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Ganglioside GM2 N-acetil-beta-D-galattosaminidasi e asialo GM2 (GA2) N-acetil-beta-D-galattosaminidasi; studi su fibroblasti della pelle umana.Ganglioside GM2 e il suo asialo-derivato, GA2 sono stati radiomarcati nelle loro parti N-acetil-D-galattosaminile mediante ossidazione con galattosio ossidasi e riduzione con sodio boroidruro triziato. Attività specifiche di 6 X 10(4) dpm/nmol ( GM2) e 1,8 X 10(6) dpm/nmol (GA2). Circa il 98% dell'etichetta era in N-acetil-D-galattosamina. Utilizzando questi substrati, è stato sviluppato un test per GM2-N-acetil-beta -D-galattosaminidasi (EC3.2.1.30) e GA2-N-acetil-beta-D-galattosaminidasi (EC3.2.1.30) attività in colture di fibroblasti cutanei umani I prodotti della reazione di scissione GM2 sono stati identificati come N-acetilgalattosamina e gangliosidi GM3 Entrambe le attività di scissione GM2 e GA2 sono state stimolate circa 5 volte dal taurocolato di sodio purificato e questa stimolazione è stata inibita da detergenti neutri, lipidi e nd albumina a basse concentrazioni. Aggiunta di vari sali, agenti riducenti e un fattore attivatore proteico dal fegato umano di Li et al. (1973) non hanno stimolato l'attività della GM2-N-acetil-beta-D-galattosaminidasi oltre a quella riscontrata con il sodio taurocolato. In condizioni ottimali, i fibroblasti di controllo supernati hanno scisso il ganglioside GM2 a una velocità di 3,7 nmol/mg di proteine/h rispetto a 1100 per GA2-N-acetil-beta-D-galattosaminidasi e 4700 per 4-metilumbelliferil-N-acetil-beta-D -glucosaminidasi. I supernati di due pazienti con malattia di Tay-Sachs avevano livelli di attività marcatamente ridotti per GM2-N-acetil-beta-D-galattosaminidasi ma non per gli altri due substrati. I supernati di due pazienti con malattia di Sandhoff avevano attività ridotta per tutti e tre i substrati. Un supernato di un paziente con gangliosidosi GM2 giovanile ha scisso GM2 a una velocità leggermente superiore rispetto a quelli dei pazienti di Tay-Sachs o Sandhoff. Due donne adulte sane con attività di esosaminidasi A marcatamente ridotta utilizzando 4MU-N-acetil-beta-D-glucosaminide come substrato avevano attività circa la metà del normale utilizzando GM2 come substrato. Un paziente con il fenotipo Tay-Sachs ma con una carenza parziale di esosaminidasi A utilizzando il substrato 4-MU ha avuto una profonda carenza utilizzando GM2 come substrato. In tali mutanti esosaminidasi insoliti, i test che utilizzano GM2 come substrato sono indicatori migliori del fenotipo rispetto a quelli che utilizzano substrati sintetici.
Acido D-glucarico e gamma-glutamiltransferasi come indici di induzione degli enzimi epatici in gravidanza.L'aumento dell'attività degli enzimi microsomiali epatici può essere valutato misurando D -escrezione di acido glucarico nelle urine e attività della gamma-glutamiltransferasi (EC 2.3.2.2) nel siero. A parte diversi composti estranei, è stato dimostrato che gli ormoni steroidei endogeni sono normali substrati del sistema enzimatico microsomiale. Poiché vi è un aumento della produzione di steroidi in gravidanza, abbiamo cercato di determinare se questi indici di induzione aumentano durante la gravidanza. In 90 donne in vari stadi della gravidanza, tutte con normale funzione renale, abbiamo misurato l'escrezione di acido glucarico nelle urine e l'attività della transferasi nel siero e nelle urine. l'acido è aumentato notevolmente durante la gravidanza, da 14,4 +/- 2,1 nel primo trimestre a 23,5 +/- 2,8 mumol di D-glucaro-1,4-lattone per grammo di creatinina nel terzo trimestre. Non abbiamo riscontrato alcuna correlazione tra gluca l'escrezione di acido rico e l'attività della transferasi nel siero o nelle urine. L'attività della gamma-glutamil-transferasi rimane entro i limiti normali durante la gravidanza, il che lascia dubbi sul valore di questa misurazione nella valutazione dell'induzione enzimatica dovuta agli steroidi endogeni.
Micrometodo lipossigenico per la determinazione specifica dell'attività lipasica nel siero e nel liquido duodenale.Proponiamo un micrometodo enzimatico rapido per la determinazione specifica della lipasi (EC 3.1 .1.3) attività nel siero e nel liquido duodenale L'acido linoleico libero prodotto durante l'incubazione di 10 min di 10 mul di campione con 1 ml di substrato (emulsione di trillinoleina) a 30 gradi C viene convertito dalla lipossigenasi (EC 1.99.2.1), in un reazione accoppiata, al suo idroperossido, che viene misurato fotometricamente dopo aver solubilizzato la miscela di reazione in etanolo. L'attività della lipasi è calcolata dalla velocità di formazione dell'idroperossido, con acido linoleico come standard primario. La velocità della reazione è massima a pH 8,8, 35- 37 gradi C e una concentrazione di desossicolato di 3,6 mmol/litro. L'energia di attivazione è di 6,7 kcal/mol. I diversi valori di Km "apparente" ottenuti per la lipasi nel siero non diluito (4 X 10(-5) mol/litro ) e in diluenti a base di albumina (1 X 10(-5) mol /litro) indicano la presenza di un inibitore competitivo nella matrice sierica. Non abbiamo rilevato attività lipasica nelle urine. I risultati del metodo proposto si correlano bene con quelli di un metodo di estrazione del sapone di rame (r = 0,95), ma i valori sono significativamente più alti per i pazienti con pancreatite\' sieri (pendenza 1,6). La gamma dinamica lineare si estende a 1000 U/litro. Emolisi, lipemia e iperbilirubinemia non interferiscono. L'intervallo normale è 40-60 U/litro. L'attività lipasica dei pazienti con pancreatite generalmente supera 1000 U/litro durante la fase acuta e 250 U/litro fino a 10 giorni dopo.
Uso di sangue equilibrato per il controllo interno della qualità dei gas ematici.Utilizziamo sangue umano equilibrato per il controllo della qualità dei gas ematici dal 1970. Nel sangue equilibrato 24 ore dopo lo spargimento, le tensioni del gas sono stabili per 4-6 ore a 0-4 gradi C. Ogni campione di controllo viene analizzato più volte durante quel periodo per risolvere malfunzionamenti, ecc. Rilevati tre quarti di tutti gli errori nella misurazione della tensione del gas con sangue equilibrato sono stati rilevati con i controlli a più alta tensione. I controlli ematici equilibrati segnalano circa un errore ogni 14 giorni su ciascuno strumento. Per un controllo di qualità più completo, integriamo l'analisi del sangue equilibrato con altri tipi di controlli, confrontando i risultati ottenuti analizzando ciascuno campione del paziente su due strumenti è la nostra aggiunta più efficace. Tali confronti hanno identificato dosaggi errati nel 3,9% dei campioni testati. L'entità delle discrepanze tra gli strumenti (errori casuali) variava da 9 a 100% delle determinazioni appropriate. Utilizziamo i dati di controllo derivati dall'analisi del sangue equilibrata per scopi gestionali speciali (valutazione degli strumenti, quantificazione delle discrepanze tra micro e macrocampionamenti e riduzione dei costi di riparazione degli strumenti).
Aggregazione piastrinica nel microcircolo cerebrale: effetto dell'aspirina e di altri agenti.Dopo un certo periodo di tempo la luce ultravioletta filtrata produce aggregazione piastrinica nei microvasi su la superficie cerebrale del topo, ma solo quando la fluoresceina sodica viene iniettata per la prima volta per via intravascolare per fornire un bersaglio che assorbe la luce e che genera calore. Gli aggregati piastrinici emettono fluorescenza. Si verificano solo nel campo illuminato e aderiscono alle pareti arteriolare e venulare. La vasocostrizione è non rilevato prima o fino a 30 secondi dopo l'aggregazione La microscopia elettronica rivela endotelio danneggiato e globuli rossi non danneggiati, nonché aggregati costituiti quasi esclusivamente da piastrine in vari stadi di aggregazione, formazione di pseudopodi e degranulazione. lo stimolo e il riconoscimento del primo aggregato possono essere misurati osservando i vasi al microscopio. Questo "tempo di aggregazione" viene prolungato dalla penna tobarbital rispetto all'anestesia con uretano, ed è anche correlato al tempo trascorso dopo la craniotomia. Abbiamo anche scoperto che l'aspirina e l'indometacina prolungano significativamente il tempo di prima aggregazione, ma solo sul lato arteriolare della circolazione. Ciò anche se la composizione degli aggregati è la stessa sia sul lato arteriolare che su quello venulare. L'eparina non ha alcun effetto.
Effetti dell'ipossia alveolare sul trasporto di fluidi polmonari e proteine in pecore non anestetizzate.Per determinare se l'ipossia influisce direttamente sulla filtrazione microvascolare polmonare del fluido o sulla permeabilità al plasma proteine, abbiamo misurato allo stato stazionario flusso linfatico polmonare e trasporto delle proteine in otto pecore anestetizzato respirazione 10% O2 in N2 per 4 ore. abbiamo studiato anche tre pecore respirando la stessa miscela gassosa per 48 ore. si chirurgicamente preparato pecore per isolare e polmone raccogliere linfa e per misurare arteriosa polmonare media (PPA) e pressioni atriale sinistra (PLA). Abbiamo messo un catetere a palloncino in atrio sinistro per elevare Pla. Dopo il recupero, la pecora respirato aria attraverso una tracheostomia per 2-4 ore, seguito da 4 o 48 ore di ipossia. In 13 studi di 4 ore, la PO2 arteriosa media è scesa da 97 a 38 torr; la Ppa è aumentata da 20 a 33 cm H2O; e il flusso linfatico polmonare e il flusso proteico linfatico sono rimasti invariati. Abbiamo anche scoperto che durante 48 -ora ipossia, con un sustai elevazione ned in Ppa e un calo in Pla, flusso linfatico e il flusso di proteine non è aumentato. In quattro pecore, abbiamo anche sollevato Pla per 4 ore, seguita da 4 ore di ipossia con elevata Pla. Anche in questo caso, nonostante lo stress aggiuntivo di Pla elevato, abbiamo scoperto che il flusso linfatico e il flusso proteico linfatico sono rimasti costanti durante l'ipossia. Concludiamo che una grave ipossia alveolare, per 4 o 48 ore, da solo o con un aumento della pressione microvascolare polmonare, prodotto alcun cambiamento nel polmone filtrazione fluido o permeabilità di proteine, una scoperta supportata da normale istologico post-mortem e contenuto di acqua polmonare extravascolare.
Risposte della circolazione cerebrale all'ipercapnia e all'ipossia dopo la recisione del 7° nervo cranico nei babbuini.È stato proposto che le risposte della circolazione cerebrale a ipossia, ipercapnia e ipotensione possono essere parzialmente mediate da un riflesso autonomo con recettori nel corpo carotideo o nel seno che fungono da sensori e gli arti efferenti sono i nervi cranici 7. È stato riportato che la transezione del nervo cranico altera la risposta circolatoria cerebrale a stimolazione isolata dei chemocettori da ipossia e ipercapnia. Per verificare questa ipotesi abbiamo misurato il flusso sanguigno cerebrale (CBF) mediante una tecnica intra-arteriosa 133Xe in 10 babbuini durante i periodi di ipossia e ipercapnia indotte, sia prima che dopo la recisione del 7° nervo cranico. trovato che le risposte di CBF erano inalterate da una sezione unilaterale o bilaterale del nervo. I nostri risultati mostrano la conservazione delle normali risposte CBF, dopo transecti su, suggeriscono che il controllo neurogeno della circolazione cerebrale da parte di un riflesso autonomo che coinvolge il 7° nervo è improbabile.
[Risultati preliminari di un'indagine entomologica sui potenziali vettori di arbovirus nel territorio francese di Afars e Issas].I risultati preliminari di un'indagine entomologica dei potenziali vettori di arbovirus nel territorio francese di Afars e Issas sono state registrate 25 specie di culicidi, specialmente Anopheles gambiae, Culex tritaeniorhynchus, C. univittatus, C. pipiens fatigans, Aedes caspius, Ae. vittatus, Ae. arabiensis. Ae. sono state raccolte larve di aegypti su un dhow in arrivo a Gibuti. Sono state inoltre registrate 5 specie di zecche e 4 specie di flebotomi. Vengono discusse le modalità epidemiologiche di alcune arbovirosi in questo territorio, a seconda di questi dati entomologi e del viaggio ininterrotto delle popolazioni locali".
Michaelis--Menten analisi cinetica della benzpirene idrossilasi microsomiale epatica da ratti di controllo trattati con fenobarbital e metil-3-colantrene.Il sensibile Il saggio fluorimetrico per l'idrossi-3-benzpirene (3-OH-BP) descritto da Dehnen et al. , è stato utilizzato per studiare l'effetto della concentrazione sulla membrana microsomiale dell'attività della benzpirene idrossilasi. Microsomi da fenobarbital (PB) e metil-3-colantrene Ratti trattati con (3-MC) sono stati usati in confronto con la frazione microsomiale degli animali di controllo. A una concentrazione proteica molto bassa, la benzpirene idrossilasi segue una cinetica di tipo Michaelis--Menten. Quando la concentrazione della membrana microsomiale è superiore a un valore minimo ( +/- 6 mug proteine/ml) il Km aumenta con l'aumentare della concentrazione di proteine a causa dell'inibizione competitiva per legame reversibile e non specifico del substrato. Sono stati calcolati i Ki\' per tale legame. Pretrattamento di ratti con 3- MC selettivamente corto ns la linearità temporale, diminuisce il valore di Ks, e non ha effetto su Vmax, mentre la somministrazione di PB prolunga la linearità temporale, diminuisce Vmax e non modifica il Ks. 3-MC e PB agiscono specificamente sul citocromo P-450 e non modificano le proprietà fisico-chimiche della membrana microsomiale misurate dal legame non specifico del benzpirene (BP).
Compromissione dell'induzione enzimatica da parte dei glucocorticoidi nelle cellule dell'epatoma di Zajdela.Mentre i glucocorticoidi inducono TAT, TRP, GPT nel fegato e solo TAT nelle cellule HTC, no effetto ormonale sulla sintesi di questi enzimi è stato trovato in cellule di epatoma Zajdela coltivate in vivo come tumore ascitico, o in vitro come colture a strati. Anche se queste cellule rimangono non inducibili, l'ormone penetra normalmente, ma una forte diminuzione del legame specifico del citosol e sono state osservate proteine nucleari con l'ormone. La compromissione a livello dei recettori ormonali potrebbe spiegare la non inducibilità della sintesi enzimatica nelle cellule ZHC.
Fluorescenza indotta da formaldeide nel telencefalo e diencefalo dell'anguilla (Anguilla anguilla l.). Indagine fluorescente-microscopica e microspettrofluorimetrica con particolare riferimento all'innervazione dell'ipofisi. Nel telencefalo e diencefalo dell'anguilla (Anguilla anguilla L. ) la fluorescenza indotta dalla formaldeide è stata studiata microscopicamente e microfluorometricamente con particolare enfasi sull'innervazione dell'ipofisi. Nel telencefalo le fibre fluorescenti contenevano prevalentemente fluorofori di noradrenalina. Non è stato possibile stabilire nuclei fluorescenti. Nel diencefalo perikarya fluorescente sono stati trovati in: (1) l'organo paraventricolare (PVO), che possiede dopamina o, in misura minore, fluorofori della serotonina; (2) il gruppo che accompagna il PVO, esibendo spettrale dati simili a quelli dei fluorofori della noradrenalina; (3) il nucleo ipotalamo anteriore (NHA), un piccolo gruppo accoppiato di ce contenenti catecolamine lls posteriormente alla commissura trasversa. --Il nucleo lobi inferioris mostrava un'alta densità di terminali delicati, molto probabilmente contenenti dopamina, mentre le fibre che circondavano questo nucleo contenevano fluorofori di noradrenalina. Un'alta densità di terminali fluorescenti contenenti dopamina e/o noradrenalina è stata trovata nel complesso abenulare. I terminali fluorescenti nell'ipofisi contenevano fluorofori simili alla dopamina o alla noradrenalina. I tratti fluorescenti sono entrati nell'ipofisi da direzioni diverse. Un tratto rostrale, spaiato, entra nel lobo neurointermedio, come verificato anche sperimentalmente. La pars distalis rostrale riceve due tratti accoppiati, uno da un rostrale e uno da una direzione dorsale. La pars distalis prossimale riceve anche due tratti accoppiati, uno da una dorsale e uno da una direzione posteriore.
Un'attività proteolitica legata alla cromatina con specificità unica per l'istone H2A.È stato scoperto che una proteasi associata alla cromatina del timo di vitello purificata agisce esclusivamente sull'istone H2A, producendo una singola nuova specie proteica, cH2A. Questo frammento migra più velocemente di H2A nell'elettroforesi su gel di acrilammide in condizioni denaturanti. Il cH2A è stato purificato e sottoposto ad analisi degli amminoacidi e sequenziamento parziale mediante l'uso di carbossipeptidasi A. Questi studi hanno dimostrato che cH2A era stato derivato dalla rimozione di quindici amminoacidi dall'estremità carbossi-terminale della molecola di H2A intatta e che la valina114 era il suo nuovo residuo carbossi-terminale. Questa scissione non si verifica in condizioni di bassa forza ionica, dove si ritiene che l'H2A si avvicini una bobina casuale; richiede piuttosto condizioni di elevata forza ionica simili a quelle in cui la molecola di H2A subisce radicali cambiamenti strutturali secondari e terziari. ica forza implica che la scissione proteolitica è conformazione così come sequenza-specifica. La proteasi H2A-specifica è di origine nucleare, poiché l'isolamento dei nuclei mediante metodi progettati per massimizzare o ridurre al minimo la contaminazione citoplasmatica non influenza il livello di attività proteolitica associata alla cromatina purificata. Questa proteasi nucleare sembra essere strettamente associata alla cromatina in vivo, poiché 0,6 M NaCl non la libererà dalla cromatina isolata. È necessaria una concentrazione di 1,2 M NaCl per dissociare la proteasi e il suo substrato dalla cromatina. Viene discussa la relazione di questo enzima con le proteasi legate alla cromatina riportate in precedenza.
Angina nei pazienti ipertesi. Con particolare riferimento agli effetti cronotropi negativi della terapia simpaticolitica.Non c'era differenza significativa nella pressione sanguigna e nella frequenza cardiaca risposta dei pazienti ipertesi con e senza angina all'esercizio standardizzato su tapis roulant prima e dopo il trattamento antipertensivo Non vi è stato alcun miglioramento nella tolleranza all'esercizio nei pazienti ipertesi con angina trattati con betanidina, detriticochina o guanetidina nonostante una riduzione del cuore a riposo e all'esercizio tassi dopo il trattamento. L'effetto cronotropo negativo di questi farmaci simpaticolitici era inferiore a quello di oxprenololo o propranololo, ma la risposta ipotensiva era maggiore. Entrambi questi farmaci beta-bloccanti hanno prodotto un miglioramento della tolleranza all'esercizio nei pazienti con angina sia da soli che in combinazione con un'altra terapia ipotensiva. Il miglior controllo della pressione sanguigna e dell'angina è stato spesso ottenuto con una combinazione zione di un farmaco simpaticolitico e di un farmaco bloccante i recettori beta. Nei pazienti ipertesi trattati per diversi anni, l'angina alla presentazione è stata occasionalmente ridotta dalla riduzione della pressione sanguigna. L'insorgenza più tardiva dell'angina sembrava non essere correlata al controllo dell'ipertensione, ma dovuta a un'occlusione coronarica casuale. Non c'erano prove che l'infarto miocardico fosse scatenato da ipotensione posturale o da esercizio, sebbene questi effetti occasionalmente precipitassero l'angina.
N-glucuronidazione microsomiale epatica e legame dell'acido nucleico di N-idrossi arilammine in relazione alla carcinogenesi della vescica urinaria.Uridina 5\'-acido difosfoglucuronico- microsomi epatici fortificati di cani, ratti o esseri umani hanno rapidamente metabolizzato [3H]-N-idrossi-2-naftilamina (N-HO-2-NA) in un prodotto solubile in acqua che ha prodotto il 98% della N-idrossiammina progenitrice dopo trattamento con beta-glucuronidasi. Il metabolita è stato identificato come N-(beta-1-glucosiduronil)-N-idrossi-2-naftilamina da analisi ultraviolette, infrarosse e spettrali di massa del glucuronide e del suo derivato nitrone. Incubazione di N-idrossi -1-naftilamina (N-HO-1-NA), N-idrossi-4-amminobifenile (N-HO-ABP), o i derivati N-idrossi di 2-amminofluorene, 4-amminoazobenzene o N-acetil-2 -aminofluorene con microsomi epatici fortificati con acido uridina 5\'-difosfoglucuronico ha prodotto anche prodotti idrosolubili. Il trattamento con beta-glucuronidasi ha rilasciato dall'80 al 90% del [3H]-NHO-1-NA e [3H]-N-HO-ABP coniugati come derivati triziati estraibili con etere. N-HO-1-NA, N-HO-2-NA e N-HO-ABP e i glucuronidi di queste N-idrossi arilammine erano relativamente stabili e non reattivi vicino al pH neutro. A pH 5, l'N-glucuronide di N-HO-2-NA e i presunti N-glucuronidi di N-HO-1-NA e N-HO-ABP sono stati rapidamente idrolizzati nelle N-idrossi arilammine che sono state poi convertite in derivati reattivi capaci di legarsi covalentemente agli acidi nucleici. Questi dati supportano il concetto che gli agenti cancerogeni della vescica arilammina sono N-ossidati e N-glucuronidati nel fegato e che gli N-glucuronidi vengono trasportati alla vescica urinaria. L'idrolisi dei glucuronidi in N-idrossi arilammine e la conversione di questi ultimi derivati in ioni arilnitrenio elettrofili altamente reattivi nell'urina normalmente acida di cani e umani possono essere reazioni critiche per l'induzione del tumore nella vescica urinaria.
isoenzimi beta-esosaminidasi nel carcinoma del colon umano.La focalizzazione isoelettrica di estratti grezzi ha dimostrato che i carcinomi del colon umano contenevano una percentuale maggiore di beta-esosaminidasi B rispetto a beta-esosaminidasi A, mentre la normale mucosa del colon umano conteneva una proporzione maggiore della forma A dell'enzima. Studi sugli isoenzimi isolati hanno mostrato che la beta-esosaminidasi B era più stabile al calore e più attiva a pH basso rispetto alla beta-esosaminidasi A. Studi cinetici hanno rivelato che le forme A e B della beta-esosaminidasi avevano essenzialmente lo stesso Km e Vmax per p-nitrofenil-N-acetil-beta-D-glucosaminide.
Capacità tampone del fumo di diversi tabacchi in relazione ai rischi di cancro ai polmoni.A scopo di confronto viene descritto un metodo per valutare la "capacità tampone" del grado di acidità o alcalinità del fumo di diversi tabacchi come presentato al tratto orale e respiratorio del fumatore La nicotina è più facilmente assorbita da un fumo alcalino che da un fumo acido Il fumatore di tabacchi che dà un fumo di capacità tampone acido , per raggiungere la piena soddisfazione della nicotina, tende a fumare di più e ad inalare di più, aumentando così i rischi di cancro ai polmoni, rispetto al fumatore di tabacchi che danno un fumo meno acido o con capacità tampone alcalina.
[Studio delle attività di NADH e NADPH-ferredoxin ossidoreduttasi in Clostridium acetobutylicum].La NADH e la NADPH-ferredoxin ossidoriduttasi sono state studiate in Clostridium acetobutylicum L'acetil-CoA è un attivatore obbligatorio dell'attività della NADH-ferredossina reduttasi e il NADH un inibitore competitivo dell'attività della ferredossina-NAD+ reduttasi Queste regolazioni sono le stesse quando C. acetoburylicum passa da un metabolismo di tipo butilico a un metabolismo di tipo butirrico \'; questo dimostra che la NADH-ferredoxin ossidoreduttasi cna, attraverso la sua azione reversibile, soddisfa le esigenze cellulari molto diverse imposte da questi due tipi di coltura. La funzione fisiologica della clostridi NADPH-ferredoxin ossidoreduttasi era anabolica come lo è stata con altri clostridi.
Effetti del taglio netto sulla composizione delle popolazioni batteriche del suolo delle foreste di abeti rossi settentrionali.Questo articolo riguarda la parte microbiologica di un'indagine, l'obiettivo di cui è quello di descrivere i cambiamenti biologici nel suolo della foresta di conifere al momento del disboscamento in un'area morenica settentrionale (66 gradi 20\'N) dove il rimboschimento dopo il disboscamento era stato incontrato con difficoltà. La parte zoologica del lavoro è stata pubblicata altrove Sono stati studiati siti ben definiti di età crescente (4, 7 e 13 anni) e confrontati con un'area forestale in cui non era stato effettuato alcun taglio del legname per 120 anni. Un totale di 684 isolati casuali di batteri eterotrofi da campioni aggregati di i siti indagati sono stati sottoposti a 36 test biochimici, i dati sono stati condensati con l'ausilio dell'analisi fattoriale e il confronto delle popolazioni è stato basato su distanze euclidee quadrate tra centroidi di popolazione in uno spazio fattoriale a sette dimensioni. i cambiamenti marcati della popolazione hanno seguito un corso in cui le frequenze di alcune caratteristiche della popolazione sono diventate sempre più diverse fino a 7 anni dopo il taglio netto, con regressione verso il controllo chiaramente evidente dopo 13 anni. Anche i disturbi di durata più breve erano relativamente comuni, con cambiamenti massimi osservati nei campioni di 4 anni e con un recupero completo dopo 7 anni. Le popolazioni del suolo minerale sembravano subire cambiamenti maggiori rispetto alle popolazioni di humus. I cambiamenti più distinti ritenuti dovuti al taglio netto erano l'aumento relativo a breve termine di organismi che producono acido dal saccarosio e dissolvendo CaHPO4 e un aumento a lungo termine di organismi lipolitici e caseolitici, ramnosio-negativi; sia nello strato minerale del suolo. Nello strato di humus sembrava che si verificasse un aumento a breve termine di organismi lipolitici e ramnosio-positivi.
Nicotinamide adenina dinucleotide -- formiato deidrogenasi indipendente in Mycobacterium phlei.L'attività del formiato deidrogenasi (EC 1.2.1.2) è stata dimostrata in preparazioni prive di cellule di Mycobacterium phlei in seguito alla riduzione del 2,6 diclorofenolindofenolo, blu tiazolil tetrazolio o citocromo c equino. La riduzione del citocromo c equino è stata inibita dal 2-eptil-4-idrossichinolina-N-ossido. Né nicotinammide adenina dinucleotide né nicotinammide adenina dinucleotide fosfato sono stati ridotti da questo formiato deidrogenasi. L'enzima era costitutivo e associato alla particolare frazione. Il massimo livello di attività è stato osservato a pH 9,0, con formiato 8 mM e con estratti di cellule prelevate dalla fase logaritmica di crescita. Formaldeide , ipofosfito, nitrato e bicarbonato hanno tutti inibito l'ossidazione del formiato.
Isolamento e caratterizzazione di una D-amminoacido ossidasi mitocondriale da Neurospora crassa.D-amminoacido ossidasi (EC 1.4.3.3) in omogenati del ceppo SY7A di Neurospora crassa è stato trovato sedimentare con la frazione mitocondriale. Studi di frazionamento della digitonina sui mitocondri purificati hanno indicato una localizzazione nella matrice dell'enzima. Inoltre, un'attività perossidasi (EC 1.11.1.7), che può rimuovere il perossido di idrogeno formato come prodotto dell'ossidazione degli amminoacidi D, è stata trovata anche nella matrice mitocondriale. È stata ottenuta una purificazione parziale (da 20 a 30 volte) dell'ossidasi mitocondriale degli amminoacidi D. L'enzima ha mostrato un pH ottimale tra 9,0 e 9,2, temperatura ottimale tra 20 e 30 gradi C e un peso molecolare di 118 000 +/- 6000 determinato mediante elettroforesi su gel e 125 000 determinato mediante cromatografia su gel.
L'effetto della carenza cronica di ferro sull'attività della tirosina idrossilasi surrenale.Una carenza nutrizionale cronica di ferro della durata da 2 a 5 settimane ha ridotto il contenuto di emoglobina nel sangue a 30 -50% dei valori di controllo e ha determinato un aumento dell'attività della tirosina idrossilasi (TH) surrenale di ratto (EC 1.14.16.2). Esperimenti cinetici e di miscelazione hanno indicato che questo aumento era dovuto ad un aumento della proteina enzimatica. Il peso corporeo del ferro- ratti carenti variavano dal 60 all'80% del controllo; questo fattore, tuttavia, non era responsabile dell'aumento del TH surrenalico poiché l'attività enzimatica era direttamente proporzionale al peso corporeo finale Per determinare se l'aumento del TH surrenalico nei ratti carenti di ferro fosse a causa dell'aumentata attività simpatica alla midollare del surrene, il nervo splancnico è stato reciso. L'aumento di TH è stato ancora osservato dopo la denervazione surrenalica; ciò indica che il meccanismo di risposta alla carenza di ferro risiede all'interno del surrene stesso. L'età dei ratti è i importante nel determinare se si verificherà l'aumento dell'attività TH.
Cinetica dell'idrolisi del cellobiosio e del p-nitrofenil-beta-D-glucoside da parte della cellobiasi di Trichoderma viride.La cellobiasi è stata isolata dal grezzo miscela di cellulasi di enzimi di Trichoderma viride mediante cromatografia su colonna e metodi di scambio ionico. La cinetica dello stato stazionario dell'idrolisi del cellobiosio è stata studiata in funzione delle concentrazioni di cellobiosio e glucosio, pH della soluzione, temperatura e costante dielettrica, utilizzando miscele tampone isopropanolo I risultati mostrano che (i) vi è una marcata attivazione della reazione da concentrazioni iniziali di glucosio da 4 X 10 (-3) M a 9 X 10 (-2) M e una forte inibizione della reazione a concentrazioni iniziali, (ii) la curva log rate -pH ha un massimo a pH 5,2 e valori di pK dell'enzima di 3,5 e 6,8, (iii) l'energia di attivazione a pH 5,1 è 10,2 kcal mol-1 nell'intervallo di temperatura 5-56 gradi C e (iv) il tasso diminuisce dallo 0 al 20% (v/v) di isopropanolo. la rolisi da parte della cellobiasi (EC 3.2.1.21) del p-nitrofenil-beta-D-glucoside è stata esaminata con metodi pre-stazionari in cui [enzima]0 maggiore di [substrato]0 e con metodi stazionari in funzione di pH e temperatura. I risultati mostrano (i) un valore per k2 di 21 S-1 a pH 7,0 (dove k2 è la costante di velocità per il secondo passaggio nel presunto meccanismo a due intermedi (formula: vedi testo), (ii) una velocità logaritmica - curva del pH, significativamente diversa da quella per l'idrolisi del cellobiosio, in cui la velocità aumenta con la diminuzione del pH al di sotto di pH 4,5, è costante nella regione pH 4,5-6 e diminuisce al di sopra del pH 6 (esibisce un valore pK enzimatico di 7,3) e (iii) un'energia di attivazione di 12,5 kcal mol-1 a pH 5,7 nell'intervallo di temperatura 10-60 gradi C.
Caratterizzazione e specificità del substrato della fumarylacetoacetate fumarylhydrolase.Il peso molecolare della fumarylacetoacetate fumarylhydrolase (EC 3.7.1.2) è 86 000 +/- 10 000, come determinato mediante filtrazione su gel. L'enzima sembra essere un dimero con un peso molecolare del monomero di 38 000 - 43 000, come determinato mediante elettroforesi su gel, filtrazione su gel in cloridrato di guanidina e ultracentrifugazione. Le subunità sembrano essere identiche, poiché solo una banda viene rilevata nell'elettroforesi su gel, solo un picco proteico viene rilevato nella filtrazione su gel in guanidina-cloridrato e viene rilevato solo un amminoacido ammino-terminale (prolina). Tre gruppi sulfidrilici liberi per monomero denaturato vengono rilevati dalla reazione con 5, 5\'-ditiobis(acido 2-nitrobenzoico), mentre per l'enzima attivo solo due gruppi sulfidrilici reagiscono con questo reagente, i coefficienti di estinzione a 260 e 280 nm, la composizione amminoacidica e il punto isoelettrico (6.7) dell'enzima un vero così riportato. L'enzima catalizza l'idrolisi di sei 2,4-dichetoacidi e tre 3,5-dichetoacidi testati. Il Km dei substrati è simile ma V varia di un fattore 120. Il pH ottimale è 7,3. L'enzima non ha catalizzato l'idrolisi di un certo numero di esteri testati.
Effetti dell'alchilazione da parte di dimetilsolfato, mostarda di azoto e mitomicina C sulla struttura del DNA come studiato dal saggio di legame dell'etidio.L'entità dell'alchilazione di Il DNA da dimetilsolfato, mostarda azotata e l'antibiotico mitomicina C è correlato alla conseguente diminuzione della fluorescenza dell'etidio intercalato Le perdite di fluorescenza dovute ai primi due tipi di reagenti mostrano una marcata dipendenza dal pH, con maggiori perdite di fluorescenza osservate a pH alcalini. A pH 11,6 la fluorescenza mostra un lento recupero, cosicché con bassi livelli di metilazione (4% di residui di deossiguanosina modificati) si osserva un completo ritorno della fluorescenza. Si postula che questi fenomeni siano dovuti alla conversione della 7-metildeossiguanosina in la forma zwitterionica e la parziale denaturazione del duplex del DNA con perdita dei siti di legame dell'etidio L'apertura dell'anello imidazolico catalizzata da ioni idrossido e la rimozione della carica positiva consente la ricottura con c ritorno immediato dei siti di intercalazione dell'etidio. Questa conclusione è corroborata dall'idrolisi enzimatica del DNA metilato marcato con 14C e dall'identificazione del dosaggio dell'etidio. Il comportamento nettamente diverso della mitomicina C conferma le precedenti conclusioni secondo cui la sua alchilazione, preferenzialmente sulla guanina, non prende parte alla posizione N-7.
Specificità del substrato delle due beta-galattosidasi del cervello umano geneticamente distinte.Le due beta-galattosidasi del cervello umano sono state solubilizzate e frazionate da Sephadex G-200 Le specificità del substrato dei due enzimi sono state esaminate per galattosilceramide, lattosil-[N-stearoil]ceramide, lattosil-[N-lignoceroil]ceramide, galattosil-N-acetilgalattosaminil-[N-stearoil]ceramide, lattosil-[N-lignoceroil]ceramide, galattosil-N-acetilgalattosaminil-[N-acetilneuraminil]galattosil-glucosilceramide (GMI-ganglioside), galattosil-N-acetilgalattosaminil-galattosil-glucosilceramide), e beta-ganasialoside GM1-ganasiloside -galattoside. In condizioni opportunamente ottimizzate, una delle due beta-galattosidasi potrebbe idrolizzare tutti i substrati, anche se con velocità ampiamente variabili. Attività specifiche relative della galattosilceramide beta-galattosidasi verso galattosilceramide, lattosil-[N-steroil]cer ammide, lattosil-[N-lignoceroil]ceramide. GM1-ganglioside, asialo GM1-ganglioside e 4-metilumbelliferil beta-galattoside erano rispettivamente 100, 510, 250, 39, 41 e 120. Le attività specifiche relative del GM1-ganglioside beta-galattosidasi verso la stessa serie dei substrati erano 0,3, 78, 19, 100, 150 e 240; Tuttavia, le condizioni di analisi ottimali per ogni dato substrato naturale erano sufficientemente diverse per ciascuna beta-galattosidasi in modo che i test diagnostici per le due malattie genetiche dovute a carenze di beta-galattosidasi potessero essere eseguiti in interi tessuti. Poiché la distribuzione relativa dei due enzimi varia notevolmente nei diversi tessuti, i contributi dei due enzimi alla degradazione dei glicosfingolipidi naturali in vivo possono variare nei diversi organi. Questi risultati possono avere un impatto importante sulla patogenesi biochimica di queste malattie genetiche.
La normale presenza di octopamina nel sistema nervoso centrale del ratto.È stato sviluppato un test enzimatico per l'octopamina in grado di rilevare 50 pg di ammina e utilizzato per studiare la distribuzione di octopamina nelle regioni del sistema nervoso centrale del ratto La presenza di octopamina nell'organo pineale del ratto è stata confermata mediante spettrometria di massa La somministrazione di un inibitore della monoamino ossidasi e di tiramina ha portato ad aumenti dei livelli di octopamina nel SNC mentre la somministrazione di reserpina per via intraperitoneale o 6-idrossidopamina per via intraventricolare ha portato a diminuzioni dei livelli di octopamina. I risultati suggeriscono che nel SNC dei mammiferi l'octopamina è presente nelle strutture neurali dove può essere coinvolta nella funzione sinaptica.
Stimolazione elettrica con elettrodi Pt: analisi delle tracce per platino disciolto e altri prodotti elettrochimici disciolti.Un requisito conservativo per la stimolazione elettrica \'sicuro\' è la assenza di alterazioni chimiche adiacenti agli elettrodi stimolatori. In termini elettrochimici, ciò significa che devono essere evitati processi di trasferimento di carica che producono specie disciolte. Con questa restrizione, lo scopo di questo studio è stato quello di stabilire la massima densità di carica che può essere passata durante ogni metà di un impulso di stimolazione bifasico. Le possibili specie disciolte risultanti da reazioni faradaiche all'interfaccia Pt/salina includono prodotti di ossidazione del cloruro (ClO-, ClO3-, ecc. ) ioni H+ o OH- e ioni Pt. Per impulsi bifasici bilanciati, né Cl - l'ossidazione o le variazioni di pH sembrano costituire problemi significativi e il problema più difficile da evitare sembra essere la dissoluzione del metallo La dissoluzione del Pt è stata monitorata mediante spettrofotometro UV analisi etrica e, poiché la proteina interferisce con l'analisi, i test sono stati eseguiti in soluzione salina inorganica. I risultati sono presentati sotto forma di nomografi che mettono in relazione la dissoluzione di Pt con la densità di carica per impulso e la densità di corrente. Raccomandazioni specifiche per ridurre al minimo la dissoluzione del Pt includono l'uso di elettrodi platinati, la restrizione delle densità di carica per impulso a un valore maggiore o uguale a 300 muC/geom cm2 di superficie dell'elettrodo e preferibilmente l'uso di impulsi bifasici catodici.
Inibizione della secrezione gastrica nel trattamento dell'insufficienza pancreatica.Il contenuto di enzimi pancreatici nel duodeno è stato studiato in due pazienti con achilia pancreatica dopo uno standard pasto integrato con estratto pancreatico commerciale. Il transito gastrico degli enzimi, con comparsa di quantità quasi normali nel contenuto duodenale, è avvenuto solo dopo l'inibizione della secrezione gastrica e il tampone dell'acido gastrico residuo con antiacidi. Sono quindi necessarie l'inibizione gastrica e la neutralizzazione dell'acido per il trattamento soddisfacente di pazienti con insufficienza pancreatica esocrina ma normale funzione gastrica.
Cristalluria in soggetti normali e in calcoli con e senza trattamento con tiazidici e fosfati di cellulosa.Sono stati effettuati studi quantitativi e qualitativi dei cristalli urinari da una serie di soggetti normali e da calcolosi con ipercalciuria idiopatica con e senza trattamento con diuretici tiazidici e/o fosfato di cellulosa I risultati ottenuti da soggetti non preparati a metà mattinata sono sembrati più utili di quelli ottenuti a seguito di raccolte notturne o dopo una colazione secca. era più comune nei formatori di calcoli rispetto ai soggetti normali, ma è stata osservata in entrambi i gruppi. La differenza più evidente tra questi 2 gruppi era la quasi completa assenza di aggregazione di cristalli di ossalato nei soggetti normali. Il fosfato di cellulosa riduceva notevolmente i cristalli di fosfato ma portava a un grande aumento di piccoli cristalli di ossalato ma senza cambiamento nell'incidenza di aggregazione di cristalli di ossalato. I tiazidici riducono anche d presenza di cristalli di fosfato ma ha dato solo un piccolissimo aumento dei cristalli di ossalato e anche senza cambiamento nell'aggregazione dei cristalli di ossalato.
Meccanismo di neurotossicità dei glicosidi cardiotonici.1 Nei gatti somministrazione intracerebroventricolare di 5, 10, 20 tazze di peruvoside, un glicoside cardiaco ottenuto dalla pianta , Thevetia neriifolia e 10 e 20 tazze di ouabain, hanno prodotto una marcata neurotossicità, correlata alla dose.2 Somministrazione precedente di reserpina (2 mg/kg im, 500 tazze icv) o tetrabenazina (25 mg/kg ev, 50 mg/kg iv e 2 mg/,g icv) hanno soppresso la neurotossicità, ma il carbonato di litio (100 mg/,g ip, 2 mg 2. cv) e l'aloperidolo (200 mug icv) sono risultati inefficaci.3 Precedente somministrazione di dietilamide dell'acido 2-bromolisergico ( BOL-148, 200 mug icv) o p-clorofenilalanina (PCPA) (400 mg/kg ip) hanno soppresso la neurotossicità indotta da peruvoside e ouabaina 4 Perfusione dei ventricoli laterali dei gatti con 10, 20 e 30 tazze di peruvoside o ouqbain prodotto un massiccio rilascio di 5-idrossitriptamina (5-HT). Questo era correlato alla dose. La somministrazione precedente PCPA ha soppresso th e rilascio di 5-HT. 5 I risultati dei risultati indicano il coinvolgimento di 5-HT nella genesi della neurotossicità indotta da peruvoside o ouabaina.
L'azione selettiva dei farmaci bloccanti i recettori beta-adrenergici e la natura dei recettori beta1 e beta2 adrenergici.1 Sono state preparate membrane purificate che trattengono un'adenilato ciclasi sensibile alle catecolamine da cuore, polmone e utero (pseudo-gravidanza) di coniglio.2 Questi preparati hanno le caratteristiche delle membrane plasmatiche e sia il cuore che il polmone rispondono agli agonisti dei recettori beta-adrenergici nell'ordine: (+/-)-isoprenalina maggiore di (-)- noradrenalina maggiore di (-)-adrenalina maggiore di (+)-isoprenalina maggiore di salbutamolo La sensibilità dell'adenilato ciclasi alla stimolazione dei recettori beta-adrenergici è migliorata dal pretrattamento degli animali con reserpina e sirosingopina.3 Rapporti di dose per diversi le concentrazioni di propranololo (bloccanti non selettivi dei beta-adrenocettori), practololo e atenololo (bloccanti cardio-selettivi dei beta-adrenorecettori) sono state misurate su tutte e tre le preparazioni di membrana. y coincidente per cuore e polmone con una costante di dissociazione (Kb) per il propranololo molto vicino al valore farmacologico. Il rapporto dei valori di Kb era 0,65 per practololo e 1,23 per atenololo rispetto a rapporti farmacologici di cardioselettività (misurati su atri isolati e catena tracheale) di 67,6 e 110 rispettivamente. Il rapporto utero/cuore Kb era 51,5 per l'atenololo. L'inibizione dell'utero da parte del practolol ha dato un grafico di Schild con pendenza significativamente inferiore a 1, indicando un diverso meccanismo d'azione dal cuore. I valori di 4 Kb ottenuti misurando la stimolazione dell'adenilato ciclasi nel tessuto sminuzzato (comprese le preparazioni dell'albero bronchiale e del tessuto alveolare e dell'intero polmone) assomigliavano ai valori di membrana piuttosto che a quelli riscontrati negli organi interi. 5 I risultati mostrano che la selettività farmacologica di practololo e atenololo è mantenuta a livello recettore-adenilato ciclasi, almeno per quanto riguarda il cuore e l'utero, sebbene i rapporti di selettività più piccoli nel sistema biochimico suggeriscano che le differenze recettoriali non siano l'unico fattore e che la distribuzione di fase del farmaco può anche essere importante. Le membrane preparate da tutto il polmone mostrano che anche la distribuzione di fase del farmaco può essere importante. Le membrane preparate da tutto il polmone mostrano una risposta beta1 complessiva che potrebbe semplicemente riflettere la predominanza dei tipi di cellule beta1 contenenti beta1-adrenergici sulla muscolatura liscia bronchiale.
Il beta-adrenorecettori dei linfociti umani e del parenchima polmonare umano.1 La risposta dei beta-adrenocettori dei linfociti umani ad agonisti e antagonisti selettivi è stato studiato quantitativamente misurando i cambiamenti nei livelli di adenosina-3\',5\'-monofosfato ciclico (AMP ciclico).2 Il recettore è stato attivato dall'isoprenalina e dal salbutamolo e bloccato dal propranololo ma non dal practololo. Un modello simile di risposta è stata ottenuta con frammenti di tessuto polmonare umano. 3 Il valore medio di pA2 per il propranololo era 8,34 e per il practololo era 3,95. 4 Questi risultati indicano che il recettore beta adrenergico dei linfociti è un recettore beta 2 e supportano la solidità dell'uso dei linfociti per studiare funzione dei recettori beta-adrenergici nell'asma bronchiale. Può anche essere utile nella valutazione dei farmaci beta2-bloccanti selettivi nell'uomo.
Interazioni tra gli effetti degli agonisti dei recettori alfa e beta-adrenergici e dei nucleotidi di adenina sul potenziale di membrana delle cellule in fettine di fegato di cavia.1 L'agonista dei beta-adrenorecettori isoprenalina normalmente provoca solo un piccolo e inconsistente aumento del potenziale di membrana delle cellule nelle fette di fegato di cavia, in contrasto con le grandi iperpolarizzazioni osservate con gli alfa-agonisti. Tuttavia, dopo che un agonista selettivo dei recettori alfa-adrenergici è stato applicata, la risposta all'isoprenalina diventa notevolmente migliorata.2 L'applicazione simultanea di piccole dosi di un alfa e di un beta-agonista produce iperpolarizzazioni maggiori della somma delle risposte a ciascun agente da solo.3 Queste interazioni si verificano con una gamma di ammine simpaticomimetiche, tra cui alcuni che non sono substrati per vari processi di captazione e inattivazione delle catecolamine.4 Iperpolarizzazioni causate da adenosina-3\',5\'-monofosfato ciclico applicato esternamente AMP) diventano anche più grandi dopo l'applicazione di un alfa-agonista. 5 I nucleotidi di adenina adenosina 5\'-difosfato (ADP) e adenosina 5\'-trifosfato (ATP) iperpolarizzano le cellule del fegato di cavia nell'intervallo di dosaggio 0,1-1,0 mM. Questa risposta non è aumentata dopo un alfa-agonista. Tuttavia, l'ADP e l'ATP sono essi stessi in grado di potenziare la risposta ai beta-agonisti. 6 Queste interazioni tra alfa-agonisti, beta-agonisti e nucleotidi adennici sembrano coinvolgere fasi successive all'attivazione del recettore. Potrebbero essere interessati cambiamenti nelle azioni intracellulari dell'AMP ciclico.
Differenziazione degli adrenocettori metabolici.1 Sono state misurate le risposte cardiovascolari e metaboliche all'infusione endovenosa di isoprenalina in gatti anestetizzati a digiuno. 2 Isoprenalina (0,2 tazze kg -1 min-1 per 15 min) ha ridotto la pressione sanguigna diastolica e aumentato la frequenza cardiaca, la glicemia, il lattato nel sangue e gli acidi grassi liberi plasmatici.3 L'oxprenololo (0,5 mg/kg) ha antagonizzato tutti gli effetti cardiovascolari e metabolici dell'isoprenalina in modo non selettivo.4 Il para-oxprenololo (0,25 mg/kg) e il practololo (4 mg/kg) hanno antagonizzato selettivamente gli effetti dell'isoprenalina sulla frequenza cardiaca e sugli acidi grassi liberi.5 H 35/25 ((I-(4-metilfenil)-2-isopropil aminopropanolo ) cloridrato, 3 mg/kg) ha antagonizzato selettivamente gli effetti dell'isoprenalina sulla pressione sanguigna, sul glucosio e sul lattato.6 Si è concluso che gli adrenocettori metabolici sono differenziati in sottotipi simili a quelli che mediano la cardiostimolazione e la vasodilatazione.
Carbuterolo, fenoterolo, orciprenalina, salbutamolo e terbutalina per os nella bronchite cronica ostruttiva reversibile.Gli effetti delle compresse di carbuterolo, orciprenalina, salbutemolo, terbutalina e fenoterolo a due dosaggi sono stati studiati utilizzando FEV1 e conduttanza specifica delle vie aeree come parametri. Un placebo è stato utilizzato come riferimento. Carbuterolo e fenoterolo si sono dimostrati più potenti degli altri concorrenti simpaticomimetici. Fenoterolo 5 mg era in media leggermente meno potente di 3 mg di carbuterolo. Questa differenza non era statisticamente significativa per il FEV1; era significativa tre ore dopo l'assunzione per la conduttanza delle vie aeree. Nessuno dei farmaci ha prodotto cambiamenti significativi della pressione sanguigna. Carbuterolo e 12 mg di fenoterolo hanno causato un aumento statisticamente significativo della frequenza cardiaca. ECG sono stati osservati cambiamenti in otto pazienti con i diversi beta-simpaticomimetici, ad eccezione di 5 mg di fenoterolo.
Influenza dell'ossigeno e dell'anidride carbonica sulla relazione del pH plasma-eritrociti nel sangue intero umano normale.L'influenza del livello di ossigenazione (saturazione ossiemoglobinica 0 o 100%) sulla relazione tra pH plasmatico e pH eritrocitario è stato studiato, in vitro, in sangue umano normale sottoposto a variazioni della tensione di anidride carbonica. In primo luogo è stato confrontato il pH sia degli eritrolisati veri che separati: per i primi è stata effettuata la tonometria su sangue intero, prima della lisi dei globuli rossi; per quest'ultimo, l'equilibrio è stato effettuato su eritrolisato, i valori di pH sono apparsi diversi: a PCO2 congruente a 21 e 38 Torr, l'eritrolizzato separato era più alcalino di quello vero, e a PCO2 congruente a 0 era più acido. Pertanto, per stimare la relazione pHe-pHi, il pHi è stato valutato su vero eritrolisato. Quando l'emoglobina è passata dallo stato ridotto a quello completamente ossigenato, è stata osservata una diminuzione significativa sia di pHe che di pHi per una data PCO2 (rispettivamente circa 0,05 e 0,08 unità di pH) e di pHi per un dato pHe (circa 0,04 unità di pH). Nel fluido extra o intraeritrocitario, la differenza di pH legata all'ossigeno era correlata negativamente alla PCO2.
[Funzione respiratoria in pazienti con anemia falciforme (autore\'s transl)].La funzione respiratoria è stata studiata sistematicamente in 61 pazienti con anemia falciforme , in e fuori crisi Sono stati misurati volumi e flussi polmonari, gas ematici e P50 È stato riscontrato che: 1. la capacità vitale era diminuita in circa la metà dei pazienti (sintomi ostruttivi in cinque casi), 2. esisteva ipossiemia sotto l'aria , con una caduta della saturazione dell'emoglobina, 3. esisteva ipossiemia sotto O2 puro che mostra l'esistenza di shunt veno-arteriosi, 4. un aumento di P50 ha rivelato una diminuzione dell'affinità dell'ossigeno dell'emoglobina (P50 (7,40, 37 gradi C) torr = 49,08 -- 1,57 [Hb] (g/100 ml) +/- 4,81), 5. durante la crisi falciforme si sono manifestati sintomi ostruttivi associati ad una diminuzione della PaO2 e ad una moderata ipoventilazione alveolare Diverse ipotesi riguardanti la sindrome restrittiva e la si parla di ipossiemia.
[Cinetica della compensazione dell'acidosi respiratoria indotta da ipercapnia cronica sperimentale nell'uomo (autore\'s trad.)].Quattro gruppi di volontari maschi hanno stati esposti in una camera climatica stretta a PICO2 di 14, 21, 28 e 32 torr; i periodi di esposizione variavano da due a 30 giorni, tra due periodi di riferimento in aria normale. I risultati riguardano l'evoluzione dell'equilibrio acido-base del sangue arterioso e quello della risposta renale in relazione alla PICO2. In tutte le esposizioni, il sovraccarico alveolare di anidride carbonica aumenta di parecchi torr durante le prime 24 ore a causa dell'attenuazione dell'iperventilazione iniziale. La cinetica del compenso dell'acidosi respiratoria differisce a seconda dell'ipercapnia che è moderata ( PICO2 di 14 e 21 torr) o relativamente grave (PICO2 di 28 e 32 torr). La diminuzione del pH arterioso diminuisce già dalla 24a ora a PICO2 di 28 e 32 torr, e solo dopo due giorni a PICO2 di 14 e 21 torr. La risposta renale è cha ratterizzato da un significativo aumento dell'aciduria durante le prime 24 ore a PICO2 28 e 32 torr; le modifiche sono più piccole e iniziano dopo a PICO2 14 torr.
Ipercapnia e conseguenti processi di trasferimento del bicarbonato in un pesce elasmobranco (Scyliorhinus stellaris).Per testare gli effetti dell'ipercapnia sullo stato acido-base di pesci, il gattuccio più grande è stato esposto a improvvisi cambiamenti di PCO2 in un sistema chiuso di ricircolo dell'acqua di mare. Ph, PCO2 e PO2 sono stati determinati nel sangue arterioso e nell'acqua di mare. Lo scambio di bicarbonato tra spazio extracellulare (ECS), spazio intracellulare (ICS), e l'acqua di mare (SW) è stata ottenuta dalle variazioni della quantità totale di bicarbonato in ECS e SW. Dopo un aumento di quattro volte della PCO2 il pH arterioso è diminuito notevolmente, ma ha iniziato a recuperare immediatamente verso i valori di controllo, a causa dell'accumulo compensatorio di bicarbonato nell'ECS. A seconda dell'origine dell'aumento extracellulare di bicarbonato si possono distinguere tre periodi: 1. -- Bicarbonato trasferito da ICS sia a ECS che a SW; 2. -- Bicarbonato trasferito sia da SW che da ICS a ECS; 3. -- Bicarbonato e trasferito da SW sia a ECS che a ICS. Dopo il ritorno alla normocapnia si sono verificati periodi simili con direzioni di trasferimento opposte e transizioni periodiche ritardate. Nel primo periodo l'ICS è risultato essere l'unica fonte di aumenti compensatori di bicarbonato e anche nel secondo periodo l'ICS ha contribuito alla compensazione del pH extracellulare. Quindi lo scambio di bicarbonato con l'ICS sembra essere un importante meccanismo di regolazione che diminuisce le variazioni di pH extracellulare dopo i cambiamenti nella PCO2, prima che vengano avviati altri meccanismi compensatori.
Affinità all'ossigeno dell'emoglobina e stato acido-base dei globuli rossi in pazienti con grave malattia polmonare ostruttiva cronica.L'affinità all'ossigeno dell'emoglobina e i fattori che determinano la posizione della curva di dissociazione dell'ossigeno è stata studiata in venticinque pazienti con grave malattia polmonare cronica ostruttiva. I pazienti sono stati suddivisi in tre gruppi: il gruppo I ha mostrato una diminuzione normale o lieve della PaO2, il gruppo II un moderato calo della pressione arteriosa di ossigeno, e gruppo III una grave ipossia con equilibrio acido-base equilibrato e ipercapnia. L'emoglobina nel sangue ha mostrato un aumento significativo in tutti i gruppi, indicando un miglioramento del trasporto di ossigeno. Nella maggior parte dei pazienti si è verificato uno spostamento verso sinistra della curva di dissociazione dell'ossigeno. Si discute che la tendenza lo spostamento a sinistra è basato sull'alcalosi all'interno dei globuli rossi, evidentemente dimostrato in tutti i gruppi studiati. Il 2,3-difosfoglicerato non ha mostrato alcuna stretta relazione con l'affinità per l'ossigeno valutata moglobina. L'evidenza di una maggiore affinità per l'ossigeno può rivelare un ulteriore meccanismo compensatorio nel trasporto di ossigeno in pazienti con disturbi polmonari. Inoltre, l'alcalosi all'interno delle cellule può controbilanciare uno spostamento a destra troppo grande della curva di dissociazione dell'ossigeno in vivo quando si verificano ipossia e ipercapnia gravi.
Effetto del cianuro sull'ossidazione del NADPH da parte dei granuli di leucociti polimorfonucleati umani.È stato dimostrato che il cianuro stimola sia l'assorbimento di ossigeno che l'attività di shunt dell'esoso monofosfato nella fagocitazione leucociti polimorfonucleati umani Stimola inoltre l'ossidazione del NADPH da parte di una frazione particolata derivata dalle cellule fagocitanti Questa stimolazione della NADPH ossidasi non si osserva in presenza di Mn2+ esogeno Studi con enzimi purificati hanno dimostrato che il CN- stimola anche l'ossidazione del NADPH da parte del rafano perossidasi o lattoperossidasi, suggerendo che il burst respiratorio potrebbe essere avviato dall'attivazione di un enzima simile alla perossidasi nel leucocita polimorfonucleato umano. Sulla base di studi di altri, tuttavia, non sembra che l'enzima sia identico alla mieloperossidasi. Il meccanismo di la CN-stimolazione sembra coinvolgere una reazione a catena ossidativa, poiché stimola marcatamente l'ossidazione di NADPH in presenza di un artificiale ial sistema generatore di superossido.
[Effetto dell'ipossia sulla concentrazione dei coenzimi della nicotinammide nei tessuti dei ratti neonati].Il contenuto dei coenzimi della nicotinammide (NAD, NAD-H , NADP, NADP-H) è stato studiato nel cervello, cuore e tessuto epatico dei ratti neonati tenuti in mezzo gassoso ipossico con un contenuto di ossigeno del 4% per 2 ore e mezza. Si è verificata una marcata riduzione del contenuto di NAD, un accumulo di NAD-H e una diminuzione più che doppia del rapporto NAD/NAD-H particolarmente marcata nel cervello e nel cuore Una riduzione dei valori di NADP-H principalmente nel fegato e del pool generale di NAD-fosfati in i tessuti dei ratti neonati in studio si sono verificati nelle stesse condizioni. I dati ottenuti hanno portato alla conclusione che la carenza di ossigeno ha avuto un'influenza significativa sulla concentrazione e sul rapporto dei coenzimi nicotinammide nei tessuti dei ratti neonati, che a sua volta ha portato alle variazioni del livello e della direzione dei processi redox in condizioni di ipossia.
[Equilibrio acido-base del fluido midollare nel periodo post-rianimazione].Sono stati condotti esperimenti su cani che avevano sostenuto 10 minuti arresto circolatorio causato da elettrotrauma; l'equilibrio acido-base del liquido cerebrospinale (CSF) e del sangue è stato studiato durante il periodo post-rianimazione. Anche se l'acidosi sistemica non compensata persisteva nel corso della prima ora del periodo post-rianimazione, il compenso del CSF l'acidosi si è verificata molto prima e il pH è stato mantenuto al livello iniziale per 6 ore. Nonostante un'elevata concentrazione di lattato per un periodo di 3 ore del periodo post-rianimazione, la concentrazione di bicarbonato è rimasta vicina a quella iniziale in questo periodo.
La dinamica molecolare degli ialuronati in soluzione.Le proprietà dinamiche delle soluzioni di ialuronato sono discusse con rilevanza per alcuni problemi di fisiologia sensoriale (trasduzione meccanoelettrica), fisiologia renale, regolazione del liquido interstiziale, e soprattutto alle cause del glaucoma ad angolo aperto Rispetto all'ultimo problema: poiché recenti evidenze biochimiche indicano che la membrana ialoide non esiste, sembra ora opportuno considerare l'aumento della pressione intraoculare presente nell'occhio con glaucoma da essere dovuto, almeno nel caso ad angolo aperto, ad una variazione del peso specifico e della natura idrofila dell'acido ialuronico nel corpo vitreo in particolare, nonché nel trabecolato. l'evidenza sperimentale indica che il sistema ialuronato potrebbe, infatti, produrre i cambiamenti di pressione osservati nel glaucoma, se il pH intraoculare cambiasse ma leggermente. Un'ipotesi riguardante l'effetto dell'acetazol ammide su intr viene anche presentata la pressione oculare.
La struttura della subunità dell'emocianina del gambero Jasus edwardsii.L'emocianina del gambero Jasus edwardsii(=lalandii) è stata studiata utilizzando l'ultracentrifugazione, viscosità, dicroismo circolare e tecniche di legame dell'ossigeno Esperimenti sulla velocità di sedimentazione a pH 7,0 hanno indicato la presenza delle specie principali con S 20w=16.4 S ea pH più elevato la presenza di una specie con S20,w=5.2S. gli esperimenti hanno prodotto pesi molecolari rispettivamente di 490 000 e 81 000, indicando che l'unità più grande è un esamero dell'unità monomerica Tuttavia, esperimenti preliminari con gel filtrazione ed elettroforesi in condizioni denaturanti indicano che più di una specie di monomero può essere presente con peso molecolare nell'intervallo 76-100 000. Gli spettri di dicroismo circolare (CD) sono presentati a pH 7.0,8.6,10.0 e 11.0 per ossi-, deossi- e apo-emocianine Sono state osservate lievi differenze nell'ampiezza di t si lega in presenza o assenza di Mg++. Sono stati effettuati studi di legame dell'ossigeno a pH 6,1,7,0,8,8 e 10,6, in presenza di 0,01 M MgCl2. L'estensione del legame cooperativo è stata indicata da un valore massimo di n=3.7 ed è stato osservato un pronunciato effetto bohr.
Psicopatia ed eccitazione: una nuova interpretazione della letteratura psicofisiologica.La letteratura psicofisiologica sulla psicopatia viene rivista nel contesto della teoria della bassa eccitazione. Difficoltà nella teoria sono discussi sia in termini generali che specificamente in relazione alla psicopatia. Contrariamente alla teoria della bassa eccitazione, i dati indicano che gli psicopatici mostrano un grado di variabilità nei livelli di eccitazione e reattività più ampio rispetto ai normali indizi. Un modello più accurato del Il disturbo potrebbe essere quello in cui gli psicopatici mostrano un ritmo più veloce e una maggiore entità di cambiamento nell'attività fisiologica e comportamentale rispetto ai normali Si suggerisce che la psicopatia potrebbe essere utilmente vista come un disturbo biochimico manifestato in oscillazioni anormali nel funzionamento dei neurotrasmettitori, nell'attività autonomica e comportamento. La letteratura viene riesaminata alla luce di questa ipotesi e vengono discusse una serie di strade per ulteriori ricerche.
HNMR del legame del succinato con l'aspartato transcarbamilasi. Un confronto dei risultati in D2O e H2O.L'interazione del succinato con l'aspartato transcarbamilasi da Escherichia coli è stata studiata mediante misure di rilassamento a risonanza magnetica dei protoni di metilene dell'acido dicarbossilico in soluzioni di H2O. La dipendenza dal pH e dalla temperatura del rilassamento in presenza di asparte transcarbamilasi nativa o della sua subunità catalitica in soluzioni di H2O è qualitativamente molto simile alla situazione corrispondente che utilizza D2O come il solvente. Dal precedente risultato delle misurazioni in D2O[CB Beard e PG Schmidt, Biochemistry 12(1973)2255] è stato proposto un meccanismo che coinvolge 2 gruppi protonati che influenzano il legame del succinato e sono titolabili nell'intervallo di pH 7-10. Quantitativamente, adattando i dati dalle soluzioni H2O al meccanismo fornisce valori dei parametri di fitting generalmente in buon accordo con gli esperimenti D2O Le principali eccezioni sono Valori di pKa calcolati per i due gruppi titolabili. Per queste specie i valori ottenuti in presenza della subunità catalitica sono 6,7 e 7,8 in soluzioni di H2O contro 7,3 e 8,6 in soluzioni di D2O. In presenza di enzima nativo i valori corrispondenti sono 6,8 e 8,3 in H2O contro 7,6 e 9,2 in D2O. Queste differenze osservate sono coerenti con le differenze nelle costanti di ionizzazione degli acidi deboli in D2O rispetto a H2O. I risultati implicano che l'interazione del succinato con il sito attivo dell'enzima è simile nei due solventi.
Vescicole intracellulari contenenti cristalli nell'epidermide di coralli scleractiniani, Astrangia danae (Agassiz) e Porites porites (Pallas).Cristalli aragonitici ortorombici, incorporati con una matrice lipoproteica granulare e circondate da una membrana trilaminare, sono localizzate nel citoplasma apicale delle cellule epidermiche dei coralli scleractiniani Esemplari adulti di Astrangia danae (Agassiz) e planule sedimentate di Porites porites (Pallas) contengono cristalli in media di 0,7 mu per 0,1 mu per 0,3 mu all'interno di vescicole derivate dal Golgi La marcatura a breve termine con 45Ca rivela la distribuzione della radioattività tra una frazione tissutale basica (92%) una frazione tissutale acida (5%) e una frazione scheletrica (3%). La popolazione di cristalli primordiali all'interno dei visicoli legati alla membrana fornisce prove schiaccianti per la modalità intracellulare di calcificazione nella Scleractinia. Inoltre, consente lo sviluppo di un nuovo concetto di regolazione cellulare su questi eventi dinamici. vescicello legato alla membrana è una stazione di fabbricazione di cristalli in miniatura e un veicolo responsabile del trasporto di cristalli di semi e un materiale di matrice organica ai siti di scarico dalla cellula. La membrana della vescicola diventa un probabile luogo di trasporto attivo e attività enzimatica, nonché una barriera fisica da penetrare per il rilascio del contenuto delle vescicole nell'ambiente extracellulare. Il contatto tra la membrana della vescicola e il plasmalemma comporterebbe l'esocitosi e l'inizio della scheletogenesi. Da quel momento in poi prevarranno i principi che regolano la crescita dei cristalli. Il cristallo rilasciato diventa un catalizzatore di nucleazione e la matrice organica, un apporto di calcio ionico per la cristallizzazione autolimitante. I cristalli sono prodotti dall'organismo spontaneamente e continuamente da poco dopo l'attaccamento larvale per tutta la vita del polipo. Pertanto, queste vescicole legate alla membrana segnalano il processo dinamico mediante il quale viene regolata l'inizio, la differenziazione, la crescita e la limitazione dello scheletro del corallo.
Attività e significato fisiologico dei pleopodi nella respirazione di Callianassa californiensis (Dana) (Crustacea: Thalassinidea).1. I pleopodi di C. californiensis, un potenziale sito per lo scambio di ossigeno extrabranchiale, non contribuiscono in modo significativo al consumo di ossigeno 2. C. californiensis ha una superficie branchiale di 4,13 +/- 0,72 cm2/g di peso corporeo umido, il valore più basso mai riportato per un totale acquatico crostaceo 3. C. californiensis, quando posto in condizioni di tana simulata, regola la PO2 molto liberamente nel suo microhabitat immediato, usando i suoi pleopodi 4. Studi sul campo dei valori di pH e PO2 nelle tane di C. californiensis indicano che il movimento degli animali può giocare gran parte nello scambio idrico tra la superficie e la tana 5. Gli studi sull'attività suggeriscono che l'ossigeno non è critico per C. californiensis a breve termine La percezione dell'ossigeno dopo una lunga privazione può segnalare la possibilità di una rinnovata alimentazione e attività a t la superficie della sua tana.
Genetica e riproduzione asessuata dell'anemone di mare Metridium senile.1. Il metridium senile è stato studiato per la variazione fosfoesoso-isomerasi in tre località di Cape Cod, Massachusetts: Woods Hole, Cape Cod Canal e Barnstable Town Boat Harbour. 2. Tutte e tre le località hanno mostrato un polimorfismo significativo per PHI 3. La mappatura dei singoli polipi è stata eseguita a Barnstable per analizzare le distribuzioni spaziali di cloni e genotipi 4. A Barnstable, La PHI non si discosta in modo significativo dalle aspettative di Hardy-Weinberg al momento dell'insediamento di nuovi polipi e l'insediamento delle larve è spazialmente casuale rispetto al genotipo PHI 5. La riproduzione asessuale era usata come misura del successo relativo di diversi genotipi PHI. Ci sono indicazioni che non tutti i genotipi hanno la stessa probabilità di produrre cloni di grandi dimensioni 6. C'è una significativa eterogeneità tra le tre posizioni rispetto alle frequenze del genotipo PHI, suggerendo che potrebbe esserci differenziazione geografica delle popolazioni. 7. Gli organismi sessili e asessuali forniscono potenti strumenti per esaminare gli aspetti dinamici della struttura genetica nelle popolazioni naturali.
Studi sul meccanismo di ossidazione del NADPH da parte della frazione granulare isolata da cellule ematiche polimorfonucleate umane a riposo.Vari fattori che influenzano l'ossidazione del NADPH da parte dei leucociti umani a riposo granuli (LG) a pH acido, è stato riscontrato che: 1) l'ossidazione di NADPH da parte di LG è stata inibita in misura crescente dall'aumento delle concentrazioni di cianuro nel mezzo ed è stata abolita dal cianuro 4 mM 2) con o senza cianuro nel terreno di incubazione, LG omesso, Mn++ in presenza di produzione di anione superossido indotta da NADPH (O- CON 2), come evidenziato dal consumo di ossigeno e dalla produzione di H2O2, che sono stati aboliti (in assenza di cianuro) dal citocromo C (un potente O- con 2 scavenger). 3) Sia l'ossidazione del NADPH in presenza di 2 mM cianuro (resistente al cianuro) che in sua assenza (sensibile al cianuro) da parte di LG si sono verificati solo in presenza di Mn++, ed entrambi sono stati inibiti dalla superossido dismutasi.4 ) Ossidazione del NADPH resistente al cianuro da parte di LG generata H2O2, è stato inibito da H2O2 e non è stato modificato dalla catalasi "attiva". Il rapporto tra ossidazione di NADPH resistente al cianuro/assorbimento di O2 era compreso tra 1 e 1,25 mM di NADPH e aumentava al di sopra di questa concentrazione. 5) L'ossidazione del NADPH sensibile al cianuro è stata inibita dalla catalasi e aumentata con l'aggiunta di H2O2. Il rapporto tra ossidazione di NADPH sensibile al cianuro/assorbimento di O2 era 2. Si è concluso che dopo l'inizio da O - con 2, prodotto indipendentemente da LG, si verificano due tipi sequenziali di ossidazioni di NADPH dipendenti da LG. In primo luogo, si verifica un'ossidazione NADPH mediata dalla proteina 2-dipendente O - (resistente al cianuro) che genera H2O2 e O - con 2. In secondo luogo, avviene la perossidazione del NADPH (sensibile al cianuro) che utilizza H2O2.
Inattivazione del complesso mitocondriale 2-ossoglutarato deidrogenasi a causa della degradazione dei fosfolipidi indotta dal congelamento-scongelamento.L'inattivazione del complesso 2-ossoglutarato deidrogenasi da parte Il congelamento-scongelamento è stato esaminato insieme alle alterazioni dei fosfolipidi di membrana, al fine di chiarire il meccanismo del danno da congelamento nei mitocondri. L'attività del complesso deidrogenasi nei mitocondri congelati e scongelati lentamente è diminuita al 70% rispetto ai mitocondri intatti e ulteriormente diminuita durante l'incubazione. l'inattivazione durante l'incubazione era dipendente dalla temperatura, cioè a temperature fino a 25 gradi C si è verificata una leggera diminuzione, mentre a temperature più elevate si è verificata una marcata diminuzione dell'attività del complesso deidrogenasi Contemporaneamente si è verificato un significativo accumulo di acidi grassi liberi, generati dai fosfolipidi mitocondriali, che inibiscono la 2-ossoglutarato deidrogenasi e successivamente l'attività del complesso enzimatico. l'attività dell'idrogenasi nei mitocondri è stata notevolmente inibita dalla fosfolipasi A esogena e questa inibizione è stata parzialmente prevenuta con l'albumina di siero bovino. Inoltre, quando la fosfolipasi A intrinseca veniva inibita o stimolata, si verificava una rispettiva diminuzione o aumento dell'inattivazione del complesso enzimatico. L'attività del complesso enzimatico purificato è leggermente diminuita dopo il congelamento lento, ma è rimasta costante anche quando incubata a temperature fino a 32 gradi C. Tuttavia, l'attività di questo complesso enzimatico è stata notevolmente ridotta quando incubata in presenza di fosfolipasi A velenosa o con acido grasso esogeno. Viene discussa la relazione tra l'inattivazione del complesso 2-ossoglutarato deidrogenasi, l'attivazione della fosfolipasi A e la produzione di acidi grassi liberi nei mitocondri congelati e scongelati.
Glutatione eritrocitario elevato associato a substrato elevato nelle pecore ad alto e basso glutatione.La concentrazione di glutatione eritrocitaria aumenta notevolmente nelle pecore quando diventano anemiche. determinare il meccanismo di questo cambiamento nel controllo del glutatione, abbiamo misurato gli enzimi e i substrati necessari per il controllo del glutatione, abbiamo misurato gli enzimi e i substrati necessari per la sintesi del glutatione dopo una perdita di sangue acuta sia a bassa (gamma-glutamilcisteina sintetasi) che ad alta glutatione pecore. Glutammato eritrocitario, ATP e glicina aumentarono drammaticamente in tutte le pecore. La gamma-glutamilcisteina sintetasi eritrocitaria aumentava lentamente e sembrava non correlata ai cambiamenti nel glutatione. Glutatione sintetasi eritrocitaria e le concentrazioni plasmatiche di cisteina, glutammato e glicina non cambiarono significativamente. Apparentemente può essere importante nella regolazione dei livelli di glutatione negli eritrociti.
Idrossilazione del deidroepiandrosterone nella lente dell'occhio.L'idrossilazione dell'ormone steroideo deidroepiandrosterone nella lente del polpaccio è inibita dal monossido di carbonio e stimolata dal NADPH. L'enzima in questione è risultato essere legato alla membrana Sebbene l'enzima assomigli al sistema della monoossigenasi epatica in queste caratteristiche, la presenza del citocromo P-450 nel cristallino non può essere dimostrata misurando uno spettro di differenza con il monossido di carbonio, probabilmente perché il la concentrazione dell'enzima è troppo bassa I preparati di membrane plasmatiche di fibre purificate del cristallino inoltre idrossilano deidroepiandrosterone. Ciò indica che le membrane plasmatiche di fibre fungono da supporto per i complessi enzimatici. In questo senso assomigliano alle membrane citoplasmatiche e alle membrane plasmatiche derivate da altri tessuti. cella contengono l'enzima idrossilante, sebbene la sua attività dipenda dalle condizioni di coltura utilizzate. È sorprendente che nelle fibre del cristallino l'enzima w Tale conversione sembra che il deidroepiandrosterone avvenga specificamente sulle membrane plasmatiche, mentre, ad esempio, nel fegato, le emoproteine localizzate sul reticolo endoplasmatico, esercitano attività di idrossilazione nei confronti di una varietà di steroidi. Ciò suggerisce un ruolo regolatore del deidroepiandrosterone nella crescita e nel metabolismo del cristallino.
The transsulfuration pathway in Tetrahymena pyriformis.Quattro enzimi necessari per il metabolismo della metionina attraverso la via di trans-solforazione, metionina adenosiltransferasi (EC 2.5.1.6 ), adenosilomocisteinasi (EC 3.3.1.1), cistationina beta-sintetasi (EC 4.2.1.22) e cistationina gamma-liasi (EC 4.4.1.1) sono state identificate nel piriforme Tetrahymean La capacità di queste cellule di trasferire 35S da E135S]metionina a anche la forma [35S] cisteina è stata osservata e presa come prova diretta dell'esistenza funzionale di questa via in Tetrahymena. Un intermedio nella via e un donatore di metile attivo, S-adenosilmetionina, è stato identificato qualitativamente in Tetrahymena e la sua concentrazione è risultata essere maggiore nelle cellule in fase stazionaria tardiva che nelle cellule in fase stazionaria precoce.
Fattori che influenzano la quantità e l'attività delle glutammato deidrogenasi di Coprinus cinereus.Analisi cinetiche eseguite con estratti privi di cellule di questo fungo basidiomicete hanno mostrato che la glutammato deidrogenasi legata al NADP ha mostrato interazioni positivamente cooperative con i substrati 2-ossoglutarato e NADPH, cinetica negativamente cooperativa con NADP+ ed era estremamente sensibile all'inibizione dell'attività di deaminazione da parte dell'ammonio e/o dell'ammoniaca. cooperazione positiva con NADH, cinetica di Michaelis-Menten con tutti gli altri substrati ed era soggetto solo a blande inibizioni da parte dei prodotti di reazione Considerati insieme ai valori delle costanti di Michaelis, questi risultati indicano che il primo enzima si occupa principalmente dell'amminazione di 2-ossoglutarato quando la concentrazione di questo substrato supera circa 4 mM, mentre l'enzima legato al NAD è in grado di amminare o deaminare quando le condizioni metaboliche lo richiedono e. La sintesi di entrambi gli enzimi è stata repressa mediante aggiunta di carbamil fosfato o N-acetil-glutammato a colture di miceli che crescono in terreni contenenti glucosio e ammonio come fonti di carbonio e azoto. La crescita in terreni contenenti urea determina la repressione della glutammato deidrogenasi legata al NADP e la derepressione dell'enzima legato al NAD. Tali risultati indicano una connessione tra le glutammato deidrogenasi e il ciclo dell'urea. Si suggerisce che in condizioni normali di crescita su terreni complessi l'azoto sia assimilato sotto forma di amminoacidi e che le glutammato deidrogenasi agiscano a sostegno delle transaminasi per consentire il proseguimento di questo processo, e a sostegno del ciclo dell'urea per consentire lo smaltimento di eccesso di azoto.
Recettore del fattore intrinseco solubilizzato dall'ileo di maiale e sue caratteristiche.È stato dimostrato che il recettore del fattore intrinseco della vitamina B-12 è presente nell'ileo di maiale e localizzato sui bordi a spazzola degli enterociti, e per essere solubilizzabile con Triton X-100. A pH neutro e in presenza di Ca2+ lega il fattore intrinseco vitamina B-12 ma non il complesso vitamina B-12-cobalofilina. Il complesso vitamina B-12-fattore intrinseco-recettore solubilizzato era costituito da due specie molecolari con raggi di Stokes chiari (13,11 e 33,53 nm), coefficienti di sedimentazione (15,1 e 45,1 S) e pesi molecolari (1 600 000 e 12 000 000). una macromolecola più piccola forse rappresentava anche il recettore. Una certa attività recettoriale era presente negli estratti preparati con tamponi privi di detersivo. Vi era evidenza che il recettore fosse una lipoproteina di membrana da cui i lipidi si dissociano reversibilmente. Fattore intrinseco libero legato anche al recettore solubilizzato e al suo Il sito di legame della vitamina B-12 sembrava non essere coinvolto nell'attaccamento al recettore. Una piccola porzione del fattore intrinseco della vitamina B-12 si è spontaneamente dissociata dal recettore e quasi tutti si sono dissociati in presenza di Na2-EDTA. Il raggio di Stokes del complesso dissociato vitamina B-12-fattore intrinseco era di 0,17 nm più piccolo di prima del legame al recettore. Il fattore intrinseco e la cobalofilina erano presenti nell'estratto ileale e sono state fatte osservazioni sulle loro caratteristiche molecolari. Queste proteine, polimeri del complesso vitamina B-12-fattore intrinseco e legame della vitamina B-12 e dei suoi complessi proteici alle micelle detergenti possono dare effetti spuri simili a recettori che devono essere adeguatamente controllati.
Proteina legante per il 5 alfa-diidrotestosterone nella ghiandola sottomandibolare del topo.Le variazioni dei livelli della proteina legante per il 5 alfa-diidrotestosterone nell'estratto citoplasmatico delle ghiandole sottomandibolari durante lo sviluppo sono stati confrontati in topi maschi e femmine utilizzando un test di filtro DEAE-cellulosa. La proteina legante è stata rilevabile per la prima volta 5 giorni dopo la nascita in entrambi i sessi, in un momento coincidente con la citodifferenziazione androgeno-indipendente delle cellule tubulari convolute in ghiandola sottomandibolare. Il livello della proteina legante nelle femmine di topo si è mantenuto a 5 pmol/mg di proteina dopo la nascita, mentre nei maschi ha cominciato a diminuire da 3 settimane dopo la nascita con l'aumento del testosterone sierico, diventando molto meno di un quarto del livello nelle femmine o nei topi immaturi entro 4 settimane dalla nascita. Tuttavia, dopo la castrazione, il livello di proteina legante rilevabile nei topi maschi maturi è aumentato entro 7 giorni allo stesso livello di quello nelle femmine o nei topi immaturi i topi. Ciò suggerisce che la bassa capacità di legame per l'ormone esogeno nei topi maschi maturi è dovuta all'occupazione dei siti di legame da parte dell'ormone endogeno.
Latenza dell'attività dell'esoso-6-fosfato deidrogenasi.I microsomi intatti isolati dal fegato di ratto non hanno mostrato alcuna attività dell'esoso-6-fosfato deidrogenasi, ma il L'enzima è stato attivato da Triton X-100, desossicolato, NH4OH, glicina/NaOH, lisofosfatidilcolina, fosfolipasi A e C, lipasi pancreatica e colesterolo esterasi, e anche mediante trattamento sonico. solubilizzazione, mentre quella da fosfolipasi A sembrava essere dovuta all'azione detergente dei prodotti dell'idrolisi. D'altro canto, gli effetti primari della fosfolipasi C, della colesterolo esterasi e della lipasi pancreatica potrebbero essere spiegati dalla parziale rimozione dei lipidi di membrana. i risultati degli esperimenti di lavaggio e digestione della tripsina hanno suggerito che l'esoso-6-fosfato deidrogenasi è uno degli enzimi più saldamente legati tra le proteine microsomiali. Le proprietà catalitiche erano le stesse nel solubili zed e gli enzimi attivati legati alla membrana. Nutrire i ratti con una dieta ricca di carboidrati ha alterato l'entità dell'attivazione enzimatica mediante sonicazione e trattamento con fosfolipasi C, suggerendo che la membrana microsomiale avrebbe effettivamente subito cambiamenti nella conformazione e/o composizione chimica in determinate circostanze.
Iionizzazione dei gruppi tirosile dell'ovoalbumina in condizioni native e denaturanti.La titolazione fenolica dell'ovoalbumina è stata eseguita nell'intervallo di pH 7-12 a 30 gradi C e a tre forze ioniche vale a dire 0,033, 0,133 e 0,200. L'integrità conformazionale dell'ovoalbumina è stata studiata mediante misurazioni della viscosità a diversi valori di pH nell'intervallo di pH 7-12,4. A forza ionica 0,133 due gruppi fenolici titolati in modo reversibile con pKint = 10,31, e w = 0,032 fino a pH 11,25 in condizioni native. Il valore di w dovrebbe diminuire con l'aumento della forza ionica. Due gruppi fenolici aggiuntivi si sono resi disponibili per la titolazione reversibile tra pH 11,25 e 11,95 dopo alcuni cambiamenti conformazionali. Al di sopra di pH 12, il fenolico la titolazione è diventata irreversibile e tutti i nove residui di tirosina sono stati titolati a pH 13,3 L'esposizione dell'ovoalbumina a pH alcalino (12,4) ha causato una notevole interruzione della conformazione della proteina nativa. Il ridotto aumento della viscosità d da 4,2 ml/ga pH 7,0 a 16,8 ml/ga pH 12,4 in condizioni identiche della concentrazione proteica. Tutti i nove gruppi tirosile dell'ovoalbumina sono stati titolati normalmente (pKint = 9,9) in una miscela di guanidina cloridrato 5 M e urea 1,2 M. Tuttavia, anche in questa miscela l'interazione elettrostatica, misurata da w, non è stata completamente abolita.
Il contenuto di acido gamma-carbossi glutammico della protrombina umana e bovina dopo il trattamento con warfarin.Una forma di protrombina indotta dalla terapia con warfarin, è stata isolata che viene adsorbito su sali di bario insolubili, ma ha una ridotta attività biologica. Questa proteina contiene, in media, sette su dieci possibili residui di acido gamma-carbossi glutammico. È descritta anche una seconda forma di protrombina, che non viene adsorbita nelle lamelle di bario , e ha meno dell'1% dell'attività della proteina normale, contiene solo quattro residui di acido gamma-carbossi glutammico. Il significato di questi risultati è discusso.
Emoglobina Tarrant: alpha126(H9) Asp porta ad Asn. Una nuova variante dell'emoglobina nella regione di contatto alpha1beta1 che mostra un'elevata affinità per l'ossigeno e ridotta cooperatività.Emoglobina (Hb) Tarrant è stato rilevato dalla sua mobilità elettroforetica su acetato di cellulosa (pH 8,4) e agar citrato (pH 6,2), su acetato di cellulosa si muoveva come una banda tra le emoglobine F e S e su agar citrato come una banda all'emoglobina S Negativo il test di solubilità in tampone fosfato 2 M con Na2S2O4. La nuova variante ha una sostituzione dell'asparagina con l'acido aspartico in posizione 126 della catena alfa, uno dei siti coinvolti nel contatto alfa1beta1. Inoltre, nella deossiemoglobina aspartica l'acido 126 di ciascuna catena alfa forma anche un ponte salino elettrostatico non covalente con l'arginina 141 della corrispondente catena alfa (Perutz, MF e Ten Eyck, LF (1972) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 36, 295-310 e Perutz, MF (1970) Nature 228, 726-739). equenza di questa sostituzione nell'emoglobina Tarrant, la conformazione deossi o stato T è destabilizzata perché questi due ponti non possono essere formati. Questa condizione si riflette in un'elevata affinità per l'ossigeno e in una bassa cooperatività.
Legame organico del fosfato all'emoglobina in eritrociti umani intatti determinato mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare 31P.La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare del fosforo (31P NMR) è stata utilizzata per stimare la percentuale di 2,3-difosfoglicerato e ATP legati all'emoglobina negli eritrociti umani intatti a 37 gradi C. Il legame è stato valutato confrontando gli spostamenti chimici (delta) del 2,3-difosfoglicerato e dell'ATP osservati nelle cellule intatte con il delta valori di questi fosfati organici determinati in soluzioni modello che simulano da vicino condizioni intracellulari, in cui la percentuale di legame è stata valutata direttamente mediante ultrafiltrazione su membrana. I risultati hanno mostrato che la percentuale di 2,3-difosfoglicerato legato nelle cellule intatte variava con il pH, lo stato di ossigenazione, e concentrazione di 2,3-difosfoglicerato. I valori variavano dal 33% in cellule incubate con glucosio in aria a un pH intracellulare di 7,2-100% in cellule incubate con inosina in N2 a un pH di 6,75. Alla stessa concentrazione di 2,3-difosfoglicerato, una percentuale maggiore del composto sembrava essere legata negli eritrociti rispetto al sistema modello strettamente simulato. L'ATP non era significativamente legato all'emoglobina in nessuna condizione esaminata, ma sembrava essere fortemente complessato a Mg2+ all'interno dell'eritrocita. Le percentuali di legame sia per il 2,3-difosfoglicerato che per l'ATP nelle cellule intatte stimate mediante spettroscopia 31P NMR erano inferiori a quelle calcolate da altri da costanti di associazione individuali determinate per il legame di diversi ligandi all'emoglobina.
Il legame del calcio al fibrinogeno bovino.La determinazione del numero di siti di legame del calcio del fibrinogeno è stata effettuata mediante esperimenti di equilibrio. Il fibrinogeno a pH 7,5 ha 3 siti di legame ad alta affinità e diversi siti di legame a bassa affinità In presenza di MgCl2 (10(-2)M) i siti a bassa affinità vengono eliminati, suggerendo che non sono specifici e a causa di interazioni deboli Lo studio dell'effetto del pH ha dimostrato che i 3 siti di alta affinità non sono identici. A valori di pH inferiori a 7,5 viene eliminato un sito. Ciò potrebbe essere dovuto sia ad una protonazione anormale che ad un cambiamento conformazionale. Nessuna cooperatività tra i siti è stato trovato. Parziale identificazione del sito di legame mediante titolazione diretta del rilascio di protoni indotto dal calcio hanno mostrato che il calcio è strettamente legato attraverso un sistema chelato. Dall'apparente costante di dissociazione ottenuto un possibile coinvolgimento di istidina resi si suggerisce la quota in questo sistema chelato.
Studi sulla biotrasformazione del lisozima. III. Studi comparativi sulla biotrasformazione del lisozima esogeno ed endogeno nei ratti.Lisozima esogeno di gallina o lisozima endogeno di ratto marcato con 131I è stato iniettato per via endovenosa a ratti con lo stesso dosaggio, rispettivamente, e l'assorbimento e la degradazione del lisozima di ratto marcato con 131I iniettato nel fegato e nel rene sono stati studiati rispetto a quelli del lisozima di gallina marcato con 131I 1. Sebbene i livelli sierici di entrambi gli enzimi iniettati erano quasi identici durante le prime 6 ore, l'assorbimento epatico del lisozima di gallina marcato con 131I era 2,2 volte superiore a quello del lisozima di ratto marcato con 131I al momento di picco di 5 minuti dopo l'iniezione. lisozima di ratto marcato nel rene erano esclusivamente lenti rispetto a quelli del lisozima di gallina marcato con 131 I. 2. La distribuzione intracellulare nel fegato e nel rene è stata esaminata mediante centrifugazione differenziale dopo l'iniezione di ciascun lisozima. la radioattività legata alle proteine di ciascuna frazione subcellulare è risultata essere la più alta nella frazione di 12.000 X g (10 min) nel fegato e nella frazione di 19 600 X g (20 min) nel rene. L'attività specifica relativa di una frazione di 12.000 X g del fegato dopo l'iniezione è aumentata con il passare del tempo. D'altra parte, l'attività specifica relativa della frazione di 105 000 X g (1 h) del fegato ha raggiunto un massimo entro 5 minuti dopo l'iniezione e successivamente è diminuita. Si presumeva che il meccanismo di assorbimento del lisozima di ratto marcato con 131I iniettato nel fegato e nei reni fosse simile a quello del lisozima di gallina marcato con 131I. 3. È stata esaminata la degradazione del lisozima esogeno o endogeno nelle particelle subcellulari. Dall'effetto del pH, dell'attivatore e dell'inibitore sulla degradazione, è stato indicato che l'enzima proteolitico per degradare il lisozima di gallina marcato con 131I iniettato era principalmente catepsina BL, con il pH ottimale di circa 5,0, e il lisozima di velocità marcato con 131I iniettato era principalmente degradato dalla catepsina D, con il pH ottimale di circa 3,5 La degradazione in vitro dei lisozimi esogeni ed endogeni ha mostrato una tendenza simile alla clearance in vivo dal fegato e dai reni.
Equilibrio e cinetica dello sviluppo dell'alfa-lattoalbumina da parte della guanidina cloridrato (IV): dipendenza dell'equilibrio N A transconformazione dalla temperatura.La lo sviluppo reversibile dallo stato nativo (N) allo stato acido (A) dell'alfa-lattoalbumina da parte della guanidina-HCl (0,8-2,0 M) è stato studiato a 10-35 gradi C mediante spettri di differenza e misurazioni del salto di pH. ogni temperatura, tutti i punti tracciati come la costante di equilibrio logaritmica log KNA dell'equilibrio N Un processo contro il pH potrebbe cadere su una curva indipendente dalla concentrazione denaturante spostando ogni punto lungo l'asse log KNA, dove il fattore di spostamento f non dipende da Inoltre, spostando i punti ad ogni temperatura lungo l'asse log (KNA/f), si potrebbe ottenere una curva master, indipendente sia dalla temperatura che dalla concentrazione del denaturante, per la dipendenza dal pH di log KNA. le costanti di velocità logaritmiche sul pH, master c urve indipendenti sia dalla temperatura che dalla concentrazione denaturante potrebbero essere fatte anche per i processi N porta ad A e A porta ad A processi, dove A significa lo stato attivato. I risultati mostrano il carattere a due stati del processo di N equilibrio A. Le variazioni di entalpia e le differenze di capacità termica per i processi di N equilibrio A, N equilibrio A e A equilibrio A sono state determinate dalle misurazioni accurate della dipendenza dalla temperatura dello sviluppo a pH 4,3 e guanidina-HCl 1,0 M. I risultati mostrano che l'interruzione dell'interazione idrofobica è causata principalmente nel processo A porta ad A, mentre la maggior parte dei cambiamenti nei valori di pK dei gruppi ionizzanti sono causati nel processo N porta ad A.
Proprietà funzionali delle emoglobine di trota parzialmente ossidate.Questo articolo riporta uno studio sull'effetto dell'ossidazione parziale sull'ossigeno e sul legame del monossido di carbonio da parte dei componenti I e IV dell'emoglobina di trota. Gli equilibri di legame O2 delle varie miscele di ossidazione mostrano una diminuzione delle interazioni eme-eme all'aumentare del numero di siti ossidati. Tuttavia, l'ampio effetto Bohr, caratteristico dell'Hb Trout IV, viene mantenuto invariato. Allo stesso modo l'andamento temporale della combinazione di CO cambia all'aumentare dell'ossidazione frazionata e si perde il carattere autocatalitico della cinetica di legame della CO; tuttavia la dipendenza dal pH dell'apparente costante "on" nelle miscele di ossidazione è simile a quella caratteristica della molecola nativa. I risultati degli equilibri di O2 e della cinetica di legame della CO possono essere interpretati secondo il modello concertato a due stati che suggerisce che negli intermedi di ossidazione vi è un aumento della frazione n della conformazione ad alta affinità (R). Ulteriori esperimenti sull'effetto dell'azide e del fluoruro, ligandi ferrici che producono un cambiamento dello stato di spin del ferro eme, suggeriscono che potrebbero entrare in gioco anche ulteriori cambiamenti conformazionali di secondo ordine.
Emoglobina Djelfa beta98 (FG 5) Val porta ad Ala: isolamento e proprietà funzionali della forma eme saturata.Emoglobina Djelfa beta98 (FG 5) Val conduce ad Ala è un'emoglobina instabile neutra sostituita, che presenta le stesse caratteristiche grossolane dell'emoglobina Köln beta98 (FG 5) Val conduce a Met. Oltre alla presenza di una frazione deeminizzata, è stata visualizzata un'emoglobina anormale satura di eme e isolata mediante risoluzione elettrofocalizzazione. Da studi funzionali della forma completamente eminizzata, sono stati dimostrati un'affinità leggermente aumentata per l'ossigeno, una compromissione dell'interazione eme-eme e una ridotta risposta ai fosfati organici. Queste perturbazioni funzionali sottolineano l'importanza del residuo valilico invariante beta98, in i contatti quaternari. Possono spiegare lo scarso apporto di ossigeno degli eritrociti.
Attività solubile della fosfatasi adipocitaria di ratto: caratterizzazione ed effetti del digiuno e di vari lipidi.La fosfatasi fosfatasica (fosfatidato fosfoidrolasi, EC 3.1.3.4) era presente ad attività specifica molto elevata nella frazione solubile di adipociti isolati di ratto. Utilizzando il fosfatidato in dispersione acquosa il 90% della sua idrolisi dipendeva dalla presenza di Mg2+. Il Mg2+ sembrava quasi saturare l'enzima a 20-40 mM senza indicazione di un ottimo. La concentrazione del substrato era ottimale a 1,2 mM e il pH a 6,8. Le velocità iniziali erano lineari per soli 4-5 minuti in condizioni ottimali. L'aumento dell'inibizione si verificava a concentrazioni elevate di fosfatidato. In condizioni ottimali l'attività della fosfatasi acida o alcalina non era misurabile. Il Mg2+ l'attività dipendente è stata potenziata da 3-sn-fofatidilcolina e inibita da albumina, 3-sn-fosfatidiletanolamina, 3-sn-fosfatidilinositolo, diacilglicerolo, oleoil-CoA e oleato. il più potente "effettore". Il digiuno per 24, 48 e 72 ore ha diminuito l'attività sia relativa alle proteine che al DNA. L'attività quindi è diminuita a circa un terzo di quella del ratto nutrito durante le 72 ore di digiuno. Gli effetti di Mg2+, vari lipidi e il digiuno possono indicare che una qualche forma di controllo della sintesi dei gliceridi può essere esercitata attraverso la fosfatasi fosfatasi solubile.
Effetti dei cationi bivalenti e del sodio taurocolato sull'attività della lipasi pancreatica con substrati di tributirilglicerolo emulsionati con gomma arabica.Gli effetti di Ca2+ e/o sodio taurocolato su è stata studiata l'attività della lipasi con substrati di tributirilglicerolo emulsionato con gomma arabica. È stato riscontrato che il calcio aumenta leggermente l'attività della lipasi mentre i sali biliari hanno mostrato una marcata inibizione tranne che a concentrazioni molto basse. Il calcio ha eliminato l'inibizione osservata con basse concentrazioni di sali biliari e ha ridotto l'inibizione osservata a bile più alta spostamento dell'enzima dalla regione alcalina in assenza di sale biliare alla regione leggermente acida in presenza di sale biliare. È stato dimostrato che il calcio elimina i periodi di ritardo tra l'aggiunta dell'enzima e la velocità massima di idrolisi osservata a basse concentrazioni di substrato e il intervallo di tempo notato quando i sali biliari sono stati inclusi con le normali concentrazioni di dosaggio del substrato (concentrazione del substrato non limitante). tutte le misurazioni indicavano che il Ca2+ riduceva la carica negativa sulla particella emulsionata di gomma arabica mentre i sali biliari non aumentavano la carica negativa. Si è scoperto che le preparazioni commerciali di gomma arabica hanno concentrazioni significative di Ca2+ e Mg2+.
Inibizione della sintesi di steroli da parte della citrinina in un sistema privo di cellule da fegato di ratto e lievito.La citrinina, un metabolita fungino noto come antibiotico, fortemente ha inibito l'incorporazione dell'acetato marcato nei lipidi non saponificabili da un sistema privo di cellule dal fegato di ratto ma non l'incorporazione del mevalonato marcato Degli enzimi coinvolti nella sintesi del colesterolo, due enzimi, acetoacetil-CoA tiolasi (EC 2.3.1.9) e 3-idrossi- 3-metilglutaril-CoA reduttasi (EC 1.1.1.34), sono stati specificamente inibiti dall'antibiotico. La concentrazione richiesta per il 50% di inibizione era di 0,2 mM per il primo enzima e 0,5 mM per il secondo. Sostanzialmente gli stessi risultati sono stati ottenuti con una cellula sistema privo di lievito, sebbene per l'inibizione fossero necessarie concentrazioni più elevate dell'antibiotico.
Studi sull'aspartasi. IV. Denaturazione reversibile dell'aspartasi di Escherichia coli.Aspartasi (L-aspartato ammoniaca liasi, EC 4.3.1.1) di Escherichia coli , denaturato in guanidina-HCl 4 M, è stato rinaturato in vitro mediante semplice diluizione con un concomitante ripristino dell'attività. Mentre l'enzima nativo ha mostrato un marcato effetto Cotton negativo centrato a 233 +/- 1 nm in dispersione ottica rotatoria, l'enzima ha denaturato in 4 M la guanidina-HCl ha mantenuto poca attività ottica, ma alla diluizione dell'enzima denaturato è stato recuperato più del 90% della struttura ordinata in 1 min, mentre il ripristino dell'attività procedeva molto più lentamente. la cromatografia a permeazione su gel ha indicato che l'enzima tetramerico è soggetto a dissociazione reversibile in subunità monomeriche nelle condizioni sperimentali Vari fattori ambientali come temperatura, pH e concentrazione proteica hanno mostrato una profonda influenza su t il tasso e l'entità della riattivazione. Al fine di esaminare la correlazione tra il ripristino dell'attività e la struttura quaternaria, è stata tentata l'ispezione al microscopio elettronico dei processi cinetici di denaturazione reversibile. Alla diluizione dell'enzima denaturato a 4 gradi C, non sono state rilevate né l'attività né le immagini tetrameriche per diversi minuti. Con lo spostamento della temperatura fino a 25 gradi C, tuttavia, la ripresa dell'attività procedeva rapidamente in concomitanza con la comparsa di molecole tetrameriche. Questi risultati sono compatibili con la possibilità che l'assemblaggio della subunità sia un prerequisito essenziale, ritenuto non sufficiente, per l'attività enzimatica.
Benzamidina come inibitore dell'attivazione della proacrosina negli spermatozoi di toro.Gli spermatozoi epididimali ed eiaculati contengono una forma zimogena di acrosina (proteinasi acrosomiale, EC 3.4.21.10 ) che viene convertito in enzima attivo prima della fecondazione. È stato dimostrato che la benzamidina a concentrazioni superiori a 10 mM inibisce la conversione della proacrosina in acrosina. Sulla base di questa inibizione, è stata sviluppata una procedura per estrarre e quantificare il contenuto di proacrosina dello sperma di toro. Gli spermatozoi sono stati isolati dal liquido seminale e lavati mediante centrifugazione attraverso 1,3 M di saccarosio e la membrana acrosomiale esterna rimossa mediante omogeneizzazione. Quando 25 mM di benzamidina è stata aggiunta allo sperma e alle soluzioni di lavaggio, il 98% o più dell'attività dell'acrosina nell'omogenato spermatico era presente come proacrosina. La proacrosina può essere estratta dallo sperma omogenato mediante dialisi a pH 3, che solubilizza il proenzima e rimuove la benzamidina. La benzamidina è stata utile nell'isolare la proacrosina e fornisce un nuovo metodo per studiare l'attivazione della proacrosina negli spermatozoi intatti. La neutralizzazione degli estratti di sperma, dopo la rimozione della benzamidina, ha determinato una rapida attivazione della proacrosina con un pH ottimale di 8,5 e l'attivazione è stata completata entro 15 minuti in un intervallo di pH compreso tra 7,0 e 9,5. Una rapida attivazione si è verificata anche durante il lavaggio degli spermatozoi in assenza di benzamidina, e questa attivazione è stata correlata con un rigonfiamento della membrana acrosomiale. Questa rapida attivazione sembra derivare da una piccola quantità di attività dell'acrosina costantemente presente nell'estratto di sperma. Questi risultati indicano una conversione autocatalitica della proacrosina in acrosina e suggeriscono che la rottura della membrana acrosomiale può innescare questa attivazione.
Differenze cellula-specifiche nella beta-glucosidasi di membrana dalle cellule normali e di Gaucher.Due isoenzimi della beta-glucosidasi legata alla membrana (beta-D- glucoside glucoidrolasi, EC 3.2.1.21) con attività verso il 4-metilumbelliferil-beta-D-glucopiranoside sono stati identificati in cellule umane. Uno di questi isoenzimi è risultato avere un pH ottimale di 5,0, un Km di 0,4 mM ed essere rapidamente inattivato a pH 4.0 ("acido-labile"). Il secondo isoenzima aveva un pH ottimale di 4.5, un Km di 0.8 mM ed era stabile a pH 4.0 ("acido-stabile"). Linfoide coltivato a lungo termine linee e leucociti del sangue periferico contenevano entrambi gli isoenzimi mentre i fibroblasti cutanei in coltura contenevano solo la forma "stabile agli acidi" in quantità rilevabili. L'attività specifica dell'isoenzima "stabile agli acidi" era gravemente ridotta nei fibroblasti cutanei coltivati, coltivati a lungo -linee terminali e leucociti periferici da pazienti con malattia di Gaucher\'. L'attività specifica dell'enzima "acido-labile" in th Gli ultimi due tipi di cellule erano apparentemente inalterati. L'attività della beta-glucosidasi in tutti e tre i tipi cellulari esaminati era prevalentemente particellare, ma l'enzima poteva essere solubilizzato con basse concentrazioni di Triton X-100. L'enzima solubilizzato richiedeva sodio taurocolato (0,2%) per la massima attività. La beta-glucosidasi solubilizzata non ha mostrato le differenze specifiche delle cellule nel pH ottimale e nel Km mostrati dall'enzima legato alla membrana.
Purificazione e proprietà di un componente della fosfatasi acida prodotta da Aspergillus niger.Un componente, la forma i, della fosfatasi acida (fosfoidrolasi monoestere ortofosforica (acido ottimale), EC 3.1.3.2) prodotto da Aspergillus niger è stato purificato dall'estratto miceliale. L'enzima purificato è risultato omogeneo su gel filtrazione Sephadex G-200, elettroforesi su disco e inattivazione al calore. L'enzima purificato è stato studiato e i seguenti risultati sono stati ottenuto: 1. L'enzima ha catalizzato l'idrolisi di un'ampia varietà di fosfomonoesteri, ma non quella di bis(p-nitrofenil)fosfato, adenosina 3\',5\'-monofosfato ciclico, fruttosio 1,6-difosfato, adenosina 5\ '-difosfato o adenosina 5\'-trifosfato 2. Fluoro, ortofosfato, arsenato, borato, molibdato e (+)-tartrato hanno agito come inibitori. Questo enzima è stato inattivato da N-bromosuccinimide e 2-idrossi-5-nitrobenzil bromuro, e non è stato influenzato da p-cloromercuribenzoat e, N-acetilimidazolo, acido p-diazobenzensolfonico e tetranitrometano. Da questi risultati, si stima che il triptofano svolga un ruolo importante nell'attività enzimatica. 3. Il peso molecolare apparente era 310000 mediante filtrazione su gel di Sephadex G-200. L'elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di sodio dodecil solfato ha suggerito che il peso molecolare della subunità era di circa 89000. 4. L'enzima purificato conteneva il 29% di carboidrati costituiti da glucosamina, mannosio e galattosio. La composizione amminoacidica di questo enzima non era specifica rispetto ad altre fosfatasi acide note.
Fosfatasi alcalina del timo di vitello. I. Proprietà dell'enzima legato alla membrana.Una frazione di membrana di timociti di vitello è stata utilizzata per studiare le proprietà molecolari e catalitiche della fosfatasi alcalina legata alla membrana (fosfoidrolasi ortofosforico-monoestere EC 3.1.3.1) I risultati principali sono stati: 1. La solubilizzazione delle membrane con il detergente non ionico Triton X-100 aumenta l'attività della fosfatasi alcalina del 30-40%. l'attività enzimatica eluisce in un unico picco (raggio di Stokes\' = 7,7 nm) dopo cromatografia in Sepharose 6B in presenza di Triton X-100. L'attività inoltre sedimenta come singolo componente di circa 6,4 S durante la centrifugazione in gradienti di saccarosio contenenti Triton X-100 2. La cromatografia a scambio ionico e la focalizzazione isoelettrica in presenza di Triton X-100 indicano una sostanziale eterogeneità di carica Due bande sovrapposte, un picco a pH 5,92 con una spalla pronunciata a pH 5,29, sono evidenti mediante focalizzazione isoelettrica.3. Il pH ottimale per l'idrolisi del p-nitrofenilfosfato (pNPhP) da parte degli enzimi non disciolti è 9,57. L'attività semimassima si verifica a pH 8,65 e a pH 10,45. Triton X-100 non ha alcun effetto sul profilo del pH. 4. L'attività catalitica è influenzata dalle ammine, in particolare dagli analoghi dell'etanolamina. La dietanolammina esercita un effetto stimolante unico, ma non modifica la dipendenza dal pH. L'aumento della concentrazione di dietanolammina da 0 a 1 M provoca un aumento di 6 volte in Km e un aumento di 10 volte nella velocità di idrolisi di pNPhP. La glicina è inibitoria. 5. EDTA provoca una perdita irreversibile di attività con t1/2 (1 mM EDTA, pH 8,2, 23 gradi C) = 3,5 h. L'attività ottimale si ottiene in 0,1--1,0 mM Mg2+, sebbene ciò non causi il grado di attivazione segnalato che si verifica con gli enzimi purificati. Altri ioni bivalenti sono inibitori. Le concentrazioni richieste per ridurre l'attività al 50% del controllo sono: Zn2+, 4.0 muM (senza Mg2+ aggiunto) e 30 muM (in presenza di 1 mM Mg2+); Mn2+, 0,25 mM (+/- Mg2+); Ca2+, 20 mM (+/- Mg2+). 6. I cationi monovalenti hanno scarso effetto sull'attività. In assenza di Mg2+ aggiunto, 50--150 mM Na+ è parzialmente inibitorio, ma notevolmente meno in presenza di 1 mM Mg2+. K+ non ha effetti significativi. 7. Dei substrati testati, il pNPhP (Km = 44 muM) è stato idrolizzato più rapidamente. Altri substrati (tasso relativo al pNPhP) erano alfa-naftilfosfato (0,79), 2\'-AMP (0,80), 5\'-AMP (0,70), 3\'-AMP (0,63), alfa-glicerofosfato (0,47) e glucosio 6-fosfato (0,35). L'attività della fosfodiesterasi era inferiore o uguale al 10% dell'attività della fosfomonoesterasi (per pNPhP) come evidenziato dalla mancanza di idrolisi del bis(p-nitrofenil)-fosfato e del 3\',5\'-AMP ciclico. La capacità di queste sostanze di inibire l'idrolisi del pNPhP rifletteva la loro capacità di substrati, cioè i più inibitori erano i più rapidamente idrolizzati.
Purificazione e proprietà della polifosfoinositide fosfomonoesterasi dal cervello di ratto.1. Al frazionamento subcellulare dell'omogenato di cervello di ratto, l'attività della polifosfoinositide fosfomonoesterasi è stata maggiore nel citosol rispetto le frazioni membranose 2. L'enzima è stato purificato dal citosol mediante cromatografia su colonna su DEAE-cellulosa, gel di fosfato di calcio e Sephadex G-100. 3. La preparazione finale dell'enzima ha mostrato una purificazione di 430 volte sull'intero omogenato ed è apparso essere omogeneo poiché ha dato una singola banda all'elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide e alla focalizzazione isoelettrica. L'enzima ha un peso molecolare relativamente basso e un punto isoelettrico di 6,8. 4. La fosfatasi ha mostrato un'elevata affinità per il trifosfoinositide. Mg2+, il Km era 25 muM e V era 33 mumol Pi rilasciato/min/mg proteina 5. L'enzima idrolizzato difosfoinositide a una velocità più lenta del trifosfoinositide. nce di 10 mM Mg2+, i valori Km per trifosfoinositide e difosfoinositide erano rispettivamente 5 muM e 25 muM e V era lo stesso per ciascun substrato. 6. Sia Mg2+ che Ca2+ hanno attivato l'enzima. Mentre Ca2+ produceva la massima attivazione a 100 muM, era necessaria una concentrazione molto più alta di Mg2+ (10 mM) per suscitare un'attivazione comparabile. L'enzima non ha mostrato un requisito assoluto di Mg2+ o Ca2+ poiché ha mostrato una bassa attività in presenza di 0,5 mM EDTA o EGTA. 7. La fosfatasi ha mostrato un'attività massima tra 7,4 e 7,6. Un calo del pH a 7,0 lo ha attivato quasi completamente, mentre un aumento del pH a 8,0 ha dimezzato l'attività. 7.0 lo ha attivato quasi completamente, mentre un aumento del pH a 8.0 ha dimezzato l'attività.
Glucokinase of pea seed.1. La glucochinasi (ATP : D-glucosio 6-fosfotransferasi, EC 2.7.1.2) è stata estratta dai semi di pisello e purificata per frazionamento con (NH4)2SO4 e cromatografia su DEAE-cellulosa e Sephadex 2. Le velocità relative di fosforilazione di glucosio, mannosio e fruttosio (concentrazione finale 5 mM) erano 100, 64 e 11. 3. I Km per il glucosio di la glucochinasi dei semi di pisello era 70 muM e il Km per il mannosio era 0,5 mM. Il Km per il fruttosio era molto più alto (30 mM). 4. Gli ioni Mg2+ erano essenziali per l'attività. Mn2+ potrebbe parzialmente sostituire Mg2+ 5. L'attività enzimatica non è stata inibita dal glucosio 6-fosfato. Un certo numero di altri metaboliti non ha avuto effetto sull'attività della glucochinasi. 6. La glucochinasi dei semi di pisello è stata inibita da concentrazioni relativamente basse di ADP.
Purificazione e proprietà dell'aldeide deidrogenasi da Proteus vulgaris.Aldeide deidrogenasi legata al NADP (aldeide: NADP+ ossidoriduttasi, EC 1.2.1.4) è stata purificata da Proteus vulgaris allo stadio di omogeneità come giudicato dall'ultracentrifugazione e dall'elettroforesi su gel di poliacrilammide. Il peso molecolare dell'enzima purificato è stato stimato in 130000 mediante filtrazione su gel. L'enzima che è stato cristallizzato dalla soluzione di solfato di ammonio, ha perso la sua attività. L'enzima non ha richiedono il coenzima A e la reazione era completamente dipendente dagli ioni ammonio che potevano essere parzialmente sostituiti da Rb+ o K+. Il pH ottimale era di circa 9. È stata osservata un'ampia specificità di substrato e i valori di Km per propionaldeide, acetaldeide e isovaleraldeide erano 1,7 - 10(- 5), 4 - 10(-5) e 3 - 10(-5) M. Il ruolo fisiologico dell'enzima nelle cellule viventi è oscuro, ma potrebbe spiegare un'altra via degradativa della L-leucina in P. vulgaris diff proveniente dal percorso stabilito.
Formulazioni cinetiche per l'ossidazione e la riduzione del gliossilato da parte della lattato deidrogenasi.Lattato deidrogenasi di fegato di pollo (L-lattato : NAD+ ossidoriduttasi, EC 1.1. 1.27) catalizza irreversibilmente l'ossidazione del gliossilato (forma idrata) (I) in ossalato (pH = 9.6) e la riduzione di (forma non idrata) (II) in glicolato (pH = 7.4). (I) si attacca a l'enzima nel sito di legame del piruvato e (II) si attacca all'enzima nel sito di legame del lattato L. L'ossidazione di (I) (pH = 9.6) è adattata al seguente meccanismo: (vedi libro). I complessi abortivi , E-NADH-I e E-NAD+-II, sono responsabili dell'inibizione da eccesso di substrato nei sistemi di riduzione e ossidazione, rispettivamente. Quando la lattato deidrogenasi e il NAD+ sono preincubati, compare E-NAD+- NAD+ e provoca l'inibizione per eccesso di NAD+ nei sistemi gliossilato-lattato deidrogenasi-NAD+ e L-lattato-lattato deidrogenasi-NAD+; la seconda molecola di NAD+ si lega a l'enzima nel sito di legame dell'L-lattato.
Bis-(4-metilumbelliferil)fosfato come substrato per l'attività fosfodiesterasica associata alla membrana superficiale delle piastrine di maiale.Si è riscontrato che il nuovo -composto disponibile, bis-(4-metilumbelliferil)fosfato, potrebbe essere utilizzato come substrato per l'attività fosfodiesterasica associata alla membrana della superficie delle piastrine di maiale, solitamente dosata con bis-(p-nitrofenil)fosfato. Questa attività enzimatica è distinta dalla fosfodiesterasi attività verso il 5\'-dTMP-P-nitrofenil estere, che è probabilmente associato alle strutture di membrana intracellulare nelle piastrine. Di conseguenza, l'uso del derivato 4-metilumbelliferile come substrato per l'attività fosfodiesterasica fornisce un saggio fluorimetrico sensibile per questo enzima marcatore della membrana superficiale delle piastrine.
Studi sulla fusione delle membrane. III. Il ruolo dei cambiamenti di fase indotti dal calcio.L'interazione delle vescicole di fosfatidilserina con Ca2+ e Mg2+ è stata esaminata da diverse tecniche per studiare il meccanismo di fusione delle membrane. Sono presentati dati sugli effetti di Ca2+ e Mg2+ sulla permeabilità delle vescicole, sulle transizioni di fase termotropiche e sulla morfologia determinati mediante calorimetria differenziale a scansione, diffrazione di raggi X e microscopia elettronica a frattura di congelamento. discusso in relazione alle informazioni riguardanti il legame del Ca2+, la neutralizzazione della carica, l'impaccamento molecolare, l'aggregazione delle vescicole, le transizioni di fase, le separazioni di fase e la fusione delle vescicole. I risultati indicano che a concentrazioni di Ca2+ di 1,0-2,0 mM, si verifica un fenomeno altamente cooperativo che si traduce in un aumento della vescicola permeabilità, aggregazione e fusione delle vescicole In queste condizioni le catene idrocarburiche dei doppi strati lipidici subiscono un cambiamento di fase da fluido a cristallino uno stato. L'aggregazione delle vescicole che si osserva durante la fusione non è sufficiente, l'intervallo di 2,0-5,0 mM induce l'aggregazione delle vescicole di fosfatidilserina ma non una fusione significativa né un cambiamento di fase. Dall'effetto delle variazioni di pH, temperatura, concentrazione di Ca2+ e Mg2+ sulla fusione delle vescicole, si conclude che l'evento chiave che porta alla fusione della membrana delle vescicole è il cambiamento di fase isotermico indotto dai metalli bivalenti. Si propone che questo cambiamento di fase induca una destabilizzazione transitoria delle membrane a doppio strato che diventano suscettibili di fusione ai confini del dominio.
Caratteristiche di permeabilità dei fantasmi di eritrociti preparati in condizioni isoioniche mediante lisi osmotica indotta da glicole.È stato effettuato uno studio dettagliato delle caratteristiche di permeabilità dell'uomo fantasmi di eritrociti preparati in condizioni isoioniche mediante lisi indotta da glicole (Billah, MM, Finean, JB, Coleman, R. e Michell, RH (1976) Biochim. Biophys. Acta 433, 45-54). Impermeabilità a grandi molecole come destrano (peso molecolare medio 70 000) è stato ripristinato immediatamente e spontaneamente dopo ciascuna delle 5-7 lisi necessarie per rimuovere tutta l'emoglobina. Le permeabilità a molecole più piccole come MgATP2-, [3H]inositolo e [14C]colina sono state inizialmente elevato, ma potrebbe essere notevolmente ridotto mediante incubazione a 37 gradi C per un'ora. L'entità di tale risigillatura diminuiva all'aumentare del numero di lisi a cui erano stati sottoposti i fantasmi. Sia la rimozione dell'emoglobina che la permeabilità alle piccole molecole ne risentivano in modo significativo antly da pH, concentrazioni di CA3+ e chelanti di cationi bivalenti. La massima risigillatura è stata ottenuta nei ghost preparati nel mezzo ionico basico (130 mM KCl, 10 nM NaCl, 2 mM MgCl2, 10 mM N-2-idrossietilpiperazina-N\'-2-acido etansolfonico (HEPES)) a pH 7,0 (0 gradi C) e con un livello di calcio intorno a 10(-5) M. Il pH acido ha facilitato la rimozione dell'emoglobina mentre la presenza di chelanti cationici bivalenti ne ha mostrato il rilascio. La ritenzione di K+ da parte di fantasmi guidati con K+ durante la prima lisi e successivamente incubati a 37 gradi C è stata sostanziale, ma i chelanti della lazione ne hanno rallentato il rilascio. La ritenzione di K+ da parte di fantasmi caricati con K+ durante la prima lisi e successivamente incubati a 37 gradi C è stata sostanziale, ma è stato possibile trattenere poco K+ all'interno dei fantasmi privi di emoglobina. La permeabilità dei fantasmi al K+ dopo una lisi è stata influenzata dalla temperatura, dal pH, dalle concentrazioni di Ca2+ e dalla presenza di chelanti cationici bivalenti.
Flusso di ioni calcio attraverso le membrane di fosfatidilcolina mediato dallo ionoforo A23187.L'antibiotico A23187 trasporta Ca2+ attraverso le membrane Müller-Rudin costituite da 1,2-dierucoyl -sn-glicero-3-fosfocolina e n-decano. La conduttanza delle membrane non è aumentata dal trasporto di Ca2+. Il flusso dipende linearmente dalla concentrazione di Ca2+ e dalla concentrazione di ionofori (oltre pH 6). Aumenta all'aumentare del pH, circa di un fattore 4-5 tra pH 6 e pH 8. Sono stati rilevati flussi massimi di Ca2+ di circa 10(-10) mol-cm-2-s-1. Non è stato possibile rilevare un controtrasporto di H+. La formazione del complesso tra A23187 e Ca2+ nelle vescicole di fosfotidilcolina dell'uovo è stato studiato spettroscopicamente. I risultati sono coerenti con la formazione di un complesso 2: 1. Le misurazioni dell'assorbimento ottico su singole membrane di fofatidilcolina sono state utilizzate per calcolare la concentrazione dello ionoforo A23187 legato alla membrana.
Le reattività dei residui di tirosina e triptofano nel citocromo b5 legato ai lipidiIl citocromo b5 purificato da microsomi epatici di coniglio è stato legato a liposomi preparati da lipidi microsomiali Le catene laterali tirosile e triptofilo della proteina sono state modificate da reagenti idrosolubili e le reattività di questi residui amminoacidici nel citocromo b5 legato al liposoma sono state confrontate con quelle della proteina libera A pH 13, l'80% delle tirosine in il citocromo b5 privo di lipidi si è ionizzato immediatamente, mentre nella proteina legata ai lipidi solo il 65% si è ionizzato entro il primo minuto. Al contrario, l'acetilazione con acetilimidazolo ha portato alla conversione di tutti e 5 i gruppi di tirosina del citocromo privo di lipidi e legato ai lipidi b5 in derivati O-acetilati, che dopo trattamento con idrossilammina sono stati completamente deacetilati La reazione con N-bromosuccinimide ha rivelato che solo il 60% dei 4 residui di triptofano presenti nel citocromo b5 erano accessibili al reagente in la proteina legata ai lipidi, sebbene tutti i triptofani potrebbero essere modificati nel citocromo b5 privo di lipidi. Si è concluso che le due tirosine nella regione che collega la proteina alla membrana non sono schermate dal doppio strato lipidico ma quella dei tre triptofani nella stessa regione uno è completamente sepolto nella membrana, mentre i restanti due triptofani possono essere entrambi parzialmente esposti al solvente o, in alternativa, uno può essere parzialmente e l'altro completamente esposto.
Permeazione dell'acido ureidosuccinico in Saccharomyces cerevisiae.Alcuni ceppi di Saccharomyces cerevisiae mostrano un sistema di trasporto specifico per l'acido ureidosuccinico, che è regolato dal metabolismo dell'azoto. Ureidosuccinico l'assorbimento acido avviene con prolina ma con solfato di ammonio come fonte di azoto è inibito. La V per il trasporto è di 20-25 mumol/ml di acqua cellulare al minuto. Il Km apparente è 3-10 (-5) M. Per il mutante urep1 ( acido ureidosuccinico meno) la concentrazione interna non supera mai quella esterna. Nel ceppo permeasi più l'acido ureidosuccinico può essere concentrato fino a 10 000 volte e il composto accumulato rimane invariato nelle cellule. veleni energetici come dinitrofenolo, carbonil cianuro-m- clorofenildrazone (CCCP) o NaN3 inibiscono l'assorbimento. Nessun efflusso significativo del composto accumulato si verifica anche in presenza di questi farmaci. La specificità della permeasi è molto stretta, solo gli amminoacidi che trasportano un alfa-N-carba myl sono inibitori fortemente competitivi. L'elevata capacità di concentrazione delle cellule e la mancanza di uscita attiva del composto accumulato supportano l'ipotesi di un sistema di trasporto attivo mediato da trasportatori.
ATPasi legata alla membrana di vacuoli e tonoplasti intatti isolati da tessuto vegetale maturo.Vacuoli intatti sono stati isolati da petali di Hippeastrum e Tulipa (Wagner GJ e Siegelman, HW (1975) Science 190, 1298--1299). L'attività dell'ATPasi delle sospensioni fresche di vacuoli è risultata 2-3 volte quella dei protoplasti dello stesso tessuto. Il 70--80% dell'attività dell'ATPasi delle sospensioni intatte i vacuoli sono stati recuperati in preparazioni di tonoplasti. L'antibiotico Dio-9 a 6mug/10(6) vacuoli o protoplasti provoca un'inibizione del 40%. Tuttavia, solo il protoplasto ATPasi è sensibile all'oligomicina. La N,N\'-dicicloesilcarbodiimmide (DCCD) stimola leggermente L'attività dell'ATPasi sia nelle sospensioni di vacuoli che di protoplasti, mentre l'etil-3-(3-dimetilamminopropil carbodiimmide) (EDAC) inibisce fortemente. Studi spettrofotometrici mostrano che nel petalo il contenuto vacuolare ha un pH di 4,0 per Tuplipa e 4,3 per Hippeastrum, mentre il il vacuolo isolato intatto ha un pH interno di 7,0 (in tampone pH 8,0) per (Tulipa e circa 7,3 per Hippeastrum. Sono state trovate concentrazioni di ioni interni di 150, 46, 30, 30 e 6 mM rispettivamente per K+, Na+, Mg2+, Cl- e Ca2+, che sono circa le stesse di quelle dei protoplasti.
Legame della [3H]ctyochalasin B e [3H]colchicina alle membrane plasmatiche epatiche isolate.Il legame alle membrane plasmatiche degli epatociti isolati di inibitori marcati radioattivamente della funzione delle proteine microfilamentose e microtubulari ([3H]citocalasina B e [3H]colchicina, rispettivamente) è stata studiata come mezzo per valutare il grado di associazione di queste proteine con le membrane della superficie cellulare. [3H]citocalasina B che si è comportata in modo identico a quella non marcata composto rispetto al legame a queste membrane è stato preparato mediante riduzione della citocalasina A con NaB3H4. Il legame è stato rapido, facilmente reversibile, proporzionale alla quantità di membrana e relativamente insensibile ai cambiamenti di pH o forza ionica. A 10 (-6) M [3H]citocalasina B, glucosio di p-cloromercuribenzoato, un inibitore del trasporto del glucosio ha inibito il legame di circa il 20%; il trattamento di membrane con 0,6 M KI che depolimerizza l'actina F in actina G ha causato circa il 60% di inibizione del legame. Questi due tipi di inibizione erano additivi indicando due classi separate di siti di legame, uno associato al trasporto dello zucchero e uno ai microfilamenti. Strutture filamentose con il diametro di microfilamenti (50 A) sono state osservate in micrografie elettroniche di sezioni sottili delle membrane. A concentrazioni superiori a 10(-5) M [3H]citocalasina B, il legame era proporzionale alla concentrazione del farmaco, caratteristica dell'adsorbimento o del partizionamento non specifico. Anche le membrane intracellulari dell'epatocita si legano alla [3H]citocalasina B, quelle del reticolo endoplasmatico liscio in misura maggiore rispetto alle membrane plasmatiche. [3H]La colchicina si lega alle membrane plasmatiche in proporzione alla quantità di membrana e ad una velocità compatibile con il legame alla tubulina. Tuttavia, altre proprietà del legame, inclusi gli effetti della temperatura, della concentrazione del farmaco e degli antisieri contro la tubulina, erano diverse da quelle del legame con la tubulina. Quindi, non è stata ottenuta alcuna prova dell'associazione di elementi microtubulari con queste membrane. Nonostante ciò, sembrava esserci un'interdipendenza tra i microtubuli e gli inibitori dei microfilamenti: il solfato di vinblastina stimolava il legame della [3H]citocalasina B e la citocalasina B stimolava il legame della colchicina 3H. [3H]La colchicina si lega anche alle membrane intracellulari, in particolare ai microsomi lisci.
Trasporto di cationi nelle vescicole ricostituite di citocromo ossidasi.La traslocazione di cationi attraverso la membrana delle vescicole ricostituite di citocromo ossidasi può essere seguita con un semplice metodo spettrofotometrico. Citocromo ossidasi vescicole ricostituite, integrate con ascorbato e citocromo C. inducono grandi cambiamenti spettrali del colorante positivo safranina, invertito da disaccoppianti e inibitori della respirazione. Il colorante è probabilmente accumulato nello spazio interno delle vescicole, dove raggiunge elevate concentrazioni e aggregati. gli spostamenti spettrali e le variazioni di assorbanza, dovute all'aggregazione, sono proporzionali alla quantità di colorante assorbita e dipendono dal controllo respiratorio. In presenza di potassio, la valinomicina provoca un'inibizione, mentre la nigericina stimola la captazione del colorante. I dati sono discussi in termini di flussi dipendenti dal potenziale elettrico.
Protonazione legata all'energia della chinacrina nelle membrane subcondriali del cuore di manzo.1. Lo spettro di assorbimento della chinacrina in soluzione acquosa, nella regione visibile, cambia con il pH del mezzo nell'intervallo di pH da 6,0 a 9,0 con un punto isosbestico a 353 nm. Ciò indica che le forme di chinacrina monoprotonata (quinacrina - H+) e diprotonata (quinacrina - 2H+) all'equilibrio in questo intervallo di pH hanno a stechiometria 1 a 1. 2. Le forme monoprotonate e dipronate alla chinacrina mostrano spettri di emissione di fluorescenza simili, ma distinti spettri di eccitazione della fluorescenza 3. Si stimano le rese quantiche di fluorescenza relative della chinacrina in mezzi acquosi di vari valori di pH. La fluorescenza relativa La resa quantica della chinacrina a pH 9,0 è più di 3 volte quella a pH 6,0 4. Gli spettri di eccitazione e di emissione della fluorescenza, nonché la resa quantica relativa della fluorescenza della chinacrina associata a non-energi membrane subcondriali zed, sono simili a quelle della sola chinacrina. 5. Le analisi degli spettri di assorbimento, degli spettri di eccitazione della fluorescenza e della relativa resa quantica di fluorescenza indicano che la diminuzione della fluorescenza legata all'energia della chinacrina associata alle membrane subcondriali energizzate risulta dalla protonazione della chinacrina - H+ per formare la chinacrina - 2H+. 6. Vengono forniti dati quantitativi che indicano che l'efficienza massima della protonazione della chinacrina - H+ per formare la chinacrina - 2H+ dipende dalla concentrazione di H+ nelle membrane generate attraverso l'accoppiamento energetico e dalla concentrazione di chinacrina - H+ inizialmente presente nel mezzo di reazione. In condizioni ottimali si osserva una conversione virtualmente completa della chinacrina - H+ in chinacrina - 2H+. 7. L'intensità di fluorescenza della chinacrina, da sola o associata a membrane subcondriali non energizzate, diminuisce con l'aumentare della temperatura. Quando la chinacrina è associata alle membrane energizzate, tuttavia, la sua intensità di fluorescenza aumenta leggermente con l'aumentare della temperatura. Questo insolito comportamento di fluorescenza verso la temperatura, insieme al fatto che in condizioni ottimali praticamente tutte le molecole di chinacrina associate alle membrane energizzate sono in forma diprotonata, conferma ulteriormente la nostra precedente conclusione che le molecole di chinacrina diprotonate sono strettamente legate alle membrane energizzate in un moda che non consente un pronto equilibrio con il mezzo esterno.
Meccanismo di reazione degli elettroni idrati con il ferrocitocromo c.1. L'elettrone idrato reagisce con il ferrocitocromo c per formare un intermedio instabile. Questo intermedio decade in un modo del primo ordine per dare, in prima istanza, un prodotto che ha uno spettro di assorbimento simile nell'intervallo 400-610 nm come normale ferricitocromo C. 2. A 21 gradi C la costante di velocità per la reazione di elettroni idrati con ferrocitocromo c a pH 7,4 (tampone fosfato 2 mM) è (3,0 +/- 0,3) = 10(10) M-1 - S-1. Quando il pH aumenta al di sopra del pH 8,0 la costante di velocità diminuisce costantemente. La dipendenza di la costante di velocità sul pH può essere spiegata se il ferrocitocromo c ha un pK di circa 9,2. 3. A 21 gradi C e pH 7,4, la costante di velocità per il decadimento dell'intermedio è (1,40 +/- 0,15) - 10 (5) S-1. Questa reazione non mostra alcuna dipendenza dal pH nell'intervallo 6-2-11.0 4. Viene proposto un meccanismo per cui l'atomo di metallo centrale del ferrocitocromo c è oxi dased e un legame tioetere è ridotto. La specie ferricitocromo c risultante sviluppa quindi lentamente un'assorbanza a 606 nm a causa dell'attacco del gruppo sulfidrilico sull'eme.
Studi di dicroismo circolare di angiotensina II e analoghi: effetti della sequenza primaria, del solvente e del pH sulla conformazione della catena laterale.Aspetti conformazionali del ormone pressore angiotensina II e 11 dei suoi analoghi strutturali sono stati studiati mediante dicroismo circolare Ogni posizione del peptide è stata sostituita singolarmente con un residuo alifatico e alterazioni degli spettri CD degli analoghi risultanti nelle regioni spettrali peptidica e aromatica (320-250 nm , 250-190 nm) sono stati esaminati. Gli spettri di questi peptidi in soluzione di 2,2,2-trifluoroetanolo consentono di stimare l'importanza relativa delle varie catene laterali nel mantenimento della conformazione dorsale dell'ormone. L'evoluzione degli spettri CD in entrambe le regioni spettrali dei peptidi in soluzione acquosa durante una titolazione da pH 1 a pH 12 consentono di chiarire ulteriormente il ruolo dei gruppi ionizzabili e la loro interazione con amminoacidi aromatici come la tirosina. I risultati ottenuti indicano che le sostituzioni in acido aspartico 1, prolina 7 e fenilalanina 8 dell'angiotensina II comportano cambiamenti nella conformazione della spina dorsale. D'altra parte, le catene laterali di valina 3, isoleucina 5 e l'istidina 6 biologicamente essenziale servono principalmente ad allineare correttamente l'anello fenolico della tirosina in posizione 4.
Determinazione dello stato di ionizzazione mediante spettroscopia Raman di risonanza Il legame della solfonammide all'anidrasi carbonica.La spettroscopia di risonanza Raman (RR) è stata utilizzata per studiare lo stato di ionizzazione di la sulfonamide, 4\'-sulfamilfenil-2-azo-7-acetamido-1-idrossinaftalen-3,-6-disolfonato (Neoprontosil), legato all'anidrasi carbonica La correlazione degli effetti del pH e della deuterazione sugli spettri dei composti modello con questi effetti sullo spettro del Neoprotosil ci permette di assegnare al gruppo SO2NH2 bande spettrali nelle regioni 900-1000 e 100-1200 cm-1. Grandi spostamenti in queste bande si verificano in seguito alla ionizzazione della sulfonamide. In base alle posizioni di bande nel complesso enzimatico, è stato determinato che la sulfonamide era legata all'enzima come SO2NH2, piuttosto che come SO2NH-. I tassi di associazione e dissociazione e la costante di equilibrio di dissociazione sono stati misurati in funzione del pH. Il comportamento del tasso per Neoprontosil è coerente con quello osservato per altri sulfonamidi e kdissoc/kassoc = kdissoc, suggerendo un meccanismo di legame in un solo passaggio. Poiché la spettroscopia RR stabilisce che lo stato di ionizzazione finale della sulfonamide nel complesso enzimatico è SO2NH2, la sulfonamide protonata deve legarsi direttamente alla forma basica dell'enzima. Queste conclusioni suggeriscono che i sulfamidici formano complessi nello "spazio esterno" con il metallo nel sito attivo dell'enzima.
Dissociazione e ricostituzione della ferrossidasi umana II.La proteina ferrossidasi II del siero umano è grande e strutturalmente complessa. Possiede lipidi legati alle proteine e rame componenti essenziali per il mantenimento della sua attività catalitica. Il trattamento della ferrossidasi II con urea 8 M, guanidina cloridrato 6 M o guanidina cloridrato 6 M e l'alchilazione non determinano la dissociazione dell'enzima in subunità. Tuttavia, il trattamento con sodio il dodecil solfato provoca la dissociazione della ferrossidasi II in due subunità non identiche, designate SI e S-II. SI contiene poco fosfolipide, colesterolo o rame e ha un peso molecolare di 3,8-3,9 X 10 (5). Al contrario, S- II contiene fosfolipidi legati, colesterolo e rame e ha un peso molecolare di 2,2-2,4 X 10 (5). La composizione lipidica di S-II è identica all'enzima nativo. Il SI privo di sodio dodecil solfato non mostra attività ferrossidasi. seguire rimozione delle ali del sodio dodecil solfato, S-II mostra attività ferrossidasica ma S-II perde rapidamente la sua attività in assenza di S-I. Le subunità separate si riassociano spontaneamente dopo la rimozione del sodio dodecil solfato per produrre un enzima completamente attivo che appare chimicamente identico alla ferrossidasi II nativa. Inoltre, l'enzima ricostituito è stabile. Sia la ferrossidasi II nativa che quella ricostituita possono essere conservate a 4 gradi C per 6 settimane senza alcuna perdita di attività. Ciò suggerisce che S-II, la subunità contenente rame e lipidi, è la subunità catalitica e che S-I è essenziale per la stabilizzazione dell'attività enzimatica di S-II. Questi risultati forniscono informazioni sulla struttura molecolare e sulla composizione chimica della ferrossidasi II e suggeriscono che la struttura nativa completa della ferrossidasi II è necessaria per il mantenimento dell'integrità funzionale i-s.
Effetto del magnesio sulle proprietà della fosfatasi alcalina di zinco.Fosfatasi alcalina di Escherichia coli, isolata mediante procedimenti che non ne alterano il contenuto metallico intrinseco, contiene 4,0 +/- 0,3 g-atomi di zinco strettamente legato per mole (Kd meno di 1 muM) e 1,3 +/- 0,2 g-atomi di magnesio per mole (Bosron, WF, Kennedy, FS e Vallee, BL (1975 ), Biochimica 14, 2275-2282). È importante sottolineare che il legame del magnesio dipende sia dal pH che dal contenuto di zinco. Pertanto, l'incapacità di assegnare la massima stechiometria del magnesio all'enzima isolato mediante procedure convenzionali può essere considerata una conseguenza delle condizioni scelte per la crescita batterica ottimale e la purificazione dell'enzima che non sono le condizioni per il legame ottimale del magnesio alla fosfatasi alcalina Nelle condizioni impiegate per i presenti studi sperimentali, sono disponibili un massimo di sei siti metallici per legare zinco e magnesio, cioè quattro per zinco e due per ma gnesio. Il magnesio da solo non attiva l'apoenzima, ma regola la natura del ripristino zinco-dipendente dell'attività catalitica dell'apofosfatasi, aumentando di cinque volte l'attività dell'enzima contenente 2-g-atomi di zinco e quella dell'enzima contenente 4-g- atomi di zinco 1,4 volte. Inoltre, lo scambio idrogeno-trizio rivela gli effetti stabilizzanti del magnesio sulle proprietà strutturali della fosfatasi. Tuttavia, né il KM per il substrato né la stechiometria che lega il fosfato e il Ki sono significativamente alterati dal magnesio. Quindi, il magnesio, che è legato in modo specifico all'enzima, stabilizza la struttura proteica dinamica e regola l'espressione dell'attività catalitica dello zinco nella fosfatasi alcalina.
Variazione del pH dei parametri cinetici e del meccanismo catalitico dell'enzima malico.Variazione del pH dei parametri cinetici per la decarbossilazione ossidativa dell'L-malato e la decarbossilazione dell'ossalacetato catalizzata dall'enzima malico è stata utilizzata per ottenere informazioni sul meccanismo catalitico di questo enzima. Con Mn2+ come attivatore, un residuo del sito attivo con un pK di 5,4 deve essere protonato per la decarbossilazione dell'ossalacetato e ionizzato per la decarbossilazione ossidativa di L-malato. Con Mg2+ come metallo, questo pK è 6, e, ad alto pH, V/K per L-malato diminuisce quando vengono deprotonati gruppi con pK di 7,8 e 9. Il gruppo a 7,8 è un acido neutro ( pensato per essere l'acqua coordinata a Mg2+), mentre il gruppo a 9 è un acido cationico come la lisina. Il profilo V per la reazione del malato mostra questi pK spostati verso l'esterno di 1,4 unità di pH, poiché lo stadio limitante è normalmente il rilascio di TPNH, e la reazione chimica, che è sensibile al pH, è 25 volte Più veloce. Il legame TPN è diminuito dalla ionizzazione di un gruppo con pK 9.3 o dalla protonazione di un gruppo con pK 5.3. La variazione del pH del Km per Mg mostra che la protonazione di un gruppo con pK 8.7 (possibilmente SH) diminuisce il legame del metallo in presenza di malato di un fattore 1400, e in assenza di malato di un fattore 20. Un meccanismo catalitico viene proposto in cui il trasferimento di idruro è accompagnato dal trasferimento di un protone al gruppo con pK 5,4-6 e l'enolpiruvato è protonato dall'acqua coordinata al Mg2+ (pK 7,8) dopo decarbossilazione e rilascio di CO2.
Determinazione dei passaggi limitanti per l'enzima malico mediante l'uso di effetti isotopici e altri studi cinetici.Gli effetti isotopici sono stati misurati con Mg2+ come l'attivatore e l'L-malato marcato con deuterio o trizio al carbonio 2 come substrato nell'intervallo di pH 4-10. Confronto dell'effetto dell'isotopo di deuterio quasi indipendente dal pH su V/Kmalato di 1,5 con l'effetto trizio di 2,0 dal Il metodo di Northrop (Northrop, DB (1975), Biochemistry 14, 2644) fornisce limiti sul vero effetto della sostituzione del deuterio sulla fase di rottura del legame di 5-8 nella reazione diretta e 4-6,5 nella direzione inversa. l'effetto del deuterio su V/K con l'effetto dell'isotopo 13C di 1.031 riportato da Schimerlik et al (Schimerlik, MI, Rife, JE e Cleland, WW (1975), Biochemistry 14, 5347) permette di dedurre che a pH 8 il trasferimento inverso dell'idruro è da sei a otto volte più veloce della decarbossilazione, che è quindi largamente limitante per il ca reazione talitica. L'assenza di un effetto isotopico del deuterio su V a pH 7-8 e il confronto del Ki del piruvato come inibitore non competitivo della reazione diretta e substrato per la reazione inversa indicano che a pH neutro il rilascio di TPNH da parte dell'enzima ridotto nucleotide trifosfopiridinico (E-TPNH) è il passo limitante nella direzione in avanti. L'osservazione di un effetto del deuterio su V che si avvicina a 3 a pH 4 e 10 mostra, tuttavia, che, a pH molto bassi e molto alti, il trasferimento di idruro può diventare in parte limitante la velocità. Nella reazione inversa, il probabile passaggio limitante della velocità a pH 7 è l'isomerizzazione di E-TPNH, mentre a pH 8,5 e oltre V diventa troppo grande per essere misurato e appare infinito. La sostituzione di Co2+, Ni2+ o bassi livelli di Mn2+ con Mg2+ dà effetti simili all'isotopo di deuterio, sebbene i valori di V e Kmalate varino considerevolmente con il metallo. La cinetica di Mn2+ mostra una cooperatività pronunciata negativa, con valori di Km di 7 muM e 5 mM per intervalli di concentrazione da 4 a 100 muM e oltre 1 mM.
Studi termodinamici e conformazionali su una catena leggera di immunoglobuline che precipita reversibilmente a basse temperature.Una catena leggera lambda, isolata da una molecola di immunoglobulina G, è stata trovato per precipitare in modo reversibile a basse temperature. Questa crioprecipitazione era una funzione del pH, della forza ionica, della concentrazione proteica e del tempo, nonché della temperatura. La catena lambda ha subito un cambiamento conformazionale cooperativo quando la temperatura è stata abbassata da 26 a 0 gradi C come giudicato mediante spettroscopia a differenza ultravioletta e dicroismo circolare. Le normali catene lambda non hanno mostrato alcun cambiamento conformazionale. Con la spettroscopia differenziale è stato possibile calcolare la costante di equilibrio che governa il cambiamento conformazionale. Il cambiamento era fortemente esotermico (delta H circa -80 kcal mol-1) e accompagnato da una grande diminuzione dell'entropia (delta S circa -280 eu). Il punto medio della transizione dipendeva dalla concentrazione proteica iniziale n, suggerendo che solo il dimero non covalente della catena lambda ha mostrato il cambiamento conformazionale. L'esistenza di un eqiulibrium monomero-dimero (KA circa 4 X 10(5) M-1) è stata confermata dalla velocità di sedimentazione. Nessun cambiamento conformazionale è stato osservato dal dicroismo circolare a concentrazioni in cui più del 95% della catena lambda era sotto forma di monomero. Sebbene l'elevata forza ionica abbia inibito la crioprecipitazione, non ha avuto alcun effetto sul cambiamento conformazionale. La stabilizzazione del dimero formando un legame disolfuro intercatena tra due monomeri ha abolito sia il cambiamento conformazionale che la crioprecipitazione. Un frammento corrispondente alla regione costante è stato isolato dal digestato sia peptico che triptico della catena lambda. Questo frammento non ha crioprecipitato né ha mostrato cambiamenti conformazionali dipendenti dalla temperatura. Si è rivelato impossibile isolare un frammento corrispondente alla regione variabile. Vengono presentati modelli sia qualitativi che quantitativi per spiegare il comportamento della catena lambda a basse temperature.
Interazione di acetazolamide e ione 4-nitrotiofenolato con derivati di ioni metallici bivalenti dell'anidrasi carbonica bovina.La stabilità e le costanti di velocità per l'interazione di acetazolamide ( diamox) e lo ione 4-nitrotiofenolato (NTP) con le forme bivalenti Mn, Co, Ni, Cu e Cd dell'anidrasi carbonica bovina sono state misurate utilizzando gli spettri visibili distinti di ciascun addotto metalloenzima-NTP. (in particolare) i complessi diamox risiedono principalmente in valori variabili per le costanti di velocità di dissociazione (kd). Le costanti di velocità di formazione intrinseca (per la forma acida dell'enzima che reagisce con la forma basica del ligando) sono uniformemente alte (maggiori o uguali a 2 X 10(7) M-1 s-1 a 25 gradi C). L'invarianza di kd con pH e un profilo log K-pH a campana con gli addotti dell'enzima Cu sono caratteristiche osservate in precedenza con l'enzima nativo. Legame di NTP con i metalloenzimi Cu e Cd sono più forti di to la forma nativa.
Energetica del legame cooperativo e non cooperativo della nicotinammide adenina dinucleotide alla gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi di lievito a pH 6,5 e pH 8,5. Analisi dell'equilibrio e calorimetrica in un intervallo di temperature. Il legame della nicotinammide adenina dinucleotide (NAD+) alla gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GPDH) di lievito è stato studiato a pH 6,5 e 8,5, a 5,25 e 40 gradi C, mediante calorimetria, fluorometria , spettrofotometria, dialisi all'equilibrio e dialisi a flusso Come riportato in precedenza per pH 7.3 (Velick SF, Baggott, JP e Sturtevant, JM (1971), Biochemistry 10, 779), il legame è accompagnato da cambiamenti di entalpia che diventano rapidamente più negativi all'aumentare della temperatura, con delta Cp = da -500 a -750 cal deg-1 (mole di NAD+ legato)-1, e da variazioni di entropia che, come richiesto dall'ampio delta Cp negativo, diventano rapidamente più negative con l'aumentare temperatura I dati vincolanti a pH 6.5 possono essere f itti sulla base di quattro siti identici non interagenti, o di quattro siti che mostrano un piccolo grado di cooperatività negativa. I dati a pH 8,5, in particolare a 40 gradi C, richiedono l'introduzione di una cooperatività positiva, come precedentemente dimostrato da Kirschner et al. (Kirschner, K. , Eigen, M. , Bittman, R. e Voigt, B. (1966), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 56, 1661), e può essere ugualmente ben adattato sulla base di un modello sequenziale (Adair, GS (1925), J. Biol. Chem. 63, 529) o un modello concertato (Monod, J. , Wyman, J. e Changeux, JP (1965), J. Mol. Biol. 12 , 88). Si propone che i cambiamenti termodinamici osservati siano in gran parte il risultato di un effetto idrofobo dovuto a una diminuzione dell'esposizione dei gruppi non polari al solvente e di un restringimento della struttura proteica quando il coenzima è legato con una concomitante diminuzione del numero di gradi di libertà interni facilmente eccitabili.