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UNIVERSITE BORDEAUX 2 VICTOR SEGALEN UFR DES SCIENCES MEDICALES 2014 Thèse n169 Thèse pour l'obtention du DIPLOME D'ETAT DE DOCTEUR EN MEDECINE Spécialité : Médecine Générale présentée et soutenue publiquement le 18 décembre 2014 par Brice CHAUVIN né le 21 février 1983 REPRESENTATIONS DES MEDECINS GENERALISTES LIBERAUX SUR LA GENERALISATION DU TIERS PAYANT : ETUDE QUALITATIVE Directeur de thèse Monsieur le Docteur Baptiste LUACES Rapporteur de thèse Monsieur le Professeur associé William DURIEUX JURY Président : Monsieur le Professeur Fabrice BONNET Juge : Monsieur le Professeur associé William DURIEUX Juge : Madame le Docteur Sylvie MAURICE Juge : Monsieur le Docteur Christophe ADAM Juge : Monsieur le Docteur Bernard COADOU UNIVERSITE BORDEAUX 2 VICTOR SEGALEN UFR DES SCIENCES MEDICALES 2014 Thèse n169 Thèse pour l'obtention du DIPLOME D'ETAT DE DOCTEUR EN MEDECINE Spécialité : Médecine Générale présentée et soutenue publiquement le 18 décembre 2014 par Brice CHAUVIN né le 21 février 1983 REPRESENTATIONS DES MEDECINS GENERALISTES LIBERAUX SUR LA GENERALISATION DU TIERS PAYANT : ETUDE QUALITATIVE Directeur de thèse Monsieur le Docteur Baptiste LUACES Rapporteur de thèse : Monsieur le Professeur associé William DURIEUX JURY Président : Monsieur le Professeur Fabrice BONNET Juge : Monsieur le Professeur associé William DURIEUX Juge : Madame le Docteur Sylvie MAURICE Juge : Monsieur le Docteur Christophe ADAM Juge : Monsieur le Docteur Bernard COADOU 1 Remerciements Aux membres du jury : Monsieur le Professeur Fabrice Bonnet, Professeur des Universités, Praticien Hospitalier à l'unité de médecine interne et maladies infectieuses de l'hôpital Saint André. Vous m'avez fait l'honneur d'accepter de présider mon jury. Veuillez trouver ici la marque de toute ma reconnaissance et de mon profond respect. Monsieur le Professeur William Durieux, Professeur associé au département de médecine générale, médecin généraliste. Vous avez accepté d'être le rapporteur de ma thèse. Merci pour l'attention portée à mon travail. Veuillez recevoir ici la preuve de toute ma gratitude et de ma considération. Madame le Docteur Sylvie Maurice, Matre de Conférence des Universités, Praticien Hospitalier en santé publique à l'ISPED. Je vous prie de recevoir ici le témoignage de toute ma reconnaissance et de mon profond respect. Monsieur le Docteur Christophe Adam, matre de conférence associé au département de médecine générale, médecin généraliste. Veuillez trouver ici l'expression de toute ma reconnaissance et de ma considération. Monsieur le Docteur Bernard Coadou, médecin généraliste. Merci pour votre aide, votre participation dans ce travail et pour m'avoir permis involontairement de connatre Baptiste. Votre engagement et votre vision de la médecine constituent pour moi un modèle et une source de motivation. Monsieur le Docteur Baptiste Luaces, médecin généraliste. Merci de m'avoir fait confiance si simplement en acceptant de me diriger dans ce travail alors qu'on se connaissait à peine et que les circonstances n'étaient pas évidentes. Merci aussi de m'avoir décomplexé avec ta thèse et d'avoir accepté de s'attaquer à ce sujet. Merci pour tes conseils judicieux et ton investissement. J'espère que je n'ai pas refroidi ton enthousiasme et que de nombreux étudiants pourront apprendre grâce à toi. Longue vie enfin à la maison de santé dont tu portes le projet ! 2 Merci au Docteur Marco Romero, médecin généraliste et second investigateur. Pour ton aide pleine d'abnégation et de dévouement dans le lourd travail que je t'ai confié. comme tu en avais fait preuve déjà pour moi en tant que tuteur. Merci à tous les médecins qui ont accepté de me donner de leur temps pour répondre à mes questions dans le cadre de cette étude. Merci aux équipes médicales et para-médicales qui ont participé à ma formation et plus particulièrement les équipes infirmières des urgences du CH Pau, d'Oloron Sainte Marie, de Langon, du service de gériatrie de l'hôpital d'Oloron Sainte Marie et de neurologie du CHU de Bordeaux, du SECOP de Charles Perrens, l'équipe des sages-femmes de la maternité de Langon et les Docteurs LAJUS, BASTIN, VALIAME, MAURAN et MARTIN. Merci aux médecins généralistes qui m'ont accueilli dans leur cabinet pendant l'internat, m'ont permis de découvrir la médecine générale et de me conforter ainsi dans mon choix : Dr FAUCIE, BRIOL et DUFOUR. J'espère que tout va bien dans vos montagnes. Merci enfin aux Docteurs EHSTER et THOMAS qui m'ont donné l'opportunité de commencer à travailler en les remplaçant, qui m'ont aidé dans mes premiers pas et m'ont montré une voie que j'espère pouvoir emprunter. Merci à ma famille : à ma mère et mon père pour leur soutien sans faille. et leur patience ! Merci de m'avoir donné le goût d'apprendre et transmis des valeurs qui sont nécessaires au quotidien dans le métier de médecin. Et pour toujours me rappeler le point de vue du patient. à mon frère pour m'obliger à réfléchir toujours un peu plus loin et me pousser dans mes retranchements. Et pour me faire toujours autant rire (Je suis canoque Docteur du coup ? ). Et merci à Jess pour le coup de pouce linguistique et pour arriver à pousser Florent dans ses retranchements. à mon grand-père qui m'a montré l'importance de la rigueur. 3 Merci à mes amis (par ordre alphabétique, pour en embêter quelques un-e-s ! ) à Antoine (non, antoine, j'ai dit par ordre alphabétique. ! ; ) et Laurie. Merci Antoine pour avoir réussi à faire un panaché de tous les personnages les plus drôles de série télé médicale avec ce petit truc en plus rimbaldien. à Bérénice et Hugo, pour les photos d'encouragement des deux petits amours pendant les journées de boulot, pour l'énergie et la joie que vous dégagez toujours autant. Quand est ce que les filles passent au cours de Melbourne danse ? à Camille, pour m'avoir redonné par tes discussions, tes lectures, tes rencontres, l'envie de mettre les mains dans le cambouis-confiture des sciences sociales, pour ton soutien permanent, pour les lamas et pour tout le reste. à Emilie, pour les petites pauses bien venues ces derniers mois et tes histoires improbables. Qu'est-ce je vais bien pouvoir trouver maintenant pour ne pas aller te voir. ? à Félisa et Sam. Merci Fé pour ton soutien pendant une partie de ces études. Ca y est, vous pouvez enfin m'appeler comme Tomtom en rêvait. à Gigi et JB pour être restés pas trop loin et dans un endroit plutôt pas sympa, non ? Merci Gigi pour avoir pris le relais des mails collectifs à réponses éparses. Et pour ta soif de découverte toujours ! à Laure-Astrid et Alexandre. Merci LA, pour tes coups de fil qui rythmaient la marche progressive vers nos libérations. C'est bon, je crois que le feu sacré ne s'est pas tari ! à Maelle et Charlotte. Pour les repas un dner presque parfait si agréables chez vous ou ailleurs. Et merci Maelle de m'avoir fait tant évoluer et ouvert l'esprit depuis le début. Vous me le confiez alors le cœur voyageur, c'est mon tour ? à Marco et Caroline, pour les sessions bibliothèques dans votre salon qui m'ont bien lancé, pour avoir déménagé exprès à Thèze pour me faire penser à mes obligations. Et pour tous ces beaux moments passés grâce à vous ! Il me tarde pour votre petit bout ! à Marie et Jérôme. Pour nous montrer que oui, on peut concilier travail intense et vie familiale. A toi de jouer maintenant pour la thèse ! Et après, je vais revenir t'embêter. ; ) A la bande issue du GENEPI : Andréa, Thibault, Bastien, Elise, Armand, Chloe. Pour avoir presque réussi à me faire rajeunir et croire à nouveau en l'engagement (Haha, j'ai réussi à placer GENEPI chez les médecins. ). 4 Table des matières Abréviations et sigles Introduction Partie I : Bases théoriques I. Le tiers payant : définition et rappels I. 1) Définition I. 2) La répartition du coût du soin en France I. 3) La place du tiers payant dans le système actuel I. 4) La place de l'avance des frais et des AMC : une spécificité française II. L'histoire du tiers payant dans la protection sociale : un marqueur de l'évolution de la médecine libérale II. 1) Les systèmes de protection sociale avant 1945 : des tentatives de mise en place du tiers payant contre-carrées par les médecins II. 2) La création de la Sécurité Sociale : la réaffirmation du paiement direct par le patient mais la fin de la libre entente sur les tarifs II. 3) 1945-1970 : l'extension des droits des assurés, la marche vers le conventionnement des médecins II. 4) 1975 à nos jours : le développement du tiers payant AMO, la réintroduction d'une liberté tarifaire, l'expansion des complémentaires p. 10 p. 11 p. 14 p. 14 p. 14 p. 15 p. 16 p. 17 p. 17 p. 19 p. 20 p. 21 5 III. Tiers payant et accès aux soins III. 1) Liens entre morbidité, précarité et protection sociale III. 2) Difficultés d'accès aux soins en France III. 2. a) L'accessibilité des professionnels III. 2. b) L'accessibilité administrative III. 2. c) L'accessibilité relevant de déterminants culturels ou psychiques propres au patient III. 2. d) L'accessibilité financière III. 3) Situations pratiques d'accès aux soins pouvant être améliorées par la généralisation du tiers payant Partie II : Etude I. Matériel et méthodes I. 1) Constitution de l'échantillon I. 2) Réalisation et contenu du guide d'entretien I. 3) Réalisation des entretiens I. 4) Traitement des données II. Résultats : données quantitatives II. 1) Taille de l'échantillon II. 2) Réalisation des entretiens II. 3) Profil des médecins p. 23 p. 24 p. 24 p. 25 p. 25 p. 25 p. 26 p. 27 p. 30 p. 30 p. 30 p. 31 p. 32 p. 32 p. 32 p. 33 p. 33 6 III. Résultats : données qualitatives III. 1) Les aspects pratiques de la généralisation du tiers payant III. 1. a) Les facilitations attendues du tiers payant généralisé III. 1. b) Les craintes nombreuses sur l'application pratique du tiers payant généralisé III. 1. c) Un usage du tiers payant très disparate III. 2) L'impact du tiers payant sur les comportements des patients et sur la relation médecin-patient III. 2. a) Les conséquences positives attendues sur le comportement des patients III. 2. b) Les conséquences négatives attendues sur le comportement des patients III. 2. c) Des comportements négatifs contestés ou sur lesquels on peut agir III. 2. d) La perception par les patients de la réforme d'après les médecins III. 2. e) L'impact du paiement sur la relation médecin-patient III. 3) La question de la rémunération des médecins III. 3. a) Le prix de la consultation considéré comme faible et des perspectives incertaines III. 3. b) Le tiers payant généralisé perçu comme la fin de la médecine libérale III. 3. c) La perception des rémunérations aux forfaits mises en place III. 3. d) La perception du salariat et du forfait à la capitation et la critique du paiement à l'acte III. 4) La question de l'accès aux soins III. 4. a) L'absence de problèmes d'accès aux soins III. 4. b) Les problèmes d'accès aux soins perçus par les médecins et leurs solutions au tiers payant délétère ? III. 4. c) Du tiers payant généralisé inefficace dans l'accès aux soins III. 4. d) Un attachement à la Sécurité Sociale et à l'accès aux soins, parfois relatif pour certains. p. 36 p. 36 p. 36 p. 36 p. 38 p. 40 p. 40 p. 41 p. 42 p. 42 p. 43 p. 44 p. 44 p. 45 p. 46 p. 47 p. 49 p. 49 p. 49 p. 51 p. 51 III. 5) Variation des opinions des médecins en fonction de leur profil p. 52 7 IV. Discussion IV. 1) Choix du sujet IV. 2) Méthodologie IV. 2. a) Choix de la méthode qualitative IV. 2. b) Choix de l'entretien semi-directif IV. 2. c) Constitution de l'échantillon IV. 2. d) Constitution du guide d'entretien IV. 2. e) Réalisation des entretiens IV. 2. f) Exploitation des données IV. 3) Discussion des questions des recherche IV. 3. a) Des représentations du tiers payant témoins de l'ambivalence de la profession autour du caractère libéral IV. 3. b) Des représentations négatives au niveau pratique et technique IV. 3. c) Des représentations favorables rejoignant les attentes de l'IGAS et un aspect novateur soulevé IV. 3. d) Des représentations négatives évidentes mais contestables : le thème inflationniste IV. 3. e) Des représentations négatives évidentes mais contestables : le thème de la déresponsabilisation IV. 4) Discussion des questions de recherche : les pratiques du tiers payant IV. 5) Discussion des questions de recherche : les propositions pour la facilitation de l'accès aux soins et la place du mode de rémunération IV. 5. a) Des propositions cohérentes pour la plupart IV. 5. b) La place du mode de rémunération Conclusion Bibliographie Annexes : Annexe I : Prise en charge par l'AMO des différents soins en France pour un assuré sans exonération du ticket modérateur Annexe II : Circonstances de prise en charge du ticket modérateur par l'AMO Annexe III : Franchises instaurées sur les soins depuis 2005 p. 53 p. 53 p. 53 p. 53 p. 53 p. 54 p. 55 p. 56 p. 56 p. 57 p. 57 p. 59 p. 60 p. 60 p. 62 p. 63 p. 65 p. 65 p. 66 p. 69 p. 70 p. 76 p. 77 p. 78 8 Annexe IV : Synthèse rapport de l'IGAS sur la généralisation du tiers payant Annexe V : Evolution du taux de renoncement aux soins en France Annexe VI : Guide d'entretien formalisé p. 79 p. 81 p. 82 9 ABREVATIONS et SIGLES ACS : Aide à la Complémentaire Santé AAH : Allocation Adulte Handicapé ALD : Affection Longue Durée AMC : Assurance Maladie Complémentaire AMD : Aide Médicale Départementale AME : Aide Médicale d'Etat AMO : Assurance Maladie Obligatoire ANI : Accord National Inter-professionnel CES : Centre d'Examen de Santé CISS : Collectif Inter-associatif sur la Santé CMU-C : Couverture Maladie Universelle Complémentaire CNAM : Caisse Nationale d'Assurance Maladie CREDES : Centre de Recherche, d'Etudes et de Documentation en Economie de la Santé CSMF : Confédération des Syndicats des Médecins Français DREES : Direction de Recherche, des Etudes, de l'Evaluation et des Statistiques EPICES : (score) d'Evaluation de la Précarité et des Inégalités de Santé dans les Centres d'Examens de Santé ESPS : Enquête nationale sur la Santé et la Protection Sociale HAS : Haute Autorité de Santé IGAS : Inspection Générale des Affaires Sociales IRDES : Institut de Recherche et de Documentation en Economie de la Santé MG-France : Médecins Généralistes France OCDE : Organisation pour la Coopération et le Développement Economique OMS : Organisation Mondiale de la Santé PMI : Protection Médicale Infantile ROSP : Rémunération sur Objectifs de Santé Publique SASPAS : Stage Ambulatoire de Soins Primaires en Autonomie Supervisée UFML : Union Française pour la Médecine Libre USMF : Union des Syndicats des Médecins Français 10 La ministre de la santé, Mme Marisol Touraine, a annoncé, en septembre 2013, qu'elle souhaitait donner la possibilité à tous les patients de ne plus avoir à avancer les frais des consultations de médecins libéraux, à l'horizon 2017. Cette mesure est présentée avant tout comme permettant de favoriser l'accès aux soins de la médecine de ville. Ce projet de réforme a été mal accueilli par la plupart des syndicats de médecins qui s'inquiétèrent des conditions d'application au niveau technique et financier pour les praticiens. Mais, certaines organisations syndicales ont alerté également sur le risque de surconsommation de soins et d'une nouvelle remise en cause de la condition du médecin libéral. En revanche, hormis MG-France et le Syndicat de la Médecine Générale (SMG), aucune organisation n'a souligné les éventuels points favorables que pouvait apporter cette réforme pour les patients ou pour les médecins. Au cours de notre formation initiale, nous avons été peu confrontés à la question du paiement de l'acte médical. Salariés pendant toute la période de l'internat, le seul contact éventuel avec cette problématique pouvait être lors des stages chez le praticien mais nous étions rarement en responsabilité de cette tâche. Par ailleurs, nous avions l'occasion de rencontrer trois médecins, ou six, au mieux, en cas de SASPAS, qui ont souvent des similitudes dans l'environnement d'exercice et dont le simple fait d'être matre de stage limite la diversité des pratiques. En revanche, au cours de notre pratique en tant que médecin généraliste libéral remplaçant après l'internat, nous avons eu l'occasion de travailler pour des médecins dans des milieux très différents. Nous avons pu nous rendre compte sur le terrain de la diversité des pratiques des médecins généralistes quant à l'utilisation du tiers payant avec leurs patients. Nous avons aussi perçu, à travers ces pratiques et en discutant avec les praticiens que nous remplacions et leur patientèle, la grande variabilité des médecins dans leur conception de leur statut libéral et dans le rapport qu'ils entretiennent au paiement de l'acte médical. Nous avons enfin été confrontés à des questions et des situations que nous n'avions jamais envisagées auparavant : quand peut on considérer qu'on a réalisé un acte méritant le paiement ? Comment répondre à des demandes téléphoniques d'actes à faire sans qu'il y ait de paiement ? Comment réagir face à des accusations de faire revenir les patients pour faire du chiffre ? Comment au contraire se comporter face à des gens qui insistent pour nous donner la carte vitale pour des tâches ne le nécessitant pas presque comme s'ils nous faisaient une faveur ou parce que tout travail mérite salaire ? Qui paye quoi, quand et pourquoi ? Et comment faire payer ? L'élargissement progressif du tiers payant à différentes catégories de patients (ALD, CMU. ) et l'utilisation par certains médecins du tiers payant partiel (avance par le patient uniquement du ticket modérateur) pouvaient nous laisser penser que cette réforme serait bien accueillie par les médecins, pour la facilitation de l'accès aux soins qu'elle permet. Mais, au vu des arguments avancés par les syndicats et du fort attachement aux valeurs libérales des médecins de ville, on peut également s'attendre à ce qu'ils aient une représentation majoritairement négative de la généralisation du tiers payant. Notre recherche bibliographique n'a retrouvé aucun travail ayant étudié, de façon précise, la représentation des médecins quant à ce projet de réforme et leur perception des avantages ou inconvénients éventuels. Le caractère récent de la proposition ministérielle peut sans doute l'expliquer. Il nous semble pourtant important de dresser un tableau complet des représentations des médecins généralistes sur le terrain pour éventuellement participer à la 11 déconstruction d'opinions répandues erronées. Cette question du tiers payant généralisé est en effet primordiale dans ce qu'elle nous interroge sur notre rapport au paiement de l'acte médical et au patient et donc sur l'organisation de la médecine libérale en France. Cette réflexion nous a amenés à poser la question de recherche suivante : quels sont les avantages et inconvénients perçus par les médecins généralistes libéraux concernant la généralisation du tiers payant ? Notre objectif principal sera donc d'explorer les représentations des médecins généralistes sur ce thème. Les objectifs secondaires abordés au travers de cette étude sont : confronter les opinions sur le tiers payant généralisé avec les données de la science. décrire les pratiques actuelles de l'utilisation du tiers payant d'après les médecins. faire émerger chez les médecins généralistes d'autres propositions concernant les problématiques d'accès aux soins et la place qu'ils attribuent au mode de rémunération dans cette thématique. 12 Partie I : Bases théoriques 13 I. Le tiers payant : définition et rappels I. 1) Tiers payant : définition (1) Le tiers payant désigne le dispositif qui, dans un système de santé, permet aux patients de ne pas avoir à payer directement le professionnel qu'il sollicite car celui-ci est réglé par un organisme d'assurance-maladie autre pouvant être public, privé ou les deux. Par abus de langage, il est considéré comme synonyme de dispense d'avance des frais alors que deux cas peuvent se présenter o le patient ne fait pas l'avance des frais mais o le professionnel n'est pas payé par un tiers pour autant : quand le patient a déjà reçu un versement d'un organisme avant la consultation. quand le professionnel attend que le patient ait bénéficié du remboursement de l'organisme tiers avant d'encaisser le moyen de paiement donné par le patient lors de la consultation (solution utilisée en pratique en France par certains médecins). Par opposition, le système de paiement direct du médecin par le patient avec avance des frais et remboursement a posteriori est aussi appelé tiers garant. I. 2) La répartition du coût du soin en France Le patient qui est couvert par l'assurance maladie obligatoire (Caisse National d'Assurance Maladie et leurs subdivisions ou Mutualité Sociale agricole), en France, bénéficie d'une prise en charge d'une partie du coût des soins qui lui sont prodigués. La part prise en charge par l'assurance maladie varie selon le type de soins. Par exemple, elle est de 70 % pour les frais de consultation des médecins généralistes et spécialistes (dont actes de radiologie). (2 et annexe I) La partie non prise en charge par l'assurance maladie obligatoire (AMO) est appelée ticket modérateur et reste à la charge du patient. Ce taux varie donc selon le type d'actes, de pathologies mais aussi, depuis peu, selon le respect ou non du parcours de soins coordonnés, c'est-à-dire si le patient a bien déclaré un médecin traitant à l'assurance maladie et consulte les spécialistes éventuels adressés par le praticien. Le patient peut alors contracter une assurance maladie complémentaire (AMC) qui, en fonction du contrat, peut rembourser tout ou partie du ticket modérateur et, pour certains contrats, peut prendre en charge les éventuels dépassements d'honoraires réclamés par les praticiens. Ce ticket modérateur peut être pris en charge intégralement par l'AMO dans certaines circonstances : patients bénéficiaires de la CMU-C, de l'AME, d'une pension d'invalidité ou d'une rente après un accident du travail ou d'une maladie professionnelle ou patients souffrant d'une ALD (3, annexe II). Dans le but de diminuer les dépenses de l'assurance maladie, des systèmes de forfaits et franchises ont été mis en place progressivement sur les différents postes de dépenses de santé (consultation, médicaments, actes infirmiers, transport) depuis 2005. Ils ne sont pas appliqués aux mineurs, aux patients relevant de la CMU-C ou de l'AME et aux femmes enceintes à partir du sixième mois de grossesse et jusqu'à douze jours après l'accouchement. (4 et annexe III) 14 Il existe un dernier type de frais de santé laissé à la charge du patient : le forfait hospitalier. Il correspond à une participation aux frais d'hébergement, lors d'un séjour de plus de 24 heures, dans un établissement de santé. Il est de 18 euros par jour. Il est pris en charge par l'AMO pour les patients relevant de la CMU-C ou de l'AME et n'est pas dû dans certaines circonstances. Il est pris en charge par l'AMC pour la plupart des contrats. (4) Le reste à charge des patients dans le système français rassemble donc le ticket modérateur, les franchises et forfait institués et le forfait hospitalier. Quand le ticket modérateur est pris en charge par une AMC, il semble logique (mais n'est pas toujours appliqué) d'inclure le montant des cotisations payées à l'organisme complémentaire par le patient dans ce reste à charge. I. 3) La place du tiers payant dans le système actuel L'expression tiers payant généralisé témoigne de l'existence de dispositifs qui permettent déjà le tiers payant dans certaines circonstances que voici énumérées : (1) les patients bénéficiaires de la CMU et l'AME, le tiers payant portant sur la part AMO et AMC (disposition législative). les patients victimes d'un accident du travail ou d'une maladie professionnelle avec prise en charge à 100% par l'assurance AT-MP (disposition législative). les actes supérieurs à 120 euros bénéficient du tiers payant sur la partie AMO. Ces actes ont un ticket modérateur forfaitaire de 18 euros. Il est avancé par les patients et éventuellement remboursé par l'AMC secondairement. Ceci permet d'expliquer le plus fort taux d'actes réalisés en tiers payant chez les spécialistes dits techniques, par comparaison aux autres spécialistes dont les généralistes, du fait du coût souvent élevé de ces actes. les patients bénéficiaires de l'ACS (Aide à la Complémentaire Santé) bénéficient du tiers payant sur la partie AMO (disposition législative). Les actes réalisés dans les centres de santé, les centres de PMI et les établissements de santé (dont les consultations aux urgences), hors consultations externes, fonctionnent sur la base d'un tiers payant sur la partie AMO et, en fonction des accords entre la structure et les mutuelles, sur la partie AMC. On est en revanche hors du champ de la médecine libérale puisque les médecins y travaillant sont salariés. Le facteur de dispense d'avance des frais n'est pas forcément identifié comme une cause de chaque consultation aux urgences relevant de la médecine générale de premier recours. Mais il constitue un des arguments qui poussent certains patients à privilégier l'usage des services d'urgences plutôt que la consultation en médecine de ville pour des motifs ne relevant pas de ces services. Son estimation est variable selon le type d'études : en 2003, par exemple, 15, 4 % des gens consultant aux urgences pour des motifs relevant de la médecine de premier recours ont dit le faire à cause de la dispense d'avances des frais. (5) Les actes réalisés dans le cadre de la permanence des soins et régulés par le SAMU peuvent être pris en charge en tiers payant sur la partie AMO pour pallier les difficultés d'accessibilité à un moyen de paiement lors de la réalisation de ces actes (nuit, week- end. ). Les actes réalisés dans le cadre de campagnes préventives (dépistage cancer du sein, examen bucco-dentaire chez l'enfant à certains âges, consultation en libéral suite à un bilan de santé réalisé en centre de santé). 15 Enfin, des dispositions conventionnelles locales (donc pouvant être variables d'un département à l'autre) et souvent non obligatoires (donc variables d'un médecin à l'autre) ont également instauré un tiers payant sur la partie AMO possible : soit du fait d'accords locaux entre les caisses d'AMO et les syndicats de médecins pour certaines populations identifiées comme fragiles au niveau financier : c'est dans ce cadre que peut se réaliser le tiers payant pour les patients souffrant d'une ALD qui, de fait, est intégral puisqu'ils sont exonérés du ticket modérateur. D'autres populations peuvent être ainsi ciblées : patients âgés ou jeunes, en invalidité. soit à l'initiative personnelle du médecin s'il juge que certains patients présentent des difficultés financières ou un état de santé nécessitant des actes itératifs. Cette possibilité n'est inscrite au niveau conventionnel que depuis la dernière négociation de juillet 2011. (6) Elle vient clarifier une situation paradoxale : certaines caisses laissaient les médecins utiliser le tiers payant fréquemment vis-à-vis d'usagers n'en relevant pas d'après la loi alors que d'autres caisses rappelaient à l'ordre les praticiens ayant ces pratiques. Aucune directive nationale n'a permis de mettre à plat cette possibilité d'o des disparités très grandes entre départements et entre médecins, par exemple pour l'usage du tiers payant pour les patients souffrant d'une ALD. De même, le paiement du médecin par les AMC n'est prévu dans aucun texte mais peut faire l'objet en pratique d'accord individuel entre certaines mutuelles et praticiens : cette situation est rare (6% de tiers payant AMC en médecine de ville, d'après la Mutualité française, citée par le rapport de l'IGAS). (1) La réforme du tiers payant voulue par la ministre est présentée comme visant à clarifier cette ambivalence et augmenter le taux d'actes en tiers payant intégral en médecine de ville, en le rendant accessible à tout patient a priori, sans préjuger de sa situation financière ou de santé. I. 4) La place de l'avance des frais et des AMC : une spécificité française On peut distinguer trois grands types de système d'organisation des soins dans le monde. Le système libéral, comme aux États-Unis, consiste en une organisation o la protection contre le risque maladie dépend de la souscription volontaire d'une assurance privée pour une grande partie de la population, avec un système d'assurance publique, uniquement pour les risques majeurs, accessible aux personnes âgées et aux foyers à faibles ressources. Ce système est à l'origine d'un poids particulièrement important du coût de la santé dans l'économie du pays. 15, 3 % du PIB contre 11, 1% en France, c'est le plus fort taux au niveau mondial. Il entrane également de fortes inégalités d'accès aux soins : 45 millions d'Américains étaient sans couverture maladie en 2009. (7) Néanmoins, on peut noter que le patient, quand il est assuré, n'avance pas les frais de la consultation et que le praticien est directement réglé par l'assurance qui le couvre. Le système étatisé national de santé, comme en Angleterre, est financé par l'impôt et organisé par l'État ou plus localement par les pouvoirs publics régionaux. La dispense d'avance de frais est totale. La participation de l'assurance complémentaire est quasi-nulle ou alors ouvre l'accès à un réseau de soins totalement privés (on parle d'assurance duplicative). 16 Enfin, le système d'assurance maladie peut être organisé sur des principes bismarckiens avec financement basé sur des cotisations et gestion déléguée à des caisses (France, Allemagne, Belgique. ). La part financée par l'assurance complémentaire est assez variable dans ces pays selon les orientations privilégiées par le système de soins : dans la plupart des pays, il est plus axé sur les soins primaires donc la médecine ambulatoire, avec un plafond annuel de dépenses à la charge du patient, basé sur ses revenus ou fixe, au delà duquel la prise en charge est totalement assurée par l'AMO. Le reste à charge est de ce fait faible et fait peu appel aux assurances complémentaires privées. en France, le système est plus centré sur les soins secondaires (hôpital) et il n'y pas de plafond protégeant les assurés d'un reste à charge cumulé trop lourd à supporter. La part des soins non financée par l'AMO dans les soins de ville est donc plus grande, laissant le champ libre à des organismes privés de complémentaires qui prennent une place beaucoup plus importante en France que dans les autres pays. Elle est évaluée à 12, 2% des dépenses de santé en 2003 en France et est la deuxième plus élevée des pays en Europe avec les Pays-bas (elle n'est que de 8, 8% en Allemagne). (8) Par ailleurs, parmi ces pays au fonctionnement global similaire, seule la France, la Belgique et le Luxembourg ont un système o l'avance des frais prévaut (1). Ainsi : en Allemagne et dans la plupart des pays, le tiers payant est institué. en Suisse, le patient a trente jours après la consultation pour payer le médecin et peut donc être remboursé par son assurance avant le paiement effectif. On peut noter qu'en Belgique, un système de tiers payant pour les consultations chez le médecin tenant le dossier médical a été instauré, à l'instar de la réforme du médecin référent, tentée sans succès en France en 1996. II. L'histoire du tiers payant dans la protection sociale : un marqueur de l'évolution de la médecine libérale II. 1) Les systèmes de protection sociale avant 1945 (9) : des tentatives de mise en place du tiers payant contre-carrées par les médecins Les premières formes de protection sociale, c'est à dire, à l'époque, de protection contre les risques liés à l'incapacité de travail due à la maladie, à l'invalidité ou à la vieillesse, peuvent être retrouvées dans les organisations corporatistes de métier ou de paysans sous l'ancien régime. Mais c'est au cours du vingtième siècle que sont apparues réellement les premières assurances sociales sous trois formes : les initiatives du patronat sont rares mais constituent le modèle le plus proche de la Sécurité Sociale, notamment pour son mode de financement qui associe des cotisations prélevées sur les salaires des mineurs, des sommes payées par les propriétaires des exploitations et des fonds venant du ministère de l'intérieur. 17 les sociétés mutualistes puis de secours mutuels : elles s'apparentent aux confréries de l'ancien régime qui avaient été interdites lors de la Révolution (loi de Le Chapelier en 1791) et restent très contrôlées. Elles ne doivent s'occuper que de prévoyance et d'assistance mais le principe est déjà la possibilité de recevoir une prestation en cas de maladie, d'accident voire même de vieillesse, en échange de l'acquittement d'une cotisation sur la base du volontariat. Elles continuent de se développer tout au long du dix-neuvième siècle avec la révolution industrielle. Elles sont de de plus en plus appuyées par les pouvoirs publics jusqu'à la loi du 1er avril 1898 qui constitue la charte de la mutualité : elles sont alors définies comme des associations de prévoyance libre et volontaire avec des fonctions d'assistance et une liberté totale de création. les initiatives de l'Etat : ce sont les premiers dispositifs basés sur une solidarité nationale, avec par exemple, la loi du 18 juillet 1893 puis du 14 juillet 1905, qui institue puis réaffirme l'assistance médicale gratuite destinée aux indigents . Le projet de départ était la mise en place d'une rémunération forfaitaire avec un médecin agréé directement réglé par la caisse, donc similaire au modèle que Bismarck a mis en place en Allemagne dès 1880. Mais l'influence de l'Union des Syndicats Médicaux Français (USMF), premier syndicat unifié de médecins, autorisé en 1892, fut telle que la rémunération est finalement fixée à l'acte de soins et le libre choix du médecin réaffirmé. En revanche, c'est le premier système de tiers payant institué puisque le médecin soigne le patient gratuitement et est remboursé ensuite par l'administration. C'est alors la seule dérogation au principe du paiement direct des honoraires par le patient qui avait été affirmé d'emblée par l'USMF. Les médecins ne s'y opposent pas ouvertement car une double perspective s'ouvre ainsi : la solvabilité d'une partie nouvelle de la population pour des médecins dont les revenus dans les petites villes et les campagnes sont faibles et la possibilité de traiter le plus grand nombre. Cela correspond aux objectifs de santé publique inspirés par le courant hygiéniste, assez répandu chez les médecins à cette période. (10) Mais l'USMF se mobilise pourtant souvent contre cette loi car les rapports entre les médecins et l'administration y sont mal définis. (11) Il faut noter que l'honoraire dû au médecin n'était pas vu par la profession comme la rétribution d'un service, de toute façon jugé inestimable, mais comme un honneur fait au mérite du médecin et dont le montant dépendait de la situation financière du patient, de l'importance du service rendu, de la réputation du médecin et des moyens engagés dans le soin (d'o l'étymologie du terme honoraire). (12) Les dispositifs évoqués ci-dessus ne concernent que trop peu de personnes et des tentatives de mise en place d'assurances obligatoires par l'Etat, particulièrement après la première guerre mondiale, vont donner lieu à des oppositions farouches, notamment du mouvement mutualiste qui revendique le caractère libre et volontaire de la prévoyance. Ces luttes débouchent finalement sur la loi du 5 avril 1928, instituant une assurance maladie maternité, invalidité, vieillesse, décès pour tout salarié titulaire d'un contrat de travail. La couverture est néanmoins faible et les prévoyances continuent d'assurer l'essentiel de la protection. De leur côté, les médecins, unifiés en 1928 dans un seul syndicat, la Confédération des syndicats de Médecins Français (CSMF) viennent d'énoncer les principes fondamentaux de leur exercice dans la première charte de la médecine libérale (1927) avec notamment : le libre choix du médecin par le malade et le respect absolu du secret professionnel. la liberté thérapeutique et de prescription (l'efficacité primant sur le caractère économique). le contrôle des malades par les caisses et des médecins par les syndicats. 18 le droit à des honoraires pour tout malade soigné. le paiement direct par l'assuré en prenant pour base minimum les tarifs syndicaux (ceci pour éviter une libre concurrence entre les médecins et la pratique de tarifs jugés trop bas). La justification de ces principes qui privilégient l'identité libérale à l'intégration des syndicats de médecins dans la protection sociale organisée par l'Etat (au contraire de leurs homologues allemands sous Bismark) est énoncée comme suit, dans la revue Le médecin syndicaliste , en 1928 : C'est cet affranchissement de toute entrave morale et matérielle, cette indépendance absolue du médecin qui, avec la foi en sa science, engendre la confiance en lui que lui voue son malade et lui donne le pouvoir de guérir . (10) Ainsi, la présence d'un tiers pour le paiement, perturbant le colloque singulier si cher aux praticiens entre le médecin et son patient, est jugée comme pouvant participer à l'échec de la prise en charge du malade. Cette idée théorisée de la sorte servira d'argument noble aux médecins français pour justifier l'attachement à un paiement direct du patient. De fait, la loi de 1928 fut vigoureusement contestée par les médecins parce qu'elle laisse la possibilité d'un paiement par le patient ou d'un tiers payant par la caisse de protection qui peut régler le médecin directement. De plus, la loi ne prévoit pas la libre entente sur les tarifs. Après une importante pression de la CSMF, le texte de loi final du 30 avril 1930 n'énonce plus que le principe du paiement direct par le patient et rétablit le droit de la libre entente du montant dont une partie peut être garantie par la caisse. Seule la possibilité que l'assuré bénéficie d'une avance de la caisse survit à ces modifications. Le tiers payant n'est donc plus possible, la liberté de tarification préservée : c'est une victoire fondatrice pour le syndicalisme médical français. (12) II. 2) La création de la Sécurité Sociale : la réaffirmation du paiement direct par le patient mais la fin de la libre entente sur les tarifs A la fin de la deuxième guerre mondiale, le programme du Conseil National de la Résistance énonçait un objectif d'universalité de la protection sociale o le simple fait d'être citoyen suffisait pour ouvrir des droits. Ceci répondait à un double objectif : prendre en considération l'effort de guerre de la population et l'incapacité physique de travailler pour une partie d'entre elle. permettre une protection de meilleure qualité et plus étendue pour prévenir la pauvreté des classes populaires, terreau favorable au développement des fléaux nationalistes qui ont abouti à la deuxième guerre mondiale. Mais, dès la mise en place de la Sécurité Sociale, cet objectif d'universalité est contredit par l'ouverture de droits liés à l'exercice d'une activité salariée et le paiement de cotisations assises sur le salaire. (14) L'objectif d'unification du système énoncé dans l'ordonnance de 1945 n'est pas atteint également, avec le maintien en dehors du régime général de la MSA et des régimes spéciaux. 19 Le système mis en place en France présente la particularité d'être influencé à la fois (14, 15) : par le rapport de Beveridge (1942) qui a guidé l'organisation du système anglais : en France, le premier élément qui s'en inspire est l'instauration de plafonds de remboursements qui permettent de laisser un rôle aux mutuelles, devenant alors un complément au système de protection obligatoire. Le deuxième élément est l'objectif universaliste car, pour les pouvoirs publics, relier protection sociale et travail était l'assurance de toucher le plus grand nombre. La possibilité d'un fort taux de chômage excluant des citoyens de la protection sociale n'avait pas été envisagée. par le modèle bismarckien (venant d'Allemagne). Le financement par des cotisations sociales assises sur le salaire et payées par les travailleurs et les employeurs ainsi que la gestion par les partenaires sociaux et non directement par l'Etat sont les éléments inspirés de ce modèle que l'on retrouve dans le système français. L'ordonnance de 1945 prévoit que la part obligatoire gérée par les caisses est remboursée au patient : elle ne peut plus lui être avancée comme dans la loi de 1928. Dans le même temps, le code de déontologie médicale, énoncé dans le décret de 1947, réaffirme le principe du paiement direct par les patients sauf dans le cas o leur observation serait de nature à compromettre le fonctionnement rationnel ou le développement normal des services ou institutions de la médecine sociale . En revanche, les médecins perdent le droit de fixer librement leurs tarifs avec le patient (13), ce qui constitue la première atteinte importante aux principes de la médecine libérale de 1927. De ce fait, durant la période des 30 glorieuses, les luttes entre syndicats de médecins et le pouvoir politique portèrent principalement sur la fixation des tarifs de consultations et la question du tiers payant fut écartée. (1) Mais la création de la Sécurité Sociale a modifié clairement le rapport de forces : les revenus des médecins sont définitivement socialisés puisque le paiement par le patient est rendu possible car celui-ci est remboursé ensuite grâce à la solidarité de l'ensemble de la société. II. 3) 1945-1970 : l'extension des droits des assurés, la marche vers le conventionnement des médecins Durant cette période, différentes lois viennent élargir progressivement le champ des risques couverts (retraite, protection santé. ) et des populations concernées qui gagnent, de proche en proche, toutes les catégories professionnelles : exploitants agricoles (1961), professions non salariées non agricoles (1966). Il faut noter néanmoins le développement d'initiatives locales voire individuelles, à l'insu des pouvoirs publics et parfois illégales, de dispense d'avance des frais. Elles passaient par l'avance des frais par des caisses à l'assuré ou par l'endossement du chèque par le médecin après le remboursement de l'assuré, voire même par des accords de tiers payant entre certaines mutuelles et des médecins. (1) Parallèlement, les négociations entre les médecins et les pouvoirs publics ont pour objet un principe de l'ordonnance de 1945 qui annonçait la création de conventions entre les 20 caisses et les praticiens, eux-mêmes divisés sur cette question. Ceci aboutit à une scission dans le paysage du syndicalisme médical, lors du décret de 1960 qui établit des conventions départementales. Elles furent acceptées par la CSMF mais une minorité de médecins la refuse pour garder une liberté de fixation des honoraires : c'est la création de la Fédération des Médecins Français (FMF) qui se pose en défenseur de l'identité libérale. (16, 17) La première convention est signée en 1971 par la CSMF. L'organisation syndicale obtient l'inscription des principes de la médecine libérale dans le code de la Sécurité Sociale (o ils sont néanmoins qualifiés de code déontologique) : Dans l'intérêt des assurés sociaux et de la santé publique, le respect de la liberté d'exercice et de l'indépendance professionnelle et morale des médecins est assuré conformément aux principes déontologiques fondamentaux que sont le libre choix du médecin par le malade, la liberté de prescription du médecin, le secret professionnel, le paiement direct des honoraires par le malade, la liberté d'installation du médecin, sauf dispositions contraires en vigueur à la date de promulgation de la loi n 71-525 du 3 juillet 1971 . La convention suivante en 1976 est signée par la CSMF et la FMF car la période faste de croissance des revenus des médecins des vingt dernières années commencent à s'essouffler du fait du nombre important de praticiens : faire fi des revenus issus des patients qui sont remboursés par l'assurance maladie met en danger le niveau de rémunération des médecins. (16) Ces conventions ont d'abord pour but d'attirer les médecins par des avantages sociaux comme la prise en charge de leurs cotisations sociales par les caisses d'assurance maladie. En échange, sont mis en place des tarifs opposables pour permettre un bon taux de remboursement des patients et l'accès aux soins du plus grand nombre. Les pouvoirs publics reconnaissaient ainsi aux médecins une mission de service public de la santé malgré leur statut libéral. (17) II. 4) 1975 à nos jours : le développement du tiers payant AMO, la réintroduction d'une liberté tarifaire, l'expansion des complémentaires (1) Dans les années 1980-1990, ces conventions ont permis très rapidement de négocier avec les médecins l'introduction du tiers payant. Tout d'abord, du fait du développement des soins et d'examens techniques de plus en plus coûteux, le tiers payant semblait nécessaire pour ces actes car peu de patients étaient en mesure de faire l'avance des frais. C'est ainsi que les conventions suivantes ont ouvert progressivement le tiers payant pour les soins chirurgicaux, radiologiques et biologiques avec la fixation d'un seuil minimal (actuellement de 120 euros). Le tiers payant ne concerne en théorie que la partie AMO. A cette même période, est autorisé le tiers payant en pharmacie qui n'est pas obligatoire mais devient un argument pour attirer les patients ; son essor sera réel à l'arrivée de la télétransmission. Au niveau de la médecine générale, des tentatives de mise en place sont faites mais furent soit refusées par les médecins, soit annulées par le Conseil d'Etat, soit ne rencontrèrent que peu de succès. C'est le cas de la proposition du médecin référent, pourtant soutenu par le syndicat MG-France, qui permettait au patient de bénéficier du tiers payant en consultation chez un médecin déclaré, chargé de la tenue de son dossier médical. Du fait de cet échec et dans l'optique de mieux réguler les dépenses de santé, ces mesures incitatives ont été remplacées par un système beaucoup plus répressif pour les assurés, lors de la mise 21 en place du médecin traitant à la place du médecin référent (2004) avec la majoration du ticket modérateur en cas de non respect du parcours de soins. Le tiers payant est toujours écarté. Durant cette période, les médecins obtiennent la réintroduction d'une part de liberté tarifaire avec la création du secteur 2 au début des années 80, sous l'impulsion de la FMF. (18) Avec la liberté pour les chirurgiens dentistes de fixer le prix de leurs prothèses, la charge des frais de santé sur les ménages augmentent à nouveau soit directement, soit par l'augmentation des cotisations versées aux AMC. Le marché de l'assurance complémentaire est, lui aussi, libéralisé avec l'ouverture aux assureurs, pouvant alors concurrencer les mutuelles. (9) Le contrat d'accès aux soins, mis en place en 2012, tente de réguler a minima ces dépassements d'honoraires. (19) Malgré ce contexte, un dernier pan de la progression du tiers payant a été mis en place et s'est concentré sur les personnes les plus démunies. Ainsi, en 1983, est créée l'aide médicale départementale (AMD). Basée sur des conditions de ressources et le fait de ne pas pouvoir bénéficier d'une assurance maladie autre, elle est gérée par les collectivités locales, avec pour principe la prise en charge de la partie AMO et AMC et la dispense d'avance des frais. Néanmoins, les disparités d'application et de prise en charge liées aux différences de politique sociale des collectivités entranent la persistance de nombreuses inégalités. Elle fut remplacée par la CMU en 1999 qui s'adressent aux patients sur simple condition de résidence et de ressources, avec un plafond de revenus abaissé par rapport à l'AMD. Elle permet de bénéficier d'une couverture de santé sur la part AMO et AMC avec une dispense totale d'avance des frais. Enfin, en 2004, fut instaurée l'aide à la complémentaire santé (ACS) qui permet aux patients, sous condition de ressources, de bénéficier d'une aide financière pour pouvoir adhérer à une complémentaire santé, gérée par l'assurance maladie ou par une structure privée. Son objectif était de gommer les effets seuils apparus avec la CMU. Le patient a le droit alors de bénéficier du tiers payant sur la partie AMO. Les syndicats sont plutôt favorables à la création de la CMU (surtout MG-France et le syndicat des médecins libéraux), reconnaissant l'intérêt majeur qu'elle présente pour les patients en situation de précarité. Mais certaines critiques ne manquent pas de s'abattre sur le point précis du tiers payant. L'argument principal, notamment de la CSMF et de la FMF est, centré sur le patient qui perd sa dignité et sa liberté ou bien qui est déresponsabilisé . (20) Un autre argument, allant dans le sens du bien commun, évoque le caractère prétendu inflationniste de la dispense d'avance des frais, avec le risque d'aggravation des déficits d'assurance maladie. Ce thème avait été opposé aux médecins, lors de la réforme Juppé en 1995, pour imposer certains contrôles sur les comportements des praticiens. On constate ainsi que la couverture maladie s'étend peu à peu à toutes les catégories de patients : ce caractère universel était préconisé dans les théories de Beveridge mais aussi l'objectif voulu pour la Sécurité Sociale par le Conseil National de la Résistance. On observe également l'extension de la couverture complémentaire qui franchit une nouvelle étape avec l'obligation pour les entreprises de proposer une assurance santé complémentaire collective à ses salariés (conclue dans le cadre de l'Accord National Interprofessionnel en 2012). On notera enfin la facilitation du tiers payant au niveau pratique par la rapidité du paiement des médecins, rendue possible par le système sésame-vitale et la télétransmission. 22 Ainsi les actes réalisés en tiers payant atteignent 34, 9 % des actes réalisés en médecine de ville en 2012, avec une prépondérance nette d'actes chez les médecins spécialistes et une utilisation très répandue chez les professions para-médicales. (1) On peut donc noter que la question du tiers payant a sous-tendu, depuis plus d'un siècle, les rapports entre les pouvoirs publics et les médecins libéraux. On constate actuellement que l'évolution de la protection sociale en France, les objectifs des pouvoirs publics de santé et d'accessibilité aux soins pour tous et le pragmatisme de certains professionnels concourent à son développement. Ainsi, le rapport de l'IGAS, demandé par la ministre sur la question de la généralisation du tiers payant, observe même que les organisations syndicales de médecins ne mettent plus d'obstacle philosophique au tiers payant et affirme que le tryptique paiement à l'acte-entente directe des honoraires- paiement direct a donc historiquement évolué pour ne garder comme pierres angulaires de la médecine libérale, le libre choix du médecin par le patient, la liberté de prescription, la liberté d'installation et le secret professionnel . (1) Mais, à l'annonce du projet de réforme, les réactions effectives de la plupart des syndicats dans les médias reprennent les arguments avancés pour la CMU et peuvent faire douter de cette affirmation. Ainsi, le Dr Ortiz, président de la CSMF, premier syndicat de médecins libéraux actuellement, affirme à propos de la réforme du tiers payant, le 19 juin 2014 : Quand vous payez quelque chose, et bien vous honorez votre médecin. Et moi, je veux que mon métier soit honoré. C'est pas un service, un acte médical, c'est pas un service dû par la collectivité. C'est un honoraire et ça fait partie de la relation de confiance, d'écoute, si particulière entre le patient et son médecin. Qu'en est il de la position des médecins que nous avons rencontrés pour notre étude ? III. Tiers payant et accès aux soins La justification première donnée par la ministre pour la généralisation du tiers payant est celle de l'amélioration de l'accès aux soins. Cette question a fait l'objet de nombreux travaux en France, comme dans les autres pays développés, pour comprendre notamment les mécanismes aboutissant aux inégalités d'accès aux soins, elles-mêmes à l'origine de certaines inégalités sociales de santé. Nous allons rappeler quelques données de base sur les liens entre état de santé, revenus, protection sociale et précarité puis tenter de dresser un tableau synthétique des difficultés d'accès aux soins en France. 23 III. 1) Liens entre morbidité, précarité et protection sociale L'Institut de Recherche et Documentation en Economie de la Santé (IRDES, anciennement appelé CREDES) réalise, depuis 1988 et tous les deux ans, un programme d'étude appelé Enquête Santé et Protection Sociale (ESPS) qui constitue une référence dans le suivi de la santé, des conditions d'accès aux soins et de la répartition de la couverture maladie chez les Français. Ce travail consiste à suivre le même échantillon représentatif de la population française, à intervalles de temps réguliers. Il a ainsi été mis en évidence notamment ce que des travaux antérieurs en sciences sociales avaient déjà démontré : de façon très schématique : (21) un lien très fort entre morbidité et revenu et morbidité et catégorie socio- professionnelle : plus le revenu et la catégorie sont basses, plus la morbidité est forte. un lien très fort entre morbidité et couverture santé : plus la couverture santé est bonne, plus la morbidité est faible. un lien très fort entre précarité, couverture santé et morbidité : plus on est en situation de précarité, plus la couverture santé est mauvaise et plus la morbidité est forte. enfin, il ne faut pas négliger que précarité et morbidité ont des liens réciproques : plus on est précaire, plus on a une forte morbidité ; mais plus on a une forte morbidité, plus on a des chances de se précariser. C'est le concept de vulnérabilité médicale qui se définit par le fait d'avoir un état de santé tel que cela risque d'être une difficulté pour obtenir ou garder un emploi. La morbidité importante, une maladie invalidante ou un handicap reconnu constituent des facteurs de risque de difficultés pour avoir un emploi et donc sont aussi des facteurs de risque de précarité. (22) III. 2) Difficultés d'accès aux soins en France L'accès aux soins peut se définir comme l'utilisation en temps utile des services de santé par les individus pour atteindre le meilleur résultat possible en terme de santé. (23) On utilisera également la notion de renoncement aux soins pour raisons financières, définie comme des besoins de soins non satisfaits à cause de la barrière financière : elle est utilisée depuis peu par l'IRDES dans ses études ESPS et par les pouvoirs publics pour déterminer l'accessibilité financière des soins pour la population et donc sert d'indicateur pour l'évaluation des politiques publiques. Cette notion de renoncement aux soins a l'avantage de tenir compte de la perception subjective du besoin de soins par le patient qui peut être différente de celle des professionnels. (24) On ne saurait pour autant résumer le problème d'accès aux soins simplement à l'organisation d'un système de santé fonctionnel et à son accessibilité financière. Les avancées majeures des sciences sociales sur ces questions au cours de la deuxième moitié du vingtième siècle permettent d'identifier quatre grandes composantes jouant dans l'accès aux soins. 24 III. 2. a) l'accessibilité des professionnels Ceci comprend notamment la répartition des médecins et personnels paramédicaux sur le territoire. C'est un véritable défi pour les très médiatisés déserts médicaux (zones rurales mais aussi zones urbaines sensibles). Il faut noter que le problème peut se poser en terme de distance réelle avant d'accéder aux professionnels mais aussi de disponibilité effective : l'accroissement des délais d'attente avant un rendez-vous de gynécologie ou d'ophtalmologie constitue également une barrière dans l'accès aux soins. Un autre problème dans l'accessibilité des professionnels de santé est le comportement de refus de soins de certains d'entre eux envers les patients bénéficiaires de la CMU ou de l'AME. Si l'évaluation de son ampleur est toujours sujette à débat entre les enquêtes réalisées par le Fonds CMU ou les organisations non gouvernementales (souvent réalisées par la technique du testing) et celles réalisées par la CNAM (qui se base sur les saisines de ses services), sa réalité a été établie. Ce comportement est plus répandu chez les spécialistes, a fortiori de secteurs 2 et les chirurgiens dentistes. Il y a également une grande variabilité géographique de ces comportements : la région parisienne est par exemple particulièrement touchée, ce qui correspond à une zone de forte densité en praticiens de secteur 2. (25) Le refus d'appliquer le tiers payant à ces patients, lui aussi réel, doit, bien sûr, être qualifié aussi de refus de soins dans le sens o il représente également un déni de droits. III. 2. b) l'accessibilité administrative Elle renvoie à la connaissance de leurs droits par les patients, aux démarches administratives nécessaires et à la capacité des patients à remplir ces obligations. La barrière linguistique, la complexité des démarches et leur inadéquation avec la situation des personnes concernées peuvent conduire à l'absence de protection sociale alors que les patients relèvent d'un dispositif : la nécessité de produire un justificatif de résidence stable de plus de 3 mois pour l'ouverture des droits à la CMU, par exemple, constitue une vraie barrière pour certaines personnes. Ainsi, chez les personnes ayant fréquenté les centres d'accueil de Médecins du Monde au cours de l'année 2013, 76 % relèvent d'une assurance maladie (de base, CMU ou AME) mais 12% ont réellement des droits ouverts. 30% des gens fréquentant ces centres citent la méconnaissance de leurs droits et 28% des difficultés administratives comme obstacles à l'accès aux soins. (26) III. 2. c) l'accessibilité relevant de déterminants culturels ou psychiques propres au patient Plus difficile à évaluer car complexe et faisant appel aux parcours de vie (donc étudiée sous la forme d'enquêtes qualitatives rendant impossible son évaluation chiffrée), on peut la résumer par l'état de prédisposition a priori du sujet à se soigner : il dépend de ses croyances, de la perception de son état de santé et de la maladie, de sa défiance du monde médical, de son éducation, de sa projection dans l'avenir. (23, 24, 27). 25 III. 2. d) L'accessibilité financière Elle constitue évidemment un élément majeur dans l'accès aux soins. En 2008, 15, 4% de la population adulte en France déclare avoir renoncé aux soins pour des raisons financières au moins une fois dans l'année qui précède. Il est de 26% lors de la même étude ESPS en 2012 mais les outils d'évaluation ont été modifiés à partir de cette année, rendant la comparaison impossible. Si le problème des soins dentaires est plus mis en valeur, le renoncement à une consultation de médecine générale ou spécialisée concerne 3, 4% de la population. Le taux dans la population générale est à peu près identique à celui avant la création de la CMU, en 1998, qui avait permis une inflexion nette jusqu'en 2002. Depuis 2002, ce taux remonte progressivement. Cette évolution est due à une réascension chez les patients bénéficiaires de la CMU mais aussi chez les assurés qui n'en relèvent pas. (21, 28 et annexe V) Ce renoncement aux soins est directement corrélé à la multiplication des facteurs de précarité et au niveau de revenus : plus on est précaire ou plus son revenu est bas, plus on est amené à renoncer à des soins pour raison financière. (21, 28) L'augmentation du taux de renoncement aux soins depuis dix ans dans la population non bénéficiaire de la CMU trouve notamment son explication dans différents facteurs qui accroissent le reste à charge des patients : l'augmentation du poids des dépassements d'honoraires. Elle est essentiellement du fait des médecins spécialistes, inégalement répartie sur le territoire et entre les spécialités. On peut évoquer son impact pour deux raisons : les médecins à les pratiquer augmentent en nombre (un spécialiste qui s'installe sur deux choisit le secteur 2) ; et les dépassements augmentent en valeur puisque le taux moyen de l'excédent par rapport au tarif de l'assurance maladie est passée de 25% en 1990 à 54% en 2010. (29) L'impact des contrats d'accès aux soins mis en place en 2012, censés limiter le montant de ces dépassements, est en cours d'évaluation. Notons que ces dépassements d'honoraires participent à l'augmentation de l'ensemble des cotisations versées aux complémentaires puisque celles-ci les prennent en charge en partie pour les contrats les plus favorables. En revanche, ils ne peuvent pas être jugés responsables de la recrudescence du renoncement chez les patients bénéficiaires de la CMU, ceux-ci n'étant pas censés être soumis aux dépassements d'honoraires par les professionnels. l'augmentation du poids du ticket modérateur : la part prise en charge par la Sécurité Sociale sur la dépense courante de soins a perdu deux points entre 1995 et 2011. Cette diminution de la prise en charge par l'AMO est rattachée à la mise en place des franchises et participations forfaitaires ainsi qu'aux vagues de déremboursement de certaines classes de médicaments. Elle concerne particulièrement les soins courants qui sont pris en charge actuellement à la hauteur de 60 % : or ce sont ces soins auxquels renoncent en premier les plus pauvres. (27) Ce désengagement a été assumé par le paiement direct des ménages qui augmente depuis 2004 et par l'augmentation de la contribution des complémentaires qui l'ont répercuté sur les cotisations des patients. C'est en effet une des raisons de l'augmentation massive des cotisations versées aux complémentaires par les foyers : entre 2006 et 2010, leur coût a augmenté de 16 % (30), soit deux fois plus vite que l'augmentation des revenus et cette progression continue sur le même rythme. Cet accroissement est beaucoup plus lourd à porter pour les ménages à faibles revenus, non éligibles à la CMU, par rapport aux plus aisés : la part du revenu que les ménages consacrent à la complémentaire santé est de 3% pour les plus riches alors qu'elle est de 10% pour les plus pauvres non bénéficiaires de la CMU. (27) 26 Ce désengagement de l'AMO dans les frais de santé est donc supporté par les ménages de façon directe et indirecte via les cotisations des complémentaires et pénalise particulièrement les plus pauvres au-dessus des seuils d'obtention de la CMU. L'accroissement de l'effort que doivent faire les patients pour acquérir une complémentaire pose un vrai problème dans l'accès aux soins. En effet, il a été établi que le fait d'avoir une complémentaire ou pas était un facteur capital dans la consommation de soins et son corollaire, le renoncement aux soins. Ainsi, en 2010, 32, 6% des gens sans complémentaire ont déclaré avoir renoncé aux soins pour raisons financières contre 14 % de ceux qui en détiennent une privée. A noter que ce taux était de 23% en 2002 pour les gens sans complémentaire dans le même cadre des ESPS. Le fait d'avoir une complémentaire joue sur deux aspects : il augmente la probabilité d'entreprendre des soins ainsi que le montant des frais de soins engagés par rapport aux personnes qui n'en ont pas. (31) Très logiquement, cet effet est particulièrement sensible sur les actes à fort ticket modérateur donc les consultations de spécialistes et les soins dentaires. Ceci est à mettre en parallèle avec le taux de couverture en France de complémentaire santé qui est de 95 % de la population générale (privé et complémentaire) en 2012 : cela veut dire que plus de 3 millions de Français n'en ont pas. La tentative d'élargir la couverture en complémentaire santé de la population par le biais de l' ACS (2004) a pour le moment échoué car 15 % des gens qui relèvent de l'ACS en bénéficient effectivement. (32) Comme on l'a vu ci-dessus, une amélioration de la couverture complémentaire de la population est attendue avec l'article premier de l'Accord National Interprofessionnel portant sur l'obligation faite aux entreprises de proposer une couverture complémentaire collective aux salariés. (33) On voit que la réputation du meilleur système de santé au monde , d'après le rapport de l'OMS de 2000, de la Sécurité Sociale française ne doit pas dissimuler les problèmes qui persistent dans l'accès aux soins des plus démunis, ce d'autant que la dynamique semble être à une aggravation lentement progressive des difficultés. III. 3) Situations pratiques d'accès aux soins pouvant être améliorées par la généralisation du tiers payant On peut prévoir que la généralisation du tiers payant pourrait améliorer l'accès aux soins dans deux circonstances : pour la catégorie des personnes au-dessus des seuils d'accès à la CMU qui sont bas puisqu'en dessous du seuil de pauvreté (défini comme le montant des revenus égal à 60% du revenu médian qui divise les gens en deux effectifs égaux). En 2010, le seuil de pauvreté était ainsi de de 964 euros : 8, 4 millions vivent en dessous et la moitié en dessous de 781 euros. Le plafond de la CMU était de 634 euros et celui de l'ACS de 761. Comme on l'a vu, l'aide à l'ACS n'a pas réussi à toucher le public auquel il s'adressait. Donc, une frange de plusieurs millions de personnes, non éligibles à la CMU mais sous le seuil de pauvreté (et qui parfois travaillent néanmoins, c'est une définition de la catégorie dite des travailleurs pauvres ) bénéficierait directement de la généralisation du tiers payant. (1, 34) Ceci peut être d'autant plus utile que le taux des gens vivant sous le seuil de pauvreté est reparti à la hausse depuis 2010 et que le phénomène des travailleurs pauvres est également en augmentation. (34) 27 Le problème de l'avance des frais pour les soins coûteux. La barrière est fixée à 120 euros, ce qui peut représenter une somme assez faible pour les patients aux plus hauts revenus mais une charge importante pour des ménages plus modestes ou qui ont des dépenses incompressibles à ce moment-là : le renoncement aux soins pour raisons financières comprend également le choix de différer un soin en raison d'une situation financière avec des dépenses incompressibles au moment o il se présente. Une étude de la CPAM du Gard montre (1), sans que l'on puisse la généraliser à l'échelle nationale, que 41% des assurés considèrent une avance au delà de 50 euros comme une difficulté (on rappelle que ça représente uniquement le prix de deux consultations d'un enfant de 2 à 6 ans chez le médecin généraliste) et ils sont 80 % pour une consultation de plus de 100 euros. L'application du tiers payant dans ce genre de cas pourrait ainsi améliorer l'accès à ces soins. 28 Partie II : Etude 29 I. Matériel et méthodes Nous avons réalisé une étude qualitative à partir d'entretiens semi-dirigés. I. 1) Constitution de l'échantillon La constitution de notre échantillon de médecins a été faite de façon non aléatoire par une technique d'échantillonnage raisonnée à variation maximale. La population dont sont issus les médecins est celle des praticiens généralistes libéraux non remplaçants, dans la région Aquitaine et Midi-Pyrénées. L'échantillonnage a été raisonné selon différents critères : leur âge. leur sexe. leur lieu d'exercice : rural, semi rural, urbain. leur secteur d'activité : secteur 1 ou 2 sous contrat d'accès aux soins. leur implication politique : deux médecins ont été choisis pour le fait d'être élu local rattaché à l'UMP et au PS. leur implication associative : deux médecins ont été choisis pour leur action associative dans le domaine de l'accès aux soins. leur implication ordinale pour un médecin et syndicale pour un autre. leur pratique du tiers payant : de l'absence totale d'utilisation hormis pour les patients CMU à la proposition systématique du tiers payant partiel ou la tentative d'usage du tiers payant intégral. L'effectif de l'échantillon a été fixé à l'atteinte de la saturation des données. I. 2) Réalisation et contenu du guide d'entretien (annexe VI) Un guide d'entretien a donc été construit préalablement à partir de nos objectifs de recherche, de nos connaissances sur le sujet ainsi que de l'expérience acquise dans la participation informelle à un travail de sociologie, plusieurs années auparavant, sur les choix documentaires des bibliothécaires. Un propos introductif visait à mettre en confiance l'interviewé en le rassurant sur l'absence totale dans la thèse d'éléments permettant de l'identifier et en lui expliquant le fait que les échanges étaient enregistrés sur support numérique. S'en suivait l'annonce du sujet du travail et la manière de procéder pour recueillir les données. Le cadre contractuel de l'entretien était ainsi fixé. Une phrase rappelait ensuite le principe de la réforme prévue par la ministre. Puis, une phrase annonçait la manière dont se découpait l'entretien très globalement, qui visait à informer le sujet du déroulement de l'interview. Venait alors la première question sur l'opinion générale du médecin sur le projet de généralisation du tiers payant. A l'issue de celle-ci, une reformulation de l'avis général du médecin visait à confirmer notre 30 compréhension juste de son propos et étaient alors approfondies les raisons qui justifiaient son avis. Puis, une ouverture sur les éventuels arguments allant à l'encontre de l'opinion exprimée était proposée. Aucun élément de relance n'était proposé si le médecin n'en trouvait pas spontanément. Une question sur l'opinion que les assurés risquaient d'avoir de la réforme d'après le praticien était alors posée. Etait ensuite abordée la question des pratiques du tiers payant par le médecin de façon systématique au travers de relances fermées. Puis deux questions étaient proposées pour élargir la problématique du tiers payant à celle de l'accès aux soins et du rapport au paiement à l'acte des médecins. A l'issue des trois premiers entretiens, une question plus centrée sur les nouveaux moyen de rétribution des médecins libéraux a été rajoutée systématiquement. Une dernière relance était proposée dans l'éventualité o le médecin souhaitait compléter son propos ou revenir sur un thème abordé. L'entretien se terminait sur quelques questions plus fermées afin de récolter des éléments pour préciser le profil des médecins et de leur exercice. I. 3) Réalisation des entretiens La sollicitation des médecins interrogés a été faite par contact téléphonique directe (parfois après avoir demandé aux secrétariats de leur parler directement). Le propos alors délivré expliquait le thème général du travail et la nécessité d'une interview en vis-à-vis du fait de la méthodologie qualitative. Etait alors convenu un rendez vous en laissant aux médecins toute latitude dans le choix de l'heure, du jour et du lieu et en leur demandant de prévoir une demi-heure. Les praticiens étaient prévenus de l'enregistrement numérique des échanges. Nous prenions par ailleurs des notes sur les attitudes non verbales des médecins qui ont été incluses sous la forme de didascalies dans les transcriptions. Il a pu arriver à deux ou trois reprises qu'à l'issue de l'entretien, les médecins reviennent sur certains points, complétant ou précisant leurs propos. Les enregistrements d'échanges ont été conservés avec l'accord des médecins concernés et en le précisant lors de la transcription. Des demandes d'approbation éventuelle, souvent implicites, étaient quelques fois sollicitées par les interviewés. De simples hochements de têtes ou relances allant dans le sens des propos du médecin étaient alors opposés. Si le médecin posait des questions sur les modalités d'application de la réforme, nous répondions de façon la plus factuelle possible, lui expliquant souvent qu'un certain nombre de précisions n'avaient pas encore été données par la ministre. En aucun cas, notre avis personnel n'était livré dans le cadre de l'entretien. 31 I. 4) Traitement des données Après la passation des entretiens, les échanges ont été transcrits mot à mot avec un logiciel de traitement de textes. Les transcriptions débutent toutes par une précision du moment de la journée, de la date et du lieu de réalisation de l'interview ainsi que de la durée de l'échange. Les éventuelles attitudes des interrogés ou l'intonation sont également transcrites. L'interruption de l'entretien par un événement extérieur (téléphone) était également mentionnée, l'enregistrement ayant été alors coupé par nos soins. Les données destinant à préciser le profil des médecins ont été rassemblées dans un tableau récapitulatif et ont été exploitées. Les transcriptions et enregistrements sont accessibles à toute personne désirant les consulter sur simple demande. Concernant les propos recueillis, une première lecture globale de chaque entretien était réalisée pour s'assurer de la compréhension générale des propos du médecin et de l'absence d'erreur ou d'imprécision lors de la transcription. Puis, un codage des propos de chaque sujet, de façon linéaire et ouverte, a ensuite été réalisé. Une réévaluation de l'ensemble des codes ainsi créés a été effectuée au bout de trois entretiens, puis de dix puis à l'issue des seize entretiens avec harmonisation des éléments de codage. Un deuxième codage a été réalisé par une tierce personne de notre entourage, elle aussi médecin. Une comparaison entre les deux encodages ainsi obtenus a été effectuée de façon systématique au bout de dix entretiens puis à l'issue de toutes les interviews. Tout point de discordance dans l'interprétation des propos a été discutée pour déterminer le sens probable réel, avec quelques fois un retour à la version audio des interviews, si la transcription était trop imprécise pour rendre compte de la signification des propos. De même, les codes communs ont été analysés afin de déterminer les mots les plus pertinents pour rendre compte des idées exprimées par les sujets. Si le code était retrouvé dans plusieurs interviews, le nombre d'occurrences était noté. Puis, lorsque tous les codes ont été finalisés, ceux qui abordaient les mêmes aspects ont été regroupés et ont permis de déterminer des sous thèmes qui ont eux-mêmes été répartis en quatre grand thèmes, nous permettant de couvrir l'ensemble des sujets abordés par les médecins. II. Résultats : données quantitatives II. 1) Taille de l'échantillon Au cours de la prise de contact avec les médecins, nous avons été confrontés à deux refus de participer pour des raisons personnelles rendant les médecins sollicités indisponibles. La réalisation d'entretiens a été stoppée au bout de seize médecins, l'objectif de saturation des données ayant été atteint. 32 II. 2) Réalisation des entretiens Dix entretiens ont eu lieu au cabinet du médecin, avant ou après leur demi-journée de consultation. Un entretien a été réalisé un jour férié au cabinet d'un médecin à sa demande. Cinq ont eu lieu au domicile, en dehors de tout horaire de consultation. Un entretien a eu lieu dans un café bien connu par le médecin, au cours de sa pause déjeuner. Un seul de ces entretiens a été effectué par vidéo-conférence pour des raisons pratiques. Un entretien a été reporté le jour même par un médecin en raison d'une charge de travail trop importante pour lui le jour prévu. Un autre entretien a été décalé par nos soins en raison d'un retard. Nous avons pu enregistrer tous les participants donc nous avons disposé de seize entretiens qui ont tous été retranscrits. Les entretiens ont tous eu lieu entre fin mai et fin septembre 2014 donc sur une période de quatre mois. La durée totale d'enregistrement des entretiens est de 440 minutes soit 7 heures et 20 minutes. L'entretien moyen dure 27 minutes et 30 secondes avec des écarts assez importants, le plus faible durant 10 minutes et le plus long 40 minutes. L'écart type est de 9 minutes soit 33% du temps moyen d'entretien. Les moyennes des durées des entretiens en fonction de l'âge se répartissent comme suit (la valeur de la moyenne totale des entretiens est symbolisée par la ligne pointillée) : i n m n e s n e i t e r t n e s e d s p m e t 35 30 25 20 15 10 5 0 33 27 18, 5 Avant 40 ans Entre 40 et 60 ans Apres 60 âge des médecins II. 3) Profils des médecins Nous avons réuni les principales caractéristiques des médecins sous la forme d'un tableau Légende : - Prof. Inter. professions intermédiaires - addicto. addictologie - R retraité - vertébro. vertébrothérapie - hono. honoraires - méso. mésothérapie - CSP Catégorie socio-professionnelle - Semi-R semi-rural - CACIS Centre d'Accueil Consultation Information Sexualité - homéo homéopathie - M/F Masculin/Féminin - TP tiers payant. 33 Activité politique, syndicale ou autre ; orientation politique déclarée au cours de l'entretien aucune Elu UMP aucune oui rare oui oui Militant la santé, un droit pour tous et au CACIS ; orientation politique à gauche. CSP des parents du médecin Prof. Inter. Cadre Cadre Employé Docteur (secteur) Sexe Age/durée d'installation Spécificité d'exercice Milieu (départ ement) Usage TP partiel 1 (1) 2 (1) 3 (1) 4 (1) 5 (1) 6 (1) 7 (1) 8 (1) 9 (1) 10 (1) 11 (1) 12 (2) 13 (1) 14 (1) 15 (1) 16 (2) Aucune Aucune M 63 36 M 32 1, 5 Rural (40) Rural (33) Semi R (33) M 63 28(R) VIH/addicto Urbain (33) M 31 1, 5 Aucune F 32 1 Homéop. Urbain (33) Semi R (33) Aucune M 40 12 F 38 5 Aucune M 62 35 Permis de conduire M 45 3 VIH/addicto agréé étranger malade Gynéco F 36 2 M 51 5 Médecine d'expertise M 63 35 Mésoth. Vertébro. aucune M 44 13 F 48 12 M 77 35(R) Réseau obésité infantile Aucune F 64 37 Homéop. diététique Urbain (33) Rural (24) Urbain (33) Urbain (31) Semi R (33) Urbain (33) Semi R (33) Semi R (33) Semi R (33) Urbain (33) oui oui oui rare oui oui oui non rare oui aucune Employé orientation politique à Aucune ; gauche Aucune Cadre Cadre Syndicat CSMF ; non connue Bénévole au CACIS ; orientation politique à gauche Agriculteur Ouvrier Aucune Cadre Conseil de l'ordre ; non connue Chef d'entreprise aucune Syndicat UFML ; non connue Militante contre les dépassements d'hono. non connue Cadre Employé Prof. Inter. non Elu PS pendant 25 ans Cadre non aucune Agriculteur 34 La répartition des médecins selon le sexe est de 11 hommes pour 5 femmes. La répartition des médecins selon l'âge varie de 31 à 77 ans : La moyenne d'âge est de 49 ans et 4 mois. 5 médecins ont moins de 40 ans (dont trois femmes). 6 médecins ont entre 40 et 60 ans (dont une femme). 5 médecins ont plus de 60 ans (dont une femme). La durée moyenne d'installation est de 16 ans et 4 mois. Le lieu d'installation est : rural pour 3 médecins. semi rural pour 6 médecins. urbain pour 7 médecins. La localisation géographique de leur exercice se répartit entre : la Gironde : 13. les Landes : 1. la Dordogne : 1. la Haute-Garonne : 1. Deux médecins sur les seize travaillent seul. Un de ces praticiens (Docteur 8) n'est pas doté du système Sésame-Vitale. Six médecins ont une utilisation rare ou nulle du tiers payant partiel. Dix médecins l'utilisent habituellement. Deux médecins sont syndiqués : un à la CSMF et un à l'Union Française pour la Médecine Libre (UFML). Deux médecins sont des élus locaux : un pour l'UMP et un pour le PS. Trois autres médecins se sont déclarés à gauche au cours de l'entretien. Deux médecins sur les seize sont en secteur 2 et ont adhéré au contrat d'accès aux soins. L'origine socio-professionnelle des médecins se répartit comme suit, d'après la classification de l'INSEE de 1982 : sept médecins sont issus d'un foyer de cadre/profession intellectuelle supérieure (dont 5 dans le domaine de la santé : médecin ou dentiste). un médecin est issu d'un foyer d'ouvrier. deux médecins sont issus d'un foyer d'agriculteur. deux médecins sont issus d'un foyer de profession intermédiaire (professeur). trois médecins sont issus d'un foyer d'employé. un médecin est issu d'un foyer de chef d'entreprise. 35 III. Résultats : données qualitatives Nous analyse a permis de faire émerger quatre thématiques principales : III. 1) Les aspects pratiques de la généralisation du tiers payant III. 1. a) Les facilitations attendues du tiers payant généralisé Grâce à la généralisation du tiers payant, deux perspectives de simplification dans la pratique sont citées par les médecins : une rapidité et une facilité des paiements par rapport à la gestion de ceux émanant des patients : le docteur 2 explique par exemple : je suis payé deux jours après, je n'ai rien à faire, je n'envoie pas mes chèques à la poste. Pour un autre médecin (docteur 9), ça vient le soulager d'une tâche pénible : moi qui déteste faire les comptes, c'est une facilité aussi en me disant pour les comptes, c'est directement transféré . une facilitation dans le fait de coter des actes qu'il n'était pas possible de comptabiliser avant : - soit lors des consultations à motifs multiples en les scindant en deux consultations, permettant de coter deux actes pour le médecin mais surtout de mieux répondre à chacune des demandes : ainsi, le docteur 5 imagine que quand les gens vont venir une fois et que je vois qu'il y quatre motifs de consultation, je leur dirai : revenez en fin de semaine . J'aurai pas honte de leur dire () de revenir à une deuxième consultation quand j'estime que quatre ou cinq motifs de consultation en un quart d'heure pour 23 euros, c'est trop de conseils, donnés pas bien. - de la même manière, le médecin 16 estime que ça lui permettra de compter des actes qu'elle faisait gratuitement jusqu'à maintenant alors qu'ils méritent une rétribution d'après elle : enfin moi, je fais de plus en plus d'actes gratuits, hein. on vous téléphone parce qu'on fait une infection urinaire, on vient chercher l'ordonnance pour faire l'analyse. Par téléphone, on dit : ben voilà. vous me faites l'ordonnance. c'est des actes gratuits ! Je pourrai très bien dire : Votre carte vitale ! et voilà, je me fais payer. III. 1. b) Les craintes nombreuses sur l'application pratique du tiers payant généralisé La crainte du non paiement des actes et donc d'une augmentation des impayés est très présente : le docteur 7 souligne : je pense qu'on va avoir des impayés, vu qu'on en a déjà avec la SECU toute seule, je pense qu'on en aura encore plus. Les causes avancées sont multiples : dysfonctionnements informatiques ou administratifs inhérents à la Sécurité Sociale, mais pas identifiés de façon précise le plus souvent comme l'évoque le docteur 7 : Je sais pas pourquoi des fois. ca passe à la trappe. Alors tous les accidents de travail, j'en parle même pas, il faut tout le temps les relancer, c'est la galère. 36 Mais la plupart des médecins a plutôt confiance en la Sécurité Sociale dans son rôle de payeur, comme en témoigne le docteur 12 : Pour l'instant, je n'ai pas à m'en plaindre. Que ce soit en accident du travail, en CMU, ou en tiers payant pour des gens qui sont en ALD ou en maison de retraite, ça se passe très très bien. La mise en place du dispositif pose également problème à cause de la multitude des interlocuteurs, concernant les caisses complémentaires : le docteur 5 s'inquiète d' une surcharge de travail pour aller rentrer toutes les mutuelles comme le docteur 14 : Et puis, dans notre pratique, nous ça va être super compliqué quoi ! Avoir autant d'interlocuteurs à harmoniser. Les caisses complémentaires sont également suspectées d'être beaucoup moins performantes que la Sécurité Sociale pour payer et pour le faire dans des délais acceptables. D'o une surcharge de travail administratif certaine que beaucoup de médecins appréhendent, comme le docteur 3 : il faut y passer du temps à vérifier que chaque acte réalisé a bien été rémunéré. C'est la porte ouverte à des heures de travail en plus . Cela peut aller jusqu'à par un surcoût financier, que ce soit pour faire le travail de vérification ou pour faire les démarches pour récupérer les impayés, comme l'imagine le docteur 4 : Donc je crois que cette mesure, elle ne marchera que s'il y a d'autres mesures secondaires qui vont permettre de financer le surcoût induit ; c'est une charge pour un professionnel isolé, ou pour un cabinet de groupe, donc il faudra que ce soit accompagné . Le docteur 14 évoque l'exemple des pharmacies, obligées de payer des botes pour faire rentrer les impayés . La situation financière de certains professionnels peut être mise en danger en cas de retards de paiement des caisses alors que le règlement des charges, lui, ne peut être reporté, comme le dit le docteur 11 : Mais si la SECU se met en grève ou qu'elle est débordée pendant les vacances, c'est fini quoi et là, il n'y a pas plus de cash qui rentre et les traites, on les paye comme d'habitude. Parce qu'il y a des gens qui sont à flux tendus, des confrères . De fait, plusieurs médecins réclament que la gestion du tiers payant incombe à la Sécurité Sociale ou un autre organisme avec le docteur 10 : . tout soit centralisé sur un même contributeur qui nous paye l'intégralité de la consultation et qu'on ait pas à aller chercher à droite, à gauche, les centaines de mutuelles. Une autre crainte des médecins concerne la probité de certains confrères qui verraient dans cette réforme une facilité pour coter des actes fictifs, comme le suppose le docteur 3 : c'est à dire que tu as la carte vitale, tu sais que la personne n'a pas à payer, t'as la carte vitale avec la maman et les trois enfants et bien tu en passes trois quoi. , comportement qu'il dit avoir pu observer, notamment sur l'le de la Réunion o le tiers payant généralisé est déjà instauré. De ce fait, l'avantage de pouvoir scinder les consultations, évoqué ci dessus, peut prendre un aspect plus mercantile, d'après le docteur 12 : le médecin de son côté peut sur-solliciter, dire aux gens : bon écoutez venez me voir je vous fais un examen clinique ; revenez me voir demain je vous fais une prescription d'examens complémentaires, biologiques ; le surlendemain une prescription de radiographie, d'imagerie médicale. . Bref : au lieu d'avoir tout groupé en un seul acte, on risque d'avoir une multiplication des actes. 37 Enfin, le docteur 12, appartenant au secteur 2, s'inquiète de l'application de la réforme dans le cas des dépassements d'honoraire : quid du secteur 2 ? Doit-on faire le TP à des gens à qui on réclame un tarif supérieur à la cotation ? Prend-on simplement le dépassement ? . III. 1. c) Un usage du tiers payant très disparate Tous les médecins décrivent appliquer le tiers payant aux patients qui en relèvent d'après la loi, donc aux patients dans le cadre de consultation d'accident du travail ou de maladie professionnelle ainsi que pour les patients bénéficiaires de la CMU. Deux médecins témoignent néanmoins de comportements particuliers à l'encontre de ces derniers : Quand je vois effectivement que la CMU n'est pas à jour et que le montant complémentaire n'est pas couvert, je réclame le montant complémentaire. (docteur 12). mais mon associé, il me dit : ah moi, si des patients CMU n'ont pas leur carte, je les fais payer, et après ils ne l'oublient pas. (docteur 9). Six médecins disent ne pas faire le tiers payant de façon systématique à leurs patients en ALD pour des consultations qui en relèvent. Les raisons avancées sont diverses : au niveau comptabilité pour moi, c'est plus facile de les faire payer (docteur 3). certains patients sont habitués à payer (docteur 5). parce que rien ne l'oblige (docteur 2). La plupart de ces médecins fait le tiers payant aux patients en ALD si ces derniers le réclament ou ont des difficultés financières. On peut noter que le docteur 2 utilise surtout le tiers payant pour être rétribué lors de consultations o les gens sont dans l'incapacité physique ou psychique de régler : Parce que je ne fais pas le TP à des gens en ALD systématiquement, sauf les personnes (. ) âgées dépendantes, en maison de retraite, qui sont incapables de rédiger un chèque ou de verser de l'argent. De toute façon, ils n'en ont pas. A l'inverse, certains médecins ont une utilisation du tiers payant avec les patients en ALD qui n'est pas conforme à la loi : ils télétransmettent des actes en tiers payant intégral AMO à des gens en ALD pour des motifs de consultation ne concernant pas l'ALD. Le docteur 7 explique ainsi : J'ai beaucoup de patients eux qui ont été habitués avec leur ancien médecin (. ) Donc, lui, il faisait jamais payer que ce soit en rapport ou non avec l'ALD. Donc forcément, on fait pareil. Le docteur 9 confirme que c'est un moment de tension : . c'est une autre problématique des gens qui veulent tout faire passer en ALD. c'est pas facile. de leur dire. . Six médecins de l'échantillon disent utiliser le tiers payant partiel rarement ou jamais. Parmi eux, aucun médecin n'est amené à le faire après l'avoir proposé spontanément : ils répondent juste à la demande ponctuelle de patients. Deux d'entre eux le refusent parfois, comme le docteur 2 : certains me demandent mais je leur dis : mais non, attendez, euh. Vous pouvez me faire votre chèque aujourd'hui, je suis allé à la banque hier, je vais y aller dans dix jours. Dans dix jours, vous serez remboursé, ça sert à quoi ? Donc vous faites votre chèque de 23 et puis moi, je l'encaisserai que dans dix jours . Un autre de ces médecins, le docteur 13, décrit les patients qui lui demandent le tiers payant partiel comme suit : Ce sont des gens qui fument, ça fait chier quoi, ce sont des gens qui bouffent MacDO, ils sont gros, ils sont gras, merde ! () Je leur dis à chaque fois j'appuie. toi tu vois, tu me dois 6, 90 euros, c'est à peine moins qu'un menu MacDo, hein ? C'est le prix donc c'est au moins mettre les points sur les i. 38 Parmi les dix médecins qui utilisent le tiers payant de façon plus fréquente, tous le font à la demande des patients et la quasi-totalité le proposent s'ils le jugent nécessaire. Un seul le propose de façon systématique à tous ces patients, le docteur 14 : le TP o je me fais payer la part SECU et le patient me règle la part complémentaire, je le propose systématiquement. Je leur dis que c'est une possibilité lors des premières consultations avec les patients () Je leur laisse le choix. () C'est une possibilité qu'ont certains donc il n'y a pas de raison pour que je ne l'offre pas à d'autres. Un médecin, le docteur 6, évoque le caractère gênant que revêt le fait de le proposer aux gens : . le proposer pour nous ne pose aucun problème. Après, c'est le présenter aux patients de manière. qui est problématique. C'est la stigmatisation que ça peut être. . Le risque de stigmatisation des patients en ne les faisant pas payer est bien réel d'après un autre médecin, le docteur 4 : Moi j'ai vu des gens qui étaient à la CMU, rarement, mais qui souhaitaient justement payer, se faire rembourser après, parce qu'ils avaient l'impression -mais c'est rare- l'impression d'être dans le droit commun, de ne pas être des assistés sociaux. Un médecin, le docteur 11, le propose à titre systématique quand un même payeur doit payer plusieurs actes pour les différents membres d'une famille par exemple : Ou bien je le fais systématiquement quand je vois une famille dont je vois plusieurs membres en même temps. Parce que c'est vrai que quand je vois trois personnes, je vais pas leur faire payer 23, 26 , 28. Donc je leur fais le 1/3 payant systématique et voilà. Un médecin, le docteur 9, évoque le fait qu'il ne fasse pas pas payer le ticket modérateur dans certaines situations : ceux qui n'ont pas de mutuelle, j'essaie de les faire payer. S'ils me disent qu'ils ne peuvent pas, je leur fais pas payer. C'est un peu au pif au mètre. Quand je sais que les gens n'ont pas un radis, ne peuvent pas se payer une mutuelle, je me fais payer seize euros dix. D'autres médecins évoquent la réalisation d'actes gratuits, comme le docteur 16, du secteur 2 : il m'est arrivé, comme tous les confrères, d'avoir des gens qui avaient des problèmes, des revers de fortune, de faire un acte gratuit. Enfin, le report d'encaissement du chèque est également cité comme moyen d'aider les patients en difficultés financières, par le docteur 8 par exemple : Ce qu'on rencontre plus souvent, ce sont les gens en difficulté de paiement et ils nous disent, enfin à moi dans mon exercice personnel. : tu peux déposer mon chèque. après le 20 ça te va ? c'est du paiement différé on va dire. Trois médecins tentent ou ont tenté de faire des tiers payants intégraux mais les obstacles sont nombreux : certaines mutuelles refusent de l'appliquer : je reçois 2 ou 3 fois un truc des mutuelles : nous ne remboursons pas les médecins. (docteur 9). les délais de paiement sont longs : Deux mois plus tard, je reçois un chèque de sa mutuelle pour me payer en mon nom propre ! (docteur 9). le traçage des paiements est difficile : mais les régimes complémentaires, on peut pas les suivre. Il y a des caisses o vous avez les relevés 6 mois après (docteur 11). Cela entrane un découragement et l'arrêt de ces pratiques : là j'ai dit : OK stop j'arrête ! . Et maintenant, je le fais que pour deux trois patients pour qui je suis certaine que ça se passe correctement. ; et une vision dégradée des complémentaires : y en a une qui m'a dit : quand vous avez fait le tiers payant complet, comme on savait pas à qui rembourser parce qu'on a pas reçu l'information, l'argent va sur un compte offshore . Donc ils doivent bien s'amuser avec l'argent qu'ils ont récupéré. . 39 On peut également souligner que deux médecins réalisant ou ayant tenté de réaliser du tiers payant intégral et pratiquant le tiers payant partiel fréquemment ont cet usage car les médecins avec lesquels ils travaillaient au début de leur carrière avaient l'habitude de le proposer à leur patientèle, comme se souvient le docteur 9 : Ça a été un peu mon mentor à la fin quand j'ai fait mes derniers remplacements et qui avait vraiment généralisé complètement ça, cette pratique. J'ai eu sans me poser de questions un peu le réflexe o les gens me disaient : vous savez, je ne fais pas l'avance. Donc voilà, y eu ce biais qui était entretenu parce que les gens étaient habitués. De même, d'après les médecins, l'application du tiers payant aux patients souffrant d'une ALD dépend souvent aussi de l'habitude des patients. Enfin, on notera que pour trois médecins, cette réforme ne changera pas vraiment leur pratique car ils sont déjà dans la démarche d'éviter l'avance des frais à leurs patients, comme en témoigne la réaction qu'un des médecins (docteur 9) rapporte de ses patients, à l'annonce du projet de réforme dans les médias : des patients m'ont dit : ah vous avez vu, tout le monde va faire comme vous. . Pourtant, dans les années 90, cette logique n'était pas bien acceptée par les caisses d'assurance maladie, se rappelle ce médecin : on recevait parfois des courriers de la caisse en nous disant que les ALD devaient avancer l'argent. III. 2) L'impact attendu du tiers payant sur les comportements des patients et sur la relation médecin-patient III. 2. a) Les conséquences positives attendues sur le comportement des patients Elles sont au nombre de deux : des consultations moins limitées pour les patients en difficulté financière : une facilitation dans l'accès aux soins qui est évoquée par la moitié des médecins comme l'explique le docteur 4 : le fait de ne pas à avoir à avancer d'argent en totalité ou en partie va supprimer un obstacle financier qui intervient dans ce renoncement aux soins ou le docteur 14 : là, du coup, ça pourrait être une mesure particulièrement juste puisque tout le monde sans distinction de revenus, ni rien, peut accéder aux soins, ça me parat tout à fait intéressant. une autre modification positive du comportement des patients, moins directe, est évoquée par le docteur 1 : Après, je pense que c'est sûr que si on facilite l'accès aux médecins généralistes et que les médecins généralistes jouent aussi le jeu de faire de la présence et des urgences, on peut quand même limiter l'engorgement des urgences et faire des économies. 40 III. 2. b) Les conséquences négatives attendues sur le comportement des patients La première d'entre elles, évoquées par près de la moitié des médecins mais aucun des médecins orientés à gauche sauf l'élu du Parti Socialiste, est le risque d'une augmentation irraisonnée de consultations jugées comme inutiles par les médecins : l'avance des frais sert de frein à la consommation médicale injustifiée d'après eux : le docteur 15 affirme par exemple : Vous allez avoir des multiplications d'actes médicaux qui ne seront pas justifiés ; c'est la porte ouverte aux abus. le docteur 2 l'explique de façon métaphorique : Ça m'inspire que si la viande était gratuite, les bouchers n'arriveraient pas à fournir. Les gens qui ont rien, ben s'ils ne payent pas, ben, ils viendront deux fois plus pour rien. le docteur 12 affirme que le tiers payant, c'est inflationniste . La conséquence directe est donc une augmentation des dépenses de la Sécurité sociale et une aggravation de son déficit, prédite par exemple par le docteur 2 : Ça parat pas être une bonne solution dans un moment o on est censé faire des économies pour la SECU. C'est que si on fait des bêtises, notre système va exploser, et donc les avantages qu'on a vont se réduire. On peut remarquer que sur les sept médecins parlant de ce risque, seulement deux évoquent en parallèle la possibilité d'abus de la part des médecins (le docteur 11 et le docteur 12). Une autre conséquence est évoquée par le docteur 2 : les gens ne respecteront plus les heures de garde dans la mesure o ils n'auront plus rien à payer donc ça les déresponsabilise. Ce médecin pense que, comme les patients ne feront plus l'avance des frais, ils n'hésiteront plus à consulter pendant une garde plutôt que pendant les heures d'ouverture des cabinets : l'avance d'une somme plus importante demandée pendant une garde empêcherait ce genre de comportement d'après lui. L'origine de ces comportements est énoncée à de multiples reprises par les médecins contre la généralisation du tiers payant : c'est la déresponsabilisation qu'entranerait l'absence d'avance des frais, par une perte de conscience du coût de la santé. Le docteur 5 l'évoque ainsi : je trouve ça normal de payer quelqu'un et à la fin, je me rends compte de la valeur de l'acte ; j'ai une valeur, j'ai une notion, j'ai un sentiment. tandis que le docteur 8 s'appuie sur l'exemple du tiers payant en pharmacie : Le patient a déjà perdu la connaissance du coût de son ordonnance à la pharmacie puisqu'il ne paye plus rien. Et donc on voit des choses aberrantes, des gens qui stockent les médicaments. . Le docteur 5 précise ainsi : Le corollaire, c'est que quelqu'un qui ne paie pas pour un service ou une demande, au final, peut le prendre comme un dû. Ces affirmations se basent souvent sur la description de ce que les médecins constatent, d'après eux, avec les patients bénéficiant déjà de la dispense d'avance des frais comme ceux ayant la CMU : le docteur 7 l'explique comme suit : parce que je vois les gens qui ont la CMU consultent plus facilement pour des petites choses, genre des rhumes. . Le docteur 12 reprend cet argument même s'il avoue être peu légitime pour le constater : (. ) c'est que comme toujours avec le TP, et on voit ça avec la CMU dans certaines zones Pas ici je ne suis pas concerné personnellement, je dois avoir 3 ou 4 personnes en CMU, c'est très inflationniste. On peut noter qu'aucun médecin ne parle de travaux ou d'études ayant démontré de tels faits. Certains médecins sont même plus abruptes dans leur manière de parler des patients bénéficiaires de la CMU, comme le docteur 2 : Ils viennent n'importe quand pour rien, y a toujours quelque chose qui va pas. Ce sont des chieurs. 41 III. 2. c) Des comportements négatifs contestés ou sur lesquels on peut agir Une partie des médecins n'évoque pas les risques ci-dessus, voire même contestent fortement et spontanément le risque inflationniste en estimant que ce sont des préjugés sans fondement, comme le docteur 14 : je suis sûre que ce n'est pas une crainte justifiée, je suis sûre que c'est basé sur pas mal de croyances. ou le docteur 10 qui affirme se baser sur des travaux : ça n'entrane pas de surconsommation ou d'inflation d'après les études que j'ai lues. Un argument des médecins contre cette idée d'une surconsommation de soins liée à la dispense d'avance des frais est également le fait que dans leur patientèle, les patients qui surconsomment à leurs yeux, avancent aussi souvent les frais : Mais il y a aussi des gens qui payent et qui viennent pour un oui ou pour un non quoi. (docteur 6). La plupart de ces médecins croit beaucoup plus à l'utilité et la nécessité d'une éducation et d'une information des patients, à la fois : sur le fonctionnement de la protection sociale, comme le docteur 9 : Moi, je recadre dans la consultation. effectivement, quand je vois des gens qui me disent : oh mais non moi, je ne paie pas, on va faire ça. . bon voilà, on réexplique ce que c'est le soin, ce que c'est une couverture sociale () il faut une éducation sanitaire. Y compris sur qu'est ce qu'une couverture sociale. sur le coût des soins : le docteur 10 : Qu'on leur envoie une facture , pas qu'ils aient à payer, une facture détaillée pour qu'ils sachent juste ce que ça a coûté. Et qu'ils se rendent compte ce que ça coûte les frais et les soins, point ! . Le docteur 10 va même plus loin en estimant que les médecins sont les premiers responsables de cette surconsommation : Moi je crois que la surconsommation des personnes à la CMU, ce sont les médecins qui l'engendrent. C'est clair et net. Un médecin qui passe trois secondes pour passer une carte vitale et qui cède à toutes les doléances d'un patient, c'est pas possible, quoi. Ça marche pas comme ça. Moi, je pense que c'est un vrai travail de dire non, je pense, mais c'est le travail du médecin. III. 2. d) La perception par les patients de la réforme d'après les médecins La grande majorité des médecins estiment que la réforme sera bien accueillie par les patients, surtout du fait de l'apparente gratuité qu'elle entrane, ce que résume le docteur 12 : Je pense que la majorité va y être favorable, à partir du moment o elle ne paie rien. C'est typiquement français ça. Je paie des impôts donc ça doit rien me coûter, sauf mes impôts ! . Certaines sont plus hésitants sur la réaction de la population et pensent qu'elle sera accueillie diversement selon certaines variables : le niveau de vie : les propos du docteur 9 ( Les patients forcément, ceux que je soigne sont pour. Parce qu'ils sont aussi précarisés donc ils essayent de dépenser le moins possible ) répondent à ceux du docteur 11 ( Moi, je vois à R. o on a une clientèle plutôt bien, je pense pas que ça va changer grand chose pour eux. Les gens, ils ont les moyens de payer et ils s'en foutent ). leur orientation politique : le docteur 9 : Et puis les gens que je fréquente sont pour parce qu'ils sont de gauche. la présentation de la réforme par les médias : le docteur 10 : Je pense que l'avis des gens, à mon avis, c'est les médias qui font la politique et c'est la présentation que les 42 médias vont en faire qui va faire que les gens adhérent ou n'adhèrent pas. Si les médias font une présentation : le tiers payant pour tous, c'est bien parce que tout le monde va avoir accès à la santé etc. ben je pense que tout le monde sera d'accord pour avoir accès à la santé gratuitement. Maintenant, si on te le présente comme : ah, y a des Africains qui ont l'AME et qui vont chez le médecin toutes les deux secondes et qui ont Ebola y a des gens à la CMU qui surconsomment la médecine etc. . leur âge, en rapport avec la différence de vision du rapport médecin-patient qu'il entrane, d'après le docteur 6 : Il peut y avoir une minorité de gens pour qui ça pose un problème. Je pense par exemple à des gens qui ont l'idée qu'il y a un accord qui se fait dans le paiement. Comme j'expliquais des gens avec des revendications, des personnes en général un peu plus âgées qui vont tenir au paiement du docteur. III. 2. e) L'impact attendu du paiement sur la relation médecin patient Le paiement par le patient de son médecin est perçu par les praticiens de façon très différente. Pour certains, il a une vraie utilité car chez beaucoup de gens, le fait d'honorer le médecin est quelque chose de primordial, c'est quelque chose qui est primordial dans la relation libérale. (docteur 12). En effet, pour ce médecin, le pouvoir symbolique du paiement par le patient est très fort, autant pour le patient que pour le médecin car il représente à la fois : un moyen de témoigner sa gratitude et son respect à son médecin pour le patient : le fait de donner de l'argent, c'est honorer le médecin. C'est pour ça que ça s'appelle des honoraires. la récompense pour un travail : Ils reçoivent un soin, un conseil, une prestation quelconque et de ce fait, () ils rétribuent leur médecin. le témoignage d'une relation individuelle et particulière entre le médecin et le patient pour cet autre médecin (docteur 8) : le tiers payant de fait va modifier la relation, on va dire d'intimité entre le patient et son médecin, le patient devenant un numéro plus qu'un patient et il risque de perdre un petit peu une partie de son identité euh. de sa personnalité vis-à-vis du médecin. Le docteur 12 insiste sur l'importance que ça a pour le patient : le fait d'honorer le médecin, c'est surtout important pour le patient, pas pour le médecin mais avoue que c'est plutôt le cas des personnes âgées par rapport au reste de la population. On peut noter que cet argumentaire est porté par seulement trois médecins et que deux d'entre eux ont plus de 60 ans. De fait, le tiers payant risque d'entraner une dévalorisation de l'acte médical et réduire la consultation à une relation consumériste : les propos du docteur 15 comme t'es considéré comme un caissier de supermarché. () Tu passes, tu mets ton truc dans le caddie. rappellent ceux du docteur 5 Mais y a une sorte de drive médecin, quoi : y a un petit côté, je file ma carte et j'attends . A l'inverse, chez certains médecins, l'acte de paiement ne présente aucune utilité. Le docteur 6 le pense : est ce que le rapport à l'argent est important dans la relation ? Alors, ça, c'est pour moi, la question fondamentale. Euh. J'aurais tendance à dire non. Voilà. Ça, c'est mon avis à moi. Maintenant, on ne peut pas nier qu'il y a peut-être quelque chose qui se joue. voilà, là je fais référence, vous savez quoi, euh. à la psychothérapie et au fait qu'effectivement, il puisse y avoir une fonction symbolique au paiement () . Après, ce qui se passe en psychothérapie, c'est la psychothérapie. Ce qui se passe en médecine générale, c'est de la médecine générale. 43 De fait, ce médecin essaye d'instaurer un autre cadre lors de ses consultations : . ce rapport à l'argent, il est quelque part effacé . Le paiement peut même perturber cette relation : ainsi l'exprime avec beaucoup de franchise le docteur 5 : c'est pas la partie que je préfère faire, faire payer les gens. Ça me fait perdre du temps, c'est administratif, c'est pas mon métier, je suis pas commerçante () Faire payer les gens, c'est pas quelque chose auquel on est formé au niveau relationnel (. ) Et en plus je pense que je ne le fais pas très bien. Ca me gêne quoi. D'autres le déléguaient pour éviter qu'il ne parasite leur relation avec le patient : Disons que moi en tant que médecin, dans les différentes pratiques que j'ai eues, j'étais plus à l'aise quand il n'y avait pas ce lien d'argent avec les personnes. Le cabinet o je travaillais, c'était la secrétaire en bas qui encaissait (petit rire étouffé) donc c'était une manière très facile de diminuer le rapport direct à l'argent. (docteur 4) Pour ce médecin, la qualité du soin n'est en effet pas lié au paiement comme le souligne le docteur 8 également : je pense que ça ne va pas changer la qualité des soins. Le médecin consciencieux, il restera consciencieux. On peut noter enfin que la relation d'intimité entre le patient et son médecin est telle d'après le docteur 2, que le praticien est capable de savoir quel patient est dans le besoin ou pas. Cela lui permet de justifier qu'il vaut mieux laisser la décision de l'application du tiers payant au généraliste : Mais comme ça, c'est très bien parce que. moi je trouve que c'est le mieux parce que c'est à l'appréciation du médecin généraliste. On est médecin de famille, on sait si quelqu'un a du pognon, s'il est en difficultés. III. 3. La question de la rémunération des médecins La question de la rémunération des médecins et de son mode a été très souvent au cœur des témoignages des médecins : III. 3. a) Le prix de la consultation considéré comme faible et des perspectives incertaines Plusieurs médecins considèrent que le prix de la consultation de base est peu élevé : au regard de l'ensemble des composantes de la profession : le docteur 5 énumère : Ben à 23 euros, pour la quantité d'études, d'investissements, et de conseils que l'on donne et de soins et de risques que l'on prend avec les médicaments que l'on gère, c'est pas beaucoup ! . au regard du prix de la consultation dans les autres pays développés : le docteur 11 : Et puis après, je prends l'exemple de L. qui a vu des Canadiens la semaine dernière, et quand il leur a dit 23 euros, ils lui ont ri au nez, quoi. Là-bas, c'est plus de 50 euros. au regard du niveau de revenus actuel des médecins en comparaison avec les dernières décennie, même si le docteur 5 concède que cette baisse ressentie peut être attribuée à une activité moindre : Je veux dire aujourd'hui, si moi je travaillais avec deux enfants, je vais m'en sortir avec peut être 2000 à 2500 euros par mois parce que je ne vais pas travailler jusqu'à 22h. C'est pas non plus énorme. C'est tout à fait correct, hein, c'est mieux que le SMIC. Mais c'est pas non plus une profession. on était des notables hein dans la société ! . 44 ce qui permet de légitimer les dépassements d'honoraires, notamment pour les chirurgiens pour un seul médecin, le docteur 13 : la chirurgie est complètement dévalorisée en France : les mecs ont pu bouffer en partie parce qu'ils ont fait des dépassements d'honoraires. Seul un médecin dit spontanément avoir le sentiment de bien gagner sa vie (docteur 9) tandis que le docteur 2 concède que les médecins gagnent un peu d'argent en s'empressant d'ajouter qu'ils payent tellement de charges . La généralisation du tiers payant est considérée par certains comme leur permettant potentiellement d'augmenter leurs revenus, comme le docteur 2 par l'augmentation mécanique des demandes de consultation des patients : moi ça m'arrange, il y aura plus de monde . Mais certains voient le risque que cette croissance des dépenses de santé empêche une augmentation du prix de la consultation, comme le docteur 5 : Après, j'ai une autre question, est ce que ça va pas bloquer la C ? Et du coup, nous pendant 10 ans, après, on touche plus à rien pour pas refaire une réforme. D'o une peur du déclassement exprimée par le docteur 13 : Et si on réagit en terme de produit intérieur brut dans une société, dans un pays, et bien on va appauvrir une catégorie socio-professionnelle qui gagnait correctement sa vie et on va la mettre dans une moyenne supérieure ni plus, ni moins. III. 3. b) Le tiers payant généralisé perçu comme la fin de la médecine libérale Le tiers payant généralisé est perçu par certains médecins comme l'ultime attaque contre le statut libéral, du fait de la dépendance totale aux organismes financeurs, publics ou privés, ce que le docteur 13 exprime ainsi : c'est vraiment donner la main mise du système aux financeurs à la fois publics et malheureusement aux financeurs privés ; on va perdre notre indépendance de prescription, Et eux pourront me faire pression bien entendu. Mon financement, ma prestation, mon règlement d'honoraire sera soumis aléatoirement à la volonté des assureurs. D'après ce médecin, la conséquence peut aller jusqu'à un dilemme dangereux entre les attentes du financeur et les besoins du patient qui peuvent être divergents : Si j'ai marqué le médicament non substituable, au lieu de me faire payer 23 euros, rien ne va les empêcher de me payer que 20 euros. On va se retrouver avec un conflit d'intérêts après avec les patients () Est ce que je dois privilégier le patient dans ce que je considère être bon pour lui ? . La liberté de prescription, une des piliers de la médecine libérale, est donc, d'après ces médecins, directement menacée par cette mesure. De fait, c'est définitivement une transformation vers une médecine salariée pour le docteur 16 : donc on va vers une médecine salariée. Petit à petit, on va vers une médecine salariée. Le docteur 8 le déplore : Après ça, si on adopte ça, la médecine libérale est fichue, ça c'est sûr. Pour d'autres, la généralisation du tiers payant ne vient pas changer radicalement leur rapport avec la Sécurité Sociale car ils estiment que le caractère libéral est déjà tout à fait faussé dans le système actuel, comme le note le docteur 9 : et puis soyons pas hypocrites, on a des statuts bâtards mais on est à peu près salariés de la sécurité sociale. Pour le docteur 6, ce statut ne pose pas de problème car plus que l'identité libérale, la place 45 du médecin s'inscrit dans un cadre public, du fait de la socialisation des dépenses de santé (donc des revenus des médecins) par la Sécurité Sociale : Après, au niveau personnel, moi, je ne vois strictement aucune différence. Pour moi, on est un service de santé publique. Je veux dire, il faut quand même être honnête quoi. Donc, du coup, sans la Sécurité sociale, nous on travaille pas quoi. Cette ambivalence perçue par les médecins sur leur profession est parfaitement illustrée par ce propos du docteur 11 dont on rappelle qu'il est membre du conseil de l'ordre : Faut pas être dépendant d'un système qui nous tienne en laisse même si actuellement l'organisme payeur, c'est la SECU, qui paye les médecins quand on est conventionné. On est en train de rentrer sous la coupe. III. 3. c) La perception des rémunérations aux forfaits mises en place Elle est là encore assez variable et un même médecin peut trouver des avantages et des inconvénients à la fois. Les points positifs relevés sont : une réelle action sur la qualité des soins, d'après le docteur 10 : Parce que je pense que le nombre d'HbA1c a doublé depuis qu'ils ont mis ça. ça permet au médecin de se situer dans ses pratiques. Le même médecin souligne qu'au moins, on sache ce qu'on fait, quoi, qu'on sache par rapport aux autres, qu'on sache par rapport aux reco. la possibilité de mettre en place des tâches de prévention, de coordination ou d'éducation. Le docteur 6 explique : je ne dois pas cacher qu'on l'a utilisé pour payer une secrétaire coordinatrice et donc ça a été très utile et on a pu l'utiliser pour faire de la coordination quoi. Donc nous, c'est tombé à point nommé pour développer notre mode d'exercice. un moyen pour compenser le gel du prix de la consultation pour le docteur 1 : si la consultation stagne à 23 euros, c'est vrai qu'ils peuvent se le permettre. enfin, la Sécurité Sociale est estimée légitime pour mener ce genre d'actions en tant que financeur, même chez certains médecins attachés au statut libéral comme le docteur 9 qui déplorait la fin de la médecine libérale avec le tiers payant : Que la sécurité sociale récompense. pourquoi pas. ça me parat pas déontologiquement anormal . Le docteur 6 l'exprime encore plus clairement : Que la Sécurité sociale puisse avoir son mot à dire dans notre pratique, ça me semble assez logique finalement. C'est lui le payeur donc. . Les points négatifs sont : la crainte à nouveau d'une perte de l'identité libérale et d'une liberté de prescription relevant du même mécanisme que le tiers payant généralisé : le payeur a un moyen de pression sur le médecin. Le système pourrait même être moins favorable par la suite si, au lieu d'une récompense en cas d'objectifs atteints, on instaure des sanctions en cas d'échecs ou on demande aux médecins d'avoir un agrément pour que les patients soient remboursés. Le docteur 2 se projette ainsi : Les CAPI, c'est un piège, ça ! Parce qu'un jour, ça va se généraliser. Alors, au début, on te filera plus de pognon, après o il faudra que tu payes ou on te dira : ben t'as plus d'agrément ! Tiens vas-y ! Va faire autre chose ! . On est en train de perdre le côté libéral de la médecine quoi, et ça c'est dommage ! . 46 pour certains, le fait que la Sécurité Sociale ait un moyen de connatre les pratiques des médecins est vécu comme une intrusion. Le docteur 16 : Mais c'est effrayant comme. ils savent tout () On perd un peu son. sa. on se sent pas très libre. la légitimité scientifique des critères choisis est également pointée du doigt par le docteur 5 notamment : Je le fais mais y a aussi un moment o je pense qu'il y a aussi des pressions autres que l'objectif santé et donc du coup, j'essaye de prendre du recul par rapport à ça () Si tu veux être libre de penser pour certaines pathologies o tu sais qu'il peut y avoir des décalages entre les recommandations et la pression de l'industrie, et bien on ne te le laisse pas le faire. des critiques virulentes émanent aussi d'un médecin se catégorisant à gauche et ne remettant pas en cause la légitimité de la Sécurité Sociale dans ce domaine. Il y voit néanmoins plusieurs aspects négatifs : outre le côté infantilisant pour le médecin, le docteur 9 a l'impression d'obtenir des sommes illégitimes ou gaspillées par la SECU ( de l'argent jeté par les fenêtres ). Il a pu aussi constater que ça favorisait des comportements intéressés et mercantiles de médecins pouvant aller jusqu'à l'arrêt de la prise en charge de patients pas rentables car faisant chuter les statistiques : Moi, je vois déjà des patients qui viennent me dire : mon médecin veut plus me voir. et comme par hasard, ils ont une hémoglobine glycquée à 12% alors je me dis que c'est le patient qui devient plus rentable . Le docteur 1 considère néanmoins que c'est une piste à approfondir car les forfaits permettent un modèle mixte entre activité salariée et libérale, surtout si la part de ce mode de rémunération augmente. III. 3. d) La perception du salariat et du forfait à la capitation et la critique du paiement à l'acte Ces deux modes de rétribution ont été évoqués par certains médecins et sont rapprochés ici car ils sont perçus le plus souvent de façon identique par les praticiens qui ne font pas de distinction entre paiement à la capitation, salariat et fonctionnariat. De nombreux avantages sont cités, y compris par les médecins attachés à l'identité libérale. On y voit également en creux les défauts selon les praticiens de la rémunération à l'acte. Tout d'abord, pour les professionnels, le bénéfice de ce mode de rémunération semble être important : meilleures conditions de travail, d'après le docteur 12 du secteur 2 : On est calme, serein, détendu. Plutôt que prendre 30 patients par jour, on en prendra que 25, et on améliorera la qualité de vie. meilleure protection sociale au niveau maladie et retraite : le docteur 13, du syndicat UFML, dit : Moi, je veux bien être fonctionnaire. À la rigueur, en effet, travailler 35- 40 heures, avoir une retraite à 80 % comme. Sans problème, pourquoi pas, on peut discuter de ça. tandis que le docteur 11 du conseil de l'ordre rappelle que quand t'es salarié et tu es malade ou en vacances, t'es payé . Le docteur 12 conclut : A partir du moment o vous touchez un salaire, o vous avez vos cotisations sociales payées, o vous n'avez pas de soucis vis-à-vis de la retraite ou de l'URSSAF, vous travaillez sereinement. et pense ainsi que ça permettra à certains jeunes de s'intéresser d'un peu plus près à la médecine générale. 47 Ensuite, pour la prise en charge des patients, des avantages sont décrits par certains médecins : le docteur 6 qui a eu l'occasion de travailler à la capitation en Belgique explique que cela permet de se centrer sur l'alliance thérapeutique et sortir de la négociation induite par le paiement à l'acte avec la clôture de la consultation, sur un projet thérapeutique et pas sur un projet. enfin c'est pas un projet mais qui n'est pas une clôture financière. . Cela rend possible également un suivi plus rationnel au niveau médical : Et ça permet aussi une pratique un peu plus, je dirais, aisée dans le sens de la gestion de certains actes quoi. Donc, ça va être beaucoup plus facile de demander aux gens de revenir (je parle des structures au forfait) pour faire un contrôle d'oreille. Ecoutez je ne mets pas d'antibio aujourd'hui mais je revois dans 48 heures si ça va pas mieux quoi. Hop hop, on regarde l'oreille et le problème de payer une consultation ne se pose pas. Ni pour les gens, ni pour nous. plusieurs médecins soulignent ainsi l'effet inflationniste du paiement à l'acte, comme le docteur 12 du secteur 2 : A partir du moment o on est salarié, on n'a plus de course à l'acte à faire. Il n'y a plus pléthore et multiplication des actes. alors que le docteur 4 insiste sur les dépenses induites par la logique de ce mode de rétribution : Plus vous travaillez vite, moins vous avez tendance à écouter les gens et du coup à prescrire plus, des médicaments comme des examens complémentaires. Le changement de mode rémunération permet enfin de réorienter les soins vers la prévention et l'éducation à la santé, comme y aspire le docteur 10 : si je pouvais être médecin salarié, garder tous mes patients une demi-heure, faire de l'éducation ou avoir des après-midis pour faire des cours aux patients d'éducation thérapeutique, j'en rêve. Un effort important sur la prévention et l'éducation à la santé est plébiscité par plusieurs médecins du panel, de toutes les profils : ils estiment que les pouvoirs publics ne font pas assez d'efforts pour toucher les populations qui ne consultent pas via les écoles ou les lieux de travail mais aussi que le mode du paiement à l'acte ne permet pas de réaliser ce genre de tâches. Le docteur 5 explique sa manière de détourner le système, à son sens, pour y parvenir tout de même : moi je vois les gens, je leur demande de venir me voir une fois par an pour faire un check-up quand ils vont bien et je fais payer une consultation à la Sécurité Sociale, ce que je n'ai normalement pas le droit de faire : la prévention, c'est normalement pas payant. C'est pas remboursé par la Sécurité Sociale. Enfin, le paiement à l'acte ne permet pas de rendre compte des différences de complexité des consultations de médecine générale et notamment d'un facteur important dans la rémunération : le temps identifié comme tel par le docteur 8. Des médecins peuvent être ainsi troublés dans certaines situations comme le docteur 2 : Alors après elle, y en a un autre qui a le nez qui coule alors vous voulez pas regarder ? . alors tu regardes, toi tu t'en fous. Quand tu sors de là, toi tu as gagné 92 euros en vingt minutes. Et c'est là que je dis : moi j'ai pas intérêt, mais j'ai une certaine éthique donc je me dis : c'est de l'argent volé, quoi. alors, d'un autre côté, j'ai pas envie de pas me faire payer non plus parce qu'il y a quand même pas de raison, faut pas être con, quand le percepteur, il arrive et qu'il te demande tes impôts. Mais si tu veux, c'est pas très satisfaisant. L'exemple donné par le docteur 5 montre combien le fait de coter un acte peut être subjectif et fluctuent selon les médecins et chez un même médecin : Ma copine C. elle fait pas payer les gens par principe quand elle ne les examine pas () Parfois c'est dans le courant même de la consultation que tu bascules () C'est à l'instinct que je fais payer. Au final, le docteur 8 pense néanmoins qu' il faut laisser le choix au médecin car l'un dans l'autre tout s'équilibre . 48 Outre la dépendance aux organismes payeurs déjà déplorée pour les rémunérations forfaitaires précédentes, deux autres points négatifs du salariat ou de la capitation sont évoqués : un risque de désinvestissement et une perte de productivité du médecin, du fait de l'absence de corrélation entre son activité et son revenu, comme l'illustre le docteur 3 : j'en pense que c'est dangereux parce que tu salaries les médecins. Moi, je vais prétendre à travailler de 8h à 12 h et de 14h à 18h et puis après. hein ? Voilà ! Je ne suis plus sur un mode libéral. Voyez avec la SECU moi ils me payent tant, c'est eux. un risque de perte de niveau de revenus si la rétribution décidée est trop faible ou en tout cas, une entrave pour le médecin qui ne peut plus augmenter son revenu à sa guise, comme le note le docteur 13 : J'y suis opposé parce que ça nous empêche de nous développer. III. 4. La question de l'accès aux soins Cette question, au cœur de la réforme telle qu'elle est présentée par la ministre, revient de fait souvent dans les entretiens. III. 4. a) L'absence de problème d'accès aux soins La moitié des médecins considèrent que les dispositifs actuels en place sont suffisants pour permettre l'accès aux soins de tous : aucun des médecins catégorisés à gauche n'en fait partie. Le docteur 2 se satisfait ainsi en affirmant que quant à l'accès aux soins, moi je considère qu'en France, on a quand même beaucoup de chance. tandis que le docteur 11 pense que tout le monde a accès aux soins. On peut le tourner comme on veut. Il va à l'hôpital, il est reçu : avec ou sans argent, avec ou sans carte et tout ça. Certains pondèrent leurs propos en évoquant qu'ils se basent sur leur environnement professionnel pour affirmer cela mais que c'est peut être différent ailleurs. Le docteur 7 témoigne presque dans sa réponse d'une certaine gêne de ne pas en savoir plus : J'ai pas l'impression qu'il y ait de difficultés. A mon avis, ceux qui consultent pas, c'est plus des gens qui n'ont pas envie de se faire suivre. () J'ai pas l'impression qu'il y ait des difficultés d'accès aux soins. (Elle rit de façon gênée). Peut être que je me trompe. . De plus, ces médecins réfutent l'utilité du tiers payant généralisé en démontrant la brièveté de l'avance réelle des frais par les patients grâce à la rapidité des remboursements avec la télétransmission : ainsi le docteur 5 explique : Je passe mes feuilles de soins tous les soirs donc ils sont remboursés la semaine d'après : c'est une avance très temporaire. III. 4. b) Les problèmes d'accès aux soins perçus par les médecins et leurs solutions Les praticiens évoquent des problématiques d'accès aux soins propres à des populations ciblées : les patients jeunes (docteur 3) ou étudiants (docteur 10). les patients à la retraite ne pouvant bénéficier de la CMU car juste au dessus des seuils d'attribution (docteur 12). des patients sans complémentaire (docteur 1). 49 L'accessibilité des professionnels au niveau géographique est évoquée par un tiers des médecins et jugée comme un frein aussi important que le problème financier. Certaines spécialités sont citées spontanément comme la psychiatrie, la gynécologie et l'ophtalmologie. Le docteur 2 explique ce déficit d'accessibilité par un manque d'incitation chez ces professionnels à faire plus d'actes : ils payent tellement de charges, plus ils travaillent, plus ils payent et donc les gens qui ne sont pas idiots, ben ils ont compris qu'il faut travailler moins tout simplement. Et ça aussi, ça aussi, ça participera au fait que vous aurez des rendez-vous de plus en plus loin. Les ophtalmo, pourquoi il ont des rendez-vous loin ? Parce qu'ils font plus douze heures par jour, à 18h c'est fini. D'autres médecins évoquent le problème de l'accès aux spécialistes sous l'angle des dépassements d'honoraires, chez les libéraux comme chez les médecins hospitaliers, que déplore le docteur 3 : Donc quand les gens ont les moyens, ils vont à Bordeaux, ils se prennent un secteur 2 à 100 euros la consult' () Alors avec, comme à l'hôpital, des plages secteur 1, secteur 2. Qu'ils aient des plages secteur 2, je m'en fous, ils font ce qu'ils veulent. Mais qu'ils aient des plages secteurs 1, oui ça, ça me semble beaucoup plus prioritaire. Le médecin généraliste joue alors à plein son rôle pivot du système de santé en orientant et informant ses patients, comme le docteur 9 : mais c'est vrai que ça rend les consultations très compliquées. Moi je vois, je suis obligé de travailler avec le secteur public. ou en palliant lui-même ces problèmes, comme le docteur 3 : Moi, ici, c'est nous qui faisons la dermato, la gynéco . Le docteur 5 voit une utilité potentielle au tiers payant généralisé dans ce domaine car il mettrait mieux en exergue la valeur du dépassement si celui-ci est avancé de façon isolée par le patient. Le docteur 4, militant associatif de la santé un droit pour tous , nous rappelle aussi l'existence d'un blocage de l'accès aux soins pour raisons financières dans certains cabinets . Les autres difficultés ou solutions évoquées sont : l'accès aux soins dentaires et optiques (docteur 14 et docteur 9). la création de centres d'accès spécifiques pour les plus démunis ou le recours à l'hôpital pour le docteur 11. l'abolition des franchises. Docteur 14 : Quand t'es dans une vraie solidarité nationale, ça veut dire que le un euro supprimé pour la consultation, c'est fini, les 0, 5 euros par boite, c'est fini. T'as des gens en ALD avec des grosses pathologies lourdes à qui on sort 130 euros, c'est quand même. ça pose problème. le remboursement de certains traitements qui ne le sont pas et exercer une pression sur l'industrie pharmaceutique pour baisser le prix des médicaments en général, pour le docteur 9. Pour le docteur 6, la maison de santé pluridisciplinaire, telle qu'elle était conçue en Belgique, est la réponse la plus complète à l'accès aux soins, tant par la mise à disposition de différents professionnels sur un même lieu que par la dispense d'avance des frais prévue dans les statuts du fait de la rémunération à la capitation. III. 4. c) Du tiers payant généralisé inefficace dans l'accès aux soins au tiers payant délétère ? Outre l'inutilité affirmée de cette réforme évoquée à la partie III. 4. a), le docteur 13 affirme qu' aucune étude ne montre que ça facilite l'accès aux soins . 50 Ce même médecin y voit un outil pour permettre de désengager la Sécurité Sociale du remboursement de beaucoup, beaucoup de soins et refiler ce financement aux assureurs privés. Rien n'empêchera de déplacer le curseur vers la gauche et donc de diminuer les dépenses publiques liées à l'assurance maladie obligatoire . De fait, les cotisations des mutuelles augmenteraient à nouveau et deviendraient inaccessibles à une frange de plus en plus large de la population. III. 4. d) Un attachement à la Sécurité Sociale et à l'accès aux soins, parfois relatif pour certains Plusieurs médecins rappellent l'importance de la Sécurité Sociale, de la défendre et de faciliter l'accès aux soins au plus grand nombre comme par exemple : le docteur 4 : à partir du moment o les gens paient leurs cotisations sociales etc, moi je me dis qu'ils n'ont pas à faire d'avance d'argent pour les soins. Ni pour les soins de base, ni pour ce qui n'est pas remboursé qu'on appelle le ticket modérateur () La médecine générale, de premier recours notamment, doit être largement accessible aux individus. le docteur 9 : il faut vraiment qu'on oublie pas ce que c'est la SECU, d'o ça vient. parce qu'après, on la perd, on pourrait la perdre mais personne bouge. le docteur 14 : le but de la Sécurité sociale, c'est une solidarité décidée par l'état qui met tout le monde à égalité par rapport aux soins. D'autres ont également exprimé cet attachement dans leur entretien mais en donnant des propositions par la suite qui ne semblent pas aller dans ce sens : le docteur 5 : Même si les gens devaient payer 23 euros, ça. et ne pas être remboursé, ça ne me choquerait pas. () Je pensais au contraire qu'on allait augmenter la consultation et pas rembourser les gens de la partie supplémentaire. les docteurs 2 et 8 proposent la création d'un petit risque non remboursé par la Sécurité Sociale dont la définition pose des difficultés pour le docteur 8 tandis que le docteur 2 cite la grippe ou le gamin qui se donne un pet . Enfin, le docteur 13 nous explique que pour faciliter l'accès aux soins en France, il faut déjà l'augmentation du tarif de la consultation en France, point barre. C'est tout () Donc, 40 euros de suite, de suite et vous (les mutuelles) remboursez. Si vous voulez pas rembourser, eh bien on fait une partie d'honoraires libres, un peu de tact et mesure en effet. Mais sur une partie. Un peu de liberté ! . Il précisera plus loin que dans l'optique d'une matrise des dépenses de santé, il faut une partie qui ne soit pas remboursable. Il faut peut-être réinstaurer une forme de ticket modérateur, ni plus ni moins. Ne pas prendre en charge intégralement les frais liés à la santé ou dans une certaine partie. Par ailleurs, ce médecin nous expliquait auparavant dans l'entretien que la Sécurité Sociale avait une situation de monopole qu'il semblait juger discutable : l'argent a été donné au départ ou du moins pris au départ sans qu'il y ait aucune liberté puisqu'il y a un monopole de la Sécurité Sociale qui s'exerce de façon autoritaire donc c'est pris sur les cotisations des salariés. 51 III. 5) Variation des opinions des médecins en fonction de leur profil On peut évoquer quelques tendances dans cet échantillon concernant les opinions exprimées selon les profils des médecins : l'âge ne semble pas agir sur leur avis sur ces différents thèmes hormis sur deux d'entre eux : l'importance symbolique dans la relation médecin-patient du paiement direct du médecin par le patient, qui est peu exprimée sauf par des médecins plus âgés (trois médecins sur six de plus de 60 ans en parlent alors que seul un médecin de moins de 60 ans l'évoque) ; et l'utilisation rare du tiers payant partiel est le fait uniquement des médecins de plus de 60 ans excepté le docteur 13. A l'inverse, le docteur 4 est le seul médecin de plus de 60 à l'avoir pratiqué. le lieu d'exercice, la durée d'installation ou le sexe ne semblent pas jouer de rôle décisif dans les différentes thématiques abordées. le secteur d'activité ne joue pas non plus de façon nette mais on peut remarquer que les deux médecins du secteur deux sont opposés à la généralisation du tiers payant et n'utilisent pas le tiers payant partiel. il est difficile également de conclure à une influence précise de l'origine sociale : on peut noter tout de même que seulement deux médecins sur les huit issus de catégories socio- professionnelles élevées (cadre ou chef d'entreprise) se prononcent pour le tiers payant généralisé. une opinion globalement favorable au tiers payant généralisé est rattachée à des médecins ayant une utilisation fréquente du tiers payant partiel mais une opinion défavorable n'est pas toujours liée à son utilisation rare ou nulle. IV. Discussion IV. 1) Choix du sujet Les questions générées par nos remplacements successifs en tant que médecin généraliste remplaçant sur le paiement de l'acte médical nous ont conduit à être particulièrement interpellé par la proposition ministérielle de généralisation du tiers payant. Une recherche bibliographique sur ce thème nous a montré qu'il était souvent abordé au niveau économique, social, historique voire philosophique, dans des travaux variés. Mais aucun n'était vraiment centré sur les perceptions des médecins sur cette question. Un seul travail, datant de 2001, intitulé influence du tiers payant sur la consommation de soins ambulatoires, enquête auprès des médecins généralistes (35), était essentiellement axé sur la perception par les médecins de la consommation des soins des patients CMU. Il abordait également la responsabilité attribuée par les médecins au tiers payant dans ces comportements et, au travers d'une unique question à choix multiple, l'utilité de la dispense d'avance des frais de leur point de vue. Dès lors, il nous a semblé particulièrement pertinent et original de profiter de la proposition de généraliser le tiers payant pour explorer de façon complète les représentations des médecins à propos de ce dispositif. 52 IV. 2) Méthodologie IV. 2. a) Choix de la méthode qualitative Bien que nous pouvions formuler quelques hypothèses sur la position des médecins et les arguments de ceux qui seraient contre le tiers payant au vu des interventions médiatiques des syndicats, nous n'avions aucune idée précise de la diversité des avis que nous pouvions rencontrer car aucun travail ne s'est adressé aux médecins directement, en leur permettant de développer leur réflexion sur ce thème. Par ailleurs, il nous semblait possible que les positions des médecins ne soient pas forcément tranchées, chaque praticien pouvant considérer des aspects favorables et en même temps défavorables à la généralisation du tiers payant. Dès lors, la possibilité d'une étude quantitative ne semblait pas adaptée à notre sujet d'étude : nous n'avions pas assez de pré-requis pour constituer des questions à choix multiples ou des questions fermées permettant de rendre compte de toute la diversité potentielle des opinions. Enfin, cette méthode ne permettait pas de comprendre l'articulation de la pensée des médecins. Au contraire, une étude qualitative permet de recueillir des données lorsque les connaissances sur le sujet ne sont pas encore établies clairement ainsi que le cheminement aboutissant à ces idées. (36) Nous avons donc opté pour cette solution. IV. 2. b) Choix de l'entretien semi-directif L'observation in situ pour une réforme qui n'est pas encore appliquée n'était pas utilisable et n'aurait pas permis de recueillir les opinions des médecins. L'entretien libre ne semblait pas non plus adapté. Le recueil de données pour notre travail pouvait donc être réalisé par entretien directif qui se rapproche du questionnaire utilisé dans les méthodes quantitatives avec des questions fermées. Notre objectif étant de laisser le plus possible le médecin s'exprimer et aborder les questions en lien avec le thème qu'il souhaitait, ce choix ne semblait pas pertinent. Le focus groupe aurait pu être également retenu mais il nous semblait peut-être limiter la compréhension de la logique individuelle de chaque médecin. De plus, sur un sujet qui peut être considéré comme sensible, certains médecins auraient pu ne pas oser s'exprimer, entranant une perte d'informations. Au contraire, l'entretien semi-directif nous semblait laisser suffisamment de marge de manœuvre aux médecins dans leur réflexion et leurs réponses, tout en nous permettant de cadrer l'entretien sur les thèmes qui concernaient notre étude. Ceci a été validé lors des entretiens car par exemple, il n'est pas rare que des thèmes aient été abordés par les médecins à un moment de l'interview alors qu'une question sur ce sujet devait intervenir dessus par la suite. Cet exemple souligne la flexibilité que permet l'entretien semi-directif. IV. 2. c) Constitution de l'échantillon (36) Nous souhaitions observer la réalité des positions des médecins dont les déclarations des syndicats semblaient témoigner, mais aussi obtenir des avis de personnes qu'on peut considérer comme s'écartant de façon extrême vis-à-vis de ces positions. Notre échantillonnage est donc guidé par cet objectif. 53 Nous avons ainsi choisi pour partie des médecins pour leur investissement politique : l'appartenance à un parti du gouvernement à l'origine de cette réforme ou de l'opposition qui s'est prononcée contre en reprenant l'argument du risque de surconsommation induite (37) nous semblait pouvoir influencer la perception de cette mesure par les médecins. Nous avons également sélectionné des médecins impliqués au niveau associatif dans la défense de l'accès aux soins. Les associations de défense des patients se sont déclarées en effet favorables à cette mesure qu'elles réclamaient régulièrement et nous avons donc pensé que les médecins qui participaient à cette lutte pouvaient avoir un discours intéressant à étudier. (38) Nous n'avons volontairement pas choisi des représentants de chaque syndicat estimant que le risque de récolter un témoignage relevant plus du discours stéréotypé était grand et peu pertinent dans le cadre de notre travail. Nous avons tout de même inclus un médecin pour son implication syndicale à l'UFML, issue du mouvement né sur Facebook dit des médecins pigeons . Il nous semblait être le témoin d'une réactivation radicale des thématiques libérales et constituer ainsi un point de vue extrême intéressant. Nous avons également choisi un médecin pour son appartenance au conseil de l'ordre d'Aquitaine. Nous jugions intéressant de connatre son point de vue même si on ne peut le réduire à cette activité ordinale (tout comme les médecins ci-dessus ne peuvent être réduits à leur implication politique, syndicale ou associative). Le conseil national de l'ordre des médecins a jugé le tiers payant et sa généralisation comme n'étant pas en soi anti- déontologique en précisant qu'ils ne mettent en cause l'indépendance professionnelle des praticiens s'ils s'accompagnent de mécanismes empêchant que les praticiens soient à la merci des financeurs. (39) Par ailleurs, nous avons également essayé de constituer un échantillon qui témoigne de la diversité des pratiques du tiers payant, ce qui nécessitait de connatre les médecins. Nous pensions intuitivement qu'un médecin qui utilisait fréquemment le tiers payant partiel ou qui avait utilisé le tiers payant intégral pouvait avoir une perception différente de celui qui ne l'utilisait pas que pour les patients en ALD par exemple. La sélection des médecins s'est donc faite soit par connaissance directe du médecin pour l'avoir remplacé, soit par réseau grâce à des informateurs-clés nous ayant orientés vers des médecins ayant certaines pratiques. Enfin, on a tenté d'obtenir des profils variables concernant le lieu d'exercice, l'âge, le secteur de conventionnement et le sexe sans préjuger de l'impact de ces facteurs sur leurs réponses. Nous précisons à ce stade que la présence de médecins à la retraite depuis peu se justifie, à nos yeux, d'abord par leur spécificité d'investissement (l'un était maire PS de sa ville pendant plus de 15 ans, l'autre militant associatif) mais aussi par l'intérêt que leur témoignage pouvait apporter, au vu de leur position d'observateur des évolutions du système de santé entre le début et la fin de leur carrière. L'effectif de l'échantillon a été arrêté à seize médecins : l'objectif de saturation des données a été atteint devant la redondance des idées exprimées à l'issue des deux dernières interviews réalisées tandis que les sources de variations des profils de médecins (exercice, usage du tiers payant, implications dans différentes sphères. ) avaient été à notre avis totalement exploitées. On peut noter enfin que la sélection des médecins s'est faite au fur et à mesure des interviews et de ce qui en ressortait, ce qui correspond aux principes de la théorie ancrée. (40) Il semble évident que cette manière de constituer un échantillon ne peut en aucun cas permettre de généraliser les constatations faites à l'ensemble de la population des médecins. 54 Mais nous rappelons que notre but n'était pas d'être représentatif de la population des médecins généralistes libéraux mais de découvrir la variabilité de leurs opinions. Il nous semble au vu des résultats que cet objectif a été atteint. IV. 2. d) Constitution du guide d'entretien Le guide d'entretien a été conçu pour permettre une expression la plus libre et spontanée possible. La présentation de la réforme du tiers payant généralisé était volontairement simple pour ne pas influencer l'avis des médecins sur les avantages ou inconvénients éventuels. La première question était très ouverte pour permettre au médecin de exprimer spontanément ces réactions. Les deux questions suivantes sur les points positifs et négatifs de la généralisation du tiers payant n'ont donné lieu à aucune relance basée sur nos connaissances ou sur les arguments qui auraient pu être soulevés par les médecins lors des entretiens antérieurs. Nous ne souhaitions pas modifier leur avis initial en les faisant réfléchir sur des idées qu'ils n'avaient pas au départ. Le questionnement sur les pratiques du tiers payant a été basé sur une question ouverte mais des relances plus fermées avaient été prévues pour avoir un tableau précis et systématisé sur ce thème. Le fait de placer les questions sur le profil du médecin à la fin de l'interview était volontaire car nous ne souhaitions pas que les demandes quant à l'appartenance à une organisation politique et l'origine sociale ne provoquent de sentiment de méfiance ou de crispation de la part des personnes interrogées. La réaction d'un des médecins qui, à l'issue de l'interview, nous a demandé pourquoi interroger sur la profession des parents semble valider cette initiative. Le guide d'entretien a été préparé en concertation mais n'a pas été testé au préalable lors d'entretiens exploratoires ou d'un focus groupe, ce qui constitue un point péjoratif. Cela nous aurait peut-être évité d'avoir à rajouter une question sur les nouveaux modes de rémunération après les trois premiers entretiens. Nous pensions en effet voir surgir cette thématique dans les différentes questions prévues initialement, notamment celle sur l'accès aux soins mais ce ne fut le cas que de façon ponctuelle au cours des premières interviews et pas du tout lors de l'une d'entre elles. Une perte d'informations est donc à déplorer pour les premiers praticiens interrogés. IV. 2. e) Réalisation des entretiens Le choix laissé au médecin du lieu et du moment permettait de le placer dans les meilleurs conditions pour répondre à nos questions. Toutefois, le fait que certains médecins aient opté pour être rencontrés à leur domicile en dehors de tout contexte professionnel a pu favoriser leur expression par rapport à ceux qui étaient dans le cadre de leur journée de travail, forcément plus limités dans le temps qu'ils pouvaient nous accorder. De même, nous avons accepté de réaliser une des interviews dans un café bien connu du praticien à sa demande : nous craignions que le fait que ce soit un lieu public puisse brider sa parole mais cela ne nous est pas apparu évident dans son comportement ou ses propos pendant l'entretien. Le médecin était familier de ce lieu et des gens qui le fréquentaient : nous suivions là les principes de Stéphane Beaud qui recommande de réaliser les entretiens o les enquêtés se sentent comme chez eux . (41) Notre position en tant que médecin et interviewer nous apparat plutôt comme un avantage car il permet de créer une certaine complicité et un cadre commun de référence : ce fut par 55 exemple le cas lorsque des médecins faisaient appel à notre propre expérience pour valider leurs affirmations. En revanche, nous avons dans notre échantillon des médecins avec lesquels nous avions un degré de proximité variable. Sans qu'aucun des praticiens puisse être considéré comme un proche, certains médecins nous étaient parfaitement inconnus tandis que nous avions pu en remplacer certains autres ou les connatre dans le cadre de nos études : nous avons conscience que la proximité avec les sujets peut influer sur leur liberté de parole, tant dans le sens de favoriser l'expression du médecin que de l'inhiber. Cette différence d'intimité avec les praticiens peut constituer un biais. Nous prenons en compte également le fait que tout entretien de ce type est influencé en partie par le chercheur qui agit par ses questions sur l'interviewé et réagit avec ses propres représentations aux propos de celui-ci. On a donc un dialogue qui s'instaure. Les propos donc par la suite les connaissances qui en découlent sont le fruit de cette interaction. Ce biais est inhérent à la recherche qualitative avec entretiens semi-directifs. (41) Néanmoins, nous avons essayé de mettre de côté notre opinion lors de ces échanges afin de favoriser l'expression la plus libre des interviewés. Le fait que nous nous intéressions à un sujet peu connu a priori des médecins au départ (la plupart n'avait eu l'information que par les médias généralistes et seul un médecin avait lu le rapport de l'IGAS) pouvait inhiber certains d'entre eux : deux des praticiens ont regretté de ne pas être plus renseignés et ont exprimé leur crainte d'énoncer des idées fausses par rapport à la connaissance qu'ils nous prêtaient. Enfin, notre sujet touche à l'actualité : ce thème a été abordé à plusieurs reprises dans les médias depuis un an. De fait, les médecins interrogés en septembre avaient eu la possibilité d'obtenir plus d'informations ou en tout cas d'être plus amenés à y réfléchir que ceux interrogés en mai. Aucune précision décisive sur les modalités d'application du projet ministériel ou de travaux sur ce thème n'ont toutefois été communiqués entre mai et septembre donc nous pensons que l'influence de ce biais est limité. IV. 2. f) Exploitation des données Ayant peu d'expérience dans la pratique de l'encodage, nous avons privilégié une technique linéaire ouverte qui nous a permis de ne négliger aucun aspect des témoignages recueillis. Le fait de reprendre régulièrement les codes précédemment créés après avoir encodé d'autres entretiens nous a permis d'harmoniser progressivement les codes et de faire surgir des thématiques récurrentes traversant les différentes interviews. Nous avons pu ainsi voir émerger des concepts d'analyse qui ont constitué les thèmes décrits dans la partie résultat. Nous appliquions ainsi les principes de la théorie ancrée. (40) Par ailleurs, ce thème pouvait donner lieu à des propos soumis à un certain degré d'interprétation, en fonction des représentations de celui qui les encode. Pour diminuer ce risque de biais d'interprétation des propos, nous avons utilisé la technique de triangulation des chercheurs, ce qui renforce la crédibilité des données que l'on a extraites, en faisant réaliser un deuxième codage, en parallèle du nôtre, par une tierce personne et en les confrontant. (42) 56 IV. 3) Discussion des questions de recherche : représentations des médecins et confrontation aux données de la science IV. 3. a) Des représentations du tiers payant témoins de l'ambivalence de la profession autour du caractère libéral Deux aspects négatifs notés par les médecins ont un rapport avec l'attachement aux valeurs libérales : la perte de la caractéristique symbolique portée par le paiement direct du patient et la crainte d'une mise sous la coupe des financeurs impactant la liberté de prescription. Le premier aspect n'est partagé que par quelques médecins : il rappelle l'argumentaire cité plus haut du président de la CSMF et constitue un retour aux fondamentaux de l'affirmation de la médecine libérale française. L'argumentation d'inspiration psychanalytique consistant à dire que le paiement participe à l'efficacité de la prise en charge du patient (43) n'a pas été avancé par les praticiens et a même été écarté par d'autres. Seul un médecin a insisté de façon notable sur l'importance que ça avait pour le patient. Cette portée symbolique attribuée par certains médecins au paiement direct semble être une particularité en lien direct avec la manière dont s'est construite l'identité libérale des médecins français. Il est intéressant de remarquer que dans les rares situations o cette question est débattue dans les pays comparables à la France, la fonction symbolique du paiement pour honorer le praticien n'apparat pas du tout dans les argumentaires des syndicats qui sont contre le tiers payant. Ainsi, en Allemagne, en 2006, quelques organisations de médecins avaient réclamé son abolition dans le cadre de mobilisations contre l'Etat portant sur leur niveau de rémunération : leur grief contre le tiers payant était uniquement sa responsabilité dans la faiblesse de leurs revenus car il limitait la liberté tarifaire revendiquée. (44) En Suisse qui, comme on l'a vu, a un système de tiers garant avec remboursement du patient avant qu'il ait réellement payé le médecin, les défenseurs de ce système luttant contre la généralisation du tiers payant font appel à des raisons beaucoup plus prosaïques de protection des données vis-à-vis des caisses mais n'évoquent absolument pas que c'est, pour eux, un moyen de se sentir honoré en tant que professionnel. (45) A l'inverse, certains praticiens nient au paiement direct une utilité dans la relation médecin patient. Il peut même parasiter la relation voulue par le médecin autour d'objectifs centrés sur le patient, l'alliance thérapeutique étant remplacée par une relation commerciale. Cette perception du paiement direct comme responsable d'une influence sur l'attitude du médecin et notamment son acte de prescription est bien mis en évidence par les observations comparées de consultations entre des médecins néerlandais et français. On y observe le caractère dominant du patient à la fin de la consultation en France qui semble échanger son paiement contre la satisfaction de ce qu'il est venu chercher, par exemple une ordonnance. Ceci est une des explications avancées pour expliquer la plus grande fréquence de prescription de médicaments souvent inutiles par les médecins français par rapport aux médecins des autres pays. (46) Le deuxième argument de la mise sous la coupe des financeurs revient de façon assez fréquente chez les médecins opposés à la généralisation du tiers payant. C'est un des points souvent avancés également durant l'histoire des rapports entre les médecins et l'État. A l'inverse, d'autres médecins soulignent que ce rapport d'inféodation à la Sécurité Sociale est déjà effectif et jugé comme légitime du fait que de la socialisation des revenus des 57 médecins. Cet aspect avait en effet été noté comme un tournant majeur dans l'évolution de la médecine libérale (cf. partie théorique II. 2. ). Les causes de la crainte envers cette dépendance ne sont pas bien explicitées par les médecins au travers des entretiens. Seule la peur d'une perte d'autonomie dans la prescription est avancée par certains qui voient, de ce fait, une remise en cause d'un autre aspect de base de la médecine libérale. On peut étudier ce point sous deux angles. Tout d'abord, cette crainte peut être considérée comme relevant plus du fantasme et des projections négatives que peuvent avoir, en général, les médecins envers la Sécurité Sociale. On peut alors noter ce constat, fait dans l'enquête 50 ans d'exercice de la médecine en France par Herzlich en 1993, cité par G. Bloy (47). Les médecins qui avaient connu le tournant majeur qu'a représenté le conventionnement en 1960 ont été interrogés sur leur vision de ce changement de façon rétrospective. La plupart estimait dans cette enquête que cela n'avait pas modifié leur indépendance, ni leur relation avec la patientèle, à l'inverse des craintes vivaces exprimées à l'annonce de ce changement et basées également sur l'attachement à l'autonomie de la profession. Néanmoins, les recommandations de bonnes pratiques et leur utilisation envers les médecins via les rémunérations forfaitaires type Rémunérations sur Objectifs de Santé Publique (ROSP) peuvent faire penser que la crainte d'une pression sur la prescription des organismes payeurs est plus légitime actuellement. On peut alors s'interroger sur cette crainte. En quoi un contrôle des actes de prescription par les organismes payeurs posent-ils un problème si les objectifs de ces organismes sont les mêmes que ceux des médecins : la bonne santé des patients ? Le thème est peu abordé par les médecins de l'échantillon. Mais on perçoit chez certains une défiance vis-à-vis de la légitimité des organismes payeurs, remis en cause sur l'indépendance réelle de leurs recommandations de prescription, actuelles pour la Sécurité Sociale, ou supposées pour les assureurs privés. Ces deux financeurs pourraient être influencés par d'autres facteurs, à commencer par les objectifs économiques, et donc privilégier certains comportements de prescription de la part des médecins allant à l'encontre de l'intérêt des patients. Les médecins se voient ainsi placés dans une situation de conflit d'intérêt entre le choix de leur rémunération ou les intérêts du patient. Cette remise en cause par certains médecins de la Sécurité Sociale comme un organisme ayant pour objectif l'amélioration de la qualité des soins pour les patients a bien été mise en évidence lors des travaux autour de la perception des ROSP. Un tiers des médecins pensent en effet que les objectifs fixées pour ces rémunérations n'ont pas pour but d'améliorer la prise en charge des patients alors que plus de huit médecins sur dix pensent que ces objectifs ont pour vocation de faire réaliser des économies à l'assurance maladie. (48) Cette opposition de points de vue entre certains médecins à l'intérieur de ce panel témoigne de la dualité traversant les généralistes libéraux. Elle est sous tendue par l'attachement persistant aux principes libéraux originels alors que la réalité d'une médecine vraiment libérale actuellement peut être contestée, au moins du fait de son conventionnement. Il est même évoqué parfois le thème de fiction libérale par certains chercheurs (47) pour qui la réalité du caractère libéral de la médecine de ville, y compris à ses origines, ne résiste pas à sa confrontation aux principes du libéralisme au sens complet du terme, comme le souligne G. Bloy : fondée sur un monopole d'exercice, financé sur des prélèvements obligatoires, s'auto-régulant entre autres moyens par des clauses anti-concurrentielles, le libéralisme économique de la profession médicale a une allure très singulière. (49) 58 IV. 3. b) Des représentations négatives au niveau pratique et technique Le versant négatif de ces aspects est très présent dans les entretiens et c'est un des points qui peuvent être cités par les médecins favorables comme défavorables à la généralisation du tiers payant. Les aspects positifs (facilité de gestion et de traitement des paiements des patients) sont au contraire peu mis en avant par les médecins. La crainte, au moins d'une surcharge de travail, au pire d'un surcoût, est basée sur les expériences de pratique actuelle du tiers payant par les médecins. La gestion du paiement par les complémentaires est à l'origine de vraies craintes des médecins qui n'ont jamais tenté d'utiliser le tiers payant AMC, très majoritaires mais aussi des médecins qui en ont eu l'occasion. Il faut toutefois noter que ces derniers se basent sur une expérience actuelle alors qu'aucun dispositif n'avait été mis en place entre les différents acteurs. Le rapport de l'IGAS (1) privilégie actuellement la solution redoutée par les médecins dit d'éclatement des flux AMO et AMC, c'est-à-dire que le médecin aurait à émettre une information par télétransmission à l'AMO comme actuellement et une information à l'AMC. Les aménagements proposés par l'IGAS (1 et annexe IV) pour diminuer la surcharge de travail et le risqued'impayés pour les médecins sont : le rassemblement des multiples organismes de complémentaires en plusieurs opérateurs de tiers payant, délégataires des organismes de complémentaires et qui assurent le paiement aux médecins. C'est ce qui est en train de se développer, d'après la mission de l'IGAS, à l'le de la Réunion o le tiers payant généralisé est déjà institué et ça permettrait de réduire considérablement le nombre d'interlocuteurs pour les médecins. la détermination d'un délai maximal de paiement des médecins comme cela a été mis en place pour le paiement des médecins par les AMO et comme c'est le cas pour le paiement des assurés par les AMO et les AMC. la mise en place à terme de dispositifs de consultation des droits en ligne, plus sûrs pour réduire le risque lié aux cartes que les patients présentent comme n'étant pas à jour alors qu'ils ne bénéficient pas de droits ouverts effectifs. Ces mesures semblent en effet bien répondre aux craintes exprimées par les médecins du panel : délais prolongés de paiement, multiplicité des interlocuteurs, impayés en cas d'assurés pas à jour de leurs droits. Les médecins n'ont pas eu accès aux mesures proposées par l'IGAS car seul un médecin avait lu le rapport. On peut noter que bien qu'il soit contre la généralisation du tiers payant, il n'a pas cité l'argument technique dans les aspects défavorables. Mais les syndicats ne semblent pas rassurés pour autant puisque le seul à être favorable au projet de réforme en théorie (MG-France) revendique l'organisation du paiement avec un interlocuteur unique : il est intéressant de noter que cette idée est également réclamée par la seule médecin qui a tenté de réaliser du tiers payant intégral en suivant le cheminement des télétransmissions et des paiements. On peut enfin remarquer qu'aucun médecin du panel ne souligne que les différents organismes payeurs sont moins susceptibles d'être insolvables que les patients, comme le fait l'IGAS dans son rapport : on peut sans doute en conclure que les médecins du panel ne souffrent pas de chèques impayés de la part de leurs patients. 59 IV. 3. c) Des représentations favorables rejoignant les attentes de l'IGAS et un aspect novateur soulevé Deux points positifs cités par les médecins sont également notés dans le rapport de l'IGAS (1) en plus de la facilitation d'accès aux soins : la possible réorientation vers les médecins généralistes de patients consultant aux urgences en première intention à cause de la dispense d'avance de frais. la meilleure identification du montant du dépassement d'honoraire par le patient lorsqu'il n'aura plus que cette partie à régler lors des consultations. Néanmoins, le rapport de l'IGAS préconise que les dépassements pris en charge par les complémentaires puissent être soumis aussi au tiers-payant, ce qui atténuerait cet aspect. Un autre aspect favorable a été évoqué par trois médecins et n'a pas été cité dans le rapport de l'IGAS : deux d'entre eux ont concédé coter des actes en tiers payant AMO alors qu'ils ne relèvent pas de l'ALD et un troisième a évoqué la difficulté que ça pouvait représenter lors des consultations pour faire comprendre cette distinction aux patients. Nous n'avons pas réussi à déterminer si ce phénomène avait pu être évalué par la CNAM. S'il est assez répandu (et notre expérience du terrain semble nous indiquer qu'il n'est pas négligeable), ce peut être une source d'économie inattendue, avec une réorientation du coût de ces consultations vers l'AMO et l'AMC qui doit participer à la prise en charge de ces consultations et s'en retrouve épargnée par ce phénomène. IV. 3. d) Des représentations négatives évidentes mais contestables : le thème inflationniste Il est intéressant de noter l'absence globale de référence à des travaux scientifiques dans l'argumentation de chacun des médecins du panel : seul un y fait référence tandis que quelques uns déplorent l'absence d'études sur certains thèmes ou au moins leur méconnaissance de ces travaux. Au contraire, la connaissance conclue à partir de la perception de sa pratique ou l'idée évidente sont convoquées par les médecins très fréquemment pour appuyer leurs propos. Nous sommes là dans le champ de la représentation sociale dans ce qu'elle s'oppose à la connaissance étayée scientifiquement. (50) L'évocation des aspects négatifs est livrée de façon complète et exclusive lors de la question portant sur ce point. A l'inverse, les aspects positifs sont évoqués autant lors de la question du guide d'entretien qui interroge sur cet aspect que de façon diffuse au cours de l'interview, lors de la réflexion sur d'autres thèmes : tout se passe comme si l'évocation d'arguments contre la généralisation du tiers payant était plus immédiate que celle d'arguments pour. Le thème inflationniste fait partie de ces représentations négatives très souvent évoquées par les médecins du panel. On peut noter que dans la thèse de B. Caucat, les trois quart des médecins interrogés pensaient également que le tiers payant entranait un abus de consommation de soins. (35) L'argument est soit présenté de façon indubitable, soit appuyé par l'exemple de la population CMU qui aurait un comportement de surconsommation établi, lié à l'absence d'avance des frais. Cette perception des médecins du panel rejoint également l'opinion fréquemment rencontrée parmi le corps médical dans son ensemble (médecins et dentistes) sur les patients bénéficiaires de la CMU et qui participe à leur stigmatisation. (51) Différentes études des consommations de soins des patients CMU ou bénéficiaires de l'aide médicale 60 départementale ont été réalisées dans plusieurs CPAM. (35, 52) A répartition d'âge et de sexe comparables, on constate schématiquement que les patients CMU consomment plus de soins que les patients non CMU mais que le montant des dépenses moyennes est équivalent car : les patients CMU ont recours plus fréquemment aux généralistes (comme souvent pour les patients en situation précaire chez qui le médecin généraliste constitue la porte d'entrée dans le système de santé) mais plus rarement aux spécialistes et aux actes de biologie. le nombre de soins dentaires est plus élevé mais le coût de ces soins est inférieur. A l'instar de ce qui a été décrit dans la première partie sur les liens entre précarité et état de santé, cet accès plus fréquent aux médecins généralistes doit tenir compte du fait que les patients bénéficiaires de la CMU, plus précaires ou avec des revenus plus faibles que ceux qui n'y sont pas, ont globalement un état de santé plus dégradé que le reste de la population à âge égal : ils se déclarent en moins bonne santé, ont plus de troubles du sommeil avec retentissement dans la vie quotidienne, fument plus, souffrent plus d'obésité. (53) Le recours plus élevé au généraliste trouve là une explication qui n'est pas celle d'une surconsommation illégitime. La stigmatisation des patients CMU ne se limitent aux comportements de consommation de soins : irrespect des heures de rendez-vous, exigences particulières, complaisance dans un système qui serait de l'assistanat. Plusieurs des principaux reproches formulés contre les patients bénéficiaires de la CMU ont pour origine la dispense d'avance des frais qui expliquerait ou favoriserait ces attitudes d'après les médecins. Certains médecins du panel reprennent également ces idées. Mais une étude qualitative des représentations des médecins sur les patients CMU a permis de montrer que la description de ces comportements n'est pas confirmée quand les médecins sont interrogés sur leurs propres patients bénéficiaires de la CMU. (54) Un des bénéfices secondaires que l'on peut espérer de la généralisation du tiers payant est l'abolition de la segmentation entre des catégories de patients qui payent et d'autres qui ne payent pas, ce qui pourrait diminuer la stigmatisation des patients bénéficiaires de la CMU. Un médecin du panel soulignait la difficulté que constituait, pour lui, le fait de proposer le tiers payant partiel, en raison de sa crainte de stigmatiser le patient par cet acte. Par ailleurs, concernant l'effet prétendu inflationniste du tiers payant, une étude du CREDES, réalisée en 2001 (55), a examiné l'influence du recours au tiers payant sur le coût des ordonnances et le nombre de consultations en médecine générale. Ce travail permet de rappeler quelques éléments qui semblent primordiaux. La notion de surconsommation de soins est à manier avec précaution : la définition dans l'absolue de la surconsommation est l'excédent de consommation de soins qui n'est pas nécessaire au maintien d'un bon état de santé. Ceci implique donc la détermination d'une consommation de soins moyenne nécessaire. On voit bien là toute la difficulté pour déterminer une telle valeur. Doit-elle être confiée aux médecins, aux économistes, à des experts ? La consultation pour une rhinopharynite ou une gatro-entérite aige est-elle vraiment utile ? Quelle est la consommation de soins nécessaire et suffisante à titre préventif ? L'idée des chercheurs du CREDES n'est donc pas de comparer la consommation de soins de gens utilisant le tiers payant et de gens ne l'utilisant pas par rapport à cette valeur indéterminée mais par rapport à une moyenne de consommation dans la population, sans préjuger si cette consommation est nécessaire et suffisante pour maintenir un bon état de santé. C'est ce que les médecins qui croient à un effet inflationniste du tiers payant veulent signifier pour leurs patients CMU : un recours aux médecins, à des traitements ou des examens plus fréquent que la moyenne de leurs patients qui n'en bénéficient pas. 61 Or, les constations faites lors de cette étude montrent deux choses : en l'absence de tiers payant, il y a un effet négatif du revenu sur la consommation de soins : les gens à bas revenus qui n'utilisent pas le tiers payant consomment moins de soins par rapport à la consommation moyenne. Il en est de même pour les gens qui l'utilisent faiblement mais de façon moins intense. En revanche, l'effet revenu disparat complètement pour ceux qui utilisent fréquemment le tiers payant. Le tiers payant tend à rapprocher la dépense des assurés les plus pauvres vers la consommation de soins moyenne de l'ensemble des gens. C'est ce qu'on appelle le rattrapage de soins qui est un des objectifs de la généralisation du tiers payant, présenté par la ministre et évoqué par les médecins du panel quand ils parlent de facilitation de l'accès aux soins. en revanche, aucune différence significative de consommation par rapport à cette consommation moyenne n'est mise en évidence entre les gens utilisant le tiers payant et ceux ne l'utilisant pas ou peu. Le tiers payant est donc considéré comme une mesure socialement juste car elle permet une consommation de soins des ménages les plus pauvres se rapprochant de celle des ménages les plus aisés sans entraner une surconsommation pour autant. IV. 3. e) Des représentations négatives évidentes mais contestables : le thème de la déresponsabilisation La notion qui préside fréquemment chez les médecins du panel pour expliquer le comportement des patients CMU et également le risque inflationniste prétendu du tiers payant est celle de la déresponsabilisation du patient en lien avec l'absence d'avance des frais. Il est intéressant de noter à propos de cette notion quelques remarques. Ce concept de responsabilisation financière de l'assuré par l'avance des frais ou par les mesures instituées de franchises ou ticket modérateur est développé depuis que les politiques publiques ont eu le souci de la matrise des dépenses de santé. Il est basé sur un principe assurantiel dont les économistes contestent de plus en plus la validité lors de son application tel quel au domaine de la santé : c'est l'aléa moral ou risque moral . Le fait d'être couvert contre un risque peut conduire un sujet à modifier son comportement à l'égard de ce risque de deux façons : (56) soit en prenant moins de précautions : dans le domaine de la santé, ce risque est logiquement décrit comme faible. Par exemple, il parat en effet peu raisonnable d'imaginer qu'un patient augmente volontairement son tabagisme car il se sait bien couvert par son assurance en cas de développement d'un cancer du poumon. soit en dépensant plus pour réparer le dommage ou pour le prévenir. En économie de la santé, il est rattaché à deux facteurs : la satisfaction que peut retirer le patient de cette consommation de soins en elle-même mais aussi l'induction de consommation que peut avoir intérêt à proposer à son patient le médecin qui en retire un bénéfice personnel également. Ce risque d'induction par le médecin est d'autant plus grand que celui-ci possède un ascendant sur le patient de par sa connaissance : il y a asymétrie d'information entre le médecin détenant le savoir et le patient. Certains chercheurs considèrent ainsi que responsabiliser les patients par la voie financière est inefficace, quand les prestataires, bénéficiant de l'asymétrie d'information, sont en position d'induire la demande de soins (Anne Laude, 57). Enfin, on peut remarquer que l'OCDE, qui a pourtant promues, dans les années 80 et 90, les politiques de responsabilisation financière des assurés, les a jugées, en 2004, finalement contre-productives car elles reportaient l'accès aux soins pour les plus démunis et 62 entranaient un surcoût quand ces patients sont pris en charge à un stade plus avancé de leurs pathologies. (58) Le tiers payant pourrait-il permettre alors des économies à moyen terme plutôt que creuser les déficits ? Si l'on revient aux propos des médecins de notre panel, on se rend compte combien cette responsabilité de surconsommation est partagée. Une partie des médecins ne voit dans ce comportement qu'un abus du patient qui retirerait une satisfaction à consommer des soins inutiles et met en avant la déresponsabilisation du patient par le tiers payant. Ils ne citent pas ou rarement le risque que le médecin peut lui aussi induire cette consommation et certains avouent voir un intérêt dans cette augmentation des consultations par l'accroissement de revenus qu'elle va entraner. Une autre partie des praticiens, au contraire, cite le risque d'induction par le médecin et surtout préconise une éducation du patient pour éviter la consommation de soins inutiles. On peut remarquer que parmi ces médecins, tous sauf un ont des points communs : médecins engagés au niveau associatif ou professionnel dans l'accès aux soins de tous avec parfois activité centrée sur des populations fragilisées et tentative d'éliminer le rapport au paiement de la consultation. Cette prise de responsabilité dans la dépense induite par leurs prescriptions et dans le rôle éducationnel du médecin n'est pas sans rappeler les aspects que l'on retrouve chez le groupe intitulé petits prescripteurs analysé par Anne Vega en 2011. (59) IV. 4. Discussion des questions de recherche : les pratiques du tiers payant Ce travail a permis de montrer de façon assez précise les manières très diverses que les médecins ont d'utiliser le tiers payant d'après leurs dires. On peut souligner dans ces pratiques que : Tous les médecins sans exception disent appliquer le tiers payant aux patients CMU, ce qui correspond à ce que montre la plupart des études témoignant de la rareté du refus de soins ou apparenté (le refus d'appliquer le tiers payant doit être considéré comme tel) chez les médecins généralistes. (51) Ce constat est souvent assimilé au fait que le médecin généraliste est le médecin de premier recours, rendant un refus de soins particulièrement délicat. Il semble que, dans le panel, les médecins qui disent avoir peu de patients CMU ne voient pas l'intérêt de cette réforme alors que ceux qui ont des populations plus précaires y sont plus favorables. Il aurait donc peut-être été intéressant de rajouter une question sur la proportion de patients CMU qu'ils ont dans leur patientèle pour essayer de mettre en évidence un éventuelle tendance entre le fait d'avoir une forte proportion de patients CMU et une opinion favorable envers la généralisation du tiers payant. Si elle devait apparatre, elle nécessiterait un travail quantitatif pour être alors confirmée. Nous avons été surpris par la proportion de médecins n'utilisant pas systématiquement le tiers payant pour les patients en ALD. L'utilisation uniquement pour les patients dans l'incapacité physique ou psychique de payer par un médecin témoigne du détournement pragmatique par ce médecin d'une mesure destinée à la base à aider les patients. Le fait que le tiers payant généralisé puisse être laissé au bon vouloir du médecin pourrait aboutir à une telle situation. 63 On peut remarquer que la position actuelle du médecin traitant vis-à-vis de l'application du tiers payant aux patients en ALD ou du tiers payant partiel en fonction de l'estimation de la situation financière peut être jugée comme assez inconfortable. Cela ne semble pas poser de problème à la plupart des médecins du panel, certains arguant que leur position de médecin de famille leur permet de fait de connatre la situation économique et de précarité d'un foyer. Pourtant, dans le travail de B. Girard (60), quinze médecins généralistes de ville ont eu chacun à évaluer dix patients appartenant à leur patientèle depuis deux ans sur une échelle allant de 0 à 100 dite de vulnérabilité sociale. La valeur attribuée était ensuite comparée à celle donnée par le score dit EPICES (Evaluation de Précarité et d'Inégalité de santé pour les Centres d'Examen de Santé allant de 0 pas de précarité à 100 précarité maximale) dont on a démontré la spécificité et la sensibilité dans le repérage des patients en situation de précarité. L'écart moyen entre le score donné par les médecins et le score EPICES était de presque 30 points et dans pour près de 60 % des patients, les médecins faisaient une erreur d'au moins 20 points. Même si ce travail comporte quelques limites (taille de l'échantillon), il semble indiquer que l'évaluation intuitive du médecin généraliste sur la précarité de ses patients est moins juste que ce que certains médecins de notre panel semblent croire. Le pragmatisme et la volonté de réduire la barrière financière est néanmoins de rigueur, parmi les médecins rencontrés, puisqu'ils acceptent le plus souvent la demande de tiers payant partiel par le patient quand elle est exprimée. Mais on a vu que ce n'était pas le cas de tous les médecins puisque deux le refusent. Et on peut supposer que tous les patients ne l'expriment pas, soit parce qu'ils ne savent pas que c'est possible, soit parce qu'ils n'osent pas le demander. Par ailleurs, le témoignage de la gêne exprimée par le docteur 6 à proposer le tiers payant de peur que les patient se sentent stigmatisés est également une limite qui témoigne des difficultés que la situation actuelle génère. Au travers de l'utilisation du tiers payant partiel mais aussi du report d'encaissement de chèque ou de la réalisation d'actes gratuits, on perçoit la volonté des médecins généralistes de s'adapter encore à la situation de leurs patients avec pour objectif de réduire au maximum la barrière de l'accès aux soins pour raisons financières. Ils confirment là encore leur rôle de premier recours, indissociable de leur profession. Il est également intéressant de noter qu'outre les contingences pratiques (accord des caisses, facilité d'application. etc), deux autres facteurs, qui sont en fait corrélés, semblent jouer un rôle dans l'utilisation fréquente du tiers payant : le fait de travailler ou d'avoir pris la suite d'un médecin qui l'utilisait lui-même et les habitudes d'utilisation des patients. Pour deux des médecins qui évoquent ce facteur, il semble toutefois réducteur de croire que c'est ce fait qui les a conduits à l'utiliser. Ils ont tous les deux une volonté affirmée d'être accessible au plus grand nombre et de prendre en charge des populations fragiles. On peut penser que c'est plutôt l'inverse qui s'est produit : ils ont pris la suite de médecins qui avaient une activité façonnée ainsi parce qu'ils avaient une affinité pour l'exercice pratiqué par ces médecins. 64 IV. 5. Discussion des questions de recherche : les propositions pour la facilitation de l'accès aux soins et la place du mode de rémunération IV. 5. a) Des propositions cohérentes pour la plupart Il est intéressant de constater que pour un certain nombre de médecins du panel, il n'y a pas de problème d'accès aux soins en France. On peut remarquer que certains de ces médecins pouvaient se positionner ainsi dans un premier temps puis évoquer, sans s'en rendre compte par la suite, des problématiques d'accès aux soins, que ce soit vis à vis des spécialistes, de l'optique ou des soins dentaires ou du maillage géographique. Il semble que ces médecins n'aient pas compris toutes les dimensions que recouvre cette expression ou aient réagi uniquement par le prisme de leur pratique personnelle. On peut néanmoins s'étonner qu'autant de médecins ne perçoivent pas les enjeux de cette question. Les problèmes soulevés par les praticiens du panel sur l'accès aux soins sont également souvent en lien avec l'expérience acquise au contact des patients. Ceci permet d'expliquer que peu d'entre eux soient en capacité d'évoquer les problématiques liées à des populations qu'ils ne connaissent pas ou qu'ils voient peu dans les cabinets de médecine de ville : patients immigrés arrivés depuis peu ou patients très précaires. Néanmoins, les différentes questions soulevées par les propositions des médecins permettent en effet de dresser un tableau assez complet des difficultés d'accès aux soins en France pour les publics qui consultent en médecine de ville. Ainsi, les problèmes d'accès aux soins dentaires (10 % de patients ayant dû renoncer en 2008) et optiques (4%) sont souvent cités par les patients comme une de leurs difficultés principales (28) et font l'objet de tentatives de matrises des coûts par les pouvoirs publics, à défaut d'une meilleure prise en charge par l'AMO. Les dépassements d'honoraires ont fait l'objet d'une tentative de régulation lors de la convention de 2012 mais elle a été jugée souvent comme trop timide par les associations de défense des patients. Ces contrats proposent en effet le gel de l'augmentation des tarifs et du taux de consultations avec dépassements mais ne prévoient aucune diminution par rapport à la situation de 2012. Ainsi, UFC Que choisir réclame un plafonnement des dépassements à 40% du tarif opposable et une fermeture de l'accès au secteur II. Avec le CISS, ils préconisent une revalorisation des actes médicaux permettant l'abolition totale à terme de ces dépassements. (38, 61) La répartition des médecins sur le territoire constitue une source d'inquiétude chez les médecins du panel comme pour les patients et les pouvoirs publics même si les praticiens de l'échantillon évoquent plutôt spécifiquement celle des spécialistes : certains sont confrontés à des difficultés pour leur propre patientèle qui influent sur la prise en charge des assurés et sur leurs pratiques de médecin. Le ciblage de certaines populations ayant des problèmes d'accès aux soins est parfois évoqué par les médecins du panel avec pour certains l'impression que des patients devraient bénéficier de la CMU alors que les seuils fixés ne le permettent pas : l'élévation des seuils d'attribution, notamment au niveau de l'Allocation Adulte Handicapé, est souvent une revendication des associations comme Médecins du Monde, tout comme l'abolition des franchises et autres forfaits, réclamés aussi par un médecin du panel. (26) Enfin, les médecins ont insisté sur la nécessité de développer les actes de prévention et d'éducation à la santé, notamment auprès des publics qui ne consultent pas. On peut dans ce domaine s'accorder sur l'ambivalence des pouvoirs publics. Ces derniers reconnaissent régulièrement l'utilité pour les patients et à terme pour la matrise des dépenses de santé de telles priorités. Ils les mettent en place via des campagnes de sensibilisation ou le 65 développement de certains axes comme l'éducation thérapeutique, le dépistage de certaines pathologies, la mise en place des centres d'examen de santé (CES). Mais, dans le même temps, les centres de protection médicale infantile (PMI), de médecine du travail ou de médecine scolaire souffrent d'une pénurie de moyens de plus en plus marquée pour remplir des missions dont le cœur est précisément la prévention. (34) On peut, en revanche, s'étonner des propositions du docteur 13 qui répond à notre question sur l'accès aux soins par une augmentation du tarif de la consultation de médecine générale, dont une partie pourrait ne pas être remboursable si les mutuelles refusent de la prendre en charge. Nous ne sommes pas parvenus à comprendre la logique qui présidait à cette réponse plutôt inattendue, si ce n'est la volonté de délivrer un message qui fait partie d'un des mots d'ordre du syndicat de l'UFML auquel il appartient. IV. 5. b) La place du mode de rémunération Les médecins ont, de façon générale, peu lié spontanément les problématiques d'accès aux soins aux changements du mode de rémunération. Seul un médecin, le docteur 6, a cité le modèle de la maison de santé pluridisciplinaire avec une rémunération des médecins à la capitation (expérience acquise en Belgique d'o il est originaire) comme permettant de répondre complètement à tous les aspects qu'engage la question de l'accès aux soins. On peut conclure peut-être de cette absence de connexion faite entre accès aux soins et mode de rémunération des médecins que ceux-ci ont des difficultés à sortir du mode de raisonnement du paiement à l'acte qui constitue en effet un des socles de l'exercice de la médecine libérale en France. Ainsi, en 2007, six médecins sur dix se déclaraient satisfaits de ce mode de rémunération. (62) Ceci est d'autant plus intéressant que les médecins ont, dans le même temps, une position très partagée sur les autres modes de rétribution qui remettent en question de fait le principe du paiement à l'acte et le caractère libéral de l'activité. Les rémunérations aux forfaits déjà mises en place paraissent perturber la grille de lecture habituelle avec laquelle les médecins de notre échantillon perçoivent leur rémunération : des médecins qui semblent attachés à l'identité libérale peuvent y être favorables ou leur reconnatre des aspects positifs alors qu'un médecin qui se décrit de façon non péjorative comme déjà salarié de la Sécurité Sociale les jugent au contraire néfastes. Ce dernier semble pourtant moins ambivalent que les premiers. Médecin qui se déclare de gauche dans l'entretien, avec un profil d'activité orienté vers des populations fragiles et cherchant à abaisser la barrière financière au maximum, il formule une critique des rémunérations à la performance en santé centré sur l'intérêt de la collectivité (coût pour la Sécurité Sociale qui est en effet pointé du doigt en Angleterre depuis son instauration) et du patient (risque d'exclusion d'une patientèle lourde qui a été également décrit en Angleterre : c'est le phénomène de gaming). (63) L'évocation de systèmes de rétribution comme le salariat ou le paiement à la capitation, mal connus par les médecins du panel, a donné lieu surtout à l'expression d'une critique du paiement à l'acte. Certains médecins semblaient comme partagés entre leur attachement à ce mode de paiement, associé au caractère libéral de leur profession et les aspects négatifs qu'ils constatent pour eux, en terme de conditions de travail, et plus rarement pour leurs patients, en terme de rationalité des soins. Les principales critiques du paiement à l'acte évoquées par les médecins du panel quant à la qualité des soins témoignent d'une réalité économique établie : le caractère inflationniste du paiement à l'acte par l'induction de consultations non nécessaires pour le patient ou de 66 surprescriptions afin de fidéliser la patientèle. Ceci a pu être constatée lors d'études sur les comportements des médecins en cas de variations marquées de la densité médicale locale. (64) On peut toutefois remarquer que ces travaux témoignent de phénomènes ayant lieu dans les années 1990-début des années 2000. Les problématiques de répartition des médecins sur le territoire étaient différentes de celles actuelles et la réforme du médecin traitant, qui incite le patient à consulter toujours le même médecin, n'avait pas encore été mise en place. (65) Les représentations plutôt positives des médecins de notre échantillon sur les autres moyens de rémunération semblent correspondre aux observations réalisées dans des études sur ce sujet : en 2007, 60 % des médecins étaient prêts à accueillir favorablement de nouveaux moyens de rémunération. 46, 5% accepteraient de voir une partie de leur activité salariée. (62) On peut remarquer dans cette étude que les médecins du quart plus âgé sont plus nombreux de neuf points par rapport au quart plus jeune à se considérer satisfaits par la rémunération à l'acte et, à l'inverse 43 % des médecins les plus âgés seraient enclins à avoir une partie de leur activité salariée contre 51 % chez les plus jeunes. Dans notre échantillon, la perception favorable du revenu à la capitation ou du salariat n'était en effet pas que le fait des médecins les plus jeunes. Ces différences assez modérées de perception entre médecins âgés et jeunes vont peut-être à l'encontre de l'idée préconçue que les praticiens âgés sont beaucoup plus réfractaires que leurs confrères plus jeunes aux autres modes de rémunération. Dans cette même étude, la proposition de l'introduction d'une rémunération aux forfaits divise les médecins en deux groupes de taille égale. (62) Cet accueil plutôt favorable aux rémunérations par forfait peut s'expliquer par la teneur des missions nouvellement assignées au médecin généraliste : les tâches de prévention et de coordination s'accordent mal à une rétribution à l'acte. Ainsi, il a été mis en évidence que les médecins placent majoritairement le manque de temps et l'inadéquation de la rémunération à l'origine de l'insatisfaction ressentie dans les tâches de prévention. (66) Certains revendiquent ainsi la création d'un acte de consultation de prévention dédiée et rémunérée (67), ce qu'un médecin nous a dit faire en pratique de son propre chef en ayant la sensation d'être en dehors des règles fixées par la Sécurité Sociale. Il ne faut pas voir un fait paradoxal à ce que, dans cette étude (62), les médecins puissent être autant attachés au mode de paiement à l'acte et prêts à accueillir des modes de rémunération différents. La diversité des tâches demandées au médecin généraliste, l'hétérogénéité des médecins dans leurs souhaits (sept profils de médecin voyant de façon différente leur rémunération sont dégagées dans cette étude), les objectifs de matrise des dépenses de santé et de qualité et quantité d'offres de soins semblent concorder vers l'utilisation de modèles mixtes de rémunération. C'est en effet le cas depuis déjà le début des années 2000, dans certains pays développés, en Europe : l'instauration des paiements à la performance pour des médecins payés à la capitation en Angleterre ou l'introduction de forfaits dans le système de paiement à l'acte allemand qui est englobé dans un système à la capitation en sont des exemples. (44, 65) Nous avons également été surpris par la manière dont trois médecins nous ont évoqué spontanément et de façon péjorative l'instant du paiement et ce pour des raisons assez distinctes. Pour l'un d'entre eux, qui présente la particularité d'avoir une expérience de travail à la capitation, c'est le risque de détournement par le paiement de l'objectif d'alliance thérapeutique qu'il a pour son patient : ce thème n'est pas sans rappeler les constatations de l'expérience comparative de Rosman entre médecins français et néerlandais citée plus haut (38). On peut noter que le tiers payant généralisé ne permettrait pas d'abolir ce problème car le rapport décrit entre les médecins et leurs patients est lié à l'avance des frais mais plus encore au paiement à l'acte dans cette expérience. Pour les deux autres 67 médecins de l'échantillon, il relève plus du sentiment de gêne et du rapport à l'argent. Nous ne nous attendions pas à voir surgir cet aspect de la question qui pourrait constituer un point de départ pour un travail qualitatif afin de creuser les représentations associées à ce moment de la consultation en France. 68 Grâce à cette étude qualitative sur un échantillon de médecins généralistes libéraux, nous avons pu étudier les représentations sur la généralisation du tiers payant à l'ensemble de la population. Nous avons ainsi mis en évidence des perceptions négatives liées à des aspects pratiques qui inquiètent les médecins. Mais nous avons également pu observer une défiance face à cette proposition due à la persistance d'un attachement à l'identité libérale de la médecine. Ce lien ne prend pas en compte les changements profonds qui ont été opérés depuis la création de la Sécurité Sociale et leurs implications sur le caractère libéral. L'opposition est également le fait d'une croyance en un mythe inflationniste dont l'invalidité a pourtant été démontrée et en un thème de la responsabilisation financière contestable. Mais ce projet de réforme est également accueilli favorablement par des médecins, plus conscients des problématiques d'accès aux soins et de la réalité du statut des praticiens dans le système de santé. Il a été possible de montrer la diversité des pratiques du tiers payant par les médecins généralistes, pour lesquels le pragmatisme et la volonté de jouer à plein le rôle de premier recours président. Enfin, nous avons abordé les problématiques d'accès aux soins aux yeux des médecins dont la perception est souvent partielle mais en phase avec certains aspects. Cela a débouché sur une interrogation sur le rapport au paiement à l'acte , également source d'antagonismes parmi les médecins. Ceci a permis de mettre en évidence les limites de ce mode de rétribution pour rémunérer certaines fonctions complexes du médecin et permettre d'assurer une qualité de vie pour les médecins, et de soins pour les patients. Ce travail a tenté de mieux cerner le champ des représentations des médecins autour de la généralisation du tiers payant. On peut se demander si ces perceptions se modifieront quand ils seront confrontés à une utilisation au quotidien avec leurs patients : un travail de ce type pourrait permettre d'étudier cette évolution éventuelle, quelques années après sa mise en place. Cette réforme constitue un changement certain dans l'histoire de la médecine en France. Dans le contexte actuel et au vu des évolutions récentes engagées sur les rémunérations des médecins généralistes, on peut se demander si une remise en cause du paiement à l'acte n'aurait pas permis de répondre de façon plus judicieuse à la fois aux questions de l'accès aux soins, de la matrise des dépenses de santé et du rôle spécifique du médecin généraliste dans le système de soins. 69 BIBLIOGRAPHIE 1. Marie E, Roger J (Membres de l'Inspection Générale des Affaires Sociales). Rapport sur le tiers payant pour les consultations de médecine de ville. Paris : La documentation française ; 2014. Rapport nRM2013-143P. 2. Caisse Nationale d'Assurance Maladie (CNAM). Relevés et taux de remboursement [en ligne]. 2014. [visité le 14/05/2014]. Disponible à partir de : rembourse/releve-et-taux-de-remboursement/les-taux-de-remboursement. php. 3. Cardonna J, Daligand L, Delhomme J, Fasquel D. Sécurité Sociale. 6ème éd. Paris : Elsevier/Masson ; 2012. 30-33. 4. Caisse Nationale d'Assurance Maladie (CNAM). Ce qui reste à votre charge [en ligne]. 2014. [visité le 14/05/2014]. Disponible à partir de : 5. Baubeau D, Carrasco V. Motifs et trajectoires de recours aux urgences hospitalières. Etudes et résultats de l'Institut de Recherche et de Documentation en Economie de la Santé (IRDES). 2003 ; (215) : 6. 6. République française. Arrêté du 22 septembre 2011 portant approbation de la convention nationale des médecins généralistes et spécialistes. JORF n0223 du 25 septembre 2011, texte n16, p. 16080. 7. Galvis-Narinos F, Montélimard A. Le système de soins aux Etats-Unis. Pratiques et organisation des soins. 2009 ; (40) : 309-15. 8. Chambaretaud S, Hartman L, Obrecht O. La participation des patients aux dépenses de santé dans cinq pays européens. [en ligne]. Haute Autorité de Santé (HAS) ; 2007. [visité le 12/02/2014]. Disponible à partir de : 9. Safon M. La protection sociale complémentaire en France. [en ligne]. IRDES ; 2014. [consulté le 15/03/2014]. Disponible à partir de : 10. Guillaume P. Le rôle social du médecin depuis deux siècles : 1800-1945. Paris : Association pour l'étude de la sécurité sociale ; 1996. 319 p. 11. Launois-Robert J. La médecine libérale a-t-elle jamais existé ? Politiques et management public. 1985 ; 3 (4) : 87-97. 12. Vergez B. Le monde des médecins au XXème siècle. Bruxelles : Complexe ; 1996. 208. 70 13. Hassenteufel P. Syndicalisme et médecine libérale : le poids de l'histoire. Les Tribunes de la santé. 2008 ; (18) : 21-28. 14. Manjoni d'Intignano B. La protection sociale. 2ème éd. Paris : la librairie générale ; 1997. 183-9. 15. Vie Publique. Comment la France se situe-t-elle entre modèle bismarckien et beveridgien ? [en ligne]. 2014. [consulté le 15/05/2014]. Disponible à partir de : comment-france-situe-t-elle-entre-modele-bismarckien-modele-beveridgien. html 16. Bremond M. Les syndicats de médecins contre l'organisation de la protection sociale, tout contre. Pouvoirs. 1999 ; (89) : 127. 17. Hassenteufel P, Davesne A. Les médecins face aux réformes des systèmes de soins, une étude en perspective comparative France Allemagne Suède. Paris : Institut Montparnasse ; 2013. 16-18. 18. Régereau M. La politique conventionnelle : ses ambitions et ses limites. Revue française de l'administration publique. 2005 ; (113) : 75-76. 19. République française. Arrêté du 29 novembre 2012 portant approbation de l'avenant n 8 à la convention nationale organisant les rapports entre les médecins libéraux et l'assurance maladie signée le 26 juillet 2011. JORF n0285 du 7 décembre 2012, p. 19171. 20. Keller B. Les syndicats de médecins apportent un soutien critique au projet de CMU. Le quotidien du médecin. 1999 ; (6422). 21. Institut de Recherche et de Documentation en Economie de la Santé (IRDES). Enquête sur la Santé et la Protection sociale, enquête biennale. [en ligne]. 2014. [consulté le 05/07/2014]. Disponible à partir de : sociale/actualites. html. 22. Lecomte T, Mizrahi A, Mizrahi A. Précarité sociale : cumul des risques sociaux et médicaux. [en ligne]. IRDES ; 1996. [consulté le 08/05/2014]. Disponible à partir de : 23. Lombrail P. Accès aux soins. In : Les inégalités sociales de santé. Leclerc A, Fassin D, Grandjean H, Kaminski M, Lang T. Paris : La découverte ; 2000. 403-18. 24. Desprès C, Jusot F, Dourgnon P, Fantin R. Le renoncement aux soins : une approche socio- anthropologique. Questions d'économie de la santé. [en ligne]. 2011 [consulté le 03/06/2014] : (169). Disponible à partir de : 25. Ministère de la Santé. Résoudre le refus de soins. Conférence nationale de santé ; 10 septembre 2010. Paris ; 2010. 71 26. Médecins du Monde. Rapport de l'observatoire de l'accès aux droits et aux soins de la mission France 2013. Paris ; 2014. 48-9. 27. Legros M. Santé et accès aux soins, pour un accès plus égal et facilité à la santé et aux soins. Conférence nationale de lutte contre la pauvreté et pour l'inclusion sociale ; 29 novembre 2012. Paris ; 2012. 28. Desprès C, Jusot F, Dourgnon P, Fantin R. Le renoncement aux soins pour raisons financières : une approche économétrique. Questions d'économie de la santé. [en ligne]. 2011 [consulté le 03/06/2014] : (169). Disponible à partir de : 29. Bocognano A. Droits à dépassements et inégalités d'accès aux soins. Actualité et dossiers en santé publique. 2009 ; (69) : 8-9. 30. Union Fédérale des Consommateurs-Que choisir. Coût de la santé des ménages : vers une démutualisation des populations fragiles. [en ligne]. 2011. [consulté le 12/06/2014]. Disponible à partir de : 2012 31. Raynaud D. Les déterminants individuels de dépenses de santé : l'influence de la catégorie sociale et de l'assurance maladie complémentaire. Etudes et résultats Direction de la Recherche, des Etudes et d'Evaluation en Statistique (DREES). 2005 ; (378) : 7-9. 32. Fonds CMU. Evaluation de la loi CMU rapport n5. [en ligne]. 2012. [consulté le 14/06/2014]. p. 52. Disponible à partir de : 33. République française. Article Ier de la loi du 14 juin 2013 relative à la sécurisation de l'emploi. JORF n0138 du 16 juin 2013, p. 9958. 34. Archimbaud A. L'accès aux soins des plus démunis, 40 propositions pour un choc de solidarité : rapport au premier ministre. [en ligne]. 2013. [consulté le 14/06/2014]. Disponible à partir de : 35. Caucat B. Influence du tiers payant sur la consommation de soins ambulatoires, enquête auprès des médecins généralistes. - 116p. Thèse d'exercice : Med : paris XII (Créteil) : 2001 ; 33-43. 36. Hudelson P. La recherche qualitative en médecine de premier recours. Revue médicale suisse 2004 ; (503). 37. Taquilain A. Le tiers payant généralisé : une mesure complètement démagogique ! [en ligne] Espace Presse de l'Union pour un Mouvement Populaire : 2013. [consulté le 22/01/2014] Disponible à partir de : completement-demagogique-99642509. 72 38. Collectif Interassociatif Sur la Santé (CISS). 30 propositions pour améliorer la santé de tous. [en ligne]. 2014. [consulté le 22/08/2014] ; 6. Disponible à partir de : CISS 30propositions-AmeliorerSanteTous. pdf 39. Conseil National de l'Ordre des Médecins. A propos de la généralisation du tiers payant. [en ligne]. 2014. [consulté le 22/08/2014]. Disponible à partir de : national. medecin. fr/node/1415. 40. Paillé P. L'analyse par théorisation ancrée. Cahiers de recherche sociologique. 1994 ; (23) : 147-181. 41. Beaud S, Weber F. Guide de l'enquête de terrain : produire et analyser des données ethnographiques. 4ème éd. Paris : La découverte ; 2010. 334 p. 42. Turgeon J, Côté L. Comment lire de façon critique les articles de recherche qualitative en médecine ? Pédagogie médicale. 2002 ; (3) : 85-86. 43. Richard F, Levy G, Chabert C et al. Le travail du psychanalyste en psychothérapie. Paris : Dunod ; 2005. 278 p. 44. Hassenteufel P. La rémunération des médecins allemands sous tension. Pratiques les cahiers de la médecine utopique. 2007 ; (39) : 43-44. 45. Ghler E, Schutz K. Tiers payant ou tiers garant ? Bulletin des médecins suisses. 2014 ; (95) : 903-904. 46. Rosman S. Les pratiques de prescription des médecins généralistes. Une étude sociologique comparative entre la France et les Pays bas. In : Singuliers généralistes. Bloy G, Schweyer F, Trépos J et al. Paris : Presses de l'Ecole des Hautes Etudes en Santé Publique (EHESP) ; 2010. 117-131. 47. Bloy G. Rémunérer les médecins. La question des revenus. In : Singuliers généralistes. Bloy G, Schweyer F, Trépos J et al. Paris : Presses de l'Ecole des Hautes Etudes en Santé Publique (EHESP) ; 2010. 75-98. 48. Massin S, Paraponaris A, Bernhard M et al. Les médecins généralistes face au paiement à la performance et à la coopération avec les infirmiers. Etudes et résultats Direction de la Recherche, des Etudes et d'Evaluation en Statistique (DREES). 2014 ; (875) : 4. 49. Bloy G. La constitution paradoxale d'un groupe professionnel. In : Singuliers généralistes. Bloy G, Schweyer F, Trépos J et al. Presses de l'Ecole des Hautes Etudes en Santé Publique (EHESP) ; 2010 : 27. 50. Jodelet D. Les représentations sociales. Paris ; Presse Universitaire de France : 1994. 36. 51. Desprès C, Naiditch M. Analyse des attitudes des médecins et de dentistes à l'égard des patients bénéficiant de la CMU. Fonds CMU. Paris : la documentation francaise ; 2006. 67-68. 73 52. CPAM Val-de-Marne. Etude sur le recours aux soins et l'état de santé des bénéficiaires de la CMU. [en ligne]. 2008. [consulté le 14/06/2014]. Disponible à l'adresse : %20soins%20CMU-C. pdf 53. Celant N, Guillaume S, Rochereau T. Enquête sur la santé et la protection sociale 2012 IRDES. [en ligne]. 2014. [consulté le consulté le 05/07/2014 ]. p. 556. Disponible à partir de : sociale-2012. pdf. 54. Luaces B. Représentations et pratiques envers les patients bénéficiaires de la CMUc chez les médecins généralistes. - 115p. Thèse d'exercice : Med : Bordeaux II. 2011. 55. Dourgnon P, Grignon M. Etude de l'influence du recours au tiers payant sur la dépense de santé. Paris : Centre de Recherche, d'Etudes et de Documentation en Economie de la Santé (CREDES) ; 2000. 80 p. 56. Batifoulier P. La consommation sociale d'un marché de la santé : une mise en ordre inégalitaire et inefficace. Séminaire Hétérodoxies ; 5 avril 2011. Paris ; 2011. 57. Laude A. Le patient entre responsabilité et responsabilisation. Les tribunes de la santé. 2013 ; (41) : 86. 58. Organisation for Economic Cooperation and Development (OECD). Towards high- performing health systems. [en ligne]. 2004. [consulté le 04/08/2014]. p. 18. Disponible à partir de : 59. Vega A. Le partage des responsabilités en médecine : une approche socio-anthropologique des pratiques soignantes. Roubaix (France) : Formindep ; 2011. 60. Girard B. Comparaison du score de raisonnement analogique clinique et du score EPICES pour repérer les patients à risque d'inégalité sociale de santé en médecine générale. Thèse d'exercice : Med : Aix-Marseille II : 2011. 61. Union Fédérale des Consommateurs-Que choisir. Honoraires des médecins spécialistes en 2013 : les bornes sont dépassées. [en ligne]. 2013. [consulté le 07/09/2014]. Disponible à partir de : Honoraires medecins specialistes 2013. pdf. 62. Barlet M, Bellamy V, Guillaumat-Taillet F, Jakoubovitch S. Médecins généralistes : que pensent ils de leur rémunération ? Revue française des affaires sociales. 2011 ; (2-3) : 146. 63. Andriantsehenoharinala L. Les médecins ayant refusé la rémunération sur objectif de santé publique (ROSP)/ paiement à la performance (P4P) : une approche qualitative des raisons exprimées de leur refus. Thèse d'exercice : Med : Montpellier 1. 2014. 58-59. 64. Dormont B, Samson A. Les effets multiformes du paiement à l'acte sur les revenus des médecins généralistes : les enseignements de quelques études économétriques pour la France. Revue française des affaires sociales 2011 ; (2-3) : 173-174. 74 65. Albouy V, Duprez M. Mode de rémunération des médecins. [en ligne]. 2008. [consulté le 15/09/2014]. Disponible à partir de : 66. Fantino B, Fantino F, Dumont C et al. Pratiques préventives en médecine générale en région Rhône Alpes. Santé publique. 2004 ; (16) : 556. 67. Bataillon R, Hascoet J, Leenel H et al. Vers une consultation médicale de prévention. Santé Publique. 2008 ; (18). 75 Annexe I : Prise en charge par l'AMO des différents soins en France pour un assuré sans exonération du ticket modérateur La prise en charge des soins des chirurgiens-dentistes et des sage-femmes est de 70 % comme les médecins. La prise en charge des frais des auxiliaires médicaux (infirmière, kinésithérapeute, orthophoniste, orthoptiste et pédicure-podologue) est de 60%. La prise en charge du coût des médicaments varie de 15 % à 65 % selon l'efficacité estimée du traitement et la gravité des pathologies qu'il est censé traiter (une catégorie de médicaments irremplaçables et coûteux est même remboursée à 100% ). La prise en charge des actes de biologie est de 60% et de 70% pour les actes d'analyse cytologique et anatomo-pathologique. La prise en charge des dispositifs médicaux d'optique, de prothèses auditives et de pansements est de 60%. La prise en charge des frais d'hospitalisation, que ce soit à l'hôpital ou en clinique privée conventionnée, est de 80%. La prise en charge des frais de transport est de 65%. 76 Annexe II Circonstances de prise en charge du ticket modérateur par l'AMO : Les patients bénéficiaires de la CMU-C (le ticket modérateur peut aussi être pris en charge par une AMC) ainsi que de l'AME. Les patients relevant d'une ALD ou présentant une affection grave caractérisée ne figurant pas sur la liste des trente ALD ou plusieurs affections caractérisées entranant un état pathologique invalidant : ils bénéficient d'une prise en charge à 100% des frais uniquement liés à l'ALD. Les titulaires d'une pension d'invalidité ou d'une rente liée à un accident du travail ou une maladie professionnelle. Les femmes enceintes à partir de quatre mois avant la date présumée d'accouchement, la prise en charge des soins des prématurés ou des nouveaux- nés hospitalisés dans les trente jours suivant leur naissance. 77 Annexe III : Franchises instaurées sur les soins depuis 2005 : La franchise : quels montants ? Le montant de la franchise est de : 0, 50 euro par bote de médicaments (ou toute autre unité de conditionnement : flacon par exemple) ; 0, 50 euro par acte paramédical ; 2 euros par transport sanitaire. À noter : la franchise ne s'applique pas aux médicaments délivrés au cours d'une hospitalisation, ni aux actes paramédicaux effectués au cours d'une hospitalisation, ni aux transports d'urgence. La franchise médicale est plafonnée Un plafond annuel Le montant de la franchise médicale est plafonné à 50 euros par an pour l'ensemble des actes ou prestations concernés. Un plafond journalier Un plafond journalier a été mis en place pour les actes paramédicaux et les transports sanitaires. On ne peut pas déduire : plus de 2 euros par jour pour les actes paramédicaux ; plus de 4 euros par jour pour les transports sanitaires. Qui est concerné ? Toutes les personnes sont concernées par la franchise, sauf : les enfants et les jeunes de moins de 18 ans ; es bénéficiaires de la couverture maladie universelle (CMU) complémentaire ou de l'aide médicale de l'Etat (AME) ; les femmes prises en charge dans le cadre de la maternité (les examens obligatoires et la période d'exonération du 1erjour du 6e mois de grossesse au 12e jour après l'accouchement). À noter : les titulaires d'une pension visés à l'article L. 115 du Code des pensions militaires d'invalidité et des victimes de guerre sont dispensés de l'acquittement de la franchise mais uniquement pour les soins délivrés gratuitement par l'Etat et nécessités par les infirmités donnant lieu à pension. Pour les soins autres, c'est-à-dire ceux qui ne sont pas en rapport avec les maladies, infirmités ou blessures de guerre, ils sont exonérés du ticket modérateur mais pas de la franchise. D'après le site de la Caisse National d'Assurance Maladie. Disponible sur : medicale/qu-8217-est-ce-que-la-franchise-medicale. php 78 Annexe IV : Synthèse du rapport de l'IGAS sur la généralisation du tiers payant, rendu en février 2014 à la ministre de la santé en préparation à la loi : 79 80 Annexe V : Graphique 1 Évolution du taux de renoncement aux soins des bénéficiaires de la CMU-C et des bénéficiaires d'une couverture complémentaire privée 1998 2000 2002 2004 2006 2008 Bénéficiaires de la CMU-C 27, 1% 15, 0% 18, 5% 17, 4% 21, 3% Bénéficiaires d'une complémentaire privée 13, 2% 14, 7% 10, 3% 13, 2% 13, 9% 15, 3% Ecart entre bénéficiaires de la CMU-C et bénéficiaires d'une complémentaire privée 12, 4% 4, 7% 5, 3% 3, 5% 6, 0% Population générale 15, 1% 17, 0% 11, 8% 15, 0% 15, 6% 16, 5% Données : Enquête santé protection sociale (ESPS) 1998, 2000, 2002, 2004, 2006, 2008. Se référer à la publication pour les informations complémentaires. Extrait de Questions d'économie de la santé n 170 intitulé : Le renoncement aux soins pour raisons financières : une approche économétrique , Irdes, novembre 2011. 81 Annexe VI : Guide d'entretien formalisé Bonjour, merci de m'accorder quelques instants. Je tiens tout d'abord à vous assurer bien sûr que votre identité n'apparatra pas dans la thèse et que vous pouvez vous exprimer en totale liberté. Je vous remercie pour votre confiance à cet égard. 1) Je réalise un travail sur le 1/3 payant généralisé et les représentations des médecins généralistes libéraux sur ce projet de réforme. J'interroge différents médecins comme vous pour dresser un tableau des positions des praticiens sur ce thème lors d'entretiens individuels enregistrés. Marisol TOURAINE, la ministre des affaires sociales et de la santé, a annoncé, dans sa feuille de route concernant la stratégie nationale de santé datant de septembre 2013, sa volonté d'élargir le tiers payant et donc la dispense d'avance des frais de santé à toute la population, sans distinction, pour tous les actes de médecine libérale. Nous allons donc parler de cette mesure en général puis nous nous pencherons ensuite sur votre pratique du 1/3 payant au quotidien. Que pensez vous de la proposition de généraliser le tiers payant ? 2) Selon l'orientation générale de l'avis exprimé : Donc, je comprends que vous n'êtes pas favorable à cette mesure : pourriez vous me livrer toutes les raisons qui vous rendent réticent ? OU Donc, je comprends que vous êtes favorable à cette mesure : pourriez vous me livrer toutes les raisons qui vous poussent à être d'accord ? 3) Selon l'orientation générale de l'avis exprimé : Voyez vous néanmoins des aspects en faveur de cette réforme ? OU Voyez vous néanmoins des aspects en défaveur de cette réforme ? 4) D'après vous, que vont penser les assurés de cette réforme ? 82 5) J'aimerais maintenant que l'on évoque vos pratiques actuelles concernant le 1/3 payant. L'utilisez vous dans votre pratique quotidienne ? Avec quelles catégories de patients ? Si ne sait pas répondre, demander pour chaque situation : CMU, ALD, cs d'accidents du travail ou de maladie professionnelle. Réalisez vous des actes en tiers payant uniquement pour la partie Assurance Maladie Obligatoire (AMO) en vous faisant régler la part complémentaire de 6, 9 euros ? . Quels sont les critères qui vous font utiliser le 1/3 payant intégral ou partiel avec les patients qui n'y sont pas normalement éligibles dans les textes ? En cas d'absence de réponse, proposer : Vous avez la connaissance ou vous supposez des difficultés financières chez ces patients. C'est le patient en personne qui vous l'a réclamé. Quand le montant engagé est plus élevé qu'à l'habitude (plusieurs actes en une fois comme avec les enfants par exemple ou certaines actes techniques). Vous ne le faites qu'avec certains patients avec lesquels vous avez des affinités particulières / un certaine sympathie. Autres : 6) Imaginons que vous soyez ministre de la santé : quelles propositions auriez vous dans le but de faciliter l'accès aux soins des patients en France tout en matrisant les dépenses de santé ? Ou bien jugez vous que la situation actuelle est satisfaisante globalement ? 7) Que pensez vous des nouveaux moyens de rétribution des médecins généralistes comme les rémunérations à la performance, au forfait. dans cette perspective ? 8) Voilà, j'ai terminé : avez vous une chose à rajouter ou sur laquelle vous souhaitez revenir concernant ces thématiques ? 9) Pour finir, j'ai besoin de quelques éléments socio-biographiques qui apparatront dans le travail mais sans votre nom bien entendu : - votre age. - votre type d'exercice : rural urbain, semi rural. - êtes vous en association ou travaillez vous seul ? - depuis combien de temps exercez vous la médecine générale libérale ? - avez vous des spécificités d'exercice : médecin expert, homéopathie, du sport. ? - à quel secteur appartenez vous ? - êtes vous syndiqués ou appartenez vous à une organisation politique ? Si oui, à quelle organisation ? - quelle est ou était la profession de vos parents ? Je vous remercie pour votre participation. 83 Serment D'HIPPOCRATE Au moment d'être admis à exercer la médecine, je promets et je jure fidèle aux lois de l'honneur et de la probité. Mon premier souci sera de rétablir, de préserver ou de promouvoir la santé dans tous ses éléments, physiques et mentaux, individuels et sociaux. Je respecterai toutes les personnes, leur autonomie et leur volonté, sans aucune discrimination selon leur état ou leurs convictions. J'interviendrai pour les protéger si elles sont affaiblies, vulnérables ou menacées dans leur intégrité ou leur dignité. Même sous la contrainte, je ne ferai pas usage de mes connaissances contre les lois de l'humanité. J'informerai les patients des décisions envisagées, de leurs raisons et de leurs conséquences. Je ne tromperai jamais leur confiance et n'exploiterai pas le pouvoir hérité des circonstances pour forcer les consciences. Je donnerai mes soins à l'indigent et à quiconque me les demandera. Je ne me laisserai pas influencer par la soif du gain ou la recherche de la gloire. Admis dans l'intimité des personnes, je tairai les secrets qui me seront confiés. Reçu à l'intérieur des maisons, je respecterai les secrets des foyers et ma conduite ne servira pas à corrompre les mœurs. Je ferai tout pour soulager les souffrances. Je ne prolongerai pas abusivement les agonies. Je ne provoquerai jamais la mort délibérément. Je préserverai l'indépendance nécessaire à l'accomplissement de ma mission. Je n'entreprendrai rien qui dépasse mes compétences. Je les entretiendrai et les perfectionnerai pour assurer au mieux les services qui me seront demandés. J'apporterai mon aide à mes confrères ainsi qu'à leurs familles dans l'adversité. Que les hommes et mes confrères m'accordent leur estime si je suis fidèle à mes promesses ; que je sois déshonoré et méprisé si j'y manque. 84 85 Résumé : Un projet de loi concernant sur la généralisation du tiers payant chez les médecins libéraux en France a été annoncé le 23 septembre 2013. Nous avons cherché à explorer les représentations des médecins généralistes libéraux sur cette éventualité et leurs perceptions des liens entre problématiques d'accès aux soins et mode de rémunération des médecins. Une étude qualitative a été réalisée à partir d'entretiens semi-dirigés de mai à septembre 2014 sur un échantillon de seize médecins généralistes libéraux installés en Aquitaine et Midi-Pyrénées, obtenu par échantillonnage raisonné à variation maximale. Nous avons pu mettre en évidence les réticences marquées d'une partie des médecins en lien avec un attachement à l'identité libérale de la médecine et la croyance en un caractère inflationniste et un effet déresponsabilisant pour le patient de ce système. D'autres médecins mettent en avant l'effet bénéfique attendu sur l'accès aux soins et sur la nature de leur rapport avec les patients, reléguant le statut libéral à une réalité discutable. Les aspects techniques sont une source d'inquiétude répandue. Malgré des disparités fortes dans l'utilisation actuelle du tiers payant, la volonté d'abaisser la barrière financière de différentes manières prédomine. Les problématiques d'accès aux soins sont abordées diversement. Elles sont peu mises en rapport avec le changement du mode de rémunération qui divise les médecins. De nombreuses limites au paiement à l'acte sont évoquées. Qualitative study on the views of private physicians about wider use of third- party payment schemes A proposed law concerning the wider adoption of third-party payment schemes for private doctors in France was announced on September 23, 2013. This study seeks to explore the views of private physicians on this possible change as well as perceptions of the relationship between access to care and way to pay doctors. A qualitative study was undertaken through a series of semi-structured interviews from May to September 2014 across a sample of sixteen private physicians practicing in Aquitaine and Midi-Pyrénées. Participants were purposefully selected to ensure maximum sample variation. The study was able to point out strong reservations for certains physicians for whom their practice of medecine should inherently be liberal ; they expressed concerns over the inflation of demand and a dissolution of the patient's responsibility due to this scheme. Other physicians highlighted the expect beneficial impact on access to care and the doctor-patient relations, dismissing any purpoted liberal perception as a debatable reality. Both sides shared worries about the technical aspects of the change. Despite wide disparities in actual usage of third-party payment systems, a will to lower financial barriers to entry predominated in the sample. Questions to access to health care provoked a variety of responses. The potential change in how physicians received their income, though divisive, was seen as having little connection to the issue of access to care. The panel raised numerous limitations within the pay-for-service model. Discipline administrative : Médecine générale Mots-clés : médecine générale, tiers payant, accès aux soins, rémunération des médecins, étude qualitative. Université Bordeaux 2 Victor Segalen Faculté de médecine 146, rue Léo Saignat 33076 Bordeaux	HAL	Scientific
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Elle est imprimée sur les étiquettes et sur l' emballage.	EMEA_V3	Medicinal
RECOMMANDER LES BONNES PRATIQUES FICHE Diagnostic de la dénutrition chez l'enfant, l'adulte, et la personne de 70 ans et plus Novembre 2021 L'essentiel La dénutrition est un problème majeur de santé publique qui concerne plus de 2 millions de personnes en France1. Le diagnostic de dénutrition repose sur l'association d'un critère phénotypique et d'un critère étiologique. Depuis avril 2018, de nouvelles courbes d'indice de masse corporelle (IMC) pour les enfants s'appliquent au diagnostic de la dénutrition2. Le seuil de dénutrition selon l'IMC est plus élevé chez la personne de 70 ans et plus. L'albuminémie n'est pas un critère diagnostique ; c'est un critère de sévérité de la dénutrition. Une fois le diagnostic de dénutrition établi, la sévérité de la dénutrition est établie selon les seuils d'IMC ou de pourcentage de perte de poids ou d'albuminémie. Un IMC normal ou élevé n'exclut pas la possibilité d'une dénutrition (une personne en surpoids ou obèse peut être dénutrie). Le poids doit être mesuré à chaque consultation et/ou hospitalisation et renseigné dans le dossier médical. 1. Vie de la SFNEP. Lettre du Président : Un train peut en cacher un autre. Nutrition clinique et métabolisme 29 (2015) 6566. 2. Nouvelles courbes d'IMC d'avril 2018 : courbes AFPA CRESS/INSERM CompuGroup Medical, 2018 : cress-umr1153. fr/index. php/courbes- carnet-de-sante. Diagnostic de la dénutrition de l'enfant (< 18 ans) Une dénutrition est-elle présente ? Critères pour le diagnostic de dénutrition : présence d'au moins 1 critère phénotypique et 1 critère étiologique. Critères phénotypiques Critères étiologiques (1 seul critère suffit) (1 seul critère suffit) Perte de poids 5 % en 1 mois ou Réduction de la prise alimentaire 50 % pendant plus 10 % en 6 mois ou perte 10 % d'1 semaine ou toute réduction des apports pendant par rapport au poids habituel avant plus de 2 semaines par rapport : le début de la maladie. à la consommation alimentaire habituelle quantifiée ; IMC < courbe IOTF 18, 53. ou aux besoins protéino-énergétiques estimés. Stagnation pondérale aboutissant à un Absorption réduite (maldigestion/malabsorption). poids situé 2 couloirs en dessous du Situation d'agression (hypercatabolisme protéique couloir habituel (courbe de poids)4. avec ou sans syndrome inflammatoire) : Réduction de la masse musculaire et/ pathologie aigu ou ; ou de la fonction musculaire (lorsque les pathologie chronique évolutive ou ; normes et/ou les outils sont disponibles). pathologie maligne évolutive. NON OUI Dénutrition modérée Dénutrition sévère Enfant non dénutri (1 seul critère suffit) (1 seul critère suffit) En ambulatoire : Courbe IOTF 17 < IMC IMC courbe IOTF 173. réévaluation à chaque < courbe IOTF 18, 53. Perte de poids > 10 % en consultation. Perte de poids 5 % et 1 mois ou > 15 % en 6 mois En cas 10 % en 1 mois ou > 10 % par rapport au poids antérieur. d'hospitalisation : et 15 % en 6 mois par Stagnation pondérale réévaluation une fois rapport au poids antérieur. aboutissant à un poids situé au par semaine. Stagnation pondérale moins 3 couloirs en dessous aboutissant à un poids situé du couloir habituel. entre 2 et 3 couloirs en Infléchissement statural (avec dessous du couloir habituel. perte d'au moins 1 couloir par rapport à la taille habituelle). Un seul critère de dénutrition sévère prime sur un ou plusieurs critères de dénutrition modérée. Prise en charge nutritionnelle de tout enfant dénutri à adapter selon le degré de sévérité de la dénutrition Surveillance de l'évolution de l'état nutritionnel et adaptation de la prise en charge d'un enfant dénutri En ambulatoire : réévaluation systématiquement dans le mois suivant la dernière évaluation. En cas d'hospitalisation : réévaluation au moins une fois par semaine. 3. Courbes disponibles sur le site : cress-umr1153. fr/index. php/courbes- carnet-de-sante. Après 2 ans : courbes de l'International Obesity Task Force (IOTF). Cole TJ, Lobstein T. Pediatric Obesity 2012. Avant 2 ans : courbes actualisées à partir de données anthropométriques d'enfants nés avec un poids > 2 500 g et suivis par des médecins de France métropolitaine. Courbes établies par l'AFPA CRESS/INSERM CompuGroup Medical, 2018. Les courbes de l'IOTF sont celles préconisées par le plan national Nutrition Santé pour la surveillance de l'IMC des enfants. Cependant, l'IOTF ne propose pas de courbes d'IMC avant 2 ans ; les courbes de l'IOTF ont été prolongées par les courbes AFPA - CRESS/Inserm - CompuGroup Medical 2018 sur cette tranche d'âge. 4. Couloir habituel couloir habituel de croissance pondérale de l'enfant ou de référence pour des pathologies spécifiques (trisomie 21, myopathie, etc. ). HAS Diagnostic de la dénutrition chez l'enfant, l'adulte, et la personne de 70 ans et plus Novembre 2021 2 Diagnostic de la dénutrition de l'adulte ( 18 ans et < 70 ans) Une dénutrition est-elle présente ? Critères pour le diagnostic de dénutrition : présence d'au moins 1 critère phénotypique et 1 critère étiologique Critères phénotypiques Critères étiologiques (1 seul critère suffit) (1 seul critère suffit) Perte de poids 5 % en 1 mois ou 10 % Réduction de la prise alimentaire 50 % pendant en 6 mois ou 10 % par rapport au poids plus d'1 semaine, ou toute réduction des apports habituel avant le début de la maladie. pendant plus de 2 semaines, par rapport à la IMC < 18, 5 kg/m2. consommation alimentaire habituelle quantifiée ou Réduction quantifiée de la masse aux besoins protéino-énergétiques estimés. musculaire et/ou de la fonction musculaire Absorption réduite (maldigestion/malabsorption). (cf. texte de la recommandation). Situation d'agression (hypercatabolisme protéique avec ou sans syndrome inflammatoire) : pathologie aigu ou pathologie chronique évolutive ou pathologie maligne évolutive. NON OUI Dénutrition modérée Dénutrition sévère Patient non dénutri (1 seul critère suffit) (1 seul critère suffit) En ambulatoire : 17 < IMC < 18, 5 kg/m2. IMC 17 kg/m2. réévaluation à chaque Perte de poids 5 % en 1 Perte de poids 10 % en consultation. mois ou 10 % en 6 mois ou 1 mois ou 15 % en 6 En cas 10 % par rapport au poids mois ou 15 % par rapport d'hospitalisation : habituel avant le début de la au poids habituel avant le en MCO : réévaluation maladie. début de la maladie. une fois par semaine ; en SSR : réévaluation Albuminémie* > 30 g/L et Albuminémie* 30 g/L. < 35 g/L. toutes les 2 semaines. Un seul critère de dénutrition sévère prime sur un ou plusieurs critères de dénutrition modérée. * Mesure de l'albuminémie par immunonéphélémétrie ou immunoturbidimétrie. Les seuils d'al- buminémie sont à prendre en compte quel que soit l'état inflammatoire. Prise en charge nutritionnelle de tout patient dénutri à adapter selon le degré de sévérité de la dénutrition Surveillance de l'évolution de l'état nutritionnel et adaptation de la prise en charge d'un patient dénutri En ambulatoire : réévaluation systématiquement dans le mois suivant la dernière évaluation. En cas d'hospitalisation : réévaluation au moins une fois par semaine. Lors des consultations de suivi après une hospitalisation, notamment au cours des affections de longue durée (ALD) : réévaluer systématiquement l'état nutritionnel d'un patient dénutri. HAS Diagnostic de la dénutrition chez l'enfant, l'adulte, et la personne de 70 ans et plus Novembre 2021 3 Diagnostic de la dénutrition de l'adulte (70 ans et plus) Une dénutrition est-elle présente ? Critères pour le diagnostic de dénutrition : présence d'au moins 1 critère phénotypique et 1 critère étiologique Critères phénotypiques Critères étiologiques (1 seul critère suffit) (1 seul critère suffit) Perte de poids 5 % en 1 mois ou Réduction de la prise alimentaire 50 % pendant 10 % en 6 mois ou 10 % par plus d'1 semaine, ou toute réduction des apports rapport au poids habituel avant le pendant plus de 2 semaines par rapport à la début de la maladie. consommation alimentaire habituelle ou aux besoins IMC < 22 kg/m2. protéino-énergétiques. Sarcopénie confirmée par une Absorption réduite (malabsorption/maldigestion). réduction quantifiée de la force et de Situation d'agression (avec ou sans syndrome la masse musculaire (cf texte de la inflammatoire) : pathologie aigu ou pathologie recommandation). chronique évolutive ou pathologie maligne évolutive. NON OUI Dénutrition modérée Dénutrition sévère Patient non dénutri (1 seul critère suffit) (1 seul critère suffit) En cas d'évènement 20 IMC < 22. IMC < 20 kg/m2. clinique intercurrent Perte de poids 5 % et < 10 % Perte de poids 10 % en (infection, chirurgie) en 1 mois ou 10 % et < 15 % 1 mois ou 15 % en 6 ou de diminution en 6 mois ou 10 % et < 15 % mois ou 15 % par rapport de l'appétit ou des par rapport au poids habituel au poids habituel avant le consommations avant le début de la maladie. début de la maladie. alimentaires, rapprocher Albuminémie* 30 g/L. Albuminémie* 30 g/L. la surveillance du poids, de l'appétit et Un seul critère de dénutrition sévère prime sur un ou plusieurs critères de dénutrition des consommations modérée. * Mesure de l'albuminémie par immunonéphélémétrie ou immunoturbidimétrie. alimentaires à une fois Les seuils d'albuminémie sont à prendre en compte quel que soit l'état inflammatoire. par semaine. Prise en charge nutritionnelle à adapter selon le degré de sévérité de la dénutrition Surveillance de l'évolution de l'état nutritionnel Quel que soit le statut nutritionnel, la surveillance En ville : 1 fois par mois à domicile et à chaque repose sur : consultation. la mesure du poids ; À l'hôpital MCO et SSR : à l'entrée, puis au le calcul de l'IMC ; moins une fois par semaine, et à la sortie. l'évaluation de l'appétit ; En EHPAD et USLD : à l'entrée, puis au moins Haute Autorité de santé Novembre 2021 l'évaluation de la consommation alimentaire ; une fois par mois, et à la sortie. la force musculaire. Toutes nos publications sont téléchargeables sur	HAS	Scientific
Rôles dans les lymphocytes T de la protéine Lis1, un régulateur de la dynamique des microtubules dépendante de la dynéine Jeremy Argenty To cite this version : Jeremy Argenty. Rôles dans les lymphocytes T de la protéine Lis1, un régulateur de la dynamique des microtubules dépendante de la dynéine. Immunologie. Université Paul Sabatier - Toulouse III, 2018. Français. NNT : 2018TOU30123. tel-02277145 HAL Id : tel-02277145 Submitted on 3 Sep 2019 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. Jérémy ARGENTY mardi 25 septembre 2018 le Rôles dans les lymphocytes T de la protéine Lis1, un régulateur de la dynamique des microtubules dépendante de la dynéine École doctorale et discipline ou spécialité ED BSB : Immunologie Centre de Physiopathologie de Toulouse-Purpan - Inserm U1043 CNRS UMR5282 UPS Dr. Abdelhadi SAOUDI Dr. Renaud LESOURNE Jury : Pr. Denis HUDRISIER, président Pr. Nadia BAHI-BUISSON, rapporteur Dr. Magali IRLA, rapporteur Dr. Jérôme DELON, rapporteur ! ! ! REMERCIEMENTS ! Ce manuscrit met un terme à 8 années d'études et à plus de 3ans passés dans ce laboratoire au sein duquel j'ai pu interagir et échanger scientifiquement et amicalement. Bien évidemment, je remercie mes deux directeurs de thèse Dr Abdelhadi Saoudi et Dr Renaud Lesourne pour m'avoir appris l'immunologie, qui était une énigme pour moi au départ en tant que biochimiste. Et oui en arrivant dans ce laboratoire, je ne savais pas ce qu'étaient un lymphocyte T CD4 et CD8 . Je vous remercie Renaud et Abdel pour m'avoir fait confiance et pour m'avoir confié un sujet de thèse qui n'entrait pas entièrement dans les recherches courantes de l'équipe. Cela m'a permis de tirer des informations de la littérature et à développer des expériences non maitrisées par l'équipe. C'est avec fierté, moi qui suis très attaché à l'aspect technique de la science, d'avoir obtenu des résultats après de nombreuses réflexions et mises au point de ces techniques. Deux chefs c'est bien mais c'est encore mieux avec plein de collègues avec qui je m'entends bien et avec qui j'espère garder contact. Anne, Gaétan et Judith vous êtes les premières personnes que j'ai côtoyé au centre et je me souviens quand, au cours de mon M2, l'équipe n'était constituée que de nous quatre (en plus du chef évidemment). Anne, je te remercie encore de m'avoir amené au restaurant pour lequel tu as tellement insisté et pour lequel, j'ai fini par manger tout seul tellement le stress de ta thèse te rongeait. Plus sérieusement, je te remercie de ton aide et des moments de rigolade passés ensemble notamment à discuter de tes aventures avec les souris. Gaétan, si j'ai rejoint l'équipe, c'est grâce à toi. Je t'avais envoyé un mail pour savoir si j'avais mes chances au sein de l'équipe. J'ai beaucoup apprécié ta bonne humeur, presque excessive, comme après que tu aies fait imploser tes cellules au PBS 10X ^. Judith, nous ne nous sommes pas beaucoup connus, mais merci de m'avoir appris à faire des préparations pour l'imagerie. A l'époque, je ne m'imaginais même pas que ce que tu m'as appris lors de mon M2 m'aurait autant servi pour la thèse. Nelly, tu as rejoint l'équipe au cours de ma thèse. J'aime beaucoup ta bonne humeur et ton exigence remarquablement juste. Il en faut pour faire tourner une équipe et participer à la faire vivre et progresser. Je me souviendrai longtemps des repas à la cantine passés ensemble mais surtoutau retour de mes vacances d'été 2016 lorsque je t'ai posé la question : Quoi de neuf depuis mon départ ? et que tu m'as répondu Il faut que je te dise quelque chose d'important et bien je suis enceinte ! . Je me souviens aussi de mon fou rire au bureau lorsque nous avions appris une nouvelle qui ne nous était pas destinée et que tu étais obligée de te retenir mais tu as craqué et tu es sortie du bureau. Hélène, toi aussi tu as rejoint l'équipe au cours de ma thèse. Même si tu n'es pas toujours au labo à cause de tes importantes missions à transmettre ton savoir à l'école vétérinaire, je t'apprécie beaucoup. Je me rappelle encore quand je t'ai réveillé en arrivant au bureau à 7h du matin, quand enfin tu étais parvenue à t'endormir entre deux chaises. Tu m'avais fait peur (je me demandais ce qui se passait dans ce bureau ! ) et je pense que toi aussi tu as eu peur. J'ai beaucoup apprécié discuter équitation avec toi et agacer les autres, car seuls nous deux pouvions nous comprendre à l'époque ! Cui, you are the last student who arrived in the team. You are incredibly funny and thank for the little chinese lessons (I think I can postulate for a job in China now). Sorry also for all your mice I ate (Only Cui can understand). The next time we see each other, I will cook for you an excellent Mice Cake ! cole Laurène, Alice, Aurélie, Loïc, Yolla, Delphine, nos équipes ont fusionné les faisant grandir en un éclair. Je vous remercie pour votre bonne humeur. Loïc, merci pour vos conseils sur mon projet et pour votre optimisme. Merci à la tagueuse de chat, Delphine, pour toujours plus de chats dessinés ! Laurène, Aurélie et Yolla merci pour les kg en plus, avec les soirées pizzas au labo. Laurène, ton départ à Vienne a été difficile. Merci de toute l'aide que tu as pu me fournir. Notamment, quand je devais rédiger la partie sur la synapse immunologique alors que j'avais perdu toute inspiration (Cette partie a été rédigée en dernière, malgré sa position dans la thèse). Puis tu nous as appris aussi plein de mots, ou de phrases de ta propre langue, je pense qu'avec Aurélie, nous parlons maintenant ta langue à la perfection (Aurélie n'a pas fait trop de fautes sur le T-shirt qu'elle a confectionné pour ton départ ? ). Aurélie, avec tes sorties tu as réveillé mes gènes de Canaille qui étaient si silencieux avantn'est-ce pas ? Tiens par exemple : j'ai beaucoup rigolé notamment pour t'avoir faite souvent marcher (je pense à Skype). Tu n'es pas dans l'équipe depuis longtemps et pourtant j'ai l'impression de te connaitre depuis des années tellement nous rigolons et nous nous entendons. Nelly, Aurélie, Laurène, Hélène, Alice et Cui, désolé d'avoir été si insupportable et de vous avoir fatigué avec mes discussions incessantes au bureau alors que vous tentiez de trouver la concentration. Mais, c'est tellement amusant de vous embêter car, il parait, je cache bien mon jeu et du coup personne hors du bâtiment F ne vous croyait ^. Je remercie aussi énormément Virginie, Clémence, Emeline et Arantxa. Arantxa, tu es toujours de bonne humeur et je te souhaite bonne continuation dans ton projet de thèse et professionnel. Virginie, Clémence et Emeline, nous nous sommes connus au fur et à mesure au labo mais après un barbecue chez Virginie, je pense que nos rapports ont été davantage consolidés, et je vous remercie pour m'avoir aidé au cours de cette fin de soirée. Virginie et Clémence je vous remercie pour toutes les frites englouties les lundis à la cantine (et d'autres jours). Je pense encore à nos randonnées, dont une particulièrement o je payerai cher pour revoir Clémence la tresse coincée dans une magnifique ronce. Ainsi que de vous voir la flotte jusqu'aux genoux. Et n'oubliez pas qui aime bien, châtie bien . Je n'oublie pas non plus Maryse, Marie, Michèle, Claude et Nadège. Vous êtes la première équipe que j'ai croisé au centre, à l'époque de mon M2 o il n'y avait que deux équipes à l'étage. Maryse nous nous sommes rencontrés lors d'un Friday Drink et je t'apprécie beaucoup. J'ai aimé nos repas au restaurant en tête à tête à discuter de tout et n'importe quoi. J'espère que nous aurons l'occasion de nous revoir et de discuter de nos devenirs. Je pense encore à Fred et Emilie pour les déjeuners à discuter de saumon fumé. Je vous remercie vous deux pour votre bonne humeur à longueur de temps. Fatima ? Non je ne connais pas Je connais une Fatima-Ezzahra, qui gère un plateau de cytométrie et que j'aime beaucoup. Pour se débarrasser de moi au bureau, Nelly, Aurélie, Laurène, Hélène et Cui avaient commandité l'élite de la randonnée : Fatima-Ezzahra pour me semer sur la coulée verte du Touch. Mais comme vous avez pu le constater, Fatima- Ezzahra n'a pas mené à bout sa mission. Peut-être l'avais-je aussi fatigué dans mon discours ou avec ma marche rapide. Merci Fatima-Ezzahra pour les rigolades au bâtiment F. Il a fallu attendre d'y poser nos valises pour déconner. Merci pour tes recettes, que ce soit des olives mais aussi pour fabriquer une concoction dont j'aurais besoin pour faire une teinture dans quelques années. Valérie, merci pour ta patience. Je me pose encore la question si c'est une patience envers moi, ou envers autre chose. Car nous en avons cramé des neurones à réfléchir. Pour autant, l'ImageStream est un très bel instrument, performant et très intéressant à utiliser et je te remercie de l'aide que tu m'as fourni. Anne-Laure et Paul merci pour votre bonne humeur et pour vos tris impeccables. Le plateau de cytométrie, n'hésitez surtout pas à me contacter si vous avez besoin d'aide pour porter des bidons pleins. Je verrai ce que je peux faire depuis Marseille. Danièle, merci de m'avoir formé au microscope LSM710, pour toutes les discussions dans les couloirs du bâtiment F. Je te remercie aussi énormément pour l'aide que tu as pu m'apporter et pour avoir présenté les microscopes à nos stagiaires. Je te souhaite de profiter de ta retraite et de tes enfants et petits enfants. Astrid, merci pour ta patience pour les acquisitions au spinning disk. J'attendais avec impatience tes Oh une mitose ! Y a une mitose , un peu moins les Je ne vois pas grand-chose mais on va attendre demain . Les résultats que nous avons générés avec cet appareil ont été en partie décisifs sur la conclusion de mon projet de thèse. Sophie, merci de m'avoir permis de faire un petit stage d'une semaine lors de la métrologie des instruments. Cela me conforte sur mon projet professionnel auprès de la technologie en biologie. Je remercie Pr Roland Liblau de m'avoir accueilli dans son unité ainsi que les membres des réunions du mercredi qui ont participé à la progression de mon projet Je remercie également Florence et Annie pour votre présence et votre sourire tous les jours. Je tiens à remercier aussi les services communs très agréables et réactifs : Aline, Caroline, Francine, Sandrine, Paula, Philippe, Nicolas, Denis et Nordine. Je remercie également les membres de la zootechnie. Je souhaite aussi remercier Dr Sébastien Villéger à Montpellier, chez qui j'ai réalisé mon premier stage dans le milieu scientifique. Merci pour la pêche aux petites daurades et aux petits mulets. Je te remercie pour ta générosité de m'avoir compté parmi les auteurs de ta publication à venir. Je remercie aussi Dr Isabelle Néant avec qui j'ai réalisé mon stage de M1. Je me souviens encore de DREAM, d'ailleurs je lui ai volontairement trouvé une petite place dans mon manuscrit. Et je t'assure que c'était volontaire, pour faire un clin d'œil à ce stage de M1. Enfin je remercie Dr Manuelle Ducoux-Petit et Dr Marie-Pierre Bousquet- Dubouch pour m'avoir accepté pour un stage facultatif avant le M2 encadré par Luc. Au cours de ce stage, avec Luc et peut être aussi avec les cours données par Manue et Marie- Pierre, j'ai trouvé dans la spectrométrie de masse, la technologie de pointe sur laquelle j'aimerais me spécialiser. D'ailleurs, je remercie Marlène et Dr Anne Gonzalez-de-Peredo pour les échantillons analysés avec rapidité au cours de mon doctorat. Je remercie Anne d'avoir entendu mon souhait professionnel et de m'avoir orienté vers mon post doctorat qui devrait me permettre de réaliser mon projet professionnel. Bien évidemment, je ne remercierai jamais assez ma famille pour m'avoir accompagné au cours de ces 8 ans d'études et bien avant, et de m'avoir toujours poussé dans mes retranchements pour assurer ma réussite. Je remercie particulièrement mes grands parents qui m'ont hébergé pendant plus de cinq ans au cours de mes études et toujours aidé. Pour la rédaction de ce manuscrit je remercie Nelly, Virginie, Laurène, Aurélie et Anne-Laure de m'avoir aidé pour la relecture et pour s'être cassé la tête à faire le sommaire. Ma grand- mère était aussi de la partie à tenter de corriger les fautes d'orthographe présentes dans ce manuscrit dont elle ne maitrise pas le domaine. Les figures ont été réalisées par mes soins mais les schémas de cellules, de membranes et des récepteurs ont été adaptés de Servier Medical Art ( ! Rôles dans les lymphocytes T de la protéine Lis1, un régulateur de la dynamique des microtubules dépendante de la dynéine Résumé Les récepteurs d'antigènes des lymphocytes T (TCR) sont assemblés au cours du développement précoce de ces cellules dans le thymus suite à des recombinaisons complexes de gènes. Le réarrangement d'une chaine des TCR fonctionnelle (pré-TCR) déclenche des voies de signalisation intracellulaires qui entrainent la survie, l'expansion et la maturation des thymocytes. Par ailleurs, l'engagement des TCR à la surface des lymphocytes T (LT) matures par des antigènes conduit également à des cycles de prolifération qui permettent le développement de réponses immunitaires efficaces. Ces évènements cellulaires s'accompagnent de remaniements importants du réseau de microtubules et une redistribution des moteurs moléculaires, tels que la dynéine, qui véhiculent les structures cellulaires sur ces réseaux. Les mécanismes moléculaires et les conséquences physiologiques de ces remaniements sont peu connus dans les LT. Lis1 est un régulateur de la dynéine qui est mis à contribution dans la migration neuronale et la prolifération des cellules souches au cours du développement neural. Son rôle au sein du tissu lymphoïde est peu connu. Dans ce travail, nous avons utilisé des modèles de souris spécifiquement déficients en Lis1 dans les LT afin d'étudier les fonctions moléculaires, cellulaires et physiologiques de cette protéine dans ces cellules. Nous montrons que Lis1 joue un rôle essentiel dans le développement précoce des LT et dans l'homéostasie des LT matures. La déficience en Lis1 n'affecte pas le réarrangement de la chaine ou les évènements de signalisation déclenchés par le pré-TCR ou le TCR. Cependant, la prolifération des thymocytes ayant passé la -sélection ou des LT matures dont le TCR a été engagé, est fortement impactée. L'analyse fine de la mitose indique que la déficience en Lis1 ralentit fortement le processus mitotique, contrarie les remaniements intracellulaires conduisant à la métaphase et entrane la répartition asymétrique du matériel génétique dans les cellules filles. L'analyse des réseaux de microtubules montre que l'absence de Lis1 entrane l'augmentation des cellules multipolaires au cours de la mitose. Enfin, nous montrons que Lis1 favorise l'interaction de la dynéine avec la dynactine, indiquant que Lis1 joue un rôle important dans les LT pour relier la dynéine aux structures cellulaires qu'elle véhicule. En conclusion, nous avons montré que Lis1 est importante dans la distribution du matériel génétique au cours de la prolifération des thymocytes doubles négatifs et des lymphocytes T périphériques. l'amplification du nombre de centrosomes et ! ! ! Functions in T cells of Lis1 protein, a regulator of dynein-dependent microtubules dynamics Abstract the cellular structures via The T cell receptor (TCR) is assembled during the early development of T lymphocytes in the thymus after complexe genetic recombinations. The rearrangement of a functional TCR - chain (pre-TCR) triggers intracellular signaling pathways that cause the survival, expansion and maturation of thymocytes. The commitment of the TCR to the surface of mature T cells after antigen recognition also leads to proliferation allowing the development of effective immune responses. These cellular events go along with significant reorganization of the microtubule networks and a redistribution of molecular motors, such as dynein, which transport this network. The molecular mechanisms and physiological consequences of the reorganization are poorly understood in T cells. Lis1 is a dynein regulator involved in neuronal migration and stem cells proliferation during neural development. Its role in lymphoid tissue is still unknown. In this study, we used mouse models specifically Lis1-deficient in T cells to study the molecular, cellular and physiological functions of this protein in T cells. We identifiy that Lis1 plays an essential role in the early development of T cells and in the homeostasis of mature cells. Lis1 deficiency does not affect -chain rearrangement or signaling events triggered by pre-TCR or TCR, but leads to the blockage of thymocyte cell division that have undergone -selection or mature T cells stimulated. Fine analysis of mitosis indicates that the deficiency of Lis1 strongly slows down the mitotic process, counteracts the cell changes leading to the metaphase and leads to asymmetric distribution of the genetic material in the daughter cells. Microtubule networks analysis shows that the absence of Lis1 induces centrosomes amplification and increase of multipolar cells during mitosis. Finally, we show that Lis1 promotes the dynein-dynactin interaction, indicating that Lis1 plays an important role in T cells to bind dynein to the cell structures it carries. In conclusion, we here described that Lis1 is important for the distribution of genetic material during double negative thymocyte and peripheral lymphocyte proliferation. ! 1. 2. 1. 2. I. II. II. III. 1. 1. 1. 2. 1. 3. 2. 1. 2. 2. 2. 3. LISTE DES FIGURES . 3 LISTE DES ABREVIATIONS . 5 AVANT PROPOS . 9 INTRODUCTION . 11 INTRODUCTION GENERALE . 13 Le récepteur des lymphocytes T . 13 Structure des récepteurs des lymphocytes T . 13 La région transmembranaire . 14 1. 1. Les domaines extracellulaires . 14 1. 2. Les domaines intracellulaires . 15 1. 3. La recombinaison V(D)J. 16 Mécanismes biochimiques de la recombinaison . 17 2. 1. 2. 2. Régulation de la recombinaison . 19 Les corécepteurs CD4 et CD8 . 20 Réponse des lymphocytes T suite à la reconnaissance d'un antigène . 21 Signalisation suite à l'engagement des TCR . 21 Complexes de signalisation mis en jeu lors de la reconnaissance antigénique . 22 Principales voies de signalisation . 25 Synapse immunologique . 27 Différenciation des lymphocytes T . 31 Différenciation des lymphocytes T auxiliaires . 31 Différenciation des lymphocytes T cytotoxiques. 32 Différenciation en lymphocytes T mémoires . 33 CHAPITRE I : LE DEVELOPPEMENT PRECOCE DES LYMPHOCYTES T . 35 La différenciation des précurseurs des lymphocytes T dans la moelle osseuse . 36 Origine des cellules souches hématopoïétiques . 36 Différenciation des CSH vers le lignage lymphocytaire T . 36 Acquisition du lignage T définitif au sein du thymus . 37 Les mécanismes d'entrée au niveau de la jonction cortico-médullaire du thymus . 37 La signalisation NOTCH est essentielle dans l'établissement du lignage T . 39 La -sélection : l'étape initiale dans l'élaboration d'un répertoire T . 40 Expression du pre-TCR . 40 Déclenchement de la recombinaison du TCR . 40 1. 1. Expression de la chaine pT . 42 1. 2. Signalisations issues du pre-TCR . 43 Déclenchement de la signalisation du pre-TCR . 44 2. 1. Fonctions de la chaine pT dans la signalisation . 44 2. 2. Signaux de survie . 45 2. 3. Induction de la prolifération cellulaire . 46 2. 4. 2. 5. Exclusion allélique . 47 Transition vers le stade double positif . 48 Expression des corécepteurs CD4 et CD8 . 48 Déclenchement de la recombinaison de la chaine du TCR . 48 Du pré-TCR au TCR . 49 CHAPITRE II : LE DEVELOPPEMENT TARDIF DES LYMPHOCYTES T . 51 Les sélections clonales au sein du cortex thymique . 52 Présentation de peptides par les cTEC . 52 Signaux de survie induits par la sélection positive . 53 Transition des stades DP à SP . 53 Choix du lignage CD4 et CD8 . 54 3. 1. Acteurs mis en jeu dans la différenciation en CD4 ou CD8 SP . 55 3. 2. La sélection négative au sein de la médulla . 56 Expression des TRA (tissue-restricted antigens) . 57 Régulation de la survie cellulaire par la force du signal . 58 THEMIS, une protéine importante dans les mécanismes de sélection . 59 1. 2. 3. 1. 2. 3. 1. 2. 1. 2. 1. 2. IV. III. I. I. II. III. 1. 2. 1 I. II. III. 1. 2. 3. 4. 5. 1. 2. 3. 1. 2. 3. 1. 2. 2. 1. 2. 2. 3. 1. 3. 2. 1. 1. 1. 2. 1. 3. 2. 1. 2. 2. Rôles physiologiques de THEMIS dans les lymphocytes T . 60 Fonctions de THEMIS dans la signalisation des TCR . 62 THEMIS est un régulateur négatif de la signalisation . 62 THEMIS est un régulateur positif de la signalisation . 63 Régulation de THEMIS . 64 Régulation de son expression . 64 Régulation de son activité et de sa localisation . 65 CHAPITRE III : LIS1, UNE MOLECULE INDISPENSABLE DANS LA VIE CELLULAIRE . 67 Effets physiologiques associés à la perte ou au gain d'expression de Lis1 . 67 Conséquences neurologiques . 68 Développement tumoral. 69 Conséquences immunitaires de la perte d'expression de Lis1 . 70 Fonctions moléculaires . 70 Régulation du complexe PAFAH-1B . 71 Le complexe PAFAH-1B . 71 1. 1. Rôle de Lis1 dans la fonction enzymatique de PAFAH-1B . 72 1. 2. Régulation de la Dynéine . 73 Généralités sur dynéine . 73 2. 1. Régulation de l'activité motrice . 76 2. 2. Fonctions cellulaires . 80 Lis1 dans la migration cellulaire . 80 Recrutement et polymérisation d'actine corticale . 81 Adhérence des cellules et adhérence focale . 81 Mouvement d'organites au cours de la migration . 82 Régulation de la division cellulaire . 83 Fonctions de Lis1 au cours de la phase G2 du cycle cellulaire . 85 Fonctions de Lis1 dans le déroulement de la mitose . 85 Transport d'organelles . 86 Transport et recyclage des molécules . 87 Transport d'ARNm . 87 Transport de protéines . 87 Lis1 au sein dans la signalisation cellulaire . 87 Régulation de Lis1 . 88 1. Régulation d'expression génique . 88 Régulation post-transcriptionnelle . 88 2. 3. Modifications post-traductionnelles . 89 3. 1. Phosphorylation . 89 3. 2. Sumoylation et ubiquitination . 89 Régulation spatiale et de sa stabilité . 90 4. 1. Stabilité fonctionnelle . 90 4. 2. Stabilité structurale . 90 4. 3. Régulation spatiale . 91 Lis1 dans le système immunitaire. 92 Fonctions de Lis1 dans les lignées hématopoïétiques . 92 Rôles de Lis1 dans la fonction des lymphocytes B . 92 Rôles de Lis1 dans la fonction des lymphocytes T . 93 OBJECTIFS DE LA THESE. 95 RESULTATS . 97 DISCUSSION . 143 CONCLUSION . 159 ANNEXES . 161 PORTFOLIO . 213 REFERENCES . 215 4. 1. 4. 2. 1. 2. 3. IV. 4. V. 2 LISTE DES FIGURES Figure 1 : Représentation d'un récepteur des lymphocytes T . 16 Figure 2 : Représentation des gènes et ainsi que des chaines et du TCR issues de la recombinaison V(D)J . 17 Figure 3 : Schématisation d'une recombinaison VJ . 18 Figure 4 : Représentation des corécepteurs CD8 et CD4 complexés au CMH-I et CMH-II respectivement . 21 Figure 5 : Représentation de la signalisation précoce suite à l'engagement du TCR . 22 Figure 6 : Recrutement des complexes de signalisation à LAT . 25 Figure 7 : Schématisation de la synapse immunologique . 30 Figure 8 : Différenciation des lymphocytes T auxiliaires . 33 Figure 9 : Différenciation des cellules souches hématopoïétiques en lymphocytes T . 38 Figure 10 : Principales inductions médiées par la signalisation NOTCH . 42 Figure 11 : Représentation d'un récepteur pre-TCR . 43 Figure 12 : Représentation de la -sélection . 47 Figure 13 : Sélection positive et négative des thymocytes . 51 Figure 14 : Différenciation des cellules doubles positives en simples positives CD4 ou CD8 . 56 Figure 15 : Migration des cellules et évènements de sélection au sein du thymus 57 Figure 16 : Représentation de la protéine THEMIS1 . 60 Figure 17 : Modèle de la régulation positive de la signalisation . 64 Figure 18 : Lis1 dans la lissencéphalie . 69 Figure 19 : Structure de Lis1 . 71 Figure 20 : Représentation de Lis1 au sein du complexe PAFAH-1B. 73 Figure 21 : Représentation de la dynéine . 74 Figure 22 : La dynéine interagit avec la dynactine qui recrute des adaptateurs spécifiques. 76 Figure 23 : Lis1 initie le déplacement de la dynéine . 77 Figure 24 : Lis1 stabilise la dynéine aux extrémités positives des microtubules . 78 Figure 25 : Lis1 facilite le transport de chargements de taille importante. 79 Figure 26 : L'état nucléotidique de AAA3 régule l'activité de Lis1 vis-à-vis de la dynéine. 80 Figure 27 : Déroulement du cycle cellulaire . 84 Figure 28 : Schéma de conclusion décrivant les conséquences de la perte de Lis1 sur le développement des LT . 144 Figure 29 : Fonctions de Lis1 au cours de la prolifération des thymocytes et des LT . 155 Figure 30 : Fonctions hypothétiques des interactions dynéine/Lis1 et THEMIS1/Lis1 dans les thymocytes et LT . 158 3 4 LISTE DES ABREVIATIONS ADAP : Adhesion and Degranulation promoting Adapter Protein AGM : Aorta-Gonad-Mesonephros AIRE : Auto-Immune REgulator AKT : Serine-Threonine Kinase 1 APC : Adenomatous Polyposis Coli APC/C : Anaphase-Promoting Complex AP-1 : Activator Protein 1 ATP : Adenosine TriPhosphate Bad : Bcl-2-associated death promoter BCL-2 : B-cell lymphoma 2 BCL-6 : B-cell lymphoma 6 BCR : B Cell Receptor Bid : BH3 Interacting Domain Death Agonist Bim : Bcl-2 Interacting Mediator Of Cell Death BRAP : BRCA1-associated protein C(X)CL : C-(X)-C motif Ligand CARMA1 : CARD-containing MAGUK protein 1 CBM : Carma1-Bcl10-Malt1 complexe c-CBL : Casitas B-lineage Lymphoma CD : Cluster of Differentiation CDC42 : Cell Division Dontrol protein 42 CDK2 : Cyclin-Dependent Kinase 2 CDR : Complementarity Determining Regions CMH : Complexe Majeur d'Histocompatibilité CMP : Cellule Myéloide Progénitrice CMS : p130Cas ligand with multiple SH3 domains CPA : Cellule Présentatrice d'Antigène CSH : Cellule Souche Hématopoïétique cSMAC : central Supramolecular Activation Cluster cTEC : Cellule épithéliale thymique corticale CTLA-4 : Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated protein 4 C(X)CR : C-(X)-C motif Receptor DAG : DiAcylGlycerol DAMP : Damage-Associated Molecular Patterns DLL : DeLta-Like DN : Double Negatif DNA-PK : DNA-dependent protein kinase DP : Double Positif DREAM : Downstream Regulatory Element Antagonist Modulator dSMAC : central Supramolecular Activation Cluster E2A : Transcription Factor E2-Alpha ERK : Extracellular signal-Regulated Kinase ERM : Ezrin/Radixin/Moesin ETP : Early T-cell Precursor Fezf2 : FEZ Family Zinc Finger 2 FLT-3 : Fms Related Tyrosine Kinase 3 FoxO : Forkhead box O FoxP3 : Forkhead box P3 GADS : Grb2-related Adaptor Downstream of Shc 5 GATA3 : GATA Binding Protein 3 GDP : Guanosine DiPhosphate Grb2 : Growth factor receptor-bound protein 2 GTP : Guanosine TriPhosphate HEB : helix-loop-helix protein related to E2A ICAM1 : InterCellular Adhesion Molecule 1 Id3 : Inhibitor Of DNA Binding 3 IFN : Interféron Ig : Immunoglobulin IKK : IB kinase IL : Interleukine IP3 : Inositol triphosphate IQGAP1 : Ras GTPase-activating-like protein ITAM : Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif ITK : Interleukin-2-Inducible T-Cell Kinase JAK3 : JAnus Kinase 3 KSR : Kinase Suppressor of Ras KU70/80 : ATP-dependent DNA helicase 2 subunit KU70/80 LAT : Linker For Activation Of T Cells LB : Lymphocyte B LCK : Lymphocyte Cell-Specific Protein-Tyrosine Kinase LFA1 : Lymphocyte Function-associated Antigen 1 Lis1 : Lissencephaly-1 LMPP : Lymphocyte-primed MultiPotent Progenitors LT : Lymphocyte T MAIT : Mucosal-Associated Invariant T cells MALT1 : Mucosa-Associated lymphoid tissue Lymphoma Translocation protein 1 MAML1 : Mastermind-like protein 1 MAPK : Mitogen-Activated Protein Kinase MAZR : Myc-Associated Zinc-Finger MEK : Mitogen-activated protein kinase kinase MTBD : MicroTubule Binding Domain mTEC : Cellule épithéliale thymique médullaire NCK : Non-Catalytic Region Of Tyrosine Kinase NCor1 : Nuclear receptor Co-repressor 1 NFAT : Nuclear Factor of Activated T-cells NICD : Notch IntraCellular Domain NKT : Natural Killer T cells NFB : Nuclear Factor-kappa B Nud : Nuclear Distribution OVA : Ovalbumin peptid PAF : Platelet Activating factor PAFAH : PAF AcetylHydrolase PAMP : Pathogen-Associated Molecular Pattern pCMH : complexe CMH-peptide PD-1 : Programmed cell Death 1 PDK1 : Phosphoinositide-dependent kinase-1 PH : Pleckstrin Homology PIP2 : Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate PIP3 : Phosphatidylinositol-3, 4, 5-trisphosphate PKC : Protein Kinase C PLC-1 : Phospho Lipase C 6 PLK1 : Polo Like Kinase 1 PLK4 : Polo Like Kinase 4 PRR : Proline Rich Region ou Pattern recognition receptors PSGL1 : P-selectin glycoprotein ligand-1 pSMAC : peripheral Supramolecular Activation Cluster pT : Chaine invariante pre TCR PU. 1 : Hematopoietic Transcription Factor PU. 1 Rac1 : Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 RAG : Recombination-Activating Genes RAP1 : RAs-Proximate-1 RapL : Ras-proximate-1 binding protein RasGRP1 : Ras Guanyl-Releasing Protein 1 RBPJ : Recombining Binding Protein suppressor of hairless RhoA : Ras homolog gene family, member A RORT : RAR-Related Orphan Receptor RSS : Recombination Signal Sequences RUNX : RUNt-related transcription factor 1 SAS-6 : Spindle assembly abnormal protein 6 homolog SHP : Src Homology region 2 domain-containing phosphatase SKAP55 : Src kinase-associated phosphoprotein 55 SLP-76 : SH2 Domain-Containing Leukocyte Protein Of 76 KDa SNP : Single-Nucleotide Polymorphism SOCS : Suppressor Of Cytokine Signaling SOS : Son of Sevenless SP : Simple Positif STAT : Signal Transducers and Activators of Transcription STIL : Centriolar Assembly Protein STIM : Stromal interaction molecule SWI/SNF : SWItch/Sucrose Non-Fermentable SYK : Spleen Associated tyrosine Kinase TCR : T Cell Receptor TH : T Helper THEMIS : Thymocyte-Expressed Molecule Involved In Selection ThPOK : Th Inducing POZ-Kruppel Factor TOX : Thymocyte Selection Associated High Mobility Group Box TRA : Tissue-Restricted Antigens TRAF6 : TNF Receptor Associated Factor 6 Treg : Lymphocyte T régulateur TSP : Thymic Setting Progenitor TSSP : Thymus-Specific Serine Protease VAMP-7 : Vesicle-Associated Membrane Protein 7 VCAM1 : Vascular Cell Adhesion Molecule 1 WASP : WiskottAldrich Syndrome Protein WAVE : WASP-family verprolin-homologous protein XCCR4 : X-Ray Repair Cross Complementing 4 ZAP-70 : Zeta Chain Of T Cell Receptor Associated Protein Kinase 70 7 8 AVANT PROPOS L'introduction d'un élément étranger au sein de l'organisme et la transformation des cellules en cellules tumorales mobilisent des mécanismes de reconnaissance mis en jeu par le système immunitaire. Deux types de système immunitaire se distinguent selon le type de mécanisme de reconnaissance mobilisé : le système immunitaire inné entrainant une action rapide mais peu spécifique des pathogènes et le système immunitaire adaptatif entranant une réponse plus lente mais dotée d'une mémoire très spécifique des pathogènes. Les cellules de l'immunité innée telles que les cellules dendritiques, les basophiles, éosinophiles et macrophages expriment à leur surface des récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires PRR (Pattern Recognition Receptor). Ces récepteurs sont capables de reconnatre des molécules spécifiquement exprimées par des pathogènes appelés PAMP (Pathogen Associated Molecular Pattern) mais aussi des molécules DAMP (Damage Associated Molecular Pattern) exprimées dans l'organisme hôte par les cellules affectées lors d'inflammations. La reconnaissance de PAMP, peut conduire à l'endocytose du pathogène qui est dégradé au sein de la cellule, et/ou à la libération de médiateurs inflammatoires qui facilitent la mise en place d'une première ligne de défense. Les peptides issus de la dégradation des pathogènes sont apprêtés au complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) qui, une fois exprimé à la surface des cellules, peut être reconnu par les récepteurs des lymphocytes T (TCR), des cellules essentielles du système immunitaire adaptatif. La reconnaissance très spécifique de ces peptides (antigènes) par les TCR conduit à l'activation, à la prolifération et à la différenciation des lymphocytes T en sous- populations effectrices ayant des fonctions spécialisées. Les lymphocytes T CD4 peuvent se différencier en différents sous-types de cellules qui orchestrent les réponses immunitaires selon le type d'agent infectieux ou d'élément pathogène. Les lymphocytes T CD8 exercent une activité cytotoxique sur les cellules infectées ou cancéreuses. Les cellules de l'organisme dégradent constamment leurs protéines et apprêtent au CMH des peptides qualifiés du soi qui sont reconnus par les lymphocytes T mais n'entranent pas de réponse immunitaire. Dans le cas de cellules transformées, l'apprêtement se fait parfois avec des peptides issus de mutations géniques appelés néo-antigènes pouvant être reconnus par les récepteurs des lymphocytes T. Cette reconnaissance entraine une réponse immunitaire contre ces cellules anormales. 9 Contrairement aux lymphocytes T, les lymphocytes B ne reconnaissent pas les peptides présentés par les molécules du CMH, mais reconnaissent directement des protéines issues des pathogènes via un récepteur d'antigène exprimé à leur surface appelé BCR (B Cell Receptor). La reconnaissance d'antigènes spécifiques par les lymphocytes B entrane leur activation et leur différenciation en plasmocytes capables de produire des anticorps spécifiques des agents infectieux contribuant à leur élimination. Les lymphocytes se développent initialement au sein de la moelle osseuse à partir de cellules souches hématopoïétiques. Alors que les précurseurs des lymphocytes T migrent vers le thymus pour continuer leur développement, les précurseurs des lymphocytes B poursuivent leur maturation dans la moelle osseuse. Après leur développement, les lymphocytes migrent vers les organes lymphoïdes secondaires tels que la rate et les ganglions lymphatiques o ils sont susceptibles d'être activés, de proliférer et de se différencier après la reconnaissance d'un antigène. Au cours de ma thèse, je me suis particulièrement intéressé aux mécanismes qui gouvernent le développement des lymphocytes T dans le thymus et leur homéostasie dans les organes lymphoïdes périphériques. J'ai mis en évidence des rôles essentiels de Lis1, un régulateur du moteur moléculaire dynéine associé aux microtubules, au cours de la prolifération des lymphocytes T lors de ces processus. 10 INTRODUCTION 11 12 INTRODUCTION GENERALE Il existe deux types de lymphocytes T (LT) : les LT non conventionnels regroupant les lymphocytes TNKT et MAIT et les LT dits conventionnels ou lymphocytes T. Les LT non conventionnels représentent 2 à 10% des LT circulants (1, 2). Leur activation ne nécessite pas forcement la reconnaissance d'un peptide antigénique. Comme les cellules de l'immunité innée, la reconnaissance directe d'un pathogène ou de ces molécules peut suffire à activer ces cellules. Les lymphocytes Treprésentent la majorité des LT circulants au sein de l'organisme. Ils regroupent les LT auxiliaires exprimant le corécepteur CD4 et les LT cytotoxiques exprimant le corécepteur CD8. Les LT CD4 déclenchent, orientent et régulent la réponse immunitaire alors que les LT CD8 exercent des effets cytotoxiques qui entrainent l'apoptose des cellules infectées ou transformées. Nous nous concentrerons dans la suite de cette thèse aux lymphocytes T I. Le récepteur des lymphocytes T Les lymphocytes T se caractérisent par l'expression d'un récepteur des lymphocytes T (TCR) composé des chanes TCRet TCR ainsi que par l'expression des corécepteurs CD4 ou CD8. Chaque LT exprime un TCR spécifique ayant une affinité particulière pour un antigène donné. La synthèse et l'assemblage des TCR se déroulent au sein du thymus lors du développement des LT et fait suite à des réarrangements complexes de gènes. La reconnaissance d'un antigène par les LT matures, peut conduire à l'amplification des LT spécifiques par expansion clonale mais aussi à leur différenciation en sous populations effectrices ayant des fonctions spécifiques. 1. Structure des récepteurs des lymphocytes T Le TCR est un complexe multiprotéique constitué des chaines variables TCR et TCR, responsables de la reconnaissance antigénique, et de trois dimères invariants, CD3, CD3 et les chanes . Lors de son expression au sein du réticulum endoplasmique, la chaine TCRs'associe avec le dimère CD3alors que la chaine TCR s'associe au dimère CD3Le dimère serait essentiel à l'association du complexe TCR/CD3au complexe TCR/CD3et à sa stabilité pour sa progression vers la membrane plasmique (4) (5) (Fig. 1) 13 1. 1. La région transmembranaire leur lipides de interaction aux Toutes les sous unités du TCR sont constituées d'une région transmembranaire en hélice hydrophobe permettant la membrane plasmique. Etonnamment, cette région transmembranaire contient des résidus chargés conservés, incompatibles avec un environnement hydrophobe mais impliqués dans le maintien du complexe TCR/CD3/CD3/. En effet, les résidus acides, l'acide glutamique de la chaine CD3 et les acides aspartiques des chaines CD3et CD3 établissent des interactions ioniques avec les résidus basiques lysines et arginines des chaines et (6, 7). Ces résidus, en plus de maintenir assemblé le complexe TCR, sont essentiels à son expression stable à la membrane plasmique (8, 9). 1. 2. Les domaines extracellulaires Les caractéristiques des domaines transmembranaires des sous unités CD3 et des chaines et du TCR sont similaires, mais celles des domaines extracellulaires sont bien différentes. Les deux chaines et présentent chacune une région constante et une région variable à l'extrémité N-terminale présentant, une fois assemblée, une affinité pour un antigène donné. Les deux chaines sont reliées entre elles par un pont disulfure au niveau de leur région constante. Les cystéines établissant cette liaison ne semblent pas indispensables dans l'expression et la stabilité du TCR. En effet, la mutation de ces cystéines ne conduit pas à un défaut d'expression de TCR à la membrane plasmique (10). La résolution de structure par cristallographie au rayon X révèle une structure globulaire à feuillets des régions variables et constantes (11). Les boucles au niveau des régions variables représentent des régions hypervariables appelées CDR qui sont au nombre de trois par chaine. Les CDR1 et CDR2 se trouvent en périphérie du site de reconnaissance du peptide antigénique et interagissent avec les hélices des CMH à la surface des cellules présentatrices d'antigènes (CPA). Les CDR3 se localisent au niveau du site d'interaction du TCR avec les peptides antigéniques présentés par les CMH (12). Les chaines CD3 et la chane ont une région extracellulaire n'ayant pas de contact avec les complexes CMH-peptides (pCMH). Les chaines , et ont un domaine extracellulaire formant une structure globulaire contenant des feuillets . La chaine ne comporte que 9 résidus d'acides aminés. Les domaines extracellulaires des chaines , et interagissent 14 avec les chaines et (13). Des cystéines réalisent des ponts disulfures entre les deux chaines ce qui n'est pas le cas pour les dimères CD3 et CD3. La mutation de la cystéine de la chaine extracellulaire , conduit au défaut d'expression des TCR à la membrane plasmique (14, 15). De plus, le remplacement de la région extracellulaire de la chaine CD3 par la région extracellulaire de la chaine CD3 affecte l'expression à la surface cellulaire du TCR (13). Ces résultats démontrent l'importance des domaines extracellulaires des chaines CD3 et CD3 dans l'adressage du TCR à la membrane plasmique. 1. 3. Les domaines intracellulaires Tout comme pour les domaines extracellulaires, les domaines intracellulaires des différentes chaines constituant le TCR ont des caractéristiques spécifiques. Les deux chaines et contiennent une petite région intracellulaire correspondant aux extrémités C-terminales des protéines dont la fonction n'a pas été fortement étudiée. Il semblerait cependant, que la petite région intracellulaire de la chaine soit impliquée dans la régulation de l'expression du TCR, suite à la stimulation, en favorisant sa dégradation (16). Les chaines CD3 et se caractérisent par la présence de motifs ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) dans leur région intracellulaire (17). Ces motifs contiennent des résidus tyrosines qui peuvent être phosphorylés suite à l'engagement du TCR et qui sont indispensables à la transmission de la signalisation (18-20). Les CD3 , et possèdent un seul ITAM alors que le long domaine intracellulaire des chaines en comporte trois, totalisant ainsi un nombre de 10 ITAM par TCR. La séquence consensus d'un ITAM est YxxI/Lx(6- 8)YxxI/V/L o X représente un acide aminé divers. Il existe donc une certaine diversité entre les ITAMs portés par les sous-unités de signalisation. Cette diversité semble être importante dans le développement des LT, l'activation des cellules et l'expression du TCR (21). Les résidus leucines et isoleucines des ITAMs ne sont pas phosphorylables suite à l'engagement des TCR mais ils sont néanmoins nécessaires à la transmission de signaux efficaces (22). 15 Figure 1 : Représentation d'un récepteur des lymphocytes T Représentation schématique d'un TCR constitué de trois dimères de chaines invariantes CD3CD3et et de deux chaines variables et totalisant un nombre de dix ITAM essentiels à la signalisation du TCR. La vue 3D, permet de se rendre compte des interactions électriques s'effectuant entre les différentes chaines du TCR importantes pour la stabilité du complexe. Au sein de l'ITAM, X représente un acide aminé quelconque, I/L : Isoleucine ou leucine, I/V/L : Isoleucine, Valine ou Leucine, x(6-8) : intervalle constitué de 6 à 8 acides aminés quelconques. Adapté de Molecular mechanisms for the assembly of the T cell receptorCD3 complex de Call et Wucherpfennig 2004 2. La recombinaison V(D)J L'immunité adaptative repose sur des récepteurs, hautement spécifiques de peptides ou de protéines issus de pathogènes, qui sont exprimés à la surface des LT et des lymphocytes B (LB). Chaque TCR et récepteur des lymphocytes B (BCR) présentent des affinités différentes formant ainsi un répertoire de LT et de LB. L'expression du TCR et du BCR repose sur des 16 recombinaisons complexes d'un grand nombre de gènes appelés gènes V (Variable), D (Diversité) et J (Jonction). Le complexe RAG (Recombination-Activating Genes), constitué des protéines RAG1 et RAG2, est spécifique de la recombinaison V(D)J et est exprimé spécifiquement par les LT et LB. La déficience en RAG1 conduit à un défaut majeur du développement des lymphocytes, avec un blocage des cellules au cours des stades précoces du développement (23). Par la suite, je discuterai plus particulièrement des principes de recombinaison s'effectuant au cours du développement des LT (Fig. 2). Figure 2 : Représentation des gènes et ainsi que des chaines et du TCR issues de la recombinaison V(D)J Les gènes et sont constitués d'un ensemble de gènes codant la région Variable (V), Diversité (D), Jonction (J) et constante (C) de la chaine ou . Après recombinaison par le complexe RAG, un segment de gène par gène V, (D), J et C seront assemblés pour être exprimés en chaine ou . Entre parenthèses est indiqué le nombre de segments de gènes dans chaque gène V et J. Adapté de Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination de Shatz et Ji 2011 2. 1. Mécanismes biochimiques de la recombinaison La recombinaison V(D)J repose sur l'activité du complexe RAG mais aussi d'autres protéines impliquées dans la réparation de l'ADN. Les séquences RSS (Recombination Signal Sequences), bordant les gènes V, D et J, sont essentielles à la recombinaison car elles permettent le recrutement du complexe RAG. Ces séquences sont palindromiques et contiennent une séquence d'espacement de 12 ou 23pb. La recombinaison préférentielle s'effectue entre deux séquences RSS constituées de séquences d'espacement de 12 et 23pb. Les complexes RAG situés sur chaque séquence RSS se tétramérisent conduisant 17 aux rapprochements des deux séquences de gènes à fusionner et procèdent au clivage du double brin d'ADN entre la séquence RSS et le gène d'intérêt. Ce clivage entraine l'apparition d'un groupement hydroxyle effectuant une attaque nucléophile sur le groupement phospho- diester du brin opposé générant ainsi une structure en épingle à cheveux. KU70 et KU80 sont recrutées aux extrémités issues du clivage par le complexe RAG, favorisant le recrutement d'Artemis pour rompre l'épingle à cheveux des deux extrémités à assembler. L'activité d'Artemis n'étant pas spécifique, la rupture est aléatoire et peut générer soit des extrémités franches ou cohésives. La terminale transférase DNA - PK procède à l'ajout aléatoire ou à l'élimination de bases azotées afin de permettre à l'ADN Ligase XRCC4 de joindre les deux fragments de gènes. L'ensemble de ces évènements contribuent à la diversité du répertoire de TCR et de BCR (24) (Fig. 3). Figure 3 : Schématisation d'une recombinaison VJ Représentation la de recombinaison entre un fragment de gène variable avec un fragment de gène Jonction. Le gène réarrangé est constitué de la prochaine région variable et jonction d'une chaine de TCR. Adapté de Janeway 18 2. 2. Régulation de la recombinaison L'expression des sous unités du complexe RAG semble être un évènement essentiel dans la régulation de la recombinaison ainsi que l'accessibilité des gènes dans la chromatine. Par ailleurs, des séquences activatrices ou enhancer E et E favorisent la recombinaison des gènes. Ces séquences sont capables de recruter des acteurs de la recombinaison et peuvent aussi être soumis à des processus de régulation qui modulent les évènements de recombinaison (25-27). Expression de la machinerie de recombinaison : L'expression des RAG est séquentielle lors du développement des LT. En effet, elle s'effectue lors des stades précoces du développement pour la recombinaison de la chaine , puis s'interrompt pour reprendre lors des stades plus tardifs, pour la recombinaison de la chaine . L'expression des RAG est interrompue à nouveau après cette dernière recombinaison (28). La signalisation régule l'expression de RAG au sein des LT. En effet, la délétion de l'adaptateur moléculaire LAT (Linker For Activation Of T Cells) dans la lignée cellulaire Jurkat contribue à une augmentation de l'expression de RAG. De plus, l'inhibition d'acteurs des voies de signalisation dans le même modèle, ou dans des modèles murins, conduit aussi à cette augmentation en comparaison à des cellules stimulées sans inhibiteur (29, 30). L'expression de RAG peut aussi être directement régulée par des modifications post- traductionnelles. En effet, l'expression de RAG étant restreinte au stade G1 du cycle cellulaire, des mécanismes de régulation sont mis en place au cours du cycle cellulaire. La phosphorylation de RAG2 sur la thréonine T490 par le complexe cyclinA/CDK2 entrane l'adressage au protéasome de RAG2 durant la phase G2 du cycle cellulaire. La prolifération induite par la -sélection peut donc favoriser la dégradation du complexe RAG (31). Accessibilité aux gènes : La recombinaison des gènes se fait d'abord sur un des deux allèles. Si la recombinaison entraine le réarrangement d'une chaine fonctionnelle, des voies de signalisation conduisent à l'exclusion allélique des gènes codant les chaines et . Cette exclusion allélique coupe l'accès des gènes au complexe RAG sur cet allèle afin d'empêcher l'expression à la surface de plusieurs TCR ayant des spécificités distinctes. Cette exclusion allélique est due à des modifications post-traductionnelles des histones bloquant la fixation des protéines RAG sur les séquences RSS des gènes codant pour la chane . Le recrutement de RAG au niveau des gènes à réarranger est fortement dépendant de la 19 triméthylation des histones H3 sur leur lysine 4. RAG2 interagit avec les histones méthylées par son domaine PHD ce qui déclenche son activité enzymatique (32, 33). La déméthylation des histones peut conduire à l'arrêt du recrutement du complexe RAG et par conséquent réprimer le réarrangement de gènes (34). II. Les corécepteurs CD4 et CD8 Les corécepteurs CD4 et CD8 sont exprimés par les LT auxiliaires et cytotoxiques respectivement. Ce sont des glycoprotéines exprimées dans le réticulum endoplasmique et exportées à la membrane plasmique. Le corécepteur CD8 est constitué de sous unités et alors que le corécepteur CD4 ne représente qu'une seule protéine (35-37) La région extracellulaire de ces glycoprotéines contient une séquence ayant une forte affinité pour les CMH. Le CD4 présente une séquence d'interaction avec le CMH de classe II (CMH- II) alors que le CD8 interagit spécifiquement avec le CMH de classe I (CMH-I) (38-43). La fonction de cette interaction vis-à-vis du complexe TCR-pCMH est discutée. Alors que le CD8 semble interagir avec le CMH afin de maintenir l'interaction TCR-pCMH (44, 45), le CD4 ne semble pas avoir cette fonction de soutien (46). Les régions intracellulaires des corécepteurs CD4 et CD8 interagissent avec la protéine kinase LCK (Lymphocyte Cell-Specific Protein-Tyrosine Kinase) impliquée dans le déclenchement de la signalisation des LT (47, 48). Il est clairement démontré que l'engagement des corécepteurs CD4 et CD8 par les pCMH facilite le déclenchement des signaux par les TCR (49). Cependant, Jiang et al, ont observé que le corécepteur CD8 est recruté au TCR après son engagement (50). Un nouveau modèle émerge selon lequel des phosphorylations des ITAM par LCK, indépendamment des CD4 et CD8, se déroulent suite à l'engagement des TCR. Ces phosphorylations conduiraient au recrutement des corécepteurs CD4 ou CD8 par les LCK associés à leur région intracellulaire afin de soutenir et augmenter la signalisation (51) (Fig. 4). 20 Figure 4 : Représentation des corécepteurs CD8 et CD4 complexés au CMH-I et CMH-II respectivement Suite à l'engagement du TCR par le complexe pCMH, le corécepteur CD4 ou le corécepteur CD8 sont recrutés suite à l'activation de LCK. Le CMH-I interagit par son domaine 3 au domaine globulaire de la chaine du CD8. Le CMH-II interagit par son domaine 2 avec le corécepteur CD4. Adapté de Garland science 2005 III. Réponse des lymphocytes T suite à la reconnaissance d'un antigène 1. Signalisation suite à l'engagement des TCR Lors de la détection d'un élément étranger par les cellules de l'immunité innée, celles-ci peuvent phagocyter le pathogène, le dégrader et produire des peptides antigéniques qui sont associés aux CMH et exprimés à la surface des cellules. Les CPA professionnelles migrent ensuite vers les organes lymphoïdes secondaires o elles rencontrent des LT naïfs susceptibles de reconnaitre spécifiquement les antigènes présentés par les CPA. La reconnaissance des antigènes par le TCR entraine d'importants réarrangements moléculaires au sein des LT. La signalisation des cellules conduit à l'expression de gènes spécifiques entranant la prolifération et la différenciation des cellules. 21 1. 1. Complexes de signalisation mis en jeu lors de la reconnaissance antigénique La reconnaissance du complexe pCMH par le TCR conduit au recrutement du corécepteur CD4 ou CD8 au voisinage du TCR (50, 51). L'association du TCR avec le pCMH entrane des changements conformationnels des chaines intracellulaires de CD3 qui aboutissent à l'exposition des tyrosines des ITAM alors accessibles au domaine kinase des protéines LCK (52-55). LCK phosphoryle les tyrosines des ITAM, entrainant le recrutement des kinases ZAP-70 (Zeta Chain Of T Cell Receptor Associated Protein Kinase 70) qui sont ensuite phosphorylées et activées par LCK (48, 56, 57). Les kinases ZAP-70 activées phosphorylent alors des tyrosines situées sur le domaine intracytoplasmique des adaptateurs LAT. Les phosphorylations de ces adaptateurs favorisent le recrutement de plusieurs complexes moléculaires à l'origine de voies de signalisation distinctes (58, 59) (Fig. 5). Figure 5 : Représentation de la signalisation précoce suite à l'engagement du TCR la kinase LCK activée par L'engagement du TCR entraine déphosphorylation de la tyrosine inhibitrice Y505 par CD45. La trans-phosphorylation de LCK conduit à la phosphorylation de la tyrosine activatrice Y394 qui stabilise la conformation active de l'enzyme. LCK est recrutée avec le CD4 (ou CD8) au TCR et phosphoryle les tyrosines des ITAM des CD3 et des chaines conduisant au recrutement de ZAP-70 aux ITAM phosphorylés. Cette kinase est activée par transphosphorylation ou par LCK. Une fois activé, ZAP-70 phosphoryle l'adaptateur LAT. Adapté de T cell receptor signalling networks : branched, diversified and bounded par Brownlie et Zamoyska 2013. le recrutement de 22 Activation de LCK : LCK est une protéine kinase de la famille des Src, implantée dans la membrane plasmique par la myristoylation et palmitoylation de son extrémité N-terminale (60, 61) . Elle contient un domaine SH2, capable d'interagir avec des tyrosines phosphorylées contenues dans des motifs précis, et un domaine SH3 important dans la transmission des signaux (62-64). Ces protéines peuvent naviguer seules sous la membrane plasmique, ou associées au domaine intracellulaire des CD8 et des CD4 avec lesquelles elles interagissent via des régions riches en cystéines (65, 66). En absence de signal, la majorité des LCK sont sous conformation inactive suite à la phosphorylation par CSK de la tyrosine inhibitrice Y505 (67, 68). Cette phosphorylation conduit à une auto-inhibition de LCK par interaction de son domaine SH2 avec la tyrosine phosphorylée entrainant une conformation inactive (69-71). Suite à l'engagement des TCR, la protéine phosphatase CD45 déphosphoryle la tyrosine inhibitrice de LCK entranant l'ouverture de la protéine dans une conformation active. LCK autophosphoryle en trans la tyrosine Y394 de son site catalytique ce qui stabilise sa conformation active (60, 72). Un autre modèle plus récent suggère qu'une fraction de LCK préexiste sous forme activée dans les cellules au repos. Dans ce modèle, l'engagement des TCR n'entrane pas d'augmentation de l'activité de LCK mais conduit à une redistribution des protéines à proximité du TCR permettant ainsi la phosphorylation des ITAM (73). Les mécanismes permettant cette redistribution sont encore mal compris. Recrutement de ZAP-70 : Une fois activée, LCK phosphoryle les tyrosines des ITAM des CD3 (48). Cette phosphorylation conduit au recrutement de ZAP-70 qui interagit via ses domaines SH2 avec les tyrosines phosphorylées des ITAM (57, 74, 75). La fixation de ZAP- 70 sur les ITAMs phosphorylés entraine un changement conformationnel exposant les tyrosines Y315, Y319 et Y493 de ZAP-70 qui peuvent alors être phosphorylées par les protéines kinase LCK (76-81). Les tyrosines Y315 et Y319 se trouvent sur une région flexible en amont du domaine SH2 alors que la tyrosine Y493 est localisée sur le domaine SH2 (77, 82, 83). Ces phosphorylations entrainent l'exposition du site catalytique déclenchant alors l'activation de la fonction kinase de ZAP-70 (84). Phosphorylation de LAT : Une fois activée, la protéine kinase ZAP-70 phosphoryle les tyrosines Y132, Y171, Y191 et Y226 de LAT (58, 59). LAT est une protéine transmembranaire, avec une petite région extracellulaire et une grande région intracellulaire sur laquelle se trouve les tyrosines phosphorylées par ZAP-70. La pY132 est le site d'ancrage pour la PLC- 1 (Phospho Lipase C . Les pY226 et pY191 sont essentielles pour le recrutement du facteur d'échange de guanines Vav1 à LAT. Une fois phosphorylées, les Y171, Y191 et Y226 peuvent 23 entrainer le recrutement de l'adapteur Grb2 (Growth factor receptor-bound protein 2). Les pY191 et pY171 peuvent également interagir avec l'adaptateur GADS (Grb2-related Adaptor Downstream of Shc). Le recrutement de GADS conduit au recrutement à LAT de l'adaptateur SLP-76 (SH2 Domain-Containing Leukocyte Protein Of 76 KDa). Par ailleurs, le recrutement à LAT de Grb2 entrane celui de SOS (Son of Sevenless) ou de THEMIS1 (Thymocyte- Expressed Molecule Involved In Selection) qui interagissent constitutivement avec l'adaptateur (85-88). Phosphorylation de SLP-76 : SLP-76 interagit constitutivement avec les protéines PLC-1 et GADS (89). Une fois recrutée à LAT via GADS, ZAP-70 phosphoryle SLP-76 sur plusieurs tyrosines (90). La phosphorylation de SLP-76 sur la tyrosine Y112, Y128 et Y145 conduit au recrutement d'autres protéines de signalisation telles que la kinase ITK qui est responsable de la phosphorylation de la PLC-1 (91, 92) Ces tyrosines phosphorylées peuvent aussi conduire au recrutement de ADAP, NCK, et Vav1 (93-96). Par conséquent, la phosphorylation de LAT entrane le recrutement d'un ensemble de complexes moléculaires à l'origine de différentes voies de signalisation. 24 1. 2. Principales voies de signalisation Figure 6 : Recrutement des complexes de signalisation à LAT La phosphorylation de LAT par ZAP-70 conduit au recrutement de Grb2, GADS, PLC-1. Le recrutement de Grb2 entraine le recrutement de THEMIS1 qui régule la signalisation ou SOS qui active la voie des MAP kinases. GADS, conduit au recrutement de l'adapteur moléculaire SLP-76 qui est, par la suite, phosphorylé par ZAP-70. Cette phosphorylation entraine le recrutement de Vav1 et ADAP qui régule le cytosquelette, mais aussi de Pi3K qui active AKT et enfin ITK qui active PLC-1. L'activation de PLC-1 entraine la production de DAG et d'IP3 à partir de PIP2. IP3 entraine le relargage calcique et DAG s'associe à RasGRP et déclenche la voie des MAP kinases par activation de Ras par RasGRP. Adapté de Role of the LAT adaptor in T-cell development and Th2 differentiation. de Malissen et al. , 2005. L'ensemble de ces phosphorylations déclenchent le recrutement de complexes moléculaires entrainant l'activation ou la répression de voies de signalisation distinctes. La phosphorylation de PLC-1 active sa fonction phospholipase qui rompt la liaison phosphodiester reliant le groupement phospho-inositol au groupement diacylglycérol du phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (Pi(4, 5)P2) (97). Cette hydrolyse conduit à la formation de diacylglycérol (DAG) et d'inositol 1, 4, 5-triphosphate (IP3) (98) (Fig. 6). Voies calciques : L'IP3 peut être capté par le récepteur à l'IP3 à la surface du réticulum endoplasmique entrainant le relargage calcique depuis le réticulum endoplasmique vers le cytoplasme. Le calcium relâché dans le cytoplasme peut être capté par les domaines EF- Hand de STIM conduisant à son oligomérisation. Le complexe STIM interagit avec le canal 25 ionique Orai1 à la membrane plasmique entrainant son ouverture et une entrée massive de calcium depuis le milieu extracellulaire (99, 100). Le flux calcique entraine l'activation du complexe calcineurin/calmodulin qui déphosphoryle le facteur de transcription NFAT et favorise ainsi sa translocation nucléaire. Au sein du noyau, en collaboration avec AP-1 qui est activé par les voies des MAPK, le complexe NFAT/AP-1 favorise l'activation de gènes essentiels à l'activation cellulaire (101). Le calcium peut aussi permettre de lever des répressions dépendantes de facteurs de transcription. La protéine DREAM, sous forme tétramère, agit comme répresseur de l'expression de certains gènes. En présence de calcium, capté par les domaines EF-Hand des protéines DREAM, un changement conformationnel conduit à la dissociation du complexe et ainsi à la levée de l'inhibition des gènes réprimés par DREAM. L'expression d'une protéine DREAM constituée de domaines EF-Hand insensibles au calcium, entraine la diminution d'expression de cytokines. Cet événement s'accompagne de la diminution de la prolifération des LT (102). Voies des MAP kinases : Le DAG peut être capté par la région C1 présente sur certaines kinases PKC permettant la phosphorylation de la protéine RasGRP, qui permet l'échange de GDP en GTP sur les protéines Ras (103). La protéine SOS, qui est recrutée à LAT via Grb2 a aussi une fonction d'échangeur de guanine sur Ras et fonctionne en collaboration avec RasGRP (104). L'activation de Ras conduit à une cascade d'activation de kinase en phosphorylant les protéines Raf (MAPKKK) qui activent les kinases Mek (MAPKK) qui enfin activent les kinases Erk (MAPK). Les kinases Erk phosphorylent et activent Elk1 qui une fois transloquée dans le noyau active AP-1 (105). La protéine adaptatrice KSR favorise la signalisation des MAPK en regroupant les différentes protéines de la voie (106). La déficience en KSR conduit à la diminution de la phosphorylation de Erk dans les LT. Cette diminution de stimulation s'accompagne d'une diminution de la prolifération des LT (107, 108). Il est connu que BRAP régule négativement la voie des MAP kinases en inactivant la protéine adaptatrice KSR (109-111). Cependant, aucune donnée n'existe concernant la fonction de BRAP au sein des LT. Voies NFB : Tout comme la voie des MAP kinases, le DAG peut être capté par un domaine spécifique d'une isoforme de PKC appelé PKC. PKCphosphoryle CARMA1 ce qui entraine son oligomérisation et le recrutement de BCL-10 et enfin de MALT1. Ce complexe appelé CBM conduit à l'activation de TRAF6 qui active IKK par recrutement de TAK1. L'activation de IKK permet la phosphorylation d'IB entrainant sa dégradation et la libération des protéines NFB qui étaient retenues dans le cytoplasme par IB. Les protéines NFB 26 peuvent alors être internalisées dans le noyau o elles vont contribuer à l'expression de gènes essentiels à l'activité des LT (112, 113). Voies PI3K/AKT : Le recrutement de la PI3K à LAT, suite à l'engagement des TCR, conduit à la phosphorylation du PIP2 (Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate) formant alors du PIP3 (Phosphatidylinositol-3, 4, 5-trisphosphate) dans le feuillet interne de la membrane plasmique. Le PIP3 recrute ensuite des molécules contenant des domaines homologues pleckstrines PH telles que PDK1 et AKT. PDK1 phosphoryle AKT sur sa thréonine T308 et sérine S473 activant son groupement catalytique (114, 115). La phosphorylation par pAKT de p27, un régulateur négatif du cycle cellulaire, conduit à sa rétention et sa dégradation au sein du cytoplasme. Cela permet l'entrée des cellules dans le cycle cellulaire (116). Par ailleurs, la phosphorylation des facteurs de transcription de la famille FoxO par Akt favorise la rétention du facteur de transcription dans le cytoplasme. Les gènes régulés par FoxO tels que le facteur pro-apoptotique Bad sont alors moins exprimés conduisant à la survie et à la prolifération des cellules (117, 118). Les voies de signalisation décrites dans cette partie sont mises en jeu lors de l'engagement des TCR par les complexes pCMH. La signalisation des TCR est aussi modulée par des corécepteurs qui peuvent être engagés par des ligands exprimés sur les cellules présentatrices d'antigènes. Le corécepteur CD28, par exemple, interagit avec ses ligands CD80 et CD86 à la surface des CPA (119, 120). La déficience en CD28 entraine la diminution de la prolifération des LT suite à une immunisation (121). Par ailleurs, la stimulation des LT sans engagement du CD28 conduit à une signalisation moins efficace et une activation plus faible des LT (122). Ces corécepteurs sont, en effet, importants dans la signalisation et dans l'activité des LT (123, 124). D'autres corécepteurs existent et peuvent jouer un rôle stimulateur ou inhibiteur dans la signalisation, l'activation et les fonctions des LT. 1. 3. Synapse immunologique Les LT scannent les CPA à la recherche d'un éventuel antigène auquel ils sont spécifiques (125). L'engagement du TCR, provoque l'arrêt des mouvements cellulaires et à l'élaboration d'une zone de contact cellulaire étroite entre les LT et les CPA appelée synapse immunologique (126-129). Cette structure est importante dans l'activation des LT. En plus de cette activation, elle permet la polarisation des molécules effectrices en direction des cellules cibles dont elles régulent l'activation ou l'apoptose (130-132). La synapse 27 immunologique se caractérise par trois régions : une région centrale cSMAC (central Supramolecular Activation Cluster) dans laquelle se concentrent les TCR, les corécepteurs CD4 et CD8, d'autres corécepteurs tels que CD28 et de nombreuses protéines de signalisation, une région proximale pSMAC contenant les intégrines responsables de l'adhérence cellulaire et enfin une région distale dSMAC au sein de laquelle se trouvent des corécepteurs régulant la signalisation tels que CD43 et CD45 (133, 134) (Fig. 7A). Lors de l'engagement du TCR, le recrutement et la phosphorylation de SLP-76 entrainent le recrutement de la protéine ADAP (95, 135). ADAP interagit constitutivement avec SKAP55. RAP1GTP, la forme activée de RAP1, est produite par une RAPGEF suite à la production de DAG qui recrute PKC(136, 137). RAP1GTP interagit avec SKAP55 et conduit à l'activation des intégrines LFA-1 probablement par recrutement de RapL (138). Cette voie de signalisation, augmente l'affinité de LFA-1 pour son ligand ICAM-1 et favorise l'adhérence cellulaire et la production d'actine corticale au niveau du dSMAC (96, 139-141). Le recrutement de Vav1 à SLP-76 phosphorylée, conduit à la nucléation des fibres d'actine par activation de CDC42 et Rac1 par échange de leur GDP en GTP (142, 143). Cette activation provoque l'activation de Arp2/3 par recrutement et activation de WASP par CDC42 et de WAVE par Rac1 (144-146). L'élaboration de la synapse immunologique est fortement dépendante du cytosquelette d'actine. L'utilisation d'agents chimiques affectant les fibres d'actine compromet la formation et l'activité de la synapse immunologique (147, 148). L'actine favorise le recrutement des microsclusters de TCR au cSMAC par contraction mécanique favorisée par la protéine motrice myosine. La perte de la myosine IIA par interférence à ARNm ou traitement par les inhibiteurs Blebbistatin et ML-7 dans des LT CD4 humains ou murins entraine la diminution de la signalisation et de l'activation des LT. Ce moteur favorise donc le mouvement des TCR vers la synapse immunologique dans des cellules primaires de souris et humaines (149-152). La formation de la synapse immunologique nécessite des réarrangements moléculaires au niveau de l'actine afin de favoriser le déplacement des molécules à la surface de la membrane plasmique. L'activation de Vav1 est associée à la diminution de la phosphorylation des protéines ERM, un complexe reliant les fibres d'actine aux protéines de la membrane plasmique. Cette déphosphorylation conduit à la solubilisation du complexe ERM et donc à la flexibilité de la synapse immunologique pour favoriser les remaniements moléculaires à la surface cellulaire. (153, 154). Les fibres d'actine et les microtubules se coordonnent dans la stabilisation et la fonction de la synapse immunologique. Le recrutement du centrosome au niveau de la zone de contact entre la CPA et le LT, est une des caractéristiques de la formation de la synapse 28 interagir avec la dynéine et favoriser immunologique (155-157). L'interruption des microtubules par des agents chimiques conduit au défaut de recrutement du centrosome et à la formation de conjugués instables. Bien que la sécrétion des cytokines ne soit pas affectée par l'absence de microtubule, la polarisation de ces dernières vers la cellule cible est compromise (158). Les mécanismes mis en jeu dans le recrutement du centrosome sont encore à l'étude. Mais une publication proposait qu'ADAP puisse le recrutement du centrosome par coulissement au cours de la signalisation des intégrines (159). Les moteurs moléculaires dynéines et kinésines, se déplaçant sur les microtubules, sont impliqués dans la formation de la synapse immunologique et sa fonction. Le traitement des LT CD4 primaires de souris par EHNA, un inhibiteur de la dynéine, ou par ARNm interférents n'entraine pas de défaut de formation des microclusters de TCR. En revanche, la relocalisation de ces clusters au cSMAC est fortement altérée. Cette inhibition de la dynéine, démontre une augmentation de la signalisation par analyse de la phosphorylation de LAT et de Erk. Cet effet est accompagné de l'augmentation de la sécrétion d'IL-2. Ces résultats démontrent l'intérêt de la dynéine dans la régulation de la signalisation probablement par le recyclage des TCR (160). Cependant, une autre publication expliquant un travail réalisé dans la lignée cellulaire Jurkat, démontre que l'interférence à ARNm de la dynéine ou l'inhibition de son interaction avec la dynactine, entraine la diminution de la signalisation. Les auteurs ont démontré la diminution de recrutement du MTOC en absence de dynéine (161, 162). L'extinction du gène kif-5, codant une kinésine dans des LT CD8 primaires humains, démontre que KIF-5 est importante pour véhiculer les granules lytiques à la synapse immunologique (163). Par ailleurs, l'interférence à ARNm dans la lignée cellulaire Jurkat et dans des LT CD4 primaires humains démontre l'importance de GAKIN, une protéine de la famille des kinésines, dans la redistribution de régulateurs négatifs de la signalisation (164). Les microclusters de TCR sont constamment internalisés par endocytose au niveau du cSMAC et recyclés probablement pour limiter et perpétuer en même temps l'intensité des signaux transmis par les TCR (165). Les mécanismes moléculaires mis en place pour entrainer cette endocytose ne sont pas vraiment établis. Il a été découvert que ce processus est régulé par les protéines du complexe IFT, mis en place pour la formation des cils dans les cellules ciliées (166). Ce complexe fonctionne avec les moteurs moléculaires dynéines et kinésines dans d'autres types cellulaires (167). Cependant, l'interactome de IFT dans des LT ne permet pas de détecter ni l'un ni l'autre de ces moteurs moléculaires (168, 169) (Fig. 7B). Des échanges membranaires peuvent se réaliser depuis la CPA vers le LT formant ainsi des vésicules contenant des TCR complexés avec des CMH. Ce mécanisme de trogocytose n'est 29 pas encore compris mais il semblerait que ce processus permette de soutenir la signalisation (170). Par ailleurs, une fraction importante de LAT est contenue dans des vésicules décorées par les protéines VAMP-7. Ces vésicules gagnent immunologique sans nécessairement fusionner avec la membrane plasmique. LAT peut alors recruter des complexes de signalisation directement sur les vésicules. La déficience en VAMP-7 dans des cellules Jurkats conduit à une diminution du recrutement des vésicules contenant LAT à la membrane plasmique et une réduction des signaux transmis par les TCR engagés par des super-antigènes. Cette observation suggère l'importance de la signalisation vésiculaire dans la signalisation des LT qui pourrait favoriser la conduction des signaux vers les différents compartiments intracellulaires (171). la synapse Figure 7 : Schématisation de la synapse immunologique (A) Représentation du cSMAC, pSMAC et dSMAC sur le LT au niveau de l'interface entre une CPA et le LT. Chaque région concentre différentes molécules impliquées dans la régulation de l'activation du LT et dans les remaniements moléculaires. (B) Représentation des mouvements moléculaires au sein d'un LT conjugué à une CPA. Les microclusters de TCR actifs sont dirigés vers le cSMAC par le transport par la dynéine et grâce à la contraction de l'actine régulée par la myosine. Au cSMAC, les TCR inactifs sont endocytés grâce au complexe IFT. Les granules lytiques sont dirigées vers le centrosome par la dynéine et vers la membrane plasmique par la kinésine. 30 2. Différenciation des lymphocytes T La signalisation déclenchée par les TCR est accompagnée d'évènements de signalisation induits par les cytokines, sécrétées par les CPA ou par des lymphocytes déjà différenciés, qui se fixent à des récepteurs spécifiques sur les LT. Ce mécanisme conduit à la différenciation des LT en sous populations spécifiques telles que Th1, Th2, Th9, Th17, Tfh, Treg et cytotoxiques. La différenciation des LT en sous-populations effectrices permet le développement d'une réponse immunitaire spécifique adaptée au type de pathogène en induisant le recrutement ordonné de cellules spécialisées (Fig. 8). 2. 1. Différenciation des lymphocytes T auxiliaires Les LT auxiliaires peuvent se différencier en Th1, Th2, Th9, Th17, Tfh ou Treg en fonction des cytokines délivrées par les CPA. La présence d'IL-12 conduit à l'expression de T-bet, un facteur de transcription responsable de la différenciation des cellules en Th1. Cela entraine, entre autres, la sécrétion d'IFNqui facilite l'activation des macrophages et déclenche la commutation de classe des récepteurs des LB. Ces Th1 entranent le développement d'une réponse immunitaire dirigée plus spécifiquement contre les pathogènes intracellulaires. L'IL- 4 conduit à l'expression du facteur de transcription GATA3 entrainant le programme de différenciation en sous population Th2. Ces cellules secrètent de l'IL-4 et de l'IL-13 déclenchant la production d'IgE par les LB et l'activation des éosinophiles, des basophiles et des mastocytes qui facilitent l'élimination des parasites et dégradent les protéines toxiques contenues dans les venins. La présence de TGF en plus d'IL-4, peut conduire à la différenciation en une autre sous population sécrétant de l'IL-9 appelée Th9. En présence d'IL-1, d'IL-6, d'IL-23 et de TGF, les cellules expriment RORT et IL-17. Ces cellules, appelées Th17, entranent le développement d'une réponse spécifique dirigée contre les bactéries extracellulaires. La différenciation des cellules en Tfh est induite par la présence d'IL-6 et d'IL-21 dans le milieu extracellulaire. Dans ces cellules, le facteur de transcription BCL-6 conduit à l'expression de PD-1, CXCR4 et CXCR5 qui jouent un rôle important dans ces cellules qui sont nécessaires à la maturation des LB et à la production d'anticorps de haute affinité pour les antigènes étrangers (172). Enfin, la population Treg est indispensable à la régulation de la réponse immunitaire. Bien qu'elle puisse provenir du thymus lors du développement des LT, elle peut aussi être induite par différenciation des LT auxiliaires en présence d'IL-2 et de TGF. Ces cytokines, conduisent à l'expression du facteur de transcription FoxP3 permettant l'expression de 31 cytokines anti-inflammatoires IL-10, TGF et IL-35. Par ailleurs, l'expression de CTLA-4 et de PD-1 interagit avec les ligands CD80 et CD86 à la surface des CPA afin de limiter l'activation des LT. Enfin, l'expression du marqueur CD39 conduit à la conversion d'ATP en AMP qui est alors déphosphorylé par CD73 pour synthétiser de l'adénosine afin d'apaiser l'environnement inflammatoire dans lequel règne les LT (173). 2. 2. Différenciation des lymphocytes T cytotoxiques Les LT cytotoxiques se différencient majoritairement à partir des LT CD8 naïfs une fois activés par des CPA professionnelles et en fonction des cytokines délivrées par les CPA et les LT auxiliaires. Cela se caractérise par l'expression des protéines granzymes et perforines qui ont pour fonction d'induire l'apoptose des cellules cibles (174). L'expression des cytokines TNF par les LT CD8 activés favorise leur activité lytique (175-177). Cependant, une faible proportion des LT CD4 peut aussi acquérir les caractéristiques cytotoxiques par expression de granzymes et de perforines (178-180). 32 Figure 8 : Différenciation des lymphocytes T auxiliaires L'activation des LT par les CPA conduit à leur différenciation en sous populations de LT capables d'organiser une réponse immunitaire adaptée au pathogène. Ces LT peuvent se différencier en Th1 pour une réponse spécifique des pathogènes intracellulaires. Les Th2 conduisent à une réponse adaptée contre les parasites. Les Th9 favorisent le recrutement d'éosinophiles, de mastocytes et de LT CD8 contre les allergènes et le développement tumoral. De plus, ils modulent l'activité des Treg pour limiter l'auto-immunité. Les Th17 entrainent la sécrétion d'IL-17 pour l'activation des polynucléaires neutrophiles afin de réaliser une réponse spécifique aux bactéries extracellulaires et aux champignons. Les Th17 peuvent être responsables d'allergie. Les Tfh sont spécifiques dans la maturation des LB. La population LT CD4 cytotoxique a été nouvellement identifiée. Il semblerait, d'après les premières données, qu'ils réalisent une réponse contre les cellules infectées par un virus. La population Treg est importante dans la régulation de la réponse immunitaire. 2. 3. Différenciation en lymphocytes T mémoires L'activation des LT conduit majoritairement au développement d'une réponse effectrice contre les pathogènes intra- ou extra-cellulaires. Cependant, après l'élimination du pathogène, les LT stimulés meurent suite à la privation en cytokines et par engagement des récepteurs de mort cellulaire programmée (181). Cependant, une faible proportion des LT spécifiques des antigènes persiste au sein de l'organisme sous forme de LT mémoires. Ces cellules peuvent circuler dans l'organisme ou résider dans les tissus non lymphoïdes o elles seront mobilisées rapidement lors d'infections futures par un pathogène présentant les mêmes antigènes (182). 33 La différenciation des LT mémoires peut être due à l'asymétrie des divisions après la première division cellulaire. En effet, suite à l'engagement des TCR par les complexes pCMH, la cellule fille au contact de la CPA reçoit les protéines caractéristiques de cellules effectrices. En revanche, la cellule distale acquiert des caractéristiques de LT mémoires (183, 184). 34 CHAPITRE I : LE DEVELOPPEMENT PRECOCE DES LYMPHOCYTES T Le développement des LT se déroule dans le thymus au sein duquel se distinguent quatre populations principales de thymocytes. Le stade double négatif (DN) est la première étape du développement des LT. Il conduit à la maturation des cellules n'exprimant pas les corécepteurs CD4 et CD8. Comme nous le verrons dans ce chapitre, les précurseurs DN proviennent de la moelle osseuse et acquièrent au cours de leur développement dans le thymus la chaine du TCR. Suite à l'expression de cette chaine , les cellules coexpriment les corécepteurs CD4 et CD8 mais aussi la chaine du TCR. Ces cellules doubles positives (DP), sont soumises à des processus de sélection positive et de sélection négative afin d'éliminer les cellules exprimant un TCR de trop faible ou trop forte affinité pour les antigènes ubiquitaires du soi présentés par les CMH. Ces évènements de sélection conduisent à la progression des cellules vers un stade au cours duquel elles exprimeront exclusivement le corécepteur CD4 ou le corécepteur CD8. Durant ce stade, ces cellules simples positives (CD8 SP ou CD4 SP) sont soumises à une nouvelle étape de sélection négative afin d'éliminer les cellules exprimant des TCR qui reconnaissent fortement des autoantigènes spécifiques d'organes. Les cellules ayant survécu aux mécanismes de sélection continuent leur maturation et sortent du thymus pour rejoindre les organes lymphoïdes secondaires. Le développement précoce des LT est fortement dépendant de la signalisation par les récepteurs NOTCH qui sont engagés par les ligands DLL ou les protéines de la famille Jagged. Chez les mammifères, quatre paralogues de NOTCH existent, trois DLL (DLL-1, DLL-3 et DLL-4) et deux Jagged (JAG1 et JAG2). Le récepteur NOTCH est constitué d'une région extracellulaire NECD qui peut interagir avec son ligand et d'une région intracellulaire NICD. La reconnaissance d'un ligand par le récepteur NOTCH conduit à l'endocytose du complexe récepteur-ligand à l'intérieur des cellules exprimant les ligands. La région extracellulaire de NOTCH est clivée par la protéine ADAM et la région intracellulaire NICD est clivée par l'action de la -sécrétase. Le NICD rejoint le noyau dans lequel il active des gènes cibles en collaboration avec les facteurs de transcription RBPJ et MAML1 (185). 35 I. La différenciation des précurseurs des lymphocytes T dans la moelle osseuse 1. Origine des cellules souches hématopoïétiques Chez l'adulte, les précurseurs des LT se développent au sein de la moelle osseuse à partir de précurseurs communs à d'autres cellules lymphoïdes. Ces précurseurs, appelés cellules souches hématopoïétiques (CSH), sont originaires du lécithocèle durant le développement embryonnaire et se différencient à partir d'hémangioblastes aussi précurseurs des cellules endothéliales (186). Au stade fœtal, les CSH, alors au sein d'une région appelée Aorte- Gonade-Mésonéphros (AGM), entrent dans la circulation sanguine pour coloniser le foie fœtal dans lequel elles prolifèrent intensément et se différencient (187). A l'approche de la naissance, les CSH migrent vers la moelle osseuse et entrent dans un stade de quiescence quelques semaines après la naissance. Elles résideront toute la vie de l'organisme au sein de la moelle osseuse o elles pourront se renouveler et se différencier (188). Des la différenciation des CSH en cellules myéloïdes progénitrices (CMP) ou en cellules lymphoïdes progénitrices (CLP). Les CMP sont à l'origine des érythrocytes et des plaquettes ainsi que des cellules de l'immunité innée telles que les macrophages, les polynucléaires neutrophiles, les éosinophiles, les basophiles et les cellules dendritiques. Les CLP se différencient en LB, les cellules NK et les LT (189) (Fig. 9). facteurs de croissance hématopoïétique spécifiques peuvent conduire à 2. Différenciation des CSH vers le lignage lymphocytaire T La spécification des CSH et des CLP nécessite CXCR4, le récepteur à CXCL12, indispensable au maintien des cellules au sein de la moelle osseuse à proximité des cellules sécrétant de l'IL-7. En effet, l'IL-7 est importante dans la formation et le maintien des CLP (190). Les CLP se différencient majoritairement en LT et en LB. L'expression du ligand de NOTCH DLL-4 par certaines cellules mésenchymateuses de la moelle osseuse, déclenche des programmes génétiques de différenciation des cellules souches hématopoïétiques en cellules progénitrices des LT (TSP) (191). Cependant, de récentes études suggèrent l'existence d'une population précurseur des CPL appelée LMPP (lymphoid-primed multipotent progenitors) ayant une forte capacité à former directement des LT (192) (Fig. 9). 36 II. Acquisition du lignage T définitif au sein du thymus Les éléments génétiques du lignage T sont acquis au sein de la moelle osseuse suite à la différenciation des CSH en TSP, mais des processus supplémentaires sont mis en jeu dans le thymus pour stabiliser le lignage. En effet, en absence de signaux adéquats, les DN peuvent se différencier en d'autres cellules lymphoïdes ou myéloïdes. C'est au cours des stades DN que le lignage T est définitivement adopté. La population DN se caractérise par quatre sous populations DN en fonction de l'expression de CD25, qui est la chaine du récepteur à l'IL-2, et de CD44, une glycoprotéine impliquée dans l'adhésion et la migration des cellules. La première sous population DN provient directement de la moelle osseuse et est appelée DN1 (CD44 CD25-) ou ETP. Les cellules DN1/ETP expriment CD25 et progressent vers le stade DN2 (CD44 CD25 ). La diminution d'expression de CD44 conduit à la population DN3 (CD44- CD25 ). Au cours du stade DN3 s'effectue la -sélection, un événement indispensable dans le développement des LT, abordé plus en détail dans la suite de cette partie. Le passage de la -sélection conduit à la survie et à la prolifération des cellules. La perte de l'expression de CD25 caractérise la population DN4 (CD44- CD25-) qui se développera ensuite en cellules DP. Les populations DN1 et DN2 sont encore capables de se différencier en cellules NK, en cellules dendritiques et en LB, contrairement aux cellules DN3 et DN4 qui sont engagées irréversiblement dans le lignage lymphocytaire T (193) (Fig. 9). 1. Les mécanismes d'entrée au niveau de la jonction cortico-médullaire du thymus Les cellules ayant acquis le profil TSP sortent de la moelle osseuse et rejoignent le thymus en quelques minutes, par la circulation sanguine, au niveau de la jonction cortico-médullaire. L'expression de CXCR4 conduit au maintien des cellules au sein de la moelle osseuse suggérant que CXCR4 doit être inactivée ou moins exprimée pour la sortie des cellules. Le blocage de CXCR4 par un antagoniste AMD3100 entraine l'enrichissement des progéniteurs lymphoïdes au sein de la circulation sanguine (194). Une fois dans les vaisseaux sanguins, les TSP expriment les récepteurs aux chimiokines CCR9, CCR7 et CXCR4. Les cellules stromales thymiques de la jonction cortico-médullaire, sécrètent des chimiokines CCL25, CCL21, CCL19 et CXCL12 spécifiques de ces récepteurs (195). Les intégrines VCAM1 et ICAM1, à la surface des cellules stromales thymiques, sont importantes pour l'introduction des cellules au niveau la jonction cortico-médullaire. L'inactivation de ces intégrines à l'aide d'anticorps anti-VCAM1 ou anti-ICAM1 compromet fortement la colonisation du thymus par 37 les TSP (196). L'entrée des cellules au sein du thymus se fait par vague en fonction de la disponibilité des niches au sein de l'organe. Lexpression de P-sélectine par les cellules endothéliales au niveau du parenchyme thymique, conduit à l'association des TSP exprimant PSGL1 aux cellules endothéliales thymiques et est fortement régulée par la disponibilité des niches (197, 198). CD44 est exprimée à la surface des TSP et est importante pour l'entrée des cellules au sein du thymus (199). Les cellules entrant ainsi dans le thymus se différencient en ETP/DN1 par la perte du marqueur FLT-3 et séjournent une dizaine de jours près de la jonction cortico-médullaire o elles réalisent de nombreux cycles de prolifération (200). Figure 9 : Différenciation des cellules souches hématopoïétiques en lymphocytes T Les CSH se différencient à partir d'hémangioblastes au sein de la moelle osseuse. Les CSH se différencient en LMPP qui sont à l'origine des CMP et CLP. Les CMP se différencient en cellules de l'immunité innée alors que les CLP se différencient en LT, LB et NK. L'interaction d'une cellule stromale de la moelle osseuse exprimant le ligand DLL-4 conduit à la spécification des CLP en TSP. Les TSP peuvent provenir de la différenciation directe des LMPP. Les TSP entrent dans le thymus grâce à PSGL et se différencient en ETP/DN1 qui progressent au sein du thymus vers les stades DP et SP. 38 2. La signalisation NOTCH est essentielle dans l'établissement du lignage T La signalisation des récepteurs NOTCH est particulièrement importante au cours des stades précoces du développement des LT. Comme vu précédemment, elle est essentielle au sein de la moelle osseuse afin de conduire à la formation de cellules progénitrices des LT. Mais la signalisation par NOTCH est aussi importante dans le maintien du lignage T au sein du thymus. La déficience en NOTCH1 chez la souris, entraine la diminution importante du nombre de thymocytes totaux accompagnée de l'augmentation de la proportion de DN. L'accumulation des cellules au stade DN1 révèle l'augmentation de la différenciation en cellules B220 représentatives de LB au sein du thymus (201). Il en est de même de la déficience conditionnelle pour la protéine MAML, un coactivateur transcriptionnel de la voie NOTCH, dans le modèle Vav1Cre (202). Par ailleurs, des cellules DN1 et DN2 mises en culture sur des cellules stromales OP9 se différencient en cellules DP en présence du ligand du récepteur NOTCH : DLL-1. En absence de ce ligand, les cellules DN2 et DN1 sont incapables d'atteindre le stade DP et se différencient principalement en cellules NK (203). Ces données illustrent l'importance de la signalisation NOTCH dans l'établissement du lignage T. La signalisation NOTCH entre en compétition avec le facteur de transcription PU. 1 qui favorise le développement des lignées myéloïdes (204). Par conséquent, la signalisation NOTCH est essentielle au maintien des caractères lymphoïdes en prévenant l'action du facteur de transcription PU. 1 (205, 206). L'expression de PU. 1 est détectable au cours du stade DN1 et DN2a, une sous population DN2 exprimant un niveau élevé de c-kit. En revanche, l'expression de PU. 1 diminue au cours du stade DN2b, une sous population DN2 dont le niveau de c-kit est intermédiaire. Au cours du stade DN3, PU. 1 n'est plus exprimé (193). La surexpression de PU. 1 chez la souris, conduit au blocage du développement précoce au cours du stade DN2. L'analyse des cellules DN1 et DN2 démontre qu'il s'agit de cellules différenciées en cellules CD11c caractéristiques des cellules dendritiques (207, 208). La répression de l'expression de PU. 1 est donc indispensable dans l'acquisition du lignage T. L'expression de PU. 1 pourrait être réprimée par le facteur de transcription BCL11b (209). De manière intéressante, la déficience en BCL11b entrane l'augmentation d'expression de PU. 1. Le gène bcl11b est régulé positivement par TCF-1 lui-même induit par la signalisation NOTCH (210). La déficience en BCL11b conduit à un phénotype similaire à celui observé dans le cas de surexpression de PU. 1 (211). Par ailleurs, la signalisation NOTCH conduit à la mise en jeu d'autres facteurs de transcription essentiels à 39 l'établissement du lignage T comme GATA-3. GATA-3 est important lors du développement précoce des LT car il réprime la différenciation en LB et en NK (212, 213) (Fig. 10). III. La -sélection : l'étape initiale dans l'élaboration d'un répertoire T Une fois dans la zone subcapsullaire du thymus, les cellules perdent l'expression de CD44 et constituent la population DN3 (CD44- CD25 ). Les cellules DN3a caractérisent la population DN3 pré-sélection. Celles-ci arrêtent de proliférer puis réarrangent les gènes codant pour la chaine du TCR qui s'associe à une chaine invariante pT. Le bon arrangement de la chaine du TCR ainsi que son association avec le pT, déclenche des signaux intracellulaires entrainant l'expression de protéines, favorisant la survie cellulaire et induisant la prolifération des cellules DN3b, post-sélection. La prolifération des cellules conduit à l'expansion des cellules exprimant une chaine du TCR fonctionnelle, c'est-à-dire capable d'adopter une conformation la signalisation. La prolifération s'accompagne de la perte d'expression de CD25 caractéristique de la population DN4 (CD44- CD25-). favorable à 1. Expression du pre-TCR 1. 1. Déclenchement de la recombinaison du TCR Les cellules DN1 et DN2 réalisent de nombreux cycles de prolifération dans le thymus mais cette prolifération cesse au début du stade DN3 avant le réarrangement de la chaine du TCR. Les facteurs de transcription E2A et HEB sont nécessaires à l'arrêt des cycles prolifératifs. En effet, la déficience en E2A et HEB dans un modèle LCKCre conduit à un blocage majeur du développement des LT entre les stades DN et DP. De manière intéressante, la déficience pour ces protéines n'entrane pas l'accumulation d'une sous population particulière de cellules doubles négatives. La prolifération des cellules DN3 est néanmoins augmentée en absence de ces protéines lors de l'analyse de la dilution du BrdU. E2A et HEB favorise l'expression de la protéine p18 et la répression de la protéine p27. La déficience en p18, conduit à l'augmentation de la prolifération des cellules DN. Contrairement à la déficience en E2A et HEB (214), la déficience en p18 ne bloque pas le développement des LT (215). La surexpression de p27, en revanche, entrane un blocage de la transition DN-DP (216). Ces données suggèrent que l'expression de E2A et HEB, induit par la signalisation NOTCH, conduit à la répression de p27 et à l'expression de p18. Ces deux 40 protéines régulent l'entrée des cellules dans le cycle cellulaire avant le réarrangement de la chaine du TCR. L'expression des sous unités du complexe RAG au cours des stades précoces du développement des LT est indispensable pour déclencher le réarrangement de la chaine du TCR. La déficience en RAG compromet fortement le développement des LT qui sont bloqués au stade DN3 par défaut d'expression du pre-TCR (217, 218). L'expression de RAG débute au cours du stade DN2 (28) et pourrait être une des conséquences de la diminution d'expression de PU. 1. La surexpression de PU. 1 conduit à la diminution d'expression de RAG1. L'effet de PU. 1 sur RAG est atténué suite à la stimulation des cellules par un ligand DLL. Ces résultats suggèrent que la signalisation NOTCH peut favoriser l'expression des sous unités de RAG en diminuant l'expression ou en dominant l'activité de PU. 1 (204, 219). Chez la souris la déficience en BCL11b ne s'accompagne pas de la diminution d'expression de RAG1 (211) au contraire de chez l'homme (220). La diminution d'expression de PU. 1 favorise l'expression du facteur de transcription c-myb qui se fixe sur le promoteur du gène codant RAG et régule positivement son expression. L'expression des autres protéines impliquées dans la recombinaison est aussi finement régulée. Par exemple, les expressions de l'ADN ligase XRCC4, Artemis et KU70/80 sont régulées par le facteur de transcription GABP(221). La déficience en GABP conduit à un blocage au cours des stades précoces du développement des LT similaire à la déficience en Artemis, XRCC4, KU80 et KU70 (222-224). La signalisation NOTCH conduit à l'expression de BCL11b qui active l'expression du gène ets-1 (211, 225-227). ETS-1 s'associe à Runx et se fixe sur le promoteur E entrainant son activation (228-230). Le recrutement de ETS-1 et Runx sur la séquence E favorise la recombinaison de la chaine du TCR. La recombinaison ordonnée de la chaine du TCR peut être régulée par le complexe c-fos permettant le recrutement des protéines RAG aux séquences RSS. Le domaine d'interaction de la sous-unité AP-1 de c-fos se trouve dans la région 3'RSS de Dfavorisant la recombinaison DJet bloquant la recombinaison V- D et V-J (231) (Fig. 10) 41 Figure 10 : Principales inductions médiées par la signalisation NOTCH La signalisation NOTCH induite par les cellules stromales thymiques entraine l'expression de BCL11b. BCL11b réprimerait l'action de PU. 1 qui favorise la différenciation des cellules en LB, cellules dendritiques et NK. BCL11b conduit à l'expression de E2A/HEB qui favorise l'arrêt de la prolifération en réprimant p27 et en induisant l'expression de p18. E2A/HEB conduit aussi à l'expression de la machinerie de recombinaison V(D)J et à la chaine pT. Enfin, BCL11b induit l'expression de ETS-1 qui se complexe à Runx et favorise le réarrangement de la chaine b en activant la région enhancer E. Suite à l'expression du pre- TCR, la signalisation entraine l'expression de Id3 qui réprime E2A/HEB conduisant à la prolifération et à l'exclusion allélique. 1. 2. Expression de la chaine pT Au cours des stades doubles négatifs, la chaine du TCR n'est pas exprimée. L'expression d'une chaine invariante pT au cours du stade DN2b est essentielle au développement des LT. Les souris déficientes pour le gène ptcra codant la chaine pT présentent un fort blocage de la transition DN à DP (232). L'expression de la chaine pTdépend des facteurs de transcription HEB et E2A qui sont exprimés suite à la signalisation NOTCH et à la diminution d'expression de PU. 1 (219, 233, 234). La déficience en BCL11b conduit à la forte diminution d'expression de la chane pTcomme le démontrent des données de RT-PCR quantitatives chez l'homme (220) (Fig. 10). La structure de la chaine pT est particulière puisque contrairement à la chaine du TCR, elle comporte une longue chaine cytoplasmique contenant une région riche en proline. Par ailleurs, la chaine extracellulaire est plus courte que la chaine du TCR (235). Les résidus lysine et arginine dans le domaine transmembranaire sont conservés entre les chaines pT et et permettent l'association avec les CD3 et la chaine du TCR. L'association avec la chaine est aussi soutenue par un pont disulfure comme avec la chaine (236) (Fig. 11). 42 Figure 11 : Représentation d'un récepteur pre-TCR Représentation schématique d'un pre-TCR constitué de trois dimères de chaines invariantes CD3CD3et , d'une chaine invariante pT et de la chaine . La région intracellulaire de la chaine pT présente une région riche en proline essentielle pour la signalisation du pre-TCR. 2. Signalisations issues du pre-TCR Les chaines pT et TCR sont associées aux dimères de CD3 au sein du réticulum endoplasmique. Les chaines CD3 sont cruciales comme le montre le blocage de la transition DN-DP chez des souris déficientes pour certains CD3 (237). La signalisation issue des pré- TCR est similaire à la signalisation des TCR. Elle implique la protéine LCK qui déclenche la signalisation. La déficience en LCK entrane un blocage du développement des LT au stade DN3 (238-240). La déficience en LAT conduit au même phénotype (241, 242). La déficience en ZAP-70 n'affecte pas dramatiquement le développement T sauf lorsqu'elle est associée à la délétion en SYK une protéine kinase appartenant à la même famille moléculaire que ZAP-70. Ces résultats démontrent que les cibles de LCK : ZAP-70 et SYK sont essentielles 43 à la signalisation du pre-TCR (243). La déficience en Grb2 ne bloque pas les cellules au stade DN (244). Il est fortement possible que la perte de Grb2 soit compensée par d'autres protéines de signalisation comme Vav1 ou SLP-76. D'ailleurs, la déficience en Vav1 conduit à l'augmentation de la proportion de cellules DN et particulièrement DN3. Cette augmentation est plus importante lors des délétions concomitantes de Vav1, Vav2 et Vav3 (245). Des résultats similaires ont été observés dans le cas de la déficience en SLP-76 (246). La signalisation du pre-TCR est donc essentielle dans la progression des cellules DN en DP (247, 248). 2. 1. Déclenchement de la signalisation du pre-TCR La signalisation des pre-TCR, contrairement à celle des TCR, ne nécessite pas la fixation d'un ligand. En effet, la délétion de l'ensemble des régions extracellulaires du pre-TCR n'empêche pas le progression des cellules vers le stade tardif du développement des LT (249). De façon surprenante, la délétion seule de la région extracellulaire de pT, de la chaine ou de résidus impliqués dans l'oligomérisation des deux chaines affectent le développement des thymocytes précoces (249, 250). Il est donc possible que la région extracellulaire du pT permette de stabiliser la chaine du TCR dans une conformation favorable à la signalisation. C'est la bonne association de la chaine avec le pTqui conduit à la signalisation des pre-TCR. Cependant, de récentes études suggèrent que le CMH, exprimé par les cellules stromales thymiques, pourrait être impliqué dans la signalisation des pre-TCR. Des expériences de spectroscopie RMN révèlent que le pre-TCR est capable d'interagir avec le CMH qui induit des réarrangements structuraux du pre-TCR. Par ailleurs, la culture de DN3 sur une lignée de cellules stromales OP9 déficientes en 2m, une sous unité du CMH-I, conduit à une diminution non négligeable de la prolifération des cellules (251, 252). 2. 2. Fonctions de la chaine pT dans la signalisation La délétion de la région riche en proline située sur le domaine intracytoplasmique de la chane pT entrane un phénotype similaire à celui obtenu dans les souris déficientes en pT avec une accumulation des cellules au stade DN. Ceci s'accompagne d'une diminution de la prolifération des cellules exprimant le chaine du TCR et une augmentation de l'apoptose (248). Dans une lignée de LT humain, la délétion de cette région riche en proline entraine l'effondrement de flux calcique. Cette région permettrait le recrutement des adaptateurs 44 moléculaires CMS et CIN85. Ces résultats suggèrent que la région riche en proline de la chaine pT est impliquée dans la signalisation de la -sélection (253). Le pre-TCR est constamment internalisé par endocytose et s'accumule dans les lysosomes comme le démontrent des analyses d'imagerie (254). La transfection de constructions conduisant à l'expression de CD25 ou CD4 fusionnés à la chaine intracellulaire de pT entraine l'augmentation de CD4 et CD25 intracytoplasmiques démontrant la fonction de la chaine intracellulaire de pT dans l'endocytose du pre-TCR (255). L'adaptateur CMS colocalise avec le cytosquelette d'actine au cours de l'endocytose du pT(253) La signalisation induite par le pT est responsable de l'endocytose permanente du pre-TCR. L'utilisation d'inhibiteurs de Src kinase comme LCK dans des cellules Jurkats transfectées par le pre- TCR restaure partiellement l'expression à la surface du pre-TCR. Le même résultat est obtenu lorsque les Jurkats exprimant un TCR chimère pour lequel la chaine est fusionnée à la région cytoplasmique du pT (256). Bien que le pre-TCR soit internalisé et soit localisé majoritairement dans les lysosomes, l'inhibition du protéasome conduit à une augmentation non négligeable de l'expression du pre-TCR. L'activation des Src déclenche l'ubiquitination du pre-TCR par c-Cbl pour favoriser sa dégradation (254). La chaine pT semble avoir une fonction unique dans la signalisation du pre-TCR. En effet, son remplacement par une chaine du TCR entraine un défaut de la -sélection (257, 258). 2. 3. Signaux de survie La signalisation du pre-TCR déclenche aussi l'expression du récepteur à l'IL-7 (IL7-R). La déficience pour ce récepteur entraine l'apoptose des cellules après la -sélection (259). L'interaction de l'IL-7 avec son récepteur entraine l'activation des kinases Jak3 puis des facteurs de transcription STAT5. L'association de STAT5 et de NFAT déclenche l'expression du facteur anti-apoptotique BCL-2 important dans la survie des thymocytes doubles négatifs (260). La déficience en NFAT entraine la diminution d'expression de BCL-2 et compromet fortement la survie cellulaire suite à la -sélection (261). L'expression ectopique de BCL-2 dans des souris déficientes pour IL7-R restaure partiellement le développement précoce de LT. L'activation de STAT5, en plus d'induire l'expression de BCL-2, conduit à la répression de BCL-6. L'absence de BCL-6 dans des souris déficientes pour l'IL7-R favorise la prolifération et la survie des DN4 (262). La signalisation des pre-TCR entrane aussi l'activation de la voie de NF-b et l'expression de BCL-2A1. BCL-2A1 favorise la survie des cellules en inhibant la caspase-3. La transduction du gène bcl2a1 dans des cellules 45 déficientes pour RAG restaure la survie des cellules (263). Des études démontrent que l'absence de signalisation par les pre-TCR conduit à l'expression de Bid et Bim suite à l'action de p53 et Foxo3. L'activation du pre-TCR entraine l'activation des kinases Akt qui phosphoryle Foxo3 et prévient ainsi la transactivation du gène bim. La déficience en Bid ou Bim dans des souris n'exprimant pas de pre-TCR conduit à une augmentation de la survie des cellules DN (264). Par ailleurs, la déficience concomitante de Akt1, Akt2 et Akt3 entraine le blocage de la transition DN à DP avec l'accumulation des cellules au stade DN3 et DN4 (265). La survie des cellules est aussi étroitement liée à la signalisation NOTCH induite entre les thymocytes et les cellules stromales. La survie des cellules déficientes pour RAG est supérieure lorsque celles-ci sont en culture sur des cellules OP9 exprimant le ligand DLL-4. La signalisation NOTCH déclenche l'expression de facteurs importants dans le remaniement métabolique essentiel à la survie et la prolifération (266) (Fig. 12). 2. 4. Induction de la prolifération cellulaire La signalisation du pre-TCR conduit à l'expression du récepteur à la transferrine CD71. Ce récepteur est important car il contribue aux évènements métaboliques essentiels à la prolifération cellulaire. Le traitement de cellules en culture par un anticorps anti-CD71 réduit fortement la capacité des cellules à atteindre le stade DP (267). De plus, la signalisation du pre-TCR conduit à la phosphorylation de ShcA qui entrane l'expression du facteur de transcription Egr, un activateur du facteur de transcription Id3. L'activation de ce dernier inhibe les fonctions répressives de E2A et HEB sur la prolifération des cellules (268) (Fig. 10). L'activation de ShcA favorise aussi l'expression de c-myc, un oncogène se fixant à de nombreux promoteurs, régulant l'expression de gènes essentiels à la duplication de l'ADN. c-myc est donc une protéine essentielle à l'entrée des cellules en phase S, la phase de réplication de l'ADN (269, 270) (Fig. 12). L'expression de c-myc dans des cellules déficientes en RAG restaure la prolifération des DN3 mais n'entrane pas la différenciation des cellules en DP. L'expression de c-myc est régulée positivement par la signalisation NOTCH, qui induit de cette façon la prolifération des cellules après la -sélection (271). Une publication récente démontre que la prolifération des DN3 n'est pas symétrique. La division asymétrique des DN3 conduirait à la formation de DN3b (DN3 ayant passé la -sélection) tout en conservant des cellules ayant les caractéristiques DN3a. Le défaut de Scribble, une protéine impliquée dans la polarisation cellulaire, conduit à l'augmentation de la proportion de cellules DN4 suite à la diminution de l'asymétrie des divisions. Les auteurs proposent que les divisions asymétriques permettent aux cellules d'acquérir des caractéristiques différentes leur 46 permettant de progresser vers le stade DN4 ou de persister au sein du stade DN3. Certaines cellules recevraient une quantité importante de BCL-2A1 leur permettant de survivre et de progresser vers le stade DN4, d'autres auraient une quantité importante de BCL-2 permettant la survie au stade DN3 (272). 2. 5. Exclusion allélique Suite à la -sélection, il est essentiel que le locus conduisant à l'expression de la chaine soit bloqué afin d'éviter la recombinaison de l'allèle non réarrangé. La signalisation du pre- TCR est essentielle pour le processus d'exclusion allélique. La déficience en LCK ou en SLP- 76 affecte l'exclusion allélique de la chaine du TCR (238, 273). Figure 12 : Représentation de la -sélection Au sein du thymus, les cellules ETP/DN1, DN2a et DN2b ont une forte capacité de prolifération. Au cours de ces stades, l'expression de PU. 1 diminue en faveur de BCL11b entrainant alors l'acquisition du lignage lymphocytaire T définitif au stade DN2b. BCL11b conduit à la recombinaison de la chaine et à l'expression d'une chaine invariante pT. Si la recombinaison permet l'association de la chaine au pT, alors le pre-TCR pourra émettre un signal conduisant à l'expression du facteur de survie BCL-2A1 et à l'expression de c-myc pour induire la prolifération des cellules. 47 IV. Transition vers le stade double positif Le passage au stade double positif se caractérise par l'expression coordonnée des corécepteurs CD4 et CD8 et par l'expression de la chaine du TCR qui fait suite à la dégradation de la chaine pT. 1. Expression des corécepteurs CD4 et CD8 Chez la souris, la -sélection conduit à l'expression du corécepteur CD8 à un stade intermédiaire entre DN et DP appelé ISP (274). Chez l'homme, c'est le corécepteur CD4 qui est exprimé au stade ISP (275). Chez la souris, l'analyse de l'accessibilité des gènes révèle que les gènes cd8 deviennent accessibles à partir du stade DN3, après la -sélection (276). L'expression de CD8 est maintenue sous silence par le facteur de transcription MAZR au cours des stades DN mais Ikaros favorise l'expression de CD8 en induisant l'accessibilité aux gènes (276-278). Ce n'est qu'après le stade ISP que se fait la co-expression de CD4 et CD8. Tout comme les cellules doubles négatives, les cellules ISP réalisent de nombreux cycles de prolifération. La signalisation NOTCH est importante dans la prolifération des ISP mais n'est pas plus mise en jeu au cours des stades ultérieurs du développement (274). Chez la souris, Mi-2 est recrutée à la région enhancer du gène cd4 et conduit au recrutement d'une histone acétyltransférase catalysant l'hyperacétylation du gène cd4. Cette hyperacétylation favorise l'expression de CD4. La déficience en Mi-2 conduit au blocage du développement au stade ISP (279). 2. Déclenchement de la recombinaison de la chaine du TCR Comme pour les réarrangements de la chaine du TCR, les réarrangements de la chaine nécessitent la mise en jeu des RAG et de la machinerie de réparation de l'ADN. La signalisation du pre-TCR déclenche la recombinaison de la chaine du TCR en activant la région enhancer E. En effet, le traitement avec la ionomycine, un inducteur de flux calcique, entraine l'augmentation de la transcription de tcra dans des lignées cellulaires correspondant à DN3a. Par ailleurs, le traitement des cellules avec un inhibiteur de la voie des MAPK bloque l'expression du tcra après stimulation (280). L'expression du pre-TCR conduit à l'expression des facteurs de transcription Erg1, Erg2 et Erg3 qui se fixent avec NFAT et AP-1 sur la région enhancer E pour déclencher la recombinaison V-J(280). Ikaros est aussi important dans le réarrangement de la chaine du TCR. La lignée de thymome murine JE131 déficiente 48 pour ikaros présente un phénotype DN3 qui exprime le pre-TCR mais qui est incapable de réarranger les gènes codant pour la chaine . L'expression d'Ikaros dans cette lignée restaure l'expression normale de la chaine . La fixation d'Ikaros au complexe SWI/SNF au niveau de la séquence E favorise la recombinaison V-J en inhibant l'action répressive de Mi-2 (281). La signalisation du pre-TCR entraine la diminution d'expression des RAG. Or le réarrangement de la chaine nécessite l'expression du complexe RAG et est dépendant de la signalisation du pre-TCR. Des mécanismes complexes de régulation sont probablement mis en place dans la transition entre le réarrangement de la chaine et de la chaine (30). Comme pour le pre-TCR, la signalisation déclenchée par les TCR conduit à l'exclusion allélique de l'allèle non réarrangé. Elle entrane aussi l'arrêt d'expression des RAG et des modifications épigénétiques qui empêchent la recombinaison d'avoir lieu (282). 3. Du pré-TCR au TCR Selon Trop et al, l'expression de la chaine du TCR ne nécessite pas la dégradation ou l'absence d'expression du pTEn effet, la chaine du TCR entre en compétition avec le pT pour son expression à la membrane plasmique. La chaine pT n'est pas exprimée à la membrane plasmique lorsqu'elle est co-exprimée dans une lignée cellulaire avec la chaine . Son expression est cependant détectée dans le cytoplasme (283). Par ailleurs, il a été démontré que Ikaros interfère avec le domaine intracellulaire de NOTCH NICD et bloque ainsi l'expression de la chaine pT(284). 49 50 CHAPITRE II : LE DEVELOPPEMENT TARDIF DES LYMPHOCYTES T Suite au réarrangement aléatoire de plusieurs gènes pour l'expression des chaines variantes du TCR et , un très grand nombre de TCR (1015) sont exprimés. Ces TCR ont des affinités diverses pour les antigènes du soi présentés dans le thymus par les CPA. Chaque cellule exprime un groupe de TCR ayant la même spécificité antigénique qui peut être dirigé contre le soi ou le non-soi. Une grande partie de ces TCR ne sont pas fonctionnels, c'est-à- dire qu'ils ont une affinité insuffisante pour les complexes pCMH du soi. Il existe donc un processus de sélection positive permettant de sélectionner les LT exprimant un TCR efficient. Les LT exprimant des TCR ayant une affinité trop forte pour les antigènes du soi sont susceptibles d'induire des maladies auto-immunes. Un mécanisme de sélection négative est donc mis en place afin d'éliminer les LT exprimant des TCR auto-réactifs. Suite à ces évènements de sélection, il a été estimé que moins de 5% des thymocytes DP deviendront des LT matures (285) (Fig. 13). Figure 13 : Sélection positive et négative des thymocytes Au sein du cortex thymique, la reconnaissance d'un complexe pCMH est essentielle dans la survie des cellules. Une signalisation trop faible due à une affinité trop faible du TCR pour le pCMH conduit à la mort des cellules par négligence. Une affinité trop forte conduit à des signaux trop importants et entraine l'expression de facteur apoptotique favorisant la mort par apoptose des cellules. Seules persistent les thymocytes ayant une affinité modérée favorable à l'expression de marqueurs de survie. Au sein de la médulla thymique, l'affinité trop forte des cellules pour un antigène du soi entraine la mort des cellules par apoptose. 51 I. Les sélections clonales au sein du cortex thymique Les thymocytes DP expriment les récepteurs aux chimiokines CCR9 et CXCR4 pour induire leur chimiotactisme vers le cortex thymique. Les cellules épithéliales thymiques corticales (cTEC) sécrètent les chimiokines CCL25 et CXCL12 spécifiques des récepteurs exprimés par les cellules DP. Au sein du cortex, les cTEC apprêtent sur les CMH-I et CMH-II des antigènes ubiquitaires du soi, provenant de la dégradation courante de protéines exprimées par les cTEC (195). Les TCR exprimés par les thymocytes interagissent ou non avec les CMH chargés selon l'efficacité des réarrangements génétiques produits. L'absence d'interaction ou une interaction trop forte conduit à l'apoptose des cellules. L'affinité intermédiaire conduit à des signaux modérés favorables à l'expression et à l'activité de facteurs anti-apoptotiques (Fig. 15). 1. Présentation de peptides par les cTEC Dans les cTEC, la dégradation de protéines conduit à l'apprêtement des peptides issus de cette dégradation aux CMH par des voies spécifiques. Les peptides issus de la dégradation des protéines par le thymoprotéasome passe dans le réticulum endoplasmique par le transporteur TAP et sont apprêtés aux CMH-I. Les CMH-I sont par la suite dirigés vers la membrane plasmique pour la présentation des peptides aux thymocytes exprimant un TCR restreint au CMH-I (286). La déficience en 5t, une sous unité spécifique du thymoprotéasome, conduit à la diminution des CD8 SP alors que le nombre de CD4 SP n'est pas affecté. Ceci s'accompagne d'une forte diminution des LT CD8 périphériques sans impact sur les LT CD4 (287). La sélection positive des thymocytes CD8 SP est fortement diminuée dans ces souris. Par ailleurs, les peptides issus de la dégradation de protéines par autophagie sont apprêtés au CMH-II au sein de vésicule. Le CMH-II est exprimé dans le réticulum endoplasmique et associé à un peptide invariant li lui permettant de rejoindre les vésicules endocytiques ayant fusionné avec les phagolysosomes. Les CMH-II sont ensuite dirigés vers la membrane plasmique pour la présentation des peptides aux thymocytes exprimant un TCR restreint au CMH-II (286). La déficience en cathepsin L ou en TSSP (Thymus-specific serine protease precursor), impliquées dans la dégradation de protéines au cours de l'autophagie, compromet la sélection positive des thymocytes CD4 SP (288, 289). 52 2. Signaux de survie induits par la sélection positive La signalisation induite par l'interaction entre le complexe pCMH et le TCR des thymocytes doubles positifs conduit à l'activation de nombreuses voies de signalisation qui ont été présentées dans l'introduction générale. Ces voies de signalisation régulent et déterminent la sélection positive et négative des LT en contrôlant sélectivement l'expression de facteurs de survie ou pro-apoptotiques. L'augmentation de l'expression de facteurs de survie BCL-2 ou BCL-XL protège les cellules de l'apoptose (290, 291). BCL-XL est important pour la survie des cellules DP avant qu'elles soient engagées dans les processus de sélection. La surexpression de BCL-XL conduit à l'augmentation du nombre de thymocytes. Par ailleurs, le traitement de souris transgéniques pour BCL-XL par un anti-CD3 bloque l'élimination des cellules qui est normalement induite dans les souris sauvages (292). La protéine BCL-2 est induite lors de la sélection positive par la signalisation du TCR (291, 293, 294). Suite à l'engagement du TCR, l'activation de la voie des Map kinases et calcique déclenche l'expression de Erg2. La déficience en Erg2 entraine une diminution du développement des thymocytes en simples positifs. L'analyse de la survie cellulaire dans ce modèle, montre une diminution de la survie et une diminution d'expression de BCL-2 (295, 296). C-fos peut aussi être exprimée suite à l'activation des thymocytes DP et réguler d'une façon similaire l'expression de BCL-2 (297). Par ailleurs, l'engagement des TCR conduit à l'expression de Nur77 qui est corrélée à l'intensité des signaux transmis par les TCR. L'expression ectopique de Nur77 conduit à l'augmentation de l'apoptose des cellules doubles positives. La délétion concomitante de Nur77 et de Bim entraine l'augmentation du nombre de cellules sélectionnées positivement (298). La force du signal qui est corrélée à l'affinité des TCR pour les pCMH du soi est donc importante pour déterminer les phénomènes de sélection. 3. Transition des stades DP à SP La sélection positive favorise l'expression de facteurs de transcription mis en place pour la transition de DP à SP. Cette transition se caractérise par la perte d'expression de CD4 ou de CD8. La reconnaissance du CMH-I par le TCR conduit à la différenciation des cellules DP en thymocytes CD8 SP alors que la reconnaissance du CMH-II entraine le développement des cellules CD4 SP (Fig. 14). 53 3. 1. Choix du lignage CD4 et CD8 Différents modèles ont coexisté pour expliquer les mécanismes cellulaires conduisant à la différenciation des cellules en thymocytes CD4 SP et CD8 SP. Initialement, deux modèles dits stochastique et instructif ont été proposés. Le premier, stipulait que la reconnaissance du pCMH conduit à des signaux entrainant l'extinction aléatoire de l'expression du corécepteur CD4 ou du corécepteur CD8. Une seconde étape de signalisation se mettrait en place, au cours de laquelle, la co-expression du TCR et du corécepteur correspondant à un pCMH donné conduirait à des signaux de survie. Dans le cas contraire, la cellule mourrait par apoptose (299). Un autre modèle est ensuite devenu prédominant dans la communauté scientifique. Ce modèle propose que la reconnaissance du complexe TCR-corécepteur avec le pCMH correspondant conduirait à des signaux spécifiques déterminant l'expression du corécepteur CD4 ou CD8. La signalisation issue du corécepteur CD4 entranerait des signaux plus longs et/ou plus forts favorisant l'extinction d'expression des CD8. En revanche, la reconnaissance du TCR correspondant au CMH-I déclencherait des signaux plus brefs et/ou plus faibles favorisant l'extinction du CD4 (300). En faveur de ce modèle, l'atténuation du signal à l'aide d'un inhibiteur de la voie Erk après injection d'anticorps anti-CD3 couplés à anti-CD4, conduit à la différenciation de CD8 SP dans des souris déficientes pour 2m, une sous unité du CMH- I (301). Par ailleurs, l'injection d'anticorps anti-CD3 couplés à anti-CD8 ou anti-CD4 entraine la différenciation en CD4 SP dans un modèle déficient pour la chaine invariante li, importante pour l'apprêtement des peptides au CMH-II (302). Un dernier modèle, appelé modèle cinétique, a plus récemment été proposé pour expliquer le mécanisme par lequel le choix de lignage s'effectue. Ce modèle propose que suite à la sélection positive, toutes les cellules éteindraient l'expression du corécepteur CD8. Les cellules passeraient donc par un stade intermédiaire, CD4 CD8int, dans lequel l'expression du corécepteur CD8 est diminuée. Les signaux transmis dans les cellules exprimant un TCR restreint au CMH-II ne sont pas affectés par cette diminution car les corécepteurs CD4 sont toujours engagés. Dans ce cas, ces signaux entranent l'extinction définitive du gène codant pour CD8 en réprimant la signalisation du récepteur à l'IL-7. En revanche, si le signal est interrompu par la diminution du CD8, l'IL-7 conduira à la réexpression du corécepteur CD8 et par conséquent à la différenciation des thymocytes DP en cellules CD8 SP (303). En faveur de ce modèle, la délétion hétérozygote de STAT5, un acteur de la signalisation du récepteur à l'IL-7, conduit à la diminution de la différenciation des cellules DP en CD8 SP (304). Par ailleurs, la mise 54 en culture de cellules CD4 CD8int sur des cellules stromales exprimant un CMH-I conduit à la différenciation de ces cellules en CD8 SP (305). 3. 2. Acteurs mis en jeu dans la différenciation en CD4 ou CD8 SP La signalisation transmise lors de la sélection positive, déclenche l'expression des facteurs de transcription c-myb et de TOX. c-myb induit l'expression de GATA3 alors que GATA3 et TOX entrainent l'expression de ThPOK. La déficience en c-myb conduit à la diminution de la différenciation des cellules DP en CD4 SP et une légère augmentation de la différenciation en CD8 SP (306). La reconstitution avec de la moelle osseuse mutée pour gata3 dans des souris déficientes pour la sous unité 2m du CMH-I conduit à la différenciation en CD8 SP au lieu d'en CD4 SP (307). De plus, la déficience en TOX dans un modèle de sélection positive AND conduit à la diminution critique de la différenciation en CD4 SP (308). La signalisation induite par le récepteur à l'IL-7 déclenche l'activation de Runx3. Runx3 se fixe sur le promoteur du gène cd4 et réprime son expression en inhibant la fixation de ThPOK favorisant alors l'expression de CD8 (309, 310). De manière intéressante, l'expression de ThPOK est induite par des signaux persistants des TCR ce qui est en faveur du modèle cinétique (311). ThPOK peut favoriser l'expression de SOCS1 qui réprime la signalisation des cytokines. La diminution de la différenciation des DP en CD4 SP dans les souris déficientes pour ThPOK peut être restaurée par l'expression ectopique de SOCS1 (312). Par ailleurs, la surexpression de ThPOK dans un modèle de souris OT-I conduit à la différenciation des thymocytes en CD4 SP au lieu de CD8 SP (313). 55 Figure 14 : Différenciation des cellules doubles positives en simples positives CD4 ou CD8 Au sein du cortex thymique, la reconnaissance d'un complexe pCMH par le TCR conduit à la sélection positive si le signal est modéré. Cette reconnaissance conduit à la diminution d'expression de CD8 et d'expression du récepteur de l'IL-7. Si le signal est persistant, alors les cellules expriment GATA-3 et TOX qui activent l'expression de ThPOK, qui entraine l'expression de gènes spécifiques à la différenciation des CD4 SP. Dans le cas contraire, si le signal TCR est interrompu, le signal IL-7 conduit à l'expression de Runx3 qui réprime l'expression de ThPOK et induit l'expression de gènes pour la différenciation en CD8 SP. Adapté de CD8 thymocyte differentiation : T cell two-step par Gascoigne 2010) II. La sélection négative au sein de la médulla La signalisation induite par la sélection positive, conduit à l'expression de CCR7 qui entrane le chimiotactisme des cellules vers la médulla dont les cellules épithéliales thymiques médullaires (mTEC) sécrètent CCL21 et CCL19 (314-317) (Fig. 15). Au sein de cette région, les mTEC présentent à leur surface des CMH associés à un panel de peptides du soi, appelés TRA, représentatifs des tissus de l'organisme. Cette expression est possible grâce aux facteurs de transcription spécifiques Aire et Fezf2 (318, 319). Les mTEC sont essentielles au développement des LT. De manière intéressante, les LT auto-réactifs régulent l'activité et le développement des mTEC. La forte affinité des TCR pour les complexes pCMH sur les mTEC entrainent des voies de signalisation bilatérales pouvant conduire à l'apoptose des LT et à la maturation des mTEC qui favorisent ce processus (320). 56 Figure 15 : Migration des cellules et évènements de sélection au sein du thymus Les TSP entrent au sein du thymus sous forme ETP/DN1 par la jonction cortico-médullaire puis progressent vers le stade DN2 et DN3 jusqu'atteindre la zone sub-capsullaire. Dans cette zone se déroule la -sélection et les thymocytes prolifèrent. La différenciation en DN4 et ISP s'accompagne de l'expression des récepteurs aux chimiokines CCR9 et CXCR4 leur permettant de rejoindre le cortex thymique sécrétant le CCL25 et CXCL12. Au sein du cortex thymique se déroule la sélection positive permettant la survie des thymocytes ayant une affinité suffisante avec le complexe pCMH. La sélection positive permet la survie des cellules. Suite à la signalisation, ces dernières expriment CCR7 leur permettant de migrer vers la médulla sécrétant CCL21 et CCL19. Au sein de la médulla se déroule la sélection négative suite à l'expression par les mTEC de peptides du soi spécifiques des tissus de l'organisme. L'affinité trop forte des TCR pour le pCMH conduit à l'apoptose des cellules par le mécanisme de sélection négative. Suite à la sélection négative les cellules persistantes expriment SP1R leur permettant de rejoindre la circulation sanguine. Adapté de Signal integration and crosstalk during thymocyte migration and emigration. par Love et Bhandoola 2015. 1. Expression des TRA (tissue-restricted antigens) Les facteurs de transcription Aire et Fezf2 conduisent à l'expression de protéines exprimées par différents tissus de l'organisme. Suite à cette expression, les protéines seront dégradées et apprêtées au CMH des mTEC. La déficience en Aire chez l'Homme conduit au syndrome 57 polyendocrinopathie de type I (APS-1) aussi connu sous le nom APECED (auto-immune polyendocrinopathy-candidiasisectodermal-dystrophy/dysplasia) (321). Aire a été longuement étudié dans l'expression d'antigène du soi spécifique des tissus au sein de mTEC. Cependant, de nombreuses données suggèrent que Aire ne peut être le seul facteur de transcription conduisant à l'expression d'antigène du soi. En effet, alors qu'environ 20000 gènes sont exprimés par les mTEC, Aire ne contrôle l'expression que d'environ 4000 TRA (322). Fezf2 a été découvert comme étant un autre facteur de transcription impliqué dans l'expression et l'apprêtement d'antigènes du soi à la surface de mTEC. Tout comme la déficience en Aire, la perte de Fezf2 chez la souris, conduit à des symptômes auto-immuns (319). Les mTEC sont essentielles à la tolérance centrale car elles expriment des TRA. Mais d'autres cellules présentatrices d'antigènes professionnelles entrent dans le thymus et jouent aussi un rôle dans ce processus. La déplétion des cellules dendritiques thymiques contribue au développement de réponses auto-immunes chez la souris. L'absence de cellules dendritiques au sein du thymus entrane une augmentation du nombre de cellules CD4 SP montrant ainsi l'implication de ces cellules dans la sélection négative (323). Les cellules dendritiques peuvent conduire à la présentation de TRA provenant des mTEC par échange de matériels mais aussi à la présentation d'auto-antigènes non exprimés par les mTEC afin d'augmenter l'efficacité de la sélection négative. L'injection du peptide OVA issu de l'ovalbumine ou de cellules dendritiques chargées par ce peptide entrane la sélection négative dans des souris exprimant le TCR OTII spécifique de ce peptide (324). L'entrée des cellules dendritiques et des macrophages au sein du thymus est régulée par les chimiokines CCL2 sécrétées par les mTEC. CCL2 est le ligand de CCR2 exprimé par les macrophages et les cellules dendritiques (325). Les mTEC peuvent sécréter CCL2 suite à la signalisation induite par leurs interactions avec les thymocytes. L'augmentation de macrophages et de cellules dendritiques au sein du thymus favorise l'augmentation de la sélection négative clonale et centrale conduisant à la diminution du nombre de DP et CD4 SP (326). 2. Régulation de la survie cellulaire par la force du signal La reconnaissance des peptides du soi par les thymocytes entrane des signaux intenses et brefs déclenchant l'apoptose des cellules par activation des caspases par Bim. La signalisation induite par la reconnaissance d'un pCMH conduit à l'expression de Nur77, Trail et Bim. La sélection négative est défectueuse en absence de Nur77 dans un modèle de souris transgéniques pour le TCR OTII croisées avec des souris exprimant le peptide OVA 58 dans la médulla thymique (327). Les souris déficientes en Nur77 exprimant un TCR OTI et le peptide OVA dans la médulla thymique entrane le développement d'un diabète auto- immun (328). Le même résultat a été obtenu dans un modèle similaire déficient pour Bim (329). Le facteur de transcription NCor1 protège les cellules de la sélection négative en réprimant l'expression de Bim. L'activation de la caspase 3 est fortement augmentée dans les cellules SP de souris déficientes pour Ncor1 et s'accompagne d'une diminution du nombre de thymocytes CD4 SP et CD8 SP (330). L'intensité de la signalisation au sein de la médulla peut aussi déterminer la capacité des CD4 SP à se différencier en Treg (331). La déficience en Aire ou Fezf2 conduit à la diminution de Treg démontrant que la présentation des TRA et la signalisation des TCR résultant de la reconnaissance de ces peptides contribuent à la différenciation de ces cellules lorsqu'elles n'induisent pas l'apoptose (319, 332). La force du signal favorise la formation d'un précurseur de Treg FoxP3- CD25 . La maturation de ce précurseur en Treg nécessite les cytokines IL-2 et IL-15 exprimées par les cellules dendritiques et les mTEC respectivement. Ces cytokines entrainent l'activation de la voie Jak3-STAT5 favorisant l'expression de FoxP3 (333). Suite au processus de sélection négative dans la médulla, les thymocytes SP restants expriment le récepteur à Sphingosine-1-Phosphate (S1PR) leur permettant de rejoindre la circulation sanguine (334-336) (Fig. 15). III. THEMIS, une protéine importante dans les mécanismes de sélection THEMIS (THymocytes-Expressed Molecule Involved in Selection) représente un groupe de protéines constitué de trois membres : THEMIS1 ; THEMIS2 et THEMIS3. Ces protéines sont constituées d'un domaine riche en proline (PRR) de 9 acides aminés située à l'extrémité C- terminale et de deux domaines CABIT de 260 acides aminés chacun. La structure cystallographique de ces domaines est inconnue mais des analyses bioinformatiques prédisent qu'ils sont constitués d'au moins douze feuillets formant une structure en tonneau dans laquelle se trouve la cystéine conservée. Les domaines CABIT présentent une séquence consensus centrale de 24 acides aminés que l'on retrouve dans chaque domaine CABIT au sein de nombreuses espèces animales (337). Le CABIT2 contient une séquence de localisation nucléaire dont la fonction n'a pas encore été déterminée (338) (Fig. 16). THEMIS1 est exprimée dans les LT et les mastocytes, THEMIS2 est exprimée dans les LB et les macrophages et THEMIS3 est exprimée dans les cellules épithéliales de l'intestin. La fonction de THEMIS3 dans ces cellules est inconnue (337-339). 59 Figure 16 : Représentation de la protéine THEMIS1 Les protéines THEMIS sont au nombre de trois et présentent les mêmes domaines : deux domaines CABIT présentant une séquence consensus, dans laquelle se trouve une cystéine conservée, et un domaine riche en proline PRR. Le CABIT2 contient une séquence de translocation nucléaire. Le domaine PRR permet l'association constitutive de THEMIS1 avec Grb2. Les domaines CABIT1 et CABIT2 interagissent avec les protéines phosphatases SHP- 1 et SHP2 et pourraient entrainer ou du moins favoriser l'oxydation de la cystéine catalytique des phosphatases SHP-1 et SHP-2. 1. Rôles physiologiques de THEMIS dans les lymphocytes T THEMIS1 a été découverte par différentes approches par des groupes indépendants (337- 340). L'analyse différentielle de gènes exprimés entre les précurseurs multipotents hématopoïétiques et les thymocytes doubles négatifs au stade DN3 ayant acquis le lignage T a révélé un gène inconnu exprimé fortement lors des étapes précoces du développement des LT (339). Ce gène E430004N04Rik a aussi été déterminé par l'analyse différentielle de gènes entre des thymocytes déficients pour RAG, bloqués au stade DN3 et des thymocytes déficients pour la chaine du TCR, bloqués au stade DP (338). Par ailleurs, l'analyse d'une banque de souris traitées par l'agent mutagène ENU (N-ethyl-N-nitrosourea) a mis en évidence une lignée ne répondant pas à des immunisations et pour laquelle la survie des thymocytes est forment altérée. L'analyse de gènes révèle la mutation de E430004N04Rik 60 se caractérisant par la substitution d'une base azotée conduisant au remplacement de la tyrosine Y489 en codon stop. L'analyse prédictive suggère la formation d'une protéine tronquée à la fin du deuxième domaine globulaire CABIT (337, 340). La protéine issue de ce gène qui joue un rôle essentiel dans la sélection thymique a été nommée THEMIS signifiant THymocytes-Expressed Molecule Involved in Selection . Le rôle de THEMIS1 dans le développement des LT a été extensivement étudié. L'analyse de souris déficientes pour THEMIS1 démontre un rôle important de cette protéine lors de la transition DP-SP. Ces souris présentent un nombre de thymocytes CD4 SP et CD8 SP diminué alors que le nombre de cellules DN et DP est normal (337-339). Le croisement de ces souris avec les modèles de sélection exprimant les TCR transgéniques HY et AND, démontre que THEMIS1 est essentielle à la sélection positive des thymocytes. La déficience en THEMIS1 réduit aussi l'efficacité de la sélection négative mais a un impact plus réduit sur celle-ci (337-339). En périphérie, THEMIS1 est importante dans la fonction des Treg (341, 342). Bien que la fonction suppressive des Treg ne soit pas affectée par la déficience en THEMIS1 chez le rat Lewis, elle est fortement impactée chez le rat BN. L'analyse génétique du rat Lewis et du rat BN révèle des polymorphismes affectant quatre gènes situés sur une région de 117kb sur le chromosome 9. Un de ces polymorphismes affecte le gène de la protéine de signalisation Vav1 et entrane une mutation conduisant à la substitution d'un Arginine par un Tryptophane chez le rat BN. Cette mutation entrane une forte diminution de l'expression de Vav1 et réduit sa fonction adaptatrice. Le défaut de fonction suppressive des Treg dans les rats BN déficients pour THEMIS1 entrane une inflammation spontanée de l'intestin. En revanche, le remplacement de la région de 117kb du rat BN par la même région provenant du rat Lewis prévient le développement d'une maladie inflammatoire. Ces résultats montrent que THEMIS1 et Vav1 collaborent dans la fonction suppressive des Treg (342). Par ailleurs, la surexpression de THEMIS1 dans les Treg chez la souris conduit à l'augmentation de leur fonction suppressive (341). THEMIS1 est donc importante dans le développement des LT mais aussi dans la fonction des Treg périphériques. Les fonctions moléculaires de THEMIS2 et THEMIS1 semblent relativement conservées puisque l'expression de THEMIS2 dans des souris déficientes pour THEMIS1 restaure le développement des LT (343). Tout comme THEMIS1 dans les thymocytes, THEMIS2 est impliquée dans la sélection positive des LB en développement en modulant la signalisation en fonction de l'affinité BCR avec les antigènes (344). 61 2. Fonctions de THEMIS dans la signalisation des TCR THEMIS1 est recrutée au sein des complexes de signalisation suite à l'engagement des TCR. La région riche en proline PRR interagit constitutivement avec la protéine adaptatrice Grb2 qui est recrutée à l'adapteur LAT suite à sa phosphorylation par ZAP-70 (345). THEMIS1 est aussi un substrat de ZAP-70 et LCK qui peuvent, in vitro, conduire à la phosphorylation des tyrosine Y540 et Y541. Cependant, la fonction de cette phosphorylation n'a pas encore été déterminée. L'interaction de THEMIS1 avec Grb2 est essentielle dans le développement des LT. En effet, la transduction de CSH déficientes pour THEMIS1 par un gène codant une forme de THEMIS1 privée de sa région PRR ne parvient pas à restaurer le développement des LT contrairement à la forme sauvage transduite de façon similaire (88). La fonction de THEMIS1 dans la signalisation est très controversée et deux modèles principaux ont été proposés. 2. 1. THEMIS est un régulateur négatif de la signalisation Une première étude, réalisée par le groupe de Nick Gascoigne, a montré que la déficience en THEMIS1 peut conduire à une augmentation de la phosphorylation de Erk (346). De manière intéressante, cette augmentation n'est mise en évidence que lorsque les TCR sont engagés par des ligands de relativement faible affinité. Le flux calcique est également augmenté dans les thymocytes THEMIS1-/- DP stimulés dans des conditions similaires. Cette étude montre que THEMIS1 interagit avec SHP-1 une phosphatase inhibitrice des signaux délivrés par les TCR. Le croisement des souris déficientes pour THEMIS1 avec des souris déficientes pour le facteur pro-apoptotique Bim restaure un nombre de thymocytes CD8 SP et CD4 SP comparable aux souris WT (346). L'hypothèse formulée par les auteurs de cette étude est que THEMIS1 atténue les signaux des TCR susceptibles de conduire à l'apoptose des cellules lors de la sélection positive. THEMIS1 agirait comme une protéine adaptatrice en recrutant SHP-1 dans les complexes de signalisation des TCR. Néanmoins notre équipe a montré, en utilisant les mêmes modèles murins, que la déficience en BIM ne restaure pas la maturation des thymocytes CD4SP et le nombre de LT CD4 périphériques dans les souris déficientes pour THEMIS1 (347)(Annexe1). De plus, la mutation de la cystéine catalytique de SHP-1 rendant la phosphatase inactive a plutôt un effet inverse à la déficience en THEMIS1, en favorisant la sélection positive (348). Un autre modèle moléculaire, présenté dans le paragraphe suivant, a été proposé pour expliquer la fonction de THEMIS1 au cours du développement des LT. 62 2. 2. THEMIS est un régulateur positif de la signalisation Plusieurs résultats suggèrent que THEMIS1 exerce aussi des fonctions stimulatrices dans la signalisation des TCR. L'expression de Nur77, une protéine dont l'expression est proportionnelle à la signalisation des TCR, est diminuée dans les thymocytes THEMIS-/- DP en cours de sélection positive. La surexpression de THEMIS1, au contraire, entrane l'expression accrue de Nur77. THEMIS1 recrute la protéine Vav1, importante dans la signalisation des LT. La déficience en THEMIS1 réduit la phosphorylation de Vav1 dans des thymocytes stimulés par des doses variables d'anticorps anti-CD3 et diminue la production de Rac1GTP qui est dépendante de l'activité catalytique de Vav1. Par ailleurs, la stabilité de Grb2 qui contribue au recrutement de Vav1 à LAT est diminuée en absence de THEMIS1 comme le démontre l'augmentation de l'ubiquitination de Grb2 après stimulation des thymocytes (347)(Annexe1). Un travail réalisé par l'équipe de Paul Love auquel j'ai participé suggère que THEMIS1 agirait sur Vav1 en bloquant l'activité phosphatase de SHP-1. Des analyses in vitro, à l'aide de protéines recombinantes codant pour la forme entière de THEMIS1 ou une forme tronquée contenant uniquement les domaines CABIT, montre que THEMIS1 est capable d'inhiber l'activité phosphatase de SHP-1 en favorisant l'oxydation de son site catalytique. En faveur de ce modèle, nous avons montré que la déficience en SHP- 1 dans les souris n'exprimant pas THEMIS1 restaure totalement le développement des thymocytes SP et le nombre de LT matures dans les organes lymphoïdes secondaires (349)(Annexe2) (Fig. 17). 63 Figure 17 : Modèle de la régulation positive de la signalisation SHP-1 est un régulateur négatif de la signalisation qui déphosphoryle LCK et ZAP-70 par conséquent favorise la diminution de la signalisation. THEMIS1 recrute SHP-1 et conduit à l'oxydation de la cystéine catalytique. Cette oxydation inhibe l'activité phosphatase et favorise le soutien de la signalisation pour la sélection positive. 3. Régulation de THEMIS 3. 1. Régulation de son expression L'analyse de l'expression du gène themis par RTqPCR démontre une augmentation de l'expression de THEMIS1 lors du stade double positif précédant la sélection clonale (337, 338). THEMIS1 interagit avec la déubiquitine enzyme USP9X qui est recrutée par Grb2 au sein des complexes de signalisation suite à l'engagement du TCR. Nous avons démontré que l'engagement du TCR conduit à la diminution de l'ubiquitination de THEMIS1 et que cette diminution d'ubiquination dépend de l'activité d'USP9X. La délétion d'USP9X, spécifiquement dans les LT par le modèle USP9Xfl/fl CD4Cre, révèle l'augmentation de l'ubiquitination de THEMIS1 suite à l'engagement du TCR (350)(Annexe3). 64 3. 2. Régulation de son activité et de sa localisation Des analyses de spectrométrie de masse révèlent que THEMIS1 interagit avec plusieurs protéines dont les fonctions sur la signalisation des TCR sont bien connues. Ces analyses montrent également que l'un des partenaires principaux de THEMIS1 dans les thymocytes est une protéine impliquée dans régulation de la dynéine, un complexe moteur essentiel au transport de molécules et de structures cellulaires sur les microtubules. Il s'agit de la protéine Lis1 qui est l'objet central de mon travail de thèse (347)(Annexe1). 65 66 CHAPITRE III : LIS1, UNE MOLECULE INDISPENSABLE DANS LA VIE CELLULAIRE Les travaux d'Orly Reiner sur une maladie neurale sévère appelée lissencéphalie ont mis en évidence la perte du locus ou d'une partie du locus 17p13. 3 sur le chromosome 17 humain. Cette perte de locus entrane des délétions d'une partie ou de la totalité du gène pafah1b1. La protéine issue de ce gène fut ainsi appelée Lis1 pour lissencephaly-1. Cependant, comme ce locus contient d'autres gènes, il a fallu attendre des études génétiques plus approfondies chez la souris pour établir une relation fonctionnelle entre la lissencéphalie et la mutation de Lis1 (351). Les fonctions cellulaires et moléculaires de Lis1 ont été initialement étudiées chez Aspergillus nidulans. Des mutants présentaient un défaut de division et de migration nucléaire à forte température. Ces études ont permis de déterminer une famille de 5 gènes appelés nud (nuclear distribution) dont la mutation affecte la redistribution du noyau dans le cytoplasme. Des analyses approfondies de ce groupe de gènes étaient à la source de l'hypothèse selon laquelle le gène nudF coderait une protéine de signalisation activant la voie de transport nucléaire médiée par la dynéine codée en partie par nudA. Des analyses d'alignement de séquences ont montré une identité de 42% et une similarité de 62% entre Lis1 et NudF, suggérant qu'il s'agissait des mêmes protéines (352). La relation entre Lis1 et la dynéine a été partiellement établie suite à l'étude des gènes nud dans Aspergillus nidulans. La migration cellulaire est rétablie dans les mutants présentant une mutation du gène nudF lorsque le gène nudA est surexprimé dans le modèle suggérant que la mutation de nudF affecte nudA (353). Nous verrons dans cette partie que Lis1 est étroitement liée à la dynéine mais aussi à un autre complexe appelé PAFAH-1B et par conséquent aux évènements moléculaires et cellulaires associés à ces complexes. I. Effets physiologiques associés à la perte ou au gain d'expression de Lis1 La variation d'expression de Lis1, qu'il s'agisse d'une perte ou d'un gain d'expression conduit à des effets neurologiques graves. Il s'agit, à ce jour, des conséquences physiologiques les plus décrites suite à un défaut d'expression de Lis1. En outre, la perte d'expression spontanée de Lis1 ou la présence de SNP au sein du gène pourraient aussi être à l'origine de développement tumoral. 67 1. Conséquences neurologiques Les conséquences neurologiques associées à des défauts d'expression de Lis1 peuvent être dues à différents types de mutation. En effet, il peut s'agir d'une perte hétérozygote de Lis1 parce que le gène est tronqué ou excisé, d'un gain de fonction par dérégulation de son expression et enfin de mutations ponctuelles sur le gène pouvant affecter la structure et la fonction de la protéine résultante (354-358). Les lissencéphalies et microcéphalies sont des maladies neurologiques graves se caractérisant par la mauvaise organisation du cortex cérébral au cours du développement neural. Elle touche 1 nouveau-né sur 100000 et il n'existe pas de traitement curatif. Les enfants naissant avec ces maladies ont une espérance de vie d'environ dix ans dans les cas les plus graves. Les patients atteints de lissencéphalies présentent une texture lisse du cerveau, sans sillons cérébraux (agyrie). Dans le cas de microcéphalies, les sillons sont présents mais réduits (pachygirie) (Fig. 18A). Le syndrome Miller-Dieker correspond à l'excision au niveau du locus 17p13. 3 contenant le gène pafah1b1 (359) (Fig. 18B). D'autres formes de lissencéphalies, ou microcéphalies, peuvent être dues à des mutations ponctuelles conduisant soit à la perte d'expression de pafah1b1, soit à l'expression d'une protéine tronquée ou inactive (360) (Fig. 18C). D'autres formes de lissencéphalies, plus rares, sont dues à l'expression exacerbée de pafah1b1. La taille du cerveau de ces patients est considérablement diminuée suggérant que l'expression de ce gène doit être précisément régulée (357). Cependant, le gène pafah1b1, n'est pas seul responsable des cas de lissencéphalies et microcéphalies. En effet, ces maladies peuvent survenir par excision ou mutation d'autres gènes spécifiques comme tubg1, dync1h1, kif5c et kif2a (361). 68 Figure 18 : Lis1 dans la lissencéphalie (A) IRM de patients sains, atteints de microcéphalie et de lissencéphalie. Adapté de New insights into genotypephenotype correlations for the doublecortin-related lissencephaly spectrum par Bahi-Buisson et al. , 2013. (B) Schématisation non à l'échelle du locus 17p13. 3. Les gènes présentés ne représentent qu'une liste exhaustive. Adapté de Ensembl genome browser 92 ( (C) Schématisation non à l'échelle du gène pafah1b1 présentant quelques mutations retrouvées chez des patients atteints de lissencéphalie ou microcéphalie. Adapté de LIS1-related isolated lissencephaly : spectrum of mutations and relationships with malformation severity par Saillour et al. , 2009 2. Développement tumoral La perte d'hétérozygotie est une perte d'un locus ou d'une région de locus conduisant à la perte d'expression des gènes présents dans ce locus. Ce phénomène est retrouvé dans de nombreuses formes de cancer. La perte d'hétérozygotie au niveau du locus 17p13. 3 est récurrente (362) et a été détectée dans des cas de leucémie, cancers du sein, cancers des ovaires (363), tumeurs astrocytaires (364). Le rôle exact de cette perte de locus dans le développement des cancers n'a pas été étudié en détail. L'analyse de médulloblastomes résultants de cette perte d'hétérozygotie ne conduit pas à la perte d'expression de Lis1 (365). Cependant, dans le cas du carcinome hépatique, elle s'accompagne de la diminution d'expression de Lis1. La transfection de sh-ARNm dirigé contre le transcrit Lis1, dans une lignée de cellules hépatiques conduit à des développements de colonies tumorales in vitro. 69 L'injection à des souris de cellules traitées par ce sh-ARNm entraine le développement de tumeur hépatique, suggérant que la perte hétérozygote de Lis1 peut conduire au développement tumoral (366). En revanche, la surexpression de Lis1 dans ces lignées tumorales ne conduit pas au développement de tumeurs chez la souris. Une étude a aussi révélé la présence de SNP dans le gène pafah1b1 retrouvés chez de nombreux patients présentant des leucémies myéloïdes. Il n'y a aucune donnée vérifiant que le développement tumoral chez ces patients résulte d'une variation d'expression de Lis1 ou d'un problème fonctionnel lié à cette protéine (367). 3. Conséquences immunitaires de la perte d'expression de Lis1 Les conséquences immunitaires de la déficience en Lis1 n'ont jamais été rapportées à ce jour. Cependant, il existe un cas de patient pour lequel la lissencéphalie s'accompagne d'une diminution des LT CD4 et CD8 . L'analyse étant faite en 1989, il s'agissait du phénotype de la lissencéphalie sans certitude que Lis1 soit affectée chez ce patient, ou même que ce défaut ne soit dû qu'à un seul gène (368). II. Fonctions moléculaires Lis1 est exprimée par le gène pafah1b1 localisé sur le chromosome 17 chez l'homme et sur le chromosome 11 chez la souris. La protéine Lis1, d'une taille de 47KDa, est constituée d'un domaine de dimérisation N-terminal LisH et d'une région de 7 domaines WD40 formant une structure tridimensionnelle en hélice . Lis1 agit sous forme homodimère justifiant l'importance du domaine LisH pour ses fonctions (Fig. 19). Des expériences de compétition démontrent que la surexpression de la région N-terminale de la protéine affecte la croissance des colonies d'Aspergillus nidulans (369). Par ailleurs, la délétion du domaine LisH chez la souris affecte le développement neural. L'absence de dimérisation ne permet plus l'interaction de Lis1 avec la dynéine ou le complexe PAFAH-1B (370). L'expression d'un dimère artificiel de Lis1 dépourvu du domaine LisH (GST-LisH) restaure la capacité de Lis1 à réguler la dynéine (371). L'hélice formée par les 7 domaines WD40, permet l'association de Lis1 avec ses partenaires (Fig. 19C). L'analyse structurale par cristallographie du complexe PAFAH-1B, démontre que des interactions ioniques sont engagées entre cette région et les autres sous unités de ce complexe (372). Certains patients atteints de lissencéphalies, présentent des mutations ponctuelles dans leur génome conduisant à la substitution d'un résidu chargé par un résidu neutre. L'analyse de ces mutations dans des 70 lignées cellulaires démontre que, suite à ces substitutions, l'interaction entre Lis1 et ses partenaires est fortement compromise (373). La protéine Lis1 est très conservée au sein de l'évolution. La souris et l'homme partagent une identité de plus de 99% dans la séquence protéique. Lis1 et son homologue Pac1 chez la levure ont une identité de 30% et une similarité de 45% (374). Chez les végétaux, OsLIS-L1 est une protéine présentant un domaine de dimérisation LisH et sept domaines WD40 similaires à Lis1. De manière intéressante, des mutants pour OsLIS-L1 présentent un défaut de gamétogénèse et de croissance par défaut de la prolifération des cellules chez le riz (375). Nous verrons dans la suite de ce chapitre que Lis1 joue un rôle essentiel dans la prolifération cellulaire. Figure 19 : Structure de Lis1 (A) Schématisation de la protéine Lis1 avec un domaine de dimérisation LisH et une hélice constituée de sept domaines WD40 pour l'interaction avec des partenaires. LisH et l'hélice sont reliées par une région coiled-coil (B) Structure d'un dimère de LisH obtenue après diffraction des rayons X par Kim et al. , 2004. (C) Structure de deux hélices de Lis1 complexées à un dimère obtenu après diffraction des rayons X par Tarricone et al. , 2004. (B) et (C) les images ont été obtenues après sélection de l'orientation d'intérêt sur NGL viewer par Rose et al. , 2015 et Rose et al. , 2016. 1. Régulation du complexe PAFAH-1B 1. 1. Le complexe PAFAH-1B Le complexe Platelet activating factor acetylhydrolase 1B ou PAFAH-1B, fait partie de la famille enzymatique PAFAH comprenant la Lysoprotein-associated phospholipase A2, PAFAH-1B et PAFAH-2. Ces enzymes catalysent la déacétylation du second messager lipidique PAF (1-O-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphophatidylcholine) conduisant à la formation de lyso-PAF, l'intermédiaire inactif de PAF. Ce second messager est synthétisé et 71 sécrété par les cellules suite à divers stimuli. La stimulation du récepteur de PAF (PAFR) par PAF entrane l'activation de voies de signalisation par l'activation de phospholipases qui hydrolysent le PIP2 en DAG et en PIP3. Cette signalisation active l'expression et la sécrétion de facteurs inflammatoires par les cellules immunitaires et altère la sécrétion de neurotransmetteurs dans le système nerveux. La dérégulation de sa fonction conduit à des inflammations exacerbées et à des effets toxiques sur les neurones (376, 377). 1. 2. Rôle de Lis1 dans la fonction enzymatique de PAFAH-1B Le complexe PAFAH-1B est un tétramère constitué de deux sous unités enzymatiques PAFAH-1B2 et/ou PAFAH-1B3. Le dimère de PAFAH-1B1, correspondant à Lis1, stabilise l'interaction du complexe enzymatique (372). La fonction de Lis1 au sein du complexe PAFAH-1B est complexe. En effet, son action dépend de la combinaison des sous unités enzymatiques de PAFAH-1B. Des expériences in vitro, révèlent que Lis1 augmente considérablement l'activité enzymatique du dimère PAFAH-1B2/PAFAH-1B2 alors qu'il n'a pas d'effet sur le dimère PAFAH-1B2/PAFAH-1B3. Au contraire, Lis1 aurait une activité répressive sur l'activité du dimère PAFAH-1B3/PAFAH-1B3 (378). Bien que chaque dimère soit capable de catalyser la déacétylation de PAF, ils peuvent avoir des spécificités à d'autres substrats et à différents tissus (Fig. 20). 72 Figure 20 : Représentation de Lis1 au sein du complexe PAFAH-1B (A) Représentation schématique de Lis1 complexée aux dimères PAFAH-1B2/PAFAH-1B2, PAFAH-1B2/PAFAH-1B3 et PAFAH-1B3/PAFAH-1B3. Lis1 favorise l'activité déacétylase de PAFAH-1B2/PAFAH-1B2 ce qui conduit à la déacétylation de PAF pour inhiber la signalisation et l'inflammation associées à PAF. (B) Représentation structurale de complexe PAFAH-1B obtenue par diffraction des rayons X. La résolution structurale des hélices de Lis1 complexées au dimère de PAFAH a été obtenue par Tarricone et al. , 2004 et le dimère LisH par Kim et al. , 2004. La rotation a été réalisée à l'aide de NGL viewer par Rose et al. , 2015 et Rose et al. , 2016. 2. Régulation de la Dynéine 2. 1. Généralités sur dynéine La dynéine est un complexe de haut poids moléculaire (1, 5MDa) comprenant de nombreuses sous unités. Les deux chaines lourdes contiennent chacune un domaine d'interaction avec les microtubules MTBD, un domaine flexible dit linker, une région C- terminale de dimérisation et d'interaction avec des cargos et une région motrice présentant 6 domaines ATPase AAA. Les domaines AAA1 à AAA4 sont capables de fixer l'ATP. Les fonctions précises des domaines AAA2 et AAA4 ne sont pas connues alors que les domaines AAA1 et AAA3 hydrolysent l'ATP et participent à l'action motrice de la dynéine. Le domaine AAA1 est le domaine essentiel au déplacement de la dynéine alors que le domaine AAA3 est important pour réguler le déplacement (379). La régulation du complexe se fait par le biais de ses domaines moteurs et des domaines d'interactions avec les microtubules. Deux 73 chaines intermédiaires, deux petites chaines intermédiaires et six petites chaines sont aussi mises à contribution dans la régulation du complexe et des fonctions associées (Fig. 21). Figure 21 : Représentation de la dynéine (A) Représentation d'un dimère de dynéine sur un plan afin d'observer la composition des deux chaines lourdes constituées d'une région motrice chacune. Ces chaines lourdes ont sur leur extrémité N-terminale deux petites chaines intermédiaires, deux chaines intermédiaires et six petites chaines qui participent à la dimérisation du complexe et à sa régulation. (B) Représentation de la dynéine vue de côté avec la deuxième chaine lourde à l'arrière comme elle sera représentée dans la suite de cette thèse. L'encart est une chaine lourde de la dynéine observée en microscopie électronique par Burgess et al. , 2003 pour leur publication Dynein structure and power stroke . (C) Mouvement de la dynéine vers l'extrémité négative des microtubules. L'ATP se fixant sur AAA1 conduit à la déstabilisation de la dynéine des microtubules. L'hydrolyse de l'ATP entraine un changement conformationnel propulsant la dynéine. Ce changement conformationnel est favorable à l'interaction avec les microtubules. La libération du Pi entraine la conformation initiale de la dynéine qui peut de nouveau fixer une molécule d'ATP. 74 La dynéine, réalise un déplacement rétrograde sur les microtubules, de l'extrémité positive située au cortex cellulaire vers l'extrémité négative correspondant au centrosome à l'exception des neurones. La dynéine transporte de nombreux objets cellulaires, de la molécule comme l'ARNm à l'organite comme les mitochondries et les noyaux. Ce déplacement est dépendant de l'ATP s'hydrolysant dans les sous unités motrices AAA1 et conduisant à des changements conformationnels modifiant l'affinité du domaine MTBD avec les microtubules. De plus, ces changements structuraux conduisent à la propulsion de la dynéine pour son déplacement (380) (Fig. 21). La fonction de la dynéine dans le transport ou dans la stabilisation de complexe est fortement dépendante du complexe dynactine et des régulateurs Lis1 et Asunder. La dynactine se fixe à la dynéine et agit comme un intermédiaire entre la dynéine et les adaptateurs moléculaires qui se fixent aux cargos. Elle déclenche la mobilité de la dynéine ou alors participe à sa stabilisation sur les microtubules selon les adaptateurs moléculaires associés. Ces adaptateurs sont des protéines ayant une spécificité plus ou moins grande pour les structures cellulaires à transporter (381). Alors que Spindly est impliquée dans l'attachement de la dyneine aux kinétochores lors de la mitose (382), Hook et FIP interviennent dans le transport d'endosomes et d'organites (383, 384). HkRP3 conduit au transport de granules lytiques dans les cellules NK vers la synapse immunologique et Trak est spécifique du transport mitochondrial (385, 386). BicD et Egl sont associées au transport d'ARNm par le complexe mRNP (387). Il a été récemment découvert que la ninéine représente un nouvel adaptateur de la dynéine. La ninéine est une protéine du centrosome ce qui suggère que celle-ci est importante dans le déplacement du centrosome (381) (Fig. 22). 75 Figure 22 : La dynéine interagit avec la dynactine qui recrute des adaptateurs spécifiques (A) Représentation de l'interaction entre la dynéine et la dynactine. La dynactine interagit avec les chaines intermédiaires de la dynéine. (B) La dynactine recrute de nombreux adapteurs spécifiques aux structures à véhiculer. Hook et FIP interviennent dans le transport des organites et des endosomes. Trak et Milton sont spécifiques de la relocalisation des mitochondries. Spindly entre en jeu lors de la mitose pour permettre l'accrochage des microtubules aux kinétochores. BicD et Egl interviennent pour le transport des ARNm. HkRP3 est mis en place pour la polarisation des granules lytiques vers la synapse immunologique des cellules NK. Enfin la ninéine est un potentiel adaptateur car interagit avec la dynéine et est spécifique des centrosomes mais il reste à déterminer la fonction de la ninéine associée à la dynéine. 2. 2. Régulation de l'activité motrice Il est solidement établi depuis de nombreuses années que Lis1 joue un rôle essentiel dans la régulation spatiale de nombreuses structures cellulaires. Cette régulation nécessite l'activité de la dynéine qui est finement modulée par Lis1. L'association de Lis1 à la dynéine nécessite les protéines Nde1 ou NdeL. En effet, in vitro, l'absence de ces protéines ne permet pas l'interaction de Lis1 avec la chaine lourde de la dynéine. Nde1/NudeL interagit avec la région de sept domaines WD40 de Lis1 et avec les chaines intermédiaires de la dynéine. Le complexe Lis1-Nde1/NudeL interagit avec la dynéine et favorise le recrutement de la 76 dynactine (388). Le complexe dynactine interagira ensuite avec les adaptateurs des structures d'intérêt. De nombreux modèles existent concernant les mécanismes de régulation de la dynéine par Lis1 : Lis1 initie le déplacement de la dynéine à partir des extrémités positives des microtubules : Des expériences in vitro, démontrent que la vitesse de déplacement de la dynéine sur les microtubules est considérablement augmentée en présence de Lis1 (389). Cependant, des expériences in vivo chez Aspergilus nidulans démontrent le contraire (390). De manière intéressante, NudE et la dynactine interagissent avec le même site d'interaction sur la chaine intermédiaire de la dynéine. Des analyses biochimiques révèlent que la dynactine et NudE entrent en compétition pour interagir avec ce domaine. Ces données suggèrent fortement que la dynactine dissocie le complexe NudE-Lis1 de la dynéine pour activer la migration (391). Supportant cette idée, le suivi de la migration d'endosomes par kymographie, démontre que Lis1 ne colocalise pas avec les endosomes durant leur mouvement au contraire de la sous unité p25 de la dynactine (390, 392). Ceci suggère que Lis1 initie le mouvement de la dynéine sur les microtubules mais ne régule pas sa vitesse de déplacement lors du transport d'organelles (Fig. 23). sur Figure 23 : Lis1 initie le déplacement de la dynéine Lis1 est recrutée à la dynéine par les molécules NudE/NudEL et stabilise la dynéine les microtubules. L'interaction de la dynactine avec la dynéine conduit à la libération de la dynéine de Lis1 et donc à son déplacement 77 Lis1 recrute et stabilise la dynéine aux extrémités positives des microtubules : Lis1 est fortement concentrée aux extrémités positives des microtubules et n'est pas détectée au cours du déplacement des objets cellulaires par la dynéine. Lis1 peut conduire au recrutement de la dynéine à l'extrémité positive des microtubules en favorisant l'interaction de la dynactine avec EB1 et CLIP170 (393, 394). Cela permet le recrutement de IQGAP1 au niveau du cortex cellulaire, ce que nous discuterons dans la partie Fonctions cellulaires (395). Par ailleurs, en favorisant l'interaction de la dynactine avec EB1 et CLIP170, Lis1 favorise le recrutement de la dynéine au niveau des kinétochores lors de la mitose (396, 397) (Fig. 24). sur recrutée à Figure 24 : Lis1 stabilise la dynéine aux extrémités positives des microtubules Lis1 est la dynéine par les molécules NudE/NudEL et stabilise la dynéine les microtubules. Le recrutement de la dynactine conduit à l'association de la dynéine avec CLIP170 ce qui le stabilise au niveau des kinétochores et du cortex cellulaire Lis1 facilite le transport des gros chargements par la dynéine Lis1 est importante pour le déplacement des structures cellulaires telles que les noyaux, les vésicules et d'autres structures cellulaires (390, 397-399). Cependant, il a été clairement observé que l'extinction du gène pafah1b1 conduit à un défaut de migration majeur de lysosomes de taille importante alors que les petits lysosomes sont moins affectés (400). Ces données suggèrent que la fonction de Lis1 sur la dynéine dépend du chargement à transporter. Une publication récente démontre, dans des lignées cellulaires COS-7, que le complexe Lis1-dynéine-Nde1 permet de maintenir l'interaction entre la dynéine et les 78 microtubules. Lis1 serait seulement importante pour l'initiation du transport des charges légères mais contribuerait au transport des charges lourdes tout au long de leur déplacement sur les microtubules. Dans ce cas précis, Lis1 permettrait de maintenir l'interaction de la dynéine avec les microtubules et son cargo (401) (Fig. 25). les Figure 25 : Lis1 facilite le transport de chargements de taille importante Lis1 est recrutée à la dynéine par molécules NudE/NudEL et stabilise la dynéine chargée de grands cargos sur les microtubules pour maintenir une tension suffisante entre la dynéine et les microtubules. Pour les petits chargements, Lis1 n'est pas indispensable. Sur le plan moléculaire, des études de diffraction aux rayons X et de microscopie électronique révèlent que Lis1 interagit avec la région AAA3/4 de la dynéine (389). L'interaction de la dynéine avec les microtubules n'impacte pas l'hydrolyse de l'ATP dans le domaine AAA1. Lis1 exerce des modifications structurales sur la dynéine et modifie ainsi l'affinité du domaine MTBD pour les microtubules. Cet effet dépend du statut nucléotidique du domaine AAA3. En absence de nucléotide ou en présence d'ADP dans cette région, Lis1 augmente l'affinité de la dynéine pour les microtubules. Cependant, Lis1 fragilise cette interaction lorsque le domaine AAA3 fixe une molécule d'ATP. Le statut nucléotide du domaine AAA3 régule les modes d'interaction de Lis1 avec la dynéine. Par microscopie électronique et reconstruction atomique du complexe dynéine et Lis1, les auteurs ont révélé que deux domaines en hélice d'un dimère de Lis1 se fixe sur la dynéine en présence d'ATP. L'un interagit avec le domaine AAA3 alors que l'autre contacte la région coiled-coil de la chaine lourde faisant l'intermédiaire entre le moteur et le domaine MTBD. Au contraire, en absence de nucléotide ou en présence d'ADP, seulement une hélice interagit avec la 79 dynéine au niveau de AAA3. En présence d'ATP, l'interaction d'un domaine en hélice de Lis1 fragiliserait le domaine coiled-coil et déstabiliserait l'interaction de la dynéine avec les microtubules entrainant son décrochement (402) (Fig. 26). Figure 26 : L'état nucléotidique de AAA3 régule l'activité de Lis1 vis-à-vis de la dynéine le La présence d'ATP sur domaine AAA3 conduit à l'interaction d'une hélice de Lis1 avec le domaine coiled-coil de la déstabilisation. En présence d'ADP ou sans nucléotide, l'hélice interagit seulement au AAA5 et stabilise la dynéine sur les microtubules. entrainant AAA6 III. Fonctions cellulaires Comme mentionné dans les paragraphes précédents, Lis1 est un régulateur de la dynéine et de PAFAH-1B. Lis1 est donc impliquée dans de nombreux processus cellulaires dépendants de ces complexes moléculaires. 1. Lis1 dans la migration cellulaire La fonction de Lis1 dans la migration cellulaire a été fortement analysée au cours d'études portant sur la lissencéphalie. En effet, chez des souris hétérozygotes pour Lis1, la structure du cortex cérébral est fortement altérée et le suivi de la migration des neurones révèle un retard de migration des cellules (370, 403). De plus, l'extinction de Lis1 par ARNm interférents dans des neurones conduit au défaut majeur de la migration des neurones (404). La surexpression de Lis1 affecte également l'organisation du cortex cérébral (357, 405). Ces données démontrent l'importance du dosage de Lis1 dans la migration neurale. Mais la fonction de Lis1 dans la régulation de la migration cellulaire n'est pas spécifique aux neurones et peut être mise en jeu dans d'autres types cellulaires. Dans la lignée de 80 fibroblastes NIH3T3, l'extinction de Lis1 conduit à la diminution de la vitesse de migration (406). Lis1 peut affecter la migration des cellules par différents mécanismes. La migration cellulaire dépend de la polarisation de molécules effectrices permettant les protrusions cellulaires et l'agrippement des cellules à un substrat par le biais de molécules d'adhésion. La migration dépend aussi du recyclage de ces molécules d'adhésion et de la réorganisation des organites au sein des cellules (407). 1. 1. Recrutement et polymérisation d'actine corticale L'actine corticale représente les filaments d'actines polymérisés au niveau du cortex cellulaire. Suite au chimiotactisme, des fibres d'actine sont polymérisées au niveau des récepteurs aux chimiokines permettant alors la formation des protrusions cellulaires. Cette polymérisation polarisée d'actine est due à la régulation de petites protéines G CDC42, Rac1 et RhoA. L'activation de ces molécules se fait par échange de leur GDP en GTP. Rac1 et CDC42 sont activées au niveau du lamellipode à l'avant de la cellule en migration alors que RhoA est activée à l'uropode de celle-ci (407). Il a été démontré que la perte hétérozygote de Lis1 dans les neurones de souris conduit à la diminution des lamellipodes lorsque les cellules sont mises en culture sans stimulation. L'analyse de l'activation des petites protéines G démontre une forte diminution de l'activation de Rac1 et CDC42 mais l'augmentation de RhoAGTP. Cela s'accompagne d'une réduction de la polymérisation d'actine au lamellipode (408). Dans un contexte d'activation neuronale par engagement de récepteurs NMDA, l'activation de Rac1, CDC42 et même RhoA est diminuée dans les cellules partiellement déficientes pour Lis1. L'activation de ce récepteur, conduit au déclenchement du flux calcique qui n'est pas affecté par l'absence de Lis1. Cependant, une diminution de recrutement de la protéine IQGAP1 au niveau du cortex cellulaire a été constatée. IQGAP1 est activée par le calcium et permet de stabiliser les formes Rac1GTP et CDC42GTP. IQGAP1 formerait un complexe avec Lis1 et CLIP170 suite à un flux calcique pour stabiliser Rac1GTP et CDC42GTP au niveau du cortex cellulaire et favoriser la polymérisation d'actine corticale (395). 1. 2. Adhérence des cellules et adhérence focale L'adhérence des cellules au substrat pour la migration peut se faire par des protéines de la famille des intégrines et des cadhérines. Ces protéines forment des points d'adhésion focaux afin que le cytosquelette puisse diriger la cellule et ses composants vers l'avant. Une étude 81 publiée cette année, a montré que le nombre d'adhérences focales est spécifiquement diminué au lamellipode suite à l'extinction de Lis1 par interférence à ARNm dans des cellules NIH3T3. Ceci est corrélé à une réduction de la force de traction des cellules (406). Chez la drosophile, il a été démontré que la déficience en Lis1 conduit à la diminution de E-cadhérine à la surface de cellules souches germinales. La fonction moléculaire de Lis1 sur l'expression à la surface des cellules de cette molécule d'adhésion reste encore inconnue (409). Par ailleurs, il a été établi par des expériences de biochimie que Lis1 interagit avec le domaine C-terminal de la protéine APC (410, 411). La déficience en APC affecte la localisation de Lis1 et de la dynéine suggérant qu'APC régule la localisation de Lis1 au cours de la migration (190). APC est transportée vers le lamellipode par la kinésine et interagit au niveau des adhérences focales avec IQGAP1. APC permet de dissocier les adhérences focales et permet ainsi la progression des cellules (411, 412). 1. 3. Mouvement d'organites au cours de la migration Au cours de la migration cellulaire, le noyau se réoriente vers l'uropode alors que l'appareil de golgi et le centrosome se placent à l'avant du noyau (407). L'intérêt du remaniement nucléaire n'est pas totalement compris. Il semblerait cependant qu'il favoriserait le déplacement des cellules en facilitant l'interaction du cytosquelette avec la matrice extracellulaire par l'intermédiaire des protéines d'adhésions (413, 414). Les déplacements du golgi et du centrosome en revanche semblent être indispensables à la migration cellulaire puisqu'ils permettraient de diriger les vésicules vers le lamellipode (415). Par ailleurs, la connexion du centrosome et du noyau est importante pour le mouvement du noyau au cours de la migration. Dans des cellules en cours de migration, la déficience en Lis1 affecte le couplage entre le centrosome et le noyau. Lis1 et DCX pourraient ainsi collaborer dans la migration neuronale en maintenant l'association du centrosome avec le noyau par le biais des microtubules et de la dynéine (416-418). Par ailleurs, Lis1 est concentrée au niveau du lamellipode de cellules NIH3T3 en migration. L'expression d'un dominant négatif de Lis1 affecte la réorientation du centrosome et par conséquent la migration des cellules (419). Lis1 est donc importante dans la relocalisation du centrosome et du noyau au cours de la migration cellulaire. 82 2. Régulation de la division cellulaire La prolifération des cellules se caractérise par la progression de chaque cellule dans le cycle cellulaire. Les cellules au repos sont dans une phase de quiescence appelée G0 au cours de laquelle l'activité intracellulaire est diminuée. Suite à des stimuli, les cellules quittent cet état de quiescence, entrent en phase G1 et se préparent à dupliquer leur ADN. Cette préparation nécessite l'expression de protéines impliquées dans la réplication comme l'ADN polymérase. La synthèse de l'ADN se réalise pendant la phase S au cours de laquelle la quantité d'ADN est doublée (420). Le centrosome se duplique également pendant cette phase (421). Suite à la phase S, les cellules entrent en phase G2 et se préparent à la séparation de l'ADN et par conséquent à la division cellulaire lors de la mitose. Les centrosomes nouvellement formés commencent à se séparer. La dynéine sur les microtubules issus des centrosomes interagit avec la dynactine et l'adaptateur BicD2 associé aux pores nucléaires. Ce déplacement entraine, par la suite, la dissolution de l'enveloppe nucléaire au début de la prophase (422). La mitose est un processus séquentiel, hautement régulé, qui assure la bonne répartition de l'ADN et de diverses protéines vers les pôles opposés de la cellule qui généreront les cellules filles. Elle se caractérise par la condensation de l'ADN lors de la prophase au cours de laquelle la membrane nucléaire, l'appareil de golgi et le réticulum endoplasmique se fragmentent. Les chromosomes formés lors de la prométaphase rejoignent ensuite la plaque équatoriale de la cellule. L'alignement de ces chromosomes lors de la métaphase est un processus finement régulé. Les chromatides sœurs sont maintenues sur la plaque métaphasique par des tensions mécaniques générées par les moteurs moléculaires kinésines et dynéines au niveau des microtubules. Par ailleurs, ces chromatides sœurs sont liées entre elles par la cohésine. L'activation d'APC/C conduit à la dégradation de la sécurine libérant la séparase. Cette dernière dégrade la cohésine et conduit à la séparation des chromatides sœurs (423). L'inactivation de l'une ou de l'autre de ces protéines motrices conduit à un déséquilibre affectant alors l'organisation des chromosomes. Ces moteurs moléculaires sont aussi mis à contribution au cours du transport des chromatides sœurs vers les pôles opposés des cellules. Par ailleurs, le traitement au nocodazole synchronise les cellules lors de la prométaphase indiquant l'importance capitale des microtubules dans ce processus (424) (Fig. 27). 83 Figure 27 : Déroulement du cycle cellulaire Schématisation du cycle cellulaire au cours duquel les cellules se divisent en deux cellules filles. Au cours de la phase S se déroule la duplication de l'ADN et du centrosome. Les centrosomes composés de centrioles se séparent au cours de la phase G2 à l'aide des protéines motrices. L'ADN se condense en chromosomes au cours de la prophase et ces chromosomes se réorientent par la polarité donnée par les centrosomes (les points verts). Au cours de l'anaphase les chromatides sœurs se séparent pour former deux cellules filles constituées de la même quantité de matériel génétique. Au centre de l'image est représentée l'organisation des microtubules en mitose. Trois groupes de microtubules se distinguent : les microtubules astraux (en vert) qui fixent les centrosomes au cortex cellulaire, les microtubules kinétochoriens (en rouge) dont l'extrémité positive s'enchâsse dans les kinétochores et enfin les microtubules polaires (en bleu) qui se croisent et sont responsables du maintien de la polarité des cellules en mitose grâce aux moteurs moléculaires. 84 Lis1 joue un rôle essentiel au cours de la division cellulaire (425, 426). La délétion totale du gène pafah1b1 est létale chez la souris. L'analyse de la prolifération au stade précoce de l'embryogénèse dans ces souris démontre une division fortement altérée. Lis1 est donc importante dans la prolifération des cellules au cours de l'embryogénèse probablement par la régulation de la dynéine (403, 427). Dans le cas de souris hétérozygotes, la fréquence des cycles de prolifération n'est pas affectée de façon majeure. Cependant, la symétrie des divisions est compromise ce qui entrane la différenciation accrue des cellules souches (428, 429). La fonction de Lis1 dans la prolifération cellulaire est fortement conservée entre les espèces comme le démontre son implication au sein de Aspergillus nidulans, Caenorhabditis elegans, Drosophila et chez les végétaux en plus de chez les mammifères (369, 375, 426, 429, 430). 2. 1. Fonctions de Lis1 au cours de la phase G2 du cycle cellulaire Durant la phase G2 se déroule la séparation des centrosomes dupliqués au cours de la phase S du cycle cellulaire. La duplication des centrosomes est essentielle pour le bon déroulement de la mitose (422). Dans des lignées cellulaires MEF, la déficience en Lis1 dans un modèle inductible par le tamoxifène ERCre Lis1fl/fl conduit d'une part à l'amplification des centrosomes et à la mauvaise localisation de ces derniers. La multipolarité aberrante résultante de l'amplification des centrosomes peut conduire à la mauvaise organisation des chromosomes en métaphase. L'amplification du centrosome peut être le résultat de plusieurs phénomènes. Elle peut être la conséquence de la fragmentation des centrioles due à la mauvaise régulation de l'élongation des centrioles et/ou au retard important de la prométaphase (431-434). Par ailleurs, l'amplification du centrosome peut survenir en cas de fragmentation du matériel péricentriolaire entourant les centrioles et étant à la base de la nucléation des microtubules (432, 435). L'analyse fine par microscopie confocale des centrosomes dans le modèle ERCre Lis1fl/fl révèle une augmentation du nombre de centrioles dans le matériel péricentriolaire. Cependant, les mécanismes précis de cette amplification sont encore mal compris (436). 2. 2. Fonctions de Lis1 dans le déroulement de la mitose La mitose est un événement essentiel dans la prolifération des cellules. Elle représente la phase finale du cycle cellulaire et entrane la séparation de deux cellules filles. Celles-ci bénéficieront d'un matériel génétique identique. Cependant, dans le cas d'une division 85 asymétrique, la distribution des protéines est différente. La déficience en Lis1 dans le lignée cellulaire MEF par le modèle ERCre Lis1fl/fl conduit à une augmentation du temps de la transition métaphase à anaphase (437). Par ailleurs, l'analyse de la métaphase démontre une mauvaise organisation des chromosomes sur la plaque métaphasique (397). Le bon déroulement de la mitose, nécessite l'interaction de la dynéine avec les kinétochores au niveau des chromosomes mais aussi la capacité de la dynéine à réaliser un mouvement rétrograde (438). Le maintien des chromosomes en métaphase nécessite aussi la capacité de la dynéine à connecter les microtubules polaires et kinétochoriens (439). Le maintien des chromosomes sur la plaque métaphasique nécessite des tensions entre la dynéine et la kinésine (440, 441). L'inhibition de la dynéine ou de la kinésine déstabilise cet équilibre et conduit à un défaut d'alignement des chromosomes sur la plaque métaphasique. En revanche, l'inhibition concomitante de la kinésine et de la dynéine améliore l'organisation des chromosomes (442). La mauvaise organisation des chromosomes dans les cellules déficientes pour Lis1 est restaurée par l'inhibition de la kinésine Eg5. Ces résultats démontrent donc l'importance de Lis1 dans l'équilibre des forces entre la dynéine et la kinésine au cours de la mitose (442). Lis1 colocalise avec les kinétochores comme le révèlent des expériences d'imagerie (396). Un des composants des kinétochores, CENP-F, est important dans le recrutement de Lis1 et de Nde1/NdeL au niveau des chromosomes (443). Le mouvement des chromosomes par la dynéine vers les pôles des cellules, nécessite l'adaptateur Spindly. Comme attendu, l'extinction de Lis1 par interférence à ARNm entrane une réduction du transport de Spindly vers le centrosome (444). 3. Transport d'organelles Les découvertes des fonctions cellulaires et moléculaires de Lis1 ont été réalisées en partie au cours d'études sur le modèle Aspergillus nidulans pour comprendre la migration du noyau dans ces cellules. Ces données montrent clairement que Lis1 est importante dans le mouvement du noyau au sein de la cellule. Lis1 est aussi importante dans la migration des endosomes et des peroxysomes dans ces cellules. De manière intéressante, la mutation de Lis1 chez la drosophile augmente le transport mitochondrial antérograde et rétrograde. Cependant, cette mutation n'entraine pas la délétion totale de Lis1 dans ces souches. Cette observation suggère que Lis1, dans certaines conditions, peut réguler négativement le transport des mitochondries (445). Cependant, l'extinction totale de Lis1 par interférence à ARNm conduit à une réduction majeure du transport rétrograde et antérograde des mitochondries et des lysosomes dans des lignées cellulaires (446, 447). De manière 86 intéressante, Lis1 est capable d'interagir avec la kinésine, responsable du transport antérograde. La délétion de Lis1 affecte le mouvement de la kinésine vers l'extrémité positive des microtubules mais pas son transport rétrograde. De manière intéressante, la délétion de Nde1 ou NdeL n'affecte que le transport rétrograde des mitochondries. Ces résultats suggèrent que Lis1 est capable de réguler l'activité de la kinésine de manière indépendante de Nde1 au cours du transport d'organelles (446). 4. Transport et recyclage des molécules 4. 1. Transport d'ARNm Le transport d'ARNm vers une zone spécifique de la cellule peut conduire à la régulation localisée de l'expression de protéines (448). L'investigation des composants de la machinerie de localisation des ARNm chez la drosophile révèle que la dynéine, la dynactine et Lis1 sont recrutées à la séquence signal de localisation des ARNm. L'analyse fine par imagerie de drosophiles mutantes pour Lis1 démontre que la mutation de Lis1 affecte la relocalisation des ARNm au sein des cellules. Lis1 est importante pour le recrutement de la dynéine et de la dynactine à la séquence de localisation des ARNm. Cependant la mutation de Lis1 n'affecte pas le recrutement de Egl et BicD qui sont les adaptateurs associés au transport d'ARNm. Egl et BicD sont donc directement associés à la séquence de localisation des ARNm et Lis1 favorise l'association de Egl et BicD à la dynéine et à la dynactine (449). 4. 2. Transport de protéines Le transport et le recyclage des protéines peuvent se faire grâce aux vésicules endocytées et exocytées. Il a été démontré que Lis1 joue un rôle important dans l'endocytose comme je l'ai présenté dans un paragraphe antérieur. Une fonction bien décrite de Lis1 est sa capacité à faire retourner la dyneine à sa position d'origine à l'extrémité positive des microtubules. Il a été démontré que la déficience en Lis1 conduit à la diminution du transport antérograde de dynéine par la kinésine. Cette donnée démontre donc l'importance de Lis1 dans le transport de la dynéine vers l'extrémité positive des microtubules (450). 5. Lis1 au sein dans la signalisation cellulaire Bien que Lis1 ne semble pas être impliquée dans une voie de signalisation spécifique, elle pourrait être mise en jeu dans le transport ou la stabilisation de complexe de signalisation. Cependant, les données démontrant la fonction de Lis1 dans la signalisation diffèrent. 87 En effet, il a été montré que Lis1 interagit avec la protéine BRAP, un régulateur négatif de la voie des MAPK. La déficience en Nde1, conduit à l'augmentation du recrutement de KSR, un adapteur des MAP kinase, et par conséquent une augmentation de la phosphorylation de Mek et Erk suite à la stimulation par des doses réduites de EGF et FGF. Le recrutement de KSR est réduit en l'absence de Lis1 également. De par ces résultats, les auteurs ont interprété que Lis1 jouerait un rôle dans le recrutement de BRAP au niveau de KSR (451, 452). Une publication récente suggère que Lis1 stimule la phosphorylation de Erk et de Akt en contrôlant l'expression des récepteurs FGFR. Dans cet article, les auteurs ont utilisé un modèle conditionnel supprimant complètement le gène codant Lis1. La perte de Lis1 entrane une diminution d'expression du récepteur FGFR qui est liée à l'augmentation de sa dégradation par les lysosomes et la diminution de son recyclage. L'engagement du récepteur FGFR conduit à la phosphorylation de Nde1 interrompant l'interaction entre Lis1 et Nde1 accompagnée de la dégradation du récepteur par le lysosome (453). IV. Régulation de Lis1 L'expression ou l'activité de Lis1 est hautement régulée dans les cellules. Comme longuement discutée dans ce chapitre, l'expression excessive ou la perte d'expression de Lis1 sont associées à des troubles physiologiques graves. La régulation d'expression ou d'activité des protéines peut se faire à plusieurs niveaux, qu'elle soit par leur localisation cellulaire, par leur expression ou même par des modifications post-traductionnelles. 1. Régulation d'expression génique Les facteurs de transcription régulant l'expression de Lis1 ne sont pas connus, bien que l'expression de ce gène soit fortement régulée. En effet, l'expression de Lis1 est différente selon les stades de développement, après la naissance mais aussi entre les différents types cellulaires et tissus (404). 2. Régulation post-transcriptionnelle MAGOH entre en jeu dans le complexe de traduction des ARNm en protéines. Dans le cas de délétion hétérozygote de magoh, le niveau de transcrit de Lis1 est identique au contrôle alors que la proportion de protéines est diminuée. Les souris hétérozygotes pour magoh présentent un phénotype comparable à celui observé dans le cas de souris hétérozygotes 88 pour Lis1 (454). L'expression de l'ARNm provenant du gène pafah1b1 en protéine pourrait aussi être régulée par des petits ARN. Dans la lignée cellulaire PC12, le petit ARN miR-139- 5p conduit à la diminution d'expression de Lis1. Ce petit ARN régule le développement neural chez le rat. Dans les lignées cellulaires PC12 et HCN-2, l'absence de Lis1 et de miR-139-5p entraine une faible migration des cellules. L'expression de Lis1 conduit à une augmentation considérable de la migration qui est diminuée drastiquement en présence de miR-139-5p (455). 3. Modifications post-traductionnelles 3. 1. Phosphorylation Des expériences anciennes suggèrent que Lis1 peut être phosphorylée sur une sérine. Des tests de phosphorylation in vitro en présence de différentes kinases révèlent que Lis1 peut être phosphorylée par la kinase CKII (456). De plus, Lis1 est phosphorylée après traitement des neurones à la D-sérine, un agoniste capable de stimuler les neurones. La phosphorylation de Lis1 pourrait réguler la localisation de Lis1 au sein de la cellule de façon CLIP170 dépendante (394). Le rôle précis de cette phosphorylation n'est pour le moment pas connu. Cependant, la phosphorylation des partenaires de Lis1 peut réguler les interactions. En effet, la phosphorylation de Nde1 et NdeL1 sur leur thréonine T131 et T132 respectivement par PKA conduit à la perte de l'interaction entre Lis1 et Nde1 ou NdeL1. L'activité de PKA est modulée par le complexe PDE4/DISC suite à une élévation du niveau d'AMPc dans la cellule. Cette phosphorylation est enrichie dans le noyau et dans les centrosomes au cours de la mitose probablement pour réguler l'action de Lis1 dans ce processus (457). Nde1 et NdeL1 peuvent aussi être substrats d'autres protéines kinases telles que CDK1, CDK5 et Aurora A régulant l'interaction de Lis1 avec Nde1/NdeL1 et du complexe Nde1-Lis1 avec la dynéine. La phosphorylation de la sérine S231 par CDK5 au cours de la prophase des cellules neurales réduit l'interaction de Lis1 et Nde1 au niveau de l'enveloppe nucléaire (458). Par conséquent, les phosphorylations de Nde1 et NdeL1 peuvent réguler, indirectement, la fonction de Lis1 vis à vis de la dynéine. 3. 2. Sumoylation et ubiquitination Il a été démontré, chez la levure, que Pac1p, un homologue de Lis1, peut être sumoylé et ubiquitiné. La fonction de ces modifications post-traductionnelles reste incomprise. Cependant, cet article a démontré que la sumoylation de Pac1p pouvait entraner 89 l'ubiquitination de cette protéine. Cela pourrait alors conduire à sa dégradation par le protéasome (459). 4. Régulation spatiale et de sa stabilité 4. 1. Stabilité fonctionnelle Comme je l'ai présenté largement dans ce chapitre, Lis1 est à la fois une sous unité du complexe enzymatique PAFAH-1B et un régulateur de la dynéine. Nde1 et NdeL1 sont indispensables pour la fonction de Lis1 dans la régulation de la dynéine. De manière intéressante, Nde1 et NdeL1 entrent en compétition avec les sous unités PAFAH-1B2/3 pour leur interaction avec Lis1 (372). La surexpression des sous unités PAFAH-1B2 et PAFAH- 1B3 dans des lignées cellulaires conduit à la diminution conséquente du transport rétrograde et à du retard mitotique. En revanche, l'expression ectopique de NdeL1 dans ces cellules surexprimant les sous unités PAFAH-1B2 et PAFAH-1B3 restaure le positionnement des organelles. La fonction de Lis1 dans le complexe PAFAH-1B n'entre donc pas en jeu dans la régulation de la dynéine. Ces données démontrent que la stabilité fonctionnelle de Lis1 dans le complexe enzymatique PAFAH-1B ou dans l'activité de la dynéine peut être régulée négativement par Nde1/Ndel1 et les sous unités PAFAH-1B2/3 respectivement (404). Par ailleurs, la surexpression des sous unités PAFAH-1B2/3 dans un contexte mitotique conduit à l'augmentation de l'anormalité du nombre de centrosomes et de noyaux. L'analyse par imagerie démontre la localisation affectée de Lis1 en cas de surexpression de sous unités de PAFAH-1B (460). Dans les neurones, l'activité de Lis1 est régulée par la signalisation de la Reelin. Suite à l'association de la Reelin sur le récepteur VLDLR, Dab1 est recrutée au récepteur VLDLR entrainant la phosphorylation de Dab1. Dab1 interagit donc avec Lis1 conduisant à la dissociation de Lis1 du complexe PAFAH-1B. Par conséquent, Lis1 devient disponible pour son activité de régulateur de la dynéine au cours du développement neural (461). 4. 2. Stabilité structurale La stabilité de Lis1 peut être régulée, comme mentionné précédemment, par sumoylation et ubiquitination (459). Mais la protéine NudC participerait à la stabilisation de Lis1. En effet, l'extinction du gène nudC par interférence à ARNm conduit à la diminution du niveau de Lis1 dans des cellules HeLa. Ce résultat s'accompagne de la diminution de l'interaction entre Lis1 90 et la protéine chaperonne Hsp90. Lis1 peut interagir avec la protéine NudC qui stabilise son interaction avec la chaperonne Hsp90 (462, 463). 4. 3. Régulation spatiale La kinésine est essentielle dans la relocalisation de Lis1, de la dynéine et de la dynactine à l'extrémité positive des microtubules. Chez une souche d'Aspergillus nidulans et Ustilago maydis déficientes pour une kinésine, la dynéine et Lis1 sont concentrées à l'extrémité négative des microtubules en comparaison à des souches sauvages. Ceci s'accompagne d'un défaut de mouvement des endosomes suite à l'absence de dynéine disponible à l'extrémité positive des microtubules (392, 464). Par ailleurs, l'interférence à ARNm de NudC conduit à la mauvaise localisation de la dynéine et des organelles. L'analyse par imagerie démontre qu'en absence de NudC, les protéines Lis1, NdeL1 et des sous unités de la dynactine, sont accumulées au voisinage du noyau. Cela suggère qu'en absence de NudC, ces protéines ne parviennent pas à être relocalisées. La protéine NudC, connue pour interagir avec Lis1 (465), interagit aussi avec la protéine motrice kinésine. Lis1 interagit avec la dynéine et la tubuline lors du transport antérograde par la kinésine (450). L'analyse de la migration intracellulaire dans les neurones démontre une forte diminution du mouvement antérograde de la dynéine suite au traitement avec un anticorps anti-NudC. Ces résultats démontrent donc que NudC fait l'intermédiaire entre la kinésine et le complexe Lis1-dynéine pour leur transport vers l'extrémité positive des microtubules (466). L'arrivée du complexe Lis1-dynéine-kinésine à l'extrémité positive des microtubules, nécessite la libération du complexe pour la réactivation de la dynéine. Il a été démontré que Rab6a conduit à la libération de la dynéine en favorisant la dissociation de Lis1 et de la dynéine (467). Par ailleurs, la localisation de Lis1 peut être dépendante de la protéine Asunder, un autre régulateur de la dynéine. La diminution de concentration en Asunder dans des drosophiles conduit à une diminution de la localisation de Lis1 au niveau des chromosomes dans des cellules germinales en cours de méioses (468). Enfin, la région cellulaire de traduction de l'ARNm codant pour Lis1 peut aussi réguler sa localisation spatiale. En effet, l'abondance de l'ARNm Lis1 est augmentée suite à la stimulation par NGF dans les axones des neurones (469). 91 V. Lis1 dans le système immunitaire La fonction de Lis1 dans le système immunitaire a été peu étudiée. Cependant, quelques publications révèlent l'importance de cette protéine dans le développement et l'homéostasie de plusieurs cellules du système immunitaire. 1. Fonctions de Lis1 dans les lignées hématopoïétiques Comme expliqué au cours du chapitre I de cette thèse, les CSH sont à l'origine du système myéloïde et lymphoïde. Le modèle Vav1Cre Lis1fl/fl se caractérise par la délétion de Lis1 au sein des CSH. Cependant, les souris Vav1Cre Lis1fl/fl ne sont pas viables car elles présentent un phénotype dépourvu de sang dit bloodless . L'analyse chez les fœtus de cette lignée démontre une proportion réduite de CSH par rapport aux fœtus contrôles. Bien que la prolifération des cellules ne soit pas affectée de façon majeure, une forte augmentation de la phase G2/M du cycle cellulaire est observée. L'analyse fine par imagerie des cellules en mitose démontre une mauvaise répartition des chromosomes au cours de la mitose et un nombre anormal de centrosomes. Cela conduit à l'augmentation du nombre de cellules aneuploïdes qui s'accompagne d'une augmentation du nombre de cellules en apoptose (470). Dans un modèle inductible Lis1fl/fl Rosa26CreER, conduisant à la délétion de Lis1 au sein des CSH suite au traitement par le tamoxifène, la proportion de cellules souches diminue chez des souris adultes. Cependant, les auteurs ne trouvent pas d'impact de l'absence de Lis1 sur la prolifération et la mitose de ces cellules. L'étude par imagerie de la distribution de Numb, une protéine impliquée dans la polarisation des divisions cellulaires, révèle que la déficience en Lis1 accroit l'asymétrie des divisions cellulaires. Cette dérégulation de la symétrie des divisions accroit les processus de différenciation cellulaire et diminue ainsi la proportion de CSH (429). Ces deux publications démontrent donc l'importance de Lis1 dans la différenciation des cellules souches hématopoïétiques. D'une part en régulant la répartition des chromosomes sur le plan métaphasique et d'autre part pour la redistribution équitable des protéines au sein des cellules en cours de division. 2. Rôles de Lis1 dans la fonction des lymphocytes B Une publication faite en 2017 démontre le rôle de Lis1 dans la fonction des LB périphériques. Ces auteurs ont utilisé le modèle AIDCre Lis1fl/fl afin d'obtenir une déficience en Lis1 spécifiquement dans les LB activés. Le nombre de LB dans les centres germinatifs est fortement réduit suite à la délétion du gène pafah1b1. L'analyse par imagerie des cellules en 92 migration révèle que la déficience en Lis1 conduit à l'accumulation d'actine à l'uropode. Parce que l'uropode des cellules en migration présente une forte concentration en récepteurs BCR et en corécepteurs et que le cytosquelette est important dans la réponse à la stimulation, les auteurs ont analysé si la déficience en Lis1 affecte la signalisation induite par ces récepteurs. La phosphorylation d'AKT et de Erk est augmentée dans les LB AIDCre Lis1fl/fl MD4 transgéniques. Les auteurs montrent aussi que le cycle cellulaire est bloqué en mitose en absence de Lis1. L'apoptose des cellules est augmentée et conduit à la diminution de la proportion des LB activés. Lis1 a donc une fonction importante dans les LB en permettant un bon déroulement de la mitose suite à leur activation. Lis1 semble aussi essentielle dans la polarisation des cellules afin de permettre une signalisation et par conséquent une stimulation régulée (471). 3. Rôles de Lis1 dans la fonction des lymphocytes T En 2016, Ngoi et al ont publié un article montrant les conséquences de la déficience conditionnelle de Lis1 dans les LT en utilisant un modèle CD4Cre Lis1fl/fl. Ce modèle conduit à la délétion du gène pafah1b1 à partir du stade double positif du développement des LT. Le phénotypage de cette lignée démontre que l'absence de Lis1 n'affecte pas le développement des LT. En revanche, une forte lymphopénie a été mise en évidence avec une augmentation de la proportion des LT activés CD44hi. Des expériences de transfert adoptif de thymocytes SP matures Lis1fl/fl CD45. 1 et de Lis1fl/fl CD4Cre CD45. 2 dans des souris receveuses montrent que les thymocytes déficients pour Lis1 migrent normalement vers les organes lymphoïdes secondaires. Cependant, la prolifération homéostatique des cellules en réponse à la stimulation par l'IL-7 est fortement impactée que ce soit dans le compartiment T CD4 et T CD8 . La déficience en Lis1 accroit l'apoptose des cellules en cours de prolifération lors de cette stimulation. La déficience en Lis1 affecte aussi prolifération des LT CD8 et CD4 induite suite à l'engagement des TCR. Néanmoins, les auteurs concluent que la déficience en Lis1 a un impact plus sévère sur la prolifération induite par l'IL-7 que sur celle induite par les TCR. L'analyse des résultats présentés suggère, par ailleurs, que la déficience en Lis1 affecte plus fortement la prolifération des LT CD4 que celle des CD8 lors de l'engagement des TCR. In vivo, l'immunisation de souris OT-I par une forme de Listeria monocytogenes exprimant le peptide OVA montre que Lis1 n'affecte pas l'expansion initiale des LT CD8 spécifiques de l'antigène et la production d'IFN dans ce modèle. La production d'IFN est aussi normale in vitro dans les cellules polarisées en Th1. En revanche, la déficience en Lis1 entrane une diminution de LT CD8 mémoires suite à l'infection par Listeria. De plus, la stimulation 93 antigénique par le peptide OVA des LT CD8 OT-I naïfs en présence d'IL-15 ou IL-2 montre que les cellules déficientes pour Lis1 ne parviennent pas à se différencier en LT CD8 mémoires in vitro. Ces résultats suggèrent que Lis1 exercerait un effet sélectif sur la différenciation des LT CD8 mémoire (472). Une autre étude montre que Lis1 est recrutée au sein de la synapse immunologique suite à la stimulation de cellules Jurkats par des CPA et des superantigènes SEE. Nde1 est essentielle au recrutement de Lis1 et de la dynéine à la synapse immunologique. L'absence de Nde1 affecte la formation de la synapse immunologique et entrane une diminution de recrutement du centrosome à proximité de la synapse (473). Ce phénotype est similaire à celui observé dans un modèle de cellules Jurkats déficientes en une sous unité de la dynéine (159). 94 OBJECTIFS DE LA THESE THEMIS1 est une protéine de signalisation fortement impliquée dans les évènements de sélection positive et de sélection négative au sein du thymus (337-339). Bien que THEMIS1 soit recrutée aux complexes de signalisation par Grb2, mon équipe s'est intéressée à l'interactome de THEMIS1 dans le but de déterminer de nouveaux partenaires. Mon équipe d'accueil analysa l'interactome de THEMIS1 par spectrométrie de masse et par criblage double hybride. Parmi les partenaires de THEMIS1, sont détectées de nombreuses protéines de signalisation mais aussi la protéine Lis1 qui n'avait jamais été étudiée dans les LT (347)(Annexe1). Au début de mon doctorat, je me suis intéressé à cette interaction, et nous avons déterminé les domaines d'interaction entre ces deux protéines (Annexe 4). Cependant, afin de comprendre la fonction de l'interaction entre THEMIS1 et Lis1, nous nous sommes demandés si Lis1, comme THEMIS1, peut jouer un rôle au cours des sélections thymiques. L'analyse des conséquences de la déficience en Lis1 dans le développement thymique ne démontre pas d'effet de l'absence de Lis1 sur le développement des LT dans un modèle CD4Cre. Des analyses complémentaires confirment que la sélection positive ne sont pas affectés dans ce modèle. En revanche, comme Ngoi et al l'ont publié lors de mon doctorat, les conséquences sur la population des LT périphériques sont fortes avec une diminution conséquente de la proportion des LT périphériques. Les auteurs ont déterminé un fort impact de la prolifération des LT périphériques suite à la stimulation par IL-7 (472). Dans notre quête pour la compréhension de l'interaction entre THEMIS1 et Lis1, nous avons utilisé un modèle de déficience en Lis1 différents de Ngoi et al. En effet, le modèle CD4Cre semble conduire à une délétion trop tardive des gènes, et nous pensions que ce modèle ne nous permettrait pas de détecter d'éventuels défauts au cours des processus de sélection (244). Nous avons donc croisé des souris dans le but de créer une délétion de Lis1 dans les stades précoces du développement des LT. Dans ce modèle CD2Cre, nous remarquons une forte diminution de la cellularité thymique avec l'accumulation des cellules au cours des stades précoces du développement des LT. Manifestement, les deux modèles utilisés dans cette thèse ne nous ont pas permis de déterminer une éventuelle fonction de Lis1 dans les évènements de sélection. Par conséquent, nous nous sommes intéressés à comprendre le blocage du développement précoce des LT en absence de Lis1 et à déterminer les conséquences moléculaires du blocage de la prolifération des LT périphériques. Dans notre modèle, nous observons un blocage au cours des stades DN3 du développement des LT. Cependant, la -sélection n'est pas affectée. Mais nous avons remarqué que la prolifération des thymocytes précoces est fortement altérée tout comme la prolifération des LT 95 périphériques. Par des analyses de cytométrie en image, nous observons une accumulation des cellules en cours de mitose avec la diminution des cellules en métaphase. Grâce à des analyses de microscopie confocale et de vidéo-microscopie, nous avons pu mettre en évidence un défaut au cours de la prométaphase de la mitose ainsi qu'au cours de l'anaphase. Cela conduit à la distribution inégale du matériel génétique au cours de l'anaphase, entrainant la formation de cellules filles n'ayant pas la même quantité d'ADN, lorsque les cellules parviennent à se séparer. Ce phénomène s'accompagne de l'apoptose importante des cellules pouvant expliquer l'absence de thymocytes aux stades DP et la forte diminution de LT périphériques. 96 RESULTATS Lis1 est essentielle au développement précoce des lymphocytes T Pour analyser le rôle de Lis1 dans le développement des LT et la fonction potentielle de son interaction avec THEMIS1, nous avons croisé des souris exprimant la Cre recombinase sous le contrôle du promoteur CD2 ou CD4 avec des souris présentant dans leur génome deux séquences LoxP flanquant les exons 3 à 6 du gène pafah1b1 (Fig. S1A)(403). La Cre recombinase est exprimée soit entre les stades DN1 et DN3, dans le modèle de souris transgénique CD2Cre (474-476), soit plus tardivement, entre les stades DN4 et DP, dans le modèle de souris transgénique CD4Cre (477). Dans les deux modèles, les animaux sont fertiles et ne présentent pas de signes cliniques apparents. Confirmant une étude précédente réalisée dans un modèle similaire (472), nous montrons que la déficience en Lis1 dans les souris CD4Cre ne modifie pas la cellularité du thymus et la proportion des sous populations de thymocytes DN, DP, CD4-SP et CD8-SP (Fig. S1B et Fig. 1A). Les pourcentages de cellules SP CD24lo matures sont aussi normales dans ces souris (Fig. S1C). Nous observons également des proportions normales de cellules DP et SP exprimant un niveau élevé de TCR (TCRhi), suggérant que la déficience en Lis1 n'affecte pas la sélection positive (Fig. S1D). Pour confirmer cette observation, nous avons analysé la sélection positive des thymocytes CD4 SP dans des souris Lis1fl/fl CD4Cre exprimant le TCR transgénique AND qui est restreint aux molécules du CMH-II. Confirmant nos conclusions précédentes, nous montrons que l'absence de Lis1 dans ces souris n'affecte pas le nombre et le pourcentage thymocytes CD4 SP (Fig. 1A). L'ensemble de ces résultats suggère que Lis1, contrairement à THEMIS1, n'est pas essentielle au développement tardif des thymocytes (87, 337-339). Cependant, la délétion de Lis1 dans le modèle CD2Cre conduit à une forte diminution de la cellularité du thymus et à une augmentation de la proportion de cellules DN (Fig. S1B et Fig. 1B). Le nombre absolu de cellules DN est similaire entre les souris Lis1fl/fl CD2Cre et les animaux Lis1fl/fl alors que les populations DP et SP sont quasiment inexistantes, illustrant un blocage du développement précoce des LT (Fig. 1B). L'analyse de Lis1 par cytométrie en flux montre que les cellules DP et SP persistantes dans ce modèle expriment partiellement 97 ou totalement Lis1 suggérant qu'une partie ou que la totalité de ces cellules ait échappé à la délétion du gène codant Lis1 par la Cre recombinase (Fig. suppl. 2A). L'analyse des sous- populations DN dans les souris Lis1fl/fl CD2Cre, indique une accumulation de cellules DN3 (CD44- CD25 ) et une diminution majeure du nombre de cellules DN4 (Fig. 1C). Contrairement aux animaux CD2Cre Lis1fl/fl qui présentent un phénotype sévère, les souris CD2Cre Lis1fl/ hétérozygotes qui ont une déficience partielle pour Lis1 n'entrane pas d'anomalie significative du développement des LT (Fig. S2B). Ces résultats montrent que Lis1 est essentielle au développement précoce des LT. Comme la Cre recombinase dans le modèle CD2Cre est également exprimée au stade précoce du développement des LB, nous avons aussi analysé l'effet de la déficience en Lis1 sur le développement de ces cellules. La déficience en Lis1 dans le modèle CD2Cre conduit à une diminution drastique du nombre de LB en développement (B220 CD19 ) se traduisant par la diminution des cellules proB (B220 CD19 c-kit IgM-), preB (B220 CD19 c-kit- IgM-) et LB immature (B220 CD19 c-kit- IgM ) dans la moelle osseuse. La population des cellules précurseurs des LB (B220 CD19-) est diminuée mais légèrement en comparaison aux populations plus matures, suggérant que la perte de Lis1 dans ce modèle entrane un blocage à ce stade de développement (Fig. S3). 98 Figure 1 : Le développement précoce de lymphocytes T est affecté en absence de Lis1 (A, B) Marquage de surface de CD4 et CD8 sur des thymocytes issus de souris contrôles (Lis1fl/fl) et déficientes en Lis1 dans les modèles CD4Cre (Lis1fl/fl CD4Cre) et CD4Cre AND (Lis1fl/fl AND CD4Cre) (A) et CD2Cre (Lis1fl/fl CD2Cre) (B). (C) Marquage de surface de CD44 et CD25 après gating sur la population thymique DN (CD4- CD8-) issue de souris contrôles (Lis1fl/fl) et déficientes dans le modèle CD2Cre (Lis1fl/fl CD2Cre). Les valeurs dans les cadrans représentent les proportions de cellules au sein des principales populations thymiques. Les histogrammes regroupent les nombres absolus de cellules au sein des différentes populations. Ces figures totalisent deux (A), cinq (B) et huit expériences indépendantes (C) chacune constituée de 3 à 5 souris par groupe. p (Test non paramétrique de Mann-Whitney) 99 100 Lis1 n'est pas essentielle à la -sélection des thymocytes doubles négatifs La sélection est une étape de transition essentielle entre les stades DN3 et DN4 entrainant la survie et la prolifération des thymocytes précoces ayant procédé à des réarrangements fonctionnels de la chaine du TCR (259-261). Pour évaluer le rôle de Lis1 dans ce processus, nous avons analysé l'expression intracellulaire de la chaine du TCR (icTCR) par cytométrie en flux. Nous observons que la proportion de cellules DN3 et DN4 icTCR est diminuée de 30% et 50% respectivement dans les animaux Lis1fl/fl CD2Cre en comparaison aux animaux contrôles. La déficience en Lis1 dans les cellules DN3 et DN4 icTCR n'affecte pas les niveaux d'expression de la chaine du TCR, suggérant que Lis1 n'est pas essentielle au réarrangement de la chane dans ces cellules (Fig. 2A). L'expression d'une chane fonctionnelle déclenche des événements de signalisation qui entranent la prolifération et la survie des cellules. Pour déterminer l'effet de la déficience en Lis1 sur la signalisation déclenchée par la chane des TCR, nous avons comparé l'expression de CD5, un corécepteur dont le niveau d'expression est corrélé à l'intensité des signaux délivrés par les pre-TCR et les TCR, sur les cellules DN3 exprimant ou non la chane des TCR. L'expression de CD5 est augmentée sur les cellules DN3 icTCRhi en comparaison aux cellules DN3 icTCRlo conformément à ce qui a été décrit (478). Le niveau d'expression de CD5 est augmenté dans ces deux populations en absence de Lis1 indiquant que le blocage du développement des LT à ce stade ne résulte pas d'une diminution de la signalisation dans ces cellules (Fig. 2B). Deux populations de thymocytes DN3 se distinguent. Les thymocytes DN3a (icTCRlo CD5lo), n'expriment pas de chane fonctionnelle et ont une faible capacité à survivre et à proliférer. Les thymocytes DN3b (icTCRhi CD5hi) expriment une chane et des niveaux élevés de protéines favorisant leur survie, leur prolifération et leur maturation telles que le récepteur à l'IL-7, la protéine BCL-2 ou le récepteur trophique CD71 (262). Nous observons que l'expression du récepteur à l'IL-7 et de BCL-2 est similaire entre les souris Lis1fl/fl CD2Cre et Lis1fl/fl suggérant que les pre-TCR délivrent des signaux de survie et de maturation efficaces en absence de Lis1 (Fig. 2C). L'expression basale de CD71 est augmentée sur les cellules DN3a et DN3b déficientes en Lis1 en comparaison de ces mêmes populations cellulaires dans les souris contrôles, suggérant que les cellules parviennent à ajuster leur activité métabolique après la sélection (Fig. 2D). L'ensemble de ces données suggère que la 101 déficience en Lis1 n'entrane pas un blocage des évènements moléculaires et cellulaires précoces liés au passage de la sélection. 102 Figure 2 : La déficience en Lis1 n'affecte pas le déroulement de la -sélection (A) Marquage intracellulaire du TCR sur des thymocytes DN issus de souris contrôles (Lis1fl/fl) et déficientes en Lis1 dans le modèle CD2Cre (Lis1fl/fl CD2Cre). Les histogrammes barres représentent les proportions de cellules icTCRhi au sein des sous populations DN2 (CD44 CD25 ), DN3 (CD44- CD25 ) et DN4 (CD44- CD25-). Les droites tracées sur les histogrammes FACS intègrent les populations icTCRhi. (B) Marquage de surface de CD5 sur des thymocytes DN3 icTCRhi et DN3 icTCRlo issus de souris contrôles (Lis1fl/fl) et déficientes en Lis1 dans les modèles CD2Cre (Lis1fl/fl CD2Cre). Les droites tracées sur les histogrammes FACS intègrent les populations CD5hi. Les histogrammes barres représentent les valeurs de MFI de CD5 au sein des sous populations DN3 icTCRhi et DN3 icTCRlo (C, D) Marquage de surface de IL7-R, BCL-2 et CD71 sur des thymocytes DN3a (icTCRlo CD5lo), DN3b (icTCRhi CD5hi) et DN4 (CD44- CD25-) issus de souris contrôles (Lis1fl/fl) et déficientes en Lis1 dans les modèles CD2Cre (Lis1fl/fl CD2Cre). Les histogrammes barres représentent les valeurs de MFI au sein des sous populations DN3a et DN3b. Les valeurs inscrites sur les histogrammes FACS représentent les valeurs de MFI des marqueurs correspondants. Ces résultats totalisent cinq (A), deux (B, C) et trois expériences indépendantes (D) chacune constituée de 3 à 4 souris par groupe. p (Test non paramétrique de Mann-Whitney) 103 104 Lis1 est essentielle à la prolifération des thymocytes DN3 après la sélection Nous avons ensuite évalué le rôle de Lis1 dans les évènements de prolifération qui suivent la sélection Dans ce but, des thymocytes DN3a ont été isolés par FACS, marqués au Cell Trace Violet (CTV) et mis en culture sur une lignée de cellules stromales OP9 exprimant le ligand NOTCH DLL-1. La figure 3A montre que la déficience en Lis1 entrane une diminution majeure du pourcentage de cellules en cours de prolifération. L'expression de la chaine du TCR, de CD5, de CD71, de IL7-R et de BCL-2 est similaire dans les thymocytes Lis1fl/fl CD2Cre et les thymocytes contrôles Lis1fl/fl, confirmant que la signalisation induite par les pre-TCR n'est pas affectée par l'absence de Lis1 (Fig. 3B et Fig. 3C). Nous avons ensuite déterminé si Lis1 était importante pour le déroulement normal du cycle cellulaire en marquant l'ADN par du DAPI. L'analyse montre que la déficience en Lis1 entrane une accumulation des cellules en phase G2/M du cycle cellulaire (Fig. 3D), indiquant un blocage des cellules au cours du cycle cellulaire. Ces résultats suggèrent que Lis1 est essentielle à l'expansion des cellules DN3 après la sélection . 105 106 Figure 3 : La prolifération des thymocytes DN est compromise par l'absence de Lis1 (A) Analyse de la prolifération des cellules DN3 mis en culture sur lignée OP9 DLL-1 issues d'un pool de souris contrôles (Lis1fl/fl) ou déficientes en Lis1 dans le modèle CD2Cre (Lis1fl/fl CD2Cre) après 24h, 48h et 72h. Les droites sur l'histogramme FACS représentent les populations en prolifération. L'histogramme barre résume les proportions de cellules en prolifération. (B) Marquage intracellulaire de TCR et marquage de surface de CD5 des cellules DN3 Lis1fl/fl et Lis1fl/fl CD2Cre mis en culture sur lignée OP9 DLL-1. Le cadran démarque les cellules DN3b (icTCRhi CD5hi) et les nombres les proportions de cellules DN3b au sein de la population DN3. (C) Marquage de surface de IL7-R, BCL- 2 et CD71 des DN3a (icTCRlo CD5lo) et DN3b (icTCRhi CD5hi) après 24h de culture des cellules DN3 Lis1fl/fl et Lis1fl/fl CD2Cre sur lignée OP9 DLL-1. Les valeurs indiquées sur les histogrammes FACS correspondent aux valeurs de MFI du marqueur correspondant. (D) Marquage de l'ADN par DAPI des cellules DN3a (icTCRlo CD5lo) et DN3b (icTCRhi CD5hi) après 48h de culture des cellules DN3 Lis1fl/fl et Lis1fl/fl CD2Cre sur lignée OP9 DLL-1. Les droites sur les histogrammes FACS déterminent la 107 population en phase G0/G1 (100K), S (150K) et G2/M (200K) du cycle cellulaire. Les nombres indiqués représentent les proportions de cellules G0/G1, S et G2/M. L'histogramme barre résume la proportion de cellules G2/M au sein de la population DN3b. Les figures (A) et (D) totalisent sept et six expériences indépendantes respectivement. Les figures (B) et (C) sont représentatives de quatre et trois expériences indépendantes respectivement. p (t-test avec correction de Welch) 108 Lis1 régule la prolifération des lymphocytes T CD4 périphériques Nos résultats indiquent que Lis1 joue un rôle majeur dans la prolifération des thymocytes induite par le pre-TCR. Or une étude récente utilisant des souris Lis1fl/fl CD4Cre suggère que la déficience en Lis1 n'a qu'un effet modéré sur la prolifération des LT périphériques induite après engagement des TCR (472). Pour déterminer si Lis1 agit plus sélectivement sur la prolifération des thymocytes, nous avons analysé l'effet de la déficience en Lis1 sur la prolifération des LT périphériques. Confirmant l'analyse précédente dans les souris Lis1fl/fl CD4Cre, nous montrons que la déficience en Lis1 dans ce modèle entrane une diminution majeure du nombre de LT CD4 et CD8 dans les organes lymphoïdes secondaires. La déficience en Lis1 dans le modèle CD2Cre conduit à un phénotype similaire (Fig. S4A et Fig. S4B). Néanmoins, l'expression de Lis1 dans les LT périphériques issus de ces souris est comparable à celle observée les LT contrôles, révélant une nouvelle fois que les LT qui parviennent à se développer dans ces souris échappent à l'effet de la Cre recombinase sur le gène codant Lis1 (résultats non montrés). Nous avons donc utilisé le modèle CD4Cre pour étudier l'effet de Lis1 sur la prolifération des LT périphériques. Des LT CD4 et CD8 ont été isolés, marqués au CTV et stimulés par des anticorps anti-CD28 et anti-CD3. La dilution du CTV montre que l'absence de Lis1 dans ces cellules entrane une diminution majeure de la prolifération des LT CD4 périphériques (Fig. 4A) mais n'a pas d'impact détectable sur la prolifération des LT CD8 périphériques (Fig. S5A). La prolifération des LT CD4 exprimant le TCR transgénique AND est aussi fortement bloquée en absence de Lis1 lorsque les cellules sont stimulées par des cellules présentatrices d'antigènes chargées avec des peptides de MCC (Moth cytochrome C) spécifique du TCR AND (Fig. 4B). L'expression des marqueurs d'activation CD69 et CD25 est normale dans les LT CD4 déficients pour Lis1 après 24h de stimulation, indiquant que Lis1 n'est pas essentielle aux signaux précoces d'activation délivrés par les TCR (Fig. S5B). De plus, la prolifération des LT CD4 est fortement diminuée en absence de Lis1 lorsque les cellules sont stimulées par de la PMA/ionomycine, suggérant un rôle de Lis1 en aval des voies de signalisation déclenchées par les TCR (Fig. 4C). La prolifération des LT CD8 est également fortement diminuée en absence de Lis1 lorsque les cellules sont stimulées avec de la PMA/ionomycine, montrant que la déficience en Lis1 a un impact différent sur la prolifération des LT CD8 selon le type stimulation utilisé (Fig. 4D). Nous avons ensuite analysé l'effet de la déficience en Lis1 sur le cycle cellulaire. Comme pour les thymocytes, nous montrons que la déficience en Lis1 dans les LT CD4 entrane une accumulation des cellules en phase G2/M (Fig. 4E). En 109 conclusion, nos résultats suggèrent que, à l'instar des thymocytes, la prolifération des LT périphériques est fortement diminuée en absence de Lis1. 110 Figure 4 : La déficience en Lis1 affecte la prolifération des LT périphériques (A, C) Analyse de la prolifération après 48h de culture en présence d'anticorps anti-CD28 et anti-CD3 (A) ou de PMA/ionomycine (C) de LT CD4 issus de souris contrôles (Lis1fl/fl) ou déficientes en Lis1 dans le modèle CD4Cre (Lis1fl/fl CD4Cre). Les concentrations indiquées en (A) sur les histogrammes FACS indiquent la concentration d'anti-CD3 utilisée. Les histogrammes barres présentent la proportion de cellules en prolifération. (B) Analyse de la prolifération après 48h de culture sur lignée de cellules P13. 9 chargées de peptide MCC de LT CD4 AND issus de souris contrôles (Lis1fl/fl AND) ou déficientes en Lis1 dans le modèle CD4Cre AND (Lis1fl/fl AND CD4Cre). (D) Analyse de la prolifération après 48h de culture en présence de PMA/ionomycine de LT CD8 issus de souris contrôles (Lis1fl/fl) ou déficientes en Lis1 dans le modèle CD4Cre (Lis1fl/fl CD4Cre). (A, B, C, D) Les droites tracées sur les histogrammes FACS délimitent la population de cellules en prolifération et les nombres inscrits correspondent à la proportion de cellules en prolifération. (E) Marquage de l'ADN par DAPI des LT 111 CD4 stimulés 48h en présence d'anti-CD28 et anti-CD3. Les droites sur les histogrammes FACS déterminent la population G0/G1 (40K), S (60K) et G2/M (80K). Les nombres indiqués représentent les proportions de cellules G0/G1, S et G2/M. L'histogramme barre résume la proportion de cellules G2/M au sein de la population LT CD4 . (A, C, D) Les données totalisent deux expériences indépendantes. La figure (E) représente une expérience parmi deux et la figure (B) n'est représentative que d'une souris. p (t-test avec correction de Welch) 112 Lis1 régule la redistribution des chromosomes lors de la mitose dans les lymphocytes T Nos résultats précédents indiquent que la déficience en Lis1 entrane un blocage des LT en phase G2 ou en mitose (M) du cycle cellulaire. Pour déterminer plus spécifiquement la phase du cycle cellulaire dans laquelle les cellules sont bloquées, des LT CD4 ont été stimulés sur des plaques adsorbées d'anticorps anti-CD3 et anti-CD28 puis marqués avec du DAPI et analysés par imagerie en flux. Le paramètre Bright Detail intensity (BDI) qui permet d'évaluer l'état de condensation de l'ADN a été utilisé pour discriminer les cellules en G2 des cellules en phase M (pour plus de détails voir la section matériels et méthodes). Nous observons que la déficience en Lis1 dans les LT CD4 entrane une accumulation des cellules en cours de mitose, suggérant un blocage au cours de ce processus (Fig. 5A et Fig. S6C). En utilisant une approche similaire, nous avons ensuite analysé plus spécifiquement l'alignement des chromosomes sur la plaque métaphasique, un processus qui implique une participation active des moteurs moléculaires sur les microtubules (440, 441). Des LT CD4 ont été stimulés sur des plaques adsorbées d'anticorps anti-CD3 et anti-CD28 pendant 48h. Après 24h de culture, les cellules ont été synchronisées au nocodazole. Après synchronisation, le nocodazole a été éliminé et les cellules ont été traitées au MG132 pour les stabiliser en métaphase (436). Les cellules sont ensuite analysées par imagerie en flux, après marquage de l'ADN, en utilisant le paramètre elongatedness qui calcule le rapport de la longueur et de la largeur d'un masque DAPI et permet ainsi d'isoler les cellules en métaphase. Nous remarquons une forte diminution des cellules avec une valeur supérieure à 1. 5 lorsque les cellules mises en culture sont déficientes en Lis1 (Fig. 5B et Fig. S6D). L'analyse des résultats montre que la déficience en Lis1 entrane une diminution du pourcentage de cellules en métaphase, suggérant que Lis1 est importante pour la réorganisation des chromosomes au cours de la mitose. Pour déterminer le rôle de Lis1 sur la dynamique de redistribution des chromosomes, nous avons analysé la division des LT CD4 par vidéo-microscopie. Les cellules ont été mises en culture pendant 24h dans des chambres adsorbées d'anticorps anti-CD3 et anti-CD28 puis l'ADN a été marqué avec du Hoechst. Les images ont ensuite été acquises au spinning disk pendant 18h et traitées par ImageJ pour le montage des vidéos. Nous constatons que la durée moyenne des mitoses est augmentée en absence de Lis1 (Fig. 5C). Par ailleurs, nous observons que les mitoses sont souvent interrompues dans les cellules déficientes en Lis1 et qu'elles conduisent parfois à l'émergence de deux ou trois cellules filles avec une asymétrie apparente de la distribution du matériel génétique et la présence de noyaux multilobés. La présence de noyaux 113 multilobés dans la phase S et G2 des LT CD4 déficients en Lis1 ainsi que l'augmentation de la phase subG1 confirme que la déficience en Lis1 conduit à la mauvaise organisation des chromosomes et par conséquent à la mauvaise division des cellules (Fig. S6E). L'ensemble de ces données montre que Lis1 est essentielle au déroulement normal de la mitose et régule la répartition ordonnée du matériel génétique au sein des LT. La désorganisation des chromosomes peut être la conséquence d'un dysfonctionnement des centrosomes qui sont responsables de la mise en place des fuseaux mitotiques au cours de la mitose (479, 480). Au cours de la phase S, les centrosomes se dupliquent et se séparent au cours de la phase G2 pour démarrer la mitose (481). Pour examiner le rôle de Lis1 dans ce processus, nous avons d'abord analysé le nombre de centrosomes dans des thymocytes DN3b en mitose isolés du thymus ex-vivo. Nous observons qu'une proportion accrue de cellules contient un nombre anormalement élevé de centrosomes dans les thymocytes déficients en Lis1. Nous avons ensuite analysé le nombre de centrosomes dans des LT CD4 stimulés par des anticorps anti-CD3. Pour déterminer si l'effet exercé par Lis1 sur les centrosomes est concomitant à la division cellulaire nous avons comparé les LT CD4 blastique en cours de division (FSChi) et non-blastique (FSClo). Nous montrons que la déficience en Lis1 n'affecte pas le nombre de centrosomes retrouvé dans les LT CD4 non blastique (Fig. 5F). En revanche, une fraction importante des LT CD4 FSChi déficients pour Lis1 contient un nombre de centrosomes supérieur à deux. De plus, ces centrosomes ne sont pas organisés au sein des cellules en mitose déficientes en Lis1 au contraire des cellules contrôles (Fig. 5E). Ces résultats suggèrent que le défaut d'alignement des chromosomes peut être la conséquence de l'amplification et de la désorganisation des centrosomes. La réorganisation des chromosomes, l'amplification et la redistribution des centrosomes dépendent du complexe dynéine qui recrute des protéines adaptatrices sur ces organites cellulaires par l'intermédiaire du complexe dynactine (381). Des études précédentes suggèrent que Lis1 régule le transport des organites cellulaires par le complexe dynéine en favorisant son interaction avec la dynactine (444, 449)(388). Pour déterminer si Lis1 exerce un effet similaire dans les LT, nous avons analysé la co-immunoprécipitation de p150glued, une sous unité de la dynactine, avec la chaine intermédiaire de la dynéine dans des LT exprimant ou non Lis1, stimulés pendant 48h. Nous observons que l'interaction entre la dynéine et la dynactine est fortement diminuée dans les LT déficients pour Lis1 en comparaison aux LT contrôles. Ces résultats montrent que Lis1 stabilise l'interaction de la 114 la dynéine avec la dynactine dans les LT. Ils suggèrent que Lis1 contribue au déroulement normal des mitoses dans ces cellules en régulant formation des complexes dynéine/dynactine qui sont essentiels au transport des structures cellulaires telles que les centrosomes et les chromosomes (Fig. S7). 115 116 Figure 5 : Le déroulement de la mitose est affecté par la déficience en Lis1 (A, B) Représentation issue de l'acquisition de LT CD4 mis en culture issus de souris contrôles (Lis1fl/fl) et déficientes en Lis1 dans les modèles CD4Cre (Lis1fl/fl CD4Cre). (A) Histogramme représentant le paramètre Bright Detail Intensity de LT CD4 Lis1fl/fl et Lis1fl/fl CD4Cre en phase G2/M après 48h de culture en présence d'anticorps anti-CD28 et anti-CD3. Les droites sur les histogrammes délimitent les populations en mitose (BDIhi) et les valeurs correspondent aux proportions de cellules en mitose au sein de la population de cellules en phase G2/M. Ce résultat est représentatif de deux expériences avec acquisition d'environ 30, 000 cellules dans la population G2/M. Chaque expérience est constituée d'une souris par génotype. (B) Représentation en dot-plot des paramètres Elongatedness et Spot count des LT CD4 Lis1fl/fl et Lis1fl/fl CD4Cre en mitose après 24h de culture en présence d'anticorps anti-CD28 et anti-CD3 suivie de la synchronisation par le nododazole et MG132. Le cadran 117 représente la population de cellules de valeur Elongatedness haute et constituée d'un seul noyau. Les valeurs indiquent la proportion de cellules en métaphase au sein de la population de mitose. Ce résultat est représentatif de deux expériences avec acquisition d'environ 5000 cellules dans la population en mitose (BDIhi). Chaque expérience est constituée d'une à trois souris par groupe. (C) Time-lapse représentant les noyaux marqués au Hoechst des cellules en mitose après culture en présence d'anticorps anti-CD28 et anti-CD3 de LT CD4 issus de souris contrôles (Lis1fl/fl) et déficientes en Lis1 dans le modèle CD4Cre (Lis1fl/fl CD4Cre). Le temps indiqué sur chaque image est au format H : min. Les flèches pointent les cellules en cours de mitose. L'histogramme représente le temps de mitose en heure de chaque cellule observée. Cette figure est représentative de trois expériences indépendantes chacune constituée d'une souris par génotype. p (Test non paramétrique de Mann-Whitney) (D, E, F) Maximum Intensity Projection de Z-stacks obtenus au microscope confocal après marquage du centrosome par la -tubuline et du noyau par le DAPI de cellules DN3b (D) et de LT CD4 stimulés 48h en présence d'anticorps anti-CD28 et anti-CD3 et triées FSChi (D) et FSClo (E). Les figures (D, E, F) sont représentatives de deux expériences chacune dans laquelle ont été acquises 20 à 50 cellules. 118 La perte de Lis1 favorise l'apoptose des cellules en cours de prolifération La répartition des chromosomes lors de la métaphase est soumise à un point de contrôle qui vérifie le bon alignement des chromosomes sur la plaque métaphasique pour une répartition ordonnée du matériel génétique (423). La formation de cellules contenant des quantités anormales de matériel génétique conduit aussi à l'expression de facteurs pro-apoptotiques entranant la mort des cellules (482). L'analyse du marquage AnnexinV dans des thymocytes DN3a stimulés par des cellules OP9 DLL1 montre que la déficience en Lis1 entraine un accroissement de la fréquence des cellules en apoptose lorsque les cellules ont été engagées dans des cycles de divisions cellulaires (CTVlo). En revanche le pourcentage de cellules en apoptose est comparable dans les thymocytes activées (CD5hi ) qui n'ont pas encore été engagés dans des divisions cellulaires (CTVhi) (Fig. 6A). De la même façon, les LT CD4 stimulés par des anticorps anti-CD3 ayant subi des cycles de divisions cellulaires sont davantage en apoptose que les mêmes populations cellulaires dans les souris contrôles (Fig. 6B). Par contre, la déficience en Lis1 n'a pas d'impact significatif sur la mortalité cellulaire dans les cellules activées (CD25hi) mais non divisées. Le mauvais déroulement de la mitose et la mauvaise répartition du matériel génétique déclenche l'expression de p53 conduisant à l'apoptose des cellules (482). Nous montrons que l'expression de p53 est augmentée dans les thymocytes DN de souris déficientes en Lis1 dans le modèle CD2Cre (Fig. 6C). De plus, l'expression de p53 dans les LT CD4 déficients pour Lis1 est augmentée par rapport aux LT contrôles après 48h de stimulation (Fig. 6D). L'ensemble de ces données démontre que Lis1 prévient la mort cellulaire des thymocytes et des LT en contribuant à la réorganisation des chromosomes et des centrosomes lors de la mitose. 119 120 Figure 6 : La perte de Lis1 favorise l'apoptose des cellules en prolifération (A, B) Marquage de surface par AnnexinV sur un pool de thymocytes DN3b (CD5hi) issus de souris contrôles (Lis1fl/fl) ou déficientes en Lis1 dans le modèle CD2Cre (Lis1fl/fl CD2Cre) après culture sur lignée OP9 (A) et de LT CD4 issus de souris contrôles (Lis1fl/fl) et déficientes en Lis1 dans les modèles CD4Cre (Lis1fl/fl CD4Cre) (B). Les droites sur les histogrammes FACS délimitent les populations AnnexinV et les valeurs représentent la proportion de cellules positives pour l'annexinV au sein de la population DN3a, DN3b et DN4 (A) ou LT CD4 (B). Les histogrammes barres représentent la proportion de cellules positives pour l'AnnexinV. (C, D) Westernblot révélant l'expression de p53 au sein des DN totaux (C) et de LT CD4 stimulés de 0 à 48h (D). Rac1 a été utilisée comme contrôle de quantité. (A, B) Ces figurent totalisent trois (A) et une (B) expériences indépendantes. (C, D) Ces données sont représentatives de deux expériences indépendantes. p (t-test avec correction de Welch) 121 122 Figure Supplémentaire 1 : Le développement précoce des LT n'est pas affecté par la déficience en Lis1 (A) Représentation non à l'échelle du gène pafah1b1 flanqué de deux séquences LoxP entre l'exon 3 et l'exon 6. (B) Quantification du nombre total de thymocytes au sein de thymus issus de souris contrôles (Lis1fl/fl) et déficientes en Lis1 dans les modèles CD4Cre (Lis1fl/fl CD4Cre) et CD2Cre (Lis1fl/fl CD2Cre). Résultats représentatifs de deux et huit expériences indépendantes. p (Test non paramétrique de Mann-Whitney). (C) Marquage de surface de CD24 et TCR sur des thymocytes 123 thymiques. issus de souris contrôles (Lis1fl/fl) et déficientes en Lis1 dans le modèle CD4Cre (Lis1fl/fl CD4Cre). Les cadrans délimitent les populations de thymocytes CD4 SP matures et CD8 SP matures. Les valeurs indiquées caractérisent la proportion de cellules matures au sein des populations SP. Les histogrammes barres représentent les nombres absolus de CD4 SP matures et CD8 SP matures. (D) Marquage de surface de CD4 et CD8 sur des thymocytes TCRhi issus de souris contrôles (Lis1fl/fl) et déficientes en Lis1 dans les modèles CD4Cre (Lis1fl/fl CD4Cre) et CD4Cre AND (Lis1fl/fl AND CD4Cre). Les valeurs dans les cadrans représentent les proportions de cellules au sein des principales populations thymiques. Les histogrammes barres représentent les nombres absolus de cellules au sein des (C, D) Ces expériences différentes populations totalisent deux expériences indépendantes. p (Test non paramétrique de Mann-Whitney) 124 Figure Supplémentaire 2 : Le développement précoce des LT n'est pas affecté par la perte partielle de Lis1 (A) Marquage intracellulaire de Lis1 de thymocytes issus de souris contrôles (Lis1fl/fl) et déficientes en Lis1 dans le modèle CD2Cre (Lis1fl/fl CD2Cre). (B) Marquage de surface de CD4 et CD8 (en haut) et de CD44 et CD25 (en bas) sur des thymocytes issus de souris contrôles (Lis1fl/ ) et hétérozygotes en Lis1 dans les modèles CD2Cre (Lis1fl/ CD2Cre). Les valeurs dans les cadrans représentent les proportions de cellules au sein des principales populations thymiques. Les histogrammes barres représentent les nombres absolus de cellules au sein des différentes populations thymiques. 125 126 Figure Supplémentaire 3 : Le développement des LB est fortement affecté par l'absence de Lis1 (A) Marquage de surface de B220 et CD19 sur des cellules issues de moelle osseuse de souris contrôles (Lis1fl/fl) et déficientes en Lis1 dans le modèle CD2Cre (Lis1fl/fl CD2Cre). Les valeurs dans les cadrans représentent les proportions de cellules au sein des principales populations. L'histogramme barre représente les nombres absolus de cellules au sein des différentes populations de la moelle osseuse. (B) Marquage de surface de c-kit et IgM sur des cellules B220 CD19 issues de moelle osseuse de souris contrôles (Lis1fl/fl) et déficientes en Lis1 dans le modèle CD2Cre (Lis1fl/fl CD2Cre). Les valeurs dans les cadrans représentent les proportions de cellules au sein des différentes sous populations. L'histogramme barre représente les nombres absolus de cellules au sein des différentes populations de la moelle osseuse. Ces expériences totalisent 2 expériences indépendantes. p (Test non paramétrique de Mann-Whitney) 127 128 Figure Supplémentaire 4 : La déficience en Lis1 affecte les LT périphériques Marquage de surface de B220 et TCR (A) et CD4 et CD8 (B) sur des splénocytes issus de souris contrôles (Lis1fl/fl) et déficientes en Lis1 dans le modèle CD4Cre (Lis1fl/fl CD4Cre). Les valeurs dans les cadrans représentent les proportions de cellules au sein des principales populations. L'histogramme barre représente les nombres absolus de cellules au sein des différentes populations de la rate. Ces expériences totalisent deux (A) et quatre expériences indépendantes (B) chacune constitué de 3 à 4 souris par groupe. p (Test non paramétrique de Mann-Whitney) 129 130 Figure Supplémentaire 5 : La déficience en Lis1 n'affecte pas la prolifération de LT CD8 périphériques suite à la stimulation par des anticorps. (A) Analyse de la prolifération après 48h de culture en présence d'anticorps anti-CD28 et anti-CD3 de LT CD8 issus de souris contrôles (Lis1fl/fl) ou déficientes en Lis1 dans le modèle CD4Cre (Lis1fl/fl CD4Cre). Les concentrations indiquées sur les histogrammes FACS indiquent la concentration d'anti- CD3 utilisée. Les histogrammes barres présentent la proportion de cellules en prolifération. (B) Marquage de surface de CD25 et CD69 de LT CD4 Lis1fl/fl et Lis1fl/fl CD4Cre après 24h de culture en présence d'anticorps anti-CD28 et anti-CD3. Les droites représentées sur l'histogramme FACS délimitent les populations CD25 et CD69 . Les concentrations indiquées sur les histogrammes FACS indiquent la concentration d'anti-CD3 utilisée. Les histogrammes barres résument les proportions de cellules CD25 et CD69 au sein de la population LT CD4 n'ayant pas proliféré. Ces expériences totalisent deux expériences indépendantes, chacune constituée d'une à trois souris par groupe. p (t-test avec correction de Welch) 131 132 Figure Supplémentaire 6 : La déficience en Lis1 affecte la mitose des lymphocytes T (A, B) Schématisation des paramètres Bright Detail Intensity (A) et Elongatedness (B). Cette représentation n'est pas issue du traitement de IDEAS mais provient d'une modification d'image réalisée sur ImageJ. (C, D) Image de cellules acquises par ImageStreamX représentant le BDIhi (C) et Elongatedness >1, 5 (D). (E) Image provenant d'imageStreamX de LT CD4 stimulés en présence d'anti-CD28 et anti-CD3 provenant de souris déficientes en Lis1 dans le modèle CD4Cre (Lis1fl/fl CD4Cre) après gating sur la population subG1, S et G2 du cycle cellulaire. L'histogramme de gauche représente 133 la proportion de cellule présentant des noyaux multilobés après quantification manuelle de 400cellules. L'histogramme à droite représente la proportion de cellules subG1 du cycle cellulaire. Ce résultat est représentatif de deux expérimentations contenant une souris par génotype. 134 Figure Supplémentaire 7 : L'interaction de la dynéine avec la dynactine est interrompue en absence de Lis1 Westernblot représentant la chaine lourde de la dynéine (DHC), la chaine intermédiaire de la dynéine (DIC), la sous unité de la dynactine p150glued, Lis1 et Rac1 après immunoprécipiation contrôle (Beads IgG2b) et immunoprécipiation de DIC (Anti-DIC) sur des LT CD4 issus de souris contrôles (Lis1fl/fl) ou déficientes en Lis1 dans le modèle CD4Cre (Lis1fl/fl CD4Cre). La condition WCL représente le lysat total avant immunoprécipiation. Rac1 a été utilisée comme contrôle de quantité dans la condition WCL. Ce résultat est représentatif d'une expérience. 135 136 Matériels et méthodes Animaux Les souris Lis1fl/fl (129S-Pafah1b1tm2Awb/J) et CD2Cre (B6. Cg-Tg(CD2-icre)4Kio/J) proviennent de The Jackson Laboratory. Les lignées CD4Cre et ANDTg ont été données par Dr Olivier Joffre (INSERM UMR1043, Toulouse) et par Dr Paul Love (National Institutes of Health, Bethesda, USA) respectivement. Toutes les expérimentations ont été réalisées avec concordances des âges et des sexes entre animaux âgés de un à trois mois. Les souris ont été croisées au sein de l'unité US006 de l'INSERM sous le statut sanitaire SOPF (Specific and Opportunistic Pathogen Free) et ont été maintenues sous le statut sanitaire SPF (Specific Pathogen Free). Toutes les expériences ont été réalisées sous protocoles approuvés par le comité éthique local selon les règles françaises et de l'Union Européenne concernant le bien-être et la protection des animaux de laboratoire (Directive EC 2010/63) Lignées cellulaires Les cellules OP9-DLL1 ont été fournies par Dr Sophie Laffont-Pradines (INSERM UMR1043, Toulouse) et sont maintenues dans un milieu MEM (Gibco Cat# 22561) complémenté de 20% SVF (Sigma Aldrich Cat# F7524) et de 1% pénicilline/streptomycine (Gibco Cat# 15140). Les cellules P13. 9 ont été données par Pr Ronald Germain (National Institutes of Health, Bethesda, USA) et sont maintenues dans un milieu DMEM-L-glutamax (Gibco Cat# 31966) complémenté de 10% SVF et de pénicilline/streptomycine. Ces cellules sont cultivées dans un incubateur à 37C et 5% CO2 Cytométrie en flux La liste qui suit, énumère les anticorps primaires couplés à un fluorochrome utilisé pour la cytométrie en flux dans ce travail : CD8 (clone 53-6. 7), CD4 (clone RM4-5), CD24 (clone M1/69), TCR (clone H57-597), V11 (clone RR8-1), CD5 (clone 53-7. 3), CD69 (clone H1. 2F3), B220 (clone RA3-6B2), Gr1 (clone RB6-8C5), CD11b (clone M1/70), CD11c (clone N418), Ter119 (clone TER119), CD3 (clone 145-2C11), NK1. 1 (clone PK136), TCR (clone GL3), CD44 (clone IM7), CD25 (clone PC61. 5), CD71 (clone R17217), IL7-R (clone A7R34), BCL-2 (clone 3F11), CD19 (clone 1D3/CD19), c-kit (clone 2B8), IgM (clone RMM-1). 137 Pour tous les marquages de surface, les cellules sont resuspendues dans une solution PBS 2%SVF 2mM EDTA contenant les anticorps primaires. Pour les marquages intracellulaires, les cellules sont fixées dans une solution de PFA 4% et incubées avec les anticorps dans le tampon permeabilization buffer (Invitrogen Cat# 00-833-56). Toutes les cellules analysées par cytométrie en flux ont été préalablement marquées par le marqueur de viabilité (ThermoFisher scientific Cat# 65-0865-14). Pour le phénotypage des thymocytes, les thymus sont broyés et les corécepteurs CD4 et CD8 sont marqués. Pour l'analyse de la population DN, les thymocytes sont marqués par des anticorps dirigés contre le linéage LIN (Gr1, CD11b, CD11c, Ter119, CD3, B220, NK1. 1 et TCR), CD8 et CD4. Après sélection des populations Lin- CD8- CD4-, les cellules sont analysées grâce au marquage de surface CD44, CD25, CD5, CD71 et IL7-R et au marquage intracellulaire BCL-2 et TCR. Pour le phénotypage des splénocytes, les rates sont broyées et les globules rouges sont lysés à l'ACK (Gibco Cat# A10492) avant le marquage des marqueurs CD4, CD8, CD24 et TCR. Pour l'analyse de la moelle osseuse, les fémurs de souris sont broyés sur mortier et filtrés. Les cellules sont ensuite marquées pour détecter par cytométrie en flux les marqueurs CD19, B220, c-kit et IgM. Les données ont été acquises sur le cymomètre LSR II (BD Biosciences) et analysées à l'aide du logiciel FlowJO (Tree Star Inc. ) Culture de cellules primaires de souris L'ensemble des cellules primaires sont mises en culture dans un incubateur à 37C et 5% CO2 et maintenue dans du milieu RPMI (Sigma Aldrich Cat# R0883) complémenté de 10% SVF (Gibco cat# 10270), 1% pénicilline/streptomycine, MEM (Gibco Cat# 11140), 10mM HEPES (Gibco Cat# 15630), 1mM Sodium Pyruvate (Sigma-Aldrich Cat# S8636), 2mM L- glutamine (Gibco Cat# 25030), 50g/mL gentamycine (Sigma-Aldrich Cat# G1397), 50M 2- mercapthoéthanol (Gibco Cat# 31350). 138 Analyse in vitro de la prolifération des DN Les cellules DN sont isolées par sélection négative après marquage du CD4 et du CD8 par des anticorps générés au laboratoire et après incubation dans les billes Dynabeads magnetic beads (Invitrogen Cat# 11415D). Les cellules DN3a (Lin- CD44- CD25 CD5- ou Lin- CD44- CD25 CD71-) sont triées sur trieur cellulaire FACSARIA II (BD Biosciences) ou FACSARIA SORP (BD Biosciences) après marquage des DN dans un tampon PBS 2% SVF 2mM EDTA. Pour l'analyse de la prolifération, une partie des DN3a est marqué au Cell Trace Violet (CTV)(Invitrogen Cat# C34557) avant d'être mise en culture sur une lignée de cellules OP9- DLL1 pour les temps indiqués dans les résultats en présence de 10ng/mL d'IL-7 murin recombinant (Peprotech Cat# 217-17). Aux différents temps indiqués, les DN3 sont récupérés et marqués pour la détection des marqueurs de surface CD5, CD71 et IL7-R et des marqueurs intracellulaires BCL-2 et TCR. Pour le marquage par l'AnnexinV, les cellules sont préalablement marquées avec les anticorps de surface présentés ci-dessus puis reprises dans le tampon de marquage AnnexinV (BD Biosciences Cat# 556454) contenant l'AnnexinV (BD Biosciences Cat# 561012). Les cellules n'ayant pas été marquées au CTV, sont marquées au DAPI après fixation dans une solution de PFA 4% et perméabilisation par le tampon permeabilization buffer (Invitrogen). Le DAPI (Sigma-Aldrich Cat# D9542) est ajouté aux cellules à 1g/mL dans du PBS pour l'acquisition. Analyse in vitro de la prolifération des LT périphériques Les LT CD4 et les LT CD8 sont isolés par sélection négative après marquage du CD8, B220, CMH-II, NK1. 1, Fc etCD11b et du CD4, B220, CMH-II, NK1. 1, Fc etCD11b respectivement, par des anticorps générés au laboratoire et après incubation dans les billes Dynabeads magnetic beads (Invitrogen). Pour l'analyse de la prolifération, une partie des LT est marquée au cell trace violet avant d'être mise en culture pour les temps indiqués dans les résultats. Les LT sont stimulés sur des plaques adsorbées des différentes doses indiquées d'anticorps anti-CD3 (anticorps produit au laboratoire) et de 2g/mL d'anti-CD28 (clone 37-51 BioXCell Cat# BE0015-1). Pour la stimulation par PMA et ionomycine, les cellules sont stimulées en présence 100ng/mL de PMA (Sigma Aldrich Cat# P8139) et 100ng/mL de ionomycine (Sigma Aldrich Cat# I0634). Les LT CD4 ANDTg sont stimulés sur cellules P13. 9 chargées de 1M de peptide MCC (Moth cytochrome C 88-103 : ANERADLIAYLKQATK) (Produit à façon par GeneCust) pendant 2H. Les LT sont stimulés 139 pendant 48h à hauteur de 4 LT par P13. 9. Aux différents temps de culture, les LT sont récupérés et marqués pour analyser par cytométrie en flux le marquage CD25 et CD69. Pour le marquage par l'AnnexinV, les cellules sont préalablement marquées avec des anticorps reconnaissant les marqueurs CD25 et CD69 puis reprises dans le tampon de marquage AnnexinV contenant l'AnnexinV. Les LT CD4 non marqués au CTV, sont marqués au DAPI après fixation dans une solution de PFA 4% et perméabilisation par le tampon permeabilization buffer (Invitrogen). Le DAPI est ajouté aux cellules à 1g/mL dans du PBS pour l'acquisition. Cytométrie en image Pour l'analyse de la population G2/M, les LT CD4 sont stimulés par 10g/mL d'anticorps anti-CD3 et 2g/mL d'anti-CD28 adsorbés sur des plaques pendant 48h. Pour l'analyse de la métaphase, les LT CD4 sont stimulés par 10g/mL d'anticorps anti-CD3 et 2g/mL d'anti- CD28 adsorbés sur des plaques pendant 24h. Après 24h de culture du Nocodazole (Sigma Aldrich Cat# M1404) a été ajouté pour 100ng/mL final pendant 18h. Les cellules synchronisées sont lavées dans du RPMI complémenté de SVF puis traitées avec 10M de MG132 (Sigma Aldrich Cat# M7449) pendant 3h. Les cellules ont été acquises sur ImageStreamX (Millipore) après marquage de CD4, de la viabilité et de l'ADN suivant les protocoles décrits précédemment. Les données ont été analysées sur le logiciel d'analyse IDEAS (Millipore). Pour la discrimination des cellules mitose et celles en cellules en phase G2, nous avons utilisé le paramètre Bright Detail Intensity (BDI). Celui-ci, soustrait le bruit de fond aux images acquises et calcule l'intensité des pixels restants (Fig. S6A)(483). L'homogénéité du marquage au sein d'une cellule conduit à une valeur de BDI importante. Les cellules en mitose ayant l'ADN condensé présentent une meilleure homogénéité de marquage DAPI que les cellules G2 à ADN décondensé (Fig. S6C). le paramètre Pour l'analyse des cellules en métaphase, nous avons utilisé Elongatedness sur le masque DAPI que nous avons prédéfini. Ce paramètre calcule le rapport de la longueur et de la largeur d'un masque DAPI (Fig. S6B). L'allongement du masque DAPI des cellules en métaphase conduit à l'augmentation du paramètre dépassant alors un ratio de 1. 5 (Fig. S6D). 140 Imagerie cellulaire Les thymocytes DN3b (Lin- CD44- CD25 CD5 ou Lin- CD44- CD25 CD71 ) sont triés sur trieur cellulaire FACSARIA II ou FACSARIA SORP. Les LT CD4 triés par sélection négative sont marqués au CTV et stimulés sur des plaques adsorbées de 10g/mL d'anti-CD3 et 2g/mL pendant 48h. La population CTVhi (non proliférante) a été triée sur trieur cellulaire FACSARIA SORP. Les DN3b ou les LT CD4 CTVhi sont déposées sur lames adsorbées de 0, 01% de poly-L-lysine (Sigma aldrich Cat# P8920), fixées par PFA 4% dans du PBS et perméabilisé dans 0, 1% de Saponine (Sigma Aldrich cat# 47036). Le marquage -tubuline (clone 14C11 BioLegend Cat# 629201) est réalisé à 4C dans 0, 1% de Saponine 3% BSA 10mM HEPES pendant 18h et le marquage secondaire anti-souris IgG2b (Invitrogen Cat# A21147) dans la même solution pendant 1h à température ambiante. Le marquage de l'ADN est réalisé au DAPI pendant 15min à température ambiante dans du PBS. Les lames sont ensuite montées en présence d'une solution de DABCO (Sigma Aldrich Cat# D27802) et les images sont acquises au microscope confocal LSM710 (Zeiss) Pour la vidéo microscopie, les LT CD4 sont isolés par sélection négative et mis en culture pendant 24h sur une chambre (IBIDI Cat# 80821) adsorbée de 10ug/mL d'anti-CD3 et de 2ug/mL d'anti-CD28. Pour le marquage de l'ADN, du Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich Cat# B2261) a été ajouté dans le milieu sur les LT pour une concentration finale de 50ng/mL. Les cellules en présence de Hoechst 33342 sont observées au microscope confocal Spinning disk pendant 18h dans une chambre à 37C et 5%CO2. Les images obtenues en z-stack sont ensuite montées en film et analysées à l'aide d'ImageJ. Immunoprécipitation et westernblot Pour l'immunoprécipitation de la chaine intermédiaire de la dynéine (DIC), les LT CD4 sont isolés par sélection négative et lysés dans un tampon de lyse (Tris pH7, 2 10mM, NaCl 150mM, Triton 1%, Na3VO4 2mM, NaF 5mM, EDTA 1mM, PMSF 1mM, leupeptine 1g/mL, Aprotinine, 2g/mL, pepstatine 1g/mL) pendant 20min dans la glace. Le lysat est clarifié par centrifugation à 12000rpm pendant 15min. Le surnageant est incubé avec des billes adsorbées d'anti-DIC (clone 74-1 Santa-Cruz Cat# sc-13524) ou IgG2b (Santa-Cruz Cat# sc- 3879) pendant 2 heures sur roue à 4C. Après immunoprécipitation, les billes sont lavées avec du tampon de lyse et les protéines sont éluées dans du tampon LDS blue (Invitrogen Cat# NP0007) et de l'agent réducteur (Invitrogen Cat# NP0009) 10min à 70C. 141 Pour l'analyse de p53, les LT CD4 sont triés par sélection négative et mis en culture sur plaque adsorbée de 10g/mL d'anti-CD3 et de 2g/mL d'anti CD28 pendant 24h et 48h. Après chaque temps de culture, les cellules sont récupérées et lysées. Les thymocytes DN totaux sont isolés par sélection négative et lysés directement. Les lysats sont déposés sur des gels SDS-PAGE précoulés (Bio-Rad) 4-15% et mis à migrer dans un tampon Tris-Glycine-SDS 1X (Bio-Rad Cat# 161. 0772). Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane de PVDF (Millipore Cat# IPVH00010) de maille 0, 45m par transfert semi-sec dans du tampon de transfert : éthanol 20% ; Tris-Glycine (Euromedex Cat# EU0550) pendant 1h à 25V. Les membranes sont saturées dans du tampon Tris-Buffered- Salin (Euromedex Cat# ET220) ; Tween20 0, 1% (Sigma Aldrich Cat# P1379) (TBST) et 5% de lait (régilait). Les membranes sont incubées avec les anticorps primaires anti-Lis1 (Santa- Cruz Cat# sc-15319), anti-Rac1 (clone 23A8 Millipore Cat# 05-389), anti-DHC (Santa-Cruz Cat# sc-9115), anti-p150glued (clone 1/p150Glued BD Biosciences Cat# 610473) ou anti-p53 (clone 1C12 Cell Signaling Tech. Cat# 2524) sur la nuit à 4C. Les membranes sont lavées avec du TBST puis incubées 1h à température ambiante avec l'anticorps secondaire anti- souris (Jackson ImmunoResearch Cat# 115-035-003) ou anti-lapin couplé à l'HRP (Jackson ImmunoResearch Cat# 111-035-003). Enfin, les membranes sont révélées par incubation dans une solution de Chemiluminescent Peroxidase Substrate-3 (Sigma Aldrich Cat# CPS3100) et les photos sont obtenues par BioRad XRS imager. Analyses statistiques L'ensemble des résultats a été statistiquement analysé par test de Mann-Whitney ou par t- test suivi de correction de Welch. La p-value est indiquée dans la légende de chaque figure (p p p p 142 DISCUSSION Le développement et les fonctions des LT sont régulés par des voies de signalisation qui entranent la mobilisation de facteurs de transcription déclenchant des programmes génétiques. L'activation et la différenciation des LT entranent et nécessitent des réarrangements du cytosquelette qui contribuent au recrutement de protéines de signalisation, à la réorientation des organites et à la polarisation de cytokines effectrices vers les cellules cibles. Bien que de nombreuses études se concentrent à étudier les voies de signalisation et la régulation des gènes, peu de travaux s'intéressent aux évènements mécaniques associés au cytosquelette dans des LT. Les fonctions du cytosquelette sont régulées par de nombreuses protéines motrices qui permettent le transport de structures cellulaires ou de molécules à travers la cellule. Les moteurs moléculaires kinésines, dynéines et myosines ont très peu été étudiés dans les LT. La myosine est essentielle dans l'activité et la stabilisation de la synapse immunologique en s'associant au cytosquelette d'actine (149-152). Au niveau des microtubules, la kinésine est importante dans la sécrétion des granules lytiques au cSMAC (163). Enfin la dynéine joue un rôle important dans l'établissement de la synapse immunologique et dans la fonction de celle-ci (160-162). La majorité des études réalisées sur les moteurs moléculaires et le cytosquelette utilise des lignées cellulaires ou des cellules primaires. Seule l'étude de la kinésine KIF-7 utilise un modèle murin déficient ou hétérozygote pour KIF-7 afin d'étudier les fonctions physiologiques de cette protéine dans le système immunitaire. Dans ce travail, les auteurs ont utilisé des souris hétérozygotes pour KIF-7 suite à la létalité de la délétion totale du gène. Les animaux hétérozygotes ne leur permettent pas de démontrer une implication de KIF-7 dans le développement des LT et dans leurs fonctions. En revanche, l'étude des embryons déficients pour KIF-7 au stade E16. 5 du développement embryonnaire démontre que la déficience en KIF7 affecte légèrement la transition DN-DP. Le transfert de cellules de foie fœtal d'embryons déficients en KIF-7 dans des souris receveuses déficientes pour RAG, entraine un profil normal des populations de LT périphériques, avec une légère diminution de l'activation cellulaire après 24h de stimulation (484). Au cours de ma thèse, je me suis intéressé au régulateur de la dynéine Lis1 afin de comprendre ses fonctions physiologiques au sein des LT. Comme pour la délétion totale de KIF-7, la perte totale de Lis1 est létale (403). Afin de comprendre les fonctions physiologiques de Lis1 dans les LT, nous avons produit des souris déficientes en Lis1 spécifiquement dans les lymphocytes. 143 Bien que Ngoi et al, ne démontrent pas de défaut majeur du développement des LT en absence de Lis1 (472), l'utilisation d'une lignée différente nous a permis de conclure de la fonction critique de Lis1 dans le développement thymique précoce. Les résultats acquis au cours de ce travail de thèse et les interprétations en découlant, ont permis de démontrer la fonction indispensable de Lis1 au cours de la prolifération des thymocytes précoces. Lis1 ne joue pas de rôle au cours de la -sélection mais est essentielle à la prolifération des DN exprimant une chaine du TCR fonctionnelle. L'accumulation des cellules au cours des stades DN résulte du défaut de prolifération des cellules, qui ne parviennent plus à organiser et distribuer leur matériel génétique. Ce même défaut de prolifération, a été retrouvé lors de l'analyse de LT périphériques après leur stimulation. Ces affections se caractérisent par le ralentissement de la mitose et la distribution inégale de chromosomes entre les cellules filles lorsque celles-ci parviennent à se séparer. L'effet majeur de la déficience en Lis1 se solde par la mort cellulaire programmée afin d'éliminer ces cellules potentiellement dangereuses. Figure 28 : Schéma de conclusion décrivant les conséquences de la perte de Lis1 sur le développement des LT La déficience en Lis1 conduit au blocage du développement des LT au cours des stades précoces. Les analyses ont démontré que l'expression du pre-TCR est normale ainsi que la signalisation. En absence de Lis1, la signalisation conduit à l'expression des marqueurs de survie suggérant que la déficience en Lis1 n'affecte pas les mécanismes de survie cellulaire suivant la -sélection. Cependant, les analyses du cycle cellulaire démontrent un blocage de la phase G2/M du cycle cellulaire. Les analyses moléculaires fines réalisées sur des LT CD4 révèlent que la mitose est bloquée avec la formation de cellules multilobées suite à l'interruption de la mitose ou à la répartition anormale du matériel génétique. Cela conduit à la mort par apoptose suite à l'expression de p53 au cours des stades DN3b et aussi probablement DN4. 144 I) Fonctions physiologiques de Lis1 dans les lymphocytes T 1. Blocage précoce du développement des LT dans le modèle Lis1fl/fl CD2Cre Mon travail de thèse montre que le développement précoce des LT est bloqué au stade DN3 lorsque la Cre recombinase est exprimée sous le contrôle du promoteur CD2 (Fig. 1B et Fig. 1C). Les résultats obtenus in vitro à l'aide des cellules OP9-DLL1, suggèrent que la diminution de cellules aux stades DP est la conséquence d'un défaut de prolifération des cellules après la -sélection (Fig. 3). Nous montrons dans ce système que la déficience en Lis1 entrane un accroissement du taux d'apoptose dans les populations ayant subi un ou plusieurs cycles de divisions cellulaires. En revanche, la déficience en Lis1 n'augmente pas la proportion de cellules en apoptose dans les cellules non divisées ayant reçu des signaux de stimulation (CD5hi) (Fig. 6A). Par ailleurs, l'absence de stimulation après 24h et 48h conduit à une proportion similaire de la mortalité cellulaire (données non montrées). Ce blocage de la prolifération ne permet pas l'amplification de cellules exprimant une chaine fonctionnelle induisant alors la diminution de la proportion de DN3 TCRhi. Ceci suggère que Lis1 n'est pas essentielle à la survie des thymocytes non proliférants mais qu'elle est nécessaire au déroulement normal des cycles de prolifération. L'accumulation des cellules au stade DN3 et le blocage de la prolifération, ne résultent pas d'un défaut d'expression de la chane du TCR (Fig. 2A). L'expression normale de CD5 dans les cellules exprimant la chaine du TCR déficientes pour Lis1 suggère que Lis1 n'est pas essentielle à la signalisation des cellules par le pré-TCR dans les thymocytes précoces (Fig. 2B). Nous montrons aussi que la déficience en Lis1 n'affecte pas l'expression du récepteur à l'IL-7 qui est nécessaire à la survie des cellules à ce stade et à leur différenciation en cellules DN4 et DP (Fig. 2C). L'induction de l'IL7-R par interaction avec son ligand entraine l'activation de la voie Jak/STAT5 conduisant à la phosphorylation de STAT5 et à sa translocation dans le noyau. STAT5, au sein du noyau, est responsable de la transactivation de gènes de survie tels que Bcl-2. Suite à la stimulation du récepteur à l'IL-7, l'expression de BCL-2 diminue (262). En revanche, le passage de la -sélection est corrélée avec l'augmentation de l'expression de BCL-2A1 (263). Il n'existe pas de donnée physiologique quant aux conséquences de la perte de BCL-2A1 au cours du développement précoce des LT. Cependant, il est clair que l'expression de ce facteur de survie est considérablement augmentée après engagement du pre-TCR et du récepteur CXCR4 dans les cellules DN4 (485). L'expression de BCL-2 n'est pas affectée dans les souris déficientes en Lis1 (Fig. 2C). Afin de vérifier que la diminution de la proportion de cellules DN4 chez les souris déficientes 145 en Lis1 ne provient pas de l'absence d'expression de BCL-2A1, il serait important de vérifier l'expression de CXCR4 et l'induction de BCL-2A1. Le phénotype observé conduit au blocage de la prolifération suite à la perte totale de l'expression de Lis1. L'analyse de la quantité d'ADN montre une augmentation de la proportion des cellules en G2/M en absence de Lis1 suggérant que le défaut de prolifération des thymocytes est la conséquence d'un blocage des cellules en phase G2/M du cycle cellulaire (Fig. 3D). Une publication récente, démontre qu'au cours de la -sélection, des divisions asymétriques ont lieu pour contrôler le devenir des cellules. La délétion de Scribble, une protéine régulant la polarité cellulaire, conduit à l'augmentation de cellules DN4 dans les souris (272). Un travail précédent montre que la déficience en Lis1 dans les cellules hématopoïétiques conduit à l'asymétrie des divisions de CSH (429). Nous pouvons penser que la déficience en Lis1 dans notre modèle favorise l'asymétrie des divisions, ce qui contribuerait à la diminution des thymocytes DN4. L'analyse sur des cellules DN3 stimulées par OP9 DLL1 de la répartition de Scribble et aPKC, des protéines impliquées dans la polarisation cellulaire, nous permettrait de quantifier la proportion de cellules en division asymétrique. 2. La sélection positive est normale dans le modèle Lis1fl/fl CD4Cre Le développement tardif des LT se caractérise par des évènements de sélection importants conduisant à la survie ou à l'apoptose des cellules selon l'affinité du TCR pour les peptides du soi présentés par les molécules du CMH dans le thymus. Nous montrons que la déficience en Lis1 dans les souris Lis1fl/fl CD4Cre n'affecte pas les sous-populations de thymocytes CD4 SP et CD8 SP et n'affecte pas la sélection positive de LT CD4 exprimant le TCR AND (Fig. 1A). Il est possible que Lis1 ne soit pas essentielle à la maturation et à la sélection de ces cellules. Il est aussi possible que les modèles utilisés ne permettent pas de conclure quant à l'importance de Lis1 dans le développement tardif. Le modèle CD2Cre entrane un blocage quasiment complet du développement thymique au cours des stades DN et ne permet pas d'analyser les étapes ultérieures. Le modèle CD4Cre entrane peut-être une délétion trop tardive de Lis1 ne permettant pas de révéler l'effet de cette protéine sur la sélection positive. En faveur de cette dernière hypothèse, l'utilisation du modèle CD4Cre dans l'étude de l'adaptateur moléculaire Grb2 ne démontre pas d'effet de la déficience en Grb2 dans le développement des LT. En revanche, l'utilisation de modèle LCKCre, entrainant une délétion 146 plus précoce, conduit à la diminution de la population CD4 et CD8 SP démontrant une implication de cet adaptateur au cours des évènements de sélection thymique (244). Le développement tardif des LT nécessite une signalisation des TCR finement régulée. Des résultats précédents obtenus dans des neurones indiquent que Lis1 participe à la régulation de la signalisation dans ces cellules en stabilisant l'activation de Rac1 au niveau du cortex cellulaire suite à la stimulation neuronale (395). De plus, il a été démontré que la déficience en Lis1 peut diminuer la signalisation de la voie des MAP kinases suite à la diminution du recyclage de récepteurs aux facteurs de croissance (453). Des études d'interactome réalisées par mon équipe d'accueil démontre que Lis1 interagit avec THEMIS1, une protéine essentielle aux évènements de sélection dans le thymus (347)(Annexe1). Mon travail n'a pas permis d'établir les conséquences fonctionnelles de l'interaction entre THEMIS1 et Lis1 mais des données de la littérature suggèrent une hypothèse intéressante. GAREM, une protéine de signalisation contenant un domaine CABIT, interagit avec la protéine 14-3-3(486). Cette dernière est importante dans la relocalisation de GAREM au sein des cellules. Dans les neurones, 14-3-3 interagit avec le complexe Kinésine, Lis1 et NudE pour leur relocalisation avec DISC (487). Enfin, 14-3-3 est présente dans l'interactome de THEMIS1 suggérant fortement que Lis1 interagit avec THEMIS1 afin de relocaliser ce dernier (Communication personnelle par Dr Renaud LESOURNE). Lis1 pourrait donc être mise à contribution dans la régulation de la localisation de THEMIS1 au sein des cellules au cours de l'activation. Il serait donc intéressant d'analyser, par imagerie confocale, la localisation de THEMIS1 au sein de cellules stimulées déficientes en Lis1. Des expériences réalisées au début de mon doctorat démontrent l'importance du domaine CABIT1 de THEMIS1 dans l'interaction entre ces deux protéines. Lis1 interagit principalement avec ses partenaires par sa région en hélice probablement par le biais d'interactions ioniques (Annexe 4). Il serait intéressant de déterminer les résidus d'interaction entre THEMIS1 et Lis1 et de produire des souris knock- in contenant des mutations invalidantes du ou des résidus responsables de cette interaction. 3. Rôle de Lis1 dans la migration des thymocytes Bien que la prolifération soit un évènement essentiel dans le développement des LT afin d'amplifier des thymocytes précoces exprimant une chaine du TCR fonctionnelle, nous ne pouvons pas exclure que l'effet de Lis1 sur le développement précoce des LT soit aussi la conséquence d'un défaut de migration des cellules. Les thymocytes migrent vers différentes 147 régions du thymus tout au long de leur développement. Les ETP/DN1 entrent dans le thymus par la jonction cortico-médullaire et migrent vers la zone subcapsulaire dans laquelle se déroule la -sélection. Après différenciation en DP, les cellules rejoignent le cortex au sein duquel la sélection clonale s'effectue par interaction avec les cTEC. Enfin, les SP issus de la sélection positive, migrent vers la médulla pour subir la sélection négative grâce au mTEC exprimant les peptides antigéniques du soi (195). La délétion de CXCR4, un récepteur des chimiokines CXCL12, entraine l'augmentation en proportion et en nombre des cellules DN3 et à la diminution de la prolifération de ces cellules. La diminution en CXCR4, conduit à l'absence d'expression de BCL-2A1 après engagement du pre-TCR (485). Cependant, aucune donnée n'existe concernant la capacité de ces cellules à exprimer CD5, le récepteur à l'IL-7 et des facteurs trophiques. Comme pour la prolifération des cellules souches neurales, la migration des neurones est essentielle dans le développement neural. Comme il a été discuté dans l'introduction, Lis1 est essentielle à la migration cellulaire (403, 405, 406, 419, 425, 488). Les lissencéphalies illustrent d'ailleurs les conséquences des défauts de migration et de prolifération des cellules induites par la perte de Lis1 lorsque le gène pafah1b1 est muté chez des patients (489, 490). Par conséquent, nous pouvons supposer que Lis1 pourrait aussi jouer un rôle sur la migration des LT et affecter le développement précoce et tardif de ces cellules. Nous avons réalisé des expériences de transwell pour examiner cette possibilité in vitro. Ces expériences préliminaires, réalisées sur des LT CD4 périphériques déficients en Lis1, ne démontrent pas de défaut de migration des cellules vers CCL19 (données non montrées). Néanmoins, cette stratégie ne reflète pas la migration réelle des cellules mais plus particulièrement la capacité de celles-ci à être attirées par une chimiokine et à se déformer pour atteindre leur but. Ce type d'expérience suggère plutôt que Lis1 n'est pas nécessaire à la diapédèse, un processus conduisant à l'introduction de cellules circulantes au sein d'un organe. Une analyse par microscopie multi-photonique nous permettrait d'analyser plus finement la migration en temps réel au sein d'un organe. Il serait intéressant de trier des cellules DN ou DP déficientes pour Lis1 et de les déposer sur une coupe épaisse de thymus sain pour analyser la capacité de ces cellules à migrer au sein de l'organe. 4. Fonctions de Lis1 dans les lymphocytes T périphériques L'activation des LT dépend de voies de signalisation mobilisées suite à l'engagement du TCR par les pCMH et à la fixation de ligands sur les récepteurs aux cytokines et sur les corécepteurs. Comme il a été mentionné dans la partie précédente, la signalisation des LT 148 pourrait être affectée par la perte de Lis1 en considérant l'interaction entre THEMIS1 et Lis1. Par ailleurs, la stimulation des LT conduit à la formation d'une structure tridimensionnelle qu'est la synapse immunologique, se caractérisant par le recrutement du centrosome au niveau du contact cellulaire et au recrutement des TCR constamment endocytés pour leur recyclage (491, 492). La formation et la fonction de cette structure dépend fortement des moteurs moléculaires, dynéine et kinésine (160-163, 473). Comme vu au début de cette discussion, la dynéine et importante dans le recrutement du centrosome et des TCR. Lis1 est recrutée à la synapse immunologique et pourrait réguler la dynéine dans ces réarrangements moléculaires. Il pourrait donc être intéressant de quantifier la proportion de CPA et de LT conjugués par cytométrie en image ou microscopie confocale. Néanmoins, la déficience en Lis1 n'affecte pas l'expression des marqueurs d'activation CD69 et CD25 dans les LT stimulés par des anticorps anti-TCR ou par des antigènes (Fig. S5B et données non montrées). De plus, la sécrétion de cytokines n'est pas affectée comme l'ont démontré Ngoi et al (472). Il a été démontré que la sécrétion de cytokines de LT traités au nocodazole n'est pas affectée. En revanche, la polarisation de ces cytokines vers la cellule cible est compromise (158). Il est possible que la déficience en Lis1 ait des effets sur la polarisation à la synapse des cytokines sécrétées par les LT. De la même manière, la déficience en Lis1 pourrait conduire à la mauvaise polarisation des granules lytiques au sein des CD8 et par conséquent, compromettre la mort des cellules cibles infectées ou cancéreuses. La prolifération des LT CD4 , après engagement du TCR, est fortement diminuée en absence de Lis1 (Fig. 4A et Fig. 4B). La stimulation de ces cellules avec de la PMA/ionomycine démontre que le défaut de prolifération est indépendant du TCR (Fig. 4C). Comme au sein du thymus, la forte diminution de cette prolifération après stimulation par des anticorps, est associée à l'augmentation de la phase G2/M du cycle cellulaire et à l'augmentation de l'apoptose des quelques cellules en prolifération (Fig. 4E et Fig. 6B). Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus par Ngoi et al. montrant un défaut de prolifération des LT CD4 déficients en Lis1 stimulés en présence d'IL-7 (472). De manière intéressante, et comme l'ont montré Ngoi et al. (472), nous n'observons pas de défaut de prolifération des LT CD8 après stimulation par des anticorps anti-CD3 et anti- CD28 (Fig. S5A). Bien que la stimulation par le TCR ne conduise pas au blocage de la prolifération des LT CD8 , la stimulation par PMA/ionomycine révèle un blocage critique de la prolifération (Fig. 4D). Le transfert de CD8 naïfs dans une souris receveuse irradiée, conduit au défaut de prolifération en absence de Lis1. Cependant, l'infection par 149 L. monocytogenes d'une souris OT-I constituée majoritairement de LT CD8 entraine la diminution de LT dans le sang et les organes lymphoïdes secondaires alors que la proportion de cellules en prolifération semble normale (472). L'ensemble de ces données suggère que la prolifération des LT CD8 déficients en Lis1 est affectée lors de la stimulation par agents solubles comme la PMA/Ionomycine et les cytokines IL-7. Cependant, la stimulation par immobilisation ou par des CPA ne démontre pas de défaut de prolifération mais plutôt de différenciation des LT CD8 déficients en Lis1. Les LT CD8 peuvent se différencier en sous- populations cellulaires effectrices ou mémoires après stimulation des cellules en présence de cytokines spécifiques sécrétées par les CPA. La différenciation de ces deux sous- populations a lieu dès le premier cycle de division cellulaire qui entrane une répartition asymétrique, entre le pôle proximal (proche de la CPA) et le pôle distal des cellules stimulées, de facteurs de transcriptions déterminant les fonctions effectrices ou mémoires (184). Ngoi et al, ont démontré que la déficience en Lis1 conduit à l'augmentation du phénotype mémoire, suggérant une augmentation de la division asymétrique dans le modèle CD4Cre (472). Bien que JT Chang ait été le premier à décrire la division asymétrique dans les LT, il n'y a pas, dans son travail sur Lis1, d'expérience de microscopie confocale démontrant un rôle direct de Lis1 dans la division asymétrique. Il est donc possible que Lis1 régule la symétrie des divisions cellulaires dans les LT comme elle le fait dans les neurones ou les cellules hématopoïétiques mais ceci reste à démontrer par l'utilisation de marqueurs tels que aPKC et Scribble comme cités précédemment. 5. La perte partielle de Lis1 ne conduit pas à un défaut des lymphocytes T à la hauteur des lissencephalies Les conséquences de l'hétérozygotie de Lis1 dans le tissu neural sont critiques en comparaison au tissu lymphoïde (358, 360, 493). Les patients atteints de lissencéphalie résultant d'une mutation hétérozygote sur le gène codant Lis1 ne présentent pas de défaut apparent des populations de LT CD4 et CD8 dans le sang (communication personnelle du Pr. Nadia Bahi-Buisson). De plus, chez la souris, la perte hétérozygote de Lis1 ne conduit pas à un phénotype différent des souris sauvages alors que la perte totale a un effet majeur (Fig. S2A et Fig. S2B). Asunder est un deuxième régulateur de la dynéine, moins connu mais ayant une fonction importante dans la régulation de la dynéine. Asunder a principalement été étudiée chez la drosophile. Des expériences d'interférence à ARNm montrent que Asunder est importante dans la localisation périnucléaire de la dynéine pour entrainer la mitose. Bien que Asunder et Lis1 puissent interagir, la localisation et la fonction de Asunder ne semble 150 dans les bases de obtenus données Expression pas dépendre de Lis1 (468, 494). De manière intéressante, des résultats d'expression génique Atlas ( suggèrent que le gène codant cette protéine s'exprime dans de nombreux tissus et particulièrement dans le tissu lymphoïde. Ces mêmes bases de données suggèrent que Asunder est exprimée plus fortement dans les LT stimulés ou différenciés en sous populations effectrices de LT. L'expression de cette protéine semble moins importante dans système nerveux que dans le tissu lymphoïde. L'absence de phénotype clair dans les souris Lis1 hétérozygotes pourrait donc provenir d'une compensation de la perte partielle de Lis1 par Asunder. Il serait donc intéressant d'analyser l'expression de Asunder en absence de Lis1 et de créer une lignée de souris déficientes pour Asunder et d'analyser la perte hétérozygote dans ce modèle. II) Mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels Lis1 régule la mitose dans les lymphocytes T 1. Lis1 dans la réorganisation des chromosomes en mitose La prolifération des thymocytes post -sélection et des LT CD4 est fortement altérée en absence de Lis1 (Fig. 3A et Fig. 4A). Nous avons démontré, après marquage de l'ADN, que cette prolifération est associée à l'augmentation de la proportion des cellules en G2/M du cycle cellulaire (Fig. 3D et Fig. 4E). L'utilisation de la cytométrie en image, nous a permis de distinguer les cellules en G2 et les cellules en mitose pour montrer que la déficience en Lis1 conduit essentiellement à une accumulation de cellules en mitose (Fig. 5A). En utilisant cette technique, nous montrons aussi que la proportion de cellules en cours de métaphase est fortement diminuée en absence de Lis1 suggérant un rôle important de Lis1 dans le positionnement des chromosomes sur le plan équatorial des LT CD4 (Fig. 5B). En accord avec cette observation, la quantification par vidéo-microscopie nous a permis de conclure d'une part à un ralentissement important de la transition entre la prophase et la métaphase et d'autre part à des anaphases imparfaites conduisant à une répartition anormale du matériel génétique ou à une interruption des mitoses (Fig. 5C). Les cellules issues de ces divisions présentent souvent un noyau multilobé pouvant résulter probablement du déséquilibre génétique et d'un défaut de reformation de l'enveloppe nucléaire après la mitose. L'ancrage des chromosomes sur les microtubules se fait par l'intermédiaire des kinétochores au niveau des centromères des chromosomes. La dynéine s'associe à Spindly 151 et à la dynactine pour favoriser l'ancrage des kinétochores aux microtubules (382). Au cours de la prométaphase, le complexe RZZ situé dans la couronne fibreuse du kinétochore recrute Spindly, la dynactine et la dynéine. L'ancrage des chromosomes aux microtubules libérerait la dynéine qui éloignerait des protéines responsables du point de contrôle métaphasique afin de favoriser l'anaphase (438). L'entrée en anaphase est hautement régulée. Le bon ancrage des chromosomes sur les microtubules polaires permet l'activation de APC/C qui entraine l'ubiquitination et la dégradation de la sécurine. Cette dernière libère donc l'activité de la séparase qui dégrade la cohésine pour entrainer la séparation des chromatides sœurs (495, 496). Ce déroulement de l'anaphase peut être la conséquence du mauvais ancrage des kinétochores aux microtubules mais aussi du déséquilibre de l'activité dynéine et kinésine au niveau des microtubules polaires ne permettant pas une orientation correcte (439-442). Des analyses de microscopie à haute résolution pourraient nous permettre de déterminer d'un part la position des dynéines par rapport aux microtubules polaires et d'autres part la position des kinétochores par rapport aux extrémités positives des microtubules. Les expériences de cytométrie en image nécessitent un grand nombre de cellules afin d'acquérir plus de cellules en phase G2/M du cycle cellulaire. Par conséquent, il est difficile de réaliser cette expérimentation sur des cellules DN après culture sur des cellules OP9. De plus, la vidéo-microscopie nécessite de stimuler les cellules en chambres spécifiques pour l'imagerie en présence d'OP9 dans le cas de DN. La présence d'un autre type cellulaire, pourrait générer un bruit supplémentaire à l'analyse de la mitose, de plus que les OP9 peuvent aussi proliférer. Les défauts que nous venons de décrire dans les LT CD4 périphériques pourrait donc survenir de façon similaire dans les thymocytes DN en cours de division après la -sélection et provoquer la mort des cellules en cours de développement via la protéine p53. 2. Séparation des centrosomes au cours de la phase G2 La réorganisation des chromosomes nécessite la réorientation des centrosomes (422). L'analyse des centrosomes dans les thymocytes et des LT CD4 déficients en Lis1 en prolifération démontrent l'augmentation du nombre de centrosomes (Fig. 5D et Fig. 5E). Des résultats préliminaires permettent aussi de voir une multipolarité des microtubules. Les centrosomes sont constitués d'une paire de centrioles et du matériel péricentriolaire au sein 152 duquel se concentrent de nombreuses protéines de régulation et des complexes TURC qui sont à l'origine de la nucléation des fibres de microtubules. Ces derniers se dupliquent au cours de la phase S du cycle cellulaire et se séparent au cours de la phase G2 pour migrer, par le biais de protéines motrices, vers les pôles opposés de la cellule (422). La duplication des centrosomes est un processus complexe déclenché par la kinase PLK4 en phase S phosphorylant STIL et SAS-6 constituant l'amorce d'un nouveau centriole (481). Alors que la déficience en PLK4, STIL ou SAS-6 conduisent à l'absence de centriole, leur surexpression favorise l'amplification des centrioles et l'altération de l'organisation des chromosomes (497) (479, 498). La surexpression de PLK4 conduit à l'augmentation des centrosomes dans le thymus et les splénocytes, entrainant l'augmentation des cellules en cours de prolifération suite au ralentissement de la phase G2/M (479). Une élongation trop importante des centrioles au cours de la phase S peut conduire à l'amplification des centrosomes et à des mitoses multipolaires (499). La dynéine est capable de véhiculer des protéines vers les centrosomes en formation, d'une part pour apporter les molécules nécessaires à la synthèse mais aussi des molécules de régulation. En faveur de cette hypothèse, la dynéine est capable de transporter BRCA2 vers les centrosomes. La perte de BRCA2 compromet la cohésion entre les centrioles au cours de la phase S (500). La perte d'activité de BRCA2 dans des cellules MEF conduit à l'amplification des centrosomes(501). Des protocoles existent pour l'isolation des centrosomes (502). Par cela, il pourrait être intéressant d'analyser le protéome du centrosome dans des cellules déficientes en Lis1 afin de déterminer si les centrosomes présentent le matériel nécessaire à leur duplication et à la régulation de leur amplification. Une autre hypothèse concerne le rapport du retard mitotique avec l'amplification des centrosomes. Il a été déjà démontré que le retard de la mitose suite à un traitement des cellules synchronisées en G2, entraine l'amplification des centrosomes. Plus la mitose est longue, plus le nombre de centrosomes augmente. Ce phénomène serait dû à la séparase, normalement essentielle au cours de la mitose pour conduire à la séparation des chromatides sœurs par dégradation de la cohésine mais aussi après la mitose pour séparer les centrioles. La déficience en séparase suite à interférence à ARNm conduit à la diminution de l'amplification des centrosomes des cellules en retard de mitose. La séparase est activée suite à l'activité de l'APC/C qui dégrade la sécurine. L'utilisation d'un inhibiteur d'APC/C entraine la réduction de l'amplification des centrosomes au cours du retard mitotique. Il serait donc intéressant de traiter les LT CD4 déficients en Lis1 stimulés avec un inhibiteur de APC/C et d'analyser l'intégrité des centrosomes par microscopie confocale (432). 153 L'ensemble de ces deux hypothèses dégage deux explications possibles de cette amplification des centrosomes. L'amplification des centrosomes pourrait entrainer le retard mitotique suite à la mauvaise organisation des chromosomes dans les cellules en mitose et à l'inverse cette amplification peut être la conséquence du retard mitotique. 3. Conséquence de la déficience en Lis1 sur la survie cellulaire Les cellules sont dotées d'un système de surveillance de leur contenu afin de réduire les risques de transformations tumorales suite à la perte d'un gène de régulation essentiel. TP53 est un gène suppresseur de tumeur codant pour la protéine p53 qui est induit lors de la duplication de l'ADN et à la fin de la mitose (482). Le bon déroulement du cycle cellulaire conduit à la dégradation de p53. En revanche, une erreur ou une cassure au sein de l'ADN en phase S peut retarder l'entrée en mitose (503). La présence d'une quantité anormale de matériel génétique peut conduire à l'expression de gènes pro-apoptotiques en fin de mitose. Nous observons par vidéo-microscopie une répartition fortement altérée du matériel génétique vers les cellules filles. Certaines sont capables de former trois cellules filles alors que d'autres sont incapables de réaliser l'anaphase correctement et reforment une cellule dotée de deux fois trop de matériel génétique. L'analyse de p53, démontre une augmentation forte de l'expression de ce marqueur lorsque les cellules sont en cours de prolifération suggérant que l'apoptose des cellules survient suite à l'expression de p53 dû à la mauvaise distribution du matériel génétique. Les phénotypes thymiques et périphériques observés dans les souris déficientes en Lis1 proviendraient donc de l'expression de p53 dû à la mauvaise répartition du matériel génétique. Il serait intéressant de renforcer cette conclusion en déterminant si la diminution de p53 restaure le développement des LT et la prolifération de LT périphériques en absence de Lis1. 154 Figure 29 : Fonctions de Lis1 au cours de la prolifération des thymocytes et des LT Représentation du cycle cellulaire des thymocytes et des LT. En absence de Lis1, nous remarquons un ralentissement de la mitose important avec une désorganisation des chromosomes. L'analyse des centrosomes révèle une amplification des centrosomes qui peut être les conséquences de deux processus. 1 : l'amplification des centrosomes à lieu au cours de la phase G2 et contribue à la désorganisation des chromosomes. 2 : l'amplification des centrosomes est le résultat du retard de la mitose avec l'activation précoce de la séparase par APC/C. Les cellules sont capables de faire l'anaphase mais les chromosomes ne sont pas ordonnés dans leur ségrégation, conduisant à des pôles cellulaires ayant une quantité de matériel génétique différente. Cela favorise dans certains cas à l'interruption de la mitose et la formation d'une cellule fille multinuclée, ou alors à la formation de cellules filles constituées d'une quantité de matériel génétique différente. Dans ces deux cas, les cellules exprimeraient p53 favorisant l'apoptose. 4. Régulation moléculaire de la mitose par Lis1 La dynéine participe à la redistribution des centrosomes et des chromosomes au cours de la mitose. Pour cela, elle recrute la dynactine qui peut s'associer à Spindly et à Ninéine pour s'associer aux kinétochores et aux centrosomes respectivement (381, 382). Nous observons la perte d'interaction de la dynéine avec la dynactine en absence de Lis1. Pour approfondir ces résultats, il pourrait être intéressant de déterminer si la déficience en Lis1 affecte 155 l'interaction de la dynéine avec les adaptateurs Spindly et Ninéine. Nous avons réalisé des expériences par spectrométrie de masse pour déterminer si l'absence de Lis1 affecte l'interactome de la dynéine dans les cellules en mitose. Néanmoins, nous n'avons pas détecté d'adaptateur dans le matériel protéique co-immunoprécipité avec la dynéine. Les microtubules sont des structures sensibles aux variations de température, de pH et aux modifications du milieu intracellulaire. Ainsi, ils dépolymérisent rapidement dans les conditions de lyse à 4C que nous utilisons dans nos expériences d'immunoprécipitation. Or, l'interaction de la dynéine avec les protéines de tubuline et les cargos nécessite que les microtubules soient polymérisés. Par conséquent, il est probable que dans nos conditions expérimentales, l'interaction de la dynéine avec les structures cellulaires soit perdue. Redwine et al. ont utilisé une stratégie astucieuse leur permettant d'éviter les inconvénients des protocoles de lyse cellulaire. Ces derniers ont exprimé dans les cellules un gène codant pour une sous unité de la dynéine, couplée à la biotine ligase. La culture de ces cellules en présence de biotine entraine la biotinylation de tous les partenaires que la dynéine a rencontré au cours de la culture. L'incubation du lysat avec des billes de streptavidine permet de précipiter les partenaires de la dynéine même si celle-ci n'y est plus associée (381). Cette approche, réalisée au sein de lignées cellulaires, pourrait être reproduite dans une lignée de LT après extinction du gène Lis1 en utilisant des shRNA. Il nous serait possible par cette stratégie, d'analyser aisément l'interactome de la dynéine sous différentes conditions de stimulation. Comme nous l'avons vu précédemment, Lis1 interagit fortement avec la protéine THEMIS1. Cependant, le rôle de cette interaction reste à explorer. J'ai proposé que Lis1 puisse réguler la localisation de THEMIS1 au sein des LT par le biais de la protéine 14-3-3 L'analyse globale de l'expression des gènes dans les thymocytes déficients en THEMIS1 en cours de sélection suggère que THEMIS1 régule des gènes impliqués dans le déroulement du cycle cellulaire. Cependant, le marquage de l'ADN ne démontre pas d'effet de la déficience en THEMIS1 sur les différentes étapes du cycle cellulaire des thymocytes précoces (337). Notre équipe a récemment produit des souris qui sont sélectivement déficientes pour THEMIS1 dans les LT matures. Ces souris présentent une diminution du nombre et des proportions des LT CD8 dans les organes lymphoïdes secondaires. Des analyses in vitro montrent que les LT CD8 déficients en THEMIS1 présentent un défaut de prolifération lorsqu'ils sont stimulés par des fortes doses d'IL-7. L'effet de l'IL-7 sur la survie des cellules n'est en revanche pas altérée par la déficience en THEMIS1 lorsque les cellules sont stimulées par des faibles doses d'IL-7, qui n'induisent pas la prolifération cellulaire. Ces résultats suggèrent 156 que THEMIS1 pourrait exercer un effet sélectif sur la prolifération indépendamment de la signalisation par le récepteur à l'IL-7. Ces observations sont semblables à celles obtenues dans les LT CD8 déficients en Lis1 dont la prolifération in vitro est fortement diminuée en réponse à l'IL-7. Il est donc possible que THEMIS1 et Lis1 coopèrent pour réguler le cycle cellulaire des LT CD8 . Un travail récent auquel j'ai collaboré montre que THEMIS1 agit sur la signalisation des TCR en inhibant directement l'activité tyrosine phosphatase des protéines SHP-1 et SHP-2 (349)(Annexe2). Or, il a été montré qu'une mutation entrainant un gain de fonction de SHP- 2 entrane un défaut de cycle cellulaire et l'amplification des centrosomes dans des lignées cellulaires MEF (504). Nous pouvons penser que Lis1 favorise la localisation de THEMIS1 au centrosome pour réguler la protéine kinase SHP-2. De manière intéressante, SHP-2 favorise l'activité de PLK-1 (504). Cette kinase active APC/C qui déclenche l'activité de la séparase et entraine la séparation des chromatides sœurs en mitose et des centrioles au début de la phase G1 (435). Lis1 pourrait réguler la localisation de THEMIS1 au centrosome pour réguler l'activité de SHP-2 et par conséquent de PLK1 et de la séparase. III) La perte de fonction de Lis1 pourrait favoriser le développement tumoral L'aneuploïdie et l'amplification des centrosomes peuvent conduire à la transformation tumorale des cellules. La perte d'hétérozygotie du locus 17p13. 3 contenant le gène codant pour Lis1 est récurrente dans de nombreux cancers (362-364, 366). Cette perte ne conduit pas systématiquement à la perte d'expression de Lis1 (365). Dans les cas de carcinomes hépatiques, la perte d'hétérozygotie entraine la diminution d'expression de Lis1 (366). La délétion de Lis1 par interférence à ARNm sur une lignée cellulaire conduit à la formation de colonies démontrant que le développement tumoral peut être la conséquence de la perte de Lis1. De plus, la perte d'hétérozygotie au niveau du locus 17p13. 3 a été détectée dans des cas de leucémie (505). Par ailleurs, des SNP sur le gène pafah1b1 existent et favorisent le développement de leucémies myéloïdes mais aucune information n'existe concernant les conséquences de ces SNP sur l'intégrité de Lis1 (367). L'ancrage des chromosomes aux microtubules est essentiel pour le bon alignement des chromosomes et la répartition homogène du matériel génétique. Il est donc possible que des déficiences partielles en Lis1 puissent augmenter la susceptibilité au développement tumoral. Nous avons remarqué que p53 s'exprime particulièrement au cours de la prolifération de thymocytes et des LT. Cette 157 expression entraine l'apoptose de ces cellules, probablement suite à la mauvaise distribution du matériel génétique. Le gène suppresseur de tumeur TP53 se situe sur le locus 17p13. 1 du chromosome 17, proche de la localisation de Lis1 (506). Il existe des cas de tumeurs au sein desquels la perte d'hétérozygotie s'effectue du locus 17p13. 1 à 17p13. 3. De plus, la mutation ou l'absence de p53 est retrouvée dans plus de 50% des cancers (507). Afin d'analyser si Lis1 peut être responsable du développement tumoral in vivo, nous avons croisé des souris déficientes ou hétérozygotes pour Lis1 dans le modèle CD2Cre avec des animaux hétérozygotes pour p53. L'émergence de leucémies dans ce modèle pourrait résulter à la fois des anomalies de prolifération des lymphocytes lors des mitoses et d'une capacité réduite des LT à développer des réponses antitumorales efficaces en absence de Lis1. Figure 30 : Fonctions hypothétiques des interactions dynéine/Lis1 et THEMIS1/Lis1 dans les thymocytes et LT Nous avons démontré au cours de cette thèse que Lis1 est importante dans la prolifération des thymocytes et des LT. Il est probable que ce phénomène soit dépendant de l'interaction de Lis1 avec la dynéine. Cependant cette interaction peut aussi avoir un rôle dans la migration des thymocytes au cours des évènements de sélection et par conséquent jouer un rôle sur la sélection des thymocytes. En périphérie, Lis1 pourrait réguler la dynéine dans la sécrétion polarisée des cytokines et favoriser les fonctions des LT. Enfin Lis1 peut réguler la dynéine pour la relocalisation des protéines de signalisation et par conséquent entrer en jeu dans la sélection des thymocytes. L'interaction de Lis1 avec THEMIS1 pourrait jouer un rôle dans la signalisation en favorisant la relocalisation des protéines THEMIS1 de façon dépendant de 14-3-3. Enfin, parce que Lis1 pourrait favoriser la relocalisation de THEMIS1, cette interaction pourrait réguler la fonction de SHP-2 au sein des centrosomes afin de réguler leur amplification et donc favoriser le bon déroulement de la mitose. 158 CONCLUSION Au cours de cette thèse, j'ai pu déterminer les fonctions du régulateur de la dynéine, Lis1 dans les LT. Cette protéine n'a fait l'objet que d'une seule publication démontrant que Lis1 est importante dans la prolifération homéostatique des LT périphériques. Cependant, bien que les auteurs aient bien caractérisé ces défauts de prolifération, ils n'en avaient pas analysé les causes et concluaient que Lis1 n'avait pas de fonction dans les thymocytes. Nous avons pu montrer dans ce travail que Lis1 entre en jeu dans la prolifération des thymocytes précoces ayant passé la -sélection. Nos analyses moléculaires suggèrent fortement que Lis1 régule l'activité de la dynéine dans les LT en favorisant son association avec la dynactine et aux structures cellulaires à transporter. Lis1 régule l'amplification des centrosomes et conduit à la répartition ordonnée du matériel génétique entre les cellules filles. En absence de Lis1, les cellules s'accumulent au stade DN3 suite à l'allongement important du temps de la mitose. Les cellules qui ne parviennent pas à réaliser une anaphase correcte, exprime p53 conduisant à la mort des cellules au stade DN3b. Des expériences de restauration, en cours, nous permettront de confirmer que l'apoptose induite par la prolifération est responsable de l'absence de cellule après le stade DN3 du développement précoce des LT. Compte tenu de l'implication de Lis1 dans la régulation de la prolifération des LT et des publications associées à la perte ou la mutation de Lis1 dans le développement tumoral, nous émettons l'hypothèse que Lis1 puisse être mise en cause dans le développement tumoral au sein du tissu lymphoïde. Nous espérons que nos analyses en cours de souris déficientes en Lis1 et hétérozygotes pour p53 nous permettront de conclure quant à l'implication de Lis1 dans la carcinogénèse du tissu lymphoïde. Bien que Lis1 entre en jeu particulièrement dans la plus petite population de thymocytes, ce travail illustre l'importance de cette protéine dans l'établissement de la lignée des LT. Nous avons aussi démontré, par des expériences préliminaires, que Lis1 est aussi essentielle au développement des LB et donc essentielle à l'établissement du système immunitaire adaptatif. Enfin, selon les données de la publication, Lis1 joue un rôle critique dans la naissance des CSH par régulation de la division asymétrique. Lis1 est donc importante dans la naissance du système immunitaire dans sa généralité en régulant la prolifération et la différenciation des cellules progénitrices du système immunitaire. Cependant la fonction de 159 l'interaction entre THEMIS1, spécifique des LT, et Lis1 est intrigante. Outre le fait que Lis1 régule la prolifération, peut-elle jouer des fonctions spécifiques au sein des LT ? Afin d'analyser si Lis1 peut interagir avec des partenaires spécifiques des LT nous souhaitons terminer cette thèse pas l'analyse de l'interactome de Lis1 par spectrométrie de masse. Ces données pourraient nous permettre d'une part de déterminer si Lis1 interagit avec des partenaires associés à la prolifération des LT mais aussi d'ouvrir de nouvelles pistes d'études concernant d'autres fonctions de Lis1 spécifiques de ces cellules. 160 ANNEXES Annexe 1 : Zvezdova E, Mikolajczak J, Garreau A, Marcellin M, Rigal L, Lee J, Choi S, Blaize G, Argenty J, Familiades J, Li L, Gonzalez de Peredo A, Burlet-Schiltz O, Love PE, Lesourne R. 2016. Themis1 enhances T cell receptor signaling during thymocyte development by promoting Vav1 activity and Grb2 stability. Sci Signal 9 : ra51 Pour cette annexe, j'ai contribué à la révision de l'article. Brièvement, il avait été souligné par les rapporteurs que la stimulation par anticorps n'est pas physiologique. J'ai donc stimulé in vitro de thymocytes issus de souris THEMIS1-/- CMH-II-/- OTII par des tétramères spécifiques d'OVA pour la stimulation ou de CLIP pour la condition contrôle. Les résultats n'ont pas été présentés dans l'article. 161 162 R E S E A R C H A R T I C L E I M M U N O L O G Y Themis1 enhances T cell receptor signaling during thymocyte development by promoting Vav1 activity and Grb2 stability Ekaterina Zvezdova, 1 Judith Mikolajczak, 2, 3, 4, 5* Anne Garreau, 2, 3, 4, 5 Marlène Marcellin, 6 Lise Rigal, 2, 3, 4, 5 Jan Lee, 1 Seeyoung Choi, 1 Gatan Blaize, 2, 3, 4, 5 Jérémy Argenty, 2, 3, 4, 5 Julien Familiades, 2, 3, 4, 5 Liqi Li, 1 Anne Gonzalez de Peredo, 6 Odile Burlet-Schiltz, 6 Paul E. Love, 1 Renaud Lesourne2, 3, 4, 5 The T cell signaling protein Themis1 is essential for the positive and negative selection of thymocytes in the thymus. Although the developmental defect that results from the loss of Themis1 suggests that it enhances T cell receptor (TCR) signaling, Themis1 also recruits Src homology 2 domaincontaining phosphatase-1 (SHP-1) to the vicinity of TCR signaling complexes, suggesting that it has an inhibitory role in TCR signaling. We used TCR signaling reporter mice and quantitative proteomics to explore the role of Themis1 in developing T cells. We found that Themis1 acted mostly as a positive regulator of TCR signaling in vivo when receptors were activated by positively selecting ligands. Proteomic analysis of the Themis1 interactome identified SHP-1, the TCR-associated adaptor protein Grb2, and the guanine nucleotide exchange factor Vav1 as the principal interacting partners of Themis1 in isolated mouse thy- mocytes. Analysis of TCR signaling in Themis1-deficient and Themis1-overexpressing mouse thymo- cytes demonstrated that Themis1 promoted Vav1 activity both in vitro and in vivo. The reduced activity of Vav1 and the impaired T cell development in Themis1/ mice were due in part to increased degrada- tion of Grb2, which suggests that Themis1 is required to maintain the steady-state abundance of Grb2 in thymocytes. Together, these data suggest that Themis1 acts as a positive regulator of TCR signaling in developing T cells, and identify a mechanism by which Themis1 regulates thymic selection. INTRODUCTION Both the positive and negative selection of thymocytes are required to optimize T cell responses to foreign antigens and to prevent autoimmune reactions against self-antigens. The affinities of T cell antigen receptors (TCRs) for self-peptides bound to the major histocompatibility complex (pMHC) determine the fate of T cells during selection in the thymus. Negative selection eliminates T cells that strongly interact with self-pMHC molecules, which could otherwise result in autoimmunity, whereas pos- itive selection promotes the survival and maturation of T cells with rela- tively low affinity for self-pMHC molecules, favoring the development of cells with greater self-reactivity within a permissible range constrained by the negative selection threshold (1). The recognition of pMHCs by the TCR stimulates multiple intracellular signaling events that are modulated quantitatively and qualitatively on the basis of the strength of TCR-pMHC interaction to selectively trigger selection processes and to promote ge- netic programs required for T cell maturation and egress from the thymus. Whereas the signaling pathways activated by TCR engagement have been identified, it remains unclear how the intensity of TCR stimulation precisely 1Section on Cellular and Developmental Biology, Eunice Kennedy Shriver Na- tional Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, Bethesda, MD 20892, USA. 2Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan, Toulouse F-31300, France. 3Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, U1043, Toulouse F-31300, France. 4Centre National de la Recherche Scientifique, U5282, Toulouse F-31300, France. 5Université de Toulouse, Université Paul Sabatier, Toulouse F-31300, France. 6Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, Université de Toulouse, CNRS, UPS, Toulouse F-31077, France. These authors contributed equally to this work. Corresponding author. Email : renaud. lesourne@inserm. fr regulates the activation of downstream pathways such that two distinct out- comes [cell death (negative selection) or survival and continued maturation (positive selection)] can be elicited by engaging pMHC. We and others identified the previously uncharacterized protein Themis1 as being required for the positive selection and maturation of T cells in the thymus (26). Themis1 lacks any discernable catalytic domain, but it contains two previously uncharacterized cysteine-based globular domains (named CABIT) of unknown structure and function (3). It also contains a bipartite nuclear localization signal (KR-X12-KRRPR) and a C-terminal proline-rich region (PRR) that matches a class II Src homology 3 (SH3) recognition motif. Themis1 is constitutively associated with the cy- tosolic adaptor protein Grb2 (growth factor receptorbound protein 2) (57) and is recruited to the transmembrane adaptor protein LAT (linker of acti- vated T cells) after TCR engagement, where it becomes rapidly phospho- rylated by the protein tyrosine kinase Lck (8, 9). Although Themis1 was identified as a component of the TCR signalosome, initial investigations failed to pinpoint a major alteration in TCR signaling in Themis1-deficient thymocytes ; however, several experimental findings obtained from Themis1/ mice are consistent with there being reduced TCR signal strength. The cell surface abundance of the signaling sensor CD5 is reduced in CD4 CD8lo Themis1/ thymocytes (5), whereas that of CD69 is decreased in the absence of Themis1 in preselected OT-I TCR transgenic CD4 CD8 thymocytes [referred to as double-positive (DP) thy- mocytes] after stimulation through ovalbumin peptideconjugated tetramers (2). In addition, negative selection and CD4 T cell lineage commitment, which are dependent on intense or sustained TCR signals, respectively, are both impaired in Themis1/ mice (2, 5). In agreement with these studies of ro- dent thymocytes, human Themis1 enhances extracellular signalregulated 17 May 2016 Vol 9 Issue 428 ra51 1 l D o w n o a d e d f r o m h t t p : / / s t k e i . s c e n c e m a g . o r g / o n J u y l 1 5 , 2 0 1 8 R E S E A R C H A R T I C L E kinase (ERK) phosphorylation and nuclear factor of activated T cells (NFAT)activator protein 1 (AP1) luciferase promoter activity in Jurkat cells stimulated with TCR cross-linking antibodies (8). Further biochem- ical investigation to identify the molecular function of Themis1 has shown that it interacts with two other positive effectors of TCR signaling, phos- pholipase C-g1 (PLC-g1) (2) and Vav1, a guanine nucleotide exchange factor (GEF) Rho family guanosine triphosphatases (GTPases) (9), in thy- mocytes, but the importance of these interactions for TCR signaling and T cell development remains obscure. In contrast to these initial studies, one recent report proposed that Themis1 sets the threshold between positive and negative selection by acting as an attenuator of TCR signaling during positive selection medi- ated by low-affinity antigens (10). It was shown in that study that the loss of Themis1 results in enhanced calcium (Ca2 ) flux and increased phos- phorylation of Lck, LAT, and ERK in preselected DP thymocytes that are stimulated by low-affinity pMHCs. Themis1 binds to the inhibitory pro- tein tyrosine phosphatases SHP-1 (Src homology 2 domaincontaining phosphatase-1) and SHP-2 in thymocytes (10) and Jurkat cells (11). The tyrosine phosphorylation of SHP-1 and its recruitment to LAT are re- duced in Themis1/ thymocytes, which suggests that Themis1 inhibits ear- ly signaling events by controlling the activity and localization of SHP-1. On the basis of these results, it was proposed that Themis1 functions to digitalize TCR signaling to prevent the generation of strong signals that induce negative selection in response to relatively low-affinity TCR self-pMHC interactions. However, this model is inconsistent with results obtained in vivo that indicate that negative selection and CD4 T cell lineage commitment are impaired in Themis1/ mice. In addition, the proposed model is not fully supported by previous studies that showed that SHP-1 is not necessary for normal T cell development (1215). To gain further insight into the function of Themis1 during thymic selection, we analyzed the effect of Themis1 deficiency or overexpression on TCR signals elicited in vivo by positively selecting ligand interactions. Through experiments with TCR signaling reporter mice, we showed that Themis1 acted mostly as a positive regulator of TCR signaling during pos- itive selection. Molecular analysis by quantitative mass spectrometry (MS) revealed that Themis1 interacted preferentially with Grb2, SHP-1, and Vav1, but to a lesser extent with SHP-2 and PLC-g1. Analysis of TCR signaling events in cells treated with either low or high concentrations of TCR cross- linking complexes demonstrated that Themis1 promoted the phosphoryl- ation and activity of Vav1 independently of the strength of TCR stimulation. Further biochemical analysis revealed that the reduced phosphorylation and activation of Vav1 in Themis1/ thymocytes was due in part to the in- creased turnover of Grb2 in these cells, demonstrating a requirement for Themis1 in the maintenance of steady-state Grb2 protein abundance in thy- mocytes. Finally, we showed that positive selection was impaired in Grb2 / mice and was rescued by the transgenic expression of Themis1, suggesting that the reduction in Grb2 abundance accounted for part of the develop- mental defect observed in Themis1/ mice. RESULTS Signaling reporter mice identify a positive role for Themis1 in TCR signaling in vivo Themis1 is a component of the TCR signaling machinery, but its precise function, and particularly whether it positively or negatively regulates TCR signaling responses, remains unclear. Some in vitro studies have proposed that Themis1 acts as a negative regulator of TCR signaling (10, 11) ; however, this is inconsistent with the developmental defect ob- served in Themis1/ mice, which supports a positive role for Themis1 in TCR signaling (2, 3, 5, 9). To analyze the effect of Themis1 on the TCR signaling response to endogenous selecting ligands in developing thy- mocytes, we took advantage of the previously reported Nur77green fluorescent protein (GFP) transgenic mouse model in which GFP abun- dance correlates with the intensity of TCR signals transmitted during pos- itive or negative selection (16). We crossed Themis1/ mice with Nur77-GFP transgenic mice expressing a fixed MHC class IIrestricted ab-TCR trans- gene (AND). GFP amounts were analyzed by flow cytometry ex vivo in preselection (TCRloCD69lo) CD4 and CD8 DP thymocytes, in postselection DP thymocytes at early (TCRloCD69hi) or late (TCRhiCD69hi) stages of positive selection, and in postselection CD4 single-positive (SP) thymocytes. As previously reported for mice on the wild-type C57BL/6 background, GFP abundance was low in preselection DP thymocytes and was increased in postselection DP thymocytes (Fig. 1A). GFP abundance was similar in preselection Themis1 / and Themis1/ DP thymocytes, but was reduced in Themis1/ DP thymocytes undergoing positive selection (Fig. 1A) and in Themis1/ CD4 SP thymocytes (fig. S1A). To further analyze the influence of Themis1 on TCR signaling, we next crossed AND-Nur77-GFP trans- genic mice with mice that overexpress Themis1 (Themis1-tg). In these mice, Themis1 abundance was increased by about threefold in DP thymo- cytes compared to that in DP thymocytes in nontransgenic wild-type con- trols (fig. S1B). GFP amounts were comparable in preselection Themis1 / and Themis1-tg DP thymocytes, but were increased in postselection Themis1-tg DP thymocytes (Fig. 1A) and in CD4 SP thymocytes (fig. S1A). Together, these data suggest that Themis1 has a positive role in the regulation of TCR signaling during positive selection. A previous report proposed that Themis1 acts as an attenuator of TCR signaling, such that in the absence of Themis1, positive selection signals, which promote the development of DP thymocytes to the SP stage, are converted to negative selection signals, leading to thymocyte apoptosis (10). On the basis of this model, the reduced amount of GFP that we observed in Themis1/ mice might reflect the absence of strongly signaled thymocytes (which would have been eliminated by apoptosis) rather than an intrinsic decrease in TCR signal strength that occurred because of a positive function of Themis1 in TCR signaling. To exclude this possibility, we analyzed the effect of Themis1 deficiency on GFP pro- tein abundance in transgenic mice that overexpressed the prosurvival factor B cell lymphoma 2 (Bcl2-tg), which blocks negative selection (17, 18). We observed that DP thymocytes from Bcl2-tg mice had greater amounts of GFP at early and late stages of positive selection than did equivalent cell populations from nonBcl2-tg mice (Fig. 1A), which was suggestive of the overall rescue of thymocyte clones that had received a strong signal through the TCR. However, we found that the amount of GFP in Bcl2-tgThemis1/ DP thymocytes was reduced compared to that in Bcl2-tgThemis1 / DP thymocytes (Fig. 1A). Together, these results suggest that the reduced TCR signaling observed in Themis1/ thymocytes was not caused by the elimination of thymocytes that exhibited enhanced TCR signaling, but rather reflected an intrinsic defect in TCR signaling in DP thymocytes. We previously showed that the transgenic expression of Bcl2 in Themis1/ mice restores the development of CD8 SP thymocytes, but not CD4 SP thymocytes, which also suggests that the block in CD4 T cell development in Themis1/ mice did not result from an enhanced susceptibility of CD4 SP thymocytes to negative selection (5). It was proposed that disruption of Bim (a gene essential for negative selection) rescues CD4 SP development in Themis1/ mice ; however, a detailed analysis of thymocyte maturation and mature T cells was not performed in that study (10). To examine in greater detail whether the disruption of Bim could rescue SP thymocyte maturation in Themis1/ mice, we re- capitulated these experiments and analyzed the proportions of mature SP 17 May 2016 Vol 9 Issue 428 ra51 2 l D o w n o a d e d f r o m h t t p : / / s t k e i . s c e n c e m a g . o r g / o n J u y l 1 5 , 2 0 1 8 R E S E A R C H A R T I C L E A DP 4 D C 1 1 V CD8 CD69 101 100 GFP 102 103 104 Preselection DP V 11loCD69lo Early postselection DP Late postselection DP V 11loCD69hi V 11intCD69hi 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 Th / Th/ Th / Th-tg Th / Th/ Bcl2-tg GFP B Thymus Thymus (CD4 SP) Spleen Bim / Bim/ Themis1 / 11 82 Themis1/ Themis1 / 2. 5 93 18 Themis1/ 66 11 74 4 2 9 8 8 36 19 30 15 4 18 6 19 8 15 14 4 D C 4 2 D C CD8 TCR 19 4 D C CD8 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 25 20 15 10 5 0 P S 4 D C % ) 2 0 1 x ( l P D / o 4 2 D C P S 4 D C s l l e c T 4 D C % Bim / Bim/ Th / Th/Th / Th/ 12 10 8 6 4 2 0 5 4 3 2 1 0 P S 8 D C % ) 2 0 1 x ( l P D / o 4 2 D C P S 8 D C s l l e c T 8 D C % 20 15 10 5 0 Fig. 1. Themis1 enhances TCR signaling during thymic positive selection. (A) Contour plots represent the gating strategy to analyze GFP expression in preselection (TCRloCD69lo ; red line in the GFP plot) and postselection (TCRloCD69hi or TCRintCD69hi ; blue and green lines in the GFP plot, re- spectively) DP thymocytes from AND-Nur77-GFP transgenic mice. The abundance of the AND TCR was analyzed with anti-Va11 antibodies. His- tograms represent GFP expression in pre- and postselection DP thymo- cytes from AND-Nur77-GFP transgenic mice that either do or do not express the Bcl2 transgene (Bcl2-tg). Thymocytes from Themis1 / mice (Th / ) were compared to those from Themis1/ mice (Th/) or to Themis1 transgenic mice (Th-tg). Data are from one experiment and are repre- sentative of four independent experiments. (B) Left : Flow cytometric anal- ysis of T cell development in Themis1 / and Themis1/ mice that are either sufficient (Bim / ) or deficient (Bim/) in the proapoptotic factor Bim. Contour plots represent either CD4 versus CD8 staining profiles of thymocytes (top) and splenocytes (bottom) or CD24 versus TCR staining profiles of CD4 SP thymocytes (middle). Numbers indicate the percent- age of cells in the gated population. Right : Bar graphs present the mean percentages of CD4 and CD8 SP thymocytes (top), the mean ratio of mature CD24lo CD4 SP or CD24lo CD8 SP thymocytes to DP thymocytes (middle), and the mean percentages of splenic CD4 and CD8 T cells (bottom). Data are means SEM of three independent experiments con- taining one mouse of each genotype. P < 0. 05, P < 0. 01 by two-tailed, unpaired t test. 17 May 2016 Vol 9 Issue 428 ra51 3 l D o w n o a d e d f r o m h t t p : / / s t k e i . s c e n c e m a g . o r g / o n J u y l 1 5 , 2 0 1 8 R E S E A R C H A R T I C L E thymocytes (CD24lo) and peripheral T cells. We observed that, similar to the effect of Bcl2 overexpression, Bim disruption restored CD8 SP thymocyte development in Themis1/ mice (Fig. 1B). However, the per- centages and numbers of CD4 SP thymocytes and CD4 splenic T cells remained reduced in Themis1/Bim/ mice compared to those in Themis1 / Bim/ control mice (Fig. 1B and fig. S1C). The percentages of CD24lo CD4 SP thymocytes were also markedly reduced in Themis1/ Bim/ mice compared to those in Themis1 / Bim/ mice (Fig. 1B). These data suggest that the disruption of Bim does not rescue the block in CD4 SP T cell development in Themis1/ mice, and support the notion that Themis1 acts as a positive regulator of TCR signaling that promotes pos- itive selection. Quantitative proteomic analysis identifies SHP-1 and Vav1 as predominant interacting partners of Themis1 with effector functions in thymocytes Previous studies reported that Themis1 interacts with several positive (PLC-g1, Grb2, SHP-2, and Vav1) and negative (SHP-1) regulators of TCR signaling, but the relative importance of these interactions remains unclear because some of these binding partners were identified in in- dependent studies or within distinct cellular models through approaches that do not always enable global comparisons of protein-protein inter- actions. To determine which of these signaling proteins preferentially in- teracted with Themis1 during T cell development, and to investigate the mechanism by which Themis1 positively regulated TCR signaling, we performed an MS-based analysis of Themis1-containing signaling com- plexes in thymocytes. Themis1 was immunoprecipitated from wild-type or Themis1/ thymocytes that were untreated or treated with pervanadate. Protein complexes were eluted with antigenic peptides, and the compo- nents of the different purified complexes were characterized by nanoflow liquid chromatography combined with tandem MS. To estimate the rela- tive abundances of the different interacting partners in the immunopreci- pitated samples, we used the intensity-based absolute quantification (iBAQ) metric, which corresponds to the sum of all of the peptide inten- sities divided by the number of theoretically observable tryptic peptides of a protein (for further details, see Materials and Methods). On the basis of our selection criteria (see Materials and Methods), we identified 42 potential interacting partners of Themis1 in thymocytes (table S1). We decided to focus our analysis on the most abundant inter- actors (mean iBAQ > 20 105), which represented more likely direct binding partners of Themis1 or proteins that had a functional link with Themis1 (Fig. 2). Under these conditions, we found that Themis1 inter- acted mainly with distinct proteins in resting thymocytes (Fig. 2, A and B). Among these proteins was the cytosolic adaptor Grb2, the tyrosine phos- phatase SHP-1 (also known as PTN6), and the Rho family GEF Vav1, which were previously reported to interact with Themis1 (5, 9, 10). In addition, we found that Themis1 constitutively interacted with the cytosolic adaptor protein GADS (also known as Grap2) and Lis1, a protein that has no re- ported function in T cells. Quantitative analysis of these interactions (with normalized iBAQ intensities) indicated that Grb2 was by far the most prom- inent binding partner of Themis1 in thymocytes (iBAQ 980 105), whereas the interactions between Themis1 and SHP-1 (iBAQ 30 105), Lis1 (iBAQ 22 105), Grap2 (iBAQ 15 105), and Vav1 (iBAQ 10 105) were quantitatively similar (Fig. 2A). Treatment of thymocytes with the phosphatase inhibitor pervanadate increased either moderately (by about 2-fold for Grb2 and Lis1) or strongly (by about 10-fold for SHP-1, Vav1, and Grap2) the extent of the associations between these proteins and Themis1 (Fig. 2A). Treatment of thymocytes with pervanadate also induced the as- sociation of Themis1 with additional proteins, including the transmembrane adaptor proteins LATand SIT1 (SHP-2interacting transmembrane adaptor A B Proteins UniProt designations Peptide sequences Sequence coverage (%) iBAQ resting (x105) iBAQ stimulated (x105) Enrichment ratio (m. i. WT/ m. i. KO) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 GRB2 PTN6 GRAP2 VAV1 LIS1 GRAP LAT SIT1 LCP2 CBL PTN11 19 43 21 37 19 9 6 6 17 17 18 81. 1 78 80. 7 53 57. 3 41. 9 32. 6 40 35. 5 26. 8 38 980 30 15 10 22 2325 378 244 97 60 58 57 49 42 35 26 158 7. 4 10. 9 7. 1 9. 1 72. 4 80 23. 6 10. 6 6. 9 5. 1 GRB2 GRAP2 GRAP LAT SIT1 LCP2 THEMIS1 PTN6 VAV1 CBL PTN11 LIS1 Adaptors Phosphatase E3 ligase Effectors GEF Miscellaneous Unknown function in T cell signaling Fig. 2. Mass spectrometric analysis of the Themis1 interactome in thymo- cytes. (A) Table representing the main interactors of Themis1 in resting (unstimulated) thymocytes and in pervanadate-treated (stimulated) thy- mocytes from C57BL/6 mice. Proteins were filtered and sorted on the basis of the enrichment ratio (m. i. , mean intensity) and the mean iBAQ metric as described in Materials and Methods. The complete list of proteins identified by proteomic analysis of Themis1-immunopurified samples is provided in table S1. WT, wild type ; KO, knockout. (B) Schematic of those proteins that preferentially interact with Themis1 in stimulated thymocytes. Layouts indi- cate the classification of these proteins according to their signaling function (purple layout : adaptor proteins ; green layout : effector proteins ; gray layout : unknown function in T cell signaling). Keys indicate protein classification according to molecular function (phosphatase, GEF, and E3 ubiquitin ligase). Data are representative of three independent experiments. protein), the cytosolic adaptors Grap (GRB2-related adaptor protein) and SLP-76 (SH2 domaincontaining leukocyte protein of 76 kD ; also known as Lcp2), the E3 ubiquitin ligase c-Cbl, and the tyrosine phosphatase SHP-2 (also known as PTN11). Analysis of the iBAQ values indicated that the 17 May 2016 Vol 9 Issue 428 ra51 4 l D o w n o a d e d f r o m h t t p : / / s t k e i . s c e n c e m a g . o r g / o n J u y l 1 5 , 2 0 1 8 R E S E A R C H A R T I C L E interaction between Themis1 and SHP-2 (iBAQ 26 105) was not as pre- ponderant as those between Themis1 and other effector proteins, such as SHP-1 (iBAQ 378 105) and Vav1 (iBAQ 97 105). Note that PLC-g1, which was previously reported to interact with Themis1 in thy- mocytes, was detected in our current analysis with a statistically significant enrichment ratio in immunoprecipitated samples, but with only a low inten- sity value (iBAQ 4 105), and thus was not selected in the list of major Themis1-interacting proteins (table S1). Themis1 enhances Vav1 activity in thymocytes Our analysis of the Themis1 interactome identified SHP-1 and Vav1 as the two predominant effector proteins that bound to Themis1 in thymocytes. Vav1 is a known positive regulator of TCR signaling that promotes gua- nosine diphosphate (GDP) to guanosine triphosphate (GTP) exchange on Rho family GTPase proteins (that is, it has GEF activity) and may also serve as an adaptor protein to stabilize the recruitment of PLC-g1 to the transmembrane adaptor protein LAT after TCR engagement (19). Knock-in mice expressing a GEF-deficient form of Vav1 exhibit a block in T cell de- velopment at the DP to SP transition, which is similar to the phenotype of Themis1/ mice (20). We therefore suspected that the impaired T cell development observed in Themis1/ mice might result, in part, from a defect in Vav1 GEF activity. To first confirm the results obtained by our MS analysis, we used Western blotting to analyze the interaction between Themis1 and Vav1 in thymocytes stimulated with TCR cross-linking antibody complexes. Although Themis1 was coimmunoprecipitated with Vav1 from resting cells, the extent of the interaction between Themis1 and Vav1 was en- hanced after TCR cross-linking (fig. S2A). Transfection of human em- bryonic kidney (HEK) 293T cells with complementary DNA encoding tagged versions of Themis1 and Vav1 showed that Vav1 coimmunopre- cipitated with Themis1 only when cells were treated with pervanadate (fig. S2B). The coimmunoprecipitation of Vav1 with Themis1 was only mildly reduced when the PRR of Themis1, which is required for its inter- action with Grb2, was deleted, indicating that Grb2 was not required for the interaction between Vav1 and Themis1 (fig. S2B). We previously showed that the phosphorylation of Vav1 is impaired in Themis1/ CD4 SP thymocytes (9) ; however, two studies suggested that Themis1 acts primarily as an attenuator of TCR signaling when thymo- cytes are stimulated by low-affinity antigens (10, 11). The phosphorylation of Vav1 and its downstream substrates was not examined in these studies. To recapitulate with cross-linking antibodies what was previously reported with antigenic peptides, we incubated thymocytes with either low (3 mg/ml) or high (30 mg/ml) concentrations of preformed complexes of anti-CD3 and anti-CD4 antibodies to induce either weak or strong TCR stimulation. Con- sistent with previous reports that used antigenic peptides, we found that ERK phosphorylation was increased in Themis1/ thymocytes under weak stimulatory conditions, but was comparable to that in Themis1 / controls when strong stimuli were used to induce TCR signaling (Fig. 3A, top). The phosphorylation of SHP-1 was reduced in Themis1/ thymocytes whether low or high concentrations of antibodies were used. The phospho- rylation of Vav1 was decreased in Themis1/ thymocytes when either weak or strong stimulation occurred (Fig. 3A). In comparison, the phosphoryl- ation of Lck, ZAP-70 (z chainassociated protein kinase of 70 kD), LAT, and SLP-76, a cytosolic adaptor that associates with Vav1 (21), was similar in Themis1 / and Themis1/ thymocytes regardless of the strength of stimulus (Fig. 3A and fig. S3). To demonstrate that Themis1 enhanced Vav1 activation during positive selection, we next analyzed the phosphorylation of Vav1 by intracyto- plasmic staining in pre- and postselection DP thymocytes from Themis1/ AND-TCR transgenic mice. We observed that postselection wild-type DP thymocytes had increased amounts of phosphorylated Vav1 compared to those of preselection wild-type DP thymocytes (Fig. 3B). Confirming the data obtained from experiments with TCR cross-linking antibodies, we found that Vav1 was less phosphorylated in Themis1/ postselection DP thymocytes than in Themis1 / postselection DP thymocytes (Fig. 3B). The phosphorylation of Tyr174 and Tyr160 of Vav1 relieves its catalytic Dbl homology domain from its autoinhibitory conformation and causes Vav1 to promote GDP to GTP exchange on the small GTPase Rac1 (22). The GTP-bound form of Rac1 then stimulates signaling that leads to the activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) p38 (23, 24). To investigate the effect of Themis1 on signaling events downstream of Vav1, we analyzed the extent of phosphorylation of p38 and the abundance of Rac1-GTP generated after TCR cross-linking. The amount of phos- phorylated p38 was reduced in Themis1/ thymocytes compared to that in Themis1 / thymocytes when either low or high concentrations of anti- body complexes were used (Fig. 3A). The amount of Rac1-GTP generated was also reduced in Themis1/ thymocytes compared to that in Themis1 / control thymocytes when cells were stimulated with a high concentration of antibody complexes (Fig. 3C). Together, these data suggest that Themis1 enhances Vav1 activity in thymocytes. The abundance of Grb2 protein is reduced in Themis1/ thymocytes We next investigated the mechanism by which Themis1 stimulates Vav1 activity in thymocytes. TCR cross-linking stimulates the translocation of Vav1 to the submembranous area and results in its recruitment to the transmembrane adaptor protein LAT where it becomes phosphorylated and activated by ZAP-70 (25). Because Themis1 interacts with both Vav1 and LAT after TCR engagement, we examined the possibility that Themis1 was important to enhance the recruitment of Vav1 to LAT. Similar amounts of Vav1 were coimmunoprecipitated with LAT from Themis1/ and Themis1 / thymocytes at the earliest time point of stimulation with cross-linking antibodies (Fig. 4A) ; however, the recruitment of Vav1 to LAT was impaired in Themis1/ thymocytes when the cells were stim- ulated for longer periods of time (Fig. 4A). In comparison, the recruitment to LATof the enzyme PLC-g1, which poorly interacts with Themis1 in thy- mocytes, appeared to be similar in Themis1 / and Themis1/ thymocytes (Fig. 4A). A possible explanation for this observation is that Themis1 directly interacts with Vav1 after its recruitment to LAT and that it contributes to the enrichment of Vav1 proteins in LAT signaling complexes. Alternatively, Themis1 might be required to stabilize the interaction between Vav1 and cytosolic adaptors, such as Grb2 and SLP-76, which mediate the binding of Vav1 to LAT (2631). Therefore, we examined whether Themis1 regu- lated the interaction between Vav1 and these two adaptor proteins. Western blotting analysis showed that the amount of Grb2 that coimmunoprecipi- tated with Vav1 was decreased in Themis1/ thymocytes compared to that in Themis1 / cells, regardless of whether the cells were stimulated with preformed antibody complexes (Fig. 4B). Similar amounts of phos- phorylated SLP-76 were coimmunoprecipitated with Vav1 under the iden- tical stimulation conditions, supporting a selective effect of Themis1 on the formation of Grb2-Vav1 signaling complexes (Fig. 4B). Furthermore, analysis of Themis1/ thymocyte extracts revealed that the total cellular abundance of Grb2 was reduced relative to that in Themis1 / thymocytes (Fig. 4B, right panel). Quantification of Grb2 protein abundance in whole- cell lysates revealed that it was reduced by about twofold in Themis1/ thymocytes and was comparable to the amount of Grb2 protein in Grb2 / thymocytes (Fig. 4C). Further analysis by flow cytometry showed that Grb2 abundance was reduced similarly in DP and SP thymocytes from Themis1/ mice (Fig. 4D), suggesting that the reduction in Grb2 abundance in 17 May 2016 Vol 9 Issue 428 ra51 5 l D o w n o a d e d f r o m h t t p : / / s t k e i . s c e n c e m a g . o r g / o n J u y l 1 5 , 2 0 1 8 R E S E A R C H A R T I C L E A Time : pERK (T202/Y204) pSHP-1 (Y564) pVav1 (Y174) pSLP76 (Y126) pP38 (T180/Y182) GAPDH B -CD3 -CD4 (low concentration) -CD3 -CD4 (high concentration) Themis1 / Themis1/ Themis1 / Themis1/ -CD3 -CD4 (low concentration) -CD3 -CD4 (high concentration) / / * * * * * * * * * * * * / ) 4 0 2 Y 2 0 2 T ( K R E p ) 4 6 5 Y ( 1 - P H S p ) 4 7 1 Y ( 1 v a V p ) 6 2 1 Y ( 6 P L S p / ) 2 8 1 Y 0 8 1 T ( 8 3 P p AND TCR C Preselection DP (CD4 CD8 CD5lo) Postselection DP (CD4 CD8 CD5hi) Iso. ctl Th / Th/ -CD3 -CD4 : Pull-down : PAK1-PBD Lysate Time (min. ) Time (min. ) Themis1 / Themis1/ / / P T G - 1 c a R 10 1 10 0 10 2 pVav1 (Y174) 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 IB : Rac1 Time (min. ) Fig. 3. Themis1 enhances Vav1 activity in thymocytes. (A) Left : Thymocytes from Themis1 / and Themis1/ mice were stimulated with low (3 mg/ml) or high (30 mg/ml) concentrations of preformed anti-CD3 and anti-CD4 antibody complexes for the indicated times. Total cytoplasmic extracts of the cells were then analyzed by Western blotting with antibodies against phospho- rylated forms of ERK, SHP-1, Vav1, SLP-76, and p38 MAPK. Right : Graphs show the relative abundances of the indicated phosphorylated proteins as determined by calculating the ratios of the intensities of the bands correspond- ing to the phosphorylated proteins to those corresponding to glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), the loading control. The y axes represent means SD of the relative values calculated after normalization to the highest value in the low-dose condition. Data are from four indepen- dent experiments each including one mouse of the indicated genotype. P < 0. 05, P < 0. 01 by two-tailed, unpaired t test. (B) Analysis of Vav1 phosphorylation by intracytoplasmic staining of thymocytes from AND-TCR transgenic mice that were either sufficient (Th / ) or deficient (Th/) in Themis1. Histograms represent Vav1 phosphorylation on Tyr174 (Y174) in gated preselection (CD5lo) and postselection (CD5hi) DP thymocytes. Data are representative of three independent experiments each including one mouse of the indicated genotype. (C) Left : Thymocytes from Themis1 / and Themis1/ mice were stimulated with high-dose anti-CD3 (a-CD3) and anti-CD4 (a-CD4) antibodies (30 mg/ml) for the indicated times. Cells were then lysed and subjected to Rac1-GTP pull-downs with a GST-PAK1- RBD fusion protein. Pull-downs and total cytoplasmic lysates were then ana- lyzed by Western blotting (IB) with an anti-Rac1 antibody. Western blots are representative of three independent experiments each including one mouse of the indicated genotype. Right : Graphs show the ratios of Rac1-GTP to total Rac1. Data are representative of three independent experiments. Themis1/ thymocytes relative to that in Themis1 / thymocytes was not a result of reduced numbers of SP thymocytes in Themis1/ mice. The amounts of Grb2 that were coimmunoprecipitated with other known Grb2 binding partners, such as c-Cbl and Sos1, were also reduced in Themis1/ thymocytes compared to those in wild-type controls (fig. S4). Moreover, and similar to what we previously observed for Vav1, the recruitment of Grb2 to LAT was normal at early time points after TCR stimulation but was progressively impaired in Themis1/ thymocytes at later time points (Fig. 4A). To test whether the partial reduction in Grb2 abundance in Themis1/ thymocytes accounted for the impaired activity of Vav1 in 17 May 2016 Vol 9 Issue 428 ra51 6 l D o w n o a d e d f r o m h t t p : / / s t k e i . s c e n c e m a g . o r g / o n J u y l 1 5 , 2 0 1 8 R E S E A R C H A R T I C L E A IP : LAT B IP : Vav1 Themis1 / Themis1/ Themis1 / Themis1/ -CD3 -CD4 : 0 0 -CD3 -CD4 : 0 0 TCE / / IB : PLC 1 IB : Vav1 IB : Grb2 IB : LAT C TCE : Th / Th/ Gr / IB : Vav1 IB : Grb2 IB : pSLP76 (pY126) D Th / Th/ Gr / Th / Th/ Gr / e c n a d n u b a n e i t o r p 2 b r G DP CD4 SP CD8 SP Grb2 IB : Grb2 IB : GAPDH E TCE : -CD4 : -CD3 IB : pVav1 (Y174) IB : GAPDH -CD3 -CD4 (low concentration) -CD3 -CD4 (high concentration) Grb2 / Grb2 / Grb2 / Grb2 / -CD3 -CD4 (low concentration) -CD3 -CD4 (high concentration) Gr / Gr / ) 4 7 1 Y ( 1 v a V P - Time (min. ) Time (min. ) Fig. 4. Grb2 protein abundance is reduced in Themis1/ thymocytes. (A and B) Thymocytes from Themis1 / and Themis1/ mice were stimulated with premixed high-dose anti-CD3 (a-CD3) and anti-CD4 (a-CD4) antibodies (30 mg/ml) for the indicated times. Samples were then subjected to immu- noprecipitation (IP) with antibodies specific for LAT (A) or Vav1 (B) and then analyzed by Western blotting with antibodies specific for the indi- cated proteins. Western blots are from one experiment and are repre- sentative of three independent experiments. (B) Total cytoplasmic extracts (TCE) from each sample were analyzed by Western blotting with anti- bodies against Vav1 or Grb2. (C) Left : Total cytoplasmic extracts of thy- mocytes from Themis1 / (Th / ), Themis1/ (Th/), and Grb2 / (Gr /) mice were analyzed by Western blotting with anti-Grb2 and anti-GAPDH anti- bodies. Right : Densitometric analysis of the ratio of Grb2 band intensities to GADPH band intensities normalized to the ratio in WT control thymocytes, which was set at 1. Data are means SD of four independent experiments each including one mouse of the indicated genotype. P < 0. 01 by two- tailed, unpaired t test. (D) Flow cytometric analysis of Grb2 abundance in DP, CD4 SP, and CD8 SP thymocyte subsets from Themis1 / (Th / ), Themis1/ (Th/), and Grb2 / (Gr /) mice. Data are representative of three independent experiments. (E) Left : Thymocytes from Grb2 / and Grb2 / mice were stimulated with low (3 mg/ml) or high (30 mg/ml) concen- trations of preformed anti-CD3 and anti-CD4 antibody complexes for the indicated times. Total cytoplasmic extracts of the cells were then analyzed by Western blotting with antibody against pVav1. Right : Graphs show the relative abundance of pVav1, as determined from a ratio of the intensity of the pVav1 bands to those of the bands corresponding to the GAPDH load- ing control. Western blots and densitometry are from a single experiment and are representative of three independent experiments. these cells, we compared the extent of Vav1 phosphorylation in Grb2 / and Grb2 / thymocytes stimulated with low or high concentrations of preformed antibody complexes. Supporting this idea, Western blotting analysis showed that Vav1 phosphorylation was also reduced in Grb2 / thymocytes under both stimulatory conditions (Fig. 4E). Themis1/ thymocytes exhibit increased turnover of Grb2 protein To investigate the mechanisms leading to the reduction in Grb2 protein abundance in Themis1/ thymocytes, we first quantified Grb2 mRNA by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis. Grb2 mRNA 17 May 2016 Vol 9 Issue 428 ra51 7 l D o w n o a d e d f r o m h t t p : / / s t k e i . s c e n c e m a g . o r g / o n J u y l 1 5 , 2 0 1 8 R E S E A R C H A R T I C L E amounts were similar in Themis1 / and Themis1/ thymocytes, indi- cating that the reduction in Grb2 protein abundance in Themis1/ thy- mocytes was likely a result of posttranscriptional effects (Fig. 5A). The direct interaction between Themis1 and Grb2 suggested the possibility that Themis1 might regulate Grb2 protein stability and turnover in thy- mocytes. To investigate this possibility, we incubated thymocytes from Themis1 / or Themis1/ mice with cycloheximide for 18 hours to in- terrupt protein synthesis and then measured Grb2 protein abundance by A Themis1 / Themis1/ Grb2 / Medium Cycloheximide B I F M 2 b r G e v i t A N R m 2 b r G e v i t l a e R C e e c c n n a a d d n n u u b b a a I F M 2 b r G e v i t l a e R Themis1 / Themis1/ D l a e R Th / Th/ IP Grb2 PV / / / / Themis1 : IB : ubiquitin MG132 IB : Grb2 102 kD 52 kD 25 kD Fig. 5. Grb2 protein turnover is increased in Themis1/ thymocytes. (A) RT-PCR analysis of Grb2 mRNA abundance in total thymocytes from Themis1 / , Themis1/, and Grb2 / mice. Data are means SD of three independent experiments each including one mouse of the indicated genotype. (B) Thymocytes from Themis1 / (Th / ) and Themis1/ (Th/) mice were left untreated (black bars) or were treated (white bars) for 16 to 18 hours with cycloheximide (10 mg/ml). Grb2 protein abundance was then analyzed by flow cytometry after intracytoplasmic staining of the cells with anti-Grb2 antibodies. Bar graphs show relative mean fluorescence intensities (MFIs) of Grb2 in treated cells as a percentage of the MFI of Grb2 in untreated cells, which was set at 100%. Data are means SD of three mice of each genotype. (C) Thymocytes from Themis1 / (black bars) and Themis1/ mice (white bars) were left untreated or were treated with 1 mM MG132 for 16 to 18 hours. Grb2 protein abundance was analyzed by flow cytometry after intracytoplasmic staining of cells with anti-Grb2 antibodies. Bar graphs show the relative MFIs of Grb2 in treated cells as a percentage of the MFI of Grb2 in Themis1 / thymocytes, which was set at 100%. Data are means SD of three independent experiments each including one mouse of the indicated genotype. (D) Thymocytes from Themis1 / and Themis1/ mice were preincubated with MG132 and left untreated or treated with pervana- date (PV) for 5 min at 37C. Grb2 was then immunoprecipitated from cellular extracts as described in Materials and Methods. Samples were analyzed by Western blotting with anti-ubiquitin and anti-Grb2 antibodies. Western blots are representative of three independent experiments each including one mouse of the indicated genotype. Data in (A) to (C) were analyzed by two- tailed unpaired t test. P < 0. 05, P < 0. 01. intracellular staining and flow cytometry. Whereas the amount of Grb2 protein was reduced by about 10% in cycloheximide-treated Themis1 / thymocytes, it was reduced by 30% in Themis1/ thymocytes (Fig. 5B), which suggests that Grb2 turnover was accelerated in Themis1/ thy- mocytes. Next, we treated thymocytes with MG132 for 18 hours to in- hibit proteasome-mediated protein degradation. Under these conditions, Grb2 abundance in Themis1/ thymocytes increased from 60 to 80% of that in control Themis1 / thymocytes, demonstrating that blockade of proteasome-mediated protein degradation partially restored Grb2 abun- dance in Themis1/ thymocytes (Fig. 5C). Because ubiquitylation plays a major role in targeting proteins for proteasome-mediated degradation, we evaluated the amount of ubiquitylated Grb2 in Themis1/ thymocytes by Western blotting analysis. Under conditions in which similar amounts of Grb2 were immunoprecipitated from thymocyte lysates, the amount of ubiquitylated Grb2 was increased in Themis1/ thymocytes compared to that in wild-type controls (Fig. 5D). Because c-Cbl was identified by our MS analysis as being among the preferential binding partners of Themis1 in thymocytes, we suspected that c-Cbl might regulate Grb2 degradation and that Themis1 might inhibit this process. However, we found that Grb2 protein amounts were unaffected in c-Cbl/ thymocytes (fig. S5A). In ad- dition, we found that the TCR-stimulated phosphorylation of c-Cbl was sim- ilar in Themis1 / and Themis1/ thymocytes (fig. S5B). Increased Grb2 abundance and Vav1 phosphorylation in Themis1-tg mice correlate with enhanced positive selection of CD4 SP T cells The strength of TCR signaling was increased in vivo when Themis1 was overexpressed (Themis1-tg) in AND TCR transgenic thymocytes (Fig. 1A). We therefore examined the consequences of Themis1 overexpression on Vav1 phosphorylation and Grb2 protein abundance. The extent of Vav1 phosphorylation induced by low (Fig. 6A) or high (fig. S6A) concentra- tions of preformed anti-CD3 and anti-CD4 antibody complexes was increased in thymocytes in which Themis1 was overexpressed. Western blotting and flow cytometric analyses showed that Grb2 abundance was increased by about twofold in Themis1-tg thymocytes compared to that in Themis1 / controls (Fig. 6, B and C). In addition, the extent of the inter- action between Grb2 and Vav1 and LATwas increased in Themis1-tg thy- mocytes compared to that in Themis1 / controls (fig. S6B). We next analyzed the consequences of Themis1 overexpression on T cell development. The percentages and numbers of CD4 and CD8 SP thymocytes were unaffected in Themis1-tg mice compared to that in litter- mate controls (fig. S7A). However, in Themis1-tg mice that also expressed the MHC class IIrestricted AND transgenic TCR, the percentages of CD4 SP thymocytes and Va11high thymocytes were increased relative to those in nonThemis1-tg controls (Fig. 6D). The percentage of mature CD24lo CD4 SP thymocytes was increased in ANDThemis1-tg mice, which is in- dicative of increased positive selection (Fig. 6D). In addition, the numbers of DP thymocytes, and, to a lesser extent, of CD4 SP thymocytes, were re- duced in ANDTCRThemis1-tg mice compared to those in nonThemis1-tg controls (fig. S7B), suggesting that the enhanced TCR signaling in Themis1-tg thymocytes may also partly convert positive selection signals into negative selection signals. The cell surface expression of CD5, a signaling marker that correlates with TCR signal intensity (32), was also increased on DP and SP thymocytes in ANDThemis1-tg mice (Fig. 6D), consistent with results obtained from Nur77-GFP transgenic mice (Fig. 1A). Overexpression of Themis1 enhances TCR signaling and rescues positive selection in Grb2 / mice Consistent with a previous report (33), the phosphorylation of Vav1 and p38 was reduced in TCR-stimulated Grb2 / thymocytes compared to 17 May 2016 Vol 9 Issue 428 ra51 8 l D o w n o a d e d f r o m h t t p : / / s t k e i . s c e n c e m a g . o r g / o n J u y l 1 5 , 2 0 1 8 R E S E A R C H A R T I C L E Fig. 6. Transgenic expression of Themis1 in thymocytes increases Grb2 pro- tein abundance and improves positive selection. (A) Left : Thymocytes from Themis1 WT (Themis1 / ) and Themis1 transgenic (Themis1-tg) mice were stimulated with preformed anti-CD3 and anti-CD4 antibody complexes (3 mg/ml) for the indicated times. Total cytoplasmic extracts were then ana- lyzed by Western blotting with antibodies against pVav1 and pSLP76. GAPDH was used as a loading control. Right : Graphs show the relative abundances of the phosphorylated proteins as determined from a ratio of the intensity of the bands of phosphorylated proteins to those of GAPDH. The y axes represent means SD of the relative values calculated after nor- malization to the highest value in Themis1 / thymocytes. Data are from three independent experiments each including one mouse of the indicated geno- type. P < 0. 05, P < 0. 01 by two-tailed, unpaired t test. Western blots are from one experiment and are representative of three independent experi- ments. (B) Flow cytometric analysis of Grb2 and Themis1 in total thymocytes from Themis1 transgenic mice (Tg) or littermate controls (WT). Data are rep- resentative of three independent experiments each including one mouse of the indicated genotype. (C) Left : Western blotting analysis of the relative amounts of Themis1, Grb2, and Vav1 in total thymocytes from Themis1 transgenic mice (Tg), WT littermate controls (T / ), and Grb2 / (Gr /) mice. Right : Bar graphs show the mean ratio SD of Grb2 band intensity values to Vav1 band intensity values, normalized to the ratio in T / control thymocytes, which was set at 1. Data are means SD of three mice of each genotype. P < 0. 05 by two-tailed, unpaired t test. (D) Flow cytometric anal- ysis of positive selection in AND Themis1 transgenic mice (Th-tg). Left : Contour plots represent the CD4 versus CD8 staining profiles of thymocytes from Themis1-tg mice and WT littermate controls (Th / ) expressing the AND TCR. Histograms represent AND TCR surface staining with anti-Va11 anti- bodies. Right : CD24 versus Va11 staining profiles of CD4 SP thymocytes from Themis1-tg and littermate control mice expressing the AND TCR. Numbers indicate the percentage of cells in the gated population. Right : Bar graphs show the mean percentages of Va11hi cells (top) and the mean ratio of mature CD4 SP (CD24lo) thymocytes to total DP thymocytes (bottom) in Themis1-tg and littermate control (WT) mice. Data are means SD of nine mice of each genotype. Five independent experiments were performed. P < 0. 05, P < 0. 01 by two-tailed, unpaired t test. Bottom : Cell surface stain- ing of CD5 on gated DP and CD4 SP thymocyte subsets from Themis1-tg (Tg) and littermate control (Th / ) mice. Data are representative of three indepen- dent experiments. A -CD3 -CD4 : pVav1 (Y174) pSLP76 (Y126) GAPDH Themis1 / Themis1-tg 1 v a V p ) 4 7 1 Y ( * / Tg * 6 P L S p ) 6 2 1 Y ( B Th / Tg Thymocytes Themis1 D Th / Th-tg 4 D C Grb2 32 48 CD8 DP CD5 C TCE : IB : Themis1 IB : Grb2 IB : Vav1 T / G /- Tg T / Tg i n e t o r p 2 b r G 3 2. 5 2 1. 5 1 0. 5 0 CD4 SP 47 61 76 24 62 38 V 11 4 2 D C V 11 i h g h 1 1 V f o % Th / Tg l P D / o 4 2 D C P S 4 D C CD4 SP Th / Tg l D o w n o a d e d f r o m h t t p : / / s t k e i . s c e n c e m a g . o r g / o n J u y l 1 5 , 2 0 1 8 that in Grb2 / thymocytes (Fig. 4E). Because the overexpression of Themis1 in thymocytes resulted in increased Grb2 abundance and en- hanced Vav1 phosphorylation in response to TCR engagement, we next examined whether overexpression of Themis1 could restore the amount of Grb2 and rescue the TCR signaling defects in Grb2 / thymocytes. Western blotting analysis revealed that transgene-mediated overexpres- sion of Themis1 increased the abundance of Grb2 in Grb2 / thymocytes to amounts that were comparable to those in Grb2 / thymocytes (Fig. 7A). Moreover, phosphorylation of Vav1 and p38 in response to TCR engage- ment was restored when Themis1 was overexpressed in Grb2 / thymo- cytes (Fig. 7B). Activation-induced phosphorylation of ERK was similar in Grb2 / and Grb2 / thymocytes irrespective of whether the Themis1 transgene was expressed (Fig. 7B). We next examined whether Themis1 overexpression in Grb2 / mice restored the defect in T cell development that occurs in these mice. Con- ditional deletion of Grb2 in thymocytes impairs T cell development at the DP to SP transition and induces a block in positive selection that re- sembles what is observed in Themis1/ mice (34). A previous report demonstrated that negative selection is impaired in Grb2 / mice but that positive selection is not affected (33). In that study, the authors used the MHC class Irestricted H-Y TCR transgenic and the MHC class II restricted DO. 11 TCR transgenic mice to evaluate positive selection. In contrast to these observations, we found that the proportions of CD4 SP thymocytes and Va11high thymocytes were reduced by 40 to 50% in AND-Grb2 / mice compared to that in AND-Grb2 / mice (Fig. 7C and fig. S8A). Positive selection was also impaired, although to a lesser ex- tent, in OT-2Grb2 / mice (fig. S8B). Note that Themis1 overexpression corrected the defect in positive selection caused by Grb2 haploinsufficiency as demonstrated by the restoration of normal proportions of CD4 SP and either Va11high (for AND) or Va2high (for OT-2) T cells in the thymus (Fig. 7C and fig. S8, A and B). To determine whether Themis1 overexpression restored T cell devel- opment in mice that exhibit a TCR signaling defect that is not linked to Grb2 signaling complexes, we crossed ANDThemis1-tg mice with knock-in mice that express a mutant CD3z chain protein that lacks signaling capability (z6F/6F). We previously reported that TCR signaling is attenuated in homo- zygous z6F/6F mice, which exhibit a block in positive selection at the DP stage. AND-z6Y/6F mice, which have one copy of wild-type z6Yand one copy 17 May 2016 Vol 9 Issue 428 ra51 9 B Grb2 : / TCE : Themis1-tg : / -CD4 / -CD3 / Th / Thtg Th / Thtg Grb2 / Grb2 / Th / Thtg Th / Thtg 6Y/6Y 6Y/6F l D o w n o a d e d f r o m h t t p : / / s t k e i . s c e n c e m a g . o r g / o n J u y l 1 5 , 2 0 1 8 P S 4 D C f o % i h g h 1 1 V f o % P S 4 D C f o % i h g h 1 1 V f o % R E S E A R C H A R T I C L E Grb2 / 54 67 A C 4 D C CD8 TCE : IB : Grb2 3 0 41 50 Themis1 / Themis1-tg 2 b r G e v i t l a e R e c n a d n u b a IB : GAPDH 2. 5 2 1. 5 1 0. 5 T / Ttg T / Ttg Grb2 / Grb2 / Themis1-tg : Fig. 7. Transgenic expression of Themis1 in Grb2 / mice re- stores TCR signaling and posi- tive selection. (A) Top : Total cytoplasmic extracts of thymo- cytes from Grb2 / and Grb2 / mice that either expressed ( ) or did not express () the Themis1 transgene (Themis1-tg) were analyzed by Western blotting with anti-Grb2 and anti-GAPDH antibodies. Bottom : Bar graphs show the mean ratio of Grb2 in- tensity values to GAPDH inten- sity values normalized to the ratio in WT control thymocytes, which was set at 1. Data are means SD of three indepen- dent experiments each includ- ing one mouse of the indicated genotype. (B) Thymocytes from Grb2 / and Grb2 / mice that either expressed ( ) or did not express () the Themis1 trans- gene (Themis1-tg) were stimu- lated with preformed anti-CD3 and anti-CD4 antibody com- plexes (30 mg/ml) for the indi- cated times. Total cytoplasmic extractswereanalyzed by West- ern blotting with antibodies against the indicated phospho- rylated proteins. Western blots are representative of three inde- pendent experiments. (C) Flow cytometric analysis of positive selection in AND-Grb2 / and in AND-Grb2 / mice that did or did not express the Themis1 transgene (Themis1-tg). Con- tour plots represent CD4 versus CD8 staining profiles of thymo- cytes from mice of the indicated genotypes. Histograms repre- sent the cell surface staining of the AND TCR on total thymo- cytes with anti-Va11 antibodies. Numbers indicate the percent- ages of cells in the gated populations. Right : Bar graphs show the mean percentages of CD4 SP thymocytes (top) and Va11high thymocytes (bottom) from mice of the indicated genotypes. Data are means SD of five mice (for Themis1 / and Grb2 /) or three mice (for Themis1-tg and Themis1-tg/Grb2 /). (D) Flow cytometric analysis of positive selection in AND z6Y/6Y and AND z6Y/6F mice that did or did not express the Themis1 transgene (Themis1-tg). Contour plots represent CD4 versus CD8 staining profiles of thymocytes from the in- Themis1-tg 61 Themis1 / 43 chain6Y/6Y 49 61 4 D C CD8 V 11 D pERK (T202/Y204) pP38 (T180/Y182) IB : pVav1 (Y174) IB : GAPDH Grb2 / Grb2 / Grb2 /- Themis1 / Themis1-tg 24 43 34 55 chain6Y/6F Themis1 / Themis1-tg 13 19 16 25 V 11 dicated genotypes. Histograms represent AND TCR cell surface staining with anti-Va11 antibodies on total thymocytes. Numbers indicate the percentages of cells in the gated populations. Right : Bar graphs show the mean percentages of CD4 SP thymocytes (top) and Va11high thymocytes (bottom) from mice of the indicated genotypes. Data are means SD of three independent experiments each including one mouse of the indicated genotype. Data in (A), (C), and (D) were analyzed by two-tailed, unpaired t test. P < 0. 05, P < 0. 01. of mutant z6F, displayed a less severe, but statistically significant, defect in positive selection (Fig. 7D and fig. S8C). The percentages of CD4 SP thy- mocytes and Va11high thymocytes were reduced by about 70% in AND-z6Y/6F mice compared to those in AND-z6Y/6Y control mice (Fig. 7D). Consistent with a positive effect on TCR signaling, Themis1 overexpression in AND-Themis1 transgenic z6F/6Y mice increased the percentages of CD4 SP thymocytes and 17 May 2016 Vol 9 Issue 428 ra51 10 R E S E A R C H A R T I C L E Va11high thymocytes (Fig. 7D) ; however, Themis1 overexpression did not restore positive selection in z6F/6Y mice to the same extent as that observed in z6Y/6Y mice, suggesting that the positive effect of Themis1 on TCR signaling is restricted to Grb2 signaling complexes and does not compensate for the broad signaling defects caused by impaired TCR signaling potential (Fig. 7D and fig. S8C). Themis1 hemideficiency exacerbates the defects in positive selection and TCR signaling in Grb2 / mice To further demonstrate that Themis1 enhances Grb2-mediated signaling during positive selection, we next used a reverse strategy and examined whether Themis1 hemideficiency (Themis1 /) exacerbates the defect in TCR signaling and positive selection that is observed in Grb2 / mice. The proportions of CD4 SP and Va11hi thymocytes were decreased by 40 and 20%, respectively, in AND-Themis1 / mice, an effect that was com- parable to the defects observed in AND-Grb2 / mice (Fig. 8A and fig. S8D). Note that positive selection was further impaired in AND-TCR trans- genic mice that were hemizygous ( /) for both Grb2 and Themis1, which displayed 70 and 60% decreases in the percentages of CD4 SP and Va11high thymocytes, respectively, relative to those in AND Themis1 / Grb2 / mice (Fig. 8A and fig. S8D). We also observed that the cell surface abun- dance of CD5 was reduced on Themis1 /Grb2 / thymocytes, but not on single heterozygote Themis1 / thymocytes or Grb2 / thymocytes, indi- cating that the combined reduction in Themis1 and Grb2 expression had a cooperative effect on TCR signaling and positive selection (Fig. 8B). Final- ly, hemideficiency in both Grb2 and Themis1 resulted in a further reduction in Grb2 cell surface abundance in thymocytes compared to that in thymo- cytes hemideficient in Grb2 or Themis1 alone (Fig. 8B). DISCUSSION Initial studies reporting the identification and characterization of Themis1 included extensive analyses of T cell development in Themis1-deficient mice but failed to precisely identify the molecular function of this protein (26). Despite the absence of strong biochemical evidence, it was presumed that Themis1 likely functions as a positive regulator of TCR signaling be- cause several defects in Themis1/ mice, such as a marked impairment of both positive and negative selection, were consistent with a deficiency in TCR signaling (26). It was subsequently shown that Themis1 interacts with Vav1 and that Vav1 phosphorylation is reduced in Themis1/ thymo- cytes, results that also implied a positive role for Themis1 in TCR signaling (9). Nevertheless, two reports suggested that Themis1 acts primarily, if not exclusively, as an attenuator of TCR signaling, in part through the recruit- ment of the phosphatase SHP-1 to LAT, and these studies further proposed that Themis1 is required to prevent the induction of strong TCR signals in response to engagement by low-affinity antigens (10, 11). Although this model can explain the block in positive selection in Themis1/ mice, it does not fully explain the mechanism by which Themis1 also presumably regu- lates signaling during negative selection and CD4 T cell lineage commit- ment. In addition, other studies have shown that positive selection is not converted to negative selection in the absence of SHP-1 (1215), which sug- gests that Themis1 has additional effects on TCR signaling beyond the A Grb2 / Grb2 / Themis1 / 41 Themis1 / 25 Themis1 / Themis1 / 23 13 P S 4 D C 4 D C CD8 B V 11 CD4 SP CD5 50 43 38 20 f o % i h g h 1 1 V f o % CD4 SP Grb2 Grb2 / Grb2 / Th / Gr / Th / Gr / Th / Gr / Th / Gr / Fig. 8. Themis1 hemideficiency exacerbates the defects in positive selection and TCR signaling in Grb2 / mice. (A) Flow cytometric analysis of positive selection in AND-Grb2 / and in AND-Grb2 / mice that were either WT (Themis1 / ) or heterozygous (Themis1 /) for Themis. Contour plots represent CD4 versus CD8 staining profiles of thymocytes from mice of the indicated genotypes. Histograms show the cell surface staining of the AND TCR on thymocytes with anti-Va11 antibody. Numbers indicate the percentages of cells in the gated populations. Right : Bar graphs show the mean percentages of CD4 SP thymocytes (top) and Va11high thymocytes (bottom) from mice of the indicated genotypes. Data are means SD of five mice (for Grb2 / Themis1 / and Grb2 /Themis1 / ) or three mice (for Grb2 / Themis1 / and Grb2 /Themis1 /). P < 0. 05 by two-tailed, unpaired t test. (B) Histograms show the cell surface staining of CD5 and the relative amounts of Grb2 in CD4 SP thymocytes from mice of the indicated genotypes. Data are representative of three independent experiments. regulation of SHP-1. To gain further insight into the molecu- lar function of Themis1, we performed a quantitative proteomic analysis of the inter- actome of Themis1 in thymocytes. Analysis of this interactome showed that Themis1 preferentially interacted with proteins that function in TCR signaling, supporting a pri- mary role for this protein in TCR signaling complexes. Among these proteins, we found that Themis1 interacted with several cyto- solic adaptors, such as Grb2, GADS, SLP- 76, and Grap, but that Grb2 was by far the most abundant protein in this interactome. This finding suggests that Themis1 might be preferentially recruited into TCR signal- ing complexes through Grb2. Confirming previous studies, we found that Themis1 in- teracted with the transmembrane adaptor protein LAT in pervanadate-treated thymo- cytes. Themis1 also interacts with SIT1, a transmembrane adaptor protein that inhib- its TCR signaling through the phosphatase SHP-2 (35, 36). One possibility suggested by these data is that Themis1 is recruited to both LAT and SIT and that it promotes either positive or negative signals depending on the transmembrane adaptors to which it is recruited. The quantitative analysis of the Themis1 interactome revealed that the phosphatase SHP-1, but not SHP-2, is a predominant in- teracting partner of Themis1 in thymocytes. Themis1 attenuates the phosphorylation of 17 May 2016 Vol 9 Issue 428 ra51 11 l D o w n o a d e d f r o m h t t p : / / s t k e i . s c e n c e m a g . o r g / o n J u y l 1 5 , 2 0 1 8 R E S E A R C H A R T I C L E Lck, LAT, and ERK, mostly through its role in facilitating the recruitment of SHP-1 to TCR signaling complexes (10). This effect was most clearly demonstrated when the TCR was engaged by low-affinity, but not high- affinity, antigens, conditions that mimic positive selection. Confirming these results, we found that Themis1 enhanced the phosphorylation of SHP-1 and attenuated ERK phosphorylation when low, but not high, con- centrations of TCR cross-linking antibody were used to stimulate thymo- cytes. However, we failed to detect any increased phosphorylation of more TCR-proximal signaling proteins, such as Lck, ZAP-70, and LAT, which suggests that stimulation with low concentrations of antibodies could not fully recapitulate what was previously observed when the TCR was en- gaged by tetramers bound to low-affinity antigens in the absence of costi- mulation. The molecular events that meditate ERK activation can be driven by hysteretic regulatory effects, and it is therefore assumed that mi- nor changes in TCR-proximal signals can have a major effect on ERK activity (37, 38). It is therefore possible that TCR cross-linking with low concentrations of antibodies might not be sensitive enough to detect effects on early regulators of TCR signaling, but could still reveal the consequences on downstream proteins, such as ERK, that exhibit a digital mode of activation. Our MS analysis also revealed that the Rho family GEF Vav1 consti- tuted one of the predominant binding partners of Themis1 in thymocytes. Consistent with our previous results (9), we found that Themis1 enhanced Vav1 activity under both weak and strong stimulatory conditions. The phosphorylation of p38, which is dependent on Vav1 activity (23), was also reduced in Themis1/ thymocytes compared to that in wild-type cells. This suggests that Themis1 has more than one function in TCR signaling and that the balance between the positive and negative effects of Themis1 on TCR signaling may be dependent on the extent (or inten- sity) of TCR engagement. Our findings suggest that Themis1 functions mostly as a positive regulator of TCR signaling with respect to its effect on Vav1 when selection processes are mediated by relatively high-affinity ligands. This interpretation would explain why negative selection, a pro- cess that is induced after the strong interaction of TCR with self-pMHCs, is impaired in Themis1/ mice (2, 5). Our results further suggest that the strength of TCR signaling is reduced in Themis1/ mice when positive selection is driven by a single transgene-encoded TCR (AND), a TCR that reportedly binds with relatively high affinity to self-pMHCs (1). Thus, the positive effect of Themis1 on the effector function of Vav1 might also be important to facilitate positive selection. Consistent with this idea, we found that the phosphorylation of Vav1 was reduced in vivo in postselec- tion DP thymocytes from AND-Themis1/ mice as compared to that in Themis1 / controls, and that the overexpression of Themis1 in Grb2 / mice restored both Vav1 phosphorylation and positive selection driven by the AND TCR. Our results demonstrated that the abundance of Grb2 was reduced in Themis1/ thymocytes to an extent comparable to that in Grb2 / thymo- cytes. Vav1 phosphorylation was also decreased in Grb2 / thymocytes, which suggests that the reduced abundance of Grb2 in Themis1/ thymo- cytes could account, at least in part, for the impaired phosphorylation of Vav1 in these cells in response to TCR engagement. Grb2 binds through its SH2 domain to phosphorylated tyrosine residues on LAT (28) and through its C-terminal SH3 domain to a PRR within Vav1 (26). Themis1 may therefore facilitate the recruitment of Vav1 to LAT and its subsequent phosphorylation by the tyrosine kinase ZAP-70. Accordingly, we showed that the recruitment of Vav1 to LAT was impaired in Themis1/ thymo- cytes. A previous study of peripheral CD4 T cells showed that the recruit- ment of Vav1 to TCR signaling complexes was mostly mediated by the binding of SLP-76 to the Vav1 SH2 domain through Tyr112 and Tyr126 of SLP-76 (39). In that study, deletion of the Vav1 SH2 domain prevented the recruitment of Vav1 to the immunological synapse and its subsequent phosphorylation. Here, we showed that loss of Themis1 did not affect the ability of Vav1 to interact with phosphorylated forms of SLP-76 after TCR engagement, which suggests that the impaired recruitment of Vav1 to LAT in Themis1/ thymocytes resulted from the reduced Grb2 abundance in these cells, and that distinct mechanisms may control the recruitment of Vav1 into TCR signaling complexes in peripheral T cells and thymocytes. Previous MS-based studies of the Grb2 interactome in distinct cell types have reported the interaction of Grb2 with proteins involved in ubiquitin- mediated degradation processes, such as c-Cbl, Cbl-b, TSG101, and SOCS1 ; however, whether these enzymes regulate Grb2 turnover has not been ex- amined so far (40, 41). Because c-Cbl was identified by our MS analysis among preferential binding partners of Themis1 in thymocytes, we sus- pected that c-Cbl might regulate Grb2 degradation and that Themis1 might inhibit this process. However, we found that Grb2 protein amounts were un- affected in c-Cbl/ thymocytes and that the interaction between c-Cbl and Grb2 was decreased rather than increased in Themis1/ thymocytes com- pared to that in wild-type thymocytes. Although we cannot exclude the pos- sibility that Cbl-b compensates for the loss of c-Cbl, this seems unlikely given that the abundance of Cbl-b in thymocytes is relatively low compared to that in peripheral T cells and that c-Cbl deficiency alone has a major effect on TCR abundance and signaling (42). In-depth analysis of the Themis1 interactome identified the deubiquitylating enzyme USP9X as a potential interactor of Themis1 in thymocytes (table S1). USP9X is part of the TCR signaling machinery and enhances TCR-proximal signaling events, such as the phosphorylation of LAT and Vav1 (43). One hypothesis, therefore, is that Themis1 prevents Grb2 degradation by interacting with a deubiquity- lase that targets Grb2. Further experiments with USP9X-deficient T cells will be required to determine whether USP9X is involved in this process. In contrast to previous studies with DO. 11 TCR transgenic models, we found that positive selection driven by the AND or OT-2 TCR was par- tially attenuated in Grb2 / mice. Because Grb2 abundance was similarly reduced in Themis1/ and Grb2 / thymocytes, this suggests that at least part of the defect in positive selection observed in Themis1/ mice could be attributed to the reduced abundance of Grb2. However, the modest effect of Grb2 hemideficiency on T cell development in comparison to the marked defect observed in Themis1/ mice implies that Themis1 regulates other T cell signaling processes independently of its effect on Grb2 protein stability. We showed here that the interaction between Themis1 and Vav1 did not require the binding of Grb2 to Themis1, which suggests that Themis1 might be important to recruit Vav1 directly into TCR signaling complexes. Another possibility is that Themis1 has a direct role in stimulat- ing the enzymatic function of Vav1. Mice deficient in Vav1 GEF activity exhibit a phenotype similar to that of Themis1/ mice, with a marked block at the DP to SP transition, which contrasts with the phenotype of Vav1/ mice that exhibit an almost complete block at the b-selection checkpoint (20). Mice deficient in Vav1 GEF activity also exhibit a defect in Rac1-GTP production similar to what we observed in Themis1/ mice. Furthermore, our MS analysis revealed that Themis1 interacted predominantly with the microtubule-associated protein Lis1, a direct binding partner of Rac1, which can stabilize the GTP-bound forms of small GTP-binding proteins (G pro- teins) in neurons (44). An interesting hypothesis is that Themis1 func- tions as part of a cooperative signaling complex that includes Grb2, Vav1, and Lis1 and controls the generation and the stability of active small G proteins, which in turn transmit signals that are essential for positive and negative selection. In conclusion, our results identify a positive function for Themis1 in TCR signaling during T cell development and identify a primary role for Themis1 in promoting Grb2 stability and Vav1 effector function. These findings are concordant with a report demonstrating an epistatic effect of 17 May 2016 Vol 9 Issue 428 ra51 12 l D o w n o a d e d f r o m h t t p : / / s t k e i . s c e n c e m a g . o r g / o n J u y l 1 5 , 2 0 1 8 R E S E A R C H A R T I C L E Themis1 and Vav1 genes on the suppressive function of regulatory T cells and the development of inflammatory bowel disease (45). In view of inves- tigations that support a negative role for Themis1 in TCR signaling, our study suggests that Themis1 might have a more complex function during T cell development, perhaps transmitting either positive or negative signals depending on the affinity of the TCR for self-pMHCs, the contribution of co-receptor signaling, and the intensities of the elicited TCR-proximal signals. The identification of new Themis1 partners, such as Lis1, which is mostly known as a regulator of dynein anchoring to microtubules in neu- rons, suggests that Themis1 may have additional functions in T cells that are not directly related to its role in TCR-proximal signaling. MATERIALS AND METHODS Mice Nur77-GFP reporter mice were provided by K. Hogquist (University of Minnesota, Minneapolis, MN). c-Cbl/ mice were provided by J. Chiang (National Cancer Institute, Bethesda, MD). Themis1/ (5), Themis1-tg (9), Grb2 / (33), TCRz6Y/6Y (46), and TCRz6F/6F (46) mice were described previously. The AND and OT-2-TCR transgenic mice were obtained from Taconic Farms. The Bim/ mice were obtained from the Jackson Labora- tory. In some experiments, Themis1/ and Themis1-tg mice expressing the AND TCR were crossed to Grb2 / mice to generate either AND-TCR- Themis1 /Grb2 / or ANDTCRThemis1-tgGrb2 / mice. Themis1/ mice were also crossed with Bim/ mice to generate Themis1/Bim/ mice. Animal experiments were approved by the Animal Care and Use Committee of the Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Hu- man Development, National Institutes of Health. Antibodies and flow cytometry Sources for antibodies and reagents used in this study include the following : anti-Grb2 (C-23), antiPLC-g1 (1249), anti-Vav1 (C-14), anti-ubiquitin (P4D1), and antic-Cbl (A9), which were from Santa Cruz Biotechnology ; anti-LAT (11B. 12), anti-Sos1, and anti-Rac1, which were from Millipore ; anti-pVav1(Y174), which was obtained from Abcam ; and anti-pERK (T202/Y204), anti-pp38 (T180/Y182), and antipSHP-1 (Y564), which were obtained from Cell Signaling Technology. Alexa Fluor 488conjugated phalloidin was purchased from Life Technologies. Anti-Themis1 rabbit antibodies were previously described (5). Thymocytes were incubated for 16 hours with cycloheximide (20 mg/ml, Sigma) or 1 mM MG132 (EMD Biosciences). Biotin- and fluorochrome-conjugated antibodies against CD3e, CD4, CD5, CD8a, CD24, CD25, CD44, and Va11 were purchased from BD Biosciences. Single-cell suspensions from the thymus, spleen, or lymph nodes were incubated in phosphate-buffered saline, 0. 5% bo- vine serum albumin, and 0. 01% NaN3 containing the appropriate anti- bodies. Cell detection was performed on a FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciences), and data analysis was performed with FlowJo software (Tree Star Inc. ). Thymocyte stimulation and immunoprecipitation For MS analysis, 2 108 thymocytes from Themis1 / or Themis1/ mice were left untreated or were treated with 100 nM pervanadate for 5 min at 37C. The treatment was stopped on ice, and cells were im- mediately centrifuged and resuspended in 2 ml of ice-cold lysis buffer [10 mM tris-HCl (pH 7. 4), 150 mM NaCl, 1% Triton, 2 mM Na3VO4, 5 mM NaF, 1 mM EDTA, and protease inhibitor cocktail tablet (Roche)] and in- cubated for 20 min on ice. Lysates were cleared by centrifugation at 18, 000g for 15 min at 4C, and Themis1 was subjected to immunoprecipitation from cleared lysates for 2 hours at 4C with 30 ml of protein ASepharose resin coated with 12 mg of polyclonal rabbit anti-Themis1 antibodies. The resin was washed three times and incubated for 15 min at room tempera- ture in 200 ml of elution buffer [50 mM tris-HCl (pH 7. 4), 150 mM NaCl, and Themis1 antigenic peptide (200 mg/ml)]. Samples were further pro- cessed for proteomic analysis on a Q Exactive mass spectrometer (Thermo Scientific) as described in the Supplementary Materials. To analyze TCR signaling, thymocytes were collected and rested for 2 hours in RPMI medi- um at 37C at a density of 5 106 cells/ml. Thymocytes were resuspended at a density of 107 cells per 50 ml and incubated at 37C for 10 min before being stimulated. Antibody complexes were prepared at a 2 concentration before being used to stimulate cells at 37C for 10 min with biotin-conjugated anti-CD3 and anti-CD4 antibodies mixed with equal concentrations of streptavidin. Thymocytes were stimulated with 50 ml of antibody complexes (6 or 60 mg/ml) for the times indicated in the figure legends. Cell lysates were prepared as described earlier. Further details about immunoprecipi- tations can be found in the Supplementary Materials. Analysis of MS data Raw MS data files were processed with MaxQuant software (version 1. 5. 0) for database search with the Andromeda search engine and for quantitative analysis (see the Supplementary Materials for details on the MaxQuant parameter settings and for the processing of quantitative data). Potential Themis1 interactors were selected on the basis of an enrichment ratio of >5 between immunopurified samples from Themis1 / and Themis1/ cells and P < 0. 05 (by Student's t test) over triplicate biological experiments. Of the potential candidates, we retained as bona fide binding partners those that were identified in the Themis1 / immunopurified samples with strong mass spectrometric evidence (number of unique identified peptides > 2) and high abundance based on the intensity of the MS signal. The iBAQ metric, which corresponds to the sum of all of the peptide intensities divided by the number of observable peptides from a given protein (47), was used to es- timate absolute protein abundance, and a minimal iBAQ threshold of 20 105 was thus applied to filter low-abundant proteins from the list of potential partners. Additionally, to define the Themis1 interactome, we also eliminated candidates that had strong intensity signals in the control Themis1/ sam- ples (mean iBAQ > 20 105), which were more likely to correspond to the nonspecific binding of abundant cellular proteins in the immunopurified samples. The remaining candidate interactors were sorted on the basis of their calculated iBAQ value in the Themis1 / immunopurified samples, which reflected their absolute abundance in the sample and the strength of their interaction with the Themis1 bait. The complete unfiltered list of proteins identified in the immunopurified samples is provided in table S1. The MS proteomics data were deposited to the ProteomeXchange con- sortium through the Proteomics Identifications (PRIDE) partner repository with the data set identifier PXD004072. Rac1 activation assay Thymocytes from Themis1 / and Themis1/ mice were collected and rested for 2 hours in RPMI medium at 37C at a density of 5 106 cells/ml. Cells were resuspended at 3 107 cells per 100 ml, preincubated at 37C for 10 min, and then left untreated or treated with an equal volume of a premixed 2 cocktail of biotinylated anti-CD3 and anti-CD4 antibodies and streptavidin (100 ml) for the times indicated in the figure legends. Cells were lysed directly in excess lysis buffer (900 ml) for 20 min on ice. Lysates were cleared by centrifugation at 18, 000g for 15 min at 4C. Cleared lysates were subjected to pull-down with 10 ml of PAK1-GST agarose beads with rotation for 1 hour at 4C. An aliquot of cleared lysates was saved for whole- cell lysate analysis. Beads were washed three times with ice-cold lysis buffer. Proteins were eluted from the beads by heating them to 70C for 10 min in Laemmli buffer. Proteins were resolved by SDSpolyacrylamide gel 17 May 2016 Vol 9 Issue 428 ra51 13 l D o w n o a d e d f r o m h t t p : / / s t k e i . s c e n c e m a g . o r g / o n J u y l 1 5 , 2 0 1 8 R E S E A R C H A R T I C L E electrophoresis (PAGE), subsequently transferred to polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes, and analyzed by Western blotting to detect Rac1. Western blotting analysis and band quantification Proteins were resolved by SDS-PAGE and transferred to PVDF mem- branes according to standard protocols. Membranes were blocked with 5% milk in tris-buffered saline containing Tween for 1 hour at room tem- perature before being incubated with primary antibodies at 4C overnight. After washing, membranes were incubated with secondary antibodies for 1 hour at room temperature. Subsequently, membranes were incubated with enhanced chemoluminescence solution for 5 min in the dark, and luminescence was captured with a Bio-Rad XRS imager. Images were analyzed, and band intensities were quantitated with Bio-Rad ImageLab software. Numbers from quantitated bands were normalized for loading differences with GAPDH as a control. In Fig. 3A, the intensity values at each time point were normalized to the highest intensity value obtained for wild-type thymocytes in the low-dose condition (which was set at 1) for each individual experiment. RT-PCR analysis For gene expression studies, total cellular RNAwas isolated with a PicoPure RNA Isolation kit (Arcturus). RNA samples (100 ng each) were reverse- transcribed with the SuperScript First-Strand Synthesis system (Invitrogen) and were assayed by RT-PCR. Transcripts were quantified with a Roche LightCycler 480. Duplicates were run for each sample in a 96-well plate, and Actb served as the endogenous reference gene. The relative quantifica- tion method was used, with the ratio of the mRNA abundance of the gene of interest normalized to the abundance of Actb mRNA and with the average of the control thymocyte samples serving as the calibrator value. The specific- ity of the products was confirmed by melting curves and electrophoresis. Statistical analysis Statistical comparisons were performed with an F test to verify equal variance of the populations, which was followed by an unpaired two- tailed t test. The P values are indicated in the figure legends. SUPPLEMENTARY MATERIALS Materials and Methods Fig. S1. Themis1 enhances TCR signaling during thymic selection. Fig. S2. Analysis of the interaction between Themis1 and Vav1 in thymocytes and HEK 293T cells. Fig. S3. Themis1/ thymocytes exhibit normal phosphorylation of Lck, ZAP-70, and LAT after cross-linking of the TCR with low or high concentrations of antibody complexes. Fig. S4. The amount of Grb2 that coimmunoprecipitates with c-Cbl and Sos1 is reduced in thymocytes from Themis1/ mice. Fig. S5. Loss of c-Cbl does not affect Grb2 protein abundance in thymocytes. Fig. S6. Analysis of TCR signaling and Grb2 coimmunoprecipitation with Vav1 and LAT in Themis1 transgenic thymocytes. Fig. S7. Effect of Themis1 overexpression on T cell development. Fig. S8. Transgenic expression of Themis1 in Grb2 / mice restores positive selection in TCR transgenic mice. Table S1. List of proteins identified by proteomic analysis of Themis1-immunopurified samples. REFERENCES AND NOTES 1. J. N. Mandl, J. P. Monteiro, N. Vrisekoop, R. N. Germain, T cell-positive selection uses self-ligand binding strength to optimize repertoire recognition of foreign antigens. Immunity 38, 263274 (2013). 2. G. Fu, S. Vallée, V. Rybakin, M. V. McGuire, J. Ampudia, C. Brockmeyer, M. Salek, P. R. Fallen, J. A. H. Hoerter, A. Munshi, Y. H. Huang, J. Hu, H. S. Fox, K. Sauer, O. Acuto, N. R. J. Gascoigne, Themis controls thymocyte selection through regulation of T cell antigen receptor-mediated signaling. Nat. Immunol. 10, 848856 (2009). 3. A. L. Johnson, L. Aravind, N. Shulzhenko, A. Morgun, S. -Y. Choi, T. L. Crockford, T. Lambe, H. Domaschenz, E. M. Kucharska, L. Zheng, C. G. Vinuesa, M. J. Lenardo, C. C. Goodnow, R. J. Cornall, R. H. Schwartz, Themis is a member of a new metazoan gene family and is required for the completion of thymocyte positive selection. Nat. Immunol. 10, 831839 (2009). 4. K. Kakugawa, T. Yasuda, I. Miura, A. Kobayashi, H. Fukiage, R. Satoh, M. Matsuda, H. Koseki, S. Wakana, H. Kawamoto, H. Yoshida, A novel gene essential for the de- velopment of single positive thymocytes. Mol. Cell. Biol. 29, 51285135 (2009). 5. R. Lesourne, S. Uehara, J. Lee, K. -D. Song, L. Li, J. Pinkhasov, Y. Zhang, N. -P. Weng, K. F. Wildt, L. Wang, R. Bosselut, P. E. Love, Themis, a T cellspecific protein important for late thymocyte development. Nat. Immunol. 10, 840847 (2009). 6. M. S. Patrick, H. Oda, K. Hayakawa, Y. Sato, K. Eshima, T. Kirikae, S. -i. Iemura, M. Shirai, T. Abe, T. Natsume, T. Sasazuki, H. Suzuki, Gasp, a Grb2-associating protein, is critical for positive selection of thymocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 1634516350 (2009). 7. W. Paster, C. Brockmeyer, G. Fu, P. C. Simister, B. de Wet, A. Martinez-Riao, J. A. H. Hoerter, S. M. Feller, C. Wlfing, N. R. J. Gascoigne, O. Acuto, GRB2-mediated recruitment of THEMIS to LAT is essential for thymocyte development. J. Immunol. 190, 37493756 (2013). 8. C. Brockmeyer, W. Paster, D. Pepper, C. P. Tan, D. C. Trudgian, S. McGowan, G. Fu, N. R. J. Gascoigne, O. Acuto, M. Salek, T cell receptor (TCR)-induced tyrosine phos- phorylation dynamics identifies THEMIS as a new TCR signalosome component. J. Biol. Chem. 286, 75357547 (2011). 9. R. Lesourne, E. Zvezdova, K. -D. Song, D. El-Khoury, S. Uehara, V. A. Barr, L. E. Samelson, P. E. Love, Interchangeability of Themis1 and Themis2 in thymocyte development reveals two related proteins with conserved molecular function. J. Immunol. 189, 11541161 (2012). 10. G. Fu, J. Casas, S. Rigaud, V. Rybakin, F. Lambolez, J. Brzostek, J. A. H. Hoerter, W. Paster, O. Acuto, H. Cheroutre, K. Sauer, N. R. J. Gascoigne, Themis sets the signal threshold for positive and negative selection in T-cell development. Nature 504, 441445 (2013). 11. W. Paster, A. M. Bruger, K. Katsch, C. Grégoire, R. Roncagalli, G. Fu, N. R. J. Gascoigne, K. Nika, A. Cohnen, S. M. Feller, P. C. Simister, K. C. Molder, S. -P. Cordoba, O. Dushek, B. Malissen, O. Acuto, A THEMIS : SHP1 complex promotes T-cell survival. EMBO J. 34, 393409 (2015). 12. K. G. Johnson, F. G. LeRoy, L. K. Borysiewicz, R. J. Matthews, TCR signaling thresholds regulating T cell development and activation are dependent upon SHP-1. J. Immunol. 162, 38023813 (1999). 13. D. R. Plas, C. B. Williams, G. J. Kersh, L. S. White, J. M. White, S. Paust, T. Ulyanova, P. M. Allen, M. L. Thomas, Cutting edge : The tyrosine phosphatase SHP-1 regulates thymocyte positive selection. J. Immunol. 162, 56805684 (1999). 14. J. Zhang, A. -K. Somani, D. Yuen, Y. Yang, P. E. Love, K. A. Siminovitch, Involvement of the SHP-1 tyrosine phosphatase in regulation of T cell selection. J. Immunol. 163, 30123021 (1999). 15. C. C. Fowler, L. I. Pao, J. N. Blattman, P. D. Greenberg, SHP-1 in T cells limits the production of CD8 effector cells without impacting the formation of long-lived central memory cells. J. Immunol. 185, 32563267 (2010). 16. A. E. Moran, K. L. Holzapfel, Y. Xing, N. R. Cunningham, J. S. Maltzman, J. Punt, K. A. Hogquist, T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. J. Exp. Med. 208, 12791289 (2011). 17. R. M. Siegel, M. Katsumata, T. Miyashita, D. C. Louie, M. I. Greene, J. C. Reed, In- hibition of thymocyte apoptosis and negative antigenic selection in bcl-2 transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 70037007 (1992). 18. O. Williams, T. Norton, M. Halligey, D. Kioussis, H. J. M. Brady, The action of Bax and bcl-2 on T cell selection. J. Exp. Med. 188, 11251133 (1998). 19. L. F. Reynolds, L. A. Smyth, T. Norton, N. Freshney, J. Downward, D. Kioussis, V. L. J. Tybulewicz, Vav1 transduces T cell receptor signals to the activation of phospholipase C-g1 via phosphoinositide 3-kinase-dependent and -independent pathways. J. Exp. Med. 195, 11031114 (2002). 20. A. Saveliev, L. Vanes, O. Ksionda, J. Rapley, S. J. Smerdon, K. Rittinger, V. L. J. Tybulewicz, Function of the nucleotide exchange activity of vav1 in T cell development and activation. Sci. Signal. 2, ra83 (2009). 21. J. Wu, D. G. Motto, G. A. Koretzky, A. Weiss, Vav and SLP-76 interact and function- ally cooperate in IL-2 gene activation. Immunity 4, 593602 (1996). 22. B. Aghazadeh, W. E. Lowry, X. -Y. Huang, M. K. Rosen, Structural basis for relief of autoinhibition of the Dbl homology domain of proto-oncogene Vav by tyrosine phos- phorylation. Cell 102, 625633 (2000). 23. S. P. Hehner, T. G. Hofmann, O. Dienz, W. Drge, M. L. Schmitz, Tyrosine-phosphorylated Vav1 as a point of integration for T-cell receptor- and CD28-mediated activation of JNK, p38, and interleukin-2 transcription. J. Biol. Chem. 275, 1816018171 (2000). 24. K. V. Salojin, J. Zhang, T. L. Delovitch, TCR and CD28 are coupled via ZAP-70 to the activation of the Vav/Rac-1-/PAK-1/p38 MAPK signaling pathway. J. Immunol. 163, 844853 (1999). 17 May 2016 Vol 9 Issue 428 ra51 14 l D o w n o a d e d f r o m h t t p : / / s t k e i . s c e n c e m a g . o r g / o n J u y l 1 5 , 2 0 1 8 R E S E A R C H A R T I C L E 25. M. Deckert, S. Tartare-Deckert, C. Couture, T. Mustelin, A. Altman, Functional and physical interactions of Syk family kinases with the Vav proto-oncogene product. Immunity 5, 591604 (1996). 26. M. Nishida, K. Nagata, Y. Hachimori, M. Horiuchi, K. Ogura, V. Mandiyan, J. Schlessinger, F. Inagaki, Novel recognition mode between Vav and Grb2 SH3 domains. EMBO J. 20, 29953007 (2001). 27. Z. -S. Ye, D. Baltimore, Binding of Vav to Grb2 through dimerization of Src homology 3 domains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 1262912633 (1994). 28. W. Zhang, R. P. Trible, M. Zhu, S. K. Liu, C. J. McGlade, L. E. Samelson, Association of Grb2, Gads, and phospholipase C-g1 with phosphorylated LAT tyrosine residues. Effect of LAT tyrosine mutations on T cell antigen receptor-mediated signaling. J. Biol. Chem. 275, 2335523361 (2000). 29. N. Fang, G. A. Koretzky, SLP-76 and Vav function in separate, but overlapping path- ways to augment interleukin-2 promoter activity. J. Biol. Chem. 274, 1620616212 (1999). 30. H. Asada, N. Ishii, Y. Sasaki, K. Endo, H. Kasai, N. Tanaka, T. Takeshita, S. Tsuchiya, T. Konno, K. Sugamura, Grf40, A novel Grb2 family member, is involved in T cell signaling through interaction with SLP-76 and LAT. J. Exp. Med. 189, 13831390 (1999). 31. S. K. Liu, N. Fang, G. A. Koretzky, C. J. McGlade, The hematopoietic-specific adaptor protein gads functions in T-cell signaling via interactions with the SLP-76 and LAT adaptors. Curr. Biol. 9, 6775 (1999). 32. H. S. Azzam, A. Grinberg, K. Lui, H. Shen, E. W. Shores, P. E. Love, CD5 expression is developmentally regulated by T cell receptor (TCR) signals and TCR avidity. J. Exp. Med. 188, 23012311 (1998). 33. Q. Gong, A. M. Cheng, A. M. Akk, J. Alberola-Ila, G. Gong, T. Pawson, A. C. Chan, Disruption of T cell signaling networks and development by Grb2 haploid insufficien- cy. Nat. Immunol. 2, 2936 (2001). 34. I. K. Jang, J. Zhang, Y. J. Chiang, H. K. Kole, D. G. Cronshaw, Y. Zou, H. Gu, Grb2 functions at the top of the T-cell antigen receptorinduced tyrosine kinase cascade to control thymic selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 1062010625 (2010). 35. K. -I. Pfrepper, A. Marie-Cardine, L. Simeoni, Y. Kuramitsu, A. Leo, J. Spicka, I. Hilgert, J. Scherer, B. Schraven, Structural and functional dissection of the cytoplasmic domain of the transmembrane adaptor protein SIT (SHP2-interacting transmembrane adaptor protein). Eur. J. Immunol. 31, 18251836 (2001). 36. L. Simeoni, V. Posevitz, U. Klsch, I. Meinert, E. Bruyns, K. Pfeffer, D. Reinhold, B. Schraven, The transmembrane adapter protein SIT regulates thymic development and peripheral T-cell functions. Mol. Cell. Biol. 25, 75577568 (2005). 37. A. K. Chakraborty, J. Das, J. Zikherman, M. Yang, C. C. Govern, M. Ho, A. Weiss, J. Roose, Molecular origin and functional consequences of digital signaling and hysteresis during Ras activation in lymphocytes. Sci. Signal. 2, pt2 (2009). 38. J. Das, M. Ho, J. Zikherman, C. Govern, M. Yang, A. Weiss, A. K. Chakraborty, J. P. Roose, Digital signaling and hysteresis characterize ras activation in lymphoid cells. Cell 136, 337351 (2009). 39. O. Ksionda, A. Saveliev, R. Kchl, J. Rapley, M. Faroudi, J. E. Smith-Garvin, C. Wlfing, K. Rittinger, T. Carter, V. L. J. Tybulewicz, Mechanism and function of Vav1 localisation in TCR signalling. J. Cell Sci. 125, 53025314 (2012). 40. N. Bisson, D. A. James, G. Ivosev, S. A. Tate, R. Bonner, L. Taylor, T. Pawson, Selected reaction monitoring mass spectrometry reveals the dynamics of signaling through the GRB2 adaptor. Nat. Biotechnol. 29, 653658 (2011). 41. K. Neumann, T. Oellerich, H. Urlaub, J. Wienands, The B-lymphoid Grb2 interaction code. Immunol. Rev. 232, 135149 (2009). 42. M. Naramura, H. K. Kole, R. -J. Hu, H. Gu, Altered thymic positive selection and in- tracellular signals in Cbl-deficient mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 1554715552 (1998). 43. E. Naik, J. D. Webster, J. DeVoss, J. Liu, R. Suriben, V. M. Dixit, Regulation of proximal T cell receptor signaling and tolerance induction by deubiquitinase Usp9X. J. Exp. Med. 211, 19471955 (2014). 44. S. S. Kholmanskikh, H. B. Koeller, A. Wynshaw-Boris, T. Gomez, P. C. Letourneau, M. E. Ross, Calcium-dependent interaction of Lis1 with IQGAP1 and Cdc42 promotes neuronal motility. Nat. Neurosci. 9, 5057 (2005). 45. C. Pedros, G. Gaud, I. Bernard, S. Kassem, M. Chabod, D. Lagrange, O. Andréoletti, A. S. Dejean, R. Lesourne, G. J. Fournié, A. Saoudi, An epistatic interaction between Themis1 and Vav1 modulates regulatory T cell function and inflammatory bowel dis- ease development. J. Immunol. 195, 16081616 (2015). 46. S. Hwang, K. -D. Song, R. Lesourne, J. Lee, J. Pinkhasov, L. Li, D. El-Khoury, P. E. Love, Reduced TCR signaling potential impairs negative selection but does not result in auto- immune disease. J. Exp. Med. , 209, 17811795 (2012). 47. B. Schwanhusser, D. Busse, N. Li, G. Dittmar, J. Schuchhardt, J. Wolf, W. Chen, M. Selbach, Global quantification of mammalian gene expression control. Nature 473, 337342 (2011). Acknowledgments : We thank K. Hogquist and J. Chiang for providing the Nur77-GFP transgenic mice and the cbl/ mice, respectively ; the Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan flow cytometry facility and the INSERM UMS006-CREFRE animal care facility ; A. Saoudi for critical reading of the manuscript ; and A. Mitra for the statistical anal- ysis. Funding : This work was supported by INSERM and Sanofi (Avenir grant to R. L. ) ; the Intramural Research Program of the Eunice Kennedy Shriver, National Institute of Child Health and Human Development ; the Fondation pour la Recherche sur la Sclérose en Plaque (ARSEP) ; a Marie Curie International Reintegration Grant (R. L. ) ; the French Ministry of Higher Education and Research (PhD fellowships for A. G. , G. B. , and J. A. ) ; the Région Midi-Pyrénées ; the Fonds Européens de Développement Régional, FEDER ; the Toulouse métropole ; and the French Ministry of Research with the Investissement d'Avenir Infra- structures Nationales en Biologie et Santé program (ProFI, Proteomics French Infrastructure project, ANR-10-INBS-08). Author contributions : E. Z. and J. L. performed flow cytometric analysis ; J. M. and S. C. performed biochemistry ; A. G. , M. M. , L. R. , and J. F. performed experiments for MS ; L. L. performed RT-PCR analysis ; G. B. performed flow cytometric anal- ysis of T cells in Bim/Themis1/ mice ; J. A. performed experiments for revision of the manuscript ; M. M and A. G. d. P. performed analysis of MS data ; A. G. d. P. and O. B. -S. super- vised MS experiments ; P. E. L. and R. L. designed the research and analyzed data ; and R. L. wrote the manuscript. Competing interests : The authors declare that they have no competing interests. Data and materials availability : The MS proteomics data were deposited to the ProteomeXchange consortium through the PRIDE partner repository with the data set identifier PXD004072. The NIH requires materials transfer agreements for the distribution of the mouse lines generated for this study. Submitted 4 August 2015 Accepted 29 April 2016 Final Publication 17 May 2016 10. 1126/scisignal. aad1576 Citation : E. Zvezdova, J. Mikolajczak, A. Garreau, M. Marcellin, L. Rigal, J. Lee, S. Choi, G. Blaize, J. Argenty, J. Familiades, L. Li, A. Gonzalez de Peredo, O. Burlet-Schiltz, P. E. Love, R. Lesourne, Themis1 enhances T cell receptor signaling during thymocyte development by promoting Vav1 activity and Grb2 stability. Sci. Signal. 9, ra51 (2016). l D o w n o a d e d f r o m h t t p : / / s t k e i . s c e n c e m a g . o r g / o n J u y l 1 5 , 2 0 1 8 17 May 2016 Vol 9 Issue 428 ra51 15 178 Annexe 2 : Choi S, Warzecha C, Zvezdova E, Lee J, Argenty J, Lesourne R, Aravind L, Love PE. 2017. THEMIS enhances TCR signaling and enables positive selection by selective inhibition of the phosphatase SHP-1. Nat Immunol Pour cette annexe, j'ai contribué à la révision de l'article. Brièvement, afin de vérifier que la signalisation est diminuée suite à la stimulation des cellules en condition physiologique, j'ai stimulé des thymocytes issus de souris THEMIS1-/- CMH-/- OTII avec des LB chargés ou non du peptide OVA. Par westernblot, j'ai analysé la phosphorylation de SHP-1 et ZAP-70 ainsi que des phosphotyrosines totales. Ces résultats sont présentés Figure supplémentaire 4b. 179 180 A R T I C L E S THEMIS enhances TCR signaling and enables positive selection by selective inhibition of the phosphatase SHP-1 Seeyoung Choi1, Claude Warzecha1, Ekaterina Zvezdova1, Jan Lee1, Jérémy Argenty2, 3, Renaud Lesourne2, 3, L Aravind4 & Paul E Love1 THEMIS, a T cellspecific protein with high expression in CD4 CD8 thymocytes, has a crucial role in positive selection and T cell development. THEMIS lacks defined catalytic domains but contains two tandem repeats of a distinctive module of unknown function (CABIT). Here we found that THEMIS directly regulated the catalytic activity of the tyrosine phosphatase SHP-1. This action was mediated by the CABIT modules, which bound to the phosphatase domain of SHP-1 and promoted or stabilized oxidation of SHP-1's catalytic cysteine residue, which inhibited the tyrosine-phosphatase activity of SHP-1. Deletion of SHP-1 alleviated the developmental block in Themis/ thymocytes. Thus, THEMIS facilitates thymocyte positive selection by enhancing the T cell antigen receptor signaling response to low-affinity ligands. T cell development is a continuous process that begins when progeni- tor cells that originate in the fetal liver or adult bone marrow enter the thymus and are induced to commit to the T cell lineage. Thymocytes progress through multiple well-defined maturational steps that for simplicity are grouped into three main stages defined by expression of the co-receptors CD4 and CD8 : CD4CD8 (double negative (DN), CD4 CD8 (double positive (DP), and CD4 or CD8 (single positive : CD4SP or CD8SP, respectively). The transition of thymo- cytes through these stages of maturation is dependent upon signals transmitted by various cell-surface molecules, including Notch, cytokine receptors and precursor or mature forms of the T cell antigen receptor (TCR)1, 2. All thymocytes are subjected to a selection process at the DP stage that is based on the affinity of their expressed TCR for self-peptide ligands bound to major histocompatibility complex (self-pMHC) that tests TCR functionality and enforces self-tolerance3. Thymocytes that express TCRs that fail to bind to self-pMHC or that bind with high affinity to self-pMHC are non-selected' or negatively selected', respectively, and are triggered to undergo apoptotic death, whereas thymocytes that express TCRs that bind with low affinity to self- pMHC are positively selected' and progress to the CD4SP or CD8SP stage3. The affinity of the TCR for self-pMHC controls the intensity and duration of the TCR signaling response, which in turn leads to the differential activation of downstream signal-transduction pathways and transcriptional responses that dictate cell fate4. Thymocyte selection is dependent upon the expression and func- tion of several lineage-restricted effector molecules, including the protein tyrosine kinases (PTKs) LCK and ZAP-70, the protein tyro- sine phosphatase (PTP) SHP-1 (encoded by Ptpn6), and specialized adaptors such as LAT and SLP-76 (refs. 5, 6). THEMIS, a T cell specific protein, has an important role in thymocyte selection. In the absence of THEMIS, thymocyte development is partially blocked at the DP-to-SP transition stage, which results in a substantial reduction in mature CD4SP thymocytes and, to lesser extent, CD8SP thymo- cytes and peripheral T cells711. THEMIS is the founding member' of a group of structurally related proteins that are defined by the presence of one or more copies of a CABIT (cysteine-containing all beta in THEMIS') globular module with a median length of 261 amino acids that contains a conserved core motif ( XCX7-26 XLP X3GXF, where ' is any hydrophobic residue, X' is any amino acid, and the subscripted number indicates the number of residues)9. All members of the mammalian THEMIS family, including THEMIS, THEMIS2 (which is restricted to B cells and myeloid cells) and the more distantly related THEMIS3 (which is expressed in the large and small intestine7) contain two tandem CABIT modules and a C-terminal proline-rich sequence but lack a known catalytic domain9. THEMIS binds directly to the cytosolic adaptor GRB2, and this interaction requires the proline-rich sequence of THEMIS12, 13. Mass-spectrometry screens of proteins co- immunoprecipitated with THEMIS have identified SHP-1 as a puta- tive THEMIS-interacting protein14, 15, and it has been suggested that THEMIS functions by regulating the activity of SHP-1 or its recruit- ment to LAT16, 17. Nevertheless, a specific role for THEMIS in T cell development has not been clearly defined, and it remains unclear if 1Section on Hematopoiesis and Lymphocyte Biology, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA. 2Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan, Toulouse, France. 3Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, U1043, Centre National de la Recherche Scientifique, U5282, and Université de Toulouse, Université Paul Sabatier, Toulouse, France. 4National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA. Correspondence should be addressed to P. E. L. (lovep@mail. nih. gov). Received 6 November 2016 ; accepted 25 January 2017 ; published online 27 February 2017 ; corrected online 7 March 2017 (details online) ; doi : 10. 1038/ni. 3692 NATURE IMMUNOLOGY VOLUME 18 NUMBER 4 APRIL 2017 433 A R T I C L E S its effect on TCR signaling is mainly activating or inhibitory1416. A particular challenge has been to identify a function for the CABIT modules that constitute most of the THEMIS protein. The presence of highly conserved core sequences and their requirement for THEMIS activity in vivo18 suggests that CABIT modules have an important biological role ; however, their distinctiveness from all previously described protein domains indicates that they may perform a unique cellular function9. In this study, we identify a biological function for the CABIT mod- ules that clarifies the role of THEMIS in T cell development. We found that the THEMIS CABIT modules bound directly to the PTP domain of SHP-1 and inhibited the PTP activity of SHP-1 by promoting or stabilizing oxidation of the catalytic cysteine residue. That activity, coupled with the stage-specific regulation of THEMIS during T cell development79, 11, provides an explanation for the unusual sensitivity of DP thymocytes to TCR stimulation19, a property that is essential for positive selection. RESULTS Binding of THEMIS to the PTP domain of SHP-1 To determine if THEMIS binds directly to SHP-1, we first performed cell-free in vitro protein-binding assays. THEMIS bound to a glu- tathione S-transferase (GST)SHP-1 fusion protein in the absence of GRB2, although the THEMISSHP-1 interaction was enhanced by GRB2 (Fig. 1a). In lysates of HEK-293 human embryonic kidney cells co-transfected with plasmids encoding SHP-1 and THEMIS lacking the GRB2-binding proline-rich sequence (THEMIS-1-493), SHP-1 immunoprecipitated together with THEMIS-1-493 (Fig. 1b). GRB2- independent association of THEMIS and SHP-1 was also detected by co-immunoprecipitation of THEMIS with SHP-1 from lysates of GRB2-deficient total thymocytes (Fig. 1c). SHP-2 (another dual Src-homology-2 (SH2) PTP that is closely related to SHP-1) bound to THEMIS when co-expressed in HEK-293 cells, but two other class I PTPs (PTPN1 and PTPN7) that are expressed in thymocytes did not bind to THEMIS (Supplementary Fig. 1a, b). To locate the sequences within THEMIS that mediated its binding to SHP-1, we next performed co-immunoprecipitation experiments in HEK-293 cells transfected with plasmids encoding SHP-1 and various truncations of THEMIS. SHP-1 immunoprecipitated together with a THEMIS protein that contained only the CABIT1 and CABIT2 mod- ules (THEMIS-1-493) and, to a lesser extent, with truncated THEMIS proteins containing only the CABIT1 module (THEMIS-1-260) or CABIT2 module (THEMIS-260-493) (Fig. 1b). In similar co- transfection experiments, a protein containing only the PTP domain of SHP-1 immunoprecipitated together with THEMIS-1-493 and with THEMIS-1-260 (Fig. 1d). Also, purified SHP-1 lacking both SH2 domains but containing the PTP domain (GST- SH2-SHP-1) bound to THEMIS-1-493 in vitro (Fig. 1e and Supplementary Fig. 1c, d). THEMIS GRB2 GSTSHP-1 THEMIS GRB2 SHP-1 b 1 1 1 Cys153 CABIT 1 Cys413 CABIT 2 260 260 636 PRS 493 493 F-THE MIS-260-493 F-THE MIS-1-636 F-THE MIS-1-260 F-THE MIS-1-493 d Cys Tyr Tyr SH2 SH2 PTP SHP-1 PTP SH2-SHP-1 SHP-1 PTP F-THEMIS-1-493 F-THEMIS-1-260 SHP-1 IP : Flag IP : Flag Flag (THEMIS) Lys SHP-1 Lys a c e / / Themis Themis Grb2f/f LCK-Cre IP : SHP-1 THEMIS SHP-1 GRB2 Input GST ppt His-(1-493) GST GSTSH2-SHP-1 His (THEMIS) F SHP-1 : Myc-GRB2 : SHP-1 Myc (GRB2) Flag (THEMIS) SHP-1 Myc (GRB2) Figure 1 THEMIS binds directly to SHP-1. (a) In vitro GST-precipitation assay of GSTSHP-1, assessing the binding of THEMIS to SHP-1 in the presence ( ) or absence () of GRB2. (b) Co-immunoprecipitation analysis (below) of the binding of THEMIS CABIT modules to SHP-1 in HEK-293 cells co-transfected with Flag (F) parent plasmid or plasmid encoding various Flag-tagged (F-) THEMIS constructs (top) plus plasmids encoding SHP-1 and Myc-tagged GRB2 (above lanes), assessed by immunoblot analysis of cell lysates (bottom two blots) or proteins immunoprecipitated with anti-Flag (IP : Flag ; top three blots). PRS, proline-rich sequence. (c) Co-immunoprecipitation analysis of THEMIS and SHP-1 in lysates of total thymocytes from Themis / , Themis/ and GRB2-deficient (Grb2fl/flLCK-Cre) mice (above lanes). (d) Co-immunoprecipitation analysis (below) of the binding of THEMIS CABIT modules to the PTP domain of SHP-1 in HEK-293 cells co-transfected to express various Flag-tagged THEMIS constructs (as in b) plus plasmid encoding SHP-1 or its PTP domain (top) (above lanes), assessed by immunoblot analysis of lysates or immunoprecipitated proteins as in b. (e) In vitro GST-precipitation (ppt) assay of GSTSHP-1, assessing the binding of histidine tagged THEMIS CABIT modules (His-1-493) to the PTP domain of SHP-1 ( SH2-SHP-1 construct, d). Data are representative of three experiments. 434 VOLUME 18 NUMBER 4 APRIL 2017 NATURE IMMUNOLOGY a 1, 200 * NS NS c y t i v i t c a P T P ) d e s a e e r l l o m p ( 900 600 300 y t i v i t c a P T P ) d e s a e e r l l o m p ( * * NS NS 1, 200 800 400 y t i v i t c a P T P ) d e s a e e r l l o m p ( 1, 000 800 600 400 200 0 GSTSHP-1 (g) : THEMIS (g) : 1 0 1 0. 5 1 1 1 2 1 5 0 SHP-2 THEMIS THEMIS2 0 PTPN1 THEMIS THEMIS2 * NS * d 1, 200 * * * y t i v i t c a P T P ) d e s a e e r l l o m p ( 900 600 300 0 b 1, 200 1, 000 800 600 400 200 y t i v i t c a P T P ) d e s a e e r l l o m p ( 0 GSTSHP-1 THEMIS GRB2 His (THEMIS) GRB2 A R T I C L E S NS NS 800 600 400 200 0 y t i v i t c a P T P ) d e s a e e r l l o m p ( e y t i v i t c a P T P ) d e s a e e r l l o m p ( * PTPN7 THEMIS THEMIS2 * * 1, 500 1, 200 900 600 300 0 GSTSHP-1 THEMIS THEMIS-1-493 THEMIS-1-260 GSTSHP-1 THEMIS THEMIS-C-A THEMIS2 His (THEMIS) His (THEMIS) Figure 2 THEMIS directly inhibits the tyrosine-phosphatase activity of SHP-1. (a) In vitro PTP assay of GSTSHP-1 in the presence of increasing amounts (below plot) of THEMIS ; results are presented (throughout) as picomoles of phosphate released. (b) In vitro PTP assay (top) of GSTSHP-1 in the presence ( ) or absence () of THEMIS or GRB2 or both (below plot), with non-PTP proteins added at a molar ratio 5 : 1, relative to the PTP (in be) ; below, immunoblot analysis of input histidine-tagged THEMIS or GRB2. (c) In vitro PTP assay of SHP-2 (left), PTPN1 (middle) or PTPN7 (right) in the presence or absence of THEMIS or THEMIS2 (below plots). (d, e) In vitro PTP assay of GSTSHP-1 in the presence or absence of THEMIS, THEMIS- 1-493 or THEMIS-1-260 (d) or THEMIS, THEMIS-C-A or THEMIS2 (e). NS, not significant (P > 0. 05) ; P < 0. 05, P < 0. 01 and P < 0. 005 (t-test). Data are representative of three experiments (ac, d, e (GSTSHP-1, PTPN1 or PTPN7 with THEMIS variants or THEMIS2) ; mean s. d. ) or five experiments (a, b, d, e (GSTSHP-1 alone or with THEMIS) ; mean s. d. ). Together these results demonstrated that the CABIT modules of THEMIS interacted directly with the PTP domain of SHP-1. Inhibition of SHP-1's PTP activity by the THEMIS CABIT modules To determine if THEMIS directly regulates the PTP activity of SHP- 1, we used an in vitro assay to detect the release of phosphate from a tyrosine-phosphorylated peptide. The PTP activity of SHP-1 was diminished in the presence of THEMIS, and this correlated with the concentration of THEMIS (Fig. 2a). The PTP activity of SHP-1 was not inhibited by GRB2, which also binds to SHP-1, which demon- strated that the inhibitory effect was specific to THEMIS ; however, the inhibition of SHP-1 was slightly greater when THEMIS and GRB2 were added together (Fig. 2b). In a similar assay, the PTP activity of SHP-2 was diminished slightly by THEMIS, whereas THEMIS did not inhibit the PTP activity of PTPN1 or PTPN7 (Fig. 2c). THEMIS- 1-493 was nearly as effective as full-length THEMIS at inhibiting the PTP activity of SHP-1 (Fig. 2d), which indicated that the CABIT modules were responsible for this inhibitory function of THEMIS. THEMIS-1-260 also inhibited the PTP activity of SHP-1, although not as effectively as THEMIS-1-493, which contains both CABIT modules (Fig. 2d) ; this indicated that a single CABIT module contained the sequences necessary for regulating the PTP activity of SHP-1 but that both CABIT modules were required for full inhibition. THEMIS2, which rescues' the developmental block in Themis/ thymocytes when transgenically expressed in thymocytes, and therefore could substitute for THEMIS in vivo13, inhibited the PTP activity of SHP-1 (Fig. 2e) and, to a lesser extent, that of SHP-2, but not that of PTPN1 or PTPN7, in in vitro tyrosine-phosphatase assays (Fig. 2c). All mammalian CABIT modules contain a conserved cysteine residue (underlined below) within the core motif of XCX7- 26 XLP X3GXF9. To determine the role of the cysteine residue in the regulatory activity of THEMIS, we introduced cysteine-to-alanine point substitutions in both the CABIT1 module (Cys153) and CABIT2 module (Cys413) of THEMIS (THEMIS-C-A). THEMIS-C-A immu- noprecipitated together with SHP-1 in lysates of HEK-293 cells trans- fected to express THEMIS-C-A and SHP-1 (Supplementary Fig. 1e) and inhibited the PTP activity of SHP-1 in an in vitro tyrosine- phosphatase assay (Fig. 2e), which indicated that the cysteine residues in the CABIT domains were not essential for regulating the PTP activity of SHP-1. This was consistent with published observa- tions that retrovirally encoded THEMIS-C-A is able to rescue' the DP-to-SP developmental block in Themis/ thymocytes20. These NATURE IMMUNOLOGY VOLUME 18 NUMBER 4 APRIL 2017 435 A R T I C L E S results demonstrated that the THEMIS CABIT modules directly inhibited the PTP activity of SHP-1 and that the conserved core cysteine was not required for this function. Deletion of Ptpn6 restores T cell development in Themis/ mice We next determined if inhibition of the PTP activity of SHP-1 would reverse the developmental block in Themis/ thymocytes in an in vitro differentiation assay21. Overnight culture of immature (TCRlo) DP thymocytes with plate-bound antibody to the TCR invariant chain CD3 (anti-CD3 ) plus antibody to the adhesion molecule CD2 (anti- CD2), followed by 24 h of rest without stimulation, induces their pro- gression to the CD4 CD8lo stage21, which replicates the initial stages of positive selection in vivo. In contrast to wild-type DP thymocytes, Themis/ DP thymocytes exhibited an impaired ability to transition to the CD4 CD8lo stage7 (Fig. 3). The block in the progression of Themis/ DP thymocytes to the CD4 CD8lo stage was significantly alleviated when the in vitro assay was performed in the presence of sodium stibogluconate, a selective inhibitor of SHP-1 (ref. 22) (Fig. 3) ; this indicated that the enhanced PTP activity of SHP-1 in Themis/ thymocytes contributed to the developmental defect. To determine if the developmental block in Themis/ thymocytes could be rescued' by a reduction in the expression of SHP-1, we gen- erated Themis/ Ptpn6fl/flCd4-Cre mice, in which T celllineage specific deletion of loxP-flanked alleles encoding SHP-1 (Ptpn6fl/fl), via Cre recombinase expressed via the T cellspecific Cd4 promoter, occurs mainly in DP thymocytes23. Thymocytes from Themis/ Ptpn6 / Cd4-Cre control mice exhibited normal maturation up to the DP stage but a marked reduction in the number of CD4SP thymo- cytes and, to lesser extent, CD8SP thymocytes and peripheral T cells (Fig. 4a, b), similar to the developmental phenotype of Themis/ mice7. The expression of SHP-1 in total thymocytes from Themis/ Ptpn6fl/flCd4-Cre mice was reduced to approximately 25% that observed in total thymocytes from Themis/ Ptpn6 / Cd4-Cre mice, as assessed by densitometry (Fig. 4c). This reduction in the expression of SHP-1 alleviated the developmental block, as evinced by the significantly greater frequency and number of mature TCRhi CD4SP and CD8SP thymocytes and peripheral T cells in Themis/ Ptpn6fl/flCd4-Cre mice than in Themis/ Ptpn6 / Cd4-Cre mice (Fig. 4a, b). In contrast to Themis/ Ptpn6 / Cd4-Cre mice, which had a large frequency of peripheral T cells with a CD62LlonegCD44hi memory T cell phenotype as a result of lymphopenia-induced expan- sion7, the frequency of CD62LlonegCD44hi T cells in Themis/ Ptpn6fl/flCd4-Cre mice was similar to that in Themis / Ptpn6 / Cd4- Cre mice (Fig. 4a). Deletion of Ptpn6 at an earlier stage of development (predominantly at the DN stage) through the use of an LCKCre trans- gene23 resulted in a nearly complete absence of SHP-1 protein in total thymocytes and also substantially alleviated the developmental block caused by the deletion of Themis (Supplementary Fig. 2). Together these results indicated that the developmental defect in Themis/ thymocytes was due to the enhanced PTP activity of SHP-1. Regulation of active-site oxidation of SHP-1 by THEMIS All classical PTPs, including SHP-1 and SHP-2, contain a conserved active-site cysteine residue (with an unusually low acidic dissociation constant) that catalyzes the removal of phosphate from phosphor- ylated tyrosines6. However, the catalytically active deprotonated (S) thiolate state of the active-site cysteine is highly susceptible to oxida- tion by intracellular reactive oxygen species (ROS), which inactivate the PTP6. To determine if the binding of THEMIS to SHP-1 directly regulates the redox state of the active-site cysteine, we added pervana- date, a pantyrosine-phosphatase inhibitor that irreversibly oxidizes Themis1 / Themis1/ US CD3 CD2 US CD3 CD2 SSG 0. 4 58 0. 5 35 104 103 102 101 100 SSG 4 D C 1. 2 62 1. 5 50 100 101 102 103 104 CD8 NS SSG (mg/ml) 0 10 ( s l l l e c 80 ) 70 % 60 50 40 30 20 10 0 o 8 D C 4 D C Themis / Themis/ Figure 3 Inhibition of the PTP activity of SHP-1 restores the in vitro maturation of Themis/ thymocytes. Flow cytometry (top) of Themis/ or Themis / DP thymocytes left unstimulated (US) or treated by a two-step (stimulation-rest) process in vitro with anti-CD3 plus anti-CD2 (CD3 CD2), in the presence ( SSG) or absence (SSG) of the SHP-1 inhibitor sodium stibogluconate (left margin) ; cell recovery and frequency of apoptotic cells (positive for the apoptosis marker annexin V) were similar for Themis/ and Themis / samples treated identically (data not shown). Numbers under outlined areas (top) indicate percent CD4 CD8lo cells. Below, summary of results above. P < 0. 05 (t-test two-tailed equal variance). Data are representative of (top) or from (bottom) four experiments with n 1 mouse per genotype in each (error bars, s. d. ). PTP active-site cysteine residues to the sulfonic acid (S-O3H) form24, to cell-free suspensions of GSTSHP-1 in the presence or absence of THEMIS. Oxidized SHP-1 was detected by immunoblot analysis with a monoclonal antibody specific for sulfonylated PTP active-site cysteines25. Oxidation of SHP-1 by pervanadate was enhanced in the presence of THEMIS, and this effect was most evident at concen- trations of pervanadate that resulted in sub-maximal oxidation of SHP-1 (Fig. 5a and Supplementary Fig. 3a). THEMIS also increased the susceptibility of SHP-1 to oxidation by pervanadate in HEK-293 cells co-transfected to express THEMIS and SHP-1 (Fig. 5b and Supplementary Fig. 3b). To evaluate the redox status of SHP-1 in Themis/ thymocytes, we labeled catalytically active SHP-1 at the time of cell lysis by the addi- tion of iodoacetylpolyethylene glycolbiotin, which immediately and irreversibly binds to reduced, de-protonated (-S) cysteine thiols25. The abundance of catalytically active SHP-1 was slightly but consist- ently greater in Themis/ total thymocytes and was lower in total thy- mocytes with transgenic expression of THEMIS14 than in Themis / (control) total thymocytes (Fig. 5c). Lysis of thymocytes in the absence of PTP inhibitors resulted in the rapid oxidation and inactivation of SHP-1 (Supplementary Fig. 3c, d) ; consequently, we were unable to accurately evaluate the PTP activity of SHP-1 immunoprecipitated from thymocyte lysates by the tyrosine-phosphatase assay. However, SHP-1 was much less susceptible to oxidation by pervanadate in Themis/ total thymocytes than in Themis / total thymocytes (Fig. 5d and Supplementary Fig. 3e). The susceptibility of SHP-1 to oxidation by pervanadate was restored in Themis/ thymocytes with trans- genic expression of THEMIS2 (ref. 13) (Fig. 5e), which demonstrated 436 VOLUME 18 NUMBER 4 APRIL 2017 NATURE IMMUNOLOGY a Themis / Ptpn6 / Cd4-Cre Themis/ Ptpn6 / Cd4-Cre Themis/ Ptpn6 / Cd4-Cre Themis / Ptpn6 / Cd4-Cre 105 104 103 102 0 4 D C Thymus Total TCRhi Spleen Total CD4SP 105 104 103 0 4 D C 105 104 103 0 L 2 6 D C 0 103 104 105 0 103 104 105 0 103 104 105 0 103 104 105 CD8 CD8 CD44 A R T I C L E S NS NS b ) 6 0 1 ( s l l e c P S 4 D C 14 12 10 8 6 4 2 0 NS NS * Thymus ) 6 0 1 ( s l l e c P S 8 D C 4 3 2 1 0 NS * * ) 6 0 1 ( s l l e c P S 4 D C 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 NS NS * Spleen ) 6 0 1 ( s l l e c P S 8 D C 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Themis / Ptpn6 / Cd4-Cre Themis/ Ptpn6 / Cd4-Cre Themis/ Ptpn6 / Cd4-Cre Themis / Ptpn6 / Cd4-Cre c Themis : Ptpn6 : Cd4-Cre : / / / / / / ! / ! ! / ! THEMIS SHP-1 Actin Figure 4 Deletion of Ptpn6 alleviates the developmental block in Themis/ thymocytes. (a) Flow cytometry of cells from the thymus (left) or spleen (right) of Themis / Ptpn6 / Cd4-Cre mice, Themis/ Ptpn6 / Cd4-Cre mice, Themis/ Ptpn6fl/flCd4-Cre mice or Themis / Ptpn6fl/flCd4-Cre mice (left margin), assessing the staining of CD4 versus CD8 on total thymocytes (left column) or gated TCRhi thymocytes (right column) (thymus), or the staining CD4 versus CD8 on total splenocytes (left column) or staining of CD62L versus CD44 on gated CD4SP T cells (right column) (spleen). Numbers adjacent to outlined areas indicate percent cells in each gated area. (b) Quantification of CD4SP cells and CD8SP cells in the thymus and spleen of mice of the genotypes in a (key). (c) Immunoblot analysis of THEMIS, SHP-1 and actin (loading control) in the thymocytes in a (genotypes, above lanes). P < 0. 05, P < 0. 01 and P < 0. 005 (t-test). Data are from one experiment representative of four experiments with n 1 mouse per genotype in each (a, c) or are from four experiments with n 1 mouse per genotype in each (b ; mean s. d. ). a function shared by THEMIS and THEMIS2. The activation of T cells and B cells results in the production of ROS, predominantly H2O2, and this effect has been shown to positively regulate both TCR and BCR signaling and effector responses through oxidative inhibition of SHP-1 (refs. 2628). In the presence of THEMIS, active-site oxidation of SHP-1 by H2O2, assessed by immunoblot analysis with antibody to sulfonylated PTP active sites, was markedly increased (Fig. 5f), which indicated that THEMIS regulated the redox state of SHP-1 in response to physiological ROS. Together these results demonstrated that THEMIS inhibited the PTP activity of SHP-1 by promoting or stabilizing ROS-mediated oxidation of the active-site cysteine residue of SHP-1. p-SHP-1 does not correspond with PTP activity We found that phosphorylation of SHP-1, which occurs at two C-terminal tyrosine residues (Tyr536 and Tyr564), was lower in Themis/ total thymocytes than in Themis / total thymocytes (Fig. 6a, b), in confirmation of published results16. The amount of tyrosine-phosphorylated SHP-1 (p-SHP-1) in total thymocytes cor- related with the expression of THEMIS protein, and the amount of p-SHP-1 was restored in Themis/ thymocytes by expression of a transgene encoding THEMIS2 (ref. 13) (Fig. 6ac). The lower abun- dance of p-SHP-1 in Themis/ thymocytes has been interpreted as evidence of diminished catalytic activity of SHP-1 (ref. 16) ; however, phosphorylation of SHP-1 is not required for its PTP catalytic activ- ity, and its physiological relevance has not been established6, 29. The amount of catalytically active SHP-1 in unstimulated Themis/ total thymocytes was greater than, not less than, that in Themis / total thy- mocytes (Fig. 5c, f). Because SHP-1 is a target of SHP-1's phosphatase activity6, 29, 30, we reasoned that the diminished amount of p-SHP-1 in Themis/ thymocytes was secondary to increased auto- or trans- dephosphorylation by SHP-1. Indeed, treatment of both Themis / total thymocytes and Themis/ total thymocytes with pervanadate or H2O2, which inhibit SHP-1 activity, led to an increase in p-SHP-1 relative to its abundance in their untreated counterparts (Fig. 6d, e). Together these results demonstrated that SHP-1's phosphorylation sta- tus could not be used to predict its PTP catalytic activity and suggested that the lower abundance of p-SHP-1 in Themis/ thymocytes was secondary to enhanced auto- or trans-dephosphorylation by SHP-1. Themis/ signaling defects in the presence of ROS In contrast to mature T cells, in which engagement of the TCR induces the production of ROS3133, stimulation of thymocytes via the TCR failed to elicit ROS34 (Supplementary Fig. 4a). However, ROS are induced in thymocytes by stimulation with the lectin concanavalin A34, which engages multiple cell-surface molecules in addition to the TCR. Tyrosine-phosphorylation of the PTK ZAP-70 (p-ZAP-70), a known target of SHP-1 (refs. 6, 35), at Tyr319 was lower in Themis/ total thymocytes than in Themis / total thymocytes following stimu- lation with concanavalin A (Fig. 7a), whereas there was no difference between Themis/ total thymocytes and Themis / total thymocytes in their abundance of p-ZAP-70 following stimulation with anti-CD3 plus anti-CD4 (Fig. 7b, c). However, when H2O2 was added at the time of stimulation with anti-CD3 plus anti-CD4, the tyrosine-phos- phorylation of ZAP-70 induced by this was lower in Themis/ total thymocytes than in Themis / total thymocytes (Fig. 7b). In vitro cell culture promotes ROS production due to high oxygen tension as well as pro-oxidant metabolic and media effects36. Freshly harvested Themis/ total thymocytes exhibited no clear defects in proximal TCR signaling responses relative to those of Themis / total thymocytes (Fig. 7c). However, after in vitro culture for 6 h, the tyrosine phospho- rylation of ZAP-70, as well as the tyrosine-phosphorylation of LCK (phosphorylated at Tyr394), another putative target of SHP-1 (ref. 37), was lower in Themis/ total thymocytes than in Themis / total thymocytes in response to either stimulation with anti-CD3 plus anti-CD4 (Fig. 7c, d) or stimulation with peptide presented by NATURE IMMUNOLOGY VOLUME 18 NUMBER 4 APRIL 2017 437 d Themis / Themis/ PV (M) : 0 10 25 50100 0 10 25 50100 a c CD3 CD4 (min) : p-SHP-1(Y536) SHP-1 p-SHP-1(Y564) SHP-1 IP : SHP-1 / Themis / Themis 0 1 3 0 1 3 b CD3 CD4 (min) : p-SHP-1(Y564) / THE MIS-Tg Themis / Themis / Themis 0 2 5 0 2 5 0 2 5 0 2 5 SHP-1 THEMIS d PV (mM) : Themis / 0 10 25 50 100 Themis/ 0 10 25 50 100 p-SHP-1(Y564) / / THE MIS2-Tg Themis Themis / Themis / Themis / Themis / THE MIS2-Tg Themis 0 10 50 0 10 50 0 10 50 IP : SHP-1 A R T I C L E S a GSTSHP-1 His-THEMIS 0 0. 2 0. 2 0. 5 0. 5 PV (M) : Oxidized PTP SHP-1 0 20 50 0 20 50 / THE MIS-Tg Themis Themis / b F F-THEMIS SHP-1 PV (M) : Oxidized PTP SHP-1 THEMIS c SA-HRP p-SHP-1(Y564) SHP-1 Oxidized PTP SHP-1 Oxidized PTP SHP-1 e SHP-1 PV (M) : Oxidized PTP SHP-1 THEMIS2 THEMIS1 f / Themis / Themis SHP-1 IP : SHP-1 H2O2 (1 mM) : Oxidized PTP SHP-1 THEMIS Figure 5 THEMIS promotes or stabilizes the oxidation of SHP-1. (a) Immunoblot analysis of the in vitro active-site oxidation of GSTSHP-1 after treatment with various concentrations (above lanes) of pervanadate (PV) in the presence or absence of histidine-tagged (His-) THEMIS (above lanes). (b) Immunoblot analysis of the active-site oxidation of SHP-1 in HEK-293 cells transfected to express a Flag epitope vector (F) or Flag- tagged (F-) THEMIS (above lanes) and treated with various concentrations of pervanadate ; arrowhead (right margin) indicates SHP-1 (throughout). (c) Immunoblot analysis of proteins immunoprecipitated with anti-SHP-1 from total thymocytes of mice with transgenic expression of THEMIS (THEMIS-Tg), or Themis / or Themis/ mice (above lanes) after labeling with iodoacetylpolyethelyene glycolbiotin, probed with streptavidin horseradish peroxidase (SA-HRP) for the detection catalytically active (reduced) SHP-1 (top), antibody to SHP-1 phosphorylated at Tyr564 (p-SHP-1(Tyr564) ; middle) or anti-SHP-1 (bottom). (d) Immunoblot analysis of active-site oxidation of SHP-1 in Themis / and Themis/ thymocytes treated with various concentrations of pervanadate, assessed in cell lysates (top two blots) or proteins immunoprecipitated with anti-SHP-1 (bottom two blots). (e) Immunoblot analysis of thymocytes obtained from Themis / or Themis/ mice or from Themis/ mice with transgenic expression of THEMIS2 (THEMIS2-Tg) (above lanes) and treated with various concentrations of pervanadate, assessed in proteins immunoprecipitated with anti-SHP-1 (top two blots) or cell lysates (bottom two blots). (f) Immunoblot analysis of active-site oxidation of SHP-1 in thymocytes treated with H2O2. Data are representative of two experiments (a, b, d), six experiments (c) or three experiments (e, f). antigen-presenting cells (Supplementary Fig. 4b). Themis/ total thymocytes also exhibited less induction of tyrosine-phosphorylation of LCK and ZAP-70 in response to treatment with H2O2 alone than that of Themis / total thymocytes treated in an identical way (Fig. 7e). De-phosphorylation of ZAP-70 or of the related B cell PTK SYK by SHP-1 was inhibited by THEMIS in HEK-293 cells transfected with plasmids encoding ZAP-70 or SYK plus plasmid encoding SHP-1 and cultured under conditions in which ROS are constitutively produced36 (Fig. 7f, g). THEMIS-mediated inhibition of the PTP activity of SHP-1 in HEK-293 cells transfected with plasmids encoding SYK and SHP-1 (Supplementary Fig. 5a) or in vitro (Supplementary Fig. 5b) was attenuated by the addition of the ROS scavenger N-acetyl- -cysteine, which indicated that the redox regulation of SHP-1 by THEMIS was 0 1 3 0 1 3 0 13 CD3 CD4 (min) : p-SHP-1(Y564) p-SHP-1(Y536) SHP-1 THEMIS THEMIS2 SHP-1 e H2O2 (mM) : p-SHP-1(Y564) SHP-1 Themis / Themis/ 0 0. 5 1 5 0 0. 5 1 5 Figure 6 The diminished tyrosine-phosphorylation of SHP-1 in Themis/ thymocytes is caused by increased PTP activity of SHP-1. (a) Immunoblot analysis of SHP-1 phosphorylated at Tyr536 (p-SHP-1(Y536) or Tyr564 (p-SHP-1(Y564) and total SHP-1 (left margin) in Themis / and Themis/ total thymocytes left unstimulated (0) or stimulated for 1 or 3 min (above lanes) with anti-CD3 plus anti-CD4 (CD3 CD4). (b) Immunoblot analysis of SHP-1 phosphorylated at Tyr564 and total SHP-1, as well as total THEMIS (left margin), in total thymocytes obtained from mice with transgenic expression of THEMIS, and Themis / , Themis / or Themis/ mice (above blots). (c) Immunoblot analysis of tyrosine-phosphorylated and total SHP-1 (as in a ; left margin) in total thymocytes obtained from Themis / and Themis/ mice and Themis/ mice with transgenic expression of THEMIS2 (above blots) and stimulated as in a (above lanes). (d, e) Immunoblot analysis of tyrosine-phosphorylated and total SHP-1 (as in b ; left margin) in total thymocytes obtained from Themis / and Themis/ mice and treated with various concentrations (above lanes) of pervanadate (d) or H2O2 (e). Data are representative of three experiments (a, c), four experiments (b) or six experiments (d, e). dependent upon ROS. Collectively, these results established a posi- tive role for THEMIS in proximal TCR signaling by promoting or stabilizing the oxidation of SHP-1 by ROS. DISCUSSION Here we have shown that a critical function of THEMIS during T cell development is to negatively regulate the activity of the PTP SHP-1 in DP thymocytes and thereby enhance the TCR signaling response to low-affinity self-pMHC and enable positive selection. THEMIS promoted or stabilized oxidation of the catalytic cysteine of SHP-1, which inhibited its PTP activity, and this regulatory activity was conferred by the CABIT modules that bound directly to the PTP domain of SHP-1. While it remains to be determined how the CABIT modules regulate the oxidation of SHP-1, several plausible mechanisms can be suggested on the basis of their inferred structure together with what is already known about the structure and redox regulation of SHP-1. CABIT modules, which are composed of multiple SH3-like - barrel domains9, probably form an extensive protein-binding globu- lar interface that specifically recognizes the PTP domain of SHP-1. The catalytic cysteine residue of all classical PTPs is housed inside a pocket with an aperture that allows the entry of only the phosphate moiety on tyrosine residues38. Thus, binding of the CABIT modules might prevent access of the oxidized catalytic cysteine of SHP-1 to reducing agents such as glutathione in the bulk solvent or to cytosolic 438 VOLUME 18 NUMBER 4 APRIL 2017 NATURE IMMUNOLOGY a Themis / Themis/ ConA (g) : 0 1 3 10 30 0 1 3 10 30 p-ZAP-70(Y319) ZAP-70 b CD3 CD4 : H2O2 (mM) : p-ZAP-70(Y319) ZAP-70 Themis / Themis/ 0 0 0. 5 0. 5 0 0 0. 5 0. 5 A R T I C L E S 0 hours 6 hours Themis / Themis/ Themis / Themis/ 0 5 15 0 5 15 0 5 15 0 5 15 d Themis-Tg Themis / Themis/ 0 2 5 10 0 2 5 10 0 2 5 10 CD3 CD4 (min) : pY p-Lck(Y394) LCK p-ZAP-70(Y319) ZAP-70 p-ZAP-70(Y319) ZAP-70 IP : ZAP-70 c CD3 CD4 (min) : pY p-Lck(Y394) LCK p-ZAP-70(Y319) ZAP-70 p-SHP-1(Y564) SHP-1 THEMIS e Themis / Themis/ H2O2 (mM) : 0 0. 5 1 5 0 0. 5 1 5 p-LCK(Y394) LCK p-ZAP-70(Y319) ZAP-70 f LCK ZAP-70 THEMIS SHP-1 p-ZAP-70(Y319) ZAP-70 p-SHP-1(Y564) SHP-1 LCK THEMIS g SYK THEMIS SHP-1 p-SYK(Y352) SYK p-SHP-1(Y564) SHP-1 THEMIS Figure 7 Attenuated TCR signaling responses in Themis/ thymocytes in the presence of ROS. (a, b) Immunoblot analysis of ZAP-70 phosphorylated at Tyr319 (p-ZAP-70(Y319) and total ZAP-70 (left margins) in Themis / and Themis/ total thymocytes stimulated with various concentrations (above lanes) of concanavalin A (ConA) (a) or with various concentrations (above lanes) of H2O2 in the presence ( ) or absence () of anti-CD3 plus anti-CD4 (b). (c) Immunoblot analysis of signaling responses (left margin) in Themis / or Themis/ total thymocytes cultured for 0 h (left) or 6 h (right) at 37 C in serum-free medium and left unstimulated (0) or stimulated for 5 or 15 min (above lanes) with anti-CD3 plus anti-CD4, assessed as tyrosine phosphorylation (pY), LCK phosphorylated at Tyr394 (p-LCK(Y394) and total LCK, tyrosine-phosphorylated and total ZAP-70 (as in a, b), SHP-1 phosphorylated at Tyr564 (p-SHP-1(Y564) and total SHP-1, and total THEMIS (left margin). (d) Immunoblot analysis of signaling responses (left margin ; as in c) in total thymocytes obtained from mice with transgenic expression of THEMIS, or Themis / or Themis/ mice, then cultured for 6 h at 37 C in serum-free medium and left unstimulated (0) or stimulated for 2, 5 or 10 min (above lanes) with anti-CD3 plus anti-CD4. (e) Immunoblot analysis of tyrosine-phosphorylated and total LCK and ZAP-70 (as in c) in Themis / or Themis/ total thymocytes treated with various concentrations (above lanes) of H2O2. (f) Immunoblot analysis of tyrosine-phosphorylated and total ZAP-70 and SHP-1 (as in c), and total LCK and THEMIS (left margin), in HEK-293 cells transfected with various combinations (above lanes) of plasmids encoding LCK (always included, to induce phosphorylation of ZAP-70), ZAP-70, THEMIS and/or SHP-1. (g) Immunoblot analysis of SYK phosphorylated at Tyr352 (p-SYK(Y352) and total SYK, tyrosine-phosphorylated and total SHP-1 (as in c) and total THEMIS in HEK-293 cells transfected with various combinations (above lanes) of plasmids encoding SYK, THEMIS and SHP-1. Data are representative of three experiments (a, b, d, e), four experiments (c) or two experiments (f, g). redox-regulatory proteins39. Alternatively, the CABIT modules might stabilize the PTP domain of SHP-1 in an unfolded state, which would expose the catalytic cysteine to oxidation by ROS or prevent reactiva- tion of the oxidized catalytic cysteine by inhibiting intra-molecular relay of sulfenic acid to the two regulatory cysteine residues (Cys329 and Cys363) in SHP-1 (refs. 40, 41). We note that our in vitro PTP- inhibition data suggest that the inhibitory effect of THEMIS cannot be explained solely by redox regulation. Thus, binding of the CABIT modules probably also blocks access of the catalytic cysteine to phos- phorylated-tyrosine ligands, a mechanism of inhibition that is not mutually exclusive with redox regulation. Although the CABIT modules of THEMIS bound directly to SHP-1, experimental data suggest that the interaction of THEMIS with GRB2 is important for its in vivo function12, 18, 20. Co-binding of SHP-1 and THEMIS to GRB2 brings these proteins into close proximity and might facilitate and stabilize their direct interaction. In addition, following engagement of the TCR, GRB2, via its SH2 domain, recruits SHP-1 to tyrosine-phosphorylated ligands at the cell membrane, including LAT and CD28 (ref. 42). Thus, the binding to GRB2 ensures that THEMIS is positioned to affect the activity of the cellular portion of SHP-1 that is presumably the most relevant to TCR signaling. Finally, GRB2 might also be needed to position SHP-1 and THEMIS near sites of ROS production by NADPH oxidases at the cell membrane. It has been proposed that THEMIS enhances the activity of SHP-1, either directly or by assisting in its recruitment to LAT, and thereby acts to dampen TCR signaling in DP thymocytes16. According to that model, the PTP activity of SHP-1 is diminished in Themis/ DP thymocytes, and engagement of the TCR by low-affinity ligands that normally promote positive selection results in the transduction of enhanced signaling responses that trigger negative selection16. Our results do not support that model. If the thymocyte-maturation defect of Themis/ mice was caused by diminished SHP-1 activity, deletion of Ptpn6 or inhibition of the PTP activity of SHP-1 should not have rescued', and might possibly have exacerbated, the block in T cell development in Themis/ mice. Instead, inhibition of the PTP activity of SHP-1 or deletion of Ptpn6 in DP thymocytes allevi- ated the developmental block imposed by THEMIS deficiency ; these results identified enhanced PTP activity of SHP-1 as the underlying cause of the maturational defect in Themis/ thymocytes. It is also NATURE IMMUNOLOGY VOLUME 18 NUMBER 4 APRIL 2017 439 A R T I C L E S relevant that T cell development is not rescued in either Themis/ mice deficient in BIM, a proapoptotic member of the BCL-2 family of prosurvival proteins (Bim/)14 or Themis/ mice with transgenic expression of BCL-2 (ref. 7), which indicates that the developmental block in Themis/ thymocytes is not secondary to increased negative selection, as has been speculated16. It is well established that DP thymocytes are more sensitive to TCR stimulation than are mature T cells19. Although the mechanism(s) underlying this sensitivity has (have) remained unclear, the enhanced signaling ability of DP thymocytes is thought to be especially impor- tant for positive selection, which is mediated by signals generated from low-affinity TCRself-pMHC interactions in the thymus. Our results, together with the profound block in positive selection exhib- ited by Themis/ thymocytes, suggest that THEMIS might be respon- sible for the selective sensitivity of DP thymocytes to engagement of the TCR. Consistent with that, DP thymocytes have high expres- sion of THEMIS, but its expression is downregulated as thymocytes transition to the SP stage and become less responsive to low-affin- ity self ligands7, a property that is necessary for the prevention of autoimmunity. Thus, stage-specific regulation of THEMIS represents a mechanism for transient and selective attenuation of SHP-1 activity in DP thymocytes to enable positive selection while preserving the SHP-1-mediated inhibitory pathway for limiting the responsiveness of mature T cells. Our results suggest that in addition to regulating SHP-1, THEMIS might also regulate the activity of SHP-2, a closely related class I SH2 domain PTP. THEMIS bound to SHP-2, and the PTP activity of SHP- 2 was attenuated by THEMIS (albeit only slightly in in vitro assays). If THEMIS does have an inhibitory effect on SHP-2 in thymocytes, this might help to explain the observation that under certain stimu- latory conditions, the kinase ERK and calcium signaling responses to engagement of the TCR are enhanced in Themis/ thymocytes16. Unlike SHP-1, which is thought to have an exclusively inhibitory role in signal transduction, SHP-2 positively regulates ERK and calcium- NFATmediated signaling6, 43, 44. However, it is notable that in contrast to the rescue' observed in Themis/Ptpn6/ mice, deletion of the gene encoding SHP-2 (Ptpn11) did not alleviate the block in positive selection in Themis/ mice (data not shown), which would indicate that the main function of THEMIS in thymocytes is to regulate the catalytic activity of SHP-1. Our results have also identified an important role for ROS in thy- mocyte selection. Published data have suggested that ROS might have a role in positive selection and the maturation of SP thymocytes, but this mechanism has not been investigated extensively45, 46. ROS, gener- ated following the activation of T cells by the cell-membrane NADPH oxidase NOX2 or by mitochondria as a result of metabolic repro- gramming', or locally produced by macrophages at sites of inflamma- tion, have been shown to positively regulate the activation and effector responses of mature T cells, in part by inhibition of SHP-1 (ref. 47). The origin of ROS production in the thymus remains to be elucidated and could include both intrinsic (thymocyte-derived) sources and extrinsic (cortical epithelial, dendritic cell or macrophage) sources. The defects in TCR signaling in Themis/ thymocytes, which stem at least in part from diminished oxidative inactivation of SHP-1 by ROS, are most clearly revealed under conditions in which ROS are generated or present during TCRco-receptor engagement. This provides an explanation for the relatively mild signaling defects and the contradictory results reported by studies in which activation of Themis/ thymocyte was performed under conditions in which ROS are not present or are not produced7, 8, 14, 16. Analysis of a comprehensive collection of over 100 species across the eukaryotic tree has revealed that the CABIT module is found only in metazoa and that its emergence correlates with the expansion of the phosphorylated-tyrosine signaling network9 (data not shown). Together with the biochemical function established for THEMIS in our study here, this suggests that the CABIT module evolved in metazoa as a mechanism for regulating phosphorylated-tyro- sine signaling. The sequence diversity outside the core sequence of CABIT modules raises the possibility that different CABIT modules might have evolved to interact with distinct PTPs. That, combined with organ-restricted or developmentally restricted expression of CABIT proteins, such as that exhibited by THEMIS, could represent a novel mechanism for selective regulation of PTKPTP signaling responses in particular cellular contexts or during specific stages of maturation. METHODS Methods, including statements of data availability and any associated accession codes and references, are available in the online version of the paper. Note : Any Supplementary Information and Source Data files are available in the online version of the paper. ACKNOWLEDGMENTS We thank M. Muschen (University of California, San Francisco) for Ptpn6flox/flox mice ; H. Gu (McGill University) for Grb2fl/fl mice ; A. Ullrich (Max-Plank Institute, Germany) for Ptpn6 cDNA ; L. Tautz (Sanford-Burnham Medical Research Institute) for Ptpn7 cDNA ; J. Chernoff (Fox Chase Cancer Center) for plasmid encoding hemagglutinin-tagged PTPN1 ; and A. Bhandoola, R. Bosselut, R. Cornall, K. Pfeifer and A. Singer for critical review of the manuscript. Supported by the Intramural Research Program of the Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (1ZIAHD001803 to P. E. L. ) and by the Intramural Research Program of the National Library of Medicine (L. A. ). AUTHOR CONTRIBUTIONS S. C. , C. W. , E. Z. , J. L. and J. A. performed the experiments ; S. C. , R. L. and P. E. L. were responsible for the concept and experimental design ; L. A. performed proteomics, protein modeling and evolutionary analysis for the CABIT module and CABIT proteins ; and P. E. L. wrote the manuscript. COMPETING FINANCIAL INTERESTS The authors declare no competing financial interests. Reprints and permissions information is available online at reprints/index. html. 1. Koch, U. & Radtke, F. Mechanisms of T cell development and transformation. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 539562 (2011). 2. Aifantis, I. , Mandal, M. , Sawai, K. , Ferrando, A. & Vilimas, T. Regulation of T-cell progenitor survival and cell-cycle entry by the pre-T-cell receptor. Immunol. Rev. 209, 159169 (2006). 3. Starr, T. K. , Jameson, S. C. & Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139176 (2003). 4. Hogquist, K. A. & Jameson, S. C. The self-obsession of T cells : how TCR signaling thresholds affect fate decisions' and effector function. Nat. Immunol. 15, 815823 (2014). 5. Brownlie, R. J. & Zamoyska, R. T cell receptor signalling networks : branched, diversied and bounded. Nat. Rev. Immunol. 13, 257269 (2013). 6. Pao, L. I. , Badour, K. , Siminovitch, K. A. & Neel, B. G. Nonreceptor protein-tyrosine phosphatases in immune cell signaling. Annu. Rev. Immunol. 25, 473523 (2007). 7. Lesourne, R. et al. Themis, a T cell-specic protein important for late thymocyte development. Nat. Immunol. 10, 840847 (2009). 8. Fu, G. et al. Themis controls thymocyte selection through regulation of T cell antigen receptor-mediated signaling. Nat. Immunol. 10, 848856 (2009). 9. Johnson, A. L. et al. Themis is a member of a new metazoan gene family and is required for the completion of thymocyte positive selection. Nat. Immunol. 10, 831839 (2009). 10. Kakugawa, K. et al. A novel gene essential for the development of single positive thymocytes. Mol. Cell. Biol. 29, 51285135 (2009). 11. Patrick, M. S. et al. Gasp, a Grb2-associating protein, is critical for positive selection of thymocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 1634516350 (2009). 440 VOLUME 18 NUMBER 4 APRIL 2017 NATURE IMMUNOLOGY A R T I C L E S 12. Paster, W. et al. GRB2-mediated recruitment of THEMIS to LAT is essential for thymocyte development. J. Immunol. 190, 37493756 (2013). 13. Lesourne, R. et al. Interchangeability of Themis1 and Themis2 in thymocyte development reveals two related proteins with conserved molecular function. J. Immunol. 189, 11541161 (2012). 14. Zvezdova, E. et al. Themis1 enhances T cell receptor signaling during thymocyte development by promoting Vav1 activity and Grb2 stability. Sci. Signal. 9, ra51 (2016). 15. Paster, W. et al. A THEMIS : SHP1 complex promotes T-cell survival. EMBO J. 34, 393409 (2015). 16. Fu, G. et al. Themis sets the signal threshold for positive and negative selection in T-cell development. Nature 504, 441445 (2013). 17. Gascoigne, N. R. & Acuto, O. THEMIS : a critical TCR signal regulator for ligand discrimination. Curr. Opin. Immunol. 33, 8692 (2015). 31. Devadas, S. , Zaritskaya, L. , Rhee, S. G. , Oberley, L. & Williams, M. S. Discrete generation of superoxide and hydrogen peroxide by T cell receptor stimulation : selective regulation of mitogen-activated protein kinase activation and fas ligand expression. J. Exp. Med. 195, 5970 (2002). 32. Los, M. et al. IL-2 gene expression and NF- B activation through CD28 requires reactive oxygen production by 5-lipoxygenase. EMBO J. 14, 37313740 (1995). 33. Jackson, S. H. , Devadas, S. , Kwon, J. , Pinto, L. A. & Williams, M. S. T cells express a phagocyte-type NADPH oxidase that is activated after T cell receptor stimulation. Nat. Immunol. 5, 818827 (2004). 34. Pani, G. , Colavitti, R. , Borrello, S. & Galeotti, T. Endogenous oxygen radicals modulate protein tyrosine phosphorylation and JNK-1 activation in lectin-stimulated thymocytes. Biochem. J. 347, 173181 (2000). 35. Plas, D. R. et al. Direct regulation of ZAP-70 by SHP-1 in T cell antigen receptor 18. Okada, T. et al. Differential function of Themis CABIT domains during T cell signaling. Science 272, 11731176 (1996). development. PLoS One 9, e89115 (2014). 19. Davey, G. M. et al. Preselection thymocytes are more sensitive to T cell receptor stimulation than mature T cells. J. Exp. Med. 188, 18671874 (1998). 20. Zvezdova, E. et al. In vivo functional mapping of the conserved protein domains within murine Themis1. Immunol. Cell Biol. 92, 721728 (2014). 21. Cibotti, R. , Punt, J. A. , Dash, K. S. , Sharrow, S. O. & Singer, A. Surface molecules that drive T cell development in vitro in the absence of thymic epithelium and in the absence of lineage-specic signals. Immunity 6, 245255 (1997). 22. Pathak, M. K. & Yi, T. Sodium stibogluconate is a potent inhibitor of protein tyrosine phosphatases and augments cytokine responses in hemopoietic cell lines. J. Immunol. 167, 33913397 (2001). 23. Lee, P. P. et al. A critical role for Dnmt1 and DNA methylation in T cell development, function, and survival. Immunity 15, 763774 (2001). 24. Huyer, G. et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. J. Biol. Chem. 272, 843851 (1997). 25. Karisch, R. & Neel, B. G. Methods to monitor classical protein-tyrosine phosphatase 36. Halliwell, B. Cell culture, oxidative stress, and antioxidants : avoiding pitfalls. Biomed. J. 37, 99105 (2014). 37. Stefanova, I. et al. TCR ligand discrimination is enforced by competing ERK positive and SHP-1 negative feedback pathways. Nat. Immunol. 4, 248254 (2003). 38. Andersen, J. N. et al. Structural and evolutionary relationships among protein tyrosine phosphatase domains. Mol. Cell. Biol. 21, 71177136 (2001). 39. Tanner, J. J. , Parsons, Z. D. , Cummings, A. H. , Zhou, H. & Gates, K. S. Redox regulation of protein tyrosine phosphatases : structural and chemical aspects. Antioxid. Redox Signal. 15, 7797 (2011). 40. Pregel, M. J. & Storer, A. C. Active site titration of the tyrosine phosphatases SHP-1 and PTP1B using aromatic disuldes. Reaction with the essential cysteine residue in the active site. J. Biol. Chem. 272, 2355223558 (1997). 41. Chen, C. Y. , Willard, D. & Rudolph, J. Redox regulation of SH2-domain-containing protein tyrosine phosphatases by two backdoor cysteines. Biochemistry 48, 13991409 (2009). 42. Smith-Garvin, J. E. , Koretzky, G. A. & Jordan, M. S. T cell activation. Annu. Rev. oxidation. FEBS J. 280, 459475 (2013). Immunol. 27, 591619 (2009). 26. Michalek, R. D. et al. The requirement of reversible cysteine sulfenic acid formation 43. Bunda, S. et al. Inhibition of SHP2-mediated dephosphorylation of Ras suppresses for T cell activation and function. J. Immunol. 179, 64566467 (2007). 27. Singh, D. K. et al. The strength of receptor signaling is centrally controlled through a cooperative loop between Ca2 and an oxidant signal. Cell 121, 281293 (2005). 28. Capasso, M. et al. HVCN1 modulates BCR signal strength via regulation of BCR- dependent generation of reactive oxygen species. Nat. Immunol. 11, 265272 (2010). 29. Lorenz, U. SHP-1 and SHP-2 in T cells : two phosphatases functioning at many levels. Immunol. Rev. 228, 342359 (2009). 30. Ozawa, T. , Nakata, K. , Mizuno, K. & Yakura, H. Negative autoregulation of Src homology region 2-domain-containing phosphatase-1 in rat basophilic leukemia- 2H3 cells. Int. Immunol. 19, 10491061 (2007). oncogenesis. Nat. Commun. 6, 8859 (2015). 44. Fang, X. et al. Shp2 activates Fyn and Ras to regulate RBL-2H3 mast cell activation following FcepsilonRI aggregation. PLoS One 7, e40566 (2012). 45. Moon, E. Y. , Han, Y. H. , Lee, D. S. , Han, Y. M. & Yu, D. Y. Reactive oxygen species induced by the deletion of peroxiredoxin II (PrxII) increases the number of thymocytes resulting in the enlargement of PrxII-null thymus. Eur. J. Immunol. 34, 21192128 (2004). 46. Jin, R. et al. Trx1/TrxR1 system regulates post-selected DP thymocytes survival by modulating ASK1-JNK/p38 MAPK activities. Immunol. Cell Biol. 93, 744752 (2015). 47. Simeoni, L. & Bogeski, I. Redox regulation of T-cell receptor signaling. Biol. Chem. 396, 555568 (2015). NATURE IMMUNOLOGY VOLUME 18 NUMBER 4 APRIL 2017 441 ONLINE METHODS Mice. Themis/ mice7 and mice with transgenic expression of THEMIS13 were generated as described. Ptpn6flox/flox mice48 were obtained from M. Muschen (UCSF). Grb2flox/flox mice49 were obtained from H. Gu (McGill University). LCK-Cre and CD4-Cre transgenic mice23 were obtained from Taconic. All animal experiments were performed according to ACUC approved protocols (ASP# 15-020 ; PEL). Antibodies and reagents. For stimulation, biotin-anti-CD3 (553060), biotin- anti-CD4 (553728), and biotin-anti-CD28 (553296), used at 0. 5 g each per 1 107 thymocytes, were from BD Biosciences. For immunoprecipita- tion, anti-Flag (F1804) Sigma-Aldrich ; anti-SHP-1 (SC287) and anti-SHP- 2 (SC280), with 1 g of antibody used for 1 107 thymocytes, were from Santa Cruz. For immunoblot analysis, anti-pTyr (05321), anti-GST (06332), anti-ERK (06182), anti-SHP-1 (06117) EMD Millipore ; anti-pTyr564-SHP-1 (8849) and anti-pTyr416-Src (2101) were from Cell signaling Technology ; anti-pTyr319-ZAP-70 (612574) and anti-GRB2 (610111) were from BD Biosciences ; anti-LCK (SC433), anti-SYK (SC1077), anti-ZAP-70 (SC574), anti-pERK (SC7383) and anti-hemagglutinin tag (SC805) were from Santa Cruz ; anti-PTPN7 (ab118978) was from Abcam ; anti-Myc tag (M0473) was from MBL International ; anti-SHP-1 (MS1190) was from Thermo Fisher ; anti-pTyr536-SHP-1(SP1571) was from ECM Biosciences ; anti- actin (A5441) was from Sigma-Aldrich ; and anti-oxidized PTP active site mAb (MAB2844) was from R&D Systems. The antibodies for immunoblot analysis were diluted 1 : 1, 000. The rabbit polyclonal antiserum to THEMIS7 or THEMIS2 (ref. 13) has been described. Streptavidin-HRP conjugate was purchased from Sigma-Aldrich. Streptavidin was purchased from Southern Biotechnology. Plasmids and constructs. The constructs for Flag-tagged THEMIS and deletion mutants were subcloned into pFLAG-CMV2 vector by PCR with THEMIS-eGFP plasmid9. GST-THEMIS was subcloned into pEBG vector by PCR. THEMIS (C153A and C413A) was generated by site-directed muta- genesis with the Quik Change Kit (Stratagene). FLAG-tagged THEMIS2 was subcloned into pFLAG-CMV2 vector by PCR with mouse cDNA for THEMIS2 from ImaGene. Ptpn6 cDNA was obtained from A. Ullrich (Max-Plank Institute, Germany). SHP-1 deletion mutants were subcloned into pCDNA3 vector by PCR from Ptpn6 wild type cDNA. Ptpn7 cDNA was provided by L. Tautz (Sanford-Burnham Medical Research Institute). Plasmid encod- ing hemagglutinin-tagged PTPN1 was a gift from J. Chernoff (Fox Chase Cancer Center). Immunoprecipitation and immunoblot analysis. Thymocytes were stimu- lated with anti-CD3 biotin plus anti-CD4 biotin followed by cross-linking with streptavidin. Cells were then washed in ice-cold PBS and, unless stated otherwise, were lysed in standard lysis buffer (1% Nonidet P-40, 10 mM Tris (pH 7. 5), 150 mM NaCl, 2 mM EGTA, 50 mM -glycerophosphate, 2 mM Na3VO4, 10 mM NaF, and protease inhibitors (Roche). Immunoprecipitation and immunoblot analysis were performed as described14. Transient Transfections. HEK-293 cells were cultured in DMEM supplemented with 10% (vol/vol) FBS and 2 mM glutamine, plus penicillin and streptomycin (100 U/ml each). 1 106 cells were co-trans- fected with the appropriate plasmid using Lipofectamine 2000 (Thermo Scientific). For pervanadate treatment, cells were first serum starved for 16 h after transfection. GST-precipitation assays. GSTSHP-1 protein was purchased from Abcam. His-tagged THEMIS protein was purified by Ni-NTA column from the trans- formed Escherichia coli bacterial strain BL21DE3. GST fusion proteins were incubated with the indicated His-tagged proteins in GST binding buffer (30 mM HEPES (pH 7), 100 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mg/ml BSA, 1 mM Na3VO4, 10 mM NaF and protease inhibitors) for 30 min on ice and then glutathione-Sepharose (GE Healthcare) was added. After incu- bation for 30 min at 4 C, this mixture was washed three times with GST wash buffer : [0. 2% Triton X-100 and 1 mM Na3VO4 in 1 PBS]. In vitro PTP assay. GSTSHP-1, GST-PTPN1, and GST-PTPN7 fusion pro- teins were purchased from Abcam. GSTSHP-2 protein was purified with glutathione-Sepharose columns from the transformed E. coli bacterial strain BL21DE3. Purified PTP proteins were incubated with or without His-THEMIS (or variant), His-THEMIS2 and/or GRB2 proteins at a 1 : 5 molar ratio for 10 min on ice. PTP substrate peptide (RRLIEDAEpYAARG) was added at a concentration of 0. 2 mM in phosphatase assay buffer (20-180, EMD Millipore) and incubated for 30 min at room temperature. Released phosphate was detected by addition of malachite green (17-125, EMD Millipore) and quan- titated from a standard curve. N-acetyl-L-cysteine was obtained from Sigma (Cat# A9165). Detection of reduced (catalytically active) SHP-1. Reduced SHP-1 was detected by direct labeling of cell lysates with Iodoacetyl PEG-biotin (21334, Thermo Scientific). Cells were lysed in degassed oxidation lysis buffer (50 mM Tris (pH 7. 5), 100 mM NaCl, 0. 1% SDS, 0. 5% Sodium Deoxycholate, 0. 5% NP-40, 0. 5% Triton X-100, 50 mM NaF, 1 mM PMSF, 0. 4 mM Iodoacetyl PEG-biotin, 100 M DTPA, 200 U/ml catalase, and protease inhibitors). Lysates were immunoprecipitated with anti-SHP-1 overnight. Protein G-Sepharose was added and lysates were rotated for 1 h at 4 C. Beads were washed three times with oxidation wash buffer (50 mM Tris (pH 7. 5), 100 mM NaCl, 0. 5% NP-40, 0. 5% Triton X-100, 50 mM NaF). Proteins were eluded with SDS load- ing buffer, separated on SDS-PAGE then transferred to PVDF membranes. Blots were probed with Streptavidin-HRP. Analysis of SHP-1 oxidation after stimulation with pervanadate or H2O2. Thymocytes or HEK-293 cells were stimulated with pervanadate for 10 min or H2O2 for 5 min at room temperature. Pervanadate (1 mM stock) was pre- pared with 1 mM Na3VO4 mixed with 5 mM H2O2. H2O2 (final concentration) was 0. 5-5 mM as noted for individual experiments. Following treatment, cells were washed with degassed 1 PBS and lysed in degassed standard lysis buffer including 10 mM iodoacetamide and 10 mM NEM. Immunoblot analysis of SHP-1 oxidation was performed with antibody to oxidized PTP active site. In vitro oxidation of SHP-1. GSTSHP-1 fusion protein was incubated with glutathione-Sepharose for 30 min in degassed GST binding buffer minus Na3VO4 and washed with degassed 1 GST wash buffer minus Na3VO4. Beads were incubated with or without His-THEMIS fusion protein in phosphatase assay buffer for 10 min on ice and then pervanadate was added and protein solution was incubated for 10 min at room temperature. Reactions were washed with degassed GST wash buffer minus Na3VO4. SHP-1 oxidation was visual- ized by immunoblot analysis with antibody to oxidized PTP active site. In vitro thymocyte-differentiation assay. The in vitro thymocyte differentia- tion assay was performed as described21. In brief, DP thymocytes purified by magnetic bead enrichment (Miltenyi) were resuspended in RPMI 1640 (supplemented with 50 M 2-mercaptoethanol and 10% charcoal/dextran treated FBS) and incubated overnight in wells coated with anti-CD3 (10 g/ml) plus anti-CD2 (5 g/ml ; RM2-5 ; BD Biosciences). Cells were extensively washed and either analyzed immediately by flow cytometry (stimulatory culture) or incubated for 24 h in the same medium before analysis by flow cytometry (recovery culture). Sodium stibogluconate (CAS16037-91-5) was from EMD Millipore. Statistics. For PTP assays and cell (thymocyte and lymphocyte) counts, signifi- cance was calculated by t-test, 2-tailed, type 2 (unpaired equal variance). Data availability. The authors declare that the data supporting the findings of this study are available within the paper and its supplementary informa- tion files. 48. Pao, L. I. et al. B cell-specic deletion of protein-tyrosine phosphatase Shp1 promotes B-1a cell development and causes systemic autoimmunity. Immunity 27, 3548 (2007). 49. Jang, I. K. et al. Grb2 functions at the top of the T-cell antigen receptor-induced tyrosine kinase cascade to control thymic selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107, 1062010625 (2010). NATURE IMMUNOLOGY doi : 10. 1038/ni. 3692 C O R R I G E N D A A N D E R R ATA Corrigendum : Quantifying the shifting landscape of B cell immunodominance Gordon A Dale, Jessica R Shartouny & Joshy Jacob Nat. Immunol. 18, 367368 (2017) ; published online 22 March 2017 ; corrected after print 3 April 2017 In the version of this article initially published, a spelling error was made in the citation list. The error has been corrected in the HTML and PDF versions of the article. Erratum : Epigenetic landscapes reveal transcription factors that regulate CD8 T cell differentiation Bingfei Yu, Kai Zhang, J Justin Milner, Clara Toma, Runqiang Chen, James P Scott-Browne, Renata M Pereira, Shane Crotty, John T Chang, Matthew E Pipkin, Wei Wang & Ananda W Goldrath Nat. Immunol. ; doi : 10. 1038/ni. 3706 ; corrected online 27 March 2017 In the version of this article initially published online, some labels in Figure 2 were illegible or incorrect. Those should read Enhancers ( 103) along the top and TE, MP and M (top to bottom) along the left margin of Figure 2a ; N, TE, MP and M (left to right) above the plot in Figure 2b ; and GO below the plot in Figure 2c. Also, in the third sentence of the final paragraph of the final subsection of Results (Validation of PageRank- predicted TFs), the description of the control cells (shCon-transfected) was incorrect. The correct text is . lower among shNr3c1-transduced cells than among shCon-transduced cells. The errors have been corrected in the print, PDF and HTML versions of this article. Erratum : THEMIS enhances TCR signaling and enables positive selection by selective inhibition of the phosphatase SHP-1 Seeyoung Choi, Claude Warzecha, Ekaterina Zvezdova, Jan Lee, Jérémy Argenty, Renaud Lesourne, L Aravind & Paul E Love Nat. Immunol. ; doi : 10. 1038/ni. 3692 ; corrected online 7 March 2017 In the version of this article initially published online, in the second sentence of the first paragraph of the third subsection of Results (Deletion of Ptpn6 restores T cell development in Themis/ mice'), the TCR chain is identified incorrectly as CD3' ; that phrase should read . antibody to the TCR invariant chain CD3 (anti-CD3). instead. In the legend to Figure 3, the P value (< 0. 005) was incorrect ; the correct value is P < 0. 05. Also, in the final sentence of that legend, the directions (left)' and (right)' are incorrect ; that should read Data are representative of (top) or from (bottom) four experiments. instead. In Figure 4a, the numbers along the horizontal axes are incorrectly vertical ; they should be horizontal instead. In Figure 4b, the labels along the vertical axes of the second and fourth plots incorrectly include (%)' ; the correct label is CD8SP cells (106)' only. In the third sentence of the first paragraph of the fifth subsection of Results (p-SHP-1 does not correspond with PTP activity'), the word of' is missing ; this should read The lower abundance of p-SHP-1. instead. In the legend to Figure 5c, the antibody is incorrectly set off in commas ; that should read . immunoprecipitated with anti-SHP-1 from. instead. Finally, Figure 7e is too large and should be the same size as all other panels in that figure. The errors have been corrected in the print, PDF and HTML versions of this article. Erratum : CCL19-CCR7dependent reverse transendothelial migration of myeloid cells clears Chlamydia muridarum from the arterial intima Mark Roufaiel, Eric Gracey, Allan Siu, Su-Ning Zhu, Andrew Lau, Hisham Ibrahim, Marwan Althagafi, Kelly Tai, Sharon J Hyduk, Kateryna O Cybulsky, Sherine Ensan, Angela Li, Rickvinder Besla, Henry M Becker, Haiyan Xiao, Sanjiv A Luther, Robert D Inman, Clinton S Robbins, Jenny Jongstra-Bilen & Myron I Cybulsky Nat. Immunol. 11, 12631272 (2016) ; published online 26 September 2016 ; corrected after print 20 March 2017 In the version of this article initially published, the label along the horizontal axis of the graph in Figure 1a (Dose (mg)') is incorrect. The correct label is Dose (g)'. The error has been corrected in the HTML and PDF versions of the article. NATURE IMMUNOLOGY VOLUME 18 NUMBER 6 JUNE 2017 705 Supplementary Figure 1 THEMIS selectively binds to SHP-1 and SHP-2. a, THEMIS binds to SHP-1 but not PTPN1 or PTPN7. HEK-293 cells were transfected with plasmids encoding Flag-tagged THEMIS plus plasmids encoding SHP-1 (left), PTPN7 (middle) or PTPN1 (right). Cell lysates of transfected cells were analyzed directly by SDS- PAGE and immunoblotting (lower blots) or incubated with anti-Flag and immunoprecipitated proteins were subjected to SDS-PAGE then immunoblotted with the indicated antibodies (upper blots). One representative of two experiments. b, THEMIS binds to SHP-2. HEK-293 cells were transfected with plasmids encoding GST or GST-THEMIS. Lower blot is endogenous SHP-2. Upper blots show GST or GST-THEMIS pull downs blotted with anti-SHP-2 or anti-GST. One representative of two experiments. c, d, THEMIS CABIT modules bind to the SHP-1 PTP domain. Purified His-tagged CABIT-1 (THEMIS-1-260) or CABIT-2 (THEMIS-260-493) and GST- SH2-SHP-1 proteins were incubated in GST binding buffer then incubated with glutathione beads. Bound proteins were subjected to SDS-PAGE and then blotted with anti-His. e, THEMIS-C-A binds SHP-1. CABIT-1 and CABIT-2 core domain cysteine residues were mutated to alanine (C-A). Plasmids encoding THEMIS, THEMIS-C-A and SHP-1 were transfected into HEK-293 cells in the combinations indicated. Flag (THEMIS) immunoprecipitated proteins (upper blot) or cell lysates (lower blot) were blotted for SHP-1. One representative of two experiments. Nature Immunology : doi : 10. 1038/ni. 3692 Supplementary Figure 2 Deletion of Ptpn6 rescues' T cell development in Themis-/- mice. a, Flow cytometry analysis of thymocytes (left) or splenocytes (right) from mice of the indicated genotype. Thymus : two parameter plots show CD4 versus CD8 staining of total thymocytes or gated TCRhi thymocytes. Spleen : two parameter plots show CD4 versus CD8 staining of total spleen cells or CD62L versus CD44 staining of gated CD4 SP cells. Percentage of cells in the indicated quadrants are shown. b, Expression of THEMIS and SHP-1 in total thymocytes from the experiment shown. c, CD4 SP and CD8 SP T cell counts (x106) from thymus and spleen of the indicated mice (see a). Data shown are representative of 3 independent experiments. Error bars are SD, t-test 2-tailed, equal variance. P P P n. s. , not significant (P >. 05). Nature Immunology : doi : 10. 1038/ni. 3692 Supplementary Figure 3 THEMIS promotes or stabilizes active-site oxidation of SHP-1. a, SHP-1 oxidation by pervanadate (PV) in vitro. Repeat of experiment shown in Fig. 5a. b, SHP-1 oxidation by PV in transfected HEK293 cells. Repeat of experiment shown in Fig. 5b. c, SHP-1 is rapidly oxidized in thymocytes lysed in buffer lacking PTP inhibitors. Lanes 1-3, thymocytes from the indicated mice were lysed on ice in degassed oxidation lysis buffer containing IAP-Bio to immediately label reduced PTP active site cysteines. Lanes 4-6, thymocytes were lysed on ice for 20 min in lysis buffer without PTP inhibitors then Nature Immunology : doi : 10. 1038/ni. 3692 IAP-Bio was added. All lysates were incubated for 1 hr with anti-SHP-1 and immunoprecipitated proteins were analyzed by immunoblotting with Streptavidin (SA)-HRP to detect biotinylated protein. d, PTP activity of SHP-1 immunoprecipitated from thymocyte cell lysates. Cells were lysed in degassed PTP lysis buffer without PTP inhibitors for 20 min on ice, anti-SHP-1 was added and lysates were rotated for 1 h at 4oC. Immunoprecipitated SHP-1 was assayed for PTP activity as described in methods. e, SHP-1 oxidation in vivo. Repeat of experiment shown in Fig. 5d. Nature Immunology : doi : 10. 1038/ni. 3692 Supplementary Figure 4 Themis-/- signaling defects are revealed in the presence of ROS. a, TCR stimulation does not induce ROS production in thymocytes. Freshly harvested thymocytes from B6 mice were unstimulated or stimulated for 5 min with anti-CD3 CD4, anti-CD3 CD28 or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), lysed, and Reactive Oxygen Species (ROS) were measured by chemiluminescence assay. Results are from three experiments. b, Reduced induction of p-ZAP-70 in peptide stimulated Themis-/- thymocytes. Purified CD4 CD8 thymocytes from MHCII (I-A)-/- mice expressing the OTII-TCR were rested for three hours at 5x106 cells/ml in RPMI at 37C prior stimulation. Purified splenic B cells were pulsed for 2h at 37C with 100ng/ml of OVA peptide (ISQAVHAAHAEINEAGR) or no peptide (NP) in RPMI supplemented with 5% FBS and 10mM HEPES. For stimulation, pulsed B cells and thymocytes were mixed at a ratio of 1/10 and spun at 5000 x g prior incubation at 37C for the indicated time. Cells were lysed in Standard lysis buffer then subjected to SDS-PAGE and immunoblotted with the indicated antibodies. Data shown are representative of 2 independent experiments. Nature Immunology : doi : 10. 1038/ni. 3692 Supplementary Figure 5 Inhibition of SHP-1 by THEMIS is attenuated by the ROS scavenger N-acetyl-L-cysteine (NAC). a, THEMIS-mediated inhibition of SHP-1 is attenuated by NAC in transfected HEK-293 cells. HEK-293 cells were transfected with plasmid encoding the protein tyrosine kinase SYK, a target of SHP-1, plus or minus plasmids encoding SHP-1 and THEMIS. Transfected cells were treated or not overnight with N-acetyl-cysteine (NAC) before lysis, SDS-PAGE and western blotting with the indicated antibodies. One representative of 2 experiments. b, THEMIS-mediated inhibition of SHP-1 in vitro is partially attenuated in the presence of NAC. SHP-1 was assayed for PTP activity in the presence or absence of THEMIS and NAC as indicated. PTP assay was performed as is described in Methods. Bar graphs show means /- SD, t-test, two-tailed, equal variance. n 3 each. P P Nature Immunology : doi : 10. 1038/ni. 3692 198 Annexe 3 : Garreau A, Blaize G, Argenty J, Rouquié N, Tourdès A, Wood SA, Saoudi A, Lesourne R. 2017. Grb2-Mediated Recruitment of USP9X to LAT Enhances Themis Stability following Thymic Selection. J Immunol 199 : 2758-2766. Pour cette annexe, j'ai contribué à la révision de l'article. Brièvement, j'ai stimulé des thymocytes issus de souris déficientes en USP9X ou en THEMIS1 avec des anticorps anti- CD3 et anti-CD4 pendant 1 ou 3 minutes. J'ai analysé par westernblot, la phosphorylation de SHP-1 et ZAP-70. Il s'agit de la figure 3F de l'article. D'autres expériences consistant à analyser la signalisation suite au traitement des thymocytes avec l'inhibiteur de déubiquitine enzyme PR619 ont aussi été réalisées mais n'ont pas été présentées dans l'article. 199 200 The Journal of Immunology Grb2-Mediated Recruitment of USP9X to LAT Enhances Themis Stability following Thymic Selection Anne Garreau, * Gaetan Blaize, , 1 Jeremy Argenty, , 1 Nelly Rouquie, * Audrey Tourde`s, * Stephen A. Wood, Abdelhadi Saoudi, * and Renaud Lesourne* Themis is a new component of the TCR signaling machinery that plays a critical role during T cell development. The positive selection of immature CD4 CD8 double-positive thymocytes and their commitment to the CD4 CD82 single-positive stage are impaired in Themis2/2 mice, suggesting that Themis might be important to sustain TCR signals during these key developmental processes. However, the analysis of Themis mRNA levels revealed that Themis gene expression is rapidly extinguished during positive selection. We show in this article that Themis protein expression is increased in double-positive thymocytes undergoing positive selection and is sustained in immature single-positive thymocytes, despite the strong decrease in Themis mRNA levels in these subsets. We found that Themis stability is controlled by the ubiquitin-specic protease USP9X, which removes ubiquitin K48-linked chains on Themis following TCR engagement. Biochemical analyses indicate that USP9X binds directly to the N-terminal CABIT domain of Themis and indirectly to the adaptor protein Grb2, with the latter interaction enabling recruitment of Themis/USP9X complexes to LAT, thereby sustaining Themis expression following positive selection. Together, these data suggest that TCR-mediated signals enhance Themis stability upon T cell development and identify USP9X as a key regulator of Themis protein turnover. The Journal of Immunology, 2017, 199 : 27582766. T he selection of thymocytes that express a functional self- tolerant TCR and the commitment of immature CD4 CD8 (double-positive [DP]) thymocytes to the CD4 or the CD8 T cell lineage constitute two major decision checkpoints during T cell development (1). The afnities of TCRs for self- peptides bound to the MHC (self-pMHCs) determine the fate of T cells during selection in the thymus. Thymocytes that express TCRs that bind with high afnity to self-pMHCs are negatively selected and are triggered to undergo apoptotic cell death, whereas thymocytes that express TCRs that bind with low afnity to self- pMHCs are positively selected and become CD4 or CD8 single- positive (SP) thymocytes, according to the MHC class restriction of their TCRs (2). The fate of thymocytes during these processes is dependent upon signals transmitted by the TCR and by coreceptors, such as CD4 and CD8, that bind together with the TCR to self-pMHCs. The strength of the TCRself-pMHC interaction and the differential Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan, Universite de Toulouse, CNRS, INSERM, UPS, 31024 Toulouse, France ; and Grifth Institute for Drug Discovery, Grifth University, Brisbane, Queensland 4111, Australia 1G. B. and J. A. contributed equally to this work. ORCIDs : 0000-0003-4494-9704 (G. B. ) ; 0000-0001-9133-330X (A. T. ) ; 0000-0002- 2576-7457 (S. A. W. ) ; 0000-0001-7015-8178 (A. S. ). Received for publication April 20, 2017. Accepted for publication August 10, 2017. This work was supported by INSERM and Sano (Avenir grant to R. L. ), the Asso- ciation pour la Recherche sur la Sclerose en Plaques, a Marie Curie International Reintegration grant (to R. L. ), the French Ministry of Higher Education and Research (Ph. D. fellowships to A. G. and G. B. ), and the Fondation pour la Recherche Medicale (extension of the Ph. D. fellowship that had been awarded to A. G. ). Address correspondence and reprint requests to Dr. Renaud Lesourne, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan, CHU Purpan, 31024 Toulouse Cedex 3, France. E-mail address : renaud. lesourne@inserm. fr Abbreviations used in this article : CABIT, cysteine-containing, all-b in Themis ; DN, double-negative ; DP, double-positive ; DUB, deubiquitylating enzyme ; HA, hemag- glutinin ; b2m, b2-microglobulin ; PRS, proline-rich C-terminal sequence ; self- pMHC, self-peptide bound to the MHC ; SP, single-positive ; USP, ubiquitin-specic protease ; Usp9X / , Usp9Xox/ox ; Usp9X2/2, Usp9Xox/ox ; Cd4-Cre. Copyright 2017 by The American Association of Immunologists, Inc. 0022-1767/17/$35. 00 kinetics of CD4 and CD8 surface expression during the transition from the DP stage to the SP stage govern the intensity and the duration of TCR signals, which, in turn, dictate distinct develop- mental outcomes (3). Although positive selection and CD4 lineage commitment are promoted by sustained or repeated TCR signaling waves (48), negative selection and CD8 lineage commitment are preferentially induced by short-lived or interrupted TCR signaling events, respectively (5, 810). Signals triggered by TCRs and coreceptors propagate through a complex network of intracellular signaling proteins that exhibit enhancing or inhibitory functions. TCR engagement by pMHC leads to activation of the protein tyrosine kinases Lck and ZAP70, which phosphorylate the transmembrane adaptor protein LAT on multiple tyrosine residues (11). Phosphorylated LAT proteins serve as docking sites for cytosolic adaptors (e. g. , Grb2, GADS, and SLP76) that enable the recruitment of effectors proteins, such as PLCg1, Vav1, and Itk, which, in turn, trigger distinct signaling pathways important for the regulation of T cell development (12). Inhibitory proteins, such as the protein tyrosine phosphatase SHP-1, function to attenuate or interrupt TCR-mediated signals, according to the strength of the TCRpMHC interactions (1315). Themis is a recently identied TCR signaling protein that has an important role during T cell development (1618). It contains a proline-rich C-terminal sequence (PRS), which binds to the adaptor protein Grb2 (19, 20), and two globular cysteine-containing, all-b in Themis (CABIT) domains (17). Themis is recruited to LAT through Grb2 following TCR engagement (21). Although the molecular function of Themis has long remained elusive, it was shown recently that Themis enhances TCR signaling in thymo- cytes by blocking the inhibitory activity of SHP-1 (22). This ac- tion is mediated by the CABIT domains of Themis, which bind to the phosphatase domain of SHP-1 and promote or stabilize oxi- dation of the SHP-1 catalytic cysteine (22). The phenotype of Themis2/2 mice shows that Themis is es- sential for the positive selection of DP thymocytes (1618) and for their commitment to the CD4 lineage (18), suggesting that Themis D o w n l o a d e d f r o m h t t p : / / w w w . j i m m u n o l . o r g / b y g u e s t o n J u l y 1 5 , 2 0 1 8 The Journal of Immunology 2759 might be important to perpetuate and sustain TCR signals during these steps of T cell development. However, previous studies reported that the transcription of the gene encoding for Themis is strongly downregulated in DP cells at the early stages of positive selection (16, 17). We show in this article that, despite the strong downregulation of Themis mRNA, the amount of Themis pro- tein increases following positive selection. We found that Themis stability is controlled by the ubiquitin-specic protease USP9X, which removes K48-linked ubiquitin chains on Themis following TCR engagement. Biochemical analyses reveal that USP9X binds directly to the N-terminal CABIT domain of Themis. Using Grb2- decient thymocytes, we show that Grb2 promotes the recruitment of Themis/USP9X to LAT, which stabilizes Themis expression during T cell development. Materials and Methods Mice C57BL/6 mice are from Janvier (Le Genest-Saint-Isle, France). Themis2/2 (18), Grb2 /2 (23), and Usp9Xox/ox (24) mice were described previously. AND TCR-transgenic mice were from Taconic Farms. OT-1 and OT-2 TCR-transgenic mice were provided by Prof. R. Liblau (INSERM UMR 1043, Toulouse, France), and CD4-Cre mice were provided by Dr. O. Joffre (INSERM UMR 1043). All of the experiments were conducted with sex- and age-matched mice between 6 and 10 wk old that were housed under specic pathogenfree conditions at the INSERM animal facility (Zoo- technie US-006 ; accreditation number A-31 55508), which is accredited by the French Ministry of Agriculture to perform experiments on live mice. All experimental protocols were approved by the local ethics committee and are in compliance with the French and European regulations on the care and protection of laboratory animals (European Commission Direc- tive 2010/63). Abs and ow cytometry The following Abs and reagents were used in this study : anti-Vav1 (C-14), antic-Cbl (A9), anti-GAPDH (FL-335), anti-ERDj3 (C-7), and anti-GFP (B-2) (all from Santa Cruz Biotechnology) ; anti-V5 and anti-USP9X (Bethyl Laboratories) ; antip-SHP1(Y564), antip-ZAP (Y319), anti- ubiquitin (P4D1), anti-K48 (D9D5), and anti-K63 (D7A11) polyubiquitin (all from Cell Signaling Technology) ; anti-hemagglutinin (HA) and anti- FLAG (M2) (Sigma-Aldrich) ; and anti-Themis (Q13-1103), anti-Grb2, antiprotein tyrosine phosphatase 1C/SHP-1, and anti-LAT Y226 (all from BD Biosciences). Anti-Themis (3A3) Ab was provided by Dr. P. E. Love (National Institutes of Health, Bethesda, MD). Anti-FLAG M2 and anti-V5 Agarose Afnity Gel were from Sigma-Aldrich. Thymocytes were incubated for the indicated period of times with MG132 (20 mM) or with PR-619 (10 mM) (Sigma-Aldrich). Fluorochrome-conjugated Abs against CD4 and CD69 were from BioLegend, and those against CD8a, CD5, TCRb, and Themis were from eBioscience. Biotin-conjugated Abs against CD3 (145-2C11) and CD4 (GK1. 5) were purchased from BD Biosciences. For ow cytometry analysis, single-cell suspensions from thymus, spleen, or lymph nodes were incubated in PBS, 0. 5% BSA, and 2 mM EDTA containing the appropriate Abs. Intracellular staining was performed by xing cells with 4% formaldehyde and permeabilizing them with 0. 5% Triton X-100. Cell detection was performed on a BD LSR II ow cytometer (BD Biosciences), after analysis was performed with FlowJo software (TreeStar). Real-time PCR analysis For the purication of thymocyte subpopulations, total thymocytes were labeled with the appropriate Abs. Each population was isolated with a BD FACSAria cell sorter. For gene-expression studies, total cell RNA was isolated with an RNeasy Kit (QIAGEN). RNA samples (500 ng of each) were reverse transcribed with SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen) and were assayed by real-time PCR. Transcripts were quan- tied with a Roche LightCycler 480 System. Duplicates were run for each sample in a 96-well plate ; b2-microglobulin (b2m) served as the endog- enous reference gene. The relative quantication method was used, with the mRNA abundance of the gene of interest normalized to the abundance of b2m mRNA ; the average of control thymocyte samples served as the calibrator value. Themis primers were exon-3 forward 59-TGAAATC- CAAGGTGTGCTGA-39, exon-4 reverse 59-CGTCCGTAGACAGCAAC- TGA-39, b2m forward 59-ACATACGCCTGCAGAGTTAAGCAT-39, and b2m reverse 59-CGATCCCAGTAGACGGTCTTG-39. Plasmids and constructs Plasmids encoding for FLAG-ThemisWt, FLAG-ThemisDPRS, GFP- Themis, and V5-USP9X were described previously (20, 25). HA- Ubiquitin, HA-UbiquitinK48R, and FLAG-USP19 were purchased from Addgene. Plasmids encoding for FLAG-ThemisDCABIT1(1243), FLAG- ThemisDCABIT2(267494), HA-UbiquitinK63R, HA-UbiquitinK33R, and HA-UbiquitinK29R were generated by site-directed mutagenesis us- ing a QuikChange kit (Stratagene). Cell stimulation and immunoprecipitation For the analysis of Themis ubiquitylation, 6 3 107 thymocytes or 5 3 106 Jurkat cells were stimulated or not with anti-CD3, anti-CD4, and strepta- vidin (30 mg/ml) at 37C. Stimulation was stopped on ice, and cells were immediately centrifuged and resuspended in 140 ml of ice-cold lysis buffer (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 2 mM Na3VO4, 5 mM NaF, 1 mM EDTA, 1% SDS, 10 mM iodoacetamide, 10 mM N-ethylmaleimide, and Protease Inhibitor Cocktail Tablet [Roche]). Lysates were boiled at 95C for 10 min and sonicated two times for 5 s (30% duty cycle). Lysates were diluted in 1. 4 ml of ice-cold lysis buffer without SDS and cleared by cen- trifugation at 12, 000 rpm for 15 min at 4C. Themis was immunoprecipitated from cleared lysate for 2 h at 4C with 15 ml of protein ASepharose resin coated with 10 ml of serum containing polyclonal rabbit anti-Themis Abs. Resins were washed and incubated on a shaker for 15 min with elution buffer (100 mg/ml Themis antigenic peptides, 50 mM Tris, and 150 mM NaCl). Samples were further processed for Western blot analysis. For any other immunoprecipitation, thymocytes or Jurkat cells were resuspended in ice-cold lysis buffer (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 2 mM Na3VO4, 5 mM NaF, 10% glycerol, and Protease Inhibitor Cocktail Tablet [Roche]) for 20 min on ice. Lysates were cleared by centrifugation at 12, 000 rpm for 15 min at 4C, and proteins were immunoprecipitated from cleared lysate with 15 ml of Sepharose resin coated with the indicated Abs for 2 h at 4C. Cell lines and transfections Jurkat-TAg cells were maintained in RPMI 1640 medium supplemented with 10% FBS (Sigma-Aldrich). Human embryonic kidney epithelial cells (HEK293) were maintained in DMEM and 10% FBS. For transfection, 107 Jurkat-Tag cells were washed three times with RPMI 1640 medium without FBS and resuspended in 100 ml of Ingenio electroporation solution (Euro- medex) containing 20 mg of the indicated plasmids. Cells were electro- porated with the Nucleofector II Device (H10 program). For lipofection, HEK293 cells were incubated for 6 h with 500 ml of DMEM containing 5 mg of the indicated plasmids and 15 ml of LipoD293 DNA (Tebu-bio). Pull-down assays Ten micrograms of puried human USP9X (E-552 ; Boston Biochem) and 10 mg of puried mouse Themis were incubated for 45 min in buffer containing 150 mM NaCl and 10 mM Tris (pH 7. 4). The solution was adjusted with 0. 2% Triton X-100, and USP9X was immunoprecipitated for 3 h at 4C with 15 ml of protein ASepharose resin coated with anti- USP9X Abs. Samples were further processed for Western blot analysis. Western blot Proteins were resolved by SDS-PAGE and transferred to a polyvinylidene diuoride membrane. The membrane was blocked with 20% FCS for the analysis of Themis ubiquitylation and 5% milk for coimmunoprecipitation analysis in TBST for 1 h at room temperature prior to incubation with primary Abs at 4C overnight. After washing, membranes were incubated with secondary Abs for 1 h at room temperature. Subsequently, membranes were incubated with ECL solution for 5 min in the dark, and luminescence was captured using a Bio-Rad XRS imager. Images were analyzed using Bio-Rad Image Lab software. Statistical analysis Statistical comparisons were carried out using the Fisher test to verify equal variance of the populations, followed by an unpaired or paired two-tailed t test or MannWhitney U test if variance was not equal. The p values are indicated in the gure legends. Results Posttranslational control of Themis expression during positive selection We rst compared the protein and mRNA levels of Themis in DP thymocytes, before selection (preselection, TCRloCD69loCD5lo) D o w n l o a d e d f r o m h t t p : / / w w w . j i m m u n o l . o r g / b y g u e s t o n J u l y 1 5 , 2 0 1 8 2760 USPs CONTROL THEMIS STABILITY DURING THYMIC SELECTION or soon after they were stimulated by self-pMHC ligand (TCRlo CD69hiCD5hi). In accordance with previous studies (16, 17), we found that Themis mRNA levels are strongly decreased in TCRlo CD69hiCD5hi DP thymocytes compared with those in preselection DP thymocytes (Fig. 1A). Unexpectedly, we found that the amount of Themis protein is increased in DP thymocytes under- going positive selection, indicating a posttranslational regulation of Themis expression (Fig. 1B). The amount of Themis protein was similarly increased in TCRloCD69hiCD5hi DP thymocytes expressing class I (OT-1) or class II (OT-2) restricted TCRs, suggesting that the increased amount of Themis observed in these cells does not result from a shift in the TCR repertoire and is not specic to thymocytes positively selected by MHC class I or MHC class II self-pMHC interactions (Fig. 1C, 1D). Further analyses at later stages of T cell development show that Themis mRNA levels are decreased by 80% in CD69hi CD4 SP thymocytes compared with those in preselection DP thymocytes, whereas the amounts of Themis protein are similar in these two populations (Fig. 1B). Finally, Themis protein levels are decreased in mature CD69lo CD4 and CD8 SP thymocytes compared with preselection DP thymocytes, conrming the previously reported decrease in Themis protein expression in these mature thymocyte subsets (Fig. 1B). Ubiquitin-specic proteases regulate Themis expression in thymocytes The discrepancy between Themis mRNA and protein levels during the positive selection of DP thymocytes suggests that posttrans- lational events might be important to stabilize Themis expression at this stage of T cell development. Ubiquitin-specic proteases (USPs) remove mono- or polyubiquitin chains on proteins and, thus, enhance their stability by preventing them from degradation by the proteasome (26). Previously, mass spectrometry analysis of proteins that coimmunoprecipitate with Themis in thymocytes led us to identify several USPs (USP9X, USP24, USP19, and USP15) (Fig. 2A), among other proteins, as potential binding partners of Themis in these cells (27). To investigate the potential role of these interactions on Themis expression, we incubated thymocytes with PR619, a well-characterized inhibitor that blocks the activity of most deubiquitylating enzymes (DUBs) (28). We found that incubation of thymocytes with PR619 results in a rapid and dra- matic decrease in the amount of Themis protein, whereas the amount of other signaling proteins, such as c-Cbl, was not af- fected, indicating that Themis expression is highly sensitive to DUB-mediated stabilization (Fig. 2B). We identied USP9X, but not the other USPs, as a binding partner of Themis in a yeast two- hybrid screen using a cDNA bank of murine splenocytes (Fig. 2C). Transfection of HEK293T cells with cDNA encoding tagged versions of Themis and USP9X conrmed the binding of USP9X to Themis (Fig. 2D). To investigate whether USP9X controls the stability of Themis, we analyzed Themis protein levels in thymocytes from Usp9Xox/ox mice expressing the Cd4-Cre transgene, which begins to be expressed in DP thymocytes (29). We found that the amount of Themis was similar in Usp9Xox/ox (Usp9X / ) and Usp9Xox/ox ; Cd4-Cre (Usp9X2/2) CD42CD82 double-negative (DN) thymo- cytes but was decreased in Usp9X2/2 DP thymocytes (Fig. 3A, 3B). D o w n l o a d e d f r o m h t t p : / / w w w . j i m m u n o l . o r g / b y g u e s t o n J u l y 1 5 , 2 0 1 8 FIGURE 1. Posttranslational control of Themis expression during positive selection. (A) Real-time PCR analysis of Themis mRNA abundance in preselection DP (TCRloCD69loCD5lo), self-pMHC stimulated DP (TCRloCD69hiCD5hi), and CD4 SP CD69hi thymocytes. (B) Contour plot represents the gating strategy to analyze Themis expression in preselection (red rectangle) and self-pMHCstimulated (blue rectangle) DP thymocytes (left panel). Line graph represents Themis staining in the indicated DP thymocyte subsets from Themis / and Themis2/2 mice (black and dashed lines) (middle panel). Bar graph represents the relative expression of Themis protein in the indicated thymocyte subsets normalized to its expression level in preselection DP thy- mocytes (right panel). Themis staining in the indicated DP thymocyte subsets from OT-2 TCR-transgenic (C) and OT-1 TCR-transgenic (D) mice (black and dashed lines represent the isotype control). Bar graphs represent the relative expression of Themis protein in the indicated DP thymocyte subsets. Data are mean SEM of three (A and B) or four (C and D) independent experiments. p , 0. 05, p , 0. 01, two-tailed, paired t test. The Journal of Immunology 2761 D o w n l o a d e d f r o m h t t p : / / w w w . j i m m u n o l . o r g / b y g u e s t o n J u l y 1 5 , 2 0 1 8 FIGURE 2. Themis expression is controlled by ubiquitin-specic proteases. (A) USPs identied as Themis-binding partners by mass spectrometry in Zvezdova et al. (27). (B) Western blot analysis of Themis, Cbl, and GAPDH in thymocytes incubated with PR619 (10 mM) for the indicated times. Total cytoplasmic extracts (TCE) from each sample were analyzed by Western blot with the indicated Abs. Bar graph shows the relative abundance of Themis proteins after PR619 treatment at the indicated times, as determined by calculating the ratios of the intensities of the bands corresponding to Themis proteins/GAPDH (loading control). (C) Schematic diagram of Themis-binding partners identied by a yeast two-hybrid screen. Proteins shaded in red were also identied as Themis interactors by mass spectrometry in thymocytes (27). (D) HEK293 cells were transfected with plasmids encoding FLAG-tagged Themis plus plasmids encoding V5-tagged USP9X. Samples were subjected to immunoprecipitation (IP) with Abs specic for V5 and analyzed by Western blotting with Abs specic to the indicated epitope. Western blots are from one experiment and are representative of three (B) and four (D) independent experiments. Themis protein levels were further decreased in positively selected Usp9X2/2 CD4 and CD8 SP thymocytes and in peripheral CD4 and CD8 T cells (Fig. 3AC). However, the amount of Themis remained higher in Usp9X2/2 SP thymocytes than in thymocytes treated with PR619 (Fig. 2B), indicating that USPs other than USP9X contribute to regulate Themis expression. Quantication of Themis mRNA amounts by real-time PCR showed similar expres- sion levels in Usp9X / and Usp9X2/2 DP and CD4 SP thymocytes, showing that the decreased protein abundance of Themis in Usp9X2/2 thymocytes does not result from a transcriptional defect (Fig. 3D). The adaptor protein Grb2 and the tyrosine phosphatase SHP-1, which are known binding partners of Themis, were expressed normally in Usp9X2/2 CD4 SP thymocytes, indicating a selective effect of USP9X on Themis (Fig. 3E). To examine whether the reduced expression of Themis in Usp9X2/2 thymocytes has a functional effect on Themis-mediated signaling, we compared the phosphorylation of SHP-1 and ZAP70, which are known to be impaired in Themis2/2 thymo- cytes, in Usp9X / and Usp9X2/2 CD4 SP thymocytes. We found that SHP-1 phosphorylation was decreased in Usp9X2/2 CD4 SP thymocytes compared with that in Usp9X / control cells (Fig. 3F). The phosphorylation of SHP-1 was more strongly im- paired in Themis2/2 thymocytes than in Usp9X2/2 thymocytes, in accordance with the partial decrease in Themis expression levels observed in Usp9X2/2 thymocytes (Fig. 3F). Although the phos- phorylation of ZAP70 was reduced in Themis2/2 thymocytes compared with that in control cells, it was not affected in Usp9X2/2 thymocytes, suggesting that the inhibition of SHP-1 by Themis remains sufcient in Usp9X2/2 thymocytes to promote the ac- tivity of potential targets of SHP-1, such as ZAP70 (Fig. 3F). To determine the impact of USP9X deciency on positive selection, we next crossed Usp9X2/2 mice with transgenic mice expressing a xed MHC class IIrestricted ab-TCR transgene (AND). We found similar proportions of CD4 SP thymocytes in AND Usp9X / and Usp9X2/2 mice, indicating that the reduced expression level of Themis in Usp9X2/2 mice is not sufcient to signicantly impair positive selection (Fig. 3G). CD4 SP/CD8 SP ratios in thymocytes in Usp9X2/2 mice were also comparable to those in Usp9X / mice, suggesting that the choice for CD4 or CD8 lineage was also normal in Usp9X2/2 mice (Fig. 3H). USP9X promotes Themis deubiquitylation following TCR engagement We next investigated whether Themis is directly regulated by ubiquitin-mediated modications. Analysis of Themis in unsti- mulated thymocytes and in Jurkat cells transfected with cDNA encoding for tagged versions of Themis and ubiquitin showed that Themis is polyubiquitylated (Fig. 4A, 4B). Incubation of thymo- cytes with the proteasome inhibitor MG132 resulted in an increase in ubiquitylated Themis, supporting that Themis is targeted to the proteasome through ubiquitin chain modications (Fig. 4C). We next investigated the type of linkage by which Themisubiquitin chains are assembled. We found that ubiquitylated Themis was recognized by ubiquitin K48 chainspecic Abs, but not by Abs specic for ubiquitin K63 chains, in freshly isolated thymocytes (Fig. 4D). Conrming these results, we found that Themis ubiq- uitylation was strongly reduced in Jurkat cells expressing tagged versions of ubiquitin mutated on its K48 residue (K48R), whereas it was only moderately affected in Jurkat cells expressing K63R, K29R, and K33R ubiquitin mutants (Fig. 4E). We noticed that Themis ubiquitylation was increased when thymocytes were rested for 1 h in culture medium, suggesting that stimuli occurring in the thymic environment might dampen or prevent Themis ubiquitylation (Fig. 4F). Thus, we examined the effect of TCR cross-linking on Themis ubiquitylation and found that the amount of ubiquitylated Themis decreases following the 2762 USPs CONTROL THEMIS STABILITY DURING THYMIC SELECTION D o w n l o a d e d f r o m h t t p : / / w w w . j i m m u n o l . o r g / b y g u e s t o n J u l y 1 5 , 2 0 1 8 FIGURE 3. Themis expression is controlled by USP9X. (A and B) Flow cytometry analysis of Themis protein abundance in DN, DP, CD4 SP, and CD8 SP thymocyte subsets from Usp9X / , Usp9X2/2, and Themis2/2 mice. (B) Relative expression of Themis protein in the indicated subsets from Usp9X / and Usp9X2/2 mice. (C) Line graphs represent Themis staining in lymph node CD4 and CD8 T cells from Usp9X / , Usp9X2/2, and Themis2/2 mice (left panel). Bar graph represents the relative expression of Themis protein in the T cell subsets (right panel). Data are mean SEM of two independent experiments. (D) Real-time PCR analysis of Themis mRNA abundance in DP and CD4 SP thymocytes from Usp9X / and Usp9X2/2 mice. (E) Western blot analysis of USP9X, Themis, SHP-1, Grb2, and GAPDH in total thymocytes from Usp9X / and Usp9X2/2 mice. (F) Western blot analysis of SHP-1 (Y564) and ZAP70 (Y319) phosphorylation in total thymocytes from Usp9X / and Usp9X2/2 mice (left and middle panels). Graph represents the quantication of SHP-1 phosphorylation normalized to the amount of Rac1 (right panel). (G) Flow cytometry analysis of positive selection in AND Usp9X2/2 mice. Contour plots represent CD4 versus CD8 staining proles of thymocytes from Usp9X / and Usp9X2/2 mice expressing the AND TCR. Data are representative of four independent experiments. (H) Graph shows the CD3hi CD4 SP/CD3hi CD8 SP thymocyte ratio in Usp9X / (n 4) and Usp9X2/2 (n 5) mice. Data are mean SEM of three (B) or two (C, D, and F) independent experiments. Western blots are from one experiment and are representative of four (E) or two (F) independent experiments. p , 0. 05, two-tailed, unpaired t test. n. s. , not signicant. The Journal of Immunology 2763 FIGURE 4. USP9X removes K48 ubiquitin chains on Themis following TCR engagement. (A) Themis was immunoprecipitated from cellular extracts of thymocytes as described in Materials and Methods. Samples were analyzed by Western blotting with anti-ubiquitin and anti-Themis Abs. (B) Jurkat cells were transfected with plasmids encoding for FLAG-tagged Themis plus plasmids encoding HA- tagged ubiquitin. Themis was immunoprecipitated from cellular extracts, and samples were analyzed by Western blotting with anti-HA Abs. (C) Total thymocytes were incubated with MG132 for 2 h. Samples were subjected to immunoprecipitation with Abs specic for Themis and analyzed by Western blotting with Abs specic for the indicated proteins. (D) Western blot analysis of Themis ubiquitylation in total thymocytes with Abs specic for K48 or K63 polyubiquitin chains. (E) Jurkat cells were transfected with plasmids encoding FLAG-tagged Themis plus plasmids encoding HA- tagged ubiquitin wild-type (WT) or ubiquitin K48R, K63R, K33R, or K29R. Samples were subjected to immunoprecipitation with Abs specic for FLAG and analyzed by Western blotting with Abs specic for the indicated proteins. The black lines indicate where parts of the image were joined. (F) Freshly isolated thymocytes were rested or not (09) for the indicated times at 37C. Themis was immunoprecipitated from cellular extracts analyzed by Western blotting with anti-ubiquitin Abs. Thy- mocytes from C57BL/6 (G) and Usp9X / or Usp9X2/2 (I) mice were stimulated with premixed anti-CD3 (aCD3) and anti-CD4 (aCD4) Abs for the indicated times. Samples were subjected to immunoprecipitation with Abs specic for Themis and were analyzed by Western blotting with Abs specic of the indicated proteins. (H) CD4 pe- ripheral T cells were stimulated with premixed anti-CD3 and anti-CD4 Abs for the indicated times. Themis was ubiq- uitylation was analyzed by Western blotting. Western blots are from one experiment and are representative of four (AC), three (DF and I), six (G), and two (H) independent experiments. immunoprecipitated, and stimulation of thymocytes or peripheral CD4 T cells with anti-CD3 anti-CD4 Abs (Fig. 4G, 4H). In contrast, we found that Themis ubiquitylation was enhanced in Usp9X2/2 thymocytes after stim- ulation, suggesting that ubiquitin ligases may further ubiquitylate Themis following TCR engagement but that USP9X overcomes this process and reduces Themis ubiquitylation to less than its baseline level by removing polyubiquitin chains on Themis (Fig. 4I). USP9X interacts directly with Themis CABIT1 domain We next investigated the molecular mechanism by which USP9X controls Themis expression and ubiquitylation. We found that USP9X coimmunoprecipitates with Themis in unstimulated thy- mocytes (Fig. 5A). TCR cross-linking with anti-CD3 and anti- CD4 Abs did not result in a signicant increase in this interac- tion (Fig. 5A). Additionally, we found that Grb2 and Themis coimmunoprecipitate with USP9X in thymocytes (Fig. 5B). Transfection of HEK293T cells with cDNA-encoding tagged versions of Grb2 and USP9X conrmed the binding of USP9X to Grb2 (Fig. 5C), indicating that Grb2 and USP9X may interact in the absence of Themis. However, the coimmunoprecipitation of Grb2 with USP9X was reduced in Themis2/2 thymocytes, sug- gesting that part of the interaction between Grb2 and USP9X occurs through Themis in thymocytes (Fig. 5B). The mutation of Themis PRS, required for the binding of Themis to Grb2, did not prevent Themis interaction with USP9X in 293T cells, supporting a direct interaction between Themis and USP9X (Fig. 5D, 5E). Accordingly, we found that recombinant proteins of Themis and USP9X could coprecipitate in cell-free assays (Fig. 5F). We next investigated whether the CABIT modules of Themis were im- portant for its interaction with USP9X and found that deletion of Themis' CABIT1(1260) domain, but not of its CABIT2(260 493) domain, impaired the coimmunoprecipitation of USP9X with Themis (Fig. 5D, 5E). The adaptor protein Grb2 regulates the recruitment of Themis/ USP9X complexes to LAT and enhances Themis stability The recruitment of USP9X to LAT promotes its phosphorylation on one of its serine residues (S1600) and enhances its catalytic activity D o w n l o a d e d f r o m h t t p : / / w w w . j i m m u n o l . o r g / b y g u e s t o n J u l y 1 5 , 2 0 1 8 2764 USPs CONTROL THEMIS STABILITY DURING THYMIC SELECTION FIGURE 5. USP9X interacts directly with the N-terminal CABIT domain of Themis. Thymo- cytes from Themis / and Themis2/2 mice were stimulated (A) or not (B) with premixed anti-CD3 and anti-CD4 Abs for the indicated times. Sam- ples were subjected to immunoprecipitation with Abs specic for Themis (A) or USP9X (B) and then analyzed by Western blotting with Abs specic for the indicated proteins. (C) HEK293 cells were transfected with plasmids encoding for V5-tagged USP9X plus plasmids encoding for FLAG-tagged Grb2. Samples were subjected to immunoprecipitation with Abs specic for FLAG and then analyzed by Western blotting with Abs specic for the indicated proteins. (D) Schematic diagram of Themis constructs used for transfec- tion. (E) HEK293 cells were transfected with plasmids encoding for V5-tagged USP9X plus plasmids encoding for the indicated Themis constructs. Samples were subjected to immuno- precipitation with Abs specic for FLAG and analyzed by Western blotting with Abs specic for the indicated proteins. (F) Puried Themis and USP9X proteins were incubated together prior to immunoprecipitation with Abs specic for USP9X and Western blot analyses with the indicated Abs. Western blots are from one ex- periment and are representative of three (A and C) or two (B, E, and F) independent experiments. (30). Because Grb2 is important for the recruitment of Themis to LAT, we suspected that Grb2 might also be involved in the translocation of USP9X to LAT signaling complexes through its interaction with Themis. To address this possibility, we analyzed the interaction of USP9X with LAT in thymocytes partially de- cient for Grb2 (Grb2 /2) to avoid the substantial perturbations of early TCR signaling observed in thymocytes fully decient for Grb2 (31). We found that the amounts of LAT that coimmuno- precipitate with USP9X following TCR engagement were de- creased in Grb2 /2 heterozygote thymocytes (Fig. 6A). We then analyzed Themis ubiquitylation in Grb2 /2 thymocytes, suspect- ing that Grb2 might be important to regulate USP9X activity and, thereby, to positively regulate Themis deubiquitylation. We found the ubiquitylation of Themis was increased in Grb2 /2 that thymocytes compared with that in Grb2 / thymocytes when thy- mocytes were stimulated with anti-CD3 anti-CD4 Abs (Fig. 6B). Accordingly, we found that the expression levels of Themis were comparable in Grb2 / and Grb2 /2 DN thymocytes but were decreased in Grb2 /2 DP thymocytes (Fig. 6C, 6D). The amounts of Themis protein were further decreased in SP thymocytes, whereas the relative amount of Themis mRNA remained unchanged in these cells (Fig. 6CE). Expression of other binding partners of Grb2, such as Cbl or Vav1, remained unchanged in Grb2 /2 thy- mocytes, indicating that Grb2 selectively stabilizes Themis in thy- mocytes (Fig. 6F). Collectively, these results identify Grb2 as an important regulator of Themis stability that promotes the deubi- quitylation of Themis by USP9X following TCR engagement. Discussion The strong defect in T cell development initially reported in Themis2/2 mice and the concomitant lack of a clear molecular model to explain this phenotype have led to intensive investiga- tions to resolve the molecular function of this protein. Recent ndings suggesting that Themis enhances TCR signaling through the selective inhibition of the tyrosine phosphatase SHP-1 con- stitute an important breakthrough in the comprehension of this enigmatic molecule (22). Although the role of Themis in TCR signaling begins to be better understood, the mechanisms that regulate Themis expression and/or function have not yet been investigated. In this article, we show that Themis binds to the ubiquitin-specic protease USP9X, which sustains Themis ex- pression transiently during positive selection, whereas the gene encoding for Themis is transcriptionally shutdown. USP9X asso- ciates with Themis/Grb2 signaling complexes and enhances Themis stability by removing K48-ubiquitin chains on Themis following TCR engagement. Our study suggests that Grb2 is re- quired for the recruitment of Themis into TCR signaling com- plexes, as well as contributes to stabilize Themis expression to sustain TCR signals by recruiting USP9X to LAT, where its ac- tivity is enhanced following initial signaling events (30). We show that Themis is ubiquitylated predominantly by K48- linked chains that have a well-established function in the target- ing of proteins to proteasomes for degradation (32). Supporting this mechanism, ubiquitylated Themis accumulates when thymocytes are incubated with the proteasome inhibitor MG132. Themis ubiquitylation is detected in unstimulated thymocytes and Jurkat cells, suggesting that Themis is constitutively ubiquitylated in these cells and may have a high turnover rate. These results are supported by proteomic resources obtained in Jurkat cells that identify up to 21 ubiquitylation sites on Themis (33). The mech- anism that promotes Themis ubiquitylation is unknown. We pre- viously used mass spectrometry to characterize the interactome of D o w n l o a d e d f r o m h t t p : / / w w w . j i m m u n o l . o r g / b y g u e s t o n J u l y 1 5 , 2 0 1 8 The Journal of Immunology FIGURE 6. Grb2 prevents Themis ubiq- uitylation and degradation by promoting the re- cruitment of USP9X to LAT. (A and B) Thymocytes from Grb2 / and Grb2 /2 mice were stimulated with premixed anti-CD3 and anti-CD4 Abs for the indicated times. Samples were subjected to immunoprecipitation with control (Ctl) (A), anti-USP9X (A), or anti-The- mis (B) Abs and analyzed by Western blotting with the indicated Abs. (C) Themis staining in the indicated thymocyte subsets from Grb2 / , Grb2 /2, and Themis2/2 mice. (D) Relative ex- pression of Themis protein in the indicated thy- mocyte subsets. (E) Real-time PCR analysis of Themis mRNA abundance in total thymocytes from Grb2 / and Grb2 /2 mice. (F) Total cy- toplasmic extracts (TCE) of thymocytes from Grb2 / and Grb2 /2 mice were analyzed by Western blotting. Data in (CE) are mean SEM of three independent experiments. Western blots are from one experiment and are representative of three (F and B) or one (A) independent ex- periment. p , 0. 05, two-tailed, unpaired t test. C DN Themis D i f o n o s s e r p x e e v i t l a e R i s m e h T 0. 5 A CD3 IP : Ctl USP9X Grb2 : / / /- B -CD3 -CD4 : Themis IP Grb2 / Grb2 /- IB : LAT Y226 IB : Grb2 IB : USP9X IB : Ubiquitin IB : Themis 2765 -70kDa Grb2 / Grb2 /- Themis-/- DP CD4 SP CD8 SP 1. 0 Protein Grb2 / Grb2 /- * * 0 DN DP CD4 SP CD8 SP F Grb2 : TCE / /- mRNA ns 2. 0 E i f o n o s s e r p x e e v i t l a e R 1. 5 1. 0 i s m e h T 0. 5 0 Grb2 : / /- IB : Grb2 IB : Themis IB : Vav1 IB : Cbl IB : GAPDH Themis in thymocytes and identied several ubiquitin ligases, such as c-Cbl, Arih2, and Nedd4, as potential binding partners of Themis (27). The cellular levels of Themis remain unchanged in c-Cbl2/2 thymocytes (data not shown), suggesting that Arih2, Nedd4, or another ubiquitin ligase might be responsible for The- mis ubiquitylation. In this study, we show that the amount of ubiquitylated Themis is decreased following TCR cross-linking, suggesting that TCR- mediated signals promote deubiquitylation and stabilization of Themis. We identied Themis as a new target for the DUB USP9X, a protein that was recently shown to positively regulate TCR signaling (34). USP9X enhances TCR signaling by removing in- hibitory monoubiquitylation from ZAP70 and by preventing the sequestration of ZAP70 in early endosomes (30). Interestingly, it was recently shown that the recruitment of USP9X to LAT in peripheral CD4 T cells induces its phosphorylation on S1600, which enhances its catalytic activity (30) ; however, the mecha- nism of USP9X recruitment to LAT was not identied in that study. Our biochemical analysis demonstrates that USP9X binds directly to Themis through its CABIT domains, and it may also bind directly to Grb2. Themis binds to the C-terminal SH3 domain of Grb2 via its PRS and is recruited by Grb2 to tyrosine phos- phorylated LAT following TCR engagement (21). By facilitating the recruitment of Themis/USP9X complexes to LAT, Grb2 might promote activation of USP9X by serine phosphorylation, which then deubiquitylates Themis. Supporting this mechanism, we found that Themis ubiquitylation is increased in Grb2 /2 thy- mocytes. Thus, in addition to recruiting Themis to LAT signaling complexes, Grb2 is important for the stabilization of Themis once it becomes recruited to this transmembrane adaptor. We show that the amounts of Themis protein are increased in DP thymocytes stimulated by self-pMHC ligand even though Themis mRNA is decreased, suggesting that positive-selection signals stabilize Themis protein expression and shut down Themis gene expression. The stabilization of Themis protein at this stage of T cell development might be important to compensate for the profound drop in Themis mRNA levels that could lead to a sudden decrease in TCR signaling and, consequently, impair positive se- lection or CD4 lineage commitment, which are known to be de- pendent upon long-lasting TCR signals (35). In contrast, the downregulation of Themis mRNA levels might be important in the longer term, in peripheral T cells, to persistently reduce the amount of Themis protein and, thereby, to dampen the responsiveness of these cells to self-ligands, which is required for the prevention of autoimmunity. It is interesting to note in this context that Themis and SHP-1 expression proles are inversely correlated, with SHP-1 being more highly expressed in mature T cells than in immature DP thymocytes (36). Reducing the Themis/SHP-1 ratio in mature T cells might be important to relieve the brake that Themis exerts on SHP-1 and enable this phosphatase to inhibit weak TCR signals that may potentially lead to self-recognition (15). We previously showed that positive selection is impaired when Themis expression level is decreased by 2-fold in AND TCR- transgenic mice hemidecient for Themis (Themis /2), indicat- ing that a quantitative variation in Themis expression may affect positive selection (27). However, we found that positive selection and CD4 lineage choice occur normally in Usp9X2/2 mice, sug- gesting that the reduced expression of Themis observed in Usp9X2/2 DP thymocytes might not be sufcient to signicantly impair these developmental processes. Notably, the partial re- duction in Themis expression in Usp9X2/2 thymocytes only moderately attenuated SHP-1 phosphorylation in comparison with the strong reduction observed in Themis2/2 thymocytes, and it had no impact on Grb2 expression level, which is decreased in Themis-decient thymocytes (27). It is possible that USP9X acts redundantly with other USPs to stabilize Themis expression dur- ing these late stages of T cell development. Supporting this hy- pothesis, the expression levels of Themis are only moderately decreased in Usp9X2/2 thymocytes in comparison with the dra- matic decrease in Themis expression observed in thymocytes D o w n l o a d e d f r o m h t t p : / / w w w . j i m m u n o l . o r g / b y g u e s t o n J u l y 1 5 , 2 0 1 8 2766 USPs CONTROL THEMIS STABILITY DURING THYMIC SELECTION treated with the pan-DUB inhibitor PR619. Mass spectrometry analysis of Themis binding partners showed that Themis binds other USPs (USP24, USP19, and USP15), in addition to USP9X, that have no reported function in T cell development (27). Further studies will be required to evaluate the role of these proteins in Themis-mediated signaling events and more generally on thymic selection processes. We previously showed that Themis enhances Grb2 stability by reducing its ubiquitylation in thymocytes (27). This suggests that Themis and Grb2 are more stable as a complex than as free un- bound proteins. This mutual stabilization mechanism might be important to enrich thymocytes with effective Themis/Grb2 sig- naling complexes, which may facilitate the transmission of TCR signals and their persistence during the development of T cells. We showed, in the same article, that the transgenic expression of Themis in Grb2 /2 thymocytes expressing the class IIrestricted AND TCR rescues the defect in positive selection resulting from the partial loss of Grb2 (27). We speculated at that time that Themis acts by readjusting the amount of intracellular Grb2 close to its level in wild-type thymocytes. This new study provides a different interpretation for these data, suggesting that the defect in positive selection in Grb2-decient mice might result from the destabilization of Themis and from the subsequent decrease in its expression. Thus, an unexpected function of Grb2 could be to maintain the expression of Themis above a certain level and under which level TCR signals are not sufcient to effectively promote positive selection. Whether the transgenic expression of Themis rescues the defect in positive selection in thymocytes that are fully decient for Grb2 remains to be addressed. Acknowledgments We thank P. E. Love for critical reading of the manuscript, the Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan ow cytometry facility, and the INSERM UMS006-CREFRE animal care facility. Disclosures The authors have no nancial conicts of interest. References 1. Carpenter, A. C. , and R. Bosselut. 2010. Decision checkpoints in the thymus. Nat. Immunol. 11 : 666673. 2. Starr, T. K. , S. C. Jameson, and K. A. Hogquist. 2003. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21 : 139176. 3. Hogquist, K. A. , and S. C. Jameson. 2014. The self-obsession of T cells : how TCR signaling thresholds affect fate decisions' and effector function. Nat. Immunol. 15 : 815823. 4. Wilkinson, R. W. , G. Anderson, J. J. Owen, and E. J. Jenkinson. 1995. Positive selection of thymocytes involves sustained interactions with the thymic micro- environment. J. Immunol. 155 : 52345240. 5. Mariathasan, S. , A. Zakarian, D. Bouchard, A. M. Michie, J. C. Zuniga-Pucker, and P. S. Ohashi. 2001. Duration and strength of extracellular signal-regulated kinase signals are altered during positive versus negative thymocyte selection. J. Immunol. 167 : 49664973. 6. Ross, J. O. , H. J. Melichar, B. B. Au-Yeung, P. Herzmark, A. Weiss, and E. A. Robey. 2014. Distinct phases in the positive selection of CD8 T cells distinguished by intrathymic migration and T-cell receptor signaling patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111 : E2550E2558. 7. Daniels, M. A. , E. Teixeiro, J. Gill, B. Hausmann, D. Roubaty, K. Holmberg, G. Werlen, G. A. Hollander, N. R. Gascoigne, and E. Palmer. 2006. Thymic selection threshold dened by compartmentalization of Ras/MAPK signalling. Nature 444 : 724729. 8. Au-Yeung, B. B. , H. J. Melichar, J. O. Ross, D. A. Cheng, J. Zikherman, K. M. Shokat, E. A. Robey, and A. Weiss. 2014. Quantitative and temporal re- quirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development. Nat. Immunol. 15 : 687694. 9. Brugnera, E. , A. Bhandoola, R. Cibotti, Q. Yu, T. I. Guinter, Y. Yamashita, S. O. Sharrow, and A. Singer. 2000. Coreceptor reversal in the thymus : signaled CD4 8 thymocytes initially terminate CD8 transcription even when differen- tiating into CD8 T cells. Immunity 13 : 5971. 10. Dzhagalov, I. L. , K. G. Chen, P. Herzmark, and E. A. Robey. 2013. Elimination of self-reactive T cells in the thymus : a timeline for negative selection. PLoS Biol. 11 : e1001566. 11. Acuto, O. , V. Di Bartolo, and F. Michel. 2008. Tailoring T-cell receptor signals by proximal negative feedback mechanisms. Nat. Rev. Immunol. 8 : 699712. 12. Malissen, B. , C. Gregoire, M. Malissen, and R. Roncagalli. 2014. Integrative biology of T cell activation. Nat. Immunol. 15 : 790797. 13. Kosugi, A. , J. Sakakura, K. Yasuda, M. Ogata, and T. Hamaoka. 2001. In- volvement of SHP-1 tyrosine phosphatase in TCR-mediated signaling pathways in lipid rafts. Immunity 14 : 669680. 14. Lorenz, U. 2009. SHP-1 and SHP-2 in T cells : two phosphatases functioning at many levels. Immunol. Rev. 228 : 342359. 15. Stefanova, I. , B. Hemmer, M. Vergelli, R. Martin, W. E. Biddison, and R. N. Germain. 2003. TCR ligand discrimination is enforced by competing ERK positive and SHP-1 negative feedback pathways. Nat. Immunol. 4 : 248254. 16. Fu, G. , S. Vallee, V. Rybakin, M. V. McGuire, J. Ampudia, C. Brockmeyer, M. Salek, P. R. Fallen, J. A. Hoerter, A. Munshi, et al. 2009. Themis controls thymocyte selection through regulation of T cell antigen receptor-mediated signaling. Nat. Immunol. 10 : 848856. 17. Johnson, A. L. , L. Aravind, N. Shulzhenko, A. Morgun, S. Y. Choi, T. L. Crockford, T. Lambe, H. Domaschenz, E. M. Kucharska, L. Zheng, et al. 2009. Themis is a member of a new metazoan gene family and is required for the completion of thymocyte positive selection. Nat. Immunol. 10 : 831839. 18. Lesourne, R. , S. Uehara, J. Lee, K. D. Song, L. Li, J. Pinkhasov, Y. Zhang, N. P. Weng, K. F. Wildt, L. Wang, et al. 2009. Themis, a T cell-specic protein important for late thymocyte development. Nat. Immunol. 10 : 840847. 19. Patrick, M. S. , H. Oda, K. Hayakawa, Y. Sato, K. Eshima, T. Kirikae, S. Iemura, M. Shirai, T. Abe, T. Natsume, et al. 2009. Gasp, a Grb2-associating protein, is critical for positive selection of thymocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106 : 1634516350. 20. Lesourne, R. , E. Zvezdova, K. D. Song, D. El-Khoury, S. Uehara, V. A. Barr, L. E. Samelson, and P. E. Love. 2012. Interchangeability of Themis1 and The- mis2 in thymocyte development reveals two related proteins with conserved molecular function. J. Immunol. 189 : 11541161. 21. Paster, W. , C. Brockmeyer, G. Fu, P. C. Simister, B. de Wet, A. Martinez-Riano, J. A. Hoerter, S. M. Feller, C. Wulng, N. R. Gascoigne, and O. Acuto. 2013. GRB2-mediated recruitment of THEMIS to LAT is essential for thymocyte development. J. Immunol. 190 : 37493756. 22. Choi, S. , C. Warzecha, E. Zvezdova, J. Lee, J. Argenty, R. Lesourne, L. Aravind, and P. E. Love. 2017. THEMIS enhances TCR signaling and enables positive selection by selective inhibition of the phosphatase SHP-1. [Published erratum appears in 2017 Nat. Immunol. 18 : 705. ] Nat. Immunol. 18 : 433441. 23. Gong, Q. , A. M. Cheng, A. M. Akk, J. Alberola-Ila, G. Gong, T. Pawson, and A. C. Chan. 2001. Disruption of T cell signaling networks and development by Grb2 haploid insufciency. Nat. Immunol. 2 : 2936. 24. Stegeman, S. , L. A. Jolly, S. Premarathne, J. Gecz, L. J. Richards, A. Mackay- Sim, and S. A. Wood. 2013. Loss of Usp9x disrupts cortical architecture, hip- pocampal development and TGFb-mediated axonogenesis. PLoS One 8 : e68287. 25. Theard, D. , F. Labarrade, M. Partisani, J. Milanini, H. Sakagami, E. A. Fon, S. A. Wood, M. Franco, and F. Luton. 2010. USP9x-mediated deubiquitination of EFA6 regulates de novo tight junction assembly. EMBO J. 29 : 14991509. 26. Komander, D. , M. J. Clague, and S. Urbe. 2009. Breaking the chains : structure and function of the deubiquitinases. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 : 550563. 27. Zvezdova, E. , J. Mikolajczak, A. Garreau, M. Marcellin, L. Rigal, J. Lee, S. Choi, G. Blaize, J. Argenty, J. Familiades, et al. 2016. Themis1 enhances T cell receptor signaling during thymocyte development by promoting Vav1 activity and Grb2 stability. Sci. Signal. 9 : ra51. 28. Tian, X. , N. S. Isamiddinova, R. J. Peroutka, S. J. Goldenberg, M. R. Mattern, B. Nicholson, and C. Leach. 2011. Characterization of selective ubiquitin and ubiquitin-like protease inhibitors using a uorescence-based multiplex assay format. Assay Drug Dev. Technol. 9 : 165173. 29. Shi, J. , and H. T. Petrie. 2012. Activation kinetics and off-target effects of thymus-initiated cre transgenes. PLoS One 7 : e46590. 30. Naik, E. , and V. M. Dixit. 2016. Usp9X is required for lymphocyte activation and homeostasis through its control of ZAP70 ubiquitination and PKCb kinase ac- tivity. J. Immunol. 196 : 34383451. 31. Jang, I. K. , J. Zhang, Y. J. Chiang, H. K. Kole, D. G. Cronshaw, Y. Zou, and H. Gu. 2010. Grb2 functions at the top of the T-cell antigen receptor-induced tyrosine kinase cascade to control thymic selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107 : 1062010625. 32. Pickart, C. M. 1997. Targeting of substrates to the 26S proteasome. FASEB J. 11 : 10551066. 33. Udeshi, N. D. , T. Svinkina, P. Mertins, E. Kuhn, D. R. Mani, J. W. Qiao, and S. A. Carr. 2013. Rened preparation and use of anti-diglycine remnant (K- -GG) antibody enables routine quantication of 10, 000s of ubiquitination sites in single proteomics experiments. Mol. Cell. Proteomics 12 : 825831. 34. Naik, E. , J. D. Webster, J. DeVoss, J. Liu, R. Suriben, and V. M. Dixit. 2014. Regulation of proximal T cell receptor signaling and tolerance induction by deubiquitinase Usp9X. J. Exp. Med. 211 : 19471955. 35. Liu, X. , and R. Bosselut. 2004. Duration of TCR signaling controls CD4-CD8 lineage differentiation in vivo. Nat. Immunol. 5 : 280288. 36. Stephen, T. L. , A. Tikhonova, J. M. Riberdy, and T. M. Laufer. 2009. The ac- tivation threshold of CD4 T cells is dened by TCR/peptide-MHC class II interactions in the thymic medulla. J. Immunol. 183 : 55545562. D o w n l o a d e d f r o m h t t p : / / w w w . j i m m u n o l . o r g / b y g u e s t o n J u l y 1 5 , 2 0 1 8 210 Annexe 4 : Détermination des domaines d'interaction entre THEMIS1 et Lis1 (A) Des cellules HEK293T ont été co-transfectées de plasmides codants les protéines Lis1-HA et THEMIS1-Flag WT (ThWT) ou codant pour la protéine THEMIS1-Flag privée de domaine CABIT1 (ThDCABIT1), CABIT2 (ThDCABIT2) ou PRR (ThDPRR). Les cellules ont été lysée puis FLAG a été immunoprécipité. Le Westernblot représente les protéines Lis1-HA co-immunoprécipitées avec les différentes protéines THEMIS1. Nous observons que le CABIT1 est important pour l'interaction entre THEMIS1 et Lis1. Rac1 a été utilisée comme contrôle de quantité dans la condition WCL. (B) Des cellules HEK293T ont été co-transfectées de plasmides codant les protéines THEMIS1-Flag WT (ThWT) et Lis1-GFP WT ou codant pour la région LisH-GFP . Les cellules ont été lysées puis FLAG a été immunoprécipité. Le Westernblot représente les protéines Lis1-GFP ou LisH-GFP co- immunoprécipitées ou nous avec les différentes protéines THEMIS1. Nous observons que le domaine LisH ne suffit pas pour l'interaction entre THEMIS1 et Lis1 suggerant que THEMIS1 interagisse avec l'hélice de Lis1. Rac1 a été utilisée comme contrôle de quantité dans la condition WCL 211 212 PORTFOLIO Au cours de cette thèse, j'ai pu participer à la revision de trois publications scientifiques insérées en annexe1, annexe2 et annexe3 de cette thèse. I) Compétences expérimentales acquises Au cours de cette these j'ai pu acquérir les compétences suivantes : Analyse par cytométrie en flux (MACSQUANT, LSR-II, LSR-FORTESSA) : marquages de surface et intracellulaires pour phénotypage, analyses de la proliferation et du cycle cellulaire et traitements sur FlowJO. Imagerie en flux (ImageStreamX) : marquages des cellules, analyses sur le logiciel IDEAS des images Microscopie confocale et video-microscopie (LSM710 et Spinning Disk) : réalisation de marquages pour microscopie confocale et vidéo-microscopie et analyses des images sur le logiciel ImageJ, Culture cellulaire des LT primaires de souris, des thymocytes doubles négatifs et de lignées cellulaires Jurkats, HEK293T, OP9 et P13. 9 Réalisation de stimulation de thymocytes et de LT in vitro pour l'analyse de proteines phosphorylées, d'immunoprécipitation et révélation par westernblot ou spectrométrie de masse Transfection de cellules Jurkats et HEK293T pour immunoprecipitation et révélation par westernblot. II) Formations suivies Formation Microscopie de fluorescence : présentation de la microscopie et des différentes techniques d'imagerie Formation ImageJ : apprentissage des fonctions principalement utilisées sur ImageJ pour les traitements d'images Formation Enjeux sociétaux de la recherche : Présentation des consignes éthiques dans un laboratoire de recherche concernant la transmission des résultats, la transparence des experiences dans un article scientifique et dans les essais cliniques Formation Vers le métier de chercheur : presentation de différents chercheurs et des formations qu'ils ont suivi jusqu'à leur prise de poste 213 214 REFERENCES Li J, Reantragoon R, Kostenko L, Corbett AJ, Varigos G, Carbone FR. 2017. The frequency of mucosal-associated invariant T cells is selectively increased in dermatitis herpetiformis. Australas J Dermatol 58 : 200-204. Tsuda H, Sakai M, Michimata T, Tanebe K, Hayakawa S, Saito S. 2001. Characterization of NKT cells in human peripheral blood and decidual lymphocytes. Am J Reprod Immunol 45 : 295-302. Kearse KP, Roberts JL, Singer A. 1995. TCR alpha-CD3 delta epsilon association is the initial step in alpha beta dimer formation in murine T cells and is limiting in immature CD4 CD8 thymocytes. Immunity 2 : 391-399. Sussman JJ, Bonifacino JS, Lippincott-Schwartz J, Weissman AM, Saito T, Klausner RD, Ashwell JD. 1988. Failure to synthesize the T cell CD3-zeta chain : structure and function of a partial T cell receptor complex. Cell 52 : 85-95. Bolliger L, Johansson B. 1999. Identification and functional characterization of the zeta-chain dimerization motif for TCR surface expression. J Immunol 163 : 3867- 3876. Call ME, Pyrdol J, Wiedmann M, Wucherpfennig KW. 2002. The organizing principle in the formation of the T cell receptor-CD3 complex. Cell 111 : 967-979. Cosson P, Lankford SP, Bonifacino JS, Klausner RD. 1991. Membrane protein association by potential intramembrane charge pairs. Nature 351 : 414-416. Soetandyo N, Wang Q, Ye Y, Li L. 2010. Role of intramembrane charged residues in the quality control of unassembled T-cell receptor alpha-chains at the endoplasmic reticulum. J Cell Sci 123 : 1031-1038. Alcover A, Mariuzza RA, Ermonval M, Acuto O. 1990. Lysine 271 in the transmembrane domain of the T-cell antigen receptor beta chain is necessary for its assembly with the CD3 complex but not for alpha/beta dimerization. J Biol Chem 265 : 4131-4135. Li ZG, Wu WP, Manolios N. 1996. Structural mutations in the constant region of the T-cell antigen receptor (TCR)beta chain and their effect on TCR alpha and beta chain interaction. Immunology 88 : 524-530. Fields BA, Mariuzza RA. 1996. Structure and function of the T-cell receptor : insights from X-ray crystallography. Immunol Today 17 : 330-336. Garcia KC, Degano M, Stanfield RL, Brunmark A, Jackson MR, Peterson PA, Teyton L, Wilson IA. 1996. An alphabeta T cell receptor structure at 2. 5 A and its orientation in the TCR-MHC complex. Science 274 : 209-219. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 14. 13. Wegener AM, Hou X, Dietrich J, Geisler C. 1995. Distinct domains of the CD3- gamma chain are involved in surface expression and function of the T cell antigen receptor. J Biol Chem 270 : 4675-4680. Bolliger L, Johansson B, Palmer E. 1997. The short extracellular domain of the T cell receptor zeta chain is involved in assembly and signal transduction. Mol Immunol 34 : 819-827. 215 Johansson B, Palmer E, Bolliger L. 1999. The extracellular domain of the zeta-chain is essential for TCR function. J Immunol 162 : 878-885. Bckstrm BT, Rubin B, Peter A, Tiefenthaler G, Palmer E. 1997. T cell receptor alpha-chain tail is required for protein kinase C-mediated down-regulation, but not for signaling. Eur J Immunol 27 : 1433-1441. Reth M. 1989. Antigen receptor tail clue. Nature 338 : 383-384. Irving BA, Weiss A. 1991. The cytoplasmic domain of the T cell receptor zeta chain is sufficient to couple to receptor-associated signal transduction pathways. Cell 64 : 891-901. Letourneur F, Klausner RD. 1992. Activation of T cells by a tyrosine kinase activation domain in the cytoplasmic tail of CD3 epsilon. Science 255 : 79-82. Straus DB, Weiss A. 1993. The CD3 chains of the T cell antigen receptor associate with the ZAP-70 tyrosine kinase and are tyrosine phosphorylated after receptor stimulation. J Exp Med 178 : 1523-1530. Bettini ML, Chou PC, Guy CS, Lee T, Vignali KM, Vignali DAA. 2017. Cutting Edge : CD3 ITAM Diversity Is Required for Optimal TCR Signaling and Thymocyte Development. J Immunol 199 : 1555-1560. Sunder-Plassmann R, Lialios F, Madsen M, Koyasu S, Reinherz EL. 1997. Functional analysis of immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-mediated signal transduction : the two YxxL segments within a single CD3zeta-ITAM are functionally distinct. Eur J Immunol 27 : 2001-2009. 1992. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell 68 : 869-877. Schatz DG, Swanson PC. 2011. V(D)J recombination : mechanisms of initiation. Annu Rev Genet 45 : 167-202. Sleckman BP, Bardon CG, Ferrini R, Davidson L, Alt FW. 1997. Function of the TCR alpha enhancer in alphabeta and gammadelta T cells. Immunity 7 : 505-515. Bouvier G, Watrin F, Naspetti M, Verthuy C, Naquet P, Ferrier P. 1996. Deletion of the mouse T-cell receptor beta gene enhancer blocks alphabeta T-cell development. Proc Natl Acad Sci U S A 93 : 7877-7881. Bories JC, Demengeot J, Davidson L, Alt FW. 1996. Gene-targeted deletion and replacement mutations of the T-cell receptor beta-chain enhancer : the role of enhancer elements in controlling V(D)J recombination accessibility. Proc Natl Acad Sci U S A 93 : 7871-7876. 23. Mombaerts P, Iacomini J, Johnson RS, Herrup K, Tonegawa S, Papaioannou VE. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 24. 25. 26. 27. 29. 30. 31. 28. Monroe RJ, Seidl KJ, Gaertner F, Han S, Chen F, Sekiguchi J, Wang J, Ferrini R, Davidson L, Kelsoe G, Alt FW. 1999. RAG2 : GFP knockin mice reveal novel aspects of RAG2 expression in primary and peripheral lymphoid tissues. Immunity 11 : 201-212. Roose JP, Diehn M, Tomlinson MG, Lin J, Alizadeh AA, Botstein D, Brown PO, Weiss A. 2003. T cell receptor-independent basal signaling via Erk and Abl kinases suppresses RAG gene expression. PLoS Biol 1 : E53. Patra AK, Drewes T, Engelmann S, Chuvpilo S, Kishi H, Hnig T, Serfling E, Bommhardt UH. 2006. PKB rescues calcineurin/NFAT-induced arrest of Rag expression and pre-T cell differentiation. J Immunol 177 : 4567-4576. Chao J, Rothschild G, Basu U. 2014. Ubiquitination events that regulate recombination of immunoglobulin Loci gene segments. Front Immunol 5 : 100. 216 32. Liu Y, Subrahmanyam R, Chakraborty T, Sen R, Desiderio S. 2007. A plant homeodomain in RAG-2 that binds Hypermethylated lysine 4 of histone H3 is necessary for efficient antigen-receptor-gene rearrangement. Immunity 27 : 561- 571. 33. Matthews AG, Kuo AJ, Ramn-Maiques S, Han S, Champagne KS, Ivanov D, Gallardo M, Carney D, Cheung P, Ciccone DN, Walter KL, Utz PJ, Shi Y, Kutateladze TG, Yang W, Gozani O, Oettinger MA. 2007. RAG2 PHD finger couples histone H3 lysine 4 trimethylation with V(D)J recombination. Nature 450 : 1106-1110. Hathcock KS, Farrington L, Ivanova I, Livak F, Selimyan R, Sen R, Williams J, Tai X, Hodes RJ. 2011. The requirement for pre-TCR during thymic differentiation enforces a developmental pause that is essential for V-DJ rearrangement. PLoS One 6 : e20639. 35. Maddon PJ, Molineaux SM, Maddon DE, Zimmerman KA, Godfrey M, Alt FW, Chess L, Axel R. 1987. Structure and expression of the human and mouse T4 genes. Proc Natl Acad Sci U S A 84 : 9155-9159. Norment AM, Littman DR. 1988. A second subunit of CD8 is expressed in human T cells. EMBO J 7 : 3433-3439. Shiue L, Gorman SD, Parnes JR. 1988. A second chain of human CD8 is expressed on peripheral blood lymphocytes. J Exp Med 168 : 1993-2005. Doyle C, Strominger JL. 1987. Interaction between CD4 and class II MHC molecules mediates cell adhesion. Nature 330 : 256-259. Norment AM, Salter RD, Parham P, Engelhard VH, Littman DR. 1988. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules. Nature 336 : 79-81. Rosenstein Y, Ratnofsky S, Burakoff SJ, Herrmann SH. 1989. Direct evidence for binding of CD8 to HLA class I antigens. J Exp Med 169 : 149-160. Knig R, Huang LY, Germain RN. 1992. MHC class II interaction with CD4 mediated by a region analogous to the MHC class I binding site for CD8. Nature 356 : 796-798. Potter TA, Rajan TV, Dick RF, Bluestone JA. 1989. Substitution at residue 227 of H-2 class I molecules abrogates recognition by CD8-dependent, but not CD8- independent, cytotoxic T lymphocytes. Nature 337 : 73-75. Salter RD, Benjamin RJ, Wesley PK, Buxton SE, Garrett TP, Clayberger C, Krensky AM, Norment AM, Littman DR, Parham P. 1990. A binding site for the T-cell co- receptor CD8 on the alpha 3 domain of HLA-A2. Nature 345 : 41-46. 44. Wooldridge L, van den Berg HA, Glick M, Gostick E, Laugel B, Hutchinson SL, Milicic A, Brenchley JM, Douek DC, Price DA, Sewell AK. 2005. Interaction between the CD8 coreceptor and major histocompatibility complex class I stabilizes T cell receptor-antigen complexes at the cell surface. J Biol Chem 280 : 27491-27501. Garcia KC, Scott CA, Brunmark A, Carbone FR, Peterson PA, Wilson IA, Teyton L. 1996. CD8 enhances formation of stable T-cell receptor/MHC class I molecule complexes. Nature 384 : 577-581. Huppa JB, Axmann M, Mrtelmaier MA, Lillemeier BF, Newell EW, Brameshuber M, Klein LO, Schtz GJ, Davis MM. 2010. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature 463 : 963-967. 34. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 45. 46. 217 Veillette A, Bookman MA, Horak EM, Bolen JB. 1988. The CD4 and CD8 T cell surface antigens are associated with the internal membrane tyrosine-protein kinase p56lck. Cell 55 : 301-308. Iwashima M, Irving BA, van Oers NS, Chan AC, Weiss A. 1994. Sequential interactions of the TCR with two distinct cytoplasmic tyrosine kinases. Science 263 : 1136-1139. Artyomov MN, Lis M, Devadas S, Davis MM, Chakraborty AK. 2010. CD4 and CD8 binding to MHC molecules primarily acts to enhance Lck delivery. Proc Natl Acad Sci U S A 107 : 16916-16921. Jiang N, Huang J, Edwards LJ, Liu B, Zhang Y, Beal CD, Evavold BD, Zhu C. 2011. Two-stage cooperative T cell receptor-peptide major histocompatibility complex- CD8 trimolecular interactions amplify antigen discrimination. Immunity 34 : 13-23. Casas J, Brzostek J, Zarnitsyna VI, Hong JS, Wei Q, Hoerter JA, Fu G, Ampudia J, Zamoyska R, Zhu C, Gascoigne NR. 2014. Ligand-engaged TCR is triggered by Lck not associated with CD8 coreceptor. Nat Commun 5 : 5624. Gil D, Schamel WW, Montoya M, Sánchez-Madrid F, Alarcn B. 2002. Recruitment of Nck by CD3 epsilon reveals a ligand-induced conformational change essential for T cell receptor signaling and synapse formation. Cell 109 : 901-912. Gil D, Schrum AG, Alarcn B, Palmer E. 2005. T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes. J Exp Med 201 : 517-522. de la Cruz J, Kruger T, Parks CA, Silge RL, van Oers NS, Luescher IF, Schrum AG, Gil D. 2011. Basal and antigen-induced exposure of the proline-rich sequence in CD3. J Immunol 186 : 2282-2290. the T cell receptor requires both clustering and conformational changes at CD3. Immunity 26 : 43-54. van Oers NS, Killeen N, Weiss A. 1996. Lck regulates the tyrosine phosphorylation of the T cell receptor subunits and ZAP-70 in murine thymocytes. J Exp Med 183 : 1053-1062. Chan AC, Iwashima M, Turck CW, Weiss A. 1992. ZAP-70 : a 70 kd protein-tyrosine kinase that associates with the TCR zeta chain. Cell 71 : 649-662. Zhang W, Sloan-Lancaster J, Kitchen J, Trible RP, Samelson LE. 1998. LAT : the ZAP- 70 tyrosine kinase substrate that links T cell receptor to cellular activation. Cell 92 : 83-92. Paz PE, Wang S, Clarke H, Lu X, Stokoe D, Abo A. 2001. Mapping the Zap-70 phosphorylation sites on LAT (linker for activation of T cells) required for recruitment and activation of signalling proteins in T cells. Biochem J 356 : 461-471. Abraham N, Veillette A. 1990. Activation of p56lck through mutation of a regulatory carboxy-terminal tyrosine residue requires intact sites of autophosphorylation and myristylation. Mol Cell Biol 10 : 5197-5206. Paige LA, Nadler MJ, Harrison ML, Cassady JM, Geahlen RL. 1993. Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck. J Biol Chem 268 : 8669-8674. 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 56. 57. 58. 59. 60. 61. 55. Minguet S, Swamy M, Alarcn B, Luescher IF, Schamel WW. 2007. Full activation of 218 Straus DB, Chan AC, Patai B, Weiss A. 1996. SH2 domain function is essential for the role of the Lck tyrosine kinase in T cell receptor signal transduction. J Biol Chem 271 : 9976-9981. Caron L, Abraham N, Pawson T, Veillette A. 1992. Structural requirements for enhancement of T-cell responsiveness by the lymphocyte-specific tyrosine protein kinase p56lck. Mol Cell Biol 12 : 2720-2729. Denny MF, Kaufman HC, Chan AC, Straus DB. 1999. The lck SH3 domain is required for activation of the mitogen-activated protein kinase pathway but not the initiation of T-cell antigen receptor signaling. J Biol Chem 274 : 5146-5152. Shaw AS, Amrein KE, Hammond C, Stern DF, Sefton BM, Rose JK. 1989. The lck tyrosine protein kinase interacts with the cytoplasmic tail of the CD4 glycoprotein through its unique amino-terminal domain. Cell 59 : 627-636. Turner JM, Brodsky MH, Irving BA, Levin SD, Perlmutter RM, Littman DR. 1990. Interaction of the unique N-terminal region of tyrosine kinase p56lck with cytoplasmic domains of CD4 and CD8 is mediated by cysteine motifs. Cell 60 : 755- 765. Ostergaard HL, Shackelford DA, Hurley TR, Johnson P, Hyman R, Sefton BM, Trowbridge IS. 1989. Expression of CD45 alters phosphorylation of the lck-encoded tyrosine protein kinase in murine lymphoma T-cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A 86 : 8959-8963. Amrein KE, Sefton BM. 1988. Mutation of a site of tyrosine phosphorylation in the lymphocyte-specific tyrosine protein kinase, p56lck, reveals its oncogenic potential in fibroblasts. Proc Natl Acad Sci U S A 85 : 4247-4251. Xu W, Harrison SC, Eck MJ. 1997. Three-dimensional structure of the tyrosine kinase c-Src. Nature 385 : 595-602. Sicheri F, Moarefi I, Kuriyan J. 1997. Crystal structure of the Src family tyrosine kinase Hck. Nature 385 : 602-609. Xu W, Doshi A, Lei M, Eck MJ, Harrison SC. 1999. Crystal structures of c-Src reveal features of its autoinhibitory mechanism. Mol Cell 3 : 629-638. Hardwick JS, Sefton BM. 1995. Activation of the Lck tyrosine protein kinase by hydrogen peroxide requires the phosphorylation of Tyr-394. Proc Natl Acad Sci U S A 92 : 4527-4531. Nika K, Soldani C, Salek M, Paster W, Gray A, Etzensperger R, Fugger L, Polzella P, Cerundolo V, Dushek O, Hfer T, Viola A, Acuto O. 2010. Constitutively active Lck kinase in T cells drives antigen receptor signal transduction. Immunity 32 : 766-777. Chan AC, Irving BA, Fraser JD, Weiss A. 1991. The zeta chain is associated with a tyrosine kinase and upon T-cell antigen receptor stimulation associates with ZAP-70, a 70-kDa tyrosine phosphoprotein. Proc Natl Acad Sci U S A 88 : 9166-9170. Identification by electrospray ionization mass spectrometry of the sites of tyrosine phosphorylation induced in activated Jurkat T cells on the protein tyrosine kinase ZAP-70. J Biol Chem 269 : 29520-29529. 219 62. 63. 64. 65. 66. 67. 68. 69. 70. 71. 72. 73. 74. 75. Wange RL, Malek SN, Desiderio S, Samelson LE. 1993. Tandem SH2 domains of ZAP-70 bind to T cell antigen receptor zeta and CD3 epsilon from activated Jurkat T cells. J Biol Chem 268 : 19797-19801. 76. Watts JD, Affolter M, Krebs DL, Wange RL, Samelson LE, Aebersold R. 1994. M, Chan AC, Abraham RT. 1999. Phosphorylation of Tyr319 in ZAP-70 is required for T-cell antigen receptor-dependent phospholipase C-gamma1 and Ras activation. EMBO J 18 : 1832-1844. Chan AC, Dalton M, Johnson R, Kong GH, Wang T, Thoma R, Kurosaki T. 1995. Activation of ZAP-70 kinase activity by phosphorylation of tyrosine 493 is required for lymphocyte antigen receptor function. EMBO J 14 : 2499-2508. Grazioli L, Germain V, Weiss A, Acuto O. 1998. Anti-peptide antibodies detect conformational changes of the inter-SH2 domain of ZAP-70 due to binding to the zeta chain and to intramolecular interactions. J Biol Chem 273 : 8916-8921. Hatada MH, Lu X, Laird ER, Green J, Morgenstern JP, Lou M, Marr CS, Phillips TB, Ram MK, Theriault K. 1995. Molecular basis for interaction of the protein tyrosine kinase ZAP-70 with the T-cell receptor. Nature 377 : 32-38. Folmer RH, Geschwindner S, Xue Y. 2002. Crystal structure and NMR studies of the apo SH2 domains of ZAP-70 : two bikes rather than a tandem. Biochemistry 41 : 14176-14184. critical for antigen receptor-mediated signal transduction. J Exp Med 185 : 1877- 1882. Di Bartolo V, Mège D, Germain V, Pelosi M, Dufour E, Michel F, Magistrelli G, Isacchi A, Acuto O. 1999. Tyrosine 319, a newly identified phosphorylation site of ZAP-70, plays a critical role in T cell antigen receptor signaling. J Biol Chem 274 : 6285-6294. Brdicka T, Kadlecek TA, Roose JP, Pastuszak AW, Weiss A. 2005. Intramolecular regulatory switch in ZAP-70 : analogy with receptor tyrosine kinases. Mol Cell Biol 25 : 4924-4933. Zhang W, Trible RP, Zhu M, Liu SK, McGlade CJ, Samelson LE. 2000. Association of Grb2, Gads, and phospholipase C-gamma 1 with phosphorylated LAT tyrosine residues. Effect of LAT tyrosine mutations on T cell angigen receptor-mediated signaling. J Biol Chem 275 : 23355-23361. Lin J, Weiss A. 2001. Identification of the minimal tyrosine residues required for linker for activation of T cell function. J Biol Chem 276 : 29588-29595. Patrick MS, Oda H, Hayakawa K, Sato Y, Eshima K, Kirikae T, Iemura S, Shirai M, Abe T, Natsume T, Sasazuki T, Suzuki H. 2009. Gasp, a Grb2-associating protein, is critical for positive selection of thymocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 106 : 16345- 16350. Paster W, Brockmeyer C, Fu G, Simister PC, de Wet B, Martinez-Riao A, Hoerter JA, Feller SM, Wlfing C, Gascoigne NR, Acuto O. 2013. GRB2-mediated recruitment of THEMIS to LAT is essential for thymocyte development. J Immunol 190 : 3749-3756. Liu SK, Fang N, Koretzky GA, McGlade CJ. 1999. The hematopoietic-specific adaptor protein gads functions in T-cell signaling via interactions with the SLP-76 and LAT adaptors. Curr Biol 9 : 67-75. Bubeck Wardenburg J, Fu C, Jackman JK, Flotow H, Wilkinson SE, Williams DH, Johnson R, Kong G, Chan AC, Findell PR. 1996. Phosphorylation of SLP-76 by the 220 77. Williams BL, Irvin BJ, Sutor SL, Chini CC, Yacyshyn E, Bubeck Wardenburg J, Dalton 82. Wu J, Zhao Q, Kurosaki T, Weiss A. 1997. The Vav binding site (Y315) in ZAP-70 is 78. 79. 80. 81. 83. 84. 85. 86. 87. 88. 89. 90. 91. 92. ZAP-70 protein-tyrosine kinase is required for T-cell receptor function. J Biol Chem 271 : 19641-19644. Bunnell SC, Diehn M, Yaffe MB, Findell PR, Cantley LC, Berg LJ. 2000. Biochemical interactions integrating Itk with the T cell receptor-initiated signaling cascade. J Biol Chem 275 : 2219-2230. Liu KQ, Bunnell SC, Gurniak CB, Berg LJ. 1998. T cell receptor-initiated calcium release is uncoupled from capacitative calcium entry in Itk-deficient T cells. J Exp Med 187 : 1721-1727. 93. Wunderlich L, Farag A, Downward J, Buday L. 1999. Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes. Eur J Immunol 29 : 1068- 1075. Raab M, da Silva AJ, Findell PR, Rudd CE. 1997. Regulation of Vav-SLP-76 binding by ZAP-70 and its relevance to TCR zeta/CD3 induction of interleukin-2. Immunity 6 : 155-164. da Silva AJ, Li Z, de Vera C, Canto E, Findell P, Rudd CE. 1997. Cloning of a novel T- cell protein FYB that binds FYN and SH2-domain-containing leukocyte protein 76 and modulates interleukin 2 production. Proc Natl Acad Sci U S A 94 : 7493-7498. 96. Wang H, McCann FE, Gordan JD, Wu X, Raab M, Malik TH, Davis DM, Rudd CE. 94. 95. 2004. ADAP-SLP-76 binding differentially regulates supramolecular activation cluster (SMAC) formation relative to T cell-APC conjugation. J Exp Med 200 : 1063- 1074. 97. Weiss A, Koretzky G, Schatzman RC, Kadlecek T. 1991. Functional activation of the T-cell antigen receptor induces tyrosine phosphorylation of phospholipase C- gamma 1. Proc Natl Acad Sci U S A 88 : 5484-5488. Rhee SG. 2001. Regulation of phosphoinositide-specific phospholipase C. Annu Rev Biochem 70 : 281-312. Lewis RS. 2001. Calcium signaling mechanisms in T lymphocytes. Annu Rev Immunol 19 : 497-521. Shaw PJ, Qu B, Hoth M, Feske S. 2013. Molecular regulation of CRAC channels and their role in lymphocyte function. Cell Mol Life Sci 70 : 2637-2656. 98. 99. 100. 102. 101. Baksh S, Burakoff SJ. 2000. The role of calcineurin in lymphocyte activation. Semin Immunol 12 : 405-415. Savignac M, Pintado B, Gutierrez-Adan A, Palczewska M, Mellstrm B, Naranjo JR. 2005. Transcriptional repressor DREAM regulates T-lymphocyte proliferation and cytokine gene expression. EMBO J 24 : 3555-3564. 103. Roose JP, Mollenauer M, Gupta VA, Stone J, Weiss A. 2005. A diacylglycerol- protein kinase C-RasGRP1 pathway directs Ras activation upon antigen receptor stimulation of T cells. Mol Cell Biol 25 : 4426-4441. 104. Houtman JC, Yamaguchi H, Barda-Saad M, Braiman A, Bowden B, Appella E, Schuck P, Samelson LE. 2006. Oligomerization of signaling complexes by the multipoint binding of GRB2 to both LAT and SOS1. Nat Struct Mol Biol 13 : 798-805. 105. Rincn M. 2001. MAP-kinase signaling pathways in T cells. Curr Opin Immunol 13 : 339-345. 221 108. 106. Yu W, Fantl WJ, Harrowe G, Williams LT. 1998. Regulation of the MAP kinase pathway by mammalian Ksr through direct interaction with MEK and ERK. Curr Biol 8 : 56-64. 107. Nguyen A, Burack WR, Stock JL, Kortum R, Chaika OV, Afkarian M, Muller WJ, Murphy KM, Morrison DK, Lewis RE, McNeish J, Shaw AS. 2002. Kinase suppressor of Ras (KSR) is a scaffold which facilitates mitogen-activated protein kinase activation in vivo. Mol Cell Biol 22 : 3035-3045. Laurent MN, Ramirez DM, Alberola-Ila J. 2004. Kinase suppressor of Ras couples Ras to the ERK cascade during T cell development. J Immunol 173 : 986-992. 109. Matheny SA, Chen C, Kortum RL, Razidlo GL, Lewis RE, White MA. 2004. Ras regulates assembly of mitogenic signalling complexes through the effector protein IMP. Nature 427 : 256-260. 110. Chen C, Lewis RE, White MA. 2008. IMP modulates KSR1-dependent multivalent complex formation to specify ERK1/2 pathway activation and response thresholds. J Biol Chem 283 : 12789-12796. 111. Matheny SA, White MA. 2009. Signaling threshold regulation by the Ras effector IMP. J Biol Chem 284 : 11007-11011. 112. Gerondakis S, Fulford TS, Messina NL, Grumont RJ. 2014. NF-B control of T cell development. Nat Immunol 15 : 15-25. Thome M. 2004. CARMA1, BCL-10 and MALT1 in lymphocyte development and activation. Nat Rev Immunol 4 : 348-359. 113. 114. Genot EM, Arrieumerlou C, Ku G, Burgering BM, Weiss A, Kramer IM. 2000. The T- cell receptor regulates Akt (protein kinase B) via a pathway involving Rac1 and phosphatidylinositide 3-kinase. Mol Cell Biol 20 : 5469-5478. 115. Chen R, Kim O, Yang J, Sato K, Eisenmann KM, McCarthy J, Chen H, Qiu Y. 2001. Regulation of Akt/PKB activation by tyrosine phosphorylation. J Biol Chem 276 : 31858-31862. 116. Xue L, Nolla H, Suzuki A, Mak TW, Winoto A. 2008. Normal development is an integral part of tumorigenesis in T cell-specific PTEN-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A 105 : 2022-2027. 117. Huang H, Tindall DJ. 2007. Dynamic FoxO transcription factors. J Cell Sci 120 : 2479- 118. 119. 2487. Juntilla MM, Koretzky GA. 2008. Critical roles of the PI3K/Akt signaling pathway in T cell development. Immunol Lett 116 : 104-110. Lenschow DJ, Walunas TL, Bluestone JA. 1996. CD28/B7 system of T cell costimulation. Annu Rev Immunol 14 : 233-258. 120. Beyersdorf N, Kerkau T, Hnig T. 2015. CD28 co-stimulation in T-cell homeostasis : a recent perspective. Immunotargets Ther 4 : 111-122. 121. Howland KC, Ausubel LJ, London CA, Abbas AK. 2000. The roles of CD28 and CD40 122. ligand in T cell activation and tolerance. J Immunol 164 : 4465-4470. Lucas PJ, Negishi I, Nakayama K, Fields LE, Loh DY. 1995. Naive CD28-deficient T cells can initiate but not sustain an in vitro antigen-specific immune response. J Immunol 154 : 5757-5768. 123. Miyahira Y, Katae M, Kobayashi S, Takeuchi T, Fukuchi Y, Abe R, Okumura K, Yagita H, Aoki T. 2003. Critical contribution of CD28-CD80/CD86 costimulatory 222 pathway to protection from Trypanosoma cruzi infection. Infect Immun 71 : 3131- 3137. 124. Andres PG, Howland KC, Nirula A, Kane LP, Barron L, Dresnek D, Sadra A, Imboden J, Weiss A, Abbas AK. 2004. Distinct regions in the CD28 cytoplasmic domain are required for T helper type 2 differentiation. Nat Immunol 5 : 435-442. 125. Gunzer M, Schfer A, Borgmann S, Grabbe S, Znker KS, Brcker EB, Kmpgen E, Friedl P. 2000. Antigen presentation in extracellular matrix : interactions of T cells with dendritic cells are dynamic, short lived, and sequential. Immunity 13 : 323-332. Lee KH, Holdorf AD, Dustin ML, Chan AC, Allen PM, Shaw AS. 2002. T cell receptor signaling precedes immunological synapse formation. Science 295 : 1539-1542. 127. Dustin ML, Bromley SK, Kan Z, Peterson DA, Unanue ER. 1997. Antigen receptor 126. engagement delivers a stop signal to migrating T lymphocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 94 : 3909-3913. 128. Kupfer A, Singer SJ. 1989. The specific interaction of helper T cells and antigen- presenting B cells. IV. Membrane and cytoskeletal reorganizations in the bound T cell as a function of antigen dose. J Exp Med 170 : 1697-1713. Stoll S, Delon J, Brotz TM, Germain RN. 2002. Dynamic imaging of T cell-dendritic cell interactions in lymph nodes. Science 296 : 1873-1876. 129. 130. Kupfer A, Swain SL, Janeway CA, Singer SJ. 1986. The specific direct interaction of helper T cells and antigen-presenting B cells. Proc Natl Acad Sci U S A 83 : 6080-6083. 131. Kupfer H, Monks CR, Kupfer A. 1994. Small splenic B cells that bind to antigen- specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate : immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen- presenting cell interactions. J Exp Med 179 : 1507-1515. 132. Poo WJ, Conrad L, Janeway CA. 1988. Receptor-directed focusing of lymphokine release by helper T cells. Nature 332 : 378-380. 133. Dustin ML, Choudhuri K. 2016. Signaling and Polarized Communication Across the T Cell Immunological Synapse. Annu Rev Cell Dev Biol 32 : 303-325. 134. Monks CR, Freiberg BA, Kupfer H, Sciaky N, Kupfer A. 1998. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature 395 : 82-86. 135. Musci MA, Hendricks-Taylor LR, Motto DG, Paskind M, Kamens J, Turck CW, 136. Koretzky GA. 1997. Molecular cloning of SLAP-130, an SLP-76-associated substrate of the T cell antigen receptor-stimulated protein tyrosine kinases. J Biol Chem 272 : 11674-11677. Liu J, Kang H, Raab M, da Silva AJ, Kraeft SK, Rudd CE. 1998. FYB (FYN binding protein) serves as a binding partner for lymphoid protein and FYN kinase substrate SKAP55 and a SKAP55-related protein in T cells. Proc Natl Acad Sci U S A 95 : 8779- 8784. 137. Marie-Cardine A, Hendricks-Taylor LR, Boerth NJ, Zhao H, Schraven B, Koretzky GA. 1998. Molecular interaction between the Fyn-associated protein SKAP55 and the SLP-76-associated phosphoprotein SLAP-130. J Biol Chem 273 : 25789-25795. 138. Katagiri K, Imamura M, Kinashi T. 2006. Spatiotemporal regulation of the kinase Mst1 by binding protein RAPL is critical for lymphocyte polarity and adhesion. Nat Immunol 7 : 919-928. 223 139. Griffiths EK, Krawczyk C, Kong YY, Raab M, Hyduk SJ, Bouchard D, Chan VS, Kozieradzki I, Oliveira-Dos-Santos AJ, Wakeham A, Ohashi PS, Cybulsky MI, Rudd CE, Penninger JM. 2001. Positive regulation of T cell activation and integrin adhesion by the adapter Fyb/Slap. Science 293 : 2260-2263. 140. Peterson EJ, Woods ML, Dmowski SA, Derimanov G, Jordan MS, Wu JN, Myung PS, Liu QH, Pribila JT, Freedman BD, Shimizu Y, Koretzky GA. 2001. Coupling of the TCR to integrin activation by Slap-130/Fyb. Science 293 : 2263-2265. 141. Pauker MH, Reicher B, Fried S, Perl O, Barda-Saad M. 2011. Functional cooperation 142. between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization. Mol Cell Biol 31 : 2653-2666. Zeng R, Cannon JL, Abraham RT, Way M, Billadeau DD, Bubeck-Wardenberg J, Burkhardt JK. 2003. SLP-76 coordinates Nck-dependent Wiskott-Aldrich syndrome protein recruitment with Vav-1/Cdc42-dependent Wiskott-Aldrich syndrome protein activation at the T cell-APC contact site. J Immunol 171 : 1360-1368. 143. Crespo P, Schuebel KE, Ostrom AA, Gutkind JS, Bustelo XR. 1997. Phosphotyrosine- dependent activation of Rac-1 GDP/GTP exchange by the vav proto-oncogene product. Nature 385 : 169-172. 144. Pollitt AY, Insall RH. 2009. WASP and SCAR/WAVE proteins : the drivers of actin assembly. J Cell Sci 122 : 2575-2578. Symons M, Derry JM, Karlak B, Jiang S, Lemahieu V, Mccormick F, Francke U, Abo A. 1996. Wiskott-Aldrich syndrome protein, a novel effector for the GTPase CDC42Hs, is implicated in actin polymerization. Cell 84 : 723-734. 145. 146. Aspenstrm P, Lindberg U, Hall A. 1996. Two GTPases, Cdc42 and Rac, bind directly to a protein implicated in the immunodeficiency disorder Wiskott-Aldrich syndrome. Curr Biol 6 : 70-75. 147. Valitutti S, Dessing M, Aktories K, Gallati H, Lanzavecchia A. 1995. Sustained signaling leading to T cell activation results from prolonged T cell receptor occupancy. Role of T cell actin cytoskeleton. J Exp Med 181 : 577-584. 148. Delon J, Bercovici N, Liblau R, Trautmann A. 1998. Imaging antigen recognition by 149. naive CD4 T cells : compulsory cytoskeletal alterations for the triggering of an intracellular calcium response. Eur J Immunol 28 : 716-729. Ilani T, Vasiliver-Shamis G, Vardhana S, Bretscher A, Dustin ML. 2009. T cell antigen receptor signaling and immunological synapse stability require myosin IIA. Nat Immunol 10 : 531-539. 150. Yi J, Wu XS, Crites T, Hammer JA. 2012. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Mol Biol Cell 23 : 834-852. 151. Yu Y, Fay NC, Smoligovets AA, Wu HJ, Groves JT. 2012. Myosin IIA modulates T cell receptor transport and CasL phosphorylation during early immunological synapse formation. PLoS One 7 : e30704. 152. Kumari S, Vardhana S, Cammer M, Curado S, Santos L, Sheetz MP, Dustin ML. 2012. T Lymphocyte Myosin IIA is Required for Maturation of the Immunological Synapse. Front Immunol 3 : 230. 153. Bretscher A, Edwards K, Fehon RG. 2002. ERM proteins and merlin : integrators at the cell cortex. Nat Rev Mol Cell Biol 3 : 586-599. 224 154. Faure S, Salazar-Fontana LI, Semichon M, Tybulewicz VL, Bismuth G, Trautmann A, Germain RN, Delon J. 2004. ERM proteins regulate cytoskeleton relaxation promoting T cell-APC conjugation. Nat Immunol 5 : 272-279. 155. Kupfer A, Swain SL, Singer SJ. 1987. The specific direct interaction of helper T cells and antigen-presenting B cells. II. Reorientation of the microtubule organizing center and reorganization of the membrane-associated cytoskeleton inside the bound helper T cells. J Exp Med 165 : 1565-1580. 156. Geiger B, Rosen D, Berke G. 1982. Spatial relationships of microtubule-organizing centers and the contact area of cytotoxic T lymphocytes and target cells. J Cell Biol 95 : 137-143. 157. Kupfer A, Dennert G. 1984. Reorientation of the microtubule-organizing center and the Golgi apparatus in cloned cytotoxic lymphocytes triggered by binding to lysable target cells. J Immunol 133 : 2762-2766. 158. Ueda H, Zhou J, Xie J, Davis MM. 2015. Distinct Roles of Cytoskeletal Components in Immunological Synapse Formation and Directed Secretion. J Immunol 195 : 4117- 4125. 159. Combs J, Kim SJ, Tan S, Ligon LA, Holzbaur EL, Kuhn J, Poenie M. 2006. Recruitment of dynein to the Jurkat immunological synapse. Proc Natl Acad Sci U S A 103 : 14883-14888. 160. Hashimoto-Tane A, Yokosuka T, Sakata-Sogawa K, Sakuma M, Ishihara C, Tokunaga M, Saito T. 2011. Dynein-driven transport of T cell receptor microclusters regulates immune synapse formation and T cell activation. Immunity 34 : 919-931. 161. Martn-Cfreces NB, Robles-Valero J, Cabrero JR, Mittelbrunn M, Gordn-Alonso M, Sung CH, Alarcn B, Vázquez J, Sánchez-Madrid F. 2008. MTOC translocation modulates IS formation and controls sustained T cell signaling. J Cell Biol 182 : 951- 962. 162. Yi J, Wu X, Chung AH, Chen JK, Kapoor TM, Hammer JA. 2013. Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture- shrinkage. J Cell Biol 202 : 779-792. 164. 165. 163. Kurowska M, Goudin N, Nehme NT, Court M, Garin J, Fischer A, de Saint Basile G, Ménasché G. 2012. Terminal transport of lytic granules to the immune synapse is mediated by the kinesin-1/Slp3/Rab27a complex. Blood 119 : 3879-3889. Lamason RL, Kupfer A, Pomerantz JL. 2010. The dynamic distribution of CARD11 at the immunological synapse is regulated by the inhibitory kinesin GAKIN. Mol Cell 40 : 798-809. Lee KH, Dinner AR, Tu C, Campi G, Raychaudhuri S, Varma R, Sims TN, Burack WR, Wu H, Wang J, Kanagawa O, Markiewicz M, Allen PM, Dustin ML, Chakraborty AK, Shaw AS. 2003. The immunological synapse balances T cell receptor signaling and degradation. Science 302 : 1218-1222. Finetti F, Paccani SR, Riparbelli MG, Giacomello E, Perinetti G, Pazour GJ, Rosenbaum JL, Baldari CT. 2009. Intraflagellar transport is required for polarized recycling of the TCR/CD3 complex to the immune synapse. Nat Cell Biol 11 : 1332- 1339. 167. Orozco JT, Wedaman KP, Signor D, Brown H, Rose L, Scholey JM. 1999. Movement 166. of motor and cargo along cilia. Nature 398 : 674. 225 168. Finetti F, Patrussi L, Masi G, Onnis A, Galgano D, Lucherini OM, Pazour GJ, Baldari CT. 2014. Specific recycling receptors are targeted to the immune synapse by the intraflagellar transport system. J Cell Sci 127 : 1924-1937. 169. Galgano D, Onnis A, Pappalardo E, Galvagni F, Acuto O, Baldari CT. 2017. The T cell IFT20 interactome reveals new players in immune synapse assembly. J Cell Sci 130 : 1110-1121. 170. Osborne DG, Wetzel SA. 2012. Trogocytosis results in sustained intracellular 171. 172. 173. 174. signaling in CD4( ) T cells. J Immunol 189 : 4728-4739. Larghi P, Williamson DJ, Carpier JM, Dogniaux S, Chemin K, Bohineust A, Danglot L, Gaus K, Galli T, Hivroz C. 2013. VAMP7 controls T cell activation by regulating the recruitment and phosphorylation of vesicular Lat at TCR-activation sites. Nat Immunol 14 : 723-731. Zhu J, Yamane H, Paul WE. 2010. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annu Rev Immunol 28 : 445-489. Josefowicz SZ, Lu LF, Rudensky AY. 2012. Regulatory T cells : mechanisms of differentiation and function. Annu Rev Immunol 30 : 531-564. Johnson BJ, Costelloe EO, Fitzpatrick DR, Haanen JB, Schumacher TN, Brown LE, Kelso A. 2003. Single-cell perforin and granzyme expression reveals the anatomical localization of effector CD8 T cells in influenza virus-infected mice. Proc Natl Acad Sci U S A 100 : 2657-2662. 175. Ratner A, Clark WR. 1993. Role of TNF-alpha in CD8 cytotoxic T lymphocyte- mediated lysis. J Immunol 150 : 4303-4314. 176. Prévost-Blondel A, Roth E, Rosenthal FM, Pircher H. 2000. Crucial role of TNF-alpha in CD8 T cell-mediated elimination of 3LL-A9 Lewis lung carcinoma cells in vivo. J Immunol 164 : 3645-3651. 177. Brehm MA, Daniels KA, Welsh RM. 2005. Rapid production of TNF-alpha following TCR engagement of naive CD8 T cells. J Immunol 175 : 5043-5049. 178. Cheroutre H, Husain MM. 2013. CD4 CTL : living up to the challenge. Semin 179. 180. Immunol 25 : 273-281. Tian Y, Sette A, Weiskopf D. 2016. Cytotoxic CD4 T Cells : Differentiation, Function, and Application to Dengue Virus Infection. Front Immunol 7 : 531. Takeuchi A, Saito T. 2017. CD4 CTL, a Cytotoxic Subset of CD4. Front Immunol 8 : 194. 181. Rodrigues V, Cordeiro-da-Silva A, Laforge M, Ouaissi A, Akharid K, Silvestre R, Estaquier J. 2014. Impairment of T cell function in parasitic infections. PLoS Negl Trop Dis 8 : e2567. 182. Chang JT, Wherry EJ, Goldrath AW. 2014. Molecular regulation of effector and memory T cell differentiation. Nat Immunol 15 : 1104-1115. 183. Metz PJ, Arsenio J, Kakaradov B, Kim SH, Remedios KA, Oakley K, Akimoto K, Ohno S, Yeo GW, Chang JT. 2015. Regulation of asymmetric division and CD8 T lymphocyte fate specification by protein kinase C and protein kinase C/. J Immunol 194 : 2249-2259. 184. Arsenio J, Metz PJ, Chang JT. 2015. Asymmetric Cell Division in T Lymphocyte Fate Diversification. Trends Immunol 36 : 670-683. 185. Bray SJ. 2016. Notch signalling in context. Nat Rev Mol Cell Biol 17 : 722-735. 226 186. Boisset JC, Robin C. 2012. On the origin of hematopoietic stem cells : progress and controversy. Stem Cell Res 8 : 1-13. 189. 187. He Q, Gao S, Lv J, Li W, Liu F. 2017. BLOS2 maintains hematopoietic stem cells in the fetal liver via repressing Notch signaling. Exp Hematol 51 : 1-6. e2. 188. Orkin SH, Zon LI. 2008. Hematopoiesis : an evolving paradigm for stem cell biology. Cell 132 : 631-644. Zhang Y, Gao S, Xia J, Liu F. 2018. Hematopoietic Hierarchy - An Updated Roadmap. Trends Cell Biol. 190. Cordeiro Gomes A, Hara T, Lim VY, Herndler-Brandstetter D, Nevius E, Sugiyama T, Tani-Ichi S, Schlenner S, Richie E, Rodewald HR, Flavell RA, Nagasawa T, Ikuta K, Pereira JP. 2016. Hematopoietic Stem Cell Niches Produce Lineage-Instructive Signals to Control Multipotent Progenitor Differentiation. Immunity 45 : 1219-1231. 191. Yu VW, Saez B, Cook C, Lotinun S, Pardo-Saganta A, Wang YH, Lymperi S, Ferraro F, Raaijmakers MH, Wu JY, Zhou L, Rajagopal J, Kronenberg HM, Baron R, Scadden DT. 2015. Specific bone cells produce DLL4 to generate thymus-seeding progenitors from bone marrow. J Exp Med 212 : 759-774. 192. Ghaedi M, Steer CA, Martinez-Gonzalez I, Halim TYF, Abraham N, Takei F. 2016. Common-Lymphoid-Progenitor-Independent Pathways of Innate and T Lymphocyte Development. Cell Rep 15 : 471-480. 193. Yui MA, Feng N, Rothenberg EV. 2010. Fine-scale staging of T cell lineage commitment in adult mouse thymus. J Immunol 185 : 284-293. 194. Dar A, Schajnovitz A, Lapid K, Kalinkovich A, Itkin T, Ludin A, Kao WM, Battista M, Tesio M, Kollet O, Cohen NN, Margalit R, Buss EC, Baleux F, Oishi S, Fujii N, Larochelle A, Dunbar CE, Broxmeyer HE, Frenette PS, Lapidot T. 2011. Rapid mobilization of hematopoietic progenitors by AMD3100 and catecholamines is mediated by CXCR4-dependent SDF-1 release from bone marrow stromal cells. Leukemia 25 : 1286-1296. Love PE, Bhandoola A. 2011. Signal integration and crosstalk during thymocyte migration and emigration. Nat Rev Immunol 11 : 469-477. Scimone ML, Aifantis I, Apostolou I, von Boehmer H, von Andrian UH. 2006. A multistep adhesion cascade for lymphoid progenitor cell homing to the thymus. Proc Natl Acad Sci U S A 103 : 7006-7011. Zlotoff DA, Zhang SL, De Obaldia ME, Hess PR, Todd SP, Logan TD, Bhandoola A. 2011. Delivery of progenitors to the thymus limits T-lineage reconstitution after bone marrow transplantation. Blood 118 : 1962-1970. 195. 196. 197. 199. 198. Gossens K, Naus S, Corbel SY, Lin S, Rossi FM, Kast J, Ziltener HJ. 2009. Thymic progenitor homing and lymphocyte homeostasis are linked via S1P-controlled expression of thymic P-selectin/CCL25. J Exp Med 206 : 761-778. Schwrzler C, Oliferenko S, Gnthert U. 2001. Variant isoforms of CD44 are required in early thymocyte development. Eur J Immunol 31 : 2997-3005. Tan JB, Visan I, Yuan JS, Guidos CJ. 2005. Requirement for Notch1 signals at sequential early stages of intrathymic T cell development. Nat Immunol 6 : 671-679. 201. Radtke F, Wilson A, Stark G, Bauer M, van Meerwijk J, MacDonald HR, Aguet M. 200. 1999. Deficient T cell fate specification in mice with an induced inactivation of Notch1. Immunity 10 : 547-558. 227 202. 203. 204. Francis OL, Chaudhry KK, Lamprecht T, Klco JM. 2017. Impact of Notch disruption on myeloid development. Blood Cancer J 7 : e598. Schmitt TM, Ciofani M, Petrie HT, Ziga-Pflcker JC. 2004. Maintenance of T cell specification and differentiation requires recurrent notch receptor-ligand interactions. J Exp Med 200 : 469-479. Franco CB, Scripture-Adams DD, Proekt I, Taghon T, Weiss AH, Yui MA, Adams SL, Diamond RA, Rothenberg EV. 2006. Notch/Delta signaling constrains reengineering of pro-T cells by PU. 1. Proc Natl Acad Sci U S A 103 : 11993-11998. 205. Del Real MM, Rothenberg EV. 2013. Architecture of a lymphomyeloid developmental switch controlled by PU. 1, Notch and Gata3. Development 140 : 1207-1219. 209. 208. 207. 206. Champhekar A, Damle SS, Freedman G, Carotta S, Nutt SL, Rothenberg EV. 2015. Regulation of early T-lineage gene expression and developmental progression by the progenitor cell transcription factor PU. 1. Genes Dev 29 : 832-848. Lefebvre JM, Haks MC, Carleton MO, Rhodes M, Sinnathamby G, Simon MC, Eisenlohr LC, Garrett-Sinha LA, Wiest DL. 2005. Enforced expression of Spi-B reverses T lineage commitment and blocks beta-selection. J Immunol 174 : 6184- 6194. Laiosa CV, Stadtfeld M, Xie H, de Andres-Aguayo L, Graf T. 2006. Reprogramming of committed T cell progenitors to macrophages and dendritic cells by C/EBP alpha and PU. 1 transcription factors. Immunity 25 : 731-744. Longabaugh WJR, Zeng W, Zhang JA, Hosokawa H, Jansen CS, Li L, Romero-Wolf M, Liu P, Kueh HY, Mortazavi A, Rothenberg EV. 2017. Bcl11b and combinatorial resolution of cell fate in the T-cell gene regulatory network. Proc Natl Acad Sci U S A 114 : 5800-5807. Johnson JL, Georgakilas G, Petrovic J, Kurachi M, Cai S, Harly C, Pear WS, Bhandoola A, Wherry EJ, Vahedi G. 2018. Lineage-Determining Transcription Factor TCF-1 Initiates the Epigenetic Identity of T Cells. Immunity 48 : 243-257. e210. Li L, Leid M, Rothenberg EV. 2010. An early T cell lineage commitment checkpoint dependent on the transcription factor Bcl11b. Science 329 : 89-93. 212. Hozumi K, Negishi N, Tsuchiya I, Abe N, Hirano K, Suzuki D, Yamamoto M, Engel 210. 211. JD, Habu S. 2008. Notch signaling is necessary for GATA3 function in the initiation of T cell development. Eur J Immunol 38 : 977-985. 213. Van de Walle I, Dolens AC, Durinck K, De Mulder K, Van Loocke W, Damle S, Waegemans E, De Medts J, Velghe I, De Smedt M, Vandekerckhove B, Kerre T, Plum J, Leclercq G, Rothenberg EV, Van Vlierberghe P, Speleman F, Taghon T. 2016. GATA3 induces human T-cell commitment by restraining Notch activity and repressing NK-cell fate. Nat Commun 7 : 11171. 214. Wojciechowski J, Lai A, Kondo M, Zhuang Y. 2007. E2A and HEB are required to block thymocyte proliferation prior to pre-TCR expression. J Immunol 178 : 5717- 5726. Franklin DS, Godfrey VL, Lee H, Kovalev GI, Schoonhoven R, Chen-Kiang S, Su L, Xiong Y. 1998. CDK inhibitors p18(INK4c) and p27(Kip1) mediate two separate pathways to collaboratively suppress pituitary tumorigenesis. Genes Dev 12 : 2899- 2911. 215. 228 216. Tsukiyama T, Ishida N, Shirane M, Minamishima YA, Hatakeyama S, Kitagawa M, Nakayama K. 2001. Down-regulation of p27Kip1 expression is required for development and function of T cells. J Immunol 166 : 304-312. 217. Guidos CJ, Williams CJ, Wu GE, Paige CJ, Danska JS. 1995. Development of CD4 CD8 thymocytes in RAG-deficient mice through a T cell receptor beta chain- independent pathway. J Exp Med 181 : 1187-1195. 218. Diamond RA, Ward SB, Owada-Makabe K, Wang H, Rothenberg EV. 1997. Different developmental arrest points in RAG-2 -/- and SCID thymocytes on two genetic backgrounds : developmental choices and cell death mechanisms before TCR gene rearrangement. J Immunol 158 : 4052-4064. 219. Anderson MK, Weiss AH, Hernandez-Hoyos G, Dionne CJ, Rothenberg EV. 2002. Constitutive expression of PU. 1 in fetal hematopoietic progenitors blocks T cell development at the pro-T cell stage. Immunity 16 : 285-296. 220. Ha VL, Luong A, Li F, Casero D, Malvar J, Kim YM, Bhatia R, Crooks GM, Parekh C. 2017. The T-ALL related gene BCL11B regulates the initial stages of human T-cell differentiation. Leukemia 31 : 2503-2514. 221. Yu S, Zhao DM, Jothi R, Xue HH. 2010. Critical requirement of GABPalpha for 222. normal T cell development. J Biol Chem 285 : 10179-10188. Li L, Salido E, Zhou Y, Bhattacharyya S, Yannone SM, Dunn E, Meneses J, Feeney AJ, Cowan MJ. 2005. Targeted disruption of the Artemis murine counterpart results in SCID and defective V(D)J recombination that is partially corrected with bone marrow transplantation. J Immunol 174 : 2420-2428. 223. Gao Y, Ferguson DO, Xie W, Manis JP, Sekiguchi J, Frank KM, Chaudhuri J, Horner J, DePinho RA, Alt FW. 2000. Interplay of p53 and DNA-repair protein XRCC4 in tumorigenesis, genomic stability and development. Nature 404 : 897-900. 224. Ouyang H, Nussenzweig A, Kurimasa A, Soares VC, Li X, Cordon-Cardo C, Li W, Cheong N, Nussenzweig M, Iliakis G, Chen DJ, Li GC. 1997. Ku70 is required for DNA repair but not for T cell antigen receptor gene recombination In vivo. J Exp Med 186 : 921-929. Tydell CC, David-Fung ES, Moore JE, Rowen L, Taghon T, Rothenberg EV. 2007. Molecular dissection of prethymic progenitor entry into the T lymphocyte developmental pathway. J Immunol 179 : 421-438. Li L, Zhang JA, Dose M, Kueh HY, Mosadeghi R, Gounari F, Rothenberg EV. 2013. A far downstream enhancer for murine Bcl11b controls its T-cell specific expression. Blood 122 : 902-911. 227. Kueh HY, Yui MA, Ng KK, Pease SS, Zhang JA, Damle SS, Freedman G, Siu S, Bernstein ID, Elowitz MB, Rothenberg EV. 2016. Asynchronous combinatorial action of four regulatory factors activates Bcl11b for T cell commitment. Nat Immunol 17 : 956-965. Zhao JY, Osipovich O, Koues OI, Majumder K, Oltz EM. 2017. Activation of Mouse. J Immunol 199 : 1131-1141. 229. Kim WY, Sieweke M, Ogawa E, Wee HJ, Englmeier U, Graf T, Ito Y. 1999. Mutual activation of Ets-1 and AML1 DNA binding by direct interaction of their autoinhibitory domains. EMBO J 18 : 1609-1620. 225. 226. 228. 229 230. Seo W, Muroi S, Akiyama K, Taniuchi I. 2017. Distinct requirement of Runx complexes for TCR enhancer activation at distinct developmental stages. Sci Rep 7 : 41351. 231. Wang X, Xiao G, Zhang Y, Wen X, Gao X, Okada S, Liu X. 2008. Regulation of Tcrb recombination ordering by c-Fos-dependent RAG deposition. Nat Immunol 9 : 794- 801. Fehling HJ, Krotkova A, Saint-Ruf C, von Boehmer H. 1995. Crucial role of the pre-T- cell receptor alpha gene in development of alpha beta but not gamma delta T cells. Nature 375 : 795-798. 233. Reizis B, Leder P. 2002. Direct induction of T lymphocyte-specific gene expression 232. 234. 235. by the mammalian Notch signaling pathway. Genes Dev 16 : 295-300. Takeuchi A, Yamasaki S, Takase K, Nakatsu F, Arase H, Onodera M, Saito T. 2001. E2A and HEB activate the pre-TCR alpha promoter during immature T cell development. J Immunol 167 : 2157-2163. Fehling HJ, Laplace C, Mattei MG, Saint-Ruf C, von Boehmer H. 1995. Genomic structure and chromosomal location of the mouse pre-T-cell receptor alpha gene. Immunogenetics 42 : 275-281. 236. Del Porto P, Bruno L, Mattei MG, von Boehmer H, Saint-Ruf C. 1995. Cloning and comparative analysis of the human pre-T-cell receptor alpha-chain gene. Proc Natl Acad Sci U S A 92 : 12105-12109. 237. Malissen M, Gillet A, Ardouin L, Bouvier G, Trucy J, Ferrier P, Vivier E, Malissen B. 1995. Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3- epsilon gene. EMBO J 14 : 4641-4653. 238. Anderson SJ, Levin SD, Perlmutter RM. 1993. Protein tyrosine kinase p56lck controls allelic exclusion of T-cell receptor beta-chain genes. Nature 365 : 552-554. 239. Groves T, Smiley P, Cooke MP, Forbush K, Perlmutter RM, Guidos CJ. 1996. Fyn can partially substitute for Lck in T lymphocyte development. Immunity 5 : 417-428. 240. Chiang YJ, Hodes RJ. 2016. T-cell development is regulated by the coordinated function of proximal and distal Lck promoters active at different developmental stages. Eur J Immunol 46 : 2401-2408. Shen S, Zhu M, Lau J, Chuck M, Zhang W. 2009. The essential role of LAT in thymocyte development during transition from the double-positive to single- positive stage. J Immunol 182 : 5596-5604. 241. 242. Nuez-Cruz S, Aguado E, Richelme S, Chetaille B, Mura AM, Richelme M, Pouyet L, Jouvin-Marche E, Xerri L, Malissen B, Malissen M. 2003. LAT regulates gammadelta T cell homeostasis and differentiation. Nat Immunol 4 : 999-1008. 243. Cheng AM, Negishi I, Anderson SJ, Chan AC, Bolen J, Loh DY, Pawson T. 1997. The Syk and ZAP-70 SH2-containing tyrosine kinases are implicated in pre-T cell receptor signaling. Proc Natl Acad Sci U S A 94 : 9797-9801. 244. Radtke D, Lacher SM, Szumilas N, Sandrock L, Ackermann J, Nitschke L, Zinser E. 2016. Grb2 Is Important for T Cell Development, Th Cell Differentiation, and Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J Immunol 196 : 2995- 3005. Fujikawa K, Miletic AV, Alt FW, Faccio R, Brown T, Hoog J, Fredericks J, Nishi S, Mildiner S, Moores SL, Brugge J, Rosen FS, Swat W. 2003. Vav1/2/3-null mice 245. 230 define an essential role for Vav family proteins in lymphocyte development and activation but a differential requirement in MAPK signaling in T and B cells. J Exp Med 198 : 1595-1608. 246. Kumar L, Pivniouk V, de la Fuente MA, Laouini D, Geha RS. 2002. Differential role of SLP-76 domains in T cell development and function. Proc Natl Acad Sci U S A 99 : 884-889. Fu G, Yu M, Chen Y, Zheng Y, Zhu W, Newman DK, Wang D, Wen R. 2017. Phospholipase C1 is required for pre-TCR signal transduction and pre-T cell development. Eur J Immunol 47 : 74-83. 248. Aifantis I, Gounari F, Scorrano L, Borowski C, von Boehmer H. 2001. Constitutive pre-TCR signaling promotes differentiation through Ca2 mobilization and activation of NF-kappaB and NFAT. Nat Immunol 2 : 403-409. Irving BA, Alt FW, Killeen N. 1998. Thymocyte development in the absence of pre-T cell receptor extracellular immunoglobulin domains. Science 280 : 905-908. 250. Yamasaki S, Ishikawa E, Sakuma M, Ogata K, Sakata-Sogawa K, Hiroshima M, Wiest DL, Tokunaga M, Saito T. 2006. Mechanistic basis of pre-T cell receptor- mediated autonomous signaling critical for thymocyte development. Nat Immunol 7 : 67-75. 251. Mallis RJ, Bai K, Arthanari H, Hussey RE, Handley M, Li Z, Chingozha L, Duke-Cohan JS, Lu H, Wang JH, Zhu C, Wagner G, Reinherz EL. 2015. Pre-TCR ligand binding impacts thymocyte development before TCR expression. Proc Natl Acad Sci U S A 112 : 8373-8378. 252. Mallis RJ, Arthanari H, Lang MJ, Reinherz EL, Wagner G. 2018. NMR-directed design of pre-TCR and pMHC molecules implies a distinct geometry for pre-TCR relative to TCR recognition of pMHC. J Biol Chem 293 : 754-766. 253. Navarro MN, Nusspaumer G, Fuentes P, González-Garca S, Alcain J, Toribio ML. 2007. Identification of CMS as a cytosolic adaptor of the human pTalpha chain involved in pre-TCR function. Blood 110 : 4331-4340. 254. Panigada M, Porcellini S, Barbier E, Hoeflinger S, Cazenave PA, Gu H, Band H, von Boehmer H, Grassi F. 2002. Constitutive endocytosis and degradation of the pre-T cell receptor. J Exp Med 195 : 1585-1597. 255. Carrasco YR, Ramiro AR, Trigueros C, de Yébenes VG, Garca-Peydr M, Toribio ML. 2001. An endoplasmic reticulum retention function for the cytoplasmic tail of the human pre-T cell receptor (TCR) alpha chain : potential role in the regulation of cell surface pre-TCR expression levels. J Exp Med 193 : 1045-1058. 256. Carrasco YR, Navarro MN, Toribio ML. 2003. A role for the cytoplasmic tail of the pre-T cell receptor (TCR) alpha chain in promoting constitutive internalization and degradation of the pre-TCR. J Biol Chem 278 : 14507-14513. 257. Huang CY, Kanagawa O. 2004. Impact of early expression of TCR alpha chain on thymocyte development. Eur J Immunol 34 : 1532-1541. 258. Borowski C, Li X, Aifantis I, Gounari F, von Boehmer H. 2004. Pre-TCRalpha and TCRalpha are not interchangeable partners of TCRbeta during T lymphocyte development. J Exp Med 199 : 607-615. Trigueros C, Hozumi K, Silva-Santos B, Bruno L, Hayday AC, Owen MJ, Pennington DJ. 2003. Pre-TCR signaling regulates IL-7 receptor alpha expression promoting 231 247. 249. 259. thymocyte survival at the transition from the double-negative to double-positive stage. Eur J Immunol 33 : 1968-1977. 260. Dzhagalov I, Dunkle A, He YW. 2008. The anti-apoptotic Bcl-2 family member Mcl-1 promotes T lymphocyte survival at multiple stages. J Immunol 181 : 521-528. 261. Patra AK, Avots A, Zahedi RP, Schler T, Sickmann A, Bommhardt U, Serfling E. 2013. An alternative NFAT-activation pathway mediated by IL-7 is critical for early thymocyte development. Nat Immunol 14 : 127-135. 262. Boudil A, Matei IR, Shih HY, Bogdanoski G, Yuan JS, Chang SG, Montpellier B, Kowalski PE, Voisin V, Bashir S, Bader GD, Krangel MS, Guidos CJ. 2015. IL-7 coordinates proliferation, differentiation and Tcra recombination during thymocyte -selection. Nat Immunol 16 : 397-405. 263. Mandal M, Borowski C, Palomero T, Ferrando AA, Oberdoerffer P, Meng F, Ruiz- Vela A, Ciofani M, Zuniga-Pflucker JC, Screpanti I, Look AT, Korsmeyer SJ, Rajewsky K, von Boehmer H, Aifantis I. 2005. The BCL2A1 gene as a pre-T cell receptor-induced regulator of thymocyte survival. J Exp Med 201 : 603-614. 264. Mandal M, Crusio KM, Meng F, Liu S, Kinsella M, Clark MR, Takeuchi O, Aifantis I. 2008. Regulation of lymphocyte progenitor survival by the proapoptotic activities of Bim and Bid. Proc Natl Acad Sci U S A 105 : 20840-20845. 265. Mao C, Tili EG, Dose M, Haks MC, Bear SE, Maroulakou I, Horie K, Gaitanaris GA, Fidanza V, Ludwig T, Wiest DL, Gounari F, Tsichlis PN. 2007. Unequal contribution of Akt isoforms in the double-negative to double-positive thymocyte transition. J Immunol 178 : 5443-5453. 266. Ciofani M, Ziga-Pflcker JC. 2005. Notch promotes survival of pre-T cells at the beta-selection checkpoint by regulating cellular metabolism. Nat Immunol 6 : 881- 888. 267. Brekelmans P, van Soest P, Leenen PJ, van Ewijk W. 1994. Inhibition of 268. proliferation and differentiation during early T cell development by anti-transferrin receptor antibody. Eur J Immunol 24 : 2896-2902. Trampont PC, Zhang L, Giles AJ, Walk SF, Gu JJ, Pendergast AM, Ravichandran KS. 2015. ShcA regulates thymocyte proliferation through specific transcription factors and a c-Abl-dependent signaling axis. Mol Cell Biol 35 : 1462-1476. 269. Dang CV. 2012. MYC on the path to cancer. Cell 149 : 22-35. 270. Douglas NC, Jacobs H, Bothwell AL, Hayday AC. 2001. Defining the specific physiological requirements for c-Myc in T cell development. Nat Immunol 2 : 307- 315. 271. Dose M, Khan I, Guo Z, Kovalovsky D, Krueger A, von Boehmer H, Khazaie K, Gounari F. 2006. c-Myc mediates pre-TCR-induced proliferation but not developmental progression. Blood 108 : 2669-2677. 272. Pham K, Shimoni R, Charnley M, Ludford-Menting MJ, Hawkins ED, Ramsbottom K, Oliaro J, Izon D, Ting SB, Reynolds J, Lythe G, Molina-Paris C, Melichar H, Robey E, Humbert PO, Gu M, Russell SM. 2015. Asymmetric cell division during T cell development controls downstream fate. J Cell Biol 210 : 933-950. 273. Aifantis I, Pivniouk VI, Grtner F, Feinberg J, Swat W, Alt FW, von Boehmer H, Geha RS. 1999. Allelic exclusion of the T cell receptor beta locus requires the SH2 232 domain-containing leukocyte protein (SLP)-76 adaptor protein. J Exp Med 190 : 1093- 1102. 274. Xiong J, Armato MA, Yankee TM. 2011. Immature single-positive CD8 thymocytes represent the transition from Notch-dependent to Notch-independent T-cell development. Int Immunol 23 : 55-64. 275. Galy A, Verma S, Bárcena A, Spits H. 1993. Precursors of CD3 CD4 CD8 cells in the human thymus are defined by expression of CD34. Delineation of early events in human thymic development. J Exp Med 178 : 391-401. 276. Harker N, Garefalaki A, Menzel U, Ktistaki E, Naito T, Georgopoulos K, Kioussis D. 2011. Pre-TCR signaling and CD8 gene bivalent chromatin resolution during thymocyte development. J Immunol 186 : 6368-6377. 277. Bilic I, Koesters C, Unger B, Sekimata M, Hertweck A, Maschek R, Wilson CB, Ellmeier W. 2006. Negative regulation of CD8 expression via Cd8 enhancer- mediated recruitment of the zinc finger protein MAZR. Nat Immunol 7 : 392-400. 278. Harker N, Naito T, Cortes M, Hostert A, Hirschberg S, Tolaini M, Roderick K, Georgopoulos K, Kioussis D. 2002. The CD8alpha gene locus is regulated by the Ikaros family of proteins. Mol Cell 10 : 1403-1415. 279. Williams CJ, Naito T, Arco PG, Seavitt JR, Cashman SM, De Souza B, Qi X, Keables P, Von Andrian UH, Georgopoulos K. 2004. The chromatin remodeler Mi-2beta is required for CD4 expression and T cell development. Immunity 20 : 719-733. 280. del Blanco B, Garca-Mariscal A, Wiest DL, Hernández-Munain C. 2012. Tcra enhancer activation by inducible transcription factors downstream of pre-TCR signaling. J Immunol 188 : 3278-3293. 281. Collins B, Clambey ET, Scott-Browne J, White J, Marrack P, Hagman J, Kappler JW. 2013. Ikaros promotes rearrangement of TCR genes in an Ikaros null thymoma cell line. Eur J Immunol 43 : 521-532. 282. del Blanco B, Angulo , Krangel MS, Hernández-Munain C. 2015. T-cell receptor 283. enhancer is inactivated in T lymphocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 112 : E1744- 1753. Trop S, Rhodes M, Wiest DL, Hugo P, Ziga-Pflcker JC. 2000. Competitive displacement of pT alpha by TCR-alpha during TCR assembly prevents surface coexpression of pre-TCR and alpha beta TCR. J Immunol 165 : 5566-5572. 284. Chari S, Winandy S. 2008. Ikaros regulates Notch target gene expression in developing thymocytes. J Immunol 181 : 6265-6274. 285. Merkenschlager M, Graf D, Lovatt M, Bommhardt U, Zamoyska R, Fisher AG. 1997. How many thymocytes audition for selection ? J Exp Med 186 : 1149-1158. 286. Blum JS, Wearsch PA, Cresswell P. 2013. Pathways of antigen processing. Annu Rev Immunol 31 : 443-473. 287. Murata S, Takahama Y, Tanaka K. 2008. Thymoproteasome : probable role in generating positively selecting peptides. Curr Opin Immunol 20 : 192-196. 288. Honey K, Nakagawa T, Peters C, Rudensky A. 2002. Cathepsin L regulates CD4 T cell selection independently of its effect on invariant chain : a role in the generation of positively selecting peptide ligands. J Exp Med 195 : 1349-1358. 233 289. Gommeaux J, Grégoire C, Nguessan P, Richelme M, Malissen M, Guerder S, 290. Malissen B, Carrier A. 2009. Thymus-specific serine protease regulates positive selection of a subset of CD4 thymocytes. Eur J Immunol 39 : 956-964. Linette GP, Grusby MJ, Hedrick SM, Hansen TH, Glimcher LH, Korsmeyer SJ. 1994. Bcl-2 is upregulated at the CD4 CD8 stage during positive selection and promotes thymocyte differentiation at several control points. Immunity 1 : 197-205. 291. Yuan J, Crittenden RB, Bender TP. 2010. c-Myb promotes the survival of CD4 CD8 double-positive thymocytes through upregulation of Bcl-xL. J Immunol 184 : 2793- 2804. 292. Grillot DA, Merino R, Nez G. 1995. Bcl-XL displays restricted distribution during T cell development and inhibits multiple forms of apoptosis but not clonal deletion in transgenic mice. J Exp Med 182 : 1973-1983. 293. Ma A, Pena JC, Chang B, Margosian E, Davidson L, Alt FW, Thompson CB. 1995. Bclx regulates the survival of double-positive thymocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 92 : 4763-4767. 294. Moore NC, Anderson G, Williams GT, Owen JJ, Jenkinson EJ. 1994. Developmental 295. regulation of bcl-2 expression in the thymus. Immunology 81 : 115-119. Lauritsen JP, Kurella S, Lee SY, Lefebvre JM, Rhodes M, Alberola-Ila J, Wiest DL. 2008. Egr2 is required for Bcl-2 induction during positive selection. J Immunol 181 : 7778-7785. Lawson VJ, Weston K, Maurice D. 2010. Early growth response 2 regulates the survival of thymocytes during positive selection. Eur J Immunol 40 : 232-241. 297. Wang X, Zhang Y, Xiao G, Gao X, Liu X. 2009. c-Fos enhances the survival of 296. thymocytes during positive selection by upregulating Bcl-2. Cell Res 19 : 340-347. 298. Hu QN, Baldwin TA. 2015. Differential roles for Bim and Nur77 in thymocyte clonal deletion induced by ubiquitous self-antigen. J Immunol 194 : 2643-2653. Singer A, Adoro S, Park JH. 2008. Lineage fate and intense debate : myths, models and mechanisms of CD4- versus CD8-lineage choice. Nat Rev Immunol 8 : 788-801. 300. Germain RN. 2002. T-cell development and the CD4-CD8 lineage decision. Nat Rev 299. Immunol 2 : 309-322. 301. Bommhardt U, Basson MA, Krummrei U, Zamoyska R. 1999. Activation of the extracellular signal-related kinase/mitogen-activated protein kinase pathway discriminates CD4 versus CD8 lineage commitment in the thymus. J Immunol 163 : 715-722. 302. Bommhardt U, Cole MS, Tso JY, Zamoyska R. 1997. Signals through CD8 or CD4 can induce commitment to the CD4 lineage in the thymus. Eur J Immunol 27 : 1152-1163. 303. Gascoigne NR. 2010. CD8 thymocyte differentiation : T cell two-step. Nat Immunol 11 : 189-190. 304. Park JH, Adoro S, Guinter T, Erman B, Alag AS, Catalfamo M, Kimura MY, Cui Y, Lucas PJ, Gress RE, Kubo M, Hennighausen L, Feigenbaum L, Singer A. 2010. Signaling by intrathymic cytokines, not T cell antigen receptors, specifies CD8 lineage choice and promotes the differentiation of cytotoxic-lineage T cells. Nat Immunol 11 : 257-264. 234 305. Barthlott T, Kohler H, Pircher H, Eichmann K. 1997. Differentiation of 306. CD4(high)CD8(low) coreceptor-skewed thymocytes into mature CD8 single-positive cells independent of MHC class I recognition. Eur J Immunol 27 : 2024-2032. Lieu YK, Kumar A, Pajerowski AG, Rogers TJ, Reddy EP. 2004. Requirement of c- myb in T cell development and in mature T cell function. Proc Natl Acad Sci U S A 101 : 14853-14858. 307. Wang L, Wildt KF, Zhu J, Zhang X, Feigenbaum L, Tessarollo L, Paul WE, Fowlkes BJ, Bosselut R. 2008. Distinct functions for the transcription factors GATA-3 and ThPOK during intrathymic differentiation of CD4( ) T cells. Nat Immunol 9 : 1122-1130. 308. Aliahmad P, Kadavallore A, de la Torre B, Kappes D, Kaye J. 2011. TOX is required 309. 310. 312. for development of the CD4 T cell lineage gene program. J Immunol 187 : 5931-5940. Taniuchi I, Osato M, Egawa T, Sunshine MJ, Bae SC, Komori T, Ito Y, Littman DR. 2002. Differential requirements for Runx proteins in CD4 repression and epigenetic silencing during T lymphocyte development. Cell 111 : 621-633. Sato T, Ohno S, Hayashi T, Sato C, Kohu K, Satake M, Habu S. 2005. Dual functions of Runx proteins for reactivating CD8 and silencing CD4 at the commitment process into CD8 thymocytes. Immunity 22 : 317-328. 311. He X, Park K, Wang H, Zhang Y, Hua X, Li Y, Kappes DJ. 2008. CD4-CD8 lineage commitment is regulated by a silencer element at the ThPOK transcription-factor locus. Immunity 28 : 346-358. Luckey MA, Kimura MY, Waickman AT, Feigenbaum L, Singer A, Park JH. 2014. The transcription factor ThPOK suppresses Runx3 and imposes CD4( ) lineage fate by inducing the SOCS suppressors of cytokine signaling. Nat Immunol 15 : 638-645. 313. He X, Dave VP, Zhang Y, Hua X, Nicolas E, Xu W, Roe BA, Kappes DJ. 2005. The zinc finger transcription factor Th-POK regulates CD4 versus CD8 T-cell lineage commitment. Nature 433 : 826-833. 314. Yin X, Ladi E, Chan SW, Li O, Killeen N, Kappes DJ, Robey EA. 2007. CCR7 expression in developing thymocytes is linked to the CD4 versus CD8 lineage decision. J Immunol 179 : 7358-7364. 315. Ueno T, Saito F, Gray DH, Kuse S, Hieshima K, Nakano H, Kakiuchi T, Lipp M, Boyd RL, Takahama Y. 2004. CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes. J Exp Med 200 : 493-505. 316. Kwan J, Killeen N. 2004. CCR7 directs the migration of thymocytes into the thymic medulla. J Immunol 172 : 3999-4007. Lkhagvasuren E, Sakata M, Ohigashi I, Takahama Y. 2013. Lymphotoxin receptor regulates the development of CCL21-expressing subset of postnatal medullary thymic epithelial cells. J Immunol 190 : 5110-5117. 317. 319. 318. Anderson MS, Venanzi ES, Klein L, Chen Z, Berzins SP, Turley SJ, von Boehmer H, Bronson R, Dierich A, Benoist C, Mathis D. 2002. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science 298 : 1395-1401. Takaba H, Morishita Y, Tomofuji Y, Danks L, Nitta T, Komatsu N, Kodama T, Takayanagi H. 2015. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell 163 : 975-987. Irla M, Hollander G, Reith W. 2010. Control of central self-tolerance induction by autoreactive CD4 thymocytes. Trends Immunol 31 : 71-79. 320. 235 322. 321. Nagamine K, Peterson P, Scott HS, Kudoh J, Minoshima S, Heino M, Krohn KJ, Lalioti MD, Mullis PE, Antonarakis SE, Kawasaki K, Asakawa S, Ito F, Shimizu N. 1997. Positional cloning of the APECED gene. Nat Genet 17 : 393-398. Sansom SN, Shikama-Dorn N, Zhanybekova S, Nusspaumer G, Macaulay IC, Deadman ME, Heger A, Ponting CP, Hollnder GA. 2014. Population and single-cell genomics reveal the Aire dependency, relief from Polycomb silencing, and distribution of self-antigen expression in thymic epithelia. Genome Res 24 : 1918- 1931. 323. Ohnmacht C, Pullner A, King SB, Drexler I, Meier S, Brocker T, Voehringer D. 2009. Constitutive ablation of dendritic cells breaks self-tolerance of CD4 T cells and results in spontaneous fatal autoimmunity. J Exp Med 206 : 549-559. 324. Hadeiba H, Lahl K, Edalati A, Oderup C, Habtezion A, Pachynski R, Nguyen L, Ghodsi A, Adler S, Butcher EC. 2012. Plasmacytoid dendritic cells transport peripheral antigens to the thymus to promote central tolerance. Immunity 36 : 438- 450. 325. Cédile O, Lbner M, Toft-Hansen H, Frank I, Wlodarczyk A, Irla M, Owens T. 2014. 326. 327. Thymic CCL2 influences induction of T-cell tolerance. J Autoimmun 55 : 73-85. Lopes N, Charaix J, Cédile O, Sergé A, Irla M. 2018. Lymphotoxin fine-tunes T cell clonal deletion by regulating thymic entry of antigen-presenting cells. Nat Commun 9 : 1262. Fassett MS, Jiang W, D'Alise AM, Mathis D, Benoist C. 2012. Nuclear receptor Nr4a1 modulates both regulatory T-cell (Treg) differentiation and clonal deletion. Proc Natl Acad Sci U S A 109 : 3891-3896. 328. Hu QN, Suen AYW, Henao Caviedes LM, Baldwin TA. 2017. Nur77 Regulates Nondeletional Mechanisms of Tolerance in T Cells. J Immunol 199 : 3147-3157. Suen AY, Baldwin TA. 2012. Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens. Proc Natl Acad Sci U S A 109 : 893-898. 329. 330. Wang J, He N, Zhang N, Quan D, Zhang S, Zhang C, Yu RT, Atkins AR, Zhu R, Yang C, Cui Y, Liddle C, Downes M, Xiao H, Zheng Y, Auwerx J, Evans RM, Leng Q. 2017. NCoR1 restrains thymic negative selection by repressing Bim expression to spare thymocytes undergoing positive selection. Nat Commun 8 : 959. Li MO, Rudensky AY. 2016. T cell receptor signalling in the control of regulatory T cell differentiation and function. Nat Rev Immunol 16 : 220-233. 332. Malchow S, Leventhal DS, Lee V, Nishi S, Socci ND, Savage PA. 2016. Aire Enforces Immune Tolerance by Directing Autoreactive T Cells into the Regulatory T Cell Lineage. Immunity 44 : 1102-1113. 333. Apert C, Romagnoli P, van Meerwijk JPM. 2018. IL-2 and IL-15 dependent thymic development of Foxp3-expressing regulatory T lymphocytes. Protein Cell 9 : 322-332. Zachariah MA, Cyster JG. 2010. Neural crest-derived pericytes promote egress of mature thymocytes at the corticomedullary junction. Science 328 : 1129-1135. 335. Carlson CM, Endrizzi BT, Wu J, Ding X, Weinreich MA, Walsh ER, Wani MA, Lingrel JB, Hogquist KA, Jameson SC. 2006. Kruppel-like factor 2 regulates thymocyte and T-cell migration. Nature 442 : 299-302. 331. 334. 236 336. Allende ML, Dreier JL, Mandala S, Proia RL. 2004. Expression of the sphingosine 1- 337. 338. 339. phosphate receptor, S1P1, on T-cells controls thymic emigration. J Biol Chem 279 : 15396-15401. Johnson AL, Aravind L, Shulzhenko N, Morgun A, Choi SY, Crockford TL, Lambe T, Domaschenz H, Kucharska EM, Zheng L, Vinuesa CG, Lenardo MJ, Goodnow CC, Cornall RJ, Schwartz RH. 2009. Themis is a member of a new metazoan gene family and is required for the completion of thymocyte positive selection. Nat Immunol 10 : 831-839. Fu G, Vallée S, Rybakin V, McGuire MV, Ampudia J, Brockmeyer C, Salek M, Fallen PR, Hoerter JA, Munshi A, Huang YH, Hu J, Fox HS, Sauer K, Acuto O, Gascoigne NR. 2009. Themis controls thymocyte selection through regulation of T cell antigen receptor-mediated signaling. Nat Immunol 10 : 848-856. Lesourne R, Uehara S, Lee J, Song KD, Li L, Pinkhasov J, Zhang Y, Weng NP, Wildt KF, Wang L, Bosselut R, Love PE. 2009. Themis, a T cell-specific protein important for late thymocyte development. Nat Immunol 10 : 840-847. 340. Kakugawa K, Yasuda T, Miura I, Kobayashi A, Fukiage H, Satoh R, Matsuda M, Koseki H, Wakana S, Kawamoto H, Yoshida H. 2009. A novel gene essential for the development of single positive thymocytes. Mol Cell Biol 29 : 5128-5135. 341. Duguet F, Locard-Paulet M, Marcellin M, Chaoui K, Bernard I, Andreoletti O, Lesourne R, Burlet-Schiltz O, Gonzalez de Peredo A, Saoudi A. 2017. Proteomic Analysis of Regulatory T Cells Reveals the Importance of Themis1 in the Control of Their Suppressive Function. Mol Cell Proteomics 16 : 1416-1432. 342. Pedros C, Gaud G, Bernard I, Kassem S, Chabod M, Lagrange D, Andréoletti O, 343. Dejean AS, Lesourne R, Fournié GJ, Saoudi A. 2015. An Epistatic Interaction between Themis1 and Vav1 Modulates Regulatory T Cell Function and Inflammatory Bowel Disease Development. J Immunol 195 : 1608-1616. Lesourne R, Zvezdova E, Song KD, El-Khoury D, Uehara S, Barr VA, Samelson LE, Love PE. 2012. Interchangeability of Themis1 and Themis2 in thymocyte development reveals two related proteins with conserved molecular function. J Immunol 189 : 1154-1161. 344. Cheng D, Deobagkar-Lele M, Zvezdova E, Choi S, Uehara S, Baup D, Bennett SC, Bull KR, Crockford TL, Ferry H, Warzecha C, Marcellin M, de Peredo AG, Lesourne R, Anzilotti C, Love PE, Cornall RJ. 2016. Themis2 lowers the threshold for B cell activation during positive selection. Nat Immunol. 346. 345. Brockmeyer C, Paster W, Pepper D, Tan CP, Trudgian DC, McGowan S, Fu G, Gascoigne NR, Acuto O, Salek M. 2011. T cell receptor (TCR)-induced tyrosine phosphorylation dynamics identifies THEMIS as a new TCR signalosome component. J Biol Chem 286 : 7535-7547. Fu G, Casas J, Rigaud S, Rybakin V, Lambolez F, Brzostek J, Hoerter JA, Paster W, Acuto O, Cheroutre H, Sauer K, Gascoigne NR. 2013. Themis sets the signal threshold for positive and negative selection in T-cell development. Nature 504 : 441-445. Zvezdova E, Mikolajczak J, Garreau A, Marcellin M, Rigal L, Lee J, Choi S, Blaize G, Argenty J, Familiades J, Li L, Gonzalez de Peredo A, Burlet-Schiltz O, Love PE, 347. 237 Lesourne R. 2016. Themis1 enhances T cell receptor signaling during thymocyte development by promoting Vav1 activity and Grb2 stability. Sci Signal 9 : ra51. 348. Plas DR, Williams CB, Kersh GJ, White LS, White JM, Paust S, Ulyanova T, Allen PM, Thomas ML. 1999. Cutting edge : the tyrosine phosphatase SHP-1 regulates thymocyte positive selection. J Immunol 162 : 5680-5684. 349. Choi S, Warzecha C, Zvezdova E, Lee J, Argenty J, Lesourne R, Aravind L, Love PE. 2017. THEMIS enhances TCR signaling and enables positive selection by selective inhibition of the phosphatase SHP-1. Nat Immunol. 350. Garreau A, Blaize G, Argenty J, Rouquié N, Tourdès A, Wood SA, Saoudi A, Lesourne R. 2017. Grb2-Mediated Recruitment of USP9X to LAT Enhances Themis Stability following Thymic Selection. J Immunol 199 : 2758-2766. 351. Reiner O, Carrozzo R, Shen Y, Wehnert M, Faustinella F, Dobyns WB, Caskey CT, Ledbetter DH. 1993. Isolation of a Miller-Dieker lissencephaly gene containing G protein beta-subunit-like repeats. Nature 364 : 717-721. 352. Xiang X, Osmani AH, Osmani SA, Xin M, Morris NR. 1995. NudF, a nuclear migration gene in Aspergillus nidulans, is similar to the human LIS-1 gene required for neuronal migration. Mol Biol Cell 6 : 297-310. 353. Willins DA, Liu B, Xiang X, Morris NR. 1997. Mutations in the heavy chain of cytoplasmic dynein suppress the nudF nuclear migration mutation of Aspergillus nidulans. Mol Gen Genet 255 : 194-200. 354. Bruno DL, Anderlid BM, Lindstrand A, van Ravenswaaij-Arts C, Ganesamoorthy D, Lundin J, Martin CL, Douglas J, Nowak C, Adam MP, Kooy RF, Van der Aa N, Reyniers E, Vandeweyer G, Stolte-Dijkstra I, Dijkhuizen T, Yeung A, Delatycki M, Borgstrm B, Thelin L, Cardoso C, van Bon B, Pfundt R, de Vries BB, Wallin A, Amor DJ, James PA, Slater HR, Schoumans J. 2010. Further molecular and clinical delineation of co-locating 17p13. 3 microdeletions and microduplications that show distinctive phenotypes. J Med Genet 47 : 299-311. 355. Classen S, Goecke T, Drechsler M, Betz B, Nickel N, Beier M, Schaper J, Karenfort M, Royer-Pokora B. 2013. A novel inverted 17p13. 3 microduplication disrupting PAFAH1B1 (LIS1) in a girl with syndromic lissencephaly. Am J Med Genet A 161A : 1453-1458. 356. Avela K, Aktan-Collan K, Horelli-Kuitunen N, Knuutila S, Somer M. 2011. A microduplication on chromosome 17p13. 1p13. 3 including the PAFAH1B1 (LIS1) gene. Am J Med Genet A 155A : 875-879. 357. Bi W, Sapir T, Shchelochkov OA, Zhang F, Withers MA, Hunter JV, Levy T, Shinder V, Peiffer DA, Gunderson KL, Nezarati MM, Shotts VA, Amato SS, Savage SK, Harris DJ, Day-Salvatore DL, Horner M, Lu XY, Sahoo T, Yanagawa Y, Beaudet AL, Cheung SW, Martinez S, Lupski JR, Reiner O. 2009. Increased LIS1 expression affects human and mouse brain development. Nat Genet 41 : 168-177. Saillour Y, Carion N, Quelin C, Leger PL, Boddaert N, Elie C, Toutain A, Mercier S, Barthez MA, Milh M, Joriot S, des Portes V, Philip N, Broglin D, Roubertie A, Pitelet G, Moutard ML, Pinard JM, Cances C, Kaminska A, Chelly J, Beldjord C, Bahi-Buisson N. 2009. LIS1-related isolated lissencephaly : spectrum of mutations and relationships with malformation severity. Arch Neurol 66 : 1007-1015. 238 358. 359. de Wit MC, de Rijk-van Andel J, Halley DJ, Poddighe PJ, Arts WF, de Coo IF, Mancini GM. 2011. Long-term follow-up of type 1 lissencephaly : survival is related to neuroimaging abnormalities. Dev Med Child Neurol 53 : 417-421. 360. Philbert M, Maillard C, Cavallin M, Goldenberg A, Masson C, Boddaert N, El Morjani A, Steffann J, Chelly J, Gerard X, Bahi-Buisson N. 2017. A novel recurrent LIS1 splice site mutation in classic lissencephaly. Am J Med Genet A 173 : 561-564. 361. Poirier K, Lebrun N, Broix L, Tian G, Saillour Y, Boscheron C, Parrini E, Valence S, Pierre BS, Oger M, Lacombe D, Geneviève D, Fontana E, Darra F, Cances C, Barth M, Bonneau D, Bernadina BD, N'guyen S, Gitiaux C, Parent P, des Portes V, Pedespan JM, Legrez V, Castelnau-Ptakine L, Nitschke P, Hieu T, Masson C, Zelenika D, Andrieux A, Francis F, Guerrini R, Cowan NJ, Bahi-Buisson N, Chelly J. 2013. Mutations in TUBG1, DYNC1H1, KIF5C and KIF2A cause malformations of cortical development and microcephaly. Nat Genet 45 : 639-647. 362. Hoff C, Seranski P, Mollenhauer J, Korn B, Detzel T, Reinhardt R, Ramser J, Poustka A. 2000. Physical and transcriptional mapping of the 17p13. 3 region that is frequently deleted in human cancer. Genomics 70 : 26-33. 363. Phillips NJ, Ziegler MR, Radford DM, Fair KL, Steinbrueck T, Xynos FP, Donis-Keller 364. H. 1996. Allelic deletion on chromosome 17p13. 3 in early ovarian cancer. Cancer Res 56 : 606-611. Sarkar C, Chattopadhyay P, Ralte AM, Mahapatra AK, Sinha S. 2003. Loss of heterozygosity of a locus in the chromosomal region 17p13. 3 is associated with increased cell proliferation in astrocytic tumors. Cancer Genet Cytogenet 144 : 156- 164. 365. Koch A, Tonn J, Kraus JA, Sorensen N, Albrecht NS, Wiestler OD, Pietsch T. 1996. Molecular analysis of the lissencephaly gene 1 (LIS-1) in medulloblastomas. Neuropathol Appl Neurobiol 22 : 233-242. 366. Xing Z, Tang X, Gao Y, Da L, Song H, Wang S, Tiollais P, Li T, Zhao M. 2011. The human LIS1 is downregulated in hepatocellular carcinoma and plays a tumor suppressor function. Biochem Biophys Res Commun 409 : 193-199. 367. Cao S, Lu X, Wang L, Qian X, Jin G, Ma H. 2017. The functional polymorphisms of LIS1 are associated with acute myeloid leukemia risk in a Han Chinese population. Leuk Res 54 : 7-11. 368. Krawinkel MB, Ernst M, Feller A, Flad HD, Mueller-Hermelink HK, Ulmer AJ, Schaub J. 1989. Lissencephaly, abnormal lymph nodes, and T-cell deficiency in one patient. Am J Med Genet 33 : 436-443. 369. Ahn C, Morris NR. 2001. Nudf, a fungal homolog of the human LIS1 protein, functions as a dimer in vivo. J Biol Chem 276 : 9903-9909. 370. Cahana A, Escamez T, Nowakowski RS, Hayes NL, Giacobini M, von Holst A, Shmueli O, Sapir T, McConnell SK, Wurst W, Martinez S, Reiner O. 2001. Targeted mutagenesis of Lis1 disrupts cortical development and LIS1 homodimerization. Proc Natl Acad Sci U S A 98 : 6429-6434. 371. Reiner O, Bar-Am I, Sapir T, Shmueli O, Carrozzo R, Lindsay EA, Baldini A, Ledbetter DH, Cahana A. 1995. LIS2, gene and pseudogene, homologous to LIS1 (lissencephaly 1), located on the short and long arms of chromosome 2. Genomics 30 : 251-256. 239 372. 373. Tarricone C, Perrina F, Monzani S, Massimiliano L, Kim MH, Derewenda ZS, Knapp S, Tsai LH, Musacchio A. 2004. Coupling PAF signaling to dynein regulation : structure of LIS1 in complex with PAF-acetylhydrolase. Neuron 44 : 809-821. Feng Y, Olson EC, Stukenberg PT, Flanagan LA, Kirschner MW, Walsh CA. 2000. LIS1 regulates CNS lamination by interacting with mNudE, a central component of the centrosome. Neuron 28 : 665-679. 374. Markus SM, Plevock KM, St Germain BJ, Punch JJ, Meaden CW, Lee WL. 2011. Quantitative analysis of Pac1/LIS1-mediated dynein targeting : Implications for regulation of dynein activity in budding yeast. Cytoskeleton (Hoboken) 68 : 157-174. 375. Gao X, Chen Z, Zhang J, Li X, Chen G, Wu C. 2012. OsLIS-L1 encoding a lissencephaly type-1-like protein with WD40 repeats is required for plant height and male gametophyte formation in rice. Planta 235 : 713-727. 376. Pagan K, Bartuzi Z. 2015. Platelet activating factor in allergies. Int J Immunopathol Pharmacol 28 : 584-589. 377. Hammond JW, Lu SM, Gelbard HA. 2015. Platelet Activating Factor Enhances Synaptic Vesicle Exocytosis Via PKC, Elevated Intracellular Calcium, and Modulation of Synapsin 1 Dynamics and Phosphorylation. Front Cell Neurosci 9 : 505. 378. Manya H, Aoki J, Kato H, Ishii J, Hino S, Arai H, Inoue K. 1999. Biochemical characterization of various catalytic complexes of the brain platelet-activating factor acetylhydrolase. J Biol Chem 274 : 31827-31832. 379. DeWitt MA, Cypranowska CA, Cleary FB, Belyy V, Yildiz A. 2015. The AAA3 domain of cytoplasmic dynein acts as a switch to facilitate microtubule release. Nat Struct Mol Biol 22 : 73-80. 380. Cianfrocco MA, DeSantis ME, Leschziner AE, Reck-Peterson SL. 2015. Mechanism and regulation of cytoplasmic dynein. Annu Rev Cell Dev Biol 31 : 83-108. 381. Redwine WB, DeSantis ME, Hollyer I, Htet ZM, Tran PT, Swanson SK, Florens L, Washburn MP, Reck-Peterson SL. 2017. The human cytoplasmic dynein interactome reveals novel activators of motility. Elife 6. 382. Gama JB, Pereira C, Simes PA, Celestino R, Reis RM, Barbosa DJ, Pires HR, Carvalho C, Amorim J, Carvalho AX, Cheerambathur DK, Gassmann R. 2017. Molecular mechanism of dynein recruitment to kinetochores by the Rod-Zw10- Zwilch complex and Spindly. J Cell Biol 216 : 943-960. Schroeder CM, Vale RD. 2016. Assembly and activation of dynein-dynactin by the cargo adaptor protein Hook3. J Cell Biol 214 : 309-318. 383. 384. Horgan CP, Hanscom SR, Jolly RS, Futter CE, McCaffrey MW. 2010. Rab11-FIP3 links the Rab11 GTPase and cytoplasmic dynein to mediate transport to the endosomal- recycling compartment. J Cell Sci 123 : 181-191. 385. Ham H, Huynh W, Schoon RA, Vale RD, Billadeau DD. 2015. HkRP3 is a microtubule-binding protein regulating lytic granule clustering and NK cell killing. J Immunol 194 : 3984-3996. Loss O, Stephenson FA. 2017. Developmental changes in trak-mediated mitochondrial transport in neurons. Mol Cell Neurosci 80 : 134-147. Sladewski TE, Billington N, Ali MY, Bookwalter CS, Lu H, Krementsova EB, Schroer TA, Trybus KM. 2018. Recruitment of two dyneins to an mRNA-dependent Bicaudal D transport complex. Elife 7. 386. 387. 240 388. Wang S, Ketcham SA, Schn A, Goodman B, Wang Y, Yates J, Freire E, Schroer TA, Zheng Y. 2013. Nudel/NudE and Lis1 promote dynein and dynactin interaction in the context of spindle morphogenesis. Mol Biol Cell 24 : 3522-3533. 389. Huang J, Roberts AJ, Leschziner AE, Reck-Peterson SL. 2012. Lis1 acts as a clutch between the ATPase and microtubule-binding domains of the dynein motor. Cell 150 : 975-986. Egan MJ, Tan K, Reck-Peterson SL. 2012. Lis1 is an initiation factor for dynein- driven organelle transport. J Cell Biol 197 : 971-982. 390. 392. 391. McKenney RJ, Weil SJ, Scherer J, Vallee RB. 2011. Mutually exclusive cytoplasmic dynein regulation by NudE-Lis1 and dynactin. J Biol Chem 286 : 39615-39622. Lenz JH, Schuchardt I, Straube A, Steinberg G. 2006. A dynein loading zone for retrograde endosome motility at microtubule plus-ends. EMBO J 25 : 2275-2286. Efimov VP, Zhang J, Xiang X. 2006. CLIP-170 homologue and NUDE play overlapping roles in NUDF localization in Aspergillus nidulans. Mol Biol Cell 17 : 2021-2034. 394. Coquelle FM, Caspi M, Cordelières FP, Dompierre JP, Dujardin DL, Koifman C, 393. Martin P, Hoogenraad CC, Akhmanova A, Galjart N, De Mey JR, Reiner O. 2002. LIS1, CLIP-170's key to the dynein/dynactin pathway. Mol Cell Biol 22 : 3089-3102. 395. Kholmanskikh SS, Koeller HB, Wynshaw-Boris A, Gomez T, Letourneau PC, Ross 396. 397. ME. 2006. Calcium-dependent interaction of Lis1 with IQGAP1 and Cdc42 promotes neuronal motility. Nat Neurosci 9 : 50-57. Tai CY, Dujardin DL, Faulkner NE, Vallee RB. 2002. Role of dynein, dynactin, and CLIP-170 interactions in LIS1 kinetochore function. J Cell Biol 156 : 959-968. Faulkner NE, Dujardin DL, Tai CY, Vaughan KT, O'Connell CB, Wang Y, Vallee RB. 2000. A role for the lissencephaly gene LIS1 in mitosis and cytoplasmic dynein function. Nat Cell Biol 2 : 784-791. 398. Xiang X. 2003. LIS1 at the microtubule plus end and its role in dynein-mediated nuclear migration. J Cell Biol 160 : 289-290. 399. Klinman E, Holzbaur EL. 2015. Stress-Induced CDK5 Activation Disrupts Axonal Transport via Lis1/Ndel1/Dynein. Cell Rep 12 : 462-473. 400. Yi JY, Ori-McKenney KM, McKenney RJ, Vershinin M, Gross SP, Vallee RB. 2011. High-resolution imaging reveals indirect coordination of opposite motors and a role for LIS1 in high-load axonal transport. J Cell Biol 195 : 193-201. 401. Reddy BJ, Mattson M, Wynne CL, Vadpey O, Durra A, Chapman D, Vallee RB, Gross SP. 2016. Load-induced enhancement of Dynein force production by LIS1-NudE in vivo and in vitro. Nat Commun 7 : 12259. 402. DeSantis ME, Cianfrocco MA, Htet ZM, Tran PT, Reck-Peterson SL, Leschziner AE. 2017. Lis1 Has Two Opposing Modes of Regulating Cytoplasmic Dynein. Cell 170 : 1197-1208. e1112. 403. Hirotsune S, Fleck MW, Gambello MJ, Bix GJ, Chen A, Clark GD, Ledbetter DH, McBain CJ, Wynshaw-Boris A. 1998. Graded reduction of Pafah1b1 (Lis1) activity results in neuronal migration defects and early embryonic lethality. Nat Genet 19 : 333-339. Escamez T, Bahamonde O, Tabares-Seisdedos R, Vieta E, Martinez S, Echevarria D. 2012. Developmental dynamics of PAFAH1B subunits during mouse brain development. J Comp Neurol 520 : 3877-3894. 404. 241 405. Katayama KI, Hayashi K, Inoue S, Sakaguchi K, Nakajima K. 2017. Enhanced 406. expression of Pafah1b1 causes over-migration of cerebral cortical neurons into the marginal zone. Brain Struct Funct 222 : 4283-4291. Jheng GW, Hur SS, Chang CM, Wu CC, Cheng JS, Lee HH, Chung BC, Wang YK, Lin KH, Del Álamo JC, Chien S, Tsai JW. 2018. Lis1 dysfunction leads to traction force reduction and cytoskeletal disorganization during cell migration. Biochem Biophys Res Commun 497 : 869-875. 407. Mayor R, Etienne-Manneville S. 2016. The front and rear of collective cell migration. Nat Rev Mol Cell Biol 17 : 97-109. 408. Kholmanskikh SS, Dobrin JS, Wynshaw-Boris A, Letourneau PC, Ross ME. 2003. Disregulated RhoGTPases and actin cytoskeleton contribute to the migration defect in Lis1-deficient neurons. J Neurosci 23 : 8673-8681. 409. Chen S, Kaneko S, Ma X, Chen X, Ip YT, Xu L, Xie T. 2010. Lissencephaly-1 controls germline stem cell self-renewal through modulating bone morphogenetic protein signaling and niche adhesion. Proc Natl Acad Sci U S A 107 : 19939-19944. 410. Hebbar S, Guillotte AM, Mesngon MT, Zhou Q, Wynshaw-Boris A, Smith DS. 2008. Genetic enhancement of the Lis1 /- phenotype by a heterozygous mutation in the adenomatous polyposis coli gene. Dev Neurosci 30 : 157-170. 411. Preitner N, Quan J, Nowakowski DW, Hancock ML, Shi J, Tcherkezian J, Young- Pearse TL, Flanagan JG. 2014. APC is an RNA-binding protein, and its interactome provides a link to neural development and microtubule assembly. Cell 158 : 368-382. Juanes MA, Bouguenina H, Eskin JA, Jaiswal R, Badache A, Goode BL. 2017. Adenomatous polyposis coli nucleates actin assembly to drive cell migration and microtubule-induced focal adhesion turnover. J Cell Biol 216 : 2859-2875. 412. 413. Graham DM, Andersen T, Sharek L, Uzer G, Rothenberg K, Hoffman BD, Rubin J, Balland M, Bear JE, Burridge K. 2018. Enucleated cells reveal differential roles of the nucleus in cell migration, polarity, and mechanotransduction. J Cell Biol 217 : 895-914. Fruleux A, Hawkins RJ. 2016. Physical role for the nucleus in cell migration. J Phys Condens Matter 28 : 363002. 415. Yadav S, Puri S, Linstedt AD. 2009. A primary role for Golgi positioning in directed 414. 416. secretion, cell polarity, and wound healing. Mol Biol Cell 20 : 1728-1736. Tanaka T, Serneo FF, Higgins C, Gambello MJ, Wynshaw-Boris A, Gleeson JG. 2004. Lis1 and doublecortin function with dynein to mediate coupling of the nucleus to the centrosome in neuronal migration. J Cell Biol 165 : 709-721. 417. Umeshima H, Hirano T, Kengaku M. 2007. Microtubule-based nuclear movement occurs independently of centrosome positioning in migrating neurons. Proc Natl Acad Sci U S A 104 : 16182-16187. 418. Rehberg M, Kleylein-Sohn J, Faix J, Ho TH, Schulz I, Grf R. 2005. Dictyostelium LIS1 is a centrosomal protein required for microtubule/cell cortex interactions, nucleus/centrosome linkage, and actin dynamics. Mol Biol Cell 16 : 2759-2771. 419. Dujardin DL, Barnhart LE, Stehman SA, Gomes ER, Gundersen GG, Vallee RB. 2003. A role for cytoplasmic dynein and LIS1 in directed cell movement. J Cell Biol 163 : 1205-1211. Swanton C. 2004. Cell-cycle targeted therapies. Lancet Oncol 5 : 27-36. 420. 242 424. 425. 426. 429. Signaling Dynamics. Curr Biol 25 : R1002-1018. Jordan MA, Thrower D, Wilson L. 1992. Effects of vinblastine, podophyllotoxin and nocodazole on mitotic spindles. Implications for the role of microtubule dynamics in mitosis. J Cell Sci 102 ( Pt 3) : 401-416. Tsai JW, Chen Y, Kriegstein AR, Vallee RB. 2005. LIS1 RNA interference blocks neural stem cell division, morphogenesis, and motility at multiple stages. J Cell Biol 170 : 935-945. Liu Z, Steward R, Luo L. 2000. Drosophila Lis1 is required for neuroblast proliferation, dendritic elaboration and axonal transport. Nat Cell Biol 2 : 776-783. 427. Cahana A, Jin XL, Reiner O, Wynshaw-Boris A, O'Neill C. 2003. A study of the nature of embryonic lethality in LIS1-/- mice. Mol Reprod Dev 66 : 134-142. 428. Yingling J, Youn YH, Darling D, Toyo-Oka K, Pramparo T, Hirotsune S, Wynshaw- Boris A. 2008. Neuroepithelial stem cell proliferation requires LIS1 for precise spindle orientation and symmetric division. Cell 132 : 474-486. Zimdahl B, Ito T, Blevins A, Bajaj J, Konuma T, Weeks J, Koechlein CS, Kwon HY, Arami O, Rizzieri D, Broome HE, Chuah C, Oehler VG, Sasik R, Hardiman G, Reya T. 2014. Lis1 regulates asymmetric division in hematopoietic stem cells and in leukemia. Nat Genet 46 : 245-252. 430. Cockell MM, Baumer K, Gnczy P. 2004. lis-1 is required for dynein-dependent cell division processes in C. elegans embryos. J Cell Sci 117 : 4571-4582. 431. Arquint C, Nigg EA. 2016. The PLK4-STIL-SAS-6 module at the core of centriole 421. Nigg EA, Holland AJ. 2018. Once and only once : mechanisms of centriole duplication and their deregulation in disease. Nat Rev Mol Cell Biol 19 : 297-312. 422. Agircan FG, Schiebel E, Mardin BR. 2014. Separate to operate : control of centrosome positioning and separation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 369. 423. Musacchio A. 2015. The Molecular Biology of Spindle Assembly Checkpoint duplication. Biochem Soc Trans 44 : 1253-1263. 432. Karki M, Keyhaninejad N, Shuster CB. 2017. Precocious centriole disengagement and centrosome fragmentation induced by mitotic delay. Nat Commun 8 : 15803. Izumi H, Matsumoto Y, Ikeuchi T, Saya H, Kajii T, Matsuura S. 2009. BubR1 localizes to centrosomes and suppresses centrosome amplification via regulating Plk1 activity in interphase cells. Oncogene 28 : 2806-2820. 433. 434. Cosenza MR, Krmer A. 2016. Centrosome amplification, chromosomal instability and cancer : mechanistic, clinical and therapeutic issues. Chromosome Res 24 : 105- 126. 435. Kim J, Lee K, Rhee K. 2015. PLK1 regulation of PCNT cleavage ensures fidelity of centriole separation during mitotic exit. Nat Commun 6 : 10076. 436. Moon HM, Youn YH, Pemble H, Yingling J, Wittmann T, Wynshaw-Boris A. 2014. LIS1 controls mitosis and mitotic spindle organization via the LIS1-NDEL1-dynein complex. Hum Mol Genet 23 : 449-466. Sharif SR, Islam A, Moon IS. 2016. N-Acetyl-D-Glucosamine Kinase Interacts with Dynein-Lis1-NudE1 Complex and Regulates Cell Division. Mol Cells 39 : 669-679. 437. 438. McHugh T, Welburn JP. 2017. Dynein at kinetochores : Making the connection. J Cell Biol 216 : 855-857. 243 440. 439. Gatlin JC, Matov A, Groen AC, Needleman DJ, Maresca TJ, Danuser G, Mitchison TJ, Salmon ED. 2009. Spindle fusion requires dynein-mediated sliding of oppositely oriented microtubules. Curr Biol 19 : 287-296. Florian S, Mayer TU. 2012. The functional antagonism between Eg5 and dynein in spindle bipolarization is not compatible with a simple push-pull model. Cell Rep 1 : 408-416. Ferenz NP, Paul R, Fagerstrom C, Mogilner A, Wadsworth P. 2009. Dynein antagonizes eg5 by crosslinking and sliding antiparallel microtubules. Curr Biol 19 : 1833-1838. Tanenbaum ME, Macrek L, Galjart N, Medema RH. 2008. Dynein, Lis1 and CLIP- 170 counteract Eg5-dependent centrosome separation during bipolar spindle assembly. EMBO J 27 : 3235-3245. 442. 441. 443. Vergnolle MA, Taylor SS. 2007. Cenp-F links kinetochores to Ndel1/Nde1/Lis1/dynein microtubule motor complexes. Curr Biol 17 : 1173-1179. 444. Griffis ER, Stuurman N, Vale RD. 2007. Spindly, a novel protein essential for silencing the spindle assembly checkpoint, recruits dynein to the kinetochore. J Cell Biol 177 : 1005-1015. 445. Vagnoni A, Hoffmann PC, Bullock SL. 2016. Reducing Lissencephaly-1 levels augments mitochondrial transport and has a protective effect in adult Drosophila neurons. J Cell Sci 129 : 178-190. Shao CY, Zhu J, Xie YJ, Wang Z, Wang YN, Wang Y, Su LD, Zhou L, Zhou TH, Shen Y. 2013. Distinct functions of nuclear distribution proteins LIS1, Ndel1 and NudCL in regulating axonal mitochondrial transport. Traffic 14 : 785-797. 447. Pandey JP, Smith DS. 2011. A Cdk5-dependent switch regulates Lis1/Ndel1/dynein- driven organelle transport in adult axons. J Neurosci 31 : 17207-17219. 448. Holt CE, Bullock SL. 2009. Subcellular mRNA localization in animal cells and why it 446. matters. Science 326 : 1212-1216. 451. 453. 454. 449. Dix CI, Soundararajan HC, Dzhindzhev NS, Begum F, Suter B, Ohkura H, Stephens E, Bullock SL. 2013. Lissencephaly-1 promotes the recruitment of dynein and dynactin to transported mRNAs. J Cell Biol 202 : 479-494. 450. Yamada M, Toba S, Yoshida Y, Haratani K, Mori D, Yano Y, Mimori-Kiyosue Y, Nakamura T, Itoh K, Fushiki S, Setou M, Wynshaw-Boris A, Torisawa T, Toyoshima YY, Hirotsune S. 2008. LIS1 and NDEL1 coordinate the plus-end-directed transport of cytoplasmic dynein. EMBO J 27 : 2471-2483. Lanctot AA, Peng CY, Pawlisz AS, Joksimovic M, Feng Y. 2013. Spatially dependent dynamic MAPK modulation by the Nde1-Lis1-Brap complex patterns mammalian CNS. Dev Cell 25 : 241-255. 452. Plestant C, Anton ES. 2013. Scaling the MAPK signaling threshold during CNS patterning. Dev Cell 25 : 221-222. Liu L, Lu J, Li X, Wu A, Wu Q, Zhao M, Tang N, Song H. 2018. The LIS1/NDE1 Complex Is Essential for FGF Signaling by Regulating FGF Receptor Intracellular Trafficking. Cell Rep 22 : 3277-3291. Silver DL, Watkins-Chow DE, Schreck KC, Pierfelice TJ, Larson DM, Burnetti AJ, Liaw HJ, Myung K, Walsh CA, Gaiano N, Pavan WJ. 2010. The exon junction 244 complex component Magoh controls brain size by regulating neural stem cell division. Nat Neurosci 13 : 551-558. 455. Huang Y, Jiang J, Zheng G, Chen J, Lu H, Guo H, Wu C. 2014. miR-139-5p modulates cortical neuronal migration by targeting Lis1 in a rat model of focal cortical dysplasia. Int J Mol Med 33 : 1407-1414. Sapir T, Cahana A, Seger R, Nekhai S, Reiner O. 1999. LIS1 is a microtubule- associated phosphoprotein. Eur J Biochem 265 : 181-188. 456. 457. Bradshaw NJ, Soares DC, Carlyle BC, Ogawa F, Davidson-Smith H, Christie S, Mackie S, Thomson PA, Porteous DJ, Millar JK. 2011. PKA phosphorylation of NDE1 is DISC1/PDE4 dependent and modulates its interaction with LIS1 and NDEL1. J Neurosci 31 : 9043-9054. 458. Hebbar S, Mesngon MT, Guillotte AM, Desai B, Ayala R, Smith DS. 2008. Lis1 and Ndel1 influence the timing of nuclear envelope breakdown in neural stem cells. J Cell Biol 182 : 1063-1071. 459. Alonso A, D'Silva S, Rahman M, Meluh PB, Keeling J, Meednu N, Hoops HJ, Miller RK. 2012. The yeast homologue of the microtubule-associated protein Lis1 interacts with the sumoylation machinery and a SUMO-targeted ubiquitin ligase. Mol Biol Cell 23 : 4552-4566. 460. Yamaguchi N, Koizumi H, Aoki J, Natori Y, Nishikawa K, Takanezawa Y, Arai H. 2007. Type I platelet-activating factor acetylhydrolase catalytic subunits over- expression induces pleiomorphic nuclei and centrosome amplification. Genes Cells 12 : 1153-1161. 461. Assadi AH, Zhang G, Beffert U, McNeil RS, Renfro AL, Niu S, Quattrocchi CC, Antalffy BA, Sheldon M, Armstrong DD, Wynshaw-Boris A, Herz J, D'Arcangelo G, Clark GD. 2003. Interaction of reelin signaling and Lis1 in brain development. Nat Genet 35 : 270-276. 463. 462. Aumais JP, Tunstead JR, McNeil RS, Schaar BT, McConnell SK, Lin SH, Clark GD, Yu- Lee LY. 2001. NudC associates with Lis1 and the dynein motor at the leading pole of neurons. J Neurosci 21 : RC187. Zhu XJ, Liu X, Jin Q, Cai Y, Yang Y, Zhou T. 2010. The L279P mutation of nuclear distribution gene C (NudC) influences its chaperone activity and lissencephaly protein 1 (LIS1) stability. J Biol Chem 285 : 29903-29910. Zhang J, Li S, Fischer R, Xiang X. 2003. Accumulation of cytoplasmic dynein and dynactin at microtubule plus ends in Aspergillus nidulans is kinesin dependent. Mol Biol Cell 14 : 1479-1488. 465. Morris SM, Albrecht U, Reiner O, Eichele G, Yu-Lee LY. 1998. The lissencephaly 464. gene product Lis1, a protein involved in neuronal migration, interacts with a nuclear movement protein, NudC. Curr Biol 8 : 603-606. 466. Yamada M, Toba S, Takitoh T, Yoshida Y, Mori D, Nakamura T, Iwane AH, Yanagida T, Imai H, Yu-Lee LY, Schroer T, Wynshaw-Boris A, Hirotsune S. 2010. mNUDC is required for plus-end-directed transport of cytoplasmic dynein and dynactins by kinesin-1. EMBO J 29 : 517-531. 467. Yamada M, Kumamoto K, Mikuni S, Arai Y, Kinjo M, Nagai T, Tsukasaki Y, Watanabe TM, Fukui M, Jin M, Toba S, Hirotsune S. 2013. Rab6a releases LIS1 from 245 468. a dynein idling complex and activates dynein for retrograde movement. Nat Commun 4 : 2033. Sitaram P, Anderson MA, Jodoin JN, Lee E, Lee LA. 2012. Regulation of dynein localization and centrosome positioning by Lis-1 and asunder during Drosophila spermatogenesis. Development 139 : 2945-2954. 474. 469. Villarin JM, McCurdy EP, Martnez JC, Hengst U. 2016. Local synthesis of dynein cofactors matches retrograde transport to acutely changing demands. Nat Commun 7 : 13865. 470. Chen X, Zhang J, Zhao J, Liu H, Sun X, Zhao M, Liu X. 2014. Lis1 is required for the expansion of hematopoietic stem cells in the fetal liver. Cell Res 24 : 1013-1016. 471. Chen J, Cai Z, Zhang L, Yin Y, Chen X, Chen C, Zhang Y, Zhai S, Long X, Liu X, Wang X. 2017. Lis1 Regulates Germinal Center B Cell Antigen Acquisition and Affinity Maturation. J Immunol 198 : 4304-4311. 472. Ngoi SM, Lopez JM, Chang JT. 2016. The Microtubule-Associated Protein Lis1 Regulates T Lymphocyte Homeostasis and Differentiation. J Immunol 196 : 4237- 4245. 473. Nath S, Christian L, Tan SY, Ki S, Ehrlich LI, Poenie M. 2016. Dynein Separately Partners with NDE1 and Dynactin To Orchestrate T Cell Focused Secretion. J Immunol 197 : 2090-2101. Zhumabekov T, Corbella P, Tolaini M, Kioussis D. 1995. Improved version of a human CD2 minigene based vector for T cell-specific expression in transgenic mice. J Immunol Methods 185 : 133-140. 476. 477. 475. de Boer J, Williams A, Skavdis G, Harker N, Coles M, Tolaini M, Norton T, Williams K, Roderick K, Potocnik AJ, Kioussis D. 2003. Transgenic mice with hematopoietic and lymphoid specific expression of Cre. Eur J Immunol 33 : 314-325. Shimshek DR, Kim J, Hbner MR, Spergel DJ, Buchholz F, Casanova E, Stewart AF, Seeburg PH, Sprengel R. 2002. Codon-improved Cre recombinase (iCre) expression in the mouse. Genesis 32 : 19-26. Sawada S, Scarborough JD, Killeen N, Littman DR. 1994. A lineage-specific transcriptional silencer regulates CD4 gene expression during T lymphocyte development. Cell 77 : 917-929. Zhang X, Dong X, Wang H, Li J, Yang B, Zhang J, Hua ZC. 2014. FADD regulates thymocyte development at the -selection checkpoint by modulating Notch signaling. Cell Death Dis 5 : e1273. Levine MS, Bakker B, Boeckx B, Moyett J, Lu J, Vitre B, Spierings DC, Lansdorp PM, Cleveland DW, Lambrechts D, Foijer F, Holland AJ. 2017. Centrosome Amplification Is Sufficient to Promote Spontaneous Tumorigenesis in Mammals. Dev Cell 40 : 313- 322. e315. 480. Hinchcliffe EH. 2014. Centrosomes and the art of mitotic spindle maintenance. Int 479. 478. Rev Cell Mol Biol 313 : 179-217. 481. Conduit PT, Wainman A, Raff JW. 2015. Centrosome function and assembly in animal cells. Nat Rev Mol Cell Biol 16 : 611-624. Lanni JS, Jacks T. 1998. Characterization of the p53-dependent postmitotic checkpoint following spindle disruption. Mol Cell Biol 18 : 1055-1064. 246 482. 483. de la Calle C, Joubert PE, Law HK, Hasan M, Albert ML. 2011. Simultaneous 484. 485. assessment of autophagy and apoptosis using multispectral imaging cytometry. Autophagy 7 : 1045-1051. Lau CI, Barbarulo A, Solanki A, Saldaa JI, Crompton T. 2017. The kinesin motor protein Kif7 is required for T-cell development and normal MHC expression on thymic epithelial cells (TEC) in the thymus. Oncotarget 8 : 24163-24176. Trampont PC, Tosello-Trampont AC, Shen Y, Duley AK, Sutherland AE, Bender TP, Littman DR, Ravichandran KS. 2010. CXCR4 acts as a costimulator during thymic beta-selection. Nat Immunol 11 : 162-170. 487. 486. Nishino T, Matsunaga R, Konishi H. 2015. Functional relationship between CABIT, SAM and 14-3-3 binding domains of GAREM1 that play a role in its subcellular localization. Biochem Biophys Res Commun 464 : 616-621. Taya S, Shinoda T, Tsuboi D, Asaki J, Nagai K, Hikita T, Kuroda S, Kuroda K, Shimizu M, Hirotsune S, Iwamatsu A, Kaibuchi K. 2007. DISC1 regulates the transport of the NUDEL/LIS1/14-3-3epsilon complex through kinesin-1. J Neurosci 27 : 15-26. 488. Wynshaw-Boris A. 2007. Lissencephaly and LIS1 : insights into the molecular mechanisms of neuronal migration and development. Clin Genet 72 : 296-304. 489. Reiner O. 2013. LIS1 and DCX : Implications for Brain Development and Human Disease in Relation to Microtubules. Scientifica (Cairo) 2013 : 393975. 490. Reiner O, Sapoznik S, Sapir T. 2006. Lissencephaly 1 linking to multiple diseases : mental retardation, neurodegeneration, schizophrenia, male sterility, and more. Neuromolecular Med 8 : 547-565. 491. Basu R, Huse M. 2017. Mechanical Communication at the Immunological Synapse. Trends Cell Biol 27 : 241-254. 492. Delon J. 2000. The immunological synapse. Curr Biol 10 : R214. 493. Bahi-Buisson N, Guerrini R. 2013. Diffuse malformations of cortical development. Handb Clin Neurol 111 : 653-665. Jodoin JN, Shboul M, Sitaram P, Zein-Sabatto H, Reversade B, Lee E, Lee LA. 2012. Human Asunder promotes dynein recruitment and centrosomal tethering to the nucleus at mitotic entry. Mol Biol Cell 23 : 4713-4724. 494. 495. Uhlmann F, Lottspeich F, Nasmyth K. 1999. Sister-chromatid separation at anaphase onset is promoted by cleavage of the cohesin subunit Scc1. Nature 400 : 37-42. 496. Yanagida M. 2000. Cell cycle mechanisms of sister chromatid separation ; roles of 497. Cut1/separin and Cut2/securin. Genes Cells 5 : 1-8. Leidel S, Delattre M, Cerutti L, Baumer K, Gnczy P. 2005. SAS-6 defines a protein family required for centrosome duplication in C. elegans and in human cells. Nat Cell Biol 7 : 115-125. 498. Peel N, Stevens NR, Basto R, Raff JW. 2007. Overexpressing centriole-replication proteins in vivo induces centriole overduplication and de novo formation. Curr Biol 17 : 834-843. 499. Marteil G, Guerrero A, Vieira AF, de Almeida BP, Machado P, Mendonça S, Mesquita M, Villarreal B, Fonseca I, Francia ME, Dores K, Martins NP, Jana SC, Tranfield EM, Barbosa-Morais NL, Paredes J, Pellman D, Godinho SA, Bettencourt- 247 Dias M. 2018. Over-elongation of centrioles in cancer promotes centriole amplification and chromosome missegregation. Nat Commun 9 : 1258. 500. Malik S, Saito H, Takaoka M, Miki Y, Nakanishi A. 2016. BRCA2 mediates 501. centrosome cohesion via an interaction with cytoplasmic dynein. Cell Cycle 15 : 2145-2156. Tutt A, Gabriel A, Bertwistle D, Connor F, Paterson H, Peacock J, Ross G, Ashworth A. 1999. Absence of Brca2 causes genome instability by chromosome breakage and loss associated with centrosome amplification. Curr Biol 9 : 1107-1110. 502. Meigs TE, Kaplan DD. 2008. Isolation of centrosomes from cultured Mammalian cells. CSH Protoc 2008 : pdb. prot5039. 504. 505. 503. Gully CP, Velazquez-Torres G, Shin JH, Fuentes-Mattei E, Wang E, Carlock C, Chen J, Rothenberg D, Adams HP, Choi HH, Guma S, Phan L, Chou PC, Su CH, Zhang F, Chen JS, Yang TY, Yeung SC, Lee MH. 2012. Aurora B kinase phosphorylates and instigates degradation of p53. Proc Natl Acad Sci U S A 109 : E1513-1522. Liu X, Zheng H, Li X, Wang S, Meyerson HJ, Yang W, Neel BG, Qu CK. 2016. Gain-of- function mutations of Ptpn11 (Shp2) cause aberrant mitosis and increase susceptibility to DNA damage-induced malignancies. Proc Natl Acad Sci U S A 113 : 984-989. Sankar M, Tanaka K, Kumaravel TS, Arif M, Shintani T, Yagi S, Kyo T, Dohy H, Kamada N. 1998. Identification of a commonly deleted region at 17p13. 3 in leukemia and lymphoma associated with 17p abnormality. Leukemia 12 : 510-516. 506. Kobayashi M, Kawashima A, Mai M, Ooi A. 1996. Analysis of chromosome 17p13 (p53 locus) alterations in gastric carcinoma cells by dual-color fluorescence in situ hybridization. Am J Pathol 149 : 1575-1584. 507. Olivier M, Hollstein M, Hainaut P. 2010. TP53 mutations in human cancers : origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol 2 : a001008. 248 ! ! ! ! Jérémy ARGENTY Rôles dans les lymphocytes T de la protéine Lis1, un régulateur de la dynamique des microtubules dépendante de la dynéine Directeur de thèse : Dr. Abdelhadi SAOUDI Codirecteur de thèse : Dr. Renaud LESOURNE Thèse soutenue à Toulouse le mardi 25 septembre 2018 Les récepteurs d'antigènes des lymphocytes T (TCR) sont assemblés au cours du développement précoce de ces cellules dans le thymus suite à des recombinaisons complexes de gènes. Le réarrangement d'une chaine des TCR fonctionnelle (pré-TCR) déclenche des voies de signalisation intracellulaires qui entrainent la survie, l'expansion et la maturation des thymocytes. Par ailleurs, l'engagement des TCR à la surface des lymphocytes T (LT) matures par des antigènes conduit également à des cycles de prolifération qui permettent le développement de réponses immunitaires efficaces. Ces évènements cellulaires s'accompagnent de remaniements importants du réseau de microtubules et une redistribution des moteurs moléculaires, tels que la dynéine, qui véhiculent les structures cellulaires sur ces réseaux. Les mécanismes moléculaires et les conséquences physiologiques de ces remaniements sont peu connus dans les LT. Dans ce travail, nous montrons que Lis1, un régulateur de la dynéine, joue un rôle essentiel dans le développement précoce des LT et dans l'homéostasie des LT matures. La prolifération des thymocytes ayant passé la -sélection ou des LT matures dont le TCR a été engagé, est fortement impactée. L'analyse fine de la mitose indique que la déficience en Lis1 ralentit fortement le processus mitotique, contrarie les remaniements intracellulaires conduisant à la métaphase et entrane la répartition asymétrique du matériel génétique dans les cellules filles. L'analyse des réseaux de microtubules montre que l'absence de Lis1 entrane l'amplification du nombre de centrosomes et l'augmentation des cellules multipolaires au cours de la mitose. En conclusion, nous avons montré que Lis1 est importante dans la distribution du matériel génétique au cours de la prolifération des thymocytes doubles négatifs et des lymphocytes T périphériques. Mots clefs : Lymphocytes T, Thymocytes, Lis1, prolifération, mitose, chromosomes, centrosomes Discipline : Immunologie ! Centre de Physiopathologie de Toulouse-Purpan CHU PURPAN Place du Dr Baylac 31024 Toulouse Cedex 3	HAL	Scientific
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En médecine, le test de serrage (grip test) est un test médical de mesure de la force musculaire dans des conditions standardisées, avec mesure simultanée de différents paramètres biochimiques sanguins. Pour le test de serrage de la main il suffit d'agripper la poignée d'un dynamomètre à main, serrer fort, relâcher, et serrer et relâcher de nouveau, répéter ceci autant de fois que c'est nécessaire pour exécuter les tests simultanées. Ce test permet le dépistage de pathologies mitochondriales et musculaires. La facilité du test simple l'a rendu utile aussi pour les haltérophiles et autres sportifs pour mesurer l'avancement de l'entrainement des muscles. Il existe également un test de serrage du pied. Portail de la médecine	WIKIPEDIA	Wiki
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AMLODIPINE ZYDUS 5 mg, gélule - Résumé des caractéristiques du produit. ANSM - Mis à jour le : 27/03/2019 AMLODIPINE ZYDUS 5 mg, gélule Amlodipine. 5 mg Sous forme de bésilate d'amlodipine Pour une gélule. Pour la liste complète des excipients, voir rubrique 6. 1. Angor chronique stable. Angor vasospastique (syndrome de Prinzmetal). Pour l'hypertension et l'angor, la posologie initiale habituelle est de 5 mg de AMLODIPINE ZYDUS une fois par jour, qui peut être augmentée jusqu'à une posologie maximale de 10 mg en fonction de la réponse individuelle du patient. Chez les patients hypertendus, AMLODIPINE ZYDUS a été utilisé en association avec un diurétique thiazidique, un alphabloquant, un bêtabloquant ou un inhibiteur de l'enzyme de conversion de l'angiotensine. Dans l'angor, AMLODIPINE ZYDUS peut être utilisé en monothérapie ou en association avec d'autres antiangineux chez les patients présentant un angor réfractaire aux dérivés nitrés et/ou à des doses adéquates de bêtabloquants. Aucun ajustement posologique de AMLODIPINE ZYDUS n'est nécessaire lors de l'administration concomitante de diurétiques thiazidiques, de bêtabloquants et d'inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine. Patients âgés AMLODIPINE ZYDUS utilisé à des doses similaires montre une bonne tolérance équivalente chez les patients âgés et les patients plus jeunes. Des schémas posologiques normaux sont recommandés chez les sujets âgés, mais une augmentation de la posologie doit être effectuée avec précaution (voir rubriques 4. 4 et 5. 2). Patients atteints d'insuffisance hépatique Les recommandations de posologie n'ont pas été établies chez les patients atteints d'insuffisance hépatique légère à modérée donc la dose doit être choisie avec précaution et doit démarrer à la dose efficace la plus faible (voir rubriques 4. 4 et 5. 2). Les propriétés pharmacocinétiques de l'amlodipine n'ont pas été étudiées en cas d'insuffisance hépatique sévère. L'amlodipine doit être débutée à la dose la plus faible et augmentée lentement chez les patients atteints d'insuffisance hépatique sévère. Patients atteints d'insuffisance rénale Les changements des concentrations plasmatiques d'amlodipine ne sont pas corrélés avec le degré d'insuffisance rénale, une posologie usuelle est donc recommandée. L'amlodipine n'est pas dialysable. La posologie antihypertensive orale recommandée chez les enfants âgés de 6 à 17 ans est de 2, 5 mg une fois par jour comme dose initiale, qui peut être augmentée jusqu'à 5 mg une fois par jour si la pression artérielle souhaitée n'est pas atteinte après quatre semaines. Des posologies supérieures à 5 mg une fois par jour n'ont pas été étudiées chez les patients pédiatriques (voir rubriques 5. 1 et 5. 2). Une posologie d'amlodipine de 2, 5 mg n'est pas possible avec ce médicament. Il n'existe pas de donnée disponible. Mode d'administration Gélule pour administration orale. Une hypersensibilité aux dérivés de la dihydropyridine, à l'amlodipine ou à l'un des excipients Une hypotension sévère. Un choc (y compris choc cardiogénique). Une obstruction de la voie d'éjection du ventricule gauche (par exemple, une sténose aortique de degré élevé). Une insuffisance cardiaque hémodynamiquement instable après un infarctus aigu du myocarde. Patients atteints d'insuffisance cardiaque Les patients atteints d'insuffisance cardiaque doivent être traités avec précaution. Dans une étude à long terme contrôlée placebo menée chez des patients atteints d'insuffisance cardiaque sévère (classes NYHA III et IV), l'incidence rapportée des œdèmes pulmonaires a été supérieure dans le groupe traité par l'amlodipine par rapport au groupe placebo (voir rubrique 5. 1). Les inhibiteurs calciques dont l'amlodipine doivent être utilisés avec précaution chez les patients atteints d'insuffisance cardiaque congestive parce qu'ils peuvent augmenter le risque d'évènements cardiovasculaires et de mortalité. Patients atteints d'insuffisance hépatique La demi-vie de l'amlodipine est augmentée et son ASC (Aire Sous la Courbe) est plus grande chez les patients atteints d'insuffisance hépatique ; les recommandations posologiques n'ont pas été établies. Par conséquent l'amlodipine devra être initiée à la dose efficace la plus faible et avec précaution, aussi bien durant l'initiation du traitement que lors de l'augmentation de la dose. Une augmentation posologique lente et une surveillance attentive peuvent être nécessaires chez les patients avec une insuffisance hépatique sévère. Patients âgés Chez les sujets âgés, une augmentation de la posologie doit être effectuée avec précaution (voir rubriques 4. 2 et 5. 2). Patients atteints d'insuffisance rénale L'amlodipine peut être utilisée chez ces patients à des doses normales. Les changements des concentrations plasmatiques d'amlodipine ne sont pas corrélés avec le degré d'insuffisance rénale. L'amlodipine n'est pas dialysable. Effets des autres médicaments sur l'amlodipine L'utilisation concomitante d'amlodipine avec des inhibiteurs forts ou modérés du CYP3A4 (inhibiteurs de la protéase, antifongiques azolés, macrolides tels que l'érythromycine ou la clarithromycine, le vérapamil ou le diltiazem) peut donner lieu à une augmentation significative de la concentration plasmatique d'amlodipine . La traduction clinique de ces variations pharmacocinétiques peut être plus prononcée chez le sujet âgé. Par conséquent, une surveillance clinique et un ajustement de la dose pourront être nécessaires. Lors de la co-administration d'inducteurs connus du CYP3A4, la concentration plasmatique d'amlodipine peut varier. Par conséquent, la pression artérielle doit être surveillée et une adaptation posologique doit être envisagée pendant et après la prise concomitante d'un médicament, en particulier avec des inducteurs puissants du CYP3A4 (par exemple, rifampicine, millepertuis [ ]). L'administration d'amlodipine avec du pamplemousse ou du jus de pamplemousse n'est pas recommandée, car la biodisponibilité peut être augmentée chez certains patients, ce qui peut entraner une augmentation des effets hypotenseurs. Chez l'animal, une fibrillation ventriculaire et un collapsus cardiovasculaire létaux ont été observés en association avec une hyperkaliémie après l'administration de vérapamil et de dantrolène IV. Compte tenu du risque d'hyperkaliémie, il est recommandé d'éviter l'administration concomitante d'inhibiteurs calciques comme l'amlodipine chez les patients susceptibles de présenter une hyperthermie maligne et dans la prise en charge de l'hyperthermie maligne. Effets de l'amlodipine sur d'autres médicaments Les effets hypotenseurs de l'amlodipine s'ajoutent à ceux d'autres médicaments présentant des propriétés antihypertensives. L'administration concomitante de doses répétées de 10 mg d'amlodipine avec 80 mg de simvastatine entrane une augmentation de 77% de l'exposition à la simvastatine par rapport à la simvastatine seule. La dose quotidienne de simvastatine doit être limitée à 20 mg chez les patients traités par amlodipine. Grossesse Chez la femme, la sécurité d'emploi de l'amlodipine au cours de la grossesse n'a pas été établie. Dans les études chez l'animal, une reprotoxicité a été observée à doses élevées (voir rubrique 5. 3). L'utilisation au cours de la grossesse n'est recommandée que si aucune alternative plus sûre n'est disponible et lorsque la maladie elle-même présente des risques plus importants pour la mère et le fœtus. Allaitement L'amlodipine est excrétée dans le lait maternel. La proportion de dose maternelle reçue par le nourrisson a été estimée à un intervalle interquartile de 3 à 7 %, avec un maximum de 15 %. L'effet de l'amlodipine sur les nourrissons est inconnu. La décision de poursuivre ou d'interrompre l'allaitement ou de poursuivre ou d'interrompre le traitement par l'amlodipine doit être prise en tenant compte du bénéfice de l'allaitement pour l'enfant et du bénéfice du traitement par l'amlodipine pour la mère. Fertilité Des modifications biochimiques réversibles au niveau de la tête des spermatozoïdes ont été rapportées chez certains patients traités par des inhibiteurs calciques. Les données cliniques sont insuffisantes concernant l'effet potentiel de l'amlodipine sur la fertilité. Dans une étude menée chez le rat, des effets indésirables ont été détectés sur la fertilité des mâles (voir rubrique 5. 3). Résumé du profil de sécurité Les effets indésirables les plus fréquemment rapportés en cours de traitement sont des somnolences, des sensations vertigineuses, des céphalées, des palpitations, des bouffées vasomotrices, des douleurs abdominales, des nausées, des œdèmes des chevilles, des œdèmes et de la fatigue. Liste des effets indésirables Les effets indésirables suivants ont été observés et rapportés au cours du traitement par l'amlodipine selon les fréquences suivantes : très fréquent ( 1/10) ; fréquent ( 1/100 à < 1/10) ; peu fréquent ( 1/1 000 à 1/100) ; rare ( 1/10 000 à 1/1 000) ; très rare (1/10 000) ; fréquence indéterminée (ne peut être estimée sur la base des données disponibles). Dans chaque groupe de fréquence, les effets indésirables sont présentés par ordre de sévérité décroissante. * Évoquant généralement une choléstase Des cas exceptionnels de syndrome extrapyramidal ont été rapportés. Déclaration des effets indésirables suspectés La déclaration des effets indésirables suspectés après autorisation du médicament est importante. Elle permet une surveillance continue du rapport bénéfice/risque du médicament. Les professionnels de santé déclarent tout effet indésirable suspecté via le système national de déclaration : Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé (ANSM) et réseau des Centres Régionaux de Pharmacovigilance - Site internet : . Chez l'homme, l'expérience d'un surdosage intentionnel est limitée. Symptômes Les données disponibles suggèrent qu'un surdosage important peut entraner une vasodilatation périphérique excessive et éventuellement une tachycardie réflexe. Une hypotension systémique marquée et probablement prolongée pouvant atteindre un choc avec issue fatale a été rapportée. Traitement Une hypotension cliniquement significative due à un surdosage à l'amlodipine nécessite un soutien cardiovasculaire actif comprenant une surveillance fréquente de la fonction respiratoire et cardiaque, une élévation des membres et une prise en charge de la volémie et du débit urinaire. Un vasoconstricteur peut être utile pour restaurer le tonus vasculaire et la pression artérielle, à la condition qu'il n'existe aucune contre-indication à son emploi. L'administration intraveineuse de gluconate de calcium peut être bénéfique pour inverser les effets de l'inhibition des canaux calciques. Un lavage gastrique peut être justifié dans certains cas. Chez des volontaires sains, l'utilisation de charbon jusqu'à deux heures après l'administration d'amlodipine 10 mg a montré une réduction des taux d'absorption de l'amlodipine. Dans la mesure o l'amlodipine est fortement liée aux protéines, une dialyse n'apportera probablement aucun bénéfice. L'amlodipine est un inhibiteur de l'influx d'ions calcium du groupe de la dihydropyridine (inhibiteur des canaux lents ou antagoniste des ions calcium) et de l'influx transmembranaire des ions calcium dans le muscle cardiaque et les muscles lisses vasculaires. Le mécanisme de l'effet antihypertenseur de l'amlodipine est lié à un effet relaxant direct au niveau du muscle lisse vasculaire. Le mécanisme précis par lequel l'amlodipine soulage l'angor n'a pas été entièrement déterminé, mais l'amlodipine réduit la charge ischémique totale par les deux actions suivantes : 1) L'amlodipine dilate les artérioles périphériques et par conséquent réduit la résistance périphérique totale (postcharge) contre laquelle le cœur agit. Dans la mesure o la fréquence cardiaque reste stable, cette réduction du travail du cœur diminue la consommation d'énergie myocardique et les besoins en oxygène. 2) Le mécanisme d'action de l'amlodipine comporte aussi probablement la dilatation des principales artères coronaires et artérioles coronaires, dans les régions normales et ischémiques. Cette dilatation augmente la délivrance d'oxygène au myocarde chez les patients présentant un spasme des artères coronaires (angor de Prinzmetal). Chez les patients hypertendus, l'administration en une prise unique journalière apporte des réductions cliniquement significatives de la pression artérielle à la fois en décubitus dorsal et en position debout pendant un intervalle de 24 heures. Grâce au délai d'action lent, une hypotension aigu n'est pas associée à l'administration d'amlodipine. Chez les patients atteints d'angor, l'administration en une prise unique journalière d'amlodipine augmente la durée totale de l'effort, le délai d'apparition de l'angor et d'un sous-décalage du segment ST de 1 mm, et elle diminue à la fois la fréquence des crises d'angor et la consommation de comprimés de trinitrate de glycéryle. L'amlodipine n'a pas été associée à des effets métaboliques indésirables ou des changements des lipides plasmatiques, et convient aux patients atteints d'asthme, de diabète et de goutte. L'efficacité de l'amlodipine pour la prévention des événements cliniques chez les patients atteints de coronaropathies a été évaluée au cours d'une étude indépendante, multicentrique, randomisée, en double aveugle et contrôlée versus placebo menée chez 1 997 patients : l'étude CAMELOT (Comparison of Amlodipine vs Enalapril to Limit Occurrences of Thrombosis, comparaison de l'amlodipine et de l'énalapril dans la limitation des épisodes de thrombose). Parmi ces patients, 663 ont été traités par de l'amlodipine 5-10 mg, 673 ont été traités par de l'énalapril 10-20 mg, et 655 par placebo, en complément d'un traitement standard par les statines, les bêtabloquants, les diurétiques et l'aspirine pendant deux ans. Les principaux résultats d'efficacité sont présentés dans le Tableau 1. Les résultats indiquent que le traitement par l'amlodipine a été associé à un nombre moins important d'hospitalisations pour angor et de procédures de revascularisation chez les patients atteints de coronaropathies. Des études hémodynamiques et des études contrôlées basées sur des épreuves d'effort menées chez des patients atteints d'insuffisance cardiaque de classes NYHA II-IV ont montré que l'amlodipine n'entranait aucune détérioration clinique de la tolérance à l'effort, de la fraction d'éjection ventriculaire gauche et de la symptomatologie clinique. Une étude contrôlée placebo (PRAISE) conçue pour évaluer des patients atteints d'insuffisance cardiaque de classes NYHA III-IV recevant de la digoxine, des diurétiques et des inhibiteurs de l'ECA a montré que l'amlodipine n'entranait pas d'augmentation du risque de mortalité ou de mortalité et de morbidité combinées avec l'insuffisance cardiaque. Dans une étude de suivi à long terme contrôlée placebo (PRAISE-2) sur l'amlodipine chez des patients atteints d'insuffisance cardiaque de classes NYHA III et IV sans symptômes cliniques ni résultats objectifs suggérant ou sous-jacents à une maladie ischémique, traités par des doses stables d'inhibiteurs de l'ECA, de digitaliques et de diurétiques, l'amlodipine n'a eu aucun effet sur la mortalité cardiovasculaire totale. Dans cette même population, l'amlodipine a été associé à une augmentation des notifications d'œdème pulmonaire. L'étude ALLHAT (Antihypertensive and Lipid-Lowering Treatment to Prevent Heart Attack Trial, Étude sur le traitement antihypertenseur et hypolipémiant préventif des crises cardiaques), randomisée, en double aveugle, portant sur la morbidité et la mortalité a été réalisée pour comparer des traitements récents : amlodipine 2, 5 à 10 mg/jour (inhibiteur calcique) ou lisinopril 10 à 40 mg/jour (inhibiteur de l'ECA) comme traitement de première ligne par rapport à un diurétique thiazidique, la chlortalidone à la dose de 12, 5 à 25 mg/jour dans l'hypertension légère à modérée. Au total, 33 357 patients hypertendus âgés de 55 ans ou plus ont été randomisés et suivis pendant une moyenne de 4, 9 ans. Les patients présentaient au moins un facteur de risque de coronaropathie supplémentaire, notamment : antécédents d'infarctus du myocarde ou d'accident vasculaire cérébral (plus de six mois avant l'inclusion) ou documentation d'autres maladies cardiovasculaires athéroscléreuses (au total 51, 5 %), diabète de type 2 (36, 1 %), cholestérol HDL < 35 mg/dl (11, 6 %), hypertrophie ventriculaire gauche diagnostiquée par électrocardiographie ou échocardiographie (20, 9 %), tabagisme actuel (21, 9 %). Le critère d'évaluation principal composite a regroupé les coronaropathies fatales ou l'infarctus du myocarde non fatal. Il n'a été observé aucune différence significative au niveau du critère principal entre le traitement à base d'amlodipine et le traitement à base de chlortalidone : RR : 0, 98 ; IC à 95 % (0, 90 à 1, 07) ; p 0, 65. Parmi les critères secondaires, l'incidence de l'insuffisance cardiaque (élément d'un critère cardiovasculaire composite) a été significativement supérieure dans le groupe de l'amlodipine par rapport au groupe de la chlortalidone (10, 2 % 7, 7 % ; RR : 1, 38 ; IC à 95 % [1, 25 à 1, 52] ; p < 0, 001). Cependant, il n'a été observé aucune différence significative dans la mortalité de toute cause entre le traitement à base d'amlodipine et le traitement à base de chlortalidone : RR : 0, 96 ; IC à 95 % [0, 89 à 1, 02] ; p 0, 20. Dans une étude portant sur 268 enfants âgés de 6 à 17 ans présentant une hypertension secondaire prédominante, une dose de 2, 5 mg et une dose de 5, 0 mg d'amlodipine ont été comparées à un placebo. Il est apparu que les deux doses réduisaient la pression artérielle systolique de manière significativement plus importante qu'un placebo. La différence entre les deux doses n'a pas été statistiquement significative. Les effets à long terme de l'amlodipine sur la croissance, la puberté et le développement général n'ont pas été étudiés. L'efficacité à long terme de l'amlodipine d'un traitement chez l'enfant destiné à réduire la morbidité et la mortalité cardiovasculaire à l'âge adulte n'a pas été établie. Après une administration orale de doses thérapeutiques, l'amlodipine a été bien absorbée avec des concentrations plasmatiques maximales intervenant 6 à 12 heures après dose. La biodisponibilité absolue a été estimée entre 64 et 80 %. Le volume de distribution est approximativement de 21 L/kg. Des études ont montré qu'environ 97, 5 % de l'amlodipine circulante étaient liés aux protéines plasmatiques. La biodisponibilité de l'amlodipine n'est pas affectée par la prise d'aliments. Biotransformation / élimination La demi-vie d'élimination plasmatique terminale est d'environ 35 à 50 heures, et compatible avec une administration en une prise unique journalière. L'amlodipine est intensément métabolisée par le foie en métabolites inactifs, 10 % de la molécule mère et 60 % de métabolites étant excrétés dans l'urine. Insuffisance hépatique Des données cliniques très limitées sont disponibles concernant l'administration d'amlodipine chez les patients présentant une insuffisance hépatique. Les patients atteints d'insuffisance hépatique ont une clairance de l'amlodipine diminuée résultant d'une demi-vie plus longue et d'une augmentation de l'ASC d'environ 40-60%. Patients âgés Le délai pour atteindre les concentrations plasmatiques maximales de l'amlodipine est similaire chez les sujets âgés et plus jeunes. La clairance de l'amlodipine a tendance à diminuer avec pour conséquence une augmentation de l'ASC et de la demi-vie d'élimination chez les patients âgés. L'augmentation de l'ASC et de la demi-vie d'élimination chez les patients atteints d'insuffisance cardiaque congestive a été conforme aux attentes dans la tranche d'âge des patients étudiés. Population pédiatrique Une étude pharmacocinétique de population a été menée chez 74 enfants hypertendus âgés de 1 à 17 ans (34 patients étant âgés de 6 à 12 ans et 28 patients de 13 à 17 ans), traités par une posologie d'amlodipine comprise entre 1, 25 et 20 mg administrée une fois ou deux fois par jour. Chez les enfants âgés de 6 à 12 ans et chez les adolescents âgés de 13 à 17 ans, la clairance orale typique (CL/F) a été respectivement de 22, 5 et 27, 4 L/h chez les garçons et de 16, 4 et 21, 3 L/h chez les filles. Une large variabilité de l'exposition entre les individus a été observée. Les données disponibles chez les enfants âgés de moins de 6 ans sont limitées. Les études de reprotoxicité chez le rat et la souris ont montré un retard de la mise bas, une durée prolongée du travail et une diminution de la survie de la descendance à des doses environ 50 fois supérieures à la dose maximale recommandée chez l'homme sur une base en mg/kg. Il n'a été observé aucun effet sur la fertilité chez des rats traités par l'amlodipine (mâles pendant 64 jours et femelles pendant 14 jours avant l'accouplement) à des doses ayant atteint 10 mg/kg/jour (huit fois* la dose maximale recommandée chez l'homme de 10 mg sur une base en mg/m ). Dans une autre étude menée chez le rat dans laquelle les rats mâles ont été traités par du bésilate d'amlodipine pendant 30 jours à une dose comparable à la dose administrée chez l'homme sur une base en mg/kg, on a trouvé une diminution des taux plasmatiques de l'hormone folliculo-stimulante et de la testostérone ainsi qu'une diminution de la densité du sperme et du nombre de spermatides matures et de cellules de Sertoli. Des rats et des souris traités par l'amlodipine dans l'alimentation pendant deux ans, à des concentrations calculées pour délivrer des posologies quotidiennes de 0, 5 ; 1, 25 et 2, 5 mg/kg/jour, n'ont montré aucun signe de cancérogénicité. La dose maximale (pour la souris similaire et pour les rats deux fois* la dose clinique maximale recommandée de 10 mg sur une base en mg/m ) a été proche de la dose maximale tolérée pour la souris mais non pour le rat. Des études de mutagénicité n'ont révélé aucun effet lié au médicament que ce soit au niveau génique ou chromosomique. Sur la base d'un patient pesant 50 kg. : gélatine, dioxyde de titane (E171), jaune de quinoléine (E104), laurilsulfate de sodium. 42 mois. 30, 90 ou 100 gélules sous plaquettes (PVDC/PVC/Aluminium). Toutes les présentations peuvent ne pas être commercialisées. ZAC LES HAUTES PATURES PARC D'ACTIVITÉ DES PEUPLIERS 25 RUE DES PEUPLIERS 34009 379 156 8 7 : 30 gélules sous plaquettes (PVDC/PVC/Aluminium). 34009 379 157 4 8 : 90 gélules sous plaquettes (PVDC/PVC/Aluminium). 34009 570 664 4 4 : 100 gélules sous plaquettes (PVDC/PVC/Aluminium). Sans objet. Liste I.	BDPM	Medicinal
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La fonction contenante : un double ancrage corporel et relationnel Fiona Vogel To cite this version : Fiona Vogel. La fonction contenante : un double ancrage corporel et relationnel. Médecine humaine et pathologie. 2015. dumas-01195826 HAL Id : dumas-01195826 Submitted on 8 Sep 2015 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. UNIVERSITE de BORDEAUX Collège Sciences de la Santé Institut de Formation en Psychomotricité Mémoire en vue de l'obtention du diplôme d'état de psychomotricien LA FONCTION CONTENANTE Un double ancrage corporel et relationnel Avril 2015 VOGEL Fiona Née le 28 Janvier 1990 à Asnières sur Seine Directeur de mémoire : Mme Legourrierec Corine REMERCIEMENTS Je tiens à remercier toutes les personnes qui ont motivé mon orientation sur la voie de la psychomotricité et celles qui m'ont guidées tout au long de cette formation. Je remercie aussi tous les professionnels qui m'ont accueilli en stage, pour leur disponibilité et le partage enrichissant de leurs pratiques. Enfin, je tiens particulièrement à remercier Corine Legourrierec, ma directrice de mémoire et matre de stage, qui a su m'accompagner et me conseiller tout au long de mes réflexions et de mon travail d'écriture. 2 PRECAUTIONS DE LECTURE Au cours de cet écrit, j'ai été amenée à évoquer la relation entre le nourrisson et son entourage maternant. Il m'est arrivé, comme il est parfois d'usage, d'utiliser abusivement le terme de mère comme raccourcit pour parler de cet entourage. Soyez assurés que, loin de chercher à faire porter tous les enjeux à la seule mère, je ne minimise pas un instant, l'importance des autres personnes assurant des soins à l'enfant, notamment celle du père. Le terme de mère devra donc, dans l'écrit qui suit, être compris comme synonyme de la fonction maternante et des adultes assurant cette fonction. 3 SOMMAIRE I. Introduction 1. Questions préliminaires et choix du sujet 2. Définition du concept de contenance 3. Conclusion et annonce du plan II. Genèse de la fonction contenante dans le développement psychomoteur Embryogénèse La vie intra-utérine La naissance Le sentiment d'enveloppe L'enveloppe tonique L'apport de Winnicott 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Bion, la fonction alpha () 8. Anzieu, le Moi-Peau 9. L'enveloppe visuelle 10. L'enveloppe sonore 11. Conclusion sur l'enveloppe relationnelle primaire III. Pathologies en lien avec un défaut de contenance 1. Réflexions sur l'origine du déficit de la fonction contenante 2. Angoisses liées au défaut de contenance 3. Systèmes palliatifs de la contenance IV. Constituer un projet thérapeutique contenant en psychomotricité 1. Annonce de la problématique et des hypothèses de travail 2. 3. 4. 5. 6. 7. Clinique L'image du corps La médiation L'enveloppe institutionnelle Le cadre thérapeutique La fonction contenante du thérapeute V. Conclusion générale BIBLIOGRAPHIE TABLE DES MATIERES 5 5 7 12 13 13 19 21 23 25 28 33 37 41 45 48 53 53 55 56 59 59 61 64 67 68 70 73 89 91 93 4 I. INTRODUCTION 1. Questions préliminaires et choix du sujet En début de 3ème année, j'ai effectué un stage d'un mois au sein d'un hôpital de jour pour enfant. Cette structure accueille des enfants présentant des troubles importants de la personnalité, autrefois déclinés en psychoses infantiles d'un côté et autisme de l'autre, aujourd'hui réunis sous le terme de Troubles du Spectre Autistique (TSA). Mes lectures concernant ces troubles ainsi que mes premières observations m'ont amené à les considérer comme des pathologies de l'enveloppe. Lemay les décris comme une incapacité pour un être humain de s'organiser sur un mode unitaire afin de se reconnatre progressivement dans son identité, de matriser son angoisse et de communiquer avec l'espace, les objets et les personnes qui l'environnent. 1 Or ce qui permet à l'individu de se ressentir, se percevoir et se vivre comme un tout unifié, contenu et différent des autres, c'est l'émergence progressive d'un sentiment d'enveloppe. Cette construction dynamique dépend de multiples facteurs ; environnementaux, toniques, sensoriels, relationnels, affectifs, cognitifs et même neurologiques. L'enveloppe constitue alors un contenant permettant d'accueillir un contenu. C'est une limite entre le dedans et le dehors mais aussi une interface permettant l'échange avec le monde extérieur. Chez les enfants atteints de TSA, le sentiment d'enveloppe corporelle est déficient. Cela engendre des sensations corporelles spécifiques et des angoisses énormes que l'enfant tente de combattre. A l'hôpital de jour, les enfants sont accueillis sur des demi-journées voire des journées entières. Leurs emplois du temps se répartissent entre les prises en soin individuelles ou de groupe, en psychomotricité et psychothérapie et les dits ateliers thérapeutiques encadrés par les infirmières et éducateurs du service. Entre ces différents temps thérapeutiques à proprement parler, les enfants peuvent jouer sur le lieu de vie . Il s'agit d'une salle spacieuse et plutôt bien aménagée, pourtant je suis rapidement amenée à m'interroger à son propos. Ma première expérience sur le lieu de vie, m'a en effet laissé un sentiment de chaos, d'éparpillement, de tourbillonnement assez fort. La porte de la salle s'ouvre de façon brusque 1 M. Lemay, site sospsychomotricite. com 5 et imprévisible, nous faisant sursauter, à moins que des cris et le bruit des pas qui courent dans le couloir ne nous permettent d'anticiper le choc, si nous ne sommes pas trop absorbés par notre activité. Des enfants entrent et sortent de façon discontinue de la salle, les différents ateliers n'ayant pas la même durée. Un enfant peut être seul, au calme avec un adulte dans la salle et l'instant d'après son espace peut se trouver envahis par un grand nombre de camarades surexcités. Je n'arrive à percevoir aucune logique, aucune régularité qui permette un sentiment de sécurité suffisant. Ce vécu m'a alors amené à me questionner sur la façon dont la structure de soin, son aménagement physique, son organisation dans l'articulation des différents temps, notamment la gestion des transitions, peuvent être pensés par l'équipe pour que s'installe une cohérence, une continuité, une contenance qui rende vraiment le soin efficace. Au cours de cette 3ème année toujours, j'ai effectué un stage de 6 mois en CAMSP (Centre d'Action Médico-Sociale Précoce). Cette structure de soin accueille, en ambulatoire cette fois, des enfants présentant des troubles variés, jusqu'à l'âge de 6 ans. Lors de ce stage, j'ai participé à la prise en soin d'enfants présentant des dépressions infantiles précoces, des instabilités psychomotrices, des handicaps sensoriels J'ai rapidement remarqué que mes questionnements autour de la contenance étaient toujours d'actualité. Le travail que je vous présente ici, tente de faire la synthèse de ces réflexions et se veut un support pour ma future pratique. 6 2. Définition du concept de contenance Le terme contenance fait partie de la culture soignante contemporaine. 2 En effet, sur mes lieux de stage, la contenance est dénommée comme un objectif clair de prise en soin et j'ai pu entendre différentes allusions à cette fonction ; cet enfant a besoin d'être contenu , il n'a pas construit d'enveloppe Pourtant il n'y a pas de consensus sur sa définition et les notions théoriques qui en sont le fondement. Ainsi la contenance n'apparait pas dans le dictionnaire de Laplanche et Pontalis édité en 1967. Chacun y met donc ses propres représentations en fonction de ses références théoriques, de ses pratiques et de son expérience personnelle. Pourtant, si nous nous attachons à mettre du sens, nous remarquons rapidement que la contenance recouvre des notions déjà fortement éprouvées. Selon le site du CNRTL3, le verbe contenir signifie tenir dans certaines limites . Ces limites sont : Soit d'ordre spatial et signifie avoir une capacité de (une bouteille contient 1, 5 L) ou alors comprendre en soi, renfermer (Ce coffret contient cinq pions). matrise des sentiments et de leurs manifestations extérieures : Soit d'ordre social, moral ou affectif. Dans ce second cas il est synonyme de provenant d'autrui ( Le proviseur (. ) affolé, contenant avec peine vingt horribles marmots hurlant. 4) ou de soi-même ( La tâche de la volonté n'est pas de suspendre ou d'achever une impulsion, mais au plus de se superposer de son mieux à un réflexe étranger à son empire ; elle peut parfois le freiner et le contenir 5). Cette première définition générale du terme introduit la notion de limites. 2 Y. Milleur, La contenance comme processus psychique, revue Soins psychiatrie, n295, p12 3 Centre National des Ressources Lexicales, crée en 2006 par le CNRS 4 Benoit, L'atlantide, 1919, p145 5 Ricoeur, Philosophie de la volonté, 1949, p102 7 a) La notion de limites : Elles effectuent une séparation entre deux milieux, entre l'intérieur et l'extérieur. L'ensemble de ces limites constitue un contenant, un réceptacle capable d'accueillir un objet. Au niveau anatomique, la limite est appelée membrane ou enveloppe. On retrouve donc les enveloppes jusqu'au plus petit étage de la vie et leurs fonctions sont fondamentales. Elles sont véritablement fondatrices du sujet ; lui permettent de se reconnaitre comme un tout unifié et différent des autres. Elles lui permettent de développer une sécurité en soutenant le sentiment de continuité d'exister et en effectuant une pare-excitation vis-à-vis des stimulations internes ou externes. Nous verrons que, dans un premier temps, le sentiment d'enveloppe se construit sur des bases biologiques et sur les sensations du corps propre, particulièrement les sensations cutanées. Il permet de prendre conscience des limites corporelles, de localiser et unifier les sens, et de différencier les stimulations internes et externes. A ce sujet nous aborderons notamment l'enveloppe utérine et le concept de holding de D. W. Winnicott. Il aboutit à la création d'une enveloppe psychique, contenant les contenus de pensée. Comme l'illustre D. Anzieu à l'aide du Moi-peau, cette fonction psychique suivra le même modèle de développement que l'enveloppe corporelle. Ce sentiment d'enveloppe tendra de plus en plus à s'appuyer sur des mécanismes non physiques, comme la relation, le cadre ou même les lois. Cette réflexion nous amène maintenant à penser la nature de l'objet à contenir, il s'agit du contenu. b) La question du contenu : Dans le langage courant, on cherche à contenir ses émotions et leurs conséquences motrices. La contenance qualifierait donc la façon qu'a un individu de se tenir face à un évènement déstabilisant. Ainsi faire bonne contenance signifie ne pas se montrer affecté, irrité, découragé face à un évènement déstabilisant, inattendu et désagréable. Dans le domaine du soin psychologique et psychiatrique, on évoquera la notion d'une angoisse qui submergerait le sujet et devrait absolument s'écouler, principalement sous forme motrice ; auto ou hétéro-agressivité, effondrements toniques, hypertonie, hyperactivité, 8 logorrhée, stéréotypies . mais aussi difficultés de concentration, troubles de la mémoire Ces symptômes, aussi variés qu'il y a d'individus, sont à penser comme une tentative d'expression de cette angoisse, issue de l'impossibilité à mettre en sens ses sensations, ses émotions et ses cognitions, de les mettre à contenir, afin de pouvoir les exprimer de façon symbolisée. Donc on pensera plus largement que ce contenu comprend tout ce qui est produit par la personne à partir de son environnement ; ses sensations, perceptions, affects, cognitions et représentations. Or comme nous l'avons évoqué, tout ne peut être contenu. Par moments un sentiment peut nous déborder, nous pouvons inconsciemment occulter ou modifier certains souvenirs Pour M. F. Livoir-Petersen, des comportements visant à maintenir la continuité de soi se retrouvent sous des formes mineures ou passagères chez nous tous. 6 Chez certains l'épisode est donc transitoire, chez d'autres, c'est un mode systématique, structurel, de fonctionnement. Il est donc important de se demander si l'objet est contenable, c'est-à-dire s'il peut être contenu. Cela est bien sûr éminemment dépendant de sa nature. Quel objet peut être contenu ? Bion nous donne sa réponse en distinguant les éléments béta, ces éléments bruts, non pensables par la psyché donc non contenables et les éléments alpha, pour leur part contenables. La différence entre les deux résulte d'un véritable travail de transformation. c) Les processus de mise à contenir : Pour Bion cette transformation est assurée par la fonction alpha dont nous reparlerons. Kas développe à partir des travaux de Bion, une vision de la fonction contenante qui associerait deux aspects : le contenant : réceptacle passif le conteneur : aspect actif qui correspondrait à la fonction alpha développée par Bion Gibello quand à lui, défend l'idée qu' un contenu de pensée est insensé, insignifiant, tant qu'il n'a pas été transformé ou traité par un ou plusieurs contenants de pensée 7. C'est 6 M-F. Livoir-Petersen, L'approche sensori-tonique et la question du morcellement, in thérapie psychomotrice et recherches, n162, 2010 7 Gibello, Les contenants de pensée et la psychopathologie, in Anzieu et col. Emergence et troubles de la pensée, Dunod, 1994, p20, 9 donc selon lui le contenant de pensée lui-même qui joue ce rôle de transformation d'éléments non pensables en éléments pensables. Je me demande alors, si c'est la mise en contenant qui donne sens à l'objet ou s'il faut que l'objet soit psychisé pour permettre sa mise à contenir ? La contenance doit en fait être pensée de façon complexe. Elle s'apparente à un véritable système auto-organisé et autorégulé o les éléments seraient en interaction les uns avec les autres. Ainsi mise en sens et mise à contenir sont les phénomènes conjoints d'une même fonction : la fonction contenante ou fonction à contenir. Pour plus de lisibilité, le système de la contenance peut tout de même être segmenté en terme de : Structures : les enveloppes, la partie stable du système, mais qui, par leurs qualités, permettent des : Mouvements ou transformations, qui prennent différents noms selon les auteurs ; fonction alpha chez Bion, fonction conteneur chez Kas, fonction des contenants de pensée chez Gibello Objets : éléments bruts dits béta et éléments pensables dits alpha La contenance rend donc pensable, maitrisable, mobilisable ce qui nous affecte. C'est un travail actif qui se réactualise à chaque rencontre avec un objet. Or cette capacité de transformation n'est pas innée. Chez le bébé, la fonction contenante est immature et va d'abord fonctionner par procuration sur la fonction contenante de la mère pour ensuite s'autonomiser par introjection de la fonction contenante de la mère. Par exemple, chez le nouveau-né, la faim est ressentie comme une douleur éminemment angoissante, puisque non localisable et non pensable. Elle entraine une réaction tonique globale, des pleurs intenses, une désorganisation massive. Peu à peu, aidé par sa mère, l'enfant localise cette sensation dans son ventre, y met du sens ; l'associe à la faim et peut anticiper qu'en mangeant cette douleur sera apaisée. 10 La fonction à contenir s'appuie sur un travail psychique permettant de transformer des tensions en éléments éprouvés dans et par des processus intersubjectifs, groupaux, vivants. L'état des enveloppes psychiques traduit le résultat dynamique de ce travail. 8 8 Mellier, La fonction à contenir, objet, processus, dispositif et cadre institutionnel, in La psychiatrie de l'enfant, volume 48, 2005, Presse universitaire de France, page 11 11 3. Conclusion et annonce du plan Finalement, on peut en conclure que le concept de contenance a toujours été présent dans la clinique analytique. 9 Il correspond à la capacité propre à chaque individu, de contenir ses propres contenus de pensée. Cette capacité demande une construction active qui s'origine dans les éprouvés corporels, résulte d'un véritable processus de mise en sens et s'appuie sur les différentes qualités des enveloppes : étanchéité mais aussi perméabilité sélective et adaptabilité. Nous allons donc nous attacher à décrire et expliquer ces processus à l'œuvre dans l'émergence de la capacité à contenir de l'individu, ce qui nous servira de support pour envisager, dans les cas de défaillance de cette fonction autonome, l'apport thérapeutique possible en psychomotricité sur ce sujet, basé principalement sur la propre capacité à contenir du psychomotricien. Pour Mellier, la fonction à contenir du thérapeute pourra alors se définir comme la position psychique à adopter et à mettre en œuvre sur le terrain, dans l'intersubjectivité, pour recevoir et transformer des souffrances très primitives. 10 Il apparait également important de faire la différence entre contenance et contention. Si un consensus généraliste place la contention du coté physique et la contenance du coté psychique, cette distinction n'apparait pas vraiment satisfaisante. En effet comme vaguement évoqué déjà, et comme nous le développerons plus loin, la contenance se base sur des mécanismes physiques, corporels, sensoriels. Ainsi, nous penserons plutôt la contention comme relevant d'un dispositif mis en place par l'individu ou par un tiers pour pallier à un défaut de la fonction à contenir propre de l'individu. Alors, la contention peut être envisagée comme une première réponse, immédiate, de crise, à ce défaut de contenance mais notre objectif thérapeutique à long terme sera l'instauration d'une fonction à contenir propre au sujet. 9 Ducret, La contenance, histoire d'un concept, in Chapelier et Roffat, Groupe, contenance et créativité, p 35, Eres 10 Mellier, La fonction à contenir, objet, processus, dispositif et cadre institutionnel, in La psychiatrie de l'enfant, volume 48, 2005, Presse universitaire de France, page 1 12 II. GENESE DE LA FONCTION CONTENANTE DANS LE DEVELOPPEMENT PSYCHOMOTEUR 1. Embryogénèse Il s'agit uniquement ici de rappeler certaines étapes primordiales du développement embryologique, qui vont mettre en lumière les toutes premières enveloppes nécessaires au développement de la vie, ainsi que la forme physique du corps et son enveloppe externe la peau. A partir de la fécondation, c'est-à-dire de la fusion du gamète mâle et du gamète femelle, il y a prolifération de cellules filles. Ces cellules seront à l'origine d'un être humain complet et également des structures annexes qui permettrons le développement de l'embryon jusqu'à la naissance. A l'origine, ces cellules filles sont totipotentes. Leurs différenciations successives sont notamment en lien avec leur place physique. a) La 1ère semaine de développement : Au stade de 8 cellules filles a lieu la compaction. Les cellules périphériques s'aplatissent et forment le trophoblaste qui participera à la formation du placenta. Les cellules centrales forment le bouton embryonnaire à l'origine de l'embryon et des annexes amniotiques. Le bouton embryonnaire est contenu dans le trophoblaste, au sein duquel se creuse également une cavité ; le blastocœle, qui deviendra plus tard cavité vitelline. b) La 2nde semaine de développement : Le trophoblaste forme donc une première membrane autour du bouton embryonnaire. Il est à l'origine du phénomène de nidation ; les sélectines exprimées à sa surface reconnaissent les résidus glucidiques de l'endomètre utérin, ce qui engendre un accolement à la muqueuse utérine, une digestion partielle de cette dernière et finalement une inclusion totale de l'œuf. 13 La partie la plus périphérique du trophoblaste se différencie à nouveau pour devenir syncisiotrophoblaste, dans lequel apparaissent des lacunes qui vont confluer avec les vaisseaux sanguins maternels et permettre la mise en place d'une circulation placentaire dès le 12ème jour de gestation. Le bouton embryonnaire se différencie en disque didermique. La partie en contact avec le trophoblaste forme l'épiblaste (ou ectoblaste) et celle en regard de la cavité forme l'endoderme primitif (ou entoblaste). Cette différenciation soutien la mise en place d'une première orientation de l'embryon, en dorsal (du coté de l'épiblaste) et ventral (du côté de l'endoderme). Parallèlement d'autres enveloppes vont se développer. La cavité amniotique se creuse du côté de l'épiblaste. Enfin, une troisième cavité se forme autour des cavités amniotique et vitelline par prolifération de l'épiblaste caudal, c'est la cavité choriale. L'amnios sert à retenir le liquide amniotique dans lequel baigne l'embryon. Il le protège des traumatismes et assure sa mobilité. Le placenta est d'origine fœto-maternelle, il provient de la fusion partielle de l'endomètre et du chorion. Il assure un rôle de : Barriere de protection contre les agresseurs extérieurs comme les microbes. Il est à noter que malgré tout, certains agents peuvent traverser la barrière placentaire ; toxoplasme, syphilis, rubéole et contaminer le fœtus. Le tabac, l'alcool et la drogue traversent également le placenta. Communication et d'échanges d'éléments avec le sang maternel : Oxygénation et nutrition Elimination des toxines (gaz carbonique, urine) car les reins et le foie ne sont pas encore matures. Philtre des échanges. Il est programmé pour doser les échanges et nourrir le bébé en fonction de ses besoins. Sécrétion d'hormones nécessaires au bon déroulement de la grossesse et au développement du bébé. Bouclier immunologique : les anticorps maternels le traversent et assurent la protection de l'enfant jusqu'à ses 6 premiers mois de vie. 14 Figure 1 : Apprentoile, université de Bordeaux, cours d'Embryologie générale et Fœtopathologie, D. Carles (Laboratoire de Fœtopathologie - Université Victor Segalen Bordeaux 2 - France) et R. Darboux (MEPS - Faculté des Sciences de la Santé - Cotonou - Bénin) c) La 3ème semaine de développement : Il y a maintenant formation d'un troisième feuillet qui s'interpose entre les 2 premiers, par un phénomène d'invagination des cellules épiblastiques sur la ligne médiane dans le sens caudo-céphalique, sauf en 2 points ; la membrane cloacale (futurs orifices uro-génital et anal) et la membrane pharyngée (future bouche). L'embryon est maintenant composé de 3 feuillets : Epiblaste qui devient ectoderme Mésoblaste Endoderme Ce phénomène, appelé gastrulation, permet la mise en place de l'axe céphalo-caudal de l'embryon et donc également une orientation droite/gauche. 15 d) La 4ème semaine de développement : Lors de la neurulation primaire, l'ectoderme : Médian devient tube neural à l'origine du Système Nerveux Central Latéral devient crêtes neurales à l'origine du Système Nerveux Périphérique Le reste se différencie en : Epiderme et annexes (poils, glandes, hypophyse et glande mammaire) Organes sensoriels (placodes optiques, auditives et olfactives) Il est intéressant de noter l'origine commune du système nerveux, de la peau et des autres organes sensoriels. Il existe donc de manière très précoce une relation entre les fibres nerveuses et les cellules cutanées, qui demeurera tout au long de la vie de l'individu Le mésoderme donnera les os, les muscles et viscères. L'endoderme donnera les muqueuses digestives et respiratoires. L'embryon commence à posséder une certaine organisation, mais il reste un élément plat. Cette formation primitive va évoluer grâce à différents processus cellulaires : plicatures et rotations des membres. Mouvements de plicatures de l'embryon : le disque embryonnaire va passer de la forme plane à celle d'un volume grâce à un double enroulement : Transversal : les parties latérales de l'ectoderme se replient et se rejoignent sur la ligne médio-ventrale refermant en profondeur l'endoderme en tube intestinal. Ce phénomène transforme un espace initialement externe en espace interne. Il crée donc un tube creux à l'intérieur du corps et le perfore en 2 endroits ; la bouche et l'anus. Ce phénomène étale également l'ectoderme superficiel tout autour de l'embryon, désormais délimité par une même structure sur toute sa surface ; la peau, qui apporte une notion d'unité et de continuité. 16 Figure 2 : Apprentoile, université de Bordeaux, cours d'Embryologie générale et Fœtopathologie, D. Carles (Laboratoire de Fœtopathologie - Université Victor Segalen Bordeaux 2 - France) et R. Darboux (MEPS - Faculté des Sciences de la Santé - Cotonou - Bénin) Longitudinal : les extrémités céphaliques et caudales se rapprochent sur la face ventrale, donnant la forme enroulée caractéristique de l'embryon. Cette forme sera conservée pendant le reste de la gestation et laissera son empreinte, plus tard encore, dans la mobilité générale du corps. Figure 3 : Apprentoile, université de Bordeaux, cours d'Embryologie générale et Fœtopathologie, D. Carles (Laboratoire de Fœtopathologie - Université Victor Segalen Bordeaux 2 - France) et R. Darboux (MEPS - Faculté des Sciences de la Santé - Cotonou - Bénin) 17 Ces plicatures amènent un réarrangement des structures internes et externes de l'embryon, participent à la formation d'un volume et d'une enveloppe continue. Mouvements de rotation des membres : les bourgeons des membres poussent d'abord latéralement puis modifient leur positionnement avec : Un déplacement vers l'avant Une rotation sur leur axe long, en rotation médiale pour l'ensemble du membre inférieur, en rotation latérale pour le membre supérieur. Cette nouvelle géométrie devient un véritable structurant de base du corps : Le tube digestif permet la relation dedans/dehors, la perception d'un axe et d'un volume interne. La colonne vertébrale est l'axe spatial d'orientation et soutient l'autonomie. La Peau est une surface d'unification et de contenance, elle permet également la relation dedans/dehors et la perception en soi / non soi, elle est aussi source de sensitivité. 18 2. La vie intra-utérine Le fœtus baigne donc dans le liquide amniotique. Ce liquide est chaud et favorise sa motricité. A partir de la 8ème semaine, le fœtus commence à être animé de quelques mouvements encore peu amples. Il s'agit notamment d'ondulations de l'axe vertébral (enroulements/déroulements) liés aux phénomènes de déglutition qui sont accompagnés de flexions de la tête. Ces mouvements vont ensuite diffuser vers les membres. On note que, dès in utéro, le mouvement axial d'enroulement est au service de la relation main/tête. On peut par exemple apercevoir lors des échographies des fœtus suçant leur pouce. Le liquide amniotique, à travers le sens vestibulaire, procure au fœtus les sensations de bercement. Il joue également le rôle de transmetteur sensoriel des ses mouvements propres et de ceux de sa mère. Le sens du tact est le tout premier à se mettre en place à partir de la 4ème semaine de développement. L'embryon est donc sensible aux sensations cutanées que les déplacements de liquide impriment à la surface de sa peau. Ainsi, tout au long de la gestation, la peau du bébé est caressée par ce fluide dans lequel il est immergé. La constance de cette stimulation rend la peau très sensible dès la naissance. De plus il existe une loi biologique selon laquelle plus une fonction est précoce, plus elle a de chances d'être fondamentale. 11 On comprend donc que le tact soit le vecteur privilégié par l'enfant pour découvrir son environnement et entrer en relation avec l'autre. Le fœtus est également soumis à d'autres stimulations sensorielles, visuelles et sonores ; les bruits de l'environnement maternel, la voix de ses proches mais aussi le bruit régulier et sourd du cœur de la mère, des bruits de digestion Les enveloppes amniotiques et la paroi utérine filtrent et atténuent ces stimulations, plongeant le fœtus dans un bain de sensations auditives, visuelles, tactiles, qui l'enveloppe. Progressivement, le fœtus peut se mettre à bouger pour s'ajuster aux stimulations perçues. Aucouturier parle d'une véritable adaptation du fœtus au monde externe et décrit ces mouvements comme porteur de sens. 11 Anzieu, Le Moi-Peau, Dunod, 1995, p 36 19 Enveloppé, le fœtus entend les bruits déformés des battements cardiaques, de l'abdomen, de la respiration avec ses accélérations et ses ralentissements, il entend la voix de sa mère avec sa tonalité propre () le fœtus s'y ajustera en écoutant, voire en y répondant par le mouvement qui a déjà le sens d'une adaptation au monde externe. 12 Au cours du 5ème mois de grossesse, la mère et ses proches perçoivent les premiers mouvements fœtaux, ils tentent d'y répondre ; une première communication s'établie, par le toucher notamment, mais aussi par la voix. Le fœtus est en recherche active de ce contact. Lorsque l'on pose la main sur le ventre de la mère, préférentiellement quand il s'agit de la mère elle même, le fœtus bouge afin de se positionner sous ce contact. Cette attirance est à la base des méthodes d'haptonomie prénatale. Ces interactions prénatales participent à l'investissement psychique de l'enfant par ses parents. Durant la gestation le fœtus grandit, il est de plus en plus enserré dans l'utérus et la quantité de liquide amniotique diminue ce qui multiplie les échanges tactiles directs avec la paroi utérine. En lien avec les plicatures dont l'embryon a fait l'objet et avec le manque de place qui s'installe, ce dernier est positionné en enroulement. Dans cette position, son dos est entièrement en contact avec la paroi utérine. La multiplication des contacts physiques sur son corps propre lui donne une première perception des contours de son corps. Pour Anzieu, L'utérus maternel fournit l'ébauche d'un contenant psychique ; il est vécu comme le sac qui maintient ensemble les fragments de conscience du début de la vie 13 Dans le ventre maternel, les parois de l'utérus et le liquide amniotique enveloppent et soutiennent le bébé, lui donnant des sensations rassurantes. Le bébé gardera en mémoire ces sensations, et les retrouver après la naissance pourra l'aider à s'apaiser. En effet, à la naissance, le nouveau-né fait l'expérience d'un environnement plus ou moins sans limites. 12 Aucouturier, La méthode Aucouturier : Fantasmes d'action & pratique psychomotrice, de Boeck, p 19 13 Anzieu, cité par M. Bruchon, 2004 20 3. La naissance A l'accouchement, les contractions de l'utérus stimulent la peau du bébé. Le fœtus passe par le col de l'utérus, passage rétrécit qui moule toute la surface de son corps, lui donnant une expérience intensifiée de sa forme et de son unité. Pour G. Haag l'expérience de l'expulsion serait vécue par l'enfant comme une expérience de démoulage sur le plan sensoriel. L'enfant aurait alors une empreinte archaïque d'une première forme. L'enfant naissant perçoit sur toute sa surface corporelle, qu'une distinction des corps s'opère. Du fait de son anticipation et de son rôle actif dans l'expulsion, la mère est plus à même de renoncer à la fusion, au profit d'un contact peau à peau et d'une rencontre avec son enfant. Au moment de la naissance, le bébé lui, est délogé de l'enveloppe utérine protectrice. Puis c'est l'accès à la vie aérienne qui représente un changement extrême ; L'espace autour de lui devient froid et très grand, il y a moins de zones de contact entre son corps et l'environnement. Sa peau est désormais à nue, en contact direct avec les diverses stimulations. Ces stimulations tactiles changent de nature. On passe d'un contact liquidien à un contact aérien et également à un peau à peau direct. Les sons sont puissants, la lumière également. Ses poumons s'emplissent d'air pour la première fois et il découvre ses cordes vocales, il crie. Il est écrasé sous l'effet de la pesanteur. Positionné en décubitus dorsal, ses membres sont attirés en ouverture. L'hypertonie des membres concoure au rassemblement et au retour à la position fœtale chez les enfants qui vont bien, les bébés boules . Otto Rank parle de la naissance comme d'un traumatisme. Pour lui, le passage brutal de la vie utérine, pauvre en stimulations, à la vie aérienne, entrainerait un traumatisme par excès de stimulations qui dépasseraient les capacités du nouveau-né de les gérer. Il imagine ensuite que chaque angoisse ultérieure serait la tentative de digérer ce premier traumatisme. 21 Korff-Sausse au contraire peut imaginer un bébé heureux de natre, arrivant dans un monde qu'il a hâte de découvrir, et y entrant avec les compétences acquises au cours de son séjour matriciel 14 Le passage de la vie intra-utérine à la vie extra-utérine entraine quoi qu'il en soit, la perte des enveloppes utérines et une confrontation avec de nouvelles expériences sensorielles et gravitaires. Il est donc source d'angoisses corporelles, normales chez le nourrisson qui n'a pas encore intégré le sentiment de ses propres limites corporelles. Il aura besoin de la présence sécurisante de sa mère pour s'apaiser et se sentir contenu de nouveau. En effet, tout au long de la grossesse, la mère et l'enfant sont en contact permanent. Après la naissance, l'entourage doit permettre au nouveau-né de revivre cette expérience d'être contenu, en le berçant, en le tenant tout contre soi, en lui parlant 14 Korff-Sausse, La première demeure, Champ psy, 2009, (n 56), p 13 22 4. Le sentiment d'enveloppe Les enveloppes biologiques contiennent physiquement les cellules et les organes, unifient et délimitent le corps propre. Dans le cas d'une déficience de ces enveloppes biologiques, les conséquences pour l'individu sont potentiellement mortelles : L'expression à la surface de la membrane plasmique des mauvaises protéines, engendre la reconnaissance des substances étrangères ou combat le soi (réactions auto- immunes). Une faille de la membrane cellulaire conduit à la fuite du contenu cellulaire et à l'apoptose (mort cellulaire). Un défaut de plicature de l'embryon expose les organes à l'extérieur du corps, ce qui demande des opérations chirurgicales importantes. Une abrasion de la peau (par exemple dans les brulures graves) l'expose sans protection à toutes les attaques extérieures et potentiellement à la mort. Pourtant, il arrive que certains individus, chez qui l'intégrité de ces enveloppes biologiques est respectée, présentent le sentiment, la sensation que cette enveloppe est absente, trop fragile ou trop rigide. Il s'agit en fait d'un défaut du sentiment d'enveloppe. Anne-Marie Latour nous précise qu' il ne suffit pas d'avoir une peau tout autour pour se sentir enveloppé, un squelette pour s'imaginer solide, des organes sensoriels pour communiquer et des orifices corporels pour se vivre capable de matriser et apprécier les échanges avec son environnement. Le sentiment d'être est cette part imaginaire qui doit s'intriquer avec le somatique propre à chaque individu. 15 Car si les enveloppes sont présentes, elles sont encore immatures. La peau perçoit les sensations de façon diffuse, l'hypotonie axiale et l'hypertonie des membres affectent la perception du corps, les différents sens ne sont pas encore localisés et unifiés, enfin le bébé n'a pas conscience d'être un tout différencié de son environnement, notamment de sa mère. Le sentiment des limites du Moi n'est donc pas inné. A la naissance, le bébé présente le sentiment primaire d'un Moi illimité. Il ne différencie pas ce qui vient de lui ou de 15 Latour, Les images du corps pré-contenantes, site psynem. org 23 l'environnement. Il perçoit des sensations diffuses dans tout le corps et qui le désorganisent. Progressivement il va développer le sentiment d'être limité, d'abord dans un mécanisme très dépendant du corporel, des sensations notamment tactiles mises en sens par l'entourage, c'est la prise de conscience de son enveloppe corporelle, qui soutient le sentiment d'être un tout unifié et différencié des autres. Ainsi le sentiment d'enveloppe se construit dans l'expérience répétée : De la peau D'être tenu, soutenu, compris Anne Marie Latour résume, cette construction du sentiment d'être est dépendante à la fois des expériences du corps propre et des interactions avec un objet privilégié, la mère le plus souvent. 16 16 Latour, Les images du corps pré-contenantes, site psynem. org 24 5. L'enveloppe tonique Comment le nourrisson va-t-il pouvoir faire face à ces nouveaux stimuli ? Y mettre du sens et les contenir ? En ce qui concerne la perception des stimuli ; Ils seraient traités de manière binaire par un premier système neurologique archaïque les triant qualitativement en paires contrastées, telles que les nomme B. Golse 17 ; agréable/désagréable, chaud/froid, dur/mou Ce système ne permettrait pas encore de moduler, nuancer et combiner les différentes perceptions : seul un système plus élaboré et relié à l'expérience relationnelle permettra la transformation de ces premiers ressentis. En ce qui concerne la réponse à ces stimuli : Les stimulations internes et externes impriment de manière automatique chez le nourrisson, des réactions toniques globales . Il expérimente en fonction de la nature du stimulus classé en agréable ou désagréable, une alternance entre des états d'hypotonie de réplétion et d'hypertonie d'appel. Le tonus est donc le premier vecteur des sensations et émotions du nourrisson, qui sont, dans un premier temps, indifférenciés. Wallon parle d'ébranlement organique des émotions. Le tonus participe aussi à unifier la perception du corps, en reliant les différentes sensations et les différents sens. Wallon parle du tonus comme voie finale commune des sensibilités. Il est également vecteur de communication. En effet, les états toniques permettent à l'entourage maternant de décrypter les états émotionnels du bébé et d'y répondre ; par un rapprochement physique, des conduites de maternage (nourrissage, portage, corps à corps ) et également par une mise en sens et en mots de l'état émotionnel du bébé, en symbolisant ce que pourraient être ses pensées. Les conduites d'apaisement de ses parents agiront comme une véritable transfusion tonique de l'apaisement, dans le portage notamment. Ces mécanismes 17 A-M. Latour, Les images du corps pré-contenantes, site psynem. org 25 d'adaptation tonique réciproques entre le nourrisson et son entourage seront développés par De Ajuriaguerra à travers le concept de dialogue tonico-émotionnel. Il se caractérise par la synchronie posturale et gestuelle des deux partenaires lors de leurs interactions. 18 La régulation tonique est donc, dans un premier temps, dépendante des conduites de l'entourage sur le nourrisson. Ce dernier fait l'expérience d'être contenu dans une nouvelle enveloppe protectrice et structurante qui régule ses tensions. Le nourrisson se sent contenu en présence. Puis, la continuité de ces soins contribue à apprendre au nourrisson à réguler son tonus par lui-même en se remémorant les empreintes toniques de l'apaisement procuré par les soins maternants. Il se construit progressivement une véritable enveloppe tonique, qui soutient la stabilisation de son image corporelle et donc le sentiment continu d'exister. Bullinger résume ainsi les différents niveaux de complexification du tonus : La période réflexe La régulation par les flux sensoriels. Elle est encore réflexe mais permet la mobilisation tonique et l'orientation du corps vers le stimulus. Plus tard, l'enfant apprendra, en s'appuyant sur son environnement physique et humain, à réguler son tonus. Le jeu de la petite bête qui monte par exemple, rendra progressivement l'enfant en capacité de contenir son excitation. Finalement, l'individu sera en capacité de réguler son tonus par lui-même, en fonction de son monde représentatif. L'évolution de la régulation tonique est dépendante de la maturation neurologique, de la qualité des premières interactions et de son investissement par l'individu. Elle aboutit au contrôle des sphincters et à la continence ; c'est-à-dire la capacité en conscience, de retenir ou de laisser partir ses selles, ce qui soutient la perception d'un dedans et d'un dehors. Accéder à la propreté est une façon très concrète de faire le tri : le bon, gardé dans le corps, le mauvais jeté aux poubelles. 19 18 M-F. Livoir-Petersen, L'approche sensori-tonique et la question du morcellement, in thérapie psychomotrice et recherches, n162, 2010 26 L'enfant acquiert le sentiment d'avoir une enveloppe hermétique, de maitriser les échanges avec l'extérieur et que ces échanges ne menacent pas son intégrité. Enfin, elle soutient l'individuation et l'autonomisation. La fonction tonique est donc indissociable de l'émergence du sentiment d'enveloppe. Plus tard, les tentatives de faire bonne contenance seront souvent associées à un recrutement tonique. L'hypertonie permet une perception accrue de la consistance et des limites corporelles. On observe fréquemment, dans les pathologies des enveloppes, des conduites compensatoires qui passent par l'hypertonie, comme des tentatives de maintenir en permanence les sensations corporelles d'une enveloppe, car celles-ci ne sont pas mémorisées et intériorisées. L'hypotonie de réplétion au contraire, peut être synonyme de perte des limites, d'une trop grande adaptation voire d'une fusion avec le support. En fait, c'est dans l'expérience de l'alternance entre ces deux états et surtout l'expérimentation de cette modulation que l'individu construira le sentiment d'avoir une enveloppe protectrice mais souple, qui permette les échanges. Suzane Robert Ouvray parle de gaine tonique réactive qui se modifie en fonction des stimulations, nécessairement souple pour assurer les échanges et ainsi permettre à l'enfant d'enrichir son monde interne. La régulation tonique proposée, d'abord incorporée, plus tard intériorisée par le bébé, autorise la constitution de la fonction tonique [] nécessaire à l'intégration des modalités sensorielles, à l'organisation du corps en vue de l'action mais aussi à la stabilisation de l'image corporelle : progressivement l'enfant conservera le sentiment de soi quels que soient ses mouvements, ses sensations ou ses émotions. 20 Enfin, l'intégration des différentes qualités (sensori-toniques et émotionnelles) de l'objet, autorise une [] continuité temporelle participant ainsi à la construction des enveloppes psychiques. 21 Le tonus participe donc de la fonction contenante car il permet à l'entourage puis au bébé lui-même de décrypter ses émotions, en faisant le lien hypotonie-agréable et hypertonie- désagréable, avec toutes les nuances qui vont pouvoir se développer. Mais au niveau corporel, il procure plus une sensation de consistance que d'enveloppe. Intéressons-nous alors aux travaux de Winnicott. 19 19 C. Potel, La question du cadre thérapeutique, la contenance, les limites, le corps, in Etre psychomotricien, Eres, 2010, p 338 20 A-M. Latour, les images du corps pré-contenantes, site psynem. org 21 ibid 27 6. L'apport de Winnicott Si la fonction à contenir concerne très directement la construction des propres capacités de penser du bébé, elle concerne également les soins qui lui sont proposés par ses parents. 22 Et si l'on continue à s'intéresser aux soins maternels proposés au tout petit, il y a une notion importante développée par Winnicott. Il s'agit de la notion de préoccupation maternelle primaire. a) La préoccupation maternelle primaire : C'est en fait la capacité qu'à la mère de se mettre à la place de son bébé afin de répondre à ses besoins physiques et psychiques. Cet état de préoccupation maternelle primaire, permet à la mère de se placer dans le même état émotionnel que son enfant et donc de s'adapter de façon presque totale à ses besoins au début de sa vie. Cet état d'empathie extrême qualifierait une mère suffisamment bonne selon les termes de Winnicott. C'est-à- dire, une mère qui sache décoder son enfant et lui procurer les soins physiques et psychiques nécessaires à son développement, à savoir, le Holding, le Handling et l'Object Presenting. C'est grâce à ce collage extrême de la mère aux besoins de son enfant et leur satisfaction immédiate dans un premier temps, que le nourrisson n'éprouverait pas d'angoisse majeure. Dans un environnement suffisamment bon, l'enfant est dans une illusion de toute puissance ; il pense créer lui-même son environnement en fonction de ses besoins, ce qui est très rassurant. A cette période il perçoit sa mère de façon segmentée, limitée au sein, et comme une partie de lui, qu'il fait apparaitre à son envie. L'objet maternel suffisamment bon peut seul contenir les pensées primitives de la psyché. 23 Puis, avec le temps, une désadaptation s'ébauche, parallèlement à la croissance de la capacité de l'enfant de faire face à cette défaillance maternelle. La mère va mettre plus de 22 Mellier, La fonction à contenir, objet, processus, dispositif et cadre institutionnel, in La psychiatrie de l'enfant, volume 48, 2005, p2 23 Ibid p5 28 temps à satisfaire son enfant. Elle va le faire patienter. Pendant ces temps d'attente, l'enfant va percevoir les bruits de sa mère qui se rapproche, va la voir s'affairer il va commencer à anticiper le soin, en s'appuyant sur les traces mnésiques des soins antérieurs et sur la contenance auditive, visuelle, voire olfactive de sa mère et de son environnement. Ce phénomène va permettre à l'enfant de s'individualiser. Désormais, les contacts physiques avec la mère seront non permanents. L'enfant va se construire progressivement une enveloppe personnelle et prendre conscience de sa mère comme différenciée de lui, avec sa propre enveloppe. b) Le phénomène transitionnel : Pour Winnicott ce processus de défusion et d'individuation passe par un phénomène transitionnel. Dans un premier temps, mère et enfant partagent une même enveloppe symbiotique, puis, un espace se crée entre les deux protagonistes. Cet espace transitionnel contient à la fois la présence et l'absence de l'autre. Il est indispensable pour supporter puis symboliser l'absence naissante de la mère. Un des objets transitionnels les plus connus est le doudou qui est investit par l'enfant dans les moments d'angoisse et notamment de séparation avec la mère. Il contient à la fois la mère et l'absence de la mère. Il modélise l'absence mais contient les traces mnésiques du contact, représente la mère, notamment dans ses fonctions de réassurance, de contenance Un autre exemple d'objet transitionnel est le jeu. Enfin, si l'enfant a pu se construire une enveloppe, il reconnait sa mère comme une entité séparée de lui. Mais cette enveloppe se construit dans un premier temps dans l'adaptation totale et dans le corps à corps à travers trois fonctions maternantes principales développées par D. Winnicott ; le Holding, le Handling et l'Object Presenting. c) Holding : Il se traduit par maintien ou tenue . Il correspond à la façon de soutenir et porter l'enfant, physiquement mais aussi psychiquement. 29 Le portage physique nécessite un ajustement entre le porté et le porteur. De Ajuriaguerra théorisera cet ajustement tonique et postural à travers la notion de dialogue tonico-émotionnel. Le portage induit un contact corps à corps entre le bébé et celui qui le porte, ce qui lui procure une sensation de continuité qui lui rappelle la vie intra-utérine et l'apaise ; sensations vestibulaires, contact du dos, position d'enroulement Il est également accompagné de nouvelles stimulations souvent rythmées ; paroles de la mère, caresses, ainsi que le regard, qui renforce la sensation de maintien. Le bébé est véritablement contenu physiquement mais aussi psychiquement. Un portage de qualité donne à l'enfant la confiance en son environnement, qui peut le contenir et sur lequel il peut s'appuyer. Il lui donne également confiance en lui-même. Le hoding joue essentiellement une fonction de protection contre toutes les expériences, souvent angoissantes qui sont ressenties dès la naissance. Si le holding est assuré de manière suffisante et régulière, le sentiment continu d'exister est préservé et la maturation du nourrisson est alors possible. 24 Pour Harlow, le portage réunit tous les facteurs nécessaires à l'attachement : contact, chaleur, allaitement, mouvement. Winnicott nous explique qu'un Holding de qualité permet l'intégration du moi, l'individuation. L'intégration (sous entendue du Moi) est étroitement liée à la fonction de maintien exercée par l'environnement. Une intégration réussie est l'unité. Tout d'abord vient le je , ce qui inclut que tout ce qui est autre n'est pas moi 25. d) Handling : Il correspond aux soins corporels procurés à l'enfant, qui nécessitent des mobilisations et une stimulation du corps, notamment de la surface de la peau ; le change, la toilette, les massages L'enfant acquiert ainsi la perception de la peau comme surface, ce qui permet l'élaboration d'une enveloppe corporelle, délimitant un intérieur et garantissant l'intégrité corporelle en le protégeant de l'extérieur. 24 B. Golse, Le développement affectif et intellectuel de l'enfant, Masson, 1985 25 Winnicott, Intégration du Moi au cours du développement de l'enfant, in Processus de maturation chez l'enfant Payot, 1962, p 9 à 18 30 Le bébé a de cette enveloppe une représentation concrète, qui lui est fournie par ce dont il fait l'expérience sensorielle fréquente, à savoir la peau. 26 Anzieu, évoquant les travaux de Harlow, précise que, le réconfort apporté par le contact avec la douceur d'une peau ou d'une fourrure s'avère le plus important. Le réconfort n'est trouvé que de façon secondaire dans les trois autres facteurs, l'allaitement, la chaleur physique éprouvée dans le contact, le bercement du bébé par les mouvements de sa mère quand elle le porte. 27 Cette observation démontre l'importance primaire des contacts peau à peau entre l'enfant et son entourage. Winnicott nous dit que le Handling participe à l'installation de la psyché dans le soma, donne une consistance corporelle à l'enfant et participe ainsi à la création des enveloppes corporelles. e) Object presenting : C'est la capacité de la mère de mettre à la disposition de son enfant, l'objet dont il a besoin au bon moment, en accord avec son niveau de développement et ses préoccupations actuelles. Il sert à présenter un objet de la réalité extérieure en réponse à la réalité interne de l'enfant. Si cela est correctement fait, les stimulations de l'objet ne dépassent pas les capacités de contenance de l'enfant, il se sent compris et la mère permet à l'enfant de s'ouvrir au monde extérieur, de s'intéresser et d'investir un autre objet qu'elle. D'après Winnicott, ces 3 fonctions maternantes assurent la maturation du nourrisson, selon trois schèmes principaux : le processus d'intégration qui conduit l'enfant à un état d'unité. C'est la constitution du Moi et du self, conséquence du Holding. le deuxième processus est la personnalisation, c'est-à-dire l'installation de la psyché dans le soma et le développement du fonctionnement mental. Ce sont les effets du Handling. le troisième processus concerne l'édification des premières relations objectales qui aboutit à la capacité d'utiliser l'objet, issues de la fonction d'Object Presenting. 26 Anzieu, Le Moi-Peau, réédition Dunod, 1995, p 82 27 Ibid, p 46 31 Au regard de ces éléments, le nourrissage peut être envisagé comme le paradigme de la contenance. Le bébé est porté en enroulement ; il y a une grande surface de maintien au niveau du dos, et sur tout un flanc. Il est soutenu par le regard de sa mère, éventuellement par les bruits de son cœur, par un bain d'odeurs. Parallèlement il perçoit la sensation du lait chaud qui entre dans son corps et apaise la sensation de faim, induit un relâchement tonique et la sensation de réplétion. Tout cela est accompagné des paroles de la mère qui symbolisent l'état de l'enfant. Le bébé perçoit ses limites corporelles, il fait l'expérience d'un échange entre l'extérieur et l'intérieur, une incorporation, dont la perception est favorisée par la chaleur du liquide, et fait le lien avec l'apaisement. Tout cela dans un contexte de contenance physique tactile, mais aussi sensorielle plus à distance. La mère constitue alors l'objet contenant les angoisses, les pulsions, les besoins qui agitent la vie psychique du nourrisson. Winnicott disait ce qui est en jeu, c'est non pas l'incorporation fantasmatique du sein nourricier mais l'identification primaire à un objet support contre lequel l'enfant se situe et qui le tient. 28 L'enfant s'identifie à la fonction contenante de sa mère pour construire sa propre fonction contenante. Le contenant résulte de l'intériorisation du contenant. Petit à petit, le corps à corps diminuera, l'enfant se soutiendra des sens plus à distance. 28 Anzieu, Le Moi-Peau, nouvelle revue de psychanalyse, n9, 1974 32 7. Bion, la fonction alpha () Le bébé est un être sensoriel, (mise en place précoce des organes sensoriels, proprioception, et tonus). Comme déjà évoqué, il ne peut exprimer ses émotions que de façon tonique et motrice. Ces réponses n'ont pas de forme ou de signification, Bion les nomme éléments béta (). a) Les éléments du bébé : Les éléments béta correspondent à des éprouvés corporels (sensoriels et toniques) et des éléments psychiques (détresse, envie ). Mais ces éléments restent encore bizarres, parcellaires, destructeurs, car l'enfant ne peut les identifier et les penser. Ils forment une véritable barrière d'éléments béta agglomérés, qui empêche l'enfant de penser. Les éléments béta sont des éléments non pensables, incapables de se lier entre eux, tout juste susceptibles de s'agglomérer en ce qu'il appelle un écran béta. C'est le contenu . 29 Ne sachant pas les contenir, le bébé les projette sur son environnement maternant. b) Le travail de transformation de la fonction maternelle : Celui-ci, à l'aide de sa fonction opérante, travaille à les détoxiquer, en les triant et en les organisant pour les comprendre, y mettre du sens et y répondre de manière adaptée et calmante, ah mais tu as faim , ca va aller, je prépare ton biberon , le berce et le nourrit. Ces éléments sont traités par le psychisme de la mère, par sa capacité de rêverie, laquelle est inhérente à la mystérieuse fonction alpha, elle joue alors le rôle de contenant. 30 Ces réponses maternelles sont appelées éléments alpha. 29 A. Ducret, La contenance, histoire d'un concept, in J. B. Chapelier et D. Roffat, Groupe, contenance et créativité, Eres, p21 30 ibid 33 c) Les éléments : Ils sont renvoyés par l'entourage au bébé, par des vecteurs toniques, posturaux, sonores Le bébé s'alimente des significations données par son entourage, qui lui prête dans un premier temps, sa capacité à penser. Bion insiste sur le fait que cette fonction alpha est une fonction de transformation. Transformation des éléments béta en éléments alpha, transformation du bébé qui, d'un état d'angoisse et d'hypertonie passe à un état d'hypotonie de réplétion. Enfin, transformation de la mère qui devient capable de décrypter son enfant. d) Constitution d'une fonction propre au bébé : Bion situe l'enveloppe au niveau de cette interface de transformation. L'accumulation des éléments participe à la création d'un écran d'éléments alpha contenant. Le terme d'écran précise sa fonction de filtre et de tri des excitations, le terme contenant renvoie au maintien des traces mnésiques et de l'énergie psychique. Cet écran permet la dissociation excitation/signification. L'écran alpha se développe autour d'un pôle de différenciation. Il rend possible l'acquisition des distinctions de base de la pensée : dedans/dehors, affect/représentation, imaginaire/réel. Progressivement, lorsque ces boucles cognitives se répètent de façon stable et adaptée, le bébé puise dans la répétition, des invariants cognitifs, qui seront des repères organisateurs. En introjectant la fonction de transformation de sa mère, l'enfant construit son propre appareil à penser. Le bébé apprend à discriminer de lui-même ses états, à y mettre du sens et également à pouvoir anticiper. 34 Figure 4 : schéma construit d'après le cours de Mme Latour, 3ème année, IFP Bordeaux La fonction alpha est dans un premier temps une manière de théoriser toutes les attentions contenantes de l'entourage maternant. Elle permet la constitution d'une barrière d'éléments alpha contenante pour le bébé, qui participera à la future fonction alpha autonome du bébé. Elle assure une fonction de réceptivité et de détoxification 31 des éléments béta qui nous parviennent à chaque rencontre avec un objet. Car il nous arrive sans cesse des stimuli qui doivent être catégorisés et mis en sens pour produire des pensées. Pour Bion, la fonction contenante serait une fonction d'accueil et de symbolisation. 32 On peut également la voir comme une théorisation de la fonction soignante. Nous nous attacherons à le détailler dans une prochaine partie, mais le travail du psychomotricien sera de formuler des hypothèses au patient pour tenter de l'aider à décrypter ses états et y mettre du 31 N. Kacha, La fonction contenante du thérapeute, in Groupe, contenance et créativité, Eres, 2010, p86 32 ibid 35 sens. Cela peut être plus difficile que pour la mère et son bébé. En effet, comme déjà évoqué, à la naissance la mère est dans un état de préoccupation maternelle primaire qui la met très en lien avec son bébé. 36 8. Anzieu, le Moi-Peau Quand on s'intéresse à la fonction contenante, il est un concept incontournable, celui du Moi-Peau de D. Anzieu. Premièrement car la fonction contenante est précisément une des fonctions qu'il attribue au Moi-Peau. Egalement car il nous permet de faire le lien entre le corporel et le psychique. Il construit son modèle en se référant aux concepts psychanalytiques de Moi et de pulsions, développés notamment par Freud. Ce dernier réalise une modélisation de l'appareil psychique dont le Moi, de par son rôle actif de mise en contact du psychisme avec le monde extérieur et de transmission des informations, constituerait l'enveloppe. D. Anzieu nous explique que cette formation n'est pas innée mais qu'elle se construit en s'étayant sur une fonction biologique, celle de la peau, et passerait par un stade intermédiaire ; le Moi-Peau. Il définit le Moi-Peau comme une figuration dont le Moi de l'enfant se sert au cours des phases précoces de son développement pour se représenter lui-même comme Moi contenant les contenus psychiques, à partir de son expérience de la surface du corps. 33 Intéressons-nous à la façon dont cette figuration précoce se forme. a) Construction du Moi-Peau : Pour Tisseron, la métaphore du Moi-Peau fait appel à la sensorialité et à la motricité. A l'occasion des contacts de sa peau avec la peau de sa mère, le nourrisson perçoit sa peau comme une surface. Il décrit le moment du nourrissage comme paradigme de cette perception. En effet, les sensations buccales représentent alors la première expérience d'un contact différenciateur, d'une incorporation. La réplétion est une expérience plus diffuse, durable, d'une masse centrale, d'un plein, d'un centre de gravité. Le nourrissage est accompagné de conduites de maternage riches en sensations ; le bercement, les odeurs corporelles, le regard Cela conduit progressivement l'enfant à différencier une surface comportant une face externe et une face interne, distinguant le dehors et le dedans, et un 33 Anzieu, Le Moi-Peau, Dunod, 1995, p 61 37 volume dans lequel il se sent baigné. Cette surface qu'il nomme interface et ce volume donnent à l'enfant la sensation d'un contenant. 34 Ainsi, l'enfant acquiert un Moi peau qui lui est propre selon un processus de double intériorisation : de cette interface qui devient enveloppe psychique contenant des contenus psychiques de l'entourage maternant qui devient le monde intérieur, des pensées, des images, des affects 35 b) Fonctions du Moi-Peau : D. Anzieu propose différentes figurations pour le Moi-Peau : Un sac correspondant à la fonction d'enveloppe, qui permet de retenir le bon à l'intérieur (les sons, les paroles ), de contenir. Un écran correspondant à la fonction de barrière protectrice, qui permet de délimiter le dedans et le dehors. Un tamis qui filtre les échanges et permet l'inscription des traces mnésiques. Plus précisément, D. Anzieu définit 8 fonctions du Moi-Peau : 1. Fonction contenante, à l'image de la peau qui recouvre toute la surface du corps. Il cite alors la fonction de Handling évoqué plus tôt, qui éveille la perception de l'image du corps comme un sac. 2. Fonction de maintenance du psychisme : en étayage sur la fonction de soutènement du squelette et des muscles assurée par la peau. Il cite cette fois la fonction maternelle de Holding. 3. Fonction de pare excitation qui filtre les excitations trop importantes. 4. Fonction d'individuation qui fournit à l'individu le sentiment d'être différencié des autres. 5. Fonction d'inscription des traces sensorielles, pour la collecte des informations sur le monde extérieur. Cela inscrit le sujet dans une dimension sociale. 34 A. Ducret, La contenance, histoire d'un concept, in Chapelier et Roffat, Groupe, contenance et créativité, 2011, p29 35 D. Anzieu, Le Moi-Peau, Dunod, p 85/86 38 6. Fonction d'intersensorialité. La peau est l'organe sensoriel qui supporte et relie tous les autres sens. En cela, il fonde l'unité psychique. 7. Fonction de soutien de l'excitation sexuelle. Par les soins corporels dont il fait l'objet, l'enfant fait l'expérience des plaisirs de la peau, toile de fond des plaisirs sexuels ultérieurs et fondement de la répartition de la sexualité adulte dans les zones érogènes. 8. Fonction de recharge sexuelle pour maintenir et organiser l'énergie libidinale. On peut également définir 2 autres fonctions du Moi-Peau en rapport avec les fonctions de la peau : La fonction mnésique à l'instar de la peau qui stocke les graisses. La fonction de défense archaïque, comme la peau émet les phéromones. Si le Moi fonctionne d'abord sur une structuration en Moi-Peau, comment peut-il passer a un Moi psychique ? c) Dépassement du Moi-Peau : Le Moi-Peau transforme l'expérience tactile concrète d'un contenant, en représentation symbolique, et finalement purement abstraite, d'un contenant. Dans un premier temps, l'enfant ressent l'existence de sa propre peau. Ce sentiment d'existence de base lui donne conscience des limites de son corps et une confiance suffisamment importante en son intégrité corporelle. Ce sentiment d'intégrité donne au Moi une enveloppe narcissique et un bien être de base d'o l'idée du Moi-Peau. 36 Ainsi l'instauration du Moi-peau s'établit en réponse au besoin d'une enveloppe narcissique et assure à l'appareil psychique la certitude et la constance d'un bien être de base. Cette sécurité de base permet à l'enfant de contenir ses pulsions. 36 Ducret, La contenance, histoire d'un concept, in Chapelier et Roffat, Groupe, contenance et créativité, 2011, p30 39 Selon D. Anzieu, dans une première phase, la pulsion prend corps. Dans une phase finale, elle prend nom. Entre les deux, elle prend place. 37 La pulsion a une source corporelle, elle est liée aux expériences sensorielles et motrices précoces. Puis, l'appareil psychique se représente la pulsion en la localisant imaginairement dans un organe des sens. Enfin, le langage permet d'inclure la pulsion dans un scénario fantasmatique qui agence la source et le but dans un espace et un temps. Ainsi, Le Moi peau fonde la possibilité même de la pensée. 38 Finalement, de sa double origine épidermique et proprioceptive, le Moi hérite également la double possibilité ; d'établir des barrières (qui deviennent des mécanismes de défense psychique) et de filtrer les échanges (avec le Ca, le surmoi et le monde extérieur). 39 Le concept du Moi-Peau s'étaie donc sur l'expérience cutanée du bébé et l'illusion initiale que lui fournit sa mère d'une peau commune. S'il a été suffisamment acquis, l'interdit du toucher et le fantasme d'une peau invulnérable favoriseront la structuration du Moi. Mais, à partir de 1976, D. Anzieu parlera d' enveloppe psychique , car le terme d'enveloppe a une signification plus large que celui de peau et surtout plus indépendante du substrat organique. Pour Ducret, D. Anzieu a utilisé la métaphore d'enveloppe psychique car il a eu l'intuition d'une structure psychique ayant des propriétés formelles qui sont en général attribuées à une enveloppe mais qui peuvent être extraites du substrat. 40 Ainsi, il ouvrera sa réflexion sur les enveloppes à d'autres fonctions sensorielles. Le concept initial de Moi-Peau, permet de généraliser une structure et des fonctions, de penser une plus grande diversité de ses manifestations intrapsychiques et interpsychiques, enveloppe onirique, sonore, groupale. 41 37 D. Anzieu et R. Kas, Le travail de l'inconsient, Colloque de l'APF du 12 mai 1984, Le corps de la pulsion, la pulsion pour quoi faire ? p 64 38 D. Anzieu, Le Moi-Peau, Dunod, p62 39 Ibid, p 62 40 Ducret, La contenance, histoire d'un concept, in Chapelier et Roffat, Groupe, contenance et créativité, 2011, p30 41 Ibid 40 9. L'enveloppe visuelle a) Compétences visuelles précoces : Lorsqu'il nait, la vision du bébé est encore immature. Seule la vision de près (à 20 cm environ) est opérante. Elle est donc optimum dans les moments de maternage et de nourrissage. Précocement, le bébé est doué de compétences visuelles qui vont être au service de son besoin de proximité avec les adultes qui s'en occupent. Il a une préférence pour les visages, notamment lorsque ceux-ci sont placés de face, c'est-à-dire qu'ils regardent eux même le bébé. Il possède une bonne poursuite oculaire des objets ou visages en mouvement, ce qui permet à son entourage de percevoir son intérêt et de capter son attention. Il répond alors dans un premier temps, par des sourires automatiques qui, progressivement seront différenciés, plutôt réservés aux proches et adaptés à la situation. Il est capable très tôt de percevoir les états émotionnels des autres, notamment en analysant leur regard. Toutes ces compétences lui permettent de maintenir la proximité des adultes. Même sans contact physique, la vue de l'adulte représente un certain contact, une continuité de présence à l'enfant. En effet, dans un premier temps, l'enfant pense créer son environnement lui-même, ainsi les objets absents à sa sensorialité, qu'il ne touche pas, ne voit pas ou n'entend pas, ont disparut. Il n'est pas conscient de la continuité de leur existence. Peu à peu, la conscience de la permanence de l'objet se construit. Alors, même sans le contact visuel, l'enfant se sentira contenu, par les bruits qu'il peut percevoir, mais dont il ne voit pas la source, par la mémorisation et par l'introjection qu'il aura réalisé des différents objets, notamment de sa mère. b) L'enveloppe visuelle : G. Lavallée, qui a travaillé sur la notion d'enveloppe visuelle, nous dit dans un premier temps que la vision est un sens décorporé. La sensation ne se situe pas dans l'organe sensoriel de l'œil, elle s'ébauche dans les centres visuels du cortex. Ainsi le plaisir de voir ne s'étaye pas directement sur un plaisir d'organe. Pour lui, le plaisir visuel est de l'ordre de 41 l'hallucinatoire, c'est à dire de l'ordre d'un éprouvé d'indistinction ou de continuité entre le dedans et le dehors, entre le sujet et l'objet. Ce que l'on peut voir est en continuité avec nous même. Et ce que je peux voir, peut me voir également. L'objet que je vois et moi-même, partageons un même espace, une continuité, soutenue par la vue. L'hallucination correspond à une représentation confondue avec la perception directe du réel. Mais peut-il y avoir une perception directe, véritable, du réel ? Non, car nos représentations influent sans cesse sur la perception que nous avons d'un stimulus. Dès lors, il se demande quelles transformations doivent subir les stimuli sensoriels pour acquérir la qualité de matériaux pour la pensée et permettre à un sujet un accès psychique supportable et même fécond à la réalité perçue ? Quelle différence existe-il entre un stimulus visuel à l'état brut, excitation traumatique non psychisée, pur élément bêta selon Bion, et une perception symbolisée constituée d'éléments alpha ? 42 Lavallée décrit le processus de la vision comme suit : 1. Le stimulus visuel est ce réel à l'état brut, qu'on peut également appeler élément . Il éveille instantanément des représentations inconscientes. 2. Les représentations éveillées sont projetées sur l'image perçue. La perception est donc symbolique. Tout le visible n'est pas perçu, une partie est négativée. 3. Cette perception symbolisée est introjectée dans le Moi et devient disponible pour la mise en mots. Il précise également, que percevoir et penser représentent des mouvements d'investissement contradictoires. Quand la perception demande d'ouvrir les pôles sensoriels et d'accueillir les stimuli externes, penser, au contraire, nécessite d'être capable de fermer psychiquement le pôle perceptif pour nous permettre d'endopercevoir notre monde interne. Cette distinction est permise par l'établissement dans certaines occasions particulières, d'un écran visuel. 42 G. Lavallée, L'enveloppe visuelle du moi et l'hallucinatoire, in Cahiers de psychologie clinique, 2003, n 20 42 i. L'écran visuel : Le bébé, repu, somnole dans les bras de sa mère. Elle est donc bien toujours présente devant ses yeux. Mais Lavallée nous dit que c'est comme si à ce moment là il ne la voyait plus. Un écran psychique hallucinatoire négatif pare-excitation et surface d'inscription s'est créé en lui. 43 Cet écran ferme le pole perceptif, accueille et rend utilisable les représentations nourries par le visuel. C'est à ce moment là seulement qu'il y a aperception de la mère, et que le bébé peut se voir dans le visage maternel, en oubliant sa mère. Le premier miroir hallucinatoire et positif constitué à partir du visage maternel reflétant mimétiquement les éprouvés du bébé s'est négativé : il est devenu écran. Le bébé ne voit plus sa mère qui est pourtant là en face de lui, il accède aux ébauches d'endoperceptions de celle-ci, en sa présence. 44 ii. Le miroir hallucinatoire positif : Le premier miroir hallucinatoire positif dont parle Lavallée correspond au rôle de miroir du visage maternel, décrit notamment par Lebovici. Dans les soins, lorsque le bébé est tenu dans les bras, il regarde surtout le visage de la mère. Il se voit alors lui-même, car lorsque la mère regarde son enfant, son expression est directement liée à ce qu'elle perçoit de son état émotionnel. S. Lebovici insiste sur la réciprocité de ce processus. En effet, l'enfant modifie également son expression faciale en fonction de ce qu'il perçoit de sa mère. Ce processus en abyme fonde le processus de maternalisation. La mère prend confiance en ses capacités, en observant les changements que ses soins impliquent. Le visage d'une mère suffisamment bonne , si l'on reprend l'expression de D. W. Winnicott, permet à l'enfant d'entrer en contact avec son propre monde affectif. Il permet donc à l'image de soi de se constituer. Le visage maternel est le lieu unique o peuvent s'intégrer, en un même espace, des états affectifs différents dissociés les uns des autres. L'observation de la dyade mère/nourrisson montre les changements qui affectent les visages de chacun en fonction des modifications survenant chez l'autre. Il se produit une sorte de modulation permanente du 43 G. Lavallée, L'enveloppe visuelle du moi et l'hallucinatoire, in Cahiers de psychologie clinique, 2003, n 20 44 Ibid 43 visage de la mère en fonction de ce qu'elle perçoit chez le bébé, de telle sorte qu'elle tend à lui communiquer ce qu'elle a perçu de son état affectif 45 Lavallée lui, insiste sur la nécessité de la création occasionnelle d'un écran qui ferme le miroir maternel pour permettre l'intégration des représentations. Ainsi, quand tout se passe bien, la quantité d'hallucinatoire positif se trouve régulée, ce qui conduit la formation d'un contenant. Le contenant se trouverait donc du coté de l'hallucination négative et le contenu du coté de l'hallucination positive. L'enveloppe visuelle travaille donc à nous protéger inconsciemment et en permanence de la quantité de quantum hallucinatoire positif 46. La limite psychique est maintenue dynamiquement par la régulation de la perception sensorielle. Nous ne prenons pas nos désirs pour une réalité. 47 iii. Cas pathologiques : Dans certains cas pathologiques, pour faire face à une excitation sensorielle à l'état brut, l'individu est obligé de réduire physiquement son champ visuel, faute de pouvoir le réduire psychiquement. Il y a prédominance des hallucinations négatives, opacité et permanence de l'écran visuel. Ce mécanisme de défense qui permet de ne pas voir psychiquement ce qui est physiquement présent, se retrouve par exemple, sous sa forme la plus mortifère, dans les cas d'autisme. 45 S. Lebovici et S. Stoléru, Le Nourrisson, la mère et le psychanalyste : les interactions précoces, Paris : Le Centurion, 1983, p. 163 46 G. Lavallée, L'enveloppe visuelle du moi et l'hallucinatoire, in Cahiers de psychologie clinique, 2003, n 20 47 ibid 44 10. L'enveloppe sonore a) Compétences auditives précoces : Nous avons déjà évoqué l'importance des sons perçus dès la période utérine. Le fœtus entend toutes les paroles de son entourage. Une fois né, l'enfant placé sur le torse de celui qui le porte entend les battements de son cœur, cela lui rappelle le bain sonore initial de la vie intra-utérine. Il possède des compétences auditives précoces qui lui permettent de reconnaitre la voix de sa mère parmi toutes les autres. C'est d'ailleurs elle qui pourra l'apaiser, mieux que toute autre voix. Il connait pour la vie entière, les lignes prosodiques avec lesquelles ses parents s'adressent à lui. 48 Très tôt, le bébé a un premier accès au contenu des paroles par l'intermédiaire de l'intonation de la voix, de sa mélodie, de son rythme, de son intensité Les sons ont donc déjà une valeur de communication. De son coté, le bébé émet des cris différents en fonction de son état émotionnel ; faim, douleur, frustration Dès ses 3 semaines, apparait le faux cri de détresse. Le bébé fait un premier lien entre ses émissions sonores et l'arrivée de la figure maternelle. b) L'enveloppe sonore : L'enveloppe sonore est composée de 2 faces, une face externe composée des sons de l'environnement et une face interne composée des sons émis par le bébé lui-même. Si l'hétérostimulation a été suffisamment bonne, le bébé réalisera des autostimulations ; babillages, bruits de bouches qui lui permettront de s'approprier, puis de pouvoir contrôler, ses émissions sonores dans le langage parlé. Pour que l'hétérostimulation soit de qualité, Lecourt évoque 2 conditions : Le vécu sonore doit s'étayer sur le vécu visuel et tactile. Le toucher, la motricité permettent de distinguer les sons produits des sons extérieurs. 48 M-F. Livoir-Petersen, L'approche sensori-tonique et la question du morcellement, in thérapie psychomotrice et recherches, n162, 2010 45 Le vécu sonore doit s'élaborer mentalement grâce à l'intégration des différentes composantes : bain sonore, échanges bilatéraux, cavité sonore, intégration des sons de derrière i. Le miroir sonore : L'enveloppe sonore doit donc être redoublée dans un premier temps des enveloppes tactiles et visuelles. Dans cette première période, elle doit également s'étayer sur le miroir sonore de la mère, qui renvoi au bébé une image réfléchie de son état émotionnel. Les mots, phrases ou onomatopées, culturellement investis d'une dimension émotionnelle [] sont comme les fractales sonores des tensions qu'il éprouvait à ce moment-là. Ils sont portés par leur prosodie, elle-même accordée comme une harmonique à son état tonique. 49 Ce miroir n'est structurant que si, dans cet échange, la mère exprime quelque-chose de ce qu'elle perçoit de son bébé La mère renvoi donc au bébé quelque-chose du pareil, mais aussi du différent : avec un enrichissement, avec des mots qui mettent du sens ou même depuis un autre canal sensoriel. Cela permet au bébé d'enrichir ses représentations, ses modes d'expression, son expressivité ii. Les fonctions de l'enveloppe sonore : Les sons permettent la perception : D'un espace-volume commun entre les deux interlocuteurs, qui permet l'échange bilatéral, alors que l'allaitement ou l'élimination sont des circulations à sens unique. L'entendu de l'autre nous enveloppe, il vient en réponse à notre propre émission sonore et la stimule. En distinguant progressivement ce qui vient de soi et ce qui vient de l'autre, les échanges sonores permettent la différenciation soi-non soi. D'une première image du corps propre. Les sons, notamment ceux produits par le bébé, stimulent la perception d'un corps caverne sonore . Par l'intermédiaire des vibrations qu'ils induisent, ils offrent la sensation d'un volume qui se vide et se remplit. De nouvelles dimensions de l'espace : l'orientation et la distance. De la dimension temporelle 49 M-F. Livoir-Petersen, L'approche sensori-tonique et la question du morcellement, in thérapie psychomotrice et recherches, n162, 2010 46 A travers les sons, le bébé peut se représenter mentalement des objets ou évènements qui se situent hors du champ perçu par le tact ou la vision. Cela permet au bébé d'être contenu encore plus à distance. Lorsque le bébé a faim, il émet des cris caractéristiques. Avant même, de sentir son contact ou de la voir, il entend sa mère lui parler. Elle le rassure, lui dit qu'elle arrive bientôt, lui décrit ce qu'elle fait, qu'elle prépare son biberon Ce bain de paroles lui permet déjà de se calmer, avant même la satisfaction de ses besoins. Cela lui permet de commencer à anticiper le soin. Enfin, lorsque l'enfant accède au langage parlé, il peut mettre des mots sur les objets et sur ses émotions. C'est un nouveau moyen de symboliser ce qui lui arrive. Il peut désormais se raconter un petit discours interne, ce qui lui permet d'en penser quelque-chose. Il accède à la représentation de mots. L'enveloppe sonore devient alors un contenant psychique, le contenant des mots. iii. Le défaut d'enveloppe sonore : On peut évoquer un défaut du bain sonore dans les cas de : Discordance : il intervient en contretemps de ce que ressent ou exprime l'enfant. Brusquerie : tantôt insuffisant, tantôt excessif, il multiplie les micros trauma sur la pare-excitation naissante. Impersonnalité : il ne renseigne ni sur ce que le bébé vit ni sur ce que sa mère ressent pour lui. 47 11. Conclusion sur l'enveloppe relationnelle primaire a) Résumé de la genèse de la fonction contenante : La régulation tonique, l'intégration des sensorialités, la possibilité de supporter puis penser les transformations et enfin le sentiment d'être contenu dans sa propre peau sont les premières acquisitions que réalise progressivement l'enfant. 50 La genèse de la fonction contenante est donc selon A. M. Latour, un phénomène précoce. Haag situe le premier sentiment d'enveloppe aux environs des 2 mois de vie. Cette genèse va se nourrir de sensations corporelles. Mais le corps du bébé et ce qui se joue pour lui doit nécessairement être investi et transformé par l'entourage. J. B. Chapelier parle du double ancrage corporel et relationnel 51 de la contenance. Brazzelton nous dit que les multiples feed-back ponctuels qui interviennent dans la relation nourrisson-entourage maternant constituent un système dynamique, voire économique et créent une réalité psychique nouvelle de nature topographique qu'il appelle enveloppe . 52 Cette construction passe premièrement par l'étape d'un nécessaire fantasme de fusion, de peau commune, entre le bébé et sa mère. Ce fantasme est utilisé comme mécanisme de défense par le nourrisson pour calmer ses angoisses. Il permet d'établir une compréhension mutuelle précoce entre la mère et son enfant. Cet ajustement total primaire, autorisé par l'état particulier dans lequel se trouve la mère, permet au bébé de : Calmer ses angoisses Se sentir contenu physiquement, percevoir ses limites corporelles et leur intégrité Se sentir contenu psychiquement, c'est-à-dire, se sentir compris S'approprier la fonction contenante de la mère, en introjectant les contenants et les schèmes de transformation, de désintoxication des éprouvés. 50 A-M Latour, Les images du corps pré-contenantes, site psynem. org 51 J. B. Chapelier, Chaos, contenance et créativité, in Chapelier et Roffat, Groupe, contenance et créativité, Eres, 2011, p 61 52 Anzieu, le Moi-Peau, Dunod, 1995 48 Les interactions parents-enfant construisent de manière modulée et organisée, et surtout dynamique, des représentations autorisant l'établissement des contenants (corporels et psychiques) 53 Ces expériences de transformation d'abord éprouvées dans les bras de la mère [] produisent des perceptions qui sont probablement le terreau de la capacité à penser les transformations ; ce que Tisseron nomme les schèmes de transformation , forme de contenant corporo-psychiques de l'expérience des changements et modifications. 54 Mais progressivement ce fantasme de peau commune doit céder pour que s'opère l'individuation et la formation d'une fonction contenante autonome. Cela est rendu possible grâce à l'intégration des sensations tactiles et à la mémorisation des expériences contenantes, qui assurent le sentiment de continuité d'être. De plus, le bébé a fait l'expérience des transformations, d'abord de façon passive, mais il a pu intégrer les structures symboliques de la contenance. Il est désormais capable d'identifier par lui-même ses éprouvés, de les classer, de leur donner une signification, de les ordonner, de les contenir. Il peut localiser corporellement les sensations, les excitations, les pulsions ce qui permet leur transformation psychique en représentation et leur figuration, dans le langage notamment. Pour Houzel, la fonction contenante correspond au travail d'une fonction alpha pour qu'il puisse y avoir l'établissement d'un lien contenant/contenu. La fonction à contenir est un processus actif et intersubjectif de transformation du psychisme. Et pour Mellier, L'état des enveloppes psychiques traduit le résultat dynamique de ce travail. 55 b) Fonctions et qualités des enveloppes : Elles assurent la séparation entre le dedans et le dehors. De ce fait, elles protègent contre les agressions extérieures, empêchent le passage des éléments du non soi. Elles permettent aussi de localiser l'objet psychique dans un espace restreint, elles luttent donc contre son éparpillement et sa fuite. 53 Mellier, La fonction à contenir, objet, processus, dispositif et cadre institutionnel, in La psychiatrie de l'enfant, volume 48, 2005, Presse universitaire de France 54 Ibid 55 Ibid 49 Elles doivent donc posséder des capacités de solidité et d'étanchéité. Mais elles doivent également être souples et perméables de façon sélective car : Elles doivent permettre le passage des éléments à contenir. Elles doivent permettre la communication et les échanges, car tout système doit échanger s'il veut maintenir un équilibre tout en se complexifiant. Localiser ses contenus de pensée dans un espace limité est indispensable pour : Différencier ce qui est de soi et des autres. En effet, Federn pense la limite non comme un obstacle, une barrière, mais comme la condition qui permet à l'appareil psychique d'établir des différenciations à l'intérieur de lui-même, ainsi qu'entre ce qui est psychique et ce qui ne l'est pas, entre ce qui relève du Soi et ce qui provient des autres. 56 Se protéger des stimulations extérieures et acquérir la certitude de l'étanchéité de notre psychisme (les autres ne peuvent pas lire dans nos pensées, nous inculquer des pensées qui ne viendraient pas de nous). Conserver le contenu (sensations, idées), le garder à disposition, c'est la fonction mnésique, qui lutte contre la fuite psychique. Organiser nos pensées, les maitriser, éviter qu'elles nous envahissent. Mais également mettre en contact la réalité psychique et la réalité extérieure, transmettre les informations. Si l'on reprend notre définition initiale, les limites ou enveloppes sont de deux natures : Spatiales, physiques : enveloppe utérine, holding et expériences de la peau Sociales, morales, affectives : fonction alpha, proxémie, cadre, lois Pourtant, au regard des notions abordées dans cette première partie de réflexion sur la genèse de la fonction contenante, on se rend compte qu'on ne peut pas clairement les dissocier. Dans le maternage, le sensoriel est toujours coloré d'affects, de représentations, de mots . Dès la naissance, l'enfant baigne dans un bain de représentations crée par son entourage. 56 D. Anzieu, Le moi peau, Dunod, 1995, 50 On note un primat de l'expérience de la peau et du tonus car : On retrouve une structure neurologique commune à la formation du cerveau et de la peau. Ce sont les sens les plus précoces (opérationnels in-utéro). Le corps à corps est vital dans les premiers mois de vie. Ce sont les 1ers moyens de communication. Mais dès le début, ces expériences sont accompagnées de la contenance par les autres sens et par le psychisme de la mère. Les réverbérations sensorielles de l'adulte sont seules à pouvoir lui refléter visuellement, auditivement, tactilement certains aspects de son fonctionnement et de sa morphologie. Ils lui permettent de connaitre son corps sous toutes ses coutures. 57 Petit à petit, l'interdit du toucher se met en place. La communication se fait plus à distance, mais le bébé aura incorporé les sensations de son corps propre contenu, introjecté la contenance, il pourra se contenir des sens à distance et même d'une contenance toute symbolique. Les phénomènes de contenance passent donc de contenants très concrets à des contenants très symboliques comme la loi. 58 57 M-F. Livoir-Petersen, L'approche sensori-tonique et la question du morcellement, in thérapie psychomotrice et recherches, n162, 2010 58 J. B. Chapelier, Chaos, contenance et créativité, in Chapelier et Roffat, Groupe, contenance et créativité, 2011, Eres, p 65 51 Figure 5 : Schéma de la fonction contenante selon C. Ourghanlian, 2009, site internet de l'auteure ; lien et marges (enseignement spécialisé et culture) ou site internet de D. Calin ; psychologie, éducation et enseignement spécialisé 52 III. PATHOLOGIES EN LIEN AVEC UN DEFAUT DE CONTENANCE A l'évidence, nous naissons un : un organisme. Il n'est pourtant pas assuré que nous nous concevions, ni peut-être même que nous nous percevions ainsi en toutes circonstances. 59 Dans bien des cas, il apparait que les premières images du corps sont compromises dans leur mise en forme même 60 1. Réflexions sur l'origine du déficit de la fonction contenante Nous avons évoqué le double ancrage corporel et relationnel de la genèse de la fonction contenante. Ainsi une défaillance de cette dernière peut s'envisager dans les cas de : Troubles sensoriels importants, s'ils ne peuvent être suffisamment compensés par les autres sens ou par la rencontre avec un environnement porteur. C'est le cas du polyhandicap par exemple. Troubles de la relation entre le nourrisson et son entourage maternant. Dans ce second cas, les raisons sont multiples et souvent multifactorielles. Il apparaitrait que, la part de chacune des ressources développées en première partie de cet écrit, aurait été pondérée différemment chez les personnes présentant un défaut de contenance. L'ajustement d'autrui aurait pris moins de place comme source de réverbérations sensorielles : ce sont les autres sources qui auraient été surinvesties : son organisme, le milieu inerte et souvent aussi les personnes, mais hors ajustements émotionnels. Quelles qu'en soient les raisons, qu'il ne les ait pas perçue, qu'il ne l'ait pas suscitée, qu'il l'ait 59 M-F. Livoir-Petersen, L'approche sensori-tonique et la question du morcellement, in thérapie psychomotrice et recherches, n162, 2010 60 M. Latour, Les images du corps pré-contenantes, site psynem. org 53 évitée, qu'elle ait été insuffisante au regard de ses besoins ou interrompue, la possibilité d'utiliser les signaux sensoriels propre au dialogue tonique aurait manqué. 61 Il est souvent difficile de préciser qui porte la faute ; un entourage non adapté ou un bébé qui ne réagit pas aux propositions de son entourage ? En effet, la relation est une histoire qui s'écrit à deux et qui demande un ajustement mutuel. Le bébé n'est pas un être passif, il est doué très précocement de compétences pour entrer en communication et susciter les soins. Il s'agit donc d'une co-construction. A ce sujet, Brazelton définit deux notions parallèles : L'enveloppe de maternage, constituée de l'ensemble des réponses adaptées de l'entourage au nourrisson. Elle entoure le bébé d'une enveloppe de sécurité qui calme ses angoisses. Mais également sa réciproque, L'enveloppe de contrôle, constituée des réponses du nourrisson aux propositions de la mère. Ces réactions positives (apaisement, sourires, gazouillis . ) enveloppent la mère d'une enveloppe de contrôle, elle se sent performante dans son rôle maternant. En créant cette enveloppe de contrôle le nourrisson oblige son entourage à tenir compte de ses réactions. Dans le premier cas, l'entourage peut donc se retrouver dans l'incapacité de s'adapter suffisamment à son enfant et ce pour des raisons extrêmement variées ; dépression, retard mental important, troubles psychiatriques Et, si l'équipement neuropsychologique du bébé (programme, virtualités, compétences) ne croise pas un environnement qui le potentialise et lui permette de s'actualiser, il est possible que l'enfant maintienne un contact tactile, adhésif, à travers toutes ses sensorialités même distales. 62 Dans le second cas, le nourrisson peut également être indisponible à la relation. C'est notamment le cas dans des pathologies du spectre autistique. 61 M-F. Livoir-Petersen, L'approche sensori-tonique et la question du morcellement, in thérapie psychomotrice et recherches, n162, 2010 62 A. M. Latour, Les images du corps pré-contenantes, site psynem. org 54 Pour A. M. Latour justement, l'enfant autiste semble paradigme à cet égard. () les images sensorielles ne peuvent être suffisamment élaborées dans un lien à l'autre, et donc affectées, triées et nuancées par l'autre, et profiter du retour introjectif de la fonction alpha. La confusion entre perceptions sensorielles et perceptions hallucinées perdure et ne permet pas la perte structurante de l'illusion de faire corps avec la mère. 63 Anzieu, qui a évoqué ce nécessaire dépassement du fantasme de peau commune, pose l'idée que dans la psychose, la perte de cette fusion est inacceptable, impensable, insupportable. L'enfant n'acquiert pas d'individualité, on peut notamment observer chez lui des conduites de collage avec son environnement physique ou humain ou encore des hallucinations négatives des propres parties de son corps. L'image d'un corps contenant n'est pas construite. Dans la névrose, cette perte serait à peu près acceptée mais se vivrait douloureusement. Ainsi les défauts de contenances se retrouvent à des stades bien différents. Il en suit toujours l'angoisse d'une excitation pulsionnelle diffuse, permanente, non identifiable, anéantissant le sujet. 2. Angoisses liées au défaut de contenance Cette excitation vécue comme un danger peut venir du dedans. Lorsque l'enveloppe ne contient pas le monde sensoriel, affectif et représentatif de l'enfant, il est soumit à des angoisses d'éclatement, d'explosion. Elle peut aussi venir du dehors, livrant l'enfant au risque d'être percé, déchiré, abmé ou de se faire déchiqueté. Ce sont alors des angoisses par les ouvertures, de vidage (du sang ou des forces de vie) ou de contamination (d'être rempli de choses infectes). Anzieu évoque le vécu d'un Moi passoire, interrompu par des trous. S. R. Ouvray définit 2 types de danger : L'impossibilité de maintenir les liens entre les différentes parties du squelette et des organes et d'être démantelé, démembré, éparpillé, éclaté en 1000 morceaux. 63 A. M. Latour, Les images du corps pré-contenantes, p7, site psynem. org 55 Ne plus être en étayage, en échoïsation avec les autres niveaux d'organisation et de sentir des coupures entre les sensations et la pensée, entre les images et les affects, entre le corps et la tête . 64 En conséquence, l'individu aura recours à des conduites palliatives, pour tenter d'éprouver un sentiment de contenance. 3. Systèmes palliatifs de la contenance Pour Pous, un des systèmes de défense contre ses angoisse concerne le contrôle de la sensation par : Maitrise du plein : Le corps est omniprésent. L'individu peut avoir recours à des autostimulations qui revigorent la perception de soi. Maitrise du vide, la désafférentation sensorielle. Le corps est désincarné, tout ce qui compte c'est le monde imaginaire, l'intellectualisation. Mon corps n'est pas mon corps, ainsi je ne souffre pas de ce qui lui arrive. Pour M-F. Livoir-Petersen, D'un enfant à l'autre les ressources sont différentes. L'un exploitera le fonctionnement de son organisme, on peut parler de moi-muscle. Il recherche le contact d'objets durs et les appuis sensoriels distaux. L'autre fera de l'hypotonie un usage systématique, utilisant toute sa surface tactile pour maximiser les contacts Chez d'autres encore, c'est le moi-os qui domine : l'enfant produit ou recherche des vibrations, saute, se tasse sur ses talons Beaucoup dépendent des vêtements qui les enveloppent tactilement et visuellement pour conserver un retour sensoriel global et unifiant. 65 64 S. Robert-Ouvray, Angers 25 septembre 2009 XXXVIIIème Journées annuelles de Thérapie Psychomotrice 65 M-F. Livoir-Petersen, L'approche sensori-tonique et la question du morcellement, in thérapie psychomotrice et recherches, n162, 2010 56 On note donc des symptômes extrêmement variés, tentative singulière de chaque individu de retrouver une contenance : Troubles de la régulation tonique : La notion de cuirasse musculaire développée par Reich peut se décrire comme un ensemble de crispations et de rétentions toniques qui font tenir ensemble les différentes parties de soi. Les sensations liées à ce durcissement musculaire préparent les fantasmes d'armure, de cuirasse, de personnage indestructible. 66 Au contraire, le recours à l'hypotonie par désinvestissement du corps ou pour permettre l'hyper-adaptation, le moulage avec le support physique, humain ou matériel. Le recours au tonus pneumatique par blocage de la respiration est une autre possibilité. L'asthme est cité par Anzieu comme une manière de se gonfler d'air, pour sentir les limites par le dedans d'un soi élargit, gonflé 67 Troubles de l'image du corps : non conscience de certaines zones corporelles, hallucination négative permanente Autostimulation sensorielle (stéréotypies) par recherche d'immuabilité. L'objet moi ne se maintien que par des retours sensoriels prévisibles. Cela lui permet de baigner dans un bain de sensations connues donc rassurantes, et assurant une continuité. De plus, l'auto-entretien de ces stimulations permet d'en maitriser la source, la quantité et de diminuer le seuil de sensibilité aux autres sensations, non maitrisables donc débordant potentiellement les ressources de l'individu. On peut observer des agrippements sensoriels (visuels, auditifs, vestibulaires ) sans adaptation à la situation. Inhibition psychomotrice Instabilité psychomotrice : Golse parle d'une enveloppe motrice défensive face à un défaut de contenance primordial 68. 66 S. Robert-Ouvray, Angers 25 septembre 2009 XXXVIIIème Journées annuelles de Thérapie Psychomotrice 67 Anzieu, Le Moi-Peau, Dunod, 1995, p130 68 B. Golse, L'enfant excitable, Enfance et psy2/2001(n14), p 53 57 Troubles de la distance : Evitement du contact ou au contraire collage à l'objet ; certaines personnes ne connaissent leurs contours que calés sur la consistance d'autrui, collé à sa peau. Recherche d'une enveloppe de souffrance, développée par Enriquez. Troubles mnésiques Cette liste ne se veut pas exhaustive. Elle a simplement la prétention d'apporter un éclairage, une ouverture sur les différents troubles que peuvent provoquer le défaut de contenance. Dans une dernière partie, par l'intermédiaire du récit de la prise en charge de 2 enfants, nous serons amenés à nous intéresser plus en détail au défaut de contenance dans le cas d'une inhibition psychomotrice et d'une instabilité psychomotrice. 58 IV. CONSTITUER UN PROJET THERAPEUTIQUE CONTENANT EN PSYCHOMOTRICITE 1. Annonce de la problématique et des hypothèses de travail Au regard des éléments développés précédemment, il convient maintenant de se demander : Comment la psychomotricité peut-elle intervenir auprès de patients souffrant d'un défaut de contenance ? Voici les hypothèses de travail que l'on peut poser : a) Le psychomotricien peut décrypter les symptômes en lien avec un défaut de contenance, en ayant une lecture favorisée de l'image du corps. Cela passe par une observation sensible : a. Du dialogue non-verbal et notamment du tonus b. De l'utilisation et de la représentation de l'espace et des formes géométriques que réalise le patient c. De la résonnance émotionnelle et tonique provoque en lui, la rencontre avec le patient b) Le psychomotricien peut mettre en place une thérapie à médiation corporelle afin de permettre la prise de conscience des enveloppes corporelles et de leur intégrité et relancer la dynamique de transformation pour favoriser l'émergence d'une fonction contenante autonome. Ce travail passe notamment par : a. L'accueil des symptômes, leur reconnaissance comme la tentative d'expression d'un mal-être. b. Le repérage des modalités sensorielles privilégiées du patient pour user des niveaux de contenance les plus appropriés ; la voix, le regard, les règles 59 c. La figuration des contenants à plusieurs échelles : i. L'institution ii. Le cadre thérapeutique iii. La salle de psychomotricité iv. La psyché du psychomotricien v. L'échange, le jeu commun vi. Des contenants concrets : boites, cabanes d. De façon transitoire, l'appareillage de la psyché du patient sur la propre fonction à contenir du thérapeute, qui dose les stimulations, fait vivre les expériences de transformation puis le rassemblement e. L'action sur le corps propre, la sensorialité, la motricité pour nourrir une autre image du corps. 60 2. L'image du corps L'image du corps réalise la synthèse vivante de nos expériences émotionnelles archaïques ou actuelles. Elle en constitue une incarnation symbolique. On peut détailler 2 fonctions symbolisantes fondamentales : Celle qui réalise le lien dynamique entre les différentes parties du corps et la totalité. Au-delà de cette forme, celle qui concerne le contenu et le sens de ce lien. F. Dolto précise 3 facettes de l'image corporelle : L'image de base : elle nous permet de reconnaitre que nous sommes dans une mêmeté d'être malgré les mutations. L'image fonctionnelle : c'est l'image sthénique de l'individu qui accomplit une action, soutenue par un désir. L'image érogène : elle est centrée sur l'idée du plaisir des plaisirs. L'image corporelle, fondée sur le vécu émotionnel des expériences corporelles, est donc en lien avec la fonction contenante. Elle symbolise le lien entre les différentes parties du corps et introduit ainsi la notion d'unité, très en lien avec le tonus. Les images fonctionnelle et érogène quand à elles, nous parlent des pulsions, de leur mise en sens et de leur organisation pour une action ajustée et productive. a) Le tonus : Nous avons déjà abordé l'importance du tonus dans la constitution du sentiment d'enveloppe, ainsi que la notion de dialogue tonico-émotionnel. Nous pouvons ici évoquer son lien avec l'image corporelle. En effet, le tonus est l'élément qui, par diffusion, réalise le lien entre les différentes parties du corps. La modification tonique de certaines parties du corps peut alors être le signe d'un défaut de perception de cette zone corporelle. Une zone qui peut concentrer les angoisses du patient. Cela nous permet d'envisager le tonus comme moyen de lecture du trouble. 61 Le tonus peut également être utilisé comme outil thérapeutique. Le psychomotricien tente, dans un premier temps, de transfuser sa détente tonique au patient. Puis, il pourra avoir comme objectif de faire vivre au patient une alternance d'états toniques, entre la détente et la contenance tonique, à l'image de ce qui se joue chez le petit enfant et que nous avons déjà développé. b) L'espace comme miroir du corps propre : Sami Ali nous explique que le corps de l'enfant est sa première référence. C'est lui, qui se projette et donne sens à l'espace. On parle alors de symbolisation primaire pour définir l'utilisation et le détournement des formes spatiales et de l'espace, comme première forme de symbolisation, qui permet à l'enfant de se raconter et de penser quelque-chose de ses expériences corporelles. Cette symbolisation primaire passe donc par l'action. Chez les jeunes enfants, on peut observer un attrait pour des formes ou des espaces qui font résonnance avec leur niveau de structuration et le vécu qui cherche à se symboliser à un moment précis ; représentations de ronds, cachettes dans des cabanes Chez les enfants pour qui le vécu corporel reste à des stades très archaïques et qui ne perçoivent pas leur corps comme un élément clos, sécure et différencié des autres, on peut observer une recherche compulsive d'objets particuliers, intéressants par leur forme, notamment des objets troués, qui figurent leur image d'un corps percé . Livoir-Petersen remarque leur intérêt anxieux pour les morceaux et les objets cassés 69. Elle pose ensuite l'hypothèse que la manipulation d'objets durs susceptibles de se fragmenter (ou de disparaitre) peut être le moyen de se procurer des signaux visuels, tactiles, auditifs en rapport avec l'expérience de la segmentation (ou de l'effondrement) ; ils lui permettent de les représenter. 70 En thérapie psychomotrice, le psychomotricien met à disposition du patient, du matériel, un médium, capable d'accueillir ces premières transformations, qui permette au patient de mettre en scène son vécu corporel. Il lui fournit aussi des outils (objets contenants 69 M. F. Livoir-Petersen, L'approche sensori-tonique et la question du morcellement, in thérapie psychomotrice et recherches, n162, 2010, p 40 70 Ibid, p 53 62 et pré-contenants, c'est-à-dire percés) pour qu'il fasse progressivement l'expérience de la contenance, du rassemblement Le repérage des différents espaces (celui de la salle de psychomotricité, celui d'une cabane ou d'une boite, l'espace intime de chacun) et l'intériorisation des différents temps (ponctués notamment par les rituels de début et de fin de séance) concourent à l'élaboration de limites psychiques. C. Potel nous dit que la différenciation des espaces va venir soutenir une ébauche de différenciation des espaces psychiques. 71 Les patients manipulent les matières (eau, semoule) et les objets, comme des figurations de leurs états émotionnels qu'ils ne peuvent représenter, décrire, qu'ils peuvent uniquement mettre en acte. Ce que l'enfant joue [] c'est son corps imaginaire. Ce sont les transformations fantasmées de ses premières enveloppes toniques. 72 Un enfant qui éparpille, nous raconte qu'il se sent lui-même éparpillé. A nous de lui faire vivre d'abord cet éparpillement, puis ensuite de lui faire vivre, passivement puis activement, qu'on va se rassembler. Le psychomotricien théâtralise alors ce rassemblement : en ramenant tous les grains de semoule dans une boite, en restaurant l'espace tout entier de la salle en fin de séance . Le psychomotricien permet, dans une certaine limite qui dépend du cadre posé, quelques débordements pour montrer à l'enfant que le médium, le psychomotricien et lui-même, survivent à ses attaques, à ses angoisses. Il va stimuler et accepter les excitations motrices ludiques, tout en assurant les conditions de leur intégration psychique. 73 Cela permet paradoxalement de poser une certaine limite à sa toute puissance. Il peut progressivement penser et ressentir que ses affects ne sont que des mouvements internes, limités par la réalité. Cela doit tendre à diminuer son angoisse et lui permettre de distinguer le monde interne de la réalité extérieure. C'est accepter d'avoir des pensées négatives en soi et prendre conscience qu'elles ne détruiront pas l'objet de ces pensées. 71 C. Potel, La question du cadre thérapeutique, la contenance, les limites, le corps, in Etre psychomotricien, Eres, p 332 72 S. R. Ouvray, Les transformations fantasmées de l'enveloppe tonique primitive, Thérapie psychomotrice et recherches, n162, 2010, p124 73 C. Potel, La question du cadre thérapeutique, la contenance, les limites, le corps, in Etre psychomotricien, Eres, 2010, p330 63 Pour cela, le médium utilisé doit avoir certaines qualités spécifiques, le cadre doit être pensé pour permettre ce travail et enfin le psychomotricien lui-même doit prendre la position d'un contenant potentiel. 3. La médiation La médiation est ce qui fait lien entre le patient et le psychomotricien. Elle doit donc être attractive pour les deux partenaires. Elle est l'objet d'une attention conjointe, d'un partage d'expérience. C'est ce partage d'une expérience commune, qui place le patient et le psychomotricien dans un même bain sensoriel, et permet au psychomotricien d'élaborer des hypothèses sur le vécu du patient. Il propose ensuite ses hypothèses au patient pour lui permettre d'y trouver du sens et d'en élaborer une représentation. Nous verrons effectivement que la capacité d'empathie du psychomotricien et son attention particulière à son propre état émotionnel sont des outils précieux. Il faut rester attentif à ne pas prendre le représentant concret de la médiation pour la médiation. 74 Car la quintessence de la médiation est immatérielle : elle est dans les processus déliaison/reliaison. 75 Elle n'existe donc pas pour elle-même. Elle représente l'activité de représentation. La pâte à modeler par exemple n'est pas la médiation, elle est le support d'un travail de transformation qui soutient la mise en représentation. Elle en est un outil, un média. R. Roussillon définit alors les qualités que doit posséder un média thérapeutique selon lui, pour être transformateur, symboliseur, entre la réalité psychique et la réalité externe. a) La notion de médium malléable : R. Roussillon introduit la notion de médium malléable et cite 5 propriétés que ce dernier doit présenter : Indestructivité Extrême sensibilité 74 R. Roussillon, in Entretien avec René Roussillon, par B. Sage et B. Guillaumin, Thérapie psychomotrice et recherches, n 98, 1993, p26 75 Ibid 64 Transformable indéfiniment Disponibilité inconditionnelle Capable d'animation propre Le jeu peut remplir ses conditions. b) Le jeu : Un enfant qui va bien joue spontanément, car c'est une activité fondamentale pour lui. Cette activité répond à plusieurs besoins essentiels, qui sont non sans rappeler ceux de la fonction à contenir : Epuiser la charge affective, les tensions et angoisses, lors des absences de la mère par exemple Tenter de trouver un sens aux mouvements émotionnels et pulsionnels qui le traversent Communiquer et partager avec son entourage Le jeu permet un mouvement de l'intérieur vers l'extérieur. Il permet la libre expressivité de soi sans risque, c'est-à-dire, sans risquer de détruire réellement l'objet ou sans s'exposer à des poursuites de sa part (le rejet, l'attaque), car c'est pour de faux . En abolissant provisoirement et dans un cadre donné, la limite entre le monde interne et le monde externe, il permet à l'enfant d'assimiler le réel au Moi. Il peut donc être envisagé comme un médiateur de la vie psychique de l'enfant. A ce niveau, il remplit toutes les conditions d'un médium malléable. Le jeu partagé va être l'un des éléments clés, un des leviers thérapeutique essentiels dans cette construction d'une enveloppe contenante. 76 De ce fait, le choix des jeux faits par l'enfant suit son développement psychomoteur. 76 C. Potel, La question du cadre thérapeutique, la contenance, les limites, le corps, in Etre psychomotricien, Eres, 2010, p335 65 Les jeux : De manipulations : emboitement, jeté permettent de tester la résistance et de réparer le bon objet. D'alternance : font comprendre à l'enfant le rôle et le rapport des différents partenaires et la réciprocité de leurs actions. Symboliques : permettent la réalisation des pulsions partielles et de revivre des situations pénibles en les transposant symboliquement. 66 4. L'enveloppe institutionnelle La dimension institutionnelle se compose de différents niveaux de fonctionnement : administratif, juridique, hiérarchique, travail pluridisciplinaire, communication qui créent un ensemble d'enveloppes emboitées les unes dans les autres, se contenant réciproquement. D. Houzel développe donc la notion d'enveloppe institutionnelle. Selon lui, elle se caractérise par des qualités : Etanchéité : Ce qui se passe, ce qui se dit, ce qui se vit, dans l'institution doit être gardé à l'intérieur de l'institution et ne jamais diffuser au dehors. 77 Perméabilité : C'est la possibilité malgré tout, d'établir des échanges avec l'extérieur, notamment avec la famille, l'école tout en respectant la règle de l'étanchéité précédemment citée. Il faut donc recueillir l'accord du patient ou de son représentant légal. Consistance : Il s'agit de la capacité à résister aux pressions, extérieures ou intérieures. L'institution doit faire face et maintenir une position stable, si elle est l'objet d'attaques. Elasticité : C'est la capacité à se déformer, sans se rompre sous l'effet de pressions internes ou externes 78. L'institution doit pouvoir accueillir et contenir les souffrances du patient et de sa famille et pouvoir s'adapter aux demandes latentes, dissimulées sous la demande officielle. A l'image des enveloppes que nous avons détaillées plus tôt, l'enveloppe institutionnelle doit être à la fois rigide mais souple. L'institution assure donc un rôle de contenance à la fois pour le patient et pour le thérapeute. Elle fait tiers entre eux deux et leur construit un cadre de travail sécure et prévisible. Du coté de l'équipe, l'institution joue un rôle important. En effet, les souffrances et projections du patient impactent l'équipe qui, à son tour, peut attaquer l'institution. Cette dernière doit contenir ce qui est projeté par les équipes ; angoisses, colères, résistances face 77 D. Houzel, Le concept d'enveloppe psychique, p149, site psynem. org 78 ibid 67 aux changementsElle doit également restituer des choses élaborées en terme d'organisation, informations, plannings, règles 5. Le cadre thérapeutique Le cadre est ce qui borne l'action de quelqu'un ou quelque-chose. Il délimite la séparation entre le dedans et le dehors, mais c'est aussi un lieu, un espace qui tient ensemble. Il contient à la fois le patient et le thérapeute, car il représente l'espace o se confrontent les scènes psychiques de ces deux partenaires. M. Martin dit qu'il contient l'intériorité , c'est- à-dire la pensée, de chacun. Mais tout en constituant un espace commun, il constitue un tiers, rappelant que toute relation duelle est illusoire. Après un premier mouvement régressif de l'ordre de la fusion, il permet l'individuation du patient. D. Anzieu compare ainsi le cadre à un contenant naturel. Les pensées et les excitations y sont limitées dans leurs effets désorganisateurs et peuvent donc être contenues. C'est donc un espace o la rencontre peut avoir lieu sans danger et o le patient peut réaliser des associations. C. Potel distingue un cadre physique et un cadre psychique : Le cadre physique remplit des : o Conditions d'espace : accueillir les excitations, les plaisirs. Il faut concevoir l'espace comme un vrai réceptacle contenant les expériences sensorielles et motrices. o Conditions de matériel : le psychomotricien implique sa propre sensibilité et son investissement sensoriel dans le choix des objets. o Conditions de temps : il s'agit d'organiser l'espace, de bouger son corps [] avec une régularité de temps pour qu'elles s'intègrent comme des repères. 79 Conditions d'encadrement : Moyens humains (travail en co-animation par exemple) et ensemble des règles structurantes et sécurisantes. 79 C. Potel, La question du cadre thérapeutique, la contenance, les limites, le corps, in Etre psychomotricien, Eres, 2010, p 322 68 o Conditions de fonctionnement institutionnel : un travail d'équipe qui construit un projet global, cohérent pour les patients. Le cadre psychique est composé des postulats théoriques qui garantissent une mise en pensée de notre travail. Il se traduit par l'engagement du psychomotricien, un engagement aussi bien corporel que psychique. Le cadre thérapeutique permet donc de contenir une action thérapeutique dans un temps, un lieu, une pensée. Pour Pommereau, avec le cadre il est effectivement question de contenance, et non de détention. Ses éléments doivent être fermes et stables mais aussi souples pour absorber les contraintes et éviter les cassures. Ainsi, le cadre dépend de chaque patient, de sa pathologie, de sa personnalité et du projet thérapeutique que l'on construit avec lui. Il est aussi dépendant du lieu d'exercice et du psychomotricien lui-même, de sa sensibilité. Winnicott préfère au terme de cadre, la notion de setting. Le setting correspond à un aménagement du dispositif thérapeutique, qui permet d'offrir des possibilités au patient, en réunissant des conditions favorables et adaptées afin de créer une situation donnée. Pour résumer, le cadre est fondamentalement ce qui vectorise l'écoute. 80 Une écoute qui ne se résume bien entendu pas au verbal. Le cadre c'est aussi et avant tout la disponibilité psychique du thérapeute [] sa propre capacité à être, en même temps, un réceptacle et un séparateur. 81 80 R. Roussillon, in entretien avec René Roussillon, par B. Sage et B. Guillaumin, Thérapie psychomotrice et recherches, n 98, 1993, p26 81 C. Potel, La question du cadre thérapeutique, la contenance, les limites, le corps, in Etre psychomotricien, Eres, 2010, p331 69 6. La fonction contenante du thérapeute Calin82 évoque une fonction contenante qui serait préalable au cadre. Celle-ci serait assurée par le thérapeute lui-même. Cette fonction contenante se détaille en 2 sous-fonctions : La fonction d'apaisement : c'est la capacité du thérapeute à accueillir les angoisses, tensions, excitations, à les absorber, les réduire. La fonction d'adossement : c'est la capacité à favoriser chez les autres, la liaison, l'unification, de leurs mouvements émotionnels, pulsionnels et de leurs représentations psychiques. Ces deux sous-fonctions réalisent des mouvements de sens inverses : l'accueil des éléments béta, leur transformation et le renvoi des éléments alpha. Pour Y. Milleur83, afin d'assurer une fonction contenante, le thérapeute doit développer plusieurs capacités : Capacité d'accueil : Le patient évacue ses angoisses sous forme d'agir, en les faisant vivre à l'autre. Le psychomotricien doit être prêt à se laisser toucher, habiter par des éprouvés puissants. Capacité de réserve ou de refusement : Il doit retenir ses tentations de décharger ces vécus par l'action et les élaborer pour le compte du patient. Il doit supporter de ne pas tout comprendre. Capacité à supporter ou survivre à la violence : Pour Gilbello, dans un premier temps, l'angoisse engendre chez le sujet, une volonté de destruction de l'objet. Dans un second temps, la pulsion épisthémolitique le poussera à tenter de comprendre et investir l'objet. Le thérapeute qui survit aux attaques du patient, fonde un nouvel état interne chez le patient, un état limité par la réalité. Capacité de se connaitre soi-même et de percevoir ses propres limites : Son premier outil est la connaissance qu'il a de lui-même : une connaissance sensorielle, psychomotrice . 84Cette connaissance lui permettra de déceler ce que le patient 82 Calin, site internet : psychologie, éducation et enseignement spécialisé 83 Y. Milleur, La contenance comme processus psychique, revue Soins psychiatrie, n295 84 Ibid, p324 70 induit comme changement en lui. Il doit également pouvoir s'en remettre à ses collègues dans les moments difficiles. On peut ajouter : la capacité de pare-excitation : le psychomotricien joue le rôle de filtre, il dose les stimulations. la capacité de transformation : Le thérapeute se met à disposition de l'enfant comme facteur de réflexion émotionnelle. Dans ce cadre, il n'est pas rare qu'il fasse éprouver à son partenaire ou exprime clairement des interrogations telles que : est-ce que je peux casser ? Est-ce que toi aussi tu es fait de morceaux ? 85 a) S'écouter soi-mêmepour entendre le patient : Le patient nous fait donc vivre ce qui se passe pour lui. La meilleure façon de percevoir ce qu'il souhaite nous communiquer est d'être attentif aux mouvements sensoriels et émotionnels qu'il éveille en nous. Pour Bion, [] un grand nombre d'interprétations, et les plus importantes d'entre elles, doivent être fondées sur les émotions et les affects ressentis par l'analyste. 86 C. Potel pense elle aussi, que c'est au travers de notre sensorialité et de l'écoute de cette sensorialité en résonnance, voire parfois en miroir [] que nous allons donner sens à ce que l'enfant nous fait vivre, et probablement à ce qu'il vit en lui-même d'anarchique. 87 Cette sensibilité à soi-même nourrit la capacité d'empathie. Liotard nous dit que cette dernière est indispensable pour comprendre autrui, cette notion s'appuie sur le vécu corporel et sensible du thérapeute qui accueille cet envahissement du patient, tout en le reconnaissant comme bien séparé de lui . 85 M. F. Livoir-Petersen, L'approche sensori-tonique et la question du morcellement, in thérapie psychomotrice et recherches, n162, 2010, p54 86 Ducret, La contenance, histoire d'un concept, in Chapelier et Roffat, Groupe, contenance et créativité, Eres, 2011, p22 87 C. Potel, La question du cadre thérapeutique, la contenance, les limites, le corps, in Etre psychomotricien, Eres, 2010, p 344 71 Pour N. Kacha, la qualité essentielle pour assurer une fonction de contenance est l'attention. Meltzer parle de capacité psychique d'être présent, de ne pas avoir la tête ailleurs . 88 La notion d'attention regroupe une qualité de présence psychique et de présence relationnelle ; le psychomotricien tient compte de son positionnement dans l'espace, de sa propre tonicité, de ses appuis, des inflexions de sa voix, de sa mélodie, de son rythme b) Le thérapeute contenu : Le thérapeute ne peut assurer sa fonction contenante seul. Il doit : Etre contenu lui-même par l'institution. Faire un travail de supervision, qui lui permette de détoxiquer ses vécus bruts, élaborer à partir d'eux des représentations qu'il pourra transmettre au patient. Suivre régulièrement des formations pour actualiser ses connaissances théoriques. Participer à des ateliers personnels pour rester sensible à sa sensorialité, vivre lui- même les expériences de transformation et être au clair sur ses points de blocage. Le psychomotricien devra lui-même être contenu par ses connaissances, son superviseur, son institution, différents contenants qui [] lui permettront d'assurer au mieux sa fonction de contenance. 89 88 N. Kacha, La fonction contenante du thérapeute, in Chapelier et Roffat, Groupe, contenance et créativité, Eres, 2011, p87 89 Ibid, p95 72 7. Clinique a) Ophélie et l'inhibition psychomotrice : i. Anamnèse et orientation au CAMSP : Ophélie est une petite fille née le 4 février 2011, à terme, à la suite d'une grossesse sans complications médicales. A la naissance elle pèse 2, 7 Kg et présente un score APGAR de 10/10. Elle a un grand frère né en 2003 et une grande sœur née en 2008. Ses deux parents sont placés sous un régime de curatelle. Son père travaille de jour et sa mère est sans emploi. Ophélie est gardée la journée par une assistante maternelle car la maman dit être malade des nerfs et ne pas pouvoir s'occuper de sa fille . Ophélie est hospitalisée entre le 06 et le 12. 04. 11 pour mauvaise prise de poids, elle pèse 3. 5 Kg à 8 semaines. Le bilan d'hospitalisation note une constipation (1 selle/semaine), un aspect cutané très marbré, une dysmorphie faciale qui motivera la réalisation d'un caryotype à la recherche d'une dyschromosomie mais qui s'avèrera négatif. Ophélie réalise une prise de poids de 120g en 6 jours, elle est donc autorisée à rentrer au domicile familial, avec un suivi par la PMI de secteur. Quand Ophélie à 4 mois, une puéricultrice du centre médico-social l'oriente vers le CAMSP pour retard global, difficultés d'alimentation et de communication. ii. Premier RDV médical et première indication (4 mois) : Compte rendu de la consultation avec le médecin du CAMSP : Le médecin observe des réflexes rotuliens vifs, une bonne tenue de la tête ainsi qu'une bonne poursuite oculaire sur 180. Ophélie pèse désormais 4, 210 Kg à 4 mois. Elle parvient à attraper des objets sur la ligne médiane, repousse sa tétine avec la langue et cherche à se redresser. Pourtant elle présente aussi une hypotonie du tronc, ses bras en chandeliers et les poings crispés. La maman raconte qu'Ophélie fait ses nuits, qu'elle dort beaucoup, qu'elle pleure souvent mais se calme à la voix. C'est une petite fille fatigable, qui prends très lentement pendant les tétées et qui ne grossit pas. Le médecin ne note pas de troubles de la déglutition. 73 Lors de cette consultation, Ophélie est accompagnée de sa maman et de sa grande sœur. Le médecin observe que cette dernière se montre capricieuse, prend toute la place et donne des conseils à sa maman. A la suite de cette première consultation, l'équipe décide d'une première orientation en atelier mère-enfant, co-animé par une psychomotricienne et une infirmière puéricultrice, une fois par semaine. Cette décision est motivée par le très jeune âge de la fillette et des difficultés observées de communication avec sa maman. Cet atelier doit permettre une observation plus soutenue de l'évolution d'Ophélie et un étayage de la relation mère-enfant. iii. Atelier mère-enfant (de 8 mois à 1 an et 8 mois) : Une première période est dédiée au bilan psychomoteur : Ophélie accroche le regard si elle croise le regard de l'adulte mais ne recherche pas d'elle- même le regard de ses parents. La mère montre des comportements contrastés, elle souhaite s'occuper de sa fille mais lui assure une attention fragmentée, elle reste passive et confie systématiquement sa fille à l'adulte présent. La mère parle de ses difficultés à se séparer de sa fille. Elle ne peut pas se représenter sa fille comme différente d'elle. Elle ne contrôle pas ses impulsions, a des gestes non adaptés, impose le corps à corps par moment. Se pose la question d'un défaut d'attachement. Avec son papa, Ophélie serait plus dynamique. Au cours des 4 séances de bilan, on observe une évolution. Lorsque les parents sont eux- mêmes soutenus sur le plan de la relation, ils montrent une meilleure attention à leur fille. Ophélie montre désormais des manifestations à la séparation. Lors de la dernière séance elle mobilise ses membres inférieurs dans des mouvements de repoussé. Toutefois à 9 mois, elle ne se reconnait pas encore dans le miroir, l'expression des émotions reste succincte même si le visage d'Ophélie est moins figé. Face aux intrusions de sa sœur, elle présente des effondrements toniques, une fermeture du visage mais ne cherche pas la réassurance auprès de ses parents, ni par le regard, ni par des cris. Les observations en cours de prise en charge font état : Des difficultés d'accordage entre Ophélie et sa maman, dans une discontinuité, alternant entre des moments de collage fusionnel et des moments de l'ordre de l'oubli plutôt que d'un réel rejet. 74 De la détresse d'Ophélie qui mobilise toute son attention pour solliciter sa mère, sans que cette dernière ne comprenne les tentatives de communication de sa fille. D'un tableau de dépression précoce chez Ophélie qui présente une hypotonie axiale persistante, des effondrements toniques brutaux, une atonie, des difficultés d'alimentation et des affections ORL à répétition. Au bout de 4 mois de prise en soin : La prise en soin montre la persistance des carences et incapacités maternelles. Ophélie dormirait dans le lit parental. Lors des congés de son assistante maternelle, la petite fille perdrait du poids. L'hypothèse d'une pathologie psychiatrique associée à une dépression de la maman est questionnée par l'équipe. Cette dernière peut livrer ses difficultés à s'occuper de ses enfants. Elle confie également le problème d'alcoolisme de son mari. Avec son accord, le CAMSP demande une rencontre en Unité Territoriale et dépose une première Information Préoccupante pour violences maternelles et négligences. Ophélie souffre d'un manque d'hygiène et de soins somatiques. Elle présente un tableau de dépression précoce et une anorexie. 6 mois plus tard, le CAMSP décide l'arrêt des soins et transmet une nouvelle IP. Une mesure AEMO est prise pour Ophélie. Le 16 octobre 2012, à 1 an et 8 mois, Ophélie est placée chez une assistante familiale. Son frère et sa sœur sont maintenus au domicile familial. Des rencontres sont assurées 1 fois tous les 15 jours. Depuis son placement, Ophélie mange de tout, elle est plus dynamique et semble apaisée. Cette modification de l'organisation familiale entraine un réarrangement de la prise en soin au CAMSP ; une guidance pour son assistante familiale assurée par l'infirmière puéricultrice et des séances individuelles de psychomotricité. iv. Prise en soin individuelle en psychomotricité (À partir de 1 an et 9 mois) : A partir de ses 1 an et 9 mois, Ophélie est donc suivie 1 fois par semaine en psychomotricité. En effet, au cours de l'atelier, Ophélie a su montrer son désir d'évolution malgré un contexte familial peu porteur, elle a su se saisir des propositions sensori-motrices et de l'étayage de la psychomotricienne avec un réel intérêt pour la relation et un potentiel 75 décuplé quand elle se sent contenue et sécurisée. Ce choix de prise en charge est motivé par le retard psychomoteur global de la fillette, sa grande passivité, son absence de jeu spontané, son désintérêt pour l'autre en dehors des sollicitations soutenues et son manque d'expressivité. C'est une petite fille qui ne demande rien, qui n'exprime aucune envie, ni aucune protestation. Les objectifs de cette prise en soin seront de la réassurer en lui assurant une continuité et un cadre contenant, pour l'aider à : investir son corps propre et favoriser la sensation des enveloppes corporelles pour une plus grande sécurité investir la relation exprimer ses émotions sans angoisse faire émerger le jeu pour symboliser ses difficultés et exprimer sa créativité stimuler sa curiosité pour pallier à sa grande passivité v. Mes rencontres avec Ophélie (de 2 ans et demi à 3 ans) : Je rencontre Ophélie dans le cadre de mon stage de 2nde année, au CAMSP, lors de sa prise en charge en psychomotricité. Physiquement, c'est une petite fille plutôt petite pour son âge. Marquée par les carences, elle a le teint pâle et une silhouette menue. Elle a de longs cheveux blonds et raides, une frange épaisse occupe tout son front et lui cache la partie haute des yeux. Elle est désormais habillée de façon coquette avec des petites barrettes roses et des vêtements soignés. Lors de notre première rencontre elle a 2 ans et demi. La psychomotricienne part chercher Ophélie dans la salle d'attente. Elle lui a parlé de ma venue depuis plusieurs semaines et dans le couloir qui mène à la salle de psychomotricité elle recueille une dernière fois son accord. Je suis assise dans le coin opposé à la porte d'entrée. Ophélie entre dans la salle, à ma vue elle se fige, ne parle plus. Elle m'observe longuement. La psychomotricienne lui demande si ma présence la dérange, la fillette ne répond pas, elle la questionne sur les jeux qu'elle souhaite faire, toujours pas de réponse. Elle s'assied autour de la petite table ce qui semble la rassurer. Petit à petit, elle reprend ses jeux habituels. Au bout d'un quart d'heure environ, la psychomotricienne lui propose de sortir les instruments de musique, elles se placent toutes les deux sur un tapis, face à moi. Par moments, Ophélie continue de me regarder. Elle prend le tambourin et se met à frapper extrêmement fort dessus 76 de façon à faire un maximum de bruit. Je fais alors semblant d'avoir peur et cache mon visage derrière mes mains quelques secondes. Ophélie semble intéressée, elle m'observe puis recommence à faire du bruit. Un véritable échange s'installe. Ophélie reconduit son jeu et attends une réponse de ma part, elle laisse du temps et me regarde comme pour me signifier mon tour de répondre. La fin de la séance arrive, Ophélie est proche de la porte. Elle me tire la langue. Je l'imite. Cela semble lui plaire, elle me tire encore une fois la langue d'un air malicieux. Je l'imite encore en ajoutant une variante ; de grandes oreilles en remuant les mains. Cette fois, c'est elle qui m'imite. Puis d'un coup je perçois une reprise tonique, elle se raidit et semble submergée d'angoisse à nouveau. Elle se retourne si précipitamment pour sortir de la pièce qu'elle manque se cogner de peu. Ce qui ressort de cette première rencontre c'est le fait que face à l'introduction angoissante d'un tiers, qui vient faire effraction dans sa relation privilégiée avec la psychomotricienne et dans son espace sécure de soin, Ophélie reprend ses anciennes défenses ; dans le mutisme et l'inhibition psychomotrice. Peu à peu elle réussit à se réaffirmer et à exprimer ses émotions, à les symboliser dans le jeu et finalement à initier un véritable échange. Il m'apparait que dans le jeu du tambour, elle me fait vivre la peur qu'elle a eut en me voyant dans la salle et parvient à exprimer son agressivité. Lors d'autres séances elle pourra symboliser son agressivité envers moi en jetant très fort le ballon par terre ou en utilisant des pistolets. A la fin de la séance, elle jubile de se voir imitée, elle ne se sent pas persécutée par l'imitation et y prends même du plaisir. Elle se situe réellement dans une attention conjointe, repère distinctement les différentes personnes et ébauche une individuation. Lors d'une séance suivante, Elle accepte ma présence à la table. Elle est cette fois en capacité d'exprimer verbalement son refus que je participe au jeu de lentilles. Elle donne à manger avec la cuillère au bébé, à la psychomotricienne, à elle-même mais pas à moi. Je choisis de faire semblant d'être triste et d'avoir faim. Ophélie commence enfin à s'intéresser à moi. Je vole une lentille dans le bac, Ophélie esquisse un sourire. Elle m'intègre alors à son jeu, me distribue une assiette et la remplit. 77 Au cours des séances, J'ai pu observer une petite fille dynamique, qui a envie de faire seule (monter seule sur la chaise pour accéder au lavabo, enlever et remettre ses chaussures seule). La motricité fine est encore en retard mais se travaille à travers les jeux de pâte à modeler, de lentilles, de peinture Elle réussit à exprimer son agressivité de façon symbolisée et à s'affirmer. Elle commence à s'intéresser aux jeux de faire semblant, avec un imaginaire de plus en plus riche (elle rajoute du sel dans mon assiette, saisit des objets imaginaires, fait le bruit des ustensiles). Elle questionne énormément la question de la propreté, par l'intermédiaire du poupon qu'elle met sur le pot. Elle supporte encore difficilement d'avoir les mains sales. L'usage de la parole apparait par moments de façon spontanée. Le oui et le non sont utilisés de façon adaptée. En ce moment, le non est prépondérant, il marque une toute puissance et participe d'un mécanisme de défense par rapport à la nouveauté et à ce qui pourrait la déborder. Le je émerge ponctuellement, signe du phénomène d'individuation en cours. La propreté est logiquement en cours d'acquisition. Ophélie s'est montrée en capacité de faire face à l'introduction d'un tiers dans la relation privilégiée et sécure avec la psychomotricienne. Elle a pu exprimer les émotions provoquées en elle, s'opposer à quelqu'un, ce qui lui était impossible dans la relation duelle. Dans l'avenir, il est envisageable de travailler encore cette ouverture sur l'extérieur, pourquoi pas en proposant à Ophélie un travail en groupe, o elle devra être capable de surmonter sa sidération, pour se confronter au monde émotionnel et imaginaire des autres, défendre ses choix et affirmer sa personnalité. vi. Réflexions : On peut faire l'hypothèse d'un défaut de contenance chez Ophélie, nourrit par les difficultés d'accordage de son entourage (manque de portage de qualités, manque de soins corporel, de prévisibilité de l'environnement). La fillette n'aura pas pu constituer une enveloppe corporelle suffisamment solide ; elle a encore peur de se salir ou de toucher différentes matières, comme si sa peau ne la protégeait pas suffisamment. Elle a alors construit un mode de défense par le vide, l'hypotonie, le désinvestissement corporel et relationnel. 78 La problématique d'Ophélie nous permet alors d'aborder la question de la dépression infantile précoce. La dépression est réactionnelle à une perte. Ici il s'agit de l'absence de la mère, une absence principalement psychique. Le propre état de santé de la maman d'Ophélie, l'empêchant de se placer dans l'état de préoccupation maternelle primaire définit par D. W. Winnicott. Comme définit plus haut, cet état d'empathie extrême permet à la mère de se rendre disponible affectivement pour son enfant, de décoder ses besoins et d'y répondre de façon adaptée. C'est dans la répétition stable de ces ajustements, à travers les soins de maternages de type Holding, Handling et Object Presenting, que le nourrisson construit la conscience de son intégrité et de son unité corporelle, fonde son assurance narcissique dans l'expérience sécurisante d'être compris et nourrit sa fonction imaginaire dans l'illusion primaire de construire et de contrôler lui-même son environnement. Pour Bion, les soins maternels assurent également pour le bébé, le rôle de décryptage des états émotionnels, leur détoxication et leur symbolisation. Il nomme cela la fonction alpha. Immature chez le nourrisson, c'est la propre fonction alpha de la mère qui agit pour lui. Il projette ses états émotionnels, ses ressentis corporels, ses angoisses, non identifiés (Eléments béta) sur la mère, qui les met en sens, les organise et les lui renvoie sous une forme qu'il peut assimiler ; bercements, nourrissage, paroles (Eléments alpha). La répétition de ces boucles de transformation assure à l'enfant la construction d'une enveloppe et d'une fonction alpha autonome, c'est-à-dire la capacité à décoder ses émotions, plus tard ses cognitions, de les classer et de les contenir. Concernant les émotions, une autre notion me semble importante. Il s'agit du rôle de miroir du visage maternel. En effet dans les soins, lorsque le bébé est tenu dans les bras, il regarde surtout le visage de la mère. Il se voit alors lui-même, car lorsque la mère regarde son enfant, son expression est directement liée à ce qu'elle perçoit de son état émotionnel. S. Lebovici insiste sur la réciprocité de ce processus. En effet l'enfant modifie également son expression faciale en fonction de ce qu'il perçoit de sa mère. Ce processus en abyme fonde le processus de maternalisation. La mère prend confiance en ses capacités en observant les changements que ses soins impliquent. Le visage d'une mère suffisamment bonne , si l'on reprend l'expression de D. W. Winnicott, permet à l'enfant d'entrer en contact avec son propre monde affectif. Il permet donc à l'image de soi de se constituer. 79 Le visage maternel est le lieu unique o peuvent s'intégrer, en un même espace, des états affectifs différents dissociés les uns des autres. L'observation de la dyade mère/nourrisson montre les changements qui affectent les visages de chacun en fonction des modifications survenant chez l'autre. Il se produit une sorte de modulation permanente du visage de la mère en fonction de ce qu'elle perçoit chez le bébé, de telle sorte qu'elle tend à lui communiquer ce qu'elle a perçu de son état affectif 90 L'établissement précoce d'une relation de qualité entre le bébé et son entourage maternant est donc primordial pour la genèse de fonctions psychiques réellement fondatrices de l'individu. Spitz ira plus loin, en affirmant que cette relation est véritablement vitale. C'est ce qu'il décrit à travers la notion d'hospitalisme. Dans un premier temps, l'enfant délaissé par son entourage maternant, proteste et s'agite pour attirer l'attention. Si l'entourage réagit et entre de nouveau en contact avec lui, la communication est rétablie. Mais s'il est délaissé trop longtemps, on observe un retrait progressif de l'enfant qui ne s'agite plus, fuit la relation, détourne le regard. Il finit par ne plus répondre aux sollicitations. Il déprime. Il n'est plus capable d'investir son corps, sa motricité ou la relation. Il ne se nourrit plus, ne bouge plus. Il se laisse littéralement dépérir. Il est donc primordial de proposer des suivis les plus précoces possibles avant que les défenses mises en place par le nourrisson ne soient trop ancrées dans son fonctionnement. Et qu'il puisse se saisir de la relation établie avec d'autres avatars de la fonction maternante. Dans le cas d'Ophélie, Les difficultés d'accordage de sa maman et la discontinuité de la relation entravent les processus d'attachement primordiaux pour son développement. Toute l'attention et l'énergie de la maman d'Ophélie sont autocentrées. Elle n'arrive pas à décoder les émotions et les besoins de sa fille. Ce qui pouvait donc être à redouter pour Ophélie, ce sont des difficultés de décryptage et d'expression des émotions. Ophélie présente en effet un visage plutôt lisse. Pourtant elle est très intéressée par les émotions qu'elle perçoit chez les autres et cela parait même être pour elle une porte d'entrée dans la relation. Le travail thérapeutique mis en place passe par la proposition d'un cadre stable et sécurisant qui a fait défaut, pour permettre la réassurance d'Ophélie. 90 S. Lebovici et S. Stoléru, Le Nourrisson, la mère et le psychanalyste, p. 163 80 La psychomotricienne assure la fonction alpha et le rôle de miroir décrits plus haut. Pour se faire elle doit se placer en situation d'empathie avec la petite fille, afin d'émettre des hypothèses pour l'aider à décrypter ses propres états internes. Le jeu apparait comme une médiation appropriée qui permet ce partage. C'est une activité primordiale et structurante chez l'enfant. La qualité du jeu est un signe de bonne santé. Pour R. Roussillon, le jeu suspend l'opposition acte/représentation, car il doit être agit pour recouvrir sa pleine valeur d'expérience. Jouer permet que le trop plein d'angoisses soit canalisé puis symbolisé. Il est donc le vecteur privilégié de la contenance et de l'imaginaire. Il peut être pensé comme le paradigme de la psychomotricité car il ouvre un espace transitionnel, qui permet le plaisir et la symbolisation par la mise en acte du corps, en relation. C'est pourquoi l'absence de jeu chez Ophélie est préoccupante. Dans ses jeux, l'enfant a besoin d'un autre, qui comprenne ce qui se joue pour lui, ce qui est en recherche de symbolisation, qui reconnaisse et valorise ses expériences et enfin qui enrichisse le jeu. On peut faire l'hypothèse qu'Ophélie n'a pas trouvé d'écho à ses premiers jeux. D. Winnicott prône dans le travail thérapeutique, d'appendre au patient à mieux jouer. C'est-à-dire, tenter de révéler chez lui, une potentialité ludique. Cela passe par une attitude d'engagement du thérapeute qui doit jouer avec et qui permette au patient de s'identifier à la capacité à jouer du thérapeute. On observe l'établissement d'une relation de confiance entre Ophélie et la psychomotricienne, qui a soutenu une progressive reprise du travail du jouer. Cela lui a également permit d'investir l'imitation. Pour Wallon, l'apparition et l'évolution de l'imitation permettent d'apprécier la genèse du symbolisme, base du langage et de la représentation. Conclusion : La dépression sidère. Elle induit un retrait progressif, un désinvestissement de l'autre, de soi-même. Tout le travail thérapeutique auprès de l'enfant sera basé sur la relation, pour lui permettre de reprendre confiance en l'autre, puis en lui-même. Il doit d'abord être reconnu, investit par l'autre pour pouvoir se connatre, se reconnaitre, investir son corps, ses émotions, pour enfin, être capable d'exprimer, de symboliser, de construire. 81 b) Ethan et l'instabilité psychomotrice : i. Anamnèse et orientation au CAMSP : Ethan est un petit garçon né le 02 mai 2012, prématuré spontané à 28 semaines d'aménorrhées, sans cause retrouvée. Son papa travaille de nuit. Sa maman est sans emploi. Ayant subit un accident de voiture à 2 ans, elle est reconnue adulte handicapée par la MDPH. Elle boite et marche avec lenteur. On peut repérer un strabisme, des difficultés d'élocution ainsi qu'une lenteur de langage. Ethan fréquente une crèche les lundis, mercredis et vendredis. Le reste du temps il est gardé par sa maman. Le 13 novembre 2014, les parents contactent le CAMSP sur les conseils de leur médecin pédiatre. Ils souhaitent inscrire leur fils de 2 ans et demi pour des difficultés de langage et de comportement. En janvier 2015, Ethan commence un suivi en orthophonie dans un cabinet libéral. ii. Premier RDV médical (2 ans et 7 mois) : A 2 ans et 7 mois, Ethan mesure 85. 5 cm et pèse 11. 5 Kg. Il est hypermétrope et astigmate. Pour cela, il porte des lunettes, qu'il supporte bien. Un dépistage auditif a été réalisé qui ne démontre aucun problème auditif. Par contre, il souffre régulièrement d'otites. Il souffre aussi d'asthme, traité par ventoline, et de nombreuses gènes respiratoires de nuit. Son sommeil est perturbé. Ethan aurait de nombreux réveils nocturnes. Il est mis sous traitement homéopathique pour ses problèmes de sommeil. Son alimentation est sélective. La marche est acquise à 20 mois. Le retard de langage est important, Ethan ne dit aucun mot, il ne fait que des hé . La propreté n'est pas acquise. Selon le médecin, pendant la consultation, Ethan bouge beaucoup. Il a peu conscience de l'espace et des dangers. Il tombe à 4 ou 5 reprises. Il ne répond à aucune consigne simple et ne se retourne pas à l'appel de son prénom. Il lance les jouets, monte sur tout. Après plusieurs tentatives il parvient à croiser son regard et débuter un jeu très simple. Les parents semblent dépassés. Le médecin prescrit la passation d'un bilan psychomoteur. 82 iii. Réalisation du bilan psychomoteur : Je rencontre Ethan à l'occasion de mon stage de 3ème année, o nous débutons donc, la psychomotricienne du CAMSP et moi, son bilan psychomoteur. La première rencontre a lieu en présence de ses parents. S'en suivent 4 séances individuelles. Ethan est un petit garçon toujours très souriant. Ses cheveux mi-longs font apparaitre de belles boucles blondes. Lorsque l'on croise son regard, sous ses petites lunettes rondes et bleues, on peut apercevoir une certaine malice. Il a un petit nez rond qui ajoute à sa bonhomie. Il présente une corpulence en accord avec son âge mais porte souvent des vêtements un peu trop grands, ce qui accentue sa maladresse. Il marche, et donc glisse souvent sur le bas de son pantalon. Ethan a presque toujours une respiration forte et rapide, comme s'il était en situation de stress ou venait de courir longuement. Il présente également une toux régulière et de fréquence élevée. Il entre facilement en contact avec les gens, tends des jeux ou des crayons aux autres enfants et adultes dans la salle d'attente. Il semble enthousiaste de venir en séance de psychomotricité. Première séance : Lors de la première séance, Ethan entre dans la salle et ne prend aucun temps d'observation. Il court partout, observe tout, il est comme happé par ce qu'il voit, on a l'impression que tout lui fait envie mais qu'il n'arrive pas à faire de choix ; quand il prend un objet, il le délaisse instantanément pour courir à l'autre bout de la salle. Il se jette à plusieurs reprises sur le canapé. Nous nous installons à la petite table et demandons à Ethan de nous rejoindre. Celui-ci ne répond pas à nos sollicitations. Il ne pourra nous rejoindre que lorsque nous aurons installé de la pate-à-modeler, ce qui semble l'intéresser. Là encore, il a du mal à se poser, se lève de sa chaise, tourne autour de la table Mais petit à petit en manipulant la matière il parvient à se poser. Il peut nous imiter, mettre des morceaux de pâte dans une assiette, les piquer avec la fourchette et les donner au poupon ou aux adultes. Puis Ethan repart et grimpe sur quelques modules en mousse. Nous lui expliquons qu'il est possible de s'en servir mais qu'il faut d'abord ranger. En l'accompagnant physiquement, Ethan est capable de différer de quelques secondes pour nous aider à ranger. Il prend beaucoup de plaisir dans les jeux moteurs mais peut se mettre en danger. Il a des difficultés d'équilibre et de coordinations générales. A la fin de la séance, il tend les bras vers son père pour être porté et esquisse un geste de la main pour nous dire au revoir. 83 Cette première séance me laisse une sensation d'épuisement et de vide, malgré toute l'agitation qui a régné. Séances suivantes : Lors des séances suivantes, nous recevons Ethan seul. La séparation d'avec ses parents se fait chaque fois sans difficultés, au contraire Ethan semble impatient, il nous saisit la main et se dirige vers la salle de psychomotricité. Dans le couloir Ethan présente un pas lourd et rythmé, il tape le sol de ses pieds, mais cela ne semble pas être un jeu intentionnel. Il saisit toujours chacune de nous par une main de sorte que nous l'encadrons dans ce moment de transition. Nous travaillons dans la perspective de l'aider à se poser. Il apprécie de s'allonger, le ventre sur le gros ballon. Nous lui proposons également un boudin en mousse o il peut s'allonger mais en gardant les pieds, voire les genoux au sol, ce qui lui permet de réguler lui- même la stimulation. Sur ce boudin, je me place à coté de lui en miroir et arrive à capter son regard. Je place également une main sur son dos. Nous chantons des comptines au rythme lent, ce qui tranche avec son rythme respiratoire extrêmement rapide et ponctué par des hé qui donnent l'impression d'une alarme et d'une situation d'urgence. Pour réaliser les parcours, nous l'aidons en le tenant par une main, en décrivant les différentes étapes ou en les ponctuant par des onomatopées, qui reflètent ses déplacements. Enfin, nous lui demandons de le réaliser au moins 2 ou 3 fois de suite avant de changer de jeu. Lors des échanges de balles, nous sommes, la psychomotricienne et moi-même, assises au sol. Ethan, lui, ne peut avoir une place propre, séparée de nous. Il vient de lui- même s'assoir entre nos jambes. Il semble chercher au creux de nous, une protection et une contenance. Là, nous l'accompagnons et lui donnons des pistes pour mieux s'organiser et regrouper ses actions ; dans l'échange de petites boules, nous plaçons chacune d'elle à mesure que nous les recevons, dans un petit panier, une fois toutes les boules récupérées il peut changer de place. Nous l'accompagnons et l'aidons à ranger avant de changer d'activité pour lui permettre de vivre le regroupement, qu'après l'éparpillement et l'agitation il n'y a pas que dépassement ou explosion, mais qu'il peut y avoir un certain apaisement Ethan est en recherche de contenant physique ; le corps de l'adulte ou le tunnel. Il cherche à manipuler des contenants et des contenus. Lorsque nous lui avons proposé la 84 semoule, il s'est montré très précautionneux, concentré sur ses expériences pendant un long moment, à réaliser des opérations de transvasement, de remplissage, de vidage Ethan déménage souvent les meubles ; il soulève les chaises, les amène vers nous mais ne semble pas vouloir les utiliser pour réaliser une action particulière. Peut-être que porter cet élément lourd, qui lui demande une réorganisation de sa marche, de son centre de gravité et de son équilibre, est un moyen de sentir sa force ou d'avoir une meilleur sensation de son poids, de ses appuis ? La pâte à modeler et le dessin le rassemblent bien. Il veut toujours que tout le monde participe, débouche et tends un crayon à chacune. Assis entre la psychomotricienne et moi- même, soutenu par notre activité partagée, il peut rester assis quelques minutes et presque instantanément, sa toux s'arrête et sa respiration se calme. D'une séance à l'autre Ethan reprend des exercices, il demande et va chercher des objets. Il a bien intégré le rituel de début et de fin de séance. Il enlève ses chaussures seul et avec notre aide il essaie de les remettre de lui-même. Lorsque nous le raccompagnons à la salle d'attente, Ethan est bien contenu entre nous deux. Sa maman sort souvent en l'entendant. Lorsqu'Ethan la voit, il se met à courir de façon désorganisée, avec une sorte de démarche en fauchage ; les jambes tendues et passant le pas latéralement. Il court vers elle, mais tombe systématiquement en arrivant dans ses bras. Dernière séance : Lors de notre dernière séance, nous venons chercher Ethan dans la salle d'attente. Un autre enfant, qui a été précédemment suivie par la psychomotricienne lui dit bonjour et elle le prend dans ses bras. En voyant cela, Ethan est pris de panique, il témoigne sa peur et son mécontentement, en gémissant, multipliant les allers-retours entre la psychomotricienne et moi, en tendant les bras vers elle. Au cours de la séance nous jouons avec la pâte à modeler. Ethan va chercher le poupon, le donne à la psychomotricienne pour qu'elle lui donne à manger. Puis celle-ci dit que le bébé pleure et elle le berce. Alors Ethan part vers elle en gémissant, mais elle tient le poupon dans ses bras, alors il vient vers moi et demande à être porté. Nous berçons alors en miroir et en comptine, elle le poupon et moi Ethan. Il me semble alors, qu'Ethan a pu nous 85 figurer son envie, son besoin d'être bercé comme un bébé. Peut-être a-t-il l'angoisse d'être remplacé, abandonné ? A la fin de cette séance, nous raccompagnons Ethan dans la salle d'attente, mais ses parents sont partis réaliser des démarches administratives dans l'immeuble d'à coté. Je reste donc patienter avec lui. Je peux alors repérer chez Ethan de l'inquiétude, une inquiétude qui augmente au fur et à mesure que de nouvelles personnes arrivent puis quittent la salle d'attente. Il est beaucoup moins agité de d'habitude. Il observe, comme tétanisé, les autres enfants, avec des yeux tout ronds, grands ouverts. Lorsqu'au bout d'une vingtaine de minutes, sa maman revient enfin, Ethan fait mine de ne pas la voir, il lui tourne le dos, plonge la tête dans le bac à livre, fait semblant d'être occupé à en chercher un. Il tente de lui fait comprendre qu'il s'est senti abandonné. Sa maman ne le perçoit pas. Je verbalise alors l'inquiétude d'Ethan. La maman réponds mais nous étions juste à côté . Elle a une réponse autocentrée et est dans l'incapacité de se mettre à la place de son fils. On peut imaginer que si ce genre de séparations se produit régulièrement, Ethan n'aura pas pu se construire dans un environnement suffisamment stable et prévisible. iv. Ecrit présenté en équipe : Ethan présente un retard de langage et une instabilité psychomotrice. Lors des séances sans ses parents, il accepte facilement la séparation. Il est en recherche active de contenance chez l'adulte, très avide de relation. Il a besoin du corps à corps et ne peut se saisir de simples paroles pour s'apaiser. Il présente une absence d'individuation. Il est dans une grande agitation motrice et peut se mettre en danger. Il est en retard sur le plan instrumental, sur le plan de la motricité fine mais aussi de la motricité générale avec des troubles de l'équilibre et des difficultés de coordinations. Il a un fond tonique extrêmement perturbé qui se traduit par une toux nerveuse qui s'arrête des qu'il est apaisé. Il y a une absence de langage parlé mais il sollicite tout de même l'échange. En cours de bilan, on note une évolution. Une fois contenu corporellement, il se montre un peu plus organisé dans sa gestuelle, il aborde mieux l'espace et les autres. De lui- même il recherche activement cette contenance. Du fait de son excitation permanente, au cours des premières séances, nous n'arrivions pas à percevoir les différents états émotionnels qui pouvaient le traverser. A partir de la 3ème séance, nous avons pu déceler des petits moments d'angoisse et de surprise. 86 Ethan présente un retard psychomoteur et une grande instabilité en lien avec un défaut de contenance, des troubles de l'attachement et des difficultés parentales pour l'éducation ce qui nécessiterait une aide environnementale. v. Le projet de prise en soin : L'équipe choisit de continuer les séances en psychomotricité, à raison d'une fois par semaine, pour évaluer la façon dont Ethan se saisit de l'étayage qui lui est proposé. La prise en charge en orthophonie se poursuit également. La mise en place d'une aide à domicile est proposée aux parents. En septembre 2015, une nouvelle synthèse aura lieu pour évaluer si Ethan est en capacité de rentrer au CP, accompagné d'une AVS. Une intégration à mi-temps, les matins à l'école peut être envisagée, étant donné que la crèche est d'accord pour continuer à recevoir Ethan les après-midis. vi. Réflexions : D'après nos brèves observations de la dynamique familiale, on peut imaginer que l'environnement d'Ethan, a été peu porteur, au sens figuré comme au sens propre. La maman a pu nous expliquer qu'elle avait du mal à tenir son fils dans ses bras et qu'elle attendait qu'il grandisse pour pouvoir mieux le comprendre. Ethan, quand à lui, a pu nous figurer ce manque et son besoin d'être porté. Ce sont pour le moment, les limites du corps de l'autre qui lui permettent de se sentir contenu et de s'apaiser. Le psychomotricien joue alors le rôle de contenant maternel ; il contient physiquement le corps de l'enfant, mais il reçoit également ses angoisses, ses vécus non élaborés et en réalise une transformation, qui est en défaut chez l'enfant instable. L'impulsivité du mouvement traduit en direct les états émotionnels, sans qu'ils aient pu être digérés par un quelconque travail psychique. 91 Sans ce travail psychique de transformation, son seul moyen pour diminuer ses angoisses réside dans l'épuisement du à une agitation perpétuelle. Ethan s'est construit un mode de défense basé sur le plein ; une hyperstimulation continue pour se sentir et évacuer les tensions. 91 C. Potel, La question du cadre thérapeutique, la contenance, les limites, le corps, in Etre psychomotricien, Eres, 2010, p 344 87 La décharge motrice est là pour suppléer à la carence de symbolisation. L'enfant y a recours pour ne pas exploser à l'intérieur . 92 Le manque d'enveloppe chez l'enfant instable, crée des effets délétères au niveau des processus de différenciation et d'individuation. Il est donc nécessaire, que le psychomotricien construise des limites structurantes. Ces limites permettent d'éviter une régression sans fin et favorisent l'intégration d'une séparation. Le travail psychomoteur avec Ethan passe par une nécessaire étape de régression ; faire l'expérience d'une contenance physique, tactile, pour différencier progressivement l'espace du corps propre. Parallèlement, le psychomotricien organise une différenciation des autres espaces ; la salle de psychomotricité, le tunnel, le petit panier en figurant une dualité dedans/dehors à tous les niveaux. Il introduit également la question des limites et des règles, qui vont venir contenir la toute puissante angoissante de l'enfant. 92 C. Potel, La question du cadre thérapeutique, la contenance, les limites, le corps, in Etre psychomotricien, Eres, 2010, p 340 88 V. CONCLUSION GENERALE La fonction contenante est celle dont use l'individu à chacune de ses rencontres avec l' objet , qui lui permet de mettre du sens sur les sensations et affects, que cette rencontre éveille en lui. Cette mise en sens est nécessaire, pour maintenir les objets internes au sein de la psyché, de les maitriser, de les organiser et de les mobiliser pour permettre les processus de pensée. La fonction contenante autonome de l'enfant se différencie progressivement à partir de la fonction contenante assurée, dans les phases précoces de son développement, par son entourage. Ce dernier nourrit chez l'enfant le sentiment d'une enveloppe corporelle solide mais souple qui lui assure une sécurité de base, et lui transmet les schèmes de catégorisation et de transformation, nécessaires à la mise en représentation. N. Kacha nous rappelle que l'entourage, cet objet contenant relationnel initial, suppose plusieurs qualités : portage, soutient, holding, capacité de rêverie, fonction alpha, activité de symbolisation, capacité de sollicitation, capacité à garantir une rythmicité des expériences. 93 En résumé, la fonction contenante s'étaie un double ancrage, corporel et relationnel, paradigme de l'abord thérapeutique en psychomotricité. Si l'autonomisation de cette fonction contenante ne peut avoir lieu, les affects resteront à l'état brut et seront générateurs d'angoisses. Ces angoisses, tensions, pulsions, devront être projetés hors de l'individu sous des formes pathologiques diverses. Au sein de cet écrit, nous avons pu développer deux troubles spécifiques que sont l'inhibition et l'instabilité psychomotrice, mais un défaut de contenance peut se retrouver, à des degrés divers, au sein de nombreux troubles. De ce point de vue, la fonction contenante ou fonction à contenir, représente un enjeu majeur en thérapie psychomotrice. 93 N. KACHA, La fonction contenante du thérapeute, in J. B Chapelier et D. Roffat, Groupe, contenance et créativité, p 85 à 96, Eres, 2010 89 L'objectif du psychomotricien est alors d' aider le patient à se construire dans des limites plus tranquilles et plus sécurisantes, afin d'accéder à des voies de symbolisation plus secondarisée. On pourrait également dire : permettre une mise en pensée du corps . 94 Il aborde à la fois le corps réel, porteur du symptôme et le corps imaginaire, signifié de l'histoire corporelle. Il cherche à remodeler l'image du corps et permettre au patient d'accéder à l'élaboration psychique. En effet, quand on aborde la capacité du psychomotricien à contenir ce qui déborde, ce qui n'est pas organisé, ce qui menace d'inexistence ou de destruction [] il s'agit non seulement pas de gérer mais de comprendre la situation, ou d'en avoir d'autres représentations, afin de pouvoir la faire évoluer autrement. 95 Pour comprendre le patient, le psychomotricien utilise sa lecture privilégiée du dialogue non-verbal, du tonus et de l'utilisation de l'espace, comme lieu de projection du vécu corporel. Afin d'élaborer ce vécu pour le compte du patient, il doit lui-même se placer en position de contenant potentiel ; c'est-à-dire être à la fois réceptacle et séparateur. Chez le psychomotricien, cette capacité de contenance fait appel tout autant à notre corps qu'à notre psychisme. 96 Enfin, n'oublions pas que dans la thérapeutique, la réelle contenance est celle qui parlera au sujet soigné. C. Potel de résumer ; Contenir : un travail long, difficile, qui demande du ressort, une implication corporelle et psychique de tout instant, et des moyens de compréhension théoriques pour saisir les tenants et les aboutissants de la relation thérapeutique au travers du jeu psychomoteur. 97 94 C. Potel, La question du cadre thérapeutique, la contenance, les limites, le corps, in Etre psychomotricien, Eres, 2010, p324 95Ibid, p325 96 C. Potel, p 324 97 C. Potel, p 345 90 BIBLIOGRAPHIE D. ANZIEU, Le Moi-peau, Dunod, nouvelle édition revue et argumentée, 1995 J. B. CHAPELIER, Chaos, contenance et créativité, in J. B Chapelier et D. Roffat, Groupe, contenance et créativité, p 55 à 68, Eres, 2011 A. DUCRET, La contenance, histoire d'un concept, in J. B Chapelier et D. Roffat, Groupe, contenance et créativité, p 13 à 35, Eres, 2011 G. HAAG, Stéréotypies et angoisses, les cahiers du CERFEE, sous la direction de Pry, 1996, revu et complété en 2011 N. KACHA, La fonction contenante du thérapeute, in J. B Chapelier et D. Roffat, Groupe, contenance et créativité, p 85 à 96, Eres, 2010 M. F. LIVOIR-PETERSEN, L'approche sensori-tonique et la question du morcellement, thérapie psychomotrice et recherches, SNUP, n 162, 2010 D. MELLIER, La fonction à contenir, objet, processus, dispositif et cadre institutionnel, in La psychiatrie de l'enfant, volume 48, p 425 à 499, 2005, Université Lumière, Lyon 2 Y. MILLEUR, La contenance comme processus psychique, revue Soins psychiatrie n295 C. POTEL BARANES, La question du cadre thérapeutique, la contenance, les limites, le corps, in Etre psychomotricien, p 321 à 345, Eres, 2010 S. ROBERT-OUVRAY, compte rendu des XXVIIIème Journées annuelles de Thérapie Psychomotrice, Angers, 25 septembre 2009. 91 S. ROBERT-OUVRAY, Les transformations fantasmées de l'enveloppe tonique primitive, thérapie psychomotrice et recherches, SNUP, n162, 2010 D. CALIN, site psychologie, éducation et enseignement spécialisé A. M. LATOUR, Les images du corps pré-contenantes, site psynem. org ( psychanalyse/Recherches memoires e t theses/Images du corps pre-contenantes/2. pdf) I. SEZER, Le cadre thérapeutique en psychomotricité : une enveloppe contenante pour des enfants sans limite , mémoire en vue de l'obtention du Diplôme d'Etat de Psychomotricien, Université de Bordeaux, 2014 M. A. SELLINGUE-ITEMA, Tisser des liens au fil du groupe Le groupe thérapeutique : une enveloppe contenante pour l'enfant instable, mémoire en vue de l'obtention de Diplôme d'Etat de Psychomotricien, Université de Bordeaux, 2013 92 TABLE DES MATIERES REMERCIEMENTS PRECAUTIONS DE LECTURE SOMMAIRE I. Introduction 1. Questions préliminaires et choix du sujet 2. Définition du concept de contenance a) b) c) La notion de limites : La question du contenu : Les processus de mise à contenir : 3. Conclusion et annonce du plan II. Genèse de la fonction contenante dans le développement psychomoteur 1. Embryogénèse a) b) c) d) La 1ère semaine de développement : La 2nde semaine de développement : La 3ème semaine de développement : La 4ème semaine de développement : 2. 3. 4. 5. 6. La vie intra-utérine La naissance Le sentiment d'enveloppe L'enveloppe tonique L'apport de Winnicott La préoccupation maternelle primaire : Le phénomène transitionnel : a) b) c) Holding : d) Handling : e) Object presenting : 7. Bion, la fonction alpha () Les éléments du bébé : Le travail de transformation de la fonction maternelle : Les éléments : a) b) c) d) Constitution d'une fonction propre au bébé : 8. Anzieu, le Moi-Peau a) Construction du Moi-Peau : b) c) Dépassement du Moi-Peau : Fonctions du Moi-Peau : 9. L'enveloppe visuelle a) Compétences visuelles précoces : 2 3 4 5 5 7 8 8 9 12 13 13 13 13 15 16 19 21 23 25 28 28 29 29 30 31 33 33 33 34 34 37 37 38 39 41 41 93 b) L'enveloppe visuelle : L'écran visuel : Le miroir hallucinatoire positif : i. ii. iii. Cas pathologiques : L'enveloppe sonore 10. a) Compétences auditives précoces : b) L'enveloppe sonore : i. ii. iii. Le miroir sonore : Les fonctions de l'enveloppe sonore : Le défaut d'enveloppe sonore : 11. Conclusion sur l'enveloppe relationnelle primaire a) Résumé de la genèse de la fonction contenante : b) Fonctions et qualités des enveloppes : III. Pathologies en lien avec un défaut de contenance 1. Réflexions sur l'origine du déficit de la fonction contenante 2. Angoisses liées au défaut de contenance 3. Systèmes palliatifs de la contenance IV. Constituer un projet thérapeutique contenant en psychomotricité 1. Annonce de la problématique et des hypothèses de travail 2. L'image du corps a) b) Le tonus : L'espace comme miroir du corps propre : 3. La médiation a) b) La notion de médium malléable : Le jeu : 4. 5. 6. L'enveloppe institutionnelle Le cadre thérapeutique La fonction contenante du thérapeute a) b) S'écouter soi-mêmepour entendre le patient : Le thérapeute contenu : 7. Clinique a) Ophélie et l'inhibition psychomotrice : Anamnèse et orientation au CAMSP : Premier RDV médical et première indication (4 mois) : i. ii. iii. Atelier mère-enfant (de 8 mois à 1 an et 8 mois) : iv. Prise en soin individuelle en psychomotricité (À partir de 1 an et 9 mois) : v. Mes rencontres avec Ophélie (de 2 ans et demi à 3 ans) : vi. Réflexions : b) Ethan et l'instabilité psychomotrice : Anamnèse et orientation au CAMSP : Premier RDV médical (2 ans et 7 mois) : i. ii. iii. Réalisation du bilan psychomoteur : iv. v. vi. Réflexions : Ecrit présenté en équipe : Le projet de prise en soin : 41 43 43 44 45 45 45 46 46 47 48 48 49 53 53 55 56 59 59 61 61 62 64 64 65 67 68 70 71 72 73 73 73 73 74 75 76 78 82 82 82 83 86 87 87 94 V. Conclusion générale BIBLIOGRAPHIE TABLE DES MATIERES 89 91 93 95 96	HAL	Scientific
Les sociétés ont pu poser des questions directement au VMRF par le biais du site web HEVRA et les réponses à 9 questions liées à la procédure de reconnaissance mutuelle ont été publiées en 2001 sur le site web HEVRA.	EMEA_V3	Medicinal
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VENLAFAXINE BLUEFISH LP 75 mg, gélule à libération prolongée - Résumé des caractéristiques du produit. ANSM - Mis à jour le : 13/01/2022 VENLAFAXINE BLUEFISH LP 75 mg, gélule à libération prolongée Chaque gélule contient 75 mg de venlafaxine (sous forme de chlorhydrate de venlafaxine). Pour la liste complète des excipients, voir rubrique 6. 1. Gélule de taille 1 à coiffe pêche opaque et corps pêche opaque présentant des bandes d'encre rouge radiales, circulaires épaisses et fines sur la coiffe et le corps de la gélule. La gélule est remplie de 6 micro-comprimés chacun de 12, 5 mg blancs/blancs cassés, ronds, biconvexes, pelliculés. Prévention des récidives d'épisodes dépressifs majeurs. Traitement du trouble Anxiété sociale (phobie sociale). Posologie La venlafaxine n'est pas recommandée chez les enfants et les adolescents de moins de 18 ans. Les études cliniques contrôlées chez les enfants et les adolescents présentant un épisode dépressif majeur n'ont pas permis de démontrer l'efficacité de la venlafaxine et ne soutiennent pas son utilisation chez ces patients ( et ). L'efficacité et la sécurité d'emploi de la venlafaxine dans d'autres indications chez l'enfant et l'adolescent de moins de 18 ans n'ont pas été établies. Episodes dépressifs majeurs La posologie initiale recommandée de venlafaxine à libération prolongée est de 75 mg par jour en une prise. Les patients ne répondant pas à la posologie initiale de 75 mg/jour peuvent bénéficier d'une augmentation de dose jusqu'à une posologie maximale de 375 mg/jour. Les augmentations de dose peuvent être effectuées par paliers de 2 semaines ou plus. Si la sévérité des symptômes cliniques le justifie, la posologie peut être augmentée à intervalles de temps plus rapprochés, en respectant un minimum de 4 jours. En raison du risque d'effets indésirables dose-dépendants, la posologie ne sera augmentée qu'après évaluation clinique ( ). La posologie minimale efficace devra être maintenue. Les patients doivent être traités pour une durée suffisante, généralement de plusieurs mois ou plus. Le traitement doit être réévalué régulièrement au cas par cas. Un traitement à plus long terme peut également être justifié pour la prévention des récidives d'épisodes dépressifs majeurs (EDM). Dans la plupart des cas, la posologie recommandée dans la prévention des récidives d'EDM est la même que celle utilisée pendant l'épisode traité. Le traitement antidépresseur doit être poursuivi pendant au moins 6 mois après la rémission. Trouble Anxiété sociale (Phobie sociale) La posologie recommandée de venlafaxine à libération prolongée est de 75 mg par jour en une prise. Il n'a pas été démontré que des posologies plus élevées permettaient d'obtenir un bénéfice additionnel. Cependant, chez certains patients qui ne répondent pas à la posologie initiale de 75 mg/jour, une augmentation de la dose peut être envisagée jusqu'à une posologie maximale de 225 mg/jour. La posologie peut être augmentée par paliers de 2 semaines ou plus. En raison du risque d'effets indésirables dose-dépendants, la posologie ne sera augmentée qu'après évaluation clinique ( ). La posologie minimale efficace devra être maintenue. Les patients doivent être traités pour une durée suffisante, généralement de plusieurs mois ou plus. Le traitement doit être réévalué régulièrement au cas par cas. Population âgée Aucune adaptation spécifique de la dose de venlafaxine n'est considérée comme nécessaire sur le seul critère de l'âge du patient. Cependant, la prudence s'impose au cours du traitement de patients âgés (ex : en raison du risque d'insuffisance rénale, de l'éventualité de modifications liées à l'âge de la sensibilité et de l'affinité des neurotransmetteurs). La posologie minimale efficace devra toujours être utilisée et les patients devront être attentivement surveillés lors de toute augmentation de posologie. Patients présentant une insuffisance hépatique D'une manière générale, une réduction de la posologie de 50 % doit être envisagée chez les patients présentant une insuffisance hépatique légère ou modérée. En raison de la variabilité interindividuelle de la clairance, une adaptation individuelle de la posologie peut être néanmoins nécessaire. Les données concernant les patients présentant une insuffisance hépatique sévère sont limitées. La prudence est recommandée et une réduction de plus de 50 % de la posologie doit être envisagée. Le bénéfice potentiel du traitement devra être soupesé par rapport à ses risques pour les patients présentant une insuffisance hépatique sévère. Patients présentant une insuffisance rénale Bien qu'aucune adaptation posologique ne soit nécessaire chez les patients présentant un taux de filtration glomérulaire (GRF) entre 30 et 70 ml/minute, la prudence est conseillée. Chez les patients hémodialysés et chez les patients présentant une insuffisance rénale sévère (GFR < 30 ml/min), la posologie devra être réduite de 50 %. Du fait de la variabilité interindividuelle de la clairance chez ces patients, il est souhaitable d'adapter la posologie au cas par cas. Symptômes de sevrage observés à l'arrêt de la venlafaxine L'arrêt brutal du traitement doit être évité. Lors de l'arrêt du traitement par la venlafaxine, la posologie devra être progressivement diminuée sur une durée d'au moins une à deux semaines afin de réduire le risque de survenue de réactions de sevrage ( et ). En cas de symptômes mal tolérés après une diminution de dose ou lors de l'interruption du traitement, le retour à la posologie précédemment prescrite peut être envisagé. Par la suite, le médecin pourra reprendre la diminution de la posologie, mais à un rythme plus progressif. Mode d'administration Voie orale. Il est recommandé de prendre les gélules à libération prolongée de venlafaxine au cours d'un des repas, si possible à heure fixe. Les gélules doivent être avalées avec un peu de liquide, et ne doivent être ni coupées, ni écrasées, ni croquées ou dissoutes. Les patients traités par des comprimés de venlafaxine à libération immédiate peuvent passer aux gélules à libération prolongée de venlafaxine, à la posologie quotidienne équivalente la plus proche. Par exemple, des comprimés à libération immédiate de 37, 5 mg de venlafaxine en deux prises par jour peuvent être remplacés par des gélules à libération prolongée de 75 mg de venlafaxine en une prise quotidienne. Des adaptations posologiques individuelles peuvent être nécessaires. Les gélules de venlafaxine à libération prolongée contiennent des sphéroïdes qui libèrent lentement le médicament dans l'appareil digestif. La fraction insoluble de ces sphéroïdes est éliminée et peut être retrouvée dans les selles. L'association à un traitement par inhibiteurs irréversibles de la monoamine-oxydase (IMAO) est contre-indiquée en raison du risque de survenue d'un syndrome sérotoninergique, se manifestant notamment par une agitation, des tremblements et une hyperthermie. La venlafaxine ne doit pas être débutée dans les 14 jours suivant l'arrêt d'un traitement par un IMAO irréversible. La venlafaxine doit être arrêtée au moins 7 jours avant le début d'un traitement par un IMAO irréversible ( et ). L'utilisation de VENLAFAXINE BLUEFISH LP est déconseillée chez les enfants et adolescents de moins de 18 ans. Des comportements de type suicidaire (tentative de suicide et idées suicidaires) et de type hostile (principalement agressivité, comportement d'opposition et colère) ont été plus fréquemment observés au cours des études cliniques chez les enfants et adolescents traités par antidépresseurs par rapport à ceux traités par placebo. Si, en cas de nécessité clinique, la décision de traiter est néanmoins prise, le patient devra faire l'objet d'une surveillance attentive pour détecter l'apparition de symptômes suicidaires. De plus, on ne dispose d'aucune donnée de tolérance à long terme chez l'enfant et l'adolescent concernant la croissance, la maturation, et le développement cognitif et comportemental. Suicide/idées suicidaires ou aggravation clinique La dépression est associée à un risque accru d'idées suicidaires, d'auto-agression et de suicide (comportements de type suicidaire). Ce risque persiste jusqu'à obtention d'une rémission significative. L'amélioration clinique pouvant ne pas survenir avant plusieurs semaines de traitement, les patients devront être surveillés étroitement jusqu'à obtention de cette amélioration. L'expérience clinique montre que le risque suicidaire peut augmenter en tout début de rétablissement. Les autres troubles psychiatriques dans lesquels la venlafaxine est prescrite peuvent également être associés à un risque accru de comportement suicidaire. De plus, ces troubles peuvent être associés à un épisode dépressif majeur. Les mêmes précautions d'emploi que celles mentionnées pour les patients souffrant d'épisodes dépressifs majeurs devront donc être appliquées aux patients présentant d'autres troubles psychiatriques. Les patients ayant des antécédents de comportement de type suicidaire ou ceux exprimant des idées suicidaires significatives avant de débuter le traitement présentent un risque plus élevé de survenue d'idées suicidaires ou de comportements de type suicidaire, et doivent faire l'objet d'une surveillance étroite pendant le traitement. Une méta-analyse d'essais cliniques contrôlés versus placebo sur l'utilisation d'antidépresseurs chez l'adulte présentant des troubles psychiatriques a montré une augmentation du risque de comportement de type suicidaire chez les patients de moins de 25 ans traités par antidépresseurs par rapport à ceux recevant un placebo. Une surveillance étroite des patients, et en particulier de ceux à haut risque, devra accompagner le traitement médicamenteux, particulièrement au début du traitement et lors des changements de dose. Les patients (et leur entourage) devront être avertis de la nécessité de surveiller la survenue d'une aggravation clinique, l'apparition d'idées/comportements suicidaires et tout changement anormal du comportement et de prendre immédiatement un avis médical si ces symptômes survenaient. Syndrome sérotoninergique Comme avec d'autres agents sérotoninergiques, le développement d'un syndrome sérotoninergique ou d'un syndrome malin des neuroleptiques (SMN) pouvant engager le pronostic vital, peut être observé sous traitement par venlafaxine, notamment en cas d'association à d'autres agents sérotoninergiques (notamment les ISRS, les IRSN et les triptans), avec les médicaments altérant le métabolisme sérotoninergique tels que les IMAO (ex. : le bleu de méthylène), ou avec les antipsychotiques ou d'autres antagonistes de la dopamine ( et ). Les symptômes du syndrome sérotoninergique peuvent comporter des altérations de l'état mental (ex : agitation, hallucinations, coma), des manifestations dysautonomiques (ex : tachycardie, pression artérielle labile, hyperthermie), des atteintes neuromusculaires (ex : hyperréflexie, incoordination) et/ou des symptômes gastro-intestinaux (ex : nausées, vomissements, diarrhée). Dans sa forme la plus sévère, le syndrome sérotoninergique peut ressembler à un SMN, qui comporte une hyperthermie, une rigidité musculaire, une instabilité neurovégétative avec de possibles fluctuations rapides des constantes vitales et des altérations de l'état mental. Si l'association de la venlafaxine à d'autres substances pouvant affecter le système de neurotransmetteurs sérotoninergiques et/ou dopaminergiques est cliniquement justifiée, une surveillance attentive du patient est conseillée, particulièrement lors de l'instauration du traitement et des augmentations posologiques. Si un syndrome sérotoninergique est suspecté, une diminution de la dose ou un arrêt du traitement doit être envisagé selon la sévérité des symptômes. L'utilisation concomitante de venlafaxine et de précurseurs de la sérotonine (tels que les suppléments contenant du tryptophane) n'est pas recommandée. Glaucome à angle fermé Une mydriase peut survenir au cours d'un traitement par la venlafaxine. Il est recommandé de surveiller étroitement les patients présentant une pression intraoculaire élevée ou un risque de glaucome aigu (glaucome à angle fermé). Pression artérielle Des élévations de pression artérielle dose-dépendantes ont été fréquemment rapportées avec la venlafaxine. Depuis la commercialisation, des cas d'élévation sévère de la pression artérielle nécessitant un traitement immédiat ont été rapportés. L'existence d'une pression artérielle élevée devra être recherchée attentivement chez tous les patients, et toute hypertension artérielle préexistante devra être contrôlée avant de débuter le traitement. La pression artérielle devra être contrôlée périodiquement, après instauration du traitement et après les augmentations de posologie. La prudence est de mise chez les patients qui présentent des pathologies sous-jacentes pouvant être aggravées par des élévations de pression artérielle, comme une insuffisance cardiaque. Fréquence cardiaque Des augmentations de la fréquence cardiaque peuvent survenir, en particulier à des posologies élevées. La prudence est de mise chez les patients qui présentent des pathologies sous-jacentes pouvant être aggravées par des augmentations de la fréquence cardiaque. Pathologie cardiaque et risque d'arythmie La venlafaxine n'a pas été évaluée chez les patients ayant un antécédent récent d'infarctus du myocarde ou de cardiopathie instable. Elle doit donc être utilisée avec prudence chez ces patients. Dans l'expérience acquise depuis la commercialisation, des cas d'arythmie cardiaque fatale ont été rapportés avec la venlafaxine, en particulier lors de surdosage. Les risques encourus doivent être soupesés au regard des bénéfices attendus avant de prescrire la venlafaxine chez des patients présentant un risque élevé d'arythmie cardiaque sévère. Convulsions Des convulsions peuvent survenir lors d'un traitement par venlafaxine. Comme avec tous les autres antidépresseurs, la venlafaxine doit être instaurée avec prudence chez les patients présentant des antécédents de convulsions, et les patients concernés doivent faire l'objet d'une surveillance étroite. En cas de crise convulsive, le traitement doit être interrompu. Hyponatrémie Des cas d'hyponatrémie et/ou de syndrome de sécrétion inappropriée de l'hormone antidiurétique (SIADH) peuvent être observés avec la venlafaxine. Cet effet a été signalé plus fréquemment chez des patients hypovolémiques ou déshydratés. Les sujets âgés, les patients sous diurétiques et les patients hypovolémiques peuvent présenter un risque plus élevé de survenue d'une hyponatrémie. Saignements anormaux Les médicaments inhibant la recapture de la sérotonine peuvent altérer l'agrégation plaquettaire. Les évènements hémorragiques liés à l'utilisation des ISRS et des IRSN peuvent varier decchymoses, hématomes, épistaxis et pétéchies à des hémorragies gastro intestinales engageant le pronostic vital. Le risque d'hémorragies peut être augmenté chez les patients sous venlafaxine. Les ISRS et IRSNA peuvent augmenter le risque d'hémorragie du post-partum (voir rubriques 4. 6, 4. 8). Comme avec d'autres médicaments inhibiteurs de la recapture de la sérotonine, la venlafaxine doit être utilisée avec prudence chez les patients prédisposés aux saignements, comme les patients sous anticoagulants et sous antiagrégants plaquettaires. Cholestérolémie Dans des études contrôlées contre placebo, des augmentations cliniquement significatives du cholestérol dans le sang ont été relevées chez respectivement 5, 3 % des patients traités par venlafaxine et 0, 0 % des patients traités par placebo depuis au moins 3 mois. Des mesures de la cholestérolémie doivent être envisagées lors d'un traitement au long cours. Co-administration avec des produits amaigrissants La sécurité d'emploi et l'efficacité du traitement par venlafaxine en association à des produits amaigrissants, dont la phentermine, n'ont pas été établies. L'administration concomitante de venlafaxine et de produits amaigrissants n'est pas recommandée. La venlafaxine n'est pas indiquée pour perdre du poids, seule ou en association avec d'autres produits. Manie/hypomanie Un épisode maniaque/hypomaniaque peut survenir chez une faible proportion de patients présentant des troubles de l'humeur et ayant reçu des antidépresseurs, dont la venlafaxine. Comme avec d'autres antidépresseurs, la venlafaxine doit être utilisée avec prudence chez les patients ayant des antécédents personnels ou familiaux de trouble bipolaire. Agressivité Une agressivité peut être observée chez un faible nombre de patients ayant reçu des antidépresseurs, dont la venlafaxine. Ceci a été rapporté à l'instauration du traitement, lors de changements de posologie et à l'arrêt du traitement. Comme avec d'autres antidépresseurs, la venlafaxine doit être utilisée avec prudence chez les patients ayant des antécédents d'agressivité. Arrêt du traitement La survenue de symptômes de sevrage est fréquente à l'arrêt du traitement, particulièrement si l'arrêt est brutal ( ). Dans les essais cliniques, des événements indésirables étaient observés à l'arrêt du traitement (au cours de la réduction progressive des doses ou après interruption du traitement) chez approximativement 31% des patients traités par la venlafaxine et 17 % des patients sous placebo. Le risque de syndrome de sevrage peut dépendre de plusieurs facteurs, dont la durée de traitement et la posologie, ainsi que le degré de diminution de la posologie. Les réactions les plus fréquemment rapportées sont : sensations vertigineuses, troubles sensoriels (dont des paresthésies), troubles du sommeil (dont insomnie et rêves intenses), agitation ou anxiété, nausées et/ou vomissements, tremblements et céphalées. Généralement, ces symptômes sont légers à modérés ; cependant chez certains patients, leur intensité peut être sévère. Ils surviennent habituellement dans les premiers jours suivant l'arrêt du traitement, mais, dans de très rares cas, de tels symptômes ont été rapportés chez des patients ayant, par inadvertance, oublié une prise. Généralement, ces symptômes sont spontanément résolutifs et disparaissent habituellement en 2 semaines, bien qu'ils puissent se prolonger chez certains patients (2-3 mois ou plus). Par conséquent, il est conseillé, lors de l'arrêt du traitement, de diminuer progressivement les doses de venlafaxine sur une durée de plusieurs semaines ou mois, suivant les besoins du patient ( ). Akathisie/agitation psychomotrice L'utilisation de la venlafaxine a été associée à la survenue d'une akathisie, caractérisée par une agitation ressentie comme désagréable ou pénible, et par un besoin de bouger souvent, accompagnée d'une incapacité à rester assis ou debout tranquillement. Celle-ci apparat le plus souvent dès les premières semaines du traitement. Chez les patients présentant ces symptômes, l'augmentation de la posologie peut être préjudiciable. Sécheresse buccale Une sécheresse buccale a été rapportée chez 10 % des patients traités par venlafaxine. Celle-ci peut augmenter le risque de caries dentaires et les patients doivent être informés de l'importance de l'hygiène dentaire. Diabète Chez les patients diabétiques, le contrôle de la glycémie peut être déséquilibré lors d'un traitement par un ISRS ou par la venlafaxine. Une adaptation des doses d'insuline et/ou d'hypoglycémiants par voie orale peut s'avérer nécessaire. Dysfonction sexuelle Les inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine (ISRS) ainsi que les inhibiteurs de la recapture de sérotonine et de la noradrénaline (IRSN) peuvent provoquer des symptômes de dysfonction sexuelle (voir rubrique 4. 8). Des cas de dysfonctions sexuelles persistantes sur le long terme dans lesquelles les symptômes continuaient ont été rapportés malgré l'arrêt des ISRS/IRSN. Interactions médicamenteuses testées en laboratoire Au cours des tests de dépistage urinaire de la phéncyclidine (PCP) et de l'amphétamine, des résultats faussement positifs ont été rapportés chez les patients prenant de la venlafaxine. Cela est dû au manque de spécificité des tests de dépistage. Des résultats faussement positifs peuvent être attendus pendant plusieurs jours après l'arrêt du traitement par la venlafaxine. Les tests de conformité tels que la chromatographie en phase gazeuse et la spectrométrie de masse sépareront la venlafaxine de la PCP et de l'amphétamine. IMAO non sélectifs irréversibles La venlafaxine ne doit pas être utilisée en association avec les IMAO non sélectifs irréversibles. La venlafaxine ne doit pas être débutée dans les 14 jours suivants l'arrêt d'un traitement par un IMAO non sélectif irréversible. La venlafaxine doit être arrêtée au moins 7 jours avant l'instauration d'un traitement par un IMAO non sélectif irréversible ( et ). Inhibiteur sélectif réversible de la MAO-A (moclobémide) En raison du risque de syndrome sérotoninergique, l'association de la venlafaxine à un IMAO réversible et sélectif, comme le moclobémide, n'est pas recommandée. Après un traitement par IMAO réversible, le traitement par la venlafaxine peut être débuté après une période d'arrêt de moins de 14 jours. Il est recommandé d'arrêter la venlafaxine au moins 7 jours avant l'instauration d'un traitement par un IMAO irréversible ( ). IMAO réversible, non sélectif (linézolide) Le linézolide (antibiotique) est un IMAO faible, réversible et non-sélectif et ne doit pas être donné aux patients traités par la venlafaxine ( ). Des réactions indésirables graves ont été rapportées chez des patients ayant récemment arrêté un IMAO et débuté un traitement par la venlafaxine, ou ayant récemment arrêté un traitement par la venlafaxine avant de débuter un IMAO. Ces réactions incluaient des tremblements, des myoclonies, une diaphorèse, des nausées, des vomissements, des bouffées vasomotrices, des sensations vertigineuses, et une hyperthermie pouvant faire évoquer un syndrome malin des neuroleptiques, des crises convulsives, et un décès. Syndrome sérotoninergique Comme avec d'autres agents sérotoninergiques, un syndrome sérotoninergique pouvant engager le pronostic vital peut survenir sous traitement par venlafaxine, en particulier en cas d'utilisation concomitante d'autres substances susceptibles d'affecter le système de neurotransmetteurs sérotoninergiques (notamment les triptans, les ISRS, les IRSN, le lithium, la sibutramine, le tramadol, la buprénorphine ou le millepertuis [ ]), les médicaments altérant le métabolisme sérotoninergique (incluant les IMAO ), ou avec les précurseurs de la sérotonine (comme les suppléments contenant du tryptophane). Si l'association de la venlafaxine à un ISRS, un IRSN, ou un agoniste des récepteurs de la sérotonine (triptans) est cliniquement justifiée, une surveillance attentive du patient est conseillée, particulièrement lors de l'instauration du traitement et des augmentations posologiques. L'utilisation concomitante de venlafaxine et de précurseurs de la sérotonine (tels que les suppléments contenant du tryptophane) n'est pas recommandée ( ). Substances agissant sur le SNC Le risque lié à l'utilisation de la venlafaxine en association avec d'autres substances agissant sur le SNC n'a pas été systématiquement évalué. En conséquence, la prudence est conseillée lorsque la venlafaxine est prise en association à d'autres substances agissant sur le SNC. Ethanol Il a été démontré que la venlafaxine ne majorait pas l'altération des capacités intellectuelles et motrices induite par l'éthanol. Cependant, comme pour toutes substances agissant sur le SNC, il doit être recommandé aux patients d'éviter la consommation d'alcool. Effet d'autres médicaments sur la venlafaxine Kétoconazole (inhibiteur du CYP3A4) Une étude pharmacocinétique avec le kétoconazole chez des métaboliseurs lents (ML) et rapides (MR) du CYP2D6 a mis en évidence une augmentation de l'ASC (aire sous la courbe) de la venlafaxine (de respectivement 70 % et 21 % chez les patients ML et MR du CYP2D6) et de la O-déméthylvenlafaxine (de respectivement 33 % et 23 % chez les patients ML et MR du CYP2D6) après administration de kétoconazole. L'usage concomitant d'inhibiteurs du CYP3A4 (ex : atazanavir, clarithromycine, indinavir, itraconazole, voriconazole, posaconazole, kétoconazole, nelfinavir, ritonavir, saquinavir, télithromycine) et de venlafaxine peut accrotre les concentrations de venlafaxine et d'O-déméthylvenlafaxine. Par conséquent, la prudence est conseillée si le traitement d'un patient comprend une association d'un inhibiteur du CYP3A4 et de venlafaxine. Effet de la venlafaxine sur d'autres médicaments Lithium Un syndrome sérotoninergique peut être induit par l'usage concomitant de venlafaxine et de lithium (voir paragraphe Syndrome sérotoninergique ). Diazépam La venlafaxine n'a aucun effet sur la pharmacocinétique et la pharmacodynamie du diazépam, ni sur son métabolite actif, le déméthyldiazépam. Le diazépam ne semble pas affecter la pharmacocinétique de la venlafaxine ni de la O-déméthylvenlafaxine. Aucune autre interaction pharmacocinétique et/ou pharmacodynamique avec d'autres benzodiazépines n'est connue. Imipramine La venlafaxine n'a pas modifié la pharmacocinétique de l'imipramine et du 2-OH-imipramine. Lors de l'administration de 75 à 150 mg par jour de venlafaxine, une augmentation dose-dépendante de 2, 5 à 4, 5 fois de l'ASC du 2-OH-désipramine a été observée. L'imipramine n'a pas affecté la pharmacocinétique de la venlafaxine et de la O-déméthylvenlafaxine. La signification clinique de cette interaction n'est pas connue. L'administration concomitante de venlafaxine et d'imipramine doit être faite avec prudence. Halopéridol Une étude pharmacocinétique avec l'halopéridol administré par voie orale a montré une réduction de 42 % de la clairance totale, une augmentation de 70 % de l'ASC, une augmentation de 88 % de la Cmax, mais aucune modification de la demi-vie de l'halopéridol. Ces observations doivent être prises en compte chez les patients traités par une association d'halopéridol et de venlafaxine. La signification clinique de cette interaction n'est pas connue. Rispéridone La venlafaxine a entrané une augmentation de 50 % l'ASC de la rispéridone, mais n'a pas affecté significativement le profil pharmacocinétique de la fraction active totale (rispéridone plus 9-hydroxyrispéridone). La signification clinique de cette interaction n'est pas connue. Métoprolol L'administration concomitante de venlafaxine et de métoprolol à des volontaires sains dans une étude d'interaction pharmacocinétique de ces deux médicaments a révélé une augmentation des concentrations plasmatiques de métoprolol d'environ 30 - 40 %, sans modification des concentrations plasmatiques de son métabolite actif, l'alpha-hydroxymétoprolol. La pertinence clinique de cette observation chez les patients hypertendus n'est pas connue. Le métoprolol n'a pas modifié le profil pharmacocinétique de la venlafaxine ou de son métabolite actif, la O-déméthylvenlafaxine. La prudence est recommandée en cas d'administration concomitante de venlafaxine et de métoprolol. Indinavir Une étude pharmacocinétique avec l'indinavir a montré une réduction de 28 % de l'ASC et une réduction de 36 % de la Cmax pour cette substance. L'indinavir n'a pas affecté la pharmacocinétique de la venlafaxine et de la O-déméthylvenlafaxine. La signification clinique de cette interaction n'est pas connue. Médicaments métabolisés par les isoenzyme du Cytochrome P450 Des études indiquent que la venlafaxine est un inhibiteur relativement faible du cytochrome CYP2D6. La venlafaxine n'a pas inhibé le CYP3A4 (alprazolam et carbapazépine), le CYP1A2 (caféine), le CYP2C9 (tolbutamide) ni le CYP2C19 (diazépam) dans les études Contraceptifs oraux Des études post-autorisation ont mis en évidence des grossesses non désirées chez des patientes prenant des contraceptifs oraux lors de leur traitement par venlafaxine. Il n'y a pas de preuve claire que ces grossesses résultent d'une interaction avec venlafaxine. Aucune étude d'interaction avec le contraceptif n'a été réalisée. Grossesse Il n'existe pas de données suffisamment pertinentes concernant l'utilisation de la venlafaxine chez la femme enceinte. Des études effectuées chez l'animal ont mis en évidence une toxicité sur la reproduction (voir rubrique 5. 3). Le risque potentiel en clinique n'est pas connu. La venlafaxine ne doit être administrée chez la femme enceinte que si les bénéfices attendus l'emportent sur les risques potentiels. Comme avec d'autres inhibiteurs de la recapture de la sérotonine (ISRS/IRSN), des symptômes de sevrage peuvent apparatre chez les nouveau-nés si la venlafaxine est utilisée jusqu'à la naissance ou juste avant. Certains nouveau-nés exposés à la venlafaxine tardivement au cours du troisième trimestre ont développé des complications nécessitant une alimentation par sonde, une assistance respiratoire ou une hospitalisation prolongée. Ces complications peuvent survenir immédiatement après l'accouchement. Des données épidémiologiques suggèrent que l'utilisation d'ISRS pendant la grossesse, en particulier en fin de la grossesse, pourrait augmenter le risque d'hypertension artérielle pulmonaire persistante (HTAP) du nouveau-né. Bien qu'aucune étude n'ait étudié l'existence d'une association entre HTAP et traitement par IRSN, ce risque potentiel ne peut être exclu avec la venlafaxine, compte-tenu du mécanisme d'action impliqué (inhibition de la recapture de la sérotonine). Si la mère a été traitée par des ISRS/IRSN en fin de grossesse, les symptômes suivants peuvent être observés chez les nouveau-nés : irritabilité, tremblement, hypotonie, pleurs persistants, succion ou sommeil difficiles. Ces signes peuvent correspondre, soit à des symptômes de sevrage, soit à des signes d'imprégnation sérotoninergique. Dans la majorité des cas, ces complications apparaissent immédiatement ou dans les 24 heures après l'accouchement. Les données issues d'études observationnelles indiquent un risque accru (moins de 2 fois supérieur) d'hémorragie du post-partum faisant suite à une exposition aux ISRS/IRSNA dans le mois précédant la naissance (voir rubriques 4. 4, 4. 8) Allaitement La venlafaxine et son métabolite actif, la O-déméthylvenlafaxine, sont excrétés dans le lait maternel. Des cas de nourrissons allaités qui présentaient un tableau associant pleurs persistants, irritabilité et troubles du sommeil ont été rapportés depuis la commercialisation. Des symptômes évoquant un syndrome de sevrage en venlafaxine ont également été rapportés après l'arrêt de l'allaitement. Un risque pour l'enfant allaité ne peut être exclu. Par conséquent, une décision de poursuivre/arrêter l'allaitement ou de poursuivre/arrêter le traitement par VENLAFAXINE BLUEFISH LP doit être prise, en tenant compte des bénéfices de l'allaitement pour l'enfant et de ceux du traitement par VENLAFAXINE BLUEFISH LP pour la mère. Population pédiatrique En général, le profil d'effets indésirables de la venlafaxine (dans des études contrôlées contre placebo) chez les enfants et les adolescents (âgés de 6 à 17 ans) était similaire à celui observé chez les adultes. Comme chez les adultes, perte d'appétit, perte de poids, augmentation de la pression artérielle, et augmentation du cholestérol dans le sang ont été observés ( ). Des réactions indésirables à type d'idées suicidaires ont été observées dans les études cliniques pédiatriques. Une augmentation des cas d'hostilité et, principalement dans le trouble dépressif majeur, d'auto-agressivité, a également été rapportée. En particulier, les effets indésirables suivants ont été observés chez les patients pédiatriques : douleur abdominale, agitation, dyspepsie, ecchymoses, épistaxis et myalgies Au cours des études cliniques, les réactions indésirables les plus fréquemment rapportées (> 1/10) ont été les nausées, la sécheresse buccale, les céphalées et l'hypersudation (incluant les sueurs nocturnes). Les réactions indésirables sont énumérées ci-après, par classe anatomo-fonctionnelle et par fréquence. Les fréquences sont définies comme suit : très fréquent ( 1/10), fréquent ( 1/100, < 1/10), peu fréquent ( 1/1000, < 1/100), rare ( 1/10 000, < 1/1000), fréquence indéterminée (ne peut être estimée sur la base des données disponibles). * Des cas d'idées suicidaires et de comportements suicidaires ont été rapportés pendant un traitement par la venlafaxine ou peu de temps après son arrêt ( ). * Voir rubrique 4. 4. * Dans les études cliniques poolées, l'incidence des céphalées est de 30, 3 % dans le groupe venlafaxine versus 31, 3 % dans le groupe placebo. * Cet événement a été rapporté pour la classe thérapeutique des ISRS et IRSNA (voir rubriques 4. 4, 4. 6). L'arrêt de la venlafaxine (particulièrement lorsqu'il est brutal) conduit habituellement à des symptômes de sevrage. Les réactions les plus fréquemment observées sont : sensations vertigineuses, troubles sensoriels (y compris paresthésies), troubles du sommeil (incluant insomnie et rêves intenses), agitation ou anxiété, nausées et/ou vomissements, tremblements, vertiges, céphalées et syndrome grippal. Généralement, ces symptômes sont légers à modérés et disparaissent spontanément ; cependant, chez certains patients, ils peuvent être sévères et/ou prolongés. Par conséquent, lorsque le traitement par la venlafaxine n'est plus nécessaire, il est conseillé de diminuer progressivement la posologie ( et ) Déclaration des effets indésirables suspectés La déclaration des effets indésirables suspectés après autorisation du médicament est importante. Elle permet une surveillance continue du rapport bénéfice/risque du médicament. Les professionnels de santé déclarent tout effet indésirable suspecté via le système national de déclaration : Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé (ANSM) et réseau des Centres Régionaux de Pharmacovigilance - Site internet : . Des études rétrospectives publiées rapportent qu'un surdosage en venlafaxine peut être associé à un risque accru de décès par rapport à celui observé avec les antidépresseurs de type ISRS, mais inférieur à celui observé avec les antidépresseurs tricycliques. Des études épidémiologiques ont montré que chez les patients traités par venlafaxine, le poids des facteurs de risque de suicide est supérieur à celui des patients traités par ISRS. Concernant le risque accru de décès observé, la part de responsabilité de la toxicité de la venlafaxine en cas de surdosage, par rapport à certaines caractéristiques des patients traités par venlafaxine, n'est pas clairement établie. Afin de réduire le risque de surdosage, les prescriptions de venlafaxine devront se limiter à la plus petite quantité de médicament compatible avec une bonne prise en charge du patient. Prise en charge recommandée Des mesures générales de maintien des fonctions vitales et un traitement symptomatique sont recommandées ; la fréquence cardiaque et les constantes vitales doivent être contrôlées. En cas de risque d'inhalation, l'induction de vomissements n'est pas recommandée. Le lavage gastrique peut être indiqué s'il est effectué peu après l'ingestion ou chez les patients symptomatiques. L'administration de charbon activé peut également limiter l'absorption de la substance active. La diurèse forcée, la dialyse, l'hémoperfusion et l'exsanguino-transfusion sont peu susceptibles de présenter un intérêt. Il n'existe pas d'antidote spécifique connu de la venlafaxine. Le mécanisme de l'action antidépressive de la venlafaxine chez l'homme semble être associé à la potentialisation de l'activité des neurotransmetteurs au niveau du système nerveux central. Les études précliniques ont montré que la venlafaxine et son principal métabolite, la O-déméthylvenlafaxine (ODV), sont des inhibiteurs de la recapture de la sérotonine et de la noradrénaline. La venlafaxine est également un inhibiteur faible de la recapture de la dopamine. La venlafaxine et son métabolite actif réduisent la sensibilité -adrénergique après administration aige (dose unique) et chronique. En ce qui concerne l'action globale sur la recapture de neurotransmetteurs et la liaison aux récepteurs, la venlafaxine et l'ODV sont très similaires. , la venlafaxine n'a virtuellement aucune affinité pour les récepteurs cérébraux muscariniques, cholinergiques, histaminergiques H1 ou 1-adrénergiques du rat. L'activité pharmacologique au niveau de ces récepteurs peut être liée aux divers effets indésirables, tels que les effets anticholinergiques, sédatifs et cardio-vasculaires, observés avec d'autres antidépresseurs. La venlafaxine ne possède pas d'activité inhibitrice de la monoamine-oxydase (MAO). Les études ont révélé que la venlafaxine n'a aucune affinité pour les récepteurs sensibles aux opiacés ou aux benzodiazépines. Episodes dépressifs majeurs L'efficacité de la venlafaxine à libération immédiate dans le traitement des épisodes dépressifs majeurs a été démontrée dans cinq études à court terme, de 4 à 6 semaines, contrôlées contre placebo, en double insu, randomisées, et à des posologies allant jusqu'à 375 mg/jour. L'efficacité de la venlafaxine à libération prolongée dans le traitement des épisodes dépressifs majeurs a été établie dans deux études à court terme, de 8 à 12 semaines, contrôlées contre placebo, à des posologies allant de 75 à 225 mg/jour. Dans une étude à plus long terme, des patients adultes ambulatoires ayant répondu à un traitement en ouvert de 8 semaines par la venlafaxine à libération prolongée (75, 150, ou 225 mg) ont été randomisés, soit pour poursuivre le traitement à la même posologie de venlafaxine à libération prolongée, soit pour recevoir un placebo, pour une durée d'observation des rechutes pouvant atteindre 26 semaines. Dans une seconde étude à plus long terme, l'efficacité de la venlafaxine dans la prévention des récidives d'épisodes dépressifs a été démontrée sur une période de 12 mois dans une étude en double insu, contrôlée contre placebo, chez des patients adultes ambulatoires présentant des épisodes dépressifs majeurs récurrents et ayant répondu au traitement par venlafaxine (100 à 200 mg/jour, en deux prises par jour) lors de leur dernier épisode de dépression. Trouble Anxiété sociale (Phobie sociale) L'efficacité des gélules à libération prolongée de venlafaxine dans le traitement de la phobie sociale a été établie dans quatre études en double insu et groupes parallèles, de 12 semaines, multicentriques, contrôlées versus placebo, à dose variable, et dans une étude en double insu et groupes parallèles, de 6 mois, contrôlée versus placebo, à dose fixe/variable conduites chez des patients adultes ambulatoires. Les patients avaient reçu des doses allant de 75 à 225 mg/jour. Dans l'étude à 6 mois, aucune démonstration n'a été faite d'une efficacité supérieure dans le groupe ayant reçu des doses allant de 150 à 225 mg/jour par rapport à celui ayant reçu des doses de 75 mg/jour. Absorption Au moins 92 % de venlafaxine sont absorbés après administration de doses orales uniques de venlafaxine à libération immédiate. La biodisponibilité absolue est de 40 % à 45 % en raison d'un métabolisme pré-systémique. Après administration de venlafaxine à libération immédiate, les concentrations plasmatiques maximales de venlafaxine et d'ODV sont atteintes respectivement en 2 et 3 heures. Après administration de gélules à libération prolongée de venlafaxine, les concentrations plasmatiques maximales de venlafaxine et d'ODV sont atteintes dans les 5, 5 heures et 9 heures, respectivement. Quand des posologies quotidiennes équivalentes de venlafaxine sont administrées en comprimé à libération immédiate ou en gélule à libération prolongée, la gélule à libération prolongée présente un taux d'absorption plus lente mais le même niveau final d'absorption que le comprimé à libération immédiate. Les aliments n'affectent pas la biodisponibilité de la venlafaxine et de l'ODV. Distribution Aux concentrations thérapeutiques, la venlafaxine et l'ODV sont à peine liées aux protéines plasmatiques humaines (respectivement 27 % et 30 %). Le volume de distribution de la venlafaxine à l'état d'équilibre est de 4, 4 1, 6 L/kg après administration par voie intraveineuse. Biotransformation La venlafaxine subit un important métabolisme hépatique. Des études et indiquent que la venlafaxine est métabolisée par le CYP2D6 en son principal métabolite actif, l'ODV. Des études et indiquent que la venlafaxine est métabolisée en un métabolite mineur moins actif, la N-déméthyl-venlafaxine, par le CYP3A4. Des études et indiquent que la venlafaxine est un faible inhibiteur du CYP2D6. La venlafaxine n'inhibe pas le CYP1A2, le CYP2C9, ni le CYP3A4. Elimination La venlafaxine et ses métabolites sont essentiellement éliminés par voie rénale. Environ 87 % d'une dose de venlafaxine sont retrouvés dans les urines en 48 heures sous forme inchangée (5 %), d'ODV non conjugué (29 %), d'ODV conjugué (26 %), ou d'autres métabolites inactifs mineurs (27 %). Les clairances plasmatiques moyennes Ecart Type à l'état d'équilibre de la venlafaxine et de l'ODV sont respectivement de 1, 3 0, 6 L/h/kg et 0, 4 0, 2 L/h/kg. Populations particulières Age et sexe L'âge et le sexe du sujet n'ont pas d'effet significatif sur la pharmacocinétique de la venlafaxine et de l'ODV. Métaboliseurs rapides/lents du CYP2D6 Les concentrations plasmatiques de venlafaxine sont supérieures chez les métaboliseurs lents du CYP2D6 comparés aux métaboliseurs rapides. Dans la mesure o l'exposition totale (ASC) de venlafaxine et d'ODV est similaire chez les métaboliseurs lents et rapides, il n'est pas nécessaire d'utiliser des schémas posologiques différents pour ces deux groupes. Patients présentant une insuffisance hépatique Chez les patients de stade A (insuffisance hépatique légère) et de stade B (insuffisance hépatique modérée) de la classification de Child-Pugh, les demi-vies de la venlafaxine et de l'ODV sont allongées par rapport aux sujets ayant une fonction hépatique normale. La clairance aussi bien de la venlafaxine que de l'ODV est réduite. Une importante variabilité interindividuelle est à noter. Les données chez les patients présentant une insuffisance hépatique sévère sont limitées ( ). Patients présentant une insuffisance rénale Chez des patients dialysés, la demi-vie d'élimination de la venlafaxine est allongée d'environ 180 % et la clairance réduite d'environ 57 %, par rapport aux sujets ayant une fonction rénale normale, tandis que la demi-vie d'élimination de l'ODV est allongée d'environ 142 % et la clairance réduite d'environ 56 %. Un ajustement posologique est nécessaire chez les patients présentant une insuffisance rénale sévère et chez les patients nécessitant une hémodialyse ( ). Des études animales de toxicité sur la reproduction chez les rats ont révélé une diminution du poids des petits, une augmentation des mort-nés et une augmentation des décès des petits au cours des 5 premiers jours d'allaitement. La cause de ces décès est inconnue. Ces effets sont survenus à 30 mg/kg/jour, soit 4 fois la posologie quotidienne (calculée en mg/kg) de 375 mg/jour de venlafaxine chez l'homme. La dose seuil pour l'apparition de ces évènements a été de 1, 3 fois la dose utilisée chez l'homme. Le risque potentiel chez l'homme n'est pas connu. Une réduction de la fécondité a été observée dans une étude exposant des rats mâles et femelles à l'ODV. Cette exposition était environ 1 à 2 fois supérieure à la posologie humaine de venlafaxine de 375 mg/jour. La pertinence de cette observation chez l'homme n'est pas connue. : Ethylcellulose, copovidone. : Oxyde de fer noir (E172), oxyde de fer rouge (E172), dioxyde de titane (E171), gélatine. : Gomme laque, oxyde de fer rouge (E172). Toutes les présentations peuvent ne pas être commercialisées. Pas d'exigences particulières. 100 28 STOCKHOLM SUEDE 34009 346 931 2 0 : 10 gélules sous plaquettes (PVC/Aclar/Aluminium). 34009 346 932 9 8 : 28 gélules sous plaquettes (PVC/Aclar/Aluminium). 34009 346 933 5 9 : 30 gélules sous plaquettes (PVC/Aclar/Aluminium). 34009 346 934 1 0 : 50 gélules sous plaquettes (PVC/Aclar/Aluminium). 34009 346 935 8 8 : 100 gélules sous plaquettes (PVC/Aclar/Aluminium). 34009 300 186 7 5 : 30 gélules sous plaquettes (PVC/PVdC/Aluminium). .	BDPM	Medicinal
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