -X- _ O
accepted -X- _ O
model -X- _ O
of -X- _ O
human -X- _ O
Mueller -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
, -X- _ O
expresses -X- _ O
AGT -X- _ O
, -X- _ O
ACE -X- _ O
, -X- _ O
ACE2 -X- _ O
, -X- _ O
angiotensin -X- _ O
II -X- _ O
receptors -X- _ O
AT1 -X- _ O
and -X- _ O
AT2 -X- _ O
, -X- _ O
as -X- _ O
well -X- _ O
as -X- _ O
the -X- _ O
receptor -X- _ O
of -X- _ O
angiotensin -X- _ O
( -X- _ O
1-7 -X- _ O
) -X- _ O
MAS1 -X- _ O
( -X- _ O
17-19,21-24,28 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
mRNA -X- _ O
expression -X- _ O
levels -X- _ O
of -X- _ O
these -X- _ O
were -X- _ O
largely -X- _ O
unchanged -X- _ O
when -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
were -X- _ O
exposed -X- _ O
to -X- _ O
hyperglycemic -X- _ O
or -X- _ O
hypoxic -X- _ O
conditions -X- _ O
or -X- _ O
both. -X- _ O
Exposure -X- _ O
of -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
to -X- _ O
these -X- _ O
conditions -X- _ O
seemed -X- _ O
to -X- _ O
not -X- _ O
result -X- _ O
in -X- _ O
induction -X- _ O
of -X- _ O
cellular -X- _ O
stress -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
may -X- _ O
adversely -X- _ O
affect -X- _ O
the -X- _ O
outcome -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
investigations -X- _ O
, -X- _ O
since -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
IL-6 -X- _ O
mRNA -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
marker -X- _ O
of -X- _ O
cellular -X- _ O
stress -X- _ O
, -X- _ O
remained -X- _ O
stable. -X- _ O
It -X- _ O
could -X- _ O
be -X- _ O
suggested -X- _ O
that -X- _ O
an -X- _ O
incubation -X- _ O
time -X- _ O
of -X- _ O
6 -X- _ O
h -X- _ O
is -X- _ O
too -X- _ O
short -X- _ O
, -X- _ O
but -X- _ O
due -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
short -X- _ O
half-life -X- _ O
of -X- _ O
angiotensin -X- _ O
II -X- _ O
, -X- _ O
longer -X- _ O
exposure -X- _ O
times -X- _ O
would -X- _ O
likely -X- _ O
not -X- _ O
result -X- _ O
in -X- _ O
more -X- _ O
relevant -X- _ O
data. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
expression -X- _ O
and -X- _ O
secretion -X- _ O
of -X- _ O
VEGF-A -X- _ O
were -X- _ O
substantially -X- _ O
increased -X- _ O
by -X- _ O
hypoxia -X- _ O
alone -X- _ O
or -X- _ O
in -X- _ O
combination -X- _ O
with -X- _ O
hyperglycemia -X- _ O
confirming -X- _ O
the -X- _ O
expected -X- _ O
strong -X- _ O
response -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
to -X- _ O
their -X- _ O
altered -X- _ O
environment -X- _ O
within -X- _ O
the -X- _ O
studied -X- _ O
time -X- _ O
span. -X- _ O
Angiotensin -X- _ O
II -X- _ O
and -X- _ O
aldosterone -X- _ O
did -X- _ O
not -X- _ O
modulate -X- _ O
VEGF-A -X- _ O
levels -X- _ O
, -X- _ O
proving -X- _ O
the -X- _ O
dominant -X- _ O
role -X- _ O
of -X- _ O
hypoxia -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
regulation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
growth -X- _ O
factors -X- _ O
' -X- _ O
expression -X- _ O
and -X- _ O
secretion. -X- _ O
It -X- _ O
was -X- _ O
to -X- _ O
be -X- _ O
expected -X- _ O
that -X- _ O
hyperglycemia -X- _ O
alone -X- _ O
did -X- _ O
not -X- _ O
modulate -X- _ O
VEGF-A -X- _ O
expression -X- _ O
and -X- _ O
secretion -X- _ O
within -X- _ O
6 -X- _ O
h -X- _ O
, -X- _ O
as -X- _ O
possible -X- _ O
changes -X- _ O
likely -X- _ O
manifest -X- _ O
only -X- _ O
after -X- _ O
extended -X- _ O
exposure -X- _ O
( -X- _ O
32 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
VEGF -X- _ O
receptors -X- _ O
are -X- _ O
expressed -X- _ O
in -X- _ O
various -X- _ O
retinal -X- _ B-TISSUE
tissues -X- _ I-TISSUE
including -X- _ O
the -X- _ O
retinal -X- _ B-TISSUE
vasculature -X- _ I-TISSUE
, -X- _ O
Mueller -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
, -X- _ O
and -X- _ O
the -X- _ O
retinal -X- _ B-TISSUE
pigment -X- _ I-TISSUE
epithelium -X- _ I-TISSUE
( -X- _ O
33,34 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Upregulation -X- _ O
of -X- _ O
VEGFR2 -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
retinal -X- _ B-TISSUE
vasculature -X- _ I-TISSUE
is -X- _ O
associated -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
development -X- _ O
of -X- _ O
DR -X- _ O
and -X- _ O
its -X- _ O
activation -X- _ O
by -X- _ O
the -X- _ O
ligand -X- _ O
VEGF-A165 -X- _ O
results -X- _ O
in -X- _ O
elevated -X- _ O
permeability -X- _ O
of -X- _ O
retinal -X- _ B-CELL_CONTEXT
endothelial -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
or -X- _ O
increased -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
pro-inflammatory -X- _ O
mediators -X- _ O
in -X- _ O
Mueller -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
in -X- _ O
vitro -X- _ O
( -X- _ O
29,34,35 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Inhibitors -X- _ O
of -X- _ O
ACE -X- _ O
and -X- _ O
/ -X- _ O
or -X- _ O
AT1 -X- _ O
, -X- _ O
at -X- _ O
least -X- _ O
in -X- _ O
part -X- _ O
, -X- _ O
prevent -X- _ O
VEGF-A165-induced -X- _ O
permeability -X- _ O
of -X- _ O
retinal -X- _ B-CELL_CONTEXT
endothelial -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
in -X- _ O
vitro -X- _ O
and -X- _ O
in -X- _ O
vivo -X- _ O
as -X- _ O
well -X- _ O
as -X- _ O
retinal -X- _ O
neovascularization -X- _ O
, -X- _ O
thereby -X- _ O
proving -X- _ O
an -X- _ O
interaction -X- _ O
between -X- _ O
both -X- _ O
signaling -X- _ O
pathways -X- _ O
( -X- _ O
36-39 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
expression -X- _ O
and -X- _ O
secretion -X- _ O
of -X- _ O
VEGF-A -X- _ O
by -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
were -X- _ O
not -X- _ O
altered -X- _ O
by -X- _ O
angiotensin -X- _ O
II -X- _ O
likely -X- _ O
reflecting -X- _ O
the -X- _ O
different -X- _ O
behaviors -X- _ O
of -X- _ O
both -X- _ O
cell -X- _ O
types. -X- _ O
mRNAs -X- _ O
coding -X- _ O
for -X- _ O
proteins -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
RAAS -X- _ O
indeed -X- _ O
exhibited -X- _ O
differential -X- _ O
expression -X- _ O
patterns -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
presence -X- _ O
of -X- _ O
either -X- _ O
angiotensin -X- _ O
II -X- _ O
or -X- _ O
aldosterone -X- _ O
when -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
were -X- _ O
cultured -X- _ O
under -X- _ O
hyperglycemic -X- _ O
and -X- _ O
/ -X- _ O
or -X- _ O
hypoxic -X- _ O
conditions. -X- _ O
It -X- _ O
is -X- _ O
of -X- _ O
interest -X- _ O
, -X- _ O
that -X- _ O
angiotensin -X- _ O
II -X- _ O
did -X- _ O
not -X- _ O
alter -X- _ O
the -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
its -X- _ O
precursor -X- _ O
AGT -X- _ O
under -X- _ O
any -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
tested -X- _ O
conditions -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
may -X- _ O
indicate -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
peptide -X- _ O
hormone -X- _ O
can -X- _ O
not -X- _ O
, -X- _ O
directly -X- _ O
or -X- _ O
indirectly -X- _ O
, -X- _ O
induce -X- _ O
its -X- _ O
own -X- _ O
expression -X- _ O
in -X- _ O
Mueller -X- _ B-CELL
cells. -X- _ I-CELL
To -X- _ O
assess -X- _ O
a -X- _ O
possible -X- _ O
pro-inflammatory -X- _ O
response -X- _ O
of -X- _ O
Mueller -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
, -X- _ O
the -X- _ O
changes -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
mRNA -X- _ O
as -X- _ O
well -X- _ O
as -X- _ O
secretion -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
pro-inflammatory -X- _ O
cytokine -X- _ O
IL-6 -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
is -X- _ O
constitutively -X- _ O
expressed -X- _ O
by -X- _ O
this -X- _ O
cell -X- _ O
type -X- _ O
( -X- _ O
including -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
) -X- _ O
, -X- _ O
was -X- _ O
assessed -X- _ O
( -X- _ O
31 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
under -X- _ O
normoxic -X- _ O
or -X- _ O
hypoxic -X- _ O
conditions -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
amounts -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
secreted -X- _ O
cytokine -X- _ O
and -X- _ O
its -X- _ O
mRNA -X- _ O
expression -X- _ O
levels -X- _ O
were -X- _ O
not -X- _ O
significantly -X- _ O
altered -X- _ O
by -X- _ O
the -X- _ O
treatment -X- _ O
with -X- _ O
angiotensin -X- _ O
II -X- _ O
or -X- _ O
aldosterone -X- _ O
, -X- _ O
suggesting -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
hormones -X- _ O
do -X- _ O
not -X- _ O
induce -X- _ O
a -X- _ O
pro-inflammatory -X- _ O
response -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
under -X- _ O
these -X- _ O
circumstances. -X- _ O
Interestingly -X- _ O
, -X- _ O
aldosterone -X- _ O
significantly -X- _ O
enhanced -X- _ O
the -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
ACE -X- _ O
mRNA -X- _ O
under -X- _ O
hypoxic -X- _ O
conditions -X- _ O
, -X- _ O
thus -X- _ O
not -X- _ O
resulting -X- _ O
in -X- _ O
an -X- _ O
inflammatory -X- _ O
response -X- _ O
, -X- _ O
that -X- _ O
is -X- _ O
enhanced -X- _ O
expression -X- _ O
or -X- _ O
secretion -X- _ O
of -X- _ O
IL-6 -X- _ O
via -X- _ O
the -X- _ O
angiotensin -X- _ O
II -X- _ O
/ -X- _ O
AT1-axis. -X- _ O
Angiotensin -X- _ O
II -X- _ O
, -X- _ O
on -X- _ O
the -X- _ O
other -X- _ O
hand -X- _ O
, -X- _ O
increased -X- _ O
the -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
ACE2 -X- _ O
, -X- _ O
resulting -X- _ O
in -X- _ O
its -X- _ O
own -X- _ O
inactivation -X- _ O
by -X- _ O
the -X- _ O
formation -X- _ O
of -X- _ O
angiotensin -X- _ O
( -X- _ O
1-7 -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
does -X- _ O
not -X- _ O
activate -X- _ O
AT1. -X- _ O
Similar -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
behavior -X- _ O
of -X- _ O
endothelial -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
from -X- _ O
the -X- _ O
human -X- _ O
umbilical -X- _ B-TISSUE
cord -X- _ I-TISSUE
, -X- _ O
the -X- _ O
mRNA -X- _ O
expression -X- _ O
levels -X- _ O
of -X- _ O
IL-6 -X- _ O
were -X- _ O
increased -X- _ O
in -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
exposed -X- _ O
to -X- _ O
hyperglycemia -X- _ O
and -X- _ O
aldosterone -X- _ O
, -X- _ O
although -X- _ O
the -X- _ O
amount -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
secreted -X- _ O
cytokine -X- _ O
remained -X- _ O
unchanged -X- _ O
from -X- _ O
control -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
( -X- _ O
40 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
increased -X- _ O
IL-6 -X- _ O
expression -X- _ O
is -X- _ O
likely -X- _ O
independent -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
angiotensin -X- _ O
II -X- _ O
/ -X- _ O
AT1-axis -X- _ O
, -X- _ O
as -X- _ O
possibly -X- _ O
endogenously -X- _ O
produced -X- _ O
peptide -X- _ O
hormone -X- _ O
is -X- _ O
inactivated -X- _ O
by -X- _ O
high -X- _ O
levels -X- _ O
of -X- _ O
ACE2. -X- _ O
Although -X- _ O
angiotensin -X- _ O
II -X- _ O
did -X- _ O
not -X- _ O
significantly -X- _ O
increase -X- _ O
IL-6 -X- _ O
mRNA -X- _ O
expression -X- _ O
in -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
cultured -X- _ O
under -X- _ O
hyperglycemic -X- _ O
conditions -X- _ O
, -X- _ O
more -X- _ O
IL-6 -X- _ O
was -X- _ O
secreted -X- _ O
under -X- _ O
these -X- _ O
conditions. -X- _ O
Higher -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
AT1 -X- _ O
mRNA -X- _ O
could -X- _ O
lead -X- _ O
to -X- _ O
stronger -X- _ O
activation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
pro-inflammatory -X- _ O
angiotensin -X- _ O
II -X- _ O
/ -X- _ O
AT1 -X- _ O
signaling -X- _ O
cascade -X- _ O
, -X- _ O
similar -X- _ O
to -X- _ O
that -X- _ O
observed -X- _ O
for -X- _ O
angiotensin -X- _ O
II-activated -X- _ O
retinal -X- _ B-CELL_CONTEXT
microglia -X- _ B-CELL
, -X- _ O
which -X- _ O
express -X- _ O
higher -X- _ O
quantities -X- _ O
of -X- _ O
various -X- _ O
pro-inflammatory -X- _ O
cytokines -X- _ O
and -X- _ O
chemokines -X- _ O
including -X- _ O
IL-6 -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
process -X- _ O
that -X- _ O
is -X- _ O
mediated -X- _ O
by -X- _ O
AT1 -X- _ O
( -X- _ O
41 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Elevated -X- _ O
permeability -X- _ O
of -X- _ O
retinal -X- _ B-CELL_CONTEXT
endothelial -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
due -X- _ O
to -X- _ O
IL-6-mediated -X- _ O
trans-signaling -X- _ O
in -X- _ O
vitro -X- _ O
likely -X- _ O
contributes -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
breakdown -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
inner -X- _ O
blood-retina -X- _ B-TISSUE
barrier -X- _ O
in -X- _ O
vivo -X- _ O
( -X- _ O
42 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
protective -X- _ O
ACE2 -X- _ O
/ -X- _ O
angiotensin -X- _ O
( -X- _ O
1-7 -X- _ O
) -X- _ O
/ -X- _ O
MAS1 -X- _ O
signaling -X- _ O
cascade -X- _ O
is -X- _ O
upregulated -X- _ O
during -X- _ O
acute -X- _ O
and -X- _ O
chronic -X- _ O
diseases -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
heart -X- _ B-TISSUE
or -X- _ O
kidney -X- _ B-TISSUE
to -X- _ O
counteract -X- _ O
detrimental -X- _ O
processes -X- _ O
( -X- _ O
43,44 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
This -X- _ O
signaling -X- _ O
cascade -X- _ O
seems -X- _ O
to -X- _ O
also -X- _ O
be -X- _ O
activated -X- _ O
by -X- _ O
Mueller -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
exposed -X- _ O
to -X- _ O
hyperglycemia -X- _ O
and -X- _ O
angiotensin -X- _ O
II -X- _ O
, -X- _ O
as -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
ACE2 -X- _ O
and -X- _ O
MAS1 -X- _ O
RNA -X- _ O
was -X- _ O
elevated. -X- _ O
Thus -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
concentrations -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
vasodilator -X- _ O
angiotensin -X- _ O
( -X- _ O
1-7 -X- _ O
) -X- _ O
formed -X- _ O
by -X- _ O
protease -X- _ O
ACE2 -X- _ O
may -X- _ O
be -X- _ O
higher -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
through -X- _ O
its -X- _ O
interaction -X- _ O
with -X- _ O
receptor -X- _ O
MAS1 -X- _ O
, -X- _ O
anti-angiogenic -X- _ O
and -X- _ O
anti-inflammatory -X- _ O
processes -X- _ O
can -X- _ O
be -X- _ O
induced -X- _ O
( -X- _ O
24-27 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
as -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
secreted -X- _ O
increased -X- _ O
quantities -X- _ O
of -X- _ O
IL-6 -X- _ O
when -X- _ O
exposed -X- _ O
to -X- _ O
hyperglycemia -X- _ O
and -X- _ O
angiotensin -X- _ O
II -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
pro-inflammatory -X- _ O
axis -X- _ O
seems -X- _ O
to -X- _ O
exceed -X- _ O
the -X- _ O
anti-inflammatory -X- _ O
response. -X- _ O
A -X- _ O
similar -X- _ O
inflammatory -X- _ O
response -X- _ O
to -X- _ O
angiotensin -X- _ O
II -X- _ O
was -X- _ O
also -X- _ O
observed -X- _ O
after -X- _ O
additional -X- _ O
exposure -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
to -X- _ O
hyperglycemia -X- _ O
plus -X- _ O
hypoxia -X- _ O
, -X- _ O
as -X- _ O
the -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
IL-6 -X- _ O
mRNA -X- _ O
was -X- _ O
substantially -X- _ O
upregulated. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
observed -X- _ O
lower -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
ACE -X- _ O
mRNA -X- _ O
is -X- _ O
in -X- _ O
line -X- _ O
with -X- _ O
an -X- _ O
assumed -X- _ O
capacity -X- _ O
of -X- _ O
MIO-M1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
to -X- _ O
counteract -X- _ O
angiotensin -X- _ O
II-induced -X- _ O
pro-inflammatory -X- _ O
signaling. -X- _ O
In -X- _ O
vivo -X- _ O
, -X- _ O
Mueller -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
, -X- _ O
retinal -X- _ O
endothelial -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
, -X- _ O
and -X- _ O
retinal -X- _ B-CELL_CONTEXT
pericytes -X- _ B-CELL
form -X- _ O
the -X- _ O
so-called -X- _ O
neurovascular -X- _ O
unit -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
tightly -X- _ O
regulates -X- _ O
vascular -X- _ O
homeostasis -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
retina -X- _ B-TISSUE
( -X- _ O
45 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Whether -X- _ O
the -X- _ O
cellular -X- _ O
interactions -X- _ O
change -X- _ O
their -X- _ O
individual -X- _ O
responses -X- _ O
to -X- _ O
angiotensin -X- _ O
II -X- _ O
could -X- _ O
not -X- _ O
be -X- _ O
evaluated -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
present -X- _ O
study. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
inhibitors -X- _ O
of -X- _ O
ACE -X- _ O
or -X- _ O
AT1 -X- _ O
were -X- _ O
found -X- _ O
to -X- _ O
, -X- _ O
at -X- _ O
least -X- _ O
in -X- _ O
part -X- _ O
, -X- _ O
improve -X- _ O
the -X- _ O
outcomes -X- _ O
of -X- _ O
DME -X- _ O
in -X- _ O
diabetic -X- _ O
patients -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
supports -X- _ O
the -X- _ O
findings -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
present -X- _ O
study -X- _ O
that -X- _ O
Mueller -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
likely -X- _ O
contribute -X- _ O
to -X- _ O
angiotensin -X- _ O
II-mediated -X- _ O
inflammatory -X- _ O
responses -X- _ O
present -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
early -X- _ O
development -X- _ O
of -X- _ O
this -X- _ O
disease -X- _ O
( -X- _ O
46,47 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
In -X- _ O
contrast -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
impact -X- _ O
of -X- _ O
Mueller -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
on -X- _ O
angiotensin -X- _ O
II-mediated -X- _ O
inflammatory -X- _ O
responses -X- _ O
observed -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
early -X- _ O
development -X- _ O
of -X- _ O
RVO -X- _ O
is -X- _ O
likely -X- _ O
low -X- _ O
when -X- _ O
hypoxia -X- _ O
plays -X- _ O
a -X- _ O
dominant -X- _ O
role -X- _ O
accompanied -X- _ O
by -X- _ O
induction -X- _ O
of -X- _ O
expression -X- _ O
and -X- _ O
secretion -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
angiogenic -X- _ O
and -X- _ O
permeability-inducing -X- _ O
growth -X- _ O
factor -X- _ O
VEGF-A -X- _ O
( -X- _ O
9 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
In -X- _ O
conclusion -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
results -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
present -X- _ O
in -X- _ O
vitro -X- _ O
study -X- _ O
provide -X- _ O
evidence -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
responses -X- _ O
of -X- _ O
Mueller -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
to -X- _ O
activation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
RAAS -X- _ O
by -X- _ O
angiotensin -X- _ O
II -X- _ O
depend -X- _ O
on -X- _ O
the -X- _ O
environment -X- _ O
: -X- _ O
A -X- _ O
pro-inflammatory -X- _ O
response -X- _ O
is -X- _ O
observed -X- _ O
under -X- _ O
hyperglycemic -X- _ O
( -X- _ O
plus -X- _ O
hypoxic -X- _ O
) -X- _ O
conditions -X- _ O
, -X- _ O
whereas -X- _ O
changes -X- _ O
induced -X- _ O
by -X- _ O
hypoxia -X- _ O
are -X- _ O
not -X- _ O
modulated -X- _ O
by -X- _ O
angiotensin -X- _ O
II. -X- _ O
Source -X- _ O
paper -X- _ O
: -X- _ O
PMC10442740 -X- _ O

Introduction -X- _ O
The -X- _ O
introduction -X- _ O
of -X- _ O
antiretroviral -X- _ O
therapy -X- _ O
( -X- _ O
ART -X- _ O
) -X- _ O
has -X- _ O
successfully -X- _ O
limited -X- _ O
the -X- _ O
spread -X- _ O
of -X- _ O
Human -X- _ O
Immunodeficiency -X- _ O
Virus -X- _ O
( -X- _ O
HIV -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
improved -X- _ O
patient -X- _ O
clinical -X- _ O
outcomes. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
complete -X- _ O
cure -X- _ O
for -X- _ O
HIV -X- _ O
infection -X- _ O
remains -X- _ O
out -X- _ O
of -X- _ O
reach -X- _ O
, -X- _ O
as -X- _ O
the -X- _ O
transcriptionally -X- _ O
silent -X- _ O
but -X- _ O
replication-competent -X- _ O
provirus -X- _ O
that -X- _ O
is -X- _ O
integrated -X- _ O
into -X- _ O
the -X- _ O
host -X- _ O
genome -X- _ O
persists -X- _ O
in -X- _ O
long-lived -X- _ O
cellular -X- _ O
reservoirs -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
are -X- _ O
comprised -X- _ O
of -X- _ O
memory-resting -X- _ O
CD4+ -X- _ O
T -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
, -X- _ O
as -X- _ O
well -X- _ O
as -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
of -X- _ O
myeloid -X- _ O
lineages -X- _ O
[ -X- _ O
1,2 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
These -X- _ O
reservoirs -X- _ O
are -X- _ O
highly -X- _ O
stable -X- _ O
and -X- _ O
are -X- _ O
resistant -X- _ O
to -X- _ O
both -X- _ O
ART -X- _ O
and -X- _ O
the -X- _ O
effects -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
host -X- _ O
immune -X- _ O
surveillance -X- _ O
, -X- _ O
thus -X- _ O
posing -X- _ O
a -X- _ O
significant -X- _ O
obstacle -X- _ O
to -X- _ O
eradicating -X- _ O
the -X- _ O
HIV -X- _ O
reservoirs. -X- _ O
Consequently -X- _ O
, -X- _ O
in -X- _ O
most -X- _ O
people -X- _ O
living -X- _ O
with -X- _ O
HIV -X- _ O
, -X- _ O
interrupting -X- _ O
ART -X- _ O
leads -X- _ O
to -X- _ O
rapid -X- _ O
viral -X- _ O
load -X- _ O
rebound -X- _ O
, -X- _ O
usually -X- _ O
within -X- _ O
weeks -X- _ O
after -X- _ O
treatment -X- _ O
cessation -X- _ O
[ -X- _ O
3–6 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
As -X- _ O
T -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
stimulation -X- _ O
triggers -X- _ O
activation -X- _ O
of -X- _ O
proviral -X- _ O
transcription -X- _ O
, -X- _ O
one -X- _ O
strategy -X- _ O
that -X- _ O
has -X- _ O
been -X- _ O
proposed -X- _ O
to -X- _ O
eliminate -X- _ O
the -X- _ O
HIV -X- _ O
reservoirs -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
“Shock-and-Kill” -X- _ O
approach -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
utilizes -X- _ O
latency-reversing -X- _ O
agents -X- _ O
( -X- _ O
LRAs -X- _ O
) -X- _ O
to -X- _ O
first -X- _ O
activate -X- _ O
dormant -X- _ O
HIV-infected -X- _ O
T -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
and -X- _ O
facilitate -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
death -X- _ O
by -X- _ O
viral -X- _ O
cytopathic -X- _ O
effects -X- _ O
or -X- _ O
immune-mediated -X- _ O
killing. -X- _ O
This -X- _ O
step -X- _ O
is -X- _ O
done -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
presence -X- _ O
of -X- _ O
ART -X- _ O
, -X- _ O
so -X- _ O
there -X- _ O
are -X- _ O
no -X- _ O
further -X- _ O
rounds -X- _ O
of -X- _ O
HIV -X- _ O
replication. -X- _ O
[ -X- _ O
7–9 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Alternatively -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
“Block -X- _ O
and -X- _ O
Lock” -X- _ O
approach -X- _ O
frees -X- _ O
infected -X- _ O
individuals -X- _ O
from -X- _ O
ART -X- _ O
by -X- _ O
silencing -X- _ O
HIV -X- _ O
transcription -X- _ O
and -X- _ O
inducing -X- _ O
a -X- _ O
deep -X- _ O
state -X- _ O
of -X- _ O
latency. -X- _ O
Nevertheless -X- _ O
, -X- _ O
despite -X- _ O
promising -X- _ O
therapeutic -X- _ O
options -X- _ O
, -X- _ O
these -X- _ O
strategies -X- _ O
and -X- _ O
others -X- _ O
have -X- _ O
regretfully -X- _ O
failed -X- _ O
to -X- _ O
achieve -X- _ O
significant -X- _ O
clinical -X- _ O
efficacy. -X- _ O
These -X- _ O
failures -X- _ O
highlight -X- _ O
our -X- _ O
lack -X- _ O
of -X- _ O
knowledge -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
molecular -X- _ O
mechanisms -X- _ O
that -X- _ O
govern -X- _ O
latency -X- _ O
establishment -X- _ O
and -X- _ O
reversal -X- _ O
and -X- _ O
the -X- _ O
need -X- _ O
for -X- _ O
alternative -X- _ O
therapies -X- _ O
capable -X- _ O
of -X- _ O
eliminating -X- _ O
the -X- _ O
viral -X- _ O
reservoirs -X- _ O
[ -X- _ O
10–15 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Epigenetic -X- _ O
constraints -X- _ O
that -X- _ O
suppress -X- _ O
proviral -X- _ O
gene -X- _ O
transcription -X- _ O
are -X- _ O
essential -X- _ O
for -X- _ O
establishing -X- _ O
HIV -X- _ O
latency -X- _ O
[ -X- _ O
16,17 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Low -X- _ O
levels -X- _ O
of -X- _ O
basal -X- _ O
and -X- _ O
elongating -X- _ O
transcription -X- _ O
factors -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
infected -X- _ O
T -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
, -X- _ O
together -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
absence -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
viral -X- _ O
trans-activator -X- _ O
of -X- _ O
transcription -X- _ O
( -X- _ O
Tat -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
ensure -X- _ O
that -X- _ O
proviral -X- _ O
transcription -X- _ O
remains -X- _ O
below -X- _ O
detectable -X- _ O
thresholds -X- _ O
[ -X- _ O
18,19 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Within -X- _ O
the -X- _ O
infected -X- _ O
T -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
, -X- _ O
gene -X- _ O
transcription -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
integrated -X- _ O
provirus -X- _ O
and -X- _ O
the -X- _ O
host -X- _ O
genome -X- _ O
are -X- _ O
synchronized -X- _ O
[ -X- _ O
20,21 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Both -X- _ O
display -X- _ O
key -X- _ O
steps -X- _ O
of -X- _ O
gene -X- _ O
transcription -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
include -X- _ O
initiation -X- _ O
, -X- _ O
promoter -X- _ O
arrest -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
elongation. -X- _ O
HIV-Tat -X- _ O
orchestrates -X- _ O
transcription -X- _ O
elongation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
provirus -X- _ O
by -X- _ O
binding -X- _ O
to -X- _ O
TAR -X- _ O
RNA -X- _ O
and -X- _ O
recruiting -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
and -X- _ O
Super -X- _ O
Elongation -X- _ O
Complex -X- _ O
( -X- _ O
SEC -X- _ O
) -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
viral -X- _ O
promoter -X- _ O
[ -X- _ O
22–26 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
despite -X- _ O
extensive -X- _ O
efforts -X- _ O
to -X- _ O
elucidate -X- _ O
the -X- _ O
mechanisms -X- _ O
of -X- _ O
metazoan -X- _ O
transcriptional -X- _ O
control -X- _ O
and -X- _ O
its -X- _ O
role -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
regulation -X- _ O
of -X- _ O
HIV -X- _ O
gene -X- _ O
transcription -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
knowledge -X- _ O
of -X- _ O
how -X- _ O
HIV -X- _ O
latency -X- _ O
is -X- _ O
established -X- _ O
is -X- _ O
still -X- _ O
incomplete -X- _ O
[ -X- _ O
27 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Long -X- _ O
non-coding -X- _ O
RNAs -X- _ O
( -X- _ O
lncRNAs -X- _ O
) -X- _ O
are -X- _ O
transcripts -X- _ O
with -X- _ O
longer -X- _ O
than -X- _ O
200 -X- _ O
nucleotides -X- _ O
that -X- _ O
lack -X- _ O
protein-coding -X- _ O
capacity. -X- _ O
To -X- _ O
date -X- _ O
, -X- _ O
over -X- _ O
200,000 -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
type-specific -X- _ O
lncRNAs -X- _ O
have -X- _ O
been -X- _ O
identified -X- _ O
and -X- _ O
display -X- _ O
critical -X- _ O
regulatory -X- _ O
functions -X- _ O
of -X- _ O
many -X- _ O
processes -X- _ O
within -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
[ -X- _ O
28–31 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
functions -X- _ O
of -X- _ O
most -X- _ O
of -X- _ O
these -X- _ O
transcripts -X- _ O
remain -X- _ O
poorly -X- _ O
understood. -X- _ O
In -X- _ O
the -X- _ O
context -X- _ O
of -X- _ O
HIV -X- _ O
, -X- _ O
roles -X- _ O
for -X- _ O
several -X- _ O
cellular -X- _ O
lncRNAs -X- _ O
have -X- _ O
been -X- _ O
documented -X- _ O
[ -X- _ O
32–40 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Moreover -X- _ O
, -X- _ O
significant -X- _ O
gaps -X- _ O
still -X- _ O
remain -X- _ O
in -X- _ O
our -X- _ O
knowledge -X- _ O
about -X- _ O
the -X- _ O
mechanistic -X- _ O
roles -X- _ O
that -X- _ O
lncRNAs -X- _ O
play -X- _ O
in -X- _ O
CD4 -X- _ O
T -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
activation -X- _ O
and -X- _ O
HIV -X- _ O
latency. -X- _ O
In -X- _ O
this -X- _ O
study -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
monitored -X- _ O
changes -X- _ O
in -X- _ O
gene -X- _ O
expression -X- _ O
in -X- _ O
an -X- _ O
HIV-infected -X- _ O
Jurkat-derived -X- _ B-CELL
T -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
line -X- _ I-CELL
( -X- _ O
J-Lat -X- _ O
6.3 -X- _ O
) -X- _ O
upon -X- _ O
response -X- _ O
to -X- _ O
T -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
stimulation -X- _ O
with -X- _ O
Phorbol -X- _ O
12-myristate -X- _ O
13-acetate—PMA -X- _ O
/ -X- _ O
Ionomycin -X- _ O
( -X- _ O
P -X- _ O
/ -X- _ O
I -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
We -X- _ O
documented -X- _ O
RNA -X- _ O
expression -X- _ O
in -X- _ O
stimulated -X- _ O
J-Lat -X- _ O
6.3 -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
that -X- _ O
carry -X- _ O
either -X- _ O
active -X- _ O
or -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
latent -X- _ O
HIV -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
among -X- _ O
identified -X- _ O
ncRNA -X- _ O
, -X- _ O
Cytoskeleton -X- _ O
Regulator -X- _ O
RNA -X- _ O
( -X- _ O
CYTOR -X- _ O
) -X- _ O
exhibited -X- _ O
a -X- _ O
profound -X- _ O
change -X- _ O
in -X- _ O
expression -X- _ O
in -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
that -X- _ O
expressed -X- _ O
active -X- _ O
HIV -X- _ O
following -X- _ O
T -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
stimulation. -X- _ O
CYTOR -X- _ O
directly -X- _ O
binds -X- _ O
the -X- _ O
HIV -X- _ O
promoter -X- _ O
and -X- _ O
activates -X- _ O
viral -X- _ O
gene -X- _ O
transcription -X- _ O
and -X- _ O
latency -X- _ O
reversal -X- _ O
by -X- _ O
recruiting -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
viral -X- _ O
promoter. -X- _ O
CYTOR -X- _ O
also -X- _ O
exerts -X- _ O
its -X- _ O
effects -X- _ O
indirectly -X- _ O
by -X- _ O
controlling -X- _ O
global -X- _ O
gene -X- _ O
expression -X- _ O
along -X- _ O
with -X- _ O
actin -X- _ O
dynamic -X- _ O
pathways -X- _ O
, -X- _ O
thereby -X- _ O
affecting -X- _ O
T -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
activation -X- _ O
and -X- _ O
HIV -X- _ O
infection. -X- _ O
Results -X- _ O
Discussion -X- _ O
In -X- _ O
search -X- _ O
of -X- _ O
regulators -X- _ O
of -X- _ O
HIV -X- _ O
latency -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
profiled -X- _ O
changes -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
ncRNAs -X- _ O
by -X- _ O
employing -X- _ O
RNA-Seq -X- _ O
analysis -X- _ O
in -X- _ O
resting -X- _ O
and -X- _ O
stimulated -X- _ O
HIV-infected -X- _ O
J-Lat -X- _ O
6.3 -X- _ O
T -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
, -X- _ O
comparing -X- _ O
RNA -X- _ O
expression -X- _ O
levels -X- _ O
in -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
that -X- _ O
carry -X- _ O
active -X- _ O
HIV -X- _ O
( -X- _ O
GFP+ -X- _ O
) -X- _ O
or -X- _ O
latent -X- _ O
HIV -X- _ O
( -X- _ O
GFP- -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Our -X- _ O
analysis -X- _ O
show -X- _ O
that -X- _ O
different -X- _ O
transcriptional -X- _ O
profiles -X- _ O
exist -X- _ O
in -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
where -X- _ O
HIV -X- _ O
is -X- _ O
activated -X- _ O
versus -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
where -X- _ O
it -X- _ O
remains -X- _ O
latent. -X- _ O
CYTOR -X- _ O
lncRNA -X- _ O
was -X- _ O
identified -X- _ O
as -X- _ O
one -X- _ O
of -X- _ O
these -X- _ O
RNAs -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
its -X- _ O
expression -X- _ O
is -X- _ O
elevated -X- _ O
upon -X- _ O
T -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
stimulation -X- _ O
, -X- _ O
where -X- _ O
HIV -X- _ O
is -X- _ O
active. -X- _ O
These -X- _ O
observations -X- _ O
were -X- _ O
further -X- _ O
confirmed -X- _ O
in -X- _ O
primary -X- _ O
CD4+ -X- _ O
T -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
( -X- _ O
Fig -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Functional -X- _ O
analyses -X- _ O
show -X- _ O
that -X- _ O
following -X- _ O
T -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
stimulation -X- _ O
, -X- _ O
over-expression -X- _ O
of -X- _ O
CYTOR -X- _ O
activates -X- _ O
HIV -X- _ O
gene -X- _ O
expression -X- _ O
, -X- _ O
while -X- _ O
its -X- _ O
depletion -X- _ O
inhibits -X- _ O
viral -X- _ O
gene -X- _ O
expression. -X- _ O
Significantly -X- _ O
, -X- _ O
upon -X- _ O
T -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
stimulation -X- _ O
, -X- _ O
depletion -X- _ O
of -X- _ O
CYTOR -X- _ O
promoted -X- _ O
entry -X- _ O
of -X- _ O
HIV -X- _ O
into -X- _ O
a -X- _ O
latent -X- _ O
state -X- _ O
, -X- _ O
while -X- _ O
its -X- _ O
over-expression -X- _ O
delayed -X- _ O
entry -X- _ O
into -X- _ O
latency -X- _ O
and -X- _ O
enhanced -X- _ O
latency -X- _ O
reversal -X- _ O
( -X- _ O
Fig -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Effects -X- _ O
of -X- _ O
CYTOR -X- _ O
on -X- _ O
HIV -X- _ O
infection -X- _ O
and -X- _ O
latency -X- _ O
establishment -X- _ O
were -X- _ O
also -X- _ O
confirmed -X- _ O
in -X- _ O
stimulated -X- _ O
primary -X- _ O
CD4+ -X- _ O
T -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
( -X- _ O
Fig -X- _ O
3 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
We -X- _ O
are -X- _ O
aware -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
model -X- _ O
of -X- _ O
stimulated -X- _ O
CD4+ -X- _ O
primary -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
does -X- _ O
not -X- _ O
recapitulate -X- _ O
the -X- _ O
actual -X- _ O
state -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
reservoir -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
is -X- _ O
mainly -X- _ O
comprise -X- _ O
of -X- _ O
resting -X- _ O
CD4+ -X- _ O
T -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
that -X- _ O
do -X- _ O
not -X- _ O
support -X- _ O
HIV -X- _ O
infection. -X- _ O
As -X- _ O
this -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
limitation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
current -X- _ O
study -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
are -X- _ O
trying -X- _ O
to -X- _ O
adopt -X- _ O
a -X- _ O
recently -X- _ O
developed -X- _ O
gene -X- _ O
editing -X- _ O
approach -X- _ O
to -X- _ O
lncRNAs -X- _ O
to -X- _ O
deplete -X- _ O
CYTOR -X- _ O
in -X- _ O
this -X- _ O
unique -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
population -X- _ O
and -X- _ O
monitor -X- _ O
the -X- _ O
effects -X- _ O
of -X- _ O
latency -X- _ O
kinetics -X- _ O
without -X- _ O
altering -X- _ O
its -X- _ O
activation -X- _ O
[ -X- _ O
56 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Mechanistically -X- _ O
, -X- _ O
our -X- _ O
observations -X- _ O
show -X- _ O
that -X- _ O
CYTOR -X- _ O
directly -X- _ O
binds -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
HIV -X- _ O
promoter -X- _ O
and -X- _ O
enhances -X- _ O
the -X- _ O
phosphorylation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
Ser2 -X- _ O
CTD -X- _ O
of -X- _ O
RNAPII -X- _ O
through -X- _ O
association -X- _ O
with -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
to -X- _ O
activate -X- _ O
viral -X- _ O
gene -X- _ O
expression -X- _ O
( -X- _ O
Figs -X- _ O
4 -X- _ O
and -X- _ O
5 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Changes -X- _ O
in -X- _ O
histone -X- _ O
activation -X- _ O
marks -X- _ O
around -X- _ O
the -X- _ O
viral -X- _ O
promoter -X- _ O
in -X- _ O
CYTOR-depleted -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
also -X- _ O
imply -X- _ O
that -X- _ O
CYTOR -X- _ O
activates -X- _ O
the -X- _ O
proviral -X- _ O
gene -X- _ O
expression -X- _ O
( -X- _ O
Fig -X- _ O
4 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
In -X- _ O
addition -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
direct -X- _ O
effects -X- _ O
of -X- _ O
CYTOR -X- _ O
on -X- _ O
HIV -X- _ O
gene -X- _ O
expression -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
also -X- _ O
demonstrate -X- _ O
that -X- _ O
CYTOR -X- _ O
controls -X- _ O
global -X- _ O
gene -X- _ O
expression. -X- _ O
CYTOR -X- _ O
is -X- _ O
recruited -X- _ O
to -X- _ O
other -X- _ O
gene -X- _ O
promoters -X- _ O
that -X- _ O
are -X- _ O
regulated -X- _ O
by -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
, -X- _ O
like -X- _ O
myc -X- _ O
, -X- _ O
NF-κB -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
IL2Ra -X- _ O
( -X- _ O
S3 -X- _ O
Fig -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Among -X- _ O
the -X- _ O
identified -X- _ O
enriched -X- _ O
pathways -X- _ O
that -X- _ O
potentially -X- _ O
are -X- _ O
regulated -X- _ O
by -X- _ O
CYTOR -X- _ O
are -X- _ O
those -X- _ O
that -X- _ O
are -X- _ O
involved -X- _ O
in -X- _ O
actin -X- _ O
dynamics. -X- _ O
Consistently -X- _ O
, -X- _ O
reduced -X- _ O
levels -X- _ O
of -X- _ O
CYTOR -X- _ O
expression -X- _ O
are -X- _ O
associated -X- _ O
with -X- _ O
reduced -X- _ O
polymerization -X- _ O
of -X- _ O
cortical -X- _ O
actin -X- _ O
in -X- _ O
response -X- _ O
to -X- _ O
TCR -X- _ O
engagement -X- _ O
( -X- _ O
Fig -X- _ O
6 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
In -X- _ O
turn -X- _ O
, -X- _ O
elevated -X- _ O
levels -X- _ O
of -X- _ O
CYTOR -X- _ O
do -X- _ O
not -X- _ O
further -X- _ O
increase -X- _ O
actin -X- _ O
polymerization -X- _ O
in -X- _ O
response -X- _ O
to -X- _ O
T -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
stimulation -X- _ O
and -X- _ O
can -X- _ B-CELL
not -X- _ I-CELL
induce -X- _ O
morphological -X- _ O
responses -X- _ O
of -X- _ O
T -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
in -X- _ O
the -X- _ O
absence -X- _ O
of -X- _ O
stimulation -X- _ O
( -X- _ O
S5 -X- _ O
Fig -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Thus -X- _ O
, -X- _ O
CYTOR -X- _ O
is -X- _ O
an -X- _ O
important -X- _ O
regulator -X- _ O
of -X- _ O
TCR-induced -X- _ O
actin -X- _ O
polymerization -X- _ O
in -X- _ O
T -X- _ B-CELL
cells. -X- _ I-CELL
However -X- _ O
, -X- _ O
its -X- _ O
normal -X- _ O
endogenous -X- _ O
expression -X- _ O
levels -X- _ O
are -X- _ O
sufficient -X- _ O
for -X- _ O
a -X- _ O
proper -X- _ O
response. -X- _ O
To -X- _ O
test -X- _ O
a -X- _ O
mechanistic -X- _ O
link -X- _ O
between -X- _ O
actin -X- _ O
remodeling -X- _ O
, -X- _ O
CYTOR -X- _ O
levels -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
HIV -X- _ O
gene -X- _ O
expression -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
inhibited -X- _ O
actin -X- _ O
dynamics -X- _ O
with -X- _ O
specific -X- _ O
inhibitors -X- _ O
( -X- _ O
Fig -X- _ O
6I -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Effects -X- _ O
of -X- _ O
inhibition -X- _ O
of -X- _ O
actin -X- _ O
polymerization -X- _ O
phenocopied -X- _ O
the -X- _ O
effect -X- _ O
of -X- _ O
CYTOR -X- _ O
depletion -X- _ O
on -X- _ O
HIV -X- _ O
gene -X- _ O
expression -X- _ O
, -X- _ O
suggesting -X- _ O
that -X- _ O
CYTOR -X- _ O
may -X- _ O
affect -X- _ O
HIV -X- _ O
gene -X- _ O
expression -X- _ O
by -X- _ O
the -X- _ O
regulation -X- _ O
of -X- _ O
genes -X- _ O
that -X- _ O
control -X- _ O
cellular -X- _ O
actin -X- _ O
dynamics -X- _ O
( -X- _ O
Fig -X- _ O
6I -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Accordingly -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
propose -X- _ O
a -X- _ O
model -X- _ O
where -X- _ O
CYTOR -X- _ O
exerts -X- _ O
its -X- _ O
effects -X- _ O
on -X- _ O
global -X- _ O
gene -X- _ O
expression -X- _ O
and -X- _ O
promotes -X- _ O
HIV -X- _ O
gene -X- _ O
expression -X- _ O
by -X- _ O
both -X- _ O
direct -X- _ O
and -X- _ O
indirect -X- _ O
effects -X- _ O
( -X- _ O
Fig -X- _ O
7 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
CYTOR -X- _ O
directly -X- _ O
binds -X- _ O
the -X- _ O
HIV -X- _ O
promoter -X- _ O
and -X- _ O
recruits -X- _ O
the -X- _ O
elongation -X- _ O
transcription -X- _ O
machinery -X- _ O
to -X- _ O
enhance -X- _ O
RNAPII -X- _ O
CTD -X- _ O
phosphorylation -X- _ O
and -X- _ O
deposition -X- _ O
of -X- _ O
active -X- _ O
histone -X- _ O
markers -X- _ O
around -X- _ O
the -X- _ O
HIV -X- _ O
promoter -X- _ O
, -X- _ O
ultimately -X- _ O
activating -X- _ O
HIV -X- _ O
gene -X- _ O
expression. -X- _ O
Indirectly -X- _ O
, -X- _ O
CYTOR -X- _ O
controls -X- _ O
gene -X- _ O
targets -X- _ O
that -X- _ O
regulate -X- _ O
actin -X- _ O
dynamics -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
nucleus -X- _ O
and -X- _ O
at -X- _ O
the -X- _ O
plasma -X- _ B-TISSUE
membrane -X- _ O
to -X- _ O
optimize -X- _ O
the -X- _ O
response -X- _ O
to -X- _ O
T -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
activation -X- _ O
, -X- _ O
presumably -X- _ O
via -X- _ O
the -X- _ O
regulation -X- _ O
of -X- _ O
cellular -X- _ O
gene -X- _ O
expression. -X- _ O
10.1371 -X- _ O
/ -X- _ O
journal.ppat.1012172.g007Fig -X- _ O
7***A -X- _ O
working -X- _ O
model -X- _ O
for -X- _ O
CYTOR -X- _ O
functions.*** -X- _ O
Following -X- _ O
T -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
activation -X- _ O
, -X- _ O
levels -X- _ O
of -X- _ O
CYTOR -X- _ O
are -X- _ O
elevated -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
nucleus. -X- _ O
CYTOR -X- _ O
is -X- _ O
recruited -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
HIV -X- _ O
promoter -X- _ O
and -X- _ O
binds -X- _ O
to -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
, -X- _ O
leading -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
activation -X- _ O
of -X- _ O
viral -X- _ O
gene -X- _ O
expression. -X- _ O
Cellular -X- _ O
genes -X- _ O
regulated -X- _ O
by -X- _ O
CYTOR -X- _ O
include -X- _ O
actin -X- _ O
remodeling -X- _ O
genes -X- _ O
that -X- _ O
promote -X- _ O
actin -X- _ O
polymerization -X- _ O
and -X- _ O
the -X- _ O
indirect -X- _ O
activation -X- _ O
of -X- _ O
HIV -X- _ O
gene -X- _ O
expression. -X- _ O
Like -X- _ O
CYTOR -X- _ O
, -X- _ O
other -X- _ O
lncRNAs -X- _ O
have -X- _ O
been -X- _ O
reported -X- _ O
to -X- _ O
occupy -X- _ O
the -X- _ O
HIV -X- _ O
promoter -X- _ O
and -X- _ O
modulate -X- _ O
its -X- _ O
activity -X- _ O
at -X- _ O
either -X- _ O
transcriptional -X- _ O
or -X- _ O
posttranscriptional -X- _ O
levels -X- _ O
[ -X- _ O
57 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Most -X- _ O
act -X- _ O
as -X- _ O
scaffolds -X- _ O
that -X- _ O
associate -X- _ O
with -X- _ O
other -X- _ O
transcriptional -X- _ O
activators -X- _ O
or -X- _ O
repressors -X- _ O
to -X- _ O
control -X- _ O
HIV -X- _ O
gene -X- _ O
expression -X- _ O
[ -X- _ O
35–39,58–60 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
In -X- _ O
the -X- _ O
case -X- _ O
of -X- _ O
CYTOR -X- _ O
, -X- _ O
its -X- _ O
effects -X- _ O
on -X- _ O
gene -X- _ O
expression -X- _ O
occur -X- _ O
by -X- _ O
recruiting -X- _ O
the -X- _ O
transcription -X- _ O
elongation -X- _ O
machinery -X- _ O
to -X- _ O
activate -X- _ O
gene -X- _ O
expression -X- _ O
, -X- _ O
either -X- _ O
from -X- _ O
the -X- _ O
viral -X- _ O
promoter -X- _ O
or -X- _ O
other -X- _ O
cellular -X- _ O
promoters. -X- _ O
It -X- _ O
will -X- _ O
be -X- _ O
essential -X- _ O
to -X- _ O
identify -X- _ O
other -X- _ O
partners -X- _ O
that -X- _ O
are -X- _ O
associated -X- _ O
with -X- _ O
CYTOR -X- _ O
lncRNA -X- _ O
and -X- _ O
control -X- _ O
HIV -X- _ O
promoter -X- _ O
activity. -X- _ O
As -X- _ O
we -X- _ O
also -X- _ O
aim -X- _ O
to -X- _ O
dissect -X- _ O
the -X- _ O
role -X- _ O
of -X- _ O
CYTOR -X- _ O
in -X- _ O
gene -X- _ O
expression -X- _ O
control -X- _ O
, -X- _ O
specifically -X- _ O
for -X- _ O
HIV -X- _ O
gene -X- _ O
regulation -X- _ O
, -X- _ O
it -X- _ O
will -X- _ O
be -X- _ O
essential -X- _ O
to -X- _ O
define -X- _ O
how -X- _ O
events -X- _ O
within -X- _ O
the -X- _ O
nucleus -X- _ O
are -X- _ O
regulated -X- _ O
by -X- _ O
CYTOR -X- _ O
and -X- _ O
translated -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
control -X- _ O
of -X- _ O
downstream -X- _ O
effector -X- _ O
functions -X- _ O
of -X- _ O
stimulated -X- _ O
T -X- _ B-CELL
cells. -X- _ I-CELL
Future -X- _ O
studies -X- _ O
will -X- _ O
further -X- _ O
identify -X- _ O
the -X- _ O
downstream -X- _ O
targets -X- _ O
of -X- _ O
CYTOR -X- _ O
that -X- _ O
control -X- _ O
actin -X- _ O
dynamics -X- _ O
upon -X- _ O
T-cell -X- _ B-CELL
activation. -X- _ O
As -X- _ O
additional -X- _ O
pathways -X- _ O
were -X- _ O
identified -X- _ O
by -X- _ O
our -X- _ O
RNA-seq -X- _ O
analysis -X- _ O
in -X- _ O
CYTOR-depleted -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
, -X- _ O
we -X- _ O
visualize -X- _ O
that -X- _ O
future -X- _ O
work -X- _ O
will -X- _ O
identify -X- _ O
novel -X- _ O
downstream -X- _ O
targets -X- _ O
of -X- _ O
CYTOR -X- _ O
and -X- _ O
elucidate -X- _ O
their -X- _ O
mechanisms -X- _ O
of -X- _ O
function -X- _ O
in -X- _ O
regulating -X- _ O
HIV -X- _ O
gene -X- _ O
expression -X- _ O
and -X- _ O
latency. -X- _ O
These -X- _ O
may -X- _ O
open -X- _ O
new -X- _ O
ways -X- _ O
for -X- _ O
developing -X- _ O
novel -X- _ O
therapeutic -X- _ O
tools -X- _ O
that -X- _ O
will -X- _ O
be -X- _ O
integrated -X- _ O
or -X- _ O
substitute -X- _ O
current -X- _ O
strategies -X- _ O
to -X- _ O
successfully -X- _ O
eliminate -X- _ O
the -X- _ O
HIV -X- _ O
reservoir. -X- _ O
Materials -X- _ O
and -X- _ O
methods -X- _ O
Analysis -X- _ O
of -X- _ O
actin -X- _ O
dynamics -X- _ O
in -X- _ O
response -X- _ O
to -X- _ O
t -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
activation -X- _ O
Actin -X- _ O
remodeling -X- _ O
in -X- _ O
response -X- _ O
to -X- _ O
T -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
receptor -X- _ O
( -X- _ O
TCR -X- _ O
) -X- _ O
engagement -X- _ O
was -X- _ O
monitored -X- _ O
by -X- _ O
forming -X- _ O
circumferential -X- _ O
F-actin -X- _ O
rings -X- _ O
as -X- _ O
previously -X- _ O
described -X- _ O
[ -X- _ O
61,62 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
In -X- _ O
brief -X- _ O
, -X- _ O
stimulatory -X- _ O
coverslips -X- _ O
were -X- _ O
prepared -X- _ O
by -X- _ O
coating -X- _ O
with -X- _ O
a -X- _ O
0.01 -X- _ O
% -X- _ O
poly-L-lysine -X- _ O
( -X- _ O
PLL -X- _ O
; -X- _ O
Sigma -X- _ O
) -X- _ O
solution -X- _ O
for -X- _ O
10 -X- _ O
minutes -X- _ O
at -X- _ O
room -X- _ O
temperature -X- _ O
, -X- _ O
followed -X- _ O
by -X- _ O
wet-chamber -X- _ O
incubation -X- _ O
for -X- _ O
3 -X- _ O
hours -X- _ O
at -X- _ O
37°C -X- _ O
with -X- _ O
7 -X- _ O
μg -X- _ O
/ -X- _ O
ml -X- _ O
anti-CD3 -X- _ O
antibody -X- _ O
( -X- _ O
50 -X- _ O
μl -X- _ O
per -X- _ O
coverslip -X- _ O
, -X- _ O
clone -X- _ O
HIT3a -X- _ O
against -X- _ O
CD3E -X- _ O
; -X- _ O
BD -X- _ O
Biosciences -X- _ O
) -X- _ O
in -X- _ O
phosphate-buffered -X- _ O
saline -X- _ O
( -X- _ O
PBS -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Stimulatory -X- _ O
coverslips -X- _ O
were -X- _ O
subsequently -X- _ O
washed -X- _ O
in -X- _ O
PBS -X- _ O
and -X- _ O
stored -X- _ O
at -X- _ O
4°C -X- _ O
in -X- _ O
PBS -X- _ O
until -X- _ O
use. -X- _ O
5x105 -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
per -X- _ O
anti-CD3-coated -X- _ O
coverslip -X- _ O
, -X- _ O
respectively -X- _ O
) -X- _ O
were -X- _ O
used -X- _ O
to -X- _ O
seed -X- _ O
coverslips -X- _ O
for -X- _ O
4 -X- _ O
minutes -X- _ O
to -X- _ O
allow -X- _ O
TCR-mediated -X- _ O
actin -X- _ O
ring -X- _ O
formation. -X- _ O
Cells -X- _ B-CELL
were -X- _ O
subsequently -X- _ O
fixed -X- _ O
in -X- _ O
3 -X- _ O
% -X- _ O
paraformaldehyde -X- _ O
for -X- _ O
15 -X- _ O
minutes -X- _ O
, -X- _ O
permeabilized -X- _ O
for -X- _ O
2 -X- _ O
minutes -X- _ O
in -X- _ O
0.1 -X- _ O
% -X- _ O
TritonX-100 -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
blocked -X- _ O
for -X- _ O
30 -X- _ O
minutes -X- _ O
in -X- _ O
1 -X- _ O
% -X- _ O
Fetal -X- _ O
Calf -X- _ O
Serum -X- _ B-TISSUE
( -X- _ O
FCS -X- _ O
) -X- _ O
in -X- _ O
PBS. -X- _ O
F-actin -X- _ O
was -X- _ O
visualized -X- _ O
with -X- _ O
tetramethyl -X- _ O
rhodamine -X- _ O
isothiocyanate -X- _ O
( -X- _ O
TRITC -X- _ O
) -X- _ O
-conjugated -X- _ O
phalloidin -X- _ O
( -X- _ O
1:1,000 -X- _ O
, -X- _ O
1 -X- _ O
hour -X- _ O
, -X- _ O
room -X- _ O
temperature -X- _ O
; -X- _ O
Sigma -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Samples -X- _ O
were -X- _ O
mounted -X- _ O
on -X- _ O
glass -X- _ O
slides -X- _ O
and -X- _ O
analyzed -X- _ O
by -X- _ O
epifluorescence -X- _ O
( -X- _ O
Olympus -X- _ O
IX81 -X- _ O
S1F-3 -X- _ O
, -X- _ O
cellM -X- _ O
software -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
confocal -X- _ O
( -X- _ O
spinning-disc -X- _ O
PerkinElmer -X- _ O
UltraView -X- _ O
VoX -X- _ O
, -X- _ O
Velocity -X- _ O
software -X- _ O
) -X- _ O
microscopes. -X- _ O
For -X- _ O
quantification -X- _ O
of -X- _ O
phenotype -X- _ O
frequencies -X- _ O
, -X- _ O
at -X- _ O
least -X- _ O
100 -X- _ O
transfected -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
were -X- _ O
counted. -X- _ O
Chromatin -X- _ O
immunoprecipitation -X- _ O
( -X- _ O
chip -X- _ O
) -X- _ O
analysis -X- _ O
Control -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
expressing -X- _ O
scramble -X- _ O
shRNA -X- _ O
or -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
where -X- _ O
CYTOR -X- _ O
expression -X- _ O
was -X- _ O
depleted -X- _ O
( -X- _ O
KD -X- _ O
) -X- _ O
were -X- _ O
cross-linked -X- _ O
with -X- _ O
1 -X- _ O
% -X- _ O
formaldehyde -X- _ O
for -X- _ O
10 -X- _ O
minutes -X- _ O
and -X- _ O
then -X- _ O
washed -X- _ O
with -X- _ O
PBS -X- _ O
and -X- _ O
reverse -X- _ O
cross-linked -X- _ O
with -X- _ O
glycine -X- _ O
( -X- _ O
125mM -X- _ O
; -X- _ O
5 -X- _ O
minutes -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Cells -X- _ B-CELL
were -X- _ O
then -X- _ O
lysed -X- _ O
for -X- _ O
10 -X- _ O
minutes -X- _ O
on -X- _ O
ice -X- _ O
in -X- _ O
130μl -X- _ O
sonication -X- _ O
buffer -X- _ O
( -X- _ O
20 -X- _ O
mM -X- _ O
Tris -X- _ O
pH-7.8 -X- _ O
, -X- _ O
2 -X- _ O
mM -X- _ O
EDTA -X- _ O
, -X- _ O
0,5 -X- _ O
% -X- _ O
SDS -X- _ O
, -X- _ O
0.5 -X- _ O
mM -X- _ O
phenylmethylsulfonyl -X- _ O
fluoride -X- _ O
( -X- _ O
PMSF -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
1 -X- _ O
% -X- _ O
protease -X- _ O
inhibitor -X- _ O
cocktail -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
the -X- _ O
nuclear -X- _ O
pellets -X- _ O
were -X- _ O
collected. -X- _ O
DNA -X- _ O
was -X- _ O
fragmented -X- _ O
by -X- _ O
sonication -X- _ O
at -X- _ O
the -X- _ O
following -X- _ O
settings -X- _ O
: -X- _ O
amplitude -X- _ O
20 -X- _ O
% -X- _ O
for -X- _ O
30 -X- _ O
cycles -X- _ O
at -X- _ O
10 -X- _ O
seconds -X- _ O
on -X- _ O
/ -X- _ O
10 -X- _ O
seconds -X- _ O
off. -X- _ O
Samples -X- _ O
were -X- _ O
centrifuged -X- _ O
( -X- _ O
15 -X- _ O
minutes -X- _ O
, -X- _ O
14,000 -X- _ O
rpm -X- _ O
, -X- _ O
4°C -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
soluble -X- _ O
chromatin -X- _ O
fraction -X- _ O
( -X- _ O
25 -X- _ O
μg -X- _ O
) -X- _ O
was -X- _ O
collected -X- _ O
and -X- _ O
immunoprecipitated -X- _ O
( -X- _ O
IP -X- _ O
) -X- _ O
overnight -X- _ O
at -X- _ O
4°C -X- _ O
on -X- _ O
a -X- _ O
rotating -X- _ O
wheel -X- _ O
in -X- _ O
IP -X- _ O
buffer -X- _ O
( -X- _ O
0.5 -X- _ O
% -X- _ O
Triton -X- _ O
X-100 -X- _ O
, -X- _ O
2 -X- _ O
mM -X- _ O
EDTA -X- _ O
, -X- _ O
20 -X- _ O
mM -X- _ O
Tris -X- _ O
pH-7.8 -X- _ O
, -X- _ O
150 -X- _ O
mM -X- _ O
NaCl -X- _ O
and -X- _ O
10 -X- _ O
% -X- _ O
glycerol -X- _ O
) -X- _ O
with -X- _ O
2.5 -X- _ O
μg -X- _ O
of -X- _ O
one -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
indicated -X- _ O
antibodies. -X- _ O
The -X- _ O
next -X- _ O
day -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
IP -X- _ O
material -X- _ O
was -X- _ O
incubated -X- _ O
with -X- _ O
25 -X- _ O
μl -X- _ O
dynabeads -X- _ O
protein -X- _ O
G -X- _ O
for -X- _ O
two -X- _ O
hours -X- _ O
to -X- _ O
ensure -X- _ O
the -X- _ O
binding -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
antibody -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
magnetic -X- _ O
beads. -X- _ O
DNA -X- _ O
was -X- _ O
eluted -X- _ O
with -X- _ O
freshly -X- _ O
prepared -X- _ O
elution -X- _ O
solution -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
% -X- _ O
SDS -X- _ O
and -X- _ O
0.1 -X- _ O
M -X- _ O
NaHCO3 -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
heated -X- _ O
at -X- _ O
65°C -X- _ O
overnight -X- _ O
to -X- _ O
reverse-crosslink -X- _ O
the -X- _ O
samples. -X- _ O
Precipitated -X- _ O
DNA -X- _ O
fragments -X- _ O
were -X- _ O
then -X- _ O
extracted -X- _ O
using -X- _ O
a -X- _ O
ChIP -X- _ O
DNA -X- _ O
clean -X- _ O
and -X- _ O
concentrator -X- _ O
kit -X- _ O
( -X- _ O
ZYMO -X- _ O
Research -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
HIV -X- _ O
DNA -X- _ O
levels -X- _ O
were -X- _ O
quantified -X- _ O
by -X- _ O
qPCR -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
primers -X- _ O
specifically -X- _ O
located -X- _ O
on -X- _ O
the -X- _ O
NFκB -X- _ O
region -X- _ O
at -X- _ O
the -X- _ O
HIV-LTR -X- _ O
promoter. -X- _ O
All -X- _ O
signals -X- _ O
were -X- _ O
normalized -X- _ O
relative -X- _ O
to -X- _ O
input -X- _ O
DNA. -X- _ O
ChIP -X- _ O
assays -X- _ O
were -X- _ O
also -X- _ O
performed -X- _ O
with -X- _ O
an -X- _ O
anti-rabbit -X- _ O
or -X- _ O
mouse -X- _ O
IgG -X- _ O
as -X- _ O
negative -X- _ O
control. -X- _ O
Primers -X- _ O
used -X- _ O
for -X- _ O
qpcr -X- _ O
analysis -X- _ O
Primers -X- _ O
on -X- _ O
the -X- _ O
HIV -X- _ O
promoter -X- _ O
: -X- _ O
NFκB -X- _ O
forward -X- _ O
: -X- _ O
5’ -X- _ O
- -X- _ O
AGGTTTGACAGCCGCCTA -X- _ O
-3’ -X- _ O
NFκB -X- _ O
Reverse -X- _ O
: -X- _ O
5’ -X- _ O
- -X- _ O
AGAGACCCAGTACAGGCAAAA -X- _ O
-3’ -X- _ O
gapdh -X- _ O
Forward -X- _ O
: -X- _ O
5’ -X- _ O
- -X- _ O
AGCCACATCGCTCAGACAC -X- _ O
-3’ -X- _ O
gapdh -X- _ O
Reverse -X- _ O
: -X- _ O
5’ -X- _ O
- -X- _ O
GCCCAAACGACCAAATCC -X- _ O
-3’ -X- _ O
Primers -X- _ O
for -X- _ O
CYTOR -X- _ O
: -X- _ O
Forward -X- _ O
: -X- _ O
5’- -X- _ O
AACTTGCCAGCCTCCATC -X- _ O
; -X- _ O
Reverse -X- _ O
: -X- _ O
5’- -X- _ O
GAGCTTCCTGTTTCATCTCCC -X- _ O
Primers -X- _ O
for -X- _ O
7SK -X- _ O
: -X- _ O
Forward -X- _ O
; -X- _ O
5‘- -X- _ O
GAGGGCGATCTGGCTGCGACAT -X- _ O
Reverse -X- _ O
: -X- _ O
5‘- -X- _ O
ACATGGAGCGGTGAGGGAGGAA -X- _ O
Source -X- _ O
paper -X- _ O
: -X- _ O
PMC11075828 -X- _ O

Results -X- _ O
Dcas9-targeted -X- _ O
hiv-1 -X- _ O
ltr-interactome -X- _ O
analysis -X- _ O
identified -X- _ O
prmt3 -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
ltr-binding -X- _ O
factor -X- _ O
Seeking -X- _ O
host -X- _ O
factors -X- _ O
that -X- _ O
specifically -X- _ O
associate -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
LTR -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
conducted -X- _ O
an -X- _ O
LTR-interacted -X- _ O
proteome -X- _ O
analysis -X- _ O
based -X- _ O
on -X- _ O
a -X- _ O
refined -X- _ O
version -X- _ O
of -X- _ O
a -X- _ O
previously -X- _ O
described -X- _ O
nuclease-deficient -X- _ O
Cas9 -X- _ O
( -X- _ O
dCas9 -X- _ O
) -X- _ O
-targeted -X- _ O
chromatin-based -X- _ O
purification -X- _ O
strategy -X- _ O
( -X- _ O
CLASP -X- _ O
) -X- _ O
( -X- _ O
Cas9 -X- _ O
locus-associated -X- _ O
proteome -X- _ O
) -X- _ O
( -X- _ O
Fig. -X- _ O
1a -X- _ O
) -X- _ O
33,34. -X- _ O
The -X- _ O
screen -X- _ O
used -X- _ O
NH1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
, -X- _ O
which -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
modified -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL_LINE
cell -X- _ I-CELL_LINE
line -X- _ I-CELL_LINE
that -X- _ O
harbors -X- _ O
an -X- _ O
integrated -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
LTR-driven -X- _ O
luciferase -X- _ O
reporter -X- _ O
gene -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
host -X- _ O
genome35 -X- _ O
( -X- _ O
Fig. -X- _ O
1b -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
To -X- _ O
get -X- _ O
the -X- _ O
most -X- _ O
effective -X- _ O
sgRNAs -X- _ O
that -X- _ O
target -X- _ O
LTR -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
used -X- _ O
two -X- _ O
methods -X- _ O
for -X- _ O
screening. -X- _ O
We -X- _ O
individually -X- _ O
inserted -X- _ O
the -X- _ O
sgRNAs -X- _ O
into -X- _ O
the -X- _ O
Cas9 -X- _ O
plasmid -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
was -X- _ O
then -X- _ O
co-transfected -X- _ O
with -X- _ O
a -X- _ O
Tat-expression -X- _ O
plasmid -X- _ O
into -X- _ O
NH1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
that -X- _ O
harbors -X- _ O
the -X- _ O
LTR-driven -X- _ O
luciferase -X- _ O
reporter -X- _ O
gene. -X- _ O
If -X- _ O
a -X- _ O
sgRNA-Cas9 -X- _ O
combination -X- _ O
can -X- _ O
target -X- _ O
and -X- _ O
disrupt -X- _ O
the -X- _ O
LTR -X- _ O
sequence -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
reduction -X- _ O
in -X- _ O
luciferase -X- _ O
activity -X- _ O
is -X- _ O
observed. -X- _ O
We -X- _ O
designed -X- _ O
seven -X- _ O
sgRNAs -X- _ O
targeting -X- _ O
different -X- _ O
regions -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
LTR -X- _ O
( -X- _ O
Fig. -X- _ O
1b -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
An -X- _ O
sgRNA -X- _ O
targeting -X- _ O
the -X- _ O
yeast -X- _ O
Gal4 -X- _ O
gene -X- _ O
was -X- _ O
used -X- _ O
as -X- _ O
the -X- _ O
negative -X- _ O
control. -X- _ O
Among -X- _ O
the -X- _ O
designed -X- _ O
sgLTRs -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
top -X- _ O
three -X- _ O
sgLTRs -X- _ O
( -X- _ O
# -X- _ O
5 -X- _ O
, -X- _ O
6 -X- _ O
, -X- _ O
7 -X- _ O
in -X- _ O
pink -X- _ O
, -X- _ O
Fig. -X- _ O
1b -X- _ O
) -X- _ O
exhibiting -X- _ O
the -X- _ O
capacity -X- _ O
to -X- _ O
attenuate -X- _ O
the -X- _ O
LTR -X- _ O
driven-luciferase -X- _ O
expression -X- _ O
activated -X- _ O
by -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
Tat -X- _ O
( -X- _ O
Fig. -X- _ O
1c -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Then -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
performed -X- _ O
anti-Flag -X- _ O
ChIP-qPCR -X- _ O
in -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
transfected -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
sgLTRs-dCas9-3 -X- _ O
× -X- _ O
Flag -X- _ O
plasmids -X- _ O
to -X- _ O
further -X- _ O
verify -X- _ O
the -X- _ O
abilities -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
sgLTRs -X- _ O
to -X- _ O
target -X- _ O
dCas9-3 -X- _ O
× -X- _ O
Flag -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
LTR -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
found -X- _ O
that -X- _ O
sgLTR-1 -X- _ O
and -X- _ O
-2 -X- _ O
failed -X- _ O
to -X- _ O
recruit -X- _ O
dCas9 -X- _ O
to -X- _ O
LTR -X- _ O
efficiently -X- _ O
( -X- _ O
Supplementary -X- _ O
Fig. -X- _ O
1a -X- _ O
, -X- _ O
b -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
sgLTR-5 -X- _ O
and -X- _ O
-6 -X- _ O
displayed -X- _ O
the -X- _ O
most -X- _ O
significant -X- _ O
effect -X- _ O
, -X- _ O
whereas -X- _ O
sgLTR-3 -X- _ O
, -X- _ O
-4 -X- _ O
and -X- _ O
-7 -X- _ O
all -X- _ O
displayed -X- _ O
a -X- _ O
similar -X- _ O
and -X- _ O
partial -X- _ O
effect -X- _ O
( -X- _ O
Supplementary -X- _ O
Fig. -X- _ O
1c -X- _ O
, -X- _ O
d -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Thus -X- _ O
, -X- _ O
sgLTR-5 -X- _ O
, -X- _ O
-6 -X- _ O
, -X- _ O
-7 -X- _ O
were -X- _ O
selected -X- _ O
for -X- _ O
subsequent -X- _ O
ChIP-qPCR -X- _ O
analysis. -X- _ O
By -X- _ O
utilizing -X- _ O
the -X- _ O
combination -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
three -X- _ O
sgRNAs -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
found -X- _ O
that -X- _ O
in -X- _ O
comparison -X- _ O
to -X- _ O
sgGal4 -X- _ O
, -X- _ O
these -X- _ O
sgRNAs -X- _ O
can -X- _ O
guide -X- _ O
dCas9 -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
LTR -X- _ O
as -X- _ O
revealed -X- _ O
by -X- _ O
ChIP-qPCR -X- _ O
analysis -X- _ O
( -X- _ O
Fig. -X- _ O
1d -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Next -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
performed -X- _ O
in -X- _ O
vitro -X- _ O
transcription -X- _ O
reactions -X- _ O
to -X- _ O
generate -X- _ O
these -X- _ O
sgRNAs -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
were -X- _ O
then -X- _ O
used -X- _ O
for -X- _ O
dCas9 -X- _ O
/ -X- _ O
sgRNAs -X- _ O
complex -X- _ O
formation. -X- _ O
This -X- _ O
complex -X- _ O
was -X- _ O
subsequently -X- _ O
incubated -X- _ O
with -X- _ O
sheared -X- _ O
chromatin -X- _ O
that -X- _ O
contained -X- _ O
the -X- _ O
LTR-bound -X- _ O
proteins -X- _ O
for -X- _ O
dCas9-3 -X- _ O
× -X- _ O
Flag -X- _ O
immunoprecipitation -X- _ O
, -X- _ O
following -X- _ O
with -X- _ O
mass -X- _ O
spectrometry -X- _ O
analysis.Fig. -X- _ O
1***dCas9-targeted -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
LTR-interactome -X- _ O
analysis -X- _ O
identified -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
LTR-binding -X- _ O
factor.*** -X- _ O
a -X- _ O
Schematic -X- _ O
of -X- _ O
dCas9-targeted -X- _ O
proteome -X- _ O
analysis -X- _ O
workflow. -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
sgRNAs -X- _ O
targeting -X- _ O
the -X- _ O
LTR -X- _ O
were -X- _ O
complex -X- _ O
formation -X- _ O
with -X- _ O
dCas9-3 -X- _ O
× -X- _ O
Flag -X- _ O
; -X- _ O
( -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
Crosslinking -X- _ O
of -X- _ O
proteins -X- _ O
bound -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
LTR -X- _ O
; -X- _ O
( -X- _ O
3 -X- _ O
) -X- _ O
dCas9-3 -X- _ O
× -X- _ O
Flag-sgRNA -X- _ O
complex -X- _ O
was -X- _ O
incubated -X- _ O
with -X- _ O
sheared -X- _ O
fragments -X- _ O
from -X- _ O
NH1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
that -X- _ O
stably -X- _ O
expressed -X- _ O
LTR-luciferase -X- _ O
reporter -X- _ O
; -X- _ O
( -X- _ O
4 -X- _ O
) -X- _ O
Immunoprecipitation -X- _ O
was -X- _ O
used -X- _ O
to -X- _ O
capture -X- _ O
LTR -X- _ O
bound -X- _ O
proteins -X- _ O
; -X- _ O
( -X- _ O
5 -X- _ O
) -X- _ O
LTR-interacted -X- _ O
proteins -X- _ O
were -X- _ O
identified -X- _ O
by -X- _ O
mass -X- _ O
spectrometry. -X- _ O
b -X- _ O
Schematic -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
position -X- _ O
of -X- _ O
7 -X- _ O
sgRNAs. -X- _ O
c -X- _ O
Luciferase -X- _ O
activity -X- _ O
was -X- _ O
measured -X- _ O
in -X- _ O
NH1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
transfected -X- _ O
with -X- _ O
a -X- _ O
plasmid -X- _ O
encoding -X- _ O
each -X- _ O
sgRNA -X- _ O
and -X- _ O
control -X- _ O
sgRNA -X- _ O
( -X- _ O
sgGal4 -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
expresses -X- _ O
the -X- _ O
Cas9 -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
presence -X- _ O
of -X- _ O
Tat -X- _ O
( -X- _ O
p -X- _ O
= -X- _ O
0.0016 -X- _ O
, -X- _ O
p -X- _ O
= -X- _ O
0.0024 -X- _ O
, -X- _ O
p -X- _ O
= -X- _ O
0.0042 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
d -X- _ O
ChIP-qPCR -X- _ O
analyses -X- _ O
were -X- _ O
conducted -X- _ O
to -X- _ O
assess -X- _ O
the -X- _ O
occupancy -X- _ O
of -X- _ O
3 -X- _ O
× -X- _ O
Flag-dCas9 -X- _ O
at -X- _ O
the -X- _ O
Promoter -X- _ O
( -X- _ O
Left -X- _ O
) -X- _ O
or -X- _ O
Nascent -X- _ O
region -X- _ O
( -X- _ O
Right -X- _ O
) -X- _ O
of -X- _ O
LTR -X- _ O
when -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
were -X- _ O
transfected -X- _ O
with -X- _ O
control -X- _ O
plasmid -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
mixture -X- _ O
of -X- _ O
plasmids -X- _ O
containing -X- _ O
sgLTRs-5 -X- _ O
, -X- _ O
6 -X- _ O
, -X- _ O
7 -X- _ O
or -X- _ O
the -X- _ O
sgGal4 -X- _ O
plasmid -X- _ O
( -X- _ O
Promoter -X- _ O
: -X- _ O
p -X- _ O
= -X- _ O
0.0009 -X- _ O
, -X- _ O
p -X- _ O
= -X- _ O
0.0011 -X- _ O
, -X- _ O
Nascent -X- _ O
: -X- _ O
p -X- _ O
= -X- _ O
0.000004 -X- _ O
, -X- _ O
p -X- _ O
= -X- _ O
0.000003 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
e -X- _ O
Proteins -X- _ O
showing -X- _ O
over -X- _ O
1.5-fold -X- _ O
enrichment -X- _ O
relative -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
control -X- _ O
sample -X- _ O
identified -X- _ O
from -X- _ O
3 -X- _ O
× -X- _ O
Flag-dCas9 -X- _ O
immunoprecipitation -X- _ O
following -X- _ O
by -X- _ O
mass -X- _ O
spectrometry -X- _ O
analysis -X- _ O
were -X- _ O
listed. -X- _ O
f -X- _ O
ChIP-qPCR -X- _ O
analyses -X- _ O
were -X- _ O
conducted -X- _ O
to -X- _ O
assess -X- _ O
the -X- _ O
occupancy -X- _ O
of -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
at -X- _ O
LTR-luciferase -X- _ O
region -X- _ O
( -X- _ O
p -X- _ O
= -X- _ O
0.0001 -X- _ O
, -X- _ O
p -X- _ O
= -X- _ O
0.0012 -X- _ O
, -X- _ O
p -X- _ O
= -X- _ O
0.0005 -X- _ O
, -X- _ O
p -X- _ O
= -X- _ O
0.0008 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
schematic -X- _ O
display -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
four -X- _ O
primers -X- _ O
was -X- _ O
shown -X- _ O
on -X- _ O
the -X- _ O
top -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
panel. -X- _ O
g -X- _ O
ChIP-qPCR -X- _ O
analyses -X- _ O
were -X- _ O
conducted -X- _ O
to -X- _ O
assess -X- _ O
the -X- _ O
occupancy -X- _ O
of -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
at -X- _ O
LTR-luciferase -X- _ O
regions -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
absence -X- _ O
or -X- _ O
presence -X- _ O
of -X- _ O
Tat -X- _ O
( -X- _ O
p -X- _ O
= -X- _ O
0.0022 -X- _ O
, -X- _ O
p -X- _ O
= -X- _ O
0.0012 -X- _ O
, -X- _ O
p -X- _ O
= -X- _ O
0.0045 -X- _ O
, -X- _ O
p -X- _ O
= -X- _ O
0.0017 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
h -X- _ O
CUT -X- _ O
& -X- _ O
Tag -X- _ O
sequencing -X- _ O
was -X- _ O
performed -X- _ O
in -X- _ O
primary -X- _ B-CELL_CONTEXT
CD4+ -X- _ I-CELL_CONTEXT
T -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
isolated -X- _ O
from -X- _ O
virologically -X- _ O
suppressed -X- _ O
HIV-1-infected -X- _ B-CELL_CONTEXT
patient -X- _ I-CELL_CONTEXT
cells -X- _ B-CELL
that -X- _ O
were -X- _ O
treated -X- _ O
with -X- _ O
PMA -X- _ O
, -X- _ O
by -X- _ O
using -X- _ O
IgG -X- _ O
or -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
antibody. -X- _ O
The -X- _ O
alignment -X- _ O
results -X- _ O
of -X- _ O
sequencing -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
genome -X- _ O
in -X- _ O
three -X- _ O
patients -X- _ O
were -X- _ O
displayed. -X- _ O
Error -X- _ O
bars -X- _ O
= -X- _ O
mean -X- _ O
+ -X- _ O
/ -X- _ O
− -X- _ O
SD -X- _ O
of -X- _ O
three -X- _ O
biological -X- _ O
replicates. -X- _ O
*p -X- _ O
p -X- _ O
p -X- _ O
t -X- _ O
test. -X- _ O
Source -X- _ O
data -X- _ O
are -X- _ O
provided -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
Source -X- _ O
Data -X- _ O
file. -X- _ O
Mass -X- _ O
spectrometry -X- _ O
detected -X- _ O
a -X- _ O
total -X- _ O
of -X- _ O
28 -X- _ O
proteins -X- _ O
with -X- _ O
at -X- _ O
least -X- _ O
1.5-fold -X- _ O
enrichment -X- _ O
relative -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
non-targeting -X- _ O
negative -X- _ O
control -X- _ O
( -X- _ O
Fig. -X- _ O
1e -X- _ O
and -X- _ O
Supplementary -X- _ O
Data -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
has -X- _ O
been -X- _ O
shown -X- _ O
to -X- _ O
function -X- _ O
in -X- _ O
transcriptional -X- _ O
regulation -X- _ O
and -X- _ O
antiviral -X- _ O
innate -X- _ O
immunity15,30,36 -X- _ O
, -X- _ O
was -X- _ O
among -X- _ O
the -X- _ O
hits -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
highest -X- _ O
fold -X- _ O
enrichment -X- _ O
of -X- _ O
sgLTR -X- _ O
/ -X- _ O
sgGal4 -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
was -X- _ O
therefore -X- _ O
selected -X- _ O
for -X- _ O
subsequent -X- _ O
investigation. -X- _ O
We -X- _ O
performed -X- _ O
ChIP-qPCR -X- _ O
analysis -X- _ O
to -X- _ O
examine -X- _ O
the -X- _ O
binding -X- _ O
of -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
LTR. -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
was -X- _ O
significantly -X- _ O
enriched -X- _ O
at -X- _ O
LTR-luciferase -X- _ O
reporter -X- _ O
region -X- _ O
( -X- _ O
Fig. -X- _ O
1f -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
can -X- _ O
be -X- _ O
further -X- _ O
increased -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
presence -X- _ O
of -X- _ O
Tat -X- _ O
( -X- _ O
Fig. -X- _ O
1g -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
binding -X- _ O
of -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
at -X- _ O
the -X- _ O
LTR -X- _ O
was -X- _ O
also -X- _ O
verified -X- _ O
in -X- _ O
Jurkat -X- _ B-CELL_LINE
2D10 -X- _ I-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
( -X- _ O
Supplementary -X- _ O
Fig. -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Notably -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
performed -X- _ O
Cleavage -X- _ O
Under -X- _ O
Targets -X- _ O
& -X- _ O
Tagmentation -X- _ O
( -X- _ O
CUT -X- _ O
& -X- _ O
Tag -X- _ O
) -X- _ O
sequencing -X- _ O
by -X- _ O
using -X- _ O
IgG -X- _ O
or -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
antibody -X- _ O
in -X- _ O
CD4+ -X- _ B-CELL_CONTEXT
T -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
isolated -X- _ O
from -X- _ O
HIV-1 -X- _ B-CELL_CONTEXT
infected -X- _ I-CELL_CONTEXT
patient -X- _ I-CELL_CONTEXT
cells -X- _ B-CELL
, -X- _ O
and -X- _ O
demonstrated -X- _ O
that -X- _ O
while -X- _ O
IgG -X- _ O
displayed -X- _ O
undetectable -X- _ O
signal -X- _ O
at -X- _ O
the -X- _ O
LTR -X- _ O
, -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
showed -X- _ O
significant -X- _ O
binding -X- _ O
signal -X- _ O
around -X- _ O
LTR -X- _ O
( -X- _ O
Fig. -X- _ O
1h -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Thus -X- _ O
, -X- _ O
these -X- _ O
results -X- _ O
demonstrated -X- _ O
that -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
is -X- _ O
an -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
LTR -X- _ O
binding -X- _ O
factor -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
is -X- _ O
further -X- _ O
enhanced -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
presence -X- _ O
of -X- _ O
Tat. -X- _ O
Discussion -X- _ O
The -X- _ O
elusive -X- _ O
nature -X- _ O
of -X- _ O
latent -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
reservoirs -X- _ O
presents -X- _ O
a -X- _ O
formidable -X- _ O
challenge -X- _ O
to -X- _ O
eradicating -X- _ O
the -X- _ O
virus -X- _ O
from -X- _ O
infected -X- _ O
individuals49–51. -X- _ O
Despite -X- _ O
the -X- _ O
various -X- _ O
strategies -X- _ O
employing -X- _ O
either -X- _ O
the -X- _ O
latency -X- _ O
reversal -X- _ O
agents -X- _ O
( -X- _ O
LRAs -X- _ O
) -X- _ O
or -X- _ O
latency -X- _ O
promoting -X- _ O
agents -X- _ O
( -X- _ O
LPAs -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
are -X- _ O
aimed -X- _ O
at -X- _ O
either -X- _ O
purging -X- _ O
or -X- _ O
deeply -X- _ O
silencing -X- _ O
the -X- _ O
latent -X- _ O
viral -X- _ O
reservoirs -X- _ O
, -X- _ O
these -X- _ O
agents -X- _ O
have -X- _ O
yet -X- _ O
to -X- _ O
be -X- _ O
made -X- _ O
into -X- _ O
effective -X- _ O
drugs -X- _ O
for -X- _ O
curing -X- _ O
HIV -X- _ O
/ -X- _ O
AIDS -X- _ O
and -X- _ O
targets -X- _ O
are -X- _ O
still -X- _ O
needed -X- _ O
for -X- _ O
the -X- _ O
development -X- _ O
of -X- _ O
therapies. -X- _ O
Furthermore -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
premise -X- _ O
of -X- _ O
using -X- _ O
the -X- _ O
current -X- _ O
and -X- _ O
future -X- _ O
versions -X- _ O
of -X- _ O
LRAs -X- _ O
or -X- _ O
LPAs -X- _ O
for -X- _ O
treating -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
hinges -X- _ O
on -X- _ O
the -X- _ O
potential -X- _ O
to -X- _ O
epigenetically -X- _ O
modulate -X- _ O
the -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
promoter -X- _ O
activity -X- _ O
, -X- _ O
aiming -X- _ O
for -X- _ O
a -X- _ O
sustained -X- _ O
activation -X- _ O
or -X- _ O
suppression -X- _ O
of -X- _ O
viral -X- _ O
transcription -X- _ O
, -X- _ O
respectively52–54. -X- _ O
The -X- _ O
significance -X- _ O
of -X- _ O
targeting -X- _ O
epigenetic -X- _ O
control -X- _ O
of -X- _ O
viral -X- _ O
transcription -X- _ O
was -X- _ O
highlighted -X- _ O
recently -X- _ O
in -X- _ O
a -X- _ O
human -X- _ O
clinical -X- _ O
trial -X- _ O
, -X- _ O
where -X- _ O
the -X- _ O
combination -X- _ O
of -X- _ O
panobinostat -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
potent -X- _ O
pan-histone -X- _ O
deacetylase -X- _ O
inhibitor -X- _ O
, -X- _ O
with -X- _ O
interferon-α2a -X- _ O
resulted -X- _ O
in -X- _ O
an -X- _ O
enhanced -X- _ O
vulnerability -X- _ O
of -X- _ O
latent -X- _ B-CELL_CONTEXT
HIV-1 -X- _ I-CELL_CONTEXT
reservoir -X- _ I-CELL_CONTEXT
cells -X- _ B-CELL
, -X- _ O
underscoring -X- _ O
the -X- _ O
pivotal -X- _ O
role -X- _ O
of -X- _ O
epigenetic -X- _ O
manipulation -X- _ O
in -X- _ O
combating -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
persistence2. -X- _ O
In -X- _ O
the -X- _ O
current -X- _ O
study -X- _ O
, -X- _ O
by -X- _ O
performing -X- _ O
the -X- _ O
dCas9-targeted -X- _ O
LTR -X- _ O
interactome -X- _ O
screening -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
have -X- _ O
identified -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
positive -X- _ O
regulator -X- _ O
to -X- _ O
promote -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
latency -X- _ O
reversal. -X- _ O
Mechanistically -X- _ O
, -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
activates -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
transcription -X- _ O
by -X- _ O
interaction -X- _ O
with -X- _ O
TEAD4 -X- _ O
and -X- _ O
the -X- _ O
two -X- _ O
proteins -X- _ O
co-localize -X- _ O
at -X- _ O
the -X- _ O
LTR -X- _ O
by -X- _ O
using -X- _ O
specific -X- _ O
TEAD4-binding -X- _ O
motifs -X- _ O
, -X- _ O
thereby -X- _ O
regulating -X- _ O
chromatin -X- _ O
accessibility -X- _ O
and -X- _ O
facilitating -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
/ -X- _ O
Tat -X- _ O
recruitment. -X- _ O
Thus -X- _ O
, -X- _ O
our -X- _ O
findings -X- _ O
propose -X- _ O
a -X- _ O
promising -X- _ O
epigenetic -X- _ O
strategy -X- _ O
to -X- _ O
combat -X- _ O
latent -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
infection -X- _ O
, -X- _ O
underscoring -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
and -X- _ O
its -X- _ O
partners -X- _ O
as -X- _ O
promising -X- _ O
therapeutic -X- _ O
targets -X- _ O
for -X- _ O
anti-HIV-1 -X- _ O
drug -X- _ O
development. -X- _ O
Our -X- _ O
study -X- _ O
demonstrates -X- _ O
TEAD4 -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
positive -X- _ O
regulator -X- _ O
of -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
transcription -X- _ O
, -X- _ O
acting -X- _ O
alongside -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
through -X- _ O
a -X- _ O
specific -X- _ O
interaction -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
LTR’s -X- _ O
GGAAT -X- _ O
motif. -X- _ O
This -X- _ O
discovery -X- _ O
expands -X- _ O
our -X- _ O
current -X- _ O
understanding -X- _ O
of -X- _ O
TEAD4’s -X- _ O
regulatory -X- _ O
roles -X- _ O
in -X- _ O
host -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
and -X- _ O
suggests -X- _ O
its -X- _ O
potential -X- _ O
regulation -X- _ O
of -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
viral -X- _ O
expression. -X- _ O
The -X- _ O
specificity -X- _ O
of -X- _ O
TEAD4’s -X- _ O
interaction -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
motif -X- _ O
containing -X- _ O
the -X- _ O
core -X- _ O
GGAAT -X- _ O
sequence -X- _ O
within -X- _ O
the -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
LTR -X- _ O
and -X- _ O
its -X- _ O
synergy -X- _ O
with -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
in -X- _ O
promoting -X- _ O
Tat-dependent -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
transcription -X- _ O
and -X- _ O
a -X- _ O
specific -X- _ O
subset -X- _ O
of -X- _ O
host -X- _ O
gene -X- _ O
transcription -X- _ O
is -X- _ O
particularly -X- _ O
intriguing -X- _ O
given -X- _ O
TEAD4’s -X- _ O
established -X- _ O
roles -X- _ O
in -X- _ O
cell -X- _ O
survival -X- _ O
, -X- _ O
proliferation -X- _ O
, -X- _ O
tissue -X- _ O
regeneration -X- _ O
, -X- _ O
stem -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
maintenance -X- _ O
, -X- _ O
embryonic -X- _ B-CELL_CONTEXT
trophoblast -X- _ B-CELL
and -X- _ O
organ -X- _ O
development -X- _ O
and -X- _ O
tumorigenesis9,11,13,14,55. -X- _ O
Specifically -X- _ O
, -X- _ O
we -X- _ O
selected -X- _ O
three -X- _ O
host -X- _ O
genes -X- _ O
, -X- _ O
PRDM1 -X- _ O
, -X- _ O
SLITRK5 -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
TGFB2 -X- _ O
, -X- _ O
for -X- _ O
further -X- _ O
validation -X- _ O
of -X- _ O
our -X- _ O
proposed -X- _ O
PRMT3-TEAD4 -X- _ O
regulation -X- _ O
model. -X- _ O
Our -X- _ O
data -X- _ O
demonstrate -X- _ O
that -X- _ O
in -X- _ O
addition -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
LTR -X- _ O
, -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
and -X- _ O
TEAD4 -X- _ O
indeed -X- _ O
associated -X- _ O
with -X- _ O
these -X- _ O
cellular -X- _ O
gene -X- _ O
promoters -X- _ O
, -X- _ O
where -X- _ O
the -X- _ O
binding -X- _ O
of -X- _ O
TEAD4 -X- _ O
significantly -X- _ O
decreases -X- _ O
after -X- _ O
the -X- _ O
depletion -X- _ O
of -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
, -X- _ O
suggesting -X- _ O
a -X- _ O
common -X- _ O
regulatory -X- _ O
mechanism -X- _ O
involving -X- _ O
the -X- _ O
PRMT3-TEAD4 -X- _ O
complex -X- _ O
that -X- _ O
exists -X- _ O
at -X- _ O
the -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
LTR -X- _ O
, -X- _ O
as -X- _ O
well -X- _ O
as -X- _ O
the -X- _ O
promoters -X- _ O
of -X- _ O
selected -X- _ O
host -X- _ O
genes. -X- _ O
At -X- _ O
the -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
LTR -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
interaction -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
PRMT3-TEAD4 -X- _ O
complex -X- _ O
with -X- _ O
Tat -X- _ O
and -X- _ O
the -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
provides -X- _ O
further -X- _ O
regulation -X- _ O
of -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
transcription. -X- _ O
On -X- _ O
cellular -X- _ O
gene -X- _ O
promoters -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
the -X- _ O
three -X- _ O
genes -X- _ O
mentioned -X- _ O
above -X- _ O
, -X- _ O
it -X- _ O
is -X- _ O
conceivable -X- _ O
that -X- _ O
transcription -X- _ O
can -X- _ O
also -X- _ O
be -X- _ O
modulated -X- _ O
through -X- _ O
controlling -X- _ O
the -X- _ O
function -X- _ O
and -X- _ O
/ -X- _ O
or -X- _ O
binding -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
PRMT3-TEAD4 -X- _ O
complex -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
GGAAT -X- _ O
motif -X- _ O
in -X- _ O
response -X- _ O
to -X- _ O
changes -X- _ O
in -X- _ O
physiological -X- _ O
or -X- _ O
pathological -X- _ O
conditions. -X- _ O
This -X- _ O
co-regulation -X- _ O
of -X- _ O
viral -X- _ O
and -X- _ O
host -X- _ O
gene -X- _ O
transcription -X- _ O
by -X- _ O
PRMT3-TEAD4 -X- _ O
underscores -X- _ O
a -X- _ O
finely -X- _ O
tuned -X- _ O
regulatory -X- _ O
mechanism -X- _ O
that -X- _ O
integrates -X- _ O
the -X- _ O
cellular -X- _ O
and -X- _ O
viral -X- _ O
transcriptional -X- _ O
control. -X- _ O
Furthermore -X- _ O
, -X- _ O
TEAD4 -X- _ O
has -X- _ O
also -X- _ O
been -X- _ O
demonstrated -X- _ O
to -X- _ O
interact -X- _ O
with -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
is -X- _ O
the -X- _ O
core -X- _ O
transcriptional -X- _ O
component -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
Super -X- _ O
Elongation -X- _ O
Complex -X- _ O
( -X- _ O
SEC -X- _ O
) -X- _ O
essential -X- _ O
for -X- _ O
Tat-activated -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
transcription. -X- _ O
Given -X- _ O
the -X- _ O
fact -X- _ O
that -X- _ O
TEAD4 -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
DNA -X- _ O
sequence-specific -X- _ O
transcription -X- _ O
factor -X- _ O
, -X- _ O
it -X- _ O
remains -X- _ O
to -X- _ O
be -X- _ O
investigated -X- _ O
whether -X- _ O
it -X- _ O
plays -X- _ O
a -X- _ O
key -X- _ O
role -X- _ O
in -X- _ O
recruiting -X- _ O
SEC -X- _ O
to -X- _ O
both -X- _ O
host -X- _ O
and -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
gene -X- _ O
promoters -X- _ O
that -X- _ O
contain -X- _ O
the -X- _ O
TEAD4-binding -X- _ O
motif. -X- _ O
While -X- _ O
previous -X- _ O
studies -X- _ O
have -X- _ O
indicated -X- _ O
PRMT3’s -X- _ O
involvement -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
key -X- _ O
factor -X- _ O
in -X- _ O
mediating -X- _ O
host -X- _ O
responses -X- _ O
to -X- _ O
viral -X- _ O
infection17,30 -X- _ O
, -X- _ O
its -X- _ O
specific -X- _ O
role -X- _ O
in -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
infection -X- _ O
and -X- _ O
latency -X- _ O
remains -X- _ O
largely -X- _ O
unexplored. -X- _ O
For -X- _ O
instance -X- _ O
, -X- _ O
in -X- _ O
zebrafish -X- _ O
, -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
has -X- _ O
been -X- _ O
shown -X- _ O
to -X- _ O
negatively -X- _ O
regulate -X- _ O
antiviral -X- _ O
responses17. -X- _ O
Similarly -X- _ O
, -X- _ O
recent -X- _ O
studies -X- _ O
utilizing -X- _ O
the -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
inhibitor -X- _ O
, -X- _ O
SGC707 -X- _ O
treatment -X- _ O
, -X- _ O
or -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
knockout -X- _ O
mice -X- _ O
have -X- _ O
revealed -X- _ O
PRMT3’s -X- _ O
facilitation -X- _ O
of -X- _ O
HSV-1 -X- _ O
infection30. -X- _ O
In -X- _ O
conjunction -X- _ O
with -X- _ O
our -X- _ O
current -X- _ O
discovery -X- _ O
demonstrating -X- _ O
PRMT3’s -X- _ O
promotion -X- _ O
of -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
transcription -X- _ O
to -X- _ O
reverse -X- _ O
latency -X- _ O
, -X- _ O
these -X- _ O
findings -X- _ O
suggest -X- _ O
that -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
may -X- _ O
serve -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
potential -X- _ O
target -X- _ O
for -X- _ O
broad-spectrum -X- _ O
antiviral -X- _ O
drugs. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
future -X- _ O
comprehensive -X- _ O
research -X- _ O
is -X- _ O
imperative -X- _ O
to -X- _ O
fully -X- _ O
comprehend -X- _ O
the -X- _ O
extent -X- _ O
of -X- _ O
PRMT3’s -X- _ O
involvement -X- _ O
in -X- _ O
mediating -X- _ O
viral-host -X- _ O
interactions. -X- _ O
It -X- _ O
is -X- _ O
noteworthy -X- _ O
that -X- _ O
besides -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
, -X- _ O
other -X- _ O
PRMTs -X- _ O
have -X- _ O
also -X- _ O
been -X- _ O
implicated -X- _ O
in -X- _ O
regulating -X- _ O
anti-HIV -X- _ O
activity. -X- _ O
For -X- _ O
instance -X- _ O
, -X- _ O
PRMT6 -X- _ O
has -X- _ O
been -X- _ O
shown -X- _ O
to -X- _ O
inhibit -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
replication -X- _ O
in -X- _ O
vitro -X- _ O
by -X- _ O
directly -X- _ O
methylating -X- _ O
several -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
proteins -X- _ O
, -X- _ O
including -X- _ O
Tat -X- _ O
, -X- _ O
Rev -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
nucleocapsid -X- _ O
protein -X- _ O
, -X- _ O
thereby -X- _ O
interfering -X- _ O
with -X- _ O
their -X- _ O
functions56,57. -X- _ O
Similarly -X- _ O
, -X- _ O
PRMT2 -X- _ O
was -X- _ O
recently -X- _ O
discovered -X- _ O
to -X- _ O
suppress -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
transcription -X- _ O
by -X- _ O
methylating -X- _ O
Tat -X- _ O
and -X- _ O
promoting -X- _ O
the -X- _ O
phase -X- _ O
separation -X- _ O
of -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
and -X- _ O
Tat58. -X- _ O
Thus -X- _ O
, -X- _ O
in -X- _ O
addition -X- _ O
to -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
, -X- _ O
other -X- _ O
members -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
PRMT -X- _ O
family -X- _ O
should -X- _ O
be -X- _ O
explored -X- _ O
as -X- _ O
potential -X- _ O
targets -X- _ O
for -X- _ O
developing -X- _ O
effective -X- _ O
antiviral -X- _ O
drugs. -X- _ O
In -X- _ O
addition -X- _ O
to -X- _ O
its -X- _ O
effects -X- _ O
on -X- _ O
viral -X- _ O
gene -X- _ O
expression -X- _ O
, -X- _ O
PRMT3’s -X- _ O
regulation -X- _ O
of -X- _ O
host -X- _ O
gene -X- _ O
transcription -X- _ O
has -X- _ O
been -X- _ O
implicated -X- _ O
in -X- _ O
various -X- _ O
cellular -X- _ O
processes -X- _ O
, -X- _ O
including -X- _ O
tumorigenesis -X- _ O
, -X- _ O
oxaliplatin -X- _ O
resistance -X- _ O
in -X- _ O
liver -X- _ O
cancer -X- _ O
, -X- _ O
retinoic -X- _ O
acid -X- _ O
signaling -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
hepatic -X- _ O
lipogenesis18,20,28,29,59,60. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
precise -X- _ O
mechanism -X- _ O
( -X- _ O
s -X- _ O
) -X- _ O
underlying -X- _ O
these -X- _ O
transcriptional -X- _ O
effects -X- _ O
of -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
remain -X- _ O
unclear. -X- _ O
In -X- _ O
this -X- _ O
study -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
comparison -X- _ O
of -X- _ O
ATAC-Seq -X- _ O
and -X- _ O
RNA-Seq -X- _ O
data -X- _ O
between -X- _ O
WT -X- _ B-CELL_CONTEXT
and -X- _ O
PRMT3 -X- _ B-CELL_CONTEXT
KO -X- _ I-CELL_CONTEXT
cells -X- _ B-CELL
reveals -X- _ O
that -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
selectively -X- _ O
regulates -X- _ O
chromatin -X- _ O
accessibility -X- _ O
and -X- _ O
transcription -X- _ O
of -X- _ O
a -X- _ O
small -X- _ O
subgroup -X- _ O
of -X- _ O
human -X- _ O
genes -X- _ O
, -X- _ O
including -X- _ O
some -X- _ O
well-studied -X- _ O
genes -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
TGFB2 -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
is -X- _ O
relevant -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
potential -X- _ O
pathogenic -X- _ O
effects -X- _ O
of -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
in -X- _ O
tumorigenesis. -X- _ O
The -X- _ O
selectivity -X- _ O
of -X- _ O
PRMT3’s -X- _ O
action -X- _ O
is -X- _ O
apparently -X- _ O
achieved -X- _ O
through -X- _ O
forming -X- _ O
a -X- _ O
complex -X- _ O
with -X- _ O
TEAD4 -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
then -X- _ O
co-localizes -X- _ O
at -X- _ O
specific -X- _ O
gene -X- _ O
promoter -X- _ O
regions -X- _ O
via -X- _ O
binding -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
TEAD4-recognition -X- _ O
motif. -X- _ O
Together -X- _ O
, -X- _ O
these -X- _ O
findings -X- _ O
have -X- _ O
revealed -X- _ O
the -X- _ O
mechanistic -X- _ O
basis -X- _ O
for -X- _ O
PRMT3’s -X- _ O
control -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
transcription -X- _ O
of -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
and -X- _ O
a -X- _ O
selected -X- _ O
group -X- _ O
of -X- _ O
host -X- _ O
genes. -X- _ O
Although -X- _ O
the -X- _ O
PRMT3-created -X- _ O
transcription -X- _ O
hub -X- _ O
containing -X- _ O
TEAD4 -X- _ O
and -X- _ O
P-TEFb -X- _ O
is -X- _ O
demonstrated -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
current -X- _ O
study -X- _ O
as -X- _ O
important -X- _ O
for -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
to -X- _ O
escape -X- _ O
latency -X- _ O
, -X- _ O
it -X- _ O
is -X- _ O
presently -X- _ O
unknown -X- _ O
whether -X- _ O
it -X- _ O
also -X- _ O
plays -X- _ O
a -X- _ O
role -X- _ O
during -X- _ O
the -X- _ O
establishment -X- _ O
of -X- _ O
latency. -X- _ O
It -X- _ O
is -X- _ O
conceivable -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
loss -X- _ O
of -X- _ O
expression -X- _ O
/ -X- _ O
function -X- _ O
of -X- _ O
any -X- _ O
component -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
hub -X- _ O
could -X- _ O
be -X- _ O
responsible -X- _ O
in -X- _ O
this -X- _ O
latter -X- _ O
process. -X- _ O
Further -X- _ O
studies -X- _ O
are -X- _ O
thus -X- _ O
necessary -X- _ O
to -X- _ O
test -X- _ O
this -X- _ O
hypothesis -X- _ O
and -X- _ O
explore -X- _ O
the -X- _ O
possibility -X- _ O
of -X- _ O
targeting -X- _ O
the -X- _ O
PRMT3 -X- _ O
transcription -X- _ O
hub -X- _ O
to -X- _ O
cure -X- _ O
HIV -X- _ O
/ -X- _ O
AIDS. -X- _ O
Methods -X- _ O
Dcas9-targeted -X- _ O
ltr -X- _ O
proteome -X- _ O
analysis -X- _ O
One -X- _ O
million -X- _ O
NH1 -X- _ B-CELL_LINE
cells -X- _ I-CELL_LINE
with -X- _ O
an -X- _ O
integrated -X- _ O
with -X- _ O
HIV-1 -X- _ O
5’ -X- _ O
LTR-driven -X- _ O
luciferase -X- _ O
reporter -X- _ O
construct -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
contains -X- _ O
424 -X- _ O
bp -X- _ O
of -X- _ O
LTR. -X- _ O
Cells -X- _ B-CELL
were -X- _ O
fixed -X- _ O
with -X- _ O
1 -X- _ O
% -X- _ O
formaldehyde -X- _ O
for -X- _ O
15 -X- _ O
min -X- _ O
at -X- _ O
room -X- _ O
temperature -X- _ O
and -X- _ O
0.125 -X- _ O
M -X- _ O
Glycine -X- _ O
for -X- _ O
5 -X- _ O
min -X- _ O
to -X- _ O
quench -X- _ O
unreacted -X- _ O
formaldehyde -X- _ O
at -X- _ O
room -X- _ O
temperature. -X- _ O
Use -X- _ O
20 -X- _ O
ml -X- _ O
of -X- _ O
cold -X- _ O
PBS -X- _ O
to -X- _ O
wash -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
twice. -X- _ O
Scrape -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
with -X- _ O
2 -X- _ O
ml -X- _ O
cold -X- _ O
PBS -X- _ O
containing -X- _ O
protease -X- _ O
inhibitor -X- _ O
and -X- _ O
dithiothreitol -X- _ O
( -X- _ O
DTT -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Spin -X- _ O
at -X- _ O
700 -X- _ O
× -X- _ O
g -X- _ O
at -X- _ O
4 -X- _ O
°C -X- _ O
for -X- _ O
3 -X- _ O
min -X- _ O
to -X- _ O
pellet -X- _ O
cells. -X- _ B-CELL
Cells -X- _ B-CELL
were -X- _ O
lysed -X- _ O
with -X- _ O
lysis -X- _ O
buffer -X- _ O
[ -X- _ O
1 -X- _ O
% -X- _ O
SDS -X- _ O
, -X- _ O
10 -X- _ O
mM -X- _ O
EDTA -X- _ O
, -X- _ O
50 -X- _ O
mM -X- _ O
Tris -X- _ O
, -X- _ O
pH -X- _ O
8.1 -X- _ O
] -X- _ O
and -X- _ O
incubated -X- _ O
on -X- _ O
ice -X- _ O
for -X- _ O
20 -X- _ O
min. -X- _ O
Cells -X- _ B-CELL
were -X- _ O
sheared -X- _ O
with -X- _ O
a -X- _ O
Covaris -X- _ O
sonicator -X- _ O
M220 -X- _ O
until -X- _ O
genomic -X- _ O
DNA -X- _ O
was -X- _ O
visualized -X- _ O
to -X- _ O
be -X- _ O
at -X- _ O
200–1000 -X- _ O
bp. -X- _ O
The -X- _ O
DNA -X- _ O
was -X- _ O
cleared -X- _ O
with -X- _ O
a -X- _ O
high-speed -X- _ O
spin -X- _ O
( -X- _ O
15,000 -X- _ O
g -X- _ O
for -X- _ O
10 -X- _ O
min -X- _ O
) -X- _ O
at -X- _ O
4 -X- _ O
°C. -X- _ O
The -X- _ O
DNA -X- _ O
was -X- _ O
diluted -X- _ O
by -X- _ O
ChIP -X- _ O
Dilution -X- _ O
Buffer -X- _ O
[ -X- _ O
0.01 -X- _ O
% -X- _ O
SDS -X- _ O
, -X- _ O
1 -X- _ O
% -X- _ O
Triton -X- _ O
X-100 -X- _ O
, -X- _ O
1.2 -X- _ O
mM -X- _ O
EDTA -X- _ O
, -X- _ O
16.7 -X- _ O
mM -X- _ O
Tris-HCl -X- _ O
, -X- _ O
pH -X- _ O
8.1 -X- _ O
, -X- _ O
167 -X- _ O
mM -X- _ O
NaCl -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
dCas9-3 -X- _ O
× -X- _ O
Flag -X- _ O
/ -X- _ O
sgRNAs -X- _ O
complex -X- _ O
was -X- _ O
added -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
sheared -X- _ O
DNA -X- _ O
and -X- _ O
incubated -X- _ O
at -X- _ O
4 -X- _ O
°C -X- _ O
overnight. -X- _ O
The -X- _ O
anti-Flag -X- _ O
M2 -X- _ O
agarose -X- _ O
resin -X- _ O
( -X- _ O
Sigma -X- _ O
) -X- _ O
was -X- _ O
added -X- _ O
, -X- _ O
followed -X- _ O
by -X- _ O
a -X- _ O
3 -X- _ O
h -X- _ O
incubation -X- _ O
at -X- _ O
4 -X- _ O
°C. -X- _ O
The -X- _ O
resin -X- _ O
was -X- _ O
spun -X- _ O
down -X- _ O
at -X- _ O
1500 -X- _ O
× -X- _ O
g -X- _ O
at -X- _ O
4 -X- _ O
°C -X- _ O
for -X- _ O
1 -X- _ O
min -X- _ O
and -X- _ O
washed -X- _ O
with -X- _ O
high -X- _ O
salt -X- _ O
wash -X- _ O
buffer -X- _ O
[ -X- _ O
0.1 -X- _ O
% -X- _ O
SDS -X- _ O
, -X- _ O
1 -X- _ O
% -X- _ O
Triton -X- _ O
X-100 -X- _ O
, -X- _ O
2 -X- _ O
mM -X- _ O
EDTA -X- _ O
, -X- _ O
20 -X- _ O
mM -X- _ O
Tris-HCl -X- _ O
, -X- _ O
pH -X- _ O
8.1 -X- _ O
, -X- _ O
300 -X- _ O
mM -X- _ O
NaCl -X- _ O
] -X- _ O
for -X- _ O
once -X- _ O
, -X- _ O
low -X- _ O
salt -X- _ O
wash -X- _ O
buffer -X- _ O
[ -X- _ O
0.1 -X- _ O
% -X- _ O
SDS -X- _ O
, -X- _ O
1 -X- _ O
% -X- _ O
Triton -X- _ O
X-100 -X- _ O
, -X- _ O
2 -X- _ O
mM -X- _ O
EDTA -X- _ O
, -X- _ O
20 -X- _ O
mM -X- _ O
Tris-HCl -X- _ O
, -X- _ O
pH -X- _ O
8.1 -X- _ O
, -X- _ O
150 -X- _ O
mM -X- _ O
NaCl -X- _ O
] -X- _ O
for -X- _ O
three -X- _ O
times -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
TE -X- _ O
buffer -X- _ O
[ -X- _ O
10 -X- _ O
mM -X- _ O
Tris-HCl -X- _ O
, -X- _ O
1 -X- _ O
mM -X- _ O
EDTA -X- _ O
, -X- _ O
pH -X- _ O
8.0 -X- _ O
] -X- _ O
for -X- _ O
twice -X- _ O
, -X- _ O
with -X- _ O
each -X- _ O
wash -X- _ O
for -X- _ O
5 -X- _ O
min -X- _ O
rotated -X- _ O
at -X- _ O
4 -X- _ O
°C. -X- _ O
The -X- _ O
products -X- _ O
concentrated -X- _ O
by -X- _ O
beads -X- _ O
were -X- _ O
used -X- _ O
for -X- _ O
subsequent -X- _ O
experiments. -X- _ O
Mass -X- _ O
spectrometry -X- _ O
( -X- _ O
ms -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
analysis -X- _ O
The -X- _ O
sample -X- _ O
of -X- _ O
dCas9-3 -X- _ O
× -X- _ O
Flag-sgLTRs -X- _ O
and -X- _ O
dCas9-3 -X- _ O
× -X- _ O
Flag-sgGal4 -X- _ O
( -X- _ O
control -X- _ O
) -X- _ O
immnuoprecipitated -X- _ O
proteins -X- _ O
were -X- _ O
prepared -X- _ O
and -X- _ O
analyzed -X- _ O
by -X- _ O
MS. -X- _ O
In -X- _ O
general -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
eluted -X- _ O
LTR -X- _ O
binding -X- _ O
proteins -X- _ O
were -X- _ O
reduced -X- _ O
in -X- _ O
20 -X- _ O
mM -X- _ O
DTT -X- _ O
at -X- _ O
95 -X- _ O
°C -X- _ O
for -X- _ O
5 -X- _ O
min -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
subsequently -X- _ O
alkylated -X- _ O
in -X- _ O
50 -X- _ O
mM -X- _ O
iodoacetamide -X- _ O
for -X- _ O
30 -X- _ O
min -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
dark -X- _ O
at -X- _ O
room -X- _ O
temperature. -X- _ O
After -X- _ O
alkylation -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
samples -X- _ O
were -X- _ O
transferred -X- _ O
to -X- _ O
a -X- _ O
10 -X- _ O
kD -X- _ O
centrifugal -X- _ O
spin -X- _ O
filter -X- _ O
( -X- _ O
Millipore -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
sequentially -X- _ O
washed -X- _ O
with -X- _ O
200 -X- _ O
μl -X- _ O
of -X- _ O
8 -X- _ O
M -X- _ O
urea -X- _ O
for -X- _ O
three -X- _ O
times -X- _ O
and -X- _ O
200 -X- _ O
μl -X- _ O
of -X- _ O
50 -X- _ O
mM -X- _ O
ammonium -X- _ O
bicarbonate -X- _ O
for -X- _ O
two -X- _ O
times -X- _ O
by -X- _ O
centrifugation -X- _ O
at -X- _ O
14,000 -X- _ O
× -X- _ O
g. -X- _ O
Next -X- _ O
, -X- _ O
tryptic -X- _ O
digestion -X- _ O
was -X- _ O
performed -X- _ O
by -X- _ O
adding -X- _ O
trypsinat -X- _ O
1:50 -X- _ O
( -X- _ O
enzyme -X- _ O
/ -X- _ O
substrate -X- _ O
, -X- _ O
m -X- _ O
/ -X- _ O
m -X- _ O
) -X- _ O
in -X- _ O
200 -X- _ O
μl -X- _ O
of -X- _ O
50 -X- _ O
mM -X- _ O
ammonium -X- _ O
bicarbonate -X- _ O
at -X- _ O
37 -X- _ O
°C -X- _ O
for -X- _ O
16 -X- _ O
hours. -X- _ O
Peptides -X- _ O
were -X- _ O
recovered -X- _ O
by -X- _ O
transferring -X- _ O
the -X- _ O
filter -X- _ O
to -X- _ O
a -X- _ O
collection -X- _ O
tube -X- _ O
and -X- _ O
spinning -X- _ O
at -X- _ O
14,000 -X- _ O
× -X- _ O
g. -X- _ O
To -X- _ O
increase -X- _ O
the -X- _ O
yield -X- _ O
of -X- _ O
peptides -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
filter -X- _ O
was -X- _ O
washed -X- _ O
twice -X- _ O
with -X- _ O
100 -X- _ O
μl -X- _ O
of -X- _ O
50 -X- _ O
mM -X- _ O
ammonium -X- _ O
bicarbonate. -X- _ O
Peptides -X- _ O
were -X- _ O
desalted -X- _ O
by -X- _ O
StageTips. -X- _ O
MS -X- _ O
experiments -X- _ O
were -X- _ O
performed -X- _ O
on -X- _ O
a -X- _ O
nanoscale -X- _ O
EASY-nLC -X- _ O
1200 -X- _ O
UHPLC -X- _ O
system -X- _ O
( -X- _ O
Thermo -X- _ O
Fisher -X- _ O
Scientific -X- _ O
) -X- _ O
connected -X- _ O
to -X- _ O
an -X- _ O
Orbitrap -X- _ O
Fusion -X- _ O
Lumos -X- _ O
equipped -X- _ O
with -X- _ O
a -X- _ O
nanoelectrospray -X- _ O
source -X- _ O
( -X- _ O
Thermo -X- _ O
Fisher -X- _ O
Scientific -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Mobile -X- _ O
phase -X- _ O
A -X- _ O
contained -X- _ O
0.1 -X- _ O
% -X- _ O
formic -X- _ O
acid -X- _ O
( -X- _ O
v -X- _ O
/ -X- _ O
v -X- _ O
) -X- _ O
in -X- _ O
water -X- _ O
; -X- _ O
mobile -X- _ O
phase -X- _ O
B -X- _ O
contained -X- _ O
0.1 -X- _ O
% -X- _ O
formic -X- _ O
acid -X- _ O
in -X- _ O
80 -X- _ O
% -X- _ O
acetonitrile -X- _ O
( -X- _ O
ACN -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
peptides -X- _ O
were -X- _ O
dissolved -X- _ O
in -X- _ O
0.1 -X- _ O
% -X- _ O
formic -X- _ O
acid -X- _ O
( -X- _ O
FA -X- _ O
) -X- _ O
with -X- _ O
2 -X- _ O
% -X- _ O
acetonitrile -X- _ O
and -X- _ O
separated -X- _ O
on -X- _ O
an -X- _ O
RP-HPLC -X- _ O
analytical -X- _ O
column -X- _ O
( -X- _ O
75 -X- _ O
μm -X- _ O
× -X- _ O
25 -X- _ O
cm -X- _ O
) -X- _ O
packed -X- _ O
with -X- _ O
2 -X- _ O
μm -X- _ O
C18 -X- _ O
beads -X- _ O
( -X- _ O
Thermo -X- _ O
Fisher -X- _ O
Scientific -X- _ O
) -X- _ O
using -X- _ O
a -X- _ O
linear -X- _ O
gradient -X- _ O
ranging -X- _ O
from -X- _ O
5 -X- _ O
% -X- _ O
to -X- _ O
22 -X- _ O
% -X- _ O
ACN -X- _ O
in -X- _ O
90 -X- _ O
min -X- _ O
and -X- _ O
followed -X- _ O
by -X- _ O
a -X- _ O
linear -X- _ O
increase -X- _ O
to -X- _ O
35 -X- _ O
% -X- _ O
B -X- _ O
in -X- _ O
20 -X- _ O
min -X- _ O
at -X- _ O
a -X- _ O
flow -X- _ O
rate -X- _ O
of -X- _ O
300 -X- _ O
nl -X- _ O
/ -X- _ O
min. -X- _ O
The -X- _ O
Orbitrap -X- _ O
Fusion -X- _ O
Lumos -X- _ O
acquired -X- _ O
data -X- _ O
in -X- _ O
a -X- _ O
data-dependent -X- _ O
manner -X- _ O
, -X- _ O
alternating -X- _ O
between -X- _ O
full-scan -X- _ O
MS -X- _ O
and -X- _ O
MS2 -X- _ O
scans. -X- _ O
The -X- _ O
spray -X- _ O
voltage -X- _ O
was -X- _ O
set -X- _ O
at -X- _ O
2.2 -X- _ O
kV -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
the -X- _ O
temperature -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
ion -X- _ O
transfer -X- _ O
capillary -X- _ O
was -X- _ O
300 -X- _ O
°C. -X- _ O
The -X- _ O
MS -X- _ O
spectra -X- _ O
( -X- _ O
350–1500 -X- _ O
m -X- _ O
/ -X- _ O
z -X- _ O
) -X- _ O
were -X- _ O
collected -X- _ O
with -X- _ O
120,000 -X- _ O
resolutions -X- _ O
, -X- _ O
AGC -X- _ O
of -X- _ O
4 -X- _ O
× -X- _ O
105 -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
50 -X- _ O
ms -X- _ O
maximal -X- _ O
injection -X- _ O
time. -X- _ O
Selected -X- _ O
ions -X- _ O
were -X- _ O
sequentially -X- _ O
fragmented -X- _ O
by -X- _ O
HCD -X- _ O
with -X- _ O
30 -X- _ O
% -X- _ O
normalized -X- _ O
collision -X- _ O
energy -X- _ O
, -X- _ O
specified -X- _ O
isolated -X- _ O
windows -X- _ O
1.6 -X- _ O
m -X- _ O
/ -X- _ O
z -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
15,000 -X- _ O
resolutions. -X- _ O
AGC -X- _ O
of -X- _ O
5 -X- _ O
× -X- _ O
104 -X- _ O
and -X- _ O
40 -X- _ O
ms -X- _ O
maximal -X- _ O
injection -X- _ O
time -X- _ O
were -X- _ O
used. -X- _ O
Dynamic -X- _ O
exclusion -X- _ O
was -X- _ O
set -X- _ O
to -X- _ O
40 -X- _ O
s. -X- _ O
Unassigned -X- _ O
ions -X- _ O
or -X- _ O
those -X- _ O
with -X- _ O
a -X- _ O
charge -X- _ O
of -X- _ O
2 -X- _ O
+ -X- _ O
and -X- _ O
> -X- _ O
7 -X- _ O
+ -X- _ O
were -X- _ O
rejected -X- _ O
for -X- _ O
MS -X- _ O
/ -X- _ O
MS. -X- _ O
Raw -X- _ O
data -X- _ O
was -X- _ O
processed -X- _ O
using -X- _ O
Proteome -X- _ O
Discoverer -X- _ O
( -X- _ O
PD -X- _ O
, -X- _ O
version -X- _ O
2.4 -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
MS -X- _ O
/ -X- _ O
MS -X- _ O
spectra -X- _ O
were -X- _ O
searched -X- _ O
against -X- _ O
the -X- _ O
reviewed -X- _ O
SwissProt -X- _ O
human -X- _ O
proteome -X- _ O
database. -X- _ O
Only -X- _ O
peptides -X- _ O
with -X- _ O
at -X- _ O
least -X- _ O
six -X- _ O
amino -X- _ O
acids -X- _ O
in -X- _ O
length -X- _ O
were -X- _ O
considered. -X- _ O
The -X- _ O
peptide -X- _ O
and -X- _ O
protein -X- _ O
identifications -X- _ O
were -X- _ O
filtered -X- _ O
by -X- _ O
PD -X- _ O
to -X- _ O
control -X- _ O
the -X- _ O
false -X- _ O
discovery -X- _ O
rate -X- _ O
( -X- _ O
FDR -X- _ O
) -X- _ O
***Generation -X- _ O
of -X- _ O
stable -X- _ O
knockout -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
line*** -X- _ I-CELL
sgRNA -X- _ O
sequence -X- _ O
was -X- _ O
ligate -X- _ O
into -X- _ O
plasmid -X- _ O
pSpCas9 -X- _ O
( -X- _ O
BB -X- _ O
) -X- _ O
−2A-Puro -X- _ O
( -X- _ O
PX459 -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
was -X- _ O
purchased -X- _ O
from -X- _ O
Addgene -X- _ O
( -X- _ O
# -X- _ O
48139 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Cells -X- _ B-CELL
were -X- _ O
transfected -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
plasmid -X- _ O
expressing -X- _ O
sgPRMT3 -X- _ O
by -X- _ O
using -X- _ O
Lipofectamine -X- _ O
3000 -X- _ O
( -X- _ O
Invitrogen -X- _ O
) -X- _ O
according -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
manufacturer’s -X- _ O
protocol. -X- _ O
After -X- _ O
48 -X- _ O
h -X- _ O
of -X- _ O
transfection -X- _ O
, -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
that -X- _ O
did -X- _ O
not -X- _ O
contain -X- _ O
the -X- _ O
plasmid -X- _ O
were -X- _ O
killed -X- _ O
with -X- _ O
puromycin -X- _ O
for -X- _ O
2 -X- _ O
days -X- _ O
, -X- _ O
then -X- _ O
changed -X- _ O
into -X- _ O
DMEM -X- _ O
with -X- _ O
no -X- _ O
antibiotics -X- _ O
and -X- _ O
plated -X- _ O
into -X- _ O
96-well -X- _ O
plate -X- _ O
for -X- _ O
single -X- _ O
clone -X- _ O
selection. -X- _ O
After -X- _ O
verification -X- _ O
with -X- _ O
western -X- _ O
blot -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
genome -X- _ O
was -X- _ O
extracted -X- _ O
and -X- _ O
sent -X- _ O
for -X- _ O
sequencing. -X- _ O
Source -X- _ O
paper -X- _ O
: -X- _ O
PMC12081701 -X- _ O

Materials -X- _ O
and -X- _ O
methods -X- _ O
Statistical -X- _ O
analysis -X- _ O
The -X- _ O
data -X- _ O
were -X- _ O
described -X- _ O
as -X- _ O
mean -X- _ O
± -X- _ O
standard -X- _ O
deviation -X- _ O
( -X- _ O
SD -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
the -X- _ O
statistical -X- _ O
significance -X- _ O
was -X- _ O
determined -X- _ O
by -X- _ O
one-way -X- _ O
ANOVA -X- _ O
before -X- _ O
LSD -X- _ O
test -X- _ O
for -X- _ O
multiple -X- _ O
comparisons -X- _ O
and -X- _ O
independent-sample -X- _ O
t-test -X- _ O
for -X- _ O
comparison -X- _ O
between -X- _ O
the -X- _ O
two -X- _ O
groups. -X- _ O
The -X- _ O
level -X- _ O
of -X- _ O
p -X- _ O
***Results*** -X- _ O
Discussion -X- _ O
The -X- _ O
host -X- _ O
immune -X- _ B-TISSUE
system -X- _ I-TISSUE
exerts -X- _ O
immunosurveillance -X- _ O
to -X- _ O
control -X- _ O
cancer -X- _ O
development. -X- _ O
By -X- _ O
inducing -X- _ O
the -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
immunosuppressive -X- _ O
factors -X- _ O
, -X- _ O
however -X- _ O
, -X- _ O
tumor -X- _ O
HIF-1 -X- _ O
signaling -X- _ O
subdues -X- _ O
both -X- _ O
the -X- _ O
innate -X- _ O
and -X- _ O
adaptive -X- _ O
immune -X- _ O
responses -X- _ O
, -X- _ O
thereby -X- _ O
shielding -X- _ O
the -X- _ O
tumor -X- _ O
from -X- _ O
immune -X- _ O
attacks. -X- _ O
In -X- _ O
addition -X- _ O
, -X- _ O
insufficient -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
MHC -X- _ O
class -X- _ O
I -X- _ O
on -X- _ O
cancer -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
is -X- _ O
one -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
important -X- _ O
strategies -X- _ O
employed -X- _ O
by -X- _ O
cancer -X- _ O
to -X- _ O
evade -X- _ O
the -X- _ O
immune -X- _ B-TISSUE
system. -X- _ I-TISSUE
Therefore -X- _ O
, -X- _ O
inhibition -X- _ O
of -X- _ O
HIF-1 -X- _ O
and -X- _ O
improvement -X- _ O
of -X- _ O
MHC -X- _ O
class -X- _ O
I -X- _ O
expression -X- _ O
on -X- _ O
cancer -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
is -X- _ O
important -X- _ O
to -X- _ O
induce -X- _ O
effective -X- _ O
responses -X- _ O
of -X- _ O
cell-mediated -X- _ B-CELL
immunity -X- _ O
against -X- _ O
cancer -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
lung -X- _ B-TISSUE
cancer -X- _ O
for -X- _ O
immunotherapies -X- _ O
, -X- _ O
including -X- _ O
PD-1 -X- _ O
/ -X- _ O
PD-L1 -X- _ O
inhibitor. -X- _ O
The -X- _ O
effect -X- _ O
of -X- _ O
Endostar -X- _ O
in -X- _ O
inhibiting -X- _ O
HIF-1 -X- _ O
and -X- _ O
promoting -X- _ O
MHC -X- _ O
class -X- _ O
I -X- _ O
expression -X- _ O
on -X- _ O
cancer -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
, -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
lung -X- _ B-TISSUE
cancer -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
, -X- _ O
may -X- _ O
counteract -X- _ O
cancer -X- _ O
immune -X- _ O
evasion -X- _ O
and -X- _ O
thereby -X- _ O
benefit -X- _ O
cancer -X- _ O
immunotherapy. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
this -X- _ O
remains -X- _ O
unclear. -X- _ O
This -X- _ O
study -X- _ O
was -X- _ O
designed -X- _ O
to -X- _ O
determine -X- _ O
the -X- _ O
effect -X- _ O
of -X- _ O
Endostar -X- _ O
in -X- _ O
inhibiting -X- _ O
HIF-1 -X- _ O
and -X- _ O
promoting -X- _ O
MHC -X- _ O
class -X- _ O
I -X- _ O
expression -X- _ O
on -X- _ O
lung -X- _ B-TISSUE
cancer -X- _ B-CELL
cells. -X- _ I-CELL
Endostar -X- _ O
was -X- _ O
administrated -X- _ O
to -X- _ O
A549 -X- _ B-CELL
and -X- _ O
NCI-H1299 -X- _ B-CELL
lung -X- _ B-TISSUE
cancer -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
and -X- _ O
the -X- _ O
protein -X- _ O
of -X- _ O
HIF-1 -X- _ O
and -X- _ O
MHC -X- _ O
class -X- _ O
I -X- _ O
and -X- _ O
their -X- _ O
mRNAs -X- _ O
was -X- _ O
detected -X- _ O
by -X- _ O
western -X- _ O
blot -X- _ O
and -X- _ O
RT-qPCR. -X- _ O
The -X- _ O
lower -X- _ O
HIF-1 -X- _ O
and -X- _ O
higher -X- _ O
MHC -X- _ O
class -X- _ O
I -X- _ O
were -X- _ O
found -X- _ O
in -X- _ O
Endostar -X- _ O
treated -X- _ O
A549 -X- _ B-CELL
and -X- _ O
NCI-H1299 -X- _ B-CELL
cells. -X- _ B-CELL
These -X- _ O
findings -X- _ O
demonstrated -X- _ O
inhibtion -X- _ O
on -X- _ O
HIF-1 -X- _ O
and -X- _ O
promotion -X- _ O
on -X- _ O
MHC -X- _ O
class -X- _ O
I -X- _ O
by -X- _ O
Endostar -X- _ O
, -X- _ O
suggesting -X- _ O
the -X- _ O
potential -X- _ O
of -X- _ O
Endostar -X- _ O
to -X- _ O
benefit -X- _ O
lung -X- _ B-TISSUE
cancer -X- _ O
immunotherapy. -X- _ O
Endostar -X- _ O
, -X- _ O
an -X- _ O
N-terminal -X- _ O
modified -X- _ O
recombinant -X- _ O
human -X- _ O
endostatin -X- _ O
, -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
human -X- _ O
recombinant -X- _ O
endostatin -X- _ O
, -X- _ O
an -X- _ O
attractive -X- _ O
anti-angiogenesis -X- _ O
protein. -X- _ O
Therefore -X- _ O
, -X- _ O
Endostar -X- _ O
has -X- _ O
anti-angiogenesis -X- _ O
effects. -X- _ O
Endostar -X- _ O
was -X- _ O
developed -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
specific -X- _ O
drug -X- _ O
permitted -X- _ O
by -X- _ O
the -X- _ O
State -X- _ O
Food -X- _ O
and -X- _ O
Drug -X- _ O
Administration -X- _ O
in -X- _ O
China -X- _ O
in -X- _ O
2005 -X- _ O
for -X- _ O
its -X- _ O
use -X- _ O
in -X- _ O
NSCLC -X- _ B-CELL
therapy.25,26 -X- _ O
Endostatin -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
natural -X- _ O
protein -X- _ O
, -X- _ O
first -X- _ O
isolated -X- _ O
and -X- _ O
extracted -X- _ O
from -X- _ O
mouse -X- _ O
tumors -X- _ O
by -X- _ O
Judah -X- _ O
Folkman -X- _ O
, -X- _ O
with -X- _ O
a -X- _ O
wide -X- _ O
antitumor -X- _ O
spectrum -X- _ O
and -X- _ O
strong -X- _ O
antiangiogenic -X- _ O
capacity.27,28 -X- _ O
Angiogenesis -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
physiological -X- _ O
process -X- _ O
of -X- _ O
forming -X- _ O
new -X- _ O
blood -X- _ B-TISSUE
vessels -X- _ B-TISSUE
from -X- _ O
existing -X- _ O
blood -X- _ B-TISSUE
vessels -X- _ B-TISSUE
and -X- _ O
circulating -X- _ O
endothelial -X- _ O
precursors. -X- _ O
It -X- _ O
is -X- _ O
essential -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
occurrence -X- _ O
and -X- _ O
development -X- _ O
of -X- _ O
tumors -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
grow -X- _ O
rapidly -X- _ O
and -X- _ O
metastasize -X- _ O
eventually.24 -X- _ O
Physiologically -X- _ O
, -X- _ O
angiogenesis -X- _ O
is -X- _ O
essential -X- _ O
to -X- _ O
physiological -X- _ O
processes -X- _ O
like -X- _ O
embryogenesis -X- _ O
, -X- _ O
tissue -X- _ B-TISSUE
growth -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
regeneration.29,30 -X- _ O
Oncologically -X- _ O
, -X- _ O
it -X- _ O
is -X- _ O
also -X- _ O
important -X- _ O
for -X- _ O
cancer -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
that -X- _ O
grow -X- _ O
rapidly -X- _ O
and -X- _ O
metastasize -X- _ O
eventually -X- _ O
because -X- _ O
angiogenesis -X- _ O
supplies -X- _ O
oxygen -X- _ O
and -X- _ O
nutrients -X- _ O
which -X- _ O
are -X- _ O
deficient -X- _ O
in -X- _ O
cancer -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
for -X- _ O
their -X- _ O
rapid -X- _ O
growth -X- _ O
and -X- _ O
eventual -X- _ O
metastasis.31 -X- _ O
Therefore -X- _ O
, -X- _ O
anti-angiogenesis -X- _ O
is -X- _ O
one -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
most -X- _ O
important -X- _ O
cancer -X- _ O
therapies.32 -X- _ O
Endostar -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
recombinant -X- _ O
human -X- _ O
endostatin -X- _ O
with -X- _ O
nine -X- _ O
added -X- _ O
amino -X- _ O
acids -X- _ O
( -X- _ O
MGGSHHHHH -X- _ O
) -X- _ O
33 -X- _ O
to -X- _ O
maintain -X- _ O
stability -X- _ O
and -X- _ O
a -X- _ O
long -X- _ O
half-life -X- _ O
has -X- _ O
effective -X- _ O
antiangiogenic -X- _ O
effect. -X- _ O
Besides -X- _ O
, -X- _ O
it -X- _ O
was -X- _ O
shown -X- _ O
in -X- _ O
this -X- _ O
study -X- _ O
that -X- _ O
Endostar -X- _ O
inhibited -X- _ O
HIF-1 -X- _ O
with -X- _ O
upregulation -X- _ O
of -X- _ O
MHC -X- _ O
class -X- _ O
I -X- _ O
expression -X- _ O
in -X- _ O
A549 -X- _ B-CELL
and -X- _ O
NCI-H1299 -X- _ B-CELL
lung -X- _ B-TISSUE
cancer -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
, -X- _ O
benefiting -X- _ O
cancer -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
killing -X- _ O
by -X- _ O
effectory -X- _ O
lymphocytes. -X- _ B-CELL
HIF-1 -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
heterodimer -X- _ O
consisting -X- _ O
of -X- _ O
a -X- _ O
constitutive -X- _ O
β-subunit -X- _ O
and -X- _ O
an -X- _ O
oxygen-sensitive -X- _ O
α-subunit,34 -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
main -X- _ O
transcriptional -X- _ O
regulator -X- _ O
responsible -X- _ O
for -X- _ O
metabolic -X- _ O
adaptation -X- _ O
to -X- _ O
alterations -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
oxygen -X- _ O
environment. -X- _ O
It -X- _ O
involves -X- _ O
in -X- _ O
many -X- _ O
physiological -X- _ O
and -X- _ O
pathological -X- _ O
processes -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
body -X- _ O
and -X- _ O
is -X- _ O
closely -X- _ O
associated -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
pathogenesis -X- _ O
of -X- _ O
many -X- _ O
diseases.13 -X- _ O
In -X- _ O
solid -X- _ O
tumors -X- _ O
, -X- _ O
uncontrolled -X- _ O
proliferation -X- _ O
of -X- _ O
cancer -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
vs -X- _ O
disorganized -X- _ O
growth -X- _ O
of -X- _ O
blood -X- _ B-TISSUE
vessels -X- _ B-TISSUE
results -X- _ O
in -X- _ O
limited -X- _ O
supply -X- _ O
of -X- _ O
nutrients -X- _ O
and -X- _ O
oxygen -X- _ O
resulting -X- _ O
in -X- _ O
low -X- _ O
oxygen -X- _ O
tension -X- _ O
; -X- _ O
therefore -X- _ O
, -X- _ O
regions -X- _ O
with -X- _ O
hypoxic -X- _ O
microenvironments -X- _ O
are -X- _ O
created. -X- _ O
In -X- _ O
these -X- _ O
regions -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
highly -X- _ O
overexpressed -X- _ O
HIF-1 -X- _ O
is -X- _ O
important -X- _ O
to -X- _ O
drive -X- _ O
tumor -X- _ O
growing -X- _ O
, -X- _ O
invasion -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
metastasis -X- _ O
in -X- _ O
different -X- _ O
human -X- _ O
cancers.35,36 -X- _ O
The -X- _ O
association -X- _ O
of -X- _ O
a -X- _ O
poor -X- _ O
survival -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
high -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
HIF-1α -X- _ O
has -X- _ O
been -X- _ O
indicated -X- _ O
by -X- _ O
survival -X- _ O
analysis -X- _ O
in -X- _ O
patients -X- _ O
with -X- _ O
lung -X- _ B-TISSUE
cancer -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
different -X- _ O
SNPs -X- _ O
in -X- _ O
HIF-1α -X- _ O
may -X- _ O
have -X- _ O
different -X- _ O
effects -X- _ O
on -X- _ O
overall -X- _ O
cancer -X- _ O
risk -X- _ O
in -X- _ O
an -X- _ O
ethnicity- -X- _ O
and -X- _ O
type-specific -X- _ O
manner.37 -X- _ O
Reduction -X- _ O
of -X- _ O
HIF-1α -X- _ O
by -X- _ O
Simvastatin -X- _ O
enhanced -X- _ O
Anti-tumor -X- _ O
Effects -X- _ O
of -X- _ O
Bevacizumab -X- _ O
in -X- _ O
A549 -X- _ B-CELL
cells.38 -X- _ O
Targeting -X- _ O
ATM -X- _ O
/ -X- _ O
HIF-1α -X- _ O
signaling -X- _ O
by -X- _ O
solanidine -X- _ O
induced -X- _ O
anti-angiogenesis -X- _ O
and -X- _ O
anti-cancer -X- _ O
effect -X- _ O
in -X- _ O
lung -X- _ B-TISSUE
cancer.39 -X- _ O
Besides -X- _ O
its -X- _ O
involvement -X- _ O
in -X- _ O
various -X- _ O
aspects -X- _ O
of -X- _ O
tumor -X- _ O
development -X- _ O
, -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
tumor -X- _ O
growth -X- _ O
, -X- _ O
invasion -X- _ O
, -X- _ O
metastasis -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
angiogenesis -X- _ O
, -X- _ O
HIF-1 -X- _ O
is -X- _ O
also -X- _ O
involved -X- _ O
in -X- _ O
tumor -X- _ O
immune -X- _ O
evasion -X- _ O
which -X- _ O
facilitates -X- _ O
cancer -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
to -X- _ O
proliferate -X- _ O
and -X- _ O
metastasize -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
contributes -X- _ O
to -X- _ O
failure -X- _ O
in -X- _ O
immunotherapy.40 -X- _ O
Inhibition -X- _ O
of -X- _ O
HIF-1 -X- _ O
expression -X- _ O
in -X- _ O
cancer -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
contributes -X- _ O
to -X- _ O
cancer -X- _ O
control -X- _ O
and -X- _ O
induction -X- _ O
of -X- _ O
effective -X- _ O
anti-cancer -X- _ O
immunity -X- _ O
in -X- _ O
cancer -X- _ O
immunotherapy. -X- _ O
Endostar -X- _ O
has -X- _ O
the -X- _ O
effect -X- _ O
to -X- _ O
down-regulate -X- _ O
HIF-1.41 -X- _ O
It -X- _ O
was -X- _ O
shown -X- _ O
in -X- _ O
this -X- _ O
study -X- _ O
that -X- _ O
25 -X- _ O
μg -X- _ O
/ -X- _ O
ml -X- _ O
Endostar -X- _ O
inhibited -X- _ O
HIF-1 -X- _ O
expression -X- _ O
in -X- _ O
A549 -X- _ B-CELL
and -X- _ O
NCI-H1299 -X- _ B-CELL
lung -X- _ B-TISSUE
cancer -X- _ B-CELL
cells. -X- _ I-CELL
HIF-1 -X- _ O
is -X- _ O
induced -X- _ O
by -X- _ O
hypoxia -X- _ O
in -X- _ O
cancer -X- _ O
cells,42 -X- _ O
and -X- _ O
in -X- _ O
normoxia -X- _ O
, -X- _ O
it -X- _ O
is -X- _ O
not -X- _ O
usually -X- _ O
observed -X- _ O
or -X- _ O
only -X- _ O
basal -X- _ O
expression -X- _ O
can -X- _ O
be -X- _ O
observed.43,44 -X- _ O
In -X- _ O
this -X- _ O
study -X- _ O
, -X- _ O
experiments -X- _ O
showed -X- _ O
a -X- _ O
high -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
HIF-1 -X- _ O
in -X- _ O
control -X- _ O
and -X- _ O
untreated -X- _ O
cells. -X- _ B-CELL
However -X- _ O
, -X- _ O
this -X- _ O
did -X- _ O
not -X- _ O
necessarily -X- _ O
mean -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
HIF-1 -X- _ O
in -X- _ O
control -X- _ O
and -X- _ O
untreated -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
was -X- _ O
really -X- _ O
high -X- _ O
because -X- _ O
it -X- _ O
was -X- _ O
detected -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
expression -X- _ O
in -X- _ O
Endostar -X- _ O
treated -X- _ O
A549 -X- _ B-CELL
cells -X- _ B-CELL
and -X- _ O
NCI-H1299 -X- _ B-CELL
cells -X- _ B-CELL
as -X- _ O
the -X- _ O
backgroud. -X- _ O
The -X- _ O
expression -X- _ O
detected -X- _ O
by -X- _ O
Western -X- _ O
blot -X- _ O
and -X- _ O
Immunocytochemistry -X- _ O
is -X- _ O
relative -X- _ O
quantification. -X- _ O
The -X- _ O
assays -X- _ O
had -X- _ O
been -X- _ O
optimized -X- _ O
for -X- _ O
enough -X- _ O
sensitivity -X- _ O
to -X- _ O
detect -X- _ O
the -X- _ O
reduced -X- _ O
expression -X- _ O
in -X- _ O
Endostar -X- _ O
treated -X- _ O
A549 -X- _ B-CELL
cells -X- _ B-CELL
and -X- _ O
NCI-H1299 -X- _ B-CELL
cells. -X- _ B-CELL
An -X- _ O
effective -X- _ O
adaptive -X- _ O
response -X- _ O
can -X- _ O
be -X- _ O
achieved -X- _ O
through -X- _ O
a -X- _ O
multi-step -X- _ O
antigen -X- _ O
processing -X- _ O
and -X- _ O
pathway -X- _ O
, -X- _ O
namely -X- _ O
the -X- _ O
cellular -X- _ O
antigen -X- _ O
processing -X- _ O
machinery -X- _ O
( -X- _ O
APM -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Antigens -X- _ O
must -X- _ O
be -X- _ O
processed -X- _ O
into -X- _ O
antigenic -X- _ O
peptides -X- _ O
by -X- _ O
APM. -X- _ O
These -X- _ O
peptides -X- _ O
are -X- _ O
loaded -X- _ O
onto -X- _ O
an -X- _ O
MHC -X- _ O
class -X- _ O
I -X- _ O
molecule. -X- _ O
MHC -X- _ O
class -X- _ O
I -X- _ O
molecules -X- _ O
are -X- _ O
glycoproteins -X- _ O
of -X- _ O
heterodimers -X- _ O
with -X- _ O
a -X- _ O
polymorphic -X- _ O
heavy -X- _ O
chain -X- _ O
( -X- _ O
α-chain -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
an -X- _ O
invariable -X- _ O
β2 -X- _ O
microglobulin -X- _ O
( -X- _ O
β2 -X- _ O
m -X- _ O
) -X- _ O
light -X- _ O
chain -X- _ O
( -X- _ O
β-chain -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
α-chain -X- _ O
is -X- _ O
encoded -X- _ O
by -X- _ O
the -X- _ O
Human -X- _ O
Leukocyte -X- _ B-CELL
Antigen-HLA -X- _ O
A -X- _ O
, -X- _ O
B -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
C -X- _ O
genes -X- _ O
in -X- _ O
humans. -X- _ O
There -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
groove -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
MHC -X- _ O
class -X- _ O
I -X- _ O
molecules -X- _ O
to -X- _ O
preferentially -X- _ O
bind -X- _ O
8-11mer -X- _ O
peptides. -X- _ O
The -X- _ O
antigenic -X- _ O
epitope -X- _ O
binds -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
exposed -X- _ O
surface -X- _ O
of -X- _ O
this -X- _ O
groove -X- _ O
as -X- _ O
a -X- _ O
part -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
MHC -X- _ O
class -X- _ O
I -X- _ O
complex. -X- _ O
It -X- _ O
is -X- _ O
recognized -X- _ O
by -X- _ O
the -X- _ O
TCR -X- _ O
on -X- _ O
the -X- _ O
T -X- _ O
cells.45 -X- _ O
This -X- _ O
study -X- _ O
showed -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
MHC -X- _ O
class -X- _ O
I -X- _ O
α-heavy -X- _ O
chain -X- _ O
and -X- _ O
β2 -X- _ O
m -X- _ O
light -X- _ O
chain -X- _ O
in -X- _ O
A549 -X- _ B-CELL
and -X- _ O
NCI-H1299 -X- _ B-CELL
lung -X- _ B-TISSUE
cancer -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
was -X- _ O
improved -X- _ O
by -X- _ O
Endostar -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
benefited -X- _ O
cancer -X- _ O
immunotherapy -X- _ O
against -X- _ O
the -X- _ O
lung -X- _ B-TISSUE
cancer -X- _ B-CELL
cells. -X- _ I-CELL
In -X- _ O
the -X- _ O
context -X- _ O
of -X- _ O
HIF-1 -X- _ O
down-regulation -X- _ O
by -X- _ O
Endostar -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
was -X- _ O
shown -X- _ O
in -X- _ O
this -X- _ O
study -X- _ O
, -X- _ O
to -X- _ O
demonstrate -X- _ O
the -X- _ O
role -X- _ O
of -X- _ O
HIF-1 -X- _ O
on -X- _ O
the -X- _ O
MHC -X- _ O
class -X- _ O
I -X- _ O
α-heavy -X- _ O
chain -X- _ O
and -X- _ O
β2 -X- _ O
m -X- _ O
light -X- _ O
chain -X- _ O
in -X- _ O
A549 -X- _ B-CELL
and -X- _ O
NCI-H1299 -X- _ B-CELL
lung -X- _ B-TISSUE
cancer -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
, -X- _ O
the -X- _ O
over-expressing -X- _ O
HIF-1 -X- _ O
gene -X- _ O
was -X- _ O
transfected -X- _ O
into -X- _ O
A549 -X- _ B-CELL
and -X- _ O
NCI-H1299 -X- _ B-CELL
cells -X- _ B-CELL
resulting -X- _ O
in -X- _ O
decrease -X- _ O
of -X- _ O
relative -X- _ O
levels -X- _ O
of -X- _ O
MHC -X- _ O
class -X- _ O
I -X- _ O
α-heavy -X- _ O
chain -X- _ O
and -X- _ O
β2 -X- _ O
m -X- _ O
light -X- _ O
chain. -X- _ O
This -X- _ O
results -X- _ O
were -X- _ O
in -X- _ O
line -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
decrease -X- _ O
of -X- _ O
HIF-1 -X- _ O
by -X- _ O
Endostar -X- _ O
treatment -X- _ O
accompanied -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
enhancement -X- _ O
of -X- _ O
MHC -X- _ O
class -X- _ O
I -X- _ O
α-heavy -X- _ O
chain -X- _ O
and -X- _ O
β2 -X- _ O
m -X- _ O
light -X- _ O
chain. -X- _ O
In -X- _ O
addition -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
important -X- _ O
role -X- _ O
in -X- _ O
metabolic -X- _ O
adaptation -X- _ O
to -X- _ O
hypoxia -X- _ O
stress -X- _ O
caused -X- _ O
by -X- _ O
deficient -X- _ O
supply -X- _ O
of -X- _ O
nutrients -X- _ O
and -X- _ O
oxygen -X- _ O
because -X- _ O
of -X- _ O
uncontrolled -X- _ O
growth -X- _ O
of -X- _ O
cancer -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
and -X- _ O
disorganized -X- _ O
neoangiogenesis -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
signaling -X- _ O
pathways -X- _ O
of -X- _ O
HIF-1 -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
heterodimer -X- _ O
highly -X- _ O
expressed -X- _ O
in -X- _ O
a -X- _ O
variety -X- _ O
of -X- _ O
tumor -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
, -X- _ O
suppress -X- _ O
innate -X- _ O
and -X- _ O
adaptive -X- _ O
immune -X- _ B-TISSUE
systems -X- _ I-TISSUE
to -X- _ O
escape -X- _ O
immune -X- _ O
attack. -X- _ O
That -X- _ O
HIF-1 -X- _ O
downregulates -X- _ O
the -X- _ O
antigen -X- _ O
presenting -X- _ O
MHC -X- _ O
class -X- _ O
I -X- _ O
molecules -X- _ O
is -X- _ O
an -X- _ O
important -X- _ O
strategy -X- _ O
for -X- _ O
cancer -X- _ O
to -X- _ O
evade -X- _ O
immune -X- _ O
attack -X- _ O
, -X- _ O
because -X- _ O
only -X- _ O
in -X- _ O
combination -X- _ O
with -X- _ O
MHC -X- _ O
class -X- _ O
I -X- _ O
on -X- _ O
the -X- _ O
target -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
, -X- _ O
can -X- _ O
tumor -X- _ O
antigenic -X- _ O
peptides -X- _ O
be -X- _ O
recognized -X- _ O
by -X- _ O
CD8+ -X- _ O
CTL -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
subsequent -X- _ O
destruction -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
target -X- _ O
cells. -X- _ B-CELL
Theoretically -X- _ O
, -X- _ O
inhibition -X- _ O
of -X- _ O
HIF-1 -X- _ O
may -X- _ O
upregulate -X- _ O
the -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
MHC -X- _ O
class -X- _ O
I -X- _ O
on -X- _ O
cancer -X- _ O
cells. -X- _ B-CELL
This -X- _ O
study -X- _ O
demonstrated -X- _ O
that -X- _ O
25 -X- _ O
μg -X- _ O
/ -X- _ O
ml -X- _ O
Endostar -X- _ O
inhibited -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
HIF-1 -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
upregulation -X- _ O
of -X- _ O
MHC -X- _ O
class -X- _ O
I -X- _ O
α-heavy -X- _ O
chain -X- _ O
and -X- _ O
β2 -X- _ O
m -X- _ O
light -X- _ O
chain -X- _ O
in -X- _ O
A549 -X- _ B-CELL
and -X- _ O
NCI-H1299 -X- _ B-CELL
lung -X- _ B-TISSUE
cancer -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
, -X- _ O
suggesting -X- _ O
the -X- _ O
potential -X- _ O
for -X- _ O
Endostar -X- _ O
to -X- _ O
facilitate -X- _ O
cancer -X- _ O
immunotherapy. -X- _ O
Experimental -X- _ O
evidence -X- _ O
, -X- _ O
however -X- _ O
, -X- _ O
is -X- _ O
required -X- _ O
and -X- _ O
further -X- _ O
research -X- _ O
with -X- _ O
experimental -X- _ O
evidence -X- _ O
remains -X- _ O
to -X- _ O
be -X- _ O
performed -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
future -X- _ O
to -X- _ O
confirm -X- _ O
the -X- _ O
possible -X- _ O
suppression -X- _ O
of -X- _ O
immune -X- _ O
evasion -X- _ O
tactic -X- _ O
with -X- _ O
endostar -X- _ O
treatment. -X- _ O
Other -X- _ O
limitations -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
lack -X- _ O
of -X- _ O
an -X- _ O
in -X- _ O
vivo -X- _ O
tumor -X- _ O
model -X- _ O
and -X- _ O
further -X- _ O
validation -X- _ O
using -X- _ O
flow -X- _ O
cytometry -X- _ O
remain -X- _ O
to -X- _ O
be -X- _ O
supplementarily -X- _ O
performed -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
future. -X- _ O
The -X- _ O
mechanism -X- _ O
of -X- _ O
MHC -X- _ O
class -X- _ O
I -X- _ O
regulation -X- _ O
involves -X- _ O
the -X- _ O
innate -X- _ O
immune -X- _ O
molecule -X- _ O
NLR -X- _ O
family -X- _ O
CARD -X- _ O
domain -X- _ O
containing -X- _ O
5 -X- _ O
( -X- _ O
NLRC5 -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
member -X- _ O
of -X- _ O
recently -X- _ O
discovered -X- _ O
NLRs-like -X- _ O
receptor -X- _ O
family -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
highly -X- _ O
conserved -X- _ O
one.46 -X- _ O
NLRC5 -X- _ O
is -X- _ O
an -X- _ O
MHC -X- _ O
class -X- _ O
I -X- _ O
gene -X- _ O
transactivation -X- _ O
factor -X- _ O
which -X- _ O
induces -X- _ O
the -X- _ O
MHC -X- _ O
class -X- _ O
I -X- _ O
gene -X- _ O
transcription -X- _ O
and -X- _ O
subsequently -X- _ O
activates -X- _ O
antigen -X- _ O
presentation -X- _ O
process.47,48 -X- _ O
NLRC5 -X- _ O
is -X- _ O
transcriptionally -X- _ O
regulated -X- _ O
in -X- _ O
JAK2 -X- _ O
/ -X- _ O
STAT3 -X- _ O
signaling-dependent -X- _ O
pathway.49 -X- _ O
This -X- _ O
study -X- _ O
demonstrated -X- _ O
that -X- _ O
some -X- _ O
concentrations -X- _ O
of -X- _ O
Endostar -X- _ O
decreased -X- _ O
the -X- _ O
relative -X- _ O
levels -X- _ O
of -X- _ O
STAT3 -X- _ O
and -X- _ O
pSTAT3 -X- _ O
in -X- _ O
A549 -X- _ B-CELL
lung -X- _ B-TISSUE
cancer -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
with -X- _ O
statistical -X- _ O
significance -X- _ O
, -X- _ O
which -X- _ O
is -X- _ O
in -X- _ O
line -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
role -X- _ O
of -X- _ O
JAK2 -X- _ O
/ -X- _ O
STAT3 -X- _ O
pathway -X- _ O
in -X- _ O
regulation -X- _ O
of -X- _ O
MHC -X- _ O
class -X- _ O
I -X- _ O
via -X- _ O
NLRC5 -X- _ O
, -X- _ O
suggesting -X- _ O
the -X- _ O
underlying -X- _ O
mechanism -X- _ O
of -X- _ O
MHC -X- _ O
class -X- _ O
I -X- _ O
upregulation -X- _ O
involving -X- _ O
JAK2 -X- _ O
/ -X- _ O
STAT3 -X- _ O
signaling -X- _ O
pathway. -X- _ O
Conclusions -X- _ O
Endostar -X- _ O
( -X- _ O
25 -X- _ O
μg -X- _ O
/ -X- _ O
ml -X- _ O
) -X- _ O
inhibited -X- _ O
the -X- _ O
expression -X- _ O
of -X- _ O
HIF-1 -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
upregulation -X- _ O
of -X- _ O
MHC -X- _ O
class -X- _ O
I -X- _ O
α-heavy -X- _ O
chain -X- _ O
and -X- _ O
β2 -X- _ O
m -X- _ O
light -X- _ O
chain -X- _ O
in -X- _ O
A549 -X- _ B-CELL
and -X- _ O
NCI-H1299 -X- _ B-CELL
lung -X- _ B-TISSUE
cancer -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
, -X- _ O
which -X- _ O
showed -X- _ O
the -X- _ O
potential -X- _ O
for -X- _ O
Endostar -X- _ O
to -X- _ O
facilitate -X- _ O
cancer -X- _ O
immunotherapy. -X- _ O
It -X- _ O
is -X- _ O
needed -X- _ O
for -X- _ O
future -X- _ O
studies -X- _ O
that -X- _ O
are -X- _ O
warranted -X- _ O
to -X- _ O
confirm -X- _ O
the -X- _ O
role -X- _ O
of -X- _ O
Endostar -X- _ O
treatment. -X- _ O
Source -X- _ O
paper -X- _ O
: -X- _ O
PMC12101583 -X- _ O

2. -X- _ O
results -X- _ O
3. -X- _ O
discussion -X- _ O
Conifer -X- _ O
bark -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
medicinal -X- _ O
use -X- _ O
of -X- _ O
which -X- _ O
dates -X- _ O
back -X- _ O
more -X- _ O
than -X- _ O
2000 -X- _ O
years -X- _ O
, -X- _ O
contains -X- _ O
bioactive -X- _ O
alkaloids -X- _ O
, -X- _ O
flavonoids -X- _ O
, -X- _ O
lignans -X- _ O
, -X- _ O
phenolic -X- _ O
acids -X- _ O
, -X- _ O
proanthocyanidins -X- _ O
, -X- _ O
stilbenes -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
terpenoids -X- _ O
that -X- _ O
contribute -X- _ O
to -X- _ O
its -X- _ O
therapeutic -X- _ O
potential. -X- _ O
Various -X- _ O
conifer -X- _ O
bark -X- _ O
extracts -X- _ O
are -X- _ O
used -X- _ O
nowadays -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
nutraceutical -X- _ O
, -X- _ O
food -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
pharmaceutical -X- _ O
industries -X- _ O
because -X- _ O
of -X- _ O
their -X- _ O
health-promoting -X- _ O
effects -X- _ O
in -X- _ O
numerous -X- _ O
ailments -X- _ O
and -X- _ O
diseases -X- _ O
[ -X- _ O
27,28,29 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Such -X- _ O
extracts -X- _ O
are -X- _ O
Pycnogenol® -X- _ O
, -X- _ O
Flavangenol® -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
Oligopin® -X- _ O
derived -X- _ O
from -X- _ O
Pinus -X- _ O
pinaster -X- _ O
Ait. -X- _ O
bark -X- _ O
[ -X- _ O
29 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
Enzogenol® -X- _ O
produced -X- _ O
from -X- _ O
Pinus -X- _ O
radiata -X- _ O
D. -X- _ O
Don -X- _ B-CELL
bark -X- _ O
[ -X- _ O
30 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
Abigenol® -X- _ O
originating -X- _ O
from -X- _ O
Abies -X- _ O
alba -X- _ O
Mill. -X- _ O
bark -X- _ O
[ -X- _ O
31 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Pinus -X- _ O
cembra -X- _ O
L. -X- _ O
( -X- _ O
Pinaceae -X- _ O
, -X- _ O
Swiss -X- _ O
stone -X- _ O
pine -X- _ O
, -X- _ O
Arolla -X- _ O
pine -X- _ O
, -X- _ O
cembran -X- _ O
pine -X- _ O
, -X- _ O
cedar -X- _ O
pine -X- _ O
) -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
coniferous -X- _ O
tree -X- _ O
growing -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
Alps -X- _ O
and -X- _ O
Carpathian -X- _ O
Mountains -X- _ O
[ -X- _ O
32 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
bark -X- _ O
has -X- _ O
been -X- _ O
scarcely -X- _ O
investigated -X- _ O
for -X- _ O
its -X- _ O
chemical -X- _ O
composition -X- _ O
and -X- _ O
biological -X- _ O
activity. -X- _ O
We -X- _ O
have -X- _ O
previously -X- _ O
assessed -X- _ O
the -X- _ O
antioxidant -X- _ O
potential -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
raw -X- _ B-CELL
bark -X- _ O
extract -X- _ O
( -X- _ O
80 -X- _ O
% -X- _ O
methanolic -X- _ O
bark -X- _ O
extract -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
found -X- _ O
EC50 -X- _ O
values -X- _ O
of -X- _ O
71.1 -X- _ O
± -X- _ O
0.5 -X- _ O
and -X- _ O
26.0 -X- _ O
± -X- _ O
0.3 -X- _ O
μg -X- _ O
/ -X- _ O
mL -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
DPPH -X- _ O
radical -X- _ O
scavenging -X- _ O
and -X- _ O
reducing -X- _ O
power -X- _ O
assays -X- _ O
, -X- _ O
respectively. -X- _ O
The -X- _ O
antioxidant -X- _ O
potential -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
raw -X- _ B-CELL
bark -X- _ O
extract -X- _ O
is -X- _ O
strongly -X- _ O
associated -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
total -X- _ O
phenolic -X- _ O
content -X- _ O
, -X- _ O
quantified -X- _ O
as -X- _ O
299.3 -X- _ O
± -X- _ O
1.4 -X- _ O
mg -X- _ O
/ -X- _ O
g. -X- _ O
In -X- _ O
the -X- _ O
same -X- _ O
assays -X- _ O
, -X- _ O
catechin -X- _ O
was -X- _ O
more -X- _ O
effective -X- _ O
( -X- _ O
EC50 -X- _ O
= -X- _ O
5.56 -X- _ O
± -X- _ O
0.05 -X- _ O
and -X- _ O
3.70 -X- _ O
± -X- _ O
0.03 -X- _ O
μg -X- _ O
/ -X- _ O
mL -X- _ O
, -X- _ O
respectively -X- _ O
) -X- _ O
[ -X- _ O
26 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Other -X- _ O
polar -X- _ O
conifer -X- _ O
bark -X- _ O
extracts -X- _ O
( -X- _ O
80 -X- _ O
% -X- _ O
methanolic -X- _ O
, -X- _ O
aqueous -X- _ O
) -X- _ O
scavenged -X- _ O
the -X- _ O
DPPH -X- _ O
radical -X- _ O
with -X- _ O
EC50 -X- _ O
values -X- _ O
ranging -X- _ O
from -X- _ O
6.46 -X- _ O
± -X- _ O
0.36 -X- _ O
to -X- _ O
100.1 -X- _ O
± -X- _ O
0.1 -X- _ O
μg -X- _ O
/ -X- _ O
mL -X- _ O
[ -X- _ O
29,33,34,35,36 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
In -X- _ O
the -X- _ O
reducing -X- _ O
power -X- _ O
assay -X- _ O
, -X- _ O
polar -X- _ O
conifer -X- _ O
bark -X- _ O
extracts -X- _ O
exhibited -X- _ O
EC50 -X- _ O
values -X- _ O
ranging -X- _ O
from -X- _ O
9.17 -X- _ O
± -X- _ O
0.13 -X- _ O
to -X- _ O
25.32 -X- _ O
± -X- _ O
0.62 -X- _ O
μg -X- _ O
/ -X- _ O
mL -X- _ O
[ -X- _ O
29,35,37 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Overall -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
EC50 -X- _ O
values -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
raw -X- _ B-CELL
extract -X- _ O
of -X- _ O
cembran -X- _ O
pine -X- _ O
bark -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
DPPH -X- _ O
and -X- _ O
reducing -X- _ O
power -X- _ O
assays -X- _ O
fall -X- _ O
within -X- _ O
the -X- _ O
range -X- _ O
of -X- _ O
values -X- _ O
reported -X- _ O
for -X- _ O
other -X- _ O
polar -X- _ O
conifer -X- _ O
bark -X- _ O
extracts. -X- _ O
The -X- _ O
cytotoxic -X- _ O
potential -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
raw -X- _ B-CELL
bark -X- _ O
extract -X- _ O
was -X- _ O
further -X- _ O
investigated. -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL
cells -X- _ B-CELL
were -X- _ O
used -X- _ O
for -X- _ O
this -X- _ O
purpose -X- _ O
as -X- _ O
they -X- _ O
have -X- _ O
advantages -X- _ O
over -X- _ O
other -X- _ O
tumor -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
lines -X- _ I-CELL
, -X- _ O
for -X- _ O
example -X- _ O
, -X- _ O
high -X- _ O
adaptive -X- _ O
capacity -X- _ O
and -X- _ O
proliferation -X- _ O
rate -X- _ O
[ -X- _ O
38 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
study -X- _ O
revealed -X- _ O
moderate -X- _ O
or -X- _ O
weak -X- _ O
cytotoxicity. -X- _ O
At -X- _ O
25 -X- _ O
and -X- _ O
50 -X- _ O
μg -X- _ O
/ -X- _ O
mL -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
extract -X- _ O
had -X- _ O
an -X- _ O
insignificant -X- _ O
impact -X- _ O
on -X- _ O
the -X- _ O
viability -X- _ O
of -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL
cells -X- _ B-CELL
, -X- _ O
lacked -X- _ O
apoptosis-inducing -X- _ O
effects -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
induced -X- _ O
slight -X- _ O
increases -X- _ O
( -X- _ O
≤5 -X- _ O
% -X- _ O
) -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL
cell -X- _ B-CELL
percentages -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
S -X- _ O
, -X- _ O
G2 -X- _ O
/ -X- _ O
M -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
sub-G1 -X- _ O
phases -X- _ O
in -X- _ O
comparison -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
control. -X- _ O
Other -X- _ O
polar -X- _ O
conifer -X- _ O
bark -X- _ O
extracts -X- _ O
exhibited -X- _ O
higher -X- _ O
activity -X- _ O
on -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL
cells. -X- _ B-CELL
The -X- _ O
aqueous -X- _ O
extract -X- _ O
of -X- _ O
Pinus -X- _ O
massoniana -X- _ O
Lamb. -X- _ O
bark -X- _ O
significantly -X- _ O
inhibited -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL
cell -X- _ B-CELL
viability -X- _ O
and -X- _ O
caused -X- _ O
a -X- _ O
substantial -X- _ O
increase -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
proportions -X- _ O
of -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL
cells -X- _ B-CELL
in -X- _ O
the -X- _ O
sub-G1 -X- _ O
and -X- _ O
G2 -X- _ O
/ -X- _ O
M -X- _ O
phases -X- _ O
[ -X- _ O
39 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Accumulation -X- _ O
of -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL
cells -X- _ B-CELL
in -X- _ O
the -X- _ O
sub-G1 -X- _ O
phase -X- _ O
is -X- _ O
considered -X- _ O
an -X- _ O
indicator -X- _ O
of -X- _ O
a -X- _ O
pro-apoptotic -X- _ O
effect -X- _ O
[ -X- _ O
39,40 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
In -X- _ O
other -X- _ O
studies -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
extract -X- _ O
significantly -X- _ O
inhibited -X- _ O
the -X- _ O
migration -X- _ O
and -X- _ O
invasion -X- _ O
of -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL
cells -X- _ B-CELL
, -X- _ O
respectively -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
latter -X- _ O
effect -X- _ O
being -X- _ O
attributed -X- _ O
to -X- _ O
cathepsin -X- _ O
B -X- _ O
down-regulation -X- _ O
[ -X- _ O
41,42 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Pro-apoptotic -X- _ O
effects -X- _ O
in -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL
cells -X- _ B-CELL
were -X- _ O
also -X- _ O
reported -X- _ O
for -X- _ O
the -X- _ O
80 -X- _ O
% -X- _ O
methanolic -X- _ O
extract -X- _ O
of -X- _ O
Pinus -X- _ O
sylvestris -X- _ O
L. -X- _ O
bark -X- _ O
[ -X- _ O
43 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
ethanolic -X- _ O
extract -X- _ O
of -X- _ O
Pinus -X- _ O
merkusii -X- _ O
Jung. -X- _ O
& -X- _ O
de -X- _ O
Vriese -X- _ O
bark -X- _ O
[ -X- _ O
44 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
procyanidin-rich -X- _ O
extract -X- _ O
of -X- _ O
Pinus -X- _ O
koraiensis -X- _ O
Siebold -X- _ O
& -X- _ O
Zucc. -X- _ O
bark -X- _ O
[ -X- _ O
45 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
pro-apoptotic -X- _ O
effects -X- _ O
of -X- _ O
conifer -X- _ O
bark -X- _ O
extracts -X- _ O
were -X- _ O
found -X- _ O
to -X- _ O
be -X- _ O
mediated -X- _ O
by -X- _ O
activation -X- _ O
of -X- _ O
caspase-9 -X- _ O
and -X- _ O
-3 -X- _ O
, -X- _ O
up-regulation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
pro-apoptotic -X- _ O
protein -X- _ O
Bax -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
down-regulation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
anti-apoptotic -X- _ O
protein -X- _ O
Bcl-2 -X- _ O
and -X- _ O
survivin -X- _ O
[ -X- _ O
39,44,45 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Purification -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
cembran -X- _ O
pine -X- _ O
raw -X- _ B-CELL
bark -X- _ O
extract -X- _ O
resulted -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
isolation -X- _ O
of -X- _ O
two -X- _ O
stilbene -X- _ O
glycosides -X- _ O
, -X- _ O
namely -X- _ O
resveratroloside -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
pinostilbenoside -X- _ O
( -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
structures -X- _ O
of -X- _ O
which -X- _ O
were -X- _ O
confirmed -X- _ O
through -X- _ O
spectroscopic -X- _ O
techniques. -X- _ O
To -X- _ O
the -X- _ O
best -X- _ O
of -X- _ O
our -X- _ O
knowledge -X- _ O
, -X- _ O
this -X- _ O
is -X- _ O
the -X- _ O
first -X- _ O
report -X- _ O
on -X- _ O
the -X- _ O
presence -X- _ O
of -X- _ O
resveratroloside -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
pinostilbenoside -X- _ O
( -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
in -X- _ O
Pinus -X- _ O
cembra -X- _ O
L. -X- _ O
bark. -X- _ O
Both -X- _ O
compounds -X- _ O
were -X- _ O
previously -X- _ O
isolated -X- _ O
from -X- _ O
other -X- _ O
conifer -X- _ O
barks -X- _ O
: -X- _ O
resveratroloside -X- _ O
from -X- _ O
Pinus -X- _ O
sibirica -X- _ O
R. -X- _ O
Mayr -X- _ O
bark -X- _ O
[ -X- _ O
46 -X- _ O
] -X- _ O
and -X- _ O
pinostilbenoside -X- _ O
from -X- _ O
Pinus -X- _ O
sibirica -X- _ O
R. -X- _ O
Mayr -X- _ O
bark -X- _ O
[ -X- _ O
46 -X- _ O
] -X- _ O
and -X- _ O
Pinus -X- _ O
koraiensis -X- _ O
Siebold -X- _ O
& -X- _ O
Zucc. -X- _ O
bark -X- _ O
[ -X- _ O
18 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
evaluation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
antioxidant -X- _ O
potential -X- _ O
of -X- _ O
resveratroloside -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
pinostilbenoside -X- _ O
( -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
demonstrated -X- _ O
weaker -X- _ O
effects -X- _ O
than -X- _ O
the -X- _ O
raw -X- _ B-CELL
bark -X- _ O
extract -X- _ O
, -X- _ O
indicating -X- _ O
a -X- _ O
potential -X- _ O
synergistic -X- _ O
interaction -X- _ O
among -X- _ O
the -X- _ O
components -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
extract. -X- _ O
Previous -X- _ O
studies -X- _ O
have -X- _ O
reported -X- _ O
similar -X- _ O
synergistic -X- _ O
interactions -X- _ O
in -X- _ O
pine -X- _ O
bark -X- _ O
extracts. -X- _ O
Pycnogenol -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
standardized -X- _ O
extract -X- _ O
obtained -X- _ O
from -X- _ O
the -X- _ O
bark -X- _ O
of -X- _ O
French -X- _ O
maritime -X- _ O
pine -X- _ O
( -X- _ O
Pinus -X- _ O
maritima -X- _ O
Lam. -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
exhibits -X- _ O
stronger -X- _ O
biological -X- _ O
effects -X- _ O
than -X- _ O
its -X- _ O
components -X- _ O
when -X- _ O
tested -X- _ O
individually -X- _ O
[ -X- _ O
27 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
In -X- _ O
contrast -X- _ O
to -X- _ O
our -X- _ O
findings -X- _ O
, -X- _ O
Dar -X- _ O
et -X- _ O
al. -X- _ O
( -X- _ O
2016 -X- _ O
) -X- _ O
reported -X- _ O
a -X- _ O
strong -X- _ O
antioxidant -X- _ O
potential -X- _ O
for -X- _ O
resveratroloside -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
DPPH -X- _ O
assay -X- _ O
( -X- _ O
IC50 -X- _ O
= -X- _ O
14.0 -X- _ O
μg -X- _ O
/ -X- _ O
mL -X- _ O
) -X- _ O
[ -X- _ O
47 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
explanation -X- _ O
lies -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
fact -X- _ O
that -X- _ O
Dar -X- _ O
et -X- _ O
al. -X- _ O
[ -X- _ O
47 -X- _ O
] -X- _ O
used -X- _ O
another -X- _ O
experimental -X- _ O
protocol. -X- _ O
Resveratroloside -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
exhibited -X- _ O
higher -X- _ O
activity -X- _ O
than -X- _ O
pinostilbenoside -X- _ O
( -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
in -X- _ O
both -X- _ O
assays. -X- _ O
The -X- _ O
findings -X- _ O
align -X- _ O
with -X- _ O
previous -X- _ O
studies -X- _ O
reporting -X- _ O
a -X- _ O
higher -X- _ O
antioxidant -X- _ O
capacity -X- _ O
( -X- _ O
evaluated -X- _ O
as -X- _ O
oxygen -X- _ O
radical -X- _ O
absorbance -X- _ O
capacity -X- _ O
, -X- _ O
ORAC -X- _ O
) -X- _ O
for -X- _ O
resveratroloside -X- _ O
( -X- _ O
4.01 -X- _ O
± -X- _ O
0.71 -X- _ O
Trolox -X- _ O
equivalents -X- _ O
/ -X- _ O
μM -X- _ O
) -X- _ O
than -X- _ O
pinostilbenoside -X- _ O
( -X- _ O
1.89 -X- _ O
± -X- _ O
0.25 -X- _ O
Trolox -X- _ O
equivalents -X- _ O
/ -X- _ O
μM -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
In -X- _ O
the -X- _ O
same -X- _ O
assay -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
aglycones -X- _ O
, -X- _ O
resveratrol -X- _ O
and -X- _ O
pinostilbene -X- _ O
, -X- _ O
were -X- _ O
more -X- _ O
active -X- _ O
than -X- _ O
the -X- _ O
corresponding -X- _ O
glycosides -X- _ O
, -X- _ O
showing -X- _ O
ORAC -X- _ O
values -X- _ O
of -X- _ O
5.26 -X- _ O
± -X- _ O
0.26 -X- _ O
and -X- _ O
5.01 -X- _ O
± -X- _ O
0.27 -X- _ O
Trolox -X- _ O
equivalents -X- _ O
/ -X- _ O
μM -X- _ O
, -X- _ O
respectively -X- _ O
[ -X- _ O
48 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Glycosylation -X- _ O
and -X- _ O
methylation -X- _ O
negatively -X- _ O
impact -X- _ O
the -X- _ O
antioxidant -X- _ O
capacity -X- _ O
of -X- _ O
stilbenes -X- _ O
by -X- _ O
blocking -X- _ O
the -X- _ O
free -X- _ O
phenolic -X- _ O
hydroxyl -X- _ O
groups -X- _ O
responsible -X- _ O
for -X- _ O
the -X- _ O
antioxidant -X- _ O
activity -X- _ O
[ -X- _ O
49 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
On -X- _ O
the -X- _ O
other -X- _ O
hand -X- _ O
, -X- _ O
glycosylation -X- _ O
and -X- _ O
methylation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
stilbene -X- _ O
hydroxyl -X- _ O
groups -X- _ O
might -X- _ O
enhance -X- _ O
other -X- _ O
bioactivities -X- _ O
such -X- _ O
as -X- _ O
tyrosinase -X- _ O
inhibitory -X- _ O
activity -X- _ O
[ -X- _ O
48 -X- _ O
] -X- _ O
and -X- _ O
anticancer -X- _ O
activity -X- _ O
, -X- _ O
respectively -X- _ O
[ -X- _ O
3 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Glycosylation -X- _ O
enhances -X- _ O
the -X- _ O
stability -X- _ O
of -X- _ O
stilbenes -X- _ O
, -X- _ O
while -X- _ O
methylation -X- _ O
increases -X- _ O
their -X- _ O
lipophilicity -X- _ O
, -X- _ O
leading -X- _ O
to -X- _ O
improved -X- _ O
bioavailability -X- _ O
[ -X- _ O
3 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
In -X- _ O
this -X- _ O
study -X- _ O
, -X- _ O
resveratroloside -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
pinostilbenoside -X- _ O
( -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
demonstrated -X- _ O
promising -X- _ O
cytotoxic -X- _ O
activity -X- _ O
against -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL
cells. -X- _ B-CELL
The -X- _ O
activity -X- _ O
was -X- _ O
evaluated -X- _ O
after -X- _ O
48 -X- _ O
h -X- _ O
of -X- _ O
incubation -X- _ O
with -X- _ O
25 -X- _ O
or -X- _ O
50 -X- _ O
μg -X- _ O
/ -X- _ O
mL -X- _ O
of -X- _ O
each -X- _ O
compound -X- _ O
( -X- _ O
equivalent -X- _ O
to -X- _ O
64 -X- _ O
or -X- _ O
128 -X- _ O
μM -X- _ O
of -X- _ O
resveratroloside -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
62 -X- _ O
or -X- _ O
124 -X- _ O
μM -X- _ O
of -X- _ O
pinostilbenoside -X- _ O
( -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
selection -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
concentrations -X- _ O
to -X- _ O
be -X- _ O
tested -X- _ O
and -X- _ O
incubation -X- _ O
time -X- _ O
was -X- _ O
based -X- _ O
on -X- _ O
previous -X- _ O
studies -X- _ O
investigating -X- _ O
the -X- _ O
cytotoxicity -X- _ O
of -X- _ O
resveratrol -X- _ O
in -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL
cells -X- _ B-CELL
[ -X- _ O
50,51,52 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
In -X- _ O
addition -X- _ O
, -X- _ O
this -X- _ O
study -X- _ O
revealed -X- _ O
pronounced -X- _ O
cytotoxicity -X- _ O
( -X- _ O
less -X- _ O
than -X- _ O
30 -X- _ O
% -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
viability -X- _ O
) -X- _ O
for -X- _ O
both -X- _ O
compounds -X- _ O
at -X- _ O
100 -X- _ O
μg -X- _ O
/ -X- _ O
mL. -X- _ O
This -X- _ O
served -X- _ O
as -X- _ O
additional -X- _ O
support -X- _ O
for -X- _ O
selecting -X- _ O
lower -X- _ O
doses -X- _ O
( -X- _ O
25 -X- _ O
and -X- _ O
50 -X- _ O
μg -X- _ O
/ -X- _ O
mL -X- _ O
) -X- _ O
in -X- _ O
cell-based -X- _ B-CELL
assays. -X- _ O
To -X- _ O
the -X- _ O
best -X- _ O
of -X- _ O
current -X- _ O
knowledge -X- _ O
, -X- _ O
this -X- _ O
is -X- _ O
the -X- _ O
first -X- _ O
study -X- _ O
evaluating -X- _ O
the -X- _ O
effects -X- _ O
of -X- _ O
resveratroloside -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
pinostilbenoside -X- _ O
( -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
on -X- _ O
human -X- _ O
cervical -X- _ O
carcinoma -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL
cells. -X- _ B-CELL
Resveratroloside -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
has -X- _ O
been -X- _ O
scarcely -X- _ O
investigated -X- _ O
for -X- _ O
its -X- _ O
antitumor -X- _ O
potential. -X- _ O
Only -X- _ O
its -X- _ O
antiproliferative -X- _ O
effects -X- _ O
on -X- _ O
H2452 -X- _ O
malignant -X- _ O
pleural -X- _ O
mesothelioma -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
( -X- _ O
approximately -X- _ O
30 -X- _ O
% -X- _ O
inhibition -X- _ O
at -X- _ O
200 -X- _ O
μM -X- _ O
) -X- _ O
were -X- _ O
reported -X- _ O
so -X- _ O
far -X- _ O
[ -X- _ O
53 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
To -X- _ O
the -X- _ O
best -X- _ O
of -X- _ O
our -X- _ O
knowledge -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
antitumor -X- _ O
potential -X- _ O
of -X- _ O
pinostilbenoside -X- _ O
( -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
has -X- _ O
not -X- _ O
been -X- _ O
investigated -X- _ O
before. -X- _ O
Cytotoxic -X- _ O
therapies -X- _ O
eliminate -X- _ O
cancer -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
by -X- _ O
triggering -X- _ O
various -X- _ O
pathways -X- _ O
of -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
death. -X- _ O
Induction -X- _ O
of -X- _ O
apoptosis -X- _ O
( -X- _ O
programmed -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
death -X- _ O
) -X- _ O
has -X- _ O
been -X- _ O
a -X- _ O
primary -X- _ O
objective -X- _ O
in -X- _ O
cancer -X- _ O
therapy -X- _ O
for -X- _ O
more -X- _ O
than -X- _ O
30 -X- _ O
years -X- _ O
[ -X- _ O
54 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
In -X- _ O
recent -X- _ O
years -X- _ O
, -X- _ O
many -X- _ O
drugs -X- _ O
, -X- _ O
including -X- _ O
natural -X- _ O
compounds -X- _ O
, -X- _ O
have -X- _ O
been -X- _ O
reported -X- _ O
to -X- _ O
trigger -X- _ O
other -X- _ O
types -X- _ O
of -X- _ O
death -X- _ O
in -X- _ O
cancer -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
such -X- _ O
as -X- _ O
autophagy -X- _ O
, -X- _ O
ferroptosis -X- _ O
, -X- _ O
necroptosis -X- _ O
, -X- _ O
pyroptosis -X- _ O
, -X- _ O
paraptosis -X- _ O
, -X- _ O
lysosome-dependent -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
death -X- _ O
, -X- _ O
oncosis -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
necrosis -X- _ O
[ -X- _ O
55,56 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Resveratroloside -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
pinostilbenoside -X- _ O
( -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
are -X- _ O
not -X- _ O
the -X- _ O
sole -X- _ O
stilbenes -X- _ O
that -X- _ O
cause -X- _ O
tumor -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
death -X- _ O
by -X- _ O
triggering -X- _ O
non-apoptotic -X- _ O
mechanisms. -X- _ O
Resveratrol -X- _ O
was -X- _ O
reported -X- _ O
to -X- _ O
induce -X- _ O
tumor -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
death -X- _ O
by -X- _ O
apoptosis -X- _ O
, -X- _ O
autophagy -X- _ O
, -X- _ O
necroptosis -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
necrosis -X- _ O
[ -X- _ O
56,57 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Pterostilbene -X- _ O
was -X- _ O
found -X- _ O
to -X- _ O
activate -X- _ O
apoptosis -X- _ O
, -X- _ O
autophagy -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
necrosis -X- _ O
in -X- _ O
cancer -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
, -X- _ O
apoptosis -X- _ O
being -X- _ O
the -X- _ O
major -X- _ O
mechanism -X- _ O
involved -X- _ O
in -X- _ O
cancer -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
death -X- _ O
[ -X- _ O
58 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Combrestatins -X- _ O
( -X- _ O
diaryl -X- _ O
stilbenoids -X- _ O
) -X- _ O
are -X- _ O
effective -X- _ O
promoters -X- _ O
of -X- _ O
tumor -X- _ O
necrosis -X- _ O
[ -X- _ O
59 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Dysregulation -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
cycle -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
process -X- _ O
involving -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
growth -X- _ O
, -X- _ O
DNA -X- _ O
replication -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
division -X- _ O
, -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
hallmark -X- _ O
of -X- _ O
cancer. -X- _ O
An -X- _ O
important -X- _ O
strategy -X- _ O
in -X- _ O
cancer -X- _ O
therapy -X- _ O
is -X- _ O
the -X- _ O
induction -X- _ O
of -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
cycle -X- _ O
arrest. -X- _ O
Flavopiridol -X- _ O
, -X- _ O
abemaciclib -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
palbociclib -X- _ O
are -X- _ O
a -X- _ O
few -X- _ O
examples -X- _ O
of -X- _ O
antitumor -X- _ O
drugs -X- _ O
that -X- _ O
suppress -X- _ O
the -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
cycle -X- _ O
via -X- _ O
inhibition -X- _ O
of -X- _ O
enzymes -X- _ O
/ -X- _ O
proteins -X- _ O
( -X- _ O
cyclin-dependent -X- _ O
kinases -X- _ O
/ -X- _ O
cyclins -X- _ O
) -X- _ O
responsible -X- _ O
for -X- _ O
driving -X- _ O
the -X- _ O
progression -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
cycle -X- _ O
from -X- _ O
one -X- _ O
phase -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
next -X- _ O
one -X- _ O
[ -X- _ O
60 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
According -X- _ O
to -X- _ O
this -X- _ O
study -X- _ O
, -X- _ O
resveratroloside -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
pinostilbenoside -X- _ O
( -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
impeded -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL
cell -X- _ B-CELL
proliferation -X- _ O
, -X- _ O
with -X- _ O
pinostilbenoside -X- _ O
( -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
being -X- _ O
more -X- _ O
active -X- _ O
than -X- _ O
resveratroloside -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
at -X- _ O
25 -X- _ O
μg -X- _ O
/ -X- _ O
mL. -X- _ O
This -X- _ O
result -X- _ O
aligns -X- _ O
with -X- _ O
previous -X- _ O
studies -X- _ O
showing -X- _ O
that -X- _ O
stilbenes -X- _ O
inhibit -X- _ O
the -X- _ O
proliferation -X- _ O
of -X- _ O
tumor -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
lines. -X- _ I-CELL
Resveratrol -X- _ O
[ -X- _ O
57 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
piceatannol -X- _ O
[ -X- _ O
10 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
pterostilbene -X- _ O
[ -X- _ O
61,62,63 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
polydatin -X- _ O
( -X- _ O
piceid -X- _ O
) -X- _ O
[ -X- _ O
64 -X- _ O
] -X- _ O
were -X- _ O
reported -X- _ O
to -X- _ O
suppress -X- _ O
the -X- _ O
proliferation -X- _ O
of -X- _ O
various -X- _ O
cancer -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
lines -X- _ I-CELL
( -X- _ O
lung -X- _ B-TISSUE
, -X- _ O
prostate -X- _ B-TISSUE
, -X- _ O
breast -X- _ B-TISSUE
, -X- _ O
colorectal -X- _ O
, -X- _ O
liver -X- _ B-TISSUE
, -X- _ O
pancreatic -X- _ O
, -X- _ O
cervical -X- _ O
, -X- _ O
ovarian -X- _ O
, -X- _ O
bladder -X- _ B-TISSUE
, -X- _ O
leukemia -X- _ O
, -X- _ O
multiple -X- _ O
myeloma -X- _ O
, -X- _ O
bone -X- _ B-TISSUE
, -X- _ O
oral -X- _ O
, -X- _ O
esophageal -X- _ O
, -X- _ O
head -X- _ B-TISSUE
and -X- _ O
neck -X- _ B-TISSUE
) -X- _ O
. -X- _ O
Regarding -X- _ O
the -X- _ O
impact -X- _ O
of -X- _ O
resveratroloside -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
pinostilbenoside -X- _ O
( -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
on -X- _ O
the -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL
cell -X- _ B-CELL
cycle -X- _ O
, -X- _ O
both -X- _ O
compounds -X- _ O
induced -X- _ O
a -X- _ O
significant -X- _ O
dose-dependent -X- _ O
increase -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
sub-G1 -X- _ O
phase -X- _ O
population. -X- _ O
In -X- _ O
addition -X- _ O
, -X- _ O
both -X- _ O
compounds -X- _ O
( -X- _ O
25 -X- _ O
μg -X- _ O
/ -X- _ O
mL -X- _ O
) -X- _ O
induced -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
cycle -X- _ O
arrest -X- _ O
at -X- _ O
the -X- _ O
S -X- _ O
phase -X- _ O
, -X- _ O
indicating -X- _ O
a -X- _ O
blockage -X- _ O
of -X- _ O
DNA -X- _ O
replication -X- _ O
[ -X- _ O
60 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
As -X- _ O
mentioned -X- _ O
earlier -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
sub-G1 -X- _ O
population -X- _ O
is -X- _ O
a -X- _ O
hallmark -X- _ O
of -X- _ O
apoptosis -X- _ O
[ -X- _ O
39,40 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
In -X- _ O
fact -X- _ O
, -X- _ O
not -X- _ O
only -X- _ O
apoptotic -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
accumulate -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
sub-G1 -X- _ O
phase -X- _ O
, -X- _ O
but -X- _ O
this -X- _ O
phase -X- _ O
consists -X- _ O
of -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
showing -X- _ O
DNA -X- _ O
fragmentation -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
process -X- _ O
observed -X- _ O
in -X- _ O
both -X- _ O
apoptosis -X- _ O
and -X- _ O
necrosis -X- _ O
[ -X- _ O
65,66,67 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
When -X- _ O
exploring -X- _ O
a -X- _ O
potential -X- _ O
pro-apoptotic -X- _ O
effect -X- _ O
, -X- _ O
only -X- _ O
resveratroloside -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
showed -X- _ O
activity -X- _ O
( -X- _ O
approximately -X- _ O
11 -X- _ O
% -X- _ O
increase -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
early -X- _ O
and -X- _ O
late -X- _ O
apoptotic -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL
cells -X- _ B-CELL
following -X- _ O
48 -X- _ O
h -X- _ O
treatment -X- _ O
with -X- _ O
resveratroloside -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
at -X- _ O
50 -X- _ O
μg -X- _ O
/ -X- _ O
mL -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
results -X- _ O
of -X- _ O
this -X- _ O
study -X- _ O
indicate -X- _ O
that -X- _ O
resveratroloside -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
pinostilbenoside -X- _ O
( -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
impact -X- _ O
the -X- _ O
viability -X- _ O
and -X- _ O
proliferation -X- _ O
of -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL
cells -X- _ B-CELL
by -X- _ O
triggering -X- _ O
mainly -X- _ O
non-apoptotic -X- _ O
( -X- _ O
highly -X- _ O
likely -X- _ O
necrotic -X- _ O
) -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
death -X- _ O
, -X- _ O
as -X- _ O
well -X- _ O
as -X- _ O
S-phase -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
cycle -X- _ O
arrest. -X- _ O
Similar -X- _ O
results -X- _ O
have -X- _ O
been -X- _ O
reported -X- _ O
for -X- _ O
other -X- _ O
stilbene -X- _ O
derivatives. -X- _ O
Resveratrol -X- _ O
was -X- _ O
found -X- _ O
to -X- _ O
induce -X- _ O
apoptosis -X- _ O
and -X- _ O
block -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
cycle -X- _ O
progression -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
S -X- _ O
phase -X- _ O
in -X- _ O
human -X- _ O
SW480 -X- _ B-CELL
colon -X- _ B-TISSUE
carcinoma -X- _ O
, -X- _ O
MCF7 -X- _ B-CELL
breast -X- _ B-TISSUE
carcinoma -X- _ O
, -X- _ O
HCE7 -X- _ O
esophageal -X- _ O
squamous -X- _ O
carcinoma -X- _ O
, -X- _ O
HL60 -X- _ O
promyelocytic -X- _ O
leukemia -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
[ -X- _ O
68 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
neuro-2a -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
derived -X- _ O
from -X- _ O
C1300 -X- _ O
murine -X- _ O
neuroblastoma -X- _ O
[ -X- _ O
69 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Piceatannol -X- _ O
caused -X- _ O
apoptosis -X- _ O
and -X- _ O
G0 -X- _ O
/ -X- _ O
G1 -X- _ O
phase -X- _ O
arrest -X- _ O
in -X- _ O
T24 -X- _ O
and -X- _ O
HT1376 -X- _ O
human -X- _ O
bladder -X- _ B-TISSUE
cancer -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
[ -X- _ O
70 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Pterostilbene -X- _ O
was -X- _ O
reported -X- _ O
to -X- _ O
induce -X- _ O
apoptosis -X- _ O
and -X- _ O
S-phase -X- _ O
arrest -X- _ O
in -X- _ O
MOLT4 -X- _ O
human -X- _ O
leukemia -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
[ -X- _ O
71 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
Jurkat -X- _ B-CELL
and -X- _ O
Hut-78 -X- _ O
T-cell -X- _ B-CELL
leukemia -X- _ O
/ -X- _ O
lymphoma -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
[ -X- _ O
72 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
diffuse -X- _ O
large -X- _ O
B-cell -X- _ B-CELL
lymphoma -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
[ -X- _ O
73 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
apoptosis -X- _ O
and -X- _ O
G1 -X- _ O
phase -X- _ O
arrest -X- _ O
in -X- _ O
HT-29 -X- _ B-CELL
colon -X- _ B-TISSUE
cancer -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
[ -X- _ O
58 -X- _ O
] -X- _ O
and -X- _ O
human -X- _ O
gastric -X- _ O
carcinoma -X- _ O
AGS -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
[ -X- _ O
74 -X- _ O
] -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
autophagy -X- _ O
and -X- _ O
S -X- _ O
phase -X- _ O
arrest -X- _ O
in -X- _ O
HCCC-9810 -X- _ O
and -X- _ O
RBE -X- _ O
human -X- _ O
cholangiocarcinoma -X- _ B-CELL
cells -X- _ I-CELL
[ -X- _ O
62 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
To -X- _ O
conclude -X- _ O
the -X- _ O
cytotoxicity -X- _ O
assays -X- _ O
, -X- _ O
resveratroloside -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
pinostilbenoside -X- _ O
( -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
reduced -X- _ O
viability -X- _ O
( -X- _ O
mostly -X- _ O
via -X- _ O
non-apoptotic -X- _ O
routes -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
proliferation -X- _ O
( -X- _ O
via -X- _ O
sub-G1- -X- _ O
and -X- _ O
S-phase -X- _ O
arrest -X- _ O
) -X- _ O
in -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL
cells. -X- _ B-CELL
The -X- _ O
results -X- _ O
are -X- _ O
consistent -X- _ O
with -X- _ O
previous -X- _ O
studies -X- _ O
on -X- _ O
the -X- _ O
antitumor -X- _ O
potential -X- _ O
of -X- _ O
stilbenes. -X- _ O
Resveratrol -X- _ O
, -X- _ O
the -X- _ O
basic -X- _ O
scaffold -X- _ O
of -X- _ O
resveratroloside -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
pinostilbenoside -X- _ O
( -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
was -X- _ O
reported -X- _ O
to -X- _ O
promote -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
cycle -X- _ O
arrest -X- _ O
at -X- _ O
the -X- _ O
S -X- _ O
phase -X- _ O
, -X- _ O
apoptosis -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
autophagy -X- _ O
in -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL
cells -X- _ B-CELL
[ -X- _ O
52 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
Polydatin -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
glycoside -X- _ O
of -X- _ O
resveratrol -X- _ O
, -X- _ O
namely -X- _ O
resveratrol-3-O-β-mono-D-glucoside -X- _ O
, -X- _ O
reduced -X- _ O
proliferation -X- _ O
and -X- _ O
induced -X- _ O
apoptosis -X- _ O
in -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL
cells -X- _ B-CELL
[ -X- _ O
64 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
In -X- _ O
this -X- _ O
study -X- _ O
, -X- _ O
resveratroloside -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
pinostilbenoside -X- _ O
( -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
exhibited -X- _ O
comparable -X- _ O
activity -X- _ O
in -X- _ O
arresting -X- _ O
the -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL
cell -X- _ B-CELL
cycle -X- _ O
at -X- _ O
the -X- _ O
S -X- _ O
and -X- _ O
sub-G1 -X- _ O
phases -X- _ O
( -X- _ O
at -X- _ O
25 -X- _ O
and -X- _ O
50 -X- _ O
μg -X- _ O
/ -X- _ O
mL -X- _ O
, -X- _ O
respectively -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
On -X- _ O
the -X- _ O
other -X- _ O
hand -X- _ O
, -X- _ O
pinostilbenoside -X- _ O
( -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
exhibited -X- _ O
higher -X- _ O
activity -X- _ O
than -X- _ O
resveratroloside -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
in -X- _ O
increasing -X- _ O
the -X- _ O
number -X- _ O
of -X- _ O
dead -X- _ O
cells -X- _ B-CELL
through -X- _ O
non-apoptotic -X- _ O
mechanisms -X- _ O
( -X- _ O
at -X- _ O
25 -X- _ O
and -X- _ O
50 -X- _ O
μg -X- _ O
/ -X- _ O
mL -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
in -X- _ O
reducing -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL
cell -X- _ B-CELL
proliferation -X- _ O
( -X- _ O
at -X- _ O
25 -X- _ O
μg -X- _ O
/ -X- _ O
mL -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
latter -X- _ O
findings -X- _ O
are -X- _ O
consistent -X- _ O
with -X- _ O
earlier -X- _ O
studies -X- _ O
reporting -X- _ O
increased -X- _ O
cytotoxic -X- _ O
activity -X- _ O
for -X- _ O
the -X- _ O
methoxylated -X- _ O
analogs -X- _ O
of -X- _ O
resveratrol -X- _ O
compared -X- _ O
to -X- _ O
resveratrol -X- _ O
itself -X- _ O
[ -X- _ O
75 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
two -X- _ O
compounds -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
and -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
isolated -X- _ O
in -X- _ O
this -X- _ O
study -X- _ O
are -X- _ O
stilbene -X- _ O
glycosides. -X- _ O
Glycosylation -X- _ O
is -X- _ O
known -X- _ O
to -X- _ O
positively -X- _ O
impact -X- _ O
the -X- _ O
water -X- _ O
solubility -X- _ O
, -X- _ O
intestinal -X- _ O
absorption -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
bioactivity -X- _ O
of -X- _ O
stilbenes -X- _ O
[ -X- _ O
76,77 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
A -X- _ O
notable -X- _ O
example -X- _ O
is -X- _ O
polydatin -X- _ O
, -X- _ O
one -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
main -X- _ O
compounds -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
roots -X- _ B-TISSUE
of -X- _ O
Polygonum -X- _ O
cuspidatum -X- _ O
Sieb. -X- _ O
et -X- _ O
Zucc. -X- _ O
, -X- _ O
identified -X- _ O
in -X- _ O
other -X- _ O
plant -X- _ O
species -X- _ O
across -X- _ O
the -X- _ O
Liliaceae -X- _ O
, -X- _ O
Fabaceae -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
Vitaceae -X- _ O
families. -X- _ O
Based -X- _ O
on -X- _ O
its -X- _ O
anti-inflammatory -X- _ O
, -X- _ O
antioxidant -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
apoptosis-modulating -X- _ O
potential -X- _ O
, -X- _ O
polydatin -X- _ O
displays -X- _ O
diverse -X- _ O
biological -X- _ O
activities -X- _ O
( -X- _ O
anticancer -X- _ O
, -X- _ O
antidiabetic -X- _ O
, -X- _ O
antimicrobial -X- _ O
, -X- _ O
cardioprotective -X- _ O
, -X- _ O
hepatoprotective -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
neuroprotective -X- _ O
effects -X- _ O
, -X- _ O
as -X- _ O
well -X- _ O
as -X- _ O
protective -X- _ O
effects -X- _ O
on -X- _ O
the -X- _ O
gastrointestinal -X- _ O
, -X- _ O
renal -X- _ O
, -X- _ O
respiratory -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
skeletal -X- _ B-TISSUE
systems -X- _ I-TISSUE
) -X- _ O
. -X- _ O
A -X- _ O
large -X- _ O
number -X- _ O
of -X- _ O
studies -X- _ O
conducted -X- _ O
on -X- _ O
polydatin -X- _ O
has -X- _ O
revealed -X- _ O
versatility -X- _ O
in -X- _ O
modulating -X- _ O
numerous -X- _ O
targets -X- _ O
related -X- _ O
to -X- _ O
oxidative -X- _ O
stress -X- _ O
( -X- _ O
Nrf2 -X- _ O
and -X- _ O
Akt -X- _ O
pathways -X- _ O
, -X- _ O
glutathione -X- _ O
, -X- _ O
catalase -X- _ O
( -X- _ O
CAT -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
SOD -X- _ O
, -X- _ O
GPx -X- _ O
, -X- _ O
GST -X- _ O
, -X- _ O
MPO -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
inflammation -X- _ O
( -X- _ O
NF-κB -X- _ O
, -X- _ O
phospholipase -X- _ O
A2 -X- _ O
( -X- _ O
PLA2 -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
COX-2 -X- _ O
, -X- _ O
iNOS -X- _ O
, -X- _ O
TNF-α -X- _ O
, -X- _ O
IL-1β -X- _ O
, -X- _ O
IL-6 -X- _ O
, -X- _ O
ICAM-1 -X- _ O
, -X- _ O
MAPKs -X- _ O
, -X- _ O
ERK1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
, -X- _ O
JNK1 -X- _ O
/ -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
apoptosis -X- _ O
( -X- _ O
p53 -X- _ O
/ -X- _ O
MAPK -X- _ O
/ -X- _ O
JNK -X- _ O
and -X- _ O
PI3K -X- _ O
/ -X- _ O
Akt -X- _ O
/ -X- _ O
mTOR -X- _ O
pathways -X- _ O
, -X- _ O
B-cell -X- _ B-CELL
lymphoma -X- _ O
2 -X- _ O
( -X- _ O
Bcl-2 -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
Bcl-2-associated -X- _ O
x -X- _ O
( -X- _ O
Bax -X- _ O
) -X- _ O
, -X- _ O
D-cyclins -X- _ O
, -X- _ O
caspase-3 -X- _ O
, -X- _ O
cytochrome -X- _ O
c -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Clinical -X- _ O
trials -X- _ O
support -X- _ O
the -X- _ O
benefits -X- _ O
of -X- _ O
polydatin -X- _ O
in -X- _ O
chronic -X- _ O
pelvic -X- _ O
pain -X- _ O
, -X- _ O
liver -X- _ B-TISSUE
diseases -X- _ O
, -X- _ O
inflammatory -X- _ O
bowel -X- _ O
syndrome -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
EGFR-tyrosine -X- _ O
kinase -X- _ O
inhibitor -X- _ O
( -X- _ O
TKI -X- _ O
) -X- _ O
-related -X- _ O
ashes. -X- _ O
Moreover -X- _ O
, -X- _ O
various -X- _ O
drug -X- _ O
delivery -X- _ O
systems -X- _ O
( -X- _ O
liposomes -X- _ O
, -X- _ O
micelles -X- _ O
, -X- _ O
nanoparticles -X- _ O
, -X- _ O
polymeric -X- _ O
nanocapsules -X- _ O
) -X- _ O
have -X- _ O
been -X- _ O
developed -X- _ O
to -X- _ O
improve -X- _ O
the -X- _ O
bioavailability -X- _ O
, -X- _ O
biocompatibility -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
efficacy -X- _ O
of -X- _ O
polydatin -X- _ O
[ -X- _ O
64,78 -X- _ O
] -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
results -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
present -X- _ O
study -X- _ O
, -X- _ O
along -X- _ O
with -X- _ O
the -X- _ O
remarkable -X- _ O
biological -X- _ O
potential -X- _ O
of -X- _ O
the -X- _ O
stilbene -X- _ O
scaffold -X- _ O
and -X- _ O
the -X- _ O
broad -X- _ O
bioactivity -X- _ O
of -X- _ O
polydatin -X- _ O
, -X- _ O
a -X- _ O
resveratrol -X- _ O
glycoside -X- _ O
, -X- _ O
indicate -X- _ O
that -X- _ O
the -X- _ O
bioactive -X- _ O
properties -X- _ O
of -X- _ O
resveratroloside -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
pinostilbenoside -X- _ O
( -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
require -X- _ O
further -X- _ O
in-depth -X- _ O
investigation. -X- _ O
Future -X- _ O
studies -X- _ O
should -X- _ O
explore -X- _ O
the -X- _ O
ability -X- _ O
of -X- _ O
resveratroloside -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
pinostilbenoside -X- _ O
( -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
to -X- _ O
modulate -X- _ O
cellular -X- _ O
signaling -X- _ O
pathways -X- _ O
, -X- _ O
enzymes -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
other -X- _ O
molecules -X- _ O
involved -X- _ O
in -X- _ O
the -X- _ O
antioxidant -X- _ O
defense -X- _ O
and -X- _ O
oxidative -X- _ O
damage -X- _ O
repair. -X- _ O
Research -X- _ O
on -X- _ O
the -X- _ O
antitumor -X- _ O
potential -X- _ O
( -X- _ O
mechanisms -X- _ O
underlying -X- _ O
cytotoxic -X- _ O
activity -X- _ O
in -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL
cells -X- _ B-CELL
, -X- _ O
cytotoxicity -X- _ O
against -X- _ O
other -X- _ O
tumor -X- _ B-CELL
cell -X- _ I-CELL
lines -X- _ I-CELL
) -X- _ O
should -X- _ O
also -X- _ O
continue. -X- _ O
Exploration -X- _ O
of -X- _ O
additional -X- _ O
bioactivities -X- _ O
and -X- _ O
development -X- _ O
of -X- _ O
appropriate -X- _ O
delivery -X- _ O
systems -X- _ O
are -X- _ O
crucial -X- _ O
for -X- _ O
the -X- _ O
therapeutic -X- _ O
valorization -X- _ O
of -X- _ O
resveratroloside -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
pinostilbenoside -X- _ O
( -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
4. -X- _ O
materials -X- _ O
and -X- _ O
methods -X- _ O
4.7. -X- _ O
statistical -X- _ O
analysis -X- _ O
Antioxidant -X- _ O
assays -X- _ O
were -X- _ O
performed -X- _ O
in -X- _ O
triplicate -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
the -X- _ O
results -X- _ O
were -X- _ O
expressed -X- _ O
as -X- _ O
mean -X- _ O
± -X- _ O
standard -X- _ O
deviation -X- _ O
( -X- _ O
SD -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL
cell-based -X- _ B-CELL
assays -X- _ O
were -X- _ O
performed -X- _ O
in -X- _ O
triplicate -X- _ O
; -X- _ O
the -X- _ O
results -X- _ O
were -X- _ O
expressed -X- _ O
as -X- _ O
mean -X- _ O
± -X- _ O
standard -X- _ O
error -X- _ O
( -X- _ O
SE -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
The -X- _ O
differences -X- _ O
between -X- _ O
the -X- _ O
results -X- _ O
were -X- _ O
tested -X- _ O
using -X- _ O
one-way -X- _ O
ANOVA -X- _ O
with -X- _ O
Tukey’s -X- _ O
HSD -X- _ O
test -X- _ O
( -X- _ O
SPSS -X- _ O
version -X- _ O
18.0 -X- _ O
) -X- _ O
; -X- _ O
p -X- _ O
***5. -X- _ O
Conclusions*** -X- _ O
In -X- _ O
this -X- _ O
study -X- _ O
, -X- _ O
resveratroloside -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
pinostilbenoside -X- _ O
( -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
were -X- _ O
first -X- _ O
isolated -X- _ O
from -X- _ O
Pinus -X- _ O
cembra -X- _ O
L. -X- _ O
bark. -X- _ O
This -X- _ O
is -X- _ O
the -X- _ O
first -X- _ O
report -X- _ O
of -X- _ O
these -X- _ O
compounds -X- _ O
in -X- _ O
this -X- _ O
species. -X- _ O
Their -X- _ O
structures -X- _ O
were -X- _ O
confirmed -X- _ O
by -X- _ O
1H-NMR -X- _ O
, -X- _ O
13C-NMR -X- _ O
, -X- _ O
and -X- _ O
HRESIMS. -X- _ O
Compared -X- _ O
to -X- _ O
the -X- _ O
raw -X- _ B-CELL
bark -X- _ O
extract -X- _ O
, -X- _ O
resveratroloside -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
pinostilbenoside -X- _ O
( -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
showed -X- _ O
lower -X- _ O
activity -X- _ O
as -X- _ O
free -X- _ O
radical -X- _ O
scavengers -X- _ O
and -X- _ O
reducing -X- _ O
agents. -X- _ O
However -X- _ O
, -X- _ O
they -X- _ O
were -X- _ O
more -X- _ O
effective -X- _ O
in -X- _ O
reducing -X- _ O
the -X- _ O
viability -X- _ O
and -X- _ O
suppressing -X- _ O
the -X- _ O
proliferation -X- _ O
of -X- _ O
human -X- _ O
cervical -X- _ O
carcinoma -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL
cells. -X- _ B-CELL
At -X- _ O
25 -X- _ O
µg -X- _ O
/ -X- _ O
mL -X- _ O
, -X- _ O
both -X- _ O
compounds -X- _ O
induced -X- _ O
S-phase -X- _ O
cell -X- _ B-CELL
cycle -X- _ O
arrest -X- _ O
in -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL
cells. -X- _ B-CELL
At -X- _ O
25 -X- _ O
and -X- _ O
50 -X- _ O
µg -X- _ O
/ -X- _ O
mL -X- _ O
, -X- _ O
they -X- _ O
significantly -X- _ O
reduced -X- _ O
the -X- _ O
viability -X- _ O
of -X- _ O
HeLa -X- _ B-CELL
cells -X- _ B-CELL
, -X- _ O
mainly -X- _ O
through -X- _ O
non-apoptotic -X- _ O
mechanisms. -X- _ O
Glycosylated -X- _ O
stilbene -X- _ O
scaffolds -X- _ O
have -X- _ O
great -X- _ O
potential -X- _ O
for -X- _ O
therapeutic -X- _ O
applications -X- _ O
, -X- _ O
so -X- _ O
further -X- _ O
studies -X- _ O
are -X- _ O
needed -X- _ O
to -X- _ O
assess -X- _ O
the -X- _ O
bioactive -X- _ O
potential -X- _ O
of -X- _ O
resveratroloside -X- _ O
( -X- _ O
1 -X- _ O
) -X- _ O
and -X- _ O
pinostilbenoside -X- _ O
( -X- _ O
2 -X- _ O
) -X- _ O
. -X- _ O
Source -X- _ O
paper -X- _ O
: -X- _ O
PMC12115102 -X- _ O