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Abridged English version Introduction The anticline of Jbel Kharrou, localised 25 km east of the Skhour Rehamna region, consists of Palaeozoic argillaceous formations belonging to the Hercynian Rehamna block, located in the western part of Moroccan Meseta Few studies are related to this block Based on the geographical distribution of the Palaeozoic outcrops of Rehamna, two sub-domains, separated by discontinuous plateaus of Cretaceous formations, are distinguished : ( i ) septentrional Rehamna in the north, and ( ii ) western, central and eastern Rehamna in the south The studied sector (the anticline of Jbel Kharrou) belongs to the unit of the eastern Rehamna ; it is composed of terranes of Ordovician age, of terrigenous nature The latter are organized, from bottom to the top , in three formations : the formation of Drioukat (113 m) : composed of bioturbated micaceous sandstones, of gray colour, to argillaceous-micaceous beds, this formation is allotted to Lower Arenig ; the formation of Demja (200 m) : it presents a progressive change passing from the micaceous sandstones to argillaceous deposits ; the formation of Allahia (150 m), consisted quartzitic of sandstone ; it is allotted to Caradoc The Demja formation consists of sandy clays, rich in floated and faded micas The colour is whitegrey, becoming more and more dark in-depth It contains two quartzitic bars : the lower one is lenticular, visible on a distance of 1. 5 km ; the upper bar outcropping on all the area of Jbel Kharrou is allocated by diaclases with hematite platings The thickness of this formation exceeds 200 m and its extension is 4. 5 km The deposits under the lower quartzitic bar are related to the Ordovician ; Destombes (1971) arranged them in Middle or Lower Arenig The presence of graptolites in the sediments between the two quartzitic bars suggests an Upper Arenig to Llanvirn age Within the framework of a research task initiated by the Spanish company Minera Sabater, SARL, on the opportunity to use clays of the Ordovician formation of the Jbel Kharrou anticline in ceramics, we were brought to make a study focused on their geological context and to proceed to the determination of their geochemical, mineralogical and technological characteristics This study concerns two samples B1 and B2, the most representative, taken from the surface of white clays of the Demja formation The convincing results provided by these two samples led to the realization of four boreholes to study the in-depth evolution of the carrying formation and to determine the potentialities of the sector Several samples, taken in drilling cores, were studied in the laboratory of Minera Sabater in Spain ; they will be the subject of a later publication Experimental results Granulometric analyses This analysis was carried out under water and the refusal of each sieve was dried and weighed The percentages of the various classes of particle-size are given in and The following remarks are essential : the percentage of the elements whose diameter is higher than 50 m is negligible : approximately 1% for the sample B1 and 4% for the sample B2 ; the percentage of the elements whose diameter is lower than 2 m (clays) is very high : 42. 3% for the sample B1 and 39. 1% for the sample B2 ; the granulometry of the studied samples is excellent for use in ceramics The problem of the elements whose diameter is higher than 50 m can be corrected by a simple crushing and sifting Chemical analysis The results of the chemical analyses related to the major elements, the ion sulphates (SO 4 ) and the loss on the ignition are presented in These analyses show a moderately high content of TiO 2 , Fe 2 O 3 can be regarded as acceptable for the use in ceramics The K 2 O content is very high ; it is probably related to the presence of the micas The contents recorded of SO 4 and CaO attest the presence of the gypsum The Al 2 O 3 content is weak, but SiO 2 seems however relatively high for a plastic clay By comparing this clay with a fireclay whose alumina rate is higher than 45% , the alkaline fluxes (K 2 O and Na 2 O) and the alkaline-earth (MgO and CaO) lower than 4% , it can be remarked that the clay of Jbel Kharrou is very plastic and is cooked white since the percentage in TiO 2 and Fe 2 O 3 is lower than 1. 5% The problem of sulphur will be corrected by the addition of barium carbonate to the paste, which will form a more stable barium sulphate Mineralogical analysis The used of the X-ray diffraction method, carried out on two powder samples B1 and B2, provides the determination of the various mineralogical phases and their respective rates according to the Powder Diffraction File data base The results in show the predominance of illite, presenting favourable properties for ceramic use The other argillaceous components are negligible The content of quartz is very tolerable since it can be easily digested by vitreous flow during cooking The mineralogical analyses are in accordance with the chemical analyses White clays of the Demja formation are very plastic and can be interesting in the manufacturing of ceramic pastes, which can be confirmed by industrial tests Flow In a barbotine composed of 220 g of clay and 200 ml of water, increasing quantities of deflocculant were gradually added After agitation during 15 min, the viscosity of barbotine was measured The results of this study are presented in and It was noted, that from 0. 53% of the deflocculant contents, viscosity is minimal and stable The white clay samples B1 and B2 also have an optimal flow at 0. 53% of deflocculant Technological characteristics The determination of the technological characteristics was realized on test briquettes whose higher face is marked by two lines according to the diagonals used to measure the withdrawal due to drying and cooking The briquettes were dried at 110 C, and then cooked at various temperatures Dilatometry It consists on the study of dilation and the withdrawal of dried briquettes at various temperatures The rise in temperature was carried out at the rate/rhythm of 3 C/min until 1200 C The length recorded between the two lines on briquette is 10 mm The formula applied for the determination of the rates of dilation is : placeholder formula where placeholder formula is length between the two marks recorded on briquette before cooking (it is adjusted with 10 mm), placeholder formula length between the two marks recorded on briquette after cooking at the temperature t The results obtained are given in They show that between 950 and 1040 C, the fusible phase appears mainly This mean interval of temperature (90 C) gives the opportunity to the grains to react correctly between them and to give materials that will resist to the deformation at high temperatures, favourable asset for the ceramic production The curve of dilatometry shows that clays of the formation of Demja will be charged until a temperature of 1040 C Mechanical resistance to the flexion The measurement of the resistance in kg f/cm 2 that a briquette can develop against the flexion under a load applied by an apparatus of the type NETSZH, is given by the following formula : placeholder formula where R is the mechanical resistance to the flexion, P the force in placeholder formula that causes the rupture of the briquette, l the width of briquette, and e the thickness of briquette The test was carried out on cooked briquettes at 950, 1000, 1050, and 1100 C The results obtained on the two studied samples are resumed in The mechanical resistance to the flexion increases with vitrification up to a high level of resistance, then the material becomes breakable For the two samples, the temperature of 1050 C represents the limit of the mechanical resistance to the flexion Loss in weight with cooking The reduction in the weight of each briquette between drying with 110 C and the various temperatures of cooking is given by the following formula : placeholder formula where placeholder formula is mass sample with 110 C, placeholder formula mass of cooked sample at the temperature t At 500 C, the product loses its boiler feed water Between 700 and 900 C, several chemical reactions as oxidation of FeO, decomposition of sulphates, nitrates and of carbonates happen The percentages of the weight loss at temperatures of 950, 1000, and 1050 C are provided in The percentages are very tolerable (7%), which makes this material very profitable for the industrial exploitation Withdrawal with cooking The determination of the value of withdrawal is done by the study of the variation of the average lengths of the lines recorded on briquettes between drying at 110 C and cooking at various temperatures The following formula allows the calculation of the withdrawal cooking : placeholder formula where placeholder formula is the length after cooking, and placeholder formula the length after drying at 110 C The percentages of the withdrawal to cooking determined at cooking temperatures of 950, 1000, and 1050 C, are given in The withdrawal increases with the vitrification of the material studied at high temperatures of cooking The reduction in the volume of the material is generally due to the progressive disappearance of porosity The evolution of apparent volume depends on the dilatometry which highlights a reduction in the volume involving a compaction of material by disappearance of the intergranular vacuums Colour after cooking At 1050 C, briquettes of the two samples B1 and B2 have a very favourable colour (whitecream), but it becomes dark with the increasing of the cooking temperature Conclusion The mineralogical analysis of the samples B1 and B2, taken in the outcrop of the Demja formation, indicates the presence of the illites as the main mineral, quartz and some other minerals in traces The chemical analyses and the technological tests show suitable industrial characteristics of these clays The withdrawal with cooking, slightly high (12%), can be corrected by the addition of a grease-remover (sands, crushed glass, grogs, feldspars, pegmatites or other substances with no hydraulic character) Clays of the Ordovician of the Demja formation belonging to the Jbel Kharrou anticline, Rehamna, can also be regarded as plastic clay able to find application in ceramic industry Introduction L'anticlinal de Jbel Kharrou, localisé à 25 km à l'Est de la ville de Skhour Rehamna, est constitué de formations argileuses paléozoïques faisant partie du massif hercynien des Rehamna, situé dans la partie occidentale de la Méséta marocaine Les études relatives à ce massif sont peu nombreuses Le travail le plus détaillé a été réalisé par Hoeppfner sur les Rehamna orientaux ; ce dernier a mis l'accent sur le matériel paléozoïque et son évolution hercynienne L'étude de Michard sur le massif paléozoïque des Rehamna, a apporté plus de données sur la tectonique, la stratigraphie et la pétrogenèse dans le secteur D'autres auteurs, notamment Destombes et al ont contribué à l'étude de la stratigraphie du massif des Rehamna Se basant sur la répartition géographique des affleurements paléozoïques des Rehamna, deux sous-domaines, séparés par des placages discontinus de formations crétacées , sont distingués : ( i ) les Rehamna septentrionaux au nord, et ( ii ) les Rehamna occidentaux, centraux et orientaux au sud Le secteur étudié (l'anticlinal de Jbel Kharrou) appartient à l'unité des Rehamna orientaux ; il est composé de terrains d'âge Ordovicien, de nature terrigène Ces derniers sont organisés, du bas vers le haut, en trois formations : la formation de Drioukat (113 m) : constituée de grès micacés bioturbés, de teinte grise, à lits argilo-micacés, cette formation est attribuée à l'Arenig inférieur ; la formation de Demja (200 m) : elle présente un changement progressif passant des grès micacés à des dépôts argileux ; la formation d'Allahia (150 m) : constituée de grès quartzitiques, est attribuée au Caradoc La deuxième formation dite de Demja est constituée d'argiles sableuses riches en micas flottés et décolorés (altérés) La couleur est blancgris, devenant de plus en plus foncée en profondeur Cette formation renferme deux barres quartzitiques : une barre inférieure lenticulaire, visible sur une distance de 1, 5 km, et une barre supérieure présentant des diaclases souvent à placages d'hématite ; celle-ci affleure sur toute la région de Jbel Kharrou La puissance de cette formation dépasse 200 m et son extension est de 4, 5 km Les dépôts sous la barre quartzitique inférieure sont attribués à l'Ordovicien ; Destombes les a rangés dans l'Arenig moyen ou inférieur La présence de graptolites dans les sédiments encadrés par les deux barres quartzitiques a permis de les dater de l'Arenig supérieur et Llanvirn Il est à signaler qu'au Maroc, les études intéressant les séries argileuses paléozoïques sont rares ; on cite les études établies par Destombes et Jeannette , Mazéas et Malecha sur les argiles céramiques siluriennes de Taghjicht Les travaux présentés par El Khachani en 1987 et en 1996 ont porté, d'une part sur l'étude des faciès argileux du Paléozoïque dans la région de Benhmed, d'autre part sur les possibilités d'emploi en céramique des argiles paléozoïques de quelques régions du domaine mésétien Aucune étude plus récente n'a été effectuée jusqu'à présent dans les formations, objets de notre contribution Dans le cadre d'un travail de recherche initié par la société espagnole Minera Sabater, SARL sur la possibilité d'emploi en céramique des argiles de la formation ordovicienne de l'anticlinal de Jbel Kharrou, nous avons été amenés à réaliser une étude approfondie sur leur contexte géologique et à procéder à la détermination de leurs caractères géochimiques, minéralogiques et technologiques Nos premières recherches avaient porté sur deux échantillons B1 et B2 les plus représentatifs, prélevés en surface des argiles blanches de la formation de Demja Les résultats probants fournis par ces deux échantillons ont conduit à la réalisation de quatre sondages carottés pour étudier l'évolution en profondeur de la formation porteuse et déterminer les potentialités du secteur Plusieurs échantillons, prélevés des carottes des sondages, ont été étudiés dans le laboratoire de Minera Sabater en Espagne ; ils feront l'objet d'une publication ultérieure La présente note est une mise au point, d'une part sur le contexte géologique de ces argiles, d'autre part sur les différents résultats fournis par les études de caractérisation et les tests technologiques, réalisés sur les deux échantillons B1 et B2 Nous rappelons que deux échantillons de couleur blanche B1 ( placeholder formula , placeholder formula ) et B2 ( placeholder formula , placeholder formula ), prélevés des affleurements, ont fait l'objet d'analyses granulométriques, chimiques, minéralogiques et technologiques pour l'évaluation de l'aptitude de ces argiles à être utilisées dans les domaines de la céramique Ces analyses sont faites au laboratoire Minera Sabater à Teruel (Espagne) Résultats expérimentaux Analyse granulométrique Cette analyse a été effectuée sous l'eau et le refus de chaque tamis a été séché et pesé Les pourcentages des différentes tranches granulométriques sont donnés dans le et les De cette analyse, les remarques suivantes s'imposent : le pourcentage des éléments dont le diamètre est supérieur à 50 m est négligeable : environ 1% pour l'échantillon B1 et 4% pour l'échantillon B2 ; le pourcentage des éléments dont le diamètre est inférieur à 2 m (argiles) est très élevé : 42, 3% pour l'échantillon B1 et 39, 1% pour l'échantillon B2 ; du point de vue usage dans l'industrie céramique, la granulométrie des échantillons étudiés est excellente Le problème des éléments dont le diamètre est supérieur à 50 m peut être corrigé par un simple broyage et tamisage Analyse chimique Les analyses chimiques ont porté sur les majeurs, l'ion sulfate (SO 4 ) et la perte au feu Les résultats sont présentés dans le On remarque une teneur en TiO 2 un peu élevée ; celle en Fe 2 O 3 peut être considérée comme acceptable pour l'usage en céramique La teneur en K 2 O est très élevée ; elle est probablement liée à la présence des micas Les teneurs enregistrées en SO 4 et en CaO attestent la présence du gypse La teneur en Al 2 O 3 est faible, celle en SiO 2 semble cependant relativement élevée pour une argile plastique Si l'on compare cette argile avec une argile réfractaire dont le taux d'alumine est supérieur à 45% , celui des fondants (alcalins [K 2 O et Na 2 O] et des alcalino-terreux [MgO et CaO]) inférieur à 4% , on peut dire que l'argile de Jbel Kharrou est très plastique et cuit blanc, puisque le pourcentage en TiO 2 et Fe 2 O 3 est inférieur à 1, 5% Le problème de soufre va être corrigé par l'addition de carbonate de baryum à la pâte, ce qui formera un sulfate de baryum plus stable Analyse minéralogique La méthode utilisée est celle de la diffraction X, réalisée sur deux échantillons en poudre B1et B2 La détermination des différentes phases minéralogiques et leurs taux respectifs ont été réalisés grâce à une base de données Power diffraction file compilée (mise au format spécifique au logiciel XP Software d'exploitation des données de la diffraction des rayons X) permettant le dépouillement des diffractogrammes X Les résultats obtenus montrent la prédominance des illites qui sont les porteurs des propriétés céramiques favorables de ces argiles Les autres constituants argileux sont en nette minorité et jouent un rôle tout à fait négligeable En ce qui concerne la teneur en quartz, elle est très tolérable, d'autant que le quartz peut être facilement digéré par le flux vitreux pendant la cuisson Les analyses minéralogiques étant conformes aux analyses chimiques, on peut en déduire que les argiles blanches de la formation de Demja sont très plastiques et peuvent présenter de l'intérêt dans la fabrication des pâtes céramiques, ce qui peut être confirmé par des essais industriels Coulabilité La coulabilité est la propriété d'une argile à être coulée dans un moule : la dispersion de l'argile dans l'eau forme une barbotine qui va être coulée dans un moule en plâtre qui absorbera l'eau par effet de succion Après un certain temps, la pâte dans le moule se raffermit et se détache, tout en gardant la forme de celui-ci Parfois, le mélange d'eau et d'argile forme des flocons Pour éviter ce phénomène, on ajoute un défloculant, tel le carbonate de sodium Na 2 CO 3 Dans une barbotine composée de 220 g d'argile et 200 ml d'eau, on ajoute progressivement des quantités croissantes de défloculant ; à chaque dosage, on laisse agiter pendant 15 min, puis on mesure la viscosité de la barbotine Les résultats de cette étude sont présentés dans le et la Au cours de cette étude, il a été constaté qu'à partir de 0, 53% du contenu en défloculant, la viscosité est minimale et stable On peut en déduire que, pour les échantillons d'argiles blanches, B1 et B2 présentent une coulabilité optimale à 0, 53% du défloculant Caractéristiques technologiques La détermination des caractéristiques technologiques a été menée sur les deux échantillons d'argile séchés à 60 C puis broyés Le broyage a été effectué par voie humide pendant 4 h, dans un broyeur à boules en porcelaine tournant à 80 tours/min La qualité du broyage a été contrôlée par une analyse granulométrique À partir de ces pâtes, séchées et homogénéisées, on a confectionné des briquettes d'essai dont la face supérieure est marquée par deux traits suivant les diagonales qui servent à mesurer le retrait dû au séchage et à la cuisson Ces briquettes ont été séchées à l'étuve à 110 C, puis cuites à différentes températures Dilatométrie C'est la méthode thermique dont le principe repose sur l'étude de la dilatation et le retrait d'une pâte portée à différentes températures de cuisson ; les tests sont réalisés sur des briquettes séchées La montée en température s'est effectuée au rythme de 3 C/min jusqu'à 1200 C La longueur enregistrée entre les deux traits de la briquette est de 10 mm La formule appliquée pour la détermination des taux de dilatation est : placeholder formula avec placeholder formula la longueur entre les deux traits enregistrés sur la briquette avant cuisson (elle est ajustée à 10 mm), placeholder formula la longueur entre les deux traits enregistrés sur la briquette après cuisson à la température t Les résultats obtenus sont donnés sous forme graphique sur la L'interprétation que l'on peut en faire est la suivante : le segment AB de la courbe correspond à une dilatation du matériau étudié qui s'opère de façon quasi linéaire entre 200 et 700 C ; l'intervalle BC indique la fin de la dilatation et l'amorce, à partir de 700 C, de la contraction Cette dernière évolue de façon linéaire jusqu'à 950 C, sous l'effet du frittage qui renseigne sur l'aptitude des grains à réagir entre eux pour devenir cohésifs et se densifier : c'est le début de l'apparition de la phase fusible ; l'intervalle CD : la phase fusible bien développée permet le frittage complet et la contraction du matériel, c'est le retrait Au cours de cette phase et vers 1000 C, il peut y avoir formation de mullite par transformation de l'illite de la pâte d'argile ; le segment DE correspond à la phase de refroidissement et d'achèvement de l'opération de cuisson, il est quasi linéaire Entre 950 et 1040 C, la phase fusible apparat en grande partie C'est un intervalle de température moyen (90 C), pour donner l'occasion aux grains de réagir correctement entre eux et disposer de matériaux qui auront une tenue à la déformation à des hautes températures, ce qui est un atout favorable pour la production céramique La courbe de la dilatométrie montre que les argiles de la formation de Demja vont être enfournées jusqu'à une température de 1040 C Résistance mécanique à la flexion (RMF) La détermination de la résistance en kg f/cm 2 que peut développer la briquette contre la flexion sous l'effet d'une charge appliquée par un appareil de type NETSZH, est donnée par la formule suivante : placeholder formula avec R la résistance mécanique à la flexion, P la force en kg f qui provoque la rupture de la briquette, l la largeur de la briquette, e l'épaisseur de la briquette L'essai a été réalisé sur des briquettes cuites à 950, à 1000, à 1050 et à 1100 C Les résultats obtenus sur les deux échantillons étudiés sont consignés dans le Comme on pouvait s'y attendre, la résistance mécanique à la flexion augmente avec la vitrification, jusqu'à un certain point o elle est trop élevée et le matériel devient cassant Pour les deux échantillons, la température 1050 C représente cette limite à la résistance mécanique à la flexion D'après ces résultats, ces argiles sont utilisables dans le domaine de la fabrication des carreaux de sols et des produits sanitaires, sans être rompues ou détériorées par les contraintes locales Mais il faut toujours comparer avec les valeurs des autres essais technologiques, en particulier l'essai de dilatométrie qui détermine la température de cuisson maximale (1040 C [même à 1040 C, la résistance mécanique à la flexion est forte]) Perte en poids à la cuisson La diminution du poids de chaque briquette entre le séchage à 110 C et les différentes températures de cuisson est déterminée selon la formule suivante : placeholder formula avec placeholder formula la masse de l'échantillon à 110 C et placeholder formula la masse de l'échantillon cuit à la température t La perte en poids permet seulement de connatre la quantité des produits susceptibles de se décomposer ou de se volatiliser au cours de la cuisson À 500 C, le produit perd son eau de constitution Entre 700 et 900 C, les réactions suivantes peuvent se produire : oxydation de FeO : placeholder formula décomposition des sulfates : placeholder formula décomposition des nitrates : placeholder formula décomposition des carbonates : placeholder formula Les pourcentages de la perte en poids à des températures de 950, 1000 et 1050 C sont fournis dans le On remarque que la perte en poids est à peu près constante (7%), quelle que soit la température et quel que soit l'échantillon Ce pourcentage concerne surtout l'eau moléculaire, l'oxydation de FeO et la décomposition des sulfates Ces pourcentages sont très tolérables, ce qui rend le matériau très rentable pour l'exploitation industrielle Retrait à la cuisson La détermination de la valeur de retrait se fait par l'étude de la variation de la moyenne des longueurs des traits enregistrés sur les briquettes entre le séchage à 110 C et la cuisson à différentes températures La formule suivante permet le calcul du retrait à la cuisson : placeholder formula avec placeholder formula la longueur à la cuisson, placeholder formula la longueur au séchage à 110 C Les pourcentages du retrait à la cuisson déterminés à des températures de cuisson de 950, 1000 et 1050 C, sont donnés dans le On a constaté que le retrait augmente avec la vitrification du matériel étudié à des températures de cuisson élevées La diminution du volume du matériel est généralement due à la disparition progressive de la porosité On dit qu'il y a frittage du produit L'évolution du volume apparent dépend de la dilatométrie qui met en évidence une diminution du volume qui à son tour entrane une compaction du matériau par disparition des vides intergranulaires Couleur après cuisson À 1050 C, les briquettes des deux échantillons B1 et B2 ont une couleur très favorable (blanc-crème), mais elle devient foncée avec l'augmentation de la température de cuisson Conclusion L'analyse minéralogique des échantillons B1 et B2, prélevés de la formation de Demja à l'affleurement, indique la présence des illites comme minéral prédominant, du quartz et quelques autres minéraux en traces (natrolite, jarosite, plagioclase. ) L'analyse chimique des échantillons B1 et B2 montre leur faible teneur en Fe 2 O 3 (0, 72 et 0, 79%) Les essais technologiques ont démontré des propriétés industrielles convenables de ces argiles : avant tout, un intervalle de frittage moyen de 90 C et une température de cuisson de 1040 C La couleur blanc-crème des briquettes cuites à cette même température est très favorable pour un emploi en industrie céramique La résistance mécanique à la flexion est très forte à 1050 C, ce qui est un facteur favorable pour l'incorporation de ces argiles dans le domaine de la fabrication des carreaux de revêtement des sols et des produits sanitaires La perte au feu à 1040 C est très tolérable (7%) Le retrait à la cuisson, légèrement élevé (12%), peut être corrigé par l'ajout d'un dégraissant (sables, verre broyé, chamottes, feldspaths, pegmatites ou autres substances à caractère non hydraulique) En définitive, les argiles de la formation ordovicienne de Demja faisant partie de l'anticlinal de Jbel Kharrou, dans le massif des Rehamna, peuvent être considérées comme argile plastique ou grésante pouvant trouver application dans l'industrie céramique. | ISTEX | 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(12) A été nommé en lieu et place de André BROEKMANS lors de la réunion du 7 juin 2000. | EMEA_V3 | Medicinal |
Thèse n 202 THÈSE PRÉSENTÉE POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DE BORDEAUX ÉCOLE DOCTORALE DE MÉDECINE Par Alexandra GUILLET née le 17 février 1987 à Brest LES MÉDECINS GÉNÉRALISTES FACE AUX QUESTIONNEMENTS SUSCITÉS PAR LES ANTENNES-RELAIS DE TÉLÉPHONIE MOBILE Sous la direction du Dr Jacques GUILLET Soutenue le 6 décembre 2016 Membres du jury : Madame le Pr Laurence BORDENAVE Présidente Monsieur le Pr Jean-Philippe JOSEPH Rapporteur Monsieur le Pr Louis-Rachid SALMI Juge Monsieur le Dr Damien MUZARD Juge Monsieur le Dr Jacques GUILLET Directeur 2 Thèse n 202 THÈSE PRÉSENTÉE POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DE BORDEAUX ÉCOLE DOCTORALE DE MÉDECINE Par Alexandra GUILLET née le 17 février 1987 à Brest LES MÉDECINS GÉNÉRALISTES FACE AUX QUESTIONNEMENTS SUSCITÉS PAR LES ANTENNES-RELAIS DE TÉLÉPHONIE MOBILE Sous la direction du Dr Jacques GUILLET Soutenue le 6 décembre 2016 Membres du jury : Madame le Pr Laurence BORDENAVE Présidente Monsieur le Pr Jean-Philippe JOSEPH Rapporteur Monsieur le Pr Louis-Rachid SALMI Juge Monsieur le Dr Damien MUZARD Juge Monsieur le Dr Jacques GUILLET Directeur Remerciements À mon oncle et directeur de thèse, Jacques GUILLET, qui m'a pris sous son aile pour travailler sur ce sujet passionnant et complexe. Tes judicieux conseils et ta patience ont rendu cette collaboration très agréable. Je te dis toute mon affection et mon admiration. À Madame le Professeur Laurence BORDENAVE, vous me faites l'honneur de présider ce jury de thèse et je vous en remercie. Veuillez accepter l'expression de mon profond respect et de ma reconnaissance. À Monsieur le Professeur Jean-Philippe JOSEPH pour avoir accepté d'effectuer le rapport de cette thèse. Merci pour le soin que vous avez apporté à la rédaction de celui-ci, pour vos conseils et votre bienveillance. À Monsieur le Professeur Louis-Rachid SALMI, merci d'avoir accepté de juger ce travail, soyez assuré de mon respect et de ma reconnaissance. Au Docteur Damien MUZARD, qui a eu la gentillesse de rejoindre ce jury, merci d'avoir accepté de juger ce travail. Soyez assuré de mon respect et de ma reconnaissance. Au Professeur Roger SALAMON et à l'équipe de l'ISPED pour avoir aidé à la réalisation du questionnaire, soyez assuré de ma reconnaissance. Remerciements personnels Merci à ceux qui se sont déplacés, et à ceux qui l'auraient fait s'ils avaient pu. Un merci tout particulier à mes petites fées de l'orthographe (et des fautes de typographies) : avec par ordre alphabétique Amélia, Analle, Damien et Marion. Merci d'avoir pris le temps de lire mon petit pavé ! Un grand merci à Isabelle pour son aide dans la rédaction du résumé en anglais. Merci à tous d'avoir été aussi consciencieux et réactifs ! À ma famille À mon père, qui m'a appris à avancer et à garder le sourire malgré les difficultés. Ton dynamisme et ton humour forcent le respect. J'espère en avoir un peu hérité. À mes frère et sœurs, Aurélia Stéphanie et Christophe, tous si différents et adorables. Merci de m'avoir motivé et soutenu pendant la réalisation de cette thèse. Je n'ai pas assez de place pour dire tout le bien que je penses de chacun de vous, ni la fierté que vous m'inspirez. On en a fait du chemin depuis Brest. Cette complicité que nous avons su garder est essentielle pour moi. Vous méritez le meilleur. À mes beaux-frères Aymeric et Mathieu, je compte sur vous pour prendre soin de mes grandes sœurs. Je vous embrasse ! Une pensée pour mes magnifiques nièces Éléa et Nina. À ma grand-mère Gloria, un petit concentré de force et de tendresse à elle toute seule. À mes tantes et oncle Cathy, Maylis et Jean, Dominique, et mes cousins Guillaume et Xavier. À ma cousine Audrey pour le coaching motivation. J'ai déjà une famille incroyable, mais j'ai eu la chance d'être adoptée par une deuxième. À Chantal, Yves, Quentin (et Morgane) Geoffrey (et Myriam). Pour m'avoir accueilli à bras ouverts, pour toutes vos attentions (en particulier tout ce qui se mange ! ) et votre gentillesse. 4 Je vous dis merci. À Analle, tu sais l'affection que j'ai pour toi, tu es plus qu'une amie, je me sens en famille avec toi. Toujours à l'écoute dans les moments difficiles et toujours partante pour passer de bons moments ! Merci pour tout. Et mention spéciale à ta famille que j'ai pris énormément de plaisir à côtoyer davantage cette année. Merci à Pierre Janine et Alexandre d'avoir fait le déplacement. Aux amis poitevins À Amélia, Anne-Sophie, aux deux Céline et à Laurianne : nos petites retrouvailles annuelles sont vraiment des moments forts. Vivement la prochaine fois sur Bordeaux ! À Anne-Laure : cela fait trop longtemps que le trio infernal n'a pas sévi. Je vous embrasse toi et ta petite famille. À Stéphanie et Maxime. Je vous souhaite beaucoup de bonheur, à vous et à vos petits ! Aux amis bordelais. À Marie et Beesham. Marie, pour ta fracheur, tes marinades , et les fous rires qu'on a pu avoir ensemble ; et toi Beesham, discret mais si plein d'humanité. Merci de nous avoir permis d'assister à votre incroyable mariage qui restera un des grands moments de ma vie. À Amélie, dommage que tu sois si loin ! Merci pour tes conseils, tes encouragements et ta bonne humeur. Bonne chance pour ta nouvelle vie. À Corinne, pour ta gentillesse, et le plaisir que j'ai à discuter avec toi, que ce soit au cabinet ou en dehors. À Marion G. Même si on se voit (trop) peu, je sais que je peux compter sur toi, après toutes ces années. Merci de m'avoir aidé pour la relecture. Je compte venir te voir prochainement en Bretagne ! Je t'embrasse. À tous les autres que je n'ai pas cité par manque de place mais que je n'oublie pas. Ils se reconnatront ! À Damien. Merci pour tellement de choses. Ton soutien, ta compréhension, ta diplomatie, tes relectures si pertinentes, ton aide pour envoyer les 400 enveloppes pour l'étude, pour m'avoir empêché de craquer lors de mes déboires informatiques. heureusement que tu étais là. Ces années ensemble sont passées si vite. La vie avec toi est à la fois simple et merveilleuse. Il faut vraiment qu'on s'attelle à cette préparation de mariage. 5 Table des matières Remerciements. 4 Sommaire des tableaux et des figures. 8 INTRODUCTION . 12 1. Ondes électromagnétiques : généralités . 13 1. 1. Les ondes : rappels de physique . 13 1. 2. Les ondes électromagnétiques. 13 1. 3. Le spectre électromagnétique. 15 2. Les antennes-relais. 19 2. 1. Un peu d'histoire . 19 2. 2. Les antennes-relais : quelques chiffres. 20 2. 3. Fonctionnement . 20 2. 3. 1. Des antennes-relais. 20 2. 3. 2. Les réseaux de téléphonie mobile . 21 2. 4. Législation actuelle. 22 2. 4. 1. Concernant l'implantation . 22 2. 4. 2. Concernant le respect des valeurs d'exposition . 23 2. 4. 3. Valeurs limites d'exposition . 23 2. 5. Opposition aux antennes-relais. 27 2. 5. 1. Les associations dites anti-ondes. 27 2. 5. 2. Inquiétudes de la population face aux antennes-relais : quelques données. 28 2. 5. 3. Défiance envers les antennes. Les origines ? . 29 2. 5. 3. Un mot sur l'effet NIMBY. 34 2. 5. 4. Les effets sanitaires supposés des antennes-relais de téléphonie mobile. 34 2. 6. Effets biologiques et sanitaires des antennes-relais. 35 2. 6. 1. Effets biologiques connus des champs électromagnétiques : effets thermiques et non thermiques. 35 2. 6. 2. Les antennes-relais : revue des principaux rapports scientifiques. . 36 2. 6. 3. Antennes et effet nocebo. 45 2. 6. 4. Principe de précaution : a-t-il sa place dans le débat sur les antennes ? . 45 3. L'Intolérance environnementale idiopathique attribuée aux champs électromagnétiques ou Hypersensibilité aux ondes électromagnétiques (HSEM). 50 3. 1. Définition. 50 3. 2. Prévalence. 51 3. 3. Présentation clinique. 51 3. 4. Que dit la Science ? . 51 3. 5. Effet nocebo et HSEM. 52 3. 6. Dispositifs anti-ondes et compléments alimentaires, sont-ils efficaces ? . 52 3. 7. Des pistes pour la recherche ? . 53 3. 8. Les décisions juridiques liées à l'HSEM. 54 4. Le médecin généraliste face aux différents problèmes soulevés par l'exemple des antennes-relais. 55 4. 1. En première ligne. 55 4. 2. Médiatisation des sujets de santé : un outil à double-tranchant. 55 4. 3. Sélectionner l'information fiable. Quelques règles. 57 6 4. 4. La relation médecin malade : une relation de confiance et d'influence réciproque. . 58 4. 5. Médecine générale et incertitude. 60 ÉTUDE DESCRIPTIVE : LES MÉDECINS GÉNÉRALISTES FACE AUX INTERROGATIONS SUSCITÉES PAR LES ANTENNES-RELAIS DE TÉLÉPHONIE MOBILE. 63 1. Objectifs de l'étude. 63 2. Matériel et méthode. 63 2. 1. Type d'étude. 63 2. 2. Population de l'étude. 63 2. 3. Outil : le questionnaire. 64 2. 3. 1. Sa genèse. 64 2. 3. 2. Son contenu. 64 2. 4. Déroulement de l'étude. 64 3. Résultats. 65 3. 1. Population répondante. 65 3. 1. 1. Taux de réponse. 65 3. 1. 2. Démographie. 65 3. 2. Enquête . 67 3. 2. 1. Objectif principal. 67 3. 2. 2. Objectifs secondaires. 68 3. 2. 3. Questions subsidiaires. 72 3. 3. Études croisées . 74 3. 3. 1. Caractéristiques de la population considérant les antennes comme dangereuses. 74 3. 3. 2. Caractéristiques de la population des médecins généralistes ayant cherché à s'informer . 80 3. 3. 3. Caractéristiques des médecins ayant cherché à s'informer. 82 3. 3. 4. Caractéristiques de la population ayant été confrontée au problème des antennes relais et/ou des ondes électromagnétiques. 85 4. Discussion . 86 4. 1. Discussion de la méthode. 86 4. 1. 1. Recrutement. 86 4. 1. 2. Recueil des données . 86 4. 1. 3. Le questionnaire . 87 4. 2 Discussion des résultats. 88 4. 2. 1. Démographie. 88 4. 2. 2. Objectif principal . 89 4. 2. 3. Objectifs secondaires. 91 5. Conclusion et perspectives de l'étude. 103 Bibliographie. 104 7 Sommaire des tableaux et des figures Figures : Figure 1 : nature et propagation d'une onde électromagnétique (Bonn et Rochon 1992). 14 Figure 2 : classification par fréquence des rayonnements non-ionisants et ionisants (INRS 2016). 15 Figure 3 : classification des radiofréquences . 18 Figure 4 : taux d'équipement français en téléphonie mobile (CREDOC 2015). 20 Figure 5 : valeurs maximales d'exposition pour les radiofréquences (ICNIRP, 1998). 24 Figure 6 : valeurs limites d'exposition du public (JORF du 5 mai 2002). 25 Figure 7 : les mécanismes de production de la défiance. 30 Figure 8 : résultat du sondage INPES : médecins déclarant être sollicités par leurs patients sur les risques ou les pathologies liés à l'environnement. 95 Tableaux : Tableau 1 : répartition par genre de l'échantillon des médecins généralistes interrogés . 65 Tableau 2 : répartition par âge de l'échantillon des médecins généralistes interrogés. 65 Tableau 3 : répartition de l'échantillon des médecins généralistes interrogés par type d'exercice. . 66 Tableau 4 : durée d'installation au moment de l'enquête. 66 Tableau 5 : région d'exercice au moment de l'étude. 66 Tableau 6 : que pensez-vous de la dangerosité des antennes-relais ? . 67 Tableau 7 : avez-vous déjà essayé de vous informer sur le sujet des antennes-relais ? . 68 Tableau 8 : sources citées par les médecins ayant cherché à s'informer. 71 Tableau 9 : médecins non informés au sujet des antennes-relais : souhaitent-ils le faire suite à ce questionnaire ? . 71 Tableau 10 : nombre de médecins ayant reçu en consultation au moins un patient pour un motif qu'il rattachait aux ondes électromagnétiques. 72 Tableau 11 : nombre de médecins ayant reçu en consultation au moins un patient pour un motif qu'il rattachait aux antennes-relais. 72 Tableau 12 : nombre de médecins ayant reçu en consultation au moins un patient pour un motif qu'il(s) rattachai(en)t à l'une des deux problématiques. 73 Tableau 13 : caractéristiques démographiques de l'échantillon et perception du danger. 74 Tableau 14 : représentation du danger potentiel des antennes-relais selon le sexe. 74 Tableau 15 : représentation du danger potentiel des antennes-relais selon l'âge . 75 Tableau 16 : représentation du danger potentiel des antennes-relais selon le type d'exercice. 76 Tableau 17 : représentation de la dangerosité en fonction de la durée d'installation. 77 Tableau 18 : perception du danger chez les MG ayant été confronté au problème en consultation 78 Tableau 19 : perception d'un danger selon confrontation au problème des antennes relais en consultation. 79 Tableau 20 : perception du danger selon information . 80 Tableau 21 : caractéristiques des médecins ayant cherché à s'informer. 82 Tableau 22 : information sur les antennes-relais selon expérience vécue en consultation. 84 Tableau 23 : caractéristiques des médecins confrontés au problème des antennes-relais, et/ou des ondes électromagnétiques en général en consultation. 85 Tableau 24 : type d'exercice des médecins confrontés au problème des ondes en général en consultation. 85 Tableau 25 : type d'exercice des médecins confrontés au problème des antennes-relais en consultation. 85 Tableau 26 : répartition des médecins généralistes en activité régulière tous modes d'exercice confondus selon leur âge dans les zones Gironde, Aquitaine, Poitou-Charentes, France(cartographie de l'ordre national des médecins réalisée en 2016). 88 Tableau 27 : Perception de la dangerosité des antennes en fonction des sources utilisées. 98 8 Histogrammes Histogramme 1 : perception d'un danger potentiel des antennes-relais par les médecin. 67 Histogramme 2 : nombre de médecins de l'échantillon ayant cherché à s'informer sur le sujet des antennes-relais. 68 Histogramme 3 : perception d'un danger chez les médecins ayant cherché à s'informer ou non sur le sujet des antennes-relais. 69 Histogramme 3 bis : perception d'un danger des antennes-relais chez les médecins ayant cherché à s'informer et chez les non-informés. 69 Histogramme 3 ter : perception d'un danger des antennes-relais chez les médecins ayant cherché à s'informer et chez les non-informés. 70 Histogramme 4 : perception d'un danger ou non en fonction de l'âge des médecins interrogés. 75 Histogramme 5 : perception ou non d'un danger des antennes-relais selon le type dexercice. 76 Histogramme 6 : représentation de la dangerosité des antennes-relais en fonction de la durée d'installation. 77 Histogramme 6 bis : représentation d'une dangerosité ou non selon durée d'installation. 78 Histogramme 7 : perception ou non d'un danger représenté par les antennes-relais selon confrontation ou non au problème des antennes-relais en consultation. 79 Histogramme 8 : perception du danger des antennes-relais selon présence ou non d'une information antérieure à l'étude. 80 Histogramme 9 : perception d'un danger selon information ou non sur le sujet des antennes-relais . 81 Histogramme 10 : Répartition des médecins informés et non informés par mode d'exercice. 83 Histogramme 11 : Répartition des médecins informés et non informés sur la question des AR par tranche d' âge. 84 9 Table des abréviations AFSSET ANFR ANSES ARCEP ARTAC ASEF CEM CIRANO CIRC CISMEF COMEST CREDOC CRIIREM Agence Française de Sécurité Sanitaire de l'Environnement et du Travail Agence Nationale des Fréquences Radio Agence Nationale de SEcurité Sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail Autorité de Régulation des Communications Électroniques et des Postes Association Recherche Thérapeutique Anti-Cancéreuse Association Santé Environnement France Champs ElectroMagnétiques Centre Interuniversitaire de Recherche en ANalyse des Organisations Centre International de Recherche sur le Cancer Catalogue et Index des Sites MÉdicaux de langue Française COmmission Mondiale d'Éthique des connaissances Scientifiques et des Technologies Centre de Recherche pour l'ÉtuDe et l'Observation des Conditions de vie Centre de Recherche et d'Information Indépendant sur les Rayonnements ÉlectroMagnétiques non ionisants. Comité Scientifique sur la Toxicité, l'Écotoxicité et l'Environnement CSTEE Débit d'Absorption Spécifique DAS Extrêmement Basse Fréquence EBF ÉlectroHyperSensibilité EHS Global System for Mobile Communications GSM Haute Autorité de Santé HAS Hypersensibilité Électromagnétique liée aux ondes. HSEM International Commission on Non-Ionizing Radiation Protection ICNIRP Institute of Electrical and Electronics Engineers IEEE Institut National de l'EnviRonnement Industriel et des RisqueS INERIS Institut National de Prévention et d'Éducation pour la Santé INPES Institut national de recherche et de sécurité INRS Institut de Veille Sanitaire InVS InfraRouge IR Institut de Recherche et Documentation en Économie de la Santé IRDES Institut de Radioprotection et de Sûreté Nucléaire IRSN Long Term Evolution LTE MG Médecin Généraliste NIMBY Not In My BackYard 10 OEM PP PRIARTEM Pour Rassembler Informer et Agir sur les Risques liés aux Technologies Ondes ÉlectroMagnétiques Principe de Précaution ÉlectroMagnétiques Rayonnement ÉlectroMagnétique Rayonnements Ionisants Rayonnements Non Ionisants Scientific Committee on Emerging and Newly Identified Health Risks Société Française de RadioProtection Universal Mobile Telecommunications System REM RI RNI SCENIHR SFRP UMTS UNAFORMEC Union Nationale des Associations de Formation Médicale et d'Évaluation Continues UV Ultraviolet 11 INTRODUCTION Depuis quelques dizaines d'années, les télécommunications ont connu une expansion rapide, suscitant un véritable engouement auprès de l'ensemble de la population. Ne pas posséder de téléphone portable nanti d'une connexion internet est devenu une bizarrerie, et ce phénomène s'amplifie au fur et à mesure que les générations se succèdent. Mais qui dit téléphone mobile dit : antennes-relais. Nécessaires pour transmettre le signal, elles cristallisent autour d'elles une véritable méfiance, dont les principaux porte-paroles sont les associations anti-ondes comme Robin des toits ou PRIARTEM. Les alertes les concernant trouvent un écho au sein de la population, et certains riverains envisagent chaque nouvelle implantation avec suspicion. Les médias grands publics, friands de dossiers anxiogènes se sont saisis du sujet, entretenant une ambiance d'angoisse et d'incertitude. Des études ont été réalisées il y a quelques années afin d'évaluer l'incidence des ondes électromagnétiques ainsi que de certaines autres nuisances environnementales sur l'activité des médecins généralistes. Si ceux-ci ont convenu de l'importance de la question environnementale au cours de leur exercice, la plupart d'entre eux avait jugé à l'époque que les formations et informations reçues étaient insuffisantes et qu'ils ne se sentaient pas prêts à donner des conseils en matière de prévention environnementale. Il est très difficile de trouver des études traitant spécifiquement du problème des antennes- relais, des représentations, et de l'information des médecins généralistes à leur sujet. Cette thématique soulève différentes interrogations. On peut bien sûr raisonner en terme de danger ou d'innocuité, le débat public portant essentiellement sur cette dichotomie. Mais elle pose d'autres questions fondamentales, telles que la médiatisation des sujets de santé, la défiance suscitée par certains secteurs technologiques et leurs répercussions sur la pratique médicale elle-même. On peut également s'interroger sur l'impact de ces éléments sur les représentations et la façon de s'informer des médecins prenant en charge la population. Ce travail comporte une première partie théorique et une étude descriptive. Dans la partie théorique, après un rappel sur les ondes électromagnétiques, nous aborderons l'objet du travail, à savoir les antennes : leur fonctionnement, les réglementations d'exposition, les effets sanitaires étudiés via une synthèse des principaux rapports existant. Puis nous réaliserons une rapide vue d'ensemble sur la question de l'hypersensibilité électromagnétique, et pour finir, nous résumerons les problèmes soulevés par le sujet, qui sont au cœur de notre travail centré sur la population des médecins généralistes. Dans une deuxième partie, nous nous intéresserons au point de vue de médecins généralistes libéraux dans une étude descriptive transversale. Les objectifs de l'étude sont les suivants : - Connatre leurs représentations sur le sujet des antennes-relais, à savoir leur perception d'un potentiel danger pour la santé, et vérifier leur adéquation avec les données actuelles de la Science. - Vérifier si certains ont déjà cherché à s'informer sur la question et sur quelles sources. - Évaluer l'existence d'une demande au sein de leur patientèle. 12 REVUE DE LA LITTÉRATURE 1. Ondes électromagnétiques : généralités 1. 1. Les ondes : rappels de physique Une onde est la propagation d'une perturbation dans un milieu défini. Elle produit, là o elle passe, des variations réversibles des propriétés physiques du milieu. La vitesse à laquelle elle se déplace est définie par les caractéristiques du milieu de propagation (1, 2, 3). Elle a la particularité de transporter de l'énergie sans se déformer ni transporter de matière avec elle. Il en existe différents types : - - longitudinales : propagation dans la même direction que la perturbation (ressort). transversales : propagation perpendiculaire au sens de la perturbation (cas des tremblements de terre et des ondes électromagnétiques). Le milieu de propagation d'une onde peut être tridimensionnel (ondes sonores et lumineuses) bidimensionnel (onde à la surface de l'eau) ou unidimensionnel (cas d'une corde vibrante). On peut imaginer une onde comme une succession de vagues : la longueur d'onde correspond à la distance séparant deux crêtes successives, et la fréquence au nombre de vagues se succédant sur une période d'une seconde. La fréquence s'exprime en hertz. Plus les vagues se succèdent rapidement, plus la fréquence augmente. La notion de fréquence s'applique à toutes les ondes y compris le son et la lumière (2, 3). Le fonctionnement des antennes-relais met en jeu un type d'onde particulier, les ondes électromagnétiques. 1. 2. Les ondes électromagnétiques L'onde électromagnétique est composée comme son nom l'indique d'un champ électrique et d'un champ magnétique. Plus précisément, l'onde est générée par le déplacement des charges électriques qui induit une perturbation magnétique perpendiculaire à sa trajectoire. Cette propagation ne nécessite aucun support, elle peut se faire dans l'air comme dans le vide (3, 4). En cas de charges électriques, immobiles, on parle d'électrostatisme. Ce phénomène nécessite la présence d'aimants permanents, d'électroaimants alimentés en courant continu ou plus généralement de sources de courants continus pour être maintenu. Dans le cadre de l'électromagnétisme, deux modèles peuvent s'appliquer selon les besoins de l'expérimentateur : le modèle ondulatoire, et le phénomène corpusculaire (5). Modèle ondulatoire Un champ électromagnétique apparat dès lors que des charges électriques sont en mouvement. Ce champ résulte de la combinaison de deux ondes oscillant perpendiculairement à la même fréquence (l'une électrique, l'autre magnétique) et se propageant à la vitesse de la lumière(6). 13 Figure 1 : nature et propagation d'une onde électromagnétique selon Bonn et Rochon (1992) (7) Elle est caractérisée par les grandeurs physiques suivantes : - - - la longueur d'onde () mesurée en mètre. la fréquence (v) mesurée en hertz, soit le nombre de cycles par unité de temps. 1 Hz 1 oscillation par seconde. On utilise généralement les multiples du hertz (1 kilohertz (kHz) 1000 Hz : 1 mégahertz (MHz) 1 million de hertz, 1 gigahertz (GHz) 1 milliard de Hertz) la période (T) : l'inverse de la fréquence, à savoir le temps nécessaire pour que l'onde effectue un cycle. Unité : la seconde. Longueur d'onde et fréquence sont inversement proportionnelles et unies par la relation suivante : c/v, c étant la vitesse de la lumière soit 3. 108 m. s-1 . Modèle corpusculaire Le champ électromagnétique y est représenté comme un flux de particules chargées énergétiquement. On nomme ces particules photons ou quanta, entités à la base des principes de la physique quantique. L'énergie (E) transportée par un photon est définie par la relation de Planck-Einstein : E h. v . E s'exprime en joule (J) et est proportionnelle à la fréquence (v). h est la constante de Planck (exprimée en joule-seconde), h 6, 63. 10-34 J. s Unités de mesure propres aux composantes des champs électromagnétiques - l'intensité du champ électrique s'exprime en volt par mètre (V. m-1) et correspond à la force exercée par ses particules chargées. - l'intensité du champ magnétique est mesurée en tesla (T), en ampère/mètre (A. m-1) ou en gauss (G). A ces grandeurs de base s'ajoutent : - la puissance d'émission en watts (W) ou en décibels (dB). Celle-ci dépend entre autres de la puissance électrique fournie à l'émetteur, mais aussi des caractéristiques du rayonnement de celui-ci. - la densité de puissance du champ électromagnétique. Celle-ci s'exprime en W/m2. C'est la puissance par unité de surface dans un lieu donné. La densité de puissance diminue donc très 14 rapidement, selon la loi de l'inverse du carré de la distance (exemple : à 10 m, d'une antenne, elle est divisée par 102 ou 100) (8). Les champs électromagnétiques peuvent être de trois origines : naturelle (champ magnétique terrestre, foudre, rayonnement corporel) ; artificielle domestique (lignes électriques, radio, téléphones, plaques à induction etc) ; artificielle professionnelle (surtout dans l'industrie, soudage par résistance, électrolyse etc. ) (9). 1. 3. Le spectre électromagnétique Il découle de l'ensemble de formules et règles évoquées précédemment que les rayonnements électromagnétiques de courte longueur d'onde (ou de haute fréquence) véhiculent davantage d'énergie que les rayonnements de grande longueur d'onde (ou de basse fréquence). Pour mémoire dans le chapitre précédent : c/v et E h. F (o v et F correspondent toutes deux à une même variable, la fréquence) (9, 10). Ondes radio, micro-ondes, rayons X, infrarouges, ou encore lumière visible correspondent à différents types de rayonnements électromagnétiques et chacun d'eux est caractérisé par une gamme de fréquences (11). La palette de ces différents rayonnements constitue le spectre électromagnétique, dans lequel ils sont classés par ordre de fréquence. Figure 2 : classification par fréquence des rayonnements non-ionisants et ionisants (INRS 2016)(10) Les basses fréquences : elles sont comprises entre quelques hertz et environ 10 kHz . En dessous de 300 Hz, on parle d'extrêmement basses fréquences. Au quotidien, les sources d'exposition aux champs basses fréquences sont nombreuses (courant électrique domestique, électroménager, fax, écrans d'ordinateurs etc. ). Les radiofréquences : de 10 kHz à 300 GHz. Elles occupent la majeure partie du spectre électromagnétique. Leur longueur d'onde peut être comprise entre quelques centimètres et au maximum plusieurs kilomètres. Elles sont notamment émises par les antennes-relais de téléphonie mobile. Les micro-ondes appartiennent également à cette catégorie. Leur longueur d'onde varie entre 30 centimètres (1 GHz) et 1 millimètre (300 GHz). Le terme de micro-ondes provient du fait que leur longueur d'onde est plus courte que celles de la bande VHF (Very High Frequency ou 15 Très Haute Fréquence), utilisée par les radars pendant la seconde guerre mondiale. Elles sont utilisées dans le cas des fours à micro-ondes et des téléphones portables. Lorsqu'une micro- onde traverse la matière, elle perturbe les champs électriques et magnétiques, et a donc la capacité de mettre en mouvement les molécules sensibles aux champs électriques, et en particulier les molécules d'eau présentes dans les aliments. Agitées dans tous les sens (à la vitesse de l'onde traversante), elles se cognent les unes aux autres, et augmentent ainsi leur température. Les ondes ricochent ensuite sur le métal, permettant ainsi de chauffer la nourriture sans chauffer le four lui-même. Dans la mesure o ces ondes se comportent comme les ondes radio, elles permettent également le transport des informations, mais avec une moins grande portée. Les téléphones utilisent une puissance d'environ 2 watts, soit environ 400 fois moins que celle d'un four à micro-ondes. Les infrarouges : leur fréquence est comprise entre 300 GHz et 385 THz (térahertz). Ils sont situés, comme leur nom l'indique, juste sous la couleur rouge du domaine visible. Ils sont utilisés dans les équipements de vision nocturne, les diodes électroluminescentes, les télécommandes etc. La lumière visible : comprise entre 385 THz à 750 THz. Les rayonnements de plus basse fréquence sont rouges. Ceux de plus haute fréquence sont bleus et violets. On peut manipuler cette lumière grâce à des instruments d'optique : lentilles, prismes, etc. L'œil se comporte lui- même comme un instrument d'optique, avec ses limites : il ne saisit qu'une gamme réduite du spectre électromagnétique. L'énergie transportée par les photons de la lumière visible devient importante, car la fréquence est assez grande. Elle est à l'origine de la photosynthèse des végétaux ainsi que de l'effet photovoltaïque utilisé par les panneaux solaires. Les ultraviolets : (750 THz à 3 PHza) la lumière transporte de plus en plus d'énergie et est désormais capable de traverser la matière ; elle a donc un retentissement immédiat. Les ultraviolets sont déjà dangereux, car ils ne sont pas arrêtés par les couches superficielles de la peau, contrairement à la lumière visible. Ils sont responsables de ce que nous appelons les coups de soleil, c'est-à-dire de brûlures. Les rayons X (13) : ce sont les plus énergétiques. Ils appartiennent aux et gamma (12) rayonnements dits ionisants . Dangereux à haute dose, ils sont utilisés dans le cadre de la radiographie conventionnelle (12) pour les premiers, de la tomographie par émission de positons (ou TEP-scan) et la scintigraphie pour les seconds (13). Le dépôt d'énergie dans les tissus se mesure en gray (Gy). Il représente l'énergie absorbée par un kilogramme de matière exposé à un rayonnement ionisant apportant une énergie d'1 joule : 1 Gy 1 J/kg. En radioprotection, des facteurs de conversion sont utilisés en fonction du type de rayonnement et des tissus traversés. Ils permettent de déterminer un risque d'effet aléatoire (ou stochastique) exprimé en sievert. Dans le domaine des rayonnements, les effets stochastiques semblent principalement induits par des micro-lésions de la molécule d'ADN, à la suite d'une exposition plus ou moins longue à des rayonnements ionisants plus ou moins énergétiques. Une problématique posée par ce type d'effet est évidemment l'estimation du risque pour des doses très faibles, puisque pour des doses élevées, les effets sont de type déterministe (décès ou lésions typiques). La probabilité qu'une cellule modifiée par une mutation viable de son ADN développe un cancer est faible ; le risque réel couru par une personne exposée à des rayonnements très limités (en dose et/ou en durée) est dès lors non quantifiable, mais théoriquement non nul. a PHz : petahertz soit 1015 Hz 16 Différence entre rayonnements ionisants et non ionisants Au sein de ce spectre, il est capital de différencier les rayonnements ionisants (RI) (X et gamma) des rayonnements non ionisants (RNI), notamment par rapport à leurs effets potentiels sur la santé. Rayonnements ionisants Selon l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) les rayonnements ionisants sont un type d'énergie libérée par les atomes sous forme d'ondes ou de particules (14). Grâce à leurs fréquences très élevées, ils sont capables de transporter suffisamment d'énergie pour créer une ionisation. Celle-ci correspond à une modification des liaisons électrodynamiques d'un atome ou d'une molécule, entranant l'apparition de particules chargées. Les atomes touchés passent d'un état énergétique E1 à un état ionisé E2. La valeur d'énergie nécessaire pour ioniser l'atome correspond à E2-E1. Voici les quantités d'énergie nécessaires pour ioniser les principaux atomes (en électron-Volt) (15, 16) : Carbone (C) : 11, 24 eV Hydrogène (H) : 13, 54 eV Oxygène (O) : 13, 57 eV Azote (N) : 14, 24 eV. Si nous prenons le corps humain, celui-ci est majoritairement constitué d'eau, une molécule comportant deux atomes d'hydrogène et un atome d'oxygène. Pour que le rayonnement soit considéré comme ionisant, il faut donc que ses particules transportent une énergie au moins égale à 13, 54 eV (longueur d'onde de 100 nm) pour altérer les molécules d'eau (15). Celles-ci vont se décomposer pour donner des radicaux libres. La molécule ionisée va chercher à se stabiliser, lors de la réorganisation du cortège électronique, en expulsant l'excédent d'énergie, soit par émission de photons de fluorescence soit par rupture de liaison, ce qui peut entraner une altération de son activité biochimique ou sa destruction. Après quelques microsecondes, l'excitation et l'ionisation entranent l'apparition de radicaux libres, fortement réactifs. Après quelques millisecondes, ces radicaux libres provoquent des réactions chimiques anormales, qui dénaturent les protéines et autres constituants de la cellule, rompent les liaisons de l'édifice cellulaire et en perturbent le fonctionnement et la structure. Leur action sur l'ADN peut conduire, après un temps de latence plus ou moins long, à la manifestation de radiolésions. Dans le spectre électromagnétique, sont considérés comme ionisants les rayons gamma, les rayons X et certains UV. Rayonnements non-ionisants Selon l'Agence Nationale des Radiofréquences, le terme de rayonnement non ionisant désigne tout rayonnement électromagnétique qui, contrairement au rayonnement ionisant n'a pas assez d'énergie pour modifier les éléments constitutifs de la matière et des êtres vivants (atomes, molécules) (17). Les ondes radioélectriques, les IR, la lumière visible et la majorité des UV transportent une énergie inférieure à 13, 54 eV et sont par définition non ionisants (Champion, 2002)(15). Voici les caractéristiques de leur énergie (E) et de leur longueur d'onde ( ). - Radiations UV : 100 nm < < 400 nm et 3, 1 eV < E < 12, 4 eV - Radiations visibles : 400 nm < < 750 nm et 1, 65 eV < E < 3, 1 eV - Radiations IR : 750 nm < < 1 mm et 1, 2 meV < E < 1, 65 eV - Ondes hertziennes : > 1 mm et E < 1, 2 meV 17 Les rayonnements électromagnétiques non ionisants n'ont pas la capacité d'interagir directement avec les tissus biologiques, mais possèdent tout de même une énergie pouvant être absorbée. De plus, leur composante électrique peut induire le passage d'un courant dans les tissus étudiés. La pénétration et les effets sur la matière seront différents selon la longueur d'onde du rayonnement (13). Celles qui nous intéressent dans le cas des antennes-relais sont les ondes radioélectriques. Leur nom et leurs limites en fréquence résultent du fait qu'elles peuvent être obtenues électroniquement, et modulées finement afin de transmettre une information. Spectre des radiofréquences La bande des radiofréquences dans laquelle on inclut habituellement les micro-ondes s'étend de 3 kHz à 300 GHz (18), soit des longueurs d'onde supérieures à 1 mm. Son utilisation est réglementée par une Agence des Nations Unies : l'Union Internationale des télécommunications. Le spectre radio est divisé en huit sous-domaines. Leur nom fait directement référence à la valeur des fréquences. Les fréquences limites Very Low Frequency (VLF) et Very High Frequency (VHF) correspondent aux ondes radio. Les sous-domaines UHF SHF et EHF (respectivement Ultra, Super et Extremely High Frequency) correspondent aux micro-ondes. C'est le comportement des ondes électromagnétiques qui détermine en partie l'attribution des bandes de fréquences. Figure 3 : classification des radiofréquences (19) 18 2. Les antennes-relais 2. 1. Un peu d'histoire En 1873, James Clerk Maxwell réalise une synthèse des connaissances sur l'électromagnétisme, basée sur ses propres découvertes et celles d'autres prestigieux scientifiques dont André Ampère (mathématicien et physicien français, père du galvanomètre et de l'électroaimant), et Michael Faraday, (physicien anglais à l'origine de la découverte des courants électriques engendrés par le mouvement d'un aimant. ). Les équations de Maxwell ont permis de lier l'électricité, le magnétisme et l'induction (20). Elles prévoient l'existence d'une onde se déplaçant dans le vide, dont il mesure expérimentalement la vitesse avec les moyens de l'époque : il évalue alors la vitesse de la lumière à un déplacement de 310 740 000 mètres par seconde. Il émet l'hypothèse en 1864, dans un article intitulé A Dynamical Theory of the Electromagnetic Field, que la lumière pourrait être une onde électromagnétique. L'accord des résultats semble montrer que la lumière et le magnétisme sont deux phénomènes de même nature et que la lumière est une perturbation électromagnétique se propageant dans l'espace suivant les lois de l'électromagnétisme. (21) Au fil de ses expériences, Maxwell a d'abord obtenu des ondes électriques dans des fils métalliques, puis a démontré l'existence d'ondes magnétiques dans l'air. Il avait remarqué qu'une simple modification d'amplitude ou de fréquence rendait possible le transport d'une voix ou de données entre un émetteur et un récepteur. C'est ainsi que Heinrich Hertz, en se basant sur ses travaux, a construit les premières antennes émettrices et réceptrices d'ondes. Cette technologie s'est rapidement développée à la fin du XIXe siècle et c'est en 1895 que le russe Alexandre Popov a rendu possible la première transmission de signaux en Morse par voie hertzienne : la télégraphie sans fil était née. (21) Les toutes premières antennes-relais ont été implantées en 1947 à titre expérimental par les scientifiques des laboratoires américains Bell. Il faudra attendre 1970 pour qu'ils installent le premier réseau commercial de téléphonie cellulaire à Chicago, permettant des échanges uniquement intra-muros. On doit l'idée d'un téléphone mobile à Martin Cooper : celui-ci s'est inspiré de la série Star Trek, dans laquelle le capitaine Kirk utilisait un communicateur portatif pour transmettre ses ordres. Il passe son premier appel depuis un cellulaire en avril 1979. Le téléphone ne tient néanmoins toujours pas dans la poche (il reste volumineux, lourd et muni d'une antenne de dix centimètres). En 1983, Motorola sort le premier véritable téléphone portable : le Motorola DynaTAC (800 grammes). Le premier réseau cellulaire français a été installé en 1985. A l'époque, il s'agissait du système de radiotéléphonie Radiocom 2000 prenant en charge des mobiles de première génération (1G) fonctionnant sous la bande de fréquence des 400 MHz en mode analogique. Ce réseau a été abandonné au profit du numérique et de la norme GSM en 2000, permettant grâce à des fréquences plus élevées de transporter davantage de données, à l'aide d'antennes 2G. Les réseaux 3G et 4G se développeront par la suite (22). 19 2. 2. Les antennes-relais : quelques chiffres Selon un rapport disponible sur le site radiofrequence. gouv, on trouvait en 2013 environ 80 000 antennes de téléphonie mobile sur le territoire français (23). Le site indique que 13 251 ont été installées en un peu plus de trois ans et demi, dans un contexte d'apparition récente de la 4G (24). Ce site peut également comptabiliser les antennes en fonction du type de site d'implantation : silos, pylônes haubanés ou arbres, phares, monuments historiques ou même édifices religieux. Leur puissance d'émission est généralement comprise entre 1 et quelques dizaines de watts. Leur portée varie entre 1 et 10 kilomètres selon l'environnement (les obstacles étant beaucoup plus nombreux en ville) . En 2015, 92% de la population française possédait un téléphone mobile selon le CREDOC (Centre de recherche pour l'étude et l'observation des conditions de vie), contre 89% en 2014) (25). Figure 4 : taux d'équipement français en téléphonie mobile (CREDOC 2015) (25) 2. 3. Fonctionnement 2. 3. 1. Des antennes-relais. L'Union Internationale des Télécommunications à laquelle adhèrent la quasi-totalité des pays du monde définit le domaine des télécommunications ainsi : Any transmission, emission, or reception of signs, writing, image, and sounds of any nature by wire, radio, optical or other electromagnetic systems (26). (Toute transmission, émission ou réception de signes, écriture, image et sons quelle qu'en soit la nature par système filaire, radio, optique ou autre système électromagnétique). L'un des principaux vecteurs de cette télécommunication est l'antenne-relais. Le terme fait essentiellement référence aux réseaux de téléphonie mobile, mais il concerne également les réémetteurs de télévision terrestre et les équipements de radiocommunication (gendarmerie, police etc. ). En radioélectricité, une antenne est un dispositif conducteur permettant de 20 rayonner (émetteur) ou de capter (récepteur) les ondes électromagnétiques (27). Elles sont généralement implantées sur des sites dégagés, perchés entre 12 et 50 mètres de hauteur afin de faciliter la propagation des informations et de limiter les obstacles pouvant gêner la transmission. C'est pourquoi on les trouve principalement sur des bâtiments, des pylônes et des châteaux d'eau (21). Chaque station de base comporte trois antennes-relais à 120 l'une de l'autre. Leur émission se fait dans un faisceau très concentré : environ 6 à 7 dans le plan vertical et 65 dans le plan horizontal (27). Les antennes sont réparties selon un maillage géométrique : chacune couvre trois cellules hexagonales, disposées de façon à s'imbriquer les unes dans les autres pour que chaque faisceau couvre la zone d'ombre présente au niveau de leur pied c'est-à-dire la zone intercellulaire. En ville les antennes sont séparées de quelques centaines de mètres contre 10 à 15 kilomètres en campagne (21). Le téléphone mobile est lui- même un émetteur-récepteur capable de distinguer et démoduler une information ; il émet en retour vers l'antenne de la cellule o il se trouve, qui redirigera les données vers un autre téléphone via le réseau filaire. C'est un système complexe, nécessitant un signal de bonne qualité. Chaque antenne-relais comporte un certain nombre de canaux radio ou fréquences, pour communiquer avec les téléphones mobiles. Leur nombre étant limité, ces fréquences sont souvent réutilisées dans les cellules voisines. En réduisant la puissance de l'antenne et en limitant la taille des cellules, on évite ou du moins on minimise un chevauchement de couverture entre les cellules. Ceci toujours afin d'avoir le moins d'interférences possible, et donc un signal de meilleure qualité. La dimension d'une cellule est fonction de la puissance de son émetteur-récepteur. Si celui-ci est très puissant, son champ d'action sera très vaste, mais sa bande de fréquence sera rapidement saturée par le grand nombre de communications. Par contre, en utilisant des cellules plus petites (émetteur-récepteur moins puissant) alors une même bande de fréquence pourra être utilisée plus loin, ce qui augmente le nombre de communications possibles (27). Les modalités de calculs des puissances d'émission sont sous-tendues par des notions de physique complexes et avancées. Les détailler ne nous paraissant pas essentiel pour la compréhension du sujet, nous avons donc choisi de ne pas les aborder. 2. 3. 2. Les réseaux de téléphonie mobile Les réseaux GSM (Global System for Mobile Communications) se situent dans des gammes de fréquences comprises entre 900 et 1800 MHz (d'o les appellations GSM 900 et 1800). Ils sont dits de deuxième génération (2G), et permettent uniquement l'échange de voix et messages. Ils disparaissent progressivement au profit de la 3G et de la 4G (25, 27). GPRS (2. 5G) et EDGE (2. 75G) sont des technologies de transition vers la 3G s'appuyant sur les réseaux GSM en permettant des échanges de données et l'accès au réseau internet. La 2G est amenée à disparatre progressivement au profit de la 3G et de la 4G (21). La troisième génération (3G), portée par les antennes du réseau UMTS (Universal Mobile Telecommunications System) est plus performante : grâce à un débit supérieur, elle permet un accès à internet, le transfert d'images, de vidéos et de courriers électroniques. Elle utilise actuellement la bande de fréquence de 2100 MHz mais pourra reprendre les fréquences abandonnées par le système GSM (900 et 1800 Hz donc). Enfin la 4G, ou LTE (Long Term Evolution) utilise les bandes de fréquences de 800 MHz (laissées vacantes depuis le passage à la TNT) et 2, 6 GHz. Les fréquences utilisées par la téléphonie mobile vont de 800 à 2100 MHz, contre 800MHz pour la télévision et 100MHz pour la radioa. a : Ceux-ci ne fonctionnent qu'en mode réception. Les émissions sont permanentes, à un niveau de puissance constant, que les récepteurs 21 2. 4. Législation actuelle L'essentiel des réglementations françaises concernant les antennes est disponible sur le site (23). En voici une synthèse. 2. 4. 1. Concernant l'implantation Elle nécessite une déclaration préalable auprès de l'Autorité de régulation des communications électroniques et des postes (23) (ARCEP) conformément aux dispositions de l'article L. 33-1 du code des postes et communications électroniques (27). Pour les émetteurs d'une puissance inférieure à 5 watts, cette déclaration suffit. Au-delà, une autorisation de l'Agence nationale des fréquences (ANFR) est requise pour pouvoir émettre. L'implantation des antennes doit respecter les règles générales d'urbanisme ou selon les cas, les règles du plan local d'urbanisme (article L. 421-8 du Code de l'Urbanisme) . Conformément aux articles R. 421-9 et R. 421-2 du code de l'urbanisme, les constructions sont soumises : à déclaration préalable si elles dépassent 12 mètres de haut ou si elles nécessitent la construction d'un local technique de 2 à 20 m, à permis de construire si elles nécessitent la construction d'un local technique supérieur à 20 m (28). Ces obligations sont renforcées en site classé et en secteur sauvegardé. Par ailleurs, les exploitants de réseaux bénéficient de servitudes en cas d'installation sur des propriétés privées, sur autorisation délivrée par le maire au nom de l'état (articles L. 45-1 et L. 48 du code des postes et des communications électroniques) (30). Le pouvoir de décision des maires en matière d'implantation d'antennes se limite aux conditions touchant au Code de l'Urbanisme. Le maire peut refuser le projet d'implantation ou lui imposer des prescriptions spéciales s'il est de nature à porter atteinte à la salubrité ou à la sécurité publique (art. R. 111-2 du Code de l'urbanisme), à l'environnement (art. R. 111-15) ou s'il porte atteinte au caractère ou à l'intérêt des lieux avoisinants, sites et paysages (art. R. 111-21), protection des monuments historiques (art. L. 621 et suivants du Code du patrimoine), des sites classés ou inscrits (art. L. 341-1 et suivants du Code de l'environnement) (27-31). Antennes et écoles : la réglementation n'impose actuellement aucune distance minimum entre les antennes-relais et des établissements particuliers, tels que les écoles. Toutefois le décret du 3 mai 2002 (32) (relatif aux valeurs limites d'exposition du public aux champs électromagnétiques émis par les équipements utilisés dans les réseaux de télécommunication ou par les installations radioélectriques) prévoit que les exploitants communiquent un dossier qui précise les actions engagées pour assurer qu'au sein des établissements scolaires, crèches ou établissements de soins qui sont dans un rayon de cent mètres de l'installation, l'exposition du public au champ électromagnétique émis par cette installation est aussi faible que possible tout en préservant la qualité du service rendu. soient allumés ou éteints. L'exposition de la population ne résulte que de l'émission par les stations, dont les puissances sont importantes afin de couvrir une zone étendue (plusieurs centaines de kilowatts). Leur nombre est donc moindre par rapport aux relais de téléphonie mobile. 22 2. 4. 2. Concernant le respect des valeurs d'exposition L'ANFR est l'organisme chargé de veiller au respect des réglementations (tant en ce qui concerne l'implantation que dans la surveillance du niveau d'exposition). Selon les conditions prévues par la loi, ses missions sont les suivantes : - veiller au respect des valeurs limites réglementaires d'exposition du public (articles L. 34- 9-1 et L. 43 du CPCE) ; - tenir à jour le protocole de mesures dont les références sont publiées par arrêté ministériel ; - gérer le dispositif national de mesure de l'exposition aux champs électromagnétiques (alinéa 17 de l'article R. 20-44-11 du CPCE, décret n 2013-1162 et arrêté du 14 décembre 2013) ; - contrôler la conformité des terminaux radioélectriques mis sur le marché (alinéa 12 de l'article R. 20-44-11). La loi n 2015-136 du 9 février 2015 relative à la sobriété, à la transparence, à l'information et à la concertation en matière d'exposition aux ondes électromagnétiques dite loi Abeille a confié à l'ANFR de nouvelles missions, et en particulier celle de recenser les points dits atypiques, c'est-à-dire les lieux dans lesquels le niveau d'exposition aux champs électromagnétiques dépasse significativement ceux généralement observés sur le reste du territoire (29, 30, 32). La circulaire du 16 octobre 2001 précise que l'exploitant de l'antenne doit prendre les mesures nécessaires pour éviter toute exposition du public à des niveaux dépassant les valeurs limites fixées par la réglementation (33). Afin d'éviter toute exposition accidentelle, l'accès dans une zone o les valeurs sont susceptibles d'être dépassées (de quelques dizaines de centimètres jusqu'à quelques mètres face à l'antenne) doit être interdit et indiqué par une signalisation. Chaque antenne indiquée à l'ANFR est ensuite répertoriée sur Cartoradio, un site internet accessible au public. Enfin un protocole de mesure aux alentours de l'antenne est fourni par l'ANFR, et ces mesures doivent lui être communiquées. La loi n 2009. 967 du 3 août 2009 (Grenelle 1) prévoit la mise en place d'un dispositif de surveillance permettant à toute personne de faire mesurer gratuitement le niveau d'exposition de son logement par un organisme accrédité indépendant financé par un fond public alimenté par la contribution des opérateurs de réseaux émettant des ondes électromagnétiques (28). 2. 4. 3. Valeurs limites d'exposition Initialement les premiers décrets concernant les limites d'exposition ne concernaient que les travailleurs exposés aux micro-ondes (1953). Puis ces réglementations se sont étendues à l'ensemble de la population. C'est en 1984 que le Comité International pour les Rayonnements Non Ionisants a publié ses premières recommandations. Elles ont été révisées en 1988 et 1998. Cet organisme a été remplacé par la Commission internationale pour la protection contre les rayonnements non ionisants (ICNIRP), qui est à l'origine de la plupart des recommandations françaises. Elle est aujourd'hui considérée comme une référence. C'est une organisation non gouvernementale regroupant des experts scientifiques indépendants. Son rôle est d'étudier les risques potentiels liés aux différents types de rayons non ionisants et d'élaborer des guides pour l'établissement de valeurs limites d'exposition basées sur les connaissances scientifiques actuelles (34). Ces valeurs sont exprimées en volts par mètre (V/m). 23 Valeurs limites d'exposition aux ondes émises par les antennes-relais de téléphonie mobile en France (17, 34) - - - 41 V/m pour une antenne GSM 900 (téléphonie mobile 2G) 58 V/m pour une antenne GSM 1800 (téléphonie mobile 2G) 61 V/m pour une antenne UMTS (3G et Wi-fi) (17) Ces valeurs sont atteintes à moins de 5 mètres de ces antennes, mais en ce qui concerne la population générale au sol, elle n'est exposée en moyenne qu'à des champs d'une intensité avoisinant les 2 V/m, ce qui est loin des valeurs limites d'exposition (ICNIRP, 1998) (34). Valeurs limites d'exposition pour les ondes électromagnétiques en général en France Les valeurs limites d'exposition du public aux champs électromagnétiques sont fixées, en France, par le décret 2002-775 du 3 mai 2002 relatif aux valeurs limites d'exposition du public aux champs électromagnétiques (télécommunications ou installations radioélectriques) (32). Elles suivent la recommandation européenne 1999/519/CE (pour le public) et la directive européenne 2004/40/CE (pour les professionnels) (35). Il est important de faire une distinction entre deux entités soumises à des réglementations : - les niveaux de référence, correspondant à des limites exprimées en grandeurs physiques mesurables, qui doivent être appliquées au niveau de l'émetteur, et permettent d'évaluer l'exposition et de respecter les restrictions de base au niveau de l'organisme. - les restrictions de base, à savoir les valeurs limites en terme d'exposition recevable au niveau de l'organisme pour éviter un effet biologique. Niveaux de référence (35) Ils sont exprimés en intensités des champs électrique (volt par mètre) et magnétique (ampère par mètre) ou induction magnétique (tesla) en un point donné, en fonction de la fréquence du champ électromagnétique utilisée par l'émetteur . Pour les différents types de fréquences, les valeurs limites du champ électrique sont les suivantes : - 28 V/m pour l'émission FM - 41 V/m pour une antenne GSM 900 (téléphonie mobile 2G) - 58 V/m pour une antenne GSM 1800 (téléphonie mobile 2G) - 61 V/m pour une antenne UMTS (3G et Wi-fi) - 28 V/m pour un émetteur de radiodiffusion - 31 à 41 V/m pour un émetteur de télédiffusion Ces valeurs ont été établies à partir d'un barème en fonction de chaque fréquence (17). Fréquences 10 à 400 MHz 400 à 2000 MHz (antennes-relais) 2 à 300 GHz Intensité du champ électrique (V/m) 28 1. 375*f*0. 5 (f étant la fréquence en MHz) 61 Figure 5 : valeurs maximales d'exposition pour les radiofréquences (ICNIRP, 1998) (34, 36) Restrictions de base (34, 35) Elles sont exprimées en Débit d'Absorption Spécifique (DAS), en densité de courant ou en densité de puissance selon la fréquence du champ électromagnétique. Le DAS correspond à la puissance absorbée par unité de masse du tissu du corps, qui s'exprime en watt par kilogramme (W. kg-1). 24 L'exposition de l'antenne-relais est lointaine et diffuse, donc l'intensité du champ magnétique subi par le corps humain est homogène, et mesurable directement à l'aide d'appareils de détection. Dans d'autres cas comme celui du téléphone portable, la partie du corps proche de la source est la plus touchée (tête, poche de pantalon etc. ), et l'énergie absorbée par les tissus biologiques ne peut être évaluée qu'indirectement, la mesure ne pouvant se faire à l'intérieur du corps. Ceci rend les restrictions de base difficiles à quantifier. On raisonne donc en terme de niveaux de référence pour contrôler l'exposition locale. Les niveaux de référence correspondent à des valeurs environnementales, de quantités plus facilement mesurables : le champ électrique, le champ magnétique et la densité de puissance. Pour chaque paramètre caractérisant l'exposition, le pire cas est envisagé (polarisation du champ, profil du signal, taille du sujet, caractéristiques électriques des tissus). La probabilité de leur concomitance est en réalité extrêmement faible mais c'est une sécurité supplémentaire dans le processus de calcul. Pour établir les doses-limites, les scientifiques définissent d'abord l'effet critique, c'est-à-dire le niveau d'exposition au-delà duquel il est possible d'observer le premier effet thermique ayant des conséquences sanitaires connues. On lui applique alors un facteur de sécurité de 50 afin d'obtenir une valeur limite d'exposition 50 fois inférieure. Ceci permet de prendre en compte les incertitudes scientifiques pouvant exister du fait de difficultés méthodologiques (liées au modèle dosimétrique ou à l'extrapolation de l'animal à l'homme par exemple). Après application de ce facteur 50, les seuils définis sont de 4 W/Kg (DAS corps entier de l'animal) et de 100 W/Kg pour une exposition localisée. Un facteur de sécurité de 10 a été choisi pour obtenir la limite de 0, 4 W/Kg pour les professionnels (directive 2004/40/CE) (33). Un facteur de réduction supplémentaire de 5 est appliqué pour le public soit 0, 08 W/Kg (directive 1999/519/CE) (33-35). Au total, une fois ces différents facteurs appliqués (50, 10 et 5), on obtient une valeur 2500 fois plus faible que celle pour laquelle les premiers effets sont observés en l'état actuel des connaissances. Ces réglementations concernent le DAS pour un corps entier. Des valeurs localisées (tête- tronc et membres) ont également été calculées. Le DAS tête-tronc à ne pas dépasser pour un téléphone portable est de 2 W/Kg, et doit impérativement figurer dans le guide d'utilisateur du téléphone (arrêté du 8 octobre 2003 relatif à l'information des consommateurs sur les terminaux radioélectriques) (33). Fréquences > 0 - 1 Hz 1 - 4 Hz 4 - 1000 Hz 1000 kHz - 100 kHz 10 kHz - 10 MHz 10 MHz - 10 GHz 10 - 300 GHZ Densité de courant (mA/m) DAS corps entier (W/kg) DAS local tête et tronc (W/kg DAS local membre (W/kg) Densité de puissance (W/m) 8 8/fa 2 f/500 f/500 - - - - - - 0, 08 0, 08 - - - - - 2 2 - - - - - 4 2 - - - - - - - 10 Figure 6 : valeurs limites d'exposition du public (Source : Journal Officiel de la République Française du 5 mai 2002) (32, 36) a : f est la fréquence en Hz ; la valeur limite d'exposition en Débit d'Absorption Spécifique pour un téléphone portable est en caractères gras. 25 Réglementations à l'étranger (34, 37) Environ trente pays ont adopté ces directives, dont la plupart des pays d'Europe de l'Est, l'Inde, le Brésil. Les États-Unis, le Canada et quelques autres pays suivent les recommandations d'un autre organisme, l'IEEE (Institute of Electrical and Electronics Engineers). Leur approche correspond à celle de l'ICNIRP : mêmes bases scientifiques, même évaluation du risque. Dans la gamme 10 MHz - 300 MHz, les niveaux de référence retrouvés ne sont pas exactement les mêmes (exemple : pour 10 MHz le niveau de référence de l'IEEE pour le public est de 82, 4V/m pour le champ électrique, contre 28 V/m en France). En 2004, le Conseil Européen a recommandé que les lignes directrices de l'ICNIRP soient adoptées dans toute l'Union Européenne. La grande majorité des pays membres les ont suivies, soit en les intégrant dans leurs réglementations (Allemagne, Autriche, Espagne, Estonie, Finlande, France, Hongrie, Portugal, République Tchèque, Slovaquie, Roumanie), soit en les présentant sous forme de recommandations (Danemark, Irlande, Lettonie, Malte, Pays-Bas, Royaume-Uni, Suède). Toutefois, des approches différentes sont appliquées dans certains états membres, avec l'introduction de limites plus restrictives dans des lieux de vie (Belgique, Italie, Luxembourg, Grèce, Pologne, Lituanie, Bulgarie, Slovénie). C'est aussi le cas pour la Suisse et le Liechtenstein. Les valeurs choisies par ces états reposent sur l'application du principe de précaution face à d'éventuels risques sanitaires liés à l'exposition aux champs électromagnétiques, et les valeurs limites d'exposition n'ont pas été fixées sur la base d'un calcul scientifique explicité (37). Quelques exemples européens (38) : - en Italie, le seuil est de 20 V/m pour l'ensemble des technologies, sauf dans les lieux o un individu est susceptible de passer plus de quatre heures par jour. Dans ce cas, le seuil passe à 6 V/m. - en Belgique, une norme est rentrée en application depuis fin mars 2009. Cette norme stipule que dans la région de Bruxelles, le seuil à ne pas dépasser est de 3 V/m. Ce seuil est applicable à toutes les zones accessibles au public pour les fréquences comprises entre 400 MHz et 2 GHz. Limites de ces réglementations Le DAS comporte certaines limites. En effet seule la valeur la plus élevée est prise en compte, sans précision quant à la valeur moyenne ou les conditions exactes de la mesure. Celle-ci est réalisée sur une faible portion de tissu (10g) et cela rend l'extrapolation à un corps humain entier assez difficile (35). Se pose également la question de l'exposition des enfants, au cours de laquelle les effets biologiques pourraient ne pas être équivalents à ceux d'un adulte. Ce problème a été soulevé par l'ANSES (Agence Nationale de Sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail). Nous parlerons de leurs rapports dans le chapitre consacré aux effets sanitaires. Ceci ne concerne pas les antennes-relais mais les téléphones mobiles et jouets connectés. 26 2. 5. Opposition aux antennes-relais 2. 5. 1. Les associations dites anti-ondes Les associations les plus connues sont Robin des toits, CRIIREM (Centre de Recherche et d'Information Indépendant sur les Rayonnements Électro Magnétiques non ionisants) et PRIARTEM (Pour Rassembler Informer et Agir sur les Risques liés aux Technologies ÉlectroMagnétiques). PRIARTEM (38), créée en 2000, est la plus ancienne. Son action se concentre sur les implantations d'antennes de téléphonie mobile. Son ambition est de veiller à ce que celles-ci soient respectueuses des conditions de vie et de santé de tous. Sa revendication principale est l'abaissement du seuil légal des champs électriques à 0, 6 V/m . L'association Robin des toits (39), plus récente (2004) va plus loin que PRIARTEM dans ses revendications. Elle réclame également un abaissement des seuils à 0, 6 V/m pour les antennes-relais, mais aussi un abandon de toutes les technologies sans fil comme le Wi-fi, le DECT, le Bluetooth etc. A noter également que cette association propose des mesures indépendantes payantes de champ électrique aux particuliers et aux collectivités. Enfin on peut citer la CRIIREM (40) (Centre de Recherche et d'Information Indépendant sur les Rayonnements Électro Magnétiques non ionisants). Ses revendications sont les mêmes que celles de Robin des Toits. Elle propose des mesures de champs électriques ainsi qu'une activité de consultation. Ses méthodes alarmistes ont été pointées du doigt, notamment lors de la classification des ondes radiofréquence dans la catégorie 2B (peut-être cancérogène) (41) par l'OMS. La CRIIREM avait alors déclaré que cela les rangeait dans la même catégorie que l'amiante et le VIH (qui appartiennent en réalité à la catégorie 1 correspondant aux cancérogènes avérés). Une des figures emblématiques de la lutte anti-onde est le Professeur Belpomme, cancérologue et président de l'ARTAC (42) (Association pour la Recherche et la Thérapie Anti-cancéreuse). Il organise régulièrement des conférences dont la plupart traitent des ondes électromagnétiques et de l'électrosensibilité. Il possède également une activité de consultation orientée vers les personnes se disant électrosensibles. De façon générale, les militants anti-ondes appellent à l'application du principe de précaution sur les valeurs réglementaires d'exposition. Les forces en présence utilisent des paradigmes différents, ce qui est source de confusion et de conflit. D'une part, les experts scientifiques ont pour mission de surveiller les risques potentiels plausibles de certaines technologies comme les antennes-relais et de les garantir non pas nuls (car c'est impossible), mais acceptables pour la population générale. Toutefois, l'épaisse littérature existante sur les antennes-relais n'indique actuellement aucun effet sanitaire y compris pour des seuils très supérieurs à ceux des valeurs réglementaires en vigueur. D'autre part, les opposants pointent justement du doigt cette incapacité des scientifiques à garantir une absence totale de risque. En effet, pour certains d'entre eux, exposer une population alors que des incertitudes existent est moralement inacceptable. Cette attitude n'est pas dénuée de logique mais présente tout de même une certaine ambivalence. Le caractère collectif des antennes en fait des proies logiques (inesthétiques, envahissantes) mais détourne l'attention de ce qui les rend actuellement indispensables, à savoir une adhésion complète de la population à une technologie avec laquelle elle s'est familiarisée : le téléphone portable. 27 Abaisser les valeurs d'exposition à 0, 6 V/m : origine de la revendication ? Cette demande prend sa source dans une étude autrichienne de 1996 (35). Celle-ci étudiait les effets d'une exposition GSM grâce à des électroencéphalogrammes réalisés durant le sommeil des sujets. Des modifications du tracé ont été obtenues au-delà de 0, 5 W/m2. Un organisme national a donc décidé d'abaisser le seuil réglementaire en appliquant un facteur de sécurité de 500 à cette valeur, soit 1 mW/m2 ou 0, 614 V/m. Cette étude a été répliquée par la même équipe en 1998 et par une autre en 2000, ces résultats n'ont jamais été reproduits. Les premiers effets similaires ne sont même apparus sur le tracé qu'à partir de 50 W/m2, soit une puissance cent fois supérieure à celle des premiers résultats. Il a donc été conclu à une absence de preuve scientifique. données. 2. 5. 2. Inquiétudes de la population face aux antennes-relais : quelques Dans son rapport de 2009, l'AFSSET (Agence française de sécurité sanitaire de l'environnement et du travail) a évalué la répercussion sur la population de la controverse existant concernant les ondes électromagnétiques (35). Une population divisée Les préoccupations concernant les risques pour la santé des champs électromagnétiques divisent la population en deux parties sensiblement égales. Les personnes qui se disent très et plutôt préoccupées par les risques potentiels pour la santé des champs électromagnétiques représentent 48 % des personnes interrogées dans l'Euro baromètre. Une forte disparité règne dans l'Union européenne : ainsi 27 % des Suédois, 28 % des Finlandais, 30 % des Danois et 31 % des Tchèques, Estoniens Hongrois, Néerlandais se montrent préoccupés par le sujet, alors que 69 % des Italiens, 82 % des Chypriotes, et 86 % des Grecs le sont. La France se situe en position médiane avec 52 % de la population préoccupée par ce risque (35). Un problème d'information En France, 70 % des personnes interrogées ne se déclarent pas satisfaites de l'information reçue sur le sujet. Les citoyens les plus préoccupés par les risques sur la santé sont aussi ceux qui se sentent les moins bien informés. Dans les motifs d'insatisfaction quant aux informations reçues sur les risques possibles pour la santé des champs électromagnétiques, nous trouvons dans l'ordre décroissant : l'information est insuffisante 50 %, l'information n'est pas objective 11 %, l'information n'est pas communiquée de manière objective 10 % ; l'information n'est pas fiable 9 %, l'information est compliquée 8 %, etc. (35). Un problème de confiance L'AFSSET dans son rapport de 2009 a constaté que la confiance des français en la capacité des autorités à les protéger des risques associés aux stations de base de téléphonie mobile est assez faible : seules 21 % des personnes déclarent avoir confiance, 32 % avoir plus ou moins confiance, et 42 % ne pas avoir confiance. Ce sujet est l'un de ceux pour lesquels les français sont les plus méfiants vis-à-vis des autorités publiques : il arrive en 26ème position sur les 31 situations de risques environnementaux proposées. Ce jugement négatif s'est progressivement accentué (36 % des personnes interrogées déclaraient ne pas avoir confiance dans les autorités pour les protéger des stations de bases de téléphonie mobile en 2002 contre 42 % en 2007) (35). A la question pour chacun des domaines suivants estimez-vous que l'on dit la vérité sur les dangers qu'ils représentent pour la population , les réponses positives viennent également en 28 26ème position par rapport aux 31 autres risques environnementaux avec seulement 14 % de oui, 25% de plus ou moins d'accord, et 56% de non. 2. 5. 3. Défiance envers les antennes. Les origines ? Comme nous allons le voir, la littérature disponible sur les antennes elles-mêmes semble plutôt rassurante, même s'il est impossible de garantir un risque zéro. Actuellement, le travail des scientifiques se concentre davantage sur l'évaluation du risque lié aux téléphones portables. Les nouvelles études en cours portent essentiellement sur eux, et notamment sur leur rôle dans la genèse de certaines tumeurs cérébrales comme les gliomes et neurinomes de l'acoustique. L'exposition localisée en particulier au niveau de la tête, et ce à un âge de plus en plus précoce, rend cette hypothèse tout à fait légitime. Pour faire une comparaison, un téléphone peut émettre jusqu'à 5 mW/cm2, contre 2 W/cm2 à 15 mètres d'une antenne-relais, sachant qu'à 150 mètres, elle n'en émet plus que 0, 02 W/cm2 (sa puissance diminuant avec le carré de la distance). Pourtant, les antennes semblent toujours cristalliser les tensions. Les associations en ont fait le symbole de leur croisade contre les ondes, et la baisse des seuils réglementaires d'exposition est devenue la pierre angulaire des revendications. Les différentes actions en justice intentées par des riverains, l'écho que trouvent les discours alarmistes des médias et des associations au sein de la population, semblent indiquer que l'acceptation des antennes par la population est loin d'être évidente. Et pourtant, la vente de téléphones mobiles ne faiblit pas comme le montre la récente étude du CREDOC (25). Des travaux menés par le CNRS (Borraz, Devigne & Salomon, 2005) (43) ont montré que les préoccupations exprimées à propos des antennes ne sont pas seulement d'ordre sanitaire. A l'origine, les réticences prenaient leurs sources dans des conflits d'aménagement du territoire, (considérations esthétiques, patrimoniales, ou encore de démocratie locale (43). Les riverains concernés ont d'ailleurs dénoncé de manière récurrente le manque d'information et de concertation préalables. Mais les mobilisations locales et les protestations ont peu à peu glissé vers une inquiétude sanitaire. Le mouvement contestataire a progressivement gagné en force et s'est organisé. Comment en est-on arrivé à un tel mouvement de rejet ? Un article publié dans la revue L'actualité chimique a analysé les origines de la défiance de la population face à certains secteurs en analysant les composantes problématiques dans son domaine, la chimie (44). Il précise d'ailleurs que ces mécanismes peuvent tout à fait s'appliquer à d'autres secteurs pour peu qu'ils répondent à certains critères que nous allons détailler ensemble. Voici le diagramme réalisé par son auteur, Richard Emmanuel Eastes (cf page suivante). 29 Une technologie : Spécialisée Extensive Lucrative Inaccessibilité, perte de contrôle, suspicion Inéluctabilité, perte de contrôle Inquiétude, insécurité Risque non choisi MÉFIANCE DEFIANCE PEURS-REJET Imaginaire, rumeurs Précaution, irrationalité Valeurs Invasive Intime Contre-nature Figure 7 : les mécanismes de production de la défiance par une activité qui possède les caractéristiques indiquées en haut et en bas de l'image (44). Nous allons donc utiliser cette trame et vérifier son applicabilité au domaine des antennes- relais pour chaque caractéristique. Production de la méfiance - Un secteur et des applications spécialisés La problématique des antennes touche plusieurs domaines d'expertise : l'ingénierie, la médecine mais aussi la physique et la chimie organique. La multidisciplinarité du sujet le rend particulièrement complexe. La compréhension des différents mécanismes et de leur action sur la santé implique un travail collectif d'experts, chacun effectuant sa participation selon son propre domaine de compétences. Énormément de paramètres doivent donc être pris en compte et croisés afin que les conclusions soient les plus exhaustives possibles. L'accès à ces informations est loin d'être évident, tant pour le public que pour la population médicale. La décision et l'analyse des risques est confiée à des institutions et des groupes d'experts dont les conclusions prudentes ont quelques difficultés à faire entendre leur voix au travers des multiples formules chocs et alarmistes. Les communications d'experts ne sont d'ailleurs pas toujours correctement interprétées par un public non familiarisé avec le vocabulaire scientifique ; la tournure de certaines conclusions peut parfois même induire une confusion ou des raccourcis. 30 Prenons deux exemples : la monographie de l'OMS de 2011 (41) et le rapport de l'AFSSET de 2009 (35). Le classement des ondes dans la catégorie des facteurs peut-être cancérogènes a servi de levier pour certains militants anti-ondes . D'aucuns ont pu prendre cette décision pour un aveu, une reconnaissance d'un risque avéré. La réalité est plus complexe et moins tranchée. Cette décision repose sur la possibilité d'un risque accru de gliome cérébral chez des utilisateurs intensifs de téléphone portable mis en évidence par l'étude INTERPHONE (45), de niveau de preuve toutefois jugé limité par l'OMS. A défaut d'avoir lu le rapport, encore fallait-il connatre la classification de l'OMS pour comprendre la nuance existant entre une substance peut-être cancérogène et probablement cancérogène, pour ne pas tirer de conclusion hâtive. Une telle phrase citée hors de son contexte a de fortes chances d'être interprétée par un public non averti comme beaucoup plus alarmante qu'elle ne l'est en réalité, en particulier quand une composante émotionnelle est présente dans l'équation. Dans son rapport de 2009, l'AFSSET a réalisé une importante méta-analyse, concluant à l'absence d'effet sanitaire avéré des antennes-relais. Pourtant, sa conclusion met l'accent sur des effets des radiofréquences sur des fonctions cellulaires rapportées par une dizaine d'études considérées comme incontestables, et préconise une réduction des émissions afin de les maintenir aussi basses que possible. Cette discordance a été relevée par l'Académie de Médecine, qui a souligné le fait que cette communication pouvait alerter inutilement la population (46). Dans une étude de 2007, l'INPES a mis en évidence le manque de confiance de la population en l'expertise scientifique relative aux stations de base de téléphonie mobile. Le nombre de personnes qui se déclaraient très ou plutôt confiantes dans celle-ci n'était que de 49, 5 %. Ceci plaçait la téléphonie mobile en dernière position derrière six autres risques présentés, dont l'amiante (73, 6 %) et la pollution extérieure (72, 7 %), qui suscitaient une plus grande confiance (47). - Un caractère extensif Cet élément est probablement moins valable pour les antennes que pour le secteur chimique. Le Dr Eastes traite ici du phénomène de méfiance généré par des multinationales lointaines et déshumanisées, et d'un processus de décision trop lointain pour que la population puisse avoir la moindre prise sur les choix effectués. C'est en partie vrai mais les réglementations permettent en théorie un contrôle des bonnes pratiques au niveau local concernant l'implantation, ce qui limite les abus. Les maires bénéficient d'un pouvoir décisionnel pour les problèmes d'implantation liés à l'urbanisme (48). Pour le reste, l'ANFR est l'organisme en charge de veiller au respect des réglementations. - Un secteur lucratif. Donc suspect. Chacun sait que le respect de l'humain et de l'environnement n'a pas toujours sa place dans une logique de profit. Les énormes sommes investies impliquent généralement une obligation de réussite, quitte à ce qu'elle se fasse au détriment du bien-être des populations. Les réglementations et les différents travaux réclamés pour évaluer les risques sont donc probablement insuffisants pour faire oublier les enjeux financiers, et la remise en cause de l'indépendance des chercheurs vis-à-vis des lobbies de la téléphonie s'avère être une tactique particulièrement payante. Les conflits d'intérêts font d'ailleurs partie des arguments les plus utilisés par les militants anti-ondes pour décrédibiliser certains rapports ayant tendance à innocenter les antennes-relais. 31 Peurs et rejet - Caractère invasif En 2015, 92% de la population française possédait un téléphone portable (25). Le secteur ne cesse d'évoluer, notamment avec le développement de la 4G. L'implantation des antennes suit fatalement les besoins, ou du moins, la consommation de la population, et leur prolifération importante est source d'inquiétudes. Un sondage réalisé par PRIARTEM et Agir pour l'environnement a montré que 80 % des sondés seraient plutôt favorables (35 %) ou tout à fait favorables (45 %) à une loi ayant pour objectif de réglementer davantage le développement des antennes-relais (49). - Une technologie parfois vécue comme une atteinte à l'intimité L'exposition aux ondes électromagnétiques est permanente. Elle a lieu au travail, mais aussi au domicile, et sur le trajet entre les deux. Ce constat est déjà douloureux pour certains sans même qu'on puisse parler de proximité ou qu'il n'y ait de contact visuel avec la source d'inquiétude. L'implantation de l'antenne-relais à proximité du domicile peut alors parfois être vécue comme une véritable agression, une épée de Damoclès impossible à esquiver et difficile à ignorer si celle-ci est visible. De la même façon, les implantations proches de crèches ou d'écoles ont un véritable impact émotionnel sur les familles, ne souhaitant pas exposer leur progéniture à un risque incertain. Le caractère invisible de la menace (très souvent retrouvé dans les titres d'articles de presse grand public) introduit une notion de danger sournois, implacable car inévitable et joue peut- être également un rôle dans les représentations collectives. La question de l'esthétique pourrait également être classée dans cette catégorie. Elle est à elle seule l'origine de certaines actions en justice. Un opérateur a été attaqué pour nuisance esthétique, et condamné en première instance le 16 février 2008 par le tribunal de Carpentras à démonter une antenne-relais pour ce motif. Les opérateurs ont essayé de faire des efforts afin que les antennes se fondent mieux dans le paysage (en leur donnant un aspect extérieur végétal par exemple), mais les associations anti- ondes leur ont alors reproché d'essayer de cacher les antennes. - Une technologie contre-nature ? Les enjeux environnementaux occupent aujourd'hui une place importante dans les préoccupations de la population. On peut observer un grand retour des valeurs naturalistes (47), se traduisant par une consommation plus responsable et une volonté de trouver des solutions alternatives à certains modes de production actuels, plus en accord avec le respect de l'environnement. Cette attitude est louable mais peut avoir pour effet un rejet automatique de certaines technologies considérées comme contre-nature et donc indésirables. Encore une fois l'impact émotionnel ne doit pas être sous-estimé : sa violence peut rendre une argumentation rationnelle scientifique impuissante face au poids de certaines représentations et d'un rejet parfois à la limite du viscéral (nous reparlerons de l'effet nocebo). - Risque choisi, risque accepté et risque subi Les craintes focalisées sur les antennes peuvent être mises en opposition avec l'acceptation large d'une technologie moins bien cernée comme celle du téléphone portable. Ce paradoxe peut en partie s'expliquer par une différence de perception entre un risque choisi (l'achat et l'utilisation du téléphone) et un risque subi (l'implantation d'une antenne-relais proche de son 32 domicile). L'article du Dr Eastes aborde cette question essentielle en prenant différents exemples. Le risque choisi est un risque délibérément pris par un individu alors qu'il n'y est pas obligé (exemple de la cigarette). Le risque accepté concerne des activités nécessaires comportant un risque reconnu, mais jugé acceptable (exemple de la conduite automobile). Dans le secteur de la téléphonie, un risque de l'utilisation du téléphone portable semble plausible au vu des données de la littérature, même si rien n'a été prouvé à ce jour. La population juge toutefois ce risque suffisamment acceptable pour en posséder un, ou même en acheter à des enfants. Mais dans le cas des antennes-relais, la notion de choix disparat. La population a peu de prise sur leur prolifération et leur installation. Elle peut ainsi difficilement choisir de ne pas y être exposée. Le risque est alors subi, ce qui influe considérablement sur le ressenti, et le rend beaucoup moins acceptable surtout si la personne exposée a le sentiment que certaines informations pourraient lui être dissimulées. A chaque type de risque son moyen de protection : dans le cas du risque choisi, ce sera la prudence, pour le risque accepté, la prévention, et enfin le risque subi sera atténué par des précautions s'il est jugé inacceptable. Au final La méfiance, la peur, le rejet ou une sensation de risque subi sont autant de voies menant à la défiance. Et pour peu que l'objet du délit soit inesthétique, tous les ingrédients sont réunis pour que la désapprobation s'installe. L'argumentation fonctionne donc parfaitement avec les antennes-relais, et permet de mettre le doigt sur certaines origines du malaise ambiant. Un des points sur lequel des améliorations pourraient être apportées est le problème de communication entre les décideurs et le public, actuellement insuffisante pour peser sur les représentations de la population. Face à certaines actions militantes, le cancérologue Maurice Tubiana soulignait la disproportion entre les efforts relativement réduits qui suffisent à susciter des peurs, et les conséquences économiques de ces peurs (50). Et n'oublions pas que même la population scientifique incluant les médecins n'est pas à l'abri de ces peurs et de cette défiance (51). Le sujet ne repose pas sur des connaissances médicales pures mais touche à de multiples domaines d'expertise, et ne s'inscrit pas dans le cursus des études médicales. Il est donc plausible que certains d'entre eux ne soient pas épargnés par ces différents mécanismes. Une étude chinoise s'est penchée sur le rôle de la communication dans le processus d'implantation des antennes. L'équipe a réalisé une série de mesures concernant les valeurs d'exposition et a mené en parallèle une campagne d'information concernant ces protocoles de mesure. Deux constats ont été faits : non seulement les niveaux d'exposition proches des stations GSM étaient très bas, inférieurs aux recommandations, mais l'effort de communication semble avoir permis d'améliorer les perceptions de la population par rapport à ces champs magnétiques et de favoriser les échanges entre les riverains et les autorités (52). 33 2. 5. 3. Un mot sur l'effet NIMBY. Un sondage a été réalisé en 2003 par le CREDOC (Centre de recherche pour l'étude et l'observation des conditions de vie) et publié par 60 millions de consommateurs (53). Ses conclusions étaient les suivantes : 41 % des interrogés se déclaraient inquiets de la présence en ville et en campagne de nombreuses antennes-relais ; 63 % déclaraient qu'ils n'accepteraient pas que l'on pose une antenne à proximité de leur lieu de résidence ; 75 % étaient favorables à ce que leur installation soit interdite près des écoles ; 70 % souhaitaient une réglementation pour éviter leur prolifération sur les toits ; 55 % étaient favorables à ce que l'on interdise de nouvelles installations. Ces résultats datent de 2003, pourtant le nombre d'usagers de téléphones portables n'a pas ralenti sa progression (92% de la population en 2015 (25) selon une étude du CREDOC ). Le nombre de refus de vivre près d'une station de base de téléphonie mobile a tendance à augmenter car il est passé de 50 % en 2004 à 64 % en 2007. Nous n'avons pas trouvé de donnée plus récente. Ce paradoxe a engendré ce que les anglo-saxons nomment l'effet NIMBY (acronyme de Not In My BackYard, littéralement Pas dans mon arrière-cour). Cette expression, née aux États-Unis, était initialement utilisée de façon péjorative pour désigner l'attitude d'opposition de personnes qui, bien que bénéficiant des avantages d'un projet d'intérêt général, refusent d'être exposées aux éventuelles nuisances générées par son installation, même si cela implique que d'autres personnes les subissent à leur place. L'expression a évolué pour devenir neutre, et désigne maintenant une opposition à l'implantation de nouvelles infrastructures potentiellement nuisibles (54). mobile. 2. 5. 4. Les effets sanitaires supposés des antennes-relais de téléphonie La visite de certains sites anti-ondes à la recherche d'effets sanitaires décriés amène quelques remarques. L'existence de lanceurs d'alerte peut être salutaire dans certains cas, tant que l'alerte dispose d'une certaine consistance scientifique. La plupart du temps, aucune distinction n'est faite entre les différentes sources électromagnétiques (antennes, téléphones, wi-fi, Bluetooth, DECT etc. ) ce qui entretient une confusion. Le problème des différentes informations données par ces sites est qu'ils ne tiennent pas toujours compte du niveau de preuve (comme dans le cas du rapport BioInitiative), et que certaines des revendications ne sont pas forcément pertinentes ou applicables en pratique (l'exemple des 0, 6 V/m). Peu d'allégations impliquent directement les antennes-relais, si ce n'est une accusation de provoquer des troubles du sommeil, dont des centaines de personnes peuvent témoigner (39). Cet élément n'a à priori pas été retrouvé lors des différentes études réalisées (cf AFSSET 2009). Ont également été cités des problèmes liés à la médecine vétérinaire (augmentation de mortalité chez des veaux, baisse de qualité du lait, baisse de ponte dans une exploitation avicole) sur lesquels nous ne nous étendrons pas, n'ayant trouvé aucune donnée scientifique concluante lors des recherches. 34 2. 6. Effets biologiques et sanitaires des antennes-relais thermiques et non thermiques 2. 6. 1. Effets biologiques connus des champs électromagnétiques : effets L'organisme humain est le siège de multiples réactions chimiques engendrant des émissions électromagnétiques, et ceci sans aucune influence externe. Ces réactions correspondent au mode de fonctionnement normal de celui-ci. Le système nerveux transmet les informations sous forme d'impulsions électriques, ce qui les rend détectables par des outils comme l'électrocardiogramme ou l'électroencéphalogramme. Les champs électromagnétiques extérieurs ont la capacité d'interagir avec ce système. Différents effets biologiques peuvent être observés selon le type de tissu traversé et la fréquence de l'onde électromagnétique étudiée (55). Une fréquence inférieure à 100 KHz entrane une stimulation électrique des tissus excitables comme le système nerveux et les muscles. Au-delà de 10 MHz, l'absorption est prépondérante et c'est donc un échauffement des tissus que l'on peut observer : c'est l'effet thermique. Entre 100 KHz et 10 MHz, les effets thermiques et non thermiques cohabitent. Dans le cas des antennes-relais de téléphonie, nous parlons de fréquences supérieures à 400 MHz. C'est donc l'effet thermique qui va nous intéresser. Effets thermiques Les effets thermiques résultent de l'action d'hyperfréquences sur des molécules chargées électriquement, provoquant une friction et un dégagement de chaleur, ce qui entrane une élévation de la température des tissus (35, 55). Les multiples stimuli externes subis par le corps humain entranent des réactions biologiques d'adaptation, de compensation, généralement bien supportées et sans incidence sur la santé. Les effets néfastes apparaissent lorsque le système biologique n'est plus capable de compenser. Dans le cadre de l'effet thermique, l'adaptation se fait via la thermorégulation, ce qui limite l'échauffement des tissus concernés. Comme nous l'avons dit dans le chapitre sur les réglementations, l'élaboration des restrictions de base repose sur les seuils auxquels ont été observés les premiers effets thermiques. Ainsi, on peut observer un échauffement excessif des tissus au-delà de quatre watts par kilogramme (W/Kg) pour une exposition corps entier et de cent watts par kilogramme pour une exposition localisée chez l'adulte. Effet non thermiques ? Christophe Champion (15, 16) (2002) a décrit l'action des rayonnements non ionisants de la façon suivante. Suite à l'excitation d'une molécule, l'énergie est absorbée par celle-ci et se transforme pour donner : une énergie électronique (quelques électron-volt ou eV) ; puis une énergie de vibration (quelques 1/10e d'eV) ; puis une énergie de rotation (quelques 1/100e d'eV) ; et enfin un retour à l'état électronique fondamental. 35 Dans le cas des ultraviolets (transport d'énergie important) toutes les étapes ont lieu, d'o des réactions photochimiques avec impact sur les molécules (libération de radicaux libres). Les infrarouges génèrent seulement des énergies vibratoires et rotatoires. Les ondes hertziennes engendrent uniquement une rotation, ce qui en terme d'énergie est considéré comme négligeable et n'induit donc à priori pas de modification chimique significative. A ce jour, les effets thermiques sont donc les seuls à avoir été mis évidence lors d'une exposition aux ondes radioélectriques. (Annexe 1 : effets biologiques des différents rayonnements électromagnétiques) 2. 6. 2. Les antennes-relais : revue des principaux rapports scientifiques. La communauté scientifique a commencé à s'intéresser aux effets sanitaires des champs électromagnétiques à la fin des années 70, dans un contexte d'expansion des télécommunications. Dans une publication de 1979, Wertheimer et Leeper (56) ont ouvert le débat en montrant une augmentation de l'incidence des leucémies chez des enfants résidant dans des zones fortement exposées aux champs magnétiques d'extrêmement basse fréquence. Puis avec l'apparition des téléphones portables, les chercheurs se sont tournés vers les radiofréquences, notamment en cherchant une implication carcinogène. A la demande des autorités publiques, les rapports d'expertise se sont multipliés afin d'évaluer les risques des radiofréquences (incluant celles des antennes-relais) pour la population. Ces rapports ont passé au crible les études sur le sujet afin d'en donner un panorama le plus complet possiblea. En France, le site de l'ANSES (Agence Nationale de SÉcurité Sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail) est une référence en ce qui concerne les risques environnementaux. Des rapports d'experts y sont publiés régulièrement, et portent sur les risques liés à des sujets aussi divers que l'alimentation, la santé au travail, la médecine vétérinaire etc. Voici les conclusions des principaux rapports disponibles. Rapport de l'AFSSET concernant les radiofréquences (2009) (57) L'AFSSET (Agence Française de Sécurité Sanitaire de l'Environnement et du Travail) a changé de nom pour devenir l'ANSES (Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail) quelques années plus tard. Elle est à l'origine du rapport le plus complet réalisé sur le sujet des radiofréquences, incluant celles émises par les antennes-relais de téléphonie mobile. Nous nous attarderons sur ce rapport dont la rigueur a été saluée par la communauté scientifique, malgré des conclusions en demi-teinte. Dans ce rapport, 226 études publiées entre 2005 et 2009 ont été passées en revue. Sur ces 226 études, 102 ont mis en évidence des effets biologiques, dont 11 ont été retenues, les autres présentant des faiblesses méthodologiques. Sur les 124 ne montrant pas d'effet, 73 ont été retenues comme fiables. Études portant sur les radiofréquences en général : études ayant soulevé des questionnements Onze études ont été retenues, qui rapportaient des perturbations organiques mineures et a : on peut citer principalement les monographies de l'OMS [WHO, 1993] , les publications du Centre International de Recherche contre le Cancer (CIRC) en 2013 [IARC, 2013] ; le rapport de la Health Protection Agency (HPA) en 2012 et les rapports d'expertise de l'Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail (ANSES, anciennement AFSSET) en 2003, 2009 et 2013. [AFSSET, 2003, 2009] ; [Anses 2013 et 2016] 36 hétérogènes sans impact majeur. - Une hausse de l'endocytose (58) (transport de molécules à l'intérieur de la cellule) dans des cellules exposées aux radiofréquences [Mahrour N. et al 2005]. Ce phénomène apparaissait après quelques minutes et au-delà d'un seuil de DAS légèrement supérieur aux niveaux atteints à l'intérieur de corps avec des téléphones mobiles. Les chercheurs supposent que la composante électrique des ondes pourrait rendre les cellules plus perméables à certaines molécules. - Une augmentation de la vulnérabilité des cellules issues de neuroblastome (59) au un oxydant impliqué dans certains processus peroxyde d'hydrogène, neurodégénératifs, c'est-à-dire une potentialisation du stress oxydatif sur ces cellules en particulier, sans que cela soit extrapolable à l'homme [Del Vecchio G. et al 2009]. - Une étude menée en 2005 par une équipe japonaise [Miyakoshi J. et al. 2005] a cherché à savoir si l'exposition aux radiofréquences induisait une réponse cellulaire spécifique au stress (60), comme une production de la Heat Shock Protein (HSP). L'expression d'HSP n'était pas différente entre les cellules exposées et les cellules témoins. Pourtant l'exposition à 10 W/Kg semblait inhiber une modification chimique nécessaire à la fonction de protection des HSP27. Toutefois au vu de la puissance appliquée, ce phénomène serait probablement lié à l'effet thermique lui-même. - Concernant le taux d'apoptose (61), une équipe française [Joubert V. 2008] a mis en évidence une augmentation de celui-ci dans un groupe de cellules exposées aux radiofréquences, ainsi qu'une élévation de 2C. Un groupe de cellules témoins maintenues à la même température que le groupe observé n'a pas présenté cette augmentation ; il ne s'agirait donc pas que de l'effet thermique. A noter que ces résultats ne se sont pas reproduits dans d'autres études pourtant menées par la même équipe. - Une étude italienne de 2008 [Palumbo R. 2008] aurait mis en évidence une augmentation de l'activité de la caspase 3 (62) (enzyme jouant un rôle dans le déclenchement de l'apoptose). En revanche, aucun effet n'a été observé ni sur le cycle cellulaire ni sur l'apoptose elle-même au cours de cette étude. - Dans une lignée de cellules humaines du système nerveux exposées aux radiofréquences, une équipe de l'université de Bari (Italie) a observé l'expression de différents gènes intervenant dans la cascade d'événements aboutissant à l'apoptose [Buttiglione et al 2009]. Un effet faible et transitoire a été observé sur l'expression des gènes EGr-1. Ceux-ci sont connus pour être liés à l'apoptose induite par certaines radiations ionisantes comme les UV. Mais encore une fois ces résultats n'ont pas été reproduits par d'autres études. - Enfin l'étude INERIS France (63) [Ammari M. 2008] a montré une augmentation significative de l'expression GFAP (acide protéique fibrillaire glial) dans différentes régions du cerveau chez les rats soumis à un signal avec un DAS de 6 W/Kg cinq jours par semaine pendant vingt-quatre semaines. Ceci suggère une prolifération de la glie lors d'une exposition chronique, et donc une altération des tissus de soutien. Toutefois cet effet n'est pas apparu lors d'une exposition plus prolongée à 1, 5 W/Kg. Rappelons que la limite légale d'exposition pour les téléphones portables est de 2 W/Kg. L'Académie de Médecine a émis un avis sur les onze études retenues. Elles n'ont pas été validées, dans la mesure o elles n'ont jamais été répliquées, et ont même été contredites par d'autres travaux. Leur niveau de preuve scientifique est donc considéré comme faible. 37 Conclusions du rapport de l'AFSSET À ce jour, il ressort de cette analyse que, en conditions non thermiques, les radiofréquences supérieures à 400 MHz : ne modifient pas les grandes fonctions cellulaires telles que l'expression génique, la production de radicaux libres oxygénés et l'apoptose notamment des cellules d'origine cérébrale (provenant de gliome ou de neuroblastome humains), les plus exposées en cas d'utilisation d'un téléphone mobile ; ne sont pas un facteur de stress pour les cellules en comparaison des facteurs de stress avérés. Les seuls effets de stress observés sont des effets thermiques associés à des niveaux d'exposition élevés. ne provoquent pas d'effet génotoxique ou co-génotoxique reproductible à court ou à long terme et ne sont pas mutagènes dans les tests de mutagénicité classique. ne provoquent pas d'augmentation d'incidence ou l'aggravation de cancers dans les conditions expérimentales testées. Les résultats convergent donc vers une absence d'effet cancérogène ou cocancérogène des radiofréquences pour des expositions pouvant excéder 4 W/kg. n'ont pas d'effet délétère sur le système nerveux, que ce soit en termes de cognition et de bien-être, en termes d'intégrité de la barrière hémato-encéphalique ou en terme de fonctionnement cérébral général. n'ont pas d'effet susceptible d'affecter le fonctionnement du système immunitaire. n'ont pas d'impact sur la reproduction et le développement d'après les études les plus récentes et les mieux paramétrées. Cependant, les résultats ne sont pas homogènes, et plusieurs études devraient être répliquées dans des conditions d'expérimentation fiables, avec notamment des données dosimétriques. n'ont pas d'effet délétère sur le système cochléo-vestibulaire après une exposition aigu. Et d'après les résultats d'un nombre limité d'études, les radiofréquences supérieures à 400 MHz : ne paraissent pas perturber le système cardio-vasculaire, en particulier la régulation de la pression artérielle et du rythme cardiaque. n'auraient pas d'effet délétère sur le système oculaire. ne modifieraient pas le taux de mélatonine chez l'homme. Quelques études isolées ont porté sur des effets ponctuels, ce qui ne permet pas de donner une conclusion valide. Certaines mériteraient d'être reproduites. Elle a tout de même rappelé certaines limites concernant : l'évaluation des sources de l'exposition (utilisation d'appareils de mesures complexes, simulations numériques imparfaites et évaluation par interrogatoire des utilisateurs, comportant un biais de mémorisation) l'évaluation des effets de l'exposition (les effets sanitaires étudiés sélectionnés étaient ceux qui semblaient les plus plausibles, et la plupart des tests sont réalisés sur des mannequins ce qui pose la question de l'extrapolabilité à l'homme). l'évolution incessante des sources d'exposition. L'AFSSET conclut son rapport en indiquant que les données expérimentales n'ont pas mis en évidence d'effet sanitaire à court ni à long terme lors d'une exposition aux radiofréquences (incluant les antennes-relais). Les données épidémiologiques n'indiquent pas non plus d'effet à court terme de l'exposition 38 aux radiofréquences, même si des interrogations persistent pour les effets à long terme. Aucun des résultats n'appuie actuellement cette hypothèse. Aucune réduction générale de la puissance des antennes n'était donc recommandée par ce rapport, une telle mesure n'étant pas justifiée scientifiquement. Cependant cette conclusion rassurante est tempérée par l'évocation du principe ALARA (As Low As Reasonably Achievable). L'un des rédacteurs, Jean-François Doré s'est appuyé sur ce principe pour recommander de réfléchir à la diminution des niveaux d'expositions dans les lieux présentant des valeurs sensiblement plus élevées que le niveau moyen ambiant. Malgré ces conclusions rassurantes, l'agence a insisté dans son communiqué de presse sur des effets des radiofréquences sur des fonctions cellulaires rapportées par une dizaine d'études considérées comme incontestables. Les Académies de Médecine et de Science se sont d'ailleurs étonnées de cette discordance entre le travail, jugé complet et rigoureux, et ces conclusions plus alarmistes, ne reflétant pas les précédents résultats. Avis des Académies de Médecine et des Sciences (46) Ce communiqué rédigé par le Professeur André Aurengo valide le rapport AFSSET 2009, approuvant sans réserve son travail et soulignant sa cohérence avec d'autres rapports d'expertises collectives (OMS, SCENIHR, ICNIRPa) à savoir : l'absence d'effet sanitaire démontré (génotoxicité, effet inducteur non-thermique d'apoptose cellulaire, effet cancérogène, effet délétère sur le système immunitaire, interaction cellule-onde etc. ). Comme nous l'avons précisé dans le paragraphe sur le rapport de l'AFSSET, les Académies ont pointé du doigt la discordance entre ses conclusions rassurantes et son communiqué de presse plus alarmiste, et ceci en l'absence de matériel susceptible d'inquiéter les scientifiques. Elles ont également évoqué le risque de renforcement artificiel de l'anxiété au sein de la population, avec tout ce que cela implique en terme de santé publique. Pour elles la diminution de puissance des antennes entranerait, afin d'améliorer la couverture du réseau, une augmentation de la puissance des téléphones portables, ce qui ne serait absolument pas pertinent sur le plan sanitaire, l'exposition au téléphone portable étant très supérieure à celle des antennes. Enfin le bulletin s'achevait sur un encouragement à poursuivre les recherches épidémiologiques. Monographie de l'OMS (2011) (41) Ce rapport portait en particulier sur les téléphones portables et le risque de cancer mais il est important de l'aborder car ses conclusions ont probablement joué un rôle dans les représentations de la population générale (soignants compris) sur les ondes au sens large, en incluant les antennes-relais. Les études ont été passées en revue de façon critique, et évaluées dans leur ensemble. Deux études sur plus d'une centaine ont retenu l'attention du CIRC (Centre International de Recherche sur le Cancer ). La première était une étude finlandaise basée sur des données de 1996 et publiée en 2002, montrant une hausse du risque de gliome chez les utilisateurs de téléphones analogiques (non numériques). La deuxième est l'étude Interphone (45). Cette étude rétrospective de l'utilisation du a OMS : Organisation Mondiale de la Santé ; SCENIHR : Scientific Committee on Emerging and Newly Identified Health Risks ; ICNIRP : Commission internationale de protection contre les rayonnements non ionisants 39 téléphone portable a montré un risque accru de 40 % de développer un gliome chez les plus grands utilisateurs (moyenne rapportée : 30 minutes par jour sur une période de 10 ans). Toutefois les biais de cette étude (de l'aveu même de l'équipe) peuvent avoir faussé les résultats. Son niveau de preuve a donc été jugé limité, mais suffisant pour classer les ondes électromagnétiques radiofréquences comme étant peut-être cancérogènes pour l'homme, soit une classification 2B (Annexe 2 : classification de l'OMS). Le niveau de preuve a également été jugé limité pour le neurinome de l'acoustique, et insuffisant pour les autres types de cancer. L'OMS a donc recommandé une surveillance étroite du lien possible entre téléphone portable et cancer, via de nouvelles études : Étant données les implications de cette classification et de ces résultats pour la santé publique, il est crucial que des recherches supplémentaires soient menées sur l'utilisation intensive à long terme des téléphones portables, a déclaré le Directeur du CIRC (Centre international de recherche sur le cancer), Christopher Wild. En attendant qu'une telle information soit disponible, il est important de prendre des mesures pratiques afin de réduire l'exposition, comme l'utilisation de kits mains libres ou des textos. Rapport du SCENIHR Le SCENIHR (ou Scientific committee on emerging and newly identified health risks) est un comité scientifique européen créé par la Commission Européenne portant sur les risques émergents liés à l'environnement. Le rapport qu'il a réalisé comportait également une revue de la littérature, s'étalant de 2009 à 2013 et portait sur les ondes électromagnétiques en général incluant les téléphone portables (64). Voici ses principales conclusions : la question d'une éventuelle augmentation du risque de développer un neurinome du nerf vestibulo-acoustique reste ouverte ; un effet est possible sur le sommeil (sans que l'on sache si cela peut avoir une incidence sur la santé) ; il n'y a pas d'effet avéré sur le développement, la reproduction, la barrière hématoencéphalique, etc le risque de gliome chez les utilisateurs intensifs de téléphone portable est écarté ; concernant l'électro hypersensibilité aux ondes électromagnétiques, il conclut, avec un poids de la preuve modéré, à une absence d'effet des radiofréquences sur les symptômes ressentis. Pour finir, le rapport recommande la réalisation d'études dans le domaine des radiofréquences, avec une priorité forte pour des études de cohorte relatives au risque de cancer, à la fois pour les adultes et les enfants. L'ANSES (65) a analysé ce rapport après avoir réalisé un travail similaire en parallèle. S'ils se rejoignent sur certaines conclusions, il existe des points de divergence : concernant le risque de gliome, l'ANSES estime le niveau de preuve trop limité pour conclure à un risque mais ne l'écarte pas. elle recommande la poursuite des études sur les effets potentiels génotoxiques et cancérogènes des radiofréquences, contrairement au SCENIHR. L'ANSES leur a reproché de ne pas suffisamment avoir analysé les raisons pour lesquelles certaines études ont été écartées et d'autres non, notamment certains résultats positifs. Rapport de l'ANSES (2012) (65) Dans ce rapport de 2012, différents travaux d'études ont été repris, la plupart à partir 40 de l'ancien groupe de travail de l'AFSSET (cité précédemment). Puis des sujets d'actualité ont été abordés comme les expositions, les effets des ondes et les questionnements autour de l'hypersensibilité électromagnétique. Nous n'en citerons que deux. A- Étude : Réponses cellulaires aux expositions millimétriques. [Le Dréan Y. , 2012] Au cours de ce travail (66), des cultures de peau humaine ont été exposées à des ondes millimétriques (ondes EHF), d'une densité de puissance moyenne de 20 mW/cm2 (correspondant à la norme grand public définie par l'ICNIRP pour les expositions locales). Deux types de réponses ont été étudiées : l'expression de gènes marqueurs (codant pour des facteurs impliqués dans le phénomène inflammatoire avec comme témoin plusieurs gènes référents invariants) et l'expression de gènes codant des protéines chaperons, impliquées dans le choc thermique. Les résultats montrent que l'exposition aux ondes peut interférer avec la physiologie cellulaire, mais uniquement pour des densités de puissance suffisamment élevées pour induire un effet thermique. Ce phénomène peut s'observer à partir d'un seuil compris entre 10 et 20 mW/cm, les limites légales étant de 1 mW/cm pour le public et 5 mW/cm pour les travailleurs. En pratique les conditions d'exposition induisant cette réponse correspondraient au cas o l'antenne serait placée à proximité du corps. Pour mémoire, ceci concerne les ondes millimétriques ou EHF, (Extremely High Frequency), utilisées par les réseaux privés, les radars anticollision pour automobiles, les liaisons vidéo transportables etc. Les ondes émises par les antennes sont des ondes décimétriques ou UHF Ultra High Frequency. B- Evaluation des effets génotoxiques sur des amniocytes humains exposés aux GSM-900 grâce au caryotype en bandes R. [Yardin C. et al 2010] Publiée en 2010 dans Radiation Research (67) Dans cette deuxième étude, quatre échantillons de liquide amniotique ont été exposés à des ondes électromagnétiques à fréquence utilisée par la téléphonie mobile (GSM 900) pendant cent métaphases. Les métaphases comportant des anomalies de nombre ou de structure chromosomique ont été comptabilisées ainsi que le nombre total d'anomalies et de cassures chromosomiques. Ces résultats ont été comparés avec ceux obtenus sur des cellules non exposées. L'étude conclut que les radiations n'induisent pas de lésion chromosomique sur les cellules exposées pendant 24 heures. Rapport du COPIC (valeurs d'exposition et faisabilité d'une réduction de l'exposition à 0, 6 V/m) (68) Le COPIC est le comité opérationnel sur les ondes de téléphonie mobile. Il a été mis en place par le gouvernement, avec pour mission de vérifier si un abaissement de l'exposition aux ondes émises par les antennes-relais était réalisable sans compromettre la couverture réseau. Un état des lieux des expositions effectives par rapport à celles préconisées par la loi a aussi été demandé. Dans un premier temps, une modélisation a été faite (mesures théoriques en basant les calculs sur l'hypothèse que les émetteurs fonctionnent tous en même temps et à puissance maximale) sur des millions de points différents répartis sur 16 zones. L'état des lieux a indiqué que 90% des niveaux d'expositions modélisés étaient inférieurs à 0, 7 V/m, et 99% inférieurs à 2, 7 V/m (les valeurs limites légales se situant entre 40 et 61 V/m). Dans les points les plus exposés, l'antenne-relais n'était pas la source principale dans 20% 41 des cas (wi-fi, téléphones mobiles etc. ). Les simulations ont également montré qu'un abaissement de l'exposition à 0, 6 V/m (seuil généralement réclamé par les associations anti-ondes) entranerait une forte détérioration de la couverture et du réseau. Afin de la compenser, le nombre d'antennes devrait être au minimum multiplié par trois. Enfin, une simulation de l'impact du déploiement d'antennes 4G sur l'exposition du public a confirmé une augmentation de l'exposition, avec une augmentation moyenne de l'exposition en façade et au sol de 50 % environ. Par exemple, sur la zone étudiée Paris (14e arrondissement), l'exposition moyenne passerait de 0, 6 V/m à 0, 9 V/m environ, ce qui reste toujours très largement en-dessous des limites réglementaires. Le rapport Bioinitiative (69) Il s'agit également d'une méta-analyse. Le rapport porte à la fois sur les champs électromagnétiques de très basse fréquence (50-60 Hz) et sur ceux associés aux radiofréquences comme celles utilisées dans la téléphonie mobile. Ses principales conclusions étaient les suivantes : les effets biologiques négatifs des champs électromagnétiques sont avérés, avec plus ou moins d'incertitudes selon les cas, les normes actuelles d'exposition aux rayonnements électromagnétiques sont inadaptées et doivent être révisées à la baisse, d'autres effets biologiques (autres que les effets thermiques actuellement retenus) doivent être pris en compte. Le rapport fait donc appel au principe de précaution pour baisser les normes actuelles d'exposition. Ce rapport a été fortement critiqué par différentes associations gouvernementales de santé (l'ANSES, le groupe EMF-NET de la commission européenne, le conseil de santé des Pays- Bas et l'office fédéral allemand de radioprotection) Pour citer l'ANSES : Certains articles ne présentent pas les données scientifiques disponibles de manière équilibrée, n'analysent pas la qualité des articles cités ou reflètent les opinions ou convictions personnelles de leurs auteurs. Enfin, bien que se présentant comme un travail d'expertise collective, il est précisé au début que les informations et conclusions de chacun des chapitres sont sous la seule responsabilité de leurs auteurs . Aucune information n'est donnée sur la méthode de travail, ni même sur un quelconque travail collectif préalable. Elle pointe également les conflits d'intérêt de certains chapitres, et le caractère militant du texte (70). Malgré ces différents problèmes, ce rapport est fréquemment cité et alimente la méfiance ambiante. Enfance et radiofréquences : ANSES 2016 (71) Le rapport de l'AFSSET de 2009 (35) avait indiqué que la caractérisation de l'exposition des enfants aux radiofréquences et ses effets sanitaires éventuels restaient méconnus, et ce du fait du nombre insuffisant de données disponibles. Les objectifs du rapport étaient donc les suivants : réaliser un inventaire des différents produits radioélectriques à destination des enfants de moins de six ans. faire un état des lieux des réglementations en vigueur et des textes normatifs applicables concernant l'exposition des enfants aux champs électromagnétiques émis par les dispositifs radioélectriques. 42 établir une revue de la littérature relative à l'influence du champ électromagnétique sur les personnes, et plus spécifiquement sur les enfants (celle-ci s'étalait du 1er janvier 2005 au 31 décembre 2013) ; caractériser l'exposition des enfants à certains dispositifs radioélectriques ; essayer d'évaluer, si possible, les risques sanitaires potentiels pour les enfants liés à leur exposition aux champs électromagnétiques radiofréquences émis par des dispositifs radioélectriques qui leur sont destinés. Conclusions du rapport - Exposition des enfants et des adolescents Une forte expansion des nouvelles technologies est observée chez les enfants, notamment par l'arrivée de jouets connectés et par la possession d'un téléphone mobile à un âge de plus en plus jeune (mais généralement au-delà de sept ans). Les modélisations numériques réalisées suggèrent que l'exposition d'un adulte et celle d'un enfant ne sont pas équivalentes, en particulier au niveau des aires cérébrales périphériques, les plus proches de la paroi crânienne. Ceci semble lié à certaines particularités anatomiques de l'enfant (poids et taille plus faibles) ou aux propriétés diélectriques des tissus jeunes ou immatures. L'exposition des enfants et des adultes pourraient ne pas être équivalentes, en particulier au niveau des aires cérébrales les plus proches de la bote crânienne. De plus, les études ayant évalué le DAS corps entier rapportent des niveaux d'exposition plus élevés chez les enfants que chez les adultes (en particulier dans deux gammes de fréquence : vers 100 MHz et de 1 à 4 GHz). Un DAS réglementaire pour un adulte peut dépasser les restrictions de base de 40% si on l'applique à l'enfant. Autrement dit, le DAS de l'enfant correspondrait dans certains cas à celui de l'adulte auquel on ajouterait 40%. Ceci s'applique pour toute personne d'une taille inférieure à 1, 30 mètres. Cela signifie que les valeurs limites d'expositions prévues pour les adultes ne sont pas suffisamment protectrices pour que les restrictions de bases soient respectées chez lenfant. - Effets sanitaires Les données actuelles répertoriées ne permettent pas de conclure sur l'existence ou non d'un effet négatif sur le comportement, les fonctions auditives, le développement, les systèmes reproducteurs mâle et femelle, le système immunitaire. Il n'a pas non plus été possible de conclure sur une éventuelle toxicité systémique, des effets tératogènes ou des effets cancérogènes. En revanche les études semblent orienter vers un possible effet des radiofréquences en ce qui concerne les fonctions cognitives et le bien-être des enfants. Toutefois l'ANSES juge le lien de causalité difficile à établir, l'utilisation du téléphone mobile lui-même pouvant être mise en cause dans ces résultats. - Recommandations suite à ce travail L'ANSES a rappelé une précédente recommandation incitant à limiter l'usage du téléphone portable et les expositions multiples chez les jeunes enfants, ainsi qu'à utiliser autant que possible des kits mains-libres. Elle préconise une adaptation des recommandations en ce qui concerne les dispositifs radioélectriques, et notamment ceux destinés aux enfants (tablettes tactiles, veille-bébés, jouets connectés, etc. ), afin qu'ils soient soumis aux mêmes obligations réglementaires que celles encadrant les téléphones mobiles (contrôle des niveaux d'exposition, information du 43 public, affichage du DAS) . Elle demande également que les niveaux de référence visant à limiter l'exposition environnementale aux radiofréquences soient réévalués, afin d'assurer des marges de sécurité suffisamment grandes pour protéger la santé et la sécurité de la population générale, et particulièrement celles des enfants. Enfin elle recommande de réévaluer la pertinence du DAS utilisé pour l'établissement des valeurs limites d'exposition des personnes, à des fins de protection contre les effets sanitaires connus et avérés (effets thermiques) des radiofréquences, et de développer un indicateur représentatif de l'exposition réelle des utilisateurs de téléphones mobiles, quelles que soient les conditions d'utilisation : signal utilisé, bonne ou mauvaise réception, mode d'usage (appel, chargement de données, etc. ). Dernières études sur le sujet ? Afin de vérifier la littérature récente sur la question des antennes, nous avons effectué différentes recherches sur Pubmed par mot-clé afin de vérifier si de nouvelles données existent, pouvant remettre en cause les rapports précédemment cités. Le rapport ANSES sur les radiofréquences date de 2012, nous avons donc éliminé les études antérieures. Une recherche avec les mots-clés relay et antennas ou masts ne donne aucun résultat en lien avec le sujet postérieur à 1999a. Une étude serbe (72) réalisée en 2016 portant sur les valeurs d'exposition (et non sur les risques sanitaires) semble avoir montré que celles-ci pouvaient dans certains cas dépasser les réglementation de l'ICNIRP de 2, 5%, et les réglementations nationales serbes de 15, 6% (uniquement en zone extérieure). Une étude de 2014 intitulée Radio-frequency electromagnetic field (RF-EMF) exposure levels in different European outdoor urban environments in comparison with regulatory limits (73) a également réalisé des mesures dans quatre villes européennes (Bâle, Amsterdam, Bruxelles, et Gand). Elle a montré que toutes les valeurs d'expositions y étaient très inférieures à celles proposées par l'ICNIRP, et qu'une baisse des réglementations n'était donc pas justifiée. Une méta-analyse de 2016 a repris 17 études récentes évaluant l'effet de la proximité d'une station de base sur le bien-être de la population. Si des effets ont été constatés chez celui-ci, ils semblaient directement liés à la connaissance de l'existence d'une source d'ondes électromagnétiques à proximité. Selon les auteurs, les effets (ndlr : sanitaires) des stations de base de téléphonie mobile semblent être peu probables et plus vraisemblablement liés à un effet nocebo (74). Nous n'avons pas trouvé de nouvelle étude semblant indiquer un effet sanitaire des antennes- relais pour les valeurs d'expositions actuelles. Synthèse de la recherche bibliographique sur les risques sanitaires des antennes-relais Les différentes revues de la littérature réalisées n'ont à ce jour pas montré d'effet sanitaire des antennes-relais aux seuils actuels d'exposition. De nouvelles études doivent être menées pour étudier les effets des autres sources électromagnétiques comme les téléphones portables. Le tout récent rapport de l'ANSES préconise d'ailleurs une réévaluation de certaines valeurs a Équations de recherche : (emf[All Fields] AND ( health [MeSH Terms] OR health [All Fields]) AND ( 2006/10/04 [PDat] : 2016/09/30 [PDat]) ; (phone[All Fields] AND ( alkalies [MeSH Terms] OR alkalies [All Fields] OR base [All Fields]) AND station[All Fields]) AND ( 2006/10/04 [PDat] : 2016/09/30 [PDat]) ; ( radio waves [MeSH Terms] OR ( radio [All Fields] AND waves [All Fields]) OR radio waves [All Fields] OR ( radio [All Fields] AND wave [All Fields]) OR radio wave [All Fields]) 44 réglementaires, celles-ci ayant été pensées pour respecter les restrictions de base chez l'adulte, induisant une probable surexposition chez les enfants du fait de particularités anatomiques. Mais cette préconisation touche essentiellement les téléphones portables et les jouets connectés. L'un des problèmes posés par les ondes reste l'accumulation de différentes sources électromagnétiques dont l'exposition reste difficile à quantifier dans son ensemble. 2. 6. 3. Antennes et effet nocebo Du latin nocebo, je nuirai. Ce phénomène psychique induit qu'une exposition à un élément au cours de laquelle on s'attend à subir des effets indésirables risque de provoquer ces mêmes effets indésirables, et ce alors que l'élément lui-même est inoffensif. Il est le pendant négatif de l'effet placebo. Suite à l'installation de trois antennes-relais en mars 2009 dans la ville de Saint-Cloud, certains habitants ont commencé à éprouver des symptômes diffus et invalidants comme des céphalées, des dysgueusies, des troubles du sommeil etc. L'association Robin des toits a donc lancé une plainte collective pour troubles du voisinage. Or il a été montré que les symptômes des riverains se sont déclenchés environ un mois avant que les antennes ne soient connectées au réseau, et donc commencent à émettre. Selon l'AFSSET (35), la conscience d'avoir une antenne relais dans son voisinage (parce qu'on la voit, qu'on le sait ou qu'on en a entendu parler) est susceptible d'engendrer, chez certaines personnes, des craintes, du stress, voire même des symptômes. Selon Lawrence Challis, professeur de physique à l'université de Nottingham (cf. audition de Lawrence Challis du 3 décembre 2008 page 383 du rapport de l'AFSSET), le témoignage des médecins généralistes va dans ce sens. Dans son bulletin de 2009, l'Académie de Médecine indique qu'aucune étude ne montre que l'électrohypersensibilité est due aux ondes électromagnétiques. Les études suggèrent un effet nocebo et des facteurs neuro-psychiques individuels (46). antennes ? 2. 6. 4. Principe de précaution : a-t-il sa place dans le débat sur les Il apparat dans toutes les revendications anti-ondes. Certains tribunaux ont fait appel à lui pour condamner des opérateurs de téléphonie à démonter des antennes ou annuler leur installation. Mais le principe de précaution (PP) a-t-il sa place dans les débats sur les antennes-relais ? La naissance d'un concept à la portée juridique, mais aussi philosophique (76) Le philosophe Hans Jonas est souvent désigné comme le père fondateur du principe de précaution. Sa réflexion s'articule autour du principe que l'humanité a pour obligation morale le maintien de la propre présupposition du principe de responsabilité (77). Cette phrase implique que la responsabilité à côté de ses tâches particulières à court ou moyen terme, comporte également la responsabilité que par-delà son propre accomplissement subsiste encore la possibilité d'un agir responsable dans l'avenir . Il remet ainsi l'Humain et l'environnement au cœur des enjeux d'un progrès parfois déshumanisé. Cette obligation morale avait déjà été formulée par Emmanuel Kant, d'une façon plus 45 universelle : Agis de façon que les effets de ton action soient compatibles avec la permanence d'une vie authentiquement humaine sur terre . Selon l'intellectuel et philosophe français François Ewald, le développement de nos sociétés modernes a vu se succéder la dominance de trois grands principes de responsabilité (78). Le principe de prévoyance, au XIXe siècle, est articulé autour de la faute et de la responsabilité individuelles. Tout aléa de la vie doit être assumé par l'individu sans aide des pouvoirs publics ; cette responsabilisation est supposée permettre une autorégulation des risques. Faute et erreur sont alors mises sur un même plan. Le principe de solidarité, au XXe siècle marque l'avènement de l'État-Providence : de nombreuses avancées sociales ont lieu et l'individu ayant subi un aléa de la vie peut désormais bénéficier d'une indemnisation. Le risque est considéré comme inhérent à toute collectivité, échappant à la prévoyance individuelle, mais prévisible et pouvant donc dans une certaine mesure relever d'une prévention. Enfin, le principe de précaution émerge dans les années 1960. La société prend conscience de sa vulnérabilité face à des catastrophes sanitaires provoquées par ses propres activités. L'idée d'une Science toute puissante et parfaitement matrisée par l'Homme se heurte à des dommages graves et irréversibles qui n'ont pas su être anticipés. L'incertitude prend un sens nouveau, et doit désormais être intégrée dans le processus de décision, et être circonscrite par des précautions. Dans son ouvrage Risikogesellschaft (La société du risque) (79), Ulrich Beck met en évidence le passage d'une société industrielle à une société du risque , à savoir le glissement d'un paradigme positiviste vers une production d'incertitude née de nouveaux risques civilisationnels ou modernes . Selon lui la science est alors devenue de plus en plus nécessaire mais de moins en moins suffisante à l'élaboration d'une définition socialement établie de la vérité Un principe moral qui s'est progressivement ancré dans le domaine juridique (80) Sa première apparition remonte à la n des années 1960 en Allemagne sous le terme Vorsorgeprinzip . Elle portait alors sur la pureté de l'air. Le concept, ambitieux, intégrait à la fois une gestion des dangers immédiats, la prévention des risques à moyen terme et l'optimisation de la gestion des ressources naturelles à long terme. C'est lors de la Déclaration de Rio sur l'environnement et le développement en 1992 que le PP a pris une ampleur internationale. L'article 15 de ce texte stipule que : pour protéger l'environnement, des mesures de précaution doivent être largement appliquées par les États selon leurs capacités. En cas de risque de dommages graves et irréversibles, l'absence de certitude scientique absolue ne doit pas servir de prétexte pour remettre à plus tard l'adoption de mesures eectives visant à prévenir la dégradation de l'environnement (81). Son introduction dans le droit français s'est faite grâce à la loi n 95-101 du 2 février 1995 relative au renforcement de la protection de l'environnement, dite loi Barnier (82). L'absence de certitude, compte tenu des connaissances scientifiques et techniques du moment, ne doit pas retarder l'adoption de mesures effectives et proportionnées visant à prévenir un risque de dommages graves et irréversibles à l'environnement à un coût économiquement acceptable ; cette définition figure toujours au début de l'actuel Code de l'Environnement. Finalement, il ne sera intégré à la Constitution qu'en 2005, dans la loi constitutionnelle n2005-205 du 1er mars 2005 relative à la Charte de l'environnement (83). Article 5. - Lorsque la réalisation d'un dommage, bien qu'incertaine en l'état des connaissances scientifiques, pourrait affecter de manière grave et irréversible 46 l'environnement, les autorités publiques veillent, par application du principe de précaution et dans leurs domaines d'attributions, à la mise en œuvre de procédures d'évaluation des risques et à l'adoption de mesures provisoires et proportionnées afin de parer à la réalisation du dommage . Il figure également dans le Traité de Maastricht (article 130 R) signé en février de la même année : La politique de la Communauté [] vise un niveau de protection élevé []. Elle est fondée sur le principe de précaution et d'action préventive, sur le principe de correction, par priorité à la source, des atteintes à l'environnement et sur le principe du pollueur-payeur . Synthèse des définitions officielles C'est un principe d'action prospectif ayant comme objectif une réduction des risques en situation d'incertitude. Il s'inscrit dans un contexte décisionnel en évolution, marqué par une incertitude multidimensionnelle quant aux conséquences environnementales, économiques, sociales, politiques ou éthiques des innovations technologiques. Autorités publiques, citoyens, acteurs économiques et sociaux sont en effet directement concernés par ses applications concrètes ou ses traductions. (84) De multiples définitions existent selon les textes, mais en voici les conceptions les plus largement partagées, rapportées dans une synthèse réalisée par la COMEST (80) (COmmission Mondiale d'Éthique des Connaissances Scientifiques et des Technologies) organisme appartenant à l'UNESCO. Le PP s'applique lorsqu'une incertitude scientifique importante existe par rapport à la causalité, l'ordre de grandeur, la probabilité et la nature d'un danger. Les incertitudes en question doivent être plausibles et avoir bénéficié d'un minimum d'analyse scientifique. Une probabilité inconnue du risque serait en soi un motif suffisant pour déclencher son application. Dans le cas d'une probabilité déjà connue du risque, c'est le principe de prévention qui s'applique. Le risque amené à le motiver doit également être considéré comme moralement inacceptable. Ce terme est important car il introduit une notion d'éthique dans la réflexion. La COMEST décrit un risque moralement inacceptable pour les humains ou l'environnement comme répondant à l'un des critères suivants (80) : menaçant pour la vie ou la santé humaine, grave et réellement irréversible, ou bien, inéquitable pour les générations présentes ou futures, imposé sans qu'aient été pris dûment en compte les droits humains de ceux qui le subissent. Son intervention doit survenir avant que le danger suspecté ait eu le temps de faire des dégâts, et avant même qu'une quelconque certitude soit acquise sur la question. Enfin, en cas d'intervention, celle-ci doit être proportionnelle à l'ordre de grandeur du sujet possible. Pour résumer il s'agit d'une attitude d'anticipation des risques, sa mise en place permet de cibler les risques hypothétiques les plus plausibles, et éventuellement d'essayer de les mettre en évidence via des recherches scientifiques. La distinction de perception entre risques avérés et risques hypothétiques est très importante car elle permet de déterminer ce qui relève de la recherche, de la précaution ou de la prévention. L'interdisciplinarité et l'indépendance sont des conditions nécessaires à sa réalisation. Le PP en pratique : un frein à l'innovation ? Une innovation technologique en cours de développement est au départ une source d'espoirs, peut-être même un succès annoncé selon les bénéfices attendus. Mais ce qui la rend 47 révolutionnaire est précisément lié au fait qu'elle était inconnue ou non utilisée à grande échelle jusque-là. Il est parfois difficile, dans l'enthousiasme, de prévoir que la médaille aura un revers. Le passé a malheureusement montré que les succès les plus retentissants dans leur domaine ne sont pas à l'abri d'avoir des conséquences dramatiques sur le plan de l'environnement et de la santé. Avant d'être le cancérogène que nous connaissons, l'amiante a longtemps été un isolant particulièrement apprécié pour sa résistance à la chaleur, aux agressions électriques et chimiques, ainsi que pour ses pouvoirs absorbant et isolant. Mais pour autant, il serait déraisonnable de réclamer que toute technologie nouvelle fasse la preuve de son innocuité avant d'être placée en contact avec le public : cette démarche serait un frein considérable au progrès. Par ailleurs, un risque ne s'envisage pas tous azimut. Un minimum d'observation est nécessaire pour savoir comment orienter les recherches. Le développement d'une nouvelle technologie peut se faire malgré la présence d'incertitudes. Mais cela implique que les responsables, conscients de ce brouillard, soient vigilants quant à de potentiels effets nocifs non envisagés au moment de la conception. Et si un risque plausible émerge et semble suffisamment inquiétant pour attirer l'attention vers un danger identifiable, c'est là que le PP a un rôle à jouer. Son rôle n'est pas de bloquer ou de freiner le développement de la technologie mais plutôt de lui prêter main forte : en identifiant d'abord les zones d'ombres et les lacunes de la connaissance scientifique, puis en cherchant à les atténuer et si besoin en les encadrant par des limites, des seuils d'expositions etc. Le PP peut également permettre d'aiguiller des technologies potentiellement dangereuses vers des alternatives s'inscrivant dans une logique de développement durable et stimuler les recherches dans ce domaine. PP, un terme souvent mal compris Son nom est régulièrement invoqué à tort dans le cadre des antennes-relais, y compris lors de décisions de justice pourtant lourdes de conséquences en terme de représentation des populations. La confusion semble natre d'une mauvaise connaissance à la fois de ses champs d'application, et des conséquences pouvant découler de sa mise en action. Voici donc quelques notions parfois reliées à tort au PP. un principe d'abstention (ou un équivalent du dicton populaire Dans le doute, abstiens-toi). une action ayant pour effet systématique une interdiction. une exigence zéro risque. un principe de prévention (qui lui, porte sur des risques avérés sans qu'on puisse en estimer la fréquence). L'incertitude ne porte pas sur le risque lui-même mais sur la probabilité de sa réalisation. ) un principe portant uniquement sur des risques avérés. ou portant, a contrario, sur tous les risques hypothétiques, y compris ceux ne paraissant pas plausibles au vu des observations accumulées. un principe de gestion de crise. L'une des stratégies utilisée les militants anti-ondes consiste à réclamer qu'une preuve de l'absence de risque soit apportée, ou à pointer l'incapacité des scientifiques à apporter cette preuve. Sauf que dans le cas des antennes, il s'agit d'un risque hypothétique, rendu peu plausible par les recherches déjà effectuées et non d'un risque avéré. Cette méthodologie n'est donc pas adaptée au problème. Cette dérive semble avoir tendance à se généraliser ; c'est ce qu'on appelle l' inversion de la charge de la preuve. 48 Les obstacles à sa bonne application : la jurisprudence, qui consiste à utiliser le principe de précaution dans les troubles de voisinage sous forme de crainte légitime, constitue une dérive à laquelle il convient de remédier ; la mauvaise perception sociale d'un risque : celui-ci peut conduire non seulement le politique, mais aussi le juge à appliquer ce principe de façon erronée ; l'absence de prise en compte des données scientifiques et de leur signification statistique par rapport à la précaution attendue. PP et antennes-relais : une jurisprudence jugée regrettable(85) Dans un document de travail de 2013, un retour est fait sur certaines actions en justice ayant débouché sur une condamnation des opérateurs au titre du PP. Le juge de la Cour d'Appel du Tribunal de Versailles a considéré que l'implantation d'antennes relais relevait d'un trouble du voisinage. Le rédacteur du rapport souligne que le fait d'assimiler une crainte jugée légitime à un trouble de voisinage ne relève pas d'une application juridique du PP mais plutôt d'une forme de prévention morale . Dans le même esprit, le Tribunal de Grande Instance de Carpentras a ordonné le 16 février 2009 le démantèlement d'une antenne-relais située à proximité d'habitations en relevant l'existence d'une crainte légitime d'une atteinte directe à [la] santé [des riverains] constitutive d'un trouble dont le caractère anormal tient au fait qu'il porterait atteinte, une fois réalisé, à l'intégrité physique sans qu'il soit à ce jour possible d'en mesurer toute l'ampleur. Cette décision a également été critiquée pour le motif qu'elle n'a pas tenu compte des données scientifiques disponibles. Conclusion Il s'agit d'un principe d'action et non d'immobilisme. Son rôle n'est pas d'engendrer un repli mais une recherche prospective permettant de faire avancer les recherches dans les domaines de l'environnement et de la santé. Ceux qui le réclament ne doivent pas oublier que le travail des scientifiques n'est pas de garantir le zéro-risque mais de reconnatre et remédier à l'ignorance, à l'incertitude et au risque, en matière d'évaluation technologique et de prise de décision(Harremos 2001) (86). Une utilisation inappropriée peut constituer un frein à l'innovation technologique (la paralysie par l'analyse décrite par Harremos), et contribuer à entretenir les inquiétudes de la population et ce alors que des données scientifiques existent déjà. Il est invoqué dans différents pays comme moyen pour répondre aux préoccupations des populations, alors que certaines des études montreraient que cette approche pourrait en déclencher de nouvelles et d'amplifier les perceptions de risques [Wiedemann et Schtz, 2005] (87). Une approche expérimentale leur permet de conclure que les mesures de précaution pourraient déclencher des préoccupations et amplifier les perceptions des risques. Dans le cas des antennes-relais, son application ne semble pas appropriée. 49 3. L'Intolérance environnementale idiopathique attribuée aux champs électromagnétiques ou Hypersensibilité aux ondes électromagnétiques (HSEM) 3. 1. Définition L'appellation de cette entité émergente a évolué au fil du temps. Les premiers cas de maladie des micro-ondesont été décrits dans les années 50 en Europe de l'est, chez des travailleurs exposés aux micro-ondes ou à certaines radiofréquences. Leurs symptômes : maux de tête, faiblesse, troubles du sommeil, instabilité émotionnelle, vertiges, pertes de mémoire, fatigue et palpitations cardiaques [Sadchikova, 1960] . Dans les années 80, en Norvège et en Suède, des travailleurs exposés aux écrans d'ordinateur consultent la médecine du travail pour des éruptions cutanées (Screen dermatitis). D'autres symptômes ont été répertoriés par la suite, mais sans critère diagnostique bien défini. Ils ont ensuite été regroupés sous le nom d'Hypersensibilité à l'électricité, qui donnera le synonyme Électrosensibilité . Puis l'accent sera mis sur le caractère électromagnétique de l'exposition Electromagnetic hypersensitivity . Le terme officiel retenu est désormais celui d' Idiopathic Environmental Intolerance Attributed to electromagnetic fields (intolérance idiopathique environnementale attribuée aux champs électromagnétiques) (88, 89). Pour des raisons pratiques, les médias emploient généralement le terme plus court d'électrosensibilité . L'OMS a réalisé un aide-mémoire sur le sujet en 2005 (89). Voici sa définition : L'HSEM est caractérisée par divers symptômes que les individus touchés attribuent à l'exposition aux Champs ÉlectroMagnétiques (CEM). Si certains rapportent des symptômes bénins et réagissent en évitant autant qu'ils le peuvent ces champs, d'autres sont si gravement affectés qu'ils cessent de travailler et modifient totalement leur mode de vie. Cette sensibilité présumée aux CEM est généralement appelée hypersensibilité électromagnétique (HSEM). Elle est décrite comme une sensibilité accrue notamment aux radiofréquences et aux champs électriques ou magnétiques dans le cadre d'une exposition largement inférieure aux normes en vigueur, et a fortiori aux seuils décrits comme ayant des effets sur l'organisme . Ce n'est pas le seul syndrome d'intolérance idiopathique. Il en existe plusieurs, leur point commun étant un ensemble de symptômes non spécifiques inexpliqués sur le plan médical et entranant un retentissement significatif sur la vie quotidienne des patients concernés. L'hypersensibilité chimique multiple par exemple, a été définie en 1987 par Mark Cullen comme une pathologie acquise caractérisée par des symptômes récurrents concernant de nombreuses sphères du corps, consécutive à une exposition avérée à de multiples composés chimiques de nature très variée, à des niveaux d'exposition bien en deçà de ceux causant des effets nocifs dans la population générale. Aucune anomalie physiologique pouvant expliquer ces symptômes ne peut être mise en évidence (90). On peut encore citer le syndrome d'intolérance aux odeurs chimiques. Les premiers cas ont été décrits en 1992 par une équipe parisienne à partir d'observations cliniques issues des consultations de pathologie professionnelle (91). 50 3. 2. Prévalence Des enquêtes ont été réalisées dans plusieurs centres de médecine du travail afin de chercher à déterminer le nombre de personnes touchées par l'HSEM. Mais dans la mesure o il n'existe actuellement ni critère diagnostique ni reconnaissance officielle de ce syndrome (excepté dans certains pays), le recensement est compliqué. Selon l'OMS, la prévalence serait plus importante en Allemagne (8% selon Infas Institut fr angewandte Sozialwissenschaft GmbH, 2003) et en Autriche (3, 5%) qu'en France (2%). Les études de prévalence citées dans un rapport de l'AFSSET en 2009 l'ont estimée à environ 2% en France, 1, 5% en Suède, 5% en Suisse (35). Les formes cliniques dominantes semblent varier également selon les pays : une prédominance des symptômes dermatologiques est constatée dans les pays scandinaves, alors qu'en France ou aux États-Unis, les signes neurovégétatifs seraient plus présents (88). 3. 3. Présentation clinique Les présentations cliniques les plus fréquemment décrites comportent des signes dermatologiques (érythème facial, éruption, prurit, sensation de chaleur etc. ) et neurovégétatifs (troubles de la mémoire, de la concentration, du sommeil, asthénie diffuse etc. ) (88). Selon les sujets touchés, les signes surviendraient dans les minutes ou les heures qui suivent l'utilisation ou le rapprochement physique d'une source émettrice et disparatraient lors de l'éloignement de celle-ci. Une étude de 2007 [Eltiti et al. ] (92) a permis d'affiner le tableau clinique. Un questionnaire avec 57 items quantifiés a été rempli par 3633 témoins et 88 patients se déclarant électrosensibles. Huit catégories de symptômes se sont distinguées au cours de cette étude (symptômes neurovégétatifs, cutanés, auditifs, céphalées, cardio-respiratoires, locomoteurs, liés au froid, liés à l'allergie). Elles ont été obtenues dans les deux groupes, le groupe témoin et celui se déclarant électrosensible. Par contre, l'intensité ressentie était supérieure dans ce dernier. Une distinction a été proposée par l'AFSSET en 2009 (35) entre les intolérances aux ondes électromagnétiques et celles reliées aux ondes de la téléphonie mobile en particulier. 3. 4. Que dit la Science ? De nombreuses études (pour la plupart des études de provocation) ont été réalisées en France et à l'étranger, aucune pour l'instant n'a mis en évidence de lien de cause à effet entre les symptômes et les ondes électromagnétiques. 46 études de provocation en simple ou double aveugle ont analysé les réponses de 1176 patients se déclarant électrosensibles exposés à des sources de rayonnements électromagnétiques actifs ou non. Quelle que soit la nature de l'exposition, le groupe de sujets n'a pas montré plus de capacité à déterminer la réalité de l'exposition par rapport au groupe témoin [Rubin et al. 2006] (93). La limite de ce mode de recherche est que seuls les effets à court terme peuvent être étudiés. Une acuité plus importantes des symptômes était retrouvée dans le groupe témoin mais 51 l'étude concluait que l'effet nocebo constituait une explication suffisante pour expliquer ce fait, et qu'une approche psychothérapeutique pourrait être intéressante dans la prise en charge des patients électrosensibles. Une autre revue de la littérature, toujours avec James Rubin à sa tête, n'a pas non plus retrouvé de lien de cause à effet entre les ondes électromagnétiques et les symptômes présentés, tout en précisant que ceux-ci pouvaient dans certains cas s'avérer sévères (94). 3. 5. Effet nocebo et HSEM Certaines études semblent indiquer que certaines manifestations somatiques rapportées ressenties lors d'une exposition aux ondes pourraient être causées par un effet nocebo. Cette hypothèse a été évoqué notamment suite à l'affaire des antennes de Saint-Cloud (cf chapitre sur les antennes) . Des études ont été menées en France et à l'étranger afin de le mettre en évidence. Une étude allemande réalisée en 2008 a pu objectiver ce phénomène, en mettant en évidence de véritables manifestations cérébrales du phénomène par IRM (83). L'étude menée par Michael Landgrebe et Ulrich Frick, de l'Université de Regensburg en Allemagne a recruté une trentaine de patients dont la moitié se déclarait électrosensible. Il leur a été expliqué qu'ils seraient soumis à une exposition soit à un appareil chauffant, soit à un téléphone portable, et ceci avec une surveillance de leur IRM cérébrale durant l'expérience. Le type de stimulus, qu'il s'agisse de la source de chaleur ou du faux rayonnement électromagnétique, était annoncé avant chaque exposition et les volontaires devaient évaluer leur inconfort sur une échelle de 1 à 5. Dans le cas de la chaleur, les descriptions de l'expérience des deux groupes étaient comparables, y compris en ce qui concerne leur activité cérébrale. Concernant l'exposition au faux téléphone portable, seuls les électrosensibles ont rapporté des sensations, allant des picotements à la douleur. L'IRM cérébrale montrait une activation des mêmes zones cérébrales lors de l'exposition au faux portable que lors de l'exposition aux températures élevées. Différentes études retrouvent des résultats abondant dans ce sens. On peut notamment citer celle publiée dans la revue Cephalalgia en 2007, intitulée Mobile phone headache : a double blind, sham-controlled provocation study. (96) Avis de l'Académie de Médecine Dans cette publication de 2009, il est indiqué qu' aucune étude ne montre que l'électrohypersensibilité est due aux ondes électromagnétiques. Les études suggèrent un effet nocebo (inverse de l'effet placebo : troubles relatés résultant d'un mécanisme psychologique) et des facteurs neuro-psychiques individuels) (97). La souffrance liée à une exposition aux ondes ne doit pas être prise à la légère car même dans le cas d'un effet nocebo, elle est réellement ressentie par le patient. La seule prise en charge actuellement préconisée est un accompagnement et un suivi psychothérapeutique (97). 3. 6. Dispositifs anti-ondes et compléments alimentaires, sont-ils efficaces ? Aucun traitement n'a actuellement fait la preuve de son efficacité dans le cadre de la prise en charge de l'HSEM, toutefois les thérapies cognitivo-comportementales pourraient 52 être envisagées, et la prise en charge des patients aurait tout intérêt à être la plus précoce possible. Les traitements alternatifs comme celui basé sur la chélation des métaux lourds ou la supplémentation par antioxydants n'ont pas fait la preuve de leur efficacité (35). Concernant les dispositifs anti-ondes, aucune étude n'a pu apporter la preuve de leur efficacité (rapport de l'AFSSET). Nous citerons tout de même une étude publiée en janvier 2016, intitulée Radioprotective effects of the Ayurvedic medicinal plant Ocimum sanctum Linn. (Holy Basil) : A memoir . Celle-ci serait en faveur d'un effet protecteur des extraits de feuille de basilic sacré contre la rupture des brins d'ADN sur les tissus sains de souris porteuses de cancer radio-induit (de par le piégeage de radicaux libres et les effets anti-oxydant, chélateur de métaux et anti- inflammatoire). Ces résultats doivent bien sûr être répliqués (98). 3. 7. Des pistes pour la recherche ? Une publication canadienne de 2011 évoque deux études qui auraient montré au cours des tests de provocation une réponse somatique objective. La première, [McCarty et al. , 2011] (99) publiée dans The Journal of Neurosciences, a étudié en double-aveugle le cas d'une femme médecin auto-diagnostiquée hypersensible. Celle-ci avait été exposée à des ondes radio fréquences tandis que l'on surveillait l'apparition de symptômes (céphalées, palpitations, spasmes musculaires). La patiente ne savait pas si elle était exposée ou non mais les symptômes ont eu tendance à apparatre lors des transitions on- off. Ces résultats, selon les auteurs, seraient compatibles avec un lien de cause à effet. Ce qui pose problème dans cette étude, c'est bien évidemment le manque de puissance (un seul sujet), et le type de symptômes ciblés (spasme musculaire, palpitations etc. ), difficiles à quantifier de façon objective. Une autre, [Havas et al. 2011] (100) a observé le rythme cardiaque de différents sujets lors de faibles expositions électromagnétiques (100 Hz). Dans le groupe, 40 % affirmaient souffrir d'une électrosensibilité modérée à sévère, 16% une légère, 8% déclaraient ne pas être électrosensible du tout, et enfin un tiers des sujets ne savaient pas s'ils l'étaient. Sur les 25 sujets, 10 ont présenté une élévation de leur rythme cardiaque, comprise entre 10 et 91 battements supplémentaires par minute. L'un d'entre eux notamment a présenté une accélération majeure au moment de l'exposition en aveugle (de 61 à 154 battements par minute) avec retour à la normale dès l'arrêt de l'exposition. Toutefois il a été constaté une discordance entre les symptômes ressentis (sur les 5 personnes alléguant des palpitations, 2 seulement ont présenté des modifications du rythme cardiaque, et cela de façon inconstante). Les auteurs concluaient en indiquant que ces résultats seraient compatibles avec une réaction du système nerveux autonome, via une stimulation du système sympathique et une régulation du système parasympathique (99). Une autre hypothèse de travail a été testée au cours de deux expériences. Celles-ci semblent avoir montré que l'activité électrodermale (les modifications électriques de la peau au cours d'un stress) serait significativement plus élevée chez les personnes se déclarant électrosensibles. Ceci se manifeste par une brusque diminution de la résistance électrique cutanée liée à l'activité des glandes sudoripares lors des périodes d'anxiété, et d'augmentation de cette résistance lorsque l'attention décrot (88). En marge de ces éléments, certaines recherches tendraient à montrer que certains facteurs dits organisationnels (insatisfaction au travail, manque de support de la part des collègues, excès de travail, introduction de nouveaux équipements) favoriseraient l'apparition et/ou le maintien des symptômes chez certains sujets travaillant sur ordinateur et présentant des signes cutanés. Toutefois les résultats n'ont pas été significatifs (88). 53 3. 8. Les décisions juridiques liées à l'HSEM. En 2014, un homme déclarant souffrir d' HSEM s'est vu accorder par la Maison Départementale des Personnes Handicapées une aide financière, dans le cadre d'un accord à l'amiable. Avril 2015 : une demande d'aménagement de poste a été obtenue par une fonctionnaire territoriale après quatre ans de procédure sur décision du Comité Médical Supérieur. Juillet 2015 : une journaliste de 39 ans a vécu pendant 10 ans recluse dans les montagnes afin d'échapper à des symptômes qu'elle estimait liés à une HSEM (céphalées, asthénie, acouphènes etc. ). Après avoir été déboutée lors d'une première demande, le tribunal de contentieux de Toulouse a condamné la MDPH à lui verser une allocation adulte handicapé en juillet 2015. Il faut bien comprendre que dans ces différents cas, c'est la souffrance du patient, le caractère handicapant de ses symptômes qui ont entrané une réponse favorable. Sur un plan médical la pathologie elle-même n'est pour l'instant pas reconnue en tant que telle. 54 4. Le médecin généraliste face aux différents problèmes soulevés par l'exemple des antennes-relais. 4. 1. En première ligne Il (ndlr : le médecin généraliste) doit être à même d'assimiler et d'interpréter tous les éléments d'information fournis par le malade. Il se prononce en premier lieu sur tout problème qui lui est soumis en tant que médecin. Il assure le traitement d'entretien de ces patients. Ces contacts prolongés lui permettent de recueillir des informations à un rythme adapté à chaque malade et d'établir des rapports de confiance qu'il peut exploiter sur le plan professionnel. Il exerce ces fonctions en coopération avec des collègues, médecins ou non. Il est capable de jouer son rôle en tant que membre d'une équipe de santé tout en continuant à assumer la responsabilité personnelle du traitement de son malade à titre individuel. Il doit savoir quand et comment intervenir par les soins la prévention et l'éducation en vue de sauvegarder la santé de ses pareils et de leurs familles. Il se reconnat en outre la responsabilité de donner des avis autorisés sur les questions concernant la santé de la collectivité au sein de laquelle il vit. (Extrait de la Directive 2005/36/CE du Parlement européen et du Conseil du 7 septembre 2005 relative à la reconnaissance des qualifications professionnelles) (101). Ce texte laisse entrevoir le poids qui peut parfois peser sur la communauté des médecins généralistes. Il est intéressant d'observer que la notion d'incertitude en est absente, bien que celle-ci est inhérente à la pratique de la médecine, une science mouvante et en constante évolution. Le médecin généraliste est le premier interlocuteur, le trait d'union entre les patients et le monde médical. Ses missions sont multiples : pose de diagnostic, soins primaires, suivi, prévention, alerte, orientation, éducation etc. Les connaissances requises sont de plus en plus vastes, et les patients attendent de lui non seulement de les prendre en charge en cas de maladie, mais aussi de répondre à leurs interrogations, sur des sujets aussi divers que la nutrition, l'environnement, les médecines alternatives etc. L'évolution technologique a vu grandir les préoccupations de la population vis-à-vis de certains risques environnementaux, en concomitance avec une médiatisation croissante des sujets liés à la santé. 4. 2. Médiatisation des sujets de santé : un outil à double-tranchant. Au fil du temps, les questions de santé ont progressivement envahi le paysage médiatique (102). Des effets positifs ont pu être observés. La diffusion à grande échelle de campagnes de prévention et de sensibilisation a rendu possible une évolution des mentalités sur certains sujets, comme la nutrition, le dépistage des cancers, les addictions, ou sur des sujets touchant davantage au domaine social comme les violences conjugales. L'information du public non médical via des émissions de vulgarisation permet une plus large diffusion des connaissances (sur la reconnaissance de certaines maladies, sur les gestes qui sauvent), une meilleure intégration de certains groupes mis à l'écart de la société (handicapés, personnes séropositives) ou encore de mettre en lumière certaines pathologies afin 55 d'encourager les dons et faire progresser la recherche. Selon une étude réalisée au CHU Saint-Pierre à Bruxelles, une information de qualité permettrait d' améliorer le sentiment de contrôle, réduire l'anxiété et la détresse émotionnelle, accrotre la compliance aux traitements, rendre les attentes plus réalistes et générer des sentiments de sécurité et de réassurance (103). Une bonne utilisation des données scientifiques disponibles, présentées de façon claire et compréhensible, peut donc être bénéfique. En Europe, les professionnels de santé représenteraient la première source d'information dans le domaine de la santé dans 45 % des cas. Cependant, pour un cinquième des citoyens européens, la télévision représenterait la première source d'information médicale. En Belgique, 21 % de la population utilise Internet pour obtenir des informations médicales et 15 % en France. Un peu moins de la moitié des Européens (41, 5 %) pense qu'Internet représente une bonne manière d'obtenir ces informations (103). Mais ces critères ne sont pas toujours réunis, loin s'en faut. Nous savons bien que l'angle choisi par les médias ne reflète pas toujours la réalité scientifique. Les logiques de vente pour la presse, d'audience pour la radio et la télévision et de nombre de clics pour les sites internet entrent également dans l'équation, ce qui peut aboutir à des choix peu judicieux voire préjudiciables en terme de santé publique. Une étude réalisée en Argentine a évalué le traitement des informations de santé par les médias grand public : celle-ci a conclu à un manque de fiabilité de ceux-ci par rapport aux données scientifiques établies par des experts (104). La qualité des nouvelles médicales rapportées par les médias est donc très inégale et 43 % des citoyens européens ne leur ferait pas confiance (105). Un sujet très médiatisé et volontiers présenté sur un mode alarmiste et parfois erroné comme celui des antennes-relais peut impacter le public en y distillant des représentations négatives, du simple doute à la peur, voire à un effet nocebo comme dans le cas des antennes de Saint-Cloud. On ne peut donc pas nier aujourd'hui l'impact des médias sur le public qui est aussi une patientèle potentielle. L'influence peut s'exercer à différents niveaux : sur certaines de leurs perceptions, sur leur mode de vie, sur leurs priorités (88). Or la Médecine est définie non seulement par des connaissances scientifiques, mais aussi par l'attitude du public en tant qu'acteur et consommateur de santé. D'après l'enquête conjointe du Conseil National de l'Ordre des Médecins (CNOM) et de l'Institut Politique de Sondages et d'Opinions Sociales (IPSOS) de 2010 (106), 71% des Français consulteraient Internet pour obtenir des informations en matière de santé. Nous allons le voir, une recherche bibliographique de qualité nécessite une démarche rigoureuse, et parfois difficile dans un contexte de controverse pour la communauté médicale, a fortiori pour une population non rompue à cette pratique. Devant des informations préoccupantes et manquant souvent de clarté, les patients pourraient être amenés à consulter leur médecin généraliste afin de chercher des réponses. Face à ces demandes, certains de ces médecins se tourneront vers un diplôme universitaire ou une formation continue, une grande partie cherchera à s'autoformer, en réalisant une recherche bibliographique. Dans certains cas, la recherche est simple, quand des recommandations et protocoles clairs sont établis, sur des bases scientifiques indiscutables. Mais ce n'est pas toujours le cas. Et la recherche peut alors devenir un véritable casse-tête dans un contexte de controverse médiatique et d'incertitude scientifique, comme c'est le cas pour les antennes. Et bien évidemment, les médecins sont également exposés à cette forte médiatisation, ce qui peut poser quelques problèmes en termes de préjugés. Face à une surabondance de source, le tri des informations devient une nécessité. 56 4. 3. Sélectionner l'information fiable. Quelques règles. Voici les critères de qualité retenus par les Conseils Nationaux de la Formation Médicale Continue (107, 108) : - - - - - la sélection des articles doit être réalisée par un comité scientifique et/ou de lecture selon des critères clairement identifiés, et tous les articles doivent comporter les noms et les coordonnées professionnelles des auteurs. l'existence d'une bibliographie référencée dans chaque article. la promotion des médicaments et du matériel médical, quelle que soit sa forme, illustrée ou rédactionnelle, doit être clairement identifiée et ne doit pas interrompre la continuité d'un article. le ou les rédacteurs d'un article, liés, directement ou indirectement, par un contrat de travail ou un contrat financier à un laboratoire pharmaceutique ou à une entreprise fabriquant ou distribuant du matériel médical, devront être clairement identifiés comme tels dans l'article. les articles d'ordre scientifique et didactique doivent être clairement distincts des informations d'ordre professionnel, syndical ou autres, et doivent constituer l'essentiel du contenu rédactionnel (en surface, hors articles promotionnels ou publicités). Dans le cas d'une recherche bibliographique par internet, certains outils peuvent aider à sélectionner les sources (109). Le Health On the Net (109) (ou HONcode), est une organisation non gouvernementale donnant quelques critères de transparence à respecter par les sites web. Ceux qui souhaitent adhérer à cette charte et obtenir le label HONcode doivent satisfaire à 8 principes. 1. 2. Complémentarité : compléter et non remplacer la relation médecin-patient. 3. Confidentialité : la confidentialité des informations personnelles soumises par les Autorité : le site doit indiquer la qualification des rédacteurs. visiteurs du site doit être préservée. 4. Attribution : citer la/les source(s) des informations publiées et dater les pages de santé. 5. Justification : justifier toute affirmation sur les bienfaits ou inconvénients de produits ou de traitements. 6. Professionnalisme : l'information doit être la plus accessible possible, le nom du gérant du site doit être indiqué avec un moyen de le contacter. 7. Transparence du financement : présenter les sources de financement. 8. Honnêteté dans la publicité et la politique éditoriale : séparer la politique publicitaire de la politique éditoriale. La possession du label HONcode ne garantit pas la qualité de l'information délivrée par le site web, mais uniquement sa transparence (109). Le Netscoring (110) est un autre outil de certification des sites web, notamment utilisé par le CISMeF (Catalogue et Index des Sites Médicaux de langue Française). Il s'agit d'un groupe pluridisciplinaire s'engageant à fournir des critères de qualité pour l'information en santé. Ces critères sont répartis en huit catégories principales : crédibilité, contenu, liens, design, interactivité, aspects quantitatifs, aspects déontologiques, accessibilité Il a l'avantage par rapport au HONcode d'intégrer la notion de validité scientifique et d'indépendance. L'INSERM (111) a édité une liste de vérifications à effectuer afin de sélectionner les sites web les plus sérieux à savoir : vérifier qui produit le site (organisme, association de malade, université, page personnelle etc. ), quels sont ses financements, quelles sources sont utilisées, 57 de quand date la dernière mise à jour, et quels autres liens sont recommandés. Les derniers critères s'adressent en particulier au patient et sont un gage de qualité du site : la confidentialité, les mises en garde (incitant à consulter son médecin par exemple) et l'accessibilité aux handicapés. On peut également citer le Discern (109), développé par un groupe multidisciplinaire comportant des cliniciens spécialistes, des représentants de groupes de soutien, des médecins généralistes, des experts en information en santé destinée à l'usager, des professionnels de l'édition scientifique, etc. Il s'agit d'un questionnaire en seize questions construit pour permettre à un non-expert de juger de la qualité d'un texte médical (papier ou web). Pour finir, un rapport a été remis par la Haute Autorité de Santé (HAS) en 2007 concernant la recherche d'informations médicales sur Internet (109). Dans ce rapport, quelques pistes sont indiquées pour faciliter la recherche dans un moteur de recherche généraliste (préférer le langage médical, combiner les termes et utiliser des expressions, apprendre à relier correctement les termes d'une recherche, restreindre les recherches sur le titre, essayer singulier et pluriel etc. ). Selon la HAS, les sites bibliographiques de référence sont : Pubmed (112) (base de données de la National Library of Medecine , comportant 4500 revues biomédicales) ArticleInist ( Institut National de l'Information Scientifique et Technique, répertoriant plus de dix millions de documents). Il a été remplacé par Refdoc (113) depuis. Les bases de données gratuites sont Orphanet (114) et la Banque de Données Santé Publique (115) (BDSP). Les sites des agences de santé (109) : l' AFSSAPS (Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé) qui assure l'évaluation scientifique et médico-économique des produits de santé, exerce le contrôle des produits dans ses laboratoires et de la publicité et inspecte les établissements. L'AFSSA (Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments) L'ANSES (anciennement AFSSET) La HAS (Haute autorité de Santé) L'Agence de la biomédecine (domaines du prélèvement et de la greffe d'organes, de cellules et de tissus, de la procréation, de l'embryologie et de la génétique humaines) L'EFS (Établissement Français du Sang) : activités de collecte, de préparation, de qualification et de distribution des produits sanguins labiles aux établissements de soins. L'InVS (Institut de Veille Sanitaire) L'IRSN (Institut de Radioprotection et de Sûreté Nucléaire) L'INPES (Institut National de Prévention et d'Éducation pour la Santé) Enfin, deux catalogues de référence sont cités : le Catalogue et Index des Sites Médicaux Francophones (CISMeF) et MedlinePlus aux États-Unis. 4. 4. La relation médecin malade : une relation de confiance et d'influence réciproque. Le philosophe et médecin Edmund Pellegrino décrit dans son œuvre la rencontre clinique entre le médecin et le patient. Celui-ci, en état de souffrance ou d'humanité blessée viendrait voir son médecin, qu'il présume vouloir l'aider et ne pas lui nuire, et se faire en tout temps l'avocat de son propre bien (116). 58 La confiance est nécessaire à une relation médecin-malade fonctionnelle de bonne qualité (117). Elle peut jouer un rôle dans toutes les étapes de la prise en charge : en poussant le malade à se confier sur son problème sans omettre de détail déterminant pour la pose du diagnostic, en facilitant l'observance et l'application d'éventuels conseils hygiéno-diététiques etc. Confiance du patient mais aussi confiance du médecin dans les informations fournies par le patient et sa capacité à suivre les préconisations. Sans elle, difficile d'exercer avec empathie et bienveillance. Mais cette confiance ne doit pas se départir d'un certain recul. Il peut arriver que le malade vienne en toute confiance solliciter l'aide d'un médecin sur un sujet sur lequel celui-ci soit ne possède pas la réponse, ou pense en toute bonne foi la posséder ou encore ne possède pas de conviction tranchée mais seulement une méfiance. Dans le cas o le médecin a évité les écueils de la recherche bibliographique et dispose de l'information considérée comme fiable, il est en capacité d'apporter une réponse aussi proche que possible de la vérité scientifique du moment. En cas d'ignorance, une abstention prudente est de mise, mais l'accueil réservé à celle-ci sera totalement variable selon le degré d'anxiété du patient (l'incertitude elle-même pourra générer l'angoisse chez l'un, quand l'absence de données négatives pourrait suffire à rassurer partiellement chez l'autre). Le patient pourrait essayer de se renseigner seul en réalisant lui-même une recherche sur internet, avec un fort risque de sélection d'informations non pertinentes. Si une conviction négative ou une méfiance existe, celle-ci pourrait exercer une influence sur le patient, même en l'absence d'expertise du médecin sur le sujet. La prise en charge en médecine générale n'est pas une démarche mécanique immuable basée uniquement sur des protocoles établis. Le médecin est un être humain dont les expériences passées, et les représentations personnelles peuvent subtilement teinter les pratiques. Les représentations des individus jouent un rôle essentiel dans les relations de soins (117). Le contexte d'incertitude scientifique est un véritable problème en médecine. Un médecin désireux de ne pas trahir la confiance de son patient en l'exposant à un danger potentiel pourrait être tenté d'adopter une attitude surprotectrice. Une sorte d'usage individuel d'un principe de précaution, dont nous avons vu qu'il n'était à priori pas justifié dans le cas des antennes-relais. Pourtant doté des meilleures intentions, et bien que cette attitude puisse se discuter sur le plan éthique, il risque lors de conforter les angoisses de son patient, avec toutes les répercussions que celles-ci peuvent avoir. À l'inverse, la patientèle pourrait exercer un effet sur les perceptions du médecin. Un médecin ayant reçu plusieurs patients pour un motif lié aux ondes pourrait légitimement remettre en question leur innocuité. Cette sorte de sensibilisation progressive serait susceptible de l'amener à considérer ces expériences comme un signal d'alerte, et pourquoi pas acquérir la conviction qu'il se passe quelque chose d'anormal. Si certains évoquent une crise de confiance entre la population et le monde médical (ou scientifique au sens large), la relation entre les médecins généralistes et leurs patients semble avoir été relativement préservée : selon un sondage réalisé en 2010 par le groupe Pasteur mutualité (118), 910 des 1000 patients interrogés déclaraient faire confiance à leur médecin traitant. L'accès à l'information sur internet pour les patients ne semble pas avoir bouleversé cette relation, contrairement à ce que l'on aurait pu craindre. En effet, une thèse de 2015 réalisée en Gironde et dans les Landes a montré que si 64% des patients cherchent des informations médicales sur internet, eux et leurs médecins n'ont pas observé d'évolution de leur relation, notamment en termes de confiance (119). Le premier interlocuteur des patients et le dépositaire de leur confiance dans de nombreux cas a un véritable rôle à jouer dans certains domaines de santé publique, notamment sur des sujets environnementaux, soit par le rôle d'alerte que lui confère sa présence sur le terrain, soit pour servir de médiateur entre la communauté scientifique et le public, et permettre ainsi d'apaiser le débat. Une situation d'incertitude peut venir mettre à mal la réalisation de ces missions. 59 4. 5. Médecine générale et incertitude. Notre incertitude s'accrot en fonction de nos connaissances comme le périmètre d'un cercle en fonction de son rayon . Socrate. Voici comment le Comité de la Prévention et de la Précaution a défini l'incertitude dans le rapport ministériel La décision publique face à l'incertitude : l'incertitude signifie que les connaissances disponibles ne permettent pas de caractériser une situation aussi précisément qu'on le souhaiterait ; elle n'est pas synonyme d'ignorance. Il est donc important d'établir aussi clairement que possible les limites des connaissances existantes, afin d'en faire le meilleur usage (120). Une analyse menée par Renée Fox en 1988 décompose l'incertitude médicale en trois niveaux (121) : un niveau 1 qui résulte d'une matrise incomplète ou imparfaite du savoir disponible , un niveau 2 qui dépend des limites propres à la connaissance médicale du moment, et un niveau 3 qui tient à la difficulté pour un praticien donné de faire la part du premier et du deuxième niveau. Chaque profession est confrontée à son lot d'incertitudes. Dans le domaine médical, la décision engage la responsabilité du médecin et peut être lourde de conséquences ce qui la rend particulièrement inconfortable. La fréquence des situations d'incertitude en médecine est discutée. Les données disponibles portent surtout sur l'incertitude diagnostique. Les travaux de prévalence dans ce domaine se sont intéressés aux symptômes médicalement inexpliqués qui représenteraient 13% des consultations (122). De tous les médecins, le généraliste est celui qui est confronté au champ de connaissances le plus étendu. De ce fait, certains professionnels considèrent que choisir une spécialité délimitée plutôt que la médecine générale générerait moins d'angoisse (Dowie J, 1988) (123). Selon Urfalino (2001) le médecin généraliste serait structurellement une sorte de mauvais élève, condamné à ne jamais matriser totalement sa spécialité, étant entendu qu'il est impossible de tout savoir, surtout dans un domaine en perpétuelle évolution. De nouvelles connaissances sont acquises inlassablement, et bien souvent avec enthousiasme (123). C'est un aspect du métier qui le rend passionnant mais peut aussi exposer à une certaine frustration. Si de nombreux travaux semblent montrer que l'incertitude inhérente à l'exercice médical peut engendrer un stress, l'un d'entre eux en étudiant l'impact émotionnel du doute sur les généralistes avait mis en évidence les résultats suivants : l'indifférence y était très majoritairement notée comme jamais ressentie ; motivation, intérêt, stimulation, étaient au contraire considérés comme souvent ressentis, avant les autres propositions de sentiments plus négatifs (124). Isabelle Baszanger, en 1981 (125), relevait les inadéquations existant parfois entre la formation originelle et ce à quoi le médecin généraliste est confronté lors de ses consultations. D'une part, parce que les cas cliniques dont on abreuve les étudiants sont souvent de beaux cas, typiques et relativement fléchés. Les choses sont souvent plus complexes en pratique courante. Au cours de ses études l'étudiant en médecine se prépare à travailler sur un modèle blanc-noir alors que la réalité se décline le plus souvent entre les deux, dans toutes les teintes de gris que l'on peut imaginer, et sans oublier que les éléments extérieurs (besoins individuels 60 des patients) doivent être pris en compte (123). Une étude a été réalisée par l'UNAFORMEC auprès des médecins généralistes, afin de quantifier cette incertitude (124) : le nombre moyen quotidien de questions ne trouvant pas immédiatement une réponse de par les connaissances propres du praticien est de 2, 5, soit 1 question pour 8 patients vus. Les thèmes de ces questions étaient équitablement répartis entre le diagnostic et la thérapeutique (médicamenteuse ou non). Vingt-cinq pour cent de ces questionnements ne trouveraient jamais de réponse malgré les recherches faites (126). Une étude de l'INSERM menée en région PACA s'est interrogée sur les causes possibles de stress chez les médecins généralistes. Ont été citées entre autres : le manque de temps (80, 8% des interrogés), une charge de travail excessive (72 , 5%), un manque de coordination avec les autres acteurs de santé (45, 5%), une formation initiale inadaptée (24, 9%) (127). La complexité croissante des contextes médicaux (population vieillissante polypathologique, polymédicamentation) ou sociaux (familles éclatées/recomposées), l'impact des médias, les nouveaux enjeux éthiques, la complexité des interactions entre biologie, culture et technique caractérisent aujourd'hui l'activité d'un médecin généraliste, et sont autant de paramètres à intégrer à la discussion lors d'une prise de décision. A l'heure o tous les sous-domaines de la médecine auraient tendance à se sur-spécialiser, l'activité des médecins généralistes se diversifie au gré des nouvelles problématiques, réelles ou fantasmées, liées aux nouvelles expositions à des risques potentiels. 61 Conclusion de la première partie Le sujet des antennes-relais est intéressant car il soulève de nombreuses questions. Sur le plan de la recherche et de la connaissance médicale, sur la gestion collective et personnelle de l'incertitude, sur les nouveaux enjeux environnementaux et la surveillance de leurs risques potentiels. Il nous interroge également sur le rapport ambigu qu'entretient notre société avec la technologie, mélange de fascination et de répulsion. Le professeur d'histoire du droit, théologien et sociologue Jacques Ellul a décrit la mutation de celle-ci d'un vaste ensemble de moyens assignés chacun à une fin , en un milieu environnant à part entière , un phénomène désormais autonome , échappant de plus en plus au contrôle de l'homme. Pour lui, la technique n'est ni bonne, ni mauvaise ; elle est ambivalente. On ne peut dissocier ses effets positifs des effets négatifs, ses effets prévus de ses effets imprévus (128). Ce constat douloureux s'est rappelé à nous en plusieurs occasions. Cohabitent ainsi une addiction collective aux nouvelles technologies comme le téléphone portable (J. Ellul employait le terme d'aliénation (129) et des craintes compréhensibles quant à leurs effets à long terme, difficiles à apaiser malgré des efforts importants réalisés dans le domaine de la recherche. Les médecins généralistes, sur des questions comme celle-ci, sont exposés. Aux patients et à leurs questions, aux médias et à la vision parfois tronquée qu'ils ont tendance à propager, aux difficultés de la recherche bibliographique. L'approche globale de cette introduction permet d'éclairer le contexte dans lequel l'étude a été menée et son importance dans la problématique étudiée. 62 ÉTUDE DESCRIPTIVE : LES MÉDECINS GÉNÉRALISTES FACE AUX INTERROGATIONS SUSCITÉES PAR LES ANTENNES-RELAIS DE TÉLÉPHONIE MOBILE. Nous venons de faire le point sur l'état actuel des connaissances concernant les risques d'une exposition aux ondes émises par les antennes-relais. La littérature sur le sujet est plutôt rassurante. Les inquiétudes liées aux nouvelles technologies, leur relais médiatique fort et la jurisprudence récente (la décision du tribunal de Toulouse vis-à-vis de la patiente électrosensible date d'août 2015) pourraient avoir amené les médecins à s'informer, spontanément ou suite à une demande de leur patientèle. Leur représentation du danger de ces antennes (documentée ou non) pourrait influencer celle de leurs patients, c'est pourquoi nous avons cherché à évaluer leur perception de cette problématique, et leur adéquation avec les données scientifiques actuelles. 1. Objectifs de l'étude Objectif principal : évaluer quelles sont les représentations des médecins généralistes libéraux (informés ou non) du danger potentiel des antennes-relais (autres sources électromagnétiques exclues contrairement aux études citées dans la partie théorique). Objectifs secondaires : vérifier si les médecins généralistes ont déjà essayé de s'informer sur le sujet (et sur quelles sources) et s'ils ont sont effectivement confrontés à des craintes émanant de leur patientèle. 2. Matériel et méthode 2. 1. Type d'étude Nous avons réalisé une étude transversale descriptive qualitative de janvier à mai 2016 en envoyant un questionnaire à des médecins généralistes libéraux de différentes régions. 2. 2. Population de l'étude Médecins généralistes exerçant une activité libérale, installés ou non. Les réponses concernent majoritairement des médecins de la région Aquitaine ainsi que des médecins du Poitou-Charentes. Critères d'inclusion : Médecins généralistes exerçant une activité libérale, installés ou remplaçants. 63 2. 3. Outil : le questionnaire 2. 3. 1. Sa genèse Le questionnaire a été réalisé avec l'aide du Pr Roger Salamon et de l'équipe de l'institut de santé publique, d'épidémiologie et de développement du CHU de Bordeaux. 2. 3. 2. Son contenu Les premières questions permettaient de caractériser la population répondante : sexe, tranches d'âges, type d'exercice (remplaçant, urbain, rural ou semi-rural), date d'installation si installé, région d'exercice. Afin de répondre aux objectifs, le questionnaire comportait les items suivants (annexe 3). Avez-vous déjà reçu en consultation des patients pour des troubles qu'ils rattachaient aux ondes électromagnétiques ? Avez-vous déjà reçu en consultation des patients pour des troubles qu'ils rattachaient aux antennes-relais en général ? (dans chaque cas, les médecins devaient préciser s'il s'agissait de questions ou de symptômes, et si possible les quantifier). Avez-vous déjà essayé de vous informer sur le sujet ? Si oui, quelle(s) source(s) avez-vous utilisé ? Que pensez-vous de la dangerosité des antennes-relais ? Si vous ne vous êtes pas informé, pensez-vous le faire suite à ce questionnaire ? 2. 4. Déroulement de l'étude Dans un premier temps une déclaration a été réalisée auprès de la CNILa. Initialement, une étude multicentrique était envisagée. Dans cette optique nous avons contacté les différentes unions régionales de médecins libéraux, avec de nombreux refus liés à la surcharge de demandes de thésards. C'est pourquoi nous avons adressé le questionnaire dans un premier temps à une mailing liste de remplaçants d'Aquitaine ainsi qu'à des contacts professionnels. L'Ordre des médecins de Poitou-Charentes a ensuite donné son feu vert pour diffuser le questionnaire par mail, et enfin l'union des médecins libéraux d'Aquitaine nous a communiqué les adresses de 400 médecins généralistes de Bordeaux centre. Les étiquettes ont été fournies par ordre alphabétique, il n'y avait donc pas de randomisation possible. Aucun rappel n'a été réalisé, les réponses étant anonymes. Pour la version informatique du questionnaire, les réponses ont été reçues présentées sous forme de tableau Excel grâce au logiciel Google Drive. La version papier a été adressée à 400 médecins du Bordeaux centre ; une enveloppe timbrée était jointe afin d'optimiser au maximum le taux de réponse. Après réception, les résultats ont également été saisis dans un tableau Excel afin d'être analysés. Le résultat des pourcentages est systématiquement arrondi à la première décimale, à l'exception des totaux, calculés sur la base des chiffres bruts. a Commission nationale de l'informatique et des libertés 64 3. Résultats 3. 1. Population répondante 3. 1. 1. Taux de réponse En tout 297 réponses ont été obtenues et incluses. - - - 136 réponses de la part des médecins de Bordeaux centre sur 400 envois. 42 réponses de médecins généralistes du Poitou-Charentes suite à la diffusion du mail via l'Ordre des médecins. (Le nombre de destinataires n'a pas été communiqué. Selon l'atlas 2016 du Conseil de l'Ordre, le Poitou-Charentes compte actuellement environ 1451 médecins libéraux) 119 réponses via la mailing liste de remplaçants et une diffusion via des contacts remplaçants ou installés. Le taux de réponse est impossible à calculer dans la mesure o les coordonnées informatiques des médecins généralistes ne pouvaient être obtenues, et o les réponses étaient anonymes, et il a donc fallu passer par des organismes pour les contacter, sans rappel possible. 3. 1. 2. Démographie. Genre de l'échantillon Femmes n (%) Hommes n (%) Total n (%) 151 (50, 8) 146 (49, 2) 297 (100) Tableau 1 : répartition par genre de l'échantillon des médecins généralistes interrogés (n 297). Â ge de l'échantillon 20-29 ans 30-39 ans 40-49 ans 50-59 ans 60 ans et Total n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) 50 (16, 8) 94 (31, 6) 34 (11, 5) 56 (18, 9) 63 (21, 2) 297 (100) Tableau 2 : répartition par tranche d'âge de l'échantillon des médecins généralistes interrogés (n 297). 65 Type d'exercice Remplaçant n (%) 84 (28, 3) Urbain n (%) 155 (52, 2) Semi-rural n (%) 41 (13, 8) Rural n (%) 17 (5, 7) Total n (%) 297 (100) Tableau 3 : répartition des MG interrogés selon leur type d'exercice (n 297). Durée d'installation Installation depuis < 5 ans n (%) entre 5 et 10 ans n (%) entre 10 et 15 ans n (%) entre 15 et 20 ans n (%) >20 ans n (%) Rempla- çants N'ont pas répondu n (%) n (%) 48 (16, 2) 19 (6, 4) 14 (4, 7) 16 (5, 7) 96 (32, 3) 84 (28, 3) 20 (6, 7) Tableau 4 : répartition des MG interrogés selon la durée d'installation au moment de l'enquête (n 297). Région d'exercice Aquitaine Poitou-Cha- rentes n (%) n (%) Midi- Pyrénées n (%) Picardie Autres Total n (%) n (%) n (%) 238 (80) 42 (14, 1) 6 (2) 4 (1, 4) 7 (2, 5) 297 (100) Tableau 5 : répartition des MG interrogés selon leur région d'exercice au moment de l'étude (n 297). 66 3. 2. Enquête 3. 2. 1. Objectif principal. Que pensez-vous de la dangerosité des antennes-relais ? Oui je pense qu'elles sont dangereuses n (%) pas qu'elles représentent un Non je ne pense danger n (%) Je ne sais pas N'ont pas répondu Total n (%) n (%) n (%) 58 (19, 5) 57 (19, 2) 175 (58, 9) 7 (2, 4) 297 (100) Tableau 6 : Que pensez-vous de la dangerosité des antennes-relais ? (n 297) Histogramme 1 : perception d'un danger potentiel des antennes-relais par les médecins (n 297). Au moment de l'enquête, 58 médecins généralistes sur 297 estiment que les antennes- relais pourraient être dangereuses pour la santé (19, 5%). 57 médecins ne pensent pas qu'elles le sont (19, 2%) et 175 ignorent si elles représentent un danger (58, 9%). 67 3. 2. 2. Objectifs secondaires Avez-vous déjà essayé de vous informer sur le sujet ? Oui n (%) 108 (36, 4) Non N'ont pas répondu Total n (%) 182 (61, 3) n (%) 7 (2, 3) n (%) 297 (100) Tableau 7 : Avez-vous déjà essayé de vous informer sur le sujet des antennes-relais ? (n 297) Histogramme 2 : nombre de médecins de l'échantillon ayant cherché à s'informer sur le sujet des antennes-relais (n 297). Sur les 297 médecins interrogés, 108 ont cherché à s'informer sur la question soit 36, 4%. - - Si on croise les données de ces deux questions. Parmi les 108 personnes informées : 52 (48, 1%) ne savent pas si les antennes représentent un danger, 20 (18, 5%) pensent qu'elles sont inoffensives et 36 (33, 3%) les estiment dangereuses. Parmi les 182 personnes non informées : 122 (67%) ne savent pas si les antennes représentent un danger, 36 (19, 8%) pensent qu'elles sont inoffensives, et 24 (13, 2%) les estiment dangereuses. 68 Histogramme 3 : perception d'un danger chez les médecins ayant cherché à s'informer ou non sur le sujet des antennes-relais (n 297). Histogramme 3 bis : perception d'un danger chez les médecins ayant cherché à s'informer (n 108) ou non (n 182) sur le sujet des antennes-relais. 69 Histogramme 3 ter : perception d'un danger des antennes-relais chez les médecins ayant cherché à s'informer (n 108) et chez les non-informés (n 182). 70 Quelle(s) source(s) avez-vous utilisé pour vous informer ? (question ouverte) Parmi les 108 médecins informés, 90 ont répondu à cette question. Au moins une source médicale/scien tifique citée n (%) Pensent qu'elles sont dangereuses 10 (27) Médias grand public uniquement n (%) 15 (40, 5) Google ou Internet uniquement n (%) 8 (21, 6) Ne pensent pas qu'elles soient dangereuses 9 (5, 6) 3 (18, 8) 2 (12, 5) Sources spécifiques Total n (%) 4 (10, 8) (conférence Pr Belpomme : 3 ; site INRSa : 1) 2 (12, 5) (formation au Val de Grace : 1 ; site ASEFb : 1) n (%) 37 (100) 16 (100) 37 (100) Ne savent pas 8 (21, 6) 14 (37, 8) 13 (35, 1) 2 (5, 4) (cf Pr Belpomme : 1 ; site ASEF : 1) Total 27 (30) 32 (35, 6) 23 (25, 6) 8 (8, 9) 90 (100) a : Institut national de recherche et de sécurité b : Association Santé Environnement France Tableau 8 : catégories de sources citées par les médecins ayant cherché à s'informer (n 90). Si vous ne vous êtes jamais informé sur le sujet, comptez-vous le faire suite à ce questionnaire ? Oui n (%) 77 (42, 3) Non Pas répondu n (%) 93 (51, 1) n (%) 12 (6, 6) Total (des non informés) n (%) 182 (100) Tableau 9 : médecins non informés au sujet des antennes-relais : souhaitent-ils le faire suite à ce questionnaire ? (n 182) Parmi les 93 ne souhaitant pas s'informer, 2 ont précisé sur le questionnaire papier que ce refus était lié à un manque de temps et 2 autres ont demandé s'il était possible de leur envoyer un résumé. Sur le total des 297 médecins interrogés, 185 (62, 3%) manifestent un intérêt suffisant pour le sujet pour soit s'être informé au préalable (108 médecins), soit envisager de le faire plus tard (77 médecins). 71 3. 2. 3. Questions subsidiaires Le sujet traite des antennes-relais. Afin d'éviter une confusion dans les réponses, une distinction a été faite entre les motifs de consultation liés aux ondes électromagnétiques et aux antennes en particulier. Avez vous déjà reçu en consultation un patient pour un motif qu'il rattachait aux ondes électromagnétiques en général ? Pour des questions n (%) 8 (2, 7) Oui Pour des symptômes n (%) 23 (7, 7) Pour les deux n (%) 17 (5, 7) Non Total n (%) 249 (83, 8) n (%) 297 (100) Tableau 10 : nombre de médecins ayant reçu en consultation au moins un patient pour un motif qu'il(s) rattachaient aux ondes électromagnétiques (n 297). Au total 48 médecins sur 297 ont été confrontés au moins une fois en consultation à la problématique des ondes électromagnétiques en général soit 16, 1%. En complément il était demandé de préciser à combien de reprises le cas s'était produit. Parmi les 48 médecins ayant été confrontés au problème, 39 ont précisé le nombre de patients. 26 déclarent avoir reçu au moins 2 patients pour ce motif (dont 10 médecins pour plus de 10 patients et 4 médecins pour plus de 15 patients). Avez vous déjà reçu en consultation un patient pour un motif qu'il rattachait aux antennes-relais en particulier ? Pour des questions n (%) 15 (5) Oui Pour des symptômes n (%) 14 (4, 7) Non Total Pour les deux n (%) 17 (5, 7) n (%) 251 (84, 5) n (%) 297 (100) Tableau 11 : nombre de médecins ayant reçu en consultation au moins un patient pour un motif qu'il(s) rattachai(en)t aux antennes-relais (n 297). Au total 46 médecins de l'échantillon ont déjà été confrontés au moins une fois à la problématique des antennes-relais soit 15, 5%. 72 En complément il leur était demandé de préciser le nombre de patients reçus. Parmi ces 46 médecins, 42 ont précisé le nombre de patients : - - - 27 déclarent avoir reçu au moins 2 patients pour ce motif. 14 déclarent avoir reçu au moins 5 patients pour ce motif. 8 déclarent avoir reçu au moins 10 patients pour ce motif. Problématique Ondes électromagnétiques (antennes exclues) n (%) Nombre de médecins 16 (5, 4) Antennes-relais n (%) 14 (4, 7) Ondes électromagnétiques (antennes incluses) n (%) 32 (10, 8) Tableau 12 : Nombre de médecins ayant reçu en consultation au moins un patient pour un motif qu'il(s) rattachai(en)t à l'une des deux problématiques (n 297). Sur la totalité de l'échantillon, 62 (20, 9%) médecins ont été confrontés au moins une fois à la problématique des ondes électromagnétiques en général et 46 aux antennes- relais en particulier (15, 5%) 73 3. 3. Études croisées dangereuses 3. 3. 1. Caractéristiques de la population considérant les antennes comme Croisement selon le genre et l'âge des médecins généralistes interrogés Tranche d'âge Femmes Danger Hommes 20-29 ans 30-39 ans 40-49 ans 50-59 ans 60 ans et Total 6 0 10 6 6 2 2 10 3 13 27 31 Total 6 (10, 3) 16 (27, 6) 8(13, 8) 12 (20, 7) 16 (27, 6) 58 (100) Pas de danger Femmes Hommes 5 2 7 11 1 5 2 6 2 16 17 40 Total 7 (12, 3) 18 (31, 6) 6 (10, 5) 8 (14) 18 (31, 6) 57 (100) Ne savent pas Femmes Hommes 29 8 44 16 12 6 12 24 5 19 102 73 Total 37 (21, 1) 60 (34, 3) 18 (10, 3) 36 (20, 6) 24 (13, 7) 175 (100) N'ont pas répondu Femmes Hommes Total Total des Femmes Total des Hommes Total 0 0 0 40 10 50 0 0 0 61 33 94 2 0 2 21 13 34 0 0 0 16 40 56 3 2 5 11 52 63 5 2 7 151 146 297 Tableau 13 : caractéristiques démographiques de l'échantillon et perception du danger (n 297). Danger n % 27 (17, 9) 31 (21, 2) 58 Pas de danger n % 17 (11, 3) 40 (27, 4) 57 Ne sait pas n % 102 (67, 5%) 73 (50%) 175 N'a pas répondu n % 5 (3, 3) 2 (1, 4%) 7 Total n % 151 (100) 146 (100) 297 Femmes Hommes Total Tableau 14 : représentation du danger potentiel des antennes-relais selon le sexe des médecins interrogés (n 297). 74 Danger Pas de danger Ne sait pas n (%) 6 (12) 16 (17) 8 (23, 5) 12 (21, 4) 16 (25, 4) 58 (19, 5) n (%) 7 (14) 18 (19, 1) 6 (17, 7) 8 (14, 3) 18 (28, 6) 57 (19, 2) n (%) 37 (74) 60 (63, 8) 18 (52, 9) 36 (64, 3) 24 (38, 1) 175 (58, 9) N'a pas répondu n (%) 0 (0) 0 (0) 2 (5, 9) 0 (0) 5 (7, 9) 7 (23, 4) Total n (%) 50 (100) 94 (100) 34 (100) 56 (100) 63 (100) 297 (100) 20-29 ans 30-39 ans 40-49 ans 50-59 ans 60 et Total Tableau 15 : représentation du danger potentiel des antennes-relais selon l'âge des sujets interrogés (n 297). Histogramme 4 : perception d'un danger ou non en fonction de l'âge des médecins interrogés (n 297). 75 Perception du danger en fonction du type d'exercice Type d'exercice Danger n (%) Pas de danger n (%) Ne sait pas n (%) Remplaçant 10 (11, 8) 14 (16, 5) 61 (71, 7) Urbain 39 (25, 2) 32 (20, 6) 77 (49, 7) Semi-Rural 7 (17, 1) 5 (12, 2) 29 (70, 7) Rural Total 2 (11, 8) 6 (35, 3) 8 (47, 1) 58 57 175 N'a pas répondu n (%) 0 (0) 6 (3, 9) 0 (0) 1 (5, 8) 7 Total n (%) 85 (100) 155 (100) 41 (100) 17 (100) 297 Tableau 16 : représentation du danger potentiel des antennes-relais selon le type d'exercice des médecins interrogés (n 297). Histogramme 5 : perception ou non d'un danger des antennes-relais selon le type dexercice (n 297). 76 Perception du danger représenté par les antennes en fonction de la durée d'installation Installation depuis Danger n (%) Pas de danger n (%) Ne sait pas n (%) N'a pas répondu n (%) Total n (%) < 5 ans 9 (18, 4) 7 (14, 3) 32 (65, 3) 1 (2) 49 (100) 5 à 10 ans 2 (10, 5) 6 (31, 6) 11 (57, 9) 10 à 15 ans 5 (35, 7) 2 (14, 3) 7 (50) 0 0 19 (100) 14 (100) 15 à 20 ans 5 (31, 3) 1 (6, 3) 9 (56, 3) 1 (6, 3) 16 (100) > 20 ans 21 (21, 9) 23 (24) 48 (50) 4 (4, 2) 96 (100) Remplaçants 10 (12) 14 (16, 9) 59 (71, 1) 0 83 (100) Pas répondu 6 (30) 4 (20) 9 (45) 1 (5) 20 (100) Total 58 57 175 7 297 (100) Tableau 17 : représentation de la dangerosité des AR en fonction de la durée d'installation (n 297). Histogramme 6 : représentation de la dangerosité des antennes-relais en fonction de la durée d'installation. 77 Histogramme 6bis : représentation d'une dangerosité ou non selon durée d'installation (exclusion des médecins ne s'étant pas prononcés) Perception du danger des antennes selon confrontation ou non au problème en consultation Motif de consultation Danger n (%) Pas de danger n (%) Ne sait pas n (%) Antennes- relais OEMa Les deux Total 5 (35, 7) 2 (14, 3) 7 (50) 2 (12, 5) 14 (43, 8) 21 (33, 9) 3 (18, 8) 3 (9, 4) 8 (12, 9) 11 (68, 8) 15 (46, 9) 33 (53, 2) Total n (%) 14 (100) 16 (100) 32 (100) 62 (100) Tableau 18 : perception du danger chez les médecins ayant été confrontés au problème des ondes électromagnétiques en général en consultation (n 62). a OEM : ondes électromagnétiques 78 Danger n (%) Pas de danger Ne sait pas Pas répondu n (%) n (%) n (%) Total n (%) 19 (41, 3) 5 (10, 9) 22 (47, 8) 0 (0) 46 (100) Confrontés au problème en consultation Non Total 37 (15, 7) 49 (20, 9) 142 (60, 4) 56 54 164 7 (3) 7 235 (100) 281 Tableau 19 : perception d'un danger selon confrontation au problème spécifique des antennes- relais en consultation (avec exclusion des médecins ayant été confrontés à d'autres sources d'ondes électromagnétiques mais pas aux antennes-relais) (n 281). Parmi les 46 médecins ayant déjà été confrontés au problème des antennes-relais, (exclusion des ondes électromagnétiques sans rapport avec les antennes), 19 considèrent qu'elles représentent un danger soit 41, 3 %. Parmi les 235 médecins n'ayant jamais été confrontés au problème, 37 considèrent qu'elles pourraient représenter un danger soit 15, 7%. Histogramme 7 : perception ou non d'un danger représenté par les antennes-relais selon confrontation (n 46) ou non (n 235) au problème en consultation. 79 cherché à s'informer 3. 3. 2. Caractéristiques de la population des médecins généralistes ayant Représentation du danger potentiel des antennes en fonction de l'information Danger n (%) Pas de danger n (%) n (%) Ne sait pas Pas répondu Informés 36 (33, 3) 20 (18, 5) 52 (48, 1) Non informés N'ont pas répondu Total 22 (12, 1) 36 (19, 8) 122 (67) 0 58 1 57 1 175 Total n (%) 108 (100) 182 (100) 7 297 n (%) 0 (0) 2 (1, 1) 5 7 Tableau 20 : perception du danger selon information ou non (n 297). Histogramme 8 : perception du danger des antennes-relais selon présence ou non d'une information antérieure à l'étude. 80 Histogramme 9 : perception d'un danger selon information (n 108) ou non (n 182) sur le sujet des antennes-relais. Parmi les 108 médecins ayant cherché à s'informer, 33, 3% estiment que les antennes-relais pourraient présenter un danger contre 12, 1% chez les non informés (182). Le pourcentage de médecins estimant le danger absent est de 18, 5% chez les médecins informés contre 19, 8% chez les non informés. 81 3. 3. 3. Caractéristiques des médecins ayant cherché à s'informer Tranche d'âge Urbain Semi-rural Rural Remplaçant Total Urbain Semi-rural Rural Remplaçant Total Urbain Semi-rural Rural Remplaçant Total Informés Non informés Pas répondu 20-29 ans 30-39 ans 40-49 ans 50-59 ans n (%) n (%) n (%) n (%) 60 ans et n (%) 2 1 0 4 11 1 1 12 10 3 0 0 22 2 0 0 34 5 0 0 Total n (%) 79 12 1 16 7 (6, 5) 25 (23, 1) 13 (12) 24 (22, 2) 39 (36, 1) 108 (100) 2 7 2 32 13 16 5 35 16 2 1 0 27 2 3 0 15 1 2 1 73 28 13 68 43 (23, 6) 69 (37, 9) 19 (10, 4) 32 (17, 6) 19 (10, 4) 182 (100) 0 0 0 0 50 0 0 0 0 94 1 0 1 0 34 0 0 0 0 56 4 0 1 0 63 5 0 2 0 297 Tableau 21 : caractéristiques démographiques des médecins informés et non informés (n total 297) 82 Histogramme 10 : Répartition des médecins informés (n 108)et non informés (n 182) par mode d'exercice. Les médecins ayant cherché à s'informer sont pour une grande majorité installés en milieu urbain (73, 1%). Leur proportion est de 40, 1% parmi les non informés. 83 Histogramme 11 : Répartition des médecins informés (n 108) et non informés (n 182) sur la question des antennes relais par tranche d'âge Information et confrontation au problème des antennes-relais en consultation Confrontés au problème Non confrontés Total Des antennes n (%) 9 (8, 3) 5 (2, 7) 0 14 Informés Non informés Pas répondu Total Des ondes et des antennes n (%) 23 (21, 3) 8 (4, 4) Des ondes hors antennes n (%) 8 (7, 4) 8 (4, 4) n (%) 68 (63) 161 (88, 5) n (%) 108 (100) 182 (100) 1 32 0 16 6 235 7 297 Tableau 22 : information sur les antennes-relais selon expérience vécue en consultation (n 297). Parmi les 108 médecins informés, 32 ont été confrontés au moins une fois au problème des antennes-relais en consultation (29, 6%) contre 13 (7, 1%) parmi les 182 non informés. 84 problème des antennes relais et/ou des ondes électromagnétiques 3. 3. 4. Caractéristiques de la population ayant été confrontée au Antennes OEM Les deux Tranche d'âge Urbain Semi-rural Rural Remplaçant Total Urbain Semi-rural Rural Remplaçant Total Urbain Semi-rural Rural Remplaçant Total 20-29 ans 1 0 0 3 4 0 0 1 1 2 0 1 0 1 2 30-39 ans 2 0 0 1 3 4 0 0 1 5 1 0 0 5 6 40-49 ans 50-59 ans 60 ans et Total 1 0 0 0 1 1 1 0 0 2 2 0 0 0 2 4 0 0 0 4 4 0 0 0 4 7 2 1 0 10 2 0 0 0 2 2 1 0 0 3 10 1 1 0 12 10 0 0 4 14 11 2 1 2 16 20 4 2 6 32 Tableau 23 : caractéristiques des médecins confrontés au problème des antennes-relais, et/ou des ondes électromagnétiques en général en consultation. Milieu urbain Semi-rural n (%) 41 (66, 1) n (%) 6 (9, 7) Rural n (%) 3 (4, 8) Remplaçant n (%) 12 (19, 4) Total n (%) 62 (100) Tableau 24 : type d'exercice des médecins confrontés au problème des ondes en général en consultation (n 62). 20-29 ans 30-39 ans 40-49 ans 50-59 ans 60 ans et n (%) n (%) 8 (12, 9) 14 (22, 6) n (%) 5 (8) n (%) 18 (29) n (%) Total n (%) 17 (27, 4) 62 (100) Tableau 25 : âge des MG confrontés au problème des ondes en consultation (n 62). 85 4. Discussion 4. 1. Discussion de la méthode 4. 1. 1. Recrutement La plupart des unions régionales de médecins libéraux ne peuvent pas transmettre les études menées par des thésards hors région. Néanmoins nous avons pu diffuser le questionnaire via celle d'Aquitaine, ainsi que par l'Ordre des médecins du Poitou-Charentes. Nous avons utilisé la mailing-list des remplaçants d'Aquitaine ainsi que des contacts professionnels afin d'obtenir davantage de réponses. La diffusion par courrier concernait 400 médecins généralistes libéraux de Bordeaux centre. En tout 297 réponses ont été obtenues et incluses. 136 réponses de la part des médecins de Bordeaux centre sur 400 envois. 42 réponses de médecins généralistes du Poitou-Charentes sur une population totale de 1751 médecins selon l'ARS (Agence Régionale de Santé). 119 réponses par la mailing-list de remplaçants et une diffusion à des contacts remplaçants ou installés. - - - Le taux de réponse ne peut être calculé dans la mesure o les réponses étaient anonymes, et o les coordonnées informatiques des médecins généralistes étaient impossibles à obtenir. Il a fallu passer par des organismes pour les contacter mais sans rappel possible. Les critères d'inclusion étaient peu nombreux, à savoir tous les médecins exerçant une activité de médecine générale libérale, installés ou non. Ce recrutement est à l'origine de biais de sélections importants, avec une sur-représentation des remplaçants et des médecins généralistes exerçant une activité urbaine. Nous aurons l'occasion de revenir sur la population des répondants au cours de la discussion. 4. 1. 2. Recueil des données Le questionnaire a été diffusé via deux supports : papier et informatique. Ceci permettait de limiter le biais de sélection en incluant des médecins travaillant dans des cabinets non informatisés. Le questionnaire étant relativement long, nous avions choisi de ne pas réaliser d'entretien téléphonique, afin que les médecins prennent le temps de répondre plutôt que de les déranger en pleine consultation. Mais cela rendait les réponses intraçables et empêchait tout rappel. On note un biais de volontariat : les médecins concernés ou intéressés par le sujet auront eu davantage tendance à répondre que les autres. L'étude a été menée quelques mois après la reconnaissance de la patiente électrosensible par le tribunal de Toulouse. Il est possible que cette proximité ait joué un rôle dans la façon des médecins d'appréhender le sujet. 86 4. 1. 3. Le questionnaire Une partie de l'enquête concerne les perceptions du danger représenté par les antennes-relais au moment de l'étude. Ceci correspondait à notre objectif principal. On peut regretter l'utilisation non définie du terme danger mais il semblait préférable au terme de risque, trop large. La question touchant à l'objectif principal n'a volontairement pas été mise en début du questionnaire. L'ordre des questions leur permettait d'abord de se remémorer leurs expériences passées, afin de mieux mûrir leur réponse. La deuxième partie de l'enquête concernait la notion d'information ou non sur le sujet des antennes-relais, ainsi qu'une question ouverte sur ses modalités. Cette question nous paraissait intéressante pour l'étude afin d'évaluer le retentissement de cette information sur la perception du danger. La question des sources était ouverte, ce qui a dans certains cas engendré des réponses imprécises. Une des questions portait sur la confrontation ou non au problème en consultation, avec quantification si possible. Elle n'entre pas dans les objectifs de l'étude mais permet de mieux cibler la population interrogée et son vécu. Les interrogés devaient également préciser si les patients avaient consulté pour des symptômes, des questions ou pour les deux. Suite à un problème technique dans la version informatique du questionnaire, les résultats n'ont pas été exploités : dans la mesure o ils n'entrent pas dans les objectifs de l'étude et comportent un biais de mémorisation, leur absence ne semble pas gêner l'analyse. Nous avons séparé antennes-relais seules et ondes électromagnétiques incluant les antennes- relais afin de limiter le biais de confusion entre les deux, les sources électromagnétiques étant extrêmement diverses. Les deux sujets sont toutefois en rapport direct, donc ce biais existe toujours. Par ailleurs, ceux que le sujet intéresse ou inquiète se souviendront davantage des cas rencontrés en consultation. Encore une fois la quantification n'est pas interprétable mais il aurait été intéressant de savoir si les médecins avaient été confrontés au problème de façon anecdotique ou significative, afin d'obtenir une meilleure vue d'ensemble. Enfin, pour ce qui est de la perception d'un danger, il a été choisi de ne pas démultiplier les propositions, ce qui ne permettait pas de nuancer les réponses. Ceci a probablement poussé certains médecins à répondre Je ne sais pas ou à ne pas répondre alors qu'ils avaient une opinion sur le sujet, mais pas suffisamment tranchée pour la partager. Grâce à ces différentes questions, il nous a été possible d'évaluer différents éléments touchant au positionnement des généralistes face aux antennes-relais : non seulement leur représentation de leur dangerosité éventuelle, mais aussi leur information et leur expérience passée dans ce domaine. Elle explore également une population moins souvent étudiée, à savoir les médecins remplaçants. Nous n'avons pas trouvé d'étude explorant les perceptions des médecins généralistes sur le sujet ciblé des antennes-relais. 87 4. 2 Discussion des résultats 4. 2. 1. Démographie Genre et âge L'enquête retrouve 151 femmes (50, 8%) et 146 hommes (49, 2%). La répartition des tranches d'âges était la suivante : 20-29 ans : 16, 8 % de l'échantillon 30-39 ans : 31, 6 % de l'échantillon 40-49 ans : 11, 4 % de l'échantillon 50-59 ans : 18, 9 % de l'échantillon. 60 ans et plus : 21, 2 % de l'échantillon. Selon la cartographie de l'ordre national des médecins réalisée en 2016, voici la répartition des médecins généralistes en activité régulière tous modes d'exercice confondus. Gironde Aquitaine Hommes Femmes Total Age moyen 60 ans et plus Moins de 40 ans 1250 1071 2321 51 24, 8% 16, 1% 2728 2100 4828 52 25, 4% 15, 3% Poitou- Charentes 1385 1096 2481 52 27% 16, 6% France 48099 40787 88886 52 27, 3% 16% Tableau 26 : répartition des médecins généralistes en activité régulière tous modes d'exercice confondus selon leur âge dans les zones Gironde, Aquitaine, Poitou-Charentes, France (cartographie de l'ordre national des médecins réalisée en 2016). Les répondants proviennent majoritairement d'Aquitaine (80%) et dans une moindre mesure, de Poitou-Charentes (14, 1%) c'est pourquoi nous n'avons pas précisé les démographies des autres régions. Les médecins ayant une activité urbaine sont également fortement représentés par rapport aux exercices rural et semi-rural, étant donné que le questionnaire papier a été envoyé aux médecins de Bordeaux Centre. Dans notre étude, la proportion de femmes est supérieure à celle des hommes ce qui ne reflète pas la situation démographique actuelle. Ceci est lié au biais de sélection au moment du recrutement (la première série de questionnaire avait été adressée aux remplaçants d'Aquitaine en attendant l'autorisation de diffusion aux médecins installés, cette population étant connue pour être plus jeune et plus féminisée). Pour cette même raison, la catégorie des moins de 40 ans est sur-représentée. Ce fait pourrait également s'expliquer par un manque de temps ou un moindre intérêt des médecins plus âgés pour cette question émergente. 88 La répartition de l'échantillon par mode d'exercice était la suivante : Mode d'exercice Urbain : 52, 9% Semi-rural : 13, 5% Rural : 5, 4% Remplaçant : 28, 3% Une unité urbaine est définie par l'INSEE comme une commune ou un ensemble de communes présentant une zone de bâti continu (pas de coupure de plus de 200 mètres entre deux constructions) et comptant au moins 2000 habitantsa. Nous n'avons pas trouvé de source officielle indiquant la répartition nationale des médecins généralistes ayant une activité libérale salariée ou mixte par lieu d'exercice. Toutefois il est évident que le mode de recrutement implique une faible inclusion de médecins exerçant en territoire rural et semi-rural par rapport à la moyenne nationale. Les remplaçants en revanche, sont plus présents du fait du mode de recrutement (la première diffusion de questionnaires concernait les remplaçants, la diffusions aux installés a pu se faire ensuite). La forte proportion de médecins urbains risque d'influer sur le nombre de médecins confrontés au problème parmi leur patientèle, la densité d'antennes et l'exposition électromagnétique étant beaucoup plus élevées en ville qu'à la campagne. Pour ce qui concerne les remplaçants, leur plus jeune expérience rend leur confrontation au problème et leur éventuelle information sur le sujet moins probable que pour des médecins plus âgés et installés. 4. 2. 2. Objectif principal Que pensez-vous de la dangerosité des antennes-relais ? 58 médecins (19, 5%) de l'échantillon pensent que les antennes-relais pourraient représenter un danger pour la population. 57 médecins (19, 2%) les estiment sans danger. 175 (58, 9%) ont répondu qu'ils ne savaient pas et 7 (2, 4%) n'ont pas répondu. Un sondage a été réalisé par la Société Française de RadioProtection (130) (SFRP) en 2011 auprès d'un panel de médecins généralistes (MG) : Pensez-vous qu'habiter à proximité d'une ligne à haute tension ou d'une antenne relais de téléphonie mobile, ou utiliser régulièrement un téléphone portable augmente le risque de développer certaines pathologies ? . 79% ont répondu oui, 21% ont répondu non. Ces résultats diffèrent des nôtres mais les risques cités étant plus nombreux cela semble logique. Ce résultat marquait en tous cas une inquiétude des médecins généralistes envers ces différentes technologies. Un sondage INPES (131) de 2012 a questionné des MG sur leur perception des risques environnementaux pour la santé des personnes résidant en France : 6% ont spontanément cité la téléphonie mobile (incluant les antennes-relais) et 8% les ondes électromagnétiques en général. a Unité urbaine : définition de l' INSEE ; Disponible sur : 89 Il leur a été demandé de citer des éléments environnementaux situés à proximité de leur cabinet qu'ils considéraient comme des nuisances : 69% ont cité les antennes. Parmi ces 69%, 44% considéraient qu'elles représentaient un danger, 49% qu'elles étaient inoffensives et 7% ne s'étaient pas prononcés. On constate que même si davantage de MG se sont prononcés par rapport à notre étude, le nombre de médecins inquiets est comparable au nombre de médecins rassurés. Ces deux études semblent donc indiquer qu'une part non négligeable des médecins interrogés les considérait comme un danger potentiel. Les sondés ont moins eu tendance à avoir une opinion tranchée au cours de notre étude. Il est possible que les médecins se soient davantage prononcés sur la dangerosité des lignes haute tension et des téléphones portables, beaucoup plus présents dans leur quotidien que les antennes-relais, et générateurs de davantage d'inquiétudes. Ces études ont été réalisées en 2011 et 2012, la nôtre en 2016. De nouveaux rapports ont été publiés entre ces deux dates mais les publications rassurantes de l'AFSSET et des Académie de Médecine et de Science (2009) ne semblent avoir eu qu'un impact limité sur les perceptions des sondés. Nos résultats recoupent donc les éléments de la littérature en faveur d'une population médicale divisée. Au vu de la forte proportion de personnes n'ayant pas d'avis sur la question (58, 9%, sans compter ceux qui n'ont pas répondu du tout), on peut extrapoler qu'une majorité se considère trop mal informée pour répondre. Dans l'étude INPES, 71% des médecins interrogés étaient dans le même cas (131). Pour les 58, 9% de médecins ne s'étant pas prononcés, on peut imaginer deux cas de figure : ceux qui n'ont pas eu le temps, l'occasion ou l'envie de s'informer sur le sujet, et ceux qui ont bien essayé de s'informer mais n'ont pas pu tirer de conclusion, du fait de difficultés rencontrées lors de leur recherche. Parmi ceux qui se sont forgé une opinion, la moitié a adopté un point de vue différent de celui attendu, à savoir celui des experts (aucun danger n'a actuellement été mis en évidence). Les causes peuvent en être diverses : mauvaise visibilité des informations dites fiables, manque de confiance dans les données officielles rassurantes fournies, expérience antérieure problématique dans leur exercice ou dans leur vie privée, biais de confirmation lié à un préjugé, imprégnation médiatique etc. Facteurs semblant avoir influencé la perception de dangerosité : - Des croyances ? Certains se sont prononcés sur la dangerosité en reconnaissant ne pas s'être informés au préalable. Ils ont donc conçu une opinion sur le sujet sans s'appuyer sur une démarche scientifique. Les degrés de conviction résultant peuvent être divers, de la simple présomption jusqu'à une possible croyance (le terme croyance désignant une disposition, une propension de l'esprit qui porte un individu, singulier ou collectif, à donner son assentiment à une représentation ou à un état de choses, et ce en l'absence de certitude attestée par l'existence d'une preuve (132). La couverture médiatique en est partiellement responsable. En effet une étude publiée dans la Public Library of Science (133) a montré que la médiatisation des sujets pouvait avoir un impact sur la perception d'une dangerosité, y compris chez des étudiants en médecine, quand leur formation aurait dû les en prémunir. Les résultats suggèrent que les maladies qui sont fréquemment évoquées par les médias sont considérées comme plus sérieuses que des maladies identiques, mais n'ayant pas la même couverture médiatique. - Leur vécu Un autre élément semble avoir exercé une influence sur les résultats : parmi les 46 médecins 90 confrontés au problème des antennes, 41, 3% estiment les antennes dangereuses contre 15, 7% chez ceux qui ne l'ont jamais été. Le vécu aurait donc un impact sur le perception du danger. Ce résultat doit être nuancé car le biais de mémorisation implique que des personnes considérant les antennes dangereuses risquent non seulement de mieux se souvenir d'avoir eu une consultation en rapport, mais risquent d'avoir fait eux-mêmes le rapprochement entre d'éventuels symptômes et la présence d'antennes-relais dans l'environnement du patient. Conclusion sur la question de la dangerosité Il existe donc un décalage entre les données rassurantes de la littérature et cette incertitude planant sur une partie des médecins généralistes. Les questions de la population risquent donc dans la majorité des cas de se heurter à un statu quo, ou pour une part non négligeable, à une validation de leurs inquiétudes par le médecin généraliste. Se pose alors la question de leur information. 4. 2. 3. Objectifs secondaires Avez-vous déjà essayé de vous informer sur le sujet des antennes-relais ? Dans notre étude, 108 médecins (36, 4%) ont cherché à s'informer sur le sujet. 182 (61, 3%) ne l'ont jamais fait, 7 n'ont pas répondu. On peut considérer que 36, 4% est un pourcentage finalement assez élevé, au regard du nombre de consultations liées au sujet. Toutefois le biais de réponse implique que les personnes intéressées auront davantage eu tendance à répondre au questionnaire que les autres, même si la forte proportion de remplaçants peut, elle, générer une sous-estimation. L'étude de l'INPES (131) citée précédemment abordait la question de l'information sur les sujets touchant à l'environnement. Cinq pour cent des médecins généralistes disaient avoir reçu une formation initiale, et 21% une formation continue. Dans notre étude, un seul a rapporté une formation réalisée dans le cadre de son cursus. Tous les autres ont cité des sources dans un contexte d'autoformation par une recherche bibliographique. Ceci valide l'hypothèse d'une formation initiale insuffisante dans la population des médecins généralistes. Parmi les 182 médecins n'ayant pas cherché à s'informer, 77 envisagent de le faire suite à ce questionnaire, 93 ne le souhaitent pas et 12 n'ont pas répondu. Sur la totalité de l'échantillon, 62, 3% ont soit déjà cherché à s'informer, soit envisagent de le faire suite à ce questionnaire). L'étude de l'INPES (131) indiquait que 53% des médecins généralistes souhaitaient suivre une formation continue en santé environnement. Nos résultats valident l'hypothèse d'un intérêt réel des médecins généralistes pour cette problématique environnementale. Concernant la qualité de l'information, l'étude INPES a mis en lumière les éléments suivants. Les MG interrogés se déclaraient majoritairement mal informés sur les problèmes de santé liés à l'environnement (en excluant les problèmes de santé et travail) : seuls 2 % s'estimaient très bien informés, 27 % plutôt bien informés, 59 % plutôt mal informés et 12 % très mal informés. Dans notre étude, 58, 9 % ne se sont pas prononcés, (sans compter ceux qui n'ont pas du tout répondu) ce qui suggère que ces médecins s'estimaient trop mal informés pour répondre à la question. Ce constat avait été fait par les médecins lors du sondage de 2012. Parmi les 93 ne souhaitant pas s'informer, 2 ont précisé (sur le questionnaire papier) que ce 91 refus était lié à un manque de temps et 2 autres ont demandé s'il était possible d'obtenir un résumé. Le manque de temps fait effectivement partie selon certaines études des freins à la réalisation d'une recherche bibliographique (134). Perception et information : croisement des résultats Il est intéressant de croiser les deux questions pour évaluer l'impact de l'information sur la perception du danger. Parmi les informés 33, 3% estiment les antennes dangereuses contre 13, 2% chez les non informés. Parmi les informés 18, 5% les pensent inoffensives contre 19, 8% chez les non informés. Parmi les informés, 48, 1% ne se prononcent pas contre 67% chez les non informés. L'étude INPES de 2012 indiquait que 71% des interrogés estimaient les informations disponibles en terme d'environnement contradictoires, ce qui peut aboutir à des difficultés d'interprétation. Dans cette étude, 48, 1% des MG ne se sont pas prononcé malgré une information préalable (la qualité de l'information reçue n'étant pas vérifiable). Une proportion importante de médecins n'a pas jugé les informations reçues suffisamment convaincantes pour en tirer des conclusions. Ces résultats témoignent de la multiplicité et de la dissonance des sources disponibles. Un biais de confusion rend les résultats difficiles à interpréter : les personnes ayant un a priori négatif sur les antennes auront eu davantage tendance à s'informer que les autres. La proportion de personnes rassurées ne varie pas ou peu après information ; en revanche le fait de s'informer aurait plutôt tendance au choix à conforter une inquiétude pré-existante ou à en générer de nouvelles. Cet élément est en faveur de l'existence de biais cognitifs. Un mot sur les biais cognitifs (135) Il s'agit de modes de pensée intuitifs, déviant la réflexion (et donc le jugement) de sa logique et de sa rationalité. Certains de ces biais peuvent en fait être efficaces en situation de prise de décision rapide ou d'intérêt vital pour l'être humain, permettant une évaluation ou une action plus performante. Mais en situation d'analyse d'un problème complexe, les raccourcis et omissions qui peuvent en découler aboutissent souvent à un jugement erroné. On distingue différents groupes de biais cognitifs : les biais sensori-moteurs, attentionnels, mnésiques, de jugement, de raisonnement, liés à la personnalité. Dans le cas qui nous intéresse, les principaux biais entrant en jeu peuvent être ceux de jugement et de raisonnement. Quelques biais de jugement potentiels : - ancrage mental : influence laissée par la première impression persistant malgré l'acquisition de nouveaux éléments contradictoires. - effet de halo : perception sélective d'informations allant dans le sens d'une première impression que l'on cherche à confirmer. - effet retour de flamme : croyance initiale renforcée en face de preuves pourtant contradictoires Biais de raisonnement possibles : - confirmation d'hypothèse : fait de préférer les éléments qui confirment plutôt que ceux qui infirment une hypothèse - biais de disponibilité : ne pas chercher d'autres informations que celles immédiatement disponibles - biais de cadrage : la façon de présenter une situation influe sur la façon dont elle est 92 interprétée - perception sélective : interpréter de manière sélective des informations en fonction de sa propre expérience Dans la pratique médicale, un autre biais cognitif est bien connu : l'heuristique de disponibilité. Des diagnostics récents ou frappants chez les patients reviennent à l'esprit plus facilement (sont davantage disponibles) et sont surestimés lors de l'évaluation de la probabilité du diagnostic actuel (136). Ces biais pourraient faire partie des problèmes posés par la recherche bibliographique dans ce contexte médiatique. Un autre élément attire notre attention : les perceptions des médecins non informés. Parmi eux, 122 ne se prononcent pas sur la dangerosité des antennes-relais. 36 ne les pensent pas dangereuses et 23 ont un avis péjoratif de base sur le danger qu'elles peuvent représenter. Dans ce dernier cas, l'imprégnation passive (qu'on le veuille ou non, le sujet est difficilement évitable dans les médias) a pu aboutir à l'existence d'une conviction ne reposant de fait sur aucune preuve scientifique. La médiatisation du sujet est ici en cause. Il semblerait que dans certains cas, le fait de s'informer, au lieu d'apporter des réponses en adéquation avec les connaissances actuelles, ne garantisse pas une interprétation claire et homogène des données recueillies. Cela recoupe également les données de la littérature évoquant des difficultés des médecins généralistes à réaliser une recherche bibliographique et à sélectionner des sources fiables dans un contexte de forte médiatisation. Celle-ci est ici un obstacle et non une aide à la diffusion de l'information. Le biais de réponse induit que les médecins intéressés auront plus eu tendance à répondre que les autres. A l'inverse, les remplaçants présents dans l'échantillon étaient également nombreux. Plus jeunes et moins expérimentés, ils n'ont peut-être pas encore eu l'occasion de s'intéresser au sujet. Avez-vous déjà reçu en consultation un patient : - - pour un problème qu'il rattachait aux ondes électromagnétiques en général ? pour un problème qu'il rattachait aux antennes-relais en particulier ? Une distinction était faite dans l'intitulé des questions afin d'éviter une confusion, mais l'étude porte sur les antennes-relais. Celles-ci appartenant au large domaine des ondes électromagnétiques, il était donc difficile d'aborder l'un sans associer l'autre au cours d'une consultation dédiée. La question précisait que le lien devait être fait par le patient et non par le médecin lui-même mais il est impossible de vérifier que ce critère a bien été pris en compte. Parmi les médecins répondant, 46 disent avoir été confrontés spécifiquement au problème des antennes-relais en consultation (15 pour des questions, 14 pour des symptômes et 17 pour les deux) soit 15, 5% de l'échantillon. 62 médecins (20, 1%) ont été confronté au moins une fois à la problématique des ondes électromagnétiques en général. Parmi les 46 médecins, 27 déclarent avoir reçu au moins 2 patients pour ce motif soit 9 % (dont 14 rapportent plus de 5 cas et 8 plus de 10 cas). Dans notre étude, 84% des médecins n'ont jamais été confrontés au problème des antennes- relais en consultation. La sur-représentation de jeunes médecins remplaçants (ayant donc moins d'années 93 d'expérience derrière eux) a pu induire un biais de sélection ce qui rend ce résultat difficile à interpréter. Toutefois, 15, 5% est un pourcentage non négligeable et témoigne de l'existence de craintes au sein de la population. Lors d'un sondage INPES réalisé en 2007 (137) la perception des risques associés aux stations de base de téléphonie mobile (ou antennes de téléphonie mobile) avait été évaluée au sein de la population générale par rapport à d'autres problématiques environnementales. Les antennes se situaient en 11ème position sur les 13 risques présentés dans l'enquête, avec 51, 5 % seulement de personnes inquiètes (dont 14 % déclarant un risque très élevé et 37, 5 % déclarant un risque assez élevé). Sur le risque lié aux stations de base de téléphonie mobile, 10, 7% de l'échantillon ne s'était pas prononcé. Cette thématique était celle pour laquelle on trouvait le moins de personnes ayant une opinion arrêtée. Un autre sondage mené par l'IRSN (138) (Institut de Radioprotection et de Sûreté Nucléaire) en 2008 a interrogé 1 002 personnes au sujet de 31 situations à risque. Le risque lié aux stations de base de téléphonie mobile était en 21ème position, avec 34 % de personnes estimant un risque élevé, et 34 % moyennement élevé. Ce risque est estimé faible pour 24 % de la population. Cinq pour cent des personnes interrogées n'ont pas répondu à cette question. Dans les études postérieures publiées par l'IRSN, les antennes-relais n'étaient plus proposées dans le classement. L'étude SFRPa de 2011 indiquait que 71% des médecins généralistes interrogés avaient déjà été questionnés par leurs patients sur les risques liés aux champs électromagnétiques en général : 3% souvent, 28% de temps en temps, 43% rarement, 26% jamais. Les sources électromagnétiques les plus souvent citées étaient les téléphones mobiles (79 médecins) les antennes-relais de téléphonie mobile (69 médecins) et les lignes haute tension (53 médecins) (130). À la question Au cours des douze derniers mois, avez-vous été confrontés à des patients se plaignant d'hypersensibilité aux champs électromagnétiques, et si oui combien ? 3% des médecins ont répondu oui (130). Enfin, lors du sondage Médecine générale et santé-environnement de l'INPES (2012), un des items portait sur le nombre de médecins déclarant être sollicités par leurs patients sur les risques ou les pathologies liés à l'environnement. Sur les 752 médecins interrogés voici quelle était la répartition des demandes liées aux antennes-relais ou à d'autres sources électromagnétiques comme le téléphone portable ou le wi-fi : 2% ont répondu très souvent, 15% assez souvent, 50% parfois et 31% jamais. Les ondes électromagnétiques en général, incluant les antennes, semblent constituer un sujet de préoccupation modérément présent, mais suffisant pour générer une activité de consultation significative chez la population des médecins généralistes. Toutefois ces études successives sembleraient indiquer une décroissance du nombre de consultation dédiées, tendance qui se confirmerait avec notre étude (tout en gardant à l'esprit que les autres études ne traitaient pas exclusivement des antennes-relais). a Société Française de RadioProtection 94 Figure 8 : résultat du sondage INPES : médecins déclarant être sollicités par leurs patients sur les risques ou les pathologies liés à l'environnement (en pourcentage) (Base : 752 médecins généralistes) Ouverture : les médecins généralistes face aux nouveaux enjeux environnementaux Revenons au sondage de l'INPES de 2012 Médecins généralistes santé- environnement (137). L'étude abordait la question de l'information sur les sujets touchant à l'environnement. Différents constats s'imposent à sa lecture. Tout d'abord, les généralistes ont bien conscience des problèmes posés par les enjeux environnementaux : 96 % d'entre eux sont d'accord (dont 54 % tout à fait d'accord) avec le fait que de nombreuses incertitudes existent sur les causes environnementales de certaines pathologies. D'ailleurs, 53 % des interrogés ont émis le souhait de suivre une formation continue en santé-environnement (137). Mais malgré cet intérêt, la formation initiale est comme nous l'avons dit souvent absente de leur cursus (seuls 5% des interrogés en auraient bénéficié) et la majorité des médecins s'estime mal informée sur les problèmes de santé liés à l'environnement (12% très mal et 59 % plutôt mal). Il en résulte que seuls 6 % se disaient tout à fait en mesure de fournir à leurs patients des informations sur le sujet, (49 % pensaient pouvoir le faire, 42 % ne se sentaient pas facilement en mesure de le faire et 3 % déclaraient ne pas du tout le faire). Ceci rejoint le constat de Baszanger (125) sur les inadéquations existant parfois entre la 95 formation originelle et ce à quoi le médecin généraliste est confronté lors de ses consultations (123). Par ailleurs, la recherche bibliographique dans ce domaine semble poser des problèmes : parmi l'échantillon interrogé par l'INPES, 71% estimaient les informations en matière de santé environnement souvent contradictoires. Pour s'informer sur le sujet, c'est la presse qui est citée le plus souvent (89% presse médicale et 57% la presse spécialisée). Le recours à ces sources et à Internet est d'autant plus important que les médecins ont été formés en santé- environnement. Quant aux non-formés sur le sujet, ils seraient plus sensibles que les autres aux informations diffusées par les médias généralistes que les autres (54 % vs 45 % ; p (137). Soixante-quinze pour cent jugent l'information scientifique fiable, 67 % la considèrent plutôt bien expliquée. Toutefois, 61 % estiment que cette information est insuffisante. Les angoisses de la population sur différents sujets liés à l'environnement, (angoisse d'autant plus forte qu'une incertitude scientifique existe ou qu'elle est nourrie par une sur- médiatisation) et les moyens donnés aux médecins généralistes pour y répondre ne semblent donc pas en cohérence. Que ce soit lors de leurs études ou plus tard, l'information scientifique peine à arriver jusqu'à eux. Or, les médecins généralistes, de par leur proximité avec les patients, ont un rôle à jouer en terme de prévention, de réassurance (si les données scientifiques le leur permettent), d'orientation et éventuellement d'alerte. Mais tout cela ne peut fonctionner que s'ils disposent des éléments nécessaires pour tirer les bonnes conclusions. Notre étude montre que sur ce sujet spécifique en lien avec l'environnement, ils ne sont pas armés pour apporter aux patients une réponse basée sur les données actuelles de la science. Les auteurs de l'étude INPES concluaient en donnant quelques pistes de réflexion pour améliorer ces points : développer de nouvelles formations en santé-environnement. rendre l'information plus accessible via une meilleure articulation entre les agences sanitaires, presse médicale, associations environnementales et associations de médecins. la création de consultations pluridisciplinaires faisant intervenir entre autres des médecins généralistes. Des consultations de toxicologie environnementale ont été par exemple ouvertes à Rouen et à Paris. Des progrès sembleraient souhaitables sur ces différents points. D'une part pour faciliter la communication avec le public, mais aussi pour ne pas laisser le médecin généraliste face à une incertitude qui parfois, peut être difficile à gérer. Caractéristiques de la population des médecins estimant les antennes dangereuses Parmi les 58 médecins estimant que les antennes pourraient représenter un danger (les résultats sont donnés versus ceux de la population restante) : - - - - 27 sont des femmes (46, 5% vs 45, 9%), 31 des hommes (53, 4% vs 48, 1%). 22 ont moins de 40 ans (37, 9% vs 60, 2%) 36 ont plus de 40 ans (62% vs 64%). 39 ont un exercice urbain (67, 2% vs 48, 5%), 7 un exercice semi-rural, 2 un exercice rural et 10 sont des remplaçants. 19 ont été confrontés au problème des antennes-relais au moins une fois en 96 consultation (32, 7% vs 7, 1%) Les données qui se détachent chez la population considérant les antennes comme dangereuses sont l'âge (la proportion de médecins de moins de 40 ans y est moindre), le type d'exercice (on y trouve davantage de médecins travaillant en milieu urbain) et surtout la confrontation antérieure avec le problème en consultation. Ces éléments auraient tendance à valider l'existence d'une influence de l'activité de consultation sur les perceptions des médecins généralistes : les médecins urbains semblent être davantage confrontés au problème (la densité en antennes étant supérieure en ville), ainsi que les médecins ayant le plus d'expérience. Plus ils y ont été confrontés en consultation, plus la perception de danger semble prégnante. Un médecin ayant croisé plusieurs cas serait sans doute plus sensibilisé au problème et potentiellement plus méfiant qu'un médecin n'ayant jamais constaté aucune demande particulière au sein de sa patientèle. Caractéristiques de la population informée Parmi les 108 personnes ayant cherché à s'informer sur le sujet (les résultats sont donnés versus ceux de la population restante) : 33, 3% estiment les antennes potentiellement dangereuses (vs 12, 1%) ; 18, 5% ne les croient pas dangereuses (vs 19, 8%) ; 48, 2% ont répondu qu'ils ne savaient pas (vs 65%). 73, 1% ont une activité urbaine (vs 40, 1%) ; 11, 1% une activité semi-rurale (vs 15, 4%) ; 0, 9% une activité rurale (vs 7, 1%) et 14, 1% sont des remplaçants (vs 37, 4%). 32 ont moins de 40 ans ( 32% vs 61, 5%), 76 ont plus de 40 ans (68% vs 38, 5%) 32 ont été confrontés au problème des antennes-relais au moins une fois en consultation (29, 6% vs 7, 1% chez les non informés) . - - - - La population informée travaille essentiellement en milieu urbain, et est globalement plus âgée que la population non informée : ces résultats sont en faveur d'une démarche d'information liée à une demande de la part des patientèles de ces médecins généralistes, validant une relation d'influence. Les médecins confrontés à une demande de leur patientèle chercheront plus que les autres à s'informer. Toutefois, la perception des antennes comme un potentiel danger y est plus fréquemment retrouvée que chez les non informés. Nos résultats concordent avec ceux de l'étude INPES (131) estimant l'information difficile d'accès et manquant de clarté. Par ailleurs, cet élément met en évidence le fait que non seulement la recherche bibliographique ne permet pas toujours de trouver des réponses, mais qu'elle peut ajouter à la confusion. La recherche bibliographique dans le cadre d'une autoformation, ne semble donc pas une réponse suffisante sur un sujet aussi complexe, du moins chez les médecins n'y ayant pas été formés. L'accès aux informations, leur sélection et leur compréhension sont loin d'être évidents, surtout dans un contexte d'emplois du temps surchargés et d'exigences de formation continue sur des domaines aussi variés qu'étendus. Quelles sources avez-vous utilisé pour vous informer ? Les réponses à cette question étaient libres. Sur les 108 personnes informées, 90 ont précisé leurs sources. 97 Nous avons divisé les réponses en quatre catégories : les MG ayant cité au moins une source dite scientifique (Presse médicale et scientifique, revues spécialisées, sites comme Pubmed ou Cismef) ; ceux ayant cité plusieurs sources parmi les médias grands publics sans avoir cité de source scientifique ou médicale (reportages télévisés, presse grand public, Internet) ; ceux n'ayant cité que Google ou Internet sans presse écrite, qu'elle soit médicale ou non ; ceux ayant utilisé des sources spécifiques à savoir : les conférences du professeur Belpomme (4), une formation au Val de Grâce (1) ; le site de l'INRS (1), le site de l'ASEF (2). Au moins une source médicale/scien tifique citée n (%) Pensent qu'elles sont dangereuses 10 (27) Médias grand public uniquement n (%) 15 (40, 5) Google ou Internet uniquement n (%) 8 (21, 6) Ne pensent pas qu'elles soient dangereuses 9 (5, 6) 3 (18, 8) 2 (12, 5) Sources spécifiques Total n (%) 4 (10, 8) (conférence Pr Belpomme : 3 ; site INRSa : 1) 2 (12, 5) (formation au Val de Grace : 1 ; site ASEFb : 1) n (%) 37 (100) 16 (100) 37 (100) Ne savent pas 8 (21, 6) 14 (37, 8) 13 (35, 1) 2 (5, 4) (cf Pr Belpomme : 1 ; site ASEF : 1) Total 27 (30) 32 (35, 6) 23 (25, 6) 8 (8, 9) 90 (100) Tableau 27 : Perception de la dangerosité des antennes en fonction des sources utilisées (n 90). Parmi les principales sources citées, les médias grands publics arrivent en tête (32 médecins soit 35, 6%) suivis par la presse médicale et scientifique (27 médecins soit 30%) et enfin internet ou Google sans précision (23 soit 25, 6%). On peut constater que le fait de n'utiliser que les sources dites grand public aurait plutôt tendance à aboutir à une conclusion de dangerosité ou à une absence de conclusion. Il en va de même pour une utilisation exclusive de source Google ou Internet. En revanche, l'emploi d'au moins une source dite médicale ou scientifique (selon l'interrogé) semble équilibrer les réponses, même si la perception de dangerosité arrive toujours en tête. Concernant les conférences du Pr Belpomme, cité nominativement à quatre reprises, il ne fait aucun mystère de son militantisme anti-ondes, il est donc cohérent que les médecins y ayant participé aient plutôt tendance à croire les antennes dangereuses. 98 Médecins généralistes : leurs sources Google ou internet ont été cité 43 fois, 23 fois sans autre source citée, 20 fois en complément d'une autre source. Plusieurs études ont déjà mis en avant ce plébiscite du moteur de recherche. Une étude quantitative de 2008 sur 137 médecins adhérents à l'Union Nationale des Associations de Formation Médicale et d'Évaluation Continues (UNAFORMEC) montrait que les sources d'information les plus citées par les MG étaient : les revues généralistes (105 médecins) - Google (103) - la HASa (88) - les livres (80) (126). Une thèse de 2016 (138) a passé en revue les données de la littérature sur la recherche documentaire des médecins généralistes et en sont ressortis les éléments suivants : jusqu'en 2005, les documents papiers, les congrès et séminaires et l'avis de confrères étaient privilégiés par rapport aux documents numériques. Des études récentes réalisées en France ont montré que les deux outils sont désormais utilisés de façon plus équitable. Dans une étude descriptive de 2010, rapportée dans cette même thèse et menée auprès de 85 médecins généralistes, les participants ont déclaré consulter par ordre de fréquence décroissante des sources Internet (38 %), un logiciel d'aide à la prescription (21 %), un confrère (21 %) et des sources papier (20 %). L'évolution technologique a donc modifié le rapport des médecins généralistes à la recherche bibliographique, et ce assez récemment. Le sujet de recherche de la thèse était d'évaluer quels étaient les sites consultés par le plus grand nombre de médecins. Étaient cités en premier les sites de revues médicales (60% des médecins), les sites grand public (53%), le site de l'assurance maladie (47%) et les sites des universités (47%). Google était le seul moteur de recherche utilisé par les médecins de l'enquête (139). Une étude de 2009 (140) a été réalisée afin de déterminer quelles étaient les sources internet les plus fréquemment utilisées par les médecins généralistes informatisés : Google était plébiscité par 89. 9% des médecins, 35. 6% avaient pour habitude d'utiliser des bases de données comme PubMed ou CISMeF et 2. 6% déclaraient avoir recours à d'autres ressources comme : Univadis, Prescrire , Bibliomed et les sites de la HAS et de l'ANSM. Dans une étude de 2011 (141) portant sur le même thème : les sites les plus utilisés étaient les suivants : Google, CISMeF, le Centre de Référence des Agents Tératogènes (CRAT), les répertoires de recommandations (HAS) et les sites des sociétés savantes et des universités. Enfin, dans une étude australienne de 2008 (142) auprès de médecins généralistes, le moteur de recherche Google était la source internet la plus utilisée, tous sites confondus. Les raisons évoquées étaient notamment l'accès permis vers d'autres sites de qualité, sa facilité d'emploi, et sa rapidité d'action. Notre étude recoupe donc les données existantes sur la forte utilisation d'internet et de Google au cours de la recherche bibliographique. L'utilisation de sites spécialisés n'a été signalée qu'à très peu de reprises (Cismef a été cité 1 fois, Pubmed 3 fois, INRS 1 fois, ASEF 2 fois et la HAS 1 fois). Le reste du temps, aucune précision n'était apportée. Une autre donnée est mise en évidence ici : les médecins ayant utilisé uniquement des médias grand public étaient plus nombreux que ceux ayant utilisé au moins une source dite médicale ou scientifique Ceci est inhabituel si on regarde la littérature, et tient probablement au caractère très médiatique du sujet. a Haute Autorité de Santé 99 Choix des sources, les conséquences Le choix des sources peut biaiser les résultats Sur une question médicale classique, la plupart des études ont montré que la littérature médicale prévaut généralement sur les autres sources (126, 128). Ce n'est pas le cas ici. Nous avons eu l'occasion de voir que les médias grands publics, sur le sujet des antennes-relais, ont plutôt tendance à choisir un angle alarmiste. Cette approche semble avoir une influence sur la population médicale. Comme cela a été démontré dans l'étude publiée dans la Public Library of Science (133) , les médias semblent ici exercer une influence négative sur les perceptions des médecins généralistes bien que leur formation antérieure soit censée les en prémunir. La forte utilisation de médias grands publics comme source d'information est un élément capital (ont été cités : la presse non médicale, les reportages télévisés ou radiophoniques essentiellement). Certains journalistes peuvent être limités par une connaissance insuffisante de la méthodologie scientifique, par un manque de temps, par la course au scoop et par la nécessité d'attirer l'attention brève du lecteur ou du téléspectateur et donc de faire court plutôt que de rédiger des dossiers argumentés (102). Ces limites sont responsables du sensationnalisme qui accompagne parfois l'information médicale, et cela d'autant plus que les études sont rapportées de manière isolée sans véritable suivi. Leur fiabilité est donc souvent sujette à caution (104). Ces informations, quelle que soit leur qualité, impactent le public, y compris les professionnels de santé. Le sujet des antennes-relais a ceci de particulier qu'il touche non seulement à la santé, mais réclame aussi des notions de physique, lointaines pour l'essentiel des médecins généralistes qui ont eu à apprendre entre-temps une somme importante de connaissances plus utiles à leur exercice quotidien. A cela s'ajoute un climat d'incertitude scientifique largement exploité par les détracteurs, et comme nous l'avons déjà expliqué, un climat de défiance envers une technologie à la fois indispensable et indésirable. Les sources d'informations choisies et l'état d'esprit dans lequel est mené la recherche peuvent s'avérer déterminants pour l'orientation des conclusions. Les informations disponibles sur le sujet sont tellement contradictoires qu'il est complexe de se forger un avis objectif. Chacun, s'il n'y prend pas garde, trouvera des arguments en apparence valables et semblant présenter le sérieux scientifique requis pour chaque hypothèse (à savoir, présentent- elles un danger pour la santé au vu des données actuelles de la Science, ou non). La presse médicale et scientifique présuppose une sélection en amont des articles et permettrait en théorie d'éviter les informations de trop faible niveau de preuve scientifique. Cela n'est toutefois pas garanti et certains articles, malgré un apparent sérieux scientifique ne disposent pas d'un bon niveau de preuve (l'exemple du rapport Bioinitiative). En 2016, en tapant antennes-relais sur le moteur de recherche du CISMeF, on peut obtenir 2 références : un rapport gouvernemental du COMOP (COmité OPérationnel) sur la faisabilité de l'abaissement des valeurs d'exposition (68) et le bulletin de l'Académie de Médecine de 2009 (46). Deux références seulement dont une comporte des éléments techniques propres à rebuter un médecin ne disposant d'aucune connaissance technique sur le sujet. Quant à Pubmed, la conjonction du vocabulaire technique non spécifique renvoyant à de nombreuses études sans rapport avec le sujet traité (le terme anglais antenna couvrant des domaines très variés) et l'utilisation de l'anglais (134) n'encouragent pas non plus à son utilisation. Google semble donc être le moteur de recherche qui sera le plus amené à être utilisé dans ce cas précis, surtout dans un contexte de manque de temps (134). Or, nous l'avons dit, le sujet 100 est clivant et les informations disponibles très nombreuses et contradictoires. Le fonctionnement de Google repose sur une diffusion des résultats par pertinence. Google indique que plus de 200 facteurs sont pris en compte pour l'évaluer. L'un de ces critères est le PageRank : celui-ci évalue l'importance d'une page en fonction des liens provenant d'autres sites et renvoyant à ladite page. En d'autres termes, tous les liens qui figurent sur d'autres sites et qui renvoient vers l'une de vos pages sont pris en compte pour établir le classement PageRank de votre site. Les fonctionnalités Google telles que les suggestions orthographiques et la saisie semi- automatique ont été conçues pour faire gagner du temps aux internautes en affichant les termes associés à la recherche, les fautes d'orthographe courantes et les requêtes les plus populairesa. Le nombre de citations renvoyant au site et sa popularité sont donc deux éléments clés dans l'ordre de présentation des résultats, et ce indépendamment de toute pertinence scientifique. Une recherche sur les antennes-relais non orientée par des mots-clés débouchera presque automatiquement sur l'affichage de sources les désignant comme dangereuses car ce sont les plus consultées, au détriment de sources moins alarmistes. La personne réalisant la recherche risque d'être influencée par cette sélection biaisée d'informations qu'on lui propose. Le sujet nous l'avons dit, engendre certaines craintes au sein de la population. Ces craintes vont se répercuter sur le référencement des sites en offrant une visibilité très importante aux titres alarmistes contenant des mots-clés suggestifs (comme danger, cancer, catastrophe sanitaire, etc. ), et une quasi-invisibilité aux propos des scientifiques, plus mesurés et moins accrocheurs. Pour donner un exemple, en 2016, le choix d'un mot-clé neutre comme antennes-relais induit les résultats suivants : trois premiers résultats neutres comportant des informations purement techniques (Cartoradio, ANFRb) ; les quatre résultats suivants conduisent vers des sites militants (Robin des toits et PRIARTEM) et des articles de presse grand public. Le site de l'ANSES (125) est actuellement le plus complet portant sur les risques environnementaux et publie régulièrement des mises à jour, mais aucune donnée sur son utilisation par les médecins généralistes n'est publiée. Aucun des médecins interrogé ne l'a cité parmi ses sources. Ces résultats amènent à deux conclusions. Le choix de la source est primordial et semble orienter les conclusions, en particulier sur ce sujet très médiatisé. Par ailleurs, le fait de privilégier les sources dites scientifiques ne garantit pas d'aboutir au résultat escompté, à savoir l'avis actuel rassurant des experts (absence de dangerosité démontrée des antennes). La recherche bibliographique réalisée par les médecins interrogés donne des résultats très hétérogènes et contrastés, à l'image des avis donnés par les différentes sources. Le problème est bidimensionnel : si la méthodologie risque d'être biaisée par le moteur de recherche lui-même, un a priori conscient ou non sur le sujet peut orienter la recherche dans un sens ou dans l'autre. Faute d'une vérification de la fiabilité des informations (et nous avons vu que celle-ci est loin d'être aisée), chaque camp dispose de suffisamment d'arguments d'apparence fiable pour conforter la position de départ. Un tri difficile. Dans notre étude, 30% des informés ont cité au moins une source médicale ou scientifique. Parmi eux les résultats sont répartis de la façon suivante : 10 pensent que les antennes sont dangereuses, 9 pensent qu'elles ne le sont pas et 8 n'ont pas répondu. Le résultat obtenu chez les médecins ayant utilisé ce type de sources est surprenant car la répartition est certes moins Comment fonctionne la recherche Google ? : a b Agence Nationale des Radio Fréquences 101 en faveur d'une dangerosité que dans les autres cas, mais l'opinion, attendue conforme à celle des rapports d'expertise, reste totalement divisée. La mauvaise visibilité des sources dites fiables semble en cause (rappelons que parmi les médecins interrogés, aucun n'a cité l'Académie de Médecine ou les rapports de l'ANSES, pourtant très complets parmi leurs sources). Le manque de temps disponible pour se former a pu pousser certains vers l'outil le plus accessible, à savoir un moteur de recherche classique comme Google, avec les problèmes de pertinence des références que cela implique. Nous retrouvons l'interférence des croyances et des représentations pré-existantes du médecin (effet de halo et biais de confirmation). Le choix des sources est donc déterminant, les plus fiables étant constituées par la presse médicale et scientifique et les rapports d'expert. Le choix d'Internet, de Google et des médias grand public semble avoir tendance à majorer les biais de jugement. En 2007, 83% des médecins généralistes interrogés déclaraient consacrer en moyenne 2, 6 heures par semaine à la lecture de la presse, de revues et d'articles médicaux (107). C'est peu au vu de la rapidité d'évolution des connaissances. On comprend donc que parfois le manque de temps puisse poser problème aux médecins. Dans une thèse réalisée en 2014 (134), une enquête a été menée afin de déterminer les obstacles à une recherche bibliographique rencontrés par les médecins généralistes. Les difficultés obtenues ont été classées en deux catégories : difficultés liées aux médecins : le manque de temps, l'âge avancé, la barrière de la langue (l'anglais étant la langue la plus largement utilisée dans les articles médicaux) mais surtout le manque de formation en recherche bibliographique. Le temps consacré à la recherche documentaire était plus important chez les médecins formateurs en FMIa ou en FMCb et les médecins à exercice particulier. difficultés liées aux sources d'information : existence de conflits d'intérêts, mauvaise ergonomie de certaines ressources, manque de pertinence de l'information et coût de l'accès à l'information. L'auteur a également réalisé des entretiens au cours desquels d'autres difficultés ont été citées : le sentiment d'invulnérabilité du médecin, la surabondance de données noyant l'information de qualité, les relations amicales, la confiance en la notoriété . Si ces difficultés n'ont pas été spécifiquement abordées au cours du questionnaire, deux médecins ont spontanément précisé sur le questionnaire papier ne pas avoir cherché à s'informer par manque de temps , ce qui rejoint les résultats de la thèse sus-citée. a Formation Médicale Initiale b Formation Médicale Continue 102 5. Conclusion et perspectives de l'étude L'objectif principal de cette étude était d'évaluer les représentations des médecins généralistes sur le sujet des antennes-relais, et de vérifier leur cohérence vis-à-vis des connaissances scientifiques actuelles. Parmi les interrogés, 61, 3% ne se sont pas prononcés, et 19, 5% les estiment dangereuses contre 19, 2% les jugeant inoffensives. Quatre ans après le précédent sondage de l'INPES, et malgré l'absence d'élément nouveau, la population des médecins généralistes semble toujours divisée, et cela malgré le fait que plus d'un tiers ait essayé de s'informer. Il existe donc une inadéquation entre leurs représentations et la littérature, pourtant rassurante en l'état actuel des connaissances. Le relais médiatique répété de discours sensationnalistes sur les effets sanitaires supposés des antennes-relais entretient un climat de doute voire de crainte dans la population générale. Malheureusement, les interventions des autorités compétentes sur le sujet ne bénéficient pas de la même visibilité. Les problématiques soulevées par les antennes-relais ne leurs sont pas propres. Nous pouvons les retrouver dans de nombreux secteurs technologiques. L'évolution de notre mode de vie nous expose à de nouvelles incertitudes portant sur des risques sanitaires potentiels. Les médecins généralistes risquent d'être de plus en plus sollicités par leurs patients pour ce type de problématiques environnementales, et ce alors que l'autoformation par une recherche bibliographique nécessite beaucoup de temps, des connaissances débordant du domaine médical et un choix judicieux de sources. Certaines incertitudes peuvent difficilement être levées lors d'une recherche bibliographique, c'est le cas ici. La formation initiale devrait être repensée non seulement en ce qui concerne les nouveaux enjeux environnementaux, mais également les bonnes pratiques de la recherche bibliographique, en dehors et dans un contexte de controverse sanitaire. Des formations médicales continues pourraient être mises en place afin de faire le point sur les connaissances actuelles des dangers environnementaux avec mises à jour régulières suivant la sortie de nouvelles conclusions d'experts. Le site de l'ANSES (143) constitue une bonne référence en ce qui concerne les dangers environnementaux mais semble bénéficier d'une visibilité limitée. Des plaquettes d'information ou de mise au point pourraient également être réalisées à destination des soignants et de leur patientèle, afin de favoriser les échanges et de rétablir le dialogue entre la recherche et la médecine de terrain. 103 Bibliographie 1. Mollier B, Tresse L. Qu'est-ce qu'une onde ? [Internet]. Unité Formation- Enseignement de l'Observatoire de Paris ; 2013. Disponible sur : 2. Université Rennes I. Éléments de physique du rayonnement [Internet]. Université Virtuelle Environnement et Développement durable ; 2008. Disponible sur : cours. univ-paris1. fr/modules/uved/envcal/html/rayonnement/1-rayonnement- electromagnetique/index. html. 3. Benson H. Physique : ondes, optique et physique moderne. Paris : De Boeck ; 1999. p. 34. 4. Kuban N. Les ondes électromagnétiques, innocuité ou réel danger pour la santé ? 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Aust Fam Physician. 2008 ; 37(6) : 471-4. 143. ANSES [Site web]. Disponible sur : 115 A nnexe 1 : effets biologiques des rayonnements électromagnétiques : grandeurs physiques caractérisant l'interaction onde / matière, en fonction de la fréquence Annexes Gamme de fréquences Grandeurs physiques Unités 0 - 1 Hz Induction magnétique pour les champs statiques (fréquence nulle Densité de courants pour les champs variables dans le temps Densité de courants 1 Hz - 100 kHz 100 kHz - 10 MHz Densité de courant et débit d'absorption spécifique 10 MHz - 10 GHz Débit d'absorption spécifique 10 GHz - 300 GHz Densité de puissance T (tesla) A/m2 A/m2 A/m2 W/kg W/kg W/m2 300 GHz Rayonnements ionisants Énergie des photons eV R a d i o f r é q u e n c e s Système cardiovasculaire / charges électriques Effets à l'origine des valeurs limites visant à prévenir les effets sanitaires S t i m u l a t i o n de surface - induction de mouvement champ électrique dans les tissus en Système nerveux central Système nerveux Système nerveux Stress thermique généralisé du corps Échauffement localisé m u s c u l a i r e É c h a u f f e m e n t Stress thermique généralisé du corps Échauffement localisé Tissus à la surface ou proches de la surface du corps Tissus à la surface ou proches de la surface du corps, réaction photochimique A : ampère T : tesla W : watt eV : électron-volt 116 Annexe 2 : Classification de l'OMS (Organisation Mondiale de la Santé) des substances cancérogènes. (dernière mise à jour en février 2016) Classe d'agents Critères de détermination du degré d'indication de risque pour l'homme et pour l'animal de laboratoire : principes généraux et particuliers de classement de l'agent dans le groupe Agent cancérogène pour l'homme (groupe1) 118 agents Agent probablement cancérogène pour l'homme (groupe 2A) 79 agents Principe général : Indications suffisantes de cancérogénicité pour l'homme. Exception : Indications pas tout à fait suffisantes pour l'homme associées à des indications suffisantes pour l'animal et à de fortes présomptions envers un mécanisme de cancérogénicité reconnu. Principe général : Indications limitées de cancérogénicité chez l'homme et suffisantes chez l'animal. Cas particulier : Indications insuffisantes pour l'homme et suffisantes pour l'animal associés à de fortes présomptions pour une cancérogénèse selon un mécanisme identique chez l'homme. Exceptions : - Seule base des indications limitées de cancérogénicité pour l'homme. - Appartenance de l'agent à une catégorie d'agents dont un ou plusieurs membres ont été classés dans le groupe 1 ou 2A. Agent peut-être cancérogène pour l'homme (groupe 2B) 290 agents Principe général (2 formes) : Forme 1 : Indications limitées de cancérogénicité chez l'homme et insuffisantes chez l'animal. Forme 2 : Indications insuffisantes chez l'homme et suffisantes chez l'animal. Cas particuliers : - Indications insuffisantes pour l'homme et insuffisantes pour l'animal cependant corroborées par des données sur les mécanismes notamment. - Seule base d'indications solides provenant de données sur les mécanismes. Agent inclassable quant à sa cancérogénicité pour l'homme (groupe 3) 501 agents Agent n'est probablement pas cancérogène pour l'homme (groupe 4) 1 agent (caprolactam) Principe général : Indications insuffisantes chez l'homme et insuffisantes ou limitées chez l'animal Exception : Indications insuffisantes pour l'homme et suffisantes chez l'animal associées à de fortes présomptions pour un mécanisme de cancérogénicité chez l'animal ne fonctionnant pas chez l'homme. Principe général : Indications suggérant une absence de cancérogénicité chez l'homme et chez l'animal de laboratoire. Cas particulier : Indications insuffisantes pour l'homme associés à des indications suggérant une absence de cancérogénicité pour l'animal et fortement corroborées par des données mécanistiques et d'autres données pertinentes. 117 Annexe 3 : le questionnaire Bonjour. Ce questionnaire concerne les antennes-relais de téléphonie mobile et non les émissions liées aux téléphones mobiles eux-mêmes. Les autres types de rayonnements électromagnétiques sont abordés dans la question 6. Il s'adresse aux médecins généralistes libéraux installés ou non. Merci de votre participation. 1- Quel est votre type d'exercice ? Rural Urbain Semi-rural Remplaçant 2- Dans quelle région exercez-vous ? 3- Année d'installation ? (si installé) 4- Sexe ? Femme Homme 5- Quel âge avez-vous ? 20-29 ans 30-39 ans 40-49 ans 50-59 ans 60 ans et plus 6- Depuis le début de votre exercice, avez-vous reçu des patients pour des plaintes qu'ils rattachaient aux ondes électromagnétiques en général ? Non Oui, pour des symptômes Oui, pour des questions s'y rapportant Oui pour les deux 7- Si vous avez répondu oui pour des symptômes, merci de préciser le nombre de patients : 8- Si vous avez répondu oui pour des questions, merci de préciser le nombre de patients : 9- Depuis le début de votre exercice, avez-vous reçu en consultation des patients pour des plaintes qu'ils rattachaient à une exposition à des antennes-relais ou pour un questionnement sur leurs dangers potentiels ? Non Oui, pour des symptômes Oui, pour des questions s'y rapportant. Oui pour les deux 10- Si vous avez répondu oui pour des symptômes, merci de préciser le nombre de patients : 11- Si vous avez répondu oui pour des questions, merci de préciser le nombre de patients : 12- Avez-vous déjà essayé de vous informer sur le sujet ? Oui Non 13- Que savez-vous de la dangerosité des antennes-relais ? Oui, je pense qu'elles sont dangereuses. Non, je ne pense pas qu'elles représentent un danger. Je ne sais pas. 14- Si vous avez répondu oui, quelle(s) source(s) avez-vous utilisé pour vous former ? 15- SI VOUS AVEZ REPONDU NON, pensez-vous que vous chercherez à vous informer sur le sujet suite à ce questionnaire ? Oui Non 118 Serment d'Hippocrate Au moment d'être admise à exercer la médecine, je promets et je jure d'être fidèle aux lois de l'honneur et de la probité. Mon premier souci sera de rétablir, de préserver ou de promouvoir la santé dans tous ses éléments, physiques et mentaux, individuels et sociaux. Je respecterai toutes les personnes, leur autonomie et leur volonté, sans aucune discrimination selon leur état ou leurs convictions. J'interviendrai pour les protéger si elles sont affaiblies, vulnérables ou menacées dans leur intégrité ou leur dignité. Même sous la contrainte, je ne ferai pas usage de mes connaissances contre les lois de l'humanité. J'informerai les patients des décisions envisagées, de leurs raisons et de leurs conséquences. Je ne tromperai jamais leur confiance et n'exploiterai pas le pouvoir hérité des circonstances pour forcer les consciences. Je donnerai mes soins à l'indigent et à quiconque me les demandera. Je ne me laisserai pas influencer par la soif du gain ou la recherche de la gloire. Admise dans l'intimité des personnes, je tairai les secrets qui me seront confiés. Reçue à l'intérieur des maisons, je respecterai les secrets des foyers et ma conduite ne servira pas à corrompre les mœurs. Je ferai tout pour soulager les souffrances. Je ne prolongerai pas abusivement les agonies. Je ne provoquerai jamais la mort délibérément. Je préserverai l'indépendance nécessaire à l'accomplissement de ma mission. Je n'entreprendrai rien qui dépasse mes compétences. Je les entretiendrai et les perfectionnerai pour assurer au mieux les services qui me seront demandés. J'apporterai mon aide à mes confrères ainsi qu'à leurs familles dans l'adversité. Que les hommes et mes confrères m'accordent leur estime si je suis fidèle à mes promesses ; que je sois déshonorée et méprisée si j'y manque. 119 120 R É SUM É TITRE Les médecins généralistes face aux questionnements suscités par les antennes-relais de téléphonie mobile. INTRODUCTION Durant les dernières décennies, les télécommunications ont connu une forte expansion, qui s'est traduite entre autres par des implantation massives d'antennes-relais sur l'ensemble du territoire. Celles-ci semblent toujours cristalliser autour d'elles de nombreuses tensions, bien que la littérature disponible sur le sujet soit rassurante. MATERIEL ET METHODE Une enquête transversale descriptive a été menée de janvier à mai 2016 parmi des médecins généralistes libéraux installés et remplaçants de différentes régions. Un questionnaire leur a été envoyé par courrier et par internet. L'objectif était d'évaluer les perceptions des médecins généralistes sur ce sujet, et vérifier leur adéquation avec les données scientifiques disponibles. La question de leur information a également été abordée. RESULTATS 297 réponses ont été incluses. 19, 5% des interrogés pensent que les antennes-relais pourraient représenter un danger pour la population, 19, 2% les estiment sans danger et 58, 9% ont répondu qu'ils ne savaient pas. 36, 4% des interrogés avaient déjà cherché à s'informer sur le sujet. 15, 5% ont déjà été confrontés au moins une fois au problème en consultation. CONCLUSION Il existe une inadéquation entre les données scientifiques disponibles et les représentations des médecins généralistes sur le sujet des antennes-relais, et ce malgré un intérêt pour le sujet et une volonté de s'informer. TITLE General practionners face the questioning about mobile-phone relay masts. INTRODUCTION In recent decades, telecommunications have quickly expanded, which, among others things, resulted in a massive implantation of relay masts on the whole territory. Although the available litterature on the subject is reassuring, those masts still center many tensions. MATERIAL AND METHOD A descriptive cross-sectional survey was conducted from January to May 2016 among both installed and substitutes general practitioners from differents regions. A questionnaire was sent to them by mail and internet. The aim was to evaluate the general practitioners' perceptions of this topic, and their consistency with the available scientific data. The question of how informed they were was also discussed. RESULTS 297 responses were included. 19. 5 % of respondents believed that the masts could represent a danger for the population, 19. 2 % considered them safe and 58. 9 % said they did not know. 36, 4 % of respondents had already sought for information on the subject. 15, 5 % met the problem at least once during a consultation. CONCLUSION There is a mismatch between the available scientific data and the representations general practitioners have on the subject of masts, despite an interest in the subject and a willingness to learn. DISCIPLINE : Médecine générale MOTS-CLES : Antennes-relais ; médecins généralistes ; questionnements ; représentations ; information Relay masts ; general practitionners ; perceptions ; information 121 122 | HAL | Scientific |
Déterminer la durée de réponse . | ESSAI | Clinical |
La vaccination antigrippale : renforcement de son efficacité par association d'une immunostimulation | WMT16 | Scientific |
Les variations de l'uricémie dans les décompensations respiratoires aigus des bronchopneumopathies chroniques | WMT16 | Scientific |
Ecto-parasitoses cutanées : les pédiculoses. Etiologie, épidémiologie, diagnostic, traitement | WMT16 | Scientific |
Argumentaire 1 : prise en charge diagnostique de la migraine et évaluation du handicap chez l'adulte et chez l'enfant | WMT16 | Scientific |
24 heures Ne préparer que la quantité d'eau de boisson médicamenteuse nécessaire pour couvrir les besoins journaliers. | EMEA_V3 | Medicinal |
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Analyse des propriétés antivirales des lymphocytes T Vgamma9Vdelta2 humains : potentiel immuno-thérapeutique au cours des infections par le cytomégalovirus humain Charline Daguzan To cite this version : Charline Daguzan. Analyse des propriétés antivirales des lymphocytes T Vgamma9Vdelta2 humains : potentiel immuno-thérapeutique au cours des infections par le cytomégalovirus humain. Immunologie. Université Paul Sabatier - Toulouse III, 2015. Français. NNT : 2015TOU30241. tel-01391086 HAL Id : tel-01391086 Submitted on 2 Nov 2016 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. Université Toulouse 3 Paul Sabatier (UT3 Paul Sabatier) Charline DAGUZAN le mardi 15 décembre 2015 Analyse des propriétés antivirales des lymphocytes T V 9V 2 humains : Potentiel immuno-thérapeutique au cours des infections par le Cytomégalovirus humain et discipline ou spécialité ED BSB : Immunologie INSERM U1043 CPTP Dr. Eric CHAMPAGNE Jury : Dr. Julie DECHANET-MERVILLE, rapportrice Dr. Philippe CLEZARDIN, rapporteur Dr. Emmanuel SCOTET, rapporteur Pr. Denis HUDRISIER, examinateur Dr. Eric CHAMPAGNE, directeur de thèse UNIVERSITE PAUL SABATIER TOULOUSE III ECOLE DOCTORALE BIOLOGIE-SANTE-BIOTECHNOLOGIE 2015 THESE Pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE TOULOUSE III Spécialité IMMUNOLOGIE ET MALADIES INFECTIEUSES Charline DAGUZAN Analyse des propriétés antivirales des lymphocytes T V9V2 humains : Potentiel immuno-thérapeutique au cours des infections par le Cytomégalovirus humain Directeur de thèse Dr. Eric CHAMPAGNE Rapporteurs Dr. Philippe CLEZARDIN Dr. Julie DECHANET-MERVILLE Dr. Emmanuel SCOTET 1 2 REMERCIEMENTS Tout d'abord, je tiens à remercier les membres de mon jury de thèse : Les rapporteurs, le Dr Philippe Clézardin, le Dr Julie Déchanet-Merville et le Dr Emmanuel Scotet ainsi que le président du jury, le Pr Denis Hudrisier. Je vous remercie pour l'attention que vous avez portée à ce travail. Ensuite, je tiens à remercier l'ensemble des membres de l'équipe 8 : Eric Champagne, comme tu l'as dit, nous avons eu des hauts et de nombreux bas dans nos recherches, mais dans l'ensemble la mission a été accomplie et le travail publié ! Merci pour m'avoir fait confiance durant ces trois années et pour m'avoir laissé une grande autonomie dans ce projet. Je te souhaite beaucoup de réussite dans tes projets futurs. Christian Davrinche, je vous remercie de m'avoir permis de réaliser cette thèse au sein de votre équipe. Merci pour votre accueil si chaleureux et l'intérêt que vous avez porté à mon travail. Surtout, je tiens à vous remercier pour votre optimisme et vos encouragements même face à des résultats pas toujours positifs. J'en profite pour vous souhaiter une bonne retraite bien méritée ! Je tiens à remercier l'ensemble des chercheurs et professeurs de l'équipe qui m'ont toujours donné de bons conseils pour mener à bien ce projet : Elmostafa Bahraoui, Stéphane Chavanas, Faouzi Lakhdar-Ghazal. Un grand merci à Nabila Jabrane-Ferrat, pour ses conseils scientifiques mais également pour l'énorme soutien qu'elle m'a apporté durant cette dernière année de thèse. Hélène, merci pour tout ! Je te remercie pour tous tes bons conseils techniques, pour ton écoute et ton soutien au quotidien. Merci aussi pour tous ces moments détentes et de rigolades ! Grâce à toi, j'ai remis à jour ma culture générale sur la variété française des années 80 (Nostalgie ). Je remercie également les doctorants actuels du laboratoire. Jordi et Hugo, je vous remercie d'avoir fermé les PSM en fin de journée quand j'en avais encore besoin ! Non blague à part, c'était très agréable de discuter et travailler avec vous. Maude, merci pour ces danses improvisées dans le labo (mais attention avec gants et blouses bleues de rigueur), et tes anecdotes bien marrantes. Je vous souhaite à tous les trois beaucoup de réussite et de publications scientifiques pour la suite, ainsi qu'à la nouvelle arrivée Qian. Bien évidemment, durant 3 ans de thèse, on est amené à croiser les chemins d'autres personnes. Ainsi, je tiens à dire merci aux ex-membres de l'équipe 8 qui ont été présents à un moment donné durant ma thèse : Un énorme merci à ma collègue ex-thésarde Emeline ! J'ai adoré nos nombreuses discussions professionnelles mais aussi culinaires et autres. Je te remercie aussi pour avoir répondu à mes nombreuses questions pratiques sur la préparation de la soutenance ! C'était un plaisir de t'avoir à côté durant cette thèse 3 Je remercie également ma collègue de PSM Frédérique, en particulier pour sa bonne humeur légendaire ! Elle est même capable de venir au labo à 4h du matin avec le sourire c'est pour vous dire. Dans la catégorie des ex-thésards, je remercie également Johan. Merci pour tes nombreux bons conseils, mais aussi tes cours d'histoire (surtout sur Eisenhower, le 34e président des Etats-Unis, né le 14 octobre 1890). C'était vraiment un plaisir de t'avoir rencontré durant cette thèse ! Rémi, je te remercie également et te souhaite bonne chance pour la suite. Merci également à Bernard Mariamé, pour tout ce qu'il m'a appris en biologie moléculaire et également pour nos discussions sur nos Pyrénées à nous. Je remercie aussi Morgane et Manutea à qui je souhaite bonne chance pour la suite. Enfin, je remercie également tous les membres de l'équipe qui sont à l'IFB. Je tiens également à remercier les stagiaires qui ont travaillé sur ce projet. Un grand merci à Manon, malgré la tragique expérience des 70 tubes FACS étalés au sol (Désolé tu as tellement bien travaillé durant ton stage qu'il fallait bien que je parle de cette histoire ! ). Je te souhaite beaucoup de bonheur et réussite pour ta thèse à Clermont-Ferrand, tu le mérites vraiment. Merci également à Elodie à qui je souhaite bonne chance pour la suite. Le travail au CPTP ne peut fonctionner sans les services communs. Ainsi je remercie le service technique, le magasin, la gestion Un merci tout particulier à Aline pour sa gentillesse et sa générosité avec toutes ses petites sucreries qui tombent toujours à pic ! Grâce à toi mon cerveau a pu avoir son apport en glucose nécessaire pour fonctionner. Durant ces 3 ans, j'ai eu la chance de pourvoir être monitrice à l'Université. Ainsi je remercie sincèrement Denis et Cécile pour m'avoir permis de réaliser cette expérience extrêmement enrichissante. Bien évidement cette thèse n'aurait pas été la même sans la M2R Team ! Un énorme merci à notre gersois Lilian ! Est-ce que vraiment j'en serai arrivé là sans toi ? Tu as toujours su bien me conseiller, me remotiver et m'encourager. On se connait depuis maintenant de nombreuses années : de la licence au doctorat : 1er stage découverte en L2 ensemble au CPTP M2R ensemble obtention de la bourse de thèse ensemble monitorat ensemble (désolé, mais je ne te suis pas au Canada, mais je viendrais en touriste bien sûr ! ). Je me rappelle encore de toi en TD de physio, tu étais le seul à comprendre le prof par moment Par contre, comprendre comment prendre un rond-point, ça c'est plus difficile En tout cas, que de bons moments ensemble. C'était cool de partager ça avec un gersois qui répond (avec l'accent de chez nous) Pareil ! quand on lui propose un café Mais surtout, qui se rend vite dispo pour le prendre ! Je te souhaite que du bonheur pour la suite au Canada et à ton retour également. Je suis convaincue que tu feras un EXCELLENT chercheur plus tard. Un énorme merci à notre blonde charentaise, Emilie ! Grâce à toi : je sais maintenant designer des primers, j'ai découvert le Ragga Dancehall, et j'ai découvert également ta région, la Charente Maritime, à travers les paysages et ton patois étrange, je connais tous les sondages bizarres sur les français, j'aime presque les bouledogues français C'était un plaisir de partager cette expérience avec toi car, pour une si petite personne, tu as plein de qualités 4 humaines et juste un seul petit, tout petit défaut : . Mais à la fois, ce trait de ta personnalité nous a quand même permis de bien rire ! Je te souhaite beaucoup de réussite et de bonheur pour la suite sur le plan professionnel car tu les mérites vraiment. Un énorme merci à notre rousse (ou blond vénitien ? ) Laure ! Merci pour me comprendre quand on prend une photo et que je dis : non pas de profil ! . Je te remercie aussi d'avoir accepté de faire du squash avec moi et de continuer malgré que je ne sois plus au labo. Merci aussi pour ton écoute quand j'avais un souci et pour avoir été toujours présente pour faire les montages vidéo malgré l'heure. Alors maintenant, tu finis ton article, tu écris ta thèse, tu trouves un super post-doc à un endroit o je peux venir te voir, et tu reviens avec de gros papiers scientifiques ! Un énorme merci à notre petite (sauveuse de vie) Fanny ! Merci pour tes pâtisseries, à toi et à Hervé, toutes les plus gourmandes les unes que les autres. Je te remercie pour ces bons moments de rigolades la journée et le soir ! Merci d'avoir partagé avec moi cette question : Pourquoi rentrer maintenant ? . Je te souhaite également beaucoup de réussite pour la suite sur tous les plans ! Un énorme merci à notre maman du groupe, Claire ! Merci pour avoir joué les taxis quand j'avais soit un plâtre, soit une atèle Je te remercie aussi pour toute la compassion que tu avais quand je t'écrivais : c'est horrible ça fait une heure que je suis dans les bouchons Je te souhaite beaucoup de réussite et de bonheur pour la suite avec ta petite choupinette et ton mari ! Enfin je tiens à remercier tous les personnes avec qui j'ai pu discuter au sein du CPTP, allant de l'étage vert (équipe DGD, équipe JCG) au bâtiment F (les plateformes de cytométrie et microscopie). Il y en a un, dont je ne me rappelle pas le nom et qui, je crois, à gagner un prix à la SFI (Mathias, Mathieu ou Régis ? ) Enfin je tiens à remercier mes amis, ma famille et ma belle-famille pour leur soutien et leurs encouragements. Un merci tout particulier pour ma maman et ses accents circonflexes ! Pour terminer, un énorme merci à Mika. Tu m'as toujours soutenue, encouragée et surtout tu as cru en moi, depuis le tout début de mes études, alors MERCI. Je te remercie également pour m'avoir bien fait changer les idées les week-ends de cette dernière année de thèse en me proposant des activités ludiques telles que la maçonnerie, la pose d'une charpente, l'étanchéité Un grand MERCI à toi et notre MOB ! Cela m'a permis de me rendre compte que construire une maison ressemble fortement à un doctorat : on élabore un plan de travail, au fur et à mesure on l'améliore, parfois on se heurte à un problème (comme lorsqu'on trouve des gros cailloux dans le sable avec lequel on veut faire un crépi, ou bien qu'on veut étudier la latence du HCMV), on trouve une solution (enlever les cailloux, étudier plutôt l'infection productive du HCMV) et au final, le papier est publié et la maison sur pied ! 5 6 SOMMAIRE RESUME . 10 ABSTRACT . 11 ABREVIATIONS . 12 FIGURES ET TABLEAUX . 14 INTRODUCTION . 15 CHAPITRE 1 : LES LYMPHOCYTES T GAMMA DELTA . 17 I. Les lymphocytes T . 18 A. Généralités . 18 1. Découverte des T . 20 2. Différentes populations de T chez l'Homme et la souris. 20 B. Répertoire des T . 21 C. Distribution tissulaire des T . 23 Modalités d'activation des T . 24 D. 1. De multiples antigènes détectés . 24 2. Régulation de l'activation . 26 E. Fonctions effectrices des T . 28 1. Activité cytotoxique . 28 2. Sécrétion de cytokines . 28 II. Les lymphocytes T V9V2 . 30 A. Composés activant les lymphocytes T V9V2 . 30 1. Rôle majeur des Phosphoantigènes . 30 a) Nature des Phosphoantigènes . 30 b) Origine des Phosphoantigènes . 31 2. Phosphoantigènes synthétiques . 33 3. Les Aminobisphosphonates . 34 a) Utilisation thérapeutique des bisphosphonates . 34 b) Utilisation des ABP dans certaines pathologies cancéreuses . 37 c) Traitement ABP : mode d'activation des T V9V2 . 37 4. Les Alkylamines . 38 B. Mécanismes d'action des Phosphoantigènes . 38 1. L'ecto-F1-ATPase . 39 2. La Butyrophiline . 40 a) Modèle allostérique . 42 b) Modèle de présentation antigénique . 43 a) 3ème modèle . 43 Régulation de l'activation des T V9V2 . 44 1. NKR . 45 a) NKR inhibiteurs . 45 b) NKR activateurs . 45 2. TLR . 46 3. Fc Récepteurs (FcR) . 47 C. 7 D. A. B. 3. 4. 1. 2. 4. Molécules d'adhérence . 47 Fonctions effectrices des TV9V2 . 49 1. Immunité anti-tumorale . 49 2. Rôle des T V9V2 face à des virus . 52 a) Coronavirus . 52 b) VIH . 52 c) HCV . 53 d) Virus de la grippe . 54 e) EBV . 54 CHAPITRE 2 : LE CYTOMEGALOVIRUS HUMAIN . 57 I. Généralités sur le HCMV . 58 A. Généralités . 58 1. Historique . 58 2. Classification . 59 B. Epidémiologie . 60 Pathologies associées aux infections HCMV . 62 C. Infection d'individus sains immunocompétents . 62 Infection d'individus immunodéprimés . 62 a) Personnes transplantées d'organe solide . 62 b) Personnes transplantées de cellules souches hématopoïétiques . 62 c) Personnes infectées par le VIH. 63 Infection congénitale et néonatale . 63 Implication dans le cancer ? . 65 D. Traitements actuels et vaccination . 65 E. HCMV et immunosénescence . 66 F. Biologie du HCMV . 68 1. Structure . 68 a) Le génome viral . 68 b) La capside . 69 c) Le tégument. 69 d) L'enveloppe virale . 69 2. Cycle viral : Réplication et assemblage . 70 3. Infection latente et réactivation . 72 4. Les différentes souches virales HCMV . 74 II. Réponses immunitaires anti-HCMV . 75 Immunité innée . 75 1. Reconnaissance du CMV via les PRR. 76 2. Les cellules NK . 77 3. Les lymphocytes T . 79 Immunité adaptative . 82 1. Réponses humorales . 82 2. Réponses cellulaires . 83 a) Les lymphocytes T CD8 . 84 b) Les lymphocytes T CD4 . 85 c) Les lymphocytes T régulateurs . 86 III. Mécanismes d'échappement du HCMV au système immunitaire . 88 A. Echappement virale à l'immunité innée . 88 1. Modulation des récepteurs inhibiteurs des cellules NK . 88 8 2. Modulation des récepteurs activateurs des cellules NK . 89 Immunité adaptative : modulation de la présentation antigénique . 90 1. Baisse d'expression du CMH-I . 90 2. Baisse d'expression du CMH-II . 91 Intérêt physiologique . 92 3. Latence du HCMV . 93 B. C. OBJECTIFS DU PROJET . 95 RESULTATS . 99 PUBLICATION SOUMISE EN JUILLET 2015 . 101 RESULTATS SUPPLEMENTAIRES . 139 DISCUSSION ET PERSPECTIVES . 145 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES . 155 9 RESUME Le traitement de cellules par des aminobisphosphonates (ABP) induit une accumulation intracellulaire de molécules activatrices des lymphocytes T V9V2 (IPP, ApppI). Alors que ces lymphocytes ne semblent pas naturellement activés lors d'une infection par le cytomégalovirus humain (HCMV), le laboratoire a mis en évidence l'existence d'une action synergique entre le HCMV et les ABP sur leur activation. Ma thèse a eu pour objectif d'analyser le mécanisme de cette synergie et d'évaluer le potentiel immuno-thérapeutique des ABP dans le cadre d'une infection HCMV. Nous avons montré qu'après sensibilisation par des ABP in vitro, des cellules infectées sont fortement activatrices des T V9V2. Les fibroblastes traités par des ABP activent la production d'IFN- par les T V9V2 mais pas la production de TNF. L'infection de ces fibroblastes par le HCMV induit une augmentation de la production d'IFN- et stimule la production de TNF par des T V9V2. Cette activation a été observée avec des lymphocytes T V9V2 établis en lignées cellulaires mais aussi avec des cellules V9V2 isolées directement de sang périphérique. De plus, cette augmentation de production de cytokines est observée avec différentes souches virales (souche de laboratoire et isolats cliniques) et différents types cellulaires permissifs pour HCMV. Nous avons également montré que l'infection par le HCMV entraine une surproduction d'IPP et d'ApppI dans les cellules cibles traitées aux ABP, ce qui explique en partie l'augmentation de la sécrétion de cytokines par les T V9V2. Enfin, nous avons mis en évidence que ces T V9V2 sont capables de limiter la réplication et la production virale suite à un traitement par des ABP, tout en préservant les cellules non infectées. Selon nos études, cette activité antivirale implique la production des cytokines IFN- et TNF et non l'activité cytotoxique des T V9V2. Par conséquent, mes travaux de thèse fournissent une preuve de concept pour une application thérapeutique des ABP dans le cadre d'une infection par le HCMV. 10 ABSTRACT Aminobisphosphonates (ABP) treatment of cells induces intracellular accumulation of molecules (IPP, ApppI) which stimulate human V9V2 T cells. Although these lymphocytes do not appear naturally activated during human cytomegalovirus (HCMV) infection, the laboratory demonstrated a synergistic effect of HCMV and ABP on V9V2 T cell activation. My PhD thesis aimed to analyze the mechanism of this synergy and evaluate the immunotherapeutic potential of ABP in the context of HCMV infection. After ABP treatment of cells in vitro, we showed that HCMV-infected cells strongly activated V9V2 T cells. ABP-treated fibroblasts activate V9V2 T cells to produce IFN- but not TNF. The HCMV infection of these fibroblasts stimulates TNF secretion and an increased production of IFN-, indicating that V9V2 cells can sense HCMV infection. Increased cytokine production was observed with V9V2 T cell lines and fresh V9V2 directly isolated of blood. Moreover, V9V2 T cell activation was observed with most HCMV strains (laboratory strains or clinical isolates) and different HCMV-permissive cells. We also showed that HCMV infection induces an overproduction of IPP and ApppI in ABP-treated cells, which explains in part the increased cytokine production by V9V2 T cells. At last, we demonstrated the capacity of V9V2 T cells to limit viral replication and production after ABP treatment while preserving uninfected cells. Our experiments indicate that this antiviral activity involves IFN- and TNF secretion by V9V2 T cells but not their cytotoxicity activity. Consequently, my work provides a proof of concept of the therapeutic potential of ABP in the context of HCMV infection. 11 ABREVIATIONS ABP : Aminobisphosphonates ApppI : Gamma-P-(3-méthyl-but-3-en-1-yl)-5'-adénosine disodium triphosphate BP : Bisphosphonates BTN : Butyrophiline CMH : Complexe Majeur d'Histocompatibilité (de classe I ou II) DETC : Cellule T dendritique épidermique DMAPP : Dyméthylallyl pyrophosphate DNAM-1/CD226 : DNAX accessory molecule-1 DOXP : 1-désoxy-D-xylulose-5-phosphate EBV : virus d'Epstein-Barr EGFR : Récepteur du facteur de croissance épidermique ELISA : Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay EPCR : Endothelial protein C receptor FcR : Récepteur au Fc des immunoglobulines FPPS : Farnésyl Pyrophosphate Synthase gB : glycoprotéine B HCMV : Cytomégalovirus humain HCV : Virus de l'hépatite C HDMAPP/ HMBPP : Hydroxy-diméthylallyl pyrophosphate /(E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate HLA : Human leukocyte antigen HSPG : protéoglycanes à héparane sulfate ICAM : Intercellular adhesion molecule 1 IE : Immediate Early IFN : Interféron Ig : Immunoglobulines ILT2/LIR-1 : immunoglobuline like transcript 2 IPP : Isopentenyl-pyrophosphate KIR : Killer-cell immunoglobulin-like receptors LFA-1 : Lymphocyte function-associated antigen 1 12 MCMV : Cytomégalovirus murin MEP : Méthylérythritol phosphate MIC : Major histocompatibility complex class I-related chain A MIEP : promoteur Major Immediate Early Promotor MVA : Mévalonate NABP : Non-aminobisphosphonate NCR : Natural cytotoxicity receptors NK : cellules Natural Killer NKR : Natural Killer Receptor ORF : Open Reading Frame P-Ag : Phosphoantigènes PAMP/DAMP : Pathogen/Damage Associated Molecular Patterns PBMC : Peripheral Blood Mononuclear Cells PRR : Pattern Recognition Receptors RE : Réticulum Endoplasmique SIDA : syndrome de l'immunodéficience acquise T : Lymphocytes T conventionnels T : Lymphocytes T T CD4 : Lymphocytes T CD4 T CD8 : Lymphocytes T CD8 T V2neg : lymphocytes T V2 négatives T V9V2 : lymphocytes T V9V2 TCR : T Cell Receptor (récepteur T à l'antigène) Th : Lymphocytes T helper TLR : Toll-Like Receptors TNF : Tumor Necrosis Factor TRAIL : TNF-related apoptosis-inducing ligand TUBag : Tuberculosis Antigen UL : Région longue unique du HCMV ULBP : UL16 binding protein US : Région courte unique VIH : Virus de l'Immunodéficience Humaine 13 FIGURES ET TABLEAUX Figure 1 : Les T sont à l'interface entre l'immunité innée et adaptative Figure 2 : Structure tridimensionnelle du TCR Figure 3 : Reconnaissance d'une cellule cible par les T Figure 4 : Les différents profils cytokiniques des T Figure 5 : Structures des Phosphoantigènes naturels Figure 6 : Les voies de biosynthèse du cholestérol DOXP/MEP et MVA induisent une production de P-Ags. Figure 7 : Structures des Phosphoantigènes synthétiques Figure 8 : Structures des aminobisphosphonates Figure 9 : Voie du mévalonate Figure 10 : Modèle hypothétique d'activation des T V9V2 Figure 11 : Structure de la BTN3 Figure 12 : Les différents modèles proposés impliquant la BTN3A1 dans l'activation des T V9V2 Figure 13 : Les différents récepteurs impliqués dans la régulation de l'activation des T V9V2 Figure 14 : Stratégies d'immunothérapie anticancéreuse utilisant les T V9V2 Figure 15 : Inclusions nucléaires de fibroblastes infectés Figure 16 : Manifestations cliniques d'une infection HCMV Figure 17 : Le HCMV Figure 18 : Mécanisme d'entrée du HCMV par fusion membranaire Figure 19 : Cycle viral lytique du HCMV Figure 20 : Régulation de la réactivation et de la latence par des mécanismes épigénétiques Figure 21 : L'activation des TLR par les herpesvirus Figure 22 : Effets directs et indirects des T V2neg induit lors d'une infection par HCMV, in vivo et in vitro Figure 23 : Contrôle du HCMV par l'immunité innée et adaptative Figure 24 : Reconnaissance de protéines HCMV par les cellules NK Figure 25 : Diminution d'expression des ligands du NKG2D par UL16 Figure 26 : Diminution d'expression des molécules de CMH-I par le HCMV Figure 27 : Effets majeurs des immunoévasines du HCMV Figure 28 : Rôle de la BTN3A1 dans l'activation des T V9V2 suite à une infection HCMV Figure 29 : Expression de la BTN3A1 sur des fibroblastes MRC-5 infectés par HCMV Figure 30 : Sécrétion de cytokines par les T V9V2 en présence de cellules infectées et chargées en HDMAPP Figure 31 : Quels sont le ou les signaux induits par l'infection HCMV, en synergie avec le traitement ABP, qui sont nécessaires à l'activation des T V9V2 ? Tableau 1 : Nomenclature des lymphocytes T murins et humains Tableau 2 : TCR et des lymphocytes T murins et humains : Tableau 3 : Distribution des différentes populations de T chez la souris et chez l'Homme Tableau 4 : Les différents ligands des T humains et murins Tableau 5 : Classification des Herpesvirus 14 INTRODUCTION 15 16 CHAPITRE 1 : Les lymphocytes T 17 I. Les lymphocytes T A. Généralités Lors de l'intrusion d'un agent pathogène dans l'organisme, une réponse immunitaire innée se met rapidement en place, faisant intervenir des cellules présentes sur le site infectieux. Durant les jours suivant cette infection, une réponse adaptative se développe faisant intervenir des lymphocytes B ainsi que des lymphocytes T, présents dans les organes lymphoïdes drainant le site infectieux. Ces lymphocytes ainsi activés ont pour particularité d'être spécifiques d'antigènes présents sur l'agent pathogène. Il existe différentes sous-populations de lymphocytes T : les lymphocytes T dits conventionnels exprimant un TCR (T ) et les lymphocytes T dits non conventionnels . Les lymphocytes T conventionnels reconnaissent des peptides antigèniques présentés par des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) classiques de classe I (CMH-I) ou II (CMH-II) et expriment les corécepteurs CD4 ou CD8 respectivement. Ces cellules sont les lymphocytes T CD4 (T CD4 ) qui sécrètent des cytokines modulant l'activité d'autres cellules immunitaires, et les lymphocytes T CD8 (T CD8 ) ayant des propriétés cytotoxiques. Les lymphocytes T non conventionnels, quant à eux, reconnaissent des antigènes non présentés par les molécules de CMH classiques, et n'expriment généralement pas de corécepteurs CD4 ou CD8, contrairement aux T conventionnels. Parmi ces lymphocytes T non conventionnels, certaines populations expriment un TCR (les Natural Killer T et les T invariants associés aux muqueuses) tandis qu'une autre population exprime un TCR (T Cell Receptor) composé des chanes et : les lymphocytes T (T ). Dans cette introduction, nous nous focaliserons sur les caractéristiques des T qui concernent directement nos travaux. Les T sont souvent classés à l'interface entre l'immunité innée et adaptative (Figure 1). En effet, leur multiplication rapide, le développement de fonctions effectrices qui ne nécessite pas de sélection clonale, ainsi que leurs mécanismes de reconnaissance antigénique leur confèrent des caractéristiques de l'immunité innée. A l'inverse, la structure et le réarrangement de leur TCR confèrent à ces cellules certaines caractéristiques de l'immunité adaptative. 18 Figure 1 : Les T sont à l'interface entre l'immunité innée et adaptative (Dranoff, 2004). Les T interviennent dans les premières lignes de défense face à une infection, contrairement aux T conventionnels. Cette activation rapide des T s'explique par un ensemble de mécanismes : - La localisation principalement tissulaire des T leur permet de pouvoir rapidement détecter in situ les cellules infectées ou tumorales, contrairement aux T localisés dans les organes lymphoïdes secondaires. Ces cellules peuvent représenter jusqu'à 70% des lymphocytes présents. - Des sous-populations de T sont capables de reconnaitre directement les cellules infectées ou tumorales sans préalable présentation d'antigènes apprêtés par des cellules présentatrices d'antigènes. - Leur fréquence est élevée ce qui fait que leur stimulation ne nécessite pas de sélection ou d'expansion clonale forte pour répondre de façon efficace à l'infection ou au stress. Par conséquent, ces cellules font partie des premières cellules de l'immunité à être activées lors de l'intrusion d'un agent pathogène. 19 1. Découverte des T Il y a plusieurs dizaines d'années, une des populations de lymphocytes T non conventionnels, les lymphocytes T , a été découverte. Dans les années 80, suite à l'identification des gènes codant les immunoglobulines, plusieurs équipes de recherche ont cherché à identifier les gènes codant pour le TCR des lymphocytes T. L'une d'entre elle a identifié un transcrit dans le thymus de souris qui correspond à la chane du TCR (Saito et al. , 1984). En 1987, Chien et ses collaborateurs ont mis en évidence une nouvelle région localisée dans le locus de la chane du TCR qui semble être réarrangé plus précocement durant le développement thymique des lymphocytes (Chien et al. , 1987). La caractérisation de ce locus a permis de découvrir un nouveau segment du TCR : la chane . C'est ainsi que l'identification d'une chane et du TCR a permis de mettre en évidence une nouvelle sous- population de lymphocytes T : Les T . 2. Différentes populations de T chez l'Homme et la souris Il est important de noter que les différentes populations de T (caractérisées par la nature des parties variables, V, de leur chane et de leur TCR) présents chez l'Homme et la souris sont différentes. En effet, il n'existe pas forcément de correspondance entre ces deux espèces et leur TCR. Par exemple, la population T V5V1 (aussi appelés T dendritiques épidermiques, DETC) présente dans l'épiderme des souris n'existe pas chez l'Homme, et les T V9V2 localisés dans la circulation sanguine chez l'Homme sont propres aux primates supérieurs. Chaque population peut avoir des caractéristiques différentes en ce qui concerne l'activation, la différenciation, les cytokines produites et l'activité cytotoxique. De plus, cette complexité est encore accentuée par les différentes nomenclatures utilisées pour identifier les différents TCR (clones et ) (Tableau 1). 20 Tableau 1 : Nomenclature des lymphocytes T murins et humains (Bergstresser and Takashima, 2001). B. Répertoire des T Tout comme les autres lymphocytes T non conventionnels, les lymphocytes T sont caractérisés par l'expression d'un TCR réarrangé qui reconnait des antigènes du soi et du non soi en absence de présentation par les molécules de CMH-I et II classiques. Comme leur nom l'indique, les T expriment un TCR sous forme d'hétérodimère TCR/TCR lié au complexe CD3. De façon semblable aux T conventionnels, chaque chane du TCR est constituée d'une partie variable (V) et d'une partie constante (C). Les mécanismes de recombinaisons concernant les deux chanes sont globalement les mêmes que ceux décrits chez les T . Ainsi la diversité du TCR est générée par la recombinaison : des segments V (Variable), D (Diversité) et J (Jonctionnel) pour la chane et des segments V et J pour la chane , de façon semblable à ce qui est obtenu avec les chanes et respectivement. Cependant, chez l'Homme, les T ont un répertoire restreint de gènes des segments V comparé à celui des T conventionnels. Il existe seulement 6 gènes V fonctionnels dont 5 appartiennent à la famille VI (V2, 3, 4, 5, 8) et le dernier (V9) appartient à la famille VII (Tableau 2). Le nombre de gènes fonctionnels V est aussi faible comparé à ceux de la chane . Malgré cela, la diversité combinatoire théorique des T (environ 1020) serait plus élevée que celle des T (environ 1015). Ce phénomène serait dû principalement à leur capacité d'utiliser de multiples copies en tandem de gènes D ainsi qu'à générer une diversité jonctionnelle (insertion ou la 21 délétion de nucléotides) plus élevée créant ainsi une forte diversité dans la partie CDR3 (Complementary determining region 3) de la chane (Carding and Egan, 2002). Cependant la réalité est différente de la théorie car cette diversité des T est nettement moins élevée. En effet, des associations préférentielles entre les chanes et les chanes (porteuses de régions V ou V particulières) ont lieu durant le développement des T . Par exemple, chez l'Homme, la chane V9 s'associe exclusivement avec la chane V2 tandis que les autres chanes V (2, 3, 4, 5 et 8) peuvent s'associer à la chane V1. Tableau 2 : TCR et des lymphocytes T murins et humains : Nombre de gènes de la partie variable (V) des chanes , , et du TCR des lymphocytes T chez la souris et chez l'Homme (Girardi, 2006). La structure tridimensionnelle du TCR est également différente de celle du TCR. L'angle formé entre les domaines C et V est plus prononcé dans un TCR que dans un TCR, ce qui a pour conséquence qu'il ressemble davantage, d'un point de vue structurel, au fragment Fab d'une immunoglobuline (Ig) (Figure 2). Ainsi, les T possèdent un TCR ayant une structure particulière probablement en rapport avec la nature des complexes antigéniques reconnus (voir partie D. ). 22 Figure 2 : Structure tridimensionnelle du TCR : Structure d'un TCR humain type V9V2 (clone G115) (a), d'un TCR (b) et de la partie Fab d'une immunoglobuline (c). Les traits noirs représentent l'angle formé entre les domaines C et V (Allison et al. , 2001). C. Distribution tissulaire des T Contrairement aux T , les T sont davantage présents en périphérie et représentent une forte proportion des lymphocytes dans les tissus tels que le derme et les muqueuses du tractus digestif et génital. Chez l'Homme, les T représentent 0. 5 à 16% des lymphocytes dans le sang périphérique et dans les organes lymphoïdes tels que le thymus, les amygdales, les ganglions lymphatiques et la rate. Ces cellules sont plus fortement présentes dans l'épiderme et les muqueuses. Ainsi, elles peuvent représenter jusqu'à 30% des lymphocytes dans l'intestin. Chez la souris, 1 à 4% des lymphocytes T dans le thymus et les organes lymphoïdes secondaires sont des T et ceux-ci peuvent représenter jusqu'à 40% des lymphocytes dans l'intestin et 70% dans le derme. Les T ont une expression tissulaire qui varie selon les différentes populations caractérisées par la nature des parties variables de leur chane et de leur TCR. Il existe principalement 3 populations chez l'Homme : les T V1, V2 et V3. Les T majoritairement présents dans le sang sont les T V9V2 (50 à 95% des T ), sous-population absente chez la souris. De plus, les T V1 et V3 humains sont majoritairement présents dans les tissus et organes tels que le thymus, la rate, le foie, les tractus génitaux et l'épithélium intestinal. Le derme, quant à lui, est principalement constitué de T V1. Chez la souris, les T sont 23 présents dans la rate (V1 et V4), dans la peau et l'épithélium intestinal (V7V4, V7V5 et V7V6), dans l'épithélium pulmonaire (V4 et V6), et dans les organes reproducteurs (V6V1). De plus, chez les souris on retrouve une population de T présente dans l'épiderme, inexistante chez l'Homme, qui sont les T V5V1 (DETC) (Tableau 3) (Lafont et al. , 2014). Tableau 3 : Distribution des différentes populations de T chez la souris et chez l'Homme. Pour chaque population de T murins ou humains caractérisée par leur TCR, est indiqué leur localisation dans différents organes, tissus ou muqueuses et leur niveau de diversité de V(D)J (Bonneville et al. , 2010). D. Modalités d'activation des T 1. De multiples antigènes détectés L'activation des T conventionnels nécessite une reconnaissance de peptides antigéniques par leur TCR. L'activation des T nécessite aussi d'une stimulation de leur TCR mais avec des antigènes de natures différentes et diverses : des antigènes protéiques, des lipides exogènes ou endogènes associés à des molécules apparentées au CMH (CD1c et CD1d) (Luoma et al. , 2013), ou bien encore des composés phosphorylés exogènes ou endogènes nommés phosphoantigènes (P-Ags). Ainsi, il a été identifié pour chaque population de T , différents types d'antigènes qui sont résumés dans le tableau 4. Les T perçoivent ainsi principalement des signaux induits lors d'un stress cellulaire tel que la transformation tumorale ou l'infection par un agent pathogène. De plus, une des différences notable entre les 24 T et les T est que ces derniers ne reconnaissent pas des antigènes apprêtés mais des antigènes sous forme native. Populations T Antigènes Humains Souris V1 V1 (clones) V1 (sang) V1 V2 V9V2 V4V5 (clones) V1. 3V2 Plusieurs populations V2V5 (clones) V2V8 (clones) V1 (clones) V1 (clones) Plusieurs populations Plusieurs populations MICA CD1c Tétramères CD1d chargés avec sulphatides Lipohexapeptides ULBP4 Phosphoantigènes EPCR Histidyl-tRNA synthase Phycoerythrine I-EK HSV glycoprotein I Cardiolipine, apolipoprotéine H Peptide insuline H2-T10, H2-T22 Phycoerythrine Tableau 4 : Les différents ligands des T humains et murins. Modifié d'après (Vantourout and Hayday, 2013). Des populations de T peuvent reconnaitre des molécules de CMH tels que les I-EK par les T V2V5 murins et H2-T10 ou H2-T22 par des différents clones de T murins (Matis et al. , 1989). Des molécules apparentées à celles-ci telles que MICA (Major histocompatibility complex class I-related chain A), ULBP (UL16 binding protein), CD1d et CD1c peuvent aussi être reconnues par des T humains (V1). Récemment, il a été mis en évidence la reconnaissance d'une protéine transmembranaire de type 1 homologue des molécules du CMH-I/CD1, le récepteur EPCR (endothelial protein C receptor) par les T V4V5 humains (Willcox et al. , 2012). D'autres antigènes apparaissent comme étant des cibles uniques des T telles que les P-Ags endogènes qui ont une structure similaire à celles des isoprénoïdes et qui sont impliqués dans l'activation des T V9V2. Les modalités de reconnaissance antigénique des différentes populations de T par leur TCR ne sont toujours pas claires à l'heure actuelle, malgré de nombreuses études menées sur l'interaction TCR-ligand. De plus, la reconnaissance des antigènes varie en fonction des populations de T , ce qui complexifie l'étude de cette interaction. 25 2. Régulation de l'activation Nous venons de voir que les T peuvent parfois reconnaitre, via leur TCR, des antigènes du soi tels que les molécules de CMH. Par conséquent, l'activation de ces cellules nécessite une régulation importante afin de limiter les risques d'auto-immunité et de discriminer ainsi des cellules saines à des cellules infectées ou tumorales. Ainsi, les T perçoivent des signaux induits lors d'un stress cellulaire par des récepteurs autres que le TCR et dont l'expression varie en fonction des différentes populations de T . Ces récepteurs induisent des signaux activateurs ou inhibiteurs, ce qui permet de réguler de façon positive ou négative les différentes fonctions effectrices de ces cellules. Ainsi, l'activation des T est le résultat de l'intégration de signaux activateurs et/ou inhibiteurs qui agissent en synergie (Figure 3). En effet, ces cellules possèdent des Pattern Recognition Receptors (PRR). Il existe différentes classes de PRR impliquées dans la détection de différents types d'agents pathogènes (bactéries, virus . ) à l'origine de l'initiation de la réponse immunitaire. Ces récepteurs reconnaissent des motifs communs exprimés par différents types d'agents pathogènes (PAMPs). Les Toll-Like Receptors (TLR) sont une classe de PRR transmembranaires capables de reconnaitre une grande variété d'agents pathogènes. Les Nucleotide Oligomerization Domain Receptors (NLR) sont, quant à eux, une classe de PRR cytoplasmiques également capables de reconnaitre différents types de pathogènes. Cette reconnaissance active des voies de signalisation qui dépendent ou pas de la molécule MyD88 menant à la transcription de cytokines pro-inflammatoires (IL-1, IL-8 ou TNF) et/ou d'interféron de type I (IFN /). Ainsi, les T expriment des TLR ou NLR, impliqués dans la reconnaissance de motifs PAMPs qui sont exprimés par différents types d'agents pathogènes (Dar et al. , 2014). Les T expriment aussi des Natural Killer Receptors (NKR), initialement décrits sur les cellules NK, pouvant induire un signal inhibiteur ou activateur. Par exemple, le récepteur activateur NKG2D a un rôle important dans la reconnaissance de cellules tumorales ou infectées (Rincon-Orozco et al. , 2005). Certains T expriment aussi des récepteurs appartenant à la famille des récepteurs de cytotoxicité naturelle (NCR) tels que NKp30, NKp44 ou NKp46 dont la stimulation induit des signaux activateurs. D'autres types de récepteurs sont exprimés par ces cellules telles que les récepteurs aux fragments Fc des Ig (FcRIIIA /CD16) et des molécules d'adhérence. Ces dernières ont un rôle important dans l'activation des T car elles permettent le maintien du contact entre la cellule cible et ces lymphocytes. Ainsi la molécule d'adhérence LFA-1 (Lymphocyte function-associated antigen 1) exprimée à la 26 surface des T V9V2 humains participe à l'activation de ces dernières par liaison à la molécule ICAM-1 (Intercellular adhesion molecule 1) sur les cellules cibles (Kato et al. , 2003). Il est généralement admis que la stimulation de leur TCR est nécessaire pour l'activation des T . Cependant, pour certains récepteurs comme le NKG2D, le rôle n'est pas encore clair. En effet, la stimulation du NKG2D, qui fonctionne généralement de façon synergique avec le TCR, peut induire une activité cytotoxique par les T V5V1 murins ou bien par les T V9V2 humains contre des cellules tumorales, parfois sans engagement du TCR (Girardi et al. , 2001 ; Qin et al. , 2009). Cependant, les autres récepteurs sont en général incapables d'activer les T sans signal TCR. Nous verrons dans la partie II. D, le rôle de ces différents récepteurs dans l'activation de la population qui nous intéresse pour la suite, les T V9V2. Figure 3 : Reconnaissance d'une cellule cible par les T : Les T reconnaissent différents stimuli de stress : des molécules du CMH ou apparentées (CD1c, T10, T22) ou des P-Ags par le TCR, des ligands (RAE1, MICA, MICB, ULBPs) par des NKR tels que le NKG2D, ou bien des DAMPs et PAMPs par des TLR ou récepteur Dectin 1. En réponse à ces stimuli, les T sont capables d'exercer une activité cytotoxique, de proliférer et de relarguer des cytokines (Bonneville et al. , 2010). 27 E. Fonctions effectrices des T De façon générale, de par leur rapide réactivité et leur localisation stratégique, les T jouent un rôle important dans la protection contre certains pathogènes d'origine bactérienne, virale et parasitaire ainsi que contre certains cancers. Leurs diversités phénotypiques, leurs spécificités antigéniques et leurs localisations sont associés à des fonctions effectrices diverses pour les différentes populations. 1. Activité cytotoxique De multiples populations de T sont capables d'éliminer divers cellules cibles : des cellules infectées par des bactéries ou virus, et des cellules tumorales. En effet, ces lymphocytes sont capables de lyser directement ces cellules cibles ou bien d'induire leur apoptose. Plusieurs mécanismes inducteurs d'apoptose sont décrits. Les T peuvent induire l'apoptose des cellules cibles suite à l'engagement des récepteurs de mort CD95 (Système Fas /FasL) ou TRAILR (système TRAIL/TRAILR) (Li et al. , 1998). Ces cellules peuvent aussi libérer des granules lytiques contenant le couple perforine/granzyme qui peut entrainer une lyse directe via la perforation de membrane plasmique par la perforine et l'apoptose via le clivage des caspases par les granzymes (Qin et al. , 2009). Comme pour les cellules NK, ces granules lytiques sont préformés permettant une rapide cytotoxicité. Ainsi, une fois le contact cellulaire établi entre le T et la cellule cible, les granules sont orientés directement vers cette dernière ce qui entraine sa mort. De plus, les T peuvent relarguer des granules contenant des molécules aux propriétés antimicrobiennes telles que la granulysine ou les défensines (Dieli et al. , 2001). 2. Sécrétion de cytokines En plus de leurs propriétés cytotoxiques, les T peuvent produire des cytokines immuno-modulatrices jouant un rôle dans la protection immunitaire contre différents types d'agents pathogènes ou dans l'inhibition de la réplication d'agents infectieux. Ayant une implication préférentielle dans la protection de pathogènes intracellulaires, les T produisent majoritairement des cytokines de type Th1 (IFN- et TNF). Cependant, face à d'autres pathogènes, ces cellules sont également capables de sécréter : de l'IL-17 en présence de champignons ou de bactéries extracellulaires (profil Th17), ou bien de l'IL-4, IL-5 et IL-13 lors d'infection parasitaire (profil Th2). Les T peuvent aussi avoir un profil intermédiaire en sécrétant des cytokines issues de différentes polarisations (Wu et al. , 2014) (Figure 4). Ces cytokines produites peuvent avoir un effet bénéfique en permettant l'élimination de ces 28 différents agents pathogènes mais aussi un effet délétère notamment lors de maladies auto- immunes (à travers la production d'IFN- et d'IL-17) ou dans le cas d'allergie et d'asthme (par la sécrétion d'IL-4 et IL-13). A l'inverse, les T peuvent diminuer la réponse des cellules effectrices de l'immunité innée et adaptative à travers la production de cytokines immuno- régulatrices (IL-10, TGF). Ces cellules peuvent aussi moduler les fonctions de cellules stromales, comme par exemple les DETC, qui sont capables de produire des facteurs de croissance pour les cellules épithéliales (Sharp et al. , 2005). En plus des interleukines, les T sécrètent des chimiokines permettant le recrutement de cellules de l'immunité. Par exemple, certains T V9V2 sécrètent du CXCL13 ce qui régule l'organisation des cellules B dans les follicules et les tissus lymphoïdes (Vermijlen et al. , 2007). Certains sécrètent d'autres chimiokines tels que CCL4 et CXCL10 favorisant le recrutement des macrophages et des cellules NK en particulier (Vantourout and Hayday, 2013). Figures 4 : Les différents profils cytokiniques des T KGF : keratinocyte growth factor. CTGF : Connective tissue growth factor. 29 II. Les lymphocytes T V9V2 Chez l'Homme, la population T V9V2 (appelée aussi V2V2 ou 22 par d'autres groupes) constitue la population de T (65 à 90%) majoritairement présente dans le sang périphérique. Elle représente entre 1 et 10% des lymphocytes T totaux circulants et peut atteindre 50% après une infection microbienne. C'est l'une des expansions clonales les plus importante, ce qui suggère un rôle fondamental de ces cellules lors d'infection. Ces cellules ont particulièrement été décrites pour leur rôle dans l'immunité anti-infectieuse mais aussi anti- tumorale. Différents lymphocytes T V9V2 peuvent avoir des caractéristiques aussi bien Th1, Th2, Th17, T CD4 folliculaires, T régulateurs que de T cytotoxiques, ou des propriétés de cellules NK et de cellules présentatrices d'antigènes. Cette population est exclusivement présente chez les primates supérieurs et c'est la population qui a été la plus étudiée à ce jour chez l'Homme. A. Composés activant les lymphocytes T V9V2 1. Rôle majeur des Phosphoantigènes a) Nature des Phosphoantigènes Rapidement après leur découverte, il a été montré que les T V9V2 sont réactifs au cours d'infections par les mycobactéries et face à des cellules tumorales (Fisch et al. , 1990). De façon surprenante, dans le cas des mycobactéries, cette activation n'est pas due à la reconnaissance de peptides antigéniques classiquement décrits pour les lymphocytes T car l'extrait microbien est résistant à la protéinase K et sensible à la dégradation par la phosphatase alcaline. Les premières analyses sur ces composés stimulants issus de Mycobacterium tuberculosis ont mené à l'identification de 4 fractions en chromatographie liquide, appelés TUBag 1-4 (Tuberculosis Antigènes 1-4) correspondant à des alkyles pyrophosphorylés et des dérivés nucléotidiques triphosphates de ces mêmes alkyles. En parallèle, une autre équipe a identifié d'autres antigènes phosphorylés naturels qui sont l'isopentenyl-pyrophosphate (IPP) et le dyméthylallyl pyrophosphate (DMAPP) (Tanaka et al. , 1995 ; Tanaka et al. , 1994). Il a ensuite été mis en évidence l'hydroxy-diméthylallyl pyrophosphate (HDMAPP) également appelé (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP) par une autre équipe qui finalement correspond à celui initialement mis en évidence chez les mycobactéries : TUBag 1. 30 Ces différents composés sont produits par de multiples micro-organismes et plantes (Behr et al. , 1996 ; Fischer et al. , 1996). L'IPP et le DMAPP sont quant à eux, également produits par les cellules eucaryotes. Dans des cellules eucaryotes, plusieurs équipes ont pu montrer qu'un dérivé nucléotidique (adénylé) de l'IPP existe de façon naturelle : l'ApppI. Celui-ci pourrait être produit à partir d'IPP et d'adénosine monophosphate par une aminoacyl tRNA synthase (Monkkonen et al. , 2006 ; Monkkonen et al. , 2007). Il a été démontré que ce dérivé ApppI confère aux cellules tumorales les caractéristiques de cellules naturellement activatrices des T V9V2 et que cette stimulation nécessite un processus d'hydrolyse en IPP pour être actif (Vantourout et al. , 2009). Ces dérivés nucléotidiques ont la capacité de se lier à certaines protéines cellulaires et pourraient jouer un rôle particulier dans les mécanismes d'action de ces composés phosphorylés (Mookerjee-Basu et al. , 2010). L'ensemble de ces composés non-peptidiques, de faibles poids moléculaires sont appelés phosphoantigènes (P-Ags) (Behr et al. , 1996 ; Belmant et al. , 1999 ; Constant et al. , 1994). Leur structure globale est dérivée de celle des isoprénoïdes, comportant une courte chane hydrocarbonée (le plus souvent à 5 carbones) et un groupement pyrophosphate (Figure 5). Figure 5 : Structures des Phosphoantigènes naturels avec leur activité sur les T V9V2 indiquée en dessous comparée à celle de l'HDMAPP (activité de l'HDMAPP représentant le 1) (Riganti et al. , 2012). b) Origine des Phosphoantigènes Ces différents composés phosphorylés sont des métabolites de la voie de biosynthèse des isoprénoïdes et stérols, cette dernière étant une voie essentielle au métabolisme cellulaire des différents organismes. 31 La plupart des eubactéries, archées, plantes et certains parasites protozoaires produisent ces métabolites phosphorylés par la voie 1-désoxy-D-xylulose-5-phosphate (DOXP) / méthylérythritol phosphate (MEP), voie alternative de la synthèse du cholestérol. La voie du DOXP démarre par un pyruvate et du D-Glyceraldehyde-3-phosphate qui après plusieurs étapes aboutit à la synthèse de HDMAPP suivi de DMAPP et d'IPP (Figure 6) (Kollas et al. , 2002). Il existe une voie de biosynthèse des isoprénoïdes et des stérols chez les eucaryotes (plantes et animaux) et les archaebactéries, équivalente à la voie du DOXP : la voie du mévalonate (MVA). Cette voie représente la seule voie de biosynthèse de stérols et de dérivés prénylés qui sont importants dans de nombreuses fonctions cellulaires. Elle aboutit à la synthèse d'IPP et DMAPP (Figure 6). L'HDMAPP étant issu de la voie du DOXP exclusivement, il n'est pas produit par des cellules eucaryotes humaines. La voie métabolique DOXP/MEP, présente uniquement chez certains microorganismes, conduit à la production du métabolite HDMAPP qui a des effets stimulants sur les T V9V2 nettement supérieurs à ceux obtenus avec les métabolites IPP/DMAPP. Ainsi, le HDMAPP est un P-Ag dit fort car il est 1000 fois plus efficace que l'IPP et le DMAPP qui sont des P-Ags dits faible . 32 Figure 6 : Les voies de biosynthèse du cholestérol DOXP/MEP et MVA induisent une production de P-Ags. En haut de la figure : Distribution phylogénétique simplifiée des voies du DOXP/MEP (vert) et du MVA (jaune). En bas de la figure : production des P-Ags HDMAPP, DMAPP et IPP par les voies de biosynthèse DOXP et MVA. Ces P-Ags sont ensuite reconnus par le T (V9V2) via leur TCR (Bonneville and Fournie, 2005) 2. Phosphoantigènes synthétiques De nombreux agonistes des P-Ags naturels pour les lymphocytes T ont été produits par synthèse chimique tels qu'un analogue de l'HDMAPP (cHDMAPP/ HMB-CPP /PicostimTM), le BrHPP (PhosphostimTM), et le 2-methyl-3-butenyl pyrophosphate (2M3BPP). Ces trois analogues synthétiques sont actuellement en cours d'essai clinique pour le développement d'immunothérapie ciblant les T V9V2 (Riganti et al. , 2012) (Figure 7). 33 Figure 7 : Structures des Phosphoantigènes synthétiques avec leur activité sur les T V9V2 indiquée en dessous comparée à celle de l'HDMAPP (activité de l'HDMAPP représentant le 1) (Riganti et al. , 2012) 3. Les Aminobisphosphonates : En plus des P-Ags, d'autres composés pharmacologiques sont décrits comme étant stimulateurs des T V9V2 : les aminobisphosphonates (ABP) et les alkylamines. Les alkylamines étant moins étudiés que les ABP, principalement en raison de leurs propriétés stimulatrices moins fortes, nous nous focaliserons principalement sur les ABP. Les Bisphosphonates (famille contenant entre autre les ABP) ont été synthétisés pour la première fois au milieu du XIXème siècle et ont été utilisés principalement en tant qu'agents détartrants dans l'industrie. Ce n'est que durant ces cinquante dernières années que ceux-ci furent utilisés pour traiter des pathologies ainsi qu'étudiés pour leur propriétés stimulantes sur les T V9V2. a) Utilisation thérapeutique des bisphosphonates Les bisphosphonates (BP) sont actuellement utilisés depuis de nombreuses années pour traiter des maladies liées à une résorption osseuse telles que l'ostéoporose, la maladie de Paget (Osteitis deformans), et des maladies cancéreuses métastatiques associées à une ostéolyse importante. Ceux-ci limitent l'ostéolyse excessive en inhibant principalement l'activité des ostéoclastes. Les BP ont une structure chimique similaire à celle des pyrophosphates inorganiques qui sont des régulateurs endogènes de la minéralisation osseuse (Rogers et al. , 2000). Après la prise de ce traitement, la molécule se retrouve localisée sur les sites présentant une forte activité des ostéoclastes, tel que cela a été démontré par l'utilisation d'Alendronate-H3 qui, après injection en intraveineuse dans des rats, a été détecté principalement sur les sites de résorption osseuse (Sato et al. , 1991). Ils sont constitués d'une structure de base Phosphate- Carbone-Phosphate (P-C-P) sur laquelle sont rattachées au niveau du carbone deux chanes 34 latérales (R1 et R2) (Figure 8). Leur structure tridimensionnelle, le squelette P-C-P et la nature de la chane latérale R1 (généralement un hydroxyle) permet à la molécule de pouvoir fixer et chélater le calcium, ce qui leur confère une forte affinité pour le minéral osseux. La chane latérale R2, quant à elle, est à l'origine de l'activité inhibitrice sur les ostéoclastes. Suivant la nature de cette chane R2, deux types de BP sont obtenus ayant des activités différentes : les aminobisphosphonates (ABP) et les non-aminobisphosphonates (NABP). Figure 8 : Structures des aminobisphosphonates avec leur activité sur les T V9V2 indiquée en dessous comparée à celle de l'HDMAPP (activité de l'HDMAPP représentant le 1). (Riganti et al. , 2012). Les NABP, qui n'ont pas de groupement amine dans la chane latérale R2, entrent directement dans les ostéoclastes par endocytose. Ceux-ci sont capables de former des analogues non hydrolysables de l'ATP qui, une fois accumulés dans les ostéoclastes, entrainent leur apoptose (Frith et al. , 1997). Ainsi de nombreuses études ont démontré que les NABP induisent la mort par apoptose des ostéoclastes de souris, rat ou lapin in vitro et in vivo (Hughes et al. , 1995). Ce phénomène serait le mode d'action principal des BP pour limiter l'ostéolyse. De plus, les NABP sont capables d'inhiber les ATPases, pompes à protons présentes dans les vacuoles des ostéoclastes qui sont requises pour leur activité (David et al. , 1996), ainsi que d'inhiber certaines protéines tyrosines phosphatases connues pour être impliquées dans l'activité ostéolytique (Schmidt et al. , 1996). Les BP classiquement utilisés sont le clodronate, le tiludronate et l'étidronate. Les ABP ont un groupement amine dans leur chane latérale R2 (Figure 8). Contrairement aux NABP, ceux-ci n'induisent pas de métabolites toxiques pour les ostéoclastes par leur chane R2 mais la présence de ce groupement amine augmente malgré tout leur activité qui est ainsi de 1000 à 10000 fois supérieure à celle des BP tel que l'étidronate in vivo. La présence de ce groupement amine leur confère un mode d'action différent de celui observé avec les BP. En effet, ces molécules sont capables d'interférer avec la voie du MVA, voie présente dans toutes les cellules eucaryotes, qui aboutit à la production de cholestérol, 35 stérols et d'isoprénoïdes. Les ABP bloquent une enzyme clé de cette voie : la Farnésyl Pyrophosphate Synthase (FPPS) (Figure 9). Ceci a pour conséquence une inhibition de la prénylation (farnesylation et geranylgeranylprénylation) des GTPases (Rho, Rac, Ras). Ces GTPases jouent un rôle important dans la régulation des fonctions des ostéoclastes en contrôlant le réarrangement du cytosquelette, le trafic vésiculaire et l'apoptose (Rogers et al. , 2000). Figure 9 : Voie du mévalonate : La voie du mévalonate aboutit à la synthèse de cholestérol, stéroïdes, dolichol et des protéines farnésylées et géranylgéranylées. Les ABP bloquent l'enzyme farnésyl pyrophosphate synthase ce qui entraine l'accumulation de l'IPP. Les statines bloquent l'enzyme HMG- CoA reductase, ce qui inhibe la production d'IPP. 36 b) Utilisation des ABP dans certaines pathologies cancéreuses Les métastases osseuses sont une cause majeure de décès chez les patients atteints de cancer, en particulier du sein et de la prostate. Des données cliniques et expérimentales démontrent que le traitement par des ABP permet une diminution de la progression des métastases osseuses et que celle-ci serait indépendante d'un effet des ABP sur l'inhibition de la résorption osseuse (Clezardin, 2011). Autrement dit, les ABP n'agissent pas uniquement sur les ostéoclastes mais également directement sur des cellules tumorales (Caraglia et al. , 2006). Plusieurs mécanismes sont impliqués dans la dissémination des cellules métastatiques dans le tissu osseux. Il a été démontré un rôle du traitement par les ABP sur certains de ces mécanismes par son action sur la voie du MVA. En effet, les ABP peuvent induire une inhibition de l'adhésion et de la migration des cellules cancéreuses sur la matrice osseuse (Boissier et al. , 1997). De plus, il a été observé un effet anti-prolifératif de ceux-ci, avec une perturbation importante du cycle cellulaire dans les cellules cancéreuses traitées menant jusqu'à la mort cellulaire par apoptose avec des doses importantes d'ABP (zolédronate 40-100M) (Kuroda et al. , 2004). Des effets variables sont cependant observés en fonction du type cellulaire des cellules cancéreuses (Caraglia et al. , 2006). A des doses plus faibles, les ABP ont aussi un effet anti-invasif sur les cellules de carcinomes de sein ou de la prostate (Boissier et al. , 2000). Enfin, ceux-ci ont été décrits comme pouvant diminuer l'angiogenèse qui est un mécanisme majeur de la croissance tumorale et la dissémination métastatique (Fournier et al. , 2002 ; Stresing et al. , 2011). L'ensemble de ces données confirme un effet anti-tumoral des ABP, qui varie selon le type cellulaire. A l'heure actuelle, les mécanismes moléculaires mis en jeu restent encore à déterminer. c) Traitement ABP : mode d'activation des T V9V2 En 1999, il a été observé, chez des patients traités par un ABP, le pamidronate, une réaction inflammatoire aigue accompagnée d'une amplification importante des T (Kunzmann et al. , 1999). Ce composé pharmacologique a été ensuite décrit comme pouvant activer les T V9V2 in vitro (Kunzmann et al. , 2000). Le mécanisme d'action des ABP sur les T V9V2 a pu être compris lorsqu'il a été mis en évidence que ce composé était capable d'inhiber la voie MVA. En bloquant l'enzyme FPPS, qui transforme l'IPP en Geranyl-Pyrophosphate et Farnesyl-pyrophosphate, les ABP induisent une accumulation du métabolite en amont qui est l'IPP, responsable de l'activation des T V9V2 (Figure 9) (Gober et al. , 2003). De plus, l'effet stimulant induit par le blocage de la voie du MVA a été confirmé par l'utilisation de statines qui sont capables d'inhiber une enzyme dans la voie du MVA, l'HMG-CoA reductase qui transforme l'HMG-CoA en mévalonate. Son 37 blocage entraine une diminution de la formation d'IPP en aval, ce qui abolit l'effet stimulant des ABP sur les T V9V2 (Figure 9). Par conséquent, les ABP ne sont pas à proprement parler des P-Ags, mais ils induisent la production de ceux-ci. 4. Les Alkylamines Les alkylamines sont des composés naturels, identifiés à partir de la bactérie Proteus morganii. Ils sont sécrétés par certaines bactéries commensales ou pathogènes et sont également présents dans des produits végétaux comestibles comme le thé, le vin, les pommes et les champignons. Ces composés naturels sont capables d'activer les T V9V2 et semblent agir comme les ABP par une inhibition de la FFPS dans la voie du MVA. En effet, un traitement par des statines abolit l'effet stimulant des alkylamines sur les T V9V2 (Thompson et al. , 2006) . Par conséquent, tout comme les ABP, les alkylamines ne sont pas à proprement parler des P-Ags, mais ils induisent la production de ceux-ci. Cependant, cet effet requiert de fortes concentrations comparé à ce qui est obtenu avec les ABP, ce qui en fait de moins bons stimulateurs des T V9V2. B. Mécanismes d'action des Phosphoantigènes Alors que les mécanismes de reconnaissance de peptides antigéniques par les T conventionnels sont connus depuis de nombreuses années, ceux concernant les T V9V2 restent mal définis. Les T V9V2 peuvent être activés en présence de cellules cibles et de lysat microbien contenant les P-Ags décrits précédemment (Lang et al. , 1995). Cette activation est dépendante d'une stimulation de leur TCR V9V2 car la transfection du TCR92 dans des cellules Jurkat déficientes pour l'expression du TCR , rend ces cellules réactives aux P-Ags (Bukowski et al. , 1995). Cette reconnaissance ne nécessite pas de cellules présentatrices spécialisées mais nécessite un contact du T V9V2 avec une autre cellule qui doit être une cellule humaine (pouvant être une autre cellule T V9V2) (Morita et al. , 1995). Par ailleurs, bien que la structure tridimensionnelle du TCR suggère que celui-ci possède un site de liaison antigénique compatible avec la structure générale des P-Ags, aucune étude n'a réussi à mettre en évidence cette interaction entre les P-Ags et le TCR des T V9V2 (Allison et al. , 2001). 38 En ce qui concerne l'utilisation des ABP et les alkylamines, c'est l'accumulation intracellulaire de P-Ags des cellules traitées qui les rend stimulantes. Comme pour la stimulation par les P-Ags, l'activation des T V9V2 par ces composés dépend d'une activation de leur TCR V9V2 (Bukowski et al. , 1999 ; Das et al. , 2001b). La stimulation des T V9V2 obtenue par les ABP est différente de celle observée par traitement direct avec les P-Ags : l'activation des T V9V2 est plus lente à se mettre en place. Ceci serait certainement dû au temps nécessaire pour que le blocage de la FPPS soit suffisant pour induire une concentration de P-Ags détectable par les lymphocytes. De plus, la stimulation par ceux-ci nécessite des cellules présentatrices d'antigènes (pas nécessairement professionnelles) (Miyagawa et al. , 2001). Nous verrons dans la partie D le rôle du traitement ABP sur l'activité anti-tumorale et anti-infectieuse des T V9V2. Dans tous les cas, c'est la production de P-Ags qui est déterminante pour l'activation du TCR V9V2. De nombreuses molécules de présentation connues ont été testées pour déterminer si elles pouvaient être impliquées dans la présentation des P-Ags. Aucune des molécules de CMH-I, CMH-II et CD1 n'est nécessaire à l'activation des T V9V2. Il a donc été émis comme hypothèse que les P-Ags avaient un effet indirect sur l'activation des T V9V2 : Les P-Ags ne seraient pas présentés directement au TCR des T V9V2 mais ils seraient capables de modifier des protéines membranaires favorisant leur reconnaissance par les T V9V2. Suivant cette hypothèse, les protéines de choc thermique (HSP) ont été proposées comme étant impliquées dans cette activation suite à l'observation d'une reconnaissance de cellules tumorales par les T V9V2 (humains et murins) corrélé avec une augmentation de l'expression de HSP (en particulier Hsp60) (O'Brien et al. , 1991). Cependant, une interaction directe des HSP avec les T V9V2 n'a jamais été mise en évidence. Il y a quelques années, un complexe membranaire, l'ecto-F1-ATPase, a été proposé pour la présentation des P-Ags. 1. L'ecto-F1-ATPase L'ecto-F1-ATPase est un complexe analogue à l'ATP synthase mitochondriale, exprimé de façon ectopique à la membrane cellulaire de différentes lignées cellulaires tumorales (Scotet et al. , 2005). Celui-ci semble avoir un rôle dans l'activation des T V9V2. En effet, une interaction entre l'ecto-F1-ATPase purifié et des TCR recombinants purifiés de T V9V2 a été observée. Il semblerait que cette interaction soit favorisée en présence d'une forme délipidée de l'apolipoprotéine A1 (Apo A1) qui pourrait stabiliser le contact entre les deux molécules (Scotet et al. , 2005). Cette interaction entre l'ecto-F1-ATPase/ApoA1 et le 39 TCR induit une activation des T V9V2 qui se traduit par une sécrétion de TNF. Cette étude combinée à l'étude décrite précédemment (partie II. A. 1. a) sur le rôle de l'ApppI (Vantourout et al. , 2009) ont amené à proposer un modèle pour la reconnaissance des P-Ags qui fait intervenir la liaison du TCR avec un complexe formé à la membrane par la liaison d'un P-Ag nucléotidique (ApppI) avec l'ecto-F1-ATPase (Mookerjee-Basu et al. , 2010) (Figure 10). Figure 10 : Modèle hypothétique d'activation des T V9V2 : (A) Les P-Ags sont détectés par les T V9V2 sous forme de dérivés nucléotidiques (telle que l'ApppI) présenté par l'ecto-F1-ATPase. Après reconnaissance de l'Antigène (étape 1) et l'aggrégation du TCR (étape 2), il pourrait y avoir un recrutement ou l'activation d'une éventuelle nucléotide pyrophosphatase (NPP) à la surface de la cellule APC (cellule cible), ce qui entraine l'hydrolyse du P-Ag (étape 3). Cette hydrolyse est requise pour une activation complète des fonctions effectrices des T V9V2 (étape 4). (B) En solution les P-Ags ne sont pas reconnus car il n'y a pas d'interaction avec l'ecto-F1-ATPase présente sur les cellules voisines (étape 1). Cependant si le P-Ag est présent en grande quantité, celui-ci pourrait rentrer en contact avec le TCR, et l'ecto-F1-ATPase présents sur les cellules. D'autres corécepteurs seraient mis en jeu ce qui assurerait l'activation des T V9V2 (étape 4) (Mookerjee-Basu et al. , 2010). Cependant, ces dernières années ont été marquées par la découverte de l'implication d'une nouvelle molécule dans l'activation des T V9V2 : la Butyrophiline 3A. 2. La Butyrophiline La molécule BTN3 appartient la superfamille des Butyrophilines qui sont notamment décrites pour leurs différents rôles dans la régulation des réponses immunitaires (Arnett and Viney, 2014). Chez l'Homme, il existe 3 isoformes de la BTN3 : BTNA3A1, BTN3A2 et BTN3A3. La BTN3 (CD227) est une protéine membranaire qui a une homologie structurale avec la superfamille des protéines de co-stimulation B7. Elle a un domaine extracellulaire 40 (DEC) possédant une partie N-terminale ayant une structure semblable au domaine V des Immunoglobulines et une partie proximale ayant des similitudes avec le domaine C des immunoglobulines. Ce domaine DEC est conservé entre les 3 isoformes ce qui rend l'identification de l'isoforme impossible par cette partie de la BTN. Le domaine intracellulaire (DIC) de BTN3A1 et de la BTN3A3 possède un domaine B30. 2, connu pour pouvoir interagir avec des protéines intracellulaires dans d'autres complexes (Figure 11). Figure 11 : Structure de la BTN3 : (A) La BTN3 est une protéine membranaire qui existe sous 3 isoformes : A1, A2, A3. Chaque isoforme possède une partie extracellulaire (DEC) avec un domaine variable (V) et un domaine constant (C), et une partie intracellulaire (DIC). Les BTN3 A1 et A3 possèdent une région B30. 2. (B) Structure tridimensionnelle de la partie DEC de la BTN3A1 à gauche (en bleu) et superposée à celle de la BTN3 A2 et A3 à droite (en jaune et rose respectivement). Les structures sont fortement homologues avec seulement quelques variations sur les régions charnières entre les domaines V et C. Modifiée de (Gu et al. , 2014). Il a été montré un rôle d'une protéine apparentée à la BTN dans l'activation d'une population de T chez la souris : Skint1. En effet, Skint1 est associé à la sélection et l'activation des T V5V1 dans la peau des souris (Boyden et al. , 2008). La première démonstration de l'implication de la BTN3 dans l'activation des T V9V2 a été faite par l'équipe d'Emmanuel Scotet et de Marc Bonneville. Ils ont observé une activation de ces cellules (sécrétion de cytokines et cytotoxicité) et une augmentation de l'expression de CD69 en présence d'Ig monoclonales agonistes de la BTN3A1 (mAb 20. 1) (Harly et al. , 2012). 41 Le traitement de cellules tumorales avec ces agonistes les rendent stimulantes (comme un traitement par des P-Ags ou des ABP) et implique une stimulation du TCR des T V9V2. De plus, l'activation induite par des P-Ags ou des ABP est inhibée en présence d'Ig antagonistes de la BTN3A1 (mAb 103. 2). Plus précisément, seule l'isoforme BTN3A1, et non BTN3A2 et A3 est mise en jeu dans l'activation du TCR de ces cellules (Wang et al. , 2013). L'importance de cette molécule a été confirmée par la mise en évidence que les Ig agonistes de la BTN3A1 induisent une stimulation de leur TCR aussi importante que celle observée en présence de P-Ags (Decaup et al. , 2014). De plus, cette stimulation par mAb 20. 1 (Ig agonistes) est résistante aux statines et n'est pas accompagnée d'une accumulation d'IPP comme lors d'un traitement par des ABP, ce qui permet d'affirmer que la BTN3A1 ne joue pas un rôle dans la voie du MVA (Wang et al. , 2013). Suite à ces récentes découvertes du rôle crucial de la BTN3A1 dans l'activation des T V9V2, deux hypothèses ont été émises quant au mode d'action des P-Ags (Karunakaran and Herrmann, 2014). En effet, deux études montrent un rôle de la BTN3A1, une par l'utilisation d'Ig monoclonales, l'autre génétique. Néanmoins elles proposent des rôles différents de cette protéine. a) Modèle allostérique La première hypothèse est que les P-Ags intracellulaires lient le domaine DIC de la BTN3A1, ce qui induit un changement dans la partie DEC soit directement soit par l'intermédiaire d'autres molécules inconnues. Ces évènements sont accompagnés d'une réduction de la mobilité des BTN3A1 qui vont s'associer entre elles ou avec d'autres molécules non identifiées afin de pouvoir se lier au TCR V9V2 (Figure 12). A la vue des premiers résultats obtenus en 2012 (Harly et al. , 2012), le blocage seul de la BTN par des Ig antagonistes, suffit à inhiber l'activation des T V9V2. Par conséquent la BTN3A1 suite à un changement de conformation pourrait être le ligand du TCR. De plus, l'augmentation intracellulaire de P-Ags induit par un traitement ABP, est corrélée à une diminution de la mobilité des molécules de BTN3A1 à la membrane. Ainsi, une étude a été menée sur la caractérisation structurelle et fonctionnelle de la partir DEC de BTN3A1 et le rôle des Ig agonistes et antagonistes de celle-ci (Palakodeti et al. , 2012). La partie DEC apparait sous forme de dimères symétriques ou asymétriques. Les Ig agonistes (mAb 20. 1) mais pas les Ig antagonistes (mAb 103. 2), induiraient un changement de conformation en faveur de la formation de dimères symétriques. En ce qui concerne le domaine DIC de la BTN3A1, d'après l'étude de Harly et ses collaborateurs, la région B30. 2 serait nécessaire à l'activation des T 42 V9V2. Ces résultats ont été approfondis par une autre équipe qui a mis en évidence récemment, par cristallographie, que cette région B30. 2 interagit avec les P-Ags IPP et HDMAPP (Sandstrom et al. , 2014). Ceci expliquerait aussi la raison pour laquelle l'isoforme BTN3A3, possédant une région B30. 2 différente, n'est pas impliquée dans l'activation des T V9V2. Il est à noter que, d'après leur étude, la BTN3A1 est nécessaire mais non suffisante pour l'activation des T V9V2 : la présence de P-Ags est toujours nécessaire pour l'activation de ces cellules. Une récente étude a mis en évidence le rôle d'une autre protéine dans ce phénomène : la périplakine. Cette protéine est décrite comme étant liée au cytosquelette cellulaire. Il a été démontré que celle-ci interagit avec la BTN3A1 en intracellulaire à proximité de la région B30. 2 et serait nécessaire pour l'activation des T V9V2 (Rhodes et al. , 2015). De plus, des molécules codées par le chromosome 6 (autre que la BTN3A1) semblent requises pour l'activation des T V9V2 par les P-Ags (Riano et al. , 2014). b) Modèle de présentation antigénique L'équipe de Gennaro De Libero a émis une autre hypothèse qui est que la BTN3A1 pourrait agir comme une molécule présentatrice de P-Ags (Figure 12) (Vavassori et al. , 2013). Ils ont utilisé un modèle différent de celui utilisé par Harly et ces collaborateurs : Génération de transfectants qui expriment le domaine V de la partie DEC de la BTN3A1. En présence de P-Ags ces transfectants sont capables de stimuler les T V9V2. De plus, ils montrent par cristallographie que ce domaine possède une poche dans laquelle le P-Ag peut se lier et être ainsi présenté au TCR des T V9V2. Cependant, Cette dernière hypothèse semble contradictoire avec celle d'Erin Adams (modèle allostérique) proposé plus récemment car, dans ce cas-là, comment expliquer le rôle essentiel du domaine B30. 2 dans la partie intracellulaire ? Il a donc été proposé un troisième modèle hypothétique qui pourrait concilier les deux modèles. a) 3ème modèle Dans ce modèle, le P-Ag pourrait interagir avec le domaine B30. 2 de la partie DIC puis serait exporté hors de la cellule par une molécule de transport non identifiée à ce jour (Figure 12). Le P-Ags exporté pourrait alors interagir avec le domaine V de la partie DEC et serait présenté au TCR des T V9V2 (Harly et al. , 2014). 43 Figure 12 : Les différents modèles proposés impliquant la BTN3A1 dans l'activation des T V9V2 : (A) Modèle allostérique : Les P-Ags endogènes se fixent à la partie DIC de le BTN3A1, ce qui entraine un changement de conformation de celle-ci qui s'associe à d'autres molécules identiques ou différentes (X) telle que la molécule periplakine. L'ensemble est ensuite reconnu par le TCR des T V9V2. (B) Modèle de présentation antigénique : Les P-Ags sont reconnus par la partie DEC de la BTN3A1 et peuvent ainsi être présentés au TCR des T V9V2. (C) 3ème modèle : Les P-Ags endogènes se fixent à la partie DIC de le BTN3A1 (domaine B30. 2), puis sont transportés à l'extérieur de la cellule par une molécule de transport actuellement inconnue (violet). Les P-Ags sont alors reconnus par la partie DEC de la BTN3A1 et ainsi présentés au TCR des T V9V2. Modifiée d'après (Karunakaran and Herrmann, 2014). Par conséquent, la BTN3A1 a un rôle clé dans l'activation des T V9V2 mais on ne sait pas actuellement si elle est reconnue directement ou non par le TCR de ces cellules. C. Régulation de l'activation des T V9V2 Etant donné que les T V9V2 sont activés par des antigènes du soi et du non soi via leur TCR (IPP / ApppI), un co-stimulus est nécessaire afin de discriminer des cellules saines des cellules infectées ou tumorales. Contrairement aux T conventionnels, les T V9V2 n'expriment généralement pas le corécepteur CD28 à l'origine la prolifération et de l'activation des cellules T CD4 et T CD8 . Cependant, ceux-ci expriment d'autres récepteurs, tels que des NKR, TLR, des molécules d'adhésion et des Fc récepteurs permettant une activation spécifique contre des cellules tumorales ou infectées et limitant ainsi les risques d'auto- immunité (Figure 13). 44 1. NKR Comme l'ensemble des T , l'activation des T V9V2 est régulée par la stimulation de NKR activateurs ou inhibiteurs exprimés à la membrane cellulaire. a) NKR inhibiteurs La majorité des T V9V2 expriment des NKR inhibiteurs appartenant à la famille des lectines de type C (tel que l'hétérodimère CD94/NKG2A) ou à la superfamille des Ig (immunoglobuline like transcript 2/ ILT2/LIR-1). Ces récepteurs induisent un signal inhibiteur suite à une reconnaissance des molécules de CMH-I classiques (HLA-A, B, C chez l'Homme) ou non classiques (HLA-E) selon le récepteur. Le récepteur inhibiteur CD94/NKG2A, exprimé à la surface des nombreux clones T V9V2, a pour ligand la molécule de CMH non classique HLA-E. Etant donné que cette molécule présente principalement des peptides dérivés de la séquence leader des autres molécules de CMH classiques, sa reconnaissance permet aux lymphocytes de vérifier que l'expression de ces molécules classiques est normale. La stimulation du CD94/NKG2A induit une inhibition de la prolifération et des fonctions effectrices (production de cytokines et activité cytotoxique) des T V9V2. Cependant, ce récepteur est impliqué dans la reconnaissance de cellules infectées ou tumorales par les T V9V2 (Poccia et al. , 1997). En effet, des cellules tumorales telles que les cellules Daudi (Lymphome de Burkitt) et K562 (érythroleucémie) sont décrites comme n'exprimant pas ou peu des molécules HLA-E (Marin et al. , 2003). En présence de ces cellules, les T V9V2 ont une activité cytotoxique augmentée du fait d'une levée de l'inhibition par ces récepteurs inhibiteurs (Fisch et al. , 1997 ; Halary et al. , 1997). Les T V9V2 expriment aussi le récepteur inhibiteur ILT2 (LIR-1) ayant pour ligand les molécules de CMH-I classiques HLA-A et B et non classiques HLA-G. Ainsi il a été décrit que la reconnaissance de HLA-G sur des cellules tumorales de mélanome induit une inhibition de la prolifération et de la sécrétion de cytokines par les T V9V2 en présence de P-Ags ce qui interfère avec l'activité anti-tumorale de celles-ci (Lesport et al. , 2011). b) NKR activateurs La majorité des T V9V2 expriment un NKR activateur appartenant à la famille des lectines de type C : le NKG2D. C'est un récepteur de co-stimulation majeur qui a pour ligand les molécules de CMH-I non classiques MICA/MICB et ULBP1-4. Ces molécules sont exprimées lors d'un stress cellulaire et sont présentes sur différents types de cellules tumorales ou infectées comme les cellules infectées par le HCMV (Raulet et al. , 2013). Par exemple, une interaction entre NKG2D et la molécule MICA dont l'expression est augmentée sur les cellules dendritiques (CD) lors d'une infection par Mycobacterium tuberculosis est à 45 l'origine d'une augmentation de la réponse T V9V2 en présence de P-Ags (Das et al. , 2001a). Le NKG2D est aussi impliqué dans l'activité anti-tumorale des T V9V2. Ainsi, la stimulation de ce corécepteur par différents types de cellules tumorales (cancer du côlon, colorectal, carcinome, mélanome, lymphome, cellules leucémiques) augmente l'activité cytotoxique des T V9V2 (Corvaisier et al. , 2005 ; Groh et al. , 1999 ; Todaro et al. , 2009). Dans le cas de lymphomes et de leucémies, ce serait le ligand ULBP1 qui serait reconnu par le NKG2D afin d'augmenter l'activité cytotoxique des T V9V2 (Lanca et al. , 2010). Cependant, le rôle exact du corécepteur NKG2D est controversé. Des études démontrent que la stimulation de celui-ci peut induire à lui seul le déclenchement des fonctions effectrices des T V9V2 (Rincon-Orozco et al. , 2005) tandis que d'autres équipes n'observent un effet stimulateur de ce récepteur qu'en présence d'une activation du TCR (Nedellec et al. , 2010). Bien que le NKG2D soit décrit comme étant le corécepteur majeur des T V9V2, d'autres NKR activateurs sont exprimés par ces dernières. L'activité régulatrice du récepteur CD94/NKG2C sur les T V9V2 a été décrite récemment. Comme pour le CD94/NKG2A, le CD94/NKG2C a pour ligand la molécule HLA-E. Même si ce corécepteur est peu exprimé par les T V9V2 circulants chez des donneurs sains, une stimulation de celui-ci mène à une prolifération, une production des cytokines IFN- et de TNF ainsi qu'une réponse cytotoxique (Angelini et al. , 2011). Un autre NKR est exprimé par les T V9V2 : DNAX accessory molecule-1 (DNAM- 1/CD226). DNAM-1, via la reconnaissance de son ligand CD155 (Nectin-like 5), est impliqué dans la cytotoxicité des T V9V2 contre des cellules de carcinomes hépatocellulaires (Toutirais et al. , 2009). Certains T V9V2 expriment un récepteur appartenant à la famille des NCR, décrit dans l'activation des cellules NK, le NKp44. Ce récepteur a différents types de ligands qui sont PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen), MLL5 (Mixed-Lineage Leukemia-5) et des hémagglutinines présents à la surface de certains virus tels que le virus Influenza ou le Poxvirus. Il a été décrit que ce récepteur NKp44 serait impliqué dans l'activité cytotoxique des T V9V2 contre des cellules de myélome multiple (von Lilienfeld-Toal et al. , 2006). 2. TLR Les TLR, appartenant à la famille des PRR, sont exprimés par de nombreux types cellulaires dont les T V9V2 frachement isolés de sang périphérique de donneurs sains. Leur stimulation sur les T V9V2 de façon générale entraine un signal activateur qui, en parallèle d'une stimulation du TCR, va entrainer le déclenchement de fonction effectrices diverses par ces cellules. Certains clones de T V9V2 expriment les TLR-2, 3 et 5 (Beetz et al. , 2008). 46 La stimulation du TLR-3 par un ligand synthétique Poly (I : C), en présence d'une activation du TCR, induit une augmentation de la sécrétion de cytokines telles que l'IFN- et le TNF et des chimiokines par les T V9V2 (Beetz et al. , 2008 ; Wesch et al. , 2006). Il a aussi été démontré que la stimulation du TLR-2 et du TLR-5 (par leurs ligands respectifs le lipopeptide Pam3Cys et la flagelline) en parallèle d'une stimulation du TCR induit quant à elle une augmentation de la production de d'IFN- et d'IL-8 par ces cellules (Pietschmann et al. , 2009). 3. Fc Récepteurs (FcR) : Certains T V9V2 expriment des récepteurs aux Fc des Ig (FcRIIIA /CD16), exprimés également par les cellules NK et impliqués dans leur activité cytotoxique par ADCC (antibody- dependent cell-mediated cytotoxicity). Ainsi il a été démontré qu'après une activation du TCR par des P-Ags, la stimulation de ce récepteur entraine une augmentation de la production de TNF (Lafont et al. , 2001). De plus, il a été démontré que la stimulation du FcR sur les T V9V2 augmente leur activité cytotoxique en présence de cellules de neuroblastomes in vitro et des cellules de lymphomes (Daudi, Raji) (Fisher et al. , 2014 ; Tokuyama et al. , 2008). Ces propriétés ont été particulièrement utilisées dans le cas d'immunothérapie ayant pour cibles des cellules tumorales. Nous verrons plus en détail ces propriétés par la suite (partie II. D. 1. ). 4. Molécules d'adhérence L'efficacité d'activation des fonctions effectrices des T , comme celle de la plupart des lymphocytes, nécessite des récepteurs de surface autres que le TCR, en particulier des molécules d'adhésion. Ainsi les T V9V2 expriment des molécules d'adhésion telles que LFA- 1, CD2 et CD6. LFA-1 appartient à la famille des intégrines et est exprimé pas des lymphocytes B, T ainsi que des cellules de l'immunité innée. Ce récepteur a pour ligand la molécule ICAM-1 qui est surexprimée par des lignées tumorales. Ainsi, en présence d'un traitement ABP, la reconnaissance d'ICAM-1 exprimé par ces cellules tumorales favorise l'activation des T V9V2 (Benzaid et al. , 2012 ; Kato et al. , 2003). Les T V9V2 expriment aussi la molécule CD2, appartenant à la superfamille des Ig, et qui a pour ligand LFA-3. L'interaction entre CD2 et LFA-3 augmente l'activité cytotoxique et la sécrétion de TNF par des clones de T V9V2 lorsqu'ils sont en co-culture avec des cellules cibles traitées par des P-Ags (Wang and Malkovsky, 2000). Le CD6, un membre de la famille des récepteurs Scavenger , décrit à la surface des lymphocytes T et B, est impliqué dans l'activation des T V9V2 par des cellules tumorales 47 traitées par des P-Ags, via son interaction avec la molécule CD166 (Kato et al. , 2006). Ce récepteur jouerait davantage un rôle de corécepteur en augmentant le signal TCR de ces lymphocytes. Figure 13 : Les différents récepteurs impliqués dans la régulation de l'activation des T V9V2. Les récepteurs appartenant à la famille des NKR activateurs, NCR, TLR, FcR, molécules d'adhérence, et le TCR induisent des signaux activateurs ( ) aux T V9V2. Les récepteurs appartenant à la famille des NKR inhibiteurs induisent des signaux inhibiteurs (-) aux T V9V2. 48 D. Fonctions effectrices des TV9V2 Il est connu depuis de nombreuses années que les T V9V2 ont une activité antibactérienne contre mycobacterium tuberculosis, grâce à la mise en évidence des premiers P-Ags stimulants issus de ces bactéries, TUBag 1-4 (TUBag 1 étant le HDMAPP). Depuis, il a été montré que ces cellules sont capables de reconnaitre le HDMAPP produit par un grand nombre de bactéries et parasites : Escherichia Coli, Brucella, Listeria, Mycobacterium, Campylobacter, Francisella, Pseudomonas, Salmonella, Yersinia, aussi bien que Plasmodium et Toxoplama (Eberl et al. , 2003). Les T V9V2 ont particulièrement été étudiés pour leurs propriétés anti-tumorales, et plus récemment, pour leurs propriétés antivirales. Dans ce cas, les T V9V2 reconnaissent des P-Ags endogènes produits par la voie du MVA des cellules cibles. De nombreuses études montrent qu'après une stimulation par des P-Ags, les T V9V2 périphériques engagent une réponse de type Th1 caractérisée par une production de cytokines IFN- et de TNF ainsi qu'une activité cytotoxique (Dunne et al. , 2010). 1. Immunité anti-tumorale Les cellules immunitaires présentes dans le microenvironnement tumoral peuvent influencer la progression et le devenir des tumeurs. En effet, différentes sous-populations de cellules immunitaires présentes dans ce microenvironnement participent au contrôle et à l'élimination des cellules cancéreuses. Les T contribuent à cette immunité et cela a été démontré face à différents types de cancers tels que les lymphomes, les myélomes, les mélanomes, les cancers du sein, du colon, du poumon, des ovaires, du rein et de la prostate (Lafont et al. , 2014). Ces cellules peuvent agir directement par cytotoxicité et par la production de cytokines agissant contre les cellules tumorales, ou indirectement en stimulant et/ou régulant les fonctions effectrices d'autres cellules telles que les cellules dendritiques ou les T CD8 qui sont requises pour l'initiation et le maintien d'une réponse immunitaire efficace. Les T V9V2 sont capables de reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales par différents mécanismes qui vont en particulier dépendre du type de tumeurs : - Dans les cellules saines, la concentration d'IPP produit par la voie MVA est trop faible pour être détectée par les T V9V2. Cependant, il est observé une dérégulation de cette voie dans certains types de cellules tumorales menant à une surproduction d'IPP qui peut être ainsi reconnue par les T V9V2 (Gober et al. , 2003 ; Uchida et al. , 2007). De façon similaire, le traitement de cellules tumorales par des ABP entraine une accumulation d'IPP plus importante 49 que dans des cellules saines ce qui les rend stimulantes pour les T V9V2 (Dhar and Chiplunkar, 2010 ; Mattarollo et al. , 2007). - Les cellules tumorales sont capables de moduler l'expression de certains ligands des récepteurs NKR décrits sur les T V9V2. En effet, certaines cellules tumorales ont une surexpression des molécules MIC et ULBP ce qui entraine une activation de la sécrétion d'IFN- , et de TNF ainsi qu'une activité cytotoxique par la stimulation du récepteur NKG2D (Das et al. , 2001a ; Rincon-Orozco et al. , 2005). Par exemple, les molécules ULBP sont augmentées sur des cellules de leucémies, ou de lymphomes et également sur des cellules issues de tumeurs solides telles que les carcinomes du colon ou des ovaires (Deniger et al. , 2014 ; Lanca et al. , 2010). L'expression d'autres ligands de NKR est modulée dans les cellules tumorales : l'expression du ligand de DNAM-1 (CD155) est augmentée dans certaines tumeurs, ce qui induit une activation des T V9V2 en coopération avec un stimulus du TCR et du NKG2D (Toutirais et al. , 2009). A l'inverse, des ligands de NKR inhibiteurs peuvent être moins exprimés par les cellules tumorales comme des molécules de CMH classiques et non classiques. - D'autres récepteurs sont impliqués dans la reconnaissance des cellules tumorales tels le récepteur CD16 (FcRIIIA). En effet, les T V9V2 peuvent être activés par les Ig monoclonales thérapeutiques utilisées pour le traitement de certains cancers à travers une activité ADCC médiée par leur CD16 (Gertner-Dardenne et al. , 2009). Ces données ont été renforcées par une étude chez l'Homme dans laquelle il a été montré que les T V9V2 augmentent l'efficacité du traitement à base d'Ig (Trastuzumab) dirigées contre la protéine HER2 (récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain) chez des patients atteints de cancer du sein (Capietto et al. , 2011). De plus, la combinaison d'une amplification ex vivo des T V9V2 CD16 et le traitement par des Ig monoclonales (Rituximab et Trastuzumab dirigées contre HER2 et CD20) induit une augmentation de l'activité cytotoxique des T V9V2 par ADCC, ce qui permet de cibler les cellules tumorales résistantes au traitement Ig seul (Tokuyama et al. , 2008). Par conséquent, les T V9V2 sont capables de répondre face à des cellules tumorales par la production de cytokines de types pro-inflammatoires et/ou par une activité cytotoxique. Cette réponse est variable et implique différents récepteurs selon le type de tumeur. Suite à ces travaux sur le potentiel anti-tumoral des T V9V2 in vitro, des études in vivo ont été entreprises. Les T V9V2 étant absents chez la souris, les études précliniques ont été limitées à des études utilisant des souris immunodéficientes (SCID) xénogreffées par des tumeurs humaines et dans lesquelles ont été injectées des T V9V2 humains amplifiés avec un P-Ags ou des ABP et de l'IL-2. Ainsi il a été observé une caractéristique importante 50 de ces lymphocytes principalement localisés dans le sang périphérique : leur capacité d'infiltration des tumeurs. Après injection de T V9V2 dans des souris xénogreffées avec des tumeurs de sein ou des carcinomes de la vessie, il a été observé une infiltration de T V9V2 et une inhibition de la progression des tumeurs (Capietto et al. , 2011 ; Yuasa et al. , 2009). Ceci est corrélé avec une diminution de cette population dans le sang périphérique. D'autres études ont été réalisées à partir de souris xénogreffées avec des tumeurs de mélanome ou d'adénome pancréatique avec des résultats similaires : diminution de la progression de la tumeur et augmentation de la survie des souris (Kabelitz et al. , 2004). Il a également été montré que les T V9V2 peuvent infiltrer des xénogreffes tumorales mammaires humaines et freiner la croissance de ces tumeurs in vivo chez la souris (Benzaid et al. , 2012 ; Benzaid et al. , 2011) Ces démonstrations in vitro et in vivo du potentiel anti-tumoral des T V9V2 ont amené à mettre au point des protocoles d'immunothérapies anti-cancéreuse chez l'Homme à partir de ces lymphocytes. Ainsi des essais cliniques ont été entrepris utilisant soit des P-Ags synthétiques BrHPP (Phosphostim) soit des ABP. Différentes stratégies ont été réalisées sur des patients atteints de cancers hématologiques ou des tumeurs solides (Figure 14) (Fournie et al. , 2013) : - Transfert adoptif de T V9V2 autologues préalablement amplifiés ex vivo par des P-Ags ou des ABP et en présence d'IL-2 (Figure 14A) ; - Pas d'amplification ex vivo mais une amplification directement in vivo par l'administration au patients de P-Ags ou d'ABP ainsi que de l'IL-2 (Figure 14B). Figure 14 : Stratégies d'immunothérapie anticancéreuse utilisant les T V9V2. Modifiée d'après (Castella et al. , 2011) 51 Des résultats cliniques encourageants ont montré globalement une bonne tolérance des traitements et un ralentissement de la progression tumorale dans certains cas. Cependant, un grand nombre de patients n'ont pas répondu au traitement laissant supposer que des ajustements des protocoles doivent être réalisés (Fournie et al. , 2013). 2. Rôle des T V9V2 face à des virus Parmi les différents types de cellules impliquées dans l'immunité innée, les T sont connus pour exercer une activité antivirale contre différents virus tels que les rétrovirus, les flavivirus, les paramyxovirus, orthomyxovirus, picornavirus, coronavirus, arénavirus, herpesvirus, hepadnavirus et le virus de l'orthopoxvirus (Poccia et al. , 2005). Alors que ce sont majoritairement les T V2négatifs (V2neg) qui sont décrit pour leurs propriétés antivirales, les T V9V2 sont de plus en plus étudiés pour un potentiel antiviral similaire grâce à l'utilisation des P-Ags ou des ABP. Ainsi l'activité des T V9V2 a été notamment étudiée lors d'infection par le coronavirus, le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), virus de l'hépatite C (HCV), le virus de la grippe (Influenza) et le virus d'Epstein-Barr (EBV). a) Coronavirus Le syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) est causé par une nouvelle souche de Coronavirus (SARS-CoV). Chez les patients atteints du SRAS, il a été montré une expansion de la population T V9V2 associée à un fort taux d'Ig anti-SARS-CoV, 3 mois après le début des premiers symptômes (Poccia et al. , 2006). Des expériences de co-culture in vitro démontrent que les T V9V2 pré-activés en présence de P-Ags sont capables d'inhiber la réplication virale du coronavirus (Poccia et al. , 2006). Cette inhibition est en partie induite par la production d'IFN-. Cependant, à l'heure actuelle, aucune étude n'a confirmé cette observation in vivo. b) VIH Le VIH est un rétrovirus responsable du syndrome de l'immunodéficience acquise (SIDA) chez l'Homme. Il est observé une inversion du rapport V1 /V2 circulants (augmentation du nombre de T V1 associé à une diminution du nombre de T V2 ) chez des patients infectés par le VIH (De Paoli et al. , 1991 ; Poccia et al. , 1996). D'après une étude menée sur le macaque, il semblerait que cette expansion de T V1 soit une conséquence indirecte de l'infection virale et reflète une augmentation de translocation de produits bactériens dans l'épithélium intestinal (Harris et al. , 2010). Il a été montré que les T V1 induisent la lyse des cellules infectées par une reconnaissance via les récepteurs NKp30 et CD94/NKG2C (Fausther-Bovendo et al. , 2008 ; Hudspeth et al. , 2012). Cependant ces 52 lymphocytes T V1 sont aussi capables de lyser des cellules non infectées ce qui a pour conséquence qu'à l'heure actuelle, nous ne savons pas si ces cellules accélèrent ou ralentissent la progression virale du VIH (Sindhu et al. , 2003). De plus, le fait que l'antigène reconnu par les T ne soit pas connu limite les études potentielles d'immunothérapie. En parallèle de cette expansion de T V1 , le nombre de T V2 a tendance à diminuer chez des patients atteints du VIH (sans traitement) avec des déclins importants chez les personnes à un stade d'infection tardif ayant une forte diminution du pool T CD4 , une virémie élevée et l'apparition d'infections opportunistes (Hermier et al. , 1993). De plus, cette inversion du rapport V1 /V2 fait partie des évènements précoces de la maladie VIH au stade ou le rapport T CD4/ T CD8 n'a pas encore été affecté. Des études ont montré que cette déplétion en T V2 est associée à une anergie fonctionnelle de ces cellules qui se manifeste par une diminution de la prolifération et de la sécrétion de cytokines après stimulation par des antigènes bactériens ou des cellules tumorales (Poccia et al. , 1996 ; Wallace et al. , 1997). Cependant, ces cellules pourraient avoir un rôle intéressant car il a été observé d'une part une expansion rapide juste après une infection chez les macaques, suivi d'un rapide déclin, et d'autre part, elles développent in vitro un effet antiviral (Gan et al. , 1995). En effet, ces cellules seraient impliquées dans l'immunité anti-VIH en particulier par la production de chimiokines et cytokines (RANTES et d'autres) qui permettent de bloquer l'entrée du virus et/ ou la réplication (Lehner et al. , 2000 ; Poccia et al. , 1999). Ainsi, les T V9V2 semblent être une cible intéressante d'immunothérapie, en particulier par l'utilisation d'ABP couplés à de l'IL-2 afin d'augmenter leur nombre et leurs fonctions effectrices. Dans ce but, une étude pilote a été menée utilisant du zolédronate et de l'IL-2 (Poccia et al. , 2009). Cette approche n'a montré aucun effet délétère important pour les patients. Il a été observé une expansion de T V9V2 matures et activés ainsi qu'une augmentation de cellules dendritiques matures et de TCD8 fonctionnels, ce qui irait dans le sens d'une restauration de réponses immunitaires innées et adaptatives. Toutefois, cette étude doit être répétée et confirmée pour son utilisation en immunothérapie anti-VIH (Pauza et al. , 2014). Cependant, il a récemment été montré que le traitement par trithérapie (HAART) utilisée chez les patients atteints du VIH altère les fonctions effectrices des T V9V2 ce qui complique l'utilisation d'une immunothérapie utilisant ces cellules (Casetti et al. , 2015). c) HCV Le HCV appartient à la famille des flaviviridae et est responsable d'hépatites pouvant entrainer une cirrhose chez l'Homme. De façon comparable aux infections par le VIH, il est observé une diminution du nombre de T V2 circulant chez des patients atteints d'infections chroniques par le HCV (Par et al. , 2002). Cette population, préalablement stimulée en 53 présence des P-Ags (IPP, BrHPP) ou des ABP (zolédronate), entraine l'inhibition de la réplication virale du HCV in vitro (Agrati et al. , 2006). Cette activité antivirale serait médiée par la production d'IFN- et non à une activité cytotoxique directe. A l'heure actuelle aucune étude in vivo n'a été faite quant à ce potentiel antiviral des T V9V2 en présence de HCV. Cependant, il pourrait être intéressant d'essayer de cibler spécifiquement les T V9V2, en particulier par l'utilisation d'ABP couplés à de l'IL-2, comme décrit précédemment dans le cas des infections par le VIH. d) Virus de la grippe Il a récemment été mis en évidence un rôle antiviral des T V9V2 contre le virus Influenza. Les T V9V2 pré-activés avec de l'IPP ou des ABP (pamidronate) in vitro, présentent une activité cytotoxique en présence de Macrophages dérivés de monocytes ou de cellules épithéliales alvéolaires infectées par différentes souches d'Influenza (H1N1, H9N2) in vitro (Li et al. , 2013 ; Qin et al. , 2009). Dans ce contexte, les T V9V2 pré-activés sont capables d'induire la mort des cellules infectées par contact direct avec celles-ci, via l'activation du récepteur NKG2D. Cette activité cytotoxique implique une dégranulation de Perforine/Granzyme ainsi que le système Fas-Fas ligand. De plus, ces cellules sont aussi capables d'inhiber la réplication virale via la production d'IFN- (Qin et al. , 2011). Enfin, il est observé une diminution de la sévérité des pathologies associées à l'infection par le virus Influenza de souris humanisées (souris Rag-/- c-/- reconstituées avec des PBMC humains) infectées lorsqu'elles sont traitées par des ABP (pamidronate) in vivo (Tu et al. , 2011). En effet, le traitement par des ABP diminue la perte de poids, l'inflammation des poumons et augmente la survie de ces souris. Cet effet n'est pas observé lorsque les T V9V2 sont préalablement déplétés des PBMC, supposant donc que ceux-ci ont un rôle majeur dans la diminution de la sévérité de la maladie observée. Par conséquent, les T V9V2 pré-activés par des P-Ags ou des ABP pourraient avoir une activité antivirale contre le virus Influenza (Tu et al. , 2011). e) EBV Des résultats similaires à ceux décrits lors d'infections par Influenza ont été observés en présence du virus EBV (Xiang et al. , 2014). Des T V9V2 amplifiés avec des ABP (Pamidronate) in vitro sont capables de lyser spécifiquement des cellules transformées par EBV grâce à la stimulation du récepteur NKG2D et leur TCR menant à une activité cytotoxique médiée par Fas et TRAIL. De plus, les auteurs ont démontré une activité des T V9V2 in vivo à partir de souris immunodéficientes et humanisées. En effet, chez des souris immunodéficientes (Rag-/-c-/-) qui ont été inoculées avec des cellules tumorales transformées par EBV, le transfert de T V9V2 (amplifiés in vitro à partir de Pamidronate) 54 induit une régression de la tumeur et des complications associées. Des résultats similaires ont été observés à partir de souris humanisées (reconstituées avec des PBMC humains). Ainsi cette étude, démontre un potentiel anti-EBV des T V9V2 suite à un traitement par des ABP. 55 56 CHAPITRE 2 : Le Cytomégalovirus humain 57 I. Généralités sur le HCMV A. Généralités 1. Historique Au début du XXème siècle, Dr Ribbert ainsi que Jesionek et Kiolemenoglou ont décrit pour la première fois la présence de cellules dites cytomégaliques au niveau de différents organes (reins, foie, poumons et glandes salivaires) issus d'autopsies d'enfants mort-nés. Ils ont alors désigné cette pathologie : la maladie des inclusions cytomégaliques . En 1930 puis en 1950, des inclusions cytomégaliques ont aussi été retrouvées dans les vaisseaux sanguins issus du cordon ombilical de nouveau-nés décédés. En 1955, l'équipe de Weller a fait la corrélation entre les différents symptômes de cette maladie et la présence de cellules présentant ces inclusions cytomégaliques dans les urines des patients. De plus, ils ont observé que ces cellules étaient caractérisées par des inclusions virales nucléaires et cytoplasmiques par microscopie électronique. Ils ont alors identifié ce virus comme l'agent responsable de cette maladie. Après avoir réussi à isoler ce virus pour la première fois en 1956, Weller décide de nommer cet agent infectieux Cytomégalovirus en raison de l'augmentation de la taille des cellules infectées observée. Deux autres groupes ont isolé le virus dans les années 50, l'équipe de Smith et de Rowe (1956) (Figure 15). Dans les années 1970, le lien entre l'infection lors de la grossesse et les séquelles neurologiques chez le nouveau-né est mis en évidence, ainsi que la corrélation entre la baisse des défenses immunitaires et la réactivation virale. A ce jour le cytomégalovirus reste un problème de santé publique chez les personnes immunodéprimées et lors d'infection congénitale. Figure 15 : Inclusions nucléaires de fibroblastes infectés par une souche humaine de HCMV isolée par l'équipe de MG Smith en microscopie électronique (x60 000) (Luse and Smith, 1958) 58 2. Classification Les Herpesvirus, appartenant à la famille des Herpesviridae, ont co-évolué avec leurs hôtes vertébrés depuis plus de cent millions d'années (McGeoch et al. , 2000). La famille des Herpesviridae comporte 3 sous-familles : les -, - et -herpesvirinae (Tableau 5). Les virus appartenant à cette famille sont caractérisés par leur capacité à produire des infections latentes et persistantes tout au long de la vie de l'individu. De plus, les herpesvirus ont tous la même composition : un génome d'ADN linéaire double brin de taille relativement importante, encapsulé dans une capside icosaédrique, elle-même enveloppée dans une bicouche lipidique, l'enveloppe. Le cytomégalovirus humain (HCMV), aussi appelé human herpesvirus 5 (HHV-5), appartient à la sous famille des -herpesvirinae des Herpesviridae. Les -herpesvirinae ont pour particularité d'avoir un cycle réplicatif long comparé aux autres sous familles, ainsi que d'établir une latence dans les leucocytes. Tout comme le virus EBV, les herpesvirus humain de type 1, 6, 7, et 8, le HCMV est capable de se réactiver de façon périodique et d'entrainer la production de nouveaux virions infectieux. Ce virus a un spectre d'hôte restreint à une seule espèce, l'Homme, mais a un tropisme large car il peut infecter une grande variété de types cellulaires comme les fibroblastes, les trophoblastes placentaires, les cellules épithéliales, endothéliales, les macrophages, les cellules dendritiques, les neutrophiles, les hépatocytes, les cellules stromales médullaires, les cellules musculaires lisses, mais aussi des cellules du système nerveux central tels que les neurones, les astrocytes et les cellules progénitrices neuronales. (Luo et al. , 2008 ; Mocarski et al. , 2007b) . De plus, le HCMV est capable d'établir une latence dans les cellules des lignées myéloïdes telles que les monocytes et leurs précurseurs hématopoïétiques CD34 , et dans les cellules endothéliales. 59 Tableau 5 : Classification des Herpesvirus de la famille des Herpesviridae (Crough and Khanna, 2009) B. Epidémiologie L'Homme est le seul réservoir du HCMV. Ce virus touche la population mondiale avec une répartition qui varie selon les zones géographiques sans variations saisonnières. Ainsi le HCMV a une séroprévalence de 30 à 70% dans les pays développés et de 80 à 100% dans les pays en développement. En France, la séroprévalence est de 50-60%. Cette prévalence varie dans la population selon différents critères : l'âge, le sexe et les facteurs socio- économiques. En effet, la prévalence augmente avec l'âge et on observe deux pics d'incidence : l'un durant l'enfance entre 0 et 5 ans, puis l'autre pendant l'adolescence et chez le jeune adulte (entre 15 et 20 ans). De plus, les personnes nées dans des pays sous- développés ou en développement ont une primo-infection plus précoce par le HCMV en particulier en raison des conditions sanitaires. Le HCMV a pour particularité de persister dans l'organisme tout au long de la vie de l'individu : la personne une fois infectée, est dite séropositive pour le HCMV. Ainsi, chez un individu séropositif, le virus reste sous forme latente et pourra se réactiver de façon périodique suite à certains stimuli. 60 Le HCMV se transmet uniquement par contact étroit car c'est un virus particulièrement fragile dans le milieu extérieur. Ainsi, le HCMV peut se transmettre par contact direct avec les fluides corporels tels que la salive, les larmes, les urines, le sang, le sperme et les secrétions cervicales d'un individu séropositif. La contamination par voie sexuelle est un mode de transmission majeur qui explique le pic d'incidence d'infection obtenu chez le jeune adulte (Coonrod et al. , 1998). Le HCMV peut aussi se transmettre de la mère à l'enfant. C'est le mode de contamination le plus répandu. Cette transmission peut s'effectuer durant la grossesse in utero par voie trans-placentaire, mais aussi lors de l'allaitement à travers le lait maternel. Cette contamination peut s'effectuer dans deux cas principalement : si la mère est séropositive avant la grossesse ou bien si la mère séronégative et est infectée durant sa grossesse (particulièrement à risque lors du premier trimestre). Une ré-infection de la mère séropositive peut aussi être à l'origine d'une transmission du virus au fœtus. On compte 20 000 à 40 000 cas d'infections congénitales ou néonatales chaque année dans les pays développés. Il est décrit que le risque de primo-infection pendant la grossesse est d'environ 2% avec un risque de transmission au fœtus de moins de 40% (Griffiths et al. , 2015). De plus, 1% des mères séropositives avant leur grossesse ont un nouveau-né ayant subi une infection congénitale par le HCMV (Griffiths et al. , 2013). En 2007, une revue a été publiée regroupant les données épidémiologiques de 15 études faites dans des pays industrialisés sur les infections congénitales et néonatales par le HCMV (Dollard et al. , 2007). D'après ces données, il est détecté du HCMV dans les urines de moins de 1% des nouveau-nés. Sur ces nouveau-nés infectés, seulement 12. 7% ont des symptômes associés au HCMV à la naissance. De plus, 32% des mères séropositives transportent du HCMV dans leur lait maternel et 69% des nourrissons sont ainsi infectés suite à l'allaitement (Hamprecht et al. , 2008). Dans les pays développés un troisième mode de transmission existe lors des transplantations d'organes : la transmission iatrogène. En effet, lorsque le donneur d'organes est séropositif, le virus peut être transmis à l'individu receveur. Environ 80% des donneurs séropositifs transmettent du HCMV au receveur d'organe hépatique ou rénal (Atabani et al. , 2012). De plus, les personnes transplantées sont généralement sous immunosuppresseurs, ce qui est corrélé à un risque plus important de réactivation virale (Mori et al. , 2004). 61 C. Pathologies associées aux infections HCMV Le HCMV n'est pas à l'origine de graves pathologies chez un individu sain, principalement en raison d'une réponse efficace du système immunitaire. Par contre, chez une personne ayant un système immunitaire peu fonctionnel tel que les individus immunodéprimés (personnes transplantées ou bien atteintes du SIDA), les fœtus et les nouveau-nés, le HCMV peut entrainer de graves pathologies. 1. Infection d'individus sains immunocompétents La primo-infection d'un individu sain est généralement asymptomatique. Dans certains cas, le HCMV peut entrainer des symptômes cliniques de type mononucléose (fièvre et myalgies) (Mocarski et al. , 2007a). Dans de rares cas, le HCMV peut causer des pneumopathies, hépatites, myocardites, arthrites, arthralgies ou des maladies gastro- intestinales chez des patients sains (Figure 16). 2. Infection d'individus immunodéprimés a) Personnes transplantées d'organe solide L'infection par le HCMV est une cause majeure de complication chez les personnes transplantées, en particulier chez les individus transplantés de reins (Lucia et al. , 2014). Ainsi, l'infection par HCMV est l'infection virale la plus fréquente en transplantation rénale. Malgré un dépistage, il est en pratique difficile de limiter la transplantation d'organes entre donneur et receveur en fonction de leur statut HCMV. Par conséquent, le HCMV reste une cause importante de morbidité lors de transplantation, malgré des traitements et une surveillance accrue des patients. Les complications du HCMV sont plus importantes dans le cadre de transplantation donneur séropositif / receveur séronégatif. Ces patients manifestent des complications telles que de la fièvre, une leucopénie, une arthralgie ainsi que des hépatites, pneumopathies, myocardites, arthrites, entérocolites, pancréatites en fonction de l'organe transplanté. L'apparition de ces pathologies est corrélée avec une présence de HCMV dans le sang et les organes concernés. De plus, le HCMV est impliqué dans des dommages indirects sur les patients transplantés comme le rejet d'allogreffes aigus ou chroniques (Sagedal et al. , 2002). b) Personnes transplantées de cellules souches hématopoïétiques L'infection par le HCMV est plus fréquente dans le cas de transplantation de cellules souches hématopoïétiques que lors de transplantation d'organe solide. Ceci est 62 principalement dû à la réactivation de virus latent présent dans les cellules souches hématopoïétiques de donneurs séropositifs (Castro-Malaspina et al. , 2002). Dans le cas d'une transplantation donneur séropositif / receveur séronégatif, le risque d'infection du patient transplanté est d'environ 17%. Dans les 100 premiers jours après la transplantation, l'infection par HCMV est souvent responsable de pneumopathie et d'entérocolite, avec par exemple une mortalité allant de 60-80% sans traitement après une pneumopathie. A l'heure actuelle les traitements antiviraux limitent considérablement les complications associées au HCMV et augmentent de façon significative la survie des patients transplantés (Crough and Khanna, 2009). c) Personnes infectées par le VIH L'infection par le HCMV reste une des infections virales les plus répandues chez les patients atteints du SIDA. La manifestation la plus fréquente est l'apparition de rétinite. Avant la mise en place de la trithérapie antivirale (HAART), 25% des patients atteints du SIDA développaient des rétinites pouvant aller jusqu'à la cécité. Aujourd'hui, son incidence a considérablement diminué grâce aux traitements antiviraux. En effet, l'utilisation de la trithérapie a permis de réduire la charge virale de VIH mais aussi celle du HCMV avec les complications qui lui sont associées (Foca et al. , 2012). D'autres pathologies induites par l'infection HCMV peuvent être observées chez ces patients telles que des entérocolites, gastrites, œsophagites, hépatites, encéphalopathies 3. Infection congénitale et néonatale L'infection congénitale à HCMV est l'une des causes les plus importantes de séquelles à long terme chez les nouveau-nés. Elle peut être responsable de morbidité et mortalité chez le nouveau-né. En effet, lors d'atteintes précoces durant la grossesse, l'infection peut entrainer la mort in utero du fœtus. Dans les pays développés, 13 % des nouveau-nés infectés ont des symptômes cliniques associés au HCMV à la naissance parmi lesquels environ 50% développeront des séquelles permanentes (Dollard et al. , 2007). En France, environ 5 à 10% des enfants infectés in utero naissent avec des anomalies. Le HCMV peut entrainer de graves anomalies neuro-développementales telles que des microcéphalies, encéphalites, lissencéphalies, des troubles sensoriels (vue, ouïe) ou bien encore des retards mentaux. La perte d'audition est le symptôme le plus fréquent suite à une infection congénitale à HCMV, elle touche environ 10-15% des nouveau-nés infectés avec des symptômes visibles à la naissance (Dollard et al. , 2007). Le risque de développer ce type de pathologie est plus fréquent lors d'infection congénitale chez la mère séronégative que lors de réactivation de virus latent chez la mère séropositive ou bien d'infection périnatale lors de l'allaitement. 63 D'autres pathologies peuvent être causées par le HCMV tels qu'une jaunisse, une hépatosplénomégalie, et une hépatite chez le nouveau-né. De plus, certaines pathologies peuvent apparaitre tardivement, c'est le cas notamment pour la surdité. Figure 16 : Manifestations cliniques d'une infection HCMV. Les individus séropositifs possèdent du virus sous forme latente. Le virus peut causer des effets indirects par notamment l'expression de transcrits de latence (Immunosuppression, rejet de greffe et autres). Le virus latent peut aussi être réactivé, dû à une immunosuppression (traitement suite à la greffe, HIV, grossesse et autres) menant à une réplication active du virus qui entraine l'apparition de maladies associées au HCMV mais aussi des effets indirects décrits précédemment. Une nouvelle transmission (transplantation, transfusion, sécrétion) peut aussi entrainer l'apparition de ces pathologies. Ces maladies associées au HCMV sont : des (inflammation périventriculaire) détectés en IRM (à gauche) et post-mortem (à droite), hépatites (coupe histologique), colites (ulcère profond dans une biopsie de colon), pneumonies (image d'un scan du poumon) (Boeckh and Geballe, 2011). (vue ophtalmoscopique d'hémorragie rétinites rétinienne), épendymites 64 4. Implication dans le cancer ? Des données laissent supposer que le HCMV pourrait jouer un rôle dans certains cancers d'origine épithéliale et neuronale. Cependant, les premières données démontrant une détection d'antigènes HCMV dans des coupes histologiques de glioblastome ont fortement été controversées (Cobbs et al. , 2002). Depuis des études ont confirmé ces résultats dans d'autres types de cancer tels que les cancers du côlon ou les médulloblastomes (Baryawno et al. , 2011). D'autres équipes n'ont montré aucune détection du HCMV, ce qui fait qu'à l'heure actuelle, le sujet reste discuté (Soderberg-Naucler and Johnsen, 2015). Le rôle précis du HCMV dans le glioblastome multiforme n'est toujours pas clair. A l'inverse d'autres herpesvirus comme le virus d'EBV, il est clair que le HCMV n'est pas un virus oncogène. Cependant, celui- ci pourrait avoir un effet oncomodulateur en jouant un rôle dans l'initiation et la progression des tumeurs (Barami, 2010). Par exemple, la protéine pp71 du HCMV a été décrite comme contribuant à l'angiogenèse observée dans les glioblastomes (Matlaf et al. , 2013). Ainsi, le HCMV semblerait être une nouvelle cible thérapeutique dans le cas de certains cancers, notamment dans le cas de glioblastome (Schuessler et al. , 2014). D. Traitements actuels et vaccination A l'heure actuelle, il existe plusieurs traitements antiviraux efficaces contre le HCMV. Les plus utilisés sont le Ganciclovir, le Valganciclovir, le Foscarnet et le Cidofovir. Ces traitements sont utilisés de façon curative et préventive chez des patients immunodéprimés. Ils ont comme point commun leur cible : l'ADN polymérase virale. Par exemple, le ganciclovir, qui est le traitement antiviral le plus utilisé, est un analogue de guanosine qui est phosphorylé dans la cellule infectée. Une fois triphosphorylé, le ganciclovir exerce son activité par deux mécanismes : inhibition compétitive de l'ADN polymérase et incorporation de celui-ci dans l'ADN viral ce qui a pour conséquence un arrêt de l'élongation et donc de la réplication virale. Malheureusement, l'utilisation prolongée d'antiviraux chez les patients immunodéprimés a mené à l'émergence de mutations sur le génome du HCMV qui sont à l'origine de souches virales résistantes à ces traitements. Ainsi des mutations sont apparues sur la séquence de la kinase UL97 impliquée dans la phosphorylation du ganciclovir. L'ADN polymérase UL54 peut elle aussi être mutée ce qui rend également le virus résistant aux molécules antivirales (Komatsu et al. , 2014). En parallèle de ces traitements antiviraux, il peut être administré des immunoglobulines hyper-immunes anti-HCMV. Celles-ci sont utilisées à but prophylactique et toujours avec les traitements antiviraux nommés précédemment. Ces traitements peuvent être utilisés avant 65 une transplantation d'organe à risque (donneur séropositif / receveur séronégatif). L'administration de ces immunoglobulines à des patients transplantés de reins diminue l'incidence de complications associées à l'infection par HCMV (Snydman et al. , 1987). De plus, celles-ci peuvent aussi être utilisées en prévention pour éviter les transmissions du virus au fœtus lors de l'infection congénitale (Nigro et al. , 2005). Actuellement peu utilisé, le transfert adoptif de lymphocytes T a aussi fait ses preuves pour le traitement de l'infection par HCMV chez les patients transplantés (Crough and Khanna, 2009). En effet, le transfert de clones de T CD4 ou CD8 spécifiques du virus (culture de lymphocytes préalable en présence de cellules dendritiques chargées avec des lysats viraux) permet une réponse T efficace contre celui-ci, diminuant significativement la virémie chez les patients (Peggs et al. , 2003). A l'heure actuelle, il n'existe pas de vaccin contre le HCMV. Le problème réside principalement dans le fait que le virus, persistant tout au long de la vie de l'individu, est difficile à cibler spécifiquement. De plus le virus a mis en place des mécanismes d'échappement contre le système immunitaire. L'utilisation de virus atténués ou bien recombinants a été testée mais sans résultats bénéfiques. Récemment, des entreprises pharmaceutiques essaient de développer des protéines recombinantes du HCMV connues comme étant fortement immunogènes (pp65, gB, IE). Celles-ci sont en cours d'essais cliniques en phase 1 et/ou 2 pour le développement de vaccins. Ces protéines ont été testées sur des mères séronégatives et chez des patients avant une transplantation de rein ou de foie. Ainsi, un vaccin utilisant une protéine recombinante gB protège environ 50% des mères séronégatives et il a été observé une diminution de la charge virale chez les patients transplantés (Lilja and Mason, 2012). Cet effet serait obtenu en particulier par une stimulation de la production d'immunoglobulines anti- HCMV dans l'organisme. Cependant, bien que le vaccin stimule le système immunitaire, nous ne savons pas actuellement s'il protège de l'infection intra-utérine durant la grossesse et/ou bien de la réactivation virale (Griffiths et al. , 2013). Des essais cliniques en phases 2 et 3 pour ces potentiels vaccins sont en cours. E. HCMV et immunosénescence Le HCMV latent peut se réactiver, entrainant une infection chronique durant laquelle le virus est à nouveau produit à un bas niveau pendant des périodes de temps prolongées. Chez un individu immunocompétent, cet état d'infection chronique se produit par intermittence et est accompagné de changements substantiels phénotypiques des lymphocytes T spécifiques du HCMV. Chez les personnes âgées, il est observé une forte augmentation de la proportion de 66 T CD4 et T CD8 mémoires spécifiques du HCMV, pouvant atteindre près de 50% du répertoire lymphocytaire. Ainsi le HCMV aurait un rôle important dans l'immunosénescence (altérations immunitaires chez les personnes âgées) car un encombrement aussi important (près de la moitié) du répertoire immunologique au profit d'un seul virus pourrait nuire à la diversité du répertoire et compromettre les défenses dirigées contre d'autres agents pathogènes, les réponses anti-tumorales ou encore vaccinales. Cependant cette hypothèse est à l'heure actuelle controversée (Sansoni et al. , 2014). Par exemple, chez des individus jeunes et chez la jeune souris, le CMV pourrait augmenter les réponses immunologiques contre des antigènes différents de ceux-du HCMV (Pera et al. , 2014 ; Yager et al. , 2009). A l'inverse, chez les personnes âgées, différentes études suggèrent que la séropositivité pour le HCMV est liée à des dysfonctionnements dans les réponses immunitaires (immunosénescence) et est associée à des pathologies incluant des maladies cardiovasculaires, athérosclérose, mais aussi des cancers et une augmentation de la mortalité (Sansoni et al. , 2014). Ces observations suggèrent que le HCMV a un effet sur le système immunitaire qui dépend de l'âge de l'individu concerné. De plus, le HCMV peut influencer les réponses vaccinales contre d'autres agents pathogènes. Une récente étude menée par Furman et ses collaborateurs, montre que le CMV influence les réponses vaccinales contre le virus Influenza (virus de la grippe) et que cet effet est dépendant de l'âge de l'individu. En effet, ils ont observé que les jeunes individus séropositifs pour le HCMV ont une réponse anticorps et des T CD8 augmentées suite à la vaccination contre le virus influenza alors que, chez les personnes âgées séropositives, cette réponse est diminuée. De plus, ils ont aussi montré que les jeunes souris infectées par le MCMV sont davantage protégées contre le virus influenza comparées aux souris non infectées et cette protection diminue avec l'âge de l'animal (Furman et al. , 2015). Par conséquent, le HCMV semble jouer un rôle dans l'immunosénescence chez l'Homme mais ceci reste controversé à l'heure actuelle. 67 F. Biologie du HCMV 1. Structure La structure du HCMV est semblable à celles des autres Herpesvirus : Ce sont des virus à ADN double brin encapsulés dans une capside icosaédrique (proteinaceous capsid) elle-même entourée d'une matrice composée de protéines virales du tégument. L'ensemble est enveloppé d'une double couche lipidique contenant des glycoprotéines virales (Figure 17). Cependant, le HCMV a pour particularité d'avoir une taille importante de 200 à 300nm, c'est le génome le plus long des Herpesvirus. Figure 17 : Le HCMV (a) Modèle virtuel en 3D de la structure du HCMV. Modifié de (Gandhi and Khanna, 2004). (b) reconstitution 3D en cryo microscopie électronique de la capside du HCMV. Modifié de (Dai et al. , 2013) . a) Le génome viral Le génome du HCMV mesure environ 235kb contenant environ 200 gènes, dont certains codent pour des ARNs non codants, incluant environ 14 microARNs. Par convention, les gènes sont nommés par leur position dans le génome. Le génome du HCMV a une architecture caractéristique des herpesvirus de classe E. Il est constitué de 2 régions uniques : une région longue unique (UL) et une région courte unique (US). Ces 2 régions sont flanquées par des paires de séquences répétées internes et externes : TRL (terminal repeat long) et IRL (internal repeat long) entourent la région UL tandis que TRS (terminal repeat short) et IRS (internal repeat short) entourent la région US. Le génome existe sous 4 formes isomériques générées par inversion des régions UL et US (Sijmons et al. , 2014). Le génome possède plus de 200 cadres de lecture ouverts (Mocarski et al. , 2007c) 68 b) La capside La capside a une structure icosaédrique comprenant 12 pentons, 150 hexons, et 320 triplexes. Elle est composée d'au moins 5 protéines : Major capsid protein (MCP) codée par UL86, Smallest capsid protein (SCP) codée par UL48-49, Minor capsid protein codée par UL85, minor capsid binding protein codé par UL46, et des protéines d'assemblages codées par des fragments d'UL80. La MCP est la protéine la plus abondante (960 copies) de la capside et forme les pentons et hexons de cette dernière, tandis que la Minor capsid protein et minor capsid binding protein forme les triplexes qui sont localisés entre les pentons et hexons. La SCP quant à elle, a été démontrée comme décorant les hexons et ayant un rôle essentiel dans l'assemblage des virions, probablement par une interaction avec des protéines du tégument (Britt and Boppana, 2004). c) Le tégument Le tégument est la partie intermédiaire entre la capside et l'enveloppe. Celui-ci est formé par l'addition séquentielle de protéines d'abord dans le noyau puis dans le cytoplasme des cellules infectées. Le tégument est un compartiment qui contient la majorité des protéines virales. Approximativement 38 protéines virales tégumentaires différentes sont relarguées à l'intérieur de la cellule infectée durant l'infection. Cependant, ce compartiment contient aussi des protéines cellulaires et des ARN cellulaires dont le rôle est peu connu à ce jour. La majorité des protéines virales tégumentaires a pour particularité d'être phosphorylées et immunogènes. La protéine la plus abondante est pp65 codée par le gène UL83, suivi par pp71 et pp150 (Smith et al. , 2014). Les protéines du tégument peuvent être classées en deux catégories : une partie de ces protéines joue un rôle structural et est importante dans l'assemblage et le désassemblage du virion, l'autre partie de ces protéines a un rôle dans la régulation de la réponse immune et de la réplication virale (Crough and Khanna, 2009 ; Tomtishen, 2012). d) L'enveloppe virale L'enveloppe du HCMV est composée d'une bicouche lipidique d'origine cellulaire (RE/Golgi) ainsi que de glycoprotéines virales telles que gB, gH, gL, gM et gN. La majorité d'entre elles (gB, gH, gM, gN) ont été décrites comme étant essentielles à la production de virions infectieux (Hobom et al. , 2000). De plus, ces glycoprotéines jouent un rôle important dans l'entrée du virus dans la cellule hôte et dans sa transmission de cellule à cellule (Navarro et al. , 1993). Par exemple, il a été démontré que la glycoprotéine gB peut interagir avec le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) ou avec des intégrines pour favoriser l'entrée du virus dans la cellule (Compton, 2004). Ainsi l'attachement et l'entrée du virus dans la cellule cible peuvent être inhibés par l'utilisation d'anticorps neutralisants spécifiques de gH/gL (Fouts et al. , 2012). 69 2. Cycle viral : Réplication et assemblage Avant l'entrée dans la cellule, le virus doit s'attacher à la membrane. La capacité du HCMV à pouvoir infecter différents types cellulaires suggère qu'il utilise différents récepteurs présents à la surface des cellules. Il a été décrit que les glycoprotéines virales gB ou gM/gN peuvent se lier aux proteoglycanes à héparane sulfate (HSPG) présents sur la majorité des cellules (Compton et al. , 1993). Cependant cette interaction est nécessaire mais pas suffisante pour induire l'entrée du virus. Ainsi, le récepteur EGFR présent sur un grand nombre de types cellulaires permissifs pour HCMV tels que les fibroblastes semble être un récepteur important via sa liaison avec gB du HCMV (Compton, 2004). EGFR n'est pas exprimé sur les cellules hématopoïétiques ce qui suggère qu'un autre récepteur est utilisé pour l'entrée du virus dans ces cellules, tel que DC-SIGN (Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3- Grabbing Non-integrin) pour les cellules dendritiques (Halary et al. , 2002). Une fois l'attachement réalisé, le mécanisme d'entrée varie selon le type cellulaire. Le virus peut entrer soit par fusion de l'enveloppe virale avec la membrane plasmique cellulaire, ce qui concerne la majorité des cellules permissives, soit par endocytose (cellules endothéliales) (Figure 18). La capside et les protéines du tégument sont alors libérées dans le cytoplasme de la cellule infectée. La nucléocapside est transportée le long des microtubules jusqu'au noyau, lieu o l'ADN viral est libéré. Figure 18 : Mécanisme d'entrée du HCMV par fusion membranaire. Les glycoprotéines gB ou gM/gN se lient aux HSPG, puis gB interagit avec l'EGFR. Des interactions entre les glycoprotéines du HCMV et des intégrines ainsi que des TLR ont aussi lieu, entrainant un rapprochement puis la fusion des membranes cellulaires et virales. La nucléocapside est alors libérée dans le cytoplasme (Compton, 2004). 70 Les cellules différenciées telles que les fibroblastes, neurones, astrocytes, cellules épithéliales, stromales sont permissives pour le HCMV. Dans ce cas, le virus pénètre dans la cellule et entame un cycle réplicatif dont l'expression des gènes viraux est régulée dans le temps en 3 phases distinctes : - Phase très précoce (IE, Immediate Early) C'est durant cette phase que vont être produites les protéines régulant les transcriptions ultérieures. Les transcrits très précoces (IE) sont produits entre 1 et 4h après l'infection. Cette transcription est notamment régulée par le promoteur Major Immediate Early Promotor (MIEP) qui permet l'expression des protéines IE-1 et IE-2, protéines IE principales et les mieux caractérisées à ce jour. IE-1 et IE-2 jouent un rôle important dans la régulation de l'expression des gènes viraux précoces et tardifs. - Phase précoce (E, Early) Durant cette phase, les protéines responsables de la réplication de l'ADN viral double brin sont produites telles que l'ADN-polymérase virale codée par le gène UL54 qui est associée à la protéine UL44 pour former le complexe de réplication, ainsi que les protéines UL34a et b (Yu et al. , 2003). - Phase tardive (L, Late) Les protéines tardives sont des composantes structurales du virion qui permettent l'assemblage de la capside, l'encapsidation de l'ADN et la sortie des nouveaux virions hors de la cellule. En effet, durant cette phase vont être produites notamment les glycoprotéines d'enveloppe, les protéines majeures et mineures de la capside. Une fois l'ADN viral répliqué et les protéines tégumentaires enfermées dans la capside, cette dernière migre du noyau vers le cytoplasme en s'enveloppant de la membrane interne nucléaire qui forme alors sa première enveloppe. Le virion va récupérer une deuxième enveloppe provenant du compartiment intermédiaire entre RE-Golgi. Les nouveaux virions formés sont relargués hors de la cellule par exocytose à la membrane plasmique entrainant la lyse des cellules (Figure 19). Il peut également y avoir production de corps denses qui sont des particules virales défectives car elles ne contiennent quasiment que des protéines tégumentaires (absence de génome). Ces corps denses sont très fortement immunogènes car les protéines tégumentaires font partie des antigènes du HCMV reconnus par les lymphocytes T et B (voir partie II. B. 2. ). 71 Figure 19 : Cycle viral lytique du HCMV Le virus entre dans la cellule soit par fusion soit par endocytose. Une fois la nucléocapside libérée dans le cytoplasme, celle-ci est amenée jusqu'au noyau. L'ADN viral est alors répliqué puis encapsulé et transporté dans le cytoplasme. Enfin, la capside est enveloppée par la membrane nucléaire puis par celle du RE. Les nouveaux virions sont ensuite libérés de la cellule par exocytose (Crough and Khanna, 2009). 3. Infection latente et réactivation Le HCMV a pour particularité de persister, sous forme latente, tout au long de la vie de l'individu. Les première évidences de la latence proviennent de l'observation que le virus ne pouvait pas être isolé dans le sang de donneurs d'organes mais que la transfusion de sang permettait le transfert de l'infection au receveur (Jordan, 1983). Les cellules dans lesquelles est retrouvé du virus latent sont les cellules souches hématopoïétiques CD34 , les monocytes, les cellules endothéliales et les progéniteurs de DC myéloïdes (Reeves et al. , 2005b). Dans ce cas, le virus s'attache à la membrane plasmique et pénètre dans la cellule mais le cycle réplicatif est rapidement interrompu : il n'y a pas d'expression des gènes précoces et tardifs. L'ADN viral forme alors un épisome et l'expression de ses gènes se limite à quelques transcrits spécifiques de latence (Latency Associated Protein). L'expression des gènes très précoces IE peut être retrouvée in vitro lors d'infection latente de façon transitoire au début de l'infection. La protéine LUNA est présente lors d'une 72 infection latente : son niveau d'expression diminue lorsque le niveau d'expression des gènes très précoces augmente, mais sa fonction n'est pas décrite (Reeves and Sinclair, 2010). CMV- IL10 codé par le gène UL111a est aussi produit lors d'une infection latente. Cette cytokine virale est importante pour entretenir la persistance virale notamment en inhibant la production de cytokines pro-inflammatoires (Avdic et al. , 2011). D'autres protéines produites sont importantes pour le maintien de la latence comme pUL138. En effet, la séquence UL138 est nécessaire pour maintenir une infection latente dans des cellules CD34 in vitro (Goodrum et al. , 2007). La latence du HCMV reste un domaine mal connu à ce jour et le rôle de certains transcrits de latence reste à éclaircir (Goodrum et al. , 2012). Le modèle le plus utilisé pour étudier la latence, est l'infection de cellules souches CD34 in vitro par des souches cliniques de HCMV. Plus rarement, les monocytes ont aussi été utilisés pour étudier la latence in vitro. La latence est principalement due à un contrôle de l'expression des gènes du HCMV, en particulier des gènes sous le contrôle du MIEP (Reeves and Sinclair, 2013). Lors de la latence, le MIEP est associé à des facteurs qui répriment la transcription des gènes sous son contrôle. Ces facteurs sont généralement des enzymes associées à la méthylation ou déacétylation des gènes, réprimant leur transcription. Ceci entraine entre autre la répression des gènes IE dont l'expression est importante pour réguler les transcriptions ultérieures (précoces et tardives). Cette répression d'IE entraine donc un arrêt du cycle réplicatif (Figure 20). Le virus se réactive périodiquement, ce qui conduit à des épisodes dexcrétion intermittente de virus dans les sécrétions respiratoires, lurine, le sperme, les sécrétions cervicales. En effet, le virus peut se réactiver suite à certains stimuli, comme la différenciation cellulaire des monocytes ou des cellules souches CD34 en cellules dendritiques et macrophages ex vivo (Reeves et al. , 2005b). La réactivation virale lors de la différenciation peut s'expliquer par le fait que des facteurs impliqués dans l'acétylation (histone acétyl transférases) sont associés à des états de différenciation cellulaire (Reeves et al. , 2005a ; Sinclair, 2008). Les facteurs impliqués dans cette réactivation sont à l'heure actuelle mal connus mais il semblerait que le TNF- joue un rôle clé dans ce phénomène (Goodrum et al. , 2012). En effet, le TNF- en se liant sur son récepteur sur les cellules infectées favorise l'activation de la protéine kinase C et de NF-kB qui va déclencher la transcription des gènes très précoces IE, eux-mêmes entrainant la suite du cycle réplicatif décrit précédemment (Crough and Khanna, 2009 ; Stein et al. , 1993). Il a été montré récemment qu'un corépresseur KAP1/TRIM28 (Krppel-associated box associated protein 1) est impliqué dans la répression d'expression de gènes durant la latence. A l'inverse, durant une infection lytique, l'activité de KAP1 est inhibée par la phosphorylation induite par mTOR (Rauwel et al. , 2015). 73 Figure 20 : Régulation de la réactivation et de la latence par des mécanismes épigénétiques. Suite à la primo-infection (a), le HCMV établit une infection latente dans les précurseurs hématopoïétiques CD34 (b). Le génome viral persiste dans ces cellules (c), en absence d'expression de gènes viraux lytiques due à l'action des répresseurs transcriptionnels cellulaires (dont KAP1 et HP1) liés au promoteur MIEP. Ces répresseurs recrutent des enzymes qui induisent la modification des histones liées au MIEP ce qui a pour conséquence une répression de la transcription des gènes IE (e). Cependant, si les cellules CD34 se différencient en CD, une réactivation de l'expression des gènes lytiques a lieu, ayant pour résultat une libération de nouveaux virions infectieux (d). Cette réactivation est concomitante avec un remodelage de la chromatine du MIEP ce qui a pour conséquence une activation de la transcription des gènes IE (f). (Sinclair and Sissons, 2006) 4. Les différentes souches virales HCMV Afin de les amplifier, les différentes souches HCMV utilisées en laboratoire ont subi de nombreux passages sur des fibroblastes in vitro. Ces passages excessifs ont entrainé des modifications dans le génome viral qui sont associées à de nombreux changements phénotypiques de ces variants (Wilkinson et al. , 2015). Une des modifications les plus importantes concerne le tropisme de ces souches. En effet, généralement les souches issues d'isolats cliniques (Toledo, VHL/E) ayant subi peu de passages peuvent infecter efficacement les cellules endothéliales, épithéliales et les cellules myéloïdes. Les souches dites de laboratoire (AD169, Towne) ayant subi de nombreux passages ont perdu leur tropisme pour ces cellules et ne peuvent pas s'y répliquer. Ainsi il a été démontré que la souche AD169 a perdu une séquence d'environ 13kb, nommée région UL/b' contenant les séquences UL133 à UL150. Cette région UL/b' code notamment pour vCXC-1 (un homologue d'IL-8) et UL144, un membre de la famille des récepteurs du TNF (Prichard et al. , 2001). De plus, d'autres gènes ont subi des mutations dues aux nombreux passages. Il a été mis en évidence qu'une mutation située dans la séquence UL131 est à l'origine de la perte de tropisme pour les cellules 74 endothéliales et des mutations situées entre UL128 et 131 à la perte de tropisme pour les cellules épithéliales (Ryckman et al. , 2008 ; Wang and Shenk, 2005). Ces souches auraient à l'inverse acquis des répétitions excessives dans la région interne. L'hypothèse serait que ces répétitions sont apparues suite à la duplication des séquences à partir du bord gauche du composant UL pour compenser la perte de séquences (Prichard et al. , 2001). II. Réponses immunitaires anti-HCMV Le HCMV est généralement asymptomatique chez un individu sain, principalement grâce à une réponse efficace du système immunitaire. Ainsi l'immunité innée et adaptative joue un rôle clé dans le contrôle des infections par ce virus (Figure 23). Ces réponses immunitaires permettent d'inhiber la réplication virale efficacement lors d'une primo-infection ainsi que lors d'épisodes de réactivation virale. Etant donné que le HCMV a une spécificité d'hôte restreinte à l'Homme, l'étude du rôle du système immunitaire dans le contrôle des infections par le CMV a été largement étudiée à partir de modèle de souris utilisant du CMV murin (MCMV). Des études ont aussi été réalisées à partir de rats, cochons d'inde et macaques. Les différentes souches de CMV utilisées dans ces études n'ont pas une homologie parfaite avec les souches de HCMV. Par exemple, les souches de MCMV ont 50% des ORF (Open Reading Frame) homologues avec les souches de HCMV. Ainsi, les résultats expérimentaux obtenus avec les souches MCMV ne sont pas tous transposables à l'Homme. Cependant, les mécanismes de stimulation du système immunitaire par le CMV sont en grande partie conservés en utilisant ces modèles animaux (Loewendorf and Benedict, 2010). Par conséquent, je vous détaillerai les études utilisant d'une part les modèles animaux et, d'une autre part, les études cliniques chez l'Homme. A. Immunité innée L'immunité innée est la première réponse immunitaire mise en jeu lors d'une infection. Cette réponse se met en place en seulement quelques heures. Elle permet l'élimination du pathogène grâce à l'intervention de cellules de l'immunité innée présentes localement. Elle permet aussi le déclenchement de l'immunité adaptative en menant à l'activation des différentes populations de lymphocytes. Il a été démontré un rôle clé de l'immunité innée dans le contrôle de l'infection par le CMV. 75 1. Reconnaissance du CMV via les PRR La reconnaissance de pathogènes par les cellules de l'immunité innée implique des récepteurs appartenant à la famille des PRR : les TLR. Mêmes si la majorité des études sur les PRR mettent en évidence la détection de bactéries, de nombreuses études plus récentes montrent une reconnaissance d'agents infectieux viraux. Ainsi il a été mis en évidence que le CMV peut être reconnu par des TLR-2, 3 et 9 (Figure 21). Cette stimulation des TLR par le CMV induit une sécrétion de cytokines pro-inflammatoires à l'origine du recrutement de cellules de l'immunité innée ainsi qu'une sécrétion d'IFN de type I qui sont des éléments clés dans les réponses antivirales (Boehme and Compton, 2004). Les TLR-3 et 9 présents dans les endosomes sont capables de reconnaitre respectivement l'ARN viral double brin et les motifs CpG contenus dans l'ADN. En effet, des souris homozygotes pour une mutation sur le TLR-9 ou Knock-out pour le TLR-3 sont plus susceptibles à l'infection par le MCMV et présentent une diminution de la sécrétion d'IFN de type I et de l'activation de cellules NK (Tabeta et al. , 2004). De plus, la stimulation de TLR-9 par le MCMV est importante pour le contrôle de l'infection par MCMV in vitro et in vivo (Delale et al. , 2005 ; Hokeness-Antonelli et al. , 2007). Le HCMV est également capable d'interagir avec le TLR-2 via ses glycoprotéines d'enveloppes gB/gH menant à une activation de NF-kB suivi d'une sécrétion de cytokines inflammatoires dans des fibroblastes infectés (Boehme et al. , 2006). La reconnaissance du CMV par les PRR peut aussi avoir un effet indirect sur le système immunitaire. En effet, les monocytes, macrophages et cellules dendritiques sont des cellules qui expriment des PRR et qui peuvent être infectées par le HCMV. Suite à l'infection et à la stimulation de leur PRR, ces cellules produisent des cytokines pro-inflammatoires et présentent les antigènes HCMV aux lymphocytes T, acteurs majeur dans l'immunité anti- HCMV. 76 Figure 21 : L'activation des TLR par les herpesvirus Le HCMV peut être reconnu à la membrane cellulaire par le TLR-2 via ses glycoprotéines d'enveloppe gB/gH. Il est également reconnu dans les endosomes par les TLR-3 et 9 via son ARN et ADN viral. Ces stimulations des TLR par le HCMV mènent à l'activation de la voie NF-KB à l'origine de la transcription de cytokines pro-inflammatoires (a) et l'activation de la voie IRF7/3 menant à la sécrétion d'IFN de type I (b). (West et al. , 2012). 2. Les cellules NK L'activation des cellules NK est sous le contrôle d'une balance de signaux médiés par des récepteurs activateurs ou inhibiteurs. Une fois activées, ces cellules peuvent secréter des cytokines telles que l'IFN- et le TNF et avoir une activité cytotoxique. Depuis de nombreuses années, le rôle des cellules NK lors d'infection par le CMV a beaucoup été étudié chez la souris en utilisant la souche MCMV. Les premières expériences dans les années 80 démontraient que des souris déplétées en cellules NK et infectées par le MCMV ont un titre viral plus élevé dans le foie et la rate (Bukowski et al. , 1983). Ceci suggère que les cellules NK participent au contrôle de la réplication virale. De plus, il a aussi été démontré que le transfert adoptif de cellules NK dans des souris permet une protection contre l'infection par le MCMV (Bukowski et al. , 1985). Plus récemment, il a été mis en évidence que 77 la reconnaissance des cellules infectées par les cellules les NK implique l'immunorécepteur Ly49H, récepteur absent chez l'Homme (Brown et al. , 2001). A l'heure actuelle, il semble clair que le CMV peut être contrôlé par les cellules NK via des récepteurs activateurs, mais la contribution exacte des différents signaux reste floue (Carrillo-Bustamante et al. , 2014). Chez l'Homme, le rôle des NK lors d'infection par HCMV est peu décrit dans la littérature. En 1989, il a été décrit un cas unique d'un adolescent déficient en NK hautement susceptible aux infections par les herpesvirus dont le HCMV (Biron et al. , 1989). De plus, l'activité des cellules NK est augmentée durant une infection par le HCMV chez des patients transplantés de reins suggérant une implication de ceux-ci dans l'élimination du virus (Venema et al. , 1994). Chez les patients transplantés avec des cellules souches hématopoïétiques, les cellules NK sont les premiers lymphocytes restaurés et cette restauration est corrélée avec une guérison de l'infection par le HCMV (Quinnan et al. , 1982). Chez ces patients, l'infection ou la réactivation du HCMV induit une accélération de la maturation et la différentiation des cellules NK caractérisées par un phénotype KIR NKG2A- et NKG2C , et décrites comme ayant un rôle protecteur contre l'infection par le HCMV (Della Chiesa et al. , 2013 ; Foley et al. , 2012). Cependant le rôle précis de cette population dans le contrôle de l'infection reste à déterminer (Muntasell et al. , 2013). De nombreuses études in vitro ont été réalisées afin de mettre en évidence l'activité des cellules NK humaines ainsi que les récepteurs mis en jeu. Ainsi, il apparait clairement qu'en fonction du type cellulaire de la cellule cible et de la souche virale utilisée, les cellules NK n'ont pas toujours la même activité et les récepteurs mis en jeu sont variables. Des études utilisant des cellules NK humaines démontrent que ces derniers peuvent inhiber la réplication virale dans des fibroblastes infectés en stimulant la sécrétion d'IFN- par ces derniers (Iversen et al. , 2005). Dans ce cas, les cellules NK sont capables de produire de l'IFN- et du TNF, participant ainsi au contrôle de la réplication virale et au recrutement et à l'activation des effecteurs de l'immunité innée et adaptative. Au niveau du mécanisme d'activation des cellules NK, alors que le récepteur principal mis en jeu dans l'élimination des fibroblastes infectés est le NKG2D, la reconnaissance et la lyse des cellules dendritiques infectées impliquent les récepteurs NKp46 et DNAM-1 (Magri et al. , 2011). De plus, il a récemment été mis en évidence une implication des cellules NK de la decidua placentaire dans le contrôle des infections intra- utérines par le HCMV (Siewiera et al. , 2013). Cependant, les cellules infectées ne sont pas toujours sensibles à l'activité des cellules NK. Cerboni et ses collaborateurs, ont démontré que des fibroblastes infectés par des isolats cliniques de HCMV sont résistants à l'activité cytotoxique de cellules NK, tandis qu'il est observé un effet variable de cette cytotoxicité avec des souches de laboratoire tel qu'AD169 et Towne (Cerboni et al. , 2000). Ces résultats sont notamment la conséquence d'une mise en 78 place de mécanismes d'échappement au système immunitaire par le HCMV. Nous verrons ces mécanismes dans le chapitre suivant. 3. Les lymphocytes T De nombreuses études ont mis en évidence un rôle important des lymphocytes T chez la souris lors d'une infection par le MCMV. Cependant, nous avons vu dans le Chapitre 1 (partie I. A. 2. ) que les T comportent des populations qui ne sont pas homologues chez l'Homme et la souris. Par exemple, la population des T humains majoritaire dans le sang, les T V9V2 n'ont pas d'équivalent chez la souris. Par conséquent, les résultats obtenus chez la souris ne peuvent pas être directement transposables à l'Homme, en ce qui concerne ces populations de T . Après infection par le MCMV, les T , parmi d'autres cellules de l'immunité innée, sont recrutés sur le site infectieux dans les glandes salivaires sous-maxillaires (Cavanaugh et al. , 2003). Il a été mis en évidence qu'une population de T , les T V1 participent à la réponse immunitaire rapidement mise en place suite à l'infection, notamment grâce à la production d'IFN- induite par la reconnaissance d'une protéine de choc thermique (HSP65) dont l'expression est augmentée suite à l'infection par le MCMV (Ninomiya et al. , 2000). De plus, la déplétion de ces cellules est corrélée à une augmentation du titre viral dans le foie (Ninomiya et al. , 2000). Etant donné que l'infection par le CMV touche particulièrement les individus immunodéprimés, deux études récentes ont été menées pour approfondir les connaissances sur le rôle de ces T dans un contexte d'immunosuppression. Ainsi ces études ont porté sur l'implication des T dans l'immunité anti-MCMV chez des souris déficientes en lymphocytes T et B. Winkler et ses collaborateurs, ont montré que des souris n'ayant ni lymphocytes B, ni T CD8 et ni T CD4 (JHT CD8-/- et déplétées en T CD4 ) sont capables de contrôler l'infection par le MCMV (Sell et al. , 2015). Les T isolés des souris infectées sont capables de lyser des cellules infectées par le MCMV in vitro et ces mêmes cellules, une fois transférées dans des souris RAG-/- (absence de lymphocytes T et B) leur confèrent une protection contre le virus. Une expansion de T V1 et V2 est observée dans les organes o le MCMV est persistant. Dechanet-Merville et ses collaborateurs ont montré que les T sont aussi compétents que les T conventionnels pour protéger les souris contre le MCMV en limitant la réplication virale, les dommages associés à l'infection et la mort induite par ce virus (Khairallah et al. , 2015). Dans des souris TCR-/-, cette réponse serait médiée par des T V1 et V4 ayant un phénotype effecteur/mémoire (CD44 CD62L-). Ainsi, ces études ont permis de démontrer un potentiel antiviral des T dans un contexte d'immunosuppression en lymphocytes T et B chez la souris. 79 Chez l'Homme, dès la fin des années 90, l'implication de populations T lors d'une infection par le HCMV a été mise en évidence. Les T ont d'abord été étudiés chez des patients immunodéprimés suite à une transplantation de rein. Il a été observé une expansion de ceux-ci associée à une infection par HCMV (Dechanet et al. , 1999a ; Fornara et al. , 2011). Cette expansion concerne les sous-populations T V1 et V3 qui sont capables de proliférer in vitro en présence de lysat de cellules infectées et auraient un rôle dans la réponse immune anti-HCMV chez les patients transplantés (Dechanet et al. , 1999b). Cette expansion a été suivie durant 10 mois après la transplantation. Ainsi, il a été démontré que les patients avec une expansion tardive de T (après 45 jours) ont un niveau de virémie plus élevée et des maladies associées aux infections HCMV plus grave que les patients ayant une expansion de T plus précoce (Lafarge et al. , 2001). De plus, cette expansion, concernant seulement les T V2neg, est associée à une résolution de l'infection HCMV chez les patients. Une prolifération des T V2neg a aussi été observée suite à une réactivation virale chez des patients transplantés de cellules souches hématopoïétiques ainsi que chez des individus immunocompétents (Knight et al. , 2010 ; Pitard et al. , 2008) avec une fréquence qui augmente avec l'âge de l'individu (Alejenef et al. , 2014). Enfin, In utero, dans le cas d'infection congénitale HCMV, on retrouve une expansion des T V2neg fœtaux produisant de l'IFN- (Vermijlen et al. , 2010). De façon similaire aux lymphocytes T CD8 spécifiques du HCMV, le phénotype des T V2neg ont un phénotype de type effecteur/mémoire (CD45RA CD27-) considéré comme étant une signature d'une infection HCMV antérieure (Couzi et al. , 2015). Ces T V2neg produisent de l'IFN- et du TNF, ont une activité cytotoxique contre des fibroblastes infectés in vitro et peuvent limiter la réplication virale (Halary et al. , 2005). Les T V2neg sont cytotoxiques in vitro contre les cellules infectées par la production de perforine et granzyme B (Halary et al. , 2005 ; Vermijlen et al. , 2010). Les mécanismes d'activation des T V2neg dans un contexte d'infection par HCMV sont longtemps restés inconnus. L'utilisation d'anticorps bloquants du TCR démontre que la stimulation de celui-ci est nécessaire à l'activation de ces cellules. Récemment, il a été mis en évidence que les T V2neg (V4V5) reconnaissent via leur TCR une protéine transmembranaire de type 1 homologue des molécules de CMH-I, le récepteur EPCR (endothelial protein C receptor) (Willcox et al. , 2012) (Figure 22). Cependant, les T V2neg capables de reconnaitre les cellules infectées par HCMV ne reconnaissent pas tous la molécule EPCR, indiquant l'existence d'autres ligands du TCR (Couzi et al. , 2015). De plus, il a été démontré que ces cellules activées expriment le récepteur CD16. L'infection favorise 80 une expansion de T V2neg CD16 circulants dont le nombre double (Couzi et al. , 2015). Ce récepteur peut lier les Ig anti-HCMV et après une interaction avec l'antigène, ces cellules inhibent la réplication virale en particulier en stimulant la production de cytokines telles que l'IFN- et le TNF (Couzi et al. , 2012) (Figure 22). Deux autres molécules peuvent participer à la co-stimulation des T V2neg : CD8 qui agit comme corécepteur avec les TCR et LFA- 1 qui reconnait la molécule ICAM-1 dont l'expression augmente sur les cellules infectées par CMV (Scheper et al. , 2013 ; Willcox et al. , 2012). Les récepteurs NKG2 ne semblent pas être impliqués dans l'activation de ces lymphocytes malgré que l'expression de certains de leurs ligands augmente sur les cellules infectées tels que les molécules MICA/B et ULBP1-6 (Halary et al. , 2005). Les T V2neg spécifiques du HCMV ont aussi un effet indirect dans l'immunité anti- tumorale. In vitro, ces T V2neg sont capables de tuer les cellules tumorales aussi efficacement que les cellules infectées par le HCMV (Figure 22). De plus, il a été observé chez des souris immunodéficientes ayant des xenogreffes de tumeurs humaines, que les T V2neg spécifiques du HCMV sont capables d'inhiber le développement de la tumeur (Devaud et al. , 2013). Chez les patients transplantés, l'expansion de cette population lymphocytaire est corrélée avec une diminution de l'apparition de cancer les années suivantes (Couzi et al. , 2010). 81 Figure 22 : Effets directs et indirects des T V2neg induit lors d'une infection par HCMV, in vivo et in vitro : (A) In vitro, les T V2neg reconnaissent les molécules EPCR sur les cellules infectées via leur TCR ainsi qu'ICAM-1 et LFA-3 exprimés sur les cellules cibles. En réponse les T V2neg produisent du TNF et de l'IFN- et lysent les cellules infectées. (B) En absence de stimulation TCR, les T V2neg CD16 produisent de l'IFN- et inhibent la réplication virale en réponse aux IgG-CMV, en présence d'IL- 12 et d'IFN- produites par des monocytes et des cellules dendritiques. (C) Ces T V2neg induits lors d'une infection HCMV sont également capables de tuer des cellules tumorales (Couzi et al. , 2015). B. Immunité adaptative Le HCMV est un agent très immunogène ce qui induit de fortes réponses immunitaires contre celui-ci. La réponse adaptative joue un rôle important dans le contrôle de l'infection par le HCMV. Cette réponse est médiée par les lymphocytes B mais aussi les lymphocytes TCD4 et lymphocytes TCD8 qui sont des acteurs importants de l'immunité anti-HCMV. 1. Réponses humorales Plusieurs études démontrent un rôle important de la réponse humorale dans le contrôle de l'infection par le HCMV, notamment en limitant la dissémination du virus et la sévérité de la maladie. L'importance de la neutralisation du virus par des anticorps est soutenue par de nombreuses études utilisant différents types de modèles animaux ainsi que des études chez l'Homme. 82 Dans les années 90, les premières études utilisant des cochons d'inde démontrent un effet protecteur des Ig suite à une infection congénitale par CMV, en limitant la sévérité de la maladie par un contrôle de la dissémination virale. Ainsi, l'immunisation passive par des Ig spécifiques du CMV améliore la survie des animaux mais cependant ne permet pas de la prévenir (Bratcher et al. , 1995 ; Harrison et al. , 1995). Quelques années plus tard, une immunisation active à partir de protéines gB recombinantes sur des cochons d'inde a permis de protéger contre l'infection fœtale et limiter la sévérité de la maladie liée au CMV (Schleiss et al. , 2004). Après primo-infection chez l'Homme, des Ig spécifiques d'un grand nombre de protéines de HCMV sont détectables dans le sérum. Ces Ig sont spécifiques de protéines du tégument telles que pp65 ou pp150, de glycoprotéines d'enveloppe comme gB ou gH mais aussi de protéines non structurales telles que la protéine IE1 (Hanley and Bollard, 2014). La plupart des patients séropositifs ont des Ig anti-gB dans le sérum et il est décrit que ceux-ci représentent, dans plus de 50% des cas, des Ig neutralisants. La réponse humorale a été particulièrement étudiée lors de la grossesse. En effet, il a été mis en évidence que les Ig anti- HCMV présentes chez les femmes séropositives avant une grossesse jouent un rôle important pour limiter la transmission du virus au fœtus et protéger le nouveau-né de complications associées aux infections par le HCMV (Fowler et al. , 1992). Ainsi, l'utilisation d'une immunisation passive avec des Ig anti-HCMV chez la femme enceinte permet de limiter la réplication virale au niveau du placenta et réduire les complications associées aux HCMV (Maidji et al. , 2010). Le rôle des Ig anti-HCMV a aussi été étudié chez les patients immunodéprimés transplantés. Des effets bénéfiques ont été observés sur la primo-infection ou la réactivation chez des patients transplantés de reins (Snydman et al. , 1987) mais les effets sont moins clairs concernant les patients transplantés de cellules souches hématopoïétiques. Les Ig anti-HCMV peuvent avoir un effet direct par neutralisation des particules virales mais aussi indirect en favorisant l'activation des cellules NK ou des lymphocytes T par l'intermédiaire de récepteur de la partie Fc des immunoglobulines (CD16) (Couzi et al. , 2012). 2. Réponses cellulaires La réponse médiée par les lymphocytes T est le mécanisme immunitaire principal par lequel la réplication du HCMV est contrôlée. En effet, la réponse immune déclenchée suite à la primo-infection ne permet pas d'éradiquer le virus mais les lymphocytes T CD4 et T CD8 sont importants dans le contrôle de la réplication virale suite à une réactivation. 83 a) Les lymphocytes T CD8 Le rôle des T CD8 lors d'une infection CMV a été, dans un premier temps, étudié chez la souris. Ainsi, la déplétion de T CD8 chez la souris induit une augmentation de l'incidence de la réactivation virale du MCMV (Polic et al. , 1998). De plus, le transfert adoptif de T CD8 confère une protection face à la réplication et la dissémination du MCMV (Mutter et al. , 1988). L'implication des T CD8 chez l'Homme dans l'immunité anti-HCMV a été démontrée depuis de nombreuses années. Les patients ayant subi une transplantation de moelle osseuse ont davantage de complications associées à l'infection HCMV lorsquils n'ont pas de réponse T CD8 spécifiques du HCMV détectable (Reusser et al. , 1991). La présence de T CD8 chez les patients transplantés de reins ou d'autres organes solides est aussi associée à une protection contre le HCMV, avec une diminution des complications associées (Reusser et al. , 1999). Riddell et ses collaborateurs ont réalisé pour la première fois un transfert adoptif de clones TCD8 spécifiques du HCMV chez des patients transplantés de moelle osseuse. Ils ont observé que le transfert a permis de reconstituer l'immunité cellulaire du HCMV et de favoriser une protection contre celui-ci en limitant la réactivation virale et les maladies associées (Riddell et al. , 1992 ; Walter et al. , 1995). Un grand nombre de protéines virales produites durant les différentes phases de la réplication sont reconnues par les T CD8 . Ainsi la réponse T CD8 est diversifiée, avec une reconnaissance d'antigènes structuraux tels que les glycoprotéines d'enveloppe gB et gH, des protéines tégumentaires comme pp28, pp150, pp65, des protéines très précoces telles que IE1 et IE2 et des séquences US2, US3, US6, US11, UL16 et UL18 (Crough and Khanna, 2009). Les antigènes immunodominants dans la réponse T CD8 anti-HCMV sont IE1 (UL123), IE2 (UL122) et pp65 (UL83). Grâce à l'utilisation de banques de peptides synthétiques couvrant l'ensemble du protéome HCMV, une analyse complète des réponses T CD4 et T CD8 face au HCMV a été réalisée. Ces données ont montré que, dans une grande cohorte de donneurs séropositifs sains (de type HLA variable), une réponse des T CD4 ou T CD8 était détectable avec plus de 150 ORF virales qui comprennent à la fois des protéines structurelles et non structurelles exprimées au cours de toutes les phases d'infection lytique (Sylwester et al. , 2005). La majorité des études in vitro portant sur la réponse T CD8 utilisent des lymphocytes T spécifiques de deux antigènes immunodominants : IE et pp65. En réponse au HCMV, les T CD8 sont capables d'être cytotoxiques (granzymeB , perforin ) et de produire de nombreuses cytokines telles qu'IFN-, TNF et MIP1 (Zhou et al. , 2009). Le phénotype des T CD8 varie en fonction du stade de l'infection. La population effectrice lors de la phase aige a un phénotype CD45RA-CD45RO CD27 et CD28 /- (phénotype central mémoire). En 84 revanche lors de la phase chronique ces cellules expriment le CD45RA (phénotype de différenciation terminale). b) Les lymphocytes T CD4 Dans un premier temps, l'importance des T CD4 dans la réponse anti-CMV a été mise en évidence chez la souris. Il a été observé une augmentation d'incidence de réactivation virale dans des souris infectées par le MCMV et déplétées en T CD4 (Polic et al. , 1998). Les T CD4 participent aussi au contrôle de l'infection dans des souris déplétées en T CD8 (Jonjic et al. , 1990). Chez l'Homme, l'importance des T CD4 a été démontrée depuis environ 20 ans, lorsqu'il a été observé que le maintien de T CD8 spécifiques du HCMV était dépendante de la présence de T CD4 (Walter et al. , 1995). Une augmentation de la fréquence de T CD4 chez les personnes saines séropositives pour le HCMV est corrélée à une immunité anti- HCMV efficace. Le rôle des T CD4 lors de l'infection par le HCMV a aussi été montré chez les patients immunodéprimés transplantés chez lesquels une fréquence faible de T CD4 spécifiques chez ces patients est corrélée avec une fréquence importante de complications liées au HCMV (Sester et al. , 2005). Chez des patients transplantés de reins infectés, les patients asymptomatiques ont une réponse des T CD4 spécifiques du HCMV qui précède la réponse des T CD8 (ayant un rôle crucial dans la réponse anti-HCMV), alors que chez les patients symptomatiques cette réponse est retardée et détectable seulement après un traitement antiviral (Gamadia et al. , 2003). L'importance des T CD4 est également soutenue par de nombreuses études chez les patients transplantés de moelle osseuse (Jackson et al. , 2011). Ces T CD4 participent à la réponse anti-HCMV, de façon indirecte, en particulier par l'aide qu'ils apportent aux T CD8 , effecteurs majeurs dans la réponse antivirale (réponse de type Th1). Il a été mis récemment en évidence que les T CD4 produisent de l'IL-2 lors de l'infection par le HCMV et celle-ci augmenterait l'activité cytotoxique des cellules NK face à des macrophages infectés (Wu et al. , 2015). Cependant, il a aussi été démontré un rôle direct des T CD4 sur le contrôle de l'infection par le HCMV car ils peuvent être aussi cytotoxiques ou induire l'apoptose des cellules infectées (Elkington et al. , 2004). Ceci pourrait faire intervenir la production de cytokines pro-inflammatoires IFN- et de TNF par des T CD4 spécifiques du HCMV (IE1) à l'origine d'une inhibition de la réplication virale dans les cellules infectées (Davignon et al. , 1996). Tout comme les T CD8 , les T CD4 sont capables de reconnaitre un grand nombre de protéines virales structurales et non structurales. Des peptides issus de protéines très précoces telles que IE1 et IE2, des protéines tégumentaires comme pp65 ou bien encore la glycoprotéine d'enveloppe gB peuvent être reconnus par les T CD4 . De plus, chez une 85 personne âgée, environ 10% de T CD4 mémoires sont spécifiques du HCMV (Sylwester et al. , 2005). De façon intéressante, il a été démontré récemment que les T CD4 sont aussi capables de reconnaitre des antigènes induits durant la latence (UL138 et LUNA). Cependant ces T CD4 ont une polarisation différente de celle décrite précédemment (profil Th1) et produisent une cytokine immunosuppressive, l'IL-10 (Mason et al. , 2013). Ceci suggère que le HCMV induit des réponses T CD4 immunosuppressives durant la latence, ce qui lui permet de pouvoir persister dans l'organisme de l'hôte. c) Les lymphocytes T régulateurs Chez la souris, il a été mis en évidence une activité de T régulateurs producteurs d'IL- 10 qui peut déprimer la réponse immunitaire anti-MCMV (Jost et al. , 2014). Ces cellules sont capables de réguler l'activation des NK lors d'une infection MCMV (Sungur et al. , 2013). Chez l'Homme de récentes études ont examiné le rôle des T régulateurs lors d'une infection HCMV. La fréquence de T régulateurs induits spécifiques du HCMV serait augmentée chez des personnes âgées séropositives (Terrazzini et al. , 2014). Cependant, à l'heure actuelle, le lien entre cette population de T régulateurs et les maladies associées est encore mal défini. 86 Figure 23 : Contrôle du HCMV par l'immunité innée et adaptative L'infection primaire par le HCMV chez des individus en bonne santé commence dans l'épithélium des muqueuses (A). Le virus se dissémine ensuite dans les cellules myéloïdes dont les monocytes et les cellules CD34 , dans lesquels il établira une latence (B). Une expression restreinte des gènes viraux est observée dans ces cellules infectées de façon latente ce qui limite leur reconnaissance par les cellules immunitaires effectrices. La différenciation des monocytes infectés en macrophages ou cellules dendritiques peut être à l'origine d'une infection productive (C). Les particules virales ou les corps denses (particules virales défectives) peuvent être présentés par les cellules dendritiques pouvant alors stimuler les cellules T spécifiques de l'antigène viral (D). Les cellules dendritiques activées via leur TLR peuvent sécréter des cytokines permettant l'activation de cellules effectrices de la réponse innée telles que les cellules NK (D). Les macrophages infectés peuvent aussi directement activer les T spécifiques de l'antigène viral (C). Ces T activés (CD4, CD8 ou ) et les cellules NK peuvent directement lyser les cellules infectées par cytolyse ou bloquer la réplication virale par la sécrétion de cytokines telles que l'IFN- ou encore du TNF (E). Une autre réponse importante est médiée par les lymphocytes B activés qui sont capables de contrôler la dissémination de virions libres par la production d'anticorps neutralisants (F) (Crough and Khanna, 2009) 87 III. Mécanismes d'échappement du HCMV au système immunitaire Comme la majorité des herpesvirus, le HCMV a développé de nombreux mécanismes d'échappement aux acteurs de la réponse immunitaire innée et adaptative, lors d'infection productive mais aussi durant la latence. De façon générale, le HCMV est capable de moduler ces réponses immunitaires en augmentant l'expression de récepteurs et cytokines homologues à ceux couramment observés lors d'une infection. Ainsi, différents gènes viraux, UL33, UL78, US27 et US28 codent pour des récepteurs homologues aux récepteurs des chimiokines (Chee et al. , 1990). De plus d'autres gènes codent des cytokines homologues à IL-10 (UL111. a), à l'IL-8 (UL146) un homologue du récepteur au TNF (UL144), ainsi que de nombreux gènes anti-apoptotiques (UL36, UL37). Le HCMV est également capable d'échapper aux cellules de l'immunité innée et adaptative en modulant des éléments clés spécifiques de l'activation de ces dernières. A. Echappement virale à l'immunité innée L'activation des cellules NK dépend de signaux activateurs et inhibiteurs. Le HCMV peut contrôler l'activation de ces cellules et leur cytotoxicité en favorisant des signaux inhibiteurs ou bien en diminuant des signaux activateurs. 1. Modulation des récepteurs inhibiteurs des cellules NK Le CMH-I est reconnu par les récepteurs inhibiteurs Leukocyte Ig-like receptor (LIR-1) et les Killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) présents sur les cellules NK. Le HCMV est capable de produire une protéine homologue du CMH-I : UL18 (Beck and Barrell, 1988). Ainsi, cette protéine UL18 se retrouve exprimée à la surface de la cellule infectée et se lie aux récepteurs inhibiteurs LIR-1 des cellules NK avec une affinité aussi élevée que les molécules de CMH-I classiques (Chapman et al. , 1999) ce qui a pour conséquence l'inhibition de l'activation des cellules NK LIR-1 (Figure 24) (Prod'homme et al. , 2007). De plus, le HCMV utilise la voie d'expression de la molécule HLA-E pour inhiber l'activation des cellules NK via les récepteurs inhibiteurs CD94/NKG2A. La molécule HLA-E n'est exprimée que si elle est complexée avec des peptides issus de certaines protéines (CMH en particulier). La protéine UL40 du HCMV est capable d'entrer dans le réticulum endoplasmique et d'être chargée par les molécules HLA-E, ce qui entraine leur expression à 88 la surface des cellules infectées (Figure 24). Ainsi, Les cellules NK NKG2A sont inhibées par liaison avec ce complexe UL40/HLA-E (Tomasec et al. , 2000). Figure 24 : Reconnaissance de protéines HCMV par les cellules NK La protéine UL40 contient un épitope qui est reconnu par la molécule HLA-E, et est présentée à la surface de la cellule infectée. UL40/HLA-E se lie au récepteur inhibiteur CD94/NKG2A entrainant un signal inhibiteur. Cependant, UL40/HLA-E peut aussi se lier au récepteur activateur CD94/NKG2C entrainant dans ce cas un signal activateur. En parallèle, la protéine UL18 est exprimée à la surface de la cellule infectée et se lie au récepteur inhibiteur LIR-1, menant à une inhibition des cellules NK (Sun and Lanier, 2009). 2. Modulation des récepteurs activateurs des cellules NK En réponse au stress induit par l'infection HCMV, les cellules peuvent avoir une expression augmentée de molécules de stress telles que les molécules MICA/B et ULBP1-6, qui sont des ligands du récepteurs activateurs NKG2D. Cependant tous les MIC/ULBP ne sont pas toujours exprimés en fonction du type cellulaire infecté. Le HCMV produit des protéines qui interfèrent avec l'expression de ces ligands. UL16 lie les protéines MICB et ULBP1, 2 et 6 et empêche ainsi leur transport à la surface (Rolle et al. , 2003) (Figure 25). La traduction de la protéine MICB est aussi inhibée par un microARN du HCMV, UL112 (Stern-Ginossar et al. , 2007). UL142 quant à elle, entraine la rétention de MICA dans le cis-Golgi. De plus la signalisation induite par d'autres récepteurs activateurs peut être modulée par le HCMV. Ainsi, la protéine tégumentaire pp65 (UL83) se lie au récepteur activateur NKp30 ce qui entraine la dissociation de la chane CD3 associée pour la transduction du signal activateur et une inhibition de l'activité cytotoxique des cellules NK (Arnon et al. , 2005). UL141 entraine une diminution d'expression de CD155 et CD112 (ligands du récepteur activateur DNAM-1) à la surface des cellules infectées (Tomasec et al. , 2005). La protéine UL40 du HCMV peut également être chargée par les molécules HLA-E, l'ensemble étant reconnu par des récepteurs activateurs CD94/NKG2C (Figure 24). 89 Figure 25 : Diminution d'expression des ligands du NKG2D par UL16 La protéine UL16 du HCMV lie les molécules MICB, ULBP1-2 ce qui entraine leur rétention dans le Cis- Golgi. Les autres ligands du NKG2D, c'est-à-dire MICA et ULBP3-4 ne sont pas affectés par UL16 et sont donc exprimés à la surface de la cellule infectée (Lodoen and Lanier, 2005) B. Immunité adaptative : modulation de la présentation antigénique 1. Baisse d'expression du CMH-I Les T CD8 , acteurs majeurs de la réponse immunitaire anti-HCMV, sont activés par des peptides présentés par les molécules de CMH-I. Ainsi, le HCMV a mis en place de nombreux mécanismes d'échappement aux T CD8 en interférant dans la voie de présentation de ces molécules à la surface (Noriega et al. , 2012). En effet, lors d'une infection par le HCMV, les gènes viraux US2, 3, 6, 10 et 11 induisent la baisse d'expression du CMH-I (Figure 26 et 27). US2 et US11, produits précocement durant l'infection, induisent la dégradation des molécules de CMH-I (Wiertz et al. , 1996). US3 et US10 entrainent la rétention du CMH-I dans le réticulum endoplasmique (Jones et al. , 1996). US6, quant à lui, induit un changement de conformation des protéines de transport antigéniques (TAP) ce qui bloque la translocation de peptides antigéniques dans le réticulum endoplasmique et empêche ainsi l'expression normale des complexes CMH-peptides (Ahn et al. , 1997). Des protéines du tégument sont aussi impliquées dans la diminution d'expression du CMH-I sur les cellules infectées. La phosphoprotéine pp65 qui a une activité de kinase, peut phosphoryler la protéine IE, ce qui bloque la présentation des épitopes associés par les molécules de CMH-I (Gilbert et al. , 1993). La protéine pp71 retarde la translocation du CMH-I du réticulum endoplasmique au cis-Golgi. 90 Un microARN viral, miRNA US4-1, cible l'ARN messager codant pour ERAP-1, une aminopeptidase qui est impliquée dans la génération de certains peptides antigéniques et impacte ainsi leur présentation normale par le CMH-I (Kim et al. , 2011). Figure 26 : Diminution d'expression des molécules de CMH-I par le HCMV Les protéines US2, 10 et 11 induisent la dégradation du CMH-I par le protéasome. La phosphoprotéine pp65 phosphoryle certains peptides, ce qui empêche le chargement de ceux-ci par le CMH-I. US6 inhibe TAP ce qui bloque le transport de peptides dans le RE. US3 et 10 entrainent la rétention des CMH-I dans le RE. MiR-US4-1 bloque la traduction d'ERAP-1 inhibant ainsi le chargement des peptides sur le CMH-I. Quant à pp71, elle induit une rétention du CMH-I dans le Cis-Golgi. (Noriega et al. , 2012) 2. Baisse d'expression du CMH-II Le HCMV a aussi mis en place un mécanisme d'immuno-échappement aux T CD4 , cellules qui sont activées par des peptides présentés par les molécules de CMH-II (Figure 27). Ainsi US2 du virus est capable d'induire la dégradation par le protéasome des molécules de CMH-II, prévenant ainsi la reconnaissance par les T CD4 (Tomazin et al. , 1999). US3 réduit la présentation par les molécules de CMH-II en se liant aux chanes / nouvellement synthétisées, bloquant ainsi l'association de ces dernières avec la chane invariante Ii (Hegde et al. , 2002). 91 3. Intérêt physiologique Bien que le HCMV code pour de nombreuses protéines (appelées immunoévasines ) altérant la présentation des antigènes aux T CD4 et TCD8 , la réelle contribution de ces dernières lors de l'infection est mal connue. En effet, au vu du nombre important de T CD8 et TCD4 spécifiques du HCMV retrouvé chez des individus séropositifs, nous pourrions imaginer que ces protéines n'ont pas un rôle majeur lors de l'infection (Noriega et al. , 2012). Cependant, les T CD8 spécifiques du HCMV issus de donneurs séropositifs ont une activité cytotoxique et une sécrétion de cytokine plus élevée en présence de souches virales délétées d'US2 et US11, (Khan et al. , 2005). De plus, la présence des immunoévasines US2, 3, 6 et 11 est requise pour la réinfection de macaques par le CMV (Hansen et al. , 2010). Ces études démontrent que ces immunoévasines sont importantes lors d'une réinfection, favorisant ainsi un échappement au T CD8 in vivo. Cependant, l'importance de ces molécules est démontrée lors de réinfection mais pas lors de primo-infection. Figure 27 : Effets majeurs des immunoévasines du HCMV La voie de sécrétion apparait en orange et la voie d'endocytose en vert. Les immunoevasines jouant sur ces deux voies sont listées à droite. Modifiée d'après (Lucin et al. , 2015). 92 C. Latence du HCMV L'échappement du HCMV au système immunitaire est important lors de sur-infection ou lors de réactivation virale, c'est-à-dire lorsque l'infection est dite productive. Cependant, le HCMV échappe également au système immunitaire en établissant une latence dans certaines cellules. L'un des mécanismes majeurs d'immuno-échappement du virus durant la latence est l'inhibition de la différentiation des progéniteurs myéloïdes CD34 en cellules dendritiques. L'infection in vitro de monocytes altère leur différentiation en cellules dendritiques : les cellules dendritiques dérivées de monocytes infectés ont un phénotype et une fonction altérée en raison du blocage de la voie du GM-CSF (facteur de différenciation des cellules dendritiques) (Carlier et al. , 2011). De plus, les cellules dendritiques infectées par le HCMV ont des capacités d'endocytose, de phagocytose et de migration réduites. La région UL111. a du HCMV code pour une cytokine immunosuppressive homologue à l'IL10 (cmv-IL10) (Kotenko et al. , 2000). Cette cytokine est présente dans des cellules infectées de façon latente et productive in vitro, et a été retrouvée dans des cellules mononuclées du sang d'individus séropositifs (Jenkins et al. , 2004). Cmv-IL10 inhibe la maturation des cellules dendritiques et altère leur fonction (Chang et al. , 2004). De plus, elle induit une diminution de l'expression des molécules de CMH-I et CMH-II sur ces cellules et inhibe ainsi les réponses immunes T-dépendantes (Spencer et al. , 2002). La diminution des molécules de CMH-II est aussi retrouvée sur des progéniteurs myéloïdes CD34 infectés de façon latente, ce qui diminue aussi les réponses T CD4 spécifiques durant la latence (Cheung et al. , 2009). 93 94 OBJECTIFS DU PROJET 95 Lors d'une infection congénitale, le HCMV peut être responsable de pathologies graves à la naissance telles que des retards mentaux ou des troubles neurosensoriels. Il peut être également responsable de complications sévères comme des atteintes viscérales ou des rétinites chez des patients immunodéprimés. Chez un individu sain immunocompétent, l'infection est généralement asymptomatique, mais le virus a pour particularité de persister dans le noyau de précurseurs hématopoïétiques, ce qui en fait des cellules réservoirs du HCMV. Ce virus latent peut être réactivé, et être responsable de complications sévères chez des individus immunodéprimés. Lors d'une infection par le HCMV, il a été démontré une expansion de la population lymphocytaire T V2neg, alors que la population T V9V2 ne semble pas naturellement activée dans ce contexte infectieux. Les T V9V2 ont été décrits pour leur propriétés antivirales contre certains agents viraux tels que le coronavirus, VIH, HCV, Influenza ou encore EBV. Cependant, l'interaction possible entre les T V9V2 et des cellules infectées par HCMV n'a jamais été étudiée. Par ailleurs, il est connu que le HCMV a développé des mécanismes d'échappement au système immunitaire, notamment contre les cellules NK, en modulant l'expression de ligands de récepteurs NKR. Les cellules T V9V2 exprimant elles aussi des NKR, nous pouvons penser que les cellules infectées puissent échapper aux T V9V2 pour les mêmes raisons qu'elles échappent aux cellules NK. Cependant, l'effet d'un traitement par ABP, molécules favorisant l'accumulation de P-Ags reconnus par ces lymphocytes T V9V2, n'a jamais été étudié lors d'une infection par HCMV. Nous avons donc fait l'hypothèse qu'en favorisant la stimulation du TCR des T V9V2 à l'aide d'un traitement des cellules cibles par les ABP, nous pourrions induire une reconnaissance des cellules infectées par le HCMV. Des études préliminaires ont été réalisées dans le laboratoire pour étudier l'effet des ABP sur l'activité des T V9V2 contre des cellules infectées par le HCMV in vitro. Pour cela, des fibroblastes embryonnaires humains (MRC-5) ont été infectés par le HCMV, traités avec des ABP, puis co-cultivés en présence de T V9V2. D'après les résultats, les ABP permettent une activation préférentielle de certaines fonctions des T V9V2 lorsqu'ils reconnaissent les cellules infectées. Nous avons donc émis l'hypothèse qu'une immuno-stimulation des T V9V2 pourrait être utilisée à des fins antivirales. Ainsi, mon projet de thèse a consisté à analyser le potentiel antiviral des T V9V2 au cours des infections par le HCMV, en particulier dans le cadre d'une immuno-stimulation par les ABP. Dans un premier temps, l'objectif de ma thèse a été de caractériser l'effet d'un traitement ABP des cellules infectées par le HCMV sur l'activation des différentes fonctions 96 effectrices des T V9V2. Nous avons étudié cette activation en présence de différents types cellulaires permissifs pour HCMV et avec différentes souches virales. D'autre part, nous avons également voulu déterminer quelles étaient les conséquences de cette activation des T V9V2 sur les cellules infectées en analysant la réplication et la production virale en présence de T V9V2. Le deuxième objectif a été d'étudier cette synergie entre le traitement ABP et l'infection du HCMV afin de préciser les mécanismes par lesquels le virus induit un stimulus pour les T V9V2. 97 98 RESULTATS (Article et résultats supplémentaires) 99 100 Publication soumise en juillet 2015 (Journal of Immunology) TITLE Aminobisphosphonates synergize with HCMV to activate the antiviral activity of V9V2 cellsa RUNNING TITLE Sensing of HCMV by V9V2 T cells AUTHORS Charline Daguzan *, , , , Morgane Moulin *, , , , Hanna Kulyk-Barbier , Christian Davrinche*, , , , Suzanne Peyrottes |, and Eric Champagne *, , , AFFILIATIONS * Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan, Toulouse, France INSERM, U1043, Toulouse, France CNRS, UMR5282, Toulouse, France Université Toulouse III Paul-Sabatier, Toulouse, France 1 Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, INSA, UMR INSA/CNRS 5504 - UMR INSA/INRA 792, Toulouse, France | Institut des Biomolécules Max Mousseron, UMR 5247 CNRS-UM-ENSCM, Montpellier, France CORRESPONDENCE Eric Champagne, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan, CHU Purpan, BP 3028, 31024 Toulouse, CEDEX 03, France Mail : eric. champagne@inserm. fr Fax : (33) 562744558 Phone : (33) 562748369 101 Abstract Human V9V2 T cells are activated through their TCR by neighbouring cells producing phosphoantigens. Zoledronate (ZOL) treatment of cells induces intracellular accumulation of the phosphoantigens IPP and ApppI. Immunomanipulation of V9V2 lymphocytes with these drugs is exploited for anti-cancer immunotherapy but few attempts were made to use it in chronic viral infections. Although V9V2 T cells seem to ignore HCMV-infected cells, we examined if they can sense HCMV when a TCR stimulus is provided with ZOL. Fibroblasts treated with ZOL activate V9V2 T cells to produce IFN- but not TNF. Following the same treatment, HCMV-infected fibroblasts stimulate TNF secretion and an increased production of IFN-, indicating that V9V2 cells can sense HCMV infection. Quantification of intracellular IPP/ApppI following ZOL treatment showed that HCMV infection boosts their accumulation, explaining the increased lymphokine secretion. Increased lymphokine production was observed with most clinical isolates and laboratory HCMV strains, HCMV-permissive astrocytoma or dendritic cells, and naïve as well as activated V9V2 cells. Using an experimental setting where infected fibroblasts were co-cultured with cells in sub-micromolar concentrations of ZOL, we show that V9V2 cells suppressed substantially the release of infectious particles while preserving uninfected cells. V9V2 cytotoxicity was decreased by HCMV infection of targets while anti-IFN- and anti-TNF antibodies significantly blocked the anti-viral effect. Our experiments indicate that cytokines produced by V9V2 T cells have an antiviral potential in HCMV infection. This should motivate in vivo studies to explore the possible antiviral effect of immunostimulation with ZOL in this context. 102 Introduction In humans, T cells represent 1-5% of peripheral T cells and are subdivided in subsets expressing preferential combinations of variable and variable TCR regions. The largest subset in humans expresses a TCR with variable 9 and 2 regions (GV2S1/DV102S1 according to the official WHO nomenclature ; thereafter referred to as V9V2 cells), is absent in rodents and expands in vivo or in vitro after contacting cells producing or loaded with small phosphorylated compounds called phosphoantigens. Exogenous phosphoantigens are produced by several bacteria and parasites and thus V9V2 cells are components of the innate defense against these pathogens (Eberl et al. , 2003). Endogenous phosphoantigens such as isopentenyl pyrophosphate (IPP) are also ubiquitously produced by eukaryotic cells as intermediates of the mevalonate pathway (Tanaka et al. , 1995). IPP accumulation occurs naturally in some tumors following perturbation of this pathway but it can also be induced by aminobisphosphonate (ABP) drugs. ABPs limit bone resorption and this property is widely used in the clinic for treatment of demineralizing diseases such as osteoporosis, rheumatoid arthritis, Paget disease and cancer metastases. More recently it has been demonstrated that they block the mevalonate pathway enzyme farnesyl pyrophosphate synthase and subsequently promote intracellular IPP accumulation in target cells (Thompson et al. , 2002). This promotes the recognition and killing of tumors by V9V2 cells (Gober et al. , 2003 ; Thompson et al. , 2002) and this property is exploited in anti-cancer immunotherapeutic approaches using ABPs (Kobayashi and Tanaka, 2015). Multiple clinical trials have been performed to evaluate the beneficial effect of V9V2 T cell stimulation by ABPs in conjunction with IL-2 administration and encouraging results have been obtained, showing the relative safety and adjuvant potential of this approach for anti-tumor therapy (Kobayashi and Tanaka, 2015) and for restoring immune competence in HIV patients (Poccia et al. , 2009). The V9V2 T cell response to APB-induced phosphoantigen accumulation is TCR- and CD277 (butyrophylin BTN3A1)-dependent (Chien et al. , 2014 ; Dimova et al. , 2015 ; Harly et al. , 2014). Intracellular phosphoantigens can bind to the cytoplasmic domain of BTN3A1, 103 and this interaction is sensed by the V9V2 TCR in a manner which is still incompletely understood but may involve a conformational rearrangement of BTN3 and other protein complexes such as periplakin and F1-ATPase, conferring the cells an increased sensitivity to V9V2 killing activity (Rhodes et al. , 2015 ; Sandstrom et al. , 2012 ; Scotet et al. , 2005 ; Vavassori et al. , 2013 ; Wang et al. , 2013). Non-V2 T cells expand in response to acute HCMV infections in immuno- compromised patients or following placental infections, where they are thought to provide some protection in conjunction with CD8 and NK cells (Lafarge et al. , 2001). Although alterations of the V9V2 subset are observed in multiple viral contexts such as HIV or HCV infections (Agrati et al. , 2011 ; Cimini et al. , 2012 ; Cimini et al. , 2013 ; Cummings et al. , 2008), the role of these cells is not clear. Human V9V2 cells that have been activated in vivo with ABPs can control influenza virus-mediated disease after transfer in RAG-deficient mice (Tu et al. , 2011). Thus, V9V2 cells, as well as non-V2 subsets could possibly exert anti-viral activity either naturally or following specific immuno-stimulation. HCMV is a -Herpesvirus which replicates in epithelial, endothelial, fibroblasts and other cell types following primo-infection, and persists life-long in a latent state in myeloid lineage cells which constitute a reservoir for subsequent reactivation, with deleterious consequences in immuno-compromized individuals. There is at present no possibility to clear HCMV infection. HCMV persistence are largely influenced by viral factors which interfere with apoptosis and with the MHC-class I peptide antigen presentation pathway allowing the escape of infected cells from CD8 T cells (Lucin et al. , 2015). In addition, several viral micro RNAs and proteins down-modulate the expression of stress molecules on the surface of HCMV-infected cells. This is the case for UL16-binding proteins (ULBP) and MHC class I chain-related (MIC) antigens which stimulate activating receptors on NK cells and cells (Fielding et al. , 2014 ; Halenius et al. , 2015). The present study was undertaken to examine in vitro the immune-therapeutic potential of V9V2 immuno-manipulation in the context of HCMV infection since pharmacological 104 stimulation of these cells is more readily achievable than that of non-V2 cells. How V9V2 cells behave when they are challenged with HCMV-infected cells and the effect of V9V2- specific immune-manipulation have not been reported. Although V9V2 cells do not normally recognize HCMV-infected targets, we show here that viral infection provides a potent additional stimulus when stimulating cells are concomitantly treated with ABPs. Consequently, doses of ABP which do not promote full activation of V9V2 cells by uninfected targets allow their activation by infected cells and subsequent inhibition/limitation of viral replication. 105 Material and methods Cells and culture medium Unless otherwise indicated, cultures were performed in complete medium (CM) containing RPMI1640-glutamax, sodium pyruvate, penicillin, streptomycin and 10% heat- inactivated FCS (all reagents from Life Technologies). Healthy donors PBMC were purified on ficoll from buffy coats obtained from the Etablissement Français du Sang. MRC-5 (Human embryonic lung fibroblasts, from Seromed) and U-373MG (Human astrocytoma, from ATCC) were maintained and infected with HCMV in DMEM-Glutamax medium (Life Technologies) supplemented with 10% heat-inactivated FCS, sodium pyruvate and antibiotics. Monocyte-derived dendritic cells (DC) were generated as described previously (Carlier et al. , 2011). In brief, CD14 cells were purified from PBMC by positive magnetic sorting (Miltenyi Biotec kit) and put to differentiate in CM containing IL-4 and GM-CSF (Miltenyi Biotec, 50ng/ml and 20ng/ml respectively) for 5 days. For production of short term V9V2 T cell lines, PBMC were isolated from healthy donor buffy coat samples (obtained from the Etablissement Français du Sang). T cells were purified by magnetic sorting with anti-TCR/ microbeads (Miltenyi Biotec) and V9V2 cells (1x106) were expanded with the (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HDMAPP) phosphoantigen (Tebu-Bio ; 10nM) and IL-2 (400iu/ml, after 48h) in presence of irradiated autologous PBMC (30Gy ; 15x106 cells) and a mix of allogeneic lymphoblastoid cells (50Gy, 1. 5x106 cells) in CM, in a final volume of 10ml. The cell concentration was kept close to 106cells/ml by adding fresh medium and IL-2 every 2-3 days. After 19-22 days of culture, the percentage ofV9V2 T cells was checked (usually >99% V9 ). If necessary, non-cells were eliminated by negative magnetic sorting (Miltenyi Biotec) and cells were frozen. Virus strains, virus titration, inactivation and infections 106 HCMV-AD169 was from ATCC. The endothelial cell-adapted strains VHL/E and TB40/E GFP were provided by C. Sinzger (Tubingen, Germany) and M. Messerle (Hanover, Germany) respectively. Clinical isolates CON and TRI were provided by F. Halary (Nantes, France). All strains were amplified once on MRC-5 fibroblasts and collected from supernatants by ultracentrifugation at 70000g for 40min and frozen in aliquots. Virus titers (fluorescent focus forming units, ffu/ml) of viral stocks and culture supernatants were determined after infection of MRC-5 cells with serial dilutions, followed by immuno-staining of fibroblast layers at day 2 with anti-CMV-IE antibody and determination of ffu counts by immunofluorescence microscopy. Viral inactivation by UV irradiation was performed by putting the virus suspension in an Eppendorf tube 3 cm below a Spectroline UV light (0. 17Amp) for 20min. For heat inactivation the viral suspension was put at 65C for 30min in a dry heating block. HCMV infection of cell lines and fibroblasts were performed by adding virus dilutions to sub-confluent (~80%) monolayers of cells, after having determined cell density to adjust for the desired multiplicity of infection (MOI). Cells were washed after 3h. For the infection of DCs, the virus (VHL/E) was added to the cell suspension in culture wells (106cells/ml) at an MOI of 5. Detection of HCMV proteins by immunofluorescence microscopy Cell monolayers in microtiter plates were washed with PBS, fixed with formaldehyde (4% in PBS, pH7. 3) for 15min at room temperature and permeabilized for 15min in PBS containing 10mM Hepes, pH7. 3, 3% bovine albumin and 0. 1% Triton X100. Cells were stained with anti-HCMV-IE1/2 (anti-IEA, Bio-Mérieux, France) or anti-pp28 (5C3, Abcam) followed by FITC-coupled anti-IgG F(ab')2 antibody (Beckman-Coulter), both steps at room temperature for 2h. Nuclei were then stained with DAPI (1g/ml) and fluorescence images were acquired using a Zeiss Apotome microscope (wide field mode). For the quantitative evaluation of viral 107 replication, images corresponding to nuclei staining for HCMV proteins (green chanel) and total nuclei (DAPI, blue chanel) were analyzed with the ImageJTM software and the automatic counting function. Two fields (~600nuclei/field) were acquired for each well with the 10X objective and counts were averaged. Quantitative RT-PCR for IE-mRNA expression Cells were harvested and total RNA was isolated using the GenElute Mammalian Total RNA kit, Sigma-Aldrich). Reverse transcription was performed on 0. 5g of total RNA (Super Script III, Life Technologies) and real time quantitative PCR was performed using the SYBR Green I Master system and LightCycler 480 (Roche). GAPDH was used as the endogenous control. The following primers were used (5' to 3') : GAPDH(forward) : TCATTTCCTGGTATGACAACG ; GAPDH(reverse) : TCTTACTCCTTGGAGGCCAT ; HCMV-IE(forward) : AACATAGTCTGCAGGAACGTC ; HCMV-IE(reverse) : CCAAGAGAAAGATGGACCCTG. The efficiency of amplification with all primer pairs was >0. 98 and the specificity of amplification products was checked by denaturation curve analysis. 51Cr-release assay Adherent fibroblasts were labeled in flat bottom microtiter wells (7500 cells/well) with 1Ci of 51Cr-sodium chromate (Perkin Elmer) in 40l of CM for 1h and washed three times with 150 l of RPMI medium. V9V2 effector T cells were added (100l) at the indicated effector : target ratio, spun briefly to pellet cells and incubated 4h at 37C. Cell-free supernatants (70l) were transferred to Lumaplates (Perkin-Elmer) and counted using a TopCount (Perkin- Elmer) counter. Spontaneous and maximum release values were determined for each target with a specific treatment (infection and/or zoledronate), and were averaged from triplicates. Spontaneous release (spont) was determined from wells containing target cells only ; maximum release (max) was obtained by replacing effector cells by 100l of 1% Triton X-100. The percentage of specific lysis (%SL) was calculated as follows : 108 %SL 100x [ cpmsample cpmspont] / [cpmmax cpmspont]. Measure of cytokine expression IFN- and TNF release in supernatants were measured by a standard ELISA (BD biosciences kit) 48h after addition of V9V2 T cells in co-cultures with adherent cells in 96- well microtiter plates. In experiments with fresh PBMC, cytokine expression was measured by FACS : adherent MRC-5 fibroblasts (2x105cells) were cultured, infected and treated with ZOL in 24-well plates. Total PBMC (106cells/well) were added for 16h in CM, and brefeldin A (5g/ml) was added during the last 4h of co-culture. Non-adherent lymphocytes were then harvested, washed, and surface-stained with anti-V9-PC5 monoclonal antibodies (Beckman- Coulter), then fixed and permeabilized with the Cytofix/Cytoperm kit (BD Biosciences) and stained with anti-IFN-FITC and TNF-PE (BD-Biosciences). After washing, fluorescence was acquired on an LSR-II cytofluorometer (BD-Biosciences) and analyzed with the FlowJo software (TreeStar). Co-cultures with T cells Short-term co-cultures of V9V2 T cell lines with adherent targets were performed at a 1 : 1 and 5 : 1 ratio for cytokine and cytotoxicity measurements respectively. In these experiments, adherent targets were plated in 96-well microtiter plates and infected for the indicated time. When present, mevastatin, pamidronate (Sigma-Aldrich) and ZOL (Novartis) were added after infection at the indicated time and concentration before co-culture and were washed out before the addition of T cells. A different setting was used for prolonged 6-day co-cultures of V9V2 cells with infected adherent cells to evaluate the level of viral replication. ZOL was added (0. 05 to 0. 4M) to adherent cells 24h before infection, to the culture medium in the T cell suspension and with fresh medium replacement at day 3 of the co-culture to maintain the same final concentration. Microplates were used for immunofluorescence analysis (15x103 fibroblasts/well) ; for 109 quantitative RT-PCR analysis of viral RNA and for the titration of live virus in supernatants, parallel co-cultures were performed in 24-well plates (2x105 fibroblasts/well), with an identical effector : target ratio of 0. 2 : 1 and an MOI of ~0. 2. The role of IFN- and TNF in co-cultures was assessed by adding anti-IFN- (B27, IgG1), anti-TNF (Mab1, IgG1) antibodies and IgG1 control antibodies in the culture medium (10g/ml) at the start of the co-culture and at day 3 with medium change. All antibodies were azide-free and endotoxin-low, and were purchased from (Pharmingen). Quantification IPP and ApppI by ion chromatography-coupled tandem mass spectrometry (IC-MS/MS) MRC-5 fibroblasts were cultured in 6-well plates to 80% confluence (106 cells in 2ml of CM) and infected with HCMV-AD169 (MOI 1) for 48h or 96h. ZOL was added at the indicated concentration during the last 16h of culture. At the end of the culture, the fibroblast layer was washed twice with cold PBS and the plates were put on liquid nitrogen for fast freezing. The plate was then taken out and 5ml of cold lysis solution (acetonitrile : methanol : water, 4 : 4 : 4) and 180l of the isotope dilution mass spectrometry standard (IDMS) were added to ensure accurate quantification. Lysates were harvested in 15ml-polypropylene tubes by scrapping, vortexed extensively and insoluble material was removed by quick centrifugation. Samples were evaporated under vacuum in a SpeedVac (SC110A SpeedVac Plus, ThermoSavant, USA) for 6h and then stored at -80C for further use. Dried samples were resolubilized in 100l of milliQ water and IPP and triphosphoric acid 1-adenosin-5'-yl ester 3-(3-methylbut-3-enyl) ester (ApppI) were analyzed and quantified by ion chromatography coupled with a triple quadrupole mass spectrometer (IC-MS/MS) using the isotope dilution mass spectrometry (IDMS) method (Wu et al. , 2005). Liquid anion exchange chromatography was performed with the Thermo Scientific Dionex ICS-5000 Reagent-Free HPIC system (Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA) equipped with an eluent generator system (ICS-5000 EG, Dionex) for automatic 110 base generation (KOH). Analytes were separated within 45min, using a linear KOH gradient elution applied to an IonPac AS11 column (250 x 2mm, Dionex) equipped with an AG11 precolumn (50 x 2mm, Dionex) at a flow rate of 0. 35ml/min. The gradient was as follows : equilibration with 0. 5mM KOH, 1. 1min, KOH ramp from 0. 5mM to 4. 1mM, 1 to 9. 5min, constant concentration 5. 1min ; isocratic ramp to 9. 65mM in 9. 4min ; isocratic ramp to 60mM in 8min ; isocratic ramp to 90mM in 0. 1min ; constant concentration 6. 9min ; drop to 0. 5mM in 0. 1min ; equilibration at 0. 5mM KOH for 1. 9min. The column and autosampler temperature were thermostated at 29C and 4C respectively. The injected sample volume was 15l. Measures were performed in triplicates from separate cultures. Tandem mass analyses were carried out in the negative mode with a 4000 QTRAP hybrid triple quadrupole/linear ion trap mass spectrometer (AB Sciex, Foster City, CA, USA) equipped with a Turbo V source (AB Sciex/MDS Sciex, Toronto, Canada) for electrospray ionization. The MRM approach was used for quantification of IPP and ApppI and was done by collision-activated dissociation using nitrogen as the collision gas at medium pressure. The nebulizer gas pressure was 50psi, the desolvation gas pressure was 60psi, the temperature was 55C, and the capillary voltage was 4. 2kV. Instrument control, data acquisition, and data analysis were performed with the Analyst version 1. 5. 2 software. The MRM transitions used for quantification of the IPP and ApppI were 245. 0->79. 0 and 574. 1->79. 0 respectively. For absolute quantification of IPP and ApppI the IPP U-13C MRM transition was taken. To determine the method's linearity, the limit of detection (LOD) and of quantification (LOQ), mixtures of the standard compounds at various concentrations (0. 0055mol/l) were analyzed. A linear range was observed between 0. 01 and 5mol/l for both IPP and ApppI. For further quantification, linear ranges were chosen between 0. 1-2. 5 mol/l and 0. 01-0. 3 mol/l for IPP and ApppI, respectively. The variation of the ratio peak area 12C/U-13C with the concentration of 12C standard was given by the linear regression equations : y 93. 747x 4. 3075(mol/l), R 0. 9992 (n 5) for IPP ; y 248. 06x 0. 6977(mol/l), R 0. 9995 (n 5) for ApppI, where R is the correlation coefficient and n is the number of points. The LOD and LOQ 111 for IPP and ApppI were 0. 1 and 0. 3mol/l (IPP) and 0. 01 and 0. 03mol/l (ApppI) respectively, calculated by using the calibration curve method with the following equations : LOD 3Sy/x b and LOQ 10 Sy/x b, were (b) is the intercept of regression line and (Sy/x) is the standard deviation of the intercept. Statistical analyses Most analyses were performed with Prism Version 5 software (GraphPad). Non parametric Wilcoxon test was used for all single point comparisons. ExcelStat software was used for covariance analyses in antibody blocking experiments : in this case, p values were calculated for slope and intercept of regression lines, and the lowest p value only is indicated. A p value was considered significant. 112 Results Lymphokine secretion by V9V2 cell lines We wanted to know if V9V2 T cells could detect signs of infection by HCMV. To this end we challenged short term V9V2 cell lines (>95%V9 ) with MRC-5 fibroblasts which were infected or not with the HCMV-AD169 laboratory strain and we measured IFN- and TNF secretion, the main cytokines produced by V9V2 cells. In the absence of additional stimulus, no significant lymphokine secretion was detected. Then we tested whether infection could be sensed by V9V2 T cells after treatment of fibroblasts with ABPs to promote intracellular production of phosphoantigens and provide a specific stimulation of the V9V2 TCR (Fig. 1). To this end HCMV-infected and control uninfected fibroblasts were treated 16h with various doses of ZOL. When V9V2 cells were stimulated with ZOL-treated uninfected fibroblasts, increasing amounts of IFN- were released in response to increasing doses of ZOL, whereas TNF secretion was barely detectable. When V9V2 cells were challenged with infected ZOL- treated cells, large and dose-dependent amounts of TNF were released and IFN- production was increased. The effect of viral infection on IFN- and TNF release was abrogated by virus inactivation by UV or heat treatment (65C, 30min) (Fortunato et al. , 2000) and was thus dependent on viral transcription and/or replication (Fig. 1A). The stimulatory activity of ABP-treated fibroblasts increased with the length of infection, from 24 to 96h (Fig1B, C). Longer infection times were not tested because virus cycle completion induced significant fibroblast lysis. HCMV infection of fibroblasts also increased the IFN- response of V9V2 T cells when another ABP, pamidronate, was used instead of ZOL (Fig. 1C). No significant IFN- and no TNF were detected in control fibroblast cultures without cells, treated or not with ABPs, infected or not (Fig1C and data not shown). Thus viral replication in AD169-infected fibroblasts synergizes with ABP treatment for the stimulation of IFN- and TNF secretion by V9V2 cells. 113 Figure 1 : Lymphokine secretion by V9V2 cell lines stimulated with HCMV-infected fibroblasts V9V2 T cell lines were co-cultured in micro-culture wells with MRC-5 fibroblasts (1 : 1 ratio) that had been infected with HCMV (AD169, MOI 1) and treated with aminobisphosphonates. IFN- and TNF production were quantified by ELISA after 48h. A, MRC-5 cells were either mock infected (no virus), infected with untreated HCMV (AD169 strain, MOI 1), or infected with heat-inactivated (65C, 30min) or UV-irradiated virus, during 72h before co-culture. Zoledronate was added during the last 16h and washed before addition of cells (mean /- SD of triplicate cultures, representative experiment out of three). B, MRC-5 were infected or not with AD169 (MOI 1) 48h or 96h and treated by zoledronate 16h before co-culture with cells ; mean of 9 independent experiments performed in triplicates. C, MRC-5 cells were infected with AD169 during 24-48-72h and treated or not with pamidronate (PAM, 100M) 16h before co-culture with cells or medium only to check for cytokine secretion by fibroblasts (mean of triplicate cultures). Error bars indicate SD ; *P (Wilcoxon's test). 114 HCMV infection modulates endogenous production of phosphoantigens The effect of HCMV infection on the V9V2 T cell response could result from several non-exclusive mechanisms, including induction of ligands for costimulatory molecules such as NKG2D ligands (MICA/B and ULBP proteins) or modulation of molecules involved in the sensing of phosphoantigen such as BTN3A1. Blocking NKG2D ligands with NKG2D-Fc had no effect on above responses and we could not demonstrate any modulation of BTN3A1 on infected cells, although V9V2 T cell stimulation was abolished by anti-BTN3 antibody 103. 2 (Harly et al. , 2012), confirming the absolute need for phosphoantigen sensing (data not shown). ABPs inhibit the mevalonate pathway enzyme farnesyl pyrophosphate synthase and promote accumulation of V9V2 T cell agonists such as IPP and ApppI. Nevertheless they also affect cellular metabolism independently of farnesyl pyrophosphate synthase inhibition (Nussbaumer et al. , 2011 ; Schmidt et al. , 1996 ; Skorey et al. , 1997). To check that V9V2 T cell activation by ZOL-treated MRC5 cells, infected or not, was dependent on modulation of the mevalonate pathway, fibroblasts were treated with mevastatin for 24h prior to addition of ZOL to block the synthesis of mevalonate and downstream metabolites. Mevastatin treatment of fibroblasts abrogated IFN- and TNF production by V9V2 cells in a dose-dependent manner (Fig. 2A). Then we then measured the intracellular concentration of endogenous phosphoantigens in ZOL-treated fibroblasts, infected or not, using ionic chromatography coupled to tandem mass spectrometry. The limits of detection and of quantification were 0. 1 and 0. 3 M (IPP) and 0. 01 and 0. 03 M (ApppI) respectively. Note that our procedure does not distinguish IPP and ApppI from their respective isomers DMAPP and ApppD (Jauhiainen et al. , 2009). The intracellular amounts of IPP and of its adenylated derivative ApppI (Vantourout and Hayday, 2013) were both increased in a dose-dependent manner after ZOL treatment. Importantly, the amount of both metabolites was strongly increased when cells had been infected for 48h. Intracellular IPP decreased but was still elevated in cells that had been 115 infected for 96h, whereas ApppI returned below the limit of detection (Fig. 2B). This indicates that HCMV infection boosts the accumulation of endogenous phosphoantigens following ZOL treatment and explains, at least in part, the synergy between ZOL and HCMV for V9V2 stimulation. Figure 2 : Involvement of the mevalonate pathway and phosphoantigen production A, MRC-5 fibroblasts were infected with HCMV-AD169 (MOI 1) during 72h. V9V2 T cells were then added and IFN- and TNF production were quantified as in Fig1a ; in some cultures mevastatin (or control solvent) and zoledronate were added 40h and 16h respectively before the addition of cells. Results are means /- SD of triplicate cultures ; representative experiment out of three. B, IPP and ApppI phosphoantigens were quantified by IC-MS/MS in cytosolic extracts from MRC-5 fibroblasts which had been either not infected, or infected with HCMV-AD169 (MOI 1) during 48 or 96h. In some cultures zoledronate was added at the indicated concentration during the last 16h of culture. Zol : zoledronate ; Mev : mevastatin. 116 Influence of the HCMV strain and of the host cell type The AD169 HCMV strain is a laboratory-adapted isolate and carries multiple genomic deletions which alter tropism and virus-host interactions (Cha et al. , 1996). To see if other strains of HCMV could similarly boost lymphokine secretion by V9V2 T cells, we tested the laboratory strains VHL/E and TB40/E and two low-passage clinical isolates (CON, TRI). TB40/E did not increase significantly cytokine production whereas infection with other strains led to increased production of IFN- and TNF although their efficiency to promote TNF release was variable. Differences between strains for the speed of viral cycle progression are not excluded. Thus the V9V2 cell response is dependents on the virus but most tested HCMV strains, either being clinical isolates or laboratory-adapted strains, were able to boost cytokine secretion by V9V2 cells after ABP treatment (Fig. 3). Figure 3 : V9V2 lymphocyte sensing of infection with different HCMV strains IFN- and TNF production by V9V2 T cell lines were quantified by ELISA after 48h of co- culture (1 : 1 ratio) with MRC-5 fibroblasts infected 48h (top panels) or 96h (bottom panels) before co-culture by different HCMV isolates (MOI 1) : A, TB40/E and VHL/E are laboratory- adapted strains ; B, CON and TRI are low-passage clinical isolates. Zoledronate was added 16h before co-culture and washed. Results are mean /- SD of triplicate cultures. Each strain was tested at least twice with similar results. 117 As HCMV can infect multiple cell lineages in vivo, we also tested whether infection of other cell types could also stimulate lymphokine production. Infection of primary fibroblast instead of MRC-5 cells gave identical results (not shown). V9V2 cell stimulation with the astrocytoma U-373MG treated with ZOL induced dose-dependent IFN- and TNF secretion in the absence of infection. Nevertheless, infection with either AD169 or VHL/E increased the production of both cytokines (Fig. 4A). To see if V9V2 cells were also able to sense HCMV infection in cells of the myeloid lineage, we produced monocyte-derived DCs by in vitro culture of sorted monocytes in the presence of IL-4 and GM-CSF for 5 days. In vitro differentiation of monocytes into DCs was checked by the loss of CD14 expression and upregulation of CD86 ; VHL/E was used because, unlike AD169, it is known to retain infectivity for myeloid cells. DC permissiveness was checked by the nuclear expression of HCMV-IE protein and was ~3-5% when using and MOI of 5 (Supplemental Fig. 1). After infection with HCMV-VHL/E, DCs were treated with ZOL and co-cultured with V9V2 cells. IFN- production in the presence of infected DC was increased compared with co-cultures with uninfected DC. TNF production remained very low even in co-cultures of cells with infected DCs (Fig. 4B), possibly due to the relatively low percentage of cells expressing viral proteins. Thus HCMV infection stimulates the lymphokine response of V9V2 cells in most combinations of viral strain and cellular target in the context of ZOL treatment although these factors influence qualitatively and quantitatively the responses of V9V2 cells. 118 Figure 4 : V9V2 lymphocyte sensing of infection with HCMV in non-fibroblast targets IFN- and TNF production by V9V2 T cell lines were quantified by ELISA after 48h of co- culture with infected cells, treated or not with zoledronate during the last 16h. A, Astrocytoma cells U-373MG infected 48h before co-culture by AD169 and VHL/E (MOI 1) ; B, Monocyte- derived DC infected by VHL/E (MOI 5) five days post-differentiation of CD14 cells in IL-4 and GM-CSF, treated with zoledronate (day 6) and co-cultured (day 7) with V9V2 cells during 48h. Results are means /- SD of triplicate cultures. Response of fresh V9V2 cells to HCMV-infected cells All above experiments were performed using activated V9V2 cell lines obtained after their short term amplification from PBMC with HDMAPP phosphoantigen. As T cells that had not been primed in vitro may behave differently, we evaluated whether V9V2 cells from fresh PBMC samples could also be activated by ZOL-treated fibroblasts and whether HCMV 119 infection also affected their activation. In agreement with other reports (Miyagawa et al. , 2001) the cytokine response of sorted fresh cells was undetectable (not shown) suggesting that they require accessory cells. Thus we co-cultured total PBMC with fibroblasts, infected or not with HCMV AD169 or VHL/E, and measured the specific activation of V9 cells by intracellular staining of IFN- and TNF (Fig. 5). In independent cultures with six different PBMC samples, the response of V9 cells to uninfected, ZOL-treated fibroblasts was barely detected. This response was significantly higher when fibroblasts were infected with HCMV-AD169 or VHL/E and the majority of activated cells produced IFN- and TNF. This cytokine production was essentially confined to V9 cells (Fig. 1A, B). Thus fresh V9V2 cells also respond by an increased lymphokine production when stimulated with HCMV-infected ZOL-treated fibroblasts. 120 Figure 5 : FACS analysis of fresh V9 cell responses to HCMV infected fibroblasts MRC-5 fibroblasts were infected by HCMV (AD169 or VHL/E ; MOI 1) for 48h and treated with zoledronate at the indicated concentration during the last 16h. Fresh unsorted PBMC were then added for 16h and brefeldin A was added during the last 4h of co-culture. In some cultures, PMA and ionomycin were added instead of zoledronate during 4h to assess maximal response. Non-adherent cells were then recovered, stained for surface V9 expression and intracellular IFN- and TNF accumulation, and analyzed by FACS. A-B, Representative dot plots from one individual showing percentages of IFN- production in V9 gate and V9- cells (A), and double staining for IFN- and TNF in V9 cells (B). C, Mean percentages /-SD of IFN- and TNF- producing cells from 6 independent experiments with PBMC from different healthy donors. *P ns : non significant (Wilcoxon's test). V9V2 cells can control HCMV replication The synergistic effect of ZOL and HCMV on cytokine release by V9V2 cells suggests that this drug could be used to specifically target infected cells and possibly limit viral amplification. The co-culture conditions used in above experiments to demonstrate the effect of HCMV on lymphokine secretion resulted in a rapid disruption of the fibroblast layer by 121 V9V2 cell lines even in the absence of infection and were not appropriate for examining viral amplification on a complete viral cycle (5-7 days). To evaluate the antiviral potential of V9V2 cells, we switched to cultures where ZOL was kept at a low concentration all along the co- culture with T cells. When the concentration of ZOL was kept below 0. 5M and the V9V2fibroblast ratio around 1 : 5, uninfected fibroblasts were not altered and the layer was respected. A multiplicity of infection (MOI) of ~0. 2 was used to allow quantification of the percentage of infected fibroblasts by fluorescence in all conditions. Fibroblasts were thus cultured in medium containing ZOL and subsequently infected with HCMV-AD169. Three hours after infection, a V9V2 cell line was added to the culture for 6 days. The replication cycle of HCMV was followed by monitoring HCMV-IE and -pp28 protein expression on the fibroblast layer, quantification of HCMV-IE (IE1 IE2) mRNA by quantitative RT-PCR in cell lysates, and quantification of infectious particles in supernatants (Fig. 6). In the absence of cells, we observed only a slight decrease of the percentage of HCMV-IE cells in cultures containing ZOL up to 0. 4M, with no significant decrease of viral mRNA expression and only a slight decrease of virion release (about one log). In co-cultures with V9V2 cells, the percentage of HCMV-IE cells decreased gradually with increasing concentrations of ZOL to below 10% of the control level (Fig. 6A, B). Similar results were obtained by monitoring late phase cytoplasmic HCMV-pp28 protein by fluorescence (Supplemental Fig. 2). HCMV-IE mRNA expression was similarly decreased in cultures contraining cells and ZOL (Fig. 6C). The production of infectious virions in the co-culture supernatant dropped by approximately three orders of magnitude when V9V2 cells were present and with 0. 2-0. 4M ZOL (Fig. 6D). Thus V9V2 T cells can potentially limit HCMV replication in presence of sub-micromolar concentrations of ZOL. 122 Figure 6 : Limitation of HCMV replication by V9V2 T cells A-B, MRC-5 were cultured in medium containing zoledronate at the indicated concentration and infected or not with HCMV (AD169, MOI 0. 2) 3h before co-culture with or without V9V2 cells (T cell line ; lymphocyte : fibroblast ratio of 0. 2 : 1). Zoledronate was maintained in the medium throughout 6 days of co-culture. Non-adherent cells were then removed ; the adherent fibroblast layer was fixed, stained with anti-IE antibodies (FITC, green) and DAPI (red), and analyzed by wide field fluorescence microscopy for nuclear staining. A, Cumulative data (n 6) from 3 independent experiments performed in duplicates cultures (3 optic fields, >1500nuclei for each culture) showing the percentage of infected cells (IE nuclei) among total nuclei (DAPI ). Results are expressed in % of the control (without zoledronate). B, Representative images obtained in co-cultures of infected fibroblasts with cells, in the absence (medium) or presence of increasing doses of zoledronate. C, Cells were cultured as described above. At the end of the 6-day-co-culture, the fibroblast layer was recovered, total RNA was extracted and HCMV-IE mRNA expression was measured by quantitative RT-PCR. The results are expressed as the ratio of IE expression in cultures with ZOL over cultures without ZOL (fold change, 2-Ct). Mean /- SD of six cultures. D, Infectious HCMV particles in supernatants were titrated at the end of the 6-day co-culture by secondary infection of fibroblasts micro-cultures and immunofluorescence staining with anti-IE antibody and counting IE fluorescent focus forming units (ffu). *P in Wilcoxon. 123 Role of cytokines and cytotoxicity in the control of infection Activated V9V2 cells are known to develop a potent cytolytic activity in addition to their ability to produce inflammatory cytokines. We wished to determine which of their activities was determinant for the antiviral effect. We used 51Cr-release assays to examine how HCMV infection affects fibroblast sensitivity to V9V2 killing activity, after ZOL treatment. This could only be evaluated in the initial co-culture conditions (Fig. 7A). V9V2 cells displayed a moderate but significant cytolytic activity on ZOL-treated fibroblasts at an effector : target ratio of 5 : 1. This activity was strictly ZOL dose-dependent. HCMV infection of targets did not increase fibroblast lysis. Instead, they became resistant to lysis after 24-48h of infection. Thus cytolytic activity is unlikely to be responsible for the inhibition of viral replication in co-cultures with V9V2 cells. IFN- and TNF produced by CD4 cells have been shown to affect the replication of HCMV and other viruses (Davignon et al. , 1996 ; Romero and Lavine, 1996). To see if they were involved in the antiviral effect of V9V2 cells, we used the co-culture system described in the previous section and monitored viral replication in the presence or absence of anti-IFN- and anti-TNF blocking antibodies. Both antibodies were able to restore partially viral amplification in co-cultures of ZOL-treated fibroblasts, with significant increase of the percentage of cells expressing the IE-protein, and a concomitant increase of infectious virions in the culture supernatant (Fig. 7B, C). Thus the release of IFN- and TNF by V9V2 cells is probably the major mechanism by which V9V2 cells limit viral replication in this system. 124 Figure 7. Role of cytokines and cytotoxicity in the antiviral effect of V9V2 cells The cytolytic activity of V9V2 cell lines were measured by 51Cr chromium release assays on MRC-5 cells that had been infected (MOI 1) during 3 to 48h or not, and treated or not with zoledronate for 16h. A, A representative experiment of 3 with different cell lines is shown. Results are expressed as the mean of specific lysis /- SD of triplicate cultures. B, Co-cultures of MRC-5 cells with a V9V2 cell line were performed as described in Fig. 6A, B except that anti-IFN-(top panels) , anti-TNF (bottom panels) or control antibodies were added in the cultures with cells. HCMV-IE expression on the fibroblast layer (left panels) and virus release (right panels) (as in Fig. 6D) after 6 days were measured. Results are expressed as the mean /- SD of four cultures from two independent experiments. Covariance analysis was used for the statistical comparison of linear regression curves (left panels). 125 Discussion Activation of T cells during HCMV infection is documented in fetuses and in organ- transplanted patients where it involves minor subsets of V2-negative lymphocytes. These cells can detect stress-induced antigens such as endothelial protein C receptor (EPCR) (Willcox et al. , 2012) and this recognition involves a specific TCR. At present it is difficult to target theses subsets for immunotherapeutic purposes. On the other hand V9V2 cells are abundant and prone to immunomanipulation by ABPs or phosphoantigens but there is no report of an alteration of V9V2 numbers or function in the course of HCMV infection. This goes along with our observations that V9V2 cells do not respond in vitro to HCMV-infected cells and seem to ignore HCMV. However, we show here that HCMV infection induces cellular perturbations which can be sensed by V9V2 cells when an additional TCR stimulus is provided. Previous studies have shown that HCMV infection activates the transcription factor PPAR- (Rauwel et al. , 2010), a transcription factor which also activates the expression of HMG-CoA synthetase and HMG-CoA reductase, the enzymes which control the initial steps of the mevalonate pathway (Iida et al. , 2002). Upregulation of this pathway is possibly important to increase the availability of metabolites essential for the cycle of herpes viruses, such as geranyl-geranyl pyrophosphate (Blanc et al. , 2011 ; Ye et al. , 2003). The effect of HCMV on the endogenous production of phosphoantigens was however unpredictable as HCMV infection also induces an endogenous type 1-IFN response which has an opposite effect on this pathway (Blanc et al. , 2011). In our experiments, fibroblasts that have been treated with ABPs such as pamidronate or ZOL are more potent stimulators of cytokine release by V9V2 T cells when they are infected with HCMV and this infection increases the effect of ZOL by stimulating the accumulation of endogenous phosphoantigens IPP and ApppI. Except in the particular case of Daudi lymphoma, IPP and derived metabolites (ApppI, DMAPP, ApppD) are usually not detected in cells and this is because IPP is consumed in downstream metabolic reactions 126 (Gober et al. , 2003 ; Jauhiainen et al. , 2009 ; Vantourout et al. , 2009). Similarly, we show here that it remains below the level of detection in HCMV-infected cells. Upregulation of phosphoantigens by HCMV is revealed when IPP is not consumed due to inhibition of farnesyl pyrophosphate synthase by ZOL. Strikingly, the accumulation of IPP/ApppI was high at 48h of infection and decreased thereafter. It is possible that activation of the type 1-IFN response is responsible for the decrease of IPP/ApppI at the late phase of infection. However, It is intriguing that the stimulatory activity of infected fibroblasts for lymphokine secretion increases further between 48 and 96 hours of infection. It is possible that a transient increase of intracellular phosphoantigens induces long-lasting effects in infected cells, involving for example butyrophilin 3A1 rearrangement (Harly et al. , 2012). Nevertheless, additional mechanisms are not excluded and may involve expression of surface molecules or secretion of soluble factors by infected cells. We show that V9V2 cells have the potential to limit HCMV replication when they are in co-culture with infected fibroblasts. V9V2 cells have a potent anti-tumor activity which is mainly due to their cytolytic potential and is controlled by NKG2D and other NK receptors (Nedellec et al. , 2010). Our V9V2 cell lines are also cytotoxic in in vitro assays on fibroblasts treated with ZOL at doses above 0. 4M, but strikingly, infection of fibroblasts with HCMV progressively decreased their sensitivity to lysis during the first 48h, possibly due to multiple escape mechanisms involving NKG2D ligands. Thus the main mechanism which allows the control of HCMV amplification in co-cultures is probably not a preferential cytolytic activity on HCMV-infected targets. Our results also suggest that escape mechanisms have a distinct impact on cytotoxicity and stimulation of IFN-/TNF. HCMV infection may impact the expression of NKG2D ligands in our experiments and leads to resistance to V9V2 cytotoxicity. It has been shown however, in the case of V9V2 T cells, that NKG2D regulation has a little effect on lymphokine secretion (Nedellec et al. , 2010). Finally, blocking TNF or IFN- decreases strongly the anti-viral activity of V9V2 T cells, showing that these two cytokines 127 are important antiviral effectors in this system as well as for anti-HCMV CD4 cells (Davignon et al. , 1996). Usage of a synergy between ABPs and HCMV for targeting infected cells with V9V2 T cells requires preservation of non-infected cells ; the relative safeness of ABP administration in the clinic even in the presence of IL-2 (Clezardin, 2011 ; Fournie et al. , 2013) indicates that this is the case at therapeutic concentrations. However, the peak serum concentration of ZOL after therapeutic intervention is close or below 1M (Belmant et al. , 2006 ; Chen et al. , 2002). As the setting used to demonstrate the synergistic effect on lymphokine secretion resulted in unwanted cytotoxicity on non-infected cells, we evaluated an experimental setting where ABPs were maintained at low concentration. ZOL had no detrimental effect on the uninfected cells even the presence of cells although it allowed to inhibition of virion release by infected cells by more than 3 logs in the presence of V9V2 cells. Interestingly, in the absence of cells, the same concentrations produced a slight inhibition of viral replication (about one log), possibly because optimal viral replication requires downstream mevalonate pathway metabolites (Ye et al. , 2003) and thus ABPs could be beneficial to control HCMV replication through a dual effect at clinically relevant concentrations. Based on these in vitro experiments, it will be important to evaluate the effect of ABPs in vivo, in a primate infection model for example which would combine permissiveness for HCMV, presence of phosphoantigen-responsive cells and expression of species-restricted molecules such as BTN3A1. Such a model would allow investigating whether targeting V9V2 T cells with ABPs is useful and safe for controlling infection on the long term or for controlling viral reactivation from latent reservoirs, which is still a challenging issue in the context of transplantation for example. ACKNOWLEDGMENTS We are grateful to Franck Halary, Martin Messerle and Christian Sinzger for kindly providing HCMV strains. We thank Fatima-Ezzahra L'Faqihi-Olive, Valérie Duplan-Eche, Anne-Laure 128 Iscache (cytometry platform of CPTP), Sophie Allard and Astrid Canivet (imagery platform of CPTP) for their expert assistance. SUPLEMENTAL FIGURES Supplemental figure 1 : Differentiation and permissiveness of DC for HCMV Monocyte-derived dendritic cells (DC) were generated as described in (Ref). In brief, CD14 cells were purified from PBMC by positive magnetic sorting (Miltenyi Biotec kit) and put to differentiate in CM-FCS containing IL-4 and GM-CSF (Miltenyi Biotec, 50ng/ml and 20ng/ml respectively) for 5 days. (A) Histograms show surface staining of sorted monocytes at the start of culture (mono) and after differentiation (DC) with anti-CD14-FITC and CD1a-FITC (BD Biosciences). (B) DCs were infected with HCMV-VHL/E (MOI 5) at day 5 post-differentiation induction. Cells were stained after 72h of infection with anti-HCMV-IE antibody and DAPI to check for permissiveness for HCMV. (Ref) : Carlier, J. , H. Martin, B. Mariame, B. Rauwel, C. Mengelle, H. Weclawiak, A. Coaquette, C. Vauchy, P. Rohrlich, N. Kamar, L. Rostaing, G. Herbein, and C. Davrinche. 2011. Paracrine inhibition of GM-CSF signaling by human cytomegalovirus in monocytes differentiating to dendritic cells. Blood 118 : 6783-6792 129 Supplemental figure 2 : V9V2 T cells limit expression of late HCMV antigen pp28 Representative images obtained in co-cultures of infected fibroblasts with cells, in the absence (no stim) or presence of increasing doses of zoledronate (Zol) : MRC-5 cells were cultured in medium containing Zol at the indicated concentration and infected or not with HCMV (AD169, MOI 0. 2) 3h before addition of a V9V2 T cell line (lymphocyte : fibroblast ratio of 0. 2 : 1). Zol was maintained in the medium throughout 6 days of co-culture. Non-adherent cells were then removed ; the adherent fibroblast layer was fixed, stained with anti-HCMV-pp28 antibodies (FITC, green) and DAPI (red), and analyzed by wide field fluorescence microscopy for nuclear staining. 130 REFERENCES 1. Eberl, M. , M. Hintz, A. Reichenberg, A. K. Kollas, J. Wiesner, and H. Jomaa. 2003. Microbial isoprenoid biosynthesis and human gammadelta T cell activation. FEBS Lett 544 : 4-10. 2. Tanaka, Y. , C. T. 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What lessons can be learned from gammadelta T cell-based cancer immunotherapy trials ? Cell Mol Immunol 10 : 35-41. 136 46. Chen, T. , J. Berenson, R. Vescio, R. Swift, A. Gilchick, S. Goodin, P. LoRusso, P. Ma, C. Ravera, F. Deckert, H. Schran, J. Seaman, and A. Skerjanec. 2002. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of zoledronic acid in cancer patients with bone metastases. J Clin Pharmacol 42 : 1228-1236. 47. Belmant, C. , D. Decise, and J. J. Fournie. 2006. Phosphoantigens and aminobisphosphonates. New leads targeting gammadelta T lymphocytes for cancer immunotherapy. Drug Discov Today 3 : 17-23. FOOTNOTE a FUNDING This work was supported by the Fondation pour la Recherche Médicale, grant DCM20121225761 137 138 Résultats supplémentaires Dans ce manuscrit, nous avons précisé les mécanismes effecteurs des T V9V2 qui sont en jeu pour limiter l'infection. En effet, la sécrétion d'IFN- et de TNF semble essentielle, alors que la cytotoxicité ne semble pas être impliquée. Le deuxième objectif de ma thèse a eu pour but de préciser les mécanismes par lesquels le virus induit un stimulus aux T V9V2 en synergie avec le traitement par les ABP. Les résultats précédents montrent que l'infection par le HCMV induit une surproduction intracellulaire de P-Ags dans des cellules traitées par des ABP. Ceci pourrait s'expliquer par une modulation de la voie du MVA au cours de l'infection virale. Cependant, cette production apparait maximale après 48h d'infection et diminue fortement à 96h d'infection. Par contre, la sécrétion de cytokines par les T V9V2 augmente avec le temps d'infection, jusqu'à 96h. Par conséquent, la surproduction de P-Ags suite à l'infection ne semble pas expliquer à elle seule l'activation des T V9V2. Le HCMV induirait au moins un autre co-stimulus aux T V9V2 après 48h d'infection. Plusieurs autres mécanismes peuvent être envisagés. Nous avons émis l'hypothèse que l'expression de la BTN3A1, molécule clé dans l'activation des T V9V2, pourrait être modulée par l'infection HCMV. Il est également possible que le HCMV induise un autre co-stimulus (membranaire ou soluble) indépendamment de la voie du MVA. 1. Rôle de la BTN3A1 dans l'activation des T V9V2 suite à une infection HCMV Etant donné que la BTN3A1 a un rôle clé dans l'activation des T V9V2, nous avons voulu confirmer que cette molécule était néanmoins indispensable à la reconnaissance des cellules infectées par les T V9V2. En effet, nous ne pouvons pas exclure que le zolédronate induise dans les cellules infectées un stimulus activateur indépendant de l'axe BTN/P-Ags. Pour mettre en évidence le rôle possible de la BTN3A1, les fibroblastes MRC-5 infectées ou non par HCMV ont été préalablement traités avec l'anticorps antagoniste de la BTN3A1 (103. 2). Les travaux de Harly et ses collaborateurs suggèrent en effet que cet anticorps inhibe la réactivité des T V9V2 en figeant la BTN3A1 dans une conformation non activatrice (Harly et al. , 2012). Nous avons ensuite analysé l'activation de la production de cytokines par des T V9V2 mis en co-culture avec ces fibroblastes. 139 Figure 28 : Rôle de la BTN3A1 dans l'activation des T V9V2 suite à une infection HCMV. Les cellules MRC-5 ont été ou non infectées pendant 48h (AD169 MOI 1) puis traitées par du zolédronate (Zol 10M) les 16 dernières heures avant la co-culture avec les T V9V2 (rapport E/T : 1/1). 2h avant la co-culture, les fibroblastes MRC-5 non infectés (A) ou infectés 48h (B) ont été prétraités avec l'anticorps antagoniste de la BTN (103. 2) ou IgG2a contrôle (10g/ml) puis lavés. Dans certaines conditions, les lymphocytes ont été stimulées des anticorps anti-CD3 et des anticorps anti-Ig souris de chèvre (5g/ml) au moment de la co-culture. Après 48h de co-culture, les surnageants ont été récupérés puis les cytokines IFN- et TNF ont été dosées par ELISA. Dans notre système, en présence de fibroblastes MRC-5 traités par du zolédronate (10M), nous observons que l'anticorps 103. 2 abolit la sécrétion des cytokines IFN- et TNF par les T V9V2, ce qui n'est pas observé avec l'anticorps contrôle (IgG2a) (Figure 28A). En réponse à l'anticorps anti-CD3, la sécrétion des cytokines n'est pas inhibée en présence de l'antagoniste 103. 2. Nous observons également un blocage similaire dans des co-cultures avec des cellules MRC-5 infectées par HCMV et traitées avec du zolédronate et l'anticorps 103. 2 (figure 28B). Par conséquent, la BTN3A1 est essentielle dans la reconnaissance de cellules MRC-5 par les T V9V2 même dans le cas de l'infection par le HCMV. 140 Nous avons émis l'hypothèse que l'expression de la BTN3A1 pourrait être modulée par l'infection HCMV. Nous avons analysé le niveau d'expression de la BTN3A1 par cytométrie en flux à l'aide des anticorps 103. 2 et 20. 1 sur des fibroblastes MRC-5 infectés ou non par la souche AD169 du HCMV et traités ou non par du zolédronate (Zol). Ces 2 anticorps reconnaissent 2 épitopes différents sur le domaine extracellulaire de la BTN3A1. Figure 29 : Expression de la BTN3A1 sur des fibroblastes MRC-5 infectés par HCMV. Les cellules MRC-5 ont été infectées ou non (AD169, MOI 1) pendant différents temps (48-96h) puis traitées par du zolédronate (3M) on non (non stim. ) les 16 dernières heures. Les cellules ont été décollées par du PBS 1mM EDTA. L'expression à la surface de la BTN3A1 a été analysée par cytométrie en flux après un marquage par deux types d'anticorps anti-BTN (BTN 20. 1 et BTN 103. 2) puis par un anticorps secondaire couplé PE. Les expériences décrites dans la figure 29 montrent que la BTN3A1 est exprimée à la surface des fibroblastes MRC-5 en absence d'infection et/ou de traitement par des ABP. L'infection par le HCMV pendant 48h ou 96h ne semble pas induire de modulation d'expression de la molécule BTN3A1 à la surface des cellules MRC-5. De plus, le traitement par des ABP ne semble pas non plus moduler de façon significative l'expression de cette protéine. Il reste toutefois possible que le virus induise un changement de conformation de la BTN3A1 qui ne serait par détectable par ces anticorps en cytométrie en flux. 141 2. Rôle de la voie du mévalonate : Remplacement du zolédronate par de l'HDMAPP Les résultats présents dans le manuscrit montrent également que l'infection par le HCMV entraine une surproduction d'IPP et d'ApppI suite à un traitement au zolédronate. Plusieurs mécanismes peuvent être envisagés. D'une part, il est possible que le zolédronate soit davantage capturé par les cellules préalablement infectées par le HCMV. D'autre part, une autre hypothèse est que le HCMV pourrait moduler positivement la voie du MVA. Afin de déterminer si le HCMV peut induire un autre co-stimulus indépendamment de la voie du MVA nous avons réalisé des co-cultures avec des fibroblastes MRC-5 préalablement chargés avec différentes concentrations d'un P-Ags fort , le HDMAPP. L'activation des T V9V2 par le chargement en P-Ags des cellules cibles n'implique pas la voie du MVA contrairement au traitement par des ABP. Ainsi, nous avons voulu déterminer si le chargement en HDMAPP in vitro des cellules cibles infectées par HCMV induit également une activation des T V9V2. Figure 30 : Sécrétion de cytokines par les T V9V2 en présence de cellules infectées et chargées en HDMAPP. Les fibroblastes MRC-5 ont été infectés (AD169, MOI 1) ou non pendant 48/96h, puis traités par du zolédronate ou du HDMAPP les 16 dernières heures avant la co-culture avec les T V9V2 culture (rapport E/T : 1/1). Après 48h de co-culture, les surnageants ont été récupérés puis les cytokines IFN- et TNF ont été dosées par ELISA. 142 D'après l'expérience décrite dans la figure 30, on retrouve une augmentation de la sécrétion d'IFN- lorsque les T V9V2 sont en présence de fibroblastes MRC-5 infectés et traités par du HDMAPP. A l'inverse du zolédronate, cette réponse est maximale au début de l'infection (48h). De plus, nous n'avons pas observé de stimulation de la production de TNF avec un traitement par du HDMAPP, même suite à une infection par le HCMV (contrairement à ce qui est obtenu en présence de zolédronate). Par conséquent, lors d'une infection HCMV, l'activation des T V9V2 semble rester moins forte en présence d'un P-Ag dit fort tel que le HDMAPP, que celle obtenue suite à un traitement ABP. Cette étude suggère que l'accumulation de P-Ags n'est pas seul responsable de la synergie ABP-HCMV mais qu'il existe un autre effet, non reproduit en présence d'HDMAPP, qui déclenche la production de TNF et est maximal à un temps d'infection tardif. 143 144 DISCUSSION ET PERSPECTIVES 145 Nos travaux ont donc permis de mettre en évidence une action synergique entre les ABP et le HCMV sur l'activation des T V9V2. Après sensibilisation par des ABP in vitro, des cellules infectées sont fortement activatrices des T V9V2. De plus, ces lymphocytes présentent des propriétés antivirales car ils sont capables de limiter la réplication et la production virale par la sécrétion des cytokines IFN- et TNF. Enfin, nous avons également montré que l'infection par le HCMV entraine une surproduction d'IPP et d'ApppI dans les cellules cibles traitées aux ABP, ce qui explique en partie l'augmentation de la sécrétion de cytokines par ces lymphocytes. En conclusion, cette étude ouvre de nouvelles perspectives quant à une application thérapeutique des ABP dans le cadre d'une infection par le HCMV. De plus, poursuivre des études sur l'identification du ou des mécanisme(s) employé(s) par le virus sur l'activation des T V9V2 permettrait une meilleure compréhension du potentiel antiviral de ces lymphocytes. Différentes souches virales HCMV et différents types cellulaires : conséquences sur l'activation des T V9V2 Nos résultats montrent une action synergique entre les ABP et le HCMV pour induire une sécrétion de cytokines par les T V9V2 in vitro. Cependant, cette sécrétion varie en fonction du type cellulaire infecté et de la souche virale utilisée. En effet, alors que la souche virale de laboratoire AD169 et les souches cliniques VHL/E et CON induisent toujours une augmentation de la sécrétion d'IFN- et de TNF en synergie avec le traitement ABP, l'infection par la souche TB40 n'entraine pas de sécrétion de TNF. Cette observation pourrait s'expliquer par des délétions génomiques existantes dans certaines de ces souches, en particulier les souches de laboratoire (Wilkinson et al. , 2015). De plus, la souche TB40 semble avoir un cycle réplicatif plus long que les autres souches que nous avons utilisées (supérieur à 5 jours dans les fibroblastes MRC-5). La majorité des expériences réalisées ont été faites à partir de culture de fibroblastes MRC-5. Ces fibroblastes ont l'avantage de pouvoir être infectés facilement par différentes souches virales (AD169, VHL/E, TB40, CON et TRI). Cependant, lorsque nous avons analysé les réponses cytokiniques des T V9V2 avec d'autres types cellulaires, nous avons observé que ces réponses varient en fonction du type cellulaire infecté, en particulier en ce qui concerne la sécrétion du TNF. En effet, alors qu'avec des fibroblastes, l'infection en présence de traitement ABP entraine un déclenchement de la sécrétion de TNF, on retrouve déjà un niveau basal de sécrétion de TNF suite au traitement ABP en absence d'infection avec des cellules d'astrocytome (U-373MG). Nous observons également peu de TNF en présence de cellules dendritiques dérivées de monocytes infectées. Il est possible que la sécrétion de TNF soit déclenchée par un co-stimulus membranaire absent sur les fibroblastes et les cellules 146 dendritiques mais présent constitutivement sur les cellules d'astrocytome. De plus, le virus pourrait induire l'expression de molécules impliquées dans ce co-stimulus dans les fibroblastes notamment. Ceci évoque la possibilité d'une expression de ligands de stress tels qu'ULBP/MIC dont l'expression peut être modulée par le HCMV (Welte et al. , 2003). Par conséquent, des molécules membranaires pourraient être impliquées dans le phénomène observé, mais elles ne sont pas caractérisées à ce jour. Conséquences du traitement ABP lors d'une infection par le HCMV Nous avons observé que la co-culture avec des T V9V2 en présence d'un traitement ABP diminue le nombre de fibroblastes infectés, suggérant ainsi que ces lymphocytes limitent l'infection virale. Nos résultats ont permis de lier l'activité antivirale des T V9V2 à la production des cytokines IFN- et TNF et non pas à l'activité cytotoxique de ces cellules. Il est décrit que le HCMV peut empêcher la lyse des cellules infectées par des mécanismes anti- apoptotiques (Andoniou and Degli-Esposti, 2006). De plus, on peut également penser que les mécanismes d'échappement utilisés par le HCMV décrits pour échapper à la cytotoxicité des cellules NK pourraient être actifs vis-à-vis des T V9V2. Par exemple, le HCMV peut moduler l'expression de ligands du récepteur NKG2D, corécepteur clé impliqué dans l'activité cytotoxique, empêchant ainsi la lyse des cellules infectées (Rolle et al. , 2003). Ce récepteur semble cependant peu impliqué dans l'activation de la sécrétion de cytokines, ce qui pourrait expliquer la différence entre l'augmentation de la sécrétion d'IFN- et de TNF et la diminution de l'activité cytotoxique après 48h d'infection en présence d'ABP. L'IFN- et le TNF ont un rôle important dans l'inhibition de la réplication virale par les T V9V2. Ces cytokines, produites aussi par les T CD4 , sont en effet décrites pour leur activité antivirale depuis plusieurs années (Davignon et al. , 1996). Cependant, il n'est pas exclu que la production d'autres molécules puissent être impliquée dans l'activité anti-HCMV des T V9V2. Nous avons également observé que le traitement de cellules MRC-5 avec le zolédronate en absence de T V9V2 induit une légère diminution du nombre de cellules infectées après 6 jours de culture. Il est décrit que le HCMV a besoin de métabolites issus de la voie du MVA pour pouvoir se répliquer dans les cellules. En effet, le blocage par des statines de l'enzyme HMG-CoA réductase, qui agit au niveau des premières transformations de la voie du MVA, induit une inhibition de la réplication virale dans des cellules endothéliales ou des fibroblastes infectés in vitro (Ponroy et al. , 2015 ; Potena et al. , 2004). Il est donc possible que, le traitement zolédronate, en bloquant la voie du MVA en aval, entraine une diminution la production de métabolites nécessaires à la réplication virale, tout comme le traitement par les 147 statines. Par conséquent dans nos co-cultures, la diminution du nombre de cellules infectées est la conséquence de deux phénomènes : une diminution de la réplication virale par le traitement zolédronate seul et une forte accentuation de cette diminution en présence des T V9V2. Quels sont le ou les signaux induits par l'infection HCMV, en synergie avec le traitement ABP, qui sont nécessaires à l'activation des T V9V2 ? Figure 31 : Quels sont le ou les signaux induits par l'infection HCMV, en synergie avec le traitement ABP, qui sont nécessaires à l'activation des T V9V2 ? Le HCMV pourrait activer la voie du MVA (enzymes HMG-CoA synthase et reductase) via PPAR (1). Il est également possible que le zolédronate soit davantage capturé par les cellules préalablement infectées par le HCMV (2). Le HCMV est capable de moduler des ligands des NKR (ULBP/MIC, CMH-I, CD155/CD112) (3). Il est aussi possible que les cellules infectées produisent des facteurs (IFN type 1 ou IL-18) (4). 148 Le HCMV pourrait moduler la voie du MVA ? Nous avons observé que l'infection par le HCMV entraine une surproduction d'IPP et d'ApppI dans les cellules cibles traitées par des ABP. Comment le HCMV peut-il induire cette surproduction de P-Ags lors d'un traitement ABP ? Des données de la littérature suggèrent que le HCMV est capable de moduler la voie du MVA. En effet, la réponse IFN de type 1 induite lors d'une infection par MCMV peut entrainer une inhibition de cette voie (Blanc et al. , 2011). A l'inverse, l'expression de gènes précoces du HCMV peut induire l'expression du facteur de transcription PPAR- (Rauwel et al. , 2010), et il a été montré par ailleurs que ce facteur de transcription peut activer la voie du MVA. En effet, des travaux indiquent que PPAR- et ses ligands agonistes induisent une augmentation de l'expression de gènes impliqués dans cette voie de biosynthèse du cholestérol, en particulier HMG-CoA synthase et réductase (Iida et al. , 2002). Cependant, à l'heure actuelle, aucune étude n'a permis de mettre en évidence un lien entre l'infection par HCMV et l'augmentation de la voie du MVA. Nous sommes actuellement en train de quantifier les ARNm des enzymes HMG-CoA réductase et synthase dans des fibroblastes infectés afin de déterminer si le HCMV est capable de moduler cette voie. Par la suite, il serait intéressant de bloquer PPAR- dans ces cellules infectées afin de définir si le HCMV module la voie du MVA via l'expression de ce facteur de transcription. L'infection rend la capture du zolédronate plus élevée dans les cellules ? Il est également possible que la capture du zolédronate soit augmentée dans les cellules préalablement infectées par le HCMV. Ceci aurait pour conséquence directe un blocage plus important de la FPPS dans les cellules infectées et donc une surproduction de P-Ags. Nous allons tester cette hypothèse en utilisant du zolédronate couplé à un fluorochrome (CFSE), ce qui permettra de quantifier sa présence intracellulaire par cytométrie en flux dans des fibroblastes infectées. Nous avons observé une augmentation de la production de P-Ags à 48h d'infection, suivie d'une diminution de cette surproduction dans les cellules infectées pendant 96h. Etant donné que la sécrétion de cytokines par les T V9V2 augmente avec le temps d'infection des cellules cibles entre 48 et 96h, ce phénomène de surproduction de P-Ags par les cellules infectées ne semble pas complétement expliquer l'activation des T V9V2. Un autre co- stimulus induit par le HCMV pourrait permettre l'activation des lymphocytes entre 48 et 96h d'infection. Le HCMV induit un co-stimulus membranaire ? Nous avons observé que la protéine BTN3A1 est essentielle dans la reconnaissance des cellules MRC-5 par les T V9V2. Cependant celle-ci semble être impliquée aussi bien 149 dans la reconnaissance de cellules infectées que non infectées. De plus, il est connu que le HCMV est capable de moduler l'expression de certains ligands des récepteurs NKR tels que le CMH-I reconnu par CD94/NKG2A et ILT2, CD155 et CD112 reconnus par le récepteur activateur DNAM-1 (Noriega et al. , 2012 ; Rolle et al. , 2003 ; Stern-Ginossar et al. , 2007 ; Tomasec et al. , 2005). L'activation des T V9V2 en présence de cellules infectées par le HCMV pourrait donc impliquer la stimulation de ces NKR. Il serait intéressant d'inhiber l'interaction entre ces NKR exprimés par les T V9V2 et leurs ligands potentiellement exprimés par les cellules infectées à l'aide d'anticorps antagonistes afin de voir si cela interfère avec la réponse cytokinique des T V9V2. Le HCMV induit un co-stimulus soluble ? Il est également possible que ce co-stimulus passe par une sécrétion, suite à l'infection par HCMV, d'une ou de(s) molécule(s) activatrice(s) pour les T V9V2. Par exemple, on pourrait imaginer que la production d'IFN de type I par les cellules infectées soit impliquée dans l'activation des T V9V2. En effet, il a été montré que la réponse antivirale cytokinique des T V9V2 face à des cellules dendritiques infectées par le virus de la Dengue dépend de la présence d'IFN de type I (reconnu par des récepteurs IFNAR exprimés à la surface des lymphocytes) (Tsai et al. , 2015). Les IFN de type I sont aussi impliqués dans l'activité cytotoxique des T V9V2 face à des cellules leucémiques (Watanabe et al. , 2006). De plus, il a été récemment décrit que la cytokine IL-18 est impliquée dans l'expansion des T V9V2 et leur production de cytokines suite à une stimulation par un traitement zolédronate des cellules cibles (Nussbaumer et al. , 2013). En effet, en provoquant une diminution de métabolites prényl pyrophosphates, le zolédronate induit une activation de l'inflammasome, un complexe protéique contenant la caspase 1 à l'origine du clivage de la pro-IL-18 en IL-18 (forme active sécrétée). De façon intéressante, il a été également publié récemment que des cellules infectées par HCMV peuvent produire de l'IL-18 (Guerville et al. , 2015). Il serait donc intéressant de déterminer l'implication de cette cytokine dans notre étude en analysant sa sécrétion par les fibroblastes infectés et en bloquant sa fonction dans les co-cultures avec les T V9V2 par des anticorps neutralisants. Nous avons constaté que l'administration de P-Ags dits fort tel que le HDMAPP sur des cellules infectées n'induit pas une sécrétion de cytokines par les T V9V2 aussi élevée qu'en présence de zolédronate. Ceci peut être dû à un problème technique de chargement ou de stabilité in vitro des P-Ags solubles utilisés sur les fibroblastes. Il est également possible que le zolédronate induise un autre stimulus, non retrouvé en présence d'HDMAPP, qui agit en synergie avec le HCMV. Par exemple, l'activation de l'inflammasome par le zolédronate et le HCMV pourrait être nécessaire pour activer la sécrétion d'IFN- et de TNF par les T V9V2 en présence de cellules infectées. 150 Perspectives à long terme : Les lymphocytes T V9V2 : une cible d'immunothérapie intéressante Le HCMV est responsable de complications sévères chez des individus immunodéprimés. Malgré des traitements antiviraux existant pour limiter l'infection, ceux-ci sont parfois peu efficace ce qui peut compliquer la guérison du patient. Ces traitements antiviraux peuvent être toxiques chez des patients transplantés de rein. De plus, le virus persiste sous forme latente tout au long de la vie de l'individu ce qui rend son éradication impossible à ce jour. Ces complications dues à l'infection chez les individus transplantés sont liées à l'état d'affaiblissement du système immunitaire qui n'est plus capable de limiter l'infection, comme c'est le cas chez un individu en bonne santé. Par conséquent, il serait intéressant d'essayer de rétablir une immunité efficace contre le HCMV chez ces patients. Dans ce sens, les lymphocytes T V9V2 apparaissent comme étant une cible d'immunothérapie intéressante pour plusieurs raisons. Premièrement, ces cellules sont relativement abondantes dans le sang (jusqu'à 10% des lymphocytes) et leur stimulation ne nécessite pas de sélection ou d'expansion clonale forte pour répondre de façon efficace à l'infection. Deuxièmement, ces cellules ont des propriétés intéressantes face à une infection virale. En effet, elles sont capables de de produire des cytokines pro-inflammatoires telles que l'IFN- qui est décrit comme pouvant inhiber la réplication du HCMV dans les cellules infectées (Davignon et al. , 1996). De plus, ces lymphocytes sont capables d'avoir une activité cytotoxique rapide permettant de lyser des cellules tumorales ou infectées. Troisièmement, les T V9V2 ont pour particularité de pouvoir être immunomanipulés par l'utilisation de P-Ags ou d'ABP. En effet, comme décrit dans l'introduction, des protocoles d'immunothérapie anticancéreuse sont en cours de mise au point chez l'Homme à partir de ces lymphocytes, de P-Ags ou d'ABP et d'IL-2 (Fournie et al. , 2013). De plus, les ABP, qui sont actuellement utilisés pour traiter des maladies liées à une résorption osseuse, présentent une toxicité relativement faible aux doses utilisées, ce qui rend leur utilisation facilement envisageable. Qu'en est-il d'un traitement ABP in vivo lors d'une infection ou réactivation du HCMV ? Nos résultats ont permis de montrer un effet synergique entre l'infection par le HCMV et le traitement par des ABP afin de favoriser l'élimination du virus par les T V9V2. Ces résultats étant basés exclusivement sur des données issues de co-cultures de cellules 151 humaines, il serait intéressant d'évaluer le potentiel antiviral des T V9V2 lors d'une infection HCMV in vivo. Cependant, l'étude in vivo parait difficile car les T V9V2 sont propres aux primates supérieurs et le HCMV n'est capable d'infecter que les cellules humaines. Ainsi, le modèle le plus approprié serait le macaque infecté par le cytomégalovirus puis traité par des ABP, sachant que l'infection par HCMV et une immuno-manipulation des T V9V2 ont déjà été réalisées sur ces animaux (Powers and Fruh, 2008 ; Sicard et al. , 2005). Toutefois, un traitement ABP sur des macaques infectés par le HCMV n'a jamais été rapporté. Cela permettrait de caractériser l'effet des ABP sur la dissémination virale in vivo. Afin de pallier aux problèmes liés à l'utilisation de macaques, il serait possible d'utiliser un modèle de souris humanisées. Un modèle in vivo de latence et de réactivation pour le HCMV a récemment été décrit dans des souris immunodéficientes NSG (NOD/-scid/IL- 2Rcnull), dépourvues de cellules B, T, NK et du système du complément, et dont le système immunitaire peut être en partie reconstitué avec des précurseurs hématopoïétiques humains CD34 (Smith et al. , 2010). Ces souris peuvent être infectées par le HCMV : le virus est retrouvé sous forme latente dans les précurseurs hématopoïétiques et peut être réactivé par des cytokines. La génération de lymphocytes T V9V2 dans ce système n'a pas été montrée et il est possible que les souris NSG reconstituées par des précurseurs hématopoïétiques humains ne développent pas naturellement de T V9V2. Néanmoins, elles ont été utilisées avec succès pour analyser les propriétés anti-tumorales des T V9V2 après reconstitution avec des T V9V2 humains matures préalablement cultivés in vitro (Devaud et al. , 2009 ; Tu et al. , 2011). Il serait également intéressant de savoir si les patients sous traitement ABP font autant d'infections ou de réactivations virales HCMV que les patients sans traitement ABP. Les doses de zolédronate ayant montré une activité antivirale dans notre étude sont des concentrations thérapeutiques retrouvées chez les patients traités. En effet, après une administration de zolédronate, on retrouve généralement un pic de zolédronate à environ 1M dans le sérum de ces patients (Chen et al. , 2002). Est-ce que ces patients ont une rémission de pathologies associées au HCMV plus rapide lors d'un traitement ABP et cela est-il corrélé à une amplification de T V9V2 ? Il serait également intéressant d'étudier l'effet de ce traitement en présence d'IL-2, tels les protocoles étudiés actuellement en cancérologie (Kunzmann et al. , 2000). Il est actuellement impossible d'éradiquer le HCMV du fait que celui-ci puisse persister sous forme latente dans les cellules myéloïdes. Actuellement il n'existe pas de moyen de cibler et d'éliminer les cellules infectées de façon latente. Il serait intéressant de regarder si les T 152 V9V2 sont capables d'être activés en présence de cellules infectées de façon latente et traitées par des ABP. Il est peu probable que les cellules infectées de façon latente expriment une molécule co-stimulatrice des T V9V2 car l'expression des gènes du virus sous forme latente se limite à quelques transcrits spécifiques. Néanmoins, il n'est pas exclu que le HCMV soit capable de moduler la voie du MVA lors d'une infection latente. Si cela est le cas, on peut imaginer que le traitement par des ABP de cellules infectées de façon latente pourrait stimuler les T V9V2. Le traitement ABP : nouvelles perspectives ? Cette étude sur la synergie entre le traitement par les ABP et le HCMV permet aussi de poser la question : Est-ce que le traitement ABP pourrait agir en synergie avec d'autres virus que le HCMV, appartenant ou non à la famille des Herpesviridae ? Nous avons vu dans l'introduction que les T V9V2 amplifiés avec des ABP (Pamidronate) in vitro sont capables de lyser spécifiquement des cellules transformées par EBV (Herpesvirus appartenant à la sous famille des -herpesvirinae) (Xiang et al. , 2014). De plus, les auteurs ont démontré une activité antivirale des T V9V2 in vivo à partir de souris immunodéficientes et humanisées. Il serait donc intéressant de voir s'il existe une synergie entre les ABP et des virus appartenant aux différentes sous-familles -, - et -herpesvirinae. Est-ce que dans ce contexte les T V9V2 peuvent cibler spécifiquement les cellules infectées ? 153 154 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 155 Agrati, C. , Alonzi, T. , De Santis, R. , Castilletti, C. , Abbate, I. , Capobianchi, M. R. , D'Offizi, G. , Siepi, F. , Fimia, G. M. , Tripodi, M. , et al. (2006). Activation of Vgamma9Vdelta2 T cells by non- peptidic antigens induces the inhibition of subgenomic HCV replication. International immunology 18, 11-18. Agrati, C. , D'Offizi, G. , Gougeon, M. L. , Malkovsky, M. , Sacchi, A. , Casetti, R. , Bordoni, V. , Cimini, E. , and Martini, F. (2011). Innate Gamma/Delta T-Cells during HIV Infection : Terra Relatively Incognita in Novel Vaccination Strategies ? AIDS Rev 13, 3-12. Ahn, K. , Gruhler, A. , Galocha, B. , Jones, T. R. , Wiertz, E. J. , Ploegh, H. L. , Peterson, P. A. , Yang, Y. , and Fruh, K. (1997). The ER-luminal domain of the HCMV glycoprotein US6 inhibits peptide translocation by TAP. Immunity 6, 613-621. 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Increased cytokine production was observed with V9V2 T cell lines and fresh V9V2 directly isolated of blood. Moreover, V9V2 T cell activation was observed with most HCMV strains (laboratory strains or clinical isolates) and different HCMV-permissive cells. We also showed that HCMV infection induces an overproduction of IPP and ApppI in ABP-treated cells, which explains in part the increased cytokine production by V9V2 T cells. At last, we demonstrated the capacity of V9V2 T cells to limit viral replication and production after ABP treatment while preserving uninfected cells. Our experiments indicate that this antiviral activity involves IFN- and TNF secretion by V9V2 T cells but not their cytotoxicity activity. context of HCMV infection. Consequently, my work provides a proof of concept of the therapeutic potential of ABP in the AUTEUR : Charline DAGUZAN TITRE : Analyse des propriétés antivirales des lymphocytes T V9V2 humains : Potentiel immuno-thérapeutique au cours des infections par le Cytomégalovirus humain DIRECTEUR DE THESE : Dr Eric CHAMPAGNE LIEU ET DATE DE SOUTENANCE : Hôpital Purpan Toulouse, le 15 décembre 2015 RESUME : Le traitement de cellules par des aminobisphosphonates (ABP) induit une accumulation intracellulaire de molécules activatrices des lymphocytes T V9V2 (IPP, ApppI). Alors que ces lymphocytes ne semblent pas naturellement activés lors d'une infection par le cytomégalovirus humain (HCMV), le laboratoire a mis en évidence l'existence d'une action synergique entre le HCMV et les ABP sur leur activation. Ma thèse a eu pour objectif d'analyser le mécanisme de cette synergie et d'évaluer le potentiel immuno-thérapeutique des ABP dans le cadre d'une infection HCMV. Nous avons montré qu'après sensibilisation par des ABP in vitro, des cellules infectées sont fortement activatrices des T V9V2. Les fibroblastes traités par des ABP activent la production d'IFN- par les T V9V2 mais pas la production de TNF. L'infection de ces fibroblastes par le HCMV induit une augmentation de la production d'IFN- et stimule la production de TNF par des T V9V2. Cette activation a été observée avec des lymphocytes T V9V2 établis en lignées cellulaires mais aussi avec des cellules V9V2 isolées directement de sang périphérique. De plus, cette augmentation de production de cytokines est observée avec différentes souches virales (souche de laboratoire et isolats cliniques) et différents types cellulaires permissifs pour HCMV. Nous avons également montré que l'infection par le HCMV entraine une surproduction d'IPP et d'ApppI dans les cellules cibles traitées aux ABP, ce qui explique en partie l'augmentation de la sécrétion de cytokines par les T V9V2. Enfin, nous avons mis en évidence que ces T V9V2 sont capables de limiter la réplication et la production virale suite à un traitement par des ABP, tout en préservant les cellules non infectées. Selon nos études, cette activité antivirale implique la production des cytokines IFN- et TNF et non l'activité cytotoxique des T V9V2. pour une application thérapeutique des ABP dans le cadre d'une infection par le HCMV. fournissent une preuve de concept thèse Par conséquent, mes travaux de MOTS-CLES : Lymphocytes T ; Cytomégalovirus humain ; Aminobisphosphonates DISCIPLINE ADMINISTRATIVE : Immunologie - Virologie INTITULE ET ADRESSE DE L'U. F. R. OU DU LABORATOIRE : INSERM UMR1043, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan (CPTP) Equipe 8 Infections virales : persistance, réponse de l'hôte et physiopathologie Bâtiment B. 4ème étage, CHU Purpan BP 3028, 31024 Toulouse Cedex 3 | HAL | Scientific |
Hépatectomie et comportement cardiovasculaire | WMT16 | Scientific |
Colite collagène coexistant avec un polyadénome. Effet favorable de la mépacrine | WMT16 | Scientific |
De la crise d'asthme aigu grave á celle fatale : prévalence, prévention | WMT16 | Scientific |
Dans de rares cas, l'utilisation de Betaferon a été associée à une pancréatite s'accompagnant souvent d'hypertriglycéridémie. | EMEA_V3 | Medicinal |
Considérations sur la clientèle lausannoise de la policlinique psychiatrique universitaire | WMT16 | Scientific |
Cetrotide n' est délivré que sur ordonnance. | EMEA_V3 | Medicinal |
36 vaches en lactation saines ont subi une stimulation dans un quartier arrière, avec injection d' endotoxine Bacto E. coli 026 : B6 lipopolysaccharide B (LPS). | EMEA_V3 | Medicinal |
un flacon de 6 000 unités de METALYSE sous forme de poudre et une seringue préremplie | EMEA_V3 | Medicinal |
L'identification et le dosage des barbituriques par chromatographie en phase gazeuse. 1. Dans le sang | WMT16 | Scientific |
Caractérisation et évolution post-natale d'un inhibiteur protéique endogène des fucosyl-transférases intestinales | WMT16 | Scientific |
Septicémies et infections focales. Efficacité de moxalactam. Résultats de l'étude coopérative réalisée en France | WMT16 | Scientific |
Urgence psychiatrique et dangerosité | WMT16 | Scientific |
Les effets de la varénicline sur le besoin impérieux de fumer, le manque et le renforcement du tabagisme n' ont pas été mesurés durant la phase de suivi sans traitement à long terme. | EMEA_V3 | Medicinal |
Lymphomes B diffus à grandes cellules : de la morphologie à la biologie | WMT16 | Scientific |
Sverige GE Healthcare AB | EMEA_V3 | Medicinal |
Fracture de stress du fémur dans la drépanocytose : une complication rare | WMT16 | Scientific |
Génétique. Tests génétiques chez l'enfant. Une réflexion urgente est nécessaire | WMT16 | Scientific |
A propos de 12 cas de para-ostéo-arthropathie observés au cours du tétanos. Note préliminaire | WMT16 | Scientific |
Les tumers d'Abrikossoff du larynx | WMT16 | Scientific |
Lorsque les résultats des deux études ont été comparés, LeukoScan s' est avéré aussi efficace pour diagnostiquer les infections osseuses que la technique de biopsie et de culture. | EMEA_V3 | Medicinal |
Il a été également observé une augmentation de la sécrétion salivaire, l'apparition de symptômes gastro- intestinaux, de selles molles et de perturbations ioniques. | EMEA_V3 | Medicinal |
Facteurs pronostiques dans le traitement avec photocoagulation focale de la rétinopathie diabétique oedémateuse | WMT16 | Scientific |
Sondes d'intubation et protoxyde d'azote : étude sur banc et évaluation de la pratique clinique | WMT16 | Scientific |
Effets d'inhibiteurs d'ADN sur la multiplication du bactériophage Ox 174 | WMT16 | Scientific |
Absorption gastro-intestinale et analyse multicompartimentale sur ordinateurs | WMT16 | Scientific |
Etude de la réactivité des antigénes des hématies-tests en solution de conservation. Groupe Immunohématologie de la Société Française de Transfusion Sanguine | WMT16 | Scientific |
Evolution des paramètres gazométriques sur les 24 premières heures suivant l'administration d'Exosurf | WMT16 | Scientific |
Listeriose aprés transplantation renale | WMT16 | Scientific |
Premiers résultats éloignés des néo-vessies iléales ; à propos de 45 observations | WMT16 | Scientific |
Vérifiez que l'insuline sort de l'aiguille | EMEA_V3 | Medicinal |
Mots clés OEsophage Carcinome épidermoïde superficiel Traitement endoscopique Abstract Introduction : Endoscopic mucosal resection (EMR) is a curative treatment of early squamous cell carcinoma (SCC) of the esophagus The objective was to evaluate the efficacy, safety, long-term outcome, and survival of EMR Patients and methods : Forty-four patients were treated by EMR between February 1998 and October 2005 for an early SCC of the esophagus The technique of EMR was carried out by suction and section with cap or traction and section, or by the combination of both Results : Forty-four patients had endoscopic treatment with resection of 49 early SCC They were all of T1N0 stage as found by standard endoscopic ultrasound (EUS) No major complications occurred The median endoscopic follow-up was 44 months A curative resection (T1m1, T1m2) was achieved in 68% of cases without recurrence Among patients with T2 lesion (16%), 6 had a radio-chemotherapy and only 1 patient died because of the metastatic evolution of esophageal cancer The remaining 2 left patients had a complementary esophagectomy, among whom 1 died after recurrence Eight patients had a histologically significant risk of nodes invasion (2 m3, 3 sm1, 2 sm2, and 1 sm3), and 6 had a complementary radio-chemotherapy without recurrence in the follow-up Introduction La résection muqueuse endoscopique (ou endoscopic mucosal resection ) est actuellement un nouveau standard pour le traitement des cancers épidermoïdes (squamous cell carcinoma ) superficiels de l'oesophage Il s'agit d'un traitement mini-invasif et permet ainsi de préserver la qualité de vie des patients L'EMR est indiquée pour les tumeurs limitées à la muqueuse et classée m1 ou m2, car le risque d'envahissement ganglionnaire est très faible Lorsque la tumeur dépasse la musculaire muqueuse (m3), l'incidence de l'envahissement ganglionnaire peut atteindre 12 % Le but de cette étude est de connatre le devenir à long terme des patients traités par EMR pour une dysplasie de haut grade (DHG) ou un SCC superficiel de l'oesophage DHG ou SCC confirmé histologiquement ; Patients et méthodes absence d'envahissement lymphatique ganglionnaire (N0) ou de métastases à distance (M0) au scanner thoracoabdominal ; réalisation d'une échoendoscopie haute (endoscopic ultrasound ) systématique (7, 5-12 MHz) classant la lésion usT0N0 (absence de ganglion pathologique) ou usT1N0 (musculeuse non atteinte) après EMR ; absence de traitement antérieur sur la lésion oesophagienne Bilan préthérapeutique Les endoscopes utilisés étaient des endoscopes Fujinon (EG450DS, EG450WS, EG590ZW, Fujifilm group) permettant une vidéoendoscopie avec une haute résolution d'image Pour préciser la taille, la localisation et l'aspect superficiel de la lésion, une chromoendoscopie avec du lugol à 1, 5 % était utilisée L'EUS était réalisée chez tous les patients avec un échoendoscope radial (Olympus GFYM 30 et GF-UM 160, Olympus, France) permettant de classer la lésion T0 ou T1 et d'éliminer l'envahissement ganglionnaire locorégional Lorsqu'il existait un doute sur un envahissement ganglionnaire, une ponction-aspiration à l'aiguille fine était réalisée en utilisant un échoendoscope linéaire électronique (GFE 140P, Olympus, France) Un scanner thoracoabdominopelvien était réalisé chez tous les patients afin d'éliminer une localisation métastatique Techniques d'EMR Différentes techniques de résection ont été utilisées en fonction des caractéristiques de la lésion Après coloration au lugol, la lésion était surélevée par une injection sousmuqueuse de sérum physiologique L'EMR était ensuite réa-lisée par la technique d'aspiration-section avec l'utilisation d'un capuchon, ou de traction-section en utilisant un double canal opérateur En fin d'examen, une analyse minutieuse était faite notamment au niveau des berges de la mucosectomie pour s'assurer du caractère macroscopiquement complet de la résection Lorsque la résection était fragmentée, la taille et la localisation des différents fragments étaient précisées par l'endoscopiste pour l'anatomopathologiste, et les marges laté-rales étaient séparément exposées pour s'assurer de l'absence d'envahissement tumoral La profondeur d'envahissement, les marges latérales et le degré de différenciation étaient précisés par le pathologiste Suivi après EMR Après résection, tous les patients étaient mis sous inhibiteurs de la pompe à protons (ezomeprazole 80 mg IVD immédia-tement, puis 8 mg/h pendant 24 heures) pour prévenir une hémorragie secondaire Une endoscopie de contrôle était réalisée à trois mois avec une coloration au lugol, puis tous les six mois pendant trois ans et enfin tous les ans Pour les lésions classées T1m1 ou T1m2, aucun traitement complé-mentaire n'était réalisé Pour les lésions classées T1m3, T1sm ou T2, un traitement complémentaire chirurgical était discuté en réunion multidisciplinaire de cancérologie digestive Pour les patients âgés avec un risque chirurgical important et pour ceux qui refusaient malgré des explications claires, une chimiothérapie associée ou non à une radiothérapie était proposée La rémission complète locale était définie par l'absence de lésion à trois mois sur des biopsies réalisées lors d'une chromoendoscopie Les récidives locales (biopsie positive à moins de 1 cm de la cicatrice de mucosectomie) et l'apparition de lésions métachrones étaient traitées, lorsque c'était possible, par de nouvelles séances d'EMR Analyses statistiques L'analyse statistique a été faite avec le logiciel SatView Software Package La survie globale (SG) et la survie causespécifique (SCS) étaient calculées entre la date de l'EMR et la date de décès ou des dernières nouvelles Les courbes de survie ont été construites selon la méthode de KaplanMeier La comparaison des courbes était réalisée avec le test du Log-Rank, et la différence était significative lorsque p était inférieur à 0, 05 Résultats Nous avons inclus 44 patients (25 hommes, moyenne d'âge de 61 ans Pour les lésions les plus superficielles (pT1m1, pT1m2), aucun traitement complémentaire n'a été réalisé Pour celles classées pT1m3, pT1sm et pT2, un traitement chirurgical, lorsqu'il était possible, était systématiquement proposé et expliqué au patient Dans le groupe des huit patients ayant une lésion pT2, deux ont eu une oesophagectomie, six ont eu une radiochimiothérapie complémentaire (deux patients ayant refusé le traitement chirurgical et quatre patients ayant des contre-indications comme une cirrhose avec insuffisance hépatique ou une pathologie cardiovasculaire sévère) Chez les patients avec une lésion pT1m3 et pT1sm, six ont eu une radiochimiothérapie complémentaire (trois patients ayant refusé la chirurgie et trois ayant des contre-indications) et deux ont eu un traitement palliatif (patients de plus de 80 ans) Au total, dans le groupe des patients classés pT1m3, pT1sm ou pT2, deux ont été opérés et 12 ont eu une radiochimiothérapie sans toxicité sévère Durant un suivi médian de 44 mois (moyenne : 29-73 mois), aucune lésion classée pT1 n'a récidivé Deux patients avec une lésion classée pT2 ont récidivé localement avec une évolution métastatique Parmi ceux-ci, un patient avait été traité par radiochimiothérapie et un patient avait été opéré La durée médiane de survie était de 56 mois et la SG à cinq ans était de 81 % La SCS à cinq ans (ne prenant en compte que les décès en rapport avec la pathologie oesophagienne) était de 93 % Pour les patients traités par radiochimiothérapie complémentaire en raison d'une lésion classée pT1m3, pT1sm ou pT2, la SG à cinq ans était de 64 % et la SCS à cinq ans était de 91 % ) Discussion La technique d'EMR pour les tumeurs superficielles de l'oesophage est un traitement efficace si le risque d'envahissement ganglionnaire est quasi nul, ce qui est le cas pour les lésions limitées à la muqueuse Cependant, peu d'études rapportent le suivi à long terme dans cette situation Dans notre étude, 44 patients ont été suivis après EMR afin d'évaluer l'efficacité à long terme de cette technique Les recommandations consensuelles concernant la résection endoscopique curative des tumeurs superficielles de l'oesophage sont : une taille inférieure à 20 mm, une lésion non ulcérée et non déprimée, classée T1m1 ou T1m2 Dans notre étude, les indications étaient élargies à toutes les lésions de l'oesophage quelles que soient leurs tailles et classées usT0-1 et usN0 en échoendoscopie standard Pour les lésions classées pT1m3, pT1sm et pT20, un traitement chirurgical standard de type oesophagectomie était systématiquement discuté Si la chirurgie était contre-indiquée (nombreux anté-cédents médicaux et chirurgicaux sévères et/ou un âge avancé) ou si le patient refusait la chirurgie malgré une information claire et objective, un traitement complémentaire par radiochimiothérapie était proposé Il y avait huit patients (16 %) classés usT1N0 et dont l'histologie montrait finalement un envahissement de la musculeuse, et les patients étaient classés T2N0 Les données de la littérature montrent que la précision diagnostique varie de 75 à 85 % pour l'envahissement en profondeur et de 70-75 % pour l'envahissement ganglionnaire Dans la littérature, le taux de complication lié à l'EMR est bas et la mortalité associée est nulle Dans notre étude, deux résections profondes ont été surveillées cliniquement et biologiquement durant une semaine d'hospitalisation et l'évolution a été favorable La complication principale était une sténose après mucosectomie circonférentielle et des dilatations endoscopiques répétées ont été un traitement efficace Une des limites de l'analyse histologique est de pré-ciser avec certitude l'absence d'envahissement tumoral des marges latérales lors des résections fragmentées La résection complète était donc définie dans ces cas comme l'absence de résidu tumoral sur l'analyse macroscopique et endoscopique après l'EMR Nous n'avons pas observé de récidive chez les patients avec une lésion ne dépassant pas la musculaire muqueuse, Par ailleurs, ces bons résultats s'expliquent aussi par le fait que toutes les EMR ont été réalisées par le même endoscopiste expérimenté La SG à cinq ans était excellente et comparable à celle reportée dans la littérature La SG à cinq ans après un traitement chirurgical de ces lésions superficielles est aussi élevée, mais la morbidité (10 à 50 %) et la mortalité sont supérieures, dépendant de l'expertise du centre o est réalisé le traitement chirurgical (la mortalité peut effectivement varier entre 5 et 10 %) Pour les tumeurs classées pT1m3 et pT1sm, aucune réci-dive n'a été observée après un traitement complémentaire par radiochimiothérapie Les deux patients qui étaient en simple surveillance n'ont pas eu de récidive L'EMR est un traitement moins invasif que la chirurgie, et la faible morbidité pourrait justifier le risque pris en décidant de traiter par mucosectomie les lésions atteignant la sous-muqueuse L'attitude thérapeutique doit être adaptée après l'analyse histologique Dans une étude non randomisée, Okawa et al ont montré que la survie globale et spécifique après radiothéra-pie seule pour des lésions superficielles de l'oesophage était comparable à celle après traitement chirurgical Après radiothérapie seule, les survies globales et spécifiques étaient respectivement de 40, 8 et 61, 7 % Une autre étude menée par Katada et al a montré que sur 86 patients traités par EMR pour un SCC de l'oesophage classé T1m3, seuls deux patients (1, 9 %) ont développé des métastases ganglionnaires sur un suivi médian de 43 mois (moyenne : 8-134 mois) Aucun de ces patients n'avait eu de traitement complémentaire (chimiothérapie, radiothérapie ou chirurgie) après l'EMR Dans la littérature, les patients ayant des lésions pT1 traitées par radiochimiothérapie sans EMR au préalable ont une survie comprise entre 70 et 79 % Dans notre étude, les patients ont tous eu une EMR, et la survie est supérieure à 90 % Notre étude confirme l'efficacité du traitement endoscopique pour les lésions ne dépassant pas la musculaire muqueuse (pT1m1 et pT1m2) Pour les lésions atteignant et/ou dépassant la partie profonde de la muqueuse (pT1m3, pT1sm ou pT2), classées usN0 en échoendoscopie standard, traitées par EMR puis par radiochimiothérapie, la survie est excellente L'analyse histologique permet donc de déci-der d'un traitement complémentaire lorsque l'invasion en profondeur dépasse la musculaire muqueuse Conclusion L'EMR pour les SCC superficiels de l'oesophage est une technique très bien tolérée et la survie spécifique à cinq ans est excellente (93 %) La résection complète macroscopique et l'absence d'envahissement ganglionnaire à l'échoendoscopie sont indispensables pour obtenir de bons résultats et pour éviter la récidive Le suivi régulier des patients après l'EMR est primordial pour diagnostiquer et traiter l'éventuelle réci-dive et/ou l'apparition de lésions métachrones Nos résultats suggèrent que l'EMR est aussi un traitement efficace pour les lésions dépassant la musculaire muqueuse lorsqu'une radiochimiothérapie adjuvante est réalisée L'analyse histologique est le gold standard pour connatre l'envahissement en profondeur et donc pour décider d'un éventuel traitement adjuvant Des études prospectives complémentaires sont bien sûr nécessaires pour confirmer ces résultats. | ISTEX | Scientific |
It is available on request in all the official EU languages. | EMEA_V3 | Medicinal |
Aspects sialographiques des cystadéno-lymphomes papillaires de la parotide | WMT16 | Scientific |
Electronthérapie corporelle totale dans le mycosis fongoide : une nouvelle technique | WMT16 | Scientific |
Action inhibitrice de l'oxygène hyperbare (OHB) sur le développement des bactéries aérobies. I. Comparison des effets de l'OHB à 2 atmosphères absolues, sur 3 espèces bactériennes de type métabolique différent | WMT16 | Scientific |
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notilium 1 comprimé 1 quart d'heure avant les repas et 1 comprimé avant le coucher pendant 1 semaine | PXCORPUS | Dialogue |
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Essor de la psychiatrie française ; I. Le malade mental au XXe siècle | WMT16 | Scientific |
Patients ayant une insuffisance hépatique (voir rubrique 4. 2) Chez les patients atteints de cirrhose hépatique, la pharmacocinétique de l' hydrochlorothiazide n' est pas significativement modifiée. | EMEA_V3 | Medicinal |
Un traitement par Vistide doit être prescrit par un médecin expérimenté dans la prise en charge de l' infection par le virus de l' immunodéficience humaine (VIH). | EMEA_V3 | Medicinal |
CHECK-LIST SÉCURITÉ DU PATIENT AU BLOC OPÉRATOIRE Bloc : . Salle : . Identification du patient Date d'intervention : . Heure (début) : . Version 2018 Étiquette du patient ou Chirurgien intervenant : . Nom, prénom, date de naissance Vérifier ensemble pour décider Anesthésiste intervenant : . Coordonnateur(s) check-list : . AVANT INDUCTION ANESTHÉSIQUE AVANT INTERVENTION CHIRURGICALE APRÈS INTERVENTION Temps de pause avant anesthésie Temps de pause avant incision (appelé aussi time-out) Pause avant sortie de salle d'opération 1 L'identité du patient est correcte Oui Non* 7 Vérification ultime croisée au sein de l'équipe 10 Confirmation orale par le personnel auprès de l'équipe : L'autorisation d'opérer est signée par les Oui Non* en présence des chirurgiens(s), anesthésiste(s), IADE-IBODE/IDE de l'intervention enregistrée Oui Non* parents ou le représentant légal N/A identité patient confirmée Oui Oui Non Non* * du compte final correct Oui Non* intervention prévue confirmée Oui Non* des compresses, aiguilles, instruments, etc. N/A 2 L'intervention et le site opératoire sont confirmés : site opératoire confirmé Oui Non* de l'étiquetage des prélèvements, pièces Oui Non* idéalement par le patient et, dans tous les Oui Non* opératoires, etc. N/A cas, par le dossier ou procédure spécifique installation correcte confirmée Oui Non* documents nécessaires disponibles Oui Non* si des événements indésirables ou por- Oui Non* la documentation clinique et para clinique Oui Non* teurs de risques médicaux sont survenus : N/A nécessaire est disponible en salle (notamment imagerie) N/A ont-ils fait l'objet d'un signalement / déclaration ? 3 Le mode d'installation est connu de l'équipe Oui Non* 8 Partage des informations essentielles oralement au sein Si aucun évènement indésirable n'est survenu en salle, cohérent avec le site / l'intervention de l'équipe sur les éléments à risque / étapes critiques de pendant l'intervention cochez N/A et non dangereux pour le patient l'intervention (time-out) sur le plan chirurgical Oui Non* 11 Les prescriptions et la surveillance post- Oui Non* 4 La préparation cutanée de l'opéré est Oui Non* (temps opératoire difficile, points spécifiques de opératoires (y compris les seuils d'alerte documentée dans la fiche de liaison N/A l'intervention, identification des matériels nécessaires, spécifiques) sont faites conjointement service / bloc opératoire confirmation de leur opérationnalité, etc. ) par l'équipe chirurgicale et anesthésique (ou autre procédure en œuvre dans sur le plan anesthésique Oui Non* et adaptées à l'âge, au poids et à la taille l'établissement) Acte sans prise en charge anesthésique N/A du patient [risques potentiels liés au terrain (hypothermie, etc. ) 5 L'équipement / le matériel nécessaires pour l'intervention sont ou à des traitements éventuellement maintenus, etc. ] vérifiés et adaptés au poids et à la taille du patient Décision concertée et motivée en cas de réponse dans une case marquée d'un * pour la partie chirurgicale Oui Non* 9 L'antibioprophylaxie a été effectuée Oui Non * pour la partie anesthésique Oui Non* selon les recommandations et protocoles N/R Acte sans prise en charge anesthésique N/A en vigueur dans l'établissement La préparation du champ opératoire Oui Non* 6 Le patient présente-t-il un : est réalisée selon le protocole en vigueur N/A ATTENTION SI ENFANT ! risque allergique Non Oui* dans l'établissement hh Associer les parents à la vérification de l'identité, de l'intervention et du site opératoire. hh Autorisation d'opérer signée. risque d'inhalation, de difficulté Non Oui* hh Installation, matériel et prescription adaptés au poids, à l'âge et à la taille. d'intubation ou de ventilation au masque N/A hh Prévention de l'hypothermie. risque de saignement important Non Oui* DÉCISION FINALE hh Seuils d'alerte en post-op définis. Le rôle du coordonnateur de la check-list, aidé par le(s) chirur- GO OK pour incision SELON PROCÉDURE EN VIGUEUR DANS L'ÉTABLISSEMENT gien(s) et anesthésiste(s) responsables de l'intervention, est de cocher les items de la check-list : 1. si la vérification a bien été NO GO Pas d'incision ! Attestation que la check-list a été renseignée suite effectuée, 2. si la vérification a été faite oralement en présence à un partage des informations entre les membres de l'équipe des membres de l'équipe concernée et 3. si les réponses marquées Si No Go : conséquence sur l'intervention ? Retard Annulation d'un * ont fait l'objet d'une concertation en équipe et d'une décision Chirurgien Anesthésiste / IADE Coordonnateur CL motivée. N/A : Non Applicable pour cette intervention ; N/R : Non Recommandé pour cette intervention CHECK-LIST SÉCURITÉ DU PATIENT AU BLOC OPÉRATOIRE Version 2018 Mode d'emploi Vérifier ensemble pour décider La check-list HAS Sécurité du patient au bloc opératoire comporte les éléments indispensables et non modifiables à vérifier ensemble et en équipe au bloc opératoire afin de prendre des décisions sur la poursuite ou non d'une intervention chirurgicale. Cependant, elle peut donner lieu à tous développements souhaités par les professionnels, dans le cadre de leurs collèges professionnels/organismes agréés d'accréditation. AVANT INDUCTION ANESTHÉSIQUE AVANT INTERVENTION CHIRURGICALE APRÈS INTERVENTION Temps de pause avant anesthésie Temps de pause avant incision (time-out) Pause avant sortie de salle d'opération 1 Les professionnels insistent sur l'importance de faire décliner par le 7 Ces vérifications croisées de l'identité, de l'intervention prévue 10 L'équipe confirme oralement le type de l'intervention enregistrée et, s'il patient son identité. Pour les patients incapables de décliner leur identité, et du site opératoire peuvent sembler répétitives, mais elles y a lieu, le décompte correct des compresses, instruments et aiguilles, la vérification est effectuée par le personnel en salle selon la procédure sont indispensables pour améliorer la sécurité du patient au bloc ainsi que l'identification des prélèvements et des pièces opératoires. d'identitovigilance en vigueur dans l'établissement (bracelet, concordance des opératoire ; ce sont les vérifications ultimes avant le début de Il importe que tout problème d'équipement survenant pendant une informations, personnel d'accompagnement, etc. ) l'intervention chirurgicale. intervention soit signalé, déclaré par l'équipe. Le chirurgien vérifie également que l'installation du patient est 2 L'intervention et le site opératoire sont confirmés idéalement par le patient cohérente avec le site/intervention chirurgicale et ne présente pas 11 Les prescriptions pour les suites opératoires immédiates sont faites de et, dans tous les cas, à travers le dossier ou toute autre procédure en vigueur de danger pour le patient. manière conjointe pour la prise en charge postopératoire du patient dans l'établissement (réunion de staff, fiches navette par exemple) ou recom- Il convient aussi de vérifier au plus tard, à ce moment de la (notamment, la prévention thromboembolique). mandée par les collèges professionnels de la spécialité (marquage, etc. ) procédure, la disponibilité en salle des documents cliniques et para cliniques nécessaires, notamment d'imagerie. 3 L'équipe qui reçoit le patient en salle dispose des informations précisant la nature de l'intervention prévue et les modalités d'installation du patient et 8 Lors de ce temps de pause préopératoire (aussi appelé time-out), vérifie le choix adapté du plateau et la disponibilité des accessoires, etc. il est également crucial de communiquer au sein des équipes chirurgicale, anesthésique et infirmière, sur les informations En cas de réponse marquée d'un astérisque*, la décision prise par essentielles afin d'anticiper les éléments à risque, notamment : l'équipe doit être tracée et argumentée. 4 La préparation cutanée est documentée dans la fiche de liaison service /bloc opératoire. La préparation est faite selon les recommandations/ procédures en sur le plan chirurgical : pour informer tous les membres de vigueur dans l'établissement (douche ou toilette pour les patients dépendants, l'équipe des étapes qui peuvent exposer le patient à un risque dépilation éventuelle précisant le mode). d'hémorragie importante, de traumatisme ou d'autres causes de morbidité majeure. C'est également l'occasion de revoir La décision de demander aux professionnels d'attester de leur les étapes qui peuvent nécessiter un équipement spécial, des participation active au renseignement de la check-list relève des 5 Le personnel qualifié vérifie la disponibilité et le bon fonctionnement des instruments, sources d'énergie (bistouri électrique, etc. ), appareils, dispositifs implants ou des préparations particulières ; instances administrative et médicale de l'établissement et a pour médicaux nécessaires pour l'intervention. Les procédures de vérification de sur le plan anesthésique : pour communiquer, si besoin, sur les seul but de favoriser l'utilisation optimale de la check-list. sécurité anesthésique sont effectuées selon la réglementation par les person- comorbidités ou traitements en cours (AAP, anticoagulants, nels qualifiés en anesthésie. antihypertenseurs, antidiabétiques) ; sur le plan infirmier : le personnel doit confirmer qu'il n'y a pas 6 L'équipe anesthésique et infirmière communique sur certains points critiques de problème particulier avec le matériel nécessaire à l'interven- et adopte les mesures adéquates ; ainsi les anesthésistes s'assurent notam- tion (plaque de bistouri, aspiration, colonne vidéo, DM). ment : POINTS CLÉS POUR UN ENFANT en cas de risque d'inhalation/difficulté d'intubation/ventilation au masque, 9 L'équipe vérifie que l'antibioprophylaxie, si elle est indiquée, a de la confirmation de la disponibilité de l'équipement et de l'assistance bien été effectuée selon les recommandations et protocoles en vigueur dans l'établissement. hh Associer les parents à la vérification de l'identité, de l'intervention prévue ; et du site opératoire. en cas de risque de saignement important (évalué à plus de 500 ml ou C'est également à cette étape que l'on confirme la préparation 7ml/kg en pédiatrie), de la disponibilité des documents (carte de groupage, du champ opératoire réalisée selon le protocole en vigueur dans hh Disposer d'une autorisation d'opérer signée. RAI, etc. ), des accès veineux, des produits et matériels de transfusion, etc. l'établissement. hh Prévoir une installation, du matériel et des prescriptions adaptés La conformité au protocole préopératoire concernant un traitement anti- coagulant et/ou antiagrégant est vérifiée. à l'âge, au poids et à la taille. À la suite des temps 1 et 2 de la check-list, la décision finale hh Prévenir l'hypothermie peropératoire. de poursuivre ou non l'intervention est tracée et motivée. hh Définir des seuils d'alerte spécifiques pour la période postopératoire. | HAS | Scientific |
Le groupe de travail conjoint CPMP-CVMP sur la qualité s'est réuni trois fois en 2000. | EMEA_V3 | Medicinal |
Six de ces patients ont présenté des embolies pulmonaires une de grade 3 et cinq de grade 4 , et cinq de ces patients ont présenté une TVP une de grade 1, une de grade 2 et trois de grade 3. | EMEA_V3 | Medicinal |
Hémichorée survenant sous contraceptif oral | WMT16 | Scientific |
Résultats du fractionnement électrophorétique des lipoprotéines sériques dans les ictères et dans les cirrhoses | WMT16 | Scientific |
Depuis la commercialisation d'Aerius, des cas de réactions allergiques sévères (avec gêne respiratoire, sifflements bronchiques, démangeaisons, plaques d'urticaire et gonflements) et d' éruption cutanée ont été | EMEA_V3 | Medicinal |
Le retard thérapeutique : principal facteur de gravité de l'accès à P. falciparum ? | WMT16 | Scientific |
Prévalence de l'infection par le virus HTLV-1 au Togo (préfecture de la Kozah et CHU de Lomé) | WMT16 | Scientific |
Lettre de New York | WMT16 | Scientific |
Un cas de leishmaniose pseudo-lépromateuse de la face | WMT16 | Scientific |
Recherche de caractéristiques de personnalité chez l'hypertendu. Etude de sujets hypertendus essentiels en référence à une population témoin | WMT16 | Scientific |
COMMISSION DE LA TRANSPARENCE Avis 22 mars 2017 Dates d'examen par la Commission : 30 novembre 2016 et 7 décembre 2016 L'avis de la commission de la Transparence adopté le 11 janvier 2017 a fait l'objet d'une audition le 22 mars 2017. alpha alglucosidase MYOZYME 50 mg, poudre pour solution à diluer pour perfusion B/1 flacon (CIP : 34009 569 575 1 4) B/10 flacons (CIP : en 34009 569 576 8 2) Laboratoire GENZYME S. A. S. Code ATC A16AB07 (enzyme) Réévaluation du Service Médical Rendu, de l'Amélioration du Service Motif de l'examen Médical Rendu et de la Population cible à la demande de la Commission, conformément à l'article R163-21 du code de la sécurité sociale. Liste concernée Collectivités (CSP L. 5123-2) Myozyme est indiqué dans le traitement enzymatique substitutif (TES) à long terme chez les patients ayant un diagnostic confirmé de maladie de Indications Pompe (déficit en alpha-glucosidase acide). concernées Myozyme est indiqué chez les patients adultes et pédiatriques de tous âges. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 1/28 Avis Post Audition Dans les formes infantiles de la maladie de Pompe : important. SMR Dans les formes tardives de la maladie de Pompe : faible. Ce SMR est conditionné à la mise à disposition rapide d'un conditionnement adapté au traitement de l'adulte. Dans les formes infantiles de la maladie de Pompe : Prenant en compte : - les nouvelles données disponibles confirmant le bénéfice sur la survie globale des patients à court terme, - l'absence d'impact sur les atteintes neurologiques provoquant à terme un handicap majeur et une mortalité importante, - et l'absence d'alternative thérapeutique dans un contexte o le besoin thérapeutique reste important, la Commission considère que MYOZYME apporte une amélioration du service médical rendu modérée (ASMR III) dans la stratégie thérapeutique des formes infantiles de la maladie de Pompe. ASMR Dans les formes tardives de la maladie de Pompe : Prenant en compte : - les nouvelles données disponibles confirmant le bénéfice transitoire sur des critères fonctionnels (6MWT, CVF), - l'absence de démonstration, avec un niveau de preuve optimal, d'un impact sur le handicap à long terme et la survie globale des patients, - et l'absence d'alternative thérapeutique dans un contexte o le besoin thérapeutique reste important, la Commission considère que MYOZYME apporte une amélioration du service médical rendu mineure (ASMR IV) dans la stratégie thérapeutique des formes tardives de la maladie de Pompe. Cette ASMR est conditionnée à la mise à disposition rapide d'un conditionnement adapté au traitement de l'adulte. ISP MYOZYME n'est pas susceptible d'avoir un impact sur la santé publique. MYOZYME, seul traitement enzymatique substitutif du déficit en alpha- Place dans la ère glucosidase acide actuellement disponible, est un traitement de 1 intention stratégie des patients symptomatiques dont le diagnostic de maladie de Pompe a été thérapeutique confirmé. Conditionnement Le conditionnement en flacon de 50 mg n'est pas adapté à l'administration de MYOZYME chez l'adulte. La Commission note que malgré sa recommandation dans l'avis de réévaluation du 09/01/2013, pour un conditionnement adapté à cette population, cette situation n'a pas changé. La Commission considère que plus de dix ans après la commercialisation de MYOZYME, l'absence de conditionnement adapté à l'administration de cette spécialité chez l'adulte n'est pas acceptable. Par conséquent, l'avis favorable au maintien de l'inscription sur la liste des spécialités agréées à Recommandations l'usage des collectivités de MYOZYME dans le traitement des formes tardives de la maladie de Pompe est conditionné à la mise à disposition rapide d'un conditionnement adapté au traitement des adultes. Autre demande Lorsque nécessaire et conformément au protocole national de diagnostic et de soins de la maladie de Pompe, l'instauration et les décisions d'arrêts de traitement par MYOZYME devront être prises lors de concertations collégiales au sein d'un groupe d'experts (comité d'évaluation du traitement de la maladie de Pompe, CETP). HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 2/28 Avis Post Audition 01 INFORMATIONS ADMINISTRATIVES ET REGLEMENTAIRES 29 mars 2006 (procédure centralisée) AMM Derniers rectificatifs : 20/12/2012 et 18/11/2013 (cf. tableau face/face en annexe). Conditions de Liste I prescription et de Médicament orphelin délivrance / statut Réservé à l'usage hospitalier particulier A Voies digestives A16 Autres produits à visée digestive et métabolique Classification ATC A16A Autres produits à visée digestive et métabolique A16AB enzymes A16AB07 alpha alglucosidase 02 CONTEXTE MYOZYME est une forme recombinante de l'alpha-glucosidase humaine ayant obtenu une AMM en mars 2006 pour le traitement enzymatique substitutif (TES) des patients atteints d'une forme infantile ou tardive de la maladie de Pompe. Dans son avis d'inscription, le 20 septembre 2006, la commission de la Transparence a considéré que dans la forme infantile, le SMR de MYOZYME était important et qu'il apportait une ASMR importante (II) dans la prise en charge de cette maladie et que dans la forme tardive, le SMR était insuffisant en l'absence de démonstration formelle d'une efficacité. Quatre ans plus tard, la Commission a procédé à la réévaluation de cette spécialité dans la forme tardive de la maladie au vu des nouvelles données disponibles. Dans son avis du 16 juin 2010, elle a alors considéré que chez ces patients, le SMR de MYOZYME était faible et qu'il apportait une ASMR mineure (IV) dans la stratégie thérapeutique. Elle a également souhaité obtenir des données complémentaires dans un délai de deux ans concernant le suivi des patients à long terme et la définition de critères d'interruption du traitement. Suite à cette demande, le laboratoire a déposé fin 2012 des nouvelles données dans la forme tardive de la maladie sur la base desquelles il a sollicité la réévaluation du SMR et de l'ASMR de MYOZYME. Dans son avis de réévaluation du 9 janvier 2013, la Commission a maintenu ses précédentes conclusions dans la forme tardive de la maladie de Pompe (SMR faible, ASMR IV). En 2016, suite à une recommandation du Comité de Suivi des Etudes en Vie Réelle, la Commission a souhaité réévaluer le SMR, l'ASMR et la population cible de MYOZYME dans l'ensemble de son indication, objet de ce présent avis. 03 INDICATION THERAPEUTIQUE Myozyme est indiqué dans le traitement enzymatique substitutif (TES) à long terme chez les patients ayant un diagnostic confirmé de maladie de Pompe (déficit en alpha-glucosidase acide). Myozyme est indiqué chez les patients adultes et pédiatriques de tous âges. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 3/28 Avis Post Audition 04 POSOLOGIE Le traitement par Myozyme doit être supervisé par un médecin ayant l'expérience de la prise en charge de patients atteints de la maladie de Pompe ou d'autres maladies métaboliques héréditaires ou neuromusculaires. Posologie La posologie recommandée pour l'alpha alglucosidase est de 20 mg/kg de poids corporel administrés toutes les 2 semaines. La réponse du patient au traitement doit être régulièrement évaluée en prenant en compte l'évaluation de tous les paramètres cliniques de la maladie. 05 BESOIN MEDICAL La maladie de Pompe (ou glycogénose de type II ou maladie de surcharge en glycogène de type II ou déficit en maltase acide) est une myopathie rare de transmission autosomique récessive, secondaire à un déficit complet ou partiel de l'activité de l'enzyme alpha-glucosidase acide. Le déficit de cette enzyme, entraine une accumulation du glycogène dans différents tissus, aboutissant à des dysfonctions essentiellement musculaires cardiaques, diaphragmatiques ou squelettiques. L'âge d'apparition des premiers symptômes, la sévérité des atteintes fonctionnelles ainsi que les durées et vitesse d'évolution de la maladie sont très variables d'un patient à l'autre1. Deux formes cliniques peuvent être cependant distinguées : les formes infantiles sous catégorisées en forme classique débutant dans les premiers mois de vie et en forme atypique lorsque les symptômes apparaissent dans la première année de vie. Les formes infantiles sont caractérisées par une atteinte musculaire squelettique et cardiaque. Leur évolution est rapide et, en l'absence de traitement, entraine le décès de l'enfant dans les premières années de vie par insuffisance cardiaque et/ou respiratoire, dans la plupart des cas. les formes tardives sous catégorisées en formes juvéniles lorsque les premiers symptômes apparaissent pendant la petite enfance ou l'adolescence et en forme adulte lorsque la maladie se manifeste après l'âge de 20 ans. Ces formes tardives qui représentent les formes les plus fréquentes de la maladie (90% des patients) sont caractérisées par une atteinte musculaire squelettique sans atteinte cardiaque le plus souvent. Leur évolution est plus lente, mais très hétérogène et peu prévisible. Généralement, la faiblesse musculaire et l'apparition d'une insuffisance respiratoire s'installent progressivement et nécessitent à terme l'utilisation d'un fauteuil roulant, d'une assistance respiratoire et/ou nutritionnelle. L'espérance de vie de ces patients est globalement réduite par rapport à la population générale2. Le traitement enzymatique substitutif (TES) par l'alpha alglucosidase a considérablement modifié la prise en charge de cette maladie3 4 5. Encyclopédie Orphanet Grand Public. La maladie de Pompe. Décembre 2010. Gngr D, De Vries JM, Hop WCJ et al. Survival and associated factors in 268 adults with Pompe disease prior to treatment with enzyme replacement therapy. Orphanet J Rare Dis 2011 ; 6 : 34. Protocole National de Diagnostic et de Soins (PNDS). Maladie de Pompe. Juillet 2016. sante. fr/portail/upload/docs/application/pdf/2016-08/pnds - maladie de pompe. pdf Cupler EJ, Berger KI, Leshner RT et al. Consensus treatment recommendations for late-onset Pompe disease. Muscle Nerve 2012 ; 45 : 319-333. Annane D, Caillaud C, Desnuelle C et al. Recommandations du Comité d'Evaluation du Traitement de la maladie de Pompe. Modalités de l'utilisation de l'alpha-glucosidase recombinante humaine (MYOZYME) et du suivi des patients HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 4/28 Avis Post Audition Dans les formes infantiles, son utilisation, associée à une prise en charge symptomatique, a augmenté la survie globale des patients dits répondeurs au traitement. Toutefois, le traitement n'empêche pas une mortalité importante et permet au mieux une survie prolongée en situation de handicap moteur et respiratoire sévère6. Ce handicap inévitable s'explique notamment par l'expression du déficit enzymatique au niveau de la corne antérieure de la moelle épinière, du système auditif et du système nerveux central7 8, zones inaccessibles aux enzymes recombinantes. Ces atteintes neurologiques ont été clairement établies avec l'augmentation de la survie des nourrissons recevant l'enzymothérapie. Dans les formes tardives de la maladie, l'utilisation de MYOZYME peut conduire à une amélioration des fonctions motrices et respiratoires à court terme mais n'a jamais formellement démontré son impact sur la survie globale des patients. L'utilisation de MYOZYME dans les formes juvéniles est peu documentée. Au total, malgré la disponibilité d'un TES, il persiste un besoin important de nouveaux traitements qui amélioreraient la qualité de vie en diminuant la morbidité et augmentant la survie globale de l'ensemble des patients atteints de la maladie de Pompe. 06 COMPARATEURS CLINIQUEMENT PERTINENTS 06. 1 Médicaments Aucun autre médicament ne dispose d'une AMM ou n'est recommandé dans le traitement enzymatique substitutif de la maladie de Pompe. 06. 2 Comparateurs non médicamenteux Sans objet. Conclusion Il n'existe pas de comparateur cliniquement pertinent. adultes. cetpompe, consulté le 20 septembre 2012. Han A et al. Outcome of patients with classical infantile pompe disease receiving enzyme replacement therapy in Germany. JIMD Rep 2015 ; 20 : 65-75 Chien YH et al. Brain development in infantile-onset Pompe disease treated by enzyme replacement therapy. Pediatr Res 2006 ; 60 : 349-52 Pena LD et al. Postmortem Findings and Clinical Correlates in Individuals with Infantile-Onset Pompe Disease. JMD Rep 2015 ; 23 : 45-54 HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 5/28 Avis Post Audition 07 INFORMATIONS SUR LE MEDICAMENT AU NIVEAU INTERNATIONAL PRISE EN CHARGE Pays OUI/NON Population(s) Si non pourquoi Celle de l'AMM ou restreinte Allemagne Pays-Bas Belgique Bulgarie Chypre Croatie Espagne Italie Autriche Danemark Finlande Grèce Oui Population de l'AMM Irlande Lettonie Norvège Pologne Portugal République Tchèque Roumanie Slovaquie Slovénie Suède Australie Etats-Unis Angleterre : population de l'AMM Pays de Galles : restreint aux patients atteints d'une Royaume-Uni Oui forme infantile de la maladie ou d'une forme tardive avec apparition juvénile Ecosse : prise en charge individuelle Restreint aux patients non intubés (dans certaines Canada Oui provinces) Hongrie Oui Prise en charge individuelle Prise en charge restreinte dans la forme tardive de la Suisse Oui maladie : critère d'initiation du traitement et de poursuite au-delà de un an Estonie Evaluation en cours / Lituanie Non (pas de patient Luxembourg identifié dans ces / Malte pays). 08 RAPPEL DES PRECEDENTES EVALUATIONS Date de l'avis 20 septembre 2006 (inscription collectivités) (motif de la demande) Indication TES à long terme chez les patients ayant un diagnostic confirmé de maladie de Pompe (déficit en -glucosidase acide). Les bénéfices de Myozyme pour les patients atteints de la forme tardive de la maladie de Pompe n'ont pas été établis. SMR - Important dans la forme infantile (libellé) - Insuffisant dans la forme tardive ASMR ASMR importante (II) dans le cadre de la prise en charge de la seule forme (libellé) infantile de la maladie de Pompe. Recommandations La Commission réexaminera la spécialité MYOZYME dans la forme tardive de la maladie de Pompe au vu des résultats de l'étude comparative qui sera fournie à l'agence européenne d'évaluation des médicaments et/ou de toute donnée nouvelle susceptible d'être fournie par la firme. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 6/28 Avis Post Audition Date de l'avis 16 juin 2010 (réévaluation dans la forme tardive de la maladie) (motif de la demande) Indication TES à long terme chez les patients ayant un diagnostic confirmé de maladie de Pompe (déficit en -glucosidase acide). Chez les patients atteints de la forme tardive de la maladie de Pompe, l'évidence d'une efficacité est limitée. SMR Faible dans la forme tardive. (libellé) ASMR Compte tenu de la faible quantité d'effet observée, de l'absence de donnée (libellé) concernant l'efficacité à long terme (notamment l'effet sur le passage à la ventilation assistée et malgré l'absence d'alternative thérapeutique, Myozyme apporte une amélioration du service médical rendu mineure (ASMR IV) dans la prise en charge de la forme tardive de la maladie de Pompe. Recommandations La Commission souhaite réévaluer la spécialité MYOZYME dans un délai de deux ans avec des données supplémentaires concernant le suivi des patients à plus long terme et la définition de critères d'interruption de ce traitement. La Commission insiste sur l'importance de la pérennisation du registre de la maladie de Pompe. Date de l'avis 9 janvier 2013 (réévaluation dans la forme tardive de la maladie) (motif de la demande) Indication TES à long terme chez les patients ayant un diagnostic confirmé de maladie de Pompe (déficit en -glucosidase acide). Chez les patients atteints de la forme tardive de la maladie de Pompe, l'évidence d'une efficacité est limitée. SMR Faible dans la forme tardive. (libellé) ASMR Au vu des données disponibles, la Commission considère que l'amélioration (libellé) du service médical rendu par MYOZYME reste mineure (ASMR IV) dans la forme tardive de la maladie de Pompe. Recommandations La Commission recommande une évaluation annuelle de tous les patients traités par MYOZYME dans la forme tardive de la maladie de Pompe afin de procéder à une réévaluation périodique de l'efficacité et de la justification de la poursuite du traitement. La Commission souhaite être destinataire des résultats d'évaluations qui pourraient être menées dans le cadre du registre français, concernant notamment la raison de poursuite ou d'arrêt du traitement par MYOZYME dans la forme tardive de la maladie de Pompe. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 7/28 Avis Post Audition 09 ANALYSE DES DONNEES DISPONIBLES Dans le cadre de cette réévaluation, le laboratoire a déposé des nouvelles données cliniques dans les deux formes cliniques de la maladie. Seront détaillés dans cet avis les résultats : Formes infantiles - de la phase d'extension de l'étude non comparative réalisée chez des patients atteints d'une forme infantile classique âgés de moins de 6 mois (AGLU0602) dont l'analyse principale a déjà été évaluée par la CT dans son avis d'inscription du 20/09/20069 ; - de l'analyse finale de l'étude non comparative réalisée chez des patients atteints d'une forme infantile classique ou atypique de la maladie de Pompe âgés de 6 mois à 3, 5 ans à l'inclusion (AGLU01702) dont l'analyse intermédiaire a déjà été évaluée par la Commission dans son avis du 20/09/200610 ; - d'une analyse rétrospective post-hoc fondée sur les données des études AGLU01602 et 01702 dont l'objectif était d'évaluer l'impact des anticorps IgG anti-alpha alglucosidase sur la réponse clinique11. Forme tardive - de deux analyses rétrospectives post-hoc issues d'études observationnelles chez des patients atteints d'une forme tardive de la maladie, ayant pour objectif d'analyser soit la qualité de vie12 soit la fatigue13 des patients à long terme ; - d'une méta-analyse réalisée à partir des études évaluant MYOZYME chez des patients atteints d'une forme tardive de la maladie de Pompe 14 ; - d'une analyse actualisée issue du registre Français de la maladie de Pompe. Formes infantiles et forme tardive - et des données actualisées issues du registre international comprenant des données dans les deux formes cliniques de la maladie de Pompe détaillées dans cet avis. Ne seront pas détaillés dans cet avis, les résultats : - de trois publications correspondant à des analyses rétrospectives de cas cliniques dans la forme infantile de la maladie, en raison de leur faible niveau de preuve15 16 17 ; - des données de suivi des patients ayant terminé l'étude comparative versus placebo, réalisée chez des patients atteints d'une forme tardive de la maladie et sa phase d'extension (étude LOTS) puis suivis dans le cadre du registre international de la maladie de Pompe, en raison du nombre trop important de données manquantes ne permettant pas leur évaluation à long terme (données non publiées) ; Kishani PS et al. Early treatment with alglucosidase alpha prolongs long-term survival of infants with Pompe disease. Pediatr Res 2009 ; 66 : 329-35 Nicolino M et al. Clinical outcomes after long-term treatment with alglucosidase alfa in infants and children with advanced Pompe disease. Genet Med 2009 ; 11 : 210-9 Banugaria SG et al. The impact of antibodies on clinical outcomes in diseases treated with therapeutic protein : lessons learned from infantile Pompe disease. Genet Med 2011 ; 13 : 729-36 Gngr et al. Quality of life and participation in daily life of adults with Pompe disease receiving enzyme replacement therapy : 10 years of international follow-up. J Inherit Metab Dis 2016 ; 39 : 253-60 Gngr et al. Enzyme replacement therapy and fatigue in adults with Pompe disease. Mol Genet Metab. 2013 ; 109 : 174-8 Schoser B et al. Survival and long-term outcomes in late-onset Pompe disease following alglucosidase alfa treatment : a systematic review and meta-analysis. J Neurol 2016 (e-publication). Van Gelder C et al. Enzyme therapy and immune response in relation to CRIM status : the Dutch experience in classic infantile Pompe disease. J Inherit Metab Dis 2015 ; 38 : 305-14 Hahn A et al. Outcome of patients with classical infantile Pompe disease receiving enzyme replacement therapy in Germany. JIMD Reports 2015 ; 20 : 65-75 Broomfield A et al. Response of 33 UK patients with infantile-onset Pompe disease to enzyme replacement therapy. J Inherit Metab Dis 2016 ; 39 : 261-71 HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 8/28 Avis Post Audition - des données issues d'une thèse de médecine soutenue en 2012 et non publiées à ce jour portant sur l'évaluation rétrospective de 30 patients atteints d'une forme infantile de la maladie. 09. 1 Efficacité 9. 1. 1 Formes infantiles de la maladie de Pompe 9. 1. 1. 1 Données déjà évaluées par la CT (cf. avis du 26 septembre 2006) L'évaluation de MYOZYME à l'inscription reposait principalement sur l'analyse finale de l'étude AGLU01602 et l'analyse intermédiaire des 15 premiers patients inclus de l'étude AGLU01702. Ces résultats sont rappelés ci-dessous : Données dans la forme infantile classique (étude AGLU01602) Il s'agit d'une étude non comparative réalisée chez 18 patients non ventilés âgés de 6 mois ou moins à l'inclusion et randomisés pour recevoir MYOZYME à 20 mg/kg ou à 40 mg/kg toutes les deux semaines pendant 52 semaines. Les résultats de cette étude ont été comparés à des données historiques d'un sous-groupe (n 42) d'une cohorte non traitée de patients (AGLU004) dont les caractéristiques étaient comparables à celles de l'étude AGLU01602. Résultats : Après 52 semaines de traitement, tous les patients traités par MYOZYME étaient en vie et 15 parmi les 18 inclus étaient sans assistance respiratoire. Dans le sous-groupe historique, un patient parmi les 42 était en vie à l'âge de 18 mois (la survie étant le seul critère évalué). Chez les 12 patients évaluables/18 inclus, il a été observé une diminution moyenne de 57, 6 % de la masse ventriculaire gauche (MVG) par rapport aux valeurs initiales. Treize patients/18 inclus ont eu une amélioration de leurs fonctions motrices par rapport aux valeurs initiales, mesurées par les scores de performance motrice à âge équivalent de l'AIMS (Alberta Infant Motor Scale). Un maintien ou une amélioration de la croissance par rapport aux valeurs initiales après 26 semaines de traitement par MYOZYME a été observé chez 13 patients /18 et 17 patients/18 des patients respectivement pour le poids et la taille. Les résultats d'efficacité n'étaient pas différents entre les 2 groupes posologiques (20 mg ou 40 mg/kg une fois toutes les 2 semaines). Seule la dose de 20 mg/kg une fois toutes les 2 semaines a été retenue dans l'AMM. Données dans la forme infantile classique ou atypique (étude AGLU01702) Il s'agit d'une étude non comparative réalisée chez 21 patients atteints d'une forme infantile classique ou atypique de la maladie de Pompe âgé de 6 mois à 3, 5 ans à l'inclusion. Les résultats d'efficacité ont été comparés à des données historiques d'un sous-groupe (n 48) d'une cohorte non traitée de patients (AGLU004) dont les caractéristiques étaient comparables à celles de l'étude AGLU01702. Les patients ont reçu 20 mg/kg de Myozyme toutes les deux semaines pendant 52 semaines. Résultats : Selon une analyse intermédiaire chez les 15 premiers patients inclus traités durant 52 semaines, le taux de survie a été de 73% (IC 95% : 44, 9 92, 2) dans le groupe MYOZYME comparé à 37% (IC 95% : 13, 8 61, 2) dans un groupe non traité issu des données historiques. L'analyse en sous-groupe de la survie en fonction de l'âge à l'inclusion ( et >1an) prévue dans le protocole a montré : - dans le sous-groupe de patients âgés de < 1 an, un taux de survie de 50% (3/6) sous MYOZYME et de 16, 2% dans le sous-groupe historique. - dans le sous-groupe de patients âgés de > 1 an, un taux de survie de 88, 9% (8/9) sous MYOZYME et de 45, 5% dans le sous-groupe historique. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 9/28 Avis Post Audition Chez les 10 patients qui n'avaient pas initialement d'assistance respiratoire invasive, à l'issu des 52 premières semaines de traitement : - 3 sont décédés - 2 ont eu besoin d'une assistance respiratoire invasive (trachéotomie) - 5 n'ont pas eu besoin d'assistance respiratoire Treize des 15 patients ayant des données de suivi ont eu une amélioration moyenne de 33% de la fraction d'éjection ventriculaire par rapport aux valeurs initiales. Un maintien ou une amélioration des paramètres de croissance a été observé chez 12 patients/15 et 14 patients /15 respectivement pour le poids et la taille. Six patients parmi les 15 évalués ont eu une amélioration de leur fonction motrice par rapport aux valeurs initiales, mesurés par les scores de performance de l'AIMS (Alberta Infant Motor Scale). 9. 1. 1. 2 Nouvelles données Données dans la forme infantile classique (extension de l'étude AGLU016029) Sur les 18 patients inclus et traités dans l'étude AGLU01602, 16 ont poursuivi le traitement par MYOZYME dans le cadre de cette étude d'extension (un patient est décédé et un n'a pas été inclus dans la phase d'extension). A la fin de l'étude, après un suivi moyen de 119 semaines et une durée de traitement maximale de 150 semaines, 9 patients sur les 18 initialement inclus dans l'étude AGLU01602 étaient en vie et sans assistance respiratoire invasive. Sur la base des données de cette étude, le taux de survie sans assistance respiratoire était de 83, 3% IC95% [66, 1 ; 100] à 18 mois et de 49, 4 % IC95% [26, 0 ; 72, 8] à 36 mois. A titre de comparaison, dans la cohorte historique seul un patient sur les 61 inclus était en vie à l'âge de 18 et de 36 mois. Chez les 8 patients dont les données sont disponibles, il a été observé une diminution moyenne de 40, 5 % de la MVG par rapport aux valeurs initiales après 104 semaines de traitement. Données dans la forme infantile classique ou atypique (analyse finale de l'étude AGLU0170210) Sur les 21 patients inclus et traités dans cette étude, 14 l'ont terminé : 6 patients sont décédés pendant l'étude et un patient est sorti de l'étude pour poursuivre le traitement dans le cadre d'un programme d'accès étendu (EAP). Après 52 semaines de traitement, 16 patients /21 étaient en vie et après 104 semaines de traitement 14 patients /21 étaient en vie (patients alors âgés de 34, 7 mois à 80, 3 mois). A titre de comparaison, dans la cohorte historique 5 patients sur les 47 évaluables étaient en vie à l'âge de 30 mois. Parmi les 16 patients sans assistance respiratoire invasive à l'inclusion, 7 le sont resté après 104 semaines de traitement et parmi les 14 patients sans aucune assistance respiratoire à l'inclusion, 7 le sont restés après 104 semaines de traitement. Entre l'inclusion et la fin de l'étude, 17 patients sur 21 ont eu une diminution d'au moins 1 Z-score ou une normalisation de leur MVG. Données groupées dans les formes infantiles (étude Banugaria et al. 11) Il s'agit d'une étude rétrospective post-hoc fondée sur les données des études AGLU01602 et AGLU01702 dont l'objectif était d'évaluer l'impact des anticorps IgG anti-alpha alglucosidase sur la réponse clinique des patients atteints d'une forme infantile de la maladie et traités par MYOZYME. Pour cela, il a été identifié à partir des données de 34 enfants des études AGLU01602 et AGLU01702, trois sous-groupes de patients : - les patients CRIM (crossreactive immunologic material) négatif correspondant aux patients n'ayant pas d'enzyme alpha glucosidase et sont donc susceptibles d'avoir une production d'IgG anti-alpha alglucosidase (n 11) ; - les patients CRIM positifs avec des titres IgG élevés et persistants (n 9) ; HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 10/28 Avis Post Audition - et les patients CRIM positifs avec des titres IgG bas (n 14). Cette analyse suggère un taux de survie globale et de survie sans ventilation invasive plus important chez les patients du groupe CRIM positifs à titre IgG bas par rapport aux patients CRIM positifs à titre IgG élevé et CRIM négatif. 9. 1. 2 Formes tardives de la maladie de Pompe 9. 1. 2. 1 Données déjà évaluées par la CT (cf. avis du 20 septembre 2006, du 16 juin 2010 et du 9 janvier 2013) Données comparatives Etude AGLU02704 (LOTS)18 et sa phase d'extension (AGLU03206)19 L'étude LOTS est une étude clinique randomisée (2 : 1), double aveugle, comparative versus placebo réalisée chez 90 patients atteints d'une forme tardive de la maladie de Pompe. Les principaux critères d'inclusion étaient les suivants : - âge 8 ans ; - diagnostic de maladie de Pompe confirmé par une activité de l' glucosidase acide (GAA) sur culture de fibroblastes 40% de la moyenne normale et par l'identification de 2 mutations du gène de la GAA ; - patients capables de parcourir 40 mètres au cours de 2 tests de marche de 6 minutes réalisés 2 jours consécutifs, avec ou sans support d'aide à la marche ; - CVF en position assise 30% et < 80% de la valeur théorique ; - perte en CVF 10% lors du passage de la position assise à la position couchée. Les principaux critères de non inclusion étaient les suivants - utilisation d'un support de ventilation invasive sur tube endotrachéal ; - utilisation d'un support de ventilation non invasive durant l'éveil en position debout ; Au total, 90 patients ont été inclus : 60 dans le groupe MYOZYME et 30 dans le groupe placebo. Quarante-deux d'entre eux avaient participé à l'étude observationnelle AGLU02303. Critères de jugement principaux : A l'issu de 78 semaines de traitement, MYOZYME a démontré sa supériorité sur les deux critères principaux de jugement : la distance parcourue lors du test de marche de 6 minutes (6MWT ; 26, 06 mètres versus -4, 87 mètres) et la capacité vitale forcée (CVF) en position assise (1, 25% de la valeur théorique versus -2, 3%). Tableau 1 : critères de jugement principaux de l'étude LOTS MYOZYME (n 60) Placebo (n 30) p* 6MWT : différence entre l'inclusion et la fin de l'étude (mètres) < 0, 03 Moyenne écart-type 26, 1 64, 4 - 4, 9 45, 2 Médiane et étendue 15 [-87 ; 260] - 7, 5 [-112 ; 7] CVF : différence entre l'inclusion et la fin de l'étude (% de la valeur théorique) < 0, 003 Moyenne écart-type 1, 25 5, 5 - 2, 3 4, 3 Médiane et étendue 0 [-12 ; 14] - 3 [-11 ; 7] * : test de Wilcoxon-Mann-Whitney pour la différence entre groupes ; : Fin de l'étude : semaine 78 ou dernière donnée disponible ; Van Der Ploeg A et al. A randomized study of alglucosidase alfa in late-onset Pompe's disease. N Engl J Med 2010 ; 362 : 1396-406 Van Der Ploeg A et al. Open-label extension study following the Late-Onset Treatment Study (LOTS) of alglucosidase alfa. Mol Genet Metab 2012 ; 107 : 456-61 HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 11/28 Avis Post Audition Critères de jugement secondaires : Une différence en faveur de MYOZYME a également été mise en évidence sur le test QMT (test musculaire quantitatif bilatéral des fléchisseurs et extenseurs de genou) En revanche, aucune différence en termes de qualité de vie (SF-36) ou d'évolution du handicap (échelle de Rotterdam) n'a été en revanche mise en évidence entre les deux groupes de traitement. A la suite de ces 78 semaines, les patients avaient la possibilité d'entrer dans une phase de suivi en ouvert de 26 semaines supplémentaires. Au total, 81 patients sur les 90 de l'étude LOTS sont entrés dans cette phase d'extension. Au cours de ces 26 semaines, les patients déjà prétraité par MYOZYME ont en moyenne perdu 6, 9 /- 32, 8 mètres de distance de marche au test de marche de 6 minutes contre un gain de 4, 2 /- 23, 8 mètres chez les patients ayant initialement reçu le placebo. La capacité vitale forcée en position assise a évolué de -0, 7% /-3, 7 dans le groupe prétraité et de -1% /-5, 4 dans le groupe ayant initialement reçu le placebo. Etude de Gngr et al. 20 Il s'agit d'une étude observationnelle prospective réalisée chez 283 adultes dont 79 (28%) non traités et 204 (72%) traités par MYOZYME. dont l'objectif était d'évaluer l'impact du traitement par MYOZYME sur la survie d'une cohorte de patients adultes atteints de la forme tardive de la maladie de Pompe. L'âge médian à l'inclusion des patients non traités était de 51 ans (20 à 81), comparable à l'âge médian des patients traités soit 51 ans (24 à 76). Le pourcentage de patients ne nécessitant pas d'assistance respiratoire ou d'utilisation d'un fauteuil roulant était de 34% dans le groupe MYOZYME et de 44% dans le groupe non traité. Dans cette cohorte, la majorité des patients non traités a été mise sous MYOZYME au cours du suivi. Cependant les critères d'instauration du traitement ne sont pas renseignés dans le dossier du laboratoire. MYOZYME a été administré toutes les deux semaines en perfusion intraveineuse à raison de 20 mg/kg. Résultats : Pendant la période de suivi, d'une durée médiane de 6 ans (0, 04 à 9 ans), 46 patients sont décédés : 18 chez les patients traités par MYOZYME (9%) et 28 chez les patients non traités (35%). Les résultats issus d'une modélisation en ITT suggèrent un taux de survie plus important dans le groupe traité par MYOZYME que dans le groupe non traités : HR ajusté21 0, 41 IC95% [0, 19 ; 0, 87]. En raison du déséquilibre numérique entre les groupes en termes de sévérité de la maladie, notamment le nombre de patients n'ayant pas recours à une assistance respiratoire ou à l'utilisation d'un fauteuil roulant et de l'absence d'information sur les raisons d'instauration ou non d'un TES, ces résultats ont été considérés à visée exploratoire. Données issues du registre français de la maladie de Pompe Ce registre observationnel multicentrique coordonné par l'Institut de Myologie à la Pitié-Salpêtrière a débuté en 2004 dans l'objectif : - de recenser et suivre tous les patients atteints de la maladie de Pompe en France ; - de recueillir des informations cliniques et paracliniques, afin de mieux connatre l'histoire naturelle des patients non traités, d'évaluer l'influence des thérapeutiques et de préciser les causes de décès des patients ; Gngr D et al. Impact of enzyme replacement therapy on survival in adults with Pompe disease : results from a prospective international observational study. Orphanet J Rare Dis 2013 ; 8 : 49 Ajustement sur l'âge, le sexe, la sévérité de la maladie et le pays de résidence. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 12/28 Avis Post Audition - et de permettre de développer la recherche scientifique par l'intermédiaire des réseaux constitués par les centres de références de pathologie neuromusculaires et de maladies métaboliques. de permettre le suivi prospectif des patients atteints de la maladie de Pompe en France. Des données issues de ce registre ont été déposées par le laboratoire pour la réévaluation de 2010 et de 2013, seuls les résultats issus de la dernière réévaluation sont résumés ci-dessous : Au 7 juillet 2011, 104 patients adultes ont été enregistrés dont 94 évaluables : 81 patients traités par MYOZYME et 13 patients non traités. A l'inclusion, la durée médiane de la maladie était de 16 ans dans le groupe des patients traités et de 10 ans dans le groupe des patients non traités. Les principales raisons de non instauration du traitement ont été la bénignité de la faiblesse musculaire et l'absence d'atteinte respiratoire significative. Pour chaque critère d'évaluation, la pente a été calculée par régression linéaire en stratifiant le calcul sur le groupe de traitement. Fonction motrice : Après 66 mois de suivi, une diminution du périmètre de marche (6MWT) a été observée chez les patients traités alors qu'aucune différence n'a été observée chez les patients non traités. La diminution des distances mesurées chez les patients traités pourrait être due à un effet de seuil. En effet, les patients ayant été traités le plus longtemps étaient plus sévèrement atteints lors de l'instauration du traitement. Ainsi, aucune dégradation n'est observée après modélisation de l'évolution de la distance de marche pour une fenêtre d'observation ne dépassant pas 48 mois. Tableau 2 : analyse globale de l'évolution du test de marche de 6 minutes Groupe Visite Pente Ecart type p Initiale - mois 66 -1, 53 0, 52 Traité Initiale - mois 18 2, 19 1, 69 NS Mois 18 - mois 66 -4, 45 3, 06 NS Initiale - mois 66 1, 05 1, 69 NS Non traité Initiale - mois 18 -4, 29 5, 92 NS Mois 18 - mois 66 6, 53 4, 36 NS Fonction respiratoire : Une amélioration de la CVF en position assise a été observée sur les 18 premiers mois de traitement. Cependant, aucune différence n'a été observée entre l'état initial et à 66 mois sur ce critère. Tableau 3 : analyse globale de l'évolution de la CVF Groupe Visite Pente Ecart type p Initiale - mois 66 -0, 1 0, 07 NS Traité Initiale - mois 18 0, 57 0, 25 0, 02 Mois 18 - mois 66 -0, 04 0, 36 NS Initiale - mois 66 0, 09 0, 17 NS Non traité Initiale - mois 18 -0, 49 0, 64 NS Mois 18 - mois 66 -0, 17 0, 32 NS HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 13/28 Avis Post Audition Autres données non comparatives déjà évaluées (cf. tableau ci-dessous) Durée du Référence Type d'étude Effectifs et population étudiée Principaux résultats traitement Données évaluées à l'inscription (cf. avis du 20/09/2006) Etude observationnelle fondée Les résultats hétérogènes observés dans l'étude ne N 18 patients âgés de 9 à 42 ans tous en 8 mois à 2, 8 Non publiée sur les données d'un programme permettent pas l'évaluation de la fonction motrice et fauteuil roulant et 8 sous ventilation invasive ans d'accès précoce au traitement. respiratoire chez ces patients. Données évaluées lors de la première réévaluation (cf. Avis du 16/06/2010) 6MWT : La distance parcourue en marche de confort a diminué chez 3 patients (de 5, 48 et 61m) et augmenté chez les deux autres (de 22 et 64m). Van Capelle Etude clinique non comparative N 5 patients âgés de 5 à 15 ans sans La distance parcourue en marche rapide a augmenté chez 22 74 semaines les 5 patients (de 64 à 184 m). CI et al. (AGLU02804) assistance respiratoire ni aide à la marche. CVF : Chez les 3 patients avec une CVF de la valeur théorique, la CVF en position assise a augmenté pendant l'étude ( 6, 8 à 21, 8%). N 5 patients âgés de 28 à 62 ans atteints Chez deux patients le temps sans ventilation assistée/jour d'une forme avancée de la maladie. Orlikowski D Etude clinique non comparative en position assise a diminué de 20 et 30 min. La fonction 23 Tous étaient sous ventilation assistée dont 4 52 semaines et al. (AGLU03105) motrice s'est améliorée chez 2 patients. sous ventilation assistée invasive et étaient Un patient est décédé pendant l'étude. en fauteuil roulant ou alités. 6MWT : Parmi les patients évaluables (n 22), la distance moyenne N 44 patients âgés de 49 ans en moyenne parcourue a augmenté de 52m pendant l'étude. Strothotte et Etude observationnelle 24 sans aide à la marche pour 44 % et sans 12 mois al prospective CVF : assistance respiratoire pour 57 %. Parmi les patients évaluables (n 33), la CVF est restée stable pendant l'étude. Van Capelle CI et al. Effect of enzyme therapy in juvenile patients with Pompe disease : a three-year open-label study. Neuromuscul Disord. 2010 ; 20 : 775-82 Orlikowski D et al. Recombinant human acid alpha-glucosidase (rhGAA) in adult patients with severe respiratory failure due to Pompe disease. Neuromuscul Disord 2011 ; 21 : 477- Strothotte S, Strigl-Pill N. Enzyme replacement therapy with alglucosidase alfa in 44 patients with late-onset glycogen storage disease type 2 : 12-month results of an observational clinical trial. J Neurol 2010 ; 257 : 91-7 HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 14/28 Avis Post Audition Données évaluées lors de la deuxième réévaluation (cf. Avis du 13/01/2013) N 71 patients adultes (âge médian 52, 1 Fonction motrice : Etude observationnelle non Vries et ans) sans assistance respiratoire pour 64% 23 Parmi les patients évaluables (n 69), la force musculaire évaluée par 25 comparative. prospective et al. et sans utilisation d'un fauteuil roulant pour mois le score MRC a en moyenne augmenté de 1, 4 % par an et de 4, 0 % monocentrique 61 %. par an selon le score HHD. Etude observationnelle, non N 24 patients atteints d'une forme tardive de Bembi et 36 Les résultats hétérogènes observés dans l'étude ne permettent pas 26 comparative monocentrique, la maladie d'apparition juvénile (n 7) ou à al. mois l'évaluation de la fonction motrice chez ces patients. prospective l'âge adulte (n 17). N 74 patients âgés de 7 à 72 ans (moyenne 43 ans) prétraités par MYOZYME pendant au moins 12 mois. 6MWT : Angelini et Etude observationnelle non 12 à 54 27 L'utilisation d'un fauteuil roulant était Chez les patients évaluables (n 58/74), la distance de marche al. comparative, prospective mois nécessaire pour 10% des patients et une parcourue a augmentée de 20% (soit un gain absolu de 63 m) assistance respiratoire nécessaire pour 36 %. N 38 patients âgés de 27 à 73 ans (moyenne 53 ans). 6MWT : Regnery et Etude observationnelle non L'utilisation d'un fauteuil roulant était Chez les patients évaluables (n 21/38) la distance moyenne 28 3 ans ère al. comparative, prospective nécessaire chez 29% des patients et une parcourue a augmenté la 1 année (gain absolue 32m) puis s'est ème ème assistante respiratoire nécessaire chez 34 % stabilisée pendant la 2 et 3 année de suivi. des patients. De Vries et al. Effect of enzyme therapy and prognostic factors in 69 adults with Pompe disease : an open-label single-center study. Orphanet J Rare Dis 2012 ; 7 : 73 Bembi et al. Long-term observational, non-randomized study of enzyme replacement therapy in late-onset glycogenosis type II. J Inherit Metab Dis 2010 ; 3356 : 727-35 Angelini C et al. Observational clinical study in juvenile-adult glycogenosis type 2 patients undergoing enzyme replacement therapy for up to 4 years. J Neurol 2012 ; 259 : 952-8 Regnery C et al. 36 months observational clinical study of 38 adult Pompe disease patients under alglucosidase alfa enzyme replacement therapy. J Inherit Metab Dis 2012 ; 35 : 837-45 HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 15/28 Avis Post Audition 9. 1. 2. 2 Nouvelles données Etude Gngr D et al (2016)12 Il s'agit d'une analyse rétrospective réalisée à partir de données collectées chez des patients atteints d'une forme tardive de la maladie de Pompe dont les données sont issues d'une étude observationnelle prospective toujours en cours. L'objectif de cette analyse était d'évaluer la qualité de vie (questionnaire SF-36 et échelle de handicap de Rotterdam RHS ) des patients avant et après leur mise sous traitement au long court par MYOZYME. Sur les 174 patients inclus dans cette analyse, 52% utilisaient un fauteuil roulant et 48% avaient besoin d'une assistante respiratoire. Leur âge médian d'instauration du traitement par MYOZYME était de 50 ans. Le temps médian de suivis était de 4 ans avant et de 4 ans pendant le traitement. Cette analyse suggère une amélioration significative, mais cliniquement peu pertinente, de la qualité de vie uniquement retrouvée sur la composante physique du questionnaire SF-36 après un temps de traitement allant de 0 à 2 ans (variation 1, 49 IC95% [0, 76 ; 2, 21]). Au-delà de deux années de traitement, aucune amélioration de la qualité de vie sur le score SF-36 n'a été mise en évidence. Aucune amélioration de la qualité de vie selon l'échelle RHS n'a été mise en évidence après l'instauration du traitement par MYOZYME. Etude Gngr D et al. (2013)13 Il s'agit d'une analyse rétrospective réalisée à partir de données collectées chez 163 patients dans le cadre d'une étude observationnelle prospective entre 2002 et 2011. L'objectif de cette analyse était d'évaluer l'évolution de la fatigue vie l'utilisation du questionnaire FSS avant et après leur mise sous traitement par MYOZYME. Sur les 163 patients inclus dans cette analyse, 52% utilisaient un fauteuil roulant et 50% avaient besoin d'une assistance respiratoire. Leur âge médian d'instauration du traitement par MYOZYME était de 50 ans. Le temps médian de suivi était de 4 ans avant la mise sous traitement et de 3 ans pendant le traitement. Cette analyse suggère une amélioration de la fatigue après la mise sous traitement de -0, 14 points par sur l'échelle FSS (IC95% [-0, 23 ; -0, 04]). Cette différence avant/après instauration du traitement semble toutefois peu cliniquement pertinente. Méta-analyse de Schoser B et al. (2016)14 Cette publication correspond à une méta-analyse réalisée à partir de l'ensemble des études réalisées chez des patients avec une forme tardive de la maladie et traités par MYOZYME. Au total, 22 publications correspondant à 19 études ont été inclues dans cette méta-analyse. La grande majorité de ces études ont déjà été analysées par la Commission ou sont présentées dans cet avis de réévaluation. Compte tenu de la faiblesse méthodologique de la majorité des études incluent dans cette méta- analyse (un seul essai randomisé comparatif) et de l'hétérogénéité des patients inclus notamment en termes de sévérité de la maladie, ces résultats ne permettent pas d'estimer la quantité d'effet de MYOZYME. Par conséquent, seuls les résultats sur la mortalité (issus de 6 études) sont détaillés à titre exploratoire. Cette méta-analyse suggère un taux de mortalité plus faible chez les patients traités par MYOZYME par rapport à ceux non traités (RR 0, 21 IC95% [0, 11 ; 0, 41]). Actualisation des données du registre Français Dans ce dossier de réévaluation, le laboratoire a déposé des données actualisées au 26 aout 2015 issues du registre Français de la maladie de Pompe et provenant d'un seul centre Parisien ayant inclus 59 patients suivis jusqu'à un maximum de 10 ans. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 16/28 Avis Post Audition La durée médiane de la maladie était de 21, 6 ans dans le groupe traité (N 43) et de 12, 6 ans dans le groupe non traité (N 16). Les patients du groupe des patients traités avaient une maladie plus sévère en termes d'utilisation d'une assistance à la marche, d'assistance respiratoire, de tests 6MWT et MFM que les patients non traités. Vingt patients étaient traités par MYOZYME et avaient un 6MWT évaluable. La valeur moyenne du test à l'inclusion était de 54% de la valeur prédite. La distance parcourue a augmenté selon une pente de 2, 3% par an pendant les deux premières années de traitement, puis a constamment diminué les années suivantes selon une pente d'environ -2, 95% par an. Les analyses sur les patients évaluables concernant la capacité vitale forcée (N 26) et le score MFM (N 24) montrent une dégradation lente mais constante de l'état clinique des patients sur ces critères. En raison du nombre important de données manquantes ne permettant l'interprétation correcte de la quantité d'effet du traitement, ces données ne seront pas détaillées dans cet avis. Par ailleurs, aucun facteur prédictif d'une meilleure efficacité du traitement n'a été mis en évidence dans cette analyse. 9. 1. 3 Registre international de la maladie de Pompe (données dans les formes infantiles et tardives de la maladie) Ce programme observationnel basé sur le volontariat des médecins et des patients, a été initié par le laboratoire GENZYME en 2004, afin de collecter des données sur les patients atteints de la maladie de Pompe, qu'ils soient traités par MYOZYME ou non. Des données issues de ce registre ont déjà été déposées par le laboratoire lors des réévaluations concernant la forme tardive en 2010 et 2013. Dans la dernière réévaluation était présenté des données recueillies jusqu'au 3 octobre 2011 évaluant 430 patients atteints de la forme tardive de la maladie dont 371 traités par MYOZYME avec une durée médiane de traitement de 2, 95 ans (cf. avis du 13/01/2013). Dans ce présent dossier de réévaluation, le laboratoire a déposé les données actualisées au 3 juillet 2015. A cette date, un total de 1 479 patients a été inclus dans ce registre : 1 157 traités par MYOZYME, 246 non traités par MYOZYME, 21 issus des études AGLU1602 et 1702 et 76 pour lesquels le statut de traitement n'était pas disponible. La majorité était atteinte d'une forme tardive de la maladie avec un âge d'apparition des premiers symptômes > 18 ans dans 44% des cas (N 654) et 23% des patient (n 346) avec un âge < 2 ans à l'apparition des premiers symptômes de la maladie. Un total de 157 décès a été rapporté dans ce registre : 36 avant l'âge de 1 an, 47 entre 1 et 5 ans, et 74 après l'âge de 5 ans. Au 3 juillet 2015, le temps médian de traitement chez les 1 157 patients traités par MYOZYME dans ce registre était de 4, 22 ans. Le nombre important de données manquantes, la grande hétérogénéité entre les patients en termes de sévérité de la maladie et l'absence de comparaison ne permet pas d'apprécier l'effet du traitement de MYOZYME sur l'évolution au long cours de la maladie. Les résultats concernant le 6MWT et la CVF parmi les patients évaluables et traités par MYOZYME sont toutefois rapportés à titre exploratoire ci-dessous. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 17/28 Avis Post Audition Tableau 4 : analyses du 6MWT et de la CVF dans le registre international de la maladie de Pompe Variation entre l'inclusion Paramètre évalués et la fin du suivi 6MWT chez tous les patients (N 1157) N évaluables 177 moyenne (ET), m 3, 5 (109, 7) 6MWT chez les patients diagnostiqués entre 0 et 2 ans (N 276) N évaluables 5 moyenne (ET), m -73, 0 (79, 7) 6MWT chez les patients diagnostiqués entre 2 et 12 ans (N 122) 19 N évaluables 44, 4 (117, 6) moyenne (ET), m 6MWT chez les patients diagnostiqués entre 12 et 18 ans (N 84) 15 N évaluables -28, 5 (91, 0) moyenne (ET), m 6MWT chez les patients diagnostiqués après 18 ans (N 560) N évaluables 124 moyenne (ET), m -0, 2 (105, 2) CVF debout n évaluables 297 moyenne(ET) 0, 0 (0, 68) CVF debout, % de la valeur prédite N évaluables 275 Moyenne (ET) -1, 1 (15, 60) CVF couchée n évaluables 118 moyenne (ET) 0, 0 (0, 73) CVF couchée, % de la valeur prédite N évaluables 93 moyenne (ET) 1, 7 (13, 70) 09. 2 Tolérance/Effets indésirables 9. 2. 1 Données issues du RCP Mises en garde et précaution d'emplois Hypersensibilité/réactions anaphylactiques Des réactions anaphylactiques graves avec menace du pronostic vital, dont des chocs anaphylactiques, ont été rapportées chez des patients atteints de la forme infantile ou tardive de la maladie pendant les perfusions de Myozyme (cf Effets indésirables ). En raison de réactions potentielles sévères associées à la perfusion, des mesures médicales d'urgence appropriées, incluant un dispositif de réanimation cardiorespiratoire, doivent être immédiatement disponibles lorsque Myozyme est administré. En cas de réactions anaphylactiques ou d'hypersensibilité sévère, un arrêt immédiat de la perfusion de Myozyme doit être envisagé et un traitement médical adéquat doit être initié. Les normes médicales actuelles pour le traitement d'urgence des réactions anaphylactiques doivent être observées. Réactions associées à la perfusion Environ la moitié des patients traités par Myozyme dans le cadre d'études cliniques portant sur la forme infantile de la maladie, ainsi que 28 % des patients traités par Myozyme dans le cadre d'une étude clinique sur la forme tardive de la maladie ont présenté des réactions associées à la HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 18/28 Avis Post Audition perfusion (RAP), définies comme étant tout événement indésirable associé survenant pendant la perfusion ou au cours des heures qui la suivent. Certaines réactions ont été sévères (cf Effets indésirables ). [] Immunogénicité Dans les études cliniques, la majorité des patients a développé des anticorps IgG anti-alpha alglucosidase généralement dans les 3 premiers mois de traitement. Ainsi une séroconversion est attendue chez la plupart des patients traités par Myozyme. On a observé que les patients atteints de la forme infantile recevant une dose plus élevée (40 mg/kg) ont eu tendance à avoir un titre d'anticorps IgG plus élevé. Il ne semble pas y avoir de corrélation entre la survenue des RAP et le délai d'apparition des anticorps IgG. Les IgG d'un nombre limité de patients testés positifs ont montré un effet inhibiteur de l'activité enzymatique lors d'un test in vitro. En raison de la rareté de la pathologie et de l'expérience limitée à ce jour, l'effet de l'apparition d'anticorps IgG sur la tolérance et l'efficacité n'est actuellement pas entièrement établi. La probabilité d'obtenir une réponse insuffisante au traitement et de développer des titres d'anticorps IgG élevés et soutenus s'avère plus forte chez les patients CRIM-négatifs (Cross Reactive Immunologic Material ; patients chez qui aucune protéine GAA endogène n'a été détectée par l'analyse du western blot) que chez les patients CRIM-positifs (patients chez qui la protéine GAA endogène a été détectée par l'analyse du western blot). Toutefois, certains patients CRIM-positifs peuvent également présenter des titres d'anticorps IgG élevés et soutenus. L'origine d'une réponse clinique insuffisante et du développement de titres d'anticorps IgG élevés et soutenus semble être multifactorielle. Le titre des anticorps IgG doit être régulièrement surveillé. Chez les patients présentant des réactions d'hypersensibilité, la présence éventuelle d'anticorps IgE anti-alpha alglucosidase et d'autres médiateurs de l'anaphylaxie peut également être recherchée. Il apparat que les patients développant des anticorps IgE à l'alpha alglucosidase présentent un risque accru de survenue de RAP en cas de reprise du traitement par Myozyme (cf Effets indésirables ). Par conséquent, ces patients devront faire l'objet d'une surveillance plus étroite durant l'administration de Myozyme. Chez certains patients positifs aux anticorps IgE, la reprise du traitement par Myozyme a été possible à une vitesse de perfusion plus lente et à des doses initiales moins élevées ; ces patients ont continué de recevoir Myozyme sous étroite surveillance médicale. Réactions à médiation immunitaire Des réactions cutanées sévères, probablement à médiation immunitaire, ont été rapportées avec l'alpha alglucosidase, notamment des lésions cutanées ulcéreuses et nécrosantes (cf Effets indésirables ). Un syndrome néphrotique a été observé chez quelques patients atteints de maladie de Pompe traités par alpha alglucosidase et présentant un titre d'anticorps IgG élevé (> 102 400) (cf Effets indésirables ). Chez ces patients, une biopsie rénale a mis en évidence un dépôt de complexes immuns. L'état des patients s'est amélioré après l'arrêt du traitement. Il est donc recommandé d'effectuer un examen des urines régulièrement chez les patients présentant un titre d'anticorps IgG élevé. [] HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 19/28 Avis Post Audition Evènements indésirables les plus fréquemment rapportés Forme infantile de la maladie de Pompe Forme tardive de la maladie de Pompe Tachycardie Bouffées congestives Tachypnée, toux Très fréquent Vomissements / (1/10) Urticaire, éruption Pyrexie Saturation en oxygène diminuée Hypersensibilité Agitation Sensations vertigineuses, paresthésie, Tremblement céphalées Cyanose Bouffées congestives Hypertension, pâleur Sensation gorge serrée Efforts de vomissement, nausées Diarrhée, vomissement, nausées Fréquent Erythème, éruptions maculopapuleuses, Urticaires, éruptions papuleuses, prurit (1/100, éruption maculaire, éruptions papuleuses, hyperhidrose prurit Spasmes musculaires, contractions Irritabilité, frissons fasciculaires, myalgie Fréquence cardiaque augmentée, pression Pyrexie, gène thoracique, œdème artérielle augmentée, température périphérique, gonflement localisé, fatigue, augmentée sensation de chaleur Pression artérielle augmentée 9. 2. 2 Données issues du PGR Risques importants identifiés Réactions liées à la perfusion dont hypersensibilité et réactions anaphylactiques Réactions à médiation immunitaire Réponse immunologique Insuffisance cardiorespiratoire aige associée à une surcharge liquidienne Risques importants potentiels Insuffisance hépatique Informations manquantes Utilisation de MYOZYME chez : - les femmes enceintes ou allaitantes, - les personnes âgées - les patients avec une insuffisance rénale ou hépatique Tolérance à long terme 09. 3 Données d'utilisation issues du registre Français de la maladie de Pompe (non publiées) Au 15 décembre 2015, 172 patients étaient inclus dans ce registre dont 158 atteints d'une forme tardive et 14 atteints d'une forme infantile (inclusion de cette forme autorisée depuis 2014) : - sur les 14 enfants inclus, 10 ont été traités par MYOZYME. Six enfants sont décédés pendant le suivi (4 traités et 2 non traités). - la majorité des patients adultes (n 116/158) ont été traités par MYOZYME. Sur ces 116 adultes traités, 14 ont par la suite arrêté le traitement et 17 sont décédés. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 20/28 Avis Post Audition 09. 4 Résumé & discussion 9. 4. 1 Formes infantiles de la maladie de Pompe L'évaluation de MYOZYME dans la forme infantile de la maladie de Pompe repose principalement sur deux études non comparatives dont les résultats ont été mis en perspective avec ceux de cohortes historiques. La première étude a été réalisée chez 18 patients atteints d'une forme infantile classique de la maladie, non ventilés et âgés de moins de 6 mois. Après 52 semaines de traitement, 15 patients étaient en vie et sans assistance respiratoire. D'après les données de suivi fournies pour cette réévaluation, le taux de survie sans assistance respiratoire a été de 49, 4% à 36 mois d'âge. A titre de comparaison, dans une cohorte historique chez des patients aux caractéristiques comparables, seul 1 patient sur 61 étudiés était en vie à l'âge de 36 mois. La deuxième étude a été réalisée chez 21 patients atteints d'une forme un peu plus tardive que la forme infantile de maladie de Pompe mais ayant démarré dans l'enfance : de 6 mois à 3, 5 ans à l'inclusion (forme atypique). Après 52 semaines de traitement, 16 patients/21 étaient en vie et après 104 semaines de traitement 14 patients /21, alors âgés de 34, 7 à 80, 3, mois étaient en vie. A titre de comparaison, dans une cohorte historique chez des patients aux caractéristiques comparables, seuls 5 patients sur 47 étaient en vie à l'âge de 30 mois. La moitié des patients sans aucune assistance respiratoire à l'inclusion, le sont restés après 104 semaines de traitement. Compte tenu des données disponibles, confirmant l'impact positif de MYOZYME sur la survie globale des patients, il est attendu un impact de cette spécialité sur la mortalité. En revanche, aucune donnée ne documente l'impact de MYOZYME sur l'évolution du handicap à long terme liée à l'atteinte neurologique désormais clairement établie. Aucune donnée ne documente la qualité de vie de ces patients pourtant largement dégradée. En conséquence, MYOZYME apporte une réponse très partielle et à court terme au besoin de santé médical identifié chez les patients atteints d'une forme infantile de la maladie de Pompe. Du fait de l'hospitalisation tous les 15 jours nécessaire à la perfusion et du niveau de soins à domicile très lourd chez ces enfants à l'espérance de vie augmentée mais dans des conditions de dépendance importantes et de handicap majeur, MYOZYME est susceptible d'avoir un impact négatif sur l'organisation des soins. 9. 4. 2 Formes tardives de la maladie de Pompe L'évaluation de MYOZYME dans la forme tardive de la maladie de Pompe repose principalement sur une étude comparative versus placebo réalisée chez 90 patients non ventilés et capables de parcourir au moins 40 mètres. A l'issu de 78 semaines de traitement, MYOZYME a démontré sa supériorité sur les deux critères de jugement principaux : la distance de marche parcourue au test des 6 minutes ( 26, 1 versus -4, 9 m) et la capacité vite forcée en position assise ( 1, 25% de la valeur théorique versus -2, 3%). Toutefois, dans la phase d'extension en ouvert de 26 semaines supplémentaires, la distance parcourue au test de 6 minutes et la capacité vitale forcée ont diminué chez les patients traités par MYOZYME depuis le début de l'étude (-6, 9 m et 4, 2%, respectivement). De nombreuses études observationnelles non comparatives ont permis d'analyser l'effet de MYOZYME sur les fonctions motrices et les fonctions respiratoires. Toutefois, leurs résultats très hétérogènes et portant sur de très faibles effectifs ne permettent pas d'apprécier la quantité d'effet lié à ce médicament. Dans le cadre de cette réévaluation, le laboratoire a déposé les données de suivi à long terme (jusqu'à 10 ans) des patients atteints d'une forme tardive de la maladie inclus dans le registre Français de la maladie de Pompe (cohorte d'un seul Centre à Paris). Ces résultats montrent que la maladie continue de progresser chez les patients traités. En l'absence de données comparatives HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 21/28 Avis Post Audition recevables, il n'est pas possible de déterminer si la vitesse d'évolution de la maladie est modifiée par MYOZYME. Compte tenu des données disponibles, montrant des résultats très hétérogènes selon les caractéristiques des patients sur des critères fonctionnels (6MWT et CVF) et ne permettant pas d'évaluer MYOZYME sur la progression du handicap ni sur la survie globale, il n'est pas attendu d'impact de MYOZYME sur la morbidité-mortalité. Par ailleurs, l'utilisation de MYOZYME n'a pas permis de mettre en évidence un impact, avec un niveau de preuve satisfaisant, sur la qualité de vie avec des patients. Par conséquent, MYOZYME n'apporte pas de réponse au besoin de santé médical identifié. Du fait de l'hospitalisation tous les 15 jours nécessaire à la perfusion et du conditionnement inadapté de cette spécialité à l'administration du traitement chez l'adulte, MYOZYME est susceptible d'avoir un impact négatif sur l'organisation des soins. Tolérance Les réactions d'hypersensibilité et les réactions anaphylactiques liées à la perfusion restent les principales préoccupations de tolérance avec MYOZYME. Ces réactions potentiellement graves et pouvant menacer le pronostic vital nécessitent une surveillance étroite des patients lors de l'administration du produit (cf. chapitre mises en garde et précautions d'emploi du RCP). Les réactions à médiation immunitaire, les réponses immunologiques et les insuffisances cardiorespiratoires aigus associées à une surcharge liquidienne représentent les autres risques importants identifiés dans le PGR. 09. 5 Programme d'études Plusieurs études évaluant l'efficacité et la tolérance de l'alpha-alglucosidase sont en cours : - Etude ALGU03606 : non comparative ayant pour objectif d'évaluer la croissance et le développement des patients atteints d'une forme infantile de la maladie de Pompe et traités par l'alpha-alglucosidase (résultats attendus pour 2026) ; - Etude AGLU07710 : non comparative ayant pour objectif d'évaluer la pharmacocinétique de l'alpha-alglucosidase chez les patients âgés de 8 ans ou plus (résultats attendus pour 2018). 010 PLACE DANS LA STRATEGIE THERAPEUTIQUE3 Le traitement de la maladie de Pompe associe un traitement enzymatique substitutif (TES) par alpha-alglucosidase à une prise en charge symptomatique. Dans les formes infantiles : Dès le diagnostic établi et confirmé biologiquement l'instauration doit être discutée et validée par un médecin d'un centre de référence ou de compétence spécialisé dans la prise en charge de cette maladie. Si l'instauration du traitement est décidée, celle-ci doit être débutée le plus précocement possible. Une immunosuppression préventive peut être envisagée chez les patients CRIM-, son intérêt n'a toutefois pas été clairement établi. Le TES doit être associé à une prise en charge symptomatique qui évolue en fonction du degré d'atteinte motrice et/ou respiratoire : kinésithérapie, ventilation et alimentation assistée, . En cas de retard diagnostique associé à un état neuromusculaire déjà détérioré, l'abstention thérapeutique doit être envisagée, en accord avec la famille. Dans les formes tardives : L'instauration du TES doit être envisagée dès les premiers signes de déficit musculo-squelettiques ou respiratoires chez les patients dont le diagnostic a été confirmé biologiquement. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 22/28 Avis Post Audition Son suivi repose sur une évaluation semestrielle des fonctions motrices (6MWT, MFM) et respiratoire (CVF, Pi max, Pe max). Il peut être poursuivi tant que le bilan clinique annuel montre une amélioration ou une stabilisation des déficiences musculo-squelettique et diaphragmatique. Il est associé à une prise en charge symptomatique qui évolue en fonction du degré d'atteinte motrice ou respiratoire : aides à la marche (cannes, déambulateur) puis fauteuil, ventilation assistée non invasive puis invasive. Il n'a pas été démontré l'intérêt d'un TES par MYOZYME chez les patients asymptomatiques. Sur avis d'experts, les formes juvéniles seraient celles chez qui le bénéfice d'un traitement par TES serait le plus important. Toutefois, peu de données documentent de façon spécifique l'efficacité du TES dans ces formes juvéniles. Dans toutes les situations et en accord avec le PNDS, l'instauration du traitement et sa poursuite doivent être effectuées dans le cadre d'une prise en charge globale, multidisciplinaire et coordonnée par les spécialistes des centres de références ou de compétences. Doivent être en particulier discutées : les indications de traitement et de non traitement et les conditions d'arrêt (souhait du patient ou des patients, mauvaise tolérance, aggravation de l'état de santé, absence d'efficacité) en tenant compte de la qualité de vie des patients. Lorsque nécessaire et conformément au PNDS, ces décisions devront être prises lors de concertations collégiales au sein d'un groupe d'experts (comité d'évaluation du traitement de la maladie de Pompe, CETP). Place de MYOZYME dans la stratégie thérapeutique : MYOZYME, seul traitement enzymatique substitutif du déficit en alpha-glucosidase acide actuellement disponible, est un traitement de 1ère intention des patients symptomatiques dont le diagnostic de maladie de Pompe a été confirmé. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 23/28 Avis Post Audition 011 CONCLUSIONS DE LA COMMISSION Considérant l'ensemble de ces informations et après débat et vote, la Commission estime : 011. 1 Service Médical Rendu 11. 1. 1 Formes infantiles de la maladie de Pompe La maladie de Pompe ou glycogénose de type 2 est une maladie héréditaire du métabolisme affectant principalement les muscles. Les formes infantiles, sont les formes les moins fréquentes mais les plus sévères de la maladie. Leur évolution rapide engage le pronostic vital des enfants à court terme. Il s'agit d'un traitement à visée substitutive. Le rapport efficacité/effets indésirables de MYOZYME est important à court terme mais non établi à moyen et long terme du fait de l'absence de donnée démontrant son impact sur les atteintes neurologiques dues à la maladie. Il n'existe pas d'alternative thérapeutique. Il s'agit d'un traitement de 1ère intention. Intérêt de santé publique : Compte tenu de : - la gravité des formes infantiles de la maladie de Pompe, - sa faible prévalence à la naissance estimée à une naissance sur 138 000, - du besoin médical important pour de nouveaux traitements démontrant une efficacité sur la progression du handicap, la qualité de vie et la survie globale chez l'ensemble des patients, - de la réponse très partielle et à court terme de MYOZYME au besoin de santé médical identifié (absence de donnée sur le handicap lié l'atteinte neurologique et la qualité de vie), - et du potentiel impact négatif de MYOZYME sur l'organisation des soins, MYOZYME n'est pas susceptible d'avoir un impact sur la santé publique dans les formes infantiles de la maladie de Pompe. Compte tenu de l'ensemble de ces éléments, la Commission considère que le service médical rendu par MYOZYME reste important dans les formes infantiles de la maladie de Pompe. 11. 1. 2 Formes tardives de la maladie de Pompe La maladie de Pompe ou glycogénose de type 2 est une maladie héréditaire du métabolisme affectant principalement les muscles. Les symptômes cliniques chez les patients atteints d'une forme tardive de la maladie (forme la plus fréquente) sont très variables et peu prévisibles mais engagent le pronostic vital des patients à long terme. Il s'agit d'un traitement à visée substitutive. Le rapport efficacité/effets indésirables de MYOZYME est important à court terme mais non établi à moyen et long terme du fait de l'absence de donnée montrant son impact sur la morbidité et la mortalité. Il n'existe pas d'alternative thérapeutique. Il s'agit d'un traitement de 1ère intention. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 24/28 Avis Post Audition Intérêt de santé publique : Compte tenu de : - la gravité de la forme tardive de la maladie de Pompe, - sa faible prévalence, - du besoin médical important pour de nouveaux traitements démontrant une efficacité sur la progression du handicap, la qualité de vie et la survie globale chez l'ensemble des patients, - de l'absence de réponse à ce besoin médical identifié (absence d'impact sur la morbi- mortalité) ; - et du potentiel impact négatif de MYOZYME sur l'organisation des soins, MYOZYME n'est pas susceptible d'avoir un impact sur la santé publique dans les formes tardives de la maladie de Pompe. Compte tenu de ces éléments, la Commission considère que le service médical rendu par MYOZYME reste faible dans les formes tardives de la maladie de Pompe. Ce service médical rendu est conditionné à la mise à disposition rapide d'un conditionnement adapté au traitement de l'adulte. 011. 2 Amélioration du Service Médical Rendu 11. 2. 1 Formes infantiles de la maladie de Pompe Prenant en compte : - les nouvelles données disponibles confirmant le bénéfice sur la survie globale des patients à court terme, - l'absence d'impact sur les atteintes neurologiques provoquant à terme un handicap majeur et une mortalité importante, - et l'absence d'alternative thérapeutique dans un contexte o le besoin thérapeutique reste important, La Commission considère que MYOZYME apporte une amélioration du service médical rendu modérée (ASMR III) dans la stratégie thérapeutique des formes infantiles de la maladie de Pompe. 11. 2. 2 Formes tardives de la maladie de Pompe Prenant en compte : - les nouvelles données disponibles confirmant le bénéfice transitoire sur des critères fonctionnels (6MWT, CVF), - l'absence de démonstration, avec un niveau de preuve optimal, d'un impact sur le handicap à long terme et la survie globale des patients, - et l'absence d'alternative thérapeutique dans un contexte o le besoin thérapeutique reste important, la Commission considère que MYOZYME apporte une amélioration du service médical rendu mineure (ASMR IV) dans la stratégie thérapeutique des formes tardives de la maladie de Pompe. Cette ASMR est conditionnée à la mise à disposition rapide d'un conditionnement adapté au traitement de l'adulte. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 25/28 Avis Post Audition 011. 3 Population cible La population estimée est celle des patients atteints d'une maladie de Pompe de forme infantile ou tardive : - la prévalence à la naissance de la forme infantile de la maladie serait d'une naissance sur 138 0001, - la prévalence de toutes les formes cliniques de cette maladie, y compris les formes asymptomatiques ne nécessitant pas de TES, serait en France de 1 pour 40 0003, - au 15 décembre 2015, 172 patients ont été enregistré dans le registre français de la maladie de Pompe depuis le début des inclusions (2004) dont 126 traités par MYOZYME (10 enfants et 158 adultes). Au total, la population cible de MYOZYME est au maximum de 170 patients dont une vingtaine atteints d'une forme infantile. 012 RECOMMANDATIONS DE LA COMMISSION La Commission donne un avis favorable au maintien de l'inscription sur la liste des spécialités agréées à l'usage des collectivités dans l'indication traitement enzymatique substitutif (TES) à long terme chez les patients ayant un diagnostic confirmé de maladie de Pompe (déficit en alpha-glucosidase acide) et aux posologies de l'AMM. Conditionnements Le conditionnement en flacon de 50 mg n'est pas adapté à l'administration de MYOZYME chez l'adulte. La Commission note que malgré sa recommandation dans l'avis de réévaluation du 09/01/2013, pour un conditionnement adapté à cette population, cette situation n'a pas changé. La Commission considère que plus de dix ans après la commercialisation de MYOZYME, l'absence de conditionnement adapté à l'administration de cette spécialité chez l'adulte n'est pas acceptable. Par conséquent, l'avis favorable au maintien de l'inscription sur la liste des spécialités agréées à l'usage des collectivités de MYOZYME dans le traitement des formes tardives de la maladie de Pompe est conditionné à la mise à disposition rapide d'un conditionnement adapté au traitement des adultes. Autre demande Lorsque nécessaire et conformément au PNDS, l'instauration et les décisions d'arrêts de traitement par MYOZYME devront être prises lors de concertations collégiales au sein d'un groupe d'experts (comité d'évaluation du traitement de la maladie de Pompe, CETP). HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 26/28 Avis Post Audition 013 ANNEXE Les ajouts sont identifiés en caractères surlignés et les suppressions en caractères barrés. Seuls les paragraphes concernés figurent dans le tableau. Ancien RCP Nouvel RCP 4. 1 Indications thérapeutiques 4. 1 Indications thérapeutiques Myozyme est indiqué dans le traitement enzymatique substitutif (TES) à long terme chez Myozyme est indiqué dans le traitement enzymatique substitutif (TES) à long terme chez les patients ayant un diagnostic confirmé de maladie de Pompe (déficit en -glucosidase les patients ayant un diagnostic confirmé de maladie de Pompe (déficit en -glucosidase acide). acide). Myozyme est indiqué chez les patients adultes et pédiatriques de tous âges. Myozyme est indiqué chez les patients adultes et pédiatriques de tous âges. Chez les patients atteints de la forme tardive de la maladie de Pompe, l'évidence d'une efficacité est limitée (voir rubrique 5. 1). 4. 4 Mises en garde spéciales et précautions d'emploi 4. 4 Mises en garde spéciales et précautions d'emploi [] [] Immunomodulation Les patients atteints de la maladie de Pompe sont à risque de développer des infections respiratoires suite à l'atteinte progressive des muscles respiratoires par la maladie. Des agents immunosuppresseurs ont été administrés dans des conditions expérimentales chez un petit nombre de patients, dans le but de réduire ou de prévenir le développement des anticorps anti-alpha alglucosidase. Des infections respiratoires fatales menaçant le pronostic vital ont été observées chez certains de ces patients. De ce fait, le traitement de patients atteints de la maladie de Pompe par des agents immunosuppresseurs peut augmenter le risque d'apparition d'infections respiratoires graves et il est recommandé d'être vigilant. 4. 8 Effets indésirables 4. 8 Effets indésirables [] Résumé du profil de tolérance [] Tableau des effets indésirables [] Description de certains effets indésirables [] Il a été observé, chez certains patients traités par l'alpha alglucosidase, des réactions récurrentes sous la forme d'un syndrome pseudo-grippal ou d'une association de symptômes tels que fièvre, frissons, myalgies, arthralgies, douleurs ou fatigue intervenant après la perfusion et qui, généralement, persistent pendant quelques jours. La majorité des patients a été retraitée avec succès par l'alpha alglucosidase à des doses plus faibles et/ou en administrant préalablement des anti-inflammatoires et/ou des corticostéroïdes, et a continué à recevoir son traitement sous une stricte surveillance clinique. [] Déclaration des effets indésirables suspectés La déclaration des effets indésirables suspectés après autorisation du médicament est importante. Elle permet une surveillance continue du rapport bénéfice/risque du médicament. Les professionnels de santé déclarent tout effet indésirable suspecté via le système national de déclaration voir Annexe V. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 27/28 Avis Post Audition 5. PROPRIETES PHARMACOLOGIQUES 5. PROPRIETES PHARMACOLOGIQUES 5. 1 Propriétés pharmacodynamiques 5. 1 Propriétés pharmacodynamiques [] [] Mécanisme d'action L'hypothèse est que Myozyme restaure l'activité de la GAA lysosomale pour stabiliser ou L'hypothèse est que Myozyme restaure l'activité de la GAA lysosomale pour stabiliser ou restaurer les fonctions musculaires cardiaques et squelettiques (y compris les muscles restaurer les fonctions musculaires cardiaques et squelettiques (y compris les muscles respiratoires). En raison de l'effet de la barrière hémato-méningée et de la taille de respiratoires). En raison de l'effet de la barrière hémato-méningée et de la taille de l'enzyme, le passage de l'alpha alglucosidase dans le système nerveux central est peu l'enzyme, le passage de l'alpha alglucosidase dans le système nerveux central est peu probable. probable. [] Efficacité et sécurité clinique [. ] Forme tardive de la maladie de Pompe ; autres essais cliniques et analyses Trois essais cliniques ouverts indépendants comprenant un seul bras traité par Myozyme ont été conduits à l'initiative des investigateurs : - une étude en Italie ayant inclus 74 patients atteints de la forme tardive avec une durée de suivi allant jusqu'à 48 mois ; - une étude en Allemagne ayant inclus 38 patients atteints de la forme tardive avec une durée de suivi de 36 mois ; - une étude au Pays-Bas ayant inclus 69 patients atteints de la forme tardive avec une durée médiane de suivi de 23 mois. Ces trois études utilisant Myozyme (avec un suivi d'au moins 3 ans dans deux études et une durée médiane de 23 mois dans l'autre étude) ont suggéré une stabilisation ou une amélioration de la fonction motrice et une stabilisation de la fonction pulmonaire. Dans l'étude menée au Pays-Bas précédemment décrite, portant sur 69 patients atteints de la forme tardive, Myozyme a montré une amélioration de la force musculaire. Cependant, la fonction musculaire s'améliorait uniquement chez les patients ne nécessitant pas de fauteuil roulant et les patients présentant une faiblesse musculaire moins prononcée. Dans deux autres essais cliniques ouverts menés avec Myozyme avec une durée de suivi de 24 mois, dix patients sévères atteints de la forme tardive de la maladie de Pompe (altération motrice modérée à sévère et ventilation assistée) ont montré une réponse variable lors de l'évaluation des fonctions motrice et respiratoire, principalement sous forme d'une amélioration modeste (AGLU03105, AGLU04107). 5. 2 Propriétés pharmacocinétiques 5. 2 Propriétés pharmacocinétiques [] [] Distribution et élimination [] Linéarité/non-linéarité [] 6. 3 Durée de conservation 6. 3 Durée de conservation 2 ans 3 ans 10. DATE DE MISE A JOUR DU TEXTE 10. DATE DE MISE A JOUR DU TEXTE 11-2011 18/12/2013 HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 28/28 Avis Post Audition | HAS | Scientific |
Administrée 2 minutes avant le repas, l' insuline glulisine assure un meilleur contrôle postprandial que l' insuline rapide humaine administrée 2 minutes avant le repas. | EMEA_V3 | Medicinal |
Flacon de solvant Capsule en plastique Bouchon en caoutchouc | EMEA_V3 | Medicinal |
Etude du comportement sexuel chez les epileptiques psychomoteurs | WMT16 | Scientific |
INTRODUCTION Led éveloppementaudébut desannées90, d'une nouvelle génération d'échoendoscopesmunisd'une sonde d'échographie électroniquee tlinéaireaa mé-liorél esperformancesde cettetechnique Tout d'abord, l'utilisation d'une sonde linéaired ontl'axe est situép arallèlementàl'axed ucanalo pérateur a permislaréalisation de biopsieséchoguidéesde massess olidesoukystiquespéri-digestivesetplus récemment, ouvert lavoie de l'échoendoscopie théra-peutique, a veclaréalisation de kysto-entérostomie, de neurolysecoeliaqueo ude drainage biliopancréatiqueguidéssous échoendoscopie Parailleurs, l'utilisation d'une sonde électroniquea permisinitialementd'améliorerlaqualitédel'image échographiquee tensuited 'adaptercertainsoutils initialementdéveloppéspour l'échographie transcutanée àl'échoendoscopie, telsquel 'échographie tridimensionnelle, lesagents de contrasteultrasonoresetl'élastosonographie ÉCHOENDOSCOPIE TRIDIMENSIONNELLE Basestechniques Lesdernièresgénérationsd'appareilsd'écho-graphie permettentdésormaislaréalisation de reconstruction en 3dimensions, a vecdest emps d'acquisition beaucoupp lus rapidesqu'initialement (30 secondespour une échographie endorectale parexemple) Lesimagesen 2dimensionss ont reconstruitesen 6plansdifférents parle logiciel dédié permettantalors de reconstruireunvolume en 3dimensions. Ilest alors possible de réalisertout plan de coupe transversalo ulongitudinal Lesdernières versionsde celogiciel permettentune correction en tempsréel desartéfacts liésaufaitquelavitessede retraitde l'endoscope est non linéairedes images3Ddépendentdumode de renduutilisé Trois modesde basepeuventêtreutilisés : a)Visualisation multiplanaire -Vuesorthogonales : 3plansperpendiculaires sontaffichéssur unmême planetl'axedecoupe peut êtred éplacésur l'ensemble des3plansde manière simultanée -Polyèdre : L 'algorithme dulogiciel permetde reconstruireunvolume parlajuxtaposition des images2 D. Apartirde celui-ci, toutecoupe longitudinale, transversale ouobliqueest alors réalisable b)Visualisation en rendude volume Pour cela, on simule lesr ayonspartantde l'oeil de l'observateur ett raversantle volume Onaffiche ensuiteàl'écranune valeur correspondantàune combinaison donnée despropriétésdesv oxelsr encontrésparchaquerayon Lechoixde lacombinaison dépend alors descaractéristiquesde lastructureque l'on veut visualiser Impactcliniquedel'échoendoscopie tridimensionnelle L'acquisition tridimensionnelle offrep lusieurs avantagesthéoriques : -Enregistrementde laprocédurep ermettantde revoirl'ensemble de l'examen sansperted 'information, en l'absenced upatient, éventuellementde manièrep luridisciplinaire( chirurgien, expert, ); -m eilleureprécision dansl'analysedel'multiplanaire ; -amélioration de lavisualisation de certaines structuresen utilisantle mode de rendude volume Echoendoscopie rectale tridimensionnelle (EER 3D) L'échoendoscopie en 3Daétéé valuée essentiellementpour le staging descancers durectum Tout d'abord, il semble quel 'EER 3Dpermette d'améliorerlaperformanced el 'EER pour définir l'infiltration pariétale de latumeur (usT) . Dans l'étude rapportée parnotreg roupe sur 35p atients, EER 2Ddéfinissaitcorrectementl'usTdans7 1, 4% descas versus 88, 6%d escaspour l'EER 3D. Ce pointaétéconfirmé pard'autres . Demanièreplus surprenante, nous retrouvionsdanslamême étude une supérioritéd el a3Dpour le staging ganglionnaire Eneffet, siaucune différencen'existaitpour les tumeurs superficielles(T1e tT2), 40%d espatients classésinitialementu sT3N0en analyse2Détait reclassésu sT3N p arl'examen en 3Da vecune confirmation histologiqued ans83% Dep lus, les patients usT3N0en EER 3Ddéveloppaients ignificativementmoinsde métastasesquel espatients usT3N0aprèsEER 2D(11 % vs 40%, p 0, 002) (TableauI) Figure1 Echoanatomie rectale normale en reconstruction 3DEER 3D (1 : mesorectum, 2 : sphincterinterne, 3 : releveur de l'anus) 3Dreconstruction of normalrectum (1 : mesorectum, 2 : internalsphincter, 3 : elevatorani) Figure2 Mode de rendude volume durectum Volume-based rendering aspectof the rectum Résultats de 462 23 lachirurgie Secondairement, plusieurs étudesmontrentque l'analysee nrendude volume augmentel aperformancedel'EER pour l'analysedumésorectumetde seslimites Cepointaunimpactpronostique important, lest umeurs envahissantplus des2 /3 de l'épaisseurcomparable aux stadesmétastatiques(50% vs 26 % despatientsp& ; lt ; 0, 001) T ABLEAU I DIAGNOSTIC CORRECT PAR 3D-ERUS Autresapplications Quelquesétudessuggèrentquel'analysetridimensionnelle permetd'améliorerle biland'extension vasculaireauniveaude l'axespléno-mésentérico-portal descancers pancréatiques. Dem ême, l'appréciation de l'extension veineusesemble plus précise Toutefois, peud'lalittérature Pour conclure, l'échoendoscopie tridimensionnelleamé-liorerle staging descancers dur ectum D'autres étudess ontnécessairespour spécifierl'exactep lace de cettetechniquep our le bilanl ocorégionald es cancers durectum CARACTÉRISATION TISSULAIRE NON INVASIVE L'introduction de l'échoendoscopie areprésenté une avancée majeured ansle diagnosticetle staging descancers gastro-intestinaux. Alapossibilitéd e visualiseravecune hauterésolution spatiale l'infiltration pariétale destumeurs digestivespermettantainsi unm eilleur staging tumoral, l'échoendoscopie offre égalementlapossibilitéd eréaliserdesbiopsiess ous échoendoscopie de massesoud'adénopathiespéri digestives, a pportantdesdonnéesimportantesen terme de diagnosticetde pronostic, rendantcet examen incontournable pour définirlameilleure stratégie thérapeutiquedansungrand nombredecas Toutefois, il existeenviron 10à15 %defaux néga-tifsde cettetechniqueetnotamment, le diagnosticde massesdéveloppéess ur pancréatitechroniquee st le plus souventdécevant. Dem ême, il existeunf aible risqued ep ancréatiteaiguaprèsbiopsie etcela rend prudentpour laréalisation de prélèvements sur desimagespancréatiquesde découvertef ortuite, de petitest ailles, notammentchezle sujetjeune Par ailleurs, laponction écho guidée d'adénopathiesdoit êtreréalisée pour en confirmerle statut tumoralsile projett hérapeutiqued oiten êtrem odifié, l'écho-structureseule duganglion étantinsuffisante Maisle nombred 'adénopathiesv isualiséeslors d'une écho-endoscopie peut êtreé levén otammentauniveau médiastinaleten périrectal Pour cesr aisons, il seraitintéressantde disposer d'outilsnon invasifsde caractérisation tissulaire, afin de définirlameilleurecible àb iopsieravecle meilleur rendementdiagnostique, d'apporterdes informationscomplémentairesen casde biopsie non contributive Deux stratégiess onten cours de développement danscebut : lesproduits de contrasteultrasonoreset lasono-élastographie Echoendoscopie etproduits de contraste ultrasonores(CE-EUS) Lesagents de contrasteultrasonores, initialement développéspour l'échographie cardiovasculaire, augmententlasensibilitédel'étude Doppler, notamment pour l'analysed el amicrovascularisation tissulaire Plusieurs étudesontmontrél 'intérêtde cettetechniquee né chographie transpariétale pour lac aracté-risation desmasseshépatiquesetpancréatiques Concernantlest umeurs pancréatiques, le principal avantage de cettep rocéduree st de permettreune meilleured ifférenciation entreadénocarcinome et autreslésionsfocales. Ene ffet, latrèsgrande majoritéd esadénocarcinomespancréatiquesne serontpasr ehaussésparl'injection de produits de contrasteàl'inversed esautrest umeurs pancréa-tiques(tumeur endocrine, métastase, ) etdes lésionsbénignes(pancréatitechronique, pancréatite auto-immune, ) quisontgénéralementr ehaussées aprèsinjection de produitde contraste Toutefois, laprincipale limitation de cettetechnique étaits on utilisation en combinaison avecl'échogra-phie abdominale transpariétale dontlasensibilité pour ladétection etl'analysedestumeurs inférieures à3cme st limitée, suggérantu ni ntérêtprobable àc ombinercettetechniqueàl'échoendoscopie (CE-EUS Aproposde l'intérêtde l'échoendoscopie de contrasted anslaprisee ncharge dest umeurs endocrines, on ne disposeactuellementqued 'uncascliniquerapportantl'utilisation duLevovist comme méthode diagnostiquep our localiseravecprécision uninsulinome de petitetaille . Dansnotreétude, lest umeurs endocrinesontu naspectde rehaussementimportants uggérantu ne hyperv ascularisation tumorale dans87, 5%descas. Cesrésultats sontsimilairesàc eux retrouvésen CE-US . Ile st bien établi quel 'échoendoscopie standard aune grande importanced ansle diagnosticetlalocalisation destumeurs pancréatiquesendocrinesdufaitde sagrande capacitéàvisualiserde petiteslésionsetà analyserlavascularisation tumorale dansle même temps . Ile st hautementprobable quel 'écho-endoscopie de contrasteaitu ne meilleuresensibilité pour le diagnosticetlalocalisation destumeurs endocrinespancréatiques Leslésionsmétastatiquesdupancréass ontr ares : entre5à10% . Iln 'yaqu'uncasde métastase pancréatiqued 'uncancerdur ein, a nalysée en écho-graphie de contraste . Dansnotretravail, toutes lesmétastasespancréatiquesàl'exception d'une [4/5 ; 80%]étaientr ehausséesaprèsinjection de produit de contrasteencorrélation avecleur hypervascularisation La seule métastaseh ypo vascularisée était d'origine colorectale CE-EUS pourraitdonnerdes arguments pour différencieru ncancerpancréatique primitif etune lésion métastatiqueetdoncavoirune influenced écisivesur lasélection de lastratégie thérapeutiqueadaptée La confirmationegold standard CE-EUS aétéé valuée pour ladifférenciation des adénopathies, permettantde distinguerganglions malinsd'inflammatoiresavecune VPP etu ne VPN respectivementégalesà88, 5%et96, 6% Sono-élastographie Théorie etaspects techniquesde lasono-élastographie La sono-élastographie est basée sur lac onnaissanceq uecertainesmaladies, dontlest umeurs, entranentu ne modification de ladensitée tdoncde l'élasticitédestissus (module d'élasticité) Cephéno-mène est déjàutilisél ors de l'exploration écho-graphiqued us ein . Lesz oness ouplesdus ein vibrentplus en réponseàlamobilisation mécanique dus ein, a lors quel escancers etlesz onesdenses dus ein vibrentmoinsetdonca pparaissentcomme plus sombresalors qu'ellesétaientiso-échogènesen mode B. La sono-élastographie statiquep ermet d'examinerde lamême manièrel espropriétésélas-tiquesd'untissu parapplication d'une compression dutissu eten comparantune image obtenueavantet aprèscompression Lesdonnéesobtenuesavecet sanscompression sontalors comparéesu tilisantu ne corrélation croisée pour déterminerl'importanced u déplacementde chaquep etitep ortion de tissu àla réponseàlacompression appliquée parlestransducteurs . Lem odule d'élasticitép eut êtrealors calculé àpartirde lacompression etde latension des structuresexaminéesetest rendulisible p aru n encodage couleur en tempsréel La sono-élastographie est une nouvelle application dansle champ Thishasani mportantimpacton the therapeutica ssumption of responsibility, rectal tumours invading morethan2/3 of the thickness of the mesorectumh avebadp rognosis, a smetastaticstage (50% vs 26%developed distantmetastasis, p& ; lt ; 0. 001) Sono-élastographie etéchoendoscopie Otherapplications Itwould alsoseem thatpancreaticthree-dimensional EUS makesitpossible tobetterappreciatethe tumoral infiltration on the level of the porto-spleno-mesenteric confluenceo fp ancreaticc ancers. The assessmentof venous extension would seem morep recisei nthreedimensionalp ancreaticecho-endoscopy. However, fewdataareavailable in the literature Toconclude, itw ould seem thatt hree-dimensional EUS bringsmorei nformation thanthe conventional echo-endoscopyatt he level of cancers of the rectum Otherstudiesarenecessary tospecifythe exactplaceof the three-dimensionalp ancreaticecho-endoscopyin the staging of pancreaticcancer . Forfurtherconsideration isthe fact thatpancreaticmasseshaveawideand malignantaetiologiesand FNA of the pancreasisassociated withasmall, but not insignificant, riskofpancreatitis . Hence, the ability tom oreaccuratelyevaluatem assesand lymphn odes priort otheirpuncturei nane ffort toaid in targeting lesionsforFNA and possiblyr educecomplications would bewelcomed byecho-endoscopists. Atleast two strategieshavebeen developed withtheseg oalsin mind, c ontrast enhanced endosonographyand sonoelastography NON-INVASIVE TISSUE CHARACTERIZATION Contrast enhanced endoscopicultrasound (CE-EUS) Ultrasound contrast agents allowbetterv ascular examination asu sed forcardiovascularu ltrasound and improvevisualisation of microvasculature byDopplerexamination Manys tudiesevaluating contrast enhanced abdominalultrasound (CE-US) showed the interest of thistechniqueforcharacterization of liverand pancreatictumour. Concerning pancreatictumour the principaladvantage of thisprocedurei st oallowab etterdifferentiation between adenocarcinomaa nd otherfocall esions. Indeed, vascularization of the majority of pancreaticadenocarcinomawill notbee nhanced byinjection of contrast whereasv ascularization of otherpancreaticc ancers (endocrine tumour, metastases) orbenign lesions (chronicpancreatitis, a uto-immune pancreatitis)will bee nhanced generallyduring CE-US However, the principallimitation of CE-US isthe lack of sensitivity fordetection of tumour inferiort o3cm, suggesting the interest tocombine thist echniquewith endoscopicultrasound (CE-EUS) Moreover, itis possible actuallyt oi njectcontrast agentduring endosonography, using Dopplerand harmonicmode Some studiesareactuallyavailable evaluating results and indicationsof CE-EUS. Firstly, B uthani etal evaluated the utility of SHU508A(Levovist ) and concluded itcould potentiallyimprovethe accuracyof EUS in diagnosismalignantvascularinvasion, in detection of occultpancreaticneoplasia. Subsequently, H irooka etal studied in 37 patients presenceo rabsenceo fe nhancementof differentlesions withAlbunex . Ane nhancementof the lesion was observed in 100%ofpatients withisletcell tumour, in 80%withi ntraductalp apillary mucinous carcinomas (IPMT), in 75% withchronicpancreatitisand no enhancementeffectwasobserved in adenocarcinoma All patients underwentangiography, a nd comparison between imagesof contrast-enhanced EUS and angiographicimagess howed similarr esults, exceptfor 3patients (2IPMT and 1chronicpancreatitis)i n whom angiogramsw ereh ypovascular, b ut enhancementeffectw asobserved on EUS images. Finally, Becker etal showed theirexperiencein23 patients withanothercontrast agent(FS 069Optison )and evaluatecontrast-enhanced EUS asamethod of differentiating inflammation and carcinomabased on perfusion characteristics. Markedlyhyperperfused lesions wereconsidered asinflammatory pseudotumorw hereashypoperfused lesionscompared tosurrounding tissuewereconsidered ascarcinoma. Positivep redictivevalue(PPV)and negativepredictivevalue(NPV) fordiagnosisof pancreaticc arcinoma versus inflammatory changesw ererespectively100%and 88% Theseresults werevery similartoours, using asecond generation contrast agent(sulfur hexafluorur, S onovue ) : sensitivity 90. 9%, specificity 88. 8%, P PV 88. 2%and NPV 91. 4% (personaldata) Regarding (IPMT), in CE-US studies, malignancy could beassociated withcontrast enhancement. Inour study, the onlyone benign IPMT wasenhanced whereasmalignantIPMPT washypervascularin all cases exceptone ForSofuni etal , a ll patients with IPMT showed hypervascularity of the nodulesinside the cyst. ForNagase etal , 2of the 5IPMT had solid components within the tumours and theyw ere positivef orenhancements effects. All 5p atients with IPMT underwents urgicalresection and pathologic examination revealed malignancyin the 2lesionswith solid components and positiveenhancement. ForItoh etal when the patients withcarcinomawerecompared withthosewithadenomathe post-enhancement intensity wass ignificantlyhigherin the carcinoma group CE-US could beusefulforthe differentialdiagnosisof benign and malignantIPMT. The small numberof patients withIMPT in eachstudyisinsufficienttoconclude definitively Concerning CE-EUS and endocrine tumours, there isonlyone casereport, using Levovist who seemed to beausefuld iagnosticmethod top recisel ocalisation of small insulinoma . Ino ur study, endocrine tumours hadastrong contrast-enhancementpattern indicating hypervascularlesionsin 87. 5% These results weresimilartoCE-US . Inaddition standard EUS isalreadyknowntoh aveagreat valuef orlocalizing endocrine pancreatictumours becauseo fi ts excellentcapacity tovisualizesmall lesionsand tumour vascularisation att he same time . Therefore, theyisani mportantprobability thatCE-EUS could increasesensitivity of diagnosisof pancreatictumours Metastaticlesionsof the pancreasarerarebetween 5to10% . Thereisonlyone description of one case of kidneymetastasisanalysed in contrast CE-US Inour work, all metastasisexceptone [4/5 ; 80%]showed ane cho enhancementpatternp robablyproving theirhypervascularization The onlynon-enhanced pancreaticmetastasisw asfrom colonicc ancer. CE-EUS could provide ac ontribution tothe differential diagnosisbetween aprimary pancreaticc arcinoma and apancreaticmetastasisand thereforecanh avea decisivei nfluenceo nthe selection of appropriatetherapeuticstrategies(chemotherapyr athert hansurgery forexample) However, histologyr emainst he standardi nthe differentiald iagnosisof pancreatic tumours CE-EUS wasequallyevaluated fordifferentiation of lymph nodes, a llowing tod ifferentiatem alignant from benign lymph nodeswithaPPV and aNPV respectivelyequalto88. 5% and 96. 6% Sonoelastography Theory and technicalaspects of sonoelastography Sonoelastographyisbased on the knowledge that some diseases, suchascancer, leadtoachange of tissuehardness ( i. e the so-called elasticity modulus)and isano utgrowtho fthe well-knownbreast ultrasound fremitus technique during whichthe patientis asked tohumwhile colour orpowerDopplerisused to examine the breast. Softerportionsof the breast vibratem orei nresponsetothe humming, while cancers and otherfirmm assesv ibratel ess and thus are seen asareasof decreased colour, even if theyareisoechoicon the ordinary Bscan Staticsonoelastography examinesthe elasticpropertiesof tissuesbyapplying a slightcompression tothe tissueand comparing an image obtained beforeand aftert hiscompression Dataobtained withand without compressionsarethen compared, using ac ross-correlation techniqueto determine the amountof displacementeachsmall portion of tissueundergoesin responsetothe compression applied byt he ultrasound transducer . The elasticity modulus canbecalculated from the strain and the stress of the examined structuresand realtime encoded in colour. While the strain field canbeestimated from the radio frequencys ignalsr eturned from tissuestructuresbeforeand aftercompression, itis impossible tom easurethe stress field directlyw ithin the tissue Anotherproblem isthatthe compression of hardert issuestructuresisoften followed byalateral displacementof thesestructures. Itisnearlyimpossible torepresentthe volume of thissideslip withconventional2Dmethodsbut its calculation isindispensable for anaccuratedetermination of the tissueelasticity of the examined structures. Toovercome theseproblems, the Extended Combined Autocorrelation Method has been developed, whichallows the reconstruction of the tissueelasticity of the examined structureson the basis of the three-dimensionalf initee lementmodel The newt echniquee nableshighlyaccuratee stimation of the tissueelasticity distribution and adequatecompensation of sideslips. The elasticity imaging canbe performed in real-time withthe SonoElastography module thatcanbeintegrated intothe platformofthe Hitachi EUB-8500 system (Hitachi MedicalSystems Europe, Zug, Switzerland) EUS Sonoelastography a)Preliminary results Weh avep ublished our preliminary experienceo n 49 patients | ISTEX | Scientific |
Fillette de. chez qui le diagnostic anté-natal de dilatation pyélo-urétérale gauche a été porté.
L'urographie en période néo-natale a montré un retard de secrétion à gauche (Figure 4a) avec sur les clichés tardifs une importante dilatation de toute la voie supérieure gauche. L'ombre urétérale était peu précise compte tenu de la dilatation et de la qualité de la secrétion.
La scintigraphie rénale au DMSA a confirmé l'altération fonctionnelle, avec une fonction rénale relative à 33% pour le rein gauche, et a confirmé l'aspect rétentionnel.
La cystographie a permis de visualiser un reflux vésico-rénal droit de grade I, l'absence de reflux à gauche.
Le diagnostic porté à ce stade était celui de méga-uretère non refluant gauche et de reflux droit.
L'existence d'épisodes infectieux mal contrôlés a conduit à poser assez rapidement l'indication opératoire.
La cystoscopie réalisée en pré-opératoire immédiat a permis de visualiser un méat droit discrètement dysplasique, mais n'a pas permis de mettre en évidence de méat du côté gauche.
C'est l'exploration para-vésicale gauche qui a permis de trouver en fait deux uretères dilatés s'abouchant au dessous du col.
Une résection des deux uretères pelviens gauches a été réalisée, associée à une anastomose inter-urétérale et à une réimplantation supra-méatale de l'uretère correspondant au pyélon inférieur.
Les suites initiales ont été simples, mais la réapparition ultérieure d'épisodes infectieux a conduit à réaliser une échographie rénale et une cystographie rétrograde.
C'est la cystographie qui a conduit cette fois au diagnostic final de triplicité urétérale gauche par la mise en évidence d'un reflux résiduel massif dans l'uretère gauche (Figure 4b).
La réimplantation urétérale gauche a été reprise et l'évolution a été favorable avec une urographie à 2 ans montrant une secrétion satisfaisante des trois pyélons.
| CAS | Clinical |
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