Datasets:
OTAR3088
/
CeLLaTe-cleaned

Dataset card Data Studio Files
xet
Community
words
listlengths
1.34k
3.83k
labels
listlengths
1.34k
3.83k
[ "Introduction", "The", "persistence", "of", "replication-competent", ",", "but", "transcriptionally", "inhibited", "HIV-1", "proviral", "DNA", "in", "long-lived", ",", "latent", "cellular", "reservoirs", "is", "a", "significant", "barrier", "to", "the", "development", "of", "a", "functional", "cure", "[", "1,2", "]", "Even", "after", "long-term", ",", "suppressive", "antiretroviral", "therapy", "(", "ART", ")", ",", "spontaneous", "reactivation", "of", "proviral", "gene", "expression", "from", "the", "latent", "reservoir", "is", "sufficient", "to", "initiate", "viral", "rebound", "shortly", "after", "ART", "cessation", ",", "thus", "requiring", "life-long", "adherence", "[", "3–5", "]", ".", "Multifaceted", "and", "heterogenous", "blocks", "to", "viral", "gene", "expression", "establish", "and", "maintain", "HIV-1", "latency", "at", "the", "epigenetic", ",", "transcriptional", ",", "and", "post-transcriptional", "levels", "[", "2", "]", ".", "Several", "strategies", "to", "either", "reactivate", "latent", "proviruses", "and", "clear", "infected", "cells", "(", "i.e.", ",", "“shock", "and", "kill”", ")", "or", "reinforce", "latency", "to", "prevent", "spontaneous", "reactivation", "(", "i.e.", ",", "“block", "and", "lock”", ")", "are", "currently", "under", "investigation", "[", "6,7", "]", ".", "While", "many", "small", "molecule", "latency", "reversing", "agents", "(", "LRAs", ")", "have", "been", "described", "that", "reactivate", "latent", "proviruses", "ex", "vivo", ",", "they", "have", "had", "little", "success", "in", "clinical", "trials", "[", "8,9", "]", ".", "This", "failure", "is", "partly", "due", "to", "the", "latent", "reservoir’s", "heterogenous", "nature", ",", "such", "that", "treatment", "by", "a", "single", "agent", "that", "acts", "to", "target", "a", "specific", "block", "may", "only", "ever", "reactivate", "a", "small", "fraction", "of", "proviruses", "in", "vivo", "[", "10", "]", ".", "Even", "if", "transcriptional", "reactivation", "is", "achieved", ",", "it", "is", "unlikely", "this", "is", "sufficient", "to", "result", "in", "the", "clearance", "of", "these", "infected", "cells", "without", "additional", "immune", "augmentation", "such", "as", "the", "administration", "of", "antibodies", ",", "vaccines", ",", "or", "immunotherapies", "to", "prime", "the", "immune", "system", "[", "6", "]", ".", "Given", "these", "limitations", ",", "much", "research", "is", "now", "focused", "on", "combinatorial", "approaches", "to", "trigger", "more", "widespread", "and", "robust", "reactivation", "[", "11", "]", ".", "For", "example", ",", "a", "recent", "study", "reported", "synergistic", "reactivation", "potential", "between", "an", "activator", "of", "non-canonical", "NF-kB", "signaling", "(", "AZD5582", ")", "and", "BET", "bromodomain", "inhibitors", "that", "act", "to", "lift", "blocks", "to", "transcriptional", "initiation", "and", "elongation", ",", "respectively", "[", "12", "]", ".", "Blocks", "to", "transcriptional", "elongation", "are", "major", "contributors", "to", "establishing", "and", "maintaining", "HIV-1", "latency", "[", "13,14", "]", ".", "After", "integration", "of", "the", "proviral", "DNA", ",", "RNA", "Polymerase", "II", "(", "RNA", "Pol", "II", ")", "is", "recruited", "to", "the", "transcription", "start", "site", "by", "transcription", "factors", "that", "bind", "cis-elements", "in", "the", "HIV-1", "promoter", "region.", "After", "transcriptional", "initiation", ",", "RNA", "Pol", "II", "synthesizes", "20–60", "nucleotides", "before", "stalling", "through", "a", "well-conserved", "process", "known", "as", "promoter-proximal", "pausing", "[", "15", "]", ".", "Pausing", "is", "enforced", "by", "several", "negative", "elongation", "factors", ",", "including", "negative", "elongation", "factor", "(", "NELF", ")", ",", "DRB", "Sensitivity", "Inducing", "Factor", "(", "DSIF", ")", ",", "and", "the", "RNA", "Polymerase", "II", "Associated", "Factor", "1", "(", "PAF1", ")", "complex", "[", "16–18", "]", ".", "Pause", "release", "is", "regulated", "by", "positive", "transcription", "elongation", "factor-b", "(", "P-TEFb", ")", ",", "a", "heterodimeric", "protein", "complex", "composed", "of", "cyclin-dependent", "kinase", "9", "(", "CDK9", ")", "and", "cyclin", "T1", "(", "CCNT1", ")", "[", "19–21", "]", ".", "P-TEFb", "phosphorylates", "the", "C-terminal", "tail", "of", "RNA", "Pol", "II", "and", "several", "negative", "elongation", "factors", ",", "which", "collectively", "license", "transcriptional", "elongation", "[", "22–24", "]", ".", "Recruitment", "of", "P-TEFb", "to", "sites", "of", "nascent", "transcription", "is", "a", "highly", "regulated", "process", "mediated", "by", "several", "cellular", "complexes.", "The", "majority", "of", "cellular", "P-TEFb", "is", "sequestered", "in", "an", "inactive", "state", "by", "the", "7SK", "ribonucleoprotein", "(", "RNP", ")", "complex", "[", "25,26", "]", ".", "Diverse", "extracellular", "stimuli", "and", "intracellular", "signals", "can", "induce", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "the", "7SK", "complex", "[", "27–29", "]", "where", "it", "can", "be", "recruited", "to", "sites", "of", "nascent", "transcription", "by", "transcription", "factors", "(", "i.e.", ",", "NF-kB", "and", "c-MYC", ")", "[", "30–32", "]", ",", "epigenetic", "regulators", "(", "i.e.", ",", "BRD4", ")", "[", "33,34", "]", ",", "or", "super", "elongation", "complexes", "(", "SECs", ")", "composed", "of", "an", "ARF4", "/", "FMR2", "(", "AFF", ")", "family", "scaffold", "protein", "in", "complex", "with", "AF9", ",", "ENL", ",", "an", "eleven-nineteen", "Lys-rich", "leukemia", "(", "ELL", ")", "family", "protein", ",", "and", "an", "ELL-associated", "factor", "(", "EAF", ")", "protein", "[", "35", "]", ".", "To", "circumvent", "this", "regulatory", "step", ",", "HIV-1", "encodes", "a", "trans-activator", "protein", "(", "Tat", ")", "that", "binds", "to", "and", "recruits", "P-TEFb", "specifically", "to", "sites", "of", "nascent", "proviral", "transcription", "through", "recognition", "of", "a", "transactivation", "response", "(", "TAR", ")", "RNA", "stem", "loop", "produced", "at", "the", "immediate", "3’", "end", "of", "all", "viral", "RNA", "transcripts", "[", "36–38", "]", ".", "The", "distribution", "of", "and", "competition", "for", "P-TEFb", "binding", "among", "different", "complexes", "is", "an", "area", "of", "active", "investigation", ",", "with", "several", "strategies", "to", "enhance", "the", "biogenesis", "or", "availability", "of", "P-TEFb", "showing", "promise", "for", "HIV-1", "latency", "reversal.", "For", "example", ",", "BET", "bromodomain", "inhibitors", "(", "such", "as", "JQ1", ")", "have", "been", "shown", "to", "be", "potent", "LRAs", "in", "ex", "vivo", "models", "by", "releasing", "P-TEFb", "from", "BRD4", "[", "12", "]", ".", "Likewise", ",", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "the", "7SK", "RNP", "complex", "has", "been", "shown", "to", "reactivate", "latent", "proviruses", "in", "ex", "vivo", "models", "[", "39", "]", ".", "That", "being", "said", ",", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "the", "7SK", "RNP", "complex", "has", "been", "shown", "to", "directly", "correlate", "with", "increased", "BRD4", "binding", ",", "suggesting", "that", "release", "from", "any", "one", "complex", "will", "not", "necessarily", "increase", "the", "amount", "of", "unbound", "P-TEFb", "or", "the", "amount", "recruited", "to", "specific", "sites", "of", "transcription", "[", "33", "]", ".", "Furthermore", ",", "post-translational", "modification", "of", "P-TEFb", "(", "i.e.", ",", "through", "phosphorylation", "of", "CDK9", "at", "Serine", "175", ")", "has", "been", "shown", "to", "influence", "P-TEFb", "distribution", "in", "certain", "regulatory", "complexes", ",", "again", "highlighting", "the", "unique", "properties", "of", "release", "from", "each", "complex", "[", "40", "]", ".", "While", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "the", "7SK", "RNP", "complex", "and", "BET", "proteins", "such", "as", "BRD4", "have", "been", "explored", "as", "strategies", "for", "HIV-1", "latency", "reversal", ",", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "SECs", "has", "not", "been", "explored.", "Previous", "work", "has", "demonstrated", "that", "HIV-1", "Tat", "biochemically", "co-purifies", "with", "several", "SEC", "proteins", "[", "41,42", "]", ",", "though", "the", "reason", "for", "this", "is", "unclear", "as", "they", "seemingly", "have", "functionally", "redundant", "purposes", "in", "P-TEFb", "recruitment.", "In", "this", "study", ",", "we", "test", "the", "hypothesis", "that", "the", "SEC", "is", "not", "necessary", "for", "HIV-1", "viral", "transcription", "and", "that", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "cellular", "SEC", "complexes", "can", "serve", "as", "a", "novel", "strategy", "to", "reactivate", "latent", "HIV-1", "proviruses.", "Results", "Discussion", "In", "this", "study", ",", "we", "demonstrate", "a", "potential", "new", "strategy", "for", "enhancing", "HIV-1", "latency", "reversal", "through", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "the", "cellular", "pool", "of", "SECs.", "We", "show", "that", "KL-2", ",", "a", "small", "molecule", "inhibitor", "of", "the", "interaction", "between", "the", "SEC", "and", "P-TEFb", ",", "is", "sufficient", "to", "enhance", "viral", "transcription", "in", "primary", "CD4+", "T", "cells", "and", "can", "synergistically", "enhance", "the", "activity", "of", "other", "LRAs", "in", "certain", "cell", "line", "models", "of", "latency.", "Finally", ",", "we", "demonstrate", "that", "KL-2", "can", "increase", "HIV-1", "gag", "expression", "in", "PBMCs", "from", "PLWH", "on", "suppressive", "ART", ",", "most", "notably", "in", "combination", "with", "the", "non-canonical", "NF-kB", "agonist", ",", "AZD5582.", "We", "propose", "a", "model", "in", "which", "KL-2", "release", "of", "P-TEFb", "from", "the", "cellular", "pool", "of", "SECs", "enhances", "transcriptional", "elongation", "of", "integrated", "proviruses", ",", "akin", "to", "BET", "bromodomain", "inhibitors", "and", "7SK", "RNP", "inhibitors", "(", "Fig", "6D", ")", ".", "These", "results", "have", "several", "implications", "for", "our", "understanding", "of", "viral", "transcription", "and", "future", "directions.", "Latency", "reversal", "through", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "cellular", "SECs", "had", "not", "been", "previously", "explored", ",", "likely", "due", "to", "the", "perceived", "dependency", "of", "viral", "transcription", "on", "the", "SEC.", "This", "effect", "has", "been", "supported", "by", "biochemical", "purifications", "of", "HIV-1", "Tat", "from", "human", "cell", "lines", "that", "revealed", "interactions", "with", "a", "larger", "SEC", "[", "41,42", "]", ",", "as", "well", "as", "by", "genetic", "knock-down", "experiments", "in", "cell", "lines", "showing", "a", "decrease", "in", "Tat-dependent", "transcription", "upon", "SEC", "component", "depletion", "[", "64,65", "]", ".", "However", ",", "given", "that", "both", "the", "SEC", "and", "Tat", "recruit", "P-TEFb", "to", "sites", "of", "nascent", "transcription", ",", "they", "share", "some", "functional", "redundancy.", "We", "found", "that", "knock-out", "of", "SEC", "components", "from", "activated", ",", "primary", "CD4+", "T", "cells", "from", "12", "independent", "donors", "did", "not", "inhibit", "viral", "replication", ",", "suggesting", "that", "the", "SEC", "is", "not", "required", "in", "this", "cellular", "context.", "This", "result", "was", "independently", "verified", "using", "KL-2", ",", "which", "inhibits", "the", "interaction", "between", "CCNT1", "(", "P-TEFb", ")", "and", "AFF1", "/", "4", "(", "of", "the", "larger", "SEC", ")", ".", "Notably", ",", "disruption", "of", "the", "SEC", "using", "KL-2", "resulted", "in", "significant", "increases", "in", "HIV-1", "replication", "in", "primary", "CD4+", "T", "cells", "whereas", "genetic", "knockout", "of", "most", "SEC", "members", "had", "minimal", "to", "no", "impact", "on", "replication.", "One", "potential", "explanation", "for", "this", "difference", "is", "that", "genetic", "knockout", "results", "in", "the", "ablation", "of", "SEC", "assembly", "and", "relocalization", "of", "P-TEFb", "into", "other", "complexes", "at", "steady-state", "whereas", "chemical", "perturbation", "by", "KL-2", "results", "in", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "SECs", "that", "are", "continually", "being", "formed.", "Understanding", "the", "dynamics", "of", "P-TEFb", "distribution", "and", "relocalization", "upon", "different", "types", "of", "perturbation", "is", "an", "ongoing", "area", "of", "investigation.", "While", "we", "expected", "KL-2", "to", "enhance", "the", "transcriptional", "elongation", "of", "integrated", "proviruses", "due", "to", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "cellular", "SECs", ",", "we", "also", "saw", "increases", "in", "transcriptional", "initiation", "as", "measured", "by", "qRT-PCR", "for", "TAR", "transcript", "levels.", "Likewise", ",", "in", "J-Lat", "5A8", "cells", ",", "we", "saw", "increases", "in", "transcriptional", "elongation", ",", "transcriptional", "initiation", ",", "and", "in", "RNA", "Pol", "II", "recruitment", "to", "the", "proviral", "promoter", "when", "KL-2", "was", "added", ",", "even", "though", "KL-2", "addition", "alone", "was", "not", "sufficient", "for", "reactivation", "as", "measured", "by", "GFP", "positivity", "in", "this", "model.", "This", "finding", "suggests", "that", "either", "KL-2", "has", "secondary", "effects", "not", "mediated", "by", "P-TEFb", "or", "that", "the", "redistribution", "of", "P-TEFb", "away", "from", "SECs", "has", "secondary", "effects", "that", "could", "impact", "transcriptional", "initiation", "at", "proviral", "integration", "sites.", "BET", "bromodomain", "inhibitors", "have", "also", "been", "reported", "to", "increase", "HIV-1", "transcriptional", "initiation", "[", "12,13", "]", ",", "though", "these", "effects", "have", "been", "suggested", "to", "occur", "through", "modulation", "of", "the", "epigenetic", "regulatory", "functions", "of", "these", "proteins", "[", "66", "]", ".", "Other", "reports", "have", "indicated", "that", "P-TEFb", "mediated", "release", "of", "paused", "RNA", "Pol", "II", "can", "result", "in", "enhanced", "transcriptional", "initiation", "and", "even", "RNA", "Pol", "II", "recruitment", "simply", "by", "increasing", "the", "number", "of", "transcribing", "polymerases", "[", "67", "]", ".", "Still", ",", "this", "connection", "between", "transcriptional", "elongation", "and", "initiation", "has", "yet", "to", "be", "fully", "understood", "in", "the", "context", "of", "HIV-1", "transcription.", "While", "KL-2", "was", "sufficient", "to", "boost", "viral", "replication", "in", "activated", ",", "primary", "CD4+", "T", "cells", ",", "in", "and", "of", "itself", "it", "displayed", "minimal", "reactivation", "potential", "in", "both", "cell", "line", "models", "of", "latency", "and", "in", "PBMCs", "from", "PLWH", "on", "suppressive", "ART.", "This", "finding", "is", "similar", "to", "our", "recent", "report", "of", "a", "novel", "inhibitor", "of", "the", "PAF1", "complex", "(", "iPAF1C", ")", "that", "had", "minimal", "activity", "on", "its", "own", ",", "but", "greatly", "enhanced", "the", "reactivation", "potential", "of", "other", "LRAs", "[", "16", "]", ".", "Both", "cases", "highlight", "the", "multifaceted", "nature", "of", "the", "blocks", "to", "viral", "gene", "expression", "that", "underlie", "the", "latent", "state", "as", "well", "as", "the", "limitations", "to", "single", "agent", "drug", "screening", "to", "identify", "promising", ",", "next-generation", "LRAs.", "Combinatorial", "approaches", "to", "dissect", "the", "genetic", "underpinnings", "of", "HIV-1", "latency", "and", "discover", "new", ",", "synergistic", "drug", "interactions", "should", "be", "prioritized.", "While", "KL-2", "alone", "failed", "to", "significantly", "increase", "HIV-1", "gag", "transcript", "levels", "in", "patient", "PBMCs", ",", "in", "combination", "with", "AZD5582", "it", "resulted", "in", "a", "16-fold", "increase", "over", "AZD5582", "treatment", "alone", "and", "a", "53-fold", "increase", "over", "the", "DMSO", "control.", "Crosswise", "dose", "titrations", "in", "J-Lat", "5A8", "cells", "showed", "a", "strong", "synergistic", "potential", "between", "AZD5582", "and", "KL-2.", "This", "is", "consistent", "with", "reports", "of", "robust", "synergy", "between", "AZD5582", "and", "P-TEFb", "release", "through", "BET", "bromodomain", "inhibition", "[", "12", "]", ".", "Notably", ",", "the", "BET", "bromodomain", "inhibitor", "JQ1", "showed", "minimal", "reactivation", "activity", "in", "our", "patient", "PBMCs", ",", "even", "in", "the", "presence", "of", "KL-2", ",", "in", "contrast", "to", "our", "cell", "line", "data.", "This", "finding", "could", "reflect", "stochastic", "differences", "driven", "by", "variations", "in", "patient", "characteristics", ",", "integration", "site", ",", "chromatin", "state", ",", "transcription", "factor", "availability", ",", "etc.", "[", "13", "]", ".", "Future", "work", "will", "compare", "P-TEFb", "release", "from", "SECs", "to", "release", "from", "other", "cellular", "reservoirs", ",", "such", "as", "BRD4", "or", "the", "7SK", "RNP.", "Recent", "studies", "have", "shown", "that", "post-translational", "modifications", "of", "P-TEFb", ",", "most", "notably", "phosphorylation", "of", "CDK9", "Serine", "175", "and", "Threonine", "186", ",", "can", "drive", "inclusion", "into", "different", "complexes", "and", "may", "strongly", "influence", "bioavailability", "and", "activity", "[", "40", ",", "68–70", "]", ".", "Therefore", ",", "it", "is", "possible", "that", "disruption", "of", "complexes", "housing", "‘active’", "P-TEFb", "is", "a", "more", "direct", "route", "to", "redirecting", "P-TEFb", "activity.", "This", "is", "not", "to", "say", "that", "the", "SEC", "is", "never", "required", "for", "viral", "transcription.", "In", "latency", "model", "cell", "lines", "that", "lacked", "a", "functional", "Tat", "(", "U1", "cells", ")", "or", "TAR", "stem", "loop", "(", "ACH-2", "cells", ")", ",", "KL-2", "inhibited", "the", "reactivation", "potential", "of", "several", "LRAs", ",", "suggesting", "that", "viral", "transcription", "may", "be", "more", "dependent", "on", "the", "SEC", "when", "Tat", "is", "either", "defective", "or", "not", "expressed.", "We", "attempted", "to", "test", "this", "by", "inhibiting", "Tat", "in", "the", "J-Lat", "5A8", "model", "cell", "line", "using", "two", "previously", "described", "Tat-dependent", "transcription", "inhibitors", ",", "Triptolide", "and", "Spironolactone.", "While", "both", "compounds", "reduced", "LRA", "efficacy", ",", "KL-2", "still", "boosted", "the", "activity", "of", "JQ1", "and", "PMA", ",", "but", "not", "AZD5582.", "This", "suggests", "that", "P-TEFb", "can", "be", "recruited", "to", "proviral", "integration", "sites", "in", "a", "Tat", "and", "SEC-independent", "manner", "upon", "PMA", "or", "JQ1", "treatment", ",", "potentially", "through", "a", "transcription", "factor", "such", "as", "NF-kB.", "The", "inability", "of", "AZD5582", "to", "do", "so", "suggests", "that", "non-canonical", "NF-kB", "activation", "does", "not", "recruit", "the", "same", "milieu", "of", "transcription", "factors", ",", "making", "it", "uniquely", "Tat", "or", "SEC", "dependent.", "This", "is", "consistent", "with", "the", "complete", "lack", "of", "activity", "of", "AZD5582", "in", "cell", "line", "models", "lacking", "functional", "Tat", "/", "TAR", "activity", "and", "may", "underlie", "the", "remarkable", "synergy", "between", "non-canonical", "NF-kB", "agonists", "and", "agents", "that", "release", "P-TEFb", "[", "12", "]", ".", "Additionally", ",", "triptolide", "has", "been", "characterized", "outside", "of", "HIV-1", "transcription", "in", "its", "ability", "to", "prevent", "RNA", "Pol", "II", "reinitiation", "following", "pausing", "through", "inhibition", "of", "xeoderma", "pigmentosum", "group", "B-complementing", "protein", "(", "XPB", ")", "and", "is", "often", "used", "as", "a", "tool", "compound", "for", "measuring", "the", "fate", "of", "paused", "RNA", "Pol", "II", "at", "different", "time", "points", "[", "51,71", "]", ".", "With", "this", "in", "mind", ",", "it", "is", "possible", "that", "compounds", "JQ1", "and", "PMA", "result", "in", "de", "novo", "recruitment", "of", "RNA", "Pol", "II", "thereby", "increasing", "transcriptional", "initiation", "whereas", "AZD5582", "may", "be", "more", "reliant", "on", "RNA", "Pol", "II", "pause-release.", "To", "further", "explore", "the", "Tat", "dependency", "of", "KL-2", ",", "we", "tried", "to", "rescue", "Tat", "function", "in", "the", "U1", "cell", "line", "using", "a", "Dox-inducible", "system.", "We", "hypothesized", "that", "by", "providing", "Tat", ",", "the", "SEC", "would", "no", "longer", "be", "required", "for", "viral", "gene", "expression", "such", "that", "SEC", "disruption", "by", "KL-2", "would", "enhance", "reactivation", "as", "seen", "in", "the", "J-Lat", "models.", "While", "Tat", "induction", "itself", "was", "sufficient", "for", "reactivation", ",", "this", "reactivation", "was", "completely", "abolished", "by", "the", "addition", "of", "KL-2.", "Even", "when", "Tat", "was", "minimally", "induced", "and", "other", "LRAs", "were", "added", ",", "KL-2", "still", "inhibited", "reactivation", ",", "suggesting", "that", "additional", "factors—such", "as", "steady-state", "levels", "of", "P-TEFb", ",", "integration", "site", ",", "epigenetic", "factors", ",", "or", "transcription", "factor", "availability—may", "drive", "SEC", "dependency", "besides", "just", "the", "presence", "or", "absence", "of", "Tat.", "Indeed", ",", "SEC", "disruption", "by", "KL-2", "in", "the", "original", "report", "of", "the", "inhibitor", "demonstrated", "an", "outsized", "impact", "on", "Myc-dependent", "transcription", "[", "32", "]", ",", "suggesting", "that", "additional", "factors", "driving", "the", "SEC", "dependency", "of", "proviral", "transcription", "have", "yet", "to", "be", "described.", "Regardless", ",", "the", "dual-acting", "nature", "of", "KL-2", "in", "enhancing", "latency", "reactivation", "in", "some", "circumstances", "(", "i.e.", ",", "if", "Tat", "is", "present", ")", "and", "inhibiting", "latency", "reactivation", "in", "others", "(", "i.e.", ",", "when", "the", "cell", "state", "dictates", "SEC", "dependency", ")", "presents", "a", "unique", "opportunity", "to", "leverage", "the", "heterogenous", "nature", "of", "the", "latent", "reservoir", "to", "both", "reverse", "and", "promote", "latency.", "Taken", "together", ",", "our", "results", "indicate", "that", "release", "of", "P-TEFb", "from", "cellular", "SECs", "is", "a", "novel", "mechanism", "for", "promoting", "HIV-1", "viral", "transcription", "during", "both", "active", "and", "latent", "infection.", "We", "demonstrated", "the", "enhancement", "of", "latency", "reversal", "in", "multiple", "latent", "cell", "line", "models", "and", "in", "primary", "PBMCs", "from", "PLWH", "on", "suppressive", "ART.", "This", "work", "demonstrates", "the", "importance", "of", "increasing", "the", "production", "or", "availability", "of", "free", "P-TEFb", "for", "recruitment", "to", "viral", "loci", "as", "a", "powerful", "strategy", "for", "bolstering", "current", "LRAs", ",", "most", "notably", "non-canonical", "NF-kB", "agonists.", "Due", "to", "the", "heterogeneity", "of", "blocks", "to", "viral", "replication", "in", "the", "latent", "reservoir", ",", "it", "is", "likely", "that", "combinatorial", "LRA", "treatments", "will", "be", "the", "best", "strategy", "for", "potent", "latency", "reversal", "moving", "forward.", "Further", "efforts", "are", "needed", "to", "understand", "the", "intracellular", "distribution", "of", "active", "P-TEFb", "to", "characterize", "the", "most", "critical", "reservoir", "to", "target", "to", "enhance", "transcription.", "Additionally", ",", "our", "work", "demonstrates", "that", "disruption", "of", "SECs", "could", "enhance", "latency", "reversal", "or", "promote", "the", "maintenance", "of", "latency", "depending", "on", "the", "cellular", "context.", "Understanding", "the", "mechanism", "that", "controls", "this", "molecular", "switch", "would", "aid", "in", "understanding", "whether", "SEC", "disruptors", "could", "be", "a", "viable", "dual-acting", "molecule", "to", "aid", "in", "finding", "a", "functional", "cure", "for", "HIV-1", "infection.", "Methods", "Flow", "cytometry", "and", "analysis", "of", "viability", "/", "infection", "/", "reactivation", "data", "Flow", "cytometry", "analysis", "was", "performed", "on", "an", "Attune", "NxT", "acoustic", "focusing", "cytometer", "(", "Thermo", "Fisher", "Scientific", ")", ",", "recording", "all", "events", "in", "a", "40-μL", "sample", "volume", "after", "one", "150", "μL", "of", "mixing", "cycle.", "Data", "were", "exported", "as", "FCS3.0", "files", "using", "Attune", "NxT", "Software", "v3.2.0", "and", "analyzed", "with", "a", "consistent", "template", "on", "FlowJo.", "Briefly", ",", "cells", "were", "gated", "for", "lymphocytes", "by", "light", "scatter", "followed", "by", "doublet", "discrimination", "in", "both", "side", "and", "forward", "scatter.", "Cells", "with", "equal", "fluorescence", "in", "the", "BL-1", "(", "GFP", ")", "channel", "and", "the", "VL-2", "(", "AmCyan", ")", "channel", "were", "identified", "as", "autofluorescent", "and", "excluded", "from", "the", "analysis.", "A", "consistent", "gate", "was", "then", "used", "to", "quantify", "the", "fraction", "of", "remaining", "cells", "that", "expressed", "the", "target", "of", "interest.", "Analysis", "of", "hiv-specific", "rna", "transcripts", "Following", "cDNA", "synthesis", ",", "viral", "transcripts", "were", "assessed", "by", "qRT-PCR", "as", "described", "previously", "[", "13", "]", ".", "For", "HIV-1", "TAR", ",", "the", "following", "primers", "were", "used", ":", "PF", ":", "5′-GTCTCTCTGGTTAGACCAG-3′", ";", "PR", ":", "5′-TGGGTTCCCTAGYTAGCC-3′", ";", "and", "probe", ":", "5′-AGCCTGGGAGCTC-3′.", "HIV-1", "Long", "LTR", "levels", "were", "assessed", "using", "the", "following", "primers", ":", "PF", ":", "5′-GCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3′", ";", "PR", ":", "5′-GGGCGCCACTGCTAGAGA-3′", ";", "and", "probe", ":", "5′-CCAGAGTCACACAACAGACGGGCACA-3.", "For", "expression", "level", "normalization", ",", "β-Actin", "was", "used", "(", "Thermo", "Fisher", "Scientific", ",", "catalog", "no.", "4331182", ")", ".", "Notably", ",", "β-Actin", "is", "an", "RNA", "Pol", "II", "controlled", "gene.", "To", "ensure", "that", "β-Actin", "levels", "were", "not", "being", "altered", "by", "KL-2", "induced", "SEC", "disruption", ",", "we", "compared", "β-Actin", "expression", "to", "that", "of", "the", "18S", "ribosomal", "subunit", ",", "an", "RNA", "Pol", "I", "controlled", "gene", "(", "Thermo", "Fisher", "Scientific", ",", "catalog", "no.", "4331182", ")", ".", "No", "statistically", "significant", "changes", "were", "noted", "between", "the", "two", "housekeeping", "genes", "upon", "KL-2", "treatment", ",", "so", "β-Actin", "was", "used", "as", "the", "normalization", "gene", "for", "subsequent", "qPCR", "analyses.", "The", "reaction", "was", "performed", "using", "TaqMan", "Fast", "Advanced", "Master", "Mix", "(", "Thermo", "Fisher", "Scientific", ",", "catalog", "no.", "4444553", ")", "according", "to", "manufacturer’s", "instructions.", "Briefly", ",", "10", "μL", "of", "reaction", "was", "mixed", "using", "5", "μL", "of", "Taqman", "Master", "Mix", ",", "0.5", "μL", "of", "20x", "primer", "probe", "mix", "(", "18", "μM", "of", "primers", "and", "5", "μM", "probe", ")", ",", "2.5", "μL", "water", ",", "and", "2", "μL", "of", "template", "cDNA.", "The", "PCR", "cycles", "were", "as", "follows", ":", "50", "°C", "for", "2", "minutes", ",", "95", "°C", "for", "20", "seconds", ",", "followed", "by", "40", "cycles", "of", "95", "°C", "for", "1", "second", "and", "60", "°C", "for", "20", "seconds.", "Rna", "sequencing", "analysis", "Sequencing", "data", "was", "demultiplexed", "and", "trimmed", "using", "Trimmomatic", "v0.36", "to", "remove", "adapters", "and", "low-quality", "reads.", "Trimmed", "reads", "were", "aligned", "to", "the", "Homo", "sapiens", "reference", "genome", "GRCh38", "and", "transcripts", "quantified", "using", "the", "Hisat2-StringTie", "pipeline", "[", "76", "]", ".", "Differential", "gene", "expression", "analysis", "of", "the", "quantified", "gene", "transcripts", "was", "performed", "with", "DESeq2", "v.1.42.0", "R", "package", "using", "R", "v.4.3.2.", "After", "retaining", "genes", "with", "nonzero", "total", "read", "count", "and", "with", "more", "than", "10", "reads", "in", "total", "between", "all", "samples", ",", "we", "fitted", "a", "model", "that", "included", "all", "treatments", "to", "account", "for", "overall", "variability", "and", "identified", "differentially", "expressed", "genes", "(", "DEGs", ")", "within", "that", "model", "between", "all", "tested", "conditions", "against", "DMSO-treated", "cells", "(", "i.e.", "KL2", "vs", "DMSO", ",", "AZD5582", "vs", "DMSO", ",", "and", "AZD5582+KL2", "vs", "DMSO", ")", ".", "To", "define", "DEGs", ",", "we", "used", "as", "cut-offs", "an", "absolute", "log2", "fold", "change", ">", "1", "and", "a", "false", "discovery", "rate", "(", "FDR", ")", "compareCluster", "function.", "For", "these", "analyses", "all", "genes", "whose", "gene", "symbols", "could", "be", "mapped", "to", "ENTREZ", "Ids", "using", "the", "org.Hs.eg.db", "v.3.18.0", "Bioconductor", "annotation", "package", "were", "included.", "Statistical", "analysis", "All", "statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "GraphPad", "Prism", "version", "10.2.0", "(", "392", ")", "for", "Windows", "64-bit", ",", "GraphPad", "Software", ",", "Boston", ",", "Massachusetts", ",", "USA", "(", "www.graphpad.com", ")", ".", "Source", "paper", ":", "PMC11419360" ]
[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]
[ "2.", "results", "3.", "discussion", "Müller", "glial", "cells", "play", "fundamental", "roles", "in", "retinal", "tissue", "functions.", "Therefore", ",", "studies", "into", "their", "biology", "and", "functions", "may", "contribute", "to", "understanding", "the", "causes", "of", "retinal", "pathologies", "and", "to", "develop", "strategies", "to", "alleviate", "their", "outcomes.", "The", "aim", "of", "this", "study", "was", "to", "investigate", "the", "impact", "of", "high", "glucose", "and", "glucose", "fluctuations", "on", "critical", "cellular", "processes", ",", "such", "as", "gliosis", "and", "reprogramming", "in", "Müller", "cells.", "These", "processes", "are", "of", "pivotal", "importance", "in", "the", "onset", "and", "progression", "of", "retinal", "neurodegeneration", "and", "diabetic", "retinopathy.", "In", "the", "present", "study", ",", "we", "observed", "a", "significant", "increase", "in", "GFAP", "expression", "in", "NG", "MIO-M1", "cells", "exposed", "to", "sustained", "high-glucose", "and", "GF", "treatments", ",", "indicating", "a", "glucose", "stress-induced", "gliotic", "response.", "This", "response", "was", "associated", "with", "other", "markers", "of", "reactive", "gliosis", ",", "such", "as", "the", "morphological", "changes", "associated", "with", "the", "transition", "from", "a", "bipolar", "to", "a", "radial", "morphology", "and", "the", "overexpression", "/", "reorganization", "of", "vimentin", "intermediate", "filament.", "These", "findings", "indicate", "that", "NG", "MIO-M1", "cells", "are", "sensitive", "to", "glucose", "changes", "in", "their", "surrounding", "environment", ",", "potentially", "functioning", "as", "a", "protective", "or", "reactive", "mechanism", "in", "response", "to", "metabolic", "stress.", "The", "remarkable", "sensitivity", "to", "glucose", "stress", "and", "the", "prompt", "reactive", "gliosis", "observed", "in", "MIO-M1", "cells", "were", "found", "to", "be", "similar", "to", "those", "observed", "in", "Müller", "cells", "of", "diabetic", "subjects", "[", "8", "]", ".", "This", "finding", "confirms", "the", "suitability", "of", "MIO-M1", "cells", "as", "an", "in", "vitro", "model", "to", "study", "Müller", "cell", "response.", "In", "contrast", ",", "HG", "MIO-M1", "cells", "maintain", "a", "basal", "high", "level", "of", "both", "GFAP", "and", "Vimentin", "together", "to", "less", "organized", "intermediate", "filaments", "across", "the", "different", "glucose", "treatments", ",", "suggesting", "a", "limited", "and", "static", "response", "to", "sustained", "high-glucose", "and", "GF", "treatments.", "These", "findings", "highlight", "that", "MIO-M1", "cells", "in", "chronic", "hyperglycemic", "conditions", "may", "adapt", "or", "develop", "enhanced", "tolerance", "over", "time", "due", "to", "constant", "and", "prolonged", "exposure", "to", "high", "glucose", "levels.", "The", "adaptation", "or", "desensitization", "of", "HG", "MIO-M1", "cells", "to", "sustained", "high-glucose", "and", "GFs", "may", "indicate", "a", "saturation", "of", "the", "gliotic", "response", ",", "which", "is", "characteristic", "of", "prolonged", "hyperglycemic", "states", ",", "as", "observed", "in", "uncontrolled", "diabetes", "[", "34", "]", ".", "This", "adaptation", "or", "desensitization", "may", "result", "in", "a", "reduction", "in", "the", "cellular", "capacity", "to", "respond", "to", "additional", "metabolic", "challenges", "or", "stress.", "To", "understand", "the", "clinical", "consequences", "of", "Müller", "cell", "gliosis", "it", "is", "essential", "to", "also", "consider", "the", "reprogramming", "process", ",", "which", "may", "include", "dedifferentiation", "of", "Müller", "cells", "and", "regeneration", "of", "various", "retinal", "neurons", ",", "contributing", "to", "retinal", "tissues", "repair", "under", "certain", "conditions.", "In", "species", "such", "as", "birds", "[", "35", "]", ",", "zebrafish", "[", "36,37", "]", ",", "and", "rodents", "[", "38", "]", ",", "Müller", "glia", "contribute", "as", "the", "primary", "source", "of", "retinal", "regeneration.", "When", "the", "retina", "is", "damaged", ",", "Müller", "glia", "can", "dedifferentiate", "into", "Müller", "glia-derived", "progenitor", "cells", "(", "MGPCs", ")", ",", "acquiring", "a", "progenitor-like", "phenotype", "and", "starting", "to", "proliferate", ",", "thus", "contributing", "to", "retinal", "repair", "[", "39,40", "]", ".", "Notably", ",", "Müller", "glia", "in", "lower", "vertebrates", "exhibit", "a", "remarkable", "ability", "to", "regenerate", "retinal", "neurons", ",", "contrasting", "with", "the", "limited", "regenerative", "capacity", "seen", "in", "mammals", ",", "including", "humans", "[", "40", "]", ",", "where", "Müller", "cells", "typically", "respond", "to", "injury", "with", "reactive", "gliosis", ",", "leading", "to", "scarring", "rather", "than", "regeneration", "[", "11,20", "]", ".", "The", "SHH", "signaling", "pathway", "is", "essential", "for", "the", "proper", "development", "of", "all", "vertebrate", "retinas", "[", "41,42,43,44,45,46,47", "]", ",", "and", "several", "studies", "have", "demonstrated", "the", "involvement", "of", "SHH", "signaling", "in", "the", "proliferation", "and", "differentiation", "of", "MGPCs", ",", "contributing", "to", "retinal", "regeneration", "in", "lower", "vertebrate", "[", "18,19,31,32,34", "]", ".", "However", ",", "in", "mammals", ",", "the", "SHH", "pathway", "alone", "may", "not", "be", "sufficient", "to", "overcome", "the", "intrinsic", "limitations", "of", "Müller", "cells", "to", "regenerate", "neuronal", "cells.", "In", "our", "study", ",", "we", "observed", "an", "increase", "in", "SHH", "expression", "in", "NG", "MIO-M1cells", "exposed", "to", "sustained", "high-glucose", "and", "GF", "treatments.", "This", "suggests", "that", "these", "cells", "are", "engaging", "in", "pathways", "associated", "with", "cellular", "dedifferentiation", "and", "potential", "reprogramming", "towards", "a", "progenitor", "state.", "The", "increased", "SHH", "protein", "expression", "in", "NG", "cells", "was", "accompanied", "by", "significant", "changes", "in", "the", "intracellular", "localization", "of", "SHH", ",", "exhibiting", "a", "more", "spotted", "/", "punctate", "pattern", "in", "the", "cytoplasm", "and", "in", "close", "proximity", "to", "the", "plasma", "membrane.", "These", "findings", "suggest", "an", "enhanced", "state", "of", "cellular", "activity", "with", "increased", "synthesis", "and", "potential", "accumulation", "of", "SHH", ",", "aligning", "with", "the", "findings", "in", "lower", "vertebrates", "and", "rodents", ",", "where", "increased", "SHH", "signaling", "plays", "a", "role", "in", "Müller", "cell", "reprogramming", "and", "retinal", "regeneration", "[", "18,48,49", "]", ".", "Furthermore", ",", "significantly", "higher", "levels", "of", "SHH", "were", "observed", "in", "HG", "MIO-M1", "cells", "compared", "to", "NG", "MIO-M1", "cells.", "Conversely", ",", "HG", "MIO-M1", "cells", "exposed", "to", "GF", "treatments", "showed", "a", "decrease", "in", "SHH", "protein", "expression", "levels.", "A", "trend", "toward", "a", "decrease", "was", "also", "observed", "in", "response", "to", "sustained", "high-glucose.", "This", "finding", "is", "consistent", "with", "a", "previous", "study", "in", "which", "the", "authors", "observed", "a", "decrease", "in", "SHH", "signaling", "in", "reactive", "astrocytes", "of", "the", "cerebral", "cortex", "after", "acute", ",", "focal", "injury", ",", "particularly", "in", "cells", "proximal", "to", "the", "lesion", "site", "[", "50", "]", ".", "This", "highlights", "that", "the", "negative", "regulation", "of", "SHH", "activity", "in", "astrocytes", "is", "context-dependent", "and", "varies", "with", "the", "degree", "of", "cellular", "damage.", "In", "our", "study", ",", "the", "decreased", "SHH", "levels", "observed", "in", "HG", "MIO-M1", "cells", "exposed", "to", "GFs", "indicate", "that", "the", "severity", "of", "metabolic", "stress", "may", "influence", "SHH", "signaling", "pathways", "through", "a", "similar", "mechanism.", "These", "observations", "underscore", "the", "notion", "that", "glial", "cells", ",", "including", "Müller", "cells", "and", "astrocytes", ",", "exhibit", "differential", "SHH", "responses", "depending", "on", "the", "extent", "of", "glucose", "stress", ",", "highlighting", "the", "dynamic", "regulation", "of", "SHH", "signaling", "in", "glial", "cells.", "Although", "the", "SHH", "level", "has", "decreased", ",", "the", "cells", "that", "express", "it", "maintain", "a", "dot-like", "distribution", "of", "SHH", "inside", "the", "cells.", "Our", "findings", "suggest", "that", ",", "under", "NG", "condition", ",", "exposure", "to", "sustained", "high-glucose", "and", "GFs", "stimulates", "SHH", "expression", ",", "potentially", "promoting", "the", "dedifferentiation", "and", "reprogramming", "of", "Müller", "cells.", "However", ",", "in", "HG-adapted", "cells", ",", "additional", "metabolic", "stress", "from", "GF", "treatments", "leads", "to", "decreased", "SHH", "expression", ",", "possibly", "impairing", "regenerative", "capacity", "and", "enhancing", "gliotic", "responses.", "These", "observations", "indicate", "that", "the", "severity", "and", "fluctuation", "of", "glucose", "stress", "influence", "SHH", "signaling", "pathways", ",", "affecting", "the", "balance", "between", "neuroprotection", "and", "gliosis", "in", "the", "retina.", "A", "previous", "study", "demonstrated", "that", "high-glucose", "conditions", "have", "been", "associated", "with", "increased", "SOX2", "levels", "in", "human", "Müller", "glial", "cells", ",", "which", "may", "support", "cell", "survival", "and", "regeneration", "under", "stress", "conditions", "[", "51", "]", ".", "In", "our", "experiments", ",", "SOX2", "was", "significantly", "upregulated", "in", "HG", "MIO-M1", "cells", ",", "compared", "to", "NG", "MIO-M1", "cells.", "Furthermore", ",", "NG", "MIO-M1", "cells", "have", "the", "capacity", "to", "modulate", "this", "gene", "when", "exposed", "to", "sustained", "high-glucose", "and", "GF", "treatments", ",", "exhibiting", "a", "consistent", "upregulation", "of", "SOX2.", "These", "findings", "are", "consistent", "with", "the", "observed", "upregulation", "of", "SHH", "in", "NG", "MIO-M1", "cells", "exposed", "to", "different", "glucose", "treatments.", "Unlike", "NG", "MIO-M1cells", ",", "HG", "MIO-M1", "cells", "exposed", "to", "the", "same", "glucose", "treatments", "do", "not", "show", "variations", "in", "SOX2", "expression.", "This", "different", "behavior", "of", "HG", "MIO-M1", "cells", ",", "with", "regards", "to", "SOX2", "and", "SHH", "expression", ",", "may", "be", "due", "to", "the", "different", "roles", "and", "regulatory", "mechanisms", "in", "the", "glial", "cells", "of", "these", "two", "genes.", "SOX2", "is", "a", "transcription", "factor", "crucial", "for", "maintaining", "stemness", "and", "promoting", "cell", "progenitor", "proliferation", ",", "and", "its", "upregulation", "could", "be", "a", "response", "to", "cellular", "stress", "in", "order", "to", "maintain", "or", "enhance", "regenerative", "capacity.", "In", "contrast", ",", "SHH", "signaling", ",", "which", "is", "involved", "in", "cell", "differentiation", "and", "tissue", "patterning", ",", "may", "be", "more", "sensitive", "to", "metabolic", "perturbations", "with", "a", "more", "dynamic", "regulation", ",", "which", "can", "lead", "to", "its", "downregulation", "under", "glucose", "fluctuations", "treatments.", "However", ",", "despite", "the", "observed", "upregulation", "of", "SHH", "and", "SOX2", "in", "NG", "MIO-M1", "cells", ",", "the", "expression", "of", "rhodopsin", ",", "a", "marker", "of", "mature", "neuronal", "cells", ",", "was", "not", "detected.", "This", "indicates", "that", ",", "although", "the", "cells", "possess", "the", "potential", "to", "differentiate", "into", "neuronal", "cells", ",", "the", "conditions", "employed", "in", "our", "protocol", "were", "not", "sufficient", "to", "fully", "induce", "this", "differentiation.", "The", "lack", "of", "mature", "neuronal", "marker", "expression", "is", "likely", "due", "to", "the", "timing", "and", "duration", "of", "the", "experimental", "conditions.", "It", "may", "therefore", "be", "worthwhile", "to", "optimize", "the", "protocol", "in", "order", "to", "more", "accurately", "reflect", "the", "diabetic", "conditions", "in", "humans", ",", "with", "a", "view", "to", "promoting", "full", "neuronal", "differentiation.", "Given", "the", "role", "of", "SHH", "in", "Müller", "cells", "reprogramming", "and", "the", "observed", "upregulation", "under", "sustained", "high-glucose", "and", "GF", "treatments", ",", "future", "experiments", "could", "investigate", "the", "effect", "of", "exogenous", "SHH", "treatment", "on", "human", "Müller", "cells.", "This", "approach", "would", "provide", "insights", "into", "the", "therapeutic", "potential", "of", "modulating", "SHH", "signaling", "to", "mitigate", "the", "adverse", "effects", "of", "reactive", "gliosis", "and", "enhance", "regenerative", "processes", "in", "the", "diabetic", "retina.", "Although", "the", "current", "study", "provides", "important", "insights", "into", "the", "gliotic", "and", "reprogramming", "potential", "of", "Müller", "cells", "under", "different", "glucose", "treatments", ",", "some", "limitations", "should", "be", "considered.", "The", "study", "employed", "the", "MIO-M1", "cell", "line", ",", "which", ",", "although", "well", "established", "in", "human", "retinal", "research", ",", "may", "not", "fully", "capture", "the", "physiological", "complexity", "of", "Müller", "cells", "found", "in", "human", "retina.", "Future", "research", "could", "benefit", "from", "using", "primary", "Müller", "cells", "to", "better", "reflect", "the", "in", "vivo", "context", "of", "human", "diabetic", "retinopathy.", "In", "addition", ",", "the", "effects", "of", "other", "stressors", ",", "such", "as", "oxidative", "stress", "or", "hypoxia", ",", "which", "also", "play", "a", "role", "in", "diabetic", "retinal", "damage", ",", "were", "not", "included", "in", "our", "model.", "Inclusion", "of", "these", "factors", "could", "provide", "a", "more", "comprehensive", "understanding", "of", "the", "cellular", "mechanisms", "involved.", "Despite", "these", "limitations", ",", "the", "current", "study", "contributes", "important", "insights", "into", "the", "gliotic", "and", "reprogramming", "potential", "of", "Müller", "cells", "under", "varying", "glucose", "conditions.", "4.", "materials", "and", "methods", "4.5.", "statistical", "analysis", "All", "the", "results", "are", "expressed", "as", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "standard", "error", "of", "the", "mean", ")", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments.", "Statistically", "significant", "differences", "were", "assessed", "using", "Prism", "6.05", "(", "GraphPad", "PRISM", "Software", ",", "Inc.", ",", "La", "Jolla", ",", "CA", ",", "USA", ")", "with", "Student’s", "t-test", "for", "statistical", "comparison", "between", "groups.", "Differences", "between", "means", "were", "considered", "statistically", "significant", "when", "p-values", "were", "at", "least", "***5.", "Conclusions***", "The", "results", "showed", "that", "MIO-M1", "Müller", "cells", "exhibit", "distinct", "responses", "to", "different", "glucose", "treatments", ",", "which", "are", "strongly", "dependent", "on", "their", "metabolic", "environment.", "This", "differential", "response", "could", "have", "implications", "for", "the", "onset", "and", "progression", "of", "diabetic", "retinopathy.", "The", "increased", "levels", "of", "activation", "and", "dedifferentiation", "markers", "observed", "in", "NG", "MIO-M1", "cells", "in", "response", "to", "different", "glucose", "treatments", "suggest", "a", "protective", "response", "that", "may", "occur", "in", "early", "or", "well-controlled", "diabetes.", "In", "contrast", ",", "the", "lack", "of", "response", "observed", "in", "HG", "MIO-M1", "cells", "exposed", "to", "different", "glucose", "treatments", "may", "reflect", "an", "exhausted", "gliotic", "and", "reprogramming", "capacity", ",", "which", "could", "contribute", "to", "the", "development", "and", "progression", "of", "diabetic", "complications", "such", "as", "retinal", "neurodegeneration", "and", "diabetic", "retinopathy", "observed", "in", "uncontrolled", "diabetic", "patients", "exposed", "to", "prolonged", "metabolic", "glucose", "stress.", "Although", "our", "results", "provide", "valuable", "insights", ",", "further", "in-depth", "studies", "are", "needed", "to", "elucidate", "the", "mechanisms", "involved", "and", "to", "explore", "the", "potential", "therapeutic", "implications", "for", "mitigating", "retinal", "neurodegeneration", "associated", "with", "diabetes.", "Extending", "these", "studies", "to", "primary", "Müller", "cells", "in", "future", "research", "would", "provide", "a", "more", "physiologically", "relevant", "system", ",", "helping", "to", "validate", "and", "refine", "our", "findings.", "This", "approach", "would", "provide", "a", "deeper", "understanding", "of", "the", "cellular", "response", "to", "sustained", "high-glucose", "and", "glucose", "fluctuations", "and", "could", "improve", "the", "development", "of", "targeted", "therapeutic", "strategies", "for", "retinal", "pathologies", "in", "human", "patients.", "Source", "paper", ":", "PMC11641291" ]
[ "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]
[ "Introduction", "Antiretroviral", "therapy", "(", "ART", ")", "has", "been", "highly", "effective", "at", "suppressing", "human", "immunodeficiency", "virus", "(", "HIV", ")", "replication", ",", "thus", "significantly", "reducing", "disease", "progression", "and", "mortality", "in", "infected", "individuals.", "However", ",", "ART", "is", "not", "curative", "and", "does", "not", "meaningfully", "impact", "persistent", "viral", "reservoirs", "(", "VRs", ")", "of", "latently", "infected", "cells", "that", "comprise", "CD4+", "T", "cells", "and", "myeloid", "cells.1,2,3", "Indeed", ",", "upon", "antiviral", "treatment", "interruption", "(", "ATI", ")", ",", "the", "virus", "quickly", "rebounds", "after", "several", "weeks", ",", "highlighting", "how", "the", "presence", "of", "VRs", "obviates", "an", "HIV", "cure.4,5,6", "Therefore", ",", "eliminating", "or", "controlling", "VRs", "remains", "an", "unwavering", "priority", "for", "HIV", "cure", "research.", "In", "this", "context", ",", "the", "aim", "of", "the", "“shock-and-kill”", "strategy", "is", "to", "reactivate", "latently", "infected", "cells", "with", "latency", "reversal", "agents", "(", "LRAs", ")", "and", "render", "them", "vulnerable", "to", "cell", "death", "or", "clearance", "by", "the", "immune", "system.7,8", "Previously", "reported", "approaches", "to", "HIV", "reactivation", ",", "including", "protein", "kinase", "C", "(", "PRKC", ")", "agonists", ",", "histone", "deacetylase", "(", "HDAC", ")", "inhibitors", "(", "HDACi", ")", ",", "and", "toll-like", "receptor", "(", "TLR", ")", "agonists,9", "have", "been", "highly", "effective", "in", "in", "vitro", "models", "of", "latency", ",", "but", "their", "efficacy", "is", "only", "moderate", "when", "tested", "in", "vivo.10,11,12,13", "Moreover", ",", "by", "broadly", "activating", "cellular", "pathways", ",", "these", "compounds", "elicit", "significant", "proinflammatory", "effects", "or", "alter", "the", "function", "and", "fate", "of", "specific", "immune", "effector", "cells,14,15", "hence", "limiting", "their", "use", "in", "clinical", "settings.16,17,18,19", "Similarly", ",", "promising", "candidates", "such", "as", "bryostatin-1", "and", "analogs", ",", "phorbol", "esters", ",", "and", "phosphatidylethanolamine", "binding", "protein", "1", "(", "PEBP1", ")", "agonists", "reactivate", "HIV", "via", "activation", "of", "the", "canonical", "nuclear", "factor", "kappa", "B", "(", "NFKB", ")", "pathway,13,20", "inadvertently", "leading", "to", "uncontrolled", "cytokine", "release", "and", "overt", "T", "cell", "activation.21,22", "Consequently", ",", "there", "is", "a", "need", "to", "develop", "alternative", "approach", "(", "es", ")", "that", "can", "reactivate", "latent", "reservoirs", "and", "eliminate", "infected", "cells", "without", "triggering", "systemic", "activation", ",", "inflammation", ",", "or", "impairment", "of", "immune", "clearance", "mechanisms.", "In", "this", "regard", ",", "small", "molecules", "known", "as", "mimetics", "of", "the", "second", "mitochondrial", "activator", "of", "caspases", "(", "SMAC", "mimetics", "[", "SMs", "]", ")", "were", "originally", "developed", "as", "cancer", "therapeutics.", "They", "have", "received", "increasing", "recognition", "because", "they", "specifically", "activate", "the", "non-canonical", "NFKB", "pathway,23,24,25", "which", "naturally", "exhibits", "higher", "functional", "selectivity", "and", "more", "confined", "proinflammatory", "effects", "compared", "to", "the", "canonical", "NFKB", "pathway.24,26", "Engagement", "of", "the", "non-canonical", "NFKB", "pathway", "by", "SMAC", "leads", "to", "degradation", "of", "cellular", "inhibitor", "of", "apoptosis", "(", "cIAP", ")", ",", "accumulation", "of", "NFKB-inducing", "kinase", "(", "NIK", ")", ",", "and", "activation", "of", "component", "of", "inhibitor", "of", "NFKB", "kinase", "complex", "(", "CHUK", ")", "homodimer", ",", "culminating", "in", "cleavage", "of", "inactive", "NFKB2", "p100", "to", "active", "p52.26", "An", "association", "between", "RELB", "and", "p52", "induces", "expression", "of", "target", "genes27", "and", ",", "in", "the", "context", "of", "HIV", ",", "the", "pathway", "reactivates", "latently", "infected", "VRs.20", "The", "non-canonical", "NFKB", "pathway", "can", "also", "be", "triggered", "by", "signaling", "intermediates", "of", "the", "apoptosis", "cascade.", "In", "fact", ",", "cleavage", "of", "SMAC", "/", "DIABLO", "exposes", "the", "N-terminal", "motif", "Ala-Val-Pro-Ile", ",", "which", "binds", "specifically", "to", "baculovirus", "intermediate", "repeat", "domains", "2", "and", "3", "of", "IAP", "proteins.", "These", "proteins", "in", "turn", "trigger", "downstream", "events", "that", "ultimately", "lead", "to", "degradation", "of", "baculoviral", "IAP", "repeat", "containing", "2", "(", "BIRC2", ",", "also", "known", "as", "cIAP1", ")", "and", "baculoviral", "IAP", "repeat", "containing", "3", "(", "BIRC3", ",", "also", "known", "as", "cIAP2", ")", "28", "and", "potentiation", "of", "apoptosis.29", "The", "unique", "ability", "of", "SMAC", "to", "degrade", "IAPs", "and", "activate", "apoptosis", "pathway", "(", "s", ")", "makes", "SMs", "interesting", "candidates", "in", "the", "field", "of", "HIV", "cure", "research30,31", "because", "latently", "infected", "CD4+", "T", "cells", "display", "aberrant", "expression", "of", "cell", "survival", "factors", ",", "including", "XIAP", ",", "BIRC2", "and", "BCL2.8,32", "Pharmacological", "activation", "of", "the", "non-canonical", "NFKB", "pathway", "by", "SMs", "was", "recently", "found", "to", "induce", "on-ART", "plasma", "viremia", "in", "animal", "models", "of", "HIV", "latency,24,25", "underscoring", "the", "potential", "of", "this", "class", "of", "molecules", "as", "LRAs.", "However", ",", "it", "remains", "unclear", "whether", "induction", "of", "HIV", "expression", "by", "SMs", "leads", "to", "a", "reduction", "of", "VRs", "in", "lymphoid", "and", "non-lymphoid", "tissues", "of", "animal", "models.", "In", "this", "study", ",", "we", "show", "that", "bivalent", "APG-1387", ",", "currently", "in", "clinical", "development", "in", "the", "oncology", "field", ",", "activates", "the", "non-canonical", "NFKB", "pathway", "and", "hence", ",", "is", "a", "potent", "LRA.", "By", "degrading", "IAPs", ",", "this", "compound", "also", "induces", "the", "expression", "of", "active", "caspase", "3", "(", "CASP3", ")", ",", "a", "key", "component", "of", "the", "execution", "phase", "of", "apoptosis", ",", "in", "latently", "infected", "cells.", "Likewise", ",", "in", "primary", "CD4+", "T", "cells", "infected", "with", "a", "dual", "reporter-encoded", "HIV", ",", "APG-1387", "reduces", "the", "level", "of", "latent", "cells", "without", "notably", "affecting", "the", "productively", "infected", "pool.", "Accordingly", ",", "in", "vivo", "treatment", "with", "APG-1387", "could", "reactivate", "expression", "of", "latent", "viruses", "and", "was", "found", "to", "meaningfully", "reduce", "the", "integrated", "HIV-DNA", "level", "in", "tissues", "of", "ART-suppressed", "humanized", "bone", "marrow", "liver", "thymus", "(", "BLT", ")", "mice", ",", "without", "assessable", "immunotoxicity.", "Upon", "ART", "interruption", ",", "APG-1387-treated", "mice", "rebounded", "more", "slowly", "and", "to", "a", "lower", "set", "point.", "Overall", ",", "the", "study", "demonstrates", "that", "APG-1387", "has", "the", "capacity", "to", "not", "only", "reverse", "HIV", "latency", "but", "also", "potentiate", "cell", "apoptosis", ",", "thus", "supporting", "the", "notion", "that", "bivalent", "SMs", "could", "be", "harnessed", "to", "reduce", "VRs", "without", "causing", "generalized", "T", "cell", "activation.", "Results", "Discussion", "Several", "LRAs", "have", "shown", "their", "biological", "activity", "both", "in", "vitro", "and", "in", "vivo", "but", "are", "clinically", "unsafe", "for", "further", "evaluations.46,47", "The", "most", "potent", "LRAs", ",", "including", "HDACi", "and", "protein", "kinase", "C", "(", "PRKC", ")", "agonist", "bryostatin-1", ",", "activate", "the", "canonical", "NFKB", "pathway,46", "causing", "explicit", "T", "cell", "activation", "and", "broad", "cytotoxicity", ",", "and", "hence", "eliciting", "significant", "collateral", "damage", "on", "host", "cells.", "Reactivation", "of", "latent", "HIV", "by", "PRKC", "agonists", "has", "recently", "been", "demonstrated", "to", "induce", "resistance", "to", "apoptosis", ",", "a", "phenomenon", "often", "associated", "with", "phosphorylation", "and", "activation", "of", "the", "antiapoptotic", "protein", "BCL2.48", "Thus", ",", "the", "failure", "of", "common", "LRAs", "such", "as", "PRKC", "agonists", "and", "HDACi", "to", "safely", "purge", "HIV", "and", "effectively", "reduce", "VRs", "in", "people", "living", "with", "HIV", "necessitates", "the", "development", "of", "clinical", "approaches", "to", "achieve", "an", "HIV", "cure.", "In", "this", "study", ",", "we", "demonstrate", "that", "APG-1387", ",", "a", "bivalent", "SM", "initially", "developed", "as", "a", "cancer", "therapy", ",", "can", "efficiently", "reactivate", "HIV", "in", "CD4+", "T", "cell", "line", "models", "of", "HIV-1", "latency", "via", "a", "process", "that", "involves", "activation", "of", "the", "noncanonical", "NFKB", "pathway.", "Although", "this", "IAP", "antagonist", "modestly", "increases", "HIV", "RNA", "detection", "in", "virally", "suppressed", "hu-mice", ",", "it", "has", "the", "capability", "to", "reduce", "both", "the", "frequency", "of", "latently", "infected", "cells", "and", "the", "level", "of", "viral", "rebound", "upon", "ART", "treatment", "interruption.", "Indeed", ",", "APG-1387", "treatment", "enhances", "the", "expression", "of", "caspase-3", ",", "a", "marker", "of", "apoptosis", ",", "in", "latently", "infected", "cells", "from", "T", "cell", "lines", "or", "in", "T", "cells", "from", "certain", "tissues", "of", "virally", "suppressed", "hu-mice.", "In", "the", "context", "of", "productive", "infection", ",", "in", "vitro", "stimulation", "with", "APG-1387", "also", "enhanced", "cleavage", "of", "CASP3.", "IAPs", "are", "overly", "expressed", "in", "various", "cancers", ",", "enabling", "prolonged", "survival", "of", "cancerous", "cells", "[", "as", "reviewed", "by49", "]", ".", "Consequently", ",", "their", "antagonists", "are", "thought", "to", "either", "directly", "induce", "or", "sensitize", "cancerous", "cells", "to", "death", "by", "triggering", "proapoptotic", "pathways.50,51", "Interestingly", ",", "IAPs", "such", "as", "BIRC2", "have", "recently", "been", "shown", "to", "be", "negative", "regulators", "of", "HIV", "transcription", ",", "and", "their", "expression", "is", "found", "to", "be", "correlated", "with", "viral", "latency.23,31,32", "Indeed", ",", "both", "BIRC2", "/", "3", "and", "XIAP", "are", "overexpressed", "in", "HIV", "latently", "infected", "CD4+", "T", "and", "myeloid", "cells", ",", "and", "the", "SMs", "which", "induce", "the", "degradation", "of", "these", "IAPs", "can", "reactivate", "HIV.", "We", "demonstrate", "herein", "that", "various", "monovalent", "and", "bivalent", "SMs", "can", "induce", "efficient", "viral", "reactivation", "in", "different", "T", "cell", "models", "of", "latency", "and", "that", "some", "are", "more", "potent", "than", "others.", "Bivalent", "SMs", "are", "more", "effective", "than", "their", "monovalent", "counterparts", ",", "probably", "because", "of", "the", "presence", "of", "dimers", "that", "may", "contribute", "to", "a", "more", "stable", "and", "enhanced", "activation", "via", "interactions", "with", "the", "two", "adjacent", "binding", "domains", "of", "IAPs.52", "Among", "the", "bivalent", "SMs", "we", "examined", ",", "APG-1387", "is", "most", "effective", "at", "degrading", "IAPs", ",", "facilitating", "a", "conversion", "of", "NFKB", "p100", "to", "p52", ",", "and", "reactivating", "HIV", "expression", "through", "an", "NIK-dependent", "process", ",", "a", "hallmark", "of", "an", "activated", "non-canonical", "NFKB", "pathway.23,24", "In", "CD4+", "T", "cell", "models", "of", "HIV", "latency", ",", "APG-1387", "treatment", "is", "associated", "with", "remarkable", "viral", "reactivation.", "However", ",", "in", "primary", "CD4+", "T", "cells", "infected", "with", "HI.fate.E", "dual", "reporter", "virus", ",", "exposure", "to", "APG-1387", "is", "accompanied", "by", "a", "reduction", "in", "the", "frequency", "of", "latently", "infected", "cells", "(", "Figure", "2", ")", "without", "a", "detectable", "change", "in", "the", "level", "of", "cells", "supporting", "LTR-directed", "transcription.", "The", "data", "suggest", "that", "the", "latent", "cells", "might", "be", "preferentially", "targeted", "for", "elimination", "without", "reactivation", "in", "contrast", "to", "PMA", "and", "ionomycin", "stimulation.", "This", "said", ",", "given", "the", "intrinsic", "properties", "of", "SMs", ",", "we", "can", "not", "completely", "exclude", "the", "possibility", "that", "there", "was", "no", "change", "in", "the", "frequency", "of", "reactivated", "cells", "because", "latently", "infected", "cells", "rapidly", "die", "after", "reactivation.", "Consistent", "with", "previous", "works", "with", "other", "SMs", "including", "AZD5582", "24", "and", "ciapavir,25", "APG-1387", "induces", "detection", "of", "viremia", ",", "albeit", "modestly", ",", "in", "ART-suppressed", "hu-mice", "as", "early", "as", "48", "h", "after", "treatment.", "Importantly", ",", "in", "mice", "treated", "with", "multiple", "doses", "of", "APG-1387", ",", "the", "proportion", "of", "cells", "carrying", "the", "integrated", "HIV", "DNA", "was", "meaningfully", "reduced", ",", "suggesting", "that", "the", "bivalent", "APG-1387", "might", "preferentially", "target", "latently", "infected", "cells", "directly", "or", "indirectly", "for", "death", "(", "Figure", "4", ")", ".", "In", "addition", ",", "in", "APG-1387-treated", "mice", "the", "fact", "that", "the", "viral", "rebound", "was", "consistently", "lower", "throughout", "the", "ATI", "and", "plateaued", "at", "a", "level", "below", "pre-ART", "further", "strengthens", "the", "notion", "that", "APG-1387", "impacts", "negatively", "the", "pool", "of", "VRs", "(", "Figure", "6", ")", ".", "It", "is", "conceivable", "that", "such", "an", "impact", "is", "significant", "considering", "the", "modest", "effect", "of", "APG-1387", "on", "latency", "reversal", "in", "this", "experimental", "condition", "and", "the", "limited", "functional", "immune", "clearance", "mechanisms", "present", "in", "hu-BLT", "mice.", "This", "said", ",", "further", "experimentation", "with", "a", "larger", "group", "of", "animals", "analyzed", "at", "endpoint", "is", "needed", "to", "confirm", "the", "modulatory", "role", "of", "APG-1387", "on", "VRs.", "A", "more", "detailed", "analysis", "gauging", "the", "effect", "of", "APG-1387", "on", "different", "CD4+", "T", "cell", "subsets", "revealed", "a", "potential", "modulation", "of", "splenic", "Th17-like", "cells", "and", "FOXP3-expressing", "CD4+", "T", "cells.", "We", "observe", "a", "trend", "toward", "a", "reduction", "in", "Th17-cell", "frequency", "in", "both", "ART-suppressed", "mice", "treated", "in", "vivo", "with", "APG-1387", "and", "in", "ART-naïve", "infected", "mice", "whose", "splenocytes", "were", "stimulated", "ex", "vivo", "with", "APG-1387", "(", "Figure", "5", ")", ".", "Since", "Th17", "cells", "have", "been", "proposed", "to", "be", "an", "important", "source", "of", "HIV", "latent", "reservoirs", "[", "reviewed", "in53", "]", ",", "a", "decrease", "in", "Th17", "cells", "might", "suggest", "a", "reduction", "in", "the", "level", "of", "integrated", "HIV", "DNA-harboring", "cells", ",", "an", "observation", "that", "was", "made", "with", "APG-1387", "treated", "mice", "(", "Figure", "4", ")", ".", "Regarding", "FOXP3-expressing", "CD4+", "T", "cells", "in", "the", "spleen", ",", "there", "was", "no", "significant", "difference", "between", "ART-suppressed", "mice", "treated", "with", "APG-1387", "or", "with", "the", "vehicle", "control.", "However", ",", "ex", "vivo", "stimulation", "of", "splenocytes", "from", "ART-naïve", ",", "HIV-infected", "mice", "with", "APG-1387", "modestly", "decreased", "the", "number", "of", "p24-expressing", "FOXP3+", "CD4+", "T", "cells", ",", "although", "the", "difference", "was", "not", "statistically", "significant.", "Whether", "the", "non-canonical", "NFKB", "pathway", "is", "more", "functional", "in", "certain", "memory", "CD4+", "T", "cell", "subsets", "remains", "to", "be", "fully", "elucidated.", "The", "fact", "that", "the", "central", "memory", "subset", "has", "been", "shown", "to", "require", "strong", "TCR-mediated", "signaling", "for", "maintenance", "suggests", "a", "more", "important", "role", "of", "the", "canonical", "NFKB", "pathway", "in", "this", "context", "[", "reviewed", "in26,54,55", "]", ".", "Taken", "together", ",", "these", "results", "highlight", "the", "importance", "of", "evaluating", "the", "potential", "effects", "of", "SMs", "on", "various", "immune", "subsets", "known", "to", "be", "susceptible", "to", "HIV.", "Our", "study", "shows", "that", "APG-1387", "has", "the", "capability", "to", "reactivate", "HIV", ",", "activate", "markers", "of", "apoptosis", "in", "latently", "infected", "cells", ",", "and", "reduce", "VRs", "without", "causing", "global", "T", "cell", "activation.", "However", ",", "the", "findings", "also", "underscore", "the", "need", "to", "combine", "bivalent", "SMs", "with", "other", "therapeutics", "to", "improve", "the", "reactivation", "and", "elimination", "of", "VRs.", "Indeed", ",", "recent", "findings", "have", "shown", "that", "combined", "panobinostat", "and", "pegylated", "interferon", "alpha", "2", "can", "transform", "the", "VR", "landscape", "through", "latency", "reversal", "and", "innate", "immune", "activation.56", "Star★methods", "Experimental", "model", "and", "study", "participant", "details", "Experimental", "design", "No", "randomization", "and", "/", "or", "stratification", "was", "performed.", "Hu-mice", "with", "variable", "levels", "of", "human", "CD45+", "cells", "were", "equally", "distributed", "among", "experimental", "groups.", "All", "efforts", "were", "made", "to", "have", "equal", "or", "comparable", "number", "of", "mice", "or", "samples", "(", "i.e.", ",", "number", "of", "n", ")", "per", "experimental", "group", "or", "condition.", "The", "exact", "number", "of", "n", "was", "provided", "in", "relevant", "Figure", "legends.", "Experimenters", "were", "blinded", "during", "processing", "biological", "samples", ",", "conducting", "experiments", "and", "analyzing", "samples", "in", "different", "assays.", "No", "inclusion", "or", "exclusion", "criteria", "were", "applied", "to", "the", "study.", "No", "statistical", "methods", "were", "used", "to", "pre-determine", "strategies", "for", "randomization", "and", "/", "or", "stratification", ",", "population", "size", ",", "inclusion", "and", "exclusion", "of", "any", "data", "or", "subjects", ",", "or", "whether", "the", "data", "met", "assumptions", "of", "the", "statistical", "approach.", "Pharmacological", "and", "toxicity", "analysis", "Hu-BLT", "mice", "were", "left", "untreated", "or", "treated", "via", "intraperitoneal", "route", "(", "IP", ")", "with", "either", "vehicle-", "(", "10", "%", "sterile", "Cremophor", "dissolved", "in", "5", "%", "polyethylene", "glycol-400", "and", "85", "%", "PBS", ")", "or", "20", "mg", "/", "kg", "(", "100", "APG-1387", "(", "Ascentage", "Pharma", ",", "China", ")", "every", "third", "day", "(", "maximum", "100", "μL", "injection", "volume", ")", "for", "up", "to", "4", "weeks.", "Plasma", "was", "collected", "at", "different", "intervals", "and", "white", "blood", "cells", "isolated", "by", "treating", "whole", "blood", "with", "red", "blood", "cell", "lysis", "buffer", "(", "Invitrogen", ",", "U.S.A", ")", ".", "Cells", "from", "blood", "and", "tissues", "were", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", "as", "described", "in", "Section", "‘flow", "cytometry’", "below", "for", "the", "effect", "of", "APG-1387", "on", "cell", "proliferation", "and", "activation.", "Proinflammatory", "cytokines", "were", "evaluated", "in", "plasma", "of", "healthy", "untreated", ",", "APG-1387-", "and", "vehicle-treated", "hu-BLT", "mice", "using", "Legend", "Max", "enzyme-linked", "immunosorbent", "assay", "(", "ELISA", ")", "kits", "for", "human", "TNF", "and", "IL6", "(", "both", "from", "BioLegend", ",", "U.S.A", ")", "as", "per", "the", "manufacturer’s", "protocol.", "Data", "analysis", "was", "performed", "using", "GraphPad", "Prism", "software", "(", "Version", "8.0", ")", ".", "Quantification", "and", "statistical", "analysis", "Flow", "cytometry", "data", "were", "analyzed", "using", "FlowJo", "(", "Versions", "9.9.3", "and", "10.1", ")", ".", "Quantification", "of", "Western", "blots", "was", "performed", "using", "ImageJ", "software.", "Data", "analysis", "and", "presentation", "was", "done", "using", "GraphPad", "Prism", "(", "Version", "8.0", ")", ".", "Experimenters", "were", "blinded", "during", "data", "analysis", "of", "samples.", "Descriptive", "measures", "(", "mean", ",", "median", ",", "minimum", "/", "maximum", "range", ",", "95", "%", "confidence", "intervals", ",", "and", "percent", ")", "were", "used", "to", "summarize", "the", "data", "and", "illustrate", "in", "graphical", "presentations.", "All", "statistical", "analysis", "was", "done", "using", "GraphPad", "Prism", "(", "Version", "8.0", ")", ".", "Nonparametric", "(", "unpaired", ")", "Mann-Whitney’s", "U-test", "(", "two-tailed", ")", "was", "conducted", "to", "compare", "ranks", "between", "two", "experimental", "groups", "(", "e.g.", ",", "treated", "with", "vehicle", "or", "with", "APG-1387", ")", ".", "Nonparametric", "(", "paired", ")", "Wilcoxon", "test", "was", "performed", "to", "compare", "the", "ranks", "of", "two", "matched", "samples", "(", "e.g.", ",", "before", "and", "after", "treatment", "with", "APG-1387", ")", ".", "When", "comparing", "multiple", "groups", ",", "non-parametric", "tests", "Kruskal-Wallis", "or", "Friedman", "were", "performed", "and", "followed", "by", "Dunn’s", "multiple", "comparison", "test", "(", "e.g.", ",", "vehicle-treated", "group", "compared", "to", "those", "treated", "with", "different", "concentrations", "of", "APG-1387", "or", "combined", "PMA", "and", "ionomycin", ";", "effect", "of", "APG-1387", "on", "viral", "rebound", "at", "different", "time", "points", "post", "treatment", "interruption", ")", ".", "A", "p", "value", "of", "less", "than", "0.05", "was", "considered", "statistically", "significant.", "ns", ",", "∗", ",", "∗∗", ",", "∗∗∗", ",", "signify", "not", "significant", ",", "Figure", "2", ",", "the", "exact", "p", "values", "were", "∗p", "=", "0.026", ",", "∗∗p", "=", "0.007", ",", "∗∗∗p", "=", "0.0004.", "In", "the", "two-tailed", "Mann-Whitney", "unpaired", "rank", "test", "shown", "in", "Figure", "3", ",", "the", "∗p", "value", "was", "0.0286", "while", "in", "Figure", "4", ",", "the", "p", "values", "were", "as", "follows", ":", "∗p", "=", "0.0317", "and", "∗∗p", "=", "0.0043.", "For", "Figure", "S6", ",", "the", "∗p", "value", "was", "No", "statistical", "methods", "were", "used", "to", "pre-determine", "strategies", "for", "randomization", "and", "/", "or", "stratification", ",", "population", "size", ",", "inclusion", "and", "exclusion", "of", "any", "data", "or", "subjects", ",", "or", "whether", "the", "data", "met", "assumptions", "of", "the", "statistical", "approach.", "All", "software", "used", "in", "data", "analysis", "along", "with", "statistical", "parameters", "were", "mentioned", "in", "the", "appropriate", "Figure", "legends.", "Details", "about", "the", "statistical", "tests", ",", "exact", "values", "of", "n", "and", "definitions", "of", "the", "n", "were", "as", "indicated", "in", "the", "legend", "for", "each", "relevant", "Figure.", "When", "applicable", ",", "definition", "of", "asterisks", "and", "descriptive", "measures", "were", "indicated", "in", "the", "Figure", "legends", "or", "Results.", "Drawing", "of", "the", "chemical", "structure", "of", "APG-1387", "shown", "in", "Figure", "1", "was", "done", "using", "the", "ChemDraw", "software.", "Source", "paper", ":", "PMC11699618" ]
[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "B-Tissue", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]
[ "2.", "results", "3.", "discussion", "Cell", "surface", "receptors", "and", "their", "coupled", "intracellular", "signaling", "pathways", "have", "been", "intensively", "studied", "in", "many", "physiological", "and", "pathological", "processes", "over", "five", "decades.", "Due", "to", "the", "critical", "feature", "of", "these", "receptor-mediated", "signaling", "in", "promoting", "malignant", "proliferation", ",", "invasion", ",", "and", "metastasis", ",", "designing", "/", "seeking", "small", "molecules", "and", "monoclonal", "antibodies", "that", "target", "receptors", "and", "downstream", "pathways", "has", "become", "a", "pivotal", "strategy", "in", "anti-cancer", "drug", "discovery.", "Therefore", ",", "a", "better", "understanding", "of", "the", "key", "players", "in", "the", "signaling", "pathways", "may", "offer", "opportunities", "for", "therapeutic", "intervention.", "This", "study", "reveals", "a", "positive", "feedback", "DNA-PK", "/", "MYT1L-CXCR1", "proliferative", "signaling", "loop", "that", "contributes", "to", "the", "progression", "of", "glioblastoma", "via", "the", "ERK1", "/", "2", "pathway", "and", "provides", "a", "novel", "insight", "into", "the", "role", "of", "DNA-PK", "in", "the", "MYT1L-mediated", "transactivation", "of", "CXCR1.", "MYT1L", "is", "predominantly", "expressed", "in", "human", "brains", ",", "in", "particular", "fetal", "brains", "[", "32", "]", ".", "Several", "key", "studies", "have", "demonstrated", "the", "pivotal", "role", "of", "MYT1L", "in", "the", "direct", "conversion", "of", "human", "non-neuronal", "cells", "to", "neurons", "[", "33,34,35", "]", ".", "However", ",", "the", "contributing", "role", "of", "MYT1L", "in", "carcinogenesis", "remains", "poorly", "understood.", "Our", "previous", "studies", "have", "uncovered", "that", "miR-141", "was", "down-regulated", "in", "glioblastoma", "and", "was", "able", "to", "suppress", "cell", "proliferation", "by", "directly", "targeting", "MYT1L", ",", "implicating", "an", "oncogenic", "role", "of", "MYT1L", "in", "glioblastoma.", "In", "this", "study", ",", "we", "found", "that", "in", "normal", "DNA-PK", "glioblastoma", "M059K", "cell", "lines", ",", "knockdown", "of", "MYT1L", "attenuated", "cell", "proliferation", "and", "induced", "apoptosis", "and", "S-phase", "cell", "cycle", "arrest", "(", "Figure", "1A–D", ")", ".", "In", "contrast", ",", "the", "ectopic", "expression", "of", "MYT1L", "promoted", "cell", "proliferation", ",", "inhibited", "apoptosis", ",", "and", "shortened", "the", "S", "phase", "(", "Figure", "1E", ",", "F", ",", "H", ",", "J", ")", ".", "Similar", "phenotypic", "alterations", "were", "also", "noted", "in", "HEK293", "cells", "in", "response", "to", "ectopic", "MYT1L", "(", "Figure", "1E–G", ",", "I", ")", ".", "These", "results", "indicated", "that", "in", "cooperation", "with", "DNA-PK", ",", "MYT1L", "may", "function", "as", "an", "oncogene", "in", "the", "progression", "of", "glioblastoma.", "However", ",", "in", "the", "loss-of-function", "DNA-PK", "M059J", "cell", "line", ",", "the", "knockdown", "of", "MYT1L", "promoted", "cell", "proliferation", ",", "attenuated", "apoptosis", ",", "and", "shortened", "the", "S", "phase", "(", "Figure", "2A–D", ")", ".", "Conversely", ",", "the", "enforced", "expression", "of", "MYT1L", "inhibited", "cell", "proliferation", "and", "induced", "a", "G1", "cell", "cycle", "arrest", "(", "Figure", "2E–G", ")", ",", "suggesting", "a", "tumor", "suppressor", "role", "of", "MYT1L", "in", "DNA-PK-deficient", "glioblastoma", "cells", ",", "although", "it", "suppressed", "apoptosis", "(", "Figure", "2H", ")", ".", "Mechanically", ",", "the", "sustained", "activation", "of", "the", "AKT", "pathway", "in", "both", "HEK293", "and", "M059K", "cells", "and", "the", "activation", "of", "the", "ERK1", "/", "2", "pathway", "in", "M059K", "cells", "(", "Figure", "1K", ")", "may", "contribute", "to", "cell", "proliferation", "induced", "by", "ectopic", "expression", "of", "MYT1L", ",", "which", "supports", "the", "key", "role", "of", "these", "two", "well-studied", "oncogenic", "signaling", "pathways", "in", "the", "development", "of", "human", "malignancies", "[", "36", "]", ".", "However", ",", "the", "proliferative", "inhibition", "mediated", "by", "ectopic", "expression", "of", "MYT1L", "in", "M059J", "cells", "may", "not", "be", "attributed", "to", "the", "activation", "of", "these", "two", "pathways", "(", "Figure", "2I", ")", ".", "A", "total", "of", "13", "%", "apoptotic", "cells", "were", "also", "found", "in", "the", "negative", "control", "siRNA", "group", "(", "Figure", "1C", ")", ",", "which", "may", "reflect", "the", "cytotoxic", "effect", "of", "either", "transfection", "reagent", "(", "Lipofectamine", "3000", ")", "or", "negative", "control", "siRNA.", "The", "cell", "cycle", "is", "tightly", "regulated", "by", "cyclins", ",", "CDKs", ",", "and", "CDK", "inhibitors.", "Although", "cyclin", "E1", "was", "down-regulated", "in", "HEK293", ",", "while", "it", "was", "up-regulated", "in", "M059K", "cells", "in", "response", "to", "MYT1L", "expression", "(", "Figure", "1K", ")", ",", "that", "may", "play", "a", "role", "in", "shortening", "the", "S", "phase", "(", "Figure", "1G", ",", "H", ")", "because", "of", "the", "critical", "requirement", "of", "cyclin", "E", "in", "the", "S", "phase", "progression", "[", "37,38", "]", ".", "Furthermore", ",", "p21", ",", "a", "well-known", "CDK", "inhibitor", ",", "was", "down-regulated", "in", "HEK293", "and", "M059K", "cells", "in", "response", "to", "MYT1L", "(", "Figure", "1K", ")", ",", "which", "may", "also", "contribute", "to", "shortening", "the", "S", "phase.", "Moreover", ",", "p21", "has", "been", "shown", "to", "promote", "cell", "death", "in", "cancer", "cells", "via", "the", "activation", "of", "autophagy", "[", "39,40,41", "]", ";", "the", "down-regulated", "p21", "may", "be", "a", "causal", "player", "in", "attenuating", "apoptosis", "in", "HEK293", "cells", "that", "express", "MYT1L", "(", "Figure", "1I", ",", "J", ")", ".", "Interestingly", ",", "CDK6", "was", "down-regulated", "in", "M059J", "cells", "in", "response", "to", "MYT1L", "(", "Figure", "2I", ")", ",", "which", "may", "play", "a", "role", "in", "a", "G1", "cell", "cycle", "arrest", "(", "Figure", "2G", ")", ".", "Ectopic", "MYT1L", "induced", "down-regulation", "of", "caspase", "3", "(", "Figure", "1K", ",", "Supplementary", "Figure", "S1", ")", "in", "both", "HEK293", "and", "M509K", "cells", ",", "which", "may", "play", "a", "contributing", "role", "in", "apoptotic", "inhibition", "(", "Figure", "1I", ",", "J", ")", ".", "However", ",", "this", "is", "not", "the", "case", "in", "M059J", "due", "to", "the", "absence", "of", "caspase", "3", "in", "both", "GFP-", "and", "MYT1L-M059J", "cells", "(", "Figure", "2I", ")", ".", "As", "a", "transcription", "factor", ",", "the", "transcriptional", "targets", "of", "MYT1L", ",", "unfortunately", ",", "remain", "largely", "unknown.", "Here", ",", "we", "discovered", "that", "MYT1L", "could", "directly", "regulate", "the", "transcription", "of", "CXCR1", "through", "a", "novel", "cis-acting", "element", "(", "−2114", "/", "−2103", ")", "at", "the", "CXCR1", "promoter.", "We", "noted", "that", "the", "overexpression", "of", "MYT1L", "correlated", "with", "CXCR1", "mRNA", "levels", "in", "4", "out", "of", "6", "brain", "cancer", "cell", "lines", "(", "Figure", "3A", ",", "B", ")", "and", "the", "induction", "of", "CXCR1", "in", "the", "normal", "DNA-PK", "HEK293", "and", "M059K", "cells", "in", "response", "to", "the", "ectopically", "expressed", "MYT1L", "(", "Figure", "3C", ",", "D", ")", ",", "supporting", "the", "opinion", "that", "CXCR1", "is", "a", "transcriptional", "target", "of", "MYT1L.", "Surprisingly", ",", "in", "M059J", "cells", "with", "loss", "of", "DNA-PK", "function", "(", "Supplementary", "Figure", "S4", ")", ",", "the", "enforced", "expression", "of", "MYT1L", "failed", "to", "induce", "CXCR1", "transcription", "(", "Figure", "3C", ")", ",", "although", "the", "protein", "levels", "of", "CXCR1", "were", "not", "consistent", "with", "its", "mRNA", "levels", "(", "Figure", "3C", ",", "D", ")", ".", "Taken", "together", ",", "our", "results", "demonstrate", "that", "MYT1L", "functionality", "depends", "on", "DNA-PK", "activity.", "Furthermore", ",", "the", "ectopically", "expressed", "MYT1L", "increased", "the", "luciferase", "activity", "of", "the", "wild-type", "CXCR1", "promoter", "/", "luciferase", "reporter", "in", "HEK-293", "and", "M059K", "cells", "with", "the", "normal", "expression", "of", "DNA-PK", ",", "which", "was", "abolished", "when", "the", "mutant", "construct", "was", "used", "(", "Figure", "3G", ")", ".", "However", ",", "the", "ectopic", "expression", "of", "MYT1L", "suppressed", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "DNA-PK-deficient", "M059J", "cells", "(", "Figure", "3G", ")", ".", "Moreover", ",", "the", "enforced", "expression", "of", "MYT1L", "resulted", "in", "the", "sustained", "activation", "of", "the", "AKT", "pathway", "in", "all", "three", "cell", "lines", "examined", "(", "Figure", "1K", "and", "Figure", "2I", ")", ".", "The", "ERK1", "/", "2", "pathway", "was", "activated", "in", "M059K", "and", "M059J", "cells", ",", "while", "it", "was", "inhibited", "in", "HEK293", "cells", "in", "response", "to", "MYT1L", "(", "Figure", "1K", "and", "Figure", "2I", ")", ".", "The", "activation", "of", "the", "ERK1", "/", "2", "pathway", "was", "CXCR1-dependent", ",", "whereas", "the", "AKT", "pathway", "was", "not", "(", "Figure", "4J", ")", ".", "Based", "on", "these", "findings", ",", "we", "may", "propose", "that", "under", "non-stimulated", "conditions", ",", "MYT1L", "may", "act", "as", "a", "transcriptional", "repressor", "suppressing", "CXCR1", "transcription", ";", "DNA-PK", "may", "function", "as", "a", "coactivator", ",", "and", "once", "it", "is", "phosphorylated", "by", "the", "CXCR1-dependent", "activation", "of", "the", "ERK1", "/", "2", "kinase", ",", "it", ",", "in", "turn", ",", "phosphorylates", "MYT1L", ";", "the", "phosphorylated", "MYT1L", "recruits", "histone", "acetyltransferases", "(", "HATs", ")", "and", "transcription", "factors", "(", "TFs", ")", "to", "the", "CXCR1", "promoter", "and", "promotes", "CXCR1", "transcription", "(", "Figure", "5", ")", ".", "DNA-PK", "(", "also", "known", "as", "PRKDC", "and", "p350", ")", "is", "a", "nuclear", "serine", "/", "threonine", "protein", "kinase", "complex", "that", "is", "composed", "of", "a", "catalytic", "subunit", "of", "DNA-PKcs", "and", "a", "heterodimer", "of", "Ku", "proteins", "(", "Ku70", "/", "Ku80", ")", ".", "Although", "one", "of", "the", "most", "well-defined", "functions", "of", "DNA-PK", "is", "to", "govern", "the", "repair", "of", "DNA", "double-strand", "breaks", "through", "both", "non-homologous", "end-joining", "(", "NHEJ", ")", "and", "homologous", "recombination", "(", "HR", ")", "[", "42", "]", ",", "it", "was", "originally", "identified", "as", "a", "component", "of", "the", "Sp1", "transcription", "complex", "in", "which", "it", "may", "modulate", "the", "transcriptional", "activity", "of", "the", "complex", "by", "phosphorylating", "Sp1", "[", "43", "]", ".", "For", "the", "first", "time", ",", "our", "findings", "demonstrated", "that", "DNA-PK", "may", "functionally", "modulate", "the", "transcriptional", "activity", "of", "MYT1L", "by", "phosphorylation", ",", "eventually", "leading", "to", "the", "transcriptional", "activation", "of", "CXCR1", ",", "although", "this", "requires", "further", "validation", "using", "chromatin", "immunoprecipitation", "quantitative", "PCR", "(", "ChIP-qPCR", ")", "and", "the", "electrophoretic", "mobility", "shift", "assay", "(", "EMSA", ")", "when", "a", "ChIP-grade", "antibody", "to", "the", "phosphorylated", "MYT1L", "is", "commercially", "available.", "Our", "previous", "work", "demonstrated", "that", "DNA-PK", "may", "also", "function", "as", "a", "repressor", "of", "MYT1L", ",", "resulting", "in", "the", "transcriptional", "inhibition", "of", "tumor", "suppressor", "p21", ",", "a", "transcriptional", "target", "of", "MYT1L", "[", "29", "]", ".", "Several", "publications", "support", "the", "dual", "role", "of", "DNA-PK", "in", "the", "transcriptional", "control", "of", "gene", "expression.", "DNA-PK", "inhibited", "the", "transcription", "of", "the", "xanthine", "oxidoreductase", "gene", "via", "E-box", "/", "TATA-like", "elements", "[", "44", "]", ".", "Simultaneously", ",", "Ku", "proteins", "may", "also", "act", "as", "a", "transcriptional", "recycling", "coactivator", "of", "the", "androgen", "receptor", "[", "45", "]", ".", "Chemokines", "are", "a", "superfamily", "of", "small", "(", "about", "8", "to", "14", "kDa", ")", "cytokine-like", "proteins", "that", "selectively", "regulate", "the", "recruitment", "and", "trafficking", "of", "leukocytes", "to", "inflammatory", "sites", "through", "chemoattraction", "[", "46", "]", ".", "Members", "of", "this", "family", "have", "been", "divided", "into", "four", "subfamilies", ",", "CXC", ",", "CC", ",", "C", ",", "and", "CX3C", ",", "based", "on", "the", "arrangement", "of", "the", "first", "two", "of", "the", "four", "conserved", "cysteine", "residues", "in", "the", "amino", "terminus", "of", "the", "proteins", ",", "which", "can", "bind", "CXCR", ",", "CCR", ",", "XCR1", ",", "and", "CX3CR1", ",", "respectively.", "Chemokines", "play", "a", "critical", "role", "in", "inflammatory", "reactions.", "IL-8", "is", "a", "well-characterized", "ELR+", "CXC", "chemokine", "that", "attracts", "neutrophils", "through", "binding", "CXCR1", "and", "CXCR2", "receptors", "on", "the", "cell", "surface", "[", "47", "]", ".", "It", "is", "suspected", "that", "the", "signature", "of", "chemokines", "that", "persist", "at", "inflammatory", "sites", "may", "be", "important", "in", "the", "development", "of", "chronic", "diseases", "and", "can", "contribute", "to", "the", "development", "of", "malignancies", "[", "48", "]", ".", "There", "is", "sufficient", "evidence", "to", "show", "that", "chemokines", "also", "play", "a", "significant", "role", "in", "cancer", ",", "including", "melanoma", "[", "49", "]", ",", "breast", "[", "50", "]", ",", "colon", "[", "51", "]", ",", "esophageal", "[", "52", "]", ",", "prostate", "[", "53", "]", ",", "and", "non-small", "cell", "lung", "[", "54", "]", "cancers", ",", "in", "addition", "to", "its", "role", "in", "the", "development", "of", "inflammatory", "responses.", "Here", ",", "we", "showed", "that", "IL-8", "was", "significantly", "up-regulated", "in", "HEK293", "and", "M059J", "cells", ",", "while", "it", "was", "only", "slightly", "increased", "in", "M059K", "cells", "in", "response", "to", "the", "ectopically", "expressed", "MYT1L", "(", "Figure", "4A", ")", ".", "Unlike", "IL-8", ",", "GROα", "more", "selectively", "binds", "to", "the", "CXCR2", "receptor", ",", "while", "the", "affinity", "to", "CXCR1", "is", "significantly", "lower", "[", "55", "]", ".", "Since", "the", "CXCR2", "receptor", "was", "undetectable", "in", "HEK293", "and", "M059K", "cells", "(", "Figure", "3E", ")", ",", "GROα", "in", "these", "cells", "could", "only", "function", "through", "CXCR1.", "The", "enforced", "expression", "of", "MYT1L", "caused", "an", "elevation", "of", "GROα", "in", "HEK293", "and", "M059J", "cells", "(", "Figure", "4B–E", ")", ".", "Although", "GROα", "mRNA", "was", "down-regulated", ",", "its", "protein", "level", "was", "unaffected", "in", "M059K", "cells", "in", "response", "to", "the", "ectopically", "expressed", "MYT1L", "(", "Figure", "4F", ",", "G", ")", ".", "IL-8", "and", "/", "or", "GROα", "bind", "to", "CXCR1", ",", "eventually", "promoting", "glioblastoma", "proliferation", "via", "the", "ERK1", "/", "2", "pathway", "that", "can", "be", "blocked", "by", "CXCR1", "siRNA", "(", "Figure", "4J", ",", "K", ")", ",", "suggesting", "that", "the", "activation", "of", "the", "proliferative", "ERK1", "/", "2", "pathway", "in", "glioblastoma", "is", ",", "at", "least", "in", "part", ",", "CXCR1-dependent.", "Although", "this", "is", "the", "first", "report", "regarding", "the", "critical", "role", "of", "DNA-PK", "/", "MYT1L", "in", "the", "proliferative", "IL-8", "/", "GROα-CXCR1", "signaling", "loop", "in", "glioblastoma", ",", "the", "significant", "contributing", "role", "of", "IL-8-CXCR1", "/", "2", "axes", "in", "the", "proliferation", "and", "angiogenesis", "of", "glioblastoma", "cells", "has", "been", "demonstrated", "before", "[", "28", "]", ".", "Taken", "together", ",", "we", "propose", "a", "potential", "DNA-PK", "/", "MYT1L-CXCR1", "signaling", "loop", "in", "the", "progression", "of", "glioblastoma", "(", "Figure", "5", ")", ".", "We", "speculate", "that", "the", "DNA-PK", "/", "MYT1L-CXCR1-ERK1", "/", "2", "might", "be", "up-regulated", "at", "WHO", "grade", "IV", "and", "/", "or", "recurrent", "glioblastomas", "due", "to", "chemo-", "or", "radio-resistance.", "DNA-PK", "is", "a", "key", "player", "in", "DNA", "damage", "response", "on", "double-strand", "breaks.", "Activation", "of", "DNA", "damage", "response", "facilitates", "glioma", "stem", "cells", "to", "develop", "radio-resistance", "[", "56", "]", ".", "Furthermore", ",", "DNA-PK", "is", "a", "master", "kinase", "of", "the", "proliferative", "/", "progenitor", "subtype", "of", "glioblastoma", ",", "guiding", "targeted", "cancer", "therapy", "[", "57", "]", ".", "Immunohistochemical", "staining", "has", "indicated", "the", "expression", "of", "IL-8", "in", "66.7–67.3", "%", "of", "WHO", "grade", "IV", "glioblastoma", "tissues", ",", "with", "the", "expression", "of", "its", "receptor", "CXCR1", "found", "primarily", "in", "both", "tumor-associated", "vessels", "and", "grade", "IV", "glioblastomas", "[", "28", "]", ",", "supporting", "the", "previous", "report", "showing", "a", "crucial", "role", "of", "IL-8", "/", "CXCR1", "/", "2", "signaling", "in", "glioblastoma", "stem", "cells", "[", "58", "]", ".", "Moreover", ",", "the", "IL-8", "/", "CXCR1", "/", "STAT3", "pathway", "is", "crucial", "for", "the", "maintenance", "of", "glioblastoma", "stem", "cells", "[", "59", "]", ".", "Glioblastoma", "and", "neuroblastoma", "are", "two", "common", "types", "of", "brain", "tumors", "that", "occur", "in", "different", "aged", "populations.", "Our", "previous", "studies", "indicated", "that", "MYT1L", "was", "overexpressed", "in", "glioblastoma", "cell", "lines", "and", "46.9", "%", "of", "malignant", "glioma", "tissue", "samples", "(", "n", "=", "32", ")", "[", "29", "]", ",", "functioning", "as", "an", "oncogene", "in", "glioblastoma", "cells", "with", "normal", "DNA-PK", "activity.", "To", "see", "whether", "MYT1L", "is", "also", "up-regulated", "in", "neuroblastoma", ",", "we", "compared", "its", "expression", "in", "both", "glioblastoma", "and", "neuroblastoma", "cell", "lines.", "It", "was", "found", "that", "MYT1L", "was", "overexpressed", "in", "3", "out", "of", "7", "neuroblastoma", "cell", "lines", "examined", "(", "Figure", "3A", ")", ",", "suggesting", "that", "MYT1L", "up-regulation", "may", "be", "a", "common", "event", "in", "both", "glioblastoma", "and", "neuroblastoma.", "Although", "the", "SH-SY5Y", "cell", "line", "is", "a", "subclone", "of", "the", "SK-N-SH", "cell", "line", ",", "the", "global", "gene", "expression", "microarray", "showed", "a", "profound", "differential", "expression", "of", "genes", "in", "these", "two", "cell", "lines", "[", "60", "]", ".", "However", ",", "the", "mechanism", "involved", "is", "unclear.", "In", "the", "present", "study", ",", "we", "noted", "that", "MYT1L", "was", "up-regulated", "in", "the", "SH-SY5Y", "cell", "line", "at", "both", "mRNA", "and", "protein", "levels", "(", "Figure", "3A", ",", "B", ")", ",", "while", "in", "its", "parental", "line", ",", "SK-N-SH", ",", "only", "MYT1L", "mRNA", "was", "up-regulated.", "The", "MYT1L", "protein", "was", "undetectable", ",", "which", "may", "implicate", "the", "involvement", "of", "post-transcriptional", "regulation", ",", "such", "as", "miRNA", "(", "s", ")", ",", "in", "MYT1L", "expression.", "Some", "of", "the", "molecules", "analyzed", "in", "this", "manuscript", "can", "be", "molecular", "targets", "in", "cancer", "therapy.", "The", "IL-8-CXCR1", "/", "2", "axis", "has", "been", "proposed", "as", "a", "potential", "therapeutic", "target", "for", "numerous", "cancers", "due", "to", "its", "contributing", "roles", "in", "proliferation", ",", "migration", "/", "invasion", ",", "angiogenesis", ",", "and", "tumor", "immunosuppression", "[", "61,62", "]", ".", "The", "tumor-produced", "IL-8", "is", "a", "potent", "chemoattractant", "that", "recruits", "CXCR1", "/", "2-expressing", "human", "myeloid-derived", "suppressor", "cells", "to", "tumor", "foci", ",", "playing", "a", "crucial", "role", "in", "immune", "resistance", "[", "63", "]", ".", "IL-8", "receptor", "CXCR1", "may", "be", "a", "biomarker", "for", "cancer", "stem", "cells", "[", "64", "]", ",", "including", "glioblastoma", "stem", "cells", "[", "58", "]", ".", "Targeting", "myeloid", "cell", "CXCR1", "/", "2", "enhances", "antitumor", "immunity", "in", "pancreatic", "cancer", "[", "65", "]", ".", "Neutralizing", "IL-8", "or", "inhibiting", "its", "receptor", "CXCR1", "/", "2", "potentiates", "anti-PD-1-mediated", "antitumor", "immunotherapy", "for", "glioma", "[", "66", "]", ".", "These", "findings", "highlight", "IL-8", "and", "CXCR1", "/", "2", "as", "potential", "therapeutic", "targets", "for", "cancer.", "McClelland", "and", "colleagues", "have", "summarized", "numerous", "inhibitors", "developed", "to", "target", "IL-8", "or", "its", "receptor", "CXCR1", "/", "2", "for", "the", "treatment", "of", "chronic", "obstructive", "pulmonary", "disease", "(", "COPD", ")", ",", "asthma", ",", "diabetes", ",", "pneumonia", ",", "and", "solid", "tumors", ",", "including", "prostate", "cancer", "[", "62", "]", ".", "Phase", "1", "and", "2", "clinical", "trials", "in", "prostate", "cancer", "with", "Navarixin", ",", "a", "small-molecule", "inhibitor", "of", "CXCR1", "/", "2", ",", "have", "been", "completed.", "Phase", "1", "and", "2", "clinical", "trials", "in", "prostate", "cancer", "with", "BMS-986253", ",", "a", "monoclonal", "antibody", "against", "IL-8", ",", "are", "still", "active.", "However", ",", "none", "of", "these", "inhibitors", "have", "yet", "been", "approved", "to", "treat", "cancer.", "The", "ERK1", "/", "2", "signaling", "pathway", "contributes", "to", "numerous", "biological", "and", "pathological", "processes.", "Excessive", "activation", "of", "the", "ERK1", "/", "2", "pathway", "is", "a", "hallmark", "of", "human", "malignancies", "[", "67,68,69,70,71,72,73", "]", "due", "to", "its", "crucial", "role", "in", "maintaining", "sustained", "cellular", "proliferation", ",", "resistance", "to", "cell", "death", ",", "angiogenesis", ",", "invasion", ",", "and", "metastasis.", "Many", "FDA-approved", "drugs", "target", "upstream", "regulators", "of", "the", "ERK1", "/", "2", "pathway", ",", "resulting", "in", "an", "indirect", "inhibition", "of", "ERK1", "/", "2", "kinase", "[", "74", "]", ".", "ERK1", "/", "2", "signaling", "may", "be", "reactivated", "upon", "the", "development", "of", "drug", "resistance.", "Liu", "and", "colleagues", "have", "described", "10", "small-molecule", "inhibitors", "of", "ERK1", "/", "2", "which", "were", "developed", "recently", "and", "have", "undergone", "clinical", "trials", "in", "cancer", "patients", "[", "75", "]", ".", "Some", "of", "them", "have", "shown", "promising", "results", "in", "the", "treatment", "of", "cancers.", "Surprisingly", ",", "a", "large", "body", "of", "evidence", "also", "indicates", "a", "contributing", "role", "of", "ERK1", "/", "2", "activation", "in", "cancer", "cell", "apoptosis", "primarily", "induced", "by", "chemical", "compounds", ",", "including", "glioblastoma", ",", "bladder", ",", "breast", ",", "colon", ",", "endometrial", ",", "head", "and", "neck", ",", "lung", ",", "renal", "cell", ",", "and", "testicular", "germ", "cell", "carcinomas", "[", "76,77,78,79,80,81,82,83,84,85", "]", ",", "and", "mechanically", ",", "through", "activation", "of", "caspase", "3", "and", "induction", "of", "reactive", "oxygen", "species.", "Both", "oncogene", "and", "non-oncogene", "addiction", "have", "been", "demonstrated", "as", "fantastic", "targets", "for", "cancer", "therapy", "due", "to", "their", "crucial", "role", "in", "supporting", "cancer", "progression", "[", "86", "]", ".", "Using", "a", "unique", "glioblastoma", "cell", "model", "system", ",", "M059J", "with", "deficient", "DNA-PK", ",", "while", "M059K", "with", "normal", "DNA-PK", ",", "we", "demonstrate", "in", "vitro", "that", "MYT1L-overexpressing", "cells", "show", "non-oncogene", "addiction", "to", "DNA-PK.", "Genomic", "instability", "due", "to", "defects", "in", "DNA", "repair", "genes", "is", "a", "key", "hallmark", "of", "cancer", "that", "drives", "the", "development", "of", "human", "malignancies", "[", "87", "]", ".", "However", ",", "these", "defects", "may", "also", "offer", "cancer", "cells", "opportunities", "to", "evolve", "a", "dependency", "on", "a", "non-oncogene", "addiction", "gene.", "For", "instance", ",", "BRCA2-deficient", "cancer", "cells", "are", "more", "dependent", "on", "PARP1", "to", "repair", "DNA", "for", "survival", ",", "resulting", "in", "an", "increased", "sensitivity", "to", "PARP1", "inhibitors", "[", "88", "]", ",", "which", "kill", "the", "cancer", "cells", "through", "the", "genetic", "concept", "of", "synthetic", "lethality", "[", "89", "]", ".", "Targeting", "mediators", "of", "DNA", "repair", "has", "become", "a", "state-of-the-art", "strategy", "for", "cancer", "[", "90", "]", ",", "leading", "to", "the", "development", "of", "inhibitors", "of", "key", "mediators", "of", "DNA", "repair", ",", "including", "DNA-PK.", "Interestingly", ",", "genetic", "and", "pharmacological", "targeting", "of", "a", "strong", "non-oncogene", "addiction", "to", "DNA-PKcs", "(", "DNA-dependent", "protein", "kinase", "catalytic", "subunit", ")", "leads", "to", "the", "accumulation", "of", "DNA", "double-strand", "breaks", "in", "ATM-defective", "cancer", "cells", ",", "which", "triggers", "cell", "apoptosis", "via", "the", "proapoptotic", "signaling", "pathway", "[", "91", "]", ".", "These", "results", "are", "supported", "by", "our", "findings", "showing", "the", "dependence", "of", "MYT1L-overexpressing", "glioblastoma", "cells", "on", "DNA-PK.", "VX-984", "and", "M3814", "are", "two", "selective", "DNA-PK", "inhibitors", "[", "92,93", "]", "that", "profoundly", "inhibit", "tumor", "growth", "in", "tumor", "xenograft", "models", "by", "enhancing", "radiotherapy.", "These", "two", "inhibitors", "are", "currently", "in", "ongoing", "clinical", "trials.", "The", "DNA-PK", "/", "MYT1L-CXCR1-ERK1", "/", "2", "proliferative", "signaling", "loop", "we", "proposed", "here", "was", "primarily", "based", "on", "data", "obtained", "from", "glioblastoma", "cell", "lines.", "It", "is", "interesting", "to", "look", "at", "the", "expression", "of", "DNA-PK", ",", "MYT1L", ",", "and", "CXCR1", "and", "the", "levels", "of", "phosphorylated", "ERK1", "/", "2", "in", "a", "large", "cohort", "of", "glioblastoma", "tissue", "samples", "and", "correlate", "the", "levels", "of", "these", "molecules", "to", "clinicopathological", "parameters", "of", "this", "disease.", "It", "is", "also", "interesting", "to", "look", "at", "the", "effect", "of", "MYT1L", "on", "tumor", "growth", "in", "an", "in", "vivo", "tumor", "xenograft", "animal", "model", "using", "GFP-", "/", "MYT1L-M059J", "and", "GFP-", "/", "MYT1L", "M059K", "cells", ",", "further", "confirming", "our", "in", "vitro", "findings.", "4.", "materials", "and", "methods", "4.5.", "western", "blot", "analysis", "The", "cells", "were", "rinsed", "twice", "with", "ice-cold", "PBS", "and", "scraped", "off", "the", "plate", "in", "radioimmunoprecipitation", "assay", "buffer", "(", "RIPA", ")", ".", "The", "total", "protein", "lysate", "prepared", "from", "human", "adult", "brain", "normal", "tissues", "was", "purchased", "from", "BioChain", "(", "Newark", ",", "CA", ",", "USA", ")", "and", "served", "as", "a", "normal", "control", "for", "human", "cell", "lines.", "The", "whole", "cellular", "lysates", "(", "30–100", "µg", "per", "sample", ")", "were", "electrophoresed", "via", "10", "%", "SDS-PAGE", "and", "electrophoretically", "transferred", "to", "PVDF", "membranes", "(", "Amersham", "HybondTM-P", ",", "GE", "Healthcare", ",", "Chicago", ",", "IL", ",", "USA", ")", "at", "4", "°C", "for", "1.5", "h.", "The", "blots", "were", "incubated", "for", "1", "h", "with", "5", "%", "nonfat", "dry", "milk", "to", "block", "the", "nonspecific", "binding", "sites", "and", "subsequently", "incubated", "with", "polyclonal", "/", "monoclonal", "antibodies", "specific", "to", "MYT1L", "(", "Abnova", ",", "Taipei", ",", "China", ")", "or", "AKT1", "(", "Abcam", ",", "Cambridge", ",", "GH", ",", "UK", ")", ",", "CDK2", "(", "Abcam", ",", "Cambridge", ",", "GH", ",", "UK", ")", ",", "DNA-PKcs", "(", "Abcam", ",", "Cambridge", ",", "GH", ",", "UK", ")", ",", "p21", "(", "Abcam", ",", "Cambridge", ",", "GH", ",", "UK", ")", "or", "CDK4", "(", "Cell", "Signaling", "Technology", ",", "Danvers", ",", "MA", ",", "USA", ")", ",", "CDK6", "(", "Cell", "Signaling", "Technology", ",", "Danvers", ",", "MA", ",", "USA", ")", ",", "cyclin", "A2", "(", "Cell", "Signaling", "Technology", ",", "Danvers", ",", "MA", ",", "USA", ")", ",", "cyclin", "D1", "(", "Cell", "Signaling", "Technology", ",", "Danvers", ",", "MA", ",", "USA", ")", ",", "cyclin", "E1", "(", "Cell", "Signaling", "Technology", ",", "Danvers", ",", "MA", ",", "USA", ")", ",", "ERK1", "/", "2", "(", "Cell", "Signaling", "Technology", ",", "Danvers", ",", "MA", ",", "USA", ")", ",", "p27", "(", "Cell", "Signaling", "Technology", ",", "Danvers", ",", "MA", ",", "USA", ")", ",", "pERK1", "/", "2", "(", "Cell", "Signaling", "Technology", ",", "Danvers", ",", "MA", ",", "USA", ")", "or", "BAX", "(", "Santa", "Cruz", "Biotechnology", ",", "Dallas", ",", "TX", ",", "USA", ")", ",", "BCL2", "(", "Santa", "Cruz", "Biotechnology", ",", "Dallas", ",", "TX", ",", "USA", ")", ",", "GROα", "(", "Santa", "Cruz", "Biotechnology", ",", "Dallas", ",", "TX", ",", "USA", ")", ",", "IL8RB", "(", "Santa", "Cruz", "Biotechnology", ",", "Dallas", ",", "TX", ",", "USA", ")", ",", "pAKT1", "/", "2", "/", "3", "(", "Santa", "Cruz", "Biotechnology", ",", "Dallas", ",", "TX", ",", "USA", ")", ",", "or", "CXCR1", "(", "LSBio", ",", "Lynnwood", ",", "WA", ",", "USA", ")", "at", "4", "°C", "overnight.", "Immunoreactivity", "was", "detected", "using", "a", "peroxidase-conjugated", "antibody", "and", "visualized", "using", "the", "ECL", "Plus", "Western", "Blotting", "Detection", "System", "(", "GE", "Healthcare", ",", "Chicago", ",", "IL", ",", "USA", ")", ".", "The", "blots", "were", "stripped", "before", "reprobing", "with", "an", "antibody", "against", "actin", "(", "Abcam", ",", "Cambridge", ",", "GH", ",", "UK", ")", "or", "GAPDH", "(", "Santa", "Cruz", "Biotechnology", ",", "Dallas", ",", "TX", ",", "USA", ")", ".", "4.9.", "bioinformatics", "analysis", "The", "MYT1L", "binding", "sites", "in", "the", "CXCR1", "promoter", "were", "predicted", "using", "Zinc", "Finger", "Protein-DNA", "Scoring", "Form", ",", "a", "DNA", "binding", "site", "predictor", "for", "Cys2His2", "zinc", "finger", "proteins", "(", "http", ":", "/", "/", "zf.princeton.edu", "/", "form.php", ",", "accessed", "on", "14", "March", "2025", ")", ".", "The", "Cancer", "Genome", "Atlas", "(", "TCGA", ")", "datasets", "were", "used", "to", "analyze", "a", "relationship", "between", "MYT1L", "expression", "and", "CXCR1", "expression", "in", "glioblastoma", "and", "neuroblastoma.", "4.12.", "statistical", "analysis", "The", "Student’s", "t-test", "was", "used", "to", "determine", "the", "statistical", "significance", "of", "differences", "in", "GROα", "expression", ",", "IL-8", "expression", ",", "cell", "growth", ",", "apoptosis", ",", "cell", "cycle", ",", "and", "luciferase", "activity", "between", "groups.", "Luciferase", "activity", "was", "measured", "in", "duplicate", ",", "while", "other", "experiments", "were", "performed", "in", "triplicate.", "A", "value", "of", "p", "***5.", "Conclusions***", "This", "work", ",", "for", "the", "first", "time", ",", "reveals", "that", "MYT1L", "functions", "as", "a", "transcription", "factor", "governing", "the", "expression", "of", "CXC", "chemokine", "receptor", "CXCR1.", "The", "CXCR1", "signaling", "promotes", "proliferation", ",", "inhibits", "apoptosis", ",", "and", "shortens", "the", "S", "phase", "in", "DNA-PK+", "glioblastoma", "cells", "via", "activation", "of", "the", "ERK1", "/", "2", "pathway", ",", "which", "can", "be", "blocked", "by", "CXCR1", "knockdown.", "The", "function", "of", "MYT1L", "is", "DNA-PK-dependent", ",", "highlighting", "a", "key", "role", "of", "DNA-PK", "modulating", "the", "transcriptional", "activity", "of", "MYT1L.", "Our", "findings", "have", "demonstrated", "a", "positive", "feedback", "DNA-PK", "/", "MYT1L-CXCR1-ERK1", "/", "2", "proliferative", "signaling", "loop", "in", "glioblastoma", "cells", "and", "might", "have", "significant", "therapeutic", "implications.", "In", "the", "future", ",", "our", "studies", "can", "be", "extended", "by", "analyzing", "the", "effect", "of", "CXCR1", "knockdown", "in", "M059J", "cells", "with", "impaired", "DNA-PK.", "This", "would", "allow", "us", "to", "understand", "the", "interlink", "between", "DNA-PK-MYT1L-CXCR1-pERK1", "/", "2.", "Source", "paper", ":", "PMC12072392" ]
[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]
[ "Methods", "The", "cytotoxic", "effects", "of", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "were", "evaluated", "in", "a", "dose-dependent", "manner", "using", "the", "MTT", "assay", "on", "several", "cancer", "cell", "lines", ",", "with", "particular", "emphasis", "on", "HeLa", "cells.", "Flow", "cytometry", "was", "used", "to", "assess", "cell", "cycle", "arrest", "and", "apoptosis", ",", "while", "RT-qPCR", "quantified", "changes", "in", "the", "expression", "of", "apoptotic", "markers", "(", "Bax", ",", "Bcl-2", ",", "and", "p53", ")", ".", "Chemical", "composition", "analysis", "was", "conducted", "using", "gas", "chromatography-mass", "spectrometry", "/", "flame", "ionization", "detection", "(", "GC-MS", "/", "FID", ")", "to", "identify", "the", "major", "bioactive", "compounds", "within", "the", "fraction.", "Results", "The", "DCM", "fraction", "exhibited", "dose-dependent", "cytotoxicity", "in", "HeLa", "cells", ",", "with", "an", "IC50", "value", "of", "135.6", "µg", "/", "mL", "and", "a", "selectivity", "index", "(", "SI", ")", "of", "2.72", "relative", "to", "normal", "cells.", "Flow", "cytometry", "analysis", "revealed", "G0", "/", "G1", "cell", "cycle", "arrest", ",", "significantly", "hindering", "progression", "through", "the", "S", "and", "G2", "/", "M", "phases.", "Moreover", ",", "there", "was", "a", "significant", "increase", "in", "both", "early", "and", "late", "apoptotic", "cell", "populations", ",", "correlating", "with", "the", "upregulation", "of", "pro-apoptotic", "genes", "(", "Bax", "and", "p53", ")", "and", "the", "downregulation", "of", "the", "anti-apoptotic", "gene", "Bcl-2.", "The", "chemical", "analysis", "identified", "22", "compounds", "in", "the", "unsaponifiable", "fraction", ",", "chiefly", "terpenoids", "such", "as", "phytol", "(", "65.74", "%", ")", ".", "The", "saponifiable", "fraction", "presented", "a", "balanced", "composition", "of", "saturated", "(", "48.69", "%", ")", "and", "unsaturated", "(", "51.29", "%", ")", "fatty", "acids", ",", "with", "palmitic", "acid", ",", "linolenic", "acid", ",", "and", "linoleic", "acid", "as", "the", "predominant", "compounds.", "Conclusion", "While", "the", "DCM", "fraction’s", "relatively", "high", "IC50", "value", "may", "limit", "its", "utility", "as", "a", "standalone", "treatment", ",", "its", "ability", "to", "induce", "cell", "cycle", "arrest", "and", "apoptosis", "demonstrates", "its", "promise", "as", "a", "co-therapeutic", "agent", "with", "conventional", "anticancer", "drugs.", "Further", "research", "is", "essential", "to", "elucidate", "its", "precise", "mechanisms", "of", "action", "and", "to", "evaluate", "its", "efficacy", "in", "combination", "therapies", ",", "potentially", "advancing", "its", "role", "in", "cervical", "cancer", "treatment.", "Methods", "Cell", "cycle", "analysis", "To", "assess", "the", "impact", "of", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "on", "cell", "cycle", "progression", ",", "propidium", "iodide", "(", "PI", ")", "staining", "followed", "by", "flow", "cytometry", "was", "employed", "as", "outlined", "previously", "[", "17", "]", ".", "PI", "(", "Company", ")", "is", "a", "fluorescent", "dye", "that", "binds", "to", "DNA", "allowing", "differentiation", "of", "cell", "cycle", "phases", "(", "G0", "/", "G1", ",", "S", ",", "G2", "/", "M", ")", "based", "on", "their", "DNA", "content.", "Briefly", ",", "HeLa", "cells", "(", "2", "×", "105", "cells", "/", "mL", ")", "were", "cultured", "overnight", "and", "then", "treated", "with", "the", "DCM", "fraction", "at", "its", "IC50", "concentration", "(", "135.6", "µg", "/", "mL", ")", "for", "24", "h.", "After", "treatment", ",", "cells", "were", "fixed", ",", "stained", "with", "a", "PI", "/", "RNase", "solution", ",", "and", "analyzed", "using", "a", "FACSCalibur", "Scan", "flow", "cytometer", "(", "BD", "Biosciences", ")", "to", "determine", "cell", "cycle", "distribution.", "Apoptosis", "analysis", "using", "annexin", "v-fitc", "/", "pi", "assay", "To", "determine", "the", "mode", "of", "cell", "death", "induced", "by", "A.", "incana", "DCM", "fraction", ",", "the", "Annexin", "V-FITC", "apoptosis", "detection", "kit", "(", "BioVision", "Inc.", ",", "CA", ",", "USA", ",", "K101-25", ")", "was", "used", "following", "the", "manufacturer’s", "protocol.", "This", "assay", "detects", "phosphatidylserine", "translocation", ",", "a", "hallmark", "of", "early", "apoptosis", ",", "by", "Annexin", "V-FITC", "staining.", "PI", ",", "a", "viability", "dye", "excluded", "by", "healthy", "and", "early", "apoptotic", "cells", "with", "intact", "membranes", ",", "stains", "the", "DNA", "of", "late", "apoptotic", "and", "necrotic", "cells", "with", "compromised", "membranes", ",", "allowing", "for", "their", "identification.", "Briefly", ",", "HeLa", "cells", "(", "2", "×", "105", "cells", "/", "mL", ")", "were", "cultured", "for", "24", "h", "and", "treated", "with", "the", "extract", "at", "its", "IC50", "concentration", "(", "135.6", "µg", "/", "mL", ")", "for", "an", "additional", "48", "h.", "Following", "treatment", ",", "cells", "were", "stained", "with", "Annexin", "V-FITC", "and", "PI.", "Apoptosis", "was", "quantified", "by", "flow", "cytometry", "using", "a", "BD", "FACSCalibur", "Scan", "system", "(", "BD", "Biosciences", ")", ".", "For", "accurate", "quantification", "of", "apoptotic", "populations", ",", "a", "specific", "gating", "strategy", "was", "applied.", "Cells", "were", "initially", "gated", "based", "on", "forward", "scatter", "(", "FSC", ")", "versus", "side", "scatter", "(", "SSC", ")", "to", "exclude", "debris", ",", "followed", "by", "gating", "on", "FSC-Height", "(", "FSC-H", ")", "versus", "FSC-Area", "(", "FSC-A", ")", "to", "exclude", "doublets.", "Apoptotic", "populations", "were", "classified", "by", "gating", "on", "Annexin", "V-FITC", "versus", "PI", "as", "follows", ":", "live", "cells", "(", "Q4", ")", "were", "Annexin", "V-", "/", "PI-", ",", "early", "apoptotic", "cells", "(", "Q3", ")", "were", "Annexin", "V+", "/", "PI-", ",", "late", "apoptotic", "/", "necrotic", "cells", "(", "Q2", ")", "were", "Annexin", "V+", "/", "PI+", ",", "and", "dead", "/", "necrotic", "cells", "(", "Q1", ")", "were", "Annexin", "V-", "/", "PI+.", "The", "percentage", "of", "cells", "in", "each", "quadrant", "was", "calculated", "to", "assess", "the", "extent", "of", "apoptosis", "and", "necrosis.", "Statistical", "analysis", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "SPSS", "version", "24.0.", "Differences", "between", "the", "means", "of", "two", "independent", "groups", "were", "analyzed", "using", "an", "independent", "t-test", ",", "with", "p", "***Results***", "Effect", "of", "a.", "incana", "dcm", "fraction", "on", "cell", "cycle", "analysis", "To", "investigate", "the", "effect", "of", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "on", "cell", "cycle", "progression", ",", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "the", "IC50", "concentration", "(", "135.6", "µg", "/", "mL", ")", "of", "the", "fraction", "for", "48", "h.", "Cell", "cycle", "distribution", "was", "assessed", "by", "flow", "cytometry", "using", "Propidium", "Iodide", "(", "PI", ")", "staining", ",", "which", "binds", "to", "DNA", "and", "allows", "differentiation", "of", "cell", "cycle", "phases", "(", "G0", "/", "G1", ",", "S", ",", "G2", "/", "M", ")", "based", "on", "DNA", "content.", "As", "illustrated", "in", "Fig.", "2", ",", "a", "significant", "increase", "(", "p", "A.", "incana", "exerts", "cytostatic", "effects", "on", "HeLa", "cells", "by", "inducing", "cell", "cycle", "arrest.", "Fig.", "2Flow", "cytometric", "analysis", "of", "cell", "cycle", "distribution", "in", "HeLa", "cells", "treated", "with", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction.", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "the", "IC50", "concentration", "(", "135.6", "µg", "/", "mL", ")", "of", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "for", "48", "h", ",", "and", "cell", "cycle", "phase", "distribution", "was", "analyzed", "via", "flow", "cytometry.", "Panels", ":", "(", "a", ")", "Control", "(", "untreated", ")", "HeLa", "cells", ",", "(", "b", ")", "HeLa", "cells", "treated", "with", "the", "DCM", "fraction", ",", "and", "(", "c", ")", "A", "graphical", "comparison", "of", "cell", "percentages", "across", "each", "cell", "cycle", "phase", "between", "treated", "and", "untreated", "groups", "Discussion", "This", "study", "investigated", "the", "cytotoxic", "potential", "of", "the", "DCM", "fraction", "from", "the", "leaves", "of", "the", "medicinal", "plant", "A.", "incana.", "Given", "the", "documented", "cytotoxic", "activity", "of", "the", "DCM", "extract", "from", "the", "related", "subspecies", "A.", "rugosa", "[", "8", "]", ",", "we", "hypothesized", "that", "A.", "incana", "might", "exhibit", "similar", "effects.", "Although", "previous", "studies", "confirmed", "the", "cytotoxic", "properties", "of", "its", "methanol", "extract", "[", "10", "]", ",", "the", "effects", "of", "the", "DCM", "fraction", "remain", "unexamined.", "To", "address", "this", "gap", ",", "the", "fraction’s", "cytotoxicity", "was", "evaluated", "against", "four", "human", "cancer", "cell", "lines", ":", "HepG2", ",", "HCT116", ",", "HeLa", ",", "and", "MCF-7", ",", "representing", "diverse", "cancer", "types.", "The", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "demonstrated", "IC50", "values", "ranging", "from", "135.6", "to", "273.1", "µg", "/", "mL", ",", "with", "HeLa", "cells", "(", "a", "cervical", "cancer", "model", ")", "showing", "the", "highest", "sensitivity", "(", "IC50", "=", "135.6", "µg", "/", "mL", ")", ".", "Significantly", ",", "the", "DCM", "fraction", "exhibited", "a", "selectivity", "index", "(", "SI", ")", "of", "2.72", "against", "HeLa", "cells", ",", "indicating", "preferential", "cytotoxicity", "toward", "cancer", "cells", "over", "normal", "cells", "and", "highlighting", "its", "therapeutic", "potential.", "Although", "the", "IC50", "values", "for", "A.", "incana", "were", "higher", "than", "those", "reported", "for", "the", "DCM", "extract", "of", "the", "related", "subspecies", "A.", "rugosa", "[", "8", "]", ",", "this", "difference", "may", "be", "attributed", "to", "variations", "in", "the", "concentration", "or", "composition", "of", "active", "compounds", "in", "each", "extract.", "Despite", "this", ",", "both", "species", "showed", "their", "most", "potent", "cytotoxic", "effects", "against", "HeLa", "cells", ",", "suggesting", "a", "potential", "shared", "mechanism", "targeting", "cervical", "cancer", "cells", "specifically.", "Additionally", ",", "prior", "studies", "have", "reported", "that", "the", "methanol", "extract", "of", "A.", "incana", "leaves", "has", "a", "pronounced", "effect", "on", "HeLa", "cells", "(", "IC50", "of", "68.5", "µg", "/", "mL", ")", "[", "10", "]", ".", "The", "selective", "cytotoxicity", "observed", "in", "both", "A.", "incana", "and", "A.", "rugosa", "DCM", "extracts", ",", "alongside", "the", "methanol", "extract’s", "activity", ",", "indicates", "the", "presence", "of", "bioactive", "compounds", "within", "these", "species", "that", "may", "preferentially", "disrupt", "HeLa", "cell", "function.", "This", "selective", "activity", "underscores", "the", "potential", "of", "Alnus", "species", "as", "promising", "candidates", "for", "developing", "targeted", "therapies", "against", "gynecological", "cancers", ",", "particularly", "cervical", "cancer.", "Given", "the", "substantial", "cytotoxic", "response", "observed", ",", "further", "investigation", "into", "the", "active", "compounds", "and", "mechanisms", "of", "action", "of", "the", "DCM", "fraction", "of", "A.", "incana", "leaves", "is", "warranted.", "To", "explore", "the", "mechanisms", "underlying", "this", "cytotoxicity", ",", "we", "investigated", "the", "effects", "of", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "on", "cell", "cycle", "progression", "and", "apoptosis", "in", "HeLa", "cells.", "The", "results", "revealed", "a", "significant", "accumulation", "of", "cells", "in", "the", "G0", "/", "G1", "phase", ",", "indicating", "effective", "cell", "cycle", "arrest.", "This", "is", "a", "crucial", "finding", "science", "cell", "cycle", "arrest", "at", "key", "checkpoints", "is", "a", "well-established", "therapeutic", "strategy", "for", "inhibiting", "cancer", "cell", "proliferation.", "The", "mammalian", "cell", "cycle", "comprises", "four", "distinct", "phases", ":", "G1", ",", "S", ",", "G2", ",", "and", "M", ",", "where", "RNA", "and", "protein", "synthesis", "occur", "in", "G1", "and", "G2", ",", "DNA", "replication", "in", "S", ",", "and", "chromosome", "segregation", "in", "M", "[", "18", "]", ".", "By", "halting", "cells", "in", "the", "G0", "/", "G1", "phase", ",", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "appears", "to", "block", "progression", "to", "DNA", "synthesis", ",", "which", "could", "lead", "to", "senescence", "or", "cell", "death.", "Several", "plant-derived", "anticancer", "agents", ",", "such", "as", "taxanes", "and", "vinca", "alkaloids", ",", "function", "by", "disrupting", "key", "cell", "cycle", "regulators", "[", "19", "]", ".", "In", "addition", "to", "inducing", "cell", "cycle", "arrest", ",", "the", "DCM", "fraction", "significantly", "promoted", "apoptosis", ",", "a", "fundamental", "mechanism", "in", "cancer", "treatment.", "Apoptosis", ",", "or", "programmed", "cell", "death", ",", "is", "triggered", "by", "many", "natural", "cytotoxic", "agents", ",", "both", "clinically", "approved", "and", "experimental", ",", "and", "is", "essential", "for", "eliminating", "cancer", "cells", "[", "20", "]", ".", "Flow", "cytometric", "analysis", "using", "Annexin", "V", "and", "propidium", "iodide", "staining", "revealed", "a", "marked", "increase", "in", "apoptotic", "cell", "death", "(", "40.67-fold", "increase", ",", "18.71", "%", "vs.", "0.46", "%", "in", "the", "control", ")", "induced", "by", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction.", "Early", "apoptosis", "rose", "to", "14.32", "%", "from", "0.37", "%", ",", "and", "late", "apoptosis", "increased", "to", "4.39", "%", "from", "0.09", "%", ".", "Necrosis", "also", "increased", "by", "2.5-fold", "(", "2.84", "%", "vs.", "1.15", "%", "in", "the", "control", ")", ",", "indicating", "a", "broad", "cytotoxic", "effect", "on", "HeLa", "cells.", "These", "findings", "reinforce", "the", "potential", "of", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "as", "an", "effective", "anticancer", "agent", "by", "simultaneously", "inducing", "cell", "cycle", "arrest", "and", "apoptosis.", "To", "elucidate", "the", "molecular", "mechanisms", "behind", "these", "effects", ",", "we", "evaluated", "the", "expression", "of", "apoptotic", "regulators", ",", "including", "p53", ",", "Bcl-2", ",", "and", "Bax", ",", "through", "RT-PCR.", "The", "intrinsic", "apoptotic", "pathway", "is", "regulated", "by", "the", "balance", "between", "pro-apoptotic", "Bax", "and", "anti-apoptotic", "Bcl-2", ",", "where", "Bcl-2", "stabilizes", "the", "mitochondrial", "membrane", "and", "prevents", "cytochrome", "c", "release", ",", "whereas", "Bax", "promotes", "apoptosis", "by", "facilitating", "cytochrome", "c", "release", "[", "21", "]", ".", "p53", ",", "a", "critical", "tumor", "suppressor", ",", "enhances", "Bax", "expression", ",", "thus", "its", "stimulation", "tipping", "the", "balance", "towards", "apoptosis", "[", "22", "]", ".", "In", "our", "study", ",", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "significantly", "upregulated", "Bax", "and", "p53", "while", "downregulating", "Bcl-2", ",", "resulting", "in", "an", "elevated", "Bax", "/", "Bcl-2", "ratio", ",", "a", "key", "indicator", "of", "apoptosis", "activation.", "Previous", "research", "reported", "that", "elevated", "p53", "expression", "and", "a", "higher", "Bax", "/", "Bcl-2", "ratio", "correlate", "with", "increased", "tumor", "sensitivity", "to", "anticancer", "therapies", "[", "23", "]", ",", "further", "supporting", "the", "potential", "of", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "as", "a", "therapeutic", "agent.", "Given", "these", "findings", ",", "it", "is", "essential", "to", "contextualize", "the", "anticancer", "activity", "of", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "by", "comparing", "it", "to", "established", "cervical", "cancer", "treatments", ",", "such", "as", "cisplatin", "and", "paclitaxel.", "Cisplatin", "exerts", "its", "cytotoxic", "effects", "primarily", "through", "DNA", "cross-linking", ",", "causing", "extensive", "DNA", "damage", "that", "leads", "predominantly", "to", "G2", "/", "M", "cell", "cycle", "arrest", "and", "subsequent", "apoptosis", "induction", "mainly", "via", "p53-dependent", "pathways", "[", "24", ",", "25", "]", ".", "Despite", "its", "efficacy", ",", "cisplatin", "is", "often", "limited", "by", "severe", "adverse", "effects", ",", "including", "nephrotoxicity", ",", "neurotoxicity", ",", "and", "drug", "resistance", "[", "25", "]", ".", "Paclitaxel", ",", "another", "cornerstone", "treatment", ",", "acts", "by", "stabilizing", "microtubules", ",", "causing", "prolonged", "G2", "/", "M", "mitotic", "arrest", "and", "promoting", "apoptosis", "through", "a", "p53-independent", "pathway", "involving", "cyclin", "B1", "/", "CDC2", "activation", "and", "Bcl-2", "phosphorylation", "[", "24", ",", "26", "]", ".", "However", ",", "paclitaxel", "similarly", "has", "clinical", "limitations", ",", "including", "dose-dependent", "toxicities", "such", "as", "peripheral", "neuropathy", "and", "myelosuppression", "[", "27", "]", ".", "In", "contrast", ",", "our", "findings", "demonstrate", "that", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "distinctly", "arrests", "cells", "at", "the", "G0", "/", "G1", "phase", "and", "promotes", "apoptosis", "via", "a", "p53-dependent", "pathway.", "These", "unique", "molecular", "characteristics", "suggest", "a", "complementary", "role", "alongside", "traditional", "chemotherapeutics", ",", "potentially", "reducing", "toxicities", "and", "overcoming", "drug", "resistance", ",", "despite", "its", "relatively", "high", "IC50.", "The", "chemical", "profile", "of", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", ",", "analyzed", "via", "GC-MS", "/", "FID", "detection", ",", "revealed", "a", "high", "content", "of", "phytol", "(", "65.74", "%", ")", "in", "unsaponifiable", "matter", ",", "a", "compound", "known", "for", "its", "broad-spectrum", "biological", "activities", ",", "particularly", "in", "cancer", "therapy.", "Phytol", ",", "a", "diterpenoid", "derived", "from", "chlorophyll", ",", "has", "been", "widely", "recognized", "for", "its", "anti-inflammatory", "and", "anticancer", "properties", ",", "including", "the", "modulation", "of", "cell", "cycle", "and", "apoptosis", "pathways", "[", "28", "]", ".", "Previous", "studies", "have", "demonstrated", "its", "ability", "to", "induce", "apoptosis", "across", "various", "cancer", "cell", "lines", ",", "including", "lung", ",", "colon", ",", "and", "breast", "cancers", ",", "primarily", "through", "the", "disruption", "of", "mitochondrial", "membrane", "potential", "and", "subsequent", "activation", "of", "the", "intrinsic", "apoptotic", "pathway", "[", "28", ",", "29", "]", ".", "Our", "findings", ",", "which", "show", "significant", "G0", "/", "G1", "cell", "cycle", "arrest", "and", "apoptosis", "in", "HeLa", "cells", ",", "align", "with", "these", "established", "mechanisms", "of", "action", ",", "further", "validating", "phytol’s", "role", "as", "a", "potent", "anticancer", "agent.", "In", "addition", "to", "phytol", ",", "the", "saponifiable", "matter", "of", "the", "DCM", "fraction", "contained", "palmitic", "acid", "(", "31.27", "%", ")", "and", "linolenic", "acid", "(", "26.98", "%", ")", "as", "the", "major", "components.", "Both", "fatty", "acids", "are", "well-documented", "for", "their", "apoptosis-inducing", "capabilities.", "Palmitic", "acid", ",", "for", "instance", ",", "has", "been", "reported", "to", "upregulate", "pro-apoptotic", "proteins", "such", "as", "Bax", "and", "p53", ",", "while", "downregulating", "anti-apoptotic", "Bcl-2", ",", "leading", "to", "enhanced", "apoptosis", "via", "caspase", "activation", "in", "colorectal", "and", "breast", "cancer", "models", "[", "30", "]", ".", "Similarly", ",", "linolenic", "acid", "exerts", "anticancer", "effects", "by", "modulating", "the", "Bcl-2", "family", "proteins", ",", "increasing", "pro-apoptotic", "Bax", "expression", ",", "and", "inducing", "endoplasmic", "reticulum", "(", "ER", ")", "stress", ",", "which", "contributes", "to", "cancer", "cell", "death.", "Linolenic", "acid", "has", "also", "been", "shown", "to", "inhibit", "the", "PI3K", "/", "Akt", "signaling", "pathway", "and", "suppress", "fatty", "acid", "synthase", "(", "FASN", ")", ",", "an", "enzyme", "overexpressed", "in", "many", "cancers", "[", "31", "]", ".", "Our", "study’s", "findings", "of", "increased", "Bax", "expression", "and", "a", "heightened", "Bax", "/", "Bcl-2", "ratio", "in", "HeLa", "cells", "are", "consistent", "with", "these", "mechanisms", ",", "suggesting", "that", "palmitic", "and", "linolenic", "acids", "likely", "contribute", "to", "the", "cytotoxic", "effects", "observed.", "Despite", "these", "promising", "results", ",", "the", "study", "possesses", "limitations", "typical", "of", "in", "vitro", "investigations.", "Notably", ",", "the", "biological", "complexity", "of", "tumor", "microenvironments", ",", "such", "as", "gene", "expression", "variability", ",", "signaling", "heterogeneity", ",", "immune", "interactions", ",", "and", "stromal", "influences", ",", "can", "not", "be", "adequately", "mimicked", "using", "isolated", "cell", "lines", "like", "HeLa.", "Additionally", ",", "the", "relatively", "high", "IC50", "necessitates", "exploration", "of", "advanced", "drug", "delivery", "systems", "or", "combination", "therapies.", "Future", "research", "should", "incorporate", "additional", "cancer", "cell", "lines", ",", "normal", "cell", "toxicity", "assessments", ",", "patient-derived", "xenografts", "(", "PDX", ")", ",", "and", "innovative", "delivery", "strategies", ",", "such", "as", "nanoparticle", "encapsulation", ",", "to", "enhance", "efficacy", ",", "reduce", "toxicity", ",", "and", "facilitate", "clinical", "translation.", "These", "steps", "are", "crucial", "for", "validating", "the", "preclinical", "promise", "and", "advancing", "the", "clinical", "applicability", "of", "the", "Alnus", "incana", "DCM", "fraction.", "Conclusion", "This", "study", "demonstrates", "that", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", ",", "rich", "in", "bioactive", "compounds", "such", "as", "phytol", ",", "palmitic", "acid", ",", "and", "linolenic", "acid", ",", "exerts", "notable", "cytotoxic", "effects", "on", "various", "cancer", "cell", "lines", ",", "particularly", "HeLa", "cells.", "These", "effects", "are", "mediated", "through", "inducing", "G0", "/", "G1", "cell", "cycle", "arrest", "and", "apoptosis", "via", "modulation", "of", "Bax", ",", "Bcl-2", ",", "and", "p53", "pathways.", "Although", "the", "relatively", "high", "IC50", "value", "(", "135.6", "µg", "/", "mL", ")", "limits", "its", "potential", "as", "a", "standalone", "therapy", ",", "the", "fraction’s", "selective", "cytotoxicity", "toward", "cancer", "cells", "suggests", "a", "potentially", "favorable", "safety", "profile.", "Its", "unique", "ability", "to", "activate", "apoptotic", "and", "cell-cycle", "arrest", "pathways", "supports", "its", "promise", "as", "an", "adjunctive", "therapy", ",", "particularly", "in", "combination", "with", "conventional", "chemotherapeutic", "agents", ",", "which", "may", "improve", "treatment", "outcomes", "by", "reducing", "associated", "toxicities", "or", "overcoming", "resistance.", "Further", "in-depth", "mechanistic", "studies", ",", "along", "with", "rigorous", "in", "vivo", "evaluations", "using", "clinically", "relevant", "models", "such", "as", "patient-derived", "xenografts", ",", "are", "essential", "to", "validate", "these", "promising", "findings", "and", "fully", "realize", "the", "clinical", "potential", "of", "this", "natural", "fraction.", "Source", "paper", ":", "PMC12105127" ]
[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]
[ "Introduction", "Hepatocellular", "carcinoma", "(", "HCC", ")", "is", "an", "exceedingly", "fatal", "malignancies", ",", "with", "mortalities", "that", "approximate", "the", "incidence", "rates", "worldwide", "[", "1", "]", ".", "HCC", "is", "usually", "diagnosed", "at", "advanced", "stages", "owing", "to", "late", "symptom", "manifestations", "with", "limited", "therapeutic", "options", ",", "leading", "to", "ineffective", "intervention", "and", "poor", "prognosis", "[", "2", "]", ".", "An", "increasing", "number", "of", "studies", "have", "focused", "on", "the", "progression", ",", "pathological", "features", ",", "and", "prognosis", "of", "liver", "cancer", "[", "3–5", "]", ".", "HCC", "epidemiology", "is", "rapidly", "evolving", ",", "one", "of", "the", "most", "common", "causes", "is", "non-alcoholic", "fatty", "liver", "disease", "[", "6", "]", ",", "further", "proving", "that", "lipid", "metabolism", "plays", "a", "crucial", "role", "in", "HCC", "occurrence.", "Therefore", ",", "the", "identification", "of", "novel", "therapeutic", "targets", "is", "urgently", "needed", "to", "improve", "the", "treatment", "of", "patients", "with", "HCC", "[", "7", "]", ".", "Phosphatidylethanolamine", "(", "PE", ")", ",", "also", "known", "as", "cephalin", ",", "is", "the", "most", "abundant", "lipid", "in", "the", "cytoplasmic", "layer", "of", "cell", "membranes", "and", "is", "involved", "in", "cellular", "processes", "such", "as", "membrane", "fusion", "[", "8", "]", ",", "autophagy", "and", "apoptosis", "[", "9–11", "]", ".", "For", "eukaryotic", "PE", "in", "vivo", ",", "two", "main", "synthetic", "pathways", "exist", "[", "12", "]", ":", "including", "the", "Kennedy", "pathway", "of", "CDP-ethanolamine", "(", "CDP-Etn", ")", "and", "mitochondrial", "phosphatidylserine", "decarboxylation", "pathway", "[", "13", "]", ".", "Phosphatidylethanolamine", "cytidyltransferase", "2", "(", "PCYT2", ")", "is", "the", "rate-limiting", "enzyme", "of", "the", "CDP-Etn", "pathway.", "Previous", "studies", "have", "shown", "that", "PCYT2", "is", "highly", "specific", ",", "and", "is", "present", "only", "in", "the", "rough", "endoplasmic", "reticulum", "of", "eukaryotes", "[", "14", "]", ".", "P-Eth", "is", "then", "catalyzed", "by", "PCYT2", "to", "form", "CDP-Etn", ",", "leading", "to", "PE", "synthesis", "[", "15", "]", ".", "Generally", ",", "PCYT2", "expression", "is", "reduced", "in", "various", "epithelial-derived", "cancer", "cell", "lines", "compared", "to", "normal", "cells", "[", "16,17", "]", ".", "Compared", "epithelial-derived", "cancer", "cell", "lines", "PCYT2", "activity", "with", "that", "of", "breast", "epithelial", "cells", "MCF-10A", "showed", "that", "its", "PCYT2", "activity", "was", "inhibited", "in", "breast", "cancer", "cells", "(", "MCF-7", ")", "[", "16", "]", ".", "PCYT2", "expression", "was", "significantly", "reduced", "in", "invasive", "human", "metastatic", "colon", "cancer", "cells", "compared", "to", "that", "in", "primary", "tumor", "cells", "[", "17", "]", ",", "and", "previous", "studies", "have", "shown", "that", "PCYT2", "knockdown", "under", "nutrient-rich", "conditions", "significantly", "facilitated", "the", "proliferation", "of", "HeLa", "and", "T98G", "cells", "and", "promoted", "in", "vivo", "tumor", "growth.", "The", "inhibition", "of", "PCYT2", "increases", "P-Etn", "levels", "in", "cancer", "cells", "and", "stimulates", "tumor", "growth", "[", "18", "]", ".", "However", ",", "in", "organoid", "models", ",", "PCYT2", "knockdown", "inhibits", "cell", "growth", "[", "19", "]", ".", "Despite", "these", "findings", ",", "no", "evidence", "exists", "that", "suggests", "that", "PCYT2", "expression", "is", "associated", "with", "HCC", "occurrence", "and", "development.", "This", "study", "aimed", "to", "investigate", "the", "role", "of", "PCYT2", "in", "human", "hepatocellular", "carcinoma", "cells", "(", "HepG2", ")", "by", "inhibiting", "their", "proliferation", ",", "invasion", ",", "and", "migration", "abilities", "and", "promoting", "cell", "apoptosis.", "Materials", "and", "methods", "Cell", "viability", "analysis", "HepG2", "cells", "were", "seeded", "into", "96-well", "plates", "and", "incubated", "with", "a", "Cell", "Counting", "kit", "(", "CCK-8", ")", "solution", "for", "40", "min", "at", "37°C.", "Absorbance", "was", "measured", "at", "450", "nm", "using", "a", "Spectra", "MAX", "M5", "microplate", "spectrophotometer", "to", "detect", "cell", "viability.", "Invasion", "experiment", "Dilute", "the", "Matrigel", "with", "basal", "medium", "(", "1:8", ")", ",", "lay", "it", "flat", "on", "a", "Transwell", "membrane", ",", "and", "incubate", "at", "37°C", "for", "4", "h.", "The", "subsequent", "experimental", "steps", "were", "identical", "to", "those", "used", "for", "the", "migration", "assay", ",", "including", "cell", "culture", ",", "paraformaldehyde", "fixation", "and", "0.1", "%", "crystal", "violet", "staining.", "Animal", "experiments", "Five-week-old", "BALB", "/", "c", "female", "nude", "mice", "were", "purchased", "from", "Jiangsu", "Jicui", "Pharmaceutical", "Biotechnology", "Co", ",", "passed", "SPF", "level", "training", "and", "assessment", ",", "and", "were", "routinely", "reared", "using", "standard", "SPF", "conditions.", "PCYT2", "overexpressed", "HepG2", "cells", "and", "control", "cells", "were", "subcutaneously", "injected", "into", "the", "left", "and", "right", "sides", "of", "the", "nude", "mice", "(", "approximately", "1", "×", "107", "cells", "on", "each", "side", ",", "n", "=", "6", "tumors", "in", "each", "group", ")", ".", "Following", "20–25", "d", ",", "the", "tumors", "achieved", "a", "certain", "size", "and", "the", "micewere", "anesthetized", "with", "isopentane", "and", "sacrificed", ";", "the", "tumors", "were", "collected", "for", "follow-up", "evaluation.", "The", "animal", "experiments", "were", "approved", "by", "the", "Animal", "Ethics", "Committee", "of", "Anhui", "Medical", "University", "and", "conducted", "in", "accordance", "with", "the", "guidelines", "for", "the", "care", "and", "use", "of", "laboratory", "animals.", "Statistical", "analysis", "Data", "were", "analyzed", "using", "GraphPad", "Prism", "software", "(", "version", "8.0", ")", ",", "and", "the", "results", "were", "expressed", "as", "mean", "±", "standard", "deviation", "(", "SD", ")", ".", "T-test", "was", "performed", "to", "determine", "the", "significant", "of", "differences", "between", "two", "groups.", "A", "one-way", "analysis", "of", "variance", "was", "used", "for", "comparison", "across", "groups.", "Statistical", "significance", "was", "set", "at", "P", "***Results***", "Discussion", "PCYT2", "is", "a", "rate-limiting", "enzyme", "in", "PE", "synthesis", "that", "is", "commonly", "used", "in", "the", "study", "of", "obesity-related", "diseases", ",", "such", "as", "non-alcoholic", "fatty", "liver", "disease", "and", "type", "2", "diabetes", "[", "12,20–22", "]", ".", "Recently", ",", "interest", "in", "the", "role", "of", "PCYT2", "in", "cancer", "has", "been", "growing", "[", "18,23,24", "]", ".", "Previous", "studies", "show", "that", "PCYT2", "has", "different", "roles", "in", "various", "cancers", "and", "cancer", "settings.", "For", "instance", ",", "in", "metastatic", "colorectal", "cancer", "(", "CRC", ")", ",", "PCYT2", "is", "significantly", "downregulated", "and", "functions", "as", "a", "tumor", "metastasis", "inhibitor", "[", "25", "]", ".", "In", "human", "breast", "cancer", "cells", "(", "MCF-7", ")", ",", "the", "level", "of", "PCYT2", "in", "cancer", "cells", "is", "elevated", "in", "response", "to", "the", "stressful", "environment", "[", "26", "]", ".", "Our", "findings", "show", "that", "PCYT2", "expression", "is", "abnormally", "downregulated", "in", "HepG2", "cells", ",", "which", "is", "consistent", "with", "that", "of", "previous", "studies", "where", "in", "PCYT2", "expression", "was", "downregulated", "in", "MCF-7", "and", "invasive", "human", "metastatic", "CRC", "[", "16,17", "]", ".", "Although", "PCYT2", "regulates", "several", "human", "cancers", "[", "18,19,23", "]", ",", "its", "role", "in", "HCC", "cells", "remains", "unknown.", "Based", "on", "the", "literature", "and", "our", "findings", ",", "PCYT2", "in", "human", "cancers", "appears", "to", "have", "a", "consistent", "expression", "profile", "in", "human", "cancers", ",", "irrespective", "of", "tumor", "origin", "or", "location", "[", "27", "]", ".", "Regarding", "the", "mechanism", "whereby", "PCYT2", "influences", "cancer", "development", ",", "a", "previous", "report", "showed", "that", "PCYT2", "downregulation-induced", "phosphoethanolamine", "(", "PEtn", ")", "accumulation", "correlated", "with", "tumor", "growth", "under", "nutrient", "starvation", ",", "thereby", "PCYT2", "overexpression", "reduced", "PEtn", "levels", "and", "tumor", "growth", "[", "18", "]", ".", "However", ",", "in", "the", "present", ",", "we", "found", "that", "CDP-Etn", "supplementation", "inhibited", "HCC", "migration", ",", "invasion", "and", "proliferation.", "In", "our", "previous", "study", ",", "we", "showed", "that", "the", "levels", "of", "BAX", "and", "cleaved", "caspase-3", "were", "significantly", "increased", "whereas", "Bcl-2", "was", "significantly", "reduced", "in", "the", "livers", "of", "type", "2", "diabetic", "mice", "and", "L02", "cells", "after", "stimulation", "with", "high", "glucose", "and", "free", "fatty", "acids", "(", "HG", "&", "FFA", ")", "(", "12", ")", ".", "CDP-Etn", "(", "100", "μM", ")", "protected", "cells", "from", "HG", "&", "FFA-induced", "apoptosis", "by", "reducing", "BAX", "and", "cleaved", "caspase-3", "levels", "as", "well", "as", "and", "increasing", "Bcl-2", "levels", "[", "12", "]", ".", "Whether", "PCYT2", "downregulation", "induced", "PEtn", "accumulation", "contributes", "to", "HCC", "development", "further", "study.", "Increasing", "evidence", "suggests", "that", "PCYT2", "is", "aberrantly", "expressed", "in", "various", "models", "of", "liver", "disease", "and", "may", "predict", "clinical", "outcomes", "in", "patients.", "PCYT2", "is", "instrumental", "in", "the", "deregulation", "of", "these", "processes", "leading", "to", "the", "development", "of", "obesity", ",", "insulin", "resistance", ",", "liver", "steatosis", "and", "dyslipidemia", "[", "28", "]", ".", "CDP-Etn", "supplementation", "has", "been", "reported", "to", "alleviate", "PCYT2", "deficiency", "engendering", "age-dependent", "and", "insulin-resistant", "non-alcoholic", "steatohepatitis", "to", "improve", "patient", "prognosis", "[", "20,29–31", "]", ".", "Chronic", "administration", "of", "peroxisome", "proliferators", "can", "increase", "the", "content", "of", "hepatic", "PC", "and", "PE", "for", "hepatomegaly", "and", "proliferation", "as", "well", "as", "cause", "liver", "cancer", "in", "rodents", "[", "32,33", "]", ".", "Based", "on", "the", "current", "studies", ",", "we", "hypothesized", "that", "PCYT2", "may", "be", "involved", "in", "the", "regulation", "of", "cellular", "processes", "in", "HCC.", "Therefore", ",", "we", "utilized", "in", "vivo", "and", "in", "vitro", "validation", "methods", "to", "assess", "the", "expression", "and", "mechanistic", "roles", "of", "PCYT2", "in", "liver", "cancer", "cells.", "Herein", ",", "PCYT2", "overexpression", "was", "determined", "to", "inhibit", "HCC", "cell", "proliferation", ",", "migration", "and", "invasion", "both", "in", "vitro", "and", "in", "vivo.", "And", ",", "the", "number", "and", "morphology", "of", "mitochondria", "in", "HCC", "cells", "overexpressing", "PCYT2", "were", "significantly", "different", "from", "those", "in", "HCC", "cells", "without", "any", "treatment", ",", "such", "as", "a", "decrease", "in", "the", "number", "of", "mitochondria", "and", "swelling", "of", "the", "mitochondria.", "These", "changes", "suggest", "that", "PCYT2", "affects", "the", "mitochondrial", "function", "of", "cells.", "Notably", ",", "when", "the", "HepG2", "cells", "received", "CDP-Etn", "supplementation", ",", "their", "proliferation", ",", "migration", ",", "and", "invasion", "were", "inhibited", "in", "vitro.", "Notably", ",", "the", "ATP", "level", "decreased", "in", "HCC", "cells", "following", "the", "overexpression", "of", "PCYT2", ",", "and", "the", "cells", "were", "found", "to", "be", "accompanied", "by", "mitochondrial", "damage", "using", "transmission", "electron", "microscopy.", "However", ",", "previous", "reports", "have", "indicated", "that", "PCYT2", "is", "present", "only", "in", "the", "endoplasmic", "reticulum", "of", "hepatocytes", "[", "14,34", "]", ".", "Additionally", ",", "the", "phenotype", "of", "liver", "PCYT2-", "/", "-", "knockout", "mice", "showed", "no", "signs", "of", "liver", "injury", ",", "however", ",", "they", "experienced", "massive", "accumulation", "of", "liver", "triglycerides", "(", "TAG", ")", "[", "35", "]", ".", "Therefore", ",", "we", "hypothesized", "that", "the", "influence", "of", "PCYT2", "on", "mitochondrial", "function", "is", "mediated", "by", "metabolites", "such", "as", "TAG", ",", "DAG", ",", "and", "PE.", "However", ",", "further", "studies", "are", "needed", "to", "clarify", "whether", "the", "PCYT2", "exerted", "inhibition", "of", "HCC", "cells", "alleviates", "mitochondrial", "damage.", "As", "understanding", ",", "the", "mechanism", "whereby", "PCYT2", "overexpression", "causes", "mitochondrial", "damage", "will", "deepen", "our", "understanding", "of", "PCYT2", "regulation", "in", "HCC", "cells.", "In", "conclusion", ",", "this", "study", "provided", "compelling", "data", "demonstrating", "the", "aberrant", "expression", "and", "functional", "role", "of", "PCYT2", "in", "HepG2", "cells.", "PCYT2", "expression", "levels", "were", "lower", "in", "HepG2", "than", "in", "L02.", "Furthermore", ",", "PCYT2", "overexpression", "in", "HepG2", "cells", "induced", "mitochondrial", "damage", ";", "inhibited", "proliferation", ",", "invasion", ",", "and", "migration", ";", "and", "promoted", "cell", "apoptosis.", "Source", "paper", ":", "PMC12118871" ]
[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]
[ "Results", "IFN-γ", "significantly", "induced", "STAT1", "phosphorylation", ",", "leading", "to", "a", "time-dependent", "upregulation", "of", "PD-L1", "expression.", "Immunofluorescence", "confirmed", "that", "p-STAT1", "is", "translocated", "to", "nucleus.", "Curcumin", "treatment", "inhibited", "STAT1", "phosphorylation", "by", "68", "%", "(", "p", "p", "***Conclusion***", "Curcumin", "effectively", "inhibits", "IFN-γ-induced", "STAT1", "phosphorylation", "and", "PD-L1", "expression", ",", "downregulates", "ISGs", ",", "and", "enhances", "IFN-γ-mediated", "tumor", "suppression.", "These", "findings", "suggest", "that", "curcumin", "may", "serve", "as", "a", "therapeutic", "adjuvant", "in", "NSCLC", ",", "potentially", "improving", "immune", "checkpoint", "inhibitor", "(", "ICI", ")", "efficacy.", "Material", "and", "methods", "Western", "blot", "analysis", "Total", "protein", "lysates", "were", "extracted", "from", "treated", "A549", "cells", "using", "ice-cold", "radioimmunoprecipitation", "assay", "(", "RIPA", ")", "buffer", "supplemented", "with", "protease", "and", "phosphatase", "inhibitors", "and", "centrifuged", "at", "10,000", "×", "g", "for", "10", "min", "at", "4◦C.", "The", "total", "protein", "concentrations", "were", "measured", "with", "the", "bicinchoninic", "acid", "(", "BCA", ")", "protein", "assay", "kit", "(", "Pierce", ",", "Thermo", "Fisher", "Scientific", ",", "USA", ")", ".", "Equal", "amounts", "of", "protein", "(", "20", "μg", "per", "sample", ")", "were", "separated", "on", "10", "%", "sodium", "dodecyl", "sulfate–polyacrylamide", "gels", "(", "SDS-PAGE", ")", "and", "transferred", "onto", "0.45", "μM", "nitrocellulose", "membranes", "(", "Merck", ")", ".", "Membranes", "were", "blocked", "with", "5", "%", "BSA", "in", "Tris-buffered", "saline", "with", "0.1", "%", "Tween-", "20", "(", "TBST", ")", "for", "1", "h", "at", "room", "temperature", "to", "prevent", "non-specific", "binding", "and", "incubated", "overnight", "at", "4", "°C", "with", "primary", "antibodies", "against", "phospho-STAT1", "(", "Tyr701", ")", ",", "total", "STAT1", ",", "PD-L1", ",", "and", "β-actin", "(", "Santa", "Cruz", "Biotechnology", ",", "Dallas", ",", "TX", ",", "USA", ")", ".", "After", "washing", "with", "TBST", ",", "membranes", "were", "incubated", "with", "horseradish", "peroxidase", "(", "HRP", ")", "-conjugated", "secondary", "anti-mouse", "IgG", "antibody", "or", "anti-rabbit", "IgG", ",", "HRP-linked", "antibody", ",", "for", "1", "h", "at", "room", "temperature.", "Protein", "bands", "were", "detected", "using", "enhanced", "chemiluminescence", "(", "ECL", ")", "reagent", "(", "GE", "Healthcare", ",", "USA", ")", "and", "visualized", "using", "a", "ChemiDoc", "imaging", "system", "(", "Bio-Rad", ",", "USA", ")", ".", "Analysis", "of", "protein", "bands", "was", "performed", "using", "ImageJ", "software", "(", "NIH", ",", "Bethesda", ",", "MD", ",", "USA", ")", ".", "The", "primary", "and", "secondary", "antibodies", "are", "listed", "in", "Table", "1.Table", "1The", "description", "of", "primary", "and", "secondary", "antibodies", "AntibodySpeciesCloneDilutionCa", "#", "SourcePD-L1RabbitMonoclonal1:1000ab213524AbcamSTAT1MouseMonoclonal1:10009176Cell", "Signaling", "TechnologypSTAT1RabbitMonoclonal1:10009177SCell", "Signaling", "Technologyβ-actinMouseMonoclonal1:500047,778Santa", "Cruz", "Biotechnology", ",", "Dallas", ",", "TX", ",", "USAAnti-mouseHorse-1:10,0007076Cell", "Signaling", ",", "Danvers", ",", "MA", ",", "USAAnti-RabbitGoat-1:10,0007074Cell", "Signaling", ",", "Danvers", ",", "MA", ",", "USA", "Quantitative", "real-time", "pcr", "(", "qrt-pcr", ")", "analysis", "Total", "RNA", "was", "extracted", "from", "A549", "cells", "using", "the", "RNeasy", "Mini-Kit", "(", "Qiagen", ",", "#", "74,104", ")", "according", "to", "the", "manufacturer’s", "instructions", ",", "and", "the", "eluted", "RNA", "purity", "and", "concentration", "were", "assessed", "using", "a", "NanoDrop", "One", "spectrophotometer", "(", "Thermo", "Scientific", ",", "USA", ")", ".", "For", "cDNA", "synthesis", ",", "500", "ng", "of", "RNA", "was", "reverse", "transcribed", "using", "the", "RevertAid", "First", "Strand", "cDNA", "Synthesis", "Kit", "to", "cDNA", "as", "per", "the", "manufacturer’s", "instructions.", "Quantitative", "real-time", "PCR", "(", "qRT-PCR", ")", "was", "conducted", "using", "the", "SYBR", "Green", "PCR", "Master", "Mix", "(", "Applied", "Biosystems™", ")", "on", "a", "QuantStudio", "5", "Machine", "(", "Thermo", "Fisher", "Scientific", ",", "Inc.", ")", ".", "The", "relative", "expression", "levels", "of", "PD-L1", ",", "STAT1", ",", "and", "ISGs", "(", "ISG15", "and", "SOCS1", ")", "were", "normalized", "to", "the", "housekeeping", "gene", "GAPDH", "and", "analyzed", "using", "the", "2^", "−", "ΔΔCt", "method.", "The", "PCR", "reactions", "were", "carried", "out", "in", "duplicate", "with", "40", "cycles", "of", "denaturation", "(", "15", "s", "at", "95", "°C", ")", ",", "annealing", "(", "20", "s", "at", "65", "°C", ")", ",", "and", "elongation", "(", "20", "s", "at", "72", "°C", ")", "after", "an", "initial", "enzyme", "activation", "(", "15", "min", "at", "95", "°C", ")", ".", "The", "primer", "sequences", "used", "are", "presented", "in", "Table", "2.Table", "2List", "of", "PCR", "primers", "designed", "using", "NCBI", "/", "Primer-BLAST", "program", "PrimerPrimer", "sequencesForwardReverseCD274", "(", "PD−L1", ")", "5′-TGGCATTTGCTGAACGCATTT-", "3′5′-AGTGCAGCCAGGTCTAATTGT-", "3′ISG155′-ATCACCCAGAAGATCGGCGT-", "3′5′-TCGCATTTGTCCACCACCAG-", "3′SOCS15’-", "TTCGCCCTTAGCGTGAAGATGG-", "3′5’-", "TAGTGCTCCAGCAGCTCGAAGA-", "3′GAPDH5′-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTC-", "3′5′-TGAAGGGGTCATTGATGGCA-", "3′", "Statistical", "analysis", "All", "experiments", "were", "performed", "in", "triplicate", ",", "and", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "standard", "deviation", "(", "SD", ")", ".", "Statistical", "analyses", "were", "conducted", "using", "GraphPad", "Prism", "10", "(", "GraphPad", "Software", ",", "USA", ")", ".", "One-way", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "followed", "by", "Tukey’s", "post-hoc", "test", "was", "used", "to", "compare", "multiple", "groups", ",", "and", "an", "unpaired", "Student’s", "t-test", "was", "used", "for", "pairwise", "comparisons.", "Differences", "were", "considered", "statistically", "significant", "at", "p", "***Results***", "Discussion", "Immune", "evasion", "remains", "a", "significant", "challenge", "in", "the", "treatment", "of", "NSCLC", ",", "with", "PD-L1", "upregulation", "being", "one", "of", "the", "primary", "mechanisms", "by", "which", "tumors", "escape", "immune", "surveillance", "(", "Cui", "et", "al.", "2024", ")", ".", "The", "IFN-γ", "/", "STAT1", "signaling", "pathway", "plays", "a", "crucial", "role", "in", "PD-L1", "regulation", ",", "enabling", "tumor", "cells", "to", "suppress", "T-cell-mediated", "immune", "responses", "and", "resist", "immune", "checkpoint", "blockade", "therapy", "(", "Padmanabhan", "et", "al.", "2022", ")", ".", "In", "this", "study", ",", "we", "investigated", "how", "IFN-γ-induced", "STAT1", "phosphorylation", "leads", "to", "PD-L1", "upregulation", "in", "A549", "cells", "and", "explored", "the", "potential", "of", "curcumin", ",", "a", "bioactive", "polyphenol", "with", "known", "anti-inflammatory", "and", "anti-cancer", "properties", ",", "as", "a", "therapeutic", "agent", "capable", "of", "modulating", "this", "pathway.", "Our", "findings", "provide", "strong", "evidence", "that", "curcumin", "inhibits", "IFN-γ-induced", "STAT1", "activation", ",", "thereby", "reducing", "PD-L1", "expression", "and", "enhancing", "the", "anti-proliferative", "effects", "of", "IFN-γ", "in", "NSCLC.", "Consistent", "with", "previous", "studies", ",", "we", "observed", "that", "IFN-γ", "induces", "a", "robust", "phosphorylation", "of", "STAT1", "at", "Tyr701", "in", "A549", "cells", ",", "leading", "to", "its", "nuclear", "translocation", "and", "subsequent", "activation", "of", "target", "genes", ",", "including", "PD-L1.", "The", "kinetics", "of", "STAT1", "phosphorylation", "followed", "a", "time-dependent", "pattern", ",", "with", "phosphorylation", "detected", "as", "early", "as", "2", "h", ",", "peaking", "at", "6", "h", ",", "and", "remaining", "elevated", "up", "to", "24", "h.", "These", "results", "are", "in", "agreement", "with", "earlier", "reports", "that", "demonstrated", "a", "similar", "pattern", "of", "IFN-γ-induced", "STAT1", "activation", "in", "various", "cancer", "models", ",", "including", "melanoma", "(", "Schmitt", "et", "al.", "2012", ")", ",", "colorectal", "cancer", "(", "Zhao", "et", "al.", "2020", ")", ",", "and", "lung", "adenocarcinoma", "(", "Gao", "et", "al.", "2018", ")", ".", "STAT1", "phosphorylation", "is", "a", "prerequisite", "for", "its", "dimerization", "and", "nuclear", "translocation", ",", "which", "is", "required", "for", "the", "transcriptional", "activation", "of", "ISGs", "(", "Wang", "et", "al.", "2017", ")", ".", "Immunofluorescence", "analysis", "confirmed", "that", "IFN-γ", "treatment", "led", "to", "a", "marked", "accumulation", "of", "p-STAT1", "in", "the", "nucleus", ",", "reinforcing", "the", "notion", "that", "STAT1", "plays", "a", "crucial", "role", "in", "IFN-γ-mediated", "transcriptional", "regulation.", "These", "findings", "align", "with", "studies", "showing", "that", "sustained", "STAT1", "activation", "promotes", "an", "immunosuppressive", "tumor", "microenvironment", "by", "inducing", "PD-L1", "expression", "and", "other", "immune-regulatory", "genes.", "The", "upregulation", "of", "PD-L1", "in", "response", "to", "IFN-γ", "was", "confirmed", "at", "both", "the", "mRNA", "and", "protein", "levels", ",", "as", "demonstrated", "by", "qRT-PCR", "and", "Western", "blotting.", "The", "increased", "surface", "expression", "of", "PD-L1", "following", "IFN-γ", "treatment", "highlights", "the", "functional", "significance", "of", "this", "regulation", ",", "as", "surface", "PD-L1", "interacts", "with", "PD-", "1", "on", "T", "cells", "to", "inhibit", "anti-tumor", "immune", "responses", "(", "Arak", "et", "al.", "2021", ")", ".", "These", "results", "are", "in", "accordance", "with", "previous", "reports", "showing", "that", "IFN-γ", "is", "one", "of", "the", "most", "potent", "inducers", "of", "PD-L1", "in", "NSCLC", ",", "facilitating", "immune", "escape", "and", "tumor", "progression", "(", "Pawelczyk", "et", "al.", "2019", ")", ".", "Additionally", ",", "the", "use", "of", "fludarabine", ",", "a", "STAT1", "inhibitor", ",", "significantly", "attenuated", "IFN-γ-induced", "PD-L1", "expression", ",", "confirming", "that", "STAT1", "is", "the", "primary", "mediator", "of", "this", "regulatory", "axis.", "This", "finding", "corroborates", "prior", "studies", "demonstrating", "that", "STAT1-deficient", "cells", "fail", "to", "upregulate", "PD-L1", "in", "response", "to", "IFN-γ", ",", "emphasizing", "the", "centrality", "of", "STAT1", "in", "this", "pathway.", "One", "of", "the", "most", "significant", "findings", "of", "this", "study", "is", "the", "ability", "of", "curcumin", "to", "inhibit", "IFN-γ-induced", "STAT1", "activation", "and", "PD-L1", "expression", "in", "A549", "cells.", "Western", "blot", "analysis", "revealed", "that", "curcumin", "suppressed", "STAT1", "phosphorylation", "in", "a", "dose-dependent", "manner", ",", "with", "the", "highest", "concentration", "(", "50", "µM", ")", "reducing", "phosphorylation", "by", "68", "%", ".", "This", "effect", "was", "not", "due", "to", "a", "decrease", "in", "total", "STAT1", "protein", "levels", ",", "indicating", "that", "curcumin", "selectively", "inhibits", "STAT1", "activation", "rather", "than", "its", "expression.", "Previous", "studies", "have", "reported", "that", "curcumin", "can", "interfere", "with", "JAK-STAT", "signaling", "in", "other", "cancer", "types.", "Curcumin", "directly", "inhibits", "the", "phosphorylation", "of", "STAT3", ",", "a", "key", "component", "of", "the", "JAK-STAT", "signaling", "pathway", "in", "breast", "cancer", "(", "Golmohammadi", "et", "al.", "2024", ")", "and", "prostate", "cancer", "(", "Li", "et", "al.", "2024", ")", ",", "as", "well", "as", "the", "downregulation", "of", "the", "STAT1", "in", "melanoma", "(", "Xu", "et", "al.", "2018", ")", ",", "but", "its", "specific", "effect", "on", "STAT1", "in", "IFN-γ-stimulated", "NSCLC", "cells", "had", "not", "been", "previously", "explored.", "Our", "findings", "extend", "these", "observations", "by", "demonstrating", "that", "curcumin", "effectively", "blocks", "STAT1", "activation", "in", "lung", "cancer", "cells", ",", "preventing", "the", "downstream", "induction", "of", "PD-L1.", "The", "suppression", "of", "PD-L1", "expression", "by", "curcumin", "was", "observed", "at", "both", "the", "transcriptional", "and", "translational", "levels", ",", "as", "evidenced", "by", "qRT-PCR", "and", "Western", "blotting.", "This", "finding", "is", "particularly", "relevant", "in", "the", "context", "of", "NSCLC", ",", "where", "high", "PD-L1", "expression", "correlates", "with", "poor", "prognosis", "and", "resistance", "to", "immunotherapy.", "Previous", "studies", "have", "reported", "that", "curcumin", "downregulates", "PD-L1", "in", "other", "cancer", "models", ",", "such", "as", "melanoma", "(", "Xu", "et", "al.", "2018", ")", "and", "hepatocellular", "carcinoma", "(", "Guo", "et", "al.", "2021", ")", ",", "but", "the", "specific", "inhibition", "of", "IFN-γ-induced", "PD-L1", "expression", "in", "NSCLC", "had", "not", "been", "thoroughly", "investigated.", "Our", "study", "provides", "the", "first", "evidence", "that", "curcumin", "can", "effectively", "suppress", "IFN-γ-mediated", "PD-L1", "upregulation", "in", "lung", "cancer", "cells", "via", "STAT1", "pathway", ",", "highlighting", "its", "potential", "as", "an", "immune-modulatory", "agent.", "In", "addition", "to", "PD-L1", ",", "STAT1", "regulates", "the", "expression", "of", "multiple", "ISGs", "involved", "in", "immune", "evasion", ",", "including", "SOCS1", "(", "Ilangumaran", "et", "al.", "2024", ")", "and", "ISG15", "(", "Desai", "2015", ")", ".", "Our", "results", "demonstrated", "that", "IFN-γ", "significantly", "upregulated", "both", "SOCS1", "and", "ISG15", ",", "reinforcing", "the", "notion", "that", "IFN-γ", "signaling", "contributes", "to", "an", "immunosuppressive", "tumor", "microenvironment.", "Curcumin", "pretreatment", ",", "however", ",", "led", "to", "a", "significant", "reduction", "in", "both", "SOCS1", "and", "ISG15", "expression", ",", "further", "supporting", "its", "ability", "to", "interfere", "with", "IFN-γ-driven", "STAT1", "signaling.", "SOCS1", "is", "known", "to", "act", "as", "a", "feedback", "inhibitor", "of", "JAK-STAT", "signaling", "(", "Liau", "et", "al.", "2018", ")", ",", "but", "paradoxically", ",", "its", "overexpression", "in", "tumors", "has", "been", "associated", "with", "immune", "escape", "mechanisms.", "By", "suppressing", "SOCS1", "expression", ",", "curcumin", "may", "enhance", "the", "responsiveness", "of", "tumor", "cells", "to", "immune-mediated", "clearance.", "Similarly", ",", "ISG15", "has", "been", "implicated", "in", "tumor", "progression", "and", "resistance", "to", "therapy", "(", "Meng", "et", "al.", "2024", ")", ",", "suggesting", "that", "its", "downregulation", "by", "curcumin", "may", "have", "additional", "therapeutic", "benefits.", "Finally", ",", "we", "observed", "that", "curcumin", "enhances", "the", "anti-proliferative", "effect", "of", "IFN-γ", "in", "A549", "cells.", "While", "IFN-γ", "alone", "resulted", "in", "a", "modest", "reduction", "in", "cell", "viability", "(", "21", "%", ")", ",", "the", "combination", "of", "IFN-γ", "and", "curcumin", "led", "to", "a", "significantly", "greater", "reduction", "(", "47", "%", ")", ",", "suggesting", "a", "synergistic", "effect.", "These", "findings", "align", "with", "previous", "reports", "that", "curcumin", "enhances", "the", "anti-tumor", "activity", "of", "cytokines", "by", "modulating", "cell", "cycle", "regulators", "and", "apoptotic", "pathways", "(", "Hu", "et", "al.", "2018", ")", ".", "The", "precise", "mechanism", "by", "which", "curcumin", "sensitizes", "NSCLC", "cells", "to", "IFN-γ-induced", "growth", "suppression", "remains", "to", "be", "elucidated", ",", "but", "it", "may", "involve", "inhibition", "of", "survival", "pathways", "downstream", "of", "STAT1", "activation.", "Given", "that", "STAT1", "has", "been", "implicated", "in", "both", "pro-apoptotic", "and", "pro-survival", "signaling", ",", "the", "net", "effect", "of", "its", "inhibition", "may", "depend", "on", "the", "cellular", "context", "and", "additional", "regulatory", "factors.", "In", "conclusion", ",", "our", "study", "provides", "novel", "evidence", "that", "IFN-γ", "induces", "PD-L1", "expression", "in", "NSCLC", "cells", "via", "STAT1", "activation", "and", "that", "curcumin", "effectively", "inhibits", "this", "process", "by", "suppressing", "STAT1", "phosphorylation", "and", "nuclear", "translocation.", "Furthermore", ",", "curcumin", "downregulates", "IFN-γ-induced", "ISGs", "and", "enhances", "IFN-γ-mediated", "tumor", "cell", "growth", "suppression", ",", "highlighting", "its", "potential", "as", "a", "therapeutic", "adjuvant", "in", "NSCLC.", "These", "findings", "suggest", "that", "curcumin", "could", "be", "used", "to", "improve", "the", "efficacy", "of", "immune", "checkpoint", "inhibitors", "by", "reducing", "tumor", "immune", "evasion.", "Future", "studies", "should", "focus", "on", "elucidating", "the", "precise", "molecular", "mechanisms", "underlying", "curcumin’s", "effects", "on", "STAT1", "signaling", "and", "investigating", "its", "potential", "synergistic", "effects", "with", "existing", "immunotherapies", "in", "preclinical", "and", "clinical", "settings.", "Source", "paper", ":", "PMC12141184" ]
[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]
[ "Materials", "and", "methods", "Statistical", "analysis", "All", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times.", "A", "one-way", "ANOVA", "followed", "by", "a", "Tukey", "'s", "post-hoc", "test", "was", "used", "to", "compare", "the", "RT-qPCR", "signals", "from", "the", "treated", "cells", "and", "the", "ELISA", "results.", "For", "comparison", "of", "RT-qPCR", "signals", "from", "treated", "cells", "to", "the", "hypothetical", "value", "of", "1", "(", "normalized", "to", "the", "signal", "of", "control", "cells", ")", ",", "a", "one-sample", "t-test", "was", "used", ",", "as", "in", "this", "type", "of", "statistical", "analysis", ",", "the", "variability", "of", "the", "values", "obtained", "from", "control", "cell", "signals", "is", "taken", "into", "consideration", ",", "although", "they", "appear", "without", "standard", "deviations", "(", "SD=0", ")", ".", "P", "#", "x003C", ";", "0.05", "was", "considered", "to", "indicate", "a", "statistically", "significant", "difference.", "All", "statistical", "analyses", "were", "performed", "in", "GraphPad", "Prism", "version", "9", "(", "GraphPad", "Software", ",", "Inc.", ")", ";", "means", "and", "standard", "deviations", "are", "provided", "as", "numbers", "or", "as", "scatter", "plots.", "Results", "Discussion", "Confirming", "previously", "published", "data", ",", "it", "was", "shown", "that", "the", "human", "cell", "line", "MIO-M1", ",", "an", "accepted", "model", "of", "human", "Mueller", "cells", ",", "expresses", "AGT", ",", "ACE", ",", "ACE2", ",", "angiotensin", "II", "receptors", "AT1", "and", "AT2", ",", "as", "well", "as", "the", "receptor", "of", "angiotensin", "(", "1-7", ")", "MAS1", "(", "17-19,21-24,28", ")", ".", "The", "mRNA", "expression", "levels", "of", "these", "were", "largely", "unchanged", "when", "cells", "were", "exposed", "to", "hyperglycemic", "or", "hypoxic", "conditions", "or", "both.", "Exposure", "of", "cells", "to", "these", "conditions", "seemed", "to", "not", "result", "in", "induction", "of", "cellular", "stress", ",", "which", "may", "adversely", "affect", "the", "outcome", "of", "the", "investigations", ",", "since", "expression", "of", "IL-6", "mRNA", ",", "a", "marker", "of", "cellular", "stress", ",", "remained", "stable.", "It", "could", "be", "suggested", "that", "an", "incubation", "time", "of", "6", "h", "is", "too", "short", ",", "but", "due", "to", "the", "short", "half-life", "of", "angiotensin", "II", ",", "longer", "exposure", "times", "would", "likely", "not", "result", "in", "more", "relevant", "data.", "However", ",", "expression", "and", "secretion", "of", "VEGF-A", "were", "substantially", "increased", "by", "hypoxia", "alone", "or", "in", "combination", "with", "hyperglycemia", "confirming", "the", "expected", "strong", "response", "of", "the", "cells", "to", "their", "altered", "environment", "within", "the", "studied", "time", "span.", "Angiotensin", "II", "and", "aldosterone", "did", "not", "modulate", "VEGF-A", "levels", ",", "proving", "the", "dominant", "role", "of", "hypoxia", "in", "the", "regulation", "of", "the", "growth", "factors", "'", "expression", "and", "secretion.", "It", "was", "to", "be", "expected", "that", "hyperglycemia", "alone", "did", "not", "modulate", "VEGF-A", "expression", "and", "secretion", "within", "6", "h", ",", "as", "possible", "changes", "likely", "manifest", "only", "after", "extended", "exposure", "(", "32", ")", ".", "VEGF", "receptors", "are", "expressed", "in", "various", "retinal", "tissues", "including", "the", "retinal", "vasculature", ",", "Mueller", "cells", ",", "and", "the", "retinal", "pigment", "epithelium", "(", "33,34", ")", ".", "Upregulation", "of", "VEGFR2", "in", "the", "retinal", "vasculature", "is", "associated", "with", "the", "development", "of", "DR", "and", "its", "activation", "by", "the", "ligand", "VEGF-A165", "results", "in", "elevated", "permeability", "of", "retinal", "endothelial", "cells", "or", "increased", "expression", "of", "pro-inflammatory", "mediators", "in", "Mueller", "cells", "in", "vitro", "(", "29,34,35", ")", ".", "Inhibitors", "of", "ACE", "and", "/", "or", "AT1", ",", "at", "least", "in", "part", ",", "prevent", "VEGF-A165-induced", "permeability", "of", "retinal", "endothelial", "cells", "in", "vitro", "and", "in", "vivo", "as", "well", "as", "retinal", "neovascularization", ",", "thereby", "proving", "an", "interaction", "between", "both", "signaling", "pathways", "(", "36-39", ")", ".", "However", ",", "expression", "and", "secretion", "of", "VEGF-A", "by", "MIO-M1", "cells", "were", "not", "altered", "by", "angiotensin", "II", "likely", "reflecting", "the", "different", "behaviors", "of", "both", "cell", "types.", "mRNAs", "coding", "for", "proteins", "of", "the", "RAAS", "indeed", "exhibited", "differential", "expression", "patterns", "in", "the", "presence", "of", "either", "angiotensin", "II", "or", "aldosterone", "when", "cells", "were", "cultured", "under", "hyperglycemic", "and", "/", "or", "hypoxic", "conditions.", "It", "is", "of", "interest", ",", "that", "angiotensin", "II", "did", "not", "alter", "the", "expression", "of", "its", "precursor", "AGT", "under", "any", "of", "the", "tested", "conditions", ",", "which", "may", "indicate", "that", "the", "peptide", "hormone", "can", "not", ",", "directly", "or", "indirectly", ",", "induce", "its", "own", "expression", "in", "Mueller", "cells.", "To", "assess", "a", "possible", "pro-inflammatory", "response", "of", "Mueller", "cells", ",", "the", "changes", "in", "the", "expression", "of", "mRNA", "as", "well", "as", "secretion", "of", "the", "pro-inflammatory", "cytokine", "IL-6", ",", "which", "is", "constitutively", "expressed", "by", "this", "cell", "type", "(", "including", "MIO-M1", "cells", ")", ",", "was", "assessed", "(", "31", ")", ".", "However", ",", "under", "normoxic", "or", "hypoxic", "conditions", ",", "the", "amounts", "of", "the", "secreted", "cytokine", "and", "its", "mRNA", "expression", "levels", "were", "not", "significantly", "altered", "by", "the", "treatment", "with", "angiotensin", "II", "or", "aldosterone", ",", "suggesting", "that", "the", "hormones", "do", "not", "induce", "a", "pro-inflammatory", "response", "of", "the", "cells", "under", "these", "circumstances.", "Interestingly", ",", "aldosterone", "significantly", "enhanced", "the", "expression", "of", "ACE", "mRNA", "under", "hypoxic", "conditions", ",", "thus", "not", "resulting", "in", "an", "inflammatory", "response", ",", "that", "is", "enhanced", "expression", "or", "secretion", "of", "IL-6", "via", "the", "angiotensin", "II", "/", "AT1-axis.", "Angiotensin", "II", ",", "on", "the", "other", "hand", ",", "increased", "the", "expression", "of", "ACE2", ",", "resulting", "in", "its", "own", "inactivation", "by", "the", "formation", "of", "angiotensin", "(", "1-7", ")", ",", "which", "does", "not", "activate", "AT1.", "Similar", "to", "the", "behavior", "of", "endothelial", "cells", "from", "the", "human", "umbilical", "cord", ",", "the", "mRNA", "expression", "levels", "of", "IL-6", "were", "increased", "in", "MIO-M1", "cells", "exposed", "to", "hyperglycemia", "and", "aldosterone", ",", "although", "the", "amount", "of", "the", "secreted", "cytokine", "remained", "unchanged", "from", "control", "cells", "(", "40", ")", ".", "However", ",", "increased", "IL-6", "expression", "is", "likely", "independent", "of", "the", "angiotensin", "II", "/", "AT1-axis", ",", "as", "possibly", "endogenously", "produced", "peptide", "hormone", "is", "inactivated", "by", "high", "levels", "of", "ACE2.", "Although", "angiotensin", "II", "did", "not", "significantly", "increase", "IL-6", "mRNA", "expression", "in", "MIO-M1", "cells", "cultured", "under", "hyperglycemic", "conditions", ",", "more", "IL-6", "was", "secreted", "under", "these", "conditions.", "Higher", "expression", "of", "AT1", "mRNA", "could", "lead", "to", "stronger", "activation", "of", "the", "pro-inflammatory", "angiotensin", "II", "/", "AT1", "signaling", "cascade", ",", "similar", "to", "that", "observed", "for", "angiotensin", "II-activated", "retinal", "microglia", ",", "which", "express", "higher", "quantities", "of", "various", "pro-inflammatory", "cytokines", "and", "chemokines", "including", "IL-6", ",", "a", "process", "that", "is", "mediated", "by", "AT1", "(", "41", ")", ".", "Elevated", "permeability", "of", "retinal", "endothelial", "cells", "due", "to", "IL-6-mediated", "trans-signaling", "in", "vitro", "likely", "contributes", "to", "the", "breakdown", "of", "the", "inner", "blood-retina", "barrier", "in", "vivo", "(", "42", ")", ".", "The", "protective", "ACE2", "/", "angiotensin", "(", "1-7", ")", "/", "MAS1", "signaling", "cascade", "is", "upregulated", "during", "acute", "and", "chronic", "diseases", "of", "the", "heart", "or", "kidney", "to", "counteract", "detrimental", "processes", "(", "43,44", ")", ".", "This", "signaling", "cascade", "seems", "to", "also", "be", "activated", "by", "Mueller", "cells", "exposed", "to", "hyperglycemia", "and", "angiotensin", "II", ",", "as", "expression", "of", "ACE2", "and", "MAS1", "RNA", "was", "elevated.", "Thus", ",", "the", "concentrations", "of", "the", "vasodilator", "angiotensin", "(", "1-7", ")", "formed", "by", "protease", "ACE2", "may", "be", "higher", ",", "and", "through", "its", "interaction", "with", "receptor", "MAS1", ",", "anti-angiogenic", "and", "anti-inflammatory", "processes", "can", "be", "induced", "(", "24-27", ")", ".", "However", ",", "as", "MIO-M1", "cells", "secreted", "increased", "quantities", "of", "IL-6", "when", "exposed", "to", "hyperglycemia", "and", "angiotensin", "II", ",", "the", "pro-inflammatory", "axis", "seems", "to", "exceed", "the", "anti-inflammatory", "response.", "A", "similar", "inflammatory", "response", "to", "angiotensin", "II", "was", "also", "observed", "after", "additional", "exposure", "of", "the", "cells", "to", "hyperglycemia", "plus", "hypoxia", ",", "as", "the", "expression", "of", "IL-6", "mRNA", "was", "substantially", "upregulated.", "However", ",", "the", "observed", "lower", "expression", "of", "ACE", "mRNA", "is", "in", "line", "with", "an", "assumed", "capacity", "of", "MIO-M1", "cells", "to", "counteract", "angiotensin", "II-induced", "pro-inflammatory", "signaling.", "In", "vivo", ",", "Mueller", "cells", ",", "retinal", "endothelial", "cells", ",", "and", "retinal", "pericytes", "form", "the", "so-called", "neurovascular", "unit", ",", "which", "tightly", "regulates", "vascular", "homeostasis", "in", "the", "retina", "(", "45", ")", ".", "Whether", "the", "cellular", "interactions", "change", "their", "individual", "responses", "to", "angiotensin", "II", "could", "not", "be", "evaluated", "in", "the", "present", "study.", "However", ",", "inhibitors", "of", "ACE", "or", "AT1", "were", "found", "to", ",", "at", "least", "in", "part", ",", "improve", "the", "outcomes", "of", "DME", "in", "diabetic", "patients", ",", "which", "supports", "the", "findings", "of", "the", "present", "study", "that", "Mueller", "cells", "likely", "contribute", "to", "angiotensin", "II-mediated", "inflammatory", "responses", "present", "in", "the", "early", "development", "of", "this", "disease", "(", "46,47", ")", ".", "In", "contrast", ",", "the", "impact", "of", "Mueller", "cells", "on", "angiotensin", "II-mediated", "inflammatory", "responses", "observed", "in", "the", "early", "development", "of", "RVO", "is", "likely", "low", "when", "hypoxia", "plays", "a", "dominant", "role", "accompanied", "by", "induction", "of", "expression", "and", "secretion", "of", "the", "angiogenic", "and", "permeability-inducing", "growth", "factor", "VEGF-A", "(", "9", ")", ".", "In", "conclusion", ",", "the", "results", "of", "the", "present", "in", "vitro", "study", "provide", "evidence", "that", "the", "responses", "of", "Mueller", "cells", "to", "activation", "of", "the", "RAAS", "by", "angiotensin", "II", "depend", "on", "the", "environment", ":", "A", "pro-inflammatory", "response", "is", "observed", "under", "hyperglycemic", "(", "plus", "hypoxic", ")", "conditions", ",", "whereas", "changes", "induced", "by", "hypoxia", "are", "not", "modulated", "by", "angiotensin", "II.", "Source", "paper", ":", "PMC10442740" ]
[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]
[ "Introduction", "The", "introduction", "of", "antiretroviral", "therapy", "(", "ART", ")", "has", "successfully", "limited", "the", "spread", "of", "Human", "Immunodeficiency", "Virus", "(", "HIV", ")", "and", "improved", "patient", "clinical", "outcomes.", "However", ",", "a", "complete", "cure", "for", "HIV", "infection", "remains", "out", "of", "reach", ",", "as", "the", "transcriptionally", "silent", "but", "replication-competent", "provirus", "that", "is", "integrated", "into", "the", "host", "genome", "persists", "in", "long-lived", "cellular", "reservoirs", ",", "which", "are", "comprised", "of", "memory-resting", "CD4+", "T", "cells", ",", "as", "well", "as", "cells", "of", "myeloid", "lineages", "[", "1,2", "]", ".", "These", "reservoirs", "are", "highly", "stable", "and", "are", "resistant", "to", "both", "ART", "and", "the", "effects", "of", "the", "host", "immune", "surveillance", ",", "thus", "posing", "a", "significant", "obstacle", "to", "eradicating", "the", "HIV", "reservoirs.", "Consequently", ",", "in", "most", "people", "living", "with", "HIV", ",", "interrupting", "ART", "leads", "to", "rapid", "viral", "load", "rebound", ",", "usually", "within", "weeks", "after", "treatment", "cessation", "[", "3–6", "]", ".", "As", "T", "cell", "stimulation", "triggers", "activation", "of", "proviral", "transcription", ",", "one", "strategy", "that", "has", "been", "proposed", "to", "eliminate", "the", "HIV", "reservoirs", "is", "a", "“Shock-and-Kill”", "approach", ",", "which", "utilizes", "latency-reversing", "agents", "(", "LRAs", ")", "to", "first", "activate", "dormant", "HIV-infected", "T", "cells", "and", "facilitate", "cell", "death", "by", "viral", "cytopathic", "effects", "or", "immune-mediated", "killing.", "This", "step", "is", "done", "in", "the", "presence", "of", "ART", ",", "so", "there", "are", "no", "further", "rounds", "of", "HIV", "replication.", "[", "7–9", "]", ".", "Alternatively", ",", "a", "“Block", "and", "Lock”", "approach", "frees", "infected", "individuals", "from", "ART", "by", "silencing", "HIV", "transcription", "and", "inducing", "a", "deep", "state", "of", "latency.", "Nevertheless", ",", "despite", "promising", "therapeutic", "options", ",", "these", "strategies", "and", "others", "have", "regretfully", "failed", "to", "achieve", "significant", "clinical", "efficacy.", "These", "failures", "highlight", "our", "lack", "of", "knowledge", "of", "the", "molecular", "mechanisms", "that", "govern", "latency", "establishment", "and", "reversal", "and", "the", "need", "for", "alternative", "therapies", "capable", "of", "eliminating", "the", "viral", "reservoirs", "[", "10–15", "]", ".", "Epigenetic", "constraints", "that", "suppress", "proviral", "gene", "transcription", "are", "essential", "for", "establishing", "HIV", "latency", "[", "16,17", "]", ".", "Low", "levels", "of", "basal", "and", "elongating", "transcription", "factors", "in", "the", "infected", "T", "cell", ",", "together", "with", "the", "absence", "of", "the", "viral", "trans-activator", "of", "transcription", "(", "Tat", ")", ",", "ensure", "that", "proviral", "transcription", "remains", "below", "detectable", "thresholds", "[", "18,19", "]", ".", "Within", "the", "infected", "T", "cells", ",", "gene", "transcription", "of", "the", "integrated", "provirus", "and", "the", "host", "genome", "are", "synchronized", "[", "20,21", "]", ".", "Both", "display", "key", "steps", "of", "gene", "transcription", ",", "which", "include", "initiation", ",", "promoter", "arrest", ",", "and", "elongation.", "HIV-Tat", "orchestrates", "transcription", "elongation", "of", "the", "provirus", "by", "binding", "to", "TAR", "RNA", "and", "recruiting", "P-TEFb", "and", "Super", "Elongation", "Complex", "(", "SEC", ")", "to", "the", "viral", "promoter", "[", "22–26", "]", ".", "However", ",", "despite", "extensive", "efforts", "to", "elucidate", "the", "mechanisms", "of", "metazoan", "transcriptional", "control", "and", "its", "role", "in", "the", "regulation", "of", "HIV", "gene", "transcription", ",", "the", "knowledge", "of", "how", "HIV", "latency", "is", "established", "is", "still", "incomplete", "[", "27", "]", ".", "Long", "non-coding", "RNAs", "(", "lncRNAs", ")", "are", "transcripts", "with", "longer", "than", "200", "nucleotides", "that", "lack", "protein-coding", "capacity.", "To", "date", ",", "over", "200,000", "cell", "type-specific", "lncRNAs", "have", "been", "identified", "and", "display", "critical", "regulatory", "functions", "of", "many", "processes", "within", "cells", "[", "28–31", "]", ".", "However", ",", "the", "functions", "of", "most", "of", "these", "transcripts", "remain", "poorly", "understood.", "In", "the", "context", "of", "HIV", ",", "roles", "for", "several", "cellular", "lncRNAs", "have", "been", "documented", "[", "32–40", "]", ".", "Moreover", ",", "significant", "gaps", "still", "remain", "in", "our", "knowledge", "about", "the", "mechanistic", "roles", "that", "lncRNAs", "play", "in", "CD4", "T", "cell", "activation", "and", "HIV", "latency.", "In", "this", "study", ",", "we", "monitored", "changes", "in", "gene", "expression", "in", "an", "HIV-infected", "Jurkat-derived", "T", "cell", "line", "(", "J-Lat", "6.3", ")", "upon", "response", "to", "T", "cell", "stimulation", "with", "Phorbol", "12-myristate", "13-acetate—PMA", "/", "Ionomycin", "(", "P", "/", "I", ")", ".", "We", "documented", "RNA", "expression", "in", "stimulated", "J-Lat", "6.3", "cells", "that", "carry", "either", "active", "or", "cells", "latent", "HIV", ",", "and", "among", "identified", "ncRNA", ",", "Cytoskeleton", "Regulator", "RNA", "(", "CYTOR", ")", "exhibited", "a", "profound", "change", "in", "expression", "in", "cells", "that", "expressed", "active", "HIV", "following", "T", "cell", "stimulation.", "CYTOR", "directly", "binds", "the", "HIV", "promoter", "and", "activates", "viral", "gene", "transcription", "and", "latency", "reversal", "by", "recruiting", "P-TEFb", "to", "the", "viral", "promoter.", "CYTOR", "also", "exerts", "its", "effects", "indirectly", "by", "controlling", "global", "gene", "expression", "along", "with", "actin", "dynamic", "pathways", ",", "thereby", "affecting", "T", "cell", "activation", "and", "HIV", "infection.", "Results", "Discussion", "In", "search", "of", "regulators", "of", "HIV", "latency", ",", "we", "profiled", "changes", "in", "the", "expression", "of", "ncRNAs", "by", "employing", "RNA-Seq", "analysis", "in", "resting", "and", "stimulated", "HIV-infected", "J-Lat", "6.3", "T", "cells", ",", "comparing", "RNA", "expression", "levels", "in", "cells", "that", "carry", "active", "HIV", "(", "GFP+", ")", "or", "latent", "HIV", "(", "GFP-", ")", ".", "Our", "analysis", "show", "that", "different", "transcriptional", "profiles", "exist", "in", "cells", "where", "HIV", "is", "activated", "versus", "cells", "where", "it", "remains", "latent.", "CYTOR", "lncRNA", "was", "identified", "as", "one", "of", "these", "RNAs", ",", "and", "its", "expression", "is", "elevated", "upon", "T", "cell", "stimulation", ",", "where", "HIV", "is", "active.", "These", "observations", "were", "further", "confirmed", "in", "primary", "CD4+", "T", "cells", "(", "Fig", "1", ")", ".", "Functional", "analyses", "show", "that", "following", "T", "cell", "stimulation", ",", "over-expression", "of", "CYTOR", "activates", "HIV", "gene", "expression", ",", "while", "its", "depletion", "inhibits", "viral", "gene", "expression.", "Significantly", ",", "upon", "T", "cell", "stimulation", ",", "depletion", "of", "CYTOR", "promoted", "entry", "of", "HIV", "into", "a", "latent", "state", ",", "while", "its", "over-expression", "delayed", "entry", "into", "latency", "and", "enhanced", "latency", "reversal", "(", "Fig", "2", ")", ".", "Effects", "of", "CYTOR", "on", "HIV", "infection", "and", "latency", "establishment", "were", "also", "confirmed", "in", "stimulated", "primary", "CD4+", "T", "cells", "(", "Fig", "3", ")", ".", "We", "are", "aware", "that", "the", "model", "of", "stimulated", "CD4+", "primary", "cells", "does", "not", "recapitulate", "the", "actual", "state", "of", "the", "reservoir", ",", "which", "is", "mainly", "comprise", "of", "resting", "CD4+", "T", "cells", "that", "do", "not", "support", "HIV", "infection.", "As", "this", "is", "a", "limitation", "of", "the", "current", "study", ",", "we", "are", "trying", "to", "adopt", "a", "recently", "developed", "gene", "editing", "approach", "to", "lncRNAs", "to", "deplete", "CYTOR", "in", "this", "unique", "cell", "population", "and", "monitor", "the", "effects", "of", "latency", "kinetics", "without", "altering", "its", "activation", "[", "56", "]", ".", "Mechanistically", ",", "our", "observations", "show", "that", "CYTOR", "directly", "binds", "to", "the", "HIV", "promoter", "and", "enhances", "the", "phosphorylation", "of", "the", "Ser2", "CTD", "of", "RNAPII", "through", "association", "with", "P-TEFb", "to", "activate", "viral", "gene", "expression", "(", "Figs", "4", "and", "5", ")", ".", "Changes", "in", "histone", "activation", "marks", "around", "the", "viral", "promoter", "in", "CYTOR-depleted", "cells", "also", "imply", "that", "CYTOR", "activates", "the", "proviral", "gene", "expression", "(", "Fig", "4", ")", ".", "In", "addition", "to", "the", "direct", "effects", "of", "CYTOR", "on", "HIV", "gene", "expression", ",", "we", "also", "demonstrate", "that", "CYTOR", "controls", "global", "gene", "expression.", "CYTOR", "is", "recruited", "to", "other", "gene", "promoters", "that", "are", "regulated", "by", "P-TEFb", ",", "like", "myc", ",", "NF-κB", ",", "and", "IL2Ra", "(", "S3", "Fig", ")", ".", "Among", "the", "identified", "enriched", "pathways", "that", "potentially", "are", "regulated", "by", "CYTOR", "are", "those", "that", "are", "involved", "in", "actin", "dynamics.", "Consistently", ",", "reduced", "levels", "of", "CYTOR", "expression", "are", "associated", "with", "reduced", "polymerization", "of", "cortical", "actin", "in", "response", "to", "TCR", "engagement", "(", "Fig", "6", ")", ".", "In", "turn", ",", "elevated", "levels", "of", "CYTOR", "do", "not", "further", "increase", "actin", "polymerization", "in", "response", "to", "T", "cell", "stimulation", "and", "can", "not", "induce", "morphological", "responses", "of", "T", "cells", "in", "the", "absence", "of", "stimulation", "(", "S5", "Fig", ")", ".", "Thus", ",", "CYTOR", "is", "an", "important", "regulator", "of", "TCR-induced", "actin", "polymerization", "in", "T", "cells.", "However", ",", "its", "normal", "endogenous", "expression", "levels", "are", "sufficient", "for", "a", "proper", "response.", "To", "test", "a", "mechanistic", "link", "between", "actin", "remodeling", ",", "CYTOR", "levels", ",", "and", "HIV", "gene", "expression", ",", "we", "inhibited", "actin", "dynamics", "with", "specific", "inhibitors", "(", "Fig", "6I", ")", ".", "Effects", "of", "inhibition", "of", "actin", "polymerization", "phenocopied", "the", "effect", "of", "CYTOR", "depletion", "on", "HIV", "gene", "expression", ",", "suggesting", "that", "CYTOR", "may", "affect", "HIV", "gene", "expression", "by", "the", "regulation", "of", "genes", "that", "control", "cellular", "actin", "dynamics", "(", "Fig", "6I", ")", ".", "Accordingly", ",", "we", "propose", "a", "model", "where", "CYTOR", "exerts", "its", "effects", "on", "global", "gene", "expression", "and", "promotes", "HIV", "gene", "expression", "by", "both", "direct", "and", "indirect", "effects", "(", "Fig", "7", ")", ".", "CYTOR", "directly", "binds", "the", "HIV", "promoter", "and", "recruits", "the", "elongation", "transcription", "machinery", "to", "enhance", "RNAPII", "CTD", "phosphorylation", "and", "deposition", "of", "active", "histone", "markers", "around", "the", "HIV", "promoter", ",", "ultimately", "activating", "HIV", "gene", "expression.", "Indirectly", ",", "CYTOR", "controls", "gene", "targets", "that", "regulate", "actin", "dynamics", "in", "the", "nucleus", "and", "at", "the", "plasma", "membrane", "to", "optimize", "the", "response", "to", "T", "cell", "activation", ",", "presumably", "via", "the", "regulation", "of", "cellular", "gene", "expression.", "10.1371", "/", "journal.ppat.1012172.g007Fig", "7***A", "working", "model", "for", "CYTOR", "functions.***", "Following", "T", "cell", "activation", ",", "levels", "of", "CYTOR", "are", "elevated", "in", "the", "nucleus.", "CYTOR", "is", "recruited", "to", "the", "HIV", "promoter", "and", "binds", "to", "P-TEFb", ",", "leading", "to", "the", "activation", "of", "viral", "gene", "expression.", "Cellular", "genes", "regulated", "by", "CYTOR", "include", "actin", "remodeling", "genes", "that", "promote", "actin", "polymerization", "and", "the", "indirect", "activation", "of", "HIV", "gene", "expression.", "Like", "CYTOR", ",", "other", "lncRNAs", "have", "been", "reported", "to", "occupy", "the", "HIV", "promoter", "and", "modulate", "its", "activity", "at", "either", "transcriptional", "or", "posttranscriptional", "levels", "[", "57", "]", ".", "Most", "act", "as", "scaffolds", "that", "associate", "with", "other", "transcriptional", "activators", "or", "repressors", "to", "control", "HIV", "gene", "expression", "[", "35–39,58–60", "]", ".", "In", "the", "case", "of", "CYTOR", ",", "its", "effects", "on", "gene", "expression", "occur", "by", "recruiting", "the", "transcription", "elongation", "machinery", "to", "activate", "gene", "expression", ",", "either", "from", "the", "viral", "promoter", "or", "other", "cellular", "promoters.", "It", "will", "be", "essential", "to", "identify", "other", "partners", "that", "are", "associated", "with", "CYTOR", "lncRNA", "and", "control", "HIV", "promoter", "activity.", "As", "we", "also", "aim", "to", "dissect", "the", "role", "of", "CYTOR", "in", "gene", "expression", "control", ",", "specifically", "for", "HIV", "gene", "regulation", ",", "it", "will", "be", "essential", "to", "define", "how", "events", "within", "the", "nucleus", "are", "regulated", "by", "CYTOR", "and", "translated", "to", "the", "control", "of", "downstream", "effector", "functions", "of", "stimulated", "T", "cells.", "Future", "studies", "will", "further", "identify", "the", "downstream", "targets", "of", "CYTOR", "that", "control", "actin", "dynamics", "upon", "T-cell", "activation.", "As", "additional", "pathways", "were", "identified", "by", "our", "RNA-seq", "analysis", "in", "CYTOR-depleted", "cells", ",", "we", "visualize", "that", "future", "work", "will", "identify", "novel", "downstream", "targets", "of", "CYTOR", "and", "elucidate", "their", "mechanisms", "of", "function", "in", "regulating", "HIV", "gene", "expression", "and", "latency.", "These", "may", "open", "new", "ways", "for", "developing", "novel", "therapeutic", "tools", "that", "will", "be", "integrated", "or", "substitute", "current", "strategies", "to", "successfully", "eliminate", "the", "HIV", "reservoir.", "Materials", "and", "methods", "Analysis", "of", "actin", "dynamics", "in", "response", "to", "t", "cell", "activation", "Actin", "remodeling", "in", "response", "to", "T", "cell", "receptor", "(", "TCR", ")", "engagement", "was", "monitored", "by", "forming", "circumferential", "F-actin", "rings", "as", "previously", "described", "[", "61,62", "]", ".", "In", "brief", ",", "stimulatory", "coverslips", "were", "prepared", "by", "coating", "with", "a", "0.01", "%", "poly-L-lysine", "(", "PLL", ";", "Sigma", ")", "solution", "for", "10", "minutes", "at", "room", "temperature", ",", "followed", "by", "wet-chamber", "incubation", "for", "3", "hours", "at", "37°C", "with", "7", "μg", "/", "ml", "anti-CD3", "antibody", "(", "50", "μl", "per", "coverslip", ",", "clone", "HIT3a", "against", "CD3E", ";", "BD", "Biosciences", ")", "in", "phosphate-buffered", "saline", "(", "PBS", ")", ".", "Stimulatory", "coverslips", "were", "subsequently", "washed", "in", "PBS", "and", "stored", "at", "4°C", "in", "PBS", "until", "use.", "5x105", "cells", "per", "anti-CD3-coated", "coverslip", ",", "respectively", ")", "were", "used", "to", "seed", "coverslips", "for", "4", "minutes", "to", "allow", "TCR-mediated", "actin", "ring", "formation.", "Cells", "were", "subsequently", "fixed", "in", "3", "%", "paraformaldehyde", "for", "15", "minutes", ",", "permeabilized", "for", "2", "minutes", "in", "0.1", "%", "TritonX-100", ",", "and", "blocked", "for", "30", "minutes", "in", "1", "%", "Fetal", "Calf", "Serum", "(", "FCS", ")", "in", "PBS.", "F-actin", "was", "visualized", "with", "tetramethyl", "rhodamine", "isothiocyanate", "(", "TRITC", ")", "-conjugated", "phalloidin", "(", "1:1,000", ",", "1", "hour", ",", "room", "temperature", ";", "Sigma", ")", ".", "Samples", "were", "mounted", "on", "glass", "slides", "and", "analyzed", "by", "epifluorescence", "(", "Olympus", "IX81", "S1F-3", ",", "cellM", "software", ")", "and", "confocal", "(", "spinning-disc", "PerkinElmer", "UltraView", "VoX", ",", "Velocity", "software", ")", "microscopes.", "For", "quantification", "of", "phenotype", "frequencies", ",", "at", "least", "100", "transfected", "cells", "were", "counted.", "Chromatin", "immunoprecipitation", "(", "chip", ")", "analysis", "Control", "cells", "expressing", "scramble", "shRNA", "or", "cells", "where", "CYTOR", "expression", "was", "depleted", "(", "KD", ")", "were", "cross-linked", "with", "1", "%", "formaldehyde", "for", "10", "minutes", "and", "then", "washed", "with", "PBS", "and", "reverse", "cross-linked", "with", "glycine", "(", "125mM", ";", "5", "minutes", ")", ".", "Cells", "were", "then", "lysed", "for", "10", "minutes", "on", "ice", "in", "130μl", "sonication", "buffer", "(", "20", "mM", "Tris", "pH-7.8", ",", "2", "mM", "EDTA", ",", "0,5", "%", "SDS", ",", "0.5", "mM", "phenylmethylsulfonyl", "fluoride", "(", "PMSF", ")", ",", "and", "1", "%", "protease", "inhibitor", "cocktail", ")", ",", "and", "the", "nuclear", "pellets", "were", "collected.", "DNA", "was", "fragmented", "by", "sonication", "at", "the", "following", "settings", ":", "amplitude", "20", "%", "for", "30", "cycles", "at", "10", "seconds", "on", "/", "10", "seconds", "off.", "Samples", "were", "centrifuged", "(", "15", "minutes", ",", "14,000", "rpm", ",", "4°C", ")", ".", "The", "soluble", "chromatin", "fraction", "(", "25", "μg", ")", "was", "collected", "and", "immunoprecipitated", "(", "IP", ")", "overnight", "at", "4°C", "on", "a", "rotating", "wheel", "in", "IP", "buffer", "(", "0.5", "%", "Triton", "X-100", ",", "2", "mM", "EDTA", ",", "20", "mM", "Tris", "pH-7.8", ",", "150", "mM", "NaCl", "and", "10", "%", "glycerol", ")", "with", "2.5", "μg", "of", "one", "of", "the", "indicated", "antibodies.", "The", "next", "day", ",", "the", "IP", "material", "was", "incubated", "with", "25", "μl", "dynabeads", "protein", "G", "for", "two", "hours", "to", "ensure", "the", "binding", "of", "the", "antibody", "to", "the", "magnetic", "beads.", "DNA", "was", "eluted", "with", "freshly", "prepared", "elution", "solution", "(", "1", "%", "SDS", "and", "0.1", "M", "NaHCO3", ")", "and", "heated", "at", "65°C", "overnight", "to", "reverse-crosslink", "the", "samples.", "Precipitated", "DNA", "fragments", "were", "then", "extracted", "using", "a", "ChIP", "DNA", "clean", "and", "concentrator", "kit", "(", "ZYMO", "Research", ")", ",", "and", "HIV", "DNA", "levels", "were", "quantified", "by", "qPCR", "with", "the", "primers", "specifically", "located", "on", "the", "NFκB", "region", "at", "the", "HIV-LTR", "promoter.", "All", "signals", "were", "normalized", "relative", "to", "input", "DNA.", "ChIP", "assays", "were", "also", "performed", "with", "an", "anti-rabbit", "or", "mouse", "IgG", "as", "negative", "control.", "Primers", "used", "for", "qpcr", "analysis", "Primers", "on", "the", "HIV", "promoter", ":", "NFκB", "forward", ":", "5’", "-", "AGGTTTGACAGCCGCCTA", "-3’", "NFκB", "Reverse", ":", "5’", "-", "AGAGACCCAGTACAGGCAAAA", "-3’", "gapdh", "Forward", ":", "5’", "-", "AGCCACATCGCTCAGACAC", "-3’", "gapdh", "Reverse", ":", "5’", "-", "GCCCAAACGACCAAATCC", "-3’", "Primers", "for", "CYTOR", ":", "Forward", ":", "5’-", "AACTTGCCAGCCTCCATC", ";", "Reverse", ":", "5’-", "GAGCTTCCTGTTTCATCTCCC", "Primers", "for", "7SK", ":", "Forward", ";", "5‘-", "GAGGGCGATCTGGCTGCGACAT", "Reverse", ":", "5‘-", "ACATGGAGCGGTGAGGGAGGAA", "Source", "paper", ":", "PMC11075828" ]
[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]
[ "Results", "Dcas9-targeted", "hiv-1", "ltr-interactome", "analysis", "identified", "prmt3", "as", "a", "ltr-binding", "factor", "Seeking", "host", "factors", "that", "specifically", "associate", "with", "the", "HIV-1", "LTR", ",", "we", "conducted", "an", "LTR-interacted", "proteome", "analysis", "based", "on", "a", "refined", "version", "of", "a", "previously", "described", "nuclease-deficient", "Cas9", "(", "dCas9", ")", "-targeted", "chromatin-based", "purification", "strategy", "(", "CLASP", ")", "(", "Cas9", "locus-associated", "proteome", ")", "(", "Fig.", "1a", ")", "33,34.", "The", "screen", "used", "NH1", "cells", ",", "which", "is", "a", "modified", "HeLa", "cell", "line", "that", "harbors", "an", "integrated", "HIV-1", "LTR-driven", "luciferase", "reporter", "gene", "in", "the", "host", "genome35", "(", "Fig.", "1b", ")", ".", "To", "get", "the", "most", "effective", "sgRNAs", "that", "target", "LTR", ",", "we", "used", "two", "methods", "for", "screening.", "We", "individually", "inserted", "the", "sgRNAs", "into", "the", "Cas9", "plasmid", ",", "which", "was", "then", "co-transfected", "with", "a", "Tat-expression", "plasmid", "into", "NH1", "cells", "that", "harbors", "the", "LTR-driven", "luciferase", "reporter", "gene.", "If", "a", "sgRNA-Cas9", "combination", "can", "target", "and", "disrupt", "the", "LTR", "sequence", ",", "a", "reduction", "in", "luciferase", "activity", "is", "observed.", "We", "designed", "seven", "sgRNAs", "targeting", "different", "regions", "of", "the", "HIV-1", "LTR", "(", "Fig.", "1b", ")", ".", "An", "sgRNA", "targeting", "the", "yeast", "Gal4", "gene", "was", "used", "as", "the", "negative", "control.", "Among", "the", "designed", "sgLTRs", ",", "the", "top", "three", "sgLTRs", "(", "#", "5", ",", "6", ",", "7", "in", "pink", ",", "Fig.", "1b", ")", "exhibiting", "the", "capacity", "to", "attenuate", "the", "LTR", "driven-luciferase", "expression", "activated", "by", "HIV-1", "Tat", "(", "Fig.", "1c", ")", ".", "Then", ",", "we", "performed", "anti-Flag", "ChIP-qPCR", "in", "cells", "transfected", "with", "the", "sgLTRs-dCas9-3", "×", "Flag", "plasmids", "to", "further", "verify", "the", "abilities", "of", "the", "sgLTRs", "to", "target", "dCas9-3", "×", "Flag", "to", "the", "LTR", ",", "and", "found", "that", "sgLTR-1", "and", "-2", "failed", "to", "recruit", "dCas9", "to", "LTR", "efficiently", "(", "Supplementary", "Fig.", "1a", ",", "b", ")", ",", "sgLTR-5", "and", "-6", "displayed", "the", "most", "significant", "effect", ",", "whereas", "sgLTR-3", ",", "-4", "and", "-7", "all", "displayed", "a", "similar", "and", "partial", "effect", "(", "Supplementary", "Fig.", "1c", ",", "d", ")", ".", "Thus", ",", "sgLTR-5", ",", "-6", ",", "-7", "were", "selected", "for", "subsequent", "ChIP-qPCR", "analysis.", "By", "utilizing", "the", "combination", "of", "the", "three", "sgRNAs", ",", "we", "found", "that", "in", "comparison", "to", "sgGal4", ",", "these", "sgRNAs", "can", "guide", "dCas9", "to", "the", "LTR", "as", "revealed", "by", "ChIP-qPCR", "analysis", "(", "Fig.", "1d", ")", ".", "Next", ",", "we", "performed", "in", "vitro", "transcription", "reactions", "to", "generate", "these", "sgRNAs", ",", "which", "were", "then", "used", "for", "dCas9", "/", "sgRNAs", "complex", "formation.", "This", "complex", "was", "subsequently", "incubated", "with", "sheared", "chromatin", "that", "contained", "the", "LTR-bound", "proteins", "for", "dCas9-3", "×", "Flag", "immunoprecipitation", ",", "following", "with", "mass", "spectrometry", "analysis.Fig.", "1***dCas9-targeted", "HIV-1", "LTR-interactome", "analysis", "identified", "PRMT3", "as", "a", "LTR-binding", "factor.***", "a", "Schematic", "of", "dCas9-targeted", "proteome", "analysis", "workflow.", "(", "1", ")", "sgRNAs", "targeting", "the", "LTR", "were", "complex", "formation", "with", "dCas9-3", "×", "Flag", ";", "(", "2", ")", "Crosslinking", "of", "proteins", "bound", "to", "the", "LTR", ";", "(", "3", ")", "dCas9-3", "×", "Flag-sgRNA", "complex", "was", "incubated", "with", "sheared", "fragments", "from", "NH1", "cells", "that", "stably", "expressed", "LTR-luciferase", "reporter", ";", "(", "4", ")", "Immunoprecipitation", "was", "used", "to", "capture", "LTR", "bound", "proteins", ";", "(", "5", ")", "LTR-interacted", "proteins", "were", "identified", "by", "mass", "spectrometry.", "b", "Schematic", "of", "the", "position", "of", "7", "sgRNAs.", "c", "Luciferase", "activity", "was", "measured", "in", "NH1", "cells", "transfected", "with", "a", "plasmid", "encoding", "each", "sgRNA", "and", "control", "sgRNA", "(", "sgGal4", ")", ",", "which", "expresses", "the", "Cas9", "in", "the", "presence", "of", "Tat", "(", "p", "=", "0.0016", ",", "p", "=", "0.0024", ",", "p", "=", "0.0042", ")", ".", "d", "ChIP-qPCR", "analyses", "were", "conducted", "to", "assess", "the", "occupancy", "of", "3", "×", "Flag-dCas9", "at", "the", "Promoter", "(", "Left", ")", "or", "Nascent", "region", "(", "Right", ")", "of", "LTR", "when", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "plasmid", ",", "a", "mixture", "of", "plasmids", "containing", "sgLTRs-5", ",", "6", ",", "7", "or", "the", "sgGal4", "plasmid", "(", "Promoter", ":", "p", "=", "0.0009", ",", "p", "=", "0.0011", ",", "Nascent", ":", "p", "=", "0.000004", ",", "p", "=", "0.000003", ")", ".", "e", "Proteins", "showing", "over", "1.5-fold", "enrichment", "relative", "to", "the", "control", "sample", "identified", "from", "3", "×", "Flag-dCas9", "immunoprecipitation", "following", "by", "mass", "spectrometry", "analysis", "were", "listed.", "f", "ChIP-qPCR", "analyses", "were", "conducted", "to", "assess", "the", "occupancy", "of", "PRMT3", "at", "LTR-luciferase", "region", "(", "p", "=", "0.0001", ",", "p", "=", "0.0012", ",", "p", "=", "0.0005", ",", "p", "=", "0.0008", ")", ".", "The", "schematic", "display", "of", "the", "four", "primers", "was", "shown", "on", "the", "top", "of", "the", "panel.", "g", "ChIP-qPCR", "analyses", "were", "conducted", "to", "assess", "the", "occupancy", "of", "PRMT3", "at", "LTR-luciferase", "regions", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "Tat", "(", "p", "=", "0.0022", ",", "p", "=", "0.0012", ",", "p", "=", "0.0045", ",", "p", "=", "0.0017", ")", ".", "h", "CUT", "&", "Tag", "sequencing", "was", "performed", "in", "primary", "CD4+", "T", "cells", "isolated", "from", "virologically", "suppressed", "HIV-1-infected", "patient", "cells", "that", "were", "treated", "with", "PMA", ",", "by", "using", "IgG", "or", "PRMT3", "antibody.", "The", "alignment", "results", "of", "sequencing", "with", "the", "HIV-1", "genome", "in", "three", "patients", "were", "displayed.", "Error", "bars", "=", "mean", "+", "/", "−", "SD", "of", "three", "biological", "replicates.", "*p", "p", "p", "t", "test.", "Source", "data", "are", "provided", "as", "a", "Source", "Data", "file.", "Mass", "spectrometry", "detected", "a", "total", "of", "28", "proteins", "with", "at", "least", "1.5-fold", "enrichment", "relative", "to", "the", "non-targeting", "negative", "control", "(", "Fig.", "1e", "and", "Supplementary", "Data", "1", ")", ".", "PRMT3", ",", "which", "has", "been", "shown", "to", "function", "in", "transcriptional", "regulation", "and", "antiviral", "innate", "immunity15,30,36", ",", "was", "among", "the", "hits", "with", "the", "highest", "fold", "enrichment", "of", "sgLTR", "/", "sgGal4", ",", "and", "was", "therefore", "selected", "for", "subsequent", "investigation.", "We", "performed", "ChIP-qPCR", "analysis", "to", "examine", "the", "binding", "of", "PRMT3", "to", "the", "LTR.", "PRMT3", "was", "significantly", "enriched", "at", "LTR-luciferase", "reporter", "region", "(", "Fig.", "1f", ")", ",", "which", "can", "be", "further", "increased", "in", "the", "presence", "of", "Tat", "(", "Fig.", "1g", ")", ".", "The", "binding", "of", "PRMT3", "at", "the", "LTR", "was", "also", "verified", "in", "Jurkat", "2D10", "cells", "(", "Supplementary", "Fig.", "2", ")", ".", "Notably", ",", "we", "performed", "Cleavage", "Under", "Targets", "&", "Tagmentation", "(", "CUT", "&", "Tag", ")", "sequencing", "by", "using", "IgG", "or", "PRMT3", "antibody", "in", "CD4+", "T", "cells", "isolated", "from", "HIV-1", "infected", "patient", "cells", ",", "and", "demonstrated", "that", "while", "IgG", "displayed", "undetectable", "signal", "at", "the", "LTR", ",", "PRMT3", "showed", "significant", "binding", "signal", "around", "LTR", "(", "Fig.", "1h", ")", ".", "Thus", ",", "these", "results", "demonstrated", "that", "PRMT3", "is", "an", "HIV-1", "LTR", "binding", "factor", ",", "which", "is", "further", "enhanced", "in", "the", "presence", "of", "Tat.", "Discussion", "The", "elusive", "nature", "of", "latent", "HIV-1", "reservoirs", "presents", "a", "formidable", "challenge", "to", "eradicating", "the", "virus", "from", "infected", "individuals49–51.", "Despite", "the", "various", "strategies", "employing", "either", "the", "latency", "reversal", "agents", "(", "LRAs", ")", "or", "latency", "promoting", "agents", "(", "LPAs", ")", ",", "which", "are", "aimed", "at", "either", "purging", "or", "deeply", "silencing", "the", "latent", "viral", "reservoirs", ",", "these", "agents", "have", "yet", "to", "be", "made", "into", "effective", "drugs", "for", "curing", "HIV", "/", "AIDS", "and", "targets", "are", "still", "needed", "for", "the", "development", "of", "therapies.", "Furthermore", ",", "the", "premise", "of", "using", "the", "current", "and", "future", "versions", "of", "LRAs", "or", "LPAs", "for", "treating", "HIV-1", "hinges", "on", "the", "potential", "to", "epigenetically", "modulate", "the", "HIV-1", "promoter", "activity", ",", "aiming", "for", "a", "sustained", "activation", "or", "suppression", "of", "viral", "transcription", ",", "respectively52–54.", "The", "significance", "of", "targeting", "epigenetic", "control", "of", "viral", "transcription", "was", "highlighted", "recently", "in", "a", "human", "clinical", "trial", ",", "where", "the", "combination", "of", "panobinostat", ",", "a", "potent", "pan-histone", "deacetylase", "inhibitor", ",", "with", "interferon-α2a", "resulted", "in", "an", "enhanced", "vulnerability", "of", "latent", "HIV-1", "reservoir", "cells", ",", "underscoring", "the", "pivotal", "role", "of", "epigenetic", "manipulation", "in", "combating", "HIV-1", "persistence2.", "In", "the", "current", "study", ",", "by", "performing", "the", "dCas9-targeted", "LTR", "interactome", "screening", ",", "we", "have", "identified", "PRMT3", "as", "a", "positive", "regulator", "to", "promote", "HIV-1", "latency", "reversal.", "Mechanistically", ",", "PRMT3", "activates", "HIV-1", "transcription", "by", "interaction", "with", "TEAD4", "and", "the", "two", "proteins", "co-localize", "at", "the", "LTR", "by", "using", "specific", "TEAD4-binding", "motifs", ",", "thereby", "regulating", "chromatin", "accessibility", "and", "facilitating", "P-TEFb", "/", "Tat", "recruitment.", "Thus", ",", "our", "findings", "propose", "a", "promising", "epigenetic", "strategy", "to", "combat", "latent", "HIV-1", "infection", ",", "underscoring", "PRMT3", "and", "its", "partners", "as", "promising", "therapeutic", "targets", "for", "anti-HIV-1", "drug", "development.", "Our", "study", "demonstrates", "TEAD4", "as", "a", "positive", "regulator", "of", "HIV-1", "transcription", ",", "acting", "alongside", "PRMT3", "through", "a", "specific", "interaction", "with", "the", "LTR’s", "GGAAT", "motif.", "This", "discovery", "expands", "our", "current", "understanding", "of", "TEAD4’s", "regulatory", "roles", "in", "host", "cells", "and", "suggests", "its", "potential", "regulation", "of", "HIV-1", "viral", "expression.", "The", "specificity", "of", "TEAD4’s", "interaction", "with", "the", "motif", "containing", "the", "core", "GGAAT", "sequence", "within", "the", "HIV-1", "LTR", "and", "its", "synergy", "with", "PRMT3", "in", "promoting", "Tat-dependent", "HIV-1", "transcription", "and", "a", "specific", "subset", "of", "host", "gene", "transcription", "is", "particularly", "intriguing", "given", "TEAD4’s", "established", "roles", "in", "cell", "survival", ",", "proliferation", ",", "tissue", "regeneration", ",", "stem", "cell", "maintenance", ",", "embryonic", "trophoblast", "and", "organ", "development", "and", "tumorigenesis9,11,13,14,55.", "Specifically", ",", "we", "selected", "three", "host", "genes", ",", "PRDM1", ",", "SLITRK5", ",", "and", "TGFB2", ",", "for", "further", "validation", "of", "our", "proposed", "PRMT3-TEAD4", "regulation", "model.", "Our", "data", "demonstrate", "that", "in", "addition", "to", "the", "HIV-1", "LTR", ",", "PRMT3", "and", "TEAD4", "indeed", "associated", "with", "these", "cellular", "gene", "promoters", ",", "where", "the", "binding", "of", "TEAD4", "significantly", "decreases", "after", "the", "depletion", "of", "PRMT3", ",", "suggesting", "a", "common", "regulatory", "mechanism", "involving", "the", "PRMT3-TEAD4", "complex", "that", "exists", "at", "the", "HIV-1", "LTR", ",", "as", "well", "as", "the", "promoters", "of", "selected", "host", "genes.", "At", "the", "HIV-1", "LTR", ",", "the", "interaction", "of", "the", "PRMT3-TEAD4", "complex", "with", "Tat", "and", "the", "P-TEFb", "provides", "further", "regulation", "of", "HIV-1", "transcription.", "On", "cellular", "gene", "promoters", "such", "as", "the", "three", "genes", "mentioned", "above", ",", "it", "is", "conceivable", "that", "transcription", "can", "also", "be", "modulated", "through", "controlling", "the", "function", "and", "/", "or", "binding", "of", "the", "PRMT3-TEAD4", "complex", "to", "the", "GGAAT", "motif", "in", "response", "to", "changes", "in", "physiological", "or", "pathological", "conditions.", "This", "co-regulation", "of", "viral", "and", "host", "gene", "transcription", "by", "PRMT3-TEAD4", "underscores", "a", "finely", "tuned", "regulatory", "mechanism", "that", "integrates", "the", "cellular", "and", "viral", "transcriptional", "control.", "Furthermore", ",", "TEAD4", "has", "also", "been", "demonstrated", "to", "interact", "with", "P-TEFb", ",", "which", "is", "the", "core", "transcriptional", "component", "of", "the", "Super", "Elongation", "Complex", "(", "SEC", ")", "essential", "for", "Tat-activated", "HIV-1", "transcription.", "Given", "the", "fact", "that", "TEAD4", "is", "a", "DNA", "sequence-specific", "transcription", "factor", ",", "it", "remains", "to", "be", "investigated", "whether", "it", "plays", "a", "key", "role", "in", "recruiting", "SEC", "to", "both", "host", "and", "HIV-1", "gene", "promoters", "that", "contain", "the", "TEAD4-binding", "motif.", "While", "previous", "studies", "have", "indicated", "PRMT3’s", "involvement", "as", "a", "key", "factor", "in", "mediating", "host", "responses", "to", "viral", "infection17,30", ",", "its", "specific", "role", "in", "HIV-1", "infection", "and", "latency", "remains", "largely", "unexplored.", "For", "instance", ",", "in", "zebrafish", ",", "PRMT3", "has", "been", "shown", "to", "negatively", "regulate", "antiviral", "responses17.", "Similarly", ",", "recent", "studies", "utilizing", "the", "PRMT3", "inhibitor", ",", "SGC707", "treatment", ",", "or", "PRMT3", "knockout", "mice", "have", "revealed", "PRMT3’s", "facilitation", "of", "HSV-1", "infection30.", "In", "conjunction", "with", "our", "current", "discovery", "demonstrating", "PRMT3’s", "promotion", "of", "HIV-1", "transcription", "to", "reverse", "latency", ",", "these", "findings", "suggest", "that", "PRMT3", "may", "serve", "as", "a", "potential", "target", "for", "broad-spectrum", "antiviral", "drugs.", "However", ",", "future", "comprehensive", "research", "is", "imperative", "to", "fully", "comprehend", "the", "extent", "of", "PRMT3’s", "involvement", "in", "mediating", "viral-host", "interactions.", "It", "is", "noteworthy", "that", "besides", "PRMT3", ",", "other", "PRMTs", "have", "also", "been", "implicated", "in", "regulating", "anti-HIV", "activity.", "For", "instance", ",", "PRMT6", "has", "been", "shown", "to", "inhibit", "HIV-1", "replication", "in", "vitro", "by", "directly", "methylating", "several", "HIV-1", "proteins", ",", "including", "Tat", ",", "Rev", ",", "and", "nucleocapsid", "protein", ",", "thereby", "interfering", "with", "their", "functions56,57.", "Similarly", ",", "PRMT2", "was", "recently", "discovered", "to", "suppress", "HIV-1", "transcription", "by", "methylating", "Tat", "and", "promoting", "the", "phase", "separation", "of", "P-TEFb", "and", "Tat58.", "Thus", ",", "in", "addition", "to", "PRMT3", ",", "other", "members", "of", "the", "PRMT", "family", "should", "be", "explored", "as", "potential", "targets", "for", "developing", "effective", "antiviral", "drugs.", "In", "addition", "to", "its", "effects", "on", "viral", "gene", "expression", ",", "PRMT3’s", "regulation", "of", "host", "gene", "transcription", "has", "been", "implicated", "in", "various", "cellular", "processes", ",", "including", "tumorigenesis", ",", "oxaliplatin", "resistance", "in", "liver", "cancer", ",", "retinoic", "acid", "signaling", ",", "and", "hepatic", "lipogenesis18,20,28,29,59,60.", "However", ",", "the", "precise", "mechanism", "(", "s", ")", "underlying", "these", "transcriptional", "effects", "of", "PRMT3", "remain", "unclear.", "In", "this", "study", ",", "the", "comparison", "of", "ATAC-Seq", "and", "RNA-Seq", "data", "between", "WT", "and", "PRMT3", "KO", "cells", "reveals", "that", "PRMT3", "selectively", "regulates", "chromatin", "accessibility", "and", "transcription", "of", "a", "small", "subgroup", "of", "human", "genes", ",", "including", "some", "well-studied", "genes", "such", "as", "TGFB2", ",", "which", "is", "relevant", "to", "the", "potential", "pathogenic", "effects", "of", "PRMT3", "in", "tumorigenesis.", "The", "selectivity", "of", "PRMT3’s", "action", "is", "apparently", "achieved", "through", "forming", "a", "complex", "with", "TEAD4", ",", "which", "then", "co-localizes", "at", "specific", "gene", "promoter", "regions", "via", "binding", "to", "the", "TEAD4-recognition", "motif.", "Together", ",", "these", "findings", "have", "revealed", "the", "mechanistic", "basis", "for", "PRMT3’s", "control", "of", "the", "transcription", "of", "HIV-1", "and", "a", "selected", "group", "of", "host", "genes.", "Although", "the", "PRMT3-created", "transcription", "hub", "containing", "TEAD4", "and", "P-TEFb", "is", "demonstrated", "in", "the", "current", "study", "as", "important", "for", "HIV-1", "to", "escape", "latency", ",", "it", "is", "presently", "unknown", "whether", "it", "also", "plays", "a", "role", "during", "the", "establishment", "of", "latency.", "It", "is", "conceivable", "that", "the", "loss", "of", "expression", "/", "function", "of", "any", "component", "of", "the", "hub", "could", "be", "responsible", "in", "this", "latter", "process.", "Further", "studies", "are", "thus", "necessary", "to", "test", "this", "hypothesis", "and", "explore", "the", "possibility", "of", "targeting", "the", "PRMT3", "transcription", "hub", "to", "cure", "HIV", "/", "AIDS.", "Methods", "Dcas9-targeted", "ltr", "proteome", "analysis", "One", "million", "NH1", "cells", "with", "an", "integrated", "with", "HIV-1", "5’", "LTR-driven", "luciferase", "reporter", "construct", ",", "which", "contains", "424", "bp", "of", "LTR.", "Cells", "were", "fixed", "with", "1", "%", "formaldehyde", "for", "15", "min", "at", "room", "temperature", "and", "0.125", "M", "Glycine", "for", "5", "min", "to", "quench", "unreacted", "formaldehyde", "at", "room", "temperature.", "Use", "20", "ml", "of", "cold", "PBS", "to", "wash", "cells", "twice.", "Scrape", "cells", "with", "2", "ml", "cold", "PBS", "containing", "protease", "inhibitor", "and", "dithiothreitol", "(", "DTT", ")", ".", "Spin", "at", "700", "×", "g", "at", "4", "°C", "for", "3", "min", "to", "pellet", "cells.", "Cells", "were", "lysed", "with", "lysis", "buffer", "[", "1", "%", "SDS", ",", "10", "mM", "EDTA", ",", "50", "mM", "Tris", ",", "pH", "8.1", "]", "and", "incubated", "on", "ice", "for", "20", "min.", "Cells", "were", "sheared", "with", "a", "Covaris", "sonicator", "M220", "until", "genomic", "DNA", "was", "visualized", "to", "be", "at", "200–1000", "bp.", "The", "DNA", "was", "cleared", "with", "a", "high-speed", "spin", "(", "15,000", "g", "for", "10", "min", ")", "at", "4", "°C.", "The", "DNA", "was", "diluted", "by", "ChIP", "Dilution", "Buffer", "[", "0.01", "%", "SDS", ",", "1", "%", "Triton", "X-100", ",", "1.2", "mM", "EDTA", ",", "16.7", "mM", "Tris-HCl", ",", "pH", "8.1", ",", "167", "mM", "NaCl", "]", ".", "dCas9-3", "×", "Flag", "/", "sgRNAs", "complex", "was", "added", "to", "the", "sheared", "DNA", "and", "incubated", "at", "4", "°C", "overnight.", "The", "anti-Flag", "M2", "agarose", "resin", "(", "Sigma", ")", "was", "added", ",", "followed", "by", "a", "3", "h", "incubation", "at", "4", "°C.", "The", "resin", "was", "spun", "down", "at", "1500", "×", "g", "at", "4", "°C", "for", "1", "min", "and", "washed", "with", "high", "salt", "wash", "buffer", "[", "0.1", "%", "SDS", ",", "1", "%", "Triton", "X-100", ",", "2", "mM", "EDTA", ",", "20", "mM", "Tris-HCl", ",", "pH", "8.1", ",", "300", "mM", "NaCl", "]", "for", "once", ",", "low", "salt", "wash", "buffer", "[", "0.1", "%", "SDS", ",", "1", "%", "Triton", "X-100", ",", "2", "mM", "EDTA", ",", "20", "mM", "Tris-HCl", ",", "pH", "8.1", ",", "150", "mM", "NaCl", "]", "for", "three", "times", ",", "and", "TE", "buffer", "[", "10", "mM", "Tris-HCl", ",", "1", "mM", "EDTA", ",", "pH", "8.0", "]", "for", "twice", ",", "with", "each", "wash", "for", "5", "min", "rotated", "at", "4", "°C.", "The", "products", "concentrated", "by", "beads", "were", "used", "for", "subsequent", "experiments.", "Mass", "spectrometry", "(", "ms", ")", "and", "analysis", "The", "sample", "of", "dCas9-3", "×", "Flag-sgLTRs", "and", "dCas9-3", "×", "Flag-sgGal4", "(", "control", ")", "immnuoprecipitated", "proteins", "were", "prepared", "and", "analyzed", "by", "MS.", "In", "general", ",", "the", "eluted", "LTR", "binding", "proteins", "were", "reduced", "in", "20", "mM", "DTT", "at", "95", "°C", "for", "5", "min", ",", "and", "subsequently", "alkylated", "in", "50", "mM", "iodoacetamide", "for", "30", "min", "in", "the", "dark", "at", "room", "temperature.", "After", "alkylation", ",", "the", "samples", "were", "transferred", "to", "a", "10", "kD", "centrifugal", "spin", "filter", "(", "Millipore", ")", "and", "sequentially", "washed", "with", "200", "μl", "of", "8", "M", "urea", "for", "three", "times", "and", "200", "μl", "of", "50", "mM", "ammonium", "bicarbonate", "for", "two", "times", "by", "centrifugation", "at", "14,000", "×", "g.", "Next", ",", "tryptic", "digestion", "was", "performed", "by", "adding", "trypsinat", "1:50", "(", "enzyme", "/", "substrate", ",", "m", "/", "m", ")", "in", "200", "μl", "of", "50", "mM", "ammonium", "bicarbonate", "at", "37", "°C", "for", "16", "hours.", "Peptides", "were", "recovered", "by", "transferring", "the", "filter", "to", "a", "collection", "tube", "and", "spinning", "at", "14,000", "×", "g.", "To", "increase", "the", "yield", "of", "peptides", ",", "the", "filter", "was", "washed", "twice", "with", "100", "μl", "of", "50", "mM", "ammonium", "bicarbonate.", "Peptides", "were", "desalted", "by", "StageTips.", "MS", "experiments", "were", "performed", "on", "a", "nanoscale", "EASY-nLC", "1200", "UHPLC", "system", "(", "Thermo", "Fisher", "Scientific", ")", "connected", "to", "an", "Orbitrap", "Fusion", "Lumos", "equipped", "with", "a", "nanoelectrospray", "source", "(", "Thermo", "Fisher", "Scientific", ")", ".", "Mobile", "phase", "A", "contained", "0.1", "%", "formic", "acid", "(", "v", "/", "v", ")", "in", "water", ";", "mobile", "phase", "B", "contained", "0.1", "%", "formic", "acid", "in", "80", "%", "acetonitrile", "(", "ACN", ")", ".", "The", "peptides", "were", "dissolved", "in", "0.1", "%", "formic", "acid", "(", "FA", ")", "with", "2", "%", "acetonitrile", "and", "separated", "on", "an", "RP-HPLC", "analytical", "column", "(", "75", "μm", "×", "25", "cm", ")", "packed", "with", "2", "μm", "C18", "beads", "(", "Thermo", "Fisher", "Scientific", ")", "using", "a", "linear", "gradient", "ranging", "from", "5", "%", "to", "22", "%", "ACN", "in", "90", "min", "and", "followed", "by", "a", "linear", "increase", "to", "35", "%", "B", "in", "20", "min", "at", "a", "flow", "rate", "of", "300", "nl", "/", "min.", "The", "Orbitrap", "Fusion", "Lumos", "acquired", "data", "in", "a", "data-dependent", "manner", ",", "alternating", "between", "full-scan", "MS", "and", "MS2", "scans.", "The", "spray", "voltage", "was", "set", "at", "2.2", "kV", ",", "and", "the", "temperature", "of", "the", "ion", "transfer", "capillary", "was", "300", "°C.", "The", "MS", "spectra", "(", "350–1500", "m", "/", "z", ")", "were", "collected", "with", "120,000", "resolutions", ",", "AGC", "of", "4", "×", "105", ",", "and", "50", "ms", "maximal", "injection", "time.", "Selected", "ions", "were", "sequentially", "fragmented", "by", "HCD", "with", "30", "%", "normalized", "collision", "energy", ",", "specified", "isolated", "windows", "1.6", "m", "/", "z", ",", "and", "15,000", "resolutions.", "AGC", "of", "5", "×", "104", "and", "40", "ms", "maximal", "injection", "time", "were", "used.", "Dynamic", "exclusion", "was", "set", "to", "40", "s.", "Unassigned", "ions", "or", "those", "with", "a", "charge", "of", "2", "+", "and", ">", "7", "+", "were", "rejected", "for", "MS", "/", "MS.", "Raw", "data", "was", "processed", "using", "Proteome", "Discoverer", "(", "PD", ",", "version", "2.4", ")", ",", "and", "MS", "/", "MS", "spectra", "were", "searched", "against", "the", "reviewed", "SwissProt", "human", "proteome", "database.", "Only", "peptides", "with", "at", "least", "six", "amino", "acids", "in", "length", "were", "considered.", "The", "peptide", "and", "protein", "identifications", "were", "filtered", "by", "PD", "to", "control", "the", "false", "discovery", "rate", "(", "FDR", ")", "***Generation", "of", "stable", "knockout", "cell", "line***", "sgRNA", "sequence", "was", "ligate", "into", "plasmid", "pSpCas9", "(", "BB", ")", "−2A-Puro", "(", "PX459", ")", ",", "which", "was", "purchased", "from", "Addgene", "(", "#", "48139", ")", ".", "Cells", "were", "transfected", "with", "the", "plasmid", "expressing", "sgPRMT3", "by", "using", "Lipofectamine", "3000", "(", "Invitrogen", ")", "according", "to", "the", "manufacturer’s", "protocol.", "After", "48", "h", "of", "transfection", ",", "cells", "that", "did", "not", "contain", "the", "plasmid", "were", "killed", "with", "puromycin", "for", "2", "days", ",", "then", "changed", "into", "DMEM", "with", "no", "antibiotics", "and", "plated", "into", "96-well", "plate", "for", "single", "clone", "selection.", "After", "verification", "with", "western", "blot", ",", "the", "genome", "was", "extracted", "and", "sent", "for", "sequencing.", "Source", "paper", ":", "PMC12081701" ]
[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]
[ "Materials", "and", "methods", "Statistical", "analysis", "The", "data", "were", "described", "as", "mean", "±", "standard", "deviation", "(", "SD", ")", "and", "the", "statistical", "significance", "was", "determined", "by", "one-way", "ANOVA", "before", "LSD", "test", "for", "multiple", "comparisons", "and", "independent-sample", "t-test", "for", "comparison", "between", "the", "two", "groups.", "The", "level", "of", "p", "***Results***", "Discussion", "The", "host", "immune", "system", "exerts", "immunosurveillance", "to", "control", "cancer", "development.", "By", "inducing", "the", "expression", "of", "immunosuppressive", "factors", ",", "however", ",", "tumor", "HIF-1", "signaling", "subdues", "both", "the", "innate", "and", "adaptive", "immune", "responses", ",", "thereby", "shielding", "the", "tumor", "from", "immune", "attacks.", "In", "addition", ",", "insufficient", "expression", "of", "MHC", "class", "I", "on", "cancer", "cells", "is", "one", "of", "the", "important", "strategies", "employed", "by", "cancer", "to", "evade", "the", "immune", "system.", "Therefore", ",", "inhibition", "of", "HIF-1", "and", "improvement", "of", "MHC", "class", "I", "expression", "on", "cancer", "cells", "is", "important", "to", "induce", "effective", "responses", "of", "cell-mediated", "immunity", "against", "cancer", "such", "as", "lung", "cancer", "for", "immunotherapies", ",", "including", "PD-1", "/", "PD-L1", "inhibitor.", "The", "effect", "of", "Endostar", "in", "inhibiting", "HIF-1", "and", "promoting", "MHC", "class", "I", "expression", "on", "cancer", "cells", ",", "such", "as", "lung", "cancer", "cells", ",", "may", "counteract", "cancer", "immune", "evasion", "and", "thereby", "benefit", "cancer", "immunotherapy.", "However", ",", "this", "remains", "unclear.", "This", "study", "was", "designed", "to", "determine", "the", "effect", "of", "Endostar", "in", "inhibiting", "HIF-1", "and", "promoting", "MHC", "class", "I", "expression", "on", "lung", "cancer", "cells.", "Endostar", "was", "administrated", "to", "A549", "and", "NCI-H1299", "lung", "cancer", "cells", "and", "the", "protein", "of", "HIF-1", "and", "MHC", "class", "I", "and", "their", "mRNAs", "was", "detected", "by", "western", "blot", "and", "RT-qPCR.", "The", "lower", "HIF-1", "and", "higher", "MHC", "class", "I", "were", "found", "in", "Endostar", "treated", "A549", "and", "NCI-H1299", "cells.", "These", "findings", "demonstrated", "inhibtion", "on", "HIF-1", "and", "promotion", "on", "MHC", "class", "I", "by", "Endostar", ",", "suggesting", "the", "potential", "of", "Endostar", "to", "benefit", "lung", "cancer", "immunotherapy.", "Endostar", ",", "an", "N-terminal", "modified", "recombinant", "human", "endostatin", ",", "is", "a", "human", "recombinant", "endostatin", ",", "an", "attractive", "anti-angiogenesis", "protein.", "Therefore", ",", "Endostar", "has", "anti-angiogenesis", "effects.", "Endostar", "was", "developed", "as", "a", "specific", "drug", "permitted", "by", "the", "State", "Food", "and", "Drug", "Administration", "in", "China", "in", "2005", "for", "its", "use", "in", "NSCLC", "therapy.25,26", "Endostatin", "is", "a", "natural", "protein", ",", "first", "isolated", "and", "extracted", "from", "mouse", "tumors", "by", "Judah", "Folkman", ",", "with", "a", "wide", "antitumor", "spectrum", "and", "strong", "antiangiogenic", "capacity.27,28", "Angiogenesis", "is", "a", "physiological", "process", "of", "forming", "new", "blood", "vessels", "from", "existing", "blood", "vessels", "and", "circulating", "endothelial", "precursors.", "It", "is", "essential", "to", "the", "occurrence", "and", "development", "of", "tumors", ",", "which", "grow", "rapidly", "and", "metastasize", "eventually.24", "Physiologically", ",", "angiogenesis", "is", "essential", "to", "physiological", "processes", "like", "embryogenesis", ",", "tissue", "growth", ",", "and", "regeneration.29,30", "Oncologically", ",", "it", "is", "also", "important", "for", "cancer", "cells", "that", "grow", "rapidly", "and", "metastasize", "eventually", "because", "angiogenesis", "supplies", "oxygen", "and", "nutrients", "which", "are", "deficient", "in", "cancer", "cells", "for", "their", "rapid", "growth", "and", "eventual", "metastasis.31", "Therefore", ",", "anti-angiogenesis", "is", "one", "of", "the", "most", "important", "cancer", "therapies.32", "Endostar", "as", "a", "recombinant", "human", "endostatin", "with", "nine", "added", "amino", "acids", "(", "MGGSHHHHH", ")", "33", "to", "maintain", "stability", "and", "a", "long", "half-life", "has", "effective", "antiangiogenic", "effect.", "Besides", ",", "it", "was", "shown", "in", "this", "study", "that", "Endostar", "inhibited", "HIF-1", "with", "upregulation", "of", "MHC", "class", "I", "expression", "in", "A549", "and", "NCI-H1299", "lung", "cancer", "cells", ",", "benefiting", "cancer", "cell", "killing", "by", "effectory", "lymphocytes.", "HIF-1", ",", "a", "heterodimer", "consisting", "of", "a", "constitutive", "β-subunit", "and", "an", "oxygen-sensitive", "α-subunit,34", "is", "a", "main", "transcriptional", "regulator", "responsible", "for", "metabolic", "adaptation", "to", "alterations", "in", "the", "oxygen", "environment.", "It", "involves", "in", "many", "physiological", "and", "pathological", "processes", "in", "the", "body", "and", "is", "closely", "associated", "with", "the", "pathogenesis", "of", "many", "diseases.13", "In", "solid", "tumors", ",", "uncontrolled", "proliferation", "of", "cancer", "cells", "vs", "disorganized", "growth", "of", "blood", "vessels", "results", "in", "limited", "supply", "of", "nutrients", "and", "oxygen", "resulting", "in", "low", "oxygen", "tension", ";", "therefore", ",", "regions", "with", "hypoxic", "microenvironments", "are", "created.", "In", "these", "regions", ",", "the", "highly", "overexpressed", "HIF-1", "is", "important", "to", "drive", "tumor", "growing", ",", "invasion", ",", "and", "metastasis", "in", "different", "human", "cancers.35,36", "The", "association", "of", "a", "poor", "survival", "with", "the", "high", "expression", "of", "HIF-1α", "has", "been", "indicated", "by", "survival", "analysis", "in", "patients", "with", "lung", "cancer", ",", "and", "different", "SNPs", "in", "HIF-1α", "may", "have", "different", "effects", "on", "overall", "cancer", "risk", "in", "an", "ethnicity-", "and", "type-specific", "manner.37", "Reduction", "of", "HIF-1α", "by", "Simvastatin", "enhanced", "Anti-tumor", "Effects", "of", "Bevacizumab", "in", "A549", "cells.38", "Targeting", "ATM", "/", "HIF-1α", "signaling", "by", "solanidine", "induced", "anti-angiogenesis", "and", "anti-cancer", "effect", "in", "lung", "cancer.39", "Besides", "its", "involvement", "in", "various", "aspects", "of", "tumor", "development", ",", "such", "as", "tumor", "growth", ",", "invasion", ",", "metastasis", ",", "and", "angiogenesis", ",", "HIF-1", "is", "also", "involved", "in", "tumor", "immune", "evasion", "which", "facilitates", "cancer", "cells", "to", "proliferate", "and", "metastasize", ",", "and", "contributes", "to", "failure", "in", "immunotherapy.40", "Inhibition", "of", "HIF-1", "expression", "in", "cancer", "cells", "contributes", "to", "cancer", "control", "and", "induction", "of", "effective", "anti-cancer", "immunity", "in", "cancer", "immunotherapy.", "Endostar", "has", "the", "effect", "to", "down-regulate", "HIF-1.41", "It", "was", "shown", "in", "this", "study", "that", "25", "μg", "/", "ml", "Endostar", "inhibited", "HIF-1", "expression", "in", "A549", "and", "NCI-H1299", "lung", "cancer", "cells.", "HIF-1", "is", "induced", "by", "hypoxia", "in", "cancer", "cells,42", "and", "in", "normoxia", ",", "it", "is", "not", "usually", "observed", "or", "only", "basal", "expression", "can", "be", "observed.43,44", "In", "this", "study", ",", "experiments", "showed", "a", "high", "expression", "of", "HIF-1", "in", "control", "and", "untreated", "cells.", "However", ",", "this", "did", "not", "necessarily", "mean", "that", "the", "expression", "of", "HIF-1", "in", "control", "and", "untreated", "cells", "was", "really", "high", "because", "it", "was", "detected", "with", "the", "expression", "in", "Endostar", "treated", "A549", "cells", "and", "NCI-H1299", "cells", "as", "the", "backgroud.", "The", "expression", "detected", "by", "Western", "blot", "and", "Immunocytochemistry", "is", "relative", "quantification.", "The", "assays", "had", "been", "optimized", "for", "enough", "sensitivity", "to", "detect", "the", "reduced", "expression", "in", "Endostar", "treated", "A549", "cells", "and", "NCI-H1299", "cells.", "An", "effective", "adaptive", "response", "can", "be", "achieved", "through", "a", "multi-step", "antigen", "processing", "and", "pathway", ",", "namely", "the", "cellular", "antigen", "processing", "machinery", "(", "APM", ")", ".", "Antigens", "must", "be", "processed", "into", "antigenic", "peptides", "by", "APM.", "These", "peptides", "are", "loaded", "onto", "an", "MHC", "class", "I", "molecule.", "MHC", "class", "I", "molecules", "are", "glycoproteins", "of", "heterodimers", "with", "a", "polymorphic", "heavy", "chain", "(", "α-chain", ")", "and", "an", "invariable", "β2", "microglobulin", "(", "β2", "m", ")", "light", "chain", "(", "β-chain", ")", ".", "The", "α-chain", "is", "encoded", "by", "the", "Human", "Leukocyte", "Antigen-HLA", "A", ",", "B", ",", "and", "C", "genes", "in", "humans.", "There", "is", "a", "groove", "in", "the", "MHC", "class", "I", "molecules", "to", "preferentially", "bind", "8-11mer", "peptides.", "The", "antigenic", "epitope", "binds", "to", "the", "exposed", "surface", "of", "this", "groove", "as", "a", "part", "of", "the", "MHC", "class", "I", "complex.", "It", "is", "recognized", "by", "the", "TCR", "on", "the", "T", "cells.45", "This", "study", "showed", "that", "the", "expression", "of", "MHC", "class", "I", "α-heavy", "chain", "and", "β2", "m", "light", "chain", "in", "A549", "and", "NCI-H1299", "lung", "cancer", "cells", "was", "improved", "by", "Endostar", ",", "which", "benefited", "cancer", "immunotherapy", "against", "the", "lung", "cancer", "cells.", "In", "the", "context", "of", "HIF-1", "down-regulation", "by", "Endostar", ",", "which", "was", "shown", "in", "this", "study", ",", "to", "demonstrate", "the", "role", "of", "HIF-1", "on", "the", "MHC", "class", "I", "α-heavy", "chain", "and", "β2", "m", "light", "chain", "in", "A549", "and", "NCI-H1299", "lung", "cancer", "cells", ",", "the", "over-expressing", "HIF-1", "gene", "was", "transfected", "into", "A549", "and", "NCI-H1299", "cells", "resulting", "in", "decrease", "of", "relative", "levels", "of", "MHC", "class", "I", "α-heavy", "chain", "and", "β2", "m", "light", "chain.", "This", "results", "were", "in", "line", "with", "the", "decrease", "of", "HIF-1", "by", "Endostar", "treatment", "accompanied", "with", "the", "enhancement", "of", "MHC", "class", "I", "α-heavy", "chain", "and", "β2", "m", "light", "chain.", "In", "addition", "to", "the", "important", "role", "in", "metabolic", "adaptation", "to", "hypoxia", "stress", "caused", "by", "deficient", "supply", "of", "nutrients", "and", "oxygen", "because", "of", "uncontrolled", "growth", "of", "cancer", "cells", "and", "disorganized", "neoangiogenesis", ",", "the", "signaling", "pathways", "of", "HIF-1", ",", "a", "heterodimer", "highly", "expressed", "in", "a", "variety", "of", "tumor", "cells", ",", "suppress", "innate", "and", "adaptive", "immune", "systems", "to", "escape", "immune", "attack.", "That", "HIF-1", "downregulates", "the", "antigen", "presenting", "MHC", "class", "I", "molecules", "is", "an", "important", "strategy", "for", "cancer", "to", "evade", "immune", "attack", ",", "because", "only", "in", "combination", "with", "MHC", "class", "I", "on", "the", "target", "cells", ",", "can", "tumor", "antigenic", "peptides", "be", "recognized", "by", "CD8+", "CTL", "with", "the", "subsequent", "destruction", "of", "the", "target", "cells.", "Theoretically", ",", "inhibition", "of", "HIF-1", "may", "upregulate", "the", "expression", "of", "MHC", "class", "I", "on", "cancer", "cells.", "This", "study", "demonstrated", "that", "25", "μg", "/", "ml", "Endostar", "inhibited", "expression", "of", "HIF-1", "with", "the", "upregulation", "of", "MHC", "class", "I", "α-heavy", "chain", "and", "β2", "m", "light", "chain", "in", "A549", "and", "NCI-H1299", "lung", "cancer", "cells", ",", "suggesting", "the", "potential", "for", "Endostar", "to", "facilitate", "cancer", "immunotherapy.", "Experimental", "evidence", ",", "however", ",", "is", "required", "and", "further", "research", "with", "experimental", "evidence", "remains", "to", "be", "performed", "in", "the", "future", "to", "confirm", "the", "possible", "suppression", "of", "immune", "evasion", "tactic", "with", "endostar", "treatment.", "Other", "limitations", "such", "as", "lack", "of", "an", "in", "vivo", "tumor", "model", "and", "further", "validation", "using", "flow", "cytometry", "remain", "to", "be", "supplementarily", "performed", "in", "the", "future.", "The", "mechanism", "of", "MHC", "class", "I", "regulation", "involves", "the", "innate", "immune", "molecule", "NLR", "family", "CARD", "domain", "containing", "5", "(", "NLRC5", ")", ",", "which", "is", "a", "member", "of", "recently", "discovered", "NLRs-like", "receptor", "family", "of", "the", "highly", "conserved", "one.46", "NLRC5", "is", "an", "MHC", "class", "I", "gene", "transactivation", "factor", "which", "induces", "the", "MHC", "class", "I", "gene", "transcription", "and", "subsequently", "activates", "antigen", "presentation", "process.47,48", "NLRC5", "is", "transcriptionally", "regulated", "in", "JAK2", "/", "STAT3", "signaling-dependent", "pathway.49", "This", "study", "demonstrated", "that", "some", "concentrations", "of", "Endostar", "decreased", "the", "relative", "levels", "of", "STAT3", "and", "pSTAT3", "in", "A549", "lung", "cancer", "cells", "with", "statistical", "significance", ",", "which", "is", "in", "line", "with", "the", "role", "of", "JAK2", "/", "STAT3", "pathway", "in", "regulation", "of", "MHC", "class", "I", "via", "NLRC5", ",", "suggesting", "the", "underlying", "mechanism", "of", "MHC", "class", "I", "upregulation", "involving", "JAK2", "/", "STAT3", "signaling", "pathway.", "Conclusions", "Endostar", "(", "25", "μg", "/", "ml", ")", "inhibited", "the", "expression", "of", "HIF-1", "with", "the", "upregulation", "of", "MHC", "class", "I", "α-heavy", "chain", "and", "β2", "m", "light", "chain", "in", "A549", "and", "NCI-H1299", "lung", "cancer", "cells", ",", "which", "showed", "the", "potential", "for", "Endostar", "to", "facilitate", "cancer", "immunotherapy.", "It", "is", "needed", "for", "future", "studies", "that", "are", "warranted", "to", "confirm", "the", "role", "of", "Endostar", "treatment.", "Source", "paper", ":", "PMC12101583" ]
[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "B-Tissue", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "B-CellType", "B-Tissue", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "B-Tissue", "O", "O", "B-Tissue", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "B-CellType", "B-Tissue", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "B-CellType", "B-Tissue", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "B-CellType", "B-Tissue", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "B-CellType", "B-Tissue", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "B-CellType", "B-Tissue", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-Tissue", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "B-CellType", "B-Tissue", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]
[ "2.", "results", "3.", "discussion", "Conifer", "bark", ",", "the", "medicinal", "use", "of", "which", "dates", "back", "more", "than", "2000", "years", ",", "contains", "bioactive", "alkaloids", ",", "flavonoids", ",", "lignans", ",", "phenolic", "acids", ",", "proanthocyanidins", ",", "stilbenes", ",", "and", "terpenoids", "that", "contribute", "to", "its", "therapeutic", "potential.", "Various", "conifer", "bark", "extracts", "are", "used", "nowadays", "in", "the", "nutraceutical", ",", "food", ",", "and", "pharmaceutical", "industries", "because", "of", "their", "health-promoting", "effects", "in", "numerous", "ailments", "and", "diseases", "[", "27,28,29", "]", ".", "Such", "extracts", "are", "Pycnogenol®", ",", "Flavangenol®", ",", "and", "Oligopin®", "derived", "from", "Pinus", "pinaster", "Ait.", "bark", "[", "29", "]", ",", "Enzogenol®", "produced", "from", "Pinus", "radiata", "D.", "Don", "bark", "[", "30", "]", ",", "and", "Abigenol®", "originating", "from", "Abies", "alba", "Mill.", "bark", "[", "31", "]", ".", "Pinus", "cembra", "L.", "(", "Pinaceae", ",", "Swiss", "stone", "pine", ",", "Arolla", "pine", ",", "cembran", "pine", ",", "cedar", "pine", ")", "is", "a", "coniferous", "tree", "growing", "in", "the", "Alps", "and", "Carpathian", "Mountains", "[", "32", "]", ".", "The", "bark", "has", "been", "scarcely", "investigated", "for", "its", "chemical", "composition", "and", "biological", "activity.", "We", "have", "previously", "assessed", "the", "antioxidant", "potential", "of", "the", "raw", "bark", "extract", "(", "80", "%", "methanolic", "bark", "extract", ")", "and", "found", "EC50", "values", "of", "71.1", "±", "0.5", "and", "26.0", "±", "0.3", "μg", "/", "mL", "in", "the", "DPPH", "radical", "scavenging", "and", "reducing", "power", "assays", ",", "respectively.", "The", "antioxidant", "potential", "of", "the", "raw", "bark", "extract", "is", "strongly", "associated", "with", "the", "total", "phenolic", "content", ",", "quantified", "as", "299.3", "±", "1.4", "mg", "/", "g.", "In", "the", "same", "assays", ",", "catechin", "was", "more", "effective", "(", "EC50", "=", "5.56", "±", "0.05", "and", "3.70", "±", "0.03", "μg", "/", "mL", ",", "respectively", ")", "[", "26", "]", ".", "Other", "polar", "conifer", "bark", "extracts", "(", "80", "%", "methanolic", ",", "aqueous", ")", "scavenged", "the", "DPPH", "radical", "with", "EC50", "values", "ranging", "from", "6.46", "±", "0.36", "to", "100.1", "±", "0.1", "μg", "/", "mL", "[", "29,33,34,35,36", "]", ".", "In", "the", "reducing", "power", "assay", ",", "polar", "conifer", "bark", "extracts", "exhibited", "EC50", "values", "ranging", "from", "9.17", "±", "0.13", "to", "25.32", "±", "0.62", "μg", "/", "mL", "[", "29,35,37", "]", ".", "Overall", ",", "the", "EC50", "values", "of", "the", "raw", "extract", "of", "cembran", "pine", "bark", "in", "the", "DPPH", "and", "reducing", "power", "assays", "fall", "within", "the", "range", "of", "values", "reported", "for", "other", "polar", "conifer", "bark", "extracts.", "The", "cytotoxic", "potential", "of", "the", "raw", "bark", "extract", "was", "further", "investigated.", "HeLa", "cells", "were", "used", "for", "this", "purpose", "as", "they", "have", "advantages", "over", "other", "tumor", "cell", "lines", ",", "for", "example", ",", "high", "adaptive", "capacity", "and", "proliferation", "rate", "[", "38", "]", ".", "The", "study", "revealed", "moderate", "or", "weak", "cytotoxicity.", "At", "25", "and", "50", "μg", "/", "mL", ",", "the", "extract", "had", "an", "insignificant", "impact", "on", "the", "viability", "of", "HeLa", "cells", ",", "lacked", "apoptosis-inducing", "effects", ",", "and", "induced", "slight", "increases", "(", "≤5", "%", ")", "in", "the", "HeLa", "cell", "percentages", "in", "the", "S", ",", "G2", "/", "M", ",", "and", "sub-G1", "phases", "in", "comparison", "with", "the", "control.", "Other", "polar", "conifer", "bark", "extracts", "exhibited", "higher", "activity", "on", "HeLa", "cells.", "The", "aqueous", "extract", "of", "Pinus", "massoniana", "Lamb.", "bark", "significantly", "inhibited", "HeLa", "cell", "viability", "and", "caused", "a", "substantial", "increase", "in", "the", "proportions", "of", "HeLa", "cells", "in", "the", "sub-G1", "and", "G2", "/", "M", "phases", "[", "39", "]", ".", "Accumulation", "of", "HeLa", "cells", "in", "the", "sub-G1", "phase", "is", "considered", "an", "indicator", "of", "a", "pro-apoptotic", "effect", "[", "39,40", "]", ".", "In", "other", "studies", ",", "the", "extract", "significantly", "inhibited", "the", "migration", "and", "invasion", "of", "HeLa", "cells", ",", "respectively", ",", "the", "latter", "effect", "being", "attributed", "to", "cathepsin", "B", "down-regulation", "[", "41,42", "]", ".", "Pro-apoptotic", "effects", "in", "HeLa", "cells", "were", "also", "reported", "for", "the", "80", "%", "methanolic", "extract", "of", "Pinus", "sylvestris", "L.", "bark", "[", "43", "]", ",", "ethanolic", "extract", "of", "Pinus", "merkusii", "Jung.", "&", "de", "Vriese", "bark", "[", "44", "]", ",", "and", "procyanidin-rich", "extract", "of", "Pinus", "koraiensis", "Siebold", "&", "Zucc.", "bark", "[", "45", "]", ".", "The", "pro-apoptotic", "effects", "of", "conifer", "bark", "extracts", "were", "found", "to", "be", "mediated", "by", "activation", "of", "caspase-9", "and", "-3", ",", "up-regulation", "of", "the", "pro-apoptotic", "protein", "Bax", ",", "and", "down-regulation", "of", "the", "anti-apoptotic", "protein", "Bcl-2", "and", "survivin", "[", "39,44,45", "]", ".", "Purification", "of", "the", "cembran", "pine", "raw", "bark", "extract", "resulted", "in", "the", "isolation", "of", "two", "stilbene", "glycosides", ",", "namely", "resveratroloside", "(", "1", ")", "and", "pinostilbenoside", "(", "2", ")", ",", "the", "structures", "of", "which", "were", "confirmed", "through", "spectroscopic", "techniques.", "To", "the", "best", "of", "our", "knowledge", ",", "this", "is", "the", "first", "report", "on", "the", "presence", "of", "resveratroloside", "(", "1", ")", "and", "pinostilbenoside", "(", "2", ")", "in", "Pinus", "cembra", "L.", "bark.", "Both", "compounds", "were", "previously", "isolated", "from", "other", "conifer", "barks", ":", "resveratroloside", "from", "Pinus", "sibirica", "R.", "Mayr", "bark", "[", "46", "]", "and", "pinostilbenoside", "from", "Pinus", "sibirica", "R.", "Mayr", "bark", "[", "46", "]", "and", "Pinus", "koraiensis", "Siebold", "&", "Zucc.", "bark", "[", "18", "]", ".", "The", "evaluation", "of", "the", "antioxidant", "potential", "of", "resveratroloside", "(", "1", ")", "and", "pinostilbenoside", "(", "2", ")", "demonstrated", "weaker", "effects", "than", "the", "raw", "bark", "extract", ",", "indicating", "a", "potential", "synergistic", "interaction", "among", "the", "components", "of", "the", "extract.", "Previous", "studies", "have", "reported", "similar", "synergistic", "interactions", "in", "pine", "bark", "extracts.", "Pycnogenol", ",", "a", "standardized", "extract", "obtained", "from", "the", "bark", "of", "French", "maritime", "pine", "(", "Pinus", "maritima", "Lam.", ")", ",", "exhibits", "stronger", "biological", "effects", "than", "its", "components", "when", "tested", "individually", "[", "27", "]", ".", "In", "contrast", "to", "our", "findings", ",", "Dar", "et", "al.", "(", "2016", ")", "reported", "a", "strong", "antioxidant", "potential", "for", "resveratroloside", "in", "the", "DPPH", "assay", "(", "IC50", "=", "14.0", "μg", "/", "mL", ")", "[", "47", "]", ".", "The", "explanation", "lies", "in", "the", "fact", "that", "Dar", "et", "al.", "[", "47", "]", "used", "another", "experimental", "protocol.", "Resveratroloside", "(", "1", ")", "exhibited", "higher", "activity", "than", "pinostilbenoside", "(", "2", ")", "in", "both", "assays.", "The", "findings", "align", "with", "previous", "studies", "reporting", "a", "higher", "antioxidant", "capacity", "(", "evaluated", "as", "oxygen", "radical", "absorbance", "capacity", ",", "ORAC", ")", "for", "resveratroloside", "(", "4.01", "±", "0.71", "Trolox", "equivalents", "/", "μM", ")", "than", "pinostilbenoside", "(", "1.89", "±", "0.25", "Trolox", "equivalents", "/", "μM", ")", ".", "In", "the", "same", "assay", ",", "the", "aglycones", ",", "resveratrol", "and", "pinostilbene", ",", "were", "more", "active", "than", "the", "corresponding", "glycosides", ",", "showing", "ORAC", "values", "of", "5.26", "±", "0.26", "and", "5.01", "±", "0.27", "Trolox", "equivalents", "/", "μM", ",", "respectively", "[", "48", "]", ".", "Glycosylation", "and", "methylation", "negatively", "impact", "the", "antioxidant", "capacity", "of", "stilbenes", "by", "blocking", "the", "free", "phenolic", "hydroxyl", "groups", "responsible", "for", "the", "antioxidant", "activity", "[", "49", "]", ".", "On", "the", "other", "hand", ",", "glycosylation", "and", "methylation", "of", "the", "stilbene", "hydroxyl", "groups", "might", "enhance", "other", "bioactivities", "such", "as", "tyrosinase", "inhibitory", "activity", "[", "48", "]", "and", "anticancer", "activity", ",", "respectively", "[", "3", "]", ".", "Glycosylation", "enhances", "the", "stability", "of", "stilbenes", ",", "while", "methylation", "increases", "their", "lipophilicity", ",", "leading", "to", "improved", "bioavailability", "[", "3", "]", ".", "In", "this", "study", ",", "resveratroloside", "(", "1", ")", "and", "pinostilbenoside", "(", "2", ")", "demonstrated", "promising", "cytotoxic", "activity", "against", "HeLa", "cells.", "The", "activity", "was", "evaluated", "after", "48", "h", "of", "incubation", "with", "25", "or", "50", "μg", "/", "mL", "of", "each", "compound", "(", "equivalent", "to", "64", "or", "128", "μM", "of", "resveratroloside", "(", "1", ")", "and", "62", "or", "124", "μM", "of", "pinostilbenoside", "(", "2", ")", ")", ".", "The", "selection", "of", "the", "concentrations", "to", "be", "tested", "and", "incubation", "time", "was", "based", "on", "previous", "studies", "investigating", "the", "cytotoxicity", "of", "resveratrol", "in", "HeLa", "cells", "[", "50,51,52", "]", ".", "In", "addition", ",", "this", "study", "revealed", "pronounced", "cytotoxicity", "(", "less", "than", "30", "%", "cell", "viability", ")", "for", "both", "compounds", "at", "100", "μg", "/", "mL.", "This", "served", "as", "additional", "support", "for", "selecting", "lower", "doses", "(", "25", "and", "50", "μg", "/", "mL", ")", "in", "cell-based", "assays.", "To", "the", "best", "of", "current", "knowledge", ",", "this", "is", "the", "first", "study", "evaluating", "the", "effects", "of", "resveratroloside", "(", "1", ")", "and", "pinostilbenoside", "(", "2", ")", "on", "human", "cervical", "carcinoma", "HeLa", "cells.", "Resveratroloside", "(", "1", ")", "has", "been", "scarcely", "investigated", "for", "its", "antitumor", "potential.", "Only", "its", "antiproliferative", "effects", "on", "H2452", "malignant", "pleural", "mesothelioma", "cells", "(", "approximately", "30", "%", "inhibition", "at", "200", "μM", ")", "were", "reported", "so", "far", "[", "53", "]", ".", "To", "the", "best", "of", "our", "knowledge", ",", "the", "antitumor", "potential", "of", "pinostilbenoside", "(", "2", ")", "has", "not", "been", "investigated", "before.", "Cytotoxic", "therapies", "eliminate", "cancer", "cells", "by", "triggering", "various", "pathways", "of", "cell", "death.", "Induction", "of", "apoptosis", "(", "programmed", "cell", "death", ")", "has", "been", "a", "primary", "objective", "in", "cancer", "therapy", "for", "more", "than", "30", "years", "[", "54", "]", ".", "In", "recent", "years", ",", "many", "drugs", ",", "including", "natural", "compounds", ",", "have", "been", "reported", "to", "trigger", "other", "types", "of", "death", "in", "cancer", "cells", "such", "as", "autophagy", ",", "ferroptosis", ",", "necroptosis", ",", "pyroptosis", ",", "paraptosis", ",", "lysosome-dependent", "cell", "death", ",", "oncosis", ",", "and", "necrosis", "[", "55,56", "]", ".", "Resveratroloside", "(", "1", ")", "and", "pinostilbenoside", "(", "2", ")", "are", "not", "the", "sole", "stilbenes", "that", "cause", "tumor", "cell", "death", "by", "triggering", "non-apoptotic", "mechanisms.", "Resveratrol", "was", "reported", "to", "induce", "tumor", "cell", "death", "by", "apoptosis", ",", "autophagy", ",", "necroptosis", ",", "and", "necrosis", "[", "56,57", "]", ".", "Pterostilbene", "was", "found", "to", "activate", "apoptosis", ",", "autophagy", ",", "and", "necrosis", "in", "cancer", "cells", ",", "apoptosis", "being", "the", "major", "mechanism", "involved", "in", "cancer", "cell", "death", "[", "58", "]", ".", "Combrestatins", "(", "diaryl", "stilbenoids", ")", "are", "effective", "promoters", "of", "tumor", "necrosis", "[", "59", "]", ".", "Dysregulation", "of", "the", "cell", "cycle", ",", "a", "process", "involving", "cell", "growth", ",", "DNA", "replication", ",", "and", "cell", "division", ",", "is", "a", "hallmark", "of", "cancer.", "An", "important", "strategy", "in", "cancer", "therapy", "is", "the", "induction", "of", "cell", "cycle", "arrest.", "Flavopiridol", ",", "abemaciclib", ",", "and", "palbociclib", "are", "a", "few", "examples", "of", "antitumor", "drugs", "that", "suppress", "the", "cell", "cycle", "via", "inhibition", "of", "enzymes", "/", "proteins", "(", "cyclin-dependent", "kinases", "/", "cyclins", ")", "responsible", "for", "driving", "the", "progression", "of", "the", "cell", "cycle", "from", "one", "phase", "to", "the", "next", "one", "[", "60", "]", ".", "According", "to", "this", "study", ",", "resveratroloside", "(", "1", ")", "and", "pinostilbenoside", "(", "2", ")", "impeded", "HeLa", "cell", "proliferation", ",", "with", "pinostilbenoside", "(", "2", ")", "being", "more", "active", "than", "resveratroloside", "(", "1", ")", "at", "25", "μg", "/", "mL.", "This", "result", "aligns", "with", "previous", "studies", "showing", "that", "stilbenes", "inhibit", "the", "proliferation", "of", "tumor", "cell", "lines.", "Resveratrol", "[", "57", "]", ",", "piceatannol", "[", "10", "]", ",", "pterostilbene", "[", "61,62,63", "]", ",", "and", "polydatin", "(", "piceid", ")", "[", "64", "]", "were", "reported", "to", "suppress", "the", "proliferation", "of", "various", "cancer", "cell", "lines", "(", "lung", ",", "prostate", ",", "breast", ",", "colorectal", ",", "liver", ",", "pancreatic", ",", "cervical", ",", "ovarian", ",", "bladder", ",", "leukemia", ",", "multiple", "myeloma", ",", "bone", ",", "oral", ",", "esophageal", ",", "head", "and", "neck", ")", ".", "Regarding", "the", "impact", "of", "resveratroloside", "(", "1", ")", "and", "pinostilbenoside", "(", "2", ")", "on", "the", "HeLa", "cell", "cycle", ",", "both", "compounds", "induced", "a", "significant", "dose-dependent", "increase", "in", "the", "sub-G1", "phase", "population.", "In", "addition", ",", "both", "compounds", "(", "25", "μg", "/", "mL", ")", "induced", "cell", "cycle", "arrest", "at", "the", "S", "phase", ",", "indicating", "a", "blockage", "of", "DNA", "replication", "[", "60", "]", ".", "As", "mentioned", "earlier", ",", "the", "sub-G1", "population", "is", "a", "hallmark", "of", "apoptosis", "[", "39,40", "]", ".", "In", "fact", ",", "not", "only", "apoptotic", "cells", "accumulate", "in", "the", "sub-G1", "phase", ",", "but", "this", "phase", "consists", "of", "cells", "showing", "DNA", "fragmentation", ",", "a", "process", "observed", "in", "both", "apoptosis", "and", "necrosis", "[", "65,66,67", "]", ".", "When", "exploring", "a", "potential", "pro-apoptotic", "effect", ",", "only", "resveratroloside", "(", "1", ")", "showed", "activity", "(", "approximately", "11", "%", "increase", "in", "the", "early", "and", "late", "apoptotic", "HeLa", "cells", "following", "48", "h", "treatment", "with", "resveratroloside", "(", "1", ")", "at", "50", "μg", "/", "mL", ")", ".", "The", "results", "of", "this", "study", "indicate", "that", "resveratroloside", "(", "1", ")", "and", "pinostilbenoside", "(", "2", ")", "impact", "the", "viability", "and", "proliferation", "of", "HeLa", "cells", "by", "triggering", "mainly", "non-apoptotic", "(", "highly", "likely", "necrotic", ")", "cell", "death", ",", "as", "well", "as", "S-phase", "cell", "cycle", "arrest.", "Similar", "results", "have", "been", "reported", "for", "other", "stilbene", "derivatives.", "Resveratrol", "was", "found", "to", "induce", "apoptosis", "and", "block", "cell", "cycle", "progression", "in", "the", "S", "phase", "in", "human", "SW480", "colon", "carcinoma", ",", "MCF7", "breast", "carcinoma", ",", "HCE7", "esophageal", "squamous", "carcinoma", ",", "HL60", "promyelocytic", "leukemia", "cells", "[", "68", "]", ",", "and", "neuro-2a", "cells", "derived", "from", "C1300", "murine", "neuroblastoma", "[", "69", "]", ".", "Piceatannol", "caused", "apoptosis", "and", "G0", "/", "G1", "phase", "arrest", "in", "T24", "and", "HT1376", "human", "bladder", "cancer", "cells", "[", "70", "]", ".", "Pterostilbene", "was", "reported", "to", "induce", "apoptosis", "and", "S-phase", "arrest", "in", "MOLT4", "human", "leukemia", "cells", "[", "71", "]", ",", "Jurkat", "and", "Hut-78", "T-cell", "leukemia", "/", "lymphoma", "cells", "[", "72", "]", ",", "and", "diffuse", "large", "B-cell", "lymphoma", "cells", "[", "73", "]", ",", "apoptosis", "and", "G1", "phase", "arrest", "in", "HT-29", "colon", "cancer", "cells", "[", "58", "]", "and", "human", "gastric", "carcinoma", "AGS", "cells", "[", "74", "]", ",", "and", "autophagy", "and", "S", "phase", "arrest", "in", "HCCC-9810", "and", "RBE", "human", "cholangiocarcinoma", "cells", "[", "62", "]", ".", "To", "conclude", "the", "cytotoxicity", "assays", ",", "resveratroloside", "(", "1", ")", "and", "pinostilbenoside", "(", "2", ")", "reduced", "viability", "(", "mostly", "via", "non-apoptotic", "routes", ")", "and", "proliferation", "(", "via", "sub-G1-", "and", "S-phase", "arrest", ")", "in", "HeLa", "cells.", "The", "results", "are", "consistent", "with", "previous", "studies", "on", "the", "antitumor", "potential", "of", "stilbenes.", "Resveratrol", ",", "the", "basic", "scaffold", "of", "resveratroloside", "(", "1", ")", "and", "pinostilbenoside", "(", "2", ")", ",", "was", "reported", "to", "promote", "cell", "cycle", "arrest", "at", "the", "S", "phase", ",", "apoptosis", ",", "and", "autophagy", "in", "HeLa", "cells", "[", "52", "]", ".", "Polydatin", ",", "a", "glycoside", "of", "resveratrol", ",", "namely", "resveratrol-3-O-β-mono-D-glucoside", ",", "reduced", "proliferation", "and", "induced", "apoptosis", "in", "HeLa", "cells", "[", "64", "]", ".", "In", "this", "study", ",", "resveratroloside", "(", "1", ")", "and", "pinostilbenoside", "(", "2", ")", "exhibited", "comparable", "activity", "in", "arresting", "the", "HeLa", "cell", "cycle", "at", "the", "S", "and", "sub-G1", "phases", "(", "at", "25", "and", "50", "μg", "/", "mL", ",", "respectively", ")", ".", "On", "the", "other", "hand", ",", "pinostilbenoside", "(", "2", ")", "exhibited", "higher", "activity", "than", "resveratroloside", "(", "1", ")", "in", "increasing", "the", "number", "of", "dead", "cells", "through", "non-apoptotic", "mechanisms", "(", "at", "25", "and", "50", "μg", "/", "mL", ")", "and", "in", "reducing", "HeLa", "cell", "proliferation", "(", "at", "25", "μg", "/", "mL", ")", ".", "The", "latter", "findings", "are", "consistent", "with", "earlier", "studies", "reporting", "increased", "cytotoxic", "activity", "for", "the", "methoxylated", "analogs", "of", "resveratrol", "compared", "to", "resveratrol", "itself", "[", "75", "]", ".", "The", "two", "compounds", "(", "1", "and", "2", ")", "isolated", "in", "this", "study", "are", "stilbene", "glycosides.", "Glycosylation", "is", "known", "to", "positively", "impact", "the", "water", "solubility", ",", "intestinal", "absorption", ",", "and", "bioactivity", "of", "stilbenes", "[", "76,77", "]", ".", "A", "notable", "example", "is", "polydatin", ",", "one", "of", "the", "main", "compounds", "in", "the", "roots", "of", "Polygonum", "cuspidatum", "Sieb.", "et", "Zucc.", ",", "identified", "in", "other", "plant", "species", "across", "the", "Liliaceae", ",", "Fabaceae", ",", "and", "Vitaceae", "families.", "Based", "on", "its", "anti-inflammatory", ",", "antioxidant", ",", "and", "apoptosis-modulating", "potential", ",", "polydatin", "displays", "diverse", "biological", "activities", "(", "anticancer", ",", "antidiabetic", ",", "antimicrobial", ",", "cardioprotective", ",", "hepatoprotective", ",", "and", "neuroprotective", "effects", ",", "as", "well", "as", "protective", "effects", "on", "the", "gastrointestinal", ",", "renal", ",", "respiratory", ",", "and", "skeletal", "systems", ")", ".", "A", "large", "number", "of", "studies", "conducted", "on", "polydatin", "has", "revealed", "versatility", "in", "modulating", "numerous", "targets", "related", "to", "oxidative", "stress", "(", "Nrf2", "and", "Akt", "pathways", ",", "glutathione", ",", "catalase", "(", "CAT", ")", ",", "SOD", ",", "GPx", ",", "GST", ",", "MPO", ")", ",", "inflammation", "(", "NF-κB", ",", "phospholipase", "A2", "(", "PLA2", ")", ",", "COX-2", ",", "iNOS", ",", "TNF-α", ",", "IL-1β", ",", "IL-6", ",", "ICAM-1", ",", "MAPKs", ",", "ERK1", "/", "2", ",", "JNK1", "/", "2", ")", ",", "and", "apoptosis", "(", "p53", "/", "MAPK", "/", "JNK", "and", "PI3K", "/", "Akt", "/", "mTOR", "pathways", ",", "B-cell", "lymphoma", "2", "(", "Bcl-2", ")", ",", "Bcl-2-associated", "x", "(", "Bax", ")", ",", "D-cyclins", ",", "caspase-3", ",", "cytochrome", "c", ")", ".", "Clinical", "trials", "support", "the", "benefits", "of", "polydatin", "in", "chronic", "pelvic", "pain", ",", "liver", "diseases", ",", "inflammatory", "bowel", "syndrome", ",", "and", "EGFR-tyrosine", "kinase", "inhibitor", "(", "TKI", ")", "-related", "ashes.", "Moreover", ",", "various", "drug", "delivery", "systems", "(", "liposomes", ",", "micelles", ",", "nanoparticles", ",", "polymeric", "nanocapsules", ")", "have", "been", "developed", "to", "improve", "the", "bioavailability", ",", "biocompatibility", ",", "and", "efficacy", "of", "polydatin", "[", "64,78", "]", ".", "The", "results", "of", "the", "present", "study", ",", "along", "with", "the", "remarkable", "biological", "potential", "of", "the", "stilbene", "scaffold", "and", "the", "broad", "bioactivity", "of", "polydatin", ",", "a", "resveratrol", "glycoside", ",", "indicate", "that", "the", "bioactive", "properties", "of", "resveratroloside", "(", "1", ")", "and", "pinostilbenoside", "(", "2", ")", "require", "further", "in-depth", "investigation.", "Future", "studies", "should", "explore", "the", "ability", "of", "resveratroloside", "(", "1", ")", "and", "pinostilbenoside", "(", "2", ")", "to", "modulate", "cellular", "signaling", "pathways", ",", "enzymes", ",", "and", "other", "molecules", "involved", "in", "the", "antioxidant", "defense", "and", "oxidative", "damage", "repair.", "Research", "on", "the", "antitumor", "potential", "(", "mechanisms", "underlying", "cytotoxic", "activity", "in", "HeLa", "cells", ",", "cytotoxicity", "against", "other", "tumor", "cell", "lines", ")", "should", "also", "continue.", "Exploration", "of", "additional", "bioactivities", "and", "development", "of", "appropriate", "delivery", "systems", "are", "crucial", "for", "the", "therapeutic", "valorization", "of", "resveratroloside", "(", "1", ")", "and", "pinostilbenoside", "(", "2", ")", ".", "4.", "materials", "and", "methods", "4.7.", "statistical", "analysis", "Antioxidant", "assays", "were", "performed", "in", "triplicate", ",", "and", "the", "results", "were", "expressed", "as", "mean", "±", "standard", "deviation", "(", "SD", ")", ".", "HeLa", "cell-based", "assays", "were", "performed", "in", "triplicate", ";", "the", "results", "were", "expressed", "as", "mean", "±", "standard", "error", "(", "SE", ")", ".", "The", "differences", "between", "the", "results", "were", "tested", "using", "one-way", "ANOVA", "with", "Tukey’s", "HSD", "test", "(", "SPSS", "version", "18.0", ")", ";", "p", "***5.", "Conclusions***", "In", "this", "study", ",", "resveratroloside", "(", "1", ")", "and", "pinostilbenoside", "(", "2", ")", "were", "first", "isolated", "from", "Pinus", "cembra", "L.", "bark.", "This", "is", "the", "first", "report", "of", "these", "compounds", "in", "this", "species.", "Their", "structures", "were", "confirmed", "by", "1H-NMR", ",", "13C-NMR", ",", "and", "HRESIMS.", "Compared", "to", "the", "raw", "bark", "extract", ",", "resveratroloside", "(", "1", ")", "and", "pinostilbenoside", "(", "2", ")", "showed", "lower", "activity", "as", "free", "radical", "scavengers", "and", "reducing", "agents.", "However", ",", "they", "were", "more", "effective", "in", "reducing", "the", "viability", "and", "suppressing", "the", "proliferation", "of", "human", "cervical", "carcinoma", "HeLa", "cells.", "At", "25", "µg", "/", "mL", ",", "both", "compounds", "induced", "S-phase", "cell", "cycle", "arrest", "in", "HeLa", "cells.", "At", "25", "and", "50", "µg", "/", "mL", ",", "they", "significantly", "reduced", "the", "viability", "of", "HeLa", "cells", ",", "mainly", "through", "non-apoptotic", "mechanisms.", "Glycosylated", "stilbene", "scaffolds", "have", "great", "potential", "for", "therapeutic", "applications", ",", "so", "further", "studies", "are", "needed", "to", "assess", "the", "bioactive", "potential", "of", "resveratroloside", "(", "1", ")", "and", "pinostilbenoside", "(", "2", ")", ".", "Source", "paper", ":", "PMC12115102" ]
[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-Tissue", "O", "O", "B-CellType", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-Tissue", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]