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input stringclasses 6 values	output stringlengths 0 10.2k	instruction stringlengths 4 833k
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 원문을 바탕으로 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 생성하세요.	이러한 손실들은 태양 에너지를 기반으로 하는 무선 센서 노드를 설계할 때 센서 노드의 수명을 예측하기 위해서 고려되어야 할 요인들이다.	다음 텍스트에서 제공된 문맥을 정확히 이해하고, 마지막 문장을 자연스럽고 문맥에 맞게 완성하세요. 문장은 이전 내용과 논리적으로 연결되어야 합니다. #텍스트: 무선 센서 네트워크는 근거리 무선통신 장치를 이용하고 배터리로 동작하며 다양한 분야에서 유용하게 사용된다. 일반적으로 무선 센서 네트워크는 수백에서 수천만 개의 노드들을 이용하며 산, 숲, 도로, 건물 등 사람의 손이 닿기 어려운 곳에 배치된다. 이러한 이유로 배터리 방전 시 교체 및 충전이 쉽지 않으므로 한 개의 배터리로 최소 몇 년 이상 동작할 수 있어야 한다. 즉 배터리의 수명이 그 센서네트워크의 수명을 좌우한다고 할 수 있다. 이러한 배경으로 무선 센서 네트워크에서 신재생 에너지를 사용하여 수명을 연장하려는 연구가 진행되어 왔다. 특히 태양 에너지는 매일 사용할 수 있고 에너지의 밀도가 다른 에너지원들 보다 높아 많이 이용되고 있다. 하지만 태양 에너지를 사용할 때에는 태양으로 부터의 일사량이 끊임없이 변하고 또한 태양의 이동 때문에 각도 및 과열과 결빙 손실, 오염 등에 의한 손실들이 발생한다.
	무려 2만3천명에 달하는 광주·전남지역 학생들이 2019광주FINA세계수영선수권대회를 오는 28일까지 체험학습으로 관람하는데, 학생들은 세계적 행사를 눈으로 직접 보며 국제적 시각과 함께 광주정신과 도전정신을 배우게 한다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 광주 89개교·전남 53개교 참여 28일까지 체험학습으로 관람 국제적 시각·광주정신·도전정신 배워…진로 결정 등에 도움 무려 2만3천명에 달하는 광주·전남지역 학생들이 2019광주FINA세계수영선수권대회를 오는 28일까지 체험학습으로 관람한다. 학생들은 세계적 행사를 눈으로 직접 보며 국제적 시각과 함께 광주정신과 도전정신을 함께 배우고 있다. 일부 학생들은 “진로를 결정하는 데 도움이 될 것 같다”며 스포츠 산업분야에 대한 꿈을 드러냈다. 광주에선 모두 89개교 1만8천336명이 대회장을 찾는다. 전남에선 53개교 4천528명이 예약을 했다. 16일 광주 학생 4천959명은 다이빙, 수구, 아티스틱 경기를 관람했다. 광주시교육청 장휘국 교육감은 이날 남부대학교 수구장에서 열린 세계수영선수권대회 한국 대 러시아의 여자 수구 경기를 교육청 직원 100명, 전자공업고등학교와 첨단중학교 등 학생·교직원 1천200여명과 함께 관람했다. 교육청 직원과 학생들은 손에 땀을 쥐게 하는 박진감 넘친 경기를 보며 열띤 응원을 펼쳤다. 1 대 30으로 러시아에게 패했으나 여자 수구 사상 첫 골을 넣은 ‘각본 없는 드라마’를 관람하며 승패에 연연하지 않고 최선의 노력을 다해준 우리 선수들에게 아낌없는 갈채와 찬사를 보냈다. 수준높은 경기를 보여주며 페어플레이를 해준 러시아 선수들에게도 힘찬 격려의 박수를 아끼지 않았다. 시교육청은 광주에서 펼쳐지는 다이빙 등 모든 종목에 대해 학생 현장체험 학습용 입장권을 예매했다. 학생들이 관람을 위해 이용한 버스만 380대에 달한다. 이 외에도 더 많은 홍보와 안내를 통해 학생, 학부모들이 참여해 수영대회가 성공적으로 마무리 될 수 있도록 광주시 및 조직위와 협조해 나갈 계획이다. 장 교육감은 “광주세계수영선수권대회 관람을 통해 학생들이 실패에 두려워하지 않고 새로운 것에 도전하는 열정과 끈기를 갖고 열심히 생활할 수 있는 계기가 됐으면 한다”고 말했다. 이어 “친절과 질서 있는 성숙한 시민의식으로 선수단에게 의향·예향·미향의 도시 광주의 이미지를 심어주고, 슬로건인 ‘평화의 물결 속으로’처럼 남북 화해 무드가 무르익어 평화통일과 세계평화에 이르는 발판이 될 것으로 기대된다”고 강조했다. /김종민 기자 김종민 기자
	통합학교에 따라 개설되는 교과와 교육과정 운영 방식은 다양할 수 있을 것이다. 이에 따라 학교급간 통합에 따른 연계 교육과정 운영, 연령이 아닌 학생의 교육 수준(레벨)에 따른 학습집단 운영, 통합학교 유형에 따른 교육과정 운영 모델 등에 대한 연구가 필요하다. 또한 통합학교에 근무하는 교원들은 다른 학교급의 특성(교육과정, 학생 발달 단계와 특징 등)에 대한 이해를 높일 필요가 있다. 이에 따라 통합학교에 근무하는 교원을 대상으로 한 맞춤형 연수, 학교별로 통합학교 운영의 애로점, 요구 사항은 차이가 있을 것이라는 점에서 학교별 연수를 강화할 필요가 있을 것이다. 이와 더불어 통합학교에 근무하는 교사들의 전보, 승진 등 인사 관리에서 고려해야 할 점에 대한 검토가 이루어질 필요가 있다.	주어진 제목과 요약문에 대한 정보를 토대로, 요약되기 전 문장을 유추해서 생성해주세요. 제목: 교육개혁 전망과 과제(Ⅱ) : 초·중등교육영역 요약문: 통합학교는 학교급간 통합, 학생 교육 수준에 따른 학습집단 운영등 교과와 운영방식이 다양해서 통합학교 특성에 따른 학교별 교원의 연수와 이들 교원의 인사 관리에 고려할 점에 대한 검토도 필요하다.
	즉, 과거 박물관, 미술관이 시각적 경험을 제공하고 큐레이터 중심으로 지식을 전달했던 것이 금방 IT로 대체될 수 있다. 이미 전 세계 모든 박물관, 미술관에서 소장품을 디지털화하는 것은 상당히 진척되었고 중앙박물관도 고화질 소장품 이미지를 축적하기 시작한 단계다. 이걸 관람객에게 어떻게 보여줄 수 있을지, 기존에는 소장품을 전시로 보여줬으나 그 외에 전혀 다르게 관람객에게 보여줄 수 있는 가능성이 스마트융합 환경에서의 박물관, 미술관의 새로운 방향이 될 것이라고 본다. 기존 박물관, 미술관의 과거의 소장품 중심 전시 서비스의 기능을 바꿀 충분한 자극제가 될 수 있을 것이다.	주어진 제목과 요약문에 대한 정보를 토대로, 요약되기 전 문장을 유추해서 생성해주세요. 제목: 스마트융합 환경에서의 박물관·미술관 기능개선의 방향 연구 요약문: 전 세계 박물관, 미술관에서 소장품 디지털화 작업이 많이 진행되었고, 중앙박물관도 소장품을 디지털화하기 시작하였다. 스마트융합 환경에서는 관람객에게 다르게 보여줄 수 있다.
	대수학에서 직접곱은 여러 개의 대수 구조들의 곱집합 위에 표준적으로 정의되는 대수 구조입니다. 예를 들어, 여러 군들의 직접곱이나 가군들의 직접곱을 정의할 수 있습니다. 또한, 같은 부호수 의 대수 구조들의 집합 의 직접곱도 존재하며, 이것은 모든 항 연산이 구성원들의 연산에 따라 성분별로 정의됩니다. 유한 개의 대수 구조들의 직접곱은 범주론적 곱과 동일하지만, 무한 개의 대수 구조들의 직접곱은 일반적으로 더 복잡합니다. 아벨 군들의 직접곱은 직합과 비슷하지만, 무한 개의 아벨 군들의 직접곱은 직합보다 더 큰 크기를 가집니다. 가운의 경우, 유한 개의 직접곱은 집합과 동일하지만, 무한 개의 가운들의 직접곱은 직합보다 더 큰 크기를 가집니다. 집합의 직접곱은 곱집합이며, 반직접곱 곱, 직합, 자유곱은 대수 구조의 분류 중 일부입니다.	대수학에서 직접곱은 무엇인가?
	태평양판 섭입대는 역이동성 응력환경이 지배적이며, 압축 축은 판의 전반적인 이동 방향과 평행한 서북서-동남동으로 배열된다(Heidbach et al., 2010). 이는 태평양판이 유라시아 대륙 아래로 빠르게 저각 섭입하며 지속적으로 광역적인 서북서-동남동 방향의 압축 응력을 발생시키고 있음을 시사한다. 한편, 필리핀해판은 젊고 따뜻한 슬랩으로 4~6 cm/y의 속도로 서북서로 이동 중이며, 난카이곡분과 류큐해구를 따라 아무르판 하부로 섭입 중이다. 난카이곡분을 따라 섭입하는 필리핀해판의 기하는 복잡하여 위치와 깊이에 따라 수렴율과 각도가 변화하며, 슬랩 내부에서도 지진학적 특성이 복잡하다(Zhao, 2015). 현재 난카이곡분을 따라 관찰되는 최대수평응력은 서북서-동남동이 우세하나, 남서쪽으로 갈수록 섭입각도가 깊어져 역단층성 환경에서 주향이동 내지 정단층성 응력환경으로 바뀌는 특징을 보인다. 따라서 필리핀 해판의 섭입에 의한 압축력이 한반도까지 전파될 가능성은 매우 낮다.	주어진 제목과 요약문에 대한 정보를 토대로, 요약되기 전 문장을 유추해서 생성해주세요. 제목: 지진포커스. 통권7호 요약문: 태평양판 섭입대는 역이동성 응력환경으로, 압축 축은 서북서-동남동으로 배열된다. 필리핀해판은 역단층성 환경에서 주향이동 내지 정단층성 응력환경으로 바뀌는 특징을 보인다. 따라서 필리핀 해판의 섭입에 의한 압축력이 한반도까지 전파될 가능성은 매우 낮다.
	오일 함유 미생물 및 상기 미생물의 저렴한 배양 방법을 포함하여, 프로토테카에서 오일, 연료, 함유화학물질 및 기타 화합물을 제조하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 예를 들어, 리파제, 슈크로스 수송체, 슈크로스 인버타제, 프럭토키나제, 폴리사카라이드-분해 효소, 지방 아실-ACP 티오에스테라제, 지방 아실-CoA/알데하이드 리덕타제, 지방 아실-CoA 리덕타제, 지방 알데하이드 리덕타제, 지방 알데하이드 데카보닐라제 및/또는 아실 운반 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 포함하는 프로토테카 세포는 재생가능한 디젤, 바이오디젤 및 재생가능한 제트 연료를 포함하는 수송 연료를 제조하는데 유용하다.	주어진 문장을 읽고 간략하게 요약해주세요. 문장: [ 발명의 명칭 ] 종속영양성 미생물에서 맞춤 오일의 생성Production of tailored oils in heterotrophic microorganisms [ 기술분야 ] 관련 출원의 상호 참조본 출원은 35 U.S.C. 119(e)하에 2008년 11월 28일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제61/118,590호, 2008년 12월 1일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제61/118,994호, 2009년 4월 30일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제61/174,357호, 및 2009년 6월 23일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제61/219,525호에 대한 우선권을 주장한다. 이들 각각의 출원은 이의 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조문헌으로서 인용된다.서열목록에 대한 참조본 출원은 이에 첨부된 제1면 내지 제72면에 나타낸 서열 목록을 포함한다.본 발명은 미생물로부터 만들어진 오일, 연료 및 오일 함유 화학제품의 제법에 관한 것이다. 특히, 본원은 오일 함유 미세조류, 지질, 지방산 에스테르, 지방산, 알데하이드, 알콜 및 알칸을 포함하는 유용한 화합물의 제조를 위해 상기 조류를 배양하는 방법, 및 상기 조류를 유전학적으로 변형시켜 제조 효율을 개선시키고 상기 조류에 의해 생성된 오일의 유형과 조성을 변화시키는 방법 및 시약에 관한 것이다. [ 배경기술 ] 화석 연료는 썩은 식물 및 동물로부터 형성되어 10억년 이상 동안 지각에서 열 및 압력에 노출됨에 의해 원유, 석탄, 천연 가스 또는 중질유로 전환된, 매장된 유기 물질의 연소성 지질학적 퇴적물에 대한 관용어이다. 화석 연료는 한정된 재생가능하지 않은 자원이다. 세계 경제의 에너지에 대한 수요 증가는 또한 탄화수소 비용에 대한 가중된 압력을 부여하였다. 에너지외에도 플라스틱 및 화학물질 제조업체를 포함하는 많은 산업은 이들의 제조 공정을 위한 공급 연료로서 탄화수소의 유용성에 크게 의존한다. 현재 공급 자원에 대한 저렴한 대용물이 에너지 및 이들의 원료 비용에 대한 상승된 압력을 완화시키는데 일조할 수 있었다. PCT 공개 번호 제2008/151149호는 오일 제조용의 미세조류를 배양하기 위한 방법 및 재료를 기재하고 있고 특히 미세조류 클로렐라 프로토테코이데스(Chlorella protothecoides)에 의해 생성된 오일로부터 디젤 연료의 제조를 예시하고 있다. 미세조류에서의 개선된 오일 제조 방법, 특히 단쇄의 길이를 갖고 고도로 포화된 안료 부재인 오일을 보다 높은 수율 및 효율로 제조하는 방법이 여전히 요구되고 있다. 본 발명은 상기 필요성을 충족시킨다.발명의 요약본 발명은 외인성 유전자를 포함하는 프로토테카(Prototheca) 속의 세포를 제공하고 몇몇 양태에서, 상기 세포는 프로토테카 모리포르미스(Prototheca moriformis), 프로토테카 크루가니(Prototheca krugani), 프로토테카 스타그노라(Prototheca stagnora) 또는 프로토테카 조프피(Prototheca zopfii) 종의 균주이고 다른 양태에서 상기 세포는 서열번호 11 내지 19중 하나 이상과 70, 75, 80, 85 또는 95% 이상의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 23S rRNA 서열을 갖는다. 몇몇 세포에서, 외인성 유전자는 암호화 서열이고 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있으며 몇몇 양태에서, 상기 프로모터는 프로토테카 속의 종에 대한 내인성 유전자로부터 기원한다. 추가의 양태에서, 상기 암호화 서열은 슈크로스 인버타제, 지방 아실-ACP 티오에스테라제, 지방 아실-CoA/알데하이드 리덕타제, 지방 아실-CoA 리덕타제, 지방 알데하이드 리덕타제, 지방 알데하이드 데카보닐라제, 아실 운반 단백질 및 항생제에 대해 내성을 부여하는 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화한다. 쇄 길이가 C8, C10, C12 또는 C14인 하나 이상의 지방 아실-ACP 기질로의 가수분해 활성을 갖는 지방 아실-ACP 티오에스테라제의 몇몇 양태는 서열번호 59, 61, 63 및 138 내지 140으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 서열과 50, 60, 70, 80, 또는 90% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아실-ACP 티오에스테라제를 포함한다. 추가의 양태에서, 상기 암호화 서열은 미세조류 기원의 플라스티드(plastid) 표적화 서열을 포함하고 몇몇 양태에서 상기 미세조류는 클로렐라세애(Chlorellaceae)과 기원의 다른 속 뿐만 아니라 프로토테카 또는 클로렐라(Chlorella) 속의 종이다. 몇몇 양태에서, 상기 플라스티드 표적화 서열은 서열번호 127 내지 133의 하나 이상과 20, 25, 35, 45, 또는 55% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖고 플라스티드 게놈에 위치하지 않는 플라스티드에 대한 외인성 유전자에 의해 암호화된 단백질을 표적화할 수 있다. 다른 양태에서, 상기 프로모터는 세포의 배양 배지내 질소의 감소 또는 고갈에 응답하여 상향조절되고, 예를 들어, 세포외 환경이 10mM 또는 5mM 이상의 질소 함유로부터 질소 부재로 변화하는 경우 프로토테카 속의 세포에 전사체가 풍부해짐에 의해 결정되는 바와 같이 3배 이상 상향조절된다. 추가의 양태에서, 상기 프로모터는 서열번호 91 내지 102중 하나의 50개 이상의 뉴클레오타이드 절편을 포함한다. 다른 양태에서, 상기 세포는 서열번호 11 내지 19중 하나 이상과 70, 75, 80, 85 또는 95% 이상의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 23S rRNA 서열을 갖는다. 다른 양태에서, 외인성 유전자는 세포의 염색체내로 통합된다.본 발명의 세포의 추가의 양태에서, 상기 세포는 프로토테카 속 기원이고 외인성 지방 아실-ACP 티오에스테라제 유전자 및 세포의 총 지질중 C8-C14가 4% 이상인 지질 프로필을 포함하고, 이때, C8의 양은 세포의 총 지질중 0.3% 이상이고 C10의 양은 세포의 총 지질중 2% 이상이고, C12의 양은 세포의 총 지질중 2% 이상이고, C14의 양은 세포의 총 지질중 4% 이상이고 C8-C14의 양은 세포의 총 지질중 10-30%, 20-30%, 또는 10, 20, 또는 30% 이상이다. 몇몇 양태에서, 상기 세포는 외인성 슈크로스 인버타제 유전자를 추가로 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 세포는 프로토테카 모리포르미스, 프로토테카 크루가니, 프로토테카 스타그노라 또는 프로토테카 조프피 종의 균주이고 다른 양태에서 상기 세포는 서열번호 11 내지 19중 하나 이상과 70, 75, 80, 85 또는 95% 이상의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 23S rRNA 서열을 갖는다. 다른 양태에서, 외인성 지방 아실-ACP 티오에스테라제 유전자는 세포의 염색체내로 통합된다. 본 발명의 다른 양태는 트리글리세라이드 조성물중 4% 이상의 C8-C14 w/w 또는 면적%의 지질 프로필의 트리글리세라이드 조성물을 제조하는 방법을 포함하고, 이때, C8의 양은 0.3% 이상의 w/w 또는 면적%이고, C10의 양은 2% 이상의 w/w 또는 면적%이고, C12의 양은 2% 이상의 w/w 또는 면적%이고 C14의 양은 4% 이상의 w/w 또는 면적%이고 C8-C14의 양은 10-30%, 20-30%, 또는 10, 20, 또는 30% 이상의 w/w 또는 면적%이다. 본 발명은 또한 상기 세포를 배양함을 포함하는 트리글리세라이드 조성물을 제조하는 방법을 포함하고, 여기서, 상기 세포는 슈크로스 인버타제를 암호화하는 외인성 유전자를 더욱 포함하고 슈크로스는 탄소원으로서 제공된다. 몇몇 양태에서, 상기 슈크로스 인버타제는 서열번호 3, 20 내지 29 및 90중 하나 이상과 50, 60, 70, 80, 또는 90% 이상의 아미노산 동일성을 갖는다.본 발명의 양태는 트리글리세라이드 오일 조성물을 함유하는 세포 뿐만 아니라 트리글리세라이드 오일 조성물을 포함하고 상기 조성물은 4% 이상의 C8 내지 C14의 지질 프로필 및 하기의 특성중 하나 이상을 포함한다: 0.1-0.4 마이크로그램/ml의 총 카로테노이드, 0.4 마이크로그램/ml 미만의 총 카로테노이드, 0.001 마이크로그램/ml 미만의 리코펜; 0.02 마이크로그램/ml 미만의 베타 카로틴, 오일 kg당 0.02 밀리그램 미만의 클로로필; 오일 100그램당 0.40-0.60 밀리그램의 감마 토코페롤; 오일 그램당 0.2-0.5 밀리그램의 총 토코트리에놀, 오일 그램당 0.4 밀리그램 미만의 총 토코트리에놀, 오일의 100그램당 4-8 mg의 캄페스테롤, 및 오일 100 그램당 40-60 mg의 스티그마스테롤. 본 발명의 몇몇 양태에서, 트리글리세라이드 오일 조성물은 트리글리세라이드 조성물 중 4% 이상의 C8-C14 w/w 또는 면적%를 갖고, 이때 C8의 양은 0.3% 이상의 w/w 또는 면적%이고, C10의 양은 2% w/w 또는 면적%이고 C12의 양은 2% 이상의 w/w 또는 면적%이고, C14의 양은 4% w/w 또는 면적%이고, C8-C14의 양은 10-30%, 20-30%, 또는 10, 20, 또는 30% 이상의 w/w 또는 면적%이다. 다른 양태에서, 트리글리세라이드 오일 조성물은 대두, 평지씨, 카놀라, 팜, 팜 커넬, 코코넛, 옥수수, 폐기 식물, 차이니즈 탈로우, 올리브, 해바라기, 면화씨, 치킨 지방, 소 탈로우, 돼지 탈로우, 미세조류, 거대조류, 쿠페아, 아마, 피넛, 쵸이스 백색 그리스, 라드, 카멜리나 사티바, 머스타드 씨, 캐슈 너트, 귀리, 루핀, 케나프, 금잔화, 헴프, 커피, 아마인(아마), 헤이즐넛, 유포비아, 호박씨, 코리안더, 카멜리아, 참깨, 홍화, 쌀, 유동, 코코아, 코프라(copra), 양귀비(opium poppy), 아주까리, 피칸, 호호바, 자트로파, 마카다미아, 브라질 너트, 아보카도, 석유 또는 상기 오일 중 임의의 증류 분획물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 다른 조성물과 블렌딩된다.본 발명의 방법은 또한 트랜스에스테르화, 수소화, 수소크랙킹화, 탈산소화, 이성체화, 상호에스테르화, 하이드록실화, 유리 지방산을 수득하기 위한 가수분해, 그리고 비누화로 이루어진 목록으로부터 기원하는 하나 이상의 화학적 반응을 수행하여 상기 오일을 가공처리함을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 언급된 오일의 수소화 및 이성체화로부터 제조된 탄화수소 연료 및 상기 언급된 오일의 트랜스에스테르화로부터 제조된 지방산 알킬 에스테르를 포함한다. 몇몇 양태에서, 탄화수소 연료는 프로토테카 속의 세포로부터 분리된 트리글리세라이드로부터 제조되고 이때, ASTM D86 T10-T90 증류 범위는 25℃ 이상이다. 다른 양태에서, 지방산 알킬 에스테르 연료는 프로토테카 속의 세포로부터 분리된 트리글리세라이드로부터 제조되고, 이때 상기 조성물은 120초 미만의 ASTM D6751 A1 냉 침지 시간을 갖는다.본 발명은 또한 (a) 20 내지 30몰%의 갈락토스; 55 내지 65몰%의 글루코스 및 5 내지 15몰%의 만노스로 이루어진 그룹으로부터 기원하는 하나 이상의 모노사카라이드를 포함하는 폴리사카라이드; (b) 단백질; 및 (c) 서열번호 11 내지 19중 하나 이상과 70, 75, 80, 85 또는 95% 이상의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 23S rRNA 서열을 포함하는 DNA; 및 (d) 외인성 유전자를 포함하는 조성물을 포함한다. 몇몇 양태에서, 외인성 유전자는 슈크로스 인버타제 및 지방 아실-ACP 티오에스테라제로부터 선택되고 추가의 양태에서 상기 조성물은 지질 프로필이 4% 이상의 C8-C14인 지질을 추가로 포함한다. 다른 양태에서, 상기 조성물은 동물 사료 소비용으로 제형화된다.본 발명은 프로토테카 속의 세포의 배양 배지에서 질소의 감소 또는 고갈에 응답하여 상향조절되는 프로모터를 암호화하는 재조합 핵산을 포함하고, 예를 들어, 세포외 환경이 10mM 또는 5mM 이상의 질소 함유로부터 질소 부재로 변화하는 경우 전사체의 풍부함으로 측정되는 바와 같이 3배 이상 상향조절된다. 몇몇 양태에서, 재조합 핵산은 서열번호 91 내지 102중 하나의 50개 이상의 뉴클레오타이드 절편을 포함한다. 본 발명은 또한 (a) 프로토테카 속의 세포에서 활성인 프로모터; 및 (b) 프로모터와 작동적으로 연결되고, 암호화 서열의 코돈중 20, 30, 40, 50, 60, 또는 80% 이상이 표 1의 가장 바람직하거나 두번째 바람직한 코돈을 함유하는 암호화 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 핵산 벡터를 포함한다. 몇몇 벡터에서, 상기 암호화 서열은 쇄 길이가 C8, C10, C12 또는 C14인 하나 이상의 지방 아실-ACP 기질로의 가수분해 활성을 갖는 티오에스테라제를 포함하는, 지방 아실-ACP 티오에스테라제와 프레임내에 있는 플라스티드 표적화 서열을 포함한다. 몇몇 벡터는 미세조류로부터 기원하는 것들 및 플라스티드 표적화 서열이 서열번호 127 내지 133중 하나 이상과 20, 25, 35, 45, 또는 55% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖고 단백질을 프로토테카 속의 세포의 플라스티드로 표적화시킬 수 있는 것들을 포함하는, 프로토테카 속의 세포의 플라스티드로 단백질을 표적화시킬 수 있는 펩타이드를 암호화하는 플라스티드 표적화 서열을 포함한다. 본 발명의 추가의 벡터는 프로토테카 속의 세포의 핵 게놈에 내인성인 핵산 서열을 포함하고, 상기 서열은 길이가 200개 이상의 뉴클레오타이드이고 몇몇 벡터는 프로토테카 속의 세포의 핵 게놈에 내인성인 제1 및 제2 핵산 서열을 포함하고, 여기서, 제1 및 제2 서열은 (a) 각각 길이가 200개 이상의 뉴클레오타이드이고; (b) 발현 카세트를 플랭킹하고; (c) 동일한 프로토테카 염색체상에서 5, 10, 15, 20, 및 5OkB 이하로 이격되어 위치하고 있다.본 발명은 또한 서열번호 134-135중 하나 또는 둘다와 80, 90, 95 또는 98% 이상의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 재조합 핵산 및 서열번호 136-137중 하나 또는 둘다와 80, 90, 95 또는 98% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 단백질을 암호화하는 재조합 핵산을 포함한다.본 발명은 또한 (a) 고정 탄소원의 존재하에 프로토테카 속의 세포 집단(여기서, (i) 세포는 외인성 유전자를 함유하고, (ii) 상기 세포는 지질을 이들의 무수 세포 중량의 10, 20, 30, 40, 60, 또는 70% 이상으로 축적시키고; (iii) 고정 탄소원은 수수 및 탈중합된 셀룰로스 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다)을 배양하는 단계; 및 (b) 배양된 미생물로부터 지질 성분을 분리하는 단계를 포함하는, 트리글리세라이드 조성물을 제조하는 방법을 포함한다. 몇몇 양태에서, 고정 탄소원은 옥수수 스토버, 미스칸투스, 가축 수수, 사탕무 펄프 및 사탕수수 바가스(bagasse)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 탈중합된 셀룰로스 물질이고, 이것은 임의로 배양 단계 전에 물로 세척한다. 몇몇 양태에서, 고정 탄소원은 탈중합된 셀룰로스 물질이고 탈중합된 셀룰로스 물질의 글루코스 수준은 배양 단계전에 300 g/리터 이상, 400 g/리터 이상, 500 g/리터 이상, 또는 600 g/리터 이상의 수준으로 농축시키고 세포가 성장하고 지질을 축적시킴으로써 시간 경과에 따라 배양물에 공급된다. 몇몇 양태에서, 외인성 유전자는 쇄 길이가 C8, C10, C12 또는 C14인 하나 이상의 지방 아실-ACP 기질로의 가수분해 활성을 갖는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하고 몇몇 방법에서, 상기 트리글리세라이드는 4% 이상의 C8-C14의 지질 프로필 및 하기의 특성중 하나 이상을 갖는다: 0.1-0.4 마이크로그램/ml의 총 카로테노이드; 오일 kg당 0.02 밀리그램 미만의 클로로필; 오일 100그램당 0.40-0.60 밀리그램의 감마 토코페롤; 오일 그램당 0.2-0.5 밀리그램의 총 토코트리에놀, 오일 100 그램당 4-8 mg의 캄페스테롤 및 오일 100 그램당 40-60 mg의 스티그마스테롤.본 발명의 추가의 방법은 (a) 탈중합된 셀룰로스 물질의 존재하에 미생물 집단(여기서, (i) 탈중합된 셀룰로스 물질은 배양 단계 전에 물로 세척하고; (ii) 상기 세포는 지질을 이의 무수 세포 중량의 10, 20, 30, 40, 60, 또는 70% 이상으로 축적시키고; (iii) 탈중합된 셀룰로스 물질은 배양 단계 전에 300, 400, 500, 또는 600 g/리터 이상의 글루코스로 농축시키고; (iv) 미생물은 유가식 반응으로 배양하고 이때, 글루코스가 300, 400, 500, 또는 600 g/리터 이상인 탈중합된 셀룰로스 물질이 미생물에 공급된다)을 배양하는 단계; 및 (b) 배양된 미생물로부터 지질 성분을 분리하는 단계를 포함하는, 트리글리세라이드 조성물을 제조함을 포함한다. 몇몇 양태에서, 고정 탄소원은 옥수수 스토버, 미스칸투스, 가축 수수, 사탕무 펄프 및 사탕수수 바가스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 탈중합된 셀룰로스 물질이다. 추가의 양태에서, 상기 미생물은 프로토테카 속의 종이고, 쇄 길이가 C8, C10, C12 또는 C14인 하나 이상의 지방 아실-ACP 기질로의 가수분해 활성을 갖는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 포함하는, 외인성 유전자를 함유한다. 본 발명의 추가의 방법은 탄소원으로서 슈크로스의 존재하에 서열번호 30과 90 또는 96% 이상의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 23S rRNA 서열을 갖는 세포를 배양함을 포함하는, 트리글리세라이드 오일을 제조하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 트랜스에스테르화, 수소화, 수소크랙킹화, 탈산소화, 이성체화, 상호에스테르화, 하이드록실화, 가수분해 및 비누화로 이루어진 그룹으로부터의 하나 이상의 화학 반응을 트리글리세라이드 오일상에 수행함을 포함하는 화학물질의 제조 방법을 포함하고, 여기서, 상기 트리글리세라이드 오일은 4% 이상의 C8-C14의 지질 프로필 및 하기의 특성중 하나 이상을 갖는다: 0.1-0.4 마이크로그램/ml의 총 카로테노이드, 오일 kg당 0.02 밀리그램 미만의 클로로필; 오일 100그램당 0.10-0.60 밀리그램의 감마 토코페롤; 오일 그램당 0.1-0.5 밀리그램의 총 토코트리에놀, 오일 100그램당 1 내지 8mg의 캄페스테롤, 및 오일 100 그램당 10-60 mg의 스티그마스테롤. 몇몇 방법은 쇄 길이가 C8, C10, C12 또는 C14인 하나 이상의 지방 아실-ACP 기질로의 가수분해 활성을 갖는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 지방 아실-ACP 티오에스테라제 유전자를 포함하는 프로토테카 속의 세포를 배양함에 의해 오일을 제조하여 수행된다. 몇몇 방법에서, 상기 가수분해 반응은 오일이 글리세롤 및 지방산으로 분리되는 촉매 가수분해 반응을 포함하는, 비누화, 산 가수분해, 알칼린 가수분해, 효소 가수분해, 촉매 가수분해 및 고온-압착 물 가수분해로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 추가의 방법에서, 지방산은 아민화 반응을 진행하여 지방 질소 화합물을 생성하거나 오존분해 반응으로 일염기성- 및 이염기성-산을 생성한다. 몇몇 양태에서, 상기 오일은 효소 분리 및 압력 분리로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 트리글리세라이드 분리 방법(splitting method)에 적용된다. 몇몇 방법에서, 응축 반응은 가수분해 반응 후에 수행한다. 다른 방법은 오일중에서 수소화처리 반응(hydroprocessing reaction)을 수행함을 포함하고, 이때 임의로 수소화처리 반응 생성물은 수소화처리 반응 전에 또는 이와 동시에 탈산소 반응 또는 응축 반응을 진행한다. 몇몇 방법은 추가로 가스 제거 반응을 포함한다. 추가의 방법은 수소분해 반응, 수소화, 연속 수소화-수소분해 반응, 연속 수소분해-수소화 반응 및 조합된 수소화-수소분해 반응으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 탈산소화 반응을 수행함에 의해 상기 언급된 오일을 가공시킴을 포함한다. 몇몇 방법에서, 응축 반응은 탈산소화 반응 후에 수행한다. 다른 방법은 상기 언급된 오일에 대해, 에스테르화 반응, 임의로 상호에스테르화 반응 또는 트랜스에스테르화 반응을 수행함을 포함한다. 다른 방법은 상기 언급된 오일에 대해 하이드록실화 반응을 수행함을 포함하고, 이때 임의로 응축 반응은 하이드록실화 반응 후에 수행한다. [ 도면의 간단한 설명 ] 도 1 및 2는 탄소원으로서 수수상에서 성장한 프로토테카 종 및 클로렐라 루테오비리디스(Chlorella luteoviridis) 균주 SAG 2214의 성장 곡선을 설명한다.도 3은 글루코스 및 슈크로스상에서의 SAG 2214의 시간 경과 성장을 보여준다. 도 4는 실시예 3에 기재된 바와 같이, 프로토테카 형질전환에 사용하는 카세트 맵을 보여준다.도 5는 실시예 3에 기재된 바와 같이 UTEX 균주 1435의 3개의 형질전환체에 대한 서던 블롯 분석 결과를 보여준다.도 6은 코돈 최적화되고 비-코돈 최적화된 suc2(효모 슈크로스 인버타제ylnv)) 전이유전자 작제물을 도시한다. 관련 제한 클로닝 부위를 나타내고 화살표는 전사 방향을 지적한다. 도 7a는 셀룰로스 유래된 당(옥수수 스토버, 사탕무, 사탕수수, 미스칸투스 및 글루코스 대조군)상에서 성장한 프로토테카 모리포르미스의 결과를 보여준다. 성장은 광학 밀도 측정으로 표현한다 (A750 판독).도 7b는 글루코스/크실로스 대조군과 비교하여, 옥수수 스토버-유래된 셀룰로스 당의 상이한 수준을 사용한 프로토테카 모리포르미스를 사용하는 성장 실험의 결과를 보여준다.도 7c는 크실로스가 프로토테카 배양에서 지질 생산에 미치는 영향을 보여준다.도 7d는 프로토테카의 성장(무수 세포 중량(DCW)에서)에 대한 염 농도(Na2SO4) 및 소포제의 영향을 보여준다.도 8은 프로토테카 성장에 대한 다양한 셀룰로스 물질(사탕수수 바가스, 수수 케인(sorghum cane), 미스칸투스 및 비트 펄프)의 열수 처리 및 수득한 당 스트림에 대한 영향을 보여준다.도 9는 반복되는 열수 처리 사이클 후 셀룰로스 바이오매쓰에서 하이드록시메틸 푸르푸랄(HMF) 및 푸르푸랄의 수준이 감소함을 보여준다.도 10은 발효기에서 종속영양성 오일 생성에 사용하기에 적합한 당 스트림을 생성하기 위한 셀룰로스 물질의 당화 공정을 도시한 것이다.도 11은 반복적인 열수 처리 사이클 후 분해된 사탕수수 바가스에서 HMF 및 푸르푸랄의 수준이 감소함을 보여준다.도 12는 프로토테카 형질전환에 사용되는 티오에스테라제 작제물을 도시한 것이다. 이종성 베타-튜불린(NeoR 구동시킴) 및 글루타메이트 데하이드로게나제 프로모터는 각각 클라미도모나스 레인하르드티(Chlamydomonas reinhardtii) 및 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana)로부터 유래한다. 니트레이트 리덕타제 3'UTR은 클로렐라 불가리스로부터 유래하였다. 관련 제한 클로닝 부위를 나타내고 화살표는 전사 방향을 지적한다.도 13은 프로토테카 트리글리세라이드 오일로부터 제조된 재생가능한 디젤의 크로마토그램을 보여준다. [ 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 ] 본 발명은 프로토테카 및 특정 관련 미생물이 예상치 않게 오일, 연료 및 기타 탄화수소 또는 지질 조성물을 경제적으로 및 대량으로 생성하기에 유리한 성질을 갖는다는 발견 및 이들 미생물을 유전학적으로 변형시켜 당해 성질을 개선시키는 방법 및 시약의 발견을 기초로 한다. 이들 미생물에 의해 생성된 오일은 무엇보다 운송 연료, 석유 및/또는 식품 및 화장품 산업에서 사용될 수 있다. 지질의 트랜스에스테르화는 바이오디젤로서 유용한 장쇄의 지방산 에스테르를 생성시킨다. 다른 효소 및 화학적 공정은 지방산, 알데하이드, 알콜, 알칸 및 알켄을 수득하기 위해 개조될 수 있다. 몇몇 응용에서, 재생가능한 디젤, 제트 연료 또는 기타 탄화수소 화합물이 제조된다. 본 발명은 또한 생산성 증가 및 지질 수율 증가 및/또는 본원에 기재된 조성물의 보다 저렴한 생산을 위해 미세조류를 배양하는 방법을 제공한다. 본 발명의 상세한 설명은 구독자의 편리를 위해 여러 섹션으로 나누어진다. 섹션 1은 본원에 사용되는 용어의 정의를 제공한다. 섹션 2는 본 발명의 방법에 유용한 배양 조건을 기재한다. 섹션 3은 유전자 가공 기술 및 재료를 기재한다. 섹션 4는 슈크로스를 이용가능할 수 있게 하는 프로토테카의 유전자 가공을 기재한다. 섹션 5는 지질 생합성을 변형시키기 위한 프로토테카의 유전자 가공을 기재한다. 섹션 6은 연료 및 화학물질을 제조하는 방법을 기재한다. 섹션 7은 발명의 실시예 및 양태를 기재한다. 본 발명의 상세한 설명에 이어서 발명의 다양한 측면 및 양태를 설명하는 예가 제공된다. I. 정의달리 정의되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명의 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 갖는다. 하기의 참조문헌은 본 발명에 사용되는 많은 용어의 일반적인 정의를 당업자에게 제공한다: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale 0026# Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). 본원에 사용된 바와 같이, 하기의 용어는 달리 특정되지 않는 경우 이들 본래의 의미를 갖는다. 핵산에 관하여 "미세조류에서 활성(active in microalgae)"은 미세조류에서 기능성인 핵산을 지칭한다. 예를들어, 유전자전이 미세조류에 항생제 내성을 부여하는 항생제 내성 유전자를 구동하기 위해 사용된 프로모터는 미세조류에서 활성이다."아실 운반 단백질" 또는 "ACP"는 4'-포스포판테테인 잔기의 원위 티올에서 티올 에스테르로서 지방산 합성 동안에 성장하는 아실 쇄와 결합하는 단백질이고 지방산 신타제 복합체의 성분을 포함한다."아실-CoA 분자" 또는 "아실-CoA"는 조효소 A의 4'-포스포판테테인 잔기의 원위 티올에서 티올 에스테르 연결을 통해 조효소 A에 공유적으로 부착된 아실 잔기를 포함하는 분자이다. "면적%"는 FAME GC/FID 검출 방법을 사용하여 관찰된 피크 면적을 언급하고 상기 방법에서, 샘플내 모든 지방산은 검출 전에 지방산 메틸 에스테르(FAME)로 전환된다. 예를 들어, 분리 피크는 C14:1과 같은 임의의 다른 지방산과 비교하여 불포화성(C14:0)을 갖지 않는 14개 탄소원자의 지방산에 대해서 관찰된다. 각각의 부류의 FAME에 대한 면적%는 혼합물내 이의 % 조성물과 직비례하고 샘플내 존재하는 모든 피크의 합계를 기준으로 계산된다(즉, [특정 피크하의 면적/모든 측정된 피크의 총 면적] X 100). 본 발명의 오일 및 세포의 지질 프로필을 언급하는 경우, "4% 이상의 C8-C14"는 세포내 또는 추출된 글리세로지질 조성물내의 총 지방산의 4% 이상이 탄소원자 8, 10, 12 또는 14개를 포함하는 쇄 길이를 가짐을 의미한다."무균성"은 다른 생존 유기체에 의해 오염되지 않은 유기체 배양물이다."바이오디젤"은 디젤 엔진에서 연료로서 사용하기에 적합한 생물학적으로 생산된 지방산 알킬 에스테르이다."바이오매쓰"는 세포의 성장 및/또는 증식에 의해 생산된 물질이다. 바이오매쓰는 세포에 의해 분비되는 화합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 세포외 물질 뿐만 아니라 세포 및/또는 세포내 내용물을 함유할 수 있다."생물반응기"는 임의로 현탁된 세포가 배양된 인클로저(enclosure) 또는 부분적 인클로저이다."촉매"는 생성물의 일부가 되지 않고 반응물의 생성물로의 화학적 반응을 용이하게 하거나 촉진시킬 수 있는 분자 또는 거대분자 복합체와 같은 제제이다. 촉매는 반응 속도를 증가시키고 이후 촉매는 또 다른 반응물에 작용하여 생성물을 형성시킬 수 있다. 촉매는 일반적으로 반응을 위해 요구되는 총 활성화 에너지를 저하시켜 반응이 보다 신속하게 또는 보다 저온에서 진행되도록 한다. 따라서, 반응 평형은 보다 신속하게 도달할 수 있다. 촉매의 예는 생물학적 촉매인 효소; 비생물학적 촉매인 열; 및 화석 오일 정련 공정에 사용되는 금속을 포함한다."셀룰로스 물질"은 글루코스 및 크실로스, 및 디사카라이드, 올리고사카라이드, 리그닌, 푸르푸랄 및 기타 화합물과 같은 임의의 추가의 화합물을 포함하는, 셀룰로스의 분해 생성물이다. 셀룰로스 물질의 공급원의 비제한적인 예는 사탕수수 바가스, 사탕무 펄프, 옥수수 스토버, 목재 칩, 톱밥 및 지팽이풀을 포함한다."동시배양", 및 이의 변형어구인 "동시 배양하다" 및 "동시-발효시키다"는 동일한 생물반응기에 2개 이상의 세포 유형이 존재함을 언급한다. 2개 이상의 세포 유형은 미세조류와 같은 미생물일 수 있거나 상이한 세포 유형과 함께 배양되는 미세조류 세포일 수 있다. 상기 배양 조건은 2개 이상의 세포 유형의 성장 및/또는 증식을 조성하는 것들 또는 다른 나머지 세포 성장을 유지하면서 2개 이상의 세포중 하나 또는 서브세트의 성장 및/또는 증식을 촉진시키는 것들일 수 있다. "조인자"는 이의 효소 활성을 수행하는 효소에 대해 요구되는 기질 이외의 임의의 분자이다."상보적 DNA" 또는 "cDNA"는 전령 RNA(mRNA) 또는 증포(예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응("PCR")을 통한)에 의해 보통 수득되는 mRNA의 DNA 카피이다."배양된", 및 이의 변형어 예를 들어, "변형된" 및 "발효된"은 선택되고/되거나 제어된 조건을 사용함에 의한 하나 이상의 세포의 성장의 의도적인 조성(세포 크기, 세포 함량 및/또는 세포 활성의 증가) 및/또는 번식(유사분열을 통한 세포수의 증가)을 언급한다. 성장 및 번식 둘다의 조합은 증식으로 통합될 수 있다. 선택되고/되거나 제어된 조건의 예는 생물반응기에서 합성 배지(pH, 이온 강도 및 탄소원과 같은 공지된 특성과 함께), 특정 온도, 산소압, 이산화탄소 수준 및 성장의 사용을 포함한다. 배양하다는 천연적인 또는 사람 간섭이 없는 미생물의 성장 또는 번식을 언급하지 않고, 예를 들어, 궁극적으로 지질학적 조악한 오일을 생성하기 위해 화석화된 유기체의 천연의 증식은 배양이 아니다. "세포용해"는 저장성 환경내에서의 세포의 용해이다. 세포 용해는 과도한 삼투압, 또는 세포 내부를 향한 물의 이동(과수화)에 의해 유발된다. 상기 세포는 내부 물의 삼투압을 견딜 수 없어서 터진다. "탈지질화된 음식물" 및 "탈지질화된 미생물 바이오매쓰"는 오일(지질을 포함)이 기계적 추출(즉, 익스펠러 프레스에 의해 수행되는) 또는 용매 추출 또는 이 둘다를 통해 이로부터 추출되거나 분리된 후의 미생물 바이오매쓰이다. 탈지질화된 음식물은 미생물 바이오매쓰로부터 오일/지질의 추출 또는 분리 전과 비교하여 감소된 양의 오일/지질을 갖지만 일부 잔류하는 오일/지질을 함유한다. "발현 벡터" 또는 "발현 작제물" 또는 "플라스미드" 또는 "재조합 DNA 작제물"은 숙주 세포에서 특정 핵산의 전사 및/또는 해독을 허용하는 일련의 특정 핵산 요소를 사용한 재조합 수단 또는 직접적인 화학적 합성에 의한 것을 포함하는, 사람 간섭을 통해 생성된 핵산을 언급한다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 또는 핵산 단편의 일부일 수 있다. 전형적으로, 상기 발현 벡터는 프로모터에 작동적으로 연결되어 전사된 핵산을 포함한다. "외인성 유전자"는 세포로 도입된("형질전환된") RNA 및/또는 단백질의 발현을 위해 이들을 암호화하는 핵산이다. 형질전환된 세포는 추가의 외인성 유전자(들)가 도입될 수 있는 재조합 세포로서 언급될 수 있다. 상기 외인성 유전자는 형질전환된 세포에 대해 상이한 종(및 따라서 이종성) 또는 동일한 종(따라서 동종성)의 기원일 수 있다. 따라서, 외인성 유전자는 유전자의 내인성 카피물에 비해 세포의 게놈내에서 상이한 위치를 차지하거나 상이한 제어하에 있는 동종성 유전자를 포함한다. 외인성 유전자는 세포내에서 하나 이상의 카피물로 존재할 수 있다. 외인성 유전자는 게놈내로의 삽입물로서 또는 에피좀 분자로서 세포내 유지될 수 있다."외인성으로 제공된"은 세포 배양의 배양 배지에 공급된 분자를 언급한다."익스펠러 프레싱"은 대두 및 평지씨와 같은 원료로부터 오일을 추출하는 기계적 방법이다. 익스펠러 프레스는 스크류형의 기계이고 케이지 배럴형 공극을 통해 물질을 압착시킨다. 원료는 프레스의 한 측면으로 들어가고 적용된 케이크는 다른 측면에서 빠져 나오며 오일은 케이지내 막대 사이에서 스며나오고 수거된다. 상기 기계는 원료를 움직이고 압착시키는 스크류 구동체로부터의 마찰 및 연속적인 가압을 사용한다. 상기 오일은 고체가 통과하지 못하도록 하는 작은 구멍을 통해 스며나온다. 원료가 압착되므로써, 마찰은 전형적으로 이를 가열시킨다. "지방 아실-ACP 티오에스테라제"는 지질 합성동안에 아실 운반 단백질(ACP)로부터 지방산의 절단을 촉매하는 효소이다."지방 아실-CoA/알데하이드 리덕타제"는 아실-CoA 분자의 1급 알콜로의 환원을 촉매하는 효소이다."지방 아실-CoA 리덕타제"는 아실-CoA 분자의 알데하이드로의 환원을 촉매하는 효소이다."지방 알데하이드 데카보닐라제"는 지방 알데하이드의 알칸으로의 전환을 촉매하는 효소이다."지방 알데하이드 리덕타제"는 알데하이드의 1급 알콜로의 환원을 촉매하는 효소이다."고정 탄소원"은 본원에서 배양된 미생물에 의해 사용될 수 있는 배양 배지내 고체 또는 액체 형태로 실온 및 압력에서 존재하는 탄소 함유 분자(들), 전형적으로 유기 분자이다. "파쇄물"은 물리적으로 파쇄된 바이오매쓰이다. "탄화수소"는 (a) 수소 및 탄소 원자만을 함유하는 분자이고, 여기서, 탄소원자는 공유 결합되어 직쇄, 측쇄, 사이클릭 또는 부분적인 사이클릭 골격을 형성하고 상기 골격에는 수소 원자가 부착되어 있다. 탄화수소 화합물의 분자 구조는 천연 가스 성분인 메탄(CH4) 형태의 가장 단순한 형태에서 매우 무겁고 복잡한, 예를 들어, 원유, 석유 및 역청에서 발견되는 아스팔텐과 같은 몇몇 분자까지 다양하다. 탄화수소는 가스, 액체 또는 고체 형태, 또는 이들의 조합된 형태일 수 있고 골격내 인접한 탄소원자간에 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 가질 수 있다. 따라서, 당해 용어는 직쇄, 측쇄, 사이클릭 또는 부분적인 사이클릭 알칸, 알켄, 지질 및 파라핀을 포함한다. 이의 예는 프로판, 부탄, 펜탄, 헥산, 옥탄, 및 스쿠알렌을 포함한다."수소:탄소 비율"은 원자 대 원자를 기준으로 분자 내 탄소 원자에 대한 질소 원자의 비율이다. 상기 비율은 탄화수소 분자내 탄소 원자 및 수소 원자의 수를 언급하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 최고 비율의 탄화수소는 메탄CH4 (4:1)이다."소수성 분획"은 수성상과 비교하여 소수성상에서 보다 가용성인 물질의 일부 또는 분획이다. 소수성 분획은 실질적으로 물에 불용성이고 통상적으로 비극성이다."지질 수율을 증가시킨다"는 예를 들어, 배양 리터당 세포의 무수 중량을 증가시키거나 지질로 구성된 세포의 %를 증가시키거나 단위 시간당 배양 용적 리터당 지질의 전체 양을 증가시킴에 의한 미생물 배양의 생산성의 증가를 언급한다."유도성 프로모터"는 특정 자극에 응답하여 작동적으로 연결된 유전자의 전사를 매개하는 프로모터이다."작동가능한 연결로"는 2개의 핵산 서열, 예를 들어, 조절 서열(전형적으로 프로모터)과 연결된 서열(전형적으로 단백질을 암호화하는 서열, 또한 소위 암호화 서열)간의 기능적 연결이다. 프로모터는 이것이 유전자의 전사를 매개할 수 있다면 외인성 유전자와 작동가능하게 연결되어 있다."동일계"는 "원위치" 또는 "본래의 위치"를 의미한다."영양물의 제한 농도"는 배양된 유기체의 번식을 제한하는 배양물내 화합물의 농도이다. "영양물의 비제한 농도"는 소정의 배양 기간동안에 최대 번식을 지지하는 농도이다. 따라서, 소정의 배양 기간동안에 생성되는 세포의 수는 영양물이 비제한적인 경우 보다 영양물의 제한 농도의 존재하에 보다 낮다. 영양물은 영양물이 최대 번식을 지지하는 것 보다 큰 농도로 존재하는 경우 배양물에 과량인 것으로 언급된다. "리파제"는 수불용성 지질 기질에서 에스테르 결합의 가수분해를 촉매하는 수용성 효소이다. 리파제는 지질의 글리세롤 및 지방산으로의 가수분해를 촉매한다."지질 변형 효소"는 지질의 공유 구조물을 변형시키는 효소를 언급한다. 지질 변형 효소의 예는 리파제, 지방 아실-ACP 티오에스테라제, 지방 아실-CoA/알데하이드 리덕타제, 지방 아실-CoA 리덕타제, 지방 알데하이드 리덕타제 및 지방 알데하이드 데카보닐라제를 포함한다."지질 경로 효소"는 지질 대사, 즉 지질 합성, 변형 또는 분해에 역할을 하는 임의의 효소 및 운반 단백질 뿐만 아니라 지질을 화학적으로 변형시키는 임의의 단백질이다."지질"은 비극성 용매(예를 들어, 에테르 및 클로로포름)에 가용성이고 물에 상대적으로 또는 완전히 불용성인 부류의 분자이다. 지질 분자는 이들이 주로 천연적으로 소수성인 장쇄의 탄화수소 꼬리로 이루어지기 때문에 상기 성질을 갖는다. 지질의 예는 지방산(포화되고 불포화된); 글리세라이드 또는 글리세로지질(예를 들어, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 트리글리세라이드 또는 천연 지방 및 포스포글리세라이드 또는 글리세로인지질); 난글리세라이드(스핑고지질, 스테롤 지질(콜레스테롤 및 스테로이드 호르몬 포함), 프레놀 지질(터페노이드 포함), 지방 알콜, 왁스 및 폴리케타이드); 및 복합 지질 유도체(당-연결된 지질 또는 당지질 및 단백질 연결된 지질)을 포함한다. "지방"은 소위 "트리글리세라이드"인 지질의 서브그룹이다."용해물"은 용해된 세포의 내용물을 함유하는 용액이다. "용해"는 유기체의 일체성을 손상시키는 흔히, 기계적, 바이러스 또는 삼투압 기작에 의해 적어도 일부의 세포내 내용물을 방출하기에 충분한 생물학적 유기체의 세포질 막 및 임의로 세포 벽의 파괴이다. "용해시키는"은 적어도 일부 세포내 내용물을 방출시키기에 충분한 생물학적 유기체 또는 세포의 세포막 및 임의로 세포벽을 파괴시키는 것이다. "미세조류"는 엽록체 또는 플라스티드를 함유하고 임의로 광합성을 수행할 수 있는 진핵 미생물 유기체, 또는 광합성을 수행할 수 있는 원핵 미생물 유기체이다. 미세조류는 고정 탄소원으로부터 유일하게 생존할 수 있는 종속영양생물 뿐만 아니라 에너지로서 고정 탄소원을 대사시킬 수 없는 절대 광합성독립영양생물을 포함한다. 미세조류는 2개의 독특한 세포 유형의 단순한 다중세포 광합성 미생물인, 예를 들어, 볼복스(Volvox)와 같은 미생물 뿐만 아니라 세포 분열 후 단시간에 자매세포로부터 분리되는 단일 세포 유기체, 예를 들어, 클라미도모나스(Chlamydomonas)를 포함한다. 미세조류는 클로렐라, 두날리엘라(Dunaliella), 및 프로토테카와 같은 세포를 포함한다. 미세조류는 또한 아그메넬룸(Agmenellum), 아나바에나(Anabaena), 및 피로보트리스(Pyrobotrys)와 같은 세포-세포 접착을 나타내는 다른 미생물 광합성 유기체를 포함한다. 미세조류는 또한 특정 디노플라겔레이트 조류 종 및 프로토테카 속의 종과 같은 광합성을 수행하는 능력을 상실한 절대 종속영양 미생물을 포함한다."미생물(microorganism)" 및 "미생물(microbe)"은 현미경적 단일 세포 유기체이다.2개의 단백질 또는 유전자와 관련하여 "천연적으로 동시 발현된"은 단백질 또는 이들의 유전자가 이들이 유래된 조직 또는 유기체에서 천연적으로 동시 발현됨을 의미하고, 상기 동시 발현 이유는 2개의 단백질을 암호화하는 유전자가 공통된 조절 서열의 제어하에 있기 때문이거나 이들이 동일한 자극에 응답하여 발현되기 때문이다."삽투압 쇼크"는 삼투압의 급작스런 감소 후 용액내 세포의 붕괴이다. 삽투압 쇼크는 때때로 상기 세포의 세포 성분을 용액내로 방출하도록 유도된다."폴리사카라이드-분해 효소"는 임의의 폴리사카라이드의 가수분해 또는 당화를 촉매할 수 있는 임의의 효소이다. 예를 들어, 셀룰라제는 셀룰로스의 가수분해를 촉매한다."폴리사카라이드" 또는 "글리칸"은 글리코시드 결합에 의해 서로 함께 연결된 모노사카라이드로 구성된 탄수화물이다. 셀룰로스는 특정 식물 세포 벽을 구성하는 폴리사카라이드이다. 셀룰로스는 보다 큰 디사카라이드 및 올리고사카라이드 뿐만 아니라 크실로스 및 글루코스와 같은 모노사카라이드를 생성하도록 효소에 의해 탈중합될 수 있다."프로모터"는 핵산의 전사를 지시하는 핵산 조절 서열이다. 본원에 사용된 바와 같이, 프로모터는 전사 개시 부위 근처에 필수 핵산 서열, 예를 들어, 폴리머라제 II형 프로모터의 경우에, TATA 요소를 포함한다. 프로모터는 또한 임의로 전사 개시 부위로부터 수천 염기쌍 정도로 멀리 위치할 수 있는 원거리 인핸서 또는 리프레서 요소를 포함한다."재조합체"는 외인성 핵산의 도입 또는 고유 핵산의 변화로 인해 변형된 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터이다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 천연(비-재조합체) 형태의 세포내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나 비-재조합 세포에 의해 발현되는 유전자와는 상이하게 천연 유전자를 발현한다. "재조합 핵산"은 예를 들어, 폴리머라제 및 엔도뉴클레아제를 사용하는 핵산의 조작에 의해 일반적으로 시험관내 형성된 본래의 핵산이거나 통상적으로 천연적으로 존재하지 않는 형태로 존재한다. 재조합 핵산은 예를 들어, 2개 이상의 핵산을 작동가능하게 연결시키도록 하여 생성시킬 수 있다. 따라서, 통상적으로 천연적으로 연결되어 있지 않은 DNA 분자를 연결함에 의해 시험관내 형성된 분리된 핵산 또는 발현 벡터는 둘다 본 발명의 목적을 위한 재조합체인 것으로 고려된다. 재조합 핵산이 제조되고 숙주 세포 또는 유기체로 도입되는 경우, 이것은 숙주 세포의 생체내 세포 기구를 사용하여 복제할 수 있지만 일단 재조합적으로 생성되는 경우 당해 핵산은 후속적으로 세포내에서 복제된다 하더라도 여전히 본 발명의 목적을 위한 재조합체인 것으로 고려된다. 유사하게, "재조합 단백질"은 즉, 재조합 핵산의 발현을 통해 재조합 기술을 사용하여 제조된 단백질이다."재생가능한 디젤"은 지질의 수소화 및 탈산소화를 통해 생성된 알칸(예를 들어, C10:0, C12:0, C14:0, C16:0 및 C 18:0)의 혼합물이다."당화"는 바이오매쓰, 통상적으로 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 바이오매쓰를 글루코스 및 크실로스와 같은 단량체성 당으로 전환시키는 공정이다. "당화된" 또는 "탈중합된" 셀룰로스 물질 또는 바이오매쓰는 당화를 통해 단량체 당으로 전환되는 셀룰로스 물질 또는 바이오매쓰를 언급한다."초음파 처리"는 초음파 에너지를 사용하여 세포와 같은 생물학적 물질을 파괴시키는 공정이다."푸르푸랄 종"은 동일한 염기성 구조 특성을 보유한 2-푸란카복스알데하이드 또는 유도체이다."스토버"는 낟알이 수거된 후 잔류하는 작물의 무수 줄기 및 잎이다."슈크로스 이용 유전자"는 발현되는 경우 에너지원으로서 슈크로스를 이용하는 세포의 능력을 도와주는 유전자이다. 슈크로스 이용 유전자에 의해 암호화된 단백질은 본원에서 "슈크로스 이용 효소"로 언급되고 슈크로스 수송체, 슈크로스 인버타제, 및 글루코키나제 및 프럭토키나제와 같은 헥소키나제를 포함한다.II. 배양본 발명은 지질의 생성을 위해 일반적으로 프로토테카 균주, 특히 재조합 프로토테카 균주를 배양하는 것에 관한 것이다. 구독자의 편이를 위해, 본 섹션은 여러 서브섹션으로 세분된다. 서브섹션 1은 프로토테카 종 및 균주를 기재하고 게놈 DNA 비교에 의해 새로운 프로토테카 종 및 균주 및 관련 미세조류를 동정하는 방법을 기재한다. 서브섹션 2는 배양을 위해 유용한 생물반응기를 기재한다. 서브섹션 3은 배양을 위한 배지를 기재한다. 서브섹션 4는 본 발명의 예시적인 배양 방법에 따른 오일 생성을 기재한다.1. 프로토테카 종 및 균주프로토테카는 고수준의 지질, 특히, 연료 생산을 위해 적합한 지질을 생산할 수 있기 때문에 지질의 생산에 사용하기 위해 주목할만 한 미생물이다. 프로토테카에 의해 생산된 지질은 다른 미세조류에 의해 생산되는 것 보다 단쇄 길이 및 고도의 포화를 갖는 탄화수소 쇄를 갖는다. 더욱이, 프로토테카 지질은 일반적으로 색소 부재(클로로필 및 특정 카로테노이드의 낮거나 검출가능하지 않은 수준)이고 임의의 경우에 다른 미세조류 기원의 지질 보다 색소를 훨씬 적게 포함한다. 더욱이 본 발명에 의해 제공된 재조합 프로토테카 세포는 다른 미생물로부터 지질을 생산하는 것과 비교하여 보다 큰 수율 및 효율로 저렴하게 지질을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 예시적인 프로토테카 균주가 포함된다. 추가로, 상기 미세조류는 종속영양적으로 성장하고 프로토테카 윅케르하미(Prototheca wickerhamii), 프로토테카 스타그노라(Prototheca stagnora) (UTEX 327을 포함), 프로토테카 포르토리센시스(Prototheca portoricensis), 프로토테카 모리포르미스(Prototheca moriformis)(UTEX 균주 1441, 1435를 포함), 및 프로토테카 조프리(Prototheca zopfii)로서 유전자 조작될 수 있다. 프로토테카 속의 종은 절대 종속영양생물이다. 본 발명에 사용하기 위한 프로토테카 종은 게놈의 특정 표적 영역의 증폭으로 동정될 수 있다. 예를 들어, 특정 프로토테카 종 또는 균주의 동정은 프라이머 및 게놈의 임의의 영역을 사용하는 방법, 예를 들어, 문헌[참조: Wu et al., Bot. Bull. Acad. Sin. (2001) 42: 115-121 Identification of Chlorella spp. isolates using ribosomal DNA sequences]에 기재된 방법을 사용하여 핵 및/또는 엽록체 DNA의 증폭 및 서열분석을 통해 성취할 수 있다. 리보솜 내부 전사된 스페이서 (ITSl 및 ITS2 rDNA), 23S rRNA, 18S rRNA, 및 기타 보존된 게놈 영역의 증폭 및 서열분석과 같은 계통발생적 분석에 대해 널리 확립된 방법은 당업자에 의해 사용되어 프로토테카의 종 뿐만 아니라 유사한 지질 프로필 및 생산 능력을 갖는 다른 탄화수소 및 지질 생산 미생물 종을 동정할 수 있다. 조류의 동정 및 분류 방법에 대한 예는 또한 문헌[참조: Genetics, 2005 Aug;170(4): 1601-10 and RNA, 2005 Apr;11(4):361-4]을 참조한다.따라서, 게놈 DNA 비교를 사용하여 본 발명에 사용되는 미세조류의 적합한 종을 동정할 수 있다. 이에 제한되지 않는 23S rRNA를 암호화하는 DNA와 같은 보존된 게놈 DNA의 영역은 미세조류 종으로부터 증폭시키고 컨센서스 서열과 비교하여 본 발명에 사용되는 바람직한 미세조류와 분류학적으로 관련된 미세조류 종을 스크리닝할 수 있다. 프로토테카 속 내의 종에 대한 상기 DNA 서열 비교의 예는 하기에 나타낸다. 게놈 DNA 비교는 또한 균주 수거에서 잘못 동정된 미생물 종을 동정하기 위해 유용할 수 있다. 흔히 균주 수거는 표현형 및 형태적 특성을 기본으로 미세조류 종을 동정한다. 이들 특성의 사용은 미세조류의 종 또는 속의 잘못된 분류를 유도할 수 있다. 게놈 DNA 비교를 사용하는 것이 이들의 계통발생 관계를 기준으로 미세조류 종을 분류하는데 보다 우수한 방법일 수 있다.본 발명에 사용하기 위한 미세조류는 전형적으로 서열번호 11 내지 19에 목록된 서열중 하나 이상과 99%, 95%, 90%, 또는 85% 이상의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 23S rRNA를 암호화하는 게놈 DNA 서열을 갖는다. % 뉴클레오타이드 또는 아미노산 동일성을 결정하기 위한 서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 참조 서열로서 작용하고 이것과 시험 서열을 비교한다. 서열 비교 알고리듬을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고 경우에 따라 세부서열의 좌표를 지정하고 서열 알고리듬 프로그램 파라미터를 지정한다. 이어서 서열 비교 알고리듬을 사용하여 지정된 프로그램 파라미터를 기준으로 표준 서열에 대한 시험 서열의 % 서열 동일성을 계산한다.비교용 서열의 최적의 정렬은 예를 들어, 문헌[참조: Smith 0026# Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리듬, 문헌[참조: Needleman 0026# Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리듬, 문헌[참조: Pearson 0026# Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 검색 방법, 문헌[참조: GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)]의 당해 알고리듬의 컴퓨터에 의한 수행, 또는 육안 검사[문헌참조: generally Ausubel et al., supra]에 의해 수행될 수 있다. % 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기 위해 적합한 또 다른 예시적 알고리듬은 문헌[참조: Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]에 기재된 BLAST 알고리듬이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 기관[National Center for Biotechnology Information (웹 주소: www.ncbi.nlm.nih.gov)]을 통해 입수할 수 있다. 상기 알고리듬은 먼저 탐색 서열에서 길이에 대한 단축어 W를 동정으로 높은 점수의 서열쌍(HSP)를 동정함을 포함하고 이는 데이타베이스 서열중에 동일한 길이의 단어와 정렬되는 경우 몇몇 양성값의 역치 점수 T와 일치하거나 이를 충족한다. T는 이웃 단어 점수 역치로서 언급된다(Altschul et al., supra.). 이들 초기 이웃 단어 히트는 이들을 함유하는 보다 긴 HSP를 발견하기 위한 검색을 개시하기 위한 근원으로서 작용한다. 단어 히트를 이어서 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한 각각의 서열을 따라 양방향으로 확장시킨다. 누적 점수는 뉴클레오타이드 서열에 대해 파라미터 M(일치하는 잔기쌍에 대한 보상 점수: 항상 003e# 0임) 및 N(불일치 잔기에 대한 페널티 점수: 항상 003c# 0)을 사용하여 계산한다. 아미노산 서열에 대해, 스코어링 매트릭스를 사용하여 누적 점수를 계산한다. 각각의 방향에서의 단어 히트의 확장은 다음의 경우에 중지한다: 누적 정렬 점수가 이의 최대 성취 값으로부터 X 양으로 이탈하는 경우; 누적 점수가 하나 이상의 음성 스코어링 잔기 정렬의 누적으로 인해 0 이하로 되는 경우; 또는 서열의 말단에 도달하는 경우. 핵산 또는 폴리펩타이드가 본 발명의 범위내에 있는지의 여부를 동정하기 위해, BLAST 프로그램의 디폴트(default) 파라미터가 적합하다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오타이드 서열용)은 11의 단어 길이(W), 10의 예상치(E), M=5, N=-4, 및 양쪽 서열가닥의 비교를 디폴트로서 사용한다. 아미노산 서열을 위해, BLASTP 프로그램은 3의 단어 길이(W), 10의 예상치(E) 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스를 디폴트로서 사용한다. TBLATN 프로그램(뉴클레오타이드 서열용 단백질 서열을 사용하는)은 3의 단어 길이(W), 10의 예상값(E) 및 BLOSUM 62 스코어링 매트릭스를 디폴트로서 사용한다(문헌참조: Henikoff 0026# Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)].% 서열 동일성을 계산하는 것 뿐만 아니라, BLAST 알고리듬은 또한 2개의 서열간의 유사성에 대한 통계학적 분석을 수행한다(문헌참조: 예를 들어, Karlin 0026# Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). BLAST 알고리듬에 의해 제공된 한가지의 유사성 측정은 최소 합계 가능성(P(N))이고 이는 2개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열간의 일치가 우연히 발생할 가능성을 지적한다. 예를 들어, 표준 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에 있어서 최소의 합계 가능성이 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만 및 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우 핵산은 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.본 발명에 사용하기 위한 미생물의 선별에 영향을 주는 다른 고려사항은 오일, 연료 및 함유화학제품(oleochemicals)의 생산을 위해 적합한 지질 또는 탄화수소의 생성 뿐만 아니라 다음을 포함한다: (1) 세포 중량%로서 고지질 함량; (2) 성장의 용이함; (3) 유전자 가공의 용이함; 및 (4) 바이오매쓰 가공처리의 용이함. 특정 양태에서, 야생형 또는 유전자 조작된 미생물은 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 또는 70% 이상의 지질인 세포가 생성되도록 한다. 바람직한 유기체는 (빛의 부재하에 당을 기초로) 종속영양적으로 성장한다.2. 생물반응기미생물은 유전자 조작을 수행하고 탄화수소(예를 들어, 지질, 지방산, 알데하이드, 알콜 및 알칸)를 생성할 2가지 목적을 위해 배양한다. 전자 유형의 배양은 소규모 및 처음에는 적어도 출발 미생물이 성장할 수 있는 조건하에서 수행한다. 탄화수소를 생산하기 위한 배양은 생물반응기에서 통상적으로 대규모(예를 들어, 10,000 L, 40,000 L, 100,000 L 또는 보다 대형의 생물반응기)로 수행한다. 프로토테카는 전형적으로 생물반응기내 액체 배재중에서 본 발명의 방법으로 배양한다. 전형적으로, 생물반응기는 빛이 입사되지 않도록 한다.생물반응기 또는 발효기를 사용하여 다양한 단계의 세포의 생리학적 사이클을 통해 미세조류 세포를 배양한다. 생물반응기는 종속영양 성장 및 번식 방법에 사용하기 위해 많은 잇점을 제공한다. 식품에 사용하기 위한 바이오매쓰를 생산하기 위해 미세조류를 바람직하게 액체중에서, 예를 들어, 하나의 예로서 현탁 배양으로 대량으로 발효시킨다. 강철 발효기와 같은 생물반응기는 매우 큰 배양 용적(40,000 리터 이상의 용량을 갖는 생물반응기가 본 발명의 다양한 양태에서 사용된다)을 수용할 수 있다. 생물반응기는 또한 전형적으로 온도, pH, 산소압 및 이산화탄소 수준과 같은 배양 조건의 제어를 허용한다. 예를 들어, 생물반응기는 전형적으로 예를 들어, 튜빙에 부착된 포트를 사용하여 산소 또는 질소와 같은 가스 성분이 액체 배양물을 통해 기포 주입될 수 있도록 하는 형태를 취할 수 있다. 배양 배지의 pH, 미량 요소의 종류 및 농도 및 기타 배지 성분과 같은 다른 배양 파라미터가 또한 생물반응기를 사용하여 보다 용이하게 조작될 수 있다.생물반응기는 미세조류가 증식하고 수적으로 증가하는 전반적인 시간에 걸쳐 생물반응기를 통해 배양 배지가 유입되도록 하는 형태를 취할 수 있다. 몇몇 양태에서, 예를 들어, 배지는 접종 후 세포가 목적하는 밀도에 도달하기 전에 생물반응기로 주입될 수 있다. 다른 경우에, 생물반응기에는 배양 초기에 배양 배지가 충전되고 배양물이 접종된 후에는 더이상의 배양 배지가 주입되지 않는다. 다른 말로, 미세조류 바이오매쓰는 미세조류가 증식하고 수적으로 증가하는 기간동안 수성 배지에서 배양되지만 수성 배양 배지의 양이 그 기간에 걸쳐 생물반응기를 통해 유입되지 않는다. 따라서, 몇몇 양태에서, 수성 배양 배지는 접종 후 생물반응기를 통해 유입되지 않는다.회전 블레이드 및 임펠러, 락킹 기구, 교반 막대, 가압 가스 주입용 수단과 같은 장치가 장착된 생물반응기를 사용하여 미세조류 배양물이 혼합되도록 할 수 있다. 혼합은 연속적이거나 간헐적일 수 있다. 예를 들어, 몇몇 양태에서, 가스 주입 및 배지 주입의 난기류가 목적하는 수로 미세조류가 증가할때까지는 미세조류의 증식동안에 유지되지 않는다.생물반응기 포트를 사용하여 가스, 고체, 반고체 및 액체를, 미세조류를 함유하는 생물반응기 챔버에 도입하거나 추출할 수 있다. 많은 생물반응기는 하나 이상의 포트(예를 들어, 배지 주입을 위한 하나 및 샘플링을 위한 또 다른 하나)를 갖고 단지 하나의 물질이 포트를 출입할 필요는 없다. 예를 들어, 포트를 사용하여 배양 배지가 생물반응기로 유입될 수 있도록 하고 이후에 샘플링, 가스 주입, 가스 배출 또는 기타 목적을 위해 사용될 수 있다. 바람직하게, 샘플링 포트는 배양의 무균 특성을 손상시키지 않고 반복적으로 사용될 수 있다. 샘플링 포트는 샘플의 흐름이 중지되고 개시되거나 연속 샘플링의 수단을 제공하도록 하는 밸브 또는 기타 장치로 구성될 수 있다. 생물반응기는 전형적으로 배양의 접종을 허용하는 하나 이상의 포트를 갖고 상기 포트는 또한 배지 또는 가스 주입과 같은 다른 목적을 위해 사용될 수 있다.생물반응기 포트는 미세조류의 배양의 가스 함량이 조작되도록 할 수 있다. 설명하자면 생물반응기 용적의 일부는 액체 보다는 가스일 수 있고 생물반응기의 가스 주입구는 가스를 생물반응기로 펌핑될 수 있도록 한다. 생물반응기내로 이롭계 펌핑될 수 있는 가스는 공기, 공기/CO2 혼합물, 희가스(예를 들어, 아르곤) 및 기타 가스를 포함한다. 생물반응기는 전형적으로 사용자가 생물반응기로의 가스 주입 속도를 조절할 수 있도록 구성된다. 상기된 바와 같이, 생물반응기로의 가스 주입 증가를 사용하여 배양물의 혼합을 증가시킬 수 있다.증가된 가스 유입은 또한 배양물의 탁도에 영향을 미친다. 난기류는 수성 배양 배지의 수위 하부에 가스 주입 포트를 위치시켜 생물반응기로 주입되는 가스가 배양 표면으로 기포 주입되도록 함에 의해 성취할 수 있다. 하나 이상의 가스 배출 포트는 가스가 배출되도록 하여 생물반응기내 압력 증강을 차단한다. 바람직하게, 가스 배출 포트는 생물반응기로 오염 미생물이 들어가는 것을 차단하는 '원-웨이' 밸브를 유도한다.3. 배지미생물 배양 배지는 전형적으로 고정 질소원, 고정 탄소원, 미량 요소, 임의로 pH 유지를 위한 완충제 및 포스페이트(전형적으로 포스페이트 염으로서 제공됨)과 같은 성분들을 함유한다. 기타 성분은 특히 해양 미세조류를 위해 염화나트륨과 같은 염을 함유할 수 있다. 질소 공급원은 예를 들어, 제한 없이 분자 질소, 니트레이트, 니트레이트 염, 암모니아(순수 형태 또는 염 형태, 예를 들어, (NH4)2SO4 및 NH4OH), 단백질, 대두 음식물, 옥수수침지액, 및 효모 추출물을 포함하는 유기 및 무기 질소원을 함유한다. 미량 요소의 예는 아연, 붕소, 코발트, 구리, 망간, 및 몰리브덴을 포함하고 예를 들어, 이의 각각의 형태는 ZnCl2, H3BO3, CoCl2ㆍ6H2O, CuCl2ㆍ2H2O, MnCl2ㆍ4H2O 및 (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O이다. 본 발명의 방법에 따라 유용한 미생물은 전세계적으로 다양한 장소 및 환경에서 발견된다. 다른 종 및 이들의 궁극적인 분화 분기점으로부터의 분리 결과로서, 최적의 성장 및 지질 및/또는 탄화수소 성분들의 최적의 생산을 위한 특정 성장 배지는 예측하기 어려울 수 있다. 몇몇 경우에, 특정 미생물 균주는 몇몇 억제 성분의 존재 또는 특정 미생물 균주에 의해 요구되는 임의의 필수 영양 요구성 물질의 부재 때문에 특정 성장 배지상에서 성장할 수 없다.고체 및 액체 성장 배지는 일반적으로 다양한 공급원으로부터 시판되고 광범위한 미생물 균주를 위해 적합한 특정 배지를 제조하기 위한 지침은 예를 들어, 기관[University of Texas at Austin, 1 University Station A6700, Austin, Texas, 78712-0183, for its culture collection of algae (UTEX)]에서 운영하는 온라인 사이트(http://www.utex.org/)에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 다양한 담수 및 염수 배지는 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조: PCT Pub. No. 2008/151149]에 기재된 것들을 포함한다.특정 예에서, 프로테오스 배지(Proteose Medium)는 무균 조건을 위해 적합하고 배지의 1L 용적의 배지(pH ~ 6.8)는 1리터의 Bristol 배지에 1g의 프로테오스 펩톤을 첨가하여 제조할 수 있다. Bristol 배지는 수용액중에 2.94 mM NaNO3, 0.17 mM CaCl2ㆍ2H2O, 0.3 mM MgSO4ㆍ7H2O, 0.43 mM, 1.29 mM KH2PO4, 및 1.43 mM NaCl를 포함한다. 1.5% 한천 배지에 대해, 15g의 한천을 1L의 용액에 첨가할 수 있다. 상기 용액을 덮고 오토클레이빙하고 이어서 사용전에 냉장 온도에 저장한다. 또 다른 예는 10g/L의 수소칼륨 프탈레이트(KHP), 0.9g/L의 수산화나트륨, 0.1g/L의 황산마그네슘, 0.2g/L의 인산수소칼륨, 0.3g/L의 염화암모늄, 10g/L의 글루코스, 0.001 g/L의 티아민 하이드로클로라이드, 20g/L 한천, 0.25g/L의 5-플루오로사이토신을 포함하고 pH 범위가 5.0 내지 5.2인 프로토테카 분리 배지(PIM)이다(문헌참조: Pore, 1973, App. Microbiology, 26: 648-649). 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 다른 배지는 상기된 URL에 문의하거나 미생물 배양물을 유지하는 다른 기관(예를 들어, SAG, CCAP, 또는 CCALA)에 문의하여 용이하게 확인할 수 있다. SAG는 기탁기관[the University of Gottingen (Gottingen, Germany)]에서의 조류 배양 수거물을 언급하고, CCAP는 기탁기관[the Scottish Association for Marine Science (Scotland, United Kingdom)]에 의해 관리되는 조류 및 원생동물의 배양 수거물을 언급하고, CCALA는 기탁기관[the Institute of Botany (Trebon, Czech Republic)]의 조류 연구소의 배양 수거물을 언급한다. 추가로, 미국 특허 제5,900,370호는 프로토테카 종의 종속영양 발효에 적합한 배지 제형 및 조건을 기재하고 있다. 오일 생산을 위해, 고정 탄소원의 선택이 중요한데 그 이유는 고정 탄소원의 비용이 경제적인 오일 생산을 위해 충분히 낮아야 하기 때문이다. 따라서, 적합한 탄소원은 예를 들어, 아세테이트, 플로리도사이드, 프럭토스, 갈락토스, 글루쿠론산, 글루코스, 글리세롤, 락토스, 만노스, N-아세틸글루코사민, 람노스, 슈크로스, 및/또는 크실로스를 포함하고 상기 화합물을 함유하는 공급원료의 선택이 본 발명의 방법의 중요한 측면이다. 본 발명의 방법에 따라 유용한 적합한 공급원료는 예를 들어, 블랙 음료, 옥수수 전분, 탈중합된 셀룰로스 물질, 유청, 당밀, 감자, 수수, 슈크로스, 사탕수수, 사탕무, 쌀 및 밀을 포함한다. 탄소원은 또한 슈크로스와 탈중합된 사탕무 펄프의 혼합물과 같은 혼합물로서 제공될 수 있다. 하나 이상의 탄소원(들)은 하나 이상의 외인성으로 제공된 고정 탄소원(들)의 약 50 μM 이상, 약 100 μM 이상, 약 500 μM 이상, 약 5 mM 이상, 약 50 mM 이상, 및 약 500 mM 이상의 농도로 제공될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 특히 유리한 탄소원은 셀룰로스(탈중합된 형태), 글리세롤, 슈크로스 및 수수를 포함하고, 이들 각각은 하기에서 보다 상세히 논의된다본 발명에 따라, 미생물은 공급원료로서 탈중합된 셀룰로스 바이오매쓰를 사용하여 배양할 수 있다. 셀룰로스 바이오매쓰(예를 들어, 스토버)는 저렴하고 용이하게 입수할 수 있지만, 효모용 공급원료서 상기 물질을 사용하기 위한 시도는 실패했었다. 특히, 상기 공급원료는 효모 성장에 억제 작용을 하는 것으로 밝혀졌고 효모는 셀룰로스 물질로부터 생성된 5탄당(예를 들어, 헤미-셀룰로스 기원의 크실로스)을 사용할 수 없다. 대조적으로, 미세조류는 가공된 셀룰로스 물질상에서 성장할 수 있다. 셀룰로스 물질은 일반적으로 약 40-60%의 셀룰로스; 약 20-40%의 헤미셀룰로스 및 10-30%의 리그닌을 포함한다.적합한 셀룰로스 물질은 농작물, 즉, 식물 일부, 1차 식품 또는 섬유 생성물과 함께 야생에서 제거되지 않는 주로 줄기 및 잎 뿐만 아니라 초본성 및 목재 에너지 작물로부터의 잔사를 포함한다. 이의 예는 농업 폐기물, 예를 들어, 사탕 수수 바가스, 쌀겨, 옥수수 섬유(줄기, 잎, 껍질 및 코브), 밀짚, 쌀짚, 사탕무 펄프, 감귤 펄프, 감귤 과피; 산림 폐기물, 예를 들어, 경목재 및 연목재 간벌, 및 수목 작업으로부터의 경목재 및 연목재 잔사; 목재 폐기물, 예를 들어, 톱 가루 폐기물(목재 칩, 톱밥) 및 펄프 가루 폐기물; 도시 폐기물, 예를 들어, 시의 고형 폐기물의 종이 분획물, 도시 목재 폐기물 및 도시 녹색 폐기물, 예를 들어, 시의 유리 클립핑; 및 목재 건축 폐기물을 포함한다. 추가의 셀룰로스는 스위치그래스, 하이브리드 포플라 목재 및 미스칸투스, 섬유 케인(cane) 및 섬유 수수와 같은 전용 셀룰로스 작물을 포한한다. 상기 물질로부터 생성된 5탄당은 크실로스를 포함한다.셀룰로스 물질은 상기 물질내 함유된 당(들)을 미생물이 이용할 수 있도록 효율이 증가되도록 처리된다. 본 발명은 산 분해 후 셀룰로스 물질을 처리하여 물질이 미생물(예를 들어, 미세조류 및 유성 효모)의 종속영양성 배양에 사용하기에 적합하도록 하는 신규 방법을 제공한다. 상기 논의된 바와 같이, 리그노셀룰로스 바이오매쓰는 셀룰로스, 베타 1,4 연결된 글루코스(6탄당)의 결정성 중합체, 헤미셀룰로스, 크실로스(5탄당)로 주로 구성된 보다 느슨하게 연합된 중하체 및 보다 드문 정도의 만노스, 갈락토스, 아라비노스, 리그닌, 시나필 알콜 및 이의 유도체로 구성된 복합 방향족 중합체, 및 알파 1,4-연결된 폴리갈락투론산의 직쇄인 펙틴을 포함하는, 다양한 분획물로 구성된다. 셀룰로스 및 헤미셀룰로스의 중합체 구조때문에 이들내 당(예를 들어, 단량체 글루코스 및 크실로스)은 많은 미생물에 의해 효율적으로 사용될 수 있는(대사되는) 형태로 존재하지 않는다. 상기 미생물을 위해 중합체를 구성하는 단량체 당을 생성하도록 셀룰로스 바이오매쓰를 추가로 가공하면 셀룰로스 물질이 공급원료(탄소원)로서 효율적으로 확실히 사용되는데 매우 도움이 될 수 있다.셀룰로스 또는 셀룰로스 바이오매쓰는, 바이오매쓰가 승온 및 승압에서 희석 황산(또는 다른 산)으로 처리되는 "분해(explosion)"로 호칭되는 공정에 적용된다. 상기 공정 조건은 셀룰로스 및 헤미셀룰로스 분획물의 글루코스 및 크실로스 단량체로 효소적 가수분해에 바이오매쓰가 효율적으로 적용될 수 있도록 한다. 수득한 단량체 당은 셀룰로스 당으로 호칭된다. 셀룰로스 당은 이어서 미생물에 의해 이용되어 다양한 대사물(예를 들어, 지질)이 생성될 수 있도록 한다. 산 분해 단계는 헤미셀룰로스 분획물이 구성 모노사카라이드로 부분 가수분해되도록 한다. 이들 당은 추가의 처리로 바이오매쓰로부터 완전히 유리될 수 있다. 몇몇 양태에서, 추가의 처리는 열수 처리이고 이는 분해된 물질을 고온수로 세척하여 염과 같은 오염물을 제거하도록 함을 포함한다. 상기 단계는 상기 공정에 사용되는 보다 희석된 당 농도로 인해 셀룰로스 에탄올 발효를 위해 필요하지 않다. 다른 양태에서, 추가의 처리는 추가의 산 처리이다. 여전히 다른 양태에서, 추가의 처리는 분해된 물질의 효소적 가수분해이다. 이들 처리는 또한 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 처리 유형은 유리되는 당(예를 들어, 5탄당 대 6탄당), 및 이들이 당해 공정에서 유리되는 단계의 유형에 영향을 미칠 수 있다. 결과로서, 이들이 5탄당 또는 6탄당이든 상관없이 상이한 당 스트림이 생성될 수 있다. 이들 집적된 5탄당 또는 6탄당 스트림은 따라서 상이한 탄소 이용 능력을 갖는 특이적 미생물에 지시될 수 있다. 본 발명의 방법은 전형적으로 에탄올 발효에서 성취되는 것 보다 높은 세포 밀도로 발효시킴을 포함한다. 종속영양성 셀룰로스 오일 생산을 위한 배양물의 보다 높은 밀도 때문에, 고정 탄소원(예를 들어, 셀룰로스 유래된 당 스트림(들))은 바람직하게 농축된 형태로 존재한다. 탈중합된 셀룰로스 물질의 글루코스 수준은 바람직하게 배양 단계 전에 300 g/리터 이상, 400 g/리터 이상, 500 g/리터 이상 또는 600 g/리터 이상이고 상기 배양 단계는 임의로 유가식 배양이고 여기서, 상기 물질은 세포가 성장하고 지질을 축적시킴으로써 시간 경과에 따라 세포에 공급된다. 셀룰로스 당 스트림은 셀룰로스 에탄올 생산에서 상기 농도 범위에서 또는 이의 근처에서 사용되지 않는다. 따라서, 리그노셀룰로스 오일의 생산 동안에 매우 높은 세포 밀도를 생성하고 유지하기 위해서는 탄소 공급원료(들)가 고농축된 형태로 종속영양 배양물로 전달되어야만 한다. 그러나, 이에 대한 기질이 아니고 유성 미생물에 의해 대사되지 않는 공급 스트림에서 임의의 성분은 생물반응기에 축적되고 이것은 성분이 목적하는 최종 생성물의 생산에 독성이거나 억제성인 경우 문제를 유발할 수 있다. 분해 공정 및 후속적인 중화 공정 둘다에서 셀룰로스 물질의 생성으로부터 유래된 푸르푸랄 및 하이드록시메틸 푸르푸랄 및 염과 같은 리그닌 및 리그닌 유래 부산물, 탄수화물 유래된 부산물 및 심지어 비대사된 펜토스/헥소스 당은 에탄올 발효에서 문제점을 제공할 수 있고 이들 효과는 초기 공급원료에서 이들의 농도가 높은 공정에서 상당히 증폭된다. 본 발명에 기재된 리그노셀룰로스 오일의 대규모 생산에 사용될 수 있는 6탄당에 대한 300g/L 범위 (또는 이보다 높은)의 당 농도를 성취하기 위해, 이들 독성 물질의 농도는 셀룰로스 바이오매쓰의 에탄올 발효에 전형적으로 존재하는 농도 보다 20배 높을 수 있다. 셀룰로스 물질의 분해 공정 처리는 상당한 양의 황산, 열 및 압력을 사용하므로써 탄수화물의 부산물, 즉 푸르푸랄 및 하이드록시메틸 푸르푸랄을 유리시킨다. 푸르푸랄 및 하이드록시메틸 푸르푸랄은 크실로스의 푸르푸랄 및 물로의 탈수를 통한 헤미셀룰로스의 가수분해동안에 생성된다. 본 발명의 몇몇 양태에서, 이들 부산물(예를 들어, 푸르푸랄 및 하이드록시메틸 푸르푸랄)은 생물반응기로 도입하기 전에 당화된 리그노셀룰로스 물질로부터 제거된다. 본 발명의 특정 양태에서, 탄수화물의 부산물의 제거 공정은 분해된 셀룰로스 물질의 열수 처리이다. 또한, 본 발명은 푸르푸랄 또는 하이드록시메틸 푸르푸랄과 같은 화합물에 내성일 수 있는 균주가 리그노셀룰로스 오일 생산에 사용되는 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 발효 배지에서 푸르푸랄에 내성일 수 있는 것 뿐만 아니라 실제로 리그노셀룰로스 오일의 생산 동안에 당해 부산물을 대사시킬 수 있는 미생물 및 방법을 제공한다.상기 분해 공정은 또한 상당한 수준의 염을 생성한다. 예를 들어, 분해를 위한 전형적인 조건은 분해된 셀룰로스 바이오매쓰가 10:1의 물:고체(무수 중량)로 재현탁되는 경우 5 mS/cm 초과의 전도성을 유도할 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 희석된 분해된 바이오매쓰는 효소 당화에 적용되고 수득한 현탁액은 생물반응기에 사용하기 위해 25배까지 농축된다. 농축된 당 스트림(들)에서 염 수준(전도성에 의해 측정된 바와 같이)은 허용가능하지 않게 높을 수 있다(1.5M까지의 Na+ 당량). 추가의 염은 또한 후속적인 효소 당화 공정을 위해 분해된 물질의 중화 즉시 생성된다. 본 발명은 이들 염을 제거하기 위한 방법을 제공하여 수득한 농축된 셀룰로스 당 스트림(들)은 리그노셀룰로스 오일을 생산하기 위한 종속영양 공정에 사용될 수 있도록 한다. 몇몇 양태에서, 상기 염을 제거하는 방법은 예를 들어, 이에 제한되지 않지만 DOWEX Marathon MR3과 같은 수지를 사용한 탈이온화이다. 특정 양태에서, 수지 단계를 사용하는 탈이온화는 당화 전에, 당 농축 또는 pH 조정 전 및 바이오매쓰의 열수 처리 전 또는 이들의 임의의 조합전에 수행한다; 다른 양태에서, 상기 단계는 이들 공정중 하나 이상 후에 수행한다. 다른 양태에서, 분해 공정 자체는 허용가능하지 않게 고수준으로 염의 생성을 피하도록 변화시킨다. 예를 들어, 셀룰로스 바이오매쓰의 황산(또는 다른 산) 분해에 대한 적합한 대용법은 기계적 펄핑으로 셀룰로스 바이오매쓰가 효소적 가수분해(당화)에 민감해지도록 하는 것이다. 여전히 다른 양태에서, 고수준의 염에 내성인 미생물의 본래의 균주 또는 고수준의 염에 내성을 갖는 유전자 조작된 균주가 사용된다. 유성 미생물을 사용하는 종속영양 오일 생산에 사용하기 위한 분해된 셀룰로스 바이오매쓰를 제조하는 방법에 대한 바람직한 양태는 도 10에 도시되어 있다. 단계 I은 재현탁된 분해된 셀룰로스 바이오매쓰를 5.0 내지 5.3의 범위로 pH를 조정하고 이어서 셀룰로스 바이오매쓰를 3회 세척함을 포함한다. 상기 세척 단계는 탈염 및 이온 교환 수지, 역삼투압, 열수 처리(상기된 바와 같이) 또는 단지 반복적인 재현탁 및 탈이온수중에서 원심분리의 사용을 포함하는 다양한 수단에 의해 성취될 수 있다. 상기 세척 단계는 전도성이 100-300 μS/cm인 셀룰로스 스트림을 유도하고 상당한 양의 푸르푸랄 및 하이드록시메틸 푸르푸랄을 제거시킨다. 상기 세척 단계로부터 이동은 헤미셀룰로스 분획물로부터 유리된 5탄당을 농축시키는 단계를 배제할 수 있다. 단계 II는 세척된 셀룰로스 바이오매쓰의 효소적 당화를 포함한다. 바람직한 양태에서, 아셀레라제(Genencor)를 사용한다. 단계 III은 상기 당화된 바이오매쓰의 원심분리 또는 이동시키기 및 세정을 통한 당의 회수를 포함한다. 수득한 바이오매쓰(고체)는 연료로서 사용될 수 있거나 폐기물로 보내질 수 있는 에너지 집적된 리그닌 풍부 성분이다. 원심분리/이동시키기 및 세정 공정에서 회수된 당 스트림을 수거한다. 단계 IV는 투과물의 회수와 함께 오염 고체를 제거하기 위한 마이크로여과를 포함한다. 단계 V는 진공 증발기를 사용하여 성취될 수 있는 농축 단계를 포함한다. 상기 단계는 수득한 당 공급원료의 단백질 함량으로 인해 때때로 필요한 P'2000(Sigma/Fluka)과 같은 소포제의 첨가를 임의로 포함할 수 있다.본 발명의 방법의 또 다른 양태에서, 탄소원은 바이오디젤 트랜스에스테르화로부터 산성화되고 비-산성화된 글리세롤 부산물을 포함하는 글리세롤이다. 하나의 양태에서, 탄소원은 글리세롤 및 하나 이상의 다른 탄소원을 포함한다. 몇몇 경우에, 글리세롤 및 하나 이상의 다른 고정 탄소원 모두는 발효 초기에 미생물에 제공된다. 몇몇 경우에, 글리세롤 및 하나 이상의 다른 고정 탄소원이 소정의 비율로 동시에 미생물에 제공된다. 몇몇 경우에, 글리세롤 및 하나 이상의 다른 고정 탄소원은 발효 과정 동안에 소정의 속도로 미생물에 공급된다.몇몇 미세조류는 글루코스의 존재때보다 글리세롤의 존재하에서 보다 신속하게 세포 분열을 진행한다(문헌참조: PCT 공개번호 제2008/151149호). 이들 경우에, 처음에 세포에게 글리세롤을 공급하여 세포 밀도를 신속하게 증가시킴에 이어서 글루코스를 공급하여 지질을 축적시키는 2단계 성장 공정은 지질이 생산되는 효율을 개선시킬 수 있다. 트랜스에스테르화 공정의 글리세롤 부산물의 사용은 생산 공정으로 도입되는 경우 상당한 경제적인 잇점을 제공한다. 글리세롤 및 글루코스의 혼합물과 같은 다른 공급 방법이 제공된다. 상기 혼합물의 공급은 또한 동일한 경제적 이득을 취득한다. 또한, 본 발명은 글리세롤과 다양하게 배합된 슈크로스와 같은 대안적인 당을 미생물에 공급하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법의 또 다른 양태에서, 탄소원은 슈크로스이고 사탕무 가공 기원의 진한 사탕무 쥬스와 같이 슈크로스를 함유하는 복합 공급원료를 포함한다. 하나의 양태에서, 배양 배지는 추가로 하나 이상의 슈크로스 이용 효소를 추가로 포함한다. 몇몇 경우에, 배양 배지는 슈크로스 인버타제를 포함한다. 하나의 양태에서, 슈크로스 인버타제 효소는 미생물 집단에 의해 발현되는 외인성 슈크로스 인버타제 유전자에 의해 암호화된 분비가능한 슈크로스 인버타제 효소이다. 따라서, 몇몇 경우에 하기 섹션 IV에 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 미세조류는 슈크로스 수송체, 슈크로스 인버타제, 헥소키나제, 글루코키나제 또는 프럭토키나제와 같은 슈크로스 이용 효소를 발현하도록 유전자 조작하였다.슈크로스를 함유하는 복합 공급원료는 사탕무 가공 기원의 폐기 당밀을 포함한다: 사탕무 가공의 낮은 가치의 폐기물의 사용은 탄화수소 및 기타 오일의 제조에 상당한 비용 절감을 제공할 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 또 다른 복합 공급원료는 수수 시럽 및 순수한 수수를 포함하는 수수이다. 수수 시럽은 달콤한 수수 케인의 쥬스로부터 생산된다. 이의 당 프로필은 주로 글루코스(덱스트로스), 프럭토스 및 슈크로스로 이루어진다.4. 오일 생산본 발명의 방법에 따른 오일 생산을 위해, 예를 들어, 빛이 배양물에 입사되지 않도록 하는 매우 대용량(40,000 리터 이상)의 발효기를 사용하는 경우에서와 같이 암실에서 세포를 배양하는 것이 바람직할 수 있다. 프로토테카 종은 고정 탄소원을 함유하는 배지에서 빛의 부재하에 오일 생산을 위해 성장시키고 번식시킨다; 상기 성장은 종속영양 성장으로서 공지되어 있다. 하나의 예로서, 지질 생산 미새물 세포의 접종물을 배지에 도입하고 세포가 번식을 시작하기 전에 지체(lag) 기간(지체 단계)이 있다. 지체 기간 후, 번식율은 일정하게 증가하고 로그 또는 대수증식기로 진입한다. 대수증식기에 이어서 질소와 같은 영양물의 감소 및 독성 물질의 증가 및 정족수 감지 기작으로 번식이 느려진다. 상기와 같이 느려진 후, 번식은 멈추고 세포는 정체기 또는 일정한 성장 상태로 진입하고 이는 세포에 제공된 특정 환경에 의존한다. 지질 풍부 바이오매쓰를 수득하기 위해, 상기 배양물은 전형적으로 질소 또는 또 다른 주요 영양물(탄소 이외의 다른 영양물)이 고갈됨으로써 조기에 종결되어 세포가 과량으로 존재하는 탄소원을 지질로 전환하도록 강요되는 대수증식기 말기 후에 수거한다. 배양 조건 파라미터는 총 오일 생산, 생산된 지질 종의 배합 및/또는 특정 오일의 생성을 최적화하도록 조작될 수 있다.상기 논의된 바와 같이, 생물반응기 또는 발효기는 세포가 이들의 성장 사이클의 다양한 단계를 진행하도록 사용된다. 하나의 예로서, 지질 생산 세포의 접종물은 배지에 도입될 수 있고 이어서 세포가 성장을 시작하기 전에 지체 기간(지체 기)이 도래한다. 상기 지체 기간 후, 성장 속도는 일정하게 증가하고 로그기 또는 대수증식기로 진입한다. 대수증식기에 이어서 영양물의 감소 및/또는 독성 물질의 증가로 인해 성장이 느려진다. 상기 느려진 후, 성장은 멈추고 당해 세포는 정체기 또는 일정 상태로 진입하고 이는 세포에 제공되는 특정 환경에 의존한다. 본원에 기재된 세포에 의한 지질 생산은 영양물이 공급되거나 세포 분열의 부재하에 계속적인 지질 생산을 허용하기에 여전히 가용한 정체기를 포함하는, 로그기 또는 이후 기간 동안에 일어날 수 있다. 바람직하게, 본원에 기재되고 당업계에 공지된 조건을 사용하여 성장한 미생물은 약 20중량% 이상의 지질, 바람직하게는 약 40중량% 이상의 지질, 보다 바람직하게는 약 50중량% 이상의 지질 및 가장 바람직하게는 약 60중량% 이상의 지질을 포함한다. 가공 조건은 특정 용도를 위해 적합한 지질의 수율을 증가시키도록 및/또는 생산 비용을 절감시키도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 특정 양태에서, 미세조류는 예를 들어, 질소, 인 또는 황과 같은 하나 이상의 영양물의 제한 농도의 존재하에 배양하고 글루코스와 같은 과량의 고정 탄소 에너지를 제공한다. 질소 제한은 질소가 과량으로 공급된 배양물에서의 미생물 지질 수율 이상으로 미생물 지질 수율을 증가시키는 경향이 있다. 특정 양태에서, 지질 수율의 증가는 약 10%, 50%, 100%, 200%, 또는 500% 이상이다. 상기 미생물은 전체 배양 기간중 일부 동안 또는 전체 기간동안 제한된 양의 영양물의 존재하에 배양할 수 있다. 특정 양태에서, 총 배양 기간동안 2회 이상 영양물 농도는 제한 농도와 비제한 농도 사이에서 순환한다. 세포의 지질 함량은 과량의 탄소를 제공하지만 질소를 제한하거나 제공하지 않으면서 증가된 기간동안 배양을 계속하여 증가시킬 수 있다.또 다른 양태에서, 지질 수율은 지질 경로 효소(예를 들어, 지방산 합성 효소)를 위한 하나 이상의 조인자(들)의 존재하에 지질 생산 미생물(예를 들어, 미세조류)를 배양함에 의해 증가된다. 일반적으로, 조인자(들)의 농도는 조인자(들)의 부재하에 미생물 지질 수율 보다 미생물 지질(예를 들어, 지방산) 수율을 증가시키기에 충분하다. 특정 양태에서, 상기 조인자(들)는 배양물에 조인자(들)를 암호화하는 외인성 유전자를 함유하는 미생물(예를 들어, 미세조류)을 포함시킴에 의해 배양물에 제공된다. 또는, 조인자(들)는 조인자의 합성에 관여하는 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 함유하는 미생물(예를 들어, 미세조류)를 포함사킴에 의해 배양물에 제공할 수 있다. 특정 양태에서, 적합한 조인자는 예를 들어, 비오틴 또는 판토테네이트와 같은 지질 경로 효소에 의해 요구되는 임의의 비타민을 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 조인자를 암호화하거나 상기 조인자의 합성에 관여하는 유전자는 널리 공지되어 있고 상기된 것들과 같은 기술 및 전략을 사용하여 미생물(예를 들어, 미세조류)에 도입될 수 있다. 본원에 기재된 생물반응기, 배양 조건 및 종속영양 성장 및 번식 방법의 특정 예는 임의의 적합한 방식으로 조합하여 미생물 성장 및 지질 및/또는 단백질 생산의 효율을 개선시키킬 수 있다. 무수 중량을 기준으로 높은 %의 오일/지질 축적과 함께 미세조류 바이오매쓰는 당업계에 공지된 상이한 배양 방법을 사용하여 생산되었다(문헌참조: PCT 공개번호 제2008/151149호). 본원에 기재되고 본 발명에 따라 유용한 배양 방법에 의해 생성된 미세조류 바이오매쓰는 무수 중량을 기준으로 10% 이상의 미세조류 오일을 포함한다. 몇몇 양태에서, 미생물 바이오매쓰는 무수 중량을 기준으로 25% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 또는 60% 이상의 미세조류 오일을 포함한다. 몇몇 양태에서, 미세조류 바이오매쓰는 무수 중량을 기준으로 10-90%의 미세조류 오일, 25-75%의 미세조류 오일, 40-75%의 미세조류 오일 또는 50-70%의 미세조류 오일을 함유한다. 본원에 기재된 바이오매쓰의 미세조류 오일 또는 본 발명의 방법 및 조성물에 사용하기 위해 바이오매쓰로부터 추출된 오일은 하나 이상의 독특한 지방산 에스테르 측쇄를 갖는 글리세로지질을 포함할 수 있다. 글리세로지질은 다양한 길이 및 다양한 정도의 포화를 가질 수 있는 1개, 2개 또는 3개의 지방산 분자에 에스테르화된 글리세롤 분자로 구성된다. 지방산 분자(및 미세조류 오일)의 길이 및 포화 특성은 하기 섹션 IV에서 보다 상세하게 기재된 바와 같은 배양 조건을 통해 또는 지질 경로 가공을 통해 본 발명의 미세조류 오일내에서 지방산 분자의 성질 또는 비율을 변형시키기 위해 조작될 수 있다. 따라서, 조류 오일의 특이적 블렌드는 2개 이상의 미세조류 종으로부터 바이오매쓰 또는 조류 오일을 함께 혼합함에 의해 또는 대두, 평지씨, 카놀라, 팜, 팜 커넬, 코코넛, 옥수수, 폐기 식물, 차이니즈 탈로우, 올리브, 해바라기, 면화씨, 치킨 지방, 소 탈로우, 돼지 탈로우, 미세조류, 거대조류, 미생물, 쿠페아, 아마, 피넛, 쵸이스 백색 그리스, 라드, 카멜리나 사티바, 머스타드 씨, 캐슈 너트, 귀리, 루핀, 케나프, 금잔화, 헴프, 커피, 아마인(아마), 헤이즐넛, 유포비아, 호박씨, 코리안더, 카멜리아, 참깨, 홍화, 쌀, 유동, 코코아, 코프라, 양귀비, 아주까리, 피칸, 호호바, 마카다미아, 브라질 너트, 아보카도, 석유 또는 상기 오일 중 임의의 증류 분획물과 같은 다른 공급원 기원의 오일과 본 발명의 조류 오일을 블렌딩함에 의해 조류의 단일 종내에서 생산할 수 있다.오일 조성물, 즉, 글리세로지질의 지방산 성분의 성질 및 비율은 또한 2개 이상의 독특한 종의 미세조류 기원의 바이오매쓰 또는 오일을 배합함에 의해 조작할 수 있다. 몇몇 양태에서, 독특한 종의 미세조류중 2개 이상은 상이한 글리세로지질 프로필을 갖는다. 미세조류의 독특한 종은 바람직하게 종속영양 조건하에 본원에 기재된 바와 같이 함께 배양하거나 별도로 배양하여 각각의 오일을 생성할 수 있다. 상이한 종의 미세조류는 세포의 글리세로지질 내 상이한 %의 독특한 지방산 성분을 함유할 수 있다. 일반적으로, 프로토테카 균주는 쇄 길이가 C8-C14인 지방산을 거의 갖지 않는다. 예를 들어, 프로토테타 모리포르미스(UTEX 1435), 프로토테카 크루가니(Prototheca krugani)(UTEX 329), 프로토테카 스타그노라(UTEX 1442) 및 프로토테카 조프피(UTEX 1438)는 C8 지방산을 함유하지 않고(검출가능하지 않은 양) C10 지방산이 0 내지 0.01%이고 C12 지방산은 0.03 내지 2.1%이고 C14 지방산은 1.0 내지 1.7%이다.몇몇 경우에, 쇄 길이가 C8-10인 지방 아실-ACP 기질에 대한 활성을 갖는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 전이유전자를 함유하는 프로토테카 균주는 쇄 길이가 C8인 지방산을 0.3% 이상, 0.8% 이상, 1.5% 이상 갖고 쇄 길이가 C10인 지방산을 0.3% 이상, 1.0% 이상, 3.0% 이상, 5% 이상 갖는다. 다른 경우에, 쇄 길이가 C12인 지방 아실-ACP 기질에 대해 활성을 갖는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 전이유전자를 함유하는 프로토테카 균주는 쇄 길이가 C12인 지방산을 3.0% 이상, 5% 이상, 7% 이상, 10% 이상, 13% 이상 갖고 쇄 길이가 C14인 지방산을 1.5% 이상, 2% 이상, 또는 3% 이상 갖는다. 다른 경우에, 쇄 길이가 C14인 지방 아실-ACP 기질에 대한 활성을 갖는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 전이유전자를 함유하는 프로토테카 균주는 쇄 길이가 C14인 지방산을 4.0% 이상, 7% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상 갖고 쇄 길이가 C12인 지방산을 0.4% 이상, 1% 이상, 1.5% 이상 갖는다.비제한적인 예에서, 쇄 길이가 C8 및 C10인 지방 아실-ACP 기질에 대한 활성을 갖는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 전이유전자를 함유하는 프로토테카 균주는 쇄 길이가 C8인 지방산을 0.3 내지 1.58% 갖고 쇄 길이가 C10인 지방산을 0.35 내지 6.76% 갖는다. 다른 비제한적인 예에서, 쇄 길이가 C12인 지방 아실-ACP 기질에 대한 활성을 갖는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 전이유전자를 함유하는 프로토테카 균주는 쇄 길이가 C12인 지방산을 3.9 내지 14.11% 갖고 쇄 길이가 C14인 지방산을 1.95 내지 3.05% 갖는다. 다른 비제한적인 예에서, 쇄 길이가 C14인 지방 아실-ACP 기질에 대한 활성을 갖는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 전이유전자를 함유하는 프로토테카 균주는 쇄 길이가 C14인 지방산을 4.40 내지 17.35% 갖고 쇄 길이가 C12인 지방산을 0.4 내지 1.83 면적% 갖는다. 몇몇 경우에, 쇄 길이가 C8 내지 C14인 지방 아실-ACP 기질에 대한 활성을 갖는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 전이유전자를 함유하는 프로토테카 균주는 중간쇄(C8-C14)의 지방산을 3.5 내지 20% 갖는다. 몇몇 경우에, 외인성 유전자를 유지하기 위한 일정하고 높은 선별압하에 유전자전이 프로토테카 균주를 유지시키는 것이 특이적 쇄 길이의 목적하는 지방산의 증가로 인해 유리하다. 비제한적인 예에서, 실시예 5는 C14 선호 티오에스테라제 외인성 유전자를 함유하는 프로토테카 모리포르미스의 배양물이 유지되는 경우 C14 쇄 길이의 지방산(30% 초과의 C8-C14 쇄 길이의 지방산)이 2배 증가함을 입증한다. 고수준의 외인성 유전자 보유는 본원에 기재된 상동성 재조합 벡터 및 방법을 사용하여 세포의 핵 염색체내로 외인성 유전자를 삽입함에 의해 성취될 수 있다. 핵 염색체로 통합된 외인성 유전자를 함유하는 재조합 세포가 본 발명의 목적이다. 미세조류 오일은 또한 미세조류에 의해 생산되거나 배양 배지로부터 미세조류 오일로 혼입된 다른 성분을 포함할 수 있다. 이들 다른 성분들은 미세조류를 배양하기 위해 사용되는 배양 조건, 미세조류 종, 바이오매쓰로부터 미세조류 오일을 회수하기 위해 사용되는 추출 방법 및 미세조류 오일 조성물에 영향을 줄 수 있는 다른 인자에 따라 다양한 양으로 존재할 수 있다. 상기 성분의 비제한적인 예는 0.1-0.4 마이크로그램/ml로 존재하는 카로테노이드, 오일의 킬로그램당 0 내지 0.02 밀리그램으로 존재하는 클로로필, 오일의 100그램당 0.4 내지 0.6 밀리그램으로 존재하는 감마 토코페롤, 및 오일의 그램당 0.2 내지 0.5 밀리그램으로 존재하는 총 토코트리에놀을 포함한다.다른 성분은 제한 없이, 인지질, 토코페롤, 토코트리에놀, 카로테노이드(예를 들어, 알파-카로틴, 베타-카로틴, 리코펜 등), 크산토필(예를 들어, 루테인, 제악산틴, 알파-크립토산틴 및 베타-크립토산틴), 및 다양한 유기 또는 무기 화합물을 함유할 수 있다.몇몇 경우에, 프로토테카 종으로부터 추출된 오일은 0.02mg/kg 이하의 클로로필을 포함한다. 몇몇 경우에, 프로토테카 종으로부터 추출된 오일은 총 0.4 mcg/ml 이하의 카로테노이드를 포함한다. 몇몇 경우에, 상기 프로토테카 오일은 오일 100그램당 0.40 내지 0.60 밀리그램의 감마 토코페롤을 포함한다. 다른 경우에, 프로토테카 오일은 오일 그램당 총 0.2-0.5 밀리그램의 토코트리에놀을 포함한다. III. 유전자 조작 방법 및 재료본 발명은 프로토테카 세포를 유전자 변형시키기 위한 방법 및 재료 및 본 발명의 방법에 유용한 재조합 숙주 세포를 제공하고, 당해 숙주 세포는 재조합 프로토테카 모리포르미스, 프로토테카 조프피, 프로토테카 조프피, 프로토테카 크루가니 및 프로토테카 스타그노라 숙주 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 방법 및 재료의 기재는 구독자의 편의를 위해 서브섹션으로 나눈다. 서브섹션 1에서, 형질전환 방법을 기재한다. 서브섹션 2에서 상동성 재조합을 사용한 유전자 조작 방법을 기재한다. 서브섹션 3에서 발현 벡터 및 성분을 기재한다.1. 조작 방법 - 형질전환세포를, 예를 들어, 유전자주입, 전기천공(참조: Maruyama et al. (2004), Biotechnology Techniques 8:821-826)), 유리 비드 형질전환 및 탄화규소 휘스커 형질전환을 포함하는 임의의 적합한 기술에 의해 형질전환시킬 수 있다. 사용될 수 있는 또 다른 방법은 원형질세포를 형성하고 CaCl2 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 사용하여 재조합 DNA를 미세조류 세포에 도입하는 것이다[문헌참조: Kim et al. (2002), Mar. Biotechnol. 4:63-73, 본 문헌은 클로렐라 엘리프소이데아(Chorella ellipsoidea)의 형질전환을 위한 상기 방법의 사용을 보고한다]. 미세조류의 동시 형질감염을 사용하여 2개의 독특한 벡터 분자를 세포에 동시에 도입할 수 있다[문헌참조: 예를 들어 Protist 2004 Dec;155(4):381-93]. 또한 유전자 주입 방법[문헌참조: 예를 들어, Sanford, Trends In Biotech. (1988) 6:299 302, U.S. Patent No. 4,945,050]; 전기천공[문헌참조: Fromm et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) (1985) 82:5824 5828]; 레이져 빔, 미세주입 또는 DNA를 미세조류로 도입할 수 있는 임의의 다른 방법의 사용으로 프로토테카 세포를 형질전환시킬 수 있다.2. 조작 방법 - 상동성 재조합상동성 재조합은 상동성 영역을 정렬하고 교환하는 상보적 DNA 서열의 능력이다. 표적화된 게놈 서열("주형")과 상동성인 서열을 함유하는 유전자전이 DNA ("공여체")를 유기체에 도입함에 이어서 상응하는 게놈 상동성 서열 부위에서 게놈으로 재조합을 진행한다. 많은 경우에 상기 공정의 기계론적 단위는 다음을 포함한다: (1) 상동성 DNA 절편의 쌍형성; (2) 이중가닥 브레이크의 공여체 DNA 분자로의 도입; (3) 유리된 공여체 DNA 말단에 의한 주형 DNA 분자의 공격에 이어서 DNA의 합성; 및 (4) 이중가닥 브레이크 복구 반응으로 최종 재조합 생성물 생성.숙주 유기체에서 상동성 재조합을 수행하기 위한 능력은 분자 유전학적 수준에서 수행될 수 있는 것에 대한 많은 실제 연관성을 갖고 맞춤 오일을 생성할 수 있는 유성 미생물의 생성에 유용한 많은 실제 연관성을 갖는다. 이의 천연의 상동성 재조합이란 정확한 유전자 표적화 반응이고 따라서 동일한 표적화 서열로 생성된 대부분의 유전자 전이 계열은 근본적으로 표현형과 관련해서 동일하고 극소수의 형질전환 반응의 스크리닝을 필요로 한다. 상동성 재조합은 또한 숙주 염색체로의 유전자 삽입 반응을 표적화하여 유전자 선별 부재하에서도 우수한 유전학적 안정성을 수득한다. 상이한 염색체 유전자좌는 심지어 이종성 프로모터/UTR로부터 유전자 발현에 영향을 줄 가능성이 있기 때문에 상동성 재조합은 유사하지 않은 게놈 환경내에서 유전자좌를 탐색하고 유전자 발현에 대한 이들 환경의 영향을 평가하는 방법일 수 있다.특히 유용한 상동성 재조합을 사용하는 유전자 조작 응용은 고도로 특이적인 양상으로 이종성 유전자 발현을 구동시키는 프로모터/UTR과 같은 특이적 숙주 조절 요소를 선택하는 것이다. 예를 들어, 이종성 C12:0 특이적 FATB(티오에스테라제) 유전자 카세트와 적합한 선택적 마커를 사용한 내인성 스테아로일 ACP 데스타우라제 유전자의 정확한 절단은 C18:1의 지방산 수준을 급격히 감소시키고 동시에 C12:0 지방산의 수준을 증가시키는 것으로 예측할 수 있다. 실시예 13은 내인성 프로토테카 모리포르미스 스테아로일 ACP 데스타우라제 유전자의 절단을 위해 적합한 상동성 재조합 표적화 작제물을 기재한다.상동성 재조합은 정확한 유전자 표적화 반응이기 때문에, 충분한 플랭킹 영역이 확인된 이상 목적하는 유전자 또는 영역내 임의의 뉴클레오타이드(들)를 정확히 변형시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 상동성 재조합은 RNA 및/또는 단백질의 유전자 발현에 영향을 주는 조절 서열을 변형시키기 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 이것은 또한 기질 특이성, 친화성 및 Km과 같은 효소 활성을 변형시킴에 따라서 숙주 세포 대사의 목적하는 변화에 영향을 주고자 단백질 암호화 영역을 변형시키는데 사용될 수 있다. 상동성 재조합은 유전자 표적화, 유전자 전환, 유전자 결실, 유전자 복제, 유전자 역위를 유도하고 프로모터, 인핸서 및 3'UTR과 같은 유전자 발현 조절 요소를 교환하여 고스트(gost) 게놈을 조작하기 위한 강력한 수단을 제공한다.상동성 재조합은 내인성 숙주 세포 게놈내에 목적하는 유전자 또는 영역을 "표적화"하기 위한 내인성 서열 조각을 함유하는 표적화 작제물을 사용하여 성취될 수 있다. 상기 표적화 서열은 목적하는 유전자 또는 영역의 5'에 위치하거나 목적하는 유전자/영역의 3'에 위치하거나 심지어 목적하는 유전자/영역을 플랭킹할 수 있다. 상기 표적화 작제물은 추가의 벡터 골격과 함께 슈퍼코일된 플라스미드 DNA로서, 벡터 골격을 갖지 않는 PCR 생성물로서 또는 선형화된 분자로서 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 몇몇 경우에, 이것은 먼저 제한 효소에 유전자전이 DNA(공여체 DNA)내의 상동성 서열을 노출시키는 것이 유리할 수 있다. 상기 단계는 재조합 효율을 증가시킬 수 있고 목적하지 않은 반응의 발생을 감소시킬 수 있다. 재조합 효율을 증가시키는 다른 방법은 PCR을 사용하여 표적화된 게놈 서열에 상동성인 선형 말단을 함유하는 형질전환 유전자전이 DNA를 생성시킴을 포함한다. 3. 벡터 및 벡터 성분본 발명에 따라 미생물을 형질전환시키기 위한 벡터는 본원에 기재된 바를 토대로 당업자에게 유사한 공지된 기술에 의해 제조할 수 있다. 벡터는 전형적으로 하나 이상의 유전자를 함유하고 여기서 각각의 유전자는 목적하는 생성물(유전자 생성물)의 발현을 암호화하고 유전자 발현을 조절하거나 유전자 생성물을 재조합 세포내 특정 위치에 표적화하는 하나 이상의 제어 서열에 작동적으로 연결되어 있다. 구독자를 도와주기 위해 본 서브섹션은 여러 서브섹션으로 나누어진다. 서브섹션 A는 본 발명에 의해 제공된 신규 제어 서열 뿐만 아니라 전형적으로 벡터상에 함유된 제어 서열을 기재한다. 서브섹션 B는 신규 최적화 방법 및 본 발명에 의해 제공된 것들을 사용하여 제조된 유전자 뿐만 아니라 벡터내 전형적으로 함유된 유전자를 기재한다.A. 제어 서열제어 서열은 암호화 서열의 발현을 조절하거나 유전자 생성물을 세포 내부 또는 외부의 특정 위치로 지시하는 핵산이다. 발현을 조절하는 제어 서열은 예를 들어, 암호화 서열의 전사를 조절하는 프로모터 및 암호화 서열의 전사를 종결시키는 터미네이터를 포함한다. 또 다른 제어 서열은 폴리아데닐화 시그날을 암호화하는 암호화 서열의 말단에 위치한 3' 비해독 서열이다. 유전자 생성물을 특정 위치로 지시하는 제어 서열은 단백질이 세포 내부 또는 외부의 특정 위치에 부착되는 위치로 지시하는 시그날 펩타이드를 암호화하는 것들을 포함한다. 따라서, 미세조류내 외인성 유전자의 발현을 위한 예시적인 벡터 디자인은 미세조류내에서 활성인 프로모터에 작동적으로 연결된 목적하는 유전자 생성물(예를 들어, 선택가능한 마커, 지질 경로 변형 효소 또는 슈크로스 이용 효소)에 대한 암호화 서열을 함유한다. 또한, 벡터가 목적하는 암호화 서열과 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유하지 않는 경우, 상기 암호화 서열은 이것이 벡터 통합 부위에서 내인성 프로모터와 작동가능하게 연결되도록 세포를 형질전환시킬 수 있다. 형질전환의 프로모터 부재 방법은 미세조류에서 작동하는 것으로 입증되었다[문헌참조: 예를 들어, Plant Journal 14:4, (1998), pp.441-447].많은 프로모터는 미세조류내에서 활성이고 형질전환된 조류에 내인성이 아닌 프로모터(즉, 다른 조류 기원의 프로모터, 고등 식물 기원의 프로모터 및 식물 바이러스 또는 조류 바이러스 기원의 프로모터) 뿐만 아니라 형질전환된 조류에 내인성인 프로모터를 포함한다. 미세조류내에서 활성인 예시적인 외인성 및/또는 내인성 프로모터(또한 미세조류에서 기능하는 항생제 내성 유전자)는 문헌[참조: PCT 공개 번호 제2008/151149호 및 본원에 인용된 문헌]에 기재되어 있다. 외인성 유전자를 발현시키기 위해 사용되는 프로모터는 천연적으로 상기 유전자 또는 이종성 유전자에 연결된 프로모터일 수 있다. 몇몇 프로모터는 하나 이상의 미세조류 종에서 활성이다. 다른 프로모터는 종 특이적이다. 예시적인 프로모터는 하기 실시예에 사용된 클라미도모나스 레인하르드티(Chlamydomonas reinhardtii) 기원의 β-튜불린과 같은 프로모터 및 다수의 미세조류 종에서 활성인 것으로 밝혀진 콜리플라워 모자이크 바이러스(CMV) 및 클로렐라 바이러스와 같은 바이러스 프로모터를 포함한다[문헌참조: 예를 들어, Plant Cell Rep. 2005 Mar;23(10-11):727-35; J Microbiol. 2005 Aug;43(4):361-5; Mar Biotechnol (NY). 2002 Jan;4(l):63-73]. 프로토테카에서 외인성 유전자의 발현에 사용하기에 적합할 수 있는 또 다른 프로모터는 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana) 글루타메이트 데하이드로게나제 프로모터/5 'UTR (서열번호 69)이다. 임의로, 프로모터를 함유하는 상기 서열중 10, 20, 30, 40, 50, 또는 60개 이상의 뉴클레오타이드가 사용되다. 프로토테카 외인성 유전자의 발현에 유용한 프로모터는 본원의 서열 목록에 열거되어 있고 예를 들어 클로렐라 HUP1 유전자(서열번호 1)의 프로모터 및 클로렐라 엘립소이데아 니트레이트 리덕타제 프로모터(서열번호 2)가 있다. 클로렐라 바이러스 프로모터는 또한 프로토테카에서 미국 특허 제6,395,965호의 서열번호 1 내지 7과 같은 유전자를 발현시키는데 사용될 수 있다. 프로토테카에서 활성인 추가의 프로모터는 예를 들어 문헌[참조: Biochem Biophys Res Commun. 1994 Oct 14;204(l): 187-94; Plant Mol Biol. 1994 Oct;26(l):85-93; Virology. 2004 Aug 15;326(1): 150-9; and Virology. 2004 Jan 5;318(l):214-23]에서 찾을 수 있다. 프로모터는 일반적으로 항상성이거나 유도성인 것으로서 특성화될 수 있다. 항상성 프로모터는 일반적으로 동일한 수준에서 항상(또는 세포 생활 사이클에서 특정 시점에서) 활성이거나 기능성이다. 역으로, 유도성 프로모터는 활성(또는 불활성)이거나 단지 자극에 응답하여 상당히 상향 조절되거나 하향 조절된다. 상기 프로모터 유형 둘다는 본원의 방법에 적용된다. 본 발명에서 유용한 유도성 프로모터는 외인성으로 제공된 소분자(예를 들어, 서열번호 1에서와 같이 글루코스), 온도(열 또는 냉), 배양 배지내 질소 부재 등과 같은 자극에 응답하여 작동적으로 연결된 유전자의 전사를 매개하는 것들을 포함한다. 적합한 프로모터는 근본적으로 사일런트 유전자의 전사를 활성화시킬 수 있거나 바람직하게 낮은 수준으로 전사된 작동가능하게 연결된 유전자의 전사를 상당히 상향 조절한다.종결 영역 제어 서열의 내포는 임의적이고 사용되는 경우 상기 선택은 상기 종결 영역이 비교적 상호교환가능하므로 주로 편의를 위한 것이다. 상기 종결 영역은 전사 개시 영역(프로모터)에 특정된 것일 수 있거나 목적하는 DNA 서열에 특정된 것일 수 있거나 또 다른 공급원으로부터 수득할 수 있다[문헌참조: 예를 들어, Chen and Orozco, Nucleic Acids Res. (1988) 16:8411]. 본 발명은 또한 제어 서열 및 재조합 유전자, 및 목적하는 유전자의 구분된 발현을 제공하는 것들을 함유하는 벡터를 제공한다. 표적화를 위한 기관은 엽록체, 플라스티드, 미토콘드리아, 및 소포체이다. 또한, 본 발명은 제어 서열 및 재조합 유전자, 및 세포 외부로의 단백질의 분비를 제공하는 것들을 함유하는 벡터를 제공한다. 프로토테카 핵 게놈에서 발현되는 단백질은 플라스티드 표적화 시그날을 사용하여 플라스티드로 표적화될 수 있다. 클로렐라에 내인성인 플라스티드 표적화 서열은 공지되어 있고 예를 들어, 플라스티드로 표적화되는 단백질을 암호화하는 클로렐라 핵 게놈내 유전자들이 있고[문헌참조: 예를 들어, GenBank 승인 번호 AY646197 및 AF499684], 하나의 양태에서, 상기 제어 서열은 단백질의 발현을 프로토테카 플라스티드로 표적화하는 본 발명의 벡터내에 사용된다. 하기 실시예는 숙주 세포내 올바른 구획으로 이종성 단백질을 표적화하는 조류 플라스티드 표적화 서열의 용도를 기재한다. cDNA 라이브러리는 프로토테카 모리포르미스 및 클로렐라 프로토테코디에스 세포를 사용하여 제조되고 하기 실시예 12 및 11에 기재되어 있다. 서열은 BLAST이고 플라스티드/엽록체로 수송되는 공지된 단백질과의 상동성에 대해 분석된다. 상기 단백질을 암호화하는 cDNA를 클로닝하고 플라스티드 표적화 서열은 상기 cDNA로부터 분리하였다. cDNA 라이브러리로부터 동정된 조류 플라스티드 표적화 서열의 아미노산 서열 및 하기 이종성 발현 실시예에 사용된 식물 지방 아실-ACP 티오에스테라제의 아미노산 서열은 서열번호 127 내지 133에 열거되어 있다.본 발명의 또 다른 양태에서, 프로토테카내에서 폴리펩타이드의 발현은 소포체로 표적화된다. 발현 벡터내 적절한 보유 또는 분류 시그날의 내포는 단백질이 소포체(ER)에 보유되고 골지체로 다운스트림되지 않도록 하는 것을 보장한다. 예를 들어, IMPACT VECTOR 1.3 벡터[제조원:Wageningen UR- Plant Research International]는 널리 공지된 KDEL 보유 또는 분류 시그날을 포함한다. 상기 벡터와 함께, ER 보유는 이것이 발현 수준을 5배 이상으로 개선시킴이 보고되었다는 점에서 실제 잇점을 갖는다. 이에 대한 주요 이유는 ER이 세포질내 존재하는 것 보다 발현된 단백질의 해독후 분해에 관여하는 프로테아제가 보다 낮은 농도이고/이거나 상이하다는 점에 있는 것으로 나타난다. 녹색 미세조류에서 기능하는 ER 보유 시그날은 문헌[참조: 예를 들어, Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Apr 26;102(17):6225-30]에 공지되어 있다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 폴리펩타이드는 배양 배지내로 세포 외부로의 분비를 위해 표적화된다. 프로토테카에서 본 발명에 방법에 따라 사용될 수 있는 클로렐라중에서 활성인 분비 시그날에 대한 예는 문헌[참조: Hawkins et al., Current Microbiology Vol. 38 (1999), pp. 335-341]을 참조한다.B. 유전자 및 코돈 최적화전형적으로, 유전자는 프로모터, 암호화 서열 및 종결 제어 서열을 포함한다. 재조합 DNA 기술에 의해 어셈블리되는 경우, 유전자는 발현 카세트로 호칭될 수 있고 재조합 유전자를 숙주 세포로 도입하는데 사용되는 벡터로의 편리한 삽입을 위한 제한 부위에 의해 플랭킹될 수 있다. 상기 발현 카세트는 상동성 재조합에 의한 발현 카세트의 게놈으로의 안정적인 통합을 촉진시키는, 게놈 또는 다른 핵산 표적 기원의 DNA 서열에 의해 플랭킹될 수 있다. 또는, 상기 벡터 및 이의 발현 카세트는 통합되지 않은 상태로 유지될 수 있고, 이 경우에, 상기 벡터는 전형적으로, 이종성 벡터 DNA의 복제를 제공할 수 있는 복제 오리진을 포함한다.벡터상에 존재하는 통상의 유전자는 단백질을 암호화하는 유전자이고 이의 발현은 상기 단백질을 함유하는 재조합 세포가 상기 단백질을 발현하지 않는 세포로부터 구분될 수 있도록 한다. 상기 유전자 및 이의 상응하는 유전자 생성물은 선택가능한 마커로서 호칭된다. 임의의 광범위한 선택가능한 마커는 프로토테카를 형질전환시키기 위해 유용한 전이유전자 작제물에 사용될 수 있다. 적합한 선택가능한 마커의 예는 G418 내성 유전자, 니트레이트 리덕타제 유전자(문헌참조: Dawson et al. (1997), Current Microbiology 35:356-362), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자(HPT; 참조: Kim et al. (2002), Mar. Biotechnol. 4:63-73), 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 및 플레오마이신(문헌참조: Huang et al. (2007), Appl. Microbiol. Biotechnol. 72:197-205)에 대해 내성을 부여하는 ble 유전자를 포함한다. 항생제에 대한 미세조류의 민감성을 측정하는 방법은 널리 공지되어 있다[문헌참조: 예를 들어, Mol Gen Genet. 1996 Oct 16;252(5):572-9]. 본 발명의 목적을 위해, 본 발명의 재조합 숙주 세포를 제조하기 위해 사용되는 발현 벡터는 상기 유전자들중 하나가 선택가능한 마커인 경우, 2개 이상 및 흔히 3개의 유전자를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 유전자 조작된 프로토테카는 선택가능한 마커 뿐만 아니라 하나 이상의 외인성 유전자, 예를 들어, 슈크로스 인버타제 유전자 또는 아실 ACP-티오에스테라제 유전자를 포함하는 본 발명의 벡터로 형질전환시킬 수 있다. 하나 또는 2개의 유전자는 지질 수율 및 지방산 에스테르로의 전환을 증진시키기 위해 상기 유전자들의 발현과 관련된 타이밍을 허용하는 유도성 프로모터를 사용하여 발현될 수 있다. 2개 이상의 외인성 유전자의 발현은 동일한 유도성 프로모터의 제어하게 또는 상이한 유도성(또는 항상성) 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 후자 상황에서, 제1 외인성 유전자의 발현은 제1 기간동안 유도될 수 있고(이동안에 제2 외인성 유전자의 발현은 유도되거나 유도되지 않을 수 있다) 제2 외인성 유전자의 발현은 제2 기간동안 유도될 수 있다(이동안에 제1 외인성 유전자의 발현은 유도되거나 유도되지 않을 수 있다).다른 양태에서, 2개 이상의 외인성 유전자(임의의 선택가능한 마커에 추가로)는 지방 아실-ACP 티오에스테라제 및 지방 아실-CoA/알데하이드 리덕타제이고, 상기 수율의 조합 작용은 알콜 생성물을 생성시킨다. 추가로 제한 없이 알데하이드를 생성하기 위한 지방 아실-ACP 티오에스테라제 및 지방 아실-CoA 리덕타제를 포함하는 외인성 유전자의 다른 조합이 제공된다. 하나의 양태에서, 벡터는 알칸을 생성하기 위해 지방 아실-ACP 티오에스테라제, 지방 아실-CoA 리덕타제 및 지방 알데하이드 데카보닐라제의 조합을 제공한다. 이들 각각의 양태에서, 외인성 유전자중 하나 이상은 유도성 프로모터를 사용하여 발현될 수 있다. 2개 이상의 외인성 유전자를 발현하는 본 발명의 다른 예시적인 벡터는 슈크로스 수송체 및 슈크로스 인버타제 효소 둘다를 암호화하는 것들 및 선택가능한 마커 및 분비된 슈크로스 인버타제 둘다를 암호화하는 것들을 포함한다. 벡터중 어느 하나의 유형으로 형질전환된 재조합 프로토테카는 탄소원으로서 사탕무(및 사탕무 유래 당)를 사용하는 능력으로 조작되었으므로 보다 낮은 제조 비용으로 지질을 생산한다. 상기된 2개의 외인성 유전자의 삽입은, 보다 큰 탄소 유입이 지질 생산과 맞물리도록 지시되고/되거나 무작위 돌연변이 유발을 통해 폴리사카라이드 생합성의 파괴와 조합될 수 있다. 개별적으로 및 조합적으로, 영양성 전환, 지질 생산을 변화시키기 위한 조작 및 외인성 효소를 사용한 처리는 미생물에 의해 생산되는 지질 조성물을 변형시킨다. 상기 변형은 미생물내에서 생산되는 지질의 양의 변화, 다른 지질과 비교하여 생산되는 하나 이상의 탄화수소 종의 양 및/또는 생산되는 지질 종의 유형의 변화일 수 있다. 예를 들어, 미세조류는 보다 높은 양의 TAG 및/또는 %를 생산하도록 조작될 수 있다.재조합 단백질의 최적의 발현을 위해, 형질전환된 숙주 세포에 의해 우선적으로 사용되는 코돈으로 mRNA를 생산하는 암호화 서열을 사용하는 것이 이롭다. 따라서, 전이유전자의 적당한 발현은 전이유전자의 코돈 용법이 전이유전자가 발현되는 유기체의 특이적 코돈 편력에 부합되도록 하는 것이 요구될 수 있다. 상기 효과가 근거하는 정확한 기작은 많지만, 상기 필요성이 충족되는 경우 전이유전자 전령 RNA(mRNA)의 보다 효율적인 해독과 커플링되는, 세포내에서 합성되는 단백질과 가용하게 아미노아실화된 tRNA 풀의 적당한 균형을 포함한다. 전이유전장내 코돈 용법이 최적화되지 않은 경우, 가용한 tRNA 풀은 이종성 mRNA의 효율적인 해독을 허용하기에 충분하지 않고 리보솜 스톨링 및 종결 및 전이유전자 mRNA의 가능한 불안정성을 유도한다. 본 발명은 프로토테카내에서 재조합 단백질의 성공적인 발현을 위해 유용한 코돈 최적화된 핵산을 제공한다. 프로토테카 종에서 코돈 용법은 프로토테카 모리포르미스로부터 분리된 cDNA 서열을 연구함에 의해 분석된다. 상기 분석은 24,000개 코돈에 대한 탐색이고 이의 결과는 하기의 표 1에 나타낸다. 다른 양태에서, 재조합 벡터내 유전자는 프로토테카 균주 이외의 다른 미세조류 균주를 참조하여 코돈 최적화되었다. 예를 들어, 미세조류내 발현용 유전자를 재암호화하는 방법은 미국 특허 제7,135,290호에 기재되어 있다. 암호화 최적화를 위한 추가의 정보는 예를 들어, GenBank의 코돈 용법 데이타베이스에서 수득할 수 있다.본 발명의 방법 및 재료가 외인성 유전자의 프로토테카로의 도입을 허용하고 슈크로스 이용 및 지질 경로 변형에 관한 유전자가 하기의 섹션에서 논의되는 바와 같이 관심 대상이다. IV. 슈크로스 이용하나의 양태에서, 본 발명의 재조합 프로토테카 세포는 하나 이상의 외인성 슈크로스 이용 유전자를 함유한다. 다양한 양태에서, 하나 이상의 유전자는 프럭토키나제, 글루코키나제, 헥소키나제, 슈크로스 인버타제 및 슈크로스 수송체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 슈크로스 수송체 및 슈크로스 인버타제의 발현은 프로토테카가 슈크로스를 배양 배지로부터 세포에 수송하여 슈크로스를 가수분해시켜 글루코스 및 프럭토스를 생성하도록 한다. 임의로, 내인성 헥소키나제 활성이 프럭토스의 최대 인산화를 위해 불충분한 경우에도 프럭토키나제는 발현될 수 있다. 적합한 슈크로스 수송체의 예는 Genbank 승인 번호 제CAD91334호, 제CAB92307호, 및 제CAA53390호이다. 적합한 프럭토키나제의 예는 Genbank 승인 번호 제P26984호, 제P26420호 및 제CAA43322호이다.하나의 양태에서, 본 발명은 슈크로스 인버타제를 분비하는 프로토테카 숙주 세포를 제공한다. 슈크로스 인버타제의 분비는 슈크로스를 세포내로 수송할 수 있는 수송체를 발현할 필요성을 제거한다. 이것은 분비된 인버타제가 슈크로스 분자의 글루코스 및 프럭토스 분자로의 전환을 촉매하기 때문이고, 이들 분자 둘다는 본 발명에 의해 제공된 미생물에 의해 수송되고 이용될 수 있다. 예를 들어, 분비 시그날 (예를 들어, 서열번호 4의 시그날(효모 기원), 예를 들어, 서열번호 5의 시그날(고등 식물 기원), 서열번호 6의 시그날(진핵 컨센서스 분비 시그날) 및 서열번호의 시그날(고등 식물 및 진핵 컨센서스 기원의 시그날 서열의 조합체))와 함께 슈크로스 인버타제(예를 들어, 서열번호 3)의 발현은 세포 외부에서 인버타제 활성을 생성시킨다. 본원에 기재된 유전자 조작 방법에 가능한 상기 단백질의 발현은 이미 에너지원으로서 세포외 글루코스를 이용할 수 있는 세포가 세포외 에너지원으로 슈크로스를 이용할 수 있게 해준다. 슈크로스 함유 배지에서 인버타제를 발현하는 프로토테카 종은 오일 생산을 위해 바람직한 미세조류 종이다. 실시예 3은 본 발명의 방법 및 시약이 어떻게 재조합 효모 인버타제를 발현하고 이를 재조합 프로토테카 세포로부터 분비하기 위해 사용될 수 있는지를 설명한다. 상기 완전 활성 단백질의 발현 및 세포외 표적화는 수득한 숙주 세포가 슈크로상에서 성장하도록 하는 반면, 이들의 비형질전환된 대응 숙주 세포는 성장할 수 없다. 따라서, 본 발명은 효모 인버타제 유전자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 코돈 최적화된 인버타제 유전자를 갖는 프로토테카 재조합 세포를 제공하고, 이때 상기 효모 인버타제 유전자는 게놈에 통합되어 있어 상기 인버타제 유전자는 인버타제 활성 및 슈크로스 가수분해에 의해 평가되는 바와 같이 발현된다. 본 발명은 또한 세포가 슈크로스상에 성장할 수 있는 반면 이들의 비형질전환된 대응 세포는 발현할 수 없으므로 프로토테카 재조합 세포에서 선택가능한 마커로서 유용한 인버타제 유전자; 및 조류 분자 유전자에 대한 강력한 선택가능한 마커로서 인버타제를 사용하여 재조합 숙주 세포를 선택하기 위한 방법을 제공한다.프로토테카에서 슈크로스 인버타제의 성공적인 발현은 또한 이것이, 이종성(재조합) 단백질이 완전한 활성 및 기능적 형태로서 세포 외부로 및 배양 배지내로 성공적으로 분비됨을 입증한다는 점에서 본 발명의 또 다른 측면을 설명한다. 따라서, 본 발명은 미세조류내 광범위한 이종성 단백질을 발현하고 이들을 숙주 세포 외부로 분비시키기 위한 방법 및 시약을 제공한다. 상기 단백질은 예를 들어, 산업용 효소, 예를 들어, 리파제, 프로테아제, 셀룰라제, 펙티나제, 아밀라제, 에스테라제, 옥시도리덕타제, 트랜스퍼라제, 락타제, 이소머라제 및 인버타제, 및 치료학적 단백질, 예를 들어, 성장 인자, 사이토킨, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하는 전장 항체, Fab, scFv (단일쇄 가변 단편), 카멜리드형 항체, 항체 단편, 항체-단편 융합체, 항체-수용체 융합체, 인슐린, 인터페론 및 인슐린형 성장 인자를 포함한다. 프로토테카내 슈크로스 인버타제의 성공적인 발현은 또한 이것이 프로토테카내 단백질의 분비를 지시하기 위한 조류내 진균류 수송 펩타이드의 사용을 위한 방법 및 시약을 제공하고 펩타이드가 기능할 수 있는지의 여부 및 이것이 프로토테카 세포에서 수송 펩타이드로서 기능하는 능력을 결정하기 위한 방법 및 시약을 제공한다는 점에서 본 발명의 또 다른 측면을 설명한다. 본 발명의 방법 및 시약은 단백질을 세포외로 성공적으로 수송할 수 있는 다른 수송 펩타이드를 동정하기 위한 도구 및 플랫폼으로서 사용될 수 있고, 이때 효모 인버타제가 이들 방법에서 우수한 용도를 갖는다. 본 실시예에서 입증된 바와 같이, 내인성 효모 인버타제 수송 펩타이드의 제거 및 숙주 조류에 내인성이거나 다른 공급원(진핵, 원핵 및 바이러스)으로부터 기원하는 다른 수송 펩타이드로의 이의 대체가 목적하는 임의의 펩타이드가 세포로부터 단백질의 방출을 유도하는 수송 펩타이드로서 기능할 수 있는지의 여부를 동정할 수 있다.적합한 슈크로스 인버타제의 예는 Genbank 승인 번호 제CAB95010호, 제NP_012104호 및 제CAA06839호에 의해 동정된 것들을 포함한다. 적합한 인버타제의 비제한적인 예는 하기 표 2에 열거되어 있다. 각각의 열거된 인버타제에 대한 아미노산 서열은 하기의 서열 목록에 포함된다. 몇몇 경우에, 본 발명의 방법 및 벡터에 사용하기에 적합한 외인성 슈크로스 이용 유전자는 표 2로부터 선택되는 슈크로스 인버타제와 40, 50, 60, 75, 또는 90% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 슈크로스 인버타제를 암호화한다. 프로토테카에 의한 배양 배지로의 인버타제의 분비는 세포가 이들이 순수 시약 등급의 글루코스상에 성장하는 바와 같이 사탕무 가공으로부터 비롯된 폐기 당밀상에서 성장할 수 있도록 해주고 사탕무 가공의 상기 낮은 가치의 폐기물의 사용은 지질 및 다른 오일의 제조에서 상당한 비용 절감을 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명은 (i) 슈크로스 및 (ii) 슈크로스 인버타제 효소를 포함하는 배양 배지 및 프로토테카 미생물 집단을 함유하는 미생물 배양물을 제공한다. 다양한 양태에서 배양물내 슈크로스는 수수, 사탕무, 사탕 수수, 당밀 또는 탈중합된 셀룰로스 물질(이것은 임의로 리그닌을 함유할 수 있다)로부터 기원한다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 방법 및 시약은 재조합 프로토테카에 의해 사용될 수 있는 공급원료의 수 및 유형을 상당히 증가시킨다. 본원에 예시된 미생물은 이들이 슈크로스를 이용할 수 있도록 변형되고 본 발명의 방법 및 시약이 적용되어 셀룰로스와 같은 공급원료가 셀룰라제, 펙티나제, 이소머라제 등을 분비하는 능력을 갖는 본 발명의 조작된 숙주 미생물에 의해 이용될 수 있도록 하고 효소 반응의 분해 생성물은 더 이상 단순히 내성이 아니고 숙주에 의해 탄소원으로 이용된다. V. 지질 경로 조작슈크로스 함유 공급원료와 같은 공급원료를 사용하는 프로토테카의 능력을 변형시키는 것에 추가로, 본 발명은 생산된 지질의 성질 및/또는 비율이 변화하도록 변형된 재조합 프로토테카를 제공한다. 상기 경로는 추가로 또는 대안적으로 지장산 경로에서 지질 및 중간체의 효소적 가공을 통해 생성된 다양한 지질 분자의 성질 및/또는 비율이 변화되도록 변형될 수 있다. 다양한 양태에서, 본 발명의 재조합 프로토테카 세포는 이들의 비형질전환된 대응 세포에 비해 단위 용적당 및/또는 단위 시간당 최적화된 지질 수율, 탄소 쇄 길이(예를 들어, 재생가능한 디젤 생산 또는 지질 공급원료를 요구하는 산업적 화학 제품), 감소된 수의 이중 결합 또는 삼중 결합, 임의로 0개를 갖고 지질 또는 독특한 지질 집단의 수소:탄소 비율을 증가시킨다.특정 양태에서, 지방산 합성으로의 대사에서 측쇄 지점을 제어하는 하나 이상의 주요 효소는 지질 생산을 개선시키기 위해 상향 조절되거나 하향 조절된다. 상향조절은 예를 들어, 전사를 증가시키는 강한 프로모터 및/또는 인핸서 요소를 사용하여, 목적하는 효소를 암호화하는 유전자가 발현되는 발현 작제물로 세포를 형질전환시킴에 의해 성취될 수 있다. 상기 작제물은 선택가능한 마커를 함유하여 상기 형질전환체는 선택될 수 있고 이에 의해 작제물을 증폭시키고 암호화된 효소의 발현 수준을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 방법에 다른 상향 조절을 위해 적합한 효소의 예는 피루베이트를 아세틸-CoA로 전환시키는 역할을 하는 피루베이트 데하이드로게나제(예를 들어, 미세조류 기원의 일부는 Genbank 승인 번호 제NP_415392호; 제AAA53047호; 제QlXDMl호; 및 제CAF05587호를 포함한다)를 포함한다. 피루베이트 데하이드로게나제의 상향조절은 아세틸-CoA의 생산을 증가시킬 수 있고 이에 의해 지방산 합성을 증가시킬 수 있다. 아세틸-CoA 카복실라제는 지방산 합성에서 초기 단계를 촉매한다. 따라서, 상기 효소는 지방산의 생산을 증가시키기 위해 상향조절될 수 있다(예를 들어, 미세조류 기원의 일부는 Genbank 승인번호 제BAA94752호; 제AAA75528호; 제AA A81471호; 제YP_537052호; 제YP_536879호; 제NP_045833호; 및 제BAA57908호를 포함한다). 지방산 생산은 또한 지방산 합성 동안에 성장하는 아실 쇄를 운반하는 아실 운반 단백질(ACP)의 상향 조절될 수 있다(예를 들어, 미세조류 기원의 일부는 Genbank 승인 번호 제A0T0F8호; 제P51280호; 제NP_849041호; 제YP_874433호를 포함한다). 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제는 지방산 합성의 율속 단계를 촉매한다. 상기 효소의 상향 조절은 지방산 생산을 증가시킬 수 있다(예를 들어, 미세조류 기원의 일부는 Genbank 승인번호 제AAA74319호; 제AAA33122호; 제AAA37647호; 제P44857호; 및 제ABO94442호를 포함한다).유전자의 상향- 및/또는 하향 조절은 지방산 생합성 경로의 유전자의 발현을 제어하는 범용 조절제에 적용될 수 있다. 따라서, 지방산 합성의 하나 이상의 범용 조절제는 적당히 각각 다수의 지방산 합성 유전자의 발현을 억제하거나 증진시키고 궁극적으로 지질 생산을 증가시키도록 상향 또는 하향 조절될 수 있다. 이의 예는 스테롤 조절 요소 결합 단백질(SREBP), 예를 들어, SREBP-1a 및 SREBP-1c (예를 들어, Genbank 승인 번호 제NP_035610호 및 제Q9WTN3호를 참조)를 포함한다.본 발명은 또한 예를 들어, 지방 아실-ACP 티오에스테라제(표 3 참조), 지방 아실-CoA/알데하이드 리덕타제(표 4 참조), 지방 아실-CoA 리덕타제(표 5 참조), 지방 알데하이드 데카보닐라제(표 6 참조), 지방 알데하이드 리덕타제 및 스쿠알렌 신타제(GenBank 승인 번호 제AF205791호 참조)와 같은 지질 변형 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 유전자를 함유하도록 변형된 재조합 프로토테카 세포를 제공한다. 몇몇 양태에서, 지방 아실-ACP 티오에스테라제 및 천연적으로 동시 발현되는 아실 운반 단백질을 암호화하는 유전자는 임의로 다른 지질 변형 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자와 함께 프로토테카 세포에 형질전환시킨다. 다른 양태에서, ACP 및 지방 아실-ACP 티오에스테라제는 이들이 특정 조직 또는 유기체중에서 천연적으로 동시 발현되거나 발현되지 않는 것과 상관없이 2개가 함께 본 발명의 미생물 및 방법에 사용되는 경우 잇점을 부여하는, 서로에 대한 친화성을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명은 ACP로부터 길이 특이적 탄소쇄의 절단을 촉진시키기 위해 서로간에 상호작용하는 친화성을 공유하는 것들 뿐만 아니라 이들 효소의 동시 발현된 쌍 둘다를 고려한다.여전히 다른 양태에서, 데사투라제를 암호화하는 외인성 유전자를 지질 포화와 관련하여 변형을 제공하기 위해 다른 지질 변형 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자와 연계하여 프로토테카 세포에 형질전환시킨다. 스테아로일-ACP 데사투라제(문헌참조: 예를 들어, GenBank 승인 번호 제AAF15308호; 제ABM45911호; 및 제 AAY86086호)는 예를 들어, 스테아로일-ACP의 올레오일-ACP로의 전환을 촉매한다. 상기 유전자의 상향 조절은 세포에 의해 생산된 단일불포화 지방산의 비율을 증가시킬 수 있는 반면, 하향 조절은 단일불포화 비율을 감소시킬 수 있다. 유사하게, ω-6 지방산 데사투라제, 코-3 지방산 데사투라제, 또는 ω-6-올레에이트 데사투라제와 같은 하나 이상의 글리세로지질 데사투라제의 발현은 포화 지방산에 대한 불포화 지방산의 비율을 변화시키기 위해 제어될 수 있다. 몇몇 양태에서, 데사투라제는 데사투라제가 특정 탄소-길이 기질 또는 특정 범위내 탄소-길이를 갖는 기질내에서 위치 특이적 변형을 만들 수 있도록 목적하는 탄소 쇄 길이와 관련하여 선택될 수 있다.따라서, 특정 양태에서, 본 발명의 미생물은 아실-ACP 티오에스테라제, 아실-CoA/알데하이드 리덕타제, 지방 아실-CoA 리덕타제, 지방 알데하이드 리덕타제, 지방 알데하이드 데카보닐라제 또는 천연적으로 동시 발현되는 아실 운반 단백질로 부터 선택되는 하나 이상의 외인성 유전자를 발현하도록 유전자 조작된다. 적합한 발현 방법은 기타 방법중에서 유도성 발현 및 구분된 발현을 포함하는 리파제 유전자와 관련하여 상기 기재된다. 지방 아실-ACP 티오에스테라제는 지질 합성동안에 아실 운반 단백질(ACP)로부터 지방산을 절단한다. 추가의 효소적 가공을 통해, 절단된 지방산은 이어서 조효소와 조합되어 아실-CoA 분자를 생성한다. 이러한 아실-CoA는 알콜을 생성하기 위한 지방 아실-CoA 알데하이드 리덕타제에 대한 것 뿐만 아니라 알데하이드를 생성하기 위한 지방 아실-CoA 리덕타제의 효소 활성에 대한 기질이다. 상기된 지방 아실-CoA 리덕타제의 작용에 의해 생산된 알데하이드는 알콜을 생성하기 위한 지방 알데하이드 리덕타제 또는 알칸 또는 알켄을 생성하기 위한 지방 알데하이드 리덕타제에 의한 추가의 효소적 활성에 대한 기질이다.몇몇 양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생산되는 지방산, 글리세로지질, 또는 상응하는 1급 알콜, 알데하이드, 알칸 또는 알켄은 8, 10, 12, 또는 14개의 탄소원자를 함유한다. 디젤, 바이오디젤, 재생가능한 디젤 또는 제트 연료를 위해 바람직한 지방산 또는 산업용을 위한 상응하는 1급 알콜, 알데하이드, 알칸 및 알켄은 8 내지 14개의 탄소원자를 함유한다. 특정 양태에서, 다른 상응하는 탄화수소 분자 뿐만 아니라 상기 지방산은 포화되거나(어떠한 탄소-탄소 이중 또는 삼중 결합을 갖지 않는다); 단일 불포화되거나(단일 이중 결합); 다중 불포화되거나(2개 이상의 이중 결합); 선형(환형이 아님)이거나 측쇄이다. 연료 생산을 위해 보다 큰 포화가 바람직하다.상기 직접 기재된 효소는 특정 수의 탄소원자를 함유하는 기질의 가수분해에 대해 우선적인 특이성을 갖는다. 예를 들어, 지방 아실-ACP 티오에스테라제는 ACP로부터 12개의 탄소원자를 갖는 지방산을 절단하는 것을 선호할 수 있다. 몇몇 양태에서, ACP 및 쇄 특이적 티오에스테라제는 이들이 조합체로서 특히 유용하게 하는 서로에 대해 친화성을 가질 수 있다(예를 들어, 외인성 ACP 및 티오에스테라제 유전자는 이들이 유래하는 특정 조직 또는 유기체에서 천연적으로 동시 발현될 수 있다). 따라서, 다양한 양태에서, 본 발명의 재조합 프로토테카 세포는 기질내 함유된 탄소원자수와 관련하여 효소적 활성을 촉매하기 위한 특이성(예를 들어, ACP로부터 지방산의 절단, 아실-CoA의 알데하이드 또는 알콜로의 환원, 또는 알데하이드의 알칸으로의 전환)을 갖는 단백질을 암호화하는 외인성 유전자를 함유할 수 있다. 다양한 양태에서 효소적 특이성은 8 내지 34개의 탄소원자, 바람직하게는 8 내지 18개의 탄소원자 및 보다 바람직하게는 8 내지 14개의 탄소원자를 갖는 기질에 대한 것일 수 있다. 바람직한 특이성은 즉 18개 탄소원자 보다는 적은 즉, 12개를 갖는 기질에 대한 것이다.비제한적이고 예시적인 실시예에서, 본 발명은 티오에스테라제가 특이적인 쇄 길이에서 비형질전환된 프로토테카 세포의 지질 프로필에 비해, 외인성 티오에스테라제를 발현하고 따라서 풍부한 지질을 생산하는 벡터 및 프로토테카 숙주 세포를 제공한다. 예시된 티오에스테라제는 (i) 14의 탄소쇄 길이를 갖는 지방 아실-ACP 기질을 선호하는 시나모몸 캄포럼(Cinnamomum camphorum) FatBl (GenBank 승인 번호 제Q39473호, 아미노산 서열은 서열번호 59중에 있고, 플라스티드 표적화 서열(PTS) 부재인 아미노산 서열은 서열번호 140중에 있고 표 1을 기초로 한 코돈 최적화된 cDNA 서열은 서열번호 60중에 있다); (ii) 8 내지 10의 탄소쇄 길이를 갖는 지방 아실-ACP 기질을 선호하는 쿠페아 후케리아나(Cuphea hookeriana) FatB2 (GenBank 승인번호 제AAC49269호, 아미노산 서열은 서열번호 61중에 있고 PTS 부재인 아미노산 서열은 서열번호 138중에 있고 표 1을 기초로 하는 코돈 최적화된 cDNA 서열은 서열번호 62중에 있다); 및 (iii) 12의 탄소쇄 길이를 갖는 지방 아실-ACP 기질을 선호하는 움벨루라리아(Umbellularia) 지방 Bl (GenBank 승인 번호 제Q41635호, 아미노산 서열은 서열번호 63중에 있고 PTS 부재인 아미노산 서열은 서열번호 139중에 있고 표 1을 기초로 하는 코돈 최적화된 cDNA 서열은 서열번호 64중에 포함된다)이다.본 발명의 미생물 및 방법과 함께 사용하기에 적합한 다른 지방 아실-ACP 티오에스테라제는 표 3에 열거된 것들을 제한없이 포함한다.하기 실시예는 프로토테카 종중에서 쿠페아 후케리아나, 움벨루라리아 캘리포니카(Umbellularia californica), 시나모멈 캄포라(Cinnamomun camphora) 기원의 이종성 지방 아실-ACP 티오에스테라제의 성공적인 표적화 및 발현을 기재한다. 추가로, 지방산 프로필중의 변형은 숙주 세포 발현에서 이들 이종성 지방 아실-ACP 티오에스테라제중에서 확인되었다. 이들 결과는 일반적으로 조류와 고등 식물 티오에스테라제간에 서열 상동성의 부재 및 프로토테카 모리포르미스 지방 아실-ACP 티오에스테라제와 상기 열거된 이종성 지방-아실-ACP 티오에스테라제간의 서열 상동성의 부재를 고려할때 전혀 예상치 못한 것이었다. 2개의 프로토테카 모리포르미스 아실-ACP 티오에스테라제를 분리하고 서열분석하였다. 2개 cDNA의 서열은 서로간에 고도의 동일성을 나타내었고 뉴클레오타이드 수준에서 단지 12개의 위치에서 상이하였고 아미노산 수준에서 5개의 위치에서 상이하였으며 플라스티드 수송 펩타이드에서 이들 중 4개가 상이하였다. 프로토테카 모리포르미스 기원의 게놈 서열의 추가 분석은 실제로 이들 2개의 cDNA가 별도의 콘티그상에 암호화되어 있고 고도로 상동성이지만 2개의 별도의 유전자에 의해 암호화되어 있음을 확인시켜 주었다. 2개의 프로토테카 모리포르미스 지방 아실-ACP 티오에스테라제인 프로토테카 모리포르미스 지방 아실-ACP 티오에스테라제-1과 프로토테카 모리포르미스 지방 아실-ACP 티오에스테라제-2의 cDNA 및 아미노산 서열은 서열번호 134 내지 137로서 열거되어 있다.이들 2개의 cDNA의 아미노산 서열이 NCBI 데이타베이스에 대해 BLAST되는 경우, 2개의 최대 상동성 서열은 클라미도모나스 레인하르드티 및 아라비도프시스 탈리아나 기원의 지방 아실-ACP 티오에스테라제였다. 놀랍게도, 프로토테카 모리포르미스 지방 아실-ACP 티오에스테라제와 고등 식물 티오에스테라제간의 아미노산 동일성 수준은 단지 49 및 37% 동일성으로 매우 낮았다. 또한, 이들 지방 아실-ACP 티오에스테라제중에서 촉매 트리아드(NXHX36C)의 아미노 말단 부분 주변의 서열에 상당한 차이가 있다. 조사된 40개의 고등 식물 지방 아실-ACP 티오에스테라제중 39개는 상기 트리아드의 아미노 말단에서 N 및 H 잔기 주변에 서열 LDMNQH를 나타내었지만 동정된 조류 서열 모두는 MDMNGH를 가졌다. 티오에스테라제의 촉매 트리아드 주변의 낮은 아미노산 서열 동일성 및 차이를 고려할때, 특히 외인성 지방 아실-ACP 티오에스테라제의 활성이 내인성 프로토테카 아실 운반 단백질과 기능성 단백질-단백질 상호작용에 의존한다는 사실을 고려할때 실시예에서 수득되고 기재된 외인성 지방 아실-ACP 티오에스테라제 발현의 성공적인 결과는 예상치 못한 것이다. 본 발명의 미생물 및 방법과 함께 사용하기에 적합한 지방 아실-CoA/알데하이드 리덕타제는 제한없이 표 4에 열거된 것들을 포함한다.본 발명의 미생물 및 방법과 함께 사용하기에 적합한 지방 아실-CoA 리덕타제는 제한 없이 표 5에 기재된 것들을 포함한다.본 발명의 미생물 및 방법과 함께 사용하기에 적합한 지방 알데하이드 데카보닐라제는 제한 없이 표 6에 열거된 것들을 포함한다.천연적으로 동시 발현된 지방 아실-ACP 티오에스테라제 및 아실 운반 단백질의 조합은 본 발명의 미생물 및 방법과 사용하기에 적합하다. 탄화수소 또는 지질 변형 효소의 추가의 예는 미국 특허 제6,610,527호; 제6,451,576호; 제6,429,014호; 제6,342,380호; 제6,265,639호; 제6,194,185호; 제6,114,160호; 제6,083,731호; 제6,043,072호; 제5,994,114호; 제5,891,697호; 제5,871,988호; 제6,265,639호중 어느 하나에 포함되거나 참조되거나, 함유되거나 참조된 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하고 추가로 GenBank 승인 번호 제AAO18435호; 제ZP_00513891호; 제Q38710호; 제AAK60613호; 제AAK60610호; 제AAK60611호; 제NP_113747호; 제CAB75874호; 제AAK60612호; 제AAF20201호; 제BAAl 1024호; 제AF205791호; 및 제CAA03710호에 기재되어 있다.본 발명의 미생물 및 방법과 사용하기에 적합한 다른 효소는 표 3 내지 6에 열거된 단백질중 하나와 70% 이상의 아미노산 동일성을 갖고 상응하는 목적하는 효소 활성(예를 들어, 아실 운반 단백질로부터 지방산의 절단, 아실-CoA의 알데하이드 또는 알콜로의 환원 또는 알데하이드의 알칸으로의 전환)을 나타내는 것들을 포함한다. 추가의 양태에서, 효소적 활성은 상기된 서열중 하나와 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 99% 이상의 동일성을 갖는 서열중에 존재하고 이 모두는 완전하게 제시된 것처럼 본원에 참조로서 인용된다. 발현되는 외인성 유전자의 목적하는 조합을 선택함에 의해, 수성 바이오매쓰로부터 추출될 수 있는 미생물에 의해 생산되는 생성물을 절단 개조할 수 있다. 예를 들어, 상기 미생물은 다음을 함유할 수 있다: (i) 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자; 및, 임의로, (ii) 천연적으로 동시 발현된 아실 운반 단백질 또는 지방 아실-ACP 티오에스테라제(또는 역으로)에 대해 친화성을 또한 갖는 아실 운반 단백질; 및, 임의로, (iii) 지방 아실-CoA/알데하이드 리덕타제 또는 지방 아실-CoA 리덕타제를 암호화하는 외인성 유전자; 및, 임의로, (iv) 지방 알데하이드 리덕타제 또는 지방 알데하이드 데카보닐라제를 암호화하는 외인성 유전자. 본원에 기재된 배양 조건하의 미생물은 ACP에 연결된 지방산을 합성하고 지방 아실-ACP 티오에스테라제는 ACP로부터 지방산의 절단을 촉매하여 추가의 효소적 가공을 통해 지방 아실-CoA 분자를 생산한다. 존재하는 경우, 지방 아실-CoA/알데하이드 리덕타제는 아실-CoA의 알콜로의 환원을 촉매한다. 유사하게, 존재하는 경우 지방 아실-CoA 리덕타제는 아실-CoA의 알데하이드로의 환원을 촉매한다. 지방 아실-CoA 리덕타제를 암호화하는 외인성 유전자가 존재하고 알데하이드 생성물을 생산하기 위해 발현되는 상기 양태에서, 제3 외인성 유전자에 의해 암호화된 지방 알데하이드 리덕타제는 알데하이드의 알콜로의 환원을 촉매한다. 유사하게, 지방 알데하이드 데카보닐라제는 존재하는 경우 알데하이드의 알칸 또는 알켄으로의 전환을 촉매한다.상기 효소를 암호화하는 유전자는 클로렐라 프로토테코이데스(Chlorella protothecoides)와 같이 상당한 지질 생산을 나타내는 것으로 이미 공지된 세포로부터 수득될 수 있다. 지질 생산에 역할을 하는 것으로 이미 공지된 유전자, 예를 들어, 이중 결합을 포화시키는 효소를 암호화하는 유전자를 개별적으로 수용 세포에 형질전환시킬 수 있다. 그러나, 본 발명을 실시하기 위해 어느 유전자가 요구되는지에 관해 우선적으로 추측할 필요는 없다. 미세조류내 지질 생산을 변형(개선)시킬 수 있는 유전자를 동정하는 방법은 PCT 공개 번호 제2008/151149호에 기재되어 있다.따라서, 본 발명은 동일 종의 야생형 세포에 비해 변화된 수준에서 지질 경로 효소를 발현하도록 유전자 조작된 프로토테카 세포를 제공한다. 몇몇 경우에, 상기 세포는 2개 세포가 동일한 조건하에서 성장하는 경우 야생형 세포에 비해 보다 많은 세포를 생산한다. 몇몇 경우에, 상기 세포는 야생형 세포 보다 높은 수준에서 지질 경로 효소를 발현하도록 유전자 조작되고/되거나 선택되었다. 몇몇 경우에, 지질 경로 효소는 피루베이트 데하이드로게나제, 아세틸-CoA 카복실라제, 아실 운반 단백질 및 글리세롤-3 포스페이트 아실트랜스퍼라제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 몇몇 경우에, 상기 세포는 야생형 세포 보다 낮은 수준에서 지질 경로 효소를 발현하도록 유전자 조작되고/되거나 선택된다. 세포가 보다 낮은 수준에서 지질 경로 효소를 발현하는 하나 이상의 양태에서, 지질 경로 효소는 시트레이트 신타제를 포함한다.몇몇 양태에서, 상기 세포는 야생형 세포와 비교하여 변화된 수준에서 지방산 합성의 범용 조절제를 발현하도록 유전자 조작되고/되거나 선택됨으로써 다수의 지방산 합성 유전자의 발현 수준은 야생형 세포와 비교하여 변화된다. 몇몇 경우에, 지질 경로 효소는 지방산을 변형시키는 효소를 포함한다. 몇몇 경우에, 지질 경로 효소는 스테아로일-ACP 데사투라제 및 글리세로지질 데사투라제로부터 선택된다.다른 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 외인성 유전자를 함유하는 오일 생산 미생물에 관한 것이고 여기서, 외인성 유전자는 지방 아실-ACP 티오에스테라제, 지방 아실-CoA 리덕타제, 지방 알데하이드 리덕타제, 지방 아실-CoA/알데하이드 리덕타제, 지방 알데하이드 데카보닐라제 및 아실 운반 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질(들)을 암호화한다. 하나의 양태에서, 외인성 유전자는 자극에 응답하여 유도성이거나 억제성인 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 몇몇 경우에, 상기 자극은 외부적으로 제공되는 작은 분자, 열, 냉 및 배양 배지에서 제한되거나 부재인 질소로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 몇몇 경우에, 외인성 유전자는 세포 구획에서 발현된다. 몇몇 양태에서, 세포 구획은 엽록체, 플라스티드 및 미토콘드리아로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 몇몇 양태에서 미생물은 프로토테카 모리포르미스, 프로토테카 크루가니, 프로토테카 스타그노라 또는 프로토테카 조프피이다.하나의 양태에서, 외인성 유전자는 지방산 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화한다. 몇몇 경우에, 외인성 유전자에 의해 암호화된 티오에스테라제는 아실 운반 단백질(ACP)로부터 8 내지 18개의 탄소 지방산의 절단을 촉매한다. 몇몇 경우에, 외인성 유전자에 의해 암호화된 티오에스테라제는 ACP로부터 10 내지 14개 탄소 지방산의 절단을 촉매한다. 하나의 양태에서, 외인성 유전자에 의해 암호화된 티오에스테라제는 ACP로부터 12 탄소 지방산의 절단을 촉매한다.하나의 양태에서, 외인성 유전자는 지방 아실-CoA/알데하이드 리덕타제를 암호화한다. 몇몇 경우에, 외인성 유전자에 의해 암호화된 리덕타제는 8 내지 18개의 탄소 지방 아실-CoA의 상응하는 1급 알콜로의 환원을 촉매한다. 몇몇 경우에, 외인성 유전자에 의해 암호화된 리덕타제는 10 내지 14개의 탄소 지방 아실-CoA의 상응하는 1급 알콜로의 환원을 촉매한다. 하나의 양태에서, 외인성 유전자에 의해 암호화된 리덕타제는 12-탄소 지방 아실-CoA의 도데칸올로의 환원을 촉매한다.본 발명은 또한 2개의 외인성 유전자를 함유하는 재조합 프로토테카 세포를 제공하고 여기서, 제1 외인성 유전자는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하고 제2 외인성 유전자는 지방 아실-CoA 리덕타제, 지방 아실-CoA/알데하이드 리덕타제, 및 아실 운반 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단백질을 암호화한다. 몇몇 경우에, 2개의 외인성 유전자는 각각 자극에 응답하여 유도성인 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있다. 몇몇 경우에, 각각의 프로모터는 배양 배지내 제한된 질소 또는 질소 부재와 같은 동일한 자극에 응답하여 유도성이다. 배양 배지에서 질소의 제한 또는 완전한 부재는 프로토테카 종과 같은 몇몇 미생물에서 오일 생산을 자극하고 높은 수준으로 오일 생산을 유도하기 위한 유발제로서 사용될 수 있다. 본원에 기재된 유전자 조작 방법과 조합하여 사용되는 경우, 무수 세포 중량의 %로서 지질은 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상 및 75% 이상과 같은 높은 수준으로 상승될 수 있고; 본원에 기재된 방법은 상기 수준의 지질을 갖는 세포에 대해 제공하고, 여기서 지질은 4% 이상의 C8-C14, 0.3% 이상의 C8, 2% 이상의 C10, 2% 이상의 C12, 및 2% 이상의 C14이다. 몇몇 양태에서, 상기 세포는 무수 세포 중량을 기준으로 25% 초과의 지질이고 10% 이상의 C8-C14, 20% 이상의 C8-C14, 30% 이상의 C8-C14, 10-30%의 C8-C14 및 20-30%의 C8-C14인 지질을 함유한다.본원에 기재된 신규 오일은 mic-쇄 지방산(예를 들어, 팜유, 팜 커넬 오일 및 코코넛 오일)의 함량이 높은 다른 천연적으로 존재하는 오일과는 구분된다. 예를 들어, 카로테노이드와 같은 오염물 수준은 본 발명의 오일에서 보다 팜유 및 팜 커넬 오일에서 보다 높다. 특히 팜유 및 팜 커넬 오일은 본 발명의 오일에서 보다 보다 높은 양으로 알파 및 베타 카로틴 및 리코펜을 함유한다. 추가로, 20개 초과의 상이한 카로테노이드가 팜유 및 팜 커넬 오일에서 발견된 반면 실시예는 본 발명의 오일이 매우 소수의 카로테노이드 종을 매우 낮은 수준으로 함유함을 입증한다. 추가로, 토코트리에놀과 같은 비타민 E 화합물의 수준은 본 발명의 오일에서 보다 팜유, 팜 커넬 및 코코넛유에서 훨씬 높다.하나의 양태에서, 제1 외인성 유전자에 의해 암호화된 티오에스테라제는 ACP로부터 8 내지 18-탄소 지방산의 절단을 촉매한다. 몇몇 양태에서, 제2 외인성 유전자는 8 내지 18-탄소 지방 아실-CoA의 상응하는 1급 알콜로의 환원을 촉매하는 지방 아실-CoA/알데하이드 리덕타제를 암호화한다. 몇몇 경우에, 제1 외인성 유전자에 의해 암호화된 티오에스테라제는 ACP로부터 10 내지 14-탄소 지방산의 절단을 촉매하고 제2 외인성 유전자에 의해 암호화된 리덕타제는 10 내지 14-탄소 지방 아실-CoA의 상응하는 1급 알콜로의 환원을 촉매하고 여기서, 티오에스테라제 및 리덕타제는 동일한 탄소 쇄 길이상에 작용한다. 하나의 양태에서, 제1 외인성 유전자에 의해 암호화된 티오에스테라제는 ACP로부터 12-탄소 지방산의 절단을 촉매하고 제2 외인성 유전자에 의해 암호화된 리덕타제는 12-탄소 지방 아실-CoA의 도데칸올로의 환원을 촉매한다. 몇몇 양태에서, 제2 외이넝 유전자는 8 내지 18-탄소 지방 아실-CoA의 상응하는 알데하이드로의 환원을 촉매하는 지방 아실-CoA 리덕타제를 암호화한다. 몇몇 양태에서, 제2 외인성 유전자는 천연적으로 지방 아실-ACP 티오에스테라제와 함께 동시 발현되는 아실 운반 단백질을 암호화한다.몇몇 양태에서, 제2 외인성 유전자는 지방 아실-CoA 리덕타제를 암호화하고 상기 미생물은 추가로 지방 알데하이드 데카보닐라제를 암호화하는 제3 외인성 유전자를 함유한다. 몇몇 경우에, 제1 외인성 유전자에 의해 암호화된 티오에스테라제는 ACP로부터 8 내지 18-탄소 지방산의 절단을 촉매하고 제2 외인성 유전자에 의해 암호화된 리덕타제는 8 내지 18-탄소 지방 아실-CoA의 상응하는 지방 알데하이드로의 환원을 촉매하고 제3 외인성 유전자에 의해 암호화된 데카보닐라제는 8 내지 18-탄소 지방 아실-CoA의 상응하는 지방 알데하이드의 상응하는 알칸으로의 전환을 촉매하고, 여기서, 티오에스테라제, 리덕타제 및 데카보닐라제는 동일한 탄소 쇄 길이에 대해서 작용한다.몇몇 양태에서, 제2 외인성 유전자는 아실 운반 단백질을 암호화하고 상기 미생물은 지방 아실-CoA 리덕타제 및 지방 아실-CoA/알데하이드 리덕타제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 제3 외인성 유전자를 함유한다. 몇몇 경우에 제3 외인성 유전자는 지방 아실-CoA 리덕타제를 암호화하고 상기 미생물은 지방 알데하이드 데카보닐라제를 암호화하는 제4 외인성 유전자를 추가로 함유한다. 본 발명은 또한 배양 배지에서 재조합 프로토테카 세포의 집단을 배양함을 포함하는 알콜을 생산하는 방법을 제공하고, 여기서, 상기 세포는 (i) 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 제1 외인성 유전자, 및 (ii) 지방 아실-CoA/알데하이드 리덕타제를 암호화하는 제2 외인성 유전자를 함유하고 상기 세포는 아실 운반 단백질(ACP)에 연결된 지방산을 합성하고 지방 아실-ACP 티오에스테라제는 ACP로부터 지방산의 절단을 촉매하여 추가의 가공을 통해 지방 아실-CoA를 생산하고 지방 아실-CoA/알데하이드 리덕타제는 아실-CoA의 알콜로의 환원을 촉매한다.본 발명은 또한 프로토테카 세포에서 지질 분자를 생산하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 배양 배지에서 프로토테카 세포 집단을 배양함을 포함하고, 상기 세포는 (i) 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 제1 외인성 유전자, 및 (ii) 지방 아실-CoA 리덕타제를 암호화하는 제2 외인성 유전자를 함유하고 상기 미생물은 아실 운반 단백질(ACP)에 연결된 지방산을 합성하고 지방 아실-ACP 티오에스테라제는 ACP로부터 지방산의 절단을 촉매하여 추가의 가공을 통해 지방 아실-CoA를 생산하고 지방 아실-CoA 리덕타제는 아실-CoA의 알데하이드로의 환원을 촉매한다. 본 발명은 또한 프로토테카 세포에서 특정된 탄소 쇄 길이를 갖는 지방산 분자를 생산하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 배양 배지에서 지질 생산 프로토테카 세포 집단을 배양함을 포함하고 여기서 상기 미생물은 8, 10, 12 또는 14개 탄소 원자와 같은 특정 탄소 쇄 길이에 특이적이거나 우선적인 활성을 갖는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자를 함유하고, 상기 미생물은 아실 운반 단백질(ACP)에 연결된 지방 산을 합성하고 상기 티오에스테라제는 지방산이 특정 탄소 쇄 길이로 합성되는 경우 ACP로부터 지방산의 절단을 촉매한다. 상기된 다양한 양태에서, 상기 프로토테카 세포는 지질 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 유전자를 함유할 수 있다. 몇몇 경우에, 지질 경로 효소는 스테아로일-ACP 데사투라제, 글리세로지질 데사투라제, 피루베이트 데하이드로게나제, 아세틸-CoA 카복실라제, 아실 운반 단백질 및 글리세롤-3 포스페이트 아실트랜스퍼라제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 다른 경우에, 프로토테카 세포는 지방 아실-ACP 티오에스테라제, 지방 아실-CoA/알데하이드 리덕타제, 지방 아실-CoA 리덕타제, 지방 알데하이드 리덕타제, 지방 알데하이드 데카보닐라제 및/또는 아실 운반 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 지질 변형 효소를 함유한다. VI. 연료 및 화학물질 생산본 발명의 방법에 따른 연료의 생산을 위해, 본 발명의 세포에 의해 생산된 지질을 수거하거나 다르게는 임의의 편리한 수단에 의해 수거한다. 지질은 전체 세포 추출에 의해 분리될 수 있다. 상기 세포를 우선 파쇄시키고 이어서 세포내 및 세포막/세포벽 연합 지질 및 세포외 탄화수소를 예를 들어, 상기된 바와 같은 원심분리를 사용하여 세포 매쓰로부터 분리할 수 있다. 미생물내에서 생성된 세포내 지질은 몇몇 양태에서 미생물의 세포를 용해시킨 후 추출된다. 일단 추출된 후 지질을 추가로 정련하여 오일, 연료 또는 유성화학물질을 생성한다.배양을 완료 한 후, 미생물을 발효 브로쓰로부터 분리할 수 있다. 임의로, 상기 분리는 원심분리로 수행하여 농축된 페이스트를 생성한다. 원심분리는 미생물로부터 상당양의 세포내 물을 제거하지 못하고 건조 단계가 아니다. 이어서 상기 바이오매쓰는 임의로 세척액(예를 들어, 탈이온수)로 세척하여 발효 브로쓰 및 잔해를 제거할 수 있다. 임의로 세척된 미생물 바이오매쓰는 또한 세포 분쇄 전에 건조(오븐 건조, 동결 건조 등)시킬 수 있다. 또한, 세포는 발효가 완료된 경우 발효 브로쓰의 일부 또는 전부로부터 분리 없이 용해시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 세포가 용해된 경우 세포외 액체에 대한 세포의 비율이 1:1(v:v) 미만일 수 있다. 액체를 함유하는 미생물은 용해시켜 용해물을 생성시킬 수 있다. 본원에 상세하게 기재된 바와 같이 미생물 용해시키는 단계(또한 세포 용해로서 언급됨)는 열-유도된 용해, 염기의 첨가, 산의 첨가, 프로테아제와 같은 효소 및 아밀라제와 같은 폴리사카라이드 분해 효소의 사용, 초음파, 기계적 용해의 사용, 삼투압 쇼크의 사용, 용해성 바이러스에 의한 감염 및/또는 하나 이상의 용해성 유전자의 발현을 포함하는 임의의 간편한 수단에 의해 성취될 수 있다. 용해를 수행하여 미생물에 의해 생성된 세포내 분자를 방출시킨다. 미생물을 용해시키기 위한 이들 방법 각각은 단일 방법으로 또는 동시에 또는 연속적으로 조합하여 사용할 수 있다. 세포 파쇄 정도는 현미경 분석에 의해 관찰할 수 있다. 본원에 기재된 방법중 하나 이상을 사용하여, 전형적으로 70% 초과의 세포 파괴가 관찰된다. 바람직하게, 세포 파괴는 80% 초과, 보다 바람직하게는 90% 초과 및 가장 바람직하게는 약 100%이다.특정 양태에서, 미생물은 예를 들어, 추출 또는 추가의 가공을 위해 세포 지질 및/또는 탄화수소의 노출을 증가시키기 위해 성장 후 용해시킨다. 리파제 발현 및 세포 용해의 타이밍(예를 들어, 유도성 프로모터를 통한)은 지질 및/또는 탄화수소의 수율을 최적화하기 위해 조정할 수 있다. 다수의 용해 기술은 하기에 기재한다. 이들 기술은 개별적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, 미생물을 용해시키는 단계는 미생물을 함유하는 세포 현탁액의 가열을 포함한다. 이러한 양태에서, 미생물을 함유하는 발효 브로쓰(또는 발효 브로쓰로부터 분리된 미생물 현탁액)는 미생물, 즉 미생물의 세포벽 및 막이 분해하거나 파괴될때까지 가열한다. 전형적으로, 적용되는 온도는 5O℃ 이상이다. 보다 효율적인 세포 용해를 위해, 보다 고온, 예를 들어, 30℃ 이상, 6O℃ 이상, 70℃ 이상, 80℃ 이상, 9O℃ 이상, 100℃ 이상, 11O℃ 이상, 12O℃ 이상, 13O℃ 이상을 사용한다. 가열 처리에 의한 세포 용해는 미생물을 비등시킴에 의해 수행할 수 있다. 또는, 열 처리(비등 없이)는 오토클레이브에서 수행할 수 있다. 열 처리된 용해물은 추가의 처리를 위해 냉각시킬 수 있다. 세포 파쇄는 또한 증기 처리, 즉 가압된 증기의 부가를 통해 수행할 수 있다. 세포 파쇄를 위한 미세조류의 증기 처리는 예를 들어, 문헌[참조: 미국 특허 제6,750,048호]에 기재되어 있다. 몇몇 양태에서, 증기 처리는 발효기로 증기를 살포하고 브로쓰를 약 90분 미만, 바람직하게는 약 60분 미만 및 보다 바람직하게는 약 30분 미만 동안 목적하는 온도에 유지시킴에 의해 성취할 수 있다.본 발명의 또 다른 양태에서, 미생물을 용해시키는 단계는 염기를, 미생물을 함유하는 세포 현탁액에 첨가함을 포함한다. 상기 염기는 사용되는 미생물의 단백질성 화합물의 적어도 일부를 가수분해하기에 충분히 강해야만 한다. 단백질을 가용화시키기 위해 유용한 염기는 화학 기술 분야에 공지되어 있다. 본 발명의 방법에 유용한 예시적인 염기는 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘의 수산화물, 카보네이트 및 바이카보네이트 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 염기는 KOH이다. 세포 파쇄를 위한 미세조류의 염기 처리는 예를 들어, 미국 특허 제6,750,048호에 기재되어 있다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 미생물을 용해시키는 단계는 산을, 미생물을 함유하는 세포 현탁액에 첨가함을 포함한다. 산 용해는 10-500 mN 또는 바람직하게 40-160 nM의 농도로 산을 사용하여 수행할 수 있다. 산 용해는 바람직하게 실온 이상(예를 들어, 40 내지 160℃, 및 바람직하게 50 내지 130℃)에서 수행한다. 적당한 온도(예를 들어, 실온 내지 100℃ 및 특히 실온 내지 65℃)에 대해서, 산 처리는 통상적으로 초음파 처리 또는 다른 세포 파쇄 방법과 조합할 수 있다.본 발명의 또 다른 양태에서, 미생물을 용해시키는 단게는 효소를 사용함에 의해 미생물을 용해시킴을 포함한다. 미생물을 용해시키기 위해 바람직한 효소는 프로테아제 및 폴리사카라이드-분해 효소, 예를 들어, 헤미셀룰라제(예를 들어, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger); Sigma Aldrich, St. Louis, MO; #H2125), 펙티나제(예를 들어, 리조푸스 종 기원의 펙티나제; Sigma Aldrich, St. Louis, MO; #P2401), 만나웨이(Mannaway) 4.0 L (노보자임(Novozymes)), 셀룰라제(예를 들어, 트리코더마 비리드 기원의 셀룰라제; Sigma Aldrich, St. Louis, MO; #C9422), 및 드리셀라제 (예를 들어, 바시디오마이세테스 종 기원의 드리셀라제; Sigma Aldrich, St. Louis, MO; #D9515)이다.본 발명의 또 다른 양태에서, 용해는 예를 들어, 임의로 클로렐라 또는 클로렐라 바이러스 기원의 폴리사카라이드 분해 효소와 같은 셀룰라제 또는 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 프로테아제, 키모트립신, 프로테이나제 K, 문헌[참조: proteases listed in Degradation of Polylactide by Commercial Proteases, Oda Yet al., Journal of Polymers and the Environment, Volume 8, Number 1, January 2000 , pp. 29-32(4)]에 기재된 프로테아제, 알칼라제 2.4 FG (노보자임), 및 플라보우르짐 100 L (노보자임)과 같은 프로테아제와 같은 효소를 사용하여 성취한다. 프로테아제 및 폴리사카라이드-분해 효소의 임의의 조합은 또한 이전의 프로테아제 및 폴리사카라이드 분해 효소의 임의의 조합을 포함하여 사용할 수 있다.또 다른 양태에서, 용해는 익스펠러 프레스를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 공정에서, 바이오매쓰는 고압에서 스크류형 장치를 통해 강제 주입하고 세포를 용해시키고 세포내 지질이 방출되고 세포내 단백질 및 섬유(및 기타 성분)로부터 분리되도록 한다.본 발명의 또 다른 양태에서, 미생물을 용해시키는 단계는 초음파, 즉, 초음파 처리를 사용하여 수행한다. 따라서, 세포는 또한 고주파 음파로 용해시킬 수 있다. 상기 음파는 전기적으로 생성될 수 있고 금속 팁을 통해 적당히 농축된 세포 현탁액으로 운반된다. 상기 초음파 처리(또는 초음파 처리(ultrasonication))는 세포 현탁액중 공극의 형성을 기준으로 세포 통합성을 붕괴시킨다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 미생물을 용해시키는 단계는 기계적 용해에 의해 수행한다. 세포는 기계적으로 용해시키고 파쇄하여 탄화수소 (예를 들어, 지질) 수집을 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 압력 분쇄기를 사용하여 세포 함유 슬러리를 제한된 오리피스 밸브를 통과하도록 펌핑시킬 수 있다. 고압( 1500 바 이하)을 적용함에 이어서 출구 노출을 통해 즉시 확장시킨다. 세포 분쇄는 3개의 상기한 기작에 의해 성취한다: 밸브상에 충돌, 오리피스내 액체 고전단, 및 방출시 급작스런 압력 강하로 세포 분해의 유도. 상기 방법은 세포내 분자를 방출시킨다. 또는, 볼 밀을 사용할 수 있다. 볼 밀에서, 세포는 비드와 같은 작은 연마 입자와 함께 현탁 상태로 진탕시킨다. 전단력 때문에 세포는 분해되고 비드 사이에서 분쇄되며 비드와 충돌한다. 상기 비드는 세포를 파쇄하여 세포 내용물을 방출시킨다. 세포는 예를 들어, 블렌딩의 사용과 함께(예를 들어, 고속 또는 와링 블렌더(Waring blender)), 프레치 프레스 또는 심지어 약한 세포 벽의 경우에 세포 파쇄를 위한 원심분리의 사용과 같은 전단력에 의해 파쇄될 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 미생물을 용해시키는 단계는 삼투압 쇼크를 적용함에 의해 수행한다.본 발명의 또 다른 양태에서, 미생물을 용해시키는 단계는 용해성 바이러스로 미생물을 감염시킴을 포함한다. 광범위한 바이러스는 본 발명에 사용하기 위해 적합한 미생물을 용해시키는 것으로 공지되어 있고 특정 미생물에 대한 특정 용해성 바이러스의 선택 및 용도는 당업계의 기술 범위내에 있다. 예를 들어, 파라메시움 부르사리아 클로렐라 바이러스(Paramecium bursaria chlorella virus)(PBCV-l)는 특정 단일 세포 진핵 클로렐라형 녹색 조류내에서 복제하고 이를 용해시키는 대형의 20면체 플라크 형성 이중가닥의 DNA 바이러스의 원형이다(필코드나비리대( Phycodnaviridae) 계열, 클로로바이러스(Chlorovirus) 속). 따라서, 임의의 민감성 미세조류는 적합한 클로렐라 바이러스로 배양물을 감염시킴에 의해 용해시킬 수 있다. 클로렐라 바이러스로 클로렐라 종을 감염시키는 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[참조: Adv. Virus Res. 2006;66:293-336; Virology, 1999 Apr 25;257(1): 15-23; Virology, 2004 Jan 5;318(l):214-23; Nucleic Acids Symp. Ser. 2000;(44): 161-2; J. Virol. 2006 Mar;80(5):2437-44; and Annu. Rev. Microbiol. 1999;53:447-94]을 참조한다.본 발명의 또 다른 양태에서, 미생물을 용해시키는 단계는 자가용해를 포함한다. 상기 양태에서, 본 발명에 따른 미생물은 미생물을 용해시키는 용해성 단백질을 생성하도록 유전자 조작한다. 상기 용해성 유전자는 유도성 프로모터를 사용하여 발현시켜 세포가 처음에 발효기내에서 목적하는 밀도로 성장한 후 프로모터를 유도하여 용해성 유전자를 발현시키므로써 세포를 용해시킬 수 있다. 하나의 양태에서, 상기 용해성 유전자는 폴리사카라이드-분해 효소를 암호화한다. 특정 다른 양태에서, 상기 용해성 유전자는 용해성 바이러스 기원의 유전자이다. 따라서, 예를 들어, 클로렐라 바이러스 기원의 용해성 유전자는 조류 세포에서 발현시킬 수 있고 문헌[참조: Virology 260, 308-315 (1999); FEMS Microbiology Letters 180 (1999) 45-53; Virology 263, 376-387 (1999); and Virology 230, 361-368 (1997)]을 참조한다. 용해성 유전자의 발현은 바람직하게 유도성 프로모터, 예를 들어, 소분자, 광, 열과 같은 자극 및 다른 자극의 존재하에 유도되는 미세조류에서 활성인 프로모터를 사용하여 수행한다. 상기 방법에 의해 생성된 세포 용해물로부터 지질을 분리하기 위한 다양한 방법이 유용하다. 예를 들어, 지방 알데하이드, 지방 알콜 및 탄화수소(예를 들어, 알칸)와 같은 지질 및 지질 유도체는 헥산과 같은 소수성 용매로 추출할 수 있다(문헌참조: Frenz et al. 1989, Enzyme Microb. Technol., 11:717). 지질 및 지질 유도체는 또한 액화(문헌참조: Sawayama et al. 1999, Biomass and Bioenergy 17:33-39 and Inoue et al. 1993, Biomass Bioenergy 6(4):269-274); 오일 액화(문헌참조: 예를 들어, Minowa et al. 1995, Fuel 74(12): 1735-1738); 및 초임계 CO2 추출(문헌참조: 예를 들어, Mendes et al. 2003, Inorganica Chimica Acta 356:328-334)를 사용하여 추출할 수 있다. 미아오(Miao) 및 우(Wu)는 클로렐라 프로토테오코이데스의 배양으로부터 미세조류 지질 회수의 프로토콜을 기재하고 있고 여기서, 상기 세포는 원심분리에 의해 수거되고 증류수로 세척되며 동결 건조에 의해 건조시킨다. 수득한 세포 분말을 모르타르에서 분쇄하고 이어서 n-헥산으로 추출한다[문헌참조: Miao and Wu, Biosource Technology (2006) 97:841-846].따라서, 본 발명의 미생물에 의해 생성된 지질, 지질 유도체 및 탄화수소는 유기 용매로 추출하여 회수할 수 있다. 몇몇 경우에, 바람직한 유기 용매는 헥산이다. 전형적으로, 유기 용매는 용해 성분의 사전 분리 없이 용해물에 직접 첨가한다. 하나의 양태에서, 상기된 하나 이상의 방법에 의해 생성된 용해물은 지질 및/또는 탄화수소 성분이 유기 용매와 용액을 형성하도록하기에 충분한 시간 동안 유기 용매와 접촉시킨다. 몇몇 경우에, 상기 용액을 이어서 추가로 정련하여 특정 목적하는 지질 또는 탄화수소 성분을 회수한다. 헥산 추출 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.본원에 기재된 세포에 의해 생성된 지방 알데하이드, 지방 알콜 및 탄화수소(예를 들어, 알칸)과 같은 지질 및 지질 유도체는 상기된 바와 같은 리파제를 포함하는 하나 이상의 효소를 사용함에 의해 변형시킬 수 있다. 탄화수소가 세포의 세포외 환경에 존재하는 경우, 하나 이상의 효소는, 효소가 탄화수소를 변형시키거나 탄화수소 전구체로부터 이의 합성을 완성하도록 하는 조건하에서 상기 환경에 첨가할 수 있다. 또는, 상기 탄화수소는 효소와 같은 하나 이상의 촉매의 첨가 전에 세포 물질로부터 부분적으로 또는 완전하게 분리될 수 있다. 상기 촉매는 외인성으로 첨가되고 이들의 활성은 세포 외부에서 또는 시험관내에서 발생한다.따라서, 본원에 기재된 바와 같이 생체내 세포에 의해 생성되거나 시험관내에서 효소적으로 변형된 지질 및 탄화수소는 임의로 통상적인 수단에 의해 추가로 가공될 수 있다. 상기 가공은 탄화수소의 크기를 감소시키고 이어서 이의 수소화 비율을 증가시키기 위한 "크랙킹(cracking)"을 포함할 수 있다. 촉매 및 열 크랙킹방법은 통상적으로 탄화수소 및 트리글리세라이드 오일 가공에 사용한다. 촉매 방법은 고체 산 촉매와 같은 촉매의 사용을 포함한다. 상기 촉매는 실리카-알루미나 또는 제올라이트일 수 있고 이로써 탄소-탄소 결합을 이종용해 또는 비대칭 분해시켜 카보양이온(carbocation) 및 수소화물 음이온을 수득할 수 있다. 이들 반응성 중간체를 이어서 또 다른 탄화수소와 함께 재배열하거나 수소화 전달을 진행시킨다. 상기 반응은 따라서 중간체를 재생성시켜 자가-증폭 쇄 기작을 유도할 수 있다. 또한 탄화수소는 여기서의 탄소-탄소 이중 또는 삼중 결합의 수가 임의로 제로까지 감소하도록 가공할 수 있다. 또한 탄화수소를 가공하여 여기서의 환 또는 사이클릭 구조를 제거할 수 있다. 탄화수소를 또한 가공하여 수소화 비율을 증가시킬 수 있다. 이것은 수소의 첨가("수소화") 및/또는 탄화수소의 보다 작은 탄화수소로의 "크랙킹"을 포함할 수 있다.열 방법은 탄화수소 크기를 감소시키기 위한 상승된 온도 및 압력의 용도를 포함한다. 약 800℃의 승온 및 약 700kPa의 압력을 사용할 수 있다. 이들 조건은 때때로 수소 풍부 탄화수소 분자(양성자 플럭스와는 구분되는 바와 같이)를 언급하는데 사용되는 용어 '가벼운 탄화수소 분자'를 생성하고 또한 응축에 의해 상대적으로 수소가 고갈된 보다 무거운 탄화수소 분자를 생성한다. 상기 방법은 등방성 또는 대칭적 절단을 제공하고 상기된 바와 같이 임의로 효소적으로 포화될 수 있는 알켄을 생성한다. 촉매 및 열 방법은 탄화수소 가공 및 오일 정련을 위한 식물에서의 표준 방법이다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 세포에 의해 생성된 탄화수소가 수거될 수 있고 통상적인 수단에 의해 가공되거나 정련될 수 있다. 미세조류 생산 탄화수소의 수소크랙킹에 대한 보고에 대해 문헌[Hillen et al. (Biotechnology and Bioengineering, Vol. XXIV: 193-205 (1982))]을 참조한다. 또 다른 양태에서, 상기 분획물은 또 다른 촉매, 예를 들어, 유기 화합물, 열 및/또는 무기 화합물로 처리한다. 지질의 바이오디젤로의 가공을 위해, 트랜스에스테르화 공정이 본원의 섹션 IV에 기재된 바와 같이 사용된다. 본 발명의 방법을 통해 생성되는 탄화수소는 다양한 산업 응용 분야에서 유용하다. 예를 들어, 거의 모든 유형의 세제 및 세정제에서 사용되는 음이온 게면활성제인 직쇄 알킬벤젠 설포네이트(LAS)의 생산은 일반적으로 10 내지 14개의 탄소원자 쇄를 포함하는 탄화수소를 사용한다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 번호: 제6,946,430호; 제5,506,201호; 제6,692,730호; 제6,268,517호; 제6,020,509호; 제6,140,302호; 제5,080,848호; 및 제5,567,359호]를 참조한다. LAS와 같은 계면활성제는 퍼스널 케어 조성물 및 세제[예를 들어, 미국 특허 제5,942,479호; 제6,086,903호; 제5,833,999호; 제6,468,955호; 및 제6,407,044호에 기재된 것들]의 제조에 사용할 수 있다.관심이 고조되고 있는 것은 화석 연료로부터 유래된 출발 물질을 대체할 수 있는 재생가능한 생물학적 출발 물질이 가용하고 이의 사용이 바람직할 수 있기 때문에 바이오디젤, 재생가능한 디젤 및 제트 연료와 같은 연료에서의 생물학적 기원의 탄화수소 성분의 용도에 대한 것이다. 생물학적 물질로부터 탄화수소 성분을 생산하기 위한 방법이 시급히 요구되고 있다. 본 발명은 바이오디젤, 재생가능한 디젤 및 제트 연료를 제조하기 위해 본원에 기재된 방법에 의해 생성된, 생물학적 재료로서의 지질을 사용하여, 바이오디젤, 재생가능한 디젤 및 제트 연료의 생산 방법을 제공하므로써 상기 필요성을 충족시킨다.통상적인 디젤 연료는 파라핀 탄화수소가 풍부한 석유 증류물이다. 이들은 370° 내지 78O°F 정도로 넓은 비등 범위를 갖고 이는 디젤 엔진 승용차와 같은 압착 점화 엔진에서 연소용으로서 적합하다. 기관[The American Society of Testing and Materials (ASTM)]은 세탄수, 혼탁점, 플래쉬 포인트, 점도, 아닐린 포인트, 황 함량, 물 함량, 재 함량, 구리 스트립 부식 및 탄소 잔기와 같은 허용 가능한 범위의 다른 연료 성질과 함께 비등 범위에 따라 디젤 등급을 확립한다. 기술적으로, 적당한 ASTM 세부항목을 충족하는 바이오매쓰 또는 기타로부터 유래된 임의의 탄화수소 증류 재료는 디젤 연료(ASTM D975), 제트 연료(ASTM D1655), 또는 이것이 지방산 메틸 에스테르인 경우 바이오디젤(ASTM D6751)로서 정의될 수 있다.추출 후, 본원에 기재된 미생물 바이오매쓰로부터 회수된 지질 및/또는 탄화수소 성분은 디젤 승용차 및 제트 엔진에 사용하기 위한 연료를 제조하기 위해 화학적 처리에 적용될 수 있다.바이오디젤은 금색에서 암갈색으로 생산 공급원료에 따라 색상이 다양한 액체이다. 이것은 실제로 수불혼화성이고 고융점 및 저증기압을 갖는다. 바이오디젤은 디젤-엔진 승용차에 사용하기 위한 디젤-등가의 가공된 연료를 언급한다. 바이오디젤은 생분해성이고 비독성이다. 통상적인 디젤 연료에 비해 바이오디젤의 추가의 이득은 보다 낮은 엔진 마모이다. 전형적으로, 바이오디젤은 C14-C18 알킬 에스테르를 포함한다. 다양한 가공은 본원에 기재된 바와 같이 생성되고 분리된 바이오매쓰 또는 지질을 디젤 연료로 전환시킨다. 바이오디젤을 생산하기 위한 바람직한 방법은 본원에 기재된 바와 같이 지질의 트랜스에스테르화에 의한 것이다. 바이오디젤로서 사용하기 위한 바람직한 알킬 에스테르는 메틸 에스테르 또는 에틸 에스테르이다.본원에 기재된 방법에 의해 생성된 바이오디젤은 대부분의 모뎀 디젤-엔진 승용차에서 임의의 농도로 단독으로 사용하거나 통상적인 디젤 연료와 블렌딩하여 사용될 수 있다. 통상적인 디젤 연료(석유 디젤)와 블렌딩되는 경우, 바이오디젤은 약 0.1% 내지 약 99.9%로 존재할 수 있다. 많은 국가에서는 임의의 연료 혼합물에서 바이오디젤의 양을 지칭하기 위해 "B" 인자로서 공지된 시스템을 사용한다. 예를 들어, 20% 바이오디젤을 함유하는 연료는 B20으로 표시된다. 순수한 바이오디젤은 BlOO으로 언급된다.바이오디젤은 또한 가정용 및 상업용 보일러에서 가열 연료로서 사용될 수 있다. 기존의 오일 보일러는 고무 구성품을 함유할 수 있고 바이오디젤상에서의 운행을 위해서는 전환을 필요로 할 수 있다. 전환 과정은 일반적으로 비교적 단순하고 바이오디젤이 강한 용매임으로 고무 구성품의 합성 구성품으로의 교환을 포함한다. 이의 강한 용해력 때문에, 바이오디젤의 연소는 보일러의 효율을 증가시킨다. 바이오디젤은 수순한 울트라-로우 황 디젤(ULSD) 연료의 윤활성을 증가시키기 위해 디젤 제형중에 첨가제로서 사용될 수 있고, 이는 이것이 실제로 황을 내포하지 않기 때문에 유리하다. 바이오디젤은 석유디젤 보다 양호한 용매이고 이전에 석유디젤상에서 운행된 자동차 연료 라인중에 잔류 침적물을 분해시키는데 사용될 수 있다.바이오디젤은 오일 풍부 바이오매쓰중에 함유된 트리글리세라이드의 트랜스에스테르화에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서, 바이오디젤을 생산하기 위한 방법이 제공된다. 바람직한 양태에서, 바이오디젤을 생산하는 방법은 (a) 본원에 기재된 방법을 사용하여 지질 함유 미생물을 배양하는 단계, (b) 지질 함유 미생물을 용해시켜 용해물을 생성시키는 단계, (c) 용해된 미생물로부터 지질을 분리하는 단계 및 (d) 지질 조성물을 트랜스에스테르화하여 바이오디젤을 생성시키는 단계를 포함한다. 미생물의 성장 방법, 미생물을 용해시켜 용해물을 생성하는 방법, 유기 용매를 포함하는 배지에서 용해물을 처리하여 이종성 혼합물을 형성시키는 방법 및 처리된 용해물을 지질 조성물로 분리하는 방법은 상기되었고 또한 바이오디젤을 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 바이오디젤의 지질 프로필은 일반적으로 공급원료 오일의 지질 프로필과 고도로 유사하다. 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 제공된 다른 오일은 트랜스에스테르화시켜 바이오디젤을 생산할 수 있고 이때 지질 프로필은 (a) 4% 이상의 C8-C14; (b) 0.3% 이상의 C8; (c) 2% 이상의 C10; (d) 2% 이상의 C12; 및 (3) 30% 이상의 C8-C14를 포함한다.지질 조성물은 트랜스에스테르화시켜 바이오디젤로서 유용한 장쇄의 지방산 에스테르를 생산할 수 있다. 바람직한 트랜스에스테르화 반응은 하기에 명시되고 염기 촉매된 트렌스에스테르화 및 재조합 리파제를 사용하는 트랜스에스테르화를 포함한다. 염기 촉매된 트랜스에스테르화 공정에서, 트리아실글리세라이드는 알칼린 촉매인, 전형적으로 수산화칼륨의 존재하에 메탄올 또는 에탄올과 같은 알콜과 반응시킨다. 상기 반응은 부산물로서 메틸 또는 에틸 에스테르 및 글리세린(글리세롤)을 형성한다. 동물 및 식물 오일은 전형적으로 트리하이드릭 알콜인 글리세롤과 유리된 지방산의 에스테르인 트리글리세라이드로 구성된다. 트랜스에스테르화에서, 트리글리세라이드(TAG)중의 글리세롤은 메탄올 또는 에탄올과 같은 단쇄 알콜로 대체한다. 전형적인 반응 계획은 다음과 같다:상기 반응에서, 상기 알콜은 염기로 탈양성자화되어 보다 강한 친핵성이 된다. 통상적으로, 에탄올 또는 메탄올은 매우 과량(50배 이하)으로 사용된다. 정상적으로 상기 반응은 상당히 느리게 진행하거나 전혀 진행하지 않는다. 산 또는 염기 뿐만 아니라 열을 사용하여 반응의 보다 신속한 진행을 도와줄 수 있다. 산 또는 염기는 트랜스에스테르화에 의해 소비되지 않고 따라서 이들은 반응물이 아니고 촉매이다. 거의 모든 바이오디젤은 이것이 단지 저온 및 저압을 요구하고 98% 초과의 전환 수율을 나타내므로(단, 출발 오일은 수분 및 유리된 지방산이 낮아야 한다) 염기 촉매된 기술을 사용하여 생산될 수 있다.트랜스에스테르화는 또한 염기 대신 리파제와 같은 효소를 사용하여 수행하였다. 리파제-촉매된 트랜스에스테르화는 예를 들어, 실온 내지 80℃의 온도 및 1:1 초과, 바람직하게는 약 3:1인 TAG 대 저급 알콜의 몰비에서 수행할 수 있다. 트랜스에스테르화에 사용하기에 적합한 리파제는 표 7에 기재된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 트랜스에스테르화를 위해 유용한 리파제의 다른 예는 예를 들어, 미국 특허 제4,798,793호; 제4,940,845호; 제5,156,963호; 제5,342,768호; 제5,776,741호 및 WO89/01032에서 찾을 수 있다. 상기 리파제는 리조푸스 (Rhizopus), 아스퍼질러스(Aspergillus), 캔디다(Candida), 뮤코(Mucor), 슈도모나스(Pseudomonas), 리조뮤코(Rhizomucor), 캔디다 및 휴미콜라(Humicola)에 의해 생성된 리파제 및 췌장 리파제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바이오디젤용으로 적합한 지방산 에스테르의 제조를 위해 리파제를 사용하는 문제는 리파제 가격이 강염기 공정에 의해 사용되는 수산화나트륨(NaOH)의 가격보다 훨씬 고가라는 것이다. 상기 문제점은 재활용될 수 있는 고정화된 리파제를 사용하므로써 해결되었다. 그러나, 고정화된 리파제의 활성은 리파제-기본 공정이 생산 단가의 측면에서 강염기 공정과 경쟁을 위해서는 최소의 사이클동안 재활용된 후 유지되어야만 한다. 고정화된 리파제는 트랜스에스테르화에 전형적으로 사용되는 저급 알콜에 의해 독성이 된다. 미국 특허 제6,398,707호(우 등에게 2002년 6월 4일자로 허여됨)는 고정화된 리파제의 활성을 증진시키는 방법 및 감소된 활성을 갖는 고정화된 리파제를 재생시키는 방법을 기재하고 있다. 몇몇 적합한 방법은 일정 기간의 시간, 바람직하게는 0.5 내지 48시간 및 보다 바람직하게는 0.5 내지 1.5시간 동안 3개 이상의 탄소 원자수를 갖는 알콜중에 고정화된 리파제를 침지시킴을 포함한다. 몇몇 적합한 방법은 또한 3개 이상의 탄소원자수를 갖는 알콜과 불활성화된 고정화된 리파제를 세척함에 이어서 식물성 오일중에 0.5 내지 48시간 동안 불활성화된 고정화된 리파제를 침지시킴을 포함한다.특정 양태에서, 재조합 리파제는 리파제가 작용하는 지질을 생산하는 동일한 미생물내에서 발현된다. 적합한 재조합 리파제는 표 7에 상기 열거되고/되거나 표 7에 상기 열거된 GenBank 승인 번호를 갖는 것들, 또는 표 7에 상기 열거된 리파제중 하나와 70% 이상의 아미노산 동일성을 갖고 리파제 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 포함한다. 추가의 양태에서, 효소 활성은 상기된 서열중 하나와 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 99% 이상 동일성을 갖는 서열중에 존재하고 상기 서열 모두는 완전히 제시된 바와 같이 참조로서 인용된다. 리파제 및 선택가능한 마커를 암호화하는 DNA는 바람직하게 코돈 최적화된 cDNA이다. 미세조류중에서 발현하기 위해 유전자를 재암호화하는 방법은 미국 특허 제7,135,290호에 기재되어 있다.바이오디젤에 대한 통상의 국제 표준은 EN 14214이다. ASTM D6751은 미국 및 캐나다에서 참조되는 가장 공통된 바이오디젤 표준이다. 독일은 DIN EN 14214을 사용하고 UK는 BS EN 14214을 준수할 것으로 요구한다. 생성물이 이들 표준에 부합하는지의 여부를 결정하기 위한 기본 산업적 시험은 전형적으로 가스 크로마토그래피, HPLC 등을 포함한다. 품질 표준을 충족하는 바이오디젤은 매우 비독성이고 독성 등급(LD50)은 50 mL/kg을 초과한다.ASTM 표준을 충족하는 바이오디젤이 비독성이어야만 하지만 결정화하고/하거나 침전하고 용액으로부터 침강하는 경향이 있는 오염물이 있을 수 있다. 침강물 형성은 특히 바이오디젤이 보다 저온에서 사용되는 경우 문제이다. 침강 또는 침전은 연료 흐름을 감소시키고, 연료 라인을 막히게하고 여과기를 막히게하는 것과 같은 문제를 유발할 수 있다. 고품질의 생성물을 제조하기 위해 바이오디젤에서 상기 오염물 및 침강물을 제거하는 것과 관련된 공정들은 당업계에 널리 공지되어 있다. 상기 공정들의 예는 인지질 및 유리 지방산과 같은 오염물을 제거하기 위한 오일의 전처리(예를 들어, 정련, 부식성 정련 및 실리카 흡착 여과) 및 냉각 여과를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 냉각 여과는 생성 후 바이오디젤에 존재하는 임의의 미립자 및 침강물을 제거하기 위해 특별히 개발된 공정이다. 상기 공정은 바이오디젤을 냉각시키고 연료가 보다 저온에서 사용되는 경우 형성될 수 있는 임의의 침강물 또는 침전물을 여과 제거한다. 상기 공정은 당업계에 널리 공지되어 있고 미국 특허원 공개 번호 제2007-0175091호에 기재되어 있다. 적합한 방법은 바이오디젤을 약 38℃ 미만의 온도로 냉각시켜 불순물 및 오염물이 바이오디젤 액체중에서 미립자로서 침전하도록 함을 포함할 수 있다. 이어서 규조토 또는 다른 여과 재료를 냉각된 바이오디젤에 첨가하여 슬러리를 형성시킬 수 있고 이것은 이어서 압력 리프(pressure leaf) 또는 다른 유형의 여과기를 통해 여과하여 미립자를 제거할 수 있다. 이어서 여과된 바이오디젤은 가연성 여과기에 통과시켜 임의의 잔류 침강물 및 규조토를 제거하여 최종 바이오디젤 생성물을 생성할 수 있다.실시예 14는 프로토테카 모리포르미스로부터 트리글리세라이드를 사용하는 바이오디젤의 제조법을 기재하였다. 실시예 14에서 제조된 바이오디젤의 The Cold Soak Filterability by the ASTM D6751 Al 방법에 의한 냉각 담금 여과능(Cold Soak Filterability)은 300ml의 용적에 대해 120초였다. 상기 시험은 16시간 동안 40°Ｆ로 냉각시키고 실온으로 가온되도록 방치하고 스테인레스 강철 지지체를 가진 0.7마이크론 유리 섬유 필터를 사용하여 진공 여과하는, 300ml의 B100의 여과를 포함한다. 본 발명의 오일은 120초 미만, 100초 미만 및 90초 미만의 냉각 담금 시간과 함께 트랜스에스테르화되어 바이오디젤을 생성할 수 있다. 후속 공정은 또한 바이오디젤이 특히 냉온에서 사용되는 경우 사용될 수 있다. 상기 공정은 동결방지처리(winterization) 및 분획화를 포함한다. 2개 공정은 혼탁점(바이오디젤이 결정화하기 시작하는 온도)을 저하시킴에 의해 연료의 냉각 흐름 및 동결방지 수행능을 개선시키도록 디자인된다. 바이오디젤의 동결방지처리에는 다수의 방법이 있다. 한가지 방법은 바이오디젤을 석유 디젤과 블렌딩하는 것이다. 또 다른 방법은 바이오디젤의 혼탁점을 저하시킬 수 있는 첨가제를 사용하는 것이다. 또 다른 방법은 첨가제중에 혼합하고 포화물이 결정화하도록 방치하고 이어서 결정을 여과 제거함에 의해 무분별하게 포화된 메틸 에스테를 제거하는 것이다. 분획화는 선택적으로 메틸 에스테르를 개별 성분 또는 분획으로 분리하여 특정 메틸 에스테르가 제거 또는 포함되도록 할 수 있다. 분획화 방법은 우레아 분획화, 용매 분획화 및 열 증류를 포함한다. 본 발명의 방법에 의해 제공될 수 있는 또 다른 가치있는 연료는 C10:0, C12:0, C14:0, C16:0 및 C18:0과 같은 알칸을 포함하여 바이오디젤과는 구분될 수 있는 재생가능한 디젤이다. 고품질의 재생가능한 디젤은 ASTM D95 표준에 부합한다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 지질은 공급원료로서 작용하여 재생가능한 디젤을 생성할 수 있다. 따라서 본 발명의 또 다른 측면에서,재생가능한 디젤을 생성하는 방법이 제공된다. 재생가능한 디젤은 3개 이상의 공정에 의해 생성될 수 있다: 열수 가공(수소 처리); 수소화처리; 및 간접적인 액화. 이들 공정으로 비-에스테르 증류물을 수득한다. 이들 공정동안에, 본원에 기재된 바와 같이 생성되고 분리된 트리아실글리세라이드는 알칸으로 전환된다. 하나의 양태에서, 재생가능한 디젤을 생성하는 방법은 (a) 본원에 기재된 방법을 사용하여 지질 함유 미생물을 배양하고 (b) 미생물을 용해시켜 용해물을 생성하고, (c) 용해된 미생물로부터 지질을 분리하고 (d) 지질을 탈산화하고 수소화처리하여 알칸을 생성하므로써 재생가능한 디젤이 생성되도록 함을 포함한다. 재생가능한 디젤을 제조하기에 적합한 지질은 헥산과 같은 유기 용매를 사용하거나 미국 특허 제5,928,696호에 기재된 것들과 같은 다른 방법을 통해 미생물 바이오매쓰로부터 추출을 통해 수득할 수 있다. 몇몇 적합한 방법은 기계적 프레싱 및 원심분리를 포함할 수 있다.몇몇 방법에서, 미생물 지질은 먼저 수소화처리와 연계하여 크랙킹하여 각각 탄소쇄 길이를 감소시키고 이중 결합을 포화시킨다. 상기 물질을 또한 이어서 수소화처리와 연계하여 이성체화한다. 이어서 나프타 분획을 증류를 통해 제거함에 이어서 추가 증류하여 디젤 연료에 요구되는 성분을 증발시키고 증류시키므로써 ASTM D975에 충족하도록 하고 D975 표준을 충족시키기 위해 요구되는 것 보다 무거운 성분을 잔류시킨다. 트리글리세라이드 오일을 포함하는 화학적으로 변형된 오일의 수소 처리, 수소 크랙킹, 탈산소화 및 이성체화 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 유럽 특허원 제EP1741768호 (A1); 제EP1741767호 (A1); 제EP1682466호 (A1); 제EP1640437호 (A1); 제EP1681337호 (A1); 제EP1795576호 (A1); 및 미국 특허 제7,238,277호; 제6,630,066호; 제6,596,155호; 제6,977,322호; 제7,041,866호; 제6,217,746호; 제5,885,440호; 제6,881,873호를 참조한다.재생가능한 디젤을 생성하기 위한 방법의 하나의 양태에서, 알칸을 생성하기 위한 지질의 처리는 지질 조성물의 수소 처리에 의해 수행한다. 열수 가공에서, 전형적으로 바이오매쓰는 승온 및 승압에서 물중에서 반응시켜 오일 및 잔류 고체를 형성시킨다. 전환 온도는 전형적으로 300°F 내지 660°F이고, 이때 압력은 주로 액체로서 물을 유지하게 충분한 100 내지 170 표준 대기압(atm)이다. 반응 시간은 15 내지 30분 정도이다. 반응을 종결한 후 유기물을 물로부터 분리한다. 이로써 디젤을 위해 적합한 증류물이 생성된다. 재생가능한 디젤을 제조하는 몇몇 양태에서, 트리글리세라이드를 처리하는 제1 단계는 이중 결합을 포화시키기 위한 수소 가공에 이어서 수소 및 촉매의 존재하에 승온에서 탈산소화시키는 것이다. 몇몇 방법에서, 수소화 및 탈산소화는 동일한 반응에서 발생한다. 다른 방법에서 탈산소화는 수소화 전에 수행한다. 이어서 이성체화는 임의로 또한 수소 및 촉매의 존재하에서 수행한다. 나프타 성분은 바람직하게 증류를 통해 제거한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,475,160호 (트리글리세라이드의 수소화); 제5,091,116호(탈산소화, 수소화 및 가스 제거); 제6,391,815호 (수소화); 및 제5,888,947호(이성체화)를 참조한다.트리글리세라이드의 수소화를 위한 하나의 적합한 방법은 구리, 아연, 마그네슘 및 란탄염의 수용액 및 알칼리 금속 또는 바람직하게 탄산암모늄의 또 다른 용액을 제조함을 포함한다. 상기 2개의 용액을 약 20℃ 내지 약 85℃의 온도로 가열하고 침전 용기내 pH가 5.5 내지 7.5로 유지되어 촉매를 형성하도록 하는 비율로 침전 용기내로 함께 계량하여 부가할 수 있다. 추가의 물은 초기에 침전 용기내에사용할 수 있거나 염 용액 및 침전 용액과 동시에 첨가할 수 있다. 이어서 수득한 침전물을 약 300℃에서 세척하고 건조시키고 하소시키고 약 100℃ 내지 약 400℃의 온도 범위에서 수소중에서 활성화시킬 수 있다. 이어서 하나 이상의 트리글리세라이드는 반응기내 상기된 촉매의 존재하에 수소와 접촉시키고 반응시킬 수 있다. 상기 반응기는 트리클 상 반응기, 고정 상 가스-고체 반응기, 팩킹된 기포 칼럼 반응기, 연속 교반 탱크 반응기, 슬러리 상 반응기 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적합한 반응기 유형일 수 있다. 상기 방법은 배치식으로 또는 연속식으로 수행할 수 있다. 반응 온도는 전형적으로 약 170℃ 내지 약 250℃의 범위이고 반응 압력은 전형적으로 약 300 psig 내지 약 2000 psig 범위이다. 더욱이, 본 발명의 방법에서 수소 대 트리글리세라이드의 몰 비는 전형적으로 약 20: 1 내지 약 700: 1 범위이다. 상기 방법은 전형적으로 중량 시간 공간 속도(WHSV)에서 수행하고 이의 범위는 약 0.1hr-1 내지 약 5hr-1이다. 당업자는 반응을 위해 요구되는 시간은 사용되는 온도, 수소 대 트리글리세라이드의 몰비 및 수소 분압에 따라 다양함을 인지할 것이다. 상기 수소화 공정에 의해 생성되는 생성물은 지방 알콜, 글리세롤, 미량의 파라핀 및 미반응 트리글리세라이드를 포함한다. 이들 생성물은 전형적으로 예를 들어, 증류, 추출, 여과, 결정화 등과 같은 통상적인 수단에 의해 분리한다. 석유 정련업자는 수소화처리을 사용하여 공급물을 수소로 처리하므로써 불순물을 제거한다. 수소화처리 전환 온도는 전형적으로 300°F 내지 700°F이다. 상기 압력은 전형적으로 40 내지 100atm이다. 상기 반응 시간은 전형적으로 10 내지 60분 정도이다. 고체 촉매를 사용하여 특정 반응 속도를 증가시키고 특정 생성물에 대한 선택성을 개선시키고 수소 소비를 최적화한다.오일의 탈산소화를 위해 적합한 방법은 오일을 약 350°F 내지 약 55O°F 범위의 온도로 가열하고 연속적으로 가열된 오일을 약 5분 이상 동안 적어도 약 대기압 이상의 압력하에서 수소와 접촉시킴을 포함한다.이성체화를 위해 적합한 방법은 알칼리 이성체화 및 당업계에 공지된 다른 오일 이성체화를 사용함을 포함한다.수소 처리 및 수소 가공은 궁극적으로 트리글리세라이드 공급물의 중량 감소를 유도한다. 상기 트리글리세라이드 분자는 수소 가공 조건하에 4개의 탄화수소 분자, 즉 프로판 분자 및 전형적으로 C8 내지 C18 범위의 3개의 보다 무거운 탄화수소 분자로 감소한다.따라서, 하나의 양태에서, 본 발명의 지질 조성물상에서 수행되는 하나 이상의 화학 반응(들)의 생성물은 ASTM D975 재생가능한 디젤을 포함하는 알칸 혼합물이다. 미생물에 의한 탄화수소의 생성은 문헌[참조: Metzger et al. Appl Microbiol Biotechnol (2005) 66: 486-196 and A Look Back at the U.S. Department of Energy's Aquatic Species Program: Biodiesel from Algae, NREL/TP-580-24190, John Sheehan, Terri Dunahay, John Benemann and Paul Roessler (1998)]에 의해 검토되었다. 디젤 연료의 증류 성질은 T10-T90 (각각 10% 및 90%의 용적이 증류되는 온도)의 관점에서 기재한다. 재생가능한 디젤은 프로토테카 모리포르미스 트리글리세라이드로부터 생성되고 실시예 14에 기재된다. 실시예 14에 생성된 물질의 T10-T90은 57.9℃였다. 본원에 기재된 오일의 수소 처리, 이성체화 및 본원에 기재된 다른 공유 변형 방법 및 증류 및 본원에 기재된 분획화(예를 들어, 냉각 여과) 방법을 사용하면서, 본원에 기재된 방법에 따라 생성된 트리글리세라이드를 사용하여 재생가능한 디젤 조성물을 생성할 수 있고 이때 다른 T10-T90 범위는 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 및 65℃이다.실시예 14에서 생성된 물질의 T10은 242.1℃이다. 본원에 기재된 오일의 수소 처리, 이성체화 및 다른 공유 변형 방법 및 본원에 기재된 증류 및 분획화(냉각 여과와 같은) 방법을 사용하여 재생가능한 디젤 조성물을 생성할 수 있고 이때 다른 T10 값은 예를 들어, 180 내지 295, 190 내지 270, 210 내지 250, 225 내지 245, 및 290 이상의 T10이다. 실시예 14에서 생성된 물질의 T90은 300℃이다. 본원에 기재된 오일의 수소 처리, 이성체화 및 다른 공유 변형 방법 및 본원에 기재된 증류 및 분획화(냉각 여과와 같은) 방법을 사용하여 재생가능한 디젤 조성물을 생성할 수 있고 이때 다른 T90 값은 예를 들어, 280 내지 380, 290 내지 360, 300 내지 350, 310 내지 340, 및 290 이상의 T90이다.실시예 14에서 생성된 물질의 FBP는 300℃이다. 본원에 기재된 오일의 수소 처리, 이성체화 및 다른 공유 변형 방법 및 본원에 기재된 증류 및 분획화(냉각 여과와 같은) 방법을 사용하여 재생가능한 디젤 조성물을 생성할 수 있고 이때 다른 FBP 값은 예를 들어, 290 내지 400, 300 내지 385, 310 내지 370, 315 내지 360, 및 300 이상의 FBP이다.본 발명의 방법 및 조성물에 의해 제공된 기타 오일은 수소화처리, 이성체화 및 다른 공유 변형의 조합에 적용될 수 있고 (a) 4% 이상의 C8-C14; (b) 0.3% 이상의 C8; (c) 2% 이상의 C10; (d) 2% 이상의 C12; 및 (3) 30% 이상의 C8-C14를 포함하는 지질 프로필을 갖는 오일을 포함한다.통상적인 초-저 황 디젤은 2단계 공정에 의해 임의의 형태의 바이오매쓰로부터 생성될 수 있다. 먼저, 바이오매쓰를 수소 및 일산화탄소가 풍부한 가스 혼합물인 합성가스로 전환시킨다. 이어서, 합성가스를 촉매적으로 액체로 전환시킨다. 전형적으로, 액체의 생성은 피셔-트로프쉬(Fischer-Tropsch)(FT) 합성을 사용하여 성취한다. 상기 기술은 석탄, 천연 가스 및 중유에 적용한다. 따라서, 재생가능한 디젤을 생성하기 위한 방법의 여전히 또 다른 바람직한 양태에서, 알칸을 생성하기 위한 액체 조성물의 처리는 액체 조성물의 간접적인 액화에 의해 수행한다. 본 발명은 또한 제트 연료를 제조하는 방법을 제공한다. 제트 연료는 스트로 색상으로 투명하다. 가장 일반적인 연료는 국제 표준 세트의 세부 항목으로 제조되는 항공기 A-l로서 분류되는 무연/석유 오일계 연료이다. 제트 연료는 다수의 상이한, 가능하게는 수천개 이상의 많은 상이한 탄화수소의 혼합물이다. 이들의 크기 범위(분자량 또는 탄소수)는 생성물에 대한 요건, 예를 들어, 동결점 또는 발연점에 의해 제한된다. 케로손형(Kerosone-type) 항공기 연료(제트 A 및 제트 A-l을 포함함)는 약 8 내지 16개 탄소수의 탄소수 분포를 갖는다. 와이드-컷 또는 나프타형 항공기 연료(제트 B를 포함함)는 전형적으로 약 5 내지 15개 탄소의 탄소수 분포를 갖는다. 2개의 항공기(제트 A 및 제트 B)는 다수의 부가제를 함유할 수 있다. 유용한 부가제는 항산화제, 대전방지제, 부식 억제제, 및 연료 시스템 아이싱 억제제(FSII)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 항산화제는 검화(gumming)를 방지하고 일반적으로 알킬화된 페놀, 예를 들어, AO-30, AO-31, 또는 AO-37을 기초로 한다. 대전방지제는 정전기를 소멸시켜 스파킹을 차단한다. 활성 성분으로서 디노닐나프틸설폰산(DINNSA)을 갖는 Stadis 450이 하나의 예이다. 부식 억제제, 예를 들어, DCI-4A는 대중 및 군사 연료용으로 사용되고 DCI-6A는 군사 연료용으로 사용된다. FSII 제제는 예를 들어, Di-EGME를 포함한다.본 발명의 하나의 양태에서, 제트 연료는 기존의 제트 연료와 조류 연료를 블렌딩함에 의해 제조된다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 지질은 공급원료서 작용하여 제트 연료를 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서, 제트 연료를 제조하는 방법이 제공된다. 이와 함께 본 발명의 방법에 의해 생성된 지질로부터 제트 연료를 제조하는 2가지 방법으로서 유동 촉매 크랙킹(FCC); 및 수소탈산소화(HDO)가 제공된다.유동 촉매 크랙킹(FCC)은 중질 분획물 기원의 올레핀, 특히 프로필렌을 제조하기 위해 사용되는 하나의 방법이다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 지질은 올레핀으로 전환시킬 수 있다. 상기 방법은 FCC 영역을 통해 생성된 지질을 유동시키고 제트 연료로서 유용한 올레핀으로 구성된 생성물 스트림을 수거함을 포함한다. 생성된 지질은 크랙킹 조건에서 크랙킹 촉매와 접촉시켜 제트 연료로서 유용한 올레핀 및 탄화수소를 포함하는 생성물 스트림을 제공한다. 하나의 양태에서, 제트 연료를 제조하는 방법은 (a) 본원에 기재된 방법을 사용하여 지질 함유 미생물을 배양하고, (b) 지질 함유 미생물을 용해시켜 용해물을 생성하고, (c) 용해물로부터 지질을 분리하고 (d) 지질 조성물을 처리하므로써 제트 연료를 생성함을 포함한다. 제트 연료를 제조하는 방법의 하나의 양태에서, 상기 지질 조성물은 유체 촉매 크랙킹 영역을 통류할 수 있고 이는 하나의 양태에서 지질 조성물을 크랙킹 조건에서 크랙킹 촉매와 접촉시켜 C2-C5 올레핀을 포함하는 생성물을 제공함을 포함할 수 있다.상기 방법의 특정 양태에서, 지질 조성물에 존재할 수 있는 임의의 오염물을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 유체 촉매 크랙킹 영역을 통해 지질 조성물을 유동시키기 전에, 지질 조성물을 전처리한다. 전처리는 지질 조성물을 이온 교환 수지와 접촉시킴을 포함할 수 있다. 이온 교환 수지는 산성 이온 교환 수지, 예를 들어 Amberlyst™-15이고 지질 조성물이 통류(상향 통류 또는 하향 통류)하는 반응기내 상으로서 사용될 수 있다. 다른 전처리는 액체 조성물을 산, 예를 들어, 황산, 아세트산, 질산 또는 염산과 접촉시킴에 의한 약산 세척을 포함할 수 있다. 접촉은 일반적으로 주위 온도 및 대기압에서 희석 산 용액과 수행된다. 임의로 전처리된 지질 조성물은 탄화수소 성분이 올레핀으로 크랙킹되는 FCC 영역으로 유동한다. 촉매 크랙킹은 반응 영역중의 지질 조성물을 미분된 미립자 물질로 구성된 촉매와 접촉시킴에 의해 성취한다. 상기 반응은 수소크랙킹과는 반대로 촉매 크랙킹이고 부가되는 수소의 부재 또는 수소의 소비에서 수행한다. 크랙킹 반응이 진행하므로써 상당한 양의 코크가 촉매상에 침적된다. 상기 촉매는 재생 영역에서 촉매 기원의 코크를 연소시킴에 의해 고온에서 재생된다. 본원에서, "코크 촉매"로서 언급되는 코크 함유 촉매는 반응 영역으로부터 재생될 재생 영역으로 연속으로 수송되고 재생 영역 기원의 필수적 코크 부재의 재생된 촉매에 의해 대체된다. 다양한 가스 스트림에 의한 촉매 입자의 유동화는 반응 영역과 재생 영역간에 촉매의 수송을 허용한다. 촉매의 유동화 스트림에서 본원에 기재된 지질 조성물의 탄화수소와 같은 탄화수소를 크랙킹하고, 반응 영역 및 재생 영역간에 촉매를 수송하고 재생기내 코크를 연소시키는 방법은 FCC 방법 기술 분야의 당업자에게 널리 공지되어 있다. C2-C5 올레핀을 제조하기 위해 지질 조성물을 크랙킹하는데 유용한 예시적인 FCC 적용 및 촉매는 이의 전문이 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 제6,538,169호 및 제7,288,685호에 기재되어 있다.적합한 FCC 촉매는 일반적으로 동일한 매트릭스에 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 2개 이상의 성분을 포함한다. 몇몇 양태에서, 2개의 성분 둘다는 전체 반응 용기를 거쳐 순환할 수 있다. 제1 성분은 일반적으로 유동화된 촉매 크랙킹의 분야에 사용되는 임의의 널리 공지된 촉매를 포함하고, 예를 들어, 활성 무정형 점토형 촉매 및/또는 고활성의 결정 분자체가 있다. 분자체 촉매는 목적하는 생성물에 대한 이의 매우 개선된 선택성때문에 무정형 촉매 보다 바람직할 수 있다. 몇몇 바람직한 양태에서, 제올라이트는 FCC 공정에서 분자체로서 사용할 수 있다. 바람직하게, 제1 촉매 성분은 실리카 또는 알루미나 및 카올린과 같은 불활성 충전제를 포함하는, 대형 공극 제올라이트, 예를 들어, Y형 제올라이트, 활성 알루미나 물질, 결합제 물질을 포함한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 지질 조성물의 크랙킹은 FCC 영역의 상위 섹션 또는 리프트 섹션에서 발생한다. 상기 지질 조성물은 노즐에 의해 상부로 도입되어 지질 조성물의 신속한 증발을 유도한다. 촉매와 접촉시키기 전에, 상기 지질 조성물은 통상적으로 약 149℃ 내지 약 316℃(300°F 내지 600°F)의 온도를 갖는다. 상기 촉매는 블렌딩 용기로부터 상부로 유동하여 여기서 이것은 약 2초이하의 시간 동안 지질 조성물과 접촉한다.블렌딩된 촉매 및 반응된 지질 조성물 증기는 이어서 출구를 통해 상부로부터 배출되고 올레핀, 및 상당한 양의 코크로 덮여지고 일반적으로 "코크된 촉매"로 언급되는 촉매 입자의 수거물을 포함하는 크랙킹된 생성물 증기로 분리된다. 목적하는 생성물이 바람직하지 못한 다른 생성물로 추가로 전환되는 것을 촉진시킬 수 있는, 지질 조성물과 촉매의 접촉시간을 최소화하기 위한 일환으로 스월 암 배열 장치(swirl arm arrangement)와 같은 임의의 배열된 분리기를 사용하여 생성물 스트림으로부터 신속하게 코크된 촉매를 제거할 수 있다. 분리기, 예를 들어, 스월 암 분리기는 챔버의 하한부에 위치한 스트립핑 영역(stripping zone)과 함께 챔버의 챔버의 상한부에 위치한다. 스월 암 배열 장치에 의해 분리된 촉매는 스트립핑 영역으로 적가된다. 가벼운 올레핀 및 몇몇 촉매를 포함하는 크랙킹된 탄화수소를 포함하는 크랙킹된 생성물 증기는 사이클론과 소통하는 도관을 통해 챔버로부터 배출된다. 상기 사이클론은 생성물 증기로부터 잔류 촉매 입자를 제거하여 입자 농도를 매우 낮은 수준으로 감소시킨다. 이어서 상기 생성물 증기는 분리 용기의 상부를 상부로부터 배출된다. 사이클론에 의해 분리된 촉매는 분리 용기에 이어서 스트립팅 영역으로 복귀한다. 스트립핑 영역은 증기와의 역류 접촉에 의해 촉매 표면으로터 흡착된 탄화수소를 제거한다.낮은 탄화수소 분압은 가벼운 올레핀이 우선적으로 생성되도록 작용한다. 따라서, 상부압은 약 172 내지 241 kPa (25 내지 35 psia)로 설정되고 탄화수소 분압은 약 35 내지 172 kPa (5 내지 25 psia)이고 바람직한 탄화수소 분압은 약 69 내지 138 kPa (10 내지 20 psia)이다. 탄화수소에 대한 상대적 낮은 분압은 희석제가 지질 조성물의 10 내지 55중량% 및 바람직하게는 지질 조성물의 약 15중량% 정도인 희석제로서 증기를 사용함에 의해 성취된다. 다른 희석제, 예를 들어, 무수 가스를 사용하여 등가의 탄화수소 분압에 도달할 수 있도록 할 수 있다.상부 출구에서 크랙킹된 증기의 온도는 약 510℃ 내지 621℃ (950°F 내지 1150°F)이다. 그러나, 566℃(1050°F) 초과의 상부 출구 온도는 보다 무수의 가스 및 보다 많은 올레핀을 생성시킨다. 반면에, 566℃(1050°F) 미만의 상부 출구 온도는 에틸렌 및 프로필렌을 적게 생성시킨다. 따라서, 약 566℃ 내지 약 63O℃의 바람직한 온도, 약 138 kPa 내지 약 240 kPa (20 내지 35 psia)의 바람직한 압력에서 FCC 공정을 수행하는 것이 바람직하다. 상기 공정의 또 다른 조건은 약 5 내지 약 20 및 바람직하게는 약 10 내지 약 15로 다양할 수 있는 지질 조성물에 대한 촉매 비율이다.제트 연료를 생성하는 방법의 하나의 양태에서, 상기 지절 조성물은 FCC 반응기의 리프트 섹션으로 도입된다. 리프트 섹션에서 온도는 매우 고온이고 약 700℃(1292°F) 내지 약 760℃ (1400°F)의 범위이고 지질 조성물에 대한 촉매의 비율은 약 100 내지 약 150이다. 이것은 지질 조성물의 리프트 섹션으로의 도입이 상당양의 프로필렌 및 에틸렌을 생성시킬 것으로 예상된다.본원에 기재된 바와같이 생성된 지질 조성물 또는 지질을 사용하여 제트 연료를 생성시키는 방법의 또 다른 양태에서, 지질 조성물 또는 지질의 구조는 수소탈산소화(HDO)로서 언급되는 공정에 의해 파괴된다. HDO는 수소에 의한 산소의 제거를 의미하는데, 즉 산소는 물질의 구조를 파괴시키면서 제거된다. 올레핀 이중 결합을 수소화시키고 임의의 황 및 질소 화합물을 제거한다. 황 제거는 소위 수소탈황화(HDS)로 불리운다. 원료(지질 조성물 또는 지질)의 전처리 및 순도는 촉매의 작용 수명에 기여한다.일반적으로, HDO/HDS 단계에서, 수소는 공급 스톡(지질 조성물 또는 지질)과 혼합하고 이어서 상기 혼합물을 단일상 또는 2개상 공급 스톡으로서 동시 유류물로서 촉매 상에 통과시킨다. HDO/HDS 단계 후, 생성물 분획을 분리하고 별도의 이성체화 반응기에 통과시킨다. 생물학적 출발 물질용 이성체화 반응기는 동시 유류 반응기로서 문헌(FI 100 248)에 기재되어 있다.탄화수소 공급물, 예를 들어, 본원에서의 지질 조성물 또는 지질을 수소화시킴에 의한 연료의 제조 방법은 또한 지질 조성물 또는 지질을 동시 유류물로서 제1 수소화 영역을 통해 수소 가스와 함께 통과시킴에 의해 수행될 수 있고 이후 탄화수소 유출물은, 수소 가스를 탄화수소 유출물과는 반대로 역류 유동물로서 제2 수소화 영역에 통과시킴에 의해 제2 수소화 영역에서 추가로 수소화시킨다. 지질 조성물을 크랙킹하여 C2-C5 올레핀을 제조하는데 유용한 예시적인 HDO 적용 및 용매는 전문이 본원에 참조로서 인용되는 미국 특허 제7,232,935호에 기재되어 있다.전형적으로, 수소탈산소화 단계에서, 본원에서의 지질 조성물 또는 지질과 같은 생물학적 성분의 구조는 산소, 질소, 인 및 황 화합물로 분해되고 가스로서의 가벼운 탄화수소가 제거되며 올레핀 결합은 수소화된다. 상기 방법의 제2 단계에서, 즉 소위 이성체화와 단계에서, 이성체화는 낮은 온도에서 탄화수소 쇄를 측쇄화하고 파라핀의 수행능을 개선시킴에 의해 수행된다.제1 단계, 즉 크랙킹 공정의 HDO 단계에서 수소 가스, 및 수소화되어야만 하는 본원의 지질 조성물 또는 지질은 HDO 촉매 상 시스템에 동시 유류물로서 또는 역류물로서 통과시키고 상기 촉매 상 시스템은 하나 이상의 촉매 상, 바람직하게 1 내지 3개의 촉매 상을 포함한다. HDO 단계는 전형적으로 동시 유류 방식으로 작동한다. 2개 이상의 촉매 상을 포함하는 HDO 촉매 상 시스템의 경우에, 상기 상중 하나 이상은 역류물 원칙을 사용하여 작동할 수 있다. HDO 단계에서, 압력은 20 내지 150바(bar), 바람직하게는 50 내지 100바로 다양하고 온도는 200 내지 500℃, 바람직하게는 300 내지 400℃로 다양하다. HDO 단계에서, 원소주기율표의 VII 족 및/또는 VIB족 금속을 함유하는 공지된 수소화 촉매가 사용될 수 있다. 바람직하게, 수소화 촉매는 지지된 Pd, Pt, Ni, NiMo 또는 CoMo 촉매이고, 상기 지지체는 알루미나 및/또는 실리카이다. 전형적으로, NiMo/Al2O3 및 CoMo/Al2O3 촉매가 사용된다.HDO 단계 전에, 본원에서 지질 조성물 또는 지질은 임의로 보다 온화한 조건하에서 예비수소화로 처리하여 이중 결합의 부반응을 회피할 수 있다. 상기 예비수소화는 50 내지 400℃의 온도 및 1 내지 200바의 수소 압력, 바람직하게는 150 내지 250℃의 온도 및 10 내지 100바의 수소 압력에서 수행한다. 상기 촉매는 원소주기율표의 VIII족 및/또는 VIB족 기원의 금속을 함유할 수 있다. 바람직하게, 예비소화 촉매는 지지된 Pd, Pt, Ni, NiMo 또는 CoMo 촉매이고 상기 지지체는 알루미나 및/또는 실리카이다.수소를 함유하는 HDO 단계 기원의 가스 기류를 냉각시킴에 이어서 일산화탄소, 이산화탄소, 질소, 인 및 황 화합물, 가벼운 가스 탄화수소 및 다른 불순물을 이로부터 제거한다. 압착시킨 후 정제된 수소 또는 재활용된 수소를 제1 촉매 상으로 및/또는 촉매 상 사이로 복귀시켜 인출된 기류를 구성하도록 한다. 물은 응축 액체로부터 제거한다. 상기 액체는 제1 촉매 상 또는 촉매 상 사이로 통과시킨다.HDO 단계 후, 생성물은 이성체화 단계에 적용한다. 이것은 탄화수소를 이성체화 촉매와 접촉시키기전에 불순물을 가능한한 완전히 제거하는 공정을 위해 필요하다. 상기 이성체화 단계는 임의의 교반 단계를 포함하고, 이때, HDO 단계 기원의 반응 생성물은 수증기 또는 가벼운 탄화수소, 질소 또는 수소와 같은 적합한 가스 증기를 스트립핑시킴에 의해 정제될 수 있다. 임의의 스트립핑 단계는 이성체화 촉매의 상부 유니트에서 역류 방식(여기서, 여기서, 가스 및 액체는 서로 접촉한다)으로 수행하거나 역류 원칙을 사용하는 별도의 스트립핑 유니트 역류 원리에서 실제 이성체화 반응기 전에 수행한다.스트립핑 단계 후, 수소 가스 및 본원에서의 수소화된 지질 조성물 또는 지질 및 n-파라핀 혼합물을 하나 이상의 촉매 상(들)을 포함하는 반응성 이성체화 유니트에 통과시킨다. 이성체화 단계의 촉매 상은 동시 유류 또는 역류 방식으로 작동할 수 있다.역류 원리가 이성체화 단계에 적용되는 것이 상기 공정을 위해 중요하다. 이성화체 단계에서, 이것은 임의의 스트립핑 단계 또는 이성체화 반응 단계중 하나 또는 둘다를 역류 방식으로 진행함에 의해 수행한다. 이성체화 단계에서, 압력은 20 내지 150바, 바람직하게는 20 내지 100 바로 다양하고, 온도는 200 내지 500℃, 바람직하게는 300 내지 400℃이다. 이성체화 단계에서, 당업계에 공지된 이성체화 촉매가 사용될 수 있다. 적합한 이성체화 촉매는 분자체 및/또는 VII족 금속 및/또는 담체를 함유한다. 바람직하게, 이성체화 촉매는 SAPO-11 또는 SAPO41 또는 ZSM-22 또는 ZSM-23 또는 페리어라이트(ferrierite) 및 Pt, Pd 또는 Ni 및 Al2O3 또는 SiO2를 함유한다. 전형적인 이성체화 촉매는 예를 들어, Pt/S APO-11/Al2O3, Pt/ZSM-22/Al2O3, Pt/ZSM-23/Al2O3 및 Pt/SAPO-11/SiO2이다. 이성체화 단계 및 HDO 단계는 동일한 압력 용기 또는 별도의 압력 용기에서 수행할 수 있다. 임의의 예비수소화는 별도의 압력 용기 또는 HDO 및 이성체화 단계와 동일한 압력 용기에서 수행할 수 있다.따라서, 하나의 양태에서, 하나 이상의 화학적 반응 생성물은 ASTM D1655 제트 연료를 포함하는 알칸 혼합물이다. 몇몇 양태에서, ASTM 1655 제트 연료의 세부 항목을 준수하는 조성물은 10 ppm 미만의 황 함량을 갖는다. 다른 양태에서, ASTM 1655 제트 연료의 세부항목을 준수하는 조성물은 205℃ 미만의 증기 곡선의 T10값을 갖는다. 또 다른 양태에서, ASTM 1655 제트 연료의 세부항목을 준수하는 조성물은 300℃ 미만의 최종 비점(FBP)을 갖는다. 또 다른 양태에서, ASTM 1655 제트 연료의 세부항목을 준수하는 조성물은 38℃ 이상의 인화점을 갖는다. 또 다른 양태에서, ASTM 1655 제트 염료의 세부항목을 준수하는 조성물은 775K/M3 내지 840K/M3의 밀도를 갖는다. 또 다른 양태에서, ASTM 1655 제트 연료의 세부항목을 준수하는 조성물은 -47℃ 미만의 동결점을 갖는다. 또 다른 양태에서, ASTM 제트 연료의 세부항목을 준수하는 조성물은 42.8 MJ/K 이상의 총 연소열(Heat of Combustion)을 갖는다. 또 다른 양태에서, ASTM 1655 제트 연료의 세부항목을 준수하는 조성물은 13.4 질량% 이상의 수소 함량을 갖는다. 또 다른 양태에서, ASTM 1655 제트 연료의 세부항목을 준수하는 조성물은 Hg의 3mm 미만인, 260℃에서의 정량적 정량적 중량 JFTOT에 의한 시험시 열 안정성을 갖는다. 또 다른 양태에서, ASTM 1655 제트 연료의 세부항목을 준수하는 조성물은 7mg/dl 미만인 실제 검을 갖는다.따라서, 본 발명은 미세조류 지질의 화학적 변형으로 다양한 산업적 및 다른 적용 분야에 유용한 생성물을 수득하는 다양한 방법을 기재하고 있다. 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 오일을 변형시키는 방법의 예는 오일 가수분해, 오일의 수소화처리 및 오일의 에스테르화를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 미세조류 오일의 변형은 기본 함유화학물질을 생성하고 이는 추가로 목적하는 기능을 위해 선택된 유도체 함유화학물질로 변형시킬 수 있다. 연료 생성 공정과 관련하여 상기된 것과 유사한 방식으로, 이들 화학적 변형은 또한 본원에 기재된 미생물 배양으로부터 생성된 오일상에서 수행할 수 있다. 기본 함유화학물질의 예는 비누, 지방산, 지방산 메틸 에스테르 및 글리세롤을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 유도체 함유화학물질의 예는 지방 니트릴, 에스테르, 이량체 산, 쿠아트(quat), 계면활성제, 지방 알칸올아미드, 지방 알콜 설페이트, 수지, 유화제, 지방 알콜, 올레핀 및 고급 알칸을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.본 발명의 방법에 의해 생성된 글리세로지질 기원의 지방산 성분의 가수분해는 다른 유용한 화학물질을 생성하도록 유도체화될 수 있는 유리된 지방산을 생성시킨다. 가수분해는 산 또는 염기일 수 있는 물 및 촉매의 존재하에 수행한다. 유리된 지방산을 유도체화하여 하기에 보고된 바와 같은 다양한 생성물을 수득할 수 있다: 미국 특허 제5,304,664호(고도로 황화된 지방산); 제7,262,158호(세정 조성물); 제7,115,173호(직물 연화 조성물); 제6,342,208호(피부 처리용 에멀젼); 제7,264,886호(방수 조성물); 제6,924,333호 (페인트 첨가제); 제6,596,768호 (지질 풍부 반추동물 공급원료); 및 제6,380,410호(세제 및 세정제용 계면활성제).본 발명의 하나의 양태에서 가수분해와 관련하여 트리글리세라이드 오일은 임의로 먼저 물 또는 수산화나트륨과 같은 액체 매질중에서 가수분해하여 글리세롤 및 비누를 수득한다. 다양한 적합한 트리글리세라이드 가수분해 방법이 있고 여기에는 비누화, 산 가수분해, 알칼린 가수분해, 효소 가수분해(본원에서 스프릿팅으로서 언급됨), 및 고온 압착수를 사용한 가수분해가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 당업자는 트리글리세라이드 오일이 함유화학물질을 생성하기 위해 가수분해될 필요가 없고 차라리 상기 오일이 다른 공지된 방법에 의해 목적하는 함유화학물질로 직접 전환될 수 있다. 예를 들어, 트리글리세라이드 오일은 에스테르화를 통해 메틸 에스테르 지방산으로 직접 전환될 수 있다.몇몇 양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 오일의 촉매 가수분해는 오일을 글리세롤 및 지방산으로 분리시킴에 의해 발생한다. 상기 논의된 바와 같이, 지방산은 이어서 여러 다른 변형을 통해 수득된 유도체 함유화학물질로 추가로 가공될 수 있다. 예를 들어, 하나의 양태에서, 지방산은 아민화 반응하도록 진행시켜 지방 질소 화합물을 생성할 수 있다. 또 다른 양태에서, 지방산은 일염기성 및 이염기성 산을 생성하도록 오존용해에 적용될 수 있다.다른 양태에서, 가수분해는 오일 분리를 통해 발생하여 함유화학물질을 생성할 수 있다. 본 발명의 몇몇 바람직한 양태에서, 트리글리세라이드 오일은 다른 공정을 수행하기전에 분리될 수 있다. 당업자는 많은 적합한 트리글리세라이드 분리 방법이 존재함을 인지할 수 있고 상기 방법은 효소 분리 및 압력 분리를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.일반적으로, 효소적 오일 분리 방법은 물/오일 혼합물에 대해 작용하는 생촉매로서 효소인 리판제를 사용한다. 효소적 분리는 이어서 오일 또는 지방을 글리세롤 및 유리된 지방산으로 분리한다. 상기 글리세롤은 물상으로 이동하는 반면 상기 유기상에는 유리된 지방산이 풍부해진다.효소 분리 반응은 일반적으로 유기 및 수성 상간의 경계상에서 일어나고 여기서 효소는 단지 경계상에 존재한다. 이어서 경계상과 만나는 트리글리세라이드는 분리 반응에 기여하거나 이에 관여한다. 반응이 진행됨에 따라, 유리된 지방산과는 대조적으로 여전히 글리세라이드로 화학적으로 결합되어 있는 지방산의 작업 밀도 또는 농도는 경계상에서 감소하여 반응은 느려진다. 특정 양태에서, 효소 분리는 실온에서 일어날 수 있다. 당업자는 오일을 목적하는 지방산으로 분리시키는데 적합한 조건에 정통하고 있다. 예를 들어, 반응 속도는 상호 경계 표면을 증가시킴에 의해 가속화될 수 있다. 일단 반응이 완료되면, 유리된 지방산을 이어서 효소로부터 유리된 유기상으로부터 분리하고 글리세라이드로 여전히 화학적으로 결합되어 있는 지방산을 함유하는 잔사는 역 공급되거나 재활용되고 새로운 오일 또는 지방과 혼합되어 분리방법에 적용시킨다. 이어서 상기 방식으로 재활용된 글리세라이드는 추가의 효소적 분리 방법에 적용된다. 몇몇 양태에서, 유리된 지방산은 상기 방식으로 부분적으로 분리된 오일 또는 지방으로부터 추출된다. 상기 방식으로, 화학적으로 결합된 지방산(트리글리세라이드)이 분리 공정으로 복귀하거나 역 공급되는 경우 효소 소비는 급격히 감소할 수 있다.분리 정도는 측정된 산 값을, 소정의 오일 또는 지방에 대해 계산될 수 있는 이론적으로 가능한 산 값으로 나눈 비율로서 결정한다. 바람직하게, 산 값은 표준 일반 방법에 따른 적정을 사용하여 측정한다. 또한, 수성 글리세롤 상의 밀도는 분리 정도에 대한 척도로서 취할 수 있다.하나의 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 분리 방법은 또한 생성된 오일의 알칼리 정련 공정 기원의 소위 비누-스톡에 함유된 모노-, 디- 및 트리글리세라이드에 적합하다. 상기 방식으로, 비누 스톡은 사전 비누화 없이 천연 오일의 지방산으로 정량적으로 전환될 수 있다. 상기 목적을 위해, 비누에 화학적으로 결합된 지방산을 바람직하게는 분리 전에 산의 부가를 통해 방출시킨다. 특정 양태에서, 완충액은 분리 공정을 위한 물 및 효소에 추가로 사용된다.하나의 양태에서, 본 발명의 방법에 따라 생성된 오일은 또한 가수분해 방법으로서 비누화에 적용될 수 있다. 동물성 및 식물성 오일은 트리하이드릭 알콜인 글리세롤과 지방산의 에스테르인 트리아실글리세롤(TAG)로 이루어진다. 알칼린 가수분해 반응에서, TAG내 글리세롤이 제거되어 3개의 카복실산 음이온이 생성되고 이는 나트륨 또는 칼륨과 같은 알칼리 금속 양이온과 연합하여 지방산 염을 생성할 수 있다. 상기 기획에서, 카복실산 성분들은 글리세롤 잔기로부터 절단되고 하이드록실 그룹으로 대체된다. 상기 반응에 사용되는 염기(예를 들어, KOH)의 양은 목적하는 비누화 정도에 의해 측정된다. 예를 들어, 상기 목적이 본래 TAG 조성물중에 존재하는 오일의 일부를 포함하는 생성물을 제조하기 위한 것인 경우, 모든 TAG를 지방산 염으로 전환시키기에 불충한 양의 염기가 반응 혼합물로 도입된다. 통상적으로, 상기 반응은 수용액중에 수행하여 서서히 진행시키지만 가열에 의해 촉진될 수 있다. 지방산 염의 침전은 수용성 알칼리 금속 할라이드(예를 들어, NaCl 또는 KCl)와 같은 염을 반응 혼합물에 부가하여 촉진될 수 있다. 바람직하게, 상기 염기는 알칼리 금속 수산화물(예를 들어, NaOH 또는 KOH)이다. 또는 예를 들어, 트리에탄올아민 및 아미노메틸프로판올을 포함하는 알칸올아민과 같은 다른 염기를 상기 반응 기획에 사용할 수 있다. 몇몇 경우에, 이들 대안이 투명한 비누 생성물을 제조하는데 바람직할 수 있다.몇몇 방법에서, 화학적 변형의 제1 단계는 수소 및 촉매의 존재하에 승온에서 이중 결합을 포화시키기 위한 수소화처리에 이어서 탈산소화하는 것이다. 다른 방법에서, 수소화 및 탈산소화는 동일한 반응중에서 일어날 수 있다. 여전히 다른 방법에서, 탈산소화는 수소화전에 발생한다. 이어서 이성체화는 또한 수소 및 촉매의 존재하에서 임의로 수행할 수 있다. 최종적으로, 가스 및 나프타 성분은 경우에 따라 제거할 수 있다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 5,475,160호(트리글리세라이드의 수소화); 제5,091,116호(탈산소화, 수소화 및 가스 제거); 제6,391,815호(수소화); 및 제5,888,947호(이성체화)]을 참조한다. 본 발명의 몇몇 양태에서, 트리글리세라이드 오일은 부분적으로 또는 완전히 탈산소화된다. 탈산소화 반응은 지방산, 지방 알콜, 폴리올, 케톤 및 알데하이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는 목적하는 생성물을 생성시킨다. 일반적으로, 임의의 특정 이온에 구애되지 않고 탈산소화 반응은, 지방산 또는 지방산 에스테르로부터 산소를 적어도 부분적으로 제거하여 추가의 공정에 의해 목적하는 화학물질로 용이하게 전환될 수 있는 지방 알콜과 같은 반응 생성물을 생성시키는 반응으로서, 제한 없이 수소용해, 수소생성, 연속 수소화-수소용해, 연속 수소용해-수소화 및 조합된 수소화-수소용해 반응을 포함하는 다양하고 상이한 반응 경로의 조합을 포함한다. 예를 들어, 하나의 양태에서, 지방 알콜은 FCC 반응을 통해 올레핀으로 또는 응축 반응을 통해 고급 알칸으로 전환될 수 있다.하나의 상기 화학적 변형은 글리세로지질 또는 유리 지방산의 지방산 성분에서 이중 결합으로 수소를 첨가하는 수소화이다. 수소화 반응으로 액체 오일은 특정 응용을 위해 보다 적합할 수 있는 반고체 또는 고체 지질로 전환될 수 있다.본원에 기재된 방법에 의해 생성된 오일의 수소화는 하기에 보고된 바와 같이 본원에 제공된 방법 및/또는 재료중 하나 이상과 연계하여 수행할 수 있다: 미국 특허 제7,288,278호 (식품 첨가제 또는 의약); 제5,346,724호(윤활 생성물); 제5,475,160호(지방 알콜); 제5,091,116호(식용 오일); 제6,808,737호(마가린 및 스프레드용 구조적 지방); 제5,298,637호(감소된 칼로리 지방 대용물); 제6,391,815호(수소화 촉매 및 황 흡착제); 제5,233,099호 및 제5,233,100호(지방 알콜); 제4,584,139호(수소화 촉매); 제6,057,375호(소포제); 및 제7,118,773호(식용 에멀젼 스프레드).당업자는 탄수화물을 수소화시키기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 하나의 적합한 방법은 수소화 반응기에서 수소화된 생성물을 형성하기 위해 충분한 조건하에서 적합한 가스 및 촉매와 혼합된 수소, 또는 수소와 탄수화물을 접촉시킴을 포함한다. 수소화 촉매는 일반적으로 단독으로, 또는 W, Mo, Au, Ag, Cr, Zn, Mn, Sn, B, P, Bi, 및 합금 또는 이의 조합체와 같은 촉진제와 함께 Cu, Re, Ni, Fe, Co, Ru, Pd, Rh, Pt, Os, Ir, 및 합금 또는 이의 조합체를 포함할 수 있다. 다른 효과적인 수소화 촉매 물질은 지지된 니켈 또는 레늄으로 변형된 루테늄을 포함한다. 하나의 양태에서, 수소화 촉매는 또한 촉매의 목적하는 기능성에 따라, 지지체중 임의의 하나를 포함한다. 수소화 촉매는 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다.몇몇 양태에서, 수소화 촉매는 지지된 VIII족 금속 촉매 및 금속 스폰지 물질(예를 들어, 스폰지 니켈 촉매)을 포함한다. 라니 니켈은 본 발명에 사용하기에 적합한 활성화된 스폰지 니켈 촉매의 예를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명의 수소화 반응은 니켈-레늄 촉매 또는 텅스텐-변형된 니켈 촉매를 포함하는 촉매를 사용하여 수행한다. 본 발명의 수소화 반응을 위해 적합한 촉매의 예는 탄소 지지된 니켈-레늄 촉매이다.하나의 양태에서, 적합한 라니 니켈 촉매는 예를 들어, 약 25중량%의 수산화나트륨을 함유하는 알칼리 수용액으로 대략 균등 중량의 니켈 및 알루미늄의 합금을 처리함에 의해 제조할 수 있다. 상기 알루미늄은 선택적으로 알칼리 수용액에 의해 용해되어 알루미늄이 최소량인 대부분 니켈을 포함하는 스폰지형 물질을 수득한다. 초기 합금은 약 1 내지 2중량%가 형성된 스폰지 니켈 촉매중에 잔류하도록 하는 양으로 촉진제 금속(즉, 몰리브덴 또는 크로뮴)을 포함한다. 또 다른 양태에서, 수소화 촉매는 물중에서 루테늄(III) 니트로실니트레이트, 루테늄(III) 클로라이드의 용액을 사용하여 적합한 지지체 물질을 침지시키기 위해 제조한다. 이어서 상기 용액을 건조시켜 수분 함량이 약 1중량% 미만인 고체를 형성한다. 상기 고체는 이어서 4시간 동안 회전볼 로내 300℃(하소되지 않음) 또는 400℃(하소됨)에서 수소 스트림중에 대기압으로 감소시킬 수 있다. 촉매를 냉각시키고 질소로 촉매가 불활성이도록 한 후, 질소중에 5용적%의 산소를 2시간 동안 촉매상에 통과시킨다. 특정 양태에서, 본원에 기재된 촉매는 촉매 지지체를 포함한다. 상기 촉매 지지체는 촉매을 안정화시키고 지지한다. 사용되는 촉매 지지체의 유형은 선택된 촉매 및 반응 조건에 따라 다양하다. 본 발명에 적합한 지지체는 탄소, 실리카, 실리카-알루미나, 지르코니아, 티타니아, 세리아, 바나디아, 질화물, 질화붕소, 헤테로폴리산, 하이드록시애퍼타이트, 산화아연, 크로미아, 제올라이트, 탄소 나노튜브, 탄소 플러렌 및 이들의 임의의 조합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 사용되는 촉매는 당업자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 적합한 방법은 초기 습윤화, 증발 침지, 화학적 증착, 세척-피복, 마그네트론 스퍼터링 기술 등을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.수소화 반응을 수행하기 위한 이의 조건은 출발 물질 및 목적하는 생성물의 유형에 따라 다양하다. 본원의 이득과 함께 당업자는 적당한 반응 조건을 인지할 것이다. 일반적으로, 수소화 반응은 80℃ 내지 250℃ 및 바람직하게는 90℃ 내지 200℃, 및 가장 바람직하게는 100℃ 내지 150℃의 온도에서 수행한다. 몇몇 양태에서, 수소화 반응은 500 KPa 내지 14000 KPa에서 수행한다. 본 발명의 수소용해 반응에 사용되는 수소는 외부 소수, 재활용된 수소, 동일계 생성 수소 및 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "외부 수소"는 바이오매쓰 반응 자체 기원이 아니고 또 다른 공급원으로부터 시스템에 첨가되는 수소를 언급한다.본 발명의 몇몇 양태에서, 출발 탄수화물을, 목적하는 고급 탄화수소로 보다 용이하게 전환될 수 있는 소분자로 전환시키는 것이 바람직할 수 있다. 상기 전환을 위해 적합한 하나의 방법은 수소용해 반응을 통한 것이다. 다양한 방법이 탄수화물의 수소용해를 수행하기 위해 공지되어 있다. 하나의 적합한 방법은 소분자 또는 폴리올을 포함하는 반응 생성물을 형성하기에 충분한 조건하에서 수소용해 반응기내에서 적합한 가스 및 수소용해 촉매와 혼합된 수소, 또는 수소와 탄수화물을 접촉시킴을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "소분자 또는 폴리올"은 출발 탄수화물보다 소수의 탄소원자 또는 산소 원자를 포함할 수 있는, 소분자량을 갖는 임의의 분자를 포함한다. 하나의 양태에서, 반응 생성물은 폴리올 및 알콜을 포함하는 보다 작은 분자를 포함한다. 당업자는 수소용해 반응을 수행하기 위한 적당한 방법을 선택할 수 있다몇몇 양태에서, 5 및/또는 6개 탄소 당 또는 당 알콜은 수소용해 촉매를 사용하여 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 및 글리세롤로 전환시킬 수 있다. 수소용해 촉매는 단독으로 또는 Au, Ag, Cr, Zn, Mn, Sn, Bi, B, O, 및 이의 합금 또는 이의 조합체와 같은 촉진제와 함께 Cr, Mo, W, Re, Mn, Cu, Cd, Fe, Co, Ni, Pt, Pd, Rh, Ru, Ir, Os, 및 이의 합금 또는 조합체를 포함할 수 있다. 수소용해 촉매는 또한 전이 금속(예를 들어, 크로뮴, 몰리브덴, 텅스텐, 레늄, 망간, 구리, 카드뮴) 또는 VIII족 금속(예를 들어, 철, 코발트, 니켈, 백금, 팔라듐, 로듐, 루테늄, 이리듐 및 오스뮴)을 함유하는 탄소성 피로중합체를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 수소용해 촉매는 알칼린 토금속 산화물과 배합되거나 촉매적 활성 지지체에 부착된 임의의 상기 금속을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 수소용해 반응에 기재된 촉매는 수소화 반응을 위해 상기된 바와 같은 촉매 지지체를 포함할 수 있다. 수소용해 반응을 수행하기 위한 조건은 출발 물질 및 목적하는 생성물의 유형에 따라 다양하다. 당업자는 본원의 이득과 함께 반응을 수행하기 위해 사용하는 적당한 조건을 인지할 것이다. 일반적으로, 이들 수소용해 반응은 110℃ 내지 300℃ 및 바람직하게는 170℃ 내지 220℃, 및 가장 바람직하게는 200℃ 내지 225℃의 온도에서 수행한다. 몇몇 양태에서, 수소용해 반응은 염기성 조건, 바람직하게는 pH 8 내지 13, 및 보다 더 바람직하게는 pH 10 내지 12에서 수행한다. 몇몇 양태에서, 수소용해 반응은 60 KPa 내지 16500 KPa, 및 바람직하게는 1700 KPa 내지 14000 KPa의 범위, 및 보다 바람직하게는 4800 KPa 내지 11000 KPa의 압력에서 수행한다.본 발명의 수소용해 반응에 사용되는 수소는 외부 수소, 재활용된 수소, 동일계 생성된 수소 및 이의 임의의 조합체를 포함할 수 있다.몇몇 양태에서, 상기 논의된 반응 생성물은 응축 반응기(도 1에 응축 반응기 110으로서 도식된)에서 응축 반응을 통해 고급 탄화수소로 전환시킬 수 있다. 상기 양태에서, 반응 생성물의 응축은 고급 타화수소를 형성할 수 있는 촉매의 존재하에 수행한다. 본 이론에 의해 구애되는 것 없이 고급 탄화수소의 생산은 탄소-탄소 또는 탄소-산소 결합의 형성을 포함하는 단계적 부가 반응을 통해 진행하는 것으로 사료된다. 수득한 반응 생성물은 하기에서 보다 상세하게 기재된 상기 잔기를 함유하는 임의의 수의 화합물을 포함한다. 특정 양태에서, 적합한 응축 촉매는 산 촉매, 염기 촉매 또는 산/염기 촉매를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "산/염기 촉매"는 산 및 염기 기능 둘다를 갖는 촉매를 언급한다. 몇몇 양태에서, 상기 응축 촉매는 제한없이, 제올라이트, 카바이드, 질화물, 지르코니아, 알루미나, 실리카, 알루미노실리케이트, 포스페이트, 산화티탄, 산화아연, 산화바나듐, 산화란탄, 산화이트륨, 산화스캔듐, 산화마그네슘, 산화세륨, 산화바륨, 산화칼슘, 수산화물, 헤테로폴리산, 무기산, 산 변형된 수지, 염기 변형된 수지 및 이들의 임의의 조합체를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 응축 촉매는 또한 변형제를 포함할 수 있다. 적합한 변형제는 La, Y, Sc, P, B, Bi, Li, Na, K, Rb, Cs, Mg, Ca, Sr, Ba, 및 이들의 임의의 조합체를 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 응축 촉매는 또한 금속을 포함할 수 있다. 적합한 금속은 Cu, Ag, Au, Pt, Ni, Fe, Co, Ru, Zn, Cd, Ga, In, Rh, Pd, Ir, Re, Mn, Cr, Mo, W, Sn, Os, 합금 및 이들의 임의의 조합체를 포함한다.특정 양태에서, 응축 반응에 기재된 촉매는 수소화 반응을 위해 상기된 바와 같은 촉매 지지체를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 응축 촉매는 자가 지지형이다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "자가 지지형"은 촉매가 지지체로서 작용하기 위해 또 다른 물질을 필요로 하지 않음을 의미한다. 특정 양태에서, 상기 응축 촉매는 촉매를 현탁시키기에 적합한 별도의 지지체와 연계하여 사용된다. 하나의 양태에서, 응축 촉매 지지체는 실리카이다.응축 반응을 수행하는 조건은 출발 물질 및 목적하는 생성물의 유형에 따라 다양하다. 당업자는 본원의 이득과 함께 반응을 수행하는 적당한 조건을 인지할 것이다. 몇몇 양태에서, 응축 반응은 제안된 반응에 대한 열역학이 선호될 수 있는 온도에서 수행한다. 응축 반응을 위한 온도는 특정 출발 폴리올 또는 알콜에 따라 다양하다. 몇몇 양태에서, 응축 반응을 위한 온도는 80℃ 내지 500℃ 및 바람직하게는 125℃ 내지 450℃ 및 가장 바람직하게는 125℃ 내지 250℃의 범위이다. 몇몇 양태에서, 응축 반응은 0 Kpa 내지 9000 KPa 범위, 및 바람직하게는 0 KPa 내지 7000 KPa 범위, 및 보다 더 바람직하게는 0 KPa 내지 5000 KPa 범위의 압력에서 수행한다.본 발명에 의해 형성되는 고급 알칸은 4 내지 30개의 탄소원자를 갖는 측쇄 또는 직쇄 알칸, 4 내지 30개의 탄소원자를 갖는 측쇄 또는 직쇄 알켄, 5 내지 30개의 탄소원자를 갖는 사이클로알칸, 5 내지 30개의 탄소원자를 갖는 사이클로알켄, 아릴, 융합된 아릴, 알콜 및 케톤을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 적합한 알칸은 부탄, 펜탄, 펜텐, 2-메틸부탄, 헥산, 헥센, 2-메틸펜탄, 3-메틸펜탄, 2,2-디메틸부탄, 2,3-디메틸부탄, 헵탄, 헵텐, 옥탄, 옥텐, 2,2,4-트리메틸펜탄, 2,3-디메틸헥산, 2,3,4-트리메틸펜탄, 2,3-디메틸펜탄, 노난, 노넨, 데칸, 데센, 운데칸, 운데센, 도데칸, 도데센, 트리데칸, 트리데센, 테트라데칸, 테트라데센, 펜타데칸, 펜타데센, 노닐데칸, 노닐데센, 에이코산, 에이코센, 운데이코산, 운데이코센, 도에이코산, 도에이코센, 트리에이코산, 트리에이코센, 테트라에이코산, 테트라에이코센 및 이들의 이성체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 생성물중 일부는 연료용으로 적합할 수 있다. 몇몇 양태에서, 사이클로알칸 및 사이클로알켄은 비치환된다. 다른 양태에서, 사이클로알칸 및 사이클로알켄은 1치환된다. 여전히 또 다른 양태에서, 사이클로알칸 및 사이클로알켄은 다치환된다. 치환된 사이클로알칸 및 사이클로알켄을 포함하는 양태에서, 치환된 그룹은 제한없이, 1 내지 12개의 탄소원자를 갖는 측쇄 또는 직쇄 알킬, 1 내지 12개의 탄소원자를 갖는 측쇄 또는 직쇄 알킬렌, 페닐 및 이의 조합체를 포함한다. 적합한 사이클로알칸 및 사이클로알켄은 사이클로펜탄, 사이클로펜텐, 사이클로헥산, 사이클로헥센, 메틸-사이클로펜탄, 메틸-사이클로펜텐, 에틸-사이클로펜탄, 에틸-사이클로펜텐, 에틸-사이클로헥산, 에틸-사이클로헥센, 이들의 이성체 및 임의의 조합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.몇몇 양태에서, 형성된 아릴은 비치환된다. 또 다른 양태에서, 형성된 아릴은 1치환된다. 치환된 아릴을 포함하는 양태에서, 치환된 그룹은 제한없이 1 내지 12개의 탄소원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 알킬, 1 내지 12개의 탄소원자를 갖는 측쇄 또는 직쇄의 알킬렌, 페닐, 및 이들의 임의의 조합체를 포함한다. 본 발명을 위해 적합한 아릴은 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 에틸 벤젠, 파라실렌, 메타실렌 및 이들의 조합체를 포함한다.본 발명에서 생성된 알콜은 4 내지 30개의 탄소원자를 갖는다. 몇몇 양태에서, 알콜은 사이클릭이다. 다른 양태에서, 알콜은 측쇄이다. 또 다른 양태에서, 알콜은 직쇄이다. 본 발명의 적합한 알콜은 부탄올, 펜탄올, 헥산올, 헵탄올, 옥탄올, 노난올, 데칸올, 운데칸올, 도데칸올, 트리데칸올, 테트라데칸올, 펜타데칸올, 헥사데칸올, 헵틸데칸올, 옥틸데칸올, 노닐데칸올, 에이코산올, 우네이코산올, 도에이코산올, 트리에이코산올, 테트라에이코산올 및 이들의 이성체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.본 발명에서 생성된 케톤은 4 내지 30개의 탄소원자를 갖는다. 하나의 양태에서, 케톤은 사이클릭이다. 또 다른 양태에서, 상기 케톤은 측쇄이다. 또 다른 양태에서, 케톤은 직쇄이다. 본 발명을 위해 적합한 케톤은 부타논, 펜타논,헥사논, 헵타논, 옥타논, 노나논, 데카논, 운데카논, 도데카논, 트리데카논, 테트라데카논, 펜타데카논, 헥사데카논, 헵틸데카논, 옥틸데카논, 노닐데카논, 에이코사논, 우네이코사논, 도에이코사논, 트리에이코사논, 테트라에이코사논, 및 이들의 이성체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또 다른 상기 화학적 변형은 상호에스테르화이다. 천연적으로 생성된 글리세로지질은 지방산 성분의 균일한 분포를 갖지 않는다. 오일과 관련하여, 상호에스테르화는 상이한 글리세로지질의 2개의 에스테르간의 아실 라디칼의 교환을 언급한다. 상호에스테르화 공정은 글리세로지질의 혼합물의 지방산 성분이 재배열되어 분포 패턴을 변형시킬 수 있는 기작을 제공한다. 상호에스테르화는 널리 공지된 화학적 공정이고 일반적으로 알칼리 금속 또는 알칼리 금속 알킬레이트(예를 들어, 나트륨 메톡시드)와 같은 촉매의 존재하에 일정 시간(예를 들어, 30분)동안 오일의 혼합물을 가열(약 200℃로)함을 포함한다. 이러한 공정을 사용하여 오일 혼합물의 지방산 성분의 분포 패턴을 무작위화 할 수 있거나 목적하는 분포 패턴을 생성하도록 지시될 수 있다. 지질의 화학적 변형에 대한 상기 방법은, 지질로서 무수 세포 중량%가 적어도 20%인 미생물 바이오매쓰와 같은 본원에 제공된 물질에 대해 수행할 수 있다.지방산의 특정 분포 패턴이 요구되는 직접적인 상호에스테르화는 존재할 수 있는 몇몇 TAG의 융점 미만의 온도에서 오일을 유지시킴에 의해 수행할 수 있다. 이것은 이들 TAG를 선택적으로 결정화하고 이는 이들이 결정화하으로써 반응 혼합물로부터 이들을 효과적으로 제거한다. 상기 방법은 예를 들어, 오일중 대부분의 지방산이 침전할때까지 계속할 수 있다. 지시된 상호에스테르화 방법은 예를 들어 장쇄 지방산의 단쇄 대응물로의 치환을 통해 보다 낮은 칼로리 함량을 갖는 생성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 직접적인 상호에스테르화는 또한 원치않는 트랜스 이성체를 생성시킬 수 있는 수소화에 의지하는 것 없이 식품 부가물 또는 제품(예를들어, 마가린)에서 요구되는 목적하는 융점 특성 및 구조적 특징을 제공할 수 있는 지방 혼합물을 갖는 생성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다.본원에 기재된 방법에 의해 생성된 오일의 상호에스테르화는 하기에 보고된 바와 같이 방법 및/또는 물질중 하나 이상과 연계하여 또는 생성물을 생성하기 위해 수행할 수 있다: 미국 특허 제6,080,853호(비분해성 지방 대용물); 제4,288,378호 (피넛 버터 안정화제); 제5,391,383호(식용 스프레이 오일); 제6,022,577호(식품 생성물에 대한 식용 지방); 제5,434,278호(식품 생성물에 대한 식용 지방);제 5,268,192호(저칼로리 너트 생성물); 제5,258,197호(감소된 칼로리의 식용 조성물); 제4,335,156호(식용 지방 생성물); 제7,288,278호(식품 부가물 또는 의약); 제7,115,760호(분획 방법); 제6,808,737호(구조적 지방); 제5,888,947호(엔진 윤활제); 제5,686,131호(식용 오일 혼합물); 및 제4,603,188호(경화성 우레탄 조성물).본 발명에 따른 하나의 양태에서, 이어서 상기된 바와 같은 오일의 트랜스에스테르화는 미국 특허 제6,465,642호에 보고된 바와 같이 트랜스에스테르화된 생성물을 폴리올과 반응시켜 폴리올 지방산 폴리에스테르를 생성시킨다. 상기 에스테르화 및 포화 공정은 하기와 같은 단계를 포함할 수 있다: 저급 알킬 에스테를 비누의 존재하에 폴리올과 반응시키는 단계; 생성물 혼합물로부터 잔여 비누를 제거하는 단계; 생성물 혼합물을 물 세척 및 건조시켜 불순물을 제거하는 단계; 정련을 위해 생성물 혼합물을 표백시키는 단계; 생성물 혼합물중에 폴리올 지방산 폴리에스테르로부터 미반응된 저급 알킬 에스테르의 적어도 일부를 분리하는 단계; 및 분리된 미반응된 저급 알킬 에스테르를 재활용하는 단계.트랜스에스테르화는 또한 미국 특허 제6,278,006호에 보고된 바와 같은 단쇄 지방산 에스테를 갖는 미생물 바이오매쓰상에서 수행할 수 있다. 일반적으로, 트랜스에스테르화는 단쇄 지방산 에스테르를 적합한 촉매의 존재하에 오일에 부가하고 혼합물을 가열시킴에 의해 수행할 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 오일은 약 5중량% 내지 약 90중량%의 반응 혼합물을 포함한다. 몇몇 양태에서, 단쇄 지방산 에스테르는 반응 혼합물의 약 10중량% 내지 약 50중량%일 수 있다. 촉매의 비제한적인 예는 염기 촉매, 나트륨 메톡사이드, 황산 및 산성화된 점토와 같은 무기산, 메탄 설폰산, 벤젠설폰산 및 톨루엔설폰산과 같은 유기산 및 Amberlyst 15와 같은 산성 수지를 포함하는 산 촉매를 포함한다. 나트륨 및 마그네슘과 같은 금속 및 금속 수소화물은 또한 유용한 촉매이다. 또 다른 당해 화학적 변형은 하이드록실화이고 이는 물을 이중 결합으로 부가하여 하이드록실 잔기의 포화 및 혼입을 유도한다. 상기 하이드록실화 공정은 글리세로지질의 하나 이상의 지방산을 하이드록시 지방산으로 전환시키기 위한 기작을 제공한다. 하이드록실화는 예를 들어, 미국 특허 제5,576,027호에 보고된 바와 같은 방법을 통해 수행할 수 있다. 아주까리유를 포함하는 하이드록실화된 지방산 및 이의 유도체는 식품 첨가제, 계면활성제, 안료 습윤제, 소포제, 방수 첨가제, 가소화제, 화장품 유화제 및/또는 탈취제를 포함하는 다수의 산업 응용 분야 및 전자, 약제, 페인트, 잉크, 접착제 및 윤활제에서 성분으로서 유용하다. 글리세라이드가 하이드록실화되는 방법의 한가지 예는 다음과 같다: 지방은 바람직하게 헵탄과 배합하여 약 30 내지 50℃로 가열할 수 있고 30분 이상 동안 온도에 유지시키며; 이어서 아세트산을 혼합물에 첨가함에 이어서 황산 수용액, 과산화소수 수용액을 점진적 증가량으로 1시간 이상 동안 혼합물에 첨가하고; 수성 과산화수소 후에 온도를 이어서 약 60℃ 이상으로 증가시키고 6시간 이상 동안 교반시키고; 교반 후 상기 혼합물이 침강하도록 방치하고 반응에 의해 형성된 저급 수성 층을 제거하면서 반응에 의해 형성된 상부 헵탄층을 약 60℃의 온도를 갖는 고온수로 세척할 수 있고; 세척된 헵탄 층을 이어서 수산화칼륨 수용액을 사용하여 pH 약 5 내지 7로 중화시키고 이어서 진공 증류에 의해 제거할 수 있고; 반응 생성물을 이어서 100℃에서 진공 건조시킬 수 있고 건조된 생성물을 진공 조건하에 증기 탈취시키고 규조토를 사용하여 약 50℃ 내지 60℃에서 여과한다.본원에 기재된 방법에 의해 생성된 미생물 오일의 하이드록실화는 하기에 보고된 바와 같이 상기 방법 및/또는 물질의 하나 이상과 연계하여 또는 생성물을 생성하기 위해 수행할 수 있다: 미국 특허 제6,590,113호(오일계 피복 및 잉크); 제4,049,724호(하이드록실화 반응); 제6,113,971호(올리브유 버터); 제4,992,189호 (윤활제 및 루브 첨가제); 제5,576,027호(하이드록실화된 밀크); 및 제6,869,597호 (화장품). 하이드록실화된 글리세로지질은 에스톨리드로 전환시킬 수 있다. 에스톨리드는 글리세로지질로 이루어지고 여기서, 하이드록실화된 지방산 성분은 또 다른 지방산 분자에 에스테르화시켰다. 하이드록실화된 글리세로리피드의 에스톨리드의 전환은 글리세로지질 및 지방산의 혼합물을 가온시키고 상기 혼합물을 문헌[참조: Isbell et al., JAOCS 71(2): 169-174 (1994)]에 기재된 바와 같이 무기산과 접촉시킴에 의해 수행할 수 있다. 에스톨리드는 제한없이 하기에 보고된 것들을 포함하는, 다양한 응용 분야에서 유용하다: 미국 특허 제7,196,124호(탄성 물질 및 바닥덮개); 제5,458,795호(고온 응용을 위한 증점 오일); 제5,451,332호(산업적 응용을 위한 유체); 제5,427,704호(연료 첨가제); 및 제5,380,894호(윤활제, 그리스, 기가소제 및 인쇄 잉크). 미생물 오일상에서 수행될 수 있는 다른 화학적 반응은 미국 특허 제6,051,539호에 보고된 바와 같이 트리아실글리세롤과 사이클로프로판화제와 반응시켜 유동성 및/또는 산화성 안정을 증진시키는는 것; 미국 특허 제6,770,104호에 보고된 바와 같이 트리아실글리세롤로부터 왁스를 제조하는 것; 및 문헌[참조: "The effect of fatty acid composition on the acrylation kinetics of epoxidized triacylglycerols", Journal of the American Oil Chemists' Society, 79:1, 59-63, (2001) and Free Radical Biology and Medicine, 37:1, 104-114 (2004)]에 보고된 바와 같이 트리아실글리세롤을 에폭시화시키는 것을 포함한다.상기된 바와 같이 연료 및 화학적 생성물에 대한 오일 함유 마생물 바이오매스의 생성은 탈지된 바이오매쓰 밀을 생성시킨다. 탈지된 밀은 조류 오일을 제조하는데 있어서의 부산물이고 농장 동물, 예를 들어, 반추동물, 가금류, 돼지 및 양식물고기에 대한 동물 사료로서 유용하다. 수득한 밀은 오일 함량이 감소하였지만 여전히 단백질, 탄수화물, 섬유, 재, 잔류 오일 및 동물 사료에 적당한 다른 영양물 함량이 높다. 세포는 주로 오일 분리 공정에 의해 용해되기 때문에 탈지된 밀은 상기 동물에 의해 쉽게 소화될 수 있다. 탈지된 밀은 임의로 동물 사료에서 곡물과 같은 다른 성분과 배합될 수 있다. 탈지된 밀은 분말성 점도를 갖기 때문에 이것은 압출기 또는 확장기 또는 시판되는 다른 유형의 기계를 사용하여 펠렛으로 압착될 수 있다. 상기에서 상세하게 기재된 본 발명은 하기의 실시예에 예시되지만 이는 청구된 발명을 설명하기 위해 제공될 뿐 이에 제한되지 않는다. VII. 실시예실시예 1: 프로토테카를 배양하기 위한 방법프로토테카 균주는 무수 세포 중량을 기준으로 높은 %의 오일을 성취하기 위해 배양하였다. 동결보존된 세포를 실온에서 해동시키고 500㎕의 세포를 4.5ml의 배지(4.2 g/L K2HPO4, 3.1 g/L NaH2PO4, 0.24 g/L MgSO4·7H2O, 0.25 g/L 시트르산 1수화물, 0.025 g/L CaCl2 2H2O, 2g/L 효모 추출물) + 2% 글루코스에 첨가하고 6웰 플레이트에서 진탕(200rpm)과 함께 7일 동안 28℃에서 배양하였다. 무수 세포 중량은 1ml의 배양물을 예비 칭량된 에펜도르프 튜브에서 5분 동안 14,000 rpm에서 원심분리하여 결정하였다. 배양 상등액을 버리고 수득한 세포 펠렛을 1ml의 탈이온수로 세척하였다. 배양물을 다시 원심분리하고 상등액을 버리고 세포 펠렛을 동결될때까지 -80℃에 위치시켰다. 이어서 샘플을 24시간 동안 동결건조시키고 무수 세포 중량을 계산하였다. 배양물중 총 지질을 결정하기 위해, 3 ml의 배양물을 제거하고 제조업자의 프로토콜에 따라 Ankom 시스템(Ankom Inc., Macedon, NY)을 사용하여 분석하였다. 샘플은 제조업자의 프로토콜에 따라 Amkom XTlO 추출기로 용매 추출에 적용하였다. 총 지질은 산 가수분해된 무수 샘플 및 용매 용매 추출된 무수 샘플간의 샘플 차이로서 결정하였다. % 오일 무수 세포 중량 측정은 표 8에 나타낸다.상기 표 22에 열거된 균주 기원의 미세조류 샘플을 유전자형으로 분류하였다. 게놈 DNA를 다음과 같이 조류 바이오매쓰로부터 분리하였다. 세포(대략 200mg)를 14,000 x g에서 5분 동안 배양물로부터 원심분리하였다. 세포를 이어서 멸균 증류수에 재현탁시키고 14,000 x g에서 5분 동안 원심분리하고 상등액을 버렸다. 직경이 약 2mm인 단일 유리 비이드를 바이오매쓰에 첨가하고 튜브를 15분 이상 동안 -80℃에 위치시켰다. 샘플을 제거하고 150 μl의 분쇄 완충액(1% 사르코실(Sarkosyl), 0.25 M 슈크로스, 50 mM NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, RNase A 0.5 ug/ul)을 첨가하였다. 펠렛을 간단히 볼텍싱하여 재현탁시키고 이어서 40㎕의 5M NaCl를 첨가하였다. 샘플을 간략하게 볼텍싱하고 이어서 66 μl의 5% CTAB (세틸 트리메틸암모늄 브로마이드)를 첨가하고 최종적으로 간략하게 볼텍싱하였다. 다음에 샘플을 10분 동안 65℃에서 배양하고 이후 이들을 10분 동안 14,000 x g에서 원심분리하였다. 상기 상등액을 새로운 튜브로 옮기고 300 μl의 페놀: 클로로포름: 이소아밀 알콜 12:12:1로 1회 추출함에 이어서 14,000 x g에서 5분 동안 원심분리하였다. 수득한 수성 상을 0.7 용적의 이소프로판올(약 190㎕)을 함유하는 새로운 튜브로 옮기고 뒤집어서 혼합하고 40℃에서 30분 동안 또는 밤새 실온에서 항온처리하였다. DNA를 10분 동안 14,000 x g에서 원심분리를 통해 회수하였다. 이어서 수득한 펠렛을 70% 에탄올로 2회 세척함에 이어서 100% 에탄올로 최종 세척하였다. 펠렛을 실온에서 20분 내지 30분 동안 공기 건조시킴에 이어서 50 μl의 1OmM TrisCl, 1mM EDTA (pH 8.0)중에 현탁시켰다.상기된 바와 같이 제조된 5 μl의 총 조류 DNA를 10mM Tris(pH 8.0)중에서 1:50으로 희석시켰다. 최종 용적 20㎕의 PCR 반응물을 다음과 같이 셋-업하였다. 10 μl의 2 x iProof HF 마스터 믹스(BIO-RAD)를 0.4 μl의 프라이머 SZ02613 (10mM 스톡 농도에서 5'-TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAC-3'(서열번호 9))에 첨가하였다. 상기 프라이머 서열은 GenBank 승인 번호 L43357에서 567번 내지 588번이고 고등 식물 및 조류 플라스티드 게놈에서 고도로 보존되어 있다. 이어서 0.4 μl의 프라이머 SZ02615 (10mM 스톡 농도에서 5'-CAGTGAGCTATTACGCACTC-S' (서열번호 10))를 첨가하였다. 상기 프라이머 서열은 GenBank 승인번호 L43357에서 1112번 내지 1093번 위치에 상보적이고 고등 식물 및 조류 플라스티드 게놈에서 고도로 보존되어 있다. 다음에, 5μl의 희석된 총 DNA 및 3.2 μl의 dH2O를 첨가하였다. PCR 반응을 다음과 같이 수행하였다: 35사이클동안 98℃, 45"; 98℃, 8"; 53℃, 12"; 72℃, 20" 에 이어서 1분 동안 72℃에서 수행하고 25℃에 유지시킨다. PCR 생성물의 정제를 위해, 20 μl의 10 mM Tris(pH 8.0)를 각각의 반응물에 첨가하고 이어서 40 μl의 페놀:클로로포름:이소아밀 알콜 12:12:1로 추출하고, 볼텍싱하고 5분 동안 14,000 x g에서 원심분리한다. PCR 반응을 S-400 칼럼(GE Healthcare)에 적용하고 3,000 x g에서 2분 동안 원심분리하였다. 정제된 PCR 생성물을 이어서 PCR8/GW/TOPO으로 TOPO 클로닝하고 양성 클론을 LB/Spec 플레이트를 위해 선택하였다. 정제된 플라스미드 DNA를 M13 정배향 및 역배향 프라이머를 사용하여 양 방향으로 서열분석하였다. 전체적으로, 12개의 프로토테카 균주는 서열분석된 이들의 23S rRNA DNA를 갖도록 선택하고 상기 서열을 서열 목록중에 열거한다. 균주 및 서열 번호에 대한 요약은 하기에 포함된다. 상기 서열은 UTEX 1435(서열번호 15) 서열로부터 총 분기점에 대해 분석하였다. 2개의 쌍(UTEX 329/UTEX 1533 및 UTEX 329/UTEX 1440)이 가장 분기된 것으로서 나타났다. 양 경우에, 쌍형성 정렬은 75.0% 쌍형성 서열 동일성을 나타내었다. UTEX 1435에 대한 % 서열 동일성은 또한 하기에 포함된다.상기된 균주의 서브셋트 기원의 지질 샘플은 HPLC를 사용하여 지질 프로필에 대해 분석하였다. 결과는 하기 표 9에 나타낸다. 조류 플라스티드 수송 펩타이드는 하기 실시예 12 및 실시예 11에 기재된 바와 같이 UTEX 1435 (프로토테카 모리포르미스) 또는 UTEX 250 (클로렐라 프로토테코이데스) cDNA 라이브러리의 분석을 통해 동정하였다. 다른 공지된 플라스티드 표적화된 단백질에 대한 BLAST 히트 상동성을 기초로 하는 잠재적 플라스티드 표적화된 단백질을 암호화하는 cDNA를 소프트웨어 프로그램 PSORT (http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form.html), ChloroP (http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/) 및 TargetP (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)에 의해 추가 분석하였다. 이들 3개의 프로그램중 하나 이상을 통해 동정된 후보물 플라스티드 수송 펩타이드는 이어서 적당한 게놈 DNA로부터 PCR 증폭시켰다. 하기에서는 상기 스크리닝으로부터 동정된 조류 플라스티드 표적화 서열(PTS)의 아미노산 서열을 요약한다. 또한 하기 실시예의 이종성 발현에서 사용되는 식물 지방 아실-ACP 티오에스테라제의 아미노산 서열이 포함된다. 실시예 2: 다양한 공급원료상에서 프로토테카의 배양A. 수수하기의 균주는 유일한 탄소원으로서 수수를 사용할 수 있는 것으로 나타났다: 프로토테카 모리포르미스 균주 UTEX 1435, UTEX 1437, UTEX 288, UTEX 1439, UTEX 1441 및 UTEX 1434, 및 프로토테카 스타그노라 균주 UTEX 1442. "UTEX" 표시는 기관[University of Texas, 1 University State A6700, Austin, Texas 78712-0183]의 조류 배양 수집물로부터 균주 번호를 지적한다.순수 수수는 제조사[Maasdam Sorghum Mills (Lynnville, Iowa)]로부터 구입하였고 당 프로필은 프럭토스 21.0% w/w, 덱스트로스 28.0% w/w, 슈크로스 16.0% w/w 및 말토스 003c#0.5%w/w이다. 상기 배양물을, 유일한 탄소원으로서 2%, 5%, 또는 7% (v/v)의 순수 수수(순수 스톡으로부터 희석됨)를 함유하는 액체 배지에서 성장시키고 상기 용액은 약 350rpm에서 진탕시키면서 암실에서 종속영양으로 배양하였다. 배양물로부터 샘플을 24, 40, 48, 67 및 89시간째에 인출하고 성장은 분광측정기상에서 A750 판독을 사용하여 측정하였다. 성장은 도 1 및 2에서 보여진 바와 같이 시험된 균주 각각에 대해서 관찰되었다.B. 셀룰로스습윤 분해된 옥수수 스토버, 미스칸투스, 포라지 수수(forage sorghum), 비트 펄프 및 사탕 수수 바사지는 1.4% 황산 용액중에서 쿠킹하고 수득한 슬러리를 탕수시킴에 의해 제조원[National Renewable Energy Laboratory (Golden, CO)]으로부터 제조되었다. % 고체는 건조시킴에 의해 중량적으로 측정하였고 다음과 같았다: 옥수수 스토버, 25%의 고체; 미스칸투스, 28.7%의 고체; 포라지 수수, 26.7%의 고체; 및 사탕 수수 바사지, 26% 고체.분해된 셀룰로스 물질(옥수수 스토버 또는 스위치 그래스)의 100그램 습윤 샘플을 탈이온수에 재현탁시켜 최종 용적 420ml까지 재현탁시키고 pH를 10N NaOH를 사용하여 4.8로 조정하였다. 비트 펄프에 대해, 9.8그램의 무수 고체를 탈이온수로 350ml가 되게 하고 pH를 10N NaOH를 사용하여 4.8로 조정하였다. 상기 모든 공급원료에 대해, 아셀러라제 1000 (Genencor, New York)을 셀룰로스 물질의 당화를 위해 무수 바이오매쓰의 그램당 0.25ml의 비율로 사용하였다. 샘플은 50℃에서 72시간 동안 진탕(110rpm)과 함께 항온처리하였다. 샘플 각각의 pH는 NaOH(무시할만한 용적 변화와 함께)를 사용하여 7.0으로 조정하고, 0.22㎛의 여과기를 통해 여과 멸균시키고 하기의 상세한 공정에서 사용하였다. 대규모 공정을 위해, 접선 유동 여과(TFF)의 추가의 단계 또는 미세여과 단계가 공급원료의 여과기 멸균을 도와주기기 위해 수행되는 것을 제외하고는 당화를 위한 동일한 과정에 따른다. 제조된 각각의 공급원료 기원의 샘플은 HPLC/ELSD계 시스템 또는 헥소키나제계 키트 (Sigma)를 사용하여 글루코스 및 크실로스 농도의 결정을 위해 보존하였다. 추가로, 비트 펄프를 위해, 상기 물질을 처음에 다른 공급원료와 같이 용적으로 하고 이어서 pH를 4.0으로 조정하고 펙티나제 처리는 24시간 동안 50℃에서 수행하였다. 이어서, pH는 어떠한 세척 단계가 수행되지 않는 경우 4.8로 조정하고 세척 단계가 수행되는 경우에는 5.3으로 조정하였다. 이어서 효소적 당화는 상기된 다른 공급원료를 위해 사용된 동일한 과정을 사용하여 수행하였다.미세조류 프로토테카 모리포르미스 균주 UTEX 1435는 상기된 바와 같이 제조된 일련의 셀룰로스 공급원료(옥수수 스토버, 비트 펄프, 슈가 케인, 미스칸투스 및 글루코스 대조군)상에서 성장하는 능력에 대해 평가하였다. 미세조류 배양물은 탄소원을 제외하고는 상기 실시예 1에 기재된 조건에서 성장시켰다. 탄소원은 셀룰로스 물질에서 가용한 글루코스에 의한 측정시 4% 글루코스(대조군 조건에 대해) 또는 4% 글루코스였다. 성장은 A750의 판독으로 평가하고 배양 시간은 168시간이었고 A50 판독값은 배양 개시 후 48, 72, 96, 120, 144 및 168시간에 대한 것이다. 도 7a에 나타낼 수 있는 바와 같이, 프로토테카 모리포르미스 배양물이 옥수수 소토버에서 가장 잘 성장하였다. 사용되는 다른 셀룰로스 공급원료, 미스칸투스, 사탕 수수 및 비트 펄프 모두는 성장 억제를 나타내었다.옥수수 스토버 유래된 셀룰로스 당을 사용한 상기 결과를 토대로, 지질 축적은 또한 상이한 수준의 옥수수 스토버 유래된 셀룰로스 당 및 대조군으로서 시약 당을 사용하여 프로토테카 모리포르미스에서 평가하였다. 배양물을 완전히 옥수수 스토버 유래된 셀룰로스 당(도 7b에서 100% 옥수수 스토버 조건) 기원의 18g/L 글루코스, 9g/L 시약 글루코스가 보충된 옥수수 스토버 유래된 셀룰로스 당(도 7b에서 18g/L 조건으로 글루코스가 보충된 50% 옥수수 스토버) 기원의 9g/L 글루코스, 옥수수 스토버 유래된 셀룰로스 당(50% 옥수수 스토버, 보충되지 않음; 도 7b에서 9g/L 조건에서의 글루코스) 기원의 9g/L 글루코스 및 42g/L 시약 글루코스의 대조군 배양물 및 삼투압 조절을 위한 13g/L의 시약 크실로스중에서 성장시켰다. 모든 배양물에는 시약 글루코스가 공급되어 글루코스 농도를 20g/L로 유지하는 대조군 배양물을 제외하고는 셀룰로스 당을 공급하여 글루코스 농도를 20g/L로 유지시킨다. 성장은 배양물의 무수 세포 중량을 기준으로 측정하고 지질 생산성은 % 무수 세포 중량으로서 측정하였다. 총 지질은 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 안콤산 가수분해/용매 추출 시스템을 사용하여 중량적으로 측정하였다.도 7b에서 알 수 있는 바와 같이, 바이오매쓰 축적을 기준으로(DCW에 의해 측정된 바와 같이), 옥수수 스토버 유래딘 셀룰로스의 모든 농도는 단독의 글루코스가 공급된 대조군 배지를 능가하였다(보다 높은 DCW). DCW의 %로서 지질 생산은 또한 모든 조건에 대해 계산하였다. 옥수수 스토버상에서의 성장에 대해 나타낸 보다 높은 바이오매쓰 축적에 추가로, 지질 축적은 또한 글루코스 대조군 조건과 비교하여 옥수수 스토버 유래된 셀룰로스 조건에서 보다 높았다. 이들 데이타는 셀룰로스 유래 당을 제공하는 것 뿐만 아니라 옥수수 스토버가 추가의 영양물/성분을 제공하여 증가된 바이오매쓰 축적(성장) 및 증가된 생성물 수율에 기여함을 입증한다.셀룰로스 공급원료는 글루코스에 추가로 성분을 함유하고 있기 때문에 이들 추가의 성분의 일부는 배양 동안에 보다 많은 셀룰로스 유래 당이 주요 탄소원(보통 글루코스이지만 이에 제한되지 않음)이 소비됨에 따라 배양물에 공급되어 배양 동안에 목적하지 않은 수준까지 축적할 수 있다. 예를 들어, 셀룰로스 유래 당 공급원료에 존재하는 크실로스는 미세조류의 성장 및 최종 생성물 생산을 억제하는 수준까지의 고밀도 배양 동안에 증강될 수 있다. 프로토테카 배양 동안에 증가된 크실로스의 효과를 시험하기 위해, 배양물은 배지에서 4%의 글루코스와 함께 성장시키고 0, 10 g/L, 25 g/L, 50 g/L 및 100 g/L의 크실로스 보충하였다. 배양 6일 후, 성장 및 지질 축적은 상기된 방법을 사용하여 평가하였다. 도 7c에 나타낸 바와 같이, 놀랍게도 시험된 크실로스의 최고 농도는 프로토테카 모리포르미스가 성장하고 지질을 축적하는 능력을 억제하지 않았고 상기 배양물은 실제로 보다 우수하게 성장하고 최고의 크실로스 농도에서 보다 많은 지질을 축적시켰다. 상기 현상을 분석하기 위해, 유사한 실험은 야생형 프로토테카 모리포르미스가 대사할 수 없는 탄소원인 슈크로스를 사용하여 수행하였다. 어떠한 양성 효과가 슈크로스를 사용해서는 관찰되지 않았고 이것은 크실로스에 대해서 나타나는 증가된 성장 및 지질 축적이 배지에서 고농도의 대사되지 않은 성분으로부터의 삼투압 스트레스 이외의 기작에 기여할 수 있고 크실로스 특이적임을 시사한다.대사되지 않은 당에 추가로, 염은 리그노셀룰로스 유래 당을 농축시키는 결과로서 억제 수준까지 축적할 수 있다. 셀룰로스 물질의 전형적인 제조동안에 H2SO4를 사용한 산 가수분해 단계에 이어서 NaOH를 사용한 산의 중화로 인해, Na2SO4는 리그노셀룰로스 당의 생성동안에 형성된다. 성장 및 지질 생산에 대한 염 농도의 효과를 평가하기 위해, 프로토테카 모리포르미스 배양물을 4% 글루코스가 보충된 배지에서 0 내지 700mM 범위의 Na2SO4 농도에서 성장시켰다. 도 7d에 나타낸 바와 같이 DCW 축적에 의한 측정시 상당한 성장의 억제가 관찰되었고, 이때 Na2SO4 농도는 25mM을 초과하여 구체적으로 80mM, 240mM 및 700mM 농도였다. 추가로, 소포제 P2000의 효과는 동일한 시험에서 평가하였다. 소포제 화합물은 바이오매쓰 생산성에 대해 상당한 양성 효과를 나타냈다. 지질 생산성은 또한 각각의 조건을 위해 평가하고 80mM 초과, 구체적으로 240mM 및 700mM의 Na2SO4 농도는 억제성이었고 소포제 P2000의 첨가는 지질 생산성을 상당히 증가시켰다. 따라서, 하나의 양태에서, 본 발명의 방법의 배양 단계는 소포제를 함유하는 배지에서 배양시킴을 포함한다.상기 논의되고 도 7a에 요약된 결과를 토대로, 억제제는 불량한 성장을 나타내는 셀룰로스 공급원료에 존재할 가능성이 있었다. 본 발명은 고온수(열수 처리)로 물질을 세척함에 의해 상기 화합물을 제거하는 수단을 제공한다. 도 8은 단일 고온수 세척과 함께 셀룰로스 공급원료로부터 유래된 당을 사용한 A750에 의한 측정시 성장 결과를 요약한다. 배양 조건은 도 7a에 요약된 공정에 사용되는 것들과 동일하다. 도 7a에 나타낸 결과와 비교하여, 단 1회 고온수 세척 후, 프로토테카 모리포르미스 배양물은 글루코스 대조군과 비교하여 시험된 모든 셀룰로스 공급원료, 특히 사탕 수수 바사지, 사탕 수수, 미스캔투스 및 비트 펄프에서 보다 우수하게 성장하였다. 지질 생산성은 또한 각각의 조건에서 평가하였다. 글루코스 대조군에 필적할 수 있는 비트 펄프 조건을 제외하고는 1회 고온수 세척에 적용된 셀룰로스 물질로부터 유래된 당에서 성장한 배양물은 글루코스 대조군보다 양호한 지질 생산성을 나타내었다. 셀룰로스 바이오매쓰의 열수 처리(고온수 세척)에 대한 하나의 잠재적인 효과는 물질의 산 분해에 의해 방출되는 푸르푸랄 및 하이드록시메틸 푸르푸랄의 제거이다. 푸르푸랄 및 하이드록시메틸 푸르푸랄의 존재는 도 7a에 요약된 몇몇 공정에서 관찰된 제한된 성장에 기여할 수 있었다. 열수 처리가 푸르푸랄(FA) 및 하이드록시메틸 푸르푸랄(HMF)의 수준에 어떻게 영향을 주는가를 평가하기 위해, 사탕수수 바가스(B), 사탕 수수(S), 미스캔투스(M) 또는 비트 펄프(BP)로부터 유래된 셀룰로스 바이오매쓰의 1 내지 3회 세척으로부터 수득한 상등액을 HPLC에 의해 FA 및 HMF에 대해 분석하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, FA 및 HMF 수준은 각 세척 단계와 함께 상당히 감소한다. 상기 결과는 FA 및 HMF가 (도 7a에 나타낸 바와 같이) 미세조류 성장을 억제할 수 있고 열수처리가 이들 화합물을 제거하고 대조군 글루코스 조건에서의 성장(도 8에 나타낸 바와 같이) 보다 더 우수한 성장을 유도한다는 관찰과 일치한다. 다양한 열수 처리된 리그노셀룰로스 유래된 당상에서 성장한 프로토테카 모리포르미스 배양물의 지질 프로필에 대한 효과를 평가하였다. 프로토테카 모리포르미스 배양물을 하기의 4회 세척된 셀룰로스 공급원료상에서 성장시켰다: 셀룰로스 당의 공급을 통해 당 수준이 20g/L로 유지되는 매스캔투스, 사탕 수수 바사지 및 수수 케인. 배양을 종료 시점에 각각의 조건으로부터 미세조류 바이오매쓰는 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 지질 프로필에 대해 분석하였다. 지질 프로필 분석(면적%로 표시) 결과는 하기 표 10에 요약한다. 각각의 조건을 2회 시험하고 2회 시험 각각으로부터의 결과가 포함된다. 셀룰로스 공급원료상에서의 성장은 글루코스 대조군과 비교하여 지질 프로필이 상당히 재분포된다. 예를 들어, 글루코스 대조군 조건과 비교하여 셀룰로스 공급원료 조건 모두에서 C18:0 면적%가 상당히 증가하였다.n.d.는 검출되지 않았음을 나타낸다셀룰로스 당 스트림은 분해된 옥수수 스토버로부터 생성시키고 아셀러라제 효소를 사용하여 당화시키고 진공 증발을 사용하여 농축시켰다. 상기 당 스트림은 4% 글루코스 농도에서 프로토테카 모리포르미스 성장 분석에서 시험하였다. 성장 분석 결과는 매우 불량한 성장을 보여주고 셀룰로스 당 스트림은 전도성(염 함량)에 대해 시험하였다. 상기 전도성은, 상기된 바와 같고 도 7d에 나타낸 바와 같은 성장에 억제성인 것으로 보여지는 수준인 700mM 나트륨 등가물 보다 훨씬 높았다. 본 발명의 방법은 리그노셀룰로스 유래 미세조류 오일의 생산에서 이들 공급원료를 사용하기 전에 리그노셀룰로스 유래 당으로부터 염이 감소되거나 제거되는 방법을 포함한다. 그러나, 당업자는 놀랍게도 농축된 당 스트림을 탈염시키기 위해 수지를 사용할 수 없고 농축된 당 스트림을 먼저 희석시켜야만 한다. 이러한 양태의 발명을 입증하기 위해, 옥수수 스토버 물질로부터 유래된 셀룰로스 당을 수지를 사용하여 오염된 염을 제거하기 전에 8배 희석시켰다. 농축된 출발 물질의 초기 전도성은 87 mS/cm이었고 8배 희석된 스트림의 전도성은 pH 5.61에서 10990 μS/cm이었다. 이전의 연구는 탈이온전에 농축된 당 스트림을 희석시키지 못하여 당 스트림으로부터 글루코스의 상당한 손실 뿐만 아니라 염을 정량적으로 제거할 수 없었음을 지적하였다. IEX 수지(DOWEX Marathon MR3)의 3가지 상이한 상 용적을 사용하였다(1:2, 1:4 및 1:10). 표 11은 희석된 공급원료에서 이전에 농축된 옥수수 스토버 유래의 셀룰로스 당 스트림에서 염을 상당히 감소시키기 위해(전도성 측정시) 혼합된 상 이온 교환(IEX) 수지의 능력을 입증하는 결과를 요약하고 있다.1:4 상 용적:셀룰로스 공급원료를 사용하는 방법 및 물질의 8배 재농축은 나트륨 농도가 정상적인 바이오매쓰 및 지질 축적을 위한 범위내에 있도록 한다. 또는, 탈이온화 또는 염 제거는 당화 전에 또는 당화 후에 수행할 수 있지만 당 스트림의 농축 전일 수 있다. 염 제거가 당 스트림의 농축 전에 수행되는 경우, 염 제거전에 당 스트림의 희석 단계가 필수적이지 않을 수 있다. 상기 실시예는 셀룰로스 오일 생산에 사용하기 위한 분해된 셀룰로스 물질의 세척 효능을 입증한다. 상기된 바와 같이, 염 제거 없이 셀룰로스 유래 당(분해된 셀룰로스 물질 및 후소적 처리에 고유한)의 농축은 최적 이하의 발효를 유도하였다. 하기된 방법으로 처리된 물질은 후속적 당화를 위해 적당한 pH를 가졌다. 또한, 상기 물질의 전도성은 출발 공급원료부터 상당히 감소(100배 이상)하였다. 따라서, 발효에 사용될 후속적인 농축된 당은 과량의 염의 존재로 인한 억제성이 아니었다. 추가의 잇점은 셀룰로스 물질로부터 푸르푸랄의 제거에 의해 나타난다. 헤미셀룰로스 분획에서 제거된 크실로스 또는 글루코스는 처분되거나 바람직하게 발효에 사용하기 위해 재농축될 수 있다.65kg의 습윤 중량의 초기 출발 질량을 갖고 15,000 μS/cm의 전도성(pH 2.4)을 갖는 습윤 분해된 사탕 수수 바사지(NREL, Colorado)는 탈이온수로 128kg이 되게하고 pH를 10N NaOH를 사용하여 4.6으로 조정하므로써 수득한 전도성이 6,800 μS/cm이 되게하였다. % 고체는 테어드(tared)(중량=t) 알루미늄 팬으로 현탁된 물질 분취액을 제거하고 습윤 중량(중량 = w)을 기록함에 이어서 110℃에서 3시간 동안 건조시켜 평가하였다. 무수 샘플을 데시케이터로 제거하고 이 시점에서 실온(25℃)이 되게 방치시킨 후, 이들을 다시 칭량한다(중량 = d). % 고체는 다음과 같이 계산하였다: % 고체 = [(d-t/w-t)]x 100. 전도성은 열 전자 오리온 3 스타 전도성 계측기(Thermo Electron Orion 3 Star Conductivity meter)상에서 측정하였다. 사탕 수수 바사지는 스테인레스 반응기(150L 용량)에서 50℃의 온도에서 셀룰로스 슬러리(8.2%의 초기 % 고체)를 연속으로 혼합함에 의해 반 연속 양상으로 세척하였다. 셀룰로스는 유속 1.9-3.8 kg/분으로 회전 로드 펌프를 통해 반응기 용기로부터 Sharpies Model 660 데칸터 원심분리기로 방출시켰다. 액체 침투물은 배치식으로 유지시키고(약 35 내지 175kg 분취액, 하기 표 12 참조) 균질의 분취액을 표 12에 기재된 바와 같이 총 당(글루코스 및 크실로스) 및 % 고체의 평가를 위해 제거하였다. 셀룰로스 물질의 전도성 및 pH는 각각 탈이온수 및 10N NaOH의 첨가를 통해 조절하였다. 표 12에서 샘플 1-10은 버려진 원심분리 침투물을 나타내고 그와 같이, 이들 분획중에 존재하는 고체 및 당은 최종 세척된 셀룰로스 물질로부터 제거한다. 제거된 고체와 비교하여 총 고체 - 손실된 고체 + 당화를 위한 최종 고체의 질량 균형 계산은 상기 공정에서 99%의 회수율을 유도하였다. 도 8은 수거되고 표 12에 기재된 11개의 원심분리 침투물 각각에서 푸르푸랄 및 하이드록시메틸 푸르푸랄 농도(mg/L)를 요약한다. 이들 데이타는 사탕 수수 바사지로부터 루프푸랄 및 하이드록시메틸 푸르푸랄의 명백한 제거를 입증한다. 프로토테카가 셀룰로스 유래된 공급원료를 사용하는 능력에 대한 또 다른 입증에서, 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)를 고정된 탄소 공급원료로서 셀룰로스 유래 당을 사용하여 3리터의 생물반응기에서 배양하였다. 상기 접종물은 실온에서 해동시킨 동결보존된 세포로부터 제조하고 1ml의 세포를, 1 g/L (NH4)2SO4, 4 g/L 효모 추출물 및 미량 원소 용액 +4% 글루코스를 사용하는 실시예 1에 기재된 기본 미세조류 배지를 기초로 하는 300ml의 접종 배지에 첨가하고 진탕(200rpm)과 함께 28℃에서 1일 동안 성장시켰다. 상기 배양물을 1L 배지 + 0.26ml의 Antifoam 204(Sigma, USA)를 함유하는 3리터 생물반응기에 접종하는데 사용하였다. 발효기는 28℃로 조정하고 pH를 KOH를 첨가하여 6.8로 유지시켰다. 용존 산소는 단계적 교반과 공기주입에 의해 30% 포화로 유지시켰다. 옥수수 스토버 기원의 셀룰로스 당 공급원료를 배양물에 주입하여 0 내지 10g/L의 글루코스를 유지시켰다. 셀룰로스 당 공급원료를 300mM 미만의 염으로 탈염시키는 것이 정제된 당 공급원료 대조군에 비해 유사한 무수 세포 중량 및 지질 축적 수행능을 보장하는데 필수적이다. 셀룰로스 당 공급원료의 탈염은 상기된 방법을 사용하여 수행하였다. 발효기 샘플은 발효 수행능을 모니터링하기 위해 제거하였다. 세포 매쓰 축적은 광학 밀도 및 무수 세포 중량으로 모니터링하였다. 글루코스, 크실로스, 암모니아, 칼륨, 나트륨 및 푸르푸랄 농도는 또한 발효 과정 전반에 걸쳐 측정하고 모니터링하였다. 지질 농도는 상기 논의된 중량 측정 방법에 의해 측정하였다. 실시예 3: 프로토테카를 형질전환시키는 방법A. 프로토테카의 유전자주입 형질전환을 위한 일반적인 방법제조원[Seashell technology]으로부터 시판되는 S550d 골드 캐리어를 제조업자의 프로토콜에 따라 제조하였다. 선형화된 플라스미드 (20 μg)를 50 μl의 결합 완충액과 60 μl (30 mg)의 S55Od 골드 캐리어와 혼합하고 1분 동안 빙상에서 항온처리하였다. 침전 완충액(100 μl)을 첨가하고 상기 혼합물을 또 다른 1분 동안 빙내에서 항온처리하였다. 볼텍싱한 후, DNA-피복된 입자를 10초 동안 에펜도르프 5415C 소형원심분리기내에서 10,000rpm으로 회전시켜 펠렛화하였다. 상기 골드 펠렛을 500 μl의 냉 100% 에탄올로 1회 세척하고, 소형원심분리기에서 간단히 회전시켜 펠렛화하고 50 μl의 빙냉 에탄올로 재현탁시켰다. 간략한 (1 내지 2초) 초음파 처리 후, 10 μl의 DNA-피복된 입자를 즉시 캐리어 막으로 이동시켰다.프로토테카 균주를 이의 세포 밀도가 2 x 106 세포/ml가 될 때까지 회전 진탕기상에서 프로테오스 배지(2g/L 효모 추출물, 2.94mM NaNO3, 0.17mM CaC12ㆍ2H2O, 0.3mM MgSO4ㆍ7H2O, 0.4mM K2HPO4, 1.28mM KH2PO4, 0.43mM NaCl)내에서 성장시켰다. 상기 세포를 수거하고 멸균 증류수로 1회 세척하고 50 μl의 배지에 재현탁시켰다. 1 x 107 세포를 비선택적 프로테오스 배지 플레이트의 3번째 중앙에 도말하였다. 상기 세포를 PDS-1000/He 유전자주입 입자 전달 시스템(Biolistic Particle Delivery system )(Bio-Rad)으로 충격을 가했다. 파열 디스크(1100 및 1350 psi)를 사용하고 플레이트를 스크린/마크로캐리어 어셈블리 9 및 12cm 아래에 위치시킨다. 상기 세포가 12 내지 24시간 동안 25℃에서 회복하도록 방치하였다. 회복시 상기 세포를 고무 스패튤라를 사용하여 플레이트로부터 긁어내어 100 μl의 배지와 혼합하고 적당한 선별 항생제를 함유하는 플레이트상에 도말하였다 25℃에서 배양 7 내지 10일 후에, 1100 및 1350 psi 파열 디스크로부터 및 9 및 12cm 거리로부터 플레이트상에 형질전환 세포를 나타내는 콜로니가 확인되었다. 콜로니를 집어내고 제2 차 선별용 선택 한천 플레이트상에 스팟팅하였다.B. G418 내성 유전자를 사용한 프로토테카의 형질전환G418에 민감한 프로토테카 모리포르미스 및 다른 프로토테카 균주는 하기된 방법을 사용하여 형질전환시킬 수 있다. G418은 80S 리보솜의 기능을 억제하여 단백질 합성을 억제하는 아미노글리코시드 항생제이다. 상기 상응하는 내성 유전자는 인산화를 통해 기능하고 G418을 불활성화시킨다. 프로토테카 균주 UTEX 1435, UTEX 1439 및 UTEX 1437은 형질전환을 위해 선택하였다. 모든 3개의 프로토테카 균주는 상기된 방법을 사용하여 유전자형 분류하였다. 모든 3개의 프로토테카 균주는 동일한 23s rRNA 게놈 서열(서열번호 15)을 가졌다.모든 형질전환 카세트는 EcoRI-SacI 단편으로서 pUC19에 클로닝하였다. 표준 분자 생물학 기술은 문헌[참조: Sambrook and Russell, 2001]에 따른 모든 벡터의 작제에 사용하였다. 클라미도모나스 레인하르드티(C. reinhardtii) 베타-튜불린 프로모터/5 'UTR을 플라스미드 pHyg3 (문헌참조: Berthold et al, (2002) Protist: 153(4), pp 401-412)로부터 EcoRI-AscI 단편으로서 PCR에 의해 수득하였다. 클로렐라 불가리스 니트레이트 리덕타제 3'UTR은 하기의 프라이머 쌍을 사용한 PCR을 통해 UTEX 균주 1803으로부터 분리된 게놈 DNA로부터 수득하였다:정배향:5' TGACCTAGGTGATTAATTAACTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCG 3'(서열번호 35)역배향:5' CTACGAGCTCAAGCTTTCCATTTGTGTTC CCATCCCACTACTTCC 3'(서열번호 36)클로렐라 소로키니아나 글루타메이트 데하이드로게나제 프로모터/UTR은 하기의 프라이머 쌍을 사용하여 UTEX 균주 1230으로부터 분리된 게놈 DNA의 PCR을 통해 수득하였다:정배향: 5' GATCAGAATTCCGCCTGCAACGCAAGG GCAGC 3' (서열번호 37)역배향: 5' GCATACTAGTGGCGGGACGGAGAGA GGGCG 3' (서열번호 38)코돈 최적화는 프로토테카 모리포르미스을 위한 표 1의 코돈을 기준으로 하였다.비-코된 최적화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(nptII) 카세트의 서열은 AscI-XhoI 단편으로서 합성하고 GenBank 승인번호 YP_788126을 기준으로 하였다. 코돈 최적화된 nptII 카세트는 또한 상기 GenBank 승인 번호를 기초로 하였다.3개의 프로토테카 균주를 상기된 유전자주입 방법을 사용하여 형질전환시켰다. 간략하게, 상기 프로토테카 균주는 종속영양으로 이들의 목적하는 세포 밀도(1 x 107 세포/ml 내지 5 x 107 세포/ml)가 될때까지 2% 글루코스를 함유하는 액체 배지에서 성장시켰다. 상기 세포를 수거하고 멸균 증류수로 1회 세척하고 1 x 108 세포/ml로 재현탁시켰다. 이어서 0.5mL의 세포를 비-선택 고체 배지 플레이트상에 도말하고 멸균 후드에서 건조되도록 방치하였다. 세포를 PDS-1000/He 유전자주입 입자 전달 시스템(BioRad)을 사용하여 충격을 가하였다. 상기 세포가 24시간 동안 25℃에서 회복하도록 방치하였다. 회복 즉시 세포를 1ml의 멸균 배지로 플레이트를 세척하고 100μg/mL의 G418을 함유하는 새로운 플레이트로 이동시켜 제거하였다. 세포가 멸균 후드에서 건조되도록 방치하고 콜로니가 3주 이하동안 실온에서 상기 플레이트상에 나타날때까지 방치하였다. UTEX 1435, UTEX 1439 및 UTEX 1437의 콜로니를 집어내고 제2차 선별을 위해 선택 한천 플레이트상에 스팟팅하였다.상기된 제2차 선택으로부터 생존한 콜로니 서브세트를 작은 용적으로 배양하고 게놈 DNA 및 RNA를 표준 분자 생물학 방법을 사용하여 추출하였다. 서던 블롯은 비형질전환된(WT) 야생형 및 형질전환체로부터 추출된 게놈 DNA 및 플라스미드 DNA에 대해서 수행하였다. 각각의 샘플 기원의 DNA를 하기의 처리 후에 0.8% 아가로스 겔에 적용하였다: 비분해된(U), AvrII(A)로 분해된, NcoI(N)로 분해된, SacI(S)로 분해된. 상기 겔 기원의 DNA를 Nylon+ 막(Amersham)상에 블롯팅하였다. 이들 막을 nptII 유전자(NeoR 프로브)의 전체 암호화 영역에 상응하는 단편으로 탐침시켰다. 도 4는 형질전환에 사용되는 카세트의 맵을 보여준다. 도 5는 베타-튜불린::neo::nit(서열번호 39)(형질전환체 1 및 2) 또는 글루타메이트 데하이드로게나제 :neo:nit(서열번호 40)(형질전환체 3)로 형질전환된 3개의 형질전환체(모두는 UTEX 균주 1435)(1, 2 및 3)에 대한 서던 블롯 분석 결과를 보여준다. 글루타메이트 데하이드로게나제:neo:nit 형질전환 플라스미드를 대조군으로서 적용하고 NcoI 및 SacI로 절단하였다. AvrII는 상기 플라스미드에서 절단하지 않는다. 비형질전환된 UTEX 균주 1435로부터 분리된 게놈 DNA는 NeoR 프로브와의 하이브리드화를 나타내지 않는다. 코돈 최적화된 글루타메이트 데하이드로게나제:neo:nit(서열번호 41) 및 코돈 최적화된 β-튜불린::neo::nit(서열번호 42) 작제물을 함유하는 추가의 형질전환체를 집어내고 서던 블롯 분석으로 분석하였다. 예상된 바와 같이, SacI을 사용한 분해물만이 선형화된 형질전환 DNA를 나타낸다. 이들 형질전환 반응은 형질전환 플라스미드의 올리고머 형태로 발생하는 통합 반응과 일치한다. 형질전환 플라스미드 DNA를 절단하는 제한 효소를 사용한 분해시에 만, 이들 분자는 형질전환 플라스미드 크기 미만으로 붕괴한다. 서던 블롯 분석은 또한 글루타메이트 데하이드로게나제::neo::nit 카세트를 사용한 프로토테카 균주 UTEX 1437 및 UTEX 1439의 형질전환시 생성된 형질전환체에 대해 수행하였다. 상기 블롯은 NeoR 프로브 프로브로 탐침하였고 상기 결과는 UTEX 1435 형질전환체와 유사하다. 상기 결과는 형질전환 플라스미드의 올리고머화 및 통합을 특징으로 하는 통합 반응을 나타낸다. 상기 유형의 통합 반응은 딕티오스텔리움 디스코이데움(Dictyostelium discoideum)에서 매우 통상적으로 발생하는 것으로 공지되어 있다(문헌참조: 예를 들어, Kuspa, A. and Loomis, W. (1992) PNAS, 89:8803-8807 and Morio et al., (1995) J. Plant Res. 108: 111-114).형질전환 플라스미드의 발현을 추가로 확인하기 위해, 노던 블롯 분석 및 RT-PCR 분석은 선택된 형질전환체에 대해 수행하였다. RNA 추출은 제조업자의 지침에 따라 Trizol 시약을 사용하여 수행하였다. 노던 블롯 분석은 문헌[참조: Sambrook and Russel, 2001]에 공개된 방법에 따라 수행하였다. 5개의 UTEX 1435 형질전환체 및 비형질전환된 UTEX 1435(대조군 레인)으로부터 분리된 총 RNA (15 μg)을 1% 아가로스-포름알데하이드 겔상에서 분리하고 나일론 막상에 블롯팅하였다. 상기 블롯은 형질전환체 1 및 3에서 전이유전자 서열에 특이적인 neo-비-최적화된 프로브에 하이브리드화하였다. 2개의 다른 형질전환체 RNA는 예상된 바와 같이 neo-전이유전자의 코돈 최적화된 버젼을 발현하고 최적화된 neo 유전자와 비최적화된 neo 유전자간의 서열 상동성을 기준으로 상당히 낮은 하이브리드화 시그날을 나타냈다. RNA (1 μg)를 비형질전환된 프로토테카 균주 UTEX 1435 및 2개의 대표적인 UTEX 1435 형질전환체로부터 추출하고 올리고 dT 프라이머 또는 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 역전사시켰다. 이어서 이들 cDNA (이중)를 하기의 프라이머(nptII)를 사용하여, SYBR-Green qPCR 화학물질을 사용하는 ABI Veriti 열 순환기상에서 qPCR 분석에 적용하였다:정배향: 5' GCCGCGACTGGCTGCTGCTGG 3' (서열번호 43)역배향: 5' AGGTCCTCGCCGTCGGGCATG 3' (서열번호 44)가능한 게놈 DNA 오염은 역전사효소 음성 대조군 샘플을 사용하지 않음에 의해 배제되었다. 상기 결과는 상기 균주를 형질전환시키기 위해 사용되는 NeoR 유전자가 형질전환체에서 활성적으로 전사됨을 지적했다.C. 분비된 이종성 슈크로스 인버타제를 사용한 프로토테카의 형질전환모든 하기의 실험은 미국 특허 제5,900,370호에 기재된 미량 무기물 및 1x DAS 비타민 칵테일(1000x 용액): 트리신: 9g의 티아민 HCL: 0.67g의 비오틴: 0.01g의 시아노코발라민(비타민 B 12): 0.008g의 칼슘 판토테네이트: 0.02g 및 p-아미노벤조산: 0.04g의 첨가와 함께 문헌[참조: Ueno et al., (2002) J Bioscience and Bioengineering 94(2): 160-65]에 기재된 기본 배지를 기본으로하는 액체 배지/한천 플레이트를 사용하여 수행하였다.2개의 플라스미드 작제물은 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 어셈블리하였다. 효모 슈크로스 인버타제 유전자(최적화된 하나의 코돈 및 최적화된 하나의 비코돈)인 suc2를 클라미도모나스 레인하르드티 베타-튜불린 프로모터/5' UTR의 조절하에 있도록 하고 클로렐라 불가리스 니트레이트 리덕타제 3' UTR을 가졌다. 비-코돈 최적화된 (Crβ-tub::NCO-suc2::CvNitRed) 작제물, 서열번호 57 및 코돈 최적화된(Crβ-tub::CO-suc2::CvNitRed) 작제물, 서열번호 58에 대한 서열(5' UTR 및 3' UTR 서열을 포함하는)은 서열목록에 열거되어 있다. 코돈 최적화는 프로토테카 종에 대한 표 1을 기초로 하였다. 도 6은 관련 제한 클로닝 부위를 갖는 2개의 작제물을 도시하고 화살표는 전사 방향을 나타낸다. 선택은 NeoR에 의해 제공되었다(표 1의 코돈 최적화된). DNA/골드 미세캐리어의 제조: DNA/골드 마이크로캐리어를 사용직전에 제조하고 마크로캐리어에 적용할때까지 빙상에 저장하였다. 상기 플라스미드 DNA (TE 완충액중)를 50 μl의 결합 완충액에 첨가하였다. 골드 비드의 포화는 3mg 골드 캐리어에 대해 15 μg 플라스미드 DNA에서 성취하였다. 상기 결합 완충액 및 DNA를 볼텍싱을 통해 잘 혼합하였다. 상기 DNA 및 결합 완충액은 골드 첨가전에 예비혼합하여 골드 캐리어 입자에 플라스미드가 균일하게 결합되도록 해야만 한다. 60 μl의 S550d (Seashell Technologies, San Diego, CA) 골드 캐리어를 DNA/결합 완충액 혼합물에 첨가하였다. 50mg/ml의 골드 스탁을 위해, 60 μl의 첨가는 15 μg DNA/3 mg 골드 캐리어의 최적의 비를 유도한다. 상기 골드 캐리어/DNA 혼합물을 1분 동안 빙상에 방치하여 항온처리하고 이어서 100 μl의 침전 완충액을 첨가하였다. 상기 혼합물을 1분 동안 빙상에 다시 방치하여 항온처리함에 이어서 간략하게 볼텍싱하고 10초 동안 실온에서 10,000rpm으로 원심분리하여 골드 캐리어를 펠렛화한다. 상기 상등액을 주의깊게 피펫으로 제거하고 상기 펠렛을 500㎕의 빙냉 100% 에탄올로 세척하였다. 상기 골드 입자를 다시 10초 동안 10,000rpm에서 원심분리하여 재펠렛화하였다. 상기 에탄올을 제거하고 50 μl의 빙냉 에탄올을 골드 혼합물에 첨가하였다. 골드를 마크로캐리어에 적용하기 직전에, 골드/에탄올은 마이크로 칩을 사용하여 MISONIX 초음파 처리기상의 2단계에서 간략하게 1 내지 2초 펄스를 가하여 재현탁시켰다. 재현탁 직후, 10 μl의 분산된 골드 입자를 마크로캐리어에 전달하고 멸균 후드에서 건조되도록 방치하였다.2개의 프로토테카 모리포르미스 균주(UTEX 1435 및 1441)를 종속영양으로 냉동보존된 바이엘로부터 2% 글루코스를 함유하는 액체 배지에서 성장시켰다. 각각의 균주를 107의 세포/ml의 밀도로 성장시켰다. 상기 씨드 배양물을 이어서 새로운 배지로 희석하여 밀도가 105 세포/ml가 되도록 하고 12 내지 15시간 동안 성장하도록 방치하여 최종 세포 밀도가 대략 106 세포/ml가 되도록 하였다. 미세조류를 50ml의 원뿔 튜브로 적정하고 3500rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상기 세포를 새로운 배지로 세척하고 3500 rpm에서 10분 동안 다시 원심분리하였다. 상기 세포를 이어서 새로운 배지에서 1.25 x 108 세포/ml의 밀도로 재현탁시켰다.멸균 후드에서, 0.4ml의 상기 제조된 세포를 제거하고 한천 플레이트(선택 제제 부재)의 중앙에 직접 위치시켰다. 상기 플레이트를 회전 모션 수준으로 약하게 빙빙 돌게하여 세포가 균등하게 3cm 이하의 직경으로 분포하도록 하였다. 상기 세포는 대략 30 내지 40분 동안 멸균 후드에서 플레이트상에서 건조되도록 방치하고 이어서 1350 psi의 파열 디스크 압력에서 충격을 가하고 플레이트가 6cm의 마크로캐리어 거리에 있도록 하였다. 상기 플레이트를 이어서 덮고 파라필름으로 감싸고 24시간 동안 낮은 광하에서 배양하도록 방치하였다.24시간 회복 후, 1 ml의 멸균 배지(글루코스 부재)를 세포 론에 첨가하였다. 상기 세포를 멸균 루프를 사용하여 재현탁시키고 환상 모션으로 세포의 론에 적용하고 재현탁된 세포를 멸균 피펫을 사용하여 수거하였다. 이어서 상기 세포를 2% 글루코스 및 100㎍/ml의 G418을 갖는 새로운 한천 플레이트상에 도말하였다. 도말한지 7일 내지 12일에 콜로니가 출현하였다. 개별 콜로니를 집어내고 2% 글루코스 및 100 μg/ml G418을 갖는 선택 배지에서 성장시켰다. 야생형(비형질전환된) 및 유전자전이 세포를 이어서 전이유전자의 성공적인 도입, 통합 및 발현에 대해 분석하였다.형질전환된 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 및 1441 및 이들의 야생형(비형질전환된) 대응물로부터의 게놈 DNA를 표준 방법을 사용하여 분리하였다. 간략하게 상기 세포를 표준 탁상 탑 에펜도르프 원심분리기(모델 5418)에서 5분 동안 14,000rpm에서 원심분리하고 DNA 추출전에 급속 동결시켰다. 세포 펠렛은 200㎕의 용해 완충액 (100 mM Tris HCl, pH 8.0, 1% 라우릴 사르코신, 50 mM NaCl, 20 mM EDTA, 0.25 M 슈크로스, 0.5 mg/ml RNase A)을 세포 100 내지 200mg(습윤 중량)에 대해 첨가하고 30초 내지 60초 동안 볼텍싱하여 용해시켰다. 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB) 및 NaCl을 각각 1% 및 1M로 하고 세포 추출물을 10분 동안 60 내지 65℃에서 항온처리하였다. 이어서, 추출물을 10분 동안 14,000rpm에서 원심분리를 통해 세정하고 수득한 상등액을 동일한 용적의 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜 (25:24:1)의 동일 용적으로 추출하였다. 이어서 샘플을 14,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 수성상을 제거하였다. DNA를 0.7 용적의 이소프로판올로 침전시켰다. 10분 동안 14,000rpm에서 원심분리를 통해 DNA를 펠렛화하고 80% 에탄올로 2회 세척하고 에탄올로 1회 세척하였다. 건조시킨 후, DNA를 10mM Tris HCl(pH 8.0)중에 재현탁시키고 DNA 농도는 PicoGreen 형광 정량 분석(Molecular Probes)을 사용하여 측정하였다.형질전환된 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 및 1441 및 이들의 야생형(비형질전환된) 대응물로부터의 RNA는 표준 방법을 사용하여 분리하였다. 간략하게 상기 세포를 표준 탁상 탑 에펜도르프 원심분리기(모델 5418)에서 5분 동안 14,000 rpm으로 원심분리하고 RNA 추출전에 급속 동결시켰다. 세포 펠렛을 1mL의 트리졸 시약(Sigma)을 세포의 100mg(습윤 중량)에 대해 첨가하고 1 내지 2분 동안 볼텍싱함에 의해 용해시켰다. 샘플을 5분 동안 실온에서 항온처리하고 이어서 트리졸 시약 1ml당 200 uL의 클로로포름으로 조정하였다. 연장된 진탕 후 세포를 냉장된 탁상 탑 소형원심분리기에서 15분 동안 14000rpm의 원심분리에 적용하였다. 상부 수성 상으로 분획화된 RNA를 제거하고 이소프로판올(1ml의 트리졸 시약 당 500ul)을 첨가하여 침전시켰다. RNA를 10분 동안 원심분리하여 수거하고 수득한 펠렛을 1ml의 80% 에탄올로 2회 세척하고 건조시키고 RNAse 유리수중에 재현탁시켰다. RNA 농도는 RiboGreen 형광 정량 분석(Molecular Probes)을 사용하여 측정하였다. G418 항생제 내성을 부여하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 및 효모 인버타제의 발현은 비형질전환된 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 및 1441 및 형질전환체 T98 (UTEX 1435 형질전환체) 및 T97 (UTEX 1441 형질전환체)에서 역전사 정량 PCR 분석(RT-qPCR)을 사용하여 분석하였다. 20 ng의 총 RNA (상기된 바와 같이 분리된)을 iScript SYBR Green RT-PCR 키트(BioRad Laboratories) 및 네오마이신 내성 유전자를 표적화하는 프라이머 쌍(정배향 프라이머 5 'CCGCCGTGCTGGACGTGGTG 3' 및 역배향 프라이머 5' GGTGGCGGGGTCCAGGGTGT 3'; 각각 서열번호 65 및 66) 및 suc2 인버타제 전사체를 표적화하는 프라이머 쌍(정배향 프라이머 5' CGGCCGGCGGCTCCTTCAAC 3' 및 역배향 프라이머 5' GGCGCTCCCGTAGGTCGGGT 3'; 각각 서열번호 67 및 68)을 사용한 1단계 RT-qPCR 분석에 적용하였다. 내인성 베타-튜불린 전사체는 상대적 전사체 수준을 평가하기 위한, PCR 증폭에 대한 내부 양성 대조군으로서 및 표준 참조물로서 작용하였다. 코돈 최적화되고 비코돈 최적화된 작제물 둘다를 사용하여 UTEX 1435 및 1441 프로토테카 모리포르미스를 상기된 바와 같이 형질전환시켰다. 처음에, 형질전환체는 상기 2개 작제물을 사용하여 수득하고 전이유전자의 존재는 서던 블롯 분석에 이어서 RTPCR로 입증하여 전이유전자 기원의 DNA 및 mRNA의 존재를 확인하였다. 서던 블롯 분석을 위해, 상기된 바와 같이 분리된 게놈 DNA를 1 x TAE 완충액중의 0.7% 아가로스 겔상에서 전기영동하였다. 겔은 문헌[참조: Sambrook et al. (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에 기재된 바와 같이 가공하였다. 프로브는 문헌[Sambrook et al]에 기재된 바와 같이 수행된 무작위 프라이밍 및 하이브리드화에 의해 제조하였다. 코돈 최적화되고 비코돈 최적화된 작제물 둘다로부터의 형질전환체는 인버타제 카세트의 존재를 나타내었고 비형질전환된 대조군은 음성이었다. 인버타제 mRNA는 또한 코돈 최적화되고 비코돈 최적화된 작제물을 갖는 형절전환체에서 검출되었다. 형질전환체가 활성 인버타제 단백질을 발현하는지의 여부를 확인하기 위해, 형질전환체를 슈크로스 플레이트상에 도말하였다. 비코돈 최적화된 카세트를 함유하는 형질전환체는 슈크로스 함유 플레이트상에서 성장하는데 실패하였고 이는 상기 유전자 및 SUC2 단백질을 암호화하는 mRNA가 존재하지만 상기 단백질은 (1) 해독되지 않거나 (2) 해독되지만 유일 탄소원으로서 슈크로스상에서 성장하는데 충분한 수준으로 축적되지 못함을 지적한다. 코돈 최적화된 카세트를 갖는 형질전환체는 슈크로스 함유 플레이트상에서 성장시켰다. 이들 형질전환체에 의해 발현된 인버타제의 수준을 평가하기 위해, 2개의 클론(T98 및 T97)을 고체 배지로부터 박리 제거된 전체 세포의 인버타제를 분석하고 직접적으로 샘플링하고 유일 탄소원으로서 2% 슈크로스를 함유하는 액체 배지에서 48시간 성장시킨 후 배양 상등액중에서의 당을 정량하였다.인버타제 분석을 위해, 세포(T98 및 T97)를 2% 슈크로스를 함유하는 플레이트상에서 성장시키고 박리 제거하고 인버타제 활성에 대해 분석하였다. 10 μl의 박리 제거된 세포는 40 μl의 5OmM NaOAc(pH 5.1)와 혼합하였다. 12.5 μl의 0.5M 슈크로스를 세포 혼합물에 첨가하고 10 내지 30분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 반응을 종료하기 위해, 75 μl의 0.2M K2HPO4를 첨가하였다. 유리된 글루코스를 분석하기 위해, 500 μl의 재구성된 시약(글루코스 옥시다제/퍼옥시다제 + o-디아니시딘)(제조원: Sigma)(GAGO-20 분석 키트)을 각각의 튜브에 첨가하고 30분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 글루코스 표준 곡선을 또한 이 시점에서 작성하였다 (범위: 25 μg 내지 0.3 μg의 글루코스). 항온처리 후, 500 μl의 6N HCl을 첨가하여 반응을 종료하고 발색되도록 하였다. 샘플은 540nm에서 판독하였다. 유리된 글루코스의 양은 수학식 y=mx+c(여기서, y는 540nm 판독값이고 x는 μg의 글루코스이다)을 사용하는 글루코스 표준 곡선으로부터 계산하였다. 글루코스 중량은 글루코스 몰로 환산하고 가수분해된 슈크로스 몰과 생성된 글루코스 몰간의 동몰 관계가 주어진 경우 데이타를 단위 시간당 가수분해된 슈크로스 몰로서 표현하였다. 상기 분석은 T98 및 T97 클론 둘다가 슈크로스를 가수분해할 수 있음을 보여주었고 이것은 기능성 슈크로스 인버타제가 세포에 의해 생성되고 분비됨을 지적한다. 48시간의 조류 성장 후 액체 배양 배지상에서의 당 분석을 위해, T97 및 T98 세포를 48시간 동안 2% 슈크로스 함유 배지에서 성장시키고 배양 배지를 당 분석을 위해 가공하였다. 각각의 형질전환체(및 음성 비-형질전환된 세포 대조군)으로부터의 배양 브로쓰를 5분 동안 14,000rpm에서 원심분리하였다. 수득한 상등액을 제거하고 HPLC/ELSD (증발 광 산란 검출)에 적용하였다. 각각의 샘플중의 당의 양은 외부 표준 및 선형 회귀 분석을 사용하여 측정하였다. 형질전환체의 배양 배지에서 슈크로스 수준은 매우 낮았다(1.2g/L 미만, 및 대부분의 경우 0g/L). 음성 대조군에서, 슈크로스 수준은 48시간의 성장 후 대략 19g/L로 높게 유지되었다. 이들 결과는 인버타제 활성 결과와 일치하고 이를 종합하면 코돈 최적화된 형질전환체 T97 및 T98이 활성 슈크로스 인버타제를 분비하여 미세조류가 유일한 탄소원으로서 슈크로스를 사용가능하게 함을 지적하는 반면, 이는 (1) 비-코돈 최적화된 형질전환체 및 (2)비-형질전환된 야생형 미세조류 둘다가 배양 배지에서 유일한 탄소원으로 슈크로스를 사용할 수 없는 것과는 대조적이다. 기능성 분비된 슈크로스 인버타제(SUC2) 전이유전자를 발현하는 프로토테카 모리포르미스 균주, T98 및 T97은 유일 탄소원으로서 슈크로스를 사용하는 성장 및 지질 생산에 대해 분석하였다.야생형(비형질전환된), T98 및 T97 균주는 종속영양 조건하에 대략 6일 동안 유일 탄소원으로서 4% 글루코스 또는 4% 슈크로스를 함유하는 성장 배지(상기된 바와 같음)에서 성장시켰다. A750 광학 밀도 판독에 의한 측정시 성장에 대해 24시간 마다 모든 4개의 샘플을 채취하고 배양물의 무수 세포 중량 및 지질 프로필을 성장 6일 후 측정하였다. 글루코스 및 슈크로스 조건 둘다에서 성장한 유전자전이 균주의 광학 밀도 판독값은 글루코스 조건에서 성장한 야생형 균주에 필적하였다. 이들 결과는 유전자전이 균주가 글루코스 조건의 야생형 균주와 동등한 비율로 유일 탄소원으로서 글루코스 또는 슈크로스상에서 성장할 수 있음을 지적한다. 비형질전환된 야생형 균주는 슈크로스 단독의 조건에서는 성장하지 않았다.글루코스상에서 성장한 야생형 균주 및 슈크로스상에서 성장한 T98 균주에 대한 바이오매쓰는 지질 프로필에 대해 분석하였다. 지질 샘플은 제조업자의 지침에 따라 산 가수분해 시스템(Acid Hydrolysis System) (Ankom Technology, NY)을 사용하여 무수 바이오매쓰(동결건조된)로부터 제조하였다. 지질 프로필 측정은 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. 유일한 탄소원으로서 글루코스상에서 성장한 비형질전환된 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 균주 및 유일 탄소원으로서 슈크로스상에서 성장한 2개의 클론 T98 균주(슈크로스 인버타제 전이유전자로 형질전환된 UTEX 1435)에 대한 지질 프로필은 표 13에 기재한다(하기, 야생형 UTEX 1435 및 T98 클론 8 및 클론 11). C:19:0 지질을 내부 계산 대조군으로서 사용하였다.용매 추출을 통해 또는 익스펠러 프레스(상기 실시예 44에 기재된 방법을 참조)를 사용하여 야생형 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435로부터 추출된 오일은 카로테노이드, 클로로프로필, 토코페롤, 다른 스테롤 및 토코트리에놀에 대해 분석하였다. 그 결과는 하기 표 14에 요약한다.G418(또는 다른 항생제) 대신 suc2 전이유전자 작제물을 함유하는 클론에 대한 선택 인자로서, 유일한 탄소원으로서 슈크로스를 사용하는 능력은 양성 suc2 유전자 형질전환체를 사용하여 평가하였다. 양성 형질전환체 서브세트는 24회 증식동안 항생제 없이 유일한 탄소원으로서 슈크로스를 함유하는 플레이트상에서 성장시켰다. 이어서 상기 클론을 유일한 탄소원으로서 글루코스 및 G418을 함유하는 플레이트에 적용하였다. 글루코스 + G418 조건상에서는 성장하지 않는 클론의 서브세트가 있고, 이는 전이유전자의 발현이 상실되었음을 지적한다. 추가의 실험은 G418이 부재이고 유일한 탄소원으로서 슈크로스를 함유하는 플레이트를 사용하고 suc2 전이유전자 발현 클론을 플레이트의 반쪽에 스트리킹하고 야생형 프로토테카 모리포르미스를 플레이트의 다른 반쪽에 스트리킹하여 수행하였다. 성장은 야생형 및 전이유전자 함유 프로토테카 모리포르미스 세포 둘다에서 나타났다. 야생형 프로토테카 모리포르미스는 슈크로스상에서 성장하는 능력을 입증하지 못하였고 따라서 상기 결과는 항생제 내성 같지 않게 슈크로스/인버타제 선택의 사용이 세포-자가가 아님을 보여준다. 상기 형질전환체는 충분한 슈크로스 인버타제를 플레이트/배지로 분비하여 슈크로스가 프럭토스 및 글루코스로 가수분해됨에 따라 야생형 성장을 지지할 가능성이 매우 높다.실시예 4: 외인성 TE 유전자를 사용한 재조합 프로토테카 상기된 바와 같이, 프로토테카 균주를 외인성 유전자로 형질전환시킬 수 있다. 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)는 상기된 방법을 사용하여 움벨루라리아 칼리프 오르니카(Umbellularia calif ornica) C12 티오에스테라제 유전자 또는 시나모뭄 캄포라 C14 티오트에스테라제 유전자(2개의 코돈은 표 1에 따라 최적화됨)로 형질전환시켰다. 형질전환 작제물 각각은 클로렐라 소로키니아나 글루타메이트 데하이드로게나제 프로모터/5 'UTR 영역(서열번호 69)를 함유하여 티오에스테라제 전이유전자의 발현을 구성시켰다. 움벨루라리아 칼리프 오르니카 C12 티오에스테라제(서열번호 70) 또는 시나모뭄 캄포라 C14 티오에스테라제(서열번호 71)의 티오에스테라제 전이유전자 암호화 영역은 각각 본래의 추정 플라스티드 표적화 서열을 갖는다. 티오에스테라제 암호화 서열 바로 뒤에 c-말단 3x-FLAG 태그의 암호화 서열(서열번호 72)에 이어서 클로렐라 불가리스 니트레이트 리덕타제 3'UTR(서열번호 73)이 있다. 프로토테카 모리포르미스 형질전환에 사용되는 티오에스테라제 작제물의 다이아그램은 도 9에 나타낸다. DNA, 골드 마이크로캐리어 및 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 세포의 제조는 실시예 3에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 수행하였다. 미세조류에 골드 마이크로캐리어-DNA 혼합물을 사용하여 충격을 가하고 2% 글루코스 및 lOOμg/ml의 G418을 함유하는 선택 플레이트상에 도말하였다. 콜로니가 7 내지 12일 동안 나타나도록 방치하고 콜로니를 각각의 형질전환 플레이트로부터 집어내고 서던 블롯 분석을 사용한 DNA 작제물 혼입에 의해 스크리닝하고 티오에스테라제 작제물의 발현은 RT-PCR을 사용하여 스크리닝하였다.양성 클론은 C12 및 C14 티오에스테라제 형질전환 플레이트 둘다로부터 집어내고 서던 블롯 분석을 사용하여 작제물 혼입에 대해 스크리닝하였다. 서던 블롯 분석은 서열번호 70 및 서열번호 71의 서열을 기초로 최적화된 c 프로브를 사용한 표준 방법(및 실시예 3에 기재된 방법)을 사용하여 수행하였다. 플라스미드 DNA로 형질전환된 것을 양성 대조군으로서 사용하였다. 작제물 혼입에 대해 양성인 클론중에서 C12 티오에스테라제 및 C14 티오에스테라제 발현에 대한 역전사 정량 PCR (RT-qPCR) 분석을 위한 서브세트를 선택하였다.RNA 분리는 상기 실시예 3에 기재된 방법을 사용하여 수행하고 양성 클론의 RT-qPCR은 제조업자의 프로토콜에 따라 하기된 프라이머 쌍 및 iScript SYBR Green RT-PCR 키트(Bio-Rad Laboratories)를 사용한 각각의 클론 기원의 총 20ng의 RNA를 사용하여 수행하였다. 야생형(비형질전환된) 프로토테카 모리포르미스 총 RNA는 음성 대조군으로서 포함되었다. mRNA 발현은 음성 대조군과 비교하여 상대적 배수 발현(RFE)으로서 표현하였다. C12 티오에스테라제 형질전환 RT-qPCR 스크리닝에 사용되는 프라이머는 다음과 같다:움벨루라리아 칼리포르니카 C 12 티오에스테라제 PCR 프라이머:정배향: 5' CTGGGCGACGGCTTCGGCAC 3' (서열번호 74)역배향: 5' AAGTCGCGGCGCATGCCGTT 3' (서여번호 75)C14 티오에스테라제 형질전환 RT-qPCR 스크리닝에서 사용된 프라이머는 다음과 같았다:시나모뭄 캄포라 C14 티오에스테라제 PCR 프라이머:정배향: 5' TACCCCGCCTGGGGCGACAC 3' (서열번호 76)역배향: 5' CTTGCTCAGGCGGCGGGTGC 3' (서열번호 77)양성 클론중에서 C12 티오에스테라제 발현에 대한 RT-qPCR 결과는 음성 대조군과 비교하여 약 40배 내지 2000배 초과로 발현이 증진된 RFE를 보여주었다. 유사한 결과는 음성 대조군과 비교하여 약 60 배 내지 1200배 초과로 발현이 증가된 RFE와 함께 양성 클론에서 C14 티오에스테라제 발현이 나타났다.각각의 형질전환체로부터 양성 클론의 서브세트(서던 블롯팅 및 RT-qPCR 분석에 의해 스크리닝된 바와 같이)를 선택하고 질소 풍부 조건하에서 성장시키고 총 지질 생산 및 프로필에 대해 분석하였다. 지질 샘플은 각각의 클론으로부터 건조된 바이오매쓰로부터 제조하였다. 각각의 유전자전이 클론 기원의 20 내지 40 mg의 무수 바이오매쓰는 MeOH중 2ml의 3% H2SO4중에 재현탁시키고 적합한 내부 표준물(C19:0)의 적당량을 함유하는 200ul의 톨루엔을 첨가하였다. 상기 혼합물을 간략하게 초음파 처리하여 바이오매쓰를 분산시킴에 이어서 2시간 동안 65 내지 70℃에서 가열하였다. 2 mL의 헵탄을 첨가하여 지방산 메틸 에스테르를 추출함에 이어서 2ml의 6% K2CO3(aq)를 첨가하여 산을 중화시켰다. 상기 혼합물을 왕성하게 진탕시키고 상부층 일부를 표준 FAME GC/FID(지방산 메틸 에스테르 가스 크로마토그래피 플레임 이온화 검출) 방법을 사용한 가스 크로마토그래피 분석을 위해 Na2SO4(무수)를 함유하는 바이엘에 이동시켰다. 야생형 음성 대조군과 비교하여 양성 클론의 지질 프로필(면적%로서 표현됨)은 하기 표 15 및 16에 요약한다. 표 15에 나타낸 바와 같이, C12 형질전환체중 C12 생산의 배수 증가는 약 5배 증가(클른 C12-5) 내지 11배 초과의 증가(클론 C12-1) 범위이다. C14 형질전환체중에서 C14 생산의 배수 증가는 약 1.5배 증가 내지 약 2.5배 증가 범위이다상기된 실험은 형질전환 결과로서 전이유전자의 성공적인 발현 뿐만 아니라 발현 단백질의 플라스티로의 올바른 표적화 및 기능성 효과를 포함하는 2개의 상이한 티오에스테라제(C12 및 C14)의 전이유전자 작제물을 사용한 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)의 성공적인 형질전환(예상되는 지질 프로필의 변화)을 나타낸다. 동일한 형질전환 실험은 지질 프로필에 어떠한 변화를 나타내지 않는 본래의 플라스티드 표적화 서열(서열번호 78)와 함께 표 1에 따라 코돈 최적화된 쿠에파 후케리아나 C8-C10 티에오에스테라제 암호화 영역을 함유하는 발현 작제물을 사용하여 수행하였다. 쿠페아 후케리아나 C8-C10 전이유전자의 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)로의 도입이 성공적이고 서던 블롯 분석에 의해 확인되었지만 C8 또는 C10 지방산 생산에서는 야생형 균주와 비교하여 형질전환체에서 어떠한 변화가 검출되지 않았다. 실시예 5: 조류 플라스티드 표적화 서열을 갖는 외인성 시물 TE를 사용한 프로토테카 모리포르미스 균주의 생성조류 엽록체/플라스티드 표적화 서열이 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)에서 중간 쇄(C8-C14) 티오에스테라제 발현 및 후속적 중간 쇄 지질 생산을 개선시키는지의 여부를 조사하기 위해, 여러 추정 조류 플라스티드 표적화 서열을 클로렐라 프로토테코이데스 및 프로토테카 모리포르미스로부터 클로닝하였다. 쿠페아 훅케리아나 C8-C10 티오에스테라제, 움벨루라리아 칼리프 오르니카 C12 티오에스테라제 및 시나모뭄 캄포라 C14 티오에스테라제를 기본으로 하는 티오에스테라제 작제물을, 클로렐라 소로키니아나 글루타메이트 데하이드로게나제 프로모터/5'UTR 및 클로렐라 불가리스 니트레이트 리덕타제 3'UTR을 사용하여 제조된 것을 사용하여 제조하였다. 티오에스테라제 암호화 서열은 본래의 플라스티드 표적화 서열을 제거하고 이들을 클로렐라 프로토테코이데스 및 프로토테카 모리포르미스 게놈 기원의 플라스티드 표적화 서열로 대체함에 의해 변형시켰다. 티오에스테라제 발현 작제물 및 이들의 상응하는 서열 동일성 번호는 하기에 열거한다. 각각의 형질전환 플라스미드는 또한 상기 실시예 3에 기재된 것과 동일한 Neo 내성 작제물을 함유하였다. 추가로, 또 다른 조류-유래 프로모터, 클라미도모나스 레인하르드티 β-튜불린 프로모터는 또한 티오에스테라제 작제물과 연계하여 시험하였다. "본래의" 플라스티드 표적화 서열은 고등 식물 티오에스테라제 플라스티드 표적화 서열을 언급한다. 이들 실험에 사용된 작제물의 요약은 하기에 제공한다:각각의 작제물을 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)로 형질전환시키고 상기 실시예 4에 기재된 방법을 사용한, G418을 사용하여 선택하였다. 각각의 형질전환체로부터 여러 양성 클론을 집어내고 서던 블롯팅 분석을 사용하여 티오에스테라제 전이유전자의 존재에 대해 스크리닝하였다. 티오에스테라제 전이유전자의 발현은 RT-PCR을 사용하여 확인하였다. 각각의 형질전환으로부터 양성 클론(서던 블롯팅 분석 및 RT-PCR에 의해 확인된 바와 같이)의 서브세트를 선택하고 지질 프로필 분석을 위해 성장시켰다. 지질 샘플은 각각의 클론의 무수 바이오매쓰 샘플로부터 제조하고 지질 프로필 분석은 실시예 4에 기재된 가수분해 방법을 사용하여 수행하였다. 티오에스테라제 전이유전자에 상응하는 지방산의 면역 %의 변화를 야생형 수준 및 본래의 플라스티드 표적화 서열을 갖는 티오에스테르라제로 형질전환된 클론과 비교하였다.실시예 4에 언급된 바와 같이, 본래의 플라스티드 표적화 서열을 갖는 쿠에파 후케리아나 C8-C10 티오에스테라제 작제물로 형질전환된 클론은 야생형과 동일한 수준의 C8 및 C10 지방산을 가졌다. 조류 플라스티드 표적화 서열을 갖는 쿠에파 후케리아나 C8-C10 티오에스테라제 작제물(작제물 1-3)로 형질전환된 클론은 야생형과 비교하여 작제물 3에 있어서 C10 지방산이 10배 이상 증가하였고 작제물 1 및 2에 있어서 C10 지방산이 40배 이상 증가하였다. 본래의 플라스티드 표적화 서열을 갖는 움벨루라리아 칼리프 오르니카 C12 티오에스테라제 작제물로 형질전환된 클론은 야생형과 비교하여 C12 지방 수준에 있어서 중간 정도의 6 내지 9배의 증가를 가졌다. 조류 플라스티드 표적화 작제물(작제물 4 내지 7)을 갖는 움벨루라리아 칼리프 오르니카 C12 티오에스테라제 작제물로 형질전환된 클론은 (모두 야생형과 비교하여) 작제물 4에 있어서 C12 지방산 수준이 80배 이상 증가하였고 작제물 6에 있어서 C12 지방산이 약 20배 증가하였고 작제물 7에 있어서 C12 지방산 수준이 약 10배 증가하였고 작제물 5에 있어서 C12 지방산 수준이 약 3배 증가하였다. 본래의 플라스티드 표적화 서열을 갖는 시노모뭄 캄포라 C14 티오에스테라제 또는 작제물 8(클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일 ACP 데사투라제 플라스티드 표적화 서열을 갖는)로 형질전환된 클론은 야생형과 비교하여 C14 지방산 수준이 2 내지 3배 증가하였다. 일반적으로, 조류 플라스티드 표적화 서열 티오에스테라제 작제물로 형질전환된 클론은 본래의 고등 식물 표적화 서열을 사용하는 경우 보다 상응하는 쇄 길이의 지방산 수준이 보다 높은 배수로 증가하였다.A. 클라미도모나스 레인하르티 β-튜불린 프로모터추가의 이종성 티오에스테라제 발현 작제물은 클로렐라 소로키니아나 글루타메이트 데하이드로게나제 프로모터 대신 클라미도모나스 레인하르드티 β-튜불린 프로모터를 사용하여 제조하였다. 작제물 요소 및 발현 작제물의 서열은 상기 열거되어 있다. 각각의 작제물은 상기된 방법을 사용하여 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 숙주 세포로 형질전환시켰다. 지질 프로필은 각각의 작제물에 대한 양성 클론의 서브세트로부터 제조하여 각각의 작제물의 성공 및 생산성을 평가하였다. 상기 지질 프로필은 야생형 숙주 세포에 대한 지방산 수준(면적%로 표현함)을 비교한다. "평균" 칼럼은 양성 클론의 서브세트의 수치 평균을 나타낸다. "샘플" 칼럼은 스크리닝된 최상의 양성 클론(상응하는 쇄길이의 지방산 생산의 면적%에서 최상의 변화를 생성하는 샘플이 최상인 것으로서 정의된다)을 나타낸다. "저-고" 칼럼은 스크리닝된 클론으로부터 최저의 면적% 및 최고의 면적%를 나타낸다. 작제물 9 내지 23의 지질 프로필 결과는 하기에 요약한다.작제물 9-13은 쿠페아 훅케리아나 C8-C10 티오에스테라제 작제물을 함유하는 발현 벡터이다. 상기 데이타 용약에서 알 수 있는 바와 같이, 최상의 결과는 작제물 11에서 나타나고 샘플 C8 지방산은 1.57면적%(야생형 0과 비교하여)이고 C10 지방산은 6.76의 면적%(야생형 0과 비교하여)를 나타낸다. 또한 C12 지방산에서는 약간의 증가(대략 2 내지 5배 증가)가 있었다. 본래의 플라스티드 표적화 서열은 클로렐라 소로키니아나 글루타메이트 데하이드로게나제 프로모터의 조절하에 있는 경우 어떠한 변화를 나타내지 않고, 클라미도모나스 레인하르드티 β-튜불린 프로모터에 의해 구동되는 동일한 발현 작제물은 숙주 세포에서 C8-C10 지방산에서 상당한 변화를 나타냈다. 이것은 추가로 프로토테카 종에서 티오에스테라제의 이종성 발현의 특이성에 대해 추가의 증거가 있다. 클라미도모나스 레인하르드티 β-튜불린 프로모터 C8-C10 티오에스테라제 작제물을 함유하는 모든 클론은 클로렐라 소로키니아나 글루타메이트 데하이드로게나제 프로모터 C8-C10 티오에스테라제 작제물을 함유하는 클론 보다 C8-C10 지방산에서 보다 크게 증가하였다. 작제물 13에 대한 지질 프로필 데이타는 수득되지 않았고 따라서 상기에 포함되지 않았다. 작제물 14-18은 움벨루라리아 칼리프 오르니카 C12 티오에스테라제 작제물을 함유하는 발현 벡터이었다. 상기 데이타 요약에서 알 수 있는 바와 같이, 최상의 결과는 작제물 15(프로토테카 모리포르미스 이소펜테닐 디포스페이트 신타제 플라스티드 표적화 서열) 및 17(클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일 ACP 데사투라제 플라스티드 표적화 서열)에서 나타났다. C12 지방산 생산에서 최상의 변화는 작제 17에서 나타났고 C12 지방산 수준은 야생형에서 0.04 면적%인 것과 비교하여 14.11 면적%이하였다. 약간의 변화(약 2배)가 또한 C14 지방산 수준에서 나타났다. 동일한 작제물과 클로렐라 소로키니아나 글루타메이트 데하이드로게나제 프로모터를 비교하는 경우, 클라미도모나스 레인하르드티 β-튜불린 프로모터-클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일 ACP 데사투라제에서 동일한 경향이 나타났고 프로토테카 모리포르미스 이소펜테닐 디포스페이트 신타제 플라스티드 표적화 서열은 2개의 프로모터와 함께 C12 지방산 수준에서 가장 큰 변화를 나타냈다.작제물 19-23은 시나모뭄 캄포라 C14 티오에스테라제 작제물을 함유하는 발현 벡터였다. 상기 데이타 요약에서 알 수 있는 바와 같이, 최상의 결과는 작제물 22 및 23에서 나타났다. C14 지방산 생산에서 가장 큰 변화는 작제물 22에서 나타났고 C14 지방산 수준은 야생형에서 1.40%인 것과 비교하여 (C140 및 C141에 대한 수치가 조합되는 경우) 17.35면적%였다. C12 지방산의 변화를 또한 나타냈다(5 내지 60배). 동일한 작제물과 클로렐라 소로키니아나 글루타메이트 데하이드로게나제 프로모터를 비교하는 경우, 클라미도모나스 레인하르드티 β-튜불린 프로모터-클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일 ACP 데사투라제에서도 동일한 경향이 나타났고 프로토테카 모리포르미스 스테아로일 ACP 데사투라제 플라스티드 표적화 서열은 2개의 프로모터와 함께 C14 지방산 수준에서 최고의 변화를 나타냈다. 모든 티오에스테라제 발현 작제물과 일치되게, 클라미도모나스 레인하르드티 β-튜불린 프로모터 작제물은 클로렐라 소로키니아나 글루타메이트 데하이로게나제 보다 C8-14 지방산 수준에서 보다 큰 변화를 나타내었다. 작제물 22로부터 2개의 양성 클론을 선택하고 고선택압(50mg/L G418)하에서 성장시켰다. 배양 6일 후, 상기 클론을 수거하고 이들의 지질 프로필은 상기된 방법을 사용하여 측정하였다. 지질 프로필 데이타는 하기에 요약하고 면적%로 표현하였다.일정한 고 선택압하에 성장하는 경우 2개의 클론은 C14 및 C12 지방산의 양이 상기 작제물 22에서 나타난 수준 보다 약 2배 증가하였다. 이들 클론은 야생형 세포에서 C12-14 지방산이 1.5면적%인 것과 비교하여 C12-14 지방산이 30면적% 이상이었다. 실시예 6: 프로토테카에서 쿠페아 팔루스트리스 및 울무스 아메리칸카 티오에스테라제의 이종성 발현프로토테카 종에서 상기된 이종성 발현 티오에스테라제가 성공한 경우, 쿠페아 팔루스트리스 및 울무스 아메리카타 기원의 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 코돈 최적화된(표 1에 따라) 서열을 함유하는 발현 카세트를 작제하고 하기한 바와 같다.울무스 아메리카나 (코돈 최적화된 암호화 서열)는 상기 발현 카세트로 삽입될 수 있다. 울무스 아메리카나 티오에스테라제에 대한 본래의 플라스티드 표적화 서열이 부재인 코돈 최적화된 암호화 서열은 서열번호 108로서 기재되고 임의의 목적하는 플라스티드 표적화 서열 및 발현 요소(즉, 프로모터/5'UTR 및 3'UTR)와 융합될 수 있다. 이들 발현 카세트로 상기된 방법을 사용하여 프로토테카를 형질전환시킬 수 있다. 양성 클론은 발현 작제물상에 항생제 내성 유전자(예를 들어, neoR)를 포함하여 스크리닝될 수 있고 G418 함유 플레이트/배지상에서 스크리닝하였다. 양성 클론은 이종성 티오에스테라제 암호화 영역에 특이적인 프로브와 함께 서던 블롯 분석을 사용하여 확인할 수 있고 작제물의 발현은 또한 이종성 티오에스테라제의 암호화 영역에 특이적인 RT-PCR 및 프라이머를 사용하여 확인될 수 있다. 양성 클론의 2차 확인은 숙주 세포의 지질 프로필에서 지방산의 수준 변화를 관찰하여 성취할 수 있다. 상기 실시예에 나타낸 바와 같이, 프로토테카 종에서 티오에스테라제의 이종성 발현은 특정 티오에스테라제에 특이적일 수 있다. 프로모터 요소 및 플라스티드 표적화 서열(및 다른 발현 조절 요소)은 티오에스테라제의 발현(및 상응하는 지방산의 후속적인 증가)이 목적하는 수준에 도달할때까지 상호 변화될 수 있다. 실시예 7: 이중 형질전환체 - 2개 이종성 단백질의 동시 발현미세조류 균주 프로토테카 모리포르미스 (UTEX 1435)를 에스. 세레비지애 인버타제의 분비된 형태를 암호화하는 효모 슈크로스 인버타제 suc2 유전자를 함유하는 발현 작제물과 함께 상기된 방법을 사용하여 형질전환시켰다. 상기 유전자의 성공적인 발현 및 세포막주변으로의 표적화는 종속영양 조건에서 유일 탄소원으로서 슈크로스상에서 성장하는(이를 사용하는) 숙주 세포의 능력을 유도한다(상기 실시예 3에서 입증된 바와 같이). 발현된 유전자의 제2 세트는 아실 운반 단백질로부터 아실 잔기의 절단에 관여하는 티오에스테라제이다. 구체적으로, 티오에스테라제는 쿠페아 후케리아나(C8-10 선호 티오에스테라제), 움벨루라리아 칼리포르니카(C12 선호 티오에스테라제), 및 시나모뭄 캄포라(C14 우선 티오에스테라제)로부터 기원한다. 이들 티오에스테라제 발현 카세트는, (상기 실시예에서) 본래의 고등 식물 플라스티드 표적화 서열 보다 최적인 것으로 나타난 프로토테카 모리포르미스 또는 클로렐라 프로토테코이데스 기원의 N-말단 미세조류 플라스티드 표적화 서열과의 융합체로서 클로닝하였다. 티오에스테라제 유전자의 성공적인 발현과 플라스티드로의 표적화는 숙주 세포내에서 지방산 프로필의 측정가능한 변화를 유도하였다. 프로필에서 이들 변화는 각각의 티오에스테라제의 효소적 특이성 또는 선호도와 일치한다. 하기에서 프로토테카 모리포르미스 (UTEX 1435)로 어셈블리되고 형질전환된 이중 발현 작제물은 하기에 요약한다. 각각의 작제물은 클라미도모나스 레인하르드티 β-튜불린 5'UTR/프로모터의 조절하에 효모 suc2 유전자를 함유하고 클로렐라 불가리스 니트레이트 리덕타제 3'UTR 및 클로렐라 소로키니아나 글루타메이트 데하이드로게나제 5'UTR의 조절하의 본래의 서열을 대체하는 미세조류 플라스티드 표적화 서열을 갖는 고등 식물 티오에스테라제를 함유하며 클로렐라 불가리스 니트레이트 리덕타제 3'UTR을 함유하였다. 하기에서 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)로 어셈블리되고 형질전환된 작제물의 티오에스테라제 부분을 요약한다. suc2 유전자 및 티오에스테라제 유전자를 갖는 전체 이중 발현 카세트는 서열 확인 목록에 열거한다. 실시예 5에 기재된 티오에스테라제 카세트를 갖는 유사한 이중 발현 작제물(예를 들어, 클라미도모나스 레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5' UTR와 같은 상이한 프로모터의 조절하에)은 또한 표준 분자 생물학 방법 및 본원에 기재된 방법을 사용하여 제조할 수 있다.각각의 발현 작제물을 함유하는 양성 클론은 슈크로스 함유 플레이트상에서 성장하는 이들의 능력을 사용하여 스크리닝하였고, 여기서 슈크로스는 선택 인자로서 유일한 탄소원이다. 각각의 작제물 형질전환 기원의 이들 양성 클론의 서브세트를 선택하고 발현 작제물의 존재는 서던 블롯 분석을 사용하여 확인하였다. 효모 슈크로스 인버타제의 기능은 또한 슈크로스 가수분해 분석을 사용하여 확인하였다. 양성 클론을 선택하고 40g/L의 출발 농도에서 유일한 탄소원으로서 슈크로스 함유 배지에서 성장시켰다. 동일한 40g/L 출발 농도에서 유일한 탄소원으로서 글루코스를 함유하는 배지에서 성장한 야생형 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)의 음성 대조군을 또한 포함시켰다. 슈크로스의 사용은 슈크로스-특이적 막을 갖는 YSI 2700 생화학 분석기를 사용하여 배지중의 슈크로스 수준을 측정하므로써 실험 과정 전반에 걸쳐 측정하였다. 배양 6일 후, 배양물을 수거하고 상기된 바와 동일한 방법을 사용하여 지질 프로필에 대해 가공하였다. 지질 프로필 결과는 하기 표 17에 요약하고 면적%로 나타낸다. 슈크로스 이용 분석을 위해 선택된 모든 양성 클론은 배지에서 및 6일 배양 기간 말기에 슈크로스를 가수분해시킬 수 있고 배지에는 어떠한 측정 가능한 수준의 슈크로스가 없다. 양성 클론에 대한 선택 도구로서 슈크로스의 성공적인 사용 뿐만 아니라 상기 데이타는 외인성 효모 suc2 슈크로스 인버타제 유전자가 형질전환체에서 올바르게 표적화하고 발현되었음을 지적한다. 상기 표 17에 나타낸 바와 같이, 작제물 24(C8-10 티오에스테라제)를 발현하는 클론은 C10 지방산이 측정가능하게 증가(8배 증가와 같이 높게)하였다. 또한, 상응하는 배지 쇄 지방산에서 작제물 25(C12 티오에스테라제) 및 작제물 26(C14 티오에스테라제)(C 14 티오에스테라제)를 발현하는 클론에서 측정가능한 증가를 나타내었다. 이를 종합하면, 상기 데이타는 2개의 재조합 단백질(예를 들어, 슈크로스 인버타제 및 지방산 아실-ACP 티오에스테라제)에서의 성공적인 동시 발현을 보여주고, 이 둘다는 숙주 기관상에 유용하고 정량가능한 표현형 변화를 부여한다실시예 8: C14 티오에스테라제 형질전환체에서 C10-C14 지방산 생산에 대한 글리세롤의 효과모든 티오에스테라제 형질전환 기원의 클론을 선택하고 추가로 평가하였다. 작제물 8을 발현하는 하나의 클론(시나모뭄 캄포라 C14 TE)을 종속영양으로 상이한 탄소원으로서 단독의 글루코스, 단독의 프럭토스 및 단독의 글리세롤을 사용하여 성장시켰다. 상기 단독의 글루코스 조건은 단독의 프럭토스 및 단독의 글리세롤 조건과 비교하는 경우 보다 높은 세포 성장 및 지질 총 생산을 유도하였다. 그러나, 단독의 글리세롤 조건에서 생성된 C12-14 지방산의 생산은 단독의 글루코스 조건에서 달성되는 것 보다 2배 이상 높았다. 실시예 9: 프로토테카 모리포르미스에서 아라비도프시스 탈리아나 인버타제의 발현미세조류 균주 모리포르미스(UTEX 1435)는 아라비도프시스 탈리아나 기원의 코돈 최적화된(표 1에 따른) 세포벽 연합 인버타제를 함유하는 발현 작제물로 상기된 방법을 사용하여 형질전환시켰다. 아라비도프시스 인버타제 서열은 효모 인버타제(SUC2 단백질) 기원의 N-말단 39개 아미노산을 포함하도록 변형시켜 ER 및 궁극적으로 세포막주변으로 효율적으로 표적화되는 것을 확실히 한다. 검출을 보조하기 위해, 플래그(Flag) 에피토프를 재조합 단백질의 C-말든으로 첨가하였다. 전이유전자를 클로렐라 소로키니아나 글루타메이트 데하이드로게나제 프로모터/5' UTR 영역 및 클로렐라 불가리스 니트레이트 리덕타제 3'UTR 영역과 함께 발현 벡터에 클로닝시켰다. 상기 전이유전자 카세트의 DNA 서열은 서열번호 89로서 기재되고 해독된 아미노산 서열은 서열번호 90으로서 기재한다. 양성 클론을 슈크로스 함유 배지/플레이트를 사용하여 스크리닝하고 선택하였다. 양성 클론의 서브세트는 플래그 태그된 인버타제에 대한 서던 블롯 분석 및 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 전이유전자의 존재 및 인버타제의 발현에 대해 확인하였다. 이들 스크리닝으로부터 10개의 양성 클론은 지질 생산성 및 슈크로스 이용 분석을 위해 선택하였다. 모든 10개의 클론을 유일 탄소원으로서 슈크로스를 함유하는 배지상에서 성장시키고 양성 대조군 suc2 인버타제 형질전환체를 또한 포함시켰다. 음성 대조군인 야생형 프로토테카 모리포르미스를 또한 글루코스 함유 배지상에서 성장시켰다. 6일 후, 상기 세포를 수거하고 건조시키고 무수 세포 중량을 기준으로 총 % 지질을 측정하였다. 상기 배지를 또한 총 슈크로스 소비에 대해 분석하였다.모든 10개의 양성 클론은 슈크로스를 가수분해시킬 수 있지만 대부분의 클론은 실험 말기에 무수 세포 중량에 의해 측정된 바와 같이 야생형 또는 양성 대조군 suc2 효모 인버타제 형질전환체의 약 절반 정도로 성장하였다. 유사하게, 모든 10개의 양성 클론은 야생형 또는 양성 대조군 형질전환체와 비교하는 경우 약 절반 정도로 총 지질을 생성하였다. 이러한 데이타는 프로토테카에서 다양한 슈크로스 인버타제의 성공적인 이종성 발현을 입증한다. 실시예 10: 프로토테카 크루가니, 프로토테카 스타그노라 및 프로토테카 조프피에서 효모 인버타제 (suc2)의 이종성 발현프로토테카 속의 종에 사용하기 위한 형질전환 방법의 일반적인 적용성을 시험하기 위해, 3개의 다른 프로토테카 종을 선택하였다: 프로토테카 크루가니 (UTEX 329), 프로토테카 스타그노라(UTEX 1442) 및 프로토테카 조프피 (UTEX 1438). 이들 3개의 균주를 실시예 1에 기재된 배지 및 조건에서 성장시키고 이들 지질 프로필을 상기된 방법을 사용하여 측정하였다. 3개의 프로토테카 균주 기원의 지질 프로필은 하기에 면적%로서 요약한다.이들 3개의 균주는 상기 실시예 3에 기재된 방법을 사용하여 효모 인버타제(suc2) 발현 카세트(서열번호 58)로 형질전환시켰다. 상기 효모 인버타제(suc2) 발현 카세트는 실시예에서 상기 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)에서 작용하는 것으로 입증되었다. 상기 형질전환체는 슈크로스 함유 플레이트/배지를 사용하여 스크리닝하였다. 각각의 프로토테카 종에 대한 양성 클론의 서브세트를 선택하고 전이유전자의 존재는 서던 블롯 분석으로 확인하였다. 각각의 종으로부터 기원하는 확인된 양성 클론중 10개는 슈크로스 가수분해 분석 및 지질 생산성에 대해 선택하였다. 상기 클론을 유일 탄소원으로서 슈크로스를 함유하는 배지에서 성장시키고 글루코스상에서 성장한 이의 야생형 대응물과 비교하였다. 6일 후, 상기 배양물을 수거하고 건조시키고 총 % 지질 및 무수 세포 중량을 평가하였다. 각각의 배양물 기원의 배지를 또한 실험 과정 동안 슈크로스 함량에 대해 YSI12700 생화학 분석기를 사용하여 슈크로스 가수분해에 대해 분석하였다. 모든 3개의 종 기원의 클론은 슈크로스를 가수분해시킬 수 있고 프로토테카 스타그노라 및 프로토테카 조프피 형질전환체는 프로토테카 크루가니 보다 효율적으로 슈크로스를 가수분해시킬 수 있다. 3개의 형질전환체 종의 총 지질 생산 및 무수 세포 중량을 글루코스상에서 성장한 이들의 야생형 대응물에 상응하였다. 상기 데이타는 프로토테카 속의 다중 종에서 성공적인 형질전환 및 발현 외인성 유전자를 입증한다. 실시예 11: 미세조류에서 사용하기 위한 조류 유래 프로모터 및 유전자A. 클로렐라 프로토테코이데스 기원의 5'UTR 및 프로모터 서열cDNA 라이브러리를 표준 기술을 사용하여 혼합영양(mixotrophically)으로 성장한 클로렐라 프로토테코이데스(UTEX 250)로부터 생성하였다. cDNA 서열을 기준으로, 씨진의 DNA 워킹 키트(Seegene's DNA Walking kit)(Rockville, MD)를 사용하여 암호화 영역의 업스트림을 "워크(walk)"하기 위해 특정 공지된 하우스키핑(housekeeping) 유전자에서 디자인하였다. 분리된 서열은 액틴(서열번호 31) 및 연장 인자-Ia(EFIa)(서열번호 32) 프로모터/UTR를 포함하고 이 둘다는 인트론(하한부에 나타낸 바와 같이) 및 엑손(이탤릭체의 상한부) 및 예측된 개시 부위(볼드체) 및 2개의 베타-튜불린 프로모터/UTR 요소, 이소형 A (서열번호 33) 및 이소형 B (SEQ ID NO:34)를 함유한다.B. 클로렐라 프로토테코이데스 기원의 지질 생합성 효소 및 플라스티드 표적화 서열상기된 cDNA 라이브러리로부터, 클로렐라 프로토테코이데스(UTEX 250)에서 지질 대사에서 작용성인 단백질을 암호화하는 3개의 cDNA를 상기된 바와 동일한 방법을 사용하여 클로닝하였다. 아실 ACP 데사투라제(서열번호 45 및 46) 및 2개의 게라닐 게라닐 디포스페이트 신타제(서열번호 47 내지 50)에 대한 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 하기 서열목록에 포함된다. 추가로, 플라스티드에 표적화하는 추정 시그날 서열을 갖는 3개의 cDNA를 또한 클로닝하였다. 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(서열번호 51 및 52)에 대한 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열, 산소 방출 복합 단백질 OEE33(서열번호 53 및 54) 및 CIp 프로테아제(서열번호 55 및 56)은 하기 서열목록에 포함된다. 추정 플라스티드 표적화 서열은 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열 둘다에서 밑줄쳐져 있다. 상기 플라스티드 표적화 서열은 지질 변형 효소와 같은 전이유전자 생성물을 미생물의 플라스티드에 표적화시키는데 사용될 수 있다. 실시예 12: 프로토테카 모리포르미스로부터 질소 반응성인 5'UTR/프로모터cDNA 라이브러리는 표준 기술을 사용하여 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)로부터 작제하였다. 상기 프로토테카 모리포르미스를 질소 풍부 조건하에서 48시간 동안 성장시켰다. 이어서 5%의 접종물(v/v)을 낮은 질소로 이동시키고 상기 세포를 7일 동안 24시간 마다 수거하였다. 배양 약 24시간 후, 배지내 질소 공급은 완전히 고갈되었다. 수거된 샘플은 무수 빙상 및 이소프로판올을 사용하여 즉시 동결시켰다. 후속적으로 총 RNA는 동겨된 세포 펠렛 샘플로부터 분리하고 각각의 샘플로부터 기원하는 일부는 RT-PCR 연구를 위해 보존하였다. 상기 샘플로부터 수거된 총 RNA의 나머지는 폴리A 선택에 적용하였다. 이어서 각각의 조건으로부터 동몰량의 폴리A 선택된 RNA를 모으고 이를 사용하여 벡터 pcDNA 3.0(Invirogen)중에서 cDNA 라이브러리를 작제하였다. 대략적으로 1200개 클론을 무작위로 수득한 모아진 cDNA 라이브러리로부터 집어내고 양쪽 가닥상의 서열분석에 적용하였다. 대략적으로 68개의 상이한 cDNA는 이들 1200개의 서열로부터 선택하고 이를 사용하여 실시간 RT-PCR 연구에 사용하기 위한 cDNA 특이적 프라이머를 디자인하였다. 보존된 세포 펠렛 샘플로부터 분리된 RNA를 상기 생성된 cDNA 특이적 프라이머를 사용한 실시간 RT-PCR 연구에서 기질로서 사용하였다. 상기 보존된 RNA를 cDNA로 전환시키고 68개 유전자 특이적인 프라이머 세트 각각에 대한 RT-PCR의 기질로서 사용하였다. 역치 사이클 또는 CT 수를 사용하여 시간 전반에 걸쳐 수거된 각각의 RNA 샘플내에서 68개 cDNA 각각에 대한 상대적인 전사체 풍부함을 나타내었다. 질소 풍부와 질소 고갈된 조건간의 상당한 증가(3배 초과)를 나타내는 cDNA는 잠재적인 유전자로서 플래그하고 이의 발현은 질소 고갈에 의해 상향조절된다. 명세서에서 논의된 바와 같이, 질소 고갈/제한은 유성 미생물에서 지질 합성의 공지된 유도인자이다.질소 고갈/제한 동안에 발현이 상향조절되는 cDNA 기원의 추정 프로모터/5'UTR 서열을 동정하기 위해, 총 RNA를 질소 풍부 조건하에서 성장한 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)로부터 분리하고 이어서 454 서열분석 기술(Roche)를 사용하는 서열분석에 적용하였다. 상기 RT-PCR 결과에 의해 상향 조절된 바와 같은 플래그된 cDNA는 454 게놈 서열분석 판독으로부터 비롯된 어셈블리된 콘티그에 대한 BLAST를 사용하여 비교하였다. cDNA의 5' 말단은 특이적 콘티그로 맵핑하고 가능한 경우 500bp 초과의 5' 플랭킹 DNA를 사용하여 추정적으로 프로모터/UTR을 동정하였다. 이어서 프로모터/5'UTR의 존재는 게놈 DNA의 PCR 증폭을 사용하여 확인하고 클로닝하였다. 개별 cDNA 5' 말단을 사용하여 3' 프라이머를 디자인하고 454 콘티그 어셈블리의 5' 말단을 사용하여 5' 유전자 특이적 프라이머를 디자인하였다.제1 스크리닝으로서, 추정 프로모터중 하나인 Aat2(암모늄 수송체, 서열번호 99)로부터 분리된 5'UTR/프로모터를 상기 실시예 5에 기재된 클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일 ACP 데사투라제 수송 펩타이드와 함께 시나모뭄 캄포라 C14 티오에스테라제 작제물에 클로닝하여 클로렐라 소로키니아나 글루타메이트 데하이드로게나제 프로모터를 대체한다. 상기 작제물을 서열번호 112로서 나타낸다. 추정 프로모터를 시험하기 위해, 티오에스테라제 작제물을 프로토테카 모리포르미스 세포로 형질전환시켜 상기된 방법을 사용하여 낮은/무 질소 조건하에서 C14/C12 지방산 증가에 대해 스크리닝하여 실제 프로모터 활성을 확인하였다. cDNA/게놈 스크리닝으로부터 분리된 추정 질소 조정된 프로모터의 유사한 실험은 동일한 방법을 사용하여 수행할 수 있다.cDNA/게놈 스크리닝으로부터 분리된 또 다른 추정 질소-조절된 프로모터/5' UTR은 다음과 같다:실시예 13: 프로토테카 종에서 상동성 재조합 전이유전자의 상동성 재조합은 상기 실시예에 기재된 형질전환 방법 보다 여러 잇점을 갖는다. 첫번째로, 상동성 재조합 없이 전이유전자의 도입은 세포에 도입된 플라스미드의 카피수에 대한 조절이 없기때문에 예측할 수 없다. 또한, 상동성 재조합 없이 전이유전자의 도입은 플라스미드가 에피좀으로 존재할 수 있고 후속적인 세포 분열에 따라 상실되기 때문에 불안정할 수 있다. 상동성 재조합의 또 다른 잇점은 유전자 표적물을 "녹-아웃"시키고 에피토프 태그를 도입하고 내인성 유전자의 프로모터를 스위칭시키고 다르게는 유전자 표적물을 변형시키는(예를 들어, 점 돌연변이의 도입) 능력이다.KE858로 지정된 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)의 특정 영역을 사용하여 2개의 벡터를 작제하였다. KE858은 단백질의 전달 RNA(tRNA)와 상동성을 공유하는 단백질에 대한 암호화 영역의 일부를 포함하는 1.3kb의 게놈 단편이다. 서던 블롯은 KE858 서열이 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 게놈에서 단일 카피로 존재한다. (서열번호 103)으로 지정된, 작제된 제1 유형의 벡터는 상기 실시예 3에 사용된 최적화된 효모 인버타제(suc2) 유전자를 함유하는 pUC19 벡터 골격으로 클로닝된 전체 1.3kb KE858 단편으로 이루어진다. KE858 단편은 표적화 작제물에 어디에도 존재하지 않는 유일한 SnaB1 부위를 함유한다. SZ726 (서열번호 126)으로 지정된 작제된 제2 유형의 벡터는 KE858 게놈 서열내 SnaB1 부위에서 효모 인버타제 유전자(suc2)의 삽입에 의해 파괴된 KE858 서열로 이루어졌다. 효모 인버타제 유전자를 플랭킹하는 KE858 서열을 함유하는 전체 DNA 단편은 KE858 영역의 어느 한 말단을 절단하는 EcoRI로 분해하여 벡터 골격으로부터 절단될 수 있다.벡터 둘다를 사용하여 효모 인버타제 유전자(suc2)의 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 게놈의 상응하는 KE858 영역으로의 상동성 재조합을 지시하였다. 상동성 재조합을 위해 표적화된 게놈 영역에 상응하는 선형 DNA 말단을, SnaB1으로 작제물 SZ725를 분해하고 벡터 작제물 SZ726을 EcoRI로 분해함에 의해 노출시켰다. 분해된 벡터 작제물을 이어서 실시예 3에서 상기된 방법을 사용하여 프로토테카 모리포르미스 배양물에 도입하였다. 이어서 각각의 벡터 작제물 기원의 형질전환체를 슈크로스 플레이트를 사용하여 선택하였다. 각각의 벡터 형질전환 기원의 10개의 독립적인 크론적으로 순수한 형질전환체는 목적하는 게놈 위치로의 효모 인버타제 유전자의 성공적인 재조합(서던 블롯을 사용하여) 및 전이유전자의 안정성에 대해 분석하였다.SZ725 형질전환체의 서던 블롯 분석은 분석을 위해 집어낸 10개의 형질전환체중 4개가 예측된 재조합 밴드를 함유함을 보여주었고 이는 단일 크로스오버 반응이 벡터상의 KE858 서열과 게놈내 KE858 서열사이에서 발생하였음을 지적한다. 대조적으로, SZ726 형질전환체중 모든 10개는 예측된 재조합 밴드를 함유하였고 이는 이중 크로스오버 반응이 효모 인버타제 전이유전자를 플랭킹하는 KE858 서열을 함유한 pSZ726의 EcoRI 단편과 게놈의 상응하는 KE858 영역 사이에서 발생하였음을 지적한다.슈크로스 인버타제 발현 및 전이유전자 안정성은 선택의 부재하에 15 세대 이상 동안 형질전환체를 성장시킴에 의해 평가하였다. 서던 블롯팅에 의한 전이유전자에 대해 양성인 4개의 SZ725 형질전환체 및 10개의 SZ276 형질전환체를 선택하고 형질전환체 각각으로부터 48개 단일 콜로니를 먼저 글루코스 함유 배지에서 선택 없이 및 이어서 유일한 탄소원으로부터 슈크로스 함유 배지에서 선택과 함께 연속으로 성장시켰다. 서던 블롯팅에 의해 전이유전자에 대해 양성인 4개의 SZ725 형질전환체 및 10개의 SZ276 형질전환체를 선택하고 형질전환체 각각으로부터 기원하는 48개 단일 콜로니를 먼저 글루코스 함유 배지에서 선택 없이 및 유일 탄소원으로서 슈크로스를 함유하는 배지에서 선택과 함께 연속으로 성장시켰다. 모든 10개의 SZ276 형질전환체(100%)는 15세대 후 슈크로스상에서 성장하는 능력을 보유한 반면 SZ725 형질전환체의 약 97%는 15세대 후 글루코스상에서 성장하는 능력을 보유하였다. 이중 크로스오버 반응에 의해 도입된 전이유전자(SZ726 벡터)는 세대 증식과 함께 극히 높은 안정성을 갖는다. 대조적으로, 단일 크로스오버 반응에 의해 도입된 전이유전자(SZ725 벡터)는 탠덤 카피의 전이유전자가 도입되고 전이유전자를 플랭킹하는 반복되는 상동성 영역이 재조합되고 이들 사이에 위치한 전이유전자 DNA를 절단할 수 있기때문에 세대 증식 동안 몇몇 불안정성을 유발할 수 있다. 이들 실험은 유기체의 핵 염색체로 안정하게 통합되는 이종성 슈크로스 인버타제 유전자를 함유하는 프로토테카 형질전환체를 제조하기 위한 상동성 재조합의 성공적인 사용을 입증한다. 상동성 재조합의 성공은 유전자 결실, 점 돌연변이 및 목적하는 유전자 생성물을 태깅하는 에피토프를 포함하는, 프로토테카 내 다른 유게놈 변형을 가능하게 할 수 있다. 이들 실험은 또한 진핵 미세조류의 핵 게놈에서 상동성 재조합을 위해 먼저 보고된 시스템을 입증한다.A. 내인성 프로토테카 모리포르미스 유전자를 녹-아웃 시키기 위한 상동성 재조합의 용도상기 실시예 11에 기재된 프로토테카 모리포르미스 cDNA/게놈 스크리닝에서, 내인성 스테아로일 ACP 데사투라제 (SAPD) cDNA를 동정하였다. 스테아로일 ACP 데사투라제 효소는 지질 합성 경로의 일부이고 이들은 지방 아실 쇄로 이중 결합을 도입하는 기능을 한다. 몇몇 경우에, 이것은 지방산 프로필을 변형시키기 위해 지질 경로 효소의 발현을 녹-아웃시키거나 감소시키는데 유리할 수 있다. 상동성 재조합 작제물은 내인성 스테아로일 ACP 데사투라제 효소의 발현이 감소될 수 있는지(또는 녹아웃될 수 있는지)의 여부 및 불포화된 지방산의 상응하는 감소가 숙주 세포의 지질 프로필에서 관찰될 수 있는지의 여부를 평가하기 위해 작제하였다. 대략적으로, 프로토테카 모리포르미스 (UTEX 1435) 기원의 스테아로일 ACP 데사투라제 유전자의 1.5kb 암호화 서열을 동정하여쏘 클로닝하였다(서열번호 104). 상동성 재조합 작제물은 5'말단(5' 표적화 부위)에서 SAPD 암호화 서열을 사용함에 이어서 클로렐라 불가리스 3'UR과 함께 코돈 최적화된 효모 슈크로스 인버타제 suc2 유전자를 구동시키는 클라미도모나스 레인하르드티 β-튜불린 프로모터를 사용하여 작제하였다. 프로토테카 모리포르미스 SAPD 암호화 서열의 나머지(약 1kb)를 이어서 3' 표적화 부위를 구성하기 위해 클로렐라 불가리스 3' UTR 이후에 삽입하였다. 상기 상동성 재조합 카세트에 대한 서열은 서열번호 105로 나타낸다. 상기된 바와 같이, 상동성 재조합 카세트의 핵 게놈으로의 통합을 위한 성공율은 미세조류를 형질전환시키기 전에 카세트를 선형화하여 말단이 노출되도록 함에 의해 증가될 수 있다. 프로토테카 모리포르미스에서 내인성 SAPD 효소를 표적화하는 상동성 재조합 카세트를 선형화시키고 이어서 숙주 세포(프로토테카 모리포르미스, UTEX 1435)에 형질전환시킨다. 성공적인 통합은 이중 상호 재조합 반응을 통해 숙주 게놈으로부터 내인성 SAPD 효소 암호화 영역을 제거할 거이고 새롭게 삽입된 suc2 유전자의 발현은 클라미도모나스 레인하르드티 β-튜불린 프로모터에 의해 조절된다. 수득한 클론은 유일한 탄소원으로서 슈크로스를 함유하는 플레이트/배지를 사용하여 스크리닝할 수 있다. 상동성 재조합 카세트의 성공적인 통합을 함유하는 클론은 유일한 탄소원으로서 슈크로스상에서 성장하는 능력을 갖고 지질 프로필내 지방산의 총 포화의 변화는 2차 확인 인자로서 작용한다. 추가로, 효모 슈크로스 인버타제 suc2 유전자에 특이적인 프로브를 사용하는 블롯팅 분석 및 RT-PCR은 또한 양성 클론에서 인버타제 유전자의 존재 및 발현을 확인시켜줄 수 있다. 대안으로서, β-튜불린 프로모터가 부재인 동일한 작제물을 사용하여 내인성 SAPD 효소 암호화 영역을 절단할 수 있다. 이 경우에, 새롭게 삽입된 효모 슈크로스 인버타제 suc2 유전자는 내인성 SAPD 프로모터/5'UTR에 의해 조절될 것이다. 실시예 14: 연료 생산A. 익스펠러 프레스 및 프레스 보조기를 사용한 미세조류로부터 오일의 추출DCW를 기준으로 38%의 오일을 함유하는 미세조류 바이오매쓰는 드럼 건조기로 건조시켜 수분 함량이 5 내지 5.5%가 되게하였다. 상기 바이오매쓰는 프렌치 L250 프레스에 공급하였다. 30.4 kg (67 lbs.)의 바이오매쓰를 프레스를 통해 공급하고 오일을 회수하였다. 프레스 보조기로서 다양한 %의 스위치그래스와 조합된 동일한 건조된 미세조류 바이오매쓰를 프레스를 통해 공급하였다. 건조된 미생물 바이오매쓰와 20% w/w의 스위치그래스의 조합으로 최상의 총 %의 오일을 회수하였다. 프레스된 케이크를 이어서 헥산 추출에 적용하고 20% 스위치그래스 조건에 대한 최종 수율은 총 61.6%의 가용 오일(중량으로 계산하여)이었다. 상기 50% 오일 무수 세포 중량을 갖는 바이오매쓰는 오일을 유리시키기 위해 스위치그래스와 같은 프레싱 보조기의 사용을 요구하지 않는다.B. 탈지된 프로토테카 모리포르미스 바이오매쓰의 모노사카라이드 조성물프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)는 상기 실시예 45에 기재된 바와 같은 조건 및 영양 배지(4% 글루코스를 갖는)에서 성장시켰다. 미세조류 바이오매쓰를 이어서 수거하고 드럼 건조기를 사용하여 건조시켰다. 건조된 조류 바이오매쓰를 가수분해시키고 오일은 상기 실시예 44에 기재된 바와 같이 익스펠러 프레스를 사용하여 추출하였다. 프레스된 바이오매쓰에서 잔여 오일을 이어서 석유 에테르를 사용하여 용매 추출하였다. 잔류 석유 에테르는 회전증발기(Buchi Labortechnik AG, Switzerland)를 사용하여 탈지된 밀로부터 증발시켰다. 이어서 글리코실(모노사카라이드) 조성 분석은 산성 메탄올용해에 의해 샘플로부터 제조된 모노사카라이드 메틸 글리코사이드의 퍼-O-트리메틸실릴(TMS) 유도체의 조합된 가스 크로마토그래피/질량 분광기(GC/MS)를 사용하여 탈지된 밀상에서 수행하였다. 탈지된 밀의 샘플을 대략 20시간 동안 80℃에서 메탄올중 1M HCl에서 메탄올 용해에 적용하고 메탄올중에서(아미노당 검출을 위해) 피리딘 및 무수 아세트산으로 다시 N-아세틸화하였다. 이어서 상기 샘플은 30분 동안 80℃에서 Tri-Sil(Pierce)을 사용한 처리에 의해 퍼-O-트리메티릴릴화하였다(문헌참조: methods in Merkle and Poppe (1994) Methods Enzymol. 230: 1-15 and York et al., (1985) Methods Enzymol. 118:3-40). TMS 메틸 글리코시드의 GC/MS 분석은 모든 Tech EC-l 융합된 실리카 모세관 칼럼 (30m x 0.25 mm ID)을 사용하여 5975b MSD로 상호접지된 HP 6890 GC상에서 수행하였다. 상기 모노사카라이드는 표준물과 비교하여 이들의 체류 시간으로 동정하였고 이들의 탄수화물 특성은 이들의 질량 분광기에 의해 입증된다. 샘플 당 20마이코그램의 이노시톨을 내부 표준물로서 유도체화전에 샘플에 첨가하였다. 탈지된 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 바이오매쓰의 모노사카라이드 프로필은 하기 표 18에 요약되어 있다. 샘플 기원의 총 % 탄수화물은 28.7%인 것으로 계산되었다. n.d. = 검출되지 않음탈지된 밀의 탄수화물 함량 및 모노사카라이드 조성은 이것이 동물 사료로서 또는 동물 사료 제형의 일부로서 사용하기에 적합하게 한다. 따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은 상기 표에 제시된 생성물 함량을 갖는 탈지된 밀을 제공한다.C. 프로토테카 오일로부터 바이오디젤의 생성상기된 방법에 따라 생성된 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 기원의 탈검화된 오일을 트랜스에스테르화에 적용하여 지방산 메틸 에스테르를 생성하였다. 결과는 하기에 나타낸다:오일의 지질 프로필은 다음과 같다:바이오디젤의 지질 프로필은 원료공급 오일의 지질 프로필과 매우 유사하였다. 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 제공된 기타 오일은 트랜스에스테르화에 적용하여 (a) 4% 이상의 C8-C14; (b) 0.3% 이상의 C8; (c) 2% 이상의 C10; (d) 2% 이상의 C12; 및 (3) 30% 이상의 C8-C14을 포함하는 지질 프로필을 갖는 바이오디젤을 수득할 수 있다.생성된 바이오디젤의 ASTM D6751 A1 방법에 의한 냉침지 여과기 능력은 300ml의 용적에 대해 120 초였다. 이러한 시험은 16시간 동안 40°F로 냉각되고 실온으로 가온되도록 방치되며 스테인레스강 지지체와 함께 0.7마이크론 유리 섬유 필터를 사용한 진공 여과하는 300ml의 B100의 여과를 포함한다. 본 발명의 오일은 트랜스에스테르화하여 바이오디젤을 생성시킬 수 있고 냉침지 시간은 120초 미만, 100초 미만 및 90초 미만이다. D. 재생가능한 디젤의 생산상기된 방법에 따라 제조되고 상기 실시예 X에서 바이오디젤을 제조하기 위해 사용되는 오일과 동일한 지질 프로필을 갖는, 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 기원의 탈검화된 오일은 트랜스에스테르화하여 재생가능한 디젤을 생성하였다. 상기 오일을 먼저 수소화처리하여 산소 및 글리세롤 골격을 제거하여 n-파라핀을 수득한다. 상기 n-파라핀을 이어서 크랙킹 및 이성체화에 적용하였다. 상기 물질의 크로마토그램은 도 13에 나타낸다. 상기 물질을 이어서 냉 여과시켜 C18 물질의 약 5%를 제거하였다. 냉 여과 후, 총 용적의 물질을 인화점으로 컷팅하고 인화점, ASTM D-86 증기 분포, 혼탁점 및 점도에 대해 평가하였다. 인화점은 63℃이었고; 점도는 2.86 cSt (센티스트로크)이었고; 혼탁점은 4℃이었다. ASTM D86 증기 값은 표 20에 나타낸다:생성된 물질의 T10-T90은 57.9℃이었다. 본원에 기재된 오일의 수소화처리, 이성체화 및 기타 공유적 변형 방법 및 본원에 기재된 증류 및 분획화(냉각 여과와 같은) 방법을 사용하여, 본원에 기재된 방법에 따라 생성된 트리글리세라이드 오일을 사용하는 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 및 65℃와 같은 다른 T10-T90 범위를 갖는 재생가능한 디젤 조성물 생성할 수 있다.생성된 물질의 TlO은 242.1℃이었다. 본원에 기재된 오일의 수소화처리, 이성체화 및 기타 공유적 변형 방법 및 본원에 기재된 증류 및 분획화(예를 들어, 냉각 여과) 방법을 사용하여, 180 내지 295, 190 내지 270, 210 내지 250, 225 내지 245, 및 290 이상의 T10과 같은 다른 T10 값을 갖는 재생가능한 디젤 조성물을 생성할 수 있다. 생성된 물질의 TlO은 300℃이었다. 본원에 기재된 오일의 수소화처리, 이성체화 및 기타 공유적 변형 방법 및 본원에 기재된 증류 및 분획화(예를 들어, 냉각 여과) 방법을 사용하여, 280 내지 380, 290 내지 360, 300 내지 350, 310 내지 340, 및 290 이상의 T90과 같은 다른 T90 값을 갖는 재생가능한 디젤 조성물을 생성할 수 있다.생성된 물질의 FBP는 300℃이었다. 본원에 기재된 오일의 수소화처리, 이성체화 및 기타 공유적 변형 방법 및 본원에 기재된 증류 및 분획화(예를 들어, 냉각 여과) 방법을 사용하여, 290 내지 400, 300 내지 385, 310 내지 370, 315 내지 360, 및 300 이상의 FBP와 같은 다른 FBP 값을 갖는 재생가능한 디젤 조성물을 생성할 수 있다.(a) 4% 이상의 C8-C14; (b) 0.3% 이상의 C8; (c) 2% 이상의 C10; (d) 2% 이상의 C12; 및 (3) 30% 이상의 C8-C14를 포함하는 지질 프로필을 갖는 오일을 포함하는, 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 제공된 기타 오일은 조합된 수소화처리, 이성체화 및 기타 공유적 변형에 적용될 수 있다. 실시예 15: 클로렐라 루테오비리디스(Chlorella luteoviridis)에 의한 슈크로스의 이용A. 글루코스 및 슈크로스상에서의 SAG 2214 성장SAG 2214 (클로렐라 루테오비리디스로서 지정됨)는 글루코스 또는 슈크로스중 하나를 함유하는 배지상에서 암실에서의 성장에 대해 시험하였다. 종속영양 액체 배양은 유일한 탄소원으로서 4% 글루코스 또는 4% 슈크로스를 함유하는 배지중 동결된 바이엘 기원의 접종물을 사용하여 개시하였다. 배양물은 200rpm에서 진탕시키면서 암실에서 성장시켰다. 배양물로부터의 샘플은 0, 24, 48 및 72시간 시점에 채취하고 성장은 750nm에서의 상대적 흡광도 (UV Minil240, Shimadzu)로 측정하였다. SAG 2214는 슈크로스 또는 글루코스에서 동등하게 잘 성장하였고 이는 상기 미세조류가 유일한 탄소원으로부터 글루코스와 같이 효과적으로 슈크로스를 이용할 수 있음을 보여준다. 상기 실험 결과는 도 3에 그래프로 나타낸다.B. SAG 2214에 대한 지질 생산성 및 지방산 프로필미세조류 균주 SAG 2214를 상기 실시예 32에 기재된 바와 같은 유사한 조건에서 유일 탄소원으로부터 글루코스 또는 슈크로스를 함유하는 액체 배지에서 배양하였다. 7일 후, 세포를 무수 세포중량 계산을 위해 수거하였다. 세포를 원심분리하고 24시간 동안 동결건조시켰다. 무수 세포 펠렛을 칭량하고 리터당 무수 세포 중량을 계산하였다. 지질 분석을 위해 세포를 또한 수거하고 실온에서 10분 동안 4000 x g에서 원심분리하였다. 상등액을 버리고 상기 샘플은 표준 가스 크로마토그래피 (GC/FID) 과정을 사용하여 지질 분석 및 지방산 프로필을 위해 가공하였다. 상기 결과는 하기 표 21 및 22에 요약한다.C. SAG 2214와 다른 클로렐라 루테오비리디스 균주의 게놈 비교미세조류 균주 SAG 2214가 탄소원으로서 슈크로스상에서 성장하는 능력(상기 설명된 바와 같이)으로 인해 일반적인 관심대상임을 입증하였다. 상기 균주의 성장 특성 뿐만 아니라, 다른 미세조류 종과 이의 분류학적 관계가 또한 관심 대상이다. 클로렐라 루테오비리디스 균주로서 SAG 수거에 의해 저정된 SAG 2214의 23s rRNA 유전자를 서열분석하고 또한 클로렐라 루테오비리디스로서 SAG 및 UTEX 수거에 의해 또한 동정된 9개의 다른 균주의 23s rRNA 게놈 서열과 비교하였다. 이들 균주는 UTEX 21, 22, 28, 257 및 258이고, SAG 균주는 2133, 2196, 2198 및 2203이다. 사용되는 DNA 유전자분류 방법은 실시예 1에서 상기된 방법과 동일하다. 서열 정렬 및 언루티드 트리(unrooted tree)는 유전자 DNA 분석 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 9개 다른 균주중에서 유전자형 UTEX 21, 22, 28 및 257이 동일한 23s rRNA DNA 서열(서열번호 106)을 가졌다. 기타 다른 5개의 클로렐라 루테오비리디스 균주는 UTEX 21, 22, 28, 및 257과 고도로 상동성인 23s rRNA 서열을 가졌다. SAG 2214(서열번호 30) 기원의 23s rRNA 유전자 서열은 결정적으로 다른 다른 균주에서 발견되지 않았던 대형 삽입체를 갖는 다른 9개의 클로렐라 루테오비리디스 균주의 서열과 상이하다. BLAST를 사용하는 상기 23s rRNA 유전자 서열의 추가 분석은 이것이 펩토시라 및 트레보욱시아(리켄의 피코비온트 부분의 구성원) 속의 구성원과 최대 상동성을 공유함을 지적하였다. 이들 결과는 SAG2214가 균주 수거에 의해 분류된 바와 같은 클로렐라 루테오비리디스 균주가 아닐 수 있고 대신 리켄에서 발견되는 조류 공생자와 상당한 23S rRNA 뉴클레오타이드 동일성을 공유함을 지적한다. 성장 특성과 함께 게놈 분석은 SAG 2214가 슈크로스 대사에 관여하는 유전자 및 단백질, 및 상기 효소의 올바른 위치화에 관여하는 시그날 전달 및 수송 펩타이드의 공급원일 수 있음을 지적한다. 고도의 게놈 유사성을 갖는 SAG 2214 및 기타 균주는 또한 고정 탄소원으로서 슈크로스를 사용하는 오일 생산에 유용한 균주일 수 있다.본 발명은 이의 특정 양태와 연계하여 기재하였지만 이것은 추가의 변형이 있을 수 있는 것으로 이해되어야만 한다. 본원은 일반적으로 본 발명의 원리에 따르고 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지되거나 통상적인 실시 범위내 있고 이전에 제시된 필수적 특징에 적용될 수 있는 바와 같이, 본원으로부터 비롯되는 것을 포함하는 임의의 변형, 용도 또는 적용을 포함하는 것으로 의도된다. 특허, 특허원 및 공보를 포함하는 본원에 인용된 모든 참조문헌은 이전에 구체적으로 인용되거나 인용되지 않는 것에 상관 없이 이의 전문이 참조로서 인용된다. 본원에 언급된 공보는 본 발명과 연계하여 사용될 수 있는 시약, 방법 및 개념을 기술하고 기재할 목적으로 인용된다. 본원에서 어떠한 것도 이들 문헌이 본원에 기재된 발명과 관련된 선행 기술임을 인정하는 것으로 해석되지 말아야 한다. 특히, 하기의 특허원은 모든 목적을 위해 이들의 전문이 참조로 인용된다: US 가출원 번호 제60/941,581호, 2007년 6월 1일 출원, 표제("Production of Hydrocarbons in Microorganisms"); US 가출원 번호 제60/959,174호, 2007년 7월 10일 출원, 표제("Production of Hydrocarbons in Microorganisms"); 미국 가출원 번호 제60/968,291호, 2007년 8월 27일 출원, 표제("Production of Hydrocarbons in Microorganisms"); 미국 가출원 번호 제61/024,069호, 2008년 1월 28일 출원, 표제("Production of Hydrocarbons in Microorganims"); PCT 출원 번호 제PCT/US08/65563호, 2008년 6월 2일 출원, 표제("Production of Oil in Microorganisms"); 미국 특허원 제12/131,783호, 2008년 6월 2일 출원, 표제("Use of Cellulosic Material for Cultivation of Microorganisms"); 미국 특허 출원 번호 제12/131,773호, 2008년 6월 2일 출원, 표제("Renewable Diesel and Jet Fuel from Microbial Sources"); 미국 특허 출원 번호 제12/131,793호, 2008년 6월 2일 출원, 표제("Sucrose Feedstock Utilization for Oil-Based Fuel Manufacturing"); 미국 특허 출원 번호 제12/131,766호, 2008년 6월 2일 출원, 표제("Glycerol Feedstock Utilization for Oil-Based Fuel Manufacturing"); 미국 특허 출원 번호제12/131,804호, 2008년 6월 2일 출원, 표제("Lipid Pathway Modification in Oil- Bearing Microorganisms"); 미국 특허 출원 번호 제61/118,590호, 2008년 11월 28일 출원, 표제("Production of Oil in Microorganisms"); 미국 가특허 출원 번호 제61/118,994호, 2008년 12월 1일 출원, 표제("Production of Oil in Microorganisms"); 미국 가특허 출원 번호 제61/174,357호, 2009년 4월 3일 출원, 표제("Production of Oil in Microorganisms"); 미국 가특허 출원 번호 제61/219,525호, 2009년 6월 23일 출원, 표제("Production of Oil in Microorganisms"); 및 PCT 출원 번호 [[대리인 도켓 번호 026172-005010PC]], 2009년 11월 30일 출원, 표제("Production of Tailored Oils in Heterotrophic Microorganisms").
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 원문을 바탕으로 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 생성하세요.	춤 발생의 기원설과 관련된 문제에서 출발하여 역사적 변천과, 특징적 동작의 의미, 복색, 가면의 제작, 장단과 선율을 포함한 음악 및 악기편성, 노래가사와 창조(唱調), 등등이 종합적으로 연구되어야 하고 그 성과가 축적되어야만이 가치있는 문화재로서의 몫을 다 할 것이라 믿는다.	다음 텍스트에서 제공된 문맥을 정확히 이해하고, 마지막 문장을 자연스럽고 문맥에 맞게 완성하세요. 문장은 이전 내용과 논리적으로 연결되어야 합니다. #텍스트: 처용무(處容舞)는 처용의 가면을 쓰고 화려한 복식을 갖춘 5명의 무원이 호방하게 추는 궁중무의 하나이다. 처용이나 처용가에 대해서는 정병욱의 “문학으로 본 처용가”, 김열규의 “처용전승”, 이두현의 “처용가무”, 이용범의 “처용설화”, 조동일의 “처용가무의 연극사적 이해” 등 주로 국문학적인 연구가 있고, 정작 처용무에 관해서는 그에 부가적인 언급이 되고 있을 뿐, 무용학적 측면에서의 연구발표가 등한시되어 왔음을 인정하지 않을 수 없다. 무용계 자체만을 보더라도 이론적 깊이가 없이 실기만을 위주로 한 전승 과정에 치중하여 당장의 시급한 보존문제는 일단 성과를 거두었으나 아직까지 처용가무의 역사적 이해 및 현대적 관점에서의 해석, 그리고 오늘날에 새롭게 되살리는 작업으로까지는 연결되지 못하고 있다는 자성의 목소리에 공감이 크다. 국악계에서의 처용무 관련 음악연구는 더욱 찾아보기 어려운 형편이다. 최근 들어 관련 논문으로 임미선의 “처용무 반주음악의 특징”이나 처용무의 반주 음악으로 등장하는 수제천과 관련하여 문숙희의 “정읍과 수제천의 음악적인 관계에 대한 고찰” 등이 있다. 처용무의 문화재적인 가치는 춤의 대형이나 손동작, 발동작만이 전부가 아닐 것이다.
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 원문을 바탕으로 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 생성하세요.	관련 선행기술로는 한국공개특허 제2003-0036406호(2003.05.09.)인 "무선통신 기반의 고속도로 통행료 자동 결제시스템 및 그 방법"이 있다.	다음 텍스트에서 제공된 문맥을 정확히 이해하고, 마지막 문장을 자연스럽고 문맥에 맞게 완성하세요. 문장은 이전 내용과 논리적으로 연결되어야 합니다. #텍스트: 일반적으로, 고속도로, 도심고속화도로, 유료터널, 주차장 등의 각종 유료도로는 크게 폐쇄형과 개방형 두 가지로 나뉘며, 이들 중 폐쇄형은 입구와 출구가 별도로 설치되어 거리에 따른 통행요금을 부과하는 유료도로를 말하고, 개방형은 입구와 출구가 별도로 설치되어 있지 않고 특정 구간 중간에 톨게이트(tollgate)를 세워 놓고 그 구간을 지날 때 마다 통행요금을 부과하는 유료도로를 말한다. 이러한 유료도로 통행요금 지불방식 중 폐쇄형의 경우는 차량이 유료도로 입구를 진입할 때 입구 영업소 번호와 차종정보 및 진입시간을 포함하는 입구정보를 기록한 통행권을 자동으로 발행하며, 운전자는 그 통행권을 가지고 유료도로를 통행한 후 출구 톨 부스에 도착하여 통행권을 제시하면 톨 부스 관리자가 통행권을 통행권 판독기에 삽입하여 입구정보를 읽어 통행요금을 운전자에게 알려주면 현금 또는 전자카드로 통행요금을 지불하고 있다. 또한 개방형의 경우는 규정된 통행요금이 제시되어 있으므로 운전자는 톨 부스에 도착하여 현금 또는 전자카드로 통행요금을 지불하고 있다. 최근에는 톨 부스에 정차하지 않고 통과하면서 요금을 자동 징수할 수 있는 전자식 요금 징수 장치(Electronic Toll Collection System: ETCS)로서 하이패스 시스템이 대부분의 고속도로에 설치 운영되고 있다. 이러한 전자식 요금 징수 장치는 유료도로 등 유료도로의 톨게이트(Tollgate)에 설치 운영되며 통행료 부과대상차량에 탑재된 차량단말기(On Board Unit, 'OBU')와 통행료 징수를 위해 도로변에 설치한 노변장치(Road Side Unit)가 서로 연동하여 통행요금을 전자적으로 과금하는 시스템으로, 사용자가 차량단말기를 차량에 부착하여 서비스를 지원하는 차로로 진입하게 되면 단거리전용통신(Dedicated Short Range Communication, 'DSRC')을 활용하여 차량단말기와 노변장치와의 통신을 통해 인증된 전자카드에 기록된 입구정보를 획득함으로써 통행요금징수가 이루어지게 된다.
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 원문을 바탕으로 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 생성하세요.	그러나 초음파 검사는 실시간 검사라는 장점에도 불구하고 초음파 장비에 따라 보이는 병변의 영상 화질 차이로 인해 검사자의 경험과 지식에 따라 병변의 진단 결과가 다르게 나타나기 때문에 표준적이고 객관적인 검사 기술이 요구되어 진다.	다음 텍스트에서 제공된 문맥을 정확히 이해하고, 마지막 문장을 자연스럽고 문맥에 맞게 완성하세요. 문장은 이전 내용과 논리적으로 연결되어야 합니다. #텍스트: 암 1위를 차지하고 있고, 매년 3%이상씩 증가하고 있다. 건강보험심사평가원에 따르면 국내 유방암 환자 수는 201년부터 2015년 사이 104,293명에서 141,379명으로 4년간 36%가 증가하였다. 국내 유방암 발생률은 연령에 따라 점점 증가하다가 40~50세에서 64.5%로 가장 높았으며 그 이후에는 감소하는 추세를 보이는데 이는 연령이 증가할수록 유방암 발생률이 증가하는 서구와는 다른 양상이다. 유방암은 조기에 발견하면 95%에 이르는 완치율을 보이지만 유방암이 진행한 경우에는 4기 암의 경우 생존율이 10%이하로 급격하게 감소되므로 유방암을 치료하기 위해서는 무엇보다 조기 발견이 중요하다. 유방암 진단에 주로 사용되는 초음파검사는 안전하고 영상획득이 실시간으로 가능하여 의료 영상 검사 방법으로 자주 이용된다. 특히 유방초음파검사는 유방암 조기 발견을 위한 1차 선별 검사로 많이 이용되고있으며, 유선조직의 특징과 패턴을 분석하여 2차적인 조직검사 유무를 결정하는 중요한 검사이다. 이 검사는 검진 시 통증이 없으며, 치밀 유방을 정확하게 진단할 수 있어 유방진단에 주로 이용된다.
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 원문을 바탕으로 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 생성하세요.	특허 문헌 1에는, PLC로부터 변수 할당 정보를 읽어내고, PLC 내의 메모리 어드레스와 대응지어져 있지 않은 변수가 이용된 어드레스 미해결 화면 데이터를, PLC로부터 읽어낸 변수 할당 정보에 기초하여 어드레스 해결 화면 데이터로 변환하는 표시 장치가 개시되어 있다.	다음 텍스트에서 제공된 문맥을 정확히 이해하고, 마지막 문장을 자연스럽고 문맥에 맞게 완성하세요. 문장은 이전 내용과 논리적으로 연결되어야 합니다. #텍스트: 프로그래머블 표시기는 통상, PLC(Programmable Logic Controller)와 접속되어, 자(自)장치 및 접속된 PLC의 상태를 표시하고, 조작하는 것에 이용된다. PLC의 상태 표시 및 조작을 위한 프로젝트 데이터는, 작화 소프트웨어를 인스톨한 컴퓨터인 프로젝트 데이터 작성 장치를 이용하여 작성되고, 프로젝트 데이터 작성 장치로부터 프로그래머블 표시기에 전송된다. 많은 경우, PLC의 프로그래밍을 행한 다음, 작화 소프트웨어에 의한 표시 화면의 작성을 행하기 위해, PLC에서 사용하고 있는 디바이스를 코멘트와 함께 일람화하고, 그것을 참조하여 작화 소프트웨어상에서 디바이스의 할당을 행하는 것이 일반적이다. 또한, 디바이스란 PLC가 구비하는 특정의 기능이나 PLC에 접속되는 기기에 대응지어지는 PLC의 메모리 어드레스이고, PLC의 제어 프로그램 중에 디바이스를 기술하여 디바이스에 의해서 지정된 메모리 어드레스의 값을 덮어씀으로써, 디바이스에 할당된 기능을 실행하거나, 디바이스에 할당된 기기의 제어가 행해지거나 한다. 이하, 코멘트가 부가된 디바이스를 디바이스 코멘트라고 말한다. 표시 화면 작성의 효율화에 있어서, 디바이스를 입력할 때 PLC 프로그래밍 소프트웨어에서 미리 할당된 코멘트를 참조하여, 디바이스가 어떠한 역할을 가지고 있는지를 알 수 있도록 함으로써, 작화 효율을 향상시키는 것이 종래의 수법이다. 또는, 개개의 디바이스에 유저가 임의로 라벨을 설정함으로써 디바이스를 라벨화하는 경우에는, 라벨과 디바이스의 할당 등을 일원 관리하여 디바이스를 의식하지 않고 라벨을 이용하여 설정할 수 있도록 하여 작화 효율을 향상시키는 것이 종래의 수법이다. 라벨이란 메모리 어드레스에 대응지어진 변수이고, 이러한 변수를 디바이스 대신에 이용하여 제어 프로그램을 작성함으로써, 변수와 메모리 어드레스의 할당을 변경하는 것만으로, 다른 제어 프로그램을 조합하여 새로운 제어 프로그램을 작성하는 경우 등에, 어드레스 할당의 부정합을 해소할 수 있다.
	본 발명은 일반적인 공지된 유형의 시멘트/모르타르/콘크리트(단순히 "시멘트" 조성물 또는 시스템(이하 "시멘트" 조성물 또는 시스템 단순히)의 제조 방법으로서, 충전제(들)가 "탄산칼슘계 충전제(들)"로 이루어지거나 이를 포함하고, 상기 충전제(들)를 초가소제(들)로 이루어지거나 이를 포함하는 효과적인 처리량의 1종 이상의 처리제로 처리하는 1 이상의 단계를 포함하는 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 주목적은 개선된 압축성, 개선된 유동성, 및 일반적으로 말해서 최종 시스템의 특성의 한정적인 개선된 "작업성", 및 "규칙성"을 갖는 개선된, "고성능", 유체, 시멘트 또는 모르타르 또는 콘크리트 시스템 또는 조성물을 제공하는 것을 목표로 하는 방법을 구축하는 것이다. 본 발명은 또한 "유효량"의 1종 이상의 초가소제에 의해 전처리된 탄산칼슘계 충전제 또는 이들의 블렌드로 이루어지거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는 "시멘트" 조성물용 충전제에 관한 것이다.	주어진 문장을 읽고 간략하게 요약해주세요. 문장: [ 발명의 명칭 ] 초가소화제에 의해 (전)처리된 탄산칼슘계 충전제를 포함하는 시멘트, 모르타르, 콘크리트 조성물의 제조 방법, 얻은 조성물 및 시멘트 제품 및 이의 용도PROCESS FOR THE PREPARATION OF CEMENT, MORTARS, CONCRETE COMPOSITIONS CONTAINING A CALCIUM CARBONATE ― BASED FILLER (PRE) ― TREATED WITH A SUPERPLASTICIZER, COMPOSITIONS AND CEMENT PRODUCTS OBTAINED AND THEIR APPLICATIONS [ 기술분야 ] 본 발명은 시멘트 조성물, 시멘트질 조성물, 수경성 결합제 조성물, 모르타르 조성물, 콘크리트 "조성물"(또는 이하 동등하게 "시스템"), 즉 충전제로서의 탄산칼슘(들) 유형의 1종 이상의 미립자 광물을 포함하는 시멘트/수경성 결합제, 모르타르, 콘크리트의 유형 조성물(또는 "시스템")의 분야 및 이의 용도, 및 상응하는 시멘트, 모르타르, 콘크리트 제품 또는 부재에 관한 것이고, 상기 충전제는 본 발명에 따라 본 발명의 필수 부분인 공정으로 인해 성능의 "기술적인" 또는 "고성능"("HP") 수준으로 "업그레이드"된다.본 발명은 시멘트, 수경성 결합제, 모르타르, 콘크리트를 위한 상기 조성물 또는 "시스템"(이 용어는 본 출원 및 특허청구범위에서 등가물로서 사용되도록 주어진다)을 제조하는 특정한 방법, 얻은 조성물, 이로부터 얻은 시멘트, 모르타르 및 콘크리트 제품, 및 이의 용도에 관한 것이다. [ 배경기술 ] 시멘트 시스템(또는 동등하게 "조성물")은 시멘트 입자, 혼합수(또는 동등하게 당업자에게 공지된 바대로 상기 시스템을 방해하지 않는 혼합 수성 조성물), 충전제(들), 다양한 임의의 및 일반적인 첨가제, 예컨대 공기 연행제, 응결 지연제, 응결 촉진제 및 기타 등등, 및 당업자에게 널리 공지된 임의의 이러한 통상적인 첨가제를 포함하는 시스템이라는 것을 상기한다.모르타르 시스템은 부가적으로 비활성 골재 재료, 일반적으로 모래를 포함한다.콘크리트 시스템은 여전히 부가적으로 자갈을 포함한다.상기는 아주 분명히 공지되어 있고 상식이다.단순함의 문제에 있어서, 또한 본 발명은 임의의 이러한 3개의 시스템의 특성을 개선하거나 "업그레이드"하도록 채택되는 첨가제의 사용에 관한 것이므로, "시멘트 시스템"(또는 "조성물")이라는 용어는 시멘트, 시멘트질, 수경성 결합제, 모르타르 또는 콘크리트 조성물 또는 시스템인 상기 3개의 주요 유형의 조성물 또는 "시스템" 중 임의의 것을 포함하도록 하기에서 사용될 것이다. 당업자는 시스템이 모래 및/또는 자갈의 존재 또는 부재의 관점에서 시멘트, 모르타르 또는 콘크리트 조성물인지를 이해할 수 있을 것이다. 모래 및 자갈이 비활성 재료이고, 따라서 본 발명을 현저히 방해하지 않으므로 이러한 단순함이 가능하다.심지어, 하기에서, 예를 들면 "시멘트 시스템"에 관한 정보가 제공된다 할지라도, 또한 4개의 다른 유형의 시스템 중 임의의 것에 필요한 변경을 가하여 적용되는 것이 또한 지적된다. 시스템 사이의 유일한 차이점은 모래 및/또는 자갈의 존재 또는 부재이다.이러한 조성에서, 유체화제(들)가 종종 사용된다.이 영역에서, EP 0 663 892(CHRYSO)는 분명히 가장 관련된 문헌이고, 이는 수압 설정 없이 광물 현탁액에 대한 유체화제 중합체, 또는 수경성 결합제 슬러리를 개시하고 있다.인용된 출원은 종이 코팅, 페인트, 및 합성 수지 또는 고무 조성물이다.상기 선행 기술에 따르면, 점도를 감소시키기 위해 광물, 특정한 현탁액 중에 유체화제를 첨가하는 것이 공지되어 있고, 특히 종이 용도의 경우, 이는 높은 광물 농도, 더 우수한 실행성(workability)를 생성시키고, 이는 건조 에너지를 감소시킨다. 예를 들면, 이는 탄산칼슘의 현탁액과 함께 사용된다.물 함량을 감소시키기 위한 목적으로 이러한 유체화제를 (상기 설명된 광의에서의) "시멘트" 슬러리에 첨가하고, 침강 후 "더 치밀한 구조"를 갖는 "시멘트" 조성물을 얻는 것이 또한 공지되어 있다.유체화 효과를 감소시키고 (비용 증가와 함께) 유체화제의 양의 증가를 강요하는 전해질의 영향, 및 "시멘트"의 경우 최종 특성이 아니라 시멘트 조성물의 침강 특성을 부정적으로 변경시키지 않는 필요성의 문제점과 맞닥뜨린다.몇몇 널리 공지된 유체화제는 초가소제 또는 가소제이다.이 영역에서, EP 0 663 892(CHRYSO)뿐만 아니라 관심 있는 초가소제를 또한 개시하고 있는 FR 2 815 627, FR 2 815 629 및 WO2008/107790이 관련된다. 설폰화 나프탈렌 및 포름알데하이드 또는 멜라민-포름알데하이드와 설폰화 화합물의 축합 생성물과 같은 몇몇 공지된 유체화제는 침강 시간에 덜 영향을 미치지만, 여전히 만족스럽지 못하다. 이러한 제품 몇몇은 또한 초가소제이지만, 훨씬 덜 바람직하다.또한, EP 0 099 954는 적어도 방향족 고리를 포함하는 아미노설폰산의 여러 아민 작용기를 갖는 질화 화합물 및 포름알데하이드에 의한 축합에 의해 제조된 유체화제에 관한 것이다.시멘트 조성물의 침강을 너무 많이 지연시키지는 않지만, 이의 "활성"에 관한 한 전해질에 매우 민감하다고 일컬어진다. 이들은 또한 일반적으로 약 40 중량%(건조) 이하의 낮은 농도로 얻어질 수 있는데, 왜냐하면 결국 임의의 농도 증가가 허용 불가능한 수준으로 이의 점도를 증가시키기 때문이다.바람직한 특성의 요약이 상기 언급된 EP의 3 페이지 15 라인 ff에 기재되어 있다.시멘트, 수경성 결합제, 시멘트질 또는 콘크리트 또는 모르타르 조성물 또는 "시스템"에서 충전제(들)를 첨가하는 것이 또한 공지되어 있다.이러한 충전제(들)의 첨가의 목적은 입자 사이의 공극을 충전하고, 전체 비용을 감소시키고, "점조도"(점조도는 고려되는 시스템이 용이하게 흐르거나 "자가 평탄화(self-level)"되거나 되지 않는 용량 또는 능력임)라 불리는 특성 및 "압축성"(즉, 최종 조성물 내의 건조 재료의 백분율(백분율이 더 높을수록, 압축성이 더 우수하다))이라 불리는 특성을 크게 개선하기 위한 것이다.본 발명에서, 상기 사용 가능한 충전제(들)는, 본원 및 특허청구범위에서, 당업자에게 공지된 카올린, 벤토나이트 등과 같은 상이한 유형의 다른 충전제를 갖지 않음을 의미하는 탄산칼슘(들)(가능하게는 다양한 기원의 탄산칼슘(들), 예컨대 다양한 천연 암석 또는 다양한 PCC)만을 포함하는 "탄산칼슘계 충전제(들)"로서 정의되고, 바람직하게는 (충전제(들)가 GCC(들)이거나 이를 포함할 때) 적어도 50∼65 중량%(건조), 바람직하게는 80 중량% 초과, 훨씬 더 바람직하게는 90 중량% 초과의 CaCO3를 포함하는 탄산화 암석 또는 더 일반적으로는 광물 재료(들)에 의해 제공되고; 상기 충전제(들)는 - 천연 탄산칼슘(들) 또는 분쇄 탄산칼슘(들)(GCC(들)), 예컨대, 비제한적으로, 대리석, 백악, 방해석으로부터의 GCC, 또는 바람직하게는 상기 % 기준을 만족시키는 다른 천연 및 널리 공지된 형태의 천연 탄산칼슘;- 침강 탄산칼슘, 및 널리 공지된 침전/제조 공정에 따라 다양한 널리 공지된 형태 하에 존재하는 PCC(들); 또는 - 암석 또는 광물 재료를 서로 포함하는 상기 CaCO3의 혼합물 및 GCC(들) 및 PCC(들)의 블렌드 또는 혼합물 중에서 선택된다.GCC/PCC 비는 0∼100 내지 100∼0 중량%(건조), 바람직하게는 30∼70 내지 70∼30 중량%(건조)로부터 선택될 수 있다.일반적으로 "충전제"는 하기 특성을 갖는다: - 순도(메틸렌 블루 시험)는 10 g/kg 미만, 바람직하게는 3∼5 g/kg 미만, 바람직하게는 1∼1,5 g 미만이고, 가장 흥미로운 값은 1.2 g/kg에 있다.- 평균 직경 또는 d50은 Malvern 2000 PSD 설비/방법론을 이용하여 측정할 때 1∼3 내지 30∼50 마이크로미터의 범위이다.- 널리 공지된 충전제의 특징적인 특징인 블레인 표면은 EU 규격(유럽 규격 EN 196-6) 하에 측정할 때 180∼2000 ㎡/㎏, 바람직하게는 300 내지 800 ㎡/㎏의 영역에 있다.공지된 바대로, (상기 언급된 광의에서) "시멘트" 조성물 또는 "시스템"은 하기로 이루어진다:시멘트(또는 시멘트질 조성물 또는 수경성 결합제) + 혼합수(또는 침강을 허용하지만 시스템을 방해하지 않는 혼합 수성 조성물) + 임의로 (일반적으로 비활성) 미립자 및/또는 섬유 충전제(들) + 비활성 골재(들), 예컨대 임의로 모래 + 임의로 비활성 자갈(+ 본원에 자세히 언급되지 않고 완전히 언급되지 않은 임의로 널리 공지된 첨가제, 예컨대 응결 촉진제, 응결 지연제, 공기 연행제 등...) + 최종 사용자의 정확한 수요를 맞추도록 의도되는 기타 "통상적인" 첨가제.골재, 예컨대 모래, 비활성 자갈 또는 "올인(all-in)" 골재는 본원에서 설명이 필요치 않은 매우 통상적으로 사용되는 공지된 재료이다.상기 기재된 바대로, 본 발명은 또한 동등하게 (단순히 일반적인 용어 "시멘트" 하에) (모래와 같지만 자갈이 아닌 골재를 비롯하여 상기와 같은) 모르타르 조성물 또는 "시스템" 및 (상기와 동일하지만 자갈이 아니고 모래가 아닌) 시멘트 조성물에 관한 것이다. "주로"는 본원에서 시스템이 본원에서 언급되지 않은 여러 불순물 또는 미량의 첨가제 또는 부형제, 예컨대 공기 연행제, 촉진제, 지연제 등을 포함할 수 있다는 것을 의미한다."혼합수"는 본 출원에서 "시멘트" 조성물의 일반적인 침강을 허용하지만, 전체 조성물의 다른 특성을 방해하지 않거나, 첨가제를 통해, 여러 일반적인 특성을 개선하기만 하는 주로 물 + 일반적인 첨가제인 단순한 혼합수 또는 수성 혼합 조성물을 의미한다.본 발명에서의 "충전제"는 상기 정확하게 정의되어 있고, 임의의 공지된 형태(즉, GCC 및/또는 PCC) 하에 오직 CaCO3 미립자 재료 + 임의로 여러 다른 비활성 충전제 입자 또는 섬유 재료, 예컨대 대마 등을 포함하지만, 다른 유형의 충전제, 예컨대 카올린, 벤토나이트 등, 및 이들의 다양한 블렌드를 포함하지 않는 충전제이다. 본원 및 특허청구범위에서, "비활성"은 본 발명의 방법 및 얻은 조성물, 제품 및 용도에 현저하지 않은(또는 무시할만한) 영향 또는 방해를 갖는 재료를 의미한다. 관여된 성분을 고려할 때, 당업자가 용이하게 이해할 수 있을 것이다.따라서, 현재까지 선행 기술의 (상기 정의된 바와 같은 광의에서) "시멘트" 시스템은 주로 하기로 이루어진다:- 시멘트(또는 수경성 결합제 또는 시멘트질 조성물) + 혼합수(또는 시스템을 방해하지 않는 혼합 수성 조성물) + 임의로 골재(들), 예컨대 모래 + 임의로 자갈 + 충전제(들) + "통상적인" 첨가제.시멘트/수경성 결합제/시멘트질 조성물, 시멘트, 모르타르 및 콘크리트 조성물은 기본적으로 하기로 분류될 수 있는 것으로 또한 공지되어 있다:- 건조 시스템(빈약한 품질 또는 "저" 품질)(캐스팅을 고 진동 및 에너지로 수행함).- 플라스틱 시스템(중간 품질)(중간 진동 및 에너지).- 유체 시스템(고성능 또는 "HP")(낮은 진동 및 낮은 에너지)."자가 평탄화 시험" 또는 "스크리드 플로우 콘 테스트(screed flow cone test)"로도 공지된 "미니 코네 아 샤페(mini cone a chape)"을 이용하여 시스템을 분류하기 위해 매우 단순한 시험을 이용한다.시험은 널리 공지되어 있고 인정된 규격 EN 196-1에 따라 하기와 같이 수행한다; 상기 규격은 사용하고자 하는 혼합기 또는 혼련(또한 연화(malaxing)) 장치, 회전 속도, 및 시험을 재현하기에 유용한 각각의 및 모든 이러한 데이터를 정확하게 정의하고 있다. 따라서, 명확성 또는 재현성을 위해 더 많은 설명 또는 정의가 본원에서 필요치 않다.단순히, "시멘트"는 본원 전체에서 시멘트 재료와 시멘트질 조성물 및 (시멘트 이외의) 수경성 결합제 조성물, 및 이들의 블렌드를 포함한다. 상기 기재된 바대로, 이것은 또한 상응하는 모르타르 및 콘크리트를 포함한다.자가 평탄화 시험:기본적으로, 공정 조건이 널리 공지되어 있더라도 하기 더 자세히 다시 한번 기재된 일반적인 절차에 따라 상기 성분을 혼합하고, 이후 상기 표준 조건에 따라, 이의 바닥에서 천공된 역원뿔에 부음으로써 시멘트 또는 모르타르 또는 콘크리트 "시스템"을 제조한다(그 치수는 또한 상기 규격 및 시험의 각각의 및 모든 유용한 데이터에 의해 제공된다).따라서, 시멘트 또는 모르타르 또는 콘크리트 시스템은 상기 원뿔로 그리고 상기 원뿔로부터, 즉 이의 바닥 구멍을 통해 흐르고, 수평 판으로 하강하여 "샤프"("스크리드")를 형성한다."플라스틱 형태로 건조"로도 공지된 "갈레뜨" 또는 "원뿔"을 형성하는 경우, 그 직경을 측정하고, 그 양상을 예를 들면 점착성 및 "두께"에 대해 육안으로 검사하고, 나중의 특성은 "느린" 또는 "점성" 혼합물을 반영하고, 즉 "두꺼운 경우", 취급하기 어렵다.직경이 더 클수록, 시스템이 더 유동 가능하다. 본 발명에서 표적되는 바대로 소정의 높은 점조도의 경우, 이는 주요 시험이다.콘크리트 시스템에서 사용하고자 하는 초기 충전제의 품질, 즉 제조 위치, 형태학 등을 고려하면, 생성된 원뿔은 직경이 변할 것이고, 이는 유동성의 변화를 나타낸다.예로서, 혼합수를 사용하지 않거나 거의 사용하지 않는 것으로 공지되어 있고 이러한 귀중한 특성을 나타내는 GCC는 매우 유체의 비점착성 시멘트 또는 콘크리트 조성물을 생성시킬 것이다. 이러한 조성물은 상기 "유체"라 불리는 "기술적인"(즉, "고성능" 또는 "HP") 콘크리트 조성물에 완전히 사용 가능할 것이다.반대의 경우, 충전제, 즉 GCC 충전제가 뚜렷한 양의 물을 흡수하거나 사용하거나, 약간의 불순물 등을 포함하는 경우, 생성된 조성물은 덜 유체이고 약간 점착성이 될 것이다. 최종 사용자는 특히 (관련된 추가 비용 및 전체로서의 조성물의 2차 효과의 관련된 위험을 갖는) 부식성 부형제를 첨가하고/하거나 (따라서 점조도에 해롭고 관련된 위험을 유도하는) 추가의 물을 첨가하도록 강요될 것이다. 이 조성물은 상기 "플라스틱"이라 불리는 중간 품질 조성물에 사용될 것이다.단계의 다른 사용에서, 충전제, 즉 빈약한 품질의 GCC를 사용하는 것은 점착성 과립의 형태 하에 혼합기를 빠져나가는 조성물을 생성시킬 것이다. 이는 건조 콘크리트 조성물에만 사용될 것이고, 본 발명의 일부가 아니다.시험은 당업자가 출발 GCC 및/또는 PCC(들)을 등급 매기기에 충분할 것이다.PCC 또는 GCC/PCC 블렌드를 사용할 때 필요한 부분만 수정하여 동일사항이 변한다."저품질", "중간 품질" 또는 "HP" 충전제의 의미에 대한 유용한 가이드라인 및 정보를 당업자에 제공하기 위해, 본 발명자들은 (당업자가 규명을 위해 기재한 바대로) 다양한 기원 및 형태의 10개의 충전제 A 내지 K를 다양한 특성 및 품질, 또는 단점에 대해 시험한 표 A를 첨부하였고, "낮은", "중간" 또는 "HP"의 분류는 각각의 라인에서 추가된다.[표 A]Firm CHRYSO에 의해 시판되고, 25.3 중량%의 농도의 상업용 제품인 (시멘트의 건조 중량 기준으로) 3 g 또는 각각 4 g의 초가소제 Premia 196을 사용한다(건조 추출물을 규격 EN 480-8에 따라 측정한다).상기 표 A에서, "+15% B"는 명백히 블렌드 또는 혼합물을 형성하기 위한 생성물 B의 15%의 첨가를 의미하고, %는 건조 중량/건조 MIX 중량 단위이다.동등하게, 칼럼 "3 g" 및 "4 g"은 3 g 또는 각각 4 g의 상기 초가소제가 시멘트 성분 단독의 건조 중량에 의해 첨가된다는 것을 의미한다."Mi"는 "수백만년"(암석의 연대)을 의미한다. "블루"는 "메틸렌 블루 시험"(순도 시험)을 의미한다.본원의 도입부는 명확하게 개선된 압축성(가능한 가장 높은 건조 재료의 %), 개선된 유동성(즉, 상기 기재된 시험에서 직경이 큰 비점착성 "갈레뜨" 또는 "원뿔"을 형성하는, 직경이 더 클수록, 유동성이 더 우수하다), 및 일반적으로 말해서 한정적으로 개선된 "실행성"(실행성은 시멘트 또는 콘크리트 조성물이 제조되고, 공정처리되고, 취급되고, 고성능 또는 "기술적인" 콘크리트를 형성하도록 사용되는 능력이다) 및 특히 최종 사용자 수준에서의 최종 생성물 특성에서의 훨씬 우수한 "규칙성"을 갖는 개선된 시멘트 또는 모르타르 또는 콘크리트 시스템 또는 조성물에 대한 필요성을 언급한다.명확하게, 이러한 바람직한 특성 중 일부는 길항제이고, 예를 들면 높은 % 건조 재료가 유동성 시험에서 빈약하게 수행되는 것을 예상해야 한다. [ 발명의 개요 ] [해결되어야 하는 기술적인 문제점(들)]본 발명의 주목적은 개선된 압축성(가능한 가장 높은 건조 재료의 백분율), 개선된 유동성(즉, 상기 기재된 시험에서 직경이 큰 비점착성 "갈레뜨" 또는 "원뿔"을 형성하는, 직경이 더 클수록, 유동성이 더 우수하다), 및 일반적으로 말해서 한정적으로 개선된 "실행성"(실행성은 시멘트 또는 콘크리트 조성물이 제조되고, 공정처리되고, 취급되고, 고성능 또는 "기술적인" 시멘트, 모르타르 또는 콘크리트 조성물 또는 시스템을 형성하도록 사용되는 능력이다)을 갖는 개선된, "고성능", 유체, 시멘트 또는 모르타르 또는 콘크리트 시스템 또는 조성물을 제공하는 것을 목표로 하는 방법을 구축하는 것이다.선행 기술에 존재하지 않고, 산업이 강하게 요구하는 또 다른 특성은 최종 시스템의 특성의 "규칙성"이다.오직 소량의 처리제로 그리고 매우 인상적인 기술적인 효과로 하기 기재된 특정한 방식에서 충전제(들)를 처리함으로써 일련의 목적이 도달될 수 있다는 것을 놀랍게도 본 발명에 따라 밝혀졌다.[발명의 간단한 개요]본 발명은 우선 상기 정의된 바와 같은 "탄산칼슘계 충전제(들)"로 이루어지거나 이들을 포함하는 충전제(들)를 포함하는 상기 정의된 바와 같은 일반적인 공지된 유형의 상기 정의된 바와 같은 시멘트/모르타르/콘크리트 조성물 또는 시스템(이하 단순히 "시멘트" 조성물 또는 시스템)의 제조 방법으로서, 상기 탄산칼슘계 충전제(들)를 초가소제(들)(superplastifier)로 이루어지거나 이들을 포함하는 효과적인 처리량의 1종 이상의 처리제로 처리하는 1 이상의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법에 있다. 처리는 예를 들면 이 방법에서 비활성이라 생각되는 다른 미립자 또는 섬유성 충전제가 아니라 충전제(들)의 탄산칼슘(들) 부분만을 처리하는 것으로 생각된다.이 바람직한 옵션 또는 최고의 방식을 "전처리" 또는 (충전제가 소형 실험실 혼합기에서 전처리되는 실험실 실험에 상응하는 표 1∼표 6에서는) 동등하게 "초기" 방식이라 칭할 것이다.동일한 표에서 언급된 "로지(Lodige)" 시험은 또한 본 발명에 따라 전처리 시험이지만, 로지 설비라 불리는 산업용의 널리 공지된 혼련 또는 혼합 장치에서 수행된다는 것에 유의해야 한다."이루어지거나 포함하는"이란 충전제가 탄산칼슘(들)으로 이루어질 수 있고, 임의로 방해하지 않는 충전제와 혼합되고, 처리제(들)는 오직 초가소제(들) 또는 초가소제(들)와 (하기 정의된 바와 같은) 방해하지 않는 가소화제(들) 및/또는 통상적인 비활성 첨가제의 블렌드일 수 있다."효과적인 처리량" 또는 "충전제 입자 또는 그레인의 효과적인 표면 피복율" 또는 "효과적으로 처리한다"는 본원에서 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 또는 훨씬 80% 또는 90% 이상 또는 여전히 훨씬 적어도 100%에 가까운 충전제(들)의 입자 표면이 초가소제(들)와 물리화학적 상호작용으로 처리된다는 것을 의미한다. 이 물리화학적 상호작용은 출원일에 완전히 이해되지 않고, 오직 효과 및 결과가 적절히 확인되었고 처리 초가소제(들)에 관련되지만, 임의의 이론에 구속됨이 없이, 출원인은 상기 상호작용 또는 "처리"는 이온성, 물리적, 기계적 및/또는 화학적 처리(들)를 수반하고 상기 상호작용(들)을 통한 표면 처리 또는 "표면 피복" 처리인 것으로 생각한다. 이 효과적인 처리 또는 처리량은 따라서 하기 더 자세히 설명되어 있고 개시된 바대로, 상기 입자 표면의 %를 처리하기에 충분히 중요해야 한다."표면 피복"이란 초가소화제가, 임의의 이론에 구속됨이 없이, 충전제의 표면의 이온성 전하와의 전기 전하 잠재적 상호작용에 관여된다고 출원인에 의해 제안되었고, 여기서 초가소제를 표면에 및/또는 표면 주위에 가깝게 고정하는 것을 촉진하고 상기 처리에 의해 그레인의 표면 포화를 갖지 않는 입자의 "접근 가능한" 표면을 감소시킨다는 것을 의미한다. 이는 입자 또는 그레인의 "비차단"에 해당하고, 처음에 "촉발"하는 것은 이후 서로에 대한 입자의 자유 이동도를 촉진한다.이는 유체화 공정이 아니다: 이는 비차단 공정을 발생시키는 "촉발 작용"이거나 입자간 상호작용/마찰의 제거를 억제하고, 특성의 나머지가 도달될 수 없고 특히 필요한 유동성에 도달될 수 없다. 이러한 "촉발된", "비차단" 기능은 적절한 "처리" 또는 "표면 피복"을 이해하는 것을 허용하는 매우 중요한 매개변수 중 하나인 것으로 생각된다."포함하는"이란 본원에서 처리제가 오직 초가소제(들)(1종 이상의 함께 혼합된, 바람직하게는 1종) 또는 하기 더 자세히 기재된 바대로 비용 절감의 목적상 공지된 가소화제(들)의 상호 방해하지 않는(즉, 뚜렷하게 상기 "처리"를 악화시킬 수 없는) 양 또는 분획을 나타내는 초가소제(들)의 블렌드로 제조될 수 있다는 것을 의미한다.1. 현재까지 정의된 바와 같은 본 발명의 최고의 방식에 따르면, 상기 충전제(들)은, 혼련 또는 혼합 장치 내에 도입하기 전에, 예컨대 외부 혼합 실험 설비 내에서 효과적으로 처리하고(표 1 내지 표 6에서 "초기"라고도 칭하는 "전처리"); 산업용 규모에서는, 이러한 전처리를 로지 혼합기와 같은 산업용 장치 또는 당해 분야에 공지된 임의의 다른 산업용 혼련 또는 혼합 설비에서 수행할 수 있다.2. 덜 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 충전제(들)를 혼련 또는 혼합 장치("내부 처리") 내에 도입한 후에 처리한다. 이러한 경우에, 상기 충전제(들)를 혼련 또는 혼합 장치 내에 도입한 후에 효과적으로 처리하고("내부 처리"), 충전제(들) 및 효과적인 처리량의 처리제(들)를, 동시에 또는 충전제(들) 및 유효량의 처리제(들)가 별도로 그러나 매우 가까운 위치 및 시간에 도입되는 방식으로, 혼련 또는 혼합 장치 내에 도입한다.3. 또 다른 실시양태에 따르면, 상기 충전제(들)은 혼련 또는 혼합 장치(예컨대, 널리 공지된 로지 설비) 내에 도입하기 전에 효과적으로 부분 전처리("부분 전처리")하고, 상기 혼합 또는 혼련 장치 내에 전처리된 상태로 도입한 후에 효과적으로 부분 전처리하며, 총 2회의 부분 처리는 상기 기재된 바와 같이 처리, 표면 피복 등의 면에서 "효과적"이고("혼합 처리"), 여기서 처리제(들)의 제2 부분 또는 양은, 전처리된 충전제와 동시적으로, 또는 전처리된 충전제(들) 및 처리제(들)의 제2 부분이 별도로 그러나 매우 가까운 위치 및 시간에 도입되는 방식으로, 혼련 또는 혼합 장치 내에 도입한다.충전제(들)를 적어도 부분적으로 혼련 또는 혼합 장치 내에서 처리할 때("고정 처리"), 당업자는 상응하는 양 또는 비율의 처리 초가소제(들)를 상기 혼련 또는 혼합 장치에 직접 또는 혼련 또는 혼합 장치(이 경우에, 예를 들면 분말화 제품을 혼련 또는 혼합 장치에 도입하기 직전에 제공되는 중량측정 장치("천칭")) 내에 도입하기 직전에 고려되는 충전제와 혼합하여 첨가해야 한다는 것을 이해할 것이다. "직전"은 충전제(들) 및 처리제가 함께 혼합되는 시간을 가질 수 없거나 갖지 않는 장소 및 시간으로서 쉽게 이해될 것이고, 처리의 시작을 유도하는 것일 것이다. 우수한 예는 2종의 분말이 함께 위치하여 이전의 혼련 또는 혼합 없이, 혼련 또는 혼합 장치에 거의 바로 도입되는 천칭이다.상기 비율의 처리제의 도입의 시점 및 시간이 부분 처리된 충전제(들)의 도입의 시점 및 시간에 가능한 가까워서, 혼합 또는 혼련 장치에 이미 존재하는 생성물(예컨대, 모래, 자갈, 혼합수, 임의로 통상적인 첨가제) 중에 희석되지 않아서, 처리제가 충전제(들)에 완전히 이용 가능한 것이 훨씬 바람직하다.옵션 "내부 처리"와 관련하여 이는 또한 사실이다. 옵션 둘 다에서, 실제로, 충전제를 처리제의 위치 및 시간과 너무 먼 위치 및 시간에서 첨가하는 경우, 도입 순서가 어떠하든, 너무 늦을 수 있는 처리로 이동할 수 있다: 이는 실제로 충전제가 도입되기 전에 처리제가 다른 성분에 의해 "소비되는 것"이 가능하게 하거나, 충전제가 처음에 도입되는 경우에, 늦은 처리, 즉 표 1∼표 6에서의 "후첨가" 방식을 발생시킬 것이다(도입된 특정한 시간 후 처리제(들)의 "후첨가"; 표 1∼표 6 및 도 1∼도 6으로부터 볼 수 있는 것처럼, 결과는 본 발명에 따른 전처리, 혼합 처리 또는 내부 처리보다 훨씬 낮다).임의의 후첨가가 회피되어야 한다.본 발명은 또한 처리 초가소제(들)의 유효량의 적어도 일부, 또는 상기 유효량의 전부가 혼련 또는 혼합 장치에 연결되는 중량측정 장치("천칭")에서 충전제(들)와 혼합되는 것을 특징으로 하는 산업 옵션을 포괄한다. 이는 동시 첨가, 또는 "근동시" 첨가로서 간주될 수 있다.또한, 충전제(들)의 일부가 효과적으로 "전처리"되고 충전제의 제2 일부가 혼련 또는 혼합 "내부에서" 효과적으로 처리되는 본 발명의 방법을 고안하는 것이 가능하다.상기 옵션 중 몇몇은 명확히 복잡하고/하거나 추가의 설비 또는 기존 설비의 변형을 요한다. 이것은 따라서 훨씬 덜 바람직하고, "전처리" 또는 초기 방식이 가장 바람직하다. 이러한 단점을 회피하기 위한 현재까지의 "최고의 방식"은 명확히 전처리된 충전제를 제조하고 이후 이를 최종 사용자에게 전달하고 이를 그대로 혼련 또는 혼합 장치 내에 도입하는 것, 가장 바람직하게는 이를, 존재하는 경우, 혼합수 및 모래 및 자갈 후에, 도입하고 연속적으로 이 산업에서 일반적인 바대로 연속해서 연화되게 하는 것이다(본 발명에서의 차이는 충전제가 처리되는 것이고, 선행 기술에서는 그렇지 않다).본 발명은 또한 예컨대- 새로운 산업 생성물으로서의 전처리된 "탄산칼슘계 충전제(들)",- 임의로 수송을 용이하게 하는 임의의 처리 후, 최종 사용자에게 전달되는 것을 포괄한다.실험실 실험에서, 관여된 적은 용적 또는 로드로 인해, 때때로 우선 실험실 혼합 장치의 바닥에서의 약간 소량의 "유체화제"로 인해: 많이는 아니지만, 약간이 이러한 유체화제가 초가소제일 수 있는 것으로 공지되어 있다. 그러나, 심지어 약간 소량의 초가소제-"유체화제"가 존재할 때, 이들은 상기 기술된 정의에 따라 본 발명에서처럼 "효과적으로" 충전제를 "처리"할 수 없다. 이들은 단지 유체화제로서 작용하여, 이들은 소정의 기간 동안 주로 단독으로, 함께 연화되는 모래, 자갈, 혼합수 등과 같은 로드의 다른 제1 구성성분과 상호작용하여, 현탁액 중에 입자 또는 골재를 유체화하기에 편리하고; 이 공정에서, 이들은 정확하게 유체화될 필요가 있는 상기 골재 입자에 의해 "고정"되거나 "소비"된다. 이들이 그렇지 않은 경우, 유체화가 없을 것이다. 따라서, 이후 이들은 충전제에 더 이상 이용 가능하지 않고; 절대적으로 완료되더라도, 본 발명자들은 잠시 약간(강제적으로 매우 소량)의 이러한 유체화제가 쾌 부분적으로 및 쾌 미미하게 이용 가능하고, 오직 쾌 미미하게 충전제를 방해하지 않을 수 있고, 이는 임의의 경우에 잠시 및 "효과적인 처리"의 시점에 도달하기 위한 시간에 본 발명에 고의적으로 첨가되는 초가소제에 의해 생성된 "효과적인" 처리 효과 또는 "표면 피복" 효과 또는 "비차단" 효과가 절대적으로 없을 수 있는 것으로 추정한다. 단순히, 비차단에 대한 필수적인 "한계점" 또는 "촉발"은 단연코 도달될 수 없고, "촉발" 없이, 결코 "비차단"되지 않을 수 있다.선행 기술은 유체화제와 관련될 수 있는 임의의 개선 또는 업그레이드를 보고하지 않고 있고(많은 유체화제가 부가적으로 초가소제가 아닌 단지 가소제이다); 특히 R0026#D 실험실에서, 이러한 업그레이드가 관찰되는 경우, 보고될 것이라는 것이 의심할 여지가 없다. "비차단"에 대한 "촉발" 효과가 결코 일어나지 않기 때문에 이는 단순하다.산업용 규모에서, 가장 일반적으로 유체화제를 사용하지 않거나, 일부 예외적인 경우에 소량 사용하고, 혼합물을 "유화"하기 위해 사용한다: 다시 한번, 유체화제는 모래, 자갈 등을 유체화하도록 "사용"되고 충전제에 이용 가능하지 않고, 따라서 본 발명의 필수 부분인 시스템의 "비차단"을 "촉발"하지 않을 수 있다.상기 기재된 바대로, 상기 충전제(들)는 탄산칼슘(들) 또는 이들의 블렌드, 즉 주로 GCC 또는 PCC 또는 GCC의 블렌드 또는 PCC의 블렌드 또는 GCC와 PCC의 블렌드로 제조된다. 본 발명은 또한 (상기 정의된 광의에서의) 상기 "시멘트 조성물" 및 이의 용도, 및 상기 조성물로부터 얻은 "시멘트 부재 또는 제품", 및 "시멘트" 산업에서의 이의 용도에 있다. "시멘트 부재 또는 제품"이란 이의 전체 명세서에서 상기 조성물로부터 제조되는 빌딩 또는 구조물의 각각의 및 임의의 조각(또는 "시멘트" 조성물을 사용하여 해양 굴착(off-shore) 시멘팅, 또는 유정 시멘팅을 비롯하여, 당업자에게 공지된 임의의 다른 산업 목적을 위한 임의의 조각 또는 제품)을 의미한다.이는 하기 자세히 기술될 것이다. [ 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 ] 상세한 그리고 가장 바람직한(오늘날의 "최고의 방식") 실시양태에서, 상기 "시멘트" 조성물 또는 시스템을 제조하기 위한 상기 공정은 (소위 "전처리" 또는(즉, 표 1∼표 6에서) 동등하게 "초기" 방식에서) (a) 이하 충전제 또는 충전제(들)라 칭하는 상기 정의된 바와 같은 건조 탄산칼슘(들) 충전제의 분말을 제공하는 단계,(b) 상기 충전제(들)를 유효량의 1종 이상의 초가소제와 혼합하여, 전처리된 충전제(들)를 생성하는 단계,(c) 상기 전처리된 충전제(들)를 혼합수 또는 가능하게는 통상적인 또는 "방해하지 않는" 첨가제를 포함하는 혼합수의 조성물("혼합수 조성물")(이하 단순히 "혼합수")을 이미 포함하는 혼련 또는 혼합 장치에 도입하는 단계, (d) 임의로, 단계 (c) 전에 또는 후에, 바람직하게는 단계 (c) 전에, 모래 및/또는 자갈과 같은 골재, 및 가능하게는 다른 "방해하지 않는" 통상적인 첨가제 또는 부형제를 첨가하는 단계,(e) 효과적인 기간 동안 상기 장입물을 혼련 또는 혼합하는 단계, 및(f) 상기 "시멘트" 조성물을 회수하는 단계를 특징으로 한다."방해하지 않는"이란 상기 고려되는 처리 또는 본 발명의 방법에 의해 방해되지 않거나 두드러지게 방해되지 않는다는 것을 의미한다."효과적인 기간"이란, 2∼15 분, 바람직하게는, "표준" 혼합물 또는 블렌드의 경우, 30∼60 초의 차수로 균일한 혼합물 또는 블렌드를 생성시키는 전체 기간을 의미한다. 이는 이하 기술될 것이다.최종 사용자 용도의 예는 하기와 같다: 최종 사용자가, 예를 들면 고정 설비 등에서 시설 내의 최종 혼합에 의해 이의 최종 시멘트 조성물에 대한 중간 또는 "표준" 특성을 표적하는 경우, 통상적인 첨가제, 초가소제, 충전제 등의 면에서 구체적으로 복잡하거나 민감하지 않은 상응하게 단순한 조성물을 사용할 것이고; 따라서, 최종 사용자는 35∼65 초 초과에서처럼 비교적 짧은 시간 동안 혼합해야 할 것이다.　 반대로 최종 사용자가 높은 수준의 또는 매우 HP 특성을 표적하는 경우, 이 사용자는 상응하게 더 복잡한 조성물 및 더 민감한 부품, 예를 들면 더 민감한 충전제 또는 초가소제, 또는 특정한 특성 등에 도달하는 것을 목표하는 민감한 통상적인 첨가제를 사용할 것이고, 일반적으로 이 사용자는 혼합수를 덜 또는 훨씬 덜 사용할 것이고: 따라서 이 사용자는 1∼3 내지 10∼15 분 초과와 같은 훨씬 긴 시간 동안 혼합할 필요가 있을 것이다.명확하게, "기술적인" 조성물 또는 시스템은 "HP" 품질(상기 "자가 평탄화 시험" 섹션 참조) 또는 "유체"(또한 상기 참조)를 의미하고, 반대로 "표준" 최종 조성물은 "비HP" 품질, 즉 "건조" 또는 그보다 더 "플라스틱"(상기 참조)을 의미한다.두 경우, 즉 "기술적인" 또는 "표준" 조성물에서, 본 출원에 설명된 바대로, 공통의 목적은 또한 본 출원에 구체적으로 설명된 바대로 균일한 조성물에 도달하는 것이고, "주요 필수 조건은 ... 최종 생성물이 균일해야 한다"는 것이라는 하기를 참조한다.상기 작동 원칙은 당업자에게 널리 공지되어 있고 단지 완성도를 위한 것이다. 상기 값 및 예는 오직 가이드라인을 제공할 것이고, 당업자는 필수 "주요 기준"을 충족하기 위해 이를 쉽게 사용할 수 있을 것이다. 상호작용이 복잡하고, 동력학 등도 복잡하기 때문에 임의의 유형의 궁극적인 조성물 또는 성분에 대한 예 또는 데이터를 제공하는 것이 불가능하지만, 당업자가 이 매개변수에 대해 알고 있다는 것을 이해할 것이다.덜 바람직한 방식에 따르면, 상기 "시멘트" 조성물 또는 시스템을 제조하기 위한 상기 방법은 "혼합 처리" 방식에서 (a) 상기 정의된 바와 같은 건조 탄산칼슘(들) 충전제의 분말을 제공하는 단계,(b) 상기 충전제(들)를 유효량의 1종 이상의 초가소제의 일부분 또는 일부와 혼합하여, 부분적으로 전처리된 충전제(들)를 생성하는 단계,(c) 상기 부분 전처리된 충전제(들)를 혼합수 또는 가능하게는 통상적인 첨가제를 포함하는 혼합수의 조성물("혼합수 조성물")(이하 단순히 "혼합수")을 이미 포함하는 혼련 또는 혼합 장치에 도입하는 단계, (d) 단계 (c) 전에 또는 후에, 바람직하게는 단계 (c) 전에, 상기 효과적인 처리량 또는 비율의 초가소제(들)의 나머지를 상기 혼련 또는 혼합 장치에 도입하는 단계, (e) 임의로 단계 (c) 및 단계 (d) 전에 또는 후에, 바람직하게는 후에, 모래 및/또는 자갈과 같은 골재, 및 가능하게는 상기 처리를 방해하지 않는 다른 통상적인 첨가제를 첨가하는 단계, (f) 효과적인 기간 동안 상기 장입물을 혼련 또는 혼합하는 단계, 및(g) 상기 "시멘트" 조성물을 회수하는 단계를 특징으로 한다.또 다른 실시양태에 따르면, 상기 "시멘트" 조성물 또는 시스템을 제조하기 위한 상기 방법은 "내부 처리" 방식에서 (a) 상기 정의된 바와 같은 건조 탄산칼슘(들) 충전제의 분말을 제공하는 단계,(b) 상기 비처리된 충전제(들)를 혼합수, 가능하게는 통상적인 첨가제를 포함하는 혼합수의 조성물("혼합수 조성물")(이하 단순히 "혼합수") 또는 처리량의 1종 이상의 초가소제를 이미 포함하는(또는 상기 비처리된 충전제(들)의 도입 직후 상기 초가소제를 수용한) 혼련 또는 혼합 장치에 도입하는 단계,(c) 효과적인 기간 동안 상기 장입물을 혼련 또는 혼합하는 단계, (d) 임의로 단계 (c) 전에 또는 후에, 바람직하게는 후에, 모래 및/또는 자갈과 같은 골재, 및 가능하게는 상기 처리를 방해하지 않는 다른 통상적인 첨가제를 첨가하는 단계, 및(e) 상기 "시멘트" 조성물을 회수하는 단계를 특징으로 한다."직후"는 처리된 충전제(들) 전에 또는 후에 처리제가 도입될 수 있지만, 제2 경우에, 모래, 자갈 등과의 혼련 또는 혼합으로 인해 어떠한 방해 없이 충전제가 처리제에 완전히 이용 가능하게 남아 있도록, 충전제(들) 후 신속히, 즉 수초 내지 10 초 등등으로 도입되어야 한다는 것을 의미한다.다른 단계를 수행하기 전에 모래 및 자갈과 같은 골재를 혼련 또는 혼합 장치에 도입하고, 이를 임의로 소량의 물 및/또는 유체화제(상기 참조)와 혼합하는 것이 일반적으로 가장 바람직하다.처리제로서, 1종 이상의 초가소제(및 가능하게는 약간의 비활성 양의 가소화제와 함께 1종 이상의 초가소화제)가 사용된다.처리제의 상기 정의에 따르면, 충전제에 대한 소위 처리제는 초가소제(들)로 이루어지거나 이를 포함하거나, 1종 이상의 초가소제(및 임의로 전체 비용을 감소시키기 위해 1종 이상의 가소제)를 포함하고, 바람직하게는 1종 이상의 초가소제 및 임의로 1종 이상의 효과적으로 비용을 감소시키는 양의 가소제, 및 가장 바람직하게는 1종의 초가소제 및 임의로 1종의 효과적으로 비용을 감소시키는 양의 가소화제로 이루어진다. 초가소제는 널리 공지된 물질이고, 하기 생성물 또는 부류 및 이들의 블렌드 중에서 가장 바람직하게 선택된다: 폴리카복실레이트, 폴리카복실레이트 에테르, 또는 훨씬 덜 바람직하게는 설폰화 나프탈렌 응축물 또는 설폰화 멜라민 포름알데하이드로부터 제조된 생성물. 이러한 생성물은, 당업자가 알고있는 것이며 상기에서 인용된 선행 기술에 추가로 개시되어 있다. 본 발명에서, 최고의 방식 처리제(생성물 A 및 생성물 B)는 초가소제 패밀리에서, 폴리카복실레이트 에테르 화학식인 것으로 보인다.표 A에서의 생성물 코드 A 내지 K는 (초가소제(들))인 상기 바람직한 처리제(들) A 및 B와 혼동을 야기하지 않으면서 특징지어지는 충전제라는 것에 유의한다."효과적인 기간"은 본원에서 표준 조성물의 경우 약 35∼65 초의 기간을 의미하고, 더 "기술적인", 즉 더 복잡하고/하거나 더 민감한 조성물의 경우 당업자에게 공지된 바대로 1∼3 분 내지 10∼15 분이다."표준" 조성물의 경우, 예는 자갈 및 모래의 경우 10∼15∼20 초(건식 혼련 또는 혼합이 바람직함), 이후 수경성 결합제 및 비처리된 충전제의 혼련 또는 혼합의 경우 10 초, 이후 처리제(들) 및 혼합수와의 혼련 또는 혼합(이는 소위 "내부 처리 방식")의 경우 10∼15 초, 이후 최종 통상적인 첨가제"와의 최종 혼련 또는 혼합의 경우 5∼15 초의 혼련 시간일 수 있다. 상기 "혼합 기간"에 대한 주요 필수 조건은 최종 생성물이 균일해야 하고 처리제(들)가 모래 또는 자갈에 흡착 또는 흡수되지 않거나, 덜 가능한 정도로 흡착 또는 흡수되는 것이다."유효량"의 가소화제(초가소제와 존재할 때)는 본원에서 시스템, 즉 충전제(들) 거동을, 즉 표면 활성 및 반응성의 면에서, 부정적으로 방해하지 않으면서, 처리 비용을 감소시킬 수 있는 가소제의 양 또는 비율을 의미하고; 동일한 기준이 불활성 첨가제"에 적용된다. "포함하는"이란 본원에서 상기 처리제가 실질적으로 또는 전부 정의된 바와 같은 초가소제(들)로 이루어지고, 기재된 바대로 비용을 감소시키는 유효량의 1종 이상의 가소제를 포함할 수 있고, 또한 절대적으로 당업자에게 공지된 바대로 의도하는 최종 용도, 예컨대 소포제, 지연제, 촉진제 등에 유용한 비활성 첨가제를 포함할 수 있다는 것을 의미한다. 비활성 성질의 일반적인 첨가제를 상기 기재된 바대로 당업자에게 공지된 주입 시점에서 첨가할 수 있다.혼합 또는 혼련 장치를 뱃치 방식, 반연속 방식, 또는 연속 방식으로 조작할 수 있고, 적용은 평균 당업자의 용이한 범위 내에 있다.실제로, 단순히 "유체화제"로서 이전에 사용한 이러한 초가소제(들)가 중간 등급으로부터, 때때로 낮은 등급으로부터 HP 등급으로 충전제를 업그레이드할 수 있다는 것을 놀랍게도 발견하였다. 충전제(들)의 전처리 및 처리에 사용되는 초가소제(들)의 용량최종 사용자의 위치에서, 초가소제(들)의 용량은 건조/건조 기준으로 100 kg의 시멘트의 경우 0.3 내지 3 kg, 바람직하게는 100 kg의 시멘트의 경우 0.8 내지 1.2 kg이다.실험실 조건에서, 상기 비율은 건조/건조 기준으로 (건조) 탄산염의 0.05 ∼ 0.1 중량% 범위, 즉, 시멘트 100 kg당 0.1 ∼ 0.3 kg이다.실험실 조건에서, 표 A를 확립하기 위해, 건조/건조 기준으로 시멘트 100 kg당 0.8 내지 1.1 kg을 사용한다.최종 사용자 위치에서, 초가소제(들)/가소화제(들) 비는 중량 건조 기준으로 100/0 내지 95/5∼90/10, 바람직하게는 85/15 이상일 수 있다. 본 발명은 또한 - 특히, 물리적 구조 및 특성에 의해 선행 기술의 유사한 조성물로부터 구별되므로, 또는- 본 발명의 상기 방법에 의해 제조된 바와 같은, 상기 시멘트(시멘트, 시멘트질 조성물, 모르타르, 콘크리트인 상기 제공된 광의에서의) 조성물(또는 시스템), 및 콘크리트 부재를 제조하기 위한 이러한 시멘트 시스템 또는 조성물의 용도, 및 - 특히, 동일한 이유로 조성물과 구별되므로, 그리고- 상기 조성물을 사용하여 제조된 바와 같은,궁극적으로 시멘트 부재, 및 - 본 발명의 전처리 방법에 의해 전처리된 탄산칼슘계 충전제(들)에 있다.또 다른 목적은 비용 효과적인 용량에서 "갈레뜨" 또는 "원뿔"이 직경 250 ㎜ 초과, 가장 바람직하게는 300 ㎜ 초과, 또는 훨씬 더 바람직하게는 300 ㎜ 초과라는 의뢰인의 요건을 명확히 만족시키는 것이다.몇몇 충전제 함유 조성물은 충전제의 기원에 따라 이 요건을 만족시킨다. 원뿔 및 플레이트 시험을 수행함으로써 당업자가 이를 용이하게 그리고 신속하게 이해할 수 있다.따라서, 이 시험은, 최종 사용자가 요하는 최종 특성의 관점에서, 충전제를 구별하고 최고로 수행되는 충전제 및 심지어 최고로 수행되는 초가소제(들)를 선택하게 할 것이다.많은 것이 특히 훨씬 이 요건을 만족시키지 못한다.일반적으로(선행 기술 공정), 비처리된 충전제 상에서 시험을 수행한다. 본원에서, 초가소제를 특정한 공정 및 본 발명의 공정에서 충전제용 처리제로서 사용한다. 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 충전제(들) 및 따라서 전체 조성물의 거동을 개선하기 위해 상기 초가소제(들) 및 임의로 (상기 참조) 1종 이상의 비용을 감소시키는 유효량의 가소제(들)를 혼합/혼련 장치 내에 도입함으로써 중간 또는 저 품질, 충전제 함유, 시멘트/모르타르/콘크리트(단순히, "시멘트" 조성물 또는 시스템을 HP(또는 고성능) 조성물로 업그레이드하는 것이다.바람직하게는 상기 인용된 것 중에서 가소제(들)를 선택한다.이 패밀리는 당업자에게 매우 잘 공지되어 있다. 본 발명자들의 장점은 이 패밀리 및 선행 기술의 상식에서의 초가소제로서의 이의 용도를 발견하지 못했고, 탄산칼슘계 충전제를 이러한 종으로 처리함으로써 시멘트 충전제(및 따라서 시멘트 조성물)를 매우 업그레이드할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 특정한 조성물이 원뿔 직경("자가 평탄화 시험"), 점착성 등에서 너무 낮아서 이를 업그레이드할 방법이 없다는 것에 유의하고; 이는 본 발명의 업무의 어려움을 입증한다.몇몇은 본 발명에 따라 사용되는 많은 비율의 초가소제를 첨가함으로써만 업그레이드될 수 있고, 심지어 이러한 경우에, 직경 요건이 일치될 수 있지만, "갈레뜨" 또는 "원뿔"은 점조도에서 두껍고 점착성으로 남아 있고, 이것은, "갈레뜨"의 직경이 정확하다는 사실에도 불구하고, 조성물이 HP 콘크리트 조성물로 업그레이드되는 것으로 고려될 수 없다는 결과를 의미한다.조성물로서 허용 가능하거나 또는 저 또는 중간 품질로부터 HP 품질로 업그레이드되는 콘크리트 조성물 또는 시스템의 경우, 2가지 특징이 동시에 만족되어야 한다는 것을 유의해야 한다:- "갈레뜨" 또는 원뿔의 직경은 약 250 초과, 또는 300 훨씬 초과, 또는 350 ㎜ 보다 훨씬 초과이어야 하고,- "갈레뜨" 또는 원뿔은 점조도에서 두껍지 않거나 점착성이어야 한다.이는 본 발명이 극복하고자 하는 매우 어려운 도전, 및 당해 분야의 현재 상태에 대한 본 발명이 가져오는 매우 높은 기술적인 및 과학적 투입의 또 다른 측정이다.첨부된 표 A로부터 볼 수 있는 것처럼, "빈약한" 충전제는 이것이 결코 특징 둘 다를 만족시킬 수 없으므로 업그레이드될 수 없다.여러 "중간" 충전제, 예컨대 생성물 D, B, G, I 및 K가, 예를 들면 4 g의 용량에서 우수한 유동성을 보일 수 있지만 나쁜 양상 또는 취급 거동을 갖는 것이 또한 사실이다. 표 A 및 상기 및 하기 코멘트의 도움으로, 당업자는 본 발명에 의해 업그레이드될 수 있는 충전제와 본 발명에 의해 업그레이드될 수 없는 충전제(표 A의 시험마다 "저품질"로 간주됨)를 구별할 수 있을 것이다.이러한 목적을 성취하기 위해, 당업자는 우선 특정한 물/시멘트 비율이 조성물의 실행성에 바로 연결되고 이것이 또한 고성능 또는 "기술적인" 수준의 침강 특성, 건조 특성, 기계적 강도, 즉 압축 강도 등과 같은 최종 생성물에서의 고성능 품질을 개발하는 데 긴요하다는 것을 유념해야 한다.상기 기재된 바대로, 본 발명은 우선 (임의로 1종 이상의 가소제와 함께) 1종 이상의 초가소화제(들)에 의한 CaCO3계 충전제(들)의 표면 처리에 있다. 상기 기재된 전체 처리를 방해하지 않는, 효과적인 비용 효과적인 양으로서 가소제의 양을 당업자가 용이하게 계산할 수 있을 것이다.2개의 초가소제 생성물은 최고의 결과를 제공한다. 이는 상기 언급된 바대로 출원일자(폴리카복실레이트 에테르 패밀리의 생성물 A 및 B)에 "최고의 방식"이다.본 발명을 사용할 때, 0.03 또는 0.05 내지 0.1%만큼 낮은 CaCO3 충전제(들)의 경우 초가소제(들) 처리제(들)의 비율이 충분하다는 것이 매우 놀랍다. 이러한 극소량의 처리제가 심지어 중간 내지 빈약한 충전제를 HP 품질로 업그레이드할 수 있다는 것을 확인한 것이 매우 놀랍다.많은 이러한 가소화제, 초가소화제 또는 유체화제가 예를 들면 CHRYSO 특허 EP 0 663 892에 기재된 바대로 공지되어 있다.탄산염 충전제, 예컨대 상기 인용된 EP 특허에 기재된 CHRYSO™ 제품, 예컨대 PREMIA 196™ 또는 Mappei™으로부터의 NRG 100의 표면 처리를 수행하기 위해 본 발명의 방법에서 사용 가능한 초가소제(들)로서 다른 제품을 성공적으로 시험하였다.공기 연행제, 응결 지연제 또는 촉진제 등과 같은 여러 일반적인 첨가제를 예를 들면 물과 함께 또는 초가소제를 첨가한 후 당업자로부터 공지된 위치에서 통상적으로 첨가한다.시멘트 및 충전제인 "분말"과 관련하여, 시멘트를 처음에 첨가하고, 이후 충전제를 첨가할 수 있거나, 그 역일 수 있거나, 이들을 사전혼합물(premix)로서 함께 도입할 수 있다.그러나, 분말 둘 다 물과 균일하게 혼합되고 이에 의해 습식되도록 더 잘 보장하기 위해 시멘트 및 충전제를 사전혼합물로서 함께 도입하는 것이 바람직하다. 상기는 뱃치 방식이다. 또한, 예를 들면 (설비의 길이에 걸친 다양한 시점에서의 첨가와 함께) 엔드리스 나사가 구비된 혼련 또는 혼합 장치에서(가능하게는 사전혼합물을 여러 시점(들)에 첨가함), 또는 또 다른 예로서, 또한 장치 중 하나에서 사전혼합물(들)을 첨가하는 가능성으로, 일련의 연속 혼련 또는 혼합 장치에서 상기 순서 중 하나에서 첨가를 수행하는 것과 같은 연속 방식을 생각할 수 있다. 특히 후자의 옵션(몇몇 혼련 또는 혼합 장치)이 필요한 공간 및 투자의 경우에 한해 다양한 단점을 갖는다는 것이 당업자에게 명확할 것이다.뱃치 방식이 바람직하고 하기 언급될 것이다.시험은 당업자가, 이용 가능한 설비의 관점에서 및 본원에 첨부된 하기 표 및 도면의 도움으로, 가장 적절한 최종 사용자 실행을 선택하는 것을 도울 수 있다.표 1, 표 2 및 표 3 및 도 1, 도 2, 도 3:표 및 도 1, 도 2 및 도 3에서, "중간" 충전제를 사용하고, 이는 처리제가 없는 170 ㎜의 직경(왼편 칼럼) 및 자가 평탄화 공정 후 동등하게 기재된 처리제의 용량(용량이 건조 처리제/CaCO3(중량 건조)의 중량%로 표현됨)에서의 양상이 기재된 "갈레뜨"로, "원뿔 시험"을 생성시킨다. 상기 기재된 바대로 170 ㎜은 훨씬 불충분하다.표 1 및 도 1은 상응하는 표에서 표시되는 바와 같은 용량으로 상기 기재된 초가소제 A에 의한 표면 처리에 상응한다.표 2 및 도 2는 상응하는 표에서 표시되는 바와 같은 용량으로 상기 기재된 초가소제 B에 의한 표면 처리에 상응한다.표 3 및 도 3은 상응하는 표에서 표시되는 바와 같은 용량으로 제품 NRG 100에 의한 표면 처리에 상응한다.[표 1][표 2][표 3]도 1 내지 도 3의 3개의 곡선에서, 모든 다른 성분(비교용, 훨씬 덜 바람직한 방식) 후 초가소제(들)의 첨가에 상응하는 곡선은 "다이아몬드"(표에서의 "후첨가 방식")로 표시되고, 본 발명의 "전처리 방식" 또는 "초기"(전처리의 실험실 버전) 곡선"은 "사각형"(표에서의 "초기 방식")으로 표시된다.표에서의 "삼각형"은 혼련 또는 혼합 장치(표에서의 오른편, 오직 0.1% 용량에서의 원뿔 시험에서의 "갈레뜨"에 대한 435, 437 및 435 ㎜) 내에 이의 도입 전에 3 또는 5 분 동안 로디그(LODIGUE)와 같은 외부 혼합 장치에서 충전제의 100% 전처리에 상응하는 분리 지점이다. 상기 "삼각형"은 때때로 도 1∼도 6에서 알아차리기 어려운데, 왜냐하면 이것은 사격형 및/또는 다이아몬드와 중첩되고, 도 1 내지 도 6은 도 1a 내지 도 6a(곡선) 및 도 1b 내지 도 6b(중첩 마스크의 대략적 위치를 보여주는 도식적인 확대 규모)로 분할된다. 더 조악한 충전제를 처리하기 위해, 부형제(들)의 양이 훨씬 또는 상당히 더 높아야 하는 것으로 예상된다. 그 역이 일어날 수 있다는 것, 즉 0.03∼0.05 내지 0.1∼0.5%와 같은 비율이 쾌 효과적이라는 것이 쾌 놀랍다.도 1 및 2의 곡선에서(및 상응하는 표 1 및 표 2에서의 % 값으로부터) 약 0.1% 초과의 부형제를 도입하는 것이 필요 없도록 약 0.12%에서의 "플래토(plateau)"의 발생에 주목하는 것이 놀랍다.최고의 범위는 따라서 0.1%∼0.12%이다.곡선의 더 낮은 부분의 연구, 즉 B에 의한 처리에 관한 연구가 명확한 기술적인 효과가 0.03∼0.05%에서 나타난다는 것을 보여준다는 것에 유의하고: 직경(점조도)에서의 매우 가파른 증가에 주목하고 이는 250∼300 ㎜의 ("갈레뜨" 또는 원뿔의) 자가 평탄화 요건이 도달되는 한계점 용량(범위의 더 낮은 한계)을 나타낸다.표 3 및 도 3에 있어서, "초기 방식" 곡선이 도 1 및 도 2의 곡선과 쾌 유사하는, 즉 0.1∼0.12%∼0.20% 또는 기타 등등 후 매우 명확한 "플래토", 및 더 낮은 용량에 대한 점조도의 유사한 가파른 증가라는 것을 볼 수 있고, "후첨가" 방식 곡선은 낮은 용량에서 유사한 거동을 보여주지만, (0.05% 초과 또는 기타 등등) 규칙적이지만 더 느린 증가를 보여준다. 이 초가소제 A의 경우, "초기 방식" 공정에서의 용량의 유용한 범위가 (300 ㎜ 점조도에 상응하는) 0.05% 내지 0.1∼0.12%∼0.20%(곡선 1 및 곡선 2에서와 같은 명확한 "플래토"의 시작)이라는 것으로 볼 수 있고; 반대로, "후첨가 방식" 곡선으로, 더 낮은 용량 한계점은 거의 동일하고(2개의 곡선은 약 300 ㎜에서 중첩됨), 전처리 곡선의 경우 약 0.1%에 대해 약 425 ㎜, 또는 로지 지점에 도달하기 위해 약 0.3%의 제품 NRG 100을 첨가하는 것이 필요하다.그러나, "초기 방식" 곡선은 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 약 0.1∼0.12∼0.15%의 처리제 A에 대해 사용되는 450 ㎜에서 플래토에 도달하도록 허용하고, B 및 NRG 100은 동일한 %의 경우(및 "초기 방식" 곡선의 경우) 약 425 ㎜에 있다는 것을 볼 수 있다.따라서, 곡선 및 부형제(들)의 비율이 시스템이 비차단되게 허용하는 시점(이는 비차단 지점임)인 0.02∼0.03∼0.05% 초과의 초가소제(들)/중량 시멘트(건조)의 ㎜ 단위의 점조도의 원하는 값에 따라, 기술적인 효과가 나타나는 것을 볼 수 있다. 이 "비차단"은 아마도 본 발명의 방법의 예상치못한 효과에 대한 비결일 것이다. 따라서, 다시 부형제 및 점조도의 원하는 값에 따라, 그리고 이 충전제의 경우, 상기 "비차단" 지점으로부터 최적 비율이 약 0.08∼0.1∼0.12∼0.15%에 있다는 것을 추론할 수 있고("플래토"가 뒤따르므로, 더 많은 값비싼 부형제를 첨가할 필요가 없고, 예를 들면 0.5% 이하로 상승할 필요가 없다), "초기 방식 또는 "전처리" 공정" - 즉 초가소제(들) 부형제(들)가 (또는 첨가의 동일한 시점에) 충전제와 첨가되는 공정(즉, 충전제는 우선 공지된 로지 혼합 장치와 같은 별개의 설비에서 초가소제 부형제(실제 더 우수한 결과가 없고, 상기 "삼각형" 지점 참조)을 사용하는 것이 가장 바람직하거나, 초가소제(들)(및 임의로 비용 감소적인 양의 가소제(들))를 충전제와 함께 첨가할 수 있는데, 왜냐하면 "초기 방식" 또는 "전처리" 곡선이 "후첨가 방식" 곡선(즉, 처리제가 충전제(들) 후를 비롯하여 모든 주성분 후 첨가될 때)보다 항상 우수하다는 것을 도 1, 도 2 및 도 3으로부터 볼 수 있기 때문이다.더 많은 최적의 0.1∼0.12∼0.15%의 부형제/시멘트를 첨가하는 것이 심지어 더 위험할 수 있는데, 왜냐하면 너무 많은 부형제가 있을 것이고 따라서 자유 중합체(즉, 자유 부형제)가 시스템에 잔류할 것이기 때문이다. 상기 과량의 부형제(자유 중합체)가 시멘트, 다른 첨가제 등과 상호작용할 수 있고 시스템을 불안정하게 할 것이다.표 4, 표 5, 표 6 및 도 4, 도 5, 도 6:원칙 및 절차는 표 1∼표 3 및 상응하는 도 1∼도 3에서와 동일하다.본 발명자들은 이때 원뿔 시험에서 매우 우수한 거동의, 이미 288 ㎜ 직경의 처리되지 않고, 점착성이 아니고, 두껍지 않고 매우 유체 자가 평탄화된 원뿔 또는 "갈레뜨"를 갖는 상이한 충전제에 의함을 제외하고는 상기와 동일한 실험을 나타내는 (도 4, 도 5 및 도 6에 상응하는) 표 4, 표 5 및 표 6을 첨부하였다. [표 4][표 5][표 6]볼 수 있는 것처럼, 2개의 상이한 공정에 상응하는 곡선 사이에 "우수한 또는 HP" 충전제의 유형에 대해 심오한 차이가 존재한다.그러나, 곡선 유형 둘 다의 경우 약 0.1%의 초가소제(들) 부형제/건조 시멘트에서 상부 최적 한계점이 존재하고, 다시 한번, 부형제 A가 B 및 NRG 100과 약간 상이하게 거동한다는 것을 볼 수 있다.상기 언급된 바대로, 그러나 HP 또는 기술적인 품질 시스템을 생성하기 위해 2가지 특성이 동시에 만족되어야 한다는 것에 유의해야 한다:- 높은 점조도 즉, 대략, 자가 평탄화 시험을 통해 볼 수 있는 것처럼 높은 유체성/실행성, 즉 약 250∼300 초과 또는 320∼350 ㎜ 훨씬 초과의 직경(및 다공도가 거의 없는 밀도 또는 압축성) 및 동시에- 경사 분리 없이, 점착성이 아니고, "두껍지" 않은(즉, "취급"하기 쉬운), "플라스틱"이 아닌(그리고 명확히 "건조"가 아닌) 생성물.이는 상기 6개의 표로부터 볼 수 있다.예를 들면, 표 1 및 표 2(중간 (170 ㎜) 충전제 + A 또는 B 초가소제)에서, 하기를 알 수 있다:- 시험 2312/B1 및 B4, 둘 다 "후첨가 방식": 0.025%의 부형제에서 의해, 얻어진 시스템은 0.05%(395 ㎜)에서의 용량으로의 열등 물질을 통해 2312/B4에 대해서만 직경(335 ㎜)에서 우수하지만 B4는 사용 가능한 생성물을 형성하지 않는데, 왜냐하면 이는 "플라스틱 양상"을 갖기 때문이고: 제2 조건이 만족되지 않고, B5는 "유체"이고 사용 가능하다. 반대로, B1은 0.05%에서 균일한 양상을 갖지만 오직 불충분한 238 ㎜ 피쳐를 나타낸다.- 시험 2312 B10("초기", 즉 "전처리 방식") 및 B13(너무 초기 방식): 0.025%의 동일한 용량의 경우, 표 2 생성물 B는 더 우수한 직경을 생성시키지만, 상기 모두 "유체" 생성물을 생성시키고 B10은 오직 균일한 생성물을 형성한다. 동일한 용량에서, 생성물 B를 갖는 B4는 플라스틱 생성물을 생성시킨다.표 2의 "초기 방식" 시험 B13 내지 B16 중에서, 본 발명자들은 모든 시스템이 유체이고, 용량에 따른 직경(점조도)의 증가가 있다는 것에 주목하였다.로지: 본 발명자들이 0.1%의 용량에서 2312/B21(로지 장치에서의 사전혼합물의 사용)을 비교한 경우, 그리고 본 발명자들이 0.1%의 동일한 용량에서 로지가 없는 초기 방식, 즉 2248/1(표 1)과 비교한 경우, 둘 다 유체이고 로지가 명확히 추가의 설비 로지의 사용을 정당화하지 않는 약간 더 낮은 직경(435 대 442 ㎜)을 제공한다는 것을 볼 수 있다. 따라서, 충전제(들) 및 처리제(들)를 "동시에", 즉 위치 및 시간의 면에서 매우 가까운 첨가 시점에서 도입함으로써 "초기" 또는 "전처리" 방식을 최고로 수행한다.각각의 표 및 곡선을 상기와 같이 분석할 수 있고, 당업자는 상기 매개변수의 관점에서 자체의 시스템, 특정한 수요 또는 요건을 "구축"하기 위해 복수의 매개변수, 상이한 초가소제, 2가지 상이한 유형의 충전제(1개는 비처리된 170 ㎜ 점조도에서 중간이고, 다른 1개는 비처리된 280 ㎜ 점조도에서 HP이다), 및 2가지 공정 방식을 사용하여 이러한 다양한 데이터를 사용할 수 있을 것이다."혼합 처리" 시험:전체량의 충전제(GCC "중간" 품질)에 50%(0.05%)의 유효량의 초가소제 A를 첨가함으로써 그리고 실험실 혼합기에서 생성물 둘 다를 혼합하고, 이후 신속히 남은 50%이 초가소제를 혼련 또는 혼합 장치에 도입하고, 이후 처음 50%의 초가소제 A에 의해 외부에서 처리된 충전제를 5 초 후 도입함으로써 충전제에서 처리를 수행한다는 점을 제외하고는, 표 1(처리 용량 0.1%)의 2회 시험 2248/1에 의해 실험실 시험을 수행한다. 자가 평탄화 시험에서의 직경은 392 ㎜이고, 양상은 "유체"이고; 따라서 혼합 처리가 직경에서 약간 열악하지만, 명확히 본 발명의 일부라는 것을 고려할 수 있다.초가소제(들)(및 임의로 비용 감소적인 앙의 가소제(들))의 첨가의 전체 범위는 따라서 모든 상기 시험 및 곡선, 및 본원에 제공된 일반적인 정보의 관점에서 하기와 같이 정의될 수 있다:0.02∼0.03∼0.05% 내지 0.08∼0.1∼0.12∼0.15%의 부형제(들)/건조 중량의 시멘트로부터당업자에 의한 용이한 조정에 의해.본 발명의 모든 목적, 즉 현대의 산업의 수요 및 요건은 하기를 만족시킨다는 것을 볼 수 있다:- 상기 기재된 1종 이상의 부형제에 의한 표면 처리의 낮은 용량에서(그러므로 낮은 비용에서),- 추가의 설비의 사용을 필요로 하지 않고,- (선행 기술에서 거절되거나 부당한 비용 및 투자에서 처리된) 중간 내지 빈약한 거동 충전제를 다른 일반적인 성분과 형성할 수 있는 HP 충전제로 용이하게 업그레이드할 수 있다,- 시멘트 또는 모르타르 또는 콘크리트 조성물 또는 시스템,- 자가 평탄화 표준화된 시험에서의 250 초과, 300 초과, 또는 심지어 350 ㎜ 초과의 높은 내지 매우 높은 점조도, 높은 내지 매우 높은 압축성(밀도), 최종 생성물에서의 높은 내지 매우 높은 %의 건조 재료, 최종, 완전한 시스템에서의 87 내지 95 중량%의 건조 재료에 의해 "기술적인" 등급에 있다,- 당업자는 제공하는 것은 가장 엄격한 및 최신의 산업 필요조건을 만족시키는 가능성뿐만 아니라, 처음으로 특성에서의 "규칙성", 예측가능성을 특징으로 하는 생성물이다.이 "규칙성"은 산업에서의 필요에도 불구하고 선행 기술에 의해 훨씬 도달되지 않는 신규한 특성이고; 이론에 구속되고자 함이 없이, 공정 단계 및 사용된 초가소제는 이 "규칙성"을 담당한다. A 및 B 상기 표면 처리 생성물의 용량을 조정하거나, 상기 기재된 바와 같은 다른 생성물을 선택하고, "규칙성"이라 불리는 특성이 일정하게 남아있는지를 보장하기 위해 상기 기재된 시험 방법을 사용함으로써 "규칙성"의 추적관찰이 가능하다.용도(들)용도는 통상적으로 상기 기재된 시멘트, 모르타르, 또는 콘크리트 조성물 또는 시스템을 사용하는 모든 것이다.시멘트 제품이들은 널리 공지된 방식으로 빌딩 산업 또는 임의의 다른 산업에서 상기 시멘트, 모르타르 또는 콘크리트 조성물로부터 제조되는 것으로 공지된 생성물 또는 구성성분이다.
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 제공하세요.	사회	이 문제에서는 주어진 텍스트 내의 <MASK>로 표시된 부분에 들어갈 적절한 단어를 예측해야 합니다. <MASK>가 위치한 문장의 전체 문맥을 분석하여, 문장의 나머지 내용과 일관되게 <MASK>에 들어갈 가장 적합한 단어를 답하세요. #텍스트: 태권도는 무도·스포츠로써 현재 191개국에서 약 7,000만 명이 수련하고 있는 거대문화로 인식되고 있으며, 한국적 문화유산으로 우리나라의 대내외적 자랑거리이다. 그러나 이것은 외현적인 모습일 뿐 태권도의 근본적 뿌리인 태권도장은 정부의 교육정책 ‘방과후교육’과 더불어 불과 얼마전 세계적으로 확산되었던 ‘신종인플루엔자 A(H1N1)’의 대규모 유행으로 인해 최대의 위기를 맞이하기도 하였다. 이처럼 태권도장은 최근 들어 새롭게 도입된 국가정책과 자연적 재해(災害) 및 <MASK>·인위적 재난(災難), 인재(人災) 등으로 인하여 태권도장 태동 이래 가장 어려움을 격고 있는 실정이다. 물론 이러한 문제들은 단연 태권도장의 위기만은 아닐 것이다. 더욱이 이에 대한 방안은 태권도장을 운영하고 있는 지도자들의 몫이지 태권도(학)를 전공하는 사람들 전부의 몫은 아닐 것이다. 그러나 우리는 이 시점에서 과거를 회상해 볼 필요가 있다. 현재 태권도를 전공하고 있는 학생들은 태권도를 어떻게 시작하게 되었을까? 태권도학과생들 전부는 아닐지 모르겠지만 대부분의 학과생 중 약 90%이상은 태권도장에서 태권도를 처음 접하였을 것이며, 대학에 진학하기 이전까지 태권도장에서 태권도를 수련하였을 것이다.
	6월 25일에 난리가 났다고 세상이 발끈 뒤집히었다. 그런 어수선한 판국에서도 학회 편찬실에서는 사전 편찬에 열을 올리고 어휘 하나의 처리 여부를 놓고 열띤 토론을 벌이기도 하였다. 이때 가장 의젓하게 평시와 다름없이 사전 일을 계속하는 석인 선생의 모습은 세속을 초월한 성인처럼 우러러 보이었다. 드디어 6월 27일 총성은 더욱 가까이 들리고 북한군이 서울 가까이 육박하였다는 급보가 뻔질나게 이어졌다. 그러나 우리는 이 일을 늦출 수가 없었다. 허둥지둥 저녁을 때우고 다시 편찬실에서 일을 계속하였다. 그때 석인 선생과 정인승 선생, 나 이 세 사람이 국어사전 넷째 권을 보았는데 '이살부리다, 야살부리다'가 대립어가 될 수 있는지 없는지를 놓고 토론을 계속하였다. 그런데 난리의 진행이 심상치 않다고 직감되어 내일 결정하기로 하고 아쉽게 헤어졌다. 그런데 그날 새벽 28일에 한강 철교가 끊어지고 서울이 북괴군에게 함락되었다. 그 뒤로 뿔뿔이 헤어져서 생사존망을 모르다가 건재 선생 이하 몇 사람은 다시 만나 사전 일을 계속하였으나 한국 고제에 능통하셨던 동운 이중화 선생은 납치되었다 돌아가시고 석인 선생도 27일 저녁에 헤어진 것이 마지막 영이별이었다. 이 어른의 돌아가심은 한글학회의 손실에 그치지 않고 온 겨레의 손실이었다. 이리하여 나와 석인 선생은 악마 같은 6/25난리로 영영 끊어졌다.	주어진 제목과 요약문에 대한 정보를 토대로, 요약되기 전 문장을 유추해서 생성해주세요. 제목: 석인 정태진 선생의 학문과 인간 요약문: 6월 25일 전쟁이 났으나 학회 편찬실에서는 여느 때와 같이 사전 편찬이 계속되었다. 하지만 27일 저녁을 마지막으로 학회원들은 뿔뿔이 흩어지고 서울 함락 이후 일부만 사전 편찬 일을 이어갔다. 내가 본 석인 선생의 모습은 27일 저녁이 마지막이었다. 석인 선생의 죽음은 온 겨레의 손실이었다.
	광주 북구는 ‘하얀나비’, ‘이름 모를 소녀’ 등 명곡을 남기고 떠난 포크가수 김정호를 기리기 위해 사업계획 변경 승인을 받아 오는 7월부터 김정호 동산 조성, 김정호 스토리길 조성 등 ‘김정호 거리’ 조성사업을 재개할 방침이다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 지난해 일부 조성된 광주 북동 40번지의 김정호 동산. “어디로 갈까요. 님 찾는 하얀나비. (중략) 꽃잎은 시들어도 슬퍼하지 말아요. 때가 되면 다시 필 걸 서러워 말아요.” 33세의 나이로 세상을 떠난 가객 김정호와 광주의 인연이 그의 사후 약 20여년만에 다시 맺어질 전망이다. 광주 북구는 6일 ‘하얀나비’, ‘이름 모를 소녀’ 등 유명곡을 남기고 떠난 포크가수 김정호를 기리는 거리 조성사업을 재개한다고 밝혔다. 북구에 따르면 포크가수 김정호는 1952년 3월 광주 북구 북동에서 출생해 수창초등학교를 다니는 등 광주에서 어린 시절을 보냈다. 현재 북동 40번지에 있는 북동성당 뒤편 생가터는 과거 그의 외조부이자 조선 최고의 명창 박동실씨와 김정호의 어머니 박희숙씨가 함께 살던 집이다. 그러나 6·25 전쟁때 박동실씨가 월북하고 난 후 어머니 홀로 김정호를 키우며 고단한 삶을 살았던 것으로 전해지고 있다. 홀어머니 밑에서 자란 김정호는 왜소한 몸집과 내성적인 성격 탓에 친구들과 두루 어울리지 못했던 것으로 알려졌다. 외조부 박동실씨의 월북 탓에 어려서부터 차별과 멸시를 받고 자라온 탓도 컸다. 가족을 향한 싸늘한 시선들을 피하고자 그는 음악에 몰두했다. 그의 닫힌 마음을 보듬고 열어줄 수 있는 유일한 친구는 통기타 한대였다. 어린 나이부터 기타 한대를 들고 시작한 그의 음악 여정은 삶을 마감하는 순간까지 이어졌다. 그는 이후 서석초등학교로 전학해 1963년 6학년 재학을 마친 후 서울 교동초교로 전학갔다. 북구 한 관계자는 김정호의 이사 배경에 “아버지의 직업이 경찰 고위공무직이다보니 타지 발령이 잦았을 것으로 보인다”며 “이때문에 북동을 떠나 서울로 올라가 자리를 잡은 것이 아닐까 추정된다”고 밝혔다. 이후 김정호는 포크그룹 ‘사월과 오월’의 3기 멤버로 활약하며 그룹사운드 ‘어니언스’의 노래를 작사· 작곡하는 등 다방면으로 재능을 발휘했다. 1973년 ‘이름모를 소녀’를 발표하고 스타덤에 올랐으며 포크와 국악을 시범적으로 접목하는 등 왕성한 음악적 활동을 펼쳤다. 그러나 그가 33세이던 1985년 11월 폐결핵으로 짧은 생을 마감했다. 그는 삶의 마지막 순간까지도 악기를 손에 놓지 않은 채 국악적 실험정신이 짙게 배인 ‘님’이라는 이별곡을 남기기도 했다. 북구는 지난 2017년 광주시 공모로 ‘김정호 거리’ 조성 사업에 선정돼 올 연말까지 시비 3억원을 들여 김정호 동산 조성, 김정호 스토리길 조성, 마을골목길 꾸미기, 음악다방 설치 등의 사업을 추진할 계획이었다. 그러나 사업 대상지가 북동 재개발 지역에 포함되면서 지난해 1월 김정호 동산 조경 사업까지만 완료하고 사업이 일시적으로 중단됐었다. 그러던 중 지난 4월 북구와 김정호 거리 조성 사업자인 마을주민협의체, 북동 재개발추진위가 사업 대상지를 최대한 보존하기로 협의, 사업 재개를 결정했다. 이에 북구는 6월 중 광주시의 사업계획 변경 승인을 받아 오는 7월부터 ‘김정호 거리’ 조성 사업을 추진키로 했다. 이와 함께 올해 북구 중앙동주민자치위원회 마을만들기 사업으로 북동 일원에서 하얀나비 김정호 노래부르기 대회, 김정호 추억 나눔장터 등 ‘김정호 추억의 거리 만들기’ 사업을 추진하고, 대한가수협회 광주시지회 주관으로 2015년부터 매년 열리는 ‘제5회 김정호 추모 음악회’도 개최한다. 북구 관계자는 “관내 출신 포크 가수 김정호를 기리는 의미에서 시작된 사업은 향후 음악 다방 설립과 스토리길 조성 등으로 김정호의 흔적을 거리 곳곳에 스며들게 할 계획이다”며 “김정호가 남긴 음악 자산을 통해 구도심이 활성화 되는 계기가 되길 바란다”고 밝혔다. 이영주기자 lyj2578@srb.co.kr 이영주
	제목: 현대건설 ‘힐스테이트 비산 파크뷰 내달 1일 견본주택 개관' 현대건설은 내달 1일 경기도 안양시 동안구 비산동 510번지 일원에 지하 2층~지상 29층, 총 6개 동 전용면적 59㎡, 76㎡, 총 303세대 규모의 전 세대 4베이, 판상형으로 설계된 '힐스테이트 비산 파크뷰' 견본주택을 개관하여 분양할 예정이며, 이는 오는 2021년 착공, 2025년 개통 예정인 월곶~판교 복선전철의 수혜가 기대되는 단지라고 설명했다.	주어진 문장에 적절한 제목을 생성하고, 내용을 요약해주세요. 문장: 현대건설이 내달 1일 경기도 안양시 동안구 비산동 510번지 일원에 공급하는 '힐스테이트 비산 파크뷰' 견본주택을 개관하고, 본격 분양몰이에 나선다. 힐스테이트 비산 파크뷰는 지하 2층~지상 29층, 총 6개 동 전용면적 59㎡, 76㎡, 총 303세대 규모로 구성되며, 공급면적은 △59㎡ 153세대, △76㎡ 150세대로 선호도 높은 중·소형 면적으로만 구성되며 환기성이 좋고 맞통풍이 뛰어난 전 세대 4베이, 판상형으로 설계된다. 힐스테이트 비산 파크뷰는 오는 2021년 착공, 2025년 개통 예정인 월곶~판교 복선전철의 수혜가 기대되는 단지다. 이 사업은 작년 말 국토교통부가 고시했으며 총 34.1km, 정거장 11개로 구성된다. 이 노선이 개통되면 안양역에서 광명역(KTX)까지 2개 정거장, 약 7분 정도면 갈 수 있어 광명역을 통해 경부선은 물론 호남선, 경전선, 전라선 등을 통해 전국 곳곳으로 쉽게 이동할 수 있게 돼 안양시 광역교통이 획기적으로 개선될 전망이다. 또 판교역(신분당선)까지 5개 정거장, 약 18분이면 도달 할 수 있을 것으로 보여 쇼핑과 문화시설이 풍부한 판교 생활권도 누릴 수 있고, 판교역에서 강남까지 빠른 이동이 가능해 강남 접근성도 좋아질 것으로 기대된다. 이 곳은 안양구도심과 평촌신도시와 인접해 있어 생활인프라가 풍부하다. 이마트, 홈플러스, 롯데백화점, 안양1번가, 한림대학교성심병원, 안양시청, 동안구청, 안양종합운동장 등이 가깝다. 교통도 편리해 1번국도, 경수대로를 이용해 안양 중심권역으로 이동이 쉬운데다 서울외곽순환고속도로, 제2경인고속도로(안양~성남) 등 주요 도로 이용도 용이해 서울과 수도권으로의 접근이 양호하다. 광역버스, 마을버스 등 대중교통 수단이 잘 발달돼 있으며, 지하철 1호선 안양역과 4호선 범계역도 이용할 수 있다. 뛰어난 교육환경도 장점으로 부각된다. 단지 바로 옆으로 안양동초가 있고 임곡중도 가까워 도보로 통학이 가능한 안심통학 단지다. 현대건설의 '힐스테이트'는 한국기업평판연구소 아파트 브랜드 평판에서 1위에 빛나는 브랜드다. 대한민국 라이프스타일을 주도해 온 현대건설이 힐스테이트의 위상을 공고히 하기 위해 지난 3월 디자인 리뉴얼 및 브랜드 컨셉을 재정립했다. 한편 힐스테이트 비산 파크뷰의 견본주택은 경기도 안양시 동안구 시민대로 112 일대에 마련되며, 입주는 2022년 4월 예정이다.
	상표 유사 여부는 두 상표를 전체로서 관찰해 외관, 호칭 및 관념이 유사한지를 판단해야하고, 이에 따르면 출원서비스표와 선등록서비스표 외관, 관념, 호칭에 있어서 차이가 있으므로 상표등록거절사유에 해당하지 않는다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: [1] 둘 이상의 문자나 도형으로 구성된 결합상표의 경우 그 구성부분의 결합이 부자연스럽고 일련 불가분적이라고 할 수 없는 경우에는 그 구성부분을 분리 추출하여 대비하는 것이 허용되나, 상표의 유사 여부는 동일·유사한 상품에 사용되는 두 개의 상표를 전체로서 관찰하여 그 외관, 호칭 및 관념을 비교·검토하여 판단하는 것이 원칙이다. [2] 출원서비스표 " "와 선등록서비스표 " "은 외관이 다르고 관념과 호칭에 있어서도 차이가 있어 양 표장은 유사하지 않으므로, 상표법 제7조 제1항 제7호에서 정한 등록거절사유에 해당한다고 할 수 없다고 한 사례.
	건강·미용 용품 매장인 올리브영이 2014년 1월부터 2017년 6월까지 172개 업체로부터 직매입한 상품을 정당한 이유도 없이 반품하고 31개 납품업체로부터 종업원 559명을 파견받아 올리브영에 근무하게 하면서 인건비를 부담하지 않아서 '갑질' 행위가 적발됐다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 건강·미용 용품 매장인 올리브영이 납품업체로부터 받은 상품을 부당하게 반품하고 종업원을 파견받아 인건비도 주지 않는 등 각종 ‘갑질’을 하다 적발됐다. 공정거래위원회는 올리브영을 운영하는 CJ올리브네트웍스가 대규모 유통업법을 위반했다며 시정명령과 함께 과징금 10억원을 부과했다고 4일 밝혔다. 먼저 올리브영은 2014년 1월부터 2017년 6월까지 172개 업체로부터 직매입한 상품을 정당한 이유도 없이 반품(41억원 어치)했다. 올리브영은 계약서에서 시즌상품에 대해 반품을 하겠다고 했으나 약정서에 기재되지 않은 상품도 반품을 했다. 또 2016~2017년엔 31개 납품업체로부터 종업원 559명을 파견받아 올리브영에 근무하게 하면서 인건비를 부담하지 않았다. 법적으로 대형유통업자가 납품업체 종업원을 사용하는 행위는 금지되는데, 만약 인건비를 부담하거나 납품업체가 자발적으로 파견을 요청한 경우에는 허용된다. 올리브영은 206개 업체와 254건의 직매입 등 거래계약을 하면서 계약서도 쓰지 않고 상품을 발주했으며 계약서는 발주후 1~114일 지난 뒤에야 교부했다. 4개업체와 특약매입거래를 하면서 상품판매대금을 법정기한이 지난 뒤에야 지급한 사실도 드러났다. 올리브영은 판촉비도 납품업체들에 떠넘겼다. CJ올리브네트웍스는 11개 납품업체와 판촉행사를 하면서 사전에 비용분담 등을 서면으로 약정하지 않고 판촉비 2500만 원을 부담시켰다. 공정위 관계자는 “이번이 헬스뷰티(H＆B) 분야의 불공정 행위를 대규모유통업법으로 제재한 첫 사례”라며 “최근 특정 카테고리 상품을 판매하는 전문점이 빠르게 성장하면서 거래상 우월적 지위를 이용해 각종 비용을 납품업체들에 떠넘기는 사례가 있다”고 말했다. CJ올리브네트웍스는 “위반 사실을 모두 인정하지만 대부분 서류 누락 등 절차상의 문제들”이라며 “공정위 조사 이후 신속히 자진 시정했으며 재발 방지 조치도 모두 완료했다”고 밝혔다. 김덕준 기자 casiopea@busan.com
	한미약품은 29일 공시 결과 올해 3분기 매출과 영업이익이 모두 증가하였는데, 이대로라면 매출 1조원 달성도 무난할 것으로 예상되며, 탄탄한 매출과 글로벌 혁신 신약 개발 투자의 선순환을 통해 견실한 경영을 지속해나갈 수 있을 것으로 기대된다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 한미약품은 올해 3분기 매출과 영업이익이 전년 동기대비 각각 12.9%, 16.0% 성장했다고 29일 잠정 공시했다. 연결기준으로 매출 2657억원, 영업이익 249억원, 순이익 89억원을 달성했다. 연구개발(R&D)비용은 매출 대비 19..7%인 523억원을 투자했다. 올해 한미약품 누적매출액은 8107억원으로, 이대로라면 매출 1조원 달성은 무난할 것으로 점쳐진다. 한미약품 관계자는 "제넨텍으로부터 받은 신약 라이선스 계약금의 분할인식(매월 30억원씩 30개월)이 지난 4월에 끝나면서 이번 분기 실적에 대해 우려가 있었으나, 자체 개발한 제품들의 탄탄한 성장에 힘입어 호실적을 달성했다"고 말했다. 한미약품이 자체 개발한 고지혈증 치료 복합신약 '로수젯'과 고혈압 치료 복합신약 '아모잘탄패밀리(아모잘탄, 아모잘탄플러스, 아모잘탄큐)' 성장이 이번 분기 실적에 크게 기여했다. 로수젯 3분기 원외처방액은 206억원으로, 전년 동기대비 43% 성장했다. 아모잘탄패밀리는 같은 기간 251억원으로, 전년 동기대비 24% 성장했다. 해당 관계자는 "이외에도 역류성식도염 치료 개량신약 '에소메졸'과 전립선비대증치료제 '한미탐스' 등이 전년 동기대비 두 자릿수 이상 성장률을 달성하는 등 한미약품 자체 개발 제품이 고르게 성장했다"고 설명했다. 이어 "중국 현지법인 북경한미약품도 양호한 실적을 보였는데, 북경한미약품 3분기 매출은 전년 동기대비 8.9% 성장한 600억원을 기록했으며, 영업이익은 3.7% 증가한 103억원을 기록했다"며 "원료의약품 전문회사 한미정밀화학의 3분기 매출은 전년 동기대비 14.4% 상승한 236억원이며, 영업이익과 순이익도 전년 동기대비 크게 개선됐다"고 말했다. 자회사 실적에 따라 한미약품그룹 지주회사인 한미사이언스(대표이사 임종윤)의 연결기준 매출은 전년 동기대비 19.8% 성장한 2042억원을 기록했다. 우종수 한미약품 대표이사 사장은 "한미약품은 탄탄한 매출과 글로벌 혁신신약 개발을 위한 R&D 투자의 선순환을 통해 안정과 혁신을 모두 이루는 견실한 경영을 지속해 나갈 것"이라고 전했다.
	때문에 공공 기후금융에 대한 이행점검․평가를 실행하기에는 그 실효성이 떨어진다	주어진 문장 뒤에 자연스럽게 이어질 문장을 생성해주세요. 문장: 소관부처가 기후정책과 에너지정책의 통합에 대한 실효적 권한을 가질 수 있도록 온실가스 감축이행에 대한 성과평가-환류체계를 개선할 것을 제안한다. 현행 온실가스 감축 관련 성과평가-환류체계는 형식적인 측면이 강하다. 국무조정실 (2014)은 온실가스 로드맵의 부문별 감축 이행계획에 대한 이행실적을 주기적으로 평가하고, 그 결과를 이행계획 개선 등에 활용하는 내용을 담고 있다. 그런데 평가결과의 환류가 관계부처별 로드맵의 이행계획을 수정․보완하는 수준이고, 이행실적에 따라 소관부처에게 유인·불이익을 부여하는 것은 아니다. 또한 현행 「저탄소 녹색성장기본법」제12조는 국무총리가 ‘녹색성장 국가전략’ 및 그 추진계획의 이행사항을 점검․평가하도록 규정하고 있고, 동법 시행령 제8조에서는 이를 「정부업무평가기본법」에 따라 실시하도록 하고 있다. 그러나 ‘녹색성장 국가전략’은 2050년까지의 장기 목표를 담고 있고 온실가스 감축뿐만 아니라 녹색기술․녹색산업 육성, 지속가능발전 정책, 에너지 정책 등 매우 포괄적인 내용을 담고 있다.
	민주평화당 김광수 의원이 국회 예결위에서 장애인 복합 커뮤니티 센터 건립 등을 집중 질의하며 전북현안을 해결하는 선봉장 역할을 하고 있다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 김형민 기자l jal74@naver.com 국회 예산결산특별위원으로 활동 중인 민주평화당 김광수(전주갑)의원이 전북 현안 해결을 위한 총력전을 펼치고 있어, 20대 마지막 정기국회에서 전북 발전을 위한 국가예산 확보 활동에 대한 기대가 높아지고 있다. 김 의원은 2일 국회 예결위 부별심사에서 홍남기 경제부총리 겸 기획재정부 장관을 상대로 전북 제3금융중심지 지정을 비롯해 전북형일자리 사업, 탄소산업 국가기관 설치 및 예타면제, 국가식품클러스터 활성화, 장애인 복합 커뮤니티 센터 건립 등을 집중 질의하며 전북 현안 해결을 위한 선봉장 역할을 톡톡히 했다. 김광수 의원은 이날 홍남기 부총리 겸 기획재정부 장관에게 전북 제3금융중심지 지정과 관련, “지난 4월 문재인 대통령의 대선공약인 전북 제3금융중심지 지정이 경영 및 생활 여건 확충과 금융중심지 모델 계획의 구체화 등을 이유로 보류 결정됐다”며 “그러나 글로벌 수탁업계 1·2위 금융기관이 전북에 안착하며 금융 인프라 조성에 잰걸음을 보이고 있는 지금, 부산과 같이 ‘先 지정 後 보완’으로 인프라 확대에 탄력을 받을 수 있도록 정부가 적극 나서야 한다”며 금융중심지 지정을 촉구 했다. 전북 탄소산업과 관련해서는 “지난 달 28일 일본 정부는 화이트리스트 배제 조치 강행에 이어 무역전쟁 2탄으로 탄소산업카드를 만지작 거리고 있다”며 “현재 미래 신성장동력산업으로 손꼽히는 탄소산업은 현재 일본 도레이와 미쓰비시케미칼, 데이진이 세계시장 60%를 장악한 반면, 한국의 점유율은 2%대에 불과해 정부의 대책 마련이 시급하다”고 지적했다. 또한, 장애인 고용 전문인력 양성과 인식전환 교육 등 종합적인 복지서비스를 제공하는 ‘장애인 복합 커뮤니티 센터’가 전주시에 위치한 옛 자림복지재단 부지에 건립될 수 있도록 정부에 요청했다. /서울=김형민기자.bvlgari@ 김형민 기자 jal74@naver.com
	제목: 충남농협, 태풍 '링링' 피해 극복하고 영농 정상화에 최선 태풍 '링링'의 영향으로 사과,배 등 농작물과 농작업시설물 등의 큰 피해를 입은 농업인들을 돕기위해 농협 임직원들과 행정기관, 봉사원등 연인원 약 1650명이 사과,배등 낙과 모으기등 피해복구에 힘을 보탰으며 농협은 낙과 팔아주기 운동등 다양한 지원을 강구하고 있다.	주어진 문장에 적절한 제목을 생성하고, 내용을 요약해주세요. 문장: 농협, 전사적으로 태풍피해 현장으로 달려가 복구에 전력 조소행 본부장, 추곡수매 앞두고 미곡종합처리장 수매 준비 점검 조소행 충남농협 본부장이 태풍 피해 시설하우스를 살피고 현장에서 농가와 피해규모에 대해 이야기를 나누고 있다. 농협 제공 제13호 태풍 '링링'의 영향으로 추석명절 앞 사과·배 등 농작물과 농작업시설물 등이 큰 피해를 입어 좌절과 실의에 빠져 있는 농업인들을 돕기 위해 농협 임직원들과 행정기관, 사회단체 봉사원들이 한걸음에 달려와 피해 복구에 전사적으로 힘을 보탰다. 15일 농협에 따르면 이번 태풍의 직접적인 영향권에 포함된 충남지역은 낙과 1564.2㏊, 벼·전작 도복 1138.3㏊, 시설물 파손 106.3㏊, 기타 9.1㏊ 등 농작물과 농작업시설 등에 큰 피해를 입었다. 태풍이 쓸고 지나간 이후 일손지원에 나선 연인원은 1650여 명으로 283.7㏊에 이르는 과수면적에서 바닥에 떨어진 사과·배 등 낙과 모으기에 힘을 모았다. 농협은 중앙회를 비롯한 충남농협, NH금융지주, NH네트웍스, NH파트너스 등 계열사 임직원들이 충남 태풍피해 현장에서 구슬땀을 흘렸다. 조소행 충남농협 본부장은 가용 가능한 인원을 모아 과수 피해복구 현장 지원에 집중하는 한편, 추석 이후 실시되는 추곡수매에 대비해 남포면 만세보령농협쌀조합공동사업법인을 방문, 수매시설을 점검하고 "농가들이 한해의 노고를 보상받는 수매현장이 되도록 노력해 줄 것"을 주문하는 한편 "추석 연휴기간 동안 농작물과 시설물의 2차 피해가 없도록 예방시찰 및 점검에 힘쓰고 축사관리로 질병예방에 만전을 기해 줄 것"을 당부했다. 조 본부장은 "충남농협은 농작물재해보험 관련 낙과 피해 현장조사 완료 및 과수농가 돕기 낙과 팔아주기 운동 등 다양하고 신속한 지원책을 강구하고 있다"고 밝혔다. jdyhs@ 조소행 충남농협 본부장이 태풍 피해 낙과 현장에서 농가와 피해규모에 대해 이야기를 나누고 있다. 농협 제공
	이후 농업관측사업은 관측사업의 안정적 운영을 위하여 정보의 수집, 가공 및 분산체계에 적합한 정보화 시스템을 구축하였고, 농업관측정보센터 홈페이지(http://aglook.krei.re.kr/index.jsp)를 구축하였다. 그리고 정보수집 부문의 농업관측지원정보시스템 구축은 2001년에 이뤄졌고, 2004년에는 PDA(Personal Digital Assistants) 조사방식이 추가되었다. 이후 웹(메일) 조사 및 전화조사 요원용 조사시스템 등이 구축되면서 보다 전산화에 많은 개선이 이루어졌다. 아울러 정보 분산과 관련하여 농축산물 생산 및 수습분석시스템이 2002년에 구축되었고, 2005년에 지리정보시스템인 GIS(Geographic Information System)를 활용하고 있는 농업관측정보서비스 시스템의 통합․운영이 실시되었다.	주어진 제목과 요약문에 대한 정보를 토대로, 요약되기 전 문장을 유추해서 생성해주세요. 제목: 양식정보의 통합관리 방안에 관한 연구 요약문: 농업관측사업은 농업관측지원정보시스템 및 농축산물 생산 및 수습분석시스템 등이 구축하였고, 농업관측정보센터 홈페이지를 개설하였다. 2005년에는 GIS 기반의 농업관측정보서시스 시스템이 실시되었다.
	자동차, 항공기 등의 복잡한 제품에는 수백 개에서 많게는 수천 개의 전기적 커넥터가 존재한다. 이런 커넥터의 체결은 대부분은 수작업으로 이루어지는데, 다양한 작업 오류로 인해서 불량이 발생하게 된다. 현재 사용되는 불량 검사인 사진 촬영의 경우, 외부 조명 상황에 의한 사진 검사의 오류나 다른 부품에 의해 가려진 커넥터의 검사 불가 등의 문제점이 있다. 테라헤르츠파는 외부 조명에 영향을 받지 않고 플라스틱 등을 잘 투과하므로 사진 촬영 검사의 대안이 될 가능성이 있다. 본 연구실에서는 실제 차량에서 사용되고 있는 두 종류 커넥터의 체결 상태를 테라헤르츠 이미징을 통해 확인하였다(그림 6 참조). 각 커넥터의 체결 여부가 점선으로 표시된 영역의 이미지 차이를 통해 확연하게 구분됨을 확인하였다.	주어진 제목과 요약문에 대한 정보를 토대로, 요약되기 전 문장을 유추해서 생성해주세요. 제목: 테라헤르츠 이미징 기술 개발 동향 (Trends in Terahertz Imaging Technology) 요약문: 복잡한 제품에는 수많은 전기적 커넥터가 들어 있다. 이는 대부분 수작업으로 체결되며, 그에 따라 불량도 발생한다. 테라헤르츠파는 사진 촬영 검사의 한계를 극복할 수 있다.
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 제공하세요.	있다	이 문제에서는 주어진 텍스트 내의 <MASK>로 표시된 부분에 들어갈 적절한 단어를 예측해야 합니다. <MASK>가 위치한 문장의 전체 문맥을 분석하여, 문장의 나머지 내용과 일관되게 <MASK>에 들어갈 가장 적합한 단어를 답하세요. #텍스트: 일반적으로 조릿대는 다년생 대나무의 일종으로 해발 600m에서 1400m 사이에서 자생하며 따뜻한 기후에서는 해발 1,800m까지 자라는 식물이다. 대개 1미터 안팎의 작은 규모로 빽빽하게 모여 자라는데 독성이 없어 식용과 약용으로 사용되며, 특히 조릿대 중에서도 청정한 제주도, 그 중에서도 한라산과 인근의 산림 지역에서 자생하는 조릿대는 ‘제주의 인삼’이라고 불릴 정도로 그 효능을 주목받아 왔다. 뿐만 아니라 동의보감에 따르면 조릿대는 피로 회복에 좋다고 언급하고 있으며 해열 작용도 있어 여름철 더위를 먹었거나 열대야로 인한 수면부족 등으로 심신이 지쳤을 때 차로 마시면 좋다고 알려지는 등 그 약리적인 효능으로 인하여 과거에는 차로 대부분 이용되고 최근에 이르러서는 조릿대를 이용한 다양한 가공 식품들이 개발되고 <MASK>.그러나 조릿대 차를 포함하여 조릿대를 음용수를 제조하는 경우 고려해야 할 점은 조릿대의 잎, 줄기, 뿌리 등에서 나타나는 조릿대 특유의 냄새로 인하여 기호에 따라 이러한 이취나 특유의 냄새는 기호성 저하의 원인으로 작용할 수 있는 문제가 <MASK>.이에 따라 현재 차를 포함한 조릿대 음용수의 개발에 있어 이취나 냄새 제거를 위한 다양한 방법들이 제시되었으나 아직까지 냄새를 충분히 제거할 수 없었다는 문제가 <MASK>.
	이 밖에 프린팅 소재가 화학제품이므로 이에 따른 화재 및 인체 접촉에 의한 안전성 문제도 발생할 수 있다	주어진 문장 뒤에 자연스럽게 이어질 문장을 생성해주세요. 문장: 여섯째, 3D 프린팅 소재 가격이 비싸고, 3D 프린팅 장비의 관리 유지 비용이 높을 뿐만 아니라 사용 방법도 복잡하다. 3D 프린팅 소재는 아직까지 규모의 경제가 미흡하여 매우 고가로 판매되고 있다. 또한, 소재와 기술방식에 따라 3D 프린팅 장비가 매우 다양하며, 이로 인해 3D 모델링·연결 및 통신 방법·운영 소프트웨어 사용 및 업데이트 방법 등 3D 프린터의 사용이 매우 복잡하다. 관리 유지 보수의 경우 프린팅 시 발생하는 찌꺼기 및 오염물에 대한 청소의 문제, 프린팅 소재의 종류에 따라 프린팅 소재를 뿜는 노즐 및 SLA 프린터의 수조의 관리 방법상이, 금속 출력 프린터는 전력 소모량이 매우 큰 점 등의 애로사항이 있다.
	1. 미용사 보조 2. 봄 3. 민경 4. 1989년 12월 8일 5. 22세 6. 봄 7. 서울 8. 22세 9. 밀라노 국제 영화제	주어진 정보를 기반으로 질문에 답하세요. 답을 모른다면 답을 지어내지 말고 그냥 모른다고 말하세요. 이유영은 1989년 12월 8일 서울에서 태어났다. 그녀는 고등학교 졸업 후 대학에 진학하지 않고 미용실에서 미용사 보조 일을 하다가 2010년 22세의 나이에 한국예술종합학교 연극원 연기과에 진학하였고, 한국예술종합학교 재학 중 상업영화 데뷔작인 2014년 영화 《봄》으로 밀라노 국제 영화제에서 여우주연상을 받으며 주목을 받기 시작했다. 1969년 경상북도 포항을 배경으로 한 이 영화에서 정숙(김서형 분)에게 돈을 받고 정숙의 남편이자 불치병에 걸려 실의에 빠진 조각가 준구(박용우 분)의 누드모델이 되는 가난한 시골 여자 민경을 연기했다. 이 역할을 연기한 배경으로 이유영은 “시나리오를 읽고 한눈에 사랑에 빠졌다”고 말하였고, 노출 때문에 지인과 가족들에게 영화를 보여주기엔 걱정이 앞섰지만 엄마의 "넌 너의 연기, 너의 몸이 창피하니?"라는 한마디에 용기를 냈다고 한다. 그녀는 이 작품으로 이듬해인 2015년 올해의 영화상, 부일영화상과 대종상 영화제에서 여우신인상을 수상하였고, 2015년에는 영화 《간신》으로 그해 청룡영화상에서 신인여우상을 수상했다. 2018년이 기대되는 배우 중 한 명이다. 질문: 1. 이유영이 고등학교 졸업 후 처음으로 한 일은? 2. 이유영이 한국예술종합학교 재학 중에 데뷔한 영화의 제목은? 3. 이유영이 영화 '봄'에서 연기한 인물의 이름은? 4. 이유영의 생년월일은? 5. 이유영은 몇 세때 한국예술종합학교 연극원 연기과에 진학하였는가? 6. 이유영이 2014년 국제 영화제에서 여우주연상을 받은 영화의 제목은 무엇인가? 7. 이유영이 태어난 도시는? 8. 이유영이 한국예술종합학교 연극원 연기과에 진학한 나이는? 9. 이유영은 영화 봄으로 무슨 영화제에서 여우주연상을 수상했는가?
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 원문을 바탕으로 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 생성하세요.	그러나 그렇게 단편적으로 보기에는 생각해야 할 요소들이 그 회의의 주변에는 상당히 많았다.	다음 텍스트에서 제공된 문맥을 정확히 이해하고, 마지막 문장을 자연스럽고 문맥에 맞게 완성하세요. 문장은 이전 내용과 논리적으로 연결되어야 합니다. #텍스트: 2019년은 개혁파 종교개혁 500주년으로 기념하고 있다. 이미 2년 전 종교개혁 500주년을 기념하였던 것을 기억하면, 과연 개혁파의 기념과 앞서 2년 전의 기념이 어떤 관계가 있는지를 살펴보는 것은 의미가 있는 일이다. 츠빙글리는 분명 루터와 상관 없이 종교개혁적 설교를 시작하였다. 그러나 그의 종교개혁적이라는 의미는 루터의 그것과 다르지 않았다. 달리 말하면 츠빙글리와 루터라는 인물을 통해 종교개혁이 시작되었지만, 종교개혁은 그들의 창작물이 아니었다. 오히려 15세기, 16세기의 교회의 양상과 학문적 사상과 정치적 상황이 아주 긴밀하게 맞물려 어느 정도의 공감대를 이루고 있었고, 루터와 츠빙글리와 같은 위대한 인물들이 그들의 일을 시작하였을 때, 봇물 터지듯 종교개혁 운동이 확산되었던 것으로 이해해야 한다. 츠빙글리로 대표되는 개혁파 신학과 루터로 대표되는 비텐베르크 신학은 어떤 관계를 가지고 있었는가? 1529년 마르부르크에서 열린 종교회의는 양자가 만나 서로의 입장을 확인한 회의라고 할 수 있다. 이 회의의 결과는 잘 알려진대로 실패였다. 둘은 서로의 차이점을 확인하고 서로의 길을 떠났다.
	오늘 5일(토) 배우 유아인과 도올 김용옥 선생이 KBS1의 시사교양 프로그램 ‘도올아인 오방간다’에 출연, 해당 방송은 오늘 5일(토) kbs1에서 첫방송 예정이다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: KBS1 시사교양 프로그램 ‘도올아인 오방간다’. 오는 5일(토) 첫방송 될 예정이다.KBS1 배우 유아인과 도올 김용옥 선생이 KBS1의 시사교양 프로그램 ‘도올아인 오방간다’에 출연한다. ‘도올아인 오방간다’는 3·1운동 및 대한민국 임시정부 수립 100주년 기념 특별기획 프로그램으로 한국의 근현대사 100년을 재조명할 계획이다. 3일 오후 2시 서울 영중로 타임스퀘어 아모리스 홀에서 열린 제작발표회에서 도울 김용옥 선생은 프로그램의 탄생 과정을 밝혔다. 그는 영화 ‘버닝’을 통해 유아인을 “인상 깊은 인물”로 여기게 됐으며 KBS에서 프로그램 제안이 들어왔을 때 “유아인과 함께 이 의미 있는 프로그램을 하고 싶다”라고 생각했던 것을 밝혔다. 유아인 역시 “TV 프로그램을 통해 대중들에게 좀 더 인간적인 모습을 보여주고 싶다고 느꼈을 때 도올 선생님이 제안을 주셨고 이에 응했다”라고 출연을 결심한 배경을 밝혔다. 도올 김용옥 선생은 前 기자이자 현재는 작가, 철학자, 평론가로 다양한 활동을 하고 있는 지식인이다. 그의 호(號)는 ‘도올’로 ‘돌’이라는 뜻이다. 그는 과거 KBS의 한 방송에서 자신의 호(號)의 의미를 설명하며 학창시절 성적이 우수하지 않았다고 밝혔다. 도올은 또한 중국 신화에 등장하는 전설의 동물이기도 하다. 김용옥 선생을 나타내는 ‘도올’과 유아인의 ‘아인’의 합성어인 ‘도올아인 오방간다’는 오는 5일(토) KBS1에서 첫 방송 될 예정이다. 박은혜 인턴기자 .
	제목: 지방세부과처분취소 부동산 취득가액이 시가표준액보다 낮으므로 시가표준액을 과세표준으로 한 경우, 과세표준이 되는 시가표준액이 기타 정황에 비추어 봤을 때 상당한 불합리성이 인정되는 경우에는 그 시가표준액이 지방자치단체장의 결정에 의한 것이라 하더라도 위법하다고 할 진데, 본 사안에서의 시가표준액은 산정의 경위와 기타 정황들을 면밀히 살펴보았을 때 관계법령에 따라 적절하게 결정되었다고 보여진다.	주어진 문장에 적절한 제목을 생성하고, 내용을 요약해주세요. 문장: 부동산 취득가액이 시가표준액에 미달하여 시가표준액을 과세표준으로 한 경우, 지방세법 제111조 제2항 제1호, 제2호, 지방세법 시행령 제80조 제1항 제1호, 구 소득세법(2005. 7. 13. 법률 제7575호로 개정되기 전의 것) 제99조 제1항 제1호 (나)목, 지방세법 시행령 제80조 제3항의 규정 내용에 비추어, 지방자치단체장이 결정한 시가표준액이라 하더라도 시가나 기타 사정에 비추어 현저히 불합리한 것으로 인정되는 경우에는 시가표준액 결정이 위법하다고 할 것이나, 과세관청이 부동산의 시가표준액을 산출함에 있어 토지에 관하여는 개별공시지가에 따라 적정하게 시가표준액을 결정하였고, 또한 건축물에 관하여는 건축물의 ㎡당 기준가액에 구조지수·용도지수·위치지수·경과연수별 잔가율을 적용하는 이외에 건물의 규모·형태·특수한 부대설비 등의 유무 및 기타 여건에 따른 가감산율을 참작하여 시가표준액을 결정하였으므로, 위 부동산의 시가표준액이 관계 법령에 따라 적정하게 결정되었다고 한 사례.
	3일 투자은행 업계에 따르면 삼성생명이 새로운 국제보험회계기준에 대비하는 차원에서 자사가 보유한 DGB금융지주 지분 중 절반가량을 장 마감 이후 블록딜 시장에서 전일 종가 8160원에서 4.04% 할인된 주당 7830원에 매각하여 DGB금융지주 지분율은 6.95%에서 3.35%로 줄였다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 삼성생명이 보유한 DGB금융지주 지분 중 절반가량을 블록딜(시간 외 대량 매매) 시장에서 팔았다. 옛 대구은행(현 DGB금융지주) 주식을 사들인 지 40년 만에 처음으로 대규모 매각에 나선 것이다. 새로운 국제보험회계기준(IFRS17)에 대비하는 차원에서 주식을 처분한 것으로 풀이된다. 3일 투자은행(IB) 업계에 따르면 삼성생명은 전날 장 마감 이후 DGB금융지주 지분 3.6%(609만3219주)를 블록딜 시장에서 팔기 위해 수요예측에 나섰다. 할인율은 전일 종가 8160원에 4.04~6.99%를 적용했으며 이에 따른 거래 규모는 462억~477억원으로 예상됐다. 매각주간사는 삼성증권이 맡았다. 투자자 모집 결과, 매각 측은 충분한 기관 수요를 확보한 뒤 할인율을 4.04%로 확정했다. 주당 매각가는 7830원이다. 이로써 삼성생명의 DGB금융지주 지분율은 6.95%에서 3.35%로 절반 이상 줄었다. 삼성생명은 약 40년 전부터 옛 대구은행의 주요 주주였다. 과거 거래 기업의 부도로 해당 기업이 보유했던 대구은행 주식을 사들였다. 삼성생명은 지분율을 7~8% 수준을 유지하며 국민연금, 사우디아라비아 국영은행 산하 'SAUDI ARABIAN MONETARY AGENCY'와 함께 최대주주 자리에 번갈아가며 올랐다. DGB금융지주 관계자는 "삼성생명이 대구은행 지분을 처음 취득한 시점은 40여 년 전으로 알려져 있다"며 "공시가 시작된 1998년 이후 자료는 남아 있지만 초기의 정확한 기록은 없는 상황"이라고 말했다. 삼성생명과 DGB금융지주는 특수관계에 가까운 사이로 평가받는다. 삼성생명은 대구상공회의소의 주선을 받아 대구은행에 지분을 투자했다. 삼성그룹의 모태로 꼽히는 제일모직 역시 대구 지역을 중심으로 사세를 키워왔다. 삼성생명은 지분 취득 시 투자 목적을 '경영 참여'라고 밝혔지만, 실제 DGB금융지주 경영에는 참여하지 않고 있다. 삼성생명이 블록딜에 나선 건 주식 비중을 조절하기 위한 조치로 풀이된다. 새로운 IFRS17 도입에 앞서 위험자산 투자 포트폴리오를 소폭 수정하고 있다는 얘기다. 김수현 신한금융투자 연구원은 "두 회사의 특수한 관계를 고려했을 때 이번 블록딜 거래는 상당히 이례적"이라며 "할인율이 높아 단기적으로 주가는 조정될 것으로 예상된다"고 말했다. 이날 DGB금융지주 종가는 7870원으로 전일 대비 3.55% 하락했다. 당분간 삼성생명 측은 잔여 지분을 추가로 매각할 계획이 없는 것으로 알려졌다.
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 제공하세요.	요인들이	이 문제에서는 주어진 텍스트 내의 <MASK>로 표시된 부분에 들어갈 적절한 단어를 예측해야 합니다. <MASK>가 위치한 문장의 전체 문맥을 분석하여, 문장의 나머지 내용과 일관되게 <MASK>에 들어갈 가장 적합한 단어를 답하세요. #텍스트: 첨단기술 및 기계화로 인한 여가시간의 증대, 주 5일제의 확대, 교통수단의 발달은 많은 사람들의 자유로운 여행을 가능하게 하였고, 여가의 중요성을 확인시켜 주었다. 세계화의 흐름은 자연스럽게 관광산업에 대한 중요성으로 이어졌으며, 이러한 국제화 시대의 흐름은 많은 사람들의 해외여행 증가의 요인이 되었다. 이처럼 해외여행의 증가는 국제 항공사들의 양적팽창을 이루는데 크게 영향을 주었음을 알 수 있다. 한편 이들 항공사들의 경영성과로 표현되는 주가의 변동은 다양한 <MASK> 작용할 것이지만 그중에도 환율의 변동, 유가의 변동, 그리고 세계경제 변화를 가장 잘 반영하는 지수중 하나인 다우지수 변화는 항공사의 주가변동에 유의한 영향을 미칠 것으로 사료된다. 제일 먼저 환율의 변동은 국내 항공사의 기업 가치에 영향을 주기 때문에 기업 경영에 있어 환율 변동에 대한 대응은 필수가 되고 있다(Faff and Marshall, 2005). 김범석(2009)은 환율 변동은 여행수요의 변화를 초래하여 항공사의 수익에 영향을 주며, 항공기 구매 또는 리스 등 고정자산매입에 외화부채를 많이 사용하는 항공사의 영업 방식의 특성상 환율상승은 항공사의 차입금 상환 비용에도 영향을 미친다는 연구결과를 발표하였다.
	일정한 기준에서 벗어난 상 품들에 대해서는 제재가 있어야 할 것이되, 기준은 통일적으로 적용되어야만 할 것이다	주어진 문장 뒤에 자연스럽게 이어질 문장을 생성해주세요. 문장: 성공적인 지리적표시제도는 전통문화표현물 보유자에게 경제적으로 그리고 사회적으로 많은 이익을 가져다주지만, 지리적표시의 시장가치와 이익발생은 그 것이 어떻게 개발・활용・감독되느냐에 달려있다고 할 수 있으며 이러한 시장가치를 창출하고 이익을 얻기 위해서는 투자가 필요하다. 예컨대 생산방법에 있어서 믿을 만한 원재료 공급선을 확보하고 품질을 통제해야만 이익을 발생시킬 수 있는 것이다. 이러한 경쟁력을 확보하기 위해서는 경우에 따라서 상당한 비용이 발생할 수도 있는데, 결국 이러한 부담은 지리적표시권자가 부담해야 할 몫이다. 전 통문화표현물 보유자도 이러한 부담을 감수해야 한다면 전통문화표현물 보호를 위해 지리적표시제도를 활용하려고 하지 않을 수도 있다. 또한 성공적인 지리적 표시 활용을 위해서는 적절한 마케팅 전략이 수반되어야 하고, 아울러 상품, 품질 및 장소 간의 견련성에 관한 수요자들의 인식제고 및 신뢰를 담보해야만 한다. 시장을 공략하기 위한 마케팅 전략은 아주 중요하다. 예컨대 대다수의 원산지라벨 상품의 전략은 시장에 맞추어져 있다기보다는 더 많은 생산에만 집중되어 있는 경우가 많다. 전통적 생산기술에 의한 상품생산에 대한 자부심과 긍지는 고품질의 생산물을 만들어낼 수 있지만, 그렇다고 해서 그것이 결과적으로 성공적인 판매전략이라고 단언할 수는 없기 때문이다. 그러므로 홍보, 가격설정, 유통과 같은 여러 가지 요소들을 고려한 적절한 마케팅 전략을 통해서만 지리적표시를 성공적 으로 활용할 수 있는 것이다. 뿐만 아니라 상품의 품질이 일정한 기준을 충족하는 지에 대한 행정당국의 철저한 관리감독이 필요하다.
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 제공하세요.	교향곡	이 문제에서는 주어진 텍스트 내의 <MASK>로 표시된 부분에 들어갈 적절한 단어를 예측해야 합니다. <MASK>가 위치한 문장의 전체 문맥을 분석하여, 문장의 나머지 내용과 일관되게 <MASK>에 들어갈 가장 적합한 단어를 답하세요. #텍스트: 그렇다면 록버그의 12음 음악과 동시대 작곡가들의 12음 음악과는 어떠한 점에서 상이한지 생각해 볼 필요가 있다. 록버그는 쇤베르크 이후의 음열 음악에서 멜로디는 더 이상 서정적이지 않고 따라 부르기 조차 어렵다고 비평하며, 자신의 음악은 다른 12음 음악 작곡가들 보다 더 선율적이라 주장하였다. 또한, 1976년 인터뷰에서 록버그는 1900년대 이후의 음악들이 몇몇 작곡가들을 제외하고는 점점 더 기억하기 어려운 경향이 되어, 곡의 시작 부분 몇 마디는 선율을 노래로 부를 수 있으나 그 이후부터는 잊혀지는 음악이 되어버린다고 지적하였다. 결국, 음악이 귀로 먼저 인지되는 것이 아니라 악보를 통해 눈으로 전달되고 있는 것이다. 실제로 록버그의 <MASK> 제 2번은 쉽게 귀로 인지할 수 있는 주제 선율과 짜임새 있는 프레이즈 구조 및 전통적인 화성어법의 요소들을 많이 포함하고 있다. 그러므로, 이 작품은 음열 기법을 바탕으로 작곡되었으나 조성 음악의 수직적 울림과 선율 구조가 곳곳에 내포되어 있고, 이러한 사운드는 결국 록버그가 사용했던 음열의 구조와 배열에 밀접한 관계가 있음을 알 수 있다.
	렐레 폰스(Lele Pons)는 1996년 6월 25일생으로 베네수엘라와 미국의 인터넷 유명인, 엔터테이너, 배우, 가수입니다. 그녀는 바인을 통해 이름을 알리기 시작했고, 바인에서 10억 루프를 경신한 최초의 사용자였습니다. 바인 서비스 이후 그녀는 유튜브로 활동을 전환하여 현재까지 활발히 활동하고 있습니다. 그녀의 주된 컨텐츠는 일상물과 코미디 영상입니다. 2015년 타임지에서 '가장 영향력이 큰 십대' 명단에 포함되었으며, 2016년에는 '인터넷에서 영향력이 큰 30인' 명단에 이름이 올랐습니다. 또한 2017년에는 포브스에서 '30 언더 30' 엔터테인먼트 부문에 포함되었습니다. 렐레 폰스는 마시멜로의 'Summer' 뮤직비디오와 카밀라 카베요의 'Havana' 뮤직비디오에 출연했습니다.	렐레 폰스의 직업은 무엇인가요?
	광주시 남구에 개관하는 '오방 최흥종 기념관'에 전시 유물이 6점에 그쳐 콘텐츠 부실 논란이 일고 있다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 18억여원 들여 설립 내일 개관 전시유물 성경책 4권 등 달랑 6점 수장고 보관 66점도 대부분 서적 광주기독병원 등과 유물 교류해야 광주시 남구 양림동 최흥종기념관. 광주시 남구가 3년 간의 준비 끝에 개관하는 양림동 ‘오방 최흥종 기념관’이 콘텐츠 부실 논란에 휩싸이고 있다. 기념관 전시 유물이 6점에 그친 것으로 알려지면서 공간 조성에만 급급한 ‘전시 행정’이라는 지적이 나오고 있다. 14일 남구에 따르면 오는 16일 오후 4시 양림동 유진벨 기념관 옆에서 ‘오방 최흥종 기념관 개관식’이 열린다. 남구는 광주 대표 독립운동가인 오방 최흥종(1880~1966) 선생의 업적을 기리기 위해 사업비 18억 원을 투입, 지난 2016년 7월부터 기념관 건립을 추진해 왔다. 기념관은 옛 양림동 테니스장 부지를 활용해 지상 1층 연면적 451㎡ 규모로 지어졌으며, 옥상에 조성되는 정원은 인근 양림미술관과 유진벨 선교사 기념관 등으로 연결된다. 기념관은 애초 지난해 5월 개관이 목표였지만 유물 확보가 늦어지면서 1년 반을 연기했다. 남구가 개관에 맞춰 선보이는 유물은 오방 선생이 생전에 사용했던 러시아·라틴어·영어·한글 성경 4권과 대한민국 건국훈장 애족장·훈장, 백범 김구 선생이 선물한 ‘노자 도덕경’ 족자 1점 등 6점이다. 이 외에 수장고에 보관된 유물 66점 대부분 오방 선생이 소지했던 책인 것으로 전해졌다. 지난 1일부터 오는 31일까지 ‘무등, 시대의 스승을 품다:오방·석아·의재’ 전시를 열고 있는 의재미술관이 오방 선생이 회장으로 있던 애국단체 ‘계유구락부’ 회원 사진, 오방 선생의 장례식 사진 등 희귀 자료들을 처음 공개하는 것과 비교된다. 남구 주민 A씨는 “18억원이나 들여 건물을 지었는데 고작 유물 6점만 볼 수 있는 게 말이 되느냐”며 “광주를 대표하는 독립운동가 기념 공간이 시민들에게 외면을 받는 예상 낭비 공간으로 전락하지 않을까 우려된다”고 말했다. 이에 대해 문화재 전문가들은 광주기독병원 제중역사관과 광주YMCA 역사관 등이 보유하고 있는 오방 선생 관련 유물을 임대 형식으로라도 오방 최흥종 기념관으로 옮겨 한 곳에서 전시하는 방안도 고려해야 한다고 제안했다. 제중역사관과 YMCA역사관 등은 오방 선생이 사용했던 의료기기, 활동 모습 사진 등을 갖추고 있다. 외지 방문객 등을 고려해 세군데에 분산된 유품을 한곳에 모야 한다는 의견이다. 남구는 현재 확보한 유물 중 가장 의미가 있다고 꼽히는 6점을 엄선해 선보인다는 입장이다. 남구 관계자는 “전시실 규모가 작아 유물 6점 이상을 배치할 수 없는 구조”라며 “시기별로 주제를 정해 수장고 유물을 교체 전시할 예정”이라고 해명했다. 기념관 운영을 맡은 광주 YMCA 관계자는 “오방 선생이 돌아가신지 60년이 지났고 평생 어려운 이웃들과 함께하며 책 이외에는 남아 있는 유품이 많지 않다”며 “학술대회나 문화 행사를 통해 오방 선생의 삶을 알릴 수 있는 방안을 마련하겠다”고 밝혔다. 한편 최흥종 선생은 1904년 광주 제중병원(현 기독병원)에서 근무하며 나환자 치료에 헌신했고 3·1운동 당시 광주 만세시위를 주도한 혐의로 3년간 옥고를 치렀다. 광주 YMCA를 설립했으며 해방 후 건국준비위원회 전남지회장을 역임하는 등 광주지역 사회운동에 몸담았다. 1966년 별세했을 때는 광주 최초 사회장(社會葬)으로 장례식이 치러지기도 했다. 정부는 지난 1962년 애국훈장을 수여했으며 1986년과 1990년에는 각각 대통령 표창과 건국훈장 애족장을 추서했다. /김용희 기자 kimyh@kwangju.co.kr
	여성창업가의 특성에 관하여는 미국경영협회(AMA, American Management Association)의 보고서에 나타난 것을 8가지로 정리할 수 있다(DOC, 1986, pp.9~12). 첫째, 지원해 주는 가족들 가까이에서 사업을 시작한다. 둘째, 관리직 또는 전문직에 있으면서 남편의 지원을 받는다. 셋째로는 일찍부터 강한 기업가적 성향을 보이고 있다. 넷째, 고학력의 경향을 보이고 있다. 다섯째, 어려운 업무의 해결에 탁월한 역량을 보이며 자신의 기업에 매우 헌신적이다. 여섯째, 자신의 사업 분야에서 두각을 나타내고 있다. 일곱째, 자신의 삶에서 다양한 면을 변화시키고 종합할 수 있는 능력을 보유하고 있다. 마지막으로, 자신의 능력에 대한 부정적인 상황과 태도를 전환할 수 있는 능력을 갖고 있다.	주어진 제목과 요약문에 대한 정보를 토대로, 요약되기 전 문장을 유추해서 생성해주세요. 제목: 여성 지식기술창업 실태 및 활성화 방안 요약문: 미국경영협회 보고서에서는 여성창업가 특성을 8가지로 정리했다. 가족 가까이서 사업을 시작하고, 관리직 또는 전문직에 있으면서 남편의 지원을 받으며, 강한 기업가적 성향을 가지며, 고학력이라는 점 등이 이에 속한다.
	2014 동계올림픽 피겨스케이팅 여자 싱글 프리스케이팅 무대에서 은메달을 획득하며 고별 무대를 마친 김연아는 피겨의 불모지를 개척한 전설의 선수였으며, 그가 이룬 성취와 수고에 박수를 보낸다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: '피겨 여왕'의 마지막 무대는 아름답고 감동적이었다. 김연아는 어제 러시아 소치 아이스버그 스케이팅 팰리스에서 열린 2014 동계올림픽 피겨스케이팅 여자 싱글 프리스케이팅에서 무결점의 연기로 전날 쇼트프로그램과 합계 219.11점을 얻어 은메달을 목에 걸었다. 홈 텃세 논란과 판정 시비 속에 러시아의 아델리나 소트니코바에게 점수(224.59점)에서 뒤져 올림픽 2연패를 이루지 못한 것이 팬들에게는 아쉽겠지만 그에게 점수나 기록, 메달의 색깔은 그다지 중요하지 않다. '아디오스 노니노'의 선율과 함께 보여준 그의 명품 연기는 전 세계를 매혹시켰고, 그것으로 충분하다. '진정한 여왕'의 멋진 고별 무대에 아낌없는 박수를 보낸다. 김연아는 은반 안에서뿐 아니라 밖에서도 진한 감동과 여운을 남겼다. 많은 세계 언론과 국내외 전문가가 판정에 문제가 있다고 지적했지만 미소를 잃지 않았고 결과에 깨끗이 승복하는 모습을 보인 것이다. 그는 "1등은 아니었지만 내가 할 수 있는 건 다 보여드릴 수 있어서 기분 좋고 또 감사드린다"면서 "쇼트프로그램과 프리스케이팅 모두 큰 실수 없이 준비한 대로 다 보여 만족하고 행복하다"고 소감을 밝혔다. 실로 '여왕'다운 품위와 의연함이 느껴지는 태도다. 소치올림픽을 끝으로 김연아는 피겨 선수 생활에 마침표를 찍었다. 6살이던 1996년 어머니의 손에 이끌려 과천 빙상장에서 처음 피겨를 접한 이래 각종 기록을 새로 쓰며 세계 피겨 역사의 신기원을 열었던 18년의 여정이었다. 2010년 밴쿠버 동계올림픽에서 받은 쇼트프로그램 78.50점과 프리스케이팅 150.06점, 총점 228.56점은 지금도 깨지지 않은 세계 기록이며, 여자 싱글 선수로는 처음으로 동계올림픽, 세계선수권, 4대륙선수권, 그랑프리파이널을 제패한 그랜드슬램의 주인공이기도 하다. 피겨의 불모지에서 전설을 쓴 김연아의 성취와 노고에 경의를 표하지 않을 수 없다. 피겨의 화려한 연기 뒤에는 혹독한 훈련과 잦은 부상이 일상처럼 따라다닌다. 이미 최정상에 섰던 선수가 다시 정상에 도전하는 것은 매우 고통스러운 결정일 수밖에 없다. 김연아도 "밴쿠버올림픽 때와는 달리 이번에는 정해놓은 목표가 없다는 게 준비하면서 가장 힘들었다"고 할 정도로 간절함과 동기부여 없이는 어려운 종목인 것이다. 그의 은메달이 더욱 아름다운 이유가 여기에 있다고 하겠다. 고통과 역경을 이겨내며 끊임없이 도전했던 정신은 그가 이룬 성취보다 오히려 값지다고 할 수 있기 때문이다. 그동안 행복했고 고마웠다. 이제 무거운 짐을 벗고 홀가분하게 무대에서 내려와도 좋다.
	아카시아 나무와 아까시 나무는 서로 다른 나무 종류입니다. 아카시아는 상록수이며 대개 열대와 온대 지역에 분포하며, 오스트레일리아 원산지의 총 500종 가운데 대표적인 종류입니다. 반면 아까시 나무는 낙엽교목으로 북아메리카 원산지로, 높이 약 25m 정도 자랍니다. 일반적으로 한국에서는 아까시 나무를 아카시아라고 오해하는 경우가 있으나, 정확한 명칭은 아까시 나무입니다. 따라서 우리나라와 일본에는 아카시아 나무는 존재하지 않으며, 아까시 나무만 자라고 있습니다.	아카시아 나무와 아까시 나무의 차이점이 무엇인가요? 우리나라와 일본에는 아카시아 나무가 없는가요?
	취업아카데미 운영을 약정한 대가로 지급받은 정부지원금을 부당하게 사용하였는가에 대하여는 실제 얻은 이익이나 고의, 과실 등을 종합적으로 고려하여야 하기때문에, 갑 법인의 사업진행의 운영실태에 대해 보조금 중 일부를 부당하게 사용하여 환수 조치를 통지한 것에 대해 결과적으로 사업의 목적과 관련 없는 곳에 사용한 것이 인정되어 한국산업인력공단의 환수 조치는 정당하다고 본다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 고용노동부로부터 청년 취업아카데미 사업을 위탁받아 진행하는 한국산업인력공단이 문화산업 전문인력 양성사업 등을 영위할 목적으로 설립된 甲 재단법인과 청년 취업아카데미 운영약정을 체결하고 정부지원금을 지급하였는데, 甲 법인의 사업진행에 대한 운영실태를 점검한 결과 甲 법인이 한국산업인력공단으로부터 지급받은 보조금 중 일부 금액을 부당하게 사용하였다는 이유로 해당 금액에 대하여 환수 조치할 것을 통보한 사안이다. 고용정책 기본법 제25조, 청년고용촉진 특별법 제8조의2, 제8조의3, 제10조, 근로자직업능력 개발법 제20조, 보조금 관리에 관한 법률 제30조 제1항, 제31조 제1항 및 위 운영약정에 따른 환수 조치는 위반자의 고의나 과실이 있었는지, 위반자가 그 행위로 실제 이득을 얻었는지 등과 무관하게 행정목적의 달성을 위하여 행정법규 위반이라는 객관적 사실에 착안하여 가하는 제재조치의 일종으로서, 甲 법인에 근무하였던 직원의 민원 제기에 따른 점검 결과 실제로 보조금 부당사용 내용이 적발된 점, 점검 과정에서 甲 법인의 원장이 해당 금액에 관하여 사업과 관련 없이 부당하게 지출하였음을 인정하는 취지의 확인서를 작성한 점 등에 비추어 볼 때, 甲 법인이 환수 조치 금액에 해당하는 돈을 사업의 목적과 관련 없이 부당하게 사용하였음이 인정되므로 한국산업인력공단이 위 금액에 대하여 甲 법인에 환수 조치를 한 것은 정당하다고 한 사례이다.
	지난 1월 시행된 8회 변호사시험에서 서울대를 비롯한 기존 SKY 강세 구도와 수도권과 지방 로스쿨 간의 합격률 차이가 여전한 가운데 합격률 최상위와 최하위 간 격차는 확대되었다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 조석준 수도권-지방 로스쿨 격차 심화 드라마 스카이캐슬 포스터. /자료사진 (동양일보 조석준 기자) 지난 1월 치러진 8회 변호사시험에서 서울대 법학전문대학(로스쿨) 합격률이 80%대로 가장 높게 나타나는 등 기존 ‘SKY’(서울대·연대·고대) 강세 구도에 변화가 없는 가운데 합격률 상위권과 하위권 대학 간 격차가 갈수록 벌어지고 있다. 1일 법무부가 공개한 로스쿨별 8회 변호사시험 합격률 통계를 보면, 서울대 로스쿨의 합격률이 80.9%로 전국 25개 로스쿨 중 가장 높았다. 올해는 모두 188명이 응시해 152명이 합격했다. 지난해 열린 7회 변호사시험에서도 서울대 합격률은 78.7%로 가장 높았고 고려대와 연세대가 2~3위를 다퉜다. 올해 시험에선 서울대 다음으로 고려대(76.4%), 연세대(69%), 성균관대(68.8%), 서강대(65.57%) 순으로 합격률이 높으며 지난해 2·3위는 연세대(73.4%)·고려대(72.0%)였다. 경희대(63.8%), 이화여대(62.5%), 영남대(61.2%) 합격률도 60%를 넘어섰다. 전국 평균 합격률(50.8%)을 웃도는 대학이 12곳으로 집계된 가운데 수도권 로스쿨과 지방 로스쿨 사이 합격률 격차는 여전했다. 전북대(35.6%), 동아대(31.6%), 충북대(37.3%), 제주대(28.1%) 등 5개 학교는 20~30%대 합격률을 보였고 원광대 합격률이 23.5%로 가장 낮았다. 합격률 최상위와 최하위 간 격차는 지난해 54.0%포인트에서 올해 57.4%로 확대됐다. 지난 1월 8~12일 치러진 8회 변호사시험에는 3330명이 응시해 1691명(50.8%)이 합격했다. 이는 지난해 49.4%에서 소폭 상승한 수치다. 법무부는 당초 로스쿨 서열화가 굳어질 수 있다며 학교별 합격률을 공개하지 않았으나 대한변호사협회가 법무부를 상대로 낸 정보공개 소송이 지난해 3월 서울고법에서 변협 승소로 확정되면서 합격률 공개가 시작됐다. 조석준 기자
	과거 전쟁에서는 군대들이 휘황찬란한 색깔의 깃발을 수십개씩 들고 전장에 나갔습니다. 이는 군대의 힘을 상징하는 데에 충분했습니다. 하얀색은 강력한 깃발과 반대되는 의미를 가지므로 항복의 의미로 사용되게 되었습니다. 전쟁에서 패배한 진영은 하얀 깃발을 들고 항복 의사를 밝혀야 했습니다. 항복 의사를 전달하지 못하면 적대 진영에서 모든 군인들이 몰살 될 위험이 있기 때문입니다. 따라서 항복의 의미로 흰기가 사용되어졌으며 이는 지금까지 계승되어 사용되고 있습니다.	왜 항복을 할때 흰깃발을 흔들었는지 그 유래가 무엇인가요?
	문재인 대통령은 21일 아랍에미리트(UAE) 특임 외교 특별보좌관으로 대통령 비서실장 재직 시 UAE 대통령 특사를 맡았던 임종석 전 청와대 비서실장을, 이라크 특임 외교 특별보좌관으로 2009년부터 한·이라크우호재단 이사장을 맡아 온 한병도 전 청와대 정무수석비서관을 위촉하였다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 문재인 대통령은 21일 아랍에미리트(UAE) 특임 외교 특별보좌관으로 임종석(53·전남 장흥) 전 청와대 비서실장을, 이라크 특임 외교 특별보좌관으로 한병도(52·전북 익산) 전 청와대 정무수석비서관을 위촉했다. 임종석 신임 외교특보는 재선 국회의원 출신으로 민주통합당 사무총장과 서울특별시 정무부시장을 거쳐 현 정부의 초대 대통령비서실장을 역임했으며, 내년 총선에 출마할 것으로 알려졌다. 김의겸 청와대 대변인은 임 특보 위촉 배경에 대해 “대통령 비서실장 재직 시 UAE 대통령 특사를 맡아 방문하는 등 UAE 특임 외교특별보좌관으로서 양국 간의 신뢰와 협력관계를 공고화하여 우리나라 국익 수호에 크게 기여할 것으로 기대한다”고 밝혔다. 한병도 신임 외교특보는 제17대 국회의원으로 국회 의정활동 경험과 대통령비서실 정무비서관, 정무수석비서관을 차례로 역임했다. 김 대변인은 한 특보에 대해 “2009년부터 한·이라크우호재단 이사장을 맡아 이라크의 인적 네트워크는 물론 외교·문화 등에 대한 식견이 풍부하여 이라크 특임 외교특별보좌관으로서 역할을 성공적으로 수행할 적임자”라고 평가했다. 한 신임 특보는 오는 27~31일 이라크 특사단으로 이라크를 방문해 마흐디 총리를 만나 현대그룹, 한화그룹 등 여러 가지 기업들의 진출문제와 방산협력 등 현안 해결에 나선다. 직전까지 청와대 비서실장과 정무수석을 지낸 인물을 UAE·이라크 특임 외교특보로 임명한 배경을 묻는 질문에 김 대변인은 “현안이 있기에 대통령께서 사람을 쓰는 것”이라며 “임금, 차량 제공 등은 없고 사무실을 이용할 수 있도록 편의를 제공한다”고 밝혔다. 문 대통령은 아울러 신임 민정비서관에 김영배(52·부산) 정책조정비서관, 신임 정책조정비서관에 이진석(48·울산) 사회정책비서관, 신임 자치발전비서관에 김우영(50·강원 강릉) 제도개혁비서관, 신임 사회정책비서관에 민형배(58·전남 해남) 자치발전비서관 등에 대한 전보 인사도 단행했다. 기존 민정비서관직을 맡았던 백원우 전 비서관의 경우 사임 후 2020년 총선 준비에 돌입할 것으로 전해지고 있다. 김태경 기자 tgkim@kookje.co.kr 김영배 신임 민정비서관 민형배 신임 사회정책비서관 김우영 신임 자치발전비서관 임종석 신임 UAE 외교특보 한병도 신임 이라크 외교특보 이진석 신임 정책조정비서관
	제목: 민주당 충북도당, 논평서 "미세먼지특위 충북 점검 정책 수립 촉매 되길 기대" 더불어민주당 중앙당 미세먼지 특별위원회가 13일 충북 단양에서 실태를 점검한 것에 대해 충북도당은 각종 여론조사에서 도민들은 미세먼지 해결을 최우선 해결 과제로 꼽고 있어 실효성 있는 저감정책 수립을 위해 혁신적인 해법을 모색하고 있다고 전했다.	주어진 문장에 적절한 제목을 생성하고, 내용을 요약해주세요. 문장: 더불어민주당 중앙당 미세먼지 특별위원회가 13일 충북 단양에서 대기오염 배출시설 등 실태를 점검하고 지역주민들의 고충을 청취한 것과 관련 충북도당은 "이번 실태점검이 실효성 있는 저감정책 수립과 지방정부의 과감한 저감노력 확산으로 이어지는 촉매제가 되기를 기대한다"고 밝혔다. 민주당 충북도당은 이날 논평에서 "충북은 지형적 특성과 소각장 밀집 등의 영향으로 최악의 미세먼지 피해 지역으로 분류되고, 각종 여론조사에서 도민들은 최우선 해결 과제로 '미세먼지 해결'을 압도적으로 꼽고 있다"며 이같이 언급했다. 그러면서 "민주당 충북도당은 지난 1월 23일 미세먼지를 주제로 토론회를 개최해 지자체, 시민사회단체, 학계, 언론계 등과 함께 해결책을 고민했다"며 "이에 그치지 않고 정책콘서트에서 나온 의견을 종합해 중앙당에 전달하고 지역에 공유하는 등 지자체, 정치권 등과 함께 혁신적인 해법을 모색하고 있다"고 전했다. 이어 "변재일 충북도당위원장을 비롯해 오제세·도종환·이후삼 의원 등 소속 충북 국회의원들도 주민 눈높이에 맞춘 미세먼지 저감을 위한 제도적 장치 마련에 한마음으로 노력하고 있다"고 강조했다. 아울러 "앞으로도 미세먼지 저감을 반드시 해결해야 할 숙명적 과제로 인식하고 정부, 지자체, 대통령 직속 미세먼지 문제 해결을 위한 국가기후환경회의(위원장 반기문 전 유엔사무총장), 정치권, 시민단체, 관계기관 등과 협력해 맑고 건강한 사회를 만드는 일에 앞장설 것을 도민들께 약속한다"고 덧붙였다.
	한편, 난청의 경우 세계적으로 연령과 지역에 관계없이 다양한 원인으로 환자수가 계속 증가하는 경향을 보이고 있다(방희일, 2006). 우리나라의 난청 유병률은 2008년 국민건강영양조사에 의하면 만 12세 이상에서 일측성 난청 유병률이 9.6%(남자 10.2%, 여자 9.1%), 양측성 난청 유병률은 15.2%(남자 13.0%, 여자17.3%)로 보고되었다. 연령별로는 20대를 제외하고 연령이 높을수록 유병률이 높은 것으로 나타났다. 또한, 2008년 건강보험통계연보에 따르면 난청으로 의료 서비스를 이용한 환자는 약 33만 명으로 보고되었는데 고령으로 갈수록 난청 의료이용 환자가 많은 것으로 나타났다. 난청을 주상병으로 하여 이용한 총 진료비는 2008년 약 395억원(비급여 본인부담 비용 제외, 약국비용 포함)으로 제시되었다.	주어진 제목과 요약문에 대한 정보를 토대로, 요약되기 전 문장을 유추해서 생성해주세요. 제목: 난청환자의 국내 보청기 사용 효과성과 장애요인 분석 요약문: 전세계적으로 다양한 원인에 의한 난청환자가 발생하고 있다. 고령일수록 유병률이 높은 비율로 발생하였으며, 국내 난청질환으로 인한 총 진료비는 약 395억으로 집계되었다.
	2012년 3월부터 전국의 중학교는 선택적으로 ‘학교스포츠클럽 활동’을 창의적 체험활동에 도입하여 1, 2, 3학년의 주당 체육 수업 3 3 2시간에 더하여 ‘학교스포츠클럽 활동’ 시간으로 1 1 2시간을 배정하여 체육활동 시간을 4 4 4 시간으로 증배하여 운영하고 있다. ‘학교스포츠클럽 활동’ 시수는 학교의 사정에 따라 교과 수업시수의 감축 또는 창의적 체험활동 시간 중에서 ‘학교스포츠클럽 활동’으로 3개 학년에 걸쳐 136시간을 전환하였거나 ‘학교스포츠클럽 활동’을 위해 교육과정 시수를 순증하여 편성하는 등 다양한 방식으로 운영되었다. 이 후 2012년 7월 수정 고시된 교육과정에 의하여 2012년 2학기부터는 교과(군)별 수업시수를 20% 내에서 감축하거나 창의적 체험활동 시간을 별도로 만들어 시행하도록 하고 있다.	주어진 제목과 요약문에 대한 정보를 토대로, 요약되기 전 문장을 유추해서 생성해주세요. 제목: 학교스포츠클럽 활동의 교육 성과 분석 요약문: ‘학교스포츠클럽 활동’을 체육 수업에 더하여 시간을 늘려 운영하는데 학교 사정에 따라 전환하거나 시수를 순증하는 방법으로 운영하다 수정된 교육과정에서는 교과별 수업시수를 감축하거나 별도 시간으로 시행토록 하고 있다.
	근대 이후에 확고하게 정착되었던 분야들이 경계를 넘어서 서로 상호소통하고 융합하면서, 시각예술과 청각예술, 그리고 공연예술 등의 융합현상도 가속화되고 있다. 20세기 초반 미래파와 러시아 구성주의 운동에서 기존의 장르를 파괴한 새로운 표현형식이 대두되었고, 1960년대에 과학기술에 대한 장밋빛 비전이 더해지면서, ‘기술과 예술의 만남’, 즉 ‘아트 테크놀로지’가 중요한 분야로 등장하였다. 특히 미술의 경우에 진보한 테크놀로지 자체를 미술에 직접 활용하는 키네틱 아트 나 비디오 또는 컴퓨터 아트 등이 등장하였다. 또한 새로운 미디어 기술은 미술, 음악, 문학, 공연, 건축, 영화 등의 장르가 통합되는 실험예 술의 탄생에 일조하였다.	주어진 제목과 요약문에 대한 정보를 토대로, 요약되기 전 문장을 유추해서 생성해주세요. 제목: 융복합 무대기술 기초연구 요약문: 근대 이후 확고하게 정착되었던 분야들이 상호소통과 융합을 거치며 시각예술과 청각예술, 공연예술 등의 융합현상이 가속화되고 있다. 그 예로 기술과 예술이 융합된 아트 테크놀로지가 있다.
	제목: [사설] 한국 경제의 뇌관 가계빚 1687 조원 어제자 한국은행의 자금순환 통계에 따르면 가계 금융부채가 1687조원으로 알려졌고, 가계 순처분 가능소득이 907조로 2년전에비해 4.5% 증가 했으나, 금융부채가 112% 폭증한 것으로 알려졌다.	주어진 문장에 적절한 제목을 생성하고, 내용을 요약해주세요. 문장: 어제 나온 한국은행 자금순환 통계를 보면 소규모 개인사업자를 포함한 가계 부문 금융부채는 작년 말 1687 조원으로 한 해 전보다 120 조원(7.7%) 늘어났다. 하지만 지난해 가계의 순처분가능소득은 907 조원으로 전년에 비해 39 조원(4.5%) 늘어나는 데 그쳤다. 글로벌 금융위기가 시작된 2007 년 이후 가계의 순처분가능소득은 60% 증가한 데 비해 금융부채는 112%나 급증했다. 외환위기가 터진 1997 년 이후 가계소득이 2.7 배가 되는 동안 빚은 5.6 배로 불어났다. 20 년 전 순처분가능소득의 0.9 배에 불과했던 빚은 10 년 전 1.4 배로 불어났고 지난해 다시 1.85 배로 급증했다. 초저금리기에는 가계가 손쉽게 빚을 얻어 집을 사고 소비를 늘리며 자산시장과 내수경기를 받쳐줬다. 하지만 금리가 상승기에 접어든 지금 과중한 가계빚은 소비 위축과 자산시장 불안을 초래할 최대 리스크 요인으로 바뀌었다. 한국 경제의 가장 위험한 뇌관이 된 가계빚 문제를 해결하기 위한 더욱 체계적이고 치밀한 전략이 필요하다. 가계빚 문제를 해소하는 데는 네 갈래의 길이 있다. 급속한 인플레이션을 일으켜 실질적인 빚의 무게를 줄여주거나, 빚보다 빨리 소득을 늘려 상환 능력을 키워주거나, 채무자의 처지에 맞게 채무 구조조정을 해주거나, 아예 빚을 탕감해주는 것이다. 인위적으로 큰 폭의 물가 상승을 부추기거나 도덕적 해이를 야기할 채무 탕감을 해주는 것은 바람직하지 않다. 그렇다면 결국 부실 위험이 큰 한계가구에 대한 적극적인 채무 구조조정을 실시하면서 성장의 활력을 키워 상환 능력을 키워주는 것이 중요하다. 한국은행에 따르면 작년 말 3 곳 이상의 금융회사에서 돈을 빌린 다중채무자 가운데 신용등급이 7~10 등급으로 낮거나 소득 하위 30% 계층에 속하는 취약 차주는 150 만명에 육박하며 이들의 대출은 82 조원을 넘는다. 이 중 3 분의 2 가 상호금융과 여신전문회사, 대부업체 같은 비은행권에 몰려 있는데 집중적인 감독과 채무 구조조정으로 가계·금융 부문의 동반 부실을 막아야 한다. 또한 성장의 활력을 높일 유연한 재정·통화 정책과 함께 맞춤형 일자리 지원과 주택 시장 안정화를 포함한 종합처방을 써야 한다.
	제목: 홍준표, '조국 수사 지시' 윤석열에 "국민만 보고 가라" 홍준표 전 자유한국당 대표는 자신이 수사했던 1993년 슬롯머신 비리 사건을 언급, 여권이 검찰 수사 외압에 나선 것을 지탄하며, 조국 법무부 장관 후보자 관련 의혹 수사를 지시한 윤석열 검찰총장에게 정권은 일순간이지만, 국민의 검찰은 영원하므로 국민만 보고 갈 것을 당부했다.	주어진 문장에 적절한 제목을 생성하고, 내용을 요약해주세요. 문장: 홍준표 전 자유한국당 대표가 3일 오전 서울 강남구 한 스튜디오에서 열리는 유튜브 맞짱토론 '홍카레오'에 참석하며 취재진의 질문을 듣고 있다. '홍카레오'는 두 사람의 유튜브 계정 '유시민의 알릴레오'와 'TV홍카콜라'를 조합해서 정해졌으며 3일 오후 10시 유튜브를 통해 공개된다. 홍준표 전 자유한국당 대표가 조국 법무부 장관 후보자 관련 의혹 수사를 지시한 윤석열 검찰총장에게 "국민만 보고 가라. 큰 권력은 모래성에 불과하다"며 "정권은 순간이지만, 국민의 검찰은 영원하다"고 말했다. 홍 전 대표는 31일 자신의 페이스북을 통해 "비리백화점 조국 수사는 검찰 존립 여부를 결정짓는 가늠자가 될 것"이라며 윤 총장에게 "검사는 그만둬도 변호사를 할 수 있으니 먹고 살 수도 있다"고 했다. 그는 "시시하게 굴지 마라"며 "인생은 짧다"고도 했다. 자신이 수사한 지난 1993년 슬롯머신 비리 사건도 언급했다. 그는 "제일 먼저 수사 개시를 못하도록 막은 곳은 대검찰청 수뇌부였고 연이어 청와대 수석 비서관이 서울 섬사장에게 전화를 걸어 수사를 못 하도록 압박했다"며 "그런데 우리가 그걸 돌파할 수 있었던 것은 정의를 향한 일념과 언론의 정론 보도였다"고 말했다. 홍 전 대표는 이를 통해 여권이 검찰 수사에 대한 외압에 나섰다고 비판한 것으로 풀이된다.
	4사분면은 중앙의 지방적 정책 선호에 대한 개입이 강하다. 지방이 하고 싶지 않으나 중앙정책에 의해 강제적으로 실시하는 것이다. 중앙의 지시와 강제에 의해 지방이 사업을 수행한 것이고 중앙정부의 지원을 강화해야 할 필요가 있다. 지자체가 스스로 수행할 유인이 상당히 적지만, 국가적으로는 전국적으로 일정한 수준의 공공서비스를 제공해야 하는 경우, 대응 지방비를 통하여 중앙정부와 필요 경비를 분담하는 차원에서 중앙정부와 지자체가 국고보조금을 통하여 해당 사업의 재원을 조달하는 경우이다. 보건복지부의 기초생활보장 사업, 영유아보육료 지원 사업, 노인생활 안정사업 등이 모두 이러한 유형에 해당된다, 복지사업 중 기초생활보장사업과 같이 재분배적 성격이강한 사업의 경우, 지자체가 자발적으로 이러한 서비스를 제공할 유인이 없으므로, 국가가 법령을 통하여 국고보조금을 지원하여 지방의 재원을 동원하게 되므로 중앙과 지방간 재원분담의 적정성에 대한 갈등이 유발되는 원인이 되고 있다.	주어진 제목과 요약문에 대한 정보를 토대로, 요약되기 전 문장을 유추해서 생성해주세요. 제목: 광역지역발전특별회계 사업의 집행실태 및 사례연구 요약문: 중앙정부와 지자체가 국고의 보조금을 통해 재원을 조달하는 사업은 보건복지부의 기초생활보장 사업과 영유아보육료 지원 사업 등이 해당된다. 재분배적인 성격이 강할 경우엔 중앙 및 지방간의 재원분담에 따른 갈등이 유발되기도 한다.
	출생아 감소 추세가 이어지고 전년 동월과 비교한 출생아 수는 34개월 연속 최저기록을 세우면서 2028년으로 전망되던 인구 감소 전환 시점이 크게 앞당겨질 것으로 보여 특단의 대책이 요구된다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 도무지 약발이 들지 않는다. 황금돼지의 해 효과도 없다. 유치원 등에서 또래보다 큰 아이를 원해 1월 출생을 선호하는 학부모들도 찾아보기 어렵다. 관련 통계 작성을 시작한 1981년 이래 1월 기준 역대 최저를 기록한 출생아 수 얘기다. 보통 1월에 연중 출생아 수가 가장 많곤 했는 데 올해는 거꾸로 여서 올해 연간 출생아 수 역시 사상 최저를 기록할 것이라는 관측이 나온다. 인구 절벽 현실화로 경제를 포함 사회 전반의 활력을 잃지 않을까 걱정이다. 통계청이 어제 발표한 '1월 인구동향'에 따르면 1월 출생아 수는 3만 300 명에 그쳤다. 지난해 같은 달 보다 2000 명(-6.2%)이나 줄었다. 출생아 감소 추세가 이어지면서 전년 동월과 비교한 출생아 수는 34개월 연속 최저기록을 세워나가고 있다. 출산의 선행 지표인 혼인마저 급감세라서 우려를 더한다. 학령 인구 부족으로 폐교하는 곳이 수두룩하고, 지방소멸이 눈 앞에 다가왔는 데 속수무책이다. 인구 절벽 시계가 빠르게 돌아가면서 당장 소비가 위축되고, 고령화에 따른 복지 부담 증가 등 경제에 미칠 여파가 가장 문제다. 2028년으로 전망되던 인구 감소 전환 시점이 크게 앞당겨질 것으로 보여 대책 마련이 발등에 불이다. 생산가능인구의 감소 같은 인구구조 변화로 잠재성장률이 2016-2025년 1.9%, 2026-2035년 0.4%까지 추락할 가능성이 있다는 게 한국은행의 분석이고 보면 여간 심각한 상황이 아니다. 퍼주기 식 저출산 대책으로는 한계가 드러난 만큼 백지상태에서 탈출구를 모색해야 한다. 정부는 2006년부터 13년간 152조 원을 쏟아 부었지만 효과는 거의 없는 게 현실이다. 연간 9000억 원에 달하는 전국 지방자치단체의 올해 저출산 대응 예산 역시 얼마나 먹혀 들지 미지수다. 대한민국의 미래가 걸렸다는 위기의식을 갖고 특단의 대책을 서둘러 세울 때다. 코 앞으로 다가온 대재앙에 눈 뜨고 당해서는 안 된다.
	이 LP방법론은 비선형계획법(Non-Linear Programming)이 가지는 문제점들, global optimum을 보장하지 못하고, 연산시간이 너무 길어질 수 있으며, 강건성이 보장이 안 된다는 문제를 피하기 위해서 사용이 되었다	주어진 문장 뒤에 자연스럽게 이어질 문장을 생성해주세요. 문장: 과거 1960년대에 Carpentier(1962)에서 전력시스템의 발전계획을 최적화 해주는 본격적인 OPF 모형이 처음 소개되고 제안된 지 50여 년이 지났지만, 현재에도 OPF모형은 수학적으로, 공학적으로 풀기가 아주 어려운 문제로 인식되고 있다. 초기의 OPF모형은 목적함수와 제약조건들을 선형함수로 제한해서 선형계획법(Linear Programming, 이하 LP)을 이용하여 접근하였다.
	당시 북한은 2013년 2월 12일의 3차 핵실험 직후 “우주강국, 핵강국으로 위용 떨쳐주신 위대한 김정은 만세!”라고 적힌 현수막을 평양 시내에 내걸었을 뿐 아니라, “핵강국”에 대한 기사도 『로동신문』 상에서 2013년 1/4분기 5건에서 경제･핵병진노선의 선포 직후인 2013년 2/4분기에는 63건으로 대폭 증가했다	주어진 문장 뒤에 자연스럽게 이어질 문장을 생성해주세요. 문장: 그리고 2013년 초에 들어서면서 북한의 핵강국 주장은 더욱 적극적으로 폭넓게 배포되기 시작했다. 2012년 3월 말의 핵강국 주장이 일회적인 것이었다면, 2013년 3차 핵실험 직후에는 핵강국 주장이 보다 지속적이며 빈번한 형태로 등장했다.
	허재환 유진투자증권 연구원은 보고서에서 중국 증시의 강세는 미국이 대중국 관세 인상 시한을 연장함에 따른 미·중 무역협상에 대한 기대와 2월 말 예정된 MSCI의 중국 A주 편입 비율 확정 이벤트와 관련된다며 중국이 위안화 환율 안정 및 자본 시장 개방이 예상된다고 25일 밝혔다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 도널드 트럼프 미국 대통령이 다음 달 1일로 예정돼 있던 대중국 관세 인상 시한을 연장하면서 미·중 무역협상의 향방에 대해 시장의 이목이 집중되고 있다. 증권가에선 중국의 자본시장 개방 등을 통한 미중 무역협상의 연착륙 가능성을 높게 점쳤다. 허재환 유진투자증권 연구원은 25일 보고서에서 "중국 증시가 강세를 이어가고 있는 이유는 미·중 무역협상에 대한 기대와 2월 말 예정된 MSCI의 중국 A주 편입 비율 확정 이벤트와 관련이 있다"며 "무역협상은 중국의 자본시장 개방으로, 중국 A주의 MSCI 편입은 한국 증시에도 긍정적인 영향을 미칠 가능성이 높다"고 설명했다. 미중 무역협상에서 위안화의 빠른 절상은 없으리란 판단이다. 허 연구원은 "무역갈등이 본격화 되기 이전의 평균 위안화·달러 환율 6.26위안이 적정하다고 보고 중국 정부가 관세 피해를 전가하기 위해 관세가 인상되는 만큼 위안화를 절하시킨다고 보면 현 관세수준에선 6.6~6.7위안 달러 수준이 적정하다"며 "최근 위안화 가치가 상승한 점을 감안하면 위안화가 더 빠르게 절상될 여지는 적다"고 분석했다. 위안화 안정의 진짜 중요한 의미는 중국 정부의 자본시장 개방에 있다는 설명이다. 허 연구원은 "중국이 미국산 제품과 서비스를 대규모로 매입하면 중국 경상흑자는 지금보다 감소할 가능성이 높아 이를 상쇄하기 위해선 중국이 자본시장을 보다 더 개방해야 위안화 안정과 동시에 자본을 조달할 수 있다"며 "향후 중국은 통화정책은 완만하게 완화하고 자본시장 개방은 속도를 내며 주식 자금조달을 활성화할 것"이라고 내다봤다. 그러면서 중국 정부는 △2분기 중 추가 지준율 인하 △자본시장 개방 및 해외자본 유치 △올 상반기 상하이판 나스닥 커촹반 시장 출범과 함께 기술 개발 기업 성장에 노력할 것이라고 설명했다. 중국 증시의 강세는 한국 등 아시아 증시에 플러스 효과를 나타낼 것이라는 전망이다. 허 연구원은 "MSCI에서 중국 비중 확대로 한국 비중은 축소될 가능성이 높지만 중국 증시가 오르는데 한국 증시만 하락할 가능성이 높지 않다"며 "이미 중국의 비중 확대는 예고됐다는 점에서 급격한 자금 유출입이 나타날 가능성은 낮지만 코스피지수와 상해종합지수 간 상승 상대강도에서는 차이가 나타날 수 있다"고 분석했다. 위안화 안정의 수혜주에 주목할 필요가 있다는 조언이다. 허 연구원은 "위안화가 중국 소비자들의 구매력을 의미하기 때문에 화장품과 유통업종에 주목하는 건 위안화 안정 시기 유효한 전략"이라며 "중국과의 경합도가 높아지고 있는 반도체·테크 섹터의 관심도 유효해 보인다"고 설명했다.
	청년고용할당제는 대한민국 정부의 정책으로, 공공기관과 공기업에 매년 정원의 3% 이상을 차지하는 청년 미취업자를 채용하도록 하는 제도입니다. 이 제도는 청년실업 문제를 해결하고 경제 성장과 사회 안정을 추구하기 위해 도입된 것으로 판명되었습니다. 2013헌마553 사건에서 대한민국 헌법재판소는 청년할당제가 합헌으로 판단되었으며, 청년실업 문제를 완화하는 데 기여하고 입법 목적을 달성하는 적절한 방법임을 언급했습니다. 또한, 청년할당제는 모든 공공기관에 일률적으로 강제되는 것이 아니라 특정 규모 이상의 기관에만 적용되며, 3년 동안 한시적으로 시행되어 불이익을 최소화했습니다. 이러한 점에서 청년할당제는 35세 이상 지원자들의 공공기관 취업 기회에 영향을 주지 않았으므로 평등권을 침해하지 않았다고 판단되었습니다.	청년고용할당제는 대한민국 정부의 정책이다. (이렇게 생각되는데 맞아?)
	제목: 불법 복제만화 최대 사이트 '마루마루' 폐쇄 문체부는 지난해 5월부터 서버를 외국으로 이전해 불법 복제물을 유통하는 사이트에 대해 방송통신위원회·경찰청과 합동으로 점검하여 25개 사이트를 폐쇄하고 이 중 범죄 사실이 중대한 13개 사이트의 운영자를 검거했으며, 국내 최대 불법 복제만화 사이트인 '마루마루' 운영자 2명을 저작권법 위반 혐의로 입건하고 당해 사이트를 폐쇄했다고 8일 알렸다.	주어진 문장에 적절한 제목을 생성하고, 내용을 요약해주세요. 문장: 문화체육관광부는 저작권 특별사법경찰이 국내 최대 불법복제만화 공유사이트인 '마루마루' 운영자 2명을 적발해 저작권법 위반 혐의로 입건하고 해당 사이트를 폐쇄했다고 8일 밝혔다. 문체부는 지난해 5월부터 방송통신위원회·경찰청과 함께 서버를 해외로 이전해 불법 복제물을 유통하는 사이트에 대한 정부 합동 단속을 실시해 왔다. 이를 통해 정부는 '마루마루'를 포함해 25개 사이트를 폐쇄하고 이 가운데 범죄 사실이 중대한 13개 사이트의 운영자를 검거했다. 특히 대표적인 웹툰 불법공유사이트 '밤토끼'와 방송저작물 불법공유사이트 '토렌트킴'에 이어 작년 12월 만화 불법공유사이트 '마루마루' 운영자까지 검거하면서 분야별 최대 규모 불법사이트 운영자를 모두 검거하는 성과를 거뒀다. 이번에 입건된 마루마루 운영자 A씨는 국내 단속을 피하기 위해 미국의 도메인 서비스업체를 통해 불법 사이트를 개설하고, 이를 불법복제 만화저작물 약 4만2,000건을 저장해 놓은 웹서버에 연결하는 방식으로 사이트를 운영한 혐의를 받는다. A씨가 사이트 운영을 통해 거둬 들인 광고수익만 12억원 이상인 것으로 파악된다. 정부 합동단속으로 검거된 13개 불법사이트 운영자 중에는 고교생을 비롯해 대학생도 다수 포함됐으며, 일부는 가족까지 사이트 운영을 도운 혐의로 기소됐다. 이들은 형사처벌 이외에도 권리자들로부터 범죄수익의 몇 배에 달하는 민사소송을 당하게 된다. 실제 웹툰 불법공유사이트 '밤토끼' 운영자의 경우 1심에서 2년 6개월의 징역형을 선고받은 후 피해자들이 제기한 소송으로 수십억 원의 손해배상 판결을 받았다. 문체부 관계자는 "불법사이트 운영자를 도와 만화 번역을 하거나 사이트를 관리한 이들도 2차 저작물 작성권 침해나 저작권 침해 방조 등의 혐의로 기소돼 처벌을 받게 된다"며 "특히 평범한 학생과 같은 일반인이 범죄라는 인식 없이 소액의 대가를 받고 사이트 운영을 도왔다가 범죄자로 전락할 수 있음을 유의해야 한다"고 설명했다.
	민주당은 19일 3+1 야당들이 전날 도출한 선거법개정 합의안 중 석패율 도입에 대해 수용 불가를 주장하며 민생법안과 검찰개혁법안 ‘선(先) 처리’ 제안하자 야당이 즉각 반발하면서 그동안의 공조가 흔들려 선거법과 패스트트랙(신속처리안건) 법안을 올해 안에 처리하기 어려워졌다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 민주·‘3+1’ 야당 석패율제 도입 놓고 갈등 격화 검찰개혁법 선처리 요구에 야당 "비겁한 행동" 김선욱 기자 더불어민주당과 선거법 협상을 진행해 온 ‘3+1′(바른미래당·정의당·민주평화당+대안신당) 야당간 공조가 흔들리면서 선거법을 비롯한 패스트트랙(신속처리안건) 법안의 연내 처리에 빨간불이 켜졌다. 민주당은 19일 3+1 야당들이 전날 도출한 선거법개정 합의안 가운데 석패율 도입에 대해 수용 불가 입장을 밝히면서 민생법안과 검찰개혁법안 ‘선(先) 처리’ 카드를 꺼내들었다. 이인영 원내대표는 이날 국회에서 열린 정책조정회의에서 4+1에 참여한 야당을 향해 “국민이 원하는 것부터 먼저 처리하자. 우선 합의할 수 있는 것부터 차례차례 처리해 나가자”며 “민생과 검찰개혁을 먼저 마무리 짓는 것도 열어놓고 검토해 줄 것을 요청한다”며 원포인트 본회의 개최를 제안했다. 지난 4월 자유한국당을 제외한 여야 4당의 패스트트랙 합의는 선거법 개정안을 먼저 처리한 뒤 검찰개혁 관련 법안을 처리한다는 것이었다. 그러나 4+1의 선거법 협상이 석패율제 도입을 놓고 막히자, 상당부분 이견을 좁혀온 검찰개혁법안과 민생법안을 먼저 마무리 짓는 것으로 방향을 바꾼 것이다. 야당은 즉각 반발했다. 바른미래당 손학규 대표는 패스트트랙법안 처리 순서가 선거법 이후 검찰개혁법으로 합의된 상황을 지적하며 검찰개혁 선 처리 제안을 일축했다. 정의당 윤소하 원내대표는 “그것(검찰개혁법)을 볼모로 (협상을) 안 한다는 것처럼 말하지 말라. 비겁한 행동”이라고 날을 세웠다. 대안신당 천정배 의원과 평화당 조배숙 의원은 이날 예정됐던 ‘4+1 협의체’의 검찰개혁 실무회의에 불참하며 불편한 심기를 드러내기도 했다. ‘4+1협의체 공조가 균열을 보이면서 패스트트랙법안 처리는 장기화 국면으로 빠져들었고, 셈법은 더욱 꼬여가고 있다. 특히 서로가 진정성을 의심하면서 감정의 골도 더 깊어지고 있다. 정의당과 민주평화당, 대안신당(가칭)은 이날 각 당별 회의에서 민주당을 향한 실망감과 불신을 드러냈다. 심상정 대표는 “민주당이 여전히 당익을 앞세운다”고 지적했고, 조배숙 원내대표는 “작은 이익에 집착하면 큰일을 이룰 수 없다”며 이해찬 대표를 겨냥했다. 유성엽 창당준비위원장은 “전형적인 소인배 정치”라고 비난했다. 정치권 일각에선 석패율제와 검찰개혁법 선처리의 ‘딜’ 가능성도 거론되고 있지만, 연내 처리는 물건너 갔다는 관측이 많다. 다음주 중 4+1 단일안이 나오지 못하면 연내 처리는 무산될 전망이다. 이런 가운데 자유한국당은 이날 국회 규탄대회에 이어 ‘비례한국당’ 추진 가능성을 내비치며 민주당을 압박했다. 박완수 사무총장은 “연동형 비례대표제가 시행된다면 비례정당을 만들 수도 있기 때문에 실무적인 준비를 하고있다”며 “언제든지 등록을 할 수 있는 절차를 만들고 있다”고 말했다. 서울=김선욱 기자
	도쿠가와 요리노부는 일본 에도 시대의 다이묘로, 초대 쇼군 도쿠가와 이에야스의 10남이자 기슈 도쿠가와가의 시조였습니다. 그는 히타치 국 미토 번, 스루가 국 슨푸 번, 기이 국 와카야마 번의 번주를 역임했으며, 8대 쇼군 도쿠가와 요시무네의 조부였습니다. 그는 패기 있고 씩씩한 성격으로 알려져 있었습니다. 1602년 후시미 성에서 태어난 그는 히타치 국 미토 번 20만 석의 영주가 되었고, 이에야스와 함께 교토로 상경하여 관례를 치르고 스루가 국 슨푸 번 50만 석의 영주로 영지가 변경되었습니다. 그는 기슈 성에 정착하기 전부터 이전의 영주 가문인 아사노 가문의 실책을 조사하여 개정하려 노력했고, 정착한 이후에도 와카야마 성과 성내 도시를 개편하고 지방 토호들을 회유하여 사회 안정을 추구했습니다. 그러나 1651년 게이안의 변 당시 주동자인 유이 쇼세쓰가 그의 인장을 도용한 위장 문서를 사용한 것이 드러나면서 바쿠후로부터 모반의 혐의를 받아 10여년 간 영지인 기슈로 복귀하지 못하고 억류되었습니다. 이후 요리노부는 혐의를 벗고 기슈로 되돌아오는 데는 성공했으나, 와카야마 성의 증축은 중지해야 했습니다.	도쿠가와 요리노부는 어떤 인물이었나요?
	술을 마시면 체내에서 분해되는 과정에서 아세톤이 발생하게 됩니다. 이 아세톤이 구강내에 축적되면 구취를 유발하게 됩니다. 게다가 알코올이 구강 내 수분을 빼앗아 구강 건조를 유도합니다. 이로 인해 자연스레 구취가 생겨나게 됩니다. 만약 구강 건조를 방지하고 싶다면, 평소에 충분한 수분을 섭취하며, 술을 마시기 전 물을 충분히 마셔 수분 섭취량을 보충하는 것이 좋습니다. 숙취가 걸렸을 때는 입냄새 개선법으로는 입안을 깨끗하게 닦는 것이 중요합니다. 이빨뿐만 아니라 혀와 입천장도 깨끗하게 닦아주어야 하며, 사랑니를 뽑는 등의 치과 수술도 입냄새 예방에 효과적입니다. 또한, 입냄새 유발 제품을 줄이기 위해서는 육류와 고기방 음식 및 마늘, 파, 양파, 고추, 고사리 등은 자제하는 것이 좋습니다. 입냄새 개선을 위해서는 토마토 주스, 녹차, 우유 등 특정 음식 섭취로도 효과를 냅니다. 적절한 섭취와 구강 위생으로 관리하여 입냄새를 예방할 수 있습니다.	술을 마시면 입냄새가 심한가요? 어떻게 해결할 수 있나요?
	제목: 홍성군, 돼지 사육 농장 일제 청소 및 소독 홍성군은 추석을 앞두고 가축전염병 예방을 위해 관내 양돈농장 등 청소 및 소독을 실시하고 방역 실태도 함께 조사할 계획이다.	주어진 문장에 적절한 제목을 생성하고, 내용을 요약해주세요. 문장: 홍성군은 추석을 앞두고 구제역 및 아프리카돼지열병(ASF) 등 가축전염병 예방을 위한 차단방역에 총력을 기울이고 있다고 밝혔다. 군은 지난달 28일 관내 양돈농장에 대해 민·관 합동으로 일제 청소 및 소독을 실시한 것에 이어 추석 전후인 오는 9일과 17일 양돈농장 등 관련 축산시설에 대한 일제소독을 진행할 계획이다. 공동방제단, 읍·면 소독차량을 총동원해 밀집단지 및 취약농장 등을 집중 소독하는 것은 물론 농장 자체적으로도 이동식 고압분무기 등을 활용해 소독할 예정이다. 군은 지속적인 관리를 위해 양돈농장 아프리카돼지열병 담당관을 동원해 농장의 소독상황과 구제역백신 접종여부 등 방역 실태를 일제점검도 함께 시행할 방침이다. 또 홍성역과 읍·면 행정복지센터 등 귀성객들이 많이 찾는 장소에 홍보용 현수막 설치, 방역 수칙 등을 홍보해 선제적 방역을 위한 안내를 시행할 계획이다. 이 외에도 명절 동안 귀향객과 자동차의 이동이 잦은 만큼 고향 방문 시 축산농가 출입을 금지하고, 부득이 축산농가를 방문한 귀성객은 소독 절차를 철저히 이행하는 등 ASF방역관리 수칙을 지켜야하는 등의 주의 사항도 함께 홍보할 계획이다. 군 관계자는 "추석명절을 앞두고 해외여행이 늘어나는데 가급적 ASF, 구제역 발생 국가는 피하고 축산물 해외 반입을 자제해 주길 바란다"며 "명절 전후 차단방역을 위해 귀성객분들도 적극 방역에 함께 해주길 바란다"고 말했다.
	엠넷 5뉴스는 대한민국 SBS에서 평일 아침 5시에 방송했던 SBS의 아침 뉴스 프로그램이었습니다. 2012년 10월 29일부터 SBS가 24시간 방송을 시작하면서 굿모닝 510과 함께 매일 아침 5시에 신설되어 10분간 방송되었습니다. 2013년 10월 14일부터 편성이 평일로 축소되었고, 2016년 12월 30일에 SBS의 2017년 새해 개편으로 종영되었습니다. 이 프로그램은 월요일 이병희 아나운서, 화요일 박은경 아나운서, 수요일 김선재 아나운서, 목요일 이혜승 아나운서, 금요일 박찬민 아나운서가 진행했습니다.	엠넷 5뉴스는 어떤 프로그램이었나요?
	제목: 손해배상(기) 갑 회사의 직원 을이 몰래 자재를 횡령하여 병 회사의 대표 정에게 팔아온 사안에서, 정과 병 회사는 해당 물건이 장물인지에 대한 주의의무를 게을리한 과실로 갑 회사에 대한 불법행위를 저지른 것이지만, 재고관리 등에 관한 주의의무를 다하지 못한 갑 회사의 과실을 참작하여 정과 병 회사의 책임은 80%로 제한된다.	주어진 문장에 적절한 제목을 생성하고, 내용을 요약해주세요. 문장: 배관 및 철강 자재 등 도소매업을 하는 甲 주식회사의 직원인 乙이 회사 몰래 배관자재를 횡령하여 丙 주식회사의 대표자인 丁에게 시가보다 낮은 금액으로 팔아 온 사안에서, 乙은 업무상 보관하던 甲 회사 소유의 배관자재를 甲 회사 몰래 판 후 대금을 임의로 사용하였고, 丁은 乙이 판매하는 배관자재가 장물인지를 확인할 수 있었음에도 그러한 주의의무를 게을리한 과실로 甲 회사에 배관자재의 매입원가 상당의 손해를 입혔으므로 乙과 丁은 공동하여 甲 회사에 손해배상금을 지급할 의무가 있고, 丙 회사는 대표자인 丁이 위와 같이 불법행위를 하여 甲 회사에 손해를 입혔으므로 丁과 공동하여 甲 회사에 손해배상금을 지급할 의무가 있는데, 甲 회사의 자재를 고의로 빼돌린 乙과 달리 丁과 丙 회사는 乙이 판매하려는 물건이 장물인지에 대한 주의의무를 게을리한 과실로 甲 회사에 대하여 불법행위를 저지른 것이므로, 재고관리 등에 관한 주의의무를 다하지 아니하여 손해의 확대를 방지하지 못한 甲 회사의 과실을 참작하여 丁과 丙 회사의 책임을 80%로 제한한 사례.
	이들 지원조직은 현장에 밀착하여 공동체의 역량 강화, 사업 컨설팅 등을 수행하고 있다	주어진 문장 뒤에 자연스럽게 이어질 문장을 생성해주세요. 문장: 제4장에서는 공동체 관련 국내외 사례를 분석하였다. 국내 사례로는 농촌공동체를 대상으로 했으며, 국외 사례로는 일본과 EU의 어촌공동체를 검토하였다. 농촌공동체는 산업화 및 도시화 과정을 거치면서 빠르게 해제되었지만 마을개발 및 소득증대의 필요성에 따라 정부 주도로 공동체를 회복하였고, 최근에는 민간 주도로 농촌공동체가 육성되고 있다. 일본과 EU의 사례에서 어촌공동체의 활성화를 위한 다양한 지원조직이 결성되어 있다. 일본은 어업협동조합과 지자체 및 전문가가 참여한 ‘지역수산업 재생협의회’가 있으며, EU는 지역 전문가인 ‘지역수산공동체(FLAG)’가 활동하고 있다.
	바닷마을 다이어리는 요시다 아키미의 동명의 만화를 원작으로 하여 고레에다 히로카즈 감독이 실사 영화화한 작품으로, 2015년 6월 13일에 일본에서 개봉되었습니다. 이 영화는 제68회 칸 국제 영화제에 초청되었지만 수상하지는 않았지만, 2015년 부산 국제 영화제 갈라 프레젠테이션 부문에 초청되었습니다. 또한 2015년 12월 17일에 대한민국에서도 개봉되었습니다. 이 영화는 아버지가 15년 전 가족을 버리고 다른 여자와 재혼하여 두 번째 부인과 사별하고 세 번째 부인까지 얻은 가마쿠라 마을의 낡은 집에 세 딸만 살게 됩니다. 세 딸인 사치, 요시노, 치카는 아버지의 부고 소식을 듣고 장례식장을 찾아갑니다. 그러나 이복 여동생 스즈와 갈등이 없을 수 없는 법이므로 아버지에 대한 서로 다른 기억을 공유하면서 부모의 부재로 인한 상처를 이겨내고 서로를 한 가족으로 받아들입니다. 이 영화는 2015년 제68회 칸 국제 영화제에서 출품되었으며, 주요 인물들은 코다 사치, 코다 요시노, 코다 치카로 구성되어 있습니다.	"바닷마을 다이어리"는 어떤 작품인가요?
	True	H(X_n\|X_0)$ 는 고정된 마르코프 과정의 n 오목 함수입니다. 참인가 거짓인가? 관련 정리: 정보 이론의 맥락에서 열역학 제2법칙은 종종 시스템의 불확실성 또는 무작위성을 측정하는 엔트로피의 개념과 연관됩니다. 여기서 오목함수란 엔트로피가 오목함수라는 속성을 말하며, 이는 다양한 프로세스에서 정보의 동작에 영향을 미칩니다. 오목 함수는 함수 그래프에서 두 점 사이에 선분을 그릴 때 선분이 그래프 아래에 놓이는 함수입니다. 즉, 함수가 아래쪽으로 "곡선"을 그리는 것입니다. 수학적으로 함수는 두 번째 도함수가 음이거나 헤시안 행렬(다변량 함수의 경우)이 음의 반정확 행렬인 경우 오목 함수입니다. 정보 이론에서 확률 분포의 엔트로피는 다음과 같이 정의됩니다: H(X) = - ∑ P(x) * log(P(x)) 여기서 X는 이산 확률 변수이고, P(x)는 각 결과 x의 확률이며, 로그는 일반적으로 기저 2입니다(따라서 엔트로피는 비트 단위로 측정됩니다). 정보 이론에서 엔트로피의 오목함에는 몇 가지 중요한 함의가 있습니다: 1. 데이터 처리 불평등: 엔트로피의 오목성은 무작위 변수가 결정론적 함수를 통해 처리될 때 출력의 엔트로피가 입력의 엔트로피보다 클 수 없다는 것을 의미합니다. 즉, 결정론적 처리는 새로운 정보를 생성할 수 없습니다. 2. 공동 엔트로피: 두 무작위 변수의 공동 분포의 엔트로피는 항상 각 개별 변수의 엔트로피보다 크거나 같습니다. 이는 엔트로피 함수의 오목함의 결과로, 정보 소스를 결합해도 전체 불확실성을 줄일 수 없음을 의미합니다. 3. 조건부 엔트로피: 다른 무작위 변수에 조건이 붙은 무작위 변수의 엔트로피는 항상 조건이 없는 변수의 엔트로피보다 작거나 같습니다. 이는 조건이 불확실성을 감소시키고 엔트로피의 오목성이 불확실성 감소가 항상 음수가 아닌 것을 보장하기 때문입니다. 4. 상호 정보: 엔트로피의 오목성은 또한 상호 정보라는 개념으로 이어지며, 이는 다른 무작위 변수에 대한 지식으로 인해 한 무작위 변수에 대한 불확실성이 감소하는 것을 측정합니다. 상호 정보는 항상 음수가 아니므로 한 변수를 알면 다른 변수에 대한 불확실성만 줄일 수 있음을 나타냅니다. 요약하자면, 정보 이론에서 열역학 제2법칙의 오목성은 엔트로피 함수의 오목한 특성과 관련이 있습니다. 이 속성은 데이터 처리, 공동 및 조건부 엔트로피, 상호 정보와 같은 다양한 프로세스에서 정보의 동작에 중요한 영향을 미칩니다.
	왼쪽에 분배하고 양쪽에서 3을 빼면 $2x^2-7x-3=0$을 구합니다. 검사 결과 $2x^2-7x-3$은 쉽게 인수분해되지 않으므로 계수 $2$, $-7$, $-3$을 이차식에 대입합니다: \[ \frac{-(-7)\pm\sqrt{(-7)^2-(4)(2)(-3)}}{2(2)}=\frac{7\pm\sqrt{49+24}}{4}=\frac{7\pm\sqrt{73}}{4}. \]따라서 $m=7$, $n=73$, $p=4$이므로 $m+n+p=7+73+4=84$입니다.	x(2x-7)=3$의 해는 $\frac{m+\sqrt{n}}{p}$ 및 $\frac{m-\sqrt{n}}{p}$의 형태로 표현할 수 있으며, 여기서 $m$, $n$, $p$는 상대적으로 소수입니다. m+n+p$를 구합니다.
	단원 정리를 위한 Do It Yourself도 따로 시간을 배정하지 않고 각 영역에서 문제를 점검해보는 방향으로 축소하였으며, Project 파트는 Writing 부분과 연계시키고, Culture 파트는 Reading 부분과 연계시켜 세계의 전통 음식을 조사하여 text를 이해하고 발표하기 수업으로 학생 활동을 다양화시켰다	주어진 문장 뒤에 자연스럽게 이어질 문장을 생성해주세요. 문장: 핵심 성취기준과 교과 핵심역량에 따라서 위와 같이 교육과정을 재구성하였으며 핵심성취기준에 해당되는 영역의 비중을 높여서 학생들의 활동 시간을 좀 더 제공하도록 구성하였다. 또한 핵심 성취기준을 도입함으로써 본 단원의 Listening&Speaking에서는 묘사와 설명에 반복되는 유형의 표현과 탐구 과제에 해당되는 영역을 줄이고 듣기와 말하기 핵심 성취기준에서는 제외된 ‘일반적 주제에 관한 말이나 대화를 듣고 화자의 의도를 파악하기’ 및 ‘친숙한 일반적 주제에 관해 표, 도식을 활용하여 설명하기’ 부분에 따로 시간을 배정하지 않았다. 대신 이를 본문의 전체적인 내용 파악하기 단계에 포함시켜 본래의 시간을 유지하되, 본문의 Reading Comprehension 과정을 모둠 학습을 통해 내용을 정리하고 파악하도록 구성하여 학생들이 스스로 본문의 내용을 정리하는데 시간을 할애할 수 있도록 하였다. 이는 본문의 text 읽기 이해 능력이 여전히 중요한 사항이므로 차시를 줄이지 않았다.
	한태천 경운대 도서관장이 영천 신녕면 치산계곡에서 청개구리와 거북 형상의 바위가 발견되면서 이 두 바위를 소재로 한 스토리텔링 작업이 진행돼 관심을 끌고 있으며, 시 관계자는 “현장을 방문해 종합적인 실사와 전문가들의 의견을 거쳐 사업타당성 검토를 할 계획”이라고 말했다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 한태천 경운대 도서관장이 청개구리 무덤 바위에 대해 설명하고 있다. 작은사진은 치산계곡 청개구리 무덤바위 계곡 건너편에 마주하고 있는 거북바위. 영천 신녕면 치산계곡에서 청개구리와 거북 형상의 바위가 발견되고, 이를 소재로 한 스토리텔링 작업이 진행돼 관심을 끌고 있다. 영천시는 관광자원화 여부를 놓고 검토에 들어갔다. 한태천 경운대 도서관장(전 경찰행정학과 교수)은 지난해 등산 중 영천 수덕사 입구 계곡에서 우연히 이 두 바위를 발견했다. 계곡을 사이에 두고 동쪽에는 거북바위가, 서쪽에는 청개구리바위(청개구리 엄마무덤 바위)가 자리잡고 있다. 한 교수는 “청개구리 무덤 바위는 남방식 고인돌 형태로 상판은 청개구리 모습을 하고 있다”고 했다. 또 “계곡 건너편 동쪽에 있는 거북바위 2개는 청개구리 바위를 지켜주는 수호신”이라고 설명했다. 영천 화산이 고향인 한 교수는 이 두 바위에 재미있는 스토리를 입혀 자연물을 활용한 관광자원화를 제안했다. 그는 “스토리를 바탕으로 전시관, 체험관, 영상관 등이 포함된 종합 체험관을 건립해 새로운 관광자원으로 활용하면 좋을 것”이라고 했다. 아울러 청개구리를 활용한 캐릭터 개발, 상품등록으로 지역 농특산물의 판매홍보에 이용할 수 있을 것이라고 덧붙였다. 실제 한 교수는 이 두 바위를 바탕으로 ‘청개구리 엄마의 무덤’이란 스토리를 만들어냈다. 가뭄이 심해 목마름으로 고통받다 죽은 엄마 청개구리를 위한 효심이 주제다. ‘옛날 하고도 또 옛날, 이곳 수도사 앞 계곡 근처에 일기예보를 잘하는 효자 청개구리가 살고 있었다. 어느 해 가뭄이 심해지면서 나무와 풀이 말라죽고 청개구리 가족도 목마름에 허덕였다. 엄마 청개구리는 죽은 후 물이라도 마음껏 먹을 수 있도록 계곡 옆에 묻어 달라고 아들 청개구리에게 말했다. 아들 청개구리는 엄마 묘가 떠내려 가는 것을 막기 위해 상판에 큰 돌(청개구리 형상)을 올려놓고 계곡 동쪽에는 엄마 묘를 지켜 줄 수호신으로 거북 형상의 바위를 만들어 놓았다. 엄마가 목마르지 않게 계곡물을 적당하게 흐르게 해달라고 태양을 향해 절하는 형상의 거북바위다.’(전체 내용은 http://blog.daum.net/smtime/23941 참조) 이 같은 내용이 알려지면서 영천시에서도 관심을 표명하고 있어 실제 관광자원화할 수 있을지 주목된다. 시 관계자는 “현장을 방문해 관광자원화 활용 여부 등 종합적인 실사와 전문가들의 의견을 거쳐 사업타당성 검토를 할 계획”이라고 말했다. 글·사진=영천 유시용기자 ysy@yeongnam.com
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 원문을 바탕으로 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 생성하세요.	따라서 시스템 기반의 관계마케팅이 효과적인 조직성과(시스템 효율성 및 판매성과)로 연결되기 위해서는 고객접점에서의 인적요인에 대한 신중한 고려가 필요하다.	다음 텍스트에서 제공된 문맥을 정확히 이해하고, 마지막 문장을 자연스럽고 문맥에 맞게 완성하세요. 문장은 이전 내용과 논리적으로 연결되어야 합니다. #텍스트: 1990년대 이후 마케팅 패러다임의 변화에 따라 많은 회사들은 관계마케팅에 전사적 노력을 기울이고 있으며, 델(Dell), 아마존닷컴(Amazon.com), 페덱스(FedEx) 등이 그 좋은 예이다. 초기 관계마케팅의 성과는 미약하였으나 여전히 연구자들과 마케터들은 관계마케팅이 회사의 효율성과 수익에 영향을 준다고 믿고 있다. 실제 Reichheld와 Sasser(1990)는 관계마케팅의 효율적 운영을 통해 고객이탈율 5%를 감소시킨다면 회사의 수익성을 25%에서 85%까지 향상시킬 수 있다고 주장한다. 이는 관계마케팅 솔루션(예, CRM 시스템)이 기존의 대중 마케팅 활동을 일대일 고객관계 마케팅으로 전환시킴과 동시에 방대한 고객정보를 바탕으로 한 효과적인 고객관리(예, 고객세분화나 마케팅캠페인의 전개)의 실현에 유용하다는 것을 말한다. 그럼에도 불구하고 마케터들은 관계마케팅을 위한 시스템 접근법에 한계를 느끼고 있다. 이는 고객 데이터베이스 기반의 CRM이 아무리 잘 갖추어져 있더라도 시스템 운영의 인적요소가 제대로 작동하지 않으면 결국 마케팅 실패로 이어지기 때문이다. 예를 들어 서비스 마케팅에서 고객과의 접점을 이루고 있는 판매원은 고객으로 하여금 회사와의 마케팅 관계를 형성하고 유지하는 데에 중요한 단서가 된다.
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 원문을 바탕으로 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 생성하세요.	따라서, 에너지 절감을 위한 대기소모 전력의 규제에 따른 제로 와트(ZERO WATT)를 만족하기는 어려운 문제점이 있다.	다음 텍스트에서 제공된 문맥을 정확히 이해하고, 마지막 문장을 자연스럽고 문맥에 맞게 완성하세요. 문장은 이전 내용과 논리적으로 연결되어야 합니다. #텍스트: TV와 같은 디스플레이장치를 포함하는 전자기기에는 동작에 필요한 전원을 공급하기 위한 전원공급부가 마련된다. 전자기기는 복수의 전원모드를 가지며, 동작을 수행하지 않는 상태로 소정 시간이 경과하면, 전력 소모를 줄이기 위해 일부 구성에 전원 공급을 중지하는 대기모드(이하, 스탠바이(Stand-By) 모드 라고도 한다)로 진입할 수 있다. 전자기기가 대기모드에 진입한 경우에도, 시스템부에는 최소한의 동작을 수행하기 위한 대기전원이 공급될 필요가 있다. 이를 위해, 전자기기에는 대기전원을 생성하는 대기전원장치(이하, 스탠바이 전원장치 라고도 함)로서, 스탠바이 AC/DC 컨버터 회로(Stand-By AC/DC Converter Circuit)가 구비될 수 있다.도 1은 종래의 대기전원 공급장치의 구성을 도시한 도면이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 대기전원 공급장치는 스탠바이 AC/DC 컨버터 회로(10)로 구현될 수 있다. 도 1을 참조하면, 스탠바이 AC/DC 컨버터 회로(10)는 다음과 같이 동작한다. 교류(AC) 전원이 인가되면 브릿지 정류회로(11)를 거쳐, PWM IC(12)가 PWM 신호를 생성한다. PWM IC(12)의 고전압 스타트 업(HV Start-Up)에 의해 스위칭 소자 Q1의 스위칭 동작이 개시되고, VCC 전압이 인가되어 PWM IC(12)가 정상적으로 동작을 수행하여, 스탠바이 전원(DC)이 출력된다. 구체적으로, PWM IC(12)에서 생성된 펄스 전압은 Q1에 의해 스위칭되어, 트랜스포머(14)의 변압비에 따라 2차측으로 전달되고, 정류기(Rectifier) D1과 전해 캐패시터(Capacitor)를 거쳐, 전자기기의 동작을 수행하는 시스템부(도시안됨)에 직류(DC) 전압으로 출력된다. 출력된 DC 전압은 PWM IC(12)의 피드백 단자(F/D)로 피드백되며, PWM IC(12)의 피드백 제어에 의해 출력 전압의 레귤레이션(Regulation)이 이루어진다.그런데, 도 1의 종래기술에 따르면, 종래의 스탠바이 AC/DC 컨버터(10)는 전자기기의 대기상태에서도 항상 동작하므로, 이에 의한 전력의 손실이 발생한다. 또한, 부하와 관계없이 AC/DC 컨버터(10)의 1-2 차간 회로 자체의 전력변환 손실이 존재하게 된다. 즉, 스탠바이 AC/DC 변환(Conversion) 동작에 따라 대기모드에서 지속적으로 손실이 발생하게 되어, 대기전력이 증가되는 원인이 된다. 이에, 대기전력을 감소시키기 위해, 대기모드 시 출력 피드백 전압에 의해 PWM IC 출력을 제어하여, 스위칭 소자 Q1의 동작 회수, 주기 등을 변화시키는 방법을 사용하기도 하지만, 스탠바이 AC/DC 컨버터(10) 자체에서 소모되는 전압을 감소시키기에는 한계가 있다.
	제목: 유승준, SNS 통해 밝힌 심경..."절대 포기하지 않겠다" 지난 2002년 군 입대 직전 미국 시민권 취득으로 인해 병역기피 논란이 있었던 유승준이 SNS를 통해 한국 활동을 절대 포기하지 않겠다는 뜻을 드러내는 한편, 대법원이 지난 7월 "유승준의 비자 발급은 적법하지 않다"고 판단하여 파기 환송 했다.	주어진 문장에 적절한 제목을 생성하고, 내용을 요약해주세요. 문장: 사진=SBS '본격연예 한밤' 유승준이 한국 활동을 위해 '절대 포기하지 않겠다'는 뜻을 내비쳤다. 유승준은 지난 16일 자신의 인스타그램에 "절대 나아갈 수 없을 것 같을 것 같을 때 성장한다. 계속 가야만 한다(Strength grows in the moments When you think you can’t go on But you keep going anyway)"는 글을 올렸다. 이와 함께 유승준은 "책임지기 위해 절대 포기하지 않겠다(nevergiveup, be, responsible)"는 해시태그를 덧붙였다. 유승준은 지난 2002년 군 입대를 앞두고 미국 시민권을 취득해 병역기피 논란이 일었다. 이후 입국 금지 처분을 받으면서 한국 활동을 하지 못하게 됐다. 유승준은 2015년 8월 재외동포 체류자격의 사증 발급을 신청했으나 LA 총여사관이 이를 거부했다. 이에 유승준은 행정법원에 소를 제기했지만 1심과 2심에서 모두 패소했다. 그러다가 대법원이 지난 7월 "유승준의 비자 발급은 위법하다"고 판단, 파기 환송 했다. 한편 유승준은 SBS '본격연예 한밤'과의 인터뷰에서 "저는 처음에 군대를 가겠다고 제 입으로 솔직히 이야기한 적이 한 번도 없다"면서 "방송 일이 끝나고 집 앞에서 아는 기자분이 오셨고, 꾸벅 인사를 했는데 '너 이제 나이도 찼는데 군대 가야지'라고 해서 '네, 가게 되면 가야죠'라고 아무 생각 없이 말했다"고 당시 상황에 대해 전했다. 그러면서 "저보고 '해병대 가면 넌 몸도 체격도 좋으니까 좋겠다'라고 해서 전 '아무거나 괜찮습니다'라고 대답했고, 그런 뒤에 헤어졌는데 바로 다음날 스포츠 신문 1면에 '유승준 자원입대 하겠다'라는 기사가 나온 것"이라고 밝혔다. 김은지 부산닷컴 기자 sksdmsw807@ ▶ 네이버에서 부산일보 구독하기 클릭! ▶ 부산일보 구독하고 스타벅스 Get 하자! ▶ 부산일보 홈 바로가기
	1939년부터 1945년까지 영국에서 활동한 벨기에 자유군은 제2차 세계 대전 중 벨기에의 군사 활동을 담당했습니다. 이 군대는 벨기에 북프랑스 군정청에서 도주한 벨기에 병사들과 전쟁 이전에 영국으로 이주한 이민자들로 구성되었습니다. 이들은 보병 편제, 공수부대, 코만도 등 다양한 부대에 배속되었습니다. 벨기에 정부는 프랑스의 보르도로 도망간 후 영국 런던으로 가서 벨기에 망명 정부를 설립했습니다. 벨기에 군단은 1940년 7월에 창립되었으며, 벨기에 자원자들은 전쟁 기간 동안 자유 벨기에군에 참여했습니다. 그러나 벨기에 군단은 공식적으로 위법적인 행동이었기 때문에 벨기에 헌법에 따라 벨기에 군 복무를 금지하였습니다. 이에도 불구하고 벨기에 자원자들은 벨기에군 편성 이전까지 영국군에서 복무했습니다.	영국에서 활동한 벨기에 자유군은 어떤 역할을 했나요?
	주택임대차시장의 구조변화는 자가와 임차가구 간, 임차가구 및 자가 상호 간 등 주택수요자들 간 주거비 부담구조의 변화를 가져올 수 있고 이는 주거안정의 변화를 가져올 수 있다. 특히 주택임대차시장의 구조변화는 주택수요자들의 주거비 부담구조를 변화시킬 수 있기 때문에 그에 따른 주거이동은 임차인들의 비자발적인 선택으로 이어질 수 있다. 한국감정원의 전국주택가격동향조사 결과에 따르면 주택전월세전환율[{연세 /전세금( 보증금 )}×100]이 2015년 6월 기준 7.5% (지방의경우 8.6%)로 가계대출 평균금리 3.22%보다 훨씬 높은 상황이다. 예를 들어 국토교통부의 주거실태조사 결과에 따르면 2014년 전국 평균 전세보증금은 1억 976만원으로 이를 연 3.22%로 계산할 때 월 주거비용은 29만원, 동일 보증금을 주택전월세전환율 7.5%를 가지고 순수 월세로 전환할 때 부담해야 하는 월주거비용을 계산하면 69만원이다. 단순히 가계대출 평균금리와 전월세전환율로만 주거비용을 계산해보면 2배 이상 늘어나는 상황이다.	주어진 제목과 요약문에 대한 정보를 토대로, 요약되기 전 문장을 유추해서 생성해주세요. 제목: 주거안정 사업 평가 요약문: 주택임대차시장의 구조변화로 주거비용이 늘어나면, 주택 수요와 관련된 이해당사자로 하여금 주거비에 대한 압박 및 이들의 의지와 무관한 주거이동이 증가할 것이다.
	북한이 미국인 3 명을 9 일 석방한 것은 환영하나 청와대는 10 일 우리 국민 6 명의 송환을 위해 최선을 다하고 있으며 남북 평화 체제 구축에 진정성을 보이기 위해서도 김정은 위원장은 하루빨리 이들을 석방해야 한다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 북한이 억류 중이던 미국인 3 명을 9 일 석방한 것은 환영할 일이다. 김정은 국무위원장은 마이크 폼페이오 미국 국무부 장관의 2 차 방북에 맞춰 이들을 특별사면했고 도널드 트럼프 대통령은 10 일 앤드루스 공군기지로 이들을 직접 마중 나갔다. 미·북정상회담을 앞두고 반가운 신호지만 북한에 억류 중인 우리 국민 6 명은 풀려나지 못했으니 안타까울 뿐이다. 김정은 위원장은 폼페이오 국무장관을 만난 뒤 미·북정상회담에 대해 "한반도의 훌륭한 미래를 건설하기 위한 역사적인 만남이 될 것"이라고 말했다고 한다. 또 트럼프 대통령은 석방된 3 명을 맞이하면서 "김정은에게 감사하다"고 화답했다. 그동안에도 북한은 억류 중이던 미국인을 몇 차례 석방한 사례가 있으나 국무위원장 특사 형식으로 풀어준 것은 이번이 처음이다. 그러면서 북한은 미·북정상회담이 열릴 것이란 사실도 주민들에게 처음 공개했는데 이 모든 움직임들은 미국과의 관계 개선 의지를 보여준 것이라 할 수 있다. 미·북정상회담 준비가 착착 진행되면서 북한의 완전한 비핵화, 정전협정 체결, 평화 체제 전환 등에 대한 기대도 그만큼 높아지고 있다. 미국은 '완전하고 검증 가능하며 불가역적인 북핵 폐기(CVID)'를 정상회담의 전제조건으로 강력하게 요구해왔다. 그러니 미·북 대화 진전은 북한 비핵화 협상의 진전이라고 유추해볼 수 있다. 그동안 미국과 북한 사이에서 비핵화와 평화협정을 위해 중재하느라 힘써온 우리 정부도 이런 핵심 과제에서 성과가 나오도록 끝까지 최선을 다해야 할 것이다. 이런 분위기 속에서 북한에 억류된 사람들 중 미국 국적이면 풀려나고 한국 국적이면 풀려나지 못하는 상황은 참으로 납득하기 힘든 일이다. 남북정상회담을 지켜보며 북한의 변화에 기대를 가졌던 많은 한국인들이 실망하고 불신을 표시할 수밖에 없다. 이들 대부분은 북·중 접경지역에서 선교활동을 하다 억류됐다고 하는데 국적 때문에 차별대우를 받아선 안될 일이다. 청와대는 10 일 "우리 국민 6 명의 송환을 위해 드러나지는 않지만 최선을 다하고 있다"고 했다. 남북 평화 체제 구축에 진정성을 보이기 위해서도 김정은 위원장은 하루빨리 이들을 석방해야 한다.
	제목: 태안해경, 어선 선저폐수 적법처리 캠페인 동참 호소 태안해양경찰서는 내달 21일까지 한달간 '선저폐수 적법처리 캠페인'을 실시하여 선저폐수를 바다에 몰래 버리는 단속뿐만 아니라 지역 수협과 어촌계와 함께 게시판 포스터 및 지역 현수막을 게시하고 어민들에게 홍보물을 직접 배부하는 등 선저폐수 적법처리를 위한 캠페인을 펼쳐 적극동참해 달라고 당부했다.	주어진 문장에 적절한 제목을 생성하고, 내용을 요약해주세요. 문장: 태안해양경찰서(서장 김환경)는 본격적인 행락철과 맞물려 조업활동이 활발해지는 시기를 맞아 어선 가동에 따른 선저폐수 무단 배출에 의한 해양오염 및 민원이 발생되지 않도록 내달 21일까지 한 달간 '선저폐수 적법처리 캠페인'을 실시한다고 밝혔다. 최근 3년간 해양오염 신고 접수 통계 자료에 따르면 6월 해양오염신고 건수는 441건으로 상위 1월 178건, 12월 205건과 비교해 약 2배를 상회할 정도로 오염신고가 많은 시기이다. 이 시기에 신고된 오염사고는 주로 좁은 범위에 걸친 엷은 유막으로 어선 선저폐수를 바다에 몰래 버리는 것으로 추정되며, 바닷가로 몰리는 행락객들이 이를 보고 신고하는 경우가 대부분이다. 해경은 이러한 어선들의 선저폐수 적법 처리를 활성화하기 위해 단속뿐만 아니라 지역 수협과 어촌계와 함께 게시판 포스터 및 지역 현수막을 게시하고 어민들에게 홍보물을 직접 배부하는 등 선저폐수 적법처리를 위한 캠페인을 펼친다는 계획이다. 또한 해양환경공단과도 합동 캠페인 펼쳐 어선 내 선저폐수 무상 수거 방안을 적극 알리고 수협중앙회 산하 어업정보통신국에서는 조업 중인 어선들에게 안내방송도 실시하게 된다. 황선화 해양오염방제과장은 "바다는 어민들뿐 아니라 우리 모두의 마지막 남은 삶의 터전인 만큼 생명과 직결된 해양환경의 중요성을 인식하고 개개인의 작은 실천의 노력과 결집이 중요하다"며 "이번 켐페인에 적극적으로 동참해 달라"고 당부했다.
	원내 국어문화학교는 2013~2014년 2년간 51회 교육에 6,212명이 수강하였고, 기획 과정은 2년간 263회 교육에 17,258명이 수강하였으며, ‘찾아가는 국어문화학교’는 2년간 1,133회 교육에 59,516명이 수강하였다. 국어문화학교 강의 후 실시된 설문 조사에서 평균 만족도가 90%로 나옴으로써 국어문화학교가 국어 전문 교육 기관으로서의 기능을 충실히 수행하였다고 평가할 수 있다. 원내 국어문화학교에서 교사, 공무원, 북한이탈주민 지원 교사, 대학 교양 국어 담당 강사 등의 교육과정 프로그램을 운영한 것은 수요자 중심의 맞춤형 교육을 도모한 것으로서 교육의 효과를 크게 증대시킨 것으로 판단된다. 기관 특성에 맞추어 교육하는 ‘기획과정’은 2010년에는 15회 489명이 수강했으나 2014년에는 163회 9,952명이 수강하여 기획 과정이 시작한 이래 5년 동안 20배 가까이 급증하였다. 국립국어원을 직접 방문하여 수업을 듣기 어려운 직장인, 지역민을 위해 강사를 파견하여 교육하는 ‘찾아가는 국어문화학교’는 2013년에 504회 25,264명이 수강하였고, 2014년에 629회 34,252명이 수강하여 35.5% 증가하였다. 또한 ‘찾아가는 국어문화학교’에서 기초 국어 능력이 부족한 지역 아동센터의 초중등학생을 대상으로 하는 프로그램을 개발하여 운영한 것은 언어 소외 계층의 국어 능력 향상과 우리 국어 환경 개 선에도 크게 이바지했다고 할 수 있다.	주어진 제목과 요약문에 대한 정보를 토대로, 요약되기 전 문장을 유추해서 생성해주세요. 제목: 13년~14년 국어 발전과 보전에 관한 시책 및 시행 결과 보고서 요약문: 국어문화학교 설문 조사 결과 평균 만족도가 90% 나온 것은 국어 전문 교육 기관으로서의 충실한 기능 수행이라 평가한다. 수요자 중심의 맞춤형 교육으로 교육의 효과를 증대시켰으며, 기관 특성에 맞춰 교육하는 기획과정은 5년 동안 20배가 급증했고, 찾아가는 국어문화학교는 약35% 증가했다. 언어 소외 계층의 국어 능력 향상과 국어 환경 개선에도 크게 이바지했다고 할 수 있다.
	멸치속은 멸치과에 속하는데, 그중에는 아르헨티나 멸치, 호주 멸치, 유럽 멸치, 은빛 멸치, 일본 멸치, 대한민국에서 볼 수 있는 캘리포니아 멸치, 페루 멸치, 그리고 멸치와 같은 물고기들이 있어요. 이러한 물고기들은 어분, 사료, 비료로도 많이 사용되며, 조르주 퀴비에가 만든 분류군에 속합니다.	멸치는 어떤 물고기들이 있을까?
	28일 통계청이 발표한 ‘2018년 출생 통계’ 확정치에 따르면 32만6천800명으로 합계 출산율이 사상 최저인 0.98명으로 떨어졌으며 광주도 0.97명으로 나타났다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 지난해 우리나라에서 태어난 아기가 32만명대로 줄어들면서 합계출산율이 사상 최저인 0.98명으로 떨어졌다. 광주도 사상 처음으로 합계출산율이 0명대로 내려앉았고, 특히 6년째 출산율 전국 1위를 기록한 해남군 마저도 2명대가 붕괴됐다. 28일 통계청이 발표한 ‘2018년 출생 통계’ 확정치에 따르면 지난해 전국 출생아는 전년(35만7천800명)보다 8.7% 줄어든 32만6천800명으로 1970년 통계 작성 이래 가장 적었다. 세종(5.7%)을 제외한 모든 시·도에서 출생아 수가 전년 보다 감소했다. 감소 폭은 대전(-14.0%)이 가장 컸고 울산(-13.1%), 전북(-11.9%), 서울(-11.2%)이 뒤를 이었다. 광주는 9천100명이 출생해 2017년 (1만100명)보다 10.0%, 전남은 1만2천400명으로 전년(1만2천400명)보다 9.0% 줄었다. 이에 따라 여성 1명이 가임 기간(15~49세) 낳을 것으로 예상되는 평균 출생아 수를 뜻하는 전국 합계출산율은 0.98명으로 떨어졌다. 전년 1.05명보다 7.1%(0.08명) 줄어 사상 최저를 기록했다. 합계출산율이 1.0명 이하로 떨어진 것은 통계 집계 이후 처음이다. 전국 시·도 가운데 ‘합계출산율’이 가장 높은 지역은 세종으로 1.57명이다. 전남(1.24명), 제주(1.22명), 충남(1.19명), 경북(1.17명), 충북(1.17명), 울산(1.13명), 경남(1.12명) 등에서 1명을 웃돌았다. 반면 서울(0.76명), 부산(0.90명), 대전(0.95명), 광주(0.97명), 대구(0.99명) 등에선 0명대를 나타냈다. 일선 시·군·구에서는 해남군이 2017년 합계출산율 2.10명으로 유일하게 2명을 넘겼지만 지난해는1.89명으로 하락했다. 전남에서는 영광군(1.82명)과 완도군(1.62명)이 높은 합계출산율을 기록했다. 우리나라 합계출산율은 현재 인구 유지를 위해 필요한 대체출산율(2.1명)의 절반에도 미치지 못했다. 경제협력개발기구(OECD) 36개 회원국의 2017년 평균인 1.65명을 크게 밑돌았다. 여성의 연령별 출산율(해당 연령 여성인구 1천명당 출생아 수)은 40대를 제외한 모든 연령층에서 감소했다. 30대 초반이 91.4명으로 가장 높았고, 20대 후반 출산율은 41.0명에 불과했다. 평균 출산 연령은 32.8세로 전년보다 0.2세 상승했다. 평균 출산 연령은 첫째 아이는 31.9세, 둘째 아이는 33.6세, 셋째 아이는 35.1세로 전년보다 0.2~0.3세 늘었다. 3명 이상의 아이를 낳는 비율은 구례군(22.9%)에서 가장 높았다. 이 비중이 가장 낮은 지역은 서울 성동구(4.1%)였다. 이삼섭기자 seobi@srb.co.kr 이삼섭
	구 채무자 회생 및 파산에 관한 법률 제179조 제9호에서 정한 ‘납부기한’은 법정납부기한을 의미하며, 부도가 난 甲 주식회사의 회생절차개시결정 전 甲 회사의 공급자들이 대손세액공제를 받자 과세관청이 甲 회사 파산관재인에게 대손세액 상당의 부가가치세 경정부과처분을 한 후에, 위 경정부과처분이 당연무효인 것을 전제로 한 화해권고결정이 확정되자 다시 甲 회사에 대손세액공제에 따른 부가가치세 채권 중 부과제척기간이 도과하지 않은 부분에 대해 부가가치세 부과처분을 한 사안에서, 회생절차개시결정일 전에 납부기한이 도래한 부가가치세 채권은 회생채권에 해당하고, 회생채권이 실권·면책된 이상 위 부과처분은 위법하다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: [1] [다수의견] 회생채권과 공익채권은 회생절차에서 인정되는 지위가 달라 어떠한 조세채권이 회생채권과 공익채권 중 어디에 해당하는지는 채권자·주주·지분권자 등 다른 이해관계인에게 미치는 영향이 지대하므로, 다수 이해관계인의 법률관계를 조절하는 회생절차의 특성상 회생채권과 공익채권은 객관적이고 명확한 기준에 의하여 구분되어야만 한다. 그럼에도 만일 구 채무자 회생 및 파산에 관한 법률(2009. 10. 21. 법률 제9804호로 개정되기 전의 것, 이하 '채무자회생법'이라 한다) 제179조 제9호의 '납부기한'을 법정납부기한이 아닌 지정납부기한으로 보게 되면, 과세관청이 회생절차개시 전에 도래하는 날을 납부기한으로 정하여 납세고지를 한 경우에는 회생채권이 되고, 납세고지를 할 수 있었음에도 이를 하지 않거나 회생절차개시 후에 도래하는 날을 납부기한으로 정하여 납세고지를 한 경우에는 공익채권이 될 터인데, 이처럼 회생절차에서 과세관청의 의사에 따라 공익채권 해당 여부가 좌우되는 결과를 가져오는 해석은 집단적 이해관계의 합리적 조절이라는 회생절차의 취지에 부합하지 않고, 조세채권이 갖는 공공성을 이유로 정당화되기도 어렵다. 따라서 채무자회생법 제179조 제9호가 규정하는 납부기한은 원칙적으로 과세관청의 의사에 따라 결정되는 지정납부기한이 아니라 개별 세법이 객관적이고 명확하게 규정하고 있는 법정납부기한을 의미하는 것으로 보아야 한다. [대법관 박일환, 대법관 안대희, 대법관 민일영, 대법관 박병대, 대법관 김용덕의 반대의견] 신고납세방식의 조세에 관하여 법정납부기한 내에 신고가 있는 경우와 자동확정방식의 조세의 경우에는, 회생절차개시 당시 이미 구체적인 조세채무가 확정되어 있고 법정납부기한도 도래한 이상 별도의 납세고지 없이 강제징수가 가능한 상태에 있으므로 이때 채무자회생법 제179조 제9호가 규정하는 납부기한은 법정납부기한을 뜻하는 것으로 보아야 하지만, 신고납세방식의 조세에 관하여 납세의무자가 법정납부기한 내에 과세표준과 세액을 신고하지 아니하거나 신고내용에 오류 또는 탈루가 있어 과세관청이 결정 또는 경정하여야 하는 경우에는, 회생절차개시 당시 법정납부기한의 도래만으로는 구체적인 조세채무가 확정되어 있다고 할 수 없고 강제징수를 하기 위해 별도로 납부기한을 정한 납세고지가 필요하므로 이때의 납부기한은 지정납부기한을 뜻하는 것으로 보아야 한다. 다만 과세관청의 자의적인 시기 조정 등으로 인하여 공익채권으로 되는 조세채권의 범위가 부당하게 확장되는 것은 불합리하므로, 위와 같은 특별한 사정이 있는 경우에는 신의칙 등을 적용하여 과세관청이 당초 지정할 수 있었던 납부기한을 기준으로 공익채권에 해당하는지를 판단하여야 한다. [2] 부도가 난 甲 주식회사의 회생절차개시결정 전에 甲 회사로부터 매출채권을 회수할 수 없게 된 공급자들이 매출세액 상당의 대손세액공제를 받았고, 이에 과세관청이 甲 회사의 파산관재인에게 대손세액 상당의 부가가치세를 부과하는 처분을 하였는데, 이후 위 경정부과처분이 당연무효임을 전제로 하는 화해권고결정이 확정되자 과세관청이 다시 甲 회사에 공급자의 대손세액공제에 따른 부가가치세 채권 중 부과제척기간이 도과하지 않은 2003년 제2기분, 2004년 제2기분 및 2005년 제1기분의 부가가치세 부과처분을 한 사안에서, 구 채무자 회생 및 파산에 관한 법률(2009. 10. 21. 법률 제9804호로 개정되기 전의 것) 제179조 제9호가 정하는 납부기한이 법정납부기한을 의미한다고 전제한 다음, 2003년 제2기분, 2004년 제2기분 및 2005년 제1기분 각 부가가치세의 법정납부기한은 과세기간 종료 후 25일째가 되는 2004. 1. 25.과 2005. 1. 25. 및 2005. 7. 25.로서 甲 회사에 대한 회생절차개시결정일인 2007. 1. 9. 이전에 이미 납부기한이 모두 도래하여 경과하였으므로 위 각 부가가치세 채권은 회생채권에 해당하고, 과세관청이 회생절차에서 회생채권으로 신고하지 않아 실권·면책된 이상 甲 회사에 부과권을 행사할 수 없는 상태에서 이루어진 부과처분은 위법하다고 본 원심판단을 수긍한 사례.
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 제공하세요.	유전이나	이 문제에서는 주어진 텍스트 내의 <MASK>로 표시된 부분에 들어갈 적절한 단어를 예측해야 합니다. <MASK>가 위치한 문장의 전체 문맥을 분석하여, 문장의 나머지 내용과 일관되게 <MASK>에 들어갈 가장 적합한 단어를 답하세요. #텍스트: 하부 요로 염증은 비교적 흔한 질환이며 주된 이유는 요로 감염의 결과로 인하여 발생한다. 요로 감염은 사람에게 있어서 두 번째로 흔한 감염이며 이로 인해 해마다 830만 명이 병원을 방문하게 된다. 이 중 5%만이 통증, 절박뇨, 빈뇨 등의 염증 증상을 호소한다. 방광 통증증후군/간질성 방광염(painful bladder syndrome/interstitial cystitis PBS/IC)은 통증, 절박뇨 그리고 빈뇨를 일으키는 체계화가 덜 된 증후군이다. 이 증후군의 최근 고찰에 따르면 19세 이상의 여성에서 1-10%의 유병률을 보이며, 미국의 경우에 있어서도 일백만 명 이상이 이 질환에 이환되어 있는 것으로 추정된다. PBS/IC의 진단은 보통 감염을 포함한 다른 원인을 배제하는 것으로 할 수 있고 상당 수의 환자에서 조직검사를 통해 방광 염증을 확진 할 수 있다. 통증은 특징적으로 하부요로의 염증이 수반되었을 때 나타난다. 전립선비대증이 있는 환자에서 얻은 전립선 조직검사에서도 흔하게 염증이 규명될 수 있다. 비록 염증이 전립선비대증의 유무와 항상 관련되어 있는 것은 아니지만 일정 수의 환자에서 하부요로와 관련된 통증을 호소한다. 다양한 종양과 기생충 질환들이 하부요로의 염증을 일으키기는 하지만 흔하게 일어나지는 않는다. 분명히 사람을 통해서 기술적인 검사를 시행한다는 것은 비윤리적이고 불가능한 일이나 만약에 시행된다면 <MASK> 환경적인 요소들이 영향을 준다는 점을 기억해야 한다.
	고베 방송국은 효고현을 방송구역으로 하는 NHK의 지역방송국으로서, 1925년에 오사카 방송국 고베 출장소를 개설했습니다. 이후 여러 차례 변경과 확장을 거치면서 현재는 고베 방송국으로 불리며, FM 라디오와 텔레비전 방송을 담당하고 있습니다. 1970년에 첫 번째로 현역 FM 방송을 시작하였고, 1971년에는 종합 텔레비전 방송을 시작하였습니다. 1995년에는 한심·아와지 대지진으로 인해 방송 회관이 파괴되었지만, 이후 이전하여 새로운 건물을 세우게 됩니다. 또한 2004년에는 지상 디지털 텔레비전 방송을 시작하였고, 2011년에는 지상파 아날로그 텔레비전 방송을 종료하였습니다.	고베 방송국은 어디에 위치해 있나요?
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 원문을 바탕으로 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 생성하세요.	정조가 인자한 군주였기에 가능한 일이었지만, 그렇다고 해서 그 이유만으로 충분히 납득할 수 있는 사안은 아닌 듯하다.	다음 텍스트에서 제공된 문맥을 정확히 이해하고, 마지막 문장을 자연스럽고 문맥에 맞게 완성하세요. 문장은 이전 내용과 논리적으로 연결되어야 합니다. #텍스트: 정조 23년(1799)에 편찬된 『審理錄』은 정조 1년(1777) 정월에 발생한 ‘李㖯伊獄’ 일명 ‘私刻曆書發賣事件’을 수록하고 있다. 그 요지는 한양 북부에 사는 자격장 이똥이가 각수 전치학을 시켜서 관인을 위조하고 책력을 사사로이 간행하는 중죄를 범했는데, 정조가 그의 죄를 경감하여 정배토록 했다는 내용이다. 그런데 私刻曆書發賣事件은 당시의 책력 발행제도와 주범인 이똥이의 장인으로서 활동사항, 그리고 그에 대한 치죄과정을 보다 자세히 들여다보면 단순한 범죄로만 이해하기에는 미심쩍은 부분이 없지 않다. 조선시대에 하늘의 변화와 때를 알리는 曆象과 授時는 왕권의 권위를 상징하는 중대한 일이었다. 관상감은 그 일을 관장하는 기구로서 책력을 독점적으로 발행했고, 책력의 판매수익으로 이듬해 책력의 발행비용과 관상감 인원의 인건비를 충당하였다. 그리고 이를 보장하기 위해서 책력을 사사로이 간행한 자, 또는 관인이 찍히지 않은 책력을 소지한 자는 僞造印信律에 따라 처벌하도록 강력한 규정을 마련해놓고 있었다. 관상감의 소수 장인이 참형에 해당하는 중죄를 범한 사실이 명백함에도 불구하고 정조는 사건 발생 후 당시 사각역서의 발매행위가 관례적인 일이었고, 인신의 위조는 각수 전치학이 감당했을 것이라는 정황근거를 들어서 주범인 이똥이를 살려준다.
	제주영어교육도시는 제주특별자치도 서귀포시 대정읍 구억리 일대에 위치한 정주형 영어교육도시로, 제주국제자유도시개발센터(JDC)가 추진하는 핵심 프로젝트 중 하나입니다. 이 지역은 18세기 이후 상동 동쪽과 서쪽에 사람들이 거주하기 시작하면서 형성된 마을이며, 1914년 일제 강점기 때 행정구역을 통폐합하면서 '구석밧' 일대를 분리하여 구억리라 불렸습니다. 현재 이 지역에는 영어전용 초중고 국제학교 7개교, 외국교육기관, 영어교육센터, 주거상업시설 및 교육문화시설이 있으며, 주택 180세대와 편의시설 5개 등이 있습니다. 영어교육도시 지원사무소는 주민들에게 행정, 소방, 경찰 등의 서비스를 제공하고 있습니다. 2011년 9월에는 영국 명문 사립학교 North London Collegiate School Jeju(노스 런던 컬리지잇 스쿨 제주), 2012년 10월에는 캐나다 명문 여학교인 Branksome Hall Asia(브랭섬홀 아시아)가 제주영어교육도시 내에 설립되어 운영되고 있습니다. 또한, 2012년 11월에는 미국 제30대 대통령인 Calvin Klein Coolidge가 졸업한 명문 사립학교 St. Johnsbury Academy와 영어교육도시 내 국제학교 설립과 운영에 관한 본계약을 체결하여 St. Johnsbury Academy Jeju(세인트 존스베리 아카데미 제주)가 개교될 예정입니다. 2014년 12월에는 영어교육 연구 및 개발, 영어상용화를 지원하기 위한 영어교육센터가 개관할 예정입니다.	제주영어교육도시는 어디에 위치해 있나요?
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 원문을 바탕으로 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 생성하세요.	또한 암환자와 그들의 보호자들 사이의 정신적 고통을 비교한 연구에서 보호자들도 환자만큼의 고통을 겪으며, 질병으로 인한 부담이 환자들보다 오히려 그들의 배우자에게 더 높은 정신적인 스트레스를 일으킨다는 보고도 있다.	다음 텍스트에서 제공된 문맥을 정확히 이해하고, 마지막 문장을 자연스럽고 문맥에 맞게 완성하세요. 문장은 이전 내용과 논리적으로 연결되어야 합니다. #텍스트: 모든 질병이 인간에게 고통을 안겨주지만 현재까지 암은 가장 심각한 고통을 초래하는 질병 중 하나이다. 암환자들은 암의 진단, 치료과정, 완화치료, 완치 후의 후유증 등 암의 경과와 단계에 따라 많은 위협적인 사건들을 경험하고 변화된 스트레스 상황에 적응해 나가야 하며, 이 과정에서 환자의 적응 양상과 대처방식은 삶의 질 및 신체적, 정신적 건강에 영향을 준다. 암은 진단자체가 죽음과 동일시되기 때문에 환자뿐만 아니라 가족의 신체적, 사회심리적, 경제적 상태를 저하시켜 가족의 삶 전체에 영향을 미친다. 실제로 암환자의 정신증상은 신체증상과 통증 등 여러 측면들과 상호작용하면서 암 환자와 가족의 삶의 질에 영향을 미치며, 최근 의료의 발달과 평균수명 연장에 따른 암 유병률 및 장기 투병 암 환자의 증가로 환자뿐만 아니라 암환자 가족의 총체적인 삶의 질 문제가 더욱 중요시되고 있다. 암환자의 간병은 환자이동, 장보기, 가사일, 간호, 정서적 지지, 개인적인 돌봄 등을 포함하며 이러한 간병 활동은 암환자 가족의 건강을 나쁘게 하며 사회 활동에 어려움을 줄 수 있을 뿐 아니라 스트레스를 증가시켜 정신질환의 원인이 되기도 한다. 기존 연구에서 암환자 보호자들의 정신질환 유병률은 20~30%으로 일반 인구에 비해 높은 결과를 보였으며, 간병제공자가 일반인보다 더 높은 수준의 정신적인 스트레스를 겪고 있는 것으로 보고하였다.
	아라코 역은 일본 아이치현 나고야 시 나카가와 구에 위치한 나고야 임해 고속 철도 니시나고야코 선의 역이며, 역 번호는 AN04입니다. 이 역은 오와리시 관음에 위치하고 있으며, 2004년 10월 6일에 영업을 개시했습니다. 이 역은 섬식 승강장 1면 2선의 성토 위에 있는 고가역으로, 배리어 프리 대응으로 엘리베이터를 1기 배치하였습니다. 또한, 상하행 선의 승강장에 안전 대책으로서 스크린도어가 설치되어 있습니다. 국철 시대에는 간사이 본선 욧카이치 역 방향과 니시나고야코 선 나고야 화물 터미널 역 방면을 상호 연결하는 화물 열차로 인하여 현재의 본 역 ~ 고모토역 간에서 분기하고 간사이 선 핫타 역까지 삼각선이 계획되었지만, 남쪽 화물선의 계획 좌절과 함께 중단되었습니다. 그러나 취득한 용지는 현재 도로 및 주택지로 전용되고 있습니다. 이 역은 일부 시간에만 역무원의 있는 순회역이자 나카지마 역이 관리하고 있습니다. 아라코 출신의 전국 무장 마에다 도시이에의 첫 출전의 기마상이 설치되어 있으며, 본 역과 히가시야마 선 다카바타를 중심으로 한 지역에는 나카가와 구의 공공 행정 기관들이 집중되어 있습니다. 나카가와 구청, 나카가와 보건소, 나카가와 구 휴일 진료소, 나카가와 문화 소극장, 나카가와 도서관, 나카가와 환경 사업소, 나카가와 우체국 아라코 관음, 아라코 신사, 아라코 공원, 스카이락 아라코점, 나고야 시영 지하철 히가시야마 선 다카바타 역, 나고야 화물 터미널 역 - JR 화물, 나고야 임해 고속 철도선 슈에이 예비 학교 아라코 역전 학교 서클 K 시노하라바시도리 3초메점 등이 있습니다.	아라코 역은 어디에 위치하나?
	대법원 2004. 7. 9. 선고 2003다46758 판결은, “수탁보증인이 민법 제442조에 의하여 주채무자에 대하여 미리 구상권을 행사하는 경우에 사전구상으로서 청구할 수 있는 범위는 주채무인 원금과 사전구상에 응할 때까지 이미 발생한 이자와 기한 후의 지연손해금, 피할 수 없는 비용 기타의 손해액이 포함될 뿐이고, 주채무인 원금에 대한 완제일까지의 지연손해금은 사전구상권의 범위에 포함될 수 없으며, 또한 사전구상권은 장래의 변제를 위하여 자금의 제공을 청구하는 것이므로 수탁보증인이 아직 지출하지 아니한 금원에 대하여 지연손해금을 청구할 수도 없는 것이므로 원고의 위 지연손해금청구가 사전구상권의 범위에 속하는 주채무의 지급을 구하는 것인지(사전구상금청구로서 주채무의 지연손해금을 청구하는 경우) 아니면 사전구상금채권에 대한 지연손해금을 별도로 청구하는 것인지를 석명하여 분명하게 한 다음에 그 청구의 당부에 관하여 판단하여야 할 것이다.”라고 판시하였다. 甲이 乙의 보증 아래 2014. 1. 1. 丙에게 1억 원을 이자 연 10%, 변제기 2014. 12. 31.로 정하여 대여하였는데, 변제기가 도래하였음에도 丙이 대여원리금채무를 한 푼도 갚지 않은 사례를 들어보자. 2015. 5. 31.을 기준으로 한다면, 보증인인 乙로서는 주채무자인 丙을 상대로 1억 원 및 이에 대한 2014. 1. 1.부터 2015. 5. 31.까지 연 10%의 비율로 계산한 이자 및 지연손해금만을 구상할 수 있다. 한편 대법원 2005. 11. 25. 선고 2004다66834, 66841 판결은 면책비용에 대한 법정이자도 사전구상권의 성질상 허용될 수 없다고 판시하였다.	주어진 제목과 요약문에 대한 정보를 토대로, 요약되기 전 문장을 유추해서 생성해주세요. 제목: 지연손해금과 법정이자 요약문: 대법원은 2003다46758 판결에서 수탁보증인이 주채무자에게 미리 구상권을 행사하는 경우 원고의 위 지연손해금청구가 사전구상권의 주채무 지급을 구하는지 사전구상금채권의 지연손해금을 별도로 청구하는지 분명히 밝힌 다음 청구의 당부를 판단하여야 한다고 판시하였다. 한편 대법원은 2004다66834, 66841 판결에서 면책비용의 법정이자도 허용될 수 없다고 판시하였다.
	건설현장의 산업안전보건을 조율할 자는 산업안전보건계획(Sicherheits-und Gesundheitsschutzplan)을 작성 또는 작성토록 하여야 하며(제2호), 건축시설에 이후 필요할지도 모르는 작업(예컨대 유지․보수작업 등)에 고려되어야 할 산업안전보건에 대한 사항이 기재된 문서를 작성하여야 한다(제3호)	주어진 문장 뒤에 자연스럽게 이어질 문장을 생성해주세요. 문장: 건설작업 계획 중 산업안전보건을 조율할 자의 의무에 대하여는 건설현장령 제3조 제2항에서 규정하고 있다. 이에 따르면, 건설현장의 산업안전보건을 조율할 자는 ｢산업안전보건법｣ 제4조에서 규정하고 있는 산업안전보건의 일반적 원칙80)을 준수하면서 동시 또는 순차적으로 수행되어야 할 작업을 분류하고 작업의 수행시간을 조율하여야 한다(제1호).
	올해 경기도가 공중화장실 불법 촬영 점검 사업을 시작했지만 ‘몰카’ 탐지기의 절반이 무용지물로 단속 실적이 ‘0건’에 불과하며 실제 범죄 발생지는 상가, 유흥업소, 대합실 등이 주를 이루는 데 반해 조사 대상은 공중화장실에 한정된다는 점 등에서 사업의 실효성에 의문이 제기되고 있다고 전했다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 남궁진 기자 올해 66명 투입 1만4000곳 점검 불구 탐지기 기능 뒤떨어져 절반 무용지물 공중시설에 한정된 점검사업도 ‘문제’ 실제 주택·상가 대다수… 실효성 의문 경기도가 불법 촬영 예방을 위해 올해 첫 시작한 공중화장실 불법 촬영 점검 사업의 실효성에 의문이 제기되고 있다. 지난 5월 제1회 추가경정예산 편성을 통해 시작된 이 사업을 통해 거둔 단속 실적은 ‘0건’에 그쳤고, ‘몰카’ 단속을 위해 필수적인 탐지기의 절반가량이 실제 불법 촬영 적발에는 무용하다는 지적이다. 19일 경기도의회 예산정책담당관실의 ‘2020년도 예산안 분석’에 따르면 도는 내년 불법 촬영 점검 전담인력 지원사업에 5억 원을 반영했다. 올 추경에 첫 반영된 2억1천700만 원에서 두 배가량 늘어난 규모다. 불법 촬영 점검 전담인력을 배치해 도가 인건비 50%를 부담하는 이 사업은 올해 도내 27개 시·군을 대상으로 전담인력 66명을 투입한 공중화장실 카메라 점검 방식으로 진행됐으며, 내년 70명으로 늘어난다. 그러나 점검을 통한 실제 적발 건수는 ‘0건’이다. 불법 촬영 점검 전담인력들은 도내 공중화장실 1만1천328개소, 민간화장실 2천765개소 등 화장실 총 1만4천123개소를 점검했지만 불법 촬영 카메라는 발견하지 못했다. 전담인력이 조사할 수 있는 화장실은 시·군 관리 소관인 공중화장실에 한정되는 데 반해 실제 불법 촬영 범죄가 발생하는 곳은 상가, 숙박(목욕탕), 유흥업소, 대합실(역), 학교, 주택(아파트), 지하철 등의 교통수단이 주를 이룬다. 지난해 도내 불법 촬영 범죄 발생 현황을 살펴보면 전체 1천325건 중 아파트 등 주택이 197건으로 가장 많았고 노상 137건, 지하철 131건, 목욕탕 76건 등의 순으로 나타났다. 도의회는 또한 탐지기가 적발하지 못하는 다양한 변형 카메라나 범죄 수법의 진화 속에 불법 촬영 점검에 사용되는 탐지기가 기능적 측면에서 뒤떨어진다고 분석했다. ‘경기도 불법 촬영 탐지기 보유 현황’에 따르면 도가 사용하는 탐지기 1천101대 중 적외선 렌즈 탐지기는 498대, 적색 LED 렌즈 탐지기는 114대, 전파 탐지기는 488대로 코팅된 ‘위장형 카메라’를 찾을 수 있는 적외선 렌즈 탐지기 비율은 45.2%에 그친다. 도의회 예산정책담당관실은 "최근 진화된 범죄 수법으로 점검 및 단속에 현실적 어려움이 있어 사업이 보다 실효성 있게 추진될 수 있도록 사업 운영 및 점검 방식에 고민과 노력이 필요하다"고 말했다. 남궁진 기자 why0524@kihoilbo.co.kr
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 원문을 바탕으로 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 생성하세요.	이 이야기는 자신의 능력을 과신하는 남동생을 타이르려던 누이의 의도가 엉뚱한 방향으로 빗나간 결과를 초래하여 결국 오누이가 생사를 건 내기를 하게 되는데, 이때 누이가 이길 것을 예견한 어머니가 일부러 누이를 지게 하고 이를 받아들인 누이가 스스로 죽음을 자초하는 내용으로 구성되어 있다.	다음 텍스트에서 제공된 문맥을 정확히 이해하고, 마지막 문장을 자연스럽고 문맥에 맞게 완성하세요. 문장은 이전 내용과 논리적으로 연결되어야 합니다. #텍스트: 여기, ‘여성’의 ‘신성한 속성’ 때문에 윤리적 과오를 범하고 영원히 회복 불가능한 ‘상실’과 ‘결핍’을 안게 된 ‘남성’에 관한 이야기가 있다. 그 어떤 인간도 따라올 수 없는, 더구나 초월적 능력을 지닌 ‘남동생’마저 능가하는 힘과 능력을 지녀 ‘남성’에게 질투와 시기, 경쟁과 다툼의 불씨를 당기게 하고야마는 ‘누이’는, 결국 자신의 죽음으로 그에게 간접적인 근친살해 공모의 굴레와 함께 반쪽짜리 쌍둥이 영웅이라는 근원적인 결핍을 안겨 준다. 이 이야기는 흔히 <오뉘힘겨루기>, <오뉘힘내기> 등으로 불리는 작품으로, 성이나 탑 등의 지형에 얽힌 전설이나 역모에 연루되어 죽은 비운의 인물에 관한 전설로 전승되며 선행 연구를 통해 신화적 성격이 강한 서사로 해석되어왔다. <오뉘힘내기>는 장사로 태어난 두 오누이가 서로 능력을 겨루는 내기를 하다가 일부러 내기에 진 누이 장사가 결국 죽음을 맞이하는 내용의 이야기다.
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 제공하세요.	화학	이 문제에서는 주어진 텍스트 내의 <MASK>로 표시된 부분에 들어갈 적절한 단어를 예측해야 합니다. <MASK>가 위치한 문장의 전체 문맥을 분석하여, 문장의 나머지 내용과 일관되게 <MASK>에 들어갈 가장 적합한 단어를 답하세요. #텍스트: 일반적으로, 담배란 담뱃잎을 주재료로 해 만든 흡연 제품이다. 이러한 담배에는 4700여가지의 유해성분을 포함하고 있으며, 그중 대표적인 것이 니코틴, 타르, 일산화탄소 등이다.일산화탄소는 연탄이 불완전 연소될 경우 생성되는 기체로서, 지속적으로 일산호탄소를 흡입하게 되면 혈액의 산소 운반 능력을 감소시켜 만성 저산소증을 일으켜 세포의 신진대사에 장애를 주게 된다.니코틴은 카페인처럼 흥분 작용을 함과 동시에 뇌세포 간 정보전달을 방해해 진정제 역할을 하지만 중독성이 강하기 때문에 담배 중독의 원인이 된다.타르는 담배를 피우면 필터가 검게 되는 것이나 오랜 흡연자의 인지를 노랗게 물들이는 독성 <MASK> 물질로서, 200종 이상의 화합물로 되어 있고 약 20여종류의 발암물질이 포함되어 있어 폐암, 구강암, 식도암, 후두암 등을 일으킨다.이러한 담배를 세계보건기구 WHO(World Health Organization)에서는 담배로 인한 흡연의 위험성을 “6.5초마다 한 명이 담배 때문에 목숨을 잃는다”라고 지적한바 있다.또한, 실제로 담배를 피우는 사람은 남성의 경우 13.2년, 여성의 경우 14.5년 수명이 단축된다는 연구결과가 보고되었다.이처럼, 담배는 직접 흡연으로 인해 흡연자의 건강을 위태롭게 할 뿐만 아니라 간접 흡연으로 주변 사람들의 건강도 위협하고 있는 실정이다.이 때문에, 서울시를 비롯한 여러 광역단체에서는 세계보건기구 WHO(World Health Organization) 규정에 맞취 2020년까지 시내 음식점 및 모든 실내 다중이용시설에서 전면 금연을 추진하기로 했으며, 흡연률을 줄이고자 정부에서는 2014년 9월 담배값 인상을 국회 본회의에 상정하고 입법을 추진중에 있으며, 초, 중, 고등학교에서는 다양한 금연프로그램 및 교육 기자재 실습을 통해 담배의 유해성을 학생들에게 인지시키는데 노력을 기울이고 있다.이러한 금연관련 교육 기자재 중 하기 특허문헌 1의 “교육용 금연보조기구(대한민국 등록실용신안공보 제20-0279376호)”는 본체의 외부에 담배가 접착되는 흡입구를 형성하고, 내부에는 상기 흡입구와 연결되어 담배연기가 유통될 수 있는 흡입관을 형성시키되, 상기 흡입관의 하부에 개폐문이 부착된 고정틀 속에 보관되어 주기적으로 교체될 수 있는 흰색 필터를 연결하는 한편, 내부로 흡입된 담배연기는 상기 필터에 침착되어 변색된 후 배출구를 통해 외부로 배기되어지는 흡연 재연과정을 외부에서 확인할 수 있도록 본체의 소정의 위치에 투시창을 구성한 것이 특징으로서, 외부 가슴부분에 소정의 투시창을 통하여 담배 연기에 함유된 독성물질에 의한 침전과정을 확인할 수 있다는 장점이 있었다.그러나, 상기 특허문헌 1의 “교육용 금연보조기구”는 실제 담배를 이용하여 담배연기가 인체 내부로 흡입되는 과정을 보여주기 때문에, 교육시 해로운 담배연기가 교육자들에게 그대로 노출됨으로써, 교육자들이 담배연기를 간접적으로 흡입할 수 있게 된다는 문제점이 있었다.또한, 상기 특허문헌 1의 “교육용 금연보조기구”는 투시창을 통해 담배에 포함되어 있는 발암물질 등을 확인할 수 있는 구조만 개시되어 있을 뿐, 흡연으로 인해 발생하는 피부의 노화, 충혈 등의 시각적인 효과를 통해 흡연자와 비흡연자의 차이를 육안으로 확인할 수 있는 구조가 존재하지 않아 금연교육의 극대화를 유도할 수 없는 문제점이 있었다.
	추진체 이형작업 도중 추진체의 코어 상단에 이형기계의 글리퍼를 결합하는 과정에서 중심부가 정확히 맞지 않아 그 결합 충격이나 마찰의 발생이 3명의 근로자가 숨진 한화 대전공장 폭발사고 원인으로 추정되지만 정확한 규명을 위해 대전지방경찰청은 한화 대전사업장 내에 있는 기술센터에서 국립과학수사연구원, 대전고용노동청 등과 함께 합동으로 모의실험을 진행하고 있다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 경찰이 3명의 근로자가 숨진 한화 대전공장 폭발사고 원인을 작업 중 발생한 충격이나 마찰, 정전기 등으로 압축해 수사에 착수했다. 대전지방경찰청은 추진체 이형작업 도중 추진체의 코어 상단에 이형기계의 글리퍼를 결합하는 과정에서 중심부가 정확히 맞지 않아 충격이나 마찰이 발생한 것으로 추정된다고 14일 밝혔다. 이성선 대전지방경찰청 광역수사대장은 "CCTV 확인결과 숨진 근로자가 글리퍼를 코어상단과 결합하기 전 이격을 바로잡기 위한 작업을 했다"며 "그 과정에서 마찰이 발생해 폭발이 일어난 것을 하나의 사고원인으로 염두에 두고 수사 중"이라고 말했다. 경찰은 정확한 사고원인 규명을 위해 한화 대전사업장 내에 있는 기술센터에서 국립과학수사연구원, 대전고용노동청 등과 함께 합동으로 모의실험을 진행하고 있다. 반복적인 실험을 통해 코어 상단에서 마찰과 연소, 발화가 어떻게 일어나는지 확인할 계획이다. 경찰은 이외에도 사고원인으로 '정전기 관리 소홀'에 주안점을 두고 수사하고 있다. 추진체는 산업안전보건기준에 관한 규칙에 따라 정전기, 마찰, 충격 등을 철저히 관리하도록 규정돼 있다. 경찰에 따르면 한화는 지난해 11월 해당 공정의 사고위험을 파악하고 설비를 개선하기 위해 예산까지 편성해 올 하반기 보수·수리할 계획이었던 것으로 전해졌다. 이 같은 문제는 한화 근로자들이 거듭 지적해온 부분이다. 경찰은 이와 관련 지난 6일 이모(54)씨 등 공정관리 책임자 6명을 업무상 과실치사 혐의로 입건해 조사 중이다. 김성준 기자
	우리공화당 조원진 공동대표는 5일 광화문광장에서 개최된 당 최고위원연석회의에서 지금 문재인 정권은 조국이 첫 번째이고 문재인이 두 번째인 ‘조문 정치’를 하고 있다며 조국의 임명을 강행한다면 전면전을 할 수 밖에 없다고 말했다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: ‘조문정치’- 조국이 첫 번째고 문재인이 두 번째다. 조국 임명 비단길 깔아주는 나경원은 원내대표 그만해야 조원진 의원우리공화당 조원진 공동대표(대구 달서구병 국회의원)는 5일 광화문광장에서 개최된 당 최고위원연석회의에서 “문재인 정권이 가족 사기단 조국의 임명을 강행한다면 문재인 정권과 전면전을 할 수 밖에 없다. 그들이 말하는 죽창을 들고라도 책임을 묻고 문재인 퇴진을 위해 싸우겠다”고 강하게 말했다. 조 대표는 “지금 문재인 정권은 ‘조문 정치’를 하고 있다. 조문 정치란 조국이 첫 번째이고 문재인이 두 번째라는 것”이라면서 “비리가 그렇게도 많은 조국을 끝까지 지키겠다는 것은 조국의 비리와 커넥션이 있다는 것과 무엇이 다른가”라고 말했다. 이어 “나경원 원내대표가 3권 분립을 침탈하고 청년의 가슴에 피멍이 들게 만든 조국의 청문회를 하겠다는 것은 문재인 정권이 조국 임명하는 비단길을 깔아주는 꼴이 됐다”면서 “가족 사기단을 제대로 된 증인없이 청문회하는 것은 국회의 나쁜 선례를 만들어주는 것으로 지금이라도 원내대표 자리를 내려놓고 그만하는게 좋다”고 말했다. 조 대표는 또 “사상 처음으로 마이너스 물가를 비롯해 민간소비 위축, 투자 부진, 법인세 수입 감소 등 대내외적 경제상황이 악화되는 상황에서도 문재인 정권은 3년만에 내년 총예산 규모를 113조 늘리면서 500조 원을 돌파했는데 경제를 망친 주범이 이렇게 해도 되는가”라면서 “적자 국채를 역대 최대 규모인 60조 원을 발행하는 빚잔치를 하면서 포퓰리즘 정책을 계속하는 것은 너무나 뻔뻔하다”고 말했다. 그는 특히 “오늘로 박근혜 대통령이 옥중투쟁하신지 889일이고 2년 6개월로 접어들었다. 촛불쿠데타로 권력찬탈한 문재인 정권이 정통성이 없이 국정을 마구잡이로 운영하면서 국민 혼란이 지속되고 있다”면서 “작은정부를 지향하고 일자리, 미래세대, 저출산과 고령화를 대비해 국가 예산을 아끼고 아껴서 미래를 대비했던 박근혜 대통령의 업적이 제대로 평가 받을 날이 곧 올 것”이라고 말했다. 이창재 기자 lcj@idaegu.com
	게릴라 콘서트는 2000년 9월 24일부터 2003년 1월 12일까지 방송된 문화방송 <일요일 일요일 밤에>의 코너였습니다. 이 프로그램은 특정 도시를 방문하여 길거리 홍보를 통해 목표 인원 수를 넘기면 공연을 진행하는 형식이었습니다. 총 2년 동안 방송되었으며 시청률은 23.2%, 순간 최고 시청률은 40.1%를 기록했습니다. 이 프로그램은 2001년 1월 21일 태진아의 공연이 취소된 후 끝났습니다.	게릴라 콘서트는 어떤 코너였고 언제 방송되었나?
	금융휴무를 실시할 경우 금융기관의 연말결산, 고객원장자료 백업 및 최종 테스트 등을 위한 충분한 시간이 확보되어 금융기관의 리스크를 크게 줄이는 이점이 있는 반면, 각종 금융거래와 관련된 결제일, 이자지급일 및 세금납부일 등의 변경이 불가피하여 금융기관의 업무부담이 증가하고 국민의 불편이 초래되는 부작용이 있다. 그러나 Y2K문제는 사전에 완전한 해결여부를 확인할 수 없는 데다, 기실시한 테스트도 전기, 통신 등 외부요인에 문제가 없다는 전자하에 실시한 것이므로 2000년 도래후 실제의 상황에서 최종적인 검증기회를 갖는 것이 바람직할 뿐만 아니라 세계표준시간(GMT)상으로 우리나라는 구미국가에 비해 9~14시간 이상 일직 2000년이 도래함에 따라 실제 문제발새이 다른 나라의 대처사례를 참조할 시간적 여유가 없으며, 우리나라의 문제가 다른 나라로 확대, 왜곡되어 전달될 가능성도 있음에 따라 금융기관 자체시스템, 지급결제시스템 및 전기, 통신 등 주요 기간시설의 문제유무를 철저히 검증하고, 문제발생시 복구에 필요한 시간을 충분히 확보할 필요가 있어 99년 12월 31일과 2000년 1월 3일을 모두 금융휴무로 추진하기로 하였다.	주어진 제목과 요약문에 대한 정보를 토대로, 요약되기 전 문장을 유추해서 생성해주세요. 제목: 숨어있는 귀함 : 홈 요약문: 금융휴무의 이점에도 불구하고 각종 거래 관련 일정의 변경이 불가피한 문제가 있다. Y2K문제는 사전에 해결여부를 확인할 수 없고, GMT상으로 2000년이 되는 시간이 달라 문제상황을 참조할 여유도 없고, 문제가 확대될 가능성이 있다. 이런 이유로 99년 12월 31일과 00년 1월 3일을 금융휴무로 추진했다.
	국립공원공단은 23일 대설주의보가 발령되면 전면 통제되던 국립공원 탐방로 중 설경명소인 62개 구간을 개방한다고 밝히고 올해 개방되는 대표적인 설경명소로는 태백산 천제단 일대, 변산반도 내소사 전나무숲길 등이 있으며 대설특보로 격상되거나 폭설, 한파 등 위험요소가 노출될 경우 즉시 탐방로를 통제하고 탐방객을 대피조치토록 할 예정이다.	주어진 문장을 적절하게 요약해주세요. 문장: 국립공원공단은 대설주의보가 발령될 때 전면 통제되던 국립공원 탐방로 중 설경명소인 62개 구간(195㎞)을 지난해에 이어 올해도 개방한다고 23일 밝혔다. 대설주의보란 24시간 내로 눈이 5㎝ 이상 내릴 것으로 예상될 때 기상청에서 발표하는 대설특보 중 하나다. 그간 공단은 매년 11월 15일부터 이듬해 3월 15일까지 대설주의보 이상의 대설특보가 발령되면 탐방로를 전면 통제했다. 공단은 설경 감상을 위해 국립공원을 방문하는 탐방객의 요구가 계속됨에 따라 공원별 현장여건을 고려한 저지대 탐방로, 사찰, 안전이 확보된 설경 경관지역 등 96개 구간을 지난해 시범 개방했다. 올해 개방하는 구간은 지난해 설경 명소인 지리산 뱀사골계곡(반선~요룡대) 등 39개 구간을 포함해 탐방객이 많이 찾는 설악산 백담계곡(수렴동대피소 일원) 등 23개 구간을 새로 지정했다. 올해 개방되는 대표적인 설경명소로는 ▲지리산 성삼재 ~ 노고단 일대 ▲오대산 선재길 ▲태백산 천제단 일대 ▲설악산 장수대분소 ~ 대승폭포 ▲치악산 세렴폭포 일대 ▲소백산 죽령 ~ 연화봉 ▲변산반도 내소사 전나무숲길 등이 있다. 공단은 지난해처럼 대설경보로 특보가 격상되거나, 현장에서의 폭설·한파 등 위험요소가 노출될 경우 즉시 탐방로를 통제하고 탐방객을 대피조치토록 할 예정이다. 아울러 대설주의보 발표 시 해당구간에 탐방객 안전을 위해 거점근무 및 안전요원을 배치할 계획이다. 양해승 국립공원공단 재난안전처장은 "국립공원의 아름다운 설경을 많은 탐방객이 감상하도록 안전관리에 최선을 다할 예정"이라며 "기상상황으로 갑작스런 통제가 될 수 있으니 사전에 국립공원 누리집에서 개방여부 등을 확인해 탐방 계획을 세워야 한다"고 밝혔다.
	제목: [사설] 베트남 2 차 북·미 정상회담, ‘완전한 비핵화’ 원칙 지켜야 오는 27, 28일 베트남에서 2차 북·미 정상회담이 열릴 예정이며 1차 공동선언의 핵심인 북한의 '완전한 비핵화'가 담보된 합의하에 원칙을 지켜야 할 것이다.	주어진 문장에 적절한 제목을 생성하고, 내용을 요약해주세요. 문장: 트럼프, "27, 28 일 김정은 만날 것"/비건, 평양서 김혁철과 실무협상/美, '포괄적 핵신고' 후순위로 미뤄 관련이슈 : 사설 도널드 트럼프 미국 대통령이 어제 국정연설에서 "김정은 북한 국무위원장과 나는 오는 27, 28 일 양일간 베트남에서 다시 만날 것"이라고 밝혔다. 지난해 6 월12 일 싱가포르에서 1 차 북·미 정상회담이 열린 지 260 일 만에 두 정상이 마주 앉는 것이다. 한동안 더디게 진척됐던 북핵 실무협상도 빠른 속도로 진행되고 있다. 스티븐 비건 미 국무부 대북정책특별대표가 어제 방북해 카운터파트인 김혁철 전 스페인 주재 북한대사를 만났다. 비건 특별대표는 방북에 앞서 한·미 간 조율을 거친 뒤 북한과 '구체적인 세부 목표', '협상과 신고 로드맵'을 논의하겠다고 했다. 비건 특별대표가 실무협상 전면에 나서면서 미국의 협상기조가 '동시적·병행적'으로 바뀌었다. 선(先) 핵 신고 요구를 접은 것이다. 그는 지난달 31 일 스탠퍼드대 강연에서 "북한이 약속을 지킨다면 싱가포르 공동성명에서 했던 약속을 동시에 그리고 병행적으로 추진하겠다"고 했다. 김 위원장이 신년사에서 거론한 '단계적·동시적 이행' 요구를 수용한 것이다. 김 위원장은 지난해 10 월 마이크 폼페이오 국무장관에게 미국의 상응조치를 조건으로 영변 핵시설뿐 아니라 플루토늄과 우라늄 농축시설 전체의 폐기 및 파기, 그 이상의 +α에 대한 이행 의사를 밝혔다고 한다. 미국은 북한에 대해 핵 목록을 당장 제출하라고 요구하지 않을 것임을 암시했다. 비건 특별대표는 "비핵화 과정이 최종적으로 되기 전에 북한의 대량살상무기(WMD)와 미사일 프로그램의 전체 범위에 대해 파악해야 한다"며 "포괄적 신고를 통해 어느 시점에는 이를 얻어낼 것"이라고 했다. 북한이 일부 핵시설 폐기안을 들고나오면 미국은 종전선언을 포함한 신뢰구축·경제지원안을 제시하는 게 2 차 북·미 정상회담의 핵심 내용이 될 것으로 보인다. 트럼프 대통령은 미 CBS방송 인터뷰에서 "김 위원장은 북한을 엄청난 경제대국으로 만들 기회를 가졌다"고 말했다. 싱가포르 1 차 북·미 정상회담에서 채택된 공동선언의 핵심은 북한의 '완전한 비핵화'였다. 핵 목록 신고에 이은 불가역적 해체가 목표였다. 2 차 북·미 정상회담에서 '포괄적 핵 신고'를 후순위에 두려는 것은 원칙을 포기하는 것이나 다름없다. 협상이 이런 식으로 타결되면 북한은 사실상 핵보유국 지위를 인정받게 된다. 완전한 비핵화를 담보하지 않는 합의는 언제든 깨질 수 있다. 전례가 한두 번이 아니다. 과거의 실수를 반복하지 않으려면 원칙을 훼손하지 말아야 한다.
	실제 시각장애인을 대상으로 답변합니다. 시각장애인용 홈페이지는 음성 출력이나 높은 대비 등 직접적인 시각장애인의 선호를 고려한 디자인이 필요합니다. 하지만 중요한 것은 시각장애인 사용자가 직접 접근 가능해야 하기 때문에 시각장애인이 스크린 리더 프로그램 등을 이용하여 화면에서 보이는 내용을 음성으로 들을 수 있도록 하는 것이 중요합니다. 시각장애인용 홈페이지의 특징은 대개 이미지나 그래픽 등 시각적으로 효과적인 디자인 요소를 배제하고, 텍스트로 이루어진 내용 중심으로 구성된다는 것입니다. 따라서 시각장애인용 홈페이지를 만들 때에도 이미지보다는 텍스트로 된 내용을 활용하고, 이를 스크린 리더 프로그램이 인식할 수 있도록 태그를 달아주어야 합니다. 또한 이미지 링크는 alt 테그를 사용하여 부가적인 설명을 함께 제공해주어야 합니다. 제작시 HTML, CSS 등의 웹 개발 도구를 이용할 때에도 시각장애인 사용자도 접근이 용이하도록 alt 테그 등을 적극 활용하는 것이 필요합니다. 이러한 디자인 및 개발 방법을 따르면 시각장애인 사용자들도 동등하게 웹 사이트를 이용할 수 있으며, 웹 접근성을 만족시키는 것이 가능해집니다. 마지막으로, 웹 사이트 구축 및 운영에 대한 법적인 요구사항은 나라마다 다르기 때문에 해당 나라의 규정에 따라 웹 사이트의 접근성을 고려한 제작이 필요할 수 있습니다. 한마디 시각장애인이 이용할 수 있는 웹 접근성을 고려한 디자인과 개발이 필요합니다. alt 테그의 사용과 텍스트 위주의 디자인을 고려하여 제작해야 합니다.	시각장애인을 위한 홈페이지를 만드는 방법은 무엇인가요? 시각장애인이 이용할 수 있는 홈페이지를 만들고자 할 때 어떤 점을 고려해야 하는지 궁금합니다. 시각장애인용 홈페이지의 특징과 제작 방법을 알려주세요.
	이리나 니콜라예프나 코르자넨코(1974년 5월 16일 ~)는 러시아의 전직 육상 선수로, 키는 1.78m, 몸무게는 85kg입니다. 그녀는 1999년 세계 실내 선수권 대회에서 도핑 양성 반응을 보였으며, 은메달을 잃고 2년간 선수 자격 정지 징계를 받았습니다. 또한 2004년 하계 올림픽 포환던지기에서 금메달을 획득했지만, 스타노졸롤 양성 반응을 보이면서 실격 처리되었습니다. 이후 2005년 9월 21일의 각서에 따른 IAAF에서 평생 선수 자격 정지 징계를 받았습니다. 이리나는 국가 육상 경기 연맹 관계자의 압박에도 불구하고 금메달 반납을 거부했습니다.	이리나 니콜라예프나 코르자넨코는 어떤 육상 선수인가?
	나카가와 쇼코의 17번째 싱글인 '사카사마세카이/Once Upon a Time -키보우노우타-'는 2013년 12월 11일에 소니 레코드스에서 발매되었습니다. 이 싱글은 전작 '조쿠 콘돈'으로부터 6개월 만의 새로운 싱글이며, 발매 형식은 CD+DVD의 초회 한정반 A/B와 통상반 3종으로 출시되었습니다. 양면 싱글로는 '플라잉 휴먼로이드'가 이어지며, 오리콘 주간 차트 TOP 10에 진입하는 것은 12번째 싱글 이후 네 번째 때이며, 총 열 번째입니다. 특별 기프트로는 '파즈도라Z' 게임 내에서 사용할 수 있는 두 종류의 특전 코드와 함께 아자 재킷이 포함되어 있습니다. 재킷은 머리카락에서 크리스마스 트리를 모티브로 디자인되었으며, 표제곡인 '전나무의 머리'는 독특한 비주얼을 가지고 있습니다. 커플링곡인 'Satellite Girl'은 7월 7일에 발매되었습니다.	나카가와 쇼코의 17번째 싱글은 언제 발매되었나요?
당신은 인공지능 비서입니다. 주어진 원문을 바탕으로 주어진 질문에 가장 적절한 답변을 생성하세요.	특히 최근에는 split-sphere를 비롯한 멀티앤빌(multi-anvil) 형의 소형, 경량 고온고압 합성기가 개발되어 경제적으로 인공적으로 다이아몬드의 생성조건을 만족시키는 고압고온 환경이 가능하게 되어 비교적 단시간에 흑연을 원료로 하여 벌크(bulk) 다이아몬드 구조를 합성하거나 저급 천연다이아몬드를 색향상 처리하는 것이 상업적으로 가능하게 되었다.	다음 텍스트에서 제공된 문맥을 정확히 이해하고, 마지막 문장을 자연스럽고 문맥에 맞게 완성하세요. 문장은 이전 내용과 논리적으로 연결되어야 합니다. #텍스트: 보석용으로 사용되고 있는 다이아몬드는 높은 반사율과 투명한 구조가 만들어내는 아름다움, 고유의 내구성으로 변하지 않는 영원성, 그리고 보석으로서의 희소성을 가지고 있어 높은 가치를 형성하고 있다. 또한 천연 다이아몬드 중에서도 희소성이 높은 노란색(vivid yellow)이나 핑크(pink) 등의 유색 다이아몬드의 가치는 오히려 무색투명한 칼라리스(colorless) 다이아몬드나 상대적으로 양이 많은 갈색(brown) 계열의 다이아몬드보다 매우 높은 가치를 지니고 있다. 이러한 보석용 천연 유색 다이아몬드의 가치 때문에 기존 천연 다이아몬드의 생성조건을 인위적으로 모사하여 고온고압법(high temperature high pressure: HTHP)을 써서 수 캐럿(carats)의 보석용 다이아몬드로 합성하거나, 상대적으로 양이 많은 갈색의 천연다이아몬드를 고온고압 상태에서 질소 불순물의 색심 (color center)기능을 제어하여 색을 향상시켜 부가가치가 높은 색의 다이아몬드로 향상 처리하는 기술의 개발이 계속되어 왔다.

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