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用枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)限制性水解RNase，在20和21(Ala-Ser)氨基酸残基之间断裂，得到S肽(20肽)和S蛋白(104肽)，在变性溶剂中用层析法分离，所得产物在除去变性剂后仍无活性。若在中性pH下将2个肽段共同保温，则S肽和S蛋白依靠次级键结合，可恢复全部活性，叫做RNase S。具有S肽氨基末端的13个残基的合成肽和S蛋白合并时，发现能恢复70%的活性，说明氨基酸残基14-20对催化并非必需。但是若缺少His${12}$和Met${13}$只含有11个残基的肽，则不能恢复活性。
图 10-19 牛胰核糖核酸酶的氨基酸顺序
核糖核酸酶是第一个从氨基酸完全合成的酶，最终产物与天然核糖核酸酶在酶学性质上毫无区别。4个二硫键在图中以高棒表示，在活性部位中有3个重要的残基 $His_{12}$、$His_{19}$ 和 $Lys_{41}$。参与底物与活性部位结合的其他基团有 $Thr_{43}$、$Val_{43}$ 和 $Php_{129}$。
用化学修饰法研究 RNase A 活性的必需氨基酸残基。在 pH5.5 下，用等摩尔碘乙酸处理 RNase A，羧甲基化的 His₁₁₉ 是主要产物，而羧甲基化的 His₁₂ 产物较少（图 10-20）。RNase A 中其他组氨酸对这个试剂的反应性弱得多。所得 RNase A 的两个羧甲基化的衍生物均无活性，因此可以推测 His₁₁₉ 和 His₁₂ 为酶活性的必需基团。
$\smiles{[O-]C(=O)CN1C=NC=C1CC(NC=O)C=O}$
1-CM Hisus
$\smiles{[O-]C(=O)CN1C=NC(CC(C=O)NC=O)=C1}$
3-CM Hisg:
图 10·20 当 RNase A 以等摩尔量的碘乙酸处理时，得到 2 个主要产物 His₁₁₉ 和 His₁₂ 的羧甲基化衍生物