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Préférences trophiques des femelles endophiles d'Anopheles funestus au Sénégal | WMT16 | Scientific |
Retourner le flacon (tête en bas), et prélever le volume nécessaire. | EMEA_V3 | Medicinal |
UNE NOUVELLE M'ETHODE, D'ENDOPROTH'ESE DE DRAINAGE DANS LES OP'ERATIONS PLASTIQUES DU BASSINET ET DE L'UR'ET'ERE | WMT16 | Scientific |
Médicaments par classe thérapeutique | EMEA_V3 | Medicinal |
ajouter un commentaire pour aciclovir comprimés et ne propose pas les différentes formes galéniques du produit il prend par défaut aciclovir 5 pourcent crème aux flacons 2 grammes pas de proposition pour la forme galénique afin de choisir la bonne | PXCORPUS | Dialogue |
Ce médicament ne doit pas être mélangé avec d' autres médicaments, particulièrement avec les solutions de chlorure de sodium. | EMEA_V3 | Medicinal |
Drainage veineux et innervation du sinus maxillaire | WMT16 | Scientific |
Duplications oesophagiennes de l'adulte. Un cas reconnu par scaner et revue de la littérature | WMT16 | Scientific |
Sténose post-radiothérapique de l'artère carotide interne supraclinoïdienne. Réseau de Moyamoya | WMT16 | Scientific |
Traitement de la maladie de Behçet sévère par un anti-TNFalpha : l'infliximab. Une observaction | WMT16 | Scientific |
De la poésie des cigales aux réalités laborieuses des fourmis | WMT16 | Scientific |
Henri Lestradet (1921-1997), médecin pédiatre, scientifique et pédagogue | WMT16 | Scientific |
LA " ; PENS'EE OP'ERATOIRE" ; | WMT16 | Scientific |
Contrôle des dosages de mercure dans les analyses biologiques | WMT16 | Scientific |
Insulin Human Winthrop Comb 15 contient 100 UI d'insuline par ml de suspension. | EMEA_V3 | Medicinal |
De par sa faible affinité pour les récepteurs nicotiniques des mammifères et son faible passage supposé de la barrière hémato-méningée de ceux -ci, l' imidaclopride n' a pas d' effet sur le système nerveux central des mammifères. | EMEA_V3 | Medicinal |
Le service médical rendu par MAGNESIUM VITAMINE B6 BIOGARAN est insuffisant pour être pris en charge par la solidarité nationale. | BDPM | Medicinal |
Obésité et inflammation : les adipocytokines | WMT16 | Scientific |
Selon les estimations des médecins des patientes prises en compte, l' ajout de Tyverb a augmenté le délai jusqu' à l' aggravation de la maladie de18, 3 à 23, 9 semaines en moyenne. | EMEA_V3 | Medicinal |
Risques liés à l'exposition à la radioactivité naturelle | WMT16 | Scientific |
L'effet rebond ou phénomène de rebond est l'apparition ou la réapparition de symptômes qui étaient absents ou contrôlés pendant un traitement médicamenteux, mais (ré)apparaissent lorsque ce traitement est arrêté ou que la dose est réduite. Dans le cas de réapparition, les symptômes qui réapparaissent ont souvent une intensité augmentée par rapport aux symptômes présents avant traitement.
Par exemple, des anxiolytiques, des antidépresseurs, des sédatifs, des stimulants, et des antipsychotiques peuvent provoquer cet effet rebond.
Cas des hypnotiques sédatifs
Effets rapportés
Anxiété
Plusieurs anxiolytiques et hypnotiques ont un effet rebond. Par exemple, le sevrage des benzodiazépines peut causer une anxiété rebond et une insomnie rebond graves, pire que l'insomnie ou que le trouble anxieux d'origine. Environ 70 % des patients qui arrêtent les benzodiazépines font l'expérience de l'effet rebond. Les symptômes de l'effet rebond peuvent être un facteur dans l'utilisation chronique de médicaments et dans la dépendance à la drogue sur le long terme. Des patients continuent à prendre certains médicaments uniquement pour conjurer les symptômes désagréables et parfois invalidants de deux phénomènes distincts : le sevrage physique et l'effet rebond.
Insomnie
L'insomnie rebond est l'insomnie qui se produit après l'arrêt de substances sédatives prises pour soulager l'insomnie primaire. L'utilisation régulière de ces substances peut entraner un sujet à devenir dépendant de ses effets afin de s'endormir. Par conséquent, quand une personne a cessé de prendre son traitement et expérimente les effets rebonds, elle peut souffrir d'insomnie comme un symptôme de sevrage. Parfois, cette insomnie rebond peut être pire que l'insomnie d'origine que le médicament était pourtant destiné à traiter.
Les médicaments couramment délivrés, reconnus pour provoquer ce problème d'insomnie rebond, et prescrits aux individus ayant des difficultés à s'endormir ou à rester endormis, sont l'eszopiclone, le zolpidem, et les anxiolytiques comme les benzodiazépines.
Dépression
Des symptômes dépressifs peuvent sembler apparatre chez des patients jusque-là indemnes d'un tel trouble.
Délai de survenue
Le délai de survenue du phénomène de rebond dépend des caractéristiques pharmacocinétiques (durée de vie dans l'organisme) des molécules. Par exemple durant la journée, des effets rebond d'anxiété, de goût métallique, de troubles de la perception, qui sont typiques des symptômes de sevrage aux benzodiazépines peuvent se produire si la veille on a pris des benzodiazépines et que leur action hypnotique diminue. Un autre exemple est l'insomnie rebond du petit matin qui peut se produire quand l'effet d'un hypnotique à élimination rapide se dissipe, ce qui conduit à un éveil-rebond forçant prématurément le réveil complet du sujet.
Un médicament qui semble être souvent associé à ces problèmes est le triazolam en raison de sa forte puissance et de sa demi-vie ultra courte ; mais ces problèmes peuvent aussi se produire avec d'autres hypnotiques à action courte, . Le quazépam, en raison de sa sélectivité pour les récepteurs benzodiazépines de type1 et de sa longue demi-vie, n'entrane pas d'anxiété rebond dans la journée.
Cela montre que la demi-vie est très importante pour déterminer si un hypnotique utilisé la nuit entrainera le lendemain des effets rebonds ou non. Les effets rebonds qui apparaissent la journée ne sont pas nécessairement légers, et peuvent parfois entrainer des perturbations psychiatriques et psychologiques importantes.
Autres exemples
Stimulants
Les effets rebonds des stimulants tels que le méthylphénidate ou la dextroamphetamine comprennent la psychose, la dépression et des symptômes du trouble du déficit de l'attention ; mais sous une forme temporaire et exagérée, . Jusqu'à un tiers des enfants atteints du trouble du déficit de l'attention éprouvent un effet de rebond lorsque le méthylphénidate est arrêté.
Antidépresseurs
De nombreux antidépresseurs, y compris les ISRS, peuvent causer une dépression rebond, des attaques de panique rebonds, une anxiété rebond, et une insomnie rebond quand ils sont arrêtés.
Antipsychotiques
L'apparition ou la réapparition soudaine et grave d'une psychose peut survenir quand des antipsychotiques sont arrêtés trop rapidement.
Modulateurs adrénergiques de type alpha-2
Une hypertension rebond, au-dessus du niveau avant traitement, a été observée après l'arrêt de la clonidine, et après l'arrêt de la guanfacine.
Corticostéroïdes
L'utilisation de corticostéroïdes très puissants, tels que le clobetasol (en) pour le psoriasis et la dermite séborrhéique, expose lors d'un sevrage brusque au développement d'un cas beaucoup plus grave de psoriasis. Par conséquent, le sevrage devrait être progressif, peut-être en diluant le médicament dans une lotion, de manière à baisser graduellement et jusqu'à ce que très peu de médicament soit appliqué.
Analgésiques
La céphalée de rebond (en) peut apparaitre lorsque la dose d'un traitement analgésique est diminuée, ou que le traitement analgésique est arrêté (rapidement ou non).
Décongestionnants
L'utilisation continue de décongestionnants topiques (aérosols nasaux) peut conduire à une congestion nasale constante connue sous le nom de rhinite médicamenteuse ou iatrogène (en).
Voir aussi
Sevrage (toxicologie)
Notes et références
(en) Cet article est partiellement ou en totalité issu de l'article de Wikipédia en anglais intitulé Rebound_effect (voir la liste des auteurs).
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METOPROLOL SANDOZ 50 mg, comprimé - Résumé des caractéristiques du produit. ANSM - Mis à jour le : 19/03/2020 METOPROLOL SANDOZ 50 mg, comprimé Tartrate de métoprolol. 50 mg Pour un comprimé. Excipient à effet notoire : lactose. Pour la liste complète des excipients, voir rubrique 6. 1. Prophylaxie des crises d'angor d'effort, Traitement au long cours après infarctus du myocarde (réduction de la mortalité), Traitement de la tachyarythmie cardiaque : incluant arythmies supraventriculaires (tachycardies, flutters et fibrillations auriculaires, tachycardies jonctionnelles) ou ventriculaires (extrasystolie ventriculaire, tachycardies ventriculaires), Manifestations fonctionnelles cardiaques : éréthisme cardiaque. METOPROLOL SANDOZ doit toujours être pris de manière constante par rapport aux repas. Si votre médecin vous a demandé de prendre METOPROLOL SANDOZ avant le petit-déjeuner, vous devez continuer à le prendre au même moment durant toute la durée du traitement. Hypertension artérielle 2 à 4 comprimés par jour en 1 ou 2 prises (soit 100 à 200 mg), seuls ou associés. La posologie sera adaptée en fonction de la réponse tensionnelle, elle pourra être diminuée à 1 comprimé par jour (50 mg par jour) ou augmentée. Prophylaxie des crises d'angor d'effort Le traitement est initié avec 1 comprimé ou 2 comprimés par jour en 1 à 2 prises (soit 50 à 100 mg/jour), posologie éventuellement augmentée à intervalles hebdomadaires en fonction de la réponse clinique. Traitement au long cours après infarctus du myocarde 2 à 4 comprimés par jour (soit 100 à 200 mg) en 2 ou 3 prises. Tachyarythmie cardiaque En général 2 à 4 comprimés par jour (soit 100 à 200 mg) en 2 ou 3 prises. Une posologie de 1 comprimé par jour (soit 50 mg) pourra être utilisée. Eréthisme cardiaque 1 à 2 comprimés par jour (soit 50 à 100 mg). Populations spéciales Population pédiatrique La sécurité et l'efficacité de METOPROLOL SANDOZ chez les enfants et les adolescents de moins de 18 ans n'ont pas été établies. Aucune donnée n'est disponible. Insuffisance rénale Aucune adaptation posologique de METOPROLOL SANDOZ n'est nécessaire chez les insuffisants rénaux. Insuffisance hépatique Les niveaux sanguins de METOPROLOL SANDOZ sont susceptibles d'augmenter de manière substantielle chez les insuffisants hépatiques. De plus, METOPROLOL SANDOZ doit être initié à faible dose avec une titration de la dose graduelle selon la réponse clinique. Sujets âgés (plus de 65 ans) Aucune adaptation posologique de METOPROLOL SANDOZ n'est nécessaire chez les sujets âgés, mais le traitement doit être pris avec prudence du fait d'une augmentation de la probabilité d'effets indésirables. Mode d'administration Les comprimés sont à avaler sans les croquer, avec un verre d'eau, pendant ou juste après les repas, la prise alimentaire augmentant la biodisponibilité du métoprolol. Asthme et bronchopneumopathies chroniques obstructives, dans leurs formes sévères, Insuffisance cardiaque non contrôlée par le traitement, Choc cardiogénique, Blocs auriculo-ventriculaires des second et troisième degrés non appareillés, Angor de Prinzmetal (dans les formes pures et en monothérapie), Maladie du sinus (y compris bloc sino-auriculaire), Bradycardie (< 45-50 battements par minute), Phénomène de Raynaud et troubles circulatoires périphériques, dans leurs formes sévères, Phéochromocytome non traité, Hypotension, Antécédent de réaction anaphylactique. Ce médicament est généralement déconseillé en association avec le diltiazem, le vérapamil et le fingolimod (voir rubrique 4. 5) ainsi qu'au cours de l'allaitement (voir rubrique 4. 6). Ce médicament contient du lactose. Les patients présentant une intolérance au galactose, un déficit total en lactase ou un syndrome de malabsorption du glucose et du galactose (maladies héréditaires rares) ne doivent pas prendre ce médicament. Arrêt du traitement Le traitement ne doit pas être interrompu brutalement, en particulier chez les patients présentant une cardiopathie ischémique. La posologie doit être diminuée progressivement, c'est-à-dire idéalement sur une à deux semaines, en commençant en même temps, si nécessaire, le traitement substitutif, pour éviter une aggravation de l'angor. Asthme et bronchopneumopathies chroniques obstructives Les bêta-bloquants ne peuvent être administrés qu'en cas de formes légères en choisissant un bêta-1 sélectif à posologie initiale faible. Il est recommandé de faire pratiquer des épreuves fonctionnelles respiratoires avant la mise en route du traitement. En cas de crise survenant sous traitement, on pourra utiliser des bronchodilatateurs bêta-mimétiques. Insuffisance cardiaque Chez l'insuffisant cardiaque contrôlé par le traitement et en cas de nécessité, le métoprolol sera administré à très faibles doses progressivement croissantes et sous surveillance médicale stricte. Bradycardie Si la fréquence s'abaisse au-dessous de 50-55 pulsations par minute au repos et que le patient présente des symptômes liés à la bradycardie, la posologie doit être diminuée. Bloc auriculo-ventriculaire du premier degré Etant donné leur effet dromotrope négatif, les bêta-bloquants doivent être administrés avec prudence aux patients présentant un bloc auriculo-ventriculaire du premier degré. Infarctus du myocarde Chez les patients avec un infarctus du myocarde, si une hypotension significative apparait, le traitement par METOPROLOL SANDOZ doit être interrompu, et le statut hémodynamique du patient et la mesure de l'ischémie myocardique soigneusement évalués. Une surveillance hémodynamique intensive peut être nécessaire et des modalités de traitement appropriées doivent être mises en place. Si l'hypotension est associée à une bradycardie ou un bloc auriculo-ventriculaire significatif, le traitement doit être réajusté pour les rétablir. Angor de Prinzmetal Les bêta-bloquants peuvent augmenter le nombre et la durée des crises chez les patients souffrant d'un angor de Prinzmetal. L'utilisation d'un bêta-bloquant bêta-1 cardiosélectif est possible, dans les formes mineures et associées, à condition d'administrer conjointement un vasodilatateur. Troubles circulatoires périphériques Chez les patients souffrant de troubles artériels périphériques (maladie ou syndrome de Raynaud, artérites ou artériopathies chroniques oblitérantes des membres inférieurs), les bêta-bloquants peuvent entraner une aggravation de ces troubles. Dans ces situations, il convient de privilégier un bêta-bloquant cardiosélectif et doté d'un pouvoir agoniste partiel, que l'on administrera avec prudence. Phéochromocytome L'utilisation des bêta-bloquants dans le traitement de l'hypertension due au phéochromocytome traité nécessite une surveillance étroite de la pression artérielle. Chez les patients ayant, ou suspectés d'avoir, un phéochromocytome, METOPROLOL SANDOZ doit toujours être prescrit en association avec un alpha-bloquant et seulement après l'initiation de l'alpha-bloquant (voir rubrique 4. 5 Interactions). Sujet âgé Chez le sujet âgé, le respect absolu des contre-indications est impératif. On veillera à initier le traitement par une posologie faible et à assurer une surveillance étroite. Insuffisant hépatique En pratique, on surveillera le rythme cardiaque, de façon à diminuer les doses s'il apparat une bradycardie excessive (< 50-55 battements/min au repos). L'insuffisance hépatique peut augmenter la biodisponibilité du métoprolol par diminution de la clairance, entrainant une augmentation des concentrations plasmatiques. Sujet diabétique Prévenir le patient et renforcer en début de traitement l'autosurveillance glycémique. Les signes annonciateurs d'une hypoglycémie peuvent être masqués, en particulier tachycardie, palpitations et sueurs. Psoriasis Des aggravations de la maladie ayant été rapportées sous bêta-bloquants, l'indication mérite d'être pesée. Réactions allergiques Chez les patients susceptibles de faire une réaction anaphylactique sévère, quelle qu'en soit l'origine, en particulier avec des produits de contraste iodés ou la floctafénine (voir rubrique 4. 5) ou au cours de traitements désensibilisants, le traitement bêta-bloquant peut entraner une aggravation de la réaction et une résistance à son traitement par l'adrénaline aux posologies habituelles. Anesthésie générale Les bêta-bloquants vont entraner une atténuation de la tachycardie réflexe et une augmentation du risque d'hypotension. Un traitement chronique par bêta-bloquant ne doit pas être interrompu de manière systématique avant un acte chirurgical majeur. La poursuite du traitement par bêta-bloquant diminue le risque d'arythmie, d'ischémie myocardique et de poussées hypertensives. Il convient de prévenir l'anesthésiste que le patient est traité par un bêta-bloquant. Si l'arrêt du traitement est jugé nécessaire, une suspension de 48 heures peut être considérée comme suffisante pour permettre la réapparition de la sensibilité aux catécholamines. Dans certains cas, le traitement bêta-bloquant ne peut être interrompu : Chez les patients atteints d'insuffisance coronarienne, il est souhaitable de poursuivre le traitement jusqu'à l'intervention, étant donné le risque lié à l'arrêt brutal des bêta-bloquants, En cas d'urgence ou d'impossibilité d'arrêt, le patient doit être protégé d'une prédominance vagale par une prémédication suffisante d'atropine renouvelée selon les besoins. L'anesthésie devra faire appel à des produits aussi peu dépresseurs myocardiques que possible et les pertes sanguines devront être compensées, Le risque anaphylactique devra être pris en compte. Thyrotoxicose Les bêta-bloquants sont susceptibles d'en masquer les signes cardiovasculaires. Sportifs L'attention des sportifs est attirée sur le fait que cette spécialité contient un principe actif pouvant induire une réaction positive des tests pratiqués lors des contrôles antidopage. Interactions Les inhibiteurs des canaux calciques du type verapamil (phenylalkylamine) ne doivent pas être administrés par voie I. V. aux patients recevant du METOPROLOL SANDOZ car il existe un risque d'arrêt cardiaque dans cette situation (voir rubrique 4. 5 Interactions). Associations déconseillées Diltiazem Troubles de l'automatisme (bradycardie excessive, arrêt sinusal), troubles de la conduction sino-auriculaire et auriculo-ventriculaire et défaillance cardiaque. Une telle association ne doit se faire que sous surveillance clinique et ECG étroite, en particulier chez le sujet âgé ou en début de traitement. Vérapamil Troubles de l'automatisme (bradycardie excessive, arrêt sinusal), troubles de la conduction sino-auriculaire et auriculo-ventriculaire et défaillance cardiaque. Une telle association ne doit se faire que sous surveillance clinique et ECG étroite, en particulier chez le sujet âgé ou en début de traitement. Fingolimod Potentialisation des effets bradycardisants pouvant avoir des conséquences fatales. Les bêta-bloquants sont d'autant plus à risque qu'ils empêchent les mécanismes de compensation adrénergique. Surveillance clinique et ECG continu pendant les 24 heures suivant la première dose. Associations faisant l'objet de précautions d'emploi Abiratérone Chez l'insuffisant cardiaque, risque d'augmentation des effets indésirables du métoprolol, par diminution de son métabolisme hépatique par l'abiratérone. Surveillance clinique. Si besoin, adaptation de la posologie du métoprolol pendant le traitement par l'abiratérone. Amiodarone Troubles de l'automatisme et de la conduction (suppression des mécanismes sympathiques compensateurs). Surveillance clinique et ECG. Antiarythmiques classe I (sauf lidocaïne) Troubles de la contractilité, de l'automatisme et de la conduction (suppression des mécanismes sympathiques compensateurs). Surveillance clinique et ECG. Anesthésiques volatils halogénés Réduction des réactions cardiovasculaires de compensation par les bêta-bloquants. L'inhibition bêta-adrénergique peut être levée durant l'intervention par les bêta-mimétiques. En règle générale, ne pas arrêter le traitement bêta-bloquant et, de toute façon, éviter l'arrêt brutal. Informer l'anesthésiste de ce traitement. Antihypertenseurs centraux Augmentation importante de la pression artérielle en cas d'arrêt brutal du traitement par l'antihypertenseur central. Eviter l'arrêt brutal du traitement par l'antihypertenseur central. Surveillance clinique. Bupropion Avec le métoprolol utilisé dans l'insuffisance cardiaque : risque d'augmentation des effets indésirables du métoprolol par diminution de son métabolisme hépatique par le bupropion. Surveillance clinique. Si besoin, adaptation de la posologie du métoprolol pendant le traitement par le bupropion. Cinacalcet Augmentation des concentrations plasmatiques de métoprolol avec risque de surdosage, par diminution de son métabolisme hépatique par le cinacalcet. Surveillance clinique et réduction de la posologie du métoprolol pendant le traitement par le cinacalcet. Darifénacine Augmentation des concentrations plasmatiques de métoprolol avec risque de surdosage, par diminution de son métabolisme hépatique par la darifénacine. Surveillance clinique et réduction de la posologie du métoprolol pendant le traitement par la darifénacine. Duloxétine Augmentation des concentrations plasmatiques de métoprolol avec risque de surdosage, par diminution de son métabolisme hépatique par la duloxétine. Surveillance clinique et réduction de la posologie du métoprolol pendant le traitement par la duloxétine et après son arrêt. Insuline, glinides, gliptines et sulfamides hypoglycémiants Tous les bêta-bloquants peuvent masquer certains symptômes de l'hypoglycémie : palpitations et tachycardie. Prévenir le patient et renforcer, surtout en début de traitement, l'autosurveillance glycémique. Lidocaïne Avec la lidocaïne utilisée par voie IV : augmentation des concentrations plasmatiques de lidocaïne avec possibilité d'effets indésirables neurologiques et cardiaques (diminution de la clairance hépatique de la lidocaïne). Surveillance clinique, ECG et éventuellement contrôle des concentrations plasmatiques de la lidocaïne pendant l'association et après l'arrêt du bêta-bloquant. Adaptation si besoin de la posologie de la lidocaïne. Médicaments susceptibles de donner des torsades de pointes Risque majoré de troubles du rythme ventriculaire, notamment de torsades de pointes. Surveillance clinique et électrocardiographique. Paroxétine avec le métoprolol utilisé dans les indications sauf insuffisance cardiaque Risque de majoration des effets indésirables du métoprolol, avec notamment bradycardie excessive, par inhibition de son métabolisme par la paroxétine. Surveillance clinique accrue ; si besoin, adaptation de la posologie du métoprolol pendant la durée du traitement par la paroxétine et après son arrêt. Propafénone Troubles de la contractilité, de l'automatisme et de la conduction (suppression des mécanismes sympathiques compensateurs). Surveillance clinique et ECG. Terbinafine Chez l'insuffisant cardiaque, risque d'augmentation des effets indésirables du métoprolol, par diminution de son métabolisme hépatique par la terbinafine. Surveillance clinique. Si besoin, adaptation de la posologie du métoprolol pendant le traitement par la terbinafine. Associations à prendre en compte Alpha-bloquants à visée urologique Majoration de l'effet hypotenseur. Risque d'hypotension orthostatique majoré. Anti-inflammatoires non stéroïdiens Réduction de l'effet antihypertenseur (inhibition des prostaglandines vasodilatatrices par les anti-inflammatoires non stéroïdiens et rétention hydrosodée avec les anti-inflammatoires non stéroïdiens pyrazolés). Antihypertenseurs alpha-bloquants Majoration de l'effet hypotenseur. Risque d'hypotension orthostatique majoré. Autres bradycardisants Risque de bradycardie excessive (addition des effets). Dihydropyridines Hypotension, défaillance cardiaque chez les patients en insuffisance cardiaque latente ou non contrôlée (effet inotrope négatif des dihydropyridines, plus ou moins marqué et susceptibles de s'additionner aux effets inotropes négatifs des bêta-bloquants). La présence d'un traitement bêta-bloquant peut par ailleurs minimiser la réaction sympathique réflexe mise en jeu en cas de répercussion hémodynamique excessive. Dipyridamole IV Avec le dipyridamole IV : majoration de l'effet antihypertenseur. Dérivés nitrés et apparentés Majoration du risque d'hypotension, notamment orthostatique. Médicaments à l'origine d'une hypotension orthostatique Risque de majoration d'une hypotension, notamment orthostatique. Pilocarpine Risque de bradycardie excessive (addition des effets bradycardisants). Phénobarbital (et, par extrapolation, primidone) Diminution des concentrations plasmatiques du métoprolol avec réduction de ses effets cliniques (augmentation de son métabolisme hépatique). Rifampicine Diminution des concentrations plasmatiques et de l'efficacité du bêta-bloquant (augmentation de son métabolisme hépatique). * La fréquence plus élevée de 0, 4 % par rapport au placebo a été observée dans une étude de 46000 patients présentant un infarctus du myocarde. Dans cette étude, la fréquence du choc cardiogénique était de 2, 3 % dans le groupe Métoprolol et de 1, 9 % dans le groupe placebo dans le sous-groupe des patients présentant un indice de risque de choc faible. Les effets indésirables suivants ont été rapportés lors de l'utilisation après autorisation de mise sur le marché : état confusionnel, augmentation des triglycérides sanguins et diminution des lipoprotéines de haute densité (HDL). Ces déclarations étant issues d'une population de taille incertaine et étant sujette à des facteurs de perturbation, il n'est pas possible d'estimer de manière fiable la fréquence de ces effets indésirables. Déclaration des effets indésirables suspectés La déclaration des effets indésirables suspectés après autorisation du médicament est importante. Elle permet une surveillance continue du rapport bénéfice/risque du médicament. Les professionnels de santé déclarent tout effet indésirable suspecté via le système national de déclaration : Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé (ANSM) et réseau des Centres Régionaux de Pharmacovigilance - Site internet : . Symptômes Les symptômes de surdosage peuvent inclure une hypotension, une insuffisance cardiaque, une bradycardie et une bradyarythmie, des troubles de la conduction cardiaque et un bronchospasme. L'ingestion concomitante d'alcool, d'antihypertenseurs, de quinidine ou de barbituriques aggrave les signes et symptômes. Les premières manifestations de surdosage apparaissent entre 20 minutes à 2 heures après l'ingestion de METOPROLOL SANDOZ. Les effets d'un surdosage massif peuvent perdurer plusieurs jours, malgré la diminution des concentrations plasmatiques. Conduite à tenir Les soins doivent être dispensés dans un établissement permettant une prise en charge, une surveillance et un encadrement approprié. Si nécessaire, un lavage gastrique et/ou du charbon actif peuvent être administrés. De l'atropine, des stimulants adrénergiques ou un pacemaker peuvent être utilisés pour traiter la bradycardie et les troubles de la conduction. L'hypotension, l'insuffisance cardiaque aigu et l'arrêt cardiaque doivent être traités avec une expansion volémique convenable, un bolus de glucagon (si nécessaire, suivi d'une perfusion de glucagon), une administration intraveineuse de stimulants adrénergiques tels que la dobutamine, des agonistes des récepteurs 1 si présence d'une vasodilatation. Une administration intraveineuse de Ca peut également être considérée. Le bronchospasme peut généralement être traité par des bronchodilatateurs. Le métoprolol se caractérise par trois propriétés pharmacologiques : une activité bêta-bloquante bêta-1 cardiosélective, un effet anti-arythmique, l'absence de pouvoir agoniste partiel (ou d'activité sympathomimétique intrinsèque). Le métoprolol réduit la mortalité à la phase aigu de l'infarctus du myocarde. Le traitement est institué au plus tard avant la 12 heure. Le métoprolol diminue le risque de récidive d'infarctus du myocarde et la mortalité, particulièrement la mort subite. Administré par voie orale, le métoprolol est rapidement absorbé ; la biodisponibilité est comprise entre 40 et 50 % et augmente avec la prise alimentaire. L'effet de premier passage hépatique est modéré. Le pic de concentration plasmatique est atteint au bout de 1 à 2 heures environ. Distribution Le volume de distribution est de 5, 5 L/kg. Le volume de distribution apparent à l'état d'équilibre (Vss) chez les métaboliseurs rapides (4, 84 L/kg) est relativement plus élevé que chez les métaboliseurs lents (2, 83 L/kg). Le métoprolol passe la barrière hémato-encéphalique. Liaison aux protéines plasmatiques : la liaison aux protéines plasmatiques est faible (10 %). Demi-vie d'élimination : la demi-vie d'élimination plasmatique du métoprolol est comprise entre 2, 5 et 5 heures. Le métoprolol n'est pas un substrat significatif de la glycoprotéine P, ce qui indique que la variabilité interindividuelle de la pharmacocinétique du métoprolol est majoritairement due au métabolisme du CYP2D6. Biotransformation Le métoprolol est métabolisé par les enzymes du cytochrome P450. Environ 10 % du métoprolol est transformé au niveau hépatique en un métabolite, l'alpha-hydroxy-métoprolol. Celui-ci est 10 fois moins actif que la molécule-mère. Elimination Le métoprolol est excrété en quasi-totalité par le rein, essentiellement sous forme de métabolites (95 %). La demi-vie d'élimination est de 3 à 4 heures. Chez les métaboliseurs lents, elle peut être de 7 à 9 heures. Après administration orale de 100 mg de métoprolol, la clairance moyenne était respectivement de 31, 168 et 367 L/h chez les métaboliseurs lents, les métaboliseurs rapides et les métaboliseurs ultra-rapides. Proportionnalité de dose Le métoprolol montre un métabolisme pré-systémique saturable conduisant à une augmentation non proportionnelle lors de l'augmentation des doses. Cependant une pharmacocinétique des doses plus proportionnée est attendue avec les formes à libération prolongée. Effet de la nourriture La nourriture augmente le taux d'absorption du métoprolol conduisant à une concentration plasmatique maximum légèrement plus élevée dans un temps plus court. Cependant, cela n'impacte pas significativement la clairance ou le moment o le pic de concentration maximale est observé (Tmax). Afin de minimiser les variations d'effet chez un individu, il est recommandé de prendre METOPROLOL SANDOZ de manière régulière par rapport aux repas : si le médecin demande au patient de prendre METOPROLOL SANDOZ soit avant le petit-déjeuner soit pendant le petit-déjeuner, alors le patient doit continuer à prendre METOPROLOL SANDOZ au même moment durant toute la durée du traitement. Populations spéciales Insuffisance rénale La pharmacocinétique du métoprolol n'est pas impactée chez les patients avec une insuffisance rénale. Cependant, il y a une possibilité d'accumulation de l'un de ses métabolites les moins actifs chez les patients avec une clairance de la créatinine inférieure à 5 mL/min et cette accumulation ne devrait pas influencer les propriétés bêta-bloquantes du métoprolol. Les patients avec une insuffisance rénale peuvent être habituellement traités avec des doses normales. Insuffisance hépatique Puisque le principe actif est d'abord éliminé par le métabolisme hépatique, l'insuffisance hépatique peut impacter la pharmacocinétique du métoprolol. La demi-vie d'élimination du métoprolol est considérablement prolongée (jusqu'à 7, 2 h), selon la sévérité de l'insuffisance hépatique. Il peut être nécessaire de réduire la posologie (voir rubrique 4. 4). Sujet âgé Chez les sujets âgés, la concentration plasmatique du métabolite du métoprolol peut être légèrement augmentée, dû à la fois à une baisse de l'élimination du métabolite et à une diminution du flux sanguin hépatique. Cependant, cette augmentation n'est pas cliniquement ou thérapeutiquement significative. Le métoprolol ne s'accumule pas lors de l'administration de doses répétées. Il n'est pas nécessaire d'adapter la posologie chez les sujets âgés. Grossesse Le métoprolol passe dans le placenta. Le rapport moyen des concentrations sang du cordon/sang maternel de métoprolol est égal à 1. Allaitement Le métoprolol est excrété dans le lait maternel ; le rapport moyen des concentrations lait maternel/sang maternel est de 3, 7. Anastomose porto-cave Des patients avec une anastomose porto-cave ont une clairance systémique lors d'une administration intraveineuse d'approximativement 0, 3 L/min et des valeurs d'aire sous la courbe (AUC) jusqu'à six fois plus élevées que celles des sujets sains. Hyperthyroïdisme L'hyperthyroïdisme peut augmenter la clairance pré-systémique du métoprolol. Différences ethniques Le métabolisme oxydatif du métoprolol est sous contrôle génétique avec une contribution importante du polymorphisme du cytochrome P450 isoforme 2D6. Il y a une différence ethnique marquée dans la prévalence du phénotype de métaboliseur lent. Approximativement 7 % des caucasiens et moins de 1 % des orientaux sont des métaboliseurs lents. Les métaboliseurs lents du CYP2D6 montrent des concentrations plasmatiques en métoprolol plusieurs fois supérieures par rapport aux métaboliseurs rapides ayant une activité CYP2D6 normale. Différences liées au sexe Il n'y a pas de preuve significative suggérant une possible différence au niveau de l'élimination entre les populations mâle et femelle. Aucune adaptation posologique spécifique (liée au sexe) n'est utile pour le métoprolol. Les études de toxicité sur la reproduction chez les souris, les rats et les lapins n'ont pas indiqué de potentiel tératogène pour le tartrate de métoprolol. Une embryotoxicité et/ou une foetotoxicité chez les rats et les lapins ont été mises en évidence, à partir des doses de 50 mg/kg chez le rat et 25 mg/kg chez le lapin, par les augmentations des pertes au stade embryonnaire avant implantation utérine, les diminutions des nombres de fœtus viables par lapine et/ou les diminutions au niveau de la survie néonatale. Des doses élevées ont été associées à une certaine toxicité maternelle et à un retard de croissance de la progéniture in-utéro, qui s'est traduit par une réduction du poids à la naissance. Le tartrate de métoprolol a été associé à des effets indésirables réversibles sur la spermatogenèse, débutant à des doses de 3, 5 mg/kg chez le rat, bien que d'autres études n'aient montré aucun effet du tartrate de métoprolol sur les performances reproductives des rats mâles. Toxicité après administration répétée La toxicité du tartrate de métoprolol, après administration répétée, a été étudiée chez les rats et les chiens. La dose minimale avec effet nocif observé (LOAEL) par voie orale chez les rats et les chiens correspond à des niveaux de doses qui sont d'environ 1, 25 à 6, 25 fois plus élevées que la dose orale maximale recommandée (8 mg/kg), respectivement, et de 2, 5 à 12, 5 fois plus élevées que la dose orale d'entretien (4 mg/kg) de tartrate de métoprolol. Mutagénicité Le tartrate de métoprolol était dénué de potentiel mutagène ou génotoxique dans le test du système cellulaire bactérien (Ames) et dans les essais impliquant des cellules somatiques ou germinales de souris mâles. Cancérogénicité Le tartrate de métoprolol ne s'est pas révélé cancérogène chez les souris et les rats après administration orale de doses allant jusqu'à 800 mg/kg pendant 21 à 24 mois. 3 ans. 30 ou 90 comprimés sous plaquettes (Polypropylène/Aluminium). Toutes les présentations peuvent ne pas être commercialisées. 49 AVENUE GEORGES POMPIDOU 92300 LEVALLOIS-PERRET 34009 376 668 8 6 : 30 comprimés sous plaquettes (Polypropylène/Aluminium). 34009 373 158 9 0 : 90 comprimés sous plaquettes (Polypropylène/Aluminium). Sans objet. Liste I. | BDPM | Medicinal |
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Inactivation virale par méthodes physiques Swan Firquet To cite this version : Swan Firquet. Inactivation virale par méthodes physiques. Médecine humaine et pathologie. Univer- sité du Droit et de la Santé - Lille II, 2014. Français. NNT : 2014LIL2S048. tel-01247888 HAL Id : tel-01247888 Submitted on 4 Jan 2016 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. THESE DE DOCTORAT DE L'UNIVERSITE LILLE 2 Ecole Doctorale Biologie Santé de Lille Pour l'obtention du grade de Docteur de l'UNIVERSITE LILLE 2 Inactivation virale par méthodes physiques Présentée et soutenue par : Swan FIRQUET Le 17 décembre 2014 Devant le jury composé de : Pr. Jean DUBUISSON Pr. Gilles DUVERLIE Pr. Frédéric MORINET Pr. Didier HOBER Président Rapporteur Rapporteur Directeur de thèse FEDER REMERCIEMENTS Soyons reconnaissants aux personnes qui nous donnent du bonheur ; elles sont les charmants jardiniers par qui nos âmes sont fleuries. Marcel Proust Je tiens à exprimer ici toute ma gratitude envers les personnes qui ont contribué de près comme de loin à la réalisation de cette thèse. Pour moi, ces trois années de doctorat ont été avant tout une aventure humaine et je profite de ce moment pour en remercier les acteurs. Dans un premier temps, je tiens à remercier le Pr. Didier HOBER pour m'avoir accordé sa confiance, son temps et son énergie. J'ai eu, grâce à lui, un encadrement exemplaire, des conseils avisés et une vision réaliste de la recherche scientifique. Outre nos discussions scientifiques, j'ai apprécié nos différents débats. Parce que la recherche scientifique commence par la recherche de fonds, à laquelle participe grandement le Pr. HOBER, je voudrais remercier les financeurs du projet de recherche. Parmi eux, nous avons le Fonds Européen de Développement Régional, la région Nord Pas-de-Calais, l'Université Lille 2 et le CHRU de Lille. Que serait le nerf de la guerre sans ses soldats ? Dans cette partie, je souhaite remercier toute l'équipe de recherche du laboratoire de virologie EA3610. J'ai toujours eu de l'enthousiasme à me lever le matin pour aller travailler et je dois cela en grande partie au climat serein et familial qui règne au sein de l'équipe. Plus particulièrement, je remercie du fond du cœur Famara SANE. Je n'ai jamais rencontré un individu de cet acabit : chaleureux, intéressant, ouvert et j'en passe. J'ai partagé avec lui des moments inestimables d'échanges scientifiques, personnels, sur le monde, les idées Son aide m'a été d'un grand secours dans bien des situations. Alors, pour tout cela et plus encore, merci. Je remercie aussi Delphine LOBERT pour son aide et notamment pour ses réponses à ces fameuses questions Sais-tu o je peux trouver ceci ou cela ? . Je sais que cela la fera sourire ; et je profite de ces quelques lignes pour faire l'éloge de sa personnalité, simple et enjouée, qui est un rayon de soleil dans ces terres du Nord. Tout aussi simple, à penser qu'ils se sont bien trouvés, je remercie Pierre-Emmanuel LOBERT pour tout ce qu'il a fait pour moi. Un fournisseur de cellules hors pair et un expert dans la lecture de plaques, deux qualités qui ont sauvé plusieurs expériences. Une étude a montré qu'au cours d'une thèse, un moment de doute est rencontré par le doctorant. Je remercie infiniment mon premier directeur de thèse, le Pr. Daniel IZARD d'avoir su trouver la phrase juste pour me remotiver. Je remercie Mehdi pour son aide et son soutien qui m'ont permis de continuer sereinement l'écriture de mon mémoire. Je remercie aussi toutes les autres personnes que j'ai pu côtoyer au laboratoire pendant ces trois années et qui ont laissé une empreinte positive dans ma mémoire ; en particulier : Kazali, Ilka, Pr. ROMOND, Angélo, Sophie, Céline, Amélie, Laura, Thomas, Quentin, Rémi, Orianne, Firas, Alicia, Jolle, Cindy, Noémie, Anaïs, Khalil, Juliano, Antoine, Cyrielle, Maxime, Aka, Roméo, Darline, Imad, Oussamatou, Pierre J'adresse mes remerciements au Pr. Jean DUBUISSON pour m'avoir fait l'honneur d'accepter de présider mon jury ainsi que le Pr. Gilles DUVERLIE et le Pr. Frédéric MORINET pour avoir accepté d'être mes rapporteurs. Je remercie également mes amis qui m'ont apporté un soutien tout au long de ces trois années. Ils ont réussi les temps d'une heure, d'une soirée, d'un week-end à me changer les idées et me permettre de retourner au travail plus léger. Une mention très spéciale à Kévin qui a su me soutenir jusqu'au bout en me donnant la force chaque matin. Tu as su être le jardinier de mon bonheur. Enfin quel mot terriblement banal pour commencer à exprimer l'indescriptible reconnaissance que je voue à ma famille et mes parents. Vous m'avez tant donné et c'est avec émotion que je vous dis merci ! Merci du fond du cœur. Vous m'avez montré la voie, vous m'avez entouré d'amour et vous avez réussi à me rendre heureux. J'ai tant appris à vos côtés. Merci de m'avoir fait comme je suis. Je vous aime. A mes parents, à mon oncle Eric et à tous ceux qui me sont chers. RESUME Les profils de viabilité sur surface, de virus non enveloppés : Murine Minute Virus (MVM), Coxsackievirus B4 (CVB4), Virus Simien 40 (SV40), et de virus enveloppés : virus de grippe A (H1N1), et virus Herpès Simplex de type 1 (HSV-1), ainsi que la résistance à la chaleur et aux ultraviolets C (UVc) de ces virus ont été étudiés. Pour déterminer la viabilité de MVM, CVB4, H1N1 et HSV-1 sur surface, 50 L de suspension virale ont été déposés sur des couvercles de boites de Pétri et séchés sous un flux d'air avant d'être récupérés et titrés sur des lignées cellulaires appropriées. Les virus enveloppés ont persisté moins de 5 jours alors que CVB4 et MVM sont restés infectieux pendant plusieurs semaines. Cependant, les cycles répétés de séchage et de remise en suspension ont eu un effet plus virucide sur CVB4 que sur H1N1 et HSV-1. Aucun effet des répétitions de ces cycles n'a été observé sur le titre infectieux du MVM. Quant au séchage, les concentrations initiales d'albumine de sérum bovin, de sérum de veau fœtal et de chlorure de sodium, ont un impact sur la survie de CVB4. Dans un milieu riche en protéines, CVB4 a été plus facilement inactivé par le séchage, alors qu'en présence de chlorure de sodium, le pouvoir virucide du séchage a été réduit. Ces résultats montrent que la résistance des virus vis-à-vis du séchage, n'est pas due à une hétérogénéité de populations virales, mais peut être influencée par la composition du milieu et la concentration des composants. Nous avons évalué la résistance thermique de MVM, CVB4, H1N1 et HSV-1 contenus dans des gouttelettes. Quatre microlitres de suspension virale ont été déposés sur une surface chauffée et exposés à des températures comprises entre 70 et 130c pendant 0 à 90min, selon le virus, avant d'être titrés. Clairement, MVM a été plus résistant que H1N1, lui-même plus résistant que HSV-1 et CVB4. Pour la première fois, l'inactivation de particules virales contenues dans des gouttelettes exposées à des températures supérieures à 100C a été étudiée. Il apparat que le chauffage peut provoquer un effet plus rapidement virucide que décrit précédemment. La résistance aux UVc (254nm) de MVM, CVB4, H1N1, HSV-1 et SV40 contenus dans des gouttelettes a été évaluée. Les virus à ADN double brins (HSV-1 et SV40) restaient infectieux après une exposition à 60mJ/cm d'UVc, tandis que les virus à ARN (H1N1 et CVB4) et un virus à ADN simple brin (MVM) ont été totalement inactivés par une exposition inférieure ou égale à 35mJ/cm d'UVc. De plus, l'effet des UVc combinés à la chaleur sur la viabilité de MVM a été déterminé. Le titre infectieux de MVM, contenu dans une gouttelette a été totalement inactivé après une exposition à 27mJ/cm d'UVc. Le chauffage (20s à 100C) a provoqué une réduction modérée du titre viral de MVM (-1. 8 log10TCID50), alors que le chauffage, suivi par une exposition à 17mJ/cm d'UVc, entraine une inactivation complète. En conclusion, nos études montrent que les virus peuvent persister pendant des jours, voire des semaines, sur une surface hydrophobe. Le profil de résistance des virus vis-à-vis du séchage, n'est pas dû à une hétérogénéité de populations virales, comme l'ont montré les résultats obtenus avec CVB4. De plus, dans la mesure o la composition du milieu joue un rôle dans la viabilité des virus exposés au séchage, la persistance des virus devrait être étudiée dans des milieux naturels plutôt que dans des milieux définis. L'impact de temps d'exposition courts à la chaleur sur les virus contenus dans de petits volumes de suspension a été déterminé. La résistance thermique de H1N1 jusqu'à 100C, supérieure à celle d'HSV-1, un autre virus enveloppé, et à celle de CVB4, un virus non-enveloppé, a été observée. Une inactivation virale efficace peut être obtenue en combinant une exposition aux UVc et à la chaleur comme le montrent les résultats obtenus avec MVM. SOMMAIRE LISTE DES ABREVIATIONS . 1 INTRODUCTION . 3 1) Les virus . 3 a) Classification . 3 b) Les virus modèles . 6 c) Les virus enveloppés . 7 i) L'Herpès Simplex Virus de type 1 ii) Le virus de la grippe : H1N1 d) Les virus non-enveloppés . 9 i) Le Coxsakievirus B4 ii) Le Virus Simien 40 iii) Le Murine Minute Virus 2) La persistance virale . 13 3) L'inactivation virale . 19 a) Moyens chimiques . 19 b) Moyens physiques . 20 i) La chaleur ii) Les ultraviolets 4) Objectifs de l'étude . 50 MATERIELS ET METHODES . 52 RESULTATS . 59 1) Persistance du pouvoir infectieux de virus enveloppés et non- enveloppés déposés sur une surface . 59 2) Inactivation rapide de virus contenus dans des gouttelettes appliquées sur une surface chauffée . 65 3) Résistance des virus aux UVc et effet de la combinaison UV-chaleur sur MVM . 72 DISCUSSION GENERALE . 77 1) Persistance du pouvoir infectieux de virus, enveloppés et non- enveloppés, déposés sur une surface. 77 2) Inactivation rapide de virus contenus dans des gouttelettes appliquées sur une surface chauffée . 82 3) Résistance des virus aux UVc et effet de la combinaison UVc- chaleur sur le MVM . 87 CONCLUSION ET PERSPECTIVES . 90 BIBLIOGRAPHIE . 92 ANNEXES . 111 LISTE DES ABREVIATIONS C m Degré Celsius micromètre ADN Acide Désoxyribonucléique ARN Acide Ribonucléique BSA Albumine Sérique Bovin Ct Cycle threshold CVB4 Coxsackievirus B4 DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium ECP Effet Cytopathique H1N1 Virus de la grippe A H1N1 HR Humidité Relative HSV-1 Herpès Simplex Virus type 1 J kb Joule kilo base log logarithme MDCK Madin-Darby Canine Kidney - 1 - MEM Minimum Essential Medium min minute MVM Murine Minute Virus NaCl chlorure de sodium nm pb nanomètre paire de base PBS tampon phosphate salin PEG Polyéthylène Glycol PSMII Poste de Sécurité Microbiologique de classe II RT-qPCR rétrotranscription et réaction en chane par polymérase en temps réel s seconde SV40 Virus Simien 40 SVF Sérum de Veau Fœtal TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose UV Ultraviolets UVc Ultraviolets C vs versus VSV Virus de la stomatite vésiculaire - 2 - INTRODUCTION 1) Les virus a) Classification Les maladies sont connues depuis plusieurs millénaires, mais ce n'est qu'à partir du milieu du XVIe siècle, avec Girolamo FRACASTORO (1478-1553), que commencent les premières hypothèses sur des agents infectieux et contagieux invisibles à l'œil nu. A partir de ce moment, plusieurs dates ont marqué l'histoire de la découverte des virus (figure 1). De nos jours, on distingue le virus du virion, comme l'a suggéré Bândae en 1983. Le virion est la forme de transition du virus pour la propagation de ce dernier. Les virions peuvent être différenciés selon : leurs hôtes, ce qui était la première méthode de classification utilisée. la nature de leur acide nucléique (ADN ou ARN) et son mode d'expression. A noter que les virus ont un génome compris entre 200 (virus satellite du virus de la panachure jaune du riz) et plusieurs centaines de milliers de nucléotides. Par exemple, le bactériophage G (Bacillus Megaterium phage G) possède un génome de 670 kpb (Donelli et al. , 1975). leur capside qui répond à une symétrie soit hélicoïdale, soit icosaédrique. Certains virus d'archées se distinguent par leur forme très différente (ovoïdes ou en filaments) (Prangishvili et al. , 2006). la présence ou non d'une enveloppe. leur taille qui se situe entre 10 et 400 nanomètres. Le plus petit virus connu est le virus Delta, qui parasite lui-même celui de l'Hépatite B (Gish, 2013). Il ne comporte qu'un - 3 - seul gène. L'un des plus gros virus connu est le Mimivirus, avec un diamètre qui atteint 750 nanomètres (Mutsafi et al. , 2013). Le plus grand virus connu, le virus Ebola, est une particule filamenteuse pouvant atteindre une longueur de 14m (Geisbert and Jahrling, 1995). - 4 - Figure 1 : Chronologie de la découverte des virus - 5 - b) Les virus modèles Dans le but d'étudier l'inactivation virale, plusieurs modèles de virus ont été utilisés au cours de la thèse. Plusieurs critères ont été pris en compte pour le choix des virus : facilité de culture, titre élevé, virus possédé par le laboratoire et/ou virus responsable d'infections nosocomiales. Nous avons ainsi sélectionné les virus enveloppés, l'Herpès Simplex Virus de type 1, le virus de la grippe H1N1, et les virus nonenveloppés, Virus Simien 40, Coxsackievirus B4, Murine Minute Virus. - 6 - c) Les virus enveloppés i) L'Herpès Simplex Virus de type 1 Le HSV-1 (Figure 2) est un virus à ADN double brins de la famille des Herpesviridae (Huraux JM et al. , 2003). HSV-1 est responsable d'infections buccales, ophtalmiques et encéphaliques (Whitley and Roizman, 2001). L'HSV-1 Famille : Herpesviridae Sous-famille : Alphaherpevirinae Genre : Simplex Virus Taille : 120 à 200 nm Génome : ADN bicaténaire, linéaire 152kb, 84 gènes Nucléocapside : Icosaédrique (162 capsomères) Enveloppe dérivée de la membrane nucléaire interne Réplication dans le noyau Figure 2 : Image d'HSV-1 piégé dans la glace. Barre 50 nm. (Rochat et al. , 2011) (Rochat et al. , 2011) L'HSV-1 est cultivé dans plusieurs lignées cellulaires humaines ou animales (Fibroblastes, Vero, RK13, Hep-2, HeLa ), (Huraux JM et al. , 2003). Il est responsable d'un ECP caractéristique en grappe de raisin (cellules rondes et réfringentes) qui apparait après 2-3 jours (Huraux JM et al. , 2003). - 7 - ii) Le virus de la grippe : H1N1 Les virus de la grippe (Influenzaviruses) sont des virus enveloppés à ARN simple brin segmenté de polarité négative qui appartiennent à la famille des Orthomyxoviridae (Fauquet et al. , 2005). Cette famille comprend cinq genres : Trois d'entre eux formant le groupe des virus de la grippe : Influenzavirus A (grippe A), Influenzavirus B (grippe B) et Influenzavirus C (grippe C) ; et deux autres : Thogotovirus et Isavirus. La classification en sous-types des virus grippaux ne s'applique qu'aux virus de type A. Elle est basée sur les propriétés antigéniques des deux principales glycoprotéines de surface des virus : l'Hémagglutinine (HA ou H) et la Neuraminidase (NA ou N). Il existe : 16 sous- types HA, 9 sous-types NA, ce qui fait théoriquement 144 (16x9) sous-types possibles. Seuls les virus H1N1 (Figure 3), H2N2 et H3N2 causent la grippe saisonnière et les pandémies du XXème et XXIème siècle. Le H1N1 Famille : Orthomyxoviridae Genre : Influenzavirus A Taille : 80 à 120 nm Génome : (Golds mith et al. , 2011) ARN simple brin segmenté de polarité négative 152kb, 84 gènes Nucléocapside : Icosaédrique (162 capsomères) Enveloppe dérivée de la membrane plasmatique Réplication dans le noyau Figure 3 : H1N1 observé on microscope électronique. Barre 100 nm (Goldsmith et al. , 2011) Le virus H1N1 est cultivé sur des MDCK. Il crée un ECP visible en 2 à 4 jours. - 8 - d) Les virus non-enveloppés i) Le Coxsakievirus B4 Le Coxsackievirus B4 (figure 4) est un virus à ARN simple brin à polarité positive de la famille des Picornaviridae et du genre Enterovirus (Huraux JM et al. , 2003). Le rôle du Coxsackievirus B4 dans le diabète de type 1 est fortement suspecté (Hober and Sauter, 2010). Le CVB4 est transmis selon un mode fécal-oral, mais la voie respiratoire est également évoquée (Fields et al. , 2007) (Oberste, 2008). Le Coxsackievirus B4 Famille : Picornaviridae Genre : Enterovirus Taille : 28 à 30 nm Génome : ARN monocaténaire linéaire, positif 7, 5kb Capside : Icosaédrique (60 protoomères) Virus non-enveloppé Réplication dans le cytoplasme Figure 4 : CVB4 vu en microscopie électronique for disease (centers control and prevention) Le CVB4 est cultivé sur de nombreuses lignées humaines (Hep-2, HeLa, RD ) ou animales (Vero, BGM), (Huraux JM et al. , 2003). L'ECP est visible en 3-5 jours. - 9 - ii) Le Virus Simien 40 Le Virus Simien 40 (SV40) (Figure 5) est un polyomavirus isolé chez un macaque rhésus (Cole, 1996), (Butel and Lednicky, 1999), (Butel, 1994). Il était présent mais introuvable dans des cultures de cellules de rein de singe utilisées pour préparer les vaccins poliovirus inactivés ou atténués, ainsi que d'autres vaccins viraux (Sweet and Hilleman, 1960). Par conséquent, entre 1955 et 1963, des millions de personnes ont été exposées au SV40 quand des vaccins contaminés par le SV40 leur ont été administrés (Fraumeni et al. , 1963), (Lewis, 1973), (Shah and Nathanson, 1976), (Geissler, 1990). Les sources majeures de l'exposition à SV40 étaient les vaccins à poliovirus. Malgré les moyens d'inactivations utilisés pour la production de vaccins, le SV40 peut conserver son pouvoir infectieux. Carte d'identité du virus simien 40 Famille : Polyomaviridae Genre : Polyomavirus Taille : 28 à 30 nm Génome : ADN monocaténaire linéaire 7, 5kb Capside : Icosaédrique (60 protomères) Virus non-enveloppé Réplication dans le cytoplasme Figure 5 : particules de SV40 accrochées à la membrane cytoplasmique 10 min après inoculation à une culture de BSC-1 (Brown and Lewis, 1998) (x73 500) (Brown and Lewis, 1998) Le SV40 se cultive dans des lignées cellulaires issues de reins de singe vert africain tel que BSC-1 et CV1. Dans ces cellules, l'effet cytopathique prend 3-4 jours et produit environ 300 virions infectieux par cellule infectée (Pipas, 2009). - 10 - iii) Le Murine Minute Virus Le Murine Minute Virus (MVM) (Figure 6) appartient à la famille des Parvoviridae (Willwand et al. , 1997). Le MVM est un virus murin communément utilisé en laboratoire à cause de sa nature hautement infectieuse et sa facilité de culture (Baker, 1998). Ce virus peut être transmis via les fèces et les urines mais aussi via les fomites et les sécrétions nasales (Baker, 1998). Typiquement, il n'y a pas de signe clinique d'infection à l'âge adulte, cependant, des infections expérimentales ont causé de multiples dommages pendant le développement fœtal ou rapidement après la naissance (Baker, 1998) Le murine minute virus Famille : Parvoviridae Genre : Protoparvovirus Taille : 1828 nm Génome : ADN simple brin 5 kb Capside : Icosaédrique (60 protoomères) Virus non enveloppé Réplication dans le noyau Figure 6 : MVM vu en microscopie électronique (Livingston et al. , 2002) (Livingston et al. , 2002) Le MVM se cultive sur des cellules A9 et donne un ECP en 15-20 jours. - 11 - Les effets cytopathiques de HSV-1, H1N1, CVB4, SV40 et MVM sur, respectivement les cellules Vero, MDCK, HEP-2, BSC1 et A9, sont illustrés dans la figure 7. Figure 7 : Photographies de cultures de Vero (A), MDCK (B), Hep-2 (C), BSC1 (D) et A9 (E) et des ECP sur ces cellules, respectivement provoqués par HSV-1 (A'), H1N1 (B'), CVB4 (C'), SV40 (D') et MVM (E'). Grossissement X160. - 12 - 2) La persistance virale Le Rhinovirus 2, un petit entérovirus (30nm), non enveloppé, persiste de 2 heures à 7 jours selon les articles (Reed, 1975), (Sattar et al. , 1987). Poliovirus de type 2, un autre entérovirus, résiste entre 1 jour et 8 semaines selon les articles (Mahl and Sadler, 1975), (Abad et al. , 2001). Du coté des virus enveloppés, le Coronavirus, un virus de 80-90 nm, persiste 3 heures (Sizun et al. , 2000), (Gagneur et al. , 2002) et le virus de la Vaccine, dont l'enveloppe est néoformée (Smith et al. , 2002), est un grand virus (360 270 250 nm) qui persiste de 3 à plus de 20 semaines, selon les travaux (Mahnel, 1987), (Mahl and Sadler, 1975). De nombreux paramètres peuvent influencer la persistance des virus dans leur environnement : la température : assez logiquement, il a été montré que plus la température augmente plus la résistance à la dessiccation des virus diminue (Mbithi et al. , 1991) le type de support : selon que le support est poreux ou non, la résistance des virus est différente. Par exemple, le virus de l'Hépatite A est plus sensible sur les matériaux poreux, comme le papier, que sur les matériaux non poreux, comme la porcelaine (Abad et al. , 1994). Au contraire, le Poliovirus 1 et l'Adénovirus type 40 sont plus résistants sur les matériaux poreux (Abad et al. , 1994). Certains métaux comme l'argent, le cuivre et le fer inactivent les virus (Lara et al. , 2010), (Chen et al. , 2013), (Kim et al. , 2011) l'humidité relative : la relation entre l'humidité relative et la viabilité virale a été reportée par Sobsey et Meschke (Sobsey and Meschke, 2003). En général, les virus enveloppés qui contiennent une membrane lipidique survivent mieux à faible humidité relative ( tandis que les virus non-enveloppés sont plus stables lorsque l'humidité relative - 13 - est plus élevée (>70%) (Sobsey and Meschke, 2003). Cependant, il y a de nombreuses exceptions qui demeurent inexpliquées (tableau 1). Le virus du Sarcome de Rous (famille : Retroviridae) et de la Rhinotrachéite Infectieuse Bovine (famille : Herpesviridae), deux virus enveloppés, sont plus stables lorsque l'humidité relative est élevée, et, la persistance du Poxvirus du Pigeon (famille : Poxviridae), lui aussi enveloppé, n'est pas influencé par le taux d'humidité relative (Songer, 1967)(Webb et al. , 1963). Il y a aussi des exceptions parmi les virus non enveloppés, par exemple, le Calicivirus Félin et le virus de l'Exanthème Vésiculeux type E (famille : Caliciviridae) sont tous les deux stables à faible humidité relative (Donaldson and Ferris, 1976) la vitesse du flux d'air : il a été montré qu'un flux d'air au-dessus du liquide permet un brassage des virus augmentant ainsi leur exposition à l'interface air liquide. (Ward and Ashley, 1979) la composition en sels : lors du séchage, la concentration en sels augmente ce qui peut être toxique pour les virus. Cet effet peut être diminué quand la solution cristallise. Ainsi dans un liquide l'effet toxique des sels se situe juste avant le point de cristallisation. L'effet toxique des sels a été observé sur plusieurs virus comme le virus de la grippe A (Yang et al. , 2012). Un effet protecteur des sels, lors de la réhydratation, a été observé sur des virus non-enveloppés, comme les entérovirus. Dans ce cas, les sels ralentissent le processus de réhydratation évitant ainsi un brutal changement d'environnement (Benbough, 1971). la taille de l'inoculum : plus la taille de l'inoculum augmente, plus le rapport surface sur volume diminue, ce qui réduit l'effet de l'interface air liquide. - 14 - Famille Virus Survie aux HR* : faible moyenne forte Notes Milieu Références Caliciviridae Coronaviridae Calicivirus Félin Virus de l'Exanthème Césiculeux SARS Coronavirid ae Coronavirus Flaviviridae Langat - - - - - - - Survie plus élevée d'HR et plus faible entre 40-80% d'HR Survie plus élevée à 20%, diminue avec l'augmentation de l'HR, la plus faible à 60% et augmente aux HR >60% Inactivation sur gouttelettes ; stable entre 40-50% d'HR et plus rapidement inactivé à de plus forte HR Survie la plus élevée à env. 20% HR, la plus faible entre 40-60% HR et moyenne >70% HR Survie la plus élevée à env. 20% HR, la plus faible à 50% HR et moyenne >70% HR milieu MEM milieu d'Eagle (Donaldson and Ferris, 1976) (Donaldson and Ferris, 1976) milieu de culture (Chan et al. , 2011) milieu de culture (Benbough, 1971) Solution salée (NaCl, KCl, LiCl) (Benbough, 1971) La survie diminue avec l'augmentation de l'HR Milieu dessalé (avec protéines) (Benbough, 1971) Survie élevée entre env. 20-95% d'HR Dessalé et sans protéine (Benbough, 1971) - Survie la plus élevée entre 20-70% d'HR Dessalé et sans protéine plus 0, 1% et plus faible >70% d'HR BSA (Benbough, 1971) - 15 - Herpesviridae Rhinotrachéite - Virus de la Orthomyxoviridae Bovine Virus de la grippe A Picornaviridae Poliovirus (type 1) - - - - - - - - - - - - Survie plus faible à 10% et 35% qu'à 90% d'HR milieu de culture (Songer, 1967) Survie la plus élevée entre 15-40% d'HR et 10 fois plus faible entre 50-95% d'HR Allantoïd et 2% peptone (Hemmes et al. , 1960) (Hemmes et al. , 1962) La survie diminue avec l'augmentation d'HR Allantoïd dilué au 1 : 8 ou 1 : 10 dans du tampon caséine Mcllvaine (Harper, 1961) (pH7, 2) Survie la plus élevée entre 30-34% HR, la plus faible entre 58-60% HR et moyenne entre 66-70%HR Survie la plus élevée HR, la plus faible entre 40-60% HR et moyenne >60%HR Allantoïd avec 0, 1M de tampon phosphate Sorensen (pH7, 1) (Shechmeister, 1950) MEM ; MEM plus 0, 1% BSA ; allantoïd (Schaffer et al. , 1976) pas de survie à 20% et 50%, élevée à 80% d'HR Milieu de Earle (Harper, 1963) (Harper, 1961) pas de survie à 20% et 50%, élevée à 80% d'HR pas de survie à 20% et 50%, élevée à 80% d'HR eau (Harper, 1963) 0, 5% de gélatine (Harper, 1963) - 16 - Poxviridae Retroviridae Virus de la Vaccine Poxvirus du Pigeon Retrovirid ae Sarcome de Virus du Rous - - - - - - - pas de survie à 20% et 50%, élevée à 80% d'HR pas de survie à 20% et 50%, élevée à 80% d'HR pas de survie à 20% et 50%, élevée à 80% d'HR tampon phosphate (Harper, 1963) 0, 1% cystéine (Harper, 1963) 0, 5% Na2SO4 (Harper, 1963) survie moyenne à toutes les HR 0, 65% KCl (Harper, 1963) Survie moyenne la plus faible entre 45-60% et la plus élevée >60% d'HR milieu de culture clarifié (Benbough, 1971) Survie moyenne la plus faible à environ 70% et la plus élevée >80% d'HR milieu dessalé et sans protéines (Benbough, 1971) Survie similaire entre 20-84% d'HR est un peu plus faible à environ 80% d'HR Tampon de Mcllaine (acide citrique/ disodium de phosphate) plus 1% de sérum de cheval (Harper, 1961) (Harper, 1963) Survie élevée à toutes les HR - minimum à 30% d'HR et augmente entre La survie diminue entre 10-30%, 30-100% d'HR - 17 - Eau Eau (Webb et al. , 1963) (Webb et al. , 1963) Togaviridae Survie élevée à toutes les HR 6% i-inositol - - La survie diminue avec l'augmentation de l'HR 0, 005M de tampon de citrate (Webb et al. , 1963) (Webb et al. , 1963) Virus de la Togavirid ae Forêt de Semlik - Survie la plus élevée entre 20-60% d'HR et plus faible à env. 85% d'HR Dessalé (Benbough, 1971) - - Survie la plus élevée entre 20-40% d'HR et plus faible entre 50-85% d'HR Milieu dessalé plus 5% NaCl (Benbough, 1971) *Cette colonne indique le niveau de survie en Humidité Relative faible ( moyenne (entre 50 et 70%) et forte (>70). signifie une survie élevée (en général >10% de survie). indique une survie environ 10 fois plus faible que . - indique une survie plus faible que les deux autres cas. Tableau 1 : relation entre l'humidité relative (HR) et la survie de plusieurs virus - 18 - 3) L'inactivation virale a) Moyens chimiques L'inactivation virale par méthodes chimiques regroupe de nombreux agents : les alcools qui ont une meilleure efficacité sur les virus enveloppés que les virus nus (McDonnell, 2007). L'explication la plus plausible de l'action des alcools est la dénaturation des protéines. L'alcool détruit les structures des surfaces lipidiques des virus enveloppés (McDonnell 2007). les ions chlorures que l'on retrouve dans l'eau de javel. L'action des ions chlorures n'est pas encore élucidée, mais l'oxydation des acides aminées et des nucléotides est supposée (Gerba and Rusin, 2001). les formaldéhydes et glutaraldéhydes sont très efficaces contre les virus. Ils agissent sur les protéines et les acides nucléiques par un procédé d'alkylation (Block, 2001) le peroxyde d'hydrogène inactive les virus en produisant des radicaux libres qui modifient les lipides, les acides nucléiques et les protéines des virus (Sattar et al. , 1998) l'iode agirait sur la dénaturation des protéines et des acides nucléiques. l'ortho-phthalaldéhyde a un mode d'action similaire au glutaraldéhyde et au formaldéhyde (Simons et al. , 2000), (Cabrera-Martinez et al. , 2002). l'acide péracétique, dont l'action est peu connue, semblerait agir comme les autres agents oxydants qui dénaturent les protéines (Block, 2001). les ammoniums quaternaires, de par leurs propriétés tensioactives, vont cibler les lipides des virus, ce qui en fait un élément préférentiellement efficace contre les virus enveloppés (Block, 2001). les métaux, comme l'argent, le cuivre et le fer ont montré une activité virucide (Chen et al. , 2013)(Kim et al. , 2011)(Lara et al. , 2010). - 19 - l'ozone, un gaz, crée des radicaux libres. le gaz d'oxyde éthylène est utilisé à une température comprise entre 37 et 63C, à une humidité relative de 40 à 80% et à une durée d'exposition de 1 à 6 heures. Il agit sur les protéines et les acides nucléiques par un procédé d'alkylation (Block, 2001). b) Moyens physiques Les procédés d'inactivation virale par méthodes physiques ont une similarité d'action. Ils apportent de l'énergie qui inactive le virus. Ces méthodes sont : le plasma de peroxyde d'hydrogène, qui crée des radicaux libre, modifie les lipides, les acides nucléiques et les protéines des virus (Kyi et al. , 1995)(Roberts and Antonoplos, 1998). les micro-ondes produisent une friction des molécules d'eau par un changement de champ électrique. Cette friction permet de générer de la chaleur qui inactive les virus (Sanborn et al. , 1982), bien que certain auteurs pensent qu'il y a un effet létal non thermique (Najdovski et al. , 1991), (Rosaspina et al. , 1994), (Welt et al. , 1994). les bains à ultrason permettent d'inactiver les virus par un phénomène de cavitation qui créé des turbulences à l'échelle microscopique entrainant une destruction virale. (Wichelhaus et al. , 2006). La chaleur et les UVc sont deux autres moyens physiques d'inactivation présentés ci- après. - 20 - i) La chaleur La notion de chaleur, au sens scientifique du terme, est définie comme un transfert thermique qui ne doit pas être confondu avec la température. C'est un transfert d'énergie désordonnée à l'échelle microscopique qui se traduit par des chocs aléatoires entre particules. Trois modes de transfert existent (Chéron, 1999) : la conduction thermique : un phénomène de diffusion propage l'énergie de proche en proche sans transfert de matière sous l'effet d'un gradient de température. la convection : les différences de températures dans un liquide ou un gaz créent des différences de masse volumique qui induisent un mouvement naturel des particules en fonction de la gravité. le rayonnement : tout corps ayant une température supérieure au zéro absolu émet un rayonnement électromagnétique appelé rayonnement thermique. Ces trois modes de transfert sont utilisés par différents procédés pour la lutte contre les micro-organismes. Parmi eux, on distingue la stérilisation par chaleur humide, par chaleur sèche et par infrarouge. De toutes les méthodes disponibles pour la stérilisation, la chaleur humide sous la forme de vapeur saturante sous pression est la plus largement utilisée et la plus fiable. La stérilisation par vapeur saturante est non toxique est peu couteuse (Adler et al. , 1998). Elle est effectuée dans un autoclave o quatre facteurs sont déterminants : la température, la vapeur, la pression et le temps. Les deux cycles classiques de stérilisation par autoclaves sont 121C, - 21 - pendant 30 minutes, et 132C, pendant 4 minutes. La chaleur humide détruit les virus par une coagulation irréversible et une dénaturation des protéines. La stérilisation par chaleur sèche est utilisée pour les matériaux qui ne peuvent subir de stérilisation par chaleur humide. La stérilisation par chaleur sèche est une méthode non toxique relativement peu couteuse. Les inconvénients de cette technique sont le temps nécessaire à la stérilisation et l'incompatibilité des hautes températures associées avec les matériaux thermosensibles. Les cycles communs d'utilisation sont 60 minutes à 170C, 120 minutes à 160C et 150 minutes à 150C. Le mode d'action principale de ce processus est l'oxydation irréversible des protéines. La stérilisation par infrarouge est une méthode plus récemment développée. Les infrarouges permettent de chauffer uniquement le matériel à stériliser. Ils ont l'avantage de permettre une rapide élévation de la température avec une consommation énergétique réduite. Le mode d'action étant identique à celui de la chaleur sèche. On remarque facilement que les cycles recommandés pour la chaleur sèche sont plus longs et à des températures plus élevées que pour la chaleur humide. Cela est expliqué dans le cas des virus par le fait qu'un virus séché est plus résistant qu'un virus en milieu liquide (Sauerbrei and Wutzler, 2009). Un exemple parlant est l'inactivation du Parvovirus Bovin lyophilisé avec une humidité résiduelle ou égale à 8%. Dans le premier cas, 7h30 sont nécessaires pour avoir 4 log de réduction du titre viral alors que, dans le second cas, 15 minutes sont nécessaires (Bruniger et al. , 2000). La réduction du titre viral dû à la température, est classiquement représentée à l'aide d'un modèle exponentiel de premier ordre développé par Stumbo et al. (Stumbo, 1973). Ce modèle considère que l'inactivation virale est due à la destruction de composants viraux essentiels. L'équation retenue étant la suivante : - 22 - lnN lnN0 kt o N est le nombre de virus, N0 est le nombre initial de virus et k est le coefficient d'inactivation en s-1. Cette équation a été réarrangée en : log 0 log o D est le facteur de réduction décimale (égale à 2. 303/k) exprimé en s ou min. Il correspond au temps nécessaire pour avoir une réduction de 90% de la population virale initiale (figure 8) x u e i t c e f n i s u r i v e d % 100 10 1 0. 1 0. 01 0. 001 0. 0001 0 1D 2D 3D 4D 5D 6D Temps Figure 8 : Illustration de l'évolution du pourcentage de virus infectieux suivant un modèle exponentiel de premier ordre. Pour la stérilisation par la température, un temps correspondant à 12 fois le facteur de réduction décimale est recommandé (Van Boekel, 2002). En échelle logarithmique, ce modèle est linéaire. Cependant même si le modèle exponentiel de premier ordre est largement utilisé, de nombreuses courbes d'inactivation ne semblent pas obéir à ce modèle. En effet, certaines courbes d'inactivation présentent des épaulements ou des formes concaves (Cerf, 1977). - 23 - L'explication la plus probable étant que dans la population d'un même virus, plusieurs sous- populations existent avec leurs propres modèles d'inactivation donnant ainsi des courbes non linéaires en échelle logarithmique. Pour modéliser ces courbes le modèle de Weibull a été développé dont l'équation de survie est la suivante : log 1 2. 303 o et sont deux constantes déterminées expérimentalement. On remarque que l'on obtient de nouveau le modèle de premier ordre quand 1 Le tableau 2 regroupe les données de la littérature et met en évidence une grande disparité de résistance entre les virus, ceux qui appartiennent à la famille des Parvoviridae étant les plus résistants (Boschetti et al. , 2003), (Eterpi et al. , 2009), (Harris et al. , 1987), (Blmel et al. , 2008), (Sauerbrei and Wutzler, 2009). Pour un même virus, des résistances différentes sont rapportées. Par exemple, Seo et al. (Seo et al. , 2012) observent une réduction d'un facteur 10 du norovirus murin à 60C en 2, 86 min alors que Bozkurt et al. obtiennent une réduction d'un facteur 10 en 0, 57 min (Bozkurt et al. , 2013). Plusieurs facteurs peuvent faire varier l'efficacité de l'inactivation thermique comme la composition du milieu et pour la chaleur sèche le taux d'humidité (Blmel et al. , 2008), (Bruniger et al. , 2000), (McDevitt et al. , 2010). - 24 - Famille Virus Chaleur Température D (C) (min) Temps Réduction (log) Notes Références Adenoviridae Adénovirus type 5 sèche sèche sèche sèche sèche sèche Adénovirus type 6 sèche Adénovirus type 7 humide Adénovirus type 8 humide Birnaviridae Virus de la Nécrose Pancréatique Infectieuse humide humide 75 75 80 85 85 95 90 70 90 60 70 1h 2h 10min 1h 2h 1h 1min 10 min 1 min 288 16 - 25 - 0, 7 1, 9 3, 8 1, 2 >5, 5 3, 7 3, 9 >4, 1 >4, 1 (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Eterpi et al. , 2009) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Eterpi et al. , 2009) (Eterpi et al. , 2009) (Eterpi et al. , 2009) (Nygaard et al. , 2012) (Nygaard et al. , 2012) humide humide 80 90 2, 7 0, 48 Capsicum Chlorosis Virus humide 71, 3 1min 3 (Nygaard et al. , 2012) (Nygaard et al. , 2012) (Duizer et al. , 2004) (Bozkurt et al. , 2013) (Bozkurt et al. , 2013) (Bozkurt et al. , 2013) (Seo et al. , 2012) (Bozkurt et al. , 2013) (Bozkurt et al. , 2013) (Seo et al. , 2012) (Bozkurt et al. , 2013) (Seo et al. , 2012) (Duizer et al. , 2004) (Roberts and Antonoplos, 1998) Caliciviridae Calicivirus Félin-F10 humide Calicivirus Félin-F11 humide Calicivirus Félin-F9 humide Norovirus Murin humide humide humide humide humide humide 65 72 60 60 60 65 70 72 85 Coronaviridae Coronavirus Félin humide 71, 3 Flaviviridae Diarrhée Virale Bovine sèche 80 0, 32 0, 11 de 0 à 3 min de 0 à 5 2, 86 0, 57 de 0 à 3 min de 0 à 4 1min 8h 3 1, 6 0, 30 1, 19 0, 15 1, 06 - 26 - Herpesviridae Virus Pseudorabique humide humide sèche sèche 80 80 sèche 100 24h 72h 2, 3 2, 9 30 min >6, 6 1h 2h 1h 2h 1h 2h 2h 3h 0, 9 1 1, 5 1, 7 2, 8 >4 3 4 - 27 - (Roberts and Antonoplos, 1998) (Roberts and Antonoplos, 1998) (Dichtelmller et al. , 1996) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Mpandi et al. , 2007) (Mpandi et al. , 2007) sèche sèche sèche sèche sèche sèche 75 75 85 85 95 95 47 55 Virus de l'Herpès Porcin sèche 100 30 min 5, 7 Leviviridae Phage MS2 Orthomyxoviridae Virus de la grippe A H1N1 humide humide humide sèche sèche sèche sèche sèche sèche sèche 15min 30min 60min 15min 30min 1, 2 1, 5 1, 8 4, 1 >5 15min >5, 2 15min 1, 8 60 70 85 60 60 60 60 60 60 65 7, 14 0, 93 0, 48 - 28 - 25% humidité dans l'air 25% humidité dans l'air 25% humidité dans l'air 50% humidité dans l'air 50% humidité dans l'air 75% humidité dans l'air 25% humidité dans l'air (Dichtelmller et al. , 1996) (Seo et al. , 2012) (Seo et al. , 2012) (Seo et al. , 2012) (McDevitt et al. , 2010) (McDevitt et al. , 2010) (McDevitt et al. , 2010) (McDevitt et al. , 2010) (McDevitt et al. , 2010) (McDevitt et al. , 2010) (McDevitt et al. , 2010) Virus de la grippe A H1N2 Virus de la grippe A H1N3 Virus de la grippe A H1N4 Virus de la grippe A H1N5 Virus de la grippe A H1N6 sèche sèche sèche sèche humide humide humide humide humide humide 65 65 65 65 70 70 70 80 80 90 30min 60min 2, 2 3, 1 15min >5, 1 15min >5, 1 1min 0, 55 2, 5min 3, 06 5min >6, 2 1min 1, 37 2, 5min >6, 14 1min >8, 04 - 29 - 25% humidité dans l'air 25% humidité dans l'air 50% humidité dans l'air 75% humidité dans l'air (McDevitt et al. , 2010) (McDevitt et al. , 2010) (McDevitt et al. , 2010) (McDevitt et al. , 2010) (Jeong et al. , 2010) (Jeong et al. , 2010) (Jeong et al. , 2010) (Jeong et al. , 2010) (Jeong et al. , 2010) (Jeong et al. , 2010) Virus de la grippe A H5N2 Virus de la grippe A H7N2 humide humide 59 60 0, 4 0, 5 Papillomaviridae Papillomavirus Bovin sèche 100 30 min 1, 4 Paramyxoviridae Paramyxovirus Aviaire sérotype 1 humide Virus de la Maladie de Newcastle humide humide Parvoviridae Murine Minute Virus humide humide humide humide humide humide de 0 à 60 min de 0 à 4 10min 10min 10min 10min 10 min 0, 3 0, 6 0, 4 4 >5 59 61 63 60 70 70 80 80 90 1, 7 0, 19 0, 17 15, 4 - 30 - (Chmielewski et al. , 2011) (Chmielewski et al. , 2011) (Dichtelmller et al. , 1996) (Chmielewski et al. , 2011) (Chmielewski et al. , 2011) (Chmielewski et al. , 2011) (Harris et al. , 1987) (Boschetti et al. , 2003) (Eterpi et al. , 2009) (Boschetti et al. , 2003) (Eterpi et al. , 2009) (Boschetti et al. , 2003) Parvovirus B19 sèche sèche sèche sèche sèche sèche sèche sèche 100 humide humide 90 90 humide 100 1, 62 80 90 80 80 80 80 80 - 31 - 10min 1 min de 0 à 10 min 10 min 1min 24h >4, 4 3, 7 de 0 à 6, 2 0, 3 0, 4 2, 3 72h >4, 7 24h 3, 5 48h >5, 5 24h >5, 3 10min 2, 5 0, 3-0, 35% d'humidité 0, 3-0, 35% d'humidité 0, 85-1, 19% d'humidité 0, 3-0, 35% d'humidité (Eterpi et al. , 2009) (Eterpi et al. , 2009) (Harris et al. , 1987) (Eterpi et al. , 2009) (Eterpi et al. , 2009) (Roberts and Antonoplos, 1998) (Roberts and Antonoplos, 1998) (Blmel et al. , 2008) (Blmel et al. , 2008) (Blmel et al. , 2008) (Blmel et al. , 2008) sèche 100 sèche 100 sèche 100 sèche 100 sèche 100 Parvovirus Bovin humide humide sèche sèche sèche 60 60 75 75 85 - 32 - 20min 2, 5 30min 10min 20min 3, 2 3, 2 3, 8 30min >5, 3 0, 3-0, 35% d'humidité 0, 3-0, 35% d'humidité 0, 85-1, 19% d'humidité 0, 85-1, 19% d'humidité 0, 85-1, 19% d'humidité de 0 à 27 min de 0 à 47 min de 0 à 7 eau de 0 à 7 plasma 1h 2h 1h 0 0, 1 0, 1 (Blmel et al. , 2008) (Blmel et al. , 2008) (Blmel et al. , 2008) (Blmel et al. , 2008) (Blmel et al. , 2008) (Bruniger et al. , 2000) (Bruniger et al. , 2000) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) sèche sèche sèche 85 95 95 sèche 100 sèche 100 sèche 100 Parvovirus Porcin humide humide humide humide sèche sèche 70 80 90 90 80 80 - 33 - 2h 1h 2h 0, 6 0, 8 0, 9 de 0 à 8h de 0 à 5 de 0 à 3h de 0 à 5 lyophilisat avec d'humidité lyophilisat avec 2% d'humidité (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Bruniger et al. , 2000) (Bruniger et al. , 2000) de 0 à 15 min de 0 à 5 lyophilisat avec 8% d'humidité (Bruniger et al. , 2000) 10min 10min 10min 1 min 10min 8h 0, 7 5, 9 >6, 1 6 0, 5 0, 4 (Eterpi et al. , 2009) (Eterpi et al. , 2009) (Eterpi et al. , 2009) (Eterpi et al. , 2009) (Eterpi et al. , 2009) (Roberts and Antonoplos, 1998) 24h 72h 24h 48h 24h 1, 1 2 2, 2 3, 9 3, 7 0, 3-0, 35% d'humidité 0, 3-0, 35% d'humidité 0, 85-1, 19% d'humidité 1min 0, 4 10min 2 20min 2, 2 30min 3 10min 1, 3 0, 3-0, 35% d'humidité 0, 3-0, 35% d'humidité 0, 3-0, 35% d'humidité 0, 85-1, 19% d'humidité (Roberts and Antonoplos, 1998) (Roberts and Antonoplos, 1998) (Blmel et al. , 2008) (Blmel et al. , 2008) (Blmel et al. , 2008) (Eterpi et al. , 2009) (Blmel et al. , 2008) (Blmel et al. , 2008) (Blmel et al. , 2008) (Blmel et al. , 2008) sèche sèche sèche sèche sèche sèche 80 80 80 80 80 90 sèche 100 sèche 100 sèche 100 sèche 100 - 34 - sèche 100 sèche 100 Picornaviridae Virus de l'Hépatite A sèche 80 sèche 100 Virus de la Fièvre Aphteuse humide humide Poliovirus 1 sèche sèche sèche sèche 60 70 75 75 80 85 20min 30min 1, 6 2, 2 0, 85-1, 19% d'humidité 0, 85-1, 19% d'humidité 8h >2, 8 30 min >5, 3 1h 2h 8h 1h 4, 3 >4, 3 5, 1 >4, 8 (Blmel et al. , 2008) (Blmel et al. , 2008) (Roberts and Antonoplos, 1998) (Dichtelmller et al. , 1996) (Kamolsiripichaiporn et al. , 2007) (Kamolsiripichaiporn et al. , 2007) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Roberts and Antonoplos, 1998) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) 0, 27- 0, 7 0, 10- 0, 18 - 35 - Poliovirus Sabin humide humide sèche sèche Polyomaviridae Virus Simien 40 sèche 70 90 80 90 75 75 85 85 95 95 10 min 1 min 10min 1min 1h 2h 1h 2h 1h 2h >4, 6 >4, 6 >4, 6 >4, 6 0, 8 2, 3 2, 7 3, 4 5, 2 >5, 1 30 min - 36 - (Eterpi et al. , 2009) (Eterpi et al. , 2009) (Eterpi et al. , 2009) (Eterpi et al. , 2009) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Dichtelmller et al. , 1996) sèche sèche sèche sèche sèche sèche 100 Poxviridae Virus de la Vaccine humide humide sèche sèche sèche sèche sèche sèche sèche sèche 70 90 80 90 75 75 85 85 95 95 Reoviridae Réovirus sèche 100 10 min 1 min 10min 1min 1h 2h 1h 2h 1h 2h >4, 6 >4, 6 >4, 6 >4, 6 0, 3 0, 6 1, 6 1, 6 2, 1 >4, 3 30 min >6 - 37 - (Eterpi et al. , 2009) (Eterpi et al. , 2009) (Eterpi et al. , 2009) (Eterpi et al. , 2009) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Sauerbrei and Wutzler, 2009) (Dichtelmller et al. , 1996) Virus de Retroviridae l'Immunodéficience sèche 100 Humaine Rhabdoviridae Virus de la Stomatite Vésiculaire sèche 100 30 min >6, 6 lyophilisat 30 min >5, 8 (Dichtelmller et al. , 1996) (Dichtelmller et al. , 1996) Tableau 2 : Données dans la littérature de l'inactivation virale par chaleur sèche ou humide. - 38 - ii) Les ultraviolets Les ultraviolets sont des rayonnements électromagnétiques dont les longueurs d'ondes (entre 100nm et 400 nm) sont inférieures à celles du domaine visible (entre 390nm et 790 nm). Les ultraviolets sont séparés en trois groupes en fonction de leurs longueurs d'onde : les UV-A, compris entre 400 et 115 nm, correspondent à la lumière noire. Ils traversent la couche d'ozone de la stratosphère. les UV-B, compris entre 315 et 280 nm, sont responsables de la synthèse de la vitamine D. Ils sont en grande partie absorbés par la couche d'ozone. les UV-C, compris entre 280 et 100 nm, sont totalement absorbés par l'ozone de la stratosphère et ont une activité germicide reconnue. Les UVc ont une action virucide due au spectre d'absorption des acides nucléiques qui composent le matériel génétique des virus. En effet, les acides nucléiques absorbent les longueurs d'onde comprises entre 210 et 310 nm avec un maximum à 260 nm (figure 9). A noter que les lampes à mercure basse pression génèrent un pic de radiation à 253, 7nm, proche du maximum d'absorbance des acides nucléiques. - 39 - Figure 9 : Spectres d'absorbance relatifs des bases de l'ADN et de l'ADN (BEN MESSAOUD, 2009) L'énergie apportée par les UVc est absorbée au niveau de la base azotée des nucléotides permettant la création de liaisons covalentes entre deux nucléotides adjacents. Les photo- produits formés concernent 3 types de liaisons : T-T (appelé le dimère de thymine est le plus fréquent) (figure 10), T-C et C-C. Ces trois liaisons déforment la structure du génome viral par l'introduction de pliure rendant la réplication difficile voire impossible. - 40 - Figure 10 : Produit possible de deux pyrimidines adjacentes dans l'ADN en réaction aux UV (Bolton Bolton James R. Light Compendium Ultraviolet Principles and Applications , Inter-American Photochemical Society Newsletter, Vol. 22(2), 1999. ). L'ARN possède de l'uracile au lieu de la thymine. Or le dimère d'uracile est plus difficilement formé que le dimère de pyrimidines, qui est le plus fréquent. Ainsi, l'ADN est plus sensible aux UVc que l'ARN (A. Ben Messaoud 2009). L'efficacité de l'inactivation virale par les rayons UVc est fonction de la dose absorbée par les virus. Cette dose est définie par le produit de l'intensité UV, mesurée au niveau du virus, et du temps d'exposition aux rayonnements, elle est exprimée en mJ/cm. Des - 41 - expériences ont montré qu'à doses reçues égales, l'effet des UV sur les micro-organismes est indépendant de l'intensité utilisée (Hunt, 1992). Les profils d'inactivation des virus par les UVc, sont exprimés à partir des modèles de cinétique de réduction des micro-organismes. Ces modèles sont exprimés en fonction de la concentration d'un désinfectant C qui est remplacée par l'intensité du rayonnement I, dans le cas des UVc. Modèle de Chick-Watson : en 1908, Chick a observé une analogie entre la cinétique de réduction des micro-organismes par un désinfectant et une réaction chimique. Elle a utilisé une loi similaire à celle d'une réaction chimique du premier ordre pour modéliser la cinétique de désinfection, soit : . o N est le nombre de virus infectieux, t est le temps et k est la constante cinétique de réduction Watson a proposé un modèle qui précise la constante cinétique de réduction en prenant compte de la concentration du désinfectant : . . o C est la concentration du désinfectant, n est la constante de dilution, et k' est la constante cinétique de réduction, indépendante de la concentration C. Ce modèle est ensuite adapté à la cinétique d'inactivation par les UVc o la concentration du désinfectant a été remplacée par l'intensité des UVc. Par conséquent, la cinétique de premier ordre, de la réduction des virus par les UVc, est : - 42 - . ! . o N est le nombre de virus infectieux, I est l'intensité UVc en mW/cm et kuv est la constante cinétique de réduction cm/mW. s. L'intégration de l'équation donne le nombre de virus infectieux en fonction du temps par l'expression : . #$%&'. (. ) o N est le nombre de virus infectieux à l'instant t (en s), N0 est le nombre initial de virus infectieux, I est l'intensité UV en mW/cmet kuv, la constante cinétique de réduction en cm/mW/s, Modèle de Scheible (Scheible et al. , 1985) : le modèle de premier ordre est en général valable pour des réductions virales de l'ordre de 5 log (Harris et al. , 1987). Au-delà, les courbes présentent un ralentissement de l'inactivation par un phénomène de queue. Pour expliquer ce phénomène, Scheible propose de diviser la population virale en deux catégories : les virus isolés, de concentration N0 ', qui sont sensibles aux UVc les virus associés à des éléments de protection (particules solides, agrégats ), de concentration Np, qui les protègent des rayonnements UVc. Le nombre initial de virus infectieux N0 est égal à la somme des virus isolés, N0' et des virus associés, Np. Scheible propose cette équation pour modéliser la cinétique de réduction virale : . #$%&'. (. ) * - 43 - Cette équation considère que les virus protégés Np ne peuvent pas être inactivé par le rayonnement UVc. Avec ce modèle, l'évolution du nombre de virus infectieux commence par suivre une décroissance exponentielle avant de ralentir est de se stabiliser à la valeur Np. Le tableau 3 regroupe les données de la littérature concernant les doses d'UV nécessaire pour inactiver des virus à ADN (Adenoviridae, Herpesviridae ) et des virus à ARN (Reoviridae, Picornaviridae ) - 44 - Famille Virus ARN/ADN Dose UV pour 4 log d'inactivation (mJ/cm) Références Adenoviridae Adénovirus 1 ADN 138 Adénovirus 2 Adénovirus 4 Adénovirus 5 Adénovirus 6 Adénovirus 15 Adénovirus 40 Adénovirus 41 Herpesviridae Herpes Simplex Virus 2 Herpes Simplex Virus 1 80-167 116 216-240 154 165 124-222, 2 100-222 13 24 - 45 - (Nwachuku et al. , 2005) (Day, 1974) (Gerba et al. , 2002) (Sirikanchana et al. , 2008) (Gerrity et al. , 2008) (Kallenbach et al. , 1989) (Wang et al. , 2004) (Nwachuku et al. , 2005) (Thompson et al. , 2003) (Meng and Gerba, 1996) (Meng and Gerba, 1996) (Ko et al. , 2005) (Hijnen et al. , 2006) (Wolff and Schneweis, 1973) (Wolff and Schneweis, 1973) (Henderson et al. , 1978) (Ross et al. , 1971) Poxviridae Virus de la Vaccine Coronaviridae Virus de Berne ARN SARS Coronavirus Caliciviridae Calicivirus Bovin Calicivirus Canin Calicivirus Félin Picornaviridae Coxsackievirus B3 Coxsackievirus B4 Coxsackievirus B5 Echovirus I Echovirus II Virus de l'Encéphalomyocardite 6, 1 5 91 13, 7-21, 1 30 30 32. 5 30-58 33, 6-36 33 28 16-113 - 46 - (Lytle et al. , 1972) (Ross et al. , 1971) (Weiss and Horzinek, 1986) (Duan et al. , 2003) (Kariwa et al. , 2004) (Hijnen et al. , 2006) (De Roda Husman et al. , 2004) (Thurston-Enriquez et al. , 2003) (Gerba et al. , 2002) (Battigelli et al. , 2011) (Gerba et al. , 2002) (Hijnen et al. , 2006) (Gerba et al. , 2002) (Gerba et al. , 2002) (Gerba et al. , 2002) (Smirnov YuA et al. , 1992) Virus de la Fièvre Aphteuse Virus de l'Hépatite A Poliovirus Rhabdoviridae Virus de la Rage Virus de la Stomatite Vésiculaire Reoviridae Réovirus Rotavirus 96 11-37 12, 9-40 5 19 70-74 19, 6-92 200 - 47 - (Nuanualsuwan et al. , 2008) (Battigelli et al. , 2011)(Chin et al. , 1997) (Wang et al. , 1995)(Wang et al. , 2004) (Battigelli et al. , 2011)(Chang et al. , 1985) (Gerba et al. , 2002)(Harris et al. , 1987) (Lazarova and Savoys, 2004) (Lytle and Sagripanti, 2005) (Meng and Gerba, 1996) (Tree et al. , 2005)(Hughes et al. , 1979) (Weiss and Horzinek, 1986) (Kariwa et al. , 2004) (Danner and Mayr, 1979) (McClain and Spendlove, 1966) (Harris et al. , 1987) (Wang et al. , 2004) (Wang and Casadevall, 1994) (Kowalski, 2010) (Battigelli et al. , 2011)(Chang et al. , 1985) (Meng et al. , 1987)(Smirnov et al. , 1991) (Caballero et al. , 2004) Rotavirus SA-11 Rotavirus Simien Togaviridae Virus Sindbis Virus de l'Encéphalite Equine Vénézuélienne Orthomyxoviridae Virus de la grippe Tableau 3 : dose d'UV nécessaire pour inactiver des virus. 26-39, 2 117 40 22 6, 25 (Sommer et al. , 1989) (Hijnen et al. , 2006) (Li et al. , 2009) (Wang et al. , 2004) (Závadová and Libková, 1975) (Smirnov YuA et al. , 1992) (Ben Messaoud, 2009) - 48 - Les adénovirus ont une forte résistance aux UVc. La dose nécessaire pour une réduction de 4 log va jusqu'à 240 mJ/cm. Les autres virus, présentés dans le tableau 3, ont une résistance moindre, comprise entre 5 et 91 mJ/cm, excepté pour les Rotavirus dont l'énergie nécessaire est de 200 mJ/cm. La résistance des adénovirus, virus à ADN, aux UVc est inattendue, vu que l'ADN est plus sensible à ces rayonnements que l'ARN. Cette résistance des adénovirus aux UVc est due à leur capacité à mettre à profit les mécanismes cellulaires de réparations des altérations des acides nucléiques (Eischeid et al. , 2009). L'interaction entre UVc et séchage Il a été montré pour le virus de la Vaccine, le virus Ebola et le virus de Lassa, que le séchage confère une plus grande résistance des virus vis-à-vis des UV (Sagripanti and Lytle, 2011). La couche superficielle, contenant des virus séchés, ferait office de bouclier, protégeant ainsi les virus situés plus en profondeur. L'interaction entre UVc et chaleur Les bases des acides nucléiques s'apparient et forment des structures dont la capacité d'absorption des UVc est réduite. Lorsque l'appariement des bases est rompu par le chauffage, les bases sont davantage exposées aux UVc qu'elles absorbent de 20 à 40 % en plus par rapport à l'état apparié (Michelson, 1958) (Mergny, 2003). C'est le phénomène d'hyperchromicité qui peut jouer un rôle dans l'effet de la combinaison UVc et chaleur. - 49 - 4) Objectifs de l'étude La connaissance de la persistance et des moyens de réduction du pouvoir infectieux viral, est un enjeu essentiel pour la lutte contre la propagation des infections. Les virus pouvant être transmis par l'intermédiaire de gouttes qui se déposent sur une surface, notre objectif a été l'étude de la résistance de virus, contenus dans de petits volumes. Cinq virus appartenant à des familles différentes ont été sélectionnés : H1N1 et HSV-1, deux virus enveloppés appartenant, respectivement, à la famille des Orthomyxoviridae et des Herpesviridae ; ainsi que CVB4, MVM et SV40, trois virus non-enveloppés appartenant, respectivement, à la famille des Picornaviridae, des Parvovirida et des Polyomaviridae. La problématique de la résistance des virus, H1N1, HSV-1, CVB4 et MVM, au séchage a été abordée. L'hypothèse de l'existence dans une population virale de particules sensibles et résistantes au séchage a été étudiée. Le pouvoir infectieux des virus sur support est influencé par la nature des matériaux et l'humidité relative (notamment), en revanche l'impact de la composition du milieu dans la résistance au séchage, est moins bien connu et a été analysé dans nos travaux. L'effet de la concentration initiale du chlorure de sodium (NaCl), du Sérum de Veau Fœtal (SVF) et de l'Albumine Sérique Bovine (BSA), dans la résistance du CVB4 vis-à-vis du séchage a été évalué. L'inactivation du pouvoir infectieux des virus présents sur des surfaces, est un moyen de lutte contre la propagation des infections. Notre but a été d'étudier l'effet virucide de la chaleur et des UVc. Un système original a été conçu et mis en œuvre pour étudier l'inactivation thermique de MVM, CVB4, H1N1 et HSV-1. La résistance aux UVc de CVB4, - 50 - MVM, HSV-1, H1N1 et SV40 a été déterminée. De plus, l'effet virucide de la combinaison chaleur et UVc a été exploré. - 51 - MATERIELS ET METHODES Virus et lignées cellulaires CVB4 E2 est une souche fournie par Jo-Won Yoon, du centre de recherche Julia Mc FARLANE Diabetes (Calgary, Alta. , Canada), (Kang et al. , 1994). Les virus sont propagés dans des flasques sur des lignées cellulaires appropriées : HSV-1 (ATCC VR-260) sur des cellules Vero (ATCC CCL-81), CVB4 sur des cellules Hep-2 (ATCC CCL-23), MVM (ATCC VR-1346) sur des cellules A9 (EACC N 85011426), SV40 (l'ATCC VR-305) sur des cellules BSC-1 (ECACC N 85011422) et H1N1 A/PR/8/34 (ATCC VR-1469) sur des cellules MDCK (NBL2) (ATCC CCL-34). Les cellules Vero, A9, BSC-1 et Hep-2 sont cultivées dans du Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM ; Invitrogen, France) supplémenté avec 10% de SVF et 1% de L- glutamine, à 37C dans une atmosphère à 5% CO2. Les cellules MDCK sont cultivées dans du Eagle's Essential Medium (MEM ; Invitrogen, France) supplémenté avec 0, 8% de tricine, 5% de SVF et 1% de L-glutamine. Quand une confluence cellulaire est observée, les cellules sont rincées avec du PBS puis trypsinées à 37C. Les cellules sont ensuite diluées est mises dans de nouvelles flasques ou en plaques 96 puits. Pour les plaques, 50L de cellules A9, Vero, MDCK, Hep-2 et BSC-1, respectivement à une concentration de 1 x 105, 2, 5 x 105, 1 x 105, 1, 5 x 105 et 1 x 105 cellules/mL sont déposés dans les puits. Des informations concernant les lignées cellulaires sont regroupées dans le tableau 4. - 52 - Cellules Organisme BSC-1 Hep-2 Cercopithecus Homo sapiens Tissu aethiops Rein Morphologie épithéliale contaminant des cellules HeLa (issues d'un adénocarcinome du col de l'utérus) épithéliale MDCK Canis familiaris Rein Vero A9 Cercopithecus Mus musculus aethiops Rein Hybridome de lymphocyte B épithéliale épithéliale lymphoblastique Culture adhérente adhérente adhérente adhérente semi-adhérente Permissivité virale SV40, poliovirus 1, VSV adénovirus 3, poliovirus 1, VSV MVM CVB3-4-5, Réovirus 2, Adénovirus associé 4-5, virus de la vaccine, VSV poliovirus 2 plus d'une quarantaine notamment poliovirus 1- 2-3, HSV-1, SV40 Tableau 4 : caractéristique des lignées cellulaires BSC-1, Hep-2, MDCK, Vero et A9. Les cellules Vero, BSC-1 et Hep-2 infectées sont cultivées dans du MEM supplémenté, les cellules A9 infectées sont cultivées dans du DMEM supplémenté, à 37C dans une atmosphère à 5% CO2. MEM et DMEM ont été supplémentés avec 2% de SVF, 1% d'acides aminés non essentiels et 1% de L-glutamine. Les cellules MDCK infectées sont cultivées dans du MEM à 35C dans une atmosphère à 5% CO2. Quand un effet cytopathique d'au moins 75% apparat, les cellules sont grattées et les particules virales sont libérées par trois cycles de congélation/décongélation. Après centrifugation à 2 000g pendant 10 min à 4C, les surnageants sont récupérés, aliquotés et conservés à -80C. En plus du stock de CVB4, obtenu à partir des cultures de cellules Hep-2 infectées, comme expliqué précédemment, une purification de CVB4 a été réalisée selon un protocole du laboratoire modifié (Chehadeh et al. , 2005). Brièvement, le surnageant clarifié de cellules Hep-2 infectées par CVB4 a été mis en présence de PEG puis centrifugé à 8 000g pendant 20 - 53 - min à 4C. Le culot obtenu a été ensuite resuspendu et ultra-centrifugé sur un gradient de chlorure de césium. Enfin, la suspension de CVB4 a été dessalée et resuspendue dans du PBS. Les aliquots ont été stockés à -80C. Titration virale Les liquides à titrer ont été distribués en 6 réplicats dans des micro-puits et dilués de 10 en 10 de 10-1 à 10-8 dans du MEM supplémenté avec 2% de PBS, 1% d'acides aminés non essentiels et 1% de L-glutamine pour HSV-1, SV40 et CVB4 ; du DMEM supplémenté avec 2% de PBS, 1% d'acides aminés non essentiels et 1% de L-glutamine pour MVM ; et du MEM pour H1N1. Ensuite les plaques ont été incubées pendant 5 jours pour H1N1 et CVB4, 7 jours pour HSV-1, 2 semaines pour SV40 et 3 semaines pour MVM, à 37C dans une atmosphère à 5% C02. Après cela, les plaques ont été examinées en utilisant un microscope inversé afin d'évaluer l'ampleur de l'effet cytopathique induit par les virus sur les cultures cellulaires. Le titre viral a été estimé par dilution limite et calculé grâce à la méthode de Spearman-Krber et exprimé en log10 TCDI50/XL (Hamilton et al. , 1977), X représentant la valeur du volume de suspension virale prélevée dans la solution stock. RT-qPCR La quantité d'ARN à polarité positive de CVB4 E2 a été évaluée par RT-PCR quantitative en deux étapes, comme précédemment décrit (Thevenin et al. , 2013). Brièvement, les ARN totaux ont été extraits avec le RNeasy minikit (Qiagen, Valencia, Calif. ) et resuspendus. La quantité d'ARN viral a été déterminé par RT-PCR quantitative à l'aide des kits : Affinityscript QPCR cDNA et Brilliant II QPCR (Agilent Technologie Stratagene). Une - 54 - rétrotranscription du brin ARN de polarité positive de CVB4 a été effectuée en utilisant une amorce antisens (séquence : 5-ATT GTC ACC ATA AGC AGC CA) à 42C pendant 15 min. L'étape de PCR a été réalisée selon le programme suivant : 10 min à 95C, puis 40 cycles de 1 min à 60C et 30s à 95C (Mx3000p (Stratagen). Les amorces suivantes, utilisées pour détecter l'ARN de CVB4, sont localisées au niveau de la région 5' non codante, qui est fortement conservée. L'amorce sens était 5-CCC TGA ATG GGG CTA ATC et l'amorce antisens était 5-ATT GTC ACC ATA AGC AGC CA. La séquence de la sonde reconnaissant le fragment amplifié était 5-VIC-AAC CGA CTA CTT TGG GTG TCC GTG TTT-TAMRA (Applied Biosystems). L'absence d'ADN contaminant dans les échantillons a été vérifiée par RT-PCR sans retro-transcriptase. Les amorces et la sonde ont été conçues avec le logiciel PrimerExpress, et les données ont été analysées avec le Sequence Detector version 1. 6. 3 (tous les deux provenant de Perkin-Elmer, Boston, Mass. ). Les résultats ont été exprimés avec les cycles threshold (Ct) qui sont inversement proportionnels à la quantité d'ADN amplifié à partir de l'ARN viral. Inactivation par séchage 50L (10L pour le séchage itératif) d'inoculum viral sont déposés sur le milieu de chaque boite de Pétri (35 mm de diamètre (Falcon), et séchés sous le flux d'air d'un PSM de classe II à température ambiante. Du milieu de titrage (1mL) est ajouté pour récupérer l'inoculum de virus séché. Les titres infectieux sont ensuite déterminés. Appareillage et inactivation virale par la chaleur - 55 - L'appareillage est composé d'une plaque électrique, chauffant un bain de glycérol dans un bécher. La température du bain est vérifiée par un thermomètre électronique (AVAX, UK). Un cône d'aluminium est plongé dans le glycérol chauffé. Après quelques secondes, 4L de suspension virale sont déposés à l'intérieur du cône d'aluminium pendant le temps désiré. 200L de milieu de titrage froid sont ensuite rapidement ajoutés et récupérés, et ensuite mélangés avec 800L de milieu de titrage froid. Modélisation des courbes d'inactivation virale par la chaleur Deux modèles ont été utilisés en fonction des courbes obtenues : le modèle cinétique de premier ordre et le modèle de Weibull. Le modèle cinétique du premier ordre suppose une relation linéaire entre la réduction logarithmique de nombre de survivants et le temps selon la formule suivante : log, - o S(t) est le rapport entre le titre infectieux après exposition de durée t (N(t) en TCID50/4L) et le titre viral initial (N0 en TCID50/4L), k est le coefficient d'inactivation exprimé en log10 TCID50/4L/s et t est la durée du temps de traitement en secondes. Le modèle de Weibull permet de modéliser les courbes présentant un épaulement ou un effet de queue de la réduction logarithmique de nombre de survivants en fonction du temps selon la formule suivante : logS t 1 0 2. 303 t - 56 - o S(t) est le rapport entre le titre infectieux après exposition de durée t (N(t) en TCID50/4L) et le titre viral initial (N0 en TCID50/4L). et sont deux constantes déterminées expérimentalement et t est la durée du temps de traitement en secondes. Les coefficients et ont été calculés par la méthode des moindres carrés avec le solveur Excell (Résolution GRG non linéaire) Inactivation virale par les UVc L'inactivation par les UVc a été obtenue en utilisant une lampe à mercure basse pression émettant une raie monochromatique à 253, 7 nm (VL-4. C 4W 254nm Tube). La lampe a été maintenue au-dessus de la suspension virale déposée sur la face intérieure d'un couvercle d'une boite de Pétri. L'intensité d'UVc atteignant la suspension a été mesurée avec un détecteur d'UV (UV light meter Q652693). La dose reçue par la suspension virale (en mJ/cm) est le produit de l'intensité des UVc mesurée (en mW/cm) par la durée du traitement (en s). Modélisation des courbes d'inactivation virale par les UVc Le modèle exponentiel de premier ordre a été utilisé pour modéliser la réduction logarithmique de nombre de survivants en fonction de la dose reçue par la suspension virale selon la formule suivante : 1 2 log 0 #$%3 - 57 - o S(t) est le rapport entre le titre infectieux après exposition de durée t (N(t) en TCID50/4L) et le titre viral initial (N0 en TCID50/4L). k est le coefficient d'inactivation exprimé en log10 TCID50/10L/s et i est la dose reçue par la suspension virale en mJ/cm. Analyses statistiques L'analyse statistique des résultats a été réalisée à l'aide du test de Mann-Whitney. Les courbes ont été comparées par analyse de covariance (ANCOVA). Le logiciel utilisé pour les analyses statistiques était Graphpad Prism version 5. 00 (Graphpad Software, San Diego, USA). Les différences ont été considérées statistiquement significatives quand p < 0, 05. - 58 - RESULTATS 1) Persistance du pouvoir infectieux de virus enveloppés et non- enveloppés déposés sur une surface Impact du séchage sur le pouvoir infectieux de H1N1, HSV-1, CVB4 et MVM Cinquante microlitres de surnageant de culture clarifié de cellules infectées par CVB4, MVM, H1N1 ou HSV-1 ont été déposés sur un couvercle de boite de Pétri et séchés sous le flux d'air d'un poste de sécurité microbiologique de classe II, à température ambiante (20C 2C). L'inoculum séché a été récupéré et le titrage a été effectué comme décrit dans la section matériels et méthodes . Les échantillons ont été séchés au bout d'environ 2 heures, temps au terme duquel le liquide avait visuellement disparu. La valeur moyenne des titres infectieux des inocula d'HSV-1, H1N1 et CVB4 séchés au bout de 2 heures a été, respectivement, réduite de 2, 33 log10 ; 1, 1 log10 et 1, 5 log10 TCID50/50L (figure 11). Aucun virus infectieux n'a été détecté dans les inocula séchés d'HSV-1 et H1N1 récupérés respectivement après 3 et 5 jours. En revanche, le titre infectieux des particules dans l'inoculum séché de CVB4 récupéré 2 heures à 5 jours après inoculation était inchangé (4, 39 /- 0, 38 log10 TCID50/50L, n 4). Les titres infectieux de MVM dans les inocula séchés récupérés une semaine après inoculation sont inchangés et similaires aux niveaux mesurés dans les gouttes déposées sur le couvercle (5, 87 /- 0, 20 log10 TCID50/mL, n 4). Six semaines après l'inoculation, il n'y avait plus de particule infectieuse dans les inocula séchés de CVB4 tandis qu'une quantité significative de - 59 - particules infectieuses a été retrouvée dans les inocula séchés de MVM (respectivement 0, 5 log10 TCID50/50l (limite de détection) vs 4, 00 log10 TCID50/50l, p Figure 11 : Effet du séchage sur le pouvoir infectieux des virus. 50 l de surnageant de culture contenant H1N1, CVB4, HSV-1 et MVM ont été déposés sur un couvercle de boite de Pétri en quatre réplicats puis séchés sous le flux d'air d'un poste de sécurité microbiologique de classe II à température ambiante entre 2 heures et 6 semaines. Par la suite, l'inoculum séché a été récupéré avec 1 mL de milieu et le titre infectieux a été déterminé et exprimé en log10 TCID50/50L. Les résultats sont la moyenne SD de quatre expériences indépendantes. La ligne en pointillé représente la limite de détection du test. La réduction des titres infectieux des inocula séchés sur le couvercle d'une boite de pétri, a soulevé plusieurs questions. L'efficacité de la récupération des particules virales dans ces conditions a été évaluée. Dans ce but, d'une part le titre infectieux de CVB4 a été déterminé et d'autre part, les ARN totaux ont été extraits pour mesurer la quantité d'ARN viral par RT-PCR en temps réel afin d'estimer la quantité de particules infectieuses. - 60 - Les quantités d'ARN viral dans les inocula séchés pendant 2 heures à température ambiante et dans les inocula non séchés, étaient similaires comme le montrent les valeurs des Ct obtenues par RT-PCR en temps réel (valeurs moyennes : 24, 36 vs 23, 86 respectivement, p 0, 56) tandis que les valeurs des titres infectieux étaient nettement différents (réduction de 2, 17 log10, p 0, 028) (figure 12). Ensemble, ces résultats montrent que les particules virales séchées sur le couvercle d'une boite de pétri étaient efficacement récupérées. Figure 12 : Quantification de l'ARN et du titre infectieux de CVB4. 50L de surnageant de culture contenant du CVB4 ont été déposés sur des couvercles de boites de Pétri en quatre réplicats. Ils ont été séchés en 2h sous le flux d'air du PSM à température ambiante et ensuite récupérés avec 1mL de milieu de culture. Le titre infectieux a été déterminé et exprimé en log10 TCID50/50L(). La quantité d'ARN viral a été évaluée par RT-PCR et exprimée en Ct (). Les résultats sont les moyennes SD de 4 expériences indépendantes. Pour explorer davantage la résistance des virus, dix microlitres de surnageant clarifié contenant du MVM, CVB4, H1N1 ou HSV-1 ont été séchés comme décrit ci-dessus, puis - 61 - l'opération a été réitérée. Dix microlitres d'eau distillée stérile ont été ajoutés à l'inoculum séché avant d'être de nouveau exposé au flux d'air. Jusqu'à 8 cycles de séchage/resuspension ont été effectués. Par la suite l'inoculum séché est récupéré avec 1 mL de milieu de culture et les titres infectieux ont été déterminés. Pour H1N1, HSV-1 et CVB4, chaque cycle de séchage a engendré une réduction graduelle des particules infectieuses, respectivement d'environ -0. 4, -1. 1 et -1. 8 log10 TCID50/10l par cycle (figure 13). Aucune réduction du titre infectieux de MVM n'a été observée après chaque cycle de séchage. le pouvoir itératif sur Figure 13 : Effet du séchage infectieux des virus. 10 L de surnageant de culture ont été déposés sur un couvercle de boite de Pétri en quatre réplicats puis séchés sous le flux d'air d'un poste de sécurité microbiologique de classe II à température ambiante. 10L d'eau distillée ont été ajoutés aux inocula séchés afin de commencer un nouveau cycle de séchage. Ensuite, l'inoculum séché a été récupéré dans 1 mL de milieu et le titre infectieux a été déterminé et exprimé en log10 TCID50/50L. Les résultats sont la moyenne SD de quatre expériences indépendantes. La limite du test était 0, 5 en log10 TCID50/50L. - 62 - Effet des protéines et des sels sur la résistance au séchage du CVB4. Des suspensions de virus constituées de milieu de culture comportant différentes concentrations de SVF, BSA et NaCl diluées dans de l'eau distillée stérile, auxquelles on rajoute 1% de surnageant clarifié contenant du CVB4 ont été préparées. Cinquante microlitres de ces suspensions virales sont déposés sur un couvercle de boite de pétri et séchés. Deux heures après inoculation le nombre de particules infectieuses dans les inocula récupérés est déterminé. Quand CVB4 est resuspendu dans du milieu contenant une faible concentration de SVF ( ou BSA ( les quantités de particules infectieuses dans les inocula récupérés, après séchage, étaient les plus élevées, 2, 66 et 3, 08 log10 TCID50/50l respectivement (figure 14). En revanche, le nombre de particules infectieuses dans du milieu contenant 1, 25% de SVF et plus de 0, 39 mg/mL de BSA était en dessous de la limite de détection du test log10 TCID50/50l. Au-dessus de 1, 25% de SVF, le nombre des particules infectieuses a augmenté régulièrement et à 100% de SVF le niveau atteint était de 1, 17 log10 TCID50/50l (p 0, 019 vs la limite de détection du test). Pour toutes les concentrations de NaCl, le nombre de particules infectieuses était plus élevé que ceux avec du milieu contenant du SVF ou de la BSA (figure 14). Dans des milieux contenant de faibles concentrations de NaCl de 0 à 0, 1 mg/mL, le niveau des particules infectieuses récupérées des inocula séchés a augmenté légèrement de 2, 66 à 3, 08 log10 TCID50/50l (p 0, 1). En revanche, le pouvoir infectieux des particules dans du milieu contenant entre 0, 1 et 2 mg/mL de NaCl a diminué de 3, 08 à 2, 58 log10 TCID50/50l (p 0, 04). Au-dessus de 2 mg/mL de NaCl, le niveau des particules infectieuses avait augmenté, et à 300 mg/mL, le niveau atteignait 4, 16 log10 TCID50/50l (p 0, 028 vs. le niveau infectieux à 2 mg/mL). - 63 - Figure 14 : Effet virucide du séchage sur une suspension virale de CVB4 à différentes concentrations de SVF, BSA et NaCl. 50 l de surnageant de culture contenant du CVB4 ont été déposés sur un couvercle de boite de Pétri en quatre réplicats puis séchés sous le flux d'air d'un PSM, à température ambiante pendant 2 heures. Par la suite, l'inoculum séché a été récupéré avec 1 mL de milieu et le titre infectieux a été déterminé et exprimé en log10 TCID50/50L. Les résultats sont la moyenne SD de quatre expériences indépendantes. La ligne en pointillé représente la limite de détection du test. - 64 - 2) Inactivation rapide de virus contenus dans des gouttelettes appliquées sur une surface chauffée Des inocula (4L) de virus ont été déposés dans des cônes en feuille d'aluminium immergés dans un bain de glycérol à différentes températures (70, 80, 90, 100, 110, 120, 130C). Une seconde à 90 minutes après inoculation, les inocula ont été repris dans 200L de milieu de titrage froid. Les solutions récupérées ont été ajoutées à 800L de milieu de titrage froid avant d'être titrées. Lorsque les gouttes contenant des virus enveloppés, HSV-1 et H1N1, sont chauffées, le profil des résultats obtenus est comparable ; cependant H1N1 s'est avéré plus résistant à l'inactivation par la chaleur que HSV-1. En effet, à 70C, le titre de HSV-1 était réduit à 0, 63 log10 TCID50/4L en 6s, soit une réduction de 4 log10 TCID50/4L ; alors que dans les mêmes conditions, le titre de H1N1 était de 2, 42 log10 TCID50/4L (P 0, 017) soit une réduction de 2 log10 TCID50/4L (figure 15). Une réduction de 4 log10 du titre infectieux de H1N1 et HSV-1 a été obtenue respectivement en moins de 5s et 3s à 80C, 3s et 2s à 90C, 2s et 1s à 100C. - 65 - Figure 15 : Virus exposés à la chaleur. 4L de surnageant de culture contenant H1N1 (A), CVB4 (B), HSV-1 (C), ou MVM (D, E, F) sont déposés dans un cône, constitué d'une feuille d'aluminium, plongé dans du glycérol chauffé à différentes températures. Les inocula sont refroidis avec 200L de milieu frais. Ce mélange est récupéré, complété avec du milieu froid pour un volume final de 800L et le titre infectieux est déterminé et exprimé en log10 TCID50/4L. Les taux d'inactivation des courbes de survie de H1N1, CVB4, HSV-1 et MVM, exprimés en log10 TCID50/4L/s, sont présentés dans les tableaux sous les graphes. NA : Non applicable, lorsque la courbe ne correspond pas au modèle cinétique de premier ordre. La ligne en pointillés délimite la limite de détection du test. Les résultats sont la moyenne SD de 4 expériences indépendantes. - 66 - Les taux d'inactivation pour H1N1 vs HSV-1 étaient respectivement de -0, 81 vs -1, 28 log10 à 80C (P de -1, 44 vs -1, 90 log10 à 90C (P -2, 00 vs -1, 77 log10 TCID50/4L/s à 100C (P L'action de la chaleur sur les gouttes contenant CVB4, un virus non enveloppé, a conduit à une cinétique d'inactivation légèrement comparable à celui de HSV-1. Par rapport à H1N1, CVB4 apparat moins résistant à l'inactivation par la chaleur. En effet, CVB4 était fortement inactivé, jusqu'à 4, 23 log10 TCID50/4L à 70C en 4s, alors que dans les mêmes conditions, la réduction du titre infectieux de H1N1 n'était que de -1, 13 log10 TCID50/4L (P 0, 028). Les taux d'inactivation de CVB4 vs H1N1 à 80, 90 et 100C étaient respectivement de -1, 59 vs -0, 81 (p -2, 15 vs -1, 44 (p et -4, 27 vs -2, 00 log10 TCID50/4L/s (p L'impact, du chauffage à des températures inférieures ou égales à 100C sur le titre infectieux de 4L de suspension virale contenant MVM, est modéré. En effet, une réduction du titre de -4 log10 n'était obtenue qu'après une exposition des gouttes à 80C pendant 30 minutes, à 90C pendant 60s et à 100C durant 30s. Une réduction du titre infectieux de MVM supérieure à 4 log10 a été obtenue à 110, 120 et 130C en 9s, 3s et 2s respectivement. Les courbes d'inactivations de HSV-1 et CVB4 à 70c ainsi que celles du MVM à 80c et 100C présentaient des parties convexes ou concaves. Elles ont été analysées à l'aide du modèle de Weibull et les coefficients et ont été calculés (tableau 5). - 67 - Conditions HSV-1 70C CVB4 70C MVM 80C MVM 100C 3, 65 1, 85 0, 24 0, 12 4, 29 2, 94 0, 25 0, 39 Tableau 5 : coefficients et déterminés à l'aide du modèle de Weibull à partir des courbes d'inactivation d'HSV-1 à 70C, CVB4 à 70C et MVM à 80 et 100C. Dans la mesure o il a été rapporté que des métaux, tels que l'argent ou le cuivre, pouvaient inactiver des virus (Chen et al. , 2013), (Kim et al. , 2011), (Lara et al. , 2010), nous avons évalué, en prenant le CVB4 comme modèle, si les feuilles d'aluminium pouvaient avoir un effet inactivant sur les virus. Du milieu de culture, avec ou sans fragments de feuilles d'aluminium, a été préalablement chauffé à 90C pendant 30s, avant d'être refroidi à 4C. Le milieu de culture a été ensuite mélangé à une suspension virale de CVB4 (8, 5 log10 TCID50/mL) et a été ensuite incubé à température ambiante pendant 30 min avant d'être titré. Aucune réduction du titre infectieux n'a été observée quand la suspension virale était traitée avec du milieu contenant des fragments de feuilles d'aluminium (figure 16). - 68 - I ) L 0 0 1 / 0 5 D C T 0 1 g o l ( r e t i t l a r i V 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Medium Medium Medium Aluminium 90C for 30s Figure 16 : Effet de l'aluminium sur CVB4. 200L de milieu de culture contenant des fragments d'aluminium ont été chauffés ou non pendant 30s à 90C. Après refroidissement, 100L de suspension virale de CVB4 ont été ajoutés et incubés à température ambiante pendant 30 min. Les titres infectieux ont été déterminés et exprimés en log10 TCID50/100L. Les résultats sont la moyenne SD de 4 expériences indépendantes. La réduction des titres infectieux des différents inocula obtenue quand les gouttes étaient chauffées sur des feuilles d'aluminium, a soulevé plusieurs questions. Il s'est notamment posé la question de l'efficacité de la récupération des particules virales dans ces conditions. Par conséquent, nous avons d'une part évalué le titre viral de CVB4 et d'autre part quantifié l'ARN viral par RT-PCR en temps réel afin d'évaluer le nombre de particules virales. Le résultat de cette évaluation montre que le nombre de particules virales dans les gouttes chauffées ou non à 110C durant 15s sont comparables, comme le révèlent les valeurs des Ct (23, 86 vs 27, 15 respectivement), tandis que les titres infectieux étaient significativement différents (6, 21 log10 de réduction) (figure 17). Ces résultats confirment que - 69 - les particules virales chauffées dans des cônes en feuilles d'aluminium étaient efficacement récupérées. Figure 17 : Quantification de l'ARN de CVB4 et titre infectieux. 4L de surnageant de culture contenant du CVB4 ont été chauffés pendant 15s à 110C, puis le titre infectieux a été déterminé. Le résultat est exprimé en log10 TCID50/4L (). La quantité d'ARN virale a été évaluée par RT-PCR en temps réel et exprimée en Ct (). Les résultats sont la moyenne SD de 4 expériences indépendantes. La suspension virale de CVB4 utilisée pour les essais provenait d'un stock de virus produit sur la lignée cellulaire Hep-2, comme décrit dans la section matériels et méthodes . L'impact potentiel des composés cellulaires, ainsi que celui de la concentration en protéines sur ce procédé d'inactivation par la chaleur ont été évalués. Des expériences ont été réalisées avec, d'une part, du virus issu du stock initial de suspension virale, et, d'autre part, du CVB4 purifié (dilution finale 1%) ajouté à du PBS, du PBS supplémenté avec 2% de SVF et à du surnageant de lysat de culture de cellules Hep-2 non infectées. Lorsque le CVB4 stock, d'une - 70 - part, et le virus purifié contenu dans les différentes solutions, d'autre part, ont été chauffés 4s à 70C, les titres infectieux étaient comparables et significativement plus bas par rapport aux contrôles (réduction allant de 4, 7 à 4, 9 log10) (figure 18). Ainsi, il apparat que le surnageant cellulaire et la concentration en protéines n'interférent pas sur le résultat de l'inactivation de suspensions virales par la chaleur. Figure 18 : Inactivation par la chaleur de CVB4 stock et CVB4 purifié. 4L de CVB4 stock ou CVB4 purifié additionné (dilution finale 1%) à du PBS, du PBS supplémenté avec 2% de SVF, et à du surnageant d'un lysat de culture de cellules Hep-2 sont exposés () ou non () à la chaleur (70C pendant 4s). Le titre infectieux est ensuite déterminé et exprimé en log10 TCID50/4L. Les résultats sont la moyenne SD de 2 expériences indépendantes. - 71 - 3) Résistance des virus aux UVc et effet de la combinaison UV- chaleur sur MVM. Inactivation par les UVc de MVM, SV40, H1N1, HSV-1 et CVB4. Dix microlitres de surnageant clarifié de cultures cellulaires infectées par CVB4, MVM, SV40, H1N1 et HSV-1 ont été déposés dans des boites de Pétri placées sous la lampe UVc préchauffée. Après le temps nécessaire pour que les suspensions virales reçoivent la dose d'UVc désirée, les inocula sont récupérés et titrés comme décrit dans la section matériels et méthodes . Le préchauffage de la lampe UVc était nécessaire pour obtenir une intensité en UVc, constante au cours du temps (figure 19). L'intensité délivrée par la lampe était stable après 80 min de préchauffage. ) C ( e r u t a r é p m e T 45 40 35 30 25 20 puissance température 0 1 2 3 40 20 Temps (min) 60 80 100 120 0. 8 0. 6 0. 4 0. 2 0. 0 i P u s s a n c e m W c m / Figure 19 : Evolution de la température et de l'intensité de la lampe UVc. La lampe UV a été allumée sous le PSM et d'une part, la température de la lampe a été mesurée à l'aide d'un thermomètre électronique et d'autre part, l'intensité d'UVc a été mesurée avec le radiomètre à 7cm de la lampe. - 72 - Quand des gouttes de 10L, contenant des virus, ont été exposées aux UVc, les profils d'inactivation obtenus étaient similaires et ont été analysés avec le modèle exponentiel de premier ordre. Les coefficients d'inactivation calculés pour H1N1, MVM, CVB4, HSV-1 et SV40 étaient respectivement 0, 250 ; 0, 161 ; 0, 061 ; 0, 037 et 0, 001 log10TCID50 /10L/s (tableau de la figure 20) La résistance du SV40 aux UVc était la plus importante par rapport aux autres virus. Après une dose reçue de 263 mJ/cm, le titre viral résiduel était de 1, 4 log10 TCID50 /10L, soit une réduction de 4, 0 log10 TCID50 /10L ; tandis que des doses reçues de 115 ; 35 ; 28 et 10 mJ/cm ont été suffisantes pour, respectivement, inactiver HSV-1, CVB4, MVM et H1N1, soit des réductions respectives de 5, 12 ; 5, 77 ; 5, 2 et 4, 25 log10 TCID50 /10L. Les virus à ADN double brins, HSV-1 et SV40, ont été plus résistants à l'inactivation UVc que les virus à ARN, CVB4 et H1N1 et le virus à ADN simple brin, MVM. En effet, une dose d'UVc de 35 mJ/cm a été nécessaire pour réduire les titres infectieux de SV40 et HSV-1 de, respectivement, 0, 56 et 3, 8 log10 TCID50 /10L tandis qu'à cette dose, les titres infectieux de H1N1, CVB4 et MVM ne sont plus détectés. Comparé à l'inactivation de H1N1 et MVM, CVB4 est apparu plus résistant aux UVc. En effet, une réduction du titre infectieux de H1N1 et MVM, de 4, 25 et 4, 04 log10 TCID50/10L respectivement, a été obtenue avec une dose de 8 mJ/cm alors qu'avec cette quantité d'UVc, la réduction du titre infectieux de CVB4 était de 2, 16 log10 TCID50/10L (p 0, 028). - 73 - virus H1N1 MVM CVB4 HSV-1 SV40 k (log10TCID50 /10L/s) 0, 2500, 03 0, 1660, 02 0, 0610, 005 0, 0370, 003 0, 00330, 001 Figure 20 : Virus exposés aux UVc. 10L de surnageant viral de HSV-1, SV40 (A), H1N1, CVB4, ou MVM (B) sont déposés dans une boite de Pétri et exposés à différente doses d'UVC. Les inocula sont récupérés dans 990L de milieu de culture et le titre infectieux est déterminé et exprimé en log10 TCID50/10L. Les taux d'inactivation des courbes de survie de SV40, H1N1, CVB4, HSV-1 et MVM, exprimés en log10 TCID50/s, sont présentés dans le tableau sous les graphes. Les résultats sont la moyenne SD de 4 expériences indépendantes. - 74 - Effet combiné des UVc et de la chaleur vis-à-vis de MVM. Quatre microlitres issus des 10 L d'inocula de MVM ayant reçu différentes doses d'UVc, ont été déposés dans des cônes en feuille d'aluminium, immergés dans un bain de glycérol à 100c ou à température ambiante. Après une exposition à la chaleur de 20s, 200L de milieu de titrage froid ont été ajoutés puis repris pour récupérer l'inoculum de virus. La solution récupérée a été ajoutée à 800L de milieu de titrage froid avant d'être titrée. Quand les gouttes contenant le MVM ont été chauffées, une réduction du titre viral de 1, 79 log10 TCID50/10L a été observée (figure 21). Sans traitement thermique, une dose d'UVc de 28 mJ/cm a été nécessaire pour inactiver MVM alors qu'avec le traitement thermique (20s à 100C), la dose d'UVc nécessaire pour inactiver le MVM a été réduite à 20 mJ/cm. Les deux courbes d'inactivation obtenues, lorsque MVM a été irradié par différentes doses d'UVc puis a été chauffé ou non 20s à 100C, étaient similaires. Entre ces deux courbes, un écart horizontal relativement constant a été observé : pour un titre viral de 4, 1 log10 TCID50/4L, il était de 3 mJ/cm et pour un titre viral de 1 log10 TCID50/4L, il était aussi de 3 mJ/cm. Cette observation se vérifie avec les coefficients d'inactivation k, calculés à partir du modèle exponentiel du premier ordre, qui étaient similaires : 0, 161 et 0, 166 log10TCID50 /10L/s (p 0, 967) quand MVM était exposé respectivement aux UVc puis à la chaleur ou aux UVc uniquement. - 75 - r e t i t l a r i V ) L 4 / 0 5 D C T I 0 1 g o L ( 6 5 4 3 2 1 0 UV254nm UV254nm then 20s 100C 0 5 15 10 20 UV dose (mJ/cm) 25 30 Figure 21 : MVM exposé aux UVc puis à 100C pendant 20 s. 10L de surnageant viral de MVM ont été déposés dans une boite de Pétri et exposés à différente doses d'UVc. 4L du surnageant viral de MVM irradié ont été ensuite prélevés et déposés dans un cône en feuille d'aluminium plongé, pendant 20 s, dans du glycérol chauffé à 100C. Les inocula sont refroidis avec 200L de milieu froid. Ce mélange est récupéré, complété avec du milieu froid pour un volume final de 800L et le titre infectieux est déterminé et exprimé en log10 TCID50/4L. Les résultats sont la moyenne SD de 4 expériences indépendantes. - 76 - DISCUSSION GENERALE Plusieurs considérations dans ce mémoire sont notables. La persistance de H1N1, HSV- 1, MVM et CVB4 a été étudiée et pour la première fois, l'effet des concentrations de NaCl, SVF et BSA sur la persistance de CVB4 a été déterminé. De plus, l'effet de cycles répétés de séchage et de remise en suspension de H1N1, HSV-1, MVM et CVB4 a été étudié. Le pouvoir infectieux de petits volumes de suspensions virales (4L) de H1N1, HSV-1, MVM et CVB4, appliquées, pendant de courtes périodes, sur une surface chauffée a été déterminé. Les profils d'inactivation de H1N1, HSV-1, MVM, CVB4 et SV40 par les UVc ont été observés. Enfin, la combinaison des effets des UVc et de la chaleur sur le pouvoir infectieux du MVM a été analysée. 1) Persistance du pouvoir infectieux de virus enveloppés et non- enveloppés déposés sur une surface L'étude de la persistance a été réalisé sur des couvercles de boite de Pétri, stériles et composés de polystyrène, un plastique hydrophobe et non poreux. Ces deux qualités ont été choisies pour limiter la surface de contact entre les gouttes de suspensions virales et le support. En effet, le polystyrène est un polymère riche en cycle benzène qui lui donne son caractère hydrophobe (Mark, 2007). L'efficacité de la récupération des virus séchés sur les couvercles de boites de Pétri a été illustrée avec le CVB4 par les expériences combinant la mesure du titre viral et de la quantité - 77 - de particules virales estimée au travers de la quantité d'ARN virale mesurée par RT-PCR en temps réel. La réduction du titre viral de CVB4 observée après séchage était de 2, 17 log10 TCID50 alors que la différence des Ct observés, par RTqPCR, n'était pas significative. Cela signifie que le CVB4 a bien été récupéré. Un autre indice va dans le sens d'une récupération complète des particules virales. En effet, le titre infectieux du MVM est identique avant et après séchage ce qui exclut une perte de particules virales lors du procédé de récupération. L'inactivation sous PSMII a été obtenue au bout d'une période de temps différente selon les virus. Pour H1N1, HSV-1 et CVB4, les courbes d'inactivations comprennent deux phases (figure 22). N0 l a r i v e r t i t Phase 1 Phase 2 0 0 2h temps Figure 22 : Représentation des deux phases de l'inactivation virale de H1N1, CVB4 et HSV-1 par le séchage. La première phase dure deux heures et correspond à une diminution rapide du titre viral de -2, 33 ; -1, 1 et -1, 5 log10 TCID50/mL pour respectivement, HSV-1, H1N1 et CVB4. Aucune - 78 - réduction du titre viral de MVM n'est observée dans ces deux heures. Scheuplein et al. ont suggéré que la première phase d'inactivation est caractérisée par l'évaporation d'eau libre présente à l'interface air-liquide (Scheuplein and Morgan, 1967). L'évaporation a pour effet d'exposer le virus à cette interface ce qui conduit à son inactivation (Ward and Ashley, 1979). La seconde phase commence quand l'eau n'est plus visiblement présente dans l'inoculum. A partir de ce moment, le titre viral diminue plus lentement pour HSV-1, H1N1 et CVB4. Dans cette phase, les virus enveloppés se sont révélés plus fragiles que les virus non enveloppés. En effet, H1N1 et HSV-1 ont été inactivés en 5 et 3 jours respectivement alors que CVB4 a été inactivé en 6 semaines et le MVM restait infectieux six semaines après le séchage. Dans cette phase, l'élimination de l'eau est plus lente, ce qui est dû à la diffusion et l'évaporation de l'eau liée (Scheuplein and Morgan, 1967). Plusieurs différences, entre nos durées de persistance virale et celles obtenues par d'autres équipes, ont été observées. Ces différences peuvent s'expliquer de plusieurs façons en fonction des milieux, surfaces, souches virales et températures mis en œuvre dans les expériences. Par exemple, Bean et al. ont inactivé H1N1 en 3 jours (5 jours dans nos conditions), déposé sur du plastique, à une température supérieure à celle régnant dans nos expériences (28, 3c vs 20C) (Bean et al. , 1982). Abad et al. ont réussi à inactiver Poliovirus 1, (un entérovirus) en moins de 20 jours, en le laissant sécher sur du latex, alors que CVB4 a été inactivé en 6 semaines sur du polystyrène dans nos expériences (Abad et al. , 1994). Pour la première fois une répétition des cycles de séchage et de remise en suspension de l'inoculum viral dans de l'eau a été réalisée. Les titres infectieux de H1N1, HSV-1 et CVB4 ont diminué graduellement à chaque cycle tandis qu'aucune diminution n'a été observée pour le titre viral de MVM. Lors de ces cycles, chaque remise en suspension a modifié la position des particules virales permettant une nouvelle probabilité d'exposition des particules virales à - 79 - l'interface air/liquide. Etonnamment, CVB4, qui persiste 5 semaines sous le flux d'air du PSM, est totalement inactivé en 4 cycles de séchage et remise en suspension alors que H1N1, qui ne persiste que 5 jours, est encore infectieux après 8 cycles. Cette différence peut être expliquée par le fait que lors de la réhydration, les virus non enveloppés peuvent être considérablement inactivés (Benbough, 1971). Cependant, MVM, un virus non-enveloppé, n'est pas affecté par ces cycles de séchage et remise en suspension. Ces résultats suggèrent que la résistance de H1N1, HSV-1 et CVB4, vis-à-vis du séchage n'est pas due à une hétérogénéité des populations virales mais serait due à la position initiale des particules virales. Le lent processus d'inactivation de MVM par le séchage, reflété par nos expériences de persistance, reste à déterminer. Les résultats de notre étude montrent que les concentrations initiales de BSA, SVF et NaCl jouent un rôle dans les profils d'inactivation de CVB4 exposé au séchage. En effet, le titre infectieux du CVB4 après séchage était plus élevé quand le virus était en suspension dans l'eau pure que dans l'eau contenant de la BSA ou du SVF. En effet, nos résultats montrent qu'en présence de SVF ou BSA, la résistance de CVB4 au séchage est diminuée. Etonnamment, les courbes de survie de CVB4, initialement en suspension dans 0 à 0, 29 mg/mL de BSA et 0 à 1, 25 % de SVF, sont relativement similaires. Or, la concentration de BSA dans le SVF est de 23, 9 mg/mL, ce qui signifie que la concentration de BSA à 1, 25% de SVF était de 0, 30 mg/mL. Cela suggère que la faible résistance de CVB4, en présence de 0 à 1, 25% de SVF, pourrait dépendre de la BSA. A l'opposé, au-dessus de 1, 25% de SVF, l'impact du séchage sur la survie de CVB4 est réduit. Il a été démontré que des concentrations élevées de protéines peuvent protéger les virus contre le séchage (Thomas et al. , 2008). Néanmoins dans nos expériences, la présence de hautes concentrations de BSA (au-dessus de 0, 39 mg/mL) inactive totalement CVB4 lorsqu'il est exposé au séchage. Le mécanisme de - 80 - l'effet de protection apporté par les concentrations élevées de SVF, vis-à-vis du séchage reste à déterminer. Au-dessus de 10mg/mL, le NaCl protège CVB4 de la dessiccation. Cela peut être expliqué par le fait que lors de l'évaporation de l'eau, la concentration de NaCl augmente jusqu'au point de cristallisation. Cette cristallisation ralentie le processus de réhydratation pendant la phase de récupération du virus, protégeant les particules virales d'un choc osmotique trop important, comme précédemment suggéré (Benbough, 1971). Etonnamment, à 9mg/mL de NaCl, qui correspond à la concentration dans le sang, la survie du CVB4 vis-à-vis du séchage est minimum. - 81 - 2) Inactivation rapide de virus contenus dans des gouttelettes appliquées sur une surface chauffée Notre étude de l'inactivation virale par la chaleur se distingue de celles déjà publiées. Pour la première fois, le titre infectieux de petits volumes (4L) de suspensions virales déposées sur une surface chaude, pendant une courte période (à partir de 1s), a été étudié. Pour l'étude de l'effet virucide de la température, un système original a été conçu et mis en œuvre (figure 22). Le montage devait répondre à plusieurs contraintes qui étaient : une gamme de températures, comprises entre 70C et 130c. une durée d'exposition à la chaleur, très courte (1s). un titre viral initial d'au moins 4, 5 log10 TCID50. un usage sur le plan de travail d'un PSMII. Le système mis en œuvre comporte une feuille d'aluminium (papier aluminium alimentaire) dont la conductivité thermique est importante (237 W/m/K) (lide, 2007). La feuille sous forme conique est plongée dans un bain-marie de glycérol. Le glycérol peut être chauffé jusqu'à 171c, température de décomposition du glycérol. Après quelques instants, un faible volume de suspension virale (4L) est ajouté sur la surface du cône pendant une durée allant de 1s à 90 min. La petite goutte de suspension virale entre en contact avec le support chauffé et parvient ainsi rapidement à la température souhaitée. Une fois le temps écoulé, du milieu froid (200L à 4 C) est ajouté pour ramener le virus à une température comprise entre 4 et 20C. - 82 - Figure 22 : Photographie du montage utilisé pour l'étude de l'inactivation thermique des virus. Les métaux comme l'argent, le cuivre et le fer exercent une activité virucide (Chen et al. , 2013), (Jeong et al. , 2010), (Kim et al. , 2011). L'activité virucide de l'aluminium (un métal) chauffé a donc été testée. L'étude du milieu conditionné obtenu après chauffage de fragments d'aluminium, n'a pas montré d'effet virucide ou de toxicité cellulaire. Cela indique que le support aluminium n'interfère pas dans nos tests de température. L'efficacité de la récupération des virus chauffés dans les cônes d'aluminium a été illustrée avec le CVB4 par les expériences combinant la mesure du titre viral et de la quantité de particules virales estimée au travers de la quantité d'ARN virale mesurée par RT-PCR en temps réel. - 83 - Les virus testés ont été cultivés dans des milieux différents et/ou des cellules différentes. Il en résulte des différences dans la composition des suspensions virales qui pourraient, comme nous l'avons vu pour le séchage, modifier l'efficacité virucide de la température. Pour cela, l'impact des composants cellulaires et de la quantité de protéines sur l'inactivation thermique de CVB4 a été testé. Les expériences d'inactivation thermique de la suspension stock de CVB4 et de CVB4 purifié dilué au 1/100ème soit dans du PBS, soit du PBS avec 2% de SVF, soit du milieu conditionné enrichi avec du surnageant de lysat de culture de cellules Hep-2, ont montré une réduction équivalente des titres viraux (entre -4, 7 et -4, 9 log10 TCID50/50L). Cela suggère que, dans nos conditions, la composition du milieu ne joue pas un rôle dans l'efficacité virucide de la température. Il a été montré que la température et le pH peuvent avoir un effet synergique sur l'inactivation du norovirus murin (Seo et al. , 2012). Comme le pH peut modifier l'effet virucide de la chaleur, les expériences ont été réalisées avec des suspensions virales dont le pH était similaire (entre 7, 5 et 8). L'inactivation thermique des virus a été obtenue dans un laps de temps très court dans nos expériences et les courbes d'inactivation étaient approximativement linéaires, c'est pourquoi elles ont été analysées selon le modèle de cinétique du premier ordre. Cela nous a permis de comparer les coefficients d'inactivations (k) obtenus avec ceux rapportés par d'autres équipes (Stumbo, 1973). Cependant, le modèle de cinétique du premier ordre ne s'adapte ni aux courbes d'inactivations de HSV-1 et CVB4 à 70c ni à celles du MVM à 80c et 100C. Ces courbes sont convexes ou concaves, ce qui a déjà était observé dans de nombreux cas (Cerf, 1977). Ces courbes ont été analysées à l'aide du modèle de Weibull. Les coefficients d'inactivation de H1N1 à 70 et 80C sont respectivement -0, 30 et -0, 75 log10 TCID50/s dans nos expériences, alors que des coefficients d'inactivation plus faibles, - - 84 - 0, 0092 et -0, 023 log10 TCID50/s, respectivement 70 et 80C, ont été obtenus par une autre équipe (Jeong et al. , 2010). Cette différence peut être expliquée par l'efficacité du transfert thermique. En effet, dans notre système, la suspension virale atteint immédiatement les températures désirées car seulement 4L sont chauffés sur une surface préchauffée alors que dans l'étude de Jeong et al, un volume plus grand de suspension virale (40mL) est chauffé dans un tube de 50mL de polypropylène qui n'a pas été préalablement chauffé. CVB4, un virus non-enveloppé, a été inactivé avec des cinétiques proches de celles de HSV-1, un virus non enveloppé, et H1N1, un autre virus enveloppé, était plus résistant à la chaleur que CVB4. Une explication possible de la sensibilité à la chaleur de CVB4 est que la chaleur, à des températures relativement basses, provoque la libération de l'ARN viral de la capside de CVB4. Cela a déjà été décrit pour d'autres virus (poliovirus 1, 2 et 3) appartenant à la famille des Picornaviridae qui ont été chauffés dans une moindre mesure (37C) (Rombaut et al. , 1994). Pour la première fois, l'inactivation de particules virales contenues dans des gouttelettes exposées à des températures supérieures à 100C a été étudiée. Les coefficients d'inactivation thermique à ces températures ont été déterminés seulement pour H1N1 et MVM car HSV-1 et CVB4 ont été totalement inactivés en 1s à 100c. Le coefficient d'inactivation de H1N1 à 110C était de -3, 54 log10 TCID50/s et dans le cas de MVM à 110, 120 et 130c, ces valeurs étaient respectivement de -0, 66 ; -1, 54 et -2, 54 log10 TCID50/s. Une inactivation complète de MVM a été obtenue dans nos expériences quand les particules virales ont été exposées à 90C pendant 1min, cependant dans une étude précédente, 10 min à 90C en chaleur humide sont nécessaires pour inactiver MVM (Boschetti et al. , 2003). Dans une autre étude (Harris et al. , 1974), MVM en suspension dans un volume de 1ml chauffée à 100C, est inactivé en 15 min alors que 9s ont suffi dans nos - 85 - conditions. Selon Eterpi et al. , aucune réduction du pouvoir infectieux de MVM n'est observée après une exposition à une chaleur sèche à 90C pendant 1 min tandis que dans nos conditions (1 min à 90C), MVM est totalement inactivé (Eterpi et al. , 2009). Globalement, il apparat que l'inactivation thermique de MVM a été plus rapidement obtenue dans nos expériences que dans celles des autres études. Dans notre étude, des petites gouttes ont été exposées à la chaleur ; par conséquent ces gouttelettes ont été séchées pendant le traitement thermique. Or, nous avons vu précédemment que la première phase de séchage réduit les titres viraux de H1N1, HSV-1 et CVB4 (jusqu'à 2, 33 log10 TCID50 de réduction pour HSV-1), mais n'a pas d'effet sur MVM. Ceci suggère que le séchage peut contribuer à l'inactivation thermique de H1N1, HSV-1 et CVB4 mais pas de MVM. Cependant le séchage a été obtenu en deux heures alors que quelques secondes ont suffi pour que les virus soient inactivés par la chaleur. - 86 - 3) Résistance des virus aux UV et effet de la combinaison UV- chaleur sur le MVM Les inactivations de H1N1, HSV-1, SV40, MVM et CVB4 ont été obtenues à différentes doses d'UVc. Pour tous les virus, les profils d'inactivation sont similaires et le même modèle mathématique a été utilisé : le modèle exponentiel de premier ordre. La raison de l'effet de queue observé sur toutes les courbes d'inactivation a été expliquée par la présence de particules solides dans la suspension virale qui font écran de protection autour du virus (Scheible et al. , 1985). Cependant, selon d'autres auteurs, l'effet de queue serait dû à la présence d'agrégats viraux qui permettent une infection multiple des cellules suivi d'une recombinaison qui est la création d'un génome intégral par l'utilisation de portions intactes du génome viral de plusieurs virus endommagés (Mattle and Kohn, 2012). La polymérase passe d'un génome à l'autre pendant le processus de réplication (Nagy and Simon, 1997). Ce phénomène a été observé avec le virus de la Vaccine, un virus à ADN double brins (Sharp and Kim, 1966), le Poliovirus, un entérovirus (Savolainen-Kopra and Blomqvist, 2010) et dans une moindre mesure avec des virus à ARN simple brin à polarité négative (Simon-Loriere and Holmes, 2011) tel que H1N1 (Boni et al. , 2010). Les virus à ADN double brins, HSV-1 et SV40, ont été plus résistants que les virus à ARN, CVB4 et H1N1, et que le virus à ADN simple brin, MVM. Cette résistance s'explique par l'utilisation des mécanismes cellulaires de réparation des altérations des acides nucléiques pour la réparation de l'ADN viral irradié. Cette mise à profit a été observée dans les cellules Véro pour HSV-1 (Millhouse et al. , 2012) et dans les BSC-1 pour SV40 (Abrahams and Van der Eb, 1976). - 87 - L'expérience combinant différentes doses d'UVc suivi par un traitement thermique de 20s à 100C permet d'obtenir une inactivation plus efficace. En effet, en ajoutant le traitement par la chaleur, 17mJ/cm d'UVc sont suffisants pour inactiver le MVM alors que 27 mJ/cm d'UVc sont nécessaires dans le cas o aucun traitement thermique n'est appliqué. Par ailleurs, les coefficients d'inactivation K calculés à partir du modèle exponentiel de premier ordre sur les deux courbes obtenues sont similaires ; 0, 161 et 0, 166 log10 TCID50/s pour respectivement la suspension de MVM irradiée puis chauffée et la suspension de MVM uniquement irradiée. Ces résultats suggèrent une indépendance des effets (figure 24). Il a été montré que les UVc et la chaleur agissent sur deux parties différentes du virus. La chaleur inactive la liaison du virus à son récepteur cellulaire tandis que les UVc inhibent la réplication du génome (Wigginton et al. , 2012). - 88 - Figure 24 : Schéma explicatif de l'hypothèse de l'effet combinatoire de la chaleur et des UVc sur le MVM. - 89 - CONCLUSION ET PERSPECTIVES Cette étude montre que les virus peuvent persister pendant plusieurs jours voire des semaines sur une surface hydrophobe. Les profils de résistance des virus vis-à-vis du séchage ne sont pas dus à une hétérogénéité de populations virales. De plus, la composition et la concentration des composants du milieu jouent un rôle dans la résistance des virus exposés au séchage. Par conséquent, nous recommandons l'étude de la persistance virale dans des milieux naturels (cliniques ou environnementaux) au lieu de milieux définis. Par ailleurs, la résistance thermique des virus contenus dans un petit volume de liquide exposés pendant une très courte durée à des températures comprises entre 70C et 130C a été étudiée. Pour la première fois, l'inactivation de particules virales contenues dans des gouttelettes exposées à des températures supérieures à 100C a été réalisée. La plus grande résistance thermique de H1N1, comparé à HSV-1, un autre virus enveloppé, et à CVB4, un virus non-enveloppé a été observée. De plus, il a été montré que, dans nos conditions, la chaleur inactive plus rapidement les virus que précédemment décrit. Enfin, la résistance aux UVc des virus a été étudiée. La résistance de HSV-1 et SV40, deux virus à ADN double brins, a été observée. L'effet combiné des UVc et de la chaleur vis- à-vis de MVM a été testé et a mis en évidence une indépendance des effets. L'étude des deux moyens d'inactivation agissant en même temps serait intéressante à réaliser pour déterminer si - 90 - l'hyperchromicité des acides nucléiques provoquée par la chaleur favorise l'inactivation virale due aux UVc. La chaleur et les UVc sont une alternative efficace à la désinfection chimique. Ils présentent les avantages des moyens physiques : pas de matière résiduelle sur les surfaces et action rapide dans certaines conditions. Il reste à déterminer l'impact du séchage sur les effets virucides de la chaleur et des UVc. - 91 - BIBLIOGRAPHIE Abad, F. X. , Pinto, R. M. , and Bosch, A. (1994). Survival of enteric viruses on environmental fomites. Appl. Environ. Microbiol. 60, 37043710. Abad, F. X. , Villena, C. , Guix, S. , Caballero, S. , Pinto, R. M. , and Bosch, A. (2001). 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Acta Virol. 19, 8890. - 110 - ANNEXES - 111 - Annexe 1 : article publié par Microbes and Environments Viruses Contained in Droplets Applied on Warmed Surface Are Rapidly Inactivated SWAN FIRQUET, SOPHIE BEAUJARD, PIERRE-EMMANUEL LOBERT, FAMARA SANÉ, DELPHINE CALOONE, DANIEL IZARD and DIDIER HOBER. Abstract Heat inactivation of viruses was reported, however, the thermal resistance of viruses in droplets has not been studied. The aim of this study was to evaluate the pattern of heat resistance of minute virus of mice (MVM), coxsackievirus B4 (CVB4), influenza A virus (H1N1), and herpes simplex virus type 1 (HSV-1) contained in droplets. Four L droplets containing viruses (> 104. 5 TCID50) were applied onto warmed surface obtained by using a self-made heating device. Viral suspensions were exposed to temperatures ranging from 70 to 130C for 0 to 90 min depending on the virus, and then the recovered viral preparations were tittered. Inactivation rates were calculated from curves that were analysed according to the first order kinetics model. Full inactivation was obtained for MVM in 90 min at 80C and in 2 s at 130C, for H1N1 in 14 s at 70C and in 1s at 110C, for CVB4 and HSV-1 in 5s and 7s respectively at 70C and in 1 s at 100C. Clearly, MVM was more resistant than H1N1 that was more resistant than HSV-1 and CVB4, which was reflected by increasing inactivation rates. The impact of short time exposure to heat onto the infectivity of viruses contained in a small volume of suspension has been determined. For the first time, the inactivation of viral particles contained in drops exposed to temperatures higher than 100C has been investigated. It appears that heating can have an unexpected faster virucidal effect than previously described. - 112 - Annexe 2 : Article en révision favorable Survival of Enveloped and Non-Enveloped Viruses on Surface SWAN FIRQUET, SOPHIE BEAUJARD, PIERRE-EMMANUEL LOBERT, FAMARA SANÉ, DELPHINE CALOONE, DANIEL IZARD and DIDIER HOBER. Abstract In the present study we evaluated the viability on surface of non-enveloped viruses, minute virus of mice (MVM), and coxsackievirus B4 (CVB4), and enveloped-viruses, influenza A virus (H1N1), and herpes simplex virus type 1 (HSV-1). The impact of initial concentration of proteins and sodium chloride onto the persistence of infectious CVB4 on surface has been investigated. Fifty L of viral suspension (> 104. 5 TCID50), were applied onto petri dish lids and dried under air flow of biosafety cabinet. The recovered viral preparations were titered on appropriate cell lines. Enveloped viruses persisted for less than 5 days while CVB4 and MVM persisted for weeks. However, repetitive cycles of drying and resuspension had more virucidal effect on CVB4 than on H1N1 and HSV-1. No effect of these repetitive cycles on infectious titer of MVM was recorded. When exposed to drying, initial concentrations of bovine serum albumin (from 0 to 90mg/mL), foetal calf serum (from 0 to 100%) and sodium chloride (from 0 to 300 mg/mL) had an impact on viability of CVB4. In a protein rich medium, CVB4 was more likely inactivated by drying whereas in presence of sodium chloride the impact of drying was reduced. In conclusion the resistance of viruses toward drying, as suggested by iterative drying, is not due to a heterogeneity of viral subpopulations, but it can be influenced by media composition and component concentrations, as illustrated in the model of CVB4. - 113 - | HAL | Scientific |
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30 novembre : Carl Haussknecht (mort en 1903), pharmacien et botaniste allemand.
Thomas MacLagan (mort en 1903), médecin et pharmacologue écossais.
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12 mai : Jdrzej niadecki (né en 1768), écrivain, biologiste, chimiste et médecin polonais.
17 novembre : François Broussais (né en 1772), chirurgien français.
Références
Voir aussi
Chronologie des faits économiques et sociaux dans les années 1830
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