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Rôle moléculaire de RPAP3 et fonction dans la physiologie de l'intestin Chloé Maurizy To cite this version : Chloé Maurizy. Rôle moléculaire de RPAP3 et fonction dans la physiologie de l'intestin. Médecine hu- maine et pathologie. Université Montpellier, 2017. Français. NNT : 2017MONTT149. tel-02383823 HAL Id : tel-02383823 Submitted on 28 Nov 2019 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. THÈSE POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DE MONTPELLIER En Biochimie et biologie moléculaire École doctorale CBS2 n168 - Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé Unité de recherche : UMR5535- Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier Rôle moléculaire de RPAP3 et fonction dans la physiologie de l'intestin Présentée par Chloé MAURIZY Le 23 Novembre 2017 Sous la direction de Bérengère PRADET-BALADE Devant le jury composé de Béatrice ROMAGNOLO, directeur de recherche, Institut Cochin, Paris Didier PICARD, Professeur des universités, Université de Genève Sabine COLNOT, directeur de recherche, Institut Cochin, Paris Rapporteur Rapporteur Président Édouard BERTRAND, directeur de recherche, Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier Co-encadrant Bérengère PRADET-BALADE, chargé de recherche, Centre de Recherche de Biochimie Directeur de thèse Macromoléculaire, Montpellier Remerciements Tout d'abord, je souhaite remercier Béatrice Romagnolo, Sabine Colnot et Didier Picard, d'avoir accepté de faire partie de mon jury et d'examiner mes travaux de thèse. Merci à La Ligure nationale contre le cancer, pour le financement de mes quatre années de thèse, Merci aux plateformes RHEM, MRI, MGC et RAM. Merci à toi, Édouard pour m'avoir accueilli et fait confiance sur ces projets, et merci pour tes encouragements, par contre, je t'attends toujours pour le ping-pong . Bérengère, durant ma thèse tu m'as toujours poussé vers l'avant, suscitant ma curiosité et me poussant dans mes retranchements pour aller chercher toujours le meilleur que je pouvais donner, tu m'as incité à participer aux congrès, aux formations en insistant bien sur celle d'anglais , j'ai bien compris que mon anglais ne te plaisait pas tu m'as incité aussi à participer au programme de mentorat Femmes &Sciences , mais je pense que ce n'était pas vraiment la peine, une mentor j'en avais déjà une , Toi. Merci pour ta confiance, ton estime, ton savoir, ta curiosité communicative, ta gentillesse et ton amour du chocolat Communicatif lui aussi. Merci à la Familia BEBR, et oui cette double équipe fonctionne parfois plus comme une famille que comme une équipe avec ses bons et ses mauvais côtés, mais qui sait bien vous accueillir et vous intégrer. Merci à tous pour vos conseils, votre gentillesse, et vos bêtises, nos parties de rire Les après midis de CLAB étaient plus sympa avec vous les filles, Marion, MC, Flo . Xavier, alala , merci pour tes musiques, ta joie de vivre ( sauf quand t'as pas dormi à cause d'Abel, mais il est trop mimi tu ne peux pas lui en vouloir) et tes blagues toujours très drôle . ciao ciao, Vivi et Alja , mes deux petites choupi, la vie au labo est plus rigolote avec vos accents chantant, Alja et son lapin à la moutarde , Houda, ma formatrice, ma version algérienne, Adham et ses cascades, Claire notre dernière recrue mais pas des moindre , l'équipe des lève-tôt celle de Rémy, celle des lève-tard celle d'Edouard, mais aussi Fred et Sylvie, la devise de l'équipe toute occasion se fête donc des pots en veux tu en voilà . Une vie bien animée, vous allez me manquer ! Je souhaite aussi remercier, toutes les personnes qui m'ont aidé sur ces projets : l'équipe de Philippe Jay, et particulièrement François Gerbe, pour le temps d'écoute et les conseils pratiques Mon équipe d'adoption, évidement merci à Michael Hahne et en particulier Conception, Béné, Valérie, Sophie qui m'ont aidé en salle de dissection , grâce elles le temps passait plus vite et c'était plus sympa d'être enfermé dans ce petite salle Le comité ZPB, une fine équipe qui a beaucoup de mérite pour le travail lors de la fameuse contamination de notre animalerie, grâce à elle le projet Spaghetti-Whisky n'a pas coulé et a pu redémarrer plus rapidement que prévu, ce fut une année difficile, merci à elles pour tous leurs conseils également, sur les schémas d'accouplement etc. L'équipe de la ZEFI ( Sarah , Vera, et bien sur Marina mon binôme de choc, une équipe dynamique et serviable et adorable avec qui travailler est un plaisir , je n'oublierai pas non plus l'élection Miss ZEFI (petit clin d'oeil à Juliette ). On ne peut pas évoquer la fille Couderc sans la mère, Merci à Françoise qui se bat entre autres avec les diverses administrations pour que les doctorants aient leur salaire, je crois que je te dois beaucoup de botes de chocolat, Merci à Sarah et Lysiane aussi pour leur gentillesse Delphine, ma mentor du programme Femmes &Sciences , merci pour tes conseils et pour les cours de yoga. Merci à tous les personnes de l'IGMM parties ou encore présentes avec qui j'ai partagé de super moments qui ont rendu plus agréables ces années de thèse, les pots des thésards, l'organisation des colloques, la team sport avec Mahdi, les goûters d'anniversaire mais pour leur ouverture à le discussion scientifique Ma petite Yousra de la curly team, en qui j'ai trouvé une véritable amie que je peux soudoyer en tomates du jardin bio de Serge the beautiful . in London . Enfin merci aux personnes extérieures à l'institut mais qui ont été d'un soutien moral indéniable ; mes amis ceux qui sont ici mais aussi ceux qui sont là bas et évidement toute ma famille, mes parents qui ont cru en moi quand j'y croyais plus, ma petite fratrie DEC3, je n'ai pas de mots pour vous remercier de nos moments soupape pendant ces quatre années de thèse, et finalement Morgan, mon soutien de tous les jours pour me faire retrouver le sourire quand je l'avais perdu et qui supporte mes discours sur la nouvelle interaction que j'ai trouvé ou les détails de mes dissections ! Merci à tous ceux que j'ai pu oublié dans ces remerciements la liste n'est pas exhaustive. Table des matières I. INTRODUCTION . 10 A. La protéine chaperonne HSP90 . 11 1. Généralités . 11 2. La structure d'HSP90 . 11 3. Cycle de la protéine chaperon HSP90 . 13 4. Régulation des fonctions d'HSP90 par ses co-chaperons . 17 5. Les différents substrats et les co-chaperons adaptateurs . 21 6. Rôles dans l'organisme . 23 B. Le complexe R2TP, co-chaperon d'HSP90. 27 1. Découverte du R2TP . 27 2. Structure et mode de fonctionnement du R2TP . 29 3. Les substrats du complexe R2TP . 40 4. Modèle général d'action du complexe R2TP . 55 5. Les protéines PIH-like et RPAP3-like. . 57 6. HSP90, les RUVBL et le R2TP dans le cancer. 60 C. L'intestin comme organe d'étude de la prolifération . 61 1. Le rôle de l'intestin . 61 2. Les différents types cellulaires de l'épithélium intestinal . 65 3. L'épithélium intestinal, une régénération continue . 69 4. Les grandes voies de signalisation impliquées dans la prolifération et le maintien de l'homéostasie intestinale . 73 5. Le cancer colorectal (CRC) . 81 D. Objectifs et déroulement de la thèse . 91 1. Objectif principal : RPAP3 pourrait-il être une cible thérapeutique des cancers colorectaux ? . 91 2. Développement de modèles murins d'invalidation de RPAP3 et, conduite des expériences sur les souris . 91 3. Développement d'un sujet connexe : le rôle du domaine C-terminal de RPAP3 . 93 II. Résultats . 94 A. Rôle de RPAP3 dans l'épithélium intestinal et la tumorigénèse . 94 1. Introduction . 94 2. Résultats . 96 B. Mise en évidence d'un nouveau complexe tissu spécifique, le R2SP, apparenté au complexe R2TP . 120 1. Introduction . 120 2. Résultats . 121 1 III. Discussion . 181 A. Caractérisation de la fonction du domaine C-terminal de RPAP3 . 181 B. Mise en évidence d'un nouveau complexe tissu-spécifique, le R2SP, apparenté au R2TP 184 C. Ciliogenèse motile et les complexes apparentés au R2TP . 185 D. Rôle de RPAP3 dans le maintien des cellules prolifératives de l'épithélium intestinal et de la voie Wnt . 185 E. Rôle deRPAP3 dans l'épithélium du côlon . 187 F. Régénération du l'épithélium intestinal après l'invalidation de RPAP3 . 188 G. La perte d'une copie de RPAP3 favoriserait la tumorigenèse . 188 IV. Perspectives . 190 A. R2TP, complexes apparentés R2TP-like et ciliogenèse . 190 B. Rôle du R2TP dans d'autre tissus . 190 V. Bibliographie . 192 2 Liste des abréviations aa : acides aminés ADP : Adénosine DiPhosphate AHA1 : Activator of Hsp90 ATPase protein 1 AHR : Aryl Hydrocarbon Receptor ; AOM : AzOxyMéthane APC : Adenomatous Polyposis Coli apo apoenzyme AR : Androgen Receptor ; ARN : Acide RiboNucléique Arp5 : Actin-related protein 5 Arp8 : Actin Related Protein 8 Homolog ASCL2 : Achaete-Scute Complex-Like 2 ATM : Ataxia Telangiectasia Mutated ATP : Adénosine TriPhosphate ATPase : enzyme catalysant l'hydrolyse de l'ATP ATR : Ataxia Telangiectasia and Rad3-related protein BMP : Bone Morphogenetic Protein BRAF : Serine/threonine-protein kinase B-raf BRG1 : Brahma-Related Gene-1(BAF) CAF : Cancer Associated Fibroblaste CAM : Cancer Associated Macrophages CBC : Crypt Base Columnar CBF1 : Centromer Binding Factor 1 CBP : CREB Binding Protein CCDC103 : Coiled-Coil Domain-Containing protein 103 CD8 : Cluster Diffenciation 8 CDC23 : Cell Division Cycle protein 23 homolog Cdc37 : Cell division cycle protein 37 CDC4 : Cell Division Control protein 4 CDK4 : Cyclin-Dependent Kinase 4 3 cDNA : complementary DNA CFTR : Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator CIN : Chromosome INstability CMS : Consensus Molecular Subtype CP4 : Cellules en Position 4 CRC : Cancer ColoRectal Cre : Causes recombination CREB : C-AMP Response Element-Binding cryoEM : cryo-Electronic Microscopy CS : CHORD et SGT CSC : Cellules Souches Cancéreuses CSL : CBF1, Suppressor of Hairless, Lag-1 CTD/ C-ter : C-Terminal Domain CXCL12 : C-X-C Motif Chemokine Ligand 12 DKC1 : dyskérine DKK1 : Dickkopf homologue 1 DNA : DesoxyriboNucleic Acid DNAAF2 : Dynein Axonemal Assembly Factor 2 DNA-PKc : DNA-dependent Protein Kinase, catalytic subunit Dsh : Dishevelled DSL : Delta/Serrate/Lag-2 DSS : Dextran Sulfate Sodium DYX1C1 : Dyslexia Susceptibility 1 Candidate Gene 1 Protein EFTUD2 : Elongation factor Tu GTP-binding Domain-containing protein 2 EGF : Pro-Epidermal Growth Factor EGFR : Epidermal Growth Factor Receptor eNOS : endothelial Nitric Oxide Synthase ; EphB : EphrinB ER : Estrogen Receptor- ; FAP : Familial Adenomatous Polyposis FBL/Fib : Fibrillarine 4 FFL : Firefly Luciferase FKBP : FK506-Binding Protein Fz : Frizzled GAR1 : Glycine- and Arginine-Rich ribonucleoprotein 1 GR : Glucocorticoid Receptor GSK3- : Glycogen Synthase Kinase 3 beta HAP1 : Haeme Activator Protein 1 hBcd1 : human Box C/D snoRNA protein 1 HCK : Haemotopoietic Cell Kinase HCV : Hepatitis C Virus ; HE : Hématoxyline-Eosine HEK293 : Human Embryonic Kidney cells 293 HeLa : Henriette Lacks HER2 : Human Epidermal Growth Factor Receptor-2 HES : HairyEnhancer of Split HGF : Hepatocytes Growth Factor HIF : Hypoxia-Inducible Factor HIF-1 : Hypoxia Inducible Factor 1 alpha HNF4A : Hepatocyte Nuclear Factor 4 HOP : Hsp70-Hsp90 Organizing Protein HSF1 : Heat Shock Factor 1 HSP : Heat Shock Protein IGF2 : Insulin-like Growth Factor 2 IL-6 : InterLeukine 6 ImoPA : Ingénierie moléculaire et Physiopathologie Articulaire IP : ImmunoPrécipitation IRS2 : Insulin Receptor Substrate 2 KO : Knock Out KOMP : KnockOut Mouse Project LEF : Lymphoid Enhancer Factor LGR5 : Leucine rich repeat containing G protein coupled Receptor 5 LRIF1 : Ligand-dependent nuclear Receptor-Interacting Factor 1 5 LRP5/6 : Low-density lipoprotein Receptor-related Protein 5/6 LRR : Leu-Rich Repeat LUMIER : luminescence-based mammalian interactome mapping MD ou M : domaine central d'HSP90 MEC : Matrice ExtraCellulaire MR : Mineralocorticoid Receptor ; MSI : MicroSatellites Instability mTOR : mammalian Target Of Rapamycin N : Nucleoprotein (figure 6) NAF1 : Nuclear Assembly Factor 1 ribonucleoprotein NALP, NACHT : LRR and PYD domains-containing protein NECD : Notch ExtraCellular Domain NF B : Nuclear Factor-kappa B NICD : Notch IntraCellular Domain NLR : Nucleotide-binding LRR ; NMD : Nonsense Mediated Decay NOD1 : Nucleotide-binding Oligomerization Domain-containing protein 1 ; NOP : NucleOlar Protein N-ter / NTD / N : N- DomainTerminal NUFIP1 : Nuclear Fragile X mental retardation-Interacting Protein 1 OLFM4 : Olfactomedin-4 PAS : Periodic Acid Schiff PCR : Polymerase Chain Reaction Pi : Phosphate inorganique PIH : Protein Interacting with HSP90 PIH1D1 : PIH1 Domain Containing Protein 1 PIH1D2 : PIH1 Domain Containing Protein 2 PIH1D3 : PIH1 Domain Containing Protein 3 PIKK : PhosphatIdylinositol-3 Kinase related Kinases Pol II : ARN Polymérase II PP5 : Protein Phosphatase 5 6 PPAR : Peroxisome Proliferator-Activated Receptor- PPIase : Peptidy-Propyl cis-trans Isomerase PR : Progesterone Receptor PRF : Pseudomonas Resistance and Fenthion sensitivity Prp31 : Pre-mRNA-processing factor 31 PRPF8 : Pre-mRNA-Processing-splicing Factor 8 PTM : Post Translastional Modification PXR : Pregnane X Receptor ; R2SP : RUVBL1 RUVBL2 SPAG1 PIH1D2 R2TP : Rvb1 Rvb2 Tah1 Pih1 RL : Renilla Luciferase ROS : Reactive Oxygen Species RPAP3 : RNA Polymerase II Associated Protein 3 Rpb1 : RNA polymerase II subunit B1 RPS2 : Resistance to Pseudomonas Syringae 2 RUVBL 1 / 2 : RuvB like AAA ATPase 1 / 2 (Rvb 1/ 2 Tip48/Tip49 p50/p55) S. c : Saccharomyces cerevisiae SAGA : Spt-Ada-Gcn5 Acetyltransferase SHQ1 : Small nucleolar RNAs of the box H/ACA family Quantitative accumulation SILAC : Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture SMARCA4 : SWI/SNF related, Matrix associated, Actin dependent Regulator of Chromatin, subfamily A, member 4 (BRG1) SMN : Survival MotoNeuron snARN : small nuclear ARN SNF2 : Sucrose NonFermenting 2 snoRNP : small nucleolar Ribo-Nucleo-Protein particles snRNP : small nuclear Ribo-Nucleo-Protein Partciles SNRNP200 : Small Nuclear Ribo-Nucleo-Protein U5 Subunit 200 SNU13 : Small NUclear riboprotein 13 (15. 5K) SPAG1 : SPerm associated AntiGen 1 STAT3 : Signal Transducer and Activator of Transcription 3 7 SWI/SNF : SWItch/Sucrose Non-Fermentable TA : Transient Amplifying compartment TACE : TNF- ADAM metalloprotease Converting Enzyme Tah1 : TPR containing associated HSP90 protein TAU : Microtubule-associated protein tau TCF : T-Cell Factor Tel2 : Telomer length regulation protein 2 TEM : Transition Epithélio-Mésenchymateuse TERT : TElomerase Reverse Transcriptase TGF : Trasnforming Growth Factor beta TIC : Tumor Inducing Cells TNF : Tumor Necrosis Factor TOM70 : Translocase of Outer Membrane 70 kDa. TPR : TetratricoPeptid Repeat TRAP1 : TNF Receptor Associated Protein 1 Treg ; lymphocytes T régulateurs TRRAP : Transformation/Transcription Domain Associated Protein TSC : Tumor Suppressor Complex Tti1 : TELO2-interacting protein 1 homolog Tti2 : TELO2-interacting protein 2 homolog VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor Vil : Villine WDR92 : WD Repeat-containing protein 92 Wnt : Wingless/T-Cell ZNHIT3 : Zinc finger HIT domain-containing protein 3 ZNHIT6 : Zinc finger HIT domain-containing protein 6 (BCD1) 8 Table des illustrations Figure 1 : Schéma de la structure d'HSP90 12 Figure 2 : Représentation du cycle ATPasique responsable des changements de conformation du dimère HSP90. 15 Figure 3 : Représentation de l'activation par HSP90 des récepteurs aux glucocorticoïdes avec l'intervention des co-chaperons. 16 Figure 4 : Représentation des régulations du cycle d'HSP90 par ses co-chaperons. 19 Figure 5 : Représentation des sites de liaison connus de quatre co-chaperons d'HPS90 chez S. cerevisiae 20 Figure 6 : Représentation de la liste non exhaustive des clients d'HSP90 22 Figure 7 : Schéma des voies de signalisations impliquées dans la progression tumorale 25 Figure 8 : Représentation schématique du complexe R2TP chez l'homme et Saccharomyces cerevisiae 28 Figure 9 : représentation schématique des protéines composant le R2TP chez l'homme et chez S. cerevisiae 30 Figure 10 : Représentation de la structure d'un dimère de Rvb1 : Rvb2 chez Chaetomium thermophilus 35 Figure 11 : Schéma de la structure du complexe Ino80 chez S. cerevisiae 36 Figure 12 : représentation schématique du rôle de Rvb1 et Rvb2 dans l'assemblage du complexe INO80 37 Figure 13 : Représentation de la structure à basse résolution du complexe R2TP chez S. cerevisiae. 38 Figure 14 : Représentation des ARNs à botes C/D (A) et à botes H/ACA (B) 41 Figure 15 : Structure des particules à petits ARNs nucléolaires à bote C/D humain 44 Figure 16 : Modèle d'assemblage des petites particules ribonucléiques non codantes à botes C/D (snoRNP C/D). 45 Figure 17 : Modèle d'assemblage des snoRNP à botes H/ACA 48 Figure 18 : Modèle d'assemblage des sous unités de l'ARN polymérase II 51 Figure 19 : Modèle d'interaction entre le complexe R2TP, HSP90 et TELO2 53 Figure 20 : Schéma représentant les clients d'HSP90 dépendant du R2TP 54 Figure 21 : Modèle général d'assemblage des complexes macromoléculaires par le R2TP 56 Figure 22 : Structure des protéines RPAP3-like et PIH-like (issu du manuscrit n2) 58 Figure 23 : Modèle d'assemblage des dynéines. 59 Figure 24 : Photo du tractus digestif d'une souris RPAP3 / . 61 Figure 25 : Image de l'épithélium de l'intestin grêle (a) avec les villosités et les cryptes, et en (b) image de l'épithélium au niveau du côlon. 63 Figure 26 : Coloration à l'Hématoxyline-Eosine (panneau HE) et à l'Acide Périodique de Schiff (panneau PAS) de coupes d'épithélium intestinal de souris. 64 Figure 27 : Représentation schématique des types cellulaires connus de l'épithélium intestinal 67 Figure 28 : schéma de l'organisation des cellules dans l'épithélium de l'intestin grêle. 71 Figure 29 : Coupe de duodénum de souris RPAP3 / 72 Figure 30 : Schéma descriptif du mode d'action de la voie Wnt canonique. 74 Figure 31 : Invalidation de TCF4 dans l'épithélium intestinal. 76 Figure 33 : Séquence des mutations conduisant à la carcinogenèse colorectale 83 Issue de (Jones et al. , 2008) 83 Figure 34 : Classification des sous-types de cancer colorectal 84 Figure 35 : les 2 grandes modèles de tumorigénèse intestinale 89 Figure 36 : Représentation des interactions au sein du R2TP au cours de l'assemblage des snoRNP à botes C/D 182 Figure 37 : Assemblage des complexes macromoléculaires par le R2TP 183 9 Liste des figures de la partie Résultats : A. Rôle de RPAP3 dans l'épithélium intestinal et la tumorigénèse (page 94) Figure 1. RPAP3, a core component of the R2TP, is strongly expressed in dividing cellsfrom the intestinal epithelium Figure 2. Murine RPAP3 alleles and their viability Figure Supplemental 2 Figure 3. Invalidation of RPAP3 induces a quick destruction of the intestinal epithelium Figure Supplemental 3 : Invalidation of RPAP3 induces a quick destruction of the intestinal epithelium, which compromises the survival of animals Figure 4. Invalidation of RPAP3 compromises the CBC and TA cells. Figure 4 supplemental : Invalidation of RPAP3 compromises the CBC and TA cells. Figure 5. Invalidation of RPAP3 does not affect Paneth cells not -catenin staining Figure 6. RPAP3 prevents intestinal tumorigenesis by genetic induction Figure 7. RPAP3 prevents intestinal tumorigenesis by AOM/DSS induction B. Mise en évidence d'un nouveau complexe tissu spécifique, le R2SP, apparenté au complexe R2TP (page 120) Figure 1. Solution structure of the C-terminal domain of human RPAP3 Figure 2. RPAP3-Cter interacts with RUVBL1/2 hexamers Figure 3. The RPAP3 C-terminal domain interacts with R2TP clients via RUVBL1/2 multimers. Figure 4. RPAP3-like and PIH1-like proteins interact with each other Figure 5. Identification of R2TP-like complexes. Figure 6. Identification of PIH1D2 partners Figure 7. The R2SP complex promotes the stabilization of its clients and the assembly of liprin- 2 complexes 10 I. INTRODUCTION A. La protéine chaperonne HSP90 1. Généralités La protéine chaperonne HPS90 (Heat Shock Protein 90) a été mise en évidence dans la réponse au choc thermique mais il s'avère qu'elle est exprimée de façon constitutive dans les cellules en condition homéostatique (Ritossa, 1996). Chez les bactéries, il n'y a qu'un seul gène codant pour HSP90, alors qu'il y en a deux chez Saccharomyces cerevisiae (S. c. ). Chez les mammifères, on compte deux isoformes cytoplasmiques : HSP90 (Hsc82 chez S. c. ) qui est exprimée de manière constitutive et HSP90 (Hsp82 chez S. c) qui est inductible en condition de stress, ainsi que deux autres paralogues d'HSP90 : TRAP1 au niveau de la mitochondrie (Leskovar et al. , 2008) et Grp94 dans le réticulum endoplasmique(Frey et al. , 2007). Le fait d'avoir des localisations différentes dans la cellule suggère que ces isoformes de HSP90 ont des fonctions différentes. Contrairement aux autres chaperons, HSP90 assure les étapes tardives du repliement des protéines substrats (appelées communément clients ), après que HSP70 en ait effectué les étapes précoces. HSP90 a pour fonction de maintenir l'équilibre du protéome au sein des cellules. Elle a pour action de contrôler le repliement des protéines, la liaison d'un ligand sur son récepteur, ou encore l'assemblage de complexes macromoléculaires. 2. La structure d'HSP90 HSP90 agit en homodimère et cette dimérisation est nécessaire à sa fonction. Chaque monomère est composé de trois domaines conservés : un domaine N-Terminal (N ou NTD) impliqué dans la liaison de l'ATP un domaine central (M ou MD) important pour l'hydrolyse de l'ATP ainsi que la liaison HSP90-clients (Prodromou et al. 1997) un domaine C-Terminal (C ou CTD) responsable de la dimérisation d'HSP90 (Harris et al. , 2004) Le NTD et le MD sont reliés par une séquence flexible linker (en rouge dans la Figure 1) qui dote HSP90 d'une souplesse et permet les changements de conformation nécessaires à sa fonction. Ainsi, le domaine NTD se comporte comme un couvercle et se retrouve éloigné du domaine MD dans la configuration ouverte , puis en contact avec celui-ci dans la configuration fermée . La protéine HSP90 comporte un motif C-terminal MEEVD reconnu par les protéines 11 co-chaperonnes possédant des domaines TetratricoPeptid Repeat (TPR) particuliers (Brinker et al. , 2002 ; Rhl et al. , 2015). Figure 1 : Schéma de la structure d'HSP90 . A. Le domaine N-Terminal (N) en bleu/vert est impliqué dans la liaison à l'ATP, le domaine C- Terminal (C) est responsable de la dimérisation de HSP90. Le motif MEEVD en position C-terminale intervient dans la liaison aux co-chaperons contenant un motif TPR (par exemple RPAP3). La séquence indiquée en rouge intervient dans le changement de conformation du couvercle d'HSP90 lors de la liaison à l'ATP. B. Représentation schématique de la structure d'un dimère d'HSP90. NTD : domaine N-terminal ; Linker : séquence mobile ; Lid : couvercle ; MD : domaine central middle ; CTD : domaine C- terminal ; MEEVD : motif de liaison aux protéines à domaine TPR. Adapté de (Wandinger et al. , 2017) 12 3. Cycle de la protéine chaperonne HSP90 L'activité d'HSP90 est dépendante de l'ATP. Elle est soumise à un cycle de changements de conformation du dimère d'HSP90 (Figure 2 et 3). La protéine HOP (Hsp70-HSP90 Organizing Protein) est un co-chaperon d'HSP90, il l'accompagne dans l'initiation du cycle ATPasique. HOP fixe HSP90 dans sa forme ouverte . L'ATP est capté par chaque domaine NTD. Des changements de conformation s'opèrent, menant à la fermeture du couvercle sur la poche o se trouve l'ATP. Le dimère se trouve alors dans une forme semi-fermée . Les domaines NTD se lient entre eux pour donner lieu à la fermeture totale du dimère. Cette position est la conformation fermée . Cet état est nécessaire à l'hydrolyse de l'ATP (Cunningham et al. , 2008)(Figure 2). Le modèle représenté sur la Figure 3 est basé sur l'activation des récepteurs aux glucocorticoïdes (GR) (Figure 3), un client d'HSP90 très étudié. HSP90 est nécessaire à ce que le GR fixe son ligand et soit ainsi actif (Kirschke et al. , 2014 ; Picard et al. , 1990). Les protéines clientes néo-synthétisées sont d'abord prises en charge par le chaperon HSP40 pour éviter leur agrégation. HSP40 les transfère ensuite à HSP70 qui assure les étapes précoces du repliement. Un complexe se forme alors avec HOP (HSP70/HSP90 Organizing Protein), un co- chaperon précoce pour transférer le client à HSP90. La liaison à l'ATP se fait durant cette étape, et permet un changement de conformation du dimère d'HSP90 de la forme ouverte à la forme fermée. Ce changement est stimulé par le co-chaperon AHA1, que nous verrons plus loin. HSP70 et HOP se dissocient du complexe. L'étape suivante est l'hydrolyse de l'ATP. Elle est régulée par d'autres co-chaperons, p23 et PP5. A ce stade, la protéine client finit sa maturation, puis est libérée. Si les sites de liaison des co-chaperons sur HSP90 sont pour la plupart connus (Figure 5), les sites de fixation des substrats semblent plus difficiles à trouver. Plusieurs équipes ont cherché en vain des motifs conservés qui seraient reconnus par HSP90 pour le remodelage du client. Ainsi, certaines kinases dépendent de HSP90 pour acquérir une conformation native, active, alors que d'autres ne dépendent pas de HSP90, malgré des séquences relativement proches (Taipale et al. , 2010). Ceci a conduit à proposer qu'il y aurait une reconnaissance de la structure plutôt que de la séquence des clients. L'étude de la protéine cliente TAU a permis de déterminer ses sites de liaison sur HSP90. TAU lie HSP90 en deux points : sur le MD et sur le NTD. Le site de fixation d'HSP90 sur la protéine TAU est composé d'acides aminés chargés négativement et hydrophobiques (Karagz et al. , 2014). D'autre part, la structure du complexe HSP90 : CDC37 : CDK4 a été résolue (Vaughan et al. , 2006). Un chevauchement partiel apparat entre le site de liaison du client TAU et celui de la kinase cliente CDK4. Un même site de HSP90 pourrait donc lier diverses protéines clientes : 13 kinases, récepteurs aux hormones, ou des protéines non repliées comme TAU. La liaison de l'ATP et son hydrolyse induisent un changement de conformation d'HSP90. Si un client se lie à la fois aux domaines NTD et MD, ce changement conformationnel d'HSP90 se transmet aux clients pour provoquer leur repliement. 14 Figure 2 : Représentation du cycle ATPasique responsable des changements de conformation du dimère HSP90. 1) Deux monomères de HSP90 forment un dimère par leur domaine C-Terminal (C ). Le dimère est en position ouverte. 2) Les molécules d'ATP se fixent sur les domaines N-Terminaux (N). 3) La fermeture du couvercle (Lid) est stimulée par le co-chaperon Aha1. Cette position est la conformation fermée/closed ou fermée n1. 4) Des changements de conformation des domaines aboutissent à la fermeture complète du dimère (closed and twisted) ainsi qu'à l'hydrolyse de l'ATP. Le largage de l'ADP et du phosphate permet à HSP90 de revenir en conformation ouverte, prête à entamer un nouveau cycle. 5) Le co-chaperon Sti/HOP peut inhiber l'avancée dans le cycle en restant fixé sur le domaine C- Terminal d'HSP90. Sti/Hop est un antagoniste du co-chaperon Aha1. C : domaine C-Terminal ; N : domaine N-Terminal ; M : domaine central middle ; CL : séquence chargée charged linker Adapté de (Neckers et al. , 2009) 15 4 1 3 2 Figure 3 : Représentation de l'activation par HSP90 des récepteurs aux glucocorticoïdes avec l'intervention des co-chaperons. 1) Le récepteur aux glucocorticoïdes partiellement replié (GR) est amené par le complexe HSP70/HSP40 sur HSP90 via le co-chaperon HOP (dessiné en rose). 2) La liaison de l'ATP ainsi que du co-chaperon PPIasesur HSP90 entrane la semi-fermeture du dimère HSP90 et la libération du complexe HSP70/40. PPIase permet la fixation du clientgrâce à leur activité chaperonne like . HSP90 fixe le récepteur aux hormones glucocorticoïdes, et le maintient dans une conformation qui permet la fixation des hormones glucocorticoïdes (en violet) sur leur récepteur. 3) HOP est libéré, le co-chaperon p23 (en vert pâle) permet la fermeture totale de la conformation d'HSP90. p23 est ensuite libéré à son tour avec l'ADP. 4) Le dimère de HSP90 est à nouveau en position ouverte lié à HOP, prêt à accueillir un nouveau client. 16 4. Régulation des fonctions d'HSP90 par ses co-chaperons HSP90 a des milliers de clients qui interviennent dans des voies de signalisation ou divers processus, allant de la transcription à la réponse immunitaire, en passant par le développement (Figure 6). Elle est soumise à une régulation de ses fonctions à trois niveaux : par des modulations de son expression induite par des stress comme un changment de pH ou de température (Prodromou, 2016), par des modifications post-traductionnelles (PTM) et par des interactions avec des protéines co-chaperonnes. Ainsi une phosphorylation de HSP90 ou une acétylation peuvent moduler son interaction avec certains clients ou sa fonction ATPasique (Bali et al. , 2005 ; Kovacs et al. , 2005 ; Mollapour et al. , 2010). Les co-chaperons sont des protéines qui interagissent physiquement avec une protéine chaperonne et l'aident dans l'exécution de ses fonctions (Figure 4 et 5). Ce ne sont pas des clients d'HSP90. Certains fixent le même site sur HSP0 et sont donc mutuellement exclusifs, tandis que d'autres se lient simultanément. On distingue deux catégories de co-chaperons : les régulateurs, qui régulent le cycle du chaperon HSP90 (cf. Figure 2, 3, et 4) et les adaptateurs, qui servent au recrutement des substrats (cf. 5. Les substrats). Certains peuvent avoir les deux fonctions. Typiquement, les co-chaperons possédant des domaines TPR caractéristiques appellés carboxylate-clamp (pince à carboxylate) peuvent lier le motif MEEVD du domaine C- Terminal d'HSP90. D'autres co-chaperons ne possèdent pas de TPR, et lient HSP90 via d'autres domaines. Le co-chaperon le plus connu est HOP, que nous avons vu précédemment dans le cycle de changement de conformations d'HSP90. HOP est capable de lier HSP70 et HSP90. Il aurait pour fonction d'assurer le transfert des clients d'HSP70 sur HSP90. Il intervient dans la prise en charge des récepteurs aux glucocorticoïdes mais il agit aussi sur le cycle du chaperon en fixant HSP90 dans une conformation ouverte (Chen et Smith, 1998). Un autre co-chaperon à TPR est la protéine PP5 (Ser/Thr protein phosphatase) Elle lie le domaine N-ter d'HSP90 et empêche la formation de la conformation fermée. Elle déphosphoryle CDC37 qui favorise la poursuite du cycle. La déphosphorylation de CDC37 est nécessaire à la maturation des kinases et à leur libération (Oberoi et al. , 2016). Le co-chaperon AHA1 stimule la fermeture du dimère d'HSP90 en se liant aux domaines NTD et MD, et il accélère ainsi le cycle ATPasique (Panaretou et al. , 2002). La protéine p23 intervient dans les dernières étapes du cycle. Elle lie préférentiellement les domaines NTD et MD de la forme fermée d'HSP90, liée à l'ATP (Ali et al. , 2006). Le co- chaperon p23 stabilise ainsi cet état, ce qui permet d'assurer la pleine maturation des clients en retardant l'hydrolyse de l'ATP (Johnson et Toft, 1994 ; Richter et al. , 2004). 17 Le cycle ATPasique du changement de conformation d'HSP90 est régulé par plusieurs acteurs : HOP, CDC37 et p23 sont plutôt des ralentisseurs du cycle alors de AHA1 a tendance à l'accélérer (Forafonov et al. , 2008 ; McLaughlin et al. , 2006 ; Meyer, 2004 ; Panaretou et al. , 2002 ; Roe et al. , 2004 ; Zhang et al. , 2010) (Figure 4). 18 Figure 4 : Représentation des régulations du cycle d'HSP90 par ses co -chaperons. Le co-chaperon HOP (cercle rose) se fixe par son domaine TPR au motif EEVD du motif C-Terminal d'HSP90. Il permet le maintien de la forme ouverte d'HSP90, favorable à la liaison des clients. CDC37 lie le NTD et MD d'HSP90, participant au maintien de HSP90 dans sa forme ouverte. AHA1 (en rouge) stimule la fermeture du couvercle d'HSP90 (closed 1 state), favorisant ainsi l'hydrolyse de l'ATP. p23 intervient à la fin du cycle, il stabilise la forme fermée (closed 2 state) pour s'assurer de la maturation des clients, il est libéré en même temps que l'ADP et le phosphate inorganique. Les PPIase sont des protéines qui peuvent se fixer sur toutes les conformations d'HPS90. Leur fonction ne semble pas indispensable au déroulement du cycle. Elles interviennent dans le recrutement des clients en changeant leur conformation. (Wandinger et al. , 2017) 19 Figure 5 : Représentation des sites de liaison connus de quatre co -chaperons d'HPS90 chez S. cerevisiae a. Hop/Sti1 se fixe sur le motif MEEVD du NTD d'HSP90 et sur le MD. b. p23/Sba1 se fixe sur le NTD avec une légère fixation sur le MD aussi. c. Cdc37, l'adaptateur des kinases, fixe le NTD et MD. d. Aha1 se fixe au niveau du NTD pour fermer le couvercle du dimère d'HSP90 Adapté de (Li et al. , 2012) 20 Les différents substrats et les co-chaperons adaptateurs 5. HSP90 a de nombreux substrats, et chaque co-chaperon adaptateur l'adresse à plusieurs clients. On peut distinguer au moins trois catégories de clients : (1) ceux dont HSP90 facilite le repliement en une forme active : c'est le cas des kinases (Boczek et al. , 2015 ; Grammatikakis et al. , 1999), (2) ceux dont HSP90 favorise l'assemblage en complexes macromoléculaires tels que les clients du R2TP (cf. section suivante), (3) et enfin une catégorie de clients dont HSP90 aide à la liaison avec leur récepteur, comme dans le cas des récepteurs aux hormones stéroïdes (Pratt et Toft, 1997)(Kirschke et al. , 2014 ; Picard et al. , 1990 ; Pratt et Dittmar, 1998). L'inhibition d'HSP90 peut avoir différentes conséquences sur ses substrats : certains sont redirigés vers le protéasome pour y être dégradés, certains s'agrègent en particules insolubles, d'autres s'accumulent sous forme inactive mais semblent solubles. Pour le moment, on ignore les déterminants moléculaires qui dictent quelle sera la conséquence de l'inhibition de HSP90 sur un substrat donné (Taipale et al. , 2012). Environ 10% des protéines de la cellule sont des clients d'HSP90, et environ 60% des kinases cellulaires sont dépendantes de CDC37 comme adaptateur. Cela fait de CDC37 un des co- chaperons adaptateurs les plus étudiés. De nombreuses équipes ont tenté, sans y parvenir, de trouver un motif qui serait reconnu par CDC37, et déterminerait quelle kinase serait ou non prise en charge par CDC37 pour l'adresser à HSP90 (Taipale et al. , 2012). Les PPIases ont une activité similaire aux protéines chaperonnes. Elles sont capables de replier les protéines, ici les susbtrats clients d'HSP90 pour favoriser leur recrutement (Bose et al. , 1996 ; Freeman et al. , 1996 ; Ou et al. , 2001). D'autres clients de HSP90 sont la TERT (TElomerase Reverse Transcriptase)(Holt et al. , 1999), eNOS (endothelial Nitric Oxide Synthase) (Sessa et al. , 1998), des facteurs de transcription (Sepehrnia et al. , 1996) ou des protéines associées à la chromatine comme Trithorax (Tariq et al. , 2009) (Figure 6). Un nouveau co-chaperon de HSP90 a été identifié par W. Houry en 2005 chez S. cerevisiae : le complexe R2TP. Ce complexe présente la particularité d'être composé de 4 protéines : RUVBL1, RUVBL2, PIH1D1 et RPAP3. Il interagit avec HSP90 via le domaine TPR de la protéine RPAP3. Ensemble, HSP90 et le complexe R2TP permettent l'assemblage de machineries cellulaires. R2TP définit une nouvelle fonction de la protéine chaperonne HSP90 dans le repliement quaternaire des protéines (voir ci-dessous partie sur le R2TP). La découverte de nouveaux co-chaperons comme le complexe R2TP a permis d'identifier des substrats d'HSP90 et ainsi, de mieux comprendre les effets de l'inhibition de HSP90. 21 Figure 6 : Représentation de la liste non exhaustive des clients d'HSP90 Issue de (Taipale et al. , 2010). Les cercles concentriques représentent les différents niveaux d'interactants. Au milieu, en orange se situe la chaperonne HP90, ainsi que les deux autres chaperonnes du complexe précoce HSP70/HSP40. Le rôle des co-chaperons HOP et p23 n'a pas été mis en évidence pour tous les clients, cela reste à démontrer. Le cercle vert indique les différents adaptateurs connus, notamment CDC37 pour les kinases. Le cercle violet liste les diverses catégories de clients d'HSP90, dont les adaptateurs sont parfois encore inconnus. Enfin le dernier cercle nous informe sur les différentes fonctions des clients dans lesquelles HSP90 se retrouve impliquée. Cette liste des co-chaperons est loin d'être exhaustive et l'équipe du Dr. D. Picard s'occupe de la mettre à jour ( 22 6. Rôles dans l'organisme Du fait de la multitude de ses clients, de son implication dans diverses machineries et voies signalisations, HSP90 est impliquée dans de nombreuses maladies. C'est notamment le cas des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer via la protéine TAU (Karagz et al. , 2014), certaines infections virales, ou la fibrose kystique, due à une mauvaise conformation du récepteur CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) (Wang et al. , 2006). Les études portant sur les fonctions de HSP90 ou de ses co-chaperons dans des organismes sont encore très limitées. Elles abordent essentiellement deux aspects : le rôle de HSP90 dans l'évolution et dans la tumorigénèse. a) HSP90 et la canalisation des mutations. A partir d'études chez la drosophile, l'équipe de S. Lindquist élabore l'hypothèse que HSP90 serait un capaciteur évolutif en tamponnant les mutations . Il serait donc un moteur de l'évolution. Ce concept découle de l'observation que l'inhibition ou des mutations hypomorphes de HSP90 chez la drosophile font apparatre des phénotypes absents de la population contrôle et des parents. S. Rutherford et S. Lindquist ont émis l'hypothèse de la canalisation : certaines mutations ne s'exprimeraient pas dans un organisme o HSP90 serait actif car elle tamponnerait ces mutations. Son activité chaperonne permettrait d'atténuer, voire de masquer l'effet de ces mutations, et ainsi de permettre leur transmission. Ceci aboutirait à une plus grande variété génétique. (Rutherford et Lindquist, 1998). Ces mutations pourraient procurer un avantage sélectif lors d'un changement environnemental, et être ainsi sélectionnées. Cette fonction semble conservée dans les différents organismes testés mais le mécanisme reste encore débattu(Jarosz et Lindquist, 2010 ; Queitsch et al. , 2002 ; Rohner et al. , 2013 ; Rutherford et Lindquist, 1998). De récentes études ont remis en cause cette hypothèse de la canalisation par HSP90. En effet, HSP90 contrôle la biogenèse des machineries qui permettent de réprimer la transposition d'éléments génomiques mobiles dans les lignées germinales (Gangaraju et al. , 2011 ; Karam et al. , 2017 ; Specchia et al. , 2010) : ainsi l'inhibition de HSP90 provoque des mutations transmissibles à la descendance. Ces résultats remettent en question le rôle de HSP90 dans la tolérance phénotypique à des mutations. Quoiqu'il en soit, un rôle de canalisateur évolutif reste associé à HSP90. Ainsi les kinases clientes de HSP90 évoluent plus rapidement que les kinases qui ne sont pas substrats d'HSP90 (Lachowiec et al. , 2015). 23 b) Lien entre HSP90 et les cancers HSP90 s'avère essentielle pour les cellules normales mais encore plus pour les cellules tumorales, ce qui ouvre une potentielle fenêtre thérapeutique. De plus, l'inhibition de HSP90 par certains de ses inhibiteurs entrane la dégradation de ses clients. Les kinases et les récepteurs impliqués dans la signalisation des facteurs de croissance constituent une classe importante de clients d'HSP90. Ces voies sont presque systématiquement suractivées dans les cancers (Moser, Lang, et Stoeltzing, 2009a) (Figure 8). HSP90 a ainsi été proposée comme cible thérapeutique. Dans le cancer du sein, HSP90 est très fortement exprimée dans les cellules cancéreuses en comparaison avec les cellules normales, et ceci est associé à une diminution de la survie des individus (Pick et al. , 2007). Les délétions de HSP90 ou de TRAP1 (l'isoforme mitochondrial de HSP90) n'ont pas le même effet dans un modèle murin de cancer du sein, mais aucune n'est nécessaire pour l'initiation du processus de tumorigénèse. Elles joueraient un rôle plutôt dans la progression tumorale (Vartholomaiou et al. , 2017). Ces chaperons auraient donc un rôle direct sur le cancer. L'instabilité génétique des cellules tumorales favorise l'apparition de résistance aux traitements. L'inhibition de HSP90, en limitant la tolérance des cellules tumorales aux mutations, pourrait contrecarrer l'apparition de ces résistances. Ainsi, l'inhibition à faible dose de HSP90 potentialise les traitements hormonaux de tumeurs du sein (Whitesell et al. , 2014). Une cinquantaine d'essais cliniques ciblant HSP90 sont en cours, mais les effets secondaires peuvent s'avérer nombreux. Une nouvelle stratégie serait de cibler les co-chaperons de HSP90 pour restreindre les clients ciblés. Il est donc nécessaire d'élucider leurs mécanismes d'action au sein d'un organisme pour pouvoir savoir s'il est possible ou non de les proposer comme cibles thérapeutiques anticancéreuses. 24 Figure 7 : Schéma des voies de signalisations impliquées dans la progression tumorale Sont représentées ici les principales voies de transduction des signaux impliquées dans la carcinogénèse digestive. En rouge sont annotés les clients d'HSP90 (Moser et al. , 2009b). HSP90 apparat donc comme un bon candidat pour inhiber la progression tumorale. Si HSP90 est inhibée, cela aura des répercussions sur toutes les molécules en rouge, et permettrait de réprimer plusieurs voies simultanément. 25 Quelques modèles murins d'étude de chaperons ou de co- c) chaperons Le knockout de HOP chez la souris entrane une létalité embryonnaire au 10ème jour du développement. Un des phénotypes est la baisse des niveaux des clients d'HSP90 (Beraldo et al. , 2013). Chez la souris, la méthode de gene trapping a permis d'isoler une modification du gène p23 induisant une létalité périnatale. Cette létalité est causée par des défauts de la peau et des poumons malformés (Grad et al. , 2006 ; Lovgren et al. , 2007). Les souris TRAP1-/- sont viables, fertiles et présentent moins de maladies relatives à l'âge. De plus, ces souris ne présentent pas de dysplasie ou de tumeur. (Lisanti et al. , 2014) Les modèles murins d'HSP90 d'invalidation de et présentent, contre toute attente, des phénotypes très différents : la forme constitutive HSP90b : son knockout n'est pas viable, les embryons meurent au cours du développement embryonnaire aux alentours du 9ème jour, suite, entre autres, à un défaut de formation du placenta (Voss et al. , 2000). la forme inductible HSP90a : la délétion de ce gène n'est pas létale, et le premier phénotype observé est un défaut de spermatogénèse (Grad et al. , 2010). Par la suite, d'autres phénotypes y ont été associés comme des défaut dans la présentation des antigènes par les cellules dendritiques (Imai et al. , 2011). Ces analyses montrent surtout que la perte de HSP90 ne peut pas être compensée par HSP90 , elles ont donc des rôles bien distincts. Les modèles murins de co-chaperons d'HSP90 proposés sont des invalidations dans l'organisme en entier, en général non viables. En l'absence d'invalidation tissu-spécifique, il est difficile de déterminer la cause à l'origine du phénotype observé. En restreignant l'étude à une catégorie de clients, l'analyse de l'invalidation d'un co-chaperon permettrait de mieux comprendre la fonction de HSP90 dans l'organisme. 26 B. Le complexe R2TP, co-chaperon d'HSP90 1. Découverte du R2TP Le complexe R2TP a été identifié chez Saccharomyces cerevisiae par l'équipe de Walid Houry en 2005 comme un nouveau co-chaperon de la protéine HSP90(Zhao et al. , 2005). Grâce à l'association de différentes méthodes (cribles de double-hybride chez la levure, tests de létalité synthétique, expériences de protéomique et co-immuno-précipitations), ils ont pu mettre en évidence deux nouveaux interactants d'HSP90 : Tah1 et Pih1 pour TPR-containing protein Associated with Hsp90 et ProteinInteractingwithHsp90 . Pih1/Nop17 avait été identifée comme un facteur de la biogenèse des snoRNP (small nucleolar RiboNucleoParticles cf. B. 3. a) (Gonzales et al. , 2005). Tah1 n'avait jamais été décrit auparavant. Le complexe Tah1-Pih1 lie les protéines Rvb1 et Rvb2 (RuvB-like protein) pour former le complexe R2TP, capable de lier HSP90 (voir plus bas). Les protéines Rvb1 et Rvb2 sont très similaires entre elles et font partie de la famille des ATPases AAA . Elles forment des hétéro-hexamères et des hétéro- dodécamères(Gribun et al. , 2008). R2TP est le premier co-chaperon multimérique décrit pour HSP90. Des expériences de protéomique ont montré que le R2TP est conservé chez l'homme et la drosophile (Benbahouche et al. , 2014 ; Boulon et al. , 2008). Chez l'homme, les protéines homologues sont PIH1D1 (pour Pih1), RPAP3 (pour Tah1), et RUVBL1/RUVBL2pour Rvb1/Rvb2). Comme chez la levure S. cerevisiae, les protéines humaines PIH1D1/RPAP3 (homologue de Pih1/Tah1) forment un hétérodimère stable, qui s'associe aux hétéro-hexamères de RUVBL1/2 (Figure 4 ; (Boulon et al. , 2008 ; Zhao et al. , 2008). Enfin, le R2TP humain se lie à 7 autres protéines, dont la plupart sont de la famille des préfoldines, pour former le complexe R2TP/Prefoldin-like. La fonction de ces préfoldines est mal connue (Boulon et al. , 2010) (Figure 9). Chez la levure et l'homme, RUVBL1 et RUVBL2 font également partie de complexes macromoléculaires intervenant dans le remodelage de la chromatine, comme INO80 ou SRCAP. Dans l'étude initiale de 2005, il avait été suggéré que HSP90 aurait une nouvelle fonction, viale complexe R2TP, sur la chromatine et donc sur l'expression des gènes. Cependant, la première fonction décrite duR2TP et à ce jour la mieux documentée porte sur l'assemblage d'une famille de petites particules ribonucléiques non-codantes : les snoRNP. 27 Figure 8 : Représentation schématique du complexe R2TP chez l'homme et Saccharomyces cerevisiae A) Le complexe R2TP humain : dimère d'HSP90 en jaune, lié par RPAP3. En bleu clair, le complexe de préfoldines qui est absent chez S. cerevisiae. RPAP3 permet la liaison à PIH1D1 ainsi que RUVBL1, RUVBL2. B) Le complexe R2TP chez S. cerevisiae : RVB1/2 sont recrutés par Pih1 ; Tah1, est plus petit que chez l'homme et lie HSP90 et Pih1. 28 2. Structure et mode de fonctionnement du R2TP Le complexe R2TP est globalement conservé de S. cerevisiae à l'homme, en passant par la drosophile. Il est composé de deux modules : un hétérodimère RPAP3-PIH1D1 (Tah1-Pih1 chez l'homme), et un multimère des ATPases RUVBL1/RUVBL2 (Rvb1/Rvb2 chez la levure). Les ATPases portent l'activité catalytique du complexe, et l'hétérodimère RPAP3-PIH1D1 aurait plusieurs fonctions : recrutement de HSP90, adaptateur des substrats, voire régulateur de l'activité des ATPases RUVBL1/2(Angel Rivera-Calzada et al. , 2017a ; Tian et al. , 2017) . La fonction du R2TP dans l'assemblage des snoRNP C/D est conservée de S. cerevisiae à l'homme. Cependant, le rôle du R2TP dans l'assemblage des ARN polymérases, des snRNP et des PIKK n'est pas encore démontré chez S. cerevisiae. La structure en 3 dimensions à haute résolution du R2TP est difficile à obtenir de façon complète du fait de la grande difficulté à manipuler les ATPases RUVBL1/RUVBL2. 29 Figure 9 : représentation schématique des protéines composant le R2TP chez l'homme et chez S. cerevisiae adapté de (Kakihara et Houry, 2012). Chez l'homme comme chez S. cerevisiae, le R2TP est composé de quatre protéines. Les AAA ATPases, Rvb1/Rvb2 ( S. c) et RUVBL1 /RUVBL2 (humain) ont des structures très conservées. Tah1 est 6 fois plus petit que son homologue RPAP3. Ils comportent tous les deux des TPR qui leur permettent de lier HSP90. Le domaine C-ter de RPAP3 est absent de Tah1. Pih1 est plus grand que PIH1D1 mais comporte les mêmes domaines : PIH1 et le domaine CS. 30 Tah1 /RPAP3 a) Tah1est une protéine de 111 acides aminés, pour l'essentiel composée de motifs Tetra-trico-peptide repeatappelés TPR. Ces motifs TPR sont formés de 34 aa structurés en hélice-coude-hélice. Ils ont été découverts initialement dans des protéines régulatrices du cycle cellulaire, CDC23 et NUC (Sikorski et al. , 1990). Ces motifs sont souvent regroupés en domaines de 3 à 16 répétitions de TPR se terminant par une hélice qui vient fermer la structure. Des résidus conservés dans certains domaines TPR leur confèrent la propriété de lier le motif C- terminal EEVD des protéines chaperons HSP90 et HSP70 : on parle de carboxylate clamp (Russell et al. , 1999). Tah1 ne contient que 3 domaines de TPR (le dernier domaine étant incomplet), mais ils sont suffisants pour lier le motif C-terminal -MEEVD de la protéine HSP82 (l'homologue de HSP90 chez S. cerevisiae)(Back et al. , 2013 ; Jiménez et al. , 2012 ; Morgan et al. , 2015). Le mutant de Tah1 est viable mais montre un défaut de survie en condition de pousse saturante des levures, interprété comme un stress nutritif (Zhao et al. , 2008). RPAP3 est l'homologue de Tah1 chez les mammifères. C'est la protéine la plus dissemblable entre le R2TP de levure et de l'homme : elle est 6 fois plus longue que Tah1. Sa structure comprend : (i) un domaine N-terminal dont la fonction reste, aujourd'hui encore, inconnue, (ii) deux domaines TPR permettant de lier la protéine HSP90 (Pal et al. , 2014 ; Quinternet et al. , 2015) (iii) un domaine C-terminal conservé, appelé le domaine RPAP3-Cter , et que j'ai longuement étudié au cours de ma thèse (voir plus loin la partie Résultats 2) pour en élucider le rôle. Il existe 2 isoformes de RPAP3 générés par épissage alternatif de l'exon 12, en aval du deuxième domaine TPR (Yoshida et al. , 2013b). L'isoforme 1 est le plus grand (665 aa), tandis que l'isoforme 2 est composé de seulement 631 aa. Seul l'isoforme 1 lie PIH1D1, ce qui suggère que la région après les TPR est importante pour lier PIH1D1, de manière analogue à ce qui a été décrit chez S. cerevisiae (Yoshida et al. , 2013a). Spaghetti est l'homologue de RPAP3 chez D. melanogaster. Spaghetti est essentiel, contrairement à Tah1 dans la levure : la délétion de Spaghetti est létale au stade larvaire. Cependant, une déplétion à l'âge adulte n'entrane pas de phénotype visible dans les tissus (Benbahouche et al. , 2014). Cela suggère que Spaghetti, comme Tah1, ne joue pas un rôle crucial pour la croissance cellulaire en absence de stress. 31 b) Pih1 / PIH1D1 Pih1 est le partenaire de Tah1 dans la levure. Il contient 344 aa et est composé d'un domaine PIH N-terminal et d'un domaine C-terminal CS (pour CHORD et SGT , deux co- chaperons de HSP90 chez lesquels ce domaine a été caractérisé). Le domaine PIH est similaire à celui de son homologue humain, et on suppose qu'il assure le même rôle dans la liaison des adaptateurs et des substrats du R2TP (Hoej et al. , 2014 ; Pal et al. , 2014). Le domaine désorganisé compris entre les domaines N-ter et C-ter de Pih1 est nécessaire au recrutement des Rvb1/Rvb2 (Angel Rivera-Calzada et al. , 2017b ; Paci et al. , 2012). Un tel domaine semble absent de l'homologue humain. Enfin, le domaine CS est formé par un sandwich de feuillets antiparallèle de 7 brins. Ce domaine lie l'extrémité C-terminale de Tah1 (Pal et al. , 2014). PIH1D1, l'homologue humain de Pih1, est légèrement plus court que son homologue Pih de S. cerevisiae (290 aa au lieu de 344). Il présente une organisation similaire avec un domaine PIH N-terminal et un domaine CS C-terminal. La partie N-terminale (N-ter) de PIH1D1 comporte le domaine PIH, nécessaire à la liaison à TELO2, un adaptateur spécifique d'une classe de clients du R2TP, les PIKK (Phosphatidylinositol 3-kinase-related kinases). La résolution de la structure en cristallographie de cette partie avec le phosphopeptide de TELO2, connu pour interagir avec PIH1D1(Hoej et al. , 2010a), a permis d'identifier deux résidus de PIH1D1 (les lysines 57 et 64), présent dans une poche du domaine et impliqués dans la liaison aux sérines phosphorylées de TELO2 (Hoej et al. , 2014 ; Pal et al. , 2014). Plus généralement, ces deux résidus sont impliqués dans la reconnaissance d'un motif conservé : DpSDD/E (pS signifie que la sérine est phosphorylée). Ce motif est suffisant pour lier le domaine PIH(Hoej et al. , 2010a, 2014). Ce motif est présent dans TELO2 mais également dans d'autres protéines, dont certaines se sont avérées être des substrats du R2TP (von Morgen et al. , 2017). La mutation du résidu K64 du domaine PIH en alanine abolit l'interaction avec TELO2 et, par la même occasion, avec les PIKK, mais également avec plusieurs substrats du R2TP (Hoej et al. , 2014). Cette étude, ainsi que les données de protéomiques du domaine PIH faites dans notre équipe (Malinová et al. , 2017) a montré que le domaine PIH de PIH1D1 jouait un rôle crucial dans la reconnaissance d'une série de substrats du R2TP. Il est cependant probable que l'interaction des substrats avec PIH1D1 ne fasse pas toujours intervenir un motif DpSDD/E. Le domaine CS en Cter est nécessaire pour la liaison avec le reste du R2TP : RPAP3/RUVBL1/2 (Hoej et al. , 2014). Les modalités pourraient ressembler au modèle décrit chez S. cerevisiae (Pal et al. , 2014). Lorsque j'ai débuté ma thèse, le mode d'association de RPAP3 et des RUVBL1/2 à PIH1D1 était inconnu (cf. Résultats -2). 32 Les protéines AAA ATPases : RUVBL1 /2 c) RUVBL1 et RUVBL2 (respectivement Rvb1 etRvb2 chez la levure) sont des protéines d'environ 50kDa. Elles sont connues sous divers noms (Pontin/Reptin ; Tip48/Tip49 ; p50/p55), et elles ont été trouvées dans un grand nombre de complexes protéiques. Elles font partie de la superfamille des ATPases AAA (Adenosine triphosphatase Associated with diverse cellular Activities), une famille de protéines oligomériques possédant une structure en forme d'anneau souvent hexamérique, et un site de liaison à l'ATP partagé entre sous-unités adjacentes (Gribun et al. , 2008). RUVBL1 et RUVBL2 ont des structures très similaires entre elles, et elles ont tous les motifs canoniques des ATPases AAA , y compris les domaines Walker A et B connus pour fixer les nucléotides et hydrolyser l'ATP, respectivement (Jha et Dutta, 2009) (Figure 9). Cependant, une caractéristique unique de ces protéines, par rapport aux autres enzymes de cette famille, est la présence d'une insertion appelée domaine II, qui semble jouer un rôle essentiel dans leur activité (Figure 10 et voir plus bas)(Jha et Dutta, 2009). De nombreuses équipes ont tenté de résoudre la structure des RUVBL, seules ou ensemble, mais du fait de la difficulté à les manipuler, ces études ont longtemps donnés des résultats contradictoires. Les deux difficultés pour l'étude structurale des RUVBL, sont que d'une part, la présence de tags altère l'état multimérique de ces protéines (Cheung et al. , 2010), d'un hexamère vers un dodécamère, et que d'autre part le domaine II est très flexible (Matias et al. , 2006). Ceci a empêché la cristallisation des protéines entières jusqu'à présent. Une première controverse a porté sur l'éventuelle activité hélicase de ces enzymes (Ikura et al. , 2000 ; Matias et al. , 2006 ; Qiu et al. , 1998). RUVBL1/2 sont en effet proches des protéines RUVA/RUVB bactériennes dont elles tirent leur nom. RuvA et RuvB sont des hélicases d'ADN impliquées dans la résolution de structures particulières de l'ADN ( holliday junction ) crées lors des processus de réparation de l'ADN (Iwasa et al. , 2016). Du fait de leur présence dans des complexes associés à la chromatine, plusieurs études ont cherché à montrer une activité hélicase de RUVBL1/RUVBL2 sur des acides nucléiques (Huen et al. , 2010 ; Ikura et al. , 2000). Même s'il est accepté que les RUVBL se lient aux acides nucléiques via leur domaine II, il est maintenant admis que leur activité hélicase est minime voire inexistante. De plus, des analyses phylogénétiques plus récentes montrent qu'elles ne sont pas les homologues de RuvA/RuvB. Une deuxième controverse a porté sur la stœchiométrie des complexes, hexamériques ou dodécamériques. Il est maintenant établi que les formes hexamériques et dodécamériques existent toutes deux et sont probablement toutes deux importantes biologiquement. L'hexamère est un anneau composé de trois sous-unités de RUVBL1 intercalées par trois sous-unités de RUVBL2, et le domaine II de ces enzymes est situé au dessous de l'anneau. Le dodécamère est un dimère d'hexamères, et la dimérisation se fait via les domaines II (Zhou et al. , 2017). Enfin, une 33 étude récente suggère que la présence d'un substrat entrane à la fois une augmentation de l'activité ATPasique des RUVBLs et le passage d'une forme hexamériques à une forme dodécamérique (Zhou et al. , 2017). Dans le dodécamère, le substrat est lié au domaine II, près de la surface de dimérisation. DLes formes dodécamériques se résolvent en hexamère après hydrolyse de l'ATP, ce qui suggère un cycle dans lequel la liaison du substrat entrane la dimérisation de l'hexamère, vers une forme activée des RUVBL. Cette forme activée serait compétente pour lier d'autres protéines additionnelles du complee, ce qui stimulerait alors l'hydrolyse de l'ATP et le relâchement de deux sous-unités assemblées (Zhou et al. , 2017). Dans l'ensemble du processus, la flexibilité du domaine II est essentielle. Bien que spéculatif, ce modèle est le plus abouti et permet d'expliquer comment l'activité ATPase confère une activité chaperonne aux RUVBL, laquelle serait spécifiquement impliquée dans le folding quaternaire des protéines. Il existe un certains nombre d'études structurales sur les RUVBL (Angel Rivera-Calzada et al. , 2017b ; Puri et al. , 2007 ; Snider et al. , 2006 ; Torreira et al. , 2008). Les structures cristallines à haute résolution ont d'abord été obtenues en tronquant le domaine II, et des structures à plus basse résolution ont été obtenues par cryoEM sur les protéines entières. Plus récemment, l'utilisation du champignon thermophile Chaetomium thermophilum a permis l'obtention de structures à haute résolution avec les protéines entières. Celles-ci ont confirmé les modèles hexamériques et dodécamériques proposés, dans lesquels les RUVBL1 et RUVBL2 alternent pour former des anneaux simples ou doubles, avec un domaine II flexible, qui sort de l'anneau et permet la dimérisation des hexamères (Lakomek et al. , 2015)(Figure 10). Des études de modélisation ont également bien montré la flexibilité du domaine II et le couplage entre sa position et l'état de liaison au nucléotide au sein de l'anneau, ce qui pourrait expliquer comment l'ATP peut réguler l'échange hexamère-dodécamère (Afanasyeva et al. , 2014). 34 Figure 10 : Représentation de la structure d'un dimère de Rvb1 : Rvb2 chez Chaetomium thermophilus . Le monomère de Rvb1 est dans sa forme lié à l'ATP alors que le monomère de Rvb2 est dans sa forme apo. Les différentes couleurs représentent les domaines de Rvb1 (jaune, orange, rouge) et ceux de Rvb2 (bleu et vert). Extrait de (Lakomek et al. , 2015) 35 Les RUVBL sont des sous-unités constitutives de plusieurs complexes de remodelage de la chromatine, comme INO80, SWR-C et TIP60. Il est possible que leurs rôles dans ces complexes soient similaires à celui qu'elles jouent au sein du R2TP. Des données suggèrent même que le R2TP soit impliqué en amont dans l'assemblage de INO80 et TIP60 (Jha et al. , 2013 ; Jnsson et al. , 2004). Dans le cas du complexe INO80 de S. cerevisiae, des études montrent que Rvb1/Rvb2 sont nécessaires au recrutement de la sous-unité Arp5, peut-être par un mécanisme d'assemblage similaire à celui décrit ci-dessus (Jnsson et al. , 2004). Deux études plus récentes décrivent les structures à basse résolution des complexes Ino80 et SCR1, obtenues par cryoEM (Nguyen et al. , 2013 ; Tosi et al. , 2013). INO80 est composé d'une tête qui loge Rvb1/Rvb2, d'un corps et d'un pied. Dans ce modèle structural, l'hétéro hexamère Rvb1/Rvb2 est situé loin du nucléosome, le substrat de INO80. Les données suggèrent un changement de conformation des Rvbs, qui leur permettrait de moduler l'activité de SNF2, le composant catalytique du remodelage des nucléosome (Jnsson et al. , 2004 ; Tosi et al. , 2013). Ce changement de conformation permet le basculement du module pied (qui contient Arp8), et ainsi de modifier la position du nucléosome qui doit être modifié. Par la suite, les protéines enzymatiques effectuent les modifications (Figure 11). Les Rvbs, dans ce contexte, permettraient de moduler l'activité du complexe INO80 (Tosi et al. , 2013)( Figure 12). Figure 11 : Schéma de la structure du complexe Ino80 chez S. cerevisiae Adapté de(Tosi et al. , 2013) INO80 est composé de 3 parties : La tête comprenant les Rvb1 / 2 , le corps avec l'activité catalytique Arp5 module , Ies2 et Snf2, et enfin les pieds Arp8 module . 36 Figure 12 : représentation schématique du rôle de Rvb1 et Rvb2 dans l'assemblage du complexe INO80 Deux hétéro-hexamères de Rvb1/ Rvb2 viennent former un dodécamère. Ce complexe recrute la sous unité catalytique d'INO80. L'hydrolyse de l'ATP permet le changement de conformation deRvb1/2 en un état actif. Un hexamère de Rvb1/2 associé à la sous-unité catalytique est assemblé au reste des sous unités du complexe INO80 pour former le complexe mature. Extrait de (Zhou et al. , 2017) 37 d) La structure du R2TP entier Tout récemment, la structure tri-dimensionnelle du R2TP de S. cerevisiae a été résolue à basse résolution par l'équipe de Llorca, en utilisant la cryoEM (Angel Rivera-Calzada et al. , 2017b). Pih1p en est le composant central. Il recrute Tah1 via son domaine CS, et Rvb1/2 via son motif central, absent de PIH1D1. Rvb1/2sont sous une forme hexamérique et lient Pih1 via leurs domaines II. Dans le complexe, l'hétérodimère Pih1-Tah1 se situe donc au-dessus de l'anneau, et apparat comme étant dans une position idéale pour réguler la dimérisation de l'hexamère deRvb. Figure 13 : Représentation de la structure à basse résolution du complexe R2TP chez S. cerevisiae. adaptéde(Angel Rivera-Calzada, et al. , 2017) 38 Si la structure 3D du R2TP deS. cerevisiae commence à être élucidée, il reste néanmoins de nombreuses zones d'ombre sur le R2TP des mammifères, du fait que les protéines qui le composent diffèrent sensiblement de leurs homologues, et en particulier RPAP3. Notamment, nous ne savons toujours pas comment les protéines RUVBL1 et RUVBL2 sont assemblées dans ce complexe. Est-ce qu'il y a un domaine d'interaction sur PIH1D1 similaire à celui de levure ? Il semble que non, au vu des données de (Hoej et al. , 2014), qui montrent que l'interaction de PIH1D1 avec les RUVBL se ferait via le domaine CS, donc peut-être via la protéine RPAP3. Il faut ici souligner que, lorsque j'ai commencé ma thèse, deux domaines de RPAP3 restaient inconnus d'un point de vue structural et fonctionnel : les domaines N-terminal et C-terminal. L'analyse du rôle joué par le domaine C-terminal de RPAP3 a fait l'objet d'une partie de ma thèse, en collaboration avec l'équipe de Xavier Manival et Bruno Charpentier à Nancy et de Pedro Matias à Lisbonne (cf. Résultats - article n2). 39 3. Les substrats du complexe R2TP a) Les snoRNP (Small nucleolar Ribo-Nucleo-Protein particles) Ces particules comportent chacune un petit ARN nucléolaire non-codant associé à 4 protéines conservées. Il existe plusieurs centaines de ces ARN chez l'homme, qui se répartissent en deux grands groupes : les snoRNP à botes C/D et ceux à botes H/ACA. Ils se différencient par la présence de motifs conservés sur les ARNs ( botes C/D ou botes H/ACA ; figure 14), qui dictent le recrutement d'un jeu de 4 protéines conservées. Les snoRNP à bote C/D comprennent les protéines SNU13, NOP56/NOP58 (deux protéines très similaires entre elles), et la fibrillarine (FBL), qui porte une activité méthyltransférase. Les snoRNP H/ACA sont composés des protéines NHP2, NOP10, GAR1 et de la dyskérine (DKC1), qui a une activité pseudo-uridine- synthéase. Les snoARNs des deux classes possèdent une séquence d'appariement qui guide la particule vers un ARN cible spécifique (majoritairement des ARN ribosomiques) pour définir le nucléotide qui sera modifié par l'enzyme associée à la particule on parle d'ARN guide. Les snoRNP C/D entranent une2'-O-méthylation de ce nucléotide, et les H/ACA une pseudo- uridylation. Malgré l'apparente simplicité des snoRNP, l'assemblage de ces particules se fait en plusieurs étapes et passe par des complexes transitoires avant de former la particule mature. L'importance de ces cofacteurs est soulignée par le fait que, jusqu'à ce jour, aucune équipe n'a réussi à reconstituer une particule de snoRNP fonctionnelle chez les Eucaryotes, à partir de constituants synthétisés in vitro (et ce, malgré la petite taille des composants). Des études détaillées ont en revanche été menées en utilisant le système des Archaebactéries, o des particules snoRNP-like , appelées sARN, s'assemblent en complexes fonctionnels in vitro, en absence de tout facteur d'assemblage (Charpentier, Muller, & Branlant, 2005 ; Omer, Ziesche, Ebhardt, & Dennis, 2002). Une protéine clé dans la structure est la protéine NOP5, qui est l'homologue à la fois de NOP56 et NOP58. Les protéines NOP5, NOP56 et NOP58 comportent trois domaines : un domaine N-terminal, un domaine coiled-coil et un domaine NOP. Des études structurales ont montré que les C/D d'Archae ont une structure pseudo-dimérique qui comporte deux modules. Le premier module est organisé autour de deux motifs C/D présents sur les sARN. Les motifs C/D sont longs d'une dizaine de nucléotides et se replient en un K-turn . Ces motifs C/D permettent la formation d'un complexe ternaire avec L7Ae (l'homologue de SNU13) et NOP5, dans lequel d'une part L7Ae contacte NOP5, et d'autre part L7Ae et NOP5 ont tous deux des contacts base-spécifiques avec l'ARN. Le domaine NOP de NOP5 est suffisant pour assembler ce complexe ternaire. Le deuxième module est composé de la fibrillarine associée au domaine N- terminal de NOP5. Ce module est flexible par rapport au premier comprenant l'ARN, et cette 40 mobilité est essentielle pour l'activité catalytique du complexe. Finalement, les deux motifs C/D présents sur l'ARN permettent la formation d'un pseudo-dimère, grâce à une interaction entre les protéines NOP5 placées sur chacun des motifs C/D. Cette dimérisation de NOP5 se fait par son domaine coiled-coil, et elle est essentielle pour déterminer quelle base de l'ARN cible va être modifiée. Dans le système Eucaryote, les données disponibles suggèrent que la structure du complexe est similaire, et que NOP58 se lie au motif C/D qui clôt l'ARN, tandis que NOP56 se lie du côté apical (Figure 15). Figure 14 : Représentation des ARNs à botes C/D (A) et à botes H/ACA (B) Extrait de (Reichow et al. , 2007) En bleusont représentés les motifs conservés appelés botes , il y a d'un coté le snoARN à botes C/D et de l'autre le snoARN à botes H/ACA. En rouge, l'ARN substrat modifié par la particule. 41 b) R2TP et assemblage des snoRNP à botes C/D Historiquement, l'équipe travaillait sur l'assemblage des snoRNP à botes C/D. Cet assemblage comporte plusieurs étapes qui se déroulent dans différents territoires du noyau (Celine Verheggen et Bertrand, 2012). Du fait de l'impossibilité de reconstituer une particule in vitro, la stratégie pour analyser les étapes d'assemblage des snoRNP C/D a principalement reposé sur l'analyse en protéomique des complexes intermédiaires, en les purifiant via un facteur d'assemblage (NUFIP1, C12ORF45. ) ou de sous-unités surexprimées (NOP58, NOP56). Ces analyses sont complémentées par des cribles en double-hybride chez la levure pour affiner les interactions, des reconstitutions de complexes in vitro, ainsi que du fractionnement cellulaire et des expériences d'immunofluorescence. Les tentatives de reconstitution de snoRNP C/D Eucaryotes in vitro, en utilisant uniquement les protéines cœur, ont permis de dégager des informations importantes (Omer, et al. , 2002). Tout d'abord, comme chez les Archées, le snoARN à botes C/D se replie selon un K-turn , qui est lié in vitro par la protéine SNU13. Ce complexe peut ensuite se lier aux protéines à domaines NOP, et le modèle proposé était donc que SNU13 se lie d'abord au snoARN, ce qui permettrait ensuite l'arrimage des 3 autres protéines : Nop56, Nop58 et fibrillarine. Les études in vivo ont cependant montré que ce modèle était sans doute erroné (Bizarro et al. , 2014 ; Boulon et al. , 2008). L'hypothèse d'un assemblage grâce au système R2TP/HSP90 est supportée par de nombreuses données : (i) des études de protéomique qui montrent un lien entre les snoRNP C/D et les deux ATPasesRUVBL1 et 2 (Newman et al. , 2000), qui semblent concerner plus particulièrement NOP58 ; (ii) des études d'interactions qui montrent d'une part des liens entre les protéines cœur des snoRNP et le R2TP (e. g. Pih1 avec Nop58 (Gonzales et al. , 2005), et d'autre part des liens entre des facteurs d'assemblage des snoRNP et le R2TP (e. g. NUFIP1 avec PIH1D1(Bizarro et al. , 2014 ; Boulon et al. , 2008 ; Quinternet et al. , 2015) ; ZNHIT6 avec RUVBL1/2 (K. S. McKeegan, et al. 2009 ; R. Zhao et al. , 2008), et enfin des liens entre les différentes protéines du R2TP et les snoARN eux-mêmes(Boulon et al. , 2008 ; Kenneth Scott McKeegan, et al. , 2007) ; (iii) des expériences de létalité synthétique entre des protéines du R2TP et des facteurs d'assemblage des C/D (Rothé et al. , 2014a) ; (iv) des expériences fonctionnelles qui montrent des défauts de formation des particules C/D dans des mutants du R2TP de S. cerevisiae (pour Rvb1/2, voir(King et al. , 2001) ; pour Pih1 et Tah1 voir(Boulon et al. , 2008 ; Zhao et al. , 2008), et dans des knock-down chez l'homme(Kenneth Scott McKeegan et al. , 2007 ; Watkins, et al. , 2002). L'assemblage des snoRNP se fait par l'intermédiaire de complexes transitoires, et donc nécessite plusieurs étapes faisant intervenir différents cofacteurs. Dans l'assemblage des snoRNP C/D, au moins 4 facteurs ont été identifiés. Ces facteurs pourraient être des adaptateurs 42 entre le R2TP et les protéines à assembler, et ils pourraient également réguler l'activité des ATPases RUVBL1/2. Bcd1est essentiel chez la levure pour l'accumulation des snoRNP C/D(Peng et al. , 2003), mais sa fonction est mal caractérisée bien qu'il interagisse avec les ATPases Rvb1/2 et probablement régule leur activité( Verheggen, Pradet-Balade, & Bertrand, 2015). Ce facteur est conservé chez l'homme et s'appelle ZNHIT6. NUFIP1 est un facteur trouvé chez l'homme lors d'un crible double hybride avec SNU13 (Boulon et al. 2008). Ce facteur interagit aussi avec ZNHIT3 pour former un complexe trimérique in vitro(Rothé et al. , 2014b). Ces protéines sont conservées chez la levure S. cerevisiae(Rsa1 et ZNHIT3). NUFIP1 interagit avec PIH1D1 et cette interaction est également conservée chez la levure. C12ORF45 est une protéine trouvée chez l'homme lors d'un crible de protéomique avec NOP58. Cette protéine interagit avec les ATPases RUVBL1/RUVBL2 mais n'est pas conservée dans la levure. Des expériences de protéomiques ont permis de définir une voie d'assemblage dans le système C/D humain(Bizarro et al. , 2014). Le processus débute par la formation d'un complexe uniquement protéique, et composé des 7 protéines suivantes : SNU13, NOP58, NUFIP, ZNHIT3, ZNHIT6 et les ATPases RUVBL1/RUVBL2 (Figure 16). L'idée est que ce complexe se forme à partir de trois modules (Bizarro et al. , 2014)et des données de l'équipe non publiées) : (i) le complexe ternaire entre SNU13/ZNHIT3/NUFIP1 ; (ii) NOP58 néo-synthétisé et associé avec lechaperon HSP90 ; (iii) le R2TP. Le R2TP aiderait la formation du complexe à 7 protéines, d'une part en interagissant avec les deux autres modules, et d'autre part en venant charger les ATPase RUVBL1/RUVBL2 sur les protéines SNU13 et NOP58 (Figure 16). Dans les étapes suivantes d'assemblage, le complexe à 7 protéines s'associerait au snoARN, et le facteur ZNHIT3 serait remplacé par la fibrillarine et NOP56. Lors des étapes finales de la maturation des snoRNP C/D, il resterait à retirer RUVBL1/RUVBL2 ainsi que les facteurs ZNHIT6 et NUFIP1 (Bizarro et al. , 2014). Au cours de sa maturation, la particule migrerait dans les corpuscules de Cajal avant d'être adressée vers les nucléoles (Verheggen et al. , 2001, 2002). 43 Figure 15 : Structure des particules à petits ARNs nucléolaires à bote C/D humain Les motifs de reconnaissances sur l'ARN sont représentés sur la Figure de gauche par Box C/D C' et D'. A droite : la particule assemblée avec le snoARN et les protéines : SNU13, NOP56/58, fibrillarine (FBL). 44 Figure 16 : Modèle d'assemblage des petites particules ribonucléiques non codantes à botes C/D (snoRNP C/D). (voir le texte plus haut) Dans ce modèle, RUVL1 et RUVBL2 s'assemblent au dimère RPAP3-PIH1D1 pour former le R2TP. PIH1D1 recrute NOP58 ainsi que le trimère NUFIP-ZNHIT3-SNU13. RPAP3-PIH1D1 est libéré, et le reste des protéines forme en un premier pré-complexe protéique (2). ZNHIT3 se décroche, et la Fibrillarine (Fib) et le snoARN à bote C/D sont recrutés sur le pré complexe (3). ZNHIT6 est libéré et l'ajout d'une seconde Fibrillarine et NOP56 est la dernière étape de cet assemblage. Les RUVBL sont libérées pour reformer le R2TP. 45 Cas particulier de La particule U4 du complexe d'épissage ( spliceosome) Cette particule ribonucléo-protéique est composée d'un ARN non-codant dit small nuclear ARN U4 (snARN), qui comporte un motif dérivé des botes C/D et également structuré en K-turn et reconnu par la protéine SNU13. Un autre composant de la particule U4est similaire à ceux des snoRNP à bote C/D : il s'agit de la protéine PRP31, qui est très similaire aux protéines NOP56 et NOP58. L'assemblage des snoRNP C/D implique l'adaptateur NUFIP1, qui permet la liaison entre SNU13 et le complexe R2TP. Il a été montré que la protéine Prp31 de S. cerevisiae interagissait également avec Rsa1, l'homologue de NUFIP1. De plus, une forme mutée de la protéine PRP31 humaine empêche son incorporation stable dans la particule de U4, mais reste associée au R2TP et à NUFIP (Bizarro et al. , 2015). Enfin, NUFIP se lie au complexe SMN, connu pour être impliqué dans la biogenèse des snARN (dont U4) en assurant le chargement des protéines Sm (communes aux snRNP) sur les snARN. Par conséquent, le système NUFIP1-R2TP associé au complexe SMN faciliterait l'assemblage de la particules snRNPU4 (Bizarro et al. , 2015). 46 c) R2TP et assemblage des snoRNP à botes H/ACA Les mécanismes d'assemblages des snoRNP H/ACA ne sont pas non plus complètement élucidés, mais des interactions entre les protéines de la particule, des cofacteurs et le R2TP permettent d'émettre des hypothèses. Comme pour les C/D, la formation des snoRNP H/ACA fait intervenir un assemblage purement protéique avant la liaison à l'ARN, mais dans ce cas, la liaison à l'ARN a lieu pendant sa transcription. L'assemblage des H/ACA fait intervenir deux facteurs spécifiques : SHQ1 et NAF1. SHQ1 est un chaperon spécifique de la dyskérine, (Grozdanov et al. , 2009), tandis que NAF1 ressemble à la protéine cœur GAR1 et la remplace dans les particules immatures (Leulliot et al. , 2007). SHQ1 se lie à DKC1 très tôt dans la voie de biogenèse, et la prend en charge pour l'assembler avec les protéines NOP10, NHP2 et le cofacteur NAF1. NAF1 lie le domaine C- terminal de la grosse sous unité de l'ARN polymérase II, et il permettrait le ciblage de NOP10/NHP2 vers les snoARN H/ACA naissants. La dyskérine se lie de manière mutuellement exclusive à SHQ1 et aux H/ACA (Grozdanov et al. , 2009 ; Yang et al. , 2005), SHQ1 serait donc libéré de manière concomitante lors de la liaison de la dyskérine à l'ARN. L'étape qui suit serait la migration du complexe naissant vers les corpuscules de Cajal , o NAF1 serait remplacé par la protéine GAR1 (Darzacq et al. , 2006), permettant ainsi la formation d'un complexe fonctionnel (Li et al. , 2011). Les protéines PIH1D1 et surtout RUVBL1/2 sont nécessaires à la dissociation de SHQ1 de la dyskérine, faisant probablement intervenir le R2TP à cette étape (Machado-Pinilla et al. , 2012). Les mécanismes d'actions permettant la libération de SHQ1 de la dyskérine ne sont pas encore bien élucidés. On sait simplement que l'association entre ces deux protéines est extrêmement stable in vitro (Grozdanov et al. , 2009). Il faut noter que l'ARN qui sert de matrice à la télomérase pour allonger les télomères comporte des botes H/ACA qui s'associent avec les protéines canoniques des snoRNP H/ACA. Cet ARN appartient en fait à la famille des scaARN (small Cajal ARN), une famille dérivée des snoARN, qui s'associe avec les mêmes partenaires protéiques que les snoARN mais se localise dans les corps de Cajal (Jády et al. , 2004). L'assemblage de ces particules emprunte vraisemblablement les mécanismes décrits pour la famille des snoRNP H/ACA et il y a des évidences solides indiquant que l'assemblage de la télomérase requiert le R2TP et en particulier les ATPases RUVBL1/2 (Boulon et al. , 2008 ; Hoareau-Aveilla et al. , 2006 ; Li et al. , 2010 ; Venteicher et al. , 2008 ; Wang et Meier, 2004). 47 Figure 17 : Modèle d'assemblage des snoRNP à botes H/ACA issu de (Massenet et al. , 2017) description voir le texte. SHQ1 recrute la dyskérine (DKC1). L'étape suivante est l'assemblage des protéines NHP2 et NOP10 grâce au cofacteur NAF1 pour former la particule immature. Le R2TP interviendrait dans la dissociation de SHQ1 et FBL. Après l'incoporation de snoRNA à botes C/D, la protéine cœur GAR1 vient remplacer NAF1. NOPP140 est un facteur qui prend en charge la particule mature à sa sortie des Cajal Body pour l'amener vers le noyau. 48 d) Les autres substrats du R2TP Depuis la découverte du R2TP, d'autres substrats ont été découverts : l'ARN polymérase II, les PIKK (Phosphatidylinositol-3 kinase related kinases), et les particules associées aux petits ARNs U4 et U5 de la machinerie d'épissage. Des expériences récentes de protéomique suggèrent de plus l'existence d'un grand nombre de substrats potentiels (Cloutier et al. , 2017 ; Malinová et al. , 2017). (1) La particule snRNP U5. Deux études protéomiques ont montré des complexes intermédiaires d'assemblage d'U5. Ceux-ci sont composés des protéines d'U5 PRPF8, EFTUD2 et SNRNP200, du complexe HSP90/R2TP, de son cofacteur ZNHIT2 et d'autres protéines moins caractérisées. Ces études démontrent que le R2TP prend en charge ces protéines de U5 avant leur assemblage avec le snARN, les stabilise et favorise la formation de la particule U5 (Cloutier et al. , 2017 ; Malinová et al. , 2017). . (2) L'ARN polymérase 2. Cette enzyme fondamentale est composée de 12 sous-unités qui sont assemblées dans le cytoplasme avant que le complexe entier ne migre dans le noyau pour y assurer sa fonction. Notre équipe et celle de B. Coulombe ont montré que les sous-unités RPB1 (la plus grosse sous- unité du complexe) et RPB8 étaient associées au R2TP dans le cytoplasme de la cellule, avant leur incorporation avec les autres sous-unités de la polymérase, et que HSP90 stabilisait cette fraction de RPB1 cytoplasmique(Boulon et al. , 2010 ; Cloutier et Coulombe, 2010). Ces données s'intègrent dans un modèle o RPB1 cytoplasmique, néosynthétisé, est pris en charge par HSP90, via le R2TP. Ceci permettrait son association avec les autres sous-unités de l'ARN polymérase II, elles-mêmes assemblées en pré-complexes grâce à d'autres facteurs d'assemblage spécifiques (Figure 19). L'ARN polymérase II correctement assemblée peut ensuite être importée dans le noyau, en particulier grâce à la protéine RPAP2 qui fait la navette entre les deux compartiments(Forget et al. , 2013). Chez la levure S. cerevisiae, l'ARN polymérase II est associée dans le cytoplasme avec une protéine qui se place à l'interface d'interaction avec l'ADN pour diriger son import nucléaire (Czeko et al. , 2011). Ce résultat suggère qu'il existe probablement plusieurs facteurs d'import pour ce complexe 49 particulièrement gros. Ce modèle pourrait être étendu aux deux autres ARN polymérases, car des sous-unités de la polymérase I et III ont été trouvées associées au R2TP(Boulon et al. , 2010 ; Cloutier et Coulombe, 2010). De plus, l'interaction entre le R2TP et la grande sous-unité de l'ARN polymérase I augmente lorsque l'assemblage de cette enzyme est bloqué (Boulon et al. , 2010). Cependant, le rôle exact du R2TP reste encore à démontrer (Figure 18). 50 Figure 18 : Modèle d'assemblage des sous unités de l'ARN polymérase II d'après (Boulon et al. , 2012). Les sous unités de l'ARN polymérase II forment deux pré-complexes : un avec RPB1 et l'autre avec RPB2. Ces pré-complexes sont tous les deux associés à des protéines préfoldines (en vert) ainsi que d'autres facteurs d'assemblage dont la fonction est encore inconnue(en orange). Le pré-complexe contenant RPB1, pris en charge par R2TP, s'assemble avec le pré-complexe de RPB2 pour former un complexe mature de l'ARN polymérase II dans le cytoplasme avant de migrer dans le noyau. 51 L'adaptateur TTT et l'assemblage des PIKKs e) La protéine Tel2 pour Telomere length regulation protein 2 a été identifiée chez S. cerevisiae pour son rôle dans le maintien de la longueur des télomères(Lustig et Petes, 1986). Cependant, il n'y a pas de preuve qu'elle puisse jouer le même rôle chez les mammifères. La délétion constitutive de son homologue chez la Souris (TELO2), est létale au stade embryonnaire, cette protéine est donc essentielle pour le développement (Takai et al. , 2007). La délétion conditionnelle de TELO2 engendre une diminution des niveaux protéiques des six PIKK (PI3- Kinases-like Kinases) humaines, et ceci sans affecter les niveaux d'expression des ARNm respectifs (Takai et al. , 2007). Les PIKK sont des grosses protéines ayant une activité kinase, et elles jouent des rôles particulièrement importants dans la physiologie cellulaire : ATM, ATR et DNA-PKc sont essentiels pour la réparations des cassures de l'ADN ; mTOR est un point clé de contrôle de la croissance cellulaire en réponse aux nutriments, SMG1 fonctionne dans une voie de contrôle qualité des ARNm appelée NMD (Nonsense Mediated Decay), TRRAP fait partie de complexes de remodelage de la chromatine, et c'est la seules PIKK qui n'a pas d'activité kinase. L'étude de protéomique de TELO2 a permis d'identifier des partenaires tels que des protéines du R2TP mais aussi de nouveaux acteurs. Ainsi TELO2 agit en complexe avec TTI1 et TTI2 (TELO2-interacting protein 1 /2 ), mais aussi avec la protéine chaperon HSP90. TELO2 lie préférentiellement les protéines nouvellement synthétisées, suggérant un rôle dans la maturation des PIKKs. De plus, TELO2 est nécessaire à l'incorporation de mTOR et ATR néo- synthétisées dans leurs complexes natifs respectifs (Takai et al. , 2010). Le complexe TELO2- TTI1-TTI2 (TTT) se définit donc comme un nouveau co-chaperon d'HSP90 spécifique des PIKK. L'étude de Izumi (Izumi et al. , 2010) suggérait également une implication des protéines RUVBL1 et RUVBL2 dans le maintien de la stabilité des PIKK. Enfin, il est apparu que la phosphorylation de TELO2 par la caséine kinase II (CK II) permettait de recruter le R2TP pour stabiliser les PIKK néo-synthétisées (Hoej et al. , 2010b ; Pal et al. , 2014). Cette phosphorylation a lieu sur deux sérines, présentes au sein d'un site consensus pour la kinase Caséine Kinase 2 (CK2 ; le consensus est DSDD/E). La mutation de ces sérines en alanines entraine une perte de l'interaction de TELO2 avec le R2TP alors que les liaisons aux PIKK restent intactes. Cette interaction est essentielle car lorsqu'elle est détruite, les PIKK ne s'accumulent plus dans les cellules (Hoej et al. , 2010a). Le complexe TTT serait donc un adaptateur permettant l'adressage du système R2TP/HSP90 aux PIKK, de manière similaire au complexe NUFIP/ZNHIT3 pour les snoRNP (Figure 19). 52 Figure 19 : Modèle d'interaction entre le complexe R 2TP, HSP90 et TELO2 issu de (Hoej et al. , 2010b). Cette interaction n'est pas encore bien comprise mais il semblerait que le complexe Le R2TP/préfoldines et HSP90 sont adressés aux PIKK via TELO2 (TEL2 sur le schéma). TELO2 est l'adaptateur spécifique des PIKK. Le point d'interaction avec TELO2 sur PIH1D1 est connu : c'est la lysine 64 qui reconnat le motif DpSDD de TEL2 (voir dans le texte). Une interaction directe entre HSP90 et TELO2 ou HSP90 avec les PIKK n'est pas exclue. Sur ce schéma, l'intéraction entre HSP90 et RPAP3 est marquée d'un point d'interrogation mais elle est à présent confirmée. 53 Figure 20 : Schéma représentant les clients d'HSP90 dépendant du R2TP . A gauche, le complexe R2TP composé des RUVBL1/2, PIH1D1 et RPAP3, associé à HSP90. En turquoise, une série d'adaptateurs secondaires (NUFIP, TEL2/TTI1/TTI2) spécifiques à des classes de substrats du R2TP, et en bleu foncé les clients. Ces clients nouvellement identifiés démontrent des implications jusqu'alors insoupçonnées de HSP90 dans les fonctions cellulaires correspondantes. L'association de ces co-chaperons et leur mode d'action ne sont pas encore tous élucidés. 54 4. Modèle général d'action du complexe R2TP Lorsque j'ai commencé ma thèse, de nombreuses questions restaient en suspens, notamment (Figure 21) : - Comment PIH1D1, d'une part, et RPAP3/RUVBL1/2 interagissent ? - Comment sont recrutés les partenaires des substrats recrutés par le domaine PIH1 de PIH1D1 ? - On pensait que la sous-unité annoté B ici était amenée par HSP90 mais on ne savait pas exactement comment elle était incorporée au complexe final. - Comment est régulée l'activité des RUVBL1/2 et quelle est leur fonction au sein du complexe R2TP ? Mon travail a contribué à répondre à certaines de ces questions. 55 Figure 21 : Modèle général d'assemblage des complexes macromoléculaires par le R2TP Ce shéma représente la vision de l'assemblage des complexes par R2TP avant ma thèse. 1) HSP90 s'occuperait du repliement de certaines sous-unités ici (B) qu'elle présente au complexe R2TP. Le R2TP prendrait en charge directement une autre catégorie de sous unité (A) via le domaine N-terminal de PIH1D1. 2) Le recrutement des autres sous unité (B) n'est pas clair. L'interaction entre RPAP3 et HSP90 permettrait le chargement des sous unités B sur le R2TP, HSP90 serait alors libérée. 3) Le R2TP assurerait l'asssemblage des sous-unités. . Le R2TP et le complexe AB nouvellement assemblé se dissocient. 56 5. Les protéines PIH-like et RPAP3-like. Il existe d'autres protéines ayant un domaine apparenté au domaine PIH défini chez Pih1p/Pih1D1 : PIH1D2, PIH1D3, DNAAF2/Kintoun (Figure 22). La variété des protéines à domaine PIH chez les différents organismes a été corrélée avec la présence de cils mobiles chez ces mêmes organismes (Yamamoto et al. , 2010). Ainsi la protéine Kintoun/DNAAF2 a été identifiée pour son rôle indispensable dans l'élaboration de cils mobiles (Omran et al. , 2008). Elle permet l'assemblage des dynéines en interaction avec une protéine, DYX1C1, à domaine TPR comme RPAP3. DNAAF2/DYX1C1 forment un complexe d'assemblage qui recrute le chaperon HSP70 dans le cytoplasme (Tarkar et al. , 2013). Le mode d'action rappelle celui du R2TP dans l'assemblage de l'ARN polymérase II : les dynéines, une fois assemblées, migreraient vers leur site d'action, les cils mobiles (Figure 23). D'autre part, les génomes des mêmes organismes codent également pour des protéines dont la structure s'apparente à celle de RPAP3 : SPAG1 et CCDC103 (Figure 22). Notamment, ces protéines comportent des domaines similaires au domaine C-terminal de RPAP3. Ces protéines ont été identifiées chez des patients présentant des défauts de ciliogénèse motile, résultant dans un ensemble de maladies multifactorielles regroupées sous le nom de dyskinésies primaires du cil (Dong et al. , 2014 ; Panizzi et al. , 2012 ; Tarkar et al. , 2013). Enfin les protéines RUVBL1/2 ont été impliquées par plusieurs études dans la ciliogénèse (Raidt et al. , 2014 ; Zhao et al. , 2013). Il est donc tentant de proposer que ces protéines à domaine PIH interagissent avec des protéines à domaines RPAP3-Cter et les RUVBL1/2 pour former des complexes apparentés aux R2TP. L'intérêt pour l'analyse des modes d'action du R2TP n'en serait que renforcé. Une partie de mon travail de thèse a porté sur l'étude de la structure et de la fonction de ces complexes potentiels, en collaboration avec l'équipe ARN, RNP, maturation-structure- fonction du laboratoire IMoPA de Nancy. (cf. section Résultats 2). 57 Figure 22 : Structure des protéines RPAP3 -like et PIH-like (issu du manuscrit n2) Le domaine C-terminal de RPAP3 est conservé chez SPAG1 et CCDC103. Comme RPAP3, SPAG1 et DYX1C1 présentent des domaines TPR connus pour interagir avec les motifs C-ter des chaperons HSP90 et HSP70. DYX1C1 est également composé d'un domaine CS, tout comme les protéines à domaine PIH. 58 Figure 23 : Modèle d'assemblage des dynéines. Le modèle que nous proposons est basé sur celui de l'assemblage de l'ARN polymérase II : dans le cytoplasme, les différentes sous unités des dynéines seraient assemblées par un complexe R2TP-like. Ce complexe serait composé d'un chaperon (HSP70 ou HSP90) relié à une protéine RPAP3-like par des domaines TPR, d'une protéine à domaine PIH, et des ATPases RUVBL1 et RUVBL2. Les dynéines, une fois assemblées, seraient incorporées dans le cil. 59 6. HSP90, les RUVBL et le R2TP dans le cancer. Du fait de leur rôle dans le R2TP et les complexes de remodelage de la chromatine, les RUVBL sont des protéines impliquées dans de nombreuses fonctions cellulaires. En particulier, elles jouent des rôles importants dans la transformation des cellules normales en cellules cancéreuses (Dugan et al. , 2002 ; Wood et al. , 2000), en particulier dans les hépato-carcinomes (Berasain, 2010 ; Grigoletto et al. , 2013 ; Haurie et al. , 2009 ; Raymond et al. , 2015), et encore dans l'apoptose. L'activité oncogénique des RUVBL a été mise en relation avec leur rôle de cofacteur des facteurs de transcription oncogéniques tel que c-Myc ou la -caténine, mais leur mécanisme d'action dans la tumorigénèse reste encore très mal compris. A cet égard, il est important de noter que le R2TP intervient dans divers processus biologiques qui sont impliqués dans la croissance cellulaire et la tumorigénèse. La transcription, la biogenèse des ribosomes, la traduction, l'élongation des télomères ou encore les dommages à l'ADN, sont autant de fonctions nécessaires à la prolifération et la croissance cellulaire. Une dérégulation de ce système pourrait entrainer des dommages importants. Certains de ces substrats comme mTOR sont bien connus pour contrôler la croissance cellulaire et sont impliqués dans des cancers colorectaux (Gulhati et al. , 2009). Récemment, un lien entre le R2TP et le complexe TSC a été mis en évidence (Cloutier et al. , 2017 ; Malinová et al. , 2017). Le TSC est le régulateur principal de mTOR et c'est un suppresseur de tumeurs bien connu. Comme on le voit, les liens entre le R2TP et le cancer sont nombreux. Le R2TP est un cofacteur de HSP90, et cette chaperonne est bien connue pour être une cible thérapeutique dans de nombreux cancers : pas moins d'une vingtaine d'inhibiteurs sont en cours de test cliniques (Jhaveri et al. , 2012). Le R2TP adresse HSP90 vers des substrats dont certains sont surexprimés dans des cancers, donc il pourrait être lui aussi une cible thérapeutique. HSP90 a de nombreux clients dans beaucoup de voies de signalisations différentes : cibler le R2TP permettrait de restreindre la déstabilisation à des clients oncogéniques pour éviter d'affecter les clients de HSP90 anti-oncogéniques. De fait, l'hypothèse d'un rôle du R2TP dans la carcinogenèse via les snoRNP et snRNP émerge (Kakihara et Saeki, 2014). Une partie de ma thèse a consisté à mettre au point un système d'invalidation du gène codant pour RPAP3 chez la souris afin d'inactiver le R2TP. Ce modèle a pour but de nous permettre de mieux caractériser la fonction de RPAP3 et du complexe R2TP dans un organisme, puis en ciblant l'intestin, de l'étudier dans un tissu en prolifération continue. De plus, grâce a ce modèle, nous pourrons tester l'hypothèse de l'implication du RPAP3 et donc du R2TP dans l'établissement de cancers intestinaux. 60 C. L'intestin comme organe d'étude de la prolifération Le rôle de l'intestin 1. Chez la souris comme chez l'Homme, le tractus digestif est issu du feuillet embryonnaire endodermique. Il se compose de deux grandes parties : l'intestin grêle et le gros intestin ou côlon et se termine par le rectum. L'intestin grêle comprend le duodénum, le jéjunum et l'iléon. Le côlon est lui aussi divisé en trois parties, le côlon ascendant, transverse et descendant (Figure 24 et 26). Figure 24 : Photo du tractus digestif d'une souris R PAP3 / . 61 L'intestin grêle est un organe d'échange : sa fonction première est de digérer les aliments pour en extraire le maximum de nutriments et d'eau nécessaires au fonctionnement du corps. Ces fonctions sont assurées par des cellules de l'épithélium appelées entérocytes. Les cellules intestinales sont en contact direct avec l'extérieur (la lumière de l'intestin). Afin d'augmenter la surface d'échange, l'épithélium intestinal forme une succession de villosité. A chaque villosité sont associées plusieurs invaginations appelées cryptes de Lieberkhn comme illustré dans la Figure 25 (Barker, 2014). Ces cryptes abritent notamment, à leur base, les cellules souches intestinales à l'origine de tous les types cellulaires de l'épithélium. Dans le duodénum, les villosités sont plus longues que dans les autres parties de l'intestin. La plus grande partie de la digestion et réabsorption se fait au niveau de l'intestin grêle. Les villosités rétrécissent le long du tractus pour disparatre dans le côlon (Figure 25b et 26). Celui-ci a essentiellement une fonction mécanique de compaction des selles et de leur excrétion. De fait, les cellules sécrétrices de mucus, les cellules caliciformes, y sont plus nombreuses que dans l'intestin. Elles sont détectées par un marquage à l'acide périodique de Schiff (PAS) qui colore les gouttes de mucus en violet foncé (Figure 26). L'épithélium intestinal est à l'interface entre le milieu extérieur et intérieur : il est donc soumis en permanence aux agressions des pathogènes contenus dans le bol alimentaire. L'épithélium doit donc aussi jouer un rôle dans la défense immunitaire en constituant une barrière. Des cellules spécialisées assurent un dialogue avec le système immunitaire pour répondre à d'éventuelles attaques et assurer la régénération de l'épithélium après un épisode inflammatoire (Gerbe et al. , 2016). Toutes ces différentes fonctions (absorption, sécrétion de mucus, réponse à l'agression pathogènes. ) sont portées par des cellules spécialisées. 62 a) Intestin grêle Villosité Cryptes b) Côlon Cryptes Figure 25 : Image de l'épithélium de l' intestin grêle (a) avec les villosités et les cryptes, et en (b) image de l'épithélium au niveau du côlon. Image de microscopie électronique, issue de (Barker, 2014) Au niveau de l'intestin grêle, l'épithélium est composé d'un enchainement de villosités et des cryptes contrairement à celui du côlon qui ne contient que de cryptes. 63 Côlon Figure 26 : Coloration à l'Hématoxyline -Eosine (panneau HE) et à l'Acide Périodique de Schiff (panneau PAS) de c oupes d'épithélium intestinal de souris. Les villosités sont plus grandes dans le duodénum, elles rétrécissent au fur et à mesure du tractus et finissent par disparatre au niveau du côlon. Le marquage au PAS met en évidence les cellules caliciformes en violet foncé. Ces cellules sont plus nombreuses au niveau de l'épihélium du colon en comparaison avec l'intestin grêle. 64 Les différents types cellulaires de l'épithélium intestinal 2. L'épithélium intestinal est composé de plusieurs types cellulaires : Les cellules souches CBC à l'origine des différents types de cellules de lépithélium Les cellules souches 4 ou CP4 les entérocytes Les cellules sécrétrices o o o o les cellules caliciformes, les cellules entéroendocrines les cellules de Paneth les cellules Tuft les cup cells ou cellules en forme de coupe, peu décrites, les cellules M associées aux plaques de Peyer, des nodules lymphatiques apposés le long de la paroi intestinale. (Figure 27) Les cellules souches a) Les cellules souches de la base des cryptes sont appelées les CBC pour Crypt Base Columnar Cells(Cheng et Leblond, 1974). Elles sont intercalées de cellules de Paneth. Etant à l'origine de toutes les cellules de l'épithélium, elles sont donc multipotentes. Du fait du renouvellement rapide de l'épithélium, les CBC entrent en division fréquemment, ce qui les rend sensibles aux radiations, contrairement aux cellules souches 4 que nous verrons après. Les cellules CBC se distinguent par l'expression de marqueurs dont les plus connus sont : LGR5(Barker et al. , 2007), AScl2 (van der Flier et Clevers, 2009) et Olfm4(van der Flier et al. , 2009a). LGR5, pour Leucine rich repeat containing G protein coupled Receptor 5 , est un récepteur transmembranaire aux R-spondines, des agonistes de la voie Wnt. Il est lui-même contrôlé par cette voie. Le marqueur LGR5 est exprimé spécifiquement par les cellules souches CBC, localisées au fond des cryptes mais pas par les autres cellules souches 4 . L'activation de la voie Wnt est cruciale pour le maintien des CBC. Plusieurs études ont confirmé le rôle d'Ascl2 comme marqueur des cellules souches CBC. Ascl2 (pour Achaete Scute-Like2) est un facteur de transcription impliqué dans le devenir des cellules souche. En son absence, les CBC disparaissent au bout de quelques jours : il est donc nécessaire à leur maintien(van der Flier et al. , 2009b). Ascl2 est aussi un gène cible de la voie Wnt. Sa transcription est activée par cette voie et subit une auto-activation par la protéine ASCL2. 65 Olfm4 (Olfactomedin 4) est lui aussi un marqueur des cellules souches CBC mis en évidence en 2009 (van der Flier et al. , 2009a). Chez l'homme, les cellules de la base des cryptes expriment ce marqueur alors que chez la souris, l'expression est cantonnée aux cryptes de l'intestin grêle. Mais le signal est localisé à la même position dans les cryptes coliques humaines et les cryptes intestinales murines : dans les cellules CBC. Olfm4 est exprimé en réponse à la voie Notch et joue un rôle dans l'adhésion tissulaire (Figure 28). Les cellules souches 4 ou CP4 ont été identifiées par Potten (Potten et Hendry, 1975). Ces cellules sont quiescentes jusqu'à ce que l'épithélium ait besoin d'elles, comme dans le cas d'une perte des cellules CBC. Les cellules souches 4 sont alors capables de régénérer la production des cellules intestinales soit en se dédifférenciant en CBC, soit en se différenciant directement sans passer par l'état de cellules souches LGR5 . (Tian et al. , 2012) Comme l'indique leur nom, elles se situent juste au dessus de la base de cryptes après les cellules de Paneth et les CBC en position 4 (Figure 28, en orange). Elles se caractérisent par l'expression de 4 marqueurs principaux : Bmi1 (Sangiorgi et Capecchi, 2008 ; Yan et al. , 2012) , Hopx (Takeda et al. , 2011), mTERT (Montgomery et al. , 2011), Lrig1 (Powell et al. , 2013). Ces études montrent que les cellules des cryptes exprimant simultanément ces quatre marqueurs, les 4 , sont capables de régénérer le stock de cellules souches LGR5 . Certains de ces marqueurs, comme Lrig1, peuvent aussi être exprimés par les cellules CBC (Muoz et al. , 2012). 66 Figure 27 : Représentation schématique des types cellulaires connus de l'épithélium intestinal Schéma adapté à partir de l'article (Gerbe et al. , 2012) Les cellules souches du fond des cryptes, appelées CBC, peuvent donner en se différenciant pratiquement toutes les cellules intestinales épithéliales représentées ici : les entérocytes, les cellules sécrétirces : cellules de Paneth, cellules à mucus, les cellules cups et tuft 67 . Les cellules de l'absorption b) Les entérocytes sont les cellules les plus abondantes dans l'épithélium de l'intestin grêle. Elles sont responsables d'une partie de la digestion du bol alimentaire grâce à la libération d'enzymes dans la lumière de l'intestin. Elles assurent l'absorption des nutriments et de l'eau. Cette fonction est assurée par la présence de microvillosités sur la surface en contact avec les aliments. Elles sont polarisées : le pôle apical présente des microvillosités et le pole basal accueille le noyau. La membrane des entérocytes présente différents transporteurs de nutriments et eau, notamment du glucose. Ils permettent aussi l'entrée d'ions dans la cellule, accompagné de glucose, puis le glucose est déversé dans les capillaires sanguins. Ces cellules ont une durée de vie de 3- 4 jours. c) Les cellules sécrétrices Les cellules entéroendocrines sont des cellules polarisées présentant sur leur pôle apical des microvillosités et sur leur pôle basal des granules sécrétoires. Elles ne sont pas regroupées dans un compartiment mais disséminées le long du tractus dans l'épithélium. Elles se situent en générale dans les cryptes et à la base des villosités. Ces cellules jouent un rôle dans le dialogue inter-organe au cours de la digestion, via la sécrétion d'hormones. Les hormones sécrétées sont principalement des hormones peptidiques telles que la sécrétine ou le peptide YY. Ces hormones agissent sur la digestion mais aussi sur la coordination des mouvements péristaltiques pour faciliter le passage du bol alimentaire. Les cellules caliciformes sécrètent le mucus qui facilite le passage des aliments le long du tractus. Ce mucus est stocké dans une vacuole avant d'être déversé dans la lumière de l'intestin. Ces cellules sont peu nombreuses dans l'intestin grêle contrairement au côlon, o elles sont indispensables. Le mucus a un rôle de protection de l'épithélium mais aussi un rôle mécanique en favorisant le glissement des aliments (voire même des parasites) lors de l'excrétion. Ce mucus est détecté par un marquage à l'acide périodique de Schiff (PAS) qui colore les gouttes en violet foncé (Figure 26, PAS)(Gerbe et al. , 2012). Les cellules de Paneth se situent au fond des cryptes de l'intestin grêle, intercalées entre les cellules souches CBC (Garabedian et al. , 1997)(Figure 28). Les cellules de Paneth expriment le marqueur CD24 à leur membrane. Elles auraient un rôle dans le maintien d'une niche favorable pour le maintien des CBC car elles expriment des facteurs paracrines : signaux des voies EGF, Wnt, Notch, tous indispensables au maintien des CBC (Sato et al. , 2011). Cependant, elles ne sont pas indispensables à la survie des CBC ni au maintien de l'épithélium , 68 que ce soit en conditions d'homéostasie, de régénération ou de tumorigenèse (Durand et al. , 2012). Les cellules de Paneth assurent aussi un rôle dans l'immunité au sein de l'intestin. En effet, elles sécrètent des particules antimicrobiennes et des lysozymes qui préservent l'intégrité de l'épithélium au regard des pathogènes présents dans les aliments. Les cellules Tuft ont été caractérisées pour la première fois dans l'épithélium de la trachée chez le rat puis dans celui de l'estomac de la souris. Leur fonction n'est pas encore bien connue mais des études récentes les classent dans la catégorie des cellules sécrétrices. En réponse à une infection parasitaire, elles sécrètent de l'interleukine IL-25 pour initier une réponse immunitaire de type II, qui favorise la production d'anticorps par les cellules B. Dans le cas d'une infection par le parasite Helminthe, elles permettent de déclencher la réponse immunitaire et une hyper-prolifération des cellules caliciformes. La production de mucus qui en résulte permet alors l'élimination des parasites du tractus intestinal (Gerbe et al. , 2012, 2016). d) Autres cellules Les cellules cup , sont des cellules dont la forme fait penser un verre à pied. Elles possèdent des microvillosités et représentent environ 6% des cellules de l'épithélium intestinal. Leur fonction est encore méconnue. Les cellules M, situées entre l'épithélium et les plaques de Peyer, ont un rôle d'interlocuteur entre les cellules intestinales et les cellules immunitaires présentes dans ces amas. Les plaques de Peyer sont des agrégats de follicules lymphoïdes situés entre la muqueuse intestinale et la couche d cellules épithéliales. Ce sont des réservoirs de cellules de l'immunité, des sentinelles. La fonction des cellules M n'est pas entièrement connue mais elles auraient un rôle dans l'immuno-surveillance de lintestin en présentant des antigènes aux cellules immunitaires des plaques de Peyer, pour déclencher éventuellement une réponse immunitaire (de Lau et al. , 2012 ; Mabbott et al. , 2013)(Figure 28). 3. L'épithélium intestinal, une régénération continue En conditions normales, l'épithélium intestinal est en renouvellement constant, avec une demi-vie de l'ordre de 5 jours. Ce renouvellement se fait sur le modèle du tapis roulant, avec une migration des cellules du bas des cryptes vers le haut des villosités. Schématiquement, les Crypt Base Columnar Cells , les cellules souches situées à la base des cryptes intestinales et coliques se divisent de façon asymétrique (Cheng et Leblond, 1974). Une des cellules filles entretient le stock de CBC, tandis que l'autre donne une cellule progénitrice qui migre dans le compartiment transitoire d'amplification (TA)(Figure 29). Les cellules progénitrices effectuent 3 ou 4 divisions avant de se différencier et de continuer leur migration vers le haut de la villosité. 69 Les CBC et les cellules progénitrices formant le TA peuvent être identifiées grâce à un marquage anti- Ki67 (un marqueur de prolifération). La Figure 30 montre une section de duodénum. Le marquage Ki67 (en marron) est cantonné aux cryptes et au compartiment d'amplification. Les cellules de Paneth, également présentes au fond des cryptes (flèches bleues), se distinguent par leur absence de marquage (cellules Ki67-), en contraste avec les cellules souches CBC (indiquées par les flèches orange). En se différenciant, les cellules cessent de proliférer. Pour préserver l'intégrité de la barrière immunitaire, un phénomène de desquamation a lieu au sommet de la villosité. Ainsi sont éliminées par apoptose les cellules plus âgées, pour faciliter le renouvellement de l'épithélium. Ce modèle est évidemment schématique car tous les types cellulaires qui composent l'épithélium n'ont pas la même durée de vie : certaines cellules, à fonction immunitaire, ont un temps de demi-vie plus long que les entérocytes. En condition d'homéostasie, les cellules souches CBC sont les principales responsables du renouvellement de l'épithélium. Pourtant Tian et collègues ont montré que l'ablation spécifique et complète des CBC n'affecte pas l'homéostasie de l'épithélium. (Tian et al. , 2012). Dans ce cas, les cellules souches 4 sont en attente et interviennent en cas de défaut des cellules CBC, elles sont donc les gardiennes de l'intégrité de l'épithélium (Li et Clevers, 2010). Enfin, une plasticité des cellules intestinales peu différenciées, les progéniteurs, situés dans le compartiment d'amplification, existe. Des études suggèrent que ces cellules auraient la possibilité, en cas de dommage, de régénérer l'épithélium par dédifférenciation (Buczacki et al. , 2013 ; van Es et al. , 2012a). Ce compartiment constitue donc une autre réserve de cellules capables de palier à l'absence de cellules souches CBC. En conclusion, le terme de cellules souches intestinales (Intestinal Stem Cells) ne recouvre pas un type cellulaire établi mais un ensemble de cellules capables de régénérer l'épithélium intestinal selon les besoins. Les cellules progénitrices et les CBC ont des profils épigénétiques assez proches, ce qui pourrait expliquer leur plasticité en réponse à des stimuli de la niche(Vermeulen et Snippert, 2014). En parallèle, il existe une compétition entre les différentes cellules souches de chaque crypte pour repeupler la crypte et la villosité. Chaque CBC ayant le même avantage sélectif que la cellule souche voisine, par un phénomène de dérive neutre au cours du développement, il y a une dérive clonale de chaque villosité, dont la population est issue d'une cellule souche unique. L'architecture de l'intestin, avec des cryptes compartimentées, pourrait limiter la propagation horizontale d'une crypte à l'autre. Ceci limiterait la progression des tumeurs : si une cellule CBC subit une mutation lui conférant un avantage prolifératif, elle ne colonisera pas tout l'épithélium intestinal (Vermeulen et Snippert, 2014). 70 Figure 28 : schéma de l'organisation des cellules dans l'épithélium de l'intestin grêle. Au fond des cryptes se situent les cellules souches CBC (en vert clair) intercalées de cellules de Paneth(en jaune). Les cellules souches 4 sont représentées en orange. En violet foncé ce sont les cellules progénitrices qui prolifèrent dans le compartiment d'amplification transitoire avant de se différencier. Les cellules différenciées sont distinguées par différentes couleurs : en rose les cellules caliciformes avec leur vacuole de mucus, en vert les cellules entéroendocrines, les cellules Tuft en bleu clair et les entérocytes en violet clair. De plus, sur ce schéma sont représentées en rouge les cellules M au niveau d'un plaque de Peyer contenant des lymphocytes. TA : Transient Amplifying compartment. (van Rijn et al. , 2016) 71 Figure 29 : Coupe de duodénum de souris RPAP3 / Le marquage avec l'anticorps anti-KI67 permet de mettre en évidence les cellules en prolifération. Ici, le marquage est situé dans le compartiment d'amplification (TA) constitué des cellules progénitrices mais aussi dans le fond des cryptes : ce sont les cellules CBC indiquées par les flèches orange. Les flèches bleues désignent les cellules de Paneth, non marquées car ce sont des cellules post-mitotiques, à l'instar des cellules différenciées des villosités. 72 4. Les grandes voies de signalisation impliquées dans la prolifération et le maintien de l'homéostasie intestinale La voie Wnt canonique a) La voie Wnt est étudiée depuis longtemps et a été mise en évidence pour la première fois chez la drosophile sous le nom de Wingless. Cette voie est très étudiée et possède différentes fonctions essentielles pour le développement embryonnaire ou l'homéostasie des tissus, en régulant la prolifération, la polarité et la différenciation cellulaire(Wodarz et Nusse, 1998). Il y a une forte conservation de la voie Wnt de la drosophile jusqu'au mammifères. En effet, cette voie joue un rôle important, entre autres, dans le développement embryonnaire chez les mammifères (Logan et Nusse, 2004). Sa dérégulation dans l'intestin ou le foie induit la tumorigenèse. Modèle de signalisation transcriptionnelle par la voie Wnt (Figure 30) Dans les cellules intestinales, c'est la voie de signalisation canonique qui est à l'œuvre. En absence d'un ligand Wnt, la -caténine cytoplasmique est séquestrée par le complexe effecteur composé de APC (Adenomatous Polyposis Coli) / Axine / Dishevelled (Dsh) / la kinase GSK-3b/ CK1 . La phosphorylation de la -caténine par la kinase GSK3- a pour conséquence son adressage au protéasome et sa dégradation. Dans ce cas, les gènes cibles de la voie Wnt ne sont pas transcrits, ils sont dans un état dit OFF . En présence d'un ligand Wnt, celui est reconnu par le complexe récepteur LRP/Frizzled qui mobilise l'axine. Dsh vient alors inhiber la kinase GSK3-. Le complexe effecteur est dissocié, libérant la -caténine, stabilisée, dans le cytoplasme. Elle migre ensuite dans le noyau o elle forme un complexe avec les facteurs de transcription TCF (T-Cell Factor) et LEF (Lymphoid Enhancer Factor). Ce complexe active la transcription des gènes cibles qui sont alors dans un état ON . 73 Figure 30 : Schéma descriptif du mode d'action de la voie Wnt canonique. La fixation du ligand Wnt sur son recepteur (LPR/Frizzled) entraine l'inactivation par phsophorylation de la kinase GSK-3 et donc du complexe destructeur (GSK-3 -APC-AXIN-CK1- Dsh (non montré ici). La -caténine libre est accumulée dans le cytoplasme et peut ainsi migrer dans le noyau. Elle s'assemble avec des facteurs de transcription tel que TCF / LEF pour activer la transcription des gènes cibles notamment impliqués dans la prolifération (WNT ON state). En absence d u ligand Wnt, la -caténine est séquestrée par le complexe destructeur. Elle est phsophorylée par la GSK-3. Cette phosphyrylation est un signal d'adressage au protéasome pour se dégradation. Les gènes cibles ne sont pas transcrits. ( WNT OFF state) (Pai et al. , 2017) 74 Cas de l'épithélium intestinal : Sept des 19 ligands Wnt sont exprimés dans l'intestin. Dans le fond des cryptes, on trouve les ligands Wnt3 , Wnt 6 et Wnt 9B qui sont connus pour activer la voie canonique de Wnt (Gregorieff et al. , 2005). Le ligand Wnt3, sécrété par les cellules de Paneth, active la transcription des gènes des cellules souches en se fixant sur leur complexe récepteur. Un gradient de concentration des ligands Wnt par diffusion est observé, allant des cryptes et diminuant à l'approche des villosités. Cependant leur expression ainsi que celle de leurs récepteurs Fz5/6/7 LRP5/6 est limitée aux cryptes, ce qui limite aussi leur action et explique la localisation des cellules souches dans les cryptes. Le rôle de la voie Wnt dans l'homéostasie de l'épithélium intestinal a été montré par différentes approches (Pinto et al. , 2003)dont la suppression d'un effecteur TCF4 (voir ci-après) (van Es et al. , 2012b ; Korinek et al. , 1998)et la surexpression d'un inhibiteur de la voie : Dickkopf homologue 1 (DKK1) (Kuhnert et al. , 2004). La délétion de la -caténine dans l'épithélium des souris adultes entrane un défaut de prolifération dans les cryptes, suivi d'une diminution du nombre de cellules intestinales (Fevr et al. , 2007). DKK1 est un antagoniste de la voie Wnt. Sa surexpression dans les cellules épithéliales aboutit à une perte du compartiment d'amplification et des cellules souches, couplé a un défaut de différenciation (Kuhnert et al. , 2004). Chez les mammifères, il existe plusieurs paralogues de TCF. Dans les cellules souches intestinales CBC, seul TCF4 est responsable de la transcription des cibles de la voie Wnt (van Es et al. , 2012b). En effet, la déplétion de TCF4 de façon constitutive est létale, car l'épithélium des souris qui naissent ne contient plus que des cellules différenciées. A l'âge adulte, le même knock- out de TCF4 entrane une perte du compartiment d'amplification et des CBC des cryptes (van Es et al. , 2012b ; Korinek et al. , 1998)(Figure 31). Au contraire, la délétion des gènes codant pour les autres paralogues de TCF n'a aucun effet : ceci montre une spécialisation des différents TCF, qui ne sont pas redondants (du moins pas dans l'épithélium intestinal). Dans l'ensemble, toutes ces approches ont montré sans ambigité que le maintien d'une voie Wnt active était indispensable au maintien des cellules souches CBC et des progéniteurs du TA. L'abrogation de la voie Wnt conduit à une perte très rapide des CBC et une dégradation de l'épithélium en quelques jours(van Es et al. , 2012b ; Fevr et al. , 2007) entranant la mort des souris. 75 Figure 31 : Invalidation de TCF4 dans l'épithélium intestinal. Figure issue de (van Es et al. , 2012b). Dès 3 jours après l'induction du KO du gène codant pour TCF4 dans les cellules épithéliales (tous types confondus), une diminution drastique du marquage KI67 est observée suivi d'une perte des cryptes et du compartiment d'amplification. 76 b) La voie Notch La voie Notch est conservée de la drosophile, o elle a été initialement décrite, aux mammifères. Elle contrôle la capacité de différenciation des cellules. En effet, la voie Notch a principalement pour fonction de maintenir l'état de progéniteur des cellules souches en assurant une division asymétrique(Bardin et al. , 2010 ; Guo et Ohlstein, 2015 ; Leedham et al. , 2005 ; Mellott et al. , 2017 ; Rossi et Desplan, 2017 ; Zhong et al. , 1997). Mode d'action de la voie Notch dans l'épithélium intestinal (Figure 32) Les ligands des récepteurs Notch sont des protéines transmembranaires de la famille Delta/Serrate/Lag2 : chez les mammifères les ligands sont Delta 1/2/3 ou Jagged 1, 2. Ces ligands sont reconnus par le récepteur Notch situé à la surface des cellules voisines. Cette voie fonctionne par contact entre cellules. Le récepteur Notch est composé d'un domaine extracellulaire (NECD pour Notch Extra-Cellular Domain/ECN) et d'un domaine intracellulaire (NICD). La liaison du ligand entraine le clivage de Notch par une protéase ADAM/ TACE (TNF- ADAM metalloprotease Converting Enzyme) séparant le domaine extracellulaire (NECD) et intracellulaire (NICD) (Figure 33, B). Le NICD est par la suite pris en charge par le complexe de la -sécrétase pour subir un second clivage (c). Le domaine NICD migre alors vers le noyau pour former un complexe activateur de la transcription avec les co-activateurs MAM (MAsterMind) et CBP/CSL (CREB binding protein /CBF1, Suppressor of Hairless, Lag-1). Ce complexe active la transcription des gènes cibles. Les gènes cibles sont des gènes de différenciation comme les gènes de la famille Hes (Hairy Enhancer of Split) tel que Hes1, Hes5 et Hes6, exprimés dans le compartiment prolifératif des cryptes(van Es et al. , 2005 ; Riccio et al. , 2008 ; Schrder et Gossler, 2002) mais aussi un des marqueurs des CBC : Olfm4. 77 Figure 32 : Représentation simplifiée de la signalisation Notch . issue de (Hayward et al. , 2008) En absence de ligand, le récepteur Notch reste adressé à la membrane plasmique de la cellule réceptrice. Dans son noyau, les gènes cibles de la voie Notch sont réprimés via l'action de corépresseurs sur le complexe transcriptionnel CSL/CBP. Si le ligand DSL (Serrate/Jagged/ Delta) est exprimé (a), il est reconnu par la partie externe du récepteur Notch (ECN) (b). Cette liaison active le clivage de la partie externe par une première enzyme (ADAM S2) puis celui de la partie interne du récepteur (NICD) par la -sécrétase (clivage S3). Le NICD est adressé au noyau, o il s'assemble au complexe de la transcription CBP/CSL. Ce complexe active la transcription des gènes cibles par la Polymérase II (Pol II). 78 Rôle de la voie Notch dans l'épithélium intestinal : La voie de signalisation Notch est essentielle au renouvellement normal de l'intestin par les cellules souches intestinales. Plus précisément, Notch est impliqué dans la maintenance des cellules en prolifération, il sert à maintenir la balance entre prolifération et différenciation (van der Flier et al. , 2009a). L'inhibition de la voie Notch par différents moyens (fixation d'anticorps aux récepteurs Notch1 et Notch2 , inhibition de la g-sécrétase) provoque une baisse de la prolifération des cellules souches et des cellules progéniteurs (Riccio et al. , 2008 ; Wu et al. , 2010). De fait, la transcription d'Olfm4, un marqueur des CBC, est directement dépendante de Notch (VanDussen et al. , 2012). Dans ces conditions, une augmentation de la différenciation en cellules sécrétrices, notamment en cellules caliciformes, au détriment des cellules absorbantes est observée : il y a une hyperplasie des cellules de Paneth, caliciformes et de Tuft (Tian et al. , 2015 ; VanDussen et al. , 2012). La voie Notch assure la différenciation des cellules progénitrices en entérocytes. En fait, l'équilibre entre prolifération et différenciation en cellules sécrétrices est assuré par une balance entre les voies Wnt et Notch. Notch est nécessaire au maintien d'un niveau d'activité de la voie Wnt favorable aux cellules souches et à la prolifération. Dans le contexte d'une inhibition de la voie Notch, l'inhibition de la voie Wnt (par l'injection d'anticorps dirigés contre le corécepteur des ligands Wnt Fzd/LRP6) restaure un phénotype sauvage de l'épithélium intestinal. L'intégration moléculaire des signaux de la voie Notch et Wnt est encore mal connue. (Tian et al. , 2015). 79 c) Autres voies de signalisation en jeu dans l'épithélium intestinal La voie BMP : Le gradient de diffusion de cette voie est l'opposé de celui de la voie Wnt. La voie BMP est active dans les villosités et s'amoindrit dans les cryptes. Cette voie aurait pour fonction de réprimer la voie Wnt dans les villosités pour éviter la prolifération des cellules différenciées. (Batts et al. , 2006 ; He et al. , 2004). La surexpression d'un inhibiteur général de la voie BMP (noggin) dès le développement provoque une malformation de l'intestin, caractérisée par la formation de cryptes au niveau des villosités (Crosnier et al. , 2006). La voie de signalisation Hedgehog, elle aussi une voie antagoniste de la voie Wnt, permet de cantonner l'expression de la voie Wnt à la base des cryptes. Les ligands de cette voie sont exprimés dans le haut des cryptes et activent et maintiennent la différenciation cellulaire en entérocytes (van den Brink et al. , 2004). L'expression d'inhibiteur de cette voie entrane une défaut dans l'organisation des cellules épithéliales le long de l'épithélium (Madison et al. , 2004). La voie ephrinB (EphB) est impliquée dans l'organisation des compartiments en assurant le contrôle de la migration cellulaire au sein de l'épithélium. Les ligands (EphB) et les récepteurs sont tous deux des protéines membranaires qui fonctionnent par interaction de contact. L'expression des ligands et récepteurs de cette voie sont soumis au contrôle de la voie Wnt. Par conséquent la voie Wnt régule la migration cellulaire à travers la voie EphB-ephrinB (Kosinski et al. , 2007). 80 5. Le cancer colorectal (CRC) a) Généralités Le cancer colorectal représente, tous sexes confondus, le troisième cancer le plus fréquent en France. L'âge moyen du diagnostic est aux alentours de 70 ans mais le cancer survient en général vers l'âge de 50 ans. L'incidence en France en 2020 devrait atteindre 45 000 nouveaux cas contre environ 42 000 en 2012 (site de l'Institut National du Cancer, Il est donc important de trouver des alternatives pour traiter et dépister le cancer colorectal dont le nombre de nouveaux cas ne cesse d'augmenter. Médicalement, on considère plusieurs stades d'avancement des cancers colorectaux. Selon le stade, différents protocoles sont appliqués mais le principal traitement reste la résection chirurgicale, accompagnée ou non de traitement chimique ( adjuvant ) en amont ou en aval. Ces traitements chimiothérapiques utilisent trois types d'agents seuls ou en combinaison : (i) 5-Fluoro-uracil, (ii) Irinotecan : un inhibiteur de la synthèse d'ADN par le blocage de la méthylation de l'uracile, et (iii) oxaliplatine, qui induite la formation de ponts intrabrins dans l'ADN. Tous ces traitements conduisent à des catastrophes mitotiques et la mort des cellules prolifératives dont les cellules cancéreuses. L'apparition de métastases est un facteur aggravant. En phase métastatique, l'espérences de vie du patient est d'environ 2 ans. Les métastases sont dues à la dissémination de cellules cancéreuses issues d'une tumeur primaire vers d'autres organes : souvent les poumons, le foie ou le cerveau. Dans les cancers colorectaux, les métastases sont principalement hépatiques. b) Mécanismes intrinsèques de la tumorigenèse Sauf dans 5% des cas (la polypose adénamateuse familiale et le syndrome de Lynch), il n'existe pas de prédisposition familiale. La tumorigenèse colorectale est due à des mutations somatiques, avec une activation systématique de la voie Wnt (Muzny et al. , 2012). La tumorigenèse est le résultat d'une série d'acquisitions de mutations, dont la séquence a été proposée par B. Vogelstein (Jones et al. , 2008). La première étape de la tumorigenèse colorectale semble être une sur-activation de la voie Wnt : une perte de fonction d'APC est observée dans plus de 80% des cas, éventuellement accompagnée d'autres mutations dans la voie Wnt. Cette activation de la voie Wnt produit de petits adénomes. D'autres mutations touchant les gènes des voies de signalisation de KRAS/BRAF favoriseraient le passage du stade hyperplasie/dysplasie à adénome large mais bénin. Les mutations qui surviendraient par la suite permettraient la progression de l'adénome vers des tumeurs malignes de type carcinome. Ces mutations touchent particulièrement les voies TGF-b/SMAD4, p53 et PI3K (Jones et al. , 2008)(Figure 33). 81 On distingue les cancers à instabilité des microsatellites (MSI : Micro Satellite Instability), ainsi que les cancers hyper-mutés ou non hyper-mutés. La séquence des mutations semblent différer dans les tumeurs avec une instabilité des chromosomes (CIN : Chromosome Instability) (qui sont généralement non hypermutées) et les tumeurs avec MSI, généralement hypermutées. Malgré cette grande hétérogénéité, un consensus de catégorisation a été trouvé et définit 4 sous types (CMS : Consensus Molecular Subtype) de cancer colorectal basé sur le niveau d'expression des gènes. Le premier groupe, CMS1, englobe les tumeurs à MSI qui présente une hyper- mutation dont un enrichissement de la mutation BRAF V600E caractérisé et une hyper méthylation. Tout ceci associé à de forts infiltrats immunitaires. Les trois groupes suivant sont associés à des tumeurs présentant des CNI. Le sous-type CMS2 ou sous-type canonique sont des tumeurs épithéliales dans lesquelles : les cibles de la WNT sont surexprimée et celles de MYC sont réprimées. On observe aussi une augmentation de l'expression de certanes cyclines et d'oncogènes : EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), HER2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor-2) IGF2 (insulin-like growth factor 2), IRS2 (insulin receptor substrate 2) et HNF4A (hepatocyte nuclear factor 4). La caractéristique principale du sous-type CMS3 est le changement du programme métabolique ce qui lui vaut le nom de soustype métabolique. La mutation KRAS, enrichie dans ce groupe, est associée à l'adapation métabolique des cancers colorectaux. Le dernier sous-type CMS4 ou mésenchymateux est marqué par une activation des voies impliquées dans la transition épithélio-mésenchymateuse mais aussi dans le maintien des caractéristiques des cellules souches. De plus, ces tumeurs présentent une surexpresssion des protéines du modelage de la matrice extracellulaire (MEC) (Dienstmann et al. , 2017) (Figure 34). Enfin, certaine cellules du carcinome acquièrent la capacité de migrer et proliférer dans d'autres tissus pour former des métastases : les mécanismes en jeu sont encore controversés. Cette étape semble nécessiter peu de mutations (Jones et al. , 2008). Deux modèles s'affrontent : celui de l'acquisition de nouvelles mutations qui favoriseraient la transition épithélio-mésenchymateuse, et celui o les mutations seraient déjà présentes dans les carcinomes et les métastases représenteraient simplement l'étape suivante du processus de carcinogenèse. L'acquisition d'un phénotype de type mésenchymateux (transition épithélio-mésenchymateuse ou EMT en anglais) permettant aux cellules tumorales d'infiltrer le système circulatoire (intravasation) avait été proposée comme la première étape de la formation métastatique. Cependant cette hypothèse est remise en cause par des expériences récentes sur des modèles murins de cancers métastatiques autres que colorectaux (Fischer et al. , 2015 ; Zheng et al. , 2015) et ces études semblent favoriser un rôle pour l'EMT dans l'acquisition d'une chimiorésistance par les tumeurs. L'autre modèle propose qu'une sous-population des cellules tumorales ait la capacité de migrer pour initier une métastase (voir d). 82 Figure 33 : Séquence des mutations conduisant à la carcinogenèse colorectale Issue de (Jones et al. , 2008) Ici est représenté un modèle de séquences de mutations qui favoriseraient la progression tumorales. Les mutations de la voie WNT surviendrait au tout début de la chaine pour initier la tumoigenèse. Ensuite, il y aurait des mutations qui meneraient à l'inactivation de voies anti-tumorales tel que CDC4 ou une instabilité des chromosomes mais aussi la suractivation des voir KRAS et BRAF. L'intervention de nouvelles mutations pousseraient la tumorigenèse vers la carinogenèse. L'apparition des métastases n'est pas encore bien élucidée mais l'expression de gènes tels que TGF ou de gènes impliqués dans le modelage de la MEC pourrait être en jeux. 83 Figure 34 : Classification des sous-types de cancer colorectal (Dienstmann et al. , 2017) On distinhue quatres sous-types de cancer colorectal suivant le niveau d'expression de certains gènes mis en cause dans la tumoigenèse. Le CMS1 se distingue par la présence d'instabilité des microsatellites alors que les trois autres présentent une instabilité des chromosomes. L'aquisition de mutation, le profil de métylation, et les dérégulations métaboliques sont les critères sur lesquels cette classification a été réalisée. Le dogme de la séquence de mutation présentée à la figure 33, semble ne plus être aussi rigide. 84 Actuellement, il y a deux grandes hypothèses sur l'origine des cancers colorectaux : le modèle Bottom up ou hiérarchique et le modèle Top down ou stochastique (Figure 35). Le modèle stochastique suppose que toutes les cellules épithéliales, différenciées ou non, sont susceptibles d'acquérir une série de mutations oncogéniques pour se transformer en cellule tumorale et initier le processus de tumorigenèse colorectal (Krausova et Korinek, 2014 ; Plaks et al. , 2015a ; Rizk et Barker, 2012). Dans ce cas, une expansion latérale peut être observée. Des expériences sur des souris ont montré que la réactivation de la voie Wnt dans les cellules épithéliales différenciées peut conduire à la formation de tumeurs lorsque la voie NF-kB est également activée (Schwitalla et al. , 2013). Physiologiquement, la voie NF-kB est activée en réponse à une agression par un agent pathogène, comme c'est souvent le cas dans l'épithélium intestinal, au contact du milieu extérieur. De fait, les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin sont associées à un risque accrût de cancer colorectal(Grivennikov et al. , 2010 ; Middelhoff et al. , 2017) Le modèle bottom up ou hiérarchique suppose que les tumeurs auraient comme origine des Cellules Souches Cancéreuses (CSC). Ces cellules souches cancéreuses proviendraient de cellules souches normales ayant accumulé des mutations(Barker, 2014). Ces cellules souches cancéreuses représenteraient une sous-population distincte au sein de la tumeur, capable de se régénérer et d'entrer en quiescence. Les CSC peuvent donner directement différents types de cellules tumorales différenciées ce qui augmente l'hétérogénéité de la tumeur (tumeur polyclonale). Elles peuvent aussi engendrer des cellules de type progéniteurs qui donneront différents lignages cellulaires (tumeur monoclonale). Chacun de ces lignages donneraient lieu à une tumeur composée d'un seul type de cellules tumorales. (Plaks et al. , 2015a). Dans ce modèle, les CSC constituent la cible thérapeutique à éradiquer pour traiter efficacement les patients. Ces deux modèles ne sont pas exclusifs. Dans les faits, la plasticité des cellules épithéliales intestinales est telle que des cellules différenciées peuvent subir une dédifférenciation par la réactivation des gènes des cellules souches (Schwitalla et al. , 2013). 85 Hétérogénéité des tumeurs et cellules souches cancéreuses c) Les données récentes semblent confirmer, dans les cancers colorectaux, l'existence de cellules souches cancéreuses (CSC) au sein de la population tumorale (Todaro et al. , 2014a). Ces CSC se distinguent des autres cellules tumorales par plusieurs caractéristiques, notamment leur : - quiescence - - auto-régénération capacité à initier des tumeurs (d'o parfois la dénomination des CSC en TIC Tumor Inducing Cells ou cellules inductrices de tumeurs) - résistance à l'apoptose. L'existence des CSC suppose que leur éradication totale est nécessaire pour éliminer toute possibilité de rechute. Cependant, du fait de leur quiescence, ces CSC sont résistantes aux traitements, puisque les thérapies chimiques appliquées aux cancers colorectaux ciblent les cellules prolifératives par induction de dommages à l'ADN. Des études cherchent à identifier des composés chimiques pour pouvoir les cibler spécifiquement (Zizza et al. , 2016). D'autre part, il a été proposé que les CSC seraient à l'origine de métastases, selon l'hypothèse de la graine et du sol . Ainsi, la dissémination des CSC et leur éventuelle infiltration conduirait à la formation de métastases lorsqu'elles se retrouveraient dans un microenvironnement favorable. L'hétérogénéité intra-tumorale est problématique pour les thérapies. Comme nous l'avons vu dans la première partie de l'introduction, HSP90 permettrait l'accumulation de mutations en atténuant les phénotypes qui en découlent et ainsi favoriser leur expansion et leur sélection lors de changements environnementaux. Appliqué au cas du cancer du sein, il a été proposé d'inhiber HSP90 à des doses n'induisant pas la déstabilisation de ses cibles, pour freiner l'apparition et la fixation de mutations dans les cellules tumorales (Queitsch et al. , 2002 ; Rutherford et Lindquist, 1998 ; Whitesell et al. , 2014). Cependant l'impact de ce type de traitement sur les CSC n'a pas encore été analysé. d) Microbiote et réponse immunitaire Le régime alimentaire et le mode de vie (consommation d'alcool et de tabac, consommation fréquente de viande rouge et charcuteries, manque d'activité sportive. ) ont souvent été incriminés comme facteurs de risque (Chan et Giovannucci, 2010 ; Dahm et al. , 2010). Notre régime alimentaire conditionne l'état de notre microbiote intestinal. Le microbiote est l'ensemble des bactéries commensales présentes dans la lumière de l'intestin. La flore 86 intestinale varie tout au long du tractus digestif et elle empêche les bactéries potentiellement dangereuses de s'y implanter. Il est donc important de la préserver. Plusieurs études montrent une différence de la structure de cette flore entre des individus atteints de cancer colorectal et des individus sains. Les premiers à avoir montré cette variabilité sont Moore et Moore (Moore et Moore, 1995). L'influence du microbiote sur les cancers colorectaux s'explique principalement par deux mécanismes : - les produits sécrétés par les bactéries : ainsi certaines bactéries sous-représentées dans les microbiotes de patients, sécrètent des butyrates. Ces butyrates diminuent le potentiel redox de l'intestin, et par là les conditions favorables à la mutagenèse et la croissance tumorale. Au contraire, d'autres bactéries opportunistes, présentes chez les patients, sécrètent des toxines mutagéniques. - les réactions immunitaires qu'elles déclenchent. Le type de réponse immunitaire déclenché par la présence de bactéries dépend du type bactérien (Lasry et al. , 2016). La réponse immunitaire peut se révéler anti-tumorale, par exemple lorsque cette réponse implique des lymphocytes CD8 cytotoxiques (Lévy et al. , 2015). Le plus souvent, cependant, une réponse inflammatoire provoque favorise la tumorigenèse, notamment par la sécrétion d'interleukines comme IL-23 et IL-17 ou IL-6 (Grivennikov et al. , 2012). Ainsi les patients souffrant de maladies inflammatoires chroniques intestinales (colites ulcératives, maladie de Crohn) présentent des risques plus élevés de développer des cancers du côlon (Grivennikov et al. , 2010 ; Middelhoff et al. , 2017). Chez ces patients, une inflammation chronique provoque une activation prolongée de NF-kB. NF-kB peut coopérer avec la voie Wnt pour induire une dédifférenciation des cellules épithéliales en cellules souches cancéreuses (Schwitalla et al. , 2013). Surtout, il induit la sécrétion d'IL-6 et de TNF (Tumor Necrosis Factor), deux cytokines pro-tumorales. e) Rôle des cellules de la niche tumorale Les cellules tumorales détournent les fonctions du stroma pour créer un microenvironnement qui permette leur maintien et leur expansion : ce processus est indispensable à la tumorigenèse (Scheel et al. , 2011). La croissance de la tumeur nécessite notamment un remodelage de la matrice extracellulaire, une néo-angiogenèse pour apporter oxygène et nutriments et la sécrétion de facteurs de croissance comme le HGF (Hepatocytes Growth Factor) et les interleukines pro-tumorales. Les CSC modifieraient ainsi les fibroblastes et les macrophages du stroma pour qu'ils aient une activité pro-tumorale et créeraient un microenvironnement favorable : on parle alors de CAF (CAF : Cancer Associated Fibroblaste) et CAM (CAM : Cancer Associated Macrophages). 87 Les CAF sécrètent notamment la cytokine CXCL12, un stimulateur de la voie NF-kB dans les cellules réceptrices, le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) qui favorise la néo- angiogenèse, et l'HGF, un facteur de croissance des cellules tumorales (Plaks et al. , 2015b). Ces sécrétions favorisent l'activation de la voie Wnt et Notch pour maintenir les caractéristiques de cellules souches des CSC (Junttila et de Sauvage, 2013 ; Kalluri et Zeisberg, 2006). La niche tumorale a également pour but d'échapper à la surveillance immunitaire pour éviter une réponse cytotoxique des lymphocytes CD8 mais de modifier le comportement des macrophages (CAM) pour qu'ils sécrètent IL-6, TNFa et TGF b (Transforming Growth Factor b). Il-6 soutient la croissance tumorale, le TNF& stimule la voie NF-kB dans les cellules tumorales et participe ainsi à leur transformation, tandis que TGFb recrute des lymphocytes régulateurs (Treg) pour supprimer la réponse immunitaire (Plaks et al. , 2015b). Les CAM participent aussi au remodelage de la matrice extracellulaire. Le manque de nutriments et d'oxygène (hypoxie) provoque une reprogrammation du métabolisme des cellules tumorales vers le cycle glycolytique. Ce changement métabolique participe à la mise en place d'une hypoxie , qui favorise l'échappement des cellules souches cancéreuse au système immunitaire (Wei et al. , 2011). En aidant à cet échappement, l'hypoxie participe à la mise en place de l'EMT (Terry et al. , 2017). Elle induit l'expression de HIF-1 (Hypoxia Inducible Factor 1alpha) qui provoque la sécrétion de VEGF, une cytokine cruciale pour le recrutement de cellules endothéliales et la formation de vaisseaux sanguins (Catalano et al. , 2013 ; Wei et al. , 2011). De plus, l'hypoxie protège les cellules cancéreuses des chimiothérapies et des rayons. Cet état d'hypoxie induit une stimulation de l'angiogenèse par les cellules souches cancéreuses mais aussi par les cellules endothéliales. En état d'anaérobie, les cellules produisent des dérivés réactifs d'oxygène appelé ROS en anglais (Reactive Oxygen Species). Dans la niche intestinale, les ROS proviennent des cellules tumorales qui utilisent la fermentation pour produire de l'ATP, mais des CAF et des CAM qui expriment des enzymes pour maintenir un environnement oxydatif (Catalano et al. , 2013). Les ROS sont capables de maintenir les caractéristiques de cellules souches cancéreuses via l'activation du TGF- (Anido et al. , 2010 ; Pavlides et al. , 2010). Les cellules tumorales se protègent des ROS par l'expression d'enzymes réductases et notamment, les déterminants de surface des CSC (CD44v6) joueraient un rôle dans la stabilisation de ces enzymes (Catalano et al. , 2013 ; Todaro et al. , 2014b). 88 Figure 35 : les 2 grands modèles de tumorigénèse intestinale Figure issue de (Plaks et al. , 2015a) 89 Modèle murins d'induction de la tumorigenèse colorectale f) Dans presque 100% des cas, l'apparition de tumeurs est liée à une sur-activation de la voie Wnt. Le rôle des composants de la voie Wnt a été découvert dans des études de cancers colorectaux héréditaires (FAP pour Familial Adenomatous Polyposis Coli)(Kinzler et al. , 1991 ; Nishisho et al. , 1991). La mutation la plus fréquente est celle du gène Apc (plus de 80% des cas), entranant une sur-activation de la voie Wnt. Le complexe APC-Axine-GSK3- Dsh ne peut plus se former, la - caténine est stabilisée et migre dans le noyau. L'augmentation de la -caténine nucléaire entrane une hausse de la transcription des gènes cibles de la voie Wnt. L'un des modèles murin d'étude de la tumorigénèse intestinale est l'invalidation du gène Apc, par mutation ou délétion. En 1990, une équipe met en évidence lors d'un traitement avec un mutagène, l'implication du gène Apc dans l'apparition spontanée d'adénomes intestinaux et coliques : les souris ApcMin/ développent des adénomes intestinaux très tôt au cours du développement (Moser et al. , 1990, 1995 ; Su et al. , 1992). D'autres modifications de ce gène ont été proposées pour étudier son rôle ou pour permettre l'étude de tumorigénèse chez l'adulte : notamment des délétions inductibles comme l'allèle Apcfloxed (Colnot et al. , 2004). L'avantage de cet allèle est qu'il est d'une part inductible -contrairement à ApcMin- et d'autre part, il entrane le développement d'adénomes intestinaux mais aussi colorectaux. Ce phénotype se rapproche de ce qui est observé chez l'homme. La tumorigénèse est certes initiée par une acquisition de mutations somatiques mais le cancer est aussi une maladie plurifactorielle car l'environnement peut favoriser son apparition. Le protocole d'induction chimique par traitement à l'AOM et au DSS de tumorigénèse colorectale associe ces deux facteurs. La tumorigénèse est induite par l'injection d'un carcinogène Azoxyméthane (AOM) qui entraine une augmentation des méthylations pro-mutagènes de l'ADN, et favorise l'apparition de mutations. L'inflammation chronique souvent mise en cause chez l'homme est mimée par des cycles d'exposition à un agent inflammatoire, le sulfate de dextran et de sodium (DSS), dilué dans l'eau de boisson (Fazio et al. , 2011 ; Suzuki et al. , 2004 ; Tanaka et al. , 2003). 90 D. Objectifs et déroulement de la thèse Objectif principal : RPAP3 pourrait-il être une cible thérapeutique des 1. cancers colorectaux ? L'objectif principal de ma thèse était de tester si la protéine RPAP3 pouvait être envisagée comme cible thérapeutique dans les cancers colorectaux. C'est pour répondre à cette question que j'ai reçu un financement de la Ligue Contre le Cancer. Plusieurs données suggéraient que le R2TP pourrait jouer un rôle dans les cancers colorectaux. En particulier, des marquages immuno-histochimiques réalisés sur des coupes de tumeurs de patients par nos collaborateurs, avec un anticorps développé au laboratoire (clone 19B11), montrent que RPAP3 est surexprimé dans 70% des échantillons de tumeurs primaires testés (n 22). Notre hypothèse était qu'une diminution du niveau de RPAP3 ralentirait la croissance des tumeurs. Comme les études sur la drosophile montraient une grande résilience des organes à des baisses d'expression de Spaghetti, son homologue RPAP3 apparaissait comme une cible intéressante dans le traitement des tumeurs. Un tel objectif est éloigné de l'expertise du laboratoire d'Édouard BERTRAND. Cependant, le site de Montpellier regroupe des équipes spécialisées dans la physiologie de l'intestin et les mécanismes de tumorigenèse colorectale. Ceci est concrétisé par un groupe de travail SIRIC sur ce thème, qui a permis de nombreux échanges fructueux. De plus, plusieurs équipes dans l'institut et sur le site avaient développé une expertise dans les modèles murins d'invalidation génétique intestinale notamment par l'utilisation des recombinases Cre sous contrôle du promoteur de la villine - ainsi que dans les techniques d'analyse de l'intestin. Ainsi, nous avons particulièrement profité de l'expertise des équipes de Philippe JAY (IGF) et Michel HAHNE (IGMM). Développement de modèles murins d'invalidation de RPAP3 et, 2. conduite des expériences sur les souris Pour tester le rôle de RPAP3 dans la tumorigenèse colorectale, Bérengère PRADET- BALADE, alors membre de l'équipe d'Édouard BERTRAND, avait initié le développement d'un modèle murin d'invalidation de RPAP3 (lignée portant l'allèle RPAP3wtsiconstitutif, codant pour une protéine tronquée). A partir de cette lignée, j'ai généré des souris portant un allèle permettant une invalidation conditionnelle (allèle RPAP3flox). Dans un premier temps, j'ai caractérisé l'effet de l'invalidation de RPAP3 dans l'intestin en conditions physiologiques, car nous en ignorions les conséquences. Contre toute attente, cette invalidation s'est révélée délétère pour les souris. J'ai alors entrepris d'en caractériser les 91 mécanismes. Puis j'ai mis en place deux modèles de tumorigenèse : un modèle d'induction chimique avec un protocole alliant un carcinogène AOM avec un agent irritant (DSS) (modèle utilisé par l'équipe de Michael HAHNE à l'IGMM) et un modèle génétique d'initiation de la tumorigenèse par l'invalidation d'une copie du gène APC (modèle utilisé par l'équipe de Philippe JAY à l'IGF). Ces deux modèles étaient déjà exploités dans l'institut. Pour toutes ces expériences, j'ai mis en place les protocoles de génotypage des différents allèles : RPAP3wtsi, RPAP3flox, RPAP37. J'ai organisé et suivi les croisements des animaux afin d'obtenir les lignées avec lesquelles j'ai travaillé, en utilisant les recombinases FlpO, Cre constitutive (Cre) ou inductible (CreERT2), sous contrôle du promoteur de la Villine (allèles VilCre ouVilCreERT2 ) ou de Lgr5 (allèle Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2) mais aussi ceux avec la lignée APCflox pour les expériences de tumorigenèse. Je participe directement à la gestion des différentes lignées que nous avons, en effectuant les génotypages, en triant les animaux et en suivant les accouplements nécessaires. Je définis et j'applique les protocoles de chaque expérience, et, avec l'aide du personnel de l'animalerie ou de l'équipe de Michael HAHNE, je procède aux sacrifices et aux prélèvements. Mon projet a permis de mettre en évidence l'importance de RPAP3 dans le maintien de l'homéostasie de l'épithélium intestinal dans un modèle in vivo. Les futures expériences nous permettront peut-être de montrer son implication dans les cellules souches et ainsi mettre en évidence une nouvelle fonction du R2TP chez la souris. Nos résultats en contexte de tumorigenèse suggèrent que la délétion d'une copie de RPAP3 a tendance à favoriser la progression et/ou l'initiation des cancers. Notre stratégie de départ était d'enlever RPAP3 pour ralentir la prolifération, nos données acquises jusqu'à présent nous questionnent sur les mécanismes impactés. Cela nous renvoie à l'utilité de la surexpression de RPAP3 observée dans les cancers colorectaux, peut-être que RPAP3 a un rôle protecteur, suppresseur de tumeur. Notre animalerie a été victime d'une contamination par le virus MHV (Mouse Hepatitis Virus) en février 2015 et il a fallu la fermer, alors que nous venions d'obtenir nos premiers animaux RPAP3 flox/flox ; Vil-Cre-ERT2. Nous avons donc procédé à la redérivation de nos lignées. Leur élevage n'a repris qu'en décembre 2015. Durant cette année d'arrêt, j'ai continué à génotyper les animaux pour sélectionner les futurs parents des souris redérivées. La toute première expérience d'invalidation de RPAP3 par laVilCreERT2 a eu lieu en mars 2016. Les résultats sur les souris présentés ici ont été obtenus à partir de cette date. 92 Développement d'un sujet connexe : le rôle du domaine C-terminal 3. de RPAP3 J'ai mis à profit l'année d'arrêt de l'élevage pour développer un projet axé sur la compréhension des mécanismes moléculaires du R2TP et la caractérisation de ses interactions. Le but de ce projet était de caractériser la fonction encore inconnue du domaine C-terminal de RPAP3 au sein du R2TP mais aussi chez les protéines porteuses de ce domaine (protéines RPAP3-like ). Une expérience de protéomique faite par Céline Verheggen avait montré l'association de PIH1D2 avec SPAG1, validant l'hypothèse d'une conservation du mode de fonctionnement du R2TP dans des protéines à domaines PIH-like et RPAP3-like . J'ai participé au développement de ce projet. Nous avons, dans un premier temps, caractérisé les interactions du domaine C-terminal de RPAP3 ainsi que le rôle de RUVBL1 et 2 dans la liaison aux substrats. Puis cette étude, nous a amené à nous questionner sur l'existence de complexes avec une structure similaires au R2TP, que nous nommons les complexes R2TP-like . J'ai cloné les différents domaines de RPAP3 et étudié leurs interactions avec les autres membres par la méthode de double hybride. J'ai réalisé la mutagenèse du domaine C-terminal en me basant sur les données structurales de nos collaborateurs et j'ai testé les différents mutants par double hybride chez la levure Saccharomyces cerevisiae. J'ai effectué les clonages des plasmides utilisés pour les cribles réalisés par Hybrigenics. J'ai procédé aux expériences d'IP LUMIER pour tester les interactions entre les protéines des R2TP-like . Pour les études protéomiques, j'ai mis en place les différentes lignées stables de cellules HeLa et réalisé les IP SILAC. Les structures et les interactions in vitro ont été réalisées par nos collaborateurs de l'IMoPA de Nancy et de l'Université de Lisbonne (capables de produire les Rvb1/2 in vitro). Mon travail a permis de mettre en évidence la fonction jusqu'alors inconnue du domaine C-terminal de RPAP3 mais aussi de caractériser la structure du R2TP humain. Ces données apportent une meilleure compréhension des interactions au sein de complexe R2TP humain. Grâce à ce projet, nous pouvons proposer un modèle d'assemblage des substrats du R2TP plus complet. De plus, ce projet nous a permis de mettre en évidence un complexe apparenté au R2TP de par sa structure mais aussi sa fonction. Il soulève donc la question de l'existence d'autres complexes du même type et leur fonction dans l'organisme et les ciliopathies. 93 II. Résultats A. Rôle de RPAP3 dans l'épithélium intestinal et la tumorigénèse 1. Introduction Historiquement, l'équipe s'intéresse à l'assemblage des petites particules ribonucléiques nucléolaires (en anglais snoRNP). Ces snoRNP sont nécessaires à la production des ribosomes, eux-mêmes responsables de la synthèse des protéines. Ces études nous ont permis de caractériser le complexe R2TP. Il est composé de quatre protéines : RPAP3, qui relie le R2TP à HSP90 ; PIH1D1, qui interagit avec RPAP3 et recrute les protéines clientes ; et RUVBL1/RUVBL2, deux AAA ATPAses dont la fonction moléculaire est encore inconnue. Le R2TP est très conservé de la levure S. cerevisiae à l'homme (Zhao et al. , 2008 ; Zhao et Houry, 2005). Chez les mammifères, on le trouve associé à une série de préfoldines pour former ce qu'on appelle le R2TP/Prefoldin-like complexe (Boulon et al. , 2008). Ce complexe recrute le chaperon moléculaire HSP90 (Heat Shock Protein 90) et stabilise puis assemble plusieurs machineries de base de la cellule, comme les ARN polymérases (Boulon et al. , 2010), plusieurs RNP non- codantes dont les snoRNP (Bizarro et al. , 2014, 2015 ; Malinová et al. , 2017), et les kinases de la famille des PIKKs qui comprennent mTOR, TRRAP, ATR, ATM et DNA-PKcs (Hoej et al. , 2010 ; Takai et al. , 2007 ; Takai et al. , 2010). Toutes ces machineries sont nécessaires au bon fonctionnement de la cellule car impliquées dans les réparations des dommages de l'ADN, la biogenèse des ribosomes ou encore la transcription (Boulon, et al. , 2012)(Figure 1. A). Les complexes assemblés par le système HSP90/R2TP sont nécessaires à la prolifération, ce qui fait du R2TP un bon candidat à étudier dans le cadre de l'épithélium intestinal, un organe en régénération continue. En effet, cette régénération continuelle suppose un contrôle de la synthèse protéique (rôle des ARN polymérases, des snRNP, des snoRNP et de mTOR), du cycle cellulaire (rôle de TRRAP dans SAGA), mais aussi une réponse des dommages à l'ADN qui peuvent apparatre au cours de la réplication (rôle d'ATR, ATM et DNA-PKcs) pour ne pas propager de mutation. Si une mutation apparat dans une cellule souche, elle sera transmise à toutes ses cellules-filles, ce qui pourrait conduire à des aberrations et à des processus de transformation cellulaire. Le R2TP pourrait être un des gardiens de cette intégrité, en contrôlant simultanément ces aspects. Plusieurs données suggèrent un lien entre HSP90/R2TP et la tumorigénèse. Tout d'abord, HSP90 est une cible dans le cadre du cancer, et des drogues la ciblant sont en cours de test cliniques pour plusieurs types de tumeurs solides tels que les tumeurs rénales, du sein, de la prostate ou encore pancréatiques (Neckers et Workman, 2012). Ensuite, les AAA ATPases 94 RUVBL1/2 sont surexprimées dans les cancers hépatiques et colorectaux, et sont nécessaires à la tumorigenèse hépatique (Haurie et al. , 2009 ; Huber et al. , 2008). L'étiologie des cancers hépatocellulaires, comme celle des cancers colorectaux, a pour origine une sur-activation de la voie Wnt. Pour tester si ce rôle des RUVBL1/2 impliquait le R2TP, nous avons établi des collaborations avec des cliniciens. Grâce à un anticorps monoclonal développé au laboratoire, nous avons vérifié que RPAP3 est surexprimé dans les cancers hépatocellulaires et colorectaux (données non publiées, obtenues en collaboration avec l'équipe de J. Rosenbaum à Bordeaux et avec l'équipe de N. Rossano à Pescara, Italie). Ces données sont cohérentes avec les données de transcriptomique établies à partir de tumeurs de patients ainsi que les résultats d'immuno- histologie disponibles sur le site Bio-Atlas . L'ensemble de ces résultats nous a fait postuler que le R2TP et plus précisément RPAP3- pouvaient être une cible thérapeutique dans les cancers hépatocellulaires ou colorectaux (Boulon et al. , 2012). Nous avons donc choisi d'étudier le rôle de RPAP3, comme élément constitutif du R2TP, dans des modèles murins. Nous avons choisi de concentrer nos études sur l'intestin, au cours de la tumorigénèse mais aussi en conditions physiologiques. De plus, le site de Montpellier concentre des équipes spécialisées sur ces thématiques et un SIRIC dédié au cancer colorectal. Nous avons choisi de cibler RPAP3 car : (1) il sert de lien entre la protéine chaperonne HSP90 (via ses domaines TPR) et ses partenaires du R2TP : PIH1D1 et RUVBL1/2 ; (2) sa délétion est viable chez la levure S. cerevisiae (tandis que la délétion de Pih1 affecte plus fortement la croissance des levures), et son knock-down affecte peu la croissance des organes de Drosophile. L'ensemble de ces données suggérait donc que RPAP3 pouvait avoir un rôle de chaperon en conditions de stress cellulaire (compétition cellulaires pour les ressources nutritionnelles, changement morphogénétiques. ). Ces caractéristiques en font un bon candidat pour cibler les cellules tumorales. 95 2. Résultats Mon travail a contribué à l'élaboration de l'ensemble des figures de ce projet. Les coupes et les marquages standard (HE, PAS, Ki67) sont effectués par la plateforme locale RHEM, les autres par et avec François GERBE, de l'équipe de Philippe JAY à l'IGF (Montpellier). J'ai ensuite analysé les données avec Bérengère PRADET-BALADE. a) Rôle de RPAP3 dans la physiologie intestinale RPAP3 est essentiel au développement embryonnaire chez la souris. Grâce à des cellules ES recombinantes générées par le consortium KOMP, nous avons généré des animaux portant différents allèles de RPAP3 : un allèle hypomorphe RPAP3wtsi, qui code pour une protéine tronquée, et un allèle conditionnel RPAP3flox, o l'exon 7 de RPAP3 est flanqué de deux sites LoxP (Figure 2A). A partir de l'allèle RPAP3flox on obtient l'allèle invalidé RPAP37 par recombinaison avec une Cre qui reconnat les sites LoxP. Nous avons effectué des croisements afin d'obtenir des souris homozygotes pour l'allèle hypomorphe (RPAP3wtsi) sans succès (nombre obtenu/attendu 0/12), ce qui suggère que RPAP3 est nécessaire au développement embryonnaire chez la souris (Figure 2C). RPAP3 est exprimé de façon ubiquitaire chez la souris J'ai procédé dans un premier temps, à l'analyse par Western Blot de l'expression de RPAP3 chez la souris. Après avoir extrait les protéines de différents tissus, j'ai pu montrer que RPAP3 est exprimé au niveau protéique dans tous les tissus adultes testés (données non montrées). Nous nous sommes demandé dans quels types cellulaires de l'épithélium intestinal RPAP3 était localisé. Mise en évidence de RPAP3 dans les cellules en prolifération de l'intestin Grâce une technique d'immuno-histochimie, j'ai montré que RPAP3 était exprimé dans l'épithélium intestinal, particulièrement dans le compartiment d'amplification ainsi que dans les cellules souches. Les cellules de Paneth, l'autre catégorie de cellules composant la crypte, n'expriment pas RPAP3 (Figure 1B). L'expression de RPAP3 est cantonnée aux cellules en prolifération car nous constatons une superposition des signaux des anticorps anti-RPAP3 et anti-KI67, un marqueur de prolifération. RPAP3, et le R2TP, pourraient avoir une fonction dans le contrôle de la prolifération au sien de l'épithélium intestinal. Afin de tester cette hypothèse, nous avons généré des modèles murins d'invalidation de RPAP3 spécifiquement dans l'épithélium intestinal et colique. 96 La délétion de RPAP3 entrane une dégradation rapide de l'épithélium intestinal Nous avons rencontré le même problème de létalité quand nous avons voulu utiliser l'allèle floxé pour RPAP3avec la Cre sous contrôle du promoteur de la Villine, exprimée dans l'épithélium de l'intestin grêle et du côlon (souris VilCre ; RPAP3flox /flox)(El Marjou et al. , 2004). L'invalidation constitutive de RPAP3 est létale (nombre obtenu/attendu 0/16) (Figure 2C). Cela concorde avec nos données chez D. melanogaster o Spaghetti est nécessaire au développement. Afin de palier à cette mortalité, nous avons créé une lignée o l'invalidation de RPAP3 peut être induite à l'âge adulte dans l'intestin, grâce à l'utilisation d'une Cre inductible par le tamoxifène (VilCreERT2). Chez ces animaux et leurs contrôles, nous avons appliqué un protocole établi dans l'animalerie du laboratoire, qui consiste en deux injections successives de 2mg d'une solution de tamoxifène à une journée d'intervalle (Jour 0 et Jour 1). Les PCR sur l'ADN génomique des cellules épithéliales de l'intestin montrent une recombinaison génique détectable dès le 1er jour après la première injection de tamoxifène. Cette recombinaison est maintenue pendant au moins 4 jours, ce qui suppose que la recombinaison a bien eu lieu dans les cellules souches qui peuvent ensuite transmettre cette recombinaison à leurs cellules filles (Figure S2). Nous avons procédé à l'invalidation de RPAP3 dans l'intestin et le côlon dans des souris âgées d'au moins 6 semaines, âge o le tractus digestif est considéré comme mature. J'ai observé un phénotype sévère dès 6 jours post-induction dans les souris d'intérêt VilCreERT2 ; RPAP3flox/flox avec une perte de poids proche de 20% du poids initial et des signes de souffrance. J'ai ainsi dû sacrifier la plupart des animaux à 8 ou 10 jours. Certains individus plus résistants (parce que plus corpulents au début de l'expérimentation) ont pu être analysés 17 jours après la première injection de tamoxifène. (Figure 3B et Sup. 3) Le phénotype est caractérisé par : une perte de plus de 20% du poids initial des animaux, une distension de l'intestin grêle par l'accumulation de liquide, l'effacement de l'axe crypto-villositaire, la disparition de la couche épithéliale, un raccourcissement de la longueur de l'intestin grêle d'environ 50%. Sur les images à jour 8, les cryptes ainsi que le compartiment d'amplification ont presque totalement disparu. Seules des cryptes résiduelles, positives au KI67 - donc vraisemblablement prolifératives - semblent persister (Figure Sup. 4). Cette destruction expliquerait le gonflement de l'intestin (Figure Sup. 3) : les échanges avec la lumière de l'intestin ne peuvent plus se faire, ni 97 l'eau ni les nutriments ne sont absorbés. Il en découle la forte perte de poids visible à partir du jour 6. Un phénotype différent entre l'intestin et le côlon ? L'invalidation de RPAP3 affecte plus sévèrement l'intestin grêle que le gros intestin : après 10 jours de traitement, l'épithélium colique semble globalement préservé alors que celui de l'intestin grêle est détruit. Il semblerait que les souris ayant réussi à passer le point critique de 10 jours reprennent alors du poids. (Figure Sup. 3A ). L'épithélium intestinal de ces souris survivantes a été observé 17 jours après l'invalidation. Le phénotype se caractérise par deux choses : (1) l'épithélium de l'intestin grêle présente des villosités et des cryptes irrégulières, avec des villosités polylobées et hyperplasiques (Figure 3 B) qui semblent fonctionnelles, (2) l'épithélium colique est affecté : une perte de cryptes est observée et une morphologie également irrégulière (Figure Sup 3D). Il est possible que l'épithélium intestinal se soit régénéré à partir des cryptes résiduelles observées à jour 10. Des marquages du Ki67 et RPAP3 sont prévus pour déterminer si cette régénération est due à des cryptes qui auraient échappé à la recombinaison et seraient donc RPAP3 / ( escapers ), ou si une autre voie supplée au manque de RPAP3 ( by-passers ). Chez les souris ayant réussi à passer le point limite, on observe une distorsion de l'architecture de l'épithélium colique. La cinétique semble différente entre ces deux parties du tractus digestif. L'invalidation de RPAP3 affecte donc l'intestin grêles et le côlon mais avec une latence par rapport à l'intestin grêle. RPAP3 est essentiel au maintien des cryptes et du compartiment d'amplification J'ai procédé à une cinétique afin de déterminer la séquence des évènements qui induisent la dégradation de l'épithélium. Six jours après le début du traitement, la morphologie et le marquage Ki67 (un indicateur de prolifération) sont identiques à ceux des contrôles. Nous constatons la perte totale du signal Ki67 dans le compartiment d'amplification et les cryptes dès 7 jours, dans un épithélium globalement intact. Brusquement après 8 jours, il y a une perte quasi-totale du marquage Ki67 et l'épithélium est très dégradé (Figure 4B). Nous constatons également la présence de cryptes prolifératives, circulaires, Ki67 et potentiellement hyperplasiques (Figure 4B et Figure Sup. 4B). Les villosités sont affectées, leur morphologie et intégrité s'estompent. L'intestin est en renouvellement continu, les cellules différenciées migrent vers le haut des villosités o elles meurent par apoptose. Dans les souris VilCreERT2 ; RPAP3flox/flox, la migration de ces cellules se poursuit, mais ces cellules ne seraient pas remplacées car les CBC ainsi que les 98 progéniteurs meurent ou cessent de proliférer (nous n'avons pas détecté de signal pour la caspase 3, indicatif d'une apoptose des cellules). Les mécanismes de régénération de l'épithélium semblent bloqués. RPAP3 agit donc sur le maintien de la prolifération dans les cryptes intestinales et le compartiment d'amplification transitoire. Après un marquage PAS qui met en évidence les cellules caliciformes (responsables de la production de mucus) je n'observe pas de variation quantitative ni de délocalisation de ces cellules le long de l'axe crypto-villositaire (ainsi que cela a été décrit pour l'invalidation de mTOR, par exemple (Zhou et al. , 2015). Ceci suggère que les CBC et progéniteurs cessent de proliférer, sans différenciation massive (Figure 4 et 4 supplémentaire). Par coloration HE et marquage des lysozymes, je n'observe pas non plus de disparition des cellules de Paneth (Figure 4. B et 5). Ceci est concordant avec le fait qu'elles n'expriment pas RPAP3 et que ce sont des cellules qui se divisent rarement (elles sont KI67 négatives). Les cellules de Paneth étant intactes, on peut supposer qu'elles sécrètent toujours le ligand Wnt3 nécessaire au maintien des cellules souches. Dans ce cas, les CBC semblent y être insensibles car les cryptes disparaissent. La question que nous posons ici est donc le rôle de RPAP3 dans le maintien des CBC. RPAP3, un facteur essentiel au maintien des cellules souches de type CBC ? Pour vérifier cela, nous allons réaliser des immuno-marquages avec un anticorps anti- OLFM4, un marqueur spécifique des cellules CBC. Grâce à cette expérience, nous pourrons voir si la délétion de RPAP3 impacte la survie des cellules souches CBC. En parallèle, j'ai également construit une lignée murine o je peux invalider, de façon inductible, RPAP3 uniquement dans les cellules CBC. Pour ce faire, j'ai utilisé une lignée Knock in o la construction polycistronique GFP IRES -CreERT2 a été introduite en fusion avec la séquence de Lgr5 : dans ces souris, les cellules CBC Lgr5 expriment donc la GFP ainsi que la Cre inductible (Barker et al. , 2007). Cependant, cette Cre est peu pénétrante, dû à son expression mosaïque. L'invalidation de RPAP3 dans les souris Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2 ; RPAP3flox/flox ne conduit pas à une altération globale de l'épithélium intestinal, même après 11 jours. Je vais procéder à un marquage GFP pour voir si dans les souris Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2 ; RPAP3flox/flox , le nombre de cryptes avec des cellules GFP est modifié par rapport aux contrôles Lgr5 GFP-CreERT2 ; RPAP3 / . 99 b) RPAP3 et la tumorigenèse RPAP3 est nécessaire au maintien de la prolifération. Notre hypothèse est que si RPAP3 est surexprimé dans les tumeurs colorectales, peut-être que son rôle est de soutenir la prolifération et la croissance tumorale, comme il le fait pour le TA et les cellules souches. Du fait de la létalité engendrée par la délétion homozygote de RPAP3, nous avons pris le parti d'utiliser des souris hétérozygotes. L'invalidation d'une copie du gèneRPAP3 en contexte de tumorigenèse pourrait être un moyen de mimer l'action de drogues, qui diminuent l'activité de leur cible sans l'abolir complètement. Pour l'étude du rôle de RPAP3 dans la tumorigenèse, j'ai utilisé deux modèles différents : - 1) un modèle génétique o l'invalidation d'une copie du gène APC induit des tumeurs intestinales et coliques, - 2) un modèle chimique AOM/DSS qui reproduit les différentes étapes de carcinogénèse colorectale chez l'homme. Ce dernier engendre des adénomes exclusivement dans le côlon. Résultats préliminaires de la délétion de RPAP3 dans le modèle d'induction génétique Nous avons utilisé un modèle pour invalider simultanément une copie de RPAP3 et APC dans l'épithélium intestinal quand les animaux atteignent 8 semaines. La délétion de l'exon 14 d'un allèle APC permet son inactivation, et cela est suffisant pour favoriser l'apparition d'adénomes par dérégulation de la voie Wnt (Colnot et al. , 2004). Les animaux d'intérêtVilCreERT2 ; RPAP3flox/ ; APCflox/ sont comparés à des contrôlesVilCreERT2 ; RPAP3 / ; APCflox/ . Les animaux subissent le même protocole que pour les expériences sur l'homéostasie (2 injections consécutives de 2mg de tamoxifène). Pour l'analyse des tissus, nous regardons 12 semaines après l'induction. Nos premiers résultats révèlent de grandes disparités au sein de chaque cohorte (variations interindividuelles), ainsi que d'une expérience à l'autre, ce qui complique l'analyse. Les croisements mis en place nous ont donné plus d'animaux d'intérêt que d'animaux contrôles, nous avons donc relancé de nouveaux croisements pour comparer l'effet d'une délétion de RPAP3 dans des fratries. Cependant quelques différences entre les génotypes apparaissent. La perte d'un allèle de RPAP3semble favoriser l'apparition d'adénomes chez la souris. Nous avons choisi dans un premier temps de diviser nos observations en 3 groupes : - quand la dysplasie est inférieure à 1% de la surface totale de la section (cas 1), - quand elle est comprise entre 1 et 5 % (cas 2), - quand elle est supérieure à 5% (cas 3). 100 La première observation est que ces dysplasies les plus importantes (>5%) sont observées uniquement dans le côlon, et présentent une perte totale de la structure épithéliale (caractérisée notamment par une absence de cellules caliciformes) suggérant une différentiation carcinogène. Nous avons constaté plus de petites dysplasies chez les animaux ne comportant qu'une copie de RPAP3mais, proportionnellement, moins d'adénomes de taille moyenne correspondant au cas n2 sur la Figure 6 du manuscrit. Ces premières expériences semblent indiquer que RPAP3 jouerait freinerait l'apparition des tumeurs, mais soutiendrait leur croissance : la délétion dune copie de RPAP3 semblerait ralentir la propagation des petits adénomes en adénomes de taille moyenne. Dans le côlon, on observe peu d'adénomes : il semblerait que dans ce tissu les lésions progressent presque systématiquement en carcinomes. La faible fréquence de cet évènement nécessite que nous collections des données sur de plus grandes cohortes pour pouvoir les interpréter. Rôle de RPAP3 dans la tumorigenèse colique induite par traitement chimique En parallèle, j'ai utilisé un protocole d'induction chimique AOM/DSS bien établi et utilisé par nos collaborateurs (Rocha et al. , 2014). Nous avons utilisé un groupe contrôle, vil-Cre-ERT2 ; RPAP3 / ; et un groupe d'intérêt, vil-Cre-ERT2 ; RPAP3 flox/ . Comme pour les expériences précédentes, les animaux sont âgés d'au moins 8 semaines lors de l'invalidation au tamoxifène. Une semaine après l'invalidation, nous débutons le protocole d'AOM/DSS (voir introduction). Les tissus sont prélevés 65 jours après le début du protocole. Les analyses sont en cours, mais nos données préliminaires semblent rejoindre celles des expériences avec le modèle génétique précédent. Avec ce protocole, tous les animaux présentent un épithélium colique altéré par de l'hyperplasie, de la dysplasie, de la perte de cryptes et des infiltrats immunitaires. Dans un premier temps, j'ai analysé quantifié ces paramètres dans une expérience (n 7 pour chaque groupe, lors de cette expérience). Dans cette expérience, les différences entre les groupes sont faibles mais il apparat que le groupe ne comportant qu'une seule copie de RPAP3 présenterait plus de dysplasie (Figure 7). Nous allons reprendre ces analyses avec l'aide d'anatomo-pathologistes pour caractériser précisément les différents types de lésion observés. 101 Invalidation of RPAP3 in mouse intestine reveal an crucial role for R2TP in homeostasis of the intestinal epithlium authors : Chloé Maurizy F. Gerbe, D. Helmlinger, P. Jay, C. Paul, E. Bertrand, M. Hahne (order to be determined) Bérengère Pradet-Balade key words : RPAP3, R2TP, HSP90, CBC, intestine the roleof R2TP Abstract : HSP90 is a chaperone with many substrates, targeted via different adaptors called co-chaperones . Recent discovery of R2TP, an HSP90 cochaperone, allowed the identification of new HSP90 substrates, which include : snoRNPs, telomerase RNP, the nuclear RNA polymerases and PIKKs. All these substrates play key functions in cellular proliferation and tumorigenesis. R2TP is formed of four proteins : RUVBL1, RUVBL2, PIH1D1 and RPAP3, some of which are overexpressed in hepatocellular and colorectal cancer. To address in colon homeostasis andtumorigenesis, we generated a conditional knockout murine model for RPAP3. The invalidation of RPAP3 in adult intestine, using an inducible recombinase (vilCreERT2 ; RPAP3fl/fl), leads to a drastic destruction of the epithelium 8 days post-induction, resulting in death after 10 days. We observe a proliferative defect inCrypt Base Columnar stem cells(CBC cells) and in the Transient Amplifying compartment, while Paneth cells are not affected. This phenotype is very similar to that described for the Wnt pathway, which is crucial for intestinal stem cell maintenance. We are now testing the role of R2TP on the Wnt pathway. In parallel, we address the possibility of a therapeutic window to target RPAP3 during intestinal tumorigenesis. For this, we use heterozygous animals (vilCreERT2 ; RPAP3fl/ ) in which tumorigenesisis induced either (i) by a chemical treatment, taking advantage of the well- established AOM/DSS protocol, or (ii) by a genetic model, removing a copy of APC (vilCreERT2 ; RPAP3fl/ ; APCfl/ ). These ongoing experiments will address the role of R2TP in intestinal CBC and its relevance in tumorigenesis. Acknowledgements : people and facilities : RAM, RHEM, fundings : la Ligue Nationale Contre le Cancer (EB, CM), INCA (EB, MH, BPB) materials/strains : S. Robine (VCT), S. Colnot (APC), Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2 102 Invalidation of RPAP3 in mouse intestine reveal an unexpected role for R2TP in homeostasis of the intestinal epithelium Introduction : The R2TP complex was first discovered in S. cerevisiae where it was shown to be an HSP90 co-chaperone [1]. HSP90 is responsible for the folding of a many proteins into their native, active state. Substrate recognition is mediated by a range of adaptors called co- chaperones , with each adaptor recruiting a range of substrates [2]. R2TP is an unusual HSP90 co-chaperone, since it is specialized in quaternary protein folding, i. e. it enables the incorporation of substrates into their final, active complex. For instance, R2TP folds the newly synthesized Rpb1 (RNA Polymerase II largest subunit), so that it can recognize its partners to ultimately build an active RNA Pol II [3]. The list of identified substrates (also called clients ) of R2TP is still growing, with some cellular machines particularly important for cell growth. The first and best-documented R2TP clients are the small nucleolar ribo-nucleo-particles (snoRNPs), which are required for the maturation of ribosomal RNAs [4-6]. Later on, other substrates have been described, including the U4 and U5 spliceosomal snRNAs [7, 8], the nuclear RNA polymerases [3, 9], and the family of PI3K-like kinases (PIKKs), which comprises mTOR, DNA-PK, ATR, ATM, and TRRAP [10]. Given the role of all these clients in cell growth and proliferation, it was hypothesized that R2TP mediates part of the pro-tumoural effects elicited by HSP90 [6, 11]. Newly identified clients involved in DNA damage response corroborate this possibility [12]. Yet, despite its potential role to coordinate cellular functions during cell growth and proliferation, no animal models has yet addressed the specific role of R2TP in tissue function. In humans, R2TP associates with additional factors to form the R2TP/Prefoldin-like complex, but little is known about the function of these prefoldins [9]. The R2TP core is composed of four subunits : PIH1D1 (also called Nop17), RPAP3 (Spag), and RUVBL1 and RUVBL2 (also called Pontin and Reptin), known to heterodimerize. Unlike PiH1D1 and RPAP3, which are specific to R2TP, RUVBL1 and RUVBL2 are part of numerous complexes [13]. RPAP3 directly binds HSP90 and forms a stable heterodimer with PIH1D1, while RUVBL1 and RUVBL2 are two AAA ATPases that form hetero-hexameric and dodecameric structures. The analysis of snoRNP biogenesis suggests that R2TP functions in a stepwise process where HSP90 stabilizes clients before their assembly, followed by the recruitment of additional snoRNP components by R2TP, and ending in the loading of RUVBL1/2 on the client complex [14]. Remarkably, the precise molecular role of RUVBL1 and RUVBL2 still remains elusive, even though these are essential enzymes. 103 Most of our knowledge about R2TP comes from studies in S. cerevisiae and mammalian cell lines. Up to now, few studies investigated the role of R2TP in organism or tissue function. In S. cerevisiae, deletion of either Pih1 or Tah1 (homologs of Pih1D1 or RPAP3, respectively) is viable : Pih1 is sick under normal growth conditions, while the role of Tah1 (the homolog of RPAP3) seems restricted to stress conditions [15]. We found that knock-down of Spaghetti, the homolog of RPAP3, in Drosophila, is lethal at early stages but induces no visible phenotype in tissues [16]. Overall, these data suggest an important role for RPAP3 under stress conditions. In addition, elevated transcript [17] and protein levels (our unpublished data) in colorectal cancer (CRC) samples suggest an involvement for R2TP in colorectal cancer. In this paper, we characterize the role of RPAP3 in the physiology of the murine intestinal epithelium. For this we generated murine lines in which RPAP3 can be selectively invalidated in the intestinal epithelium (VilCreERT2 ; RPAP3flox/flox mice). Strikingly, our data show that RPAP3 is necessary to maintain intestinal epithelium integrity. The phenotype we observe in VilCreERT2 ; RPAP3flox/flox mice is very similar to that observed upon Wnt pathway inactivation or BRG1 depletion [18]. BRG1 is a central component of a co-activator complex necessary for the Wnt pathway in intestinal epithelium. We hypothesize that BRG1might be a substrate of R2TP. In addition, we analyze the effect of RPAP3 heterozygous deletion in two models of CRC, to test the possibility of a therapeutic window to target RPAP3. 104 Results & Discussion RPAP3, R2TP and the homeostatic epithelium According to Potein ATLAs database, RPAP3 was expected to be expressed ubiquituously and uniformly in most human tissues ( This was also the case for Pih1D1 ( Western blot analysis of murine tissues confirmed a broad expression of RPAP3 in nearly every tissue tested, such as liver, thymus, ovary. To gain insight into the physiological role of RPAP3 in mammals, we decided to focus on intestinal epithelium because (a) intestinal epithelium represent a chronological view of stem cells cycling to replenish the differentiated cells ; (b) published data suggested an role for RPAP3 in colorectal cancer [17]. Immunostaining of the murine intestinal tract (Figure 1B) against RPAP3 and Ki67 showed a nearly complete co-staining in the Columnar Basal Cells (the active stem cell of the epithelium) located in the base of the crypts, as well as in the upper part of the crypt, the Transitory Amplification compartment, which represents cycling progenitors before they differentiate and migrate to the top of the villus (Fig. 1B). In contrast, adjacent Paneth cells (recognized by their typical punctuated cytoplasmic staining), which provide a niche for the CBC, were not stained for RPAP3. Furthermore, cells from the mesenchyme were highly RPAP3-positive. Specificity of the RPAP3-staining was verified using epithelial from KO animals (see below). This restricted expression pattern suggested that RPAP3 plays a key role in the renewal of the intestinal epithelium. To address the role of RPAP3 in the turnover of intestinal epithelium, we took advantage of Embryonic Stem cells (ES cells) generated by the KOMP consortium. Site-specific and unique recombination at the RPAP3 locus in the ES cell line was verified by Southern blot (Figure 2A supp) in KOMP ES Cells H10 - but not clone H11 (Supp. Figure 2A). These ES cells were injected into blastocysts, yielding 8 chimerae, 3 of which transmitted the RPAP3wtsi allele (Fig1 A). Genotyping was performed by PCR amplification using primers F5, R5, of the mouse tail genomic DNA (gDNA - Figure Supplemental 2B). In the RPAP3wtsi recombinant allele designed by the KOMP consortium, a strong splice acceptor site is introduced before exon 7. The resulting mRNA encodes a RPAP3wtsi protein with a truncation after the first TPR domain (figure 2B). Interbreeding of RPAPwtsi/ animals did not yield any homozygous RPAP3wtsi/wtsianimal, supporting the idea that the truncated protein is hypomorph, thus leading to homozygous lethality (Figure 2C). To generate a conditional knock-out mutant, we crossed the RPAP3wtsi/ mice with mice carrying a transgene encoding the Flipase gene (Flpo) [20]. In the progeny, excision of the Flp-in cassette generated an RPAP3 allele with the exon 7 flanked by loxP sites (Figure 2A). RPAP3floxencodes a protein identical to the wild-type RPAP3 and indeed, there was neither bias in transmission nor any obvious phenotype in RPAP3flox/floxmice. Excision of exon 7 by the Cre 105 induces a frame shift with a premature termination codon (PTC). Such mRNA is expected to a target for degradation by the nonsense-mediated decay (NMD) surveillance pathway. To delete exon 7 in the intestinal epithelium, we crossed RPAP3flox/ mice with ones carrying a constitutive Cre under the control of the villin promoter : VilCre[21]. This driver has been abundantly described : Cre is constitutively expressed in the small and large intestine. Yet, again, we were unable to obtain homozygous VilCre RPAP3flox/flox animals, suggesting that (i) RPAP37 indeed generates a non-functional mutant ; (ii) intestinal expression of RPAP3 at the early stage of development is necessary (Figure 2C). To bypass this problem, we used a tamoxifen inducible Cre under the control of the villine promoter (VilCreERT2) : tamoxifen triggers the nuclear translocation of this Cre fused to estrogen receptor (ER), hence allowing the recombination of floxed genes [21]. We obtained numerous animals homozygous for the RPAP3 floxed allele with the inducible Cre, with a good transmission of the transgene (VilCreERT2 ; RPAP3flox/flox)(Figure 2C). Intra-peritoneal injection of tamoxifen yielded an efficient recombination of the RPAP3flallele in the intestinal epithelium as soon as one day after the first injection, as detected by PCR amplification of genomic DNA from purified epithelial intestinal cells (Supp. Figure 2). Nevertheless, in all further experiments, we injected mice (animals of interest as well as controls) with one dose of tamoxifen at day 0 and day 1, successively to ensure penetrant recombination (cf. scheme on Figure 3). To verify the role of RPAP3 in murine intestine, we injected tamoxifen intraperitoneally of VilCreERT2 ; RPAP3flox/floxand RPAP3flox/floxlittermates, as controls (Figure 3A). Animal behaviour and weight was monitored daily. While VilCreERT2 RPAP3flox/flox mice showed no sign of alteration during the first 6 days, there was a dramatic weight loss from day 7 on, so that we had to sacrifice most females at day 8 and males at day 10 (Figure 3 SB). In both cohorts, we observed a massive swelling of the small intestine in VilCreERT2 RPAP3flox/flox, filled with liquid at day8 or even blood at day 10 (Figure Supp. 3C). Besides, small intestines from VilCreERT2 RPAP3fox/flox animals were shorter than that of the control RPAP3flox/flox (which received the same tamoxifen injection), while colons were similar (Figure S3B). Hematoxylin and Eosin (HE) staining of the small intestine at day 8 and day 10 revealed similar profiles : a completely degraded epithelium, a loss of crypts and villi axis, disappearance of crypts and Paneth cells (recognizable by a characteristic pink dots in their cytoplasm, see Figure 3B, magenta arrows on Day17 RPAP3flox/flox controls). Some characteristic circular, dark crypt-like structures devoid of Paneth cells were detected (see black arrow on Fig. 3B, Day8 VilCreERT2 RPAP3fox/flox). In addition, the proximal colons from the same animals were also affected, albeit to a much lesser extent, with mostly enlarged Goblet cells, visible throughout the crypts (Figure S3 C). Collectively, these data show that RPAP3 is necessary to maintain the integrity of the intestinal epithelium. 106 Interestingly, the animals with a higher weight appeared to recover after day 10 and were analysed at day 17, when they did not show any sign of suffering. HE staining showed restored tissues, with crypts and villi, yet with irregular morphology (Fig3 B), suggestive of hyperplasic regeneration of the intestinal epithelium. Interestingly, although the colons of VilCreERT2 ; RPAP3fox/flox mice seemed moderately affected, colons at day 17 clearly showed a hyperplasia with anarchical crypt organization and decreased number of Goblet cells. We are expecting PAS staining to verify this observation (Figure Supp. 3C). To characterize the consequences of RPAP3 deletion in the intestine, we performed a short-time kinetics. Two doses of tamoxifen were injected (as described above) to two-month old mice with the following genotypes : VilCreERT2 RPAP3flox/flox ; VilCreERT2 RPAP3flox/ or RPAP3flox/floxas controls. Mice were sacrificed every day after the first injection. Immuno- histological analysis was performed by Hematoxylin and eosin (HE), periodic acid Schiff (PAS) and Ki67 staining of the three parts of the intestine and the colon. Colon from all animals looked similar, regardless of their genotype, from day 1 to day 6 (data not shown). In contrast, the small intestine from VilCreERT2 ; RPAP3flox/flox mice showed a complete disruption of the villi at day 8, with altered crypts and the occurrence of closed, circular crypts (Figure 3B, C and supplemental Fig. 3). This effect was most pronounced in the jejunum (I2), but was also visible in the duodenum (I1) and ileum (I3) (data not shown). At day 7, the global architecture of the intestine was not altered but there was a complete loss of the Ki67 staining, in the crypts and the transitory amplifying compartment (TA) from VilCreERT2 RPAP3flox/flox animals. At day 6, the intestine structure was preserved and Ki67 staining was similar in VilCreERT2 ; RPAP3flox/floxand RPAP3flox/flox animals (Figure 4B). Examination of the crypts revealed a significant loss of the Ki67 cells (corresponding to Columnar Basal Cells) at day 7 - except in the circular, irregular crypts (black arrow, see below). There was no disappearance of the Paneth cells, as observed by HE and PAS staining (figure 3C), as well as by detection of lysozyme, a specific marker of Paneth cells (Fig. 5). Collectively, these results suggest that RPAP3 is essential for the maintenance of the proliferative cells in the crypts and the TA. This is coherent with its pattern of expression (Figure 1B). Loss of the proliferative cells rapidly results in a degradation of the epithelium of the villi, inability to absorb liquids and swelling of the intestine, explaining the strong phenotype observed in previous experiment. Of note, at day 8, the intestine of the VilCreERT2 RPAP3flox/ was very similar to that of the control RPAP3flox/flox (supplemental Figure 3), suggesting that under normal conditions, one copy of RPAP3 is sufficient and necessary to ensure the regeneration of the intestinal epithelium. The phenotype observed suggested a crucial role for RPAP3 in the maintenance of the survival of the CBC stem cells. To check this, we will perform staining for Olfm4, a marker specific for the CBC in VilCreERT2 RPAP3flox/flox. This phenotype is very reminiscent of the 107 phenotype described for the KO of TCF4[22]. TCF4 is a critical effector of the Wnt pathway, which is essential for the maintenance of the CBC and the TA. We will also check if the Wnt pathway is affected in the epithelial VilCreERT2 ; RPAP3flox/flox cells by qPCR. (Figure 4 A). In addition, we generated Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2 RPAP3flox/flox animals in which the inducible Cre is under the control of the Lgr5 promoter, and, as such, expressed only in CBC[23]. This driver has mosaic expression and HE staining of intestine did not show any gross alteration. We will perform GFP staining to see if there is a quantitative disappearance of the CBC and Wnt pathway target genes. Up to now, neither RPAP3 nor R2TP have been associated with Wnt pathway activation. To address this question, we will take advantage of the widely used TOP/FOP functional test of Wnt pathway activity. Briefly, Wnt ligands induce a stabilization and translation of the b-catenin into the nucleus, where it activates the transcription of target genes. In the TOP system, GFP is under the control of a b-catenin responsive promoter. A similar construct, with defective mutations (FOP) is used to monitor background transcription of the GFP reporter [24]. RPAP3 and R2TP have a growing body of substrates. R2TP interacts with several subunits from transcriptional co-activators. This is notably the case for BRG1/SMARCA4 ([25] and our unpublished data), which is a component of the BAF transcriptional co-activator from the SWI/SNF family. BRG1 interaction with TCF4 is required for the transcriptional induction of Wnt target genes [18]. We will verify that RPAP3 does indeed interact with BRG1. We will also test functionally, using in an in vitro cellular system, whether R2TP assists BRG1-containg complex assembly. RPAP3 and colorectal tumorigenesis Activation of the Wnt pathway is central to colorectal tumorigenesis [26], as removal of one copy of the APC gene, which puts a brake on the Wnt pathway, is sufficient to induce colorectal tumorigenesis. Given the role of RPAP3 on this pathway and, more generally, in cell proliferation, we sought to analyze the role of RPAP3 on colorectal tumorigenesis. We reasoned that there could be a therapeutic window to target RPAP3 during CRC by removing one gene copy. We decided to test this hypothesis using two different well-established models of colorectal tumorigenesis : - (1) a genetic model of APC deletion, - (2) a chemical induction model, i. e. the colitis-associated carcinogenesis (CAC) in which mice are subjected to an injection of azoxymethane (AOM), a potent mutagen, followed by three rounds of dextran-sulphate sodium (DSS) administration in drinking water (Fig 7) [27]. DSS induces inflammation specifically in the colon, so that this protocol mimics the natural situation, where colorectal tumorigenesis is supported by colon inflammation. 108 In the first model, VilCreERT2 RPAP3flox/ APC flox/ and controls VilCreERT2 RPAP3 / APC flox/ 2 month-old mice received two tamoxifen injections and were sacrificed 12 weeks after. Intestine and colon were removed, fixed and stained for HE. Dysplasia were monitored according to their surface, with small adenoma ( of total volume of the intestinal surface monitored) barely detectable, medium adenoma/dysplasia (1% total surface). Eventually, advanced tumours exceeding >5% of total surface tumours could be observed sporadically in some colons. There was a significant difference in the distribution of the different dysplasia observed in the animals (p yet the frequency of affected animals was about the same in the two groups, with a high inter-individual variation. In control animals, small and medium dysplasia mostly occurred in the duodenum (F 69 % of controls animals affected by 1 or more dysplasia in duodenum). About the same proportion of VilCreERT2 RPAP3flox/ APC flox/ animals showed dysplasia in the duodenum, yet the affected animals had more dysplasic lesions (N number of dysplasia in all animals/total number of animals*100, N 96 lesions in duodenum/ 100 controls vs. 144 in controls - see Figure 6B). This suggested that removal of one copy of RPAP3 supported the appearance of dysplasia. Accordingly, dysplasia were rarely observed in jejunum or ileum from control animals (F (I2) 15% - F (I3) 23%) but much more frequently in VilCreERT2 ; RPAP3flox/ ; APC flox/ animals (F (I2) 46% - F (I3) 36%). Interestingly, in duodenum and jejunum, the proportion between middle lesions (1% from total surface) to small dysplasia was much lower in the VilCreERT2 RPAP3flox/ APC flox/ (32% of all lesions are of middle size in small intestine from controls vs. 9%in VilCreERT2 RPAP3flox/ APC flox/ animals). This suggests that removal of one copy of RPAP3 would restrict the growth of the dysplasia. In the colon, dysplasia occurred more rarely and consisted of advanced tumours. We classified tumors according to size, i. e. Only one out of 13 controls displayed two huge tumours, one a middle one (n 15% of population affected), while 7 out of 37 animals of interest showed such huge tumours (n 20% of the population). The distribution between the different dysplasia observed in colons is statistically different (p with again smaller dysplasia in animals lacking one copy of RPAP3 than in the controls. Due to the relative low number of control mice available it is difficult to draw at present a conclusion for such a final conclusion. We are currently planning complementary experiments to substantiate these observations. In parallel, we subjected VilCreERT2 ; RPAP3flox/ and controls RPAP3flox/flox or VilCreERT2 ; RPAP3 / mice to the AOM/DSS protocol (Figure 7). This treatment induced exclusively lesions in the colon. In this case, we observed major hyperplasia of the epithelium, probably as a response to epithelium inflammation induced by DSS, with some dysplasic area, in all animals, regardless of their genotype. The observed dysplasia appeared to be less aggressive than the one observed 109 by APC allele removal (though animals were observed 19 days latter after the beginning of RPAP3 deletion). We scored the relative area of hyperplasia, crypt loss, infiltration and dysplasia in the colonic sections. Figure 7 shows results from one experiment (n 7 VilCreERT2 ; RPAP3flox/ vs. n 8 control animals). In this experiment, there does not seem to be any major differences between both mouse cohorts. We are presently analysing additional data (with in total n 42 VilCreERT2 ; RPAP3flox/ vs. 46 control mice). In conclusion, at present it appears that removal of one copy of RPAP3 favors the appearance on adenoma, on the other, it restricts their proliferation. Colorectal tumorigenesis is the serial accumulation of mutations, which affect primarily the APC and/or the Wnt pathway and is then followed by additional mutations [28]. In our setting, we only remove one copy of RPAP3 because the homozygous KO is lethal. Under these conditions, RPAP3 seems to have little effect on Wnt activation. However, R2TP is known to stabilize ATR, ATM and DNAPK, involved in the response to DNA damage [29]. We speculate that RPAP3 removal might diminish active ATM, ATR and DNAPKcs, and thereby favor the accumulation of mutations leading to the occurrence of adenoma. To test this, we plan to stain the intestinal sections for gH2AX, a marker of DNA damage, to see if we detect increased signals upon RPAP3 removal. In contrast, it seems that the adenoma have a more limited spread, as measured by surface occupancy. It is tempting to speculate that this results from a decreased metabolism of the tumor, if there is less mTOR, ribosomal activity and transcription. Materiel & methods Mice generation and treatments Mouse experiments were performed in strict accordance with the guidelines of the European Community (86/609/EEC) and the French National Committee (87/848) for care and use of laboratory animals. RPAP3wtsi/ mice were generated from ES cells obtained from KOMP, as described in the paper. Mice were bred in an SOPF animal facility and maintained during the experiment in an SPF animal facility. Naive mice were minimum 6 weeks old and are euthanized by CO2 and isofloran. To activate the CreERT2, controls and animals of interest received two intra-peritoneal (IP) injection of 2mg tamoxifen each. The entire small intestine (cut in 3 parts) and colon were flushed with PBS, then with neutral buffered formalin (4% formaldehyde) and fix in 24h, dehydrated, and embedded in paraffin. For colitis-associated carcinogenesis mice were treated as described previously (Rocha et al EMBO). In brief, mice were intraperitoneally injected with azoxymethane (AOM), followed by three cycles of 2. 5% (w/v) dextrane sodium sulphate (DSS) administered in the drinking water (Figure 1A). In between the cycles the mice received no treatment for 2 weeks. 110 Histology and immunostainings For histological analysis, tissue sections (4 m thick) were deparaffinised and rehydrated. They were stained with Hematoxylin and Eosin (HE), Alcian blue and Periodic Acid Shiff staining (PAS) for preliminary analysis. For immunostainings, tissue sections were deparaffinised, rehydrated and subsequently subjected to heat induced antigen retrieval by immersing them, depending on the antibody, either in a water bath with a sodium citrate buffer (pH 6) or an EDTA buffer (pH 9). Immunohistochemistry was performed using a Dako autostainer (Dako, Glostrup, Denmark). After neutralization of the endogenous peroxidase activity, the sections were incubated with the following primary antibodies : polyclonal anti Ki67 antibody (clone SP6, Spring Biosciences, M3064), polyclonal anti cleaved caspase-3 antibody (clone Asp175, Cell Signalling ; 9661). They were respectively used at 1 : 100 and 1 : 2000 dilutions with an incubation time of 30 min. Antibody was visualized using the Envision system (Dako). Diaminobenzidine (Dako) was used as the chromogen and the sections were lightly counter-stained with Hematoxylin. All slides and immunostainings were prepared by RHEM platform and visualized with a NanoZoomerslide scanner controlled by the NDP. view software (MRI platform). Others immunostaining : the intestine sections were deparaffinised, rehydrated and heat in water bath with a sodium citrate buffer (pH6). They were blocked 20 min with a blocking solution (TBS 1X, 2% serum of secondary antibody specie, 0, 1 % Triton). They were incubate with primary antibody (anti-RPAP3 : clone 19B11 1/50 ; and anti-Ki67 (ab16667 ; AbCam). Slides were washed twice times with 0. 1% PBS-Tween before incubation with fluorescent secondary antibodies conjugated with either Alexa 488, cyanin-3, or cyanin-5, and Hoechst at 2 g ml1 in PBSTriton X-100 0. 1%. For revelation, we used Tyramide Signal Amplification kit (TSA). Histological grading of AOM/DSS-induced tumors was determined with blinded genotype according to the described classification of intestinal neoplasia (Washington et al. , 2013). Antibodies, cells and plasmids RPAP3 was detected by a murine monoclonal antibody developed by the lab. (19B11) Isolation of epithelial cells from intestine and colon. Intestine and colon were isolated and flushed with cold PBS. Colon and the 3 intestine fragments were cut open length-wise, then kept in 10 ml cold wash buffer (PBS, 2% FBS and antibiotics). Tubes were shaked several times by hand to wash the fragments and put into 15 ml falcon tube containing 10 ml CE buffer (PBS, 1% BSA, 1mM DTT, 1mM EDTA, 5, 6 mM glucose). Tubes were placed on a vertical shaker at 37C for 30 min. After removing tissue, cells were collected by centrifugation at 1410 rpm for 7 min. They were washed by 10ml wash buffer. Collected cells were split in different tubes depend of the use. 111 DNA extraction. Samples are incubated in 200 l of lysis buffer (KCl 0, 5M ; TRIS pH8 5mM ; Gelatin 5mg/ml : NP40 at 0, 45% ; Tween 20 0, 45 %) with 4 l of Proteinase K at 55C overnight. Proteinase K was inactivated 5min at 95C. 1 l was used for PCR. Primer genotyping Name F5 R5 R6 CREERT2-F CREERT2-R Sequence GGTGCCACAGTGTGAGTG TGCCTCCTGACTCACTACAG ACCGTGTCGCTACGTCACTGCG TTACGGCGCTAAGGATGACT AAGGCCAGGCTGTTCTTCTT ACKNOWLEDGMENTS We thank Francisca Z. from Pasteur facility for generation of chimera. We thank people from the animal facilities and organizing committees in Montpellier (RAM) who supported the breeding of these mice. We do not thank Charles River for animal house contamination and total absence of consideration for the time, money and energy wasted. We thank the Réseau d'Histologie Expérimentale de Montpellier (RHEM) facility and Montpellier RIO Imaging (MRI) for processing our animal tissues. We thank La Ligue Nationale contre le Cancer and INCa for funding. CM was funded by a grant for Ph. D. student from La Ligue Nationale Contre le Cancer. Research in the lab. of EB is funded by La Ligue Contre le Cancer. Research in the lab. of MH and BPB is funded by grants from INCa (#. ). 112 REFERENCES [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] R. Zhao, M. Davey, Y. -C. Hsu, P. Kaplanek, A. Tong, A. B. Parsons, et al. , Navigating the Chaperone Network : An Integrative Map of Physical and Genetic Interactions Mediated by the Hsp90 Chaperone, Cell. 120 (2005) 715727. doi : 10. 1016/j. cell. 2004. 12. 024. G. E. Karagz, S. G. D. Rdiger, Hsp90 interaction with clients, Trends Biochem. Sci. 40 (2015) 117125. doi : 10. 1016/j. tibs. 2014. 12. 002. S. Boulon, B. Pradet-Balade, C. Verheggen, D. Molle, S. Boireau, M. Georgieva, et al. , HSP90 and its R2TP/Prefoldin-like cochaperone are involved in the cytoplasmic assembly of RNA polymerase II, Mol. Cell. 39 (2010) 912924. doi : 10. 1016/j. molcel. 2010. 08. 023. R. Zhao, Y. Kakihara, A. 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(B) Mutant RPAP3 proteins encoded by the above-described alleles. (C) Viability and characteristics of the strains carrying the different RPAP3 alleles : O/E indicates the number of animals obtained (O) as compared to the animals expected (E) from several crosses. Figure Supplemental 2 : (A) Southern blot of genomic DNA shows a correct recombination of the wtsi construct at the RPAP3 locus in the H10 clone but not in the H11. (B) PCR on genomic DNA from intestinal epithelial cells shows that recombination occurs as soon as one day after tamoxifen injection to the VilCreERT2 ; RPAP3flox/flox mice, and persists for at least 4 days (amplification of a band corresponding to RPAP37). As a control, PCR on genomic DNA from RPAP3flox/flox mice intestinal epithelial cells amplifies a band corresponding to the floxed, unrecombined RPAP3 allele. Figure 3 : Invalidation of RPAP3 induces a quick destruction of the intestinal epithelium (A) Schematic representation of the experimental setting. (B) Hematoxylin and eosin staining (HE) of the jejunum shows epithelium degradation at day 8, and anarchical villi and crypts at day 17, in the survivors (see text). Intestinal epithelium from control RPAP3flox/floxmice showed no alteration, even at day 17 after the first tamoxifen injection. Pink arrows show Paneth cells and purple arrow, typical circular crypts observed at day 8. The scale is identical for all pictures, with bar representing 250 mm. Figure Supplemental 3 : Invalidation of RPAP3 induces a quick destruction of the intestinal epithelium, which compromises the survival of animals (A) Schematic representation of the experimental setting. (B) Evolution of relative body weight in females (left hand) and males (right hand) following tamoxifen injection. Length of the small intestine and colon from females 115 at day 8 or males at day 10. (C) Small intestine from VilCreERT2 ; RPAP3flox/flox animals is swelled with liquid (left panel, red arrow) or blood (central panel, red arrow), while that of control RPAP3flox/flox animals is filled with food (right panel, blue arrow). (D) Hematoxylin and Eosine staining of the colon shows a mild phenotype at day 8 or 10 but an anarchical organization at day 17 (compare with that observed in control RPAP3flox/flox animals). The scale is identical for all pictures, with bar representing 250 mm. Figure 4 : Invalidation of RPAP3 compromises the CBC and TA cells. (A) Schematic representation of the experimental setting. (B) Hematoxylin and eosin (HE), periodic acid Schiff (PAS) and Ki67 staining of jejunum from VilCreERT2 ; RPAP3flox/floxshows that, at day 7, the Ki67 cells are absent from the crypts and the transient amplification compartment, leading to a degradation of the epithelium at day 8. RPAP3flox/floxmice are shown as controls. Scale is identical for all pictures, with bar representing 100 mm. (C) Insets of crypts show specific disappearance of Ki67 staining in the crypts, but not of Paneth cells (pink arrows). Circular crypts visible at day 8 (purple arrow) are highly Ki67 . Scale is identical for all pictures, with bar representing 100 mm. Figure 4 supplemental : Invalidation of RPAP3 compromises the CBC and TA cells. (A) Schematic representation of the experimental setting. (B) Wider field view from Hematoxylin and eosin (HE), periodic acid Schiff (PAS) and Ki67 staining of jejunum from VilCreERT2 ; RPAP3flox/floxpresented in Figure 4 (B). Circular crypts visible at day 8 (purple arrow) are highly Ki67 . Scale is identical for all pictures, with bar representing 250 mm. Figure 5 : Invalidation of RPAP3 does not affect Paneth cells nor b-catenin staining (A) Lysozyme staining (typical for Paneth cells) in jejunum remains at the bottom of the crypts at day 6 and day 8 after tamoxifen injection to VilCreERT2 ; RPAP3flox/flox or controlRPAP3flox/flox mice. Scale is identical for all pictures, with bar representing 100 mm. (B) b-catenin staining is still detectable in the crypts and epithelium from VilCreERT2 ; RPAP3flox/floxmice jejunum, 6 and 8 days after the first tamoxifen injection. Scale is identical for all pictures, with bar representing 100 mm. Figure 6 : RPAP3 prevents intestinal tumorigenesis by genetic induction (A) Schematic representation of the experimental setting. (B) Repartition of the different dysplasia types (according to their size, relative to the analysed surface) is significatively different in controls and VilCreERT2 APC flox/ RPAP3flox/flox mice, with a much higher incidence of small lesions but less dysplasia of middle size upon removal of one copy of RPAP3. (C) Hematoxylin and eosin staining 116 of whole duodenum show multiple adenomas of small (surface of total - black arrows) and middle size (surface of total - pink arrows). Bar is 5 mm. Inset magnification shows a typical small adenoma (surface total). Bar is 200 mm. (D) HE and PAS staining of whole colon show typical unique, large dysplasia of advanced grade (surface >5% of total - empty arrows). Bar is 2, 5 mm. Figure 7RPAP3 prevents intestinal tumorigenesis by AOM/DSS induction (A) Schematic representation of the experimental setting. (B) Mean repartition of the different aspects of the colonic epithelium after chemical induction of tumorigenesis. (C) Relative body weight varied similarly in controls and VilCreERT2 ; RPAP3flox/flox animals during the experiment (right hand : red line VilCreERT2 ; RPAP3flox/flox, blue line control animals, which were eitherVilCreERT ; RPAP3flox/ or RPAP3flox/flox). (C) Hematoxylin and eosin staining of whole duodenum shows hyperplasia and dysplasia. Bar is 5 mm. Insets show HE, PAS and Ki67 staining of the indicated region, with hyperplasia (black arrow) and dysplasia (purple arrow). All three insets have the same scale, with bar representing 1mm. 117 Figure 1A chaperone R2TP HSP90 RPAP3 Pih1D1 Rvb1 Rvb2 substrates speci c function in intestine RiboNucleoParticles snoRNPs telomerase RNP stem cell proliferation snRNPU4, U5 RNA Polymerases I, II , III PIKKs mTOR SMG1 ATM, ATR, DNA-PKcs TRRAP intestinal regeneration DNA damage response B Intestinal crypt RPAP3 (19B11) Ki67 Hoeschst TA (Ki67 ) CBC (Ki67 ) Paneth cells (Ki67-) R P A P 3 H o e . i K 6 7 H o e . Figure 2 A RPAP3wtsi F5 R5 R6 LoxP 8 9 1 2 3 4 5 6 FRT selection cassette FRT LoxP 7 pA Flpase RPAP3 ! ox F5 R5 R6 1 2 3 4 5 6 FRT LoxP 7 LoxP 8 9 RPAP37 Cre F5 R6 1 2 3 4 5 6 FRT LoxP 8 9 B RPAP3 ox -> RPAP3wt RPAP3wtsi -> RPAP3wtsi RPAP37 -> unstable TPR-1 TPR-2 TPR-1 RPAP3-C mRNA no protein C Figure Supplemental 3 A Tamoxifen mice analysis Day 0 1 3 8 10 17 B Females Relative weight loss 120 120 110 110 100 90 80 70 i t h g e w 0 y a D % i t h g e w 0 y a D % Day 0 3 6 7 8 9 10 11 14 16 17 ) m c ( h t g n e l ) m c ( h t g n e l D8 D10 40 30 20 10 0 40 30 20 10 0 small intestine colon Males 120 110 i t h g e w 0 y a D % Relative weight loss 100 90 80 70 Day 0 3 6 7 8 9 10 11 14 16 17 C VilCreERT2 RPAP3 ox/ ox RPAP3 ox/ ox (Day 8-10 post-IP) (Day10 post-IP) D Day 8 VilCreERT2 RPAP3 / Day 10 Day 17 VilCreERT2 RPAP3 / RPAP3 ox/ ox Day 17 B. Mise en évidence d'un nouveau complexe tissu spécifique, le R2SP, apparenté au complexe R2TP 1. Introduction Le complexe R2TP est un co-chaperon moléculaire de la protéine HSP90 identifié en 2005(Zhao et al. , 2005). Ensemble, ils participent à l'assemblage de complexes macromoléculaires tels que l'ARN polymérase II, les snRNP U4 et U5, ou encore les snoRNP. Ce complexe est composé de 4 protéines : deux AAA ATPases, RUVBL1 et RUVBL2, et un hétérodimère formé de PIH1D1 et RPAP3. La protéine RPAP3 est composée de deux domaines TPR impliqués dans la liaison au chaperon HSP90(Back et al. , 2013 ; Pal et al. , 2014), et de domaines N-terminal et C-terminal : lorsque j'ai débuté ma thèse, les fonctionset les structures de ces deux domaines étaient inconnus aussi. PIH1D1 lie RPAP3 et RUVBL1/2 grâce à son domaine CS C-terminal(Hoej et al. , 2014). Son domaine N-terminal, appelé domaine PIH, est nécessaire au recrutement de certains substrats, notamment grâce à une poche de reconnaissance des phosphopeptides de type DSDD/E, comme c'est par exemple le cas pour TELO2 (l'adaptateur des PIKK). Les protéines RUVBL1 et 2 forment des hétéro-hexamères et des hétéro-dodécamères, et il semble que leur conformation ainsi que la liaison à leurs partenaires dépendent du nucléotide lié (ATP, ADP ou Apo). Ce sont cependant des protéines difficiles à manipuler in vitro. Ainsi leur structure reste controversée et leur fonction exacte est source de questions. Elles ne sont pas spécifiques du R2TP, car elles sont aussi présentes dans des complexes remodeleurs de la chromatine tels qu'INO80 ou SWR-C. Dans le génome humain, deux autres protéines possèdent un domaine annoté comme étant structurellement apparenté au domaine C-terminal de RPAP3 (RPAP3 C-ter like domaine) : SPAG1 (SPerm AntiGene 1) et CCDC103 (Coiled-Coil Domain Containing protein 103). De plus, SPAG1 comporte trois domaines TPR en aval de son domaine RPAP3-Cter like, cette organisation rappelle celle de RPAP3 (Figure 4A du papier joint). D'autre part, trois protéines humaines comportent un domaine PIH, en plus PIH1D1 lui-même : PIH1D2, PIH1D3 et DNAAF2/Kintoun. Chacune de ces protéines présente également un motif CS en C-terminal, selon une architecture qui ressemble beaucoup à celle de PIH1D1 (Figure 4A du manuscrit joint). Toutes ces protéines (à part PIH1D2 pour laquelle il n'existe pas de donnée publiée) sont impliquées dans des pathologies liées à un défaut de ciliogénèse, et plus particulièrement dans la formation des dynéines axonémales de cils motiles (Dong et al. , 2014 ; Knowles et al. , 2013 ; Omran et al. , 2008 ; Panizzi et al. , 2012 ; Tarkar et al. , 2013). Les dynéines sont de gros complexes protéiques contenant de nombreuses sous-unités. Les cils immobiles (cils primaires) 120 contiennent la dynéine 2 pour le transport rétrograde, tandis que les cils mobiles contiennent des dynéines spécifiques, appelées axonémales. Ces dynéines sont en général spécifiques de types cellulaires précis (comme les cellules de l'épithélium pulmonaire ou les spermatozoïdes), car elles déterminent les propriétés physiques des cils (vitesse de battements, onde du battement, etc. ). L'incorporation des dynéines nécessite des facteurs d'assemblage spécifiques (Omran et al. , 2008). Nous postulons que certains facteurs seraient organisés en complexes sur le modèle du R2TP : une protéine à domaine RPAP3-Cter like, une protéine PIH et les ATPases RUVBL1 et 2. Ces complexes assembleraient les dynéines dans le cytoplasme avant qu'elles ne migrent vers les cils, comme cela a été montré pour Kintoun/DNAAF2(Omran et al. , 2008) (Figure 23). 2. Résultats Mon travail a contribué à l'élaboration des figures : 2A, S2A, 3A, S3C, 4B, S4A-B, 5B, S5 et 6A du manuscrit suivant. Les figures 4B et S4A-B ont été réalisé avec Edouard Bertrand. Pour la figure 6A, j'ai réalisé les clonages nécessaires pour le crible double hybride. Le domaine C-terminal de RPAP3 sert au recrutement des RUVBL1/2 ainsi que de nombreux clients du R2TP Nous nous sommes intéressés au domaine C-terminal de RPAP3. La structure en trois dimensions de ce domaine a été résolue par la technique de RMN par nos collaborateurs de l'IMoPA à Nancy (Figure 1 et S1 du papier joint). En parallèle, avec l'aide de Céline Verheggen (chercheur dans notre équipe), j'ai réalisé des expériences de protéomique afin de déterminer les partenaires de ce domaine. Pour cela, j'ai d'abord construit des lignées de cellules HeLa exprimant de façon stable le domaine C-terminal de RPAP3 couplé à la GFP, grâce un vecteur d'expression pcDNA5-3xFlag-GFP-RPAP3cter . Ces lignées ont été générées selon la technique du Flp-in : nous disposons de lignées de cellules HeLa modifiées o les constructions sont intégrées de façon stable à un site de recombinaison génomique Flp Recombination Target (FRT) reconnu par la Flipase. Ainsi le vecteur d'expression est inséré au site FRT, la protéine est exprimée fusionnée à la GFP. Après sélection de clones stables, j'ai procédé à l'analyse des interactants de RPAP3-Cter par immunoprécipitation couplée à de la spectroscopie de masse quantitative de type SILAC. Cette méthode nous permet de comparer l'enrichissement des protéines, par rapport à une immunoprécipitation contrôle, réalisée sur des extraits ne contenant pas la protéine étiquetée. Pour chaque condition, nous utilisons un milieu de culture différent. La condition contrôle est la lignée cellulaire parentale, c'est-à-dire la lignée de cellules HeLa FRT. Cette condition est cultivée dans un milieu dit léger/light car les acides aminés 121 utilisés sont normaux. Les autres conditions sont appelées medium/ intermédiaire et heavy/lourd car les acides aminés utilisés sont marqués avec des isotopes non-radioactifs ( froids ) mais plus ou moins lourds, discriminés lors de l'analyse des peptides par le spectrophotomètre. Ici, la lignée RPAP3-Cter a été cultivée en milieu intermédiaire. Les chromatographies d'affinité de la GFP sont réalisées pour chaque condition séparément, puis regroupées enfin de protocole. Grâce aux différents marquages, on peut distinguer les protéines issues de chaque culture et calculer un ratio SILAC . Ce ratio SILAC correspond à l'enrichissement d'une protéine dans la condition medium, par exemple, rapporté à la condition contrôle : cela indique la spécificité de l'interaction d'une proie avec l'appât. L'autre paramètre que l'on prend en compte est l'abondance de la protéine enrichie (en fonction du nombre de peptides détectés). Si la protéine est très abondante, cela renforce la probabilité de l'interaction. Les résultats de la protéomique du domaine C-terminal de RPAP3 révèlent son aptitude à lier les protéines RUVBL1 et 2, mais aussi de nombreux clients du R2TP : la grande sous-unité de l'ARN polymérase II, SHQ1 et NOP58 impliqués dans l'assemblage des snoRNP H/ACA et C/D, respectivement (cf. introduction), PRPF8 qui fait partie de la particule snRNP U5. On trouve également des protéines qui sont très probablement des adaptateurs (C12ORF45, C2ORF44, ZNHIT2). Ces résultats SILAC suggèrent que l'une des fonctions de ce domaine RPAP3-Cter serait de permettre l'accrochage des RUVBL1/2 pour former le R2TP. Afin de confirmer cette hypothèse et de déterminer quelles protéines sont en interaction directe avec le RPAP3-Cter, j'ai réalisé un petit crible double-hybride en testant une série d'interactions deux à deux (Figure S2A du papier joint). J'ai pu montrer que seul RUVBL2 interagit avec RPAP3-Cter par cette technique. Nos collaborateurs ont ensuite réalisé des expériences de RMN et de BIACORE avec des protéines recombinantes pour tester la liaison des RUVBL1 et 2. Ces expériences montrent que le RPAP3-Cter lie directement RUVBL1 et 2 in vitro (Figure 2B et 2C du papier joint). Cette interaction n'a lieu qu'avec les protéines sous forme multimérique (données non montrées) et elle n'est pas influencée par la présence d'ATP (Table 1, Figure S2D). En parallèle, nous avons analysé la contribution de la liaison à l'ATP par une expérience d'IP LUMIER du domaine Cter contre 3 mutants connus des RUVBLs. Pour les IP LUMIER, nous utilisons des vecteurs d'expression o les protéines d'intérêt sont soit fusionnées avec la luciférase Firefly (FFL) portant une étiquette 3xFLAG (appât), soit fusionnées à la Renilla luciférase (RL) (proie). Ici, le RPAP3 Cter est fusionné à la 3xFLAG-FFL et les RUVBL à la RL. Nous effectuons ensuite une transfection transitoire avec les deux vecteurs dans des cellules HEK293, afin de sur-exprimer les protéines d'intérêt. 48h après la transfection, nous procédons à l'extraction des protéines et à une immunoprécipitation de l'étiquette FLAG. Cela nous permet de précipiter la protéine fusionnée à la FFL (ici le domaine RPAP3-Cter), ainsi que la protéine 122 fusionnée à la RL si elle interagit avec le RPAP3-Cter. Grâce à l'ajout de leurs substrats respectifs, nous pouvons ensuite activer tour à tour les deux luciférases et mesurer la luminescence qu'elles produisent. La mesure de la luminescence dans l'immunoprécipitât reflète la quantité des protéines immunoprécipitées. Cette expérience est réalisée en plaque de 96 puits, ainsi pour chaque point, un puits contiendra l'extrait brut (INPUT), le suivant sera incubé avec des anticorps anti-FLAG pour réaliser l'IP (IP) et le dernier subira une manipulation identique mais réalisée sans anticorps pour servir de contrôle dans l'expérience(Ct). Pour l'analyse, nous réalisons d'abord les ratios des coups mesurés dans l'IP rapporté à l'INPUT pour chacune des deux luciférases (IP/INPUT). Puis la valeur pour la RL (la protéine proie) est rapportée à celle de la FFL (la protéine appât). Ce ratio représente l'efficacité finale de l'IP, soit l'efficacité de l'IP de la proie fusionnée à la RL, ramenée à l'efficacité de l'IP de l'appât (en général autour de 30%- 50%). Le premier mutant des RUVBL que nous avons utilisé est un mutant qui ne lie pas les nucléotides (K en M dans le motif Walker A), le second ne peut hydrolyser l'ATP mais le lie (E en Q dans le motif Walker B, ) et le dernier est bloqué dans la transmission du signal conformationnel entre les sous-unités de l'hexamère (mutation du doigt arginine ). Les résultats indiquent que l'interaction est beaucoup moins forte avec mutant qui n'est pas capable d'hydrolyser l'ATP (E->Q ; Figure S2D du papier joint). La protéine RPAP3 se lierait donc aux RUVBL soit sous forme Apo (sans nucléotides), soit après l'hydrolyse de l'ATP. Le domaine RPAP3-Cter lie des clients grâce aux par les protéines RUVBL1/2 Les données sur la structure du RPAP3-Cter ont permis de proposer une série d'acides aminés potentiellement impliqués dans le recrutement de RUVBL1 et 2, et j'ai testé l'ensemble de ces résidus par double hybride. J'ai effectué une mutagénèse ciblée du domaine C-terminal basée sur la structure 3D de ce domaine. Puis, j'ai testé les interactions de chacun de ces mutants avec les protéines RUVBL1 et 2. Dans le cas précis, j'ai pu vérifier que l'interaction ainsi détectée entre le domaine C terminal de RPAP3 et RUVBL2 était spécifiquement abolie par les mutations R623A- M626A (Mutant 1) et F630A- S632A de RPAP3 (Mutant 2 ; Figure 3A du papier joint). Ces résultats ont été confirmés par la technique d'immunoprécipitation quantitative LUMIER. Dans ce cas, alors qu'environ 12% des protéines RUVBL1 et 5% des protéines RUVBL2 sont co- immuno-précipitées avec le domaine RPAP3-Cter, cette valeur tombe à des niveaux négligeables pour les mutants 1 et 2 (Figure 3C). Ces données confirment que les acides aminés R623/M626 etF630/S632 sont nécessaires au recrutement de RUVBL1/2. J'ai alors répété l'étude protéomique, en utilisant cette fois les mutants 1 et 2 du domaine RPAP3-Cter, en comparaison avec le domaine sauvage. Chez les mutants (Figure 3D et S3D du papier joint), les interactions avec les partenaires précédemment identifiés sont toutes perdues sauf celle avec SHQ1 qui persiste mais qui est nettement plus faible. Ces données confirment 123 queR623/M626 etF630/S632 sont nécessaires au recrutement des RUVBL1/2. De plus, ils montrent que l'interaction entre RPAP3 et ces substrats dépend des RUVBL1/2. Vraisemblablement, RUVBL1/2 auraient une fonction de recrutement des substrats sur le R2TP. 124 Analyse des complexes R2TP-like dans l'organisme L'hypothèse de l'existence d'autres R2TP-like est renforcée grâce aux études des protéines PIH-like et RPAP3-like. Précédemment, une étude avait en effet montré que DNNAF2 interagissait avec la protéine DYX1C1 pour permettre l'incorporation de dynéines dans le cil, avec l'aide de HSP70 (Tarkar et al. , 2013). DYX1C1 ne comporte pas de domaine RPAP3-Cter like mais un domaine CS (comme PIH1D1) et un domaine TPR (comme RPAP3 ; Figure 4A du manuscrit joint). De plus, l'analyse des banques de données révèle l'existence de plusieurs isoformes de DYX1C1 différant par le motif en aval du domaine TPR. Dans le cytoplasme, DYX1C1 recrute le chaperon HSP70 par ses domaines TPR pour l'adresser à DNAAF2 afin d'assembler les dynéines. Ce modèle rappelle celui du R2TP. SPAG1 et CCDC103 possèdent un domaine C-ter similaire à celui de RPAP3. L'étude par RMN de ces domaines confirme qu'ils se structurent comme le RPAP3-Cter (données non montrées), et l'analyse des séquences montre que les acides aminés identifiés précédemment dans l'interaction avec les RUVBL1/2 sont partiellement conservés. Afin de valider l'existence de complexes R2TP-like, j'ai d'abord procédé à des études systématiques d'interaction entre protéines PIH-like et RPAP3-like avec le test LUMIER (Figure 4B dans le manuscrit joint). Dans ces expériences, j'ai également inclus les différents isoformes de DYX1C1, qui diffèrent par leur région C-terminal et le dernier motif du domaine TPR. Ces expériences permettent de proposer l'existence de plusieurs nouvelles paires PIH-like/RPAP3- like : SPAG1-PIH1D2 ; SPAG1-DNAAF2 ; ainsi DNAAF2-DYX1C1 isoforme a ; et PIH1D3-DYX1C1 isoforme c . Les paires contenant DYX1C1 avaient déjà été mises en évidence (Olcese et al. , 2017 ; Omran et al. , 2008 ; Tarkar et al. , 2013) mais pas le fait qu'elles soient spécifiques d'isoformes de DYX1C1. Chez S. cerevisiae, Pih1 reconnat le motif en aval du dernier TPR de Tah1(Back et al. , 2013). Il semble que le motif placé après le TPR de DYX1C1 soit également responsable de l'interaction avec ses partenaires PIH-like. Je n'ai pu identifier aucun partenaire pour CCDC103. Un nouveau complexe d'assemblage, le R2SP (RUVBL1/2, SPAG1, PIH1D2) SPAG1 possède un domaine RPAP3-Cter-like susceptible de lier les RUVBL. Les données ci- dessus suggèrent que cette protéine pourrait former deux complexes R2TP-like, l'un avec DNAAF2, et l'autre avec PIH1D2. J'ai donc procédé à des expériences de protéomique quantitative SILAC pour tester cette hypothèse. Pour obtenir une vision large des protéines RPAP3-like et PIH-like, j'ai utilisé plusieurs protéines comme appâts : PIH1D2, PIH1D3, DNAAF2 et CCDC103. Comme 125 précédemment, le modèle consistait à insérer de façon stable un plasmide codant pour la protéine d'intérêt fusionnée à la GFP dans le génome de cellules HeLa, afin d'obtenir des cellules qui sur-expriment cette protéine. Il faut cependant noter que les cellules HeLa sont dépourvues de cils, et qu'elles n'expriment pas toutes les molécules qui nous intéressent : notamment PIH1D2, CCDC103 et PIH1D3 semblent absentes (d'après nos données de transcriptomique). Il peut donc y avoir un biais, et des interactions peuvent être manquées ou favorisées. Les résultats des IP SILAC que j'ai réalisées sont présentés dans la Figure 5B du manuscrit joint. Ces résultats confirment l'existence d'un complexe entre SPAG1, PIH1D2 et les RUVBL. Par analogie avec le R2TP, nous avons nommé ce complexe le R2SP. En revanche, je n'ai pas pu mettre en évidence de complexe entre DNAAF2 et SPAG1 : DNAAF2 est détecté uniquement en liaison avec l'isoforme a de DYX1C1, et ce complexe ne semble pas s'associer avec les RUVBL, comment prédit par l'absence de domaine RPAP3-Cter like dans DYX1C1. Enfin la protéomique de CCDC103 ne permet d'identifier aucun candidat, et nous ne détectons pas d'interaction significative avec les RUVBL. PIH1D3 interagit fortement avec une protéine appelée LRIF1, mais nous ne détectons pas DYX1C1 comme attendu. PIH1D3 ne semble pas non plus s'associer avec les RUVBL. Mise en évidence de substrats potentiels du complexe R2SP : la Liprine 2 Par des tests LUMIER, j'ai mis en évidence une interaction entre SPAG1 et la protéine PIH1D2 (Figure 4B du manuscrit joint). SPAG1 possède un domaine C-ter similaire à RPAP3 et elle interagit avec RUVBL1 et 2 (Figure 4C). De plus, cette interaction est renforcée en présence de Pih1D2 (Figure 5A), ce qui suggère que Pih1D2 participe à la liaison aux ATPases directement ou non. Par des expériences de protéomique SILAC, j'ai confirmé l'existence du complexe R2SP, et j'ai montré que ce complexe s'associe aussi à la protéine chaperon HSP70. (Figure 4B) SPAG1 contient lui aussi des domaines TPR, et, dans son cas, ces domaines pourraient être impliqués dans la liaison à HSP70. Pour aller plus loin, j'ai cloné les cDNAs de PIH1D2 et SPAG1 dans des vecteurs permettant la réalisation de cribles double-hybride par la société Hybrigenics. Ces cribles ont été réalisés sur des banques de testicules et de lignées cellulaires cancéreuses de poumon. Ceci nous a permis d'identifier des substrats potentiels de ce nouveau complexe (Figure 6A). Parmi ces protéines se trouvent des molécules impliquées dans différents processus cellulaires comme la transcription ou l'organisation du cytosquelette. Ces interactions ont été confirmées par IP LUMIER (Figure ure6B). Afin de déterminer si ces interactions ont une signification fonctionnelle, Céline Verheggen a réalisé une étude comparative du niveau d'expression des substrats potentiels entre des cellules HeLa et des cellules HeLa o Pih1D2 est surexprimé 126 (HeLa-PIH1D2-GFP). Ceci a permis de montrer que la présence de PIH1D2 facilitait l'expression de certaines de ces protéines (Figure 7A). Nous avons sélectionné la Liprine2comme modèle d'étude d'un substrat du R2SP car elle fait partie des protéines candidates les plus dépendantes de PIH1D2. Le R2SP semble être un complexe d'assemblage spécifique d'un tissu. Certains des substrats identifiés sont enrichis dans les testicules, ce qui suggère une fonction spécifique du R2SP dans ce tissu : en effet, le flagelle des spermatocytes n'est autre qu'un cil motile spécialisé. La même expérience qu'au paragraphe précédent a été réitérée à 37C (conditions de culture classique) et à 32C, plus proche de la température des testicules. La stabilisation des substrats candidats du R2SP (mais pas des substrats du R2TP) est plus prononcée lorsque les cellules sont cultivées à 32C qu'à 37C, suggérant une dépendance accrue à PIH1D2, et donc potentiellement au R2SP à 32C (Figure 7B). Le R2SP favorise l'assemblage de la Liprine 2 avec ses partenaires Pour vérifier le rôle de R2SP dans l'assemblage de ses substrats, nous nous sommes focalisés sur la liprine2. Les Liprines sont impliquées dans le contrôle de la migration cellulaire et de l'organisation des synapses. La liprin2 forme des hétéro-dimères avec les Liprines1 et 3, et s'associe également avec les protéines Liprineb2, CAST, GIT1 KIF1A et RIMS1 (les protéines partenaires de la liprin2). Ensemble, elles forment un complexe qui est présent notamment dans le cerveau. Pour tester un rôle éventuel du R2SPdans le recrutement des protéines partenaires de la Liprin2, une étude de co immunoprécipitation (IPLUMIER) a été réalisée. Ces expériences montrent que la sous-unité SPAG1 du R2SP lie plusieurs partenaires de la Liprine2. Ensuite, nous avons voulu tester si le complexe R2SP facilite l'association de la Liprinea2 avec ses partenaires. Pour cela, des IP LUMIER ont été faites dans des cellules HeLa et HeLa-PIH1D2. L'association de la liprine2 avec ses protéines cibles est favorisée par la présence de PIH1D2, vraisemblablement dans le contexte du R2SP. Le R2SP favoriserait donc la formation de la structure quaternaire de la Liprine2. Nous avons donc montré l'existence d'un nouveau complexe modulateur de l'assemblage de complexes, mais cette fois spécifique d'un tissu particulier. 127 quaternary chaperones Chloé Maurizy1, 2, , Marc Quinternet3, , Yoann Abel1, 2, Céline Verheggen1, 2, Paulo E. Santo4, Robert1, 2, Claire Abeza1, 2, Philippe Fabre6, Philippe Fort7, Franck Vandermoere8, Pedro M. F. Sousa4, Jean-Christophe Rain9, Bruno Charpentier6, Sarah Cianférani5, Tiago M. Bandeiras4, : equal contribution * : to whom correspondence should be addressed The RPAP3-Cterminal domain identifies R2TP-like Maxime Bourguet5, Ana C. F. Paiva4, Benot Bragantini6, Marie-Eve Chagot6, Marie-Cécile Av. da Repblica, 2780-157 Oeiras, Portugal and iBET, Instituto de Biologia Experimental e Université de Lorraine, Biopôle, Campus Biologie-Santé, 9 avenue de la Forêt de Haye, BP 5-Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganique, Université de Strasbourg, CNRS, 3-Ingénierie-Biologie-Santé Lorraine (IBSLor), UMS 2008 CNRS INSERM Université de 1-IGMM, CNRS, Université de Montpellier, Montpellier, France 2-Equipe labélisée Ligue Nationale Contre le Cancer 20199, 54505 Vandœuvre-lès-Nancy, France 7-CRBM, CNRS, Université de Montpellier, Montpellier, France Lorraine, Biopôle, Campus Biologie Santé, 54505 Vandœuvre-lès-Nancy, France. 4-Instituto de Tecnologia Qumica e Biolgica Antnio Xavier, Universidade Nova de Lisboa, IPHC UMR 7178, 67000 Strasbourg, France 6-Ingénierie Moléculaire et Physiopathologie Articulaire (IMoPA), UMR 7365 CNRS- Bérengère Pradet-Balade7, Xavier Manival6, *, Edouard Bertrand1, 2, *, $ $ : lead contact Tecnolgica, Apartado 12, 2780-901 Oeiras, Portugal Maurizy et al. 1 9-Hybrigenics Services, Paris France 8- IGF, CNRS, Université de Montpellier, Montpellier, France Keywords : Assembly of macromolecular complexes, chaperone, HSP90/R2TP, RUVBL ATPase, Pontin/Reptin, tissue proteostasis Running title : R2SP is a tissue-specific quaternary chaperone Maurizy et al. 2 Summary composed of an RPAP3-PIH1D1 heterodimer, which binds the two essential AAA ATPases folding. Effects are stronger at 32C, suggesting that it may help compensating the lower genome encodes two other proteins bearing RPAP3-C-terminal-like domains and three containing PIH-like domains. Systematic interaction analyses show that one RPAP3-like R2TP is an HSP90 co-chaperone that assembles important macro-molecular machineries. It is RUVBL1/RUVBL2. Here, we resolved the structure of the conserved C-terminal domain of RPAP3, and we show that it directly binds RUVBL1/RUVBL2 hexamers. The human large signalling complexes. Remarkably, R2SP is required for liprin-2 expression and for are expressed in testis and others are ubiquitous. One substrate is liprin-2, which organizes the assembly of liprin-2 complexes, indicating that R2SP functions in quaternary protein temperature of testis. protein, SPAG1, binds PIH1D2 and RUVBL1/2 to form an R2TP-like complex termed R2SP. This co-chaperone is enriched in testis and among 68 of the potential clients identified, some Maurizy et al. 3 The R2TP complex was discovered in S. cerevisiae as an HSP90 co-factor 1. R2TP is an substrates were described, including the U4 and U5 spliceosomal snRNAs 4, 5, 6, the nuclear response corroborate this possibility 14. In humans, R2TP is composed of a core that associates with prefoldins and additional factors to form the R2TP/Prefoldin-like complex, recently renamed PAQosome 7, 8, 9, 15. The cell growth and proliferation, it was hypothesized that R2TP mediates some of the tumorigenic effects elicited by HSP90 13. Newly identified clients involved in DNA damage and best-documented R2TP clients are the small nucleolar ribonucleoprotein particles (snoRNPs), which are required for the maturation of ribosomal RNAs 3. More recently, other unusual co-chaperone because it appears specialized in quaternary protein folding, and in particular in the assembly of key cellular machineries important for cell growth 2. The first RNA polymerases 7, 8, 9, and the family of PI3K-like kinases (PIKKs), which comprises mTOR, DNA-PK, ATR, ATM, SMG1 and TRRAP 10, 11, 12. Given the role of these clients in R2TP core is composed of four subunits (Figure 1A) : PIH1D1, RPAP3, and the two related AAA ATPases RUVBL1 and RUVBL2 (also called Pontin and Reptin). RPAP3 directly binds HSP90 and forms a stable heterodimer with PIH1D1 16, 17. These components are components by R2TP, and ending in the loading of RUVBL1/2 on the client complex 19. The precise molecular role of RUVBL1 and RUVBL2 still remains elusive. Structural studies showed that they form a hexameric ring typical for this class of enzymes 20. Additionally, they believed to function as adaptor and regulatory factors while RUVBL1 and RUVBL2 are the catalytic components that likely possess a chaperone activity 18. The analysis of snoRNP contain an insertion called domain II, which protrudes from the ATPase ring and forms a flexible structure whose conformation depends on the presence and nature of bound biogenesis suggests that R2TP functions through a stepwise process, where HSP90 stabilizes clients before their assembly, followed by the independent recruitment of several snoRNP Maurizy et al. 4 switch to control the binding and release of clients. Accordingly, it has been proposed that This provides a first glimpse of how these fascinating enzymes may chaperone their clients. Structural studies revealed that PIH1D1 has two domains. Its N-terminal region harbors the conserved PIH domain that possesses a phospho-peptide binding pocket showed that RUVBL1/2 cycle between hexameric and dodecameric forms, with client binding that they stimulate the dissociation of specific assembly factors 25. Recent structural analyses nucleotides 21, 22. RUVBL1/2 have been shown to make ATP-dependent contacts with some cofactors and client proteins 23, 24, suggesting that ATP loading and hydrolysis may act as a responsible for the recognition of some substrates 16, 17. Its C-terminal region folds as a CS domain and mediates hetero-dimerization with RPAP3 16, 17, 26. RPAP3 has a C-terminal promoting dimerization of the hexamer, and ATP hydrolysis dissociation of the dodecamer 18. RUVBL1/2 stabilize interactions between subunits of target complexes 19, or, alternatively, R2TP-like complex that functions in quaternary protein folding. clamp, which catches the last C-terminal residues of the chaperone (-MEEVD ; 17, 27). A recent binds an hetero-hexamer of Rvb1/2p (the yeast homologs of RPAP3, PIH1D1 and RUVBL1/2, respectively 28, 29). This interaction involves the DII domain of the ATPases and the linker domain of unknown function (RPAP3-Cter), and a middle region composed of six tetratricopeptide repeats (TPR) arranged in two consecutive domains (Figure 1B). Structural studies showed that they bind HSP90 through five conserved residues forming a carboxylate show that this highly conserved domain binds directly the RUVBL1/2 ATPases. A similar domain is also present in a human protein called SPAG1, and we demonstrate that it forms an cryo-EM structure of the yeast R2TP revealed that a single copy of the Tap1p : Pih1p dimer separating the PIH and CS domains of Pih1p 28, 29, 30. In this study, we elucidated the 3D structure of the RPAP3 C-terminal domain. We Maurizy et al. 5 Results The RPAP3 C-terminal domain is ancient and co-evolved with PIH-domain proteins 1C ; blue dots in the RPAP3 C column). A single such protein was likely present at the root of the tree, and a duplication event having probably occurred between Amoebozoa and evolutionary analysis (Figure 1C). In addition to RPAP3, the human genome encodes two other proteins harboring a RPAP3-Cter-like domain : SPAG1, which also contains three TPR domains, and CCDC103, which has a N-terminal dynein attachment domain. Remarkably, proteins with both an RPAP3-Cter and a TPR domain occur in all eukaryotic lineages (Figure and function of RPAP3-Cter is unknown. This domain is absent in the S. cerevisiae homolog of RPAP3, and to clarify the links between this domain and R2TP, we first performed an While extensive structural studies have been performed with R2TP proteins 15, the structure Opisthokonta (Fungi and Metazoa) generated RPAP3 and SPAG1. Concerning proteins with DYX1C1 31, a CS- and TPR- containing protein that we included in our analysis. Most of the present in all eukaryotic branches and thus of ancient origin, as previously noted 32. for this domain. This protein further co-evolved with the ancestor of PIH1D1, pointing to a Interestingly, the duplication of the RPAP3 ancestor is mimicked by a similar contemporary PIH domain, the human genome encodes three such proteins besides PIH1D1 : PIH1D2, PIH1D3 and DNAAF2 (also known as Kintoun). DNAAF2 is known to associate with duplicated (Figure 1C and data not shown). Together, this analysis indicates that the ancestral form of RPAP3 had both TPR and RPAP3-Cter domains, suggesting an important function duplication of the ancestor of PIH1D1, which generated PIH1D1 and PIH1D2. This appears specific for these genes, because RUVBL1/2, as well as other HSP90 co-chaperone were not eukaryotic lineages encode three PIH-proteins and one DYXC1 ortholog. These proteins are link with R2TP. Maurizy et al. 6 The NMR structure of RPAP3-Cter reveals a new 3D fold protein aggregation (data not shown). We submitted our structure to the DALI server to search for potential structural homologs. No strong candidate could be identified using a top respectively. We concluded that RPAP3-Cter adopts a new 3D fold, which could thus In order to get more information on RPAP3-Cter, we performed structural studies. After sequence analysis, we expressed fragments 535-665 and 547-665 of human RPAP3. Only the largest domain, i. e. RPAP3535-665, showed a high stability and solubility after expression and Interestingly, the N-terminal residues 541-548 form a loop that protects several hydrophobic amino-acids from solvent, including Leu542, Pro543, Ile545 and Pro546 (Figure S1D). This purification from E. coli (Figure S1A-B). Using NMR, intensity and distribution of peaks in the 1H-15N HSQC spectrum revealed a properly folded domain (Figure S1C). We obtained a loop contributes to the solubility of RPAP3-Cter since its truncation in RPAP3547-665 leads to composed of 8 -helices that pack together to form a globular object (Figure 1D-F). well-resolved set of 20 water-refined structures (Table S1), showing that this domain is DALI Z-score below 8, with a mean RMSD and identity percentage of 3. 6 and 9. 7%, HeLa cells using site-specific integration with the Flp-In system. Following differential RPAP3-Cter with high abundance (intensity) and specificity (SILAC ratio). The top hits were possibly be linked to a new biological function. labeling of GFP-RPAP3-Cter and control cells with isotopic amino-acids (SILAC), whole cell extracts were immuno-precipitated (IP) with anti-GFP antibodies and pellets were subjected to quantitative mass-spectrometry analysis (Figure 2A). About 20 proteins associated with To get insights into the function of RPAP3-Cter, we characterized its partners by performing a proteomic analysis in human cells. We fused this domain to GFP and stably expressed it in RPAP3-Cter associates with RUVBL1/2 and with some R2TP clients Maurizy et al. 7 RUVBL1/2, while the others belonged to several classes : (i) known R2TP clients (SHQ1 and polymerase II) ; (ii) known R2TP cofactors (ZNHIT2) and/or RUVBL1/2 partners chaperones (HSP70 isoforms and its regulator BAG2). Overall, these data suggest that clients. RPAP3-Cter directly binds RUVBL1/2 other tested proteins. To determine whether this interaction is direct, we used recombinant (C12ORF45, C2ORF44, DPCD) 6, 19, 23 ; (iii) PAQosome subunit (PFDN2) 2 ; and (iv) NOP58 for snoRNPs, PRPF8 and other U5 proteins for snRNAs, POLR2A for RNA RPAP3-Cter may play an important role in interacting with RUVBL1/2 and with R2TP We then performed pairwise yeast two-hybrid assays (Y2H) between RPAP3-Cter and its RUVBL1/2 on the methyl groups of RPAP3-Cter. Indeed, methyl groups are adapted to probe RPAP3-Cter bound heteromeric forms of RUVBL1/2. Cter corresponded to molecular masses of dodecameric and hexameric forms of RUVBL1/2, using NMR spectroscopy. We took advantage of the 13C-labeling to monitor the effect of and/or at basic pHs 33. The NMR signal of the 13C-labeled RPAP3-Cter decreased dodecamers 22, and we thus wished to determine the stochiometry of the interaction. First we co-expressed RPAP3-Cter with RUVBL1/2 in E. coli, and analyzed the complex by gel- filtration (Figure 2D-E). The eluting volumes of RUVBL1/2 alone and RUVBL1/2 : RPAP3- dramatically in presence of the RUVBL1/2 hetero-multimers (Figure 2B), while only minor effects were seen with RUVBL1 or RUVBL2 alone (Figure S2B). This demonstrated that proteins for in vitro binding assays. RUVBL1/2 were co-expressed in E. coli and they purified predominantly as a dodecamer (see below). We then assessed the binding to RPAP3-Cter interactions, due to their ability to provide strong signals even at low protein concentrations putative partners (Figure S2A). We detected a positive signal with RUVBL2, but not with the RUVBL1/2 have been recently shown to cycle between hetero-hexamers and hetero- Maurizy et al. 8 demonstrate that RPAP3-Cter binds predominantly RUVBL1/2 hetero-hexamers. Next, we analyzed the binding of RPAP3-Cter to RUVBL mutants altered in their human HEK293 cells, the bait is IP'ed with anti-FLAG antibodies, or without antibodies as control. The RL and FFL luciferase activities are then measured in the input and pellet, and respectively. Next, we performed mass spectrometry analysis under non-denaturing conditions (native MS), of either RUVBL1/2 alone, or RUVBL1/2 mixed with recombinant dodecameric complexes, but hexameric forms became largely dominant upon RPAP3-Cter binding. Note also that one hexamer can bind multiple RPAP3-Cter domains. These data thus co-IP assay where the prey and bait proteins are respectively fused to Renilla luciferase (RL) and FLAG-tagged Firefly luciferase (3xFLAG-FFL). Following transient expression in RPAP3-Cter (Figure 2F). In the free state, RUVBL1/2 formed hetero-hexameric and hetero- ATPase cycle. For this, we turned to LUMIER interaction experiments. This is a quantitative Note that the effect of several of these mutations has been previously established using the Chaetomium thermophilum orthologs of RUVBL1 and RUVBL2 22. Interestingly, while the K-M and R-E mutations had little effects on the association of either RUVBL1 or RUVBL2 with RPAP3-Cter, the E-Q mutations strongly diminished binding (Figure S2D). Taken mutants deficient in ATP hydrolysis. experiments, we used canonical mutations of AAA ATPases 34, expected to prevent hexameric RUVBL1/2. This interaction did not require nucleotide and was weakened in the co-IP efficiency is expressed as the percent of prey co-immuno-precipitated, relative to that of the bait, providing a direct measurement of binding efficiencies (Figure S2D). In these nucleotide binding (K to M mutant in the Walker A domain), nucleotide hydrolysis (E to Q in the Walker B domain), or coupling between adjacent monomers (R to E in the Arg finger ). together, these data indicated that RPAP3-Cter made a direct high affinity interaction with Maurizy et al. 9 site for RUVBL1/2. To confirm the Y2H data, we performed LUMIER interaction assays, assays, and two of them indeed lost interaction with RUVBL2 (Figure 3A) : R623A-M626A (Mut1), and F630A-S632A (Mut2). Both mutants localized in the nucleoplasm and the conserved across evolution (Figure S3D). They were located next to each other in the 3D structure of RPAP3-Cter (Figure 3B), suggesting that they may constitute a conserved binding but also a range of R2TP clients. In order to test whether RPAP3-Cter binds these other partners independently of the RUVBL ATPases, we generated a series of RPAP3-Cter involved in RUVBL1/2 interaction (Figure S3A-B). Alanine mutants were screened by Y2H cytoplasm, and were excluded from nucleoli. This is similar to wild-type RPAP3-Cter (Figure S3C), suggesting no major alteration of the mutants. The mutated residues are highly Our proteomic analysis of RPAP3-Cter showed that it binds not only the RUVBL1/2 ATPases, mutants. Structure-guided mutations were used to select solvent-exposed residues potentially which demonstrated that both RPAP3-Cter Mut1 and Mut2 lost interaction with RUVBL1 and RUVBL2 (Figure 3C). Next, we performed SILAC quantitative proteomic analyses of the RPAP3-Cter mutants, by fusing them to GFP and stably expressing them in HeLa cells using RPAP3-Cter (Figure 3D-E), with the exception of SHQ1, which remained weakly bound to RPAP3-Cter Mut1. Taken together, these data suggest that RUVBL1/2 are required for the Gene paralogs and alternative splicing generate a diversity of RPAP3-like : PIH-like hetero- As described above, the human genome encodes two other proteins bearing RPAP3-Cter-like DNAAF2 (Figure 1C, Figure 4A). This raised the possibility that these proteins could form the Flp-In system. Remarkably, both mutants lost all of the previously identified partners of dimeric complexes RPAP3-Cter mutants that do not bind RUVBL1/2 loose association to R2TP clients association of RPAP3-Cter with its other partners. domains, SPAG1 and CCDC103, and three containing PIH domains, PIH1D2, PIH1D3 and Maurizy et al. 10 R2TP-like complexes, by associating to each other and with RUVBL1/2 through their LUMIER co-IP assays between RPAP3-like and PIH-like proteins (Figure 4B). In these tests, the possible functions of these proteins as chaperone, we included HSP70, HSP90 and STIP1, fused at their N-termini to Renilla luciferase or to 3xFLAG-Firefly luciferase. The plasmids structural features of RPAP3 and PIH1D1 (e. g. TPR and CS domains), although it lacks PIH and RPAP3-Cter domains. We also included the known splicing isoforms of DYX1C1 and above, the interaction strength was expressed as the fraction of co-IP'ed prey protein a factor that promotes the transfer of clients from HSP70 to HSP90 36. These proteins were RPAP3-Cter-like domains. To test this possibility, we first performed systematic pairwise we also added DYX1C1 because this protein associates with DNAAF2 31, and bears some RPAP3, including the RPAP3 isoform 2 that does not interact with PIH1D1 35. Finally, to test were transiently transfected in HEK293 cells, and FLAG IPs were performed (Figure 4B). As which were tested against all the RPAP3-like and PIH-like proteins (Figure S4A). This affinity of these interactions, or to the fact that HSPs have many partners that potentially compete with baits in extracts. Most interestingly, we uncovered three strong associations SPAG1, although the IP efficiencies were 5-10 times less than for the previous couples (4-8% of co-IP efficiencies). Finally, a number of weak but significant interactions were also found between RPAP3-like and PIH-like proteins (30-40% of co-IP efficiencies) : RPAP3-iso-1 with PIH1D1, DYX1C1-iso-a with DNAAF2, and SPAG1 with PIH1D2. Two other strong normalized to that of the bait. Negative controls were done using four unrelated proteins, allowed us to rigorously identify specific interactions (see Methods). These experiments revealed that all the TPR-containing proteins interacted with HSP70, HSP90 and STIP1, although the co-IP efficiency was low (Figure 4B and S4B). This could be due to a low interactions were found, between DYX1C1-iso-c and PIH1D3, and between DNAAF2 and Maurizy et al. 11 assays (Figure 4C). SPAG1, RPAP3-iso-1 and iso-2 interacted with both RUVBL proteins, failed to interact with RUVBL1 or RUVBL2. The C-terminal domains of RPAP3, SPAG1 (Figures 4B and S4C), suggesting that additional PIH1D1-like/RPAP3-like pairs may also form, albeit at low efficiencies. SPAG1 binds RUVBL1/2 and this interaction is facilitated by PIH1D2 or no binding for SPAG1-Cter and CCDC103-Cter. Indeed, the amino-acids required for the binding of RPAP3-Cter to RUVBL1/2 are not strictly conserved in SPAG1 and CCDC103 (Figure S3B). Since the full-length SPAG1 protein bound better to RUVBL1/2 than the and CCDC103 have an overall identity of only 25%, and the sequence differences may We then tested whether SPAG1 and CCDC103 could bind RUVBL1/2, using LUMIER while CCDC103 did not. Surprisingly however, the isolated C-terminal domain of SPAG1 modulate their affinity for RUVBL1/2, from a high affinity binding for RPAP3-Cter, to a low RUVBL1/2. LUMIER assays indicated that significant interactions could be detected (Figure Human cells contain several complexes related to R2TP might thus form a complex similar to R2TP. To obtain direct evidence that this complex isolated SPAG1-Cter domain, we further tested whether its PIH1D2 partner would enhance binding. We repeated the LUMIER binding assay in presence of a co-expressed, untagged SPAG1 to RUVBL1 and RUVBL2 by nearly 3-fold, achieving a binding efficiency similar to that of full-length RPAP3. Taken together, these data indicate that SPAG1 binds RUVBL1/2 The LUMIER assays indicate that SPAG1 can interact with PIH1D2 and RUVBL1/2, and it and that the binding determinants likely include several regions within SPAG1 and PIH1D2. This result prompted us to test whether the PIH-like proteins would interact with PIH1D2 protein (Figure 5A). Indeed, co-expression of PIH1D2 increased the binding of S4C), but these interactions were however weak (5-20 fold weaker than with RPAP3). Maurizy et al. 12 exists, and to determine whether additional R2TP-like complexes may form, we turned to to RUVBL1 and RUVBL2 that agreed with the LUMIER assays (Figure 4B and S4C). In the all found with both a high specificity and abundance (Figure 5B). HSP70 and its regulator used them as baits in proteomic experiments (Figure 5B and Table S3). We did not find any nuclear factor enriched in testis. Only minute amounts of RUVBL1/2 were detected, in agreement with the weak interaction observed in the LUMIER assays. DYX1C1-iso-c was quantitative SILAC proteomics. To obtain a broad view of these complexes, we fused GFP to PIH1D2, PIH1D3, DNAAF2 and CCDC103, stably expressed the fusions in HeLa cells and partner for GFP-CCDC103. For GFP-PIH1D3, we found a strong association with LRIF1, a also not detected, possibly because of its low abundance in HeLa cells (Gtex dataset, 37). For GFP-DNAAF2, we found a strong association with DYX1C1-iso-a, and again a weak binding GFP-PIH1D2 IP, the three most prominent proteins were SPAG1, RUVBL1 and RUVBL2, BAG2 were also significantly enriched. This indicated the existence of an R2TP-like complex RUVBL1/2. This complex is identical to the canonical R2TP except that it lacks PIH1D1, and was thus termed R2T. A second complex comprises SPAG1, PIH1D2 and RUVBL1/2. This However, this complex remains hypothetical since it was detected in the LUMIER but not in complex shares an organization similar to R2TP and was termed R2SP. Another related complex could form with SPAG1, DNAAF2 and RUVBL1/2 (i. e. an R2SD complex). containing PIH1D2, SPAG1, RUVBL1/2, which associated with the HSP70 chaperone. The other GFP-PIH1D2 partners found in this experiment were involved in a variety of processes, ranging from metabolism to RNA processing, and may represent clients of this novel chaperone system. No prefoldin nor prefoldin-like complexes were detected, but we note that an interaction of SPAG1 with WDR92 has been previously described 23. Collectively, the LUMIER and proteomic data thus defines three types of complexes related to R2TP (Figure 5C). A first complex is composed of RPAP3-iso-2 in association with Maurizy et al. 13 specificity of DYX1C1 was not known. The occurrence and composition of these complexes is nicely corroborated by our R2TP-related factors localize to various cellular compartments and are enriched in testis. the proteomic experiments. Finally, we observed two heterodimers containing a PIH-like incorporation into R2TP and R2SP. Similarly, some species contain an RPAP3 ortholog but lack a PIH1D1/PIH1D2 gene, thus mirroring the existence of R2T in human cells. The frequent co-occurrence of DYX1C1 with either DNAAF2 or PIH1D3 is also consistent with one side, and PIH1D1 and PIH1D2 on the other, is consistent with their respective the association observed for the human proteins. protein associated with a DYX1C1 isoform : DNAAF2/DYX1C1-iso-a and evolutionary analyses (Figure 1C). The parallel duplication leading to RPAP3 and SPAG1 on PIH1D3/DYX1C1-iso-c. These interactions were previously reported 31, 38, but the isoform was performed with the stable cell lines expressing the GFP-tagged proteins. The different expressed (Gtex dataset 37 ; Figure S6A). The expression patterns of RUVBL1, RPAP3 and To gain insights into the function of these R2TP-related complexes, fluorescent microscopy SPAG1 were also broadly expressed, but with a moderate enrichment in testis. Interestingly, proteins localized to different cellular areas, suggestive of specialized functions (Figure S5). Interestingly, DYX1C1-iso-c was nuclear and concentrated in punctate structures, as did its PIH1D1 looked similar to each other, with a rather ubiquitous expression. DNAAF2 and partner PIH1D3. It is also worth noting that RPAP3-iso-2 was mainly nuclear while RPAP3- iso-1 was mainly cytoplasmic. Thus, alternative splicing determines not only the partners but also the localization of these proteins. Next, we examined existing data to determine in which tissues these factors are Maurizy et al. 14 in this organ. organization, membrane-related processes and trafficking. PIH1D2 has both ubiquitous and testis-enriched partners To characterize the function of R2SP, we first searched for partners by performing yeast two- the high quality of the screens. These PIH1D2 partners are involved in a variety of function, ranging from DNA metabolism, transcription and RNA processing, and up to cytoskeletal libraries from lung cancer cell lines and from testis (Figure 6A). The screens revealed a total of more than 60 potential partners (46 from the lung cancer library and 32 from testis ; Figure PIH1D2, PIH1D3 and RUVBL2 were highly expressed in testis, suggesting an important role hybrid screens using PIH1D2 as bait. Given its expression pattern, we screened human 6A and Table S4). Nine proteins were found in both libraries, including SPAG1, indicating molecular assemblies Next, we tested whether R2SP has any chaperone activity toward its partners. Since PIH1D2 we generated HeLa cells that stably expresses GFP-PIH1D2, and which thus have a fully partners involved in a variety of nuclear and cytoplasmic processes. Some partners were is poorly expressed in HeLa cells, in contrast to the other components of R2SP (Figure S6B), assembled R2SP complex (see Figure 5B). To measure its chaperone activity, we fused to Firefly luciferase the PIH1D2 partners identified previously and transiently transfected them in HeLa-PIH1D2 and parental HeLa cells. Remarkably, five proteins were significantly more expressed in presence of GFP-PIH1D2, reaching a threefold increase in one case (Figure 7A). To validate these interactions, we selected 16 proteins and tested them in LUMIER assays (Figure 6B). Taken together, these data demonstrated that PIH1D2 has a range of enriched in testis and others were ubiquitous (Gtex dataset, 37 ; Figure 6B). R2SP promotes the expression of some of its partners and their incorporation into large Maurizy et al. 15 of some of its partners and had a stronger effect at the unusual temperature of testis. linker and three Sterile Alpha Motif domains (SAM). The coiled-coil domain of liprin-2 can inhibitor), GIT1 (an Arf GTPase activating protein), KIF1A and RIMS1, a protein involved in These were PPFIA2 (liprin-2), ZBTB1, TCP11, PATL1 and PIK3CB. In contrast, the expression of a broad series of control proteins, including unrelated factors (Alix, FFL) or known R2TP-substrates (EFTUD2, PRPF31, NOP58), was identical in both cell lines (Figure 7A). Next, we repeated the experiments at 32C, the optimal temperature of testis where Since R2TP is involved in the assembly of target complexes 15, we hypothesized that PIH1D2 is highly expressed. We observed that the effects of R2SP were generally more important at this temperature. Taken together, this suggested that R2SP enhanced expression this is the strongest binder of PIH1D2, and it is also the most sensitive to the presence of PIH1D2. In addition, liprins are important scaffolding molecules that bring together a diverse set of factors in order to control cell adhesion, cell migration, and organization of the active synaptic zone 39. Liprins possess a long coiled-coil domain at their N-terminus, followed by a R2SP could do the same. To test this possibility, we focused on liprin-2 (PPFIA2). Indeed, CASK, as well as with the tyrosine phosphatases LAR (PTPRF), PTPRD and PTPRS 40. In CASK, liprin-2 and RIMS1 interacted with SPAG1. Next, we tested whether R2SP would dimerize or heteromerize with liprin-1 and 3 40. This domain also binds to CAST (a calpain the docking of exocytic vesicles 39, 41. The SAM domain of liprin-2 interacts with the kinase We first determined whether R2SP could interact with the partners of liprin-2. We fused liprin-1, liprin-2 (PPFIBP2), CASK and RIMS1 to Renilla Luciferase and to flagged Firefly-Luciferase, and performed LUMIER assays with R2SP subunits (Figure 7B). Indeed, addition, it can simultaneously interact with liprin- to organize higher order molecular assemblies 41. facilitate the association of liprin-2 with its partners. FLAG-FFL-liprin-2 was transfected Maurizy et al. 16 ratio of bait over preys was obtained in HeLa and HeLa-PIH1D2 cells (data not shown). The efficiency of co-precipitation of liprin-1 by liprin-2 was similar in HeLa and HeLa- in HeLa and HeLa-PIH1D2 cells, and LUMIER IPs were performed with RL-tagged liprin-2 partners. Of note, a larger amount of the FLAG-tagged liprin-2 plasmid was transfected in HeLa cells to compensate for its lower level of expression in this cell line, such that a similar PIH1D2 cells. In contrast, liprin-2, CASK, RIMS1 and PTPRS were all co-precipitated more efficiently by liprin-2 in HeLa-PIH1D2 cells (2. 3 to 3. 9 fold ; Figure 7C). These data demonstrate that the presence of PIH1D2, and thus of a full R2SP complex, promotes the association of liprin-2 with several of its targets. This indicates that R2SP is involved in quaternary protein folding. Maurizy et al. 17 Discussion complexes 15. S. cerevisiae and human R2TP share a similar organization but striking a novel helix-bundle fold and to bind RUVBL1/2 hexamers. In contrast, S. cerevisae Tah1p is six times smaller than human RPAP3 and consists of a single short TPR domain that differences distinguish their RPAP3/Tah1p subunit. Human RPAP3 contains two central TPR domains that bind HSP70 and HSP90, and a C-terminal domain, which is shown here to adopt by Pih1p in yeast 28, 30. This structural difference likely translates into different functions. In S. cerevisiae, TAH1 knock-out displays much milder phenotypes than that of PIH1 42, while functions as an adaptor between Hsp90p and Pih1p 17, 27. In particular, Tah1p lacks the The C-terminal domain of RPAP3 is a RUVBL1/2 binding module R2TP is a conserved HSP90 co-chaperone that is involved in the assembly of key cellular RPAP3-Cter homology domain and consequently, the RUVBL ATPases are mainly recruited Drosophila and mouse RPAP3 are essential genes (43 and unpublished observations). Cter could make cooperative interactions with RUVBL1/2 to bind the clients, or it may only manner analogous to CDC37 for HSP90 44. In agreement with this idea, RPAP3-Cter has structures and that this may give them chaperone activity 18. Interestingly, dimerization of the The PIH domain of PIH1D1 recruits some client proteins via a phosphopeptide- binding pocket that binds DSpDD/E motifs 16, 17. We show here that RPAP3-Cter binds a bind the ATPases, which would in turn recruit the clients. An interesting possibility would be that RPAP3-Cter maintains the ATPases in a conformation suitable for client binding, in a large number of R2TP clients and is thus also involved in client recruitment. Interestingly, binding of these clients is lost in RPAP3 mutants that no longer bind RUVBL1/2. RPAP3- different affinities for RUVBL mutants locked at different stages of their ATPase cycle. It was recently proposed that the RUVBLs cycle between single and double ring hexameric rings involves their DII domains, and a recent cryo-EM structure of the S. Maurizy et al. 18 cerevisiae R2TP complex revealed that the Tah1p : Pih1p heterodimer also associates with this conserved in human R2TP. (Table S4). Interestingly, the difference between the two isoforms of RPAP3 occurs at a domain. The position of Tah1p : Pih1p thus appears ideal to regulate the formation of double ring structures. Given the very different interaction of human RPAP3-PIH1D1 with forms an R2TP-like complex with PIH1D2, which we termed R2SP. Our two-hybrid screen shows that a short region downstream the TPR of SPAG1 is sufficient for PIH1D2 binding SPAG1 has an organization similar to RPAP3, with several TPR domains preceding the RUVBL1/2, it will be interesting to determine whether a similar structural arrangement is Human cells express a variety of complexes related to R2TP RPAP3-Cter-like domain. Remarkably, we show here that SPAG1 binds RUVBL1/2 and similar location, and this region determines binding to PIH1D1 (35 and Figure 4B). This is Tah1p, located immediately downstream the TPR interacts with the CS domain of Pih1p 17, 27. Interestingly, this complex appears mainly nuclear and may be specialized in nuclear functions. Second, an R2SD complex composed of SPAG1, DNAAF2 and RUVBL1/2. This downstream the TPRs on the other. This type of interaction may also extend to DYX1C1 since its three isoforms, which differ in the TPR domain and the downstream flanking region, Taken together, these data suggest a model in which PIH-like and RPAP3-like proteins interact via an interface composed of a CS-domain on one side and a short peptide reminiscent of the binding of yeast Tah1p to Pih1p, where a short C-terminal region of yeast interact with different PIH partners. Our interaction assays indicate that cells may contain other related complexes. First, an R2T complex that contains RPAP3-iso-2 and RUVBL1/2 but lacks a PIH1-like component. complex was not detected in our proteomic analyses and may thus form only in specific cell Maurizy et al. 19 types. Finally, DYX1C1 isoforms associate with DNAAF2 and PIH1D3 but apparently variety of R2TP-like complexes. Such a function is consistent with our and previous evolutionary analysis, which showed a involved in the biogenesis of proteins unrelated to cilia function ; (ii) the strongest proteomic partner of DNAAF2 is RTF1, which is a nuclear protein involved in transcription ; (iii) a With the exception of PIH1D2, all the R2TP-related proteins analyzed here have been previously linked to the formation of cilia and to the assembly of axonemal dyneins 31, 38, 45. lines of evidence suggest that they have additional functions : (i) R2SP interacts and is loss of these proteins specifically in species lacking cilia (Figure 1C and 32). However, several without binding the RUVBLs. We also do not exclude the possibility that additional proteins may be present, as the prefoldins in the case of R2TP. Overall, this study highlights the CCDC103 two-hybrid screen performed with a testis library revealed only a few proteins will be interesting to characterize the various functions of these R2TP-related proteins and to R2SP is involved in quaternary protein folding and has tissue-specific functions R2SP is enriched in testis and this could be due to two reasons : (i) it has testis-specific clients ; related to cilia function (see Table S4) ; (iv) GFP-tagged PIH1D3 and DYX1C1-iso-c are predominantly nuclear, with an accumulation in uncharacterized nuclear dots. In the future, it (ii) it helps ubiquitous proteins to adapt the particular environment of testis. Our data suggest that both possibilities occur, since some putative clients of R2SP are enriched in testis while others are ubiquitous. Interestingly, the requirements of some clients for R2SP increase at 32C, the temperature of testis. This suggests that proteins selected to function at 37C may determine the balance of direct and indirect effects in cilia formation. require additional help to function at 32C. Maurizy et al. 20 In the case of liprin-2, we show that R2SP is required for its expression and for its association with some partners. Interestingly, the R2SP subunit SPAG1 binds several liprin- 2 partners while PIH1D2 binds liprin-2 itself. This suggests a model in which the proteins to be assembled are brought together by R2SP, thus giving them the possibility to interact The independent recruitment of multiple subunits of given complexes may be a general Liprin-2 is a conserved scaffolding protein that is expressed at high levels in the brain and to a lesser extends in testis (Gtex Portal, 37). It plays an important role in neurons, with each other and to access the chaperoning activity of the RUVBL1/2 ATPase (Figure 7D). mechanism of action for this class of chaperones. where it participates to the organization of the synaptic active zone and in the coordinated the term acrosomal synapse 48. Since PIH1D2 is also expressed in the brain, it will be exocytosis of pre-synaptic vesicles 46. Interestingly, the acrosomal reaction also requires the simultaneous exocytosis of a large number of vesicles, and this process is also dependent on liprins 47. A parallel has been thus drawn between the synapse and the acrosome, leading to interesting to determine whether R2SP participates to synaptic transmission, through its action on liprins. Maurizy et al. 21 METHODS Cell culture of the indicated proteins and the fusions were stably expressed in HeLa H9 cells by Flp-In containing 10% fetal bovine serum (FBS), glutamin (2. 9 mg/ml), and penicillin/streptomycin (10 U/ml), at 37C, 5% CO2. For SILAC, a 3x-FLAG-GFP tag was fused at the N-terminus fluorescence microscopy. Plasmids and cloning hygromycin (150 g/ml), picked individually and characterized by Western blots and recombination, using the CMV promoter to drive expression 49. Clones were selected in HeLa and HEK293 cells were grown in Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) DNA cloning was performed using standard techniques and with the Gateway system Full length RUVBL1/RUVBL2 construct were purified as in 50 without adding ADP and with 150 mM NaCl, 5% glycerol, 2 mM MgCl2 and 0. 5 mM TCEP, which resulted in a stable pAS2 {Hallais, 2013 #5218}. For the LUMIER assays, the baits and preys were expressed an extra final Superose 6 XK 16/70 (GE Healthcare) equilibrated in 20 mM TrisHCl pH 8. 0, (InVitrogen). For pairwise two-hybrid tests, plasmids were based on pACTII and in HEK293 cells from the CMV promoter for the 3xFLAG-FFL fusions, or from the mouse L30 promoter for the RL fusions. The cDNAs were all of human origin except for RUVBL1 and RUVBL2, which were from mouse. Plasmids for in vitro expression in Escherichia coli are described below. Detailed maps and sequences are available upon request. Purification of the human RUVBL1-RUVBL2 dodecameric complex eluting as a single peak (data not shown). Maurizy et al. 22 Purification of the human RUVBL1-RUVBL2- RPAP3535-665 complex 3C cleavage site (HRV-3C), and RPAP3535-665 carries no tag. column (HIC), followed by the Superose 6 column. Peak fractions collected from Histrap column (GE Healthcare) equilibrated in Buffer C (20 mM TrisHCl pH 8. 0, 200 mM NaCl, custom pET-Based vector, were co-transformed and co-expressed in E. coli (DE3) pRARE2, IPTG, in a New Brunswick Innova 44R Shaker at 225 rpm. RUVBL1 protein is the same as in 50, RUVBL2 changes to an C-terminal FLAG FH8 Tag 51 preceded by a Human Rhino The RuvBL1-RuvBL2-RPAP3535-665 (R1R2R3) complex was purified in a similar manner as in 50 but : in the presence of ADP, and replacing the FlagTrap by a Hydrophobic interaction during 24 h at 30 C in EnPresso B animal-free Media (BioSilta), by adding 100 M of RUVBL1, RUVBL2 cloned in the pETDuet vector (Novagen), and RPAP3-Cter cloned in a were incubated with 5 mM CaCl2 during 1 hour and loaded onto an HiPrepTM Octyl FF 16/10 RPAP3-Cter eluting as a single peak (Figure 2F). The peak fractions were pooled and 5 % glycerol, 2 mM MgCl2, 5mM CaCl2, 0. 5 mM TCEP, 300 M ADP). Bound proteins were equilibrated in 20 mM TrisHCl pH 8. 0, 150 mM NaCl, 5% glycerol, 2 mM MgCl2, 0. 5 mM TCEP and 400 M ADP, which resulted in a stable R1/R2 hexameric complex bound to eluted using Buffer D (Buffer C without CaCl2, supplemented with 5 mM EDTA). To remove FLAG FH8 tag the collected samples were incubated 18 h at 4 C with 1% (w/w) HRV-3C concentrated to final 12. 5 mg/ml using a 10 kDa Cut-off Amicon Ultra centrifugal filter (Millipore). All purification steps were carried out at room temperature and were monitored by NuPage Bis-Tris gels (Invitrogen NP0302). protease (Thermo Fisher Scientific). To separate oligomeric species, FLAG FH8 and protease, we used the Superose 6 Purification of RPAP3535-665 and NMR sample preparation Maurizy et al. 23 1 mM. equipped with a cryoprobe. This permitted to obtain almost complete 1H, 13C and 15N pH 7. 5, 300 mM NaCl. A final size exclusion chromatography performed in 10 mM NaPi, pH 6. 4, 150 mM NaCl and 0. 5 mM TCEP provided 15N/13C-labeled samples at a concentration of resonance assignments of RPAP3535-665. Chemical shifts were referenced to DSS and derived into dihedral angle restraints with TALOS-N 53. Automated procedure of CYANA 3. 97 54 was Overexpression, purification and sample conditions of soluble 13C/15N-labeled RPAP3535-665 domain were done with previously described methods 52. Briefly, recombinant protein 13C-d6-Glucose and purified on TALON beads with a cleavable 6xHis-tag in 25 mM HEPES, domains were overexpressed in a minimal M9 medium complemented with 15N-NH4Cl and NMR structure calculation Classical 3D NMR spectra were recorded at 298K on a 600 MHz AVANCE III spectrometer NOESYHSQC spectra, all recorded with a mixing time of 120 ms. The final sets of dihedral NMR structures (AMPS-NMR ; 55, 56. The 20 structures with the lowest constraint energies were selected as the most representative. In the final set of structures, 94. 3% and 5. 7% of the All 3D structures were drawn with Pymol 57. 3D coordinates and NMR chemical shifts of RPAP3535-665 were deposited in the Protein Data Bank and in the Biological Magnetic Resonance Data Bank under respective entry codes 6EZ4 and 34200. NMR interaction experiments then used to derive distance restraints from 2D 1H-1H NOESY and 3D 15N- and 13C- angle and inter-proton restraints were carefully checked and used to generate 100 CYANA structures, which were refined in explicit water using the AMBER-based Portal Server for residues lie respectively in the most favored and allowed regions of the Ramachandran plot. Maurizy et al. 24 1D METHYL-SOFAST-HMQC spectra were recorded to monitor the binding of unlabeled proteins was 1 : 1 (one monomer of RPAP3-Cter and one heterodimer of RUVBL1/2). on a band width of 3 ppm and centered at 0 ppm. The relaxation delay was set to 150 ms and the number of scans to 2048. The final concentration ratio between unlabeled and labeled 298K and at 600 MHz in the RUVBL1/2 buffer (20 mM TrisHCl pH 8. 0, 250 mM NaCl, 5% glycerol, 2 mM MgCl2, 0. 5 mM TCEP). RUVBL1 was N-terminally tagged with a 6xHistidine and RUVBL2 with a 3xFLAG. Concentration of 13C-labeled proteins was around to only detect 1H nuclei attached to 13C nuclei. Interaction experiments were performed at 10 M. Protons attached to 13C nuclei lying between 5 and 35 ppm were selectively excited RUVBL proteins to 13C-labeled RPAP3535-665. The 1H dimension was edited, which permitted Non-denaturing mass spectrometry analysis were determined by UV absorbance using a NanoDrop 2000 spectrophotometer (Thermo Manchester, UK) coupled to an automated chip-based nanoelectrospray source (Triversa Nanomate, Advion Biosciences, Ithaca, U. S. A. ) operating in the positive ion mode. Mass without dissociation of weak non-covalent interactions by raising the backing pressure to 6 mbar and the cone voltage to 100 V. Data interpretation was performed using MassLynx 4. 1 solution of cesium iodide in 2-propanol/water (1v/1v) over the m/z range 1, 000-20, 000. Fisher Scientific, France). Mass spectrometry analyses were carried out on a hybrid electrospray quadrupole time-of-flight mass spectrometer (Synapt G2 HDMS, Waters, Instrumental parameters have been optimized to get optimal high m/z ion transmission For non-denaturing mass spectrometry analysis, samples were buffer exchanged against ammonium acetate (150 mM, pH 8. 0) buffer (Sigma, St. Louis, MO, USA), using Zeba Spin desalting columns (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA). Sample concentrations spectrometer calibration was performed using singly charged ions produced by a 2 mg/mL (Waters, Manchester, UK). Maurizy et al. 25 SPR interaction experiments background buffer. The carboxymethyl surface of the chip was activated with 20 mM EDC 22 kDa in-house purified protein with similar size to RPAP3-Cter and confirmed to be active performed by immobilizing either Bovine Serum Albumin (BSA, Thermo Fisher Scientific) coupling. HBS-N, which consisted of 10 mM Hepes, pH 7. 4, 0. 15 M NaCl, was used as the and 5 mM NHS for 1. 5 min. RPAP3535-665 was diluted in 10 mM Sodium Acetate, pH 5. 5, to a concentration of 1 g/ml. The protein was coupled to the surface with a 1 to 2 min injection or human Cyclophilin D43-207 (CypD) with the same RU levels as RPAP3-Cter. CypD43-207 is a time at a flow rate of 10 l. min-1. The remaining activated groups were blocked with a 5 RPAP3-Cter protein was immobilized onto CM5 (Series S) sensor chips using standard amine minute injection of 1. 0 M ethanolamine, pH 8. 5. Typically, 100 10 response units (RU) were obtained for the immobilization of RPAP3-Cter protein. Negative controls were RUVBL1/2), to determine the kinetic rate constants. Experiments were performed on a Biacore 4000 (Biacore AB, GE Healthcare Life Sciences, Uppsala, Sweden) at 25 C and the cycles consisted of a 300 second sample injection (30 l. min-1 ; association phase) followed through binding to Cyclosporin A. The RUVBL1-RUVBL2 complex was directly dissolved in running buffer (20 mM NaKPi pH 7. 5, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0. 05% by 600 second of buffer flow (dissociation phase). All sensorgrams were processed by first subtracting the binding response recorded from the control surface (reference spot), followed by subtracting of the buffer blank injection from the reaction spot. All datasets were fit to a simple 1 : 1 Langmuir interaction model (one molecule of RPAP3 binding one hexamer of P20). The RUVBL1-RUVBL2 complex was tested at 10 different concentrations using a 2- fold dilution series, with the highest concentration tested being 75. 2 nM. Interaction analysis interactions were evaluated using the provided Biacore 4000 evaluation software. Maurizy et al. 26 SILAC proteomics represent the isotopic purity of the labeled amino acids). Three 15-cm diameter plates were 20, 000 g. For all IP experiments, extracts were pre-cleared by incubation with Protein G Sepharose beads (GE healthcare) for 1 h at 4C. The control was extracted from the SILAC light condition prepared from H9 HeLa cells that did not express the GFP fusion. Each extract days in each isotopically labeled media (CIL/Eurisotop), to ensure complete incorporation of used per SILAC condition. Cells were rinsed with PBS, trypsinized and cryogrinded in lysis buffer (0. 5% triton X-100, 20 mM HEPES, pH 7. 4, 150 mM NaCl, protease inhibitor cocktail). Extracts were incubated 20 min at 4C and clarified by centrifugation for 10 min at isotopically labeled arginine and lysine (light label (K0R0, L) or semi-heavy label L-Lysine- 2HCl (2H4, 9698%)/L-Arginine-HCl (13C6, 99%) (K4R6, M) or L-Lysine-2HCl (13C6, 99% ; 15N2, 99%)/L-Arginine-HCl (13C6, 99% ; 15N4, 99%) heavy label (K8R10, H) (percentages SILAC experiments were performed as previously described 7. HeLa cells were grown for 15 was then incubated with 50 l of GFP-Trap beads (ChromoTek) for 75 min at 4C, washed were separated on SDS/PAGE, the lanes of interest were cut in 10 slices, and proteins were in were extracted from gel pieces and resuspended in 0. 1% formic acid/2% acetonitrile solution MS/MS) using a LTQ Velos Pro Orbitrap Elite mass spectrometer coupled to an Ultimate gel-digested with trypsin in 20 mM NH4HCO3 (Trypsin Gold, Promega V5280). Peptides The eluate was then reduced with DTT (BDH 443553B, 10 mM) at 95C for 2 min before being analyzed by mass spectrometry. Peptides were analyzed by nano-flow liquid chromatography coupled to Fourier transform tandem mass spectrometry (nanoLC-FT- 3000 (Thermo Fisher Scientific). Desalting and pre-concentration of samples were performed five times with lysis buffer, and beads from the different isotopic conditions were finally pooled. Bound proteins were eluted by adding 1% SDS to the beads and boiling for 10 min. and alkylated using iodoacetamide (Sigma I1149, 50 mM) for 30 min in the dark. Proteins Maurizy et al. 27 on-line on a Pepmap precolumn (0. 3 mm 10 mm, Thermo Fisher Scientific) in buffer A (2% acetonitrile with 0. 1% formic acid ; 333 min), 4080% B (3334 min), 800% B (4950 nL/min from a Pepmap capillary reversed-phase column (0. 075 mm x 150 mm, Thermo (CID) data-dependent acquisition (DDA) method. The LTQ-Orbitrap was programmed to Protein identification and quantitation were performed using the program MaxQuant (version 1. 5. 2. 8 ; Few parameters were not default : database : human perform a FT full scan (60, 000 resolution) on 4001, 400 Th mass range with the top twenty ions from each scan selected for LTQ-MS/MS. FT spectra were internally calibrated using a single lock mass (445. 1200 Th). Target ion numbers were 500, 000 for FT full scan on the acetonitrile, 0. 1% formic acid). A gradient consisting of 240% buffer B (B 99. 9% Fisher Scientific). Mass spectra were acquired using a top-20 collision-induced dissociation min), and equilibrated for 20 min in 0% B (5070 min) was used to elute peptides at 300 Orbitrap and 10, 000 MSn on the LTQ. Data were acquired using the Xcalibur software v2. 2. Acetylation ; Fixed modifications : Cysteine carbamidomethylation ; MS/MS tolerance : 0. 5 Da ; REV (non-real proteins from the reverse database) and CONT (contaminants) were reference proteome set (canonical isoforms downloaded from Expasy on May 29th 2017) ; ratio. B Significance calculation were done with the software Perseus v1. 4. 2 as previously identified if they had at least two peptides including one unique/Razor peptide and they were considered quantified if they had at least one quantified SILAC pairs. Proteins labeled as described 58 to highlight statistically significant protein ratios (pvalue LUMIER assays enzyme specificity trypsin/P ; variable modifications : methionine oxidation and protein N- False Discovery Rate (FDR) : 1%. In addition to the FDR, proteins were considered to be automatically discarded, as well as proteins that did not show any SILAC M/L, H/L and H/M Maurizy et al. 28 containing protease inhibitor cocktail (Roche), and spun down at 4C and at 20, 000g for 15 and two control wells without antibodies. Plates were incubated for 3h at 4C, and then incubated 5 minutes at room temperature, and FFL and RL luciferase activities were HEK293 cells were seeded in 24-well plates and transfected with 450 ng of the RL fusion and last wash, 10 l of PBL buffer (Promega) was added in each well. To measure the input, 2 l 50 ng of the 3xFLAG-FFL fusion, with 1 l of JetPrime (PolyPlus), as recommended by the of extract and 8 l of 1xPBL buffer was put in empty remaining wells. Plates were then manufacturer. 48 hours later, cells were extracted for 15 minutes at 4C in 450 l of HNTG minutes. The IP was performed in duplicated, by putting 100 l of the extract in each of four wells in a 96-well plate, with two wells being coated with anti-FLAG antibody (see below), washed 5 times with 300 l of ice-cold HNTG, for 10 minutes at 4C for each wash. After the measured in IP and input wells, using the dual luciferase kit (Promega). Every transfection was performed at least twice as independent replicates. Co-IP efficiency was defined as the RL/FFL ratio in the pellet, divided by the RL/FFL ratio in the input. Unless otherwise stated, The next day, wells were blocked with 300 l of blocking buffer, for 1 hour at room statistical significance was evaluated using Z-test assaying whether the co-IP efficiency in the anti-FLAG IP was more than 6 times higher than the mean values obtained in the control IP, plates were used (Lumitrac, Greiner), and 70 l of M2 antibody (10 g/ml in 1x PBS ; F1804 temperature. IP control wells were treated the same way except that no antibody was put in done without antibodies. This threshold of 6 corresponds to the mean plus two standard deviations of the FLAG/control fold difference obtained with a set of 36 assays done with non-interacting proteins (see Figure S4A). It ensures that only specific interactions are identified. To coat the wells of the 96-well plates with M2 anti-FLAG antibodies, High-binding Sigma-Aldrich) was put in each well and incubated overnight at room temperature in the dark. Maurizy et al. 29 Luciferase assays triplicate. in Photoshop. the well. Blocking buffer was 3% BSA, 5% sucrose, 0. 5% Tween 20, 1x PBS). HNTG buffer Flag-tagged Firefly luciferase (FFL) in fusion with the protein of interest, and with a plasmid buffer (Promega) and incubated at 4C for 15 minutes. RL and FFL activities were measured on 96-well plates using 10 l of cell extract and the dual-luciferase assay kit (Promega). coding Renilla luciferase as control (RL). After 48 h, cells were extracted in 100 l of 1x PLB was 20 mM Hepes-KOH pH 7. 9, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA. H9 Hela cells were grown on 24-well plates and co-transfected with plasmids expressing a Values obtained for FFL were normalized to RL values. Experiments were done at least in Microscopy HeLa cells expressing the GFP-fusion of interest were plated on glass coverslips, fixed one Genomes and Sequence analyses Amino acid sequences were aligned using MAFFT v7. 017 59. objective (NA 1. 4). Images were captured with a sCMOS camera (Hamamatsu) and mounted day later, and mounted in Vectashield containing DAPI (Vector Laboratories). Cells were Sequences were retrieved from the NCBI annotated databases (nr and EST, using NCBI PHI-BLAST as well as BLAST and Annotation search tools available in the Geneious 9. 1. 8 software package (Biomatters, imaged using an upright epifluorescence microscope (Zeiss AxioImager Z1, ) with a x63 oil Maurizy et al. 30 Pairwise yeast two-hybrid assays Plasmids pACT2 and pAS2 were introduced into haploid Saccharomyces cerevisiae strains assessed visually after 3 days at 30C. The strength of interactions was evaluated by Orthology was determined by reciprocal BLAST analysis and domain architecture. The 288 accession numbers used for the Figure are listed in Table S5. His plates (selection for interaction). Yeast two-hybrid screens (Y187 and CG1945, respectively). Strains were crossed and diploids were selected on Leu Trp selective media and then plated on triple selective media ( Leu Trp His). Growth was comparing the number of clones growing on Leu Trp (selection of diploids) and Leu Trp Yeast two-hybrid screening was performed by Hybrigenics Services, S. A. S. , Paris, France pP6 derive from pBTM116 60 and pGADGH 61 plasmids, respectively. ade2-101 : loxP-kanMX-loxP, Mat) and L40Gal4 (Mata) yeast strains, as previously described 62. For the testis, screen, 182 His colonies were selected on a medium lacking human lung cancer library, respectively. This represents 3-fold and 5-fold the complexity of the respective libraries. Screening was done using a mating approach with YHGX13 (Y187 pP6 plasmid. The first one was a made from human testis cDNAs, and the second one from cDNAs made from three human lung cancer cell lines : A549, H1703 and H460. pB27 and terminal fusion to LexA (LexA-PIH1D2). The construct was checked by sequencing the entire insert and used as a bait to screen two random-primed cDNA library constructed into ( The coding sequence for full-length (1-315) PIH1D2 (NCBI reference NM 138789) was PCR-amplified and cloned into pB27 plasmid as a C- As many as 31 and 51 million clones were screened for the human testis and the Maurizy et al. 31 database (NCBI) using a fully automated procedure. A confidence score (PBS, for Predicted Biological Score) was attributed to each tryptophan, leucine and histidine, while for the lung cancer library, 345 His colonies were selected on a medium lacking tryptophan, leucine and histidine and supplemented with 50 clones were amplified by PCR and sequenced at their 5' and 3' junctions. The resulting Firstly, a local score takes into account the redundancy and independency of prey fragments, as well as the distribution of reading frames and stop codons in overlapping fragments. sequences were used to identify the corresponding interacting proteins in the GenBank interaction as previously described 63. This score relies on two different levels of analysis. mM 3-aminotriazole to maintain a strong selectivity. The prey fragments of the positive QUANTIFICATION AND STATISTICAL ANALYSIS F. The PBS scores have been shown to positively correlate with the biological significance of Statistical tests were done with excel. screens performed on libraries derived from the same organism. Several of these highly Secondly, a global score takes into account the interactions found in all the screens performed at Hybrigenics using the same library. This global score represents the probability of an interaction being nonspecific. For practical use, the scores were divided into four categories, from A (highest confidence) to D (lowest confidence). A fifth category (E) specifically flags interactions 64, 65. interactions involving highly connected prey domains previously found several times in connected domains have been confirmed as false-positives of the technique and are tagged as Maurizy et al. 32 References 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Zhao R, et al. Navigating the chaperone network : an integrative map of physical and genetic interactions mediated by the hsp90 chaperone. Cell 120, 715-727 (2005). Houry WA, Bertrand E, Coulombe B. The PAQosome, an R2TP-Based Chaperone for Quaternary Structure Formation. Trends Biochem Sci 43, 4-9 (2018). Boulon S, et al. The Hsp90 chaperone controls the biogenesis of L7Ae RNPs through conserved machinery. J Cell Biol 180, 579-595 (2008). Bizarro J, et al. 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PES was supported by fellowship SFRH/BD/111603/2015, CM and CA were supported by fellowships from the This work was supported by grants from the Ligue Nationale Contre le Cancer, INCa PLBio Ligue Nationale Contre le Cancer ; MB was supported by a fellowship form the Région 2016-161 and ANR-16-CE11-0032-04 to EB, and from the French Proteomic Infrastructure (ProFI ; ANR-10-INBS-08-03) to SC. The work was also supported by GIS IBiSA and Région Alsace, by FCTFundaço para a Ciência e a Tecnologia, I. P. (project PTDC/BBB- BEP/1463/2014), Alsace ; Daniel Schwarz is acknowledged for his input on the SPR experiments, and P. Barbry Author contribution CM, MQ, BB, MEC, ACFP, PFa, XM, PES, PMFS, EB, CA, YA, MB and CV performed the hybrid screens. MQ, XM, BC, TB, CV, SC, BPB, EB supervised the work ; MQ, PFo, MB, XM, CV, BPB and EB wrote the manuscript. PS and EB prepared the Figures. MQ, XM, BC, CV, BPB and EB conceived the study ; MQ, experiments. FV performed mass spectrometry and statistical. JCR performed yeast two- for helpful discussions. Maurizy et al. 38 by x . Figure 2. RPAP3-Cter interacts with RUVBL1/2 hexamers. Figure Legends Figure 1. Solution structure of the C-terminal domain of human RPAP3 (pfam 13414) or Dynein attachment (pfam 15867) domains are associated to the canonical A-Schematic representation of the human R2TP complex. B-Domain architecture of RPAP3 (numbering corresponds to amino-acids of isoform 1). C-Conservation of RPAP3 and PIH repertoires across Eukaryotes. Members in which TPR RPAP3 C are colored as indicated at the left. Clades or species that have lost flagella or in which cilia are not motile are in grey background. Members that were not found are indicated D-Backbone view of the superposition of the best 20 NMR structures of human RPAP3-Cter, with -helices indicated in violet. A-SILAC proteomic analysis of RPAP3-Cter. The graph depicts the proteins identified in B-NMR interaction analysis of RPAP3-Cter with recombinant RUVBL1/2 complex. The (bottom lane). Intensity of the NMR signal (arbitrary units, y-axis) is plotted against the 1H graph depicts 1D NMR METHYL-SOFAST-HMQC spectra in the methyl region of 13C- anti-GFP immuno-precipitates of HeLa cells expressing GFP-RPAP3-Cter. Each dot is a protein and the color code is indicated below the graph. x-axis : protein abundance (Log10 of signal intensity) ; y-axis : enrichment over a control IP (Log2 of SILAC ratio). labeled RPAP3-Cter alone (top lane) or mixed with recombinant RUVBL1/2 complex E-Sequence of RPAP3-Cter, with corresponding -helices. F-Backbone orthogonal views (180C) of RPAP3-Cter structure in ribbon representation with corresponding -helices. chemical shift (in ppm, x-axis). Maurizy et al. 39 the same batch of RUVBL1/2 complex as in the control experiment (Figure S2C). E-Chromatographic analysis of the RUVBL complexes. The graph depicts the chromatograms C-SPR binding assays of RPAP3-Cter with RUVBL1/2. The graph depicts the response upon injecting the RUVBL1/2 complex (t 0s), or upon washing (t 300s), on immobilized RPAP3- spectrum presents the purified RUVBL1/2 complex. The bottom mass spectrum presents the same complex after addition of RPAP3-Cter. y-axis : signal intensity ; x-axis : m/z. Insets : zoom over the 8000-9000 m/z region. Schematics depict the complex observed. Blue : of purified RUVBL1-RUVBL2 (dashed grey, ) or RUVBL1-RUVBL2-RPAP3-Cter (black line, ), on a Superose 6 16/70 XK. x-axis : elution volume ; y-axis : Cter. x-axis : time (s) ; y-axis : response (arbitrary units). These data have been obtained with D-Native mass spectrometry analysis of recombinant RUVBL complexes. The upper mass RUVBL proteins ; red : RPAP3-Cter. multimers. A-Yeast two-hybrid analysis of interactions between RUVBL2 and RPAP3-Cter mutants. Alix is a negative control. * : strong interaction ; * : medium ; * : weak ; - : no interaction. B-Molecular surface representation of RPAP3-Cter structure, with the location of the mutants RUVBL1/2 binding. estimated to ~95 %. Lane 1 : Precision Plus Protein Unstained Standards (Biorad) ; Lane 2 : F-Electrophoresis of the purified RUVBL1-RUVBL2-RPAP3-Cter complex. The gel shows the peak fraction of the complex eluted from the column (black line in E), with a purity loosing interaction with RUVBL1/2 indicated in red. Blue : mutated residues not involved in absorbance. denatured RUVBL1-RUVBL2-RPAP3-Cter complex. Black arrow : RUVBL1 and RUVBL2 (52 and 53 kDa, respectively) ; grey arrow : RPAP3-Cter (15 kDa). Figure 3. The RPAP3 C-terminal domain interacts with R2TP clients via RUVBL1/2 Maurizy et al. 40 repectively. Legend as in Figure 2A. Figure 4. RPAP3-like and PIH1-like proteins interact with each other. deviation. Stars : values significantly greater than six-times the mean value obtained in the control IPs without anti-FLAG antibody (Ct). * : p-value (Z-test). co-precipitation of the RL fusion proteins (IP/Input), normalized by the IP/Input values obtained with the anti-FLAG IP of the 3xFLAG-FFL fusion protein. Error bars : standard plotting the IP efficiency of the indicated proteins. The values are the IP efficiencies of the mutant proteins. Top panel : schematic representation of the assay. Bottom panel : graph D, E-SILAC proteomic analysis of the partners of RPAP3-Cter-Mut1 and RPAP3-Cter-Mut2, A-Architecture of the human proteins containing a RPAP3-Cterminal domain (RPAP3-C), or DYX1C1 are shown, with their variable domains in hatched violet (RPAP3), or yellow B-Summary of pairwise LUMIER interaction assays between the indicated proteins. The C-LUMIER interaction assays between RL-RUVBL1/2 and RPAP3-like proteins tagged with mean value obtained in the control IP (Ct). * : p-value (Z-test). 3xFLAG-FL. Legend as in Figure 3C. Stars : values significantly greater than six-times the a PIH domain (PIH). Coiled-coil (CC), CHORD-containing proteins and SGT1 domain (CS) and TPR domains (TPR) are also indicated. Different splicing isoforms of RPAP3 and values are the efficiencies of the co-precipitation of the RL fusion proteins (IP/Input), expressed in percent of the efficiencies obtained with the 3xFLAG-FFL fusions. p-values are (DYX1C1). shown in Figure S4C. C-LUMIER assay showing the in vivo interaction between RPAP3-Cter and RUVBL1/2 Figure 5. Identification of R2TP-like complexes. Maurizy et al. 41 code is indicated between the graphs. Figure 6. Identification of PIH1D2 partners. strength of the Y2H interaction (PBS score). A : red ; B : dark blue ; C : green ; D : light blue. Lines with two dots indicate that the prey was found in the two libraries. A-LUMIER interaction assays between SPAG1 and RUVBL1/2. Legend as in Figure 3C excepted that an untagged PIH1D2 was co-expressed (lanes ' '), or SMD1 as control (lanes '-'). human libraries from lung carcinoma cell lines and testis. The color of the lines indicate the B-SILAC proteomic analysis of the partners of GFP-PIH1D2, GFP-DNAAF2, GFP- CCDC103, and GFP-PIH1D3, performed in HeLa cells. Legend as in Figure 2A. The color C-Models of possible R2TP-related complexes. A-Results of yeast two-hybrid screens using human PIH1D2 as bait and performed with B-Validation of the hits found in the yeast two-hybrid screens by LUMIER co-IP assays. The A-R2SP enhances expression of some of its clients. The graph depicts the relative expression HeLa cells not expressing it. Dark blue : experiment performed at 37C ; light blue : experiment with a t-test involving all the control samples ( 3). B-Binding of PPFIA2-related proteins to SPAG1 and PIH1D2. The graph depicts LUMIER interaction assays between the indicated proteins. Legend as in Figure 3C, with '*' indicating a graph depicts the results of LUMIER co-IP assays performed with the indicated proteins. Legend as in Figure 3C, with '*' indicating a p-value and '*' a p-value Figure 7. The R2SP complex promotes the stabilization of its clients and the assembly of liprin-2 complexes. levels of the indicated FFL-fusion proteins in HeLa cells expressing PIH1D2, versus parental performed at 32C. Values are normalized by the mean of controls (left) ; * : p-value p-value and '*' a p-value Maurizy et al. 42 C-R2SP promotes association of liprin-2 (PPFIA2) with its partners. The graph depicts LUMIER interaction assays between PPFIA2 and its partners, in HeLa cells expressing or not PIH1D2. Legend as in Figure 3C, with single black stars indicating a p-value and D-Assembly of liprin-2 complexes by R2SP. double black stars a p-value (Z-test comparing values of the FLAG IPs with six-times the mean value obtained in the control IP). Orange stars : comparison of HeLa and HeLa- PIH1D2 cells. Single star : p-values double stars : p-values < 0. 005 (t tests). Maurizy et al. 43 l x e p m o c P T 2 R C - 3 P A P R D A D S C R P T i s n a m o d r e h t o o N C - 3 P A P R R P T A C D F RUVBL1/2 B AAA L 1 U V U B R R RPAP3 PIH1D1 Amorphea Vertebrates Echinoderms Hemichordates Insects Nematodes Lophotrochozoa Cnidarians Sponges Choanoflagellates Dikarya Chytridiomycota Amoebozoa Archaeplastida Tracheophyta Bryophyta Chlorophyta SAR Excavata Stramenopiles Alveolates Rhizaria Euglenozoa Diplomonadida Parabasalia human RPAP3 isoform 1 RPAP3-C PIH1/CS L 2 B V P A 3 S A P P R 1 0 3 D G 11 C C 1 C X 1 Y D D 1 P I H 1 D 2 P I H D 1 3 D A N 1 P I H F 2 A M e t a z o a F u n g i S t r e p t o p h y t a H. sapiens, G. gallus, D. rerio S. purpuratus S. kowalevskii Insects, including D. melanogaster 6 species, including C. elegans C. gigas 3 species A. queenslandica M. brevicollis 6 species, including S. cerevisiae S. punctatus, N. californiae 6 species, including D. discoideum 10 species, including A. thaliana P. patens C. reinhardtii O. tauri 3 species, including P. infestans 5 species, including T. thermophila P. brassicae 6 species, including T. cruzi G. intestinalis T. vaginalis E Figure 1 C Binding and dissociation of RUVBL1/2 on immobilized RPAP3-Cter A SILAC IP OF GFP-RPAP3-Cter SILAC Ratio (Log2) C12orf45 POLR2A PFDN2 8 6 4 2 0 C2orf44 RPAP3-Cter DPCD GFP RUVBL1 RUVBL2 SHQ1 SNRNP200 EFTUD2 NOP58 BAG2 PRPF8 ZNHIT2 HSPA8 HSPA7 HSPA1A HSPA9 HSPA5 Intensity (Log10) 5 6 7 8 9 10 11 12 Chaperone R2TP R2TP-related SnoRNP U5 Polymerase Ribosome B D D NMR signal intensity Superose 6 elution profile E ) U A m ( e c n a b r o s b A RPAP3-Cter RPAP3-Cter RUVBL1/2 2 1 0 1H (ppm) F ) U A m ( e c n a b r o s b A RUVBL1/RUVBL2 RUVBL1/RUVBL2/RPAP3-Cter Volume (ml) Figure 2 A C B pACT-RUVBL2 pACT-Alix RPAP3 Cter- K584A-D587A- E604A-K605A- WT * - D589A K607A * - * - Q616A- R617A R623A-M626A F630A-S632A (Mut1) (Mut2) pACT-RUVBL2 pACT-Alix * - - - - - K636A- K637A E657A-E658A- K660A-K661A pACT-RUVBL2 pACT-Alix * - * - D SILAC IP OF GFP-RPAP3-Cter Mut1 LUMIER IP : FLAG FFL RPAP3-Cter RL RUVBL1/2 HEK 293T IP anti-FLAG MEASURE FIREFLY AND RENILLA ACTIVITIES IP / INPUTS IP EFFICIENCY (%) : RL (IP/INPUT) FL (IP/INPUT) * 12 9 6 3 0 * IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct FFL-RPAP3-Cter : WT Mut1 Mut2 WT Mut1 Mut2 6 4 2 0 SILAC Ratio (Log2) MVP RPAP3-Cter GFP IFI16 SHQ1 DDX24 RPAP2 USP9X ACYP2 PRMT1 SERPINB1 Intensity (Log10) E 6 4 2 0 RL-RUVBL1 RL-RUVBL2 Chaperone R2TP R2TP-related SnoRNP U5 Polymerase Ribosome 5 6 7 8 9 10 11 12 SILAC IP OF GFP-RPAP3-Cter Mut2 SILAC Ratio (Log2) GFP RPAP3 Cter CSRP2 IAH1 CAPNS1 FUS HSP70 HSPA7 RUVBL2 RUVBL1 5 6 7 8 9 10 11 12 Intensity (Log10) Figure 3 RPAP3 A DYX1C1 SPAG1 CCDC103 PIH1D1 PIH1D2 PIH1D3 DNAAF2 3xFlag-FFL-X DYX1C1-iso-a DYX1C1-iso-b DYX1C1-iso-c RPAP3-iso-1 RPAP3-iso-2 SPAG1 CCDC103 HSP70 HSP90 STIP1 PIH1D1 PIH1D2 PIH1D3 0. 4 0. 1 1. 0 0. 0 0. 1 0. 8 DNAAF2 42. 1 0. 3 0. 0 0. 3 0. 0 0. 0 0. 1 0. 3 1. 2 0. 3 1. 9 0. 2 0. 3 4. 2 0. 1 3. 0 0. 2 1. 9 41. 0 0. 2 0. 3 0. 3 1. 8 0. 1 1. 3 0. 7 0. 2 0. 2 0. 8 6. 7 0. 7 4. 8 0. 3 31. 3 0. 8 7. 7 1. 1 0. 3 1. 7 0. 1 0. 1 0. 2 0. 1 IP EFFICIENCY : RL (IP/INPUT) / FFL (IP/INPUT) [%] B Y - L R C FFL RPAP3-Like RL RUVBL1/2 2 * * FLAG IP EFFICIENCY (%) : RL (IP/INPUT) FL (IP/INPUT) U ) ( / HEK 293T IP anti-FLAG MEASURE FIREFLY AND RENILLA ACTIVITIES IP / INPUTS 1. 5 1 0. 5 0 RL-RUVBL1 RL-RUVBL2 * * * * IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct RPAP3-Iso1 RPAP3-Iso2 SPAG1 SPAG1-Cter DYX1C1-c CCDC103 CCDC103-Cter Figure 4 A B IP EFFICIENCY (%) : RL (IP/INPUT) FL (IP/INPUT) FFL SPAG1 PIH1D2 RL RUVBL1/2 FLAG 0. 4 0. 3 0. 2 0. 1 0 PIH1D2 : - - - - IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct RL fusion : RUVBL1 RUVBL1 RUVBL2 RUVBL2 FFL fusion : SPAG1 SILAC IP of GFP-PIH1D2 SILAC IP of GFP-DNAAF2 60 40 20 SILAC ratio GFP RTF1 DNAAF2 PPM1G DYX1C1-a RAD18 C11orf58 CDK11A CFDP1 UBE3D RUVBL1 EIF2AK1 PHGDH TCOF1 RUVBL2 Intensity (Log10) SILAC ratio 80 HSP70 SPAG1 60 40 20 0 FLNC PIH1D2 GFP MYH9 GAPDH ACTB FLNA ZBTB1 EEF1A2 MAGE2 BAG2 ENO1 PKM RUVBL2 RUVBL1 Intensity (Log10) 0 5 6 7 8 9 10 6 7 8 9 10 Chaperone R2TP-like Ribosome Others SILAC IP of GFP-CCDC103 SILAC IP of GFP-PIH1D3 30 SILAC ratio 150 SILAC ratio LRIF1 CCDC103 GFP HAX1 DNAJB6 HSP70 VBP1 RUVBL2 NUP93 DNAJA1 HSP70 HSC70 HSP90 Intensity (Log10) 100 50 0 PIH1D3 GFP SP2 BAG6 RUVBL1 KPNA2 RUVBL2 Intensity (Log10) 5 6 7 8 9 10 5 6 7 8 9 10 11 20 10 0 C HSP RUVBL1/2 SPAG1 PIH1D2 HSP RUVBL1/2 RPAP3-2 HSP RUVBL1/2 SPAG1 DNAAF2 R2SP R2T R2SD Figure 5 HSP DYX1C1-a DNAAF2 HSP DYX1C1-c PIH1D3 A Misc. RNA Transcription Chromatin DNA Protein modification Misc. RNA Golgi Membrane Cytoskeleton Cytoplasm Nucleus B IP EFFICIENCY (%) : RL (IP/INPUT) FL (IP/INPUT) RL-PIH1D2 binding assay * * 3 2 1 0 Testis-specific Enriched in testis and other tissues Enriched in endocrine tissues * * * * * * * * * * * * * IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct 3xFLAG-FFL- P PFIA2 ZBTB1 S E N P2 C L C N2 C D C A8 IT G B3B P AT R X H SF1 G O L G A6L2 Figure 6 T C P11 P PIA PATL1 EIF1AY PIK3C B EIF4A1 K P N A2 A Relative Firefly luciferase activity in GFP-PIH1D2-expressing versus parental HeLa cells Testis-specific Enriched in testis and other tissues Enriched in endocrine tissues 37C 32C 9 7 5 3 1 0 * * * * * * * * * * H SF1 G O L G A6L2 T C P11 P PIA PATL1 EIF1AY PIK3C B EIF4A1 K P N A2 * AT R X FFL fusions : FFL ALIX EFT U D2 P R PF31 N O P58 P PFIA2 ZBTB1 S E N P2 CLC N2 C D C A8 IT G B3B P B Controls PIH1D2 partners IP EFFICIENCY (%) : RL (IP/INPUT) FL (IP/INPUT) * * 1. 2 1 0. 8 0. 6 0. 4 0. 2 0 * RL fusion : IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct CASK PPFIBP2 RIMS PPFIA1 CASK PPFIBP2 RIMS PPFIA1 3xFLAG-FFL-SPAG1 3xFLAG-FFL-PIH1D2 C IP EFFICIENCY (%) : RL (IP/INPUT) FL (IP/INPUT) 3xFLAG-FFL-PPFIA2 (liprin- 2) binding assay 20 16 12 8 4 0 * * * HeLa HeLa-PIH1D2 * * * * * * * * * * * * * IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct IP Ct RL fusion : CASK PPFIA1 (liprin- 1) PPFIBP2 (liprin- 2) PTPRS RIMS1 2. 5 2. 0 1. 5 1. 0 0. 5 0 D Coiled-coil SAM domains Liprin 2 dimer Liprin 2 partners HSP RuvBL1/2 SPAG1 PIH1D2 RIMS1 CASK PTPRS Liprin dimer Figure 7 Table 1 : NMR statistics. NMR distances and dihedral constraints Distance constraints Total NOEs Short range (|i j| 1) Medium-range (|i j| < 5) Long-range (|i j| 5) Total dihedral angle restraints Structure statistics Violation occurences Distance constraints (> 0. 2 ) Dihedral angle constraints (> 5) Violations Mean distance constraints () Mean dihedral angle constraints () Max. dihedral angle violation () Max. distance constraint violation () R. m. s. deviations from idealized geometry Bond lengths () Bond angles () RMSD to best structure () All backbone atoms All heavy atoms Backbone atoms in secondary structures Heavy atoms in secondary structures Ramachandran statistics Residues in most favoured regions (%) Residues in additional allowed regions (%) Residues in generously allowed regions (%) Residues in disallowed regions (%) RPAP3535-665 3707 1704 1033 970 230 110 120 0 1. 30 1. 26 0. 10 0. 03 6. 70 1. 94 9. 99 0. 14 0. 013 1. 8 0. 98 0. 38 1. 33 0. 29 0. 37 0. 05 0. 94 0. 07 94. 3 5. 7 0. 0 0. 0 Maurizy et al. Table 2 RuvBL1/2 : RPAP3-Cter affinity and kinetic interaction parameters determined by SPR His RuvBL1 Flag RuvBL2 interaction with immobilized RPAP3-Cter KD (M) 4, 18x10 -9 1, 96x10 -9 kd (s-1) ka (M-1s-1) 1, 12x10 -3 2, 58x10 -4 2. 97x10 5 6. 35x10 4 n* 3 Maurizy et al. III. Discussion A. Caractérisation de la fonction du domaine C-terminal de RPAP3 La structure du complexe R2TP chez S. cerevisiae à basse résolution vient tout juste d'être publiée mais celle du R2TP humain présente toujours des zones d'ombre. Nos données sur le domaine C-terminal de RPAP3 (article n2) clarifient l'organisation du R2TP humain : RPAP3 C-ter lie directement les RUVBL1/2. D'autre part, on savait que RPAP3 recrutait directement HSP90 via ses domaines TPR (Pal et al. , 2014 ; Quinternet et al. , 2015)et PIH1D1 par un fragment situé après le TPR2 (données non-publiées de nos collaborateurs). Ceci en fait un élément central, constitutif du R2TP (Figure 35). De plus, les données sur les interactions dans les extraits cellulaires entre le domaine C- ter de RPAP3 et les RUVBL1/2 nous permettent de préciser le mode de fonctionnement du complexe R2TP et de proposer de nouvelles fonctions pour les RUVBL1/2. Dans le cas des snoRNP à botes C/D, on constate que NOP58 est recruté par le domaine RPAP3-Cter (article 2 Figure 2A), alors que le domaine N-ter de PIH1D1 lie SNU13 et la fibrillarine(Malinová et al. , 2017). Il en est de même pour les sous-unités des snoRNP à botes H/ACA : SHQ1, le chaperon de la dyskérine (et possiblement aussi celle-ci) est recruté par RPAP3-Cter tandis que NHP2 lie le domaine PIH de PIH1D1. Ceci suggère que, pour assembler les snoRNP, le R2TP recrute de manière indépendante, les différentes sous-unités concernées. Ces sous-unités seraient stabilisées par HSP90 puis remodelées par RUVBL1/2 (Figure 35). Les fonctions des domaines N-terminal et C-terminal de RPAP3 sont encore méconnues. Les expériences in vitro de nos collaborateurs montrent que le domaine C-terminal interagit directement et de façon très stable avec les protéines AAA ATPase RUVBL1/2 sous forme dodécamérique (deux hétéro-hexamères superposés) (article 2, Figure 2 B, C). L'absence d'interaction des clients dans les mutants du domaine RPAP3 C-ter n'interagissant plus avec RUVBL1/2 suggère que ces clients sont liés à RPAP3 via RUVBL1/2. Le rôle exact de ces AAA ATPases reste encore incompris. Le domaine RPAP3-Cter pourrait maintenir les RUVBL (sous forme RUVBL-Apo ou RUVBL-ADP) dans une conformation favorable à leur aux substrats. La forme liée à l'ATP (mutant E->Q), qui ne lie plus RPAP3(article n2, Figure 2 D) pourrait être une forme activée des RUVBL, dans laquelle elles interagiraient uniquement avec leurs substrats. Le rôle de RPAP3, sur le modèle HOP, serait de maintenir les RUVBL dans une conformation ouverte pour recruter les substrats, après leur stabilisation par HSP90. L'arrivée de l'ATP déplacerait RPAP3 tandis que l'hydrolyse d'ATP provoquerait une dissociation de l'hétéro- hexamère de RUVBL. Cette dissociation induirait un changement de conformation du substrat. 181 Cela expliquerait que, en biochimie, on détecte plus facilement l'interaction des substrats avec RUVBL1/2 qu'avec RPAP3/PIH1D1. Figure 36 : Représentation des interactions au sein du R2TP au cours de l'assemblage des snoRNP à botes C/D RPAP3 lie HSP90 grâce à son domaine TRP, PIH1D1 via un fragment situé après le TPR2, et RUVBL1 et 2 par son domaine C-terminal. L'hétéro-hexamère de RUVBL1 et RUVBL2 lie le substrat NOP58, une protéine des snoRNP à botes C/D. PIH1D1 lie la fibrillarine(FBL) et SNU13, grâce à son domaine N-terminal (domaine PIH), d'autres protéines des snoRNP à botes C/D. Enfin, PIH1D1fixe RPAP3 par son domaine C-terminal appelée domaine CS. 182 Figure 37 : Assemblage des complexes macromoléculaires par le R2TP 1) HSP90 s'occuperait du repliement de certaines sous-unités ici (B) qu'elle présente au complexe R2TP. Le R2TP prend en charge directement une autre catégorie de sous unité (A) via PIH1D1. RUVBL1 et RUVBL2 seraient maintenues en conformation apo par RPAP3 par son domaine C- terminal pour favoriser l'interaction avec les substrats. 2) L'interaction entre RPAP3 et HSP90 permettrait le chargement des sous unités B sur les ATPases. Le substrat livrée, HSP90 serait libérée. 3) A l'arrivée de l'ATP, RPAP3 et PIH1D1 quitteraient le R2TP. Les RUVBL1/2 assureraient l'incorporation des substrats ainsi que le changement de conformation nécessaire grâce à l'hydrolyse de l'ATP. 4) RUVBL1/2 lié à ADP ou apo et le complexe AB nouvellement assemblé se dissocieraient. Les ATPases seraient alors recylées pour reformer du R2TP. Certaines étapes restent encore à élucider. 183 B. Mise en évidence d'un nouveau complexe tissu-spécifique, le R2SP, apparenté au R2TP Comme nous l'avons vu dans l'introduction, l'organisme humain possède d'autres protéines similaires à RPAP3 et PIH. Nous n'avons pu mettre en évidence que certaines paires d'interactions telles que SPAG1-DNAAF2 mais pas de complexe avec les RUVBL1/2. Certaines de ces protéines sont peu ou pas exprimées dans les cellules HeLa, ce qui peut expliquer les différences des résultats obtenus par protéomique SILAC (o seule la proie est surexprimée) et les tests d'interactions LUMIER (o les deux partenaires sont co-exprimés). Les ARNm de DNAAF2 et de SPAG1 dans les cellules HeLa sont exprimés à des niveaux similaires. Dans les expériences d'IP SILAC en cellules HeLa, cependant, nous ne détectons pas DNAAF2 dans les IP de SPAG1. La formation de cette paire dépend peut-être des conditions de culture ou des cellules utilisées. Notons aussi que les cellules HeLa, dépourvues de cil, ne sont sans doute pas le meilleur système pour étudier des protéines impliquées dans la ciliogénèse. Cependant, ce système nous permet des comparer les résultats d'IP entre des protéines exprimées dans des tissus différents. L'idéal serait de disposer d'un système cellulaire cilié et compatible avec le protocole d'IP SILAC. L'étude en protéomique de PIH1D2 nous a permis de confirmer l'existence d'un nouveau complexe d'assemblage : le R2SP. R2SP semble fonctionner sur le même modèle que le R2TP. L'autre fait intéressant est la tissu-spécificité de ce complexe. En effet, SPAG1 et PIH1D2 sont tous les deux exprimés dans les testicules. Grâce au crible de double hybride et à des expériences en cellules, nous avons mis en évidence un substrat du R2SP : la Liprine 2. PIH1D2 n'avait pas été mis en évidence dans des ciliopathies, contrairement à son partenaire SPAG1. L'assemblage de la Liprine 2 avec ses partenaires montre que la fonction du R2SP n'est pas limitée à la ciliogénèse. Certains tissus présentent des conditions de températures, ou de pH particulier qui pourrait nécessiter l'aide de complexes d'assemblage spécifiques. Ainsi, le R2SP semble plus efficace sur la Liprine a2 à 32C qu'à 37, soit à la température des testicules. HSP90 est induite sous l'influence de stress comme les chocs thermiques, et sa délétion engendre notamment un défaut de la spermatogénèse (Grad et al. , 2010). Il est possible que cette chaperonne soit associée à un complexe de type R2TP dans cet organe pour assembler des complexes macromoléculaires ou les dynéines du flagelle des spermatozoïdes nécessaires au déroulement de la spermatogenèse. 184 C. Ciliogenèse motile et les complexes apparentés au R2TP Les protéines de type RPAP3 et PIH avaient toutes été mises en cause dans des maladies liées à la ciliogénèse (sauf Pih1D2, exempt de publication), et plus particulièrement dans l'assemblage des dynéines des cils (Dong et al. , 2014 ; Knowles et al. , 2013 ; Omran et al. , 2008 ; Panizzi et al. , 2012 ; Tarkar et al. , 2013). D'autre part, les données d'immunofluorescence montrent une localisation cytoplasmique, hors du cil, pour la plupart de ces protéines (Tarkar et al. , 2013). Le modèle que nous proposons est que ces complexes R2TP-like sont impliqués dans l'assemblage de dynéines dans le cytoplasme, avant leur adressage aux cils. De fait, quelques études ont dressé un parallèle entre la base du cil motile et les pores nucléaires (McClure-Begley et Klymkowsky, 2017 ; Torrado et al. , 2016). Le modèle d'action de ces nouveaux complexes (dont le R2SP) pourrait ressembler à celui proposé pour l'assemblage de l'ARN polymérase II par le R2TP : les sous unités de l'ARN polymérase II sont assemblés par le R2TP dans le cytoplasme, le complexe mature migre ensuite vers le noyau pour accomplir sa fonction (Figure 23). Il est possible que le R2SP ait aussi des substrats impliqués dans la ciliogenèse : le R2SP aurait des substrats différents suivant les tissus. Les autres complexes de type R2TP semblent impliqués dans des ciliopathies mais pourraient l'être aussi dans d'autres processus. La mise en évidence de protéines similaires à RPAP3 questionne sur la redondance fonctionnelle de ces protéines. SPAG1 est, d'après les banques de données, exprimé dans l'intestin, tout comme DYX1C1 ( mais, dans notre modèle murin d'invalidation de RPAP3, il ne semble pas y avoir de compensation. Ces données suggèrent que les différents R2TP-like ont chacun des substrats spécifiques. Il est donc important d'arriver à mieux les caractériser pour mieux les comprendre tout comme le R2TP. Notre étude ouvre donc des perspectives sur la fonction des RVBL1 et 2 qui ont trouvé ici de nouveaux partenaires, mais aussi sur la compréhension du mode d'action du R2TP et des complexes associés. Rôle de RPAP3 dans le maintien des cellules prolifératives de D. l'épithélium intestinal et de la voie Wnt Nos résultats chez les souris Vil-Cre-ERT2 ; RPAP3 flox/flox montrent que RPAP3 est essentiel pour la prolifération des CBC et du TA. Nous cherchons à savoir si ce phénotype intrinsèque aux cellules souches CBC. L'absence de phénotype visible par coloration HE sur l'épithélium dans le modèle d'invalidation de RPAP3 dans les CBC (Lgr5-GFP-IRES-CreERT2) peut s'expliquer par la l'expression mosaïque de cette construction (Barker et al. , 2007). Une autre explication est que 185 les cellules CBC ne sont pas irremplaçables (H. Tian et al. , 2011) ainsi si elles sont éliminées par la délétion de RPAP3, les progéniteurs situés dans le TA ou les cellules 4 prendront le relai afin de préserver l'intégrité de l'épithélium. Lorsque la Cre est sous contrôle du promoteur de la Villine, toutes les cellules de l'épithélium sont touchées donc la compensation ne peut pas avoir lieu. Nous montrons ici un rôle potentiel de RPAP3 dans la prolifération cellulaire, ceci supporté aussi par le fait que les cellules de Paneth, qui ont un temps de renouvellement plus long que les autres cellules de l'épithélium, ne sont pas affectées. Ces données amènent aussi à se demander si les cellules 4 , qui sont des cellules quiescentes, sont elles aussi affectées par la délétion de RPAP3 ou non. RPAP3 serait nécessaire au maintien de toutes les cellules souches en préservant leurs caractéristiques. Il est important de comprendre la cascade d'événements aboutissant au phénotype drastique observé dans l'épithélium intestinal. RUVBL1/2 ont été décrites comme interagissant physiquement avec la caténine(Bauer et al. , 1998, 2000). Si le R2TP assure l'assemblage des complexes régulateurs de la transcription de la voie Wnt, les RUVBL auraient pour rôle de recruter ces protéines et de modifier leur conformation pour mieux les insérer dans le complexe. Le phénotype observé ressemble à celui décrit pour la délétion de TCF4, qui code pour un cofacteur transcriptionnel de la -caténine (van Es, Haegebarth, et al. , 2012). La délétion du gène d'un autre cofacteur de cette voie, BRG1 (aussi appelé SMARCA4), dans toutes les cellules épithéliales (avec la VilCreERT2) entrane lui aussi une perte des cellules souches ainsi que du TA, proche de mes observations (Holik et al. , 2013). BRG1 est une unité centrale d'un complexe remodeleur de la chromatine appelé BRG1/BAF de la famille de SWI/SNF (W. Wang et al. , 1996). Ces complexes sont recrutés par des facteurs de transcription aux promoteurs de gènes pour permettre une transcription efficace par la polymérase II. Plusieurs études ont montré que BRG1 était nécessaire à l'activation transcriptionnelle par la -caténine (N Barker et al. , 2001 ; Park et al. , 2009). L'ensemble de ces données suggère que le R2TP pourrait assembler le complexe associé à BRG1 ou l'interaction entre caténine/BRG1/TCF4. Une fois assemblé dans le cytoplasme les partenaires migreraient vers le noyau au promoteur des gènes cibles de la voie Wnt. TRRAP (une PIKK) est une des sous unités des complexes co-transcriptionnels SAGA et TIP60, dont font également partie les protéines RUVBL1 et RUVBL2. TRRAP, comme els autres PIKK, est assemblée avec ses partenaires par le R2TP via TELO2 (Takai et al. , 2010)et nos résultats non-publiés). Chez la drosophile, il a été montré que l'homologue de TRRAP (Nipped- A), était nécessaire à la prolifération des cellules souches intestinales (Tauc et al. , 2017). Bien que la drosophile et la souris soient des organismes assez différents, il est possible que le rôle de TRRAP, cible du R2TP, soit aussi conservé chez la souris. Ceci suggérerait que SAGA ou TIP60 soient recrutés par la b-caténine pour activer la transcription de ses gènes cibles. L'absence de 186 RPAP3, empêchant l'assemblage de SAGA et TIP60, entranerait la perte des cellules souches intestinales. E. Rôle deRPAP3 dans l'épithélium du côlon Curieusement, l'épithélium colique est affecté plus tardivement que l'intestin. Il a déjà été suggéré que la VilCreERT2était moins pénétrante dans le côlon que dans l'intestin grêle, le phénotype serait donc moins tranché. Cela pourrait aussi s'expliquer par une cinétique différentielle de renouvellement de l'épithélium du côlon par rapport à l'intestin grêle. Le renouvellement de l'épithélium colique se ferait en 5 à 7 jours contre 3 à 5 jours pour l'intestin (Nick Barker, 2014). Cela peut varier en fonction des agressions par les pathogènes et agents extérieurs présents dans la lumière intestinale. Une troisième hypothèse serait une sensibilité différentielle du côlon par rapport à l'intestin grêle. Ainsi, Holik et ses collaborateurs observent que la délétion de BRG1 entrane un phénotype drastique dans l'intestin grêle et rien d'apparent dans l'épithélium du côlon. Cela s'explique par l'expression dans le côlon de Brahma (Brm), un homologue de BRG1 capable de compenser sa perte (Holik et al. , 2013). Si on suppose que nos observations s'expliquent par un effet de R2TP sur l'assemblage de BRG1 avec TCF4 et caténine, Brahma pourrait compenser l'absence de BRG1 au niveau du côlon et sauver le phénotype de prolifération via la voie Wnt. Ce modèle sous-entend que Brahma ne serait pas substrat de R2TP. Dans un premier temps, je vais vérifier le rôle de RPAP3 sur la voie Wnt. Pour ce faire, afin d'adresser la question d'un point de vue moléculaire, nous utiliserons le système TOP/FOP dans des lignées cellulaires de type HCT116 (une lignée humaine d'origine tumorale colique) modifiées par CRISPR Cas9 o la délétion de RPAP3 peut être induite par une dose d'auxine ou par siRNA. Dans ce système, l'activation de la voie Wnt induit l'expression de la GFP sous rapporteur TOP, alors que des mutations dans le rapporteur FOP permettent de mesurer le niveau basal de fluorescence. Avec cette expérience, nous pourrons vérifier si RPAP3 affecte ou non l'activité de la voie Wnt. Le phénotype observé dans le côlon à jour 17 pourrait résulter de la déstabilisation d'un autre substrat du R2TP, par exemple mTOR. mTOR est connu pour jouer un rôle dans la prolifération cellulaire. En fait, mTOR semble surtout jouer un rôle dans la régénération de l'épithélium intestinal : sa délétion constitutive dans l'épithélium intestinal n'est pas létale (Sampson, Davis, Grogg, & Zheng, 2016). Plusieurs études ont montré l'implication de mTOR dans la différenciation des cellules de Paneth mais aussi des cellules à mucus (Sampson et al. , 2016 ; Yilmaz et al. , 2012 ; Y. Zhou, Rychahou, Wang, Weiss, &Evers, 2015). De plus, cette régulation se ferait via la voie de signalisation de Notch (Yilmaz et al. , 2012 ; Y. Zhou, Rychahou, Wang, Weiss, &Evers, 2015). Un des phénotypes de l'inhibition de la voie Notch est la 187 différenciation massive des cellules progéniteurs en cellules sécrétrices de type cellules à mucus (H. Tian et al. , 2015). Nos données montrent une perte de la prolifération sans différenciation massive. L'effet de RPAP3 sur le maintien des CBC et du TA ne semble donc passer ni par la voie Notch ni par mTOR dans l'intestin grêle. Cependant, à jour 17, il semble qu'il y ait une augmentation du nombre de cellules à mucus dans le côlon. Nous attendons le marquage PAS pour confirmer l'observation faite en HE. Si elle est avérée, la délétion de RPAP3 pourrait affecter des voies de signalisation différentes dans l'intestin et dans le côlon. Cependant l'effet que nous observons pourrait aussi bien être dû à un substrat encore inconnu du R2TP. Nous avons découvert récemment dans nos études de protéomiques du domaine N-ter de PIH1D1 de nouvelles protéines qui n'étaient pas encore caractérisées comme des clients du R2TP. F. Régénération du l'épithélium intestinal après l'invalidation de RPAP3 La régénération de l'épithélium visible à jour 17 pourrait s'expliquer par les cryptes résiduelles, visibles à jour 10. Ainsi les premiers jours, lorsque l'épithélium est détruit, ces souris puiseraient dans leurs réserves jusqu'à la régénération de l'épithélium. Le renouvellement se régénérant en quelques jours, 7 jours après l'état critique, l'épithélium pourrait être opérationnel. Cela expliquerait la chute de poids jusqu'à jour 10 puis la remontée progressive, peut être au fur et à mesure que l'épithélium se renouvelle. Cependant, le tissu observé à jour 17 ne semble pas être un tissu normal. Les villosités sont dédoublées, certaines cryptes semblent se superposer. Cette régénération sem | HAL | Scientific |
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Introduction Une atteinte du système nerveux périphérique (SNP) est souvent évoquée devant un déficit sensitif et moteur, le plus souvent distal associé parfois à une atteinte du système nerveux autonome Elle doit être distinguée des affections du système nerveux central, des atteintes du plexus ou même du motoneurone Néanmoins, certaines neuropathies peuvent n'intéresser que le corps cellulaire et l'axone du neurone Elles engendrent alors des neuropathies motrices, telles que les neuropathies motrices multifocales avec blocs de conduction, ou ne toucher que le ganglion rachidien postérieur et ne donner qu'une symptomatologie sensitive De même, certaines formes motrices de neuropathies peuvent prêter à confusion avec certaines formes de myopathies ou des maladies de la jonction neuromusculaire Les neuropathies périphériques sont distinguées selon trois grands groupes : les mononeuropathies définies par l'atteinte d'un seul tronc nerveux ; les mononeuropathies multiples (ou multinévrites) caractérisées par une atteinte successive de plusieurs troncs nerveux ; et les polyneuropathies distales avec atteinte diffuse et symétrique des quatre membres À l'inverse, les polyradiculoneuropathies se distinguent des neuropathies distales par la présence d'un déficit moteur proximal et distal La distinction faite entre ces différentes formes de neuropathies est essentielle à la démarche diagnostique et permet d'éviter des examens biologiques inutiles Cependant, il faut bien reconnatre que de nombreuses polyneuropathies restent sans diagnostic, les différentes séries situant ce pourcentage entre 25 et 40 % selon les centres De nombreuses difficultés peuvent apparatre lors de la prise en charge d'un patient suspect de neuropathie périphérique La première difficulté est d'identifier le type de la neuropathie (axonopathie, myélinopathie ou neuronopathie) et sa cause La deuxième difficulté consiste à définir au mieux l'approche thérapeutique qu'elle soit symptomatique et/ou thérapeutique Reconnatre les signes cliniques en faveur d'une neuropathie Les signes cliniques évocateurs d'une atteinte du SNP comprennent la symptomatologie motrice et sensitive Les symptômes moteurs regroupant l'amyotrophie, les crampes, les fasciculations et le déficit moteur, coté selon la classification MRC entre 0 et 5 La symptomatologie sensitive se décline en symptômes négatifs tels que l'anesthésie, l'hypoesthésie tactile ou proprioceptive et l'ataxie traduisant un dysfonctionnement des fibres myélinisées de gros calibre L'hypoalgésie, l'anesthésie douloureuse et l'hypoesthésie thermique orientent vers une atteinte des petites fibres de type A et C La symptomatologie sensitive inclue également des signes positifs tels que les paresthésies, les dysesthésies et la symptomatologie douloureuse comme l'hyperpathie, l'hyperalgésie ou l'allodynie Enfin, l'arefléxie ou l'hyporefléxie, symétrique en cas de polyneuropathie, ou asymétrique en cas de mononeuropathie est une constatation classique de l'examen clinique Cependant, dans certaines formes de neuropathies motrices telles que les formes motrices de Guillain-Barré ou les formes spinales de Charcot-Marie-Tooth (CMT), les réflexes ostéotendineux (ROT) peuvent être conservés Les différentes étapes de l'examen clinique préciseront la topographie du déficit neurologique, les signes cliniques associés, les circonstances d'installation, le mode d'installation et le contexte dans lequel survient la neuropathie Enfin la recherche des signes cliniques extraneurologiques permettra, tout comme les éléments précités, d'en faciliter la démarche diagnostique avant de la préciser par l'électrophysiologie et la réalisation d'autres examens complémentaires Préciser la topographie du déficit neurologique Dans les polyneuropathies dites longueur-dépendantes , qui sont les plus fréquentes, le déficit moteur et/ou sensitif est symétrique et distal, en rapport avec la longueur des axones détruits Le déficit moteur débute plus fréquemment aux membres inférieurs puis gagne les membres supérieurs En revanche, les polyneuropathies non-longueur dépendantes sont rares Ainsi, dans les polyradiculoneuropathies, le déficit moteur est volontiers proximal, peut intéresser la face ou le tronc, sans rapport avec une atteinte dite longueur-dépendante car la démyélinisation se fait au hasard Les mononeuropathies sont caractérisées par un déficit moteur et sensitif asymétrique intéressant un ou plusieurs troncs nerveux Enfin, dans certaines neuropathies, le déficit moteur et/ou sensitif peut d'emblée intéresser les membres supérieurs tels que les neuronopathies du syndrome de Gougerot-Sjgren , les neuropathies dysimmunitaires de type neuropathies motrices avec blocs de conduction et certaines neuropathies toxiques consécutives au saturnisme Certaines neuropathies se caractérisent par une atteinte élective de certaines fibres sensitives Lorsque cette atteinte intéresse les fibres myélinisées de gros calibre comme dans les lésions du ganglion rachidien postérieur (les ganglionopathies), la neuropathie est volontiers asymétrique, et se caractérise par une ataxie proprioceptive associée à un tremblement des extrémités et une aréflexie Lorsque l'atteinte intéresse les petites fibres, l'examen neurologique peut être normal (la douleur étant le symptôme majeur) ou révéler une hypoesthésie thermique ou douloureuse alors que les sensibilités épicritique et proprioceptive sont intactes Dans ce dernier cas, une atteinte du système nerveux autonome peut y être associée À l'inverse, le déficit peut être moteur pur et symétrique comme dans les formes motrices de Guillain-Barré, les amyotrophies spinales ou asymétriques telles les neuropathies multifocales motrices à blocs de conduction L'atteinte des nerfs crâniens est rare dans les neuropathies Cependant la paralysie faciale sera évocatrice d'une sarcoïdose, d'une polyradiculoneuropathie aigu ou chronique, d'une maladie de Lyme L'atteinte du trijumeau oriente plus vers une neuropathie consécutive au Gougerot-Sjgren Les autres symptômes accompagnant les neuropathies périphériques Le syndrome des jambes sans repos peut parfois être observé dans les neuropathies périphériques, notamment dans les neuropathies des dialysés Le tremblement des extrémités est l'apanage des neuropathies héréditaires de type CMT et des neuropathies démyélinisantes dues à une IgM monoclonale avec activité anti-MAG ( myelin associated glycoprotein ) qui s'associe souvent à un tremblement orthostatique Les déformations articulaires telles que les pieds creux, les orteils en griffe, la scoliose sont fréquemment observées au cours des neuropathies héréditaires de type CMT L'hypertrophie nerveuse, fréquemment observée dans les neuropathies héréditaires démyélinisantes siège souvent au cou, aux chevilles, au dos du pied et peut être responsable des hypertrophies nerveuses des racines lombosacrées Circonstances d'installation de la neuropathie Comme dans tout interrogatoire, l'origine ethnique du patient et son âge sont importants à préciser car les orientations diagnostiques et la probabilité de trouver une étiologie à la neuropathie ne sont pas les mêmes en fonction de l'âge auquel a débuté la neuropathie Chez les sujets âgés, la cause des neuropathies axonales demeure souvent inconnue Les antécédents médicaux, les affections métaboliques tels que le diabète, l'hypothyroïdie, l'insuffisance rénale ou une intoxication alcoolique doivent être notés systématiquement car ils sont souvent omis par le patient qui ne les tient pas pour responsable de la neuropathie L'inventaire des thérapeutiques est une seconde étape essentielle pour dépister les neuropathies toxiques ainsi que la profession du patient car certains produits ont un tropisme pour le nerf périphérique Les troubles de la marche dans l'enfance, un retard des acquisitions motrices et des difficultés en sport orientent vers une neuropathie ancienne souvent héréditaire Dans ce dernier type, la notion d'autres membres de la famille présentant ce type de neuropathies est également un élément évocateur de neuropathie héréditaire Mode d'installation et mode évolutif Le mode d'installation est capital à préciser car il peut orienter vers l'étiologie de la neuropathie On distingue ainsi : les formes aigus définies par une installation en quelques heures jusqu'à quatre semaines ; les formes subaigus caractérisées par une installation en quelques semaines jusqu'à quelques mois ; enfin, les formes chroniques font référence à des neuropathies installées sur plusieurs années, ayant souvent débuté dans l'enfance L'examen des autres organes : les indices orientant la démarche étiologique La peau est une étape essentielle dans l'examen clinique d'une neuropathie, car elle est souvent le reflet de la sévérité de la neuropathie et permet d'orienter vers son étiologie Les ulcères plantaires ou des dernières phalanges sont caractéristiques des neuropathies ulcéromutilantes, qu'elles soient d'origine diabétique, alcoolocarentielle ou plus rarement observées dans le cadre de neuropathies sensitives et dysautonomiques héréditaires Une peau sèche, fine associée à une dépilation est l'apanage des neuropathies longueur dépendantes, comme cela est le cas dans les neuropathies alcoolocarentielles La présence d'un purpura, d'un livedo, d'une nécrose des orteils et des doigts orientera vers une vascularite , une cryoglobulinémie, une maladie de Waldenstrm ou une hépatite C La mélanodermie diffuse fera référence au POEMS syndrome ( polyneuropathy, organomegaly, endocrinopathy, monoclonal gammopathy, skin changes ) alors que la dépigmentation en patchs orientera vers une sarcoïdose ou exceptionnellement dans nos contrées vers une lèpre Les modifications des phanères incluent l'alopécie, observée dans l'hypothyroïdie, le lupus érythémateux systémique ou l'intoxication au thallium L'atteinte oculaire, qu'elle soit inflammatoire (uvéite, sclérite) ou dégénérative (cataracte, atrophie optique, rétinite pigmentaire) peut être utile dans l'orientation diagnostique d'une neuropathie De même, les modifications pupillaires telles que les pupilles toniques sont observées dans certaines étiologies telles que la syphilis, le Gougerot-Sjgren Examens complémentaires L'électroneuromyographique L'examen électroneuromyographique (ENMG) se conçoit comme une extension de l'examen clinique Cet examen permet de définir le site de la lésion (tronculaire, radiculaire, plexulaire ou le corps cellulaire moteur ou sensitif), d'en déterminer le mécanisme (axonal ou démyélinisant) et d'orienter vers le diagnostic étiologique et d'établir un pronostic évolutif Néanmoins, lorsque la neuropathie est évoluée, la distinction entre forme axonale et démyélinisante est parfois difficile L'ENMG permet parfois de suspecter d'emblée un diagnostic étiologique La présence d'un ralentissement des vitesses de conduction motrice dans les zones d'étroitesse anatomique associé à la présence de blocs de conduction dans les zones d'étroitesse anatomique permet de suspecter une neuropathie héréditaire avec hypersensibilité à la pression ( HNPP ) La présence de ces blocs de conduction signe la nature démyélinisante de la neuropathie Ces blocs de conduction sont aussi observés dans les polyradiculoneuropathies aigus et chroniques ou dans les neuropathies motrices pures avec blocs de conduction Cependant, au contraire des HNPP, ces blocs résident en dehors des points de compression Ils sont persistants et proximaux dans les neuropathies motrices avec blocs de conduction alors qu'ils sont souvent transitoires dans les polyradiculoneuropathies Concernant les neuropathies démyélinisantes, certains critères accordant plus d'importance aux blocs de conduction et à la dispersion des réponses motrices, ont été proposés par différents auteurs Au terme de cet ENMG, on peut préciser : Le type de la neuropathie : mononeuropathie unique ; mononeuropathie multiple ; polyneuropathie longueur dépendante ou non ; le mécanisme physiopathologique : les axonopathies : la lésion principale intéresse l'axone ; les myélinopathies : la lésion principale se situe au niveau de la gaine de myéline ; les formes mixtes axonales et démyélinisantes ; les neuronopathies, qu'elles soient motrices ou sensitives (ganglionopathie) lorsque la lésion principale se situe au niveau du corps cellulaire de la cellule nerveuse ; la sévérité de la neuropathie caractérisée par : une réduction du potentiel d'amplitude moteur (PAM) et sensitif et des vitesses de conduction motrice (VCM) et sensitive ; une dénervation active en électromyographie (fibrillations et ondes lentes positives) Bien que l'ENMG soit une étape essentielle au diagnostic de la neuropathie, il peut être normal ou peu altéré en début d'évolution d'une neuropathie, l'exemple le plus fréquent étant celui du syndrome de Guillain-Barré Il faut alors savoir répéter l'étude électrophysiologique afin de poser un diagnostic correct Il faut également souligner que les neuropathies à petites fibres échappent à l'ENMG puisque cet examen étudie essentiellement les fibres myélinisées de grand diamètre Le diagnostic de neuropathie à petites fibres est difficile car l'examen neurologique peut être normal et les examens de routine permettant de poser le diagnostic font défaut Le recours à des méthodes électrophysiologiques plus sophistiquées telles que les potentiels évoqués nociceptifs, permettent actuellement d'avoir des critères objectifs pour le diagnostic de ces neuropathies La biopsie cutanée permet d'étudier les fibres nerveuses non myelinisées intraépidermales, dont la dépopulation signe la présence d'une neuropathie à petites fibres Cependant, cet examen n'est pas actuellement pratiqué de façon courante, car les méthodes d'analyse de ces fibres sont lourdes et plutôt réservées à la recherche L'examen du système nerveux autonome De nombreux tests sont disponibles Les tests évaluant la fonction autonomique cardiaque tels que le test d'hypotension orthostatique ou la mesure de l'intervalle RR pendant et après une manœuvre de Valsava sont les plus connus permettant de mettre en évidence une atteinte du système nerveux autonome La fonction sudorimotrice peut être évaluée par le réflexe cutané sympathique, enregistré au moyen d'électrodes de surface appliquées sur les paumes des mains et la plante des pieds On enregistre, après une stimulation sonore ou électrique, l'amplitude de la réponse sudorimotrice cutanée Si celle-ci est absente ou diminuée de plus de 50 %, on estimera qu'il existe une atteinte de ces fibres sudorimotrices, témoignant d'une atteinte du système nerveux autonome Ce test est de réalisation simple, notamment lorsqu'il est suspecté une atteinte du système nerveux autonome comme dans le diabète Cependant, il ne permet pas une quantification du déficit, contrairement au test quantitatif sudorimoteur qui permet d'évaluer la réponse sympathique postganglionnaire des axones sudorimoteurs Ce dernier test n'est pas utilisé de façon courante dans la pratique quotidienne Les examens à visée diagnostique Il est difficile de dresser une liste exhaustive des examens biologiques utiles dans les neuropathies périphériques qui doivent toujours tenir compte du contexte clinique Néanmoins, on peut établir une liste minimale des examens répondant aux causes les plus fréquentes de neuropathies Les autres examens cités ci-après seront demandés en seconde intention et orientés par le contexte clinique Les examens paracliniques demandés en première intention NFS à la recherche d'une hémopathie, d'une leucopénie ; VS et CRP à la recherche d'un syndrome inflammatoire ; glycémie à jeun et postprandiale, hémoglobine glyquée, urée, créatinine, bilan thyroïdien (TSHus) ; transaminases (cause toxique, infection, maladie de système) ; dosage de vitamines (B1, B12, folates) ; sérologies d'hépatites B, C, du virus de l'immunodéficience humaine (VIH), de Lyme ; immunoélectrophorèse (voire immunofixation) des protéines (sang et urines) à la recherche d'une gammapathie monoclonale, de chanes légères, un dosage de cryoglobulinémie ; radiographie de thorax (recherche d'adénopathies médiastinales, d'un nodule suspect, d'un syndrome interstitiel. ) Les autres examens biologiques pratiqués en seconde intention Le dosage des anticorps spécifiques Les anticorps antinucléaires, anti-SSA, SSB, p- et c-ANCA seront demandés en cas de suspicion de lupus, de Gougerot-Sjgren ou de maladie de Wegener Les anticorps antigliadine seront dosés en cas de suspicion de maladie cœliaque qui peut causer des neuropathies sensitives d'évolution chronique De même, les anticorps anti-Hu, Yo, CV2 seront dosés en cas de suspicion d'un syndrome paranéoplasique, lorsque la neuropathie évolue dans un contexte néoplasique ou lorsqu'il s'agit d'une ganglionopathie d'évolution subaigu Les anticorps antiglycolipides Les anticorps antiglycolipides réagissent contre des épitopes de la région carbohydrate des glycolipides et sont présents en grande quantité dans le système nerveux périphérique et central Ils ont un intérêt dans le diagnostic des neuropathies sensitivomotrices démyélinisantes associées à une gammapathie monoclonale de type IgM, présentant dans 50 % des cas une activité anti-MAG et une activité croisée avec d'autres glycolipides tels que le SGPG (sulfoglucuronylparagloboside) ou le SGLPG (Dans ce cas, la biopsie nerveuse révèle un aspect de myéline décompactée, caractérisée par un élargissement des espaces entre les lamelles de myéline Dans les neuropathies motrices avec blocs de conduction (NMBC), des anticorps anti-GM1 de type IgM ont été décrits dans 30 à 50 % des cas Bien que leur présence soit un argument en faveur du diagnostic, ces anticorps ne peuvent être utilisés comme marqueur évolutif ni comme paramètre de sensibilité aux thérapeutiques Enfin, la présence d'une activité antiglycolipide dans les polyradiculonévrites aigus permet d'identifier des formes cliniques particulières telles que les formes axonales de Guillain-Barré, associées aux infections à Campylobacter jejuni et à la présence d'anticorps anti-GM1 de type IgG Il faut surtout souligner également la très grande spécificité des anticorps anti-GQ1b de type IgG dans le syndrome de Miller-Fisher, associant ataxie, ophtalmoplégie et aréflexie L'analyse du liquide céphalorachidien (LCR) Il peut mettre en évidence une hyperprotéinorachie dans les polyradiculoneuropathies, les neuropathies paranéoplasiques, diabète Une hyperlymphocytose fera évoquer un lymphome, une infection à VIH, une maladie de Lyme, une maladie de système La présence de cellules anormales, d'anticorps antineuronaux dans le LCR fait suspecter une origine néoplasique à la neuropathie La biopsie de glandes salivaires accessoires Elle sera utile pour dépister un syndrome de Gougerot-Sjgren, une sarcoïdose, une amylose ou éventuellement une vascularite La biopsie ostéomédullaire Elle est importante dans le bilan du lymphome, des gammapathies monoclonales, dans le cadre d'un syndrome de POEMS Le scanner thoracoabdominal Il permet d'étayer le diagnostic d'un carcinome pulmonaire, d'un lymphome, d'une maladie de système La biologie moléculaire L'indication de cet examen repose sur des critères cliniques et électrophysiologiques précis, s'appuyant sur la VCM du nerf médian, permettant d'orienter le diagnostic génétique Dans le cas des maladies de CMT, il est possible de faire un diagnostic précis du gène en cause notamment pour les formes dites démyélinisantes autosomiques dominantes définies par une VCM du médian inférieure à 30 m/s : on pourra citer dans ces formes les mutations du gène de la PMP22 ( peripheral myelin protein 22 ), du gène P0 Dans les HNPP, le diagnostic repose sur la mise en évidence d'une délétion du gène de la PMP22, cette analyse étant réalisée de nos jours de façon courante par les laboratoires de biologie moléculaire D'autres gènes tels que celui de la connexine 32, sont impliqués dans une forme dite intermédiaire de maladie de CMT (VCM du médian entre 30 et 40 m/s) Enfin, dans les formes axonales de CMT (VCM du médian supérieure à 40 m/s), le diagnostic en biologie moléculaire n'est pas réalisé en routine . Pour les neuropathies amyloïdes héréditaires (exemple : la transthyrétine. ), on peut d'emblée recourir au diagnostic moléculaire dès lors que la suspicion clinique est établie, ou que des dépôts amyloïdes (type préalbumine) ont été mis en évidence sur la biopsie de graisse périombilicale sur la BGSA Il n'est pas indispensable de faire une biopsie neuromusculaire dans ce cadre, ce d'autant que les dépôts amyloïdes sont parfois absents à ce niveau Ces examens doivent être demandés par des médecins experts dans le domaine et adressés à des laboratoires spécialisés dans l'exploration génétique des neuropathies héréditaires La biopsie neuromusculaire Les indications de la biopsie neuromusculaire sont actuellement réduites, notamment depuis les avancées de la biologie moléculaire Il ne s'agit en aucun cas d'un examen systématique dans l'exploration d'une neuropathie Elle nécessite un laboratoire et des techniques spécialisées Il s'agit d'un examen invasif au cours duquel un nerf sensitif de membre inférieur (le musculocutané, le sural) ou la branche sensitive du radial (lorsque la neuropathie se localise aux membres supérieurs) est prélevé, laissant des séquelles sensitives sous forme de paresthésies voire d'une hypoesthésie dans le territoire du nerf biopsié La longueur du prélèvement nerveux doit être de 3 à 5 cm Le fragment nerveux sera découpé en différentes parties : une première partie sera fixée dans le formol à 10 % avant d'être incluse dans la paraffine permettant l'étude du tissu interstitiel Cette technique permet la mise en évidence d'infiltrats inflammatoires, des dépôts anormaux (amylose) et permet d'étudier les vaisseaux (vascularites) ; une deuxième partie sera congelée permettant de réaliser des immunomarquages (utiles pour mettre en évidence des dépôts d'immunoglobulines dans le cas des neuropathies associées à une gammapathie monoclonale) ; une troisième partie sera fixée dans le glutaraldéhyde puis incluse dans l'épon permettant la réalisation de coupes semi-fines et ultrafines (microscopie électronique) Cette technique permet une étude précise des fibres myélinisées et amyéliniques, de quantifier leur perte éventuelle Elle permet l'étude de l'interstitium ; un fragment de nerf peut être conservé pour le teasing (microdissection des fibres myélinisées) permettant d'apprécier les phénomènes de démyélinisation et remyélinisation, une atteinte axonale Cette dernière technique n'est pratiquée que dans certains laboratoires en France, car elle est minutieuse et consommatrice de temps Les trois premières techniques sont pratiquées dans les laboratoires de neuropathologies, alors que le teasing n'est pratiqué que dans certains laboratoires universitaires spécialisés dans la pathologie neuromusculaire Dans la majorité des cas, un fragment de muscle est également prélevé dont une partie sera fixée dans le formol à 10 %, avant d'être incluse dans la paraffine permettant la mise en évidence de lésions de vascularite ou de granulomes et une autre partie sera congelée Les indications de la biopsie neuromusculaire comprennent actuellement : les vascularites, la sarcoïdose ; les amyloses acquises et familiales ; les infiltrations tumorales (lymphome ou autre néoplasie) ; la lèpre ; les formes atypiques de polyradiculonévrites inflammatoires chroniques (formes sensitives notamment dont l'ENMG montre peu ou pas d'anomalies en faveur d'une neuropathie démyélinisante) ; certaines neuropathies héréditaires (formes autosomiques récessives de maladie de CMT, les maladies de surcharge) Stratégie diagnostique en fonction du type de fibres atteintes et du mode d'installation et du processus physiopathologique sous-jacent En fonction du type de fibres atteintes Les neuropathies sensitives avec atteinte des petites fibres Ces neuropathies se manifestent par des douleurs distales à type de brûlures Elles se caractérisent par une altération de la sensibilité thermoalgique et douloureuse et une conservation de la sensibilité proprioceptive et épicritique ainsi que des ROT L'ENMG est normal Dans ce cas, le recours aux potentiels évoqués laser et à la biopsie cutanée peut permettre d'établir le diagnostic Les étiologies sont diverses, acquises ou héréditaires On citera parmi les causes acquises les neuropathies diabétiques, les neuropathies amyloïdes, la lèpre, les infections à VIH et certaines maladies de système (telles que la sarcoïdose) Parmi les causes héréditaires, il faut signaler la maladie de Tangier, la maladie de Fabry ainsi que les amyloses héréditaires Les neuropathies sensitives associées à une atteinte du système nerveux végétatif Elles peuvent s'inscrire dans le prolongement des neuropathies à petites fibres Les manifestations dysautonomiques peuvent apparatre sous forme d'une atteinte pupillaire avec une lenteur à la contraction pupillaire à l'exposition lumineuse, sous forme de troubles génitosphinctériens, de troubles digestifs à type de diarrhées motrices ou de gastroparésie, sous forme d'une anhidrose ou sous forme d'une atteinte cardiovasculaire (hypotension ou hypertension, bradycardie) Parmi les causes les plus fréquentes, on citera le diabète, les neuropathies amyloïdes acquises et héréditaires, le syndrome de Guillain-Barré et les causes toxiques Les neuropathies avec atteinte des fibres myélinisées de gros calibre Ces neuropathies se caractérisent par une aréflexie généralisée, une ataxie proprioceptive responsable d'une instabilité majeure à la marche et un tremblement des extrémités et/ou orthostatique Les polyneuropathies démyélinisantes telles que les neuropathies associées à une IgM monoclonale avec activité anti-MAG, les polyradiculoneuropathies inflammatoires chroniques et les formes ataxiantes de syndrome de Guillain-Barré, y sont prédominantes Dans ce cadre étiologique, on relève également les ganglionopathies caractérisées par une distribution asymétrique des troubles sensitifs secondaires soit à un syndrome paranéoplasique, à un Gougerot-Sjgren ou à une intoxication médicamenteuse Les neuropathies motrices Les polyneuropathies motrices sont caractérisées par une atteinte sélective des fibres motrices confirmée par les données de l'ENMG révélant une atteinte unique des motoneurones Dans ce cadre, il existe des formes acquises, dominées parmi les formes motrices de polyradiculoneuropathies aigus et les neuropathies motrices multifocales avec blocs de conduction caractérisées par une atteinte motrice asymétrique intéressant le plus souvent les membres supérieurs Au sein des formes héréditaires, on retiendra les formes dites spinales de maladie de CMT encore appelées amyotrophie spinale distale Parmi les causes toxiques, il faut citer les neuropathies motrices secondaires au plomb caractérisées par une atteinte radiale prédominante En fonction du mode d'installation et du processus physiopathologique de la neuropathie Formes aigus Polyneuropathies Les formes axonales Dans ce cas, l'ENMG aura permis de mettre en évidence une altération des potentiels sensitifs et moteurs, une réduction modérée voire une normalité des vitesses de conduction motrice et une atteinte neurogène associée ou non à une dénervation (fibrillations, ondes lentes positives) à l'électromyogramme témoignant de l'évolutivité du processus Les hypothèses diagnostiques sont soit : une forme axonale de Guillain-Barré Le LCR révèle souvent une hyperprotéinorachie mais il peut-être normal Les infections à Campylobacter jejuni sont fréquemment associées à ces formes axonales ; une porphyrie aigu intermittente ; une intoxication au lithium, à l'arsenic, au thallium ; une cause toxique et métabolique telle que les neuropathies alcoolocarentielles d'installation aigu, les neuropathies diabétiques apparues à l'instauration du traitement insulinique, les polyneuropathies urémiques des dialysés (s'installant parfois de façon aigu au début des dialyses) ; les polyneuropathies des vascularites nécrosantes rendant la biopsie nerveuse indispensable et urgente Les formes démyélinisantes L'électrophysiologie met en évidence un ralentissement diffus de la conduction nerveuse, un allongement des ondes F, des blocs de conduction, une dispersion du PAM et une atteinte multifocale non longueur-dépendante Les étiologies à évoquer sont le syndrome de Guillain-Barré (diagnostic étayé par l'analyse du LCR révélant une hyperprotéinorachie) ou la diphtérie caractérisée par une atteinte vélopharyngée précoce associée à des troubles de l'accommodation précédant une polyneuropathie sensitivomotrice distale et proximale Neuronopathies L'électrophysiologie met en évidence une altération des potentiels moteurs (atteinte du corps cellulaire du neurone moteur) ou des potentiels sensitifs (neurone sensitif) alors que les vitesses de conduction sont normales On évoquera en cas d'atteinte motrice pure une poliomyélite antérieure aigu , les neuronopathies sensitives aigus étant exceptionnelles Mononeuropathies multiples La présence d'une franche asymétrique clinique du déficit moteur et/ou sensitif de plusieurs troncs nerveux fait évoquer la mononeuropathie multiple L'électrophysiologie montrera alors une atteinte axonale de plusieurs troncs nerveux Le diagnostic étiologique à évoquer en priorité est une vascularite (type périartérite noueuse, Churg et Strauss) imposant la réalisation de la biopsie nerveuse Les autres causes comprennent le diabète , le lymphome , les syndromes paranéoplasiques Formes subaigus Polyneuropathies Les formes axonales Parmi les causes de ces neuropathies, on dénombre : le diabète, l'insuffisance rénale, les carences vitaminiques, l'intoxication oenolique, l'hypothyroïdie lorsque celle-ci est sévère ; les causes toxiques (médicamenteuses ou les agents industriels) : ; les polyneuropathies dites de réanimation ; les maladies de systèmes [ , les infections à VIH ou à hépatite C [ ; les hémopathies (polyglobulie), les lymphomes , les dyscrasies lymphoplasmocytaires ; les amyloses primitives (biopsie nerveuse nécessaire) ou secondaires à une amylose héréditaire de type transthyrétine Les formes démyélinisantes On y distinguera les polyradiculoneuropathies inflammatoires chroniques idiopathiques des neuropathies secondaires à des maladies générales (lupus, sarcoïdose, myélome, POEMS syndrome, infection à VIH) Les neuropathies démyélinisantes liées à une IgM monoclonale avec activité anti-MAG : la démyélinisation est plus souvent distale (allongement important des latences distales motrices), les blocs de conduction moins fréquents que dans les PIDC Neuronopathies S'il s'agit d'une forme motrice, on évoquera les neuronopathies motrices observées dans les lymphomes hodgkiniens et non hodgkiniens Dans les formes sensitives pures donnant lieu à une atteinte des fibres myélinisées de gros calibre, on évoquera entre autres une maladie de Gougerot-Sjgren , les neuropathies sensitives paranéoplasiques type Denny-Brown , les neuropathies de type idiopathique Mononeuropathies multiples Les formes axonales Elles sont dominées par les vascularites de type périartérite noueuse, Churg et Strauss, Wegener , ou par les infiltrations tumorales de type lymphome La biopsie neuromusculaire est très utile et indispensable Néanmoins, des causes plus fréquentes comme le diabète peuvent être responsables de multinévrites Plus rarement, une hépatite C reliée à une cryoglobulinémie , une sarcoïdose voire une maladie de Lyme ou une lèpre plus fréquemment rencontrée dans les pays sous développés Les formes démyélinisantes Il s'agira soit : de formes acquises telles que les neuropathies de type Lewis et Sumner encore appelées neuropathies sensitivomotrices multifocales avec blocs de conduction persistants, variante des polyradiculoneuropathies inflammatoires chroniques , et des neuropathies motrices multifocales avec blocs de conduction, caractérisées par une atteinte motrice pure déficitaire prédominant aux membres supérieurs et la présence d'anticorps anti-GM1 dans un tiers des cas ; de formes héréditaires de neuropathies avec hypersensibilité à la pression (dont le diagnostic est confirmée par mise en évidence d'une délétion PMP22 sur le chromosome 17 Formes chroniques Les étiologies sont dominées par les neuropathies héréditaires et les neuropathies inflammatoires dysimmunitaires chroniques Polyneuropathies Les formes axonales Les formes axonales de neuropathies héréditaires de type CMT encore appelées CMT2 sont caractérisées par une neuropathie d'allure chronique, associée à des pieds creux, une atrophie péronière, une scoliose et la notion d'autres membres atteints dans une même famille L'étude clinique et électrophysiologique de la famille peut s'avérer utile pour poser le diagnostic car les gènes de ces formes axonales de CMT sont encore peu connus Il faut souligner que les mutations de la connexine 32 situé sur l'X peuvent être responsables de formes axonales de neuropathies notamment chez la femme Les formes acquises de polyneuropathies répondent à des étiologies diverses et leur diagnostic demeure difficile Parmi les causes, on relèvera les gammapathies monoclonales de type IgG ou IgA dont l'imputabilité dans la genèse de ces neuropathies reste souvent difficile à démontrer, en dehors de quelques cas o la biopsie montre des dépôts d'immunoglobulines et de chanes légères En fonction du contexte clinique, on évoquera dans les formes à prédominance sensitive une maladie de Gougerot-Sjgren , une maladie cœliaque ou une sarcoïdose Parmi les causes de polyneuropathies chroniques avec atteinte du système nerveux autonome, on citera le diabète ou plus rarement l'amylose Enfin, d'autres causes métaboliques telles que l'insuffisance rénale, le myxœdème y sont notées Parmi les polyneuropathies chroniques acquises, il existe des formes motrices, peu évolutives, caractérisées par un déficit moteur distal sévère des membres inférieurs sous forme d'un steppage bilatéral, et des formes sensitivomotrices dont l'étiologie demeure inconnue Les formes démyélinisantes Elles sont en majorité représentées par les formes démyélinisantes de neuropathies de type CMT, caractérisées par un ralentissement homogène de la conduction motrice et reliées dans 75 % des cas à une duplication du gène PMP22 sur le chromosome 17 Le deuxième gène impliqué en fréquence dans ces neuropathies héréditaires est la connexine 32 situé sur l'X responsable de formes de neuropathies démyélinisantes chez l'homme Les autres neuropathies (non liées à l'X ou au chromosome 17) doivent être explorées dans le cadre des consultations spécialisées Les polyneuropathies d'origine métabolique telles que le Refsum (dosage d'acide phytanique) ou les adrénoleucodystrophies (acides gras à chanes longues) sont exceptionnelles Les formes acquises sont représentées soit par les PIDC soit par les polyneuropathies associées à une IgM monoclonale avec activité anti-MAG Neuronopathies Les neuronopathies motrices pures sont représentées par les formes héréditaires comme les amyotrophies spinales distales et proximales Les formes sensitives chroniques sont d'origine héréditaire ou idiopathiques Mononeuropathies multiples Les formes chroniques de mononeuropathies multiples font référence aux neuropathies avec hypersensibilité à la pression , caractérisées par des déficits tronculaires répétés favorisés par le maintien prolongé des membres dans certaines positions (exemple : jambes croisées, position accroupie, coudes appuyés. ) Les neuropathies secondaires aux piqûres de tiques (maladie de Lyme) ou les neuropathies lépreuses peuvent évoluer plusieurs années Conclusion Le diagnostic des neuropathies est un véritable défi pour le clinicien Outre un interrogatoire méticuleux prenant en compte le présent et le passé du patient, l'examen clinique ne devrait pas se limiter au seul système nerveux périphérique, tant l'examen des autres organes peut être une aide précieuse au diagnostic de la neuropathie L'électrophysiologie permet de localiser le site de l'atteinte nerveuse périphérique et guide les explorations paracliniques La place de la biopsie neuromusculaire longtemps considérée comme un examen incontournable dans l'approche diagnostique, est plus restreinte de nos jours notamment en raison des progrès de la biologie moléculaire Néanmoins, elle garde une place de choix dans le diagnostic des vascularites et dans certaines neuropathies dysimmunitaires Enfin, même si le diagnostic de neuropathie demeure inconnu lors d'un premier examen, le suivi du patient, l'évolution des connaissances et des techniques permettent parfois d'orienter le diagnostic étiologique et de proposer un traitement. | ISTEX | Scientific |
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COMMISSION DE LA TRANSPARENCE Avis er 1 juillet 2015 NORMACOL 62 g/100 g, granulé enrobé en vrac 1 sac papier polyéthylène de 1 kg avec cuillère-mesure (CIP : 34009 362 609 4 8) NORMACOL 62 g/100 g, granulé enrobé en sachet-dose B/30 (CIP : 34009 362 610 2 0) Laboratoire NORGINE PHARMA DCI gomme de sterculia Code ATC (2014) A06AC03 (laxatifs de lest) Motif de l'examen Renouvellement de l'inscription Liste concernée Sécurité Sociale (CSS L. 162-17) Indication(s) Traitement symptomatique de la constipation . concernée(s) HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 1/4 Avis 2 01 INFORMATIONS ADMINISTRATIVES ET REGLEMENTAIRES AMM (procédure) 19/04/2004 (procédure nationale) Conditions de prescription et de Non soumis à prescription médicale délivrance / statut particulier A Voies digestives et métabolisme A06 Laxatifs Classement ATC A06A Laxatifs A06AC Laxatifs de lest A06AC03 sterculia 02 CONTEXTE Examen des spécialités réinscrites sur la liste des spécialités remboursables aux assurés sociaux pour une durée de 5 ans à compter du 11/03/2010 (JO du 05/03/2010). Dans son dernier avis de réévaluation du Service Médical Rendu (avis du 19 octobre 2011), la Commission a considéré que le SMR de NORMACOL restait faible dans l'indication de l'AMM. 03 CARACTERISTIQUES DU MEDICAMENT 03. 1 Indication thérapeutique Traitement symptomatique de la constipation . 03. 2 Posologie NORMACOL 62 g/100 g, granulé enrobé en vrac Voie orale. Réservé à l'adulte et à l'enfant de plus de 6 ans. 1 à 3 cuillères mesures 2 à 3 fois par jour, à prendre de préférence après les repas. NORMACOL doit être ingéré avec une quantité d'eau suffisante. Mettre les granulés dans la bouche et avaler sans mâcher avec un grand verre d'eau. Il ne doit être pris ni immédiatement avant le coucher ni en position allongée. NORMACOL 62 g/100 g, granulé enrobé en sachet-dose Voie orale. Réservé à l'adulte et à l'enfant de plus de 6 ans. 2 à 4 sachets-dose par jour, à prendre de préférence après les repas. NORMACOL doit être ingéré avec une quantité d'eau suffisante. Mettre les granulés dans la bouche et avaler sans mâcher avec un grand verre d'eau. Il ne doit être pris ni immédiatement avant le coucher ni en position allongée. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 2/4 Avis 2 04 ANALYSE DES NOUVELLES DONNEES DISPONIBLES 04. 1 Efficacité Le laboratoire n'a fourni aucune nouvelle donnée clinique d'efficacité. 04. 2 Tolérance Le laboratoire a fourni des nouvelles données de tolérance (PSUR couvrant la période du 1er mars 2011 au 28 février 2014). Le profil de tolérance connu de ces spécialités n'est pas modifié. Aucune modification de RCP n'est survenue depuis l'avis précédent. 04. 3 Données d'utilisation/de prescription Selon les données IMS-EPPM (cumul mobile annuel Hiver 2014), NORMACOL en granulé a fait l'objet d'environ 140 000 prescriptions (dont 130 000 pour la forme en vrac). NORMACOL est très majoritairement prescrit dans la prise en charge de la constipation (80% des prescriptions). 04. 4 Stratégie thérapeutique Les données acquises de la science sur la constipation et ses modalités de prise en charge ont également été prises en compte. Depuis la dernière évaluation par la Commission du 19 octobre 2011, la place de NORMACOL dans la stratégie thérapeutique n'a pas été modifiée. 05 CONCLUSIONS DE LA COMMISSION Considérant l'ensemble de ces informations et après débat et vote, la Commission estime que les conclusions de son avis précédent du 19 octobre 2011 n'ont pas à être modifiées. 05. 1 Service Médical Rendu La constipation ne présente pas habituellement de caractère de gravité. NORMACOL entre dans le cadre d'un traitement à visée symptomatique. Le rapport efficacité/effets indésirables est moyen. Il existe des alternatives médicamenteuses ou non médicamenteuses. Il s'agit d'un traitement de 2ième intention après échec des mesures hygiéno-diététiques et en complément de celles-ci. Compte tenu de ces éléments, la Commission considère que le service médical rendu par NORMACOL reste faible dans l'indication de l'AMM. 05. 2 Recommandations de la Commission La Commission donne un avis favorable au maintien de l'inscription sur la liste des spécialités remboursables aux assurés sociaux dans l'indication de l'AMM. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 3/4 Avis 2 Taux de remboursement proposé : 15% Conditionnements : Ils sont adaptés aux conditions de prescription selon l'indication, la posologie et la durée de traitement. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 4/4 Avis 2 | HAS | Scientific |
SUR UN CAS DE RETICULOSE MALIGNE DE LA BASE DE LANGUE | WMT16 | Scientific |
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Vécu et représentations des patients traités par statine en prévention primaire : une étude qualitative Anne Dorval, Isabelle Pollet To cite this version : Anne Dorval, Isabelle Pollet. Vécu et représentations des patients traités par statine en prévention primaire : une étude qualitative. Médecine humaine et pathologie. 2018. dumas-01899509 HAL Id : dumas-01899509 Submitted on 19 Oct 2018 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. LIENS LIENS Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 122. 4 Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 335. 2- L 335. 10 AVERTISSEMENT Ce document est le fruit d'un long travail approuvé par le jury de soutenance et mis à disposition de l'ensemble de la communauté universitaire élargie. Il n'a pas été réévalué depuis la date de soutenance. Il est soumis à la propriété intellectuelle de l'auteur. Ceci implique une obligation de citation et de référencement lors de l'utilisation de ce document. D'autre part, toute contrefaçon, plagiat, reproduction illicite encourt une poursuite pénale. Contact au SID de Grenoble : bump-theses@univ-grenoble-alpes. fr UNIVERSITÉ GRENOBLE ALPES UFR DE MÉDECINE DE GRENOBLE Année 2018 VÉCU ET REPRÉSENTATIONS DES PATIENTS TRAITÉS PAR STATINE EN PRÉVENTION PRIMAIRE : UNE ÉTUDE QUALITATIVE PRÉSENTÉE POUR L'OBTENTION DU TITRE DE DOCTEUR EN MÉDECINE THÈSE DIPLÔME D'ÉTAT Anne DORVAL, Isabelle POLLET, THÈSE SOUTENUE PUBLIQUEMENT À LA FACULTÉ DE MÉDECINE DE GRENOBLE Le 15/10/2018 DEVANT LE JURY COMPOSÉ DE Président du jury : M. le Professeur Pierre-Yves BENHAMOU Membres : M. le Docteur Yoann GABOREAU M. le Docteur Matthieu ROUSTIT Directeur de thèse : M. le Docteur Yves BARO L'UFR de Médecine de Grenoble n'entend donner aucune approbation ni improbation aux opinions émises dans les thèses ; ces opinions sont considérées comme propres à leurs auteurs. [Données à caractère personnel][Données à caractère personnel] 2 3 4 5 REMERCIEMENTS A Monsieur le Professeur Pierre Yves BENHAMOU : Vous nous faites l'honneur de présider notre jury. Accepter pour cela nos plus sincères remerciements. A Monsieur le Matre de Conférence Universitaire Matthieu ROUSTIT : Merci d'avoir accepté aussi spontanément de faire partie de notre jury, et de juger notre travail. A Monsieur le Matre de Conférence Universitaire Yoann GABOREAU : Nous vous remercions de votre disponibilité et de l'intérêt que vous portez à notre travail en acceptant de siéger à notre jury. A Monsieur le Docteur Yves BARO : Nous vous remercions particulièrement pour votre soutien et vos encouragements tout au long de l'élaboration de notre thèse. Un immense merci à tous ceux qui ont accepté de nous confier leur histoire. 6 Remerciements d'Isabelle : Merci à toi Anne, pour être allée avec moi au bout de ce chemin périlleux, avec ces dizaines de rebondissements qui ne nous ont pas fait vaciller. Ta patience (et il en faut avec moi ! ), ta rigueur, ta bonhomie, ta simplicité et ta générosité (et la liste est bien plus longue que tous les verbatims réunis) font de toi une co-thésarde extra, mais avant tout une amie géniale et un futur docteur hors pair. Merci à mes parents, je vous dois tout. Vous m'avez nourrie d'amour et de bienveillance, et m'avez soutenue quoiqu'il arrive dans tous mes choix et mes épreuves. Et même si j'ai quitté le nid pour prendre mon envol, c'est bien grâce à ce nid que je suis là o j'en suis aujourd'hui. J'ai tellement de chance de vous avoir. Je vous aime. A mon frère Christophe, mon pilier, mon repère. A notre humour et nos fous rires que souvent nous seuls comprenons, et à ta bienveillance malgré mon sale caractère. Tu as un cœur en or, tu n'imagines pas à quel point je suis fière d'être ta sœur. A ma grand-mère, mamie Lily, connue parmi mes amis ici comme la mamie plus jeune que moi dans sa tête, qui n'a pas peur de traverser la France en Blablacar à la conquête du bonheur et des rencontres. Ps : la voilà enfin cette thèse ! A ma marraine, sur qui je peux compter et chez qui je pouvais me reposer entre ces longues années d'étude. A mes amis, à elle, et ceux qui pour d'obscures raisons m'ont supportée, portée et transportée vers l'horizon. Ceux qui m'ont fait prendre conscience de qui j'étais. A ceux qui m'ont dit que j'étais extraordinaire, et auxquels j'ai répondu que je n'étais que le reflet de ce qu'ils étaient. A tous ceux-là il est dérisoire de leur dédier ma thèse, je leur dois ma vie. 7 Remerciements d'Anne : Merci à toi, Isa. Tu ne savais pas encore dans quelle galère tu t'étais mise en voulant faire une thèse avec moi encore une Alors merci d'avoir eu de la patience, du temps, d'être venue et revenue, parfois pour rigoler, d'autre fois pour jouer et chanter, mais surtout, pour travailler et trier des bouts de papiers. On peut enfin se dire que toutes les prochaines fois qu'on se voit, c'est pour en profiter. Merci à mes parents, pour votre amour et votre soutien inconditionnel. Heureusement que les kilomètres ne vous font pas peur. Merci à toi, Charles, d'être simplement là, tous les jours avec moi, enfin ! Merci pour ta patience, ton soutien pendant ces 3 ans. Merci de m'avoir appris le style. Merci à mon fils Mael, qui aura rendu ce travail bien plus compliqué, mais tellement plus beau. Merci à Marie, Aurélien, Anne-Flore, Jérôme et Élodie, notre petite famille d'Aix coloc, pour tous ces moments partagés. Merci à Loulou, j'ai grandit avec toi. Merci à ma racine carrée, pour la correction anglaise de dernière minute. Vive les mariés. 8 LIVRET DES ABRÉVIATIONS FDRCV : Facteurs De Risque Cardio-Vasculaires FDR : Facteur De Risque RHD : Règles Hygiéno-Diététiques HAS : Haute Autorité de Santé HTA : Hypertension Artérielle CNIL : Commission Nationale de l'Informatique et des Libertés AVC : Accident Vasculaire Cérébral MT : Médecin Traitant LDL : Low Density Lipoprotein (lipoprotéines de basse densité) HDL : High Density Lipoprotein (lipoprotéines de haute densité) InVS : Institut de Veille Sanitaire Identification des citations des patients interrogés : E3 : la lettre indique que la citation est extraite du discours de l'un des patients interrogés et le numéro renvoie à l'entretien correspondant par ordre chronologique, ici le troisième entretien de l'étude. Int 1 et Int 2 font référence à chacun des deux interviewers. 9 TABLE DES MATIÈRES RÉSUMÉ. p. 12 INTRODUCTION. p. 13 MATÉRIEL ET MÉTHODE. p. 15 RÉSULTATS. p. 18 1. Données générales. p. 18 2. La représentation du cholestérolp. 19 2. 1. Représentation positive et négative. p. 19 2. 2. Cholestérol : maladie ? . p. 19 2. 3. Effet de mode et de société. p. 20 2. 4. Manque de connaissance ressenti et recherche d'informations. p. 20 2. 5. Fabrication endogène et exogène, hérédité. p. 21 2. 6. Importance du taux de cholestérol. p. 21 2. 7. Non gravité du cholestérol. p. 22 2. 8. Conséquences cardio-vasculaires du cholestérol et inquiétudesp. 23 2. 8. 1. Athérosclérose et conséquences. p. 23 2. 8. 2. Potentialisation des FDRCV. p. 23 2. 8. 3. La peur de la morbi-mortalité. p. 24 3. La prise en charge du cholestérol. p. 24 3. 1. Les règles hygiéno-diététiques. p. 24 3. 1. 1. Les freins aux RHD. p. 25 3. 1. 2. Les facteurs de modifications des RHD. p. 27 3. 1. 3. Un équilibre à trouver. p. 27 3. 2. Les statines. p. 28 3. 2. 1. Les tentatives de prise de statines. p. 28 3. 2. 2. La prise sous contrainte. p. 29 3. 2. 3. Le refus et les effets indésirables. p. 29 3. 2. 3. 1. Le refus. p. 29 10 3. 2. 3. 2. La représentation des effets indésirables. p. 30 3. 2. 3. 3. Les différents effets indésirables cités. p. 30 3. 2. 3. 4. Imputabilité des statines sur leurs symptômes. p. 31 3. 2. 4. L'acceptation : statine pilule miracle . p. 32 3. 2. 4. 1. Les justifications à l'adhésion. p. 32 3. 2. 4. 2. La bonne tolérance et observance. p. 33 3. 3. Alternatives aux statines et aux RHD. p. 33 3. 3. 1. La médecine parallèle. p. 33 3. 3. 2. Les autres facteurs de modulation du taux. p. 34 4. La réflexion sur la prise de statine et le rôle du médecin. p. 34 4. 1. La gestion du cholestérol en pratique quotidienne. p. 34 4. 2. L'ambivalence actuelle. p. 35 4. 3. Le médecin au cœur de la décision. p. 36 DISCUSSION. p. 37 1. Les limites de l'étude. p. 37 2. Les forces de l'étude. p. 38 3. Interprétation des résultats et comparaison avec la littérature. p. 39 CONCLUSION. p. 45 BIBLIOGRAPHIE. p. 47 ANNEXES. p. 49 Annexe 1 - Grille COREQ. p. 49 Annexe 2 Guides d'entretiens. p. 52 Annexe 3 Arborescence des thèmes et sous-thème. p. 56 Annexe 4 Verbatims. p. 66 SERMENT D'HIPPOCRATE. p. 150 RÉSUMÉ. p. 151 ABSTRACT. p. 152 11 RÉSUMÉ Introduction : Les atteintes cardiovasculaires sont la deuxième cause de mortalité en France. La matrise des facteurs de risque cardiaque, dont fait partie le cholestérol, est donc primordial. Les statines font polémique en prévention primaire (PP). L'objectif de l'étude était d'étudier le vécu et la représentation des patients traités par statine en PP. Matériel et méthode : C'est une étude qualitative réalisée sur des patients de Savoie et Haute- Savoie. Les entretiens semi-dirigés ont été conduits jusqu'à saturation théorique des données. Une analyse thématique des verbatims par codage, avec triangulation des 2 chercheuses a été faite, après retranscription des entretiens. Résultats : 14 entretiens ont été réalisés de novembre 2017 à mai 2018. Le cholestérol est perçu par les patients comme à la fois bon et mauvais, une maladie asymptomatique créant une ambivalence vis à vis de sa dangerosité, de ses conséquences. Le manque d'informations s'est fait ressentir. Certains patients actent leur prise en charge sur les règles hygiéno- diététiques (RHD), d'autres se reposent sur la statine, ou associent les deux. Des freins et des facteurs de modification des modes de vie sont mis en avant pour justifier ces choix. Les patients ont confiance en leur médecin, qui intègre la prise de statine en fonction des habitudes du patient. La prise en charge optimale du cholestérol relève d'une décision partagée entre médecin et patient. Conclusion : Les patients, informés de la polémique actuelle, font leurs expériences et sont critiques concernant les statines. La prise de ce traitement est au cœur d'une réflexion globale et partagée, o les RHD ont une place importante pour les patients. MOTS CLEFS : Cholestérol, Statine, Règles hygiéno-diététiques, Facteur de risque cardiaque 12 INTRODUCTION Les pathologies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde. En France, elles occupent la seconde place après les cancers. Malgré les progrès médicaux et thérapeutiques ainsi que l'amélioration de la prévention primaire, elles restent responsables de 25. 1% des décès en France (soit 142 175 décès sur les 567 078, première cause de mortalité chez les femmes : 27, 2 % contre 23% chez les hommes). Elles sont également la cause d'une morbidité avec handicap, estimée à 3. 5 millions de personnes(1). L'hypercholestérolémie est un trouble métabolique qui se traduit par un taux de cholestérol anormalement élevé dans le sang. Le LDL-cholestérol est décrit comme la fraction la plus athérogène du cholestérol : en excès, il tend à s'accumuler dans la paroi artérielle via des phénomènes inflammatoires chroniques et à favoriser le développement de plaques d'athérome. Ce qui peut provoquer, à terme, un infarctus du myocarde, un accident vasculaire cérébral ou une artérite des membres inférieurs. Elle concernerait 48% de la population adulte française âgée de 35 à 64 ans(2). Un traitement par statine fait partie des diverses mesures proposées pour traiter cette hypercholestérolémie. Plus de 7, 4 millions de patients sont traités par un traitement hypolipémiant en France en 2014, soit une prévalence de 11, 3 %, ce qui représente un coût en matière de dépense de santé(1). En prévention cardiovasculaire secondaire, la statine a une efficacité prouvée. En prévention primaire, les dernières recommandations de la HAS préconisent la prescription d'une statine en cas de haut risque cardiovasculaire, et en fonction du taux de LDL cholestérol, lors de la mise en échec de règles hygiéno-diététiques bien conduites(3). Depuis 2013, il existe une polémique autour des statines et du cholestérol. De nombreuses sources d'informations sont apparues dans les médias (reportages à la télévision, internet, livres) accusant les études menées sur ce sujet de biais et conflits d'intérêts. Elles remettent 13 en cause le rôle du cholestérol comme facteur de risque cardiovasculaire, et par conséquent celui des statines(4)(5)(6). A ce jour, la polémique est telle que la décision médicale de traiter ou non est difficile à prendre en prévention primaire. Cela a été ressenti lors de thèses qualitatives centrées sur les avis des médecins (7)(8). Dans l'optique d'une décision thérapeutique partagée, se recentrer sur les patients nous permettrait de recueillir les expériences à la source. C'est pourquoi il nous parat important d'explorer le vécu et les représentations des patients, à qui un traitement par statine a été proposé, dans la prise en charge du cholestérol en prévention primaire. Les freins et les moteurs au changement des RHD ont également été explorés. 14 MATÉRIEL ET MÉTHODE Approche méthodologique Le recours à une méthodologie qualitative a été choisie afin de répondre à cet objectif. Les différents items de la liste COREQ(9) (Consolidated Criteria for Reporting Qualitative studies) ont été respectés au cours de ce travail. L'échantillon L'échantillon a été recruté dans les départements de Savoie et Haute-Savoie, sur les différents terrains de stage et de remplacements des deux chercheuses et dans le cabinet du directeur de thèse. Les patients devaient avoir eu une prescription de statine en prévention primaire. Étaient exclus les patients avec une hypercholestérolémie familiale, et ceux disposant d'un traitement par statine en prévention secondaire, à savoir ceux ayant fait un infarctus du myocarde, un accident vasculaire cérébral ou une ischémie de membre. Un échantillonnage avec variation maximale a été réalisé. Le principe était de faire varier les caractéristiques des participants, en fonction de : leur sexe, leur âge, leur niveau socio- économique, leur sédentarité ou non, le nombres de facteurs de risques cardiovasculaires (FDRCV), avec prise actuelle ou non de statine en prévention primaire, et ayant des médecins au mode d'exercice différents (rural ou urbain). Les taux de HDL et LDL cholestérol n'étaient pas pris en compte dans le calcul des facteurs de risque, car faisaient parti de la question de recherche et pouvaient être remis en cause. Le recrutement a été poursuivi jusqu'à la saturation des données, discutée entre les deux chercheuses, obtenue après l'absence de nouvelles données lors de deux autres entretiens. 15 Les entretiens Des entretiens individuels semi-dirigés ont été réalisés par une ou les deux chercheuses à partir d'un guide d'entretien. Celles-ci étaient des internes de médecine générale de la faculté de Grenoble. Le guide d'entretien contenait un maximum de questions ouvertes afin d'essayer de recueillir les informations sans influencer la personne. Il a été testé dans un premier temps entre les deux chercheuses, puis sur trois patients, puis modifié à 2 reprises aux cours des échanges, pour mieux cibler l'objectif et faciliter le dialogue (voir annexe 2). Les entretiens ont été menés dans les cabinets de leur médecin généraliste. Un entretien a été réalisé sur le lieu de travail du patient, après choix de celui-ci. Les patients étaient informés du but de la recherche et du respect de l'anonymat. Les entretiens étaient enregistrés à l'aide d'un dictaphone. Analyse des données Les entretiens ont été retranscrits mot à mot, à l'aide du logiciel de traitement de texte Libre Office Writer. Les données non verbales jugées nécessaires à une meilleure compréhension ont également été décrites. Les données recueillies ont été analysées selon une démarche inductive, dans un souci de privilégier l'objectivité. L'analyse a été réalisée en trois phases : - Codage : identification de tous les mots, expressions, ou passages porteurs de sens. Ils étaient retenus pour éviter de sélectionner uniquement les réponses préconçues. Les réponses à des questions fermées n'étaient pas retenues car induites. Chacune des chercheuses codaient indépendamment les entretiens. Puis l'ensemble de leur de travail était joint, avec analyse et confrontation pour obtenir un consensus : la triangulation des données. - Analyse thématique : Cela consistait à regrouper les codages par sous-thèmes et thèmes. - Analyse transversale : Les sous-thèmes et les thèmes étaient mis en lien pour répondre au mieux à la question de recherche. 16 Cadre légal, financement Aucune des deux chercheuses n'avait de conflit d'intérêt à déclarer. Pour l'enregistrement, la retranscription, l'analyse et l'utilisation des données, un accord avait été recueilli auprès de chaque patient. Lors de la retranscription, les entretiens ont tous été anonymisés. L'accord de la CNIL a été requis pour ce travail. 17 RÉSULTATS 1. Données générales entretien âge sexe localisation emploi E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 E13 E14 59 65 67 62 66 67 75 70 61 60 64 68 71 74 H H H F F H H H H H F H F F urbain, Savoie urbain, Savoie urbain, Savoie urbain, Savoie urbain, Savoie urbain, Savoie semi-rural, Savoie semi-rural, Savoie urbain, Haute-Savoie urbain, Haute-Savoie Rural, Savoie urbain, Haute-Savoie urbain, Haute-Savoie urbain, Haute-Savoie autres facteur de risque CV âge, sexe, tabac imc kg/m2 31. 4 licencié, avant dessinateur industriel retraité, ancien pose de produits verriers retraité, ancien professeur de gymnastique conseillère diététique retraitée retraité retraité, ancien pilote de ligne retraité, commerçant, restaurateur Retraité, magasinier hôtelier vigneron Retraité, ancien enseignant âge, sexe, HTA, diabète âge, sexe, diabète, TA limite âge âge âge, sexe, HTA, antécédents familiaux âge, sexe âge, sexe âge, sexe âge, sexe, HTA, tabac arrêté âge âge, sexe, ATCD fx statines ou non atorvastatine 40 mg rosuvastatine 10 mg non non rosuvastatine non mais ezetimibe atorvastatine simvastatine 40 mg non pravastatine 10 mg /- pravastatine 10 mg rosuvastatine 5 mg pravastatine 10 mg non 10 mg) ( /- pravastatine 26 26. 4 23. 7 34. 5 22. 8 33. 7 24 30. 8 29 21. 8 25. 4 21. 8 durée entretien 22 min 28 min 44 min 45 min 40 min 59 min 50 min 24 min 33 min 48 min 39 min 23 min 15 min 23 min retraité, restaurant de personnes âgées âge, ATCD fx retraité, employé de bureau âge, ATCD fx 25 pravastatine 20mg Tableau 1 : Caractéristiques de la population 14 entretiens ont été menés de novembre 2017 à mai 2018. Les entretiens ont duré de 15 minutes à 1h environ, avec une moyenne de 35 minutes, et ont été numérotés de E1 à E14. La saturation des données a été atteinte lors du 12ème entretien, confirmée par la réalisation de 2 autres entretiens supplémentaires. Aucun des participants éligibles n'a refusé de participer à l'étude, et aucun n'a été exclu. Ainsi, cinq femmes et neuf hommes ont participé à l'étude. La moyenne d'âge des participants était de 66 ans. Le niveau socio-économique et les métiers étaient différents entre 18 les participants. Les modes de vie variaient également, allant de participants plutôt sédentaires, épicuriens, à d'autres très sportifs, vivant soit dans des milieux urbains ou ruraux. Parmi les patients interrogés, 4 avaient refusé ou avaient arrêté la statine prescrite et 2 autres étaient dans l'expectative de l'arrêter complètement. 2. La représentation du cholestérol L'hypercholestérolémie des patients a été diagnostiquée il y a 15 ans (E13), 20 ans (E14), 30 ans (E10) voire 50 ans (E7). Ce qui implique un long vécu avec leur cholestérol, géré de façon différente en fonction des années et de leur moment de vie. 2. 1. Représentation positive et négative La représentation du cholestérol dans les mœurs est actuellement ambivalente. D'une part, les participants considèrent que tout le monde en a (E7). Cela est même un élément indispensable au bon fonctionnement du cerveau, des organes (E6). Un des patients soulève la principale question de cette polémique récente : En fait la vraie question c'est Faut-il faire baisser le cholestérol ? (E12), remettant en cause l'intérêt d'un traitement. D'autre part, le cholestérol a longtemps été, et est encore considéré comme le mal, souvent lié à une publicité et à une médiatisation négative très importante depuis les années 1980. Certains patients interrogés parlent de lutter contre le cholestérol (E2). La distinction nette entre un bon et un mauvais cholestérol (E7) est aussi très souvent rapportée. 2. 2. Cholestérol : maladie ? Certains participants mettent en avant le paradoxe de la prévention primaire, car ceux-ci présentent des FDRCV, dont le cholestérol, sans se sentir malade. Un sentiment de maladie fantôme existe : c'est un truc invisible en fait jusqu'au jour o ça claque peut-être 19 d'ailleurs (rires) [. ] mais il y a un côté un peu pervers du cholestérol, on le voit pas, on le sent pas. (E10). L'hypercholestérolémie est perçue par certains patients comme une maladie à part entière, ayant une certaine évolutivité dans le temps : je soignais mon cholestérol (E4), avec les années, le cholestérol lui a vraiment monté (E1) . Un des participants évoque même sa maladie comme une une infirmité (E3). Il existe également une hypercholestérolémie familiale particulière, discernée de celle dont sont atteints la majorité des patients, justifiant plus dans ce cadre le terme de maladie et à fortiori de traitement : il a été malade du cholestérol depuis sa prime enfance, il m'a dit je prends des statines parce que j'ai plus de 4 ou 5 voilà donc lui c'est une maladie (E6). 2. 3. Effet de mode et de société Une notion de fait de société, d'effet de mode est mis en corrélation avec le cholestérol, accentuant le terme de maladie et de dangerosité, avec une nécessité dictée de le traiter pour revendre encore un peu plus de médicaments ? [. ] je pense qu'il y a un effet de mode et un effet dicté quand même par les grands labos (E6). La moitié des interrogés soulèvent comme lui, la notion d'un lobbying pharmaceutique, d'une manipulation, d'intérêts lucratifs, au détriment du bien-être du patient : J'ai une amie qui était déléguée régionale dans un labo, on sait comment ils font quand même pour forcer les médecins à prescrire des trucs donc (E10). Le cholestérol est également ressenti comme étant un fait de société et de malbouffe, avec tous les plats qui sont industriels et qui sont mal cuisinés (E4). 2. 4. Manque de connaissance ressenti et recherche d'informations C'est assez unanime, plus de la moitié des participants expriment qu'ils ne peuvent pas définir avec précision le mot cholestérol. Les autres se désintéressent, ou n'ont pas une démarche active pour se renseigner : C'est quoi pour moi le cholestérol ? J'en sais trop rien, je ne me suis pas du tout posé la question , je ne me suis même pas renseigné (E2). 20 Un amalgame s'est fait entre le traitement du diabète et celui du cholestérol : Je pensais que la statine était liée au diabète []. C'est le lien primaire que j'avais fait comme je suis allé voir le cardiologue pour le diabète et qu'il m'avait proposé ça (E3). Mais dans la majeure partie des cas, la recherche d'information sur le cholestérol entre dans une démarche active avec une réflexion importante : ça fait un moment que moi je me pose des questions par rapport à ça [. ] ça travaille un peu la tête. (E10). 2. 5. Fabrication endogène et exogène, hérédité L'apport du cholestérol dans l'organisme est le résultat d'un apport endogène et exogène soit parce qu'on le fabrique un peu, [. ] soit par une alimentation et une sédentarité (E10). De façon redondante, a été relatée une certaine fatalité à la production endogène du cholestérol, c'est le foie qui le fabrique (E9), je crois que quand on est une usine à cholestérol, on est une usine à cholestérol, y a un facteur élémentaire là-dedans qui o on ne peut pas tellement lutter , moi j'en fabrique, je suis une raffinerie ! (E10). Il existe une importante notion d'hérédité familiale qui surcrot à la notion de fatalité, tout le monde en avait dans ma famille [. ] tout le monde y passe (E1). Tous les participants l'évoquent et s'y rattachent, exception faite d'un patient qui n'a aucun antécédent : Pourquoi j'en ai moi, ça. c'est mystère (E9). 2. 6. Importance du taux de cholestérol La valeur du taux de cholestérol est chiffrée et objective. Cela implique la réalisation de prises de sang, donc une position d'acteur pour sa santé Mais il y avait toujours un suivi un petit peu avec des analyses régulières. (E13). C'est donc dans cet esprit que les patients jugent important de rester dans les normes (E14). Ça en devient même pour certains une préoccupation (E9), avec des injonctions que s'imposent les patients : il fallait que mon taux de cholestérol soit à des valeurs basses (E6). Cependant, l'évolution des pensées amène certains patient à relativiser concernant leur taux : je vois pas bien le risque que je prends là-dessus, parce que si j'ai 0. 7 au lieu de 1. 20, est- 21 ce que ça va changer ma vie ? Je n'y crois pas ça (E6). Ces taux sont d'ailleurs critiqués par un participants car ils varient en fonction des laboratoires d'analyses médicales (E10). La fréquence des analyses est même réduite voir arrêtée, le médecin y étant moins alerte : Ça fait au moins peut-être 3 ans qu'on ne s'est pas intéressé à mon taux de cholestérol (E12). De plus, le contrôle ne se justifie plus vraiment sous traitement (E9). Le dosage du taux de cholestérol est parfois jugé comme insuffisamment fiable pour vérifier l'état cardiaque et artériel. Par exemple, une patiente a été faussement inquiétée par son taux de cholestérol haut : Quand je suis allée faire le Doppler, je me suis dit mon dieu, ça va être complètement, peut-être tout obstrué ! , et là je m'aperçois que non alors ça me laisse perplexe quoi (E11). L'épreuve d'effort, la coronarographie et la scintigraphie sont jugés plus pertinents pour évaluer l'état des artères : Ça me confortera (E6). 2. 7. Non gravité du cholestérol Le cholestérol, c'est pas si grave que ça. (E1). A plusieurs reprises, les participants expriment une absence de peur (E3) vis à vis du cholestérol, également transmise par les médecins il ne m'affole jamais (E11). Les participants font également le lien avec la présence d'une hypercholestérolémie sans atteinte cardiovasculaire associée (E1, E11), Il m'avait un peu interrogée, en me demandant si dans ma famille il y avait eu des problèmes [. ] de crise cardiaque. Jamais ! Ce n'est jamais arrivé, les gens ils ne sont jamais morts de ça. (E4) et le pire que j'ai eu n'est pas dû au cholestérol (E1). A contrario, a déjà été vu l'apparition d'un infarctus chez quelqu'un sans cholestérol, [. ] il a fait un infarctus. Et alors là on s'est aperçu qu'il n'avait pas de cholestérol ! (E11). Le cholestérol n'est pas un sujet de préoccupation (E1, E12), et dans la hiérarchisation des soins et de la vie courante, ne passe pas au premier plan : faut pas que ça devienne. que ça soit au centre de ma vie quoi. [. ] Faut vivre quoi. (E12). Mais les patients restent vigilants : j'y pensais pas du tout quand il me l'a redit j'me dit ben mince, j'ai quand même une épée de Damoclès au dessus donc faut quand même vérifier (E6). 22 2. 8. Conséquences cardiovasculaires du cholestérol et inquiétudes 2. 8. 1. Athérosclérose et conséquences Les participants ont différerntes représentations de l'athérosclérose : c'est de la graisse dans le sang , qui circule (E11). La majorité des participants connaissent et utilisent spontanément les mots plaques d'athéromes et athérosclérose , sur des parois qui sont fragilisées (E11). Une confusion s'est faite avec un rôle dans la coagulation : C'est l'épaississement dans le sang, ça fait des caillots dans les artères c'est ça ? (E13). Depuis la remise en cause de l'intérêt des statines dans les médias, se pose la question de la relation entre le cholestérol et ces plaques d'athéromes : il n'est pas prouvé que le cholestérol [. ] parce que c'est ça le principe de l'émission qui a été dit, vous donne ces plaques et bouche les artères [. ] parce qu'il y en a qui le mettent en doute ? (E6). Les conséquences de l'athérosclérose sont assimilées et évoquées spontanément, les deux principaux étant les AVC et les infarctus du myocarde. 2. 8. 2. Potentialisation des FDRCV Les patients ont conscience d'un ensemble de facteurs étant à risque cardiovasculaire, et de leur gravité s'ils s'associent : le fait d'avoir le sang encrassé par la cigarette, ben en rajoutant de la graisse, [. ] je me dis le mélange, ça doit pas faire une mayonnaise bien super quoi. Et puis ça doit peut-être se boucher plus facilement. (E1). Il y a d'autres facteurs tout aussi importants (E12) qui permettent un calcul du risque cardiovasculaire. Ils ajoutent que ces différents facteurs peuvent se potentialiser. Le cholestérol pourrait faire monter la tension : après il y a la tension qui augmente, haha, parce que pour faire passer un débit dans un tuyau plus petit, la pression augmente [. ] (E7). Le tabac et l'HTA créent l'athérome par le biais du cholestérol : dues au tabac surtout dues à la tension un peu c'est les parois qui sont fragilisées et o le cholestérol, il ne glisse pas (E11). 23 On retrouve une certaine hiérarchie dans les différents FDRCV, l'HTA étant jugée plus délétère : Autant j'arrêterai jamais mes traitements pour l'hypertension, parce que ça, ça me fiche la trouille (rires), [. ] autant les statines, je me dis bon je fais attention à ce que je mange (E10). 2. 8. 3. La peur de la morbi-mortalité Quand est abordée la question des conséquences cardiovasculaires, il ressort pour le patient 3 : (en riant) j'ai pas envie de les connatre, j'ai pas envie de les connatre physiquement . Un sentiment de peur règne dans l'esprit des patients, avec la sensation d'une épée de Damoclès (E6). La peur de la mortalité y est présente Ben là, si tu prends pas ta statine et qu'en plus tu manges n'importe quoi t'es en train de creuser un trou [. ] (E5), mais aussi de la morbidité et du handicap : mais après c'est les conséquences d'un infarctus si on ne meurt pas (E11). Un avis médical menaçait de morbi-mortalité si le traitement n'était pas pris : Et elle m'a dit Si, si tu veux voir grandir tes petits enfants, ben tu devrais le prendre ça, [. ] après que tu seras paralysée (E5). 3. La prise en charge du cholestérol 3. 1. Les règles hygiéno-diététiques De façon spontanée, les patients nous ont fait part de leur hygiène de vie, occupant une place prépondérante dans la prise en charge du cholestérol. Les trois quarts estiment que les RHD ont une action sur le taux de cholestérol : c'est simplement un changement d'alimentation et d'activité physique hein qui les a fait baisser (E6). 7 participants font des RHD la priorité : Si c'est 10% la statine et puis tout le reste c'est ton alimentation, c'est le fait de ne pas bouger, c'est de fumer, de bon voilà quoi d'abord réduire ça, puis après on verra (E10). C'est même dans certains cas une nécessité pour éviter la prise médicamenteuse, dans une démarche volontaire : Honnêtement, si j'avais su j'aurai arrêté bien plus tôt. Je préfère 24 faire attention à ce que je mange [. ] au maximum. Je préfère. Que de prendre un médicament. (E8). En arrêtant le traitement, les RHD sont majorées, ce qui demande une certaine rigueur , une certaine discipline en terme d'alimentation et en terme de non sédentarité. (E10). 3. 1. 1. Les freins aux RHD Le vieillissement est un frein important aux RHD, l'activité physique quand on prend de l'âge, on n'est pas aussi alerte que quand on a 20 ans (E7). L'exigence alimentaire diminue avec l'âge : À l'âge qu'elle a, elle ne fait plus attention, moi c'est pareil. Je vais pas aller manger des légumes à l'eau tous les jours parce que j'ai du cholestérol ! (E8). La vie sociale entrane des difficultés importantes au respect des RHD : les repas conviviaux (E10), les tablées familiales (E11), les réceptions chez des amis (E5). Le manque de temps lié à leur activité professionnelle est également souvent relaté lors des entretiens, entranant une difficulté à appliquer un mode de vie qu'ils jugent équilibré : je travaillais tous les jours beaucoup, et c'est vrai que j'avais pas le temps (E6). En est ressentie d'ailleurs parfois de la frustration : c'est pas assez à mon goût. J'aimerai bien faire [de la natation] 2 fois par semaine [. ] pour bien équilibrer Mais bon je n'y arrive pas (E10). Les effets indésirables liés aux statines peuvent parfois limiter les efforts physiques : J'avais l'impression que je ne me relèverai jamais. (E4). L'effort, avec l'âge, est aussi moindre par peur de l'accident cardiaque : c'est un peu ma hantise. Mon cœur bat vite et mais je sais pas si je monte vraiment beaucoup ou plus mais j'essaie de m'refreiner maintenant. (E6). Les régimes demandent trop de temps c'est compliqué, parce qu'il faudrait être dans la cuisine toute la journée, pour préparer le repas du midi, du soir (E7). Ils sont, pour les patients qui en parlent, mal vécus. Ils s'en sentent acculés : Ben comment on peut le faire baisser. avec les régimes hein, tout le temps, avec les régimes. Régimes ! Régimes ! Régimes ! (E7). Le sentiment de devoir faire attention devient envahissant des fois j'aimerai bien 25 m'en débarrasser. (E14) avec des limitations concernant les quantités (E7) ou qualitatives on parle un peu plus des constituants, enfin des choses qui sont bonnes, les oméga (E7), entranant de la culpabilité lors des écarts : je me sens coupable par contre d'en manger (E11), ou de la frustration (E10). Et simplement parfois, les patients ne ressentent ni le courage ni l'envie de réaliser des efforts en ce sens : A moins de faire un régime qui est lourd. Un régime à mon âge quoi. (E14). D'autres jugent cela inefficace. Les aliments considérés comme gras sont addictifs, et pris à visée anxiolytique parfois (E4). Paradoxalement, pour le patient 11, les aliments gras doivent être consommés car ont d'autres vertus médicales pour l'ostéoporose pour le cerveau peut-être . Des participants interrogés considèrent que les RHD ne jouent pas de rôle dans la baisse du taux de cholestérol, exemples à l'appui : j'ai une copine elle est végétarienne, elle a dit j'ai toujours du cholestérol. Je veux dire c'est pas à cause de ce qu'on mange ou qu'on mange pas. (E5), j'ai quand même constaté qu'en mangeant sainement ça n'agit pas sur mon cholestérol. (E4). Un des freins importants aux RHD est le défaut de connaissance diététique : manger, euh sainement, enfin je ne sais pas ce que ça veut dire [. ] (E2). Même si un changement est souhaité, la mise en pratique est difficile : J'ai tellement lu de régimes que maintenant je ne sais pas trop comment je vais faire (E5). La lecture des étiquettes alimentaires est difficile et chronophage (E7) et les informations divergentes dans leur entourage, dans le milieu médical (E14) et dans les médias. L'échange sur la diététique et l'activité physique pendant la consultation médicale est difficile à mettre en place. Les patients évoquent un manque de temps : c'est ça en fait la discussion qu'il faudrait avoir avec le médecin, mais il faudrait passer des heures et des heures. Vous n'avez pas le temps [. ] (E7), ainsi qu'un manque d'information de la part du médecin : Quand on me disait qu'il ne fallait pas en manger, on ne m'a jamais dit pourquoi ! (E7). Il faudrait selon eux mettre en place des cours pratiques culinaires : ça on pourrait en parler 26 si vous m'invitiez à table et qu'on faisait la cuisine, et puis en m'expliquant ce que vous faites , expliquez-moi le régime ! (E7) ; ou vivre avec les patients pour éviter les biais de déclaration et les omissions : parce qu'il ne sait pas comment je vis vraiment, ce que je mange vraiment, ce que je fais quoi (E11). 3. 1. 2. Les facteurs de modification des RHD La pose du diagnostic d'hypercholestérolémie a été pour un patient un élément déclencheur : avec ce petit problème, j'ai du faire un peu plus attention [. ] une alimentation peut-être un peu meilleure, un peu moins manger [. ] je me suis remis beaucoup au vélo (E6). Pour un autre, la modification a été progressive, sans que le médecin n'ait eu d'influence sur la décision : Je ne peux pas dire que je suis sorti du cabinet de prénom du MT en me disant à partir de maintenant je change tout. Ça ne s'est pas passé comme ça (E3). Les saisons peuvent être propice aux diminutions des quantités, et à l'augmentation des salades (E9) et de l'activité physique : l'hiver, c'est le manque d'activité, plutôt casanier. (E7). Les changements de mode de vie sont généralement multifactoriels, liés aux hasards de la vie et des rencontres : changement d'emploi, de domicile (E4), la retraite (E6, E7), le schéma familial (E4). Pour être efficace, ils s'inscrivent dans une démarche active : Et puis ensuite je suis allé à l'information (E3). Les informations extérieures reçues influent moins sur le changement des RHD : les facteurs de modification sont souvent très personnels et non induits ou exigés par autrui. Pour un des patients, la gêne occasionnée par une surcharge pondérale devenait trop importante. Des substituts de repas lui ont permis de perdre 23 kg en 4 mois (E9). 3. 1. 3. Un équilibre à trouver L'équilibre est à trouver entre les plaisirs alimentaires gras, un mode de vie épicurien, et le maintien d'une bonne santé de part l'activité physique et l'alimentation saine. C'est l'ambivalence du bien-être : je pense que c'est un peu le décalage débit-crédit, nourriture 27 (E3), j'essaie d'adapter quand même mon régime alimentaire sans devenir moine non plus quoi (E10). La majorité des patients estime manger sainement. Avoir un jardin (E6, E13) permet de cuisiner ses propres plats et de se dépenser. Un de leur princeps est également de s'écarter de l'alimentation industrielle et transformée. Les connaissances diététiques sont globalement similaires chez les patients : alimentation à base de fruits et de légumes, de poissons, et limitation des viandes rouges, de la charcuterie et des laitages (beurre, fromage) : c'est le régime méditerranéen (E14). On retrouve parfois une confusion avec les produits riches en sucre : pains, pâtes (E9). Des patients s'octroient des écarts et les assument sans culpabilité. 2 patients se disent même épicuriens (E4, E7). Et comme dit le patient 1 : c'est les plaisirs de la vie aussi . L'activité physique est décrite comme un pilier de santé et fait partie intégrante de la vie des patients pour la plupart. Ils décrivent soit une activité sportive, comme la marche, soit un mode de vie actif voire une hyperactivité (E8). Seul 3 patients concèdent être sédentaires. 3. 2. Les statines 3. 2. 1. Les tentatives de prises de statines Les ajustements thérapeutiques vont plutôt dans le sens d'une décroissance du dosage de la statine, ou d'un espacement des prises, voire d'un changement de classe médicamenteuse c'est lui [médecin] qui m'avait dit mais j'en prends une fois sur 2, une fois sur 3 (E6). Ils sont liés soit aux effets indésirables, soit aux avis extérieurs reçus (médiatiques et dans l'entourage), soit faits par le médecin, souvent sans qu'ils en connaissent la raison. Certains patients persévèrent et tentent à nouveau une prise du traitement alors qu'ils ont des antécédents de douleur sous statine : je voulais refaire un test. (E7). Parfois le traitement est repris ou majoré suite à un taux de cholestérol trop élevé, pour toujours rester dans la norme : il y a eu des doses un peu plus fortes que d'autres lorsque les 28 taux étaient très élevés, et puis là en ce moment, c'est pour continuer à ne pas dépasser la norme (E7). 3. 2. 2. La prise sous contrainte Par moments, la prise du traitement est perçue comme une contrainte assimilée (E1) : - liée aux effets indésirables, particulièrement les douleurs : depuis que je prends des cachets pour le cholestérol j'ai mal partout c'est affreux. Ben depuis 35 ans que j'en ai pris [. ] mais bon faut bien travailler, faut faire avec. (E8). organisationnelle : il faut que je retourne à la pharmacie tous les mois. Et pour le peu que j'oublie, que j'ai pas le temps ou les 2 [. ] (E10). liée à une fatalité, l'organisme en produit trop : Moi je n'ai pas le choix. Donc euh, - - je sais pas, je continue à prendre le médicament (E9). Ces différentes contraintes rendent les patients moins observants : sur les 9 patients prenant le traitement, 2 déclarent ne pas être assidus sur la prise médicamenteuse avec des oublis presque volontaires (E10, E11), et ceux l'ayant arrêté ont parlé d'oublis lors de la prise. 3. 2. 3. Le refus et les effets indésirables 3. 2. 3. 1. Le refus 4 patients refusent catégoriquement la prise de statine. Leur avis est univoque et éclairé : ils acceptent de prendre le risque (E8). Parmi eux, un n'a même pas essayé j'ai pris l'ordonnance et je l'ai je l'ai pas lue et voilà j'ai refusé d'emblée dès que j'ai entendu statine (E3). Ils décrivent le médicament comme dangereux (E6) voir néfaste (E8), avec un sentiment de libération à son arrêt : Quand je compare ce que j'ai vécu et puis le bonheur que j'ai maintenant, c'est le paradis ! Honnêtement, si j'avais su j'aurai arrêté bien plus tôt (E8). Par ce refus, le patient se montre acteur de ses soins : Tout ça, ça m'a mise un peu en colère, de m'occuper de moi un peu, et. j'ai arrêté les statines, j'ai arrêté le Crestor. (E4). Pour un patient, l'arrêt de la statine s'est justifié devant des effets indésirables à répétition lors des prises (E6). Pour d'autres, son efficacité est jugée faible (avis partagé 29 avec le médecin traitant) : de toute manière si ça fait que 5 ou 10% d'effets, voilà. (E10), ou le taux de cholestérol est resté stable malgré l'arrêt de la statine (E8). Un autre patient, dans l'ambivalence d'arrêter, se demande si la dose cumulée du traitement pris dans sa vie n'est pas suffisante (E10). 3. 2. 3. 2. La représentation des effets indésirables La crainte et la méfiance des effets indésirables sont souvent citées lors des entretiens, amenant à un effet nocebo notoire. Un des participants est surtout inquiet des effets nocifs potentiels lors d'une prise au long cours. La lecture de la notice attise la peur quand vous sortez la liste des effets indésirables pfffiuu. Quand vous prenez toute la liste vous avez peur (E8). Parfois, la notice n'est pas lu pour éviter cet effet nocebo. Les effets secondaires de la statine, sont jugés fréquents là c'est 1/100. Donc, c'est vraiment ils mettent en garde quand même ! Ben ça veut dire sur 1000 personnes il y en a 10 qui ont ces effets là, donc je suis pas tout seul quoi et c'est beaucoup pour moi (E6). La notion de fatalité des effets indésirables avec irréversibilité est également décrite par un patient Quand mon foie sera [. ] cirrhosé, euh on pourra surveiller, on pourra que regarder et dire voilà vis encore une ou deux petites années ! . (E3). 3. 2. 3. 3. Les différents effets indésirables cités L'effet le plus décrit et attendu est la douleur à type d'arthralgie des épaules, des coudes, des genoux, des pieds et de façon atypique de la main : il m'est arrivé la main de rester je sais pas comment [montre sa main en forme de U entre la pince du pouce et les autres doigts hormis une hyper-extension de l'index] (E5). Des myalgies sont également subies, de façon assez diffuse, voire généralisée j'ai tout le temps mal partout partout. (E8), avec des crampes nocturnes (E8). Ces douleurs entranent un handicap avec limitation des activités de la vie quotidienne : habillage, nettoyage du domicile, si je ne peux plus me relever de par terre c'est quand même quelque chose de. , de lourd quoi. Vraiment un corps, lourd ! (E4). 30 L'atteinte hépatique est aussi souvent décrite et connue des patients, avec une interaction potentielle de l'alcool : Je sais pas, je pense que c'est pas bon alcool et Crestor parce que déjà j'ai entendu que Crestor il abme un peu le foie et l'alcool aussi (E5). De façon plus polémique, un des patients évoque l'apparition, voire l'aggravation d'un diabète lié à la prise de statine : j'ai lu dernièrement que ça pouvait même déclencher un diabète [. ] alors je me suis dit, celle-là (rires), ça vaut son pesant de cacahuètes si on traite un diabète et qu'on me propose par la suite un traitement qui pourrait le déclencher. (E3). D'autres effets plus atypiques ont été abordés : une atteinte cutanée Et maintenant je pense, est-ce que c'est possible, je deviens rouge ici [montre sous le nez], est-ce que c'est pas le Crestor qui me fait ça ! (E5), des étourdissements (E10), des céphalées (E6), une dénutrition (E6), voire un facilitateur de transit (E5). 3. 2. 3. 4. Imputabilité des statines sur leurs symptômes Vis à vis des effets indésirables, les patients prennent du recul et n'incriminent pas le médicament directement. Ils recherchent d'autres causes comme par exemple l'âge ou l'activité physique trop intense : mal d'épaule pas possible Donc, donc j'ai attribué ça au vélo puisque je fais beaucoup de vélo. Mais enfin des 2 épaules puis ça me descendait là Ça me paraissait bizarre j'avais plus mal quand [. ] même à la suite de la suppression du Tahor (E6). Ils peuvent passer des examens complémentaires à la recherche de diagnostics différentiels j'ai fait un certain nombre d'examens dont IRM (E6). Les corrélations se font entre les arrêts de la statine et les arrêts des douleurs : toutes les nuits je me réveillais j'avais mal dans les jambes. Depuis que j'ai arrêté, plus rien. (E8), Allez je me dis je l'arrête, je l'ai arrêté pour 4 mois [. ] C'est vrai les courbatures, c'est arrêté (E5). Pour le patient 6, les douleurs apparaissent 3 mois après la prise et s'arrêtent à l'arrêt du traitement. A noter comme sus-cités que les patients sont volontaires et que les essais sont multiples malgré les effets indésirables déjà ressentis. 31 3. 2. 4. L'acceptation : statine pilule miracle 5 patients décrivent la statine comme l'unique solution aux problèmes que pourrait causer le cholestérol. L'acceptation de la statine est totale, je suis contente et c'est tout. Je suis pour le Crestor ! (E5), et parfois aveugle Alors allons-y gaiement puis voilà. Moi je suis pas difficile hein. (E2). Ce médicament est entré dans une routine (E9) de vie. 3. 2. 4. 1. Les justifications de l'adhésion Ils en trouvent des intérêts multiples, la statine est bénéfique pour d'autres choses en plus du cholestérol, dont j'ai retenu le risque d'AVC (E1). L'adhérence est complète car le corps en a besoin : Je pense que mon corps, il me dit quelque chose pour le prendre (E8), avec un mal-être et une prise de poids à son arrêt (E5). C'est un traitement sécurisant, qui permet de garder une petite garantie (E11), s'il fallait l'arrêter j'aurai un peu peur. (E14). Il réduit la morbi-mortalité : je pense que c'est euh le médicament qui me tient en vie. Parce que je pense que si je l'arrête, je vais avoir ou crise cardiaque ou cérébrale, je sais pas, je le sens ça (E5). C'est aussi une solution de facilité, la statine s'occupe du cholestérol : Des fois je me dis tiens je force peut-être un peu la dose, et que je me retranche un peu sur le médicament. (E9). Elle permet de se déculpabiliser lors des écarts : je me disais Oh, ben je peux manger de la charcuterie, j'ai une statine [. ]. Donc quelque part, je ne faisais pas attention. (E10). Les exemples positifs dans l'entourage sont aussi un moteur à l'adhérence : il le prend depuis toujours, depuis plusieurs années il a 88 ans ou plus même. Et il est en pleine forme. (E5). La justification la plus objective est en lien avec le taux de cholestérol : je trouve ça un peu rassurant. Il y a eu des effets sur le cholestérol (E1). C'est même l'unique moyen pour baisser le taux : J'ai tout essayé. [. ] c'est que avec le Crestor que je l'ai baissé. (E5). Elle peut agir également dans le maintien du taux (E7). 32 Parfois, cette justification est plus subjective et est de l'ordre de la pensée magique : Et comme elle est née dans ma date de naissance seize avril, je la croyais parce que Et depuis ça y est moi et le Crestor, on est ensemble [. ] pour la vie (E5). 3. 2. 4. 2. La bonne tolérance et observance Tous les patients continuant la statine ont une très bonne tolérance du traitement. Ils ne décrivent pas d'effet secondaire, qu'ils attribuent parfois à un faible dosage . Il y a juste un effet, c'est quand à la prise de sang, je vois que ça en est là. C'est tout. Mais physiquement je ne le sens pas. (E7). L'observance est pour la plupart très bonne : je respecte scrupuleusement la prise des médicaments. (E2). Certains s'octroient quelques oublis (E1, E9, E5). 3. 3. Alternatives aux statines et aux RHD 3. 3. 1. La médecine alternative Les patients ont évoqué des médecines alternatives, comme la levure de riz rouge (E4), ou la Berbérine (E3) agissant comme un coupe faim. Ces prises sont à mettre en corrélation avec une méfiance de la médecine conventionnelle, parfois jugée trop invasive, voire nocive avec des escalades thérapeutiques néfastes : que ce soit sur les statines ou autres, j'ai toujours pensé que c'était arranger d'un côté et que ça bousillait de l'autre, de tous les effets indésirables (E1) ; mais aussi contradictoires on traite un diabète et qu'on me propose par la suite un traitement qui pourrait le déclencher. (E3) et limitées : on ne peut pas tellement lutter à moins de euh un traitement génétique ou quelque chose comme ça mais bon pour l'instant on en est pas là enfin je crois pas. (E1). Cependant, les patients restent très critiques et prennent beaucoup de recul vis à vis de la médecine alternative, soit suite à un échec personnel de la phytothérapie (E3), soit par manque de preuve scientifique : La levure de riz rouge, tu ne sais pas ce ça t'apporte. Ça me semble un peu léger comme choix (E12). 33 3. 3. 2. Les autres facteurs de modulation du taux Les patients rapportent d'autres facteurs agissant sur le taux de cholestérol : - un médicament retiré du marché modulant le taux de cholestérol et agissant comme un coupe faim [le nom n'a pas pu être retrouvé avec certitude] : ça avait un impact fort [. ] c'était bien, parce que ça m'avait incité à moins manger, ce qui m'avait permis de refaire une activité physique intense. Et donc là, ça avait baissé en quelques mois (E7). - - - le traitement hormonal substitutif a de façon étonnante eu une action positive : quand j'ai décidé de les prendre, le cholestérol s'est arrangé un peu (E5). la pilule contraceptive a tendance à augmenter le taux (E11). simplement lié au hasard, indépendamment de leur bonne volonté : [. ] mon fils n'en fait pas alors que lui mange bien, il est bien gras et il a rien lui, c'est agaçant (rires) et ma fille qui fait hyper attention en fait. (E10). - le stress : je suis vraiment stressée, est-ce que ça peut jouer ? (E11). 4. La réflexion des patients sur la prise de statine et le rôle du médecin 4. 1. La gestion du cholestérol en pratique quotidienne Comme vu dans les chapitres antérieurs, les patients gèrent différemment leur prise en charge du cholestérol : certains priorisent les RHD, d'autres ne pensent efficace que le traitement médicamenteux qu'ils peuvent même substituer aux RHD. Dans d'autres cas, c'est surtout l'association entre les 2 qui permet une prise en charge optimale. Le traitement est la solution, car le maximum des RHD est atteint : S'il doit baisser effectivement je vois pas ce que je peux faire de mieux. (E14). D'autres moyens ont été évoqués par les patients pour gérer au quotidien ce cholestérol, comme par exemple ne prendre les statines que lors des écarts alimentaires : à part 2-3 fois o je pourrais dire tiens je prends des statines, parce que c'est vraiment 2-3 fois, ah, c'est les 15 jours Nol/Nouvel an, c'est sûr que là on fait des excès (E6) ; ou ne prendre la statine 34 qu'à dose homéopathique comme ça je ne me fais pas de souci, je me dis bon ça peut pas me faire trop de mal, et puis d'un autre côté ça me protège aussi ? (E11). 4. 2. L'ambivalence actuelle Chez tous les patients, prendre une statine en prévention primaire amène à une réflexion. L'intérêt du traitement et sa balance bénéfice-risque sont difficiles à cerner. Les patients sont dubitatifs (E6), voire sceptique (E11) : donc à la limite si je n'avais jamais été traité, je me porterais tout aussi bien sans problème, mais bon vu que les résultats chiffrés sont meilleurs. Mais qu'est-ce que ça veut dire meilleurs ? Euuh tout en sachant qu'en ayant un peu plus, j'aurai la même vie sans problème particulier, je m'interroge (E1). Les cheminements personnels sont progressifs, l'ambivalence est très présente sur ce sujet. Une des participantes se sent même stupide (E11) de ne pas savoir prendre une position tranchée sur le sujet. Mais en tant que patient, c'est pas forcément facile de se faire une opinion. (E12). Ce qui rend les choses difficiles sont les avis très divergents dans l'entourage : on en entendait que du mal, que du mal (E11) ; et entre les professionnels de santé : je suis dans le doute et je reste dans le doute, parce qu'il y a 2 courants, et il n'y en a aucun qui prend le dessus sur l'autre, il n'y a aucune preuve scientifique aujourd'hui, ni pour l'un ni pour l'autre finalement, on a pas le recul (E10). Les participants ont également l'impression d'être manipulés par les médias et les lobbyings pharmaceutiques. La prescription est jugée parfois trop facile : pour beaucoup de gens, dès que vous dépassez la norme un tant soit peu, on vous colle des statines (E6). Toute la difficulté d'une action de soins primaires réside dans le fait que le médicament n'est pas une garantie quand même, même si vous avez ce traitement, vous pouvez avoir ça et si vous le prenez pas, c'est pas non plus (E6). Et même si les patients attendent un bénéfice à une thérapeutique la prise d'un médicament, en principe c'est pour apporter une réponse (E12), je suis, en forme quoi. Alors est-ce que les médicaments jouent 35 certainement un rôle, on ne prend jamais un médicament par plaisir (E12), ils se retrouvent déçus dans le fait que la statine ne leur apporte pas d'effet physique bénéfique (E7). Par ailleurs, la prise de statine en prévention secondaire est légitime et indiscutable (E6) et justifierait pour son cardiologue la prise en prévention primaire. 4. 3. Le médecin au cœur de la décision Le médecin occupe une place prépondérante dans l'information éclairée et la prise de décision. De façon redondante, les patients expriment avoir toute confiance en leur médecin traitant : c'est pas forcément facile de se faire une opinion. Donc c'est là o le médecin il joue un rôle. Je pense que le médecin de famille il a un rôle capital, parce qu'il nous connat depuis longtemps, et voilà. il peut faire des liens entre ce qui nous arrive, entre. Pour moi mon médecin de famille c'est mon pilier quoi. (rires). (E12). Le choix ou non de prescription est intégré dans le mode de vie du patient. La prise de décision finale est parfois prise par le médecin généraliste : là il me l'a supprimé le cachet, puisque j'ai passé 70 ans, et donc euh. il n'y a plus besoin (E13). Le traitement est parfois conservé pour éviter une prise de risque après il se couvre peut-être aussi, parce que si je fais quand même un problème cardiaque et qu'il m'a enlevé le médoc (rires) (E11), il me dit, voyez le cholestérol est là, donc on ne peut quand même pas le négliger (E12). Parfois, le médecin est aussi ambivalent et n'arrive pas à arrêter une décision : il a l'air ok pour que je l'arrête quoi. Mais il me l'a re-prescrit quand même ! (rires) (E10). Au final, la prise en charge optimale du cholestérol relève d'une décision partagée : Alors après on a discuté beaucoup [. ] avec le docteur et [. ] la conclusion à laquelle on est arrivée c'est que, dans le traitement des maladies cardio-vasculaire, le cholestérol c'est un élément, qui n'est pas à négliger (E12). 36 DISCUSSION 1. Les limites de l'étude - Reproductibilité Cette étude qualitative est de faible niveau de preuve, par sa restriction au département de la Savoie et de la Haute-Savoie. Selon les données de l'InVS, la prévalence de patients traités par hypolipémiants est élevée dans un croissant Nord-Est et plus faible en Auvergne-Rhône- Alpes (taux de prévalence inférieur de plus de 10% au taux national). La mortalité cardiovasculaire varie également(1). Les résultats pourraient donc être différents dans les autres régions de France. - Biais de subjectivité et d'interprétation Les entretiens étaient réalisés par les chercheuses de l'étude ce qui risquait d'influencer leur analyse et d'orienter les réponses des participants. - Biais de sélection Les participants acceptant la réalisation d'un entretien étaient des personnes choisies dans l'entourage des chercheuses ou du directeur de thèse. - Biais de déclaration Traités depuis longtemps par statine, les patients peuvent avoir oublié certaines informations ou les ressentir de façon différente à posteriori. - Biais d'environnement Les interruptions téléphoniques, ou les défauts de matériel, rendaient certains passages des enregistrements difficilement audibles et pour lesquels la retranscription a pu être moins fidèle au mot près. L'enregistrement vocal a également pu perturber certains participants, qui se sont peut-être exprimés avec plus de retenue que lors d'une conversation normale. 37 2. Les forces de l'étude Cette étude porte sur un sujet ayant un enjeu de santé publique majeur car les conséquences cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde, et les statines un réel coût sociétal. De même, la polémique qui existe sur la prescription des statines en prévention primaire en fait un sujet très actuel. Notre approche s'est orientée vers une étude qualitative pour aborder différemment le sujet. Peu d'études actuellement l'abordent du point de vue des patients, pourtant directement concernés. Les critères COREQ(9) ont été respectés. Un double codage a été réalisé pour chaque entretien, avec triangulation de l'analyse des données afin d'avoir une meilleure validité interne en limitant le biais d'interprétation et de subjectivité. Les entretiens étaient semi-dirigés, avec un guide de questions qui permettait aux participants de s'exprimer librement. Le thème de l'étude était présenté aux participants de la façon la plus neutre et la plus vaste possible. Le déroulement de l'entretien n'était pas prédéfini, l'ordre des questions n'était pas fixe. Le guide d'entretien a évolué lors de la progression de notre travail pour mieux répondre à la question de recherche et nous adapter aux problématiques soulevées par les patients. De plus, tous les entretiens ont été réalisés exclusivement en présentiel pour valoriser les analyses du comportement non-verbal. La validité externe ou transférabilité a été obtenue grâce à la saturation des données et sur la qualité de l'échantillonnage, avec la recherche de variation maximale à partir d'une liste quasi exhaustive. Les participants variaient peu sur l'âge, qui est un des facteurs non modifiables de risque cardiovasculaire, probablement lié au fait que l'incidence de l'hypercholestérolémie en prévention primaire soit plus faible dans cette tranche d'âge. Cette lacune a été prise en compte, et après discussion entre les deux chercheuses, il a été décidé de 38 ne pas inclure d'autres participants plus jeunes. Leur expérience est bien plus riche à acquérir maintenant puisqu'ils décrivaient ne se soucier que peu ou pas du cholestérol à l'époque. La taille de l'échantillon n'était pas déterminée à l'avance. Ce fut l'obtention de la saturation des données (absence de nouveaux concepts lors du codage) qui commanda l'arrêt des entretiens. Le nombre d'entretiens réalisés, 14, est dans la moyenne des thèses en recherche qualitative. Par cette étude, nous ne voulions pas résoudre une problématique, mais plutôt offrir des pistes de réflexion pour améliorer la prise en charge des patients au quotidien. 3. Interprétation des résultats et comparaison avec la littérature - La position actuelle de la statine dans la prise en charge Actuellement, les données de la littérature concernant le rôle de la statine en prévention primaire sont très divergentes et biaisées(4)(5)(6). Deux thèses récentes (2014 et 2016) ont réalisé une revue de la littérature sur ce sujet(7)(10). Pour elles, d'un point de vue scientifique, les statines en prévention primaire ont prouvé une diminution de la mortalité totale et des événements coronariens (risque relatif de l'ordre de 0. 90 et 0. 70 respectivement). Les études sur lesquelles se fondent ces affirmations sont de qualité méthodologique discutable, et financées par l'industrie pharmaceutique, donc critiquables, mais leurs résultats concordent. Selon la revue Prescrire, étant donné les incertitudes et le coût de la prévention, il est le plus souvent préférable de ne pas utiliser de statine en prévention primaire. Quand une prévention par statine est néanmoins choisie en concertation avec les patients, il est raisonnable de choisir la Pravastatine. C'est la statine qui a la balance bénéfices-risques la plus favorable en prévention secondaire et expose à moins d'interaction médicamenteuse que les autres statines(11). 39 Le traitement peut être responsable d'effets indésirables graves à prendre en considération : des nouveaux diabètes, des myalgies, une élévation des enzymes hépatiques et, plus rarement, des rhabdomyolyses(12). Dans la situation de prévention primaire, nous estimons que la statine est à prescrire en prenant en compte la complexité du patient : les niveaux de risque cardiovasculaire sont différents, l'âge(13)(14), ainsi que les modes de vie, parfois impossibles à modifier. Les raisons d'une prise médicamenteuse autre que l'action biologique, comme par exemple pour se rassurer, et leur représentation de ce traitement (un des patients a directement jeté l'ordonnance quand il a entendu le mot statine. ), diffèrent également. Pour s'aider dans la prise décisionnelle, un site internet existe et se décrit comme indépendant des entreprises de santé et des laboratoires pharmaceutiques. Initialement Américain, l'outil a été adapté pour correspondre à la population Européenne(15). Nous constatons à la vue des résultats que toutes les situations peuvent se voir. Certains patients vont améliorer leur hygiène de vie pour éviter un traitement. D'autres vont tenter de faire des efforts en ce sens et prendre en plus la statine pour une efficacité maximale. Certains ne vont prendre que le traitement, et même parfois reconnatre des écarts parce qu'ils se sentent protégés en le prenant. Ces résultats concordent en grande partie avec les données de la littérature. Une étude (de faible niveau de preuve) réalisée en 2007 sur 81 patients montre que 30 % des patients prennent le traitement par manque de motivation pour modifier leur mode de vie(16). Dans ce cas, les auteurs considèrent que le fait de traiter n'aura pas d'effet contre-productif, le patient ne souhaitant pas agir autrement. La même étude ne retrouve pas de détérioration du mode de vie après l'instauration de la statine, mais les réponses dans notre étude sont plus controversées. 40 Ce qui diffère, c'est que cette étude considère que les patients sous traitement seraient plus attentifs à leurs apports alimentaires. Cependant, dans notre étude, cette tendance se retrouve plutôt chez les patients ayant arrêté la statine. - L'état de santé et l'hygiène de vie Chaque personne, médecins ou patients, a une définition propre des RHD avec des niveaux d'exigence différents. Nous ne recherchions pas à évaluer si les participants respectaient ou non les règles, mais plutôt comment ils atteignaient leur équilibre ou leur bien-être avec leur mode de vie. 68 % des Français déclareraient être en bonne ou très bonne santé en 2014(1). Ces résultats concordent avec les données recueillies dans notre thèse. Ils le pensent d'emblée mais le mettent ensuite en opposition avec leur âge et leurs problèmes de santé. Cette ambivalence peut s'expliquer de plusieurs façons : soit les pathologies sont jugées transitoires et peu importantes, soit la question de l'état de santé induit une réponse positive mais qui n'est pas pensée ou n'est pas réfléchie. Dans notre étude, concernant les RHD, il semble que pratiquer une activité physique, ou avoir un mode de vie actif, n'est pas ressenti comme difficile à mettre en œuvre. Cela fait partie de leur quotidien. Il faut cependant envisager un éventuel biais lié au fait que les patients interrogés sont dans une région propice à l'activité physique. Avoir une alimentation anti-cholestérol semble cependant engendrer de la frustration et des contraintes importantes. Dans une démarche d'éducation thérapeutique, la HAS préconise la négociation d'objectifs simples, peu nombreux et adaptés à chaque patient , pour un nouvel équilibre alimentaire. Il convient d'éviter les régimes trop restrictifs conduisant à des déséquilibres alimentaires. Dans ce cadre, le Programme National Nutrition Santé et le Plan National de Sport Santé Bien-être, ont produit de nombreux outils et mécanismes incitatifs qui ont permis une amélioration des 41 apports nutritionnels et de l'activité physique dans la prévention des maladies cardiovasculaires(17). L'adhésion du patient est importante à obtenir pour les modifications du mode de vie. Nous remarquons en effet dans notre étude que les freins et les facteurs de modification à un mode de vie différent sont propres à chaque patient, mais que les modifications ne sont présentes que si le patient le désire profondément. S'appuyer sur un entretien motivationnel permet d'accompagner le patient dans ce changement. Pour s'y aider, nous pouvons nous appuyer sur le modèle trans-théorique de changement de Prochaska, déjà utilisé pour l'aide au sevrage tabagique. - L'ambivalence inquiétude/absence de peur Il nous a été difficile de juger leur niveau d'appréhension vis à vis du cholestérol. Il ressort de l'étude que les patients sont très ambivalents. Ils relativisent et parlent d'une maladie asymptomatique, qui touche tout le monde. Mais sont à la fois inquiets voire même angoissés des conséquences éventuelles. - L'évolution sociétale Certains patients ont évoqué un effet de mode et de société quand le sujet du cholestérol a été abordé. Il faut cependant reconnatre que notre question du guide d'entretien a pu induire cette réponse car celle-ci était fermée. Elle a cependant amené des réponses différentes, certains estimant que le cholestérol est présent à cause de l'expansion de l'industrialisation et des fast-food, d'autres jugeant que l'intérêt porté au cholestérol s'est accentué par effet de mode. Les patients n'hésitent pas à faire leurs propres expériences et leurs propres erreurs. Ils sont bien plus alertes et instruits sur le sujet que ce que nous pensions, lié à l'essor des technologies et à la facilité d'accès à l'information. Ils sont très critiques et relatent un besoin de preuves. Ils sont méfiants à l'égard des traitements médicamenteux sujets à polémique et d'autant plus des médecines alternatives. 42 Le patient s'émancipe et revendique son expertise. La France est d'ailleurs l'un des seuls pays à diplômer ses malades. Des patients-experts souffrant de diverses pathologies (cancer, VIH, diabète, sclérose en plaques) sont diplômés en éducation thérapeutique, alliant connaissance et expérience personnelle du sujet qui peut manquer au médecin(18). Toutefois, même s'ils prennent du recul vis à vis des informations reçues, ils restent parfois influencés par les médias, qui utilisent des phrases chocs, simples et attisent la peur. - Partager avec les patients Le langage médical peut être un frein à la bonne compréhension du patient. Il est important d'avoir une bonne vulgarisation médicale pour les intégrer dans une prise en charge thérapeutique partagée. En effet, les patients font parfois des confusions comme celle entre le traitement du diabète et celui du cholestérol, ou lorsqu'ils pensent que la statine est un anticoagulant. Les avis divergents entre les professionnels de santé, la mauvaise triangulation des soins et la médecine paternaliste augmentent leur méfiance vis à vis des thérapeutiques proposées. Néanmoins, ils gardent toute confiance en leur médecin généraliste, c'est ce qui ressort de notre étude. La médecine tend à devenir de plus en plus délibérative, ce qui est ressenti et voulu par le patient. Du côté médical, il est important de partager avec eux sur ces données : Le vécu du patient apporte un point de vue complémentaire à celui des professionnels de santé. En tenir compte est une nécessité [. ] (18). La prise en charge n'en sera que plus efficace et acceptée. - Ouverture Il est assez curieux de relever que notre région Auvergne-Rhône-Alpes fait partie des régions de France ayant la meilleure espérance de vie (2ème position), avec une sous mortalité de l'appareil circulatoire, et que les statines y sont les moins prescrites. Un biais de sélection et de confusion sont possibles car le taux de chômage et de pauvreté y sont bas(1). 43 Parmi les résultats surprenants de notre étude, nous remarquons que le traitement hormonal substitutif a fait baisser le taux de cholestérol. Cela peut néanmoins s'expliquer par une perte de poids grâce à ce traitement. Une autre patiente se demande s'il existe un lien entre le stress et le cholestérol. Une idée intéressante a émergé, à savoir ne prendre des statines que lors des écarts alimentaires, pour une meilleure tolérance du traitement. Y aurait-il un bénéfice sur le risque cardiovasculaire ? Aucune étude n'évoque cette possibilité, même si cela semble être pratiqué par les patients et les médecins. Un patient soulevait l'idée d'ateliers culinaires à mettre en place afin d'apprendre à mieux manger. Le manque de temps lors des consultations médicales empêchait un dialogue approfondi avec le médecin. Avoir des patients-experts dans ce domaine pourrait-il être une solution ? 44 CONCLUSION La prévention cardiovasculaire, incluant la prise en charge des facteurs de risque cardiovasculaires, est un enjeu de santé publique majeur. Cependant, traiter l'hypercholestérolémie avec un hypolipémiant en prévention primaire est controversée actuellement. Nombreux sont les médias à diffuser une image négative des statines. Et les études scientifiques réalisées ne permettent pas de prendre une décision définitive pour les médecins. L'ensemble des patients interrogés connaissent les principes des règles hygiéno-diététiques recommandées lors d'une prévention cardiovasculaire. Cependant leur application dans la vie quotidienne est parfois compliquée. L'éducation thérapeutique et l'entretien motivationnel sont nécessaires pour une bonne prise en charge mais semblent chronophages pour le patient et le médecin, et devraient être revalorisés en médecine générale pour y allouer un temps consacré. Finalement selon les patients, face à cette incertitude de prescription de statines en prévention primaire, la décision doit être collégiale, et surtout partagée. Elle prend en compte le taux de cholestérol et l'évaluation des facteurs de risque cardiovasculaires. Elle entre également dans une dimension plus large intégrant la complexité du patient dans son mode de vie et son propre choix après une information éclairée. Le médecin traitant a alors son rôle d'informateur à jouer, tous les patients ayant une entière confiance en leur médecin de famille . Les patients sont alertes et concernés par leur état de santé et recherchent de plus en plus à être informés, jusqu'à devenir des patients experts de leur pathologies. 45 46 BIBLIOGRAPHIE 1. DRESS, Fourcade N, Von Lennep F, Gremy I et all, Etat de santé de la population en France, rapport 2017. 22 août 2018. 2. Ferriéres J, Bongard V, Dallongeville J. Trens in plasma lipids, lipoproteins and dyslipidemias in French adults, 1996-2007. Arch Cardiovasc Dis 2009 ; 102 (4) : 239-301. 3. Cornet F, Désormais I, Frederic J, Principales dyslipidémies, stratégies de prise en charge, rapport d'élaboration, HAS/service de bonnes pratiques professionnelles. Février 2017 4. Wright JM, Bernard M, Bassett KL. Statines et prévention primaire du risque cardiovasculaire. Une méta-analyse des données disponibles en 2010. Médecine. 1 nov 2010 ; 6(9) : 399-404. 5. Vallée J-P. Statines en prévention primaire : oui ou non ? Cochrane Collaboration 2013 : nouvelle évaluation favorable. Médecine. 1 juin 2013 ; 9(6) : 270-2. 6. Lancet T. Statins for millions more ? The Lancet. 22 févr 2014 ; 383(9918) : 669. 7. Maksood Z. Prescriptions des statines en soins primaires d'après les données scientifiques actuelles. Thèse médecine générale Paris Diderot- Paris 7. 10 octobre 2014 8. D'Avout P. Prescription d'une statine en prévention primaire des maladies cardio- vasculaires : état des lieux des pratiques des médecins généralistes picards en 2017. Thèse de médecine générale. 23 juin 2017 ; 49. 9. Tong A, Sainsbury P, Craig J. Consolidated criteria for reporting qualitative research (COREQ) : a 32-item checklist for interviews and focus groups. Int J Qual Health Care J Int Soc Qual Health Care. déc 2007 ; 19(6) : 349-57. 10. Lapierre S. Intérêt des statines en prévention primaire. Preuves et Incertitudes. Thèse de médecine générale Lyon-Est. 31 mai 2016. 11. Statines en prévention cardiovasculaire primaire ? Revue Prescrire 2018 ; 38 (414) : 272-281 47 12. Netgen. Statines et effets indésirables musculaires [Internet] Revue Médicale Suisse [ 11 déc 2017] 13. Joseph J-P, Afonso M, Berdaï D, et al. Bénéfices et risques des statines en prévention primaire chez la personne âgée. 8 déc 2015 14. Lapierre F. Réalité de la prescription des hypolipémiants chez les personnes âgées de plus de 80 ans. Thèse de médecine générale de Nancy. 10 octobre 2008 15. Nanchen D, Vonnez J-L, Selby K, and all. Statines en prévention primaire : comment décider avec le patient ? . Revue médicale suisse 2015 ; 11 : 2222-6 16. Mann DM, Allegrante JP, Natarajan S, Montori VM, Halm EA, Charlson M. Dietary indiscretion and statin use. Mayo Clin Proc. Août 2007 ; 82(8) : 951-7. 17. Programme National de Nutrition Santé, Plan National de Sport Santé Bien-être 18. Haute Autorité de Santé - Patients et soignants, vers un nécessaire partenariat. [cité 22 août 2018]. 48 ANNEXES Annexe 1 Grille COREQ Domaine 1 : Équipe de recherche et de réflexion. Caractéristiques personnelles 1 Enquêteur/animateur Quel(s) auteur(s) a (ont) mené l'entretien individuel ou l'entretien de groupe focalisé (focus group) ? L'une ou les deux chercheuses. 2 Quels étaient les titres académiques du chercheur ? Par exemple : PhD, MD Interne en médecine générale de Grenoble. 3 Occupation. Quelle était leur activité au moment de l'étude ? Stages hospitaliers ou de médecine générale dans le cadre de la maquette d'interne, et remplacements de médecine générale non thésée. 4 Genre. Le chercheur était-il un homme ou une femme ? Les 2 chercheuses étaient des femmes. 5 Expérience et formation Quelle était l'expérience ou la formation du chercheur ? Formations à la rédaction de thèse, à la pose d'une question de recherche, à la bibliographie et introduction à la recherche qualitative ; Encadrées par la faculté de Grenoble. 1ère rédaction de thèse et de mémoire pour les 2 chercheuses. 6 Relations avec les participants. Relation antérieure Enquêteur et participants se connaissaient-ils avant le commencement de l'étude ? 1er contacts dans les cabinets des médecins remplacés ou via un médecin généraliste, une seule et unique consultation avant inclusion, patients non connus antérieurement. Pour 4 patients, 1er contact téléphonique. 7 Connaissances des participants au sujet de l'enquêteur Que savaient les participants au sujet du chercheur ? Ils savaient que c'était dans le cadre de notre thèse, et que l'on voulait recueillir sur le terrain les informations et avis actuels sur la prise de statine en prévention primaire. Ils savaient qu'on était médecins mais qu'on voulait recueillir leur expérience, et se placer en tant que chercheuses. 8 Caractéristiques de l'enquêteur Quelles caractéristiques ont été signalées au sujet de l'enquêteur/animateur ? Biais de jugement et de connaissance : importance de se placer en tant que chercheurs et non médecins et d'élargir au mieux les questions du guide d'entretien. Pas de jugement sur les réponses. Motivées par la question de la remise en cause actuelle de la prescription de statine en prévention primaire en tant que médecin, et rester vigilant sur les prescriptions. Domaine 2 : Conception de l'étude Cadre théorique 9 Orientation méthodologique et théorie Quelle orientation méthodologique a été déclarée pour étayer l'étude ? 49 Retranscription mot à mot des entretiens, codage et triangulation des données. 10 Sélection des participants, Échantillonnage Comment ont été sélectionnés les participants ? Échantillonnage dirigé : Sélection des participants lors d'une consultation dans les différents cabinets de stage/remplacement en vérifiant les critères d'inclusion et d'exclusion et demandant l'accord oral au patient. A été également demandé à des médecins généralistes d'interroger leurs patients éligibles, après avoir demandé leur accord pour qu'ils nous transmettent leurs numéros de téléphone. On a pu avoir des patients provenant de 5 cabinets différents de Savoie et Haute-Savoie. 11 Prise de contact. Comment ont été contactés les participants ? Face à face dans la majeure parti des cas lors d'une consultation de médecine générale. Parfois appel téléphonique. 12 Taille de l'échantillon Combien de participants ont été inclus dans l'étude ? 14 participants. 13 Non-participation. Combien de personnes ont refusé de participer ou ont abandonné ? Raisons ? Contexte. Aucun. 14 Cadre de la collecte de données. O les données ont-elles été recueillies ? A 13 reprises au cabinet des différents médecins généralistes, dans une pièce close (salle de consultation), et une fois au travail de la participante (convenance de la participante). 15 Présence de non-participants. Y avait-il d'autres personnes présentes, outre les participants et les chercheurs ? Non. 16 Description de l'échantillon. Quelles sont les principales caractéristiques de l'échantillon ? Un échantillonnage avec variation maximale a été réalisé. Ils sont originaires de Savoie et Haute- Savoie, vivent soit en milieu rural ou urbain, 5 médecins généralistes différents exerçant dans 4 villes différentes. Les facteurs de risques cardiovasculaire sont différents, les modes de vie également. Plus d'hommes que de femmes. 17 Recueil des données. Guide d'entretien. Les questions, les amorces, les guidages étaient-ils fournis par les auteurs ? Le guide d'entretien avait-il été testé au préalable ? Guide d'entretien crée par les 2 chercheuses et testé sur elles-même. Puis adaptation et transformation du guide d'entretien à 2 reprises suite au 3ème et 6ème entretien. 18 Entretiens répétés. Les entretiens étaient-ils répétés ? Si oui, combien de fois ? Non. 19 Enregistrement audio/visuel. Le chercheur utilisait-il un enregistrement audio ou visuel pour recueillir les données ? Recueil des données avec un dictaphone. 20 Des notes de terrain ont-elles été prises pendant et/ou après l'entretien individuel ou l'entretien de groupe focalisé (focus group) ? Les notes de terrain ont été prises pendant l'entretien. 21 Durée. Combien de temps ont duré les entretiens individuels ou l'entretien de groupe focalisé (focus group) ? Les entretiens vont de 15 minutes à 65 minutes, avec une moyenne de 40 minutes. 22 Seuil de saturation. Le seuil de saturation a-t-il été discuté ? 50 Oui, les 2 chercheuses se sont concertées, estimant au fur et à mesure des codages une saturation des données retrouvée a partir du 12ème entretien. 2 autres entretiens ont été effectué, vérifiant la saturation des données. 23 Retour des retranscriptions. Les retranscriptions d'entretien ont-elles été retournées aux participants pour commentaire et/ou correction ? Non, cela aurait été trop chronophage, et on aurait perdu la spontanéité des propos recueillis. Ils gardent néanmoins un droit de rétractation (conformément à leurs droits). Domaine 3 : Analyse et résultats. Analyse des données. 24 Nombre de personnes codant les données. Combien de personnes ont codé les données ? Les 2 chercheuses. 25 Description de l'arbre de codage. Les auteurs ont-ils fourni une description de l'arbre de codage ? Oui, début par un codage dans une approche inductive à chaque entretien de façon indépendante entre les 2 chercheuses, puis triangulation des données avec ensuite analyse thématique inductive puis transversale. 26 Détermination des thèmes. Les thèmes étaient-ils identifiés à l'avance ou déterminés à partir des données ? Les thèmes étaient déterminés à partir des données. 27 Logiciel. Quel logiciel, le cas échéant, a été utilisé pour gérer les données ? Excel et Libre Office Writer. 28 Vérification par les participants. Les participants ont-ils exprimé des retours sur les résultats ? Pas de communication des résultats avant la thèse, pas de sollicitation de leur part. 29 Citations présentées. Des citations de participants ont-elles été utilisées pour illustrer les thèmes/résultats ? Chaque citation était-elle identifiée ? Oui, exemples à l'appui pour illustrer au mieux les résultats. 30 Cohérence des données et des résultats. Y avait-il une cohérence entre les données présentées et les résultats ? Oui. 31 Clarté des thèmes principaux. Les thèmes principaux ont-ils été présentés clairement dans les résultats ? Oui. 32 Clarté des thèmes secondaires. Y a t-il une description des cas particuliers ou une discussion des thèmes secondaires ? Oui. 51 Annexe 2 Guides d'entretiens Guide d'entretiens : version n1 sexe : âge : profession : facteur de risque CV : statine et posologie : Présentation du travail : je vous remercie d'accepter de participer à ma thèse concernant les statines. Ce qui m'intéresse c'est votre expérience, votre ressenti, il n'y a pas de bonne ou de mauvaise réponse. Nous sommes là en tant que chercheuses. Notre conversation sera enregistrée et restera anonyme. Question brise glace : j'aimerai que vous me parliez de votre traitement et problème de santé, (et de vos habitudes). Cela permettra de mieux vous connatre. 1) Connaissances/représentations (Aborder la notion de facteurs de risque CV, dosage du cholestérol dans le sang, règles hygiéno- diététiques, les connaissances qu'ils ont sur ce sujet et comment ils les ont eu). - Qu'est-ce que, pour vous, le cholestérol ? O le retrouve-t-on ? - Quelles règles hygiéno-diététiques sont en lien selon vous ? Comment les mettez-vous en pratique ? - Comment s'est déroulée la première prescription ? Quelles informations avez vous reçues par votre médecin généraliste sur ce traitement ? Comment se passe le renouvellement chez votre MT ou spécialiste ? - Quel est pour vous l'intérêt de ce traitement ? (à court et long terme) -Quelles informations avez eu dans les médias ou dans votre entourage ? Comment ? Qu'est-ce que cela vous a apporté, qu'en retenez-vous ? 2) Vécu, observance, tolérance - Comment se passe la prise du médicament au quotidien ? Vous est-il arrivé de l'oublier ? Comment cela évolue-t-il dans le temps ? L'avez vous arrêté ? Si oui, pourquoi ? - Que pensez-vous des effets secondaires de ce médicament ? -Quels changements avez vous remarqués depuis que vous prenez ce traitement ? -Que pensez-vous de ce traitement ? Clore l'entretien : Y a-t-il des sujets que nous n'avons pas abordés et dont vous souhaiteriez parler ? 52 Guide d'entretiens : version n2 sexe : âge : profession : facteur de risque CV : statine et posologie : Présentation du travail : je vous remercie d'accepter de participer à ma thèse concernant les statines. Ce qui m'intéresse c'est votre expérience, votre ressenti, il n'y a pas de bonne ou de mauvaise réponse. Nous sommes là en tant que chercheuses. Notre conversation sera enregistrée et restera anonyme. 1. Questions brise glace : j'aimerai que vous me parliez de votre traitement, problème de santé, et de vos habitudes de vie. Cela permettra de mieux vous connatre. 2. La question du cholestérol : leurs représentations actuelles dans la société. (Aborder la notion de facteurs de risque CV, dosage du cholestérol dans le sang, règles hygiéno- diététiques, les connaissances qu'ils ont sur ce sujet et comment ils les ont eues). - Pensez-vous être en bonne santé ? - Qu'est-ce que, pour vous, le cholestérol ? O le retrouve-t-on ? - Comment peut-on le moduler ? (Quelles RHD sont en lien selon vous ? ) Comment les mettez-vous en pratique ? - Le cholestérol, est-ce pour vous une maladie, une mode ou un fait de société ? - Quelles informations sur le cholestérol avez-vous eu dans les médias ou dans votre entourage ? Comment ? Qu'est-ce que cela vous a apporté, qu'en retenez-vous ? - Quelle est la place de la médecine occidentale (ou allopathique) selon vous dans ce contexte (du cholestérol) ? 3. La place de la statine 1. vécu (observance, tolérance) - Comment s'est déroulée la première prescription ? Quelles informations avez vous reçues par votre médecin généraliste sur ce traitement ? Comment se passe le renouvellement chez votre MT ou spécialiste ? - Comment se passe la prise du médicament au quotidien ? Comment cela évolue-t-il dans le temps ? (aborder s'il ne le fait pas les oublis, l'arrêt potentiel et pour quelles raisons, s'il prend ou non le générique) - Quels changements avez vous remarqués depuis que vous prenez ce traitement ? 2. Représentations, croyances - Quel jugement portez-vous sur ce traitement ? - Que pensez-vous des effets secondaires de ce médicament ? - Quel est pour vous l'intérêt à court et long terme ? - Quelles informations sur les statines avez vous eu dans les médias ou dans votre entourage ? Comment ? Qu'est-ce que cela vous a apporté, qu'en retenez-vous ? Clore l'entretien : Y a-t-il des sujets que nous n'avons pas abordés et dont vous souhaiteriez parler ? 53 Guide d'entretiens : version n3 version finale Informations quantitatives posées en fin d'entretien : sexe age profession facteur de risque CV statine et posologie Présentation du travail : je vous remercie d'accepter de participer à ma thèse concernant les statines et le cholestérol. Ce qui m'intéresse, c'est votre expérience, votre ressenti, il n'y a pas de bonne ou de mauvaise réponse. Nous sommes là en tant que chercheuses. Notre conversation sera enregistrée et anonyme. 1. Question brise glace : Comment définiriez-vous votre état de santé ? 2. Qu'est-ce que représente pour vous le cholestérol ? Relances* : Comment le faire baisser ? (RHD, les alternatives a la médecine) Quel en est le but ? Ressentez-vous des difficultés à faire baisser le taux de cholestérol ? 3. Vécu : Racontez-moi votre histoire avec le cholestérol. Relances* Comment s'est déroulée la 1ère prescription de statine ? De quoi parlez-vous avec le médecin lors des renouvellements ? Quels changements avez vous remarqués depuis la prise de traitement ? (Effets indésirables, effets bénéfiques) Qu'est-ce que cela a changé dans votre façon de vivre ? 4. Cholestérol et société : Quelles informations avez-vous eu dans les médias ou dans votre entourage ? Qu'est-ce que cela vous a apporté, qu'en retenez-vous ? Relances* 5. Quel jugement portez-vous sur la statine ? Observance, tolérance Intérêt du traitement à court et long terme ? Clore l'entretien : Y a-t-il des sujets que nous n'avons pas abordés et dont vous souhaiteriez parler ? * relances si nécessaire 54 Annexe 3 Arborescence des thèmes et sous-thèmes Arborescence des thèmes et sous-thèmes 2. REPRÉSENTATION DU CHOLESTÉROL 2. 1. Représentation positive et négative Sources Le cholestérol, c'est euh, tout le monde en a, hein (E7) Il y a le bon cholestérol et le mauvais cholestérol. Un qui permet justement d'évacuer, enfin, j'ai du mal à exprimer ça puisque j'ai des. et puis il y en a un autre qui, pas qui s'agglomère, mais qui se colle sur les différents vaisseaux sanguins. Donc ça c'est le mauvais (E7) (. ) mais je me pose toujours des questions même en temps que patient, de dire, pas avoir du tout de cholestérol, est-ce que c'est une bonne chose Je trouve que c'est partagé, je relis les avis et puis est-ce que ce médicament n'est pas plus plus pernicieux qu'autre chose. (E6) Ben, malgré tout, malgré tout ce qu'en disent les uns et les autres, ça reste quand même un médicament, on sait que ça fait baisser le cholestérol. En fait la vraie question c'est faut-il faire baisser le cholestérol ? Mais apparemment les statines elles le font baisser. (E12) mais en fin de compte j'ai l'impression qu'on dit maintenant, oh bah attention parce que le cholestérol, le cerveau en a besoin, différents organes en ont besoin etc etc, et en fait finalement, ça serait presque, je mets entre guillemets une bêtise de viser un cholestérol, un taux de cholestérol trop bas. (E12) 2. 2. Cholestérol : maladie ? Donc je soignais mon cholestérol () Alors euh. je n'ai pas eu de grosse grosse pathologie à part ça, à part peut-être un fond dépressif à l'époque. Voilà donc euh, non je n'ai pas eu d'autre maladie on va dire. (E4) C'est plutôt une maladie. Ouais pour moi c'est une maladie. (E5) Non non. Je ne sais pas pourquoi, je ne l'explique pas, mais je ne parle jamais de ma maladie ou mon diabète. Comme si, come si c'était une infirmité. Ce qui fait que je manque d'échange (E3) D'ailleurs quand on en en a on ne se sens pas malade hein, pas du tout. C'est par prise de sang qu'on sait qu'on a du cholestérol mais moi j'avais du cholestérol peut être depuis euh bien plus longtemps qu'avant la prise de sang, et je me sentais bien. (E1) on a l'impression enfin c'est un truc invisible en fait jusqu'au jour o ça claque peut-être d'ailleurs (rires) enfin je sais pas, c'est vous les médecins, c'est pas moi mais il y a un coté un peu pervers du cholestérol, on le voit pas, on le sent pas euh rien de particuliers (E10) 55 2. 3. Effet de mode et de société 2. 4. Manque de connaissance ressenti et recherche d'informations 2. 5. Fabrication endogène et exogène, hérédité il a été malade du cholestérol depuis sa prime enfance, il m'a dit je prends des statines parce que j'ai plus de 4 ou 5 voilà donc lui c'est une maladie (E6) C'est un peu oui pour moi c'est un effet de mode quand même, un effet de mode entre guillemet (E6) Donc c'est quand même un effet de mode parce qu'on a m'a dit a un moment donné que c'est à 2 grammes pour tout le monde, c'est passé à 1. 60, pourquoi pas demain à 1. 40 pour revendre encore un peu plus de médicaments ? Donc aujourd'hui, je pense qu'il y a un effet de mode et un effet dicté quand même par les grands labos pour euh, pour vendre du médicament donc oui y a un effet de mode (E6) Je pense que c'est aussi un fait de société et de malbouffe, avec tous les plats qui sont industriels et qui sont mal cuisinés, avec l'huile de Palme, enfin les choses qui sont rajoutées, trop sucrées aussi, je pense que tout ça, ça peut engendrer aussi un excès de cholestérol. (E4) J'ai une amie qui était déléguée régionale dans un labo, on sait comment ils font quand même pour forcer les médecins à prescrire des trucs donc (E10) C'est quoi pour moi le cholestérol ? J'en sais trop rien, je ne me suis pas du tout posé la question , je ne me suis même pas renseigné (E2) Ben c'est confus dans ma tête (E7) Alors le cholestérol, qu'est-ce que c'est. Je ne sais pas. (E4) Et bon au fil des années, je me suis posé un peu des questions par rapport à ça (. ) Donc moi j'ai c'est ce que je vois, c'est ce que je lis dans les médias dès que je vois un article dessus je le lis systématiquement quoi. (E10) Alors je sais pas si c'est vrai ça, mais je crois l'avoir entendu soit parce qu'on le fabrique un peu, c'est-à-dire qu'on a une tendance, peut être transmise, je sais pas, par les parents Mes parents en font hein, enfin mon père est décédé mais mes parents en font. Soit par une alimentation et une sédentarité, alors une alimentation trop riche, trop grasse, trop enfin tout ce qu'il ne faut pas quoi et puis, puis doublé d'une sédentarité trop importante. (E10) ben oui j'ai tout ça, mais moi j'en fabrique, je suis une raffinerie ! (rires), si vous voulez je vous en donne ! (E10) c'est familial, ça c'est un terrain familial, donc euh comme je dis souvent ma mère en mangeant deux feuilles de salade et une tranche de jambon par jour, elle a du cholestérol, bon et moi j'ai l'impression que c'est pareil. Quoique je fasse ou même en faisant un régime alimentaire draconien, j'ai toujours du cholestérol. C'est un terrain familial. (E1) tout le monde en avait dans ma famille [. ] tout le monde y passe (E1) Pourquoi j'en ai moi, ça. c'est mystère (E9) 56 2. 6. Importance du taux de cholestérol 2. 7. Non gravité du cholestérol Mais il y avait toujours un suivi un petit peu avec des analyses régulières. (E13) Je me pose quand même des questions à savoir si c'est bien, d'avoir un taux de cholestérol quand même qui dépasse un peu les normes (. ) (E14) Ma préoccupation c'est que mon taux de cholestérol soit bon, après euh. Mais je vous dit moi je fais une prise de sang par an. Et encore hein. (E9) (. ) j'avais plus de 60 ans, des antécédents, de l'hypertension, il fallait que mon taux de cholestérol soit à des valeurs basses, donc voilà et en dessous des normes qui étaient normées en dessous de 1. 60 à peu près. (E6) je vois pas bien le risque que je prends là-dessus, parce que si j'ai 0. 7 au lieu de 1. 20, est-ce que ça va changer ma vie ? Je n'y crois pas ça (E6) dès qu'un patient dépassait un peu le seuil de la normalité, qui n'est pas la même selon les labos d'ailleurs j'ai remarqué parce que des fois j'avais fait des analyses dans un autre labo parce que celui o j'allais habituellement était fermé. Je me suis dit ah ben tiens et donc du coup à la limite, selon le labo, je pourrais prendre ou ne pas prendre la statine finalement, donc euh (E10) Ça fait au moins peut-être 3 ans qu'on ne s'est pas intéressé à mon taux de cholestérol (E12). Des fois j'ai demandé il faut faire ma prise de sang, il a dit non euh vous êtes sous traitement pour l'instant. Donc je pense qu'il estime qu'avec un traitement comme ça je n'ai pas à faire de prise de sang euh. (E9) Quand je suis allée faire le Doppler, je me suis dit mon dieu, ça va être complètement, peut-être tout obstrué ! , et là je m'aperçois que non alors ça me laisse perplexe quoi (E11) c'est que le cholestérol, c'est pas si grave que ça. Qu'on en ait ou qu'on en ait pas c'est pas ce qui va nous euh. D'ailleurs quand on en a on ne se sent pas malade hein, pas du tout (E1) je lis aussi que ça commence à être extrêmement controversé et que finalement avoir du cholestérol ne serait pas si mauvais que ça (E3) Et après on parle du cholestérol, mais on en fait pas non plus il me dit bon il faut quand même que je fasse attention à ce que je mange, tout ça mais il n'en fait pas il ne m'affole jamais. (E11) Il m'avait un peu interrogée, en me demandant si dans ma famille il y avait eu des problèmes [. ] de crise cardiaque. Jamais ! Ce n'est jamais arrivé, les gens ils ne sont jamais morts de ça. (E4) le pire que j'ai eu n'est pas dû au cholestérol (E1) il a fait un infarctus. Et alors là on s'est aperçu qu'il n'avait pas de cholestérol ! (E11) Oh bah synthèse personnelle, faut pas que ça devienne. que ça 57 2. 8. Conséquences cardiovasculaires du cholestérol et inquiétudes 2. 8. 1. Athérosclérose et conséquences 2. 8. 2. Potentialisation des FDRCV 2. 8. 3. La peur de la morbi- mortalité soit au centre de ma vie quoi. Je préfère. Que de penser à tout bout champ, est-ce que mon cholestérol est bon, est-ce que. faut vivre quoi. (E12) Pour moi, c'est pas un sujet de préoccupation. J'ai plus de préoccupation par rapport aux phlébites que j'ai faite que pour le cholestérol. (E1) j'y pensais pas du tout quand il me l'a redit j'me dit ben mince, j'ai quand même une épée de Damoclès au dessus donc faut quand même vérifier (E6) ben si je devais le définir je dirai que c'est une graisse quoi qui circule. (rires). (E11) En fait c'est pas le gras qui fait faire l'obstruction, c'est les parois qui sont dues à la au tabac surtout dues à la tension un peu c'est les parois qui sont fragilisées et o le cholestérol, il ne glisse pas. La graisse elle ne glisse pas (E11) C'est l'épaississement dans le sang, ça fait des caillots dans les artères c'est ça ? (E13) il n'est pas prouvé que le cholestérol [. ] parce que c'est ça le principe de l'émission qui a été dit, vous donne ces plaques et bouche les artères [. ] parce qu'il y en a qui le mettent en doute ? (E6) le fait d'avoir le sang encrassé par la cigarette, ben en rajoutant de la graisse, [. ] je me dis le mélange, ça doit pas faire une mayonnaise bien super quoi. Et puis ça doit peut-être se boucher plus facilement. (E1) Il y a d'autres facteurs tout aussi importants (E12) Et pourquoi, ben après il y a la tension qui augmente, haha, parce que pour faire passer un débit dans un tuyau plus petit, la pression augmente hein, c'est tout. Et donc, dit augmentation, le cœur, le palpitant va s'user plus vite. Dans la tête c'est pareil, ça circule moins vite, les neurones vont moins travailler (E7) dues au tabac surtout dues à la tension un peu c'est les parois qui sont fragilisées et o le cholestérol, il ne glisse pas (E11) Autant j'arrêterai jamais mes traitements pour l'hypertension, parce que ça, ça me fiche la trouille (rires), [. ] autant les statines, je me dis bon je fais attention à ce que je mange (E10) (en riant) j'ai pas envie de les connatre, j'ai pas envie de les connatre physiquement (E3) épée de Damoclès (E6) Ben là, si tu prends pas ta statine et qu'en plus tu manges n'importe quoi t'es en train de creuser un trou [. ] (E5) mais après c'est les conséquences d'un infarctus si on ne meurt pas (E11) 58 3. LA PRISE EN CHARGE DU CHOLESTÉROL 3. 1 Les RHD 3. 1. 1. Les freins aux RHD Et elle m'a dit Si, si tu veux voir grandir tes petits enfants, ben tu devrais le prendre ça, [. ] après que tu seras paralysée (E5) c'est simplement un changement d'alimentation et d'activité physique hein qui les a fait baisser (E6) Si c'est 10% la statine et puis tout le reste c'est ton alimentation, c'est le fait de ne pas bouger, c'est de fumer, de bon voilà quoi d'abord réduire ça, puis après on verra (E10) Honnêtement, si j'avais su j'aurai arrêté bien plus tôt. Je préfère faire attention à ce que je mange [. ] au maximum. Je préfère. Que de prendre un médicament. (E8) certaine rigueur, une certaine discipline en terme d'alimentation et en terme de non sédentarité. (E10) Ben l'activité physique quand on prend de l'âge, on n'est pas aussi alerte que quand on a 20 ans hein c'est sûr, donc euh. mais de la difficulté non, moi je fais de la marche plutôt, de la randonnée. C'est. je le fais. Je ne le fais pas de la même manière qu'il y a quelques années hein c'est sûr mais, la difficulté c'est qu'on a des muscles qui ont pris de l'âge, on a des articulations qui sont un peu moins huilées qu'à l'époque, enfin etc. (E7) À l'âge qu'elle a, elle ne fait plus attention, moi c'est pareil. Je vais pas aller manger des légumes à l'eau tous les jours parce que j'ai du cholestérol ! (E8) Donc c'est très vivant comme métier, c'est et j'étais beaucoup en hôtel donc avec tout ce que ça comporte, avec les repas, un peu gras des fois, un peu (E10) C'est vrai que c'est un peu le fromage quile Dr m'a dit de ne pas trop en manger à part de la brebis ou de la chèvre mais bon on est nombreux, plus ou moins y a le plateau de fromage voilà (E11) je travaillais tous les jours beaucoup, et c'est vrai que j'avais pas le temps (E6) c'est pas assez à mon goût. J'aimerai bien faire [de la natation] 2 fois par semaine [. ] pour bien équilibrer Mais bon je n'y arrive pas (E10) J'avais l'impression que je ne me relèverai jamais. (E4) c'est un peu ma hantise. Mon cœur bat vite et mais je sais pas si je monte vraiment beaucoup ou plus mais j'essaie de m'refreiner maintenant. (E6) c'est compliqué, parce qu'il faudrait être dans la cuisine toute la journée, pour préparer le repas du midi, du soir (E7) Ben comment on peut le faire baisser. avec les régimes hein, tout le temps, avec les régimes. Régimes ! Régimes ! Régimes ! (E7) ouais mais c'est pas assez a mon goût. J'aimerai bien en faire 2 fois par semaine. A la rigueur des séances moins intenses peut-être à la place des 70 longueurs en faire qu'une trentaine mais 2 fois 59 dans la semaine pour bien équilibrer Mais bon je n'y arrive pas (E10) je me sens coupable par contre d'en manger (E11) j'ai une copine elle est végétarienne, elle a dit j'ai toujours du cholestérol. Je veux dire c'est pas à cause de ce qu'on mange ou qu'on mange pas. (E5) j'ai quand même constaté qu'en mangeant sainement ça n'agit pas sur mon cholestérol. (E4) manger, euh sainement, enfin je ne sais pas ce que ça veut dire (E2) J'ai tellement lu de régimes que maintenant je ne sais pas trop comment je vais faire (E5) Expliquez-moi le régime ! Et oui. c'est ça en fait la discussion qu'il faudrait avoir avec le médecin, mais il faudrait passer des heures et des heures. Vous n'avez pas le temps quand vous recevez les gens. Vous allez me recevoir tous les 3 mois là, pendant 1 heure, pour discuter de ça, comment ça c'est passé ? Est-ce que ça se fait ça ? Ca ne peut pas se faire. Non c'est difficile. C'est difficile. Ouai il faudrait expliquer comment, vous mettez quoi dans l'assiette et pourquoi. Quand on me disait qu'il ne fallait pas en manger, on ne m'a jamais dit pourquoi ! (E7) Quand on me disait qu'il ne fallait pas en manger, on ne m'a jamais dit pourquoi ! (E7) parce qu'il ne sait pas comment je vis vraiment, ce que je mange vraiment, ce que je fais quoi (E11) avec ce petit problème, j'ai du faire un peu plus attention [. ] une alimentation peut-être un peu meilleure, un peu moins manger [. ] je me suis remis beaucoup au vélo (E6) Je ne peux pas dire que je suis sorti du cabinet de prénom du MT en me disant à partir de maintenant je change tout. Ça ne s'est pas passé comme ça (E3) l'hiver, c'est le manque d'activité, plutôt casanier. (E7) Faut dire que dans les 6 mois qui ont suivi ma retraite, j'avais perdu 6 ou 7 kilos en faisant beaucoup de sport, en faisant une activité physique importante, et que la mon changement de, de vie ; a fait que, effectivement, je perdais 1 kilo par mois mais sans, sans de plus. (. ) je n'ai pas fait de régime particulier ! (E6) Et puis ensuite je suis allé à l'information (E3) je pense que c'est un peu le décalage débit-crédit, nourriture (E3) j'essaie d'adapter quand même mon régime alimentaire sans devenir moine non plus quoi (E10) c'est le régime méditerranéen (E14) Mais bon l'alimentation, je ne fais pas d'excès nulle part donc euuh mais je suis contre aussi de me priver de trop de plaisirs euuh. gustatifs parce que j'ai du cholestérol. Ça, ça me gonfle un peu, c'est un peu dommage. (E1) Ben je ne fais pas de sport. Je ne suis pas sportive du tout. Ca je sais que je devrais un petit peu en faire, un peu d'activité physique 60 3. 1. 2. Les facteurs de modification des RHD 3. 1. 3. Un équilibre à trouver 3. 2 Les statines 3. 2. 1. Les tentatives de prises de statines 3. 2. 2. La prise sous contrainte 3. 2. 3. Le refus et les effets indésirables ça me ferait du bien. (E4) Ben je ne fais pas de sport. Je ne suis pas sportive du tout. (E4) c'est lui [médecin] qui m'avait dit mais j'en prends une fois sur 2, une fois sur 3 (E6) je voulais refaire un test. (E7) il y a eu des doses un peu plus fortes que d'autres lorsque les taux étaient très élevés, et puis là en ce moment, c'est pour continuer à ne pas dépasser la norme (E7) depuis que je prends des cachets pour le cholestérol j'ai mal partout c'est affreux. Ben depuis 35 ans que j'en ai pris [. ] mais bon faut bien travailler, faut faire avec. (E8) il faut que je retourne à la pharmacie tous les mois. Et pour le peu que j'oublie, que j'ai pas le temps ou les 2 [. ] (E10) Moi je n'ai pas le choix. Donc euh, je sais pas, je continue à prendre le médicament (E9) Et pour le peu que j'oublie, que j'ai pas le temps ou les 2, ou voilà, ou que j'ai pas envie puisque c'est arrivé aussi une ou 2 fois du coup j'espace quoi (E10) Comme je vous dis, depuis un temps, j'ai pas vraiment je ne le prends pas vraiment de façon régulière. (. ) le prends. Mais pas régulièrement, régulièrement. (E11) Ça risque de boucher les artères ? Moi je prends le risque, tant pis. Moi à mon âge (rire), j'ai fait le plus gros hein. (E8) j'ai pris l'ordonnance et je l'ai je l'ai pas lue et voilà j'ai refusé d'emblée dès que j'ai entendu statine (E3) Mais à partir du moment o un patient va voir un cardiologue et qu'il a 1. 70 au lieu de 1. 60 et qu'on lui met des statines, je trouve que c'est un effet de mode, je trouve que c'est dangereux Voila pour moi ça c'est dangereux. (E6) Il est néfaste ! Il est néfaste ! Quand je compare ce que j'ai vécu et puis le bonheur que j'ai maintenant, c'est le paradis ! (E8) Quand je compare ce que j'ai vécu et puis le bonheur que j'ai maintenant, c'est le paradis ! Honnêtement, si j'avais su j'aurai arrêté bien plus tôt (E8) Tout ça, ça m'a mise un peu en colère, de m'occuper de moi un peu, et. j'ai arrêté les statines, j'ai arrêté le Crestor. (E4) Ben ça veut dire sur 1000 personnes il y en a 10 qui ont ces effets là ; donc je suis pas tout seul quoi et c'est beaucoup pour moi, 1/10000 c'est pas la même chose quoi, des effets indésirables, c'est pas tout a fait la même chose donc c'est pour ça que (E6) de toute manière si ça fait que 5 ou 10% d'effets, voilà. (E10) Je me dis que, ça fait tellement longtemps que je prends des statines que je peux peut-être arrêter et qu'à condition. (E10) quand vous sortez la liste des effets indésirables pfffiuu. Quand vous prenez toute la liste vous avez peur (E8) là c'est 1/100. Donc, c'est vraiment ils mettent en garde quand même ! Ben ça veut dire sur 1000 personnes il y en a 10 qui ont 61 ces effets là, donc je suis pas tout seul quoi et c'est beaucoup pour moi (E6). Quand mon foie sera [. ] cirrhosé, euh on pourra surveiller, on pourra que regarder et dire voilà vis encore une ou deux petites années ! . (E3) il m'est arrivé la main de rester je sais pas comment [montre sa main en forme de U entre la pince du pouce et les autres doigts hormis une hyper-extension de l'index] (E5) si je ne peux plus me relever de par terre c'est quand même quelque chose de. , de lourd quoi. Vraiment un corps, lourd ! (E4) Je sais pas, je pense que c'est pas bon alcool et Crestor parce que déjà j'ai entendu que Crestor il abme un peu le foie et l'alcool aussi (E5) j'ai lu dernièrement que ça pouvait même déclencher un diabète [. ] alors je me suis dit, celle-là (rires), ça vaut son pesant de cacahuètes si on traite un diabète et qu'on me propose par la suite un traitement qui pourrait le déclencher. (E3) mal d'épaule pas possible Donc, donc j'ai attribué ça au vélo puisque je fais beaucoup de vélo. Mais enfin des 2 épaules puis ça me descendait là Ça me paraissait bizarre j'avais plus mal quand [. ] même à la suite de la suppression du Tahor (E6) toutes les nuits je me réveillais j'avais mal dans les jambes. Depuis que j'ai arrêté, plus rien. (E8) Allez je me dis je l'arrête, je l'ai arrêté pour 4 mois [. ] C'est vrai les courbatures, c'est arrêté (E5) je suis contente et c'est tout. Je suis pour le Crestor ! (E5) Alors allons-y gaiement puis voilà. Moi je suis pas difficile hein. (E2) bénéfique pour d'autres choses en plus du cholestérol, dont j'ai retenu le risque d'AVC (E1) Je pense que mon corps, il me dit quelque chose pour le prendre (E8) Je pense que c'est quand j'ai arrêté le Crestor, j'ai pris beaucoup de poids après euh. C'est vrai les courbatures, c'est arrêté. Mais, puis je ne me sentais pas bien. (E5) Ben je suis un peu sceptique, je me dis est-ce que j'ose ne plus prendre de médicaments ? Ou est-ce que je garde une petite garantie voilà pour rester toujours comme ça ? . je ne sais pas, je ne sais pas ce qu'il faut faire (E11) s'il fallait l'arrêter j'aurai un peu peur. (E14) je pense que c'est euh le médicament qui me tient en vie. Parce que je pense que si je l'arrête, je vais avoir ou crise cardiaque ou cérébrale, je sais pas, je le sens ça (E5) Des fois je me dis tiens je force peut-être un peu la dose, et que je me retranche un peu sur le médicament. (E9) je me disais oh, ben je peux manger de la charcuterie, j'ai une statine. Donc quelque part, je ne faisais pas attention. (E10) il le prend depuis toujours, depuis plusieurs années il a 88 ans 62 3. 2. 4. L'acceptation : statine pilule miracle 3. 2. 4. 1. Les justifications à l'adhésion 3. 2. 4. 2. La bonne tolérance et observance ou plus même. Et il est en pleine forme. (E5) je trouve ça un peu rassurant. Il y a eu des effets sur le cholestérol (E1) J'ai tout essayé, ce n'est que avec le Crestor que je l'ai baissé. (E5) Et comme elle est née dans ma date de naissance seize avril, je la croyais parce que Et depuis ça y est moi et le Crestor, on est ensemble [. ] pour la vie (E5) Il y a juste un effet, c'est quand à la prise de sang, je vois que ça en est là. C'est tout. Mais physiquement je ne le sens pas. (E7) je respecte scrupuleusement la prise des médicaments. (E2) De l'oublier, ça a du m'arriver, une fois ou deux. Une fois ou deux dans le mois ça a peut être du m'arriver mais en général non j'y pense je suis assez non, non c'est ça doit m'arriver mais rarement. Si ça m'arrive, c'est que je suis pas chez moi, je les ai oublié ou euh bon, ou j'ai une occupation qui a fait que bon j'ai pas pu les prendre mais autrement non non, je suis assez régulier. (E1) 3. 3. Alternatives aux statines et aux RHD 3. 3. 1. La médecine parallèle Donc là, je me suis dit, il faut que je m'en occupe de mon cholestérol (rires). Et c'est là donc, que j'ai pris la levure de riz rouge, donc je ne sais plus, de la levure de riz rouge Q10 o je ne sais pas quoi. Ça descend doucement. (E4) enfin à l'issue de la prise de Berbérine, la Berbérine avait 2 effets : le cholestérol et soit-disant le diabète, on devait rentrer dans des fourchettes qui étaient fort raisonnables, on avait plus les effets de fatigue et on avait plus cette espèce d'envie tout le temps de de de manger euh et effectivement au niveau du cholestérol, semble-t-il, ça aurait fonctionné puisque j'ai eu quand même une nette baisse au niveau des chiffres. (E3) que ce soit sur les statines ou autres, j'ai toujours pensé que c'était arranger d'un côté et que ça bousillait de l'autre, de tous les effets indésirables (E1) on traite un diabète et qu'on me propose par la suite un traitement qui pourrait le déclencher. (E3) on ne peut pas tellement lutter à moins de euh un traitement génétique ou quelque chose comme ça mais bon pour l'instant on en est pas là enfin je crois pas. (E1) La levure de riz rouge, tu ne sais pas ce ça t'apporte. Ça me semble un peu léger comme choix (E12) ça avait un impact fort [. ] c'était bien, parce que ça m'avait incité à moins manger, ce qui m'avait permis de refaire une activité physique intense. Et donc là, ça avait baissé en quelques mois (E7) quand j'ai décidé de les prendre, le cholestérol s'est arrangé un peu (E5) [. ] mon fils n'en fait pas alors que lui mange bien, il est bien 63 3. 2. 2. Les autres facteurs de modulation du taux 4. LA RÉFLEXION DES PATIENTS SUR LA PRISE DE STATINE ET LE RÔLE DU MÉDECIN TRAITANT 4. 1. La gestion du cholestérol en pratique quotidienne 4. 2. L'ambivalence actuelle gras et il a rien lui, c'est agaçant (rires) et ma fille qui fait hyper attention en fait. (E10) je suis vraiment stressée, est-ce que ça peut jouer ? (E11) S'il doit baisser effectivement je vois pas ce que je peux faire de mieux. (E14) à part 2-3 fois o je pourrais dire tiens je prends des statines, parce que c'est vraiment 2-3 fois, ah, c'est les 15 jours Nol/Nouvel an, c'est sûr que là on fait des excès (E6) je ne me fais pas de souci, je me dis bon ça peut pas me faire trop de mal, et puis d'un autre côté ça me protège aussi ? (E11) Pravastatine 20 c'est pas suffisant, c'est vraiment homéopathique, faudrait l'augmenter (E14) donc à la limite si je n'avais jamais été traité, je me porterais tout aussi bien sans problème, mais bon vu que les résultats chiffrés sont meilleurs. Mais qu'est-ce que ça veut dire meilleurs ? Euuh tout en sachant qu'en ayant un peu plus, j'aurai la même vie sans problème particulier, je m'interroge (E1) Ben je suis un peu sceptique, je me dis est-ce que j'ose ne plus prendre de médicaments ? Ou est-ce que je garde une petite garantie voilà pour rester toujours comme ça ? . je sais pas, je sais pas ce qu'il faut faire (E11) Je suis encore dubitatif sur ce médicament (E6) Ce qu'il faudrait que je fasse c'est pendant 6 mois ne pas le prendre du tout, pour savoir si vraiment le taux il va grimper ? . mais là je ne le prends pas régulièrement, je pense et me dis là je suis stupide ! Ou je fais comme il faut, ou pas. (E11) en tant que patient, c'est pas forcément facile de se faire une opinion. (E12) je suis dans le doute et je reste dans le doute, parce qu'il y a 2 courants, et il n'y en a aucun qui prend le dessus sur l'autre, il n'y a aucune preuve scientifique aujourd'hui, ni pour l'un ni pour l'autre finalement, on a pas le recul (E10) on en entendait que du mal, que du mal (E11) pour beaucoup de gens, dès que vous dépassez la norme un tant soit peu, on vous colle des statines (E6) la prise d'un médicament, en principe c'est pour apporter une réponse (E12) je suis, en forme quoi. Alors est-ce que les médicaments jouent certainement un rôle, on ne prend jamais un médicament par plaisir (E12) Et puis donc après on m'a prescrit des médicaments, mais ça n'a pas le même effet hein. Je ne le sens pas l'effet. Alors que l'autre je l'ai senti et c'était très très bien (. ) . Je ne vois pas, je ne sens pas 64 4. 3 Le médecin au cœur de la décision l'effet. Il y a juste un effet, c'est quand à la prise de sang, je vois que ça en est là. C'est tout. Mais physiquement je ne le sens pas. L'autre médicament par contre je le sentais, ça a été fort, ça a été très efficace. (E7) Donc il m'a dit euh oui mais c'est quand même mieux il m'a décortiqué, il m'a dit il faudrait vraiment que vous soyez en dessous d'1 gramme pour telle et telle raisons mais après, après, il n'a pas été aussi affirmatif en disant voilà, c'est ça ou rien . On a pu en discuter, donc ça, déjà sur la prise en compte de, de ce traitement. Je trouve que la discussion a pu s'organiser. (E6) Mais j'ai confiance en Dr B vous savez. Non puis vous pouvez discuter avec lui des problèmes, des, tout ça, vous savez. (. ) Je lui fais confiance hein. (E9) c'est pas forcément facile de se faire une opinion. Donc c'est là o le médecin il joue un rôle. Je pense que le médecin de famille il a un rôle capital, parce qu'il nous connat depuis longtemps, et voilà. il peut faire des liens entre ce qui nous arrive, entre. Pour moi mon médecin de famille c'est mon pilier quoi. (rires). (E12) là il me l'a supprimé le cachet, puisque j'ai passé 70 ans, et donc euh. il n'y a plus besoin (E13) après il se couvre peut-être aussi, parce que si je fais quand même un problème cardiaque et qu'il m'a enlevé le médoc (rires) (E11) il me dit, voyez le cholestérol est là, donc on ne peut quand même pas le négliger (E12) il a l'air ok pour que je l'arrête quoi. Mais il me l'a re-prescrit quand même ! (rires) (E10) Alors après on a discuté beaucoup [. ] avec le docteur et [. ] la conclusion à laquelle on est arrivée c'est que, dans le traitement des maladies cardio-vasculaire, le cholestérol c'est un élément, qui n'est pas à négliger (E12) 65 Annexe 4 - Verbatims Entretien n1 : Int 2 : Je suis sûre que vous allez pouvoir nous apporter certaines choses. Patient 1 : Peut-être Mais je vois pas, je ne vois pas en quoi parce que je suis un cas vraiment très basique. Bon j'ai du cholestérol très haut à plus de 3. 6, quelque chose comme ça. Et puis, Dr B. m'a fait prendre des Atorvastatine c'est ça hein ? Et euh bon, on a fluctué dans le dosage, puis au bout d'un moment on a trouvé un dosage qui me stabilisait bien donc on est resté comme ça depuis. Et depuis ça marche, donc je suis vraiment un cas très basique et qui est très. , et qui ne pose pas de problème à ce niveau là J'ai pas de Int 2 : Vous saviez à peu près ce qu'est le cholestérol ? Vous dites 3. 6, mais ça veut dire quoi pour vous ? Patient 1 : Alors c'est curieux parce qu'il y avait une émission justement de télé là-dessus hier soir. Int 2 : D'accord et du coup vous avez regardé ? Patient 1 : Bon je n'ai pas regardé de A à Z mais le peu que j'ai compris c'est que le cholestérol, c'est pas si grave que ça. Qu'on en ait ou qu'on n'en ait pas, c'est pas ce qui va nous euh. D'ailleurs quand on en a on ne se sent pas malade hein, pas du tout. C'est par prise de sang qu'on sait qu'on a du cholestérol mais moi j'avais du cholestérol peut-être depuis euh. bien plus longtemps qu'avant la prise de sang, et je me sentais. Bon j'ai été traité pour le cholestérol mais je n'ai pas ressenti de mieux spécifique et spécifiquement au traitement euh dans mes conditions physiques si vous voulez, c'est Bon je savais que j'étais traité pour le cholestérol mais je ne ressentais pas en moi euh. l'effet du traitement si vous voulez. C'est un truc qui passe complètement inaperçu. Après les prises de sang suivantes, il s'avère que le cholestérol baissait ou était en train de descendre, mais physiquement on ne sent rien de particulier. Enfin moi je suis peut-être un cas particulier aussi, mais moi j'ai rien senti suite à sa prise. Int 2 : D'accord. Et donc du coup, pour vous, c'est quoi le cholestérol ? Patient 1 : Le cholestérol d'après ce qu'on m'a expliqué, c'est du, de la graisse qui est formée dans le sang et qui adhèrerait aux artères ou dans tout le corps quoi, et qui pourrait à la limite faire des bouchons. Bon moi, il s'avère qu'à la suite j'ai fait des bouchons mais ça n'avait rien à voir avec le cholestérol, j'ai fais deux phlébites dont la dernière qui était assez urgente, j'ai frisé euuh, le pire mais vraiment frisé le pire. Et curieusement, d'après ce que je sais aussi, ça n'a rien à voir avec le cholestérol. Donc ce qui fait que maintenant j'ai un traitement contre le cholestérol plus un traitement anti. euh pour fluidifier le sang, comment il s'appelle euuh. Int 2 : Le Xarelto ? Patient 1 : Le Xarelto, oui voilà. Bon et le pire que j'ai eu n'est pas dû au cholestérol, c'est encore autre chose, donc je continue le traitement anti-cholestérol mais bon D'autant plus que hier soir, j'ai entendu que c'était bon pour les ça réduisait le risque d'AVC alors bon tant mieux, si je le prends pour deux choses à la fois, ça ne peut être que bénéfique. Int 2 : Est-ce que le médecin, du coup c'est le Dr X. (médecin traitant) qui vous l'a prescrit ? Patient 1 : Ouais. Int 2 : Et il y a eu un spécialiste qui vous en parlé un moment ou non ? Patient 1 : Euuh non, non. Pour le cholestérol non. C'est tout resté au niveau du généraliste. Int 2 : Ça a commencé quand cette histoire ? 66 Patient 1 : Piouf. moi je crois que c'est familial, ça c'est un terrain familial, donc euh comme je dis souvent, ma mère, en mangeant deux feuilles de salade et une tranche de jambon par jour, elle a du cholestérol, bon et moi j'ai l'impression que c'est pareil. Quoique je fasse ou même en faisant un régime alimentaire draconien, j'ai toujours du cholestérol. C'est un terrain familial. Int 2 : Et vous sauriez ce qui est en lien avec le cholestérol ? Patient 1 : Je crois qu'à partir du moment o on le fabrique naturellement euh, qu'on mange des carottes toute la journée ou des saucissons toute la journée, ça ne change rien du tout (rires). Bon quoique, le bon intermédiaire entre les deux est toujours à suivre, mais bon je crois que quand on est une usine à cholestérol, on est une usine à cholestérol, il y a un facteur élémentaire là dedans qui o on ne peut pas tellement lutter, à moins de euh un traitement génétique ou quelque chose comme ça, mais bon pour l'instant on en n'est pas la enfin je ne crois pas. Enfin dans les connaissances de la médecine actuelle, je ne crois pas qu'on en soit là. Int 2 : Ça a été découvert en quelle année ? Patient 1 : Ouh c'est très vieux, je vais avoir 59 ans La première fois que j'ai eu du cholestérol détecté je devais avoir 25 ans, entre 25 et 30 ans. Int 1 : Vous êtes traité depuis cette période ? Patient 1 : Non, non. A cette époque là, j'étais à [nom de ville], j'avais un autre généraliste. Il constatait que j'avais du cholestérol mais comme je faisais relativement pas mal de sport à l'époque, il s'est dit bon ça va se tempérer tout seul et puis euuh il ne m'a rien donné. Et puis bon, après les périodes sportives se sont diminuées en fréquence avec les années et le cholestérol lui a vraiment monté. Enfin les premières fois o j'ai consulté Dr X. , c'était vraiment, c'était à 3. 6 donc il fallait faire quelque chose. Mais auparavant j'en avais qui ne montait pas jusqu'à 3. 6 mais entre 2. 5 et 3, ça m'arrivait fréquemment et bon apparemment les docteurs de l'époque, vu mon mon cursus sportif m'ont dit : t'as pas de risque, tu peux tu peux y aller. Int 1 : Qu'est ce que vous faisiez ? Patient 1 : Ben je faisais beaucoup de vélo à l'époque, je faisais beaucoup de vélo, du sport en salle, je faisais pas mal de sport, ce qui fait que euh du fait que je faisais du cholestérol, ils ont certainement pensé qu'avec l'activité sportive que j'avais ça il ne pouvait pas monter, il pouvait que se stabiliser donc j'ai pas eu de traitement à cette époque là mais j'avais du cholestérol. Int 1 : Vous connaissez d'autres choses que le sport pour y faire attention ? Patient 1 : On parle de l'alimentation ? Mais bon l'alimentation, je ne fais pas d'excès nulle part donc euh Mais je suis contre aussi de me priver de trop de plaisirs euh. gustatifs parce que j'ai du cholestérol. Ça, ça me gonfle un peu, c'est un peu dommage (sourires). Int 1 : Vous savez un peu dans l'alimentation, o il y en a du cholestérol ? Patient 1 : O est-ce qu'il y en a ? En particulier dans les charcuteries, dans les viandes grasses, le porc, les charcuteries, ces choses-là. Le fromage. tout ce qui est à fort pourcentage graisseux. mais bon, c'est les plaisirs de la vie aussi On ne va pas tout non plus hein Quand il y a des fêtes qui approchent, je ne compte pas lever le pied (rires). Int 2 : Et donc vous aviez regardé l'émission hier ? Patient 1 : Ben oui, pas longtemps, j'ai vu et j'ai regardé un moment, voilà ce que j'ai retenu, c'est qu'en fait que grosso modo, je résume très vite fait, le cholestérol, c'est pas si grave qu'on le pensait, qu'on pensait avant. Et que la prise d'Atorvastatine en l'occurrence, ils parlaient de statines euh était bénéfique pour d'autres choses en plus du cholestérol, dont j'ai retenu le risque d'AVC. Ah bah ça je me dis, c'est pas mal alors, enfin j'ai retenu que le fait d'avoir du cholestérol, c'est pas si grave. Qu'on peut très bien vivre avec. Et que les médicaments pour, euh contre le cholestérol, plutôt étaient bénéfiques pour d'autres choses. Alors je suis incapable évidemment de vous expliquer le mécanisme interne qui fait que mais bon, voilà ce que j'ai retenu de l'émission. Int 2 : Et avant, vous aviez eu des notions des médias sur ce sujet ? 67 Patient 1 : Sur le cholestérol en particulier ? Int 2 : Oui Patient 1 : Ce que tout le monde sait quoi, l'alimentation et ce que c'était le cholestérol, mais autrement non, j'ai pas de Int 2 : Et dans votre entourage ? Patient 1 : Bon ils ne savent pas plus que moi. J'ai trois sœurs qui ont aussi du cholestérol, le terrain familial fait des ravages à tour de bras Int 2 : Et elles prennent aussi des statines ? Patient 1 : Je ne sais pas si elles sont toutes traitées. Je ne sais pas, mais enfin je sais qu'on a tous un taux supérieur à la normale. Alors je ne sais pas quel est leur taux à elles et si elles sont traitées ou pas, mais on n'y coupe pas. Donc tout le monde en avait dans ma famille, à des taux plus ou moins variables mais bon tout le monde y passe. Int 2 : Donc sœurs et parents ? Patient 1 : Ma mère en a et mes 3 sœurs aussi. Int 2 : Comment se passe la prise du médicament dans la vie de tous les jours ? Patient 1 : Je le prends tous les soirs. Int 2 : Y a-t-il eu un moment dans votre vie o c'était difficile, o vous vouliez peut-être ne pas le prendre ce médicament ? Patient 1 : Maintenant, c'est un rite si vous voulez donc je n'y réfléchis même plus Bon, c'est une contrainte assimilée si vous voulez, donc il arrive le soir une certaine heure et pouf, je prends mes médicaments et puis voilà. Int 2 : D'accord, vous le prenez quand du coup ? Patient 1 : Ben euh vers 10h du soir ouais. Moi je suis un couche tard donc, j'ai eu peur que vous me donniez rendez-vous le matin (rires). Int 2 : D'accord. Ça vous est arrivé de l'oublier ? Patient 1 : De l'oublier, ça a dû m'arriver, une fois ou deux. Une fois ou deux dans le mois ça a peut- être dû m'arriver, mais en général non je n'y pense, je suis assez Non, non c'est ça doit m'arriver mais rarement. Si ça m'arrive, c'est que je suis pas chez moi, je les ai oubliés ou euh bon, ou j'ai une occupation qui a fait que bon j'ai pas pu les prendre mais autrement non non, je suis assez régulier. Int 2 : D'accord. Et depuis que vous le prenez, avez-vous senti des effets ou des modifications ? Patient 1 : Comme je vous ai dit, c'est euh je ne sais pas si on peut classer ça comme une maladie mais avant euh, je me sentais d'une certaine façon, avant d'avoir le traitement, puis j'ai eu un traitement, qui a diminué d'après les prises de sang le cholestérol, mais je ne me sentais pas physiquement mieux qu'avant avoir eu un traitement, c'est Int 2 : Et est-ce qu'il y a eu des effets plutôt indésirables ? Patient 1 : Oula, j'en sais rien Ben non, pas vraiment. Je sais même pas quels sont les effets indésirables du médicament donc, c'est quoi par exemple ? Int 2 : (Rires) C'est nous qui vous interrogeons dites donc Patient 1 : (rires) Je ne sais pas non. Je n'ai pas senti physiquement de différence entre avant et après le traitement. Int 1 : Donc vous n'avez pas senti de changement en tous cas ? Patient 1 : De ? Int 1 : Changement ? Entre avant et après ? 68 Patient 1 : Non. Non, non. Je ne sais pas si je suis un cas particulier mais bon. Avant je n'avais pas mal au jambes, après j'avais pas mal aux jambes non plus, bon (rires). Tant mieux ! Pourvu que ça dure. Int 1 : Vous prenez quel traitement ? Patient 1 : Euuhh Atorvastatine Int 2 : C'est du 40 ou 20 c'est ça ? Patient 1 : Je ne sais plus du tout, de toute façon mon dossier est là, vous pouvez regarder. Int 1 : Et vous prenez d'autres traitements avec ça ? Patient 1 : Hola oui, depuis que j'ai fait les phlébites, j'ai du Xarelto, j'ai un antidépresseur puis un peu de somnifère de temps en temps. Int 2 : L'antidépresseur a été mis avant ? Patient 1 : Oh oui oui, ça fait presque 20 ans que j'en prends. Qu'est-ce que je dis, peut-être même 25 ans. Int 1 : Vous avez dit bientôt 59 ans. Vous faites quoi comme métier ? Patient 1 : J'étais dessinateur industriel. Int 1 : J'étais ? Patient 1 : Oui parce que j'ai été licencié pour restructuration d'entreprise il y a presque 2 ans de ça. Puis à mon âge, je suis relativement tranquille parce que je ne retrouverai plus de boulot jusqu'à la retraite. Int 1 : Vous attendez la retraite ? Patient 1 : Oui, il n'y a plus que ça à faire de toute façon. Au niveau professionnel euh, ils vont pas prendre un mec qui a 60 ans et qui n'a plus bossé depuis 2 ans, je crois que le boulot je peux faire une croix dessus. Puis dans un sens, ça m'arrange aussi Int 1 : Question plus personnelle, la taille ? Patient 1 : 1m72. Int 1 : Le poids ? Patient 1 : C'est vraiment des questions vaches ça, ça doit faire 93kg quelque chose comme ça. Int 1 : Vous n'êtes pas traité pour la tension ? Ou du diabète ? Patient 1 : Non, ça n'a jamais été un sujet de préoccupation ça. Int 2 : Globalement, qu'est-ce que vous pensez de ce traitement ? Pour clore tout ça ? Patient 1 : Je trouve ça un peu rassurant. Il y a eu des effets sur le cholestérol, il a fait baissé un peu le cholestérol. Mais en quoi c'est rassurant, je me demande en quoi maintenant sachant que le cholestérol n'est pas forcément un sujet mortel, et et même j'ai entendu dire, il y a eu des courants qui pensent que c'est même bien d'en avoir (rires). donc à la limite si je n'avais jamais été traité, je me porterais tout aussi bien sans problème. Mais bon vu que les résultats chiffrés sont meilleurs. Mais qu'est-ce que ça veut dire meilleurs ? Euh tout en sachant que en ayant un peu plus, j'aurai la même vie sans problème particulier, je m'interroge Int 1 : Vous savez à quel point ils doivent être bas les chiffres de cholestérol sur la prise de sang ? Patient 1 : Je ne me rappelle plus le taux à ne pas dépasser mais je, je sais que je suis encore légèrement au dessus mais je ne sais pas puis maintenant, ça ne m'inquiète pas plus que ça let's go Int 1 : Et ça, votre inquiétude vis-à-vis du cholestérol, est-ce que c'était différent avant de voir l'émission hier ? 69 Patient 1 : Non, non. Non, non, j'ai, euh non. Pour moi, ce n'est pas un sujet de préoccupation. J'ai plus de préoccupations par rapport aux phlébites que j'ai faites, que pour le cholestérol. C'est le cholestérol, ben faut Puis j'ai des exemples autour de moi, des sœurs qui en ont, euh et qui vivent très bien, bon. Et malgré une petite surcharge pondérale aussi (masse son ventre), mais bon (rires). Mais elles n'ont pas de soucis particuliers, ni elles ni moi, au sujet du cholestérol. Bien qu'on ait tous un terrain favorable quoi. D'ailleurs qu'est-ce qu'on risque à part euh ? J'ai eu mon père qui a eu des artérites, ça c'est possible ? L'artérite ? Alors je sais pas s'il avait du cholestérol lui par contre. Je sais qu'il fumait énormément, mais est-ce que c'est lié au cholestérol ? J'ai jamais su moi ça, alors ? . Int 2 : Euuhhh (rires). Int 1 : Je ne vous ai pas demandé d'ailleurs si vous fumiez ? Patient 1 : Moi je fume la pipe de temps en temps le soir. Int 1 : Vous n'avez fumé que ça ? Patient 1 : Oh avant je fumais des cigarettes oui, enfin j'ai jamais été un gros gros fumeur, non le maximum que j'ai du atteindre c'était un paquet et encore pas très longtemps. Int 2 : Et dans votre famille proche il y a eu des accidents cardiaques ? Ou vasculaires ? Patient 1 : Ben mon père a fait des artérites phénoménales, il était ponté du cœur jusqu'en bas des jambes. Mais il est pas mort de ça, il est mort d'un cancer de la vessie. Et comme c'était un gros gros fumeur, c'est lié tout ça, et je sais pas en quoi le cholestérol a joué un rôle là dedans, j'en sais rien. Je ne sais pas s'il a joué un rôle ou pas. Int 1 : A votre avis qu'est-ce qu'il pourrait faire le cholestérol ? Quel rôle là-dedans ? Patient 1 : Je ne sais pas, le fait d'avoir les poumons encrassés et le sang encrassé par la cigarette. Ben en ajoutant de la graisse, du cholestérol là-dedans, ça peut pas être, je me dis le mélange, ça ne doit pas faire une mayonnaise bien super quoi. Et puis ça doit peut-être se boucher plus facilement. Int 2 : Est-ce qu'il y a des choses que vous voulez aborder, des choses dont on aurait pas discuté à ce sujet et que vous auriez envie de dire là maintenant ? Patient 1 : Non pas spéc | HAL | Scientific |
Prise en charge des lésions kystiques du rein : revue de la littérature | WMT16 | Scientific |
Les hémorragies graves de la délivrance | WMT16 | Scientific |
Historique, technique et résultats des cytoponctions des kystes para-utérins | WMT16 | Scientific |
Les indications du traitement chirurgical des ulcères gastriques et duodénaux et de leurs complications | WMT16 | Scientific |
Thrombophlébites de la veine ovarienne. Nouvelle attitude thérapeutique | WMT16 | Scientific |
Aucune résistance croisée entre le foscarnet et le cidofovir n' a été observée avec les mutants sélectionnés au foscarnet. | EMEA_V3 | Medicinal |
La galactographie (du grec ancien / galactos, lait et / graphein, écrire) est un examen radiologique complémentaire du sein qui permet de visualiser les canaux galactophores.
Il se pratique en injectant un produit de contraste iodé hydrosoluble dans un canal galactophore, puis en réalisant des clichés lors d'une mammographie.
Il est indiqué en cas d'écoulement du sein hors allaitement, en général unipore (écoulement provenant d'un seul pore), constitué de sérum (écoulement séreux) ou d'un mélange de sérum et de sang (écoulement séro-sanglant).
Cet examen permet de mettre en évidence une anomalie à l'intérieur des canaux notamment des images lacunaires, des végétations papillaires intracanalaires multiples pathologiques (tumeur bénigne, papillome).
Voir aussi
Papillomavirus
Notes et références
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Infections graves (y compris pneumonies, cellulite, arthrites septiques, septicémies)* | EMEA_V3 | Medicinal |
Acquisitions récentes dans le diagnostic et le traitement des tumeurs des membres : l'artériographie, l'antimitogramme | WMT16 | Scientific |
Réactions de type allergique*, incluant anaphylaxie, éruption cutanée, urticaire, œ dème de Quincke, dyspnée et hypotension | EMEA_V3 | Medicinal |
Demande d'analgésie périmédullaire par les patientes et les équipes obstétricales dans quatre régions françaises. Partie I : demande d'analgésie | WMT16 | Scientific |
ENQU ETE HOSPITALI'ERE LYONNAISE 1959. 4. DONN'EES CONCERNANT LA POPULATION 'ETRANG'ERE 'A LA R'EGION RH ONE ALPES | WMT16 | Scientific |
Le cas clinique du mois. Péricardite constrictive | WMT16 | Scientific |
l'Agence européenne pour l' évaluation des médicaments (EMEA/MB/076/96) | EMEA_V3 | Medicinal |
Un patient du groupe traité par 40 mg de simvastatine a présenté une élévation de la créatine phosphokinase (CPK) > 5 fois la valeur normale au cours de l'étude, mais cela n'a pas été retenu comme un effet indésirable par l'investigateur. | EMEA_V3 | Medicinal |
La seringue est à présent prête à être fixée sur une aiguille ou une tubulure de cathéter. | EMEA_V3 | Medicinal |
Comprendre une schizophrène | WMT16 | Scientific |
Le risque duodénal dans les néphrectomies difficiles | WMT16 | Scientific |
Introduction En France, depuis bientôt 15 ans, la méthadone et la bupré-norphine sont les deux médicaments commercialisés pour la substitution chez les sujets présentant une dépendance majeure aux opiacés La France est le pays ayant le plus de recul sur l'utilisation de la buprénorphine en traitement de substitution Dès sa commercialisation en février 1996, ce médicament a été bien plus largement prescrit que la méthadone car tout médecin est autorisé à le prescrire D'après l'Observatoire Français des Drogues et des Toxicomanies (OFDT), environ 120 000 personnes étaient traitées par l'un de ces deux médicaments de substitution (MSO) en 2007, dont 80 % par la buprénorphine La buprénorphine a non seulement amélioré la prise en charge mais a également participé à la diminution de la mortalité des sujets toxicomanes aux opiacés Afin de limiter les détournements d'usage de la buprénorphine haut dosage, ses conditions de prescription et de délivrance ont été soumises à la réglementation des stupéfiants dès la commercialisation du médicament princeps ) la mise en place du dispositif Tiers-payant contre génériques Afin de savoir si des coprescriptions de médicaments psychotropes étaient plus fréquemment retrouvées chez les patients recevant un des génériques ou la spécialité princeps, une analyse descriptive de ces médicaments a également été effectuée Méthode 2. 1 Schéma de l'étude et population étudiée L'étude descriptive des ordonnances a été effectuée de façon rétrospective dans six officines de la Haute-Garonne Cinq officines font partie de la Communauté Urbaine du Grand Toulouse, et la sixième est également située dans le département de la Haute-Garonne Une des officines fait partie d'un réseau ville-hôpital d'addictologie Ces officines ont été sollicitées sur la base de leur implication dans les études pharmacoépidémiolo-giques menées par le Centre d'Évaluation et d'Information sur la Pharmacodépendance-Addictovigilance (CEIP-Addictovigilance) de Toulouse et leur participation à une réunion organisée par le CEIP-Addictovigilance Les données présentées concernent les patients ayant eu des délivrances de buprénorphine pendant au moins trois mois durant la période du 1 er octobre 2007 au 29 février 2008 (soit un mois avant et quatre mois après la mise en place du dispositif Tierspayant contre génériques ) Parmi les 62 patients de l'échantillon, 54 ont présenté à l'officine une prescription de buprénorphine pour une durée de 28 jours chaque mois durant les cinq mois de l'étude, six durant quatre mois, et deux durant trois mois Variables recueillies Les variables recueillies étaient : l'âge, le sexe des patients, la spécialité pharmaceutique (médicament princeps ou spécialité générique), la dose quotidienne de buprénorphine délivrée calculée à partir de la quantité de buprénorphine prescrite en divisant la quantité totale prescrite pour 28 jours par ce nombre de jours Ont également été enregistrés la présence ou non de la mention Non substituable sur l'ordonnance et les prescriptions associées de médicaments psychotropes présents sur la même ordonnance que la buprénorphine Les médicaments qui ont été étudiés sont : les benzodiazépines et apparentés (zolpidem, zopiclone), les anxiolytiques non benzodiazépiniques, les hypnotiques non benzodiazé-piniques, les neuroleptiques, et les antidépresseurs Méthodes de recueil et de saisie des données Les données ont été recueillies de façon complètement anonyme (uniquement âge et sexe) dans chaque officine et saisies sur un tableur Excel r Traitement des données et analyse statistique Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel SAS, version 9. 1 (SAS, Cary, NC, USA) L'âge moyen des patients de chaque groupe a été comparé en réalisant une ANOVA Les moyennes des posologies de buprénorphine en fonction du groupe de patients ont été comparées par un modèle mixte avec un effet fixe, le groupe, et un effet aléatoire, l'individu La comparaison des pourcentages a été effectuée par un test exact de Fisher Résultats Description de la population étudiée Soixante-dix-huit patients ont présenté au moins une ordonnance comprenant de la buprénorphine à l'officine durant les cinq mois de l'étude Parmi eux, 16 ont eu des délivrances de buprénor-phine pendant moins de trois mois durant la période de l'étude et n'ont pas été inclus Notre échantillon final comportait 62 patients dont 79 % d'hommes L'âge moyen était de 36, 3 7, 3 ans L'âge maximum pour les deux sexes était de 49 ans L'âge minimum était de 21 ans pour les hommes et Différents profils de patients Parmi les patients pour lesquels la même officine a délivré la buprénorphine, trois groupes peuvent être différenciés : groupe générique (n 13), groupe Subutex r -générique-Subutex r (n 10) et groupe Subutex r (n 39) Dans le groupe générique , à l'exception d'un patient à qui la buprénorphine a été délivrée dans la même officine seulement durant quatre des cinq mois de l'étude, tous les autres patients ont reçu de la buprénorphine de façon continue durant les cinq mois de suivi Les patients sont restés sous générique : soit il a été délivré au patient un générique pendant toute la période de suivi (n 5) soit le patient a reçu 16 mg/jour, il faut toutefois noter qu'un patient du groupe géné-rique avait une prescription en continu de 18 mg/jour et qu'un patient du groupe Subutex r -générique-Subutex r avait une prescription en continu de 24 mg/jour Il ne peut pas non plus être exclu que certains des patients de notre population aient pratiqué un nomadisme pharmaceutique pour obtenir la buprénorphine dans différentes officines en présentant des ordonnances de plusieurs médecins Pour avoir ces données, il aurait fallu connatre les demandes de remboursement auprès de l'Assurance Maladie effectuées par les patients, avec le risque que certains ne demandent pas le remboursement de la buprénorphine achetée D'après les résultats de notre étude, les patients qui n'ont pas reçu de générique du médicament de référence durant les cinq mois de suivi seraient plus nombreux à avoir au moins un psychotrope coprescrit en continu Il serait intéressant d'obtenir cette donnée sur un plus grand nombre de patients, et/ou par d'autres sources de données, car la différence avec les autres groupes n'est pas statistiquement significative L'obtention de telles informations permettrait sensiblement les résultats Dans le même temps, notre équipe a réalisé l'analyse des délivrances de benzodiazépines dans une cohorte de patients nouvellement substitués par buprénorphine en Haute-Garonne à partir de janvier 2005 Sur un échantillon de 320 patients ayant des délivrances régulières de buprénorphine (71, 8 % d'hommes, âge moyen 33, 5 ans), nous avons observé une prévalence de consommation de benzodiazépines sur les 2 années de suivi de 42, 5 %, le bromazépam, suivi par le clonazé-pam, le zolpidem et le diazépam, étant les plus utilisés Cependant, la prévalence d'utilisation des benzodiazépines (ainsi que les doses quotidiennes moyennes obtenues) étaient plus élevées chez les patients définis comme Non rationnels (c'est-à-dire ayant recours à plus de 2 médecins ou pharmaciens pour les premiers mois de traitement par buprénorphine) Cette prévalence d'utilisation des benzodiazépines était également associée à la présence de comorbidité psychiatrique identifiée à partir de la notion d'Affection de Longue Durée (ALD) Même si, dans ce travail, il n'a pas été possible de repérer un échantillon suffisamment important de patients passant sous générique (les 2 ans de suivi disponible ne permettaient pas un recul suffisant pour l'analyse de l'effet du Tiers-payant contre génériques ), ces données vont dans le même sens que ce que nous avons observé à travers l'analyse de ces ordonnances Discussion Références | ISTEX | Scientific |
Le traitement du glaucome chez les patients atteints de syndrome sec oculaire | WMT16 | Scientific |
CIMETIDINE MYLAN 400 mg, comprimé pelliculé - Résumé des caractéristiques du produit. ANSM - Mis à jour le : 30/09/2020 CIMETIDINE MYLAN 400 mg, comprimé pelliculé Cimétidine. 400 mg Pour un comprimé pelliculé. Pour la liste complète des excipients, voir rubrique 6. 1. Traitement d'entretien de l'ulcère duodénal chez les patients non infectés par ou chez qui l'éradication n'a pas été possible. Traitement de l'œsophagite secondaire au reflux gastro-œsophagien. Syndrome de Zollinger-Ellison. Les comprimés sont à avaler avec un peu d'eau. , la dose est : soit de 400 mg au petit déjeuner et 400 mg au coucher. soit de 800 mg au coucher. Le traitement doit être poursuivi 4 à 6 semaines même si une amélioration symptomatique est observée avant ce délai. , la dose quotidienne est de 800 mg à 1, 6 g selon la gravité des lésions. Le traitement doit être poursuivi 4 à 8 semaines même si une amélioration symptomatique est observée avant ce délai, et peut éventuellement être poursuivi jusqu'à 12 semaines. Si le est justifié, la dose est de 400 mg par jour au coucher. Pour le traitement du , la dose peut être augmentée, si nécessaire, jusqu'à 2 g par jour. Cas particuliers En cas d'insuffisance rénale, il convient de réduire la posologie en fonction de la clairance de la créatinine : 0 à 15 ml/min : 200 mg toutes les 12 heures 15 à 30 ml/min : 200 mg toutes les 8 heures 30 à 50 ml/min : 200 mg toutes les 6 heures Des données récentes ont montré que les taux circulants de cimétidine n'étaient pas diminués par l'hémodialyse conventionnelle et que l'administration de celle-ci pouvait être faite indépendamment de l'hémodialyse. Par contre, aucune donnée n'est disponible concernant les malades traités par des membranes très perméables ou par hémodiafiltration à haut débit. En cas d'insuffisance hépatique sévère, il est préférable de réduire la dose avec un maximum de 600 mg/jour. Association avec le carvédilol (voir rubrique 4. 5). La prise de ce médicament est généralement déconseillée en association avec la phénytoïne, la carmustine et la lomustine (voir rubrique 4. 5). L'administration d'antisécrétoires de la classe des inhibiteurs des récepteurs H favorise le développement bactérien intragastrique par diminution de l'acidité gastrique. Précautions d'emploi La cimétidine ne peut être prescrite que si l'ulcère a été authentifié par endoscopie. En cas d'ulcère gastrique, il est recommandé de vérifier la bénignité de la lésion avant traitement. Ce dosage n'est pas adapté au traitement, des enfants, des insuffisants rénaux ou en cas d'insuffisance hépatique sévère. La prise en dose unique de 800 mg de cimétidine est en principe à éviter chez les sujets âgés. Chez ces derniers, interrompre le traitement si survient un état confusionnel ou une bradycardie sinusale importante. Ce médicament contient moins de 1 mmol (23 mg) de sodium par comprimé, c. -à-d. qu'il est essentiellement sans sodium . La cimétidine est un inhibiteur de certaines enzymes du métabolisme hépatique. Ce mécanisme peut être à l'origine de l'augmentation des concentrations de médicaments et notamment ceux à marge thérapeutique étroite, métabolisés par ces mêmes voies. Leurs effets, notamment indésirables, peuvent alors être majorés. Une adaptation de la posologie de ces médicaments pourra alors être effectuée pendant le traitement par cimétidine et après son arrêt. Toutefois, en pratique courante, et en l'absence d'insuffisance hépatique ou rénale, ces interactions ne sont pas susceptibles d'avoir un retentissement pharmacocinétique et donc, , une traduction clinique tant que la dose quotidienne de cimétidine est inférieure à 800 mg. Associations contre-indiquées Carvédilol Augmentation des concentrations plasmatiques en carvédilol pouvant être préjudiciable dans le cas du traitement de l'insuffisance cardiaque, par diminution de son métabolisme hépatique par la cimétidine. Utiliser un autre anti-sécrétoire. Phénytoïne Augmentation des concentrations plasmatiques de phénytoïne avec possibilité d'apparition des signes habituels de surdosage. Si l'association ne peut être évitée : surveillance clinique étroite, dosage des concentrations plasmatiques de phénytoïne et adaptation éventuelle de sa posologie, pendant le traitement par la cimétidine et après son arrêt. Carmustine, lomustine (cytotoxiques alkylants) Toxicité médullaire accrue (inhibition du métabolisme de l'alkylant). Associations faisant l'objet de précautions d'emploi Topiques gastro-intestinaux Diminution de l'absorption digestive de la cimétidine. Prendre les topiques gastro-intestinaux à distance de la cimétidine (plus de 2 heures, si possible). Anticoagulants oraux Augmentation de l'effet anticoagulant oral et du risque hémorragique (diminution de son métabolisme hépatique). Contrôle plus fréquent du taux de prothrombine et surveillance de l'INR. Adaptation de la posologie de l'anticoagulant oral pendant le traitement par la cimétidine et 8 jours après son arrêt. Alfentanil Augmentation de l'effet dépresseur respiratoire de l'analgésique opiacé par diminution de son métabolisme hépatique. Adapter la posologie de l'analgésique opiacé en cas de traitement par la cimétidine. Carbamazépine En début du traitement, augmentation transitoire des concentrations plasmatiques de la carbamazépine (inhibition de son métabolisme hépatique). Surveillance clinique et réduction éventuelle de la posologie de la carbamazépine spécialement pendant les 1 jours de traitement par la cimétidine. Chlordiazépoxide, diazépam Risque accru de somnolence. Avertir les patients de l'augmentation du risque en cas de conduite automobile ou d'utilisation de machine. Midazolam, triazolam Augmentation des concentrations plasmatiques de la benzodiazépine (diminution de son métabolisme hépatique avec majoration de la sédation). Surveillance clinique et réduction de la posologie de la benzodiazépine pendant le traitement par la cimétidine. Lidocaïne (voie parentérale) (antiarythmique de classe Ib) Augmentation de la lidocaïnémie, avec possibilité d'effets indésirables neurologiques et cardiaques (inhibition du métabolisme hépatique de la lidocaïne). 1 - Adapter la posologie de la lidocaïne. 2 - Surveillance clinique, ECG et éventuellement des concentrations plasmatiques de lidocaïne pendant l'association et après l'arrêt de la cimétidine. Méthadone Augmentation des concentrations plasmatiques de méthadone avec signe de surdosage. Mécanisme invoqué : diminution de son métabolisme hépatique. Surveillance clinique renforcée : s'il y a lieu, adaptation de la posologie de la méthadone pendant le traitement par la cimétidine et après son arrêt. Moclobémide (IMAO sélectif) Augmentation des concentrations plasmatiques de l'antidépresseur (diminution de son métabolisme hépatique). Surveillance clinique avec adaptation éventuelle de la posologie de l'antidépresseur. Nifédipine Augmentation de l'effet hypotenseur de la nifédipine (inhibition de son métabolisme hépatique). Surveillance clinique accrue ; adapter la posologie de la nifédipine pendant le traitement par la cimétidine et après son arrêt. Tacrine Augmentation des effets cholinergiques de la tacrine (nausées, vomissements, diarrhée) par inhibition de son métabolisme hépatique. Surveillance clinique et adaptation de la posologie de la tacrine pendant le traitement par la cimétidine et après son arrêt. Théophylline (base et sels) et aminophylline Augmentation de la théophyllinémie avec risque de surdosage par diminution de son métabolisme. Surveillance clinique et éventuellement de la théophyllinémie. S'il y a lieu adaptation de la posologie de la théophylline pendant le traitement par la cimétidine et après son arrêt. Associations à prendre en compte Itraconazole (forme gélule), kétoconazole Diminution de l'absorption digestive de l'antifongique azolé, par augmentation du pH intragastrique par la cimétidine. Ciclosporine Augmentation des concentrations sanguines de la ciclosporine. Atazanavir Risque de diminution des concentrations plasmatiques de l'atazanavir en association avec les antisécrétoires antihistaminiques H2 comme la cimétidine. Grossesse Les études chez l'animal n'ont pas mis en évidence d'effet tératogène de la cimétidine mais une fœtotoxité à type d'effet anti-androgène lors d'une administration prolongée. En l'absence d'effet tératogène chez l'animal, un effet malformatif dans l'espèce humaine n'est pas attendu. En effet, à ce jour, les substances responsables de malformations dans l'espèce humaine se sont révélées tératogènes chez l'animal au cours d'études bien conduites sur deux espèces. En clinique, l'utilisation de la cimétidine au cours d'un nombre limité de grossesses n'a apparemment révélé aucun effet malformatif ou fœtotoxique particulier à ce jour. Toutefois, des études complémentaires sont nécessaires pour évaluer les conséquences d'une exposition en cours de grossesse. En conséquence, par mesure de précaution, il est préférable de ne pas utiliser la cimétidine pendant la grossesse. Allaitement Le passage dans le lait maternel des antihistaminiques H est documenté, avec un rapport de concentrations lait/plasma élevé mais les doses ingérées par l'enfant restent faibles (environ 1 % de la dose maternelle). Néanmoins, seules des données cinétiques sont disponibles. La tolérance chez l'enfant en cas de traitement maternel, s'il est prolongé ou à doses élevées, n'est pas connue. En conséquence, par mesure de précaution, il convient d'éviter ce médicament au cours de l'allaitement. Les effets indésirables sont listés ci-dessous par classe-organe et par fréquence. Les fréquences sont définies en : très fréquent ( 1/10), fréquent ( 1/100 et < 1/10), peu fréquent ( 1/1 000 et < 1/100), rare ( 1/10 000 et < 1/1 000) et très rare (< 1/10 000) y compris les cas isolés : Affections gastro-intestinales : : diarrhée. Affections du système nerveux : : céphalées, sensations vertigineuses. Affections psychiatriques : : dépression. : états confusionnels, réversibles à l'arrêt du traitement observés chez des sujets âgés et en cas d'insuffisance rénale sévère. Affections endocriniennes : : gynécomasties et galactorrhées réversibles à l'arrêt du traitement. : impuissance réversible chez des patients recevant de fortes doses (syndrome de Zollinger- Ellison) ; à posologie normale, leur incidence est identique à celle de la population générale. Affections hématologiques et du système lymphatique : : leucopénie et agranulocytose (environ 3 par million de patients traités par la cimétidine) chez des patients généralement dans un état grave et recevant par ailleurs d'autres médicaments réputés avoir cet effet. : thrombopénie (environ 3 par million de malades traités par la cimétidine), pancytopénie, aplasies. Affections hépatobiliaires : : hépatite, pancréatite. Une élévation transitoire des transaminases a été observée. Affections du rein et des voies urinaires : : néphrite interstitielle. Une élévation de la créatinémie a été observée. Affections cardiaques : : bradycardie sinusale (surtout par voie injectable), tachycardie et bloc auriculo-ventriculaire. Affections musculo-squelettiques et systémiques : : douleurs musculaires. Affections du système immunitaire : : réaction de type anaphylactique, vascularites allergiques. Affections de la peau et du tissu sous-cutané : : éruptions cutanées parfois sévères, alopécie réversible. Troubles généraux : : asthénie et états fébriles. Déclaration des effets indésirables suspectés La déclaration des effets indésirables suspectés après autorisation du médicament est importante. Elle permet une surveillance continue du rapport bénéfice/risque du médicament. Les professionnels de santé déclarent tout effet indésirable suspecté via le système national de déclaration : Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé (ANSM) et réseau des Centres Régionaux de Pharmacovigilance - Site internet : . Lors des prises de doses entre 20 et 40 g de cimétidine, il a été rapporté des troubles neurologiques, tels que des troubles de la conscience. Quelques cas de décès ont été rapportés chez l'adulte après ingestion d'une dose unique de 40 g de cimétidine. Emétiques et lavage gastrique associés à un traitement symptomatique peuvent être justifiés. La cimétidine est un antisécrétoire gastrique, antagoniste des récepteurs H à l'histamine. Une dose de 200 mg de cimétidine entrane dès la première heure une chute de l'acidité gastrique basale, l'effet se prolongeant au-delà de 1 h 30. Une dose de 400 mg inhibe la sécrétion acide nocturne pendant environ 8 heures. La cimétidine inhibe la sécrétion acide maximale stimulée par l'histamine, la pentagastrine, l'insuline, la caféine ou par les aliments et abaisse le débit total de pepsine par diminution du volume du suc gastrique. La cimétidine n'altère pas la production de mucus, ne modifie pas l'évacuation gastrique, n'affecte pas la sécrétion pancréatique et est sans effet sur le sphincter œsophagien inférieur. La cimétidine exerce à fortes doses chez l'animal un faible effet antiandrogénique. Chez l'homme, un blocage au niveau des récepteurs androgéniques périphériques a été évoqué. La fixation de la cimétidine aux protéines plasmatiques est faible. La demi-vie d'élimination plasmatique est d'environ 2 heures. L'élimination se fait par voie rénale essentiellement, 70 % de la dose administrée sont retrouvés dans les urines en grande partie non métabolisés. La cimétidine franchit la barrière placentaire et est excrétée dans le lait ; le rapport concentration lait/plasma est de 1, 7. La clairance de la cimétidine décrot avec l'âge. : OPADRY OY-S-88 26 (hypromellose, dioxyde de titane, polyvidone, macrogol 400, laque aluminique d'indigotine, oxyde de fer jaune, oxyde de fer noir, hydroxypropylcellulose), cire de Carnauba. 5 ans. 15 ou 30 comprimés sous plaquettes (PVC/Aluminium). 15 ou 30 comprimés en flacon (PE) muni d'un bouchon en polyuréthane. 117, ALLEE DES PARCS 69800 SAINT PRIEST 34009 339 712 7 4 : 15 comprimés sous plaquettes (PVC/Aluminium). 34009 339 713 3 5 : 30 comprimés sous plaquettes (PVC/Aluminium). 34009 339 715 6 4 : 15 comprimés en flacon (PE). 34009 339 716 2 5 : 30 comprimés en flacon (PE). Sans objet. Liste II. | BDPM | Medicinal |
Dépôts amyloïdes intraligamentaires dans la sténose du canal rachidien | WMT16 | Scientific |
cliniques de la Peste Porcine Classique, ainsi que pour réduire l' infection par, et l' excrétion du virus uth | EMEA_V3 | Medicinal |
LA CYSTOM'ETRIE DANS LA SCL'EROSE EN PLAQUES | WMT16 | Scientific |
Des réactions anaphylactoïdes associées à Elaprase ont été rapportées après sa mise sur le marché. | EMEA_V3 | Medicinal |
La résistance à la contraception | WMT16 | Scientific |
Les granulés effervescents doivent être dissous dans environ 150 ml d' eau frache. | EMEA_V3 | Medicinal |
Assistance médicale à la procréation chez un couple dépendant aux opiacés | WMT16 | Scientific |
LE PROBL'EME DES TOXICOSES FUNGIQUES | WMT16 | Scientific |
La posologie recommandée est de 375 mg/ m de surface corporelle, administrés le premier jour de chaque cure de chimiothérapie, pendant 8 cures, après perfusion intraveineuse du glucocorticoïde du protocole CHOP . | EMEA_V3 | Medicinal |
Les symptômes de l'hypercalcémie peuvent inclure : anorexie, soif, nausées, vomissements, constipation, douleur abdominale, faiblesse musculaire, fatigue, troubles mentaux, polydypsie, polyurie, douleur osseuse, calcinose rénale, calculs rénaux et dans les cas graves, arythmies cardiaques. | EMEA_V3 | Medicinal |
Quarante cas de cancers thoraciques avancés : traitement ambulatoire de 1 a 3 ans par une association de cytostatiques | WMT16 | Scientific |
Pustulose exanthématique aigu généralisée induite par l'application d'Algipan | WMT16 | Scientific |
La capillaroscopie dans l'arthrite rhumatoide | WMT16 | Scientific |
L'UTILISATION des antibiotiques dans le traitement de la tuberculose | WMT16 | Scientific |
L'approche systémique des familles non volontaires | WMT16 | Scientific |
Angioplastie coronaire percutanée transluminale dans la maladie de Takayashu | WMT16 | Scientific |
Intérêt de la pariétographie dans le diagnostic des affections gastriques | WMT16 | Scientific |
334 JEAN-FRANÇOIS TULASNE, ÉRIC SOLYOM L'hyperdivergence se définit en orthodontie comme une obliquité excessive des plans occlusal et mandibulaire par rapport à la ligne Sn ou au plan de Francfort De définition cépha-lométrique, cette anomalie se retrouve dans des tableaux cliniques variés o les modifications squelettiques à l'origine de l'hyperdivergence sont particulièrement bien mises en évidence par l'analyse architecturale et structurale de Delaire Tout comme l'orthodontiste, le chirurgien aborde avec réticence les cas d'hyperdivergence La récidive est particulièrement à craindre et, plus que pour toute autre dysmorphose, une technique chirurgicale et un traitement orthodontique bien conduits sont essentiels pour stabiliser les résultats L'ANALYSE DE DELAIRE TABLEAUX CLINIQUES Même si certains appareils fonctionnels (utilisés précocément) et, surtout, les nouveaux procédés d'ancrage orthodontique dans les bases osseuses permettent des déplacements jusqu'alors impossibles, tels que l'ingression des molaires supérieures, les moyens thérapeutiques pour réduire l'hyperdivergence sont avant tout chirurgicaux, qu'il s'agisse d'allonger les branches montantes, de réduire la hauteur du maxillaire ou encore d'augmenter la place disponible pour la langue en élargissant et en avançant le maxillaire Ces objectifs ne sont pas toujours simples à atteindre S'il est démontré que l'ingression (ou impaction) du maxillaire est une opération dont les résultats sont très stables, en revanche l'opération consistant à augmenter la hauteur faciale postérieure par allongement des branches montantes mandibulaires est depuis longtemps réputée comme récidivante à plus ou moins long terme La raison en est la mise en tension des tissus mous, particulièrement des muscles masticateurs (sangle ptérygo-massétérine) et du très puissant ligament sphéno-mandibulaire qui s'attache près Ostéotomies mandibulaires Le tracé de la maxillotomie totale type Le Fort I n'a rien de particulier Si la courbe de Spee est très prononcée, l'arcade peut être segmentée en trois ou quatre fragments, ce qui permet un nivellement et si besoin une expansion Prévention des récidives après avancement mandibulaire Le déplacement du maxillaire est fonction des données de l'examen clinique et de l'étude céphalométrique : -rotation antérieure ou postérieure selon l'orientation du plan d'occlusion maxillaire -avancement -expansion qui, selon la forme d'arcade et l'importance du déplacement, peut être soit immédiate en V à sommet interincisif, soit progressive par disjoncteur palatin classique à vérin Ostéotomie maxillaire type LeFort I -elle ne permet pas une ostéosyn-thèse suffisamment rigide pour éviter le blocage bimaxillaire -en cas d'avancement de la mandible, le diastasis inter-fragmentaire doit être comblé par une greffe osseuse -la voie d'abord sous-angulo-mandibulaire laisse une cicatrice (générale-ment peu visible) Ces inconvénients et l'amélioration des techniques chirurgicales permettant de désinsérer les muscles par voie orale font que l'ostéotomie en L inversé et la voie cutanée sont pratiquement abandonnées au profit de l'ostéotomie sagittale type Obwegeser-Dal Pont Désinsertions musculaires C'est un temps essentiel de la chirurgie d'allongement des branches montantes, au terme duquel le corps mandibulaire doit être véritablement flottant au point qu'il est possible de créer sans forcer une béance de plusieurs millimètres (jusqu'à 15 mm si nécessaire) entre les molaires, les incisives étant évidemment en contact Ceci suppose comme nous l'avons vu plus haut de désinsérer les muscles et ligaments qui s'opposent au déplace-ment du corps de la mandibule : sangle ptérygo-massétérine, ligament sphéno-mandibulaire, muscles sus-hyoïdiens -La désinsertion au moins partielle des muscles sus-hyoïdiens est indispensable dès que l'avancement du menton dépasse 15 % de la distance os hyoïde -menton d'après Epker Elle est facilement réalisée par voie orale, généralement lors de la génio-plastie qui est le plus souvent associée à l'allongement des branches montantes Elle a été proposée par Steinhauser en 1973 -La désinsertion de la sangle pté-rygo-masséterine est faite au cours de l'ostéotomie sagittale type Obwegeser-Dal Pont, technique habituelle pour les avancements mandibulaires puisqu'elle permet des osteosynthèses évitant le blocage et des contacts le plus souvent suffisants entre les fragments pour se passer de greffe osseuse La voie d'abord vestibulaire donne un accès direct à la face externe et au bord postéro-inférieur de l'angle qu'il est facile de libérer des attaches du masséter On peut alors inciser le périoste pour ouvrir le sac périosté, comme proposé par Wolford , puis par Ferri 10 , mais cela ne peut suffire à mobiliser facilement vers le bas la mandibule car il reste des attaches très puis- Hypercorrection Les déplacements squelettiques qui mettent en tension les tissus mous, en particulier les muscles et les aponé-vroses, ont évidemment tendance à récidiver après chirurgie C'est le cas par exemple des latéromandibulies o la mandibule reste soumise après recentrage à l'action prédominante des muscles plus courts du côté o était la déviation Une hypercorrection est souvent souhaitable, dans des proportions restant à la portée d'un rattrapage par les moyens orthodontiques Il en est de même pour les allongements des branches montantes, d'autant que les béances postérieures sont en règle faciles à fermer par tractions élastiques post-opératoires Dans tous les cas d'hyperdivergence par hypoplasie mandibulaire, il est donc indiqué d'exagérer la correction en maintenant entre les molaires un espace d'autant plus marqué que la rotation antérieure doit être importante Une telle hypercorrection a été proposée et appliquée chez deux patients en 1971 par Poulton et Ware A partir des conclusions de son analyse architecturale et structurale, notre matre Delaire nous faisait opérer en 1978 deux patients présen-tant une micromandibulie (dont un enfant de 9 ans) en créant une béance de 10 mm entre les premières molaires, ce qui conduisit à allonger les branches montantes de 20 mm 23, 24 Ostéosynthèses Tout avancement chirurgical de la mandibule, même de faible amplitude, tend à faire sortir le condyle de la cavité glénoïde En cas de blocage bi-maxillaire et en l'absence d'une ostéosyn-thèse refoulant le condyle en haut et en arrière, la récidive est inévitable dès la levée du blocage L'hypercorrection par un bloc de béance postérieure, proposée par Poulton et Ware (qui attribuent la récidive à la seule tension des muscles sus-hyoïdiens), avait pour but de compenser ce déplace-ment secondaire du condyle Dans un deuxième article paru en 1973 qui est la suite du précédent, les auteurs mentionnent la nécessité d'une ostéo-synthèse par fil d'acier pour maintenir en bonne place le condyle Steinhauser fait la même recommandation dans un article paru quelques mois plus tard sur l'intérêt de la section des muscles sus-hyoïdiens dans les cas de correction des rétromandibulies avec béance antérieure L'ostéosynthèse par fil d'acier ne constituait pas pour autant une garantie de stabilité dans la mesure o, le blocage inter-maxillaire restant indispensable, des déplacements mandibulaires précoces étaient possibles par extrusion des dents antérieures devenues plus ou moins mobiles avec l'orthodontie Une solidarisation des arcs aux bases osseuses (par des fils d'acier qu'il fallait resserrer périodiquement) était indispensable Si l'indication chirurgicale semble de règle, tout au moins dans les formes accentuées, il est essentiel d'agir dans le sens d'une restauration fonctionnelle : respiration nasale, espaces pharyngé et buccal, occlusion labiale On retiendra la phrase lapidaire de Paul Tessier concernant les maxillaires : Jamais trop large, jamais trop en avant qui résume bien la direction générale des déplacements des bases osseuses C'est comme toujours l'examen clinique et l'analyse céphalomé-trique qui préciseront la cause de l'hyperdivergence, les anomalies morphologiques et les moyens d'y remédier L' âge auquel il faut intervenir dépend lui aussi des désordres fonctionnels constatés à l'examen clinique et dont la persistance pendant la croissance ne peut qu'aggraver la dysmorphose La croissance du maxillaire sera perturbée en cas d'obstruction nasale ou d'hypoplasie mandibulaire On peut opérer une cloison nasale avant la puberté, et si l'enfant est trop âgé pour que les appareils fonctionnels soient efficaces, on peut envisager des ostéo-tomies dès l'éruption des deuxièmes molaires et même plus tôt pour allonger les branches montantes mandibulaires (par une ostéotomie en L inversé avec blocage ou ostéotomie et distraction progressive) dans les cas de micromandibulie En revanche, il est préfé-rable d'attendre la fin de la croissance pour opérer les cas d'hypoplasie mandibulaire modérée Des arcs vestibulaires ont été posés en per-opératoire pour permettre le port de tractions élastiques dans les suites de l'opération (pas de blocage) Contrôle radiographique en fin de traitement (f) Greffes osseuses INDICATIONS 343 HYPERDIVERGENCE SQUELETTIQUE CONSIDÉRATIONS CHIRURGICALES ments Leurs conclusions doivent être revues à la lecture des publications de ces quinze dernières années, particulièrement en ce qui concerne l'expansion maxillaire et l'avancement mandibulaire Ingression maxillaire : très stable quel que soit le mode de fixation (fil d'acier et blocage ou miniplaques vissées) Avancement maxillaire : stable à 80 % quelle que soit la fixation Expansion maxillaire : mouvement le moins stable (50 % d'expansion perdue un an après ostéotomies et fixation des fragments dans une gouttière préformée aux dimensions souhaitées), mais aucun résultat n'est donné dans cet article pour l'expansion progressive par disjoncteur En pratique, les facteurs de stabilité peuvent se résumer ainsi : -une chirurgie programmée à l'âge adulte, sauf si les troubles fonctionnels ou même les anomalies esthétiques obligent à intervenir plus tôt, -l'élimination préalable par l'orthodontiste de toutes les compensations dentaires, notamment dans le sens transversal o la récidive est quasi-certaine, -une expansion maxillaire progressive par disjoncteur, après ostéotomies complètes, et donc un élargissement squelettique et pas seulement dentaire, avec une hypercorrection de l'endognathie, -un positionnement passif des piè-ces osseuses avant fixation par plaques et vis, -une hypercorrection variable selon le sens et l'importance du déplace-ment et toujours dans les limites d'une finition orthodontique, -une chirurgie en un ou deux temps selon l'âge et le type de déplacement, CONCLUS ION anti-horaires) doivent faire craindre la récidive, à moins qu'elles ne résultent d'une ingression maxillaire comme nous l'avons vu précédemment Le risque de récidive augmente également avec la quantité d'avancement et nous avons déjà décrit en détail tous les moyens à mettre en oeuvre pour assurer un résultat stable quelque soit le degré d'hypoplasie mandibulaire (cf Prévention des récidives) Depuis la publication de ces recommandations parfaitement détaillées dans l'article d , à l'exception des ostéosynthèses rigides non utilisées à l'époque en chirurgie orthognathique, plusieurs articles font état de résultats très stables, avec un minimum de récidive, chez plusieurs dizaines de patients opérés Des résul-tats tout aussi stables sont retrouvés dans une étude très complète portant sur 47 femmes ayant eu, par le même chirurgien et dans le même temps opératoire, des prothèses temporomandibulaires complètes et une rotation antérieure de l'ensemble maxillomandibulaire 4 BIBLIOGRAPHIE -un comblement de tous les déficits osseux (secondaires aux déplacements) par des greffons osseux autogènes, et non des substituts osseux comme le proposent certaines publications, -enfin, un suivi prolongé par l'orthodontiste, avec au besoin le concours de l'orthophoniste, en veillant au maintien d'un parfait équilibre occlusal. | ISTEX | Scientific |
GLUCOSE 20 % CARELIDE, solution pour perfusion - Résumé des caractéristiques du produit. ANSM - Mis à jour le : 09/08/2021 GLUCOSE 20 % CARELIDE, solution pour perfusion Glucose. 20 g (sous forme de glucose monohydraté) pour 100 mL de solution pour perfusion. Une poche de 100 mL contient 20 g de glucose Une poche de 250 mL contient 50 g de glucose Une poche de 500 mL contient 100 g de glucose Une poche de 1000 mL contient 200 g de glucose Apport calorique glucidique : 800 kcal/L (soit 3350 kJ/L) Pour la liste complète des excipients, voir rubrique 6. 1. Solution pour perfusion. Solution limpide, incolore ou légèrement jaunâtre, exempte de particules visibles. Glucose : 1110 mmol/L. Osmolarité théorique : 1110 mOsm/L pH compris entre 3, 5 6, 5 Apport calorique glucidique (800 kcal/L) ; Prévention des déshydratations intra et extra-cellulaires ; Réhydratation lorsqu'il existe une perte d'eau supérieure à la perte en électrolytes ; Prophylaxie et traitement de la cétose dans les dénutritions ; Véhicule ou diluant pour apport thérapeutique en période préopératoire, peropératoire et postopératoire immédiate. Posologie : La concentration et la posologie d'une solution de glucose pour usage intraveineux dépendent de plusieurs facteurs comprenant l'âge, le poids et l'état clinique du patient. Les concentrations sériques en glucose peuvent nécessiter une surveillance étroite. La posologie recommandée pour le traitement de la déplétion en eau et en hydrates de carbone est la suivante : 500 mL à 3 litres/24 h. Population pédiatrique : Le débit et le volume de perfusion dépendent de l'âge, du poids, du statut clinique et métabolique du patient et du traitement concomitant. La solution doit être administrée par un personnel expérimenté. 0-10 kg de poids corporel : 25 mL/kg/24 h. 10-20 kg de poids corporel : 250 mL 12, 5 mL /kg au-dessus de 10 kg / 24 h. > 20 kg de poids corporel : 375 mL 5 mL / kg au-dessus de 20 kg / 24 h. Le débit de perfusion ne doit pas dépasser les capacités d'oxydation du glucose du patient (ex. perturbation du métabolisme oxydatif du glucose en période post-opératoire ou post-traumatique précoce ou en présence d'hypoxie ou de défaillance d'un organe), de manière à éviter une hyperglycémie. Par conséquent, les doses maximales sont de 5 mg/kg/min pour les adultes et comprises entre 10 et 18 mg/kg/min pour les nouveau-nés, les nourrissons et les enfants, selon l'âge et la masse corporelle totale. Lorsque GLUCOSE 20 % CARELIDE, solution pour perfusion est utilisée comme véhicule ou diluant pour préparation injectable d'autres médicaments, la posologie et le débit de perfusion seront principalement fonction de la nature et de la posologie du médicament à administrer. L'équilibre hydrique, le glucose sérique, le sodium sérique et d'autres électrolytes pourront faire l'objet d'une surveillance avant ou pendant l'administration, en particulier chez les patients présentant une libération non-osmotique excessive de la vasopressine (syndrome de sécrétion inappropriée de l'hormone antidiurétique, SIADH) et chez les patients traités concomitamment par des médicaments agonistes de la vasopressine, en raison du risque d'hyponatrémie. La surveillance du sodium sérique est particulièrement importante pour les solutés physiologiquement hypotoniques. GLUCOSE 20 % CARELIDE peut devenir extrêmement hypotonique après administration du fait de la métabolisation du glucose dans l'organisme (voir rubriques 4. 4, 4. 5 et 4. 8). Mode d'administration : Perfusion intraveineuse Pratiquer la perfusion lentement et régulièrement sur 24 heures, à l'aide d'un cathéter veineux central dont l'extrémité distale est située à l'entrée de l'oreillette droite et employer si possible une pompe à débit réglable. Lorsque la solution est utilisée pour la dilution et l'administration de médicaments complémentaires par perfusion intraveineuse, les instructions d'utilisation des substances ajoutées détermineront les volumes appropriés pour chaque traitement. Précautions à prendre avant la manipulation ou l'administration du médicament : voir la rubrique 6. 6. Hypersensibilité au maïs (voir rubriques 4. 4 et 4. 8), Hyperglycémie non contrôlée, Diabète décompensé, Autres intolérances connues au glucose (ex. situations de stress métabolique, états de choc aigu, collapsus), Coma hyperosmolaire, Hyperlactatémie, Acidose métabolique, Inflation hydrique. L'administration de volumes élevés peut notamment donner lieu, en raison d'une surcharge liquidienne, aux contre-indications suivantes : Hyperhydratation Insuffisance cardiaque aige Œdème pulmonaire La solution ne doit pas être utilisée seule à des fins d'apport liquidien ou de réhydratation car elle ne contient pas d'électrolytes (voir rubrique 4. 4). Respecter une vitesse de perfusion lente au risque de voir apparatre une diurèse osmotique indésirable. Une surveillance clinique particulière est nécessaire au début de toute perfusion intraveineuse. L'administration doit être effectuée sous une surveillance régulière et attentive. GLUCOSE 20 % CARELIDE, solution pour perfusion est une solution HYPERTONIQUE. La perfusion doit être immédiatement arrêtée en cas d'apparition de signes anormaux ou de symptômes d'une réaction allergique (tels que sueurs, fièvre, frissons, céphalées, rashs cutanés ou dyspnée). GLUCOSE 20 % CARELIDE, solution pour perfusion contient du glucose dérivé du maïs, ce qui provoque des réactions d'hypersensibilité chez les patients allergiques au maïs. La perfusion de volumes importants doit être effectuée sous une surveillance particulière chez les patients atteints d'intoxication hydrique, d'insuffisance cardiaque, pulmonaire ou rénale sévère, et/ou d'oligurie/anurie. L'administration de la solution pour perfusion GLUCOSE 20 % CARELIDE peut provoquer une hyperglycémie. Dans ce contexte, il est recommandé de ne pas utiliser cette solution après un accident ischémique cérébral car l'hyperglycémie a été impliquée dans l'augmentation des lésions cérébrales ischémiques et la détérioration de la récupération. La perfusion de solution de glucose n'est pas recommandée dans les 24 premières heures suivant un traumatisme crânien et la concentration sanguine en glucose doit être surveillée attentivement lors d'épisodes d'hypertension intracrânienne. L'administration de solutions de glucose, en particulier hyperosmolaires, à des patients présentant une atteinte de la barrière hémato-encéphalique peut entraner une augmentation de la pression intracrânienne/intramédullaire. Les paramètres biologiques et cliniques, en particulier la glycémie, doivent être contrôlés. Si une hyperglycémie survient, ajuster le débit de perfusion et/ou administrer de l'insuline. Si besoin, apporter des compléments parentéraux en potassium. La tolérance au glucose peut se détériorer chez les patients atteints d'insuffisance rénale ou de diabète. Chez le diabétique ou l'insuffisant rénal, surveiller attentivement la glycémie et la glycosurie et ajuster éventuellement la posologie du traitement hypoglycémiant et/ou du potassium. Les solutions pour perfusion de glucose intraveineuses sont généralement des solutions isotoniques. Cependant, dans l'organisme, les solutions contenant du glucose peuvent devenir extrêmement hypotoniques sur le plan physiologique en raison de la métabolisation rapide du glucose (voir rubrique 4. 2). En fonction de la tonicité de la solution, du volume et de la vitesse de perfusion, ainsi que de l'état clinique sous-jacent du patient et de sa capacité à métaboliser le glucose, l'administration de glucose par voie intraveineuse peut entraner des déséquilibres électrolytiques, dont le plus important est une hyponatrémie hypo-osmotique ou hyperosmotique. Hyponatrémie : Les patients présentant une libération non-osmotique de la vasopressine (ex. en cas d'affections aigus, de douleur, de stress postopératoire, d'infections, de brûlures, et de pathologies du système nerveux central), les patients atteints de pathologies cardiaques, hépatiques et rénales ainsi que les patients exposés à des agonistes de la vasopressine (voir rubrique 4. 5) encourent un risque particulièrement élevé d'hyponatrémie aigu lié à la perfusion de solutés hypotoniques. L'hyponatrémie aigu peut conduire à une encéphalopathie hyponatrémique aigu (œdème cérébral) caractérisée par des céphalées, des nausées, des convulsions, une léthargie et des vomissements. Les patients présentant un œdème cérébral encourent un risque particulièrement élevé de lésion cérébrale sévère, irréversible et engageant le pronostic vital. Les enfants, les femmes en âge de procréer et les patients présentant une compliance cérébrale réduite (ex. à la suite d'une méningite, de saignements intracrâniens ou d'une contusion cérébrale) encourent un risque particulièrement élevé d'œdème cérébral sévère et engageant le pronostic vital, dû à une hyponatrémie aigu. L'ajout de médicament ou l'utilisation d'une technique d'administration incorrecte peuvent entraner l'apparition de réactions fébriles dues à l'introduction éventuelle de substances pyrogènes. En cas d'effet indésirable, la perfusion doit être immédiatement arrêtée. En cas d'ajout de médicament, vérifier la compatibilité, la limpidité et la couleur avant usage (voir rubrique 6. 2). Ne pas conserver le mélange (voir rubrique 6. 6). Le site du cathéter doit être régulièrement contrôlé pour détecter les signes d'extravasation. En cas d'extravasation, l'administration doit être interrompue immédiatement, tout en maintenant en place la canule ou le cathéter inséré pour une prise en charge immédiate du patient. Si possible, une aspiration doit être pratiquée à travers la canule/le cathéter inséré afin de réduire la quantité de liquide présent dans les tissus avant de retirer la canule/le cathéter. Selon le produit extravasé (y compris les produits mélangés avec GLUCOSE 20 % CARELIDE, solution pour perfusion, le cas échéant) et le stade/l'étendue des lésions éventuelles, des mesures spécifiques appropriées doivent être prises. Les options thérapeutiques peuvent inclure des interventions non pharmacologiques, pharmacologiques et/ou chirurgicales. En cas de dégradation de la zone affectée (douleur continue, nécrose, ulcération), un chirurgien plasticien doit être consulté immédiatement (voir rubrique 4. 8). Le site d'extravasation doit être contrôlé au moins toutes les 4 heures pendant les premières 24 heures, puis une fois par jour. La réalimentation de patients sévèrement dénutris peut entraner un syndrome de renutrition qui est caractérisé par le passage du potassium, du phosphore et du magnésium en intracellulaire car le patient devient anabolique. Une carence en thiamine et une rétention d'eau peuvent également se développer. La mise en place d'une surveillance particulière et l'augmentation progressive des apports en nutriments tout en évitant la suralimentation peuvent prévenir ces complications. (voir rubrique 6. 6) Lors de la sélection du type de solution pour perfusion et du volume/débit de perfusion pour un patient âgé, il est nécessaire de prendre en considération la susceptibilité de ces patients à présenter des maladies cardiaques, rénales, hépatiques ou autres, ainsi que leurs traitements médicamenteux concomitants. Population pédiatrique Le débit et le volume de perfusion dépendent de l'âge, du poids, de l'état métabolique et clinique du patient, du traitement associé, et doivent être déterminés par un médecin expérimenté. Les nouveau-nés, en particulier les prématurés et ceux présentant un faible poids à la naissance, ont un risque élevé de développer une hypo- ou une hyperglycémie et nécessitent, de ce fait, une surveillance étroite pendant toute la durée du traitement par des solutions intraveineuses de glucose, afin d'assurer un contrôle glycémique approprié et d'éviter d'éventuels effets indésirables à long terme. L'hypoglycémie chez les nouveau-nés peut entraner des convulsions, un coma, et des lésions cérébrales. L'hyperglycémie chez les nouveau-nés a été associée à des cas d'hémorragie intra-ventriculaire, d'infection bactérienne et fongique d'installation tardive, de rétinopathie du prématuré, d'entérocolite nécrosante, de dysplasie broncho-pulmonaire, d'hospitalisation prolongée et de décès. Afin d'éviter une perfusion excessive de solutions intraveineuses potentiellement fatale chez le nouveau-né, une attention particulière doit être accordée au mode d'administration. Lors de l'utilisation d'un pousse-seringue pour l'administration de solutions ou de médicaments par voie intraveineuse à des nouveau-nés, la poche de liquide ne doit pas rester connectée à la seringue. Lors de l'utilisation d'une pompe pour perfusion, tous les clamps du set d'administration intraveineuse doivent être fermés avant de retirer le set d'administration ou avant d'éteindre la pompe. Ceci est nécessaire, que le set d'administration dispose ou non d'un dispositif anti-fuite. Le dispositif de perfusion intraveineuse et le matériel d'administration doivent être contrôlés régulièrement. Médicaments augmentant l'effet de la vasopressine Les médicaments cités ci-dessous augmentent l'effet de la vasopressine, ce qui entrane une diminution de l'excrétion rénale d'eau sans électrolyte et une augmentation du risque d'hyponatrémie nosocomiale à la suite d'un traitement à base de solutés intraveineux incorrectement équilibré (voir rubriques 4. 2, 4. 4 et 4. 8). Médicaments stimulant la libération de vasopressine, ex. : chlorpropamide, clofibrate, carbamazépine, vincristine, inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine, 3, 4-méthylènedioxy-N-méthamphétamine, ifosfamide, antipsychotiques, narcotiques ; Médicaments potentialisant la libération de vasopressine, ex. : chlorpropamide, anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), cyclophosphamide ; Analogues de la vasopressine, ex. : desmopressine, ocytocine, vasopressine, terlipressine. Parmi les autres médicaments qui augmentent le risque d'hyponatrémie figurent également les diurétiques en général et les antiépileptiques tels que l'oxcarbazépine Ne pas administrer du sang simultanément, au moyen du même dispositif de perfusion, en raison du risque de pseudo-agglutination et d'hémolyse. Comme avec toutes les solutions parentérales, la compatibilité des additifs avec la solution doit être vérifiée avant administration de ce médicament (voir rubrique 6. 2). Compte tenu des données disponibles, l'utilisation chez la femme enceinte ou qui allaite est possible. Les risques et les bénéfices pour chaque patiente doivent être attentivement considérés avant d'administrer la solution de glucose. La perfusion de glucose par voie intraveineuse pendant l'accouchement peut entraner un risque d'hyperglycémie fœtale et d'acidose métabolique, entranant la production d'insuline fœtale ainsi qu'une hypoglycémie de rebond chez le nouveau-né. Des précautions particulières s'imposent lors de l'administration de GLUCOSE 20 % CARELIDE à des femmes enceintes pendant le travail, en particulier s'il est administré en combinaison avec de l'ocytocine, en raison du risque d'hyponatrémie (voir rubriques 4. 4, 4. 5 et 4. 8). Les effets indésirables pouvant survenir chez des patients traités avec GLUCOSE 20 % CARELIDE par perfusion intraveineuse sont indiqués ci-dessous. Les effets indésirables listés dans cette rubrique sont mentionnés selon la convention suivante : très fréquent ( 1/10), fréquent ( 1/100 et < 1/10), peu fréquent ( 1/1 000 et < 1/100), rare ( 1/10 000 et < 1/1 000), très rare (< 1/10 000) et fréquence indéterminée (ne peut être estimée sur la base des données disponibles). * Manifestation potentielle chez les patients présentant une allergie au maïs (voir rubriques 4. 3 et 4. 4). * Effets indésirables pouvant être notamment associés à une extravasation * L'hyponatrémie nosocomiale peut causer des lésions cérébrales irréversibles et entraner le décès en raison du développement d'une encéphalopathie hyponatrémique aigu (voir rubriques 4. 2 et 4. 4). Lorsque GLUCOSE 20 % CARELIDE, solution pour perfusion est utilisé comme véhicule ou diluant pour des préparations injectables d'autres médicaments, d'autres effets indésirables associés au médicament ajouté à la solution peuvent survenir. Déclaration des effets indésirables suspectés La déclaration des effets indésirables suspectés après autorisation du médicament est importante. Elle permet une surveillance continue du rapport bénéfice/risque du médicament. Les professionnels de santé déclarent tout effet indésirable suspecté via le système national de déclaration : Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé (ANSM) et réseau des Centres Régionaux de Pharmacovigilance - Site internet : . Une administration prolongée ou une perfusion rapide de volumes importants de solution pour perfusion de glucose à 20 % peut provoquer deux types d'effets indésirables pouvant engager le pronostic vital (voir rubriques 4. 4 et 4. 8) : en raison de l'hyperglycémie : une hyperosmolarité entranant une hyponatrémie, une déshydratation cellulaire, une hyperglycémie, une glycosurie, une diurèse osmotique, susceptibles d'évoluer vers une déshydratation extracellulaire, un coma hyperosmolaire hyperglycémique et des déséquilibres électrolytiques, incluant des pertes de sodium et de potassium (voir rubrique 4. 4) et des perturbations acido-basiques. en raison de la quantité d'eau libre (une fois que le glucose est métabolisé) : une inflation hydrique avec œdème ou intoxication hydrique, entranant une hyponatrémie aigu hypoosmotique sévère, conduisant à une hyperhydratation cellulaire, et potentiellement un œdème cérébral engageant le pronostic vital (encéphalopathie hyponatrémique). Les symptômes comprennent des convulsions, nausées, léthargie et vomissements (voir rubriques 4. 4 et 4. 8). L'hyperglycémie sévère et l'hyponatrémie peuvent être fatales. Un surdosage cliniquement significatif de solutions de glucose constitue, par conséquent, une urgence médicale. Selon le type et la gravité des troubles : arrêt immédiat de la perfusion, instaurer un traitement symptomatique et de soutien adapté, en fonction des besoins (notamment administration d'électrolytes, de diurétiques ou d'insuline). En cas d'utilisation comme véhicule ou diluant pour préparation injectable d'autres médicaments, d'autres symptômes de surdosage liés à ce médicament peuvent se manifester. Se référer également au résumé des caractéristiques du produit de ce médicament. Classe pharmacothérapeutique : solution pour nutrition parentérale, code ATC : B05BA03 Solution de glucose HYPERTONIQUE (osmolarité : 1110 mOsm/L). Les propriétés pharmacodynamiques de cette solution sont celles du glucose avec un apport calorique glucidique de 800 kcal/L. Le glucose, un substrat naturel des cellules de l'organisme, est métabolisé de manière ubiquitaire. Dans des conditions physiologiques, le glucose est la principale source d'énergie avec une valeur calorique d'environ 17 kJ/g ou 4 kcal/g. En cas d'ajout de médicament, la pharmacodynamie de la préparation dépendra aussi du médicament ajouté. Absorption La solution étant administrée par voie intraveineuse, sa biodisponibilité est de 100 %. Distribution Après administration, le glucose passe tout d'abord dans le compartiment intravasculaire, puis dans le compartiment intracellulaire. Biotransformation Au cours de la glycolyse, le glucose est métabolisé en pyruvate. Dans des conditions aérobies, le pyruvate est totalement oxydé pour donner du dioxyde de carbone et de l'eau. En cas d'hypoxie, le pyruvate est transformé en lactate. Élimination Les derniers métabolites issus de l'oxydation complète du glucose sont éliminés par les poumons en gaz carbonique et par les reins en eau. Chez les sujets sains, le glucose n'est pratiquement pas éliminé par les reins. Dans les états métaboliques pathologiques associés à de l'hyperglycémie (par ex. diabète sucré ou syndrome post-agression), le glucose est excrété par les reins. En cas d'ajout de médicament, la pharmacocinétique de la préparation dépendra aussi du médicament ajouté. Des données de sécurité concernant le glucose chez l'animal ne sont pas applicables à l'Homme, étant donné que le glucose est un composant normal du plasma à la fois chez l'animal et chez l'Homme. Les données de sécurité de l'additif doivent être considérées séparément. Eau pour préparations injectables. Comme avec toutes les solutions parentérales, la compatibilité des médicaments avec la solution doit être vérifiée avant ajout. L'incompatibilité du médicament vis à vis de la solution de GLUCOSE 20 % CARELIDE, doit être déterminée en contrôlant un éventuel changement de couleur et/ou une éventuelle formation de précipité, de complexe insoluble ou de cristaux. Se référer également à la notice accompagnant le médicament à ajouter. En cas d'ajout de médicament, vérifier si le médicament est compatible avec la zone de pH de la solution de GLUCOSE 20 % CARELIDE. Lorsqu'un médicament compatible est ajouté à la solution de GLUCOSE 20 % CARELIDE, le mélange doit être administré immédiatement. Les médicaments connus pour être incompatibles ne doivent pas être utilisés. Ne pas administrer du sang simultanément, au moyen du même dispositif de perfusion, en raison du risque de pseudo-agglutination et d'hémolyse (voir rubrique 4. 5). 2 ans. Après ouverture/dilution, le produit doit être utilisé immédiatement. Pour les conditions de conservation du médicament après première ouverture, voir la rubrique 6. 3. Poche souple (PVC plastifié) de 100, 250, 500 ou 1000 mL. Poche COSINUS (polyoléfine) suremballée de 100, 250, 500 ou 1000 mL. Toutes les présentations peuvent ne pas être commercialisées. Ne pas utiliser si l'emballage / la poche est endommagé(e). Ne pas utiliser les poches plastiques pour des connexions en série. Cette utilisation pourrait entraner une embolie gazeuse en raison de l'aspiration de l'air résiduel de la première poche avant la fin de l'administration de solution venant de la deuxième poche. L'exercice d'une pression sur le récipient en plastique flexible contenant la solution intraveineuse pour augmenter le débit peut entraner une embolie gazeuse si l'air résiduel contenu dans le récipient n'est pas complètement évacué avant l'administration. L'utilisation d'un set d'administration par voie intraveineuse avec une prise d'air en position ouverte pourrait entraner une embolie gazeuse. Les sets d'administration par voie intraveineuse avec une prise d'air en position ouverte ne doivent pas être utilisés avec des récipients en plastique souple. CARELIDE RUE MICHEL RAILLARD 59420 MOUVAUX 34009 352 259 0 0 : 100 mL en poche souple COSINUS (PVC plastifié) 34009 352 260 9 9 : 250 mL en poche souple COSINUS (PVC plastifié) 34009 352 261 5 0 : 500 mL en poche souple COSINUS (PVC plastifié) 34009 352 262 1 1 : 1000 mL en poche souple COSINUS (PVC plastifié) 34009 379 425 9 1 : 100 mL en poche COSINUS (polyoléfine) suremballée 34009 379 426 5 2 : 250 mL en poche COSINUS (polyoléfine) suremballée 34009 379 427 1 3 : 500 mL en poche COSINUS (polyoléfine) suremballée 34009 379 428 8 1 : 1000 mL en poche COSINUS (polyoléfine) suremballée [à compléter ultérieurement par le titulaire] [à compléter ultérieurement par le titulaire] Sans objet. Sans objet. Liste I. | BDPM | Medicinal |
Imagerie des signes non moteurs dans la maladie de Parkinson | WMT16 | Scientific |
The device is made of two sectional cantilevers delivering, according to the authors, desirable moments onto the molar If the distance separating the mesial surface from the buccal tube of the molar of the bracket of the lower lateral incisor is 35 mm, the force of intrusion F 4 exerted at the level of the latter is 30 grams, the one exerted at the level of the second molar, F 1 is 50 grams, the forces of extrusion exerted at the level of the insertion point of one of the sectional arches on the main arch F 3 is 50 grams, the force of extrusion exerted at the level of the insertion point of the main arch in the buccal tube of the second molar, F 2 is 30 grams As for the moments, M 1 corresponds to 250 grams/mm and M 2 to 1, 050 grams/mm Cantilever Figure 9 Option thérapeutique proposée par P si une egression s'avère souhaitable, elle doit suivre le redressement axial et non la précéder Mais cette considération entrane forcément la mise en place de dispositifs d'une mécanique bien plus complexe que celle utilisée précédemment Mais nous devons à la vérité de dire que des dispositifs plus simples peuvent répondre aux besoins de nombreuses rétentions molaires qui ne relèvent pas de précaution particulière sur le plan vertical C'est ce qui nous a poussés à utiliser dans la plupart des cas un sectionnel greffé simplement sur les éléments propres à la plupart des appareils multi-attaches N'oublions pas l'adage : pourquoi faire compliqué quand on peut faire simple Quand on dispose de tubes molaires dédou-blés soudés sur les bagues des premières Gottlieb 3 solders a sectional arch intended for the impacted molar onto a removable lingual arch which reinforces the anchorage resistance of the first molar Sinah et al as for them bond a bracket the most distally and occlusally possible on the impacted molar and move it back using a compressed coil spring Assuredly this device exerts a force of translation and not a distal tipping force, its handling thus poses a mechanical problem If the reinforcement of the anchorage resistance of the molar starts from a good principle, such a sectional arch does not seem however to answer a sound mechanical logic A solution would consist in using a Tip-Edge bracket with a possibility of built-in distal tipping From that analysis one may conclude that the majority of the therapeutic proposals for second impacted molars hardly took into account the vertical dimension, until the day when W. W Roberts, EM Chaker and C. J Burstone 9 then B Melsen et al and finally EJ Weiland et al drew the attention to the fact that the treatment plan of such an anomaly has to be adapted to each individual case Thus whenever it is advisable to avoid any extrusion of the molar, it is essential to use sectional arches that are not presenting any unwanted component of extrusion and for W. W Roberts et al if an extrusion proves to be desirable, it must follow the axial uprighting and not precede it But this consideration inevitably involves the installation of devices of much more complex mechanics than the one used previously However we must, as a matter of fact, admit that simpler devices can meet the needs for many molar retentions which do not require particular precautions on the vertical level This is what encouraged us to use in the majority of cases a sectional arch simply grafted onto the elements suitable for most multibracket appliances As the saying goes : why make complicated when one can make simple molaires mandibulaires, ce qui est le cas dans la plupart des techniques multi-attaches actuelles, il est possible avec peu de moyens de pallier la rétention des deuxièmes molaires survenant en fin de traitement En effet, il suffit de coller un bouton sur la partie distale émergée de la deuxième molaire versée Il est rare d'avoir à procéder à la mise à nu chirurgicale de la face vestibulaire de la molaire étant donné que dans la majorité des cas, ledit bord distal de la deuxième molaire est largement accessible pour ce faire Il suffit de soumettre ensuite la dent à une force distalante constituée par un sectionnel passant dans l'un des tubes molaires, ici le tube rectangulaire d'une bague molaire Tip-Edge, et en doublon dans les attaches des prémolaires La partie posté-rieure dudit sectionnel est recourbée pour s'asseoir sur le bouton de la deuxième molaire, pendant que sa partie antérieure doublement recourbée sert de point d'insertion à une chanette élastomérique accrochée sur le crochet vestibulaire de la première molaire ( When having at one's disposal duplicated molar tubes soldered onto the bands of the first lower molars, which is the case in the majority of the current multibracket techniques, it is possible with few means to mitigate the retention of the second molars occurring at the end of the treatment Indeed it will suffice to bond a button onto the emerging distal part of the tipped second molar Seldom will you have to proceed to a surgical stripping of the buccal surface of the molar, since in most cases, the aforementioned distal edge of the second molar can be reached easily for that purpose It is enough then to subject the tooth to a distal drifting force consisting in a sectional arch passing through one of the molar tubes, here the rectangular tube of a Tip-Edge molar band, and in the attachments of the premolars The posterior part of the aforesaid sectional arch is bent to seat on the button of the second molar, while its anterior part bent twice is used as an insertion point for an elastomeric chain hooked on the buccal hook of the first molar ( Sous l'effet d'une telle force de distalisation, le redressement axial de la deuxième molaire s'effectue en moins de trois mois, comme on peut le voir sur cet orthopantomogramme pris après une telle période de traitement ( Under the effect of such a distal drifting force, the axial uprighting of the second molar is operated in less than three months, as can be evidenced on this orthopantomogram taken after such a period of treatment ( Le résultat est aussi probant que dans le cas précédent (voir La molaire enclavée s'est redressée du point de vue axial, sans pour autant égresser The result is as convincing as in the previous case (see The impacted molar has uprightedfrom the axial point of view, without extrusion Orthopantomogramme du même cas trois mois après la mise en oeuvre du sectionnel de redressement axial de la deuxième molaire enclavée Noter la distalisation et l'absence d'egression de la dent Orthopantomogram of the same case three months after the implementation of the sectional arch for axial uprighting of the second impacted molar Please note the distal drifting and the absence of extrusion of the tooth 20 Rev Orthop Dento Faciale Arc de base Main arch Secticmnel Sectional Bouton Button Chanette Chain Des deuxièmes molaires mandibulaires enclavées par version mésiale Second lower molars impacted because of mesial tipping Une solution encore plus simple consiste à tendre une chane élastomérique entre le crochet de la première molaire et le crochet du sectionnel réalisé en face de la deuxième pré-molaire inférieure ( Là encore l'orthopantomogramme, pris trois mois après la mise en oeuvre du dispositif de redressement, montre que le traitement de la molaire enclavée a fait son effet ( Il va de soi que si une légère malposition de la deuxième molaire persiste après ce redressement axial il reste toujours la possibilité d'y coller un tube vestibulaire et de compléter la correction avec soit un arc sectionnel, soit un arc de base prolongé Le problème de l'évolution des dents de sagesse n'est certes pas résolu pour autant, mais il est toujours possible, là encore, soit de renouveler cette opération, ou encore de faire procé-der à leur extraction si celle-ci se révèle nécessaire An even simpler solution consists in tightening an elastomeric chain between the first molar hook and the hook of the sectional arch realised in front of the second lower premolar ( There too the orthopantomogram taken three months after the implementation of the uprighting appliance of the impacted molar shows that it has been effective ( It goes without saying that if a slight malposition of the second molar persists after that axial uprighting, the possibility always remains of bonding a buccal tube and of supplementing the correction with either a sectional arch, or a prolonged main arch The problem of the evolution of the wisdom teeth is certainly not solved for all that, but it is always possible, there again, either to renew this operation for this purpose, or to proceed to their extraction when required BIBLIOGRAPHIE ' R] I I RI \( ES | ISTEX | Scientific |
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