OTAR3088/CeLLaTe-cleaned · Datasets at Hugging Face

words listlengths 1.34k 3.83k	labels listlengths 1.34k 3.83k
[ "Introduction", "The", "persistence", "of", "replication-competent", ",", "but", "transcriptionally", "inhibited", "HIV-1", "proviral", "DNA", "in", "long-lived", ",", "latent", "cellular", "reservoirs", "is", "a", "significant", "barrier", "to", "the", "development", "of", "a", "functional", "cure", "[", "1,2", "]", "Even", "after", "long-term", ",", "suppressive", "antiretroviral", "therapy", "(", "ART", ")", ",", "spontaneous", "reactivation", "of", "proviral", "gene", "expression", "from", "the", "latent", "reservoir", "is", "sufficient", "to", "initiate", "viral", "rebound", "shortly", "after", "ART", "cessation", ",", "thus", "requiring", "life-long", "adherence", "[", "3–5", "]", ".", "Multifaceted", "and", "heterogenous", "blocks", "to", "viral", "gene", "expression", "establish", "and", "maintain", "HIV-1", "latency", "at", "the", "epigenetic", ",", "transcriptional", ",", "and", "post-transcriptional", "levels", "[", "2", "]", ".", "Several", "strategies", "to", "either", "reactivate", "latent", "proviruses", "and", "clear", "infected", "cells", "(", "i.e.", ",", "“shock", "and", "kill”", ")", "or", "reinforce", "latency", "to", "prevent", "spontaneous", "reactivation", "(", "i.e.", ",", "“block", "and", "lock”", ")", "are", "currently", "under", "investigation", "[", "6,7", "]", ".", "While", "many", "small", "molecule", "latency", "reversing", "agents", "(", "LRAs", ")", "have", "been", "described", "that", "reactivate", "latent", "proviruses", "ex", "vivo", ",", "they", "have", "had", "little", "success", "in", "clinical", "trials", "[", "8,9", "]", ".", "This", "failure", "is", "partly", "due", "to", "the", "latent", "reservoir’s", "heterogenous", "nature", ",", "such", "that", "treatment", "by", "a", "single", "agent", "that", "acts", "to", "target", "a", "specific", "block", "may", "only", "ever", "reactivate", "a", "small", "fraction", "of", "proviruses", "in", "vivo", "[", "10", "]", ".", "Even", "if", "transcriptional", "reactivation", "is", "achieved", ",", "it", "is", "unlikely", "this", "is", "sufficient", "to", "result", "in", "the", "clearance", "of", "these", "infected", "cells", "without", "additional", "immune", "augmentation", "such", "as", "the", "administration", "of", "antibodies", ",", "vaccines", ",", "or", "immunotherapies", "to", "prime", "the", "immune", "system", "[", "6", "]", ".", "Given", "these", "limitations", ",", "much", "research", "is", "now", "focused", "on", "combinatorial", "approaches", "to", "trigger", "more", "widespread", "and", "robust", "reactivation", "[", "11", "]", ".", "For", "example", ",", "a", "recent", "study", "reported", "synergistic", "reactivation", "potential", "between", "an", "activator", "of", "non-canonical", "NF-kB", "signaling", "(", "AZD5582", ")", "and", "BET", "bromodomain", "inhibitors", "that", "act", "to", "lift", "blocks", "to", "transcriptional", "initiation", "and", "elongation", ",", "respectively", "[", "12", "]", ".", "Blocks", "to", "transcriptional", "elongation", "are", "major", "contributors", "to", "establishing", "and", "maintaining", "HIV-1", "latency", "[", "13,14", "]", ".", "After", "integration", "of", "the", "proviral", "DNA", ",", "RNA", "Polymerase", "II", "(", "RNA", "Pol", "II", ")", "is", "recruited", "to", "the", "transcription", "start", "site", "by", "transcription", "factors", "that", "bind", "cis-elements", "in", "the", "HIV-1", "promoter", "region.", "After", "transcriptional", "initiation", ",", "RNA", "Pol", "II", "synthesizes", "20–60", "nucleotides", "before", "stalling", "through", "a", "well-conserved", "process", "known", "as", "promoter-proximal", "pausing", "[", "15", "]", ".", "Pausing", "is", "enforced", "by", "several", "negative", "elongation", "factors", ",", "including", "negative", "elongation", "factor", "(", "NELF", ")", ",", "DRB", "Sensitivity", "Inducing", "Factor", "(", "DSIF", ")", ",", "and", "the", "RNA", "Polymerase", "II", "Associated", "Factor", "1", "(", "PAF1", ")", "complex", "[", "16–18", "]", ".", "Pause", "release", "is", "regulated", "by", "positive", "transcription", "elongation", "factor-b", "(", "P-TEFb", ")", ",", "a", "heterodimeric", "protein", "complex", "composed", "of", "cyclin-dependent", "kinase", "9", "(", "CDK9", ")", "and", "cyclin", "T1", "(", "CCNT1", ")", "[", "19–21", "]", ".", "P-TEFb", "phosphorylates", "the", "C-terminal", "tail", "of", "RNA", "Pol", "II", "and", "several", "negative", "elongation", "factors", ",", "which", "collectively", "license", "transcriptional", "elongation", "[", "22–24", "]", ".", "Recruitment", "of", "P-TEFb", "to", "sites", "of", "nascent", "transcription", "is", "a", "highly", "regulated", "process", "mediated", "by", "several", "cellular", "complexes.", "The", "majority", "of", "cellular", "P-TEFb", "is", "sequestered", "in", "an", "inactive", "state", "by", "the", "7SK", "ribonucleoprotein", "(", "RNP", ")", "complex", "[", "25,26", "]", ".", "Diverse", "extracellular", "stimuli", "and", "intracellular", "signals", "can", "induce", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "the", "7SK", "complex", "[", "27–29", "]", "where", "it", "can", "be", "recruited", "to", "sites", "of", "nascent", "transcription", "by", "transcription", "factors", "(", "i.e.", ",", "NF-kB", "and", "c-MYC", ")", "[", "30–32", "]", ",", "epigenetic", "regulators", "(", "i.e.", ",", "BRD4", ")", "[", "33,34", "]", ",", "or", "super", "elongation", "complexes", "(", "SECs", ")", "composed", "of", "an", "ARF4", "/", "FMR2", "(", "AFF", ")", "family", "scaffold", "protein", "in", "complex", "with", "AF9", ",", "ENL", ",", "an", "eleven-nineteen", "Lys-rich", "leukemia", "(", "ELL", ")", "family", "protein", ",", "and", "an", "ELL-associated", "factor", "(", "EAF", ")", "protein", "[", "35", "]", ".", "To", "circumvent", "this", "regulatory", "step", ",", "HIV-1", "encodes", "a", "trans-activator", "protein", "(", "Tat", ")", "that", "binds", "to", "and", "recruits", "P-TEFb", "specifically", "to", "sites", "of", "nascent", "proviral", "transcription", "through", "recognition", "of", "a", "transactivation", "response", "(", "TAR", ")", "RNA", "stem", "loop", "produced", "at", "the", "immediate", "3’", "end", "of", "all", "viral", "RNA", "transcripts", "[", "36–38", "]", ".", "The", "distribution", "of", "and", "competition", "for", "P-TEFb", "binding", "among", "different", "complexes", "is", "an", "area", "of", "active", "investigation", ",", "with", "several", "strategies", "to", "enhance", "the", "biogenesis", "or", "availability", "of", "P-TEFb", "showing", "promise", "for", "HIV-1", "latency", "reversal.", "For", "example", ",", "BET", "bromodomain", "inhibitors", "(", "such", "as", "JQ1", ")", "have", "been", "shown", "to", "be", "potent", "LRAs", "in", "ex", "vivo", "models", "by", "releasing", "P-TEFb", "from", "BRD4", "[", "12", "]", ".", "Likewise", ",", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "the", "7SK", "RNP", "complex", "has", "been", "shown", "to", "reactivate", "latent", "proviruses", "in", "ex", "vivo", "models", "[", "39", "]", ".", "That", "being", "said", ",", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "the", "7SK", "RNP", "complex", "has", "been", "shown", "to", "directly", "correlate", "with", "increased", "BRD4", "binding", ",", "suggesting", "that", "release", "from", "any", "one", "complex", "will", "not", "necessarily", "increase", "the", "amount", "of", "unbound", "P-TEFb", "or", "the", "amount", "recruited", "to", "specific", "sites", "of", "transcription", "[", "33", "]", ".", "Furthermore", ",", "post-translational", "modification", "of", "P-TEFb", "(", "i.e.", ",", "through", "phosphorylation", "of", "CDK9", "at", "Serine", "175", ")", "has", "been", "shown", "to", "influence", "P-TEFb", "distribution", "in", "certain", "regulatory", "complexes", ",", "again", "highlighting", "the", "unique", "properties", "of", "release", "from", "each", "complex", "[", "40", "]", ".", "While", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "the", "7SK", "RNP", "complex", "and", "BET", "proteins", "such", "as", "BRD4", "have", "been", "explored", "as", "strategies", "for", "HIV-1", "latency", "reversal", ",", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "SECs", "has", "not", "been", "explored.", "Previous", "work", "has", "demonstrated", "that", "HIV-1", "Tat", "biochemically", "co-purifies", "with", "several", "SEC", "proteins", "[", "41,42", "]", ",", "though", "the", "reason", "for", "this", "is", "unclear", "as", "they", "seemingly", "have", "functionally", "redundant", "purposes", "in", "P-TEFb", "recruitment.", "In", "this", "study", ",", "we", "test", "the", "hypothesis", "that", "the", "SEC", "is", "not", "necessary", "for", "HIV-1", "viral", "transcription", "and", "that", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "cellular", "SEC", "complexes", "can", "serve", "as", "a", "novel", "strategy", "to", "reactivate", "latent", "HIV-1", "proviruses.", "Results", "Discussion", "In", "this", "study", ",", "we", "demonstrate", "a", "potential", "new", "strategy", "for", "enhancing", "HIV-1", "latency", "reversal", "through", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "the", "cellular", "pool", "of", "SECs.", "We", "show", "that", "KL-2", ",", "a", "small", "molecule", "inhibitor", "of", "the", "interaction", "between", "the", "SEC", "and", "P-TEFb", ",", "is", "sufficient", "to", "enhance", "viral", "transcription", "in", "primary", "CD4+", "T", "cells", "and", "can", "synergistically", "enhance", "the", "activity", "of", "other", "LRAs", "in", "certain", "cell", "line", "models", "of", "latency.", "Finally", ",", "we", "demonstrate", "that", "KL-2", "can", "increase", "HIV-1", "gag", "expression", "in", "PBMCs", "from", "PLWH", "on", "suppressive", "ART", ",", "most", "notably", "in", "combination", "with", "the", "non-canonical", "NF-kB", "agonist", ",", "AZD5582.", "We", "propose", "a", "model", "in", "which", "KL-2", "release", "of", "P-TEFb", "from", "the", "cellular", "pool", "of", "SECs", "enhances", "transcriptional", "elongation", "of", "integrated", "proviruses", ",", "akin", "to", "BET", "bromodomain", "inhibitors", "and", "7SK", "RNP", "inhibitors", "(", "Fig", "6D", ")", ".", "These", "results", "have", "several", "implications", "for", "our", "understanding", "of", "viral", "transcription", "and", "future", "directions.", "Latency", "reversal", "through", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "cellular", "SECs", "had", "not", "been", "previously", "explored", ",", "likely", "due", "to", "the", "perceived", "dependency", "of", "viral", "transcription", "on", "the", "SEC.", "This", "effect", "has", "been", "supported", "by", "biochemical", "purifications", "of", "HIV-1", "Tat", "from", "human", "cell", "lines", "that", "revealed", "interactions", "with", "a", "larger", "SEC", "[", "41,42", "]", ",", "as", "well", "as", "by", "genetic", "knock-down", "experiments", "in", "cell", "lines", "showing", "a", "decrease", "in", "Tat-dependent", "transcription", "upon", "SEC", "component", "depletion", "[", "64,65", "]", ".", "However", ",", "given", "that", "both", "the", "SEC", "and", "Tat", "recruit", "P-TEFb", "to", "sites", "of", "nascent", "transcription", ",", "they", "share", "some", "functional", "redundancy.", "We", "found", "that", "knock-out", "of", "SEC", "components", "from", "activated", ",", "primary", "CD4+", "T", "cells", "from", "12", "independent", "donors", "did", "not", "inhibit", "viral", "replication", ",", "suggesting", "that", "the", "SEC", "is", "not", "required", "in", "this", "cellular", "context.", "This", "result", "was", "independently", "verified", "using", "KL-2", ",", "which", "inhibits", "the", "interaction", "between", "CCNT1", "(", "P-TEFb", ")", "and", "AFF1", "/", "4", "(", "of", "the", "larger", "SEC", ")", ".", "Notably", ",", "disruption", "of", "the", "SEC", "using", "KL-2", "resulted", "in", "significant", "increases", "in", "HIV-1", "replication", "in", "primary", "CD4+", "T", "cells", "whereas", "genetic", "knockout", "of", "most", "SEC", "members", "had", "minimal", "to", "no", "impact", "on", "replication.", "One", "potential", "explanation", "for", "this", "difference", "is", "that", "genetic", "knockout", "results", "in", "the", "ablation", "of", "SEC", "assembly", "and", "relocalization", "of", "P-TEFb", "into", "other", "complexes", "at", "steady-state", "whereas", "chemical", "perturbation", "by", "KL-2", "results", "in", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "SECs", "that", "are", "continually", "being", "formed.", "Understanding", "the", "dynamics", "of", "P-TEFb", "distribution", "and", "relocalization", "upon", "different", "types", "of", "perturbation", "is", "an", "ongoing", "area", "of", "investigation.", "While", "we", "expected", "KL-2", "to", "enhance", "the", "transcriptional", "elongation", "of", "integrated", "proviruses", "due", "to", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "cellular", "SECs", ",", "we", "also", "saw", "increases", "in", "transcriptional", "initiation", "as", "measured", "by", "qRT-PCR", "for", "TAR", "transcript", "levels.", "Likewise", ",", "in", "J-Lat", "5A8", "cells", ",", "we", "saw", "increases", "in", "transcriptional", "elongation", ",", "transcriptional", "initiation", ",", "and", "in", "RNA", "Pol", "II", "recruitment", "to", "the", "proviral", "promoter", "when", "KL-2", "was", "added", ",", "even", "though", "KL-2", "addition", "alone", "was", "not", "sufficient", "for", "reactivation", "as", "measured", "by", "GFP", "positivity", "in", "this", "model.", "This", "finding", "suggests", "that", "either", "KL-2", "has", "secondary", "effects", "not", "mediated", "by", "P-TEFb", "or", "that", "the", "redistribution", "of", "P-TEFb", "away", "from", "SECs", "has", "secondary", "effects", "that", "could", "impact", "transcriptional", "initiation", "at", "proviral", "integration", "sites.", "BET", "bromodomain", "inhibitors", "have", "also", "been", "reported", "to", "increase", "HIV-1", "transcriptional", "initiation", "[", "12,13", "]", ",", "though", "these", "effects", "have", "been", "suggested", "to", "occur", "through", "modulation", "of", "the", "epigenetic", "regulatory", "functions", "of", "these", "proteins", "[", "66", "]", ".", "Other", "reports", "have", "indicated", "that", "P-TEFb", "mediated", "release", "of", "paused", "RNA", "Pol", "II", "can", "result", "in", "enhanced", "transcriptional", "initiation", "and", "even", "RNA", "Pol", "II", "recruitment", "simply", "by", "increasing", "the", "number", "of", "transcribing", "polymerases", "[", "67", "]", ".", "Still", ",", "this", "connection", "between", "transcriptional", "elongation", "and", "initiation", "has", "yet", "to", "be", "fully", "understood", "in", "the", "context", "of", "HIV-1", "transcription.", "While", "KL-2", "was", "sufficient", "to", "boost", "viral", "replication", "in", "activated", ",", "primary", "CD4+", "T", "cells", ",", "in", "and", "of", "itself", "it", "displayed", "minimal", "reactivation", "potential", "in", "both", "cell", "line", "models", "of", "latency", "and", "in", "PBMCs", "from", "PLWH", "on", "suppressive", "ART.", "This", "finding", "is", "similar", "to", "our", "recent", "report", "of", "a", "novel", "inhibitor", "of", "the", "PAF1", "complex", "(", "iPAF1C", ")", "that", "had", "minimal", "activity", "on", "its", "own", ",", "but", "greatly", "enhanced", "the", "reactivation", "potential", "of", "other", "LRAs", "[", "16", "]", ".", "Both", "cases", "highlight", "the", "multifaceted", "nature", "of", "the", "blocks", "to", "viral", "gene", "expression", "that", "underlie", "the", "latent", "state", "as", "well", "as", "the", "limitations", "to", "single", "agent", "drug", "screening", "to", "identify", "promising", ",", "next-generation", "LRAs.", "Combinatorial", "approaches", "to", "dissect", "the", "genetic", "underpinnings", "of", "HIV-1", "latency", "and", "discover", "new", ",", "synergistic", "drug", "interactions", "should", "be", "prioritized.", "While", "KL-2", "alone", "failed", "to", "significantly", "increase", "HIV-1", "gag", "transcript", "levels", "in", "patient", "PBMCs", ",", "in", "combination", "with", "AZD5582", "it", "resulted", "in", "a", "16-fold", "increase", "over", "AZD5582", "treatment", "alone", "and", "a", "53-fold", "increase", "over", "the", "DMSO", "control.", "Crosswise", "dose", "titrations", "in", "J-Lat", "5A8", "cells", "showed", "a", "strong", "synergistic", "potential", "between", "AZD5582", "and", "KL-2.", "This", "is", "consistent", "with", "reports", "of", "robust", "synergy", "between", "AZD5582", "and", "P-TEFb", "release", "through", "BET", "bromodomain", "inhibition", "[", "12", "]", ".", "Notably", ",", "the", "BET", "bromodomain", "inhibitor", "JQ1", "showed", "minimal", "reactivation", "activity", "in", "our", "patient", "PBMCs", ",", "even", "in", "the", "presence", "of", "KL-2", ",", "in", "contrast", "to", "our", "cell", "line", "data.", "This", "finding", "could", "reflect", "stochastic", "differences", "driven", "by", "variations", "in", "patient", "characteristics", ",", "integration", "site", ",", "chromatin", "state", ",", "transcription", "factor", "availability", ",", "etc.", "[", "13", "]", ".", "Future", "work", "will", "compare", "P-TEFb", "release", "from", "SECs", "to", "release", "from", "other", "cellular", "reservoirs", ",", "such", "as", "BRD4", "or", "the", "7SK", "RNP.", "Recent", "studies", "have", "shown", "that", "post-translational", "modifications", "of", "P-TEFb", ",", "most", "notably", "phosphorylation", "of", "CDK9", "Serine", "175", "and", "Threonine", "186", ",", "can", "drive", "inclusion", "into", "different", "complexes", "and", "may", "strongly", "influence", "bioavailability", "and", "activity", "[", "40", ",", "68–70", "]", ".", "Therefore", ",", "it", "is", "possible", "that", "disruption", "of", "complexes", "housing", "‘active’", "P-TEFb", "is", "a", "more", "direct", "route", "to", "redirecting", "P-TEFb", "activity.", "This", "is", "not", "to", "say", "that", "the", "SEC", "is", "never", "required", "for", "viral", "transcription.", "In", "latency", "model", "cell", "lines", "that", "lacked", "a", "functional", "Tat", "(", "U1", "cells", ")", "or", "TAR", "stem", "loop", "(", "ACH-2", "cells", ")", ",", "KL-2", "inhibited", "the", "reactivation", "potential", "of", "several", "LRAs", ",", "suggesting", "that", "viral", "transcription", "may", "be", "more", "dependent", "on", "the", "SEC", "when", "Tat", "is", "either", "defective", "or", "not", "expressed.", "We", "attempted", "to", "test", "this", "by", "inhibiting", "Tat", "in", "the", "J-Lat", "5A8", "model", "cell", "line", "using", "two", "previously", "described", "Tat-dependent", "transcription", "inhibitors", ",", "Triptolide", "and", "Spironolactone.", "While", "both", "compounds", "reduced", "LRA", "efficacy", ",", "KL-2", "still", "boosted", "the", "activity", "of", "JQ1", "and", "PMA", ",", "but", "not", "AZD5582.", "This", "suggests", "that", "P-TEFb", "can", "be", "recruited", "to", "proviral", "integration", "sites", "in", "a", "Tat", "and", "SEC-independent", "manner", "upon", "PMA", "or", "JQ1", "treatment", ",", "potentially", "through", "a", "transcription", "factor", "such", "as", "NF-kB.", "The", "inability", "of", "AZD5582", "to", "do", "so", "suggests", "that", "non-canonical", "NF-kB", "activation", "does", "not", "recruit", "the", "same", "milieu", "of", "transcription", "factors", ",", "making", "it", "uniquely", "Tat", "or", "SEC", "dependent.", "This", "is", "consistent", "with", "the", "complete", "lack", "of", "activity", "of", "AZD5582", "in", "cell", "line", "models", "lacking", "functional", "Tat", "/", "TAR", "activity", "and", "may", "underlie", "the", "remarkable", "synergy", "between", "non-canonical", "NF-kB", "agonists", "and", "agents", "that", "release", "P-TEFb", "[", "12", "]", ".", "Additionally", ",", "triptolide", "has", "been", "characterized", "outside", "of", "HIV-1", "transcription", "in", "its", "ability", "to", "prevent", "RNA", "Pol", "II", "reinitiation", "following", "pausing", "through", "inhibition", "of", "xeoderma", "pigmentosum", "group", "B-complementing", "protein", "(", "XPB", ")", "and", "is", "often", "used", "as", "a", "tool", "compound", "for", "measuring", "the", "fate", "of", "paused", "RNA", "Pol", "II", "at", "different", "time", "points", "[", "51,71", "]", ".", "With", "this", "in", "mind", ",", "it", "is", "possible", "that", "compounds", "JQ1", "and", "PMA", "result", "in", "de", "novo", "recruitment", "of", "RNA", "Pol", "II", "thereby", "increasing", "transcriptional", "initiation", "whereas", "AZD5582", "may", "be", "more", "reliant", "on", "RNA", "Pol", "II", "pause-release.", "To", "further", "explore", "the", "Tat", "dependency", "of", "KL-2", ",", "we", "tried", "to", "rescue", "Tat", "function", "in", "the", "U1", "cell", "line", "using", "a", "Dox-inducible", "system.", "We", "hypothesized", "that", "by", "providing", "Tat", ",", "the", "SEC", "would", "no", "longer", "be", "required", "for", "viral", "gene", "expression", "such", "that", "SEC", "disruption", "by", "KL-2", "would", "enhance", "reactivation", "as", "seen", "in", "the", "J-Lat", "models.", "While", "Tat", "induction", "itself", "was", "sufficient", "for", "reactivation", ",", "this", "reactivation", "was", "completely", "abolished", "by", "the", "addition", "of", "KL-2.", "Even", "when", "Tat", "was", "minimally", "induced", "and", "other", "LRAs", "were", "added", ",", "KL-2", "still", "inhibited", "reactivation", ",", "suggesting", "that", "additional", "factors—such", "as", "steady-state", "levels", "of", "P-TEFb", ",", "integration", "site", ",", "epigenetic", "factors", ",", "or", "transcription", "factor", "availability—may", "drive", "SEC", "dependency", "besides", "just", "the", "presence", "or", "absence", "of", "Tat.", "Indeed", ",", "SEC", "disruption", "by", "KL-2", "in", "the", "original", "report", "of", "the", "inhibitor", "demonstrated", "an", "outsized", "impact", "on", "Myc-dependent", "transcription", "[", "32", "]", ",", "suggesting", "that", "additional", "factors", "driving", "the", "SEC", "dependency", "of", "proviral", "transcription", "have", "yet", "to", "be", "described.", "Regardless", ",", "the", "dual-acting", "nature", "of", "KL-2", "in", "enhancing", "latency", "reactivation", "in", "some", "circumstances", "(", "i.e.", ",", "if", "Tat", "is", "present", ")", "and", "inhibiting", "latency", "reactivation", "in", "others", "(", "i.e.", ",", "when", "the", "cell", "state", "dictates", "SEC", "dependency", ")", "presents", "a", "unique", "opportunity", "to", "leverage", "the", "heterogenous", "nature", "of", "the", "latent", "reservoir", "to", "both", "reverse", "and", "promote", "latency.", "Taken", "together", ",", "our", "results", "indicate", "that", "release", "of", "P-TEFb", "from", "cellular", "SECs", "is", "a", "novel", "mechanism", "for", "promoting", "HIV-1", "viral", "transcription", "during", "both", "active", "and", "latent", "infection.", "We", "demonstrated", "the", "enhancement", "of", "latency", "reversal", "in", "multiple", "latent", "cell", "line", "models", "and", "in", "primary", "PBMCs", "from", "PLWH", "on", "suppressive", "ART.", "This", "work", "demonstrates", "the", "importance", "of", "increasing", "the", "production", "or", "availability", "of", "free", "P-TEFb", "for", "recruitment", "to", "viral", "loci", "as", "a", "powerful", "strategy", "for", "bolstering", "current", "LRAs", ",", "most", "notably", "non-canonical", "NF-kB", "agonists.", "Due", "to", "the", "heterogeneity", "of", "blocks", "to", "viral", "replication", "in", "the", "latent", "reservoir", ",", "it", "is", "likely", "that", "combinatorial", "LRA", "treatments", "will", "be", "the", "best", "strategy", "for", "potent", "latency", "reversal", "moving", "forward.", "Further", "efforts", "are", "needed", "to", "understand", "the", "intracellular", "distribution", "of", "active", "P-TEFb", "to", "characterize", "the", "most", "critical", "reservoir", "to", "target", "to", "enhance", "transcription.", "Additionally", ",", "our", "work", "demonstrates", "that", "disruption", "of", "SECs", "could", "enhance", "latency", "reversal", "or", "promote", "the", "maintenance", "of", "latency", "depending", "on", "the", "cellular", "context.", "Understanding", "the", "mechanism", "that", "controls", "this", "molecular", "switch", "would", "aid", "in", "understanding", "whether", "SEC", "disruptors", "could", "be", "a", "viable", "dual-acting", "molecule", "to", "aid", "in", "finding", "a", "functional", "cure", "for", "HIV-1", "infection.", "Methods", "Flow", "cytometry", "and", "analysis", "of", "viability", "/", "infection", "/", "reactivation", "data", "Flow", "cytometry", "analysis", "was", "performed", "on", "an", "Attune", "NxT", "acoustic", "focusing", "cytometer", "(", "Thermo", "Fisher", "Scientific", ")", ",", "recording", "all", "events", "in", "a", "40-μL", "sample", "volume", "after", "one", "150", "μL", "of", "mixing", "cycle.", "Data", "were", "exported", "as", "FCS3.0", "files", "using", "Attune", "NxT", "Software", "v3.2.0", "and", "analyzed", "with", "a", "consistent", "template", "on", "FlowJo.", "Briefly", ",", "cells", "were", "gated", "for", "lymphocytes", "by", "light", "scatter", "followed", "by", "doublet", "discrimination", "in", "both", "side", "and", "forward", "scatter.", "Cells", "with", "equal", "fluorescence", "in", "the", "BL-1", "(", "GFP", ")", "channel", "and", "the", "VL-2", "(", "AmCyan", ")", "channel", "were", "identified", "as", "autofluorescent", "and", "excluded", "from", "the", "analysis.", "A", "consistent", "gate", "was", "then", "used", "to", "quantify", "the", "fraction", "of", "remaining", "cells", "that", "expressed", "the", "target", "of", "interest.", "Analysis", "of", "hiv-specific", "rna", "transcripts", "Following", "cDNA", "synthesis", ",", "viral", "transcripts", "were", "assessed", "by", "qRT-PCR", "as", "described", "previously", "[", "13", "]", ".", "For", "HIV-1", "TAR", ",", "the", "following", "primers", "were", "used", ":", "PF", ":", "5′-GTCTCTCTGGTTAGACCAG-3′", ";", "PR", ":", "5′-TGGGTTCCCTAGYTAGCC-3′", ";", "and", "probe", ":", "5′-AGCCTGGGAGCTC-3′.", "HIV-1", "Long", "LTR", "levels", "were", "assessed", "using", "the", "following", "primers", ":", "PF", ":", "5′-GCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3′", ";", "PR", ":", "5′-GGGCGCCACTGCTAGAGA-3′", ";", "and", "probe", ":", "5′-CCAGAGTCACACAACAGACGGGCACA-3.", "For", "expression", "level", "normalization", ",", "β-Actin", "was", "used", "(", "Thermo", "Fisher", "Scientific", ",", "catalog", "no.", "4331182", ")", ".", "Notably", ",", "β-Actin", "is", "an", "RNA", "Pol", "II", "controlled", "gene.", "To", "ensure", "that", "β-Actin", "levels", "were", "not", "being", "altered", "by", "KL-2", "induced", "SEC", "disruption", ",", "we", "compared", "β-Actin", "expression", "to", "that", "of", "the", "18S", "ribosomal", "subunit", ",", "an", "RNA", "Pol", "I", "controlled", "gene", "(", "Thermo", "Fisher", "Scientific", ",", "catalog", "no.", "4331182", ")", ".", "No", "statistically", "significant", "changes", "were", "noted", "between", "the", "two", "housekeeping", "genes", "upon", "KL-2", "treatment", ",", "so", "β-Actin", "was", "used", "as", "the", "normalization", "gene", "for", "subsequent", "qPCR", "analyses.", "The", "reaction", "was", "performed", "using", "TaqMan", "Fast", "Advanced", "Master", "Mix", "(", "Thermo", "Fisher", "Scientific", ",", "catalog", "no.", "4444553", ")", "according", "to", "manufacturer’s", "instructions.", "Briefly", ",", "10", "μL", "of", "reaction", "was", "mixed", "using", "5", "μL", "of", "Taqman", "Master", "Mix", ",", "0.5", "μL", "of", "20x", "primer", "probe", "mix", "(", "18", "μM", "of", "primers", "and", "5", "μM", "probe", ")", ",", "2.5", "μL", "water", ",", "and", "2", "μL", "of", "template", "cDNA.", "The", "PCR", "cycles", "were", "as", "follows", ":", "50", "°C", "for", "2", "minutes", ",", "95", "°C", "for", "20", "seconds", ",", "followed", "by", "40", "cycles", "of", "95", "°C", "for", "1", "second", "and", "60", "°C", "for", "20", "seconds.", "Rna", "sequencing", "analysis", "Sequencing", "data", "was", "demultiplexed", "and", "trimmed", "using", "Trimmomatic", "v0.36", "to", "remove", "adapters", "and", "low-quality", "reads.", "Trimmed", "reads", "were", "aligned", "to", "the", "Homo", "sapiens", "reference", "genome", "GRCh38", "and", "transcripts", "quantified", "using", "the", "Hisat2-StringTie", "pipeline", "[", "76", "]", ".", "Differential", "gene", "expression", "analysis", "of", "the", "quantified", "gene", "transcripts", "was", "performed", "with", "DESeq2", "v.1.42.0", "R", "package", "using", "R", "v.4.3.2.", "After", "retaining", "genes", "with", "nonzero", "total", "read", "count", "and", "with", "more", "than", "10", "reads", "in", "total", "between", "all", "samples", ",", "we", "fitted", "a", "model", "that", "included", "all", "treatments", "to", "account", "for", "overall", "variability", "and", "identified", "differentially", "expressed", "genes", "(", "DEGs", ")", "within", "that", "model", "between", "all", "tested", "conditions", "against", "DMSO-treated", "cells", "(", "i.e.", "KL2", "vs", "DMSO", ",", "AZD5582", "vs", "DMSO", ",", "and", "AZD5582+KL2", "vs", "DMSO", ")", ".", "To", "define", "DEGs", ",", "we", "used", "as", "cut-offs", "an", "absolute", "log2", "fold", "change", ">", "1", "and", "a", "false", "discovery", "rate", "(", "FDR", ")", "compareCluster", "function.", "For", "these", "analyses", "all", "genes", "whose", "gene", "symbols", "could", "be", "mapped", "to", "ENTREZ", "Ids", "using", "the", "org.Hs.eg.db", "v.3.18.0", "Bioconductor", "annotation", "package", "were", "included.", "Statistical", "analysis", "All", "statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "GraphPad", "Prism", "version", "10.2.0", "(", "392", ")", "for", "Windows", "64-bit", ",", "GraphPad", "Software", ",", "Boston", ",", "Massachusetts", ",", "USA", "(", "www.graphpad.com", ")", ".", "Source", "paper", ":", "PMC11419360" ]	[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]
[ "2.", "results", "3.", "discussion", "Müller", "glial", "cells", "play", "fundamental", "roles", "in", "retinal", "tissue", "functions.", "Therefore", ",", "studies", "into", "their", "biology", "and", "functions", "may", "contribute", "to", "understanding", "the", "causes", "of", "retinal", "pathologies", "and", "to", "develop", "strategies", "to", "alleviate", "their", "outcomes.", "The", "aim", "of", "this", "study", "was", "to", "investigate", "the", "impact", "of", "high", "glucose", "and", "glucose", "fluctuations", "on", "critical", "cellular", "processes", ",", "such", "as", "gliosis", "and", "reprogramming", "in", "Müller", "cells.", "These", "processes", "are", "of", "pivotal", "importance", "in", "the", "onset", "and", "progression", "of", "retinal", "neurodegeneration", "and", "diabetic", "retinopathy.", "In", "the", "present", "study", ",", "we", "observed", "a", "significant", "increase", "in", "GFAP", "expression", "in", "NG", "MIO-M1", "cells", "exposed", "to", "sustained", "high-glucose", "and", "GF", "treatments", ",", "indicating", "a", "glucose", "stress-induced", "gliotic", "response.", "This", "response", "was", "associated", "with", "other", "markers", "of", "reactive", "gliosis", ",", "such", "as", "the", "morphological", "changes", "associated", "with", "the", "transition", "from", "a", "bipolar", "to", "a", "radial", "morphology", "and", "the", "overexpression", "/", "reorganization", "of", "vimentin", "intermediate", "filament.", "These", "findings", "indicate", "that", "NG", "MIO-M1", "cells", "are", "sensitive", "to", "glucose", "changes", "in", "their", "surrounding", "environment", ",", "potentially", "functioning", "as", "a", "protective", "or", "reactive", "mechanism", "in", "response", "to", "metabolic", "stress.", "The", "remarkable", "sensitivity", "to", "glucose", "stress", "and", "the", "prompt", "reactive", "gliosis", "observed", "in", "MIO-M1", "cells", "were", "found", "to", "be", "similar", "to", "those", "observed", "in", "Müller", "cells", "of", "diabetic", "subjects", "[", "8", "]", ".", "This", "finding", "confirms", "the", "suitability", "of", "MIO-M1", "cells", "as", "an", "in", "vitro", "model", "to", "study", "Müller", "cell", "response.", "In", "contrast", ",", "HG", "MIO-M1", "cells", "maintain", "a", "basal", "high", "level", "of", "both", "GFAP", "and", "Vimentin", "together", "to", "less", "organized", "intermediate", "filaments", "across", "the", "different", "glucose", "treatments", ",", "suggesting", "a", "limited", "and", "static", "response", "to", "sustained", "high-glucose", "and", "GF", "treatments.", "These", "findings", "highlight", "that", "MIO-M1", "cells", "in", "chronic", "hyperglycemic", "conditions", "may", "adapt", "or", "develop", "enhanced", "tolerance", "over", "time", "due", "to", "constant", "and", "prolonged", "exposure", "to", "high", "glucose", "levels.", "The", "adaptation", "or", "desensitization", "of", "HG", "MIO-M1", "cells", "to", "sustained", "high-glucose", "and", "GFs", "may", "indicate", "a", "saturation", "of", "the", "gliotic", "response", ",", "which", "is", "characteristic", "of", "prolonged", "hyperglycemic", "states", ",", "as", "observed", "in", "uncontrolled", "diabetes", "[", "34", "]", ".", "This", "adaptation", "or", "desensitization", "may", "result", "in", "a", "reduction", "in", "the", "cellular", "capacity", "to", "respond", "to", "additional", "metabolic", "challenges", "or", "stress.", "To", "understand", "the", "clinical", "consequences", "of", "Müller", "cell", "gliosis", "it", "is", "essential", "to", "also", "consider", "the", "reprogramming", "process", ",", "which", "may", "include", "dedifferentiation", "of", "Müller", "cells", "and", "regeneration", "of", "various", "retinal", "neurons", ",", "contributing", "to", "retinal", "tissues", "repair", "under", "certain", "conditions.", "In", "species", "such", "as", "birds", "[", "35", "]", ",", "zebrafish", "[", "36,37", "]", ",", "and", "rodents", "[", "38", "]", ",", "Müller", "glia", "contribute", "as", "the", "primary", "source", "of", "retinal", "regeneration.", "When", "the", "retina", "is", "damaged", ",", "Müller", "glia", "can", "dedifferentiate", "into", "Müller", "glia-derived", "progenitor", "cells", "(", "MGPCs", ")", ",", "acquiring", "a", "progenitor-like", "phenotype", "and", "starting", "to", "proliferate", ",", "thus", "contributing", "to", "retinal", "repair", "[", "39,40", "]", ".", "Notably", ",", "Müller", "glia", "in", "lower", "vertebrates", "exhibit", "a", "remarkable", "ability", "to", "regenerate", "retinal", "neurons", ",", "contrasting", "with", "the", "limited", "regenerative", "capacity", "seen", "in", "mammals", ",", "including", "humans", "[", "40", "]", ",", "where", "Müller", "cells", "typically", "respond", "to", "injury", "with", "reactive", "gliosis", ",", "leading", "to", "scarring", "rather", "than", "regeneration", "[", "11,20", "]", ".", "The", "SHH", "signaling", "pathway", "is", "essential", "for", "the", "proper", "development", "of", "all", "vertebrate", "retinas", "[", "41,42,43,44,45,46,47", "]", ",", "and", "several", "studies", "have", "demonstrated", "the", "involvement", "of", "SHH", "signaling", "in", "the", "proliferation", "and", "differentiation", "of", "MGPCs", ",", "contributing", "to", "retinal", "regeneration", "in", "lower", "vertebrate", "[", "18,19,31,32,34", "]", ".", "However", ",", "in", "mammals", ",", "the", "SHH", "pathway", "alone", "may", "not", "be", "sufficient", "to", "overcome", "the", "intrinsic", "limitations", "of", "Müller", "cells", "to", "regenerate", "neuronal", "cells.", "In", "our", "study", ",", "we", "observed", "an", "increase", "in", "SHH", "expression", "in", "NG", "MIO-M1cells", "exposed", "to", "sustained", "high-glucose", "and", "GF", "treatments.", "This", "suggests", "that", "these", "cells", "are", "engaging", "in", "pathways", "associated", "with", "cellular", "dedifferentiation", "and", "potential", "reprogramming", "towards", "a", "progenitor", "state.", "The", "increased", "SHH", "protein", "expression", "in", "NG", "cells", "was", "accompanied", "by", "significant", "changes", "in", "the", "intracellular", "localization", "of", "SHH", ",", "exhibiting", "a", "more", "spotted", "/", "punctate", "pattern", "in", "the", "cytoplasm", "and", "in", "close", "proximity", "to", "the", "plasma", "membrane.", "These", "findings", "suggest", "an", "enhanced", "state", "of", "cellular", "activity", "with", "increased", "synthesis", "and", "potential", "accumulation", "of", "SHH", ",", "aligning", "with", "the", "findings", "in", "lower", "vertebrates", "and", "rodents", ",", "where", "increased", "SHH", "signaling", "plays", "a", "role", "in", "Müller", "cell", "reprogramming", "and", "retinal", "regeneration", "[", "18,48,49", "]", ".", "Furthermore", ",", "significantly", "higher", "levels", "of", "SHH", "were", "observed", "in", "HG", "MIO-M1", "cells", "compared", "to", "NG", "MIO-M1", "cells.", "Conversely", ",", "HG", "MIO-M1", "cells", "exposed", "to", "GF", "treatments", "showed", "a", "decrease", "in", "SHH", "protein", "expression", "levels.", "A", "trend", "toward", "a", "decrease", "was", "also", "observed", "in", "response", "to", "sustained", "high-glucose.", "This", "finding", "is", "consistent", "with", "a", "previous", "study", "in", "which", "the", "authors", "observed", "a", "decrease", "in", "SHH", "signaling", "in", "reactive", "astrocytes", "of", "the", "cerebral", "cortex", "after", "acute", ",", "focal", "injury", ",", "particularly", "in", "cells", "proximal", "to", "the", "lesion", "site", "[", "50", "]", ".", "This", "highlights", "that", "the", "negative", "regulation", "of", "SHH", "activity", "in", "astrocytes", "is", "context-dependent", "and", "varies", "with", "the", "degree", "of", "cellular", "damage.", "In", "our", "study", ",", "the", "decreased", "SHH", "levels", "observed", "in", "HG", "MIO-M1", "cells", "exposed", "to", "GFs", "indicate", "that", "the", "severity", "of", "metabolic", "stress", "may", "influence", "SHH", "signaling", "pathways", "through", "a", "similar", "mechanism.", "These", "observations", "underscore", "the", "notion", "that", "glial", "cells", ",", "including", "Müller", "cells", "and", "astrocytes", ",", "exhibit", "differential", "SHH", "responses", "depending", "on", "the", "extent", "of", "glucose", "stress", ",", "highlighting", "the", "dynamic", "regulation", "of", "SHH", "signaling", "in", "glial", "cells.", "Although", "the", "SHH", "level", "has", "decreased", ",", "the", "cells", "that", "express", "it", "maintain", "a", "dot-like", "distribution", "of", "SHH", "inside", "the", "cells.", "Our", "findings", "suggest", "that", ",", "under", "NG", "condition", ",", "exposure", "to", "sustained", "high-glucose", "and", "GFs", "stimulates", "SHH", "expression", ",", "potentially", "promoting", "the", "dedifferentiation", "and", "reprogramming", "of", "Müller", "cells.", "However", ",", "in", "HG-adapted", "cells", ",", "additional", "metabolic", "stress", "from", "GF", "treatments", "leads", "to", "decreased", "SHH", "expression", ",", "possibly", "impairing", "regenerative", "capacity", "and", "enhancing", "gliotic", "responses.", "These", "observations", "indicate", "that", "the", "severity", "and", "fluctuation", "of", "glucose", "stress", "influence", "SHH", "signaling", "pathways", ",", "affecting", "the", "balance", "between", "neuroprotection", "and", "gliosis", "in", "the", "retina.", "A", "previous", "study", "demonstrated", "that", "high-glucose", "conditions", "have", "been", "associated", "with", "increased", "SOX2", "levels", "in", "human", "Müller", "glial", "cells", ",", "which", "may", "support", "cell", "survival", "and", "regeneration", "under", "stress", "conditions", "[", "51", "]", ".", "In", "our", "experiments", ",", "SOX2", "was", "significantly", "upregulated", "in", "HG", "MIO-M1", "cells", ",", "compared", "to", "NG", "MIO-M1", "cells.", "Furthermore", ",", "NG", "MIO-M1", "cells", "have", "the", "capacity", "to", "modulate", "this", "gene", "when", "exposed", "to", "sustained", "high-glucose", "and", "GF", "treatments", ",", "exhibiting", "a", "consistent", "upregulation", "of", "SOX2.", "These", "findings", "are", "consistent", "with", "the", "observed", "upregulation", "of", "SHH", "in", "NG", "MIO-M1", "cells", "exposed", "to", "different", "glucose", "treatments.", "Unlike", "NG", "MIO-M1cells", ",", "HG", "MIO-M1", "cells", "exposed", "to", "the", "same", "glucose", "treatments", "do", "not", "show", "variations", "in", "SOX2", "expression.", "This", "different", "behavior", "of", "HG", "MIO-M1", "cells", ",", "with", "regards", "to", "SOX2", "and", "SHH", "expression", ",", "may", "be", "due", "to", "the", "different", "roles", "and", "regulatory", "mechanisms", "in", "the", "glial", "cells", "of", "these", "two", "genes.", "SOX2", "is", "a", "transcription", "factor", "crucial", "for", "maintaining", "stemness", "and", "promoting", "cell", "progenitor", "proliferation", ",", "and", "its", "upregulation", "could", "be", "a", "response", "to", "cellular", "stress", "in", "order", "to", "maintain", "or", "enhance", "regenerative", "capacity.", "In", "contrast", ",", "SHH", "signaling", ",", "which", "is", "involved", "in", "cell", "differentiation", "and", "tissue", "patterning", ",", "may", "be", "more", "sensitive", "to", "metabolic", "perturbations", "with", "a", "more", "dynamic", "regulation", ",", "which", "can", "lead", "to", "its", "downregulation", "under", "glucose", "fluctuations", "treatments.", "However", ",", "despite", "the", "observed", "upregulation", "of", "SHH", "and", "SOX2", "in", "NG", "MIO-M1", "cells", ",", "the", "expression", "of", "rhodopsin", ",", "a", "marker", "of", "mature", "neuronal", "cells", ",", "was", "not", "detected.", "This", "indicates", "that", ",", "although", "the", "cells", "possess", "the", "potential", "to", "differentiate", "into", "neuronal", "cells", ",", "the", "conditions", "employed", "in", "our", "protocol", "were", "not", "sufficient", "to", "fully", "induce", "this", "differentiation.", "The", "lack", "of", "mature", "neuronal", "marker", "expression", "is", "likely", "due", "to", "the", "timing", "and", "duration", "of", "the", "experimental", "conditions.", "It", "may", "therefore", "be", "worthwhile", "to", "optimize", "the", "protocol", "in", "order", "to", "more", "accurately", "reflect", "the", "diabetic", "conditions", "in", "humans", ",", "with", "a", "view", "to", "promoting", "full", "neuronal", "differentiation.", "Given", "the", "role", "of", "SHH", "in", "Müller", "cells", "reprogramming", "and", "the", "observed", "upregulation", "under", "sustained", "high-glucose", "and", "GF", "treatments", ",", "future", "experiments", "could", "investigate", "the", "effect", "of", "exogenous", "SHH", "treatment", "on", "human", "Müller", "cells.", "This", "approach", "would", "provide", "insights", "into", "the", "therapeutic", "potential", "of", "modulating", "SHH", "signaling", "to", "mitigate", "the", "adverse", "effects", "of", "reactive", "gliosis", "and", "enhance", "regenerative", "processes", "in", "the", "diabetic", "retina.", "Although", "the", "current", "study", "provides", "important", "insights", "into", "the", "gliotic", "and", "reprogramming", "potential", "of", "Müller", "cells", "under", "different", "glucose", "treatments", ",", "some", "limitations", "should", "be", "considered.", "The", "study", "employed", "the", "MIO-M1", "cell", "line", ",", "which", ",", "although", "well", "established", "in", "human", "retinal", "research", ",", "may", "not", "fully", "capture", "the", "physiological", "complexity", "of", "Müller", "cells", "found", "in", "human", "retina.", "Future", "research", "could", "benefit", "from", "using", "primary", "Müller", "cells", "to", "better", "reflect", "the", "in", "vivo", "context", "of", "human", "diabetic", "retinopathy.", "In", "addition", ",", "the", "effects", "of", "other", "stressors", ",", "such", "as", "oxidative", "stress", "or", "hypoxia", ",", "which", "also", "play", "a", "role", "in", "diabetic", "retinal", "damage", ",", "were", "not", "included", "in", "our", "model.", "Inclusion", "of", "these", "factors", "could", "provide", "a", "more", "comprehensive", "understanding", "of", "the", "cellular", "mechanisms", "involved.", "Despite", "these", "limitations", ",", "the", "current", "study", "contributes", "important", "insights", "into", "the", "gliotic", "and", "reprogramming", "potential", "of", "Müller", "cells", "under", "varying", "glucose", "conditions.", "4.", "materials", "and", "methods", "4.5.", "statistical", "analysis", "All", "the", "results", "are", "expressed", "as", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "standard", "error", "of", "the", "mean", ")", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments.", "Statistically", "significant", "differences", "were", "assessed", "using", "Prism", "6.05", "(", "GraphPad", "PRISM", "Software", ",", "Inc.", ",", "La", "Jolla", ",", "CA", ",", "USA", ")", "with", "Student’s", "t-test", "for", "statistical", "comparison", "between", "groups.", "Differences", "between", "means", "were", "considered", "statistically", "significant", "when", "p-values", "were", "at", "least", "*5.", "Conclusions*", "The", "results", "showed", "that", "MIO-M1", "Müller", "cells", "exhibit", "distinct", "responses", "to", "different", "glucose", "treatments", ",", "which", "are", "strongly", "dependent", "on", "their", "metabolic", "environment.", "This", "differential", "response", "could", "have", "implications", "for", "the", "onset", "and", "progression", "of", "diabetic", "retinopathy.", "The", "increased", "levels", "of", "activation", "and", "dedifferentiation", "markers", "observed", "in", "NG", "MIO-M1", "cells", "in", "response", "to", "different", "glucose", "treatments", "suggest", "a", "protective", "response", "that", "may", "occur", "in", "early", "or", "well-controlled", "diabetes.", "In", "contrast", ",", "the", "lack", "of", "response", "observed", "in", "HG", "MIO-M1", "cells", "exposed", "to", "different", "glucose", "treatments", "may", "reflect", "an", "exhausted", "gliotic", "and", "reprogramming", "capacity", ",", "which", "could", "contribute", "to", "the", "development", "and", "progression", "of", "diabetic", "complications", "such", "as", "retinal", "neurodegeneration", "and", "diabetic", "retinopathy", "observed", "in", "uncontrolled", "diabetic", "patients", "exposed", "to", "prolonged", "metabolic", "glucose", "stress.", "Although", "our", "results", "provide", "valuable", "insights", ",", "further", "in-depth", "studies", "are", "needed", "to", "elucidate", "the", "mechanisms", "involved", "and", "to", "explore", "the", "potential", "therapeutic", "implications", "for", "mitigating", "retinal", "neurodegeneration", "associated", "with", "diabetes.", "Extending", "these", "studies", "to", "primary", "Müller", "cells", "in", "future", "research", "would", "provide", "a", "more", "physiologically", "relevant", "system", ",", "helping", "to", "validate", "and", "refine", "our", "findings.", "This", "approach", "would", "provide", "a", "deeper", "understanding", "of", "the", "cellular", "response", "to", "sustained", "high-glucose", "and", "glucose", "fluctuations", "and", "could", "improve", "the", "development", "of", "targeted", "therapeutic", "strategies", "for", "retinal", "pathologies", "in", "human", "patients.", "Source", "paper", ":", "PMC11641291" ]	[ "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]
[ "Introduction", "Antiretroviral", "therapy", "(", "ART", ")", "has", "been", "highly", "effective", "at", "suppressing", "human", "immunodeficiency", "virus", "(", "HIV", ")", "replication", ",", "thus", "significantly", "reducing", "disease", "progression", "and", "mortality", "in", "infected", "individuals.", "However", ",", "ART", "is", "not", "curative", "and", "does", "not", "meaningfully", "impact", "persistent", "viral", "reservoirs", "(", "VRs", ")", "of", "latently", "infected", "cells", "that", "comprise", "CD4+", "T", "cells", "and", "myeloid", "cells.1,2,3", "Indeed", ",", "upon", "antiviral", "treatment", "interruption", "(", "ATI", ")", ",", "the", "virus", "quickly", "rebounds", "after", "several", "weeks", ",", "highlighting", "how", "the", "presence", "of", "VRs", "obviates", "an", "HIV", "cure.4,5,6", "Therefore", ",", "eliminating", "or", "controlling", "VRs", "remains", "an", "unwavering", "priority", "for", "HIV", "cure", "research.", "In", "this", "context", ",", "the", "aim", "of", "the", "“shock-and-kill”", "strategy", "is", "to", "reactivate", "latently", "infected", "cells", "with", "latency", "reversal", "agents", "(", "LRAs", ")", "and", "render", "them", "vulnerable", "to", "cell", "death", "or", "clearance", "by", "the", "immune", "system.7,8", "Previously", "reported", "approaches", "to", "HIV", "reactivation", ",", "including", "protein", "kinase", "C", "(", "PRKC", ")", "agonists", ",", "histone", "deacetylase", "(", "HDAC", ")", "inhibitors", "(", "HDACi", ")", ",", "and", "toll-like", "receptor", "(", "TLR", ")", "agonists,9", "have", "been", "highly", "effective", "in", "in", "vitro", "models", "of", "latency", ",", "but", "their", "efficacy", "is", "only", "moderate", "when", "tested", "in", "vivo.10,11,12,13", "Moreover", ",", "by", "broadly", "activating", "cellular", "pathways", ",", "these", "compounds", "elicit", "significant", "proinflammatory", "effects", "or", "alter", "the", "function", "and", "fate", "of", "specific", "immune", "effector", "cells,14,15", "hence", "limiting", "their", "use", "in", "clinical", "settings.16,17,18,19", "Similarly", ",", "promising", "candidates", "such", "as", "bryostatin-1", "and", "analogs", ",", "phorbol", "esters", ",", "and", "phosphatidylethanolamine", "binding", "protein", "1", "(", "PEBP1", ")", "agonists", "reactivate", "HIV", "via", "activation", "of", "the", "canonical", "nuclear", "factor", "kappa", "B", "(", "NFKB", ")", "pathway,13,20", "inadvertently", "leading", "to", "uncontrolled", "cytokine", "release", "and", "overt", "T", "cell", "activation.21,22", "Consequently", ",", "there", "is", "a", "need", "to", "develop", "alternative", "approach", "(", "es", ")", "that", "can", "reactivate", "latent", "reservoirs", "and", "eliminate", "infected", "cells", "without", "triggering", "systemic", "activation", ",", "inflammation", ",", "or", "impairment", "of", "immune", "clearance", "mechanisms.", "In", "this", "regard", ",", "small", "molecules", "known", "as", "mimetics", "of", "the", "second", "mitochondrial", "activator", "of", "caspases", "(", "SMAC", "mimetics", "[", "SMs", "]", ")", "were", "originally", "developed", "as", "cancer", "therapeutics.", "They", "have", "received", "increasing", "recognition", "because", "they", "specifically", "activate", "the", "non-canonical", "NFKB", "pathway,23,24,25", "which", "naturally", "exhibits", "higher", "functional", "selectivity", "and", "more", "confined", "proinflammatory", "effects", "compared", "to", "the", "canonical", "NFKB", "pathway.24,26", "Engagement", "of", "the", "non-canonical", "NFKB", "pathway", "by", "SMAC", "leads", "to", "degradation", "of", "cellular", "inhibitor", "of", "apoptosis", "(", "cIAP", ")", ",", "accumulation", "of", "NFKB-inducing", "kinase", "(", "NIK", ")", ",", "and", "activation", "of", "component", "of", "inhibitor", "of", "NFKB", "kinase", "complex", "(", "CHUK", ")", "homodimer", ",", "culminating", "in", "cleavage", "of", "inactive", "NFKB2", "p100", "to", "active", "p52.26", "An", "association", "between", "RELB", "and", "p52", "induces", "expression", "of", "target", "genes27", "and", ",", "in", "the", "context", "of", "HIV", ",", "the", "pathway", "reactivates", "latently", "infected", "VRs.20", "The", "non-canonical", "NFKB", "pathway", "can", "also", "be", "triggered", "by", "signaling", "intermediates", "of", "the", "apoptosis", "cascade.", "In", "fact", ",", "cleavage", "of", "SMAC", "/", "DIABLO", "exposes", "the", "N-terminal", "motif", "Ala-Val-Pro-Ile", ",", "which", "binds", "specifically", "to", "baculovirus", "intermediate", "repeat", "domains", "2", "and", "3", "of", "IAP", "proteins.", "These", "proteins", "in", "turn", "trigger", "downstream", "events", "that", "ultimately", "lead", "to", "degradation", "of", "baculoviral", "IAP", "repeat", "containing", "2", "(", "BIRC2", ",", "also", "known", "as", "cIAP1", ")", "and", "baculoviral", "IAP", "repeat", "containing", "3", "(", "BIRC3", ",", "also", "known", "as", "cIAP2", ")", "28", "and", "potentiation", "of", "apoptosis.29", "The", "unique", "ability", "of", "SMAC", "to", "degrade", "IAPs", "and", "activate", "apoptosis", "pathway", "(", "s", ")", "makes", "SMs", "interesting", "candidates", "in", "the", "field", "of", "HIV", "cure", "research30,31", "because", "latently", "infected", "CD4+", "T", "cells", "display", "aberrant", "expression", "of", "cell", "survival", "factors", ",", "including", "XIAP", ",", "BIRC2", "and", "BCL2.8,32", "Pharmacological", "activation", "of", "the", "non-canonical", "NFKB", "pathway", "by", "SMs", "was", "recently", "found", "to", "induce", "on-ART", "plasma", "viremia", "in", "animal", "models", "of", "HIV", "latency,24,25", "underscoring", "the", "potential", "of", "this", "class", "of", "molecules", "as", "LRAs.", "However", ",", "it", "remains", "unclear", "whether", "induction", "of", "HIV", "expression", "by", "SMs", "leads", "to", "a", "reduction", "of", "VRs", "in", "lymphoid", "and", "non-lymphoid", "tissues", "of", "animal", "models.", "In", "this", "study", ",", "we", "show", "that", "bivalent", "APG-1387", ",", "currently", "in", "clinical", "development", "in", "the", "oncology", "field", ",", "activates", "the", "non-canonical", "NFKB", "pathway", "and", "hence", ",", "is", "a", "potent", "LRA.", "By", "degrading", "IAPs", ",", "this", "compound", "also", "induces", "the", "expression", "of", "active", "caspase", "3", "(", "CASP3", ")", ",", "a", "key", "component", "of", "the", "execution", "phase", "of", "apoptosis", ",", "in", "latently", "infected", "cells.", "Likewise", ",", "in", "primary", "CD4+", "T", "cells", "infected", "with", "a", "dual", "reporter-encoded", "HIV", ",", "APG-1387", "reduces", "the", "level", "of", "latent", "cells", "without", "notably", "affecting", "the", "productively", "infected", "pool.", "Accordingly", ",", "in", "vivo", "treatment", "with", "APG-1387", "could", "reactivate", "expression", "of", "latent", "viruses", "and", "was", "found", "to", "meaningfully", "reduce", "the", "integrated", "HIV-DNA", "level", "in", "tissues", "of", "ART-suppressed", "humanized", "bone", "marrow", "liver", "thymus", "(", "BLT", ")", "mice", ",", "without", "assessable", "immunotoxicity.", "Upon", "ART", "interruption", ",", "APG-1387-treated", "mice", "rebounded", "more", "slowly", "and", "to", "a", "lower", "set", "point.", "Overall", ",", "the", "study", "demonstrates", "that", "APG-1387", "has", "the", "capacity", "to", "not", "only", "reverse", "HIV", "latency", "but", "also", "potentiate", "cell", "apoptosis", ",", "thus", "supporting", "the", "notion", "that", "bivalent", "SMs", "could", "be", "harnessed", "to", "reduce", "VRs", "without", "causing", "generalized", "T", "cell", "activation.", "Results", "Discussion", "Several", "LRAs", "have", "shown", "their", "biological", "activity", "both", "in", "vitro", "and", "in", "vivo", "but", "are", "clinically", "unsafe", "for", "further", "evaluations.46,47", "The", "most", "potent", "LRAs", ",", "including", "HDACi", "and", "protein", "kinase", "C", "(", "PRKC", ")", "agonist", "bryostatin-1", ",", "activate", "the", "canonical", "NFKB", "pathway,46", "causing", "explicit", "T", "cell", "activation", "and", "broad", "cytotoxicity", ",", "and", "hence", "eliciting", "significant", "collateral", "damage", "on", "host", "cells.", "Reactivation", "of", "latent", "HIV", "by", "PRKC", "agonists", "has", "recently", "been", "demonstrated", "to", "induce", "resistance", "to", "apoptosis", ",", "a", "phenomenon", "often", "associated", "with", "phosphorylation", "and", "activation", "of", "the", "antiapoptotic", "protein", "BCL2.48", "Thus", ",", "the", "failure", "of", "common", "LRAs", "such", "as", "PRKC", "agonists", "and", "HDACi", "to", "safely", "purge", "HIV", "and", "effectively", "reduce", "VRs", "in", "people", "living", "with", "HIV", "necessitates", "the", "development", "of", "clinical", "approaches", "to", "achieve", "an", "HIV", "cure.", "In", "this", "study", ",", "we", "demonstrate", "that", "APG-1387", ",", "a", "bivalent", "SM", "initially", "developed", "as", "a", "cancer", "therapy", ",", "can", "efficiently", "reactivate", "HIV", "in", "CD4+", "T", "cell", "line", "models", "of", "HIV-1", "latency", "via", "a", "process", "that", "involves", "activation", "of", "the", "noncanonical", "NFKB", "pathway.", "Although", "this", "IAP", "antagonist", "modestly", "increases", "HIV", "RNA", "detection", "in", "virally", "suppressed", "hu-mice", ",", "it", "has", "the", "capability", "to", "reduce", "both", "the", "frequency", "of", "latently", "infected", "cells", "and", "the", "level", "of", "viral", "rebound", "upon", "ART", "treatment", "interruption.", "Indeed", ",", "APG-1387", "treatment", "enhances", "the", "expression", "of", "caspase-3", ",", "a", "marker", "of", "apoptosis", ",", "in", "latently", "infected", "cells", "from", "T", "cell", "lines", "or", "in", "T", "cells", "from", "certain", "tissues", "of", "virally", "suppressed", "hu-mice.", "In", "the", "context", "of", "productive", "infection", ",", "in", "vitro", "stimulation", "with", "APG-1387", "also", "enhanced", "cleavage", "of", "CASP3.", "IAPs", "are", "overly", "expressed", "in", "various", "cancers", ",", "enabling", "prolonged", "survival", "of", "cancerous", "cells", "[", "as", "reviewed", "by49", "]", ".", "Consequently", ",", "their", "antagonists", "are", "thought", "to", "either", "directly", "induce", "or", "sensitize", "cancerous", "cells", "to", "death", "by", "triggering", "proapoptotic", "pathways.50,51", "Interestingly", ",", "IAPs", "such", "as", "BIRC2", "have", "recently", "been", "shown", "to", "be", "negative", "regulators", "of", "HIV", "transcription", ",", "and", "their", "expression", "is", "found", "to", "be", "correlated", "with", "viral", "latency.23,31,32", "Indeed", ",", "both", "BIRC2", "/", "3", "and", "XIAP", "are", "overexpressed", "in", "HIV", "latently", "infected", "CD4+", "T", "and", "myeloid", "cells", ",", "and", "the", "SMs", "which", "induce", "the", "degradation", "of", "these", "IAPs", "can", "reactivate", "HIV.", "We", "demonstrate", "herein", "that", "various", "monovalent", "and", "bivalent", "SMs", "can", "induce", "efficient", "viral", "reactivation", "in", "different", "T", "cell", "models", "of", "latency", "and", "that", "some", "are", "more", "potent", "than", "others.", "Bivalent", "SMs", "are", "more", "effective", "than", "their", "monovalent", "counterparts", ",", "probably", "because", "of", "the", "presence", "of", "dimers", "that", "may", "contribute", "to", "a", "more", "stable", "and", "enhanced", "activation", "via", "interactions", "with", "the", "two", "adjacent", "binding", "domains", "of", "IAPs.52", "Among", "the", "bivalent", "SMs", "we", "examined", ",", "APG-1387", "is", "most", "effective", "at", "degrading", "IAPs", ",", "facilitating", "a", "conversion", "of", "NFKB", "p100", "to", "p52", ",", "and", "reactivating", "HIV", "expression", "through", "an", "NIK-dependent", "process", ",", "a", "hallmark", "of", "an", "activated", "non-canonical", "NFKB", "pathway.23,24", "In", "CD4+", "T", "cell", "models", "of", "HIV", "latency", ",", "APG-1387", "treatment", "is", "associated", "with", "remarkable", "viral", "reactivation.", "However", ",", "in", "primary", "CD4+", "T", "cells", "infected", "with", "HI.fate.E", "dual", "reporter", "virus", ",", "exposure", "to", "APG-1387", "is", "accompanied", "by", "a", "reduction", "in", "the", "frequency", "of", "latently", "infected", "cells", "(", "Figure", "2", ")", "without", "a", "detectable", "change", "in", "the", "level", "of", "cells", "supporting", "LTR-directed", "transcription.", "The", "data", "suggest", "that", "the", "latent", "cells", "might", "be", "preferentially", "targeted", "for", "elimination", "without", "reactivation", "in", "contrast", "to", "PMA", "and", "ionomycin", "stimulation.", "This", "said", ",", "given", "the", "intrinsic", "properties", "of", "SMs", ",", "we", "can", "not", "completely", "exclude", "the", "possibility", "that", "there", "was", "no", "change", "in", "the", "frequency", "of", "reactivated", "cells", "because", "latently", "infected", "cells", "rapidly", "die", "after", "reactivation.", "Consistent", "with", "previous", "works", "with", "other", "SMs", "including", "AZD5582", "24", "and", "ciapavir,25", "APG-1387", "induces", "detection", "of", "viremia", ",", "albeit", "modestly", ",", "in", "ART-suppressed", "hu-mice", "as", "early", "as", "48", "h", "after", "treatment.", "Importantly", ",", "in", "mice", "treated", "with", "multiple", "doses", "of", "APG-1387", ",", "the", "proportion", "of", "cells", "carrying", "the", "integrated", "HIV", "DNA", "was", "meaningfully", "reduced", ",", "suggesting", "that", "the", "bivalent", "APG-1387", "might", "preferentially", "target", "latently", "infected", "cells", "directly", "or", "indirectly", "for", "death", "(", "Figure", "4", ")", ".", "In", "addition", ",", "in", "APG-1387-treated", "mice", "the", "fact", "that", "the", "viral", "rebound", "was", "consistently", "lower", "throughout", "the", "ATI", "and", "plateaued", "at", "a", "level", "below", "pre-ART", "further", "strengthens", "the", "notion", "that", "APG-1387", "impacts", "negatively", "the", "pool", "of", "VRs", "(", "Figure", "6", ")", ".", "It", "is", "conceivable", "that", "such", "an", "impact", "is", "significant", "considering", "the", "modest", "effect", "of", "APG-1387", "on", "latency", "reversal", "in", "this", "experimental", "condition", "and", "the", "limited", "functional", "immune", "clearance", "mechanisms", "present", "in", "hu-BLT", "mice.", "This", "said", ",", "further", "experimentation", "with", "a", "larger", "group", "of", "animals", "analyzed", "at", "endpoint", "is", "needed", "to", "confirm", "the", "modulatory", "role", "of", "APG-1387", "on", "VRs.", "A", "more", "detailed", "analysis", "gauging", "the", "effect", "of", "APG-1387", "on", "different", "CD4+", "T", "cell", "subsets", "revealed", "a", "potential", "modulation", "of", "splenic", "Th17-like", "cells", "and", "FOXP3-expressing", "CD4+", "T", "cells.", "We", "observe", "a", "trend", "toward", "a", "reduction", "in", "Th17-cell", "frequency", "in", "both", "ART-suppressed", "mice", "treated", "in", "vivo", "with", "APG-1387", "and", "in", "ART-naïve", "infected", "mice", "whose", "splenocytes", "were", "stimulated", "ex", "vivo", "with", "APG-1387", "(", "Figure", "5", ")", ".", "Since", "Th17", "cells", "have", "been", "proposed", "to", "be", "an", "important", "source", "of", "HIV", "latent", "reservoirs", "[", "reviewed", "in53", "]", ",", "a", "decrease", "in", "Th17", "cells", "might", "suggest", "a", "reduction", "in", "the", "level", "of", "integrated", "HIV", "DNA-harboring", "cells", ",", "an", "observation", "that", "was", "made", "with", "APG-1387", "treated", "mice", "(", "Figure", "4", ")", ".", "Regarding", "FOXP3-expressing", "CD4+", "T", "cells", "in", "the", "spleen", ",", "there", "was", "no", "significant", "difference", "between", "ART-suppressed", "mice", "treated", "with", "APG-1387", "or", "with", "the", "vehicle", "control.", "However", ",", "ex", "vivo", "stimulation", "of", "splenocytes", "from", "ART-naïve", ",", "HIV-infected", "mice", "with", "APG-1387", "modestly", "decreased", "the", "number", "of", "p24-expressing", "FOXP3+", "CD4+", "T", "cells", ",", "although", "the", "difference", "was", "not", "statistically", "significant.", "Whether", "the", "non-canonical", "NFKB", "pathway", "is", "more", "functional", "in", "certain", "memory", "CD4+", "T", "cell", "subsets", "remains", "to", "be", "fully", "elucidated.", "The", "fact", "that", "the", "central", "memory", "subset", "has", "been", "shown", "to", "require", "strong", "TCR-mediated", "signaling", "for", "maintenance", "suggests", "a", "more", "important", "role", "of", "the", "canonical", "NFKB", "pathway", "in", "this", "context", "[", "reviewed", "in26,54,55", "]", ".", "Taken", "together", ",", "these", "results", "highlight", "the", "importance", "of", "evaluating", "the", "potential", "effects", "of", "SMs", "on", "various", "immune", "subsets", "known", "to", "be", "susceptible", "to", "HIV.", "Our", "study", "shows", "that", "APG-1387", "has", "the", "capability", "to", "reactivate", "HIV", ",", "activate", "markers", "of", "apoptosis", "in", "latently", "infected", "cells", ",", "and", "reduce", "VRs", "without", "causing", "global", "T", "cell", "activation.", "However", ",", "the", "findings", "also", "underscore", "the", "need", "to", "combine", "bivalent", "SMs", "with", "other", "therapeutics", "to", "improve", "the", "reactivation", "and", "elimination", "of", "VRs.", "Indeed", ",", "recent", "findings", "have", "shown", "that", "combined", "panobinostat", "and", "pegylated", "interferon", "alpha", "2", "can", "transform", "the", "VR", "landscape", "through", "latency", "reversal", "and", "innate", "immune", "activation.56", "Star★methods", "Experimental", "model", "and", "study", "participant", "details", "Experimental", "design", "No", "randomization", "and", "/", "or", "stratification", "was", "performed.", "Hu-mice", "with", "variable", "levels", "of", "human", "CD45+", "cells", "were", "equally", "distributed", "among", "experimental", "groups.", "All", "efforts", "were", "made", "to", "have", "equal", "or", "comparable", "number", "of", "mice", "or", "samples", "(", "i.e.", ",", "number", "of", "n", ")", "per", "experimental", "group", "or", "condition.", "The", "exact", "number", "of", "n", "was", "provided", "in", "relevant", "Figure", "legends.", "Experimenters", "were", "blinded", "during", "processing", "biological", "samples", ",", "conducting", "experiments", "and", "analyzing", "samples", "in", "different", "assays.", "No", "inclusion", "or", "exclusion", "criteria", "were", "applied", "to", "the", "study.", "No", "statistical", "methods", "were", "used", "to", "pre-determine", "strategies", "for", "randomization", "and", "/", "or", "stratification", ",", "population", "size", ",", "inclusion", "and", "exclusion", "of", "any", "data", "or", "subjects", ",", "or", "whether", "the", "data", "met", "assumptions", "of", "the", "statistical", "approach.", "Pharmacological", "and", "toxicity", "analysis", "Hu-BLT", "mice", "were", "left", "untreated", "or", "treated", "via", "intraperitoneal", "route", "(", "IP", ")", "with", "either", "vehicle-", "(", "10", "%", "sterile", "Cremophor", "dissolved", "in", "5", "%", "polyethylene", "glycol-400", "and", "85", "%", "PBS", ")", "or", "20", "mg", "/", "kg", "(", "100", "APG-1387", "(", "Ascentage", "Pharma", ",", "China", ")", "every", "third", "day", "(", "maximum", "100", "μL", "injection", "volume", ")", "for", "up", "to", "4", "weeks.", "Plasma", "was", "collected", "at", "different", "intervals", "and", "white", "blood", "cells", "isolated", "by", "treating", "whole", "blood", "with", "red", "blood", "cell", "lysis", "buffer", "(", "Invitrogen", ",", "U.S.A", ")", ".", "Cells", "from", "blood", "and", "tissues", "were", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", "as", "described", "in", "Section", "‘flow", "cytometry’", "below", "for", "the", "effect", "of", "APG-1387", "on", "cell", "proliferation", "and", "activation.", "Proinflammatory", "cytokines", "were", "evaluated", "in", "plasma", "of", "healthy", "untreated", ",", "APG-1387-", "and", "vehicle-treated", "hu-BLT", "mice", "using", "Legend", "Max", "enzyme-linked", "immunosorbent", "assay", "(", "ELISA", ")", "kits", "for", "human", "TNF", "and", "IL6", "(", "both", "from", "BioLegend", ",", "U.S.A", ")", "as", "per", "the", "manufacturer’s", "protocol.", "Data", "analysis", "was", "performed", "using", "GraphPad", "Prism", "software", "(", "Version", "8.0", ")", ".", "Quantification", "and", "statistical", "analysis", "Flow", "cytometry", "data", "were", "analyzed", "using", "FlowJo", "(", "Versions", "9.9.3", "and", "10.1", ")", ".", "Quantification", "of", "Western", "blots", "was", "performed", "using", "ImageJ", "software.", "Data", "analysis", "and", "presentation", "was", "done", "using", "GraphPad", "Prism", "(", "Version", "8.0", ")", ".", "Experimenters", "were", "blinded", "during", "data", "analysis", "of", "samples.", "Descriptive", "measures", "(", "mean", ",", "median", ",", "minimum", "/", "maximum", "range", ",", "95", "%", "confidence", "intervals", ",", "and", "percent", ")", "were", "used", "to", "summarize", "the", "data", "and", "illustrate", "in", "graphical", "presentations.", "All", "statistical", "analysis", "was", "done", "using", "GraphPad", "Prism", "(", "Version", "8.0", ")", ".", "Nonparametric", "(", "unpaired", ")", "Mann-Whitney’s", "U-test", "(", "two-tailed", ")", "was", "conducted", "to", "compare", "ranks", "between", "two", "experimental", "groups", "(", "e.g.", ",", "treated", "with", "vehicle", "or", "with", "APG-1387", ")", ".", "Nonparametric", "(", "paired", ")", "Wilcoxon", "test", "was", "performed", "to", "compare", "the", "ranks", "of", "two", "matched", "samples", "(", "e.g.", ",", "before", "and", "after", "treatment", "with", "APG-1387", ")", ".", "When", "comparing", "multiple", "groups", ",", "non-parametric", "tests", "Kruskal-Wallis", "or", "Friedman", "were", "performed", "and", "followed", "by", "Dunn’s", "multiple", "comparison", "test", "(", "e.g.", ",", "vehicle-treated", "group", "compared", "to", "those", "treated", "with", "different", "concentrations", "of", "APG-1387", "or", "combined", "PMA", "and", "ionomycin", ";", "effect", "of", "APG-1387", "on", "viral", "rebound", "at", "different", "time", "points", "post", "treatment", "interruption", ")", ".", "A", "p", "value", "of", "less", "than", "0.05", "was", "considered", "statistically", "significant.", "ns", ",", "∗", ",", "∗∗", ",", "∗∗∗", ",", "signify", "not", "significant", ",", "Figure", "2", ",", "the", "exact", "p", "values", "were", "∗p", "=", "0.026", ",", "∗∗p", "=", "0.007", ",", "∗∗∗p", "=", "0.0004.", "In", "the", "two-tailed", "Mann-Whitney", "unpaired", "rank", "test", "shown", "in", "Figure", "3", ",", "the", "∗p", "value", "was", "0.0286", "while", "in", "Figure", "4", ",", "the", "p", "values", "were", "as", "follows", ":", "∗p", "=", "0.0317", "and", "∗∗p", "=", "0.0043.", "For", "Figure", "S6", ",", "the", "∗p", "value", "was", "No", "statistical", "methods", "were", "used", "to", "pre-determine", "strategies", "for", "randomization", "and", "/", "or", "stratification", ",", "population", "size", ",", "inclusion", "and", "exclusion", "of", "any", "data", "or", "subjects", ",", "or", "whether", "the", "data", "met", "assumptions", "of", "the", "statistical", "approach.", "All", "software", "used", "in", "data", "analysis", "along", "with", "statistical", "parameters", "were", "mentioned", "in", "the", "appropriate", "Figure", "legends.", "Details", "about", "the", "statistical", "tests", ",", "exact", "values", "of", "n", "and", "definitions", "of", "the", "n", "were", "as", "indicated", "in", "the", "legend", "for", "each", "relevant", "Figure.", "When", "applicable", ",", "definition", "of", "asterisks", "and", "descriptive", "measures", "were", "indicated", "in", "the", "Figure", "legends", "or", "Results.", "Drawing", "of", "the", "chemical", "structure", "of", "APG-1387", "shown", "in", "Figure", "1", "was", "done", "using", "the", "ChemDraw", "software.", "Source", "paper", ":", "PMC11699618" ]	[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "B-Tissue", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]
[ "2.", "results", "3.", "discussion", "Cell", "surface", "receptors", "and", "their", "coupled", "intracellular", "signaling", "pathways", "have", "been", "intensively", "studied", "in", "many", "physiological", "and", "pathological", "processes", "over", "five", "decades.", "Due", "to", "the", "critical", "feature", "of", "these", "receptor-mediated", "signaling", "in", "promoting", "malignant", "proliferation", ",", "invasion", ",", "and", "metastasis", ",", "designing", "/", "seeking", "small", "molecules", "and", "monoclonal", "antibodies", "that", "target", "receptors", "and", "downstream", "pathways", "has", "become", "a", "pivotal", "strategy", "in", "anti-cancer", "drug", "discovery.", "Therefore", ",", "a", "better", "understanding", "of", "the", "key", "players", "in", "the", "signaling", "pathways", "may", "offer", "opportunities", "for", "therapeutic", "intervention.", "This", "study", "reveals", "a", "positive", "feedback", "DNA-PK", "/", "MYT1L-CXCR1", "proliferative", "signaling", "loop", "that", "contributes", "to", "the", "progression", "of", "glioblastoma", "via", "the", "ERK1", "/", "2", "pathway", "and", "provides", "a", "novel", "insight", "into", "the", "role", "of", "DNA-PK", "in", "the", "MYT1L-mediated", "transactivation", "of", "CXCR1.", "MYT1L", "is", "predominantly", "expressed", "in", "human", "brains", ",", "in", "particular", "fetal", "brains", "[", "32", "]", ".", "Several", "key", "studies", "have", "demonstrated", "the", "pivotal", "role", "of", "MYT1L", "in", "the", "direct", "conversion", "of", "human", "non-neuronal", "cells", "to", "neurons", "[", "33,34,35", "]", ".", "However", ",", "the", "contributing", "role", "of", "MYT1L", "in", "carcinogenesis", "remains", "poorly", "understood.", "Our", "previous", "studies", "have", "uncovered", "that", "miR-141", "was", "down-regulated", "in", "glioblastoma", "and", "was", "able", "to", "suppress", "cell", "proliferation", "by", "directly", "targeting", "MYT1L", ",", "implicating", "an", "oncogenic", "role", "of", "MYT1L", "in", "glioblastoma.", "In", "this", "study", ",", "we", "found", "that", "in", "normal", "DNA-PK", "glioblastoma", "M059K", "cell", "lines", ",", "knockdown", "of", "MYT1L", "attenuated", "cell", "proliferation", "and", "induced", "apoptosis", "and", "S-phase", "cell", "cycle", "arrest", "(", "Figure", "1A–D", ")", ".", "In", "contrast", ",", "the", "ectopic", "expression", "of", "MYT1L", "promoted", "cell", "proliferation", ",", "inhibited", "apoptosis", ",", "and", "shortened", "the", "S", "phase", "(", "Figure", "1E", ",", "F", ",", "H", ",", "J", ")", ".", "Similar", "phenotypic", "alterations", "were", "also", "noted", "in", "HEK293", "cells", "in", "response", "to", "ectopic", "MYT1L", "(", "Figure", "1E–G", ",", "I", ")", ".", "These", "results", "indicated", "that", "in", "cooperation", "with", "DNA-PK", ",", "MYT1L", "may", "function", "as", "an", "oncogene", "in", "the", "progression", "of", "glioblastoma.", "However", ",", "in", "the", "loss-of-function", "DNA-PK", "M059J", "cell", "line", ",", "the", "knockdown", "of", "MYT1L", "promoted", "cell", "proliferation", ",", "attenuated", "apoptosis", ",", "and", "shortened", "the", "S", "phase", "(", "Figure", "2A–D", ")", ".", "Conversely", ",", "the", "enforced", "expression", "of", "MYT1L", "inhibited", "cell", "proliferation", "and", "induced", "a", "G1", "cell", "cycle", "arrest", "(", "Figure", "2E–G", ")", ",", "suggesting", "a", "tumor", "suppressor", "role", "of", "MYT1L", "in", "DNA-PK-deficient", "glioblastoma", "cells", ",", "although", "it", "suppressed", "apoptosis", "(", "Figure", "2H", ")", ".", "Mechanically", ",", "the", "sustained", "activation", "of", "the", "AKT", "pathway", "in", "both", "HEK293", "and", "M059K", "cells", "and", "the", "activation", "of", "the", "ERK1", "/", "2", "pathway", "in", "M059K", "cells", "(", "Figure", "1K", ")", "may", "contribute", "to", "cell", "proliferation", "induced", "by", "ectopic", "expression", "of", "MYT1L", ",", "which", "supports", "the", "key", "role", "of", "these", "two", "well-studied", "oncogenic", "signaling", "pathways", "in", "the", "development", "of", "human", "malignancies", "[", "36", "]", ".", "However", ",", "the", "proliferative", "inhibition", "mediated", "by", "ectopic", "expression", "of", "MYT1L", "in", "M059J", "cells", "may", "not", "be", "attributed", "to", "the", "activation", "of", "these", "two", "pathways", "(", "Figure", "2I", ")", ".", "A", "total", "of", "13", "%", "apoptotic", "cells", "were", "also", "found", "in", "the", "negative", "control", "siRNA", "group", "(", "Figure", "1C", ")", ",", "which", "may", "reflect", "the", "cytotoxic", "effect", "of", "either", "transfection", "reagent", "(", "Lipofectamine", "3000", ")", "or", "negative", "control", "siRNA.", "The", "cell", "cycle", "is", "tightly", "regulated", "by", "cyclins", ",", "CDKs", ",", "and", "CDK", "inhibitors.", "Although", "cyclin", "E1", "was", "down-regulated", "in", "HEK293", ",", "while", "it", "was", "up-regulated", "in", "M059K", "cells", "in", "response", "to", "MYT1L", "expression", "(", "Figure", "1K", ")", ",", "that", "may", "play", "a", "role", "in", "shortening", "the", "S", "phase", "(", "Figure", "1G", ",", "H", ")", "because", "of", "the", "critical", "requirement", "of", "cyclin", "E", "in", "the", "S", "phase", "progression", "[", "37,38", "]", ".", "Furthermore", ",", "p21", ",", "a", "well-known", "CDK", "inhibitor", ",", "was", "down-regulated", "in", "HEK293", "and", "M059K", "cells", "in", "response", "to", "MYT1L", "(", "Figure", "1K", ")", ",", "which", "may", "also", "contribute", "to", "shortening", "the", "S", "phase.", "Moreover", ",", "p21", "has", "been", "shown", "to", "promote", "cell", "death", "in", "cancer", "cells", "via", "the", "activation", "of", "autophagy", "[", "39,40,41", "]", ";", "the", "down-regulated", "p21", "may", "be", "a", "causal", "player", "in", "attenuating", "apoptosis", "in", "HEK293", "cells", "that", "express", "MYT1L", "(", "Figure", "1I", ",", "J", ")", ".", "Interestingly", ",", "CDK6", "was", "down-regulated", "in", "M059J", "cells", "in", "response", "to", "MYT1L", "(", "Figure", "2I", ")", ",", "which", "may", "play", "a", "role", "in", "a", "G1", "cell", "cycle", "arrest", "(", "Figure", "2G", ")", ".", "Ectopic", "MYT1L", "induced", "down-regulation", "of", "caspase", "3", "(", "Figure", "1K", ",", "Supplementary", "Figure", "S1", ")", "in", "both", "HEK293", "and", "M509K", "cells", ",", "which", "may", "play", "a", "contributing", "role", "in", "apoptotic", "inhibition", "(", "Figure", "1I", ",", "J", ")", ".", "However", ",", "this", "is", "not", "the", "case", "in", "M059J", "due", "to", "the", "absence", "of", "caspase", "3", "in", "both", "GFP-", "and", "MYT1L-M059J", "cells", "(", "Figure", "2I", ")", ".", "As", "a", "transcription", "factor", ",", "the", "transcriptional", "targets", "of", "MYT1L", ",", "unfortunately", ",", "remain", "largely", "unknown.", "Here", ",", "we", "discovered", "that", "MYT1L", "could", "directly", "regulate", "the", "transcription", "of", "CXCR1", "through", "a", "novel", "cis-acting", "element", "(", "−2114", "/", "−2103", ")", "at", "the", "CXCR1", "promoter.", "We", "noted", "that", "the", "overexpression", "of", "MYT1L", "correlated", "with", "CXCR1", "mRNA", "levels", "in", "4", "out", "of", "6", "brain", "cancer", "cell", "lines", "(", "Figure", "3A", ",", "B", ")", "and", "the", "induction", "of", "CXCR1", "in", "the", "normal", "DNA-PK", "HEK293", "and", "M059K", "cells", "in", "response", "to", "the", "ectopically", "expressed", "MYT1L", "(", "Figure", "3C", ",", "D", ")", ",", "supporting", "the", "opinion", "that", "CXCR1", "is", "a", "transcriptional", "target", "of", "MYT1L.", "Surprisingly", ",", "in", "M059J", "cells", "with", "loss", "of", "DNA-PK", "function", "(", "Supplementary", "Figure", "S4", ")", ",", "the", "enforced", "expression", "of", "MYT1L", "failed", "to", "induce", "CXCR1", "transcription", "(", "Figure", "3C", ")", ",", "although", "the", "protein", "levels", "of", "CXCR1", "were", "not", "consistent", "with", "its", "mRNA", "levels", "(", "Figure", "3C", ",", "D", ")", ".", "Taken", "together", ",", "our", "results", "demonstrate", "that", "MYT1L", "functionality", "depends", "on", "DNA-PK", "activity.", "Furthermore", ",", "the", "ectopically", "expressed", "MYT1L", "increased", "the", "luciferase", "activity", "of", "the", "wild-type", "CXCR1", "promoter", "/", "luciferase", "reporter", "in", "HEK-293", "and", "M059K", "cells", "with", "the", "normal", "expression", "of", "DNA-PK", ",", "which", "was", "abolished", "when", "the", "mutant", "construct", "was", "used", "(", "Figure", "3G", ")", ".", "However", ",", "the", "ectopic", "expression", "of", "MYT1L", "suppressed", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "DNA-PK-deficient", "M059J", "cells", "(", "Figure", "3G", ")", ".", "Moreover", ",", "the", "enforced", "expression", "of", "MYT1L", "resulted", "in", "the", "sustained", "activation", "of", "the", "AKT", "pathway", "in", "all", "three", "cell", "lines", "examined", "(", "Figure", "1K", "and", "Figure", "2I", ")", ".", "The", "ERK1", "/", "2", "pathway", "was", "activated", "in", "M059K", "and", "M059J", "cells", ",", "while", "it", "was", "inhibited", "in", "HEK293", "cells", "in", "response", "to", "MYT1L", "(", "Figure", "1K", "and", "Figure", "2I", ")", ".", "The", "activation", "of", "the", "ERK1", "/", "2", "pathway", "was", "CXCR1-dependent", ",", "whereas", "the", "AKT", "pathway", "was", "not", "(", "Figure", "4J", ")", ".", "Based", "on", "these", "findings", ",", "we", "may", "propose", "that", "under", "non-stimulated", "conditions", ",", "MYT1L", "may", "act", "as", "a", "transcriptional", "repressor", "suppressing", "CXCR1", "transcription", ";", "DNA-PK", "may", "function", "as", "a", "coactivator", ",", "and", "once", "it", "is", "phosphorylated", "by", "the", "CXCR1-dependent", "activation", "of", "the", "ERK1", "/", "2", "kinase", ",", "it", ",", "in", "turn", ",", "phosphorylates", "MYT1L", ";", "the", "phosphorylated", "MYT1L", "recruits", "histone", "acetyltransferases", "(", "HATs", ")", "and", "transcription", "factors", "(", "TFs", ")", "to", "the", "CXCR1", "promoter", "and", "promotes", "CXCR1", "transcription", "(", "Figure", "5", ")", ".", "DNA-PK", "(", "also", "known", "as", "PRKDC", "and", "p350", ")", "is", "a", "nuclear", "serine", "/", "threonine", "protein", "kinase", "complex", "that", "is", "composed", "of", "a", "catalytic", "subunit", "of", "DNA-PKcs", "and", "a", "heterodimer", "of", "Ku", "proteins", "(", "Ku70", "/", "Ku80", ")", ".", "Although", "one", "of", "the", "most", "well-defined", "functions", "of", "DNA-PK", "is", "to", "govern", "the", "repair", "of", "DNA", "double-strand", "breaks", "through", "both", "non-homologous", "end-joining", "(", "NHEJ", ")", "and", "homologous", "recombination", "(", "HR", ")", "[", "42", "]", ",", "it", "was", "originally", "identified", "as", "a", "component", "of", "the", "Sp1", "transcription", "complex", "in", "which", "it", "may", "modulate", "the", "transcriptional", "activity", "of", "the", "complex", "by", "phosphorylating", "Sp1", "[", "43", "]", ".", "For", "the", "first", "time", ",", "our", "findings", "demonstrated", "that", "DNA-PK", "may", "functionally", "modulate", "the", "transcriptional", "activity", "of", "MYT1L", "by", "phosphorylation", ",", "eventually", "leading", "to", "the", "transcriptional", "activation", "of", "CXCR1", ",", "although", "this", "requires", "further", "validation", "using", "chromatin", "immunoprecipitation", "quantitative", "PCR", "(", "ChIP-qPCR", ")", "and", "the", "electrophoretic", "mobility", "shift", "assay", "(", "EMSA", ")", "when", "a", "ChIP-grade", "antibody", "to", "the", "phosphorylated", "MYT1L", "is", "commercially", "available.", "Our", "previous", "work", "demonstrated", "that", "DNA-PK", "may", "also", "function", "as", "a", "repressor", "of", "MYT1L", ",", "resulting", "in", "the", "transcriptional", "inhibition", "of", "tumor", "suppressor", "p21", ",", "a", "transcriptional", "target", "of", "MYT1L", "[", "29", "]", ".", "Several", "publications", "support", "the", "dual", "role", "of", "DNA-PK", "in", "the", "transcriptional", "control", "of", "gene", "expression.", "DNA-PK", "inhibited", "the", "transcription", "of", "the", "xanthine", "oxidoreductase", "gene", "via", "E-box", "/", "TATA-like", "elements", "[", "44", "]", ".", "Simultaneously", ",", "Ku", "proteins", "may", "also", "act", "as", "a", "transcriptional", "recycling", "coactivator", "of", "the", "androgen", "receptor", "[", "45", "]", ".", "Chemokines", "are", "a", "superfamily", "of", "small", "(", "about", "8", "to", "14", "kDa", ")", "cytokine-like", "proteins", "that", "selectively", "regulate", "the", "recruitment", "and", "trafficking", "of", "leukocytes", "to", "inflammatory", "sites", "through", "chemoattraction", "[", "46", "]", ".", "Members", "of", "this", "family", "have", "been", "divided", "into", "four", "subfamilies", ",", "CXC", ",", "CC", ",", "C", ",", "and", "CX3C", ",", "based", "on", "the", "arrangement", "of", "the", "first", "two", "of", "the", "four", "conserved", "cysteine", "residues", "in", "the", "amino", "terminus", "of", "the", "proteins", ",", "which", "can", "bind", "CXCR", ",", "CCR", ",", "XCR1", ",", "and", "CX3CR1", ",", "respectively.", "Chemokines", "play", "a", "critical", "role", "in", "inflammatory", "reactions.", "IL-8", "is", "a", "well-characterized", "ELR+", "CXC", "chemokine", "that", "attracts", "neutrophils", "through", "binding", "CXCR1", "and", "CXCR2", "receptors", "on", "the", "cell", "surface", "[", "47", "]", ".", "It", "is", "suspected", "that", "the", "signature", "of", "chemokines", "that", "persist", "at", "inflammatory", "sites", "may", "be", "important", "in", "the", "development", "of", "chronic", "diseases", "and", "can", "contribute", "to", "the", "development", "of", "malignancies", "[", "48", "]", ".", "There", "is", "sufficient", "evidence", "to", "show", "that", "chemokines", "also", "play", "a", "significant", "role", "in", "cancer", ",", "including", "melanoma", "[", "49", "]", ",", "breast", "[", "50", "]", ",", "colon", "[", "51", "]", ",", "esophageal", "[", "52", "]", ",", "prostate", "[", "53", "]", ",", "and", "non-small", "cell", "lung", "[", "54", "]", "cancers", ",", "in", "addition", "to", "its", "role", "in", "the", "development", "of", "inflammatory", "responses.", "Here", ",", "we", "showed", "that", "IL-8", "was", "significantly", "up-regulated", "in", "HEK293", "and", "M059J", "cells", ",", "while", "it", "was", "only", "slightly", "increased", "in", "M059K", "cells", "in", "response", "to", "the", "ectopically", "expressed", "MYT1L", "(", "Figure", "4A", ")", ".", "Unlike", "IL-8", ",", "GROα", "more", "selectively", "binds", "to", "the", "CXCR2", "receptor", ",", "while", "the", "affinity", "to", "CXCR1", "is", "significantly", "lower", "[", "55", "]", ".", "Since", "the", "CXCR2", "receptor", "was", "undetectable", "in", "HEK293", "and", "M059K", "cells", "(", "Figure", "3E", ")", ",", "GROα", "in", "these", "cells", "could", "only", "function", "through", "CXCR1.", "The", "enforced", "expression", "of", "MYT1L", "caused", "an", "elevation", "of", "GROα", "in", "HEK293", "and", "M059J", "cells", "(", "Figure", "4B–E", ")", ".", "Although", "GROα", "mRNA", "was", "down-regulated", ",", "its", "protein", "level", "was", "unaffected", "in", "M059K", "cells", "in", "response", "to", "the", "ectopically", "expressed", "MYT1L", "(", "Figure", "4F", ",", "G", ")", ".", "IL-8", "and", "/", "or", "GROα", "bind", "to", "CXCR1", ",", "eventually", "promoting", "glioblastoma", "proliferation", "via", "the", "ERK1", "/", "2", "pathway", "that", "can", "be", "blocked", "by", "CXCR1", "siRNA", "(", "Figure", "4J", ",", "K", ")", ",", "suggesting", "that", "the", "activation", "of", "the", "proliferative", "ERK1", "/", "2", "pathway", "in", "glioblastoma", "is", ",", "at", "least", "in", "part", ",", "CXCR1-dependent.", "Although", "this", "is", "the", "first", "report", "regarding", "the", "critical", "role", "of", "DNA-PK", "/", "MYT1L", "in", "the", "proliferative", "IL-8", "/", "GROα-CXCR1", "signaling", "loop", "in", "glioblastoma", ",", "the", "significant", "contributing", "role", "of", "IL-8-CXCR1", "/", "2", "axes", "in", "the", "proliferation", "and", "angiogenesis", "of", "glioblastoma", "cells", "has", "been", "demonstrated", "before", "[", "28", "]", ".", "Taken", "together", ",", "we", "propose", "a", "potential", "DNA-PK", "/", "MYT1L-CXCR1", "signaling", "loop", "in", "the", "progression", "of", "glioblastoma", "(", "Figure", "5", ")", ".", "We", "speculate", "that", "the", "DNA-PK", "/", "MYT1L-CXCR1-ERK1", "/", "2", "might", "be", "up-regulated", "at", "WHO", "grade", "IV", "and", "/", "or", "recurrent", "glioblastomas", "due", "to", "chemo-", "or", "radio-resistance.", "DNA-PK", "is", "a", "key", "player", "in", "DNA", "damage", "response", "on", "double-strand", "breaks.", "Activation", "of", "DNA", "damage", "response", "facilitates", "glioma", "stem", "cells", "to", "develop", "radio-resistance", "[", "56", "]", ".", "Furthermore", ",", "DNA-PK", "is", "a", "master", "kinase", "of", "the", "proliferative", "/", "progenitor", "subtype", "of", "glioblastoma", ",", "guiding", "targeted", "cancer", "therapy", "[", "57", "]", ".", "Immunohistochemical", "staining", "has", "indicated", "the", "expression", "of", "IL-8", "in", "66.7–67.3", "%", "of", "WHO", "grade", "IV", "glioblastoma", "tissues", ",", "with", "the", "expression", "of", "its", "receptor", "CXCR1", "found", "primarily", "in", "both", "tumor-associated", "vessels", "and", "grade", "IV", "glioblastomas", "[", "28", "]", ",", "supporting", "the", "previous", "report", "showing", "a", "crucial", "role", "of", "IL-8", "/", "CXCR1", "/", "2", "signaling", "in", "glioblastoma", "stem", "cells", "[", "58", "]", ".", "Moreover", ",", "the", "IL-8", "/", "CXCR1", "/", "STAT3", "pathway", "is", "crucial", "for", "the", "maintenance", "of", "glioblastoma", "stem", "cells", "[", "59", "]", ".", "Glioblastoma", "and", "neuroblastoma", "are", "two", "common", "types", "of", "brain", "tumors", "that", "occur", "in", "different", "aged", "populations.", "Our", "previous", "studies", "indicated", "that", "MYT1L", "was", "overexpressed", "in", "glioblastoma", "cell", "lines", "and", "46.9", "%", "of", "malignant", "glioma", "tissue", "samples", "(", "n", "=", "32", ")", "[", "29", "]", ",", "functioning", "as", "an", "oncogene", "in", "glioblastoma", "cells", "with", "normal", "DNA-PK", "activity.", "To", "see", "whether", "MYT1L", "is", "also", "up-regulated", "in", "neuroblastoma", ",", "we", "compared", "its", "expression", "in", "both", "glioblastoma", "and", "neuroblastoma", "cell", "lines.", "It", "was", "found", "that", "MYT1L", "was", "overexpressed", "in", "3", "out", "of", "7", "neuroblastoma", "cell", "lines", "examined", "(", "Figure", "3A", ")", ",", "suggesting", "that", "MYT1L", "up-regulation", "may", "be", "a", "common", "event", "in", "both", "glioblastoma", "and", "neuroblastoma.", "Although", "the", "SH-SY5Y", "cell", "line", "is", "a", "subclone", "of", "the", "SK-N-SH", "cell", "line", ",", "the", "global", "gene", "expression", "microarray", "showed", "a", "profound", "differential", "expression", "of", "genes", "in", "these", "two", "cell", "lines", "[", "60", "]", ".", "However", ",", "the", "mechanism", "involved", "is", "unclear.", "In", "the", "present", "study", ",", "we", "noted", "that", "MYT1L", "was", "up-regulated", "in", "the", "SH-SY5Y", "cell", "line", "at", "both", "mRNA", "and", "protein", "levels", "(", "Figure", "3A", ",", "B", ")", ",", "while", "in", "its", "parental", "line", ",", "SK-N-SH", ",", "only", "MYT1L", "mRNA", "was", "up-regulated.", "The", "MYT1L", "protein", "was", "undetectable", ",", "which", "may", "implicate", "the", "involvement", "of", "post-transcriptional", "regulation", ",", "such", "as", "miRNA", "(", "s", ")", ",", "in", "MYT1L", "expression.", "Some", "of", "the", "molecules", "analyzed", "in", "this", "manuscript", "can", "be", "molecular", "targets", "in", "cancer", "therapy.", "The", "IL-8-CXCR1", "/", "2", "axis", "has", "been", "proposed", "as", "a", "potential", "therapeutic", "target", "for", "numerous", "cancers", "due", "to", "its", "contributing", "roles", "in", "proliferation", ",", "migration", "/", "invasion", ",", "angiogenesis", ",", "and", "tumor", "immunosuppression", "[", "61,62", "]", ".", "The", "tumor-produced", "IL-8", "is", "a", "potent", "chemoattractant", "that", "recruits", "CXCR1", "/", "2-expressing", "human", "myeloid-derived", "suppressor", "cells", "to", "tumor", "foci", ",", "playing", "a", "crucial", "role", "in", "immune", "resistance", "[", "63", "]", ".", "IL-8", "receptor", "CXCR1", "may", "be", "a", "biomarker", "for", "cancer", "stem", "cells", "[", "64", "]", ",", "including", "glioblastoma", "stem", "cells", "[", "58", "]", ".", "Targeting", "myeloid", "cell", "CXCR1", "/", "2", "enhances", "antitumor", "immunity", "in", "pancreatic", "cancer", "[", "65", "]", ".", "Neutralizing", "IL-8", "or", "inhibiting", "its", "receptor", "CXCR1", "/", "2", "potentiates", "anti-PD-1-mediated", "antitumor", "immunotherapy", "for", "glioma", "[", "66", "]", ".", "These", "findings", "highlight", "IL-8", "and", "CXCR1", "/", "2", "as", "potential", "therapeutic", "targets", "for", "cancer.", "McClelland", "and", "colleagues", "have", "summarized", "numerous", "inhibitors", "developed", "to", "target", "IL-8", "or", "its", "receptor", "CXCR1", "/", "2", "for", "the", "treatment", "of", "chronic", "obstructive", "pulmonary", "disease", "(", "COPD", ")", ",", "asthma", ",", "diabetes", ",", "pneumonia", ",", "and", "solid", "tumors", ",", "including", "prostate", "cancer", "[", "62", "]", ".", "Phase", "1", "and", "2", "clinical", "trials", "in", "prostate", "cancer", "with", "Navarixin", ",", "a", "small-molecule", "inhibitor", "of", "CXCR1", "/", "2", ",", "have", "been", "completed.", "Phase", "1", "and", "2", "clinical", "trials", "in", "prostate", "cancer", "with", "BMS-986253", ",", "a", "monoclonal", "antibody", "against", "IL-8", ",", "are", "still", "active.", "However", ",", "none", "of", "these", "inhibitors", "have", "yet", "been", "approved", "to", "treat", "cancer.", "The", "ERK1", "/", "2", "signaling", "pathway", "contributes", "to", "numerous", "biological", "and", "pathological", "processes.", "Excessive", "activation", "of", "the", "ERK1", "/", "2", "pathway", "is", "a", "hallmark", "of", "human", "malignancies", "[", "67,68,69,70,71,72,73", "]", "due", "to", "its", "crucial", "role", "in", "maintaining", "sustained", "cellular", "proliferation", ",", "resistance", "to", "cell", "death", ",", "angiogenesis", ",", "invasion", ",", "and", "metastasis.", "Many", "FDA-approved", "drugs", "target", "upstream", "regulators", "of", "the", "ERK1", "/", "2", "pathway", ",", "resulting", "in", "an", "indirect", "inhibition", "of", "ERK1", "/", "2", "kinase", "[", "74", "]", ".", "ERK1", "/", "2", "signaling", "may", "be", "reactivated", "upon", "the", "development", "of", "drug", "resistance.", "Liu", "and", "colleagues", "have", "described", "10", "small-molecule", "inhibitors", "of", "ERK1", "/", "2", "which", "were", "developed", "recently", "and", "have", "undergone", "clinical", "trials", "in", "cancer", "patients", "[", "75", "]", ".", "Some", "of", "them", "have", "shown", "promising", "results", "in", "the", "treatment", "of", "cancers.", "Surprisingly", ",", "a", "large", "body", "of", "evidence", "also", "indicates", "a", "contributing", "role", "of", "ERK1", "/", "2", "activation", "in", "cancer", "cell", "apoptosis", "primarily", "induced", "by", "chemical", "compounds", ",", "including", "glioblastoma", ",", "bladder", ",", "breast", ",", "colon", ",", "endometrial", ",", "head", "and", "neck", ",", "lung", ",", "renal", "cell", ",", "and", "testicular", "germ", "cell", "carcinomas", "[", "76,77,78,79,80,81,82,83,84,85", "]", ",", "and", "mechanically", ",", "through", "activation", "of", "caspase", "3", "and", "induction", "of", "reactive", "oxygen", "species.", "Both", "oncogene", "and", "non-oncogene", "addiction", "have", "been", "demonstrated", "as", "fantastic", "targets", "for", "cancer", "therapy", "due", "to", "their", "crucial", "role", "in", "supporting", "cancer", "progression", "[", "86", "]", ".", "Using", "a", "unique", "glioblastoma", "cell", "model", "system", ",", "M059J", "with", "deficient", "DNA-PK", ",", "while", "M059K", "with", "normal", "DNA-PK", ",", "we", "demonstrate", "in", "vitro", "that", "MYT1L-overexpressing", "cells", "show", "non-oncogene", "addiction", "to", "DNA-PK.", "Genomic", "instability", "due", "to", "defects", "in", "DNA", "repair", "genes", "is", "a", "key", "hallmark", "of", "cancer", "that", "drives", "the", "development", "of", "human", "malignancies", "[", "87", "]", ".", "However", ",", "these", "defects", "may", "also", "offer", "cancer", "cells", "opportunities", "to", "evolve", "a", "dependency", "on", "a", "non-oncogene", "addiction", "gene.", "For", "instance", ",", "BRCA2-deficient", "cancer", "cells", "are", "more", "dependent", "on", "PARP1", "to", "repair", "DNA", "for", "survival", ",", "resulting", "in", "an", "increased", "sensitivity", "to", "PARP1", "inhibitors", "[", "88", "]", ",", "which", "kill", "the", "cancer", "cells", "through", "the", "genetic", "concept", "of", "synthetic", "lethality", "[", "89", "]", ".", "Targeting", "mediators", "of", "DNA", "repair", "has", "become", "a", "state-of-the-art", "strategy", "for", "cancer", "[", "90", "]", ",", "leading", "to", "the", "development", "of", "inhibitors", "of", "key", "mediators", "of", "DNA", "repair", ",", "including", "DNA-PK.", "Interestingly", ",", "genetic", "and", "pharmacological", "targeting", "of", "a", "strong", "non-oncogene", "addiction", "to", "DNA-PKcs", "(", "DNA-dependent", "protein", "kinase", "catalytic", "subunit", ")", "leads", "to", "the", "accumulation", "of", "DNA", "double-strand", "breaks", "in", "ATM-defective", "cancer", "cells", ",", "which", "triggers", "cell", "apoptosis", "via", "the", "proapoptotic", "signaling", "pathway", "[", "91", "]", ".", "These", "results", "are", "supported", "by", "our", "findings", "showing", "the", "dependence", "of", "MYT1L-overexpressing", "glioblastoma", "cells", "on", "DNA-PK.", "VX-984", "and", "M3814", "are", "two", "selective", "DNA-PK", "inhibitors", "[", "92,93", "]", "that", "profoundly", "inhibit", "tumor", "growth", "in", "tumor", "xenograft", "models", "by", "enhancing", "radiotherapy.", "These", "two", "inhibitors", "are", "currently", "in", "ongoing", "clinical", "trials.", "The", "DNA-PK", "/", "MYT1L-CXCR1-ERK1", "/", "2", "proliferative", "signaling", "loop", "we", "proposed", "here", "was", "primarily", "based", "on", "data", "obtained", "from", "glioblastoma", "cell", "lines.", "It", "is", "interesting", "to", "look", "at", "the", "expression", "of", "DNA-PK", ",", "MYT1L", ",", "and", "CXCR1", "and", "the", "levels", "of", "phosphorylated", "ERK1", "/", "2", "in", "a", "large", "cohort", "of", "glioblastoma", "tissue", "samples", "and", "correlate", "the", "levels", "of", "these", "molecules", "to", "clinicopathological", "parameters", "of", "this", "disease.", "It", "is", "also", "interesting", "to", "look", "at", "the", "effect", "of", "MYT1L", "on", "tumor", "growth", "in", "an", "in", "vivo", "tumor", "xenograft", "animal", "model", "using", "GFP-", "/", "MYT1L-M059J", "and", "GFP-", "/", "MYT1L", "M059K", "cells", ",", "further", "confirming", "our", "in", "vitro", "findings.", "4.", "materials", "and", "methods", "4.5.", "western", "blot", "analysis", "The", "cells", "were", "rinsed", "twice", "with", "ice-cold", "PBS", "and", "scraped", "off", "the", "plate", "in", "radioimmunoprecipitation", "assay", "buffer", "(", "RIPA", ")", ".", "The", "total", "protein", "lysate", "prepared", "from", "human", "adult", "brain", "normal", "tissues", "was", "purchased", "from", "BioChain", "(", "Newark", ",", "CA", ",", "USA", ")", "and", "served", "as", "a", "normal", "control", "for", "human", "cell", "lines.", "The", "whole", "cellular", "lysates", "(", "30–100", "µg", "per", "sample", ")", "were", "electrophoresed", "via", "10", "%", "SDS-PAGE", "and", "electrophoretically", "transferred", "to", "PVDF", "membranes", "(", "Amersham", "HybondTM-P", ",", "GE", "Healthcare", ",", "Chicago", ",", "IL", ",", "USA", ")", "at", "4", "°C", "for", "1.5", "h.", "The", "blots", "were", "incubated", "for", "1", "h", "with", "5", "%", "nonfat", "dry", "milk", "to", "block", "the", "nonspecific", "binding", "sites", "and", "subsequently", "incubated", "with", "polyclonal", "/", "monoclonal", "antibodies", "specific", "to", "MYT1L", "(", "Abnova", ",", "Taipei", ",", "China", ")", "or", "AKT1", "(", "Abcam", ",", "Cambridge", ",", "GH", ",", "UK", ")", ",", "CDK2", "(", "Abcam", ",", "Cambridge", ",", "GH", ",", "UK", ")", ",", "DNA-PKcs", "(", "Abcam", ",", "Cambridge", ",", "GH", ",", "UK", ")", ",", "p21", "(", "Abcam", ",", "Cambridge", ",", "GH", ",", "UK", ")", "or", "CDK4", "(", "Cell", "Signaling", "Technology", ",", "Danvers", ",", "MA", ",", "USA", ")", ",", "CDK6", "(", "Cell", "Signaling", "Technology", ",", "Danvers", ",", "MA", ",", "USA", ")", ",", "cyclin", "A2", "(", "Cell", "Signaling", "Technology", ",", "Danvers", ",", "MA", ",", "USA", ")", ",", "cyclin", "D1", "(", "Cell", "Signaling", "Technology", ",", "Danvers", ",", "MA", ",", "USA", ")", ",", "cyclin", "E1", "(", "Cell", "Signaling", "Technology", ",", "Danvers", ",", "MA", ",", "USA", ")", ",", "ERK1", "/", "2", "(", "Cell", "Signaling", "Technology", ",", "Danvers", ",", "MA", ",", "USA", ")", ",", "p27", "(", "Cell", "Signaling", "Technology", ",", "Danvers", ",", "MA", ",", "USA", ")", ",", "pERK1", "/", "2", "(", "Cell", "Signaling", "Technology", ",", "Danvers", ",", "MA", ",", "USA", ")", "or", "BAX", "(", "Santa", "Cruz", "Biotechnology", ",", "Dallas", ",", "TX", ",", "USA", ")", ",", "BCL2", "(", "Santa", "Cruz", "Biotechnology", ",", "Dallas", ",", "TX", ",", "USA", ")", ",", "GROα", "(", "Santa", "Cruz", "Biotechnology", ",", "Dallas", ",", "TX", ",", "USA", ")", ",", "IL8RB", "(", "Santa", "Cruz", "Biotechnology", ",", "Dallas", ",", "TX", ",", "USA", ")", ",", "pAKT1", "/", "2", "/", "3", "(", "Santa", "Cruz", "Biotechnology", ",", "Dallas", ",", "TX", ",", "USA", ")", ",", "or", "CXCR1", "(", "LSBio", ",", "Lynnwood", ",", "WA", ",", "USA", ")", "at", "4", "°C", "overnight.", "Immunoreactivity", "was", "detected", "using", "a", "peroxidase-conjugated", "antibody", "and", "visualized", "using", "the", "ECL", "Plus", "Western", "Blotting", "Detection", "System", "(", "GE", "Healthcare", ",", "Chicago", ",", "IL", ",", "USA", ")", ".", "The", "blots", "were", "stripped", "before", "reprobing", "with", "an", "antibody", "against", "actin", "(", "Abcam", ",", "Cambridge", ",", "GH", ",", "UK", ")", "or", "GAPDH", "(", "Santa", "Cruz", "Biotechnology", ",", "Dallas", ",", "TX", ",", "USA", ")", ".", "4.9.", "bioinformatics", "analysis", "The", "MYT1L", "binding", "sites", "in", "the", "CXCR1", "promoter", "were", "predicted", "using", "Zinc", "Finger", "Protein-DNA", "Scoring", "Form", ",", "a", "DNA", "binding", "site", "predictor", "for", "Cys2His2", "zinc", "finger", "proteins", "(", "http", ":", "/", "/", "zf.princeton.edu", "/", "form.php", ",", "accessed", "on", "14", "March", "2025", ")", ".", "The", "Cancer", "Genome", "Atlas", "(", "TCGA", ")", "datasets", "were", "used", "to", "analyze", "a", "relationship", "between", "MYT1L", "expression", "and", "CXCR1", "expression", "in", "glioblastoma", "and", "neuroblastoma.", "4.12.", "statistical", "analysis", "The", "Student’s", "t-test", "was", "used", "to", "determine", "the", "statistical", "significance", "of", "differences", "in", "GROα", "expression", ",", "IL-8", "expression", ",", "cell", "growth", ",", "apoptosis", ",", "cell", "cycle", ",", "and", "luciferase", "activity", "between", "groups.", "Luciferase", "activity", "was", "measured", "in", "duplicate", ",", "while", "other", "experiments", "were", "performed", "in", "triplicate.", "A", "value", "of", "p", "*5.", "Conclusions*", "This", "work", ",", "for", "the", "first", "time", ",", "reveals", "that", "MYT1L", "functions", "as", "a", "transcription", "factor", "governing", "the", "expression", "of", "CXC", "chemokine", "receptor", "CXCR1.", "The", "CXCR1", "signaling", "promotes", "proliferation", ",", "inhibits", "apoptosis", ",", "and", "shortens", "the", "S", "phase", "in", "DNA-PK+", "glioblastoma", "cells", "via", "activation", "of", "the", "ERK1", "/", "2", "pathway", ",", "which", "can", "be", "blocked", "by", "CXCR1", "knockdown.", "The", "function", "of", "MYT1L", "is", "DNA-PK-dependent", ",", "highlighting", "a", "key", "role", "of", "DNA-PK", "modulating", "the", "transcriptional", "activity", "of", "MYT1L.", "Our", "findings", "have", "demonstrated", "a", "positive", "feedback", "DNA-PK", "/", "MYT1L-CXCR1-ERK1", "/", "2", "proliferative", "signaling", "loop", "in", "glioblastoma", "cells", "and", "might", "have", "significant", "therapeutic", "implications.", "In", "the", "future", ",", "our", "studies", "can", "be", "extended", "by", "analyzing", "the", "effect", "of", "CXCR1", "knockdown", "in", "M059J", "cells", "with", "impaired", "DNA-PK.", "This", "would", "allow", "us", "to", "understand", "the", "interlink", "between", "DNA-PK-MYT1L-CXCR1-pERK1", "/", "2.", "Source", "paper", ":", "PMC12072392" ]	[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]
[ "Methods", "The", "cytotoxic", "effects", "of", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "were", "evaluated", "in", "a", "dose-dependent", "manner", "using", "the", "MTT", "assay", "on", "several", "cancer", "cell", "lines", ",", "with", "particular", "emphasis", "on", "HeLa", "cells.", "Flow", "cytometry", "was", "used", "to", "assess", "cell", "cycle", "arrest", "and", "apoptosis", ",", "while", "RT-qPCR", "quantified", "changes", "in", "the", "expression", "of", "apoptotic", "markers", "(", "Bax", ",", "Bcl-2", ",", "and", "p53", ")", ".", "Chemical", "composition", "analysis", "was", "conducted", "using", "gas", "chromatography-mass", "spectrometry", "/", "flame", "ionization", "detection", "(", "GC-MS", "/", "FID", ")", "to", "identify", "the", "major", "bioactive", "compounds", "within", "the", "fraction.", "Results", "The", "DCM", "fraction", "exhibited", "dose-dependent", "cytotoxicity", "in", "HeLa", "cells", ",", "with", "an", "IC50", "value", "of", "135.6", "µg", "/", "mL", "and", "a", "selectivity", "index", "(", "SI", ")", "of", "2.72", "relative", "to", "normal", "cells.", "Flow", "cytometry", "analysis", "revealed", "G0", "/", "G1", "cell", "cycle", "arrest", ",", "significantly", "hindering", "progression", "through", "the", "S", "and", "G2", "/", "M", "phases.", "Moreover", ",", "there", "was", "a", "significant", "increase", "in", "both", "early", "and", "late", "apoptotic", "cell", "populations", ",", "correlating", "with", "the", "upregulation", "of", "pro-apoptotic", "genes", "(", "Bax", "and", "p53", ")", "and", "the", "downregulation", "of", "the", "anti-apoptotic", "gene", "Bcl-2.", "The", "chemical", "analysis", "identified", "22", "compounds", "in", "the", "unsaponifiable", "fraction", ",", "chiefly", "terpenoids", "such", "as", "phytol", "(", "65.74", "%", ")", ".", "The", "saponifiable", "fraction", "presented", "a", "balanced", "composition", "of", "saturated", "(", "48.69", "%", ")", "and", "unsaturated", "(", "51.29", "%", ")", "fatty", "acids", ",", "with", "palmitic", "acid", ",", "linolenic", "acid", ",", "and", "linoleic", "acid", "as", "the", "predominant", "compounds.", "Conclusion", "While", "the", "DCM", "fraction’s", "relatively", "high", "IC50", "value", "may", "limit", "its", "utility", "as", "a", "standalone", "treatment", ",", "its", "ability", "to", "induce", "cell", "cycle", "arrest", "and", "apoptosis", "demonstrates", "its", "promise", "as", "a", "co-therapeutic", "agent", "with", "conventional", "anticancer", "drugs.", "Further", "research", "is", "essential", "to", "elucidate", "its", "precise", "mechanisms", "of", "action", "and", "to", "evaluate", "its", "efficacy", "in", "combination", "therapies", ",", "potentially", "advancing", "its", "role", "in", "cervical", "cancer", "treatment.", "Methods", "Cell", "cycle", "analysis", "To", "assess", "the", "impact", "of", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "on", "cell", "cycle", "progression", ",", "propidium", "iodide", "(", "PI", ")", "staining", "followed", "by", "flow", "cytometry", "was", "employed", "as", "outlined", "previously", "[", "17", "]", ".", "PI", "(", "Company", ")", "is", "a", "fluorescent", "dye", "that", "binds", "to", "DNA", "allowing", "differentiation", "of", "cell", "cycle", "phases", "(", "G0", "/", "G1", ",", "S", ",", "G2", "/", "M", ")", "based", "on", "their", "DNA", "content.", "Briefly", ",", "HeLa", "cells", "(", "2", "×", "105", "cells", "/", "mL", ")", "were", "cultured", "overnight", "and", "then", "treated", "with", "the", "DCM", "fraction", "at", "its", "IC50", "concentration", "(", "135.6", "µg", "/", "mL", ")", "for", "24", "h.", "After", "treatment", ",", "cells", "were", "fixed", ",", "stained", "with", "a", "PI", "/", "RNase", "solution", ",", "and", "analyzed", "using", "a", "FACSCalibur", "Scan", "flow", "cytometer", "(", "BD", "Biosciences", ")", "to", "determine", "cell", "cycle", "distribution.", "Apoptosis", "analysis", "using", "annexin", "v-fitc", "/", "pi", "assay", "To", "determine", "the", "mode", "of", "cell", "death", "induced", "by", "A.", "incana", "DCM", "fraction", ",", "the", "Annexin", "V-FITC", "apoptosis", "detection", "kit", "(", "BioVision", "Inc.", ",", "CA", ",", "USA", ",", "K101-25", ")", "was", "used", "following", "the", "manufacturer’s", "protocol.", "This", "assay", "detects", "phosphatidylserine", "translocation", ",", "a", "hallmark", "of", "early", "apoptosis", ",", "by", "Annexin", "V-FITC", "staining.", "PI", ",", "a", "viability", "dye", "excluded", "by", "healthy", "and", "early", "apoptotic", "cells", "with", "intact", "membranes", ",", "stains", "the", "DNA", "of", "late", "apoptotic", "and", "necrotic", "cells", "with", "compromised", "membranes", ",", "allowing", "for", "their", "identification.", "Briefly", ",", "HeLa", "cells", "(", "2", "×", "105", "cells", "/", "mL", ")", "were", "cultured", "for", "24", "h", "and", "treated", "with", "the", "extract", "at", "its", "IC50", "concentration", "(", "135.6", "µg", "/", "mL", ")", "for", "an", "additional", "48", "h.", "Following", "treatment", ",", "cells", "were", "stained", "with", "Annexin", "V-FITC", "and", "PI.", "Apoptosis", "was", "quantified", "by", "flow", "cytometry", "using", "a", "BD", "FACSCalibur", "Scan", "system", "(", "BD", "Biosciences", ")", ".", "For", "accurate", "quantification", "of", "apoptotic", "populations", ",", "a", "specific", "gating", "strategy", "was", "applied.", "Cells", "were", "initially", "gated", "based", "on", "forward", "scatter", "(", "FSC", ")", "versus", "side", "scatter", "(", "SSC", ")", "to", "exclude", "debris", ",", "followed", "by", "gating", "on", "FSC-Height", "(", "FSC-H", ")", "versus", "FSC-Area", "(", "FSC-A", ")", "to", "exclude", "doublets.", "Apoptotic", "populations", "were", "classified", "by", "gating", "on", "Annexin", "V-FITC", "versus", "PI", "as", "follows", ":", "live", "cells", "(", "Q4", ")", "were", "Annexin", "V-", "/", "PI-", ",", "early", "apoptotic", "cells", "(", "Q3", ")", "were", "Annexin", "V+", "/", "PI-", ",", "late", "apoptotic", "/", "necrotic", "cells", "(", "Q2", ")", "were", "Annexin", "V+", "/", "PI+", ",", "and", "dead", "/", "necrotic", "cells", "(", "Q1", ")", "were", "Annexin", "V-", "/", "PI+.", "The", "percentage", "of", "cells", "in", "each", "quadrant", "was", "calculated", "to", "assess", "the", "extent", "of", "apoptosis", "and", "necrosis.", "Statistical", "analysis", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "SPSS", "version", "24.0.", "Differences", "between", "the", "means", "of", "two", "independent", "groups", "were", "analyzed", "using", "an", "independent", "t-test", ",", "with", "p", "*Results*", "Effect", "of", "a.", "incana", "dcm", "fraction", "on", "cell", "cycle", "analysis", "To", "investigate", "the", "effect", "of", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "on", "cell", "cycle", "progression", ",", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "the", "IC50", "concentration", "(", "135.6", "µg", "/", "mL", ")", "of", "the", "fraction", "for", "48", "h.", "Cell", "cycle", "distribution", "was", "assessed", "by", "flow", "cytometry", "using", "Propidium", "Iodide", "(", "PI", ")", "staining", ",", "which", "binds", "to", "DNA", "and", "allows", "differentiation", "of", "cell", "cycle", "phases", "(", "G0", "/", "G1", ",", "S", ",", "G2", "/", "M", ")", "based", "on", "DNA", "content.", "As", "illustrated", "in", "Fig.", "2", ",", "a", "significant", "increase", "(", "p", "A.", "incana", "exerts", "cytostatic", "effects", "on", "HeLa", "cells", "by", "inducing", "cell", "cycle", "arrest.", "Fig.", "2Flow", "cytometric", "analysis", "of", "cell", "cycle", "distribution", "in", "HeLa", "cells", "treated", "with", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction.", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "the", "IC50", "concentration", "(", "135.6", "µg", "/", "mL", ")", "of", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "for", "48", "h", ",", "and", "cell", "cycle", "phase", "distribution", "was", "analyzed", "via", "flow", "cytometry.", "Panels", ":", "(", "a", ")", "Control", "(", "untreated", ")", "HeLa", "cells", ",", "(", "b", ")", "HeLa", "cells", "treated", "with", "the", "DCM", "fraction", ",", "and", "(", "c", ")", "A", "graphical", "comparison", "of", "cell", "percentages", "across", "each", "cell", "cycle", "phase", "between", "treated", "and", "untreated", "groups", "Discussion", "This", "study", "investigated", "the", "cytotoxic", "potential", "of", "the", "DCM", "fraction", "from", "the", "leaves", "of", "the", "medicinal", "plant", "A.", "incana.", "Given", "the", "documented", "cytotoxic", "activity", "of", "the", "DCM", "extract", "from", "the", "related", "subspecies", "A.", "rugosa", "[", "8", "]", ",", "we", "hypothesized", "that", "A.", "incana", "might", "exhibit", "similar", "effects.", "Although", "previous", "studies", "confirmed", "the", "cytotoxic", "properties", "of", "its", "methanol", "extract", "[", "10", "]", ",", "the", "effects", "of", "the", "DCM", "fraction", "remain", "unexamined.", "To", "address", "this", "gap", ",", "the", "fraction’s", "cytotoxicity", "was", "evaluated", "against", "four", "human", "cancer", "cell", "lines", ":", "HepG2", ",", "HCT116", ",", "HeLa", ",", "and", "MCF-7", ",", "representing", "diverse", "cancer", "types.", "The", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "demonstrated", "IC50", "values", "ranging", "from", "135.6", "to", "273.1", "µg", "/", "mL", ",", "with", "HeLa", "cells", "(", "a", "cervical", "cancer", "model", ")", "showing", "the", "highest", "sensitivity", "(", "IC50", "=", "135.6", "µg", "/", "mL", ")", ".", "Significantly", ",", "the", "DCM", "fraction", "exhibited", "a", "selectivity", "index", "(", "SI", ")", "of", "2.72", "against", "HeLa", "cells", ",", "indicating", "preferential", "cytotoxicity", "toward", "cancer", "cells", "over", "normal", "cells", "and", "highlighting", "its", "therapeutic", "potential.", "Although", "the", "IC50", "values", "for", "A.", "incana", "were", "higher", "than", "those", "reported", "for", "the", "DCM", "extract", "of", "the", "related", "subspecies", "A.", "rugosa", "[", "8", "]", ",", "this", "difference", "may", "be", "attributed", "to", "variations", "in", "the", "concentration", "or", "composition", "of", "active", "compounds", "in", "each", "extract.", "Despite", "this", ",", "both", "species", "showed", "their", "most", "potent", "cytotoxic", "effects", "against", "HeLa", "cells", ",", "suggesting", "a", "potential", "shared", "mechanism", "targeting", "cervical", "cancer", "cells", "specifically.", "Additionally", ",", "prior", "studies", "have", "reported", "that", "the", "methanol", "extract", "of", "A.", "incana", "leaves", "has", "a", "pronounced", "effect", "on", "HeLa", "cells", "(", "IC50", "of", "68.5", "µg", "/", "mL", ")", "[", "10", "]", ".", "The", "selective", "cytotoxicity", "observed", "in", "both", "A.", "incana", "and", "A.", "rugosa", "DCM", "extracts", ",", "alongside", "the", "methanol", "extract’s", "activity", ",", "indicates", "the", "presence", "of", "bioactive", "compounds", "within", "these", "species", "that", "may", "preferentially", "disrupt", "HeLa", "cell", "function.", "This", "selective", "activity", "underscores", "the", "potential", "of", "Alnus", "species", "as", "promising", "candidates", "for", "developing", "targeted", "therapies", "against", "gynecological", "cancers", ",", "particularly", "cervical", "cancer.", "Given", "the", "substantial", "cytotoxic", "response", "observed", ",", "further", "investigation", "into", "the", "active", "compounds", "and", "mechanisms", "of", "action", "of", "the", "DCM", "fraction", "of", "A.", "incana", "leaves", "is", "warranted.", "To", "explore", "the", "mechanisms", "underlying", "this", "cytotoxicity", ",", "we", "investigated", "the", "effects", "of", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "on", "cell", "cycle", "progression", "and", "apoptosis", "in", "HeLa", "cells.", "The", "results", "revealed", "a", "significant", "accumulation", "of", "cells", "in", "the", "G0", "/", "G1", "phase", ",", "indicating", "effective", "cell", "cycle", "arrest.", "This", "is", "a", "crucial", "finding", "science", "cell", "cycle", "arrest", "at", "key", "checkpoints", "is", "a", "well-established", "therapeutic", "strategy", "for", "inhibiting", "cancer", "cell", "proliferation.", "The", "mammalian", "cell", "cycle", "comprises", "four", "distinct", "phases", ":", "G1", ",", "S", ",", "G2", ",", "and", "M", ",", "where", "RNA", "and", "protein", "synthesis", "occur", "in", "G1", "and", "G2", ",", "DNA", "replication", "in", "S", ",", "and", "chromosome", "segregation", "in", "M", "[", "18", "]", ".", "By", "halting", "cells", "in", "the", "G0", "/", "G1", "phase", ",", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "appears", "to", "block", "progression", "to", "DNA", "synthesis", ",", "which", "could", "lead", "to", "senescence", "or", "cell", "death.", "Several", "plant-derived", "anticancer", "agents", ",", "such", "as", "taxanes", "and", "vinca", "alkaloids", ",", "function", "by", "disrupting", "key", "cell", "cycle", "regulators", "[", "19", "]", ".", "In", "addition", "to", "inducing", "cell", "cycle", "arrest", ",", "the", "DCM", "fraction", "significantly", "promoted", "apoptosis", ",", "a", "fundamental", "mechanism", "in", "cancer", "treatment.", "Apoptosis", ",", "or", "programmed", "cell", "death", ",", "is", "triggered", "by", "many", "natural", "cytotoxic", "agents", ",", "both", "clinically", "approved", "and", "experimental", ",", "and", "is", "essential", "for", "eliminating", "cancer", "cells", "[", "20", "]", ".", "Flow", "cytometric", "analysis", "using", "Annexin", "V", "and", "propidium", "iodide", "staining", "revealed", "a", "marked", "increase", "in", "apoptotic", "cell", "death", "(", "40.67-fold", "increase", ",", "18.71", "%", "vs.", "0.46", "%", "in", "the", "control", ")", "induced", "by", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction.", "Early", "apoptosis", "rose", "to", "14.32", "%", "from", "0.37", "%", ",", "and", "late", "apoptosis", "increased", "to", "4.39", "%", "from", "0.09", "%", ".", "Necrosis", "also", "increased", "by", "2.5-fold", "(", "2.84", "%", "vs.", "1.15", "%", "in", "the", "control", ")", ",", "indicating", "a", "broad", "cytotoxic", "effect", "on", "HeLa", "cells.", "These", "findings", "reinforce", "the", "potential", "of", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "as", "an", "effective", "anticancer", "agent", "by", "simultaneously", "inducing", "cell", "cycle", "arrest", "and", "apoptosis.", "To", "elucidate", "the", "molecular", "mechanisms", "behind", "these", "effects", ",", "we", "evaluated", "the", "expression", "of", "apoptotic", "regulators", ",", "including", "p53", ",", "Bcl-2", ",", "and", "Bax", ",", "through", "RT-PCR.", "The", "intrinsic", "apoptotic", "pathway", "is", "regulated", "by", "the", "balance", "between", "pro-apoptotic", "Bax", "and", "anti-apoptotic", "Bcl-2", ",", "where", "Bcl-2", "stabilizes", "the", "mitochondrial", "membrane", "and", "prevents", "cytochrome", "c", "release", ",", "whereas", "Bax", "promotes", "apoptosis", "by", "facilitating", "cytochrome", "c", "release", "[", "21", "]", ".", "p53", ",", "a", "critical", "tumor", "suppressor", ",", "enhances", "Bax", "expression", ",", "thus", "its", "stimulation", "tipping", "the", "balance", "towards", "apoptosis", "[", "22", "]", ".", "In", "our", "study", ",", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "significantly", "upregulated", "Bax", "and", "p53", "while", "downregulating", "Bcl-2", ",", "resulting", "in", "an", "elevated", "Bax", "/", "Bcl-2", "ratio", ",", "a", "key", "indicator", "of", "apoptosis", "activation.", "Previous", "research", "reported", "that", "elevated", "p53", "expression", "and", "a", "higher", "Bax", "/", "Bcl-2", "ratio", "correlate", "with", "increased", "tumor", "sensitivity", "to", "anticancer", "therapies", "[", "23", "]", ",", "further", "supporting", "the", "potential", "of", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "as", "a", "therapeutic", "agent.", "Given", "these", "findings", ",", "it", "is", "essential", "to", "contextualize", "the", "anticancer", "activity", "of", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "by", "comparing", "it", "to", "established", "cervical", "cancer", "treatments", ",", "such", "as", "cisplatin", "and", "paclitaxel.", "Cisplatin", "exerts", "its", "cytotoxic", "effects", "primarily", "through", "DNA", "cross-linking", ",", "causing", "extensive", "DNA", "damage", "that", "leads", "predominantly", "to", "G2", "/", "M", "cell", "cycle", "arrest", "and", "subsequent", "apoptosis", "induction", "mainly", "via", "p53-dependent", "pathways", "[", "24", ",", "25", "]", ".", "Despite", "its", "efficacy", ",", "cisplatin", "is", "often", "limited", "by", "severe", "adverse", "effects", ",", "including", "nephrotoxicity", ",", "neurotoxicity", ",", "and", "drug", "resistance", "[", "25", "]", ".", "Paclitaxel", ",", "another", "cornerstone", "treatment", ",", "acts", "by", "stabilizing", "microtubules", ",", "causing", "prolonged", "G2", "/", "M", "mitotic", "arrest", "and", "promoting", "apoptosis", "through", "a", "p53-independent", "pathway", "involving", "cyclin", "B1", "/", "CDC2", "activation", "and", "Bcl-2", "phosphorylation", "[", "24", ",", "26", "]", ".", "However", ",", "paclitaxel", "similarly", "has", "clinical", "limitations", ",", "including", "dose-dependent", "toxicities", "such", "as", "peripheral", "neuropathy", "and", "myelosuppression", "[", "27", "]", ".", "In", "contrast", ",", "our", "findings", "demonstrate", "that", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "distinctly", "arrests", "cells", "at", "the", "G0", "/", "G1", "phase", "and", "promotes", "apoptosis", "via", "a", "p53-dependent", "pathway.", "These", "unique", "molecular", "characteristics", "suggest", "a", "complementary", "role", "alongside", "traditional", "chemotherapeutics", ",", "potentially", "reducing", "toxicities", "and", "overcoming", "drug", "resistance", ",", "despite", "its", "relatively", "high", "IC50.", "The", "chemical", "profile", "of", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", ",", "analyzed", "via", "GC-MS", "/", "FID", "detection", ",", "revealed", "a", "high", "content", "of", "phytol", "(", "65.74", "%", ")", "in", "unsaponifiable", "matter", ",", "a", "compound", "known", "for", "its", "broad-spectrum", "biological", "activities", ",", "particularly", "in", "cancer", "therapy.", "Phytol", ",", "a", "diterpenoid", "derived", "from", "chlorophyll", ",", "has", "been", "widely", "recognized", "for", "its", "anti-inflammatory", "and", "anticancer", "properties", ",", "including", "the", "modulation", "of", "cell", "cycle", "and", "apoptosis", "pathways", "[", "28", "]", ".", "Previous", "studies", "have", "demonstrated", "its", "ability", "to", "induce", "apoptosis", "across", "various", "cancer", "cell", "lines", ",", "including", "lung", ",", "colon", ",", "and", "breast", "cancers", ",", "primarily", "through", "the", "disruption", "of", "mitochondrial", "membrane", "potential", "and", "subsequent", "activation", "of", "the", "intrinsic", "apoptotic", "pathway", "[", "28", ",", "29", "]", ".", "Our", "findings", ",", "which", "show", "significant", "G0", "/", "G1", "cell", "cycle", "arrest", "and", "apoptosis", "in", "HeLa", "cells", ",", "align", "with", "these", "established", "mechanisms", "of", "action", ",", "further", "validating", "phytol’s", "role", "as", "a", "potent", "anticancer", "agent.", "In", "addition", "to", "phytol", ",", "the", "saponifiable", "matter", "of", "the", "DCM", "fraction", "contained", "palmitic", "acid", "(", "31.27", "%", ")", "and", "linolenic", "acid", "(", "26.98", "%", ")", "as", "the", "major", "components.", "Both", "fatty", "acids", "are", "well-documented", "for", "their", "apoptosis-inducing", "capabilities.", "Palmitic", "acid", ",", "for", "instance", ",", "has", "been", "reported", "to", "upregulate", "pro-apoptotic", "proteins", "such", "as", "Bax", "and", "p53", ",", "while", "downregulating", "anti-apoptotic", "Bcl-2", ",", "leading", "to", "enhanced", "apoptosis", "via", "caspase", "activation", "in", "colorectal", "and", "breast", "cancer", "models", "[", "30", "]", ".", "Similarly", ",", "linolenic", "acid", "exerts", "anticancer", "effects", "by", "modulating", "the", "Bcl-2", "family", "proteins", ",", "increasing", "pro-apoptotic", "Bax", "expression", ",", "and", "inducing", "endoplasmic", "reticulum", "(", "ER", ")", "stress", ",", "which", "contributes", "to", "cancer", "cell", "death.", "Linolenic", "acid", "has", "also", "been", "shown", "to", "inhibit", "the", "PI3K", "/", "Akt", "signaling", "pathway", "and", "suppress", "fatty", "acid", "synthase", "(", "FASN", ")", ",", "an", "enzyme", "overexpressed", "in", "many", "cancers", "[", "31", "]", ".", "Our", "study’s", "findings", "of", "increased", "Bax", "expression", "and", "a", "heightened", "Bax", "/", "Bcl-2", "ratio", "in", "HeLa", "cells", "are", "consistent", "with", "these", "mechanisms", ",", "suggesting", "that", "palmitic", "and", "linolenic", "acids", "likely", "contribute", "to", "the", "cytotoxic", "effects", "observed.", "Despite", "these", "promising", "results", ",", "the", "study", "possesses", "limitations", "typical", "of", "in", "vitro", "investigations.", "Notably", ",", "the", "biological", "complexity", "of", "tumor", "microenvironments", ",", "such", "as", "gene", "expression", "variability", ",", "signaling", "heterogeneity", ",", "immune", "interactions", ",", "and", "stromal", "influences", ",", "can", "not", "be", "adequately", "mimicked", "using", "isolated", "cell", "lines", "like", "HeLa.", "Additionally", ",", "the", "relatively", "high", "IC50", "necessitates", "exploration", "of", "advanced", "drug", "delivery", "systems", "or", "combination", "therapies.", "Future", "research", "should", "incorporate", "additional", "cancer", "cell", "lines", ",", "normal", "cell", "toxicity", "assessments", ",", "patient-derived", "xenografts", "(", "PDX", ")", ",", "and", "innovative", "delivery", "strategies", ",", "such", "as", "nanoparticle", "encapsulation", ",", "to", "enhance", "efficacy", ",", "reduce", "toxicity", ",", "and", "facilitate", "clinical", "translation.", "These", "steps", "are", "crucial", "for", "validating", "the", "preclinical", "promise", "and", "advancing", "the", "clinical", "applicability", "of", "the", "Alnus", "incana", "DCM", "fraction.", "Conclusion", "This", "study", "demonstrates", "that", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", ",", "rich", "in", "bioactive", "compounds", "such", "as", "phytol", ",", "palmitic", "acid", ",", "and", "linolenic", "acid", ",", "exerts", "notable", "cytotoxic", "effects", "on", "various", "cancer", "cell", "lines", ",", "particularly", "HeLa", "cells.", "These", "effects", "are", "mediated", "through", "inducing", "G0", "/", "G1", "cell", "cycle", "arrest", "and", "apoptosis", "via", "modulation", "of", "Bax", ",", "Bcl-2", ",", "and", "p53", "pathways.", "Although", "the", "relatively", "high", "IC50", "value", "(", "135.6", "µg", "/", "mL", ")", "limits", "its", "potential", "as", "a", "standalone", "therapy", ",", "the", "fraction’s", "selective", "cytotoxicity", "toward", "cancer", "cells", "suggests", "a", "potentially", "favorable", "safety", "profile.", "Its", "unique", "ability", "to", "activate", "apoptotic", "and", "cell-cycle", "arrest", "pathways", "supports", "its", "promise", "as", "an", "adjunctive", "therapy", ",", "particularly", "in", "combination", "with", "conventional", "chemotherapeutic", "agents", ",", "which", "may", "improve", "treatment", "outcomes", "by", "reducing", "associated", "toxicities", "or", "overcoming", "resistance.", "Further", "in-depth", "mechanistic", "studies", ",", "along", "with", "rigorous", "in", "vivo", "evaluations", "using", "clinically", "relevant", "models", "such", "as", "patient-derived", "xenografts", ",", "are", "essential", "to", "validate", "these", "promising", "findings", "and", "fully", "realize", "the", "clinical", "potential", "of", "this", "natural", "fraction.", "Source", "paper", ":", "PMC12105127" ]	[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]
[ "Introduction", "Hepatocellular", "carcinoma", "(", "HCC", ")", "is", "an", "exceedingly", "fatal", "malignancies", ",", "with", "mortalities", "that", "approximate", "the", "incidence", "rates", "worldwide", "[", "1", "]", ".", "HCC", "is", "usually", "diagnosed", "at", "advanced", "stages", "owing", "to", "late", "symptom", "manifestations", "with", "limited", "therapeutic", "options", ",", "leading", "to", "ineffective", "intervention", "and", "poor", "prognosis", "[", "2", "]", ".", "An", "increasing", "number", "of", "studies", "have", "focused", "on", "the", "progression", ",", "pathological", "features", ",", "and", "prognosis", "of", "liver", "cancer", "[", "3–5", "]", ".", "HCC", "epidemiology", "is", "rapidly", "evolving", ",", "one", "of", "the", "most", "common", "causes", "is", "non-alcoholic", "fatty", "liver", "disease", "[", "6", "]", ",", "further", "proving", "that", "lipid", "metabolism", "plays", "a", "crucial", "role", "in", "HCC", "occurrence.", "Therefore", ",", "the", "identification", "of", "novel", "therapeutic", "targets", "is", "urgently", "needed", "to", "improve", "the", "treatment", "of", "patients", "with", "HCC", "[", "7", "]", ".", "Phosphatidylethanolamine", "(", "PE", ")", ",", "also", "known", "as", "cephalin", ",", "is", "the", "most", "abundant", "lipid", "in", "the", "cytoplasmic", "layer", "of", "cell", "membranes", "and", "is", "involved", "in", "cellular", "processes", "such", "as", "membrane", "fusion", "[", "8", "]", ",", "autophagy", "and", "apoptosis", "[", "9–11", "]", ".", "For", "eukaryotic", "PE", "in", "vivo", ",", "two", "main", "synthetic", "pathways", "exist", "[", "12", "]", ":", "including", "the", "Kennedy", "pathway", "of", "CDP-ethanolamine", "(", "CDP-Etn", ")", "and", "mitochondrial", "phosphatidylserine", "decarboxylation", "pathway", "[", "13", "]", ".", "Phosphatidylethanolamine", "cytidyltransferase", "2", "(", "PCYT2", ")", "is", "the", "rate-limiting", "enzyme", "of", "the", "CDP-Etn", "pathway.", "Previous", "studies", "have", "shown", "that", "PCYT2", "is", "highly", "specific", ",", "and", "is", "present", "only", "in", "the", "rough", "endoplasmic", "reticulum", "of", "eukaryotes", "[", "14", "]", ".", "P-Eth", "is", "then", "catalyzed", "by", "PCYT2", "to", "form", "CDP-Etn", ",", "leading", "to", "PE", "synthesis", "[", "15", "]", ".", "Generally", ",", "PCYT2", "expression", "is", "reduced", "in", "various", "epithelial-derived", "cancer", "cell", "lines", "compared", "to", "normal", "cells", "[", "16,17", "]", ".", "Compared", "epithelial-derived", "cancer", "cell", "lines", "PCYT2", "activity", "with", "that", "of", "breast", "epithelial", "cells", "MCF-10A", "showed", "that", "its", "PCYT2", "activity", "was", "inhibited", "in", "breast", "cancer", "cells", "(", "MCF-7", ")", "[", "16", "]", ".", "PCYT2", "expression", "was", "significantly", "reduced", "in", "invasive", "human", "metastatic", "colon", "cancer", "cells", "compared", "to", "that", "in", "primary", "tumor", "cells", "[", "17", "]", ",", "and", "previous", "studies", "have", "shown", "that", "PCYT2", "knockdown", "under", "nutrient-rich", "conditions", "significantly", "facilitated", "the", "proliferation", "of", "HeLa", "and", "T98G", "cells", "and", "promoted", "in", "vivo", "tumor", "growth.", "The", "inhibition", "of", "PCYT2", "increases", "P-Etn", "levels", "in", "cancer", "cells", "and", "stimulates", "tumor", "growth", "[", "18", "]", ".", "However", ",", "in", "organoid", "models", ",", "PCYT2", "knockdown", "inhibits", "cell", "growth", "[", "19", "]", ".", "Despite", "these", "findings", ",", "no", "evidence", "exists", "that", "suggests", "that", "PCYT2", "expression", "is", "associated", "with", "HCC", "occurrence", "and", "development.", "This", "study", "aimed", "to", "investigate", "the", "role", "of", "PCYT2", "in", "human", "hepatocellular", "carcinoma", "cells", "(", "HepG2", ")", "by", "inhibiting", "their", "proliferation", ",", "invasion", ",", "and", "migration", "abilities", "and", "promoting", "cell", "apoptosis.", "Materials", "and", "methods", "Cell", "viability", "analysis", "HepG2", "cells", "were", "seeded", "into", "96-well", "plates", "and", "incubated", "with", "a", "Cell", "Counting", "kit", "(", "CCK-8", ")", "solution", "for", "40", "min", "at", "37°C.", "Absorbance", "was", "measured", "at", "450", "nm", "using", "a", "Spectra", "MAX", "M5", "microplate", "spectrophotometer", "to", "detect", "cell", "viability.", "Invasion", "experiment", "Dilute", "the", "Matrigel", "with", "basal", "medium", "(", "1:8", ")", ",", "lay", "it", "flat", "on", "a", "Transwell", "membrane", ",", "and", "incubate", "at", "37°C", "for", "4", "h.", "The", "subsequent", "experimental", "steps", "were", "identical", "to", "those", "used", "for", "the", "migration", "assay", ",", "including", "cell", "culture", ",", "paraformaldehyde", "fixation", "and", "0.1", "%", "crystal", "violet", "staining.", "Animal", "experiments", "Five-week-old", "BALB", "/", "c", "female", "nude", "mice", "were", "purchased", "from", "Jiangsu", "Jicui", "Pharmaceutical", "Biotechnology", "Co", ",", "passed", "SPF", "level", "training", "and", "assessment", ",", "and", "were", "routinely", "reared", "using", "standard", "SPF", "conditions.", "PCYT2", "overexpressed", "HepG2", "cells", "and", "control", "cells", "were", "subcutaneously", "injected", "into", "the", "left", "and", "right", "sides", "of", "the", "nude", "mice", "(", "approximately", "1", "×", "107", "cells", "on", "each", "side", ",", "n", "=", "6", "tumors", "in", "each", "group", ")", ".", "Following", "20–25", "d", ",", "the", "tumors", "achieved", "a", "certain", "size", "and", "the", "micewere", "anesthetized", "with", "isopentane", "and", "sacrificed", ";", "the", "tumors", "were", "collected", "for", "follow-up", "evaluation.", "The", "animal", "experiments", "were", "approved", "by", "the", "Animal", "Ethics", "Committee", "of", "Anhui", "Medical", "University", "and", "conducted", "in", "accordance", "with", "the", "guidelines", "for", "the", "care", "and", "use", "of", "laboratory", "animals.", "Statistical", "analysis", "Data", "were", "analyzed", "using", "GraphPad", "Prism", "software", "(", "version", "8.0", ")", ",", "and", "the", "results", "were", "expressed", "as", "mean", "±", "standard", "deviation", "(", "SD", ")", ".", "T-test", "was", "performed", "to", "determine", "the", "significant", "of", "differences", "between", "two", "groups.", "A", "one-way", "analysis", "of", "variance", "was", "used", "for", "comparison", "across", "groups.", "Statistical", "significance", "was", "set", "at", "P", "*Results*", "Discussion", "PCYT2", "is", "a", "rate-limiting", "enzyme", "in", "PE", "synthesis", "that", "is", "commonly", "used", "in", "the", "study", "of", "obesity-related", "diseases", ",", "such", "as", "non-alcoholic", "fatty", "liver", "disease", "and", "type", "2", "diabetes", "[", "12,20–22", "]", ".", "Recently", ",", "interest", "in", "the", "role", "of", "PCYT2", "in", "cancer", "has", "been", "growing", "[", "18,23,24", "]", ".", "Previous", "studies", "show", "that", "PCYT2", "has", "different", "roles", "in", "various", "cancers", "and", "cancer", "settings.", "For", "instance", ",", "in", "metastatic", "colorectal", "cancer", "(", "CRC", ")", ",", "PCYT2", "is", "significantly", "downregulated", "and", "functions", "as", "a", "tumor", "metastasis", "inhibitor", "[", "25", "]", ".", "In", "human", "breast", "cancer", "cells", "(", "MCF-7", ")", ",", "the", "level", "of", "PCYT2", "in", "cancer", "cells", "is", "elevated", "in", "response", "to", "the", "stressful", "environment", "[", "26", "]", ".", "Our", "findings", "show", "that", "PCYT2", "expression", "is", "abnormally", "downregulated", "in", "HepG2", "cells", ",", "which", "is", "consistent", "with", "that", "of", "previous", "studies", "where", "in", "PCYT2", "expression", "was", "downregulated", "in", "MCF-7", "and", "invasive", "human", "metastatic", "CRC", "[", "16,17", "]", ".", "Although", "PCYT2", "regulates", "several", "human", "cancers", "[", "18,19,23", "]", ",", "its", "role", "in", "HCC", "cells", "remains", "unknown.", "Based", "on", "the", "literature", "and", "our", "findings", ",", "PCYT2", "in", "human", "cancers", "appears", "to", "have", "a", "consistent", "expression", "profile", "in", "human", "cancers", ",", "irrespective", "of", "tumor", "origin", "or", "location", "[", "27", "]", ".", "Regarding", "the", "mechanism", "whereby", "PCYT2", "influences", "cancer", "development", ",", "a", "previous", "report", "showed", "that", "PCYT2", "downregulation-induced", "phosphoethanolamine", "(", "PEtn", ")", "accumulation", "correlated", "with", "tumor", "growth", "under", "nutrient", "starvation", ",", "thereby", "PCYT2", "overexpression", "reduced", "PEtn", "levels", "and", "tumor", "growth", "[", "18", "]", ".", "However", ",", "in", "the", "present", ",", "we", "found", "that", "CDP-Etn", "supplementation", "inhibited", "HCC", "migration", ",", "invasion", "and", "proliferation.", "In", "our", "previous", "study", ",", "we", "showed", "that", "the", "levels", "of", "BAX", "and", "cleaved", "caspase-3", "were", "significantly", "increased", "whereas", "Bcl-2", "was", "significantly", "reduced", "in", "the", "livers", "of", "type", "2", "diabetic", "mice", "and", "L02", "cells", "after", "stimulation", "with", "high", "glucose", "and", "free", "fatty", "acids", "(", "HG", "&", "FFA", ")", "(", "12", ")", ".", "CDP-Etn", "(", "100", "μM", ")", "protected", "cells", "from", "HG", "&", "FFA-induced", "apoptosis", "by", "reducing", "BAX", "and", "cleaved", "caspase-3", "levels", "as", "well", "as", "and", "increasing", "Bcl-2", "levels", "[", "12", "]", ".", "Whether", "PCYT2", "downregulation", "induced", "PEtn", "accumulation", "contributes", "to", "HCC", "development", "further", "study.", "Increasing", "evidence", "suggests", "that", "PCYT2", "is", "aberrantly", "expressed", "in", "various", "models", "of", "liver", "disease", "and", "may", "predict", "clinical", "outcomes", "in", "patients.", "PCYT2", "is", "instrumental", "in", "the", "deregulation", "of", "these", "processes", "leading", "to", "the", "development", "of", "obesity", ",", "insulin", "resistance", ",", "liver", "steatosis", "and", "dyslipidemia", "[", "28", "]", ".", "CDP-Etn", "supplementation", "has", "been", "reported", "to", "alleviate", "PCYT2", "deficiency", "engendering", "age-dependent", "and", "insulin-resistant", "non-alcoholic", "steatohepatitis", "to", "improve", "patient", "prognosis", "[", "20,29–31", "]", ".", "Chronic", "administration", "of", "peroxisome", "proliferators", "can", "increase", "the", "content", "of", "hepatic", "PC", "and", "PE", "for", "hepatomegaly", "and", "proliferation", "as", "well", "as", "cause", "liver", "cancer", "in", "rodents", "[", "32,33", "]", ".", "Based", "on", "the", "current", "studies", ",", "we", "hypothesized", "that", "PCYT2", "may", "be", "involved", "in", "the", "regulation", "of", "cellular", "processes", "in", "HCC.", "Therefore", ",", "we", "utilized", "in", "vivo", "and", "in", "vitro", "validation", "methods", "to", "assess", "the", "expression", "and", "mechanistic", "roles", "of", "PCYT2", "in", "liver", "cancer", "cells.", "Herein", ",", "PCYT2", "overexpression", "was", "determined", "to", "inhibit", "HCC", "cell", "proliferation", ",", "migration", "and", "invasion", "both", "in", "vitro", "and", "in", "vivo.", "And", ",", "the", "number", "and", "morphology", "of", "mitochondria", "in", "HCC", "cells", "overexpressing", "PCYT2", "were", "significantly", "different", "from", "those", "in", "HCC", "cells", "without", "any", "treatment", ",", "such", "as", "a", "decrease", "in", "the", "number", "of", "mitochondria", "and", "swelling", "of", "the", "mitochondria.", "These", "changes", "suggest", "that", "PCYT2", "affects", "the", "mitochondrial", "function", "of", "cells.", "Notably", ",", "when", "the", "HepG2", "cells", "received", "CDP-Etn", "supplementation", ",", "their", "proliferation", ",", "migration", ",", "and", "invasion", "were", "inhibited", "in", "vitro.", "Notably", ",", "the", "ATP", "level", "decreased", "in", "HCC", "cells", "following", "the", "overexpression", "of", "PCYT2", ",", "and", "the", "cells", "were", "found", "to", "be", "accompanied", "by", "mitochondrial", "damage", "using", "transmission", "electron", "microscopy.", "However", ",", "previous", "reports", "have", "indicated", "that", "PCYT2", "is", "present", "only", "in", "the", "endoplasmic", "reticulum", "of", "hepatocytes", "[", "14,34", "]", ".", "Additionally", ",", "the", "phenotype", "of", "liver", "PCYT2-", "/", "-", "knockout", "mice", "showed", "no", "signs", "of", "liver", "injury", ",", "however", ",", "they", "experienced", "massive", "accumulation", "of", "liver", "triglycerides", "(", "TAG", ")", "[", "35", "]", ".", "Therefore", ",", "we", "hypothesized", "that", "the", "influence", "of", "PCYT2", "on", "mitochondrial", "function", "is", "mediated", "by", "metabolites", "such", "as", "TAG", ",", "DAG", ",", "and", "PE.", "However", ",", "further", "studies", "are", "needed", "to", "clarify", "whether", "the", "PCYT2", "exerted", "inhibition", "of", "HCC", "cells", "alleviates", "mitochondrial", "damage.", "As", "understanding", ",", "the", "mechanism", "whereby", "PCYT2", "overexpression", "causes", "mitochondrial", "damage", "will", "deepen", "our", "understanding", "of", "PCYT2", "regulation", "in", "HCC", "cells.", "In", "conclusion", ",", "this", "study", "provided", "compelling", "data", "demonstrating", "the", "aberrant", "expression", "and", "functional", "role", "of", "PCYT2", "in", "HepG2", "cells.", "PCYT2", "expression", "levels", "were", "lower", "in", "HepG2", "than", "in", "L02.", "Furthermore", ",", "PCYT2", "overexpression", "in", "HepG2", "cells", "induced", "mitochondrial", "damage", ";", "inhibited", "proliferation", ",", "invasion", ",", "and", "migration", ";", "and", "promoted", "cell", "apoptosis.", "Source", "paper", ":", "PMC12118871" ]	[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]
["Results","IFN-γ","significantly","induced","STAT1","phosphorylation",",","leading","to","a","time(...TRUNCATED)	["O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O"(...TRUNCATED)
["Materials","and","methods","Statistical","analysis","All","experiments","were","performed","at","l(...TRUNCATED)	["O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O"(...TRUNCATED)
["Introduction","The","introduction","of","antiretroviral","therapy","(","ART",")","has","successful(...TRUNCATED)	["O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O"(...TRUNCATED)
["Results","Dcas9-targeted","hiv-1","ltr-interactome","analysis","identified","prmt3","as","a","ltr-(...TRUNCATED)	["O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O"(...TRUNCATED)

[ "Introduction", "The", "persistence", "of", "replication-competent", ",", "but", "transcriptionally", "inhibited", "HIV-1", "proviral", "DNA", "in", "long-lived", ",", "latent", "cellular", "reservoirs", "is", "a", "significant", "barrier", "to", "the", "development", "of", "a", "functional", "cure", "[", "1,2", "]", "Even", "after", "long-term", ",", "suppressive", "antiretroviral", "therapy", "(", "ART", ")", ",", "spontaneous", "reactivation", "of", "proviral", "gene", "expression", "from", "the", "latent", "reservoir", "is", "sufficient", "to", "initiate", "viral", "rebound", "shortly", "after", "ART", "cessation", ",", "thus", "requiring", "life-long", "adherence", "[", "3–5", "]", ".", "Multifaceted", "and", "heterogenous", "blocks", "to", "viral", "gene", "expression", "establish", "and", "maintain", "HIV-1", "latency", "at", "the", "epigenetic", ",", "transcriptional", ",", "and", "post-transcriptional", "levels", "[", "2", "]", ".", "Several", "strategies", "to", "either", "reactivate", "latent", "proviruses", "and", "clear", "infected", "cells", "(", "i.e.", ",", "“shock", "and", "kill”", ")", "or", "reinforce", "latency", "to", "prevent", "spontaneous", "reactivation", "(", "i.e.", ",", "“block", "and", "lock”", ")", "are", "currently", "under", "investigation", "[", "6,7", "]", ".", "While", "many", "small", "molecule", "latency", "reversing", "agents", "(", "LRAs", ")", "have", "been", "described", "that", "reactivate", "latent", "proviruses", "ex", "vivo", ",", "they", "have", "had", "little", "success", "in", "clinical", "trials", "[", "8,9", "]", ".", "This", "failure", "is", "partly", "due", "to", "the", "latent", "reservoir’s", "heterogenous", "nature", ",", "such", "that", "treatment", "by", "a", "single", "agent", "that", "acts", "to", "target", "a", "specific", "block", "may", "only", "ever", "reactivate", "a", "small", "fraction", "of", "proviruses", "in", "vivo", "[", "10", "]", ".", "Even", "if", "transcriptional", "reactivation", "is", "achieved", ",", "it", "is", "unlikely", "this", "is", "sufficient", "to", "result", "in", "the", "clearance", "of", "these", "infected", "cells", "without", "additional", "immune", "augmentation", "such", "as", "the", "administration", "of", "antibodies", ",", "vaccines", ",", "or", "immunotherapies", "to", "prime", "the", "immune", "system", "[", "6", "]", ".", "Given", "these", "limitations", ",", "much", "research", "is", "now", "focused", "on", "combinatorial", "approaches", "to", "trigger", "more", "widespread", "and", "robust", "reactivation", "[", "11", "]", ".", "For", "example", ",", "a", "recent", "study", "reported", "synergistic", "reactivation", "potential", "between", "an", "activator", "of", "non-canonical", "NF-kB", "signaling", "(", "AZD5582", ")", "and", "BET", "bromodomain", "inhibitors", "that", "act", "to", "lift", "blocks", "to", "transcriptional", "initiation", "and", "elongation", ",", "respectively", "[", "12", "]", ".", "Blocks", "to", "transcriptional", "elongation", "are", "major", "contributors", "to", "establishing", "and", "maintaining", "HIV-1", "latency", "[", "13,14", "]", ".", "After", "integration", "of", "the", "proviral", "DNA", ",", "RNA", "Polymerase", "II", "(", "RNA", "Pol", "II", ")", "is", "recruited", "to", "the", "transcription", "start", "site", "by", "transcription", "factors", "that", "bind", "cis-elements", "in", "the", "HIV-1", "promoter", "region.", "After", "transcriptional", "initiation", ",", "RNA", "Pol", "II", "synthesizes", "20–60", "nucleotides", "before", "stalling", "through", "a", "well-conserved", "process", "known", "as", "promoter-proximal", "pausing", "[", "15", "]", ".", "Pausing", "is", "enforced", "by", "several", "negative", "elongation", "factors", ",", "including", "negative", "elongation", "factor", "(", "NELF", ")", ",", "DRB", "Sensitivity", "Inducing", "Factor", "(", "DSIF", ")", ",", "and", "the", "RNA", "Polymerase", "II", "Associated", "Factor", "1", "(", "PAF1", ")", "complex", "[", "16–18", "]", ".", "Pause", "release", "is", "regulated", "by", "positive", "transcription", "elongation", "factor-b", "(", "P-TEFb", ")", ",", "a", "heterodimeric", "protein", "complex", "composed", "of", "cyclin-dependent", "kinase", "9", "(", "CDK9", ")", "and", "cyclin", "T1", "(", "CCNT1", ")", "[", "19–21", "]", ".", "P-TEFb", "phosphorylates", "the", "C-terminal", "tail", "of", "RNA", "Pol", "II", "and", "several", "negative", "elongation", "factors", ",", "which", "collectively", "license", "transcriptional", "elongation", "[", "22–24", "]", ".", "Recruitment", "of", "P-TEFb", "to", "sites", "of", "nascent", "transcription", "is", "a", "highly", "regulated", "process", "mediated", "by", "several", "cellular", "complexes.", "The", "majority", "of", "cellular", "P-TEFb", "is", "sequestered", "in", "an", "inactive", "state", "by", "the", "7SK", "ribonucleoprotein", "(", "RNP", ")", "complex", "[", "25,26", "]", ".", "Diverse", "extracellular", "stimuli", "and", "intracellular", "signals", "can", "induce", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "the", "7SK", "complex", "[", "27–29", "]", "where", "it", "can", "be", "recruited", "to", "sites", "of", "nascent", "transcription", "by", "transcription", "factors", "(", "i.e.", ",", "NF-kB", "and", "c-MYC", ")", "[", "30–32", "]", ",", "epigenetic", "regulators", "(", "i.e.", ",", "BRD4", ")", "[", "33,34", "]", ",", "or", "super", "elongation", "complexes", "(", "SECs", ")", "composed", "of", "an", "ARF4", "/", "FMR2", "(", "AFF", ")", "family", "scaffold", "protein", "in", "complex", "with", "AF9", ",", "ENL", ",", "an", "eleven-nineteen", "Lys-rich", "leukemia", "(", "ELL", ")", "family", "protein", ",", "and", "an", "ELL-associated", "factor", "(", "EAF", ")", "protein", "[", "35", "]", ".", "To", "circumvent", "this", "regulatory", "step", ",", "HIV-1", "encodes", "a", "trans-activator", "protein", "(", "Tat", ")", "that", "binds", "to", "and", "recruits", "P-TEFb", "specifically", "to", "sites", "of", "nascent", "proviral", "transcription", "through", "recognition", "of", "a", "transactivation", "response", "(", "TAR", ")", "RNA", "stem", "loop", "produced", "at", "the", "immediate", "3’", "end", "of", "all", "viral", "RNA", "transcripts", "[", "36–38", "]", ".", "The", "distribution", "of", "and", "competition", "for", "P-TEFb", "binding", "among", "different", "complexes", "is", "an", "area", "of", "active", "investigation", ",", "with", "several", "strategies", "to", "enhance", "the", "biogenesis", "or", "availability", "of", "P-TEFb", "showing", "promise", "for", "HIV-1", "latency", "reversal.", "For", "example", ",", "BET", "bromodomain", "inhibitors", "(", "such", "as", "JQ1", ")", "have", "been", "shown", "to", "be", "potent", "LRAs", "in", "ex", "vivo", "models", "by", "releasing", "P-TEFb", "from", "BRD4", "[", "12", "]", ".", "Likewise", ",", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "the", "7SK", "RNP", "complex", "has", "been", "shown", "to", "reactivate", "latent", "proviruses", "in", "ex", "vivo", "models", "[", "39", "]", ".", "That", "being", "said", ",", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "the", "7SK", "RNP", "complex", "has", "been", "shown", "to", "directly", "correlate", "with", "increased", "BRD4", "binding", ",", "suggesting", "that", "release", "from", "any", "one", "complex", "will", "not", "necessarily", "increase", "the", "amount", "of", "unbound", "P-TEFb", "or", "the", "amount", "recruited", "to", "specific", "sites", "of", "transcription", "[", "33", "]", ".", "Furthermore", ",", "post-translational", "modification", "of", "P-TEFb", "(", "i.e.", ",", "through", "phosphorylation", "of", "CDK9", "at", "Serine", "175", ")", "has", "been", "shown", "to", "influence", "P-TEFb", "distribution", "in", "certain", "regulatory", "complexes", ",", "again", "highlighting", "the", "unique", "properties", "of", "release", "from", "each", "complex", "[", "40", "]", ".", "While", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "the", "7SK", "RNP", "complex", "and", "BET", "proteins", "such", "as", "BRD4", "have", "been", "explored", "as", "strategies", "for", "HIV-1", "latency", "reversal", ",", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "SECs", "has", "not", "been", "explored.", "Previous", "work", "has", "demonstrated", "that", "HIV-1", "Tat", "biochemically", "co-purifies", "with", "several", "SEC", "proteins", "[", "41,42", "]", ",", "though", "the", "reason", "for", "this", "is", "unclear", "as", "they", "seemingly", "have", "functionally", "redundant", "purposes", "in", "P-TEFb", "recruitment.", "In", "this", "study", ",", "we", "test", "the", "hypothesis", "that", "the", "SEC", "is", "not", "necessary", "for", "HIV-1", "viral", "transcription", "and", "that", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "cellular", "SEC", "complexes", "can", "serve", "as", "a", "novel", "strategy", "to", "reactivate", "latent", "HIV-1", "proviruses.", "Results", "Discussion", "In", "this", "study", ",", "we", "demonstrate", "a", "potential", "new", "strategy", "for", "enhancing", "HIV-1", "latency", "reversal", "through", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "the", "cellular", "pool", "of", "SECs.", "We", "show", "that", "KL-2", ",", "a", "small", "molecule", "inhibitor", "of", "the", "interaction", "between", "the", "SEC", "and", "P-TEFb", ",", "is", "sufficient", "to", "enhance", "viral", "transcription", "in", "primary", "CD4+", "T", "cells", "and", "can", "synergistically", "enhance", "the", "activity", "of", "other", "LRAs", "in", "certain", "cell", "line", "models", "of", "latency.", "Finally", ",", "we", "demonstrate", "that", "KL-2", "can", "increase", "HIV-1", "gag", "expression", "in", "PBMCs", "from", "PLWH", "on", "suppressive", "ART", ",", "most", "notably", "in", "combination", "with", "the", "non-canonical", "NF-kB", "agonist", ",", "AZD5582.", "We", "propose", "a", "model", "in", "which", "KL-2", "release", "of", "P-TEFb", "from", "the", "cellular", "pool", "of", "SECs", "enhances", "transcriptional", "elongation", "of", "integrated", "proviruses", ",", "akin", "to", "BET", "bromodomain", "inhibitors", "and", "7SK", "RNP", "inhibitors", "(", "Fig", "6D", ")", ".", "These", "results", "have", "several", "implications", "for", "our", "understanding", "of", "viral", "transcription", "and", "future", "directions.", "Latency", "reversal", "through", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "cellular", "SECs", "had", "not", "been", "previously", "explored", ",", "likely", "due", "to", "the", "perceived", "dependency", "of", "viral", "transcription", "on", "the", "SEC.", "This", "effect", "has", "been", "supported", "by", "biochemical", "purifications", "of", "HIV-1", "Tat", "from", "human", "cell", "lines", "that", "revealed", "interactions", "with", "a", "larger", "SEC", "[", "41,42", "]", ",", "as", "well", "as", "by", "genetic", "knock-down", "experiments", "in", "cell", "lines", "showing", "a", "decrease", "in", "Tat-dependent", "transcription", "upon", "SEC", "component", "depletion", "[", "64,65", "]", ".", "However", ",", "given", "that", "both", "the", "SEC", "and", "Tat", "recruit", "P-TEFb", "to", "sites", "of", "nascent", "transcription", ",", "they", "share", "some", "functional", "redundancy.", "We", "found", "that", "knock-out", "of", "SEC", "components", "from", "activated", ",", "primary", "CD4+", "T", "cells", "from", "12", "independent", "donors", "did", "not", "inhibit", "viral", "replication", ",", "suggesting", "that", "the", "SEC", "is", "not", "required", "in", "this", "cellular", "context.", "This", "result", "was", "independently", "verified", "using", "KL-2", ",", "which", "inhibits", "the", "interaction", "between", "CCNT1", "(", "P-TEFb", ")", "and", "AFF1", "/", "4", "(", "of", "the", "larger", "SEC", ")", ".", "Notably", ",", "disruption", "of", "the", "SEC", "using", "KL-2", "resulted", "in", "significant", "increases", "in", "HIV-1", "replication", "in", "primary", "CD4+", "T", "cells", "whereas", "genetic", "knockout", "of", "most", "SEC", "members", "had", "minimal", "to", "no", "impact", "on", "replication.", "One", "potential", "explanation", "for", "this", "difference", "is", "that", "genetic", "knockout", "results", "in", "the", "ablation", "of", "SEC", "assembly", "and", "relocalization", "of", "P-TEFb", "into", "other", "complexes", "at", "steady-state", "whereas", "chemical", "perturbation", "by", "KL-2", "results", "in", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "SECs", "that", "are", "continually", "being", "formed.", "Understanding", "the", "dynamics", "of", "P-TEFb", "distribution", "and", "relocalization", "upon", "different", "types", "of", "perturbation", "is", "an", "ongoing", "area", "of", "investigation.", "While", "we", "expected", "KL-2", "to", "enhance", "the", "transcriptional", "elongation", "of", "integrated", "proviruses", "due", "to", "the", "release", "of", "P-TEFb", "from", "cellular", "SECs", ",", "we", "also", "saw", "increases", "in", "transcriptional", "initiation", "as", "measured", "by", "qRT-PCR", "for", "TAR", "transcript", "levels.", "Likewise", ",", "in", "J-Lat", "5A8", "cells", ",", "we", "saw", "increases", "in", "transcriptional", "elongation", ",", "transcriptional", "initiation", ",", "and", "in", "RNA", "Pol", "II", "recruitment", "to", "the", "proviral", "promoter", "when", "KL-2", "was", "added", ",", "even", "though", "KL-2", "addition", "alone", "was", "not", "sufficient", "for", "reactivation", "as", "measured", "by", "GFP", "positivity", "in", "this", "model.", "This", "finding", "suggests", "that", "either", "KL-2", "has", "secondary", "effects", "not", "mediated", "by", "P-TEFb", "or", "that", "the", "redistribution", "of", "P-TEFb", "away", "from", "SECs", "has", "secondary", "effects", "that", "could", "impact", "transcriptional", "initiation", "at", "proviral", "integration", "sites.", "BET", "bromodomain", "inhibitors", "have", "also", "been", "reported", "to", "increase", "HIV-1", "transcriptional", "initiation", "[", "12,13", "]", ",", "though", "these", "effects", "have", "been", "suggested", "to", "occur", "through", "modulation", "of", "the", "epigenetic", "regulatory", "functions", "of", "these", "proteins", "[", "66", "]", ".", "Other", "reports", "have", "indicated", "that", "P-TEFb", "mediated", "release", "of", "paused", "RNA", "Pol", "II", "can", "result", "in", "enhanced", "transcriptional", "initiation", "and", "even", "RNA", "Pol", "II", "recruitment", "simply", "by", "increasing", "the", "number", "of", "transcribing", "polymerases", "[", "67", "]", ".", "Still", ",", "this", "connection", "between", "transcriptional", "elongation", "and", "initiation", "has", "yet", "to", "be", "fully", "understood", "in", "the", "context", "of", "HIV-1", "transcription.", "While", "KL-2", "was", "sufficient", "to", "boost", "viral", "replication", "in", "activated", ",", "primary", "CD4+", "T", "cells", ",", "in", "and", "of", "itself", "it", "displayed", "minimal", "reactivation", "potential", "in", "both", "cell", "line", "models", "of", "latency", "and", "in", "PBMCs", "from", "PLWH", "on", "suppressive", "ART.", "This", "finding", "is", "similar", "to", "our", "recent", "report", "of", "a", "novel", "inhibitor", "of", "the", "PAF1", "complex", "(", "iPAF1C", ")", "that", "had", "minimal", "activity", "on", "its", "own", ",", "but", "greatly", "enhanced", "the", "reactivation", "potential", "of", "other", "LRAs", "[", "16", "]", ".", "Both", "cases", "highlight", "the", "multifaceted", "nature", "of", "the", "blocks", "to", "viral", "gene", "expression", "that", "underlie", "the", "latent", "state", "as", "well", "as", "the", "limitations", "to", "single", "agent", "drug", "screening", "to", "identify", "promising", ",", "next-generation", "LRAs.", "Combinatorial", "approaches", "to", "dissect", "the", "genetic", "underpinnings", "of", "HIV-1", "latency", "and", "discover", "new", ",", "synergistic", "drug", "interactions", "should", "be", "prioritized.", "While", "KL-2", "alone", "failed", "to", "significantly", "increase", "HIV-1", "gag", "transcript", "levels", "in", "patient", "PBMCs", ",", "in", "combination", "with", "AZD5582", "it", "resulted", "in", "a", "16-fold", "increase", "over", "AZD5582", "treatment", "alone", "and", "a", "53-fold", "increase", "over", "the", "DMSO", "control.", "Crosswise", "dose", "titrations", "in", "J-Lat", "5A8", "cells", "showed", "a", "strong", "synergistic", "potential", "between", "AZD5582", "and", "KL-2.", "This", "is", "consistent", "with", "reports", "of", "robust", "synergy", "between", "AZD5582", "and", "P-TEFb", "release", "through", "BET", "bromodomain", "inhibition", "[", "12", "]", ".", "Notably", ",", "the", "BET", "bromodomain", "inhibitor", "JQ1", "showed", "minimal", "reactivation", "activity", "in", "our", "patient", "PBMCs", ",", "even", "in", "the", "presence", "of", "KL-2", ",", "in", "contrast", "to", "our", "cell", "line", "data.", "This", "finding", "could", "reflect", "stochastic", "differences", "driven", "by", "variations", "in", "patient", "characteristics", ",", "integration", "site", ",", "chromatin", "state", ",", "transcription", "factor", "availability", ",", "etc.", "[", "13", "]", ".", "Future", "work", "will", "compare", "P-TEFb", "release", "from", "SECs", "to", "release", "from", "other", "cellular", "reservoirs", ",", "such", "as", "BRD4", "or", "the", "7SK", "RNP.", "Recent", "studies", "have", "shown", "that", "post-translational", "modifications", "of", "P-TEFb", ",", "most", "notably", "phosphorylation", "of", "CDK9", "Serine", "175", "and", "Threonine", "186", ",", "can", "drive", "inclusion", "into", "different", "complexes", "and", "may", "strongly", "influence", "bioavailability", "and", "activity", "[", "40", ",", "68–70", "]", ".", "Therefore", ",", "it", "is", "possible", "that", "disruption", "of", "complexes", "housing", "‘active’", "P-TEFb", "is", "a", "more", "direct", "route", "to", "redirecting", "P-TEFb", "activity.", "This", "is", "not", "to", "say", "that", "the", "SEC", "is", "never", "required", "for", "viral", "transcription.", "In", "latency", "model", "cell", "lines", "that", "lacked", "a", "functional", "Tat", "(", "U1", "cells", ")", "or", "TAR", "stem", "loop", "(", "ACH-2", "cells", ")", ",", "KL-2", "inhibited", "the", "reactivation", "potential", "of", "several", "LRAs", ",", "suggesting", "that", "viral", "transcription", "may", "be", "more", "dependent", "on", "the", "SEC", "when", "Tat", "is", "either", "defective", "or", "not", "expressed.", "We", "attempted", "to", "test", "this", "by", "inhibiting", "Tat", "in", "the", "J-Lat", "5A8", "model", "cell", "line", "using", "two", "previously", "described", "Tat-dependent", "transcription", "inhibitors", ",", "Triptolide", "and", "Spironolactone.", "While", "both", "compounds", "reduced", "LRA", "efficacy", ",", "KL-2", "still", "boosted", "the", "activity", "of", "JQ1", "and", "PMA", ",", "but", "not", "AZD5582.", "This", "suggests", "that", "P-TEFb", "can", "be", "recruited", "to", "proviral", "integration", "sites", "in", "a", "Tat", "and", "SEC-independent", "manner", "upon", "PMA", "or", "JQ1", "treatment", ",", "potentially", "through", "a", "transcription", "factor", "such", "as", "NF-kB.", "The", "inability", "of", "AZD5582", "to", "do", "so", "suggests", "that", "non-canonical", "NF-kB", "activation", "does", "not", "recruit", "the", "same", "milieu", "of", "transcription", "factors", ",", "making", "it", "uniquely", "Tat", "or", "SEC", "dependent.", "This", "is", "consistent", "with", "the", "complete", "lack", "of", "activity", "of", "AZD5582", "in", "cell", "line", "models", "lacking", "functional", "Tat", "/", "TAR", "activity", "and", "may", "underlie", "the", "remarkable", "synergy", "between", "non-canonical", "NF-kB", "agonists", "and", "agents", "that", "release", "P-TEFb", "[", "12", "]", ".", "Additionally", ",", "triptolide", "has", "been", "characterized", "outside", "of", "HIV-1", "transcription", "in", "its", "ability", "to", "prevent", "RNA", "Pol", "II", "reinitiation", "following", "pausing", "through", "inhibition", "of", "xeoderma", "pigmentosum", "group", "B-complementing", "protein", "(", "XPB", ")", "and", "is", "often", "used", "as", "a", "tool", "compound", "for", "measuring", "the", "fate", "of", "paused", "RNA", "Pol", "II", "at", "different", "time", "points", "[", "51,71", "]", ".", "With", "this", "in", "mind", ",", "it", "is", "possible", "that", "compounds", "JQ1", "and", "PMA", "result", "in", "de", "novo", "recruitment", "of", "RNA", "Pol", "II", "thereby", "increasing", "transcriptional", "initiation", "whereas", "AZD5582", "may", "be", "more", "reliant", "on", "RNA", "Pol", "II", "pause-release.", "To", "further", "explore", "the", "Tat", "dependency", "of", "KL-2", ",", "we", "tried", "to", "rescue", "Tat", "function", "in", "the", "U1", "cell", "line", "using", "a", "Dox-inducible", "system.", "We", "hypothesized", "that", "by", "providing", "Tat", ",", "the", "SEC", "would", "no", "longer", "be", "required", "for", "viral", "gene", "expression", "such", "that", "SEC", "disruption", "by", "KL-2", "would", "enhance", "reactivation", "as", "seen", "in", "the", "J-Lat", "models.", "While", "Tat", "induction", "itself", "was", "sufficient", "for", "reactivation", ",", "this", "reactivation", "was", "completely", "abolished", "by", "the", "addition", "of", "KL-2.", "Even", "when", "Tat", "was", "minimally", "induced", "and", "other", "LRAs", "were", "added", ",", "KL-2", "still", "inhibited", "reactivation", ",", "suggesting", "that", "additional", "factors—such", "as", "steady-state", "levels", "of", "P-TEFb", ",", "integration", "site", ",", "epigenetic", "factors", ",", "or", "transcription", "factor", "availability—may", "drive", "SEC", "dependency", "besides", "just", "the", "presence", "or", "absence", "of", "Tat.", "Indeed", ",", "SEC", "disruption", "by", "KL-2", "in", "the", "original", "report", "of", "the", "inhibitor", "demonstrated", "an", "outsized", "impact", "on", "Myc-dependent", "transcription", "[", "32", "]", ",", "suggesting", "that", "additional", "factors", "driving", "the", "SEC", "dependency", "of", "proviral", "transcription", "have", "yet", "to", "be", "described.", "Regardless", ",", "the", "dual-acting", "nature", "of", "KL-2", "in", "enhancing", "latency", "reactivation", "in", "some", "circumstances", "(", "i.e.", ",", "if", "Tat", "is", "present", ")", "and", "inhibiting", "latency", "reactivation", "in", "others", "(", "i.e.", ",", "when", "the", "cell", "state", "dictates", "SEC", "dependency", ")", "presents", "a", "unique", "opportunity", "to", "leverage", "the", "heterogenous", "nature", "of", "the", "latent", "reservoir", "to", "both", "reverse", "and", "promote", "latency.", "Taken", "together", ",", "our", "results", "indicate", "that", "release", "of", "P-TEFb", "from", "cellular", "SECs", "is", "a", "novel", "mechanism", "for", "promoting", "HIV-1", "viral", "transcription", "during", "both", "active", "and", "latent", "infection.", "We", "demonstrated", "the", "enhancement", "of", "latency", "reversal", "in", "multiple", "latent", "cell", "line", "models", "and", "in", "primary", "PBMCs", "from", "PLWH", "on", "suppressive", "ART.", "This", "work", "demonstrates", "the", "importance", "of", "increasing", "the", "production", "or", "availability", "of", "free", "P-TEFb", "for", "recruitment", "to", "viral", "loci", "as", "a", "powerful", "strategy", "for", "bolstering", "current", "LRAs", ",", "most", "notably", "non-canonical", "NF-kB", "agonists.", "Due", "to", "the", "heterogeneity", "of", "blocks", "to", "viral", "replication", "in", "the", "latent", "reservoir", ",", "it", "is", "likely", "that", "combinatorial", "LRA", "treatments", "will", "be", "the", "best", "strategy", "for", "potent", "latency", "reversal", "moving", "forward.", "Further", "efforts", "are", "needed", "to", "understand", "the", "intracellular", "distribution", "of", "active", "P-TEFb", "to", "characterize", "the", "most", "critical", "reservoir", "to", "target", "to", "enhance", "transcription.", "Additionally", ",", "our", "work", "demonstrates", "that", "disruption", "of", "SECs", "could", "enhance", "latency", "reversal", "or", "promote", "the", "maintenance", "of", "latency", "depending", "on", "the", "cellular", "context.", "Understanding", "the", "mechanism", "that", "controls", "this", "molecular", "switch", "would", "aid", "in", "understanding", "whether", "SEC", "disruptors", "could", "be", "a", "viable", "dual-acting", "molecule", "to", "aid", "in", "finding", "a", "functional", "cure", "for", "HIV-1", "infection.", "Methods", "Flow", "cytometry", "and", "analysis", "of", "viability", "/", "infection", "/", "reactivation", "data", "Flow", "cytometry", "analysis", "was", "performed", "on", "an", "Attune", "NxT", "acoustic", "focusing", "cytometer", "(", "Thermo", "Fisher", "Scientific", ")", ",", "recording", "all", "events", "in", "a", "40-μL", "sample", "volume", "after", "one", "150", "μL", "of", "mixing", "cycle.", "Data", "were", "exported", "as", "FCS3.0", "files", "using", "Attune", "NxT", "Software", "v3.2.0", "and", "analyzed", "with", "a", "consistent", "template", "on", "FlowJo.", "Briefly", ",", "cells", "were", "gated", "for", "lymphocytes", "by", "light", "scatter", "followed", "by", "doublet", "discrimination", "in", "both", "side", "and", "forward", "scatter.", "Cells", "with", "equal", "fluorescence", "in", "the", "BL-1", "(", "GFP", ")", "channel", "and", "the", "VL-2", "(", "AmCyan", ")", "channel", "were", "identified", "as", "autofluorescent", "and", "excluded", "from", "the", "analysis.", "A", "consistent", "gate", "was", "then", "used", "to", "quantify", "the", "fraction", "of", "remaining", "cells", "that", "expressed", "the", "target", "of", "interest.", "Analysis", "of", "hiv-specific", "rna", "transcripts", "Following", "cDNA", "synthesis", ",", "viral", "transcripts", "were", "assessed", "by", "qRT-PCR", "as", "described", "previously", "[", "13", "]", ".", "For", "HIV-1", "TAR", ",", "the", "following", "primers", "were", "used", ":", "PF", ":", "5′-GTCTCTCTGGTTAGACCAG-3′", ";", "PR", ":", "5′-TGGGTTCCCTAGYTAGCC-3′", ";", "and", "probe", ":", "5′-AGCCTGGGAGCTC-3′.", "HIV-1", "Long", "LTR", "levels", "were", "assessed", "using", "the", "following", "primers", ":", "PF", ":", "5′-GCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3′", ";", "PR", ":", "5′-GGGCGCCACTGCTAGAGA-3′", ";", "and", "probe", ":", "5′-CCAGAGTCACACAACAGACGGGCACA-3.", "For", "expression", "level", "normalization", ",", "β-Actin", "was", "used", "(", "Thermo", "Fisher", "Scientific", ",", "catalog", "no.", "4331182", ")", ".", "Notably", ",", "β-Actin", "is", "an", "RNA", "Pol", "II", "controlled", "gene.", "To", "ensure", "that", "β-Actin", "levels", "were", "not", "being", "altered", "by", "KL-2", "induced", "SEC", "disruption", ",", "we", "compared", "β-Actin", "expression", "to", "that", "of", "the", "18S", "ribosomal", "subunit", ",", "an", "RNA", "Pol", "I", "controlled", "gene", "(", "Thermo", "Fisher", "Scientific", ",", "catalog", "no.", "4331182", ")", ".", "No", "statistically", "significant", "changes", "were", "noted", "between", "the", "two", "housekeeping", "genes", "upon", "KL-2", "treatment", ",", "so", "β-Actin", "was", "used", "as", "the", "normalization", "gene", "for", "subsequent", "qPCR", "analyses.", "The", "reaction", "was", "performed", "using", "TaqMan", "Fast", "Advanced", "Master", "Mix", "(", "Thermo", "Fisher", "Scientific", ",", "catalog", "no.", "4444553", ")", "according", "to", "manufacturer’s", "instructions.", "Briefly", ",", "10", "μL", "of", "reaction", "was", "mixed", "using", "5", "μL", "of", "Taqman", "Master", "Mix", ",", "0.5", "μL", "of", "20x", "primer", "probe", "mix", "(", "18", "μM", "of", "primers", "and", "5", "μM", "probe", ")", ",", "2.5", "μL", "water", ",", "and", "2", "μL", "of", "template", "cDNA.", "The", "PCR", "cycles", "were", "as", "follows", ":", "50", "°C", "for", "2", "minutes", ",", "95", "°C", "for", "20", "seconds", ",", "followed", "by", "40", "cycles", "of", "95", "°C", "for", "1", "second", "and", "60", "°C", "for", "20", "seconds.", "Rna", "sequencing", "analysis", "Sequencing", "data", "was", "demultiplexed", "and", "trimmed", "using", "Trimmomatic", "v0.36", "to", "remove", "adapters", "and", "low-quality", "reads.", "Trimmed", "reads", "were", "aligned", "to", "the", "Homo", "sapiens", "reference", "genome", "GRCh38", "and", "transcripts", "quantified", "using", "the", "Hisat2-StringTie", "pipeline", "[", "76", "]", ".", "Differential", "gene", "expression", "analysis", "of", "the", "quantified", "gene", "transcripts", "was", "performed", "with", "DESeq2", "v.1.42.0", "R", "package", "using", "R", "v.4.3.2.", "After", "retaining", "genes", "with", "nonzero", "total", "read", "count", "and", "with", "more", "than", "10", "reads", "in", "total", "between", "all", "samples", ",", "we", "fitted", "a", "model", "that", "included", "all", "treatments", "to", "account", "for", "overall", "variability", "and", "identified", "differentially", "expressed", "genes", "(", "DEGs", ")", "within", "that", "model", "between", "all", "tested", "conditions", "against", "DMSO-treated", "cells", "(", "i.e.", "KL2", "vs", "DMSO", ",", "AZD5582", "vs", "DMSO", ",", "and", "AZD5582+KL2", "vs", "DMSO", ")", ".", "To", "define", "DEGs", ",", "we", "used", "as", "cut-offs", "an", "absolute", "log2", "fold", "change", ">", "1", "and", "a", "false", "discovery", "rate", "(", "FDR", ")", "compareCluster", "function.", "For", "these", "analyses", "all", "genes", "whose", "gene", "symbols", "could", "be", "mapped", "to", "ENTREZ", "Ids", "using", "the", "org.Hs.eg.db", "v.3.18.0", "Bioconductor", "annotation", "package", "were", "included.", "Statistical", "analysis", "All", "statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "GraphPad", "Prism", "version", "10.2.0", "(", "392", ")", "for", "Windows", "64-bit", ",", "GraphPad", "Software", ",", "Boston", ",", "Massachusetts", ",", "USA", "(", "www.graphpad.com", ")", ".", "Source", "paper", ":", "PMC11419360" ]

[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]

[ "2.", "results", "3.", "discussion", "Müller", "glial", "cells", "play", "fundamental", "roles", "in", "retinal", "tissue", "functions.", "Therefore", ",", "studies", "into", "their", "biology", "and", "functions", "may", "contribute", "to", "understanding", "the", "causes", "of", "retinal", "pathologies", "and", "to", "develop", "strategies", "to", "alleviate", "their", "outcomes.", "The", "aim", "of", "this", "study", "was", "to", "investigate", "the", "impact", "of", "high", "glucose", "and", "glucose", "fluctuations", "on", "critical", "cellular", "processes", ",", "such", "as", "gliosis", "and", "reprogramming", "in", "Müller", "cells.", "These", "processes", "are", "of", "pivotal", "importance", "in", "the", "onset", "and", "progression", "of", "retinal", "neurodegeneration", "and", "diabetic", "retinopathy.", "In", "the", "present", "study", ",", "we", "observed", "a", "significant", "increase", "in", "GFAP", "expression", "in", "NG", "MIO-M1", "cells", "exposed", "to", "sustained", "high-glucose", "and", "GF", "treatments", ",", "indicating", "a", "glucose", "stress-induced", "gliotic", "response.", "This", "response", "was", "associated", "with", "other", "markers", "of", "reactive", "gliosis", ",", "such", "as", "the", "morphological", "changes", "associated", "with", "the", "transition", "from", "a", "bipolar", "to", "a", "radial", "morphology", "and", "the", "overexpression", "/", "reorganization", "of", "vimentin", "intermediate", "filament.", "These", "findings", "indicate", "that", "NG", "MIO-M1", "cells", "are", "sensitive", "to", "glucose", "changes", "in", "their", "surrounding", "environment", ",", "potentially", "functioning", "as", "a", "protective", "or", "reactive", "mechanism", "in", "response", "to", "metabolic", "stress.", "The", "remarkable", "sensitivity", "to", "glucose", "stress", "and", "the", "prompt", "reactive", "gliosis", "observed", "in", "MIO-M1", "cells", "were", "found", "to", "be", "similar", "to", "those", "observed", "in", "Müller", "cells", "of", "diabetic", "subjects", "[", "8", "]", ".", "This", "finding", "confirms", "the", "suitability", "of", "MIO-M1", "cells", "as", "an", "in", "vitro", "model", "to", "study", "Müller", "cell", "response.", "In", "contrast", ",", "HG", "MIO-M1", "cells", "maintain", "a", "basal", "high", "level", "of", "both", "GFAP", "and", "Vimentin", "together", "to", "less", "organized", "intermediate", "filaments", "across", "the", "different", "glucose", "treatments", ",", "suggesting", "a", "limited", "and", "static", "response", "to", "sustained", "high-glucose", "and", "GF", "treatments.", "These", "findings", "highlight", "that", "MIO-M1", "cells", "in", "chronic", "hyperglycemic", "conditions", "may", "adapt", "or", "develop", "enhanced", "tolerance", "over", "time", "due", "to", "constant", "and", "prolonged", "exposure", "to", "high", "glucose", "levels.", "The", "adaptation", "or", "desensitization", "of", "HG", "MIO-M1", "cells", "to", "sustained", "high-glucose", "and", "GFs", "may", "indicate", "a", "saturation", "of", "the", "gliotic", "response", ",", "which", "is", "characteristic", "of", "prolonged", "hyperglycemic", "states", ",", "as", "observed", "in", "uncontrolled", "diabetes", "[", "34", "]", ".", "This", "adaptation", "or", "desensitization", "may", "result", "in", "a", "reduction", "in", "the", "cellular", "capacity", "to", "respond", "to", "additional", "metabolic", "challenges", "or", "stress.", "To", "understand", "the", "clinical", "consequences", "of", "Müller", "cell", "gliosis", "it", "is", "essential", "to", "also", "consider", "the", "reprogramming", "process", ",", "which", "may", "include", "dedifferentiation", "of", "Müller", "cells", "and", "regeneration", "of", "various", "retinal", "neurons", ",", "contributing", "to", "retinal", "tissues", "repair", "under", "certain", "conditions.", "In", "species", "such", "as", "birds", "[", "35", "]", ",", "zebrafish", "[", "36,37", "]", ",", "and", "rodents", "[", "38", "]", ",", "Müller", "glia", "contribute", "as", "the", "primary", "source", "of", "retinal", "regeneration.", "When", "the", "retina", "is", "damaged", ",", "Müller", "glia", "can", "dedifferentiate", "into", "Müller", "glia-derived", "progenitor", "cells", "(", "MGPCs", ")", ",", "acquiring", "a", "progenitor-like", "phenotype", "and", "starting", "to", "proliferate", ",", "thus", "contributing", "to", "retinal", "repair", "[", "39,40", "]", ".", "Notably", ",", "Müller", "glia", "in", "lower", "vertebrates", "exhibit", "a", "remarkable", "ability", "to", "regenerate", "retinal", "neurons", ",", "contrasting", "with", "the", "limited", "regenerative", "capacity", "seen", "in", "mammals", ",", "including", "humans", "[", "40", "]", ",", "where", "Müller", "cells", "typically", "respond", "to", "injury", "with", "reactive", "gliosis", ",", "leading", "to", "scarring", "rather", "than", "regeneration", "[", "11,20", "]", ".", "The", "SHH", "signaling", "pathway", "is", "essential", "for", "the", "proper", "development", "of", "all", "vertebrate", "retinas", "[", "41,42,43,44,45,46,47", "]", ",", "and", "several", "studies", "have", "demonstrated", "the", "involvement", "of", "SHH", "signaling", "in", "the", "proliferation", "and", "differentiation", "of", "MGPCs", ",", "contributing", "to", "retinal", "regeneration", "in", "lower", "vertebrate", "[", "18,19,31,32,34", "]", ".", "However", ",", "in", "mammals", ",", "the", "SHH", "pathway", "alone", "may", "not", "be", "sufficient", "to", "overcome", "the", "intrinsic", "limitations", "of", "Müller", "cells", "to", "regenerate", "neuronal", "cells.", "In", "our", "study", ",", "we", "observed", "an", "increase", "in", "SHH", "expression", "in", "NG", "MIO-M1cells", "exposed", "to", "sustained", "high-glucose", "and", "GF", "treatments.", "This", "suggests", "that", "these", "cells", "are", "engaging", "in", "pathways", "associated", "with", "cellular", "dedifferentiation", "and", "potential", "reprogramming", "towards", "a", "progenitor", "state.", "The", "increased", "SHH", "protein", "expression", "in", "NG", "cells", "was", "accompanied", "by", "significant", "changes", "in", "the", "intracellular", "localization", "of", "SHH", ",", "exhibiting", "a", "more", "spotted", "/", "punctate", "pattern", "in", "the", "cytoplasm", "and", "in", "close", "proximity", "to", "the", "plasma", "membrane.", "These", "findings", "suggest", "an", "enhanced", "state", "of", "cellular", "activity", "with", "increased", "synthesis", "and", "potential", "accumulation", "of", "SHH", ",", "aligning", "with", "the", "findings", "in", "lower", "vertebrates", "and", "rodents", ",", "where", "increased", "SHH", "signaling", "plays", "a", "role", "in", "Müller", "cell", "reprogramming", "and", "retinal", "regeneration", "[", "18,48,49", "]", ".", "Furthermore", ",", "significantly", "higher", "levels", "of", "SHH", "were", "observed", "in", "HG", "MIO-M1", "cells", "compared", "to", "NG", "MIO-M1", "cells.", "Conversely", ",", "HG", "MIO-M1", "cells", "exposed", "to", "GF", "treatments", "showed", "a", "decrease", "in", "SHH", "protein", "expression", "levels.", "A", "trend", "toward", "a", "decrease", "was", "also", "observed", "in", "response", "to", "sustained", "high-glucose.", "This", "finding", "is", "consistent", "with", "a", "previous", "study", "in", "which", "the", "authors", "observed", "a", "decrease", "in", "SHH", "signaling", "in", "reactive", "astrocytes", "of", "the", "cerebral", "cortex", "after", "acute", ",", "focal", "injury", ",", "particularly", "in", "cells", "proximal", "to", "the", "lesion", "site", "[", "50", "]", ".", "This", "highlights", "that", "the", "negative", "regulation", "of", "SHH", "activity", "in", "astrocytes", "is", "context-dependent", "and", "varies", "with", "the", "degree", "of", "cellular", "damage.", "In", "our", "study", ",", "the", "decreased", "SHH", "levels", "observed", "in", "HG", "MIO-M1", "cells", "exposed", "to", "GFs", "indicate", "that", "the", "severity", "of", "metabolic", "stress", "may", "influence", "SHH", "signaling", "pathways", "through", "a", "similar", "mechanism.", "These", "observations", "underscore", "the", "notion", "that", "glial", "cells", ",", "including", "Müller", "cells", "and", "astrocytes", ",", "exhibit", "differential", "SHH", "responses", "depending", "on", "the", "extent", "of", "glucose", "stress", ",", "highlighting", "the", "dynamic", "regulation", "of", "SHH", "signaling", "in", "glial", "cells.", "Although", "the", "SHH", "level", "has", "decreased", ",", "the", "cells", "that", "express", "it", "maintain", "a", "dot-like", "distribution", "of", "SHH", "inside", "the", "cells.", "Our", "findings", "suggest", "that", ",", "under", "NG", "condition", ",", "exposure", "to", "sustained", "high-glucose", "and", "GFs", "stimulates", "SHH", "expression", ",", "potentially", "promoting", "the", "dedifferentiation", "and", "reprogramming", "of", "Müller", "cells.", "However", ",", "in", "HG-adapted", "cells", ",", "additional", "metabolic", "stress", "from", "GF", "treatments", "leads", "to", "decreased", "SHH", "expression", ",", "possibly", "impairing", "regenerative", "capacity", "and", "enhancing", "gliotic", "responses.", "These", "observations", "indicate", "that", "the", "severity", "and", "fluctuation", "of", "glucose", "stress", "influence", "SHH", "signaling", "pathways", ",", "affecting", "the", "balance", "between", "neuroprotection", "and", "gliosis", "in", "the", "retina.", "A", "previous", "study", "demonstrated", "that", "high-glucose", "conditions", "have", "been", "associated", "with", "increased", "SOX2", "levels", "in", "human", "Müller", "glial", "cells", ",", "which", "may", "support", "cell", "survival", "and", "regeneration", "under", "stress", "conditions", "[", "51", "]", ".", "In", "our", "experiments", ",", "SOX2", "was", "significantly", "upregulated", "in", "HG", "MIO-M1", "cells", ",", "compared", "to", "NG", "MIO-M1", "cells.", "Furthermore", ",", "NG", "MIO-M1", "cells", "have", "the", "capacity", "to", "modulate", "this", "gene", "when", "exposed", "to", "sustained", "high-glucose", "and", "GF", "treatments", ",", "exhibiting", "a", "consistent", "upregulation", "of", "SOX2.", "These", "findings", "are", "consistent", "with", "the", "observed", "upregulation", "of", "SHH", "in", "NG", "MIO-M1", "cells", "exposed", "to", "different", "glucose", "treatments.", "Unlike", "NG", "MIO-M1cells", ",", "HG", "MIO-M1", "cells", "exposed", "to", "the", "same", "glucose", "treatments", "do", "not", "show", "variations", "in", "SOX2", "expression.", "This", "different", "behavior", "of", "HG", "MIO-M1", "cells", ",", "with", "regards", "to", "SOX2", "and", "SHH", "expression", ",", "may", "be", "due", "to", "the", "different", "roles", "and", "regulatory", "mechanisms", "in", "the", "glial", "cells", "of", "these", "two", "genes.", "SOX2", "is", "a", "transcription", "factor", "crucial", "for", "maintaining", "stemness", "and", "promoting", "cell", "progenitor", "proliferation", ",", "and", "its", "upregulation", "could", "be", "a", "response", "to", "cellular", "stress", "in", "order", "to", "maintain", "or", "enhance", "regenerative", "capacity.", "In", "contrast", ",", "SHH", "signaling", ",", "which", "is", "involved", "in", "cell", "differentiation", "and", "tissue", "patterning", ",", "may", "be", "more", "sensitive", "to", "metabolic", "perturbations", "with", "a", "more", "dynamic", "regulation", ",", "which", "can", "lead", "to", "its", "downregulation", "under", "glucose", "fluctuations", "treatments.", "However", ",", "despite", "the", "observed", "upregulation", "of", "SHH", "and", "SOX2", "in", "NG", "MIO-M1", "cells", ",", "the", "expression", "of", "rhodopsin", ",", "a", "marker", "of", "mature", "neuronal", "cells", ",", "was", "not", "detected.", "This", "indicates", "that", ",", "although", "the", "cells", "possess", "the", "potential", "to", "differentiate", "into", "neuronal", "cells", ",", "the", "conditions", "employed", "in", "our", "protocol", "were", "not", "sufficient", "to", "fully", "induce", "this", "differentiation.", "The", "lack", "of", "mature", "neuronal", "marker", "expression", "is", "likely", "due", "to", "the", "timing", "and", "duration", "of", "the", "experimental", "conditions.", "It", "may", "therefore", "be", "worthwhile", "to", "optimize", "the", "protocol", "in", "order", "to", "more", "accurately", "reflect", "the", "diabetic", "conditions", "in", "humans", ",", "with", "a", "view", "to", "promoting", "full", "neuronal", "differentiation.", "Given", "the", "role", "of", "SHH", "in", "Müller", "cells", "reprogramming", "and", "the", "observed", "upregulation", "under", "sustained", "high-glucose", "and", "GF", "treatments", ",", "future", "experiments", "could", "investigate", "the", "effect", "of", "exogenous", "SHH", "treatment", "on", "human", "Müller", "cells.", "This", "approach", "would", "provide", "insights", "into", "the", "therapeutic", "potential", "of", "modulating", "SHH", "signaling", "to", "mitigate", "the", "adverse", "effects", "of", "reactive", "gliosis", "and", "enhance", "regenerative", "processes", "in", "the", "diabetic", "retina.", "Although", "the", "current", "study", "provides", "important", "insights", "into", "the", "gliotic", "and", "reprogramming", "potential", "of", "Müller", "cells", "under", "different", "glucose", "treatments", ",", "some", "limitations", "should", "be", "considered.", "The", "study", "employed", "the", "MIO-M1", "cell", "line", ",", "which", ",", "although", "well", "established", "in", "human", "retinal", "research", ",", "may", "not", "fully", "capture", "the", "physiological", "complexity", "of", "Müller", "cells", "found", "in", "human", "retina.", "Future", "research", "could", "benefit", "from", "using", "primary", "Müller", "cells", "to", "better", "reflect", "the", "in", "vivo", "context", "of", "human", "diabetic", "retinopathy.", "In", "addition", ",", "the", "effects", "of", "other", "stressors", ",", "such", "as", "oxidative", "stress", "or", "hypoxia", ",", "which", "also", "play", "a", "role", "in", "diabetic", "retinal", "damage", ",", "were", "not", "included", "in", "our", "model.", "Inclusion", "of", "these", "factors", "could", "provide", "a", "more", "comprehensive", "understanding", "of", "the", "cellular", "mechanisms", "involved.", "Despite", "these", "limitations", ",", "the", "current", "study", "contributes", "important", "insights", "into", "the", "gliotic", "and", "reprogramming", "potential", "of", "Müller", "cells", "under", "varying", "glucose", "conditions.", "4.", "materials", "and", "methods", "4.5.", "statistical", "analysis", "All", "the", "results", "are", "expressed", "as", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "standard", "error", "of", "the", "mean", ")", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments.", "Statistically", "significant", "differences", "were", "assessed", "using", "Prism", "6.05", "(", "GraphPad", "PRISM", "Software", ",", "Inc.", ",", "La", "Jolla", ",", "CA", ",", "USA", ")", "with", "Student’s", "t-test", "for", "statistical", "comparison", "between", "groups.", "Differences", "between", "means", "were", "considered", "statistically", "significant", "when", "p-values", "were", "at", "least", "***5.", "Conclusions***", "The", "results", "showed", "that", "MIO-M1", "Müller", "cells", "exhibit", "distinct", "responses", "to", "different", "glucose", "treatments", ",", "which", "are", "strongly", "dependent", "on", "their", "metabolic", "environment.", "This", "differential", "response", "could", "have", "implications", "for", "the", "onset", "and", "progression", "of", "diabetic", "retinopathy.", "The", "increased", "levels", "of", "activation", "and", "dedifferentiation", "markers", "observed", "in", "NG", "MIO-M1", "cells", "in", "response", "to", "different", "glucose", "treatments", "suggest", "a", "protective", "response", "that", "may", "occur", "in", "early", "or", "well-controlled", "diabetes.", "In", "contrast", ",", "the", "lack", "of", "response", "observed", "in", "HG", "MIO-M1", "cells", "exposed", "to", "different", "glucose", "treatments", "may", "reflect", "an", "exhausted", "gliotic", "and", "reprogramming", "capacity", ",", "which", "could", "contribute", "to", "the", "development", "and", "progression", "of", "diabetic", "complications", "such", "as", "retinal", "neurodegeneration", "and", "diabetic", "retinopathy", "observed", "in", "uncontrolled", "diabetic", "patients", "exposed", "to", "prolonged", "metabolic", "glucose", "stress.", "Although", "our", "results", "provide", "valuable", "insights", ",", "further", "in-depth", "studies", "are", "needed", "to", "elucidate", "the", "mechanisms", "involved", "and", "to", "explore", "the", "potential", "therapeutic", "implications", "for", "mitigating", "retinal", "neurodegeneration", "associated", "with", "diabetes.", "Extending", "these", "studies", "to", "primary", "Müller", "cells", "in", "future", "research", "would", "provide", "a", "more", "physiologically", "relevant", "system", ",", "helping", "to", "validate", "and", "refine", "our", "findings.", "This", "approach", "would", "provide", "a", "deeper", "understanding", "of", "the", "cellular", "response", "to", "sustained", "high-glucose", "and", "glucose", "fluctuations", "and", "could", "improve", "the", "development", "of", "targeted", "therapeutic", "strategies", "for", "retinal", "pathologies", "in", "human", "patients.", "Source", "paper", ":", "PMC11641291" ]

[ "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]

[ "Introduction", "Antiretroviral", "therapy", "(", "ART", ")", "has", "been", "highly", "effective", "at", "suppressing", "human", "immunodeficiency", "virus", "(", "HIV", ")", "replication", ",", "thus", "significantly", "reducing", "disease", "progression", "and", "mortality", "in", "infected", "individuals.", "However", ",", "ART", "is", "not", "curative", "and", "does", "not", "meaningfully", "impact", "persistent", "viral", "reservoirs", "(", "VRs", ")", "of", "latently", "infected", "cells", "that", "comprise", "CD4+", "T", "cells", "and", "myeloid", "cells.1,2,3", "Indeed", ",", "upon", "antiviral", "treatment", "interruption", "(", "ATI", ")", ",", "the", "virus", "quickly", "rebounds", "after", "several", "weeks", ",", "highlighting", "how", "the", "presence", "of", "VRs", "obviates", "an", "HIV", "cure.4,5,6", "Therefore", ",", "eliminating", "or", "controlling", "VRs", "remains", "an", "unwavering", "priority", "for", "HIV", "cure", "research.", "In", "this", "context", ",", "the", "aim", "of", "the", "“shock-and-kill”", "strategy", "is", "to", "reactivate", "latently", "infected", "cells", "with", "latency", "reversal", "agents", "(", "LRAs", ")", "and", "render", "them", "vulnerable", "to", "cell", "death", "or", "clearance", "by", "the", "immune", "system.7,8", "Previously", "reported", "approaches", "to", "HIV", "reactivation", ",", "including", "protein", "kinase", "C", "(", "PRKC", ")", "agonists", ",", "histone", "deacetylase", "(", "HDAC", ")", "inhibitors", "(", "HDACi", ")", ",", "and", "toll-like", "receptor", "(", "TLR", ")", "agonists,9", "have", "been", "highly", "effective", "in", "in", "vitro", "models", "of", "latency", ",", "but", "their", "efficacy", "is", "only", "moderate", "when", "tested", "in", "vivo.10,11,12,13", "Moreover", ",", "by", "broadly", "activating", "cellular", "pathways", ",", "these", "compounds", "elicit", "significant", "proinflammatory", "effects", "or", "alter", "the", "function", "and", "fate", "of", "specific", "immune", "effector", "cells,14,15", "hence", "limiting", "their", "use", "in", "clinical", "settings.16,17,18,19", "Similarly", ",", "promising", "candidates", "such", "as", "bryostatin-1", "and", "analogs", ",", "phorbol", "esters", ",", "and", "phosphatidylethanolamine", "binding", "protein", "1", "(", "PEBP1", ")", "agonists", "reactivate", "HIV", "via", "activation", "of", "the", "canonical", "nuclear", "factor", "kappa", "B", "(", "NFKB", ")", "pathway,13,20", "inadvertently", "leading", "to", "uncontrolled", "cytokine", "release", "and", "overt", "T", "cell", "activation.21,22", "Consequently", ",", "there", "is", "a", "need", "to", "develop", "alternative", "approach", "(", "es", ")", "that", "can", "reactivate", "latent", "reservoirs", "and", "eliminate", "infected", "cells", "without", "triggering", "systemic", "activation", ",", "inflammation", ",", "or", "impairment", "of", "immune", "clearance", "mechanisms.", "In", "this", "regard", ",", "small", "molecules", "known", "as", "mimetics", "of", "the", "second", "mitochondrial", "activator", "of", "caspases", "(", "SMAC", "mimetics", "[", "SMs", "]", ")", "were", "originally", "developed", "as", "cancer", "therapeutics.", "They", "have", "received", "increasing", "recognition", "because", "they", "specifically", "activate", "the", "non-canonical", "NFKB", "pathway,23,24,25", "which", "naturally", "exhibits", "higher", "functional", "selectivity", "and", "more", "confined", "proinflammatory", "effects", "compared", "to", "the", "canonical", "NFKB", "pathway.24,26", "Engagement", "of", "the", "non-canonical", "NFKB", "pathway", "by", "SMAC", "leads", "to", "degradation", "of", "cellular", "inhibitor", "of", "apoptosis", "(", "cIAP", ")", ",", "accumulation", "of", "NFKB-inducing", "kinase", "(", "NIK", ")", ",", "and", "activation", "of", "component", "of", "inhibitor", "of", "NFKB", "kinase", "complex", "(", "CHUK", ")", "homodimer", ",", "culminating", "in", "cleavage", "of", "inactive", "NFKB2", "p100", "to", "active", "p52.26", "An", "association", "between", "RELB", "and", "p52", "induces", "expression", "of", "target", "genes27", "and", ",", "in", "the", "context", "of", "HIV", ",", "the", "pathway", "reactivates", "latently", "infected", "VRs.20", "The", "non-canonical", "NFKB", "pathway", "can", "also", "be", "triggered", "by", "signaling", "intermediates", "of", "the", "apoptosis", "cascade.", "In", "fact", ",", "cleavage", "of", "SMAC", "/", "DIABLO", "exposes", "the", "N-terminal", "motif", "Ala-Val-Pro-Ile", ",", "which", "binds", "specifically", "to", "baculovirus", "intermediate", "repeat", "domains", "2", "and", "3", "of", "IAP", "proteins.", "These", "proteins", "in", "turn", "trigger", "downstream", "events", "that", "ultimately", "lead", "to", "degradation", "of", "baculoviral", "IAP", "repeat", "containing", "2", "(", "BIRC2", ",", "also", "known", "as", "cIAP1", ")", "and", "baculoviral", "IAP", "repeat", "containing", "3", "(", "BIRC3", ",", "also", "known", "as", "cIAP2", ")", "28", "and", "potentiation", "of", "apoptosis.29", "The", "unique", "ability", "of", "SMAC", "to", "degrade", "IAPs", "and", "activate", "apoptosis", "pathway", "(", "s", ")", "makes", "SMs", "interesting", "candidates", "in", "the", "field", "of", "HIV", "cure", "research30,31", "because", "latently", "infected", "CD4+", "T", "cells", "display", "aberrant", "expression", "of", "cell", "survival", "factors", ",", "including", "XIAP", ",", "BIRC2", "and", "BCL2.8,32", "Pharmacological", "activation", "of", "the", "non-canonical", "NFKB", "pathway", "by", "SMs", "was", "recently", "found", "to", "induce", "on-ART", "plasma", "viremia", "in", "animal", "models", "of", "HIV", "latency,24,25", "underscoring", "the", "potential", "of", "this", "class", "of", "molecules", "as", "LRAs.", "However", ",", "it", "remains", "unclear", "whether", "induction", "of", "HIV", "expression", "by", "SMs", "leads", "to", "a", "reduction", "of", "VRs", "in", "lymphoid", "and", "non-lymphoid", "tissues", "of", "animal", "models.", "In", "this", "study", ",", "we", "show", "that", "bivalent", "APG-1387", ",", "currently", "in", "clinical", "development", "in", "the", "oncology", "field", ",", "activates", "the", "non-canonical", "NFKB", "pathway", "and", "hence", ",", "is", "a", "potent", "LRA.", "By", "degrading", "IAPs", ",", "this", "compound", "also", "induces", "the", "expression", "of", "active", "caspase", "3", "(", "CASP3", ")", ",", "a", "key", "component", "of", "the", "execution", "phase", "of", "apoptosis", ",", "in", "latently", "infected", "cells.", "Likewise", ",", "in", "primary", "CD4+", "T", "cells", "infected", "with", "a", "dual", "reporter-encoded", "HIV", ",", "APG-1387", "reduces", "the", "level", "of", "latent", "cells", "without", "notably", "affecting", "the", "productively", "infected", "pool.", "Accordingly", ",", "in", "vivo", "treatment", "with", "APG-1387", "could", "reactivate", "expression", "of", "latent", "viruses", "and", "was", "found", "to", "meaningfully", "reduce", "the", "integrated", "HIV-DNA", "level", "in", "tissues", "of", "ART-suppressed", "humanized", "bone", "marrow", "liver", "thymus", "(", "BLT", ")", "mice", ",", "without", "assessable", "immunotoxicity.", "Upon", "ART", "interruption", ",", "APG-1387-treated", "mice", "rebounded", "more", "slowly", "and", "to", "a", "lower", "set", "point.", "Overall", ",", "the", "study", "demonstrates", "that", "APG-1387", "has", "the", "capacity", "to", "not", "only", "reverse", "HIV", "latency", "but", "also", "potentiate", "cell", "apoptosis", ",", "thus", "supporting", "the", "notion", "that", "bivalent", "SMs", "could", "be", "harnessed", "to", "reduce", "VRs", "without", "causing", "generalized", "T", "cell", "activation.", "Results", "Discussion", "Several", "LRAs", "have", "shown", "their", "biological", "activity", "both", "in", "vitro", "and", "in", "vivo", "but", "are", "clinically", "unsafe", "for", "further", "evaluations.46,47", "The", "most", "potent", "LRAs", ",", "including", "HDACi", "and", "protein", "kinase", "C", "(", "PRKC", ")", "agonist", "bryostatin-1", ",", "activate", "the", "canonical", "NFKB", "pathway,46", "causing", "explicit", "T", "cell", "activation", "and", "broad", "cytotoxicity", ",", "and", "hence", "eliciting", "significant", "collateral", "damage", "on", "host", "cells.", "Reactivation", "of", "latent", "HIV", "by", "PRKC", "agonists", "has", "recently", "been", "demonstrated", "to", "induce", "resistance", "to", "apoptosis", ",", "a", "phenomenon", "often", "associated", "with", "phosphorylation", "and", "activation", "of", "the", "antiapoptotic", "protein", "BCL2.48", "Thus", ",", "the", "failure", "of", "common", "LRAs", "such", "as", "PRKC", "agonists", "and", "HDACi", "to", "safely", "purge", "HIV", "and", "effectively", "reduce", "VRs", "in", "people", "living", "with", "HIV", "necessitates", "the", "development", "of", "clinical", "approaches", "to", "achieve", "an", "HIV", "cure.", "In", "this", "study", ",", "we", "demonstrate", "that", "APG-1387", ",", "a", "bivalent", "SM", "initially", "developed", "as", "a", "cancer", "therapy", ",", "can", "efficiently", "reactivate", "HIV", "in", "CD4+", "T", "cell", "line", "models", "of", "HIV-1", "latency", "via", "a", "process", "that", "involves", "activation", "of", "the", "noncanonical", "NFKB", "pathway.", "Although", "this", "IAP", "antagonist", "modestly", "increases", "HIV", "RNA", "detection", "in", "virally", "suppressed", "hu-mice", ",", "it", "has", "the", "capability", "to", "reduce", "both", "the", "frequency", "of", "latently", "infected", "cells", "and", "the", "level", "of", "viral", "rebound", "upon", "ART", "treatment", "interruption.", "Indeed", ",", "APG-1387", "treatment", "enhances", "the", "expression", "of", "caspase-3", ",", "a", "marker", "of", "apoptosis", ",", "in", "latently", "infected", "cells", "from", "T", "cell", "lines", "or", "in", "T", "cells", "from", "certain", "tissues", "of", "virally", "suppressed", "hu-mice.", "In", "the", "context", "of", "productive", "infection", ",", "in", "vitro", "stimulation", "with", "APG-1387", "also", "enhanced", "cleavage", "of", "CASP3.", "IAPs", "are", "overly", "expressed", "in", "various", "cancers", ",", "enabling", "prolonged", "survival", "of", "cancerous", "cells", "[", "as", "reviewed", "by49", "]", ".", "Consequently", ",", "their", "antagonists", "are", "thought", "to", "either", "directly", "induce", "or", "sensitize", "cancerous", "cells", "to", "death", "by", "triggering", "proapoptotic", "pathways.50,51", "Interestingly", ",", "IAPs", "such", "as", "BIRC2", "have", "recently", "been", "shown", "to", "be", "negative", "regulators", "of", "HIV", "transcription", ",", "and", "their", "expression", "is", "found", "to", "be", "correlated", "with", "viral", "latency.23,31,32", "Indeed", ",", "both", "BIRC2", "/", "3", "and", "XIAP", "are", "overexpressed", "in", "HIV", "latently", "infected", "CD4+", "T", "and", "myeloid", "cells", ",", "and", "the", "SMs", "which", "induce", "the", "degradation", "of", "these", "IAPs", "can", "reactivate", "HIV.", "We", "demonstrate", "herein", "that", "various", "monovalent", "and", "bivalent", "SMs", "can", "induce", "efficient", "viral", "reactivation", "in", "different", "T", "cell", "models", "of", "latency", "and", "that", "some", "are", "more", "potent", "than", "others.", "Bivalent", "SMs", "are", "more", "effective", "than", "their", "monovalent", "counterparts", ",", "probably", "because", "of", "the", "presence", "of", "dimers", "that", "may", "contribute", "to", "a", "more", "stable", "and", "enhanced", "activation", "via", "interactions", "with", "the", "two", "adjacent", "binding", "domains", "of", "IAPs.52", "Among", "the", "bivalent", "SMs", "we", "examined", ",", "APG-1387", "is", "most", "effective", "at", "degrading", "IAPs", ",", "facilitating", "a", "conversion", "of", "NFKB", "p100", "to", "p52", ",", "and", "reactivating", "HIV", "expression", "through", "an", "NIK-dependent", "process", ",", "a", "hallmark", "of", "an", "activated", "non-canonical", "NFKB", "pathway.23,24", "In", "CD4+", "T", "cell", "models", "of", "HIV", "latency", ",", "APG-1387", "treatment", "is", "associated", "with", "remarkable", "viral", "reactivation.", "However", ",", "in", "primary", "CD4+", "T", "cells", "infected", "with", "HI.fate.E", "dual", "reporter", "virus", ",", "exposure", "to", "APG-1387", "is", "accompanied", "by", "a", "reduction", "in", "the", "frequency", "of", "latently", "infected", "cells", "(", "Figure", "2", ")", "without", "a", "detectable", "change", "in", "the", "level", "of", "cells", "supporting", "LTR-directed", "transcription.", "The", "data", "suggest", "that", "the", "latent", "cells", "might", "be", "preferentially", "targeted", "for", "elimination", "without", "reactivation", "in", "contrast", "to", "PMA", "and", "ionomycin", "stimulation.", "This", "said", ",", "given", "the", "intrinsic", "properties", "of", "SMs", ",", "we", "can", "not", "completely", "exclude", "the", "possibility", "that", "there", "was", "no", "change", "in", "the", "frequency", "of", "reactivated", "cells", "because", "latently", "infected", "cells", "rapidly", "die", "after", "reactivation.", "Consistent", "with", "previous", "works", "with", "other", "SMs", "including", "AZD5582", "24", "and", "ciapavir,25", "APG-1387", "induces", "detection", "of", "viremia", ",", "albeit", "modestly", ",", "in", "ART-suppressed", "hu-mice", "as", "early", "as", "48", "h", "after", "treatment.", "Importantly", ",", "in", "mice", "treated", "with", "multiple", "doses", "of", "APG-1387", ",", "the", "proportion", "of", "cells", "carrying", "the", "integrated", "HIV", "DNA", "was", "meaningfully", "reduced", ",", "suggesting", "that", "the", "bivalent", "APG-1387", "might", "preferentially", "target", "latently", "infected", "cells", "directly", "or", "indirectly", "for", "death", "(", "Figure", "4", ")", ".", "In", "addition", ",", "in", "APG-1387-treated", "mice", "the", "fact", "that", "the", "viral", "rebound", "was", "consistently", "lower", "throughout", "the", "ATI", "and", "plateaued", "at", "a", "level", "below", "pre-ART", "further", "strengthens", "the", "notion", "that", "APG-1387", "impacts", "negatively", "the", "pool", "of", "VRs", "(", "Figure", "6", ")", ".", "It", "is", "conceivable", "that", "such", "an", "impact", "is", "significant", "considering", "the", "modest", "effect", "of", "APG-1387", "on", "latency", "reversal", "in", "this", "experimental", "condition", "and", "the", "limited", "functional", "immune", "clearance", "mechanisms", "present", "in", "hu-BLT", "mice.", "This", "said", ",", "further", "experimentation", "with", "a", "larger", "group", "of", "animals", "analyzed", "at", "endpoint", "is", "needed", "to", "confirm", "the", "modulatory", "role", "of", "APG-1387", "on", "VRs.", "A", "more", "detailed", "analysis", "gauging", "the", "effect", "of", "APG-1387", "on", "different", "CD4+", "T", "cell", "subsets", "revealed", "a", "potential", "modulation", "of", "splenic", "Th17-like", "cells", "and", "FOXP3-expressing", "CD4+", "T", "cells.", "We", "observe", "a", "trend", "toward", "a", "reduction", "in", "Th17-cell", "frequency", "in", "both", "ART-suppressed", "mice", "treated", "in", "vivo", "with", "APG-1387", "and", "in", "ART-naïve", "infected", "mice", "whose", "splenocytes", "were", "stimulated", "ex", "vivo", "with", "APG-1387", "(", "Figure", "5", ")", ".", "Since", "Th17", "cells", "have", "been", "proposed", "to", "be", "an", "important", "source", "of", "HIV", "latent", "reservoirs", "[", "reviewed", "in53", "]", ",", "a", "decrease", "in", "Th17", "cells", "might", "suggest", "a", "reduction", "in", "the", "level", "of", "integrated", "HIV", "DNA-harboring", "cells", ",", "an", "observation", "that", "was", "made", "with", "APG-1387", "treated", "mice", "(", "Figure", "4", ")", ".", "Regarding", "FOXP3-expressing", "CD4+", "T", "cells", "in", "the", "spleen", ",", "there", "was", "no", "significant", "difference", "between", "ART-suppressed", "mice", "treated", "with", "APG-1387", "or", "with", "the", "vehicle", "control.", "However", ",", "ex", "vivo", "stimulation", "of", "splenocytes", "from", "ART-naïve", ",", "HIV-infected", "mice", "with", "APG-1387", "modestly", "decreased", "the", "number", "of", "p24-expressing", "FOXP3+", "CD4+", "T", "cells", ",", "although", "the", "difference", "was", "not", "statistically", "significant.", "Whether", "the", "non-canonical", "NFKB", "pathway", "is", "more", "functional", "in", "certain", "memory", "CD4+", "T", "cell", "subsets", "remains", "to", "be", "fully", "elucidated.", "The", "fact", "that", "the", "central", "memory", "subset", "has", "been", "shown", "to", "require", "strong", "TCR-mediated", "signaling", "for", "maintenance", "suggests", "a", "more", "important", "role", "of", "the", "canonical", "NFKB", "pathway", "in", "this", "context", "[", "reviewed", "in26,54,55", "]", ".", "Taken", "together", ",", "these", "results", "highlight", "the", "importance", "of", "evaluating", "the", "potential", "effects", "of", "SMs", "on", "various", "immune", "subsets", "known", "to", "be", "susceptible", "to", "HIV.", "Our", "study", "shows", "that", "APG-1387", "has", "the", "capability", "to", "reactivate", "HIV", ",", "activate", "markers", "of", "apoptosis", "in", "latently", "infected", "cells", ",", "and", "reduce", "VRs", "without", "causing", "global", "T", "cell", "activation.", "However", ",", "the", "findings", "also", "underscore", "the", "need", "to", "combine", "bivalent", "SMs", "with", "other", "therapeutics", "to", "improve", "the", "reactivation", "and", "elimination", "of", "VRs.", "Indeed", ",", "recent", "findings", "have", "shown", "that", "combined", "panobinostat", "and", "pegylated", "interferon", "alpha", "2", "can", "transform", "the", "VR", "landscape", "through", "latency", "reversal", "and", "innate", "immune", "activation.56", "Star★methods", "Experimental", "model", "and", "study", "participant", "details", "Experimental", "design", "No", "randomization", "and", "/", "or", "stratification", "was", "performed.", "Hu-mice", "with", "variable", "levels", "of", "human", "CD45+", "cells", "were", "equally", "distributed", "among", "experimental", "groups.", "All", "efforts", "were", "made", "to", "have", "equal", "or", "comparable", "number", "of", "mice", "or", "samples", "(", "i.e.", ",", "number", "of", "n", ")", "per", "experimental", "group", "or", "condition.", "The", "exact", "number", "of", "n", "was", "provided", "in", "relevant", "Figure", "legends.", "Experimenters", "were", "blinded", "during", "processing", "biological", "samples", ",", "conducting", "experiments", "and", "analyzing", "samples", "in", "different", "assays.", "No", "inclusion", "or", "exclusion", "criteria", "were", "applied", "to", "the", "study.", "No", "statistical", "methods", "were", "used", "to", "pre-determine", "strategies", "for", "randomization", "and", "/", "or", "stratification", ",", "population", "size", ",", "inclusion", "and", "exclusion", "of", "any", "data", "or", "subjects", ",", "or", "whether", "the", "data", "met", "assumptions", "of", "the", "statistical", "approach.", "Pharmacological", "and", "toxicity", "analysis", "Hu-BLT", "mice", "were", "left", "untreated", "or", "treated", "via", "intraperitoneal", "route", "(", "IP", ")", "with", "either", "vehicle-", "(", "10", "%", "sterile", "Cremophor", "dissolved", "in", "5", "%", "polyethylene", "glycol-400", "and", "85", "%", "PBS", ")", "or", "20", "mg", "/", "kg", "(", "100", "APG-1387", "(", "Ascentage", "Pharma", ",", "China", ")", "every", "third", "day", "(", "maximum", "100", "μL", "injection", "volume", ")", "for", "up", "to", "4", "weeks.", "Plasma", "was", "collected", "at", "different", "intervals", "and", "white", "blood", "cells", "isolated", "by", "treating", "whole", "blood", "with", "red", "blood", "cell", "lysis", "buffer", "(", "Invitrogen", ",", "U.S.A", ")", ".", "Cells", "from", "blood", "and", "tissues", "were", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", "as", "described", "in", "Section", "‘flow", "cytometry’", "below", "for", "the", "effect", "of", "APG-1387", "on", "cell", "proliferation", "and", "activation.", "Proinflammatory", "cytokines", "were", "evaluated", "in", "plasma", "of", "healthy", "untreated", ",", "APG-1387-", "and", "vehicle-treated", "hu-BLT", "mice", "using", "Legend", "Max", "enzyme-linked", "immunosorbent", "assay", "(", "ELISA", ")", "kits", "for", "human", "TNF", "and", "IL6", "(", "both", "from", "BioLegend", ",", "U.S.A", ")", "as", "per", "the", "manufacturer’s", "protocol.", "Data", "analysis", "was", "performed", "using", "GraphPad", "Prism", "software", "(", "Version", "8.0", ")", ".", "Quantification", "and", "statistical", "analysis", "Flow", "cytometry", "data", "were", "analyzed", "using", "FlowJo", "(", "Versions", "9.9.3", "and", "10.1", ")", ".", "Quantification", "of", "Western", "blots", "was", "performed", "using", "ImageJ", "software.", "Data", "analysis", "and", "presentation", "was", "done", "using", "GraphPad", "Prism", "(", "Version", "8.0", ")", ".", "Experimenters", "were", "blinded", "during", "data", "analysis", "of", "samples.", "Descriptive", "measures", "(", "mean", ",", "median", ",", "minimum", "/", "maximum", "range", ",", "95", "%", "confidence", "intervals", ",", "and", "percent", ")", "were", "used", "to", "summarize", "the", "data", "and", "illustrate", "in", "graphical", "presentations.", "All", "statistical", "analysis", "was", "done", "using", "GraphPad", "Prism", "(", "Version", "8.0", ")", ".", "Nonparametric", "(", "unpaired", ")", "Mann-Whitney’s", "U-test", "(", "two-tailed", ")", "was", "conducted", "to", "compare", "ranks", "between", "two", "experimental", "groups", "(", "e.g.", ",", "treated", "with", "vehicle", "or", "with", "APG-1387", ")", ".", "Nonparametric", "(", "paired", ")", "Wilcoxon", "test", "was", "performed", "to", "compare", "the", "ranks", "of", "two", "matched", "samples", "(", "e.g.", ",", "before", "and", "after", "treatment", "with", "APG-1387", ")", ".", "When", "comparing", "multiple", "groups", ",", "non-parametric", "tests", "Kruskal-Wallis", "or", "Friedman", "were", "performed", "and", "followed", "by", "Dunn’s", "multiple", "comparison", "test", "(", "e.g.", ",", "vehicle-treated", "group", "compared", "to", "those", "treated", "with", "different", "concentrations", "of", "APG-1387", "or", "combined", "PMA", "and", "ionomycin", ";", "effect", "of", "APG-1387", "on", "viral", "rebound", "at", "different", "time", "points", "post", "treatment", "interruption", ")", ".", "A", "p", "value", "of", "less", "than", "0.05", "was", "considered", "statistically", "significant.", "ns", ",", "∗", ",", "∗∗", ",", "∗∗∗", ",", "signify", "not", "significant", ",", "Figure", "2", ",", "the", "exact", "p", "values", "were", "∗p", "=", "0.026", ",", "∗∗p", "=", "0.007", ",", "∗∗∗p", "=", "0.0004.", "In", "the", "two-tailed", "Mann-Whitney", "unpaired", "rank", "test", "shown", "in", "Figure", "3", ",", "the", "∗p", "value", "was", "0.0286", "while", "in", "Figure", "4", ",", "the", "p", "values", "were", "as", "follows", ":", "∗p", "=", "0.0317", "and", "∗∗p", "=", "0.0043.", "For", "Figure", "S6", ",", "the", "∗p", "value", "was", "No", "statistical", "methods", "were", "used", "to", "pre-determine", "strategies", "for", "randomization", "and", "/", "or", "stratification", ",", "population", "size", ",", "inclusion", "and", "exclusion", "of", "any", "data", "or", "subjects", ",", "or", "whether", "the", "data", "met", "assumptions", "of", "the", "statistical", "approach.", "All", "software", "used", "in", "data", "analysis", "along", "with", "statistical", "parameters", "were", "mentioned", "in", "the", "appropriate", "Figure", "legends.", "Details", "about", "the", "statistical", "tests", ",", "exact", "values", "of", "n", "and", "definitions", "of", "the", "n", "were", "as", "indicated", "in", "the", "legend", "for", "each", "relevant", "Figure.", "When", "applicable", ",", "definition", "of", "asterisks", "and", "descriptive", "measures", "were", "indicated", "in", "the", "Figure", "legends", "or", "Results.", "Drawing", "of", "the", "chemical", "structure", "of", "APG-1387", "shown", "in", "Figure", "1", "was", "done", "using", "the", "ChemDraw", "software.", "Source", "paper", ":", "PMC11699618" ]

[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "B-Tissue", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]

[ "2.", "results", "3.", "discussion", "Cell", "surface", "receptors", "and", "their", "coupled", "intracellular", "signaling", "pathways", "have", "been", "intensively", "studied", "in", "many", "physiological", "and", "pathological", "processes", "over", "five", "decades.", "Due", "to", "the", "critical", "feature", "of", "these", "receptor-mediated", "signaling", "in", "promoting", "malignant", "proliferation", ",", "invasion", ",", "and", "metastasis", ",", "designing", "/", "seeking", "small", "molecules", "and", "monoclonal", "antibodies", "that", "target", "receptors", "and", "downstream", "pathways", "has", "become", "a", "pivotal", "strategy", "in", "anti-cancer", "drug", "discovery.", "Therefore", ",", "a", "better", "understanding", "of", "the", "key", "players", "in", "the", "signaling", "pathways", "may", "offer", "opportunities", "for", "therapeutic", "intervention.", "This", "study", "reveals", "a", "positive", "feedback", "DNA-PK", "/", "MYT1L-CXCR1", "proliferative", "signaling", "loop", "that", "contributes", "to", "the", "progression", "of", "glioblastoma", "via", "the", "ERK1", "/", "2", "pathway", "and", "provides", "a", "novel", "insight", "into", "the", "role", "of", "DNA-PK", "in", "the", "MYT1L-mediated", "transactivation", "of", "CXCR1.", "MYT1L", "is", "predominantly", "expressed", "in", "human", "brains", ",", "in", "particular", "fetal", "brains", "[", "32", "]", ".", "Several", "key", "studies", "have", "demonstrated", "the", "pivotal", "role", "of", "MYT1L", "in", "the", "direct", "conversion", "of", "human", "non-neuronal", "cells", "to", "neurons", "[", "33,34,35", "]", ".", "However", ",", "the", "contributing", "role", "of", "MYT1L", "in", "carcinogenesis", "remains", "poorly", "understood.", "Our", "previous", "studies", "have", "uncovered", "that", "miR-141", "was", "down-regulated", "in", "glioblastoma", "and", "was", "able", "to", "suppress", "cell", "proliferation", "by", "directly", "targeting", "MYT1L", ",", "implicating", "an", "oncogenic", "role", "of", "MYT1L", "in", "glioblastoma.", "In", "this", "study", ",", "we", "found", "that", "in", "normal", "DNA-PK", "glioblastoma", "M059K", "cell", "lines", ",", "knockdown", "of", "MYT1L", "attenuated", "cell", "proliferation", "and", "induced", "apoptosis", "and", "S-phase", "cell", "cycle", "arrest", "(", "Figure", "1A–D", ")", ".", "In", "contrast", ",", "the", "ectopic", "expression", "of", "MYT1L", "promoted", "cell", "proliferation", ",", "inhibited", "apoptosis", ",", "and", "shortened", "the", "S", "phase", "(", "Figure", "1E", ",", "F", ",", "H", ",", "J", ")", ".", "Similar", "phenotypic", "alterations", "were", "also", "noted", "in", "HEK293", "cells", "in", "response", "to", "ectopic", "MYT1L", "(", "Figure", "1E–G", ",", "I", ")", ".", "These", "results", "indicated", "that", "in", "cooperation", "with", "DNA-PK", ",", "MYT1L", "may", "function", "as", "an", "oncogene", "in", "the", "progression", "of", "glioblastoma.", "However", ",", "in", "the", "loss-of-function", "DNA-PK", "M059J", "cell", "line", ",", "the", "knockdown", "of", "MYT1L", "promoted", "cell", "proliferation", ",", "attenuated", "apoptosis", ",", "and", "shortened", "the", "S", "phase", "(", "Figure", "2A–D", ")", ".", "Conversely", ",", "the", "enforced", "expression", "of", "MYT1L", "inhibited", "cell", "proliferation", "and", "induced", "a", "G1", "cell", "cycle", "arrest", "(", "Figure", "2E–G", ")", ",", "suggesting", "a", "tumor", "suppressor", "role", "of", "MYT1L", "in", "DNA-PK-deficient", "glioblastoma", "cells", ",", "although", "it", "suppressed", "apoptosis", "(", "Figure", "2H", ")", ".", "Mechanically", ",", "the", "sustained", "activation", "of", "the", "AKT", "pathway", "in", "both", "HEK293", "and", "M059K", "cells", "and", "the", "activation", "of", "the", "ERK1", "/", "2", "pathway", "in", "M059K", "cells", "(", "Figure", "1K", ")", "may", "contribute", "to", "cell", "proliferation", "induced", "by", "ectopic", "expression", "of", "MYT1L", ",", "which", "supports", "the", "key", "role", "of", "these", "two", "well-studied", "oncogenic", "signaling", "pathways", "in", "the", "development", "of", "human", "malignancies", "[", "36", "]", ".", "However", ",", "the", "proliferative", "inhibition", "mediated", "by", "ectopic", "expression", "of", "MYT1L", "in", "M059J", "cells", "may", "not", "be", "attributed", "to", "the", "activation", "of", "these", "two", "pathways", "(", "Figure", "2I", ")", ".", "A", "total", "of", "13", "%", "apoptotic", "cells", "were", "also", "found", "in", "the", "negative", "control", "siRNA", "group", "(", "Figure", "1C", ")", ",", "which", "may", "reflect", "the", "cytotoxic", "effect", "of", "either", "transfection", "reagent", "(", "Lipofectamine", "3000", ")", "or", "negative", "control", "siRNA.", "The", "cell", "cycle", "is", "tightly", "regulated", "by", "cyclins", ",", "CDKs", ",", "and", "CDK", "inhibitors.", "Although", "cyclin", "E1", "was", "down-regulated", "in", "HEK293", ",", "while", "it", "was", "up-regulated", "in", "M059K", "cells", "in", "response", "to", "MYT1L", "expression", "(", "Figure", "1K", ")", ",", "that", "may", "play", "a", "role", "in", "shortening", "the", "S", "phase", "(", "Figure", "1G", ",", "H", ")", "because", "of", "the", "critical", "requirement", "of", "cyclin", "E", "in", "the", "S", "phase", "progression", "[", "37,38", "]", ".", "Furthermore", ",", "p21", ",", "a", "well-known", "CDK", "inhibitor", ",", "was", "down-regulated", "in", "HEK293", "and", "M059K", "cells", "in", "response", "to", "MYT1L", "(", "Figure", "1K", ")", ",", "which", "may", "also", "contribute", "to", "shortening", "the", "S", "phase.", "Moreover", ",", "p21", "has", "been", "shown", "to", "promote", "cell", "death", "in", "cancer", "cells", "via", "the", "activation", "of", "autophagy", "[", "39,40,41", "]", ";", "the", "down-regulated", "p21", "may", "be", "a", "causal", "player", "in", "attenuating", "apoptosis", "in", "HEK293", "cells", "that", "express", "MYT1L", "(", "Figure", "1I", ",", "J", ")", ".", "Interestingly", ",", "CDK6", "was", "down-regulated", "in", "M059J", "cells", "in", "response", "to", "MYT1L", "(", "Figure", "2I", ")", ",", "which", "may", "play", "a", "role", "in", "a", "G1", "cell", "cycle", "arrest", "(", "Figure", "2G", ")", ".", "Ectopic", "MYT1L", "induced", "down-regulation", "of", "caspase", "3", "(", "Figure", "1K", ",", "Supplementary", "Figure", "S1", ")", "in", "both", "HEK293", "and", "M509K", "cells", ",", "which", "may", "play", "a", "contributing", "role", "in", "apoptotic", "inhibition", "(", "Figure", "1I", ",", "J", ")", ".", "However", ",", "this", "is", "not", "the", "case", "in", "M059J", "due", "to", "the", "absence", "of", "caspase", "3", "in", "both", "GFP-", "and", "MYT1L-M059J", "cells", "(", "Figure", "2I", ")", ".", "As", "a", "transcription", "factor", ",", "the", "transcriptional", "targets", "of", "MYT1L", ",", "unfortunately", ",", "remain", "largely", "unknown.", "Here", ",", "we", "discovered", "that", "MYT1L", "could", "directly", "regulate", "the", "transcription", "of", "CXCR1", "through", "a", "novel", "cis-acting", "element", "(", "−2114", "/", "−2103", ")", "at", "the", "CXCR1", "promoter.", "We", "noted", "that", "the", "overexpression", "of", "MYT1L", "correlated", "with", "CXCR1", "mRNA", "levels", "in", "4", "out", "of", "6", "brain", "cancer", "cell", "lines", "(", "Figure", "3A", ",", "B", ")", "and", "the", "induction", "of", "CXCR1", "in", "the", "normal", "DNA-PK", "HEK293", "and", "M059K", "cells", "in", "response", "to", "the", "ectopically", "expressed", "MYT1L", "(", "Figure", "3C", ",", "D", ")", ",", "supporting", "the", "opinion", "that", "CXCR1", "is", "a", "transcriptional", "target", "of", "MYT1L.", "Surprisingly", ",", "in", "M059J", "cells", "with", "loss", "of", "DNA-PK", "function", "(", "Supplementary", "Figure", "S4", ")", ",", "the", "enforced", "expression", "of", "MYT1L", "failed", "to", "induce", "CXCR1", "transcription", "(", "Figure", "3C", ")", ",", "although", "the", "protein", "levels", "of", "CXCR1", "were", "not", "consistent", "with", "its", "mRNA", "levels", "(", "Figure", "3C", ",", "D", ")", ".", "Taken", "together", ",", "our", "results", "demonstrate", "that", "MYT1L", "functionality", "depends", "on", "DNA-PK", "activity.", "Furthermore", ",", "the", "ectopically", "expressed", "MYT1L", "increased", "the", "luciferase", "activity", "of", "the", "wild-type", "CXCR1", "promoter", "/", "luciferase", "reporter", "in", "HEK-293", "and", "M059K", "cells", "with", "the", "normal", "expression", "of", "DNA-PK", ",", "which", "was", "abolished", "when", "the", "mutant", "construct", "was", "used", "(", "Figure", "3G", ")", ".", "However", ",", "the", "ectopic", "expression", "of", "MYT1L", "suppressed", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "DNA-PK-deficient", "M059J", "cells", "(", "Figure", "3G", ")", ".", "Moreover", ",", "the", "enforced", "expression", "of", "MYT1L", "resulted", "in", "the", "sustained", "activation", "of", "the", "AKT", "pathway", "in", "all", "three", "cell", "lines", "examined", "(", "Figure", "1K", "and", "Figure", "2I", ")", ".", "The", "ERK1", "/", "2", "pathway", "was", "activated", "in", "M059K", "and", "M059J", "cells", ",", "while", "it", "was", "inhibited", "in", "HEK293", "cells", "in", "response", "to", "MYT1L", "(", "Figure", "1K", "and", "Figure", "2I", ")", ".", "The", "activation", "of", "the", "ERK1", "/", "2", "pathway", "was", "CXCR1-dependent", ",", "whereas", "the", "AKT", "pathway", "was", "not", "(", "Figure", "4J", ")", ".", "Based", "on", "these", "findings", ",", "we", "may", "propose", "that", "under", "non-stimulated", "conditions", ",", "MYT1L", "may", "act", "as", "a", "transcriptional", "repressor", "suppressing", "CXCR1", "transcription", ";", "DNA-PK", "may", "function", "as", "a", "coactivator", ",", "and", "once", "it", "is", "phosphorylated", "by", "the", "CXCR1-dependent", "activation", "of", "the", "ERK1", "/", "2", "kinase", ",", "it", ",", "in", "turn", ",", "phosphorylates", "MYT1L", ";", "the", "phosphorylated", "MYT1L", "recruits", "histone", "acetyltransferases", "(", "HATs", ")", "and", "transcription", "factors", "(", "TFs", ")", "to", "the", "CXCR1", "promoter", "and", "promotes", "CXCR1", "transcription", "(", "Figure", "5", ")", ".", "DNA-PK", "(", "also", "known", "as", "PRKDC", "and", "p350", ")", "is", "a", "nuclear", "serine", "/", "threonine", "protein", "kinase", "complex", "that", "is", "composed", "of", "a", "catalytic", "subunit", "of", "DNA-PKcs", "and", "a", "heterodimer", "of", "Ku", "proteins", "(", "Ku70", "/", "Ku80", ")", ".", "Although", "one", "of", "the", "most", "well-defined", "functions", "of", "DNA-PK", "is", "to", "govern", "the", "repair", "of", "DNA", "double-strand", "breaks", "through", "both", "non-homologous", "end-joining", "(", "NHEJ", ")", "and", "homologous", "recombination", "(", "HR", ")", "[", "42", "]", ",", "it", "was", "originally", "identified", "as", "a", "component", "of", "the", "Sp1", "transcription", "complex", "in", "which", "it", "may", "modulate", "the", "transcriptional", "activity", "of", "the", "complex", "by", "phosphorylating", "Sp1", "[", "43", "]", ".", "For", "the", "first", "time", ",", "our", "findings", "demonstrated", "that", "DNA-PK", "may", "functionally", "modulate", "the", "transcriptional", "activity", "of", "MYT1L", "by", "phosphorylation", ",", "eventually", "leading", "to", "the", "transcriptional", "activation", "of", "CXCR1", ",", "although", "this", "requires", "further", "validation", "using", "chromatin", "immunoprecipitation", "quantitative", "PCR", "(", "ChIP-qPCR", ")", "and", "the", "electrophoretic", "mobility", "shift", "assay", "(", "EMSA", ")", "when", "a", "ChIP-grade", "antibody", "to", "the", "phosphorylated", "MYT1L", "is", "commercially", "available.", "Our", "previous", "work", "demonstrated", "that", "DNA-PK", "may", "also", "function", "as", "a", "repressor", "of", "MYT1L", ",", "resulting", "in", "the", "transcriptional", "inhibition", "of", "tumor", "suppressor", "p21", ",", "a", "transcriptional", "target", "of", "MYT1L", "[", "29", "]", ".", "Several", "publications", "support", "the", "dual", "role", "of", "DNA-PK", "in", "the", "transcriptional", "control", "of", "gene", "expression.", "DNA-PK", "inhibited", "the", "transcription", "of", "the", "xanthine", "oxidoreductase", "gene", "via", "E-box", "/", "TATA-like", "elements", "[", "44", "]", ".", "Simultaneously", ",", "Ku", "proteins", "may", "also", "act", "as", "a", "transcriptional", "recycling", "coactivator", "of", "the", "androgen", "receptor", "[", "45", "]", ".", "Chemokines", "are", "a", "superfamily", "of", "small", "(", "about", "8", "to", "14", "kDa", ")", "cytokine-like", "proteins", "that", "selectively", "regulate", "the", "recruitment", "and", "trafficking", "of", "leukocytes", "to", "inflammatory", "sites", "through", "chemoattraction", "[", "46", "]", ".", "Members", "of", "this", "family", "have", "been", "divided", "into", "four", "subfamilies", ",", "CXC", ",", "CC", ",", "C", ",", "and", "CX3C", ",", "based", "on", "the", "arrangement", "of", "the", "first", "two", "of", "the", "four", "conserved", "cysteine", "residues", "in", "the", "amino", "terminus", "of", "the", "proteins", ",", "which", "can", "bind", "CXCR", ",", "CCR", ",", "XCR1", ",", "and", "CX3CR1", ",", "respectively.", "Chemokines", "play", "a", "critical", "role", "in", "inflammatory", "reactions.", "IL-8", "is", "a", "well-characterized", "ELR+", "CXC", "chemokine", "that", "attracts", "neutrophils", "through", "binding", "CXCR1", "and", "CXCR2", "receptors", "on", "the", "cell", "surface", "[", "47", "]", ".", "It", "is", "suspected", "that", "the", "signature", "of", "chemokines", "that", "persist", "at", "inflammatory", "sites", "may", "be", "important", "in", "the", "development", "of", "chronic", "diseases", "and", "can", "contribute", "to", "the", "development", "of", "malignancies", "[", "48", "]", ".", "There", "is", "sufficient", "evidence", "to", "show", "that", "chemokines", "also", "play", "a", "significant", "role", "in", "cancer", ",", "including", "melanoma", "[", "49", "]", ",", "breast", "[", "50", "]", ",", "colon", "[", "51", "]", ",", "esophageal", "[", "52", "]", ",", "prostate", "[", "53", "]", ",", "and", "non-small", "cell", "lung", "[", "54", "]", "cancers", ",", "in", "addition", "to", "its", "role", "in", "the", "development", "of", "inflammatory", "responses.", "Here", ",", "we", "showed", "that", "IL-8", "was", "significantly", "up-regulated", "in", "HEK293", "and", "M059J", "cells", ",", "while", "it", "was", "only", "slightly", "increased", "in", "M059K", "cells", "in", "response", "to", "the", "ectopically", "expressed", "MYT1L", "(", "Figure", "4A", ")", ".", "Unlike", "IL-8", ",", "GROα", "more", "selectively", "binds", "to", "the", "CXCR2", "receptor", ",", "while", "the", "affinity", "to", "CXCR1", "is", "significantly", "lower", "[", "55", "]", ".", "Since", "the", "CXCR2", "receptor", "was", "undetectable", "in", "HEK293", "and", "M059K", "cells", "(", "Figure", "3E", ")", ",", "GROα", "in", "these", "cells", "could", "only", "function", "through", "CXCR1.", "The", "enforced", "expression", "of", "MYT1L", "caused", "an", "elevation", "of", "GROα", "in", "HEK293", "and", "M059J", "cells", "(", "Figure", "4B–E", ")", ".", "Although", "GROα", "mRNA", "was", "down-regulated", ",", "its", "protein", "level", "was", "unaffected", "in", "M059K", "cells", "in", "response", "to", "the", "ectopically", "expressed", "MYT1L", "(", "Figure", "4F", ",", "G", ")", ".", "IL-8", "and", "/", "or", "GROα", "bind", "to", "CXCR1", ",", "eventually", "promoting", "glioblastoma", "proliferation", "via", "the", "ERK1", "/", "2", "pathway", "that", "can", "be", "blocked", "by", "CXCR1", "siRNA", "(", "Figure", "4J", ",", "K", ")", ",", "suggesting", "that", "the", "activation", "of", "the", "proliferative", "ERK1", "/", "2", "pathway", "in", "glioblastoma", "is", ",", "at", "least", "in", "part", ",", "CXCR1-dependent.", "Although", "this", "is", "the", "first", "report", "regarding", "the", "critical", "role", "of", "DNA-PK", "/", "MYT1L", "in", "the", "proliferative", "IL-8", "/", "GROα-CXCR1", "signaling", "loop", "in", "glioblastoma", ",", "the", "significant", "contributing", "role", "of", "IL-8-CXCR1", "/", "2", "axes", "in", "the", "proliferation", "and", "angiogenesis", "of", "glioblastoma", "cells", "has", "been", "demonstrated", "before", "[", "28", "]", ".", "Taken", "together", ",", "we", "propose", "a", "potential", "DNA-PK", "/", "MYT1L-CXCR1", "signaling", "loop", "in", "the", "progression", "of", "glioblastoma", "(", "Figure", "5", ")", ".", "We", "speculate", "that", "the", "DNA-PK", "/", "MYT1L-CXCR1-ERK1", "/", "2", "might", "be", "up-regulated", "at", "WHO", "grade", "IV", "and", "/", "or", "recurrent", "glioblastomas", "due", "to", "chemo-", "or", "radio-resistance.", "DNA-PK", "is", "a", "key", "player", "in", "DNA", "damage", "response", "on", "double-strand", "breaks.", "Activation", "of", "DNA", "damage", "response", "facilitates", "glioma", "stem", "cells", "to", "develop", "radio-resistance", "[", "56", "]", ".", "Furthermore", ",", "DNA-PK", "is", "a", "master", "kinase", "of", "the", "proliferative", "/", "progenitor", "subtype", "of", "glioblastoma", ",", "guiding", "targeted", "cancer", "therapy", "[", "57", "]", ".", "Immunohistochemical", "staining", "has", "indicated", "the", "expression", "of", "IL-8", "in", "66.7–67.3", "%", "of", "WHO", "grade", "IV", "glioblastoma", "tissues", ",", "with", "the", "expression", "of", "its", "receptor", "CXCR1", "found", "primarily", "in", "both", "tumor-associated", "vessels", "and", "grade", "IV", "glioblastomas", "[", "28", "]", ",", "supporting", "the", "previous", "report", "showing", "a", "crucial", "role", "of", "IL-8", "/", "CXCR1", "/", "2", "signaling", "in", "glioblastoma", "stem", "cells", "[", "58", "]", ".", "Moreover", ",", "the", "IL-8", "/", "CXCR1", "/", "STAT3", "pathway", "is", "crucial", "for", "the", "maintenance", "of", "glioblastoma", "stem", "cells", "[", "59", "]", ".", "Glioblastoma", "and", "neuroblastoma", "are", "two", "common", "types", "of", "brain", "tumors", "that", "occur", "in", "different", "aged", "populations.", "Our", "previous", "studies", "indicated", "that", "MYT1L", "was", "overexpressed", "in", "glioblastoma", "cell", "lines", "and", "46.9", "%", "of", "malignant", "glioma", "tissue", "samples", "(", "n", "=", "32", ")", "[", "29", "]", ",", "functioning", "as", "an", "oncogene", "in", "glioblastoma", "cells", "with", "normal", "DNA-PK", "activity.", "To", "see", "whether", "MYT1L", "is", "also", "up-regulated", "in", "neuroblastoma", ",", "we", "compared", "its", "expression", "in", "both", "glioblastoma", "and", "neuroblastoma", "cell", "lines.", "It", "was", "found", "that", "MYT1L", "was", "overexpressed", "in", "3", "out", "of", "7", "neuroblastoma", "cell", "lines", "examined", "(", "Figure", "3A", ")", ",", "suggesting", "that", "MYT1L", "up-regulation", "may", "be", "a", "common", "event", "in", "both", "glioblastoma", "and", "neuroblastoma.", "Although", "the", "SH-SY5Y", "cell", "line", "is", "a", "subclone", "of", "the", "SK-N-SH", "cell", "line", ",", "the", "global", "gene", "expression", "microarray", "showed", "a", "profound", "differential", "expression", "of", "genes", "in", "these", "two", "cell", "lines", "[", "60", "]", ".", "However", ",", "the", "mechanism", "involved", "is", "unclear.", "In", "the", "present", "study", ",", "we", "noted", "that", "MYT1L", "was", "up-regulated", "in", "the", "SH-SY5Y", "cell", "line", "at", "both", "mRNA", "and", "protein", "levels", "(", "Figure", "3A", ",", "B", ")", ",", "while", "in", "its", "parental", "line", ",", "SK-N-SH", ",", "only", "MYT1L", "mRNA", "was", "up-regulated.", "The", "MYT1L", "protein", "was", "undetectable", ",", "which", "may", "implicate", "the", "involvement", "of", "post-transcriptional", "regulation", ",", "such", "as", "miRNA", "(", "s", ")", ",", "in", "MYT1L", "expression.", "Some", "of", "the", "molecules", "analyzed", "in", "this", "manuscript", "can", "be", "molecular", "targets", "in", "cancer", "therapy.", "The", "IL-8-CXCR1", "/", "2", "axis", "has", "been", "proposed", "as", "a", "potential", "therapeutic", "target", "for", "numerous", "cancers", "due", "to", "its", "contributing", "roles", "in", "proliferation", ",", "migration", "/", "invasion", ",", "angiogenesis", ",", "and", "tumor", "immunosuppression", "[", "61,62", "]", ".", "The", "tumor-produced", "IL-8", "is", "a", "potent", "chemoattractant", "that", "recruits", "CXCR1", "/", "2-expressing", "human", "myeloid-derived", "suppressor", "cells", "to", "tumor", "foci", ",", "playing", "a", "crucial", "role", "in", "immune", "resistance", "[", "63", "]", ".", "IL-8", "receptor", "CXCR1", "may", "be", "a", "biomarker", "for", "cancer", "stem", "cells", "[", "64", "]", ",", "including", "glioblastoma", "stem", "cells", "[", "58", "]", ".", "Targeting", "myeloid", "cell", "CXCR1", "/", "2", "enhances", "antitumor", "immunity", "in", "pancreatic", "cancer", "[", "65", "]", ".", "Neutralizing", "IL-8", "or", "inhibiting", "its", "receptor", "CXCR1", "/", "2", "potentiates", "anti-PD-1-mediated", "antitumor", "immunotherapy", "for", "glioma", "[", "66", "]", ".", "These", "findings", "highlight", "IL-8", "and", "CXCR1", "/", "2", "as", "potential", "therapeutic", "targets", "for", "cancer.", "McClelland", "and", "colleagues", "have", "summarized", "numerous", "inhibitors", "developed", "to", "target", "IL-8", "or", "its", "receptor", "CXCR1", "/", "2", "for", "the", "treatment", "of", "chronic", "obstructive", "pulmonary", "disease", "(", "COPD", ")", ",", "asthma", ",", "diabetes", ",", "pneumonia", ",", "and", "solid", "tumors", ",", "including", "prostate", "cancer", "[", "62", "]", ".", "Phase", "1", "and", "2", "clinical", "trials", "in", "prostate", "cancer", "with", "Navarixin", ",", "a", "small-molecule", "inhibitor", "of", "CXCR1", "/", "2", ",", "have", "been", "completed.", "Phase", "1", "and", "2", "clinical", "trials", "in", "prostate", "cancer", "with", "BMS-986253", ",", "a", "monoclonal", "antibody", "against", "IL-8", ",", "are", "still", "active.", "However", ",", "none", "of", "these", "inhibitors", "have", "yet", "been", "approved", "to", "treat", "cancer.", "The", "ERK1", "/", "2", "signaling", "pathway", "contributes", "to", "numerous", "biological", "and", "pathological", "processes.", "Excessive", "activation", "of", "the", "ERK1", "/", "2", "pathway", "is", "a", "hallmark", "of", "human", "malignancies", "[", "67,68,69,70,71,72,73", "]", "due", "to", "its", "crucial", "role", "in", "maintaining", "sustained", "cellular", "proliferation", ",", "resistance", "to", "cell", "death", ",", "angiogenesis", ",", "invasion", ",", "and", "metastasis.", "Many", "FDA-approved", "drugs", "target", "upstream", "regulators", "of", "the", "ERK1", "/", "2", "pathway", ",", "resulting", "in", "an", "indirect", "inhibition", "of", "ERK1", "/", "2", "kinase", "[", "74", "]", ".", "ERK1", "/", "2", "signaling", "may", "be", "reactivated", "upon", "the", "development", "of", "drug", "resistance.", "Liu", "and", "colleagues", "have", "described", "10", "small-molecule", "inhibitors", "of", "ERK1", "/", "2", "which", "were", "developed", "recently", "and", "have", "undergone", "clinical", "trials", "in", "cancer", "patients", "[", "75", "]", ".", "Some", "of", "them", "have", "shown", "promising", "results", "in", "the", "treatment", "of", "cancers.", "Surprisingly", ",", "a", "large", "body", "of", "evidence", "also", "indicates", "a", "contributing", "role", "of", "ERK1", "/", "2", "activation", "in", "cancer", "cell", "apoptosis", "primarily", "induced", "by", "chemical", "compounds", ",", "including", "glioblastoma", ",", "bladder", ",", "breast", ",", "colon", ",", "endometrial", ",", "head", "and", "neck", ",", "lung", ",", "renal", "cell", ",", "and", "testicular", "germ", "cell", "carcinomas", "[", "76,77,78,79,80,81,82,83,84,85", "]", ",", "and", "mechanically", ",", "through", "activation", "of", "caspase", "3", "and", "induction", "of", "reactive", "oxygen", "species.", "Both", "oncogene", "and", "non-oncogene", "addiction", "have", "been", "demonstrated", "as", "fantastic", "targets", "for", "cancer", "therapy", "due", "to", "their", "crucial", "role", "in", "supporting", "cancer", "progression", "[", "86", "]", ".", "Using", "a", "unique", "glioblastoma", "cell", "model", "system", ",", "M059J", "with", "deficient", "DNA-PK", ",", "while", "M059K", "with", "normal", "DNA-PK", ",", "we", "demonstrate", "in", "vitro", "that", "MYT1L-overexpressing", "cells", "show", "non-oncogene", "addiction", "to", "DNA-PK.", "Genomic", "instability", "due", "to", "defects", "in", "DNA", "repair", "genes", "is", "a", "key", "hallmark", "of", "cancer", "that", "drives", "the", "development", "of", "human", "malignancies", "[", "87", "]", ".", "However", ",", "these", "defects", "may", "also", "offer", "cancer", "cells", "opportunities", "to", "evolve", "a", "dependency", "on", "a", "non-oncogene", "addiction", "gene.", "For", "instance", ",", "BRCA2-deficient", "cancer", "cells", "are", "more", "dependent", "on", "PARP1", "to", "repair", "DNA", "for", "survival", ",", "resulting", "in", "an", "increased", "sensitivity", "to", "PARP1", "inhibitors", "[", "88", "]", ",", "which", "kill", "the", "cancer", "cells", "through", "the", "genetic", "concept", "of", "synthetic", "lethality", "[", "89", "]", ".", "Targeting", "mediators", "of", "DNA", "repair", "has", "become", "a", "state-of-the-art", "strategy", "for", "cancer", "[", "90", "]", ",", "leading", "to", "the", "development", "of", "inhibitors", "of", "key", "mediators", "of", "DNA", "repair", ",", "including", "DNA-PK.", "Interestingly", ",", "genetic", "and", "pharmacological", "targeting", "of", "a", "strong", "non-oncogene", "addiction", "to", "DNA-PKcs", "(", "DNA-dependent", "protein", "kinase", "catalytic", "subunit", ")", "leads", "to", "the", "accumulation", "of", "DNA", "double-strand", "breaks", "in", "ATM-defective", "cancer", "cells", ",", "which", "triggers", "cell", "apoptosis", "via", "the", "proapoptotic", "signaling", "pathway", "[", "91", "]", ".", "These", "results", "are", "supported", "by", "our", "findings", "showing", "the", "dependence", "of", "MYT1L-overexpressing", "glioblastoma", "cells", "on", "DNA-PK.", "VX-984", "and", "M3814", "are", "two", "selective", "DNA-PK", "inhibitors", "[", "92,93", "]", "that", "profoundly", "inhibit", "tumor", "growth", "in", "tumor", "xenograft", "models", "by", "enhancing", "radiotherapy.", "These", "two", "inhibitors", "are", "currently", "in", "ongoing", "clinical", "trials.", "The", "DNA-PK", "/", "MYT1L-CXCR1-ERK1", "/", "2", "proliferative", "signaling", "loop", "we", "proposed", "here", "was", "primarily", "based", "on", "data", "obtained", "from", "glioblastoma", "cell", "lines.", "It", "is", "interesting", "to", "look", "at", "the", "expression", "of", "DNA-PK", ",", "MYT1L", ",", "and", "CXCR1", "and", "the", "levels", "of", "phosphorylated", "ERK1", "/", "2", "in", "a", "large", "cohort", "of", "glioblastoma", "tissue", "samples", "and", "correlate", "the", "levels", "of", "these", "molecules", "to", "clinicopathological", "parameters", "of", "this", "disease.", "It", "is", "also", "interesting", "to", "look", "at", "the", "effect", "of", "MYT1L", "on", "tumor", "growth", "in", "an", "in", "vivo", "tumor", "xenograft", "animal", "model", "using", "GFP-", "/", "MYT1L-M059J", "and", "GFP-", "/", "MYT1L", "M059K", "cells", ",", "further", "confirming", "our", "in", "vitro", "findings.", "4.", "materials", "and", "methods", "4.5.", "western", "blot", "analysis", "The", "cells", "were", "rinsed", "twice", "with", "ice-cold", "PBS", "and", "scraped", "off", "the", "plate", "in", "radioimmunoprecipitation", "assay", "buffer", "(", "RIPA", ")", ".", "The", "total", "protein", "lysate", "prepared", "from", "human", "adult", "brain", "normal", "tissues", "was", "purchased", "from", "BioChain", "(", "Newark", ",", "CA", ",", "USA", ")", "and", "served", "as", "a", "normal", "control", "for", "human", "cell", "lines.", "The", "whole", "cellular", "lysates", "(", "30–100", "µg", "per", "sample", ")", "were", "electrophoresed", "via", "10", "%", "SDS-PAGE", "and", "electrophoretically", "transferred", "to", "PVDF", "membranes", "(", "Amersham", "HybondTM-P", ",", "GE", "Healthcare", ",", "Chicago", ",", "IL", ",", "USA", ")", "at", "4", "°C", "for", "1.5", "h.", "The", "blots", "were", "incubated", "for", "1", "h", "with", "5", "%", "nonfat", "dry", "milk", "to", "block", "the", "nonspecific", "binding", "sites", "and", "subsequently", "incubated", "with", "polyclonal", "/", "monoclonal", "antibodies", "specific", "to", "MYT1L", "(", "Abnova", ",", "Taipei", ",", "China", ")", "or", "AKT1", "(", "Abcam", ",", "Cambridge", ",", "GH", ",", "UK", ")", ",", "CDK2", "(", "Abcam", ",", "Cambridge", ",", "GH", ",", "UK", ")", ",", "DNA-PKcs", "(", "Abcam", ",", "Cambridge", ",", "GH", ",", "UK", ")", ",", "p21", "(", "Abcam", ",", "Cambridge", ",", "GH", ",", "UK", ")", "or", "CDK4", "(", "Cell", "Signaling", "Technology", ",", "Danvers", ",", "MA", ",", "USA", ")", ",", "CDK6", "(", "Cell", "Signaling", "Technology", ",", "Danvers", ",", "MA", ",", "USA", ")", ",", "cyclin", "A2", "(", "Cell", "Signaling", "Technology", ",", "Danvers", ",", "MA", ",", "USA", ")", ",", "cyclin", "D1", "(", "Cell", "Signaling", "Technology", ",", "Danvers", ",", "MA", ",", "USA", ")", ",", "cyclin", "E1", "(", "Cell", "Signaling", "Technology", ",", "Danvers", ",", "MA", ",", "USA", ")", ",", "ERK1", "/", "2", "(", "Cell", "Signaling", "Technology", ",", "Danvers", ",", "MA", ",", "USA", ")", ",", "p27", "(", "Cell", "Signaling", "Technology", ",", "Danvers", ",", "MA", ",", "USA", ")", ",", "pERK1", "/", "2", "(", "Cell", "Signaling", "Technology", ",", "Danvers", ",", "MA", ",", "USA", ")", "or", "BAX", "(", "Santa", "Cruz", "Biotechnology", ",", "Dallas", ",", "TX", ",", "USA", ")", ",", "BCL2", "(", "Santa", "Cruz", "Biotechnology", ",", "Dallas", ",", "TX", ",", "USA", ")", ",", "GROα", "(", "Santa", "Cruz", "Biotechnology", ",", "Dallas", ",", "TX", ",", "USA", ")", ",", "IL8RB", "(", "Santa", "Cruz", "Biotechnology", ",", "Dallas", ",", "TX", ",", "USA", ")", ",", "pAKT1", "/", "2", "/", "3", "(", "Santa", "Cruz", "Biotechnology", ",", "Dallas", ",", "TX", ",", "USA", ")", ",", "or", "CXCR1", "(", "LSBio", ",", "Lynnwood", ",", "WA", ",", "USA", ")", "at", "4", "°C", "overnight.", "Immunoreactivity", "was", "detected", "using", "a", "peroxidase-conjugated", "antibody", "and", "visualized", "using", "the", "ECL", "Plus", "Western", "Blotting", "Detection", "System", "(", "GE", "Healthcare", ",", "Chicago", ",", "IL", ",", "USA", ")", ".", "The", "blots", "were", "stripped", "before", "reprobing", "with", "an", "antibody", "against", "actin", "(", "Abcam", ",", "Cambridge", ",", "GH", ",", "UK", ")", "or", "GAPDH", "(", "Santa", "Cruz", "Biotechnology", ",", "Dallas", ",", "TX", ",", "USA", ")", ".", "4.9.", "bioinformatics", "analysis", "The", "MYT1L", "binding", "sites", "in", "the", "CXCR1", "promoter", "were", "predicted", "using", "Zinc", "Finger", "Protein-DNA", "Scoring", "Form", ",", "a", "DNA", "binding", "site", "predictor", "for", "Cys2His2", "zinc", "finger", "proteins", "(", "http", ":", "/", "/", "zf.princeton.edu", "/", "form.php", ",", "accessed", "on", "14", "March", "2025", ")", ".", "The", "Cancer", "Genome", "Atlas", "(", "TCGA", ")", "datasets", "were", "used", "to", "analyze", "a", "relationship", "between", "MYT1L", "expression", "and", "CXCR1", "expression", "in", "glioblastoma", "and", "neuroblastoma.", "4.12.", "statistical", "analysis", "The", "Student’s", "t-test", "was", "used", "to", "determine", "the", "statistical", "significance", "of", "differences", "in", "GROα", "expression", ",", "IL-8", "expression", ",", "cell", "growth", ",", "apoptosis", ",", "cell", "cycle", ",", "and", "luciferase", "activity", "between", "groups.", "Luciferase", "activity", "was", "measured", "in", "duplicate", ",", "while", "other", "experiments", "were", "performed", "in", "triplicate.", "A", "value", "of", "p", "***5.", "Conclusions***", "This", "work", ",", "for", "the", "first", "time", ",", "reveals", "that", "MYT1L", "functions", "as", "a", "transcription", "factor", "governing", "the", "expression", "of", "CXC", "chemokine", "receptor", "CXCR1.", "The", "CXCR1", "signaling", "promotes", "proliferation", ",", "inhibits", "apoptosis", ",", "and", "shortens", "the", "S", "phase", "in", "DNA-PK+", "glioblastoma", "cells", "via", "activation", "of", "the", "ERK1", "/", "2", "pathway", ",", "which", "can", "be", "blocked", "by", "CXCR1", "knockdown.", "The", "function", "of", "MYT1L", "is", "DNA-PK-dependent", ",", "highlighting", "a", "key", "role", "of", "DNA-PK", "modulating", "the", "transcriptional", "activity", "of", "MYT1L.", "Our", "findings", "have", "demonstrated", "a", "positive", "feedback", "DNA-PK", "/", "MYT1L-CXCR1-ERK1", "/", "2", "proliferative", "signaling", "loop", "in", "glioblastoma", "cells", "and", "might", "have", "significant", "therapeutic", "implications.", "In", "the", "future", ",", "our", "studies", "can", "be", "extended", "by", "analyzing", "the", "effect", "of", "CXCR1", "knockdown", "in", "M059J", "cells", "with", "impaired", "DNA-PK.", "This", "would", "allow", "us", "to", "understand", "the", "interlink", "between", "DNA-PK-MYT1L-CXCR1-pERK1", "/", "2.", "Source", "paper", ":", "PMC12072392" ]

[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "I-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]

[ "Methods", "The", "cytotoxic", "effects", "of", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "were", "evaluated", "in", "a", "dose-dependent", "manner", "using", "the", "MTT", "assay", "on", "several", "cancer", "cell", "lines", ",", "with", "particular", "emphasis", "on", "HeLa", "cells.", "Flow", "cytometry", "was", "used", "to", "assess", "cell", "cycle", "arrest", "and", "apoptosis", ",", "while", "RT-qPCR", "quantified", "changes", "in", "the", "expression", "of", "apoptotic", "markers", "(", "Bax", ",", "Bcl-2", ",", "and", "p53", ")", ".", "Chemical", "composition", "analysis", "was", "conducted", "using", "gas", "chromatography-mass", "spectrometry", "/", "flame", "ionization", "detection", "(", "GC-MS", "/", "FID", ")", "to", "identify", "the", "major", "bioactive", "compounds", "within", "the", "fraction.", "Results", "The", "DCM", "fraction", "exhibited", "dose-dependent", "cytotoxicity", "in", "HeLa", "cells", ",", "with", "an", "IC50", "value", "of", "135.6", "µg", "/", "mL", "and", "a", "selectivity", "index", "(", "SI", ")", "of", "2.72", "relative", "to", "normal", "cells.", "Flow", "cytometry", "analysis", "revealed", "G0", "/", "G1", "cell", "cycle", "arrest", ",", "significantly", "hindering", "progression", "through", "the", "S", "and", "G2", "/", "M", "phases.", "Moreover", ",", "there", "was", "a", "significant", "increase", "in", "both", "early", "and", "late", "apoptotic", "cell", "populations", ",", "correlating", "with", "the", "upregulation", "of", "pro-apoptotic", "genes", "(", "Bax", "and", "p53", ")", "and", "the", "downregulation", "of", "the", "anti-apoptotic", "gene", "Bcl-2.", "The", "chemical", "analysis", "identified", "22", "compounds", "in", "the", "unsaponifiable", "fraction", ",", "chiefly", "terpenoids", "such", "as", "phytol", "(", "65.74", "%", ")", ".", "The", "saponifiable", "fraction", "presented", "a", "balanced", "composition", "of", "saturated", "(", "48.69", "%", ")", "and", "unsaturated", "(", "51.29", "%", ")", "fatty", "acids", ",", "with", "palmitic", "acid", ",", "linolenic", "acid", ",", "and", "linoleic", "acid", "as", "the", "predominant", "compounds.", "Conclusion", "While", "the", "DCM", "fraction’s", "relatively", "high", "IC50", "value", "may", "limit", "its", "utility", "as", "a", "standalone", "treatment", ",", "its", "ability", "to", "induce", "cell", "cycle", "arrest", "and", "apoptosis", "demonstrates", "its", "promise", "as", "a", "co-therapeutic", "agent", "with", "conventional", "anticancer", "drugs.", "Further", "research", "is", "essential", "to", "elucidate", "its", "precise", "mechanisms", "of", "action", "and", "to", "evaluate", "its", "efficacy", "in", "combination", "therapies", ",", "potentially", "advancing", "its", "role", "in", "cervical", "cancer", "treatment.", "Methods", "Cell", "cycle", "analysis", "To", "assess", "the", "impact", "of", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "on", "cell", "cycle", "progression", ",", "propidium", "iodide", "(", "PI", ")", "staining", "followed", "by", "flow", "cytometry", "was", "employed", "as", "outlined", "previously", "[", "17", "]", ".", "PI", "(", "Company", ")", "is", "a", "fluorescent", "dye", "that", "binds", "to", "DNA", "allowing", "differentiation", "of", "cell", "cycle", "phases", "(", "G0", "/", "G1", ",", "S", ",", "G2", "/", "M", ")", "based", "on", "their", "DNA", "content.", "Briefly", ",", "HeLa", "cells", "(", "2", "×", "105", "cells", "/", "mL", ")", "were", "cultured", "overnight", "and", "then", "treated", "with", "the", "DCM", "fraction", "at", "its", "IC50", "concentration", "(", "135.6", "µg", "/", "mL", ")", "for", "24", "h.", "After", "treatment", ",", "cells", "were", "fixed", ",", "stained", "with", "a", "PI", "/", "RNase", "solution", ",", "and", "analyzed", "using", "a", "FACSCalibur", "Scan", "flow", "cytometer", "(", "BD", "Biosciences", ")", "to", "determine", "cell", "cycle", "distribution.", "Apoptosis", "analysis", "using", "annexin", "v-fitc", "/", "pi", "assay", "To", "determine", "the", "mode", "of", "cell", "death", "induced", "by", "A.", "incana", "DCM", "fraction", ",", "the", "Annexin", "V-FITC", "apoptosis", "detection", "kit", "(", "BioVision", "Inc.", ",", "CA", ",", "USA", ",", "K101-25", ")", "was", "used", "following", "the", "manufacturer’s", "protocol.", "This", "assay", "detects", "phosphatidylserine", "translocation", ",", "a", "hallmark", "of", "early", "apoptosis", ",", "by", "Annexin", "V-FITC", "staining.", "PI", ",", "a", "viability", "dye", "excluded", "by", "healthy", "and", "early", "apoptotic", "cells", "with", "intact", "membranes", ",", "stains", "the", "DNA", "of", "late", "apoptotic", "and", "necrotic", "cells", "with", "compromised", "membranes", ",", "allowing", "for", "their", "identification.", "Briefly", ",", "HeLa", "cells", "(", "2", "×", "105", "cells", "/", "mL", ")", "were", "cultured", "for", "24", "h", "and", "treated", "with", "the", "extract", "at", "its", "IC50", "concentration", "(", "135.6", "µg", "/", "mL", ")", "for", "an", "additional", "48", "h.", "Following", "treatment", ",", "cells", "were", "stained", "with", "Annexin", "V-FITC", "and", "PI.", "Apoptosis", "was", "quantified", "by", "flow", "cytometry", "using", "a", "BD", "FACSCalibur", "Scan", "system", "(", "BD", "Biosciences", ")", ".", "For", "accurate", "quantification", "of", "apoptotic", "populations", ",", "a", "specific", "gating", "strategy", "was", "applied.", "Cells", "were", "initially", "gated", "based", "on", "forward", "scatter", "(", "FSC", ")", "versus", "side", "scatter", "(", "SSC", ")", "to", "exclude", "debris", ",", "followed", "by", "gating", "on", "FSC-Height", "(", "FSC-H", ")", "versus", "FSC-Area", "(", "FSC-A", ")", "to", "exclude", "doublets.", "Apoptotic", "populations", "were", "classified", "by", "gating", "on", "Annexin", "V-FITC", "versus", "PI", "as", "follows", ":", "live", "cells", "(", "Q4", ")", "were", "Annexin", "V-", "/", "PI-", ",", "early", "apoptotic", "cells", "(", "Q3", ")", "were", "Annexin", "V+", "/", "PI-", ",", "late", "apoptotic", "/", "necrotic", "cells", "(", "Q2", ")", "were", "Annexin", "V+", "/", "PI+", ",", "and", "dead", "/", "necrotic", "cells", "(", "Q1", ")", "were", "Annexin", "V-", "/", "PI+.", "The", "percentage", "of", "cells", "in", "each", "quadrant", "was", "calculated", "to", "assess", "the", "extent", "of", "apoptosis", "and", "necrosis.", "Statistical", "analysis", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "SPSS", "version", "24.0.", "Differences", "between", "the", "means", "of", "two", "independent", "groups", "were", "analyzed", "using", "an", "independent", "t-test", ",", "with", "p", "***Results***", "Effect", "of", "a.", "incana", "dcm", "fraction", "on", "cell", "cycle", "analysis", "To", "investigate", "the", "effect", "of", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "on", "cell", "cycle", "progression", ",", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "the", "IC50", "concentration", "(", "135.6", "µg", "/", "mL", ")", "of", "the", "fraction", "for", "48", "h.", "Cell", "cycle", "distribution", "was", "assessed", "by", "flow", "cytometry", "using", "Propidium", "Iodide", "(", "PI", ")", "staining", ",", "which", "binds", "to", "DNA", "and", "allows", "differentiation", "of", "cell", "cycle", "phases", "(", "G0", "/", "G1", ",", "S", ",", "G2", "/", "M", ")", "based", "on", "DNA", "content.", "As", "illustrated", "in", "Fig.", "2", ",", "a", "significant", "increase", "(", "p", "A.", "incana", "exerts", "cytostatic", "effects", "on", "HeLa", "cells", "by", "inducing", "cell", "cycle", "arrest.", "Fig.", "2Flow", "cytometric", "analysis", "of", "cell", "cycle", "distribution", "in", "HeLa", "cells", "treated", "with", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction.", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "the", "IC50", "concentration", "(", "135.6", "µg", "/", "mL", ")", "of", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "for", "48", "h", ",", "and", "cell", "cycle", "phase", "distribution", "was", "analyzed", "via", "flow", "cytometry.", "Panels", ":", "(", "a", ")", "Control", "(", "untreated", ")", "HeLa", "cells", ",", "(", "b", ")", "HeLa", "cells", "treated", "with", "the", "DCM", "fraction", ",", "and", "(", "c", ")", "A", "graphical", "comparison", "of", "cell", "percentages", "across", "each", "cell", "cycle", "phase", "between", "treated", "and", "untreated", "groups", "Discussion", "This", "study", "investigated", "the", "cytotoxic", "potential", "of", "the", "DCM", "fraction", "from", "the", "leaves", "of", "the", "medicinal", "plant", "A.", "incana.", "Given", "the", "documented", "cytotoxic", "activity", "of", "the", "DCM", "extract", "from", "the", "related", "subspecies", "A.", "rugosa", "[", "8", "]", ",", "we", "hypothesized", "that", "A.", "incana", "might", "exhibit", "similar", "effects.", "Although", "previous", "studies", "confirmed", "the", "cytotoxic", "properties", "of", "its", "methanol", "extract", "[", "10", "]", ",", "the", "effects", "of", "the", "DCM", "fraction", "remain", "unexamined.", "To", "address", "this", "gap", ",", "the", "fraction’s", "cytotoxicity", "was", "evaluated", "against", "four", "human", "cancer", "cell", "lines", ":", "HepG2", ",", "HCT116", ",", "HeLa", ",", "and", "MCF-7", ",", "representing", "diverse", "cancer", "types.", "The", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "demonstrated", "IC50", "values", "ranging", "from", "135.6", "to", "273.1", "µg", "/", "mL", ",", "with", "HeLa", "cells", "(", "a", "cervical", "cancer", "model", ")", "showing", "the", "highest", "sensitivity", "(", "IC50", "=", "135.6", "µg", "/", "mL", ")", ".", "Significantly", ",", "the", "DCM", "fraction", "exhibited", "a", "selectivity", "index", "(", "SI", ")", "of", "2.72", "against", "HeLa", "cells", ",", "indicating", "preferential", "cytotoxicity", "toward", "cancer", "cells", "over", "normal", "cells", "and", "highlighting", "its", "therapeutic", "potential.", "Although", "the", "IC50", "values", "for", "A.", "incana", "were", "higher", "than", "those", "reported", "for", "the", "DCM", "extract", "of", "the", "related", "subspecies", "A.", "rugosa", "[", "8", "]", ",", "this", "difference", "may", "be", "attributed", "to", "variations", "in", "the", "concentration", "or", "composition", "of", "active", "compounds", "in", "each", "extract.", "Despite", "this", ",", "both", "species", "showed", "their", "most", "potent", "cytotoxic", "effects", "against", "HeLa", "cells", ",", "suggesting", "a", "potential", "shared", "mechanism", "targeting", "cervical", "cancer", "cells", "specifically.", "Additionally", ",", "prior", "studies", "have", "reported", "that", "the", "methanol", "extract", "of", "A.", "incana", "leaves", "has", "a", "pronounced", "effect", "on", "HeLa", "cells", "(", "IC50", "of", "68.5", "µg", "/", "mL", ")", "[", "10", "]", ".", "The", "selective", "cytotoxicity", "observed", "in", "both", "A.", "incana", "and", "A.", "rugosa", "DCM", "extracts", ",", "alongside", "the", "methanol", "extract’s", "activity", ",", "indicates", "the", "presence", "of", "bioactive", "compounds", "within", "these", "species", "that", "may", "preferentially", "disrupt", "HeLa", "cell", "function.", "This", "selective", "activity", "underscores", "the", "potential", "of", "Alnus", "species", "as", "promising", "candidates", "for", "developing", "targeted", "therapies", "against", "gynecological", "cancers", ",", "particularly", "cervical", "cancer.", "Given", "the", "substantial", "cytotoxic", "response", "observed", ",", "further", "investigation", "into", "the", "active", "compounds", "and", "mechanisms", "of", "action", "of", "the", "DCM", "fraction", "of", "A.", "incana", "leaves", "is", "warranted.", "To", "explore", "the", "mechanisms", "underlying", "this", "cytotoxicity", ",", "we", "investigated", "the", "effects", "of", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "on", "cell", "cycle", "progression", "and", "apoptosis", "in", "HeLa", "cells.", "The", "results", "revealed", "a", "significant", "accumulation", "of", "cells", "in", "the", "G0", "/", "G1", "phase", ",", "indicating", "effective", "cell", "cycle", "arrest.", "This", "is", "a", "crucial", "finding", "science", "cell", "cycle", "arrest", "at", "key", "checkpoints", "is", "a", "well-established", "therapeutic", "strategy", "for", "inhibiting", "cancer", "cell", "proliferation.", "The", "mammalian", "cell", "cycle", "comprises", "four", "distinct", "phases", ":", "G1", ",", "S", ",", "G2", ",", "and", "M", ",", "where", "RNA", "and", "protein", "synthesis", "occur", "in", "G1", "and", "G2", ",", "DNA", "replication", "in", "S", ",", "and", "chromosome", "segregation", "in", "M", "[", "18", "]", ".", "By", "halting", "cells", "in", "the", "G0", "/", "G1", "phase", ",", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "appears", "to", "block", "progression", "to", "DNA", "synthesis", ",", "which", "could", "lead", "to", "senescence", "or", "cell", "death.", "Several", "plant-derived", "anticancer", "agents", ",", "such", "as", "taxanes", "and", "vinca", "alkaloids", ",", "function", "by", "disrupting", "key", "cell", "cycle", "regulators", "[", "19", "]", ".", "In", "addition", "to", "inducing", "cell", "cycle", "arrest", ",", "the", "DCM", "fraction", "significantly", "promoted", "apoptosis", ",", "a", "fundamental", "mechanism", "in", "cancer", "treatment.", "Apoptosis", ",", "or", "programmed", "cell", "death", ",", "is", "triggered", "by", "many", "natural", "cytotoxic", "agents", ",", "both", "clinically", "approved", "and", "experimental", ",", "and", "is", "essential", "for", "eliminating", "cancer", "cells", "[", "20", "]", ".", "Flow", "cytometric", "analysis", "using", "Annexin", "V", "and", "propidium", "iodide", "staining", "revealed", "a", "marked", "increase", "in", "apoptotic", "cell", "death", "(", "40.67-fold", "increase", ",", "18.71", "%", "vs.", "0.46", "%", "in", "the", "control", ")", "induced", "by", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction.", "Early", "apoptosis", "rose", "to", "14.32", "%", "from", "0.37", "%", ",", "and", "late", "apoptosis", "increased", "to", "4.39", "%", "from", "0.09", "%", ".", "Necrosis", "also", "increased", "by", "2.5-fold", "(", "2.84", "%", "vs.", "1.15", "%", "in", "the", "control", ")", ",", "indicating", "a", "broad", "cytotoxic", "effect", "on", "HeLa", "cells.", "These", "findings", "reinforce", "the", "potential", "of", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "as", "an", "effective", "anticancer", "agent", "by", "simultaneously", "inducing", "cell", "cycle", "arrest", "and", "apoptosis.", "To", "elucidate", "the", "molecular", "mechanisms", "behind", "these", "effects", ",", "we", "evaluated", "the", "expression", "of", "apoptotic", "regulators", ",", "including", "p53", ",", "Bcl-2", ",", "and", "Bax", ",", "through", "RT-PCR.", "The", "intrinsic", "apoptotic", "pathway", "is", "regulated", "by", "the", "balance", "between", "pro-apoptotic", "Bax", "and", "anti-apoptotic", "Bcl-2", ",", "where", "Bcl-2", "stabilizes", "the", "mitochondrial", "membrane", "and", "prevents", "cytochrome", "c", "release", ",", "whereas", "Bax", "promotes", "apoptosis", "by", "facilitating", "cytochrome", "c", "release", "[", "21", "]", ".", "p53", ",", "a", "critical", "tumor", "suppressor", ",", "enhances", "Bax", "expression", ",", "thus", "its", "stimulation", "tipping", "the", "balance", "towards", "apoptosis", "[", "22", "]", ".", "In", "our", "study", ",", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "significantly", "upregulated", "Bax", "and", "p53", "while", "downregulating", "Bcl-2", ",", "resulting", "in", "an", "elevated", "Bax", "/", "Bcl-2", "ratio", ",", "a", "key", "indicator", "of", "apoptosis", "activation.", "Previous", "research", "reported", "that", "elevated", "p53", "expression", "and", "a", "higher", "Bax", "/", "Bcl-2", "ratio", "correlate", "with", "increased", "tumor", "sensitivity", "to", "anticancer", "therapies", "[", "23", "]", ",", "further", "supporting", "the", "potential", "of", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "as", "a", "therapeutic", "agent.", "Given", "these", "findings", ",", "it", "is", "essential", "to", "contextualize", "the", "anticancer", "activity", "of", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "by", "comparing", "it", "to", "established", "cervical", "cancer", "treatments", ",", "such", "as", "cisplatin", "and", "paclitaxel.", "Cisplatin", "exerts", "its", "cytotoxic", "effects", "primarily", "through", "DNA", "cross-linking", ",", "causing", "extensive", "DNA", "damage", "that", "leads", "predominantly", "to", "G2", "/", "M", "cell", "cycle", "arrest", "and", "subsequent", "apoptosis", "induction", "mainly", "via", "p53-dependent", "pathways", "[", "24", ",", "25", "]", ".", "Despite", "its", "efficacy", ",", "cisplatin", "is", "often", "limited", "by", "severe", "adverse", "effects", ",", "including", "nephrotoxicity", ",", "neurotoxicity", ",", "and", "drug", "resistance", "[", "25", "]", ".", "Paclitaxel", ",", "another", "cornerstone", "treatment", ",", "acts", "by", "stabilizing", "microtubules", ",", "causing", "prolonged", "G2", "/", "M", "mitotic", "arrest", "and", "promoting", "apoptosis", "through", "a", "p53-independent", "pathway", "involving", "cyclin", "B1", "/", "CDC2", "activation", "and", "Bcl-2", "phosphorylation", "[", "24", ",", "26", "]", ".", "However", ",", "paclitaxel", "similarly", "has", "clinical", "limitations", ",", "including", "dose-dependent", "toxicities", "such", "as", "peripheral", "neuropathy", "and", "myelosuppression", "[", "27", "]", ".", "In", "contrast", ",", "our", "findings", "demonstrate", "that", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", "distinctly", "arrests", "cells", "at", "the", "G0", "/", "G1", "phase", "and", "promotes", "apoptosis", "via", "a", "p53-dependent", "pathway.", "These", "unique", "molecular", "characteristics", "suggest", "a", "complementary", "role", "alongside", "traditional", "chemotherapeutics", ",", "potentially", "reducing", "toxicities", "and", "overcoming", "drug", "resistance", ",", "despite", "its", "relatively", "high", "IC50.", "The", "chemical", "profile", "of", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", ",", "analyzed", "via", "GC-MS", "/", "FID", "detection", ",", "revealed", "a", "high", "content", "of", "phytol", "(", "65.74", "%", ")", "in", "unsaponifiable", "matter", ",", "a", "compound", "known", "for", "its", "broad-spectrum", "biological", "activities", ",", "particularly", "in", "cancer", "therapy.", "Phytol", ",", "a", "diterpenoid", "derived", "from", "chlorophyll", ",", "has", "been", "widely", "recognized", "for", "its", "anti-inflammatory", "and", "anticancer", "properties", ",", "including", "the", "modulation", "of", "cell", "cycle", "and", "apoptosis", "pathways", "[", "28", "]", ".", "Previous", "studies", "have", "demonstrated", "its", "ability", "to", "induce", "apoptosis", "across", "various", "cancer", "cell", "lines", ",", "including", "lung", ",", "colon", ",", "and", "breast", "cancers", ",", "primarily", "through", "the", "disruption", "of", "mitochondrial", "membrane", "potential", "and", "subsequent", "activation", "of", "the", "intrinsic", "apoptotic", "pathway", "[", "28", ",", "29", "]", ".", "Our", "findings", ",", "which", "show", "significant", "G0", "/", "G1", "cell", "cycle", "arrest", "and", "apoptosis", "in", "HeLa", "cells", ",", "align", "with", "these", "established", "mechanisms", "of", "action", ",", "further", "validating", "phytol’s", "role", "as", "a", "potent", "anticancer", "agent.", "In", "addition", "to", "phytol", ",", "the", "saponifiable", "matter", "of", "the", "DCM", "fraction", "contained", "palmitic", "acid", "(", "31.27", "%", ")", "and", "linolenic", "acid", "(", "26.98", "%", ")", "as", "the", "major", "components.", "Both", "fatty", "acids", "are", "well-documented", "for", "their", "apoptosis-inducing", "capabilities.", "Palmitic", "acid", ",", "for", "instance", ",", "has", "been", "reported", "to", "upregulate", "pro-apoptotic", "proteins", "such", "as", "Bax", "and", "p53", ",", "while", "downregulating", "anti-apoptotic", "Bcl-2", ",", "leading", "to", "enhanced", "apoptosis", "via", "caspase", "activation", "in", "colorectal", "and", "breast", "cancer", "models", "[", "30", "]", ".", "Similarly", ",", "linolenic", "acid", "exerts", "anticancer", "effects", "by", "modulating", "the", "Bcl-2", "family", "proteins", ",", "increasing", "pro-apoptotic", "Bax", "expression", ",", "and", "inducing", "endoplasmic", "reticulum", "(", "ER", ")", "stress", ",", "which", "contributes", "to", "cancer", "cell", "death.", "Linolenic", "acid", "has", "also", "been", "shown", "to", "inhibit", "the", "PI3K", "/", "Akt", "signaling", "pathway", "and", "suppress", "fatty", "acid", "synthase", "(", "FASN", ")", ",", "an", "enzyme", "overexpressed", "in", "many", "cancers", "[", "31", "]", ".", "Our", "study’s", "findings", "of", "increased", "Bax", "expression", "and", "a", "heightened", "Bax", "/", "Bcl-2", "ratio", "in", "HeLa", "cells", "are", "consistent", "with", "these", "mechanisms", ",", "suggesting", "that", "palmitic", "and", "linolenic", "acids", "likely", "contribute", "to", "the", "cytotoxic", "effects", "observed.", "Despite", "these", "promising", "results", ",", "the", "study", "possesses", "limitations", "typical", "of", "in", "vitro", "investigations.", "Notably", ",", "the", "biological", "complexity", "of", "tumor", "microenvironments", ",", "such", "as", "gene", "expression", "variability", ",", "signaling", "heterogeneity", ",", "immune", "interactions", ",", "and", "stromal", "influences", ",", "can", "not", "be", "adequately", "mimicked", "using", "isolated", "cell", "lines", "like", "HeLa.", "Additionally", ",", "the", "relatively", "high", "IC50", "necessitates", "exploration", "of", "advanced", "drug", "delivery", "systems", "or", "combination", "therapies.", "Future", "research", "should", "incorporate", "additional", "cancer", "cell", "lines", ",", "normal", "cell", "toxicity", "assessments", ",", "patient-derived", "xenografts", "(", "PDX", ")", ",", "and", "innovative", "delivery", "strategies", ",", "such", "as", "nanoparticle", "encapsulation", ",", "to", "enhance", "efficacy", ",", "reduce", "toxicity", ",", "and", "facilitate", "clinical", "translation.", "These", "steps", "are", "crucial", "for", "validating", "the", "preclinical", "promise", "and", "advancing", "the", "clinical", "applicability", "of", "the", "Alnus", "incana", "DCM", "fraction.", "Conclusion", "This", "study", "demonstrates", "that", "the", "A.", "incana", "DCM", "fraction", ",", "rich", "in", "bioactive", "compounds", "such", "as", "phytol", ",", "palmitic", "acid", ",", "and", "linolenic", "acid", ",", "exerts", "notable", "cytotoxic", "effects", "on", "various", "cancer", "cell", "lines", ",", "particularly", "HeLa", "cells.", "These", "effects", "are", "mediated", "through", "inducing", "G0", "/", "G1", "cell", "cycle", "arrest", "and", "apoptosis", "via", "modulation", "of", "Bax", ",", "Bcl-2", ",", "and", "p53", "pathways.", "Although", "the", "relatively", "high", "IC50", "value", "(", "135.6", "µg", "/", "mL", ")", "limits", "its", "potential", "as", "a", "standalone", "therapy", ",", "the", "fraction’s", "selective", "cytotoxicity", "toward", "cancer", "cells", "suggests", "a", "potentially", "favorable", "safety", "profile.", "Its", "unique", "ability", "to", "activate", "apoptotic", "and", "cell-cycle", "arrest", "pathways", "supports", "its", "promise", "as", "an", "adjunctive", "therapy", ",", "particularly", "in", "combination", "with", "conventional", "chemotherapeutic", "agents", ",", "which", "may", "improve", "treatment", "outcomes", "by", "reducing", "associated", "toxicities", "or", "overcoming", "resistance.", "Further", "in-depth", "mechanistic", "studies", ",", "along", "with", "rigorous", "in", "vivo", "evaluations", "using", "clinically", "relevant", "models", "such", "as", "patient-derived", "xenografts", ",", "are", "essential", "to", "validate", "these", "promising", "findings", "and", "fully", "realize", "the", "clinical", "potential", "of", "this", "natural", "fraction.", "Source", "paper", ":", "PMC12105127" ]

[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-Tissue", "O", "B-Tissue", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]

[ "Introduction", "Hepatocellular", "carcinoma", "(", "HCC", ")", "is", "an", "exceedingly", "fatal", "malignancies", ",", "with", "mortalities", "that", "approximate", "the", "incidence", "rates", "worldwide", "[", "1", "]", ".", "HCC", "is", "usually", "diagnosed", "at", "advanced", "stages", "owing", "to", "late", "symptom", "manifestations", "with", "limited", "therapeutic", "options", ",", "leading", "to", "ineffective", "intervention", "and", "poor", "prognosis", "[", "2", "]", ".", "An", "increasing", "number", "of", "studies", "have", "focused", "on", "the", "progression", ",", "pathological", "features", ",", "and", "prognosis", "of", "liver", "cancer", "[", "3–5", "]", ".", "HCC", "epidemiology", "is", "rapidly", "evolving", ",", "one", "of", "the", "most", "common", "causes", "is", "non-alcoholic", "fatty", "liver", "disease", "[", "6", "]", ",", "further", "proving", "that", "lipid", "metabolism", "plays", "a", "crucial", "role", "in", "HCC", "occurrence.", "Therefore", ",", "the", "identification", "of", "novel", "therapeutic", "targets", "is", "urgently", "needed", "to", "improve", "the", "treatment", "of", "patients", "with", "HCC", "[", "7", "]", ".", "Phosphatidylethanolamine", "(", "PE", ")", ",", "also", "known", "as", "cephalin", ",", "is", "the", "most", "abundant", "lipid", "in", "the", "cytoplasmic", "layer", "of", "cell", "membranes", "and", "is", "involved", "in", "cellular", "processes", "such", "as", "membrane", "fusion", "[", "8", "]", ",", "autophagy", "and", "apoptosis", "[", "9–11", "]", ".", "For", "eukaryotic", "PE", "in", "vivo", ",", "two", "main", "synthetic", "pathways", "exist", "[", "12", "]", ":", "including", "the", "Kennedy", "pathway", "of", "CDP-ethanolamine", "(", "CDP-Etn", ")", "and", "mitochondrial", "phosphatidylserine", "decarboxylation", "pathway", "[", "13", "]", ".", "Phosphatidylethanolamine", "cytidyltransferase", "2", "(", "PCYT2", ")", "is", "the", "rate-limiting", "enzyme", "of", "the", "CDP-Etn", "pathway.", "Previous", "studies", "have", "shown", "that", "PCYT2", "is", "highly", "specific", ",", "and", "is", "present", "only", "in", "the", "rough", "endoplasmic", "reticulum", "of", "eukaryotes", "[", "14", "]", ".", "P-Eth", "is", "then", "catalyzed", "by", "PCYT2", "to", "form", "CDP-Etn", ",", "leading", "to", "PE", "synthesis", "[", "15", "]", ".", "Generally", ",", "PCYT2", "expression", "is", "reduced", "in", "various", "epithelial-derived", "cancer", "cell", "lines", "compared", "to", "normal", "cells", "[", "16,17", "]", ".", "Compared", "epithelial-derived", "cancer", "cell", "lines", "PCYT2", "activity", "with", "that", "of", "breast", "epithelial", "cells", "MCF-10A", "showed", "that", "its", "PCYT2", "activity", "was", "inhibited", "in", "breast", "cancer", "cells", "(", "MCF-7", ")", "[", "16", "]", ".", "PCYT2", "expression", "was", "significantly", "reduced", "in", "invasive", "human", "metastatic", "colon", "cancer", "cells", "compared", "to", "that", "in", "primary", "tumor", "cells", "[", "17", "]", ",", "and", "previous", "studies", "have", "shown", "that", "PCYT2", "knockdown", "under", "nutrient-rich", "conditions", "significantly", "facilitated", "the", "proliferation", "of", "HeLa", "and", "T98G", "cells", "and", "promoted", "in", "vivo", "tumor", "growth.", "The", "inhibition", "of", "PCYT2", "increases", "P-Etn", "levels", "in", "cancer", "cells", "and", "stimulates", "tumor", "growth", "[", "18", "]", ".", "However", ",", "in", "organoid", "models", ",", "PCYT2", "knockdown", "inhibits", "cell", "growth", "[", "19", "]", ".", "Despite", "these", "findings", ",", "no", "evidence", "exists", "that", "suggests", "that", "PCYT2", "expression", "is", "associated", "with", "HCC", "occurrence", "and", "development.", "This", "study", "aimed", "to", "investigate", "the", "role", "of", "PCYT2", "in", "human", "hepatocellular", "carcinoma", "cells", "(", "HepG2", ")", "by", "inhibiting", "their", "proliferation", ",", "invasion", ",", "and", "migration", "abilities", "and", "promoting", "cell", "apoptosis.", "Materials", "and", "methods", "Cell", "viability", "analysis", "HepG2", "cells", "were", "seeded", "into", "96-well", "plates", "and", "incubated", "with", "a", "Cell", "Counting", "kit", "(", "CCK-8", ")", "solution", "for", "40", "min", "at", "37°C.", "Absorbance", "was", "measured", "at", "450", "nm", "using", "a", "Spectra", "MAX", "M5", "microplate", "spectrophotometer", "to", "detect", "cell", "viability.", "Invasion", "experiment", "Dilute", "the", "Matrigel", "with", "basal", "medium", "(", "1:8", ")", ",", "lay", "it", "flat", "on", "a", "Transwell", "membrane", ",", "and", "incubate", "at", "37°C", "for", "4", "h.", "The", "subsequent", "experimental", "steps", "were", "identical", "to", "those", "used", "for", "the", "migration", "assay", ",", "including", "cell", "culture", ",", "paraformaldehyde", "fixation", "and", "0.1", "%", "crystal", "violet", "staining.", "Animal", "experiments", "Five-week-old", "BALB", "/", "c", "female", "nude", "mice", "were", "purchased", "from", "Jiangsu", "Jicui", "Pharmaceutical", "Biotechnology", "Co", ",", "passed", "SPF", "level", "training", "and", "assessment", ",", "and", "were", "routinely", "reared", "using", "standard", "SPF", "conditions.", "PCYT2", "overexpressed", "HepG2", "cells", "and", "control", "cells", "were", "subcutaneously", "injected", "into", "the", "left", "and", "right", "sides", "of", "the", "nude", "mice", "(", "approximately", "1", "×", "107", "cells", "on", "each", "side", ",", "n", "=", "6", "tumors", "in", "each", "group", ")", ".", "Following", "20–25", "d", ",", "the", "tumors", "achieved", "a", "certain", "size", "and", "the", "micewere", "anesthetized", "with", "isopentane", "and", "sacrificed", ";", "the", "tumors", "were", "collected", "for", "follow-up", "evaluation.", "The", "animal", "experiments", "were", "approved", "by", "the", "Animal", "Ethics", "Committee", "of", "Anhui", "Medical", "University", "and", "conducted", "in", "accordance", "with", "the", "guidelines", "for", "the", "care", "and", "use", "of", "laboratory", "animals.", "Statistical", "analysis", "Data", "were", "analyzed", "using", "GraphPad", "Prism", "software", "(", "version", "8.0", ")", ",", "and", "the", "results", "were", "expressed", "as", "mean", "±", "standard", "deviation", "(", "SD", ")", ".", "T-test", "was", "performed", "to", "determine", "the", "significant", "of", "differences", "between", "two", "groups.", "A", "one-way", "analysis", "of", "variance", "was", "used", "for", "comparison", "across", "groups.", "Statistical", "significance", "was", "set", "at", "P", "***Results***", "Discussion", "PCYT2", "is", "a", "rate-limiting", "enzyme", "in", "PE", "synthesis", "that", "is", "commonly", "used", "in", "the", "study", "of", "obesity-related", "diseases", ",", "such", "as", "non-alcoholic", "fatty", "liver", "disease", "and", "type", "2", "diabetes", "[", "12,20–22", "]", ".", "Recently", ",", "interest", "in", "the", "role", "of", "PCYT2", "in", "cancer", "has", "been", "growing", "[", "18,23,24", "]", ".", "Previous", "studies", "show", "that", "PCYT2", "has", "different", "roles", "in", "various", "cancers", "and", "cancer", "settings.", "For", "instance", ",", "in", "metastatic", "colorectal", "cancer", "(", "CRC", ")", ",", "PCYT2", "is", "significantly", "downregulated", "and", "functions", "as", "a", "tumor", "metastasis", "inhibitor", "[", "25", "]", ".", "In", "human", "breast", "cancer", "cells", "(", "MCF-7", ")", ",", "the", "level", "of", "PCYT2", "in", "cancer", "cells", "is", "elevated", "in", "response", "to", "the", "stressful", "environment", "[", "26", "]", ".", "Our", "findings", "show", "that", "PCYT2", "expression", "is", "abnormally", "downregulated", "in", "HepG2", "cells", ",", "which", "is", "consistent", "with", "that", "of", "previous", "studies", "where", "in", "PCYT2", "expression", "was", "downregulated", "in", "MCF-7", "and", "invasive", "human", "metastatic", "CRC", "[", "16,17", "]", ".", "Although", "PCYT2", "regulates", "several", "human", "cancers", "[", "18,19,23", "]", ",", "its", "role", "in", "HCC", "cells", "remains", "unknown.", "Based", "on", "the", "literature", "and", "our", "findings", ",", "PCYT2", "in", "human", "cancers", "appears", "to", "have", "a", "consistent", "expression", "profile", "in", "human", "cancers", ",", "irrespective", "of", "tumor", "origin", "or", "location", "[", "27", "]", ".", "Regarding", "the", "mechanism", "whereby", "PCYT2", "influences", "cancer", "development", ",", "a", "previous", "report", "showed", "that", "PCYT2", "downregulation-induced", "phosphoethanolamine", "(", "PEtn", ")", "accumulation", "correlated", "with", "tumor", "growth", "under", "nutrient", "starvation", ",", "thereby", "PCYT2", "overexpression", "reduced", "PEtn", "levels", "and", "tumor", "growth", "[", "18", "]", ".", "However", ",", "in", "the", "present", ",", "we", "found", "that", "CDP-Etn", "supplementation", "inhibited", "HCC", "migration", ",", "invasion", "and", "proliferation.", "In", "our", "previous", "study", ",", "we", "showed", "that", "the", "levels", "of", "BAX", "and", "cleaved", "caspase-3", "were", "significantly", "increased", "whereas", "Bcl-2", "was", "significantly", "reduced", "in", "the", "livers", "of", "type", "2", "diabetic", "mice", "and", "L02", "cells", "after", "stimulation", "with", "high", "glucose", "and", "free", "fatty", "acids", "(", "HG", "&", "FFA", ")", "(", "12", ")", ".", "CDP-Etn", "(", "100", "μM", ")", "protected", "cells", "from", "HG", "&", "FFA-induced", "apoptosis", "by", "reducing", "BAX", "and", "cleaved", "caspase-3", "levels", "as", "well", "as", "and", "increasing", "Bcl-2", "levels", "[", "12", "]", ".", "Whether", "PCYT2", "downregulation", "induced", "PEtn", "accumulation", "contributes", "to", "HCC", "development", "further", "study.", "Increasing", "evidence", "suggests", "that", "PCYT2", "is", "aberrantly", "expressed", "in", "various", "models", "of", "liver", "disease", "and", "may", "predict", "clinical", "outcomes", "in", "patients.", "PCYT2", "is", "instrumental", "in", "the", "deregulation", "of", "these", "processes", "leading", "to", "the", "development", "of", "obesity", ",", "insulin", "resistance", ",", "liver", "steatosis", "and", "dyslipidemia", "[", "28", "]", ".", "CDP-Etn", "supplementation", "has", "been", "reported", "to", "alleviate", "PCYT2", "deficiency", "engendering", "age-dependent", "and", "insulin-resistant", "non-alcoholic", "steatohepatitis", "to", "improve", "patient", "prognosis", "[", "20,29–31", "]", ".", "Chronic", "administration", "of", "peroxisome", "proliferators", "can", "increase", "the", "content", "of", "hepatic", "PC", "and", "PE", "for", "hepatomegaly", "and", "proliferation", "as", "well", "as", "cause", "liver", "cancer", "in", "rodents", "[", "32,33", "]", ".", "Based", "on", "the", "current", "studies", ",", "we", "hypothesized", "that", "PCYT2", "may", "be", "involved", "in", "the", "regulation", "of", "cellular", "processes", "in", "HCC.", "Therefore", ",", "we", "utilized", "in", "vivo", "and", "in", "vitro", "validation", "methods", "to", "assess", "the", "expression", "and", "mechanistic", "roles", "of", "PCYT2", "in", "liver", "cancer", "cells.", "Herein", ",", "PCYT2", "overexpression", "was", "determined", "to", "inhibit", "HCC", "cell", "proliferation", ",", "migration", "and", "invasion", "both", "in", "vitro", "and", "in", "vivo.", "And", ",", "the", "number", "and", "morphology", "of", "mitochondria", "in", "HCC", "cells", "overexpressing", "PCYT2", "were", "significantly", "different", "from", "those", "in", "HCC", "cells", "without", "any", "treatment", ",", "such", "as", "a", "decrease", "in", "the", "number", "of", "mitochondria", "and", "swelling", "of", "the", "mitochondria.", "These", "changes", "suggest", "that", "PCYT2", "affects", "the", "mitochondrial", "function", "of", "cells.", "Notably", ",", "when", "the", "HepG2", "cells", "received", "CDP-Etn", "supplementation", ",", "their", "proliferation", ",", "migration", ",", "and", "invasion", "were", "inhibited", "in", "vitro.", "Notably", ",", "the", "ATP", "level", "decreased", "in", "HCC", "cells", "following", "the", "overexpression", "of", "PCYT2", ",", "and", "the", "cells", "were", "found", "to", "be", "accompanied", "by", "mitochondrial", "damage", "using", "transmission", "electron", "microscopy.", "However", ",", "previous", "reports", "have", "indicated", "that", "PCYT2", "is", "present", "only", "in", "the", "endoplasmic", "reticulum", "of", "hepatocytes", "[", "14,34", "]", ".", "Additionally", ",", "the", "phenotype", "of", "liver", "PCYT2-", "/", "-", "knockout", "mice", "showed", "no", "signs", "of", "liver", "injury", ",", "however", ",", "they", "experienced", "massive", "accumulation", "of", "liver", "triglycerides", "(", "TAG", ")", "[", "35", "]", ".", "Therefore", ",", "we", "hypothesized", "that", "the", "influence", "of", "PCYT2", "on", "mitochondrial", "function", "is", "mediated", "by", "metabolites", "such", "as", "TAG", ",", "DAG", ",", "and", "PE.", "However", ",", "further", "studies", "are", "needed", "to", "clarify", "whether", "the", "PCYT2", "exerted", "inhibition", "of", "HCC", "cells", "alleviates", "mitochondrial", "damage.", "As", "understanding", ",", "the", "mechanism", "whereby", "PCYT2", "overexpression", "causes", "mitochondrial", "damage", "will", "deepen", "our", "understanding", "of", "PCYT2", "regulation", "in", "HCC", "cells.", "In", "conclusion", ",", "this", "study", "provided", "compelling", "data", "demonstrating", "the", "aberrant", "expression", "and", "functional", "role", "of", "PCYT2", "in", "HepG2", "cells.", "PCYT2", "expression", "levels", "were", "lower", "in", "HepG2", "than", "in", "L02.", "Furthermore", ",", "PCYT2", "overexpression", "in", "HepG2", "cells", "induced", "mitochondrial", "damage", ";", "inhibited", "proliferation", ",", "invasion", ",", "and", "migration", ";", "and", "promoted", "cell", "apoptosis.", "Source", "paper", ":", "PMC12118871" ]

[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "I-CellLine", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellType", "I-CellType", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "B-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "B-CellLine", "I-CellLine", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]

["Results","IFN-γ","significantly","induced","STAT1","phosphorylation",",","leading","to","a","time(...TRUNCATED)

["O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O"(...TRUNCATED)

["Materials","and","methods","Statistical","analysis","All","experiments","were","performed","at","l(...TRUNCATED)

["O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O"(...TRUNCATED)

["Introduction","The","introduction","of","antiretroviral","therapy","(","ART",")","has","successful(...TRUNCATED)

["O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O"(...TRUNCATED)

["Results","Dcas9-targeted","hiv-1","ltr-interactome","analysis","identified","prmt3","as","a","ltr-(...TRUNCATED)

["O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O","O"(...TRUNCATED)