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热稳定性有关。此酶的作用专一性较差(图4-9)，常用于断裂较短的多肽链或大肽段。
$\smiles{NC([])C(=O)NC([])C(=O)NC([*])C(=O)} $
| 胰蛋白酶 | R₁ = Lys 或 Arg 侧链(要求, 水解速度快); AECys (能水解,速度较慢) R₂ = Pro (抑制水解) |
| 糜蛋白酶 | R₁ = Phe、Trp 或 Tyr (水解速度快); Leu、Met 或 His (水解速度次之) R₂ = Pro (抑制水解) |
| 嗜热菌蛋白酶 | R₁ = Leu、Ile、Phe、Trp、Val、Tyr 或 Met (疏水性强的残基,水解速度快) R₂ = Gly或Pro(不水解) R₃ 或 R₄ = Pro (抑制水解) |
| 胃蛋白酶 | R₁ 和/或 R₂ = Phe、Leu、Trp、Tyr 以及其他疏水性残基(水解速度好) R₁ = Pro (不水解) |
图 4-9 几种蛋白水解酶(内肽酶)的专一性
(4) 胃蛋白酶(pepsin) 它的专一性与糜蛋白酶类似，但它要求断裂点两侧的残基都是疏水性氨基酸，如 Phe—Phe。此外与糜蛋白酶不同的是酶作用的最适 pH，前者是 pH 2，后者是 pH 8~9。由于二硫键在酸性条件下稳定，因此确定二硫键位置时，常用胃蛋白酶来水解。
(5) 木瓜蛋白酶(papsin)专一性差，断裂位点与其附近的序列关系密切，它对Arg和Lys残基的羧基端肽键敏感。木瓜蛋白酶在番木瓜(Carica papaya)果中很丰富，另一个类似的蛋白酶是凤梨中的菠萝蛋白酶(bromelain)。
(6) 葡萄球菌蛋白酶和梭菌蛋白酶 近年来发现的几种高专一性肽链内切酶，在蛋白质序列测定中很有前途，对相对分子质量比较大的多肽链采用逐级专一性降解是相当理想的。葡萄球菌蛋白酶(Staphylococcal protease)和梭菌蛋白酶(clostripain)就是其中的两个。
葡萄球菌蛋白酶亦称 Glu 蛋白酶，它是从金黄色葡萄球菌菌株 Vs(Staphylococcus aureus, strain Vs) 中分离得到的，是近来发现的最有效、应用最广泛的一种蛋白酶。酶相对分子质量为 12 000。当在磷酸缓冲液 (pH 7.8) 中进行裂解时，它能在 Glu 残基和 Asp 残基的羧基端断裂肽键。如果改用碳酸氢铵缓冲液 (pH 7.8) 或醋酸铵缓冲液 (pH 4.0) 时，则只能断裂谷氨酸残基羧基端的肽键。
梭菌蛋白酶或称 Arg 蛋白酶，它是从溶组织梭状芽孢杆菌(Clostridium histolyticum)中分离出来的。此酶专门裂解 Arg 残基的羧基端肽键。即使在 6 mol/L 尿素中 20 h 内仍具活力，这样对不溶性蛋白质的长时间裂解将是很有效的。
2. 化学裂解法
用化学裂解法获得的肽段一般都比较大,适合在自动序列仪中测定序列,因此化学法对相对分子质量大的蛋白质序列测定是很重要的。
(1) 用溴化氰断裂溴化氰(cyanogen bromide)只断裂由甲硫氨酸残基的羧基参加形成的肽键。由于大多数蛋白质只含有很少的甲硫氨酸，因此CNBr裂解产生的肽段不多：这些肽段可以用胰蛋白酶处理使成更小的肽段。断裂反应在70%甲酸中进行，这样可以使卷曲的多肽链松散开来，以便暴露出甲硫氨酸侧链，有利于和CNBr发生作用。反应的第一步是甲硫氨酸残基硫原子的孤电子对对溴化氰的碳发生亲核攻击生成溴化氰基硫(cyanosulfonium bromide)中间物并释放出Br离子。第二步是Met的羰基氧对侧链R基发生亲核攻击生成环化溴化亚氨内酯(iminolactone bromide)和甲基硫氰酸。第三步环化衍生物遇水，Met残基的羧基端肽键发生断裂，C-末端为高丝氨酸内酯残基(N-末端肽段)和多肽链的原C-末端肽段。前一肽段的C-末端环酯之所以称高丝氨酸内酯是因为它可以看成是由带有$-CH_{2}-CH_{2}OH$