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	제목: 목포대 교육혁신개발원, SMART 학습공동체 동기 강화 모니터링 지원 국립목포대학교 교육혁신개발원은 SMART 학습공동체 참여팀을 대상으로 학생들이 세운 목표에 한발 다가갈 수 있도록 학습 동기 강화 중간 모니터링을 지원하였다.	주어진 문장에 적절한 제목을 생성하고, 내용을 요약해주세요. 문장: 목포대 교육혁신개발원, SMART 학습공동체 동기 강화 모니터링 지원 국립목포대학교(총장 박민서) 교육혁신개발원(원장 오장근)은 SMART 학습공동체 참여팀을 대상으로 최근 열흘간 학습 동기 강화 중간 모니터링을 지원하였다. SMART 학습공동체는 공동의 학습 목표를 설정하고 4~6명이 한 팀을 이루어 한 학기 중 10주 이상 학습을 진행하면서 ‘함께 학습하며 성찰을 통해 집단 지성의 힘을 배우고, 서로 성장을 이끌어 주는 목포대학교 대표 학습조직’이다. 총 3번의 학습코칭 중 2번째로 진행된 학습 동기 강화 중간 모니터링은 학습 현장을 직접 찾아가 중간고사 준비를 하는 학생들을 독려하고 학습을 진행하면서 생긴 다양한 문제를 해결해 나가는 시간을 가졌다. 이와 함께 학기 초에 시행한 자기 주도 학습전략 검사 결과를 통해 ‘나를 알고 나에게 맞는 학습전략’을 함께 찾아보면서 교육혁신개발원의 “방법 찾자-도와줄게-함께하자”의 3단계 학습역량 강화 체계에 맞춰 학습코칭을 지원하였다. 중간 모니터링에 참여한 학생들은 공동체 운영을 하면서 “처음 생각만큼 되지 않았다. 성찰을 통해 처음에 세웠던 목표를 실행 가능한 목표를 재설정하고, 이를 실천할 수 있는 세부 계획을 조정해보면서 한 주 한 주 성장한 것 같다.”라며 한목소리로 말했다. 오장근 교육혁신개발 원장은 “학습 동기를 상기시키며 학생들이 세운 목표에 한발 한발 다가갈 수 있도록 돕는 중간 모니터링은 학생들에게 큰 도움이 되고 있다. 공동체 팀과 소통하면서 다양한 문제점을 해결하고, 지속해서 동아리를 운영할 수 있도록 돕는 역할을 충실히 하겠다.”라고 말했다. 한편 교육혁신개발원은 오는 11월 25일부터 29일까지 5일간 진행되는 3차 학습코칭을 통해 최종 학습 목표 달성 여부를 점검하고 다른 팀의 학습전략, 개인별로 성취하고자 한 가을의 결실 등의 결과에 대해서도 함께 공유하고, 우수 사례를 확산시키고자 한다. /채희종 기자 chae@kwangju.co.kr
	서산문화복지센터 청소년수련관은 지난 23일 여성가족부 주최 2019대한민국 청소년자원봉사 Dovol Awards'전국 최장 시간 봉사 청소년'에 당 수련관 소속 영상제작동아리 B.C.C. 회장 한태림 군이 선정되어 장학금을 받았다고 밝히며, 올 해 처음 개최된 본 상은 전국 17개 시,도별 최장시간 봉사 청소년과 동아리 등에 수여, 한태림 군은 연간 300여 시간의 봉사활동으로 인정을 받았다고 했다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 서산문화복지센터 청소년영상제작동아리 B.C.C 서산문화복지센터 청소년수련관(이하 서산시청소년수련관)은 지난 23일 여성가족부 주최로 국회의원회관에서 열린 2019 대한민국 청소년자원봉사 Dovol Awards '전국 최장 시간 봉사 청소년'에 서산시청소년수련관 소속 영상제작동아리 B.C.C 회장 한태림 군이 선정되어 장학금을 수여 받았다고 밝혔다. 올 해 처음으로 개최된 2019 대한민국 청소년자원봉사 Dovol Awards는 전국 17개 시,도별 최장 시간 봉사 청소년과 운영 터전, 동아리를 선정하여 장학금 시상 및 청소년 자원봉사 참여 활성화에 기여한 공로를 격려하기 위해 마련됐다. 특히, 한태림 군은 사회적 약자를 위한 의식개선 영상 제작 및 캠페인 전개와 더불어 관심이 부족했던 향토문화재 발굴 및 홍보를 위한 프로젝트 활동을 직접 기획, 실천하는 등 연간 300여 시간의 꾸준한 봉사활동을 인정받아 의미를 더하게 되었다. 김영제 센터장은 "충청남도를 대표해 청소년 자원봉사 활성화에 힘써 준 B.C.C 동아리 친구들에게 아낌없는 격려와 축하를 보내며 앞으로도 우리 청소년들이 다양한 참여 활동을 통해 나눔이 필요한 곳에 도움을 줄 수 있는 건강한 청소년으로 성장하길 기대한다."고 전했다. 한편, 서산시청소년수련관 소속 영상제작동아리 B.C.C는 2017년 창단되어 활발한 활동을 하고 있으며 올해는 여성가족부가 주최한 2019 대한민국청소년박람회 '청소년유튜버공모전'에서 대상(전국 유일)인 여성가족부 장관상을 수상하는 등 청소년동아리 활동 활성화에 큰 역할을 하고 있다. ibs9900@
	또 다른 산업 전략으로서, 유망 기술 부문을 중심으로 8개의 기술 플랫폼에 투자함으로써, 학제 및 분야 간 융합을 통한 기술 및 산업 경쟁력을 확보하는 노력도 함께 하고 있다	주어진 문장 뒤에 자연스럽게 이어질 문장을 생성해주세요. 문장: 구체적 정책 프로그램 중 하나는 중소기업의 수익과 R&D에 대한 직접적 세금 혜택과 인센티브 부여이다. 벤처 캐피털 지원을 통하여 창업과 스타트업의 정착에 도움을 주고, 세제 감면, 기술펀드 조성 등 정책 프로그램 가동시켜 나가고 있다. 또한, TSB 프로그램을 통한 R&D 협력, 지식 네트워크(KTNs) 형성, 기술이전 파트너십(KTPs) 구축 등 기업의 혁신과 중소기업에 대한 지원을 증대시키도록 유도하는 정책이 마련되었다. 이러한 프로그램에는 '중소기업 연구주도(Small Business Research Initiative, SBRI)' 제도를 통하여 중소기업 정부지원의 폭을 확대하도록 하는 구체적인 실행계획이 수반되어 있다.
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 원문을 바탕으로 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 생성하세요.	또한 복수의 차량의 경우 각 차량의 네비게이션 장치가 무선통신망으로 직접적으로 연결되는 한계가 있었다.	다음 텍스트에서 제공된 문맥을 정확히 이해하고, 마지막 문장을 자연스럽고 문맥에 맞게 완성하세요. 문장은 이전 내용과 논리적으로 연결되어야 합니다. #텍스트: 네비게이션 시스템은 선박, 항공기, 차량 등과 같은 각종 이동체뿐만 아니라 이동 통신 단말의 사용자에게 현재 위치를 알려주고, 원하는 목적지까지의 경로를 계산하며, 경로에 따라 사용자를 안내하는 장치를 말한다. 이러한 네비게이션 시스템은 사용자에게 목적지의 위치와 목적지까지의 경로를 안내해주는 기능을 수행한다.한국특허 공개 특허공보 제 10-2009-0029438호(2009. 03.12 공개)에는 동시 여행차량 표시기능을 구비한 네비게이션 및 그제공방법을 제시한다. 이러한 종래의 네비게이션 및 그제공방법의 경우 동시 여행 차량을 표시하는 기능을 갖고 있다.하지만 종래의 네비게이션 및 그제공방법의 경우 별도의 네비게이션 장치를 필수적으로 요구하고 있으며, 차량으로 한정되는 문제가 있었다.
	그리고 지역 노동시장에서 숙련 인력이 부족한 부분을 파악하여 이 분야에 대한 훈련과정이 개설되도록 유도하고, 구직자 가운데 해당 직무에 적합한 훈련생을 선발할 수 있도록 고용센터별로 자율적인 항목을 도입한다	주어진 문장 뒤에 자연스럽게 이어질 문장을 생성해주세요. 문장: 직업훈련 추진 방식을 개편하여 예비 훈련생들이 사전 진단 없이 훈련 상담부터 받는 것을 금지한다. 대신에 모든 구직자를 잠재적인 직업능력개발훈련 대상자로 간주하고, 취업알선과정에서 구직자 가운 데 직업훈련을 이수로 취업역량이 높아질 것으로 예상되는 인력을 직업훈련 대상자로 선별한다. 또 직업훈련과 취업알선의 독자적인 추진 을 지양하고 연계를 강화하기 위해 고용센터의 업무 분장은 물론 고용노동부의 조직 개편도 추진한다.
	대선을 앞둔 정치권에서 추가경정예산을 요구하는 목소리가 끊이지 않고 있는데 취업자 증가가 8개월째 40만명을 웃도는 현 상황에서 재정적자를 더 키울 추경부터 서두를 필요는 없고 정치인들이 진정으로 나라 장래를 생각한다면 무리인줄 알면서도 버릇처럼 추경 카드부터 꺼내는 것을 자제해야 할것이다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 대선을 앞둔 정치권에서 추가경정예산을 요구하는 목소리가 끊이지 않고 있다. 주로 야권에서 추경을 요구하고 있지만 여권에서 동조하는 목소리도 적지 않다. 이해찬 민주당 신임 대표는 "민생경제 활성화를 위해 추경을 편성해서라도 내수를 살려야 한다"고 주장했다. 새누리당 대선 주자인 정몽준 의원도 "서민경제 보호를 위한 추경은 적어도 10조원은 돼야 한다"고 밝혔다. 정부는 현재로서는 추경 편성 계획이 없다고 분명히 선을 그었다. 이명박 대통령은 "당장 추경을 하는 건 고려하지 않고 있다"며 "고용이 늘고 있어 추경 요건도 안 된다"고 말했다. 박재완 기획재정부 장관은 지난주 경제연구소장들과 간담회 후 "현 상황에서 재정 확대는 위험하기 때문에 신중히 해야 하고 체질 개선에 주력해야 할 때라는 의견을 들었다"고 밝혔다. 우리는 정치권의 추경 요구가 신중하지 못한 것임을 지적하고자 한다. 정치권은 억지로 경기를 부추겨 대선 때 점수를 얻고 싶은 모양인데 그렇게 해서 성장률을 조금 올린다고 무엇이 크게 달라지겠는가. 일본은 지난 20년간 천문학적인 예산을 쏟아붓고도 별로 나아진 게 없고 GDP 대비 공공부채는 230%대로 세계에서 가장 높다. 남유럽 여러 나라들은 대부분 국가부채가 GDP의 100%를 넘어 부도 지경이다. 5년 전만 해도 정부 부채가 GDP 대비 36%로 우리와 비슷했던 스페인이 지금 같은 위기에 빠진 것을 반면교사로 삼아야 한다. 정치인들은 추경의 법적 요건조차 이해하지 못하고 있는 듯하다. 국가재정법은 전쟁이나 대규모 자연재해가 발생하거나 경기침체, 대량실업, 남북관계 변화, 경제협력 같은 중대한 여건 변화가 일어날 경우에 추경을 편성하도록 제한하고 있다. 유럽 사태가 글로벌 위기로 번지면 우리가 올해 3%만 성장해도 선방한 것이라 할 수 있다. 하지만 취업자 증가가 8개월째 40만명을 웃도는 상황에서 재정적자를 더 키울 추경부터 서두를 필요는 없다. 2008~2009년 중 한국의 GDP 대비 재정 확대 규모는 주요 20개국(G20) 평균의 2배 가까운 수준이었다. 이제 또 다른 위기에 대비해 다시 곳간을 튼튼히 해야 할 때다. 정치인들이 진정으로 나라 장래를 생각한다면 무리인줄 알면서도 버릇처럼 추경 카드부터 꺼내는 것을 자제하기 바란다.
	아다치 겐조는 1864년생으로, 일본의 정치인이다. 그는 가토 다카아키 내각과 제1차 와카쓰키 내각의 체신대신, 하마구치 내각의 내무대신을 지냈다. 또한 조선에서 한성신보 사장으로 활동하였으며, 명성황후 시해 사건에 가담하였다. 그는 구마모토 번 무사의 아들로 태어나, 삿사 도모후사가 설립한 학교에서 교육을 받았다. 그는 조선에서 신문기자로 청일 전쟁에 참전하였고, 명성황후 살해 계획을 세운 것으로 알려져 있다. 그러나 사후에 증거 불충분으로 석방되었다. 아다치는 구마모토로 돌아와 삿사 도모후사와 함께 구마모토 국권당을 결성하였다. 그는 일본 중의원 선거에서 처음 당선되었고, 이후 14선 중의원 의원을 지냈다. 그는 오쿠마 시게노부 내각의 총선거에서 민정당의 선거장을 맡았으며, 도쿠토미 소호로부터 선거의 신이라는 평을 받았다. 가토 다카아키 내각에서 체신대신, 하마구치 내각에서 내무대신을 역임하였고, 강경파로서 군부에 동조적인 태도를 보였다. 와카쓰키 내각 총사직 후 민정당을 떠나, 나카노 세이고와 함께 국민 동맹을 결성하였다. 그리고 고노에 후미마로가 이끄는 대정익찬회에 참여하였다.	아다치 겐조는 어떤 역할을 했어?
	카라타 에리카는 일본의 배우이자 모델로, 목장에서 자란 가족 중 막내였습니다. 어렸을 때부터 패션 잡지를 읽고 모델 생활에 관심이 있었지만 배우를 꿈꾸지는 않았습니다. 그녀는 치바현 내 여자고등학교 2학년 시절 마더 목장에서 아르바이트를 하던 중 현 사무소 매니저의 눈에 띄어 스카웃되었습니다. 이후 도쿄에 정착하면서 배우를 준비하게 되었습니다. 2014년에는 소녀시대의 뮤직 비디오 'DIVINE'에 출연하였고, 2015년에는 산케이 스포츠의 기사 '気になるあの娘GWコレクション'에 소개되었습니다. 또한 2015년 7월 후지 TV 드라마 '사랑하는 사이'에서 데뷔하였습니다. 카라타 에리카는 깨끗하고 청초한 이미지로 일본 전역에서도 순수한 이미지를 가진 마스크로 많은 사랑을 받는 배우 중 한 명입니다. 2016년에는 LG전자의 'V30' 광고 모델로 선택되었고, 2018년에는 제71회 칸 국제영화제에서 히가시데 마사히로, 하마구치 류스케 감독의 영화 '자나깨나'에 출연하였습니다. 또한 2017년에는 암흑여자, 러브X독, 우에다 사키 자나깨나, 21세기의 여자 방송사 등 다양한 작품에 출연하였습니다.	카라타 에리카의 직업과 출신지는 어디야?
	이와 더불어 이란의 원심분리기에 초래한 손해에 주목한 탈린 매뉴얼 작성자들도 스턱스넷 공격이 무력공격의 기준에 도달하지 않은 무력 사용이라는 견해를 취하였다	주어진 문장 뒤에 자연스럽게 이어질 문장을 생성해주세요. 문장: 해당 사건에서 원자폭탄을 만들거나 핵 전력 발전에 적합한 우라늄을 생산하기 위해서는 원심분리기가 일정한 속도로 가동되어야 하는데 스턱스넷 악성 소프트웨어는 원심분리기가 변화무쌍한 속도로 가동되도록 하거나 궁극적으로 원심분리기를 파괴함으로써 생산된 우라늄을 불순하고 사용에 적합하지 않도록 만들었다. 이러한 사이버 공격에 의한 이란의 시설 파괴에 대해 당시 일부 언론 보도는 스턱스넷 공격이 미국과 이스라엘의 작품이라고 하였지만 그들에게 책임을 지울 확실하고 결정적인 증거를 발견하지 못하였고, 무력공격에 해당한다는 국제사회의 합의가 없어 이란은 미국과 이스라엘에 대해 국제법상 책임 추궁을 하지 못하였다.
	이 연구들은 대학의 교수학습 과정과 수업에 초점을 두고 진행된 컨설팅 관련 연구물이라 할 수 있다	주어진 문장 뒤에 자연스럽게 이어질 문장을 생성해주세요. 문장: 등교육 분야에서 컨설팅과 관련된 연구는 드물다. 현재까지 출판된 연구물들을 살펴보면 주로 대학의 교수학습 분야 개선에 있어 컨설팅과 관련된 연구들이 진행되었으며, 대학경영 또는 대학운영과 관련된 컨설팅 연구물은 거의 전무한 실정이다. 전자로 언급된 연구로는 대학수업 개선에 있어서 수업컨설팅의 기능에 대한 민혜리･윤희정(2012)의 연구, 대학에서의 수업 컨설팅 현황과 과제를 다룬 김경이(2013)의 연구, 원격대학 수업컨설팅 모형 개발에 관한 정영숙 외(2014)의 연구, 교수학습센터의 대학 강의 컨설팅 영역 현황 및 개선방향에 대한 이미자(2016)의 연구를 들 수 있다.
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 원문을 바탕으로 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 생성하세요.	이러한 섭식장애의 효율적인 치료를 위해, 치료제 개발이 매우 중요한 실정이다.이에, 본 발명자들은 옥시토신이 섭식장애, 더욱 구체적으로는 폭식성 섭식장애인 신경성 폭식증(bulimia nervosa, BN) 또는 폭식장애(binge eating disorder, BED) 환자의 음식 섭취 및 감정 인지에 미치는 영향을 확인함으로써, 옥시토신이 폭식성 섭식장애 환자의 감정 인식 민감도를 증가시키고 섭취 칼로리를 감소시키는 새로운 기능을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.	다음 텍스트에서 제공된 문맥을 정확히 이해하고, 마지막 문장을 자연스럽고 문맥에 맞게 완성하세요. 문장은 이전 내용과 논리적으로 연결되어야 합니다. #텍스트: 섭식장애(eating disorders) 에 대한 빈도는 연구자와 대상 인구에 따라 다양하지만 점차 증가하고 있으며 특히 여성의 경우 자신의 섭식행동을 밝히지 않음으로 실제 빈도는 연구에서 나타난 것보다 훨씬 높다고 한다(Fogel 0026# Woods, 1995; Williamson, Cubic, 0026# Gleaves, 1993). 섭식장애는 젊은 여성들에게 흔한 정신장애이며 만성적으로 지속되고 정동장애 등의 다른 정신장애와 공병률이 높다. 또한 빈번한 자살 시도가 나타나기도 하며 신체적으로 심각한 의학적 손상을 초래하여 모든 정신질환 중 가장 치사율이 높다는 점에서 매우 심각한 장애이다(Stice,2001a).섭식장애 관련 변인으로는 생물학적 요소, 유전적 영향, 아동기 경험, 체중의 과거력, 정신병리의 가족 경력, 성과 사회 문화적 맥락, 여성 청소년 발달(신체적 성숙, 친밀한 관계의 발달, 자기감의 발달), 다이어트, 개인의 성격 특징들, 가족적 요인, 사회-문화적 요인, 대중매체의 역할 등 다양하고 광범위하며(김정내, 하정희, 2006), 여러 변인들이 복합적으로 이 병의 발병에 기여하는 것으로 생각된다. 우리나라의 경우, 섭식장애에 관한 연구 자료가 부족하여 많은 연구가 이루어지지 않았으나, 최근 외모를 중시하는 가치관의 확대로 인해 청소년 및 성인 여성의 섭식장애로 인한 손상은 날로 심각해지고 있다. 이러한 식습관은 심리 정서적 위협은 물론 신체적인 건강까지 위협하고 있으므로 이에 대한 대책의 마련이 시급하다고 볼 수 있다(성미혜, 2005).섭식장애는 연구자들이나 건강 전문직의 관심이 된지 그리 오래되지 않은 새로운 정신병리 현상으로서 진단적 특성의 결정이 명백히 이루어진 것은 1980년 DSM-Ⅲ에서 부터이며 1987년 DSM-Ⅲ-R을 거쳐, 1994년 DSM-Ⅳ, 2013년 DSM-5에 이르고 있다. 이러한 섭식장애는 다양하며 일관성 없는 섭식행동이 핵심으로, 크게 신경성 식욕부진증(anorexia nervosa, AN), 신경성 폭식증(bulimia nervosa, BN), 폭식장애 (binge eating disorder, BED)으로 나누어 볼 수 있다(이규은 외, 1998).신경성 식욕부진증은 최소한의 정상체중 유지를 거부하는 것이 주요 특징이며 신경성 폭식증은 반복되는 폭식과 그에 따르는 부적절한 보상행동(자기 유발성 구토, 하제, 이뇨제, 기타 약물의 남용, 단식, 지나친 운동을 포함)을 특징으로 한다. 두 장애 모두 체형과 체중이 자기 평가에 지나친 영향을 미친다는 것이 공통점이다(American Psychiatric Association, 2013). 섭식장애에 대한 빈도는 연구자와 대상 인구에 따라 다양하지만 점차 증가하고 있으며 특히 여성의 경우 자신의 섭식행동을 밝히지 않음으로 실제 빈도는 연구에서 나타난 것보다 훨씬 높다고 한다(Fogel 0026# Woods, 1995; Williamson, Cubic, 0026# Gleaves, 1993).
	이 날 행사는 특히 4대 필수안전수칙 중 보호구 착용이 “안전한 일터의 시작”임을 강조하며 작업장 근로자에게 전단지 및 홍보물품 등을 배포하는 캠페인 실시 및 안전보건 특별교육 및 안전수칙 준수를 위한 안전다짐 순으로 이날 행사를 마무리 하였다	주어진 문장 뒤에 자연스럽게 이어질 문장을 생성해주세요. 문장: 안전보건공단 부산지역본부(본부장 심재동)는 지난 11월 6일 오전 10시30분부터 12시까지 부산지방검찰청, 부산지방고용노동청, 대한산업안 전협회, 부산강서 안전관리협의회, 강서구청, 법사랑 위원 등 40여명이 강서구 소재 ㈜태웅에서 노사 안전 문화 확산을 위한 “안전하고 깨끗한 작업장 만들기” 행사를 실시하였다.
	중국은행 타워는 홍콩에 위치한 중국은행의 본점 건물로, 1990년에 완공되었습니다. 이 건물은 프리츠커 건축상 수상자인 중국계 미국인 건축가가 설계했으며, 높이는 315m이고 두 개의 대형 마스트는 367.4m 높이로 솟아 있습니다. 이때 홍콩에서 제일 높은 건물이었으며, 아시아에서도 가장 높은 건물이었습니다. 현재는 홍콩 내에서 국제상업센터와 국제금융센터, 센트럴 플라자 다음으로 네번째로 높습니다. 건물 디자인에는 구조적 표현주의가 도입되었으며, 대나무가 자라는 형상을 따라 디자인되었습니다. 43층에 있는 소규모 전망대는 일반인에게 개방되어 있고, 70층에 있는 주 전망대는 예약을 하고 가야 합니다. 이 건물은 머레이 하우스가 있던 터에 위치하고 있으며, 홍콩 정부에 의해 매입되었습니다. 건물의 디자인은 원래 디자인에 X 자 모양이 너무 많이 들어간다는 비판을 받아 수정되었습니다. 또한, 건물이 도봉(刀鋒, 고기 베는 큰 식칼)과 닮아 보이기도 한다는 속설이 있습니다. 중국은행 타워는 홍콩의 랜드마크로서 다양한 매체에서 언급되었으며, 대중문화에도 영향을 미쳤습니다.	중국은행 타워의 위치는 어디인가요?
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 원문을 바탕으로 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 생성하세요.	따라서, 청취 영역의 판정된 임펄스 응답은 획득하기가 어렵다.	다음 텍스트에서 제공된 문맥을 정확히 이해하고, 마지막 문장을 자연스럽고 문맥에 맞게 완성하세요. 문장은 이전 내용과 논리적으로 연결되어야 합니다. #텍스트: 스피커들 및 스피커 시스템들(이하, "스피커들")은 청취 환경 또는 영역에서 사운드의 재생을 허용한다. 예를 들어, 소정 세트의 스피커들이 청취 영역 내에 배치될 수 있고, 오디오 소스에 의해 구동되어 청취 영역 내의 소정 위치에 있는 청취자에게 사운드를 방출하게 할 수 있다. 청취 영역의 구성 및 청취 영역 내의 객체들(예컨대, 사람들 및 가구)의 구조는 음파에 대한 복잡한 흡수/반사 속성들을 생성한다. 이들 흡수/반사 속성들의 결과로서, 청취 영역의 다른 영역들에 대해서는 불량한 청취 경험을 남겨두면서 향상된 청취 경험을 제공하는 "스위트 스폿(sweet spot)"들이 청취 영역 내에 생성된다.청취 영역의 임펄스 응답을 측정하고, 이러한 판정된 임펄스 응답에 기초하여 오디오 신호들을 조절하여 청취 영역 내의 특정 위치에 있는 청취자의 경험을 개선하는 오디오 시스템들이 개발되어 왔다. 그러나, 이들 시스템들은 규정된 방식으로 재생되어야 하는 공지된 테스트 신호들에 의존한다.
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 원문을 바탕으로 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 생성하세요.	구체적으로, 제1축 도전성 패턴(120)과 제2축 도전성 투명 패턴 셀(131)들은 에칭(etching), 스퍼터링(sputtering) 또는 스크린 프린팅(screen printing)의 방법 등에 의해 형성될 수 있으며, 투명 패턴의 재료로는 일반적으로 ITO(Indium-Tin Oxide)가 사용된다.상기와 같이 형성된 제2축 도전성 패턴 셀 (131)상에는 절연층(150)을 형성하고, 형성된 절연층(150)상에 브리지 전극(190)을 형성함으로써, 서로 이격되어 있던 제2축 도전성 패턴 셀(131)들을 브리지 전극(190)이 전기적으로 연결한다.그러나, 종래의 터치 패널은 금속(metal)을 이용하여 브리지 전극(190)을 형성하는 경우, 브리지 전극(190)이 디스플레이의 RGB 블록(block)(195)의 빛을 차단하므로, 차단된 RGB 블록과 차단되지 않은 RGB 블록 간의 밝기와 색차가 발생하고 브리지 전극(190)이 사용자의 육안에 보이는 문제가 발생하였다.	다음 텍스트에서 제공된 문맥을 정확히 이해하고, 마지막 문장을 자연스럽고 문맥에 맞게 완성하세요. 문장은 이전 내용과 논리적으로 연결되어야 합니다. #텍스트: 개인 휴대 정보 단말기(PDA: personal digital assistants), 노트북 컴퓨터, OA 기기, 의료기기 또는 카 네비게이션 시스템 등의 전자기기에서는, 이들 디스플레이에 입력수단(포인팅 디바이스: pointing device)을 함께 구비하기 위한 터치 패널이 널리 이용되고 있다. 대표적인 터치 패널에는 저항막 방식, 전자 유도 방식, 광학식 등 외에도 정전용량 방식(capacitive type)이 알려져 있다.일반적으로 정전용량방식은 아날로그 방식과 디지털 방식으로 나뉜다.아날로그 방식은 센서전극이 시트(Sheet)형태의 전극으로 센싱 동작영역내 패턴이 필요 없는 반면, 디지털 방식은 센싱 동작영역내 센서용 전극의 패턴이 필요하다. 이러한 디지털 방식에 있어서, 용량성 터치 패널은 터치 위치가 확인될 수 있는 기초된 전류를 유도하기 위하여 인체의 정전기(electrostatics)와 투명 전극 사이에서 유발된 정전용량(capacitance)의 변화를 채용한다. 이러한 인체, 예를 들어, 손가락 또는 첨필(stylus)이 터치 패널을 터치한 위치를 검출하기 위하여, 다양한 용량성 터치 패널 기술들이 개발되고 있다.하나의 예로서 미국 등록번호 6,970,160은 터치 감각면(touch-sensitive surface) 상의 터치 위치를 검출하기 위한 격자형 터치 센싱 시스템(lattice touch-sensing system)을 개시하고 있다. 상기 격자형 터치 센싱 시스템은 절연물질로 분리된 두 개의 용량성 센싱층(capacitive sensing layer)을 포함할 수 있고, 상기 각 층은 실질적으로 평행한 전도성 요소들(conducting elements)로 이루어지고, 상기 두 센싱 층의 전도성 요소들은 서로 실질적으로 직교한다. 각 요소는 협소한 용량성 정사각 스트립(narrow conductive rectangular strips)으로 서로 연결된 일련의 다이아몬드 형상의 패치로 구성될 수 있다. 주어진 센싱 층의 각 전도성 요소는 일단 또는 양단에서 대응되는 리드 라인(lead line) 세트의 리드 라인과 전기적으로 연결된다. 제어 회로가 또한 포함될 수 있으며, 상기 제어 회로는 여기 신호(excitation signal)를 상기 대응되는 리드 라인 세트를 통하여 전도성 요소들의 양 세트에 제공하고, 표면상에 터치가 발생되는 경우 센서 요소들로부터 발생되는 센싱 신호(sensing signal)를 수신하며, 각 층에서의 영향을 받은 바(affected bars)의 위치에 기초하여 상기 터치의 위치를 결정한다.상기와 같은 정전용량방식은 두 개의 용량성 센싱층(capacitive sensing layer)을 포함하는 구성으로 대부분 이루어지는데, 상기 두 개의 용량성 센싱층은 상기 층들 사이의 용량성 효과(capacitive effect)를 가져오기 위해 절연 물질로 상호 공간을 두고 형성된다. 이러한 구성은 패널의 구조를 아주 두꺼워지도록 하며, 결과적으로 소형화에 역행하게 된다. 더욱이, 종래의 용량성 터치 패널은 두 개의 용량성 센싱층이 각각 형성되는 양 표면 상의 기판(substrate)을 포함한다. 이러한 점에서, 스루 홀(through holes)들이 바이어스(vias)로 역할 하도록 기판상에 형성되어야 하며, 회로층 형성(circuit layering)이 상기 센싱층들의 컨덕터 요소(conductor elements)를 적절히 연결하기 위하여 채용되어야 한다. 이것은 용량성 터치 패널의 제조를 어렵고 복잡하게 한다.따라서, 이와 같은 문제점에 대응하고자 두 개의 용량성 센싱층을 하나로 줄이기 위한 기술들이 사용되고 있다.도 1은 종래 기술에 따른 터치 패널을 도시한 도면이다. 도 1을 참조하여 종래 기술에 따른 터치 패널을 설명하기로 한다.도 1에 도시된 바와 같이, 기판(110)상에 제1축 도전성 패턴(120)을 형성하고, 제2축 도전성 투명 패턴 셀(131)들을 형성한다.
	지난해 정부가 경찰권의 민주적 분권과 주민밀착 치안서비스를 강화하기 위한 방안으로 자치경찰제 도입을 추진한다고 발표하면서 경기도는 '경기도형 자치경찰모델' 개발을 통해 선도적인 역할을 담당해야 한다는 주장을 내세웠다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 김수언 지난 5월 정부가 국가수사본부 신설 등 경찰개혁안을 확정한 가운데, 경기도가 '경기도형 자치경찰모델' 개발을 통해 2020년에 시범적으로 시행될 자치경찰제에 선도적으로 대비해야 한다는 주장이 제기됐다. 경기연구원은 28일 자치경찰제에 관한 이론과 국내외 사례를 분석하고, 정부가 발표한 자치경찰제 도입안을 평가해 조직·인력·사무·재정의 4가지 영역에서 경기도의 도입방안을 제시한 '자치경찰제 시행 대비 경기도 도입방안 연구' 보고서를 발표했다. 정부는 경찰권의 민주적 분권과 주민밀착 치안서비스를 강화하기 위해 자치경찰제 도입을 추진하고 있다. 지난해 정부가 발표한 자치경찰제 도입안에 따르면 시·도에는 자치경찰본부를, 시·군·구에는 자치경찰대를 신설해 국가경찰 사무와 인력 중 일부를 자치경찰로 이관할 예정이다. 자치경찰은 생활안전·여성청소년·교통·지역경비 등 주민밀착형 민생치안활동을 담당하게 된다. 전국의 경찰관 정원은 총 11만7천617명 중 자치경찰로의 이관인력은 총 4만3천 명으로 추정되고 있다. 총 경찰인력 대비 경기도 경찰인력 비율(19.1%)로 추정하면, 경기도의 자치경찰 이관인력은 8천170명으로 예상되고 있다. 그러나 이 인력규모로는 경기도 자치경찰이 제대로 정착될 수 없다는 지적이 제기됐다. 자치경찰 이관인력에서는 경무기능(행정지원)과 정보통신(과학경찰) 과 같은 지원인력이 아예 빠져있어 심각한 운영난이 예상되기 때문이다. 또한 무엇보다 현재의 부족한 경찰인력을 그대로 자치경찰로 이관하기 때문에 인력 운영의 어려움이 예상된다. 한편, 8천170명의 경기도 자치경찰을 운영하는 데 필요한 예산은 연간 약 7천555억 원으로 추정됐다. 지원인력이 포함되지 않은 8천170명에 대한 인건비가 5천719억 원, 주요사업비 1천509억 원, 기본경비 327억 원 등이다. 조성호 경기연구원 연구위원은 "경기도의 과태료(2016년 1천181억 원)와 범칙금(2017년 309억 원)으로는 이를 충당하기 어렵기 때문에 자치경찰교부세의 신설 등 재원조달 방안이 고려될 필요가 있다"며 "특히, 국가와 경기도간 재원분담은 자치경찰의 인건비 및 주요사업비는 국비로 하고, 기본경비는 경기도가 분담하는 것이 바람직하다"고 말했다. 조 연구위원은 "경기도는 꾸준한 인구증가와 함께 행정수요도 지속적으로 증가하고 있으며, 넓은 면적에 다양한 지역적 특성을 가지고 있어 치안수요 역시 다양하다"라며 "경기도의 특성을 감안한 '경기도형 자치경찰모델'의 개발이 필요하다"고 주장했다. 경기도의 자치경찰제 도입방안으로는 ▶업무의 통일성과 지휘체계 일원화를 위해 1개의 경기도 경찰위원회 및 2개의 자치경찰본부 설치 ▶행정구역과 경찰서 관할구역 일치를 위해 자치경찰대는 최소 50개로 상향 ▶치안수요 대비 경찰관 1인당 담당 주민 수 등을 고려해 자치경찰 인력 규모 확대 ▶자치경찰교부세의 운영방법과 제도 설계 등을 제시했다. 조 연구위원은 "향후 자치경찰제 도입에 따라 무엇보다 도민이 체감할 수 있고, 국가경찰의 역할과 자치경찰의 관계에서 혼란과 치안공백이 없어야 한다"며 "경기도는 '경기도형 자치경찰모델' 개발을 통해 자치경찰제를 선도적으로 준비하고, 이에 따른 추진전략을 반드시 확보해야 한다"고 강조했다.
	소리바다 운영자는 정당한 허락 없는 음악파일을 P2P프로그램을 이용하여 음악파일의 복제임을 예견하면서도 무료로 널리 공유하였으며 프로그램 이용자들의 접속정보를 서버에 보관하여 다른 이용자에게 제공함으로써 이용자들이 용이하게 파일을 다운로드 받아 복제권 침해를 용이하게 했으므로 운영자의 행위는 복제권 침해행위의 방조에 해당한다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: [1] 저작권법 제2조의 유형물에는 특별한 제한이 없으므로 컴퓨터의 하드디스크가 이에 포함됨은 물론이지만, 하드디스크에 전자적으로 저장하는 MPEG-1 Audio Layer-3 (MP3) 파일을 일컬어 유형물이라고는 할 수 없으므로, 음악 CD로부터 변환한 MP3 파일을 Peer-To-Peer(P2P) 방식으로 전송받아 자신의 컴퓨터 하드디스크에 전자적으로 저장하는 행위는 구 저작권법(2000. 1. 12. 법률 제6134호로 개정되기 전의 것) 제2조 제14호의 복제행위인 '유형물로 다시 제작하는 것'에는 해당하지 않고, 구 저작권법(2006. 12. 28. 법률 제8101호로 전문 개정되기 전의 것) 제2조 제14호의 복제행위인 '유형물에 고정하는 것'에 해당한다. [2] 구 저작권법(2006. 12. 28. 법률 제8101호로 전문 개정되기 전의 것) 제2조 제15호에서 말하는 '배포'란 저작물의 원작품이나 그 복제물을 유형물의 형태로 일반 공중에게 양도·대여하는 것을 말하므로, 컴퓨터 하드디스크에 저장된 MP3 파일을 다른 P2P 프로그램 이용자들이 손쉽게 다운로드 받을 수 있도록 자신의 컴퓨터 내 공유폴더에 담아 둔 행위는 이에 해당하지 않는다. [3] 저작권법이 보호하는 복제권의 침해를 방조하는 행위란 정범의 복제권 침해를 용이하게 해주는 직접·간접의 모든 행위로서, 정범의 복제권 침해행위 중에 이를 방조하는 경우는 물론, 복제권 침해행위에 착수하기 전에 장래의 복제권 침해행위를 예상하고 이를 용이하게 해주는 경우도 포함하며, 정범에 의하여 실행되는 복제권 침해행위에 대한 미필적 고의가 있는 것으로 충분하고 정범의 복제권 침해행위가 실행되는 일시, 장소, 객체 등을 구체적으로 인식할 필요가 없으며, 나아가 정범이 누구인지 확정적으로 인식할 필요도 없다. [4] P2P 프로그램을 이용하여 음악파일을 공유하는 행위가 대부분 정당한 허락 없는 음악파일의 복제임을 예견하면서도 MP3 파일 공유를 위한 P2P 프로그램인 소리바다 프로그램을 개발하여 이를 무료로 널리 제공하였으며, 그 서버를 설치·운영하면서 프로그램 이용자들의 접속정보를 서버에 보관하여 다른 이용자에게 제공함으로써 이용자들이 용이하게 음악 MP3 파일을 다운로드 받아 자신의 컴퓨터 공유폴더에 담아 둘 수 있게 하고, 소리바다 서비스가 저작권법에 위배된다는 경고와 서비스 중단 요청을 받고도 이를 계속한 경우, MP3 파일을 다운로드 받은 이용자의 행위는 구 저작권법(2006. 12. 28. 법률 제8101호로 전문 개정되기 전의 것) 제2조 제14호의 복제에 해당하고, 소리바다 서비스 운영자의 행위는 구 저작권법상 복제권 침해행위의 방조에 해당한다고 한 사례.
	SCO는 9.11 테러 사태 후 안보협력을 더욱 강화시켜 오고 있다. 즉 SCO는 한편으로는 미국의 대 아프가니스탄 전쟁을 성공적으로 수행하기 위한 협조를 하면서, 다른 한편으로는 미국의 중앙아시아에 대한 군사적 전진정책을 저지시키면서 역내 비전통적 안보위협에 대한 공동 대응을 강화하였다. 즉 SCO는 1999～2000년 사이에 우즈베키스탄, 키르기스스탄에서 발생한 테러 사태에 적극 대응하기 위하여 2001년에 타쉬켄트에 반 테러 센터(RATS)를 설치하였다. SCO 출범 당시인 2001년 6월 SCO 정상들은 ‘반테러, 반 분리주의, 반 극단주의에 관한 협약 을 하면서 SCO가 안보분야에서 협력할 핵심 이슈로 이들 세 가지 안보위협을 지목하였다. 이들 세가지 안보이슈는 체첸 분리주의자들의 테러, 신장·위구르 지역의 분리주의, 그리고 중앙아시아에서의 이슬람 근본주의자들의 세력 확산에 직면한 SCO 회원국들의 이해관계를 상합시킨 것이었다. 2002년 상트 페테르부르크 정상회담에서는 반 테러 지역기구에 대한 SCO 국가들의 협정 이 채택되었으며, 2002년에는 중국과 키르기스스탄이 SCO 안보협력 틀 내에서 반 테러 합동 군사훈련을 실시하였다. 이후 비록 SCO 안보협력의 틀은 아니었지만 2005년 8월에는 산동지역에서 대대적인 사상 첫 중·러 합동 군사 훈련이 실시되었고, 여타 가맹국들의 국방장관이 참관하였다. 내년에는 러시아 우랄군구에서 SCO 차원의 합동 군사훈련이 실시될 예정이다.	주어진 제목과 요약문에 대한 정보를 토대로, 요약되기 전 문장을 유추해서 생성해주세요. 제목: ‘유라시아 이니셔티브’의 실현을 위한 한･러 안보협력 방안 요약문: SCO는 미국의 대테러 전쟁에 협조하는 한편 미국의 군사적 전진을 저지시키며 역내 공동대응을 강화했다. 2001년 반테러센터를 설치하고 회원국의 이해관계를 종합하여 반테러, 반분리주의, 반극단주의를 안보위협으로 지목했다. 2002년 반테러 협정을 채택하고 합동군사훈련도 실시하였다. 2005년 중·러 합동군사훈련이 실시되었고 내년에는 SCO 차원의 훈련이 예정되어 있다.
	제목: [표지 이야기]유기동물로 장사하는 보호센터 유기동물 보호센터들은 입양 시 별도의 돈을 받지 않는다고 하지만 동물권보호단체는 이를 별도의 수익을 챙기는 변종 펫숍으로 보며 장사를 하는 것이라고 비판했다.	주어진 문장에 적절한 제목을 생성하고, 내용을 요약해주세요. 문장: ㆍ'안락사 없는 보호소' 내세우는 사설 업체들 맡아줄 때도 입양할 때도 돈 받아 지난 6월 인천에 사는 ㄱ씨는 경기도 김포시 한 도로에서 진도 믹스견 한 마리를 구조했다. 믹스견은 편의점 앞 도로에 버려졌는데 마침 편의점에 있던 ㄱ씨는 강아지가 버려지는 장면을 목격했다. 승용차 한 대가 편의점 앞 도로에 멈춰서더니 하얀 개 한 마리를 내려놓고 떠났다. 순식간이었다. 그대로 뒀다가는 차에 치이겠다 싶어 일단 안고 집으로 돌아왔다. 유기견은 6개월 된 수컷이었다. 병원 검사 결과 건강에 이상이 없었다. 눈치가 빠르고 대소변도 잘 가렸다. ㄱ씨는 유기견에게 '아치'라는 이름을 지어줬다. 정이 들었지만 곧 아이가 태어날 집이어서 아치와 함께 살 수는 없었다. 유기견 보호센터에 보낼까 했지만 10일 이내 새 주인을 못찾으면 안락사시킨다는 말을 듣고 생각을 접었다. '잡종'은 유기견 시장에서 인기가 없다. 아치는 안락사당할 가능성이 높았다. 다시 보호소 맡기면 파양비도 받아ㄱ씨가 택한 곳은 '안락사 없는' 사설 유기동물 보호센터였다. 센터에 맡기는 데는 돈이 들었다. 알아보니 유기견 개월 수와 예방접종 여부, 몸무게에 따라 비용이 달랐다. ㄱ씨는 아치를 센터에 입소시키는 데 모두 40만원을 지불했다. 적지 않은 돈이지만 아깝다는 생각은 들지 않았다. 그나마도 아치를 받지 않겠다는 센터를 설득해 간신히 맡긴 터였다. ㄱ씨는 "돈은 들었지만 안락사를 시키지 않는다니 그걸로 됐다"며 "좋은 주인 만나기만을 바랄 뿐"이라고 말했다. 그렇다면 아치와 같은 유기동물들은 어떻게 될까. 이들의 프로필은 곧 센터 홈페이지에 게재된다. 새 주인을 찾기 위해서다. 새 주인을 찾는 동안 센터에 머무는데 이때 센터는 동물들에게 일절 의료·진료 지원을 하지 않는다. 사료를 주고 비정기적으로 하는 목욕이 업체에서 제공하는 서비스의 전부다. 입양에도 돈이 든다. 입양 희망자들은 센터에 책임 분양비 명목으로 최소 20만원을 내야 한다. 품종과 크기에 따라 분양비는 더 올라가기도 한다. 환불은 안 된다. 입양 이후 질병·감염 사실이 발견되어도 센터 측은 일절 책임을 지지 않는다. 데리고 갔다가 다시 보호소에 맡기려면 파양비 명목으로 40만원 이상을 지불해야 한다. ㄱ씨가 아치를 맡긴 사설 유기동물 보호센터는 지자체·동물권 보호단체에서 운영하는 동물보호소와는 운영방식이 상이하다. 일반적인 유기동물 보호소는 입소과정에서 돈을 받지 않는다. 의료진들이 정기적으로 유기동물의 건강상태를 체크한다. 입양 전에 생긴 병은 보호소에서 치료한다. 유기동물 입양에 드는 비용도 다르다. 보호소마다 차이는 있지만 대개 분양에 드는 비용은 최대 10만원(책임비)이다. 동물등록비 1만원만 받는 보호소도 있다. 돈을 받는 대신 입양자가 끝까지 동물을 책임질 수 있는 사람인지를 심사한다. 김정미 서울유기동물입양센터 센터장은 "유기동물을 입양하는 데 별도의 돈은 받지 않는다"며 "대신에 데려간 동물을 버리거나 파양하지 않는다는 조건을 건다"고 말했다. 동물권보호단체에서는 '안락사 없는 보호소'를 내세운 자칭 사설 유기동물 보호센터들을 변종 '펫숍'이라고 본다. 개와 고양이 분양이 본업인 판매업체가 한편에서 유기동물을 내세워 별도의 수익을 챙기고 있다는 것이다.
	제목: 아프리카돼지열병 파주서 첫 발생 `비상`...연천군에서도 의심 신고 등 확산 우려 사람에게는 전염되지 않지만 돼지에게는 치사율 100%인 아프리카돼지열병이 파주에서 국내 처음으로 발생하였고, 연천군에서도 감염이 의심된다는 신고가 들어와 비상인 상황이다.	주어진 문장에 적절한 제목을 생성하고, 내용을 요약해주세요. 문장: 아프리카돼지열병(ASF·African Swine Fever)이 국내에서 처음으로 경기도 파주에서 발생했다. 또 경기 연천군에서도 감염 의심 신고가 들어오는 등 아프리카돼지 열병이 확산하는 것 아니냐는 우려의 목소리가 나오고 있다. 이 병은 사람에게 전염되지는 않지만 돼지에게는 치사율 100%의 치명적 질병이다. 정부는 발생농장 살처분과 함께 이동중지 명령(standstill) 발령 등 초기 대응에 나섰다. 농림축산식품부는 17일 오전 6시 30분 경기도 파주시 연다산동의 한 양돈농장을 ASF 발생 농가로 확진했다고 밝혔다. 해당 농장은 지난 16일 오후 6시쯤 어미 돼지 5마리가 폐사하자 검역 당국에 ASF 의심 신고를 했다. 농식품부의 정밀검사한 결과 폐사한 5마리 중 2마리가 ASF 양성으로 확진됐다. 경기도와 농식품부는 해당 농장에서 사육 중인 돼지 2450마리와 이 농장주의 아들이 운영하는 파평면 소재 농장 돼지 1400마리, 아내가 키우는 법원읍 농장 돼지 850마리 등 모두 4700마리에 대한 살처분에 들어갔다. 또 해당 농장 출입을 통제하고 인근 다섯 곳에 통제 초소 15개소와 거점 소독시설 16개소를 운영키로 했다. 가족이 운영하는 두 농장은 연다산동에서 각각 20㎞, 19㎞ 떨어져 있다. 두 농장이 있는 파평면과 법원읍은 파주에서 가장 많은 돼지가 사육되는 곳이다. 그러나 다행히 첫 발생 농장에서 어미돼지만 폐사한 점으로 미뤄 발병 초기에 신고가 이뤄진 것으로 방역당국은 보고 있다. 농림부는 또 이날 경기도 연천군의 돼지 사육 농가에서 아프리카돼지열병 의심 신고가 접수됐다고 밝혔다. 의심 신고된 연천군 백학면의 양돈농장은 돼지 2000여 마리를 사육 중이며, 어미돼지 한 마리가 폐사하자 이날 오후 2시쯤 축산 방역 당국에 신고했다. 검사 결과는 18일 중 나올 예정이다. 농식품부는 발병 확정 직후 아프리카돼지열병 위기경보단계를 최고 수준인 '심각'단계로 격상했다. 오는 19일 오전 6시30분까지 전국 6309곳 돼지 농장과 도축장, 사료공장, 출입차량 등에 대해 '일시이동중지명령'(Standstill)도 발령했다. 현재 파주 농장 인근 3㎞ 이내엔 돼지 농장이 없는 것으로 확인됐다. 다만 3∼10㎞ 거리에서 19개 농장에서 1만8380마리의 돼지를 사육 중인 것으로 파악됐다. 파주시 전체에는 91개 농가가 10만600여 마리를 사육중이다. 연천군의 감염 의심 신고 농장 반경 3㎞ 이내에는 3개 농가가 돼지 8500여 마리를 키우고 있다. 또 북한과 인접한 파주, 김포, 연천 등 3개 시·군에는 경기도 전체(1321개 농가 220만 마리)의 12%인 26만 마리(192개 농가)가 사육되고 있다. 김현수 농식품부 장관은 이날 오전 정부세종청사에서 긴급 브리핑을 열고 "발생 농장과 농장주 소유 2개 농장의 돼지 살처분을 오늘 중으로 완료해 초동 방역조치 완료하겠다"고 말했다. 농식품부는 반경 10km 이내의양돈농가에 대해 정밀검사 통해 발생여부를 확인할 계획이다.
	도메인 네임 등록 대행자는 인터넷 도메인 이름의 등록을 관리하고 도메인 관련 서비스를 제공하는 기업입니다. 1999년 이전에는 Network Solutions(NSI)가 도메인 네임 시장을 독점하고 있었지만, 이후 많은 회사들이 독립적인 등록 대행 서비스를 개발하였습니다. 이로 인해 도메인 산업은 소매 모델과 레지스트리에 대한 도매 모델로 변화하였습니다. 도메인 네임 시스템 보안 확장(DNSSEC)은 도메인 네임 시스템 상의 정보 보안을 위한 표준입니다. 도메인 이전은 도메인 네임의 지정 등록 대행자를 변경하는 프로세스로, 최종 사용자는 도메인 이전 절차를 따라야 합니다. 도메인 가로채기는 도메인 등록 대행자가 고객을 눈속임함으로써 자신들의 서비스로 도메인을 이전하는 방법을 쓰는 것을 말합니다. 도메인 등록 대행자들의 시장 점유율 순위와 각각의 도메인 등록 개수는 공개되며, 대부분의 국가 코드 최상위 도메인은 존 파일 남용과 같은 문제로 2003년 이래로 존 파일 제공을 중단하고 있습니다.	도메인 네임 등록 대행자는 무엇을 하는 기업인가?
	알프레도 멘데즈-곤잘레스는 1907년 6월 3일생으로 미국 일리노이주 시카고에서 출생한 로마 가톨릭교회 주교이며, 인디애나주 노터데임대학교를 졸업하여 1935년에 사제로 서품받았습니다. 그는 1960년에 프랜시스 조셉 스펠만 추기경에 의해 주교로 성성되었고, 푸에르토리코의 아레시보 교구의 교구장을 맡았습니다. 1974년에 아레시보 교구장을 사임하고 캘리포니아로 돌아와 1993년에 클래런스 켈리 신부를 주교로 성성하였습니다. 그러나 이 행동은 교황의 허락 없이 이루어진 것으로 판명되었고, 주교 성성 사실은 그가 선종한 후에야 발표되었습니다.	알프레도 멘데즈-곤잘레스는 어떤 교회 주교인가요?
	우즈베키스탄은 경제 개발에 필요한 투자 재원이 절대적으로 부족한 국가로서 1990년대 이후 외국인 투자 유치를 위한 적극적인 인센티브 제도를 도입하였다. 외국인 투자 관련 법규로는 외국인 투자법 (Foreign Investment Law)과 외국인투자자 보호법(Foreign Investor Guarantees Law)이 있는데, 이 법은 투자 시점으로부터 10년 간 법령 변경이나 제정으로 인해 야기되는 불이익을 보호해주는 것을 원칙으로 하고 있다. 또한 외국인 투자기업의 추가적인 혜택에 대해서는 그 때마다 대통령령으로 별도로 정하며, 수출 외화 수입의 본국 송금 시 적용하는 환전 특혜 범위 및 기간 등도 각 건 별로 정하고 있다. 우즈베키스탄 정부는 원자재 위주의 단순 수출을 지향하고 산업 다각화와 첨단 가공 산업의 발전을 위해 2011∼2015년 산업 발전 전략을 수립하고 기계 및 자동차, 의약 및 바이오 기술, 화학 산업, 식품 가공 산업, 전기·전자, 에너지 부분의 외국인 투자를 적극 유치하고 있다.	주어진 제목과 요약문에 대한 정보를 토대로, 요약되기 전 문장을 유추해서 생성해주세요. 제목: 중앙아시아 진출기업 애로해소 가이드북 요약문: 우즈베키스탄은 산업다각화를 위해 기계·자동차 등 분야에서 외국인 투자를 적극 유치하고 있다. 투자 관련 법규로는 외국인 투자법과 외국인투자자 보호법이 있으며, 투자 이후 10년간 법령 변경으로 인한 불이익으로부터 보호해 준다. 또 대통령령으로 추가적인 혜택을 줄 수 있다.
	우리 동네 문화기행 낭만 오디세이는 매주 일요일 오전 10시 10분에 KBS 1TV에서 방영되는 한국방송공사의 TV 프로그램으로, 예술과 여행의 만남, 낭만 오디세이를 소개합니다. 음악, 미술 등 예술의 발자취를 따라가며 각 장소의 특색을 느끼는 문화기행 프로그램입니다. 2017년 6월 11일부터 9월 3일까지 총 50분짜리 방송으로 진행되었습니다.	'한국방송공사의 TV 프로그램인 낭만 오디세이는 어느 시간에 어떤 요일에 방영되나요?'
	메이저리그 공식 홈페이지는 올-MLB 팀은 양대 리그를 통틀어 올해를 빛낸 선수로 구성된 퍼스트 팀과 세컨드 팀을 발표했는데, 코링나 몬스터 류현진이 퍼스트 팀에서 제외되었지만, 세컨드 팀 선발 투수로 이름을 올렸다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: Los Angeles Dodgers starting pitcher Hyun-Jin Ryu throws to a Washington Nationals batter during the second inning in Game 3 of a baseball National League Division Series on Sunday, Oct. 6, 2019, in Washington. (AP Photo/Pablo Martinez Monsivais) ‘코리안 몬스터’ 류현진(32)이 2019 메이저리그 올(ALL)-MLB 세컨드 팀에 선정됐다. 메이저리그 공식 홈페이지 MLB닷컴은 11일(한국시간) 2019시즌 올-MLB 퍼스트 팀과 세컨드 팀을 발표했다. 올-MLB 팀은 양대 리그를 통틀어 올해를 빛낸 선수로 구성된다. 시즌 결산 올스타팀인 셈이다. 메이저리그에서 올-MLB 팀을 선정한 건 이번이 처음이다. 미국프로풋볼(NFL)과 미국프로농구(NBA)가 한 시즌을 대표하는 선수들로 팀을 구성하는 것을 본따 시도했다. 류현진은 퍼스트 팀에서 제외됐지만, 세컨드 팀 선발 투수로 이름을 올렸다. 류현진은 올해 14승5패 평균자책점 2.32를 기록했다. 잭 그레인키(휴스턴 애스트로스), 잭 플래허티(세인트루이스 카디널스), 찰리 모턴(탬파베이 레이스), 마이크 소로카(애틀랜타 브레이브스)도 류현진과 함께 올-MLB 세컨드 팀 선발 투수 명단에 포함됐다. MLB닷컴은 류현진에 대해 “지난 시즌 뒤 다저스의 퀄리파잉 오퍼를 받아들여 승부를 건 류현진이 메이저리그 전체 평균자책점 1위(2.32)에 오르고, 2013년 데뷔 시즌(30경기, 192이닝) 이후 가장 많은 29경기, 182⅔이닝을 소화했다”고 설명했다. 이번 올-MLB팀은 팬 투표 50%와 전문가 투표 50%의 비율로 결과를 합산해 결정됐다. 퍼스트, 세컨드 팀 마다 선발 투수 5명, 구원 투수 2명, 포지션별 야수 9명이 선정됐다. 투표에서 더 많은 지지를 받은 올-MLB 퍼스트 팀의 선발 투수에는 자유계약선수(FA) 최대어 게릿 콜을 비롯해 저스틴 벌랜더(휴스턴), 제이컵 디그롬(뉴욕 메츠), 맥스 셔저(워싱턴 내셔널스)가 뽑혔다. 뉴시스 양기생
	미국의 비건 대표가 내년 미국의 지원단체들과 대북 지원 방법에 대해 논의할 것이라고 한 것은 미국인에 대한 북한여행 금지를 재검토하겠다는 뜻으로 북,미 협상 교착이 장기화 되고 있는 상황에서 북한에 메시지를 보낸 것으로 봐도 될 것이다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 지난 19일 방한한 미국의 스티븐 비건 대북특별대표가 "내년 초 미국의 지원단체들과 만나 적절한 대북 지원을 더욱 확실히 보장할 방법에 대해 논의할 것"이라고 밝혔다. 미국의 대북 실무협상을 이끌고 있는 비건 대표는 "우리는 또 미국민이 지원물품을 전달하고 국제적 기준의 검증을 위해 북한을 여행하는 부분에 대해서도 재검토할 것"이라고 했다. 미국 정부가 민간의 대북 인도적 지원이 원활히 이뤄질 수 있도록 미국인에 대한 북한여행 금지를 재검토하겠다는 뜻이다. '미국인의 북한여행 금지'는 트럼프 행정부가 지난해 8월 대학생 오토 웜비어의 사망사건을 계기로 실시한 대북 독자제재다. 비건 대표의 발언은 이를 해제할 뜻을 공개 표명한 것이어서 주목하지 않을 수 없다. 비록 인도적 지원이라는 제한을 두긴 했지만 '비핵화 전까지 대북 제재 완화는 없다'던 미국이 인적교류 제재의 완화 또는 조정을 예고한 것이다. 이는 트럼프 행정부가 여타 대북 제재에 대해서도 유연성을 발휘할 수 있음을 시사한 것으로 볼 수도 있다. 이를 비건 대표가 인천공항에 도착하자마자 취재진 앞에서 문건을 낭독하는 형태로 밝힌 형식에도 눈길이 간다. 북·미 협상의 교착이 장기화되고 있는 상황에서 북한을 협상장으로 불러내기 위해 북한에 직접 메시지를 던진 것으로 봐도 무방할 것이다. 올해가 얼마 남지 않은 가운데 나온 이번 메시지는 북한과의 대화 모멘텀을 살려 비핵화와 한반도 평화구축을 위한 북·미 협상을 내년에도 이어가겠다는 트럼프 행정부의 의지를 시사한다는 점에서도 긍정적이다. 북한은 지난 10월 마이크 폼페이오 국무장관의 4차 방북 이후 미국의 대화 제의에 응하지 않은 채 '장고'하고 있다. 북한은 그간 비핵화와 관련한 선제조치를 취해왔음에도 미국이 제재 해제 등 상응조치를 내놓지 않고 있는 것에 불만을 표출해왔다. 그렇다면 북한의 핵심 요구사항인 제재에 대해 부분적이나마 미국이 완화된 입장을 보인 점을 북한도 적극적으로 평가할 필요가 있다. 마침 북한 입장을 대변하는 조선신보가 19일 "새로운 역사의 흐름이 역전되는 일은 없다"고 보도했다. 김정은 국무위원장의 비핵화 결단이 흔들리지 않을 것임을 강조한 것이다. 이를 실현할 길은 북·미 협상 외엔 없다는 것은 자명하다. 샅바싸움이 너무 길어져 대화동력이 소진되지 않으려면 북한이 조기에 비건 발언에 대한 화답 메시지를 내놓는 것이 바람직하다. 김 위원장이 내년 신년사에서 비핵화와 평화체제 구축 및 북·미 협상 의지를 밝히는 것도 하나의 방안이다.
	니시나리 구는 일본 오사카 시의 24개 구 중 하나로, 1925년에 설립되었으며 옛 니시나리 군 이마미야 정, 다마데 정, 쓰모리 촌, 고하마 촌이 편입된 것에서 출발했습니다. 구명은 옛 군명에서 따온 것이며, 1943년에는 스미요시 구와의 경계를 조정하면서 현재의 구역이 형성되었습니다. 메이지 시대에는 기즈 강가의 농촌이었지만, 다이쇼 시대 이후 오사카 시의 확장과 함께 주택지와 공장지로 변모했습니다. 하나조노 정, 기시노사토, 다마데 등은 상가가 번창했지만, 오일 쇼크 이후 산업구조의 변화와 함께 활력이 저하되어 목수장들이 사라지고 주택지가 노후화되었습니다. 그러나 니시나리 구는 여러 교통 수단이 있는 인정많은 변두리로 알려져 있으며, 덴진노모리 지구는 아베노 구로부터 계속 되는 한적한 주택지입니다. 또한, 오사카 순환선, 간사이 본선, 사카이스지 선, 요쓰바시 선, 난카이 본선, 고야 선, 시오미바시 등 다양한 교통 수단이 운행되고 있습니다.	니시나리 구는 어디에 위치하나요?
	'서울시 공무원 간첩 증거조작 사건'이 발생하자 김진태 검찰총장은 법과 원칙대로 철저히 수사하라고 지시하였지만 김진태 검찰총장은 서울중앙지검 공안1부도 수사 대상에 포함하여 공정한 수사를 실시해야 할 것이다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 마치 잘 짜인 시나리오 한 편을 보는 듯했다. 휴일 한밤중에 국가정보원이 대국민 사과문을 내놓고, 월요일 오전 박근혜 대통령이 유감을 표명하고, 오후에는 검찰이 국정원을 압수수색했다. 이 모든 일이 진행되는 데 하루도 채 걸리지 않았다. '서울시 공무원 간첩 증거조작 사건'을 둘러싸고 국정원과 청와대, 검찰의 대응이 톱니바퀴처럼 맞물려 돌아간 것이다. 향후 검찰 수사가 어떠한 성역도 두지 않고, 가이드라인도 배제한 채 이뤄질 수 있을지 의심스럽다. 지난달 14일 간첩사건 증거조작 의혹이 제기된 이후 검찰의 태도는 줄곧 소극적이었다. 공소유지 주체로서 진상규명에 적극적으로 나서야 했음에도 망설이고 머뭇거렸다. 여론에 밀려 진상조사팀을 구성했지만 본격 수사와는 거리를 뒀다. 국정원 협조자 김모씨의 자살 시도로 파문이 확산된 뒤에야 수사 체제로 전환했다. 그러고도 압수수색에 이르기까지 사흘이 걸렸다. 대통령이 "철저한 수사"를 지시한 지 7시간 만에 압수수색에 돌입한 걸 보면 청와대와 국정원 눈치를 보며 '최종 재가'를 기다린 인상이 짙다. 검찰은 결국 실기(失期)했다. 검찰은 국정원에 증거를 인멸하도록 시간을 준 것이나 마찬가지다. 검찰을 믿기 힘든 이유는 또 있다. 무능함과 뻔뻔함이다. 검찰은 국정원 문서의 신빙성을 의심할 기회가 여러 번 있었음에도 정밀 검증을 하지 않은 채 법원에 제출했다. 증거조작 의혹이 불거진 뒤에는 절차적 문제일 뿐이라며 국정원을 편들었다. 위조가 사실로 드러난 뒤에도 국민 앞에 사과하고 책임지기는커녕 오불관언이다. 공소유지를 맡은 서울중앙지검 공안1부는 자술서가 위조됐다고 밝힌 중국동포 임모씨에 대한 증인신청조차 철회하지 않았다고 한다. 이런 검찰이 내놓는 수사 결과를 누가 신뢰하겠는가. 김진태 검찰총장은 지난 9일 "이번 사건이 형사사법제도의 신뢰와 관련된 문제라는 인식을 갖고, 법과 원칙대로 철저히 수사하라"고 지시했다. 그러나 기소와 공소유지를 담당한 검사들에 대해선 어떠한 언급도, 조치도 하지 않고 있다. 모든 책임을 국정원에 떠넘기려는 심산인 모양이다. 그러나 국민을 만만하게 봐선 안된다. 지금 국정원과 검찰이 '공범 관계'임을 모르는 이는 없다. 김 총장은 서울중앙지검 공안1부도 이번 수사 대상에 포함시켜야 한다. 수뇌부도 책임을 면할 수 없음은 물론이다. 검찰이 제 식구를 계속 감싸려든다면 사건을 특검으로 넘기는 길밖에 없다.
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 원문을 바탕으로 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 생성하세요.	이러한, 직하방식의 백라이트 유닛은 에지방식에 비해 광의 이용 효율이 높기 때문에 고휘도를 요구하는 대화면 액정표시장치에 주로 사용된다.백라이트 유닛은 광을 발광하는 광원으로 CCFL(cold cathode fluorescent lamp), HCFL(hot cathode fluorescent tube), EEFL(external electrode fluorescent tube) 및 EIFL(external 0026# internal electrode fluorescent tube) 등과 같은 플라즈마 방식의 광원을 이용하거나 발광 다이오드(LED)가 사용된다.이 중에 발광 다이오드(LED)는 장수명, 저전력, 소형 및 높은 내구성을 가지는 장점으로 많이 사용되고 있다.일반적인 에지 방식의 백라이트 유닛은 측면에 발광 다이오드가 배치되고, 상기 발광 다이오드와 나란하게 배치되어 점광을 면광으로 변환하는 도광판이 배치되고, 상기 도광판의 하부에 반사시트가 배치된다.상기 에지 방식의 백라이트 유닛은 발광 다이오드로부터 발생된 열에 의해 발광 다이오드와 인접한 반사시트의 열변형이 발생할 수 있으며, 상기 반사시트는 상기 발광 다이오드와 인접한 일측이 상부방향 또는 하부방향으로 휘어져 상기 발광 다이오드로부터 발광된 광 중에 반사시트 하부방향으로 손실되는 문제가 있었다.또한, 일반적인 에지 방식의 백라이트 유닛은 반사시트의 열변형에 의해 발광 다이오드가 배치된 영역에서 불균일한 휘도를 가지는 문제가 있었다.	다음 텍스트에서 제공된 문맥을 정확히 이해하고, 마지막 문장을 자연스럽고 문맥에 맞게 완성하세요. 문장은 이전 내용과 논리적으로 연결되어야 합니다. #텍스트: 일반적으로 널리 사용되고 있는 표시장치들 중의 하나인 CRT(cathode ray tube)는 TV를 비롯해서 계측기기, 정보 단말기기 등의 모니터에 주로 이용되고 있으나, CRT 자체의 무게와 크기로 인해 전자 제품의 소형화, 경량화의 대응에 적극적으로 대응할 수 없었다.따라서 각종 전자제품이 소형, 경량화되는 추세에서 CRT는 무게나 크기 등에 있어서 일정한 한계를 가지고 있으며, 이를 대체할 것으로 예상되는 것으로 전계 광학적인 효과를 이용한 액정표시장치(LCD: Liquid Crystal Display), 가스방전을 이용한 플라즈마 표시소자(PDP: Plasma Display Panel) 및 전계 발광 효과를 이용한 EL 표시소자(ELD: Electro Luminescence Display) 등이 있으며, 그 중에서 액정표시장치에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.액정표시장치는 경량화, 박형화, 저소비 전력 구동 등의 특징으로 인해 그 응용범위가 점차 넓어지고 있는 추세에 있다. 이에 따라 액정표시장치는 사용자의 요구에 부응하여 대면적화, 박형화, 저소비전력화의 방향으로 진행되고 있다.액정표시장치는 액정을 투과하는 광의 양을 조절하여 화상을 표시하는 디스플레이 장치로서 박형화 및 저소비 전력 등의 장점으로 많이 사용되고 있다.상기 액정표시장치는 CRT와는 달리 스스로 빛을 내는 표시장치가 아니므로, 액정표시패널의 배면에는 화상을 시각적으로 표현하기 위해 광을 제공하는 별도의 광원을 포함한 백라이트 유닛(Back Light Unit)이 구비된다.백라이트 유닛은 광원의 위치에 따라 에지 방식과 직하 방식으로 구분된다.에지 방식의 백라이트 유닛은 주로 랩탑형 컴퓨터 및 데스크탑형 컴퓨터의 모니터와 같이 비교적 크기가 작은 액정표시장치에 적용되는 것으로 빛의 균일성이 좋고, 수명이 길며, 액정표시장치의 박형화에 유리한 장점을 가진다.직하 방식의 백라이트 유닛은 액정표시장치의 크기가 20인치 이상으로 대형화되기 시작하면서 중점적으로 개발되기 시작한 것으로, 확산판의 하부면에 복수개의 광원을 배치하여 액정표시패널의 전면으로 빛을 직접 조광하는 것이다.
	모리 료센은 센고쿠 시대의 주고쿠 지방에서 형성된 군사 또는 정치 조직으로, 모리 모토나리의 모략에 의해 설립되었습니다. 이 조직은 깃카와 가문과 고바야카와 가문을 중심으로 구성되며, 두 가문의 정통 혈통을 끊고 세력을 흡수하는 데 큰 역할을 했습니다. 깃카와 가문의 모토하루와 고바야카와 다카카게를 양자로 들여보내 주고쿠 제패를 달성하였고, 고바야카와 가문은 결국 소멸하였습니다. 그러나 모토나리의 4남인 호이다 모토키요의 아들 모리 히데모토를 시조로 하는 조후 모리 가문이 그 역할을 계승하면서 넓은 의미로는 조슈 번 초기까지 존재하게 됩니다. 이 조직은 많은 성과 도시를 포함하고 있으며, 모리 모토나리, 모리 데루모토, 사쿠라오 성 등이 그 예입니다.	모리 료센은 어떤 조직인가?
	그러나 평소 근로시간을 기준으로 단시간 근로자를 파악하는 경우에도 또 다른 문제가 발생한다. 현재는 지난주에 36시간 이상 일한 근로자에 대해서는 평소 근로시간의 단시간 여부를 따로 확인하지 않기 때문에, 평소에는 단시간 근로를 하지만 지난주에 공교롭게 36시간 이상 일한 근로자는 단시간 근로자에서 누락되게 된다. 경우에 따라서는 형식적으로는 단시간(시간제) 근로자이지만 잔업이 빈번하여 실제 전일 근로자처럼 일하는 근로자도 이 범주에 포함될 수 있다. 평소 단시간 근로자를 보다 정확히 파악하기 위해서는 지난주 근로시간 외에 평소의 1주 근로시간을 추가적으로 확인할 수 있어야 할 것이다.	주어진 제목과 요약문에 대한 정보를 토대로, 요약되기 전 문장을 유추해서 생성해주세요. 제목: 시간선택제 일자리 지원정책의 성과와 과제 요약문: 단시간 근로자 평소 근로시간 기준 파악 시, 평소 단시간 근로를 하지만 지난주 36시간 이상 일한 근로자는 누락된다. 정확 파악을 위해 평소 1주 근로시간을 추가 확인해야 한다.
	어제 정부가 석유제품시장 경쟁 촉진 대책 마련을 밝히면서 현재까지의 주유소는 특정 정유사 폴을 달고서 타 정유사 제품의 판매를 제한하였는데, 현재는 주유소 거리 제한이 없어지며 주유소가 판매에 제한이 사라지면서 소비자 가격이 하락하면서 주유소의 마진율이 달라짐을 밝혔다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 정부가 어제 '석유제품시장 경쟁 촉진 대책'을 발표했다. 지난해 4월 한시적으로 정유사에 대해 ℓ당 100원씩 휘발유값을 인하하도록 하고, 알뜰주유소를 보급하는 등 여러 수단을 동원했지만 기름값이 좀처럼 잡히지 않자 범부처가 나섰다. 대책의 핵심은 정유사 간 경쟁 촉진을 통한 기름값 안정이다. 무엇보다 주목되는 게 주유소가 여러 정유사의 기름을 섞어서 판매하도록 하는 혼합판매 의무화다. 정유사가 주유소에 전량 구매를 강요할 경우 이로 인해 생긴 부당 매출액 2%까지를 과징금으로 부과하기로 했다. 지금까지는 주유소가 특정 정유사 폴을 달고 있으면 다른 정유사 제품을 팔지 못하도록 전량 구매계약을 체결하는 게 관행이었다. 하지만 여러 정유사의 제품을 섞어 팔면 정유사들이 경쟁적으로 주유소에 제품을 싸게 공급하려 할 것이고, 이렇게 되면 기름값 인하를 기대할 수 있을 것이다. 과거 주유소 수가 적었던 때에는 정유사와 협상할 때 주유소가 유리한 입장에 있었다. 하지만 주유소 거리 제한이 없어지고 허가제가 등록제로 바뀌어 주유소가 급증하자 입장이 역전됐다. 정유사들이 우월적 지위를 남용해 주유소에 전량 구매계약을 강요하게 된 것이다. 현재 전국 주유소는 모두 1만2920개인데 SK 34.8%, GS 27.3%, 현대오일 20.4%, 에쓰오일 15.2% 등 4개 정유사가 시장을 나눠 갖고 있다. 정유사는 '갑', 주유소는 '을'의 입장에 있는 셈이다. 이 점에서 혼합판매는 갑을 관계를 역전시켜 가격을 떨어뜨리려는 발상이다. 정유사 직영 주유소는 현재 1235개로 전체의 10% 정도 된다. 나머지 90%가 혼합판매에 적극 참여한다면 가격 인하 효과를 기대할 만하다. 하지만 소비자가격이 얼마나 떨어지느냐 하는 것은 주유소가 마진을 얼마나 챙기느냐에 달려 있다. 지난해 정유사가 한시적으로 기름값을 인하했을 때 그 효과는 대부분 주유소 마진으로 돌아가고 소비자들은 별 혜택을 보지 못했음에 비춰볼 때 더욱 그렇다. 국내 휘발유 시장에 정유 4사 외에 종합화학제품회사인 '삼성토탈'이 제5의 석유제품 공급사로 참여하도록 한 것은 경쟁 촉진이라는 점에서 의미가 있다. 다만 삼성토탈이 공급하는 휘발유가 국내 공급 물량의 1%도 되지 않고 판매도 알뜰주유소에 한정돼 있다는 게 약점이다.
	또한 판매시설, 근린생활시설, 업무시설 등 다른 용도의 집합건물에 대해서는 전유부분과 대지의 분리처분을 방지할 법적 장치가 전혀 없는 공백 상태이다	주어진 문장 뒤에 자연스럽게 이어질 문장을 생성해주세요. 문장: 이와 같은 현상이 엄연히 존재하는 현실 상황에서 대장등록이나 등기만이 구분행위의 유일한 기준이라는 견해를 관철하면 그로 인한 혼란과 거래의 안전에 대한 위협은 오히려 커질 수밖에 없다. 그러므로 대장등록이나 등기가 구분행위의 가장 강력한 징표가 된다고는 하겠지만, 이를 유일한 절대적 기준으로 할 때 생길 수 있는 거래상 혼란과 예측하지 못한 피해 발생을 억제하고, 나아가 개별 사안에 상응하여 분쟁의 해결이 구체적 타당성을 가지도록 하기 위해서는 대장등록이나 등기 이외의 객관적 표시행위로써도 구분행위의 존재를 긍정할 수 있다고 보는 것이 타당하다. 이에 대하여 반대의견은 분리처분금지 규정을 조기에 적용하지 않더라도 수분양자를 보호할 수 있는 다른 법적 장치가 있다고 하면서 공동주택과 대지의 분리처분을 금지하는 주택법 제40조를 들고 있다. 그러나 이 규정은 일정 세대수 이상의 공동주택에만 적용될 뿐이므로, 그 세대수에 못 미치는 공동주택은 적용대상이 아니다.
	그런데, 남원국토관리사무소에서는 교통사고 다발구간으로 남원경찰서 및 남원시의 건의가 있었던 국도17호선 남원시 주생면 중동리 소재 조산교차로는 성지교차로 개선공사 종점으로부터 약 19km 떨어져 있으므로 조산교차로 개선공사를 하려면 별도 발주를 하여야 하는데도, 소나무 군락지 보존 집단 민원 때문에 당초 설계대로 공사추진이 어려워 공사구간이 축소되면서 발생된 감액 공사비(394,000,000원 상당)를 조산교차로 개선사업(공사비 347,000,000원 상당)에 사용하는 것으로 설계변경 하는 등 3건의 공사에서 지자체 건의사항 및 지역주민 불편해소 등의 사유로 발생된 공사구간 외 물량 583,000,000원 상당을 설계변경하는 것으로 설계서에 반영하였다.	주어진 제목과 요약문에 대한 정보를 토대로, 요약되기 전 문장을 유추해서 생성해주세요. 제목: 남원국토관리사무소 종합감사결과 처분요구서 요약문: 남원국토관리사무소는 3건의 공사에서 지자체 건의사항 및 지역주민 불편해소 등의 사유로 생긴 공사구간 외 물량을 설계변경하는 것으로 설계서에 반영하였다.
	제목: 3x3농구 제주 대표 선발 KXO가 27일 제주도 JAWS농구교실체육관에서 3×3농구 제주 대표선발전을 개최하며 선발전 우승팀은 제주도 대표선수로 등록된다.	주어진 문장에 적절한 제목을 생성하고, 내용을 요약해주세요. 문장: KXO가 오는 27일 제주도 JAWS 농구교실 체육관에서 '2019 KXO 제주지회 U15, U18 선발전'을 개최한다. 일명 3인제 농구라 불리는 3x3농구 제주 대표 선발전이 개최된다. KXO(한국 3x3농구 위원회)는 오는 27일 제주도 JAWS 농구교실 체육관에서 '2019 KXO 제주지회 U15, U18 선발전'을 개최한다. 이번 지역 선발전은 다른 지역에서 열리는 3x3 대회에 참가하기 어려운 제주도 청소년들을 위해 마련됐다. 대회 이벤트로 3x3 국가대표이며 하늘내린인제팀의 김민섭 선수와 함께하는 3x3 슛팅 트레이닝 및 경품 이벤트게임도 진행된다. 대회는 제주도 내 중·고등학생(신분 상 학생 자격이면 인정)이면 참가할 수 있으며, 경기 전 신분증을 지참해야 한다. 우스포츠컴퍼니 홈페이지(www.woosports.co.kr) 자유게시판에서 참가신청서를 내려받아 7월 21일까지 이메일(kyun9541@naver.com)로 신청하면 된다. 참가 문의 751-4897. 대회는 중등부(U15) 16개팀과 고등부(U18) 16개팀으로 나눠 진행되며, 기초체력테스트 및 3x3게임을 통해 U15 8명과 U18 8명을 선발한다. 선발전 우승팀은 제주도 대표선수로 등록되며, 예비 대표선수 4명은 준우승팀이 아닌 참가 선수 중 심사위원들이 선발한다.
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 원문을 바탕으로 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 생성하세요.	특히 한국과 일본의 범자형태의 차이는 실담범자와 관련된 전통상 양국의 독특한 특징을 보여주는 것이라 생각된다.	다음 텍스트에서 제공된 문맥을 정확히 이해하고, 마지막 문장을 자연스럽고 문맥에 맞게 완성하세요. 문장은 이전 내용과 논리적으로 연결되어야 합니다. #텍스트: 본고는 고려대장경에 나타나는 실담범자를 고찰하여 한국의 전통범자가 어떠한 것인가를 밝혀보고자 한 것이다. 비록 고려대장경 속에는 많은 자료가 실려 있는 것은 아니지만, 현존하는 자료를 통해 보면 몇 가지 중요한 사실을 확인할 수 있다. 그것을 정리하면 다음과 같이 될 것이다. (1) 고려대장경의 실담범자는 고려시대의 다양한 유물들에 보이는 실담범자와 거의 동일한 문자체계를 가지고 있다고 할 수 있다. 곧 이는 고려대장경의 범자체계가 당시 실담범자로 기록된 대다수 문헌이나 유물의 범자체계의 기준이 되었다고 할 수 있을 것이다. (2) 고려대장경에 나타나는 실담범자의 체계는 고려시대는 물론 조선시대 범자체계와 거의 동일하다고 생각된다. 이것은 조선시대에 이르기까지 한국의 범자체계가 일관된 문자 체계를 바탕으로 전개된 것을 의미할 것이다. (3) 고려와 조선시대에 이르는 소위 한국의 범자체계는 일본의 범자체계와는 다른 독자적인 전통을 유지 보존했다고 생각된다.
	M$을 $\overline{BC}$의 중간점이라고 합니다. 삼각형 ABC$는 이등변이므로, $\overline{AM}$은 밑변 $\overline{BC}$에 대한 고도가 됩니다. 삼각형 ABC$를 $\overline{BC}$를 따라 접었을 때 $A$는 $O$와 일치하기 때문에, $AM = MO = \frac{5}{2} + 1 + 1 = \frac{9}{2} \text{ cm}$. 또한 $BC = 5 - 1 - 1 = 3\text{ cm}$이므로 $\삼각형 ABC$의 면적은 $\frac{1}{2}입니다. \cdot BC \cdot AM = \frac{1}{2} \3 \cdot \frac{9}{2} = \frac{27}{4}}\text{ cm^2$입니다. [asy] /* AMC8 2003 #25 솔루션 / draw((-5, 2.5)--(0,4)--(1,4)--(1,6)--(2,6)--(2,-1)--(1,-1)--(1,1)--(0,1)--cycle); draw((0,0)--(7,0)--(7,5)--(0,5)--cycle); label(scale(.6)"$A$", (-5, 2.5), W); label(scale(.6)"$B$", (0,3.75), SW); label(scale(.6)"$C$", (0,1.25), NW); label(scale(.6)"$Z$", (2,0), SE); label(scale(.6)"$W$", (2,5), NE); label(scale(.6)"$X$", (7,5), N); label(scale(.6)"$Y$", (7,0), S); label(scale(.6)"$O$", (4.5, 2.5), NE); dot((4.5,2.5)); dot((0,-1.5), white); dot((0,2.5), red); label(scale(.6)"$M$", (0,2.5), E, red); [/asy]	그림에서 정사각형 $WXYZ$의 면적은 $25 \text{ cm}^2$입니다. 네 개의 작은 정사각형의 변은 큰 정사각형의 변과 평행하거나 일치하는 1cm 길이의 변을 가집니다. 삼각형에서 ABC$에서 $AB = AC$이고, $\삼각형 ABC$를 $\overline{BC}$ 변 위로 접었을 때, 점 $A$는 정사각형 $WXYZ$의 중심인 $O$와 일치합니다. 삼각형 ABC$의 넓이는 평방 센티미터 단위로 얼마입니까? 답을 공통 분수로 표현하세요. [asy] /* AMC8 2003 #25 문제 / draw((-5, 2.5)--(0,4)--(1,4)--(1,6)--(2,6)--(2,-1)--(1,-1)--(1,1)--(0,1)--cycle); draw((0,0)--(7,0)--(7,5)--(0,5)--cycle); label(scale(.6)"$A$", (-5, 2.5), W); label(scale(.6)"$B$", (0,3.75), SW); label(scale(.6)"$C$", (0,1.25), NW); label(scale(.6)"$Z$", (2,0), SE); label(scale(.6)"$W$", (2,5), NE); label(scale(.6)"$X$", (7,5), N); label(scale(.6)"$Y$", (7,0), S); label(scale(.6)*"$O$", (4.5, 2.5), NE); dot((4.5,2.5)); dot((0,-1.5), white); [/asy]
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 제공하세요.	분야에	이 문제에서는 주어진 텍스트 내의 <MASK>로 표시된 부분에 들어갈 적절한 단어를 예측해야 합니다. <MASK>가 위치한 문장의 전체 문맥을 분석하여, 문장의 나머지 내용과 일관되게 <MASK>에 들어갈 가장 적합한 단어를 답하세요. #텍스트: 일반적으로 자이로스코프 시스템의 전력 소모를 최소화하여 배터리로 움직이는 휴대용 디바이스 응용들에서 자이로스코프 시스템의 사용을 강화하는 것에 관심을 갖는다. 전력 소모를 절감하기 위해 관련 <MASK> 알려진 한가지 방법은 시스템을 듀티 사이클링하는 것이다. 듀티 사이클식 시스템에서, 시스템은 초기에 저전력 작동 모드로 있다. 주기적으로, 그것은 정상 작동 모드로 전이하고, 측정을 행하고, 그 다음 저전력 작동 모드로 복귀한다.자이로스코프 시스템을 듀티 사이클링하는 것의 어려움은 일정 시스템 상태 변수가 시스템 상태의 변화에 매우 느리게 반응한다는 사실에 기인한다. 예를 들어, (AGC 루프에 의해 조절되는) 자이로스코프의 진동의 진폭은 MEMS 진동의 높은 큐 계수로 인해 빠르게 변화될 수 없다. 위상 동기 루프는 비교적 낮은 대역폭을 가질 수도 있으며, 위상 동기 루프가 위상 동기 루프의 VCO 동조 전압에 영향을 주는 임의의 외란(disturbance)에 느리게 반응할 것이라는 것을 의미한다.그러나, 모드 전이와 연관되는 오버헤드를 최소화하고 그것에 의해 듀티 사이클링하는 동안 유지될 수 있는 출력 데이터 속도를 최대화하기 위해 저전력 모드와 정상 작동 모드 사이에서 시스템을 빠르게 전이하는 것이 바람직하다. 본 발명은 그러한 요구를 다룬다.
	제목: 서울 강남권 신혼부부용 소형아파트...‘사당 더원캐슬’ 회사보유분 특별분양 사당역 2호선 인근 입지를 가진 투룸 오피스텔 '사당 더원캐슬'이 분양에 돌입하자마자 투기꾼들의 집중 매수로 인해 즉시 완료됐으나, 최근 회사가 자신의 남은 물량의 일무를 특별분양 할 예정이어서 이에 관심있는 투자자들의 이목을 끌고있다.	주어진 문장에 적절한 제목을 생성하고, 내용을 요약해주세요. 문장: 사당 더원캐슬(조감도) ▶ 여기를 누르시면 크게 보실 수 있습니다 최근 들어 부동산 시장에서 소형 주택에 대한 관심이 높아지고 있는 상황이다. 아파트 가격이 고공행진을 이어가며 비용 부담이 상대적으로 적은 소형 주거용 오피스텔이나 소형아파트가 각광받고 있다. 이는 대형 아파트에 비해 관리비 등 고정적 지출 부담이 적고 1~2인 가구 수요 증가로 환금성에서도 유리하기 때문이다. 오피스텔 분양대행 전문업체 ㈜성공신화 알앤디(R&D) 권성공 대표이사는 "최근 들어 연립주택, 다가구, 다세대등 빌라 건축주들도 오피스텔로 돌아서며 시행사의 분양대행 문의가 많다"며 "대출규제와 더불어 최근 1~2인 가구가 급증하면서 젊은 신혼부부 및 직장인들의 선호도가 높아 투룸 오피스텔이 수요에 비해 공급은 따라가지 못하고 있기 때문"이라고 말한다. 이러한 상황에서 지하철 사당역 2호선, 4호선 더블 역세권 도보 5분 거리에 입지를 갖춘 '사당 더원캐슬' 투룸 오피스텔의 분양에 부동산 투자자들의 관심을 집중시키고 있다. 사당역~이수역 구간은 지하철 2·4·7호선이 교차하는 환승거점이며 사당역에는 광역버스 노선이 많아 유동인구가 하루 17만여 명에 달하는 '교통의 메카'지역이다. 사당동 일대는 재개발 재건축에, 사당역 복합환승센터 개발 호재, 서리풀터널 개통예정 등과 맞물려 서울 남부 중심으로서 기능이 강화될 것으로 전망된다. 사당역 복합환승센터 규모는 지하 9층∼지상 26층으로 전체면적 약 29만㎡ 규모로 건립될 예정이며 다양한 업무ㆍ문화시설이 조성된다. 또한, 상습 정체지역으로 불리는 사당역 사거리의 차량 지체 시간도 감소해 사당역과 이수역 일대 교통난 여건이 획기적으로 개선될 전망이다 서리풀터널은 2019년 4월 개통 되면서며 서초. 강남 테헤란로 일대까지 10분대로 단축시켜 지역 전체가 상생하는효과가 크다. 사당동은 주거수요에 비해 공급이 절대적으로 부족해 소형아파트 희소가치가 매우 높다는 게 업계 안팎의 평가다. 특히, 전매규제를 받지 않고 청약통장도 필요없어 소액으로 투자 가능한 유일한 투자 상품이다. 단지 인근 이마트, 홈플러스, 태평백화점 등 이용이 편리하고 주변에는 서울대학교, 중앙대학교, 교대 등의 최고 교육 시설과 서리풀공원, 까치산공원, 서울시립남서울미술관 등의 문화생활시설이 인접해 있다. 특히 '사당 더원캐슬' 오피스텔은 전매나 시세차액을 노린 투자자들이 대거몰려 선착순 분양 마감했다. 이후 회사보유분 일부 세대를 '특별분양'에 들어갈 예정이어서 기회를 놓친 투자자들은 관심을 가져 볼만하다.
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 원문을 바탕으로 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 생성하세요.	결과적으로, 처리 비용이 그에 따라 증가될 수 있다.	다음 텍스트에서 제공된 문맥을 정확히 이해하고, 마지막 문장을 자연스럽고 문맥에 맞게 완성하세요. 문장은 이전 내용과 논리적으로 연결되어야 합니다. #텍스트: 고순도의 물은 발전소의 고압 보일러, 반도체 소자의 생산, 인쇄회로기판의 생산, 집적회로의 생산, 및 의료용 분사수(injection water)의 생산과 같은 많은 산업 공정에서 널리 사용된다.전형적으로, 연속 작동 및 안정하고 비교적 고품질의 물 제품으로 인하여, 전기 탈이온화(electrodeionization)(EDI) 장치는 예를 들면 순수한 물의 생산을 위한 액체 스트림을 처리하는데 사용되어 왔다. 일반적으로, EDI 장치는 액체 스트림을 처리하기 위하여 내부에 이온 교환 수지가 충진된 통상의 전기투석 시스템을 사용한다. 그러나, 작동하는 도중에, 고농도의 다가 양이온이 스케일링 성향을 유발할 수 있기 때문에, EDI 장치는 처리할 액체 스트림에 대해 경도 허용오차(hardness tolerance)를 갖는다. 예를 들면, EDI 장치의 경도 허용오차는 약 1ppm 미만으로, 액체 스트림이 EDI 장치내로 도입되기 전에 그 안의 경도를 감소시키기 위하여 액체 스트림의 엄격한 전처리를 필요로 할 수 있다.액체 스트림을 전처리하여 그 안의 경도를 감소시키려는 시도가 있어 왔다. 예를 들면, 역삼투압(RO) 장치(reversal osmosis (RO) apparatus)가 사용된다. 그러나, 역삼투 장치의 처리 효율은 EDI 장치에 적합한 특정 수준으로 액체 스트림내의 경도를 감소시키기에는 비교적 낮을 수 있다.
	그러므로 민속, 생활문화, 문화재정책의 강화는 ‘상대적’이다	주어진 문장 뒤에 자연스럽게 이어질 문장을 생성해주세요. 문장: 김정은 집권기의 민족문화정책은 김정일 집권기 후반(2000년대 후반∼김정일 사망)과 유사하지만 차이가 두 가지 있다. 첫째는 <문화유산보호법>(2012)이 특히 무형문화재(비물질문화유산)를 새로운 보호대상으로 설정한 것이다. 비물질문화유산에는 무형문화재라고 할 수 있는 무대예술․예식과 명절행사․민속놀이뿐 아니라 언어․전통과 관습․지식․경험 등 문화영역 전반을 포괄한다. <문화유산보호법>의 내용은 자세하게 알려지지 않았지만 상대적으로 민족적 전통을 강조하는 것으로 보인다. 물론 이것이 북한이 혁명전통을 도외시하는 것을 의미하지는 않는다. 북한에서 혁명전통은 상수(常數)이므로 민족적 전통이 혁명전통을 앞설 수 없다.
	이에 교직 입문 단계부터 수업 능력과 교직에 적합한 인성과 소양을 갖춘 교사를 선발하기 위해 ‘인·적성 요소’ 평가를 강화할 필요성과 대학의 교직 과목 이수 기준을 강화해야 한다는 요구가 대두되어 개선이 이루어진 것이다	주어진 문장 뒤에 자연스럽게 이어질 문장을 생성해주세요. 문장: 기존의 교사 임용시험은 3단계에 걸쳐 장기간 시행됨에 따라 수험생의 학습 부담은 높고 학사 운영상에 어려움을 초래했었다. 이에 따라 선택형으로 치러지는 필기시험의 부적절성을 개선하기 위해 교육공무원 임용후보자 선정경쟁시험의 단계를 줄이는 등의 방안이 마련되었다. 즉 기존의 선택형 필기시험으로 치러졌던 1차 시험은 종합적 이해력이나 사고력보다는 암기 위주의 지식을 평가한다는 문제점이 제기되었다.
	통계청이 발표한 1월 실업자 수는 100만 명을 넘어섰으며 취업 문턱이 높아 구직활동을 아예 포기하면서 실업률이 떨어진 것이라 하니 참담한 상황이며 대학 졸업장을 받자마자 바로 실업자로 전락하는 것은 막아야 한다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 통계청이 어제 발표한 '1월 고용동향'을 보면 1월 실업자 수는 100만9000명으로 100만명을 넘어섰다. 지난해 6월 이후 7개월 만에 다시 100만명을 초과했다. 1월 기준으로는 2010년 이후 최대다. 경기가 부진한 데다 조선·해운 분야 구조조정까지 겹쳤기 때문이라고 한다. 그런데 이보다 더 우려스러운 것은 앞이 보이지 않는 청년실업이다. 청년실업률은 8.6%로 0.9%포인트 하락한 것으로 나타났다. 수치상으로는 실업률이 낮아져 긍정적으로 보일 수 있으나 '착시효과'일 뿐이다. 취업 문턱이 높아 청년들이 구직활동을 아예 포기하면서 실업률이 떨어진 것이라고 하니 참담하다. 청년들이 구직활동을 벌이면서 느끼는 좌절감은 상상을 초월한다. 통계에 포함되지 않는 사실상 실업자도 상당히 많다. 청년들의 체감실업률은 공식 실업률 통계보다 2배 이상 높다. 지난 1월 체감실업률은 22.5%로 지난해 4월 이후 최고다. 지난해 6월 현대경제연구원은 청년 체감실업률이 34.2%에 달한다는 조사결과를 내놓기도 했다. 취업이 안돼 졸업을 미루는 '대학 5년생', 각종 스펙을 쌓고도 정규직으로 채용되지 않아 인턴을 전전하는 '호모인턴스'가 부지기수다. 조선소에서 일하던 20대 청년은 실직 후 굶주림을 견디다 못해 막걸리를 훔치는 사태에 이르렀다. 청년실업은 주요국 가운데서도 두드러진다. 경제협력개발기구 소속 35개국 중 최근 3년간 청년실업률이 매년 상승한 나라는 한국을 포함해 6곳에 불과하다. 일본의 5.2%에 비해서도 훨씬 높다. 한국 청년들의 일자리 얻기가 유독 힘들다는 얘기다. 미래 취업여건은 더욱 암담하다. 앞으로 3~4년간은 최악의 취업난이 빚어질 가능성이 높다고 한다. 역대 최다였던 2010~2014년 사이의 대학 신입생들이 학교를 졸업하고 취업시장에 쏟아질 것으로 예상된다. 그런데 기업들은 채용규모를 줄이고 있다. 실제로 지난해 10월부터 올해 3월까지 300인 이상 기업의 신규 채용 인원은 전년 대비 8.8% 줄었다. 채용 감소는 더욱 심화될 것으로 전망된다. 젊은이들이 대학졸업장을 받자마자 곧바로 실업자로 전락하는 파국은 막아야 한다. 현실과 동떨어진 '탁상행정'이나 '언 발에 오줌 누기'식의 단기 처방으로 이 문제를 해결할 순 없다. 노동시장이 청년 고용을 흡수할 수 있도록 전방위적인 노력을 기울여야 한다. 일자리가 사라지면 미래도 없다.
	제목: 파주서 돼지열병 추가의심 2건, 반경 3㎞ 내 5만 마리...초비상 경기도 파주의 또 다른 2개 농장에서 추가 돼지열병 의심 2건이 접수되었으며 폭우로 살처분 매몰지에서 침출수가 발생하거나 소독약이 씻겨 내려갈 수 있어 초비상이다.	주어진 문장에 적절한 제목을 생성하고, 내용을 요약해주세요. 문장: 주말 폭우땐 소독약 씻길 우려 경북 3곳 거친 연천농장 출입車 6곳 더 다녀갔지만 모두 ‘음성’ 아프리카돼지열병(ASF)이 국내 처음 발생했던 경기도 파주의 또 다른 2개 농장에서 20일 오전 ASF 의심 신고가 접수돼 방역 당국에 초비상이 걸렸다. 반경 3㎞ 이내에 신고 농장을 포함해 5만 마리에 육박하는 돼지가 길러지고 있어 피해가 걷잡을 수 없이 커질 수 있다는 우려가 나온다. 특히 태풍 ‘타파’가 북상 중이어서 자칫 폭우로 살처분 매몰지에서 침출수가 발생하거나 소독약이 씻겨 내려갈 수 있다는 우려가 나오고 있다. 이런 가운데 ASF 발생지역인 경기 연천 농장의 돼지를 경기·인천 도축장으로 옮긴 화물차량이 경북축산기술연구소 등 경북 6개 시설도 다녀간 것으로 추가 확인됐다. 다행히 이들 시설에 대한 방역당국의 ASF 정밀진단검사 결과 모두 ‘음성’인 것으로 나타났다. 20일 경북도에 따르면, 연천 농장은 지난 18일 ASF 확진 판정을 받기 전 3주간 경기·인천 도축장 3곳에 돼지를 출하했다. 당시 연천 농장에서 돼지를 실어나른 차량이 경북지역 도축장 4곳(군위·고령·영천·안동)을 비롯해 영천 한 돼지농장, 경북축산기술연구소(영주) 등 총 6곳을 들렀다. 돼지 2천여 마리를 키우는 영천 농장에는 인천 도축장을 출입한 차량이 지난 3일 방문한 것으로 확인됐다. 이에 따라 도는 영천 농장에 대해 오는 24일까지 이동을 제한하고 소독을 강화하고 있다. ASF 확진 판정 이틀 전인 지난 16일에는 경기 도축장 출입차량이 영종도 검역 계류장에서 덴마크산 종돈 17마리를 싣고 영주에 위치한 축산기술연구소에 들어왔다. 축산기술연구소는 경북형 한우 보증씨수소 개발과 우수 종축 보급을 하는 곳으로, 돼지 212마리와 우량 한우 등을 사육 중이다. 도는 축산기술연구소에 대해 다음 달 7일까지 이동을 통제했다. 경북도는 비록 ASF 바이러스가 발견되지 않았지만 잠복기가 4~21일인 만큼 이동통제 등 차단방역을 강화할 방침이다. 앞서 연천 농장 출입차량이 다녀간 것으로 확인된 칠곡·김천·예천 3곳 농장은 지난 19일 정밀진단검사 결과 모두 이상이 없는 것으로 나타났다. 임호기자 tiger35@yeongnam.com
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 제공하세요.	경제활동에	이 문제에서는 주어진 텍스트 내의 <MASK>로 표시된 부분에 들어갈 적절한 단어를 예측해야 합니다. <MASK>가 위치한 문장의 전체 문맥을 분석하여, 문장의 나머지 내용과 일관되게 <MASK>에 들어갈 가장 적합한 단어를 답하세요. #텍스트: 자유무역지역은 외국인투자 유치와 수출 확대 등을 통한 경제발전을 위하여 특정 지역의 <MASK> 대하여 관세법 등의 적용에서 예외를 인정한 제도를 말한다. 우리나라는 지난 1970년 마산과 이리에 수출자유지역을 설치한 이래 2000년에는 제조업에 국한된 수출자유지역을 교역·물류·유통·서비스 기능을 추가한 자유무역지역으로 전환하였고 2004년 관세자유지역을 통합하여 현재 부산항 등 15개 지역에 자유무역지역을 운영하고 있다. 자유무역지역은 공항만 지역에 설치되는 물류 중심형과 임해지역에 설치되는 산업단지 형이 있지만 근래에는 통합형 지역이 많다. 자유무역지역은 외투유치, 수출증대, 지역경제 활성화 등 다양한 목적을 위하여 세계 각국에서 상이한 이름으로 설치·운영되고 있는데 한 예로 미국 26개, 인도 138개, 중국 15개, 영국 5개, 대만 5개, 싱가포르 5개 등이 있다. 자유무역지역은 비록 국내에 위치하지만 법적으로 관세영역 외의 지역으로 관세법을 적용받지 않고 각종 내국세와 임대료를 감면받는다.
	관세청은 2019광주FINA 세계수영선수권대회에 참가하는 선수와 관광객들의 쇼핑편의를 위해 7월 5일부터 8월 21일까지 48일간 한시적 시내면세점을 설치하기로 하고 최종 사업자를 선정하기 위해 16일 특허신청공고를 했다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 광주본부세관,16일부터 내달 5일까지 접수 예정 박재일 기자 광주세계수영대회 한시적 시내면세점 사업자 모집 광주본부세관,16일부터 내달 5일까지 접수 예정 7월 5일부터 8월 21일 선수촌아파트 안에 설치 관세청은 2019광주FINA(세계수영연맹)세계수영선수권대회에 참가하는 선수와 관광객들의 쇼핑편의를 위해 시내면세점을 한시적으로 설치하기로 하고 16일 관세청 홈페이지를 통해 특허신청공고를 했다. 이에 따라 광주본부세관(세관장 김광호)은이날부터 다음달 5일까지 한시 시내면세점을 운영할 사업자를 모집한다. 시내면세점 운영에 참여할 사업자는 6월 5일까지 관련서류를 구비해 광주본부세관 통관지원과(062-975-8043)에 접수하면 6월 중순 관세청 보세판매장 특허심사위원회에서 최종 사업자를 선정한다. 한시적 시내면세점은 광산구 우산동 선수촌아파트 안에 설치돼 7월 5일부터 8월 21일까지 48일간 운영할 계획이다. 광주전남지역에서 한시적 시내 면세점은 지난 2012여수세계박람회에 이어 두 번째다. 김광호 광주본부세관장은“투명하고 공정한 절차에 따라 사업자가 선정되도록 사업 준비에 필요한 정보를 상세히 안내하겠다”면서 “우리지역 우수기업 제품이 면세점 입점을 통해 해외 판로개척의 통로로 활용되도록 적극 지원할 계획”이라고 말했다. /박재일 기자 jip@namdonews.com 박재일 기자 jip@namdonews.com
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 원문을 바탕으로 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 생성하세요.	일본 특허 공개 제2014-60068호의 연료 전지 시스템에서는, 전해질막의 임피던스를 측정하여 그 측정값에 기초하여 건습 상태를 특정하고, 건조 상태라고 특정된 경우에, 라디에이터 팬을 완전 개방 구동시킴으로써 연료 전지를 통해 순환하는 냉각수를 냉각하여, 연료 전지를 냉각한다.그러나, 건조 상태로 될 때까지 다량의 열이 전해질막에 부여되어 있으면, 건조 상태를 특정하고 나서 연료 전지를 냉각시켰다고 해도, 전해질막의 건조가 진행되어 전해질막의 건조 상태가 장기화된다.	다음 텍스트에서 제공된 문맥을 정확히 이해하고, 마지막 문장을 자연스럽고 문맥에 맞게 완성하세요. 문장은 이전 내용과 논리적으로 연결되어야 합니다. #텍스트: 고체 고분자형 연료 전지 등의 연료 전지에 사용되는 전해질막은, 고습윤 상태에 있어서 높은 발전 성능을 발휘할 수 있다. 이로 인해, 전해질막의 건습 상태를 특정하여, 건조 상태라고 특정된 경우에, 연료 전지를 냉각함으로써 물을 증발시키기 어렵게 하여 전해질막을 습윤시키는 연료 전지 시스템이 있다.
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 원문을 바탕으로 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 생성하세요.	본 연구에서는 영재고와 과학고 R&E 프로그램에서의 문제점을 분석하고, 그 해결방안으로서 첫째, 프로그램 모형과 평가 모형의 결합을 통한 프로그램의 내실화, 둘째, 멘토에 의한 연구 대주제와 멘티에 의한 연구 소주제 선정 단계의 구분, 셋째, 소주제 세미나를 통한 연구 능력 배양, 넷째, 학생 개인별 연구 태도 및 기여도 평가를 도입하여 개별 학생들의 연구 능력 및 창의성 신장과정 파악, 다섯째, 창의적 산출물인 논문의 학술지 게재여부를 평가 항목에 넣어 본래의 교육목적에 부합하는 멘토십 프로그램 모형을 개발하였다.	다음 텍스트에서 제공된 문맥을 정확히 이해하고, 마지막 문장을 자연스럽고 문맥에 맞게 완성하세요. 문장은 이전 내용과 논리적으로 연결되어야 합니다. #텍스트: R&E가 연구자로서의 경험과 창의성 신장을 교육 목적으로 하고 있음에도 불구하고 결과보고서와 발표 평가만으로 마무리하는 것은 목적을 충분히 달성했다고 볼 수 없다. 모든 프로그램에서 학문적으로 의미 있는 논문을 쓰고 학술지에 게재할 수 있는 것은 아니지만, 관련 학술지에 논문 투고를 의무화하거나 아니면 R&E 평가 가산점 항목으로 명시하게 되면 논문작성, 투고, 평가, 논문 게재의 과정을 거치면서 본래의 목적에 근접하게 될 것이라 판단된다.
	로켓이나 미사일이 물속에서 발사되어 물밖으로 나올 때는 계속 분사를 하여 속도를 높일 수 있습니다. 하지만 총알은 처음 발사될 때 발사체에 주어진 에너지 외에 추가로 에너지를 받을 수 없습니다. 따라서, 총알은 발사될 때 주어진 초기 속도와 물속의 저항력에 의해 처음 속도보다 낮아질 것입니다. 또한, 물속에서 발사된 총알은 수영선의 원리 때문에 일정한 각도로 굽어질 가능성이 있습니다. 그리고, 총알의 구조와 속도에 따라 물과 충돌할 때 수면에서 튀어오르거나, 그대로 수면 위로 떠오르거나, 또는 수면 아래로 가라앉을 수 있습니다. 추가 설명 총알은 처음 발사될 때 발사체에 주어진 에너지에 의해 움직입니다. 그 이후에는 총알이 진행하는 방향과 반대 방향으로 저항이 작용하게 되어 에너지를 빼앗아가게 됩니다. 이렇게 알짜 에너지를 잃은 총알은 처음 속도보다 느려져 일정 거리를 움직입니다. 그리고 저항이 다시 작용하면 결과적으로 총알은 멈추는 순간이 오게 됩니다.	물속에서 총을 발사하면 속도에 어떤 변화가 생길까요? 물속에서 발사한 총알이 수면 위로 나온 후, 속도는 변화할까요? 총알이 물속에서 발사될 때와 물밖에서 총을 발사했을 때의 속도 차이에 대해서도 궁금합니다.
	특히, 보행자와 고령자에 대한 교통사고율이 가장 높은 상황이며, 이를 해소하기 위한 교통안전 법규를 자동차 중심에서 보행자 중심으로 변경하는 대안적 법제를 검토할 필요가 있다	주어진 문장 뒤에 자연스럽게 이어질 문장을 생성해주세요. 문장: 현재 교통안전 선행연구(설재훈 외, 1990, 2012; 성낙문, 2004; 강동수, 2012a; 모창환 외, 2013; 삼성교통문화연구소, 2008)는 우리나라의 교통안전법체계가 자동차 중심으로 되어 있어 OECD 국가 중 가장 높은 보행교통사고율을 나타내는 원인 중 하나로 지목하고 있다. 또한 ITF(2012)와 Pucher and Dijkstra(2003)도 보행자의 보행권과 도로이용의 형평성을 개선하는 교통규제의 개정과 단속을 통해 보행교통사고를 감소시킬 수 있다고 지적하고 있다.
	제목: 내 일자리는 어디에 하반기 기업 공채가 진행되고 있지만 취업문이 너무나 좁은 구직의 길은 정말 힘들고 멀어 보입니다.	주어진 문장에 적절한 제목을 생성하고, 내용을 요약해주세요. 문장: 하반기 기업 공채가 한창입니다. 올해는 지난해보다 6% 늘어난 1만6000여명을 뽑는다고 합니다. 그러나 구직자 수에 비하면 취업문은 여전히 바늘구멍입니다. 분당 잡월드에서 열린 '청년 20만 + 창조일자리 박람회'의 한 장면입니다. 이력서를 접수하고, 면접까지 한자리에서 해결할 수 있어 구직자들로 붐볐습니다. 면접을 앞둔 한 여성 구직자가 난간에 기대 서서 준비한 인터뷰 내용을 외우고 있습니다. 박람회 한 켠에 '합격 부적'까지 등장했습니다. 구직의 길은 참 멀고도 험해 보입니다.
	9일 이탈리아 살레르노에서 열린 2019 나폴리 하계유니버시아드 대회에서 호남대 전수인·김정미가 펜싱 사브르 단체전에서 동메달, 수영 혼성종목에서 이재경(광주시체육회)이 동메달을 각각 획득하며 선전을 펼쳤다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 호남대 전수인·김정미 펜싱 동메달 광주체육회 이재경 다이빙 은·동 U대회 펜싱 여자 사브르 단체전서 동메달을 딴 호남대 김정미(왼쪽)와 전수인 광주 선수들이 나폴리 하계유니버시아드 대회에서 선전하고 있다. 호남대 전수인·김정미 등 4명으로 구성된 여자 사브르 대표팀은 9일(현지시간) 이탈리아 살레르노에서 열린 2019 나폴리 하계유니버시아드 펜싱 마지막 날 경기에서 여자 사브르 단체전 동메달을 추가했다. 전수인은 개인전에 이어 단체전에서도 동메달을 획득, ‘동메달 2관왕’에 올랐다. 전수인·김정미, 홍하은(서울특별시청), 고채영(경북체육회 독도스포츠단)이 나선 여자 사브르 대표팀은 이탈리아, 프랑스에 이어 3위에 올랐다. 남자 플뢰레 단체전에서도 은메달이 나왔다. 서명철, 최민서(한국체대), 서정민(대구대), 장효민(울산광역시청)으로 구성된 남자 플뢰레 대표팀은 개최국 이탈리아에 이어 준우승했다. 이로써 한국은 이번 대회 금메달 3개, 은메달 1개, 동메달 3개를 획득, 처음으로 한 대회 금메달 3개 이상을 따내며 가장 좋은 성적을 거뒀다. 남자 사브르에서 세계 정상급 기량을 자랑하는 오상욱(성남시청)을 앞세워 개인·단체전을 석권했고, 남자 에페 대표팀도 우승을 차지했다. 남자 플뢰레 단체전에서 은메달, 여자 사브르 개인(전수인)·단체전과 남자 에페(장효민) 개인전에서 동메달이 나왔다. 수영 혼성종목에서 이재경(광주시체육회)은 동메달을 합작했다. 이재경-조은비는 8일(현지시간) 다이빙 종목 마지막 날 혼성 팀 경기에서 357.20점을 받아 중국(381.80점), 멕시코(358.80점) 조에 이어 3위에 올랐다. 멕시코 조와는 불과 1.60점 차였다. 두 선수가 같이 뛰는 싱크로 종목과 달리, 팀 경기는 남녀 한 명씩 조를 이뤄 따로 3번씩 다이빙한다. 3m 스프링보드와 10ｍ 플랫폼을 섞어 시도해야 하며, 두 선수의 6차 시기 합계로 최종 승부를 가른다. 조은비와 이재경은 앞서 개인전인 여자 10m 플랫폼과 남자 3m 스프링보드에서 각각 은메달을 획득한 바 있다. 우리나라는 이번 대회 여자부에서 총 2278.07점을 받아 중국(2713.89점), 멕시코(2472.16점)에 이어 종합 3위에 올랐다. 메달은 총 5개(은2, 동3개)를 획득했고, 이 가운데 조은비가 4개(은1, 동3개)를 수확했다. /윤영기 기자 penfoot@kwangju.co.kr
	울산 중구청은 오는 17일 울산동헌과 내아에서 생생문화재 사업이면서 울산 동헌의 문화콘텐츠를 창조하는 프로그램인 '동헌씨의 품격2'의 첫 프로그램으로 문화체험 프로그램을 운영하며 오는 11월까지 일반 주민을 대상으로 프로그램을 제공한다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 고은정 기자 중구, 2019년 생생문화재 ‘동헌 씨의 품격2' 울산동헌 문화? 놀이체험…17일~11월까지 중구청은 오는 17일 울산동헌과 내아에서 2019년 생생문화재 사업인 '동헌씨의 품격2'의 첫 프로그램으로 문화체험 프로그램을 운영한다. '동헌씨의 품격2' 포스터 이미지. 울산 중구청이 지난해에 이어 올해도 울산유형문화재 제1호인 ‘울산동헌'을 활용해 다양한 체험프로그램을 운영한다. 중구청은 오는 17일 울산동헌과 내아에서 2019년 생생문화재 사업인 ‘동헌 씨의 품격2'의 첫 프로그램으로 문화체험프로그램을 운영한다고 7일 밝혔다. ‘동헌 씨의 품격2'는 문화재청 공모사업으로 선정된 생생문화재 사업의 일환으로 울산의 대표적인 문화재인 동헌의 가치와 의미를 발견하고, 문화콘텐츠를 새롭게 창조하는 체험프로그램이다. 오는 11월까지 학생과 가족, 일반 주민 등을 대상으로 한 이 사업은 지난해 처음 시작한 이후 올해 집중육성형 2년차로, 울산동헌의 격을 올리는 문화와 놀이, 체험 등으로 운영된다. 프로그램은 ‘동헌 씨의 체(體)격-동헌씨 퇴근합시다'와 ‘동헌 씨의 성(城)격', ‘동헌 씨의 인(人)격', ‘동헌 씨의 간(間)격' 등 모두 4개로 운영될 예정이다. 오는 17일과 10월 20일 모두 2차례 진행되는 ‘동헌 씨의 체(體)격'은 울산도호부사의 7가지 임무인 수령칠사를 수행하고, 이를 완료하면 퇴근하는 역사문화놀이 프로그램으로 초등학교 자녀와 학부모가 한 팀이 돼 참여할 수 있다. 4월부터 10월까지 18차례에 걸쳐 운영되는 ‘동헌 씨의 성(城)격'은 초등학교 4~6학년 학생들 대상으로 동헌과 울산읍성길을 연계해 ‘어린이 해설사'를 양성하고, 이들이 직접 해설을 시연하는 프로그램이다. ‘동헌 씨의 인(人)격'은 지역 어르신들을 위한 인문 공연으로 오는 9월과 11월 2차례 운영되며, 6월 중에 1차례 계획 중인 ‘동헌 씨의 간(間)격'은 직장인과 그 가족이 동헌에서 공연을 통해 일탈을 즐길 수 있도록 해 줄 계획이다. 참가를 원하는 주민이나 학생, 학교, 직장인은 중구청 문화관광과(052-290-3654)로 문의하면 된다.
	제목: 대구시, 맞춤형 기업지원으로 해외시장 개척 28일 인터불고 엑스코에서 대구시와 대구·경북코트라 지원단이 맞춤형 기업 지원으로 해외시장을 개척하기 위해 ‘일본 유력 소비재 바이어 초청 수출상담회’를 개최하며 일본 대형 온오프라인 유통망에 소비재를 납품 중인 17개 판매사를 초대해 지역 소비재 기업과 1대1 미팅을 진행한다.	주어진 문장에 적절한 제목을 생성하고, 내용을 요약해주세요. 문장: 17개사 일본 소비재 바이어와 수출상담회 개최 대구·경북 지역 53개사와 1:1 미팅 형식으로 진행 대구시와 대구·경북코트라 지원단이 28일 인터불고 엑스코에서 ‘일본 유력 소비재 바이어 초청 수출상담회’를 개최한다. 맞춤형 기업 지원으로 해외시장을 개척하기 위해서다. 일본 대형 온오프라인 유통망에 소비재를 납품 중인 17개 판매사를 초청해 지역 소비재 기업(대구 28개 사, 경북 25개 사)과 1대1 미팅을 한다. 또 코트라(KOTRA) 전문위원이 현장에서 수출관련 상담도 실시한다. 이번 소비재 수출상담회는 지난 2월 기업애로해결박람회와 연계한 수출상담회 및 5월 중국 베이징·창사 유통벤더 초청 수출상담회에 이어 올해 세 번째로 열리는 수출 지원 행사다. 기업들이 해외에 직접 나가지 않고 현지의 시장성을 가늠해 볼 수 있는 기회로 지역 기업인들의 참여도가 높다. 이번 상담회에는 일본 주요 도시(나고야 3개 사, 도쿄 7개 사, 후쿠오카 5개 사, 오사카 2개 사)의 유통판매사 바이어가 참가한다. 참가 바이어 중 도쿄의 ‘케이엠케이(KMK)’는 생활잡화와 주방용품 등을 취급하는 업체다. 이 업체는 한국의 다양한 아이디어 제품을 일본에 소개하고자 거래처를 발굴 중이라며 상담회 참여 의사를 밝혔다. ‘에스와이디 크리에이트(SYD CREATE)’는 헬스 관련 소비재를 취급하는 기업으로 한국의 우수한 미용제품을 수입해 자사의 취급품목을 확대하고자 참여한다. 지역에서는 안경테, 섬유제품 등을 비롯해 화장품, 소형 가전제품, 헤어용품 등 다양한 제품을 취급하는 기업이 참여 신청을 했다. 특히 디지털 헬스케어 제품 생산업체 ‘휴원트’, 가정용 미용기기 생산업체 ‘알앤유’ 등은 바이어들의 많은 관심을 받고 있다. 이동률 기자 leedr@idaegu.com
	1990년대 후반 외환위기, 2000년 후반 금융위기를 경험하면서 남성=경제적부양자, 여성=가사담당자･돌봄자에 기반을 둔 일부일처제 가족을 유지시켜주던 경제적 기반이 와해되었다는 것은 주지의 사실이다. 저출산과 젊은층의 결혼 기피･지연, 1인가구의 증가, 높은 이혼율은 이를 단적으로 보여주는 지표이다. 사랑하는 사람과 결혼하고 성관계를 맺고, 가족을 형성하여 일평생을 살아갈 수 있도록 하는 물질적 기반은 빠르게 침식되었다. 성-사랑-결혼-가족의 통합적 또는 연쇄적 관계는 해체되고 이들의 관계는 약화되고 있다. 사랑하지 않아도 성관계를 맺을 수 있고, 사랑한다고 결혼하는 것은 아니며, 한 번 결혼했다고 영원을 약속하는 관계를 기대하는 이들은 점점 줄어들고 있다. 이처럼 성-사랑-결혼-가족의 현실과 규범이 변화하고 있으므로 혼외 성관계를 둘러싼 도덕적 판단의 준거, 혼외 성관계가 가족 구성원 및 가족관계에 대해 제기하는 문제는 더욱 다양하고 복잡해 질 것으로 보인다.	주어진 제목과 요약문에 대한 정보를 토대로, 요약되기 전 문장을 유추해서 생성해주세요. 제목: 가족정책관점에서 본 간통죄 폐지의 의미와 향후 정책방안 연구 요약문: 외환위기와 금융위기를 거치면서 기존의 가족질서를 유지하던 경제적 기반이 무너지고 성-사랑-결혼-가족의 현실과 규범의 변화를 불러왔다. 이런 양상 속에서 혼외 성관계에 대한 판단 기준과 야기되는 문제점은 복잡다단해 질 것으로 보인다.
	핀과 제이크의 어드벤처 타임 시즌 6은 미국 카툰 네트워크에서 방영된 애니메이션 시리즈로, 프레드레이터 스튜디오가 제작하고 닉툰스가 방영한 랜덤! 카툰스의 단편 애니메이션을 바탕으로 합니다. 이 시즌은 2014년 4월 21일에 시작하여 2015년 6월 5일에 끝납니다. 이 작품은 종말 이후의 세상인 우 랜드에서 살고 있는 인간 소년 핀과 마법의 힘으로 몸의 크기와 모양을 자유자재로 변화시킬 수 있는 개 제이크의 모험을 다루고 있습니다. 주요 등장인물로는 버블검 공주, 얼음 대왕, 뱀파이어 여왕 마르셀린 등이 있습니다. 에피소드의 줄거리는 핀과 제이크가 이상한 생명체를 조사하거나, 얼음대왕으로부터 공주들을 보호하고, 다른 이들을 돕기 위해 괴물들을 무찌르는 이야기입니다. 이 시즌은 2013년 1월 28일에 카툰 네트워크에서 방영 재개 계획을 발표했으며, 제시 모이니한이 여섯 번째 시즌의 제작을 시작했습니다. 에피소드 제작에는 앤디 리스타이노, 콜 산체스, 톰 허피치, 스티브 울프하드, 수 킴, 솜빌레이 제이어폰, 그레이엄 포크, 데릭 발라드, 제시 모이니한, 유아사 마사아키, 애덤 무토, 켄트 오즈본, 에밀리 파트리지, 윤대주, 매들린 플로레스, 질리안 타마키, 샘 올던, 슬론 렁, 브랜던 그레이엄, 데이비 스와파즈, 폴리 구오, 제네바 호지슨 등이 참여했습니다. 윤대주는 첫 번째, 세 번째, 네 번째 시즌의 제작에 참여했으며, 여섯 번째 시즌 제작 도중에는 애덤 무토가 도움을 주었습니다. 이번 시즌이 끝나면 앤디 리스타이노는 작품을 떠날 예정이지만, 프리랜서로 가끔 참여할 생각은 있습니다.	핀과 제이크의 어드벤처 타임 시즌 6의 방영 일정은 어떻게 되나요?
	본 발명은 형질전환 쌀 알곡으로부터 인간 혈청 알부민을 정제하는 방법을 제공하며, 다음 단계를 포함한다: 1) rHSA의 미정제 추출물에 양이온 교환 크로마토그래피를 실행하여 1차 생성물 I을 얻는 단계; 2) 1차 생성물 I에 음이온 교환 크로마토그래피를 실행하여 2차 생성물 II를 얻는 단계; 3) 2차 생성물 II에 소수성 크로마토그래피를 실행하여 정제된 rHSA를 얻는 단계. 상기 방법은 소수성 크로마토그래피 이전에 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피의 단계를 더 포함할 수 있다.	주어진 문장을 읽고 간략하게 요약해주세요. 문장: [ 발명의 명칭 ] 형질전환 쌀 알곡으로부터 인간 혈청 알부민을 정제하는 방법Method for Purifying Human Serum Albumin from Transgenic Rice Grain [ 기술분야 ] 본 발명은 바이오기술 분야에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 형질전환 쌀 알곡으로부터 재조합 인간 혈청 알부민(rHSA)을 대용량으로 분리하고 정제하는 방법에 관한 것이다. [ 배경기술 ] 인간 혈청 알부민(HSA)은 585개 아미노산으로 이루어지고, 66.5kD의 분자량과 4.7~4.9 사이의 등전점을 가지는 단일 사슬이며, 비-당화 단백질이다. 이는 인간 혈장에서 가장 풍부한 단백질이며, 전체 혈장 단백질의 약 60%를 차지한다. 인간 혈액의 리터당 약 40g의 HSA가 존재한다. 혈장에 존재하는 것을 제외하고, HSA는 또한 조직 및 신체 분비물, 피부 및 림프강에서 발견된다. 정상적인 생리학적 조건하에서, HSA는 혈장 콜로이드 삼투압을 유지하고, 영양분을 제공하고, 상처의 합생을 촉진하고, 담체로서, 혈액에 있는 호르몬, 생물학적 활성 물질 및 약물과 같은 여러 소수성 생물학적 분자의 수송에 참여하는 효과를 가진다. 따라서, HSA는 혈액의 손실, 불에 의한 화상, 물에 의한 화상, 성형수술 및 뇌손상에 의해 유발된 저단백혈증의 치료뿐만 아니라 간경변, 수신증 등의 치료에 임상적으로 주로 사용되는 중요 의학적 단백질이다.현재, 임상적 용도의 HSA는 인간 혈장의 추출과 분리에 의해 주로 제조된다. 그러나, 이런 제조 방법은 다음 단점을 가진다: 한편으론, 혈장의 원료가 불충분한데, 즉 제한된 혈액 공급은 HSA 및 이의 관련 조합제의 생산 요구를 충족할 수 없으며; 다른 한편으론, 혈액 자체가 잠재적으로 위험 인자가 될 수 있는데, 예를 들어, 혈액은 간염 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 등과 같은 위험한 감염성 병원균을 포함할 수 있으며, 이는 혈장으로부터 추출된 HSA의 사용에 관해 커다란 우려를 일으킨다. 따라서, HSA를 생산하는 다른 방법을 개발하는 것이 시급하다.현대 DNA 재조합 및 합성 기술의 발전에 의해, 연구자들은 재조합 인간 혈청 알부민(rHSA)의 생산과 사용에 현저한 관심을 가진다. 지금까지, 다양한 발현 시스템이 rHSA의 대량 생산에 실험적으로 사용되었다. 예를 들어, 대장균(colon bacillus)(Latta, M. et al., Bio/Technology, 5:1309-1314, (1987)), 고초균(bacillus subtilis)(Saunders, C. W. et al, J. Bacteriol. 169: 2917-2925, (1987))과 같은 원핵생물, 효모(WO 00/44772, EP0683233A2, US 5612196)와 같은 진핵생물 및 또한 동물 세포의 배양이 rHSA의 생산에 사용되었다. 그러나, 이런 방법은 낮은 발현 수준 또는 높은 생산 비용 때문에 산업적 생산에 적합하지 않다.본 발명자들의 중국특허출원 No.200510019084.4는 생체반응기로서 쌀 배젖 세포를 사용하는 rHSA를 생산하는 방법을 개시하며, rHSA의 쌀의 배젖 세포의 내막계 속으로의 진입을 매개하고 쌀 배젖의 단백질체에 rHSA를 저장하기 위해 쌀 배젖에서 특이적으로 발현된 프로모터 및 신호 펩타이드를 사용하여, rHSA가 쌀 씨에 막대하게 축적되어 최종적으로 높은 발현 수준에 도달하게 하는 단계를 포함한다. 얻은 rHSA의 발현 수준은 쌀 알곡의 중량을 기초로 적어도 0.3% 이상이다. 상기 방법은 높은 발현 수준과 낮은 비용의 이점을 가지며, 따라서 단백질 약물의 생산을 위한 새로운 전략을 개발할 가능성을 제공한다.임의의 발현 시스템에 의해 생산된 rHSA는 시장에 들어오기 전에 정제돼야 한다. 정제 기술은 제품의 품질뿐만 아니라 생산 비용에 영향을 미칠 수 있다. 정제 방법의 비용은 전체 생산 비용의 약 80~90%를 차지한다. 현재, 쌀 알곡으로부터 rHSA를 분리하고 정제하기 위한 정제 방법이 존재하지 않는다. 따라서, 본 발명은 쌀 알곡으로부터 rHSA를 정제하기 위한 단순하고 비용 효과적인 정제 방법을 개발하는 것은 기술적으로 어렵고 경제적으로 위험하다. [ 발명의 개요 ] [ 해결하려는 과제 ] 현재, 효모 및 식물 현탁 세포로부터 rHSA를 추출하기 위한 기술들이 보고되었다. 예를 들어, 중국특허출원 CN101768206A는 효모(Pichia pastoris)에서 발현된 rHSA를 정제하기 위한 방법을 개시하였고, rHSA의 발효액을 세라믹 막으로 여과하고 뒤이어 여과물에 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 및 약한 음이온 교환 크로마토그래피를 실행하여 정제된 rHSA를 얻는 단계를 포함한다. 그러나, 쌀 알곡, 효모 및 식물 현탁 세포들 사이에 불순물들의 상당한 차이 때문에, 이런 종래기술은 쌀 알곡으로부터 rHSA를 분리하고 정제하는데 바로 사용될 수 없다. 따라서, 쌀 알곡으로부터 rHSA를 분리하고 정제하여 높은 수율과 높은 순도로 rHSA를 생산하기 위한 단순하고 효과적인 방법을 개발하는 것이 바람직하며, 이것이 미래의 산업화 생산을 위한 기초를 제공할 것이다. [ 과제의 해결 수단 ] 본 발명의 목적은 형질전환 쌀 알곡으로부터 재조합 인간 혈청 알부민(rHSA)을 대용량으로 분리하고 정제하는 방법을 제공하는 것이다.상기 목적을 성취하기 위해서, 본 발명은 다음 기술적 해결책을 제공한다.형질전환 쌀 알곡으로부터 재조합 인간 혈청 알부민(rHSA)을 분리하고 정제하는 방법은 연속적으로 다음 단계를 포함한다:1) 재조합 인간 혈청 알부민의 미정제 추출물에 양이온 교환 크로마토그래피를 실행하여 1차 생성물 I을 얻는 단계;2) 1차 생성물 I에 음이온 교환 크로마토그래피를 실행하여 2차 생성물 II를 얻는 단계;3) 2차 생성물 II에 소수성 크로마토그래피를 실행하여 정제된 재조합 인간 혈청 알부민을 얻는 단계.단계 1)에서, 양이온 교환 크로마토그래피는 크로마토그래피 매질로서 UNO 스피어(Sphere) S, 누비아(Nuvia) S, 캡토(Capto) MMC, MacroPrep-CM으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 강한 양이온 크로마토그래피 수지상에서 실행될 수 있다. UNO 스피어 S 또는 캡토 MMC가 바람직하다.양이온 교환 크로마토그래피는 pH 구배 용출(gradient elution) 또는 NaCl 농도 구배 용출을 사용할 수 있다. pH 구배 용출이 바람직하다.한 실시태양에서, 양이온 교환 크로마토그래피용 용출 버퍼는 아세트산염 버퍼, 0.25M 염화나트륨을 포함하며 5.2의 pH를 가진다.단계 2)에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 크로마토그래피 매질로서 UNO 스피어 Q, Q 세파로스 FF 및 DEAE 세파로스 FF로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 강한 음이온 크로마토그래피 수지상에서 실행될 수 있다. Q 세파로스 FF가 바람직하다.한 실시태양에서, 음이온 교환 크로마토그래피용 용출 버퍼는 인산염 버퍼, 0.2M 염화나트륨을 포함하며 7.5의 pH를 가진다.단계 3)에서, 소수성 크로마토그래피는 페닐 세파로스 HP, 페닐 세파로스 FF, macro-prep t-부틸 및 macro-prep 메틸로 이루어진 그룹으로부터 선택된 크로마토그래피 매질 상에서 실행될 수 있다. 페닐 세파로스 HP가 바람직하다.소수성 크로마토그래피 컬럼으로부터의 표적 단백질을 포함하는 용출액은 울트라-여과 농축 및 동결 건조와 같은 공지된 기술에 의해 최종 제품으로 제조될 수 있다.또한, 상기 방법은 상기 단계 3)의 소수성 크로마토그래피 이전에 2차 생성물 II에 Macro-prep 세라믹 수산화인회석(hydroxyapatite) 크로마토그래피를 실행하는 단계를 포함할 수 있다. 즉, 이런 실시태양에서, 표적 단백질을 포함하는 2차 생성물은 단계 3)으로서 Macro-prep 세라믹 수산회인회석 크로마토그래피를 거친 후 단계 4)로서 소수성 크로마토그래피를 거쳐 정제된 표적 단백질을 얻었다.세라믹 수산화인회석 크로마토그래피는 Macro-prep 세라믹 수산회인회석 타입 I 및 Macro-prep 세라믹 수산회인회석 타입 II로 이루어진 그룹으로부터 선택된 크로마토그래피 매질 상에서 실행될 수 있다. Macro-prep 세라믹 수산화인회석 타입 I이 바람직하다.한 실시태양에서, 양이온 교환 크로마토그래피에 사용된 로딩 버퍼는 아세트산염 버퍼를 포함하며, 5.0 미만의 pH를 가진다.양이온 교환 크로마토그래피에 사용된 표적 단백질을 용출하기 위한 용출 버퍼는 아세트산염 버퍼 및 염화나트륨 또는 인산염 버퍼 및 염화나트륨을 포함할 수 있고, 5.0~6.7의 pH를 가진다. 바람직하게는 염화나트륨의 농도는 0.25M이며 용출 버퍼의 pH는 5.2이다.한 실시태양에서, 양이온 교환 크로마토그래피는 UNO 스피어 S 또는 캡토 MMC 상에서 실행되며 아세트산염 버퍼, 0.25M 염화나트륨을 포함하며, 5.2의 pH를 가진 용출 버퍼가 사용된다.한 실시태양에서, 양이온 교환 크로마토그래피는 크로마토그래피 매질로서 누비아 S 상에서 실행되며 아세트산염 버퍼, 0.25M 염화나트륨를 포함하며, 5.0 또는 5.2의 pH를 가진 용출 버퍼가 사용된다.한 실시태양에서, 양이온 교환 크로마토그래피는 크로마토그래피 매질로서 캡토 MMC 상에서 실행되며, 아세트산염 버퍼, 1M 염화나트륨을 포함하며 4.7의 pH를 가진 세척 버퍼가 불순물들을 제거하는데 사용되며; 인산염 버퍼, 1M 염화나트륨을 포함하며 6.7의 pH를 가진 용출 버퍼가 표적 단백질들을 용출하는데 사용된다.한 실시태양에서, 양이온 교환 크로마토그래피는 크로마토그래피 매질로서 MaccroPrep-CM 상에서 실행되며, 아세트산염 버퍼, 1M 염화나트륨을 포함하며 4.7의 pH를 가진 세척 버퍼가 불순물들을 제거하는데 사용되며; 인산염 버퍼, 0.1M 염화나트륨을 포함하며 6.5의 pH를 가진 용출 버퍼가 표적 단백질들을 용출하는데 사용된다.한 실시태양에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 크로마토그래피 매질로서 Q 세파로스 FF 상에서 실행되며, 인산염 버퍼, 0.25M 염화나트륨을 포함하며 6.0~7.0의 pH를 가진 용출 버퍼가 사용된다.한 실시태양에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 크로마토그래피 매질로서 DEAE 세파로스 FF 상에서 실행되며, 인산염 버퍼, 0.1M 염화나트륨을 포함하며 6.0~7.0의 pH를 가진 세척 버퍼가 불순물들을 제거하는데 사용되며; 인산염 버퍼, 0.25M 염화나트륨을 포함하며 6.0~7.0의 pH를 가진 용출 버퍼가 표적 단백질들을 용출하는데 사용된다.한 실시태양에서, 소수성 크로마토그래피에 의해 정제될 rHSA-포함 분획은 황산 암모늄을 더 포함할 수 있다. 황산 암모늄의 농도는 0.1M 내지 1M일 수 있다. 한 실시태양에서, 소수성 크로마토그래피는 크로마토그래피 매질로서 페닐 세파로스 HP 상에서 실행되며, 정제될 rHSA-포함 분획에서 황산 암모늄의 농도는 0.4M이다.한 실시태양에서, 소수성 크로마토그래피는 크로마토그래피 매질로서 페닐 세파로스 FF 상에서 실행되며, 정제될 rHSA-포함 분획에서 황산 암모늄의 농도는 0.1M이다.한 실시태양에서, 소수성 크로마토그래피는 크로마토그래피 매질로서 MacroPrep-t-부틸 상에서 실행되며, 정제될 rHSA-포함 분획에서 황산 암모늄의 농도는 0.6M 내지 1.0M이다.한 실시태양에서, Macro-prep 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피는 7.0~7.5의 pH를 가진 인산염 버퍼를 포함하는 용출 버퍼를 사용하여 표적 단백질을 용출한다.본 발명의 상기 rHSA는 본 출원인에 의해 출원된 중국특허출원 No. 200510019084.4에 개시된 생체반응기로서 쌀의 배젖 세포를 사용하여 제조될 수 있다. 형질전환 쌀에서 발현된 rHSA는 본 출원인에 의해 출원된 중국특허출원 No. 201010597544.2에 개시된 방법에 의해 추출될 수 있으며, 바람직하게는 다음 단계를 포함한다:i) rHSA를 포함하는 제분된 형질전환 쌀을 추출 버퍼와 1:5의 w/v(kg/l) 비율로 혼합하고, 1~1.5시간 동안 55~60℃에서 추출하여 혼합물 I를 얻는 단계; 추출 버퍼는 10~30mM 인산염 버퍼, 10~20mM 아세트산 나트륨, 15~30mM 황산 암모늄 및 5~20mM 카프릴산 나트륨을 포함하며 6.5~8의 pH를 가진다;ii) 단계 i)의 혼합물 I의 pH를 4.0~4.5로 조절하고 이를 3~12시간 동안 침전하여 혼합물 II를 얻는 단계;iii) 단계 ii)의 혼합물 II를 여과하여 전분 또는 비-표적 단백질을 제거한 후 여과물을 수집하여 고농도의 rHSA를 포함하는 미정제 추출물을 얻는 단계.한 실시태양에서, 상기 여과는 필터 천 형태 플레이트-프레임 프레스 필터에 의한 압력 여과에 의한 여과 후, 폴리에터설폰 속 빈 섬유막을 사용하는 미세 여과에 의한 여과 단계를 포함한다. 상기 속 빈 섬유막은 0.20㎛~0.45㎛, 바람직하게는 0.22㎛의 구멍 크기를 가진다. [ 발명의 효과 ] 본 발명의 기술적 해결책은 다음 이점을 가진다:1. 쌀 알곡에서 비교적 높은 함량의 안료 및 폴리사카라이드에 대해서, 본 발명에서 제 1 단계로서 양이온 교환 크로마토그래피가 사용되어 rHSA를 포획하거나 결합하는 로딩 용량을 효과적으로 향상시키며, 이것이 크로마토그래픽 효율을 증가시킨다. 반대로, 제 1 단계로서 음이온 교환 크로마토그래피가 사용된 경우, rHSA를 포획하는 로딩 용량은 이론적 용량의 단지 약 20%이다. 한편, UNO 스피어 S 및 캡토-MMC는 수산화나트륨에서도 뛰어난 안정성과 긴 수명의 특징을 가지며, 이것이 크로마토그래피 매질의 저하 기간을 연장하며 본 발명에서 살균 작업을 단순화하며, 마지막으로 표적 단백질의 비용을 감소시킨다.2. 음이온 교환 크로마토그래피가 본 발명에서 제 2 단계로 사용된다. 용출 조건을 최적화한 후, 쌀 알곡에서 비-표적 단백질의 80% 이상이 제거될 수 있어서, 효과적으로 비-표적 단백질을 제거하고 rHSA를 회수한다. 안료 및 폴리사카라이드가 제 1 단계에서 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 쌀 알곡으로부터 제거되었기 때문에, 음이온 교환 크로마토그래피에서 로딩 용량과 정제 효율에 대한 이들의 영향이 제거되었다.3. Macro-prep 세라믹 수산회인회석 크로마토그래피가 본 발명에서 제 3 단계로서 사용되어 다이머 및 폴리머를 제거하는데 rHSA가 주사약으로 사용될 때 많은 다이머 또는 폴리머가 알레르기 반응을 일으킬 수 있기 때문이다. 이 단계는 순도를 현저하게 개선하여 임상적 응용분야 등을 위한 높은 순도의 필요조건을 충족한다.4. 소수성 크로마토그래피가 본 발명에서 최종 단계로 사용된다. 3단계 크로마토그래피 절차 이후, 표적 생성물의 HPLC 순도는 약 99.0%에 도달할 수 있다. [ 도면의 간단한 설명 ] 도 1은 1차 정제로서 상이한 크로마토그래피 상에서 실행된 양이온 교환 크로마토그래피로부터 얻은 분획들의 SDS-PAGE의 이미지이며, A: UNO 스피어 S 매질, B: 누비아 S 매질, C: 캡토 MMC 매질 및 D: MacroPrep-CM 매질.도 2는 상이한 유속(300cm/h, 600cm/h)에서 누비아 S 매질 및 UNO 스피어 S 매질 사이의 rHSA 추출물에 대한 로딩 용량(부피)의 비교 그래프를 도시한다.도 3은 1차 정제로서 상이한 크로마토그래피 상에서 실행된 음이온 교환 크로마토그래피로부터 얻은 분획들의 SDS-PAGE의 이미지이며, A: UNO 스피어 Q 매질, B: 세파로스 FF 매질.도 4는 투석 이전 또는 이후 Q 세파로스 FF 매질의 rHSA 추출물에 대한 로딩 용량 및 rHSA 추출물에서 폴리사카라이드의 함량을 도시하는 변화 차트이다.도 5는 2차 정제로서 상이한 크로마토그래피 상에서 실행된 음이온 교환 크로마토그래피로부터 얻은 분획들의 SDS-PAGE의 이미지이며, A: Q 세파로스 FF 매질, B: DEAE 세파로스 FF 매질.도 6은 최종 정제로서 상이한 크로마토그래피 상에서 실행된 소수성 크로마토그래피로부터 얻은 분획들의 SDS-PAGE의 이미지이며, A: 페닐 세파로스 HP 매질, B: 페닐 세파로스 FF 매질, C: Macro Prep-t-부틸 매질.도 7은 미정제 rHSA 추출물에 크로마토그래피 매질로서 UNO 스피어 S(A), Q 세파로스 FF(B) 및 페닐 세파로스 HP(C) 상에서 실행된 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피를 연속적으로 실행하여 얻은 용출물 분획의 SDS-PAGE의 이미지이다.도 8은 본 발명의 한 실시태양에 따라 얻은 정제된 rHSA 생성물(HPLC-SEC)의 HPLC 크로마토그램이다.도 9는 Macro-prep 세라믹 수산화인회석 타입 I 매질 상에서 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피를 실행함으로써 얻은 용출물 분획의 SDS-PAGE의 이미지이다.도 10은 본 발명의 다른 실시태양에 따라 얻은 정제된 rHSA 생성물의 HPLC 크로마토그램이다.도 11은 Macro-prep 세라믹 수산화인회석 타입 II 매질 상에서 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피를 실행하고 페닐 세파로스 HP 매질 상에서 소수성 크로마토그래피를 연속적으로 실행하여 얻은 용출물 분획의 SDS-PAGE의 이미지이다.도 12는 본 발명의 다른 실시태양에 따라 얻은 정제된 rHSA 생성물의 HPLC 크로마토그램이다.상기 도면에서, S: 로딩 샘플, FT: 투과 유체, Elu: rHSA-포함 용출물, Elu 1: 비-표적 단백질 용출물, Elu 2: rHSA 용출물, CIP: 클리닝-인-플레이스(cleaning-in-place) 분획. [ 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 ] 본 발명의 특징들과 이점들은 다음 실시예들로부터 추가로 이해될 수 있다. 실시예들은 단지 예시적이며 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 해석돼지 않아야 한다.양이온 교환 크로마토그래피에서 크로마토그래피 매질와 용출 조건의 선택본 발명은 양이온 교환 수지의 크로마토그래피를 Bio-RAD에 의해 제조된 UNO 스피어 S, 누비아 S, 캡토 MMC 및 등을 포함하는 높은 작업 유속을 가지는 것으로 정의한다. 캡토 MMC, 누비아 S 및 UNO 스피어 S의 각각이 rHSA의 정제에 사용되었다는 것이 실험에 의해 발견되었다. 캡토 MMC는 단백질 정제에 대해 최고의 효과를 가지며, UNO 스피어 S 및 누비아 S가 그 뒤를 잇는다. 누비아 S 및 UNO 스피어 S의 단백질 정제에 대한 효과들 사이에 현저한 차이가 없다. 그러나, 동일한 작업 유속 조건하에서, UNO 스피어 S의 로딩 용량은 캡토 MMC의 로딩 용량보다 1.5배 크며; UNO 스피어 S는 캡토 MMC와 동일한 작업 유속을 가지며; UNO 스피어 S는 고농도의 수산화나트륨에서도 뛰어난 안정성을 가지며 캡토 MMC와 비교하여 더 나은 세정 과정, 더 긴 작업 수명 및 더 낮은 비용을 가진다.누비아 S 및 UNO 스피어 S는 유사한 특성을 가지나 리간드의 확장 및 기질 입자 크기에 차이를 가진다. 이들 개개의 최적 작업 유속하에서, 누비아 S의 로딩 용량은 UNO 스피어 S의 로딩 용량보다 1.4배 크다; 그러나, 누비아 S의 작업 유속은 UNO 스피어 S의 작업 유속보다 약 절반 작다. 대신에, UNO 스피어 S는 동일한 유속에서 누비아 S보다 큰 로딩 용량을 가지며, 둘 다는 거의 동일한 정제 능력을 가진다.다양한 인자들의 관점에서, UNO 스피어 S는 양이온 교환 크로마토그래피용 크로마토그래피 매질로서 바람직하게 사용된다.rHSA-포함 추출물은 비교적 낮은 pH(pH = 4.4)에서 UNO 스피어 S를 채운 컬럼 상에 로딩되어 rHSA가 매질 상에 완전히 흡수되는 것을 보장하며, 기본 용출 조건을 알기 위해 각각 pH 구배 용출 버퍼 및 NaCl 구배 용출 버퍼에 의해 용출된다.결과는 pH 구배 용출에서, UNO 스피어 S 컬럼 상에 흡수된 rHSA는 용출 버퍼의 pH가 5.5 초과일 때 약간 탈착되어, 로딩 버퍼의 pH는 5.5를 초과하지 않아야 한다는 것을 나타내며; 용출 버퍼의 pH가 5.68일 때, rHSA는 컬럼으로부터 완전히 탈착된다. 따라서 UNO 스피어 S 컬럼상의 rHSA는 pH 구배 용출에 매우 민감하다.NaCl 농도 구배 용출에서, 표적 단백질 rHSA는 농도 구배가 35% 내지 60% 1M 염화나트륨(NaCl)일 때 탈착되어, UNO 스피어 S 컬럼상의 rHSA가 NaCl 농도 구배 용출에 민감하지 않다는 것을 나타낸다. 결과는 pH 구배 및 NaCl 구배 모두가 rHSA를 용출하는데 사용될 수 있다는 것을 증명한다. 또한, pH 구배는 더 높은 민감성과 더 적은 부피의 용출 버퍼로 rHSA를 용출한다. 반대로, NaCl 구배는 rHSA를 쉽게 용출할 수 없고 고농도의 NaCl과 더 큰 부피의 용출 버퍼를 필요로 한다.정제 효율과 회수율을 고려하면, 바람직한 용출 버퍼는 0.25M NaCl를 포함하는 인산염 버퍼(pH 5.2)이다.음이온 교환 크로마토그래피에 대한 크로마토그래피 매질와 용출 조건의 선택양이온 교환 수지와 같이, 음이온 교환 수지는 rHSA의 정제에 사용될 수 있다. 본 발명은 음이온 교환 수지의 크로마토그래피 매질을 UNO 스피어 Q, Q 세파로스 FF, DEAE 세파로스 FF 등을 포함하는 높은 유속 및 높은 로딩 용량을 가지는 것으로 정의한다.실험에 의해 UNO 스피어 Q, Q 세파로스 FF 및 DEAE 세파로스 FF의 각각은 rHSA의 정제에 사용될 수 있다는 것이 발견되었다. UNO 스피어 Q는 Q 세파로스 FF보다 빠른 유속을 가지나 Q 세파로스 FF는 UNO 스피어 Q보다 더 나은 정제 효율을 가지며; DEAE 세파로스 FF는 유사한 정제 효율을 가지나 Q 세파로스 FF와 비교하여 더 느린 유속을 가진다.상기한 대로, 양이온 교환 크로마토그래피용 크로마토그래피 매질로서, UNO 스피어 S는 캡토 MMC보다 약간 더 나쁜 정제 능력을 가진다. 그러나, 실험에 의해 이런 부작용은 전체 정제 능력의 개선에 의해 제거될 수 있다는 것이 증명되었다. UNO 스피어 S는 후속 음이온 교환 크로마토그래피에 대해 부작용을 일으키지 않을 것이다. 바람직한 실시태양에서, Q 세파로스 FF는 음이온 교환 크로마토그래피용 크로마토그래피 매질로서 바람직하게 사용되며 표적 단백질을 용출하기 위한 용출 버퍼는 인산염 버퍼 및 0.2M NaCl을 포함하며 6.8의 pH를 가진다.음이온- 및 양이온-교환 크로마토그래피의 순서의 결정음이온- 및 양이온-교환 크로마토그래피 모두는 rHSA의 1차 정제로 사용될 수 있으나, 실험들에 의해 Q 세파로스 FF 음이온 교환 수지가 1차 정제 단계에 사용될 때, 이의 로딩 용량은 이론적 용량보다 훨씬 더 낮다는 것이 발견되었다. 이는 쌀 알곡에 다량으로 존재하는 가용성 폴리사카라이드와 핵산과 관련이 있을 수 있다. 가용성 폴리사카라이드와 핵산은 음전하를 포함하기 때문에, Q 세파로스 FF와 결합하여 이의 로딩 용량을 감소시킬 수 있다. 실험에 의해 rHSA 추출물에서 가용성 폴리사카라이드의 함량은 투석에 의해 감소될 수 있어서, Q 세파로스 FF의 로딩 용량을 증가시킨다는 것이 증명되었다.반대로, UNO 스피어 S, 누비아 S 및 캡토 MMC와 같은 양이온 교환 크로마토그래피 매질는 가용성 폴리사카라이드 또는 핵산과 결합하지 않아서, 로딩 용량의 감소를 유발하는 것을 피한다. 따라서, 본 발명에서 양이온 교환 크로마토그래피가 1차 정제로 결정되고 음이온 교환 크로마토그래피가 2차 정제로 결정된다.소수성 크로마토그래피용 크로마토그래피 매질의 선택본 발명은 페닐 세파로스 HP, 페닐 세파로스 FF(LS), macro-prep t-부틸 및 macro-prep 메틸을 포함하는, 정제 단계를 위한 유사한 특성을 가진 다양한 소수성 크로마토그래피 매질를 사용한다.페닐 세파로스 HP는 강한 소수성과 뛰어난 정제 능력을 가진다. 미정제 추출물로부터 대부분의 비-표적 단백질과 다른 불순물을 제거하는 능력은 정제 효율에 중요하나, 미세한 입자 크기, 낮은 유속 및 특별한 작업 모드 때문에 이런 크로마토그래피의 응용분야에서 일부 불편함이 존재한다.페닐 세파로스 HP와 비교하여, 페닐 세파로스 FF(LS)는 동일한 리간드와 기질을 가지나, 상이한 지름의 구형 기질과 상이한 밀도의 리간드를 가진다. 페닐 세파로스 FF(LS)의 기질의 평균 입자 크기는 페닐 세파로스 HP의 기질의 평균 입자 크기보다 3배 더 크며 따라서 전자가 더 높은 작업 유속을 가진다. rHSA의 생산에 사용될 때, 페닐 세파로스 FF가 생산 기간을 단축할 수 있다. MacroPrep-부틸은 페닐 세파로스 FF와 페닐 세파로스 HP보다 약한 소수성을 갖는 반면 MacroPrep-메틸은 MacroPrep-부틸보다 더 약한 소수성을 가진다.페닐 세파로스 FF는 페닐 세파로스 HP와 동일한 작업 모드에서 실험적으로 수행되어 투과 유체를 수집한다. 로딩 샘플에서 염의 농도의 선택에서, 샘플이 평형 버퍼(25mM PB, 0.5M(NH4)2SO4, pH 6.8)와 함께 로딩되고 100% 물로 용출될 때, 50% 이상의 rHSA가 컬럼 상에 유지된다는 것이 발견되었다. 결과로서 평형 버퍼의 염 농도는 감소돼야 한다.UNO 스피어 S 및 Q 세파로스 FF 컬럼에 의해 여과된 샘플들에 황산 암모늄을 첨가하여 페닐 세파로스 FF(LS) 컬럼 상에 로딩되기 전에 각각 0.2M 및 0.1M로 황산 암모늄의 농도를 조절한다. 투과 유체와 정제수 용출물을 수집하여 SDS-PAGE 탐지를 실행한다. 결과는 페닐 세파로스 FF(LS)가 페닐 세파로스 HP보다 강한 소수성을 가지며 로딩 샘플에서 황산 암모늄의 농도가 0.1M로 낮은 경우에도 샘플에서 비-표적 단백질을 제거하는 좋은 효과를 가진다는 것을 나타낸다. 페닐 세파로스 FF(LS)에 의해 얻은 생성물은 93.5%의 순도를 가진다. 그러나, 여전히 30%의 rHSA가 페닐 세파로스 FF(LS) 컬럼 상에서 사라진다. 상기 실험은 황산암모늄 대신에 염화나트륨을 사용하여 실행되며, 유사한 결과를 얻는다. 비록 컬럼 상에서 rHSA의 손실이 감소하나, 생성물의 HPLC 순도는 여전히 약 93%이다.UNO 스피어 S 및 Q 세파로스 FF 컬럼에 의해 여과된 샘플들에 황산 암모늄을 첨가하여 macro-prep t-부틸 및 macro-prep 메틸 컬럼 상에 로딩되기 전에 각각 1M, 0.8M 또는 0.6M로 황산 암모늄의 농도를 조절한다. 투과 유체와 정제수 용출물을 수집하여 SDS-PAGE 탐지를 실행한다. 결과는 macro-prep t-부틸 및 macro-prep 메틸은 나쁜 소수성을 가진다는 것을 나타낸다. 둘 다는 rHSA에 대해 나쁜 정제 능력을 가지며, 얻은 rHSA는 HPLC에 의해 90%의 순도를 가진다.어떤 Macro-prep 세라믹 수산화인회석 타입 I 또는 타입 II를 선택하기 위해서, Bio Rad로부터의 두 타입의 Macro-prep 세라믹 수산화인회석을 비교하였다. Macro-prep 세라믹 수산화인회석 타입 I이 타입 II보다 훨씬 좋다는 것을 발견하였다. Macro-prep 세라믹 수산화인회석 타입 I 크로마토그래피 이후, 모노머 함량은 98.998%까지 도달할 수 있다.상기한 대로, 다른 크로마토그래피 매질가 페닐 세파로스 HP에 비해 빠른 작업 유속의 이점을 가지나, 이들은 페닐 세파로스 HP에 필적할만한 정제 효율을 얻을 수 없다. 페닐 세파로스 HP는 비교적 낮은 작업율을 가지나, 표적 단백질이 98% 초과의 순도를 가진다는 것을 보장할 수 있다. 따라서 페닐 세파로스 HP는 소수성 크로마토그래피용 매질로서 바람직하게 사용된다.실시예 재료 및 장비필터 천 타입 플레이트-프레임 필터 프레스, 타입: XMS4/500-UB, Shanghai Tianli Filter Press Co., Ltd(China)에 의해 제조; 0.20㎛ 속 빈 섬유막, Huzhou Kelu Membrane Technology Co., Ltd(China)로부터 구입가능;UNO 스피어 S, 누비아 S, 캡토 MMC, MacroPrep-CM, MacroPrep-메틸, MacroPrep-부틸 매질, BIO-RAD(US)로부터 구입가능;Q 세파로스, 페닐 세파로스 HP, 페닐 세파로스 FF, DEAE-세파로스 FF 매질, GE Healthcare(US)로부터 구입가능;C10/19, XK16/20 크로마토그래피 컬럼, GE Healthcare(US)로부터 구입가능;생물학적 15/200 크로마토그래피 컬럼, BIO-RAD(US)로부터 구입가능;실시예 1: 형질전환 쌀 알곡으로부터 rHSA의 추출본 발명자들의 중국특허출원 No.200510019084에 개시된 방법에 따라 형질전환 쌀을 제조할 수 있다. 패디 쌀을 껍질을 벗겨 절반 연마된 쌀을 얻었고 제분하여 80~100 메시의 분말도를 가진 제분된 쌀을 얻었다. 제분된 쌀을 1:5(w/v, kg/L)의 비로 추출 버퍼와 혼합하고, 60℃에서 1.5시간 동안 추출하였다. 추출 버퍼의 구성요소는 25mM 인산염 버퍼, 20mM 아세트산 나트륨, 10mM 황산 암모늄, 10mM 카프릴산 나트륨이며; pH 7.5를 가진다. 얻은 혼합물을 아세트산으로 pH 4.5로 조절하고 적어도 3시간 동안 방치하여 비-표적 단백질을 침전시켰다. 그런 후에 얻은 혼합물을 연속적으로 플레이트-프레임 프레스 필터(필터 천 형태)를 사용하는 압력 여과하고 0.22㎛의 구멍 크기를 가진 속 빈 섬유 컬럼에 의해 미세 여과하여, rHSA를 포함하는 상층액을 얻었다. rHSA의 농도는 약 0.66mg/mL이었다.실시예 2: 1차 정제로서 양이온 교환 크로마토그래피1. UNO 스피어 S 매질 상에서 실행된 양이온 교환 크로마토그래피XK16/100 컬럼을 약 8.7ml의 UNO 스피어 S 매질로 채우고 300cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(무수 아세트산나트륨 2g/L, 아세트산을 첨가하여 pH를 4.5로 조절하였다)로 유출물의 pH가 안정해질 때까지 평형화하였다. 실시예 1에서 얻은 250ml의 rHSA 추출물 샘플을 600cm/h의 유속에서 컬럼 상에 로딩하였다. 샘플은 6.1ms/cm의 전도도 및 4.53의 pH를 가진다. 로딩 후, 샘플을 300cm/h의 유속에서 용출 버퍼(아세트산나트륨 2g/L, 아세트산, pH 5.2, 염화나트륨 14.61g/L)로 용출하였다. 용출액을 수집하고 SDS-PAGE로 관찰하여 rHSA를 포함하는 분획을 얻었다. 전기영동도는 도 1a에 도시되었다.2. 누비아 S 매질 상에서 실행된 양이온 교환 크로마토그래피XK16/100 컬럼을 약 9.3ml의 누비아 S 매질로 채우고 300cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(무수 아세트산나트륨 2g/L, 아세트산을 첨가하여 pH를 4.5로 조절하였다)로 유출물의 pH가 안정해질 때까지 평형화하였다. 실시예 1에서 얻은 250ml의 rHSA 추출물 샘플을 300cm/h의 유속에서 컬럼 상에 로딩하였다. 샘플은 6.3ms/cm의 전도도 및 4.56의 pH를 가진다. 로딩 후, 샘플을 300cm/h의 유속에서 용출 버퍼(아세트산나트륨 2g/L, 아세트산, pH 5.0, 염화나트륨 14.61g/L)로 용출하였다. 용출액을 수집하고 SDS-PAGE로 관찰하여 rHSA를 포함하는 분획을 얻었다. 전기영동도는 도 1b에 도시되었다.3. 캡토 MMC 매질 상에서 실행된 양이온 교환 크로마토그래피XK16/100 컬럼을 약 15.1ml의 캡토 MMC 매질로 채우고 300cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(무수 아세트산나트륨 2g/L, 아세트산을 첨가하여 pH를 4.5로 조절하였다)로 유출물의 pH가 4.5이며 안정해질 때까지 평형화하였다. 실시예 1에서 얻은 250ml의 rHSA 추출물 샘플을 600cm/h의 유속에서 컬럼 상에 로딩하였다. 샘플은 6.3ms/cm의 전도도 및 4.56의 pH를 가진다. 로딩 후, 샘플을 300cm/h의 유속에서 용출 버퍼(아세트산나트륨 2g/L, 아세트산, pH 4.7, 염화나트륨 58.44g/L)로 용출하여 불순물을 제거한 후 용출 버퍼(인산이수소나트륨 0.3g/L, 인산수소이나트륨 3.5g/L, 염화나트륨 58.55g/L, pH 6.7)로 용출하여 rHSA-포함 분획을 얻었다. 전기영동도는 도 1c에 도시되었다.4. MacroPrep-CM 매질 상에서 실행된 양이온 교환 크로마토그래피XK16/100 컬럼을 약 10ml의 MacroPrep-CM 매질로 채우고 200cm/h의 유속에서 300ml의 평형 버퍼(무수 아세트산나트륨 2g/L, 아세트산을 첨가하여 pH를 4.5로 조절하였다)로 유출물의 pH가 4.5이며 안정해질 때까지 평형화하였다. 실시예 1에서 얻은 250ml의 rHSA 추출물 샘플을 300cm/h의 유속에서 컬럼 상에 로딩하였다. 샘플은 6.3ms/cm의 전도도 및 4.56의 pH를 가진다. 로딩 후, 샘플을 200cm/h의 유속에서 세척 버퍼(아세트산나트륨 2g/L, 아세트산, pH 4.7, 염화나트륨 58.44g/L)로 용출하여 불순물을 제거한 후 용출 버퍼(인산이수소나트륨 0.3g/L, 인산수소이나트륨 3.5g/L, 염화나트륨 5.84g/L, pH 6.5)로 용출하여 rHSA-포함 분획을 얻었다. 전기영동도는 도 1d에 도시되었다.5. 누비아 S 매질 및 UNO 스피어 S 매질 사이의 로딩 능력의 비교두 XK16/100 컬럼을 각각 약 5ml의 누비아 S 및 UNO 스피어 S 매질로 채우고 300cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(무수 아세트산나트륨 2g/L, 아세트산을 첨가하여 pH를 4.5로 조절하였다)로 유출물의 pH가 4.5일 때까지 평형화하였다. 실시예 1에서 얻은 rHSA 추출물 샘플을 각각 300cm/h의 유속에서 누비아 S 컬럼 및 UNO 스피어 S 컬럼 상에 로딩하였다. 흡수값이 10%만큼 플래토(plateau)를 초과할 때까지 샘플 로딩 동안 UV280의 흡수값을 기록하였다. 샘플 부피를 기록하고 300cm/h의 유속에서 누비아 S 또는 UNO 스피어 S의 밀리리터당 실제 로딩 용량을 각각 계산하였다.또한, UNO 스피어 S를 300cm/h의 유속에서 평형 버퍼(무수 아세트산나트륨 2g/L, 아세트산을 첨가하여 pH 4.5로 조절하였다)로 유출물의 pH가 4.5일 때까지 평형화하였다. 실시예 1에서 얻은 rHSA 추출물 샘플을 각각 600cm/h의 유속에서 UNO 스피어 S 컬럼 상에 로딩하였고 흡수값이 10%만큼 플래토(plateau)를 초과할 때까지 샘플 로딩 동안 UV280의 흡수값을 기록하였다. 샘플 부피를 기록하고 600cm/h의 유속에서 UNO 스피어 S의 밀리리터당 실제 로딩 용량을 계산하였다. 로딩 용량의 비교는 도 2에 도시되었다.실시예 3: 1차 정제로서 음이온 교환 크로마토그래피1. UNO 스피어 Q 매질 상에서 실행된 음이온 교환 크로마토그래피생물학적 15/200 컬럼을 약 10ml의 UNO 스피어 Q 매질로 채우고 300cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(인산이수소나트륨 0.3g/L, 인산수소이나트륨 3.5g/L, 수산화나트륨 또는 염산을 첨가하여 pH를 7.5로 조절하였다)로 유출물의 pH가 7.5일 때까지 평형화하였다. 실시예 1에서 얻은 250ml의 rHSA 추출물 샘플을 pH 7.5로 조절하고 버퍼로 전도도가 10.0ms 미만일 때까지 희석하고 300cm/h의 유속에서 UNO 스피어 Q 컬럼 상에 로딩하였다. 샘플을 세척 버퍼(인산이수소나트륨 0.3g/L, 인산수소이나트륨 3.5g/L, 염화나트륨 11.68g/L)로 세척하여 불순물을 제거한 후 용출 버퍼(인산이수소나트륨 0.3g/L, 인산수소이나트륨 3.5g/L, 염화나트륨 23.36g/L)로 용출하여 rHSA-포함 분획을 수집하였다. 전기영동도는 도 3a에 도시되었다.2. Q 세파로스 FF 매질 상에서 실행된 음이온 교환 크로마토그래피생물학적 15/200 컬럼을 약 10ml의 Q 세파로스 FF 매질로 채우고 300cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(인산이수소나트륨 0.3g/L, 인산수소이나트륨 3.5g/L, 수산화나트륨 또는 염산을 첨가하여 pH를 7.0로 조절하였다)로 유출물의 pH가 7.0일 때까지 평형화하였다. 실시예 1에서 얻은 250ml의 rHSA 추출물 샘플을 pH 6.8로 조절하고 버퍼로 전도도가 10.0ms 미만일 때까지 희석하고 300cm/h의 유속에서 Q 세파로스 FF 컬럼 상에 로딩하였다. 샘플을 용출 버퍼(인산이수소나트륨 0.3g/L, 인산수소이나트륨 3.5g/L, 염화나트륨 5.84g/L)로 용출하여 rHSA-포함 분획을 수집하였다. 전기영동도는 도 3b에 도시되었다.3. Q 세파로스 FF의 실제 로딩 용량에 대한 검사10/100 컬럼을 각각 약 5ml의 Q 세파로스 FF 매질로 채우고 300cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(인산이수소나트륨 0.3g/L, 인산수소이나트륨 3.5g/L, 수산화나트륨 또는 염산을 첨가하여 pH를 7.0로 조절하였다)로 유출물의 pH가 7.0이며 안정할 때까지 평형화하였다. 실시예 1에서 얻은 250ml의 rHSA 추출물 샘플을 pH 7.5로 조절하고 버퍼로 전도도가 10.0ms 미만이며 전체 부피가 1000ml일 때까지 희석하였다. 샘플을 300cm/h의 유속에서 Q 세파로스 FF 컬럼 상에 로딩하였다. 흡수값이 10%만큼 플래토(plateau)를 초과할 때까지 샘플 로딩 동안 UV280의 흡수값을 기록하였다. 샘플 부피를 기록하고 300cm/h의 유속에서 Q 세파로스 FF의 밀리리터당 실제 로딩 용량을 각각 계산하였다. 그런 후에 수지를 재생하였다.실시예 1에서 얻은 250ml의 rHSA 추출물 샘플을 pH 7.0으로 조절하고 버퍼로 전도도가 10.0ms 미만일 때까지 희석하고 GE 30KD 막 카세트를 통해 400ml로 농축하였다. 황산-페놀 방법을 사용하여 투석 이전 및 이후 폴리사카라이드의 함량을 측정하였다. 그런 후에 샘플을 평형화된 Q 세파로스 FF 컬럼 상에 로딩하였다. 흡수값이 10%만큼 플래토(plateau)를 초과할 때까지 샘플 로딩 동안 UV280의 흡수값을 기록하였다. 샘플 부피를 기록하고 300cm/h의 유속에서 Q 세파로스 FF의 밀리리터당 실제 로딩 용량을 각각 계산하였고 폴리사카라이드의 함량 변화를 도 4에 도시되었다.실시예 4: 2차 정제로서 음이온 교환 크로마토그래피실시예 2에서 얻은 rHSA-포함 분획을 다음 실험에서 사용하기 위해 두 개의 동일한 부분으로 나눴다.1. Q 세파로스 FF 매질 상에서 실행된 음이온 교환 크로마토그래피15/200 컬럼을 약 7ml의 Q 세파로스 FF로 채우고 300cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(인산이수소나트륨 0.3g/L, 인산수소이나트륨 3.5g/L, 수산화나트륨 또는 염산을 첨가하여 pH를 7.0로 조절하였다)로 유출물의 pH가 7.0일 때까지 평형화하였다. 상기 분획의 한 부분을 pH 7.0으로 조절하고 전도도가 10.0ms 미만일 때까지 버퍼로 희석하였다. 샘플을 300cm/h의 유속에서 Q 세파로스 FF 컬럼 상에 로딩한 후 용출 버퍼(인산이수소나트륨 0.3g/L, 인산수소이나트륨 3.5g/L, 염화나트륨 11.68g/L)로 용출하여 rHSA-포함 분획을 수집하였다. 전기영동도는 도 5a에 도시되었다.2. DEAE 세파로스 FF 매질 상에서 실행된 음이온 교환 크로마토그래피생물학적 15/200 컬럼을 약 8ml의 DEAE 세파로스 FF로 채우고 300cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(인산이수소나트륨 0.3g/L, 인산수소이나트륨 3.5g/L, 수산화나트륨 또는 염산을 첨가하여 pH를 7.0로 조절하였다)로 유출물의 pH가 7.0일 때까지 평형화하였다. 상기 분획의 다른 부분을 pH 7.5로 조절하고 전도도가 10.0ms 미만일 때까지 버퍼로 희석하였다. 샘플을 300cm/h의 유속에서 DEAE 세파로스 FF 컬럼 상에 로딩한 후 용출 버퍼(인산이수소나트륨 0.3g/L, 인산수소이나트륨 3.5g/L, 염화나트륨 11.68g/L)로 용출하여 rHSA-포함 분획을 수집하였다. 전기영동도는 도 5b에 도시되었다.실시예 5: 최종 정제로서 소수성 크로마토그래피1. 페닐 세파로스 HP 매질 상에서 실행된 소수성 크로마토그래피XK16/100 컬럼을 약 8ml의 페닐 세파로스 HP로 채우고 100cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(무수 아세트산나트륨 2.32g/L, 인산이수소나트륨 2.81g/L, 황산암모늄 66g/L)로 평형화하였다. 실시예 4에서 얻은 20ml의 rHSA-포함 분획(Q 세파로스 FF)에 황산암모늄(0.4M)을 첨가하여 전도도를 80.0ms로 만들었다. 그런 후에 샘플을 100cm/h의 유속에서 컬럼 상에 로딩하였다. 투과 유체를 수집하여 rHSA-포함 분획을 얻었다. 전기영동도는 도 6a에 도시되었다.2. 페닐 세파로스 FF 매질 상에서 실행된 소수성 크로마토그래피XK16/100 컬럼을 약 10ml의 페닐 세파로스 FF로 채우고 150cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(무수 아세트산나트륨 2.32g/L, 인산이수소나트륨 2.81g/L, 황산암모늄 13.2g/L)로 평형화하였다. 실시예 4에서 얻은 20ml의 rHSA-포함 분획(Q 세파로스 FF)에 황산암모늄(0.1M)을 첨가하여 전도도를 80.0ms로 만들었다. 그런 후에 샘플을 150cm/h의 유속에서 컬럼 상에 로딩하였다. 투과 유체를 수집하여 rHSA-포함 분획을 얻었다. 전기영동도는 도 6b에 도시되었다.3. MacroPrep-t-부틸 매질 상에서 실행된 소수성 크로마토그래피15/200 컬럼을 약 6ml의 MacroPrep-t-부틸로 채우고 150cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(무수 아세트산나트륨 2.32g/L, 인산이수소나트륨 2.81g/L, 황산암모늄 13.2g/L)로 평형화하였다. 실시예 3에서 얻은 20ml의 rHSA-포함 분획(Q 세파로스 FF)에 황산암모늄(각각 1.0M, 0.8M, 0.6M)을 첨가하여 전도도를 각각 130.0ms, 90.0ms, 70.0ms로 만들었다. 그런 후에 샘플을 150cm/h의 유속에서 컬럼 상에 로딩하였다. 투과 유체를 수집하여 rHSA-포함 분획을 얻었다. 전기영동도는 도 6c에 도시되었다.실시예 6: rHSA-포함 추출물로부터 rHSA의 분리 및 정제단계 1): 1차 정제로서 UNO 스피어 S 상에서 실행된 양이온 교환 크로마토그래피 XK16/100 컬럼을 약 12ml의 UNO 스피어 S 매질로 채우고 300cm/h의 유속에서 500ml의 평형 버퍼(무수 아세트산나트륨 2g/L, 아세트산, pH 4.5)로 평형화하였다. 실시예 1에서 얻은 300ml의 rHSA-포함 추출물 샘플을 600cm/h의 유속에서 컬럼 상에 로딩하였다. 샘플은 6.5ms/cm의 전도도와 4.5의 pH를 가진다. 로딩 이후, 샘플을 200cm/h의 유속에서 용출 버퍼(아세트산나트륨 2g/L, 아세트산, pH 5.0, 염화나트륨 14.61g/L)로 용출하였다. 용출액을 수집하고 SDS-PAGE로 관찰하여 rHSA를 포함하는 분획을 얻었다. 전기영도도는 도 7a에 도시되었다.단계 2): 2차 정제로서 Q 세파로스 FF 상에서 실행된 양이온 교환 크로마토그래피XK16/100 컬럼을 약 13ml의 Q 세파로스 FF 매질로 채우고 300cm/h의 유속에서 400ml의 평형 버퍼(무수 아세트산나트륨 6.51g/L, 인산이수소나트륨 0.72g/L, pH 6.8)로 평형화하였다. 이전 단계에서 얻은 rHSA-포함 분획을 약 200ml로 희석하며 10.0ms 미만의 전도도를 가지며 300cm/h의 유속에서 컬럼 상에 로딩하였다. 샘플은 8.3ms/cm의 전도도와 6.8의 pH를 가진다. 로딩 이후, 샘플을 100cm/h의 유속에서 용출 버퍼(인산수소이나트륨 6.51g/L, 인산이수소나트륨 0.72g/L, 염화나트륨 11.69g/L)로 용출하였다. 용출액을 수집하고 SDS-PAGE로 관찰하였다. rHSA-포함 분획을 수집하였다. 전기영도도는 도 7b에 도시되었다.단계 3): 최종 정제로서 페닐 세파로스 HP 상에서 실행된 소수성 크로마토그래피XK16/100 컬럼을 약 12ml의 페닐 세파로스 HP 매질로 채우고 100cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(무수 아세트산나트륨 2.32g/L, 인산이수소나트륨 2.81g/L, 황산암모늄 66g/L)로 평형화하였다. 이전 단계에서 얻은 20ml의 rHSA-포함 분획에 황산암모늄을 첨가하여 전도도를 90.0ms로 만들었다. 그런 후에 샘플을 100cm/h의 유속에서 컬럼 상에 로딩하였다. 투과 유체를 수집하여 rHSA-포함 분획을 얻었다. 전기영도도는 도 7c에 도시되었다. 정제된 rHSA 생성물의 HPLC 크로마토그램은 도 8에 도시되었다. rHSA는 HPLC에 의해 99%(모노머 플러스 다이머 및 폴리머) 초과의 순도를 가진다.실시예 7: rHSA-포함 추출물로부터 rHSA의 분리 및 정제이 실시예는 실시예 1로부터의 미정제 rHSA 추출물에 각각 UNO 스피어 S, Q 세파로스 FF, Macro-prep 세라믹 수산화인회석 타입 I 및 페닐 세파로스 HP 상에서 실행된, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피를 연속적으로 실행하여 rHSA를 분리하고 정제하는 네 단계 방법을 사용한다. 본 발명에서 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피는 실시예 6과 동일하다.CHT 컬럼을 약 15ml의 Macro-prep 세라믹 수산화인회석 타입 I 매질로 채우고 100cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(20mM 인산나트륨 + 50mM 염화나트륨, pH 7.5)로 평형화하였다. 음이온 교환 크로마토그래피로부터 얻은 rHSA-포함 분획을 100cm/h의 유속에서 컬럼 상에 직접 로딩하였다. 샘플은 26ms/cm의 전도도와 7.4~7.6의 pH를 가졌다. 로딩 이후, 샘플을 용출 버퍼(500mM 인산나트륨, pH 7.5)로 용출하였다. 투과 유체를 수집하여 rHSA-포함 분획을 얻었다. rHSA 정제 용량은 ≤30mg/g CHT I로 측정하였고 rHSA의 회복 속도는 최대 ≥80%였다. 마지막으로, CHT 세라믹 수산회인회석 컬럼을 pH 7.0의 500mM 인산나트륨 버퍼의 3~5 컬럼 부피로 재생해야한다. 컬럼은 원하는 경우 1~2N NaOH로 살균될 수 있고 0.1N NaOH에 저장될 수 있다. 전기영동도는 도 9에 도시되었다.그런 후에, 위에서 얻은 rHSA-포함 분획에 실시예 6과 유사한 절차에 따라 소수성 크로마토그래피를 실행하였다. 투과 유체를 수집하여 rHSA-포함 분획을 얻었다. 정제된 rHSA 생성물의 HPLC 크로마토그램은 도 10에 도시되었다. rHSA는 HPLC에 의해 약 99%(단지 모노머)의 순도를 가진다.실시예 8: rHSA-포함 추출물로부터 rHSA의 분리 및 정제이 실시예는 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피가 크로마토그래피 매질로서 Macro-prep 세라믹 수산화인회석 타입 II 상에서 실행된 것을 제외하고 실시예 7과 동일한 방법으로 실행하였다.CHT 컬럼을 약 15ml의 Macro-prep 세라믹 수산화인회석 타입 II 매질로 채우고 100cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(20mM 인산나트륨 + 50mM 염화나트륨, pH 7.0)로 평형화하였다. 음이온 교환 크로마토그래피로부터 얻은 rHSA-포함 분획을 100cm/h의 유속에서 컬럼 상에 직접 로딩하였다. 샘플은 26ms/cm의 전도도와 7.4~7.6의 pH를 가졌다. 로딩 이후, 샘플을 용출 버퍼(500mM 인산나트륨, pH 7.0)로 용출하였다. 투과 유체를 수집하여 rHSA-포함 분획을 얻었다. rHSA 정제 용량은 ≤25mg/g CHT II로 측정하였고 rHSA의 회복 속도는 최대 ≥85%였다. 마지막으로, CHT 세라믹 수산회인회석 컬럼을 pH 7.0의 500mM 인산나트륨 버퍼의 3~5 컬럼 부피로 재생해야한다. 컬럼은 원하는 경우 1~2N NaOH로 살균될 수 있고 0.1N NaOH에 저장될 수 있다.그런 후에, 위에서 얻은 rHSA-포함 분획에 실시예 7과 유사한 절차에 따라 소수성 크로마토그래피를 실행하였다. 투과 유체를 수집하여 rHSA-포함 분획을 얻었다. 크로마토그램은 도 11에 도시되었다. 정제된 rHSA의 HPLC 크로마토그램은 도 12에 도시되었다. rHSA는 HPLC에 의해 약 99%(단지 모노머)의 순도를 가진다.실시예 6~8의 결과로부터 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피는 최종 rHSA 생성물에서 모노머 함량을 효과적으로 증가시켜서, 최대 약 99% 순도를 가능하게 한다는 것을 알 수 있다. 또한, 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피는 페닐 세파로스 HP 단계에서 사용된 방식과 동일하게 다른 정제된 rHSA를 위한 플로우-스루(flow-through) 방식을 사용했기 때문에 간단하게 작동되며 용출 용액은 염 농도와 pH 값을 조절하지 않고 상용가능하다. 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피에 의해, 정제된 rHSA는 임상적 용도를 위한 필요조건을 충족할 수 있다.
	예당저수지는 수도권 인근의 유명 관광지로 많은 관광객을 유치하고 있으며 예산군은 안정적인 어업자원 확보 및 지속적인 관광객유치를 위해 치어방류사업과 유해어종 퇴치사업도 적극적으로 추진하고 있다	주어진 문장 뒤에 자연스럽게 이어질 문장을 생성해주세요. 문장: 예산군은 예당저수지 일원의 생태, 역사, 문화 등 핵심적인 관광자원으로 인식하고 관광단지, 생태탐방로, 전국낚시대회 등 관광인프라 확충과 활성화를 위한 핵심주체로 역할을 하고 있다. 또한, 예당저수지 일원의 농어촌민박 사업자는 예산군에 농어촌민박 신고를 통해 수려한 자연경관과 낚시관광을 목적으로 찾는 관광객들을 대상으로 경제활동을 영위하고 있다. 예산군은 최근에 생태공원 251억 원, 예당저수지 기반시설조성사업 78억 원의 계획을 확정하고 중앙정부로부터 예산을 확보하여 사업을 추진 중에 있으며, 추후 지속적인 배후지역개발과 관련된 사업계획도 수립하여 추진할 예정이다.
	손흥민은 기술과 매너에서 최고로 평가받으며 세상을 놀라게 하고 있지만 그 과정에서 남모르는 눈물이 있었을텐데, 그의 성공 이야기가 한국 청춘에게 도움이 되어주길 희망한다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 김승현 논설위원 말 그대로 '손세이셔널'이다. '손흥민+센세이셔널(sensational)'이라는 별명답게 손흥민(27)은 세상을 놀라게 하고 있다. 지난 8일 73m 폭풍 드리블에 이은 골은 축구 종가 영국에서도 '월드클래스'(월클)라고 찬양한다. "운 좋게 공간이 나왔다. 내겐 모든 골이 중요하다"는 소감도 고품격이다. '월클' 수식어가 처음은 아니지만, 손흥민은 매번 업그레이드된다. 지난달엔 '월클 매너'가 화제였다. 다친 안드레 고메스(26·에버턴) 선수의 쾌유를 비는 기도 세리머니 때문이다. 백태클로 인해 발목이 골절된 고메스를 보고 오열했던 손흥민은 이후 '쾌유를 빈다. 너와 너의 가족, 동료들에게 정말로 미안하다'는 사과 문자를 보냈다. 기술과 매너에서 최고로 평가받기까지 남모르는 눈물이 있었을 것이다. 축구 선수 출신 아버지는 춘천의 한 초등학교 훈련장에서 손흥민을 혹독하게 훈련시켰다고 한다. 당이 떨어져서 공이 두세 개로 보일 때까지 슛을 하고, 아이스크림과 초콜릿을 먹은 뒤 다시 공을 찼다. 그가 감아 차면 막을 수 없는 공간이라는 '손흥민 존'이 그렇게 만들어졌다. 18세이던 2010년엔 '리틀 차붐'으로 기대를 모으며 독일 분데스리가에서 뛰다가 발가락 골절상을 입었다. 지난 6월 다큐멘터리 방송에서 손흥민은 "치료받는 석 달 동안 최고의 기회를 놓칠 거라는 생각에 아이처럼 엉엉 울었다"고 회고했다. 부상 이후 살이 쪄서 주전 복귀가 어려울 것이란 비난도 받았다. 다시 몸을 만든 고통과 눈물의 시간이 지금의 월드클래스 질주에 녹아 있는 것이다. 최고의 플레이어가 곁에 있다는 건 감사한 일이다. 그의 성공 스토리가 실의에 빠진 한국 청춘에게 힘이 되어주길 바란다.
	하지만 최근에는 다음과 같은 이유들로 인해 경찰이 무장화되고 있는 것으로 분석되고 있으며, 그로 인해 군과 경찰의 경계는 불분명해지고 있다. 첫째, 1980년대 레이건(Ronald Reagan) 대통령에 의해 수행된 마약과의 전쟁은 전국적인 경찰의 무장화를 야기하였다. 마약과의 전쟁을 위해 1981년 연방 의회는, 법집행기관에 대한 군의 협력법(Military Cooperation with Law Enforcement Agencies Act)을 제정하였는데, 동 법률은 군으로 하여금 마약법을 집행하는 민간 경찰을 조력 하도록 했다는 점에서 위의 민병대법을 개정하는 것이었다. 즉, 동 법률에 따르면 군은 연방, 주, 지방의 경찰에게 군사 장비, 군사기지 및 연구 시설 등을 사용하게 하고, 장비 사용 에 관해 민간 경찰을 훈련시키거나 민간 경찰에 조언을 제공하며, 마약이 국경을 넘어 유입되는 것을 막기 위하여 민간 경찰을 조력하도록 요구되었다. 그 결과 군과 경찰의 관계는 견고해지고, 그만큼 군과 경찰 사이의 경계는 완화되었다.	주어진 제목과 요약문에 대한 정보를 토대로, 요약되기 전 문장을 유추해서 생성해주세요. 제목: 집회 및 시위의 권리 보장과 공공질서의 조화를 위한 형사정책 연구 요약문: 마약과의 전쟁으로 경찰의 무장화 시작과 민간 경찰을 훈련시키거나 법률적으로도 군에서 민간 경찰에 조언을 제공하였으며 마약이 국경을 넘어 유입되는 것을 차단하고자 군과 경찰의 관계는 교류가 활발해져 군과 경찰 사이의 경계는 유화되었다.
	박교수는 8쪽에서 ‘현재 수능 영어와 관련된 문제는 쉬운 수능, EBS 교재 연계 등의 문제와 맞물려 있으며 그 외부에는 사교육비 문제, 다시 그 외부에는 높은 교육열과 대학진학률 등 사회적인 문제가 놓여 있다’고 지적하면서 ‘절대평가가 교육적으로 바람직한 면이 있다고 하지만 과거 고등학교 내신 절대평가에서의 혼란(내신 부풀리기 등), 수능 등급제에 따른 혼란 등...’이라고 지적하고 있다. 그러면서 ‘2015년에 교육과정이 개정되면 그에 따라 2021학년도부터는 수능에도 변화가 불가피하다’라고 언급하고 있다. 수능 영어 절대평가에 대한 토론이 향후 수능의 바람직한 변화 방향을 제시하고 또한 미래사회를 살아가는 우리 학생들을 위한 최선의 방안으로 귀결되기를 바란다고 주장한다. 본 토론자도 이에 동의한다.	주어진 제목과 요약문에 대한 정보를 토대로, 요약되기 전 문장을 유추해서 생성해주세요. 제목: 수능 영어영역 절대평가 도입 방안 공청회(2차) 자료집 요약문: 박교수는 현재 수능 영어와 관련된 문제의 원인을 지적하였다. 또한 2015년 교육과정 개정에 따라 2021학년도 수능의 변화도 불가피하다고 주장한다. 토론을 통해 최선의 방안이 도출되기를 바란다고 말한다.
	리처드 제임스 맥도널드(Dick McDonald)는 1909년 2월 16일에 태어난 미국의 패스트푸드 개척자로, 맥도날드의 창시자입니다. 그의 형 모리스 제임스 맥도널드(Morris McDonald)는 1902년 11월 26일에 태어나 1971년 12월 11일에 세상을 떠났습니다. 두 형제는 캘리포니아 샌버너디노에서 첫 번째 맥도날드 매장을 열었지만, 처음에는 핫도그 가게였습니다. 1948년에 새로운 시스템과 함께 다시 열었고, 이것이 맥도날드의 원점이 되었습니다. 1954년에 레이 크로크와 계약을 통해 프랜차이즈화를 시작했습니다. 1961년에 미국과 해외에 점포를 확장하며 크로크에게 경영권을 양도했습니다. 리처드는 1998년 7월 30일에 세상을 떠났고, 그의 아내 도로시는 이후에 사망했습니다. 두 형제는 총 한 명의 아들인 게일 프렌치를 두었습니다.	리처드 제임스 맥도널드는 어떤 사업가이며 미국의 어느 분야에서 활동했나요?
	제목: 집단지성과 입체적사고로, 4차 산업혁명의 강을 건너자! 중마도서관이 개최한 '우리시대의 명사특강' 프로그램에서 인문학자 김경집이 집단지성과 입체적 사고를 바탕으로 한 공공성에 대한 믿음을 통해 4차 산업혁명 시대의 강을 건너야 한다고 주장했다.	주어진 문장에 적절한 제목을 생성하고, 내용을 요약해주세요. 문장: 중마도서관‘우리시대의 명사 특강’,‘인문학자 김경집’ 김영신 기자 yskim0966@naver.com “집단지성과 입체적 사고를 바탕으로 하는 공공성에 대한 신념이 미래가치를 이끌 수 있을 때 비로소 4차 산업혁명 시대를 살아갈 수 있다” 지난 28일, 중마도서관 3층 인문학실에 만난 인문학자 김경집의 말이다. 인문학자 김경집 초청강연은 중마도서관이 진행하는‘우리시대의 명사특강’프로그램의 첫 번째 강의로 시민 60여명이 참석, 4차 산업혁명에 대비해 과연 무엇을 해야 하는지에 대해 공감하는 시간을 가졌다. 오후 2시30분,“행복하세요?” 라는 질문으로 시작 된 김경집의 강의는 정해진 두 시간을 훌쩍 넘겼고 5시가 넘어서야 끝이 났다. 김경집은“4년전 히말라야에서 대한민국 청년들을 만난적이 있는데 정규직 직장인은 거의 볼 수 없었다며‘왜 왔냐고’물으니‘이거라도 안하면 억울할것 같아서 왔다’고 대답했다. 1년에 4000명의 청년들이 자살하는 나라가 과연 행복한 나라인가를 생각하지 않을 수 없었다”고 말했다. 김경집은“경영경제 어느 분야에도 인건비를 줄여서 경영의 효율화를 꾀한다는 이론은 없는데 4차 산업혁명시대를 앞두고 언론과 기업들이 겁을 주고 있다. 이렇게 4차 산업혁명은 따라가기가 힘들다는 두려움과 일자리가 사라질 것이다 라는 공포를 동시에 가져다주고 있다”고 말했다. 이어 두려움과 공포 속에서 4차 산업혁명시대는 이미 우리 곁에 와있다. 판사가 판결을 하는데, 의사가 환자를 치료하는데 미적분이 무슨 필요가 있겠느냐, 하지만 미적분을 잘하지 못하면 법대나 의대를 갈 수 없는 우리나라의 교육현실을 꼬집으며 21세기의 교육은 그 시대의 보편가치가 무엇인지 잘 파악하고 그 흐름이 어떤 방향으로 가는 지를 잘 읽어야 한다고 역설했다. 21세기에 학교를 보내는 이유는 ‘왜? 라는 질문을 통해 더 좋은 지성이 나오는 집단지성을 배우기 위해서이며 집단지성화는 700만개의 일자리는 사라져도 노동시간은 절반으로 줄고 수입은 두 배 늘어나는 200만개의 양질의 일자리가 생겨나게 하는 힘이 된다고 주장했다. 인문학자 김경집은“21세기는 ICBM(IoT-Cloud-Bigdata-Mobile)의 시대다. 우리나라는 세계에서 지식의 양이 가장 많은 나라지만 아직도 형태를 가진 것을 좋아하는‘형태적 유사성’에서 벗어나지 못하고 있다”며 “21세기에는 20세기처럼 해서는 망한다는 생각으로 발상의 전환, 생각을 재구성하는 입체적 사고가 필요하다”고 강조했다. 김경집은 두 시간이 넘는 열강을 통해“기업의 호들갑스러움이 한 몫 했건 어쨌건 우리의 의지와는 상관없이 이미 4차 산업혁명시대에 살고 있다. 집단지성과 입체적 사고로 강의 물이 불기 전에 잘 준비해서 4차 산업혁명의 강을 건너야 한다”고 역설했다.
	1. 음파는 발음체의 진동으로 공기 등에 생기는 소리의 파동입니다. 돌고래가 서로 대화할 때에도 음파를 진동으로 내지만, 이것은 음파로 알아듣는 것입니다. 2. 돌고래는 음파를 이용해서 주변에 물체를 감지할 수 있습니다. 돌고래가 사용하는 음파는 인간이 들을 수 없는 초음파입니다. 돌고래는 음파가 되돌아오는 방향과 시간 등을 참조하여 주변의 위험물이나 먹이 등을 감지할 수 있습니다.	돌고래가 내는 음파에 대해 알고 싶습니다. 돌고래가 서로 대화할 때 음파를 진동으로 내서 인지하는 건가요? 그리고 돌고래는 음파를 이용해서 주변에 물체를 감지할 수 있나요?
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 원문을 바탕으로 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 생성하세요.	따라서, 각종 탱크를 일정 높이에 위치시키도록 지지하는 구조물들이 설치되므로, 정수기의 크기가 커지고 제조단가가 증가되었다.	다음 텍스트에서 제공된 문맥을 정확히 이해하고, 마지막 문장을 자연스럽고 문맥에 맞게 완성하세요. 문장은 이전 내용과 논리적으로 연결되어야 합니다. #텍스트: 일반적으로 정수기는 원수를 여과하여 정수를 취출할 수 있는 장치이다. 이러한 정수기는 가정, 회사 등 다양한 곳에 설치되어 사용자가 정수를 취출할 수 있도록 한다.대한민국 공개특허공보 10-2008-001527(2008.02.19 공개)에는 정수기의 온도 가열 장치를 개시하고 있다. 온수탱크는 정수탱크에 연결되고, 온수탱크의 내부에는 온수의 온도를 측정할 수 있도록 온도센서가 설치된다. 또한, 정수, 온수 및 냉수를 취출할 수 있는 밸브가 탱크의 하부에 설치된다.종래의 정수기는 온도센서에 의해 온수의 온도를 감지하여 온수의 온도를 일정하게 유지하였다.또한, 정수탱크, 온수탱크 및 냉수탱크에서 정수, 온수 및 냉수가 아래로 유동되므로, 배출밸브가 정수탱크, 온수탱크 및 냉수탱크의 하부에 설치되었다.
	서맨사 제인 스토서는 오스트레일리아의 여자 테니스 선수로, 2010년 프랑스 오픈에서 준우승을 차지한 바 있습니다. 단식 최고 랭킹은 2010년 5월에 5위이며, 복식에서는 리사 레이먼드와 함께 2006년 WTA 투어 여자 복식 세계 랭킹 1위에 올랐습니다. 또한 프랑스 오픈과 US 오픈 복식에서 각각 한 번씩 우승했고, 호주 오픈과 윔블던 복식에서도 준우승했습니다. 그녀는 오스트레일리아 퀸즐랜드 주 브리즈번에서 태어나, 형제 도미닉과 대니얼과 함께 테니스를 배워 시작했습니다. 13세 때 세계 유소년 컵 대회에 참가하였고, 14세 때 퀸즐랜드 스포츠 아카데미에 입학하였으며, 16세 때 오스트레일리아 스포츠 협회의 테니스 프로그램에 참가했습니다. 또한 2004년과 2008년 하계 올림픽에서 참가하였으며, 2012년과 2016년에도 하계 올림픽에서 경쟁했습니다.	제인 스토서는 어디서 태어났어?
	금동계미명삼존불입상은 서울특별시 간송미술관에 위치한 삼국시대의 금동 삼존불 입상으로, 1962년에 국보 제72호로 지정되었다. 이 작품은 광배를 뒤에 두고 중앙에 본존불을, 양 옆에 협시보살을 배치하고 있으며, 광배 뒷면에 '계미'라는 글이 새겨져 있다. 본존불은 큰 하나의 광배를 배경으로 중앙에 위치하고 양쪽에 협시보살이 있으며, 중앙의 본존불은 상투 모양의 머리와 미소를 띤 갸름한 얼굴을 가지고 있다. 양 옆에 있는 협시보살들은 보관을 쓰고 있으며, 신체 표현은 본존불과 비슷하지만 앞면에서 X자로 교차하는 옷주름과 손모양이 다르다. 광배는 불꽃이 타오르는 모양을 가지고 있으며, 대좌는 연꽃이 새겨져 있다. 이 작품은 금동신묘명삼존불(국보 제85호)의 양식과 유사하며, 중국 남북조시대의 불상 양식을 따르고 있다. 또한, 광배 뒷면에 새겨진 글에 의해 백제 위덕왕 10년(563)에 만들어진 것으로 추정된다.	금동계미명삼존불입상은 어디에 위치해 있나요?
	5.7 \times 10^{13} \mathrm{C}$	지구와 달의 중력 인력을 중화하려면 지구와 달에 동일한 양의 전하를 배치해야 하나요?
	트루크립트는 실시간 파일 암호화를 지원하는 오픈 소스 응용 소프트웨어로, 윈도우 운영체제를 제외한 모든 데이터 저장장치에서 사용할 수 있습니다. 다양한 암호화 알고리즘을 지원하며, 에이이에스, 서펜트, 투피시 등의 알고리즘을 조합할 수 있습니다. 트루크립트는 브라질 경찰, 미국 FBI, 영국 NCA, CIA, NSA 등 다양한 정보 기관에서 암호화를 해독하려고 시도했지만 실패했습니다. 또한, 미국 애리조나 주의 마리코파 카운티 경찰청에서도 트루크립트 암호화를 해독하지 못했습니다. 트루크립트는 파일 내부나 디스크 파티션에 가상의 암호화 디스크를 생성하여 은닉된 파일을 숨길 수 있는 '숨긴 볼륨' 기능을 제공합니다.	트루크립트는 어떤 기능을 제공하나요?
	중국인들은 황색을 고귀하고 신성한 권위의 상징, 붉은 색을 상서로움과 경사로움의 상징으로 여긴다. 이는 민족의 문화역사적 원유와 원시 종교관념으로부터 유래한다. 각종 경축행사에서 붉은색으로 장식하는 풍속이 현재까지도 이어진다. 중국은 현재 수정주의에 입각한 정치를 행사하고 있다.	중국인은 어떤 색깔을 선호하나요? 이에 대한 역사적 배경도 알려주세요. 그리고 중국이 수정주의에 입각한 정치를 행사하고 있나요?
	지중해 대학교 연합(UNIMED)은 지중해를 기반으로 하거나 지중해 지역에 특별한 관심을 두고 있는 84개의 대학으로 구성되어 있습니다. 이 대학들의 회장 교수는 Abderraouf Mahbouli이며, 부회장 교수는 Domenico Laforgia입니다. 총 비서 교수는 Franco Rizzi이고, 나라 대학교와 티라나 대학교, 아부 바크르 벨카이드 대학교, 안나바 대학교, 알제르 대학교, 베자이아 대학교, 블리다 대학교, 콜폴리테크니크 도시건축, 모스타가넴 대학교, 오란 대학교, 티지 우주 대학교, 키프로스 기술 대학교, 키프로스 대학교 과학기술과 해양수송, 아랍대학교, 알렉산드리아 대학교, 카이로 대학교, 탬페어 대학교, 몽펠리어 2대학교, 파리 제8대학교, 폴 세잔 대학교, 아테네 국립 카포디스트리아 대학교, 판테이온 대학교, 네게브의 벤-구리온 대학교, 히브리 대학교, 예루살렘, 텔아비브 대학교, 사피엔자 대학교, 로마데글리 교육 2대학, 나폴리로마트레 대학교, 바리 대학교, 카메리노 대학교, 카타니아 대학교, 페루지아 외국인 대학교, 메시나 대학교, 모데나 레지오 대학교, 몰리세 대학교, 나플레스 페데리코 2세 대학교, 파도바 대학교, 팔레르모 대학교, 페루지아 대학교, 성 피오 5세 대학교, 로마, 레지오 칼라브리아 대학교, 살렌토 대학교, 사사리 대학교, 테라모 대학교, 투린 대학교, 우르비노 대학교, 알알베이트 대학교, 하셰미트 대학교, 요르단 대학교, 레바논 대학교, 세인트에스프리 카슬릭대학교, 말타 대학교, 카디 아야드 대학교, 하산 2 아인 초크 대학교, 이브누 조르 대학교, 모하메드 4 대학, 몬테네그로 대학교, 알아자르 대학교, 가자안나자 국립 대학교, 베틀레헴 대학교, 비르자이트 대학교, 아바이로 대학교, 에보라 대학교, 프리모르스카 대학교, 컴플루텐스 대학교, 마드리드, 코르도바 대학교, 바르셀로나 대학교, 그라나다 대학교, 발렌세아 대학교, 알바아트 대학교, 다마스쿠스 대학교, 티르쉬렌 대학교, 알레포 대학교, 카르타고 대학교, 투니스 엘마나르 대학교, 투니스 대학교, 스팍스 대학교, 보가지시 대학교, 이스탄불 대학교, 중동 기술대학교입니다.	UNIMED는 어떤 대학들로 구성되어 있나요?
	본 발명은 외인성 프로테아제 절단 부위, 및 이-사슬(di-chain) 루프 내에 위치된 상기 외인성 프로테아제 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 단백질을 포함하는 발현 작제물, 상기 발현 작제물을 포함하는 세포 조성물, 및 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시키는 세포내 방법을 개시한다.	주어진 문장을 읽고 간략하게 요약해주세요. 문장: [ 발명의 명칭 ] 단일-사슬 단백질의 그의 이-사슬 형태로의 세포내 전환 방법METHODS OF INTRACELLULAR CONVERSION OF SINGLE-CHAIN PROTEINS INTO THEIR DI-CHAIN FORM [ 기술분야 ] 본 특허 출원은 전체내용이 참조로서 포함되는 2010년 1월 25일에 출원된 미국 가특허출원 일련 번호 제61/286,963호에 대해서 35 U.S.C. § 119(e)에 따라 우선권을 주장한다. [ 배경기술 ] 신경 경로를 억제하는 클로스트리디움 독소(Clostridial toxin), 예를 들어, 보툴리눔 신경독소(Botulinum neurotoxin: BoNT), BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F 및 BoNT/G, 및 파상풍 신경독소(Tetanus neurotoxin: TeNT)의 능력은 매우 다양한 치료 및 미용 용용분야에서 이용되고 있으며, 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[William J. Lipham, COSMETIC AND CLINICAL APPLICATIONS OF BOTULINUM TOXIN (Slack, Inc., 2004)]을 참조할 수 있다. 약학적 조성물로서 시판되는 클로스트리디움 독소는 BoNT/A 제조물, 예를 들어, 보톡스(BOTOX)(등록상표)(캘리포니아주의 어바인시에 소재한 Allergan, Inc.) DYSPORT(등록상표)/RELOXIN(등록상표)(영국의 포튼다운시에 소재한 Beaufour Ipsen), NEURONOX(등록상표)(대한민국의 오창읍에 소재한 (주)메디톡스) BTX-A(중국의 Lanzhou Institute Biological Products) 및 XEOMIN(등록상표)(독일의 프랑크푸르트에 소재한 Merz Pharmaceuticals, GmbH.); 및 BoNT/B 제조물, 예를 들어, MYOBLOC(상표명)/NEUROBLOC(상표명)(캘리포니아주의 샌프란시스코시에 소재한 Elan Pharmaceuticals)을 포함한다. 예로서, 보톡스(등록상표)는 이완불능증, 성인 경직, 및 열창, 요통, 안검연축, 이갈이, 목 근육긴장이상증(cervical dystonia), 본태성 진전, 미간주름 또는 운동과다 안면주름, 두통, 반얼굴연축, 방광활동항진증(hyperactivity of bladder), 다한증, 유년기 뇌성마비(juvenile cerebral palsy), 다발경화증, 근육클로누스(myoclonic) 장애, 코입술 주름, 연축발성장애, 사시 및 VII 신경 장애의 적응증에 대해 하나 이상의 국가에서 현지 승인되어 있다.클로스트리디움 독소의 치료적 유용성은 감각 신경-기반 질환, 예를 들어, 다양한 종류의 만성 동통, 신경성 염증 및 비뇨생식계 장애, 뿐만 아니라 비-신경-기반 장애, 예를 들어, 췌장염을 치료하기 위해 현재의 근이완 적용을 넘어 확대되고 있다. 클로스트리디움 독소-기반 요법을 확대시키기 위해 현재 이용되는 한 방법은 클로스트리디움 독소를 변형시켜, 변형된 독소가 비-클로스트리디움 독소 표적 세포에 대한 변경된 세포 표적화 능력을 갖도록 하는 것을 포함한다. 이러한 재-표적화된 능력은, 클로스트리디움 독소의 자연 발생 표적화 도메인을 비-클로스트리디움 독소 표적 세포 내에 존재하는 비-클로스트리디움 독소 수용체에 대한 선택적 결합 활성을 나타내는 표적화 도메인으로 대체시킴으로써 달성된다. 표적화 도메인에 대한 상기 변형은 비-클로스트리디움 독소 표적 세포에 존재하는 비-클로스트리디움 독소 수용체(표적 수용체)에 선택적으로 결합할 수 있는(재-표적화된) 변형된 독소를 생성시킨다. 비-클로스트리디움 독소 표적 세포에 대해 표적화 활성을 갖는 재표적화된 클로스트리디움 독소는 비-클로스트리디움 독소 표적 세포에 존재하는 수용체에 결합할 수 있고, 세포질로 전위되고, 비-클로스트리디움 독소 표적 세포의 SNARE 복합체에서 단백질분해성 효과를 발휘할 수 있다.비-클로스트리디움 독소 표적 세포에 대한 표적화 활성을 갖는 재-표적화된 클로스트리디움 독소의 비제한적인 예는, 예를 들어, 문헌[Keith A. Foster et al., Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions, 미국 특허 제5,989,545호; Clifford C. Shone et al., Recombinant Toxin Fragments, 미국 특허 제6,461,617호; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, 미국 특허 제6,500,436호; Conrad P. Quinn et al., Methods and Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion, 미국 특허 제6,632,440호; Lance E. Steward et al., Methods And Compositions For The Treatment Of Pancreatitis, 미국 특허 제6,843,998호; J. Oliver Dolly et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허 제7,419,676호; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, 미국 특허 제7,514,088호; Keith A. Foster et al., Inhibition of Secretion from Non-neural Cells, 미국 특허 공개 공보 제2003/0180289호; 및 Keith A. Foster et al., Re-targeted Toxin Conjugates, 국제 특허 공개 공보 제WO 2005/023309호]에 기재되어 있다. 클로스트리디움 독소와 관련된 치료 효과를 재-표적화시키는 능력은 클로스트리디움 독소 요법에 사용할 수 있는 의약적 적용성의 수를 크게 확대시킨다. 비제한적인 예로, 감각 뉴런에 대해 재표적화된 변형된 클로스트리디움 독소는 다양한 종류의 만성 동통, 예를 들어, 통각과민 및 이질통증, 신경병성 동통 및 염증성 동통을 치료하는데 유용하며, 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Foster, 위에 기재됨, (1999); 및 Donovan, 위에 기재됨, (2002); 및 Stephan Donovan, Method For Treating Neurogenic Inflammation Pain with Botulinum Toxin and Substance P Components, 미국 특허 제7,022,329호]을 참조할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 췌장 세포에 대해 재표적화된 변형된 클로스트리디움 독소는 췌장염을 치료하는데 유용하며, 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Steward, 위에 기재됨, (2005)]을 참조할 수 있다.자연 발생되거나(즉, 천연형이거나) 변형되건 간에 클로스트리디움 독소는 완전한 활성을 달성하기 위해 이-사슬 형태(di-chain form)로 가공된다. 자연 발생 클로스트리디움 독소는 약 150 kDa의 단일-사슬 폴리펩타이드로 각각 번역되며, 이는 이후에 자연 발생 프로테아제에 의한 이황화 루프 내에서의 단백질분해적 절단에 의해 절단된다(도 1). 이러한 절단은 이황화 브리지를 형성하는 2개의 시스테인 잔기 사이에 생성된 별개의 이-사슬 루프 영역 내에서 발생한다. 이러한 번역후 가공은 효소 도메인을 포함하는 약 50 kDa의 경쇄(light chain: LC), 및 전위 및 세포 결합 도메인을 포함하는 약 100 kDa의 중쇄(heavy chain: HC)를 포함하는 이-사슬 분자를 생성시키며, 상기 LC 및 HC는 단일한 이황화결합 및 비-공유적 상호작용에 의해 함께 유지된다(도 1). 재조합적으로 생성되는 클로스트리디움 독소는 일반적으로 자연 발생 이-사슬 루프 프로테아제 절단 부위를 외인성 프로테아제 절단 부위로 치환시킨다(도 2). 이에 대해서는, 예를 들어, 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Dolly, J.O. et al., Activatable Clostridial Toxins, 미국 특허 제7, 419,676호]을 참조할 수 있다. 재표적화된 클로스트리디움 독소는 표적화 모이어티(moiety)의 크기로 인해 이의 전체적 분자량이 다양하나, 활성화 과정 및 외인성 절단 부위에서의 이의 신뢰성은 재조합적으로 생성되는 클로스트리디움 독소와 본질적으로 동일하다. 이에 대해서는, 예를 들어, 각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Steward, L.E. et al., Activatable Clostridial Toxins, 미국 특허 공개 공보 제2009/0005313호; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Non-Clostridial Toxin Target Cells, 미국 특허 출원 제11/776,075호; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells, 미국 특허 공개 공보 제2008/0241881호]을 참조할 수 있다.지금까지, 재조합적으로 생성되는 클로스트리디움 독소 또는 변형된 클로스트리디움 독소의 이-사슬 형태로의 전환은 시험관내 활성화 방법을 필요로 하였다. 첫째로, 상기 독소를 재조합적으로 생성시키는데 사용되는 박테리아 세포는 천연 독소를 생성시키는 클로스트리디움 균주에 존재하는 자연-발생 프로테아제가 결핍되어 있다. 둘째로, 활성화된 독소를 취급하는데서 발생하는 안전성 우려로 인해 활성화된 독소를 재조합적으로 생성시키는데 있어서 박테리아 세포가 크게 필요하지 않았다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Dolly, 미국 특허 제7,419,676호, 위에 기재됨, (2008)]을 참조할 수 있다. 그러나, 상기 우려가 극복될 수 있는 경우, 재조합적으로 생성되는 활성화된 독소의 생성은 재조합적으로 생성되는 클로스트리디움 독소 또는 변형된 클로스트리디움 독소의 제조 과정을 간소화시킬 것이다. 예를 들어, 현재, 재조합적으로 생성되는 클로스트리디움 독소 또는 변형된 클로스트리디움 독소의 제조는, 1) 고정된 금속 친화성 크로마토그래피, 2) 완충액 교환 투석, 3) 프로테아제 절단 반응, 4) 이온 교환 크로마토그래피, 및 5) PEG의 첨가 및 -80℃에서의 보관을 위한 급속 동결의 정제 단계를 포함한다. 독소를 여전히 발현하면서 세포내적으로 재조합 클로스트리디움 독소를 단백질분해적으로 절단할 수 있는 박테리아 세포의 사용은, 1) 고정된 금속 친화성 크로마토그래피, 2) 완충액 교환 투석, 3) 이온 교환 크로마토그래피, 및 4) PEG의 첨가 및 -80℃에서의 보관을 위한 급속 동결과 같이 정제 단계를 감소시킬 수 있다. [ 발명의 개요 ] 본 발명의 명세서는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시키는 방법을 개시하며, 이러한 방법은 독소의 단일-사슬 형태를 그의 이-사슬 형태로 전환시키기 위해 시험관내 방법에 의존하지 않는다. 이는 단백질, 및 이러한 단백질을 활성 이-사슬로 전환시키는데 필요한 프로테아제 둘 모두를 발현하는 세포의 사용에 의해 달성된다.따라서, 본 발명의 명세서의 양상은 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀(open reading frame), 및 이-사슬 루프 영역 내에 위치된 외인성 프로테아제 절단 부위를 단백질분해적으로 절단할 수 있는 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 이중 발현 작제물을 제공한다. 추가 양상에서, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 단백질은, 예를 들어, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 클로스트리디움 독소, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 변형된 클로스트리디움 독소, 또는 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 비-클로스트리디움 독소 결합 도메인 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 단백질일 수 있다. 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 클로스트리디움 독소 뿐만 아니라 이를 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드가, 예를 들어, 각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Dolly, J.O. et al., Activatable Clostridial Toxins, 미국 특허 제7,132,259호; Dolly, J.O. et al., Activatable Clostridial Toxins, 미국 특허 제7,419,676호]에 기재되어 있다. 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 비-클로스트리디움 독소 결합 도메인 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단백질 뿐만 아니라 이를 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드가, 예를 들어, 각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Steward, L.E. et al., Multivalent Clostridial Toxins, 미국 특허 공개 공보 제2009/0048431호; Steward, L.E. et al., Activatable Clostridial Toxins, 미국 특허 공개 공보 제2009/0069238호; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Non-Clostridial Toxin Target Cells, 미국 특허 출원 제11/776,075호; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells, 미국 특허 공개 공보 제2008/0241881호; Foster, K.A. et al., Fusion Proteins, 미국 특허 공개 공보 제2009/0035822호; Foster, K.A. et al., Non-Cytotoxic Protein Conjugates, 미국 특허 공개 공보 제2009/0162341호; Steward, L.E. et al., Activatable Clostridial Toxins, 미국 특허 공개 공보 제2008/0032931호; Foster, K.A. et al., Non-Cytotoxic Protein Conjugates, 미국 특허 공개 공보 제2008/0187960호; Steward, L.E. et al., Degradable Clostridial Toxins, 미국 특허 공개 공보 제2008/0213830호; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins With Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Clostridial Toxin Target Cells, 미국 특허 공개 공보 제2008/0241881호; Dolly, J.O. et al., Activatable Clostridial Toxins, 미국 특허 제7,419,676호; 및 동반 특허 출원 Ghanshani, et al., Modified Clostridial Toxins Comprising an Integrated Protease Cleavage Site-Binding Domain, Attorney Docket No. 18468 PROV (BOT)]에 기재되어 있다.본 발명의 명세서의 다른 양상은 외인성 프로테아제 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀, 및 이-사슬 루프 영역 내에 위치된 외인성 프로테아제 절단 부위를 단백질분해적으로 절단할 수 있는 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 이중 발현 작제물을 포함하는 세포를 제공한다. 추가 양상에서, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 단백질은, 예를 들어, 본 발명의 명세서에 개시된 바와 같은 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 클로스트리디움 독소, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 변형된 클로스트리디움 독소, 또는 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 비-클로스트리디움 독소 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 단백질일 수 있다.본 발명의 명세서의 또 다른 양상은 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시키는 세포내 방법을 제공하며, 이러한 방법은, a) i) 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀; 및 ii) 이-사슬 루프 내에 위치된 외인성 프로테아제 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 이중 발현 작제물을 포함하는 세포를, 최대 세포 밀도를 달성하기 위해 특정 기간 동안 제1 온도에서 성장시키는 단계; b) 단일-사슬 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀로부터 단백질 발현의 최대 유도를 달성하기 위해 특정 기간 동안 제2 온도에서 상기 세포를 성장시키는 단계를 포함하되, 상기 단계 (b)에서의 성장은 이중 발현 작제물로부터 단일-사슬 단백질 및 프로테아제의 발현을 유도하고; 생성된 프로테아제는 이-사슬 루프 영역 내에 위치된 외인성 프로테아제 절단 부위에서 단일-사슬 단백질을 절단함으로써, 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시킨다.본 발명의 명세서의 또 다른 양상은, a) i) 효소 도메인, 전위 도메인, 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 클로스트리디움 독소를 엔코딩하는 열린 해독 틀; 및 ii) 이-사슬 루프 내에 위치된 외인성 프로테아제 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 이중 발현 작제물을 포함하는 세포를 37℃에서 약 2 내지 약 3.5시간 동안 성장시키는 단계; b) 상기 세포를 22℃에서 약 16 내지 약 18시간 동안 성장시키는 단계를 포함하는, 단일-사슬 클로스트리디움 독소를 그의 이-사슬 형태로 전환시키는 세포내 방법을 제공하되, 상기 단계 (b)에서의 성장은 이중 발현 작제물로부터 단일-사슬 클로스트리디움 독소 및 프로테아제의 발현을 유도하고; 생성된 프로테아제는 이-사슬 루프 영역 내에 위치된 외인성 프로테아제 절단 부위에서 단일-사슬 클로스트리디움 독소를 절단함으로써, 단일-사슬 클로스트리디움 독소를 그의 이-사슬 형태로 전환시킨다.본 발명의 명세서의 추가 양상은 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시키는 세포내 방법을 제공하며, 이러한 방법은, a) i) 효소 도메인, 전위 도메인, 및 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-아편유사제 결합 도메인을 포함하는 단일-사슬 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀; 및 ii) TEV 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 이중 발현 작제물을 포함하는 세포를 37℃에서 약 2 내지 약 8시간 동안 성장시키는 단계; b) 상기 세포를 약 12 내지 약 16℃에서 약 16 내지 약 18시간 동안 성장시키는 단계를 포함하되, 상기 단계 (b)에서의 성장은 이중 발현 작제물로부터 단일-사슬 단백질 및 TEV 프로테아제의 발현을 유도하고; 생성된 TEV 프로테아제는 통합된 TEV 절단 부위 아편유사제 결합 도메인 내에 위치된 TEV 프로테아제 절단 부위에서 단일-사슬 단백질을 절단함으로써, 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시킨다.본 발명의 명세서의 추가 양상은 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시키는 세포내 방법을 제공하며, 이러한 방법은, a) i) 효소 도메인, 전위 도메인, 및 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-아편유사제 결합 도메인을 포함하는 단일-사슬 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀; 및 ii) TEV 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 이중 발현 작제물을 포함하는 세포를 37℃에서 약 2 내지 약 8시간 동안 성장시키는 단계; b) 상기 세포를 약 20 내지 약 24℃에서 약 16 내지 약 18시간 동안 성장시키는 단계를 포함하되, 상기 단계 (b)에서의 성장은 이중 발현 작제물로부터 단일-사슬 단백질 및 TEV 프로테아제의 발현을 유도하고; 생성된 TEV 프로테아제는 통합된 TEV 절단 부위 아편유사제 결합 도메인 내에 위치된 TEV 프로테아제 절단 부위에서 단일-사슬 단백질을 절단함으로써, 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시킨다.본 발명의 명세서의 또 다른 추가 양상은 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시키는 세포내 방법을 제공하며, 이러한 방법은, a) i) 효소 도메인, 전위 도메인, 비-클로스트리디움 독소 결합 도메인 및 TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀; 및 ii) TEV 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 이중 발현 작제물을 포함하는 세포를 37℃에서 약 2 내지 약 8시간 동안 성장시키는 단계; b) 상기 세포를 약 12 내지 약 16℃에서 약 16 내지 약 18시간 동안 성장시키는 단계를 포함하되, 상기 단계 (b)에서의 성장은 이중 발현 작제물로부터 단일-사슬 단백질 및 TEV 프로테아제의 발현을 유도하고; 생성된 TEV 프로테아제는 이-사슬 루프 영역 내에 위치된 TEV 프로테아제 절단 부위에서 단일-사슬 단백질을 절단함으로써, 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시킨다.본 발명의 명세서의 또 다른 추가 양상은 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시키는 세포내 방법을 제공하며, 이러한 방법은, a) i) 효소 도메인, 전위 도메인, 비-클로스트리디움 독소 결합 도메인 및 TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀; 및 ii) TEV 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 이중 발현 작제물을 포함하는 세포를 37℃에서 약 2 내지 약 8시간 동안 성장시키는 단계; b) 상기 세포를 약 20 내지 약 24℃에서 약 16 내지 약 18시간 동안 성장시키는 단계를 포함하되, 상기 단계 (b)에서의 성장은 이중 발현 작제물로부터 단일-사슬 단백질 및 TEV 프로테아제의 발현을 유도하고; 생성된 TEV 프로테아제는 이-사슬 루프 영역 내에 위치된 TEV 프로테아제 절단 부위에서 단일-사슬 단백질을 절단함으로써, 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시킨다.본 발명의 명세서의 다른 양상은 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 발현 작제물을 제공한다. 추가 양상에서, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 단백질은, 예를 들어, 본 발명의 명세서에 개시된 바와 같은 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 클로스트리디움 독소, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 변형된 클로스트리디움 독소, 또는 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 비-클로스트리디움 독소 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 단백질일 수 있다.본 발명의 명세서의 다른 양상은 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 단백질의 이-사슬 루프 영역 내에 위치된 외인성 프로테아제 절단 부위를 단백질분해적으로 절단할 수 있는 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 발현 작제물을 제공한다.본 발명의 명세서의 다른 양상은 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 발현 작제물, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 단백질의 이-사슬 루프 영역 내에 위치된 외인성 프로테아제 절단 부위를 단백질분해적으로 절단할 수 있는 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 또 다른 발현 작제물을 포함하는 세포를 제공한다. 추가 양상에서, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 단백질은, 예를 들어, 본 발명의 명세서에 개시된 바와 같은 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 클로스트리디움 독소, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 변형된 클로스트리디움 독소, 또는 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 비-클로스트리디움 독소 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 단백질일 수 있다.본 발명의 명세서의 또 다른 양상은 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시키는 세포내 방법을 제공하며, 이러한 방법은, a) i) 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 발현 작제물; 및 ii) 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 단백질의 이-사슬 루프 영역 내에 위치된 외인성 프로테아제 절단 부위를 단백질분해적으로 절단할 수 있는 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 또 다른 발현 작제물을 포함하는 세포를 성장시키는 단계; b) 단일-사슬 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀로부터 단백질 발현의 최대 유도를 달성하기 위해 특정 기간 동안 제2 온도에서 상기 세포를 성장시키는 단계를 포함하며, 상기 단계 (b)에서의 성장은 발현 작제물로부터 단일-사슬 단백질 및 프로테아제의 발현을 유도하고; 생성된 프로테아제는 이-사슬 루프 영역 내에 위치된 외인성 프로테아제 절단 부위에서 단일-사슬 단백질을 절단함으로써, 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시킨다.본 발명의 명세서의 또 다른 양상은 단일-사슬 클로스트리디움 독소를 그의 이-사슬 형태로 전환시키는 세포내 방법을 제공하며, 이러한 방법은, a) i) 효소 도메인, 전위 도메인, 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 클로스트리디움 독소를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 발현 작제물; 및 ii) 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 단백질의 이-사슬 루프 영역 내에 위치된 외인성 프로테아제 절단 부위를 단백질분해적으로 절단할 수 있는 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 또 다른 발현 작제물을 포함하는 세포를 37℃에서 약 2 내지 약 약 3.5시간 동안 성장시키는 단계; b) 상기 세포를 22℃에서 약 16 내지 약 18시간 동안 성장시키는 단계를 포함하며, 상기 단계 (b)에서의 성장은 발현 작제물로부터의 단일-사슬 클로스트리디움 독소 및 프로테아제의 발현을 유도하고, 생성된 프로테아제는 이-사슬 루프 영역 내에 위치된 외인성 프로테아제 절단 부위에서 단일-사슬 클로스트리디움 독소를 절단함으로써, 단일-사슬 클로스트리디움 독소를 그의 이-사슬 형태로 전환시킨다.본 발명의 명세서의 추가 양상은 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시키는 세포내 방법을 제공하며, 이러한 방법은, a) i) 효소 도메인, 전위 도메인, 및 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-아편유사제 결합 도메인을 포함하는 단일-사슬 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 발현 작제물; 및 ii) TEV 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 또 다른 발현 작제물을 포함하는 세포를 37℃에서 약 2 내지 약 8시간 동안 성장시키는 단계; b) 상기 세포를 약 12 내지 약 16℃에서 약 16 내지 약 18시간 동안 성장시키는 단계를 포함하며, 상기 단계 (b)에서의 성장은 발현 작제물로부터 단일-사슬 단백질 및 TEV 프로테아제의 발현을 유도하고; 생성된 TEV 프로테아제는 통합된 TEV 절단 부위 아편유사제 결합 도메인 내에 위치된 TEV 프로테아제 절단 부위에서 단일-사슬 단백질을 절단함으로써, 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시킨다.본 발명의 명세서의 추가 양상은 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시키는 세포내 방법을 제공하며, 이러한 방법은, a) i) 효소 도메인, 전위 도메인, 및 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-아편유사제 결합 도메인을 포함하는 단일-사슬 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 발현 작제물; 및 ii) TEV 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 또 다른 발현 작제물을 포함하는 세포를 37℃에서 약 2 내지 약 8시간 동안 성장시키는 단계; b) 상기 세포를 약 20 내지 약 24℃에서 약 16 내지 약 18시간 동안 성장시키는 단계를 포함하며, 상기 단계 (b)에서의 성장은 발현 작제물로부터의 단일-사슬 단백질 및 TEV 프로테아제의 발현을 유도하고; 생성된 TEV 프로테아제는 통합된 TEV 절단 부위 아편유사제 결합 도메인 내에 위치된 TEV 프로테아제 절단 부위에서 단일-사슬 단백질을 절단함으로써, 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시킨다.본 발명의 명세서의 또 다른 양상은 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시키는 세포내 방법을 제공하며, 이러한 방법은, a) i) 효소 도메인, 전위 도메인, 비-클로스트리디움 독소 결합 도메인 및 TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 발현 작제물; 및 ii) TEV 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 또 다른 발현 작제물을 포함하는 세포를 37℃에서 약 2 내지 약 8시간 동안 성장시키는 단계; b) 상기 세포를 약 12 내지 약 16℃에서 약 16 내지 약 18시간 동안 성장시키는 단계를 포함하며, 상기 단계 (b)에서의 성장은 발현 작제물로부터의 단일-사슬 단백질 및 TEV 프로테아제의 발현을 유도하고; 생성된 TEV 프로테아제는 통합된 TEV 절단 부위 아편유사제 결합 도메인 내에 위치된 TEV 프로테아제 절단 부위에서 단일-사슬 단백질을 절단함으로써, 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시킨다.본 발명의 명세서의 또 다른 추가 양상은 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시키는 세포내 방법을 제공하며, 이러한 방법은, a) i) 효소 도메인, 전위 도메인, 비-클로스트리디움 독소 결합 도메인 및 TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 발현 작제물; 및 ii) TEV 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 또 다른 발현 작제물을 포함하는 세포를 37℃에서 약 2 내지 약 8시간 동안 성장시키는 단계; b) 상기 세포를 약 20 내지 약 24℃에서 약 16 성장시키는 단계를 포함하며, 상기 단계 (b)에서의 성장은 발현 작제물로부터의 단일-사슬 단백질 및 TEV 프로테아제의 발현을 유도하고; 생성된 TEV 프로테아제는 통합된 TEV 절단 부위 아편유사제 결합 도메인 내에 위치된 TEV 프로테아제 절단 부위에서 단일-사슬 단백질을 절단함으로써, 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시킨다. [ 도면의 간단한 설명 ] 도 1은 자연 발생 클로스트리디움 독소의 도메인 구성을 도시한다. 단일 사슬 형태는 효소 도메인, 전위 도메인, 및 HC 결합 도메인을 포함하는 아미노에서 카복실로의 선형 구성을 도시한다. 전위 도메인과 효소 도메인 사이에 위치된 이-사슬 루프 영역은 이중 SS 브래킷으로 도시된다. 이러한 영역은 자연-발생 프로테아제, 예를 들어, 상기 환경에서 생성된 내인성 클로스트리디움 독소 프로테아제 또는 자연-발생 프로테아제로 단백질분해적으로 절단된 후, 독소의 단일 사슬 형태를 이-사슬 형태로 전환시키는 내인성 이-사슬 루프 프로테아제 절단 부위를 포함한다.도 2는 중추 및 말초 뉴런에서의 신경전달물질 방출 및 클로스트리디움 독소 중독의 현재의 패러다임의 개략도를 도시한다. 도 2A는 중추 뉴런 및 말초 뉴런의 신경전달물질 방출 메커니즘에 대한 개략도를 도시한다. 방출 과정은, 1) 신경전달물질 분자를 함유하는 소포의 소포-결합된 SNARE 단백질이 원형질막에 위치된 막-결합된 SNARE 단백질과 회합되는, 소포 결합(docking); 및 2) 소포가 원형질막과 융합하고, 신경전달물질 분자가 세포외배출되는, 신경전달물질 방출의 두 단계를 포함하는 것으로 기재될 수 있다. 도 2B는 중추 및 말초 뉴런에서의 파상풍 및 보툴리눔 독소 활성에 대한 중독 메커니즘의 개략도를 도시한다. 이러한 중독 과정은, 1) 클로스트리디움 독소가 클로스트리디움 수용체 시스템에 결합하고, 중독 과정을 개시시키는, 수용체 결합; 2) 독소 결합 후, 독소/수용체 시스템 복합체를 함유하는 소포가 세포 내로 세포내이입되는, 복합체 내재화; 3) 예를 들어, 소포의 내부 pH에서의 변화, 클로스트리디움 독소 중쇄의 HN 도메인을 포함하는 채널 포어의 형성, 중쇄로부터 클로스트리디움 독소 경쇄의 분리, 및 활성 경쇄의 방출을 포함하는 다수의 사건이 발생하는 것으로 생각되는, 경쇄 전위; 및 4) 클로스트리디움 독소의 경쇄 활성화가 이의 표적 SNARE 기질, 예를 들어, SNAP-25, VAMP 또는 신탁신을 단백질분해적으로 절단함으로써, 소포 결합 및 신경전달물질 방출을 방지하는, 효소 표적 변형의 4개의 단계를 포함하는 것으로 기재될 수 있다. [ 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 ] 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리디움 바라티이(Clostridium baratii) 및 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum)에 의해 생성된 클로스트리디움 독소가 인간 및 다른 포유동물의 치료적 및 미용적 치료에 가장 널리 사용된다. C. 보툴리눔의 균주는 인간(BoNT/A, /B, /E 및 /F), 동물(BoNT/C1 및 /D)에서 발발되거나 토양(BoNT/G)으로부터 분리된 보툴리눔을 연구함으로써 확인된 보툴리눔 독소(BoNT)의 7개의 항원적으로 별개의 유형을 생성한다. BoNT는 서로에 대해 약 35%의 아미노산 동일성을 가지며, 동일한 기능적 도메인 구성 및 전체적 구조적 구성을 공유한다. 클로스트리디움 독소의 각각의 유형 내에서, 아미노산 서열, 및 또한 이러한 단백질을 엔코딩하는 핵산에서 다소 상이한 서브타입이 존재할 수 있는 것이 당업자에 의해 인지된다. 예를 들어, 현재 4개의 BoNT/A 서브타입, BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3 및 BoNT/A4가 존재하고, 특정 서브타입은 또 다른 BoNT/A 서브타입과 비교하는 경우 약 89%의 아미노산 동일성을 나타낸다. 7개 모두의 BoNT 혈청형은 유사한 구조 및 약리학적 특성을 가지면서, 또한 이종성 세균학적 특징을 나타낸다. 대조적으로, 파상풍 독소(TeNT)는 C. 테타니(C. tetani)의 균일한 군에 의해 생성된다. 2개의 다른 클로스트리디움 종, C. 바라티이(C. baratii) 및 C. 부티리쿰(C. butyricum)은 BoNT/F 및 BoNT/E와 각각 유사한 독소 BaNT 및 BuNT를 생성한다.각각의 성숙한 이-사슬 분자는, 1) 신경전달물질 방출 기관의 코어 성분을 특이적으로 표적으로 하는 아연-의존성 엔도펩티다제 활성을 함유하는 메탈로프로테아제(metalloprotease) 영역을 포함하는 LC 내에 위치된 효소 도메인; 2) 세포내 소포로부터 표적 세포의 세포질로의 LC의 방출을 촉진하는 HC의 아미노-말단 절반 내에 함유된 전위 도메인(HN); 및 3) 표적 세포의 표면에 위치된 수용체 복합체로의 독소의 결합 활성 및 결합 특이성을 결정하는 HC의 카복실-말단 절반 내에서 발견되는 결합 도메인(HC)의 3개의 기능적으로 별개의 도메인을 포함한다. HC 도메인은 기능을 나타내고, HCN 및 HCC 서브도메인으로 명명된 대략 동등한 크기의 2개의 별개의 구조적 특징부를 포함한다. 표 1은 예시적인 클로스트리디움 독소에서 발견되는 각각의 도메인에 대한 대략적인 경계 영역을 제공한다.상기 3개의 기능적 도메인의 결합, 전위, 및 효소 활성은 독소에 모두 필요하다. 상기 과정의 모든 세부사항은 아직 정확히 공지되어 있지 않지만, 클로스트리디움 독소가 뉴런에 진입하고, 신경전달물질 방출을 억제하는 전체적인 세포 중독 메커니즘은 혈청형 또는 서브타입에 관계없이 유사하다. 본 출원을 다음과 같은 기재로 한정하고자 하는 것은 아니지만, 중독 메커니즘은, 1) 수용체 결합, 2) 복합체 내재화, 3) 경쇄 전위, 및 4) 효소 표적 변형의 적어도 4개의 단계를 포함하는 것으로 기재될 수 있다(도 3). 상기 과정은, 클로스트리디움 독소의 HC 도메인이 표적 세포의 원형질막 표면 상에 위치된 독소-특이적 수용체 시스템에 결합하는 경우에 개시된다. 수용체 복합체의 결합 특이성은, 부분적으로, 강글리오시드, 및 각각의 클로스트리디움 독소 수용체 복합체를 별개로 포함하는 것으로 보이는 단백질 수용체의 특정 조합에 의해 달성되는 것으로 생각된다. 결합된 후, 독소/수용체 복합체는 세포내이입에 의해 내재화되고, 내재화된 소포는 특정 세포내 경로로 분류된다. 전위 단계는 소포 구획의 산성화에 의해 촉발되는 것으로 보인다. 이러한 과정은 소수성을 증가시키고, 독소의 이-사슬 형태의 형성을 촉진하는 2개의 중요한 pH-의존성 구조 재배열을 개시키는 것으로 보인다. 활성화된 후, 독소의 경쇄 엔도펩티다제는 세포내 소포로부터 세포질로 방출되고, 여기서 이는 신경전달물질 방출 기관의 3개의 공지된 코어 구성요소 중 하나를 특이적으로 표적으로 하는 것으로 보인다. 이러한 코어 단백질, 소포-관련 막 단백질(VAMP)/시냅토브레빈(synaptobrevin), 25 kDa의 시냅토솜-관련 단백질(SNAP-25) 및 신탁신은 신경 말단에서 시냅스 소포 결합 및 융합에 필요하고, 이는 가용성 N-에틸말레이미드-민감성 인자-부착 단백질-수용체(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor-attachment protein-receptor, SNARE) 패밀리의 일원을 구성한다. BoNT/A 및 BoNT/E는 카복실-말단 영역 내의 SNAP-25를 절단하여, 각각 9개 또는 26개의 아미노산 세그먼트를 방출시키고, BoNT/C1은 또한 카복실-말단 근처의 SNAP-25를 절단한다. 보툴리눔 혈청형 BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F 및 BoNT/G, 및 파상풍 독소는 VAMP의 보존된 중심 부분상에서 작용하고, VAMP의 아미노-말단 부분을 세포질로 방출시킨다. BoNT/C1은 세포질 막 표면 근처의 단일 부위에서 신탁신을 절단한다. 시냅스 SNARE의 선택적 단백질분해는 생체내에서 클로스트리디움 독소에 의해 야기되는 신경전달물질 방출의 차단을 책임진다. 클로스트리디움 독소의 SNARE 단백질 표적은 다양한 비-뉴런 유형에서의 세포외배출에 대해 흔하며, 이러한 세포에서, 뉴런에서와 마찬가지로, 경쇄 펩티다제 활성은 세포외배출을 억제하며, 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Yann Humeau et al., How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release, 82(5) Biochimie. 427-446 (2000); Kathryn Turton et al., Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558. (2002); Giovanna Lalli et al., The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons, 11(9) Trends Microbiol. 431-437, (2003)]을 참조할 수 있다.본 발명의 한 양상에서, 변형된 클로스트리디움 독소는, 부분적으로, 단일-사슬 변형된 클로스트리디움 독소 및 이-사슬 변형된 클로스트리디움 독소를 포함한다. 상기 논의된 바와 같이, 자연 발생적이거나 비-자연발생적이건 간에 클로스트리디움 독소는 처음에 단일-사슬 폴리펩타이드로 합성된다. 이러한 단일-사슬 형태는 이후에 이황화 브리지를 형성하는 2개의 시스테인 잔기 사이에 생성된 별개의 이-사슬 루프 영역 내에 위치된 프로테아제 절단 부위에서 프로테아제에 의해 절단된다. 이러한 번역후 공정은 경쇄(LC) 및 중쇄를 포함하는 이-사슬 분자를 생성시킨다. 본원에서 사용되는 용어 "이-사슬 루프 영역"은 LC 도메인과 HC 도메인 사이에 위치된 이황화 브리지에 의해 형성된 자연 발생 또는 비-자연 발생 클로스트리디움 독소의 루프 영역을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "단일-사슬 변형된 클로스트리디움 독소"는 단일-사슬 형태인 본 발명의 명세서에 개시된 임의의 변형된 클로스트리디움 독소를 의미하며, 즉, 이러한 독소는 이-사슬 루프 영역 내에 위치된 프로테아제 절단 부위에서 이의 동족 프로테아제에 의해 절단되지 않은 상태이다. 본원에서 사용되는 용어 "이-사슬 변형된 클로스트리디움 독소"는 이-사슬 형태인 본 발명의 명세서에 개시된 임의의 변형된 클로스트리디움 독소를 의미하며, 즉, 이러한 독소는 이-사슬 루프 영역 내에 위치된 프로테아제 절단 부위에서 이의 동족 프로테아제에 의해 절단된 상태이다.본 발명의 양상은, 부분적으로, 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다. 본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드 분자"는 "핵산 분자"와 동의어이며, 이는 뉴클레오타이드의 중합체 형태, 예를 들어, 임의의 길이의 리보뉴클레오타이드 및 데옥시리보뉴클레오타이드를 의미한다. 유용한 폴리뉴클레오타이드 분자는, 비제한적인 예로, 자연 발생 및 비-자연 발생 DNA 분자 및 자연 발생 및 비-자연 발생 RNA 분자를 포함한다. 자연 발생 및 비-자연 발생 DNA 분자의 비제한적인 예는 단일가닥 DNA 분자, 이중가닥 DNA 분자, 유전체 DNA 분자, cDNA 분자, 벡터 작제물, 예를 들어, 플라스미드 작제물, 파지미드 작제물, 박테리오파지 작제물, 레트로바이러스 작제물 및 인공 염색체 작제물을 포함한다. 자연 발생 및 비-자연 발생 RNA 분자의 비제한적인 예는 단일가닥 RNA, 이중가닥 RNA 및 mRNA를 포함한다.본 발명의 명세서에 개시된 변형된 클로스트리디움 독소를 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 제조하는데 필요할 수 있는 널리 확립된 분자생물학 기술은, 비제한적인 예로, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR) 증폭, 제한 효소 반응, 아가로스 겔 전기영동, 핵산 결찰, 박테리아 형질전환, 핵산 정제, 핵산 서열분석 및 재조합-기반 기술을 포함하는 절차를 포함하며, 이는 당업자의 기술 범위 내에서 통상적이고 잘 확립되어 있고, 본원에 교시되어 있다. 변형된 클로스트리디움 독소를 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 제조하는데 필요한 특정 프로토콜의 비제한적인 예는, 예를 들어, 문헌[MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, 위에 기재됨, (2001); 및 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Frederick M. Ausubel et al., eds. John Wiley 0026# Sons, 2004)]에 기재되어 있다. 추가로, 변형된 클로스트리디움 독소를 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 제조하는데 유용한 다양한 시판되는 제품이 널리 이용가능하다. 상기 프로토콜은 당업자의 기술 범위 내에서 통상적인 절차이고, 본 발명에 교시되어 있다.본 발명의 명세서에 개시된 방법은, 부분적으로, 열린 해독 틀을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "열린 해독 틀"은 "ORF"와 동의어이며, 이는 단백질 또는 단백질의 일부를 엔코딩하는 임의의 폴리뉴클레오타이드 분자를 의미한다. 열린 해독 틀은 보통 시작 코돈(예를 들어, 표준 코드에서 RNA 분자에 대해 AUG이고, DNA 분자에서 ATG로 대표됨)으로 시작하며, 이는 프레임이 정지 코돈(예를 들어, 표준 코드에서 RNA 분자에 대해 UAA, UGA 또는 UAG이고, DNA 분자에서 TAA, TGA 또는 TAG로 대표됨)으로 종료될 때까지 코돈-트리플렛(codon-triplet)으로 판독된다. 본원에서 사용되는 용어 "코돈"은 단백질 합성 동안 특정 아미노산을 특정하는 폴리뉴클레오타이드 분자 내의 3개의 뉴클레오타이드의 서열을 의미하며, 이는 또한 트리플렛 또는 코돈-트리플렛으로 언급된다.본 발명의 명세서에 개시된 방법은, 부분적으로, 발현 작제물을 포함한다. 발현 작제물은 세포 또는 세포-비함유 추출물에서 폴리뉴클레오타이드 분자의 발현에 유용한 발현 벡터에 작동가능하게 연결된 본 발명의 명세서에 개시된 열린 해독 틀을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함한다. 비제한적인 예로, 바이러스 발현 벡터; 원핵생물 발현 벡터; 진핵생물 발현 벡터, 예를 들어, 효소 발현 벡터, 곤충 발현 벡터 및 포유동물 발현 벡터; 및 세포-비함유(시험관내) 발현 벡터를 포함하는 매우 다양한 발현 벡터가 본 발명의 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현시키는데 이용될 수 있다. 상기 방법의 양상을 실시하는데 유용한 발현 벡터는 항시성(constitutive), 조직-특이적, 세포-특이적 또는 유도성(inducible) 프로모터 구성요소, 인핸서 구성요소 또는 둘 모두의 조절 하에서 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현하는 것을 포함할 수 있음이 추가로 이해된다. 상기 발현 벡터로부터의 발현 작제물을 제조하고 이용하기 위한 잘 확립된 시약 및 조건과 함께 발현 벡터의 비제한적인 예는, 비제한적인 예로, 캘리포니아주의 팰러앨토시에 소재한 BD Biosciences-Clontech; 캘리포니아주의 샌디에이고시에 소재한 BD Biosciences Pharmingen; 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 Invitrogen, Inc; EMD Biosciences-Novagen, Madison, Wl; 캘리포니아주의 발렌시아시에 소재한 QIAGEN, Inc.; 및 캘리포니아주의 라호아주에 소재한 Stratagene을 포함하는 공급업체로부터 용이하게 이용가능하다. 적절한 발현 벡터의 선택, 제조 및 이용은 당업자의 기술 범위 내에서의 통상적인 절차이고, 본원에 교시되어 있다.본 발명의 명세서에 개시된 발현 작제물은 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함할 수 있으며, 상기 외인성 프로테아제 절단 부위의 절단은 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시킨다. 이러한 구체예의 양상에서, 바이러스 발현 벡터는 이-사슬 루프 내에 위치된 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 작동가능하게 연결되고; 원핵생물 발현 벡터는 이-사슬 루프 내에 위치된 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 작동가능하게 연결되고; 효모 발현 벡터는 이-사슬 루프 내에 위치된 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 작동가능하게 연결되고; 곤충 발현 벡터는 이-사슬 루프 내에 위치된 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 작동가능하게 연결되고; 포유생물 발현 벡터는 이-사슬 루프 내에 위치된 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 작동가능하게 연결된다. 이러한 구체예의 다른 양상에서, 본 발명의 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현시키는데 적합한 발현 작제물은 세포-비함유 추출물을 이용하여 발현될 수 있다. 이러한 구체예의 한 양상에서, 세포-비함유 발현 벡터는 이-사슬 루프 내에 위치된 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 작동가능하게 연결된다.한 구체예에서, 본 발명의 명세서에 개시된 발현 작제물은 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 클로스트리디움 독소를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함할 수 있다. 이러한 구체예의 양상에서, 본 발명의 명세서에 개시된 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 클로스트리디움 독소 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 클로스트리디움 독소를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함할 수 있다. 이러한 구체예의 양상에서, 단일-사슬 클로스트리디움 독소는, 1) 클로스트리디움 효소 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역, 클로스트리디움 전위 도메인 및 클로스트리디움 결합 도메인; 2) 클로스트리디움 효소 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역, 클로스트리디움 결합 도메인 및 클로스트리디움 전위 도메인; 3) 클로스트리디움 결합 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역 및 클로스트리디움 독소 효소 도메인; 4) 클로스트리디움 결합 도메인, 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역 및 클로스트리디움 독소 전위 도메인; 5) 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역, 클로스트리디움 독소 효소 도메인 및 클로스트리디움 결합 도메인; 또는 6) 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역, 클로스트리디움 결합 도메인 및 클로스트리디움 독소 효소 도메인의 선형의 아미노로부터 카복실로의 순서를 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은, 1) BoNT/A 독소 효소 도메인, BoNT/A 전위 도메인, BoNT/A 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 2) BoNT/B 효소 도메인, BoNT/B 전위 도메인, BoNT/B 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 3) BoNT/C1 효소 도메인, BoNT/C1 전위 도메인, BoNT/C1 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 4) BoNT/D 효소 도메인, BoNT/D 전위 도메인, BoNT/D 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 5) BoNT/E 효소 도메인, BoNT/E 전위 도메인, BoNT/E 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 6) BoNT/F 효소 도메인, BoNT/F 전위 도메인, BoNT/F 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 7) BoNT/G 효소 도메인, BoNT/G 전위 도메인, BoNT/G 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 8) TeNT 효소 도메인, TeNT 전위 도메인, TeNT 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 9) BaNT 효소 도메인, BaNT 전위 도메인, BaNT 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 10) BuNT 효소 도메인, BuNT 전위 도메인, BuNT 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 추가의 다른 양상에서, 발현 작제물은, 1) BoNT/A 독소 효소 도메인, BoNT/A 전위 도메인, BoNT/A 결합 도메인, 및 TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 2) BoNT/B 효소 도메인, BoNT/B 전위 도메인, BoNT/B 결합 도메인, 및 TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 3) BoNT/C1 효소 도메인, BoNT/C1 전위 도메인, BoNT/C1 결합 도메인, 및 TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 4) BoNT/D 효소 도메인, BoNT/D 전위 도메인, BoNT/D 결합 도메인, 및 TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 5) BoNT/E 효소 도메인, BoNT/E 전위 도메인, BoNT/E 결합 도메인, 및 TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 6) BoNT/F 효소 도메인, BoNT/F 전위 도메인, BoNT/F 결합 도메인, 및 TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 7) BoNT/G 효소 도메인, BoNT/G 전위 도메인, BoNT/G 결합 도메인, 및 TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 8) TeNT 효소 도메인, TeNT 전위 도메인, TeNT 결합 도메인, 및 TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 9) BaNT 효소 도메인, BaNT 전위 도메인, BaNT 결합 도메인, 및 TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 10) BuNT 효소 도메인, BuNT 전위 도메인, BuNT 결합 도메인, 및 TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 상기 클로스트리디움 독소의 예는, 예를 들어, 문헌[J. Oliver Dolly, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허 제7,132,529호; J. Oliver Dolly, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허 제7,419,676호; Lance Steward, et al., Leucine-Based Motifs and Clostridial Neurotoxins, 미국 특허 제6,903,187호; Lance Steward, et al., Leucine-Based Motifs and Clostridial Neurotoxins, 미국 특허 제7,393,925호; Wei-Jen Lin, et al., Neurotoxins with Enhanced Target Specificity, 미국 특허 제7,273,722호; Lance Steward, et al., Modified Botulinum Neurotoxins, 미국 특허 제7,491,799호; Lance E. Steward, et al., Optimized Expression of Active Botulinum Toxin Type E, 미국 특허 공개 공보 제2008/0138893호; Ester Fernandez-Salas, et al., Optimized Expression of Active Botulinum Toxin Type A, 미국 특허 공개 공보 제2008/0057575호]에 기재되어 있으며, 상기 문헌 각각의 전체내용은 참조로서 본원에 포함된다.또 다른 구체예에서, 본 발명의 명세서에 개시된 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 비-클로스트리디움 독소 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함할 수 있다. 이러한 구체예의 양상에서, 단일-사슬 단백질은, 1) 클로스트리디움 효소 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역, 클로스트리디움 전위 도메인 및 비-클로스트리디움 결합 도메인; 2) 클로스트리디움 효소 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역, 비-클로스트리디움 결합 도메인 및 클로스트리디움 전위 도메인; 3) 비-클로스트리디움 결합 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역 및 클로스트리디움 독소 효소 도메인; 4) 비-클로스트리디움 결합 도메인, 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역 및 클로스트리디움 독소 전위 도메인; 5) 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역, 클로스트리디움 독소 효소 도메인 및 비-클로스트리디움 결합 도메인; 또는 6) 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역, 비-클로스트리디움 결합 도메인 및 클로스트리디움 독소 효소 도메인의 선형의 아미노로부터 카복실로의 순서를 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 아편유사제 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다. 이러한 구체예의 추가 양상에서, 발현 작제물은, 1) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 엔케팔린 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 2) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 소 부신수질-22 (BAM22) 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 3) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 엔도몰핀 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 4) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 엔돌핀 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 5) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 다이놀핀 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 6) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 노시셉틴 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 7) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 헤몰핀 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 또는 8) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 리몰핀 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 멜라노코르틴 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다. 이러한 구체예의 추가 양상에서, 발현 작제물은, 1) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 멜라닌세포 자극 호르몬 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 2) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 아드레노코르티코트로핀 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 또는 3) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 리포트로핀 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 갈라닌 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다. 이러한 구체예의 추가 양상에서, 발현 작제물은, 1) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 갈라닌 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 또는 2) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 갈라닌 메세지-관련 펩타이드(GMAP) 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 그라닌 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다. 이러한 구체예의 추가 양상에서, 발현 작제물은, 1) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 크로모그라닌 A 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 2) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 크로모그라닌 B 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 또는 3) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 크로모그라닌 C 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 타키키닌 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다. 이러한 구체예의 추가 양상에서, 발현 작제물은, 1) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 물질 P 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 2) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 신경펩타이드 K 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 3) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 신경펩타이드 감마 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 4) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 뉴로키닌 A 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 5) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 헤모키닌 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 또는 6) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 엔도키닌 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 신경펩타이드 Y 관련 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다. 이러한 구체예의 추가 양상에서, 발현 작제물은, 1) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 뉴로펩타이드 Y(NPY) 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 2) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 펩타이드 YY(PYY) 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 3) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 췌장 펩타이드(Pancreatic peptide: PP) 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 또는 4) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 췌장 이코사펩타이드(Pancreatic icosapeptide: PIP) 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 신경호르몬 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다. 이러한 구체예의 추가 양상에서, 발현 작제물은, 1) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 코르티코트로핀-방출 호르몬(corticotropin-releasing hormone: CCRH) 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 2) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone: PTH) 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 3) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 갑상선자극호르몬-방출 호르몬(thyrotropin-releasing hormone: TRH) 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 또는 4) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 소마토스타틴 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 사이토카인 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다. 이러한 구체예의 추가 양상에서, 발현 작제물은, 1) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 섬모 신경영양 인자(ciliary neurotrophic factor: CNTF) 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 2) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 글리코포린-A(glycophorin-A: GPA) 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 3) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 백혈병 억제 인자(LIF) 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 4) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 인터루킨(interleukin: IL) 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 5) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 온코스타틴 M 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 6) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 카디오트로핀-1(cardiotrophin-1: CT-1) 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 7) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 카디오트로핀-유사 사이토카인(cardiotrophin-like cytokine: CLC) 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 8) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 뉴로루킨 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 키닌 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다. 이러한 구체예의 추가 양상에서, 발현 작제물은, 1) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 브라디키닌 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 2) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 칼리딘 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 3) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, desArg9 브라디키닌 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 또는 4) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, desArg10 브라디키닌 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 섬유모세포 성장 인자(Fibroblast growth factor: FGF) 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다. 이러한 구체예의 추가 양상에서, 발현 작제물은, 1) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, FGF-1 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 2) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, FGF-2 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 3) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, FGF-4 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 4) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, FGF-8 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 5) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, FGF-9 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 6) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, FGF-17 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 또는 4) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, FGF-18 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 뉴로트로핀 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다. 이러한 구체예의 추가 양상에서, 발현 작제물은, 1) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 신경 성장 인자(nerve growth factor: NGF) 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 2) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 뇌 유래 신경영양 인자(brain derived neurotrophic factor: BDNF) 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 3) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 뉴로트로핀-3(neurotrophin-3: NT-3) 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 4) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 뉴로트로핀-4/5(NT-4/5) 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 또는 5) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 헤드 활성제 펩타이드(head activator peptide: HA) 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor: TNF) 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 아교세포 유래 성장 인자(Glial derived growth factor: GDNF) 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다. 이러한 구체예의 추가 양상에서, 발현 작제물은, 1) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 뉴르투린(neurturin) 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 2) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 퍼세프린(persephrin) 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 또는 3) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 아르테민(artemin) 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 전환 성장 인자 β(Transformation growth factor β: TGFβ) 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다. 이러한 구체예의 추가 양상에서, 발현 작제물은, 1) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, TGFβ1 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 2) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, TGFβ2 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 3) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, TGFβ3 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 또는 4) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, TGFβ4 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 골 형태형성 단백질 β(Bone morphoge netic protein β: BMP) 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다. 이러한 구체예의 추가 양상에서, 발현 작제물은, 1) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, BMP2 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 2) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, BMP3 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 3) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, BMP4 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 4) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, BMP5 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 5) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, BMP6 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 6) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, BMP7 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 7) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, BMP8 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 또는 8) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, BMP10 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 성장 분화 인자 β(Growth differentiation factor β: GDF) 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다. 이러한 구체예의 추가 양상에서, 발현 작제물은, 1) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, GDF1 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 2) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, GDF2 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 3) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, GDF3 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 4) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, GDF5 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 5) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, GDF6 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 6) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, GDF7 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 7) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, GDF8 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 8) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, GDF10 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 9) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, GDF11 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 또는 10) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, GDF15 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 액티빈 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다. 이러한 구체예의 추가 양상에서, 발현 작제물은, 1) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 액티빈 A 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 2) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 액티빈 B 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 3) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 액티빈 C 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 4) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 액티빈 E 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 또는 5) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 인히빈 A 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 혈관 내피 성장 인자(Vascular endothelial growth factor: VEGF) 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 인슐린 성장 인자(insulin growth factor: IGF) 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다. 이러한 구체예의 추가 양상에서, 발현 작제물은, 1) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, IGF-1 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 또는 2) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, IGF-2 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 표피 성장 인자(Epidermal growth factor: EGF) 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 글루카곤 유사 호르몬 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다. 이러한 구체예의 추가 양상에서, 발현 작제물은, 1) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 세크레틴 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 또는 2) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 글루카곤-유사 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성화 펩타이드(Pituitary adenylate cyclase activating peptide: PACAP) 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 성장호르몬-방출 호르몬(Growth hormone-releasing hormone: GHRH) 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 성장호르몬-방출 호르몬(GHRH) 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 혈관작용성 장 펩타이드(Vasoactive intestinal peptide: VIP) 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다. 이러한 구체예의 추가 양상에서, 발현 작제물은, 1) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, VIP1 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 또는 2) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, VIP2 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 위 억제 폴리펩타이드(Gastric inhibitory polypeptide: GIP) 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 칼시토닌-관련 펩티데스비세랄 장 펩타이드 결합 도메인(calcitonin-related peptidesvisceral gut peptide binding domain), 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다. 이러한 구체예의 추가 양상에서, 발현 작제물은, 1) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 가스트린 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 2) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 가스트린-방출 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 또는 3) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 콜레시스토키닌(cholecystokinin: CCK) 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 프로테아제 활성화 수용체(protease activated receptor: PAR) 펩타이드 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다. 이러한 구체예의 추가 양상에서, 발현 작제물은, 1) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, PAR1 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 2) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, PAR2 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 3) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, PAR3 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역; 또는 4) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, PAR3 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 상기 단백질의 예는, 예를 들어, 문헌[J. Oliver Dolly, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허 제7,132,529호; J. Oliver Dolly, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허 제7,419,676호; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, 미국 특허 제7,514,088호; Keith A. Foster et al., Re-targeted Toxin Conjugates, 국제 특허 공개 공보 제WO 2005/023309호; Lance E. Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허 공개 공보 제2008/0032930호; Lance E. Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허 공개 공보 제2008/0032931호; Lance E. Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허 공개 공보 제2008/0161226호; Lance E. Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허 공개 공보 제2008/0221012호; Lance E. Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허 공개 공보 제2009/0004224호; Lance E. Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허 공개 공보 제2009/0005313호; Lance E. Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허 공개 공보 제2009/0018081호; Lance E. Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허 공개 공보 제2009/0069238호; 및 Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, 미국 특허 공개 공보 제2009/0048431호]에 기재되어 있고, 상기 문헌 각각은 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.또 다른 구체예에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 및 통합된 프로테아제 절단 부위-결합 도메인을 포함하는 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다. 이러한 구체예의 양상에서, 단일-사슬 단백질은, 1) 통합된 프로테아제 절단 부위-결합 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인 및 클로스트리디움 독소 효소 도메인; 2) 통합된 프로테아제 절단 부위-결합 도메인, 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 및 클로스트리디움 독소 전위 도메인; 3) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 통합된 프로테아제 절단 부위-결합 도메인, 및 클로스트리디움 독소 전위 도메인; 4) 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 통합된 프로테아제 절단 부위-결합 도메인, 및 클로스트리디움 독소 효소 도메인; 5) 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 및 통합된 프로테아제 절단 부위-결합 도메인; 및 6) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 및 통합된 프로테아제 절단 부위-결합 도메인의 선형의 아미노로부터 카복실로의 순서를 포함한다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-아편유사제 결합 도메인을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다. 이러한 구체예의 추가 양상에서, 발현 작제물은, 1) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-엔케팔린 결합 도메인; 2) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-소 부신수질-22(BAM22) 결합 도메인; 3) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-엔도몰핀 결합 도메인; 4) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-엔돌핀 결합 도메인; 5) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-다이놀핀 결합 도메인; 6) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-노시셉틴 결합 도메인; 7) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-헤몰핀 결합 도메인; 또는 8) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-리몰핀 결합 도메인을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다.통합된 프로테아제 절단 부위-결합 도메인을 포함하는 상기 단백질의 예는, 예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 동반 특허 출원[Sanjiv Ghanshani, et al., Modified Clostridial Toxins Comprising an Integrated Protease Cleavage Site-Binding Domain]에 기재되어 있다.본 발명의 명세서에 개시된 발현 작제물은 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함할 수 있다. 이러한 구체예의 양상에서, 바이러스 발현 벡터가 프로테아제를 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 작동가능하게 연결되고; 원핵생물 발현 벡터가 프로테아제를 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 작동가능하게 연결되며; 효모 발현 벡터가 프로테아제를 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 작동가능하게 연결되고; 곤충 발현 벡터가 프로테아제를 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 작동가능하게 연결되며; 포유동물 발현 벡터가 프로테아제를 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 작동가능하게 연결된다. 이러한 구체예의 다른 양상에서, 본 발명의 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현하는데 적합한 발현 작제물은 세포-비함유 추출물을 이용하여 발현될 수 있다. 이러한 구체예의 한 양상에서, 세포-비함유 추출물 발현 벡터는 프로테아제를 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 작동가능하게 연결된다.이러한 구체예의 양상에서, 열린 해독 틀을 포함하는 발현 벡터는 엔테로키나제, 인간 리노바이러스 3C 프로테아제, 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제, 담배 식각 바이러스(tobacco etch virus: TEV) 프로테아제, 담배 베인 모틀링 바이러스(Tobacco Vein Mottling Virus: TVMV) 프로테아제, 서브틸리신 프로테아제, 또는 카스파제 3 프로테아제를 엔코딩한다. 엔테로키나제 프로테아제 및 이를 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자의 예는, 예를 들어, 각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Edward R. LaVallie, Cloning of Enterokinase and Method of Use, 미국 특허 제5,665,566호; Edward R. LaVallie, Cloning of Enterokinase and Method of Use, 미국 특허 제6,746,859호]에 기재되어 있다. 서브틸리신 프로테아제(subtilisin protease) 및 이를 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자의 예는, 예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Donn N. Rubingh, et al., Subtillisin Protease Variants having Amino Acid Deletions and Substitutions in Defined Epitope Regions, 미국 특허 제6,586,224호]에 기재되어 있다.이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 엔테로키나제는 서열번호 11이다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 엔테로키나제는 서열번호 11의 아미노산 239-1035를 포함한다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 엔테로키나제는 자연 발생 엔테로키나제 변이체, 예를 들어, 엔테로키나제 아이소형(isoform)이다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 엔테로키나제는 비-자연 발생 엔테로키나제 변이체, 예를 들어, 보존성 엔테로키나제 변이체, 비-보존성 엔테로키나제 변이체, 엔테로키나제 키메라, 활성 엔테로키나제 단편, 또는 이의 임의의 조합물이다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 엔테로키나제는 미국 특허 제5,665,566호 또는 미국 특허 제6,746,859호에 개시된 것이다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 엔테로키나제, 자연 발생 엔테로키나제 변이체, 또는 비-자연 발생 엔테로키나제 변이체는 포유동물, 예를 들어, 인간, 소, 또는 설치류의 종으로부터 수득된다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 엔테로키나제는, 예를 들어, 서열번호 11에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 서열번호 11에 대해 많아야 70%, 많아야 75%, 많아야 80%, 많아야 85%, 많아야 90% 또는 많아야 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 엔테로키나제는, 예를 들어, 서열번호 11에 비해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 서열번호 11에 비해 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 엔테로키나제는, 예를 들어, 서열번호 11에 비해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 서열번호 11에 비해 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 인간 리노바이러스 3C 프로테아제는 서열번호 12이다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 인간 리노바이러스 3C 프로테아제는 자연 발생 인간 리노바이러스 3C 프로테아제 변이체, 예를 들어, 인간 리노바이러스 3C 프로테아제 아이소형이다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 인간 리노바이러스 3C 프로테아제는 비-자연 발생 인간 리노바이러스 3C 프로테아제 변이체, 예를 들어, 보존성 인간 리노바이러스 3C 프로테아제 변이체, 비-보존성 인간 리노바이러스 3C 프로테아제 변이체, 인간 리노바이러스 3C 프로테아제 키메라, 활성 인간 리노바이러스 3C 프로테아제 단편, 또는 이의 임의의 조합물이다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 인간 리노바이러스 3C 프로테아제, 자연 발생 인간 리노바이러스 3C 프로테아제 변이체, 또는 비-자연 발생 인간 리노바이러스 3C 프로테아제 변이체는 리노바이러스의 종으로부터 수득된다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 인간 리노바이러스 3C 프로테아제는, 예를 들어, 서열번호 12에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 서열번호 12에 대해 많아야 70%, 많아야 75%, 많아야 80%, 많아야 85%, 많아야 90% 또는 많아야 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 인간 리노바이러스 3C 프로테아제는, 예를 들어, 서열번호 12에 비해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 서열번호 12에 비해 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 인간 리노바이러스 3C 프로테아제는, 예를 들어, 서열번호 12에 비해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 서열번호 12에 비해 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제는 서열번호 13이다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제는 자연 발생 인간 에테로바이러스 3C 프로테아제 변이체, 예를 들어, 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제 아이소형이다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제는 비-자연 발생 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제 변이체, 예를 들어, 보존성 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제 변이체, 비-보존성 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제 변이체, 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제 키메라, 활성 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제 단편, 또는 이의 임의의 조합물이다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제, 자연 발생 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제 변이체, 또는 비-자연 발생 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제 변이체는 엔테로바이러스의 종으로부터 수득된다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제는, 예를 들어, 서열번호 13에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 서열번호 13에 대해 많아야 70%, 많아야 75%, 많아야 80%, 많아야 85%, 많아야 90% 또는 많아야 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제는, 예를 들어, 서열번호 13에 비해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 서열번호 13에 비해 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제는, 예를 들어, 서열번호 13에 비해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 서열번호 13에 비해 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.이러한 구체예의 또 다른 양상에서, TEV 프로테아제는 서열번호 14이다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, TEV 프로테아제는 서열번호 14의 아미노산 2038-2270을 포함한다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, TEV 프로테아제는 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 또는 서열번호 23을 포함한다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, TEV 프로테아제는 자연 발생 TEV 프로테아제 변이체, 예를 들어, TEV 프로테아제 아이소형이다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, TEV 프로테아제는 비-자연 발생 TEV 프로테아제 변이체, 예를 들어, 보존성 TEV 프로테아제 변이체, 비-보존성 TEV 프로테아제 변이체, TEV 프로테아제 키메라, 활성 TEV 프로테아제 단편, 또는 이의 임의의 조합물이다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, TEV 프로테아제, 자연 발생 TEV 프로테아제 변이체, 또는 비-자연 발생 TEV 프로테아제 변이체는 포티바이러스의 종으로부터 수득된다.이러한 구체예의 다른 양상에서, TEV 프로테아제는, 예를 들어, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 또는 서열번호 23에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 또는 서열번호 23에 대해 많아야 70%, 많아야 75%, 많아야 80%, 많아야 85%, 많아야 90% 또는 많아야 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, TEV 프로테아제는, 예를 들어, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 또는 서열번호 23에 비해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 또는 서열번호 23에 비해 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, TEV 프로테아제는, 예를 들어, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 또는 서열번호 23에 비해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 또는 서열번호 23에 비해 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.이러한 구체예의 또 다른 양상에서, TVMV 프로테아제는 서열번호 24이다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, TEV 프로테아제는 서열번호 24의 아미노산 2002-2236을 포함한다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, TVMV 프로테아제는 자연 발생 TVMV 프로테아제 변이체, 예를 들어, TVMV 프로테아제 아이소형이다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, TVMV 프로테아제는 비-자연 발생 TVMV 프로테아제 변이체, 예를 들어, 보존성 TVMV 프로테아제 변이체, 비-보존성 TVMV 프로테아제 변이체, TVMV 프로테아제 키메라, 활성 TVMV 프로테아제 단편, 또는 이의 임의의 조합물이다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, TVMV 프로테아제, 자연 발생 TVMV 프로테아제 변이체, 또는 비-자연 발생 TVMV 프로테아제 변이체는 포티바이러스의 종으로부터 수득된다.이러한 구체예의 다른 양상에서, TVMV 프로테아제는, 예를 들어, 서열번호 24 또는 서열번호 24의 아미노산 2002-2236에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 서열번호 24 또는 서열번호 24의 아미노산 2002-2236에 대해 많아야 70%, 많아야 75%, 많아야 80%, 많아야 85%, 많아야 90% 또는 많아야 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, TVMV 프로테아제는, 예를 들어, 서열번호 24 또는 서열번호 24의 아미노산 2002-2236에 비해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 서열번호 24 또는 서열번호 24의 아미노산 2002-2236에 비해 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, TVMV 프로테아제는, 예를 들어, 서열번호 24 또는 서열번호 24의 아미노산 2002-2236에 비해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 서열번호 24 또는 서열번호 24의 아미노산 2002-2236에 비해 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 서브틸리신 프로테아제는 서열번호 25이다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 서브틸리신 프로테아제는 서열번호 25의 아미노산 107-365를 포함한다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 서브틸리신 프로테아제는 자연 발생 서브틸리신 프로테아제 변이체, 예를 들어, 서브틸리신 프로테아제 아이소형이다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 서브틸리신 프로테아제는 비-자연 발생 서브틸리신 프로테아제 변이체, 예를 들어, 보존성 서브틸리신 프로테아제 변이체, 비-보존성 서브틸리신 프로테아제 변이체, 서브틸리신 프로테아제 키메라, 활성 서브틸리신 프로테아제 단편, 또는 이의 임의의 조합물이다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 서브틸리신 프로테아제, 자연 발생 서브틸리신 프로테아제 변이체, 또는 비-자연 발생 서브틸리신 프로테아제 변이체는 바실러스의 종으로부터 수득된다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 서브틸리신 프로테아제는, 예를 들어, 서열번호 25 또는 서열번호 25의 아미노산 107-365에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 서열번호 25 또는 서열번호 25의 아미노산 107-365에 대해 많아야 70%, 많아야 75%, 많아야 80%, 많아야 85%, 많아야 90% 또는 많아야 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 서브틸리신 프로테아제는, 예를 들어, 서열번호 25 또는 서열번호 25의 아미노산 107-365에 비해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 서열번호 25 또는 서열번호 25의 아미노산 107-365에 비해 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 서브틸리신 프로테아제는, 예를 들어, 서열번호 25 또는 서열번호 25의 아미노산 107-365에 비해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 서열번호 25 또는 서열번호 25의 아미노산 107-365에 비해 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 카스파제 3 프로테아제는 서열번호 26이다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 카스파제 3 프로테아제는 자연 발생 카스파제 3 프로테아제 변이체, 예를 들어, 카스파제 3 프로테아제 아이소형이다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 카스파제 3 프로테아제는 비-자연 발생 카스파제 3 프로테아제 변이체, 예를 들어, 보존성 카스파제 3 프로테아제 변이체, 비-보존성 카스파제 3 프로테아제 변이체, 카스파제 3 프로테아제 키메라, 활성 카스파제 3 프로테아제 단편, 또는 이의 임의의 조합물이다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 카스파제 3 프로테아제, 자연 발생 카스파제 3 프로테아제 변이체, 또는 비-자연 발생 카스파제 3 프로테아제 변이체는 포유동물, 예를 들어, 인간, 소, 또는 설치류의 종으로부터 수득된다.이러한 구체예의 다른 양상에서, 카스파제 3 프로테아제는, 예를 들어, 서열번호 26에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 서열번호 26에 대해 많아야 70%, 많아야 75%, 많아야 80%, 많아야 85%, 많아야 90% 또는 많아야 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 카스파제 3 프로테아제는, 예를 들어, 서열번호 26에 비해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 서열번호 26에 비해 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 비-연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 카스파제 3 프로테아제는, 예를 들어, 서열번호 26에 비해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 서열번호 26에 비해 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100개의 연속적 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.본 발명의 명세서에 개시된 방법은 부분적으로 이중 발현 작제물을 포함한다. 이중 발현 작제물은 2개의 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하며, 이러한 폴리뉴클레오타이드 분자 각각은 세포 또는 세포-비함유 추출물에서 둘 모두의 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현시키는데 유용한 발현 벡터에 작동가능하게 연결된 본 발명의 명세서에 개시된 열린 해독 틀을 포함한다. 비제한적인 예로, 바이러스 이중 발현 벡터; 원핵생물 이중 발현 벡터; 진핵생물 이중 발현 벡터, 예를 들어, 효모 이중 발현 벡터, 곤충 이중 발현 벡터 및 포유동물 이중 발현 벡터; 및 세포-비함유 추출물 이중 발현 벡터를 포함하는 매우 다양한 이중 발현 벡터가 본 발명의 명세서에 개시된 뉴클레오타이드 분자를 발현시키는데 이용될 수 있다. 이러한 방법의 양상을 실시하는데 유용한 이중 발현 벡터는 항시성, 조직-특이적, 세포-특이적 또는 유도성 프로모터 구성요소, 인핸서 구성요소 또는 둘 모두의 조절 하에서 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현하는 것을 포함할 수 있음이 추가로 이해된다. 상기 발현 벡터로부터의 발현 작제물을 제조하고 이용하기 위한 잘 확립된 시약 및 조건과 함께 이중 발현 벡터의 비제한적인 예는, 비제한적인 예로, 위스콘신주의 매디슨시에 소재한 EMD Biosciences-Novagen을 포함하는 공급업체로부터 용이하게 이용가능하다. 적절한 이중 발현 벡터의 선택, 제조 및 이용은 당업자의 기술 범위 내에서의 통상적인 절차이고, 본원에 교시되어 있다.본 발명의 명세서에 개시된 이중 발현 작제물은 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀, 및 이-사슬 루프 내에 위치된 외인성 프로테아제 절단 부위를 절단함으로써 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시킬 수 있는 프로테아제를 엔코딩하는 또 다른 열린 해독 틀을 포함할 수 있다.따라서, 한 구체예에서, 이중 발현 작제물은 본 발명의 명세서에 개시된 바와 같은 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀, 및 본 발명의 명세서에 개시된 바와 같은 이-사슬 루프 내에 위치된 외인성 프로테아제 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제를 엔코딩하는 또 다른 열린 해독 틀을 포함한다.이러한 구체예의 한 양상에서, 이중 발현 작제물은 TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 클로스트리디움 독소를 엔코딩하는 하나의 열린 해독 틀, 및 TEV 프로테아제를 엔코딩하는 또 다른 열린 해독 틀을 포함할 수 있다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 이중 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 클로스트리디움 독소 결합 도메인, 및 TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 클로스트리디움 독소를 엔코딩하는 하나의 열린 해독 틀, 및 TEV 프로테아제를 엔코딩하는 또 다른 열린 해독 틀을 포함할 수 있다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 이중 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 클로스트리디움 독소 결합 도메인, 이-사슬 루프 영역, 및 이-사슬 루프-영역 내에 위치된 TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 클로스트리디움 독소를 엔코딩하는 하나의 열린 해독 틀, 및 TEV 프로테아제를 엔코딩하는 또 다른 열린 해독 틀을 포함할 수 있다.이러한 구체예의 한 양상에서, 이중 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 비-클로스트리디움 독소 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀, 및 이-사슬 루프 영역 내에 위치된 외인성 프로테아제 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제를 엔코딩하는 또 다른 열린 해독 틀을 포함한다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 이중 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 비-클로스트리디움 독소 결합 도메인, 및 TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단백질을 엔코딩하는 하나의 열린 해독 틀, 및 TEV 프로테아제를 엔코딩하는 또 다른 열린 해독 틀을 포함할 수 있다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 이중 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 비-클로스트리디움 독소 결합 도메인, 이-사슬 루프 영역, 및 이-사슬 루프 영역 내에 위치된 TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 단백질을 엔코딩하는 하나의 열린 해독 틀, 및 TEV 프로테아제를 엔코딩하는 또 다른 열린 해독 틀을 포함할 수 있다.이러한 구체예의 한 양상에서, 이중 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 및 통합된 프로테아제 절단 부위-결합 도메인을 포함하는 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함한다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 이중 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-결합 도메인을 포함하는 단백질을 엔코딩하는 하나의 열린 해독 틀, 및 TEV 프로테아제를 엔코딩하는 또 다른 열린 해독 틀을 포함할 수 있다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 이중 발현 작제물은 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 및 TEV 프로테아제 절단 부위가 이-사슬 루프 영역 내에 위치된 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-결합 도메인을 포함하는 단백질을 엔코딩하는 하나의 열린 해독 틀, 및 TEV 프로테아제를 엔코딩하는 또 다른 열린 해독 틀을 포함할 수 있다.이중 발현 작제물 내에 함유된 열린 해독 틀 중 하나의 위치는 둘 모두의 열린 해독 틀로부터의 전사가 여전히 발생할 수 있는 한 다른 열린 해독 틀의 위치에 비해 임의의 순서일 수 있다. 이중 발현 작제물이 제조되는 경우, 첫번째 프로모터 영역으로부터의 전사 개시는 통상적으로 둘 모두의 열린 해독 틀을 전사시키는 반면, 두번째 프로모터 영역으로부터의 전사 개시는 통상적으로 열린 해독 틀 중 하나만 전사시킨다. 따라서, 첫번째 및 두번째 프로모터 영역에 비한 열린 해독 틀의 위치에 따라, 열린 해독 틀 중 하나로부터 두배로 많은 전사체가 만들어질 수 있다.따라서, 한 구체예에서, 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀은 첫번째 프로모터 영역에 의해 제어되는 반면, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀은 첫번째 프로모터 및 두번째 프로모터 영역 둘 모두에 의해 제어된다. 이러한 구체예의 한 양상에서, TEV 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀은 첫번째 프로모터 영역에 의해 제어되는 반면, 이-사슬 루프 영역 내에 위치된 TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 클로스트리디움 독소를 엔코딩하는 열린 해독 틀은 첫번째 프로모터 및 두번째 프로모터 영역 둘 모두에 의해 제어된다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, TEV 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀은 첫번째 프로모터 영역에 의해 제어되는 반면, 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 비-클로스트리디움 독소 결합 도메인, 및 TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀은 첫번째 프로모터 및 두번째 프로모터 영역 둘 모두에 의해 제어된다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, TEV 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀은 첫번째 프로모터 영역에 의해 제어되는 반면, 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 및 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-결합 도메인을 포함하는 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀은 첫번째 프로모터 및 두번째 프로모터 영역 둘 모두에 의해 제어된다.또 다른 구체예에서, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀은 첫번째 프로모터 영역에 의해 제어되는 반면, 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀은 첫번째 프로모터 및 두번째 프로모터 영역 둘 모두에 의해 제어된다. 이러한 구체예의 한 양상에서, TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 클로스트리디움 독소를 엔코딩하는 열린 해독 틀은 첫번째 프로모터 영역에 의해 제어되는 반면, TEV 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀은 첫번째 프로모터 및 두번째 프로모터 영역 둘 모두에 의해 제어된다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 비-클로스트리디움 독소 결합 도메인, 및 TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀은 첫번째 프로모터 영역에 의해 제어되는 반면, TEV 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀은 첫번째 프로모터 및 두번째 프로모터 영역 둘 모두에 의해 제어된다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 및 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-결합 도메인을 포함하는 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀은 첫번째 프로모터 영역에 의해 제어되는 반면, TEV 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀은 첫번째 프로모터 및 두번째 프로모터 영역 둘 모두에 의해 제어된다.이중 발현 작제물 내에 함유된 열린 해독 틀 중 하나의 5'-3' 배향은 둘 모두의 열린 해독 틀로부터 전사가 발생할 수 있는 한 다른 열린 해독 틀의 5'-3' 배향에 비해 임의의 방향으로 존재할 수 있다. 한 구체예에서, 열린 해독 틀 중 하나의 5'-3' 배향은 다른 열린 해독 틀의 5'-3' 배향과 동일 방향으로 존재한다. 또 다른 구체예에서, 열린 해독 틀 중 하나의 5'-3' 배향은 다른 열린 해독 틀의 5'-3' 배향과 반대 배향으로 존재한다. 이러한 구체예의 한 양상에서, 열린 해독 틀 중 하나의 5'-3' 배향은 다른 열린 해독 틀의 5'-3' 배향에 비해 한데 모여있다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 열린 해독 틀 중 하나의 5'-3' 배향은 다른 열린 해독 틀의 5'-3' 배향에 비해 분기(divergent)하여 존재한다.본 발명의 명세서에 개시된 방법은 부분적으로 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단백질을 포함한다. 본원에서 이용되는 용어 "이-사슬 루프 영역"은 클로스트리디움 독소의 단일-사슬 형태를 이-사슬 형태로 전환시키는데 사용되는 프로테아제 절단 부위를 함유하는 클로스트리디움 독소의 아미노산 서열을 의미한다. 클로스트리디움 독소 이-사슬 루프 영역의 비제한적인 예는 서열번호 1의 아미노산 430-454를 포함하는 BoNT/A의 이-사슬 루프 영역; 서열번호 2의 아미노산 437-446을 포함하는 BoNT/B의 이-사슬 루프 영역; 서열번호 3의 아미노산 437-453을 포함하는 BoNT/C1의 이-사슬 루프 영역; 서열번호 4의 아미노산 437-450을 포함하는 BoNT/D의 이-사슬 루프 영역; 서열번호 5의 아미노산 412-426을 포함하는 BoNT/E의 이-사슬 루프 영역; 서열번호 6의 아미노산 429-445를 포함하는 BoNT/F의 이-사슬 루프 영역; 서열번호 7의 아미노산 436-450을 포함하는 BoNT/G의 이-사슬 루프 영역; 서열번호 8의 아미노산 439-467을 포함하는 TeNT의 이-사슬 루프 영역; 서열번호 9의 아미노산 421-435를 포함하는 BaNT의 이-사슬 루프 영역; 및 서열번호 10의 아미노산 412-426을 포함하는 BuNT의 이-사슬 루프 영역을 포함한다(표 2).상기 언급된 바와 같이, 클로스트리디움 독소는 자연-발생 프로테아제에 의해 이황화 루프 내에서의 단백질분해성 절단에 의해 이후에 절단되는 약 150 kDa의 단일-사슬 폴리펩타이드로 번역된다. 이러한 번역후 처리는 하나의 이황화결합 및 비공유적 상호작용에 의해 함께 유지되는 약 50 kDa 경쇄(LC) 및 약 100 kDa 중쇄(HC)를 포함하는 이-사슬 분자를 발생시킨다. 프로테아제의 정체는 현재 공지되어 있지 않으나, 많은 클로스트리디움 독소에 대한 이-사슬 루프 프로테아제 절단 부위는 결정되었다. BoNT에서, K448-A449에서의 절단은 BoNT/A의 단일 폴리펩타이드 형태를 이-사슬 형태로 전환시키고; K441-A442에서의 절단은 BoNT/B의 단일 폴리펩타이드 형태를 이-사슬 형태로 전환시키며; K449-T450에서의 절단은 BoNT/C1의 단일 폴리펩타이드 형태를 이-사슬 형태로 전환시키고; R445-D446에서의 절단은 BoNT/D의 단일 폴리펩타이드 형태를 이-사슬 형태로 전환시키며; R422-K423에서의 절단은 BoNT/E의 단일 폴리펩타이드 형태를 이-사슬 형태로 전환시키고; K439-A440에서의 절단은 BoNT/F의 단일 폴리펩타이드 형태를 이-사슬 형태로 전환시키며; K446-S447에서의 절단은 BoNT/G의 단일 폴리펩타이드 형태를 이-사슬 형태로 전환시킨다. A457-S458에서의 TeNT의 단일 폴리펩타이드 형태의 단백질분해성 절단은 이-사슬 형태를 생성시킨다. K431-N432에서의 BaNT의 단일 폴리펩타이드 형태의 단백질분해성 절단은 이-사슬 형태를 생성시킨다. R422-K423에서의 BuNT의 단일 폴리펩타이드 형태의 단백질분해성 절단은 이-사슬 형태를 생성시킨다. 이러한 이-사슬 루프 프로테아제 절단 부위는 융합 단백질로서 변형된 클로스트리디움 독소에 인-프레임(in-frame)으로 작동가능하게 연결된다. 그러나, 이-사슬 루프 내의 추가 절단 부위가 또한 절단되어 작은 펩타이드 단편의 발생이 상실되는 것으로 보이는 것이 또한 인지되어야 한다. 비제한적인 예로서, BoNT/A 단일-사슬 폴리펩타이드의 절단은 궁극적으로 이-사슬 루프 내의 10개의 아미노산 단편의 상실을 발생시킨다.이-사슬 루프영역을 포함하는 임의의 분자가 개시된 방법에 유용한 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 변형될 수 있는 것이 예견된다. 본원에 개시된 방법에 유용한 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 변형된 이-사슬 루프를 가질 수 있는 분자의 예는, 예를 들어, 각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Keith A. Foster et al., Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions, 미국 특허 제5,989,545호; Clifford C. Shone et al., Recombinant Toxin Fragments, 미국 특허 제6,461,617호; Conrad P. Quinn et al., Methods and Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion, 미국 특허 제6,632,440호; Lance E. Steward et al., Methods And Compositions For The Treatment Of Pancreatitis, 미국 특허 제6,843,998호; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, 미국 특허 제7,244,437호; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, 미국 특허 제7,413,742호; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, 미국 특허 제7,425,338호]을 포함한다.이-사슬 루프 영역은 외인성 프로테아제 절단 부위의 첨가에 의해 변형된다. 본원에서 사용되는 용어 "외인성 프로테아제 절단 부위"는 "비-자연 발생 프로테아제 절단 부위" 또는 "비-자연 프로테아제 절단 부위"와 동의어이며, 이는 자연 발생 클로스트리디움 독소로부터의 이-사슬 루프 영역에 일반적으로 존재하지 않는 프로테아제 절단 부위를 의미한다. 클로스트리디움 독소의 단일-사슬 폴리펩타이드 형태를 이-사슬 형태로 전환시키는데 이용될 수 있는 임의의 및 모든 외인성 프로테아제 절단 부위가 본 발명의 양상을 실시하는데 유용한 것이 예견된다. 외인성 프로테아제 절단 부위의 비제한적인 예는, 예를 들어, 엔테로키나제 프로테아제 절단 부위, 인간 리노바이러스 3C 프로테아제 절단 부위, 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제 절단 부위, 담배 식각 바이러스(TEV) 프로테아제 절단 부위, 담배 베인 모틀링 바이러스(TVMV) 프로테아제 절단 부위, 서브틸리신 프로테아제 절단 부위, 또는 카스파제 3 프로테아제 절단 부위를 포함한다.외인성 프로테아제 절단 부위가 이의 각각의 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 한 임의의 및 모든 길이의 외인성 프로테아제 절단 부위가 본 발명의 양상에 유용할 수 있음이 예견된다. 따라서, 이러한 구체예의 양상에서, 외인성 프로테아제 절단 부위는, 예를 들어, 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 또는 60개의 아미노산; 또는 많아야 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 또는 60개의 아미노산의 길이를 가질 수 있다.한 구체예에서, 이-사슬 루프 영역은 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함한다. 이러한 구체예의 양상에서, 이-사슬 루프 영역은, 예를 들어, 엔테로키나제 프로테아제 절단 부위, 담배 식각 바이러스 프로테아제 절단 부위, 담배 베인 모틀링 바이러스 프로테아제 절단 부위, 인간 리노바이러스 3C 프로테아제 절단 부위, 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제 절단 부위, 서브틸리신 절단 부위, 및 카스파제 3 절단 부위를 포함하도록 변형된다. 이러한 구체예의 다른 양상에서, 외인성 프로테아제 절단 부위는, 예를 들어, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT, 또는 BuNT의 이-사슬 루프 내에 위치된다. 이러한 구체예의 다른 양상에서, 외인성 프로테아제 절단 부위는, 예를 들어, 미국 특허 제5,989,545호; 미국 특허 제6,461,617호; 미국 특허 제6,632,440호; 미국 특허 제6,843,998호; 미국 특허 제7,244,437호; 미국 특허 제7,413,742호; 및 미국 특허 7,425,338호에 개시된 단백질의 이-사슬 루프 내에 위치된다.이러한 구체예의 한 양상에서, 이-사슬 루프 영역은 컨센서스 서열 E-P5-P4-Y-P2-Q-G(서열번호 27) 또는 E-P5-P4-Y-P2-Q-S(서열번호 28)를 갖는 담배 식각 바이러스 프로테아제 절단 부위를 포함하며, 상기 컨센서스 서열에서 P2, P4 및 P5는 임의의 아미노산일 수 있다. 상기 구체예의 다른 양상에서, 이-사슬 루프 영역은 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37 또는 서열번호 38을 포함하는 담배 식각 바이러스 프로테아제 절단 부위를 포함한다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 담배 식각 바이러스 프로테아제 절단 부위는, 예를 들어, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT, 또는 BuNT의 이-사슬 루프 내에 위치된다. 이러한 구체예의 다른 양상에서, 담배 식각 바이러스 프로테아제 절단 부위는, 예를 들어, 미국 특허 제5,989,545호; 미국 특허 제6,461,617호; 미국 특허 제6,632,440호; 미국 특허 제6,843,998호; 미국 특허 제7,244,437호; 미국 특허 제7,413,742; 및 미국 특허 제7,425,338호에 개시된 단백질의 이-사슬 루프 내에 위치된다.이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 이-사슬 루프 영역은 컨센서스 서열 P6-P5-V-R-F-Q-G(서열번호 39) 또는 P6-P5-V-R-F-Q-S(서열번호 40)를 갖는 담배 베인 모틀링 바이러스 프로테아제 절단 부위를 포함하며, 상기 컨센서스 서열에서 P5 및 P6은 임의의 아미노산일 수 있다. 상기 구체예의 다른 양상에서, 이-사슬 루프 영역은 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 또는 서열번호 44를 포함하는 담배 베인 모틀링 바이러스 프로테아제 절단 부위를 포함한다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 담배 베인 모틀링 바이러스 프로테아제 절단 부위는, 예를 들어, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT, 또는 BuNT의 이-사슬 루프 내에 위치된다. 이러한 구체예의 다른 양상에서, 담배 베인 모틀링 바이러스 프로테아제 절단 부위는, 예를 들어, 미국 특허 제5,989,545호; 미국 특허 제6,461,617호; 미국 특허 제6,632,440호; 미국 특허 제6,843,998호; 미국 특허 제7,244,437호; 미국 특허 제7,413,742호; 및 미국 특허 제7,425,338호에 개시된 단백질의 이-사슬 루프 내에 위치된다.이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 이-사슬 루프 영역은 컨센서스 서열 P5-P4-L-F-Q-G-P(서열번호 45)를 갖는 인간 리노바이러스 3C 프로테아제 절단 부위를 포함하며, 상기 컨센서스 서열에서 P4는 G, A, V, L, I, M, S 또는 T이고, P5는 임의의 아미노산일 수 있고, D 또는 E가 바람직하다. 상기 구체예의 다른 양상에서, 이-사슬 루프 영역은 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50 또는 서열번호 51을 포함하는 인간 리노바이러스 3C 프로테아제 절단 부위를 포함한다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 인간 리노바이러스 3C 프로테아제 절단 부위는, 예를 들어, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT, 또는 BuNT의 이-사슬 루프 내에 위치된다. 이러한 구체예의 다른 양상에서, 인간 리노바이러스 3C 프로테아제 절단 부위는, 예를 들어, 미국 특허 제5,989,545호; 미국 특허 제6,461,617호; 미국 특허 제6,632,440호; 미국 특허 제6,843,998호; 미국 특허 제7,244,437호; 미국 특허 제7,413,742호; 및 미국 특허 제7,425,338호에 개시된 단백질의 이-사슬 루프 내에 위치된다.이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 이-사슬 루프 영역은 컨센서스 서열 P6-P5-P4-P3-H-Y(서열번호 52) 또는 P6-P5-P4-P3-Y-H(서열번호 53)를 갖는 서브틸리신 프로테아제 절단 부위를 포함하며, 상기 컨센서스 서열에서 P3, P4 및 P5 및 P6은 임의의 아미노산일 수 있다. 상기 구체예의 다른 양상에서, 이-사슬 루프 영역은 서열번호 54, 서열번호 55, 또는 서열번호 56을 포함하는 서브틸리신 프로테아제 절단 부위를 포함한다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 서브틸리신 프로테아제 절단 부위는, 예를 들어, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT, 또는 BuNT의 이-사슬 루프 내에 위치된다. 이러한 구체예의 다른 양상에서, 서브틸리신 프로테아제 절단 부위는, 예를 들어, 미국 특허 제5,989,545호; 미국 특허 제6,461,617호; 미국 특허 제6,632,440호; 미국 특허 제6,843,998호; 미국 특허 제7,244,437호; 미국 특허 제7,413,742호; 및 미국 특허 제7,425,338호에 개시된 단백질의 이-사슬 내에 위치된다.이러한 구체예의 한 추가 양상에서, 이-사슬 루프 영역은 컨센서스 서열 D-P3-P2-DP1'(서열번호 57)을 갖는 카스파제 3 프로테아제 절단 부위를 포함하며, 상기 컨센서스 서열에서 P3은 임의의 아미노산일 수 있고, E가 바람직하며, P2는 임의의 아미노산일 수 있고, P1'은 임의의 아미노산일 수 있고, G 또는 S가 바람직하다. 상기 구체예의 다른 양상에서, 이-사슬 루프 영역은 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 또는 서열번호 63을 포함하는 카스파제 3 프로테아제 절단 부위를 포함한다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 카스파제 3 프로테아제 절단 부위는, 예를 들어, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT, 또는 BuNT의 이-사슬 루프 내에 위치된다. 이러한 구체예의 다른 양상에서, 카스파제 3 프로테아제 절단 부위는, 예를 들어, 미국 특허 제5,989,545호; 미국 특허 제6,461,617호; 미국 특허 제6,632,440호; 미국 특허 제6,843,998호; 미국 특허 제7,244,437호; 미국 특허 제7,413,742호; 및 미국 특허 제7,425,338호에 개시된 단백질의 이-사슬 루프 내에 위치된다.이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 이-사슬 루프 영역은 컨센서스 서열 DDDDK(서열번호 64)를 갖는 엔테로키나제 프로테아제 절단 부위를 포함한다. 이러한 구체예의 다른 양상에서, 엔테로키나제 프로테아제 절단 부위는, 예를 들어, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT, 또는 BuNT의 이-사슬 루프 내에 위치된다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 엔테로키나제 프로테아제 절단 부위는, 예를 들어, 미국 특허 제5,989,545호; 미국 특허 제6,461,617호; 미국 특허 제6,632,440호; 미국 특허 제6,843,998호; 미국 특허 제7,244,437호; 미국 특허 제7,413,742호; 및 미국 특허 제7,425,338호에 개시된 단백질의 이-사슬 루프 내에 위치된다.이-사슬 루프 영역은 자연-발생 이-사슬 루프 프로테아제 절단 부위를 외인성 프로테아제 절단 부위로 대체하도록 변형된다. 이러한 변형에서, 자연-발생 이-사슬 루프 프로테아제 절단 부위는 조작불가능하게(inoperable) 되고, 따라서 이는 이의 프로테아제에 의해 절단될 수 없다. 단지, 외인성 프로테아제 절단 부위는 이의 상응하는 외인성 프로테아제에 의해 절단될 수 있다. 이러한 유형의 변형에서, 외인성 프로테아제 부위는 융합 단백질로서 변형된 클로스트리디움 독소에 인-프레임으로 작동가능하게 연결되고, 상기 부위는 이의 각각의 외인성 프로테아제에 의해 절단될 수 있다. 외인성 프로테아제 절단 부위를 이용한 내인성 이-사슬 루프 프로테아제 절단 부위의 대체는 외인성 부위가 내인성 부위의 절단 부위 위치에 근접한 위치에서 조작되는 위치의 치환일 수 있다. 외인성 프로테아제 절단 부위를 이용한 내인성 이-사슬 루프 프로테아제 절단 부위의 대체는 외인성 부위가 내인성 부위의 절단 부위 위치와 상이한 위치에서 조작되는 외인성 부위의 첨가일 수 있고, 상기 내인성 부위는 조작불가능하게 되도록 조작된다.이-사슬 루프 영역 내에 함유된 자연-발생 프로테아제 절단 부위는 자연-발생 이-사슬 루프 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 결합 측면에 있는 적어도 2개의 아미노산을 변경시킴으로서 조작불가능하게될 수 있다. 보다 광범위한 변경이 이루어질 수 있고, 단, 이-사슬 루프 영역의 2개의 시스테인 잔기는 온전하게 유지되고, 상기 영역이 이황화 브리지를 여전히 형성할 수 있어야 한다. 아미노산 변경의 비제한적인 예는 아미노산의 결실 또는 상이한 아미노산을 이용한 본래의 아미노산의 대체를 포함한다. 따라서, 한 구체예에서, 이-사슬 루프 영역 내에 함유된 자연-발생 프로테아제 절단 부위는 자연-발생 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 결합 측면에 있는 2개의 아미노산을 변경시킴으로써 조작불가능해진다. 이러한 구체예의 다른 양상에서, 이-사슬 루프 영역 내에 함유된 자연-발생 프로테아제 절단 부위는, 예를 들어, 자연-발생 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 결합 측면에 있는 2개의 아미노산을 포함하는 적어도 3개의 아미노산; 자연-발생 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 결합 측면에 있는 2개의 아미노산을 포함하는 적어도 4개의 아미노산; 자연-발생 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 결합 측면에 있는 2개의 아미노산을 포함하는 적어도 5개의 아미노산; 자연-발생 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 결합 측면에 있는 2개의 아미노산을 포함하는 적어도 6개의 아미노산; 자연-발생 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 결합 측면에 있는 2개의 아미노산을 포함하는 적어도 7개의 아미노산; 자연-발생 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 결합 측면에 있는 2개의 아미노산을 포함하는 적어도 8개의 아미노산; 자연-발생 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 결합 측면에 있는 2개의 아미노산을 포함하는 적어도 9개의 아미노산; 자연-발생 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 결합 측면에 있는 2개의 아미노산을 포함하는 적어도 10개의 아미노산; 자연-발생 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 결합 측면에 있는 2개의 아미노산을 포함하는 적어도 15개의 아미노산; 또는 자연-발생 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 결합 측면에 있는 2개의 아미노산을 포함하는 적어도 20개의 아미노산을 변경시킴으로써 조작불가능해진다.이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 이-사슬 루프 영역 내에 함유된 자연-발생 이-사슬 프로테아제 절단 부위는, 예를 들어, 자연-발생 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 결합 측면에 있는 2개의 아미노산을 포함하는 많아야 3개의 아미노산; 자연-발생 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 결합 측면에 있는 2개의 아미노산을 포함하는 많아야 4개의 아미노산; 자연-발생 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 결합 측면에 있는 2개의 아미노산을 포함하는 많아야 5개의 아미노산; 자연-발생 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 결합 측면에 있는 2개의 아미노산을 포함하는 많아야 6개의 아미노산; 자연-발생 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 결합 측면에 있는 2개의 아미노산을 포함하는 많아야 7개의 아미노산; 자연-발생 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 결합 측면에 있는 2개의 아미노산을 포함하는 많아야 8개의 아미노산; 자연-발생 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 결합 측면에 있는 2개의 아미노산을 포함하는 많아야 9개의 아미노산; 자연-발생 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 결합 측면에 있는 2개의 아미노산을 포함하는 많아야 10개의 아미노산; 자연-발생 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 결합 측면에 있는 2개의 아미노산을 포함하는 많아야 15개의 아미노산; 또는 자연-발생 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 결합 측면에 있는 2개의 아미노산을 포함하는 많아야 20개의 아미노산을 변경시킴으로써 조작불가능해진다.본 발명의 명세서에 개시된 방법은, 부분적으로, 세포를 포함한다. 임의 및 모든 세포가 이용될 수 있는 것이 예견된다. 따라서, 이러한 구체예의 양상은, 비제한적인 예로, 원핵생물 세포, 비제한적인 예로, 호기성, 미호기성, 호이산화탄소, 조건(facultative), 혐기성, 그람-음성 및 그람-양성 박테리아 세포, 예를 들어, 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 클로스트리디아 퍼프린겐스(Clostridia perfringens), 클로스트리디아 디피실레(Clostridia difficile), 카울로박터 크레센투스(Caulobacter crescentus), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 메틸로박테리움 엑스토르켄스(Methylobacterium extorquens), 나이세리아 메닌기룰스(Neisseria meningirulls), 나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)으로부터 유래된 것; 및 진핵생물 세포, 비제한적인 예로, 효모 균주, 예를 들어, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피키아 앙구스타(Pichia angusta), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)로부터 유래된 것; 곤충 세포 및 곤충으로부터 유래된 세포주, 예를 들어, 스포돕테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda), 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) 및 만두카 섹스타(Manduca sexta)로부터 유래된 것; 및 포유동물 세포 및 포유동물 세포로부터 유래된 세포주, 예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 돼지, 소, 말, 영장류 및 인간으로부터 유래된 것을 포함한다. 세포주는 미국 미생물 보존 센터(American Type Culture Collection), 유럽 세포 배양 수집센터(European Collection of Cell Cultures) 및 독일 미생물 및 세포 배양 수집센터(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)로부터 수득될 수 있다. 적절한 세포주를 선택하고, 제조하고, 이용하기 위한 특정 프로토콜의 비제한적 예는, 예를 들어, 문헌[INSECT CELL CULTURE ENGINEERING (Mattheus F. A. Goosen et al. eds., Marcel Dekker, 1993); INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS (J. M. Vlak et al. eds., Kluwer Academic Publishers, 1996); Maureen A. Harrison 0026# Ian F. Rae, GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE (Cambridge University Press, 1997); CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Alan Doyle et al eds., John Wiley and Sons, 1998); R. Ian Freshney, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE (Wiley-Liss, 4th ed. 2000); ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John R. W. Masters ed., Oxford University Press, 3rd ed. 2000); MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, 위에 기재됨, (2001); BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John M. Davis, Oxford Press, 2nd ed. 2002); 및 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 위에 기재됨, (2004)]에 기재되어 있다. 상기 프로토콜은 당업자의 기술 범위 내의 통상적인 절차이고, 본원에 교시되어 있다.본 발명의 명세서에 개시된 방법은, 부분적으로, 본 발명의 명세서에 개시된 바와 같은 발현 작제물 또는 이중 발현 작제물을 세포에 도입시키는 것을 포함한다. 세포에 도입된 발현 작제물 또는 이중 발현 작제물은 상기 세포에 의해 일시적 또는 안정적으로 유지될 수 있다. 안정적으로-유지된 발현 작제물 또는 이중 발현 작제물은 염색체 외에 존재할 수 있고, 자율적으로 복제될 수 있거나, 이들은 세포의 염색체 물질에 통합될 수 있고, 비-자율적으로 복제될 수 있다. 세포에 본 발명의 명세서에 개시된 발현 작제물 또는 이중 발현 작제물을 도입시키기 위한 임의 및 모든 방법이 이용될 수 있음이 예견된다. 세포에 발현 작제물 또는 이중 발현 작제물을 도입시키는데 유용한 방법은, 비제한적인 예로, 화합물-매개 트랜스펙션, 예를 들어, 칼슘 포스페이트-매개, 다이에틸-아미노에틸(DEAE) 덱스트란-매개, 지질-매개, 폴리에틸렌이민(PEI)-매개, 폴리리신-매개 및 폴리브렌-매개; 물리-매개 트랜스펙션, 예를 들어, 바이올리스틱(biolistic) 입자 전달, 미세주사, 원형질체 융합 및 전기천공; 및 바이러스-매개 트랜스펙션, 예를 들어, 레트로바이러스-매개 트랜스펙션을 포함하며, 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells, pp. 16.1-16.62 (Sambrook 0026# Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3rd ed. 2001)]을 참조할 수 있다. 당업자는 세포로 발현 작제물 또는 이중 발현 작제물을 도입시키는 특정 방법의 선택은, 부분적으로, 세포가 발현 작제물 또는 이중 발현 작제물을 일시적으로 함유하는지의 여부 또는 세포가 발현 작제물 또는 이중 발현 작제물을 안정적으로 함유하는지의 여부에 좌우될 것이다. 이러한 프로토콜은 당업자의 기술 범위 내의 통상적인 절차이고, 본원에 교시되어 있다.이러한 구체예의 한 양상에서, 트랜스펙션으로 언급되는 화학-매개 방법은 세포에 본 발명의 명세서에 개시된 발현 작제물 또는 이중 발현 작제물을 도입시키는데 사용된다. 트랜스펙션의 화학-매개 방법에서, 화학 시약은 세포로의 흡수를 촉진하는 발현 작제물 또는 이중 발현 작제물과의 복합체를 형성한다. 이러한 화학적 시약은, 비제한적인 예로, 칼슘 포스페이트-매개(예를 들어, Martin Jordan 0026# Florian Worm, Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate, 33(2) Methods 136-143 (2004) 참조); 다이에틸-아미노에틸(DEAE) 덱스트란-매개, 지질-매개, 양이온 중합체-매개 유사 폴리에틸렌이민(PEI)-매개 및 폴리리신-매개 및 폴리브렌-매개(예를 들어, Chun Zhang et al., Polyethylenimine strategies for plasmid delivery to brain-derived cells, 33(2) Methods 144-150 (2004) 참조)를 포함한다. 이러한 화학-매개 전달 시스템은 표준 방법에 의해 제조될 수 있고, 이는, 예를 들어, CellPhect Transfection Kit(뉴저지주의 피스카타웨이시에 소재한 Amersham Biosciences); Mammalian Transfection Kit, Calcium phosphate and DEAE Dextran(캘리포니아주의 라호아주에 소재한 Stratagene, Inc.); Lipofectamine(상표명) Transfection Reagent(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 Invitrogen, Inc.); ExGen 500 Transfection kit(Fermentas, Inc., Hanover, MD), 및 SuperFect and Effectene Transfection Kits(캘리포니아주의 발렌시아시에 소재한 Qiagen, Inc.)와 같이 시판된다.이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 물리-매개 방법이 세포에 본 발명의 명세서에 개시된 발현 작제물 또는 이중 발현 작제물을 도입시키는데 사용된다. 물리적 기술은, 비제한적인 예로, 전기천공, 바이올리스틱 및 미세주사를 포함한다. 바이올리스틱 및 미세주사 기술은 세포에 발현 작제물 또는 이중 발현 작제물을 도입시키기 위해 세포벽을 천공시키며, 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Jeike E. Biewenga et al., Plasmid-mediated gene transfer in neurons using the biolistics technique, 71 (1) J. Neurosci. Methods. 67-75 (1997); 및 John O'Brien 0026# Sarah C. R. Lummis, Biolistic and diolistic transfection: using the gene gun to deliver DNA and lipophilic dyes into mammalian cells, 33(2) Methods 121-125 (2004)]을 참조할 수 있다. 전자투과화(electropermeabilization)로도 언급되는 전기천공은 막에 폴리뉴클레오타이드 분자가 진입하는 일시적 포어(pore)를 생성시키는데 간단한 고전압의 전기 펄스를 이용하고, 모든 세포 유형의 안정적이고 일시적인 트랜스펙션에 효과적으로 사용될 수 있으며, 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[M. Golzio et al., In vitro and in vivo electric field-mediated permeabilization, gene transfer, and expression, 33(2) Methods 126-135 (2004); 및 Oliver Greschet al., New non-viral method for gene transfer into primary cells, 33(2) Methods 151-163 (2004)]을 참조할 수 있다.이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 형질도입으로 언급되는 바이러스-매개 방법이 세포에 본 발명의 명세서에 개시된 발현 작제물 또는 이중 발현 작제물을 도입시키는데 사용된다. 일시적 형질도입의 바이러스-매개 방법에서, 세포에 발현 작제물 또는 이중 발현 작제물을 도입시키기 위한 상기 메커니즘을 이용하기 위해 바이러스 입자가 숙주 세포를 감염시키고 숙주 세포에서 복제하는 과정이 조작되었다. 바이러스-매개 방법이, 비제한적인 예로, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 피코르나바이러스, 알파바이러스 및 배큘로바이러스를 포함하는 매우 다양한 바이러스로부터 개발되었으며, 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Armin Blesch, Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer, 33(2) Methods 164-172 (2004); 및 Maurizio Federico, From lentiviruses to lentivirus vectors, 229 Methods Mol. Biol. 3-15 (2003); E. M. Poeschla, Non-primate lentiviral vectors, 5(5) Curr. Opin. Mol. Ther. 529-540 (2003); Karim Benihoud et al, Adenovirus vectors for gene delivery, 10(5) Curr. Opin. Biotechnol. 440-447 (1999); H. Bueler, Adeno-associated viral vectors for gene transfer and gene therapy, 380(6) Biol. Chem. 613-622 (1999); Chooi M. Lai et al., Adenovirus and adeno-associated virus vectors, 21 (12) DNA Cell Biol. 895-913 (2002); Edward A. Burton et al., Gene delivery using herpes simplex virus vectors, 21(12) DNA Cell Biol. 915-936 (2002); Paola Grandi et al., Targeting HSV amplicon vectors, 33(2) Methods 179-186 (2004); llya Frolov et al., Alphavirus-based expression vectors: strategies and applications, 93(21) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 11371-11377 (1996); Markus U. Ehrengruber, Alphaviral gene transfer in neurobiology, 59(1) Brain Res. Bull. 13-22 (2002); Thomas A. Kost 0026# J. Patrick Condreay, Recombinant baculoviruses as mammalian cell gene-delivery vectors, 20(4) Trends Biotechnol. 173-180 (2002); 및 A. Huser 0026# C. Hofmann, Baculovirus vectors: novel mammalian cell gene-delivery vehicles and their applications, 3(1) Am. J. Pharmacogenomics 53-63 (2003)]을 참조할 수 있다.외피 보유되지 않은 이중가닥 DNA 바이러스인 아데노바이러스가 종종 포유동물 세포 형질도입에 선택되는데, 이는 아데노바이러스가 약 36 kb의 비교적 큰 폴리뉴클레오타이드 분자를 취급하고, 높은 역가로 생성되고, 매우 다양한 분열하는 세포 및 분열하지 않는 세포 둘 모두를 효과적으로 감염시킬 수 있기 때문이며, 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Wim T. J. M. C. Hermens et al., Transient gene transfer to neurons and glia: analysis of adenoviral vector performance in the CNS and PNS, 71(1) J. Neurosci. Methods 85-98 (1997); 및 Hiroyuki Mizuguchi et al., Approaches for generating recombinant adenovirus vectors, 52(3) Adv. Drug Deliv. Rev. 165-176 (2001)]을 참조할 수 있다. 아데노바이러스-기반 시스템을 이용한 형질도입은 연장된 단백질 발현을 뒷받침하지 않는데, 이는 핵산 분자가 숙주 세포 염색체로 통합되는 것이 아닌 세포 핵 내의 에피솜에 의해 보유되기 때문이다. 상기 벡터를 이용하는 방법에 대한 아데노바이러스 벡터 시스템 및 특정 프로토콜은, 예를 들어, VIRAPOWER(상표명) Adenoviral Expression System(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 Invitrogen, Inc.) 및 VIRAPOWER(상표명) Adenoviral Expression System Instruction Manual 25-0543 version A, Invitrogen, Inc., (Jul. 15, 2002); 및 ADEASY(상표명) Adenoviral Vector System(캘리포니아주의 라호아주에 소재한 Stratagene, Inc.) 및 ADEASY(상표명) Adenoviral Vector System Instruction Manual 064004f(Stratagene, Inc.)에 개시되어 있다.세포로의 본 발명의 명세서에 개시된 발현 작제물 또는 이중 발현 작제물의 도입은 또한 단일가닥 RNA 레트로바이러스, 예를 들어, 온코레트로바이러스 및 렌티바이러스를 이용하여 달성될 수 있다. 레트로바이러스-매개 형질도입은 종종 100%에 근접한 형질도입 효율을 발생시킬 수 있고, 감염다중도(multiplicity of infection: MOI)를 다양화시킴으로써 프로바이러스 카피수(proviral copy number)를 용이하게 조절할 수 있고, 세포를 일시적 또는 안정적으로 형질도입시키는데 사용될 수 있으며, 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Tiziana Tonini et al., Transient production of retroviral- and lentiviral-based vectors for the transduction of Mammalian cells, 285 Methods Mol. Biol. 141-148 (2004); Armin Blesch, Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer, 33(2) Methods 164-172 (2004); Felix Recillas-Targa, Gene transfer and expression in mammalian cell lines and transgenic animals, 267 Methods Mol. Biol. 417-433 (2004); 및 Roland Wolkowicz et al., Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells, 246 Methods Mol. Biol. 391-411 (2004)]을 참조할 수 있다. 레트로바이러스 입자는 지질 외피에 둘러싸인 단백질 캡시드 내에 패킹된 RNA 유전체로 구성된다. 레트로바이러스는 역전사효소와 함께 세포질에 레트로바이러스의 RNA를 주입함으로써 숙주 세포를 감염시킨다. RNA 주형은 이후 숙주 세포 유전체로 통합됨으로써 자체로 복제하는 선형의 이중가닥 cDNA으로 역전사된다. 바이러스 입자는 수직적(프로바이러스를 통한 모(parent) 세포로부터 딸(daughter) 세포로의 확산)뿐만 아니라 수평적(비리온을 통한 세포로부터 세포로의 확산) 둘 모두로 확산된다. 이러한 복제 방법은 장기간의 지속적 발현을 가능케 하는데, 이는 관심 핵산 분자가 숙주 세포의 염색체에 안정적으로 통합됨으로써 단백질의 장기간의 발현이 가능하기 때문이다. 예를 들어, 동물 연구는 다양한 조직에 주입된 렌티바이러스 벡터가 1년을 초과하는 지속된 단백질 발현을 발생시킨 것을 나타내었으며, 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Luigi Naldini et al., In vivo gene delivery and stable transduction of non-dividing cells by a lentiviral vector, 272(5259) Science 263-267 (1996)]을 참조할 수 있다. 온코레트로바이러스-유래 벡터 시스템, 예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus, MoMLV)가 널리 사용되고, 많은 상이한 분열되지 않는 세포를 감염시킨다. 렌티바이러스는 또한 분열하는 세포 및 분열하지 않는 세포를 포함하는 많은 상이한 세포 유형을 감염시킬 수 있고, 복잡한 외피 단백질을 가질 수 있으며, 이는 고도로 특이적인 세포 표적화를 가능케 한다.레트로바이러스 벡터 및 상기 벡터를 이용하는 방법에 대한 특정 프로토콜은, 예를 들어, 문헌[Manfred Gossen 0026# Hermann Bujard, Tight control of gene expression in eukaryotic cells by tetracycline-responsive promoters, U미국 특허 제5,464,758호, Hermann Bujard 0026# Manfred Gossen, Methods for regulating gene expression, 미국 특허 제5,814,618호, David S. Hogness, Polynucleotides encoding insect steroid hormone receptor polypeptides and cells transformed with same, 미국 특허 제5,514,578호, 및 David S. Hogness, Polynucleotide encoding insect ecdysone receptor, 미국 특허 제6,245,531호; Elisabetta Vegeto et al., Progesterone receptor having C. terminal hormone binding domain truncations, 미국 특허 제5,364,791호, Elisabetta Vegeto et al., Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy, 미국 특허 제5,874,534호, 및 Elisabetta Vegeto et al., Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy, 미국 특허 제5,935,934호]에 개시되어 있다. 또한, 이러한 바이러스 전달 시스템은 표준 방법에 의해 제조될 수 있고, 이는, 예를 들어, BD(상표명) Tet-Off 및 Tet-On Gene Expression Systems(캘리포니아주의 팰러앨토시에 소재한 BD Biosciences-Clonetech) 및 BD(상표명) Tet-Off 및 Tet-On Gene Expression Systems User Manual, PT3001-1, BD Biosciences Clonetech, (Mar. 14, 2003), GENESWITCH(상표명) System(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 Invitrogen, Inc.) 및 GENESWITCH(상표명) System A Mifepristone-Regulated Expression System for Mammalian Cells version D, 25-0313, Invitrogen, Inc., (Nov. 4, 2002); VIRAPOWER(상표명) Lentiviral Expression System(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 Invitrogen, Inc.) 및 VIRAPOWER(상표명) Lentiviral Expression System Instruction Manual 25-0501 version E, Invitrogen, Inc., (Dec. 8, 2003); 및 COMPLETE CONTROL(등록상표) Retroviral Inducible Mammalian Expression System(캘리포니아주의 라호아주에 소재한 Stratagene) 및 COMPLETE CONTROL(등록상표) Retroviral Inducible Mammalian Expression System Instruction Manual, 064005e로 시판된다.본 발명의 명세서에 개시된 방법은, 부분적으로, 본 발명의 명세서에 개시된 발현 작제물 또는 이중 발현 작제물을 발현시키는 것을 포함한다. 비제한적인 예로, 세포-기반 시스템 및 세포-비함유 발현 시스템을 포함하는 본 발명의 명세서에 개시된 다양한 발현 시스템 중 임의의 발현 시스템이 본 발명의 명세서에 개시된 발현 작제물 또는 이중 발현 작제물을 발현시키는데 유용할 수 있는 것이 예견된다. 세포-기반 시스템은, 비제한적인 예로, 바이러스 발현 시스템, 원핵생물 발현 시스템, 효모 발현 시스템, 배큘로바이러스 발현 시스템, 곤충 발현 시스템 및 포유동물 발현 시스템을 포함한다. 세포-비함유 시스템은, 비제한적인 예로, 밀 배아 추출물, 토끼 망상적혈구 추출물 및 대장균(E. coli) 추출물을 포함하며, 이는 일반적으로 본원에 개시된 방법과 동등하다. 발현 시스템을 이용한 발현 작제물 또는 이중 발현 작제물의 발현은, 비제한적인 예로, 유도성 발현, 비-유도성 발현, 항시성 발현, 바이러스-매개 발현, 안정적으로-통합된 발현, 및 일시적 발현을 포함하는 다양한 특징 중 임의의 특징을 포함할 수 있다. 널리 특성규명된 벡터, 시약, 조건 및 세포를 포함하는 발현 시스템은 널리 확립되어 있고, 이는 비제한적인 예로, 텍사스주의 오스틴시에 소재한 Ambion, Inc.; 캘리포니아주의 팰러앨토시에 소재한 BD Biosciences-Clontech; BD Biosciences Pharmingen; 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 Invitrogen, Inc; 캘리포니아주의 발렌시아시에 소재한 QIAGEN, Inc.; 인디애나주의 인디애나폴리스시에 소재한 Roche Applied Science; 및 캘리포니아주의 라호아주에 소재한 Stratagene과 같은 공급업체에서 용이하게 이용가능하다. 적절한 이종성 발현 시스템의 선택 및 이용에 대한 비제한적인 예는, 예를 들어, 문헌[PROTEIN EXPRESSION. A PRACTICAL APPROACH(S. J. Higgins and B. David Hames eds., Oxford University Press, 1999); Joseph M. Fernandez 0026# James P. Hoeffler, GENE EXPRESSION SYSTEMS. USING NATURE FOR THE ART OF EXPRESSION (Academic Press, 1999); 및 Meena Rai 0026# Harish Padh, Expression Systems for Production of Heterologous Proteins, 80(9) CURRENT SCIENCE 1121-1128, (2001)]에 기재되어 있다. 이러한 프로토콜은 당업자의 기술 범위 내의 통상적인 절차이고, 본원에 교시되어 있다.다양한 세포-기반 발현 절차가 본 발명의 명세서에 개시된 발현 작제물 또는 이중 발현 작제물을 발현시키는데 유용하다. 비제한적인 예로, 바이러스 발현 시스템, 원핵생물 발현 시스템, 효모 발현 시스템, 배큘로바이러스 발현 시스템, 곤충 발현 시스템 및 포유동물 발현 시스템이 포함된다. 바이러스 발현 시스템은, 비제한적인 예로, VIRAPOWER(상표명) Lentiviral(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 Invitrogen, Inc.), Adenoviral Expression Systems(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 Invitrogen, Inc.), ADEASY(상표명) XL Adenoviral Vector System(캘리포니아주의 라호아주에 소재한 Stratagene) 및 VIRAPORT(등록상표) Retroviral Gene Expression System(캘리포니아주의 라호아주에 소재한 Stratagene)을 포함한다. 원핵생물 발현 시스템의 비제한적 예는 CHAMPION(상표명) pET Expression System(EMD Biosciences-Novagen, Madison, Wl), TRIEX(상표명) Bacterial Expression System(위스콘신주의 매디슨시에 소재한 EMD Biosciences-Novagen), QIAEXPRESS(등록상표) Expression System(QIAGEN, Inc.), 및 AFFINITY(등록상표) Protein Expression and Purification System(캘리포니아주의 라호아주에 소재한 Stratagene)을 포함한다. 효모 발현 시스템은, 비제한적인 예로, EASYSELECT(상표명) Pichia Expression Kit(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 Invitrogen, Inc.), YES-ECHO(상표명) Expression Vector Kits(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 Invitrogen, Inc.) 및 SPECTRA(상표명) S. pombe Expression System(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 Invitrogen, Inc.)을 포함한다. 배큘로바이러스 발현 시스템의 비제한적인 예는 BACULODIRECT(상표명)(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 Invitrogen, Inc.), BAC-TO-BAC(등록상표)(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 Invitrogen, Inc.), 및 BD BACULOGOLD(상표명)(캘리포니아주의 샌디에이고시에 소재한 BD Biosciences-Pharmigen)를 포함한다. 곤충 발현 시스템은, 비제한적인 예로, Drosophila Expression System (DES(등록상표))(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 Invitrogen, Inc.), INSECTSELECT(상표명) System(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 Invitrogen, Inc.) 및 INSECTDIRECT(상표명) System(위스콘신주의 매디슨시에 소재한 EMD Biosciences-Novagen)을 포함한다. 포유동물 발현 시스템의 비제한적인 예는 T-REX(상표명) (테트라사이클린-조절 발현) System(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 Invitrogen, Inc.), FLP-IN(상표명) T-REX(상표명) System(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 Invitrogen, Inc.), pcDNA(상표명) system(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 Invitrogen, Inc.), pSecTag2 system(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 Invitrogen, Inc.), EXCHANGER(등록상표) System, INTERPLAY(상표명) Mammalian TAP System(캘리포니아주의 라호아주에 소재한 Stratagene), COMPLETE CONTROL(등록상표) Inducible Mammalian Expression System(캘리포니아주의 라호아주에 소재한 Stratagene) 및 LACSWITCH(등록상표) II Inducible Mammalian Expression System(캘리포니아주의 라호아주에 소재한 Stratagene)을 포함한다.본 발명의 명세서에 개시된 발현 작제물 또는 이중 발현 작제물을 발현시키는 또 다른 절차는 세포-비함유 발현 시스템, 비제한적인 예로, 원핵생물 추출물 및 진핵생물 추출물을 이용한다. 원핵생물 세포 추출물의 비제한적인 예는 RTS 100 E. coli HY Kit(인디애나주의 인디애나폴리스시에 소재한 Roche Applied Science), ACTIVEPRO(상표명) In Vitro Translation Kit(텍사스주의 오스틴시에 소재한 Ambion, Inc.), ECOPRO(상표명) System(위스콘신주의 매디슨시에 소재한 EMD Biosciences-Novagen) 및 Expressway(상표명) Plus Expression System(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 Invitrogen, Inc.)을 포함한다. 진핵생물 세포 추출물은, 비제한적인 예로, RTS 100 Wheat Germ CECF Kit(인디애나주의 인디애나폴리스시에 소재한 Roche Applied Science), TNT(등록상표) Coupled Wheat Germ Extract Systems(위스콘신주의 매디슨시에 소재한 Promega Corp.), Wheat Germ IVT(상표명) Kit(텍사스주의 오스틴시에 소재한 Ambion, Inc.), Retic Lysate IVT(상표명) Kit(텍사스주의 오스틴시에 소재한 Ambion, Inc.), PROTEINSCRIPT(등록상표) II System(텍사스주의 오스틴시에 소재한 Ambion, Inc.) 및 TNT(등록상표) Coupled Reticulocyte Lysate Systems(위스콘신주의 매디슨시에 소재한 Promega Corp.)을 포함한다.본 발명의 명세서에 개시된 방법은, 부분적으로, 특정 기간 동안 제1 온도에서 세포를 성장시킨 후, 특정 기간 동안 제2 온도에서 세포를 성장시키는 것을 포함한다. 제1 및 제2 온도, 및 세포가 제1 및 제2 온도에서 성장되는 기간은 세포에 의해 발현되는 단백질의 요망되는 양, 및 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시키는 이-사슬 루프 영역 내에 위치된 외인성 프로테아제 절단 부위에서의 요망되는 절단 효율을 기초로 하여 결정된다.한 구체예에서, 세포는 최대 세포 밀도를 달성하기 위해 특정 기간 동안 제1 온도에서 성장된다. 이러한 구체예의 양상에서, 세포는 약 37℃에서 약 0.5시간, 약 1.0시간, 약 1.5시간, 약 2.0시간, 약 3.0시간, 약 3.5시간, 약 4.0시간, 약 5.0시간, 약 6.0시간, 약 7.0시간, 약 8.0시간, 약 9.0시간 또는 약 10시간 동안 성장된다. 이러한 구체예의 다른 양상에서, 세포는 약 42℃에서 약 0.5시간, 약 1.0시간, 약 1.5시간, 약 2.0시간, 약 3.0시간, 약 3.5시간, 약 4.0시간, 약 5.0시간 동안 성장된다. 이러한 구체예의 양상에서, 세포는 약 30℃에서 약 0.5시간, 약 1.0시간, 약 1.5시간, 약 2.0시간, 약 3.0시간, 약 3.5시간, 약 4.0시간, 또는 약 5.0시간 동안 성장된다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 세포는 약 12℃에서 약 2시간 내지 약 8시간 동안, 약 16℃에서 약 2시간 내지 약 8시간 동안, 약 20℃에서 약 2시간 내지 약 8시간 동안, 또는 약 24℃에서 약 2시간 내지 약 8시간 동안 성장된다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 세포는 약 12℃ 내지 약 16℃에서 약 2시간 내지 약 8시간 동안 또는 약 20℃에서 약 2시간 내지 약 8시간 동안 성장된다.또 다른 구체예에서, 세포는 단백질 발현의 최대 유도를 달성하기 위해 특정 기간 동안 제2 온도에서 성장된다. 이러한 구체예의 양상에서, 세포는 약 37℃에서 약 1.5시간, 약 2.5시간, 약 3.5시간, 약 4.5시간, 약 5.5시간, 약 6.5시간, 약 7.5시간, 약 8.5시간, 약 9.5시간, 약 10.5시간, 약 11.5시간, 약 12.5시간, 약 13.5시간, 약 14.5시간, 약 15.5시간, 약 16.5시간, 또는 약 24.5시간 동안 성장된다. 이러한 구체예의 다른 양상에서, 세포는 약 30℃에서 약 1.5시간, 약 2.5시간, 약 3.5시간, 약 4.5시간, 약 5.5시간, 약 6.5시간, 약 7.5시간, 약 8.5시간, 약 9.5시간, 약 10.5시간, 약 11.5시간, 약 12.5시간, 약 13.5시간, 약 14.5시간, 약 15.5시간, 약 16.5시간, 또는 약 24.5시간 동안 성장된다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 세포는 약 25℃에서 약 1.5시간, 약 2.5시간, 약 3.5시간, 약 4.5시간, 약 5.5시간, 약 6.5시간, 약 7.5시간, 약 8.5시간, 약 9.5시간, 약 10.5시간, 약 11.5시간, 약 12.5시간, 약 13.5시간, 약 14.5시간, 약 15.5시간, 약 16.5시간, 또는 약 24.5시간 동안 성장된다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 세포는 약 22℃에서 약 1.5시간, 약 2.5시간, 약 3.5시간, 약 4.5시간, 약 5.5시간, 약 6.5시간, 약 7.5시간, 약 8.5시간, 약 9.5시간, 약 10.5시간, 약 11.5시간, 약 12.5시간, 약 13.5시간, 약 14.5시간, 약 15.5시간, 약 16.5시간, 또는 약 24.5시간 동안 성장된다. 이러한 구체예의 추가 양상에서, 세포는 약 16℃에서 약 1.5시간, 약 2.5시간, 약 3.5시간, 약 4.5시간, 약 5.5시간, 약 6.5시간, 약 7.5시간, 약 8.5시간, 약 9.5시간, 약 10.5시간, 약 11.5시간, 약 12.5시간, 약 13.5시간, 약 14.5시간, 약 15.5시간, 약 16.5시간, 또는 약 24.5시간 동안 성장된다. 이러한 구체예의 또 다른 추가 양상에서, 세포는 약 12℃에서 약 1.5시간, 약 2.5시간, 약 3.5시간, 약 4.5시간, 약 5.5시간, 약 6.5시간, 약 7.5시간, 약 8.5시간, 약 9.5시간, 약 10.5시간, 약 11.5시간, 약 12.5시간, 약 13.5시간, 약 14.5시간, 약 15.5시간, 약 16.5시간, 또는 약 24.5시간 동안 성장된다.본 발명의 양상은 또한 하기와 같이 기재될 수 있다:1. 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시키는 세포내 방법으로서,a) i) 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀; 및 ii) 이-사슬 루프 내에 위치된 외인성 프로테아제 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 이중 발현 작제물을 포함하는 세포를, 최대 세포 밀도를 달성하기 위해 특정 기간 동안 제1 온도에서 성장시키는 단계; 및b) 단일-사슬 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀로부터 단백질 발현의 최대 유도를 달성하기 위해 특정 기간 동안 제2 온도에서 상기 세포를 성장시키는 단계를 포함하되,상기 단계 (b)에서의 성장이 이중 발현 작제물로부터 단일-사슬 단백질 및 프로테아제의 발현을 유도하고;생성된 프로테아제가 이-사슬 루프 영역 내에 위치된 외인성 프로테아제 절단 부위에서 단일-사슬 단백질을 절단함으로써, 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시키는 것인, 세포내 방법.2. 단일-사슬 클로스트리디움 독소를 그의 이-사슬 형태로 전환시키는 세포내 방법으로서,a) i) 효소 도메인, 전위 도메인, 결합 도메인, 및 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 클로스트리디움 독소를 엔코딩하는 열린 해독 틀; 및 ii) 이-사슬 루프 내에 위치된 외인성 프로테아제 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 이중 발현 작제물을 포함하는 세포를 37℃에서 약 3.5시간 동안 성장시키는 단계; 및b) 상기 세포를 22℃에서 약 16 내지 약 18시간 동안 성장시키는 단계를 포함하되,상기 단계 (b)에서의 성장이 이중 발현 작제물로부터 단일-사슬 클로스트리디움 독소 및 프로테아제의 발현을 유도하고;생성된 프로테아제가 이-사슬 루프 영역 내에 위치된 외인성 프로테아제 절단 부위에서 단일-사슬 클로스트리디움 독소를 절단함으로써, 단일-사슬 클로스트리디움 독소를 그의 이-사슬 형태로 전환시키는 것인, 세포내 방법.3. 단일-사슬 클로스트리디움 독소가, 1) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역, 클로스트리디움 독소 전위 도메인 및 클로스트리디움 독소 결합 도메인; 2) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역, 클로스트리디움 독소 결합 도메인 및 클로스트리디움 독소 전위 도메인; 3) 클로스트리디움 독소 결합 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역 및 클로스트리디움 독소 효소 도메인; 4) 클로스트리디움 독소 결합 도메인, 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역 및 클로스트리디움 독소 전위 도메인; 5) 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역, 클로스트리디움 독소 효소 도메인 및 클로스트리디움 독소 결합 도메인; 또는 6) 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역, 클로스트리디움 결합 도메인 및 클로스트리디움 독소 효소 도메인의 선형의 아미노로부터 카복실로의 단일 폴리펩타이드 순서를 포함하는 것인, 상기 2에 따른 세포내 방법.4. 클로스트리디움 독소 효소 도메인이 BoNT/A 효소 도메인, BoNT/B 효소 도메인, BoNT/C1 효소 도메인, BoNT/D 효소 도메인, BoNT/E 효소 도메인, BoNT/F 효소 도메인, BoNT/G 효소 도메인, TeNT 효소 도메인, BaNT 효소 도메인, 또는 BuNT 효소 도메인인 것인, 상기 2에 따른 세포내 방법.5. 클로스트리디움 독소 전위 도메인이 BoNT/A 전위 도메인, BoNT/B 전위 도메인, BoNT/C1 전위 도메인, BoNT/D 전위 도메인, BoNT/E 전위 도메인, BoNT/F 전위 도메인, BoNT/G 전위 도메인, TeNT 전위 도메인, BaNT 전위 도메인, 또는 BuNT 전위 도메인인 것인, 상기 2에 따른 세포내 방법.6. 클로스트리디움 독소 결합 도메인이 BoNT/A 결합 도메인, BoNT/B 결합 도메인, BoNT/C1 결합 도메인, BoNT/D 결합 도메인, BoNT/E 결합 도메인, BoNT/F 결합 도메인, BoNT/G 결합 도메인, TeNT 결합 도메인, BaNT 결합 도메인, 또는 BuNT 결합 도메인인 것인, 상기 2에 따른 세포내 방법.7. 외인성 프로테아제 절단 부위가 엔테로키나제 프로테아제 절단 부위, 인간 리노바이러스 3C 프로테아제 절단 부위, 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제 절단 부위, 담배 식각 바이러스(TEV) 프로테아제 절단 부위, 담배 베인 모틀링 바이러스(TVMV) 프로테아제 절단 부위, 서브틸리신 프로테아제 절단 부위, 또는 카스파제 3 프로테아제 절단 부위인 것인, 상기 2에 따른 세포내 방법.8. 프로테아제가 엔테로키아제 프로테아제, 인간 리노바이러스 3C 프로테아제, 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제, 담배 식각 바이러스(TEV) 프로테아제, 담배 베인 모틀링 바이러스(TVMV) 프로테아제, 서브틸리신 프로테아제, 또는 카스파제 3 프로테아제인 것인, 상기 2에 따른 세포내 방법.9. 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시키는 세포내 방법으로서,a) i) 효소 도메인, 전위 도메인, 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-아편유사제 결합 도메인을 포함하는 단일-사슬 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀; 및 ii) TEV 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 이중 발현 작제물을 포함하는 세포를 37℃에서 약 8시간 동안 성장시키는 단계; 및b) 상기 세포를 약 12 내지 약 16℃에서 약 16 내지 약 18시간 동안 성장시키는 단계를 포함하되,상기 단계 (b)에서의 성장이 이중 발현 작제물로부터 단일-사슬 단백질 및 TEV 프로테아제의 발현을 유도하고;생성된 TEV 프로테아제가 통합된 TEV 절단 부위 아편유사제 결합 도메인 내에 위치된 TEV 프로테아제 절단 부위에서 단일-사슬 단백질을 절단함으로써, 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시키는 것인, 세포내 방법.10. 단백질이, 1) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 및 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-아편유사제 결합 도메인, 2) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-아편유사제 결합 도메인, 및 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 3) 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-아편유사제 결합 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 및 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 4) 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-아편유사제 결합 도메인, 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 및 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 5) 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-아편유사제 결합 도메인, 및 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 또는 6) 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 클로스트리디움 독소 효소 도메인, 및 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-아편유사제 결합 도메인의 선형의 아미노로부터 카복실로의 단일 폴리펩타이드 순서를 포함하는 것인, 상기 9에 따른 세포내 방법.11. 클로스트리디움 독소 효소 도메인이 BoNT/A 효소 도메인, BoNT/B 효소 도메인, BoNT/C1 효소 도메인, BoNT/D 효소 도메인, BoNT/E 효소 도메인, BoNT/F 효소 도메인, BoNT/G 효소 도메인, TeNT 효소 도메인, BaNT 효소 도메인, 또는 BuNT 효소 도메인인 것인, 상기 9에 따른 세포내 방법.12. 클로스트리디움 독소 전위 도메인이 BoNT/A 전위 도메인, BoNT/B 전위 도메인, BoNT/C1 전위 도메인, BoNT/D 전위 도메인, BoNT/E 전위 도메인, BoNT/F 전위 도메인, BoNT/G 전위 도메인, TeNT 전위 도메인, BaNT 전위 도메인, 또는 BuNT 전위 도메인인 것인, 상기 9에 따른 세포내 방법.13. 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-아편유사제 결합 도메인이 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-노시셉틴 결합 도메인, 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-다이놀핀 결합 도메인, 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-엔케팔린 결합 도메인, 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-BAM22 결합 도메인, 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-엔도몰핀 결합 도메인, 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-엔돌핀 결합 도메인, 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-헤몰핀 결합 도메인, 또는 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-리몰핀 결합 도메인인 것인, 상기 9에 따른 세포내 방법.14. 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시키는 세포내 방법으로서,a) i) 효소 도메인, 전위 도메인, 비-클로스트리디움 독소 결합 도메인 및 TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 단일-사슬 단백질을 엔코딩하는 열린 해독 틀; 및 ii) TEV 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 이중 발현 작제물을 포함하는 세포를 37℃에서 약 8시간 성장시키는 단계; 및b) 상기 세포를 약 12 내지 약 16℃에서 약 16 내지 약 18시간 동안 성장시키는 단계를 포함하되,상기 단계 (b)에서의 성장이 이중 발현 작제물로부터 단일-사슬 단백질 및 TEV 프로테아제의 발현을 유도하고;생성된 TEV 프로테아제가 이-사슬 루프 영역 내에 위치된 TEV 프로테아제 절단 부위에서 단일-사슬 단백질을 절단함으로써, 단일-사슬 단백질을 그의 이-사슬 형태로 전환시키는 것인, 세포내 방법.15. 단일-사슬 클로스트리디움 독소가, 1) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역, 클로스트리디움 독소 전위 도메인 및 비-클로스트리디움 독소 결합 도메인; 2) 클로스트리디움 독소 효소 도메인, TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역, 비-클로스트리디움 독소 결합 도메인 및 클로스트리디움 독소 전위 도메인; 3) 비-클로스트리디움 독소 결합 도메인, 클로스트리디움 독소 전위 도메인, TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역 및 클로스트리디움 독소 효소 도메인; 4) 비-클로스트리디움 독소 결합 도메인, 클로스트리디움 독소 효소 도메인, TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역 및 클로스트리디움 독소 전위 도메인; 5) 클로스트리디움 독소 전위 도메인, TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역, 클로스트리디움 독소 효소 도메인 및 비-클로스트리디움 독소 결합 도메인; 또는 6) 클로스트리디움 독소 전위 도메인, 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역, 비-클로스트리디움 결합 도메인 및 클로스트리디움 독소 효소 도메인의 선형의 아미노로부터 카복실로의 단일 폴리펩타이드 순서를 포함하는 것인, 상기 14에 따른 세포내 방법.16. 클로스트리디움 독소 효소 도메인이 BoNT/A 효소 도메인, BoNT/B 효소 도메인, BoNT/C1 효소 도메인, BoNT/D 효소 도메인, BoNT/E 효소 도메인, BoNT/F 효소 도메인, BoNT/G 효소 도메인, TeNT 효소 도메인, BaNT 효소 도메인, 또는 BuNT 효소 도메인인 것인, 상기 14에 따른 세포내 방법.17. 클로스트리디움 독소 전위 도메인이 BoNT/A 전위 도메인, BoNT/B 전위 도메인, BoNT/C1 전위 도메인, BoNT/D 전위 도메인, BoNT/E 전위 도메인, BoNT/F 전위 도메인, BoNT/G 전위 도메인, TeNT 전위 도메인, BaNT 전위 도메인, 또는 BuNT 전위 도메인인 것인, 상기 14에 따른 세포내 방법.18. 비-클로스트리디움 독소 결합 도메인이 아편유사제 펩타이드 결합 도메인, 멜라노코르틴 펩타이드 결합 도메인, 갈라닌 펩타이드 결합 도메인, 그라닌 펩타이드 결합 도메인, 타키키닌 펩타이드 결합 도메인, 신경펩타이드 Y 관련 펩타이드 결합 도메인, 신경호르몬 펩타이드 결합 도메인, 사이토카인 펩타이드 결합 도메인, 키닌 펩타이드 결합 도메인, 섬유모세포 성장 인자 펩타이드 결합 도메인, 뉴로트로핀 펩타이드 결합 도메인, 종양 괴사 인자 펩타이드 결합 도메인, 아교세포 유래 신경영양 인자 펩타이드 결합 도메인, 전환 성장 인자 β 펩타이드 결합 도메인, 골 형태형성 단백질 펩타이드 결합 도메인, 성장 및 분화 인자 펩타이드 결합 도메인, 액티빈 펩타이드 결합 도메인, 혈관 내피 성장 인자 펩타이드 결합 도메인, 인슐린 성장 인자 펩타이드 결합 도메인, 상피세포 성장 인자 펩타이드 결합 도메인, 글루카곤 유사 호르몬 펩타이드 결합 도메인, 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성화 펩타이드 결합 도메인, 성장호르몬-방출 호르몬 펩타이드 결합 도메인, 혈관작용 장 펩타이드 결합 도메인, 위 억제 폴리펩타이드 펩타이드 결합 도메인, 칼시토닌-관련 펩티데스비세랄 장 펩타이드 결합 도메인, 또는 프로테아제 활성화 수용체 펩타이드 결합 도메인인 것인, 상기 14에 따른 세포내 방법.실시예실시예 1TEV 프로테아제 변이체하기 실시예는 증가된 안정성 및/또는 용해도를 가진 TEV 프로테아제 변이체를 제조하고 이용하는 방법을 예시한다.A. pET29/TEV 발현 작제물의 작제.TEV 프로테아제를 재조합적으로 생성하기 위해, 요망되는 TEV 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 표준 방법(워싱턴주 보델시에 소재한 BlueHeron Biotechnology)을 이용하여 합성하였다. 전체 열린 해독 틀에 걸쳐 20개 내지 50개 염기 길이의 상보적 올리고뉴클레오타이드를 표준 포스포아미다이트(phosphoramidite) 합성법을 이용하여 합성하였다. 상기 올리고뉴클레오타이드를 전장 폴리뉴클레오타이드 분자를 어셈블리하기 위해 함께 순차적으로 결찰되어 있는 이중가닥 듀플렉스(duplex) 내로 하이브리드화시켰다. 표준 분자 생물학 방법을 이용하여 상기 폴리뉴클레오타이드 분자를 pUCBHB1 담체 벡터 내로 SmaI 부위에 클로닝하여 pUCBHB1/TEV 플라스미드를 생성하였다. 합성된 폴리뉴클레오타이드 분자를 BIG DYE TERMINATOR(상표명) Chemistry 3.1(캘리포니아주의 포스터 시티에 소재한 Applied Biosystems) 및 ABI 3100 서열분석기(캘리포니아주의 포스터 시티에 소재한 Applied Biosystems)를 이용하여 서열분석함으로써 확인하였다.TEV 변이체를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 대장균 발현에 대해 코돈-최적화시켜서, 전체가 N- 또는 C-말단 폴리-히스티딘 친화성 정제 태그에 융합된 전장 TEV 폴리단백질(polyprotein)의 잔기 2038-2279에 상응하는 약 27.5 kDa인 약 250개 아미노산의 단백질분해성 단편을 엔코딩하도록 하였다. 야생형 TEV 프로테아제의 재조합 발현은 세린 219에서 자신을 절단하는 경향을 갖는 단백질을 발생시켜 매우 감소된 단백질분해 활성을 가진 트렁케이션된(truncated) 프로테아제가 생성시킨다. 따라서, 자가단백질분해 및 상기 트렁케이션된 생성물의 후속 생성을 대부분 제거하기 위해, 세린 219를 아스파라긴(S219N) 또는 발린(S219V)으로 변경시킨 TEV 변이체를 합성하였다. 또한, 재조합 야생형 TEV 프로테아제가 대장균에서 매우 높은 수준으로 발현됨에도 불구하고, 거의 전체적으로 불용성임은 널리 공지되어 있다(참조: Kapust et al., 2001). 따라서, 발현된 TEV의 용해도를 향상시키기 위해, 몇몇 아미노산 변이체를 제조하여, 상기 변화가 증가된 단백질 용해도를 발생시키는 지를 결정하기 위해 시험하였다. 합성된 TEV 변이체는 표 3에 제시되어 있다. 변이체 1은 C-말단 His-태그 및 S219N 돌연변이를 갖도록 조작된 코돈-최적화된 TEV 작제물이다. 변이체 11은 N-말단 태그 및 S219N 돌연변이를 갖도록 조작된 TEV 프로테아제의 천연 DNA 서열을 가진 작제물이다.pET29/TEV 변이체 발현 작제물을 작제하기 위해, pUCBHB1/TEV 작제물을, 1) TEV를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 삽입부를 잘라내고; 2) 상기 삽입부가 pET29 벡터(위스콘신주의 매디슨시에 소재한 EMD Biosciences-Novagen)에 작동가능하게 연결되도록 해주는 제한 엔도뉴클레아제로 효소처리하였다. T4 DNA 리가제 절차를 이용하여, 상기 삽입부를 다중 클로닝 부위에서 동일한 제한 엔도뉴클레아제로 효소처리한 pET29 벡터 내로 방향성을 맞춰 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 전기-적격 대장균 BL21(DE3) Acella 세포(메릴랜드주의 게이더스버그시에 소재한 Edge BioSystems) 내로 전기천공에 의해 형질전환시키고, 50 ㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 1.5% 루리아-베르타니(Luria-Bertani) 한천 플레이트(pH 7.0)에 플레이팅시키고, 밤새 성장을 위해 37℃ 인큐베이터에서 정치시켰다. 발현 작제물을 함유한 박테리아를 카나마이신 내성 콜로니로서 확인하였다. 후보 작제물을, 알칼리성 용해 플라스미드 미니-프레퍼레이션(mini-preparation) 절차를 이용하여 분리하였고, DNA 가닥 둘 모두를 제한 엔도뉴클레아제 효소처리 맵핑(mapping) 및 서열분석에 의해 분석하여 TEV 유전자 삽입부의 존재와 완전성을 확인하였다. 상기 클로닝 방법을 통해 카복실 말단 또는 아미노-말단의 폴리히스티딘 친화성 정제 펩타이드에 작동가능하게 연결된 TEV 변이체를 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 pET29 발현 작제물을 수득하였다.B. 상이한 유도 조건하에서의 TEV 발현의 분석사용하기 위한 최상의 성장 및 단백질 유도 조건을 결정하기 위해, pET29/TEV 변이체 9 및 10(표 3 참조)을 IPTG 유도 배지 및 자가-유도 배지에서 성장시키고 유도시켰다. 또한 유도의 길이를 검사하였다.IPTG를 사용하여 발현을 유도하기 위해, TEV 발현 작제물을 함유한 세포를 우선 밤새 성장시켜 출발 배양물(starter culture)을 생성시켰다. 상기 밤새 성장시킨 배양물을 1:1000으로 희석하여 새로운 LB 배지에 접종시키고, OD600이 0.7에 도달할 때까지 37℃에서 진탕시키면서 성장시키고, OD600이 0.7에 도달했을 때 IPTG를 최종 농도 0.6 mM이 되도록 첨가하였다. 유도시킨 지 4시간 후에 세포를 수확하고, 표적 발현을 검출하기 위해 전체 세포 용해물을 평가하였다.자가-유도 조건하에서 작제물을 발현시키기 위해, 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 PA-0.5G 배지 3.0㎖에 적절한 발현 작제물을 함유한 BL21(DE3) 세포의 단일 콜로니를 접종시키고, 밤새 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다. 상기 출발 배양물 중 1.0㎕를 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 ZYP-5052 자가-유도 배지 1.0㎖에 접종시키기 위해 사용하였다. 세포를 37℃에서 진탕시키면서 성장시키고, 분취액(aliquot)을 5, 8, 12, 20 및 28시간에 분리시켰다.총 TEV 프로테아제 발현을 결정하기 위해, 각 시점으로부터의 상기 유도된 세포 배양물 40㎕를 동일 부피의 2x 래믈리 샘플 완충액(Laemmli Sample Buffer)과 혼합하고, 10분 동안 95℃에서 인큐베이션시켰다. 1M MgSO4 중의 1 unit/㎕ 벤조나제(Benzonase) 2㎕를 상기 혼합물에 첨가하고, 5분 동안 95℃에서 인큐베이션시켰다. 15㎕ 분취액을 변성 및 환원 조건하에서 NuPAGE(등록상표) Novex 4-12% Bis-Tris 프리캐스트(precast) 폴리아크릴아미드 겔(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 Invitrogen, Inc.)을 이용하여 MOPS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 로딩하고 분리시켰다. 상기 겔을 세척하고 10% 메탄올, 7% 아세트산을 포함하는 고정액(Fix Solution)에서 30분 동안 고정시켰다. 고정 후에, 상기 고정액을 제거하고, 겔을 실ㄹ온에서 SYPRO 루비 단백질 겔 염색액(Ruby Protein Gel Stain)과 함께 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 그런 다음, 겔을 10% 메탄올, 7% 아세트산을 포함하는 탈염색용액(Destain Solution)에서 3시간 동안 실온에서 탈염색시켰다. Typhoon 9410 가변 모드 이미저(Variable Mode Imager) 및 이미저 분석 소프트웨어(Imager Analysis software)(GE Healthcare, Amersham Bioscience, 뉴저지주의 피스카타웨이시에 소재)를 이용하여 이미지를 시각화하였다.가용성 TEV 프로테아제 발현을 결정하기 위해, 유도된 세포 배양물 1.0㎖를 1×FASTBREAK(상표명) 세포 용해 시약(위스콘신주의 매디슨시에 소재한 Promega Corp.), 500mM NaCl, 250 unit/㎖ 벤조나제 뉴클레아제(위스콘신주의 매디슨시에 소재한 EMD Biosciences-Novagen) 및 1×프로테아제 억제제 칵테일(Cocktail) III(뉴저지주의 깁스타운시에 소재한 EMD Biosciences-Calbiochem)을 포함하는 세포 용해 용액(Cell Lysis Soultion) 100㎕를 첨가함으로써 용해시키고, 일정하게 볼텍싱(vortexing)시키면서 25분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 용해물을 15분 동안 4300 rpm에서 원심분리시켜 펠렛(pellet) 찌꺼기를 만들었다. 800㎕의 상층액을 깨끗한 튜브로 옮기고, 튜브에 MagneHis 자성 비드 30㎕를 첨가하고, 상기 혼합물을 일정하게 회전시키면서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 자성 비드를 자성 스탠드 상에서 격리시키고, 용액을 제거하고, 상기 비드를 500mM NaCl을 포함하는 150㎕ 세척 완충액을 사용하여 3회 세척하였다. 단백질을 80㎕의 용리 완충액을 사용하여 용리시키고, 동일 부피의 2 x 래믈리 샘플 완충액을 첨가하고, 혼합물을 10분 동안 95℃에서 인큐베이션시켰다. 15㎕ 분취액을 변성 및 환원 조건하에서 NuPAGE(등록상표) Novex 4-12% Bis-Tris 프리캐스트 폴리아크릴아미드 겔(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 Invitrogen, Inc.)을 이용하여 MOPS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 로딩하고 분리시켰다.유도 실험 결과는 자가-유도 조건이 IPTG-유도에 비하여 TEV 프로테아제를 5 내지 10배 더 많이 발현시킨 것을 나타내었다. 자가-유도 배지에서 총 TEV 프로테아제 발현과 가용성 TEV 프로테아제 발현의 비교를 통하여, 더 긴 유도 시간이 더 많은 총 단백질을 발생시킴에도 불구하고, 회수가능한 가용성 TEV 프로테아제의 양은 감소한 것으로 밝혀졌다. 실제로, 37℃에서 약 8시간 발현시킴으로써 가장 많은 양의 가용성 단백질을 수득하였다. 마지막으로, TEV S219N 및 TEV S219V 변이체 둘 모두가 현저하게 더 적은 자가단백질분해를 나타냈음에도 불구하고, TEV 219V 변이체는 연장된 유도 시간에서 더 많은 트렁케이션된 생성물을 나타내었으며, 이는 TEV S219V 변이체가 더욱 쉽게 자가단백질분해되었음을 암시한다.일단 성장 및 유도 조건이 pET29/TEV 변이체 9 및 10을 사용하여 최적화되면, 11개 pET29/TEV 변이체 모두의 발현을 상기 조건하에서 동시에 시험하였다. 그 결과 상위 5개 발현자 중 최대부터 최소까지, 가용성 TEV 프로테아제의 수율을 증가시키는 순서는 pET29/TEV 변이체 5부터 10, 7, 3 그리고 6이었다. 이에 비해, TEV 변이체 11은 전체 중 가장 낮은 수준으로 발현되었다.C. 대규모 발현 및 정제대규모 조건하에서, 대조군으로서 변이체 11과 함께, 상위 5개 pET29/TEV 변이체들로부터의 TEV 프로테아제 발현 수준을 정밀히 비교하기 위해, 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 PA-0.5G 배지 3.0㎖에 적절한 발현 작제물을 함유한 BL21(DE3) 세포의 단일 콜로니를 접종시키고, 밤새 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다. 출발 배양물 중 250㎕를 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 ZYP-5052 250㎖에 접종시키는 데에 사용하였고, 8시간 동안 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다. 상기 세포들을 원심분리에 의해 펠렛화하였다.세포를 용해시키기 위해, 세포 펠렛을 BUGBUSTER(상표명) 단백질 추출 시약(위스콘신주의 매디슨시에 소재한 EMD Biosciences-Novagen), 1×프로테아제 억제제 칵테일 세트 III(뉴저지주의 깁스타운시에 소재한 EMD Biosciences-Calbiochem), 25 unit/㎖ 벤조나제 뉴클레아제 및 1 Kunit/㎖ rLysozyme(위스콘신주의 매디슨시에 소재한 EMD Biosciences-Novagen)을 포함하는 용해 용액에 5.0 ㎖/그람 세포 펠렛(세포 펠렛 1g 당 용해 용액 5.0㎖)으로 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 20분 동안 플랫폼 락커(platform rocker) 상에서 실온에서 인큐베이션시킨 다음, 15분 동안 얼음 상에서 인큐베이션시켰다. 현탁액을 30,350 rcf에서 30분 동안 4℃에서 원심분리하여 펠렛 찌꺼기가 형성되도록 하고, 상층액을 깨끗한 튜브로 옮겼다. SDS-PAGE 분석을 위한 불용성 세포 추출물 펠렛을 제조하기 위해, 펠렛을 본래 부피의 1×BUGBUSTER(상표명) 단백질 추출 시약을 사용하여 재현탁시켰다.IMAC 정제에 의해 TEV 프로테아제 변이체를 정제하기 위해, 상기 정화된 용해물을 25mM 인산나트륨(pH 7.0), 500mM NaCl, 10% 글리세롤 및 35mM 이미다졸을 포함하는 IMAC 세척 용액으로 평형화된 TALON(상표명) 슈퍼플로우 금속 친화성 코발트 수지(SuperFlow Metal Affinity Cobalt Resin)와 혼합시켰다. 용해물-수지 혼합물을 플랫폼 락커 상에서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 다음, 진공 메니폴드(vacuum manifold)에 부착된 20㎖ 일회용 칼럼 지지체로 옮겼다. 상기 칼럼을 5배 칼럼 부피의 IMAC 세척 용액을 사용하여 2회 세척하였다. 25mM 인산나트륨(pH 7.8), 500mM NaCl, 10% 글리세롤 및 500mM 이미다졸을 포함하는 2배 칼럼 부피의 IMAC 용리 용액을 사용하여 상기 수지로부터 TEV 프로테아제를 용리시켰고, 1.0㎖ 분획으로 수집하였다. 단백질을 함유하는 각 분획을, 10㎕ 분취액을 200㎕의 QUICKSTART(상표명) 브래드포드 염색 시약(Bradford Dye reagent)과 혼합함으로써 확인하였다. 피크(peak) 용리 분획을 풀링(pooling)시키고, 이차 이온 교환 크로마토그래피 정체를 위해 투석시켰다.IMAC-정제된 TEV 프로테아제 변이체를 투석시키기 위해, 피크 용리 분획을 포함하는 풀링된 샘플을 4℃에서 밤새 일정하게 교반하면서 1ℓ의 탈염 완충액(Desalting Buffer) 중에 25 kD MWCO 막이 장착된 FASTDIALYZER(등록상표)로 투석시켰다. 양이온 교환 크로마토그래피를 위해, 상기 탈염 완충액(완충액 A)은 50mM Tris-HCl(pH 8.0)을 포함하였다.양이온 교환 크로마토그래피에 의해 TEV 프로테아제 변이체를 정제하기 위해, 탈염된 단백질 용액을 완충액 A로 사전-평형화된 1㎖ UNO-S1 양이온 교환 칼럼 상에 0.5 ㎖/분의 유속으로 로딩시켰다. 결합된 단백질을 1.0 ㎖/분의 유속으로 25mM 인산나트륨(pH 7.0), 1M NaCl을 포함하는 다음과 같은 완충액 B를 사용하여 NaCl 구배에 의해 용리시켰다: 3㎖에 대해서는 5% 완충액 B, 10㎖에 대해서는 20% 완충액 B, 10㎖ 초과에 대해서는 20% 내지 100% 완충액 B. 칼럼으로부터 단백질의 용리를 214㎚, 260㎚ 및 280㎚에서 UV-가시광선 검출기를 이용하여 검출하고, 모든 피크 분획을 풀링시키고, 단백질 농도를 결정하였다. 분취액을 액체 질소에서 재빨리 동결시키고, -80℃에 보관하였다. TEV 변이체 7의 가용성 프로테아제 수율이 가장 높았으며(약 35 ㎎/ℓ), 이어서 변이체 3(약 24 ㎎/ℓ) 및 변이체 10(약 23 ㎎/ℓ) 순이었다. 나머지 두 변이체인 5 및 6의 수율은 각각 18 ㎎/ℓ 및 8 ㎎/ℓ였다. TEV 변이체 11의 수율은 약 0.6 ㎎/ℓ였다. 이와 같이, 용해도 향상 아미노산 변경을 함유하는 상위 5개 TEV 변이체 전부는, 단지 자가단백질분해 제거 아미노산 변경(S219N)을 포함하는 TEV 변이체 11에 비해 정제된 가용성 TEV 프로테아제에 있어서 적어도 10배 증가를 발생시켰다. 소규모 및 대규모 발현 연구로부터 TEV 프로테아제의 수율 순위를 비교하면, 변이체 5가 소규모 발현에 있어서 가장 높은 수율을 나타냈었다(실시예 1C). 그러나, 대규모 발현에서 가장 높은 수율을 가진 것은 변이체 7이었다. 대규모 배취(batch)로부터의 수율의 반복 비교를 통해, 변이체 7이 일관되게 가장 높은 발현 변이체로 밝혀졌다. 결과적으로, 변이체 7이 선도(lead) TEV 프로테아제 작제물로 나타났으며, 이를 본원에 기재된 모든 후속 연구에 사용하였다.TEV 프로테아제 변이체의 단백질분해 활성을 결정하기 위해, TEV 프로테아제 변이체, 또는 양성대조군으로서 AcTEV 프로테아제를 50mM Tris-HCl(pH 8.0), 1mM DTT 및 2.5㎍의 TEV 기질을 포함하는 반응 용액(Reaction Solution) 30㎕에 첨가하고, 30℃에서 30분, 60분 및 120분 동안 인큐베이션시켰다. 상기 반응물을, 2×래믈리 샘플 완충액을 첨가하고 상기 샘플을 10분 동안 95℃에서 인큐베이션시킴으로써 켄칭(quenching)시켰다. 15㎕ 분취액을 변성 및 환원 조건하에서 NuPAGE(등록상표) Novex 4-12% Bis-Tris 프리캐스트 폴리아크릴아미드 겔(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 Invitrogen, Inc.)을 사용하는 MOPS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 로딩하고 분리하였다. 겔을 세척하고, 10% 메탄올, 7% 아세트산을 포함하는 고정 용액에서 30분 동안 고정시켰다. 고정 후에, 고정 용액을 제거하고, 겔을 실온에서 3시간 동안 SYPRO 루비 단백질 겔 염색액과 함께 인큐베이션시켰다. 그런 다음 겔을 실온에서 3시간 동안 10% 메탄올, 7% 아세트산을 포함하는 탈염색 용액에서 탈염색시켰다. Typhoon 9410 가변 모드 이미저를 이용하여 이미지를 시각화시키고, ImageQuantTL 이미지 분석 소프트웨어(GE Healthcare, Amersham Biosciences, 뉴저지주의 피스카타웨이시에 소재)를 이용하여 분석하였다. 절단되지 않은 기질 및 절단된 생성물의 강도의 비(ratio)를, 절단된 TEV 기질의 백분율을 계산하기 위해 이용하였다. TEV 프로테아제 활성 분석의 결과를 표 4에 기재하였다.실시예 22개의 상이한 발현 작제물을 이용한 TEV 프로테아제 절단 부위를 가진 클로스트리디움 독소의 세포내 활성화하기 실시예는 본 발명의 명세서에 개시된 바와 같은 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 클로스트리디움 독소를 세포에서 발현시키는 데에 유용한 절차를 예시한다.A. pET29/BoNT/A-TEV 발현 작제물의 작제.이-사슬 루프 영역 내에 위치된 TEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 BoNT/A를 생성시키기 위해, 요망되는 BoNT/A-TEV(서열번호 88)를 엔코딩하는 열린 해독 틀(서열번호 87)을 표준 방법(워싱턴주 보델시에 소재한 BlueHeron Biotechnology)을 이용하여 합성하였다. BoNT/A-TEV의 전체 열린 해독 틀에 걸쳐 20개 내지 50개 염기 길이의 상보적 올리고뉴클레오타이드를 표준 포스포아미다이트 합성법을 이용하여 합성하였다. 상기 올리고뉴클레오타이드를 전장 폴리뉴클레오타이드 분자를 어셈블리하기 위해 함께 순차적으로 결찰된 이중가닥 듀플렉스 내로 하이브리드화시켰다. 표준 분자 생물학 방법을 이용하여 상기 폴리뉴클레오타이드 분자를 pUCBHB1 담체 벡터 내로 SmaI 부위에 클로닝하여 pUCBHB1/BoNT/A-TEV 작제물을 생성시켰다. 합성된 폴리뉴클레오타이드 분자를 BIG DYE TERMINATOR(상표명) Chemistry 3.1(캘리포니아주의 포스터 시티에 소재한 Applied Biosystems) 및 ABI 3100 서열분석기(캘리포니아주의 포스터 시티에 소재한 Applied Biosystems)를 이용하여 서열분석함으로써 확인하였다.pET29/BoNT/A-TEV 발현 작제물을 생성하기 위해, pUCBHB1/BoNT/A-TEV를, 1) BoNT/A-TEV를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 포함하는 삽입부를 잘라내고; 2) 상기 삽입부가 pET29 벡터(위스콘신주의 매디슨시에 소재한 EMD Biosciences-Novagen)에 작동가능하게 연결되도록 해주는 제한 엔도뉴클레아제로 효소처리하였다. T4 DNA 리가제 절차를 이용하여 상기 삽입부를 유사 제한 엔도뉴클레아제로 효소처리된 pET29 벡터내로 서브클로닝하여, 적절한 pET29/BoNT/A-TEV 발현 작제물을 생성시켰다. 결찰 혼합물을 전기-적격 대장균 BL21(DE3) Acella 세포(메릴랜드주의 게이더스버그시에 소재한 Edge BioSystems) 내로 전기천공에 의해 형질전환시키고, 50 ㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 1.5% 루리아-베르타니 한천 플레이트(pH 7.0)에 플레이팅시키고, 밤새 성장을 위해 37℃ 인큐베이터에서 정치시켰다. 발현 작제물을 함유한 박테리아를 카나마이신 내성 콜로니로서 확인하였다. 후보 작제물을 알칼리성 용해 플라스미드 미니-프레퍼레이션 절차를 이용하여 분리하였고, DNA 가닥 둘 모두를 제한 엔도뉴클레아제 효소처리 맵핑 및 서열분석함으로써 분석하여 삽입부의 존재와 완전성을 분석하였다. 상기 클로닝 방법을 통해 카복실 말단의 폴리히스티딘 친화성 정제 펩타이드에 작동가능하게 연결된 BoNT/A-TEV를 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 pET29 발현 작제물을 생성시켰다.B. pET22/TEV 발현 작제물의 작제.pET22/TEV 변이체 발현 작제물을 생성하기 위해, pET29/TEV 변이체 7 발현 작제물을, 1) TEV 프로테아제(서열번호 78)를 엔코딩하는 열린 해독 틀(서열번호 77)을 포함하는 삽입부를 잘라내고; 2) 상기 삽입부가 pET22 벡터(위스콘신주의 매디슨시에 소재한 EMD Biosciences-Novagen)에 작동가능하게 연결되도록 해주는 제한 엔도뉴클레아제로 효소처리하였다. T4 DNA 리가제 절차를 이용하여 상기 삽입부를 유사 제한 엔도뉴클레아제로 효소처리된 pET22 벡터 내로 서브클로닝하여, 적절한 pET22/TEV 발현 작제물을 생성시켰다. 결찰 혼합물을 전기-적격 대장균 BL21(DE3) Acella 세포(메릴랜드주의 게이더스버그시에 소재한 Edge BioSystems) 내로 전기천공에 의해 형질전환시키고, 50 ㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 1.5% 루리아-베르타니 한천 플레이트(pH 7.0)에 플레이팅시키고, 밤새 성장을 위해 37℃ 인큐베이터에서 정치시켰다. 발현 작제물을 함유한 박테리아를 앰피실린 내성 콜로니로서 확인하였다. 후보 작제물을 알칼리성 용해 플라스미드 미니-프레퍼레이션 절차를 이용하여 분리하였고, DNA 가닥 둘 모두를 제한 엔도뉴클레아제 효소처리 맵핑 및 서열분석함으로써 분석하여 삽입부의 존재와 완전성을 확인하였다. 상기 클로닝 방법을 통해 아미노 말단의 폴리히스티딘 친화성 정제 펩타이드에 작동가능하게 연결된 TEV 변이체 7을 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 pET22 발현 작제물을 수득하였다.C. pET29/BoNT/A-TEV 및 pET22/TEV 발현 작제물을 포함하는 세포의 작제.pET29/BoNT/A-TEV 및 pET22/TEV 발현 작제물을 포함하는 세포를 제조하기 위해, pET29/BoNT/A-TEV 발현 작제물을 pET22/TEV 변이체 7 발현 작제물을 함유한 전기-적격 대장균 BL21(DE3) 세포 내로 전기천공을 이용하여 형질전환시키고, 50 ㎍/㎖의 앰피실린 및 50 ㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 1.5% 루리아-베르타니 한천 플레이트(pH 7.0)에 플레이팅시키고, 밤새 성장을 위해 37℃ 인큐베이터에서 정치시켰다. 두 발현 작제물 모두를 함유한 박테리아를 앰피실린-카나마이신 내성 콜로니로서 확인하였다. 후보 작제물을 알칼리성 용해 플라스미드 미니-프레퍼레이션 절차를 이용하여 분리하였고, 제한 엔도뉴클레아제 효소처리 맵핑에 의해 분석하여 두 작제물 모두의 존재를 결정하였다. 상기 클로닝 방법을 통해 pET29/BoNT/A-TEV 및 pET22/TEV 발현 작제물을 포함하는 세포를 생성시켰다.D. BoNT/A-TEV의 동소(in situ) 활성화.자가-유도 조건하에서 BoNT/A-TEV의 이-사슬 형태를 생성하기 위해, 50 ㎍/㎖ 카나마이신 및 50 ㎍/㎖ 앰피실린을 함유하는 3.0 ㎖의 PA-0.5G 배지에 pET29/BoNT/A-TEV 및 pET22/TEV 발현 작제물을 함유한 BL21(DE3) 세포의 단일 콜로니를 접종시키고, 밤새 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다. 상기 출발 배양물 중 약 1.0㎕를 사용하여 50 ㎍/㎖ 카나마이신 및 50 ㎍/㎖ 앰피실린을 함유하는 1.0 ㎖의 ZYP-5052에 접종시키고, 3.5시간 동안 진탕시키면서 37℃에서 성장시킨 다음 18.5시간 동안 진탕시키면서 22℃에서 성장시켰다. 대조군으로서, pET29/BoNT/A-TEV를 단독으로 함유한 BL21(DE3) 세포를 상기 기재된 바와 같이 성장시키고 유도시키되, 선별제로서 단지 50 ㎍/㎖ 카나마이신만을 사용하였다.성장 및 유도 후에, 본질적으로 실시예 1B에 기재된 바와 같이, 세포를 용해시키고 IMAC 정제하였다. 본질적으로 실시예 1B에 기재된 바와 같이, IMAC 정제된 샘플을 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 겔을 염색시켰다.결과적으로 pET29/BoNT/A-TEV를 단독으로 발현시킨 경우, 환원 및 비-환원 조건 둘 모두에서 BoNA/A-TEV의 단일-사슬에 상응하는 약 150 kDa 밴드가 검출된 것으로 나타났다. 대조적으로, BoNT/A-TEV를 TEV 프로테아제와 함께 공동-발현시킨 경우, 환원 조건하에서 2개의 밴드, 즉 하나는 약 50 kDa의 밴드 및 다른 하나는 약 100 kDa의 밴드가 관찰되었다. 또한, 동일 샘플을 비-환원 조건하에서 수행한 경우, 약 50 kDa 및 약 100 kDa 밴드가 사라졌고, 약 150 kDa의 새로운 밴드가 관찰되었다. 종합해 보면, 상기 관찰들은, 환원 조건하에서 나타난 약 50 kDa 및 약 100 kDa 밴드는 BoNT/A-TEV의 경쇄 및 중쇄에 상응함을 나타내는 것이며, 상기 두 밴드의 존재는 BoNT/A-TEV의 이-사슬 형성을 나타내는 것이다. 따라서, 상기 세포에서 BoNT/A-TEV 및 TEV 프로테아제의 공동-발현은 이-사슬 루프 내에 위치된 TEV 프로테아제 절단 부위에서 BoNA/A-TEV의 절단 및 BoNT/A-TEV의 이-사슬 형태의 후속적인 형성을 발생시킨다.상기 결과들을 확인하기 위해, pET29/BoNT/A-TEV 및 pET22/TEV 발현 작제물을 함유한 BL21(DE3) 세포의 대규모 발현을 수행하였다. 50 ㎍/㎖ 카나마이신 및 50 ㎍/㎖ 앰피실린을 함유한 3.0㎖의 PA-0.5G 배지에 pET29/BoNT/A-TEV 및 pET22/TEV 발현 작제물을 포함하는 BL21(DE3) 세포의 단일 콜로니를 접종시키고, 밤새 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다. 상기 출발 배양물 중 약 250㎕를 사용하여 50 ㎍/㎖ 카나마이신 및 50 ㎍/㎖ 앰피실린을 함유한 250 ㎖의 ZYP-5052에 접종시키고, 3.5시간 동안 진탕시키면서 37℃에서 성장시킨 다음, 18.5시간 동안 진탕시키면서 22℃에서 성장시켰다. 상기 세포를 원심분리에 의해 펠렛화시켰다. 실시예 1C에 기재된 바와 같이 세포를 용해시키고 IMAC 정제하였다.이차 이온 교환 크로마토그래피를 위한 IMAC-정제된 BoNT/A-TEV를 투석시키기 위해, 피크 용리 분획을 포함하는 풀링된 샘플을 밤새 일정하게 교반하면서 1ℓ의 탈염 완충액 중에 4℃에서 25 kD MWCO 막이 장착된 FASTDIALYZER(등록상표)로 투석시켰다. 음이온 교환 크로마토그래피를 위해, 상기 탈염 완충액(완충액 A)은 50mM Tris-HCl(pH 8.0)을 포함하였다.음이온 교환 크로마토그래피에 의해 BoNT/A-TEV를 정제하기 위해, 탈염된 단백질 용액을 완충액 A로 사전-평형화된 1 ㎖ UNO-Q1 음이온 교환 칼럼 상에 0.5 ㎖/분의 유속으로 로딩시켰다. 결합된 단백질을 0.5 ㎖/분의 유속으로 50mM Tris-HCl(pH 8.0), 1M NaCl을 포함하는 다음과 같은 완충액 B를 사용하여 NaCl 구배에 의해 용리시켰다: 3㎖에 대해서는 3% 완충액 B, 10㎖에 대해서는 7% 완충액 B, 10㎖ 초과에 대해서는 7% 내지 100% 완충액 B. 칼럼으로부터 단백질의 용리를 214㎚, 260㎚ 및 280㎚에서 UV-가시광선 검출기를 이용하여 검출하고, 모든 피크 분획을 풀링시키고, 단백질 농도를 결정하였다. 분취액을 액체 질소에서 재빨리 동결시키고, -80℃에 보관하였다. 본질적으로 실시예 1B에 기재된 바와 같이, 정제된 BoNT/A-TEV 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분석하였고, 겔을 염색시켰다. 상기 결과를 통해 최초 소규모 실험이 확인되었으며, 이는 단일-사슬 BoNT/A-TEV가 거의 100% 효율로 그의 이-사슬 형태로 전환되었음을 나타낸다.BoNT/A-TEV 이-사슬의 활성을 평가하기 위해, 상기 독소를 세포-기반 분석법 및 동물-기반 분석법에서 평가하였다.세포-기반 분석법을 이용하여 BoNT/A-TEV 이-사슬의 활성을 시험하기 위해, 멀티플렉스(multiplex) ECL 샌드위치 ELISA를 이용하는 면역-기반 BoNT/A 활성 분석법을 본질적으로 특허 출원(참조: Fernandez-Salas, et al., Immuno-Based BoNT/A Activity Assays, Attorney Docket No. 18383 (BOT), 전체내용이 참조로서 본원에 포함됨)에 기재된 바와 같이 수행하였다.분석을 위한 BoNT/A-TEV 처리된 세포 용해물을 수득하기 위해, SiMa 세포주의 스톡(stock) 배양물로부터 약 50,000개의 세포를 최소 필수 배지(Minimum Essential Medium), 얼 염(Earle's salt) 함유 2mM GlutaMAX(상표명) I, 1×B27 보충제(supplement), 1×N2 보충제, 0.1mM 비-필수 아미노산, 10mM HEPES 및 25 ㎍/㎖의 GTb1을 함유하는 혈청 비함유 배지가 함유된 폴리-D-라이신 96-웰 플레이트내로 시딩하였다. 상기 세포들을, 성장 정지 및 신경돌기 신장과 같은, 표준적이고 일반적인 형태학적 기준에 의해 평가했을 때, 세포가 분화할 때 까지(약 3일) 5% 이산화탄소 하에 37℃ 인큐베이터에서 인큐베이션시켰다. 각 웰로부터 배지를 흡인시키고, 0(미처리된 샘플), 0.01nM, 0.04nM, 0.12nM, 0.37nM, 1.11nM, 3.33nM 및 10.0nM의 BoNT/A-TEV를 함유하는 새로운 배지로 교체하였다. 24시간 처리 후에, 세포를 세척하고, 독소 없이 추가 2일 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 수확하기 위해, 배지를 흡인시키고, 1×PBS로 세척하고, 50mM HEPES, 150mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1mM EGTA, 1% 트리톤(Triton) X-100을 포함하는 용해 완충액 30㎕를 각 웰에 첨가함으로써 용해시키고, 상기 플레이트를 500 rpm으로 회전하는 진탕기에서 30분 동안 4℃에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 4℃에서 20분 동안 4000 rpm으로 원심분리시켜 세포 찌꺼기를 펠렛화하고, 검출 단계를 수행하기 위해 포획 항체가 코팅된 96-웰 플레이트로 상층액을 옮겼다.α-SNAP-25 포획 항체 용액을 제조하기 위해, 하이브리도마 세포주 2E2A6으로부터의 복수(ascite)에 함유된 α-SNAP-25 모노클로날 항체를 표준 단백질 A 정제 프로토콜을 이용하여 정제하였다. α-SNAP-25 검출 항체 용액을 제조하기 위해, α-SNAP-25 토끼 폴리클로날 항체 S9684(미주리주의 세인트루이스시세 소재한 Sigma)를 루테늄(II)-트리스-비피리딘-(4-메티설포네이트) NHS 에스터 표지 시약(메릴랜드주의 게이더스버그시에 소재한 Meso Scale Discovery)에 제조사의 설명서(메릴랜드주의 게이더스버그시에 소재한 Meso Scale Discovery)에 따라 컨쥬게이션시켰다. SNAP-25 절단된 생성물에 대해 특이적인 포획 항체를 포함하는 고상 지지체를 제조하기 위해, 약 5㎕의 α-SNAP-25 모노클로날 항체 2E2A6 용액(1×PBS 중의 20 ㎍/㎖)을 96-웰 MSD 하이 바인드(High Bind) 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 상기 용액을 2 내지 3시간 동안 생물학적 안전 캐비넷에서 공기 건조시켜 용액이 액체 증발되도록 하였다. 그런 다음, 포획 항체-결합된 웰을 블로킹(blocking)시키고, BoNT/A 활성을 검출하기 위해 직접 사용하였다.ECL 샌드위치 ELISA 분석에 의한, 절단된 SNAP-25 생성물의 존재를 검출하기 위해, 보관된 플레이트로부터 블로킹 완충액(Blocking Buffer)을 흡인시키고, BoNT/A로 처리된 세포부터의 용해물 25㎕를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포 용해물을 흡인시키고, 200㎕ 1×PBS, 0.1% TWEEN-20(등록상표)(폴리옥시에틸렌 (20) 솔비탄 모노라우레이트)를 사용하여 각 웰을 3회 린싱(rinsing)함으로써 플레이트 웰을 3회 세척하였다. 세척 후에, 1×PBS, 0.1% TWEEN-20(등록상표)(폴리옥시에틸렌 (20) 솔비탄 모노라우레이트) 중의 2% 애머샴 블로킹 시약(Amersham Blocking Reagent)을 포함하는 5㎍/㎖ α-SNAP-25 검출 항체 용액 25㎕를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하였고, 밀봉된 플레이트를 진탕시키면서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. α-SNAP-25 검출 항체 인큐베이션 후에, 200㎕ 1×PBS, 0.1% TWEEN-20(등록상표)(폴리옥시에틸렌 (20) 솔비탄 모노라우레이트)를 사용하여 3회 세척하였다. 그런 다음, ECL 이미저로부터 수득된 미가공 데이터를 SigmaPlot v. 9.0으로 전송하고, 4-파라미터 로지스틱 핏(4-parameter logistics fit)을 이용하여 용량-반응 곡선을 정의하였다. 데이터를 플로팅(plotting)할 때 4-파라미터 로지스틱 함수에 대해 사용된 제약조건은 없었다. 그래프 레포트를 다음의 분석법을 이용하여 생성하였다: R2(상관계수), a(데이터 셋에 대해 최대), b(사면(hillslope)) 및 X0 ± SE(EC50 값 ± 표준오차). 두 개의 독립적 수행으로부터의 결과는 이-사슬 둘 모두의 활성이 거의 동일하고, 천연 이-사슬의 2배 이내인 것으로 나타났다.동물-기반 분석법을 이용하여 BoNT/A-TEV 이-사슬의 활성을 시험하기 위해, 생체내(in vivo) 디지트 어브덕션 스코어(Digit Abduction Score: DAS) 분석법을 수행하였다. CD-1 Fe 마우스를 칭량하고, 각각 별개의 DAS 분석법에 대해 10마리 동물의 서브세트(subset)로 위치시켰다. 마우스를 다음의 기준에 기초하여 특정 서브세트 내로 포함시켰다: 1) 건강 양호; 2) 0의 로버스트 기저(robust baseline) DAS 반응; 3) 선택된 서브세트에 대해 확립된 X±2g의 중앙 체중 범위에 포함; 및 4) 17.0g 초과의 체중.각 마우스에 7가지 상이한 용량의 BoNT/A-TEV(0.01nM, 0.04nM, 0.12nM, 0.37nM, 1.11nM, 3.33nM 및 10.0nM) 중 하나의 5㎕를 30-게이지(gauge) 바늘을 사용하여 오른쪽 뒷다리의 비복근에 주사하였다. 대조군으로서, 왼쪽 뒷다리 비복근에 어떠한 BoNT/A-TEV도 함유하지 않은 용액 5㎕를 주사하였다. 마우스를 최초 4일 동안 연속적으로 DAS 반응에 대해 관찰하였다. 각 마우스 꼬리를 들어올려 주사된 뒷다리를 정확하게 관찰함으로써 DAS를 판독하였다. 뒷발가락의 외전(abduction) 또는 비외전은 근육에 주사된 시험 독소에 기인한 마비의 효과를 보여준다. 주사된 뒷다리의 발가락 외전을 주사되지 않은 뒷다리의 발가락 외전과 비교하고 이에 따라 스코어링하였다. DAS 데이터를, u/Kg 및/또는 ng/Kg의 단위로 하여 피크 평균 DAS 스코어 및 AUC(area under the curve: 곡선하면적)에 기초하여 ED50 투여량을 계산함으로써 분석하였다. 상기 분석은 다음과 같이 수행하였다: 1) 각 투여량에 대한 평균 피크 DAS 스코어를 각 연구에서 계산하였다; 2) 임의의 연구에서 5마리 초과의 사망을 야기한 임의의 투여량을 고려대상에서 제거하였다; 3) 소정의 개별 연구에 사용된 최고 투여량은 4.0의 평균 피크를 야기한 최저 투여량이었다; 4) 소정의 개별 연구에 사용된 최저 투여량은 0의 평균 피크를 야기한 최고 투여량이었다; 5) 평균 피크 DAS 대 로그(투여량)에 대한 각 개별 연구에 대해 곡선을 작도하였다; 6) 일부 연구에서 다중의 군 중 10마리 마우스의 각 군에 대해 AUC 값을 계산하였다; 7) 평균 AUC 대 로그(투여량)에 대한 각 개별 연구에 대해 곡선을 작도하였다; 8) 다중의 동일한 연구의 각 세트에 대해; 각 시험 독소에 대해 x, y 반복 반응 곡선을 작도하였다; 9) 투여량-반응 데이터를, 하기 방정식을 이용하는 3-파라미터 로지스틱 방정식(Sigma Plot v 8.0; SPSS Science, 일리노이주의 시카고시에 소재)을 이용하여 비선형 회귀(비-가중)에 의해 분석하였다:y = a/(1 + (x/x0)b)여기서 y는 반응, a는 점근(asymptotic) ymax, b는 기울기, x는 투여량, 0은 ED50 투여량이고, 피크 ED50 결정을 위해, Ymax를 4(척도 상 최대 DAS 판독)로 설정하였다. 평균 (피크 및/또는 AUC) ED50 값을 수행된 각 8-투여량 연구에 대해 계산하였다.두 독립 수행으로부터의 결과는 이-사슬 둘 모두의 활성 수준이 거의 동일하고, 천연 이-사슬의 2배 이내인 것으로 나타났다. 종합하면, 세포-기반 분석법 및 DAS 분석법에 따른 데이터는, 상기 세포내 활성화 방법을 통해 구조적으로는 시험관내에서 닉(nick)을 가진 재료에 필적할 뿐만 아니라 기능적으로는 구별되지 않는 이-사슬 rBoNT/A가 생성됨을 나타낸다.실시예 3독립 프로모터 제어하에 2개의 상이한 발현 작제물을 이용한 TEV 프로테아제 절단 부위를 갖는 클로스트리디움 독소의 세포내 활성화하기 실시예는 본 발명의 명세서에 개시된 바와 같은 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프 영역을 포함하는 클로스트리디움 독소를 세포에서 발현시키는 데에 유용한 절차를 예시한다. 이 경우에 있어서, 독소의 이-사슬 형태의 형성은 독립 프로모터의 제어하에서 TEV 프로테아제에 의해 조절된다.A. pBAD/TEV 발현 작제물의 작제.재조합적으로 TEV 프로테아제를 생성하기 위해, 아라비노스 프로모터(PBAD)의 제어하에서 발현되며, N-말단 His 태그가 없는, TEV 프로테아제 변이체 7(표 3 [171])을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 발현 벡터 pBAD/Myc-HisA내로 클로닝하여 pBAD/TEV를 작제하였다. pBAD/TEV를 작제하기 위해, N-말단 폴리-히스티딘 태그가 없는, TEV 프로테아제 변이체 7(서열번호 106)을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 표준 절차(캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 BlueHeron Biotechnology)를 이용하여 합성하였다. 또한 합성 단편을 제한 부위 측면에 위치시켜 상기 삽입부가 pBAD/Myc-HisA 벡터(위스콘신주의 매디슨시에 소재한 Life Technologies)에 작동가능하게 연결되도록 하였다. T4 DNA 리가제 절차를 이용하여, 상기 삽입부를 다중 클로닝 부위에서 동일한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 효소처리된 pBAD/Myc-HisA 벡터 내로 방향에 맞게 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 전기-적격 대장균 BL21(DE3) Acella 세포(메릴랜드주의 게이더스버그시에 소재한 Edge BioSystems) 내로 전기천공에 의해 형질전환시키고, 50 ㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 1.5% 루리아-베르타니 한천 플레이트(pH 7.0)에 플레이팅시키고, 밤새 성장을 위해 37℃ 인큐베이터에 정치시켰다. 발현 작제물을 함유한 박테리아를 앰피실린 내성 콜로니로서 확인하였다. 후보 작제물을 알칼리성 용해 플라스미드 미니-프레퍼레이션 절차를 이용하여 분리하였고, DNA 가닥 둘 모두를 제한 엔도뉴클레아제 효소처리 맵핑 및 서열분석함으로써 분석하여, TEV 유전자 삽입부의 존재와 완전성을 확인하였다. 상기 클로닝 방법을 통해 폴리히스티딘 친화성 정제 펩타이드가 없는 TEV 변이체 7을 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 pBAD/TEV 발현 작제물을 생성시켰다.B. pET29/BoNT/A-TEV 및 pBAD/TEV 발현 작제물을 포함하는 세포의 작제.pET29/BoNT/A-TEV 및 pBAD/TEV 발현 작제물을 포함하는 세포를 제조하기 위해, pET29/BoNT/A-TEV 발현 작제물(실시예 2A에 기재됨)을 pBAD/TEV 변이체 7 발현 작제물을 함유한 전기-적격 대장균 BL21(DE3) 세포 내로 전기천공을 이용하여 형질전환시키고, 50 ㎍/㎖의 앰피실린 및 50 ㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 1.5% 루리아-베르타니 한천 플레이트(pH 7.0)에 플레이팅시키고, 밤새 성장을 위해 37℃ 인큐베이터에 정치시켰다. 두 발현 작제물 모두를 함유한 박테리아를 앰피실린-카나마이신 내성 콜로니로서 확인하였다. 후보 작제물을 알칼리성 용해 플라스미드 미니-프레퍼레이션 절차를 이용하여 분리하였고, 제한 엔도뉴클레아제 효소처리 맵핑에 의해 분석하여 두 작제물 모두의 존재를 결정하였다. 상기 클로닝 방법을 통해 pET29/BoNT/A-TEV 및 pBAD/TEV 발현 작제물을 포함하는 세포를 생성시켰다.C. BoNT/A-TEV의 동소 활성화.자가-유도 조건하에서 BoNT/A-TEV의 이-사슬 형태를 생성시키기 위해, 50 ㎍/㎖ 카나마이신 및 50 ㎍/㎖ 앰피실린을 함유하는 3.0㎖의 PA-0.5G 배지에 pET29/BoNT/A-TEV 및 pBAD/TEV 발현 작제물을 함유한 BL21(DE3) 세포의 단일 콜로니를 접종시키고, 밤새 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다. 상기 출발 배양물 중 약 250㎕를 사용하여 50 ㎍/㎖ 카나마이신 및 100 ㎍/㎖ 앰피실린을 함유하는 250 ㎖의 ZYP-5052에 접종시키고, 8시간 동안 진탕시키면서 37℃에서 성장시킨 다음, 14시간 동안 진탕시키면서 22℃에서 성장시켰다. 이 시점에서, TEV 발현을 0.2% L-아라비노스를 사용하여 유도시키고, 배양물을 22℃에서 추가 4시간 동안 성장시켰다. 대조군으로서, pET29/BoNT/A-TEV를 단독으로 함유한 BL21(DE3) 세포를 상기 기재된 바와 같이 성장시키고 유도시키되, 선별제로서 단지 50 ㎍/㎖ 카나마이신만을 사용하였다.성장 및 유도 후에, 본질적으로 실시예 1C에 기재된 바와 같이, 세포를 용해시키고 IMAC 정제하였다. 이차 이온 교환 크로마토그래피를 위한 IMAC-정제된 BoNT/A-TEV를 투석시키기 위해, 피크 용리 분획을 포함하는 풀링된 샘플을 밤새 일정하게 교반하면서 1ℓ의 탈염 완충액 중에 4℃에서 25 kD MWCO 막이 장착된 FASTDIALYZER(등록상표)로 투석시켰다. 음이온 교환 크로마토그래피를 위해, 상기 탈염 완충액(완충액 A)은 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)을 포함하였다.음이온 교환 크로마토그래피에 의해 BoNT/A-TEV를 정제하기 위해, 탈염된 단백질 용액을 완충액 A로 사전-평형화된 1 ㎖ UNO-Q1 음이온 교환 칼럼 상에 0.5 ㎖/분의 유속으로 로딩시켰다. 결합된 단백질을 0.5 ㎖/분의 유속으로 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1M NaCl을 포함하는 다음과 같은 완충액 B를 사용하여 NaCl 구배에 의해 용리시켰다: 3㎖에 대해서는 3% 완충액 B, 10㎖에 대해서는 7% 완충액 B, 10㎖ 초과에 대해서는 7% 내지 100% 완충액 B. 칼럼으로부터 단백질의 용리를 214㎚, 260㎚ 및 280㎚에서 UV-가시광선 검출기를 이용하여 검출하고, 모든 피크 분획을 풀링시키고 단백질 농도를 결정하였다.본질적으로 실시예 1B에 기재된 바와 같이 정제된 BoNT/A-TEV 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분석하였고, 겔을 염색시켰다. 결과적으로 pET29/BoNT/A-TEV를 단독으로 발현시킨 경우, 환원 및 비-환원 조건 둘 모두에서 BoNA/A-TEV의 단일-사슬에 상응하는 약 150 kDa 밴드가 검출된 것으로 나타났다. 대조적으로, PBAD 프로모터의 제어하에서 BoNT/A-TEV를 TEV 프로테아제와 함께 공동-발현시키고, 아라비노스를 사용하여 유도시킨 경우, 환원 조건하에서 2개의 밴드, 즉 하나는 약 50 kDa의 밴드 및 다른 하나는 약 100 kDa의 밴드가 관찰되었다. 또한, 동일 샘플을 비-환원 조건하에서 수행한 경우, 약 50 kDa 및 약 100 kDa 밴드가 사라졌고, 약 150 kDa의 새로운 밴드가 관찰되었다. 종합해 보면, 상기 관찰들은 환원 조건하에서 나타난 약 50 kDa 및 약 100 kDa 밴드는 BoNT/A-TEV의 경쇄 및 중쇄에 상응함을 나타내는 것이며, 상기 두 밴드의 존재는 BoNT/A-TEV의 이-사슬 형성을 나타내는 것이다. 따라서, 상기 세포에서의 BoNT/A-TEV 및 TEV 프로테아제의 공동-발현은 이-사슬 루프 내에 위치된 TEV 프로테아제 절단 부위에서 BoNA/A-TEV의 절단 및 BoNT/A-TEV의 이-사슬 형태의 후속적인 형성을 발생시킨다. 상기 결과는 단일-사슬 BoNT/A-TEV 중 90% 내지 95%가 그의 이-사슬 형태로 전환되었음을 나타내는 것이다.실시예 4이중 발현 작제물을 이용한 TEV 프로테아제 절단 부위를 가진 클로스트리디움 독소의 세포내 활성화하기 실시예는 본 발명의 명세서에 개시된 바와 같이 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 클로스트리디움 독소를 정제하고 정량하는 데에 유용한 방법을 예시한다.A. pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV 이중 발현 작제물의 작제.pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV 이중 발현 작제물을 작제하기 위해, 대장균 발현을 위해 필요한 전사(T7 프로모터, lac 작동자 부위) 및 번역(RBS) 구성요소뿐만 아니라 BoNT/A-TEV의 마지막 37개 아미노산 및 TEV 변이체 7의 전체 코딩 영역을 엔코딩하는 합성 단편(서열번호 89)을 표준 방법(워싱턴주 보델시에 소재한 BlueHeron Biotechnology)을 사용하여 합성하였다. 20개 내지 50개 염기 길이의 상보적 올리고뉴클레오타이드를 표준 포스포아미다이트 합성법을 이용하여 합성하였다. 상기 올리고뉴클레오타이드를 전장 폴리뉴클레오타이드 분자를 어셈블리하기 위해 함께 순차적으로 결찰된 이중가닥 듀플렉스 내로 하이브리드화시켰다. 표준 분자 생물학 방법을 이용하여 상기 폴리뉴클레오타이드 분자를 pUCBHB1 담체 벡터 내로 SmaI 부위에 클로닝하여 pUCBHB1/BoNT/A-TEV_C-term/T7Prom/TEV 플라스미드를 생성하였다. 합성된 폴리뉴클레오타이드 분자를 BIG DYE TERMINATOR(상표명) Chemistry 3.1(캘리포니아주의 포스터 시티에 소재한 Applied Biosystems) 및 ABI 3100 서열분석기(캘리포니아주의 포스터 시티에 소재한 Applied Biosystems)를 이용하여 서열분석함으로써 확인하였다.pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV 발현 작제물을 생성하기 위해, pUCBHB1/BoNT/A-TEV_C-term/T7Prom/TEV를, 1) BoNT/A-TEV의 C-말단, 제2 열린 해독 틀의 대장균 발현을 위해 필요한 전사 및 번역 모티프 및 TEV 변이체 7의 전체 코딩 영역을 포함하는 삽입부를 절단하고; 2) 상기 삽입부가 실시예 1A로부터의 pET29/BoNT/A-TEV 벡터에서 BoNT/A 유전자 다음에 작동가능하게 연결되도록 해주는 제한 엔도뉴클레아제로 효소처리하였다. 상기 삽입부를 유사 제한 엔도뉴클레아제로 효소처리된 pET29/BoNT/A-TEV 벡터내로 T4 DNA 리가제 절차를 이용하여 서브클로닝하여 BoNT/A-TEV 및 서열번호 89의 개재(intervening) 전사 및 번역 구성요소를 가진 TEV 프로테아제 변이체 7 열린 해독 틀을 포함하는 적절한 pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV 이중 발현 작제물을 생성시켰다. 결찰 혼합물을 전기-적격 대장균 BL21(DE3) Acella 세포(메릴랜드주의 게이더스버그시에 소재한 Edge BioSystems) 내로 전기천공에 의해 형질전환시키고, 50 ㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 1.5% 루리아-베르타니 한천 플레이트(pH 7.0)에 플레이팅시키고, 밤새 성장을 위해 37℃ 인큐베이터에 정치시켰다. 발현 작제물을 함유한 박테리아를 카나마이신 내성 콜로니로서 확인하였다. 후보 작제물을 알칼리성 용해 플라스미드 미니-프레퍼레이션 절차를 이용하여 분리하였고, DNA 가닥 둘 모두를 제한 엔도뉴클레아제 효소처리 맵핑 및 서열분석함으로써 분석하여, 삽입부의 존재와 완전성을 확인하였다. 상기 클로닝 방법을 통해 카복실 말단의 폴리히스티딘 친화성 정제 태그에 작동가능하게 연결된 BoNT/A-TEV 변이체 및 TEV 프로테아제를 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 pET29 이중 발현 작제물을 생성시켰다. 상기 열린 해독 틀 구성은, 제1 T7 프로모터로부터의 전사 개시가 BoNT/A-TEV를 엔코딩하는 열린 해독 틀 및 TEV 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 사용하여 mRNA를 생성시키도록 하는 것이었다. 또한, 제2 T7 프로모터로부터의 전사 개시는 단지 TEV 프로테아제만을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 갖는 mRNA를 생성시킨다. 따라서, BoNT/A-TEV와 비교하여 TEV 프로테아제를 엔코딩하는 전사체가 2배 더 많을 것이다.B. pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV로부터 BoNT/A-TEV의 동소 활성화.자가-유도 조건하에서 BoNT-A-TEV의 이-사슬 형태를 생성시키기 위해, 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 PA-0.5G 배지 3.0㎖에 pET29/BoNT/A-TEV/TEV 이중 발현 작제물을 포함하는 BL21(DE3) 세포의 단일 콜로니를 접종시키고, 밤새 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다. 상기 출발 배양물 중 약 250㎕를 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유한 ZYP-5052 250 ㎖에 접종시키는 데에 사용하였고, 3.5시간 동안 진탕시키면서 37℃에서 성장시킨 다음에, 18.5시간 동안 진탕시키면서 22℃에서 성장시켰다. 상기 세포를 원심분리에 의해 펠렛화시켰다. 본질적으로 실시예 2D에 기재된 바와 같이, 세포를 용해시키고, IMAC 정제하고, 탈염시키고, 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하고, SDS-PAGE에 의해 분석하고 겔을 염색시켰다. 대조군으로서, pET29/BoNT/A-TEV를 단독으로 함유한 BL21(DE3) 세포를 상기 기재된 바와 같이 성장시키고 유도시키되, 선별제로서 단지 50 ㎍/㎖ 카나마이신만을 사용하였다.결과적으로 단독으로 발현시킨 경우, 환원 및 비-환원 조건 둘 모두에서 BoNA/A-TEV의 단일-사슬에 상응하는 약 150 kDa 밴드가 검출된 것으로 나타났다. 대조적으로, BoNT/A-TEV를 TEV 프로테아제와 함께 공동-발현시킨 경우, 환원 조건하에서 2개의 밴드, 즉 하나는 약 50 kDa의 밴드 및 다른 하나는 약 100 kDa의 밴드가 관찰되었다. 또한, 동일 샘플을 비-환원 조건하에서 수행한 경우, 약 50 kDa 및 약 100 kDa 밴드가 사라졌고, 약 150 kDa의 새로운 밴드가 관찰되었다. 종합해 보면, 상기 관찰들은, 환원 조건하에서 나타난 약 50 kDa 및 약 100 kDa 밴드는 BoNT/A-TEV의 경쇄 및 중쇄에 상응함을 나타내는 것이며, 상기 두 밴드의 존재는 BoNT/A-TEV의 이-사슬 형성을 나타내는 것이다. 또한 상기 결과는 단일-사슬 BoNT/A-TEV가 95%를 초과하는 효율로 그의 이-사슬 형태로 전환되었음을 나타낸 것이다. 따라서, 상기 세포에서 이중 발현 작제물로부터의 BoNT/A-TEV 및 TEV 프로테아제의 공동-발현은 이-사슬 루프 내에 위치된 TEV 프로테아제 절단 부위에서 BoNA/A-TEV의 절단 및 BoNT/A-TEV의 이-사슬 형태의 후속적인 형성을 발생시킨다.C. pRSFduet/TEV/2xBoNT/A-TEV 이중 발현 작제물의 작제.BoNT/A-TEV 및 TEV 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀의 구성을 역전시키는 것이 BoNT/A-TEV의 수율 및 절단 효율에 영향을 미치는지를 결정하기 위해, 이중 발현 작제물을, 제1 T7 프로모터로부터의 전사 개시가 TEV 및 BoNT/A-TEV를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 갖는 mRNA를 발생시키고, 제2 T7 프로모터로부터의 전사 개시가 BoNT/A-TEV만을 엔코딩하는 열린 해독 틀을 갖는 mRNA를 생성시키도록 제조하였다. 이로써, TEV 프로테아제에 비해 BoNT/A-TEV를 엔코딩하는 mRNA가 2배 많이 존재하게 될 것이다.pRSFduet/TEV/2xBoNT/A-TEV 이중 발현 작제물을 작제하기 위해, 2회의 순차적인 클로닝 반응을 수행하였다. 우선, TEV 변이체 7(서열번호 22)을 엔코딩하는 열린 해독 틀(서열번호 91)을 pET29/TEV 변이체 7 발현 작제물로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 폴리-히스티딘 친화성 태그를 엔코딩하는 열린 해독 틀의 5'-말단을 상기 증폭으로부터 제외시켜 태그-없는 프로테아제를 엔코딩하도록 하였다. 증폭에 후속하여, PCR 생성물을 PCR 프라이머를 사용하여 PCR 생성물의 말단에 혼입된 독특한 제한 부위에서 효소처리하고, T4 DNA 리가제 절차를 이용하여 이중 발현 플라스미드 pRSFduet-1(위스콘신주의 매디슨시에 소재한 EMD Biosciences-Novagen)의 MCSI(다중 클로닝 부위)에서 상응하는 부위내로 클로닝하였다. 상기 중간체 작제물을 pRSduet/TEV로 명명하였다. 다음으로, pET29/BoNT-A/TEV 발현 작제물을, 1) BoNT/A-TEV(서열번호 88)를 엔코딩하는 열린 해독 틀(서열번호 87)을 포함하는 삽입부를 절단하고; 2) 상기 삽입부가 pRSFduet/TEV에서 MCS2에 작동가능하게 연결되도록 하는 제한 엔도뉴클레아제로 효소처리하였다. BoNT/A-TEV 삽입부를 T4 DNA 리가제 절차를 이용하여 pRSFduet 벡터의 MCS2내로 서브클로닝함으로써 적절한 pRSFduet/TEV/2xBoNT/A-TEV 이중 발현 작제물을 생성시켰다. 상기 클로닝 방법을 통해 제1 T7 프로모터로부터의 전사가 TEV 및 BoNT/A-TEV를 엔코딩하는 mRNA를 생성시키고, 제2 T7 프로모터로부터의 전사가 BoNT/A-TEV만을 엔코딩하는 mRNA를 생성시키는 pRSFduet 이중 발현 작제물을 생성시켰다.상기 클로닝 방법을 통하여, 제1 T7 프로모터는 BoNT/A-TEV를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 전사시키고, 제2 T7 프로모터는 TEV 프로테아제를 엔코딩하는 열린 해독 틀을 전사시키는 pRSFduet 이중 발현 작제물이 생성될 것이다.D. pET29/BoNT/A-TEV/TEV 이중 발현 작제물의 작제.BoNT/A-TEV 및 TEV가 자신의 독립적인 mRNA로부터만 생성될 수 있는 전사 유닛 구성으로부터 BoNT/A-TEV 수율 및 이-사슬로의 전환 효율을 결정하기 위해, pET29/BoNT/A-TEV/TEV를 작제하였다. pET29/BoNT/A-TEV/TEV 이중 발현 작제물을 생성하기 위해, 짧은 합성 DNA 단편을 사용하여 이중 발현 작제물 pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV(실시예 3A 참조)내의 BoNT/A-TEV 및 TEV의 열린 해독 틀 사이의 개재 서열에 T7 종결자 부위(서열번호 92)를 혼입시켰다. T4 DNA 리가제 절차를 이용하여, T7 종결자 부위가 결여된 pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV내의 상기 개재 영역을 서열번호 93의 T7 종결 부위와 함께 개재 전사 및 번역 구성요소를 함유한 합성 DNA 단편으로 교환시킴으로써 상기 혼입을 본질적으로 수행하였다. pET29/BoNT/A-TEV/TEV로 명명된 생성된 이중 발현 작제물은 제1 및 제2 T7 프로모터로부터 각각 전사되는, 카복실 말단의 폴리히스티딘 친화성 태그 및 TEV 프로테아제에 작동가능하게 연결된 BoNT/A-TEV 변이체를 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함한다.E. BoNT/A-TEV의 동소 활성화.자가-유도 조건하에서 BoNT/A-TEV의 이-사슬 형태의 성장 및 유도를 실시예 2D에 기재된 바와 같이 본질적으로 수행하되, pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV 이중 발현 작제물, pRSF/TEV/2xBoNT/A-TEV 이중 발현 작제물 또는 pET29/BoNT/A-TEV/TEV 이중 발현 작제물을 포함하는 BL21(DE3) 세포를 사용하였고, 상기 세포주 각각으로부터의 단일 콜로니를 동시에 4개의 1.0㎖ 배양액에 접종시키는 데에 사용하였다. 성장 및 유도 후에, 상기 4개의 1.0㎖ 복제물을 처리를 위해 함께 풀링시켰다. 본질적으로 실시예 1B에 기재된 바와 같이, 세포를 용해시키고, IMAC 정제하고, SDS-PAGE에 의해 분석하였고, 겔을 염색시켰다. 대조군으로서, pET29/BoNT/A-TEV를 단독으로 함유한 BL21(DE3) 세포를 상기 기재된 바와 같이 성장시키고 유도시키되, 선택제로서 단지 50 ㎍/㎖ 카나마이신만을 사용하였다. 결과는, 상기 3개의 이중 발현 작제물 중 임의의 하나를 함유하는 세포로부터 매우 비슷한 수준으로 BoNT/A-TEV가 발현되었음을 나타낸다; 그러나, 이-사슬로의 전환 정도는 다양하였다. 단일-사슬 BoNT/A-TEV는, 상기 단백질이 pET29/BoNT/A-TEV/2xTEV로부터 발현된 경우 약 96% 효율로 그의 이-사슬 형태로 전환되었고, pET29/BoNT/A-TEV/TEV로부터 발현된 경우에는 약 81% 효율로 전환되었고, pRSFduet/TEV/2xBoNT/A-TEV로부터 발현된 경우에는 99%를 초과하는 효율로 전환되었다.실시예 5이중 발현 작제물을 이용한 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-아편유사제 결합 도메인을 포함하는 단백질의 세포내 활성화하기 실시예는 본 발명의 명세서에 개시된 외인성 프로테아제 절단 부위를 포함하는 이-사슬 루프를 포함하는 임의의 단백질을 정제하고 정량하는 데에 유용한 방법을 예시한다.A. pRSFduet/TEV/2xNociLHN/A-TEV 이중 발현 작제물의 작제.pRSFduet/TEV/2xNociLHN/A-TEV 이중 발현 작제물을 작제하기 위해, pET29/NociLHN/A-TEV 발현 작제물을, 1) NociLHN/A-TEV(서열번호 95)를 엔코딩하는 열린 해독 틀(서열번호 94)을 포함하는 삽입부를 절단하고; 2) 상기 삽입부가 MCSI에 TEV 변이체 7을 함유하는 pRSFduet-1 벡터인 pRSFduet/TEV의 MCS2에 작동가능하게 연결되도록 해주는(실시예 3C에 기재됨) 제한 엔도뉴클레아제로 효소처리하였다. NociLHN/A-TEV 삽입부를, T4 DNA 리가제 절차를 이용하여 pRSFduet/TEV 작제물의 MCS2내로 서브클로닝하여 적절한 pRSFduet/TEV/2xNociLHN/A-TEV 이중 발현 작제물을 생성시켰다. 결찰 혼합물을 전기-적격 대장균 BL21(DE3) Acella 세포(메릴랜드주의 게이더스버그시에 소재한 Edge BioSystems) 내로 전기천공에 의해 형질전환시키고, 50 ㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 1.5% 루리아-베르타니 한천 플레이트(pH 7.0)에 플레이팅시키고, 밤새 성장을 위해 37℃ 인큐베이터에서 정치시켰다. 발현 작제물을 함유한 박테리아를 카나마이신 내성 콜로니로서 확인하였다. 후보 작제물을 알칼리성 용해 플라스미드 미니-프레퍼레이션 절차를 이용하여 분리하였고, DNA 가닥 둘 모두를 제한 엔도뉴클레아제 효소처리 맵핑 및 서열분석함으로써 분석하여, 삽입부의 존재와 완전성을 확인하였다. 상기 클로닝 방법을 통해 제1 T7 프로모터로부터의 전사가 TEV 및 NociLHN/A-TEV를 엔코딩하는 mRNA를 생성시키고, 제2 T7 프로모터로부터의 전사가 단지 NociLHN/A-TEV만을 엔코딩하는 mRNA를 생성시키는 pRSFduet 이중 발현 작제물을 생성시켰다.B. NociLHN/A-TEV의 동소 활성화.자가-유도 조건하에서 NociLHN/A-TEV의 이-사슬 형태를 생성시키기 위해, 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 PA-0.5G 배지 3.0 ㎖에 pRSFduet/TEV/2xNociLHN/A-TEV 이중 발현 작제물을 포함하는 BL21(DE3) 세포의 단일 콜로니를 접종시키고, 밤새 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다. 상기 출발 배양물 중 250㎕를 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 ZYP-5052 250 ㎖에 접종시키는 데에 사용하고 8시간 동안 진탕시키면서 37℃에서 성장시킨 다음, 18시간 동안 진탕시키면서 16℃에서 성장시켰다. 세포를 원심분리에 의해 펠렛화시켰다. 본질적으로 실시예 2D에 기재된 바와 같이, 세포를 용해시키고, IMAC 정제하고, 탈염시키고, 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하고, SDS-PAGE에 의해 분석하였고, 겔을 염색시켰다. 대조군으로서, NociLHN/A-TEV를 단독으로 함유한 BL21(DE3)를 상기 기재된 바와 같이 성장시키고 유도시켰다.결과적으로 단독으로 발현시킨 경우, 환원 및 비-환원 조건 둘 모두에서 NociLHN/A-TEV의 단일-사슬에 상응하는 약 102 kDa 밴드가 검출된 것으로 나타났다. 대조적으로, NociLHN/A-TEV를 TEV 프로테아제와 함께 공동-발현시킨 경우, 환원 조건하에서 2개의 밴드, 즉 하나는 약 50.8 kDa의 밴드 및 다른 하나는 약 51.3 kDa의 밴드가 관찰되었다. 또한, 동일 샘플을 비-환원 조건하에서 수행한 경우, 약 50.8 kDa 및 약 51.3 kDa 밴드가 사라졌고, 약 102 kDa의 새로운 밴드가 관찰되었다. 종합해 보면, 상기 관찰들을 통해, 환원 조건하에서 나타난 약 50.8 kDa 및 약 51.3 kDa 밴드는 각각 클로스트리디움 독소 효소 도메인 및 아미노 말단에 부착된 노시셉틴(nociceptin) 표적화 모이어티를 가진 클로스트리디움 독소 전위 도메인에 상응하는 것으로 나타났다. 상기 두 밴드의 존재는 NociLHN/A-TEV의 이-사슬 형성을 나타내며, 단일-사슬 NociLHN/A-TEV가 95%를 초과하는 효율로 그의 이-사슬 형태로 전환되었음을 나타낸 것이다. 따라서, 상기 세포에서 이중 발현 작제물로부터의 NociLHN/A-TEV 및 TEV 프로테아제의 공동-발현은 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-아편유사제 결합 도메인 내에 위치된 TEV 프로테아제 절단 부위에서 NociLHN/A-TEV의 절단 및 NociLHN/A-TEV의 이-사슬 형태의 후속적인 형성을 발생시킨다.C. pRSFduet/TEV/2xDynLHN/A-TEV 이중 발현 작제물의 작제.pRSFduet/TEV/2xDynLHN/A-TEV 이중 발현 작제물을 pRSFduet/TEV/2xNociLHN/A-TEV와 거의 동일한 방법으로 생성하였다. pET29/DynLHN/A-TEV 발현 작제물을, 1) DynLHN/A-TEV(서열번호 97)를 엔코딩하는 열린 해독 틀(서열번호 96)을 포함하는 삽입부를 절단하고; 2) 상기 삽입부가 pRSFduet/TEV의 MCS2에 작동가능하게 연결되도록 해주는(실시예 3C에 기재됨) 제한 엔도뉴클레아제로 효소처리하였다. DynLHN/A-TEV 삽입부를 T4 DNA 리가제 절차를 이용하여 pRSFduet/TEV 작제물의 MCS2 내로 서브클로닝하여 적절한 pRSFduet/TEV/2xDynLHN/A-TEV 이중 발현 작제물을 생성시켰다. 결찰 혼합물을 전기-적격 대장균 BL21(DE3) Acella 세포(메릴랜드주의 게이더스버그시에 소재한 Edge BioSystems) 내로 전기천공에 의해 형질전환시키고, 50 ㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 1.5% 루리아-베르타니 한천 플레이트(pH 7.0)에 플레이팅시키고, 밤새 성장을 위해 37℃ 인큐베이터에 정치시켰다. 발현 작제물을 함유한 박테리아를 카나마이신 내성 콜로니로서 확인하였다. 후보 작제물을 알칼리성 용해 플라스미드 미니-프레퍼레이션 절차를 이용하여 분리하였고, DNA 가닥 둘 모두를 제한 엔도뉴클레아제 효소처리 맵핑 및 서열분석함으로써 분석하여, 삽입부의 존재와 완전성을 확인하였다. 상기 클로닝 방법을 통해, 제1 T7 프로모터로부터의 전사가 TEV 및 DynLHN/A-TEV를 엔코딩하는 mRNA를 생성시키고, 제2 T7 프로모터로부터의 전사가 단지 DynLHN/A-TEV만을 엔코딩하는 mRNA를 생성시키는 pRSFduet 이중 발현 작제물을 생성시켰다.D. DynLHN/A-TEV의 동소 활성화.자가-유도 조건하에서 NociLHN/A-TEV의 이-사슬 형태를 생성시키기 위해, 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 PA-0.5G 배지 3.0㎖에 pRSFduet/TEV/2xDynLHN/A-TEV 이중 발현 작제물을 포함하는 BL21(DE3) 세포의 단일 콜로니를 접종시켰고, 밤새 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다. 상기 출발 배양물 중 250㎕를 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 ZYP-5052 250 ㎖에 접종시키는 데에 사용하였고, 8시간 동안 진탕시키면서 37℃에서 성장시킨 다음, 18시간 동안 진탕시키면서 16℃에서 성장시켰다. 세포를 원심분리에 의해 펠렛화시켰다. 본질적으로 실시예 2D에 기재된 바와 같이, 세포를 용해시키고, IMAC 정제하고, 탈염시키고, 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하고, SDS-PAGE에 의해 분석하고, 겔을 염색시켰다. 대조군으로서, DynLHN/A-TEV를 단독으로 함유한 BL21(DE3) 세포를 상기 기재된 바와 같이 성장시키고 유도시켰다.결과적으로 단독으로 발현시킨 경우, 환원 및 비-환원 조건 둘 모두에서 DynLHN/A-TEV의 단일-사슬에 상응하는 약 102 kDa 밴드가 검출된 것으로 나타났다. 대조적으로, DynLHN/A-TEV를 TEV 프로테아제와 함께 공동-발현시킨 경우, 환원 조건하에서 2개의 밴드, 즉 하나는 약 50.8 kDa의 밴드 및 다른 하나는 약 52 kDa의 밴드가 관찰되었다. 또한, 동일 샘플을 비-환원 조건하에서 수행한 경우, 약 50.8 kDa 및 약 52 kDa 밴드가 사라졌고, 약 102 kDa의 새로운 밴드가 관찰되었다. 종합해 보면, 상기 관찰들을 통해, 약 50.8 kDa 밴드는 클로스트리디움 독소 효소 도메인에 상응하고, 약 52 kDa 밴드는 아미노 말단에 부착된 다이놀핀(dynorphin) 표적화 모이어티를 가진 클로스트리디움 독소 전위 도메인에 상응하는 것으로 나타났다. 상기 두 밴드의 존재는 DynLHN/A-TEV의 이-사슬 형성을 나타내며, 또한 단일-사슬 DynLHN/A-TEV가 95%를 초과하는 효율로 그의 이-사슬 형태로 전환되었음을 나타낸 것이다. 따라서, 상기 세포에서 이중 발현 작제물로부터의 DynLHN/A-TEV 및 TEV 프로테아제의 공동-발현은 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-아편유사제 결합 도메인 내에 위치된 TEV 프로테아제 절단 부위에서 DynLHN/A-TEV의 절단 및 DynLHN/A-TEV의 이-사슬 형태의 후속적인 형성을 발생시킨다.실시예 62개의 상이한 발현 작제물을 이용한 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-갈라닌(Galanin) 결합 도메인을 포함하는 단백질의 세포내 활성화하기 실시예는 본 발명의 명세서에 개시된 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-아편유사제 결합 도메인을 포함하는 이-사슬 루프를 포함하는 임의의 단백질을 정제하고 정량화하는 데에 유용한 방법을 예시하며, 여기서 표적 단백질 및 프로테아제는 상이한 프로모터의 제어하에서 별개의 플라스미드로부터 발현된다.A. pET29/GalLHN/A-TEV 발현 작제물의 작제.pET29/GalLHN/A-TEV 발현 작제물을 작제하기 위해, pET29/DynLHN/A-TEV 발현 작제물을 우선 제한 엔도뉴클레아제로 효소처리하여, 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-다이놀핀 결합 도메인을 포함하는 이-사슬 루프를 엔코딩하는 DNA 절편을 절단하였다. 생성된 pET29/LHn/A 프레임워크(framework) 단편을 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-갈라닌 결합 도메인(서열번호 99)를 포함하는 이-사슬 루프를 포함하는, 양립성 제한 부위와 함께 같은 범주로 여겨지는 합성 DNA 단편(서열번호 98)과 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 전기-적격 대장균 BL21(DE3) Acella 세포(메릴랜드주의 게이더스버그시에 소재한 Edge BioSystems) 내로 전기천공에 의해 형질전환시키고, 50 ㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 1.5% 루리아-베르타니 한천 플레이트(pH 7.0)에 플레이팅시키고, 밤새 성장을 위해 37℃ 인큐베이터에서 정치시켰다. 발현 작제물을 함유한 박테리아를 카나마이신 내성 콜로니로서 확인하였다. 후보 작제물을 알칼리성 용해 플라스미드 미니-프레퍼레이션 절차를 이용하여 분리하였고, DNA 가닥 둘 모두를 제한 엔도뉴클레아제 효소처리 맵핑 및 서열분석함으로써 분석하여, 삽입부의 존재 및 완전성을 확인하였다. 상기 클로닝 방법을 통해, GalLHN/A-TEV(서열번호 101)를 엔코딩하는 열린 해독 틀(서열번호 100)을 포함하는 pET29/GalLHN/A-TEV 발현 작제물을 생성시켰으며, 여기서 GalLHN/A-TEV는 T7 프로모터의 제어하에서 발현되었다.B. pColdIV/TEV 발현 작제물의 작제.TEV가 한랭-쇼크(cold-shock) 프로모터의 제어하에 있는 발현 작제물을 생성하기 위해, TEV 변이체 7(서열번호 22)을 엔코딩하는 열린 해독 틀(서열번호 91)을 pET29/TEV 변이체 7 발현 작제물로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 폴리-히스티딘 친화성 태그를 엔코딩하는 열린 해독 틀의 5'-말단을 상기 증폭으로부터 제외시켜 태그-없는 프로테아제를 엔코딩하도록 하였다. 증폭에 후속하여, PCR 생성물을 PCR 프라이머를 사용하여 PCR 생성물의 말단에 혼입된 독특한 제한 부위에서 효소처리하고, T4 DNA 리가제 절차를 이용하여 발현 플라스미드 pColdIV(위스콘신주의 매디슨시에 소재한 Clontech Laboratories, Inc.)의 다중 클로닝 부위에서 상응하는 부위내로 클로닝하였다. 결찰 혼합물을 전기-적격 대장균 BL21(DE3) Acella 세포(메릴랜드주의 게이더스버그시에 소재한 Edge BioSystems) 내로 전기천공에 의해 형질전환시키고, 50 ㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 1.5% 루리아-베르타니 한천 플레이트(pH 7.0)에 플레이팅시키고, 밤새 성장을 위해 37℃ 인큐베이터에서 정치시켰다. 발현 작제물을 함유한 박테리아를 앰피실린 내성 콜로니로서 확인하였다. 후보 작제물을, 알칼리성 용해 플라스미드 미니-프레퍼레이션 절차를 이용하여 분리하였고, DNA 가닥 둘 모두를 제한 엔도뉴클레아제 효소처리 맵핑 및 서열분석함으로써 분석하여, 삽입부의 존재 및 완전성을 확인하였다. 상기 클로닝 방법을 통해, 한랭-쇼크 프로모터의 제어하에 있는 TEV 변이체 7을 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 pColdIV/TEV 발현 작제물을 생성시켰다.C. pET29/GalLHN/A-TEV 및 pColdIV/TEV 발현 작제물을 포함하는 세포의 작제.pET29/GalLHN/A-TEV 및 pColdIV/TEV 발현 작제물을 포함하는 세포를 제조하기 위해, pET29/GalLHN/A-TEV 발현 작제물을 pColdIV/TEV를 함유한 전기-적격 대장균 BL21(DE3) 세포내로 전기천공을 이용하여 형질전환시키고, 100 ㎍/㎖의 앰피실린 및 50 ㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 1.5% 루리아-베르타니 한천 플레이트(pH 7.0)에 플레이팅시키고, 밤새 성장을 위해 37℃ 인큐베이터에서 정치시켰다. 두 발현 작제물 모두를 함유한 박테리아를 앰피실린-카나마이신 내성 콜로니로서 확인하였다. 후보 작제물을 알칼리성 용해 플라스미드 미니-프레퍼레이션 절차를 이용하여 분리하였고, 제한 엔도뉴클레아제 효소처리 맵핑에 의해 분석하여, 두 작제물 모두의 존재를 결정하였다. 상기 클로닝 방법을 통해, pET29/GalLHN/A-TEV 및 pColdIV/TEV 발현 작제물을 포함하는 세포를 생성시켰다.D. pET29/GalLHN/A의 동소 활성화.자가-유도 조건하에서 GalLHN/A-TEV의 이-사슬 형태를 생성시키기 위해, 50 ㎍/㎖ 카나마이신 및 100 ㎍/㎖ 앰피실린을 함유한 PA-0.5G 배지 3.0 ㎖에 pET29/GalLHN/A-TEV 및 pColdIV/TEV 발현 작제물을 함유한 BL21(DE3) 세포의 단일 콜로니를 접종시키고, 밤새 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다. 상기 출발 배양물 중 약 250㎕를 50 ㎍/㎖ 카나마이신 및 100 ㎍/㎖ 앰피실린을 함유하는 ZYP-5052 250 ㎖에 접종시키는 데에 사용하였고, 8시간 동안 진탕시키면서 37℃에서 성장시킨 다음, 18시간 동안 진탕시키면서 15℃에서 성장시켰다. 세포를 용해시키고 Magne-His 수지를 사용하여 IMAC 정제하였다.Magne-His 정제법에 의해 이-사슬 GalLHN/A-TEV를 정제하기 위해, 250㎖ 발현 배양물로부터 유도된 세포를 100mM HEPES(pH 7.5), 10% v/v 글리세롤, 10 mM 이미다졸, 1M NaCl로 구성된 냉(4 내지 6℃) IMAC 세척 완충액 16㎖에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 밀폐된 대기 처리 챔버(sealed-atmosphere treatment chamber)(#101-021-006, Branson Ultrasonics Corporation)로 옮기고, 펄스(pulse) 사이에 1분을 두고 15 펄스(10초, 30% 진폭(amplitude), 0.5-인치 파쇄기 혼(disruptor horn))에 의해 초음파처리(sonication)하였다(Sonifier(등록상표) Digital 450, Branson Ultrasonics Corporation). 초음파처리 동안, 밀폐된 대기 처리 챔버를 순환 워터 배스(water bath)(3.5℃)로부터 챔버의 외부 재킷(jacket)을 거쳐 냉각수를 통과시킴으로써 냉각시켰다. 초음파처리된 재료를 상기 처리 챔버로부터 깨끗한 오크리지(Oakridge) 튜브로 옮기고, 4℃에서 30분 동안 30,500 RCF에서 원심분리시켜(SL-50T Rotor, Sorvall; FIBERLite(등록상표) F21S-8X50 Rotor, Piramoon Technologies Inc.) 불용성 세포 찌꺼기를 제거하였다. 정화된 용해물을 주사기에 의해 흡인시키고, 깨끗한 50 ㎖ 원뿔형 튜브 내로 우선 0.8㎛에 이어 0.45㎛ 주사기 필터(Sartorius)를 통해 연속하여 통과시켰다. 균일 현탁액을 위해 Magne-His(상표명) 단백질 정제 수지(위스콘신주의 매디슨시에 소재한 Promega Corp.)를 볼텍싱하고, 현탁액 중 4㎖를 정화된 용해물로 옮겼다. 상기 튜브를 밀봉하고, 수차례 인버팅(inverting)하여 입자들이 잘 혼합되도록 하였다. 혼합물을 가볍게 흔들면서 16℃에서 30분 동안 인큐베이션시켜 표적 단백질을 결합시켰다. 튜브를 MagneSil 자성 분리 유닛(위스콘신주의 매디슨시에 소재한 Promega Corp.)으로 옮기고, 수지 입자들이 포획되도록 약 2분 정치시켰다. 상층액을 제거하고, 상기 분리 유닛으로부터 튜브를 취하였다. 그런 다음, 수지를 10㎖ IMAC 세척 완충액에 재현탁시키고, 자성 분리 유닛 상에 포획시키고, 세척 완충액을 제거하였다. 상기 세척 단계를 2회 더 반복하였다. 표적 단백질을 용리시키기 위해, 수지를 2분 동안 실온에서 인큐베이션된 Magne-His(상표명) 용리 완충액(100mM HEPES, pH 7.5, 500mM 이미다졸) 5㎖에 재현탁시키고, 수지를 자성 분리 유닛 상에 포획시키고, 상층액을 새로운 튜브로 옮겼다. 상기 용리 단계를 1회 반복하였다.이차 이온 교환 크로마토그래피를 위한 IMAC-정제된 GalLHN/A-TEV를 투석시키기 위해, 풀링된 용리 분획을 4℃에서 밤새 일정하게 교반하면서 1ℓ의 탈염 완충액(완충액 A: 50mM Tris-HCl, pH 8.0) 중에 25 kD MWCO 막이 장착된 FASTDIALYZER(등록상표)로 투석시켰다.음이온 교환 크로마토그래피에 의해 이-사슬 GalLHN/A-TEV를 정제하기 위해, 탈염된 단백질 용액을 완충액 A로 사전-평형화된 1 ㎖ UNO-Q1 음이온 교환 칼럼 상에 1 ㎖/분의 유속으로 로딩시켰다. 결합된 단백질을 1 ㎖/분의 유속으로 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1M NaCl을 포함하는 다음과 같은 완충액 B를 사용하여 NaCl 구배에 의해 용리시켰다: 3㎖에 대해서는 7% 완충액 B, 7㎖에 대해서는 15% 완충액 B, 10㎖ 초과에 대해서는 10% 내지 50% 완충액 B. 칼럼으로부터 단백질의 용리를 214㎚, 260㎚ 및 280㎚에서 UV-가시광선 검출기를 이용하여 검출하고, 모든 피크 분획을 풀링시키고 단백질 농도를 결정하였다. 분취액을 액체 질소에서 재빨리 동결시키고, -80℃에 보관하였다. 본질적으로 실시예 1B에 기재된 바와 같이, 정제된 BoNT/A-TEV 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분석하였고, 겔을 염색시켰다.상기 결과를 통해, GalLHN/A-TEV가 TEV 프로테아제와 함께 공동-발현된 경우, 환원 조건하에서 거의 겹쳐지는 2개의 밴드, 즉 하나는 약 51.1 kDa 및 다른 하나는 약 52.1 kDa인 밴드가 관찰되었다. 또한, 동일 샘플을 비-환원 조건하에서 수행한 경우에는, 약 51.1 kDa 및 52.1 kDa 두 밴드가 사라지고, 약 103 kDa의 새로운 밴드가 관찰되었다. 종합해 보면, 상기 관찰들은 약 51.1 kDa 밴드는 클로스트리디움 독소 효소 도메인에 상응하고, 약 52.1 kDa 밴드는 아미노 말단에 부착된 갈라닌 표적화 모이어티를 가진 클로스트리디움 독소 전위 도메인에 상응함을 나타낸다. 상기 두 밴드의 존재는 GalLHN/A-TEV의 이-사슬 형성을 나타내며, 또한 단일-사슬 GalLHN/A-TEV가 약 90% 효율로 그의 이-사슬 형태로 전환되었음을 나타내는 것이다. 따라서, 독립 플라스미드로부터 상기 세포에서의 GalLHN/A-TEV 및 TEV 프로테아제의 공동-발현은 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-갈라닌 결합 도메인내에 위치된 TEV 프로테아제 절단 부위에서의 GalLHN/A-TEV의 절단 및 GalLHN/A-TEV의 이-사슬 형태의 후속적인 형성을 발생시켰다.실시예 7: 이중 발현 작제물을 이용한 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-갈라닌 결합 도메인을 포함하는 단백질의 예상되는(prophetic) 세포내 활성화하기 실시예는 본 발명의 명세서에 개시된 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-아편유사제 결합 도메인을 포함하는 이-사슬 루프를 포함하는 임의의 단백질을 정제하고 정량화하는 데에 유용한 방법을 예시하며, 여기서 표적 단백질 및 프로테아제는 이중 발현 플라스미드로부터 발현된다.A. pRSFduet/TEV/2xGalLHN/A-TEV 이중 발현 작제물의 작제.상기 작제된 pRSFduet/TEV/2xNociLHN/A-TEV 및 pRSFduet/TEV/2xDynLHN/A-TEV(실시예 4 참조)와 유사한 pRSFduet/TEV/2xGalLHN/A-TEV 이중 발현 작제물을 작제하기 위해, pET29/GalLHN/A-TEV 발현 작제물은, 1) GalLHN/A-TEV(서열번호 101)를 엔코딩하는 열린 해독 틀(서열번호 100)을 포함하는 삽입부를 절단하고; 2) 상기 삽입부를 MCSI에 TEV 변이체 7을 함유한 pRSFduet-1 벡터인 pRSFduet/TEV의 MCS2에 작동가능하게 연결되도록 해주는(실시예 3C에 기재됨) 제한 엔도뉴클레아제로 효소처리될 것이다. GalLHN/A-TEV 삽입부는 T4 DNA 리가제 절차를 이용하여 pRSFduet/TEV 작제물의 MCS2내로 서브클로닝되어 pRSFduet/TEV/2xGalLHN/A-TEV 이중 발현 작제물이 생성될 것이다. 결찰 혼합물은 전기-적격 대장균 BL21(DE3) Acella 세포(메릴랜드주의 게이더스버그시에 소재한 Edge BioSystems) 내로 전기천공에 의해 형질전환되고, 50 ㎍/㎖의 카나마이신을 함유한 1.5% 루리아-베르타니 한천 플레이트(pH 7.0)에 플레이팅되고, 밤새 성장을 위해 37℃ 인큐베이터에서 정치될 것이다. 발현 작제물을 함유한 박테리아는 카나마이신 내성 콜로니로서 확인될 것이고, 후보 작제물은 DNA 가닥 둘 모두를 제한 엔도뉴클레아제 효소처리 맵핑 및 서열분석에 의해 확인됨으로써, 삽입부의 존재 및 완전성이 확인될 것이다. 상기 클로닝 방법을 통해, 제1 T7 프로모터로부터의 전사는 TEV 및 GalLHN/A-TEV를 엔코딩하는 mRNA를 생성시키고, 제2 T7 프로모터로부터의 전사는 단지 GalLHN/A-TEV만을 엔코딩하는 mRNA를 생성시키는 pRSFduet 이중 발현 작제물이 생성될 것이다.B. GalLHN/A-TEV의 동소 활성화.자가-유도 조건하에서 GalLHN/A-TEV의 이-사슬 형태를 생성시키기 위해, 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유한 PA-0.5G 배지 3.0㎖에 pRSFduet/TEV/2xGalLHN/A-TEV 이중 발현 작제물을 포함하는 BL21(DE3) 세포의 단일 콜로니를 접종시키고, 밤새 진탕시키면서 37℃에서 성장시킬 것이다. 상기 출발 배양물 중 250㎕를 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유한 ZYP-5052 250㎖에 접종시키는 데 사용하고, 8시간 동안 진탕시키면서 37℃에서 성장시킨 다음, 18시간 동안 진탕시키면서 16℃에서 성장시킬 것이다. 실시예 5D에 기재된 바와 같이, 세포를 원심분리에 의해 펠렛화시키고, 용해시키고, IMAC 정제하고, 탈염시키고, 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제할 것이다. 본질적으로 실시예 1B에 기재된 바와 같이, 정제된 표적 단백질은 환원 및 비-환원 조건 둘 모두에서 SDS-PAGE에 의해 분석되고, 겔을 염색시켜, pRSFduet/TEV/2xGalLHN/A-TEV 이중 발현 작제물로부터 생성된 GalLHN/A-TEV가 그의 이-사슬 형태로 전환되는 발현 수준 및 크기가 평가될 것이다.실시예 8BEVS에서 이중 발현 작제물을 이용한 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-다이놀핀 결합 도메인을 포함하는 단백질의 세포내 활성화하기 실시예는 본 발명의 명세서에 개시된 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-아편유사제 결합 도메인을 포함하는 이-사슬 루프를 포함하는 임의의 단백질을 정제하고 정량화하는 데 유용한 방법을 예시하며, 여기서 표적 단백질 및 프로테아제는 배큘로바이러스 발현 벡터 시스템(BEVS)에서 2개의 독립적 프로모터의 제어하에서 이중 발현 작제물에서 공동-발현된다.A. pBAC-6/TEV/DynLHN/A-TEV 이중 발현 작제물의 작제.pBAC-6/TEV/DynLHN/A-TEV 이중 발현 작제물을 작제하기 위해, p10 프로모터 서열의 재조합 TEV 변이체 7 다운스트림, 및 반대 배향의 polH 프로모터 서열의 DynLHn/A-TEV 다운스트림을 엔코딩하는 합성 단편(서열번호 107)을 표준 절차(워싱턴주 보델시에 소재한 BlueHeron Biotechnology)를 이용하여 합성하였다. 20개 내지 50개 염기 길이의 상보적 올리고뉴클레오타이드를 표준 포스포아미다이트 합성법을 이용하여 합성하였다. 상기 올리고뉴클레오타이드를 전장 폴리뉴클레오타이드 분자를 어셈블리하기 위해 순차적으로 함께 결찰되어 있는 이중가닥 듀플렉스 내로 하이브리화시켰다. 상기 폴리뉴클레오타이드 분자를 표준 분자 생물학 방법을 이용하여 pUCBHB1 담체 벡터 내로 SmaI 부위에 클로닝하여, pUCBHB1/p10-TEV/polH-DynLHN/A-TEV 플라스미드를 생성시켰다. 합성된 폴리뉴클레오타이드 분자를 BIG DYE TERMINATOR(상표명) Chemistry 3.1(캘리포니아주의 포스터 시티에 소재한 Applied Biosystems) 및 ABI 3100 서열분석기(캘리포니아주의 포스터 시티에 소재한 Applied Biosystems)를 이용하여 서열분석함으로써 확인하였다.pBAC-6/TEV/DynLHN/A-TEV 이중 발현 작제물을 생성하기 위해, pUCBHB1/p10-TEV/polH-DynLHN/A-TEV를, 1) p10 프로모터의 제어하의 TEV 변이체 7 및 polH 프로모터의 제어하의 반대 방향의 DynLHN/A-TEV의 전체 코딩 영역을 포함하는 삽입부를 절단하고; 2) 상기 삽입부가 pBAC-6 운반 벡터(위스콘신주의 매디슨시에 소재한 EMD Biosciences-Novagen)에 작동가능하게 연결되도록 해주는 제한 엔도뉴클레아제로 효소처리하였다. 상기 상입부를 T4 DNA 리가제 절차를 이용하여, 유사 제한 엔도뉴클레아제로 효소처리된 pBAC-6 운반 벡터내로 서브클로닝하여, p10 프로모터의 TEV 프로테아제 변이체 7 열린 해독 틀 다운스트림 및 polH 프로모터의 DynLHN/A-TEV 다운스트림의 제2 열린 해독 틀을 포함하는 조작된 pBAC-6 이중 발현 작제물을 생성시켰다. 결찰 혼합물을 전기-적격 대장균 BL21(DE3) Acella 세포(메릴랜드주의 게이더스버그시에 소재한 Edge BioSystems) 내로 전기천공에 의해 형질전환시키고, 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 함유한 1.5% 루리아-베르타니 한천 플레이트(pH 7.0)에 플레이팅시키고, 밤새 성장을 위해 37℃ 인큐베이터에서 정치시켰다. 발현 작제물을 함유한 박테리아를 앰피실린 내성 콜로니로서 확인하였다. 후보 작제물을 알칼리성 용해 플라스트미드 미니-프레퍼레이션 절차를 이용하여 분리하였고, DNA 가닥 둘 모두를 제한 엔도뉴클레아제 효소처리 맵핑 및 서열분석에 의해 분석하여, 삽입부의 존재 및 완전성을 확인하였다. 상기 클로닝 방법을 통해, 카복실 말단 폴리히스티딘 친화성 정제 태그에 작동가능하게 연결된 DynLH/A-TEV 및 TEV 프로테아제를 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 pBAC-6 이중 발현 작제물을 생성시켰다.B. 고 역가 TEV/DynLHN/A-TEV 재조합 배큘로바이러스 스톡(stock)의 생성.이-사슬 형태의 DynLHN/A-TEV를 생성시키기 전에, TEV/DynLHN/A-TEV를 포함하는 고 역가 재조합 배큘로바이러스 스톡을 생성시켰다. 약 2×106 Sf9 곤충 세포를 35㎜ 디쉬(dish)에서 2 ㎖ 부피의 곤충 세포 배양 배지 ESF921에 시딩하였다. 트랜스펙션 용액을 용액 A(2 ㎍의 pBAC-6/TEV/DynLHN/A-TEV, 0.5 ㎍의 선형화된 flashBAC 배큘로바이러스 DNA(영국 옥스퍼드주에 소재한 Oxford Expression Technologies) 및 100㎕의 트랜스펙션 배지를 포함함) 및 용액 B(6㎕의 TRANSLT(등록상표)-2020 트랜스펙션 시약 및 100㎕의 트랜스펙션 배지를 포함함)를 혼합하고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시킴으로써 제조하였다. 그런 다음, 800㎕의 트랜스펙션 배지를 용액 A/B 혼합물에 추가로 첨가하고, 가볍게 혼합시키고, 세포상에 적가하였다. 세포를 28℃에서 5시간 동안 인큐베이션시키고 나서, 3㎖의 ESF921을 각 웰에서 최종 부피가 4㎖가 되도록 첨가하였다. P0 재조합 바이러스의 생성을 위해 28℃에서 4 내지 5일 동안 계속 인큐베이션시켰다. 고 역가 P1 재조합 배큘로바이러스 시드(seed) 스톡을 생성시키기 위해, P0 상층액으로부터 분리된 바이러스를 baculoQUANT(영국 옥스퍼드주에 소재한 Oxford Expression Technologies)를 사용하여 역가측정하였고, 진탕 플라스크에서 추가로 증폭시켰다. 2×106 세포/㎖ 밀도의 Sf9 세포 약 100 내지 200㎖를 1 pfu/세포 미만의 MOI(감염다중도)로 P0 바이러스를 사용하여 감염시키고, 4-5일 동안 진탕시키면서 인큐베이션시켰다. 정량화 이후에, 고 역가 P1 스톡을 고-수준 단백질 발현을 위한 Tni 세포 감염을 위해 사용하였다.C. DynLHN/A-TEV의 동소 활성화.DynHN/A-TEV의 이-사슬 형태를 생성시키기 위해, 1×106/㎖ 농도의 50㎖ Tni 세포를 TEV/DynLHN/A-TEV를 포함하는 재조합 P1 바이러스 스톡을 사용하여 5의 MOI로 감염시키고, 감염 후(pi) 3일째에 수확하였다. 세포를 용해시키고, Magne-His 수지를 사용하여 IMAC 정제하였다.Magne-His 정제법에 의해 이-사슬 DynLHN/A-TEV를 정제하기 위해, 세포 펠렛을 100㎕ 곤충 팝컬처(PopCulture) 시약 및 20㎕(10U) 벤조나제 뉴클레아제의 존재하에 20㎖의 PBS w/o Ca2+ 또는 Mg2+에 재현탁시키고, 가볍게 혼합하여, 실온에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 세포 용해물을 4℃에서 15분 동안 16,000 rpm에서 원심분리에 의해 정화시킨 후에, 상층액을 4 ㎖의 균일하게 현탁된 Magne-His(상표명) 단백질 정제 수지(위스콘신주의 매디슨시에 소재한 Promega Corp.)와 혼합하였다. 혼합물을 가볍게 흔들면서 실온에서 20분 동안 인큐베이션시켜 표적 단백질을 결합시켰다. 상기 튜브를 약 2분 동안 MagneSil 자성 분리 유닛으로 옮겨 수지 입자들이 포획되도록 하였다. 상층액을 제거한 후에, 튜브를 분리 유닛으로부터 취하고, 수지를 10㎖의 IMAC 세척 완충액에 재현탁시켰다. 또 다시, 수지를 자성 분리 유닛상에 포획시키고 세척 완충액을 제거하였다. 상기 세척 단계를 2회 더 반복하였다. 표적 단백질을 용리시키기 위해, 수지를 2.5㎖의 Magne-His(상표명) 용리 완충액(100mM HEPES, pH 7.5, 500mM 이미다졸)에 재현탁시키고, 2분 동안 실온에서 인큐베이션시키고, 수지를 자성 분리 유닛상에 포획시키고, 상층액을 새로운 튜브로 옮겼다. 자성 수지로부터의 표적 회수를 최대화시키기 위해 상기 용리 단계를 다시 반복하였다.이차 이온 교환 크로마토그래피를 위한 IMAC-정제된 DynLHN/A-TEV를 투석시키기 위해, 풀링된 용리 분획을 4℃에서 밤새 일정하게 교반하면서 1ℓ의 탈염 완충액(완충액 A: 50mM Tris-HCl, pH 8.0) 중에 25 kD MWCO 막이 장착된 FASTDIALYZER(등록상표)로 투석시켰다.음이온 교환 크로마토그래피에 의해 이-사슬 DynLHN/A-TEV를 정제하기 위해, 탈염된 단백질 용액을 완충액 A로 사전-평형화된 1㎖ UNO-Q1 음이온 교환 칼럼 상에 1 ㎖/분의 유속으로 로딩시켰다. 결합된 단백질을 1 ㎖/분의 유속으로 50mM Tris-HCl(pH 8.0), 1M NaCl을 포함하는 다음과 같은 완충액 B를 사용하여 NaCl 구배에 의해 용리시켰다: 3㎖에 대해서는 7% 완충액 B, 7㎖에 대해서는 15% 완충액 B, 10㎖ 초과에 대해서는 10% 내지 50% 완충액 B. 칼럼으로부터 단백질의 용리를 214㎚, 260㎚ 및 280㎚에서 UV-가시광선 검출기를 이용하여 검출하고, 모든 피크 분획을 풀링시키고, 단백질 농도를 결정하였다. 분취액을 -20℃에 보관하였다. 본질적으로 실시예 1B에 기재된 바와 같이, 정제된 DynLHN/A-TEV 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분석하였고, 겔을 염색시켰다.상기 결과를 통해, DynLHN/A-TEV가 곤충 세포에서 TEV 프로테아제와 함께 공동-발현되고 거의 동질성으로 정제된 경우, 2개의 거의 겹쳐지는 밴드, 즉 하나는 약 51 kDa 및 다른 하나는 약 52 kDa인 밴드가 환원 조건하에서 관찰된 것으로 나타났다. 또한, 동일한 샘플이 비-환원 조건하에서 수행된 경우, 약 50 kDa 및 52 kDa 밴드 둘은 사라졌으며, 약 102 kDa의 새로운 밴드가 관찰되었다. 종합해 보면, 상기 관찰들은, 약 51 kDa 밴드는 클로스트리디움 독소 효소 도메인에 상응하고, 약 52 kDa 밴드는 아미노 말단에 결합된 다이놀핀 표적화 모이어티를 가진 클로스트리디움 독소 전위 도메인에 상응함을 나타낸다. 상기 두 밴드의 존재는 DynLHN/A-TEV의 이-사슬 형성을 나타내는 것이며, 또한 단일-사슬 DynLHN/A-TEV가 80-90% 효율로 그의 이-사슬 형태로 전환되었음을 나타내는 것이다. 따라서, pBAC-6/TEV/DynLHN/A-TEV 이중 발현 작제물로부터 생성된 TEV/DynLHN/A-TEV 재조합 배큘로바이러스로 감염시킨 곤충 세포에서 DynLHN/A-TEV 및 TEV 프로테아제의 공동-발현은 통합된 TEV 프로테아제 절단 부위-다이놀핀 결합 도메인 내에 위치된 TEV 프로테아제 절단 부위에서 DynLHN/A-TEV의 절단 및 DynLHN/A-TEV의 이-사슬 형태의 후속적인 형성을 발생시킨다.본 발명의 양상들이 개시된 구체예들을 참조로 하여 기재되어 있음에도 불구하고, 당업자는 개시된 특정 실시예들이 상기 양상들의 단지 예시일 뿐이고, 본 발명을 한정하는 것이 아님을 쉽게 이해할 것이다. 본 발명의 사상을 벗어남이 없이 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
	파울로 바티스타 느심바는 1983년 10월 12일생으로, 앙골라의 축구 선수입니다. 그는 윙어 포지션을 소화합니다. 그는 앙골라의 축구 클럽인 FC 디나모 부쿠레슈티와 보아비스타 FC에서 활약했으며, 현재 루마니아와 포르투갈에서도 활동하고 있습니다. 또한 2006년 아프리카 네이션스컵과 2006년 FIFA 월드컵에 출전했습니다. 그는 2008년과 2010년 아프리카 네이션스컵에도 참가했습니다. 그는 프리메이라리가와 리가 I에서 축구 미드필더로 활약하였으며, 앙골라 축구 국가대표팀에서도 활약하고 있습니다.	파울로 바티스타 느심바는 어느 나라 축구 선수인가?
	제목: 낙찰허가 하나의 건물 중 위치 및 면적이 특정되고 구조상 독립성이 있는 일부분씩을 2인 이상이 구분소유하기로 약정을 하고 각 소유에 해당하는 비율로 공유지분등기를 해놓은 경우 이 공유지분을 취득한 낙찰자는 구분소유적 공유지분을 그대로 취득하는 것으로 입찰을 실시하는 집행법원은 감정인에게 지분이 아닌 구분소유 목적물에 대한 평가를 하게 하고 그 평가액을 참작하여 최저입찰가격을 정한 후 입찰을 실시해야 한다.	주어진 문장에 적절한 제목을 생성하고, 내용을 요약해주세요. 문장: 1동의 건물 중 위치 및 면적이 특정되고 구조상 및 이용상 독립성이 있는 일부분씩을 2인 이상이 구분소유하기로 하는 약정을 하고 등기만은 편의상 각 구분소유의 면적에 해당하는 비율로 공유지분등기를 하여 놓은 경우 공유자들 사이에 상호 명의신탁관계에 있는 이른바 구분소유적 공유관계에 해당하고, 낙찰에 의한 소유권취득은 성질상 승계취득이어서 1동의 건물 중 특정부분에 대한 구분소유적 공유관계를 표상하는 공유지분을 목적으로 하는 근저당권이 설정된 후 그 근저당권의 실행에 의하여 위 공유지분을 취득한 낙찰자는 구분소유적 공유지분을 그대로 취득하는 것이므로, 건물에 관한 구분소유적 공유지분에 대한 입찰을 실시하는 집행법원으로서는 감정인에게 위 건물의 지분에 대한 평가가 아닌 특정 구분소유 목적물에 대한 평가를 하게 하고 그 평가액을 참작하여 최저입찰가격을 정한 후 입찰을 실시하여야 한다.
	또한 사업정보 및 지원정보에 대해 사업 관리자 관점의 분석이 가능하도록 구현하였으며, 이를 통해 보다 효과적 사업관리지원 및 재정 효율화를 실현할 수 있는 계기를 마련하였다	주어진 문장 뒤에 자연스럽게 이어질 문장을 생성해주세요. 문장: 먼저 각 부처·지자체에서 수행중인 중소기업 지원사업 정보와 지원이력을 관리하고 통합DB를 구축하기 위해 2013~2014년 중소기업 지원사업에 대한 정책분류체계를 개편하고, 2010년 이후 중소기업 지원이력 정보를 수집·구축하였다. 중소기업 지원사업 통합관리시스템은 부처·지자체에서 시행하고 있는 중소기업 지원사업의 정보와 기업별 지원이력 정보를 하나의 시스템에 통합함으로써 분산되어 관리되었던 지원사업에 대해 통합적 관리가 가능하게 되었다.
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 원문을 바탕으로 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 생성하세요.	또한, 셀프 주유소에 설치되는 셀프 주유기들 간에 비교적 저렴한 비용과 간편한 설정으로 네트워크를 구성하여, POS 시스템이나 기타 별도의 관리 장치를 사용하지 않고도, 하나 이상의 셀프 주유기를 통합적으로 관리할 수 있도록 하는 방안도 고려해 볼 필요가 있다.	다음 텍스트에서 제공된 문맥을 정확히 이해하고, 마지막 문장을 자연스럽고 문맥에 맞게 완성하세요. 문장은 이전 내용과 논리적으로 연결되어야 합니다. #텍스트: 최근 주유소 간 경쟁이 치열해져 기름값을 쉽게 올리지 못하게 되면서, 정유사나 자영업자들은 인건비 부담을 줄여 경영악화를 타개하기 위한 조치로 셀프 주유기가 설치된 셀프 주유소를 점차 늘리고 있는 추세이다. 셀프 주유소는 인건비 및 판촉비 등 각종 경비의 절감으로 인해 일반 주유소에 비해서 저렴한 가격으로 휘발유 등을 공급할 수 있다. 이러한 셀프 주유소의 증가는 동질적인 휘발유를 소비하는 가격에 민감한 운전자의 주유소 선택을 변화시킴으로써, 인근 주유소와 가격경쟁을 촉진시킬 수 있을 것으로 기대되고 있다. 셀프 주유기는 주유에 익숙하지 않은 소비자들이 유종을 혼동하는 일을 방지하기 위하여, 각 유종에 따라 주유 노즐의 색상을 다르게 구성하고 있다. 또한, 유종별 선택 버튼 등도 주유 노즐과 같은 색상으로 통일하고 있다. 이외에도, 신용카드 결제뿐만 아니라 외상카드, 현금 주유권, 보너스 카드, 주유소 자체 고객 카드 등 할인이나 적립에 필요한 장치도 탑재한 셀프 주유기도 개발되어 있다. 또한, 대부분의 셀프 주유기에는 주유구 캡을 놓는 자리를 별도로 마련해 두거나, 정전기 발생을 방지할 수 있는 금속을 부착하는 등 고객의 편의를 더하고 있다.그런데, 일반적인 셀프 주유기의 경우, 신용카드나 외상 카드 등의 결제를 위해서 POS(Point Of Sales) 시스템과 연결되어 사용되고 있다. POS 시스템은 금전등록기, 신용카드 결제 단말기 등이 결합된 것으로, 매장 금액 정산, 매장 관리 등을 편리하게 수행할 수 있도록 한다.그러나, 셀프 주유기에 POS 시스템을 연결하여 사용하기 위해서는, POS 시스템의 설치 및 관리를 위한 별도의 비용을 발생시킨다. 또한, 기존 마그네틱 신용카드 외에 IC 신용카드나 NFC 카드 등과 같은 새로운 결제 매체를 사용하기 위해서는, 새로운 POS 시스템으로 교체하여 사용해야만 한다.따라서, 셀프 주유소에서 비용을 절감하고 다양한 결제 매체를 통한 결제가 이루어지기 위해서, POS 시스템의 연결 없이도 다양한 결제 매체를 이용하여 주유 대금의 결제를 할 수 있는 셀프 주유기를 고려해 볼 필요가 있다.
	2014년 리그 오브 레전드 올스타전은 프랑스 파리에서 개최된 리그 오브 레전드의 두 번째 올스타전 대회였습니다. 올스타 인비테이셔널과 올스타 챌린지 두 부문으로 나뉘어 진행되었습니다. 인비테이셔널 부문에서는 각 지역별 리그 우승팀들이 출전했고, 챌린지 부문에서는 지역별 인기투표 상위 2명씩을 뽑아 2팀으로 나누어 진행되었습니다. 대한민국 팀 SK텔레콤 T1 K, 미국 클라우드 9, 유럽 팀 퓨닉 리그 등 각 지역별로 선수 인기투표를 진행하여 2명을 뽑았습니다. 헥사킬 모드 경기를 위해 은퇴한 선수 중 유명한 선수를 지역별로 한 명씩 총 5명을 선택하여 투표를 통해 2명을 선발하였습니다. 올스타 인비테이셔널에 참가하는 팀의 선수는 최종 결과에서 제외되었고, 팀 아이스와 팀 파이어 두 팀으로 나뉘어 경기가 진행되었습니다.	2014년 리그 오브 레전드 올스타전은 어떤 대회였나요?
	따라서 인수가 홀수인 숫자의 경우 소인수분해에 대해 생각해야 합니다. 맞습니다. 만약 어떤 숫자의 소인수분해가 $p_1^{e_1}이라면 다음과 같습니다. \cdot p_2^{e_2} \cdots p_n^{e_n}$의 소인수분해를 갖는다면 $(e_1 + 1)(e_2 + 1)\cdots(e_n + 1)$ 인자를 가집니다. 그리고 우리는 그 요인의 수가 홀수이기를 원합니다. 그렇죠. 따라서 숫자의 소인수분해를 살펴보면 소수의 지수가 짝수이기를 원합니다. 맞습니다. 그러면 각 지수에 1을 더하면 인수의 수가 홀수가 되기 때문입니다. 즉, $16, 25, 36, 49, 64, 81$입니다. 따라서 이러한 숫자는 $6$입니다.	양수 두 자리 정수의 양수 인자가 홀수인 정수는 몇 개입니까?
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 원문을 바탕으로 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 생성하세요.	그래서 예를 들면 철심 박판에 대해 눌러세움부를 형성하는 공정과, 눌러세움부에서의 볼록부보다 작은 직경의 계량 구멍을 형성하는 공정을 가지며, 계량 구멍을 형성하는 공정이 눌러세움부를 형성하는 공정보다 먼저 행해지는 적층 철심의 제조방법이 알려져 있다(특허문헌 1 참조).	다음 텍스트에서 제공된 문맥을 정확히 이해하고, 마지막 문장을 자연스럽고 문맥에 맞게 완성하세요. 문장은 이전 내용과 논리적으로 연결되어야 합니다. #텍스트: 종래, 회전 전기(電機)용 적층 철심에 대해서는, 전자 강판의 후프재(띠형 박강판)를 소재로 하여 프로그레시브 금형 장치에 의해 제조하는 방법이 보급되어 있다. 프로그레시브 금형 장치에서는, 후프재에 대해 파일럿 구멍이나 슬롯부, 티스 등의 타발 가공이 순차적으로 이루어짐으로써 철심 박판이 연속적으로 형성되고 최종적으로 외형이 타발된 철심 박판을 소정 매수 적층하여 고착시킴으로써 적층 철심이 제조된다. 철심 박판의 고착 방법으로서 각 철심 박판에 코킹용 요철을 형성해 놓고 적층시에 서로 압착시켜 코킹 결합시키는 이른바 적층 코킹법이 알려져 있다.이 적층 코킹법에서는, 펀치 및 다이를 이용하여 적층 철심의 최하층에 상당하는 철심 박판에 대해서는 관통공으로 이루어진 계량 구멍이 형성되고, 또 그 최하층 이외의 철심 박판에 대해서는 한쪽 면에 형성되는 오목부와 이 오목부에 대응하여 다른쪽 면에 형성되는 볼록부로 이루어진 눌러세움부(코킹 돌기)가 형성된다. 적층 코킹법을 이용하는 적층 철심 제조 장치에서는, 계량 구멍을 형성하는 계량 펀치는 타발 실시 및 미실시를 전환하기 위한 전환 기구(캠 기구 등)가 마련되는데, 눌러세움부를 형성하는 눌러세우기 펀치에 대해서는 장치 구조의 복잡화 방지나 장치 비용 절감 등의 관점에서 전환 기구를 마련하지 않는 경우가 있다.그러한 경우, 최하층에 상당하는 철심 박판에 대해서도 눌러세우기 펀치에 의한 펀치 동작이 실행되므로, 눌러세우기 펀치는 앞공정에서 형성된 계량 구멍에 삽입되는데, 이 삽입에 의해 계량 구멍의 주연(周緣)에 버(burr)가 발생하는 경우가 있다.
	지난 23 일 김종천 의전비서관이 면허취소 수준의 음주운전 혐의를 받는 등 최근 청와대 직원들의 일탈행위가 잇따라 발생해 임종석 대통령 비서실장이 반성문 성격의 이메일을 직원들에게 보냈다고 하니 사후약방문 식의 빈말이 되지 않도록 잘 실천해야 한다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 사후약방문 격이다. 최근 청와대 직원들의 일탈행위가 잇따라 불거진 것과 관련해 임종석 대통령 비서실장이 그제 반성문 성격의 이메일을 직원들에게 보냈다고 하니 그런 생각이 든다. 청와대의 공직기강 해이가 위험수위에 이르고 여론의 뭇매를 맞고서야 기강 다잡기에 나선 모양새다. 이메일 요지는 '더 엄격한 자세로 일해야 한다. 익숙함, 관성과 단호하게 결별해야 한다'는 얘기다. 만시지탄이라 하지 않을 수 없다. 청와대 직원들이 저지른 사고는 심하게 말해 목불인견이다. 지난 23 일 김종천 의전비서관이 면허취소 수준의 음주운전 혐의로 붙잡혔고, 앞서 10 일에는 경호처 5 급 공무원이 술집에서 시민을 폭행해 불구속 입건됐다. 음주운전에 대해 국민적 경각심이 높아지고 문재인 대통령도 살인행위라며 엄중 처벌을 경고했음에도 김 비서관은 아랑곳하지 않았다. 경호처 직원은 현행범으로 체포된 뒤에도 "내가 누군지 아느냐"며 행패를 부린 데다 경찰관 얼굴까지 가격했다고 한다. 더욱이 김 비서관의 차에는 청와대 여직원 2 명도 동승해 있었다고 하니 음주운전 방조 의혹마저 짙다. 철저한 조사가 필요한 대목이다. 또 지난 6 월에는 청와대 인사수석을 태운 관용차가 신호 위반으로 적발됐다. 앞선 일이지만 송인배 정무비서관은 불법 정치자금 수수 혐의와 관련, 지난 17 일 검찰에 피의자 신분으로 비공개 소환돼 조사를 받았다. 그가 2010 년 8 월∼2017 년 5 월 충북의 한 골프장 이사로 있으면서 급여 등 명목으로 2 억8000 만 원을 받은 것과 관련해서다. 문 대통령의 국정 지지도가 8 주 연속 하락해 취임 이후 최저인 52%로 떨어졌다. 경제·민생 악화 등이 주요인이겠지만, 청와대 참모들의 기강 해이도 그와 무관하지 않아 보인다. 권력 심장부에 있는 사람들이 타의 모범이 되기는커녕 되레 손가락질을 받는다는 건 말이 되지 않는다. 임 실장은 "다시 한번 마음을 다잡고 옷깃을 여미자. 저부터 앞장서겠다"고 했다. 빈말이 되지 않으려면 실천하는 길밖에 없다.
	제목: [건강설계]기허 심해지면 면역기능 급락 기허란 등잔불의 심지 길이가 짧아지면서 불이 잘 타오르지 않는 현상으로 비유할 수 있는데 체력에 비해 일을 많이해서 노권의 병인이 있거나 식적의 병인이 있어서 비장기능을 상하면 기허 증상이 발생하며 기허가 심해지면 면역기능이 급속히 떨어져 각종 질병이 쉽게 발생한다.	주어진 문장에 적절한 제목을 생성하고, 내용을 요약해주세요. 문장: 지난 칼럼에서 등잔불이 잘 타는 것을 '건강을 유지하고 생명현상이 활발하게 일어나는 것'에 비유했다. 등잔불의 심지는 기의 역할, 기름은 혈의 역할이라고 할 수 있다. 심지가 충분히 길어야 불이 잘 타면서 강력한 에너지를 만들어 낼 수 있으므로 심지가 길면 기가 충실한 것이다. 기허란 다시 말해 등잔불의 심지 길이가 짧아지면서 불이 잘 타오르지 않는 현상이다. 체력에 비해 일을 많이 해서 노권의 병인이 있거나 음식을 급하게 많이 먹는 습관으로 식적의 병인이 있어서 비장기능을 상하면 기허 증상이 발생한다. 타고날 때부터 기가 부족한 사람이 노권이나 식적의 병인을 가지고 있다면 기허 증상은 더 심해진다. 노권과 식적은 기를 소모하는 특징이 있다. 기운이 없으면 에너지 소모량이 줄어드는데, 그러면 신진대사에 문제가 생기고 노폐물 적체가 심해진다. 이 경우 기름을 부어주면 심지는 더 짧아지기 때문에, 생리적으로 입맛이 사라지고 음식을 잘 먹지 못하고 음식을 먹어도 기운이 나지 않는다. 기허가 더 심해지면 심지는 더욱 짧아져서 등잔불이 꺼질듯 말듯 한 상태가 된다. 그 때는 열이 거의 없으므로 손발이 차갑고 몸이 냉하면서 면역기능이 급속히 떨어지고 각종 질병이 쉽게 발생한다. 이것을 기허가 더 심해진 양허라고 한다. 기허와 양허는 면역이 떨어지고 정상적인 신진대사에 문제가 발생하기 때문에 어린이는 성장발육에 문제가 생기고, 성인은 대사질환이나 면역저하, 순환장애로 인한 각종 질병에 시달리게 된다. 이런 경우에는 기운이 좋아져서 에너지를 만들어내는 심지의 역할을 제대로 수행할 수 있을 때까지 치료를 해야 한다. 그와 더불어 기허와 양허를 초래한 과로와 과식의 습관으로부터 벗어나는 노력이 반드시 필요하다. <동의보감>에서는 기운을 도와주는 약은 평생을 먹어도 부족하다고 표현한다. 그 정도로 기허증과 그것이 악화돼서 발생하는 양허증은 쉽게 해결되지 않기 때문에 꾸준한 노력이 필요하다. 우리 몸은 기와 혈이 충실하면서 음과 양이 균형을 유지하고 있어야 건강이 유지된다. 병인이 있는 경우 이런 균형이 깨지면서 기허, 혈허, 음허, 양허 등의 문제가 발생하고, 이것은 곧바로 질병으로 연결되기 때문에 병인이 발생하지 않도록 생활관리, 습관관리, 영양관리, 환경관리 등을 철저히 하는 것이 중요하다. <글·이혁재 소아시한의원 원장>
	신빙성과 신뢰성은 모두 믿음이라는 단어와 관련이 있으며, 두 용어의 차이점은 '사실'과 '믿음'에 있습니다. 신빙성은 어떤 주장이나 정보를 근거나 증거를 통해 '사실로 인정'할 수 있는 정도나 성질을 나타내는데 반해, 신뢰성은 어떤 것을 '믿음직하다'고 여겨지는 정도나 성질을 나타냅니다. 예를 들어, A라는 사람이 "나는 이 회사에서 노동법에 의해 당연히 버는 임금을 받지 못했습니다."라고 말했을 때, 그 말이 명백한 근거가 있어 '사실'임을 인정해주는 것이 신빙성입니다. 반면, B라는 사람이 "A는 정직하다."라고 말하면, 이것은 근거나 증거 없이 그저 그 사람을 믿음직하다고 '믿음'을 보내는 것이므로 신뢰성이라고 볼 수 있습니다. 따라서, 신빙성은 사실의 참 거짓과 관련이 있고, 신뢰성은 그 사람 또는 그것에 대한 믿음의 정도와 관련되어 있다는 것을 알 수 있습니다.	신빙성과 신뢰성의 차이점이 무엇인가요? 쉬운 예시와 함께 자세히 설명 부탁드립니다.
	자유한국당 대전시당은 25일 오후 2시 서구 둔산동 대전상공회의소 회의실에서 대전시와 시의회에 대한 정책평가 토론회를 열고 내년 총선 주요 이슈와 후보 선택 기준을 발표할 예정인 반면 바른미래당 대전시당은 손학규 대표는 24일 대전을 방문해 조직 결집에 나선다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 자유한국당 대전시당이 오는 25일 내년 총선 주요 이슈와 후보 선택 기준을 발표한다. 그동안 내년 총선과 관련 이렇다 할 움직임이 없었던 바른미래당도 조직 결집에 나서면서 총선 분위기가 서서히 달아 오르고 있다. 한국당 대전시당은 25일 오후 2시 서구 둔산동 대전상공회의소 회의실에서 대전시와 시의회에 대한 정책평가 토론회를 갖는다. 이날 토론회에서는 민선 7기 출범 1년 간 민주당이 장악하고 있는 대전시정과 시의회에 대한 비판적 평가와 향후 지방자치의 성공적 도약을 위한 개선 방안 등 정책적 대안이 제시될 것으로 보인다. 한국당 대전시당은 이 자리에서 총선 주요 이슈와 후보 선택 기준 등도 발표할 예정이다. 토론회는 이윤환 건양대 교수가 좌장을 맡고, 육동일 시당위원장이 기조발제를 할 계획이다. 패널로는 우애자 시의원(한국당), 김소연 시의원(바른미래당), 유병로 한밭대 교수, 박정규 대덕대 교수 등이 참여한다. 바른미래당 대전시당은 손학규 대표가 24일 대전을 방문해 조직 결집에 나선다. 손 대표의 대전 방문은 지난해 9월 대표 취임 이후 처음이다. 앞서 손 대표는 경남과 인천, 대구, 강원 지역 시·도당을 방문하는 일정을 소화했다. 바른미래당은 지난 4·3 보궐선거 참패 이후 극심한 내홍을 겪었다. 대전 지역에서는 최근 김세환 서구갑 위원장이 개인 사정을 이유로 탈당하면서 안팎에서 우려의 목소리가 나오고 있다. 이런 상황에서 이뤄진 손 대표의 순회 방문은 침체된 분위기를 끌어 올리고, 지역민심을 다잡기 위한 목적으로 풀이된다. 오전 11시 50분 국립 대전현충원 참배를 시작으로 지역 일정을 소화하는 손 대표는 3시간 정도 머무를 예정이다. 손 대표는 현충원 참배 후 유성구 인근 한 식당으로 이동해 2시간 동안 당원들과 간담회를 갖는다. 손 대표는 타 지역 순회 자리에서 한국당과의 보수통합 및 신당 창당 등에 대해선 선을 그었다. 하지만 총선을 앞둔 시점인 만큼 지역 간담회 자리에선 이를 비롯한 당원들의 다양한 목소리가 나올 것으로 보인다. 바른미래당 관계자는 "손 대표는 당원들과의 간담회를 통해 지역 목소리를 충분히 들을 것으로 예상하고 있다"며 "그동안 당이 안팎으로 조금 시끄러웠던 만큼 이번 방문은 많은 이야기를 듣고 민심을 살피려는 목적으로 보시면 된다"고 말했다. 정성직 기자
	해양플랜트는 해상에 설치된다는 특성 때문에 유지보수에 제약이 따르며, 한번 설치되면 길게는 20~30년 동안 한 곳에 고정되어 운용되기 때문에 타 산업과 비교할 때 제작비용보다 플랜트의 안정성과 품질을 훨씬 중요시한다. 심해 및 원해로 나갈수록 파고와 수압이 거세져 화재, 폭발 등의 위험이 커지므로 안전이 매우 중시되고, 기자재 품질의 요구수준이 더욱 강화되는 경향이 있다. 이에 대부분의 핵심 및 요소 기자재는 소수의 검증받은 제한된 업체에 의해 공급되며, 이들 업체 간에는 경쟁이 치열하다.54) 신규 기자재 업체로서는 제품이 개발된 후에도 해양의 혹독한 개발환경에서 안정성이 보장될 수 있도록 현장 실증을 통해 수행실적(track record)을 쌓아야만 비로소 시장 진입이 가능해지는 진입장벽이 높은 산업이다.	주어진 제목과 요약문에 대한 정보를 토대로, 요약되기 전 문장을 유추해서 생성해주세요. 제목: 국내 자원개발 해양플랜트산업의 과제와 대응방안 요약문: 해양플랜트는 해상에 설치되기 때문에 유지보수에 제약이 따르며, 한번 설치되면 길게는 20~30년 동안 한 곳에 고정되어 운용되기 때문에 타 산업과 비교할 때 제작비용보다 플랜트의 안정성과 품질이 훨씬 중요하다.
	포비든 아일랜드(Forbidden Island)는 매트 리액록이 만든 패밀리 보드 게임으로, 2010년에 게임워라이트에서 발매했습니다. 2-4명이 플레이할 수 있으며, 보드게임 긱에서는 패밀리 게임 부문에 포함되어 있습니다. 게임 구성은 모함카드 28장, 모래주머니 카드 2장, 수면 상승 카드 3장, 헬리콥터 카드 3장, 침수카드 24장, 섬타일 24장, 캐릭터 카드 6장, 성물 피규어 4개, 수위 표시판 1개, 그리고 게임 말 6개와 설명서를 포함합니다. 포비든 아일랜드는 승패의 게임이 아니라, 멘사가 추천한 최고의 협동전략 게임으로, 팀원들이 함께 소통하여 4개의 성물을 모으고 함께 탈출하는 것이 목표입니다.	포비든 아일랜드는 누가 만들었어?
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 원문을 바탕으로 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 생성하세요.	또한, 재생하는 오디오 신호의 볼륨을 조절하는 경우, 사용자는 휴대용 단말기의 입력부를 통해 재생되는 오디오 신호의 볼륨을 조절해야 하는 불편함이 있었다.따라서, 최근에 볼륨조절이 가능한 Y형 이어폰 연결 단자가 등장하였지만 볼륨조절 기능을 사용하면서 생기는 잡음과 정확하지 않은 음향의 조절로 인해 불편함이 발생하고 있다.이와 관련하여, 한국공개특허 제2006-0012184호는 "이어폰 신호를 이용한 볼륨 조절 기능을 가지는 무선통신 단말기 및 그 방법"에 관하여 개시하고 있다.	다음 텍스트에서 제공된 문맥을 정확히 이해하고, 마지막 문장을 자연스럽고 문맥에 맞게 완성하세요. 문장은 이전 내용과 논리적으로 연결되어야 합니다. #텍스트: 휴대용 단말기는 소형화 및 경량화되면서 현대인의 필수품으로 사용하고 있으며, 서비스 제공자 및 단말기 제조자는 다른 업체와의 차별화를 위해 제품(또는 서비스)을 경쟁적으로 개발하고 있다. 예를 들어, 휴대용 단말기는 게임(game), MP3(MPEG Layer 3) 재생 및 동영상 재생 등과 같은 멀티미디어 서비스를 제공한다.상술한 바와 같이 휴대용 단말기는 MP3(MPEG Layer 3) 재생 및 동영상 재생 등과 같은 멀티미디어 서비스를 제공할 수 있다. 이때, 휴대용 단말기는 멀티미디어 서비스의 무분별한 사용으로 타인에게 주는 피해를 줄이기 위해 이어폰을 통해 멀티미디어 서비스 제공할 수 있다.휴대용 단말기는 이어폰을 이용하여 멀티미디어 서비스를 위한 음악 및 오디오 신호뿐만 아니라 통화 서비스를 위한 음성 신호를 사용자에게 제공할 수도 있다. 이때, 휴대용 단말기의 사용자는 이어폰을 통해 제공받기 위한 멀티미디어 서비스 또는 통화 서비스를 휴대용 단말기의 입력부를 통해 직접 조작해야 하는 불편함이 있다. 예를들어, 사용자가 휴대용 단말기를 이용하여 MP3 파일을 재생하는 경우, 휴대용 단말기의 사용자는 휴대용 단말기의 입력부를 조작하여 MP3 파일을 선택 및 재생한다.
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 원문을 바탕으로 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 생성하세요.	한국에서도 다수를 이루는 장로교회들과 신학자들은 진보 보수를 막론하고 모두 칼빈의 노선을 표방하고 있고, 그것을 따르고자 노력하고 있다.	다음 텍스트에서 제공된 문맥을 정확히 이해하고, 마지막 문장을 자연스럽고 문맥에 맞게 완성하세요. 문장은 이전 내용과 논리적으로 연결되어야 합니다. #텍스트: 올해는 종교개혁자 칼빈 출생 500주년이다. 칼빈의 전통을 이어받은 세계의 여러교회들과 기관들이 제네바 등지에서 기념대회와 학회를 계획하고 있고, 국내에서도 개혁신학 전통의 장로교회들을 중심으로 한 ‘기념사업회’가 6월 21일부터 이틀간 “요한 칼빈 탄생 500주년 기념대회”를 여는 등 여러 대학이나 기관에서 행사들을 개최한다. 칼빈의 출생을 기념하고 의미를 되돌아보는 일은 중요하다. 칼빈은 루터와 함께, 또는 루터와 다르게 개신교의 토대를 놓았고, 현대에 이르기까지 개신교 신앙과 신학의 큰줄기를 이뤄왔다는 점에서 그렇다. 칼빈의 전통은 루터의 그것과 함께 오늘날까지도 개신교사상의 양대 산맥을 이룬다고 해도 과언이 아니다. 현대신학의 아버지라고 불리는 프리드리히 슐라이에르마허, 20세기 대 신학자 칼 바르트, 에밀 부룬너, 위르겐 몰트만 같은 신학자들이 모두 칼빈의 교회적, 정신적 유산을 받았다. 교회적으로도 칼빈의 후예들은 오늘날 세계개혁교회연맹(WARC)에 속한 교회들만 보더라도 세계 108개국 214교단에 550만명의 신도를 가진 거대한 교회를 이루었다.
	제목: 현대차, 2022년 글로벌 커넥티드카 1000만대로 확대 현대차는 7일 미국 라스베이거스 국제 전자제품 박람회에 참가해 전동화, 커넥티드카, 오픈 이노이노베이션을 미래 모빌리티 3대 전략으로 발표하고 2022년 초 글로벌 커넥티드카 서비스 가입 고객 1000만명 확보와 모든 글로벌 차종에 커넥티드 서비스 탑재 등을 목표로 제시했다.	주어진 문장에 적절한 제목을 생성하고, 내용을 요약해주세요. 문장: CES 2019 참여…미래 모빌리티 혁신 고도화 전략 발표 자료/현대차 현대차가 CES 2019에서 미래 모빌리티 비전 고도화 혁신 전략을 발표했다. 미래 모빌리티 전략을 ▷전동화 ▷커넥티드카 ▷오픈 이노이노베이션 등 3대 키워드를 중심으로 구체화했다. 현대차는 이를 통해 시장 판도를 좌우하는 ‘게임체인저 (Game Changer)’로서 미래 대응력을 강화한다는 복안이다. 현대자동차(주)는 미국 라스베이거스에서 7일(현지시각) 열린 국제 전자제품 박람회(Consumer Electronics Show·CES 2019)에 참가해 미래 모빌리티 비전 고도화를 위한 각 부문별 혁신 전략을 발표했다. 현대차가 미래 스마트 모빌리티 솔루션 제공 업체로의 전환을 예고한 것으로 받아들여지고 있다. 이번에 공개된 현대차의 미래 혁신 전략은 ▷전동화(EV) 기반의 개인 맞춤형 모빌리티 경험 제공 ▷글로벌 커넥티드카 서비스 확대 및 오픈 플랫폼 구축 ▷오픈 이노베이션&인공지능 혁신 거점 구축 등 세가지로 요약된다. 먼저 현대차는 고객들이 자신만의 라이프 스타일에 맞춰 인테리어 부품과 하드웨어 기기, 상품 콘텐츠 등을 원하는 대로 자유롭게 구성할 수 있는 ‘스타일 셋 프리(Style Set Free)’콘셉트의 모빌리티 방향성을 제시하고 핵심 기반 기술로 전기차 전용 플랫폼 중심의 전동화 비전을 공개했다. 현대차는 2020년 스타일 셋 프리 콘셉트가 적용된 최초의 전기차 전용 플랫폼 기반 신형 전기차를 선보일 계획이다. 현대차는 커넥티드카 분야의 글로벌 리딩 전략의 일환으로 2022년 초 글로벌 커넥티드카 서비스 가입 고객 1000만명 확보와 모든 글로벌 차종에 커넥티드 서비스 탑재 등을 목표로 제시했다. 현대차는 국경과 업종을 뛰어 넘는 오픈 이노베이션 방식의 글로벌 협업 다각화에도 속도를 높일 방침이다. 국내, 미국, 이스라엘에 구축한 글로벌 오픈 이노베이션 센터를 올해 안에 베를린, 베이징으로 확대해, 글로벌 5대 혁신 거점을 완성할 계획이다. 특히 융복합 혁신 기술의 총아로 꼽히는 인공지능(AI) 분야에 대한 글로벌 경쟁력 확보에도 집중하기로 했다. 현대차는 지난해11월 신설된 인공지능 전문 연구조직 ‘에어 랩(AIR Lab, Artificial Intelligence Research lab)’을 주축으로, 올해 내 미국에도 인공지능 전문 연구개발 센터를 신설한다는 계획도 공개했다. 현대차는 스마트 모빌리티 시대를 구현하기 위해 자동차 제조업체에서 스마트 모빌리티 솔루션 제공 업체로의 전환을 추진해나가고 있으며, 이를 통해 혁신적인 아이디어로 시장의 판도를 주도해 나가는 게임체인저로 부상한다는 계획이다. 손균근 기자 kkshon@kookje.co.kr 현대차 고객경험본부장 조원홍 부사장이 고객 경험 전략 방향성 ‘스타일 셋 프리(Style Set Free)를 발표하고 있는 모습 /현대차 제공
	지역별 안보관광자원은 인천권 11개소, 경기권 11개소, 강원권 18개소 총 39개소이다. 이중 군부대에서 방문객을 관리하는 대상 자원은 17개소로 나타났다. 안보관광자원은 DMZ 중심의 전망대와 전적지 등에 대한 견학 시설이 대부분을 차지하고 있다. 관광자원 측면에서 지적된 우선적인 문제점으로 접근성의 한계가 있다. 안보관광자원은 파주와 김포 및 강화를 제외하고 인천 옹진, 경기 연천, 강원권 5개 시군과 수도권과의 접근성에 한계가 있는 실정이다. 특히, 물리적 거리와 북한의 핵 문제와 도발 사태 등의 영향으로 DMZ의 다양한 자연 및 생태 자원에 대한 관심도도 낮아지고 있는 것으로 나타났다.	주어진 제목과 요약문에 대한 정보를 토대로, 요약되기 전 문장을 유추해서 생성해주세요. 제목: 안보관광지역의 관광경쟁력 강화 방안 요약문: 안보관광자원은 DMZ를 중심으로 한 견학시설이 대부분이나 접근성의 한계가 있다. 북한의 핵 문제와 도발 등의 영향으로 DMZ의 자연,생태 자원에 대한 관심도도 낮아지고 있다.
	찹쌀떡을 '찹쌀모찌'라고 부르는 것은 맞습니다. 이 용어는 찹쌀이라는 우리말과 모찌(떡)라는 일본말이 합쳐진 말입니다. 따라서, 이 용어는 일본어 용어입니다. 경상남도 방언으로 사용되는 것은 아닙니다. 참고로, 인절미 같은 찹쌀떡은 찹쌀모찌라고 하지 않습니다. 그러한 떡을 단팥빵과 같이 '단팥찹쌀떡'이라고 부르는 것이 좋습니다.	찹쌀떡을 '찹쌀모찌'라고 부르는 것이 맞을까요? 이 용어는 일본어로 된 용어일까요? 그리고, 경상남도 방언인가요?
	따라서 표본의 편향을 조정하기 위한 보정 항목이 절실하게 필요하며, 농가여부는 매우 유용한 보정 항목으로 이용될 수 있을 것이다	주어진 문장 뒤에 자연스럽게 이어질 문장을 생성해주세요. 문장: 먼저 경활조사 조사표에는 포함되어 있으나 고용조사의 조사표에는 포함되지 않은 농가여부의 항목을 포함시키는 것에 대하여 고민해 보아야 할 것이다. 실제 고용조사는 시군구 단위의 통계 생산을 목적으로 설계된 표본조사로 소지역에서의 경제활동 관련특성을 파악하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다. 그러나 이를 16개 시도 단위로 또는 전국 단위로 확대하여 생각할 경우에는 도 지역의 군 단위 표본이 지나치게 많이 추출되어 전체적으로는 편향된 결과를 가져올 위험이 있다. 도 지역의 군 단위 표본이 상대적으로 많이 뽑히게 될 경우, 저학력, 고령, 농림어업 종사자 등의 특성을 표본이 가지고 있을 가능성이 매우 높다.
	그러나 무엇보다 우리나라의 외국인직접투자 정책은 외환위기를 기점으로 크게 변화되었다. 1998년 적극적으로 외국인투자를 유치하기 위해 개방 업종을 보다 확대하였으며, 「외국인투자촉진법」을 제정하여 시행하였다. 더불어 적대적 M&A를 허용하고, 부동산시장에 대한 전면 개방 또한 실시하였다. 또한 적극적인 외자유치를 위해서 영국 및 말레이시아 등의 사례를 벤치마킹하여, 외국인투자지원센터를 설치하고, 이를 통해 외국인투자자에게 투자상담에서부터 합작업체의 알선, 투자관련 민원대행, 생활정착지원에 이르기까지 원스톱(One-stop) 서비스를 제공하도록 하였다. 실제로 한국의 연도별 FDI유입 추이를 살펴보면, 외환위기 이후 급격한 증가세를 보이고 있는 것을 확인할 수 있다. 2000년대 초반 주요 선진국의 경기침체라는 대외적 요인으로 인하여 급격한 하락세를 보이기도 하였으나, 2000년대 중반 이후 대략 120억 달러 전후 수준으로 비교적 안정세를 보이는 것으로 나타났다.	주어진 제목과 요약문에 대한 정보를 토대로, 요약되기 전 문장을 유추해서 생성해주세요. 제목: 외국인 투자요인 변화에 따른 자유무역지역 기능 재정립 방안 요약문: 한국의 외국인직접투자정책은 외환위기를 기점으로 변화됐는데, 개방 업종 확대, 「외국인투자촉진법」 제정·시행, 적대적 M&A 허용, 부동산시장의 전면 개방을 실시했다. 외국인투자자에게 원스톱 서비스도 제공했다. 이로 인해 FDI유입이 증가하고 안정세를 보였다.
	왼쪽 위를 1로 시작하여 시계 방향으로 점의 번호를 매깁니다. 중심점에 7을 붙입니다. 변의 길이가 1인 6개의 정삼각형을 만들 수 있습니다: 176, 172, 273, 657, 574, 473입니다. 또한 한 변의 길이가 $\sqrt{3}$인 두 개의 정삼각형, 즉 135와 246을 만들 수 있습니다. 따라서 이러한 정삼각형은 $8$ 개가 있습니다.	표시된 육각형 격자의 각 점은 가장 가까운 이웃에서 한 단위씩 떨어져 있습니다. 격자에서 세 꼭지점을 모두 갖는 정삼각형은 몇 개입니까? [asy]size(75); dot(origin); dot(dir(0)); dot(dir(60)); dot(dir(120)); dot(dir(180)); dot(dir(240)); dot(dir(300)); [/asy]
	남극 부근의 별자리는 북반구에서 보이지 않는 별자리를 의미합니다. 남극 부근의 별자리에서 밝은 별 네 개가 십자 모양을 이루고 있습니다. 남극 부근의 별자리에서 알파, 베타별은 1등성이고 감마별은 2등성, 델타별은 3등성, 엡실론별은 4등성입니다. 남극 부근의 별자리는 지구의 세차운동으로 남쪽으로 점점 더 높아지고 있습니다. 남극 부근의 별자리는 은하수 안으로 뻗어 있으며, 중앙에서는 알파별과 베타별이 반짝입니다. 남극 부근의 별자리에는 안시쌍성이 있습니다. 안시쌍성은 분광형이 G2인 별과 분광형이 K5인 별로 이루어져 있으며, 궤도 주기는 80.089년입니다. 연주시차는 0.75초이고 거리는 4.3광년입니다. 안시쌍성의 동반성인 프록시마는 시차가 0.762″이며, 거리로 환산하면 4.28광년이므로 지금까지 알려진 별 중에서는 태양계와 가장 가까운 별입니다. 남극 부근의 별자리는 센타우루스자리에 있는 다중성입니다. 세 개의 별로 이루어져 있으며, 겉보기 등급은 A별이 0.33이고, B별은 1.70이며, 세 번째 별인 프록시마는 11.3입니다. 이 별은 23km/sec 정도의 속도로 태양계와 가까워지고 있습니다. 남극 부근의 별자리는 남반구에서만 관측할 수 있으며, 지구에서 4.3광년 떨어진 곳에 있습니다.	남극 부근 별자리에 있는 밝은 별 네 개의 이름은 무엇인가요?
	일주일째 국회가 파행되는 가운데 정치권의 지역구 예산 챙기기의 대부분은 지역구를 위한 선심성 증액일 가능성이 높아 예산심의실명제와 공개의무제를 도입하는 것이 필요하다 하겠다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 서울경제 일주일째 국회 파행으로 새해 예산과 민생법안 심의가 뒷전으로 밀린 가운데 정치권의 지역구 예산 챙기기 행태가 여전하다. 국회 의안정보시스템에 따르면 11 개 상임위원회가 예비심사를 마치고 예결위원회에 넘긴 예산안 증액 규모는 9 조원에 육박한다. 나머지 6 개 상임위의 예비심사안이 올라오면 증액 예산은 족히 10 조원을 웃돌 것으로 추정된다. 증액 예산 대부분은 특정 지역이 수혜를 보는 것으로 지역구를 의식한 선심성 증액일 공산이 농후하다. 사회간접자본(SOC) 관련 주관인 국토교통위가 무려 2 조원 이상의 증액을 요구했고 문화체육관광위도 체육·문화시설 위주로 예산을 늘린 것이 그런 증표가 된다. 정치권의 이런 행태는 예결위 심의과정에서 지역구 관련 예산이 삭감될 것을 감안해 일단 부풀려놓고 보자는 포퓰리즘에서 비롯된다. 여야 가릴 것도 없다. 정치권의 날 선 대립에 국회가 파행으로 얼룩져도 여야 의원들이 제 밥그릇 챙기는 것은 누이 좋고 매부 좋다는 식이다. 문제는 선심성 예산 전쟁이 시작에 불과하다는 점이다. 예산안조정소위와 예결위가 본격 가동되면 지역구 '쪽지 예산'이 기승을 부릴 것은 불 보듯 뻔하다. 가뜩이나 국회 파행으로 예결위 차원에서 특정 예산의 삭감이나 증액이 미뤄진 상황이기에 그럴 우려는 더욱 크다. 워낙 은밀한 뒷거래가 이뤄지고 몇몇 소수 의원끼리 밀실 협의를 하는 탓에 언론이나 시민단체 등의 사전적 감시조차 어렵다. 적폐가 아닐 수 없다. 이런 '묻지 마' 예산이 끼어들면 정작 재정이 뒷받침돼야 할 곳이 소외되고 예산낭비로 이어지기 십상이다. 이래저래 국민경제에 부담이 될 수밖에 없다. 국회 예산심의 시스템을 획기적으로 뜯어고치지 않으면 혈세 누수는 되풀이될 수밖에 없다. 예산의 증액 또는 신설을 누가 주도했는지 분명하게 기록으로 남겨야 그나마 예산낭비를 줄일 수 있다. 예산심의실명제와 공개의무제 도입을 서둘러야 한다. 이에 반대한다면 낙선운동이라도 벌여야 한다.
	영미법계에서는 일찍이 공판정외에서 이루어진 피고인의 불이익한 진술(admission)을 내용으로 하는 전문증거는 전문법칙이 적용되지 않는 경우로서 증거로 사용하는 것이 허용되고 있다. common law에서는 이러한 진술을 전문법칙의 예외(exception to the hearsay rule)로서 파악되어 허용되었으나, 미국 연방증거법은 이를 아예 전문증거가 아닌 것으로 정의하고 있다. 즉 미국 연방증거법 제801조 (d)(2)는 반대당사자의 진술(An Opposing Party’s Statement)을 전문진술이 아니라고 규정하고 있다. 이는 서면에 의한 것이든, 구두에 의한 것이든 마찬가지다. 따라서 피의자를 조사한 경찰관이 수사 당시에 피의자가 불이익한 사실을 진술하였다는 점을 법정에서 증언하면, 이는 피고인의 증언 여부나 인정여부에 불구하고, 그 증거능력을 인정받게 된다. 즉 미국에서 피의자의 법정 외 진술은 전문진술이 아니므로 피의자를 조사한 경찰관이 조사 당시나 현장에서 피의자가 진술을 하였다는 사실을 청취한 후, 법정에서 위 사실을 증언하면 피고인의 증언여부에 불구하고 증거능력을 인정받게 되는 것이다.	주어진 제목과 요약문에 대한 정보를 토대로, 요약되기 전 문장을 유추해서 생성해주세요. 제목: 형사법의 신동향 통권 제49호 5. 전문증거의 의의에 따른 전문법칙의 적용범위(정웅석) 요약문: 영미의 보통법 개념에서는 재판정 밖에서의 불리한 피고인의 진술은 제 3자로부터 획득한 정보임에도 예외적 증거로 채택되었으나, 미국 연방증거법에서는 법정 이외에서 관련 당사들이 채집한 피의자 앞 불리한 간접 진술은 아예 전문증거가 아닌 직접적인 사실증거로 인정하여 증거 능력이 있다고 본다.
	숭인전은 조선민주주의인민공화국 국보 제5호로, 1325년에 지은 사당 건물로 비교적 이른 시기의 건물 중 하나입니다. 평양시 중구역 종로동 평양학생소년궁전 옆에 위치하며, 숭령전과 함께 서 있습니다. 원래는 10여 채의 부속건물이 있었지만, 6·25 전쟁 때 파괴되었고, 1954년에 정전과 대문이 복구되었습니다. 1977년에 길건너 숭령전 옆으로 옮겨진 후, 현재는 정전과 대문만 남아 있습니다. 숭인전의 정전은 고려 건축의 특징을 잘 보여주는 건물로, 모서리 기둥을 가운데 기둥보다 약간 내세워 안정감을 주었습니다. 또한, 천장구조를 노출시키고 장식을 추가하여 압박감을 제거시켰습니다.	숭인전은 조선민주주의인민공화국 국보 제5호로 지은 사당 건물이야.
	알버타 주를 기반으로 하는 TappCar 사는 그동안 상업용 차량 보험을 이용해야 했지만 새로운 보험 상품의 등장으로 파트타임 운전자들의 운행이 용이하게 되었다며 변화를 환영했다	주어진 문장 뒤에 자연스럽게 이어질 문장을 생성해주세요. 문장: 2016년 6월 28일 알버타주 보험관리국(the Superintendent of Insurance of Alberta) 은 공유경제차량에 적용될 수 있는 보험 상품을 허가했다. 새로운 보험 상품은 7월 1일 부터 유효하며, Intact와 Belairdirect 등 여러 보험 회사에서 판매를 시작했다. 보험 약관은 보험 공유경제차량 운전자가 앱에 로그인을 하는 순간부터 탑승 손님이 내리는 시점까지 적용된다. 보험문제가 해결됨에 따라 Edmonton 시에서는 Uber 서비스가 7월 1일 재개되었다.
	팔레스타인 항공은 1995년에 설립된 팔레스타인의 항공사로, 아랍항공기구의 일원입니다. 처음에는 가자를 중심으로 운항했지만, 이스라엘의 반대로 이집트 북부의 포트사이드에서 운항하게 되었습니다. 1997년에 제다를 취항하기 시작했고, 그 후 아리시와 요르단, 사우디아라비아까지 국제선 노선을 운항하였습니다. 1998년에는 가자의 야세르 아라파트 국제공항을 허브 공항으로 삼았지만, 2001년에 활주로가 파괴됨에 따라 허브 공항을 엘 아리시 국제공항으로 이동했습니다. 현재 팔레스타인 항공은 26.4년의 평균 기령을 가진 다양한 기종을 보유하고 있습니다.	팔레스타인 항공은 어느 해에 설립되었나?
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 원문을 바탕으로 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 생성하세요.	출판물의 편집에서부터 인출에 이르기까지 전 과정에 참여하는 교정자는 내용의 정확성과 인출본의 정교함을 좌우하는 결정적인 역할을 하였기 때문에 간행물의 주제와 성격에 따라 그 분야의 전문가들로 구성되었다.	다음 텍스트에서 제공된 문맥을 정확히 이해하고, 마지막 문장을 자연스럽고 문맥에 맞게 완성하세요. 문장은 이전 내용과 논리적으로 연결되어야 합니다. #텍스트: 오늘날 校正의 의미는 오자나 탈자를 바로 잡는다는 뜻으로 원고와의 대조를 통한 書寫, 컴퓨터를 통한 입력, 인출과정에서의 실수를 바로잡는 일을 가리킨다. 그러나 원래의 뜻은 어떤 책에서 訛傳된 글자나 구절을 찾아 증거를 밝혀 証訂하는 것이다. 고대로부터 현재까지 서책을 출판할 때는 반드시 인출 전에 원고를 교정하고 인출 후에 다시 점검을 거쳐 최종 출판물을 완성하였다. 조선은 개국초부터 文을 숭상하여 서책의 간행과 보급에 힘을 기울여 고려로부터 계승한 인쇄술을 더욱 발전시켰다. 발달된 인쇄술을 바탕으로 찍어낸 인본의 정교함은 중앙관서의 인본에서부터 확인할 수 있는데, 중앙에서는 글을 잘 쓰는 書寫者와 숙련된 刻手 그리고 전문지식을 소유하고 교정에 임할 수 있는 많은 문신들을 바탕으로 철저한 교정이 이루어졌다. 비록 발달된 인쇄기술이 있다 하더라도 출판과정에서 오류를 바로잡아주지 못하면 정교한 인본을 간행할 수 없기 때문에 고려시대부터 중앙관서에서는 印頒을 전담하는 기구를 설치하여 監校, 監印 및 校勘하는 이를 두고 이들에 대한 상벌규정까지 마련해 두었다.

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