input stringlengths 5 3.01M | source stringclasses 16
values | document_type stringclasses 9
values |
|---|---|---|
Vérifiez votre glycémie et votre cétonurie le plus rapidement possible dès que l'un des symptômes ci-dessus apparat. | EMEA_V3 | Medicinal |
L'hystérectomie totale par voie vaginale pour prolapsus génital à propos de 10 cas | WMT16 | Scientific |
Couverture des escarres ischiatiques par lambeau fascio-cutané de face postérieure de cuisse (Griffith modifié) après matelassage par le biceps femoris. A propos de onze cas | WMT16 | Scientific |
Bilan des brûlures oesophagiennes par caustiques chez l'enfant | WMT16 | Scientific |
Les travaux sur l'eCTD ont été soutenus par la participation de la délégation de la Communauté européenne au groupe de travail d'experts M2 de l'ICH et par l'assistance technique pour les tests de l'eCTD réalisés à la mi-2001. | EMEA_V3 | Medicinal |
Lors des études cliniques avec infliximab dans lesquelles 5 780 patients ont été traités, soit 5 494 années patient, 5 cas de lymphomes et 26 cas de tumeurs non lymphomateuses ont été détectés versus aucun lymphome et 1 tumeur non lymphomateuse chez les 1 600 patients traités par le placebo soit 941 années patient. | EMEA_V3 | Medicinal |
Le ragocyte synovial. Caractères généraux | WMT16 | Scientific |
Excipient (N 72) N %4 | EMEA_V3 | Medicinal |
Une opération césarienne réussie à Petite Eneille en 1736 | WMT16 | Scientific |
Tabac et maladies vasculaires | WMT16 | Scientific |
Insuffisance rénale : la sécurité et l' efficacité de Soliris n' ont pas été étudiées chez les patients présentant une insuffisance rénale. | EMEA_V3 | Medicinal |
Resultats comparés de réactions aux antigènes empiriques cardiolipidiques et tréponemiques dans la syphilis | WMT16 | Scientific |
Le génotypage repose sur des méthodes moléculaires Il permet de distinguer avec la plus grande précision possible les espèces microbiennes et même les souches individuelles. | ECDC_TM | Medical |
26 Etudes de tolérance en chirurgie générale : | EMEA_V3 | Medicinal |
L' emballage de NovoSeven contient : | EMEA_V3 | Medicinal |
posologique nécessaire pour chacun de ces médicaments. | EMEA_V3 | Medicinal |
Stochasticité : la troisième variable | WMT16 | Scientific |
Manifestations vasculaires du diabète | WMT16 | Scientific |
N'utilisez plus le stylo KwikPen une fois vide. | EMEA_V3 | Medicinal |
Prothèse complète : science ou art ? | WMT16 | Scientific |
Introduction à la pathologie de l'alitement | WMT16 | Scientific |
Journées de Neurologie de Langue Française. Nantes, 8-12 avril 2003 | WMT16 | Scientific |
Influence de la thiamine sur la protéosynthèse bactérienne chez le mouton | WMT16 | Scientific |
Mécanismes physiopathologiques de la stimulation à haute fréquence dans la maladie de Parkinson : restauration des systèmes oscillatoires de haute et basse fréquences | WMT16 | Scientific |
Vous devez également prévenir votre médecin si vous prenez déjà Tasigna et qu' un nouveau médicament que vous ne preniez pas auparavant vous est prescrit pendant le traitement par Tasigna. | EMEA_V3 | Medicinal |
Eléments de thermographie mammaire | WMT16 | Scientific |
darbepoetin alfa de 6, 75 g/ kg toutes les trois semaines. | EMEA_V3 | Medicinal |
Les fistules entérovésicales par sigmoïdite | WMT16 | Scientific |
INCIDENCE DE LA TH'ERAPEUTIQUE M'EDICAMENTEUSE SUR LES R'EHOSPITALISATIONS 'A LA CLINIQUE DE BEL-AIR DES PSYCHOSES CHRONIQUES EN DEHORS DE LA PSYCHOSE MANIACO-D'EPRESSIVE | WMT16 | Scientific |
Contribution à l'étude d'un nouveau traitement de la goutte chronique par un complexe enzymatique du métabolisme des lipides et des amines | WMT16 | Scientific |
AMISULPRIDE ARROW LAB 400 mg, comprimé pelliculé sécable - Résumé des caractéristiques du produit. ANSM - Mis à jour le : 28/12/2021 . 400 mg Pour un comprimé pelliculé sécable. Excipient à effet notoire : chaque comprimé pelliculé sécable de 400 mg contient 200 mg de lactose monohydraté. Pour la liste complète des excipients, voir rubrique 6. 1. Symptômes positifs Pour les épisodes psychotiques aigus, des doses orales comprises entre 400 mg par jour et 800 mg par jour sont recommandées. Dans certains cas, la dose quotidienne peut être augmentée jusqu'à 1200 mg par jour. Les doses supérieures à 1200 mg par jour n'ont pas été évaluées en terme de sécurité et ne devraient donc pas être utilisés. Aucun titrage spécifique n'est requis lors de l'initiation du traitement par AMISULPRIDE ARROW LAB. Les doses doivent être ajustées en fonction de la réponse individuelle. Pour les patients présentant des symptômes mixtes, positifs et négatifs, les doses doivent être ajustées pour obtenir un contrôle optimal des signes positifs. Le traitement d'entretien doit être établi individuellement avec la plus petite dose efficace. Symptômes négatifs prédominants Une dose journalière de 50 mg à 300 mg est recommandée. Les doses doivent être ajustées individuellement. AMISULPRIDE ARROW LAB peut être administrée une fois par jour à des doses orales allant jusqu'à 300 mg, les doses plus élevées doivent être réparties en deux prises par jour. La dose minimale efficace doit être utilisée. Populations particulières la sécurité de l'amisulpride a été examinée sur un nombre limité de patients âgés. L'amisulpride doit être utilisée avec une attention particulière en raison d'un risque possible d'hypotension et de sédation. Dans le cas d'une insuffisance rénale, une réduction de la posologie peut également être nécessaire. Population pédiatrique 'efficacité et la sécurité de l'amisulpride chez les enfants et adolescents de moins de 18 ans n'a pas été établie. Il y a peu de données disponibles sur l'utilisation de l'amisulpride chez les adolescents dans la schizophrénie. Par conséquent, l'amisulpride ne doit pas être utilisée chez les adolescents de 15 à 18 ans jusqu'à ce que de nouvelles données soient disponibles. En cas d'absolue nécessité, le traitement d'adolescents par amisulpride doit être initié et réalisé par un médecin expérimenté dans le traitement de la schizophrénie pour ce groupe d'âge. L'utilisation de l'amisulpride est contre-indiquée chez les enfants et les adolescents de moins de 15 ans (voir rubrique 4. 3). Insuffisance rénale AMISULPRIDE ARROW LAB est éliminé par voie rénale. En cas d'insuffisance rénale, la dose doit être réduite de moitié chez les patients dont la clairance de la créatinine (ClCr) est comprise entre 30-60 ml/min et réduite par 3 chez les patients ayant une clairance de la créatinine entre 10-30 ml/min. Il n'existe pas de données chez les patients présentant une insuffisance rénale sévère (ClCr ml/min), l'amisulpride ne doit donc pas être utilisée chez ces patients (voir rubrique 4. 4). Insuffisance hépatique L misulpride est faiblement métabolisée, une réduction de la posologie ne devrait donc pas être nécessaire. Durée du traitement Des données d'essais cliniques contrôlés sur une période d'un an sont disponibles. La durée du traitement doit être déterminée par le médecin traitant. Pour éviter le syndrome de sevrage, le traitement doit être arrêté progressivement (voir rubrique 4. 4). Mode d'administration Voie orale. Les comprimés doivent être avalés entiers ou coupés en deux, avec une quantité suffisante de liquide. L'amisulpride peut être administrée indépendamment des repas. Tumeurs prolactine-dépendantes concomitantes (par exemple prolactinome de la glande pituitaire ou cancer du sein) ; Phéochromocytome ; Enfants et adolescents de moins de 15 ans ; Allaitement (voir rubrique 4. 6) ; Association à la lévodopa (voir rubrique 4. 5) ; En association avec les médicaments suivants qui peuvent induire des torsades de pointes (voir rubrique 4. 5) : Anti-arythmiques de classe Ia comme la quinidine et le disopyramide, Anti-arythmiques de classe III tels que l'amiodarone et le sotalol. Autres médicaments comme le bépridil, cisapride, sultopride, thioridazine, méthadone, érythromycine (par voie intraveineuse), vincamine (par voie intraveineuse), halofantrine, pentamidine, sparfloxacine et les antifongiques azolés. Des hyperglycémies ont été rapportées chez des patients traités avec des agents antipsychotiques atypiques, y compris l'amisulpride. Par conséquent, un suivi glycémique approprié devra être mis en place pour les patients ayant un diagnostic établi de diabète de type II ou présentant des facteurs de risque pour le diabète et qui prennent de l'amisulpride. doit être utilisé avec prudence en raison d'un risque possible d'hypotension et de sédation Dans le cas d'une insuffisance rénale, une réduction de la posologie peut également être nécessaire. Allongement de l'intervalle QT L'amisulpride provoque une augmentation dose-dépendante de l'intervalle QT. Cet effet, est connu pour augmenter le risque de survenue de troubles du rythme ventriculaire graves, notamment les torsades de pointe. Il convient donc lorsque la situation clinique le permet, de s'assurer avant toute administration de l'absence de facteurs pouvant favoriser la survenue de ce trouble du rythme : bradycardie inférieure à 55 battements par minute, maladies cardiaques, antécédents familiaux de mort subite ou d'allongement de l'intervalle QT, déséquilibre électrolytique, en particulier l'hypokaliémie, allongement congénital de l'intervalle QT, traitement en cours par un médicament susceptible d'entraner une bradycardie marquée (< 55 battements par minute), une hypokaliémie, un ralentissement de la conduction intracardiaque, un allongement de l'intervalle QT ( ). Un ECG de référence est recommandé avant traitement chez tous les patients. En particulier, les personnes âgées, les patients ayant des antécédents personnels ou familiaux de maladies cardiaques ou des résultats anormaux à l'examen clinique cardiaque. Au cours du traitement, des surveillances par ECG sont de rigueur (par exemple lors de l'augmentation des doses) et doivent être évaluées sur une base individuelle du patient. La dose d'amisulpride devrait être réduite si l'intervalle QT est prolongé, et, arrêté si le QTc est > 500 ms. Une surveillance périodique de l'électrolyte est recommandée en particulier si le patient prend des diurétiques ou pendant une maladie intercurrente. L'utilisation concomitante avec des antipsychotiques doit être évitée (voir rubrique 4. 5). Accident vasculaire cérébral Dans des études cliniques randomisées versus placebo réalisées chez des patients âgés atteints de démence et traités avec certains antipsychotiques atypiques, il a été observé un risque 3 fois plus élevé d'accident vasculaire cérébral. Le mécanisme d'une telle augmentation de risque n'est pas connu. Une élévation du risque avec d'autres antipsychotiques ou chez d'autres populations de patients ne peut être exclue. AMISULPRIDE ARROW LAB doit être utilisé avec prudence chez les patients présentant des facteurs de risque d'accident vasculaire cérébral. Patients âgés déments Le risque de mortalité est augmenté chez les patients âgés atteints de psychose associée à une démence et traités par antipsychotiques. Les analyses de 17 études contrôlées versus placebo (durée moyenne de 10 semaines), réalisées chez des patients prenant majoritairement des antipsychotiques atypiques, ont mis en évidence un risque de mortalité 1, 6 à 1, 7 fois plus élevé chez les patients traités par ces médicaments comparativement au placebo. A la fin du traitement d'une durée moyenne de 10 semaines, le risque de mortalité a été de 4, 5 % dans le groupe de patients traités comparé à 2, 6 % dans le groupe placebo. Bien que les causes de décès dans les essais cliniques avec les antipsychotiques atypiques aient été variées, la plupart de ces décès semblait être soit d'origine cardiovasculaire (par exemple insuffisance cardiaque, mort subite) soit d'origine infectieuse (par exemple pneumonie). Des études épidémiologiques suggèrent que, comme avec les antipsychotiques atypiques, le traitement avec les antipsychotiques classiques peut augmenter la mortalité. La part respective de l'antipsychotique et des caractéristiques des patients dans l'augmentation de la mortalité dans les études épidémiologiques n'est pas claire. Thromboembolie veineuse Des cas de thromboembolies veineuses (TEV) ont été rapportés avec les antipsychotiques. Les patients traités par des antipsychotiques présentant souvent des facteurs de risque acquis de TEV, tout facteur de risque potentiel de TEV doit être identifié avant et pendant le traitement par AMISULPRIDE ARROW LAB et des mesures préventives doivent être mises en œuvre. Cancer du sein Excipients AMISULPRIDE ARROW LAB contient du lactose. Les patients présentant une intolérance au galactose, un déficit total en lactase ou un syndrome de malabsorption du glucose et du galactose (maladies héréditaires rares) ne doivent pas prendre ce médicament. AMISULPRIDE ARROW LAB comprimé sécable Médicaments qui pourraient induire des torsades de pointes : antiarythmiques de classe Ia comme la quinidine et le disopyramide, antiarythmiques de classe III tels que l'amiodarone et le sotalol, autres médicaments comme le bépridil, le cisapride, le sultopride, la thioridazine, la méthadone, l'érythromycine (par voie intraveineuse), la vincamine (par voie intraveineuse), l'halofantrine, la pentamidine, la sparfloxacine et les antifongiques azolés. Lévodopa : antagonisme réciproque des effets entre la lévodopa et des neuroleptiques. L'amisulpride peut s'opposer à l'effet des agonistes de la dopamine, par exemple, la bromocriptine, le ropinirole. les médicaments qui augmentent le risque de torsade de pointes ou qui pourraient prolonger l'intervalle QT : des médicaments induisant une bradycardie comme les béta-bloquants, les inhibiteurs des canaux calciques induisant une bradycardie comme le diltiazem, le vérapamil, la clonidine, le guanfacine et la digitale, des médicaments induisant une hypokaliémie ou un déséquilibre électrolytique : les diurétiques hypokaliémiques, les laxatifs stimulants, l'amphotéricine B (par voie intraveineuse), les glucocorticoïdes et les tétracosactides. L'hypokaliémie devra être corrigée, des antipsychotiques comme le pimozide et l'halopéridol, les antidépresseurs imipraminiques, le lithium, certains antihistaminiques tels que l'astémizole, la terfénadine, la méfloquine. AMISULPRIDE ARROW LAB peut augmenter les effets centraux de l'alcool. Par conséquent, l'alcool ne doit pas être consommé au cours du traitement. faisant l'objet de précautions d'emploi dépresseurs du SNC, y compris des narcotiques, anesthésiques, analgésiques, antihistaminiques H1 sédatifs, barbituriques, benzodiazépines, d'autres médicaments anxiolytiques et la clonidine et dérivés, antihypertenseurs et autres médicaments hypotenseurs. Grossesse Chez les animaux, l'amisulpride n'a pas montré de toxicité reproductive. Aucun effet tératogène de l'amisulpride n'a été noté. Un nombre limité de données cliniques sur l'exposition à l'amisulpride pendant la grossesse sont disponibles. Ainsi la sécurité de l'amisulpride pendant la grossesse chez l'homme n'a pas été établie. L'utilisation du médicament est déconseillée pendant la grossesse à moins que les avantages justifient les risques potentiels. Pour les femmes en âge de procréer, la mise en place d'une contraception efficace doit être discutée de façon approfondie avec le médecin avant le traitement. En l'absence de données sur le passage dans le lait maternel, l'allaitement est contre-indiqué. Fertilité Dans les études animales, une diminution de la fertilité liée aux effets pharmacologiques du médicament (effet lié à la prolactine) a été observée. Les effets indésirables ont été classés par ordre de fréquence en utilisant la convention suivante : très fréquent ( 1/10) ; fréquent ( 1/100, < 1/10) ; peu fréquent ( 1/1 000, < 1/100) ; rare ( 1/10 000), < 1/1000) ; très rare (< 1/10 000), fréquence inconnue (ne peut être estimée avec les données disponibles) Données d'études cliniques Les effets indésirables suivants ont été observés dans des essais cliniques contrôlés. Il convient de noter que, dans certains cas, il peut être difficile de différencier les événements indésirables, des symptômes de la maladie sous-jacente. Affections du système immunitaire : réactions allergiques. Affections endocriniennes : augmentation de la prolactinémie réversible à l'arrêt du traitement, pouvant entraner au plan clinique : galactorrhée, aménorrhée, ou troubles menstruels, gynécomastie, douleur ou élargissement du sein, prolactinome (voir rubrique 4. 3) et dysfonction érectile. Troubles du métabolisme et de la nutrition : Hyperglycémie (voir rubrique 4. 4). Affections psychiatriques : insomnie, anxiété, agitation, frigidité. Affections du système nerveux : des symptômes extrapyramidaux peuvent apparatre : tremblements, hypertonie, hypersalivation, hypokinésie, akathisie, dyskinésie. Ces symptômes sont généralement modérés aux posologies d'entretien et partiellement réversibles, sans arrêt du traitement par l'amisulpride, avec l'administration d'un traitement antiparkinsonien. La fréquence des symptômes extrapyramidaux qui sont dose-dépendants, est très faible chez les patients recevant des doses entre 50 et 300 mg/jour dans le traitement des symptômes négatifs prédominants. une dystonie aigu (torticolis spasmodique, crises oculogyres, trismus. ) peut apparatre. Elle est réversible sans arrêt du traitement sous l'effet d'un traitement antiparkinsonien. Somnolence. des dyskinésies tardives caractérisées par des mouvements involontaires de la langue et/ou du visage ont été rapportées, surtout après administration prolongée. Les antiparkinsoniens sont sans action ou peuvent provoquer une aggravation des symptômes. Convulsions. Affections cardiaques Hypotension. Bradycardie. Affections gastro-intestinales Constipation, nausées, vomissements, sécheresse de la bouche. Troubles généraux et anomalie au site d'administration : : Des symptômes aigus de sevrage tels que des nausées, vomissements et insomnies ont été décrites suite à l'arrêt brusque du traitement à de fortes doses. Une récurrence des symptômes psychotiques peut également se produire ainsi que l'apparition de troubles de mouvements involontaires (tels que akathisie, dystonie et dyskinésie) (voir rubrique 4. 4). Investigations : prise de poids. élévations des enzymes hépatiques et principalement des transaminases. Données post-commercialisation Les cas de réactions indésirables suivantes ont été signalés par la notification spontanée seulement : Troubles du système sanguins et lymphatiques : : leucopénie, neutropénie et agranulocytose (voir rubrique 4. 4). Troubles du métabolisme et de la nutrition : hypertriglycéridémie et hypercholestérolémie. Affections psychiatriques : : confusion. Affections du système nerveux : syndrome malin des neuroleptiques (voir section 4. 4), qui est une complication potentiellement mortelle. Affections cardiaques : prolongation de l'intervalle QT et arythmies ventriculaires tels que torsades de pointes, tachycardie ventriculaire, ce qui peut entraner une fibrillation ventriculaire, un arrêt cardiaque ou une mort subite (voir section 4. 4). Affections vasculaires : cas de thrombo-embolies veineuses incluant des cas d'embolies pulmonaires, parfois mortels et des cas de thrombose veineuse profonde ont été rapportés. Affection de la peau et du tissu sous-cutané : œdème de Quincke, urticaire. Grossesse, conditions périnatale et puerperium : syndrome de sevrage néonatal (voir rubrique 4. 6). Déclaration des effets indésirables suspectés La déclaration des effets indésirables suspectés après autorisation du médicament est importante. Elle permet une surveillance continue du rapport bénéfice/risque du médicament. Les professionnels de santé déclarent tout effet indésirable suspecté via le système national de déclaration : Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé (ANSM) et réseau des Centres Régionaux de Pharmacovigilance - Site internet : . Des évolutions fatales ont été rapportées principalement en combinaison avec d'autres agents psychotropes. Puisque l'AMISULPRIDE ARROW LAB est faiblement dialysé, l'hémodialyse n'est d'aucune utilité pour éliminer le médicament. Il n'y a pas d'antidote spécifique pour l'AMISULPRIDE ARROW LAB. Des mesures appropriées doivent donc être engagées avec une surveillance étroite des fonctions vitales du patient jusqu'à son rétablissement, y compris une surveillance cardiaque continue en raison du risque d'allongement de l'intervalle QT. En cas d'apparition de symptômes extrapyramidaux sévères, un traitement anticholinergique doit être administré. L'amisulpride se lie avec une forte affinité au sous-type de récepteur D2/D3 dopaminergiques humains, alors qu'il est dépourvu d'affinité avec les récepteurs de sous-type D1, D4 et D5. Contrairement aux neuroleptiques classiques et atypiques, l'amisulpride n'a pas d'affinité pour les récepteurs à la sérotonine, alpha-adrénergiques, à l'histamine H1 et cholinergiques. En outre, l'amisulpride ne se lie pas aux sites sigma. Dans des études animales, l'amisulpride, à de fortes doses, bloque les récepteurs à la dopamine localisés dans les structures limbiques de préférence à ceux du striatum. A de faibles doses, l'amisulpride bloque de préférence les récepteurs présynaptiques D2/D3 ; produisant la libération de dopamine responsable de ces effets inhibiteurs. Ce profil pharmacologique explique l'efficacité clinique de l'amisulpride contre les symptômes à la fois positifs et négatifs de la schizophrénie. Chez l'homme, l'amisulpride présente deux pics d'absorption : un premier atteint rapidement une heure après la prise et un second après entre trois et quatre heures après l'administration. Les taux plasmatiques correspondants sont respectivement de 39 3 et 54 4 ng/ml après l'administration d'une dose de 50 mg. La biodisponibilité absolue est de 48%. Distribution Le volume de distribution est de 5, 8 l/kg. Le taux de fixation aux protéines est faible (16%) et ne laisse pas envisager d'interactions médicamenteuses. Biotransformation L'amisulpride est faiblement métabolisé : deux métabolites inactifs ont été identifiés et représentent 4% de la quantité totale éliminée. Après administration répétée, l'amisulpride ne s'accumule pas et les paramètres pharmacocinétiques ne sont pas modifiés. Elimination L'amisulpride est éliminé sous forme inchangée dans les urines. 50 % de la dose administrée par voie I. V. est éliminée dans les urines, dont 90% sont éliminés au cours des premières 24 heures. La clairance rénale est de l'ordre de 20 l/h ou 330 ml/min. La demi-vie d'élimination est d'environ 12 heures après une administration orale. Un repas riche en glucides (contenant 68% de liquides) abaisse significativement l'ASC, le T et la C de l'amisulpride, tandis qu'un repas riche en graisses ne modifie pas ces paramètres. L'influence de ces résultats lors du traitement par amisulpride n'est pas connue. Insuffisance hépatique L'amisulpride étant faiblement métabolisé, une réduction de la posologie ne devrait pas être nécessaire chez les patients insuffisants hépatiques. Insuffisance rénale La demi-vie d'élimination n'est pas modifiée chez les patients insuffisants rénaux tandis que la clairance totale est réduite d'un facteur 2, 5 à 3. L'AUC de l'amisulpride est multipliée par 2 chez les patients atteints d'insuffisance rénale légère et de presque 10 fois en cas d'insuffisance rénale modérée (voir rubrique 4. 2). Sujet âgé Les données de pharmacocinétiques disponibles chez le sujet âgé (>65 ans) montrent une augmentation de 10 à 30% de C , T et AUC après une prise unique de 50 mg. Aucune donnée n'est disponible après des prises répétées. Une étude de carcinogénicité chez la souris (120 mg/kg/jour) et des études de reproduction (160, 300 et 500 mg/kg/jour, respectivement chez le rat, le lapin et la souris) ont été effectuées. L'exposition des animaux à l'amisulpride au cours de ces études n'a pas été évaluée. Lactose monohydraté, méthylcellulose, cellulose microcristalline, croscarmellose sodique, stéarate de magnésium. Pelliculage : Copolymère de méthacrylate de butyle basique, dioxyde de titane (E171), talc, macrogol 6000, stéarate de magnésium. 4 ans. Plaquette : Blister de 15, 20, 30, 50, 60, 80, 100, 120 et 150 comprimés. Toutes les présentations peuvent ne pas être commercialisées. 26 AVENUE TONY GARNIER 69007 LYON 34009 301 938 7 7 : 20 comprimés sous plaquettes (PVC/Aluminium). 34009 301 938 9 1 : 30 comprimés sous plaquettes (PVC/Aluminium). 34009 301 939 0 7 : 60 comprimés sous plaquettes (PVC/Aluminium). 34009 301 939 1 4 : 80 comprimés sous plaquettes (PVC/Aluminium). 34009 301 939 2 1 : 15 comprimés sous plaquettes (PVC/PVDC/Aluminium). 34009 301 939 3 8 : 20 comprimés sous plaquettes (PVC/PVDC/Aluminium). 34009 301 939 5 2 : 30 comprimés sous plaquettes (PVC/PVDC/Aluminium). 34009 301 939 6 9 : 60 comprimés sous plaquettes (PVC/PVDC/Aluminium). 34009 301 939 7 6 : 80 comprimés sous plaquettes (PVC/PVDC/Aluminium). 34009 550 699 5 9 : 150 comprimés sous plaquettes (PVC/Aluminium). 34009 550 699 6 6 : 150 comprimés sous plaquettes (PVC/PVDC/Aluminium). Sans objet. . | BDPM | Medicinal |
Est-il possible de couvrir les besoins protéiniques de l'homme à l'aide de soja ? | WMT16 | Scientific |
Evolution de la tactique opératoire dans les interventions extensives pour cancer avancé du col utérin | WMT16 | Scientific |
Au cours de la sénescence de l'appareil locomoteur, importance des parties molles dans une perspective de rééducation | WMT16 | Scientific |
Physiologie du comportement | WMT16 | Scientific |
Réactivité des neurones corticaus moterurs et somato-sensoriels pendant l'éveil et le sommeil naturel chez le singe | WMT16 | Scientific |
Grossesse et diabète de type 1 : pompe à insuline versus traitement intensifié conventionnel | WMT16 | Scientific |
Se former pour mieux soulager | WMT16 | Scientific |
Hépatite aigu à Campylobacter fetus | WMT16 | Scientific |
L'épreuve d'hyperglycémie provoquée dans l'acromégalie : contribution a l'étude du diabète des acromégales | WMT16 | Scientific |
Role de l'anhydrase carbonique dans la formation de la bile | WMT16 | Scientific |
Le débit H'EPATIQUE DANS LES H'EPATOPATHIES CHRONIQUES | WMT16 | Scientific |
Emile Clément Jungfleisch, pharmacien et chimiste (1839-1916) | WMT16 | Scientific |
A propos d'un cas d'elliptocytose constitutionnelle dépisté chez un Africain manipulateur radiographe | WMT16 | Scientific |
Modifications métaboliques myocardiques après revascularisation chirurgicale | WMT16 | Scientific |
Chirurgie des ulcères gastro-duodénaux. Les vagotomies | WMT16 | Scientific |
Par mesure de précaution, le CPMP a recommandé que l'avertissement approprié concernant la grossesse et la lactation dans le RCP soit modifié, de manière à indiquer que l'utilisation de la loratadine pendant la grossesse n'est pas recommandée. | EMEA_V3 | Medicinal |
Mélanonychies longitudinales secondaires à une onychophagie | WMT16 | Scientific |
Le service médical rendu par CABLIVI (caplacizumab) est insuffisant dans l'extension d'indication de l'AMM, à savoir le traitement des patients adolescents de plus de 12 ans et de plus de 40 kg présentant un épisode de purpura thrombotique thrombocytopénique acquis (PTTa) conjointement à un traitement par échanges plasmatiques et par immunosuppresseurs. | BDPM | Medicinal |
Coopération entre les isoformes TAp73 et la signalisation TGF- dans la régulation de l'expression de la NO Synthase inductible Aimeric Cabrié To cite this version : Aimeric Cabrié. Coopération entre les isoformes TAp73 et la signalisation TGF- dans la régulation de l'expression de la NO Synthase inductible. Immunité innée. Université Paris-Saclay, 2017. Français. NNT : 2017SACLS397. tel-01968024 HAL Id : tel-01968024 Submitted on 2 Jan 2019 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. 7 9 3 S L C A S 7 1 0 2 : T N N Coopération entre les isoformes TAp73 et le TGF- dans la régulation de l'expression de la NO Synthase inductible Thèse de doctorat de l'Université Paris-Saclay préparée à l'Université Paris Sud École doctorale n568 BIOSIGNE Signalisations et réseaux intégratifs en biologie Spécialité de doctorat : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie Thèse présentée et soutenue à Orsay, le 18 Décembre 2017, par Aimeric Cabrié Composition du Jury : Karim Benihoud Professeur, Université Paris Sud (UMR 8203) Catherine Paul Matre de conférences, Université de Dijon (UMR 866) Richard Tomasini Directeur de recherche, Université d'Aix-Marseille (UMR 1068) Anny Slama-Schwok Directrice de recherche, Institut Gustave Roussy (UMR 8200) Franck Verrecchia Directeur de recherche, Université de Nantes (UMR 1238) Michel Lepoivre Directeur de recherche, Université Paris Sud (UMR 9198) Président Rapporteuse Rapporteur Examinatrice Examinateur Directeur de thèse Mystérieuse splendeur des choses vitales. Beauté inimitable, inintelligible, impossédable. Aimer, ce n'est pas pouvoir posséder. Jean Rostand Carnet d'un biologiste (1959) REMERCIEMENTS Pour entamer cette série de remerciements, je tiens à exprimer ma reconnaissance envers tous les membres du jury pour avoir accepté d'évaluer ces travaux : le Pr. Karim Benihoud (Président), la Dr Catherine Paul (rapporteuse), le Dr Richard Tomasini (rapporteur), la Dr Anny Slama-Schwok (examinatrice) et le Dr Franck Verrecchia (examinateur). Je salue tout particulièrement Karim Benihoud pour avoir suivi mes travaux tout au long de ma thèse et pour tous ses bons conseils. Il y a tant d'autres personnes pour lesquelles je souhaite exprimer ma gratitude après ces quatre années de thèse ! Mais je vais commencer par Michel Lepoivre, qui a accepté de me faire confiance dans cette longue aventure commencée en stage de Master. Michel, je ne te remercierai jamais assez pour toutes les compétences scientifiques que tu as su m'apporter, et pour avoir été un directeur de thèse aussi impliqué auprès de moi. Un immense merci aussi à Olivier Guittet, avec qui j'ai partagé mon bureau durant tout ce temps. Merci pour ton incroyable gentillesse et pour ton soutien au jour le jour durant tout ce temps. Ensemble, nous avons traversé des moments excitants mais aussi des moments de doutes. Malgré cela, vous vous êtes toujours montrés disponibles et à l'écoute de mes propositions et de mes interrogations. Parmi les autres personnes sans lesquelles ces travaux n'auraient pas pu exister, je tiens à remercier : Richard Tomasini pour son don très généreux des fibroblastes immortalisés sur lesquels reposent une grande partie de ces expériences, Fadel Tissir pour nous avoir permis de travailler sur des souris transgéniques conçues dans son laboratoire, et Philippe Vincendeau pour nous avoir fait profiter de son expertise des trypanosomes. Je souhaite également remercier Jean-Claude Drapier et Cécile Bouton, avec qui notre équipe a beaucoup interagit. Nos échanges ont toujours été très enrichissants. Merci à Corinne Dupuy pour son regard avisé sur nos travaux, j'espère très sincèrement que la collaboration pourra se poursuivre. Merci enfin à Boris Julien et Camille Le Guilcher, avec qui nous avons beaucoup échangé autour de nos thématiques finalement très voisines. Un grand merci à eux pour les nombreux efforts auxquels ils ont consenti pour développer notre sujet d'étude autour de modèles cellulaires hépatiques. Si ces années m'ont paru si agréables, c'est aussi grâce à toutes les personnes que j'ai pu croiser dans les couloirs de notre laboratoire et avec lesquelles je me suis si bien entendu. Je tiens tout particulièrement à remercier Jean Kanellopoulos, une personne extraordianaire et un conteur intarissable, merci pour toutes ces histoires hilarantes et pour ce soutien infaillible. Merci beaucoup à Amel Rayah qui m'a aussi beaucoup soutenu lors du concours et de ma première année de thèse. Je regrette que nous n'ayons pas eu plus de temps à partager ! Un immense merci aussi à Pierre Bobé et Amine Mellouk, pour les nombreux déjeuners partagés ensemble et pour leur bonne humeur perpétuelle. Amine, tu es un ami en or ! Je salue également toute l'équipe du 3e étage, avec laquelle je me suis vraiment bien entendu, et aussi pour nos séances de football hebdomadaires : Guillaume Manat, Rodolphe Auger, Dimitri Cherier, Dominique Mangin-Lecreulx, Thierry Touze, Victorien Decoin, Hélène Barreteau et Xudong Tian. Guillaume, merci à toi d'avoir partagé avec moi tous ces bons moments, j'espère te retrouver très vite ! Au terme de ce parcours, je veux m'adresser à celles et ceux qui me sont chers. Je remercie en particulier mes parents, mes grands-parents ainsi que mon frère Alexis. Sans vos encouragements et votre soutien de chaque instant, jamais je ne serais parvenu o je suis aujourd'hui. Enfin, je souhaite remercier du fond du coeur ma compagne, pour tout l'amour qu'elle me porte et pour la patience et la compréhension dont elle a fait preuve pour me supporter au cours de ces derniers mois. LISTE DES ABREVIATIONS -SMA alpha-Smooth muscle actin ADMA Asymmetrical dimethyl-L-arginine Akt Protein kinase B ALK Activin receptor-like kinase AP-1 Activator protein-1 APAF-1 Apoptotic peptidase activating factor-1 ARE Antioxidant response element ASPP Apoptosis-stimulating protein of p53 ATM Ataxia telangiectasia mutated ATP Adenosine triphosphate ATR Ataxia telangiectasia and Rad3-related BAMBI BMP and activin membrane-bound inhibitor Bcl-2 B cell lymphoma-2 BH4 Tetrahydrobiopterin BMDM Bone marrow-derived macrophage BMP Bone morphogenetic protein Bub1/R1 Budding uninhibited by benzimidazoles 1/R1 bZIP basic region-leucine zipper CaM Calmodulin CBP CREB binding protein CDK Cyclin-dependent kinase Chk1/2 Checkpoint kinases 1/2 CO Monoxyde de carbone CO2 Dioxyde de carbone COL1A Collagen type 1 alpha COX2 Cyclooxygenase 2 cPLA2 cytosolic Phospholipase A2 CREB cAMP response element-binding protein CTLA4 Cytotoxic T lymphocyte antigen 4 Cul3 Cullin 3 DBD DNA-binding domain DD1 Death domain 1 dNTP Desoxynucleotide triphosphate ECR Evolutionary conserved region EDRF Endothelium-derived relaxing factor EMT Epithelial to mesenchymal transition eNOS endothelial NO synthase ERK1/2 Extracellular signal-regulated kinase 1/2 FAD Flavin dinucleotide FASAY Functional analysis of separated alleles in yeast FMN Flavin mononucleotide FOXP3 Forkhead box P3 G6PD Glucose-6-phosphate dehydrogenase GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAS -interferon-activated site GM-CSF Granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor GMP Guanosine monophosphate GPX Glutathione peroxidase GSH Glutathione GSNO S-nitrosoglutathione GSSG Glutathione disulfide GST Glutathione S-transferase GTP Guanosine triphosphate H2O2 Peroxyde d'hydrogène HAT Histone acetyltransferase HDAC Histone deacetylase HIF-1 Hypoxia-inducible factor-1alpha HO Hydroxyle HO-1 Heme oxygenase-1 Hsp90 Heat shock protein 90 kDa IFN- Interferon-gamma IB Inhibitor of kappa B IKK IkappaB kinase IL-1 Interleukin-1beta iNOS inducible NO synthase IRAK Interleukin-1 receptor-associated kinase IRF1 Interferon regulatory factor-1 ISG Interferon-stimulated gene ISGF3 Interferon-stimulated gene factor 3 ISRE Interferon-stimulated response element JAK Janus kinase JNK c-Jun N-terminal kinase Keap1 Kelch-like ECH-associated protein 1 LAP Latency-associated peptide L-Arg L-arginine LLC Large latent complex LPS Lipopolysaccharide LTBP Latent TGF-beta-binding protein Maf Musculoaponeurotic fibrosarcoma MAPK Mitogen-activated protein kinase MCP-1 Monocyte chemoattractant protein-1 M-CSF Macrophage-colony-stimulationg factor MDSC Myeloid-derived suppressor cell MEF Mouse embryonic fibroblast MH2 Mad homology domain 2 MM1 Myc modulator 1 MMP Matrix metalloproteinase MyD88 Myeloid differentiation primary response gene 88 N2O3 Trioxyde d'azote NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate NEDD Neural precursor cell expressed developmentally down-regulated NF-E2 Nuclear factor-erythroid 2 NGF Nerve growth factor NF-B Nuclear factor- light chain enhancer of activated B cells NK Natural killer NLS Nuclear localization signal nNOS neuronal NO synthase NO Monoxyde d'azote NO Nitrosonium NO- Nitroxyle NO2 Dioxyde d'azote NO2 NO2 NO3 Nitronium - Nitrite - Nitrate NOS NO synthase NOX4 NADPH oxidase 4 NQO1 NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 Nrf2 NF-E2-related nuclear factor 2 O2 Dioxygène O2 - Superoxyde OD Oligomerization domain ONOO- Peroxynitrite Oct-1 Octamer-1 PAI-1 Plasminogen activator inhibitor-1 PAMP Pathogen-associated molecular pattern PARP Poly (ADP-ribose) polymerase PCAF p300/CBP-associated factor PD-L1 Programmed death-ligand 1 PI3K Phosphoinositide 3-kinase PIAS1 Protein inhibitor of activated STAT1 PIR2 p73-induced ring finger preotein 2 PKC Protein kinase C PKG cGMP-dependent protein kinase PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate PPAR- Peroxysome proliferator-activated receptor-gamma PRX Peroxiredoxin PTEN Phosphatase and TENsin homolog PTP Mitochondrial permeability transition pore RNS Reactive nitrogen species RNR Ribonucleotide reductase RORt Retinoic acid receptor-related orphan receptor gamma t ROS Reactive oxygen species RSNO S-nitrosothiol RyR Ryanodine receptor SAM Sterile alpha motif domain SARA Smad anchor for receptor activation SBE Smad binding elements SCAO2 Short chain alcohol oxidase 2 SERCA Sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase SESN2 Sestrin 2 sGC soluble Guanylate cyclase SHH Sonic hedgehog SLC Small latent complex SMAD Sma and MAD protein SNP Single nucleotide polymorphism SOCS Suppressor of cytokine signaling SOD Superoxide dismutase SPSB SPRY domain and SOCS-box-containing protein SPRY SplA/ryanodine receptor SRX Sulfiredoxin STAT1 Signal transducer and activator of transcription 1alpha TAD Transactivation domain TAK1 TGF-activated kinase 1 TAM Tumor-associated macrophage t-BHQ tert-Butylhydroquinone TCF11 Transcription factor 11 TCR T cell receptor TGF- Transforming growth factor-beta TIE TGF- inhibitory element TIGAR TP53-inducible glycolysis and apoptosis regulator TIMP1 Tissue inhibitor of metalloproteinase 1 TLR Toll-like receptor TNF- Tumor necrosis factor-alpha TRAF6 TNF receptor-associated factor 6 Trx Thioredoxin UTR Untranslated region YAP1 Yes-associated protein 1 YY1 Yin Yang 1 ZEB Zinc finger E-box-binding homeobox TABLE DES MATIERES REMERCIEMENTS LISTE DES ABREVIATIONS TABLE DES MATIERES INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE 1 Le monoxyde d'azote et les NO synthases 1. 1 La chimie de NO 1. 1. 1 1. 1. 2 1. 1. 3 1. 1. 4 1. 1. 5 1. 1. 6 1. 1. 7 Description chimique de NO Propriétés physiques de NO Réactivité de NO avec O2 et des espèces radicalaires Formation de S-nitrosothiols Nitrosylation de complexes métalliques et de métalloprotéines Formation de N-nitrosamines Nitration par des dérivés de NO 1. 2 Synthèse de NO par les NO synthases 1. 2. 1 1. 2. 2 Découverte de la synthèse de NO chez les mammifères Les NO synthases Généralités Localisation tissulaire et subcellulaire des NO Synthases Structure des NO Synthases 1. 2. 2. 1 1. 2. 2. 2 1. 2. 2. 3 1. 2. 3 Mécanisme de synthèse de NO par les NO synthases 1. 2. 4 Disponibilité en substrats et activité NO Synthase 1. 3 NO est une molécule de signalisation cellulaire 1. 3. 1 1. 3. 2 Sélectivité des cibles de NO : effets de seuils et diversité de réponses Les S-nitrosylations : un nouveau paradigme en signalisation 1. 3. 2. 1 1. 3. 2. 2 La S-nitrosylation : un mécanisme sélectif et réversible ? Rôles des S-nitrosylations en signalisation cellulaire 1. 3. 3 Quel est le destin des cellules exposées à de fortes concentrations en NO ? 1. 3. 4 Les défenses cellulaires en réponse aux dommages induits par NO Aperçu général des mécanismes de défense antioxydante L'activation de Nrf2 est une voie centrale de détoxification des xénobiotiques et des 1. 3. 4. 1 1. 3. 4. 2 espèces oxydantes Les fonctions physiologiques et les effets physio-pathologiques des NO synthases 1. 4 1. 4. 1 1. 4. 2 1. 4. 3 NO dans le système cardiovasculaire NO dans le système nerveux : un neurotransmetteur atypique NO dans l'inflammation, l'immunité et le cancer 1. 4. 3. 1 1. 4. 3. 2 1. 4. 3. 3 Les activités activités antimicrobienne, antivirale et antiparasitaire de la iNOS NO comme médiateur de l'immunité adaptative La iNOS dans les maladies inflammatoires chroniques et le cancer 1. 5 Régulation de l'expression et de l'activité iNOS 1. 5. 1 1. 5. 2 1. 5. 3 Structures du gène et du promoteur NOS2 Les facteurs de transcription modulant l'expression de la iNOS La régulation post-transcriptionnelle et post-traductionnelle de la iNOS 1. 6 Contrôle de la synthèse de NO par le TGF- 1. 6. 1 1. 6. 2 Composants de la voie de signalisation canonique du TGF- Régulation de gènes cibles par les protéines SMADs et leurs partenaires 5 7 13 17 19 19 19 20 21 23 24 25 25 27 27 28 28 29 31 34 37 38 38 40 40 44 45 48 48 49 52 52 56 58 58 60 62 65 65 68 73 75 75 77 1. 6. 3 1. 6. 4 1. 6. 5 Les voies de signalisation indépendantes des protéines SMADs. Régulation de la biodisponibilité du TGF- Régulation de l'expression de la iNOS par le TGF-1 2 2. 1 2. 1. 1 2. 1. 2 2. 1. 3 Le suppresseur de tumeur p73 et ses homologues La famille p53 : Origine, structures et fonctions Découverte d'un Gardien du génome Origine évolutive et fonctions ancestrales de p53 Structure et complexité moléculaire de la famille p53 Diversité des isoformes au sein de la famille p53 Structure protéique de p73 et de ses homologues La famille p53 forme un réseau d'interactions 2. 1. 3. 1 2. 1. 3. 2 2. 1. 3. 3 2. 1. 4 2. 1. 5 Régulation génique par p53 et ses homologues p73 est-il réellement un gène suppresseur de tumeur ? 2. 2 Contrôle de l'activité et de l'expression de p73 2. 2. 1 2. 2. 2 Régulation des fonctions de p73 Expression différentielle des isoformes de p73 2. 3 Fonctions exclusives de p63 et p73 dans le développement 2. 3. 1 2. 3. 2 p63 dans le développement des épithéliums et des tissus d'origine ectodermique p73 dans le développement et la maintenance du système nerveux central 2. 4 Rôles émergents de p53 et p73 dans l'immunité 2. 4. 1 2. 4. 2 2. 4. 3 2. 4. 4 p53 dans l'immunité antivirale et la réponse aux IFNs de type I Contrôle des réponses inflammatoires par p53 p53 dans le contrôle de l'autoimmunité et de l'immunité antitumorale Rôle émergent de p73 dans les fonctions immunes 2. 5 Interactions entre NO et la famille p53 2. 5. 1 2. 5. 2 Activation de p53 et TAp73 par NO Régulation de la synthèse de NO par p53 OBJECTIFS DES TRAVAUX MATERIEL ET METHODES 1 Culture cellulaire 1. 1 Conditions de culture 1. 2 1. 3 Lignées murines immortalisées de fibroblastes embryonnaires TAp73-/- (3T3) Isolement de cellules primaires Np73-/- Souris knockout pour les isoformes Np73 1. 3. 1 1. 3. 2 Macrophages dérivant de cellules de moelle osseuse 1. 3. 3 Fibroblastes pulmonaires 2 Cytokines et inhibiteurs pharmacologiques 3 Mesure de la production de NO avec le réactif de Griess 4 Détermination des niveaux d'expression protéique par western-blot 4. 1 Extraction et dosage des protéines solubles 4. 2 Electrophorèse SDS-PAGE et Western-Blot 4. 3 Révélation des immunoblots et anticorps 5 Mesure d'expression génique par RT-qPCR 5. 1 Extraction et purification des ARN totaux 5. 2 Rétrotranscription 5. 3 PCR quantitative 6 Mesure de production de TGF-1 par ELISA 79 80 84 88 88 88 90 91 91 93 95 97 100 103 103 107 107 108 109 111 112 113 116 120 121 121 122 125 129 131 131 131 132 132 134 135 136 137 138 138 139 139 141 141 141 142 145 7 8 Infection parasitaire avec Trypanosoma musculi Statistiques RESULTATS EXPERIMENTAUX 146 146 147 1 Les isoformes TAp73 régulent négativement l'expression de la iNOS Implication des isoformes TAp73 dans la régulation de l'expression de la iNOS 149 1. 1 Détermination des conditions d'induction de la iNOS dans des fibroblastes immortalisés de souris 149 1. 2 150 150 152 Surexpression de la iNOS dans les 3T3 TAp73-/- Les isoformes TAp73 sont nécessaires à la dégradation de la iNOS par le protéasome La régulation négative de la iNOS par les isoformes TAp73 dépend d'un facteur sécrété par les 1. 2. 1 1. 2. 2 1. 2. 3 cellules 153 1. 3 Réduction de l'effet suppresseur du TGF- sur l'induction de la iNOS dans les 3T3 TAp73-/- 154 1. 4 Mécanismes de coopération entre les isoformes TAp73 et le TGF- dans la répression de la iNOS 156 1. 5 Conséquences fonctionnelles de la surproduction de NO induite par la déficience en isoformes TAp73 159 Renforcement de la réponse antioxydante dépendante de Nrf2 et de NO dans les 3T3 TAp73-/- 159 Les isoformes TAp73 et le TGF-1 affectent les effets antiparasitaires dépendants de NO lors 1. 5. 1 1. 5. 2 d'une infection avec T. musculi 162 2 Etude préliminaire des effets des isoformes Np73 dans la régulation de la iNOS et la réponse au TGF- 163 2. 1 Régulation de l'expression de la iNOS par les isoformes Np73 dans les BMDM 2. 2 Potentialisation de l'induction de gènes cibles du TGF- par les isoformes Np73 dans les fibroblastes pulmonaires 163 165 DISCUSSION ET PERSPECTIVES 195 1 Régulation négative de l'expression de la iNOS par les isoformes TAp73 1. 1 Coopération entre les isoformes TAp73 et le TGF- dans le processus de répression de la iNOS Effet des isoformes TAp73 et du TGF- sur l'induction transcriptionnelle du gène Nos2 Leçons tirées des autres exemples d'interactions entre la voie de signalisation du TGF- et la 1. 1. 1 1. 1. 2 protéine p53 ou ses homologues 1. 1. 3 1. 1. 4 iNOS. Régulation de la signalisation TGF- par les isoformes TAp73 Implication des isoformes TAp73 et du TGF- dans la régulation de la stabilité de la protéine 205 197 198 198 201 204 207 Conséquences de la coopération entre le TGF et les isoformes TAp73 sur des fonctions cellulaires 2 dépendantes de la production de NO 2. 1 Régulation de la réponse génique dépendante de Nrf2 et des effets anti-parasitaires dépendants de NO 207 2. 2 Autres conséquences potentielles de la régulation par les isoformes TAp73 de l'expression de la iNOS 209 3 TGF- ? Le cas des isoformes Np73, vers un modèle global d'intégration de la famille p53 dans les fonctions du 210 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 214 CHAPITRE I : INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE Chapitre I : Introduction bibliographique 1 Le monoxyde d'azote et les NO synthases 1. 1 La chimie de NO 1. 1. 1 Description chimique de NO Le monoxyde d'azote (NO) est l'une des 10 plus petites molécules stables se trouvant dans la Nature. Cette molécule se caractérise principalement par quatre propriétés : elle est gazeuse, petite, non chargée, et elle comporte un électron non apparié (impossibilité pour l'atome d'azote de remplir sa couche de valence). NO est donc un radical libre doué de paramagnétisme. Cette propriété détermine en grande partie sa réactivité chimique. Cet électron non apparié présente une instabilité intrinsèque. Deux mécanismes permettent de remédier à cette instabilité et dominent la chimie de NO : l'appariement avec un autre électron non apparié, et la mise en résidence partielle dans l'orbitale d d'un métal de transition. NO est considéré comme un radical libre relativement stable et faiblement réactif. Il ne se décompose pas spontanément et ne réagit pas non plus avec lui-même en conditions biologiques. L'oxydation/réduction mono-électronique de NO, donnant respectivement le cation nitrosonium NO et l'anion nitroxyle NO- ou son acide conjugué HNO, est thermodynamiquement très défavorable, ce qui prévient leur formation directe1. NO réagit cependant rapidement avec de nombreuses cibles cellulaires, ce qui explique sa faible demi-vie biologique, la plupart du temps inférieure à 2 s2. C'est un temps de vie extrêmement court en comparaison avec d'autres molécules de signalisation, mais c'est un temps relativement long si on le compare à celui des autres radicaux libres dont la durée de vie est plutôt de l'ordre de quelques millisecondes. 19 Chapitre I : Introduction bibliographique 1. 1. 2 Propriétés physiques de NO NO est une molécule non chargée, ce qui lui permet de traverser facilement les membranes biologiques par diffusion passive. Il est soluble à la fois en milieu hydrophobe et en milieu hydrophile (avec une solubilité 10 fois inférieure cependant). En raison de sa nature gazeuse, son coefficient de diffusion élevé (3800 m/s) lui permet de parcourir des distances considérables en une courte période temporelle ( longueur d'une cellule/25 ms) (cf. Figure I- 1)3. Une fois synthétisé, le NO se déplace par diffusion aléatoire depuis son point d'origine, établissant un gradient spatial de concentration à partir de son site de production. Dans des cultures cellulaires, le NO libéré par des macrophages RAW 264. 7 en réponse à l'interféron- a été détecté à une distance de 100 à 500 m des cellules, soit un rayon de diffusion équivalent à 10-50 cellules4. Dans des systèmes biologiques, la diffusion de NO est toutefois limitée par de nombreux facteurs : son interaction avec des protéines (hémoglobine, guanylate cyclase, etc. ), la composition lipidique de la membrane plasmique (présence de cholestérol, de liposomes, etc. ) ou bien sa réactivité avec des radicaux libres. Figure I-1 : Comparaison des rayons de diffusion de NO, du peroxynitrite (ONOO-), de l'anion -) et du radical hydroxyle (HO)5. Ces distances de diffusion sont approximatives et se superoxyde (O2 basent sur une estimation de la demi-vie moyenne de NO de 1 s, dans un contexte o celle-ci est limitée par la présence de globules rouges (RBC : red blood cells). La distance de diffusion du radical hydroxyle est 104 fois plus faible que celle du peroxynitrite, soit environ le rayon d'une petite protéine. 20 Chapitre I : Introduction bibliographique 1. 1. 3 Réactivité de NO avec O2 et des espèces radicalaires NO peut réagir très rapidement avec d'autres radicaux libres au moyen d'un appariement électronique favorable, formant des composés secondaires appelés espèces réactives de l'azote (RNS Reactive nitrogen species)6. Parmi les molécules possédant un électron non apparié, le dioxygène (O2) est largement prédominant. Si O2 possède un nombre pair d'électrons, deux de ses électrons se trouvent pourtant sur des orbitales séparées dans la forme la plus commune de la molécule (état fondamental). La concentration en O2, qui varie dans de grandes proportions en fonction de l'organe, du tissu, du type cellulaire et même de la localisation intracellulaire, est un déterminant majeur de la concentration en NO à un temps donné. O2 participe en effet à la fois à la synthèse de NO comme cosubstrat des NO Synthases, mais aussi au métabolisme de NO. Ainsi, la demie-vie et la distance de diffusion de NO sont d'autant plus réduites que la concentration en O2 est élevée (cf. Figure I-2)7. Le produit immédiat de la réaction de NO avec O2 est généralement le dioxyde d'azote (NO2), qui est aussi un radical, mais qui contrairement à NO est oxydant (Réaction 1). NO2 réagit rapidement avec NO ou des molécules riches en électrons (nucléophiles), générant d'autres dérivés ainsi que l'anion nitrite (NO2 -). 2NO O2 2NO2 (Réaction 1) NO réagit également avec la forme réduite de l'oxygène, l'anion superoxyde (O2 -), de façon extrêmement rapide, ce qui réduit son potentiel de diffusion. Le produit formé par cette réaction, le peroxynitrite (ONOO-), est un puissant agent oxydant et nitrant (Réaction 2). Cette réaction est limitée par l'activité superoxyde dismutase (SOD) des cellules et a lieu essentiellement lorsque les concentrations des deux substrats sont équivalentes. NO O2 - ONOO- (Réaction 2) 21 Chapitre I : Introduction bibliographique Figure I-2 : La distance de diffusion et la demi-vie de NO (en ordonnée) sont directement corrélées à la concentration en O2 des différents tissus8. En réagissant avec le CO2 présent en grandes quantités en conditions biologiques, ONOO- se décompose et conduit à la formation d'une espèce anionique (ONOOCO2 -) puis d'un complexe radicalaire [NO2/CO3 -] (Réactions 3 et 4). ONOO- réagit aussi avec les groupements thiols (RSH), résultant en une oxydation formant des acides sulféniques instables et réactifs (RSOH). Enfin, au sein de certains microenvironnements, la forme protonée du peroxynitrite (ONOOH) subit un clivage homolytique produisant du NO2 et le radical hydroxyle (HO) qui est une espèce oxydante très puissante (oxydation des centres fer/soufre, des doigts de zinc et des thiols) (Réaction 5)9. ONOO- CO2 ONOOCO2 - (Réaction 3) ONOOCO2 - [NO2/CO3 -] O2NOCO2 - (Réaction 4) ONOO- H ONOOH (pKa 6, 8) [NO2/ HO] NO3 - H (Réaction 5) Ainsi, les réactions de NO avec des espèces non métalliques ont deux conséquences majeures : l'oxydation de molécules nucléophiles cellulaires, et la formation de deux produits stables de décomposition (les anions nitrite et nitrate). Les deux nucléophiles cibles de NO les plus étudiés sont le groupement thiol des cystéines (contenus dans les protéines et dans de petites molécules comme le glutathion) et le groupement phénolique de la tyrosine. 22 Chapitre I : Introduction bibliographique 1. 1. 4 Formation de S-nitrosothiols NO lui-même ne réagit pas avec les groupements thiol ou thiolate. La modification des thiols par NO nécessite une oxydation préalable, soit de NO (pour former un donneur NO ), soit du thiol (formation d'un radical thiyl RS)10. L'oxydation de NO pour former un cation nitrosonium (NO ) est une réaction hautement défavorable dans des conditions physiologiques. Toutefois, des espèces avec une réactivité proche de celle de NO peuvent se former. NO et NO2 peuvent par exemple se combiner pour former du trioxyde d'azote (N2O3) (Réaction6). Celui-ci s'obtient également lors de l'auto- oxydation de NO (Réaction 7). Lorsque ONOO- se décompose en présence de CO2 (Réactions 3 et 4) ou en milieu acide (Réaction 5), de puissants agents oxydants sont produits. Cependant, la balance oxydative peut basculer vers la nitrosation lorsque ces intermédiaires oxydants sont convertis en N2O3 en réagissant davantage avec NO (Réactions 8 et 9)11. NO NO2 N2O3 (Réaction 6) 4NO O2 2N2O3 (Réaction 7) ONOO- 2NO N2O3 NO2 - (Réaction 8) ONOO- 2NO 2 N2O3 NO2 - (Réaction 9) N2O3 se comporte comme un donneur de NO [ ONNO2 -] et réagit avec les thiols en transférant un groupement nitroso dans une réaction de transnitrosation, formant ainsi un composé covalent S-nitrosothiol (RSNO) (Réaction 11). La transnitrosation peut aussi se faire lors d'une attaque nucléophile d'un anion thiolate sur l'azote d'un nitrosothiol, ce qui permet le transfert du S-nitrosothiol d'une protéine à une autre par exemple (Réaction 12). N2O3 RS- RSNO NO2 - (Réaction 11) R1S- R2SNO [R1S-NO-R2S] R1SNO R2S- (Réaction 12) Il existe un second mode de génération de S-nitrosothiols : la nitrosylation oxydative. L'oxydation d'un groupement thiol par des dérivés de NO ou de l'oxygène tels que HO et NO2 génère un radical thiyl (Réaction 13). Ce radical thiyl réagit ensuite directement avec NO pour former un S-nitrosothiol par recombinaison radicalaire (Réaction 14). 23 Chapitre I : Introduction bibliographique RSH RS e- H (Réaction 13) RS NO RS-NO (Réaction 14) Enfin, les métaux de transition sont aussi des accepteurs d'électron de NO. Le NO lié au Fe(III) de l'hème présente un caractère NO et peut induire la nitrosation des thiols aussi bien que celle des amines secondaires et de groupements phénoliques (s'accompagne aussi d'une réduction de l'hème). 1. 1. 5 Nitrosylation de complexes métalliques et de métalloprotéines Les métaux de transition sont appelés ainsi car dans le tableau périodique des éléments, ils représentent les éléments qui font la transition entre les orbitales s et p, avec des électrons occupant les orbitales d. Ces orbitales peuvent accueillir 10 électrons et sont généralement assez espacées en énergie en fonction de l'arrangement des ligands autour du métal. Les métaux de transition constituent ainsi de bons foyers pour les électrons non appariés. La plupart du temps cependant, l'électron non apparié n'est pas totalement transféré au métal mais est partagé avec le radical. NO et O2 sont tous deux capables de former ce type de liaison avec un métal de transition, appelée liaison de coordination. En raison de la nature différente de la liaison qui n'est pas covalente, le groupement fonctionnel du ligand lié au métal est appelé nitrosyl. La liaison de coordination entre NO et un métal de transition la plus étudiée est celle qui lie NO au fer, soit dans son état ferreux (Fe2 ), soit dans son état ferrique (Fe3 ). Une large proportion du fer existe sous forme liée à la protoporphyrine au sein de l'hème, qui est utilisé comme cofacteur d'une grande variété d'enzymes et permet notamment le transport du dioxygène par l'hémoglobine. La coordination de NO à l'hème ferreux de la Guanylate Cyclase soluble (sGC) est sans doute la mieux connue et représente la quintessence d'un exemple de nitrosylation en biologie. La formation du complexe ferreux-nitrosyl (FeII-NO) provoque des changements structuraux qui multiplient par un facteur 100 la conversion du GTP (Guanosine triphosphate) en GMPc (cyclic Guanosine monophosphate) par l'enzyme12. Dans de nombreux cas cependant, la nitrosylation des métalloenzymes a un effet négatif sur leur activité : c'est par exemple le cas pour le cytochrome P450, la NO Synthase et pour l'aconitase13. De cette façon, NO exerce un rétrocontrôle négatif sur sa propre synthèse. 24 Chapitre I : Introduction bibliographique Le fer des hémoprotéines peut participer à des réactions d'oxydoréduction avec NO. La réaction qui se produit le plus souvent en contexte biologique est la réaction avec l'oxyferrohémoglobline (FeII) des globules rouges pour former du nitrate et la méthémoglobine contenant un ferrihème (FeIII) (Réaction 15). C'est un phénomène majeur de consommation de NO qui régule largement ses concentrations locales14. HbFe(II)O2 NO HbFe(III) NO3 - (Réaction 15) 1. 1. 6 Formation de N-nitrosamines La réaction de nitrosation, qui consiste en l'addition d'un ion nitrosonium NO sur un groupe nucléophile, ne se limite pas aux seuls thiols. Les amines primaires (RNH2) telles que celles retrouvées dans les bases nucléiques peuvent aussi subir une nitrosation par N2O3 ou par des complexes ferri-nitrosyl (FeIII-NO). Les N-nitrosamines sont instables car elles peuvent tautomériser. Ce processus est notamment à l'origine de la conversion de la cytosine en uracile15. La formation de N-nitrosamines a rapidement fait l'objet de suspicions dans la carcinogenèse associée à l'inflammation16. 1. 1. 7 Nitration par des dérivés de NO La nitration consiste en l'addition d'un ion nitronium (NO2 ) sur un groupe nucléophile. La réaction aboutit à la formation d'un composé covalent comportant le groupement fonctionnel nitro (R-NO2). Il existe de nombreux mécanismes de nitration. L'un d'eux implique l'oxydation du groupement phénol de la tyrosine par l'anion carbonate CO3 - (issu de l'interaction entre ONOO- et CO2), ce qui génère un radical tyrosyl (Réaction 16). Ce radical réagit ensuite avec NO2 pour former une 3-nitrotyrosine (Réaction 17). CO3 - Tyr-OH HCO3 - Tyr-O (Réaction 16) Tyr-O NO2 3- NO2-Tyr (Réaction 17) La formation des adduits de nitration est irréversible dans les conditions biologiques, et peut aussi cibler d'autres molécules comme le tryptophane, la guanine (8-nitroguanine) ou les acides gras. Elle peut permettre la modulation d'une activité enzymatique : notre laboratoire a 25 Chapitre I : Introduction bibliographique par exemple démontré qu'in vitro, la nitration de certains résidus tyrosine de la ribonucléotide réductase (enzyme catalysant l'étape limitante de la synthèse de novo des dNTPs) provoque son inhibition17, 18. La détection de nitrations au niveau de protéines ou de nucléotides est souvent utilisée pour signaler une condition de stress nitrant associé à des pathologies. L'activité iNOS induit la nitration et l'oxydation de la guanine (8-nitroguanine et 8-oxodG) et une transversion G T mutagénique. Ce type de mutation apparait dans de nombreux cancers d'origine inflammatoire ou pathogène : cholangiocarcinome (douve du foie), cancer gastrique (H. pilori), cancer du col de l'utérus (papilloma virus humain), carcinome du nasopharynx (virus d'Epstein- Barr), hépatocarcinome (virus de l'hépatite C), carcinome pulmonaire (amiante), maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (maladie de Crohn et rectocolite hémorragique)19. Les différentes modifications post-traductionnelles induites par NO et ses dérivés réactifs sont résumées sur la Figure I-3. Figure I-3 : Résumé des relations chimiques entre des espèces réactives de l'oxygène (ROS) et des espèces réactives de l'azote (RNS), et leur impact sur différentes modifications post-traductionnelles des protéines20. GSH : glutathion, GSSG : disulfure de glutathion, GSNO : S-nitrosoglutathion. 26 Chapitre I : Introduction bibliographique 1. 2 Synthèse de NO par les NO synthases 1. 2. 1 Découverte de la synthèse de NO chez les mammifères NO est identifié et décrit comme un gaz pour la première fois par Joseph Priestley en 1772. Pendant de longues années, cette molécule à l'apparence simple, constituée d'un atome d'azote et d'un atome d'oxygène, est seulement considérée comme un polluant atmosphérique et un poison, en raison de sa forte affinité pour l'hémoglobine. Dans les années 1980, certains chercheurs s'intéressent à la manière dont les vaisseaux sanguins peuvent se dilater. Le phénomène de vasodilatation est essentiel au contrôle de la pression artérielle. Des molécules telles que la nitroglycérine étaient couramment utilisées dans le traitement de maladies cardiaques comme l'angine de poitrine afin de favoriser la vasodilatation, sans que l'on connaisse mécanisme qui en était la cause. Figure I-4 : Robert F. Furchgott, Louis J. Ignarro et Ferid Murad furent récompensés en recevant le prix Nobel (1998) pour leurs découvertes concernant NO comme molécule de signalisation dans le système cardiovasculaire21. En 1980, Robert Furchgott examine l'effet de l'acétylcholine sur la vasodilatation et s'aperçoit que le relâchement des vaisseaux sanguins ne se produit qu'en présence de cellules endothéliales22. Ces cellules tapissent l'intérieur des vaisseaux sanguins et sont au contact de cellules musculaires lisses responsables de la dilatation ou de la constriction des vaisseaux. Les résultats de R. Furchgott suggéraient que les cellules endothéliales produisent un facteur requis pour la vasodilatation. Ce facteur, encore non identifié, fut nommé EDRF (Endothelium- Derived Relaxing Factor). 27 Chapitre I : Introduction bibliographique Auparavant, Ferid Murad avait démontré que la nitroglycérine déclenche la libération de NO qui est alors capable d'induire un relâchement des cellules musculaires lisses23. C'est finalement Louis Ignarro qui, en 1986, fournit les derniers éléments décisifs pour résoudre cette question. Il identifie l'EDRF et montre qu'il possède des propriétés chimiques et pharmacologiques identiques au radical NO24, 25. La découverte qu'un gaz puisse avoir une si grande implication dans des fonctions biologiques eut un retentissement gigantesque dans la communauté scientifique. Furchgott, Murad et Ignarro furent récompensés par un prix Nobel en 1998 (cf. Figure I-4)21. 1. 2. 2 Les NO synthases 1. 2. 2. 1 Généralités La synthèse de NO est catalysée par une famille d'enzymes appelées NO synthases (NOS). Trois isoformes distinctes de NOS ont été décrites chez les mammifères à partir de 198926. Elles sont les produits de gènes indépendants, localisés sur des chromosomes différents, et se distinguent par une localisation subcellulaire et tissulaire, une régulation et des propriétés catalytiques qui leur sont propres. Leur clonage et leur purification ont été réalisés entre 1991 et 1994. La nomenclature la plus couramment utilisée est la suivante : nNOS (aussi nommée Type I, NOS-I ou NOS-1) d'abord isolée du tissu neuronal o elle est prédominante, iNOS (Type II, NOS-II ou NOS-2) qui est inductible dans une grande variété de cellules et tissus, et eNOS (Type III, NOS-III ou NOS-3) pour l'isoforme découverte originellement dans les cellules endothéliales vasculaires. Les NOS sont également parfois classées selon leur mécanisme d'expression et leur dépendance au calcium : les NOS constitutives (eNOS et nNOS), pour lesquelles une augmentation de la concentration intracellulaire en Ca2 est nécessaire à la production de NO, et la NOS inductible (iNOS), dont l'activité est indépendante des flux calciques. Le potentiel de synthèse de NO par les NOS constitutives (concentrations nanomolaires) est très inférieur à celui de la NOS inductible (concentrations sub-micromolaires). L'idée selon laquelle la eNOS et la nNOS sont exprimées de façon constitutive tandis que la iNOS est induite durant la réponse immunitaire est vraie dans la majeure partie des situations. Cette classification est toutefois désuète du fait de l'existence de conditions entranant une hausse de l'expression génique pour les enzymes constitutives : la eNOS voit par exemple son niveau d'expression augmenté dans 28 Chapitre I : Introduction bibliographique certaines situations comme la stimulation par des œstrogènes, l'hyperthermie, l'exercice physique et les forces de cisaillement hémodynamiques2730. A l'inverse, il existe des conditions physiologiques faisant de la iNOS une enzyme exprimée constitutivement , comme c'est par exemple le cas dans le colon, la trachée, les poumons et le foie3133. 1. 2. 2. 2 Localisation tissulaire et subcellulaire des NO Synthases Si la nNOS et la eNOS tiennent leur dénomination de l'origine tissulaire à partir de laquelle elles furent décrites pour la première fois, cette classification n'est pas absolue34. La nNOS est aussi présente de façon importante dans le muscle squelettique par exemple. La iNOS, initialement purifiée à partir de macrophages activés, est aussi induite dans de très nombreux types cellulaires comme les cardiomyocytes, les fibroblastes, les hépatocytes, les cellules gliales ou les cellules musculaires lisses vasculaires. La eNOS, enfin, fut d'abord purifiée et clonée à partir de l'endothélium vasculaire, mais elle est aussi exprimée dans les cardiomyocytes ou les plaquettes sanguines. La compartimentalisation intracellulaire des isoformes de NOS est cruciale pour leurs activités de transduction du signal respectives. En plus de dépendre du type cellulaire, l'expression de chaque isoforme est en effet restreinte à des compartiments subcellulaires particuliers. Un exemple très marquant est le cas des cardiomyocytes, dans lesquels les trois isoformes sont exprimées (pour la iNOS seulement en réponse à des stimuli proinflammatoires). Les souris eNOS-/- et nNOS-/- développent une hypertrophie cardiaque liée à l'âge, mais seules les souris nNOS-/- sont hypertensives. Ces phénotypes ont pu être expliqués par une localisation subcellulaire différencielle de ces isoformes : la nNOS est proche du réticulum sarcoplasmique tandis que la eNOS se situe au niveau des cavéoles des cardiomyocytes (avec les récepteurs - adrénergiques et les canaux calciques de type L)35. Ces isoformes sont également connues pour exercer une régulation différente des flux de calcium : la eNOS inhibe l'influx calcique en réponse à des agonistes des récepteurs -adrénergiques (et via les canaux calciques de type L), alors que la nNOS facilite la sortie de calcium du réticulum sarcoplasmique. Ceci peut être facilement expliqué par les localisations subcellulaires de ces deux isoformes, qui favorisent respectivement leur interaction avec la cavéoline-3 et les récepteurs à la ryanodine. 29 Chapitre I : Introduction bibliographique De manière générale, la iNOS se trouve sous forme particulaire (à l'état dimérique) dans le cytosol. Mais elle a aussi été observée sous forme monomérique dans les péroxysomes d'hépatocytes, ainsi qu'au pôle apical des cellules épithéliales o elle s'associe au cytosquelette d'actine corticale36, 37. La eNOS est majoritairement exprimée au niveau membranaire dans le Golgi, les cavéoles et les radeaux lipidiques38. La nNOS enfin, a été décrite aussi bien sous forme soluble dans le cytosol, que sous forme particulaire au niveau du réticulum endoplasmique et des zones de densité post-synaptique39. Figure I-5 : Trafic intracellulaire de la eNOS38. La eNOS est ancrée à la membrane du Golgi après avoir été myristoylée à l'extrémité N-ter (Gly-2) au cours de sa traduction. Elle est ensuite adressée à la membrane plasmique grâce à sa palmitoylation (Cys-15 et Cys-26), au niveau de radeaux lipidiques ou des cavéoles. Le transport rétrograde de la eNOS de la membrane plasmique au Golgi est initié en cas de dépalmitoylation. Les NOS peuvent également être transloquées au sein de différents compartiments cellulaires. La eNOS est l'isoforme la plus étudiée du point de vue de son trafic intracellulaire. Elle subit des translocations entre l'appareil de Golgi et la membrane plasmique induites par des modifications post-traductionnelles qui affectent son ancrage lipidique (palmitoylation et myristoylation) (cf. Figure I-5)38. L'association eNOS/cavéoline inhibe l'activité de la eNOS. Après stimulation par un agoniste, la concentration en Ca2 intracellulaire augmente, induisant alors l'association de la CaM à la eNOS et provoquant dans le même temps sa dissociation de la cavéoline. La eNOS est dépalmitoylée et acheminée jusqu'au Golgi o elle est phosphorylée avant de revenir à la membrane o son activité est la plus élevée. La nNOS peut aussi avoir une 30 Chapitre I : Introduction bibliographique localisation membranaire : grâce à son domaine PDZ (PSD/Disc-large/ZO-1), elle s'associe à la protéine PSD-95 (Post synaptic density-95) qui est palmitoylée, et se localise dans la densité post-synaptique des neurones. 1. 2. 2. 3 Structure des NO Synthases Les NOS des mammifères sont composées d'un domaine oxygénase (N-terminal) et d'un domaine réductase (C-terminal) (cf. Figure I-6). Le domaine oxygénase des NOS lie l'arginine et deux cofacteurs, la (6R)-5, 6, 7, 8-tétrahydrobioptérine (BH4) et l'hème (coordination avec le cation Fe2 et la protoporphyrine IX). Le domaine réductase de la NOS peut être subdivisé en deux domaines de liaison aux flavines FAD (Flavin adenine dinucleotide) et FMN (Flavin mononucleotide). Le domaine réductase lie également le NADPH (Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) qui fournit les électrons nécessaires à la catalyse enzymatique. Il est apparenté à la cytochrome P450 réductase microsomiale qui permet le transfert d'électrons du NADPH aux cytochromes P450 (métabolisme des acides gras, des stéroïdes, des prostaglandines et de nombreux xénobiotiques). Le domaine de liaison à FMN est connecté au domaine oxygénase par l'intermédiaire d'un segment d'une trentaine d'acides aminés formant le domaine de liaison à la calmoduline (CaM). La forme catalytique des NOS est un homodimère. Les NOS inductible et constitutives partagent de 51 à 57% d'homologie dans la séquence primaire. Il y a une forte conservation des domaines de liaison aux cofacteurs, mais des divergences au niveau des segments de connexion (ex : domaine de liaison à la CaM) et dans des inserts. La eNOS et la nNOS partagent certaines séquences modifiées (liaison à la CaM) et deux inserts importants : une boucle d'autoinhibition (AI) de 45 acides aminés au sein du domaine FMN, et une extension de 42 acides aminés à l'extrémité C-ter du domaine réductase (CT). L'isoforme nNOS comporte également un domaine PDZ de 220 aa à l'extrémité N- terminale, qui est impliqué dans des changements de localisation subcellulaire de cette isoforme. Pour la iNOS, la liaison à la CaM est de très haute affinité et quasi irréversible, à tel point que la calmoduline est parfois considérée comme une sous-unité de cette isoforme. En conséquence, la iNOS est active de façon permanente et capable de générer du NO sur des périodes longues (plusieurs jours). La structure du domaine de fixation à la CaM est modifiée dans les NOS constitutives, ce qui rend leur activité dépendante des flux calciques, et permet seulement une flambée transitoire de la production de NO40. Certaines modifications post-traductionnelles comme la phosphorylation de la eNOS permettent toutefois de prolonger leur activité41. Pour 31 Chapitre I : Introduction bibliographique les NOS constitutives, il a aussi été montré que la délétion de la boucle d'auto-inhibition (AI) présente dans le domaine FMN et la délétion de l'extension CT résultaient en une liaison à la CaM pour de plus faibles concentrations en Ca2 , et en une hausse de l'activité du domaine réductase42, 43. Figure I-6 : Organisation des domaines structuraux des isoformes de NOS humaines26. La position des différents domaines de liaison au substrat et aux cofacteurs est indiquée, tout comme la localisation de l'atome de zinc, du résidu cystéine qui est coordonné à l'hème, du site de fixation de la CaM, de la boucle d'autoinhibition (eNOS et nNOS), des sites de myristoylation (Myr) et palmitoylation (Palm) (eNOS) et de l'interface du dimère. La technique de cristallisation aux rayons X a permis la détermination de structures à haute résolution des NO synthases, souvent par fragments et avec différents ligands (cf. Figure I-7)44. Les polypeptides AI et CT insérés augmentent la zone de contact entre les domaines FAD et FMN, et influencent la dépendance à la CaM de l'enzyme. La comparaison des structures des différentes isoformes de NOS révèle une organisation générale et une forme moléculaire très proches, avec une orientation relative des cofacteurs et une stéréochimie au sein du centre catalytique similaires45. L'association des NOS en dimères actifs fait intervenir une large interface dans le domaine oxygénase. La BH4 se lie au niveau de cette interface et aide à stabiliser la structure quaternaire de l'enzyme. En plus de la BH4, l'hème et la L-Arginine favorisent la dimérisation et/ou stabilisent les trois isoformes de NOS à l'état de dimère actif46. Les NOS humaines contiennent aussi un cluster zinc-tétrathiolate formé par un cation Zn2 qui établit une liaison de coordination avec deux motifs CysXXXXCys (un sur chaque monomère). Le zinc se situe à l'interface du dimère de NOS o il joue un rôle majeur dans sa stabilisation47, 48. 32 Chapitre I : Introduction bibliographique Figure I-7 : Visualisation 3D d'un dimère de domaines oxygénase de iNOS murine à l'aide de l'application web NGL Viewer. La structure a été résolue par cristallographie aux rayons X avec une résolution de 2, 6 (Identifiant Protein Data Bank 1NOD)44. Représentation en rubans des structures secondaires (en rose les hélices , en jaune les feuillets ) du dimère avec une vue de face (A) et du dessus (B). En (C) et (D) les mêmes représentations avec une couleur différente (rouge ou bleue) pour chaque monomère, et avec les différents ligands du site actif (L-arginine, BH4, hème). La représentation de la surface occupée par les atomes révèle seulement deux poches exposées au solvant (pour chaque monomère), qui permettent d'apercevoir la BH4 (E) et l'hème (F). L'axe de symétrie C2 est représenté en vert. Les acides aminés du domaine oxygénase qui entrent en interaction avec l'arginine (G) et l'hème (H) au niveau du site actif sont également visualisables. 33 Chapitre I : Introduction bibliographique 1. 2. 3 Mécanisme de synthèse de NO par les NO synthases Les NO synthases convertissent la L-arginine en L-citrulline et en NO par l'intermédiaire de deux réactions de mono-oxydation successives (cf. Figure I-8). Elles utilisent le NADPH et O2 comme cosubstrats. Le mécanisme catalytique est décomposé comme suit : Figure I-8 : Réaction catalysée par les NOS et aboutissant à la libération de NO49. o Transfert des électrons au sein du domaine réductase : L'apport en électrons servant à la synthèse de NO débute avec le transfert d'un ion hydrure H- provenant du NADPH directement sur le N5 du FAD au niveau du domaine réductase. L'hydroquinone FAD nouvellement formée doit ensuite transférer un électron au FMN, qui se comporte comme une navette assurant le passage d'un électron à la fois vers l'hème du domaine oxygénase. Les cofacteurs FAD et FMN sont positionnés à une distance de seulement 5 l'un par rapport à l'autre, dans une configuration optimale facilitant le transfert électronique de FAD à FMN. Pour que le transfert se poursuive jusqu'à l'hème, il est nécessaire que le FMN se rapproche au moyen d'une transition de conformation de l'enzyme qui s'effectue autour de la charnière du domaine réductase. Le rôle des flavines est par conséquent essentiel car il permet au NADPH, un donneur de deux électrons, de transférer des électrons sur l'hème, qui est un accepteur d'un électron, en formant des intermédiaires radicalaires semiquinones stables. A noter que le cheminement des électrons emprunte les deux domaines flaviniques d'une sous-unité avant de se poursuivre jusqu'au domaine héminique de la sous-unité adjacente (cf. Figure I-9)50. Ceci a pour conséquence directe que la forme monomérique des NOS est inactive. 34 Chapitre I : Introduction bibliographique Figure I-9 : Cheminement des électrons au sein d'un dimère de NOS50. Les électrons fournis par le NADPH sont transférés sur les flavines FAD et FMN du domaine réductase puis sur l'hème du domaine oxygénase de la sous-unité adjacente. Rôle de la liaison à la calmoduline (CaM) : o La liaison de CaM s'effectue via ses motifs EF hands sur la séquence de reconnaissance des NOS dans une orientation antiparallèle. Cette liaison est indispensable au transfert électronique entre le domaine réductase et le domaine oxygénase51. Elle est semblable à un commutateur électrique qui déclencherait le transfert en favorisant le changement conformationnel des NOS. Elle accélère également la réduction des flavines par le NADPH. o Synthèse de NO au sein du domaine oxygénase : Le substrat, la L-Arginine, est converti en NO et L-Citrulline en présence de O2 au niveau du domaine oxygénase des NOS via deux réactions de mono-oxydation consécutives. Le cycle catalytique a été résolu en grande partie et ressemble à celui des cytochromes P450 (cf. Figure I-10). La première étape requiert le transport de deux électrons du domaine réductase vers l'hème, o l'activation de l'oxygène a lieu26. C'est une réaction de mono-oxydation standard telle qu'elle se produit avec les cytochromes P450, qui conduit à la formation de N-hydroxy- L-arginine. Elle débute par la réduction du Fe3 de l'hème en Fe2 grâce à l'électron transféré par FMNH2. Puis l'oxygène se lie et forme un complexe oxy-ferreux [Fe2 O2], qui est 35 Chapitre I : Introduction bibliographique équivalent à un complexe superoxyde-ferrique [Fe3 O2 -]. La BH4 cède ensuite un électron au complexe qui va subir une première protonation et devenir [Fe3 OOH-]. La protonation de l'hydroperoxyde induit la rupture de la liaison O-O, générant un radical cationique lié à la protéine [Fe4 P ]. Ce dernier oxyde rapidement la L-arginine en N-hydroxy-L-arginine (NOHA) et permet un retour de l'hème à l'état ferrique. Un second électron provenant de FMNH- permet finalement de régénérer la BH4 réduite. Figure I-10 : Mécanisme catalytique détaillé de la synthèse de NO (voir le texte pour explications)52. 36 Chapitre I : Introduction bibliographique La seconde étape d'oxydation ne consomme qu'un électron issu du domaine réductase et accomplit une réaction d'activation du dioxygène de façon similaire : un électron transféré par FMNH2 permet d'abord la réduction de l'hème. La liaison d'O2 provoque la formation du complexe [Fe2 O2] [Fe3 O2 -]. Puis la BH4 réduit le complexe qui ne subit alors qu'une seule protonation pour devenir un complexe hydroperoxyde [Fe3 OOH-]. C'est ce complexe qui converti la NOHA en L-citrulline par oxydation, formant dans le même temps un complexe ferreux-nitrosyl [Fe2 NO]. Enfin, la libération de NO du complexe ferreux est déclenchée par la réduction du radical BH4 et la restauration d'un hème ferrique. La BH4 intervient donc activement dans le mécanisme catalytique, en changeant d'état redox. Elle joue tour à tour la fonction de donneur (activation de l'oxygène) puis d'accepteur d'électron (recapture de l'électron provenant du complexe ferreux-nitrosyl afin de déclencher la libération de NO)52. Lorsque la disponibilité en BH4 est réduite, il y a un découplage de l'enzyme et une production d'anions superoxyde O2 -. 1. 2. 4 Disponibilité en substrats et activité NO Synthase L'activité enzymatique des NOS est finement régulée, en fonction notamment de la disponibilité en cofacteurs et en substrats. Lorsque les cofacteurs (NADPH, BH4, FAD, FMN) sont présents en quantité suffisante, l'activité NOS est dépendante de la disponibilité en arginine et en oxygène. Il existe un paradoxe appelé le paradoxe de l'arginine, selon lequel malgré la présence d'un pool d'arginine cellulaire suffisant pour la synthèse de NO, la disponibilité en arginine reste un facteur limitant pour l'activité NOS. L'arginase 1, enzyme exprimée de façon caractéristique par les macrophages et cellules dendritiques exposés à l'IL-4, l'IL-13 ou le TGF- , clive l'arginine pour former de l'ornithine et de l'urée, menant à une déplétion du pool d'arginine. Trois processus régulent principalement la disponibilité en arginine53, 54 : 1) L'activité arginase, qui catalyse la première étape de la synthèse des polyamines et entre en compétition avec les NOS en consommant une grande proportion du pool d'arginine 2) L'absorption de l'arginine par les cellules via le transporteur d'acides aminés cationiques et 3) La formation de diméthylarginine asymétrique (ADMA) qui se comporte comme un inhibiteur endogène des NOS. La réduction de la disponibilité en arginine crée un découplage de la NOS et la convertit en un générateur d'anions superoxyde55. 37 Chapitre I : Introduction bibliographique Les changements de concentration en O2 ont aussi une profonde influence sur l'activité des NOS. La dépendance à l'oxygène est un des facteurs qui différencie le plus les isoformes de NOS. Ainsi, le Km pour O2 (concentration en O2 pour laquelle l'activité NOS atteint la moitié de sa valeur maximale) diffère considérablement d'une isoforme à l'autre : 23 M pour la eNOS, 135 M pour la iNOS, et 350 M pour la nNOS56. Lorsque la concentration en O2 est inférieure ou proche du Km, l'activité enzymatique devient très dépendante de cette concentration. Ainsi, la nNOS est l'isoforme la plus affectée par les fluctuations de concentration en O2. A l'opposé, la eNOS atteint son activité maximale pour de faibles concentrations en O2, ce qui lui permet d'exercer des fonctions critiques dans le système cardiovasculaire. La localisation subcellulaire des NOS joue également un rôle important, car la concentration en O2 est 10 fois supérieure au niveau membranaire, du fait de la solubilité très supérieure des gaz en milieu hydrophobe (NO, O2, CO). L'activité eNOS est par exemple multipliée par 10 après sa translocation à la membrane57. 1. 3 NO est une molécule de signalisation cellulaire 1. 3. 1 Sélectivité des cibles de NO : effets de seuils et diversité de réponses A la complexité de la chimie de NO s'ajoute la diversité de réponses de ses cibles biologiques, qui dépend souvent de la concentration et de la durée d'exposition à NO. De nombreuses démonstrations ont été faites d'une activation spécifique de certaines protéines ou de cascades de transduction du signal en réponse à des seuils distincts de concentration en NO (cf. Figure I-11). La sGC, une des plus importantes cibles biologiques de NO, est activée par de très faibles concentrations en NO (0, 5-5 nM). Les protéines de la famille des MAPK (Mitogen-activated protein kinases) ERK1/2 (Extracellular signal-regulated kinase) et la sérine/thréonine kinase Akt (Protein kinase B) sont phosphorylées en réponse à des concentrations légèrement supérieures en NO (respectivement 10-30 nM et 30-60 nM). Le facteur de transcription HIF-1 (Hypoxia-inducible factor-1) est stabilisé à des concentrations intermédiaires (100-300 nM). La protéine suppresseur de tumeur p53 est quant à elle activée par phosphorylation uniquement en cas de fortes concentrations en NO (>400 nM)58. Ainsi, à des concentrations faibles et modérées, NO favorise la croissance cellulaire et protège les cellules de l'apoptose. Lorsque cette concentration atteint une valeur élevée, ce sont 38 Chapitre I : Introduction bibliographique au contraire les effets proapoptiques et entranant l'arrêt du cycle cellulaire et l'entrée en sénescence qui sont privilégiés. NO est un exemple typique de molécule à deux visages : pour une même fonction biologique, elle peut tout aussi bien présenter des effets bénéfiques et des effets délétères, en fonction du contexte cellulaire dans lequel elle est produite et des conditions de l'étude. Dans le développement des cancers par exemple (et nous y reviendrons dans cette synthèse bibliographique), de nombreuses études rapportent des effets apparemment opposés. NO présente dans certains cas des effets proapoptotiques, antioxydants et cytotoxiques qui entranent une réduction du volume des tumeurs. Parfois, au contraire, il est un indicateur de mauvais pronostic en favorisant l'angiogenèse, en stimulant la migration et l'invasion, et en provoquant des lésions de l'ADN. Figure I-11 : Représentation schématique de la sensibilité de plusieurs cibles de NO à des valeurs seuil de concentrations générées par les NOS58. Pour expliquer une telle diversité de réponses, il faut comprendre qu'en plus de la quantité de NO qui est produite, l'aspect temporel de l'exposition des cibles est également un facteur déterminant. Les trois isoformes de NOS diffèrent dans leur capacité de production de NO, à la fois en termes de quantités mais aussi de durée. Alors que les NOS constitutives (eNOS et nNOS) produisent des quantités modérées de NO de façon très transitoire, la iNOS génère de 39 Chapitre I : Introduction bibliographique fortes concentrations sur des durées prolongées. Ces propriétés sont très importantes car certaines protéines sont activées (ou inhibées) immédiatement au contact de NO (sGC, HIF-1 et ERK par exemple) tandis que d'autres nécessitent une exposition prolongée à NO (p53). La durée de la réponse peut également beaucoup varier d'une cible à l'autre : certaines protéines vont être activées (ou inhibées) de façon très transitoire par NO (sGC, et HIF-1), et donc revenir rapidement à leur état d'origine lorsque la production de NO est interrompue. D'autres resteront activées (ou inhibées) sur une période plus longue (ERK et p53)59. 1. 3. 2 Les S-nitrosylations : un nouveau paradigme en signalisation 1. 3. 2. 1 La S-nitrosylation : un mécanisme sélectif et réversible ? Au cours de ces dernières années, la S-nitrosylation des protéines est peu à peu apparue comme une modification post-traductionnelle jouant un rôle majeur en signalisation cellulaire20. Dans de nombreux cas, la nitrosylation des thiols se fait sur des cystéines oxydées et induit la formation de ponts disulfure60. Le terme S-nitrosylation est souvent employé dans la littérature pour faire une analogie avec la phosphorylation. D'un point de vue mécanistique, il peut tout aussi bien s'agir d'une transnitrosation (typiquement par N2O3 ou par transfert de la S-nitrosylation d'un nitrosothiol vers un autre thiol) que d'une nitrosylation oxydative ou d'une nitrosation par un complexe métallique nitrosylé (cf. Figure I-12). Pour que l'analogie entre la S-nitrosylation et les systèmes de signalisation par phosphorylation soit valable, il faut s'interroger sur la spécificité de cette modification, ainsi que sur sa réversibilité. La spécificité des S-nitrosylations dépend de la réactivité chimique entre l'agent nitrosylant et la cible. Cette réactivité est modulée par plusieurs facteurs : la réactivité du résidu cible (état d'oxydation des cystéines, hydrophobicité), les concentrations relatives et la localisation subcellulaire de l'agent nitrosylant et de la protéine cible. La concentration en agents de nitrosation (N2O3) provenant des voies d'oxydation de NO décroit très rapidement en s'éloignant de la source de production de NO car ils sont décomposés en produits stables (l'hydrolyse de N2O3 forme par exemple du nitrite). L'interaction directe ou la colocalisation de protéines avec les NOS permettent d'apporter de la sélectivité à la S- nitrosylation. L'arginase 1 et la COX-2 (cyclooxygenase-2) sont ainsi S-nitrosylées après avoir formé un complexe avec la iNOS61. Ces complexes peuvent aussi servir d'échafaudage dans 40 Chapitre I : Introduction bibliographique une interaction indirecte avec une autre protéine : Le complexe iNOS/COX-2 permet par exemple la S-nitrosylation de la cPLA2 (cytosolic phospholipase A2, qui catalyse le clivage de l'acide arachidonique des phospholipides membranaires, et permet la biosynthèse de la prostaglandine E2)62. La compartimentalisation des NOS peut également apporter de la spécificité à la S-nitrosylation. La eNOS est la seule isoforme qui peut être adressée à des sous- compartiments membranaires (les cavéoles et l'appareil de Golgi) par myristoylation et palmitoylation. Ceci a pu être associé à une hausse généralisée de la S-nitrosylation de protéines dans ces compartiments63. Les NOS peuvent aussi être S-nitrosylées au niveau de leur cluster Zn2 -tétrathiolate64. Une réaction de transnitrosation pourrait avoir lieu au voisinage proche de ces NOS, même si ce mécanisme est encore controversé. Le glutathion (GSH) est la molécule portant un thiol la plus présente dans le cytoplasme. La forme S-nitrosylée du glutathion (GSNO) peut elle aussi transférer son groupement nitrosothiol par transnitrosation. Certaines interactions protéine-protéine peuvent également guider les réactions de transnitrosation dans une direction, notamment lorsque la S-nitrosylation résulte en un changement de conformation rendant le nitrosothiol inaccessible ou en un changement de localisation subcellulaire. De cette façon, la S-nitrosylation en C152 de la GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) induit sa liaison à Siah1 (une E3 ubiquitine ligase) qui comporte une séquence de localisation nucléaire conduisant à une translocation du complexe GAPDH/Siah1 dans le noyau, o la GAPDH transnitrosyle Sirt1 (Silent information regulator 1), HDAC2 (Histone deacetylase 2) et DNA-PK (DNA-dependent protein kinase)65. Jusqu'à très récemment, toutes les études tendaient à montrer que, contrairement aux phosphorylations, la spécificité des S-nitrosylations ne reposait pas sur la reconnaissance d'une cible par une enzyme. Cette conception fut toutefois bouleversée par la découverte d'un complexe iNOS/S100A8/A9, formé en réponse à une stimulation par l'IFN- et les LDLox, qui possède une activité S-nitrosylase et dirige la S-nitrosylation de la GAPDH et d'autres protéines cibles au niveau d'un motif protéique consensus (I/LXCXXD/E) dans des cellules myéloïdes humaines66. 41 Chapitre I : Introduction bibliographique Figure I-12 : Présentation des mécanismes de formation et de dégradation des nitrosothiols protéiques67. L'activité NOS permet une synthèse de NO et une auto-S-nitrosylation. La S-nitrosylation du glutathion (nitrosoglutathion GSNO) ou de protéines peut être réalisée soit par des voies d'oxydation de NO (N2O3), soit par la voie catalysée par un métal de transition, ou soit par une nitrosylation oxydative (recombinaison d'un radical thiyl). Une fois formés, le GSNO et les protéines portant un S- nitrosothiol peuvent transférer la S-nitrosylation à d'autres protéines grâce à une réaction de transnitrosation. La dégradation du nitrosothiol de GSNO est effectuée par des enzymes dépendantes du NAD(P)H, la GSNO réductase (GSNOR) ou la carbonyl réductase 1 (CBR1). La thioredoxine (Trx) peut dénitrosyler les protéines, un processus qui devient catalytique grâce à l'activité de la thioredoxine réductase (TrxR). 42 Chapitre I : Introduction bibliographique Si la S-nitrosylation est spécifique, elle est aussi réversible. Deux enzymes permettent la réduction du GSNO : la GSNOR (GSNO reductase) et la CBR1 (Carbonyl reductase 1), qui sont respectivement dépendantes du NADH et du NADPH67. Seule la Trx (Thioredoxin), elle aussi dépendante du NADPH, a jusqu'à présent été impliquée dans la dénitrosylation des protéines68. Le système Trx est mieux connu pour sa fonction de réduction des ponts disulfure qui joue un rôle clé dans l'homéostasie redox des cellules. La réduction par Trx des peroxyrédoxines (Prx) oxydées permet de maintenir leur activité de détoxification des peroxydes (H2O2, ONOO-). Figure I-13 : Mécanismes alternatifs de dénitrosylation des protéines par la thiorédoxine69. Deux mécanismes réactionnels de réduction d'un groupement SNO protéique sont proposés et impliquent soit : (1) la formation d'un intermédiaire disulfure intermoléculaire (flèches rouges) ou (2) la S-nitrosylation transitoire de Trx (flèches bleues). La réduction des ponts S-S par la Trx fait intervenir un motif comportant une cystéine catalytique et une cystéine de résolution (Cys-X-X-Cys). Ces mêmes cystéines sont impliquées dans la réduction des S-nitrosothiols protéiques par la Trx. Deux mécanismes réactionnels sont actuellement envisagés selon que l'attaque nucléophile de Trx sur le groupement SNO est dirigée contre l'atome de soufre ou d'azote (cf. Figure I-13)69. Le mécanisme impliquant la formation d'un intermédiaire disulfure mixte est supporté par une étude très récente : dans cette 43 Chapitre I : Introduction bibliographique dernière, une Trx mutée au niveau de sa cystéine de résolution a été utilisée pour piéger un très grand nombre de protéines S-nitrosylées dans des monocytes, des macrophages et dans des cellules de carcinome pulmonaire humaines70, 71. Il faut remarquer que la forme réduite de la Trx est régénérée par la TrxR (Thioredoxin reductase), ce qui provoque sa réactivation. 1. 3. 2. 2 Rôles des S-nitrosylations en signalisation cellulaire Il est clairement établi que les S-nitrosylations peuvent modifier la fonction de nombreuses protéines. A l'ère de la protéomique, différentes techniques ont permis d'établir un profil global des protéines S-nitrosylées, le SNO-protéome. L'avènement de la technique du biotin-switch et le développement de techniques dérivées ont largement facilité la détection et l'identification à haut débit de protéines individuelles portant cette modification72. Environ un millier de protéines nitrosylables ont été identifiées : elles interviennent dans la signalisation de récepteurs, la transduction du signal, la contraction musculaire, l'apoptose, l'homéostasie redox, la régulation génique et même dans la synthèse de NO (cf. Tableau I-1)73. Tableau I-1 : Exemples de protéines S-nitrosylées et de fonctions cellulaires qui leurs sont associées73. 44 Chapitre I : Introduction bibliographique L'impact des S-nitrosylations sur la fonction des protéines ciblées a parfois été étudié de manière plus approfondie. La S-nitrosylation inhibe par exemple la liaison à l'ADN de la sous- unité p50 de NF-B (Nuclear factor- light chain enhancer of activated B cells)74. La stabilisation et l'activation de HIF-1 par NO ont lieu même en normoxie à la fois grâce à une inhibition des prolyl hydroxylases (l'hydroxylation de résidus proline et arginine de HIF-1 entrane son ubiquitination) mais aussi grâce à la S-nitrosylation de HIF-1 qui favorise son interaction avec les coactivateurs transcriptionnels CBP (CREB-binding protein) et p30075, 76. La S-nitrosylation d'un groupement thiolate intervenant dans la liaison des ions Zn2 perturbe aussi la structure des doigts de zinc, des motifs couramment impliqués dans la liaison à l'ADN pour certains facteurs de transcription tels que Sp1 (Specificity protein 1) et EGR-1 (Early growth response protein-1)77. Les métalloprotéases matricielles (MMP) sont sécrétées sous forme inactive avec un propeptide comportant un résidu cystéine conservé dans cette famille de protéases. Cette cystéine est impliquée dans une liaison de coordination avec un atome de zinc (Zn2 ) et trois histidines du domaine catalytique, formant un complexe intramoléculaire appelé interrupteur cystéine qui maintient les MMP sous forme inactive ( cysteine switch ). L'activation est généralement accomplie après le clivage du propeptide. Toutefois, il a été découvert que l'activation de MMP9 peut se produire sans que ce clivage ait lieu, par l'intermédiaire d'une S-nitrosylation de l'interrupteur cystéine78. Au niveau du réticulum sarcoplasmique du muscle cardiaque et squelettique, la S-nitrosylation régule également l'activité des canaux calciques RyR (Ryanodine receptor) et donc la sortie d'ions Ca2 dans le sarcoplasme79. Les S-nitrosylations ont donc une influence sur la globalité des processus de signalisation cellulaire. Elles ont aussi un impact sur des protéines régulant la plupart des autres modifications post-traductionnelles : phosphorylation, acétylation, sumoylation, palmitoylation, ubiquitination (voir la revue de Douglas T. Hess et Jonathan S. Stamler pour plus de détails à ce sujet)80. 1. 3. 3 Quel est le destin des cellules exposées à de fortes concentrations en NO ? NO est une molécule aux multiples facettes : A de faibles concentrations, elle agit comme une molécule de signalisation régulant de très nombreux processus physiologiques. A de fortes concentrations essentiellement générées par une activité iNOS prolongée, elle favorise l'apparition de mutations et altère le fonctionnement de nombreuses protéines. Le destin des cellules confrontées à de fortes concentrations de NO va dépendre du contexte cellulaire et de 45 Chapitre I : Introduction bibliographique la sévérité des dommages, qui soit pourront être réparés, soit aboutiront à la mort cellulaire apoptotique voir nécrotique en cas de déplétion en ATP (Adenosine triphosphate). La plupart des dommages macromoléculaires sont causés par des espèces réactives formées à partir de dérivés de NO (N2O3, ONOO-, NO2). Au niveau de l'ADN, NO et le peroxynitrite provoquent respectivement des désaminations et des oxydations de bases mutagènes81. L'analyse des mutations induites par une exposition prolongée à NO révèle une fréquence élevée de substitutions de bases, mais aussi la présence de cassures double brin, de délétions et d'insertions. Les modifications post-traductionnelles (S-nitrosylation, nitration) de protéines induites par NO peuvent également inactiver des enzymes cruciales dans le métabolisme (ex : aconitase) ou la détoxification (ex : Mn-SOD), et inhiber la réparation de l'ADN (ex : Ribonucléotide réductase). L'inhibition de la respiration cellulaire par NO fut l'un des premiers mécanismes de cytotoxicité dépendante de NO à être mis en évidence82. NO module en effet le fonctionnement de la mitochondrie en interagissant avec différents composants de la chane respiratoire mitochondriale. En concentration subnanomolaire, NO induit une inhibition réversible de la respiration grâce à une S-nitrosylation du complexe IV (cytochrome c oxydase) au niveau du fer ferreux (Fe2 ) héminique ou du cuivre cuprique (Cu2 ) de son centre bimétallique56. Des concentrations en NO plus fortes inhibent la chane respiratoire au niveau du complexe I (NADH déshydrogénase), cette fois de manière irréversible via l'oxydation ou la S-nitrosylation de groupements thiols spécifiques83. De très nombreux travaux ont révélé une modulation par NO de la mort cellulaire par apoptose84. NO induit l'apoptose dans des types cellulaires variés dont les macrophages, les neurones, les cellules -pancréatiques et les hépatocytes. La voie mitochondriale semble être la voie apoptotique induite le plus fréquemment par NO. Elle se caractérise par une accumulation de la protéine suppresseur de tumeur p53, des changements d'expression des membres pro- et antiapoptotiques de la famille Bcl-2 (B cell lymphoma-2) et la formation d'un pore de transition de perméabilité mitochondriale. La perméabilisation de la membrane mitochondriale et la chute subséquente du potentiel de membrane mitochondrial entranent un relargage cytoplasmique de facteurs proapoptotiques (cf. Figure I-14). Le cytochrome c est l'un de ces facteurs qui, en s'associant avec la procaspase-9 et APAF-1 (Apoptotic peptidase activating factor-1), constitue l'apoptosome et active des caspases effectrices comme la caspase-385. Dans certains types cellulaires comme les cellules de neuroblastome et les cellules leucémiques HL-60, il a toutefois été rapporté une activation précoce des caspases initiatrices -2 ou -8, suggérant que la voie 46 Chapitre I : Introduction bibliographique extrinsèque de l'apoptose peut également être déclenchée par NO. Cette seconde voie fait appel à une hausse de l'expression du récepteur à domaine de mort Fas/CD95 dépendante de p5386, 87. Dans nombre de ces situations, la protéine p53 apparait comme un médiateur critique de l'apoptose induite par NO. Ceci est très bien illustré par les découvertes réalisées sur les cellules WTK-1, qui sont transformées par infection avec le virus d'Epstein-Barr. Cette lignée porte une mutation de perte de fonction de la protéine p53 à l'origine d'une forte instabilité génomique. Le traitement de ces cellules avec de fortes doses de NO, bien qu'induisant des dommages très conséquents à l'ADN, résulte en une abrogation de la réponse apoptotique88. Figure I-14 : Mécanismes moléculaires de mort cellulaire induite par NO5. La génération simultanée - (ex : fuite d'éléctrons de la chaine respiratoire de flux de NO (par les NO synthases) et d'anions O2 mitochondriale, NADPH oxydase, xanthine oxydase, découplage de NOS) favorise considérablement la formation de peroxynitrite (ONOO-). La cytotoxicité du peroxynitrite provient d'une panoplie d'effets variés tels que la peroxydation lipidique, l'oxydation et la nitration de protéines, les dommages oxydatifs de l'ADN, l'activation de métalloprotéases matricielles ou l'inactivation d'une série d'enzymes clé dans le fonctionnement de la cellule. Les enzymes mitochondriales sont particulièrement vulnérables aux attaques du peroxynitrite, ce qui conduit à une réduction de la formation d'ATP et à l'ouverture d'un pore de transition de perméabilité mitochondriale (PTP) qui dissipe le potentiel de membrane mitochondrial. Ces évènements aboutissent à une interruption de la chaine de transport d'électrons, à l'arrêt de la synthèse d'ATP, au gonflement des mitochondries et à la perméabilisation de leur membrane externe, ce qui provoque un efflux de facteurs proapoptotiques comme le cytochrome c et AIF. Ces derniers activent en aval des effecteurs comme les caspases, qui conduisent à la fragmentation nucléaire. Le peroxynitrite inflige des dommages supplémentaires au niveau de l'ADN qui provoquent l'activation de la PARP. Les dommages modérés de l'ADN activent la machinerie de réparation de l'ADN. Les dommages excessifs provenant d'un stress nitrant et d'un stress oxydatif entrainent la mort de la cellule par apoptose ou par nécrose en cas d'ouverture étendue du PTP ou de suractivation de la PARP (consommation massive de NAD et effondrement du niveau d'ATP). 47 Chapitre I : Introduction bibliographique Il existe également des situations dans lesquelles NO exerce au contraire un effet protecteur contre l'apoptose. Parmi les mécanismes biochimiques sous-jacents, la voie NO/GMPc intervient dans l'inhibition de l'apoptose induite par des ligands comme le TNF- (Tumor necrosis factor-alpha) et Fas-L, lors d'un stress oxydatif ou d'une privation en facteurs de croissance8992. La S-nitrosylation de protéines comme les caspases effectrices -3 et initiatrices -8 et -9 ou celle des facteurs de transcription AP-1 (Activator protein 1) et NF-B interfère aussi avec le programme d'exécution de l'apoptose. Enfin, NO agit dans certains cas comme un piégeur de ROS, limitant leurs effets cytotoxiques dans des cellules qui y sont particulièrement exposées comme par exemple les macrophages93. Les niveaux toxiques de NO produits par les cellules inflammatoires peuvent infliger des dommages cellulaires et macromoléculaires aux cellules situées dans leur voisinage, dont le destin dépend de la gravité des dommages et de leur capacité de réparation de l'ADN. Les cellules présentant des dommages mineurs à l'ADN peuvent les réparer de façon complète sans autre conséquence, tandis que celles touchées par des dommages sévères meurent par apoptose ou par nécrose. Dans les situations o les lésions de l'ADN sont trop importantes pour être réparées mais o la mort cellulaire n'est pas déclenchée, ces cellules peuvent acquérir de nouvelles mutations qui vont initier et renforcer la carcinogenèse. Ainsi, l'apoptose peut être considérée comme une réponse cellulaire protectrice lorsque les dommages causés par NO sont trop conséquents. 1. 3. 4 Les défenses cellulaires en réponse aux dommages induits par NO 1. 3. 4. 1 Aperçu général des mécanismes de défense antioxydante Les mécanismes de défense permettant aux cellules de se protéger des dommages induits par un stress oxydant et nitrant sont cruciaux pour la survie, la différenciation et la croissance cellulaire94. Au moins trois mécanismes de défense ont été communément adoptés par les cellules pour se protéger des effets cytotoxiques de NO. Le premier est la mise en place d'un environnement réducteur et protecteur composé de molécules de faible poids moléculaire et comportant des thiols avec un groupement sulfhydryle actif d'un point de vue redox (ex : GSH, TRX). A cela s'ajoute l'expression d'enzymes antioxydantes (ex : SOD, catalase, GPX). Les superoxyde dismutases (SOD) ont un rôle fondamental dans la limitation des effets toxiques de NO. Elles accélèrent en effet la réaction de dismutation des anions O2 - en O2 et H2O2, dont la 48 Chapitre I : Introduction bibliographique détoxification est ensuite prise en charge par la GPX (Glutathione peroxidase) ou la catalase. A noter que deux des trois types de SOD exprimées par les cellules eucaryotes sont impliquées dans la défense contre la cytotoxicité de NO : une SOD constitutivement exprimée dans le cytosol (Cu, Zn-SOD) et une SOD mitochondriale dont l'expression est largement modulée par divers stimuli (Mn-SOD, qui est induite par NO). Enfin, la réponse antioxydante reposant sur le système Nrf2 (NF-E2-related nuclear factor 2) Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1) constitue un troisième mécanisme critique de défense contre la cytotoxicité de NO. 1. 3. 4. 2 L'activation de Nrf2 est une voie centrale de détoxification des xénobiotiques et des espèces oxydantes Le système Keap1-Nrf2 est au centre d'une voie majeure de détoxification des xénobiotiques et de réponse aux stress oxydant et électrophile95. A l'état basal, la protéine Nrf2 réside principalement dans le cytoplasme o elle est liée à Keap1, elle-même ancrée au cytosquelette d'actine et qui réprime son activité96. L'exposition des cellules à des espèces oxydantes ou électrophiles libère Nrf2 de Keap1, conduisant à la translocation nucléaire de Nrf2 et à l'activation coordonnée de gènes régulés par des ARE (Antioxidant response elements). Nrf2 est apparenté au facteur de transcription NF-E2 (Nuclear factor-erythroid 2) et appartient à la famille Cap'n'collar. Il possède un domaine bZIP (Basic region-leucine zipper) lui conférant la capacité de se lier à ces éléments de réponse. Nrf2 déclenche l'expression d'enzymes de phase II qui détoxifient les intermédiaires électrophiles générés suite à la première étape de métabolisation des xénobiotiques (assurée par les cytochromes P450)97. On compte parmi ces enzymes NQO1 (NAD(P)H quinone oxidoreductase 1) et la sous- unité Ya de la GST (Glutathione S-transferase). NQO1 est une flavoprotéine qui catalyse la réduction à deux électrons des quinones à chane courte (ex : ubiquinone, benzoquinone) en hydroquinones, ce qui évite la formation d'espèces radicalaires issues de leur réduction mono- électronique. La sous-unité Ya de la GST assure la conjugaison d'électrophiles hydrophobes ou de ROS avec le glutathion, qui sont ensuite excrétés. Nrf2 induit également une batterie de gènes antioxydants codant pour HO-1 (Heme oxygenase 1), GCL (Glutamate cysteine ligase), PRX (Peroxyredoxine) ou encore SRX (Sulfiredoxin). HO-1 catalyse l'étape limitante du catabolisme de l'hème ; GCL est responsable de la première réaction de la voie de biosynthèse du GSH ; SRX réduit le thiol du résidu cystéine catalytique des PRX lorsqu'elles sont suroxydées (les faisant passer de l'état d'acide sulfinique -SO(OH) à l'acide sulfénique -SOH, qui peut être réduit à nouveau par TRX afin de régénérer l'activité de la PRX). 49 Chapitre I : Introduction bibliographique Figure I-15 : Activation de gènes cibles de Nrf2 en réponse à des stress cellulaires95. En absence de stress cellulaire, Nrf2 est maintenue dans le cytoplasme par Keap1, qui dirige constamment sa dégradation par le protéasome. L'exposition à des molécules électrophiles ou oxydantes perturbe le complexe et le rend inactif. Les protéines Nrf2 synthétisées de novo échappent à la dégradation et subissent une translocation nucléaire. Elles s'associent ensuite aux petites Maf et se lient à des ARE pour induire l'expression d'enzymes de détoxification et de protéines antioxydantes. En plus des intermédiaires issus du métabolisme des xénobiotiques, Nrf2 est activée par beaucoup d'autres molécules au caractère électrophile telles que la tert-butylhydroquinone (t- BHQ), le sulforaphane (présent en quantité dans des légumes crucifères comme les brocolis) ou le curcumin98100. Certains métaux lourds (ex : chlorure de cadmium), des ROS (ex : O2 -, H2O2) et des RNS (ex : ONOO-) peuvent aussi être à l'origine de son activation. Les ROS et RNS étant produites dans de multiples situations physiologiques comme par exemple l'activation des neutrophiles au cours d'une inflammation ou d'une infection, et la phosphorylation oxydative, la réponse Nrf2 fait partie des mécanismes vitaux mis en place par les cellules eucaryotes pour survivre face aux stress cellulaires induits par ces molécules. Deux mécanismes de dissociation de Nrf2 et Keap1 ont jusqu'à présent été identifiés. Il y a d'une part l'activation par un stress oxydant ou électrophile de la PKC (Protein kinase C) qui phosphoryle Nrf2 au niveau du résidu C40, et d'autre part la perturbation du complexe par des inducteurs ciblant des résidus cystéine de Keap1101, 102. Keap1 est une protéine adaptatrice qui sert d'échafaudage à la formation d'un complexe avec Nrf2 et Cul3 (Culline 3), une E3 50 Chapitre I : Introduction bibliographique ubiquitine ligase responsable de la poly-ubiquitination de Nrf2 et de sa dégradation protéasomale. Keap1 est une protéine riche en cystéines, dont certaines présentent une forte réactivité avec les électrophiles et les ROS : elles sont localisées dans le domaine d'homodimérisation de Keap1 (C151), dans son domaine de liaison à la Culline 3 (C273/C288), ainsi que dans son domaine de liaison à Nrf2 (C434). Les modifications chimiques (oxydation, S-nitrosylation, etc. ) de ces thiols induisent des changements conformationnels de l'homodimère Keap1 qui inactivent le complexe Keap1-Cul3 et perturbent la liaison avec Nrf2, empêchant la poly-ubiquitination de résidus lysine de cette dernière. Les dernières découvertes supportent plutôt un modèle selon lequel Nrf2 ne se dissocie pas complètement du complexe Cul3-Keap1, rendant ce dernier inactif103. Les protéines Nrf2 nouvellement synthétisées échappent ainsi à la dégradation protéasomale et peuvent s'accumuler dans le noyau o elles activent des gènes cibles (cf. Figure I-15). Plusieurs mécanismes d'activation de Nrf2 par NO ont été rapportés. Le stress nitrosant induit par NO peut activer Nrf2 en passant par la voie PI3K-Akt, via une S-nitrosylation de la phosphatase PTEN (Phosphatase and TENsin homolog, régulateur négatif de la voie PI3K- Akt)104. De plus, le produit de nitration du GMPc (8-nitro-cGMP) possède des propriétés électrophiles lui permettant de cibler Keap1 (S-guanylation de C434)105. Enfin, la S- nitrosylation directe de Keap1 (C151) a également été observée lors d'une activation de la voie Nrf2 par NO dans les cellules PC12106. Nrf2 ne comporte pas de domaine de liaison à l'ADN. Sa fixation à l'ADN et son activité transactivatrice de gènes cibles nécessitent la présence de partenaires hétérodimériques, les petites Maf (Musculoaponeurotic fibrosarcoma : MafG, MafK et MafF), dont la spécificité de reconnaissance est réservée aux seuls ARE (cf. Figure I-16). Les facteurs de transcription de la famille des petites Maf ne contiennent pas de domaine de transactivation et présentent la caractéristique de pouvoir former des homodimères qui se comportent comme des répresseurs transcriptionnels107. 51 Chapitre I : Introduction bibliographique Figure I-16 : Séquences ADN consensus de reconnaissance des protéines de la famille CNC et des petites Maf 97. La séquence consensus des éléments de réponse antioxydants (ARE) est proche de celle du site de liaison du facteur de transcription NF-E2. Les hétérodimères composés d'un membre de la famille des Cap'n'collar à domaine bZIP et d'une petite Maf interagissent avec ces éléments. D'autres protéines à domaine bZIP comme c-Jun et c-Fos peuvent également se lier aux ARE, mais seules les petites Maf reconnaissent les séquences MARE (Maf recognition elements). 1. 4 Les fonctions physiologiques et les effets physio- pathologiques des NO synthases En raison de l'extrême diversité des cibles de NO et des effets qui leur sont associés, les différentes isoformes de NO synthases, qui sont co-exprimées dans la plupart des tissus et organes, ont pu être impliquées dans un nombre très conséquent de processus physiologiques et pathologiques. Nous nous limiterons ici dans un premier temps aux rôles de NO dans les systèmes cardiovasculaire et nerveux, o les isoformes constitutives de NOS ont une importance majeure. Nous nous concentrerons ensuite sur les fonctions de NO dans le système immunitaire, l'inflammation et la carcinogenèse, o la NO synthase inductible joue un rôle prépondérant. 1. 4. 1 NO dans le système cardiovasculaire La NOS endothéliale est l'isoforme de NOS exerçant les fonctions cardiovasculaires les plus critiques108. Elle est un médiateur essentiel de la vasodilatation de tous les types de vaisseaux sanguins. L'augmentation systémique de la pression artérielle suite à la délétion du gène codant la eNOS est d'ailleurs là pour en attester109. L'activité eNOS peut être stimulée soit par sa phosphorylation (kinases PKA ou Akt) en réponse à des facteurs de croissance, des 52 Chapitre I : Introduction bibliographique hormones ou des forces de cisaillement, soit par un influx calcique en réponse à des ligands comme l'acétylcholine ou la bradykinine110. Les différentes voies de régulation du tonus vasculaire par NO sont détaillées sur la Figure I-17. Figure I-17 : Régulation du tonus vasculaire par NO110. A : La paroi vasculaire est composée de trois couches : l'intima (tunique interne monocouche de cellules endothéliales), la média (couche de cellules musculaires lisses) et l'adventice (tunique externe terminaisons nerveuses, tissu adipeux périvasculaire, tissu conjonctif). B : I. NO stimule la sGC dans les cellules musculaires lisses pour induire la formation de GMPc. Celui-ci active la PKG qui prévient l'influx calcique provenant des canaux calciques voltage-dépendants (VDCC) et la libération de calcium par les récepteurs à l'inositol 1, 4, 5-triphosphate (IP3R). La PKG favorise aussi la recapture de calcium par le réticulum sarcoplasmique via la pompe SERCA (Sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase). La réduction de la concentration en Ca2 intracellulaire inactive la kinase MLCK et active la phosphatase MLCP, ce qui entrane la déphosphorylation des chanes légères de myosine (MLC). Les ponts actine-myosine sont alors rompus et la relaxation du muscle lisse se produit. II. En condition hypoxique, la sGC produit de l'IMPc (cyclic inosine 3', 5'-monophosphate) qui active la protéine kinase ROCK et inactive la phosphatase MLCP, ce qui résulte en une contraction du muscle lisse. IIIa. La S-nitrosylation de la pompe SERCA augmente son activité et favorise la relaxation. IIIb. La S-nitrosylation de récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) entrave la liaison de leurs ligands. IIIc. La S-nitrosylation de GRK2 (G protein-coupled receptor kinase 2) empêche la désensibilisation et l'internalisation des récepteurs -adrénergiques. IIId. La S-nitrosylation de la -arrestine 2 augmente l'internalisation du RCPG. Comme évoqué précédemment, la liaison de NO à l'hème de la sGC augmente son activité de conversion du GTP en GMPc. Ceci entrane la déphosphorylation des chanes légères de myosine et la relaxation des cellules musculaires lisses vasculaires. Lorsqu'un vaisseau se dilate pour fournir plus de sang à un muscle ou un organe, cela crée une perturbation de l'écoulement sanguin qui devient turbulent. La libération de NO par l'endothélium permet de contrebalancer la contraction myogénique qui a lieu lorsque la perturbation du flux entrane un stress lié aux forces de cisaillement exercées sur les vaisseaux sanguins. Le relâchement local des muscles lisses se propage et amortit la perturbation du flux, assurant une restauration de l'écoulement laminaire111. 53 Chapitre I : Introduction bibliographique Le développement de l'athérosclérose est une complication de la modulation du tonus vasculaire par NO qui tend à se développer dans les régions de faible turbulence. Des macrophages s'accumulent sous l'endothélium et absorbent des lipoprotéines oxydées, formant alors des lésions athérosclérotiques. Des travaux ont montré que le peroxynitrite pouvait être à l'origine de l'oxydation des lipoprotéines ensuite reconnues par des récepteurs scavenger du macrophage (MSR)112. La présence d'une activité iNOS et l'apparition de nitrotyrosines au niveau de ces lésions confortent l'hypothèse d'une implication du peroxynitrite113. La eNOS exerce des effets antiathérosclérotiques majeurs. Son activité permet de réduire l'expression de la protéine chimio-attractive MCP-1 (Monocyte chemoattractant protein-1) et d'inhiber l'adhésion leucocytaire aux vaisseaux sanguins en interférant avec la molécule d'adhésion CD11/CD18 des leucocytes114, 115. Le NO libéré dans la lumière de l'endothélium vasculaire est aussi un inhibiteur très efficace de l'adhésion et de l'agrégation des plaquettes au niveau de la paroi vasculaire116. Au-delà de la protection contre la thrombose, cela prévient la libération de facteurs de croissance dérivant des plaquettes qui stimulent la prolifération des cellules musculaires lisses et la production de molécules matricielles. De cette façon, la formation de plaques fibreuses, une étape plus tardive de l'athérogenèse, est également limitée par NO. La eNOS est aussi critique dans le remodelage vasculaire en réponse à des modifications chroniques de la circulation sanguine117. Les souris eNOS-/- sont en effet affectées par un défaut de mobilisation des cellules progénitrices endothéliales de la moelle osseuse et par un déficit de néovascularisation. C'est également le cas des patients atteints d'une cardiomyopathie ischémique, chez lesquels la biodisponibilité en NO se trouve réduite118. Les patients ayant des facteurs de risque cardiovasculaire (ex : hypertension, hypercholestérolémie, diabète sucré, obésité, tabagisme, etc. ) et ceux atteints d'une maladie cardiovasculaire présentent des dysfonctionnements de l'endothélium. Ces dysfonctionnements sont associés à une incapacité de l'endothélium à produire des quantités appropriées de NO ou à induire la vasodilatation. Les souris triples mutantes n/i/eNOS-/- ont une espérance de vie réduite avec une apparition précoce de pathologies cardiovasculaire incluant l'hypertension, l'hypertrophie cardiaque, l'insuffisance cardiaque, l'athérosclérose et l'infarctus du myocarde119. La surproduction de ROS par des enzymes comme la NADPH oxydase et la xanthine oxydase et par la chane respiratoire mitochondriale joue un rôle clé dans ces pathologies. Elle entrane un découplage de la eNOS, qui est alors convertie en enzyme génératrice d'anions superoxyde et s'arrête de produire du NO (cf. Figure I-18). 54 Chapitre I : Introduction bibliographique Figure I-18 : Mécanismes de découplage de la eNOS110. I. La forme monomérique de la eNOS produit - au lieu de NO. II. Même à l'état d'homodimère, la eNOS continue de produire des anions des anions O2 - lorsque la concentration en L-arginine chute sous le seuil de saturation de l'enzyme. III. La O2 production de NO a lieu lorsque le transfert électronique entre le NADPH et les différents cofacteurs peut s'opérer. L'oxydation de la BH4 par des ROS ou des RNS peut toutefois conduire à un découplage. L'inhibiteur compétitif de l'arginine qu'est l'ADMA et l'activité arginase, qui réduisent la disponibilité en arginine, réduisent également le taux de production de NO. Ce découplage se produit dans diverses situations. Il peut intervenir lors d'une oxydation de la BH4 ou de son site de liaison (cluster zinc-tétrathiolate) par des ROS ou par le peroxynitrite120, 121. Il se produit également en cas d'apport insuffisant en L-arginine, apparemment plus en raison d'une suractivité de l'arginase plutôt que d'une synthèse insuffisante d'arginine122, 123. Par ailleurs, les ROS augmentent l'activité de l'arginine N- méthyltransférase, enzyme qui génère l'ADMA (Asymmetrical dimethyl-L-arginine). L'ADMA entre en compétition avec l'arginine, ce qui inhibe la eNOS et peut induire son découplage124. Enfin, la S-glutathionylation de la eNOS est un dernier mécanisme dont il a été démontré récemment qu'il pouvait conduire à son découplage125. Enfin, la production excessive de NO joue un rôle crucial au cours du choc septique. Celui-ci se définit par une vasodilatation artériolaire massive, une hypotension systémique, et des lésions microvasculaires. Les symptômes du choc septique sont habituellement initiés par des endotoxines bactériennes et font appel à de multiples médiateurs circulants comme le facteur d'activation des plaquettes et des cytokines comme le thromboxane A2, l'IL-1, le TNF- et l'IFN-. Cependant, la chute de la pression artérielle a pu être attribuée à l'excès de production de NO par la iNOS au niveau de la paroi vasculaire126. 55 Chapitre I : Introduction bibliographique 1. 4. 2 NO dans le système nerveux : un neurotransmetteur atypique Si NO est considéré de longue date comme un neurotransmetteur, ses propriétés le différencient néanmoins très nettement de la plupart d'entre eux. En effet, tandis qu'un neurotransmetteur conventionnel tel que l'acétylcholine conserve son activité seulement quelques millisecondes après son relargage synaptique, celle de NO peut perdurer plusieurs secondes. Sa diffusion rapide lui permet de couvrir des régions comprenant plusieurs millions de synapses127. Ceci lui octroie la possibilité d'agir comme un messager rétrograde et d'exercer un contrôle simultané sur des cellules pré- et post-synaptiques. La NOS neuronale est l'isoforme constitutive exprimée de façon prédominante dans le cerveau. La nNOS se localise dans les épines dendritiques et le bouton synaptique des neurones. Elle existe sous forme inactive particulaire, dans des agrégats de nNOS monomérique. La chaperonne Hsp90 facilite sa transition vers une forme fonctionnelle soluble et dimérique, et son association avec d'autres protéines à domaine PDZ (ex : PSD95). De cette façon, l'activité nNOS est stimulée par l'influx calcique en réponse au glutamate grâce à son association avec les récepteurs NMDA dans la zone de densité post-synaptique. Le NO synthétisé module le potentiel de membrane, la force de la synapse et l'excitabilité du neurone en ciblant de nombreux canaux ioniques : Canaux Na , canaux Ca2 dépendant du voltage, canaux K activés par le calcium ou sensibles à l'ATP, canaux ioniques sensibles aux nucléotides cycliques (CNG) et récepteurs AMPA (cf. Figure I-19)128. Grâce à ses capacités de diffusion, NO peut agir comme messager rétrograde et stimuler l'activité sGC pré-synaptique, ce qui lui permet de contrôler la libération de neurotransmetteurs (GABA, glutamate) dans la fente synaptique (phosphorylation de la synaptophysine)129. 56 Chapitre I : Introduction bibliographique Figure I-19 : Signalisation par NO au niveau de la synapse neuronale128. La libération de glutamate dans la fente synaptique active les récepteurs NMDA et AMPA, générant un influx calcique qui stimule l'activité nNOS. NO diffuse et stimule la production de GMPc, qui régule la libération pré-synaptique de neurotransmetteurs et module l'activité de différents canaux ioniques. Les années passées ont démontré l'importance de la nNOS dans une multitude d'évènements de signalisation synaptique. La nNOS module des fonctions physiologiques comme l'apprentissage, la mémoire et la neurogenèse130. Dans le système nerveux central (SNC), la nNOS est un médiateur de la plasticité synaptique à long terme, qui module les phénomènes de potentialisation et de dépression à long terme131, 132. Ces modifications durables de l'efficacité de la transmission synaptique sont impliquées dans les processus de mémorisation et d'apprentissage. L'inhibition de la nNOS provoque l'apparition d'amnésies et une détérioration de l'apprentissage dans différents modèles animaux133, 134. Ces défauts de synthèse de NO sont également observés chez les patients souffrant de troubles de la mémoire, chez lesquels les mécanismes de potentialisation à long terme sont perturbés. Au niveau périphérique, certains muscles lisses sont innervés par des nerfs nitrergiques. Ces nerfs expriment la nNOS et libèrent du NO, qui stimule l'activité sGC de cellules effectrices réduisant le tonus des muscles lisses, dont celui des vaisseaux sanguins135. La conception initiale selon laquelle la NOS endothéliale est la seule isoforme régulant le tonus vasculaire a donc largement été remise en question à la suite de ces découvertes. Le relâchement des muscles lisses des corps caverneux du pénis, responsable de l'érection, est ainsi déclenché par l'activité nNOS de nerfs nitrergiques136. 57 Chapitre I : Introduction bibliographique Les pathologies neurodégénératives se caractérisent souvent par la mise en place durable d'une excitotoxicité induite par le glutamate. Les perturbations de l'activité nNOS et les niveaux anormalement élevés de NO qui en résultent interviennent dans une série de pathologies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Huntington, la sclérose en plaque et la sclérose latérale amyotrophique137. L'installation d'une neurodégénérescence inflammatoire participe également au développement de ces pathologies. Une explication possible est l'expression simultanée de la NOX (NADPH oxidase) dans la microglie activée et de la iNOS dans les cellules gliales, qui aboutit à la formation de peroxynitrite. Les neurones exposés au peroxynitrite meurent et libèrent du glutamate qui génère de l'excitotoxicité138. Lors d'un accident vasculaire cérébral (AVC), l'hyperactivité de la nNOS, stimulée par des influx massifs de Ca2 , contribue à une mort neuronale conséquente. Certains dérèglements du tonus gastro-intestinal (ex : reflux gastro-oesophagien) pourraient aussi provenir d'une surproduction de NO par la nNOS au niveau des nerfs nitrergiques139. 1. 4. 3 NO dans l'inflammation, l'immunité et le cancer Des travaux pionniers ont montré à la fin des années 1990 que les macrophages murins produisent de grandes quantités de NO en réponse au lipopolysaccharide (LPS) et à l'interféron- (IFN-), et que l'activité antitumorale et cytotoxique des macrophages activés dépend de la production de NO140, 141. Bien que la iNOS fût pendant longtemps considérée comme un effecteur de l'immunité innée aux fonctions antimicrobiennes et tumoricides non spécifiques, il s'est clairement avéré par la suite que NO affecte aussi fortement les réponses immunes adaptatives grâce à des fonctions de signalisation versatiles et pléiotropes. 1. 4. 3. 1 Les activités activités antimicrobienne, antivirale et antiparasitaire de la iNOS Les activités antivirale, antimicrobienne et antiparasitaire de la iNOS ont été principalement étudiées avec les macrophages, mais d'autres cellules d'origine myéloïde (ex : cellules dendritiques, neutrophiles, éosinophiles) ou non myéloïde (ex : hépatocytes) exercent également ce type de fonctions effectrices. Une catégorisation simplifiée et très largement usitée classe les macrophages en deux phénotypes distincts (M1/M2) en fonction de leur état d'activation et de leur orientation inflammatoire. Dans les années 2000, l'équipe de Mills releva 58 Chapitre I : Introduction bibliographique un paramètre métabolique qui discrimine de façon remarquable ces deux catégories de macrophages : le métabolisme de l'arginine142. Une fois différenciés, les macrophages M1 (classiquement activés) déclenchent une réponse immune Th1 et produisent de grandes quantités de NO pour éliminer les agents pathogènes ou exercer une action cytotoxique sur les cellules tumorales143. A l'opposé, les macrophages M2 (activés de façon alternative) expriment des niveaux élevés d'arginase 1, qui entrent en compétition avec la iNOS pour le pool d'arginine et préviennent la génération de NO144. La production de NO représente un véritable marqueur de l'état d'activation des macrophages en contexte pathologique. Le paradigme M1/M2 a été récemment réévalué et enrichi pour prendre en compte l'immense plasticité fonctionnelle de ces cellules qui adoptent en réalité un phénotype parmi un continuum de phénotypes possibles145, 146. NO exerce des effets directs sur les pathogènes infectieux (intra- et extracellulaires) en réagissant avec des éléments structuraux, des composants de la machinerie de réplication, les acides nucléiques, des enzymes métaboliques, ou bien encore avec des facteurs de virulence qui leur sont associés147. Ces effets directs ont été impliqués dans la défense contre des infections aigus et latentes par des bactéries pathogènes variées dont Clostridium difficile (diarrhée infectieuse) et Salmonella enterica (salmonellose)148, 149. Même s'il fut d'abord postulé que l'élimination efficace des pathogènes nécessitât une colocalisation de la iNOS avec les compartiments cellulaires infectés, il est désormais admis que les propriétés de diffusion de NO lui permettent d'exercer une activité antipathogénique même dans des cellules qui n'expriment pas la iNOS. De ce point de vue, une publication récente soutient l'idée que, lors d'une infection par un pathogène intracellulaire comme Leishmania major, c'est un mécanisme coopératif basé sur la production collective de NO par des phagocytes et l'instauration à l'échelle du tissu d'un micromilieu aux propriétés antipathogènes qui prévaut150. Le contrôle de la prolifération de pathogènes par la iNOS n'implique pas nécessairement leur mort ou leur élimination. Dans certaines situations, les effets cytostatiques médiés par NO (ex : réduction de l'activité métabolique) sont suffisants pour stopper la prolifération du pathogène et pour permettre une résolution clinique de l'infection par la réponse immunitaire. C'est par exemple ce qui se produit à la suite d'une infection par Leishmania major, un parasite protozoaire intracellulaire qui infecte les macrophages et les cellules dendritiques et est responsable de la leishmaniose cutanée151. 59 Chapitre I : Introduction bibliographique En plus de la toxicité directe associée à la formation de RNS qui est particulièrement efficace contre des pathogènes extracellulaires, l'activité iNOS comporte également des effets indirects contre les pathogènes intracellulaires. Elle induit par exemple l'apoptose des macrophages murins infectés par Mycobacterium tuberculosis (tuberculose), et la nécrose des macrophages infectés par Listeria monocytogenes (listériose), privant ainsi ces bactéries de leur cellule hôte152, 153. Dans les macrophages infectés par Salmonella typhimurium (gastroentérite, fièvre typhoïde), la production de NO induit une activation de Nrf2 et l'expression de la ferroportine 1 (Fpn1), un exporteur de fer qui prive la bactérie de fer intracellulaire, ce qui inhibe sa croissance154. Chez les Anophèles (moustique vecteur du paludisme), la nitration de protéines du parasite Plasmodium falciparum facilite sa reconnaissance par le système du complément dans l'hémolymphe155. 1. 4. 3. 2 NO comme médiateur de l'immunité adaptative En plus d'exercer des effets antipathogéniques, l'activité iNOS des cellules myéloïdes peut aussi réguler la différenciation, la fonction et la survie des autres cellules du système immunitaire (cf. Figure I-20). Dans ce contexte, un des effets les plus spectaculaires de NO est sa capacité d'inhibition de la prolifération voire d'induction de la mort des lymphocytes T. Ce fut l'une des premières fonctions immunomodulatrices attribuées à NO, qui est portée par des cellules spécialisées appelées macrophages suppresseurs, cellules suppressives myéloïdes (MDSCs Myeloid-derived suppressor cells) ou encore macrophages régulateurs156. Les fortes concentrations de NO inhibent aussi les fonctions des lymphocytes T en bloquant la cascade de signalisation en aval de la liaison de l'IL-2 à son récepteur157. A l'opposé, des quantités plus modérées de NO supportent la survie et la différenciation de sous-populations de lymphocytes T. Elles promeuvent par exemple la différenciation des lymphocytes Th1 en augmentant de façon sélective l'expression du récepteur IL-12R2158. NO régule également les lymphocytes Th9 et Th17. In vitro, la présence d'un donneur de NO (50 M) stimule la différenciation des lymphocytes T CD4 (murins et humains) en Th9 induite par un traitement avec les anticorps anti-CD3 et anti-CD28 et les cytokines IL-4 et TGF- (Transforming growth factor-)159. Les preuves d'une expression de la iNOS dans les Th9 n'ont cependant pas été obtenues. Deux groupes ont en revanche démontré l'expression de la iNOS dans les Th17 humains et murins, avec toutefois des conséquences fonctionnelles différentes. Les donneurs de NO (10-200 M) et l'activité iNOS inhibent la différenciation des 60 Chapitre I : Introduction bibliographique lymphocytes T CD4 murins en Th17 après une stimulation avec les anti-CD3 et anti-CD28 et avec l'IL-6 et le TGF-160. L'inhibition par NO de la différenciation des Th17 intervient suite à la nitration de résidus tyrosine du facteur de transcription RORt (Retinoic acid receptor- related orphan receptor t), qui régule l'expression de l'IL-17 au niveau transcriptionnel. A l'inverse, les faibles doses de NO exogène (10-25 M) délivrées par des donneurs de NO ou des MDSC favorisent très fortement le développement de lymphocytes Th17 (RORt IL-23R IL-17 ) à partir de lymphocytes Th0 humains stimulés avec les anti-CD3 et anti-CD28 en combinaison avec l'IL-1, l'IL-6, l'IL-23 et le TGF-161. L'expression de la iNOS dans ces Th17 humains s'est révélée nécessaire au maintien de leur phénotype via la signalisation dépendante du GMPc. L'activité iNOS des lymphocytes T CD4 peut aussi inhiber leur différenciation en T régulateurs (Treg) en bloquant la libération de TGF-162. Figure I-20 : Effets distinctifs de NO dans différentes sous-classes de cellules immunitaires163. NO est un acteur clé dans l'immunité et l'inflammation. Les niveaux réduits de NO (sur la gauche) favorisent la réponse Th1 et la mise en place d'un environnement immuno-régulateur, tandis que des fortes concentrations (sur la droite) de NO sont nécessaires aux fonctions effectrices des macrophages M1 et bloquent l'activation des lymphocytes T. NO exerce également des effets plus controversés sur d'autres cellules du système immunitaire comme les mastocytes, les cellules NK, les lymphocytes B et les cellules dendritiques. 61 Chapitre I : Introduction bibliographique L'impact de NO sur la maturation et les fonctions d'autres cellules du système immunitaire telles que les lymphocytes B, les mastocytes et les cellules dendritiques reste encore aujourd'hui controversé. Certains travaux récents indiquent une implication de NO dans la régulation de la réponse humorale, comme le suggère la plus forte réponse humorale TI-2 et la hausse de production du facteur BAFF (B cell activating factor) par les cellules dendritiques de souris Nos2-/- 164. Les cellules dendritiques sont les cellules présentatrices d'antigène par excellence. Elles représentent le lien entre l'immunité innée et l'immunité adaptative. Lorsque leur activation survient, classiquement en réponse à des produits microbiens, elles se mettent à produire de grandes quantités de cytokines (ex : IL-12 et IFN-) qui dirigent la différenciation des lymphocytes T naïfs en cellules effectrices. De plus, les cellules dendritiques exposées à des cytokines proinflammatoires activent rapidement d'autres cellules de l'immunité innée, comme les cellules NK (Natural killer). L'expression de la iNOS et la production de TNF- par une sous-catégorie de cellules dendritiques (Tip-DC) intervient clairement dans la défense innée contre les pathogènes intracellulaires165167. 1. 4. 3. 3 La iNOS dans les maladies inflammatoires chroniques et le cancer Bien qu'il permette une réponse immunitaire efficace dans le contrôle des maladies infectieuses, le NO produit par la iNOS peut aussi être impliqué dans des dérèglements immunitaires à l'origine de maladies inflammatoires chroniques. Les maladies auto-immunes se caractérisent par la mise en place d'un état inflammatoire chronique suite à une rupture de tolérance immunitaire. Cet évènement survient lorsque des protéines de l'hôte sont reconnues comme des antigènes du non-soi , ce qui initie une réponse immunitaire adaptative inappropriée. Les stress oxydant et nitrant qui accompagnent beaucoup de maladies inflammatoires induisent des modifications post-traductionnelles des protéines, formant potentiellement de nouveaux épitopes antigéniques168170. Ces néo-épitopes peuvent déclencher une réponse adaptative directement ou indirectement via plusieurs mécanismes (mimétisme moléculaire, exposition d'antigènes cryptiques, propagation d'épitopes, etc. )171, 172. L'accumulation de RNS et d'anticorps anti-nitrotyrosine a ainsi été observée et mise en cause chez des patients atteints de lupus érythémateux systémique, de polyarthrite rhumatoïde et d'arthrose173, 174. La surproduction de NO intervient aussi dans le développement et le maintien de maladies inflammatoires chroniques intestinales (maladie de Crohn et rectocolite hémorragique), o l'activité iNOS affecte l'intégrité de la muqueuse et entrane l'activation de neutrophiles175. 62 Chapitre I : Introduction bibliographique Les liens établis entre inflammation et cancer remontent au XIXe siècle, sur la base des observations que des tumeurs émergent fréquemment de sites d'inflammation chronique, et que des cellules inflammatoires sont présentes dans les biopsies de tumeurs176. Des études épidémiologiques ont montré que l'inflammation augmente le risque de développement de nombreux cancers dont ceux de la rate, du col de l'utérus, de l'estomac, de l'intestin, de l'œsophage, des ovaires, de la prostate et de la thyroïde177. L'inflammation représente ainsi un marqueur additionnel des cancers. Le microenvironnement tumoral abrite différentes cellules résidentes reprogrammées et des cellules recrutées par la tumeur elle-même, qui établissent un environnement cytokinique particulier178. Parmi elles, les macrophages associés aux tumeurs (TAMs) et les cellules myéloïdes suppressives (MDSCs) surexpriment la iNOS et libèrent des RNS qui provoquent la nitrosylation et la nitration de composants du TCR (T cell receptor), ce qui empêche l'activation des lymphocytes T et facilite la progression tumorale179. De plus, la nitration de la chimiokine CCL2 prévient l'infiltration des tumeurs par les lymphocytes T, qui restent ainsi confinés à la périphérie des tumeurs180. Comme cela a été mentionné précédemment, les RNS suppriment également l'immunité antitumorale dépendante des lymphocytes T en perturbant la phosphorylation de JAK3/STAT5 dans la voie de signalisation de l'IL-2181. Les macrophages et NO accomplissent tous deux des fonctions divergentes qui impactent la biologie des cancers. D'un point de vue mécanistique, il a été proposé qu'au cours des étapes précoces du développement tumoral les macrophages exploitent de fortes concentrations de NO et RNS pour tuer les clones de cellules tumorales. Aux stades plus avancés de la progression tumorale, les macrophages sont reprogrammés par la tumeur pour produire des quantités plus modérées de NO, qui favorisent au contraire sa croissance et son expansion (en agissant par exemple sur le remodelage vasculaire). La nature dichotomique des fonctions du NO produit par les macrophages est ainsi le reflet de la plasticité fonctionnelle de ces cellules en réponse à des signaux environnementaux. 63 Chapitre I : Introduction bibliographique Figure I-21 : Le Yin et le Yang de NO dans la progression tumorale182. Le niveau d'expression de la iNOS est corrélé aux différents stades de la progression tumorale dans de nombreux cancers comme les cancers du sein, du poumon, du cerveau, de l'estomac, du pancréas, le cancer colorectal et le mélanome183. Il est désormais bien établi que NO opère de façon bimodale, sur la progression tumorale comme dans beaucoup de processus biologiques182. NO peut agir sur la croissance et la survie de la tumeur, la migration, l'invasion, l'angiogenèse et le caractère métastatique, en fonction de l'importance et de la durée d'exposition aux flux de NO, de l'environnement redox et du microenvironnement tumoral (cf. Figure I-21). Les faibles concentrations de NO ( nM) favorisent la prolifération et l'angiogenèse. Les niveaux modérés de NO (100-500 nM) accroissent le caractère invasif et métastatique des tumeurs, en même temps qu'ils exercent des effets cytoprotecteurs et antiapoptotiques. A l'inverse, les fortes concentrations de NO (>500 nM) provoquent des dommages à l'ADN, un stress nitrant et oxydant, et ont des effets cytotoxiques et proapoptotiques. Tout dernièrement, il a par exemple été démontré que la S-nitrosylation de STAT3 et NF-B inhibe la prolifération et sensibilise les cellules humaines de myélome multiple à un traitement chimiothérapeutique184. En conséquence, NO peut à la fois exercer des effets pro- et antitumoraux, ce qui fournit plusieurs options d'un point de vue thérapeutique. Ainsi, sur les tumeurs dont la croissance repose sur une production de NO, des inhibiteurs de NOS peuvent être utilisés pour en empêcher la progression, ou bien des donneurs de NO peuvent permettre de hisser les niveaux de NO jusqu'à ce qu'il devienne cytotoxique185187. 64 Chapitre I : Introduction bibliographique Dans les tumeurs qui ne dépendent pas de NO pour se développer, il est probable que des donneurs de NO soient cytotoxiques puisque ces cellules ne sont à priori pas adaptées à un environnement riche en NO188. 1. 5 Régulation de l'expression et de l'activité iNOS Considérant les multiples effets physiologiques et pathologiques liés à l'activité iNOS, il est d'une importance capitale de comprendre au mieux les mécanismes par lesquels les cellules régulent son expression. Si l'activité iNOS est régulée (comme les autres NOS) par la disponibilité en substrat et en cofacteurs, la régulation de son expression intervient en tout premier lieu et constitue le déterminant majeur de la synthèse de NO par cette enzyme. En effet, et contrairement aux NOS constitutives, la iNOS synthétise habituellement du NO en continu jusqu'à ce que l'enzyme soit dégradée. Ainsi, chez les mammifères, un nombre considérable de mécanismes contrôlant l'expression de la iNOS ont été mis en place. 1. 5. 1 Structures du gène et du promoteur NOS2 Le gène codant la iNOS est nommé NOS2, il se localise chez l'Homme sur le bras long du chromosome 17 (position 17q11. 2-q12) et présente une longueur de 43764 bp. Un seul transcrit semble être exprimé, il comporte 27 exons pour une longueur totale de 4176 nucléotides et code pour une protéine de 1153 acides aminés. Un pseudogène (LGALS9C) chevauche partiellement la région 3'UTR (Untranslated region) du gène NOS2 sur le brin opposé. L'analyse de la séquence humaine du gène NOS2 montre une très forte homologie avec celles des autres primates (macaque et chimpanzé). En revanche, les structures du gène et du promoteur NOS2 des rongeurs (rat et souris) se différencient sensiblement de celles des primates (cf. Figure I-22)189. Il existe cependant plusieurs régions de forte homologie (ECR Evolutionary conserved regions) dans les séquences génomiques flanquantes en 5' et en 3', qui sont susceptibles de participer à des mécanismes communs de régulation transcriptionnelle. Les recherches concernant la régulation de l'expression de la iNOS sont dominées par les études chez la souris. Toutefois, il existe un grand nombre de types cellulaires humains ayant la capacité d'exprimer la protéine iNOS in vitro et in vivo : c'est par exemple le cas pour les macrophages résidents et dérivant de monocytes, les cellules dendritiques ou les hépatocytes. La caractérisation de l'expression de la iNOS dans les cellules humaines a confirmé le rôle 65 Chapitre I : Introduction bibliographique crucial de NF-B et STAT1, mais a aussi révélé d'importantes différences dans la structure de son promoteur qui expliquent la moindre capacité de réponse de ces cellules à l'IFN- et au LPS, comme la présence de substitutions nucléotidiques au niveau d'éléments enhancer qui potentialisent l'induction de la iNOS chez la souris190. Dans les macrophages alvéolaires et les cellules endothéliales vasculaires humaines, le déficit d'induction de la iNOS a pu être corrélé à la présence de modifications épigénétiques dans le gène NOS2 (méthylation CpG, modification des histones et compaction de la chromatine)191, 192. Figure I-22 : Structure du gène et de l'ARNm NOS2 humain et comparaison avec les séquences génomiques de NOS2 chez le rat, la souris, le macaque et le chimpanzé189. (A) Les propriétés importantes du gène NOS2 humain et de ses séquences flanquantes en 3 et 5' (30 kb) sont représentées. Ces structures sont : le promoteur de 16 kb, la phase ouverte de lecture de la région 5'-UTR (ORF), le transcrit primaire (hnRNA), les régions non traduites 5'-UTR et 3'UTR, les exons (E), le site d'initiation de la traduction (Start-ATG), le site de terminaison de la traduction (Stop-TGA), les sites putatifs d'initiation de la transcription (P2) et la localisation du pseudogène LGALS9C sur le brin antisens. (B) Caractéristiques importantes de l'ARNm NOS2 humain : la phase ouverte de lecture de la région 5'-UTR (ORF), les régions non traduites 5'-UTR et 3'UTR, les exons, le site d'initiation de la traduction (Start ATG), le site de terminaison de la traduction (Stop Signal), la séquence codante de la protéine (cds), les éléments riches en AU (AU) et les sites de liaison aux protéines de liaison aux ARN AUF1, HuR, KSRP et PTB. (C) Comparaison des séquences des loci du gène NOS2 chez l'homme, le rat, la souris, le macaque et le chimpanzé avec le logiciel ECR browser. La hauteur des pics représente le pourcentage d'homologie de séquence (fenêtres de 10 bp). Les régions de haute homologie (ECR) sont représentées par des blocs roses (voir la flèche). Les exons codants sont en bleu, les régions non traduites en jaune, les régions introniques en saumoné, les régions intergéniques en rouge, et les transposons/répétitions dispersées en vert. 66 Chapitre I : Introduction bibliographique Le fragment de 1000 bp du promoteur NOS2 humain présente une faible activité basale, mais pas d'induction par des cytokines après transfection transitoire dans différentes lignées humaines193, 194. Ceci marque une très nette différence avec le promoteur murin de 1000 bp, dont la capacité d'induction est 50 fois supérieure après un traitement avec du LPS et de l'IFN- dans des macrophages murins RAW 264. 7195. Une induction par 9 a tout de même pu être observée avec le fragment humain de 1 kb dans une lignée de phagocytes humains (THP-1), en réponse à un activateur de la PKC (PMA phorbol 12-myristate 13-acetate)196. De façon intéressante, lorsque le même fragment humain de 1 kb est transfecté dans un système hétérologue (lignée RAW 264. 7), l'activité du promoteur est cette fois induite de façon remarquable en réponse au LPS, à l'IFN- et à l'IL-1197. Chez l'Homme ou la souris, la majorité des régions régulatrices importantes se concentre dans la région proximale de 1 à 2 kb (cf. Figure I-23). Cependant, les promoteurs eucaryotes comportent fréquemment des éléments enhancers très distants qui s'avèrent parfois nécessaires lors de la transcription génique, et c'est le cas du promoteur NOS2 humain198. Dans les lignées humaines AKN, DLD-1 et A549, seuls des fragments d'une taille supérieure à 3, 8 kb permettent une induction significative de l'activité du promoteur NOS2 humain en réponse à des cytokines193. Un fragment de 16 kb est apparemment nécessaire pour permettre une induction maximale de l'activité du promoteur humain (environ x10) dans des lignées humaines transfectées de façon stable (A549 et AKN)199. L'utilisation d'autres constructions a permis d'estimer la contribution des différentes régions promotrices dans l'induction. Par ailleurs, plusieurs polymorphismes affectent l'inductibilité du promoteur NOS2. La répétition du pentanucléotide CCTTT localisé en position -2. 5kb a été particulièrement étudiée. Certaines études ont pu corréler le nombre de répétitions de ce pentanucléotide avec l'activité du promoteur NOS2 et la sévérité de plusieurs maladies dont le diabète de type I, la malaria, l'asthme, l'hypertension artérielle pulmonaire, la polyarthrite rhumatoïde et l'inflammation chronique intestinale200, 201. Plusieurs autres polymorphismes ont été découverts, dont une insertion/délétion du tétranucléotide AAAT en position -0. 7kb, et des polymorphismes nucléotidiques (SNP single nucleotide polymorphisms), mais leurs effets, notamment chez des patients atteints de malaria, restent un sujet de controverse. 67 Chapitre I : Introduction bibliographique Figure I-23 : Structure du promoteur 16 kb du gène NOS2 humain et contribution des différentes régions régulatrices à l'inductibilité du promoteur189. La figure montre la position de la bote TATA et les sites de liaison à des facteurs de transcription dont il a été démontré qu'ils avaient un effet sur la régulation de l'activité du promoteur : AP-1 (1), CAR (DR4), C/EBP (C), EGFR-STAT3 (E S3), FKHRL1 (F), HMGA1 (H1), KLF6 (KL), NF-B (), NRF (NRE), Oct-1 (O), RAR/RXR (RARE), PXR (DR4), STAT1 (GAS), TCF4 (T4), TCF11/MafG (M) et YY1 (Y). La localisation des polymorphismes nucléotidiques les plus fréquents est renseignée, ainsi que celle de la répétition du pentanucléotide CCTTT et de l'insertion/délétion du tétranucléotide AAAT. La capacité d'induction des différents fragments de promoteur est signalée par les flèches (expériences de transfection transitoire dans les lignées humaines A549 ou AKN). 1. 5. 2 Les facteurs de transcription modulant l'expression de la iNOS Les séquences promotrices du gène NOS2 de tous les mammifères présentent de fortes homologies au niveau de sites de liaison à de très nombreux facteurs de transcription. L'identification des éléments de réponse à ces facteurs de transcription a mis en évidence leur fréquente localisation au sein des ECR du promoteur. Seuls certains de ces sites putatifs (qui sont au nombre de 2700 environ d'après une analyse avec le logiciel MatInspector de la région de 20 kb flanquant en 5' du gène humain) ont effectivement pu être impliqués dans la régulation de l'activité du promoteur (cf. Figure I-23). Leur répartition se concentre essentiellement à proximité de la bote TATA (elle-même située à environ 30bp du site d'initiation de la transcription) ainsi que dans la région avoisinant -900 bp pour les promoteurs murins et humain. Le facteur de transcription NF-B constitue la cible centrale d'un grand nombre d'activateurs et d'inhibiteurs de l'expression de la iNOS, chez tous les mammifères202204. La stimulation des récepteurs au LPS (TLR4), à l'IL-1 (IL1R1) et au TNF- (TNFR2) engagent des voies de signalisation distinctes qui conduisent pourtant toutes à l'activation puis à la translocation nucléaire de NF-B. L'activation de la sérine/thréonine kinase IKK, qui contrôle la dégradation de l'inhibiteur spécifique de NF-B (IB), est une étape critique dans ces voies d'activation. La liaison de NF-B à des éléments de réponse spécifiques dans le promoteur 68 Chapitre I : Introduction bibliographique NOS2 entrane l'induction de l'expression de la iNOS. Plusieurs molécules comme les glucocorticoïdes et le TGF-1 peuvent inhiber l'expression de la iNOS en bloquant l'activité de NF-B (capture par des interactions protéine-protéine ; blocage de la translocation nucléaire ; inhibition de l'activité transactivatrice ; hausse de l'expression de IB). Figure I-24 : Induction de l'expression de la iNOS par la stimulation synergique d'un macrophage avec le LPS et l'IFN-. Le LPS est un composant de la membrane externe des bactéries à Gram négatif. Le LPS se lie à la LBP (LPS binding protein), qui le délivre à CD14, un récepteur de haute affinité au LPS. Le récepteur TLR4 (Toll like receptor 4) interagit avec le complexe CD14-LPS et active une cascade de signalisation intracellulaire via les protéines adaptatrices IRAK (Interleukin-1 receptor- associated kinase) et MyD88 (Myeloid differentiation primary response gene 88). Ces adaptateurs activent à leur tour des molécules comme TRAF6 (TNF receptor-associated factor 6), TAB1 (TAK1- binding protein 1) et p38. L'activation de TLR4 conduit aussi à la phosphorylation de IKK (Inhibitor of kappaB kinase), qui phosphoryle à son tour IB et libère NF-B. Ce dernier est alors transloqué dans le noyau o il se lie à des éléments de réponse spécifiques pour activer la transcription du gène NOS2. Les cytokines proinflammatoires comme l'IL-1 et le TNF- activent également NF-B. L'IFN- se lie au complexe récepteur IFNR1/IFNR2, qui active des kinases JAK (Janus kinases), conduisant à la synthèse STAT1-dépendante d'IRF1. L'activation de STAT1 et d'IRF1 en réponse à l'IFN- fournit un boost synergique à l'induction par le LPS de la transcription de NOS2. 69 Chapitre I : Introduction bibliographique Il faut remarquer que la combinaison de différents stimuli, qui agissent en synergie, est souvent nécessaire pour assurer une induction transcriptionnelle vraiment significative du gène NOS2. Typiquement, sur des macrophages, le traitement avec du LPS en combinaison avec de l'IFN- permet une induction bien supérieure à celle obtenue isolément avec chacun des stimuli (cf. Figure I-24). Chez la souris, les interférons (de type I -/- et de type II -) et les produits d'origine microbienne (ex : LPS) sont les inducteurs prototypiques de la transcription de la iNOS, qui stimulent efficacement la libération de NO par les macrophages. Les IFNs provoquent la dimérisation de STAT1 (Signal transducer and activator of transcription 1alpha), l'expression d'IRF1 (Interferon-regulatory factor-1) puis la formation du complexe ISGF3 (Interferon-stimulated gene factor 3), tandis que le LPS déclenche l'activation de NF- B. Ces facteurs de transcription interagissent avec des sites de liaison spécifiques dans le promoteur du gène NOS2. L'équipe de Farlik et ses collaborateurs a révélé les bases moléculaires sous-jacentes à l'induction synergique de la iNOS par les IFNs de type I et des composés microbiens, en utilisant des macrophages dérivant de cellules de moelle osseuse infectées avec Listeria monocytogenes205. Dans un premier temps, les composés bactériens interagissent avec des récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires associés aux pathogènes (PAMP Pathogen-associated molecular patterns) membranaires et cytosoliques qui déclenchent respectivement l'activation de NF-B et la production d'IFN-/. La liaison de NF-B au promoteur de NOS2 conduit au recrutement de TFIIH (Transcription factor II human) et de sa sous-unité CDK7 (Cyclin-dependent kinase 7). La seconde étape est la formation et la liaison au promoteur NOS2 du complexe ISGF3, permettant le recrutement de l'ARN polymérase II et sa phosphorylation par CDK7. NF-B et ISGF3 agissent ainsi de façon séquentielle et coopérative pour induire transcriptionnellement la iNOS. La liaison de l'IFN- au récepteur aux IFN de type II provoque l'activation de JAK2, une tyrosine kinase cytosolique de la famille Janus. La phosphorylation de STAT1, par JAK2 directement ou par la PKC activée via la PI3K en réponse à JAK2, entrane son homodimérisation et sa translocation nucléaire. L'activité du promoteur NOS2 est stimulée après fixation de STAT1 à des séquences GAS (-interferon activated site)206, 207. L'activation parallèle des kinases ERK1/ERK2 induite par l'IFN- assure une activation complète de STAT1 (phosphorylation du résidu Ser727). De plus, STAT1 induit transcriptionnellement IRF1, dont le rôle est essentiel dans l'induction de la iNOS par l'IFN- dans les macrophages 70 murins. La liaison directe d'IRF1 au promoteur de NOS2 n'a été décrite jusqu'aujourd'hui que Chapitre I : Introduction bibliographique chez la souris. De multiples autres facteurs de transcription proinflammatoires ont pu être impliqués dans l'induction transcriptionnelle de NOS2, bien que leur influence varie considérablement en fonction de l'espèce et du type cellulaire concerné. Parmi ces facteurs de transcription figurent AP-1, HIF-1 (Hypoxia-inducible factor-1) et Oct-1 (Octamer-1). Le complexe AP-1 est issu de l'hétérodimérisation de c-Fos et c-Jun induite par les voies des MAPK ERK, tandis que HIF-1 est un facteur de transcription stabilisé en conditions d'hypoxie. La faible saturation en oxygène est une caractéristique des sites inflammatoires et des tissus tumoraux. Elle induit une stabilisation de la sous-unité du facteur de transcription HIF-1, qui stimule l'expression de gènes améliorant l'oxygénation des tissus et favorisant la résolution de l'inflammation. L'hypoxie seule est un faible inducteur de l'expression de la iNOS, mais une forte synergie opère entre HIF-1 et l'IFN- ou les agonistes des TLR (Toll-like receptors)-3/4/9 pour activer le promoteur de NOS2, au travers d'une coopération avec NF-B208. L'activité du promoteur NOS2 peut aussi être réprimée : des récepteurs nucléaires comme les récepteurs aux glucocorticoïdes forment des complexes avec STAT1, AP-1 et NF-B, ce qui inhibe leur activité transactivatrice209. De plus, ils entrent en compétition avec eux pour la liaison à des coactivateurs transcriptionnels (ex : CBP et p300). Il existe aussi des situations o AP-1 inhibe l'activité du promoteur NOS2 humain en se fixant sur une séquence Silencer dite AP-1-like210. Le suppresseur de tumeur p53 et le TGF- (pour ce dernier via le complexe TCF11/MafG chez l'Homme) répriment également l'expression de la iNOS. Les mécanismes mis en cause dans cette régulation seront abordés en détail au cours des prochains chapitres. Le tableau ci-après (Tableau I-2) récapitule l'effet des principaux facteurs de transcription régulant l'expression de la iNOS, et les types cellulaires dans lesquels leur implication a été décrite pour la première fois189. Tableau I-2 : Principaux facteurs de transcription régulant l'expression de la iNOS. L'effet positif ou négatif des différents facteurs sur le niveau d'induction de la iNOS est indiqué par les flèches, ainsi que les lignées cellulaires dans lesquelles ces effets ont été décrits pour la première fois. 71 Chapitre I : Introduction bibliographique Facteur de transcription Activité du promoteur Activating protein-1 (AP-1) CCAAT-enhancer box binding protein (C/EBP) Forkhead box O3A (FOXO3A) Glucocorticoid receptor-, - (GR-, -) Hypoxia-induced factor-1 (HIF-1) Hepatocyte nuclear factor-4 (HNF-4) Heat shock factor 1 (HSF1) Interferon regulatory factor 1 (IRF1) Krppel-like factor 6 (KLF6) Nuclear factor of activated T cells (NF-AT) Nuclear factor-IL6 (NF-IL6) Nuclear factor-B (NF-B) Octamer factor 1 (Oct-1) Tumor suppressor p53 (p53) Peroxisome proliferator activated receptor- (PPAR- ) Retinoic acid receptor- / Retinoic X receptor- (RAR-/RXR-) Sma and MAD protein 2/3 (SMAD2/3) Signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1) Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) Transcription factor 11 (TCF11) 72 Cellules (Espèce) A549 (Homme) DLD-1, A549, HUVEC (Homme) Astrocytes primaires (Homme) A549 (Homme) A549 (Homme) Macrophages (Souris) Cardiomyocytes (Rat) Hépatocytes (Rat) RAW 264. 7 (Souris) A549 (Homme) RAW 264. 7 (Souris) Jurkat, Lymphocytes T (Homme) COS-7 (Vervet vert) Myocytes primaires (Rat) NIH-3T3, J774. A1 (Souris) AKN-1, A549 (Homme) RAW 264. 7 (Souris) Hépatocytes primaires (Homme) RAW 264. 7 (Souris) AKN-1, DLD-1, Calu 6 (Homme) Fibroblastes de derme (Souris) Chondrocytes (Homme) RAW 264. 7 (Souris) HeLa, HepG2, A549 (Homme) Gliobl. T98G / U87MG (Homme) Cellules de Kpffer, VSMCs (Rat) RAW 264. 7, Macrophages (Souris) A549, DLD-1 (Homme) Macrophages (Souris) A431, DLD-1 (Homme) Macrophages (Souris) HASMC, HUVEC (Homme) Chapitre I : Introduction bibliographique 1. 5. 3 La régulation post-transcriptionnelle et post- traductionnelle de la iNOS Si l'activité du promoteur est un paramètre crucial lors de l'induction de la iNOS, la stabilité de l'ARN messager est également un facteur important. De façon générale, la régulation de la stabilité des ARNm dépend de séquences localisées dans la région 3'UTR des transcrits matures. L'ARNm de la iNOS contient dans cette région 3'UTR des éléments riches en AU, dont il a été démontré qu'ils déstabilisent l'ARNm en favorisant le recrutement de l'exosome. L'activité nucléasique de l'exosome provoque la dégradation rapide des transcrits. La reconnaissance des ARNm par l'exosome nécessite leur interaction avec des protéines de liaison aux éléments riches en AU. Ces protéines possèdent aussi bien des propriétés stabilisatrices (ex : HuR, TTP) que déstabilisatrices (ex : KSRP, AUF1) de l'ARNm NOS2211, 212. Un nombre croissant d'études souligne également le rôle des ARN non codants (ncRNA) dans la régulation de l'expression de la iNOS. Dans des modèles murins, de multiples séquences putatives d'interaction avec des micro-ARN (miARN) ont pu être identifiées dans l'ARNm iNOS189. Cependant, la plupart des miARNs identifiés (comme miR-125a-5p, miR-146a, miR- 149, miR-155 et miR-301a) agissent de façon indirecte en bloquant l'expression de facteurs de transcription ou de protéines intervenant dans la régulation (positive ou négative) de l'expression du gène NOS2 (ex : SOCS-1, IRAK-1, Krppel-like factor 13, Rheb). Il existe cependant plusieurs cas bien étudiés pour lesquels l'interaction de miARNs avec la région 3'- UTR (Untranslated region) de l'ARNm NOS2 conduit à sa déstabilisation et à la réduction des niveaux de transcrits et de protéine iNOS (ex : miR-939 dans les hépatocytes humains et miR- 26a dans les cellules de lymphome T humaines)213, 214. La stabilité de la protéine iNOS est également sujette à une régulation. Certains travaux suggèrent par exemple que la cavéoline-1, en interagissant avec la iNOS, stimule sa dégradation protéasomale dans des lignées humaines de carcinome intestinal215, 216. La phosphorylation de la iNOS par la tyrosine kinase Src augmente au contraire sa stabilité, mais réduit son activité enzymatique217. Il est désormais bien établi que le protéasome constitue la voie de dégradation majeure de la iNOS suite à sa polyubiquitination218, 219. Les E3 ubiquitine ligases sont les enzymes responsables de la spécificité de transfert de l'ubiquitine sur des protéines cibles qui sont ensuite adressées au protéasome. Les complexes E3 ubiquitine ligase qui ciblent la iNOS sont des complexes de type ECS, qui sont constitués de l'élongine C, de la culline 5 et d'une 73 Chapitre I : Introduction bibliographique protéine SOCS-box (Suppressor of cytokine signaling-box). Dans ces complexes ECS, la protéine SOCS-box joue le rôle de sous-unité de reconnaissance du substrat. Dans le cas de la iNOS, de multiples travaux ont montré que les complexes ECS(SPSB) (SPRY domain and SOCS-box containing proteins) sont les principaux régulateurs de sa durée de vie220222. Une équipe a par ailleurs découvert que l'expression de SPSB1 est induite lors de l'activation du TLR3 (reconnaissance des ARN double brin viraux) ou du TLR4 (récepteur au LPS), établissant ainsi une boucle de rétrocontrôle négatif sur l'expression de la iNOS223. La modulation de l'activité enzymatique constitue le dernier niveau de régulation de la iNOS. Tout comme pour les autres NO synthases, elle est régulée en premier lieu par la disponibilité en cofacteurs et en substrats. Mais plusieurs protéines sont capables d'interagir avec la iNOS pour moduler son activité, comme la protéine kinase II Ca2 /calmoduline- dépendante (CaMKII) ou la protéine de choc thermique Hsp90 (activateur allostérique de la iNOS)224, 225. Quant à la kalirine et à la protéine NAP110, elles se fixent à la forme monomérique de la iNOS et préviennent sa dimérisation226, 227. L'ensemble des niveaux de régulation de l'expression et de l'activité iNOS sont résumés sur la Figure I-25. Figure I-25 : Résumé des principaux mécanismes de régulation de l'expression et de l'activité iNOS (détaillés dans le texte)189. 74 Chapitre I : Introduction bibliographique 1. 6 Contrôle de la synthèse de NO par le TGF- Le TGF- (Transforming growth factor-) est une cytokine sécrétée par un très grand nombre de types cellulaires et impliquée dans des fonctions cellulaires variées telles que la prolifération, la différenciation, l'apoptose, l'adhésion, l'angiogenèse et la migration cellulaire228. Au niveau physiopathologique, le TGF- est très étudié en raison de son activité profibrogénique très puissante, dont les dérèglements sont associés à la plupart des fibroses (hépatique, pulmonaire, rénale, etc. )229. Il exerce cependant de nombreuses autres fonctions, dans le système immunitaire notamment, au sein duquel il module la prolifération et les fonctions des lymphocytes B et T, des cellules NK, des neutrophiles et des macrophages230232. Le TGF- a aussi été identifié comme l'un des régulateurs physiologiques négatifs de la iNOS les plus puissants233. 1. 6. 1 Composants de la voie de signalisation canonique du TGF- Le TGF- est le membre prototypique d'une famille de facteurs de croissance et de différenciation comportant plus de 30 protéines structurellement apparentées incluant les BMPs (Bone morphogenetic proteins), les GDFs (Growth and differentiation factors) et les activines. Cette superfamille exerce un ensemble divers de fonctions allant de rôles morphogéniques au cours de l'embryogenèse jusqu'au maintien de l'homéostasie physiologique chez l'adulte. Au sein de cette famille, les fonctions des différents membres varient et peuvent même s'opposer selon le type cellulaire et le stade du développement. L'exemple de rôle contextuel du TGF- le plus fréquemment rapporté est son implication dans la tumorigenèse : le TGF- est un suppresseur de tumeur et un puissant inhibiteur de croissance cellulaire dans les cellules d'origine épithéliale et les tumeurs de stade précoce, tandis que dans les stades tumoraux avancés il promeut la croissance et la progression tumorale en induisant la transition épithélio- mésenchymateuse, et en renforçant le caractère invasif des tumeurs et la formation de métastases qui en résultent234. Tous les ligands de la famille du TGF- sont des facteurs sécrétés qui se lient et activent des complexes hétéromériques de récepteurs à la surface des cellules, classés en deux catégories (type I et II, cf. Tableau I-3). Les deux types de récepteurs comportent un domaine kinase cytoplasmique qui possède une double spécificité d'activité (sérine/thréonine kinase et tyrosine 75 Chapitre I : Introduction bibliographique kinase)235. Suite à leur liaison à un ligand dimérique de la famille du TGF-, deux récepteurs de type II s'associent à deux récepteurs de type I au sein d'un complexe hétéromérique. Ceci permet aux récepteurs de type II, dont l'activité kinase est constitutive, de phosphoryler des régions juxta-membranaires cytoplasmiques des récepteurs de type I, ce qui active leur fonction kinase236. Il faut remarquer que le -glycane, s'il n'intervient pas dans la transduction du signal, lie plusieurs ligands de la famille du TGF- et sert de réservoir de ligands (récepteur de type III)237. Par la suite, les récepteurs de type I phosphorylent deux résidus sérine situés dans un motif SSXS carboxy-terminal de protéines transductrices du signal : les SMADs régulées par le récepteur (R-SMADs)238. Cet évènement active les R-SMADs et permet la formation de complexes hétérotrimériques entre deux R-SMADs et une SMAD commune (SMAD4), qui subissent ensuite une translocation nucléaire (cf. Figure I-26) 239, 240. Il existe de surcroit des SMADs inhibitrices (I-SMADs : SMAD6 et SMAD7) qui antagonisent la signalisation médiée par les ligands de la famille du TGF-241. Les I-SMADs agissent de multiples manières, en interférant avec le recrutement des R-SMADs, en induisant une déphosphorylation des récepteurs et en recrutant des E3 ubiquitine ligases (Smurf1/2) qui les dégradent, ou en formant des complexes hétéromériques inactifs avec les R-SMADs ou SMAD4242. Tableau I-3 : Nomenclature des différents récepteurs de type I et de type II aux ligands de la famille du TGF- 235. 76 Chapitre I : Introduction bibliographique Les TGF-s se lient avec une très haute affinité au récepteur de type II (TRII), qui recrute ensuite un récepteur de type I (TRI), tandis que les BMPs se lient aux deux types de récepteurs avec la même affinité243, 244. La durée et l'intensité des signaux transmis aux protéines SMADs dépendent de l'abondance et de la disponibilité des ligands, mais aussi du niveau d'expression et de la localisation à la surface des cellules des récepteurs de type I et de type II. De très nombreuses modifications post-traductionnelles de ces récepteurs, qui ne seront pas détaillées ici, régulent en effet leur activité kinase, leur niveau d'expression, leur localisation subcellulaire et leur reconnaissance du substrat. Il existe une forte spécificité d'activation des R-SMADs par les récepteurs de type I nommés ALK (Activine receptor-like kinase) (cf. Tableau I-3). En réponse au TGF- (1, 2 ou 3) ainsi qu'aux activines, SMAD2 et SMAD3 sont spécifiquement phosphorylées par les récepteurs ALK-4, ALK-5 et ALK-7. En réponse aux BMPs ou aux protéines apparentées, SMAD1, SMAD5 et SMAD8 sont activées par les récepteurs ALK-1, ALK-2, ALK-3 et ALK- 6245. C'est la structure du domaine MH2 (Mad homology 2) des R-SMADs qui spécifie leur interaction avec les récepteurs de type I246. L'activation de SMAD2 et SMAD3 est facilitée par leur présentation au récepteur par la protéine SARA (Smad anchor for receptor activation). 1. 6. 2 Régulation de gènes cibles par les protéines SMADs et leurs partenaires Les SMADs font constamment la navette entre le cytoplasme et le noyau, o elles sont transloquées via la séquence NLS (Nuclear localization signal) située dans leur domaine MH1 par des importines ou par des nucléoporines247250. La phosphorylation des R-SMADs par les récepteurs ALK et leur association à SMAD4 entrainent leur rétention dans le noyau, o les SMADs jouent le rôle de facteurs de transcription et de régulateurs des miARN. Les complexes hétérotrimériques composés de deux R-SMADs et de SMAD4 se lient à l'ADN grâce aux structures -hairpin situées dans leur domaine MH1. Le domaine MH2 des Smads interagit avec divers facteurs nucléaires afin de moduler la transcription de gènes ou le profil épigénétique. Les I-SMADs sont dépourvues de domaine MH1 mais elles conservent un domaine MH2 ce qui explique qu'elles puissent former des complexes inactifs avec les autres SMADs. SMAD7 se comporte comme un inhibiteur général de tous les TGF-s, tandis que SMAD6 bloque préférentiellement la signalisation des BMPs242. 77 Chapitre I : Introduction bibliographique Les complexes de SMADs se lient avec une faible affinité à des éléments de réponse appelés SBE (SMAD binding elements). Lorsqu'un trimère de SMADs agit de façon isolée, seuls certains gènes cibles vont pouvoir être activés à un niveau restreint. Cependant, son interaction avec des facteurs de transcription partenaires est la plupart du temps nécessaire pour améliorer l'affinité et la spécificité de liaison à l'ADN, et permettre une activation plus efficace de la transcription251. Une grande variété de partenaires de liaison à l'ADN des SMADs a été décrite, dont des protéines modifiant la structure de la chromatine comme des histone acétyltransférases (HATs, dont p300/CBP) et des histone désacétylases (HDACs). Nombre de ces partenaires de liaison sont tissu-spécifiques, ce qui est essentiel à l'établissement d'une régulation génique contextuelle par le TGF-. Figure I-26 : Voies classiques de transduction du signal activées par la famille du TGF-235. Les ligands de la famille du TGF- transmettent des signaux en induisant l'assemblage hétérotétramérique de deux récepteurs de type I avec deux récepteurs de type II. Suite à la liaison du ligand, le signal est transmis par le domaine kinase cytoplasmique des récepteurs de type I qui phosphorylent des protéines SMADs régulées par le récepteur (R-SMADs). A côté de cette voie canonique SMAD-dépendante, plusieurs voies SMAD-indépendantes sont également activables par ces récepteurs (ex : MAPK, PI3K. ). Les protéines R-SMADs acivées forment des complexes avec une protéine SMAD4 qui sont ensuite transloqués dans le noyau, o ils régulent la transcription de gènes cibles en se liant à des éléments de réponse spécifiques avec d'autres cofacteurs. Les R-SMADs forment aussi des complexes avec des protéines de remodelage de la chromatine qui reconaissent des modifications des histones et favorisent la formation de chromatine active. En supplément, les R-SMADs participent aussi à la biogenèse des miARN en interagissant avec le complexe Drosha. 78 Chapitre I : Introduction bibliographique La régulation de gènes par des miARN est aussi une voie majeure de contrôle de l'expression génique utilisée par les ligands de la famille du TGF-, qui sont capables de réguler leur biogenèse et leur expression252. Les miARN sont de petits ARN non codants qui s'associent à une séquence partiellement complémentaire souvent située dans la région 3'-UTR d'ARNm cibles, et répriment leur expression en promouvant leur dégradation ou en inhibant leur traduction. Un simple miARN est capable de cibler plusieurs dizaines d'ARNm simultanément, c'est pourquoi la régulation de quelques-uns peut affecter l'expression de centaines de gènes et contribuer au contrôle spatial et temporel des fonctions biologiques des ligands de la famille du TGF-. 1. 6. 3 Les voies de signalisation indépendantes des protéines SMADs. En marge des voies de signalisation canoniques dépendantes des protéines SMADs, les récepteurs au TGF- (et aux ligands de la même famille) relaient également des signaux au travers de voies de signalisation additionnelles dites SMAD-indépendantes253. Ces voies de signalisation établissent des croisements (crosstalks) avec la signalisation des récepteurs au TGF-, et forment un réseau complexe et intriqué d'interactions moléculaires. Les récepteurs activés par les TGF-s et les BMPs induisent par exemple l'activation des MAPK ERK1/2 dans une variété de types cellulaires (cellules endothéliales, myoblastes, cellules souches, ostéoblastes, cellules cancéreuses. )254, 255. Pour expliquer ce phénomène, la démonstration a été faite que l'activité tyrosine kinase spécifique des récepteurs TRII provoque une activation des GTPases Ras/Raf et une activation subséquente des MAPK MEKs puis ERK1/2256. Les MAPK JNK (c-Jun N-terminal kinase) et p38 peuvent aussi être activées en réponse au TGF- . Après que le récepteur TRI/ALK5 se soit associé à la E3 ligase TRAF6 (TNF receptor- associated factor 6), la polyubiquitination intramoléculaire de cette dernière sert d'échafaudage à un assemblage avec la kinase TAK1 (TGF-activated kinase 1), qui agit en amont de JNK et p38257, 258. Enfin, diverses autres voies de signalisation comme la voie PI3K-Akt et les GTPases de la famille Rho sont induites par les ligands de la famille du TGF-. L'exemple de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) est particulièrement bien adapté pour mettre en lumière l'importance de ces voies de signalisation SMAD-indépendantes. Les cellules épithéliales sont des cellules différenciées caractérisées par leur forme uniforme, une polarité apico-basale, de fortes jonctions adhérentes cellule-cellule, des hémidesmosomes 79 Chapitre I : Introduction bibliographique cellule-matrice extracellulaire, et une mobilité limitée. Ces cellules forment normalement des tubes ou des feuillets composés d'une monocouche cellulaire. A l'opposé, les cellules mésenchymateuses ont une polarité avant-arrière et perdent leur faculté d'attachement aux autres cellules. Elles ont habituellement une mobilité très supérieure, étroitement reliée à leur fonction de régénération. Les cellules mésenchymateuses résident dans des tissus lymphatiques et circulatoires, ainsi que dans certains tissus conjonctifs o elles donnent naissance à d'autres types cellulaires. Nombreux sont les processus physiologiques nécessitant la conversion de cellules d'un phénotype épithélial vers un phénotype mésenchymateux (et la conversion inverse également). Au cours du développement embryonnaire, l'EMT est ainsi nécessaire lors de stades précoces comme la gastrulation et la formation de la crête neurale, mais aussi de stades plus tardifs comme la formation d'organes complexes comme les poumons et le cœur259. L'EMT joue aussi un rôle déterminant dans les processus de cicatrisation260. Le TGF- est capable d'induire l'EMT au même titre que certains ligands de la famille de SHH (Sonic hedgehog) et de WNT, avec lesquels il existe des crosstalks261. Au niveau pathophysiologique, et sous certains aspects, le cancer est parfois comparé à un état de cicatrisation excessive ou à un processus développemental anormal262, 263. L'invasivité et la formation de métastases sont des caractéristiques associées à l'EMT. Elles sont des étapes décisives dans le développement des cancers, car elles permettent à la tumeur de former des foyers secondaires. Dans ces contextes, l'activation des voies ERK1/2, PI3K-AKT et RHO GTPases sont essentielles au désassemblage des jonctions adhérentes, à la réorganisation du cytosquelette d'actine et à la motilité cellulaire255, 264267. Dans les stades tumoraux avancés, les voies de signalisation SMAD-indépendantes exercent ainsi des effets protumoraux qui s'opposent à ceux des voies SMAD-dépendantes à l'origine des fonctions suppresseur de tumeurs du TGF- dans les stades pré-oncogéniques. 1. 6. 4 Régulation de la biodisponibilité du TGF- Le TGF- est synthétisé sous une forme dimérique inactive dans un complexe latent o il est associé au propeptide dimérique LAP (Latency-associated peptide) et à une protéine LTBP (Latent TGF-binding protein). Ce complexe tripartite (TGF-, LAT et LTBP) appelé complexe LLC (Large latent complex) joue un rôle critique dans la modulation de l'action du TGF- et dans le contrôle de sa biodisponibilité. Au sein de ce complexe, le propeptide LAP confère sa latence au TGF-, et la protéine LTBP dirige et séquestre le facteur de croissance 80 Chapitre I : Introduction bibliographique dans la matrice extracellulaire, et aide à son activation par conversion de la forme latente du TGF- en sa forme active (cf. Figure I-27)268. Figure I-27 : Mécanismes de maturation, sécrétion et régulation extracellulaire du TGF-268. (1) Le TGF- latent et sa protéine de liaison (LTBP) sont traduites dans le réticulum endoplasmique (ER) o le pro-TGF- se dimérise et est lié à LTBP grâce à une paire de ponts disulfure. (2) Le dimère de TGF- est clivé de son propeptide LAP dans le réseau trans-Golgi, mais le TGF- reste fortement associé à ce propeptide via des interactions non covalentes (complexe LLC). (3), (4) et (5) Une fois sécrétée, la protéine LTBP se lie à différentes fibres matricielles qui séquestrent le TGF- latent, jusqu'à ce qu'il soit libéré en réponse à un signal d'activation. (6) Le TGF- mature et actif peut dès lors se fixer à ses récepteurs de surface cellulaire. Le TGF- est initialement traduit sous la forme d'une protéine d'environ 50 kDa contenant à la fois le facteur de croissance et le peptide LAP. Elle se dimérise et elle adopte son repliement tridimensionnel dans le réticulum endoplasmique, o les propeptides LAP du pro- TGF- dimérique sont liés à une protéine LTBP par une paire de ponts disulfure269, 270. Le propeptide LAP est ensuite clivé de la cytokine mature au niveau du réseau trans-Golgi par la furine ou par des enzymes apparentées271. Le TGF- et le propeptide LAP demeurent toutefois associés via des interactions non covalentes et forment un complexe appelé SLC (Small latent 81 Chapitre I : Introduction bibliographique complex). L'interaction entre le propeptide LAP et le TGF- est d'une affinité telle que toutes les isoformes de TGF- sont sécrétées sous forme de complexe latent LLC ou SLC. Les protéines LTBP (famille de 4 protéines) servent de chaperonnes en améliorant le repliement et la sécrétion du pro-TGF-. Elles sont aussi responsables de la localisation du TGF- latent (complexes LLC) au niveau de la matrice extracellulaire, grâce à des interactions spécifiques avec les fibres de fibronectine et de fibrilline272274. L'ancrage du TGF- à la matrice extracellulaire permet son maintien sous forme latente et régule donc son état d'activation. C'est la raison pour laquelle les patients atteints du syndrome de Marfan, causé par des mutations du gène codant pour la fibrilline-1, affichent des niveaux plus élevés de TGF- actif275. Ceci peut s'expliquer par la réduction du nombre de sites d'ancrage du TGF- à la matrice qui entraine un excès de complexes LLC solubles disponibles pour leur activation. Une seconde hypothèse est une hausse d'activation du TGF- latent par les intégrines qui serait favorisée par la destructuration de la matrice. En effet, le TGF- latent doit encore subir une étape d'activation pour devenir actif. Celle-ci peut être accomplie par certaines protéines ou lorsque des conditions physicochimiques particulières sont mises en place. Les intégrines situées à la surface des cellules (ex : v6 et v8) sont des activateurs bien connus du TGF- latent (cf. Figure I-28)276, 277. Le mécanisme d'activation du TGF- faisant intervenir des intégrines le plus étudié repose sur les forces de traction exercées entre les cellules et la matrice extracellulaire. Les intégrines sont associées au cytosquelette d'actine de la cellule et peuvent se lier au propeptide LAP. Ce dernier est attaché à la matrice extracellulaire par l'intermédiaire de la protéine LTBP, et la force de traction engagée permet de libérer le TGF- du complexe LLC. La nature critique de ce mode d'activation du TGF- est illustrée par un modèle murin dans lequel le motif RGD de liaison aux intégrines de TGF-1-LAP a été remplacé par une séquence RGE278. Ces souris présentent un phénotype identique à celui des souris TGF-1-/-, avec une inflammation généralisée dans de multiples organes, et ce malgré une sécrétion normale de TGF-. De cette façon, les intégrines jouent également un rôle important dans des pathologies pour lesquelles le TGF- est un médiateur majeur : la délétion du gène codant les intégrines v protège par exemple les souris du développement de fibroses hépatiques, pulmonaires et rénales279. D'autre part, la délétion conditionnelle du gène codant les intégrines 8 dans les cellules dendritiques provoque de sévères maladies inflammatoires intestinales et auto-immunes, tandis que leur expression dans les lymphocytes Treg est 82 Chapitre I : Introduction bibliographique importante pour éviter une inflammation aberrante médiée par les lymphocytes T, ce qui souligne l'importance du TGF- dans le maintien de la tolérance immune280, 281. Un grand nombre de protéases de différentes classes sont aussi capables d'accomplir l'activation du TGF- latent in vitro, dont des protéases à cystéine comme la calpaïne, des protéases aspartiques comme la cathépsine D, et des métalloprotéases matricielles comme MMP2, MMP3, MMP9, MMP13 et MMP14282, 283. La pertinence de leurs fonctions in vivo dans le cadre de l'activation du TGF- reste toutefois incertaine car le phénotype des souris knockout pour ces différentes protéases ne correspond jamais à celui de souris TGF-/-. Cela pourrait indiquer un rôle mineur de cette voie dans l'activation du TGF- aussi bien qu'une forte redondance fonctionnelle à l'origine d'un phénomène de compensation. Figure I-28 : Mécanismes hypothétiques d'activation du TGF- latent par les intégrines268. (A) Le premier mécanisme fait intervenir la soumission du peptide LAP à des forces de traction imposées par l'attachement de la cellule aux fibres de la matrice extracellulaire (MEC) via son cytosquelettre d'actine. (B) Le second propose que la liaison du peptide LAP aux intégrines à la surface de la cellule puisse le rendre plus accessible et donc plus sensible au clivage par des métalloprotéases matricielles (MMP). 83 Chapitre I : Introduction bibliographique Enfin, l'activation du TGF- latent peut avoir lieu suite à son exposition à des conditions physiques ou chimiques particulières, telles que les détergents, les rayonnements ionisants et UV, les ROS, la chaleur, les forces de cisaillement et les pH extrêmes284288. Certaines de ces conditions ont une signification biologique. Par exemple, les ROS produites par des lymphocytes T infectés par le VIH peuvent activer le TGF- latent et conduire à une immunosuppression289. Les ROS libérées lors de l'exposition à des rayonnements ionisants et UV sont probablement à l'origine d'une activation du TGF-290. Il existe de surcrot des circonstances pour lesquelles un faible pH conduirait à l'activation de TGF- latent. Au cours d'une résorption osseuse, les ostéoclastes réduisent ainsi le pH extracellulaire à environ 4, 5, ce qui suffit à activer le TGF-291. Les cellules tumorales abaissent aussi significativement le pH de leur microenvironnment, ce qui pourrait contribuer à l'activation du TGF- observée en contexte tumorigénique292. Quant aux forces de cisaillement, elles permettent d'activer une part importante du TGF- latent libéré par les plaquettes sanguines288. 1. 6. 5 Régulation de l'expression de la iNOS par le TGF-1 Au début des années 1990, une étude originale démontra que les trois isoformes de TGF- sont capables de réduire la capacité de production de NO par des macrophages murins en réponse à l'IFN-293. Par la suite, nombre d'études réalisées in vitro (Y. Vodovotz et coll. ; D. J. Stuehr et coll. ) ont rapporté un effet suppresseur prédominant du TGF-1 sur la production de NO dans des types cellulaires variés, chez la souris, le rat ou chez l'Homme : macrophages, cellules musculaires lisses, cellules gliales, cardiomyocytes, cellules épithéliales pigmentaires de la rétine, cellules endothéliales, hépatocytes, cellules de Kpffer, chondrocytes, fibroblastes, kératinocytes294307. La large diversité de types cellulaires exprimant la iNOS pour lesquels le TGF-1 exerce un effet modulateur reflète la distribution généralisée de récepteurs à cette cytokine dans tous les tissus de l'organisme. La première étude ayant adressé la question de l'effet répresseur du TGF-1 en contexte in vivo a mis en évidence une expression mutuellement exclusive de la iNOS dans les macrophages de souris résistantes à une infection par Leishmania et du TGF-1 dans ceux des souris sensibles à cette même infection308. Les souris TGF-1-/-, en plus d'exhiber une inflammation dans de multiples organes et des niveaux élevés d'auto-anticorps circulants, présentent spontanément de forts niveaux sériques de dérivés de NO (NO2 - et NO3 -) et un niveau aberrant d'expression de la iNOS dans le cœur, les reins, le foie et les poumons309311. En outre, 84 Chapitre I : Introduction bibliographique le traitement de rats avec du TGF-1 avant un choc endotoxinique induit par le LPS réduit considérablement le niveau d'expression de la iNOS et la production systémique de NO, tout en augmentant significativement la survie de ces animaux312. Chez l'Homme, différentes études suggèrent que l'effet répresseur exercé sur la iNOS par le TGF-1 pourrait être impliqué dans une série de pathologies pour lesquelles sont associés des niveaux aberrants d'expression de la iNOS. Le TGF-1 est fortement exprimé chez les patients atteints de leishmaniose et il limite la capacité des macrophages humains à tuer les parasites in vitro313. Les mégacaryocytes de patients affectés par de l'athérosclérose expriment des niveaux aberrants de iNOS qui pourrait être mis en relation avec la réduction drastique du taux de TGF-1 actif circulant chez ces mêmes patients314, 315. Dans le côlon des personnes atteintes de la maladie de Crohn, une production excessive de NO aussi bien que de TGF-1 a été relevée316, 317. Cependant, la voie de signalisation du TGF- pourrait être défaillante dans cette pathologie, comme le laisse supposer la localisation anormale des récepteurs au TGF- de type I et de type II chez les patients atteints de maladie inflammatoire intestinale318. En ce qui concerne les maladies neurodégénératives, l'apparition et la progression de la sclérose en plaques ont été associées à la fois à une réduction de l'expression du TGF-1 dans les lymphocytes T et à une surexpression de la iNOS dans les cellules gliales319, 320. Dans le cerveau des patients atteints par la maladie d'Alzheimer, la iNOS est exprimée dans les micro-vaisseaux sanguins et dans les neurones en dégénérescence, tandis que l'expression neuronale du TGF-1 est diminuée dans les mêmes régions du cerveau321323. D'un point de vue mécanistique, le TGF-1 agit à de multiples niveaux de régulation de l'expression et de l'activité de la iNOS avec, malgré tout, des disparités en fonction du type cellulaire étudié (cf. Figure I-29). Aux niveaux transcriptionnel et post-transcriptionnel, le TGF-1 peut réduire l'activité du promoteur NOS2 ainsi que la stabilité des transcrits NOS2. De cette façon, en absence de stimuli inducteurs, le TGF-1 permet de réprimer l'expression de la iNOS malgré une activité basale du promoteur NOS2. Aux niveaux traductionnel et post- traductionnel, le TGF-1 peut diminuer le taux de traduction des ARNm NOS2 et la stabilité de la protéine iNOS. Le champ d'action du TGF-1 a aussi été étendu à la régulation de l'activité enzymatique de la iNOS, après que la démonstration eût été faite qu'il induit l'activité arginase des macrophages (qui prive la iNOS de son substrat) et réprime la production de tétrahydrobioptérine dans les cellules324, 302. 85 Chapitre I : Introduction bibliographique Figure I-29 : Mécanismes de régulation de l'expression et de l'activité iNOS par le TGF- 1233. Le TGF-1 interagit avec son complexe récepteur à la surface de la membrane plasmique et déclenche une série d'évènements aboutissant à une réduction de la transcription du gène NOS2, de la stabilité des transcrits NOS2, de la traduction des ARNm NOS2 ainsi que de la stabilité de la protéine. Le TGF-1 affecte également l'activité enzymatique de la iNOS en réduisant la synthèse de BH4 et en stimulant l'expression et l'activité de l'arginase. Dans certaines situations, les fortes concentrations en NO peuvent aussi stimuler la sytnhèse et la sécrétion de TGF-1, ce qui résulte en une boucle de rétrocontrôle négatif. Pour expliquer ces effets, les premières pistes mécanistiques envisagèrent que le TGF- puisse altérer la liaison et/ou l'activité de facteurs de transcription impliqués dans l'induction transcriptionnelle de NOS2. Il a par exemple été démontré que le TGF-1 est capable d'induire l'apoptose des lymphocytes B en inhibant l'activité de NF-B, via l'induction transcriptionnelle de l'inhibiteur IB (qui masque la séquence NLS de NF-B)325. Dans les cellules macrophagiques RAW 264. 7, le TGF-1 inhibe l'activation par phosphorylation de STAT1 en réponse à l'IFN-326. De plus, il a été découvert dans cette même étude que le récepteur de l'IFN- (IFNGR1) se trouve associé au récepteur au TGF- de type I (TRI), et sa phosphorylation par ce dernier le rend inactif. Une autre étude effectuée dans les mêmes cellules RAW 264. 7 a également permis de démontrer que le TGF-1 provoque une hausse de la dégradation de la iNOS dépendante du protéasome, en améliorant l'activité Trypsine-like de ce dernier327. 86 Chapitre I : Introduction bibliographique Plus récemment, des travaux utilisant des macrophages BMDM (Bone marrow-derived macrophages) knockout pour SMAD2 et/ou SMAD3 ont montré le rôle essentiel de ces deux protéines dans l'effet répresseur exercé par le TGF-1 sur la iNOS328. Dans les macrophages Smad2-/- ; Smad3-/-, l'effet répresseur du TGF-1 sur l'activité du promoteur NOS2 est perdu dans sa quasi intégralité. La phosphorylation de STAT1 est aussi plus forte et prolongée dans ces cellules, en raison d'une hausse secondaire de production d'IFN- et de phosphorylation d'IRF3 en réponse à l'activation de TLR3 ou TLR4 (respectivement par du poly(I : C) et par du LPS). Les auteurs rapportent également une induction de l'expression du complexe SPSB1 et de l'arginase par le TGF-1 très amoindries dans les BMDM Smad2-/- ; Smad3-/-. Enfin, les voies de signalisation SMAD-indépendantes testées lors de cette étude (ERK, p38 et JNK) ne sont pas apparues significativement altérées par le double knockout de SMAD2/3. Chez l'Homme, seule une étude de 2007 explore le mécanisme répresseur du TGF-1 dans des cellules musculaires lisses de l'aorte, et rapporte une induction de l'expression du facteur de transcription TCF11 (famille de NF-E2) par le TGF-1329. Le facteur nucléaire TCF11 forme un hétérodimère avec la protéine MafG, avec laquelle elle interagit au niveau d'un site de liaison spécifique dans le promoteur NOS2 pour réprimer son activité (équivalent d'un site NF-E2-like, soit une combinaison de deux demi-sites T-mare et AP-1). La liaison de TCF11 au promoteur NOS2 est apparue dépendante d'une activité PKC (induite avec le phorbol myristate acétate ou bloquée par la calphostine C). 87 Chapitre I : Introduction bibliographique 2 Le suppresseur de tumeur p73 et ses homologues La découverte, en 1979, de la protéine suppresseur de tumeurs p53, apporta un éclairage nouveau sur la biologie des cancers et constitua rapidement un axe majeur des recherches contre le cancer. La protéine p53 est un facteur de transcription principalement impliqué dans le maintien de l'intégrité génomique, capable d'induire l'apoptose cellulaire en réponse à divers stress cellulaires. Ses homologues p63 et p73, découverts à la fin des années 1990, exercent des fonctions supplémentaires dans le développement embryonnaire. L'existence de nombreuses isoformes des membres de la famille p53, qui forment un réseau complexe d'interactions aux fonctions variées, apporte une difficulté supplémentaire à la compréhension du puzzle que compose cette famille de protéines, dont l'histoire évolutive remonte aux organismes unicellulaires les plus primitifs. 2. 1 La famille p53 : Origine, structures et fonctions 2. 1. 1 Découverte d'un Gardien du génome En 1979, plusieurs groupes publient des résultats décrivant la formation de complexes entre l'antigène T de SV40 et une protéine de 54 kDa, qui sera par la suite nommée p53330, 331. L'antigène T ayant été identifié comme une oncoprotéine clé du virus SV40 dans les processus d'initiation et de maintien de la transformation cellulaire, cette interaction directe avec une protéine de l'hôte suscita beaucoup d'intérêt. En outre, la protéine p53 a été détectée comme un antigène tumoral qui élicite une réponse humorale lorsque des tumeurs sont produites chez la souris à partir de cellules transformées332. Durant les années 1980, des interactions entre p53 et d'autres oncoprotéines virales ont été rapportées (E1B de l'adénovirus et E6 du papillomavirus humain)333, 334. Avec ces découvertes, il devint clair que les fonctions de p53 sont ciblées de façon stratégique par ces virus oncogéniques, et qu'elles sont intimement liées à la réplication virale et à la tumorigenèse. Différents groupes se sont ensuite aperçus que des formes mutantes de p53 ont une activité transformante335, 336. Suite à la description de mutations de p53 dans des tumeurs murines et dans des cancers du côlon chez l'Homme, la classification de p53 dans la catégorie des gènes suppresseurs de tumeurs s'est confirmée au cours des années suivantes grâce à aux 88 Chapitre I : Introduction bibliographique observations successives que (1) les patients héritant d'un allèle mutant de TP53 sont atteints du syndrome de Li-Fraumeni, un syndrome de prédisposition génétique au développement de cancers multiples tout au long de leur vie337, (2) les souris porteuses de mutations perte de fonction de Trp53 développent des tumeurs à un âge très précoce338, (3) jusqu'à 50% des cancers humains sont associés à des mutations des deux allèles du gène TP53339, et (4) des niveaux aberrants de la protéine p53 sont mesurés dans de nombreux types de tumeurs340. Figure I-30 : Aperçu de la variété de cibles induites par p53 ou par ses homologues p63 et p73 dans des processus tels que le maintien de l'intégrité génomique, le contrôle de la prolifération et de la différenciation cellulaire, l'angiogenèse et le métabolisme341. Au fil des années et des découvertes, le facteur de transcription p53 s'est donc imposé comme un suppresseur de tumeur majeur lui ayant valu l'appellation de gardien du génome (cf. Figure I-30)342, 343. En réponse à une grande variété de stress cellulaires, p53 assure le maintien de l'intégrité génomique en induisant un arrêt du cycle cellulaire et la réparation de 89 Chapitre I : Introduction bibliographique l'ADN, ou en dirigeant les cellules vers une mort par apoptose lorsqu'elles sont endommagées de manière irréversible. Il n'est ainsi guère surprenant de constater que des mutations responsables de l'inactivation de p53 représentent l'altération génétique la plus communément observée dans les tumeurs humaines344, 345. La protéine p53 fut pendant longtemps considérée comme l'unique représentante de son genre jusqu'à l'identification, à la fin des années 1990, des protéines p63 et p73, qui présentent des structures modulaires comparables et un fort degré d'homologie346, 347. Les protéines p63 et p73 partagent toutes deux des gènes cibles en commun avec p53 qui, bien que cela ne soit pas leur fonction première, font d'elles de puissants gènes suppresseurs de tumeur. Les gènes p53, p63 et p73 (TP53/63/73 chez l'Homme ; Trp53/63/73 chez la souris) codent pour une large diversité d'isoformes dont les fonctions cellulaires sont finement orchestrées par leur localisation tissu-spécifique, leur niveau d'expression et la régulation de leur activité. 2. 1. 2 Origine évolutive et fonctions ancestrales de p53 Les origines d'un gène p53 ancestral sont clairement observables chez des descendants actuels des organismes les plus primitifs comme les choanoflagellés (des eucaryotes opisthocontes unicellulaires) et l'anémone de mer348, 349. Dans ces organismes, le gène ancestral de p53 est un gène hybride qui s'apparente en grande partie à une combinaison des gènes p63 et p73. La fonction de ce gène ancestral chez l'anémone de mer est de protéger les cellules germinales de stress environnementaux, qui endommagent l'ADN et mettent en péril la transmission fidèle de l'information génétique aux gamètes et à la descendance. Cette fonction persiste chez les insectes, les vers, les mollusques et les vertébrés, y compris les humains. L'histoire évolutionnaire de p53 s'étale donc sur plus d'un milliard d'années. Chez les premiers vertébrés (poissons cartilagineux), ce gène ancestral subit une première duplication à la suite de laquelle un gène plus proche de p53 fut produit350. Le gène p53 acquit des fonctions somatiques : il jouait désormais le rôle de suppresseur de tumeurs dans des cellules souches et progénitrices, répondant ainsi aux besoins de régénération tissulaire des vertébrés. Plus tard au cours du développement des vertébrés (à l'apparition des poissons osseux), le gène ancestral subit une nouvelle étape de duplication, à l'issue de laquelle les gènes p63 et p73 apparurent. Leurs fonctions se sont par la suite élargies à des rôles de régulateurs transcriptionnels impliqués dans la formation d'organes d'origine ectodermique (p63) et dans la formation du système nerveux et du système immunitaire (p73). Depuis les premiers poissons osseux 90 Chapitre I : Introduction bibliographique jusqu'aux mammifères, en passant par les amphibiens et les reptiles, la longueur des séquences introniques des gènes p63 et p73 a connu une augmentation spectaculaire, tandis que celle de p53 a été conservée (comme en attestent les tailles respectives des gènes : p53 19, 2 kb ; p63 265, 8 kb ; p73 80, 7 kb). La forte pression de sélection exercée sur les gènes p63 et p73 explique qu'ils aient conservé leurs fonctions ancestrales de surveillance de l'intégrité génomique dans les lignées germinales et somatiques. 2. 1. 3 Structure et complexité moléculaire de la famille p53 Suite à leur découverte à la fin des années 1990, les rôles de p63 et p73 dans le développement sont rapidement élucidés grâce à une série de travaux sur des souris knockout pour ces gènes351353. Au même moment, la complexité de leur expression génique se révèle et rend la compréhension des fonctions des membres de la famille p53 beaucoup plus difficile. Elle repose sur l'utilisation de promoteurs alternatifs et des mécanismes d'épissage qui génèrent un grand nombre d'isoformes fonctionnelles différentes354. 2. 1. 3. 1 Diversité des isoformes au sein de la famille p53 Une caractéristique commune à tous les membres de la famille p53 est qu'ils peuvent être exprimés sous la forme de multiples isoformes (cf. Figure I-31). Les isoformes TAp63/73 possèdent un domaine de transactivation N-terminal (TAD) et sont générées à partir du promoteur P1. Dans les gène p63 et p73, l'usage d'un promoteur interne (P2) situé dans l'intron 3 permet l'initiation de la transcription au niveau d'un second site produisant l'exon 3'. Ce promoteur est responsable de la génération d'une catégorie d'isoformes tronquées au niveau N- terminal, identifiées collectivement comme étant les isoformes Np63/73. Il est à noter que le promoteur P1 est également à l'origine d'isoformes tronquées Ex2 et Ex2/3 provenant de l'épissage des exons 2 et 3 du transcrit. Ces isoformes possèdent seulement une partie (Ex2) ou pas de domaine TAD (Ex2/3). En outre, le second exon du transcrit p73 contient un motif reconnu par la protéine PTBP (Polypyrimidine tract-binding protein). Cette protéine est capable de se lier à des ARN et d'agir à la fois comme un inhibiteur de l'épissage et comme un activateur de la traduction. Dans le cas du transcrit de p73, PTBP active la traduction à partir d'une séquence IRES (Internal ribosome entry site), un élément structural ribonucléique qui permet l'initiation de la traduction de manière indépendante de la coiffe 5' des ARNm. De cette façon, sont également générées des isoformes Np73-like dépourvues du domaine transactivateur N- terminal355. 91 Chapitre I : Introduction bibliographique Figure I-31 : Structure du gène et diversité des isoformes de p73356. En haut de la figure est représentée la structure du gène p73, avec la localisation des promoteurs alternatifs (P1 et P2) et l'épissage alternatif qui génère des isoformes variant au niveau de leur extrémité C-terminale (, ). Les différentes catégories d'isoformes de p73 représentées en dessous (les chiffres indiquent les exons contenus dans les différentes isoformes) comprennent les isoformes TAp73 (codées à partir du promoteur P1) qui comportent le domaine de transactivation N-terminal, les isoformes Ex2 et Ex2/3 qui sont tronquées au niveau de ce même domaine, et les isoformes Np73 codées à partir du promoteur P2 et qui en sont totalement dépourvues. 92 Chapitre I : Introduction bibliographique Une hétérogénéité supplémentaire est apportée par l'existence de variants d'épissage des exons codant l'extrémité C-terminale de p63 (, ) et de p73 (, ). Elles diffèrent notamment dans leur potentiel d'activation transcriptionnelle. Par exemple, l'isoforme TAp73, qui correspond à la forme la plus longue de p73, induit moins fortement certains gènes cibles proapoptotiques que le variant , ce qui suggère que cette extrémité peut jouer un rôle régulateur négatif. Les fonctions spécifiques de ces variants d'épissage sont peu étudiées et demeurent encore aujourd'hui très mal caractérisées. 2. 1. 3. 2 Structure protéique de p73 et de ses homologues La structure protéique des membres de la famille p53 peut être décomposée en plusieurs domaines fonctionnels : un domaine de transactivation N-terminal (TAD) suivi d'une séquence riche en prolines (PR), un domaine central de liaison à l'ADN (DBD) et un domaine d'oligomérisation C-terminal (OD) impliqué dans la formation de tétramères actifs. Les régions de haute homologie de séquence se trouvent dans le domaine de liaison à l'ADN : 60% d'identité de séquence entre p53 et p63 ; 63% entre p53 et p73 (homologie supérieure à 80% pour tous les membres). Les résidus qui interagissent directement avec l'ADN sont parfaitement conservés. En conséquence, p63 et p73 peuvent se lier à des éléments de réponse à p53 canoniques, et activer la transcription à partir de promoteurs répondant à p53, induisant ainsi un arrêt du cycle cellulaire, l'apoptose ou la sénescence. En comparaison, les domaines d'oligomérisation sont beaucoup moins bien conservés. L'extrémité C-terminale des isoformes de type contient en supplément un motif sterile alpha (SAM) et un domaine terminal inhibiteur de transcription (TID) qui ne sont pas conservés dans la protéine p53357. La protéine p73 conserve une organisation quaternaire très semblable à celle de p53 et p63 : c'est un dimère de dimères. Le domaine TAD de p73 est composé de deux sous-domaines distincts (TAD1 entre les résidus 1-31 et TAD2 entre les résidus 46-67) connectés par un linker. C'est le domaine le moins conservé de la famille (seulement 22% d'identité de séquence entre p53 et p63 ; 30% entre p53 et p73). Il est intrinsèquement désordonné, et sert de site de liaison à une variété de partenaires comme le coactivateur transcriptionnel p300. Lorsqu'il se lie à certaines protéines telles que MDM2 et Bcl-XL, le domaine TAD1 adopte une conformation en hélice . Le domaine TID des isoformes réduit leur activité transcriptionnelle en imposant une conformation fermée au travers de son interaction avec le TAD. 93 Chapitre I : Introduction bibliographique Les structures du domaine DBD de p73 à l'état libre ou lié à un élément de réponse à p53 complet (20 bp) ont été résolues en 2012 par cristallographie aux rayons X (cf. Figure I-32). Les DBD de p73 (et de ses homologues) forment des dimères puis des tétramères en présence d'ADN, mais restent sous forme monomérique en son absence. Le domaine DBD monomérique de p73 présente, comme pour p53 et p63, une structure de type immunoglobuline composée de deux feuillets enchevêtrés. Deux larges boucles contenant les hélices H1 et 310 forment l'interface de dimérisation, et permettent un enlacement de l'ADN. Un motif composé de deux boucles (L1 et L3), d'un brin (S10) et d'une hélice (H2) positionne cette interface pour permettre la reconnaissance d'un quartier de site de l'élément de réponse. Enfin, deux ions Zn2 sont coordonnés, l'un au niveau de résidus de l'hélice H1 et de la boucle L3, et l'autre à l'interface du dimère formée par l'hélice H2 et l'extrémité C-terminale du domaine DBD. Figure I-32 : Visualisation 3D d'un tétramère de domaines de liaison à l'ADN de p73 lié à un élément de réponse complet à p53, à l'aide de l'application web NGL Viewer. La structure a été résolue par cristallographie aux rayons X avec une résolution de 3, 1 (Identifiant Protein Data Bank 4G82)358. Représentation en rubans des structures secondaires (en rose les hélices , en jaune les feuillets ) du tétramère avec une vue de face (A) et du dessus (B), en complexe avec un élément de réponse de 20 bp (en violet) dont la séquence des quartiers de sites est 5'-GAACA-3'. La longueur de la séquence spacer entre les deux demi-sites de l'élément de réponse influence remarquablement la structure quaternaire de p73. Tandis que les structures du DBD de p73 lié à l'ADN avec une séquence spacer de 0 ou 1 nucléotide sont très compactes et présentent une large interface de tétramérisation, celles obtenues avec un spacer de 2 nucléotides ou plus ont une interface plus réduite et sont accompagnées d'un relâchement de l'ADN. Ces observations expliquent pourquoi l'activité transcriptionnelle de p73 est très largement affectée par une insertion de bases entre les deux demi-sites de l'élément de réponse 94 Chapitre I : Introduction bibliographique (elle s'effondre au-delà d'un nucléotide inséré), tandis que celle de p53 tolère jusqu'à 4 paires de bases de distance359. 2. 1. 3. 3 La famille p53 forme un réseau d'interactions L'importante homologie de séquence observée entre p53, p63 et p73 souleva initialement la possibilité que ces protéines pourraient s'oligomériser pour former des hétérotétramères dans un réseau complexe d'interactions. Cependant, p63 et p73 partagent seulement 38% d'identité de séquence avec le domaine d'oligomérisation de p53. Il en résulte que si p63 et p73 forment des hétérotétramères stables (elles partagent dans leur domaine d'oligomérisation une hélice supplémentaire) avec toutes les stœchiométries possibles, leur interaction avec p53 est encore l'objet d'incertitudes360. Bien que les formes WT et mutantes de p53 soient capables d'interagir avec p73 dans des systèmes de double hybride chez la levure, des expériences de cotransfection dans des lignées tumorales suggèrent que seule les formes mutantes de p53 acquièrent la possibilité d'interagir avec p63 et p73 pour inhiber leur activité transcriptionnelle361. En contraste avec la majorité des gènes suppresseurs de tumeur dont l'expression est perdue au cours de la tumorigenèse, p53 demeure exprimée bien que fréquemment affectée par des mutations faux sens. Sept hotspots mutationnels (30% des mutations rapportées) ont été identifiés pour TP53 et sont fortement corrélés à un mauvais pronostic pour les patients porteurs de ces mutations362364. Certaines mutations de p53 exercent un effet dominant négatif de telle sorte qu'elles conduisent à une perte de la fonction suppresseur de tumeur de l'allèle p53-WT restant. De plus, certains mutants de p53 acquièrent un effet dominant négatif sur les membres apparentés que sont les protéines p63 et p73, ce qui conduit à une suppression complète de l'activité des protéines de la famille p53361, 365. Plusieurs hypothèses ont été formulées pour essayer d'expliquer la capacité de ces formes mutantes à perturber le fonctionnement de p53. A ce jour, les travaux et les discussions se poursuivent afin de déterminer si cet effet passe (1) par une compétition de ces mutants ou isoformes qui privent la protéine WT de ses sites de liaison ou cofacteurs, (2) par la formation d'hétérotétramères inactifs constitués à la fois de protéines p53-WT et mutantes, ou (3) par un mécanisme de type prion par lequel une forme mutante de p53 serait capable de diriger la conversion de la forme WT de p53 vers une conformation alternative inactive366, 367. 95 Chapitre I : Introduction bibliographique Les isoformes Np63/73 sont dépourvues du domaine de transactivation N-terminal et perdent une grande partie de leur activité transcriptionnelle. Elles exercent un effet dominant négatif à la fois sur les isoformes TAp63/73 ainsi que sur p53. L'inhibition de p53 et de TAp63/73 par les isoformes N se fait par compétition pour la fixation aux mêmes sites de liaison à l'ADN (domaine DBD intact). Celle des isoformes TAp63/73 peut également se faire via la formation d'hétérotétramères inactifs368, 369. Le résultat de toutes ces interactions dépend très largement des ratios d'expression entre les différentes catégories isoformes, et une altération dans leur équilibre peut fortement influencer le devenir de la cellule. Dernièrement, une analyse FASAY (Functional analysis of separated alleles in yeast) a été employée pour évaluer et investiguer les mécanismes de dominance négative des 7 mutants hotspots de p53 et des 24 isoformes principales de p53, p63 et p73370. Elle montre que seuls les protéines p53 mutantes et les isoformes qui sont inactives mais toujours capables de former des tétramères peuvent affecter l'activité transcriptionnelle de p53-WT. La perte d'activité transcriptionnelle (ex : isoformes p53 et p53) ne permet pas nécessairement à ces isoformes d'exercer un effet dominant négatif. La présence d'un domaine de tétramérisation intact, comme c'est le cas pour 133-p53 et 160-p53, semble en effet obligatoire. Cette étude privilégie donc l'hypothèse d'un effet dominant négatif de ces isoformes qui repose sur la formation de tétramères inactifs d'un point de vue transcriptionnel. L'effet dominant négatif ne se limite pas à p53 et affecte également des isoformes de p63 et p73. L'extrémité C-terminale des isoformes N joue un rôle modulateur important dans leur capacité transactivatrice. Les isoformes Np73 sont par exemple actives sur un plus grand nombre d'éléments de réponse que les isoformes Np73 et Np73. Dans ce système, seules les isoformes Np73 et Np73 exercent un effet dominant négatif sur p53, p63 et p73. Les isoformes Np63 et Np73 sont la plupart du temps désignées comme des régulateurs dominants négatifs équivalents à des mutants perte de fonction. Dans de multiples types cellulaires et sur de nombreux promoteurs de gènes cibles de p53, les isoformes N exercent un effet répresseur qui suggère une perte d'activité transactivatrice et un effet dominant négatif. Toutefois, plusieurs études rapportent une activité transactivatrice exclusive aux isoformes N371374. L'isoforme Np73 possède par exemple une activité de transactivation dépendante de la présence des 13 résidus codés par l'exon 3' et du motif riche en prolines PXXP localisé au niveau N-terminal372. Cette isoforme est capable d'induire un arrêt de prolifération cellulaire et l'apoptose dans des cellules tumorales H1299. De leur côté, 96 Chapitre I : Introduction bibliographique Tanaka et ses collaborateurs ont mis en évidence la capacité pour les isoformes Np73 d'induire l'expression de gènes cibles de NF-B dans un contexte déficient pour p53375. Cette fonction dépend de la présence du motif PXXP mais nécessite également l'extrémité C- terminale de Np73 (les variants Np73 sont incapables d'exercer cette fonction). 2. 1. 4 Régulation génique par p53 et ses homologues La liste des signaux de stress qui provoquent une accumulation de p53 est longue, et compte par exemple les stress génotoxiques (dommages à l'ADN, déplétion en dNTPs, érosion des télomères, etc. ), l'hypoxie, la privation en nutriments ou facteurs de croissance, le stress lié à la biogenèse mitochondriale, la biogenèse ribosomale, les poisons du fuseau mitotique, les chocs thermiques, les stress du réticulum endoplasmique (anomalies de repliement tridimensionnel des protéines) et l'activation d'oncogènes ou l'inactivation de gènes suppresseurs de tumeurs. Figure I-33 : Elément de réponse à p53 et détermination d'un programme transcriptionnel376, 377. Un site consensus de liaison à p53 a pu être identifié en analysant par ChIP-sequencing les séquences de 500 sites communs à plusieurs traitements activant p53. L'élément de réponse à p53 complet est constitué de deux demi-sites du type 5'-PuPuPuC(A/T)(A/T)GPyPyPy-3'. Le diagramme de Venn à droite indique la distribution des sites de liaison de p53 en réponse à différents traitements génotoxiques (la doxorubicine est un agent intercalent de l'ADN ; le 5-fluorouracile est un analogue de la pyrimidine ; les rayonnements ultraviolets) ou induisant directement l'accumulation de p53 (la nutline-3a est un inhibiteur de MDM2). Si un grand nombre de sites de liaison de p53 sont occupés en réponse à tous les traitements (environ 500), beaucoup d'autres le sont exclusivement en réponse à un ou plusieurs traitements seulement. Ceci suggère que p53 est capable de mettre en place un programme transcriptionnel adapté à des stress cellulaires particuliers. Les premières expériences visant à définir le site de liaison de p53 démontrèrent que les gènes activés par p53 contiennent deux séquences consensus consécutives de 10 bp du type 5'- PuPuPuC(A/T)(A/T)GPyPyPy-3' (Pu Purine ; Py Pyrimidine)378, 379. Chaque demi-site est formé de répétitions inversées de 5 bp appelées quartiers de sites. Plus récemment, des études 97 Chapitre I : Introduction bibliographique génomiques utilisant principalement le ChIP-sequencing ont permis de cartographier des milliers de sites de liaison à p53 qui ne sont d'ailleurs pas nécessairement suffisant pour permettre une transactivation376, 377, 380383. L'activation de la transcription par des tétramères de p53, p63 ou p73 requiert la liaison de deux dimères de domaines DBD à un élément de réponse comportant le site complet de 20 bp. Chaque dimère de p73 se fixe sur un demi-site, et chaque monomère se lie à un quartier de site. Les études structurelles sur les complexes entre les tétramères de domaines DBD de la famille p53 et leur élément de réponse ont établi que l'arrangement spatial de ces complexes suit la symétrie déterminée par la séquence ADN358. Comme le site complet de l'élément de réponse est une répétition de deux demi-sites, les deux dimères du tétramère sont positionnés à une distance de 34 l'un de l'autre, c'est-à-dire l'équivalent d'une séquence de 10 nucléotides. Et puisque chaque quartier de site est la répétition inversée du second quartier de site du même demi-site, les deux monomères de chaque dimère sont orientés avec une rotation à 180 de l'un par rapport à l'autre. Une étude publiée en 2015 a adressé la question de l'influence de chaque nucléotide du quartier de site sur l'affinité du domaine DBD de p73 à l'élément de réponse384. Elle permit de démontrer que la conservation d'une séquence 5'-CNNG-3' au centre de chaque demi-site est la caractéristique la plus déterminante pour permettre leur reconnaissance par les membres de la famille p53. Les études ayant localisé les éléments de réponse à p63 et p73 ont montré que leurs sites de liaison correspondent aux mêmes séquences consensus que pour p53. Il est toutefois apparu que les trois premières positions de chaque quartier de site tolèrent une certaine variabilité dans le ratio purine/pyrimidine, dont la fréquence préférentielle varie selon l'homologue de p53 et pourrait jouer un rôle régulateur dans la transactivation. A ce jour, les diverses études structurelles n'ont pas encore permis d'expliquer l'existence de profils transcriptionnels spécifiques de chaque homologue au sein de la famille p53. La modification des histones est nécessaire pour ouvrir la chromatine et permettre la liaison de la machinerie transcriptionnelle. L'histone acétyltransférase p300/CBP, recrutée par p53, acétyle les histones et p53 elle-même au voisinage de ses éléments de réponse385, 386. Une fois la chromatine remodelée, les composants du complexe d'initiation de la transcription peuvent être recrutés, et les gènes cibles de p53 sont transcrits. Une des questions les plus intrigantes au sujet de la famille p53 est de savoir comment ces protéines parviennent à sélectionner un programme transcriptionnel en réponse à des stress cellulaires si variés, en discriminant parmi une myriade de promoteurs ceux qui vont être régulés (cf. Figure I-33). Au 98 Chapitre I : Introduction bibliographique moins trois types de mécanismes permettent à la protéine p53 et à ses homologues de façonner un programme transcriptionnel adapté à une situation de stress cellulaire particulière : (1) l'existence d'un nombre considérable de modifications post-traductionnelles de p53 qui modulent son activité, (2) la variabilité des éléments de réponse à p53, et (3) les interactions de p53 avec différents partenaires en fonction du contexte cellulaire. La protéine p53 tolère une certaine variabilité dans la séquence des éléments de réponse reconnus, mais cette variabilité a un impact prononcé sur l'affinité de p53. Dans une étude réalisée chez la levure Saccharomyces cerevisiae, les différences de transactivation entre les sites les plus faibles et les sites les plus forts atteignent un facteur 1000387. Dans l'ensemble, les gènes cibles de p53 intervenant dans le cycle cellulaire comportent des sites plus robustes que ceux des gènes intervenant dans la mort cellulaire programmée388. Cette affinité différentielle permet à la concentration nucléaire de p53 de devenir un facteur déterminant dans la sélectivité des gènes activés et le destin de la cellule, en fonction du type de stress génotoxique auquel elle est soumise. Enfin, de multiples partenaires de liaison de p53 ou de ses homologues influencent leur capacité de liaison à l'ADN ou de recrutement de coactivateurs transcriptionnels. L'interaction sélective de p53 avec un partenaire plutôt qu'un autre dépend de son statut en termes de modifications post-traductionnelles. L'exemple le plus connu de cofacteurs de p53 lui conférant une sélectivité de promoteurs est la famille de protéines ASPP (Apoptosis- stimulating protein of p53), qui prédisposent la cellule à un phénotype apoptotique, en induisant la transactivation de bax mais pas celle de p21389. Le haut degré d'homologie partagé entre les domaines de liaison à l'ADN des membres de la famille p53 explique la capacité commune de p63 et p73 à réguler de nombreux gènes cibles de p53 (ex : p21, Puma, Noxa, Bax et Mdm2). Le répertoire complet des gènes régulés de façon commune ou exclusive reste encore à déterminer390. Au début des années 2000, le travail de plusieurs groupes de recherche conduit à définir le rôle des isoformes TAp63 et TAp73 dans la réponse à l'endommagement de l'ADN et la chimio-sensibilité des cellules cancéreuses. Leur contribution à la suppression des tumeurs ne sera établie que plus tard, après la génération de souris sélectivement déficientes pour les isoformes TAp63 ou TAp73391, 392. Le répertoire des fonctions, des voies de signalisation et des gènes régulés par p53, p63 et p73 s'est progressivement élargit bien au-delà de la suppression tumorale et du développement. Les membres de la famille p53 ont pu être impliqués dans les processus de réparation, de recombinaison et de fidélité génomique mais aussi dans le métabolisme, la reproduction et la 99 Chapitre I : Introduction bibliographique biologie des cellules souches. La compréhension incomplète des fonctions de cet ensemble de protéines, que ce soit au niveau de leur redondance fonctionnelle ou de leur hiérarchisation opérationnelle, limite actuellement le transfert rapide des connaissances acquises vers la gestion clinique des patients atteints de cancer. 2. 1. 5 p73 est-il réellement un gène suppresseur de tumeur ? Le rôle suppresseur de tumeur de p73 fut initialement contesté par deux observations. Premièrement, seul un très faible pourcentage de tumeurs humaines (inférieur à 1%) porte des mutations du gène TP73393. Ensuite, le phénotype des souris Trp73-/- (mutation du domaine DBD qui affecte toutes les isoformes de p73) ne suggère pas une implication de p73 dans le cancer. Les souris Trp73-/- meurent fréquemment in utero ou dès la naissance. Celles qui survivent meurent pour la plupart à l'âge de 4 à 6 semaines, et présentent de lourds défauts neurologiques (hydrocéphalie, dysgénésie de l'hippocampe), comportementaux, de reproduction (perte de détection des phéromones), ainsi que des affections inflammatoires. Ces observations ont prévalu sur les résultats d'études in vitro qui soutenaient par exemple une transformation oncogénique potentialisée des MEFs (Mouse embryonic fibroblasts) Trp53-/- ; TAp73-/- ou démontraient la capacité pour les isoformes TAp73 de déclencher l'arrêt du cycle cellulaire, la sénescence ou l'apoptose en réponse à un endommagement de l'ADN, en promouvant la transcription de nombreux gènes cibles de p53 (cf. Figure I-34)394, 395. Les premiers travaux ayant établi le rôle des isoformes TAp73 comme des protéines faisant partie, avec p53 et les isoformes TAp63, d'un réseau intégré de suppresseurs de tumeurs, ont concerné des souris porteuses d'une mutation hétérozygote pour p53 et p73, et des souris sélectivement déficientes pour les isoformes TAp73. En comparaison avec les souris (Trp73 / ; Trp53 /-), les souris (Trp73 /- ; Trp53 /-) développent des tumeurs dont le phénotype est significativement plus agressif396. En 2008, la caractérisation du phénotype des souris TAp73-/- fut décisive dans la démonstration de la fonction suppresseur de tumeurs de ces isoformes392. Ces souris présentent des prédispositions à la tumorigenèse spontanée (avec une forte incidence d'adénocarcinomes pulmonaires) et à la tumorigenèse induite par un oncogène. Ces animaux sont infertiles mais, à la différence des souris Trp73-/-, ce ne sont pas des défauts sensoriels et hormonaux contribuant à un comportement reproducteur défaillant qui en sont la cause, car ces animaux s'accouplent normalement. L'année suivante, une étude présentée par la même équipe montra que les isoformes TAp73 participent à l'assemblage correct des fuseaux mitotique et 100 Chapitre I : Introduction bibliographique méiotique requis pour assurer un alignement chromosomique approprié dans les cellules en division. Les isoformes TAp73 peuvent se lier et réguler l'activité des sérine/thréonine kinases Bub1 et BubR1 (Budding uninhibited by benzimidazoles 1/R1), des composants essentiels du point de contrôle d'assemblage du fuseau mitotique qui assurent la fidélité du processus de ségrégation des chromosomes397. Ces résultats, auxquels s'ajoutent des observations précédentes impliquant les isoformes TAp73 dans le contrôle du cycle cellulaire et la prévention des aneuploïdies, attribuent clairement un rôle de ces protéines dans le maintien de l'intégrité génomique dans de multiples tissus398, 399. Figure I-34 : Modèle de régulation de l'apoptose par les membres de la famille p53356. Suite à un endommagement de l'ADN, p53 et les isoformes TAp63/73 peuvent activer à la fois la voie des récepteurs à domaine de mort et la voie mitochondriale de l'apoptose. Les isoformes Np63/73 exercent un effet dominant négatif sur les isoformes transcriptionnellement actives de la famille et se comportent donc comme des inhibiteurs de ces deux voies de déclenchement de l'apoptose. Les femelles TAp73-/- présentent un déficit d'ovulation, et des anomalies dans l'organisation du fuseau des ovocytes apparaissent très fréquemment, ce qui aboutit à un échec de l'implantation de l'embryon. De façon intéressante, le vieillissement naturel abolit l'expression des isoformes TAp73 dans les ovocytes, suggérant que la perte d'expression de 101 Chapitre I : Introduction bibliographique ces isoformes pourrait être impliquée dans l'échec du développement normal à partir des ovocytes âgés392. S'agissant de l'infertilité des souris mâles TAp73-/-, elle est la conséquence de la perte massive et prématurée de cellules germinales, elle-même causée par une rupture des contacts cellule-cellule entre les cellules germinales en développement et leurs cellules nourricières, les cellules de Sertoli, ce qui entrane un arrêt de la spermiogenèse400, 401. Ces travaux démontrent la fonction suppresseur de tumeurs des isoformes TAp73. Ils suggèrent également une implication des isoformes Np73 dans l'oncogenèse et l'importance d'un équilibre approprié entre les isoformes TAp73 et Np73 pour permettre le maintien de l'intégrité génomique des cellules en cours de prolifération. Tandis que les isoformes TA sont généralement considérées comme des suppresseurs de tumeur, leurs alter egos N se comportent comme des facteurs oncogéniques dans de nombreuses situations402, 403. Le modèle qui est aujourd'hui le plus accrédité repose sur un déséquilibre entre les isoformes TA et N qui mènerait à la tumorigenèse en empêchant les isoformes transcriptionnellement actives d'exercer leurs fonctions de suppresseurs de tumeurs. Le rôle oncogénique des isoformes Np73 est supporté par un grand nombre d'études faites in vitro et in vivo. Par exemple, la surexpression de Np73 dans des fibroblastes augmente leur capacité proliférative404. Elle facilite aussi leur transformation grâce à une coopération avec les oncogènes Ras, c-Myc et E1A, et elle augmente leur tumorigénicité395, 405. A l'opposé, les MEFs et thymocytes Np73-/- présentent une sensibilité accrue à divers agents génotoxiques (rayonnements , étoposide, doxorubicine ou cisplatine), suggérant que ces cellules entrent plus facilement en apoptose suite à un endommagement de l'ADN406. Enfin, les souris transgéniques exprimant Np73 au niveau hépatique développent spontanément des adénomes et carcinomes hépatocellulaires407. Différents mécanismes contribuent au potentiel oncogénique de Np73. Les isoformes Np73 forment des homotétramères ou des hétérotétramères avec les autres membres de la famille p53, et exercent un effet dominant négatif sur p53, TAp63 et TAp73, en entrant en compétition avec eux pour la liaison aux mêmes éléments de réponse dans le promoteur de gènes cibles408, 409. De plus, les isoformes Np73 promeuvent l'hyperphosphorylation de la protéine du rétinoblastome (Rb) par les complexes Cycline E-CDK2 et Cycline D-CDK4/6. De cette façon, le facteur de transcription E2F échappe à sa séquestration par Rb, ce qui aboutit à la progression du cycle cellulaire410. Le ratio d'expression TAp73/Np73 est, de façon remarquable, profondément altéré dans de nombreuses tumeurs411, 412. La surexpression des isoformes Np73 ou Ex2p73 et 102 Chapitre I : Introduction bibliographique Ex2/3p73 a pu être observée dans des tumeurs du sein et des ovaires, dans des cancers de la prostate et des mélanomes, des neuroblastomes et des carcinomes hépatocellulaires409, 413418. Elle confère un avantage prolifératif et augmente le potentiel tumorigénique des cellules cancéreuses, en plus d'être associée à un mauvais pronostic et à une réduction de l'efficacité des chimiothérapies414, 417, 419, 420. Dans la plupart des cas, cette surexpression est associée à un mauvais pronostic avec un échec des thérapies, une chimiorésistance, la formation de métastases et une invasion vasculaire403. Les niveaux d'expression des isoformes TAp73 et Np73 semblent ainsi pouvoir prédire l'efficacité des chimiothérapies. La récente découverte de fonctions métaboliques des membres de la famille p53 a aussi des implications en cancérologie421, 422. Les cellules cancéreuses reprogramment le métabolisme cellulaire afin de satisfaire leurs besoins croissants en énergie et en macromolécules, et pour assurer le maintien de leur homéostasie redox. Le programme métabolique de ces cellules est marqué par une augmentation de l'absorption de glucose et de glutamine pour soutenir la croissance cellulaire. La plupart du glucose importé par les cellules est métabolisé lors de la glycolyse ou sert à alimenter la voie d'oxydation des pentoses phosphates, tandis que la glutamine sert à la fois de source d'azote pour la biosynthèse de nucléotides et de divers acides aminés non essentiels et de source importante de carbone pour le réapprovisionnement en intermédiaires du cycle de Krebs. TAp73, mais pas p53 ni p63, induit spécifiquement la transcription de la G6PD (Glucose-6-phosphate dehydrogenase), l'enzyme limitante dans la voie des pentoses phosphates. Cette voie métabolique permet la production de NADPH (biosynthèse des acides gras et du cholesterol et réduction du glutathion), de ribose-5-phosphate (synthèse des nucléotides) et d'érythrose-4-phosphate (précurseur des acides aminés aromatiques). De façon intéressante, les isoformes Np73 et les formes mutées de p53 n'inhibent par l'activation de la G6PD par TAp73, ce qui suggère que ce mécanisme pourrait rester opérant dans les cellules tumorales423. 2. 2 Contrôle de l'activité et de l'expression de p73 2. 2. 1 Régulation des fonctions de p73 Les protéines de la famille p53 sont régulées spatialement et temporellement par un très grand nombre de modifications post-traductionnelles et d'interactions protéine-protéine qui régulent leur niveau d'expression et leur activité. 103 Chapitre I : Introduction bibliographique L'activité de p53 dépend surtout de mécanismes post-traductionnels qui stabilisent la protéine et augmentent son activité transcriptionnelle. Le principal mécanisme contrôlant l'abondance et l'activité de p53 implique l'E3 ubiquitine ligase à domaine RING finger appelée MDM2 (Mouse double minute 2). Elle exerce son effet inhibiteur en se liant directement à p53, ce qui inhibe à la fois son activité transcriptionnelle et provoque sa dégradation par le protéasome424, 425. MDM2 fait partie des cibles induites par p53, et cette boucle régulatrice constitue un oscillateur cellulaire qui régule les niveaux de p53 et de MDM2 en réponse à une série de stress cellulaires. L'accumulation de p53 en réponse à un endommagement de l'ADN a lieu suite à sa phosphorylation, qui la rend résistante à sa dégradation induite par MDM2 et permet son interaction avec des coactivateurs transcriptionnels. D'autre part, p53 fut la première protéine n'appartenant pas à la famille des histones à avoir été identifiée comme substrat des histone acétyltransférases (HATs)386. Figure I-35 : Principales modifications post-traductionnelles de p73426. Représentation schématique de la localisation des modifications post-traductionnelles jouant un rôle clé dans le contrôle de l'activité de p73 (P phosphorylation ; Ac acétylation ; SUMO sumoylation). Sont également indiqués le résidu ciblé par la modification et la protéine qui en est responsable. La phosphorylation de p73 par des kinases et son acétylation par des HATs est également essentielle dans la régulation de son activité et de sa stabilité. Ces modifications post- traductionnelles ont des conséquences importantes sur le répertoire d'interactions protéine- protéine de p73, et certaines altèrent sa localisation subcellulaire. Mais contrairement à p53, l'activation de p73 a d'abord lieu au niveau transcriptionnel. Dans la voie de réponse aux dommages à l'ADN, le facteur de transcription E2F1 est acétylé par PCAF (p300/CBP- associated factor), et phosphorylé par les kinases des points de contrôle du cycle cellulaire Chk1/2 (Checkpoint kinases 1/2). Ces évènements contribuent à sa stabilisation, et E2F1 se fixe 104 Chapitre I : Introduction bibliographique alors au promoteur P1 de p73 pour induire l'expression des isoformes TAp73427429. Par ailleurs, de multiples kinases de la voie de réponse aux dommages à l'ADN interviennent lors de la stabilisation et de l'accumulation des isoformes TAp73 suite à un traitement chimiothérapeutique, comme les sérine/thréonine kinases ATM (Ataxia telangiectasia mutated) et ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3-related) qui sont recrutées au niveau des sites endommagés et interviennent en amont de Chk1/2, ainsi que de la MAPK JNK 427, 430. A la différence de p53, un évènement initial de phosphorylation de p73 médié par la tyrosine kinase c-Abl est nécessaire pour permettre son accumulation431434. Cette première phosphorylation fait office de prérequis à une série d'autres modifications régulant l'état d'activation de p73 (cf. Figure I-35). La MAPK p38 est aussi activée par c-Abl lors d'un endommagement de l'ADN, elle contribue à stabiliser la protéine p73 par phosphorylation435. La prolyl isomérase PIN1 reconnait des résidus sérine et thréonine phosphorylés par p38 et joue le rôle d'adaptateur dans l'interaction de p73 avec p300. L'acétylation de résidus lysine de p73 par p300 ne se produit qu'en réponse à un endommagement de l'ADN (ex : traitement avec de la doxorubicine)436. La phosphorylation de p73 se produit par ailleurs également au cours du cycle cellulaire. Les kinases dépendantes des cyclines CDK2/CDK1 phosphorylent p73 durant les phases G2 et M en interagissant avec les cyclines A et B, ce qui entrave l'activité transcriptionnelle de p73 et garantit la progression du cycle cellulaire437. Par contraste, la PKC phosphoryle et augmente l'activité du second domaine transactivateur de p73 (acides aminés 381-399), qui est uniquement impliqué dans la progression du cycle cellulaire438. De façon remarquable, la PKC est clivée par la caspase-3 au cours de l'apoptose, et le fragment généré acquiert la capacité de phosphoryler p73 spécifiquement sur son résidu Ser289, ce qui augmente son activité proapoptotique439. Par l'intermédiaire de son extrémité N-terminale, les isoformes TAp73 interagissent avec le domaine CH1 de deux coactivateurs transcriptionnels, p300 et CBP, qui augmentent leur activité transcriptionnelle. La protéine MDM2, qui est la principale E3 ubiquitine ligase contrôlant la stabilité de p53, entre en compétition avec p300/CBP pour la fixation à p73 au niveau de la même région protéique (cf. Figure I-36)440. De façon intéressante, l'interaction de MDM2 avec l'extrémité N-terminale de p73 n'affecte pas sa stabilité, mais elle est un prérequis à sa neddylation (conjugaison de polypeptides NEDD8 selon un mécanisme proche de l'ubiquitination), qui retient les isoformes TAp73 dans le cytosol et les rend inactives441444. Il faut aussi remarquer que tout comme p53, p73 peut induire l'expression de MDM2 et ainsi 105 Chapitre I : Introduction bibliographique exercer un rétrocontrôle négatif sur sa propre activité. La première E3 ubiquitine ligase ciblant p73 à avoir été identifiée est Itch. Elle possède un domaine HECT et appartient à la famille de NEDD4 (Neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4). En se liant à p73 au niveau de son motif riche en prolines (PPPY), elle déclenche sa polyubiquitination et son adressage au protéasome445. Le coactivateur transcriptionnel YAP1 (Yes-associated protein 1), qui est un intervenant clé dans la voie de signalisation Hippo, entre en compétition avec Itch pour la fixation au même motif riche en prolines de p73, ce qui stabilise cette dernière446. Des travaux plus récents indiquent également que l'activité MDM2 est requise pour permettre la dégradation de p73 dépendante de Itch dans des MEFs447. De manière intéressante, l'enzyme NQO1, qui est induite suite à l'activation de Nrf2, se lie à p73 et empêche sa dégradation par le protéasome 20S448. Un autre exemple de contrôle compétitif de l'activité de p73 implique son interaction avec c-Myc, qui est un puissant inhibiteur de son activité transactivatrice et un compétiteur de MM1 (Myc modulator 1) pour la fixation à p73449. La protéine YAP1 est aussi un coactivateur transcriptionnel de p73 bien caractérisé, qui est dépourvu de domaine de liaison à l'ADN mais comporte un domaine WW transactivateur450. La kinase Akt contrôle strictement l'activité de YAP1 en la phosphorylant, ce qui la relocalise dans le cytosol o elle est inactive451. Figure I-36 : Sites d'interaction des protéines modulant la stabilité et/ou l'activité de p73426. Les résidus essentiels dans ces interactions sont indiqués dans les apostrophes, et la localisation des domaines est indiquée entre parenthèses. 106 Chapitre I : Introduction bibliographique 2. 2. 2 Expression différentielle des isoformes de p73 Il y a relativement peu de connaissances concernant les mécanismes responsables du différentiel d'expression entre les isoformes TA et N dans les différents tissus et les différentes conditions physiopathologiques. La transcription des isoformes TAp73 à partir du promoteur P1 est principalement contrôlée par le facteur de transcription E2F1, mais aussi par certains autres facteurs comme ZEB (Zinc finger E-box-binding homeobox) et YY1 (Yin Yang 1)452455. La régulation du promoteur interne P2 est loin d'être clarifiée, mais plusieurs travaux indiquent de façon très intéressante que p53 et TAp73 peuvent induire spécifiquement l'expression de leurs propres antagonistes que sont les isoformes Np73 en se liant à un élément de réponse à p53 situé dans ce promoteur368, 456458. La protéine p53 et les isoformes TAp73 peuvent ainsi activer directement la transcription des isoformes Np73459, 460. L'éventail d'interactions fonctionnelles entre ces régulateurs et les différentes isoformes de la famille p53 n'est pas entièrement caractérisé. Cependant, il est établi que certains facteurs régulent de façon différentielle les niveaux protéiques des isoformes TAp73 et Np73, notamment lors d'un stress génotoxique. Ainsi, l'E3 ubiquitine ligase à domaine RING-H2 nommée PIR2 (p73-induced ring finger protein 2), qui est induite par p53, entranent la dégradation préférentielle des isoformes Np73, ce qui permet aux isoformes TAp73 d'accomplir le programme apoptotique en réponse à des dommages à l'ADN461. La kinase JNK stabilise quant à elle spécifiquement les isoformes TAp73 par une phosphorylation directe et par l'activation du facteur de transcription c-Jun, qui induit l'expression de YAP1462, 430, 463. 2. 3 Fonctions exclusives de p63 et p73 dans le développement De façon très frappante, et bien que les protéines de la famille p53 partagent de nombreuses similarités de séquences, de structures et de fonctions, les conséquences de leur invalidation génétique in vivo sont très différentes. En effet, p63 et p73 exercent toutes deux des fonctions qui leur sont exclusives et qui se manifestent dans le phénotype des souris knockout. Par exemple, si l'importance capitale de la protéine p73 a dernièrement été illustrée dans la régulation du processus d'angiogenèse464467, ses fonctions exclusives dans le développement furent, comme pour p63, les premières à avoir été mises en évidence. 107 Chapitre I : Introduction bibliographique 2. 3. 1 p63 dans le développement des épithéliums et des tissus d'origine ectodermique Le rôle essentiel de p63 dans le développement de la peau et des épithéliums est désormais bien caractérisé. Les souris Trp63-/- sont atteintes de sévères malformations des membres et d'anomalies dans le développement des épithéliums (en particulier l'épithélium cutané), elles ne survivent pas plus de quelques heures après la naissance351, 352. Les principales fonctions de p63 concernent le maintien du potentiel prolifératif des cellules progénitrices de l'épiderme468. En effet, le réservoir de cellules prolifératives de la peau des souris Trp63-/- subit une déplétion progressive, ce qui se traduit par une hypoplasie sévère du tissu dermique néonatal. Ces souris activent également un programme de sénescence cellulaire qui provoque un vieillissement accéléré469. Plus précisément, ce sont les isoformes TAp63 qui préviennent le vieillissement prématuré des tissus, en maintenant le pool de précurseurs dermiques et épidermiques470. Elles permettent aussi la mise en place d'une stratification de l'épiderme471. Quant aux isoformes Np63, elles sont requises pour engager les progéniteurs kératinocytes en voie de différenciation et assurer les stades terminaux de la morphogenèse472. Plusieurs études ayant fait appel à des souris sélectivement déficientes pour les isoformes TAp63 ou Np63 suggèrent que les isoformes Np63 sont importantes pour le maintien du potentiel prolifératif des cellules de la couche basale, tandis que les isoformes TAp63 contribuent à des stades plus tardifs de la différenciation dans les kératinocytes matures473, 474. Dans la liste des gènes cibles de p63 déjà validés expérimentalement, se trouvent des gènes impliqués dans l'apoptose (ex : Fas, Noxa, Bax), le cycle cellulaire (ex : p21, p57, 14-3-3), l'adhésion (ex : Bpag1, Evl, Perp, Ita3-6, Laminin), le développement (ex : Notch, Bmp7, -catenin) et la différenciation (Ikk, Gata-3, Ets-1). Des mutations germinales de TP63 existent chez les humains et causent le développement de maladies rares autosomiques dominantes, comme le syndrome EEC (ectrodactylie, dysplasie ectodermique, fente labio-palatine), le syndrome de Hay-Wells ou encore le syndrome de Rapp- Hodgkin475. Ces syndromes affectent le développement des différents organes d'origine ectodermique ou dérivant de l'interaction entre l'ectoderme en cours de développement et le mésoderme. Ils se caractérisent cliniquement par des dysplasies ectodermiques touchant la peau, la chevelure, les ongles, et les dents, et s'accompagnent fréquemment de malformations des mains ou des pieds, et de la présence d'une fente labio-palatine. Les patients atteints du syndrome EEC sont en outre affectés par un dimorphisme facial, des anomalies des canaux 108 Chapitre I : Introduction bibliographique lacrymaux, des problèmes urogénitaux et un retard de développement476. Collectivement, la prévalence de ces dysplasies ectodermiques est estimée à 7 cas pour 10000 naissances. Dans la plupart de ces cas, les mutations de TP63 donnent lieu à des substitutions d'acides aminés dans le domaine DBD de p63 qui abolissent sa capacité de liaison à l'ADN, ou bien conduisent à des décalages de la phase ouverte de lecture qui tronquent les isoformes de type . Enfin, des mutations faux sens affectent spécifiquement le domaine SAM de p63 (domaine compact d'interaction protéine-protéine à structure globulaire) chez les patients atteints du syndrome de Hay-Wells. 2. 3. 2 p73 dans le développement et la maintenance du système nerveux central De leur côté, les souris knockout pour p73 présentent de sévères anomalies du développement cérébral. A la naissance, les souris Trp73-/- présentent une dysgénésie de l'hippocampe causée par une perte massive des neurones sympathiques situés dans le ganglion cervical supérieur (environ 40% par apoptose)477. Cette dysgénésie se caractérise par une organisation anormale de la couche de cellules pyramidales et du gyrus denté. Bien qu'affichant un retard de croissance important, ces souris sont viables mais meurent pour la plupart à l'âge de 4 semaines environ, et seul le quart d'entre elles atteignent l'âge adulte. Elles développent alors une hydrocéphalie congénitale, liée à une surproduction ou à un défaut de réabsorption du liquide cérébro-spinal, qui peut progresser de façon marquée et provoquer une expansion importante des ventricules latéraux, une compression du cortex et des saignements intraventriculaires. Des défauts de perception des phéromones provoquent aussi chez elles des d'anomalies du comportement social et reproducteur353. Les défauts neuronaux se manifestant chez les souris Trp73-/- révèlent le rôle déterminant de p73 dans les cellules neuronales en développement ainsi que dans le système nerveux mature pour le maintien à long terme des neurones adultes. L'effet prosurvie de p73 au cours du développement du système nerveux a pu être attribué à l'expression prédominante des isoformes Np73 antiapoptotiques dans le cerveau en développement et les ganglions sympathiques, o ils font office de facteurs de survie477. Ainsi, en réponse à une privation en NGF (Nerve growth factor) des cellules du ganglion cervical sympathique, les niveaux d'expression des isoformes Np73 déclinent de façon spectaculaire, ce qui permet aux neurones d'entrer en apoptose478. L'implication de p73 dans la survie 109 Chapitre I : Introduction bibliographique neuronale a aussi été décrite chez des souris adultes, dont les neurones acquièrent des mécanismes de survie se basant sur une augmentation du ratio d'expression entre les isoformes Np73 et p53479. Ceci explique la perte massive de neurones corticaux du système nerveux sympathique observée chez les souris Trp73-/- adultes, qui se traduit par un amincissement des hémisphères corticaux et un élargissement des ventricules480. Par analogie, la densité neuronale dans le cortex moteur des souris Np73-/- est significativement réduite environ 10 mois après leur naissance, et progresse avec des signes de neurodégénérescence481. La forte réduction du nombre de neurones voméro-nasaux explique également l'incapacité de ces souris à détecter les phéromones. Bien que les souris TAp73-/- présentent des défauts neurologiques moins sévères (épaisseur du cortex normale), elles sont aussi atteintes d'anomalies du développement cérébral. Un déficit de neurogenèse dans la zone subgranulaire du gyrus denté, une structure majeure de l'hippocampe, est à l'origine de la dysgénésie de l'hippocampe observée chez ces souris. Ce phénotype suggère que les isoformes TAp73 sont critiques dans le maintien du potentiel prolifératif des cellules souches neurales et la persistance mémorielle482, 483. Enfin, la protéine p73 ne régule pas simplement la mort cellulaire mais elle participe aussi activement à la différenciation neuronale via les isoformes TAp73, vraisemblablement en antagonisant la signalisation juxtacrine du récepteur Notch484, 485. Dernièrement, après avoir remarqué les ressemblances frappantes entre le phénotype des souris Foxj1-/- (le principal gène régulateur de la ciliogenèse) et celui des souris Trp73-/-, deux groupes de recherche ont examiné l'implication éventuelle de p73 dans la multiciliogenèse486. En effet, les cils cellulaires sont des organelles spécialisées présentes à la surface de nombreux épithéliums, et des anomalies de ces structures conduisent au développement de ciliopathies se caractérisant notamment par une hydrocéphalie sévère, des affections respiratoires, des otites et un infertilité487. Leurs travaux désignent p73, et plus particulièrement les isoformes TAp73, comme un facteur de transcription central dans la multiciliogenèse. Ils fournissent une explication unificatrice à la variété de défauts observés chez les souris Trp73-/-. Chez les souris Trp73-/- et TAp73-/-, sont ainsi observées une raréfaction très significative du nombre de cils et une réduction importante de leur taille dans de nombreux tissus : épithéliums mucociliaires (oreille moyenne et sinus), épithéliums respiratoires (trachée et bronchioles), tubes séminifères (testicules), épithélium de l'oviducte (trompes de Fallope) (cf. Figure I-37)488. Grâce à l'utilisation d'une technique de séquençage à haut débit (RNA-Sequencing), un ensemble de 50 gènes requis dans la formation et la motilité des cils se sont révélés être affectés par l'absence d'expression de p73 (dont le facteur de transcription Foxj1)489. 110 Chapitre I : Introduction bibliographique Figure I-37 : p73 est un régulateur central de la multiciliogenèse488. L'analyse histologique de différents épithéliums des souris Trp73-/-, effectuée après un marquage avec l'hématoxyline et l'éosine (H & E, les flèches indiquent la présence de cils), et des marquages immunofluorescents de l'-tubuline (en vert) et de p73 (en rouge), révèle une disparition complète des cellules multiciliées et fournit par la même occasion une explication unificatrice au phénotype de ces souris (inflammation des muqueuses, infections respiratoires chroniques, hydrocéphalie, stérilité, etc. ). 2. 4 Rôles émergents de p53 et p73 dans l'immunité L'importance capitale de p53 comme gène suppresseur de tumeur a conduit des chercheurs du monde entier à investiguer ses fonctions et modes d'action aux niveaux moléculaire, cellulaire et de l'organisme, en se focalisant essentiellement sur les voies de contrôle du cycle cellulaire, de l'apoptose et de réponse aux dommages à l'ADN. Depuis quelques années cependant, il apparait un nombre grandissant de preuves d'une implication de p53 dans les fonctions immunes. La protéine p53 prévient notamment les réactions inflammatoires incontrôlées et est nécessaire au maintien des mécanismes de tolérance immunitaire au soi, de telle sorte que sous bien des aspects elle pourrait aussi bientôt être considérée comme un gardien de l'intégrité immune 490. 111 Chapitre I : Introduction bibliographique 2. 4. 1 p53 dans l'immunité antivirale et la réponse aux IFNs de type I La libération locale d'interférons (IFNs), une classe de cytokines servant de signaux intercellulaires, est l'une des principales stratégies de défense mise en place par le système immunitaire de l'hôte lors d'une infection virale. Les IFNs induits par les virus sont produits de façon prédominante par des cellules de la lignée monocytaire, et sont détectés par les cellules épithéliales qui expriment à la membrane des récepteurs aux IFN-/. L'engagement de ces récepteurs active la voie de signalisation JAK-STAT qui aboutit à l'induction de nombreux gènes comportant des éléments de réponse ISRE (IFN-stimulated response element). Les gènes stimulés par les IFNs (ISGs) servent de médiateurs dans la réponse immune, et sont par exemple capables d'élaborer une réponse antivirale en bloquant l'infection virale, en inhibant la réplication et en dégradant le génome viral. Figure I-38 : Rôles de p53 dans l'immunité antivirale490. La protéine p53 est activée en réponse aux IFNs de type I en raison de la présence d'éléments de réponse ISRE localisés dans la séquence promotrice du gène p53. En plus de promouvoir l'expression de gènes responsables de l'arrêt du cycle cellulaire et de l'apoptose, plusieurs gènes dirigeant la production d'IFNs ou contrôlant leur voie de signalisation sont aussi directement activés par p53 (ex : IRF5, IRF9, TLR3, ISG15). Une boucle de rétrocontrôle positif est donc mise en place entre p53 et la voie de signalisation des IFNs de type I, avec de fortes implications dans les réponses immunes (en particulier contre les infections virales). 112 Chapitre I : Introduction bibliographique L'intégration de la signalisation par les IFN/ dans les réponses antitumorales et antivirales médiées par p53 fut démontrée pour la première fois en 2003 avec la mise en évidence d'un cross-talk entre ces deux voies de signalisation : p53 est transcriptionnellement induite par les IFNs de type I en cas de stress oncogénique et lors d'une infection virale491. Le promoteur du gène TP53 contient un élément ISRE fonctionnel, et TP53 peut par conséquent être considéré comme un ISG491, 492. De plus, la découverte que p53 puisse induire l'expression d'autres ISGs et ainsi amplifier la réponse intracellulaire aux IFNs fournit une perspective nouvelle à ses fonctions dans le système immunitaire : initialement considérée comme un effecteur situé en aval et permettant d'initier une réponse antiproliférative lors d'une infection virale, p53 se révélait être un médiateur central dans la réponse immune innée globale (cf. Figure I-38). Les ISGs ne contenant pas de site consensus de liaison à p53, leur induction se fait nécessairement de façon indirecte. Le groupe de Munoz-Fontela a identifié IRF9 (IFN regulatory factor 9) comme étant une des cibles directes de p53493. IRF9 fait partie du complexe ISGF3, qui induit l'expression de gènes comportant des éléments ISRE. Il pourrait s'agir du lien mécanistique reliant p53 à l'induction d'ISGs. De même, plusieurs autres inducteurs de l'expression d'ISGs stimulés par les IFNs ont pu être identifiés comme des gènes cibles de p53, dont IRF5 (Interferon regulatory factor 5) et TLR3 (Toll-like receptor 3)494, 495. Ces derniers induisent la production de plusieurs cytokines et chimiokines comme les IFN/, CCL2/MCP- 1 (Monocyte chemoattractant protein-1), CSF1 (Colony stimulating factor 1) et l'IL-15, qui assurent la migration et le recrutement de cellules dendritiques et de monocytes activés496. Pour échapper à l'immunité antivirale de l'hôte et rendre ses cellules plus permissives à l'infection, de nombreux virus ont acquis au cours de l'évolution des mécanismes d'abrogation de l'activité de p53 (ex : SV40, papillomavirus, herpèsvirus du sarcome de Kaposi, adenovirus, poliovirus, etc. )497, 498. 2. 4. 2 Contrôle des réponses inflammatoires par p53 Différentes cibles de p53 ont été identifiées au sein des voies impliquées dans la détection de pathogènes, la production de cytokines et l'inflammation499. Si p53 est une molécule centrale dans la réponse aux signaux de stress intrinsèques, NF-B est un composant central dans la réponse aux signaux de stress extrinsèques (infections, cytokines, etc. ), qui active des gènes des 113 Chapitre I : Introduction bibliographique réponses immunes innée et adaptative. Un certain nombre d'études faites in vitro indiquent une compétition entre ces deux protéines : p53 se révèle être un suppresseur du potentiel transactivateur de NF-B500. Dans des cellules LNCaP (carcinome de la prostate humain), l'utilisation d'un dominant négatif de p53 pour réprimer la protéine p53 permet d'augmenter l'induction d'une grande proportion de gènes (environ 50%) induits en réponse au TNF-. NF- B étant l'un des principaux effecteurs de la signalisation dépendante du TNF-, ces résultats suggèrent en effet que p53 pourrait inhiber l'activité transcriptionnelle de NF-B de façon généralisée. Cette hypothèse est confortée par des expériences démontrant que p53 WT, mais pas la forme mutante inactive de p53 (R175H), réprime l'activité de promoteurs comportant des sites de liaison à NF-B. En 2005, une étude chercha à déterminer si ce phénomène se produit également in vivo, ce qui devrait se répercuter au niveau de l'induction de la réponse inflammatoire501. En comparant la réponse de souris WT et Trp53-/- à un traitement avec du LPS, elle permit de mettre en évidence une plus forte induction de nombreuses cytokines proinflammatoires, chimiokines et récepteurs de chimiokines dans le thymus des souris Trp53-/- (dont l'IL-1, l'IL- 6, l'IL-12, le TNF-, CCR2 et CCR5). L'exacerbation de la réponse inflammatoire chez les souris déficientes en p53 est à l'origine d'une hypersensibilité au choc septique induit par le LPS, qui se traduit par un endommagement accéléré des tissus et une plus forte mortalité. Enfin, l'injection intrapéritonéale de LPS ou de thioglycolate entraine un recrutement plus important de macrophages et une clairance retardée des neutrophiles chez les souris Trp53-/-. L'antagonisme entre p53 et NF-B se manifeste aussi dans le contrôle du métabolisme. L'amplification des réponses immunes est un processus qui repose sur une sélection et une expansion clonale de certains types cellulaires produisant de grandes quantités de cytokines. Comme NF-B conduit ces processus cellulaires qui impliquent la réplication, il peut se comporter comme un oncogène en cas de surexpression. En effet, la division des lymphocytes B et T et la réponse inflammatoire utilisent, tout comme les cellules cancéreuses ou le processus de cicatrisation, des voies métaboliques conduisant à l'effet Warburg. Ce phénomène se caractérise par une forte intensification du processus de glycolyse, qui devient utilisée préférentiellement pour générer de grandes quantités d'énergie et fournir assez de substrats pour permettre une fréquence de division élevée. Dans ces cellules pourtant non privées d'oxygène, une réorientation du métabolisme glucidique est opérée, le pyruvate étant utilisé comme substrat pour la fermentation lactique plutôt que dans le cycle de Krebs. De très hauts niveaux 114 Chapitre I : Introduction bibliographique de NADH sont générés pour tempérer ce système hautement aérobie qui produit beaucoup de ROS. Les réponses immunes emploient donc NF-B pour modifier les voies métaboliques et diriger la division cellulaire, dans le but de mettre en place la sélection clonale. De façon intéressante, p53 agit de façon opposée. La protéine p53 induit l'expression de TIGAR (TP53- inducible glycolysis and apoptosis regulator), aussi connue sous le nom de fructose-2, 6- bisphosphatase, qui ralentit le rythme de la glycolyse. p53 induit aussi l'expression de SCO2 (Short chain alcohol oxidase), qui permet l'assemblage des sous-unités de la cytochrome c oxydase et augmente le fonctionnement de la phosphorylation oxydative (consommation des substrats, baisse de la consommation de glucose, et hausse de l'efficacité de la production d'énergie)421. Il existe ainsi une relation antagoniste et réciproque entre p53 et NF-B en ce qui concerne le contrôle de la prolifération cellulaire et du métabolisme. Figure I-39 : Potentialisation de la réponse des récepteurs TLR par p53499. Les agents anticancéreux qui induisent un stress chromosomique (ex : rayonnements ionisants, doxorubicine, 5-fluorouracile) provoquent une accumulation de p53, qui potentialise l'expression de la plupart des récepteurs TLR et la réponse inflammatoire, ce qui participe aussi à l'immunité antitumorale. Les mutants perte de fonction de p53, à la différence des mutants de changement de son spectre d'activités, perdent cette capacité à induire l'expression des TLR. Certains agents chimiques (ex : nutline-3, RITA) peuvent toutefois rétablir la fonctionnalité de p53 et ainsi restaurer cette boucle amplificatrice. Une autre interaction entre p53 et le système immunitaire inné a récemment été mise à jour, avec la découverte que les changements d'expression ou d'activité de p53 dans des lignées primaires et tumorales humaines affectent l'expression de la plupart des TLR (cf. Figure I- 115 Chapitre I : Introduction bibliographique 39)494, 502504. Les TLRs sont exprimés dans plusieurs types cellulaires du système immunitaire incluant les splénocytes, les lymphocytes T et B, les cellules dendritiques et les macrophages. Ces récepteurs sont des glycoprotéines membranaires qui reconnaissent une variété de motifs moléculaires associés à des agents pathogènes. Des dérégulations de l'expression et de l'activité des TLRs sont associées au développement de maladies auto-immunes et de maladies inflammatoires chroniques, telles que le lupus érythémateux systémique, les maladies inflammatoires de l'intestin, les diabètes de type I, la sclérose en plaque et la polyarthrite rhumatoïde505. Tous les gènes codant pour les récepteurs TLR humains contiennent dans leur promoteur au moins un demi-site canonique de l'élément de réponse à p53. Dès lors, l'induction de dommages chromosomiques chez des individus sains (traitement avec la nutline-3, la doxorubicine ou avec des rayonnements ionisants) modifie le profil d'expression de tous les TLR dans plusieurs types cellulaires comme les lymphocytes du sang périphérique et les macrophages alvéolaires, et cela de façon dépendante de p53. De façon surprenante, l'analyse phylogénétique des promoteurs des TLR révèle que la régulation de l'expression des TLR par p53 semble réservée aux primates. 2. 4. 3 p53 dans le contrôle de l'autoimmunité et de l'immunité antitumorale Les maladies auto-immunes sont généralement caractérisées par des niveaux élevés de lymphocytes B et T auto-réactifs et impliquent des réponses immunes adaptatives dirigées contre des antigènes du soi. Ces récentes années ont vu émerger une accumulation de travaux suggérant que le dysfonctionnement de p53 peut aboutir au développement de maladies auto- immunes506508. La présence de mutations de TP53 et d'anticorps sériques dirigés contre p53 a été rapportée chez des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, de lupus érythémateux systémique, de la maladie de Graves Basedow (maladie auto-immune de la thyroïde) et d'hépatite auto-immune509, 510. Comme précédemment évoqué, la protéine p53 réprime la transactivation de promoteurs comportant des éléments de réponse à NF-B et la transcription de certains gènes induits par le TNF-511. De cette façon, la déficience en p53 dans les macrophages augmente la production de cytokines proinflammatoires comme l'IL-1, l'IL-6, l'IL-12 et le TNF-, qui sont des cibles de NF-B impliquées dans le développement de pathologies auto-immunes512. 116 Chapitre I : Introduction bibliographique La mort cellulaire programmée est un processus vital qui a lieu dans les tissus tout au long de la vie et permet chaque jour le renouvellement de plus d'un milliard de cellules. Une défaillance dans l'élimination des corps cellulaires peut conduire à une accumulation tissulaire d'autoantigènes qui favorise le développement de pathologies inflammatoires chroniques, de maladies autoimmunes et de cancers513515. Dans le système immunitaire normal, la phagocytose des cellule apoptotiques s'accompagne d'un certain degré de tolérance immune via l'activation de points de contrôle du système immunitaire afin de prévenir la reconnaissance d'antigènes du soi. L'importance de p53 dans ces évènements postapoptotiques n'a été révélée que récemment grâce à l'identification de DD1 (Death domain 1) comme cible de p53516. L'expression de DD1 est contrôlée par p53 dans les cellules en cours d'apoptose ainsi que dans les macrophages. Cette protéine agit à la fois comme un ligand et un récepteur de phagocytose en engageant des interactions intermoléculaires homophiliques au niveau de jonctions entre les cellules en apoptose et les macrophages (un mécanisme qui se distingue nettement de la reconnaissance par des récepteurs scavengers des phosphatidylsérines externalisées à la surface des cellules mourantes). Figure I-40 : p53 comme gardien de l'intégrité immune490 ? Les fonctions de p53 dans la promotion de la tolérance immunitaire ont été révélées récemment par des travaux démontrant l'induction par p53 de molécules de point de contrôle du système immunitaire telles que PD1, PD-L1 et DD1, qui régulent négativement les réponses des lymphocytes T effecteurs. De plus, p53 favorise aussi la détection et la clairance des cellules apoptotiques par le système immunitaire, ce qui en fait un acteur central dans la prévention des réactions autoimmunes. 117 Chapitre I : Introduction bibliographique Un autre mécanisme potentiel par lequel p53 pourrait limiter les réactions auto-immunes fait intervenir l'induction transcriptionnelle de Foxp3 par p53 dans les lymphocytes Treg. Chez la souris, il a en effet été démontré que la signalisation du TCR induit une accumulation de p53 qui active alors directement l'expression du facteur de transcription FOXP3 (Forkhead box P3), qui est responsable de la différenciation des lymphocytes Treg 517. L'expression adéquate de p53 pourrait ainsi être un facteur critique dans le contrôle de l'autoimmunité, faisant de lui un gardien de l'intégrité immune (cf. Figure I-40). Le développement des cancers ne repose pas entièrement sur une altération de la croissance cellulaire. Ces dernières années ont vu une appréciation grandissante du rôle du système immunitaire dans la carcinogenèse, car il s'est révélé être une barrière fondamentale contre son développement, devant obligatoirement être détournée pour permettre la progression tumorale. A l'exception des tumeurs viro-induites, les cellules cancéreuses proviennent de cellules normales de l'hôte ayant acquis des altérations génétiques qui favorisent leur transformation maligne. Les cellules tumorales ont par conséquent souvent été considérées comme des cellules perçues par le système immunitaire comme des cellules du soi. Il est toutefois connu que les cellules cancéreuses peuvent devenir immunogéniques en raison d'une accumulation de protéines mutantes appelées néo-antigènes. Les cellules tumorales emploient une variété de mécanismes d'échappement au système immunitaire pour subsister malgré l'usage de radiothérapies et de chimiothérapies. Elles peuvent par exemple augmenter l'expression de molécules qui inhibent les fonctions de cellules effectrices telles que les lymphocytes T. Ces molécules de point de contrôle du système immunitaire , parmi lesquelles se trouvent CTLA-4 (Cytotoxic T lymphocyte antigen-4), PD- L1 (Programmed death ligand 1), et DD1, sont importantes dans le maintien de la tolérance des lymphocytes T518. Leur inhibition améliore considérablement les réponses immunes antitumorales, en déclenchant une réduction du nombre de lymphocytes Treg et une augmentation du nombre de monocytes et de cellules dendritiques circulantes519521. Dans les cellules cancéreuses soumises à un stress génotoxique et ayant conservé une protéine p53 fonctionnelle, cette dernière induit l'expression de plusieurs molécules de points de contrôle du système immunitaire - le récepteur PD-1 et son ligand PD-L1, ainsi que DD1 ce qui permet à ces cellules d'échapper à l'immunité antitumorale516, 522. 118 Chapitre I : Introduction bibliographique Figure I-41 : Cibler la voie p53 dans le microenvironnement tumoral pour activer l'immunité antitumorale et contrôler la progression tumorale de façon systémique523. Le microenvironnement d'une tumeur est composé d'un ensemble complexe de constituants cellulaires et moléculaires subdivisé en deux compartiments : (1) le compartiment des cellules immunitaires d'origine hématopoïétique ayant infiltré la tumeur (lymphocytes T, B et NK, et populations myéloïdes de cellules suppressives, de cellules dendritiques et de macrophages associés à la tumeur) et (2) le compartiment stromal (fibroblastes associés au cancer (CAF) et cellules endothéliales de la vascularisation sanguine). L'inactivation de p53 a été observée dans certaines sous-populations cellulaires du microenvironnement tumoral, ce qui promeut un état inflammatoire chronique et la progression tumorale. Une activation locale de p53 peut être accomplie par injection intratumorale d'activateurs spécifiques de p53. Cela rend la tumeur immunogénique et permet l'activation de macrophages et cellules dendritiques au niveau de zones confinées à proximité du site d'injection. Ces cellules présentent ensuite des antigènes tumoraux qui activent des lymphocytes T qui peuvent alors tuer les cellules tumorales. Les lymphocytes T activés circulent aussi dans le sang et la lymphe à la recherche de tumeurs additionnelles situées à distance du site d'injection. De cette manière, l'activation de l'immunité adaptative en réponse à une activation locale de p53 supporte un contrôle et une régression tumorale à l'échelle systémique. Toutes ces découvertes ont apporté une perspective nouvelle : l'inactivation de p53 confère aux cellules tumorales un statut immuno-privilégié et permet leur échappement à la surveillance du système immunitaire. C'est précisément la raison pour laquelle l'activation de p53 dans le microenvironnement tumoral pour réactiver une immunité antitumorale défaillante constitue aujourd'hui une piste intéressante de thérapie anticancéreuse (cf. Figure I-41). 119 Chapitre I : Introduction bibliographique 2. 4. 4 Rôle émergent de p73 dans les fonctions immunes L'analyse du phénotype des premières souris knockout pour p73 présageait déjà d'un rôle de p73 dans l'immunité innée et la réponse inflammatoire353. Les souriceaux Trp73-/- meurent pour une grande partie d'entre eux quelques jours après la naissance, des suites d'hémorragies gastro-intestinales massives. Les souris survivantes sont pour la plupart affectées de façon chronique par des infections bactériennes, des rhinites, des otites, des conjonctivites et des œdèmes périorbitaires, qui apparaissent rapidement (dès P2) et persistent à l'âge adulte. Chez les souris Trp73-/-, la présence de signaux inflammatoires constitutifs et la sécrétion excessive de mucus au niveau des différentes muqueuses épithéliales les rendent colonisables par des agents pathogènes. Les macrophages sont habituellement séparés en deux classes phénotypiques : les macrophages M1 effecteurs (ou classiquement activés) et les macrophages M2 régulateurs (ou activés de façon alternative). Les macrophages exercent des activités microbicides et promeuvent de fortes réponses de type Th1, tandis que les macrophages M2 interviennent plus tard lors d'une infection et participent à la résolution de l'inflammation grâce à une augmentation de leur capacité de phagocytose, à la synthèse de facteurs trophiques, et à une réduction de la production de cytokines proinflammatoires au profit d'une production de cytokines anti-inflammatoires. Le traitement d'un animal avec du LPS induit un relargage massif de cytokines proinflammatoires, provoquant un choc septique qui met en péril la survie de l'animal. Au niveau moléculaire, l'activation du TLR4 par le LPS conduit à l'activation de NF-B. Au niveau cellulaire, elle induit une différenciation des macrophages en macrophages effecteurs de type M1. Plus tard au cours de la réponse inflammatoire, une partie des macrophages M1 changent de phénotype et se différencient en macrophages de type M2, aux propriétés immunosuppressives. Cette transition M1-M2 se fait de façon dépendante de STAT3/6 et peut aussi être induite par certaines cytokines comme l'IL-4 et le TGF-524. Les macrophages M2 continuent de produire des cytokines proinflammatoires, mais en quantités réduites, mais commencent aussi à sécréter des cytokines anti-inflammatoires en même temps que leur capacité à phagocyter des cellules apoptotiques augmente. En conséquence de leur rôle central dans l'immunité innée, l'hyperactivation des macrophages ou le maintien prolongé de leur phénotype M1 causent une inflammation soutenue perturbant le fonctionnement des organes. 120 Chapitre I : Introduction bibliographique Jusque très récemment, peu de choses étaient connues au sujet du rôle de p73 dans l'immunité. Le phénotype des souris Trp73-/-, qui sont atteintes d'infections chroniques et d'une inflammation persistante, suggérait pourtant une implication de p73 dans le contrôle de l'inflammation. Chez l'Homme, plusieurs travaux ont relié l'expression de TP73 à des affections inflammatoires comme les otites, les gastrites et les rhinosinusites chroniques (35, 36). En 2013, l'étude conduite par Richard Tomasini a permis de délimiter les fonctions des isoformes TAp73 dans l'immunité innée : la perte sélective des isoformes TAp73 chez la souris provoque une exacerbation du phénotype proinflammatoire des macrophages péritonéaux525. Les souris TAp73-/- soumises à un traitement avec du LPS présentent ainsi une hausse de mortalité par choc septique, ce qui n'est pas le cas des souris Np73-/-. Cette hypersensibilité des souris TAp73-/- au traitement avec du LPS est corrélée à une hausse de la production de cytokines proinflammatoires (TNF-, IL-1, MIP-2, IL-12p70) observée à la fois dans le sérum de ces animaux ainsi que dans les surnageants de culture de macrophages péritonéaux et de MEFs TAp73-/-. Dans cette même étude, ce phénotype a pu être expliqué par une altération de la polarisation M1/M2 des macrophages TAp73-/-, qui est nettement orientée vers la différenciation M1 comme en attestent l'augmentation de la production d'IFN- (cytokine polarisante), la hausse d'expression du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (la présentation antigénique accrue est une marque de prédominance du sous-type M1), et la moindre activité de phagocytose des macrophages TAp73-/-. Au regard de ces données, il est légitime d'envisager l'instauration de conditions inflammatoires chroniques chez les souris TAp73-/-, qui participeraient à l'établissement d'un contexte tumorigénique déjà favorisé par la perte du contrôle exercé par ces isoformes sur l'intégrité du génome. 2. 5 Interactions entre NO et la famille p53 2. 5. 1 Activation de p53 et TAp73 par NO Les premiers éléments ayant contribué à établir un lien entre NO et l'activation de p53 sont venus d'observations indiquant que le traitement de macrophages RAW264. 7 avec des donneurs de NO induisait une accumulation rapide de p53526. Les macrophages dérivant de souris iNOS-/- ne présentent quant à eux pas de localisation nucléaire de p53 suite à un traitement avec de la bléomycine. La protéine p53 semble aussi essentielle dans l'induction par NO de régulateurs du cycle cellulaire (ex : p21Waf1/Cip1) et de protéines proapoptotiques (ex : 121 Chapitre I : Introduction bibliographique Bax)527. Enfin, des expériences avec des thymocytes issus de souris p53-/- ou avec des cellules lymphoblastoïdes exprimant une forme mutée de p53 ont révélé une forte résistance de ces cellules à l'apoptose induite par NO528, 529. Dans les fibroblastes embryonnaires de souris, l'accumulation de protéines p53 en réponse à NO est précédée par une réduction des niveaux de MDM2 et du niveau de polyubiquitination de p53530. Dans de nombreux autres types cellulaires, elle est également associée à des phosphorylations au niveau de certains résidus, la sérine 15 étant la plus fréquemment retrouvée531. Cette phosphorylation (qui dépend de la kinase ATR) n'affecte pas toujours l'interaction de p53 avec MDM2, ni son ubiquitination. En revanche, elle entrave le système de navette nucléo-cytoplasmique qui dépend aussi de MDM2, ce qui entraine une rétention et une accumulation nucléaire de p53532, 533. Une étude plus récente indique que même de plus faibles concentrations de NO (< 200 M), qui ne sont pas génotoxiques, peuvent aussi entrainer une accumulation nucléaire de p53 via la nitration du résidu Tyr327, qui favorise l'oligomérisation de p53 sans qu'elle ne soit phosphorylée par ATR au niveau de son résidu Ser15534. Mais qu'en est-il de l'éventuelle induction d'homologues de p53 par NO ? Les précédents travaux de notre équipe ont démontré que, dans la lignée leucémique humaine K562 qui n'exprime plus la protéine p53 (mutation amorphe du gène TP53), la génération de fortes concentrations en NO par l'intermédiaire de donneurs de NO ou l'induction de l'activité iNOS macrophagique provoque une accumulation de l'isoforme TAp73 (au niveau de l'ARNm et de la protéine)535. Cette activation transcriptionnelle de TAp73 dépend de la voie déjà décrite auparavant faisant intervenir E2F1. Elle survient très probablement en réponse aux dommages à l'ADN engendrés par le blocage des fourches de réplication consécutif à l'inhibition par NO de la ribonucléotide réductase, puisque des inhibiteurs pharmacologiques de la ribonucléotide réductase déclenchent la même série d'évènements. 2. 5. 2 Régulation de la synthèse de NO par p53 De façon très intéressante, l'équipe de Curtis C. Harris a pu formellement démontrer à la fin des années 1990 que le gène NOS2 est la cible d'une répression transcriptionnelle par p53. Ainsi, la transfection transitoire de p53 dans différentes lignées humaines ou dans des fibroblastes murins a pour effet de réduire considérablement l'activité basale et induite par des 122 Chapitre I : Introduction bibliographique cytokines du promoteur NOS2 (analyse en système gène rapporteur luciférase)536. Ces résultats ont pu être confortés in vivo chez des souris Trp53-/-. Ces souris présentent en effet des modifications du profil d'expression de la iNOS en réponse à des cytokines libérées de façon systémique, après injection intra-péritonéale de Propionibacterium acnes. Après cette injection, l'expression de la iNOS devient persistante dans le foie des souris Trp53-/-. De plus, la rate de ces souris devient une source importante de production de NO, car la iNOS y est exprimée en condition basale et est fortement induite après une stimulation cytokinique, alors qu'elle n'est jamais exprimée chez les souris WT537. Les résultats de cette équipe sont importants, car non seulement ils confirment que les fortes concentrations en NO générées par la NOS inductible sont à l'origine d'une activation de p53, mais ils indiquent également que p53 exerce un rétrocontrôle négatif sur l'expression de NOS2. Le mécanisme par lequel p53 exerce cette répression n'est toutefois pas élucidé, bien que plusieurs pistes existent. Le mécanisme suggéré par les auteurs de cette étude consiste en une interaction de p53 avec la protéine de liaison à la bote TATA (TBP), qui est un des composants du complexe TFIID d'initiation de la transcription. En supplément de son rôle transactivateur de nombreux gènes, p53 est aussi capable de réprimer certaines cibles. La répression de gènes par p53 est encore assez peu étudiée, mais plusieurs mécanismes ont été décrits : (1) liaison de p53 à son élément de réponse et recrutement de corépresseurs (ex : HDAC1)538541, (2) activation d'un répresseur (ex : Slug)542, et (3) liaison de p53 à son élément de réponse qui entrave la fixation d'un facteur de transcription plus fort ou le prive de coactivateurs transcriptionnels543, 544. Une autre explication probable provient de la récente description de p53 comme un suppresseur de la réponse inflammatoire chez la souris501. Comme évoqué précédemment, la protéine p53 antagonise l'activité transcriptionnelle de NF-B, qui contrôle l'expression de gènes codant pour des cytokines proinflammatoires, des chimiokines et leurs récepteurs (IL-1, Il-6, IL-12, TNF-, CCR2, CCR5. ). En conséquence, les souris Trp53-/- présentent une hypersensibilité au choc septique et des défauts de résolution de l'inflammation. 123 Chapitre I : Introduction bibliographique 124 CHAPITRE II : OBJECTIFS DES TRAVAUX Chapitre II : Objectifs des travaux Comme cela a été mentionné dans l'introduction, les précédents travaux de notre équipe ont démontré l'induction de l'expression de TAp73 par de fortes concentrations en NO dans la lignée leucémique K562. Bien que cette induction repose sur un mécanisme différent de celui aboutissant à l'activation de p53, elle intervient néanmoins dans des conditions similaires, après induction de l'activité iNOS ou pour les mêmes concentrations en précurseurs chimiques de NO. Il est ainsi légitime de se demander si p73 intervient également dans la régulation transcriptionnelle du gène NOS2, comme cela a été démontré pour p53. Dans le cadre de ce travail de thèse, nous avons donc commencé par comparer l'induction de l'expression de la iNOS et la production de NO dans des fibroblastes 3T3 WT et TAp73-/-. Nous avons peu à peu réalisé que le phénotype observé dans les cellules TAp73-/- dépendait en grande partie des conditions de culture, ce qui nous a conduit sur la piste d'un ou plusieurs facteurs sécrétés dont la fonction serait altérée par les isoformes TAp73. Nous avons alors émis l'hypothèse que le TGF- pourrait être impliqué dans le phénotype des cellules TAp73-/-, et l'emploi de différentes stratégies nous a effectivement permis de le démontrer. Nous avons poursuivi les travaux en commençant à explorer les mécanismes sous-jacents à la coopération observée entre les isoformes TAp73 et le TGF- pour réprimer l'expression de la iNOS (promoteur NOS2, voies de signalisation du TGF-, etc. ). En parallèle, nous avons souhaité savoir si la perte d'expression des isoformes TAp73, qui modifie la réponse au TGF- et altère la production de NO dans ce modèle cellulaire, pourrait avoir des répercussions fonctionnelles dépendantes de la production de NO. Dans cette optique, nous avons étudié les conséquences du knockout de TAp73 sur l'induction par NO de la réponse antioxydante dépendante de Nrf2, ainsi que la capacité de ces cellules à limiter la prolifération du parasite Trypanosoma musculi grâce à la production de NO. Disposant de souris Np73-/- depuis le mois de mai 2015, nous avons aussi pu envisager de mesurer l'effet de la perte d'expression de ces isoformes sur l'induction de la iNOS et la réponse au TGF- dans des cellules primaires (BMDM et fibroblastes pulmonaires), avec lesquelles des résultats préliminaires ont pu être obtenus. 127 Chapitre II : Objectifs des travaux 128 CHAPITRE III : MATERIEL ET METHODES Chapitre III : Matériel et méthodes 1 Culture cellulaire 1. 1 Conditions de culture L'entretien des lignées cellulaires en culture est effectué en conditions stériles sous une hotte à flux laminaire (repiquages, ensemencements, traitements, etc. ). Les cellules sont cultivées dans un incubateur à 37C en atmosphère humide enrichie de 5% de CO2. Tous les milieux de culture sont supplémentés en L-glutamine (2 mM) et en antibiotiques (100 U/ml de pénicilline, 100 g/ml de streptomycine). 1. 2 Lignées murines immortalisées de fibroblastes embryonnaires TAp73-/- (3T3) Les lignées murines utilisées sont un don de Richard Tomasini (Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille ; unité INSERM U1068). Elles ont été établies à partir de fibroblastes d'embryons de souris (MEFs) prélevés au jour embryonnaire 13, 5 en suivant le protocole 3T3. Ce protocole consiste à cultiver ces fibroblastes en les maintenant à faible densité jusqu'à l'émergence de clones de cellules spontanément immortalisées (repiquages tous les 3 jours de 3. 105 cellules / 20cm). Les fibroblastes immortalisés dans ces conditions de culture se multiplient rapidement et indéfiniment, mais leur croissance est interrompue lorsqu'elles parviennent à confluence (pas de perte de l'inhibition de contact). Ces lignées 3T3 sont immortalisées mais n'induisent pas la formation de tumeurs lorsqu'elles sont injectées dans des souris : elles n'ont pas subi de transformation oncogénique. Les cellules 3T3 utilisées pour ces travaux proviennent de souris de génotype sauvage (souris 1 et 6) ou sélectivement déficientes pour la classe d'isoformes TAp73 (souris 4 et 5). Les souris TAp73-/- ont été générées en ciblant les exons 2 et 3 de Trp73, qui sont absents dans les isoformes Np73 et codent pour le domaine de transactivation de p73. Les cellules 3T3 sont des cellules adhérentes cultivées en milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, GE Life Sciences/PAA Laboratories) avec 10% de sérum de veau fœtal (SVF) (Biowest) et du - mercaptoéthanol (55 M). Pour le stockage à long terme, les cellules sont resuspendues à une densité de 106 cellules/ml dans un mélange préalablement filtré composé de 60% de milieu DMEM, 30% de SVF et 10% de DMSO (diméthylsulfoxyde, Sigma-Aldrich). Elles sont ensuite transférées dans un tube cryogénique (Nunc CryoVials) puis dans une bote de congélation 131 Chapitre III : Matériel et méthodes contenant de l'isopropanol placée à -80C (assure une descente progressive en température qui améliore la viabilité des cellules après la décongélation). Les cryotubes sont finalement transférés dans l'azote liquide (-196C) le jour suivant. Avant les expériences, les fibroblastes 3T3 sont décollés de leur bote de culture grâce à une incubation pendant 5 minutes à 37C avec une solution de 0, 025% de trypsine et 0, 01% d'EDTA, avant d'être centrifugées (1200 rpm, 5 min) et après arrêt de la réaction par ajout de sérum. Après que les cellules aient été resuspendues, une fraction de cette suspension est colorée avec du bleu de trypan afin de pouvoir dénombrer les cellules viables avec un hématimètre de Malassez. Afin d'être utilisables dès le lendemain pour une expérience, les cellules 3T3 sont ensemencées à la densité de 2, 5x104 cellules/cm. Toutes les expériences ont été réalisées sur des lignées de 3T3 dont le nombre de passages se situe entre 20 et 35. La veille des expériences et lors des traitements, les cellules sont passées en milieu RPMI- 1640 (Roswell Park Memorial Institute medium, GE Life Sciences/PAA Laboratories), car ce dernier est plus riche en L-arginine, avec des pourcentages variables de SVF. En fonction des expériences, les cellules sont privées de sérum (SVF 0, 5%) ou non (SVF 5%). 1. 3 Isolement de cellules primaires Np73-/- 1. 3. 1 Souris knockout pour les isoformes Np73 Les souris Np73-/- proviennent d'un don du Dr Fadel Tissir (Université catholique de Louvain, équipe Neurobiologie du développement). Elles sont élevées en animalerie avec un accès à la nourriture et à l'eau ad libitum. Ces souris transgéniques ont été générées en utilisant des techniques conventionnelles de ciblage de gène. La construction permettant le ciblage contient une cassette Cre-IRES-EGFP insérée en aval de la région d'homologie située en 5' (Mm4 39308 37 ; nucléotides 7931161-7933301), qui se termine avec le codon ATG de l'exon 3', une cassette de sélection par la Néomycine flanquée de sites FRT (Flippase recombinase target), la région d'homologie en 3' (Mm4 39308 37 ; nucléotides 79200727923789), et une cassette de sélection négative DTA (Diphteria toxin A). La construction a été introduite par électroporation dans des cellules ES R1 afin d'isoler les cellules ES hétérozygotes. Les blastocystes injectés au stade B6 ont été transférés dans une souris femelle CD1 pseudo- gestante, et une colonie a été générée à partir d'animaux chimériques, puis maintenue par des croisements successifs. 132 Chapitre III : Matériel et méthodes A l'âge de 4 semaines, les souris sont identifiées par le poinçonnage de leurs oreilles et une biopsie de la queue permet d'en faire le génotypage. Pour cela, les morceaux de queue sont mis à bouillir pendant 1h dans 75 l de tampon alcalin (25 mM NaOH, 200 M EDTA). Ils sont ensuite transférés sur glace, et 75 l d'un second tampon (40 mM Tris (pH 7, 5), 16 mM HCl) permettent de neutraliser la solution. Les échantillons sont placés à 4C avant d'en prélever 1 l pour réaliser une PCR (Polymerase chain reaction) avec l'ADN polymérase One Taq (New England Biolabs) en suivant les instructions du fabricant avec 35 cycles d'amplification (température d'hybridation des amorces 60C). Il y a une amorce sens commune, et une amorce antisens spécifique pour tester la présence de la séquence wild type codant Np73 (amplicon 328 bp) ou de la construction comportant le gène GFP (souris knockout) (amplicon 796 bp) : - Primer sens commun : 5'-GAATGCCAACTCTCAGTC-3' - Primer antisens Np73-/- : 5'-ATTCTCCCACCGTCAGTACG-3' - Primer antisens Np73 / : 5'-GTCTCTCTGAACCCCAACCA-3' Enfin, les produits de PCR sont déposés sur gel d'agarose à 2% (dissous dans un tampon Tris Acétate EDTA) contenant du bromure d'éthidium (BEt) pour une migration électrophorétique (75V) afin de révéler la présence des bandes correspondant aux produits d'amplification sous irradiation UV (Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System). Le dépôt de fragments d'ADN de taille connue (DNA ladder 100 bp) permet d'estimer la taille des amplicons obtenus et de déterminer le génotype des souris (cf. Figure III-1 ci-dessous). Figure III-1 : Exemple de génotypage réalisé sur une portée de souriceaux. 133 Chapitre III : Matériel et méthodes 1. 3. 2 Macrophages dérivant de cellules de moelle osseuse A l'âge de 8 semaines, les souris sont euthanasiées avant de procéder à l'extraction des cellules de moelle osseuse. Elles sont ensuite aspergées d'éthanol à 70%, et les fémurs et tibias sont isolés par dissection à l'aide de pinces et de ciseaux chirurgicaux stériles, ainsi que de compresses afin de dégager les os des muscles attachés et des tendons liés aux articulations. Les os nettoyés sont placés dans une bote de Pétri contenant du PBS (Phosphate-buffered saline), sur de la glace et sous une hotte à flux laminaire. Les os sont ensuite placés 1 min dans un bain d'éthanol à 70%, puis lavés dans un bain de RPMI-1640. Les épiphyses des fémurs tibias et des fémurs sont sectionnées à l'aide d'un scalpel, puis une seringue contenant du RPMI-1640 est introduite à chacune des extrémités afin d'injecter le milieu au travers, au- dessus d'un tube Falcon (50 ml) surmonté d'un tamis cellulaire (40 m). Pour éliminer les globules rouges, les cellules sont centrifugées (1000 rpm, 4C, 5 min) et resuspendues dans 1 ml de tampon de lyse des globules rouges, puis laissées sur la glace pendant 10 min. Du milieu RPMI-1640 est ensuite ajouté en excès (20 ml/souris), et les cellules sont comptées avec un hématimètre de Malassez. Environ 4x107 cellules de moelle osseuses sont obtenues par souris grâce à cette méthode. Une partie des cellules est conservée pour une différenciation immédiate, l'autre est stockée pour congélation à raison de 107 cellules par cryotube dans une solution contenant 90% de SVF et 10% de DMSO. Pour la différenciation des cellules de moelle osseuse en macrophages, un protocole standard, décrit dans de multiples publications, a été utilisé. Ce protocole permet d'obtenir une population homogène composée à plus de 95% de macrophages BMDM exprimant les marqueurs de différenciation des macrophages matures que sont par exemple F4/80 et CD11b. Un milieu conditionné est d'abord préparé à partir du surnageant de cellules L929 (fibrosarcome murin de tissu conjonctif sous-cutané) qui produisent et sécrètent le facteur de croissance et de différenciation GM-CSF (Granulocyte macrophage-colony stimulating factor). Le milieu conditionné (LCCM) est préparé en laissant les cellules L929 croitre jusqu'à confluence, puis le milieu est renouvelé et maintenu en présence des cellules pendant 7 jours (Flacons de 150 cm, 30 ml de RPMI-1640 et 10% de SVF). Le surnageant de culture est ensuite prélevé et filtré (0. 45m) avant d'être stocké à -20C jusqu'à son utilisation. Pour la différenciation des BMDM, au premier jour, 107 cellules de moelle osseuse (fraiches ou décongelées) sont réparties dans une boite de Pétri de 10 cm (Non-tissue culture treated Optilux 134 Chapitre III : Matériel et méthodes Petri dishes, BD Biosciences) avec 10 ml de milieu de différenciation R20/30, qui est un mélange de RPMI-1640 avec 20% de SVF et 30% de LCCM. Le troisième jour, la moitié du milieu de différenciation est renouvelé, après centrifugation et récupération des cellules non adhérentes. Le sixième jour, beaucoup de cellules sont devenues adhérentes, elles sont détachées de leur support en les passant dans une solution de PBS dans laquelle elles sont maintenues à 4C pendant 10 min. Après centrifugation, elles sont resuspendues dans 20 ml de milieu de différenciation R20/30 puis reparties dans deux nouvelles boites. Le septième jour, la quasi-totalité des cellules sont désormais différenciées en macrophages adhérents, et le milieu de différenciation est remplacé par un milieu de culture des BMDM R10/5 composé de RPMI- 1640 avec 10% de SVF et 5% de LCCM (cf. Figure III-2). Le jour suivant, les cellules sont finalement détachées de leur support (de la même façon que précédemment), puis comptées avant d'être ensemencées dans des puits (MW12, MW24 ou MW96 selon les expériences) à une densité de 8x104 cellules/cm. La veille des expériences et lors des traitements, les cellules sont passées en milieu RPMI-1640 avec seulement 1% de SVF. Figure III-2 : Cliché de microscopie à transmission de BMDM obtenus au septième jour de la différenciation de cellules de moelle osseuse en présence de milieu conditionné de cellules L929. 1. 3. 3 Fibroblastes pulmonaires A l'âge de 8 semaines, les souris sont euthanasiées, puis les lobes pulmonaires sont récupérés après l'ouverture de la cage thoracique grâce à des pinces chirurgicales. Les lobes pulmonaires de chaque souris sont transférés dans une bote de Pétri stérile, recouverts de 135 Chapitre III : Matériel et méthodes quelques gouttes d'une solution contenant de la trypsine à 0, 05% et 750 U/ml de collagénase de type IV (don de Boris Julien, ICPH, UMR 1174), et hachés à l'aide d'un scalpel. Ils subissent ensuite une digestion enzymatique dans 6 ml de solution de trypsine-collagénase pendant 30 min et sous agitation avec un barreau aimanté (stérile). La solution digérée est filtrée sur un tamis cellulaire (70 m) au-dessus d'un tube Falcon contenant 8 ml de DMEM et 20% de SVF pour stopper la digestion. Les morceaux de poumon restants subissent une seconde étape de digestion dans le même volume de solution de trypsine-collagénase, ensuite refiltrée. Les cellules sont centrifugées et réparties dans un flacon de 25 cm (un pour chaque souris) avec 7 ml de milieu DMEM et 20% de SVF. Le milieu est renouvelé tous les deux jours en éliminant toutes les cellules non adhérentes, et les fibroblastes pulmonaires forment des clones qui peuvent se multiplier durant plusieurs passages (jusqu'à 10 maximum pour les expériences présentées). Au troisième passage, la proportion de SVF est réduite à 10%. Ces cellules sont repiquées et ensemencées dans des conditions identiques à celles utilisées pour les 3T3. La veille des expériences et lors des traitements, les cellules sont passées en milieu RPMI-1640 avec seulement 1% de SVF. 2 Cytokines et inhibiteurs pharmacologiques L'induction de la iNOS dans les cellules 3T3 ou BMDM est déclenchée en présence des cytokines suivantes : rr IFN- (Sigma Aldrich), rh TNF- (ImmunoTools), rm IFN- (PBL Interferon Source), rm IL-1 (ImmunoTools), rh TGF-1 (ImmunoTools). Le LPS de Salmonella enteritidis (Sigma Aldrich) est aussi utilisé pour la stimulation lors de certaines expériences. L'aminoguanidine (Sigma-Aldrich) inhibe sélectivement l'activité iNOS et présente l'avantage de ne pas être toxique à la concentration utilisée (2 mM). La SEITU (S-ethyl isothiourea) (Calbiochem) (50 M) et le L-NAME (Sigma Aldrich) ont aussi été utilisés pour inhiber l'activité iNOS. La cycloheximide (10 g/ml) permet le blocage de la synthèse polypeptidique. Le SB-525334 (5 M) (Selleckchem) est un inhibiteur sélectif du récepteur ALK5. Le MG-132 (Selleckchem) (5 M) et la lactacystine (Calbiochem) (5 M) sont des inhibiteurs du protéasome. 136 Chapitre III : Matériel et méthodes 3 Mesure de la production de NO avec le réactif de Griess Le nitrite (NO2 -) et le nitrate (NO3 -) sont les dérivés finaux et stables de NO. Ils proviennent de la décomposition en milieu aqueux de certains dérivés du NO (N2O3, N2O4, ONOO-). La somme de leurs concentrations reflète la production totale de NO, et constitue donc un excellent index de l'activité enzymatique des NOS. Le dosage du nitrate nécessite sa conversion préalable en nitrite (étape supplémentaire faisant intervenir la nitrate réductase). Lors de cette étude, le dosage du nitrite dans les surnageants de culture a été retenu comme un moyen simple et rapide d'évaluer l'activité iNOS résultant des différents traitements. Le dosage du nitrite consiste à le convertir, par l'intermédiaire de deux réactifs composant le réactif de Griess (sulfanilamide à 0, 75% et N-Naphtyl-1-éthylènediamine à 0, 07% dans une solution de HCl à 5% final), en un produit coloré dont l'absorbance à 540 nm est proportionnelle à la concentration en nitrite initiale. Figure III-3 : Schéma de la réaction du réactif de Griess avec les ions NO2 d'un produit coloré absorbant à 540 nm. -, qui conduit à la formation Dans un premier temps, une gamme étalon est réalisée avec une solution de NaNO2 (cf. Figure III-4). Il existe une relation linéaire entre l'absorbance à 540 nm mesurée et la concentration en ions NO2 -, ce qui permet de calculer cette concentration dans un échantillon biologique (ex : sérum, surnageant de culture, etc. ). L'absorbance est lue par un lecteur spectrophotométrique de microplaques VICTOR 1420 Multilabel Counter (Wallac), après le mélange des deux réactifs composant le réactif de Griess en volumes égaux (100 l de chaque), avec 100 l de surnageant de culture, et après 30 min d'incubation à température ambiante. 137 Chapitre III : Matériel et méthodes Figure III-4 : Exemple de gamme étalon de NaNO2 obtenue avec le réactif de Griess. 4 Détermination des niveaux d'expression protéique par western-blot 4. 1 Extraction et dosage des protéines solubles Les cellules sont récoltées à différents temps après le début des traitements, après un lavage avec du PBS glacé. Leur lyse est réalisée avec un tampon (50 l pour 10 cm) dont la composition est donnée dans le Tableau III-1, en grattant le fond du puits à l'aide d'une spatule en caoutchouc tandis que la plaque est conservée sur de la glace pendant l'opération. Les tubes sont vortexés plusieurs fois, puis les extraits bruts de protéines sont obtenus par centrifugation des lysats cellulaires à 10, 000 g pendant 20 min et à 4C. Le surnageant contenant les protéines solubles est ensuite stocké à -80C. La concentration en protéines des échantillons est déterminée en utilisant la méthode de Bradford (réactif BioRad Protein Assay comportant du Bleu de Coomassie). Il s'agit d'une méthode de dosage colorimétrique : le réactif est de couleur rouge sous sa forme cationique (en solution) et absorbe à 465 nm. Il est capable de se lier aux résidus aromatiques et basiques des protéines, et prend alors sa forme anionique avec un maximum d'absorbance à 590 nm. L'absorbance à 590 nm des échantillons dilués est lue par le lecteur de microplaques VICTORTM. La concentration en protéines des échantillons est alors déterminée à l'aide d'une gamme étalon de sérum albumine bovine. 138 Chapitre III : Matériel et méthodes 4. 2 Electrophorèse SDS-PAGE et Western-Blot La séparation électrophorétique des protéines est réalisée par migration sur gel SDS- PAGE, après dépôt de 30 à 40 g de protéines préalablement diluées dans un tampon de dénaturant 5X (Laemmli Buffer) et bouillies pendant 3 minutes. La partie supérieure du gel SDS-PAGE est un gel de concentration (acrylamide/bis-acrylamide 5% (Fisher Bio Reagents), Tris-HCl 125 mM (pH 6, 8), SDS 0, 1%), tandis que sa partie inférieure est un gel de séparation (9% d'acrylamide/bis-acrylamide, Tris-HCl 375 mM (pH 8, 8), SDS 0, 1%). La concentration du gel de séparation permet la séparation facile de protéines dont la masse est comprise entre 20 et 200 kDa. Le dépôt de marqueurs de poids moléculaire (BioRad) permet l'identification des protéines d'intérêt en évaluant la taille des bandes. La migration s'effectue en deux temps (30 min à 90V puis environ 1h à 120-130V, jusqu'à sortie du bleu) dans un tampon de migration contenant de la glycine (composition complète dans le Tableau III-1). Après la fin de la migration, les protéines séparées sur le gel sont transférées sur une membrane de nitrocellulose. Le transfert se fait en milieu liquide durant 1h30 à 100V. La migration et le transfert sont effectués dans une cuve et un générateur BioRad. Tampon Lyse Composition Tris-HCl 20 mM (pH 7, 4), NaCl 150 mM, Triton X-100 1%, Désoxycholate de sodium 0, 5%, EDTA 1mM. Extemporanément : DTT 1 mM, PEFA Bloc 1 mM, Cocktail d'inhibiteurs de protéases et Inhibiteurs de phosphatases lorsque c'est nécessaire (NaF 50 mM, Na3VO4 1 mM). Laemmli 5X Tris-HCl 1M (pH 6, 8), SDS 8%, Glycérol 30%, Bleu de bromophénol 0, 4% et -mercaptoéthanol 4% Migration Transfert Tris-HCl 25 mM (pH 8, 5), Glycine 250 mM et SDS 0, 1% Tris-HCl 48 mM, Glycine 39 mM, SDS 0, 375 mM et Ethanol 20% Tableau III-1 : Composition des tampons utilisés pour la réalisation des extraits protéiques à partir des cellules en culture, pour l'électrophorèse SDS-PAGE et pour le transfert sur membrane de nitrocellulose. 4. 3 Révélation des immunoblots et anticorps A l'issue de l'étape de transfert, la membrane de nitrocellulose est incubée 1h dans une solution de PBS contenant du lait écrémé à 5% afin de saturer les sites de liaison non spécifiques. Après un lavage rapide dans du PBS, les membranes sont incubées une nuit à 4C 139 Chapitre III : Matériel et méthodes avec des anticorps primaires (cf. Tableau III-2) dilués dans une solution PBS-Tween 0, 1% contenant 5% de BSA (Bovin serum albumin). Le lendemain, elles subissent trois lavages consécutifs de 10 min dans des bains de PBS-Tween 0, 1% avant d'être incubées en présence d'anticorps secondaires pendant 1h (dilution dans PBS-Tween-20 à 0, 1% 5% BSA). Les membranes sont à nouveau lavées trois fois avant la révélation. Les anticorps secondaires anti- souris Alexa Fluor 680 (Invitrogen) et anti-lapin Alexa Fluor 800 (Invitrogen) sont couplés à un fluorochrome. La fluorescence est détectée par l'intermédiaire d'un scanner de fluorescence infrarouge Odyssey (LI-COR). Les membranes sont scannées, et le signal de fluorescence correspondant à chaque bande d'intérêt est quantifié grâce au logiciel fourni avec le scanner. Les résultats sont normalisés en les rapportant aux variations de l'intensité de fluorescence des bandes correspondant à deux protéines de référence, la -tubuline et la -actine. Antigène Espèce Fournisseur Réf. MW Dilution Actine Souris Sigma- Aldrich HO-1 Lapin Enzo iNOS Souris BD Bioscience A5316 42 kDa 1/10000 BML- HC3001 32 kDa 1/1000 610328 130 kDa 1/500 P-Smad2 (Ser465/467) P-Smad3 (Ser423/425) Lapin Cell Signaling 8828 52, 60 Technology (D27F4) kDa 1/1000 Tubuline Souris Santa Cruz Biotechnology sc-5274 50 kDa 1/10000 Tableau III-2 : Anticorps primaires utilisés pour la détection des protéines en immunoblot. 140 Chapitre III : Matériel et méthodes 5 Mesure d'expression génique par RT-qPCR 5. 1 Extraction et purification des ARN totaux Afin de procéder à l'extraction des ARN totaux, les cellules sont dans un premier temps lysées par l'ajout d'1 ml de TRI reagent (Sigma-Aldrich, ref. T9424) par puits de plaque MW6. Ce réactif est composé de thiocyanate de guanidine et de phénol. Le principe de l'extraction repose sur l'ajout de chloroforme (200 l/échantillon) qui permet le fractionnement du lysat en 3 phases : une phase aqueuse supérieure contenant les ARN, une interphase contenant l'ADN génomique et une phase organique contenant les protéines. La phase aqueuse est prélevée et les ARN sont précipités grâce à l'ajout de 500 l d'isopropanol. Le culot d'ARN est obtenu après centrifugation à 10, 000 g pendant 5 min, Il est ensuite lavé avec 1 ml d'éthanol à 70%, puis dissout dans 30 à 50 l d'eau DEPC. La concentration en ARN de l'échantillon dilué est déterminée par lecture de l'absorbance à 260 nm, avec un spectrophotomètre UV NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific). Une unité d'absorbance correspond à une concentration en ARN de 40 g/ml. L'absorbance à 280 nm est également mesurée pour estimer la qualité de l'extraction ; un rapport A260 / A280 2 est considéré comme satisfaisant. Un rapport inférieur indique une contamination par des protéines ou par la phase phénol lors de l'extraction. La qualité des ARN est vérifiée par dépôt sur gel d'agarose à 1% en présence de BEt. 5. 2 Rétrotranscription Une quantité de 1 g des ARN extraits est ensuite prélevée pour effectuer leur rétrotranscription en ADN complémentaires (ADNc), grâce au kit qScript cDNA SuperMix (Quantabio). Le mélange réactionnel comprend, en plus des ARN, un tampon concentré 5X contenant des dNTPs et du MgCl2, des amorces aléatoires héxamériques et des amorces oligo(dT), une protéine recombinante inhibitrice des ribonucléases, ainsi qu'une transcriptase inverse qScript ajoutée extemporanément. La réaction se fait dans un volume final de 20 l, dans un appareil Thermal HiCycler (BioRad), avec le programme suivant : - 5 minutes à 25C : Activation de la transcriptase inverse qScript - 30 minutes à 42C : Température optimale d'élongation des brins d'ADNc - 5 min à 85C : Déshybridation des brins d'ARN et d'ADNc synthétisés 141 Chapitre III : Matériel et méthodes 5. 3 PCR quantitative L'analyse de l'expression génique est entreprise par PCR quantitative à partir des échantillons d'ADNc issus de la rétrotranscription. Cette méthode repose sur l'utilisation d'un agent intercalant, le SYBR Green, dont la fluorescence ( 522 nm) s'intensifie en liant l'ADN double brin. La fluorescence augmente donc de façon proportionnelle avec les quantités croissantes d'ADN double brin générées au cours des cycles d'amplification, ce qui permet le suivi en temps réel de l'amplification des produits de PCR par une enzyme thermoactivable. Le paramètre critique à prendre en compte est le cycle à partir duquel la fluorescence dépasse le seuil de fluorescence basale (point nommé Crossing point ou Cp ou Ct). Dans le cas o les échantillons sont de l'ADNc issus de la rétrotranscription des ARNm, plus Cp est faible, plus cela signifie que les ARNm étaient abondants dans l'échantillon lors de l'étape de rétrotranscription, et plus l'expression du gène d'intérêt est élevée. L'expression relative d'un gène d'intérêt par rapport à un échantillon contrôle est déterminée grâce à une équation prenant en compte la normalisation de l'expression du gène d'intérêt par un gène de référence dont l'expression est considérée comme invariante dans le système étudié. L'efficacité de l'amplification pour chaque gène considéré est également un paramètre inclus dans cette équation, qui permet donc de définir le niveau d'expression relatif d'un gène d'intérêt dans un échantillon traité par rapport à un échantillon contrôle : Niveau d'expression relatif Efficacitécible Efficacitéréférence Cp (contrôletraité) Cp (contrôletraité) L'appareil utilisé pour la PCR quantitative est un thermocycleur à air pulsé couplé à un microspectrofluorimètre Applied Step One Plus (Applied Biosystems, Life Technologies). Le kit PerfeCTa SYBR Green SuperMIX (Quantabio). La réaction se déroule dans le puits d'une microplaque (96 puits) scellée avec un film plastique pour éviter l'évaporation, en présence de l'échantillon d'ADNc (concentration finale 1/50e), d'amorces d'ADN spécifiques des gènes 142 Chapitre III : Matériel et méthodes cibles étudiés (primers) en concentration finale de 500 nM, et d'un mix dilué dans de l'eau sans nucléases contenant la sonde fluorescente SYBR Green, des dNTPs, du MgCl2 et la Taq polymérase (ADN polymérase thermoactivable). Les amorces d'ADN (Eurofins Genomics) ont toutes été définies à l'aide du programme Primer3 (Whitehead Institute for Biomedical Research), au niveau de séquences localisées sur une jonction exon-exon pour prévenir l'amplification d'ADN génomique éventuellement contaminant (température d'hybridation optimale de 60C) (Tableau III-3). La PCR est effectuée suivant le protocole décrit sur le tableau III-4. Cible Sens (S) Anti-sens (AS) 18S RNA 5'-agtttccagcacattttgcgag-3' 5'-tcatcctccgtgagttctcca-3' -Sma 5'-actactgccgagcgtgagat-3' 5'-aggtagacagcgaagcca-3' Col1A 5'-tggaagagcggagagtac-3' 5'-gcgcaggaaggtcagctg-3' Gusb 5'-cttggaggtgaaggtgacacc-3' 5'-aatttgccgtgagtggagtc-3' Hmox1 5'-cacgcatatacccgctacct-3' 5'-ccagagtgttcattcgagca-3' Hprt 5'-tcctcctcagaccgctttt-3' 5'-cctggttcatcatcgctaatc-3' Mmp2 5'-tcgcccatcatcaagttccc-3' 5'-ccttggggcagccatagaaa-3' Mmp9 5'-cgctcatgtacccgctgtat-3' 5'-gccttgggtcaggcttagag-3' Mmp13 5'-acctacactggcaaaagccat-3' 5'-tagggctgggtcacacttct-3' Nos2 5'-caccttggagttcacccagt-3' 5'-accactcgtacttgggatgc-3' Nox4 5'-gaagatttgcctggaagaacc-3' 5'-aggtttgttgctcctgatgc-3' Nqo1 5'-ttctctggccgattcagagt-3' 5'-ggctgcttggagcaaaatag-3' Pai-1 5'-tgatggctcagagcaacaag-3' 5'-gccagggttgcactaaacat-3' Sesn2 5'-gcattacctgctgctgcata-3' 5'-aaggcctggatatgctcctt-3' Smad7 5'-cggaagtcaagaggctgtgt-3' 5'-gacagcctgcagttggtttg-3' Spsb1 5'-cggggactcaagggtaaaa-3' 5'-aggggctcaggatcaagtc-3' Spsb2 5'-aagaagagtggaggaaccacaat-3' 5'-caaaggcagagtgatatttgac-3' Srxn 5'-ggaaggaagaaaggagatgga-3' 5'-agagttcaggctatggggatg-3' Timp1 5'-attcaaggctgtgggaaatg-3' 5'-ctcagagtacgccagggaac-3' Tableau III-3 : Amorces d'ADN (primers) utilisées en PCR quantitative (Tm 60C). 143 Chapitre III : Matériel et méthodes Etape Activation de la Taq polymérase dénaturation initiale Amplification (40 cycles) Fusion Dénaturation Hybridation élongation Température 95C 95C 60C 65 95C Temps 3 min 15s 50s x Tableau III-4 : Description des cycles d'amplification de la PCR. La fluorescence est enregistrée à chaque cycle d'amplification lors de l'étape d'élongation (cf. Figure III-5). A la fin de l'amplification, une étape de fusion est effectuée, qui consiste en une augmentation progressive de la température toutes les 30 s, afin de reconstituer une courbe de fusion permettant de vérifier la présence d'un unique produit d'amplification (cf. Figure III- 5). Les produits de qPCR sont également déposés sur un gel d'agarose à 1% en présence de BEt pour confirmer cela. Pour chaque couple d'amorces, deux contrôles négatifs sont aussi effectués en qPCR : des puits avec les échantillons d'ARN non rétrotranscrits (RT-), et des puits avec de l'eau sans nucléases, pour s'assurer de la spécificité de l'amplification. Chaque échantillon est déposé en triplicats pour limiter les risques d'erreurs liées aux prélèvements de faibles volumes. Figure III-5 : Courbes d'amplification et de fusion en PCR quantitative. (A gauche) Courbes d'amplification obtenues avec des échantillons d'ADNc de fibroblastes 3T3 traités ou non avec une combinaison de cytokines (IFN-, TNF-, IL-1). Les courbes en rouges correspondent à la fluorescence mesurée au cours des cycles d'amplification en utilisant des amorces spécifiques de Nos2, montrant la forte induction du gène par ces cytokines. Les courbes en bleu correspondent au gène de référence (ARN 18S), dont l'expression est invariante dans toutes les conditions. (A droite) Les courbes de fusion permettent de s'assurer de la présence d'un unique produit d'amplification, ici ceux obtenus avec les amorces ciblant les gènes Hprt (orange), ARN 18S (bleu), Nos2 (rouge), Srxn1 (rose) et Hmox1 (vert). 144 Chapitre III : Matériel et méthodes L'analyse des résultats est réalisée grâce au logiciel StepOne Software v2. 3 (Applied Biosystems, Life Technologies). Une efficacité de 100% a été retenue pour les calculs, ce qui ramène la formule initiale à la formule suivante : Niveau d'expression relatif 2Ct cible (contrôletraité) 2Ct référence (contrôletraité) 6 Mesure de production de TGF-1 par ELISA La production de TGF-1 par les cellules et la concentration en TGF-1 du sérum de veau fœtal sont quantifiées par l'intermédiaire d'un test ELISA Sandwich (Enzyme-linked immunosorbent assay) Human/mouse TGF-1 ELISA Ready-SET-Go ! (eBioscience, Affymetrix Company), en suivant le protocole fourni par le fabricant. Le coating de l'anticorps de capture est effectué dans un premier temps en incubant chaque puits d'une plaque MW96 avec l'anticorps sur la nuit à 4C. Le matin suivant, les puits sont vidés puis lavés 5 fois avec une solution de PBS-Tween-20 à 0, 05%, avant d'être remplis d'une solution de blocage des sites de liaison non spécifiques pendant 1h à température ambiante. Une série de 5 lavages est réeffectuée, avant d'introduire dans les puits les échantillons (sérums, surnageants de culture, etc. ) pour une incubation de 2h à température ambiante. L'anticorps ne reconnait que la forme active (mature) du TGF-1, lorsqu'il est dissocié du peptide LAP. C'est la raison pour laquelle une étape préalable d'activation acide du TGF-1 (incubation 10 min en présence de HCl puis neutralisation par l'addition de NaOH) peut être réalisée afin de doser tout le TGF-1 présent dans l'échantillon. C'est aussi un moyen de mesurer la proportion de TGF-1 actif au sein de l'échantillon. Une nouvelle série de 5 lavages est faite, avant l'incubation pendant 1h à température ambiante avec l'anticorps de détection qui est conjugué à la biotine. Après 5 lavages additionnels, les puits sont incubés avec une solution d'avidine-HRP (Horseradish peroxidase) pendant 30 min. Après une ultime série de 7 lavages en PBS-Tween, le substrat de la HRP est ajouté dans les puits (apparition d'une coloration bleue), et la réaction est stoppée après 15 min par l'ajout de 50 l de H2SO4 2N (la coloration vire au jaune). L'absorbance à 450 nm est mesurée par le lecteur spectrophotométrique de microplaques VICTOR 1420, et la concentration en TGF-1 des échantillons est calculée en se rapportant au coefficient directeur de la gamme étalon obtenue avec des concentrations connues de TGF-1. 145 Chapitre III : Matériel et méthodes Figure III-6 : Mesure de la production de TGF-1 par ELISA. (A gauche) La présence de l'anticorps de détection anti-TGF-1, qui est couplé à la biotine, est révélée par l'ajout d'avidine-HRP et du substrat de la HRP. (A droite) La réaction est stoppée par l'ajout d'une solution de H2SO4 2N. La coloration, qui vire au jaune, est mesurée par l'absorbance à 450 nm, et est proportionnelle à la concentration en TGF-1 actif dans l'échantillon. 7 Infection parasitaire avec Trypanosoma musculi Les parasites spécifiques de la souris Trypanosoma musculi sont un don de Philippe Vincendeau (Laboratoire de Parasitologie, Université de Bordeaux II). La croissance du parasite sur les cellules 3T3 a été mesurée dans des puits de MW96 contenant 2, 5x104 cellules 3T3. Un jour avant l'infection par le parasite, les cellules sont passées dans un milieu pauvre en sérum (RPMI-1640 avec 0, 5 de SVF). L'expression de la iNOS est induite par l'ajout de cytokines (IFN- à 50 U/ml, TNF- à 20 ng/ml, IL-1 à 20 ng/ml), en présence ou non de TGF- 1 (5 ng/ml), de SEITU (50 M), et de SB-525334 (5 M). L'infection avec 4x104 parasites T. musculi est réalisée au même moment, dans un volume final de 250 l/puits. Le jour suivant le début de l'infection et l'induction de la iNOS par les cytokines, une partie du surnageant (50 l) est prélevée pour effectuer le dosage de Griess. Enfin, 3 jours après le début de l'infection, les parasites de chaque puits sont resuspendus puis transférés dans un eppendorf sur de la glace, afin de réduire leur mobilité lors du comptage sur un hématimètre de Malassez pour estimer leur croissance. 8 Statistiques Tous les résultats présentés sont la moyenne d'au moins trois expériences indépendantes, pour lesquelles chaque échantillon a été déposé en triplicata (dosages de Griess, RT-qPCR, tests ELISA, comptages des parasites) ou en duplicata (Western-Blot). Ils sont représentés sous la forme d'une moyenne expérimentale et les barres d'erreur correspondent à l'écart type ( SD). Un test t bilatéral sur données appariées permet enfin d'estimer leur niveau de significativité. 146 CHAPITRE IV : RESULTATS EXPERIMENTAUX Chapitre IV : Résultats expérimentaux 1 Implication des isoformes TAp73 dans la régulation de l'expression de la iNOS 1. 1 Détermination des conditions d'induction de la iNOS dans des fibroblastes immortalisés de souris Avant de commencer à étudier l'effet de la déficience en isoformes TAp73 sur l'expression de la iNOS dans les cellules 3T3, nous avons déterminé les conditions optimales d'induction de l'expression de la iNOS. Les fibroblastes embryonnaires de génotype sauvage (TAp73 / ), spontanément immortalisés en suivant le protocole 3T3, ont été utilisés dans ces expériences pour tester l'effet de combinaisons de stimuli sur les niveaux d'induction de la iNOS. La mesure de cette induction a été effectuée à plusieurs niveaux. L'accumulation de la protéine iNOS a été analysée par western-blot, à l'issue de 48h de traitements avec de l'IFN- (50 U/ml), du TNF- (20 ng/ml) et de l'IL-1 (20 ng/ml) (cf. Figure III-1A/B). Les résultats indiquent que ces cytokines seules sont incapables d'induire une accumulation de la protéine. Les combinaisons TNF- IL-1 et TNF- IFN- permettent une très faible induction de l'expression de la protéine iNOS. Seul le traitement simultané avec ces trois cytokines permet d'obtenir une induction conséquente de la iNOS dans les cellules 3T3 (multiplication par 120 si on la rapporte à l'induction obtenue avec les deux cytokines citées). D'autres résultats (non rapportés ici) montrent qu'une induction identique de la iNOS est obtenue en remplaçant l'IL- 1 par du LPS (1 g/ml). Nous avons évalué l'activité enzymatique de la iNOS au cours de chaque expérience en mesurant (grâce au réactif de Griess) la concentration en nitrite (NO2 -), un dérivé stable de NO qui s'accumule dans les surnageants de culture des cellules. Les résultats présentés Figure III- 1C montrent que la production de NO par les cellules 3T3 après 48h de traitement avec les cytokines est corrélée au niveau d'expression de la iNOS. Tandis que les cellules 3T3 ne produisent pas de NO en absence de cytokines ou avec une cytokine seule, les combinaisons TNF- IL-1 et TNF- IFN- sont à l'origine d'une production modérée de nitrite (respectivement 9, 5 et 8, 9 M). La combinaison des 3 stimuli induit une forte production de nitrite par ces cellules (environ 75 M à 48h). 149 Chapitre IV : Résultats expérimentaux Puisque l'induction de la iNOS dépend d'une régulation transcriptionnelle, nous avons également mesuré l'expression du gène Nos2 par PCR quantitative après une étape de rétrotranscription des ARN totaux, 24h après le début des traitements (cf. Figure III-1D). Le gène est très peu exprimé à l'état basal (Cp > 35 cycles), mais un traitement par le TNF- et l'IL-1 pendant 24h suffit pour induire une forte accumulation d'ARNm Nos2 (x200 environ). Cette induction est donc insuffisante pour permettre une forte expression de la protéine iNOS, dont la présence est à peine détectable en western-blot après 48h de stimulation. Cette induction transcriptionnelle de Nos2 est largement potentialisée par l'ajout d'IFN- (x16, 8 avec 50 U/ml), mais beaucoup moins par l'IFN-, pourtant en forte concentration (x4, 7 avec 1000 U/ml). Pour la suite de nos travaux, seules les combinaisons de traitements permettant l'induction la plus forte de l'expression de la iNOS ont été retenues : IFN- (50 U/ml) TNF- (20 ng/ml) IL-1 (20 ng/ml) IFN- (50 U/ml) TNF- (20 ng/ml) LPS (1 g/ml) Les concentrations utilisées permettent une induction maximale de la iNOS, car des résultats supplémentaires (non montrés ici) indiquent que la production de NO et l'expression de la protéine iNOS demeurent invariantes pour des concentrations supérieures en cytokines. 1. 2 Les isoformes TAp73 régulent négativement l'expression de la iNOS 1. 2. 1 Surexpression de la iNOS dans les 3T3 TAp73-/- Afin d'examiner l'effet de la perte d'expression des isoformes TAp73 dans les cellules 3T3 issues de souris TAp73-/-, nous avons réalisé des cinétiques d'induction de l'expression de la iNOS dans des clones de 3T3 TAp73 / (souris wt-1 et wt-6) et TAp73-/- (souris ko-4 et ko- 5). Les différentes lignées fibroblastiques, après avoir été ensemencées à une densité identique et être parvenues à confluence, ont été stimulées par une combinaison d'IFN-, de TNF- et d'IL-1 (aux concentrations précédemment définies), puis ont été lysées à différents temps après le début de la stimulation. Les surnageants de culture étaient récoltés au même moment pour mesurer leur concentration en nitrite. Nous avons aussi comparé les cinétiques d'induction 150 transcriptionnelle de Nos2 dans ces lignées cellulaires en mesurant les niveaux d'ARNm Nos2 Chapitre IV : Résultats expérimentaux par RT-qPCR. Les résultats que nous avons obtenus indiquent une augmentation substantielle de l'induction de l'expression de la protéine iNOS en réponse aux cytokines dans les cellules 3T3 TAp73-/-, quel que soit le couple de lignées cellulaires analysées et la combinaison de cytokines inductrices utilisée (cf. Figure III-2A/B). Le suivi de l'expression de la protéine iNOS au cours des 48h de stimulation (cf. Figure III-2C/D) révèle une accumulation de la protéine iNOS nettement plus forte et rapide dans les cellules 3T3 TAp73-/- par rapport aux 3T3 TAp73 / en réponse aux cytokines (9, 6 fois plus de protéines iNOS au temps 16h, et 6, 8 fois plus au temps 24h). L'apparition de la protéine iNOS dans les cellules 3T3 TAp73-/- a lieu de façon plus précoce : l'analyse visuelle des blots suggère un début d'accumulation de la protéine iNOS visible dès 8h dans ces cellules et une forte expression à partir de la seizième heure de stimulation. Dans les cellules 3T3 TAp73 / , la protéine ne devient détectable et quantifiable par western-blot qu'après 16h de stimulation et son expression ne devient vraiment significative qu'après 24h. La surexpression de la iNOS observée dans les 3T3 TAp73-/- se répercute sur les quantités de NO produites par ces cellules, comme en attestent les dosages du nitrite que nous avons effectués dans les surnageants de culture (cf. Figure III-2E). Ainsi, 24h après le début de la stimulation, la concentration en nitrite dans le surnageant des 3T3 TAp73-/- est de 19, 8 M, contre seulement 3, 3 M dans celui des cellules TAp73 / . Cette hausse d'activité iNOS des cellules TAp73-/- perdure, même 72h après le début de l'induction (85, 9 M de nitrite dans les cellules TAp73-/- au lieu de 30, 9 M dans les cellules TAp73 / ). La stimulation des fibroblastes avec du LPS (1 g/ml) au lieu de l'IL-1, en plus de l'IFN- et du TNF-, aboutit à des résultats très similaires en termes d'expression de la iNOS et de production de NO qui sont nettement à l'avantage des cellules 3T3 TAp73-/- (non montré). Nous avons aussi constaté une hausse de l'induction transcriptionnelle du gène Nos2 dans les 3T3 TAp73-/-, comme le montrent les résultats présentés sur la Figure III-2F. L'augmentation du niveau de transcrits Nos2 dans les cellules 3T3 TAp73-/- est particulièrement marquée durant les 24 premières heures de l'induction, avec des ARNm Nos2 en moyenne 2, 2 fois plus abondants dans les cellules 3T3 TAp73-/- à 16h, et 3, 4 fois plus abondants à 24h. Nous avons remarqué un décalage temporel du niveau maximal d'induction transcriptionnelle de Nos2 : 151 Chapitre IV : Résultats expérimentaux celui-ci se situe dès 24h pour les 3T3 TAp73-/-, et seulement à partir de 36h dans les 3T3 TAp73 / . Il est à noter que le niveau de transcrits Nos2 diminue à partir de 48h dans les deux types de lignées, tandis que la protéine continue de s'accumuler pour atteindre un maximum d'expression à 48h. 1. 2. 2 Les isoformes TAp73 sont nécessaires à la dégradation de la iNOS par le protéasome Pour savoir si la forte surexpression de la protéine iNOS résultant de la déficience en isoformes TAp73 pourrait provenir, en plus d'une plus forte induction transcriptionnelle, de mécanismes affectant la stabilité de la protéine iNOS, nous avons voulu comparer son temps de demi-vie dans les 3T3 TAp73 / et TAp73-/-. Nous avons mesuré la stabilité de la protéine iNOS en induisant en premier lieu son expression dans les fibroblastes 3T3 avec de l'IFN-, du TNF- et de l'IL-1 (mix de cytokines) pendant 24h, puis en incubant les cellules en présence de 10 g/ml de cycloheximide pour interrompre tout processus de synthèse protéique. Des extraits protéiques ont ensuite été récoltés à différents moments pour mesurer par western-blot la dégradation de la protéine iNOS au cours du temps. Les résultats présentés sur la Figure III- 3A/B indiquent que la dégradation de la protéine iNOS est significativement plus rapide dans les 3T3 TAp73 / par rapport aux 3T3 TAp73-/-. Dans les cellules TAp73 / , la iNOS résiduelle est presque inexistante après 24h de traitement avec la cycloheximide (environ 16% de la quantité de départ), tandis qu'il en reste près de la moitié dans les cellules TAp73-/-. Le processus de dégradation de la protéine iNOS suit une loi de décroissance exponentielle, ce qui nous a permis d'estimer le temps de demi-vie de la protéine iNOS dans les cellules TAp73 / et TAp73-/- (cf. Figure III-3C). Nous avons ainsi calculé un temps de demi- vie de la iNOS de 9, 6 heures dans les 3T3 TAp73 / , tandis que ce temps est de 21, 5 heures dans les 3T3 TAp73-/-, ce qui représente une augmentation substantielle de la stabilité de la protéine iNOS dans ces cellules déficientes en isoformes TAp73. L'expression des protéines de référence (actine et tubuline) s'est révélée stable tout au long du traitement avec la cycloheximide. Nous avons ensuite souhaité évaluer l'implication du protéasome dans le déficit de dégradation de la protéine iNOS observé dans les 3T3 TAp73-/-. Pour cela, des expériences similaires à celles décrites précédemment ont été réalisées, en ajoutant des inhibiteurs du 152 Chapitre IV : Résultats expérimentaux protéasome au moment du traitement avec la cycloheximide. Après un traitement avec le MG- 132 (résultats présentés sur la Figure III-3E/F), qui inhibe les activités peptidases multiples du protéasome, la stabilité de la protéine iNOS dans les 3T3 TAp73 / après 8h de traitement avec la cycloheximide augmente pour devenir similaire à celle de la iNOS dans les 3T3 TAp73-/- (respectivement 83 et 85% de iNOS résiduelle après 8h de traitement). L'inhibition du protéasome induit donc un effet stabilisateur de la iNOS très fort dans les cellules TAp73 / , tandis qu'il est quasiment imperceptible dans les cellules TAp73-/-. Une cinétique de dégradation de la iNOS dans les 3T3 TAp73 / et TAp73-/- a aussi été réalisée en présence de lactacystine (cf. Figure III-3D), un autre inhibiteur du protéasome plus sélectif encore que le MG-132 (qui inhibe aussi les calpaïnes et certaines sérines protéases). Cette fois encore, nous avons observé une forte augmentation de la stabilité de la protéine iNOS dans les 3T3 TAp73 / grâce au traitement avec la lactacystine, alors que celle-ci n'avait aucun effet dans les cellules TAp73-/-. L'ensemble de ces résultats démontre que l'expression des isoformes TAp73 est nécessaire pour une dégradation optimale de la protéine iNOS par le protéasome. 1. 2. 3 La régulation négative de la iNOS par les isoformes TAp73 dépend d'un facteur sécrété par les cellules En multipliant les expériences d'induction de l'expression de la iNOS dans les 3T3 TAp73 / et TAp73-/-, nous avons finalement remarqué que la surexpression observée dans les cellules TAp73-/- semblait dépendre des conditions dans lesquelles sont cultivées les cellules avant l'induction : le phénotype nous est apparu beaucoup plus marqué lorsque les cellules sont maintenues en culture plusieurs jours avant le début de l'induction. Pour tester l'influence de la durée de préculture des cellules sur la capacité d'induction de l'expression de la iNOS, nous avons d'abord maintenu les cellules dans un milieu pauvre en sérum (0, 5%) pendant un, trois ou cinq jours, afin de limiter les effets de potentiels facteurs régulateurs présents dans le sérum. A l'issue de cette période d'incubation, nous avons traité les cellules avec le cocktail de cytokines sans avoir renouvelé le milieu de culture. Les résultats montrés sur la Figure III-4A/B indiquent que la régulation négative de l'expression de la iNOS exercée par les isoformes TAp73 apparait seulement après que les cellules aient été maintenues en culture plusieurs jours avant l'induction. En effet, l'expression de la iNOS dans les 3T3 153 Chapitre IV : Résultats expérimentaux TAp73 / et TAp73-/- est identique lorsque l'induction a lieu le lendemain de l'ensemencement dans le milieu pauvre en sérum. En revanche, après 3 jours de préculture, l'expression de la iNOS est réduite de 58% dans les cellules TAp73 / , mais de seulement 26% dans les cellules TAp73-/-. Après 5 jours, la différence d'expression de la iNOS est encore plus influencée par les isoformes TAp73, puisqu'elle se trouve réduite de 76% dans les 3T3 TAp73 / et de seulement 35% dans les 3T3 TAp73-/-. Cette expérience suggère que les cellules 3T3 produisent au moins un facteur qui régule négativement l'expression de la iNOS, et que son effet est très nettement renforcé par la présence des isoformes TAp73 dans les cellules. Nous suspections également que la concentration en sérum utilisée au moment de l'induction de la iNOS puisse être à l'origine de la surexpression de la iNOS observée dans les 3T3 TAp73-/-. Nous avons donc comparé l'induction de l'expression de la iNOS dans les deux lignées cellulaires après les avoir incubées pendant 24h dans un milieu pauvre (0, 5%) ou riche (5%) en sérum (cf. Figure III-4C/D). Les résultats montrent que la privation en sérum permet d'augmenter de façon spectaculaire l'induction de l'expression de la iNOS dans les 3T3 TAp73 / (avec un facteur 10, 2), ce qui lui permet d'atteindre le même niveau que dans les 3T3 TAp73-/- pour lesquels l'effet de la privation est beaucoup plus modeste (facteur 1, 9). Lorsque les cellules ne subissent pas de période prolongée de préculture, la présence d'une forte concentration en sérum est donc nécessaire pour observer la forte différence d'induction d'expression de la iNOS observée entre les cellules TAp73 / et TAp73-/-. Dans leur ensemble, ces résultats suggèrent que les isoformes TAp73 permettent un maintien de la sensibilité à un ou plusieurs facteurs produits par les fibroblastes 3T3 et présents dans le sérum qui exercent une répression de l'expression de la iNOS. 1. 3 Réduction de l'effet suppresseur du TGF- sur l'induction de la iNOS dans les 3T3 TAp73-/- A la suite des résultats acquis, nous nous sommes mis en quête d'identifier le ou les facteur(s) produit(s) par les cellules 3T3 et présent(s) dans le sérum, dont l'effet négatif sur l'expression de la iNOS serait en partie dépendant des isoformes TAp73. Notre attention s'est assez rapidement portée sur le TGF-, une cytokine immunosuppressive exerçant une régulation négative sur l'expression de la iNOS à de multiples niveaux, notamment transcriptionnels et post-traductionnels. De plus, cette cytokine est produite par les fibroblastes 154 Chapitre IV : Résultats expérimentaux et les sérums de veau fœtal utilisés en culture cellulaire sont connus pour contenir de fortes concentrations en TGF- sous forme latente545. Ces caractéristiques se rapprochant fortement des propriétés d'inhibition de l'expression de la iNOS par les isoformes TAp73 décrites précédemment, nous avons par conséquent entrepris de tester l'implication du TGF- dans cette régulation. Afin de limiter les interférences provenant du TGF- vraisemblablement présent dans le sérum et du TGF- produit par les cellules, nous avons réalisé des cinétiques d'induction de l'expression de la iNOS après privation quasi-complète de sérum (0, 5%), le jour suivant l'ensemencement, en absence ou en présence de TGF-1 exogène. Le TGF-1 est l'isoforme de TGF- la plus étudiée et celle possédant le plus fort effet répresseur sur l'expression de la iNOS d'après plusieurs études233. Dans ces conditions, comme mentionné auparavant, l'induction de la iNOS par le mix de cytokines n'est que légèrement supérieure dans les 3T3 TAp73-/-, avec une hausse de seulement 50% de l'expression de la protéine (cf. Figure III-5A/B), qui ne se répercute pas sur la production de NO (cf. Figure III-5C). L'ajout de TGF-1 exogène (5 ng/ml) au moment de l'induction de la iNOS réprime très fortement l'expression de cette dernière dans les 3T3 TAp73 / (62% de répression à 16h, 60% à 24h) et la production de NO2 - (qui passe de 12, 3 à 5, 8 M après 24h) (cf. Figure III-5D). Cependant, le TGF-1 n'exerce qu'un très léger effet répresseur sur l'induction de la iNOS dans les cellules TAp73-/- (seulement 7% à 16h, et 20% à 24h d'après son expression quantifiée en western-blot). De façon remarquable, grâce au traitement des cellules avec le TGF-1, le ratio d'expression de la iNOS TAp73 / vs TAp73-/- passe de 1, 47 à 2, 76. Ainsi, dans des cultures privées de sérum, l'ajout de TGF-1 exogène est suffisant pour restaurer l'effet négatif des isoformes TAp73 sur l'expression de la iNOS. Ces résultats semblent suggérer que les isoformes TAp73 nécessitent la présence du TGF- pour limiter l'induction de la iNOS. Dans le cas o cette hypothèse se vérifierait, une inhibition de la voie de signalisation dépendante du TGF- devrait suffire à supprimer l'effet des isoformes TAp73 dans les cellules 3T3. La molécule SB-525334 est un puissant inhibiteur sélectif du récepteur de type I au TGF- (ALK5)546. Dans des expériences o la concentration en sérum est élevée (5%) et o il y a donc une forte surexpression de la iNOS dans les cellules TAp73-/-, le SB-525334 (5 M) augmente de façon spectaculaire l'expression de la iNOS dans les cellules TAp73 / avec un facteur 4 (cf. Figure III-5E/F), de telle sorte qu'en sa présence l'expression de la iNOS devient identique dans les deux lignées. Cet inhibiteur a un effet beaucoup plus modéré sur l'induction de l'expression de la iNOS dans les 3T3 TAp73-/- (facteur 155 Chapitre IV : Résultats expérimentaux 1, 8). Ceci est en accord avec le plus faible effet répresseur exercé par le TGF-1 exogène sur l'expression de la iNOS dans ces cellules. Ces résultats suggèrent, comme nous l'avions supposé, que le TGF- contenu dans le sérum est impliqué dans la régulation négative de l'expression de la iNOS par les isoformes TAp73. Nous pouvons en outre remarquer que le SB- 525334 permet de supprimer complètement les effets cumulés du TGF- contenu dans le sérum et de celui ajouté de façon exogène, puisque dans les conditions o les deux sont présents l'expression de la iNOS est aussi rétablie au même niveau dans les 3T3 TAp73 / et TAp73-/-. Enfin, ces résultats ont pu être confirmés par le dosage des ions NO2 - dans les surnageants de culture, avec une hausse très importante de la concentration en NO2 - lorsque les 3T3 TAp73 / sont traités avec le SB-525334, tandis que cette hausse est très légère pour les 3T3 TAp73-/- (cf. Figure III-5G). Prises dans leur globalité, ces données indiquent qu'il existe un dialogue entre les isoformes TAp73 et la voie de signalisation du TGF- qui permet la répression de l'expression de la iNOS. 1. 4 Mécanismes de coopération entre les isoformes TAp73 et le TGF- dans la répression de la iNOS Afin de chercher des pistes mécanistiques qui pourraient expliquer par quels moyens les isoformes TAp73 potentialisent l'effet répresseur du TGF- sur l'induction de la iNOS, nous avons choisi de suivre l'état de phosphorylation de SMAD2 dans les cellules TAp73 / et TAp73-/- dans différentes conditions. L'activation par phosphorylation de SMAD2 sur les résidus Ser465 et Ser467 est l'un des premiers évènements à initier la voie de signalisation du TGF-. Elle se produit lors d'une interaction transitoire entre SMAD2 et le récepteur de type I au TGF- (TRI/ALK5) qui est lui-même phosphorylé par le récepteur TRII après sa liaison au TGF-. Cette phosphorylation de SMAD2 est un préalable à son association avec SMAD4 et à la translocation du complexe dans le noyau547. Dans les 3T3 TAp73-/-, nous avons effectivement mesuré une forte accumulation de la forme phosphorylée de SMAD2 en réponse au TGF-1 ajouté de façon exogène (avec un facteur 10 suite à un traitement avec 5 ng/ml de TGF-1) (cf. Figure III-6D). Le traitement préalable des cellules avec le SB-525334 prévient totalement l'activation de SMAD2 par phosphorylation. Le niveau de phosphorylation augmente très rapidement après la stimulation avec le TGF-1, et il atteint son maximum au bout d'une heure (cf. Figure III-6C). Ce niveau de phosphorylation est ensuite maintenu au moins pendant 8h. 156 Chapitre IV : Résultats expérimentaux Nous avons commencé par mesurer l'impact de la concentration en sérum (deux lots provenant de fournisseurs différents) sur le niveau de phosphorylation de SMAD2, 24h après l'induction de la iNOS dans les 3T3 TAp73 / et TAp73-/- (cf. Figure III-6A/B). Les résultats montrent que le niveau basal de phosphorylation de SMAD2 dans un milieu de culture appauvri en sérum est très faible, et associé à une induction équivalente de la iNOS dans les cellules TAp73 / et TAp73-/-. De façon très intéressante, le passage des cellules dans un milieu riche en sérum (10%) induit une accumulation significative de la forme phosphorylée de SMAD2 dans les 3T3 TAp73 / (avec un facteur 3, 10) qui ne se produit aucunement dans les 3T3 TAp73-/-. Dans ces mêmes conditions, le SB-525334 ramène le niveau de phosphorylation de SMAD2 à un niveau semblable à celui observé dans le milieu pauvre en sérum. Ces résultats suggèrent que l'activation de la voie de signalisation du TGF- par le TGF- présent dans le sérum est amoindrie dans les 3T3 TAp73-/- lorsqu'ils sont cultivés de façon prolongée dans ces conditions. Ils peuvent être corrélés à la surexpression de la iNOS observée dans ces cellules dans des conditions o le milieu de culture est riche en TGF- endogène présent dans le sérum ou produit par les cellules. La totalité du TGF- présent sous forme latente dans le sérum peut être activé grâce à la chaleur suite à une incubation préalable du sérum pendant 10 minutes à 80C. En incubant les 3T3 avec ce sérum activé par la chaleur, nous avons observé une forte augmentation de la phosphorylation de SMAD2 à la fois dans les 3T3 TAp73 / et TAp73-/- (avec un facteur voisin de 6). Ceci démontre que la concentration en TGF- latent présente dans le sérum est suffisamment importante pour activer efficacement SMAD2 par phosphorylation dans les deux types de lignées. Le SB-525334 inhibe complètement la phosphorylation de SMAD2 induite par le TGF- activé par la chaleur. A partir de ces résultats, nous avons émis l'hypothèse que la perte d'effet répresseur du TGF- sur l'expression de la iNOS constatée dans les cellules génétiquement déficientes en isoformes TAp73 pourrait provenir d'un déficit d'activation du récepteur ALK5 en réponse au TGF- dans ces cellules. Nous avons donc entrepris de tester la sensibilité des 3T3 TAp73 / et TAp73-/- au TGF-, en mesurant le niveau de phosphorylation de SMAD2 en réponse à des doses croissantes de TGF-1 (après 1h de stimulation dans un milieu appauvri en sérum). Les résultats démontrent un niveau identique de phosphorylation de SMAD2 dans les cellules TAp73 / et TAp73-/- en réponse à ces concentrations de TGF-1 (cf. Figure III-6E/F). Le niveau de phosphorylation maximal de SMAD2 est atteint pour la même concentration en TGF-1, 157 Chapitre IV : Résultats expérimentaux soit 1 ng/ml, et une concentration de 100 pg/ml est suffisante pour parvenir à la moitié de ce niveau maximal dans les deux types de lignées. Les résultats précédents suggèrent que si le niveau basal de phosphorylation de SMAD2 semble supérieur dans les 3T3 TAp73 / lorsque les cellules sont cultivées de façon prolongée (24h) dans un milieu contenant une forte concentration en sérum, l'activation précoce (1h) de la voie en réponse à du TGF-1 exogène ne semble en revanche pas altérée par la déficience en isoformes TAp73. Ces résultats suggèrent que les isoformes TAp73 pourraient moduler la réponse à long terme des cellules au TGF-, mais ils ne permettent pas encore d'expliquer la perte d'effet suppresseur du TGF-1 exogène utilisé en forte concentration (5 ng/ml) sur l'induction de la iNOS dans les cellules TAp73-/-, car dans ces conditions les niveaux d'activation par phosphorylation de SMAD2 sont identiques pour les deux génotypes après 1h de traitement. Nous avons pu confirmer, par l'intermédiaire d'un dosage ELISA, que les différents lots de sérum utilisés lors de cette étude contiennent une quantité importante de TGF-1 (500 pg/ml), suffisante pour expliquer l'effet répresseur du sérum sur l'induction de la iNOS et le fort niveau basal de phosphorylation de SMAD2 constatés dans les 3T3 TAp73 / (cf. Figure III-7A). Nous avons aussi mesuré la production totale de TGF-1 par les 3T3, que nous n'avons pas trouvé affectée par le statut de TAp73 : la production journalière s'élève à 65 pg/ml pour les cellules des deux génotypes (cf. Figure III-7B/C). Afin de trouver une explication au déficit de dégradation de la protéine iNOS par le protéasome observé dans les 3T3 TAp73-/-, nous avons décidé de suivre l'expression des gènes Spsb1 et Spsb2. Ces deux gènes codent pour des protéines SOCS-box à domaine SPRY (SplA/ryanodine receptor) qui servent de sous-unité de reconnaissance de la iNOS au sein de complexes E3 ubiquitine ligase de type ECS (cf. Introduction, partie 1. 5. 3). De façon très intéressante, nous avons constaté une forte induction de l'expression du gène Spsb1 en réponse au TGF-1 dans les 3T3 TAp73 / (avec un facteur 3, 4 après 24h de traitement), qui n'a pas lieu dans les 3T3 TAp73-/- (cf. Figure III-7D/E). Les isoformes TAp73 semblent ainsi nécessaires à l'induction de l'expression de SPSB1 en réponse au TGF-1, ce qui pourrait expliquer au moins en partie la plus grande stabilité de la iNOS dans les 3T3 TAp73-/-. Nous avons enfin remarqué que l'expression de Spsb2 n'est pas significativement modifiée par le traitement avec le TGF-1, que ce soit dans les cellules TAp73 / ou TAp73-/-. 158 Chapitre IV : Résultats expérimentaux 1. 5 Conséquences fonctionnelles de la surproduction de NO induite par la déficience en isoformes TAp73 1. 5. 1 Renforcement de la réponse antioxydante dépendante de Nrf2 et de NO dans les 3T3 TAp73-/- Comme cela a été décrit dans l'introduction, les fortes concentrations en NO peuvent induire l'activation de multiples facteurs de transcription tels que p53 et HIF-1. Le facteur de transcription Nrf2 (facteur apparenté à NF-E2) est lui aussi un effecteur activé par l'activité iNOS. Il coordonne l'expression d'un grand nombre de gènes impliqués dans le métabolisme des xénobiotiques et qui protègent les cellules d'un stress oxydatif (ROS) ou nitrosant causé par une forte concentration en NO et en ses dérivés. Malgré la forte augmentation de la production de NO par les 3T3 TAp73-/-, nous n'avons pas constaté de hausse de leur mortalité en comparaison avec les 3T3 TAp73 / . C'est la raison pour laquelle nous avons fait l'hypothèse d'un renforcement de la réponse cytoprotectrice dépendante de Nrf2 dans ces cellules. Pour évaluer les conséquences éventuelles de la perte d'expression des isoformes TAp73 sur l'activation de Nrf2, nous avons mesuré par RT-qPCR l'induction de l'expression de plusieurs gènes cibles classiquement activés par ce facteur de transcription dans les 3T3 TAp73 / et TAp73-/-, en réponse au mix de cytokines proinflammatoires. L'expression des gènes codant la sulfirédoxine (Srxn1), l'hème oxygénase 1 (Hmox1), la NADPH quinone déshydrogénase 1 (Nqo1) et la sestrine 2 (Sesn2) a été analysée 24h après le début de la stimulation cytokinique des cellules 3T3. Les résultats présentés sur la Figure III-8 montrent tout d'abord que, comme cela était attendu, la stimulation des cellules 3T3 TAp73 / avec une combinaison d'IFN-, de TNF- et d'IL-1 a pour conséquence d'induire de façon substantielle l'expression des quatres gènes cibles de Nrf2 analysés : l'expression de Hmox1 est multipliée par 5, 2, celle de Srxn par 2, 2, celle de Nqo1 par 3, 7 et celle de Sesn2 par 2, 1 (cf. Figures III-8C/D/E/F respectivement). Ceci suggère que le facteur de transcription Nrf2 est bien activé dans cette lignée de fibroblastes en réponse à une stimulation par les cytokines proinflammatoires qui induisent l'expression de la iNOS. De façon remarquable, nous avons constaté qu'une augmentation importante de l'induction de ces gènes cibles de Nrf2 apparait dans les 3T3 TAp73-/- en réponse au traitement par le mix de cytokines dans un milieu riche en sérum (5%). Après 24h, l'expression du gène 159 Chapitre IV : Résultats expérimentaux Hmox1 dans les cellules 3T3 TAp73-/- est multipliée par 26, celle de Srxn par 4, 3, celle de Nqo1 par 6, 8 et celle de Sesn2 par 3, 1. Le niveau basal d'expression de ces différents gènes est très comparable pour les deux génotypes, ce qui implique que leur niveau d'expression relatif est très largement supérieur dans les cellules TAp73 / à l'issue des 24h de stimulation, avec un ratio TAp73-/- vs TAp73 / culminant par exemple à 10 pour Hmox1. Pour déterminer si l'augmentation de l'induction de ces gènes cibles de Nrf2 dans les 3T3 TAp73-/- est bien la conséquence d'une surproduction de NO, nous avons mesuré leur expression après 24h de traitement avec le mix de cytokines en présence d'un inhibiteur de l'activité iNOS. L'aminoguanidine (2 mM) a été choisie car elle permet d'inhiber en totalité l'activité enzymatique de la iNOS (cf. Figure III-8A), mais aussi car elle n'a pas d'effet sur l'expression du gène NOS2 (cf. Figure III-8B) et ne présente pas de toxicité à cette concentration. L'analyse par RT-qPCR de l'expression des gènes Hmox1, Srxn et Nqo1 montre que le traitement des cellules avec l'aminoguanidine prévient en totalité leur induction par le mix de cytokines (cf. Figure III-8C/D/E). Ceci démontre donc que la hausse de leur induction par le mix de cytokines dans les 3T3 TAp73-/- est bien la conséquence de la surproduction de NO dans ces cellules. Nous n'avons pas observé de perte de l'induction du gène Sesn2 lors du traitement avec l'aminoguanidine, ce qui suggère que son induction par le cocktail de cytokines dans les 3T3 TAp73-/- ne dépend apparemment pas de la synthèse de NO (cf. Figure III-8F). En conclusion, nous pouvons donc affirmer que les isoformes TAp73 limitent fortement l'expression de gènes cibles de Nrf2 dont l'induction est dépendante de la production de NO. Après avoir démontré que la surexpression de la iNOS dans les 3T3 TAp73-/- a pour conséquence de renforcer l'induction de gènes sous la dépendance de Nrf2 et assurant une adaptation au stress nitrosant et oxydant, nous avons voulu savoir si ce phénomène était aussi dépendant de la signalisation par le TGF-. Nous avons pour cela réalisé une série d'expériences similaires aux précédentes en analysant l'effet d'un traitement avec du TGF-1 exogène et avec l'inhibiteur sélectif d'ALK5 (SB-525334). Les résultats indiquent que le TGF- 1 exogène permet de réduire l'accumulation d'ARNm Nos2 en réponse à la stimulation par le mix de cytokines de 34% dans les 3T3 TAp73 / , tandis qu'il n'a pas d'effet significatif sur les 3T3 TAp73-/- (cf. Figure III-9A). De façon intéressante, ces variations d'expression du gène Nos2 se répercutent directement sur le niveau d'induction des gènes cibles de Nrf2 analysés dans les mêmes conditions : les inductions de Hmox1, Srxn et Nqo1 sont respectivement réduites de 66%, 30% et 64% par le TGF-1 dans les cellules TAp73 / , alors qu'elles ne sont 160 Chapitre IV : Résultats expérimentaux pas affectées dans les cellules TAp73-/- (cf. Figure III-9B/C/D). De même que le traitement des cellules avec le SB-525334 supprime l'effet négatif exercé par les isoformes TAp73 sur l'induction du gène Nos2 (cf. Figure III-9A), il permet aussi de rétablir un niveau identique d'induction des trois gènes cibles de Nrf2 testés (cf. Figure III- 9B/C/D). L'inhibition de la voie de signalisation dépendante d'ALK5 permet en effet de multiplier l'expression de Hmox1 par 7, 9, celle de Srxn par 6, 2 et celle de Nqo1 par 5, 4 dans les 3T3 TAp73 / en comparaison aux mêmes cellules non traitées. D'un autre côté, le traitement des 3T3 TAp73-/- avec le SB-525334 n'a aucun effet significatif sur l'induction de Hmox1 et Nqo1 par le mix de cytokines, et seulement un faible effet sur celle de Srxn (facteur 2, 1). L'expression de la protéine HMOX1 a aussi été suivie par Western-Blot dans ces conditions, et elle confirme les résultats obtenus par RT-qPCR sur les variations des niveaux de transcrits Hmox1 : la protéine HMOX1 apparait fortement induite par le mix de cytokines et très surexprimée dans les cellules 3T3 TAp73-/- lorsque ces dernières sont cultivées en présence d'une forte concentration de sérum (cf. Figure III-9E). Le traitement avec le TGF-1 exalte ce différentiel d'expression tandis que le SB-525334 permet de rétablir, dans les 3T3 TAp73 / , une expression similaire de HMOX1 à celle observée dans les 3T3 TAp73-/-. En conclusion, toutes ces données indiquent que la coopération entre les isoformes TAp73 et la voie de signalisation du TGF- permet de moduler la réponse génique dépendante de Nrf2 par l'intermédiaire de leur effet répresseur sur l'induction de la iNOS. Afin de montrer la pertinence du choix des gènes cibles de Nrf2 que nous avons choisi d'étudier, nous avons analysé l'induction de ces gènes dans des macrophages dérivant de cellules de moelle osseuse de souris Nrf2 / et Nrf2-/-. L'induction de la iNOS dans ces macrophages BMDM est réalisée par un traitement des cellules avec du LPS (100 ng/ml) et de l'IFN- (10 U/ml) pendant 24h, à l'issue de leur différenciation. La dépendance à la production de NO de l'induction des différents gènes cibles analysés a aussi été testée en traitant les cellules avec différents inhibiteurs de NO synthases : l'aminoguanidine (AG), la S-éthyl thiourée (SEITU) et l'ester méthylique de N-Nitroarginine (L-NAME). Les résultats que nous avons obtenus montrent une très forte induction des gènes Hmox1 (facteur 22, 3), Srxn (facteur 5, 0), Nqo1 (facteur 2, 3) et Sesn2 (facteur 6, 8) dans les BMDM Nrf2 / en réponse au traitement avec le LPS et l'IFN- (cf. Figure III-10A/B/C/D). Alors que la iNOS semble induite de façon similaire dans les BMDM Nrf2 / et Nrf2-/-, comme en atteste 161 Chapitre IV : Résultats expérimentaux la production de NO2 - identique pour les macrophages des deux génotypes (cf. Figure III-10E), l'induction des quatre gènes testés est très fortement réduite dans les BMDM Nrf2-/- : réduction de 92% pour Hmox1, de 73% pour Srxn, de 63% pour Nqo1 et de 93% pour Sesn2. Ceci suggère que Nrf2 est en grande partie responsable de l'induction de ces quatre gènes en réponse au traitement avec le LPS et l'IFN-. De façon similaire à nos expériences sur les 3T3, l'inhibition de l'activité iNOS avec les trois inhibiteurs différents permet d'inhiber l'induction des gènes Hmox1, Srxn et Nqo1 par le traitement avec le LPS et l'IFN-, mais pas celle de Sesn2. Ces résultats démontrent que si ces quatre gènes sont bien des cibles du facteur de transcription Nrf2, seuls Hmox1, Srxn et Nqo1 sont transcriptionnellement activés en réponse à une forte production de NO par les macrophages. 1. 5. 2 Les isoformes TAp73 et le TGF-1 affectent les effets antiparasitaires dépendants de NO lors d'une infection avec T. musculi Trypanosoma musculi est un parasite spécifique de la souris qui se développe de façon extracellulaire et circule dans le flux sanguin. Plusieurs études ont rapporté une activité cytostatique et cytotoxique de l'activité iNOS des macrophages activés sur ce parasite548, 549. Nous avons étudié l'impact de la coopération entre les isoformes TAp73 et le TGF- sur la capacité des cellules 3T3 à limiter la prolifération de T. musculi grâce à la synthèse de NO. Pour cela, la croissance des parasites a été estimée par numération après une coculture de trois jours des 3T3 et de T. musculi suite à un traitement avec le mix de cytokines, du TGF-1 exogène, l'inhibiteur SB-525334 et l'inhibiteur SEITU (cf. Figure III-11A). La production de NO2 - par les 3T3 en réponse aux différents traitements a été contrôlée en parallèle, après 24h de traitement (cf. Figure III-11B). Les résultats de nos comptages montrent qu'en absence de traitement, les cellules 3T3 TAp73 / et TAp73-/- soutiennent la croissance du parasite de façon identique, avec une multiplication du nombre de parasites par un facteur voisin de 3. Lorsque les 3T3 sont traités avec le mix de cytokines (IFN-, TNF- et IL-1) dans un milieu pauvre en sérum, nous observons une forte réduction de la prolifération du parasite, de 42% avec les 3T3 TAp73 / et de 66% avec les 3T3 TAp73-/-. Cet effet antiprolifératif légèrement supérieur avec les 3T3 TAp73-/- est associé à une légère augmentation de la production de NO2 - par ces cellules (17, 6 M de NO2 - contre seulement 12, 3 M avec les 3T3 162 Chapitre IV : Résultats expérimentaux TAp73 / ). L'effet antiprolifératif du traitement des 3T3 avec les cytokines proinflammatoires est totalement perdu lorsque les cellules sont aussi traitées avec la SEITU, qui inhibe la production de NO, tandis qu'elle n'a pas d'effet sur la croissance du parasite utilisée seule. Ce résultat démontre que les 3T3 exercent un effet antiprolifératif sur T. musculi au travers de l'induction de la iNOS et la production de NO. De façon très intéressante, le traitement des 3T3 avec le TGF-1 exogène et le mix de cytokines, en même temps qu'il provoque une réduction importante de la production de NO par les 3T3 TAp73 / (seulement 6 M de NO2 - produits), limite aussi très fortement l'effet antiprolifératif des 3T3 sur le parasite, dont la multiplication est seulement réduite de 19%. A l'opposé, le TGF-1 n'a pas d'effet sur la production de NO2 - par les 3T3 TAp73-/- ni sur l'effet antiprolifératif exercé par ces cellules en réponse au mix de cytokines. De plus, le SB-525334 permet à la fois de rétablir une forte production de NO par les 3T3 TAp73 / à un niveau identique aux 3T3 TAp73-/-, mais il permet également aux cellules des deux génotypes d'exercer un très fort effet cytostatique sur T. musculi : l'inhibition de la croissance est de 74% avec les 3T3 TAp73 / , et de 72% avec les 3T3 TAp73-/-. En conclusion, ces résultats montrent que les isoformes TAp73 et le TGF-, en coopérant et en modulant la production de NO via leur effet répresseur sur l'expression de la iNOS, sont capables d'affecter les effets antiparasitaires exercés par les cellules 3T3 en réponse à des cytokines proinflammatoires. 2 Etude préliminaire des effets des isoformes Np73 dans la régulation de la iNOS et la réponse au TGF- 2. 1 Régulation de l'expression de la iNOS par les isoformes Np73 dans les BMDM Nous avons entrepris une étude préliminaire des effets des isoformes Np73 et du TGF- dans des macrophages dérivant de cellules de moelle osseuse de souris (BMDM). Pour cela, des cellules de moelle osseuse de souris Np73 / et Np73-/- ont été extraites puis différenciées en culture grâce à du milieu conditionné de cellules L929 (cf. Matériel & méthodes pour plus 163 Chapitre IV : Résultats expérimentaux de précisions), avant de subir un traitement avec une combinaison de LPS (30 ng/ml) et d'IFN- (10 U/ml) pendant 24h pour permettre l'induction de la iNOS dans ces cellules. A noter que ces concentrations en agents inducteurs permettent une induction maximale de l'expression de la iNOS dans ces cellules d'après nos tests d'induction (résultats non montrés de mesure de production de nitrite et d'expression de la iNOS en réponse à des concentrations croissantes en IFN- et/ou en LPS). Nos résultats indiquent tout d'abord qu'en absence de TGF-, l'induction de la iNOS est identique dans les BMDM Np73 / et Np73-/-, comme l'illustre la production de nitrite identique mesurée dans le surnageant de ces cellules (cf. Figure III-12A, environ 50 M de nitrite après 24h de stimulation). Lorsque les BMDM sont traités avec du TGF-1 exogène (0, 5 ng/ml) dans des conditions similaires aux 3T3 (privation de sérum et ajout du TGF-1 seulement 1h avant le LPS et l'IFN-), l'effet répresseur du TGF-1 n'est pas affecté par la déficience en isoformes Np73. Le TGF-1 réduit significativement la production de nitrite de 35% environ dans les BMDM Np73 / et Np73-/- (cf. Figure III-12A). Pour les deux génotypes, nous avons observé un effet répresseur maximal du TGF-1 sur l'expression de la protéine iNOS et la production de nitrite atteint pour une concentration en TGF-1 de 0, 25 ng/ml (résultat non présenté). Nous nous sommes ensuite demandé si un traitement prolongé de ces cellules avec du TGF-1 ne pourrait pas avoir un effet différentiel sur l'induction de la iNOS en fonction du statut de Np73. Les BMDM Np73 / et Np73-/-, à l'issue de leur différenciation, ont donc été soumis à un traitement de 48h avec du TGF-1 exogène avant de subir une stimulation avec du LPS et de l'IFN- pendant 24h (aux cours desquelles le milieu de culture et le traitement avec le TGF-1 sont renouvelés). Les résultats, présentés sur la Figure III-12A/B, montrent que l'effet répresseur du TGF-1 sur la iNOS est perdu en grande partie dans les BMDM Np73-/-. En effet, tandis que le TGF-1 exerce toujours un effet significatif sur les BMDM Np73 / , avec une réduction de la production de nitrite et de l'expression de la iNOS de respectivement 40% et 66%, son effet sur les BMDM Np73-/- a quasiment disparu. De plus, l'ajout de l'inhibiteur de ALK5 (SB-525334) pendant toute la durée des traitements permet de rétablir un niveau identique de production de nitrite et d'expression de la iNOS dans les BMDM Np73 / et Np73-/-. Nous avons aussi remarqué une réduction de la capacité d'induction de la iNOS dans les BMDM, qui est indépendante du TGF-1, après que les cellules aient été maintenues 48h dans un milieu sans cytokines exogènes (cf. Figure III-12A, seulement 25 M de nitrite 164 Chapitre IV : Résultats expérimentaux produit après 24h, soit une réduction de 50%, qui n'est pas prévenue par le SB-525334). Nos résultats suggèrent que les isoformes Np73 permettent un maintien au long terme du potentiel répresseur du TGF- sur l'induction de la iNOS dans les BMDM. Nous avons souhaité savoir si, de façon analogue à ce que nous observions dans les cellules 3T3, la modulation de l'expression de la iNOS par les isoformes Np73 et le TGF- pouvait se répercuter sur la réponse génique dépendante de Nrf2 (cf. Figure III-12C/D/E/F). Nous avons observé une forte induction transcriptionnelle des trois gènes cibles de Nrf2 (Hmox1, Nqo1, Srxn) dans les BMDM (entre un facteur 5 et un facteur 10) en réponse au traitement avec le LPS et l'IFN-. Comme dans les cellules 3T3, cette induction est aussi dépendante de la production de NO, car un traitement avec l'aminoguanidine la prévient totalement (résultat non montré). La faible surexpression de la iNOS dans les BMDM Np73-/- (facteur 1, 72 d'après la Figure III-12B) est aussi visible au niveau transcriptionnel (facteur 1, 66 ; cf. Figure III-12C). De façon intéressante, elle se répercute sur le niveau d'induction de Srxn et de Nqo1, avec une hausse de 32% et de 38%, respectivement (cf. Figure III-12D/F). Elle n'a pas d'effet significatif sur l'induction de Hmox1 (cf. Figure III-12E). En revanche, le traitement prolongé des BMDM Np73 / avec le TGF-1 réduit fortement l'induction de ces trois gènes (entre 45% et 64% selon le gène), alors qu'il n'a aucun effet significatif dans les BMDM Np73-/-. Ces résultats sont parfaitement corrélés au niveau d'expression du gène Nos2, puisque le TGF-1 réprime fortement son expression dans les BMDM Np73 / , mais pas dans les BMDM Np73-/- (cf. Figure III-12C). Enfin, le SB-525334 permet d'annuler l'effet du TGF- 1 et rétabli un niveau identique d'induction de Nos2 et des gènes cibles de Nrf2 analysés. 2. 2 Potentialisation de l'induction de gènes cibles du TGF- par les isoformes Np73 dans les fibroblastes pulmonaires Le TGF- est une cytokine régulant de nombreuses fonctions cellulaires telles que la prolifération, la migration et l'invasion, qui sont responsables de nombreux processus physiologiques (ex : transition épithélio-mésenchymateuse, cicatrisation, etc). Des régulations croisées entre la voie de signalisation du TGF- et des membres de la famille p53 ont été rapportées à de multiples reprises au cours de ces dernières années. Il a par exemple été découvert que l'interaction entre les isoformes Np73 et les protéines SMAD2/3 permet de potentialiser l'activité de promoteurs de gènes cibles du TGF- dans des lignées tumorales 165 Chapitre IV : Résultats expérimentaux transfectées avec différentes constructions de gènes-rapporteurs550. Nous avons voulu savoir si une telle coopération pouvait également intervenir dans un contexte plus physiologique, dans des cellules primaires fibroblastiques, que nous avons isolées à partir de poumons de souris Np73 / et Np73-/-. Les fibroblastes pulmonaires sont un modèle particulièrement bien adapté à l'étude des fonctions du TGF-, notamment très utilisé dans des modèles de pathologies comme la fibrose pulmonaire. Nous avons comparé la réponse au TGF-1 des fibroblastes pulmonaires Np73 / et Np73-/- en suivant le niveau d'expression génique d'une batterie de gènes connus pour être induits par le TGF- : Nox4, Pai-1, Smad7, Col1A, Timp1, -Sma, Mmp2, Mmp9 et Mmp13 (cf. Figure III-13). Nous avons également choisi de mesurer l'expression de Spsb1, une autre cible du TGF- nouvellement décrite dans d'autres modèles cellulaires et impliquée, entre autres, dans la dégradation de l'expression de la iNOS (cf. Discussion). Parmi les gènes cibles testés, seul Mmp2 n'a pas été induit en réponse à un traitement avec du TGF-1 (5 ng/ml pendant 24h). Tous les autres gènes testés sont induits dans des proportions variables : certains sont induits très fortement (Pai-1 (x18), Timp1 (x10), -Sma (x32) et Mmp9 (x19), tandis que d'autres le sont plus modestement (Nox4 (x3, 1), Smad7 (x2, 2), Col1A (x3, 4), Mmp13 (x3, 9) et Spsb1 (x2, 1). De façon très intéressante, nous avons constaté une très forte baisse de l'induction de certains de ces gènes dans les fibroblastes pulmonaires Np73-/- : c'est le cas pour les gènes Nox4 (réduction de 67%), -Sma (réduction de 79%), Mmp9 (réduction de 90%), Mmp13 (réduction de 72%) et Spsb1 (réduction de 82%). L'induction des autres gènes cibles analysés n'est pas significativement altérée par la déficience en isoformes Np73. Le blocage de la voie de la voie de signalisation dépendante du récepteur ALK5 avec le SB-525334 permet de prévenir en totalité l'induction de l'ensemble de ces gènes. Dans les fibroblastes pulmonaires, les isoformes Np73 semblent donc nécessaires à l'induction optimale d'un sous-ensemble de gènes cibles du TGF-. 166 Chapitre IV : Résultats expérimentaux 167 Chapitre IV : Résultats expérimentaux Figure III-1 : Détermination des conditions optimales d'induction de l'expression de la iNOS dans les cellules 3T3. (A) et (B) L'induction de l'expression de la protéine iNOS dans des fibroblastes 3T3 TAp73 / est analysée par western-blot, 48h après un traitement avec de l'IFN- (50 U/ml), du TNF- (20 ng/ml) et de l'IL-1 (20 ng/ml). La quantification est normalisée en fonction des variations d'expression de la -tubuline (protéine de référence), et rapportée à l'expression de la iNOS obtenue avec un traitement TNF- IL-1. (C) La production de NO par les cellules ayant subi des traitements identiques à ceux décrits en (A) et (B) est évaluée par un dosage des ions NO2 - dans les surnageants de culture, grâce au réactif de Griess. (D) L'induction transcriptionnelle de Nos2 est déterminée par RT-qPCR, après un traitement de 24h avec les différentes cytokines (1000 U/ml pour l'IFN-, les autres cytokines sont utilisées à la même concentration que précédemment). Le niveau de transcrits est normalisé en fonction de l'expression du gène de référence Gusb, et rapporté au niveau de transcrits Nos2 mesuré avec le traitement TNF- IL-1. 168 Chapitre IV : Résultats expérimentaux 169 Chapitre IV : Résultats expérimentaux Figure III-2 : Hausse de l'induction de l'expression de la iNOS dans les 3T3 TAp73-/-. (A) Analyse par western-blot de l'expression de la protéine iNOS dans deux clones de 3T3 TAp73 / (1 et 6) et deux clones de 3T3 TAp73-/- (4 et 5), 24h après un traitement avec deux types de stimulation (panneaux du bas) ou 36h après un traitement avec de l'IFN-, du TNF- et de l'IL-1 (panneau du haut). (B) Quantification de l'expression de la protéine iNOS analysée par western-blot 24h après une stimulation avec de l'IFN-, du TNF- et de l'IL-1 ( mix de cytokines). Les valeurs sont normalisées en fonction des protéines de référence (tubuline et actine) et rapportées à celles obtenues avec les 3T3 TAp73 / (n 3, p 0. 01 (*) ou 0. 05 (*). (C) et (D) Cinétique d'induction de l'expression de la protéine iNOS par un mix de cytokines dans des 3T3 TAp73 / et TAp73-/-, analysée et quantifiée par western-blot. Les valeurs sont rapportées à l'expression de la iNOS dans les cellules TAp73 / après 16h de stimulation (n 3). (E) Cinétique de production de nitrite par les 3T3 TAp73 / et TAp73-/- en réponse au mix de cytokines, déterminée par un dosage de Griess dans les surnageants de culture (expérience représentative, moyenne de triplicates). (F) Cinétique d'induction transcriptionnelle du gène Nos2 par le mix de cytokines dans les 3T3 TAp73 / et TAp73-/-, analysée par RT-qPCR après extraction des ARN totaux à différents temps après le début de l'induction. Les niveaux d'ARNm Nos2 sont rapportés à ceux des 3T3 TAp73 / au temps 16h. Toutes ces expériences sont effectuées dans un milieu RPMI contenant 5% de SVF. 170 Chapitre IV : Résultats expérimentaux 171 Chapitre IV : Résultats expérimentaux Figure III-3 : Baisse de la dégradation de la iNOS par le protéasome dans les 3T3 TAp73-/-. (A) et (B) L'impact de la déficience en isoformes TAp73 sur la stabilité de la protéine iNOS est étudié en mesurant l'expression résiduelle de la iNOS dans les cellules après les avoir traitées pendant 24h avec le mix de cytokines puis avec de la cycloheximide (CHX, 10 g/ml) sur des durées variables (RPMI 5% SVF). Les western-blots sont quantifiés et l'expression de la iNOS est rapportée aux contrôles respectifs (TAp73 / ou TAp73-/- à t 0, sans traitement avec la CHX) (n 4). (C) Pour calculer le temps de demi-vie de la iNOS dans les 3T3 TAp73 / et TAp73-/-, la dégradation de la protéine est modélisée selon la loi de décroissance exponentielle E E0. e-kt avec E0 l'expression de la iNOS au temps 0 (après 24h de stimulation mais sans CHX), E l'expression résiduelle de la iNOS aux différents temps de traitements avec la CHX, k la constante de décroissance et t le temps de traitement. La demi-vie est calculée grâce à la formule dérivée ln(2)/k t1/2, k étant déterminé à partir du coefficient directeur de la droite ln(E/E0) -kt. (D) L'effet de la lactacystine (5 M) sur la cinétique de dégradation de la iNOS dans les 3T3 TAp73 / et TAp73-/- est quantifié par western-blot, après son ajout en présence de CHX et suite à l'induction préalable de la iNOS pendant 24h. (E) et (F) L'effet du MG-132 (5 M) sur la stabilité de la iNOS est analysé et quantifié par western-blot en l'ajoutant avec la CHX pendant 8h, après que le mix de cytokines (CM) ait stimulé l'induction de la iNOS pendant 24h (n 3, p > 0, 05 (#) et p 0. 05 (*). 172 Chapitre IV : Résultats expérimentaux 173 Chapitre IV : Résultats expérimentaux Figure III-4 : La régulation de l'expression de la iNOS par les isoformes TAp73 dépend de la présence d'un facteur produit et sécrété par les cellules présent également dans le sérum. (A) et (B) Pour étudier l'influence de la durée de préculture des cellules 3T3 sur leur capacité d'induction de l'expression de la iNOS, les 3T3 TAp73 / et TAp73-/- sont ensemencés puis maintenus dans un milieu pauvre en sérum (0, 5%) pendant un, trois ou cinq jours avant leur traitement avec le mix de cytokines (sans renouvellement du milieu). L'expression de la iNOS est ensuite mesurée par western-blot pour ces différentes conditions, puis quantifiée et normalisée (vs actine et tubuline). Les valeurs sont rapportées à l'expression respective des cellules TAp73 / ou TAp73-/- après seulement un jour de préculture (n 3, p 0. 05(*). (C) et (D) Analyse par western-blot et quantification de l'expression de la iNOS 24h après la stimulation par le mix de cytokines et après une incubation préalable de 24h supplémentaires dans un milieu riche (5% SVF) ou appauvri (0, 5% SVF) en sérum. Les valeurs sont normalisées en fonction de la tubuline et rapportées à l'expression de la iNOS dans les cellules 3T3 TAp73 / en présence de 5% de sérum (n 3, p > 0, 05 (#) et p 0. 05 (*). 174 Chapitre IV : Résultats expérimentaux 175 Chapitre IV : Résultats expérimentaux Figure III-5 : La régulation négative de l'expression de la iNOS par les isoformes TAp73 dépend du TGF-. (A) et (B) Cinétique d'induction de l'expression de la iNOS par le mix de cytokines dans les 3T3 TAp73 / et TAp73-/-, dans un milieu appauvri en sérum (0, 5% SVF) et en présence ou non de TGF-1 exogène (5 ng/ml). L'expression est quantifiée par western-blot et normalisée en fonction de la tubuline, puis les valeurs sont rapportées à l'expression de la iNOS dans les 3T3 TAp73 / après 16h de stimulation par le mix de cytokine sans TGF-1 (n 3, p 0. 05 (*). (C) Mesure de l'activité iNOS dans les mêmes conditions qu'en (A) et (B), par dosage des ions NO2 - dans les surnageants de culture des cellules avec le réactif de Griess (moyenne de triplicatas, SD < 2%). (D) Pourcentage moyen d'inhibition de l'expression de la iNOS par le TGF-1 exogène (5 ng/ml) après 24h de traitement des 3T3 TAp73 / et TAp73-/-, calculé à partir de la quantification de l'expression de la iNOS en western-blot (n 8, p 0. 01 (*). (E) et (F) L'effet de l'inhibiteur d'ALK5, le SB-525334 (5 M), sur le niveau d'induction de l'expression de la iNOS par le mix de cytokines (CM) dans les 3T3 TAp73 / et TAp73-/- est analysé puis quantifié par western-blot 24h après le début du traitement dans un milieu riche en sérum (5% SVF), en présence ou non de TGF-1 (5 ng/ml) (n 4, p > 0, 05 (#) et p 0. 01 (*). (G) Mesure de production de NO par les 3T3 dans les conditions décrites en (E) et (F) (moyenne de triplicatas dans une expérience représentative). 176 Chapitre IV : Résultats expérimentaux 177 Chapitre IV : Résultats expérimentaux Figure III-6 : Comparaison des niveaux d'activation par phosphorylation de SMAD2 en réponse au TGF- dans les 3T3 TAp73 / et TAp73-/-. (A) et (B) L'impact de la concentration en sérum (deux fournisseurs : Biowest et PAA Laboratories) sur le niveau de phosphorylation de SMAD2 est mesuré et quantifié par western-blot. Les 3T3 TAp73 / et TAp73-/- sont précultivés 24h dans les différentes conditions avant l'induction de la iNOS avec le mix de cytokines, et la lyse des cellules est réalisée 24h plus tard. Le TGF- contenu dans le sérum est activé en le chauffant pendant 10 minutes à 80C (AC bouilli). L'effet du SB-525334 (5 M) est aussi testé dans ces conditions. Le niveau d'expression de la forme phosphorylée de SMAD2 est rapporté à son niveau dans les 3T3 TAp73 / en présence de 0, 5% de sérum (n 3, p > 0, 05 (#), p 0. 05 (*) et p 0. 01 (*). (C) Cinétique d'activation de SMAD2 par phosphorylation en réponse à du TGF-1 exogène (5 ng/ml) dans des 3T3 TAp73 / , analysée par western-blot. (D) Contrôle de l'effet inhibiteur du SB-525334 (5 M) sur la phosphorylation de SMAD2 induite par du TGF-1 (5 ng/ml), analysé par western-blot après 1h de traitement des 3T3 TAp73 / dans un milieu pauvre en sérum (0, 5%) (n 3, p 0. 01 (*). (E) et (F) Effet de doses croissantes de TGF-1 sur le niveau de phosphorylation de SMAD2 dans les 3T3 TAp73 / et TAp73-/-, analysé, normalisé (vs Tubuline) et quantifié par western-blot après 1h de traitement dans un milieu pauvre en sérum (0, 5%) (n 3). 178 Chapitre IV : Résultats expérimentaux 179 Chapitre IV : Résultats expérimentaux Figure III-7 : Les isoformes TAp73 n'affectent pas la production de TGF-1 par les 3T3 mais sont nécessaires à l'induction de SPSB1 en réponse au TGF-1. (A) Dosage ELISA du TGF-1 total (activé ou non) présent dans le milieu de culture avec des quantités croissantes de sérums provenant de deux lots et fournisseurs différents (moyennes de triplicatas, SD). (B) Cinétique de production totale de TGF-1 par les 3T3 TAp73 / et TAp73-/- mesurée par dosage ELISA sur des surnageants de culture à des temps variables après l'ensemencement des cellules dans un milieu pauvre en sérum (0, 5%) (moyennes SD des valeurs obtenues en triplicatas sur les deux couples de cellules TAp73 / (wt-1 et wt-6) et TAp73-/- (ko-4 et ko-5). (C) Production totale et journalière de TGF-1 par les 3T3 calculée à partir des cinétiques présentées en (B) (p > 0, 05 (#). (D) et (E) Mesure de l'expression de Spsb1 et Spsb2 analysée par RT-qPCR dans les 3T3 TAp73 / et TAp73-/- après un traitement de 24 ou 32h avec du TGF-1 (5 ng/ml), et avec ou sans SB-525334 (5 ng/ml) (n 3, p > 0, 05 (#) et p 0. 01 (*). 180 Chapitre IV : Résultats expérimentaux 181 Chapitre IV : Résultats expérimentaux Figure III-8 : Augmentation de l'induction de gènes cibles de Nrf2 par NO dans les 3T3 TAp73-/-. (A) L'effet inhibiteur de l'aminoguanidine (AG, 2 mM) sur l'activité iNOS est vérifié par un dosage de Griess dans le surnageant des 3T3 après 24h de traitement avec les cytokines dans un milieu riche en sérum (5%) (n 3, p 0. 01 (*). (B), (C), (D), (E) et (F) L'expression des gènes Nos2 (B), Hmox1 (C), Srxn (D), Nqo1 (E) et Sesn2 (F) est mesurée par RT-qPCR dans les 3T3 TAp73 / et TAp73-/- traités dans les mêmes conditions que celles décrites en (A). Le gène de référence utilisé est Gusb, et les valeurs sont rapportées à l'expression génique dans les 3T3 TAp73 / traités avec le mix de cytokines pour Nos2 ou non traités pour Hmox1, Srxn, Nqo1 et Sesn2 (n 4, p 0. 05 (*) et p 0. 01 (*). 182 Chapitre IV : Résultats expérimentaux 183 Chapitre IV : Résultats expérimentaux Figure III-9 : L'inhibition de la signalisation TGF- permet de restaurer une induction similaire de l'expression des gènes cibles de Nrf2 dans les 3T3 TAp73 / et TAp73-/-. (A), (B), (C) et (D) Mesure du niveau de transcrits des gènes Nos2 (A), Hmox1 (B) ; Srxn (C) et Nqo1 dans les 3T3 TAp73 / et TAp73-/- après 24h de traitement avec le mix de cytokines et avec ou sans TGF-1 (5 ng/ml) et SB-525334 (5 M), dans un milieu riche en sérum (5%). Le gène de référence utilisé est Gusb, et les valeurs sont rapportées à l'expression génique dans les 3T3 TAp73 / traités avec le mix de cytokines pour Nos2 ou non traités pour Hmox1, Srxn et Nqo1 (n 4, p > 0, 05 (#), p 0. 05 (*) et p 0. 01 (*). (E) Analyse par western-blot du niveau d'expression de la protéine HO-1 dans les mêmes conditions qu'en (A)-(D) (expérience représentative). 184 Chapitre IV : Résultats expérimentaux 185 Chapitre IV : Résultats expérimentaux Figure III-10 : L'induction des gènes Hmox1, Srxn et Nqo1 par le LPS et l'IFN- dans les macrophages dépend de Nrf2 et de la production de NO. (A), (B), (C) et (D) Pour étudier la dépendance à Nrf2 et à NO de l'induction des gènes Hmox1 (A), Srxn (B), Nqo1 (C) et Sesn2 (D), leur niveau d'expression est mesuré par RT-qPCR dans des macrophages issus de la différenciation de cellules de moelle osseuse (BMDM) de souris Nrf2 / ou Nrf2-/-, après un traitement de 24h avec du LPS (100 ng/ml) et de l'IFN- (10 U/ml), et en présence ou non d'inhibiteurs des NO synthases : Aminoguanidine (AG, 2 mM), S-éthyl isothiourée (SEITU, 50 M) ou N-Nitroarginine méthyl ester (L-NAME, 50 M). Les valeurs sont normalisées en fonction des variations d'expression du gène de référence ARN 18S, puis sont rapportées aux valeurs des contrôles respectifs (Ctrl TAp73 / ou Ctrl TAp73-/-) (n 3, p 0, 05 (*) et p 0. 01 (*). (E) L'induction de la iNOS dans les BMDM Nrf2 / et Nrf2-/- et l'effet des différents inhibiteurs est contrôlé en effectuant un dosage de Griess sur les surnageants prélevés 24h après le début du traitement (n 3, p > 0, 05 (#) et p 0. 01 (*). 186 Chapitre IV : Résultats expérimentaux 187 Chapitre IV : Résultats expérimentaux Figure III-11 : Les isoformes TAp73 et le TGF- modulent les effets cytostatiques exercés par NO sur le parasite T. musculi. (A) L'effet du mix de cytokines (IFN- 50 U/ml, TNF- 20 ng/ml et IL-1 20 ng/ml) et du TGF-1 (5 ng/ml) sur la croissance du parasite en présence des 3T3 TAp73 / ou TAp73-/- est étudié en procédant à un comptage des parasites 3 jours après le début de l'infection et du traitement. Le facteur multiplicatif de croissance est estimé en rapportant la valeur de trois comptages indépendants au nombre initial de parasites infectants (4. 104 T. musculi par puits avec 2, 5. 104 3T3 dans un milieu avec 0, 5% SVF). L'effet de l'inhibiteur SEITU (50 M) et du SB-525334 (5 M) sont aussi analysés dans ces conditions (n 3, p > 0, 05 (#), p 0, 05 (*) et p 0. 01 (*). (B) La production de NO par les 3T3 TAp73 / et TAp73-/- est mesurée par un dosage de Griess sur une fraction du surnageant, 24h après le début du traitement et de l'infection (moyenne de triplicatas). 188 Chapitre IV : Résultats expérimentaux 189 Chapitre IV : Résultats expérimentaux Figure III-12 : La déficience en isoformes Np73 affecte l'induction de la iNOS et la réponse génique dépendante de Nrf2 dans les BMDM lors d'un traitement prolongé avec le TGF-1. (A) Dosages de Griess réalisés à partir de surnageants de culture de BMDM de souris Np73 / et Np73-/- différenciés en milieu conditionné L929 après 24h de traitement avec du LPS (30 ng/ml) et de l'IFN- (10 U/ml) en présence ou non de TGF-1 (0, 5 ng/ml) ajouté 1h (moitié gauche de l'histogramme) ou 48h (moitié droite de l'histogramme) avant la stimulation. Ces expériences sont réalisées avec des cellules préalablement privées de sérum (0, 5% SVF). L'effet du SB-525334 (5 M) a aussi été mesuré lors d'un traitement prolongé des cellules (48h) avec le TGF-1 (n 4, p > 0, 05 (#) et p 0, 05 (*). (B) Analyse et quantification de l'expression de la protéine iNOS dans les BMDM Np73 / et Np73-/- dans les mêmes conditions qu'en (A), suite à un traitement prolongé des cellules avec du TGF-1 (48h, 0, 5 ng/ml). Les valeurs sont rapportées à l'expression de la iNOS dans les cellules Np73 / en absence de TGF-1 exogène (n 3, p > 0, 05 (#) et p 0, 05 (*). (C), (D), (E) et (F) L'expression des gènes Nos2 (C), Srxn (D), Hmox1 (E) et Nqo1 (F) est analysée par RT-qPCR dans les BMDM Np73 / et Np73-/- traités de façon identique à l'expérience présentée en (B). Les gènes de référence utilisés sont l'ARN 18S et Hprt, et les valeurs sont rapportées à celles de l'échantillon de BMDM Np73 / traités seulement avec le LPS et l'IFN- à l'issue d'une incubation de 48h dans un milieu sans TGF-1 exogène (n 3, p > 0, 05 (#), p 0, 05 (*) et p 0, 01 (*). 190 Chapitre IV : Résultats expérimentaux 191 Chapitre IV : Résultats expérimentaux Figure III-13 : L'induction maximale d'un ensemble de gènes cibles du TGF- dans les fibroblastes pulmonaires requiert la présence des isoformes Np73. L'effet du TGF-1 exogène (5 ng/ml) et du SB-525334 (5 M) sur l'induction d'une série de gènes cibles du TGF- est analysé par RT-qPCR dans les fibroblastes pulmonaires de souris Np73 / et Np73-/- après 24h de traitement des cellules dans un milieu appauvri en sérum (0, 5% SVF). Les valeurs sont normalisées en fonction des variations d'expression du gène de référence ARN 18S, puis sont rapportées aux valeurs des contrôles respectifs (Ctrl Np73 / ou Ctrl Np73-/-) (n 4, p > 0, 05 (#), p 0, 05 (*) et p 0. 01 (*). 192 Chapitre IV : Résultats expérimentaux 193 Chapitre IV : Résultats expérimentaux 194 CHAPITRE V : DISCUSSION ET PERSPECTIVES Chapitre V : Discussion et perspectives Les régulations réciproques entre la iNOS et p53 ont fait l'objet de nombreuses études. La description relativement récente des deux homologues de p53 a ouvert de nouvelles perspectives dans ce domaine. Notre laboratoire a donc abordé il y a quelques années une analyse des interactions potentielles entre NO et p73, et c'est dans ce cadre qu'a été découverte l'induction de TAp73 par de fortes concentrations en NO. Le principal objectif de mes travaux fut d'étudier le rôle potentiel de p73 dans la régulation de l'expression de la iNOS. Nous disposions pour cela de cellules 3T3 de génotype sauvage ou issues de souris sélectivement déficientes pour les isoformes TAp73, ce qui nous permit d'étudier le rôle particulier de cette classe d'isoformes. Il est à noter que, contrairement à ce qui a été démontré chez des macrophages de souris par exemple, la seule stimulation des récepteurs à l'IFN- ou au LPS est insuffisante pour induire efficacement la iNOS dans les cellules 3T3. Ceci confirme qu'il existe des propriétés d'induction du gène Nos2 spécifiques à chaque type cellulaire qui peuvent par exemple provenir de différences d'accessibilité des éléments de réponse du promoteur Nos2 aux facteurs de transcription ou de l'existence de voies de signalisation différemment activées selon le type cellulaire. De plus, et contrairement aux macrophages, les fibroblastes ne sécrètent que peu de cytokines proinflammatoires (ex : TNF- et IL-1) susceptibles d'agir de façon autocrine et paracrine pour amplifier la stimulation par les cytokines ajoutées dans le milieu de culture. 1 Régulation négative de l'expression de la iNOS par les isoformes TAp73 Considérant le rôle répresseur de p53 sur le gène Nos2, nous envisagions initialement que si les isoformes TAp73 exerçaient un rôle analogue, nous devrions observer une augmentation de l'expression de la iNOS dans les cellules TAp73-/-. Nous avons en effet constaté une forte hausse de l'induction de l'expression de la iNOS dans les cellules 3T3 TAp73-/-. Cette surexpression a été observée à la fois au niveau de la quantité de transcrits Nos2 et de protéines iNOS, en réponse au traitement avec une combinaison d'IFN-, de TNF- et d'IL-1 (ainsi qu'en substituant le LPS à l'IL-1). Elle a pour conséquence une augmentation de la production de NO, reflétée par l'augmentation de la production de nitrite. Nos observations suggèrent que les isoformes TAp73 exercent un effet négatif sur l'induction de la iNOS qui n'avait encore à ce jour jamais été décrit. 197 Chapitre V : Discussion et perspectives Il sera à l'avenir intéressant d'aborder la question du statut de p53 dans la régulation de la iNOS exercée par les isoformes TAp73, car les 3T3 sont des lignées immortalisées pour lesquelles il est probable que la voie de signalisation dépendante de p53 soit inactivée. A l'instar d'autres fonctions pour lesquelles les différents membres de la famille p53 présentent une redondance fonctionnelle, il est possible que le phénotype observé dans notre modèle cellulaire dépende strictement des isoformes TAp73 en raison d'une perte de fonction de la protéine p53. L'analyse de l'implication des isoformes TAp73 dans la régulation de la iNOS dans des lignées primaires permettra de répondre à ces questions. Des premiers résultats obtenus avec des MEFs primaires non immortalisés semblent cependant indiquer que le contrôle de l'induction de la iNOS par les isoformes TAp73 peut s'exercer en présence d'une protéine p53 fonctionnelle. 1. 1 Coopération entre les isoformes TAp73 et le TGF- dans le processus de répression de la iNOS Après avoir fait la démonstration que la surexpression de la iNOS observée dans les cellules TAp73-/- provenait d'une réponse différentielle à un facteur sécrété par les 3T3 eux- mêmes et présent dans le sérum de culture, nous avons rapidement suspecté une implication potentielle du TGF- dans le phénotype observé. Les résultats de nos travaux permettent de conclure à une perte significative de l'effet répresseur du TGF- sur l'induction de l'expression de la iNOS dans les 3T3 TAp73-/-. L'inhibition de la voie de signalisation dépendante du récepteur ALK5 permet en effet de rétablir un niveau identique d'induction de la iNOS dans les lignées des deux génotypes, tandis que le TGF- apporté de façon exogène exerce un fort effet répresseur sur l'induction de la iNOS qui est perdu en quasi-totalité dans les cellules TAp73-/-. Malgré tout, de nombreuses questions restent en suspens pour expliquer la synergie entre les isoformes TAp73 et le TGF- à l'origine de ce phénomène. 1. 1. 1 Effet des isoformes TAp73 et du TGF- sur l'induction transcriptionnelle du gène Nos2 Nos résultats montrent que le TGF- et les isoformes TAp73 exercent une partie de leur effet répresseur en réduisant la quantité de transcrits du gène Nos2 en réponse au mix de cytokines utilisé pour l'induction. Il reste à déterminer si ces observations sont la conséquence d'une répression transcriptionnelle ou d'un mécanisme de déstabilisation post- transcriptionnelle des ARNm Nos2. Si plusieurs études font état d'une répression de la iNOS 198 Chapitre V : Discussion et perspectives par p53, le mécanisme sous-jacent reste aujourd'hui inconnu, et rien n'indique qu'il nécessite une coopération avec le TGF-536, 537. Dans la plupart de ces travaux, les auteurs suggèrent que la protéine p53 entrerait en compétition avec d'autres facteurs de transcription tels que NF-B et AP-1 pour la liaison à des quantités limitées de coactivateurs transcriptionnels comme p300 et CBP551. Une multitude de facteurs de transcription (ex : NF-B, IRF1, IRF3, STAT-1) sont activés en réponse aux cytokines et concourent à l'induction de l'expression de la iNOS. Il sera nécessaire de mesurer l'impact du TGF- et de la déficience en isoformes TAp73 sur leur état d'activation (par phosphorylation de résidus spécifiques) ainsi que sur leur capacité à stimuler l'activité du promoteur Nos2. Il existe de très nombreux exemples de régulations croisées entre les voies de signalisation induites par l'IFN-, le TNF-, l'IL-1 et le LPS d'une part, et la voie de signalisation du TGF- d'autre part, au sein desquelles les isoformes TAp73 et leurs homologues pourraient s'immiscer pour moduler l'induction de la iNOS. Dans les macrophages RAW 264. 7 par exemple, la répression transcriptionnelle de la iNOS par le TGF- passe par une suppression de l'activation de STAT1 : le récepteur TRI s'associe au récepteur IFNGR1 et le phosphoryle, ce qui empêche l'activation de STAT1 par phosphorylation326. Dans les macrophages dérivant de cellules de moelle osseuse (BMDM), les macrophages péritonéaux et les macrophages associés à des tumeurs (TAMs), SMAD2 et SMAD3 sont nécessaires à la répression de la iNOS par le TGF-, en limitant l'activation d'IRF3 et donc la production d'IFN- en réponse au LPS qui contribue normalement à amplifier l'activation de STAT1328. En marge de la régulation de l'expression de la iNOS, le TGF- réprime aussi la transcription génique dépendante de STAT1 dans les cellules épithéliales, en favorisant son interaction avec la protéine PIAS1 (Protein inhibitor of activated STAT1), qui inhibe son activité transcriptionnelle552. A l'inverse, l'IFN- produit par les macrophages recrutés au niveau de lésions cutanées retarde le processus de cicatrisation en antagonisant la signalisation TGF- des fibroblastes, via une réduction de l'expression de SMAD2 et une augmentation de l'expression de SMAD7553. Il existe aussi des connexions entre la voie de signalisation du TGF- et NF-B, qui est un facteur de transcription au rôle capital dans l'induction transcriptionnelle de Nos2 et est activé dans notre modèle en réponse à l'IL-1, au TNF- et au LPS. Dans des fibroblastes de souris, NF-B/RelA induit l'expression de SMAD7, qui inhibe la phosphorylation de SMAD2/3 en s'associant au récepteur TRI554. Dans des cellules cancéreuses des voies aériennes supérieures, le TGF- induit l'activation séquentielle de la kinase TAK1 (TGF-activated 199 Chapitre V : Discussion et perspectives kinase 1), IKK, IB et RelA/p65, ce qui aboutit à la translocation nucléaire de NF-B et à la promotion de la carcinogenèse555. En retour, l'expression de SMAD7 est aussi induite par NF- B dans ces cellules. Indépendamment de NF-B, la kinase IKK forme un complexe avec SMAD3 pour induire la transcription de SNAIL et de SLUG dans un modèle cellulaire de cancer pancréatique (Panc1)556. Ces derniers répriment l'expression de la E-cadhérine (protéines des jonctions adhérentes), un phénomène caractéristique de l'EMT induite en réponse au TGF-. Enfin, il a dernièrement été démontré que l'activation du TLR4 induit une réduction de l'expression du récepteur BAMBI (BMP and activin membrane-bound inhibitor)557. BAMBI est un pseudorécepteur apparenté au récepteur TRI qui ne possède pas de domaine tyrosine kinase intracytoplasmique fonctionnel et agit donc comme un inhibiteur de la voie de signalisation du TGF-. De cette façon, le TLR4 favoriserait l'EMT induite par le TGF- et participerait au développement d'une hyperplasie de la prostate. Ces études mettent en évidence une divergence de réponse au LPS entre les cellules inflammatoires, pour lesquelles il y a une régulation négative de la signalisation TGF- par NF-B, et les cellules épithéliales et mésenchymateuses, pour lesquelles le TLR4 renforce les effets du TGF-. Le récepteur PPAR- (Peroxysome proliferator-activated receptor-gamma) figure aussi parmi les molécules capables de limiter l'induction de la iNOS en interférant avec ces voies de signalisation. Il antagonise l'activité de NF-B, STAT1 et AP-1558560. Or, ce récepteur hormonal fait partie des cibles réprimées par le TGF-, et il se trouve exprimé dans différentes lignées de fibroblastes. Toutefois, dans l'hypothèse o les isoformes TAp73 coopèreraient avec le TGF- pour réprimer l'expression de PPAR-, ceci devrait limiter l'activation transcriptionnelle de Nos2 dans les cellules TAp73-/-. Cependant, le cas de PPAR- demeure intéressant au niveau de son mécanisme de répression transcriptionnelle par le TGF-, très récemment décrit dans deux études indépendantes. Une première équipe a montré que lors d'une stimulation de fibroblastes cardiaques murins avec du TGF-, SMAD3 forme un complexe avec SMAD4 ainsi qu'avec le corépresseur mSin3A, ce qui permet le recrutement de HDAC1 sur deux sites SBE situés dans le promoteur de Pparg561. La désacétylation des histones génère un environnement restrictif autour de la chromatine, qui empêche la liaison et l'assemblage de la machinerie de transcription sur le promoteur. Dans des fibroblastes pulmonaires de foetus humain (IMR-90), une seconde équipe a identifié dans le promoteur de Pparg deux sites consensus consécutifs de type SBE (séquence GTCT suivie de son palindrome AGAC) et un autre site de type TIE (TGF-inhibitory element séquence du type 5'- GNNTTGGTGA-3')562. Les mêmes auteurs démontrent que la répression par le TGF- peut 200 Chapitre V : Discussion et perspectives être médiée de façon indépendante par une fixation de SMAD3 et SMAD4 sur chacun de ces deux sites, via la formation de complexes SMAD-E2F4-p107, de la même façon que pour c- myc (autre cible réprimée par le TGF-)563. La répression d'un gène cible par le TGF- par l'intermédiaire d'une fixation des SMADs sur une séquence TIE fut découverte dans le cadre de la répression du gène Mmp3564. Il serait intéressant d'étudier l'existence d'un mécanisme similaire conduisant à la répression par le TGF- du gène Nos2. Le premier obstacle auquel nous nous heurtons toutefois est qu'il n'a jusqu'à présent jamais été identifié de tels sites (SBE ou TIE) dans le promoteur de ce gène. En réalisant une analyse informatique du promoteur du gène Nos2, nous avons identifié plusieurs sites SBE potentiels (dont deux sites consécutifs à la manière de ceux retrouvés dans le promoteur de Pparg) ainsi qu'un site TIE potentiel dont la séquence correspond parfaitement à la séquence consensus décrite dans les travaux cités précédemment. Un travail de validation reste nécessaire pour pouvoir les impliquer dans le mécanisme de répression transcriptionnelle de Nos2 par le TGF-. Nous disposons désormais de constructions gène rapporteur qui nous permettront de comparer l'effet du mix de cytokines et du TGF- sur l'activité du promoteur Nos2 dans les 3T3 TAp73 / et TAp73-/-. Ceci nous servira à identifier et localiser de potentiels éléments de réponse nécessaires à la répression de Nos2 par le TGF- et les isoformes TAp73. Des expériences d'immunoprécipitation de la chromatine ou de retard sur gel pourraient également indiquer si le TGF- et les isoformes TAp73 affectent la capacité de différents facteurs de transcription à se lier à leurs éléments de réponse dans le promoteur du gène Nos2. 1. 1. 2 Leçons tirées des autres exemples d'interactions entre la voie de signalisation du TGF- et la protéine p53 ou ses homologues Nous décrivons ici pour la première fois une coopération entre les isoformes TAp73 et la voie de signalisation du TGF- qui potentialise l'effet répresseur de ce dernier sur l'induction de l'expression de la iNOS. Il ne faut toutefois pas ignorer que nos données rejoignent les résultats de plusieurs autres études qui rapportaient déjà l'existence d'interactions entre des membres de la famille p53 et la voie de signalisation du TGF- dans des contextes différents565. 201 Chapitre V : Discussion et perspectives La convergence entre les voies de signalisation du TGF- et de p53 a été décrite dès 1991 : l'inactivation de p53 par le virus SV40 résulte en une perte des effets antitumoraux du TGF- 566. En 2003, une équipe a fait la démonstration que p53 est nécessaire à la différenciation mésoendodermique au cours du développement embryonnaire chez le xénope, en potentialisant la réponse à l'activine, un ligand de la même famille que le TGF-567. En comparaison, la déficience en p53 n'a pas d'effet sur ce processus de différenciation chez la souris. Les auteurs font l'hypothèse d'un rôle compensatoire de p63 et p73, qui sont coexprimées avec p53 dès le stade gastrula dans les embryons de xénope, tandis qu'elles ne sont exprimées qu'à des stades plus tardifs chez la souris. Dans des cellules humaines HepG2, la présence d'un élément de réponse à p53 dans le promoteur de Mix. 2, un marqueur de différenciation mésoendodermique, est en effet requise pour son induction maximale en réponse au TGF-, et les trois membres de la famille p53 se sont révélés capables d'assurer un effet potentialisateur dans ce contexte. Les auteurs de ces travaux rapportent aussi la formation de complexes fonctionnels de p53 avec SMAD2/3, qui modulent l'induction de gènes dont le promoteur contient des éléments de réponse spécifiques à ces deux facteurs de transcription, tels que p21WAF1, Pai-1 et Mmp2. Dans des lignées primaires murines utilisées au cours de la même étude (fibroblastes embryonnaires et cellules progénitrices hématopoïétiques), la protéine p53 renforce aussi nettement les effets antiprolifératifs du TGF- qui dépendent de l'induction de p21. Plus récemment, dans un modèle de néphropathie rénale obstructive, la protéine p53 est apparue phosphorylée sur les résidus Ser9 et Ser15 en réponse au TGF-, de façon dépendante de la production de ROS via la sous-unité p22phox de la NADPH oxydase568. Ces modifications post-traductionnelles lui permettent d'être recrutée au niveau du p53RE du promoteur Pai-1, o p53 potentialise l'induction de PAI-1 en coopération avec SMAD3. Une étude supplémentaire fait également part de la nécessaire présence de séquences SBE dans le promoteur de Pai-1 pour permettre le recrutement de p53 et l'assemblage d'un complexe avec SMAD2/3569. L'interaction de p53 avec SMAD2/3 se produit spécifiquement entre le domaine N-terminal phosphorylé de p53 et le domaine MH1 N-terminal de SMAD2/3, ce qui laisse leur domaine MH2 libre de pouvoir interagir avec SMAD4. Les ROS produites par l'activité NOX4 sont impliquées dans de multiples processus contrôlés par le TGF-, tels que la migration cellulaire, la prolifération, la cicatrisation, et la modulation de marqueurs de l'EMT dans une grande variété de types cellulaires570. De récents travaux révèlent que le statut de p53 impacte différentiellement l'expression et l'activité de 202 Chapitre V : Discussion et perspectives NOX4571. La forme WT de p53 exerce une régulation négative de la NOX4 induite en réponse au TGF-, dans des cellules épithéliales pulmonaires tumorales humaines (H1299) ainsi que dans des cellules épithéliales normales (MCF-10A) et tumorales (MDA-MB-231) du sein. Elle protège ainsi les cellules épithéliales de l'EMT et de la migration induites par le TGF-. A l'opposé, les formes mutantes de p53 (R175H et R280K) perdent cette fonction répressive voire potentialisent (R280K) l'induction de NOX4 par le TGF-, ce qui s'accompagne d'une hausse de la production de ROS, de la migration cellulaire, de l'expression de la fibronectine, et de l'activation de FAK (Focal adhesion kinase). Ceci explique en partie le comportement invasif des cellules exprimant une forme mutante de p53. Les derniers travaux de cette équipe ont permis de révéler les mécanismes sous-jacents à cette régulation différentielle de NOX4 en fonction du statut de p53572. La forme WT de p53 exerce une répression de Nox4 en se fixant à un p53RE situé en position -4729, sans stimulation préalable au TGF-, et en recrutant une histone désacétylase (HDAC). Le domaine transactivateur de p53 joue un rôle capital lors de cette répression. A l'inverse, différentes formes mutantes de p53 (R175H, R249S, R273H, D281G) potentialisent l'induction transcriptionnelle de Nox4 en se fixant à un autre p53RE localisé en position -4694 uniquement en présence de TGF-, et en recrutant l'histone acétyltransférase p300. Dans les deux cas, p53 forme un complexe avec SMAD3 qui se trouve associée à un SBE en position -4644. L'ancrage à p53 de SMADs activés et de mSin3A dans le promoteur de AFP (Alpha- fetoprotein) joue aussi un rôle critique dans sa répression transcriptionnelle induite par le TGF- dans les cellules hépatiques573. L'AFP est une protéine du sérum normalement exprimée uniquement au cours du développement du fœtus, mais une mutation perte de fonction de p53 peut provoquer sa réexpression dans des cellules tumorales chez l'adulte. De plus, il a été découvert que la forme oncogénique de Ras induit la phosphorylation de la forme mutante de p53, qui forme alors des complexes ternaires avec SMAD2/3 et p63, ce qui antagonise l'action antimétastatique de cette dernière et favorise la progression tumorale574. De façon générale, il semblerait que la forme WT de p53 potentialise les effets antitumoraux du TGF-, tandis que les formes mutantes de p53 seraient au moins en partie responsables du détournement des fonctions du TGF- en faveur de la progression tumorale575. Pour la plupart des mécanismes coopératifs décrits faisant intervenir p53 ou ses homologues et le TGF-, la fixation de SMADs et de p53 sur leurs éléments de réponse respectifs était une obligation pour permettre leur interaction. De fait, il faut donc remarquer 203 Chapitre V : Discussion et perspectives que comme pour les SBE/TIE potentiels, aucun élément de réponse classique à p53 n'a encore été identifié dans le promoteur du gène Nos2. Il est ainsi probable que sa régulation transcriptionnelle par p53 et p73 passe par d'autres mécanismes qu'une simple fixation sur des éléments de réponse de type p53RE. 1. 1. 3 Régulation de la signalisation TGF- par les isoformes TAp73 De nombreux éléments doivent encore être analysés pour connaitre l'impact global des isoformes TAp73 dans la voie de signalisation du TGF-, parmi lesquels nous pouvons citer : (1) L'expression des récepteurs de type I (ALK5) et de type II ainsi que leur état d'activation par phosphorylation. (2) L'activation de SMAD3 car cette protéine a déjà été décrite comme nécessaire et suffisante pour assurer l'effet répresseur du TGF- sur la iNOS (macrophages RAW 264. 7)576. (3) L'expression de SMAD4 (co-SMAD) et SMAD7 (inhibiteur de SMAD). (4) L'activation de voies indépendantes des SMADs (p38 MAPK, JNK, ERK1/2, PI3K-Akt). Si nous avons démontré que la production totale de TGF-1 n'est pas affectée par la déficience en isoformes TAp73, il conviendra de s'assurer que cette déficience ne puisse pas intervenir dans le processus d'activation du TGF- latent. Déterminer l'effet des isoformes TAp73 sur tous ces évènements est d'autant plus important que récemment, dans un modèle cellulaire murin de cancer pancréatique, les voies de signalisation indépendantes des protéines SMADs (tout du moins les voies MAPK ERK1/2 et Akt) sont apparues favorisées au dépend de la voie classique dépendante des protéines SMADs dans les cellules TAp73-/- 577. La perte d'expression des isoformes TAp73 a ainsi été associée à un mauvais pronostic, et à une hausse des marqueurs phénotypiques caractéristiques de l'EMT, indépendamment du statut de p53. Les premiers éléments que nous avons obtenus suggèrent que le niveau basal de phosphorylation de SMAD2 est très réduit dans les 3T3 TAp73-/- cultivés en présence de fortes concentrations de sérum pendant un temps prolongé. Toutefois, la présence des isoformes TAp73 n'a pas d'effet sur la sensibilité au TGF- à court terme, d'après les niveaux de phosphorylation de SMAD2 que nous avons quantifiés en présence de concentrations croissantes de TGF-1 après 1h de stimulation. Il se pourrait donc que les isoformes TAp73 exercent un effet sur le maintien de la sensibilité au long terme au TGF-. Les 3T3 étant des cellules immortalisées, elles sont exposées de façon prolongée au TGF- qu'elles produisent elles-mêmes et au TGF- présent dans le sérum, ce qui laisserait suffisamment de temps à ce 204 Chapitre V : Discussion et perspectives type de mécanisme pour se mettre en place. Dans ce cadre, il serait intéressant d'analyser leur rôle dans le trafic des récepteurs, dont l'expression à la surface des cellules est régulée de façon spatio-temporelle et dynamique par de nombreux processus578. 1. 1. 4 Implication des isoformes TAp73 et du TGF- dans la régulation de la stabilité de la protéine iNOS. L'analyse de nos données concernant la stabilité de la protéine iNOS dans les 3T3 TAp73 / et TAp73-/- indique que les isoformes TAp73 exercent un second effet négatif sur l'expression de la iNOS en réduisant significativement son temps de vie. Si nous n'avons pas testé l'effet d'inhibiteurs de calpaïnes (seconde voie majeure de dégradation de la iNOS), nous avons cependant démontré que la plus forte dégradation de la iNOS dans les cellules 3T3 TAp73 / est strictement dépendante de l'activité du protéasome, lorsque les cellules sont cultivées dans un milieu riche en sérum. Il faudra s'assurer que la déficience en isoformes TAp73 augmente le temps de vie de la iNOS en provoquant une perte des effets du TGF-, en mesurant l'effet d'un traitement avec du TGF-1 exogène et avec l'inhibiteur d'ALK5 sur la stabilité de la protéine. Les complexes SPSB1 et SPSB2 ont été récemment identifiés comme les principaux responsables de la polyubiquitination et de la dégradation de la iNOS par le protéasome220. Ils interagissent avec des résidus localisés dans la région N-terminale de la iNOS (motif DINNN) via leur domaine SPRY579. Le complexe est stabilisé grâce à la formation de nombreuses liaisons hydrogène inter- et intramoléculaires, puis les 40 résidus du domaine SOCS permettent le recrutement et l'assemblage des composants du complexe E3 ubiquitine ligase (Elongine B et C, Culline 5 et RBX2). Plusieurs groupes développent actuellement des peptides mimétiques à visée anti-infectieuse capables de prévenir l'interaction entre la iNOS et le domaine SPRY des protéines de la famille de SPSB580, 581. Il faut remarquer que ce mécanisme se distingue nettement de celui permettant aux isoformes Np63 d'induire la dégradation de la iNOS582. En réponse à un traitement avec du cisplatine, les isoformes Np63 sont phosphorylées par ATM et, en coopération avec NF-B, induisent transcriptionnellement l'expression de RPN13 (Regulatory particle non-ATPase subunit 13), une protéine qui inhibe la dimérisation de la iNOS et entraine sa dégradation par le protéasome. 205 Chapitre V : Discussion et perspectives Nos résultats suggèrent que les isoformes TAp73 sont nécessaires à l'induction de SPSB1 par le TGF-1 dans les 3T3, tandis que l'expression de SPSB2 n'est pas affectée significativement. Ceci constitue une piste très intéressante pour expliquer le déficit de dégradation de la iNOS observé dans les 3T3 TAp73-/-. Il faudra éteindre l'expression de SPSB1 (grâce à l'emploi de siRNA en notre possession) pour déterminer si l'induction de son expression par le TGF-1 et les isoformes TAp73 est effectivement responsable de la dégradation de la iNOS par le protéasome. Une étude antérieure rapportait déjà l'induction de SPSB1 (mais pas des autres membres de la famille SPSB) par le TGF-1, mais aussi par le TLR4 qui est activé dans notre modèle en réponse au LPS583. De façon intéressante, le récepteur TRII a récemment été identifié comme une cible de SPSB1, qui induit sa dégradation protéasomale dans plusieurs lignées tumorales HEK-293T, U87MG et NIH3T3584. Ces résultats vont à l'encontre de nos observations car nous n'avons pour notre part pas constaté de réduction de la réponse au TGF-1 dans les cellules TAp73 / malgré une plus forte expression de SPSB1 en comparaison aux cellules TAp73-/-. Cependant, la découverte d'une nécessaire coopération entre les isoformes TAp73 et le TGF-1 lors de l'induction de SPSB1 constitue une avancée importante dans la compréhension des mécanismes de dégradation de la iNOS. Elle permet aussi de contextualiser les effets de cette coopération, car l'expression basale de SPSB1 varie de façon importante d'un tissu à l'autre585. En ce qui nous concerne, nous avons mesuré un niveau d'expression basale de Spsb1 beaucoup plus faible dans les macrophages en comparaison aux fibroblastes, ce qui pourrait expliquer des différences de régulation de l'expression de la iNOS par les isoformes TAp73 entre ces deux types cellulaires. Le complexe SPSB2 ayant des effets non négligeables sur la stabilité de la iNOS dans certains types cellulaires comme les macrophages, le ratio d'expression entre SPSB1 et SPSB2 devrait aussi être considéré, et l'un ou l'autre des deux complexes pourrait prédominer en fonction du type cellulaire. 206 Chapitre V : Discussion et perspectives 2 Conséquences de la coopération entre le TGF et les isoformes TAp73 sur des fonctions cellulaires dépendantes de la production de NO 2. 1 Régulation de la réponse génique dépendante de Nrf2 et des effets anti-parasitaires dépendants de NO Après avoir mis en évidence pour la première fois l'existence d'une coopération entre le TGF- et les isoformes TAp73 opérante dans la régulation de la iNOS, il nous a paru important de déterminer si cette régulation pouvait avoir des conséquences fonctionnelles dans des processus dépendant de la production de NO. C'est la raison pour laquelle nous avons choisi de mesurer les effets du TGF- et des isoformes TAp73 sur l'induction de gènes cibles de Nrf2. Ce facteur de transcription exerce un rôle majeur dans la protection des cellules contre le stress oxydant. Nos résultats indiquent que les isoformes TAp73, en réprimant l'induction la iNOS en coopération avec le TGF-, impactent l'induction de gènes cibles de Nrf2 dans les cellules 3T3. Parmi les gènes cibles de Nrf2 dont l'induction s'est trouvée notablement augmentée dans les cellules 3T3 TAp73-/-, on compte les gènes Hmox1, Nqo1, Sesn2 et Srxn. L'hème oxygénase 1 catalyse la dégradation de l'hème et a des propriétés anti-inflammatoires (notamment via l'inhibition de l'activité NO synthase et via la production de monoxyde de carbone). La NADPH quinone déshydrogénase 1 prévient la réduction monoélectronique des quinones et donc la formation d'espèce réactives qui en résulte (H2O2, O2 -). La sulfirédoxine appartient quant à elle à la famille des sulfinyles réductases, au même titre que les sestrines. Cette famille d'enzymes est essentielle à la restauration de la fonction des peroxyréductases (enzymes de détoxification des peroxydes) inactivées par sulfinylation (état de suroxydation). Les isoformes TAp73 exercent donc un effet négatif sur l'induction de gènes aux propriétés anti-inflammatoires (Hmox1) et antioxydantes (Nqo1, Srxn, Sesn2) dans le modèle cellulaire étudié. Cet effet est en grande partie dépendant de la production de NO. En effet, l'inhibition de l'activité iNOS par l'aminoguanidine prévient en totalité l'induction de l'expression des gènes cibles de Nrf2 analysés, à l'exception de Sesn2. La stimulation des récepteurs aux cytokines initie sans doute des processus indépendants de la production de NO qui activent également Nrf2 (par exemple la production d'EROs déclenchée par le TNF-). 207 Chapitre V : Discussion et perspectives La supposée hausse d'activation par phosphorylation et de translocation nucléaire de Nrf2 dans les cellules TAp73-/- en réponse à l'induction de la iNOS n'a pas pu être observée en immunoblot avec des extraits totaux de protéines. Une analyse plus spécifique de la relocalisation nucléaire de Nrf2 devra être entreprise, par un fractionnement cellulaire ou en immunocytochimie. L'implication de Nrf2 dans la régulation des gènes analysés a été démontrée à de multiples reprises dans des modèles différents, et nos résultats dans les BMDM Nrf2-/- confortent cette conclusion. Il faut toutefois souligner que d'autres facteurs de transcription peuvent aussi induire leur expression. Par exemple, l'induction de HO-1 est aussi contrôlée par NF-B et p53586. Celles de la sulfirédoxine et de NQO1 le sont par AP-1587, 588. Enfin, la sestrine 2 est régulée positivement par p53, AP-1 et HIF-1589. Etant donné que ces facteurs de transcription peuvent tous être activés par les concentrations de NO générées par la iNOS, il convient de rester prudent quant à l'interprétation des résultats que nous avons obtenus, notamment en ce qui concerne l'induction de la sestrine 2 qui s'avère indépendante de la production de NO dans notre modèle. Notre découverte de la régulation négative de l'expression de la iNOS par les isoformes TAp73 pourrait avoir des conséquences importantes en cancérologie, puisqu'il est très souvent observé une surexpression de la iNOS dans les tumeurs n'exprimant plus de protéine p53 fonctionnelle590. Dans ces situations, les isoformes TAp73 pourraient constituer une voie de sauvegarde pour limiter les effets protumoraux de la iNOS. Dans un contexte tumoral, le fait que cette coopération entre les isoformes TAp73 et le TGF- puisse impacter la production de NO et l'activité de Nrf2 pourrait avoir des conséquences importantes sur le devenir de la tumeur. A ce sujet, les fibroblastes font partie intégrante du stroma, qui joue un rôle majeur dans le développement des tumeurs : les fibroblastes du stroma déficients en p53 surexpriment la iNOS, et l'augmentation de l'activité iNOS qui en résulte supporte la croissance tumorale591. De façon générale, l'activité transitoire de Nrf2 est bénéfique pour prévenir l'oncogenèse et la progression tumorale. Cependant, la stabilisation constitutive de Nrf2, telle qu'elle a pu être observée dans de nombreuses tumeurs portant des mutations somatiques dans les gènes Nrf2 ou Keap1, peut au contraire avoir des conséquences néfastes en conférant une plus grande résistance des cellules tumorales à la chimiothérapie ou à la radiothérapie, et en augmentant leur vitesse de prolifération592. La production de NO par des cellules inflammatoires est un mécanisme majeur de défense anti-microbienne et anti-parasitaire. Nous rapportons ici une modulation des effets anti- 208 Chapitre V : Discussion et perspectives parasitaires dépendants de la production de NO par le TGF- et les isoformes TAp73 dans des fibroblastes soumis à des stimuli proinflammatoires en présence du parasite extracellulaire Trypanosoma musculi. Ces effets pourraient avoir une signification en contexte physiologique puisqu'il a par exemple été démontré que les fibroblastes (lignée L929) sont capables d'exercer des effets anti-parasitaires contre Trypanosoma cruzi en exprimant la iNOS en réponse à l'IFN- produit par les cellules NK593. En raison des nombreux rôles de l'activité iNOS et du TGF- dans la régulation de fonctions immunes variées (ex : maturation et modulation de l'activité des lymphocytes T et des MDSCs), la coopération entre les isoformes TAp73 et le TGF- pourrait avoir bien d'autres implications dans l'immunité innée et adaptative. A l'issue de ces travaux, il nous est donc possible de proposer un modèle provisoire de régulation de l'expression de la iNOS, qui dépend d'une coopération entre les isoformes TAp73 et le TGF- et permet de moduler des fonctions cellulaires reposant sur la production de NO (cf. Figure V-1). 2. 2 Autres conséquences potentielles de la régulation par les isoformes TAp73 de l'expression de la iNOS Nous venons de décrire un mécanisme coopératif de régulation de la iNOS par les isoformes TAp73 et le TGF- dans un modèle cellulaire fibroblastique. Il est donc utile de rappeler que l'activité iNOS des cellules de ce type exerce de multiples fonctions physiologiques, que ce soit chez l'Homme ou les rongeurs. Les effets bénéfiques de l'activité iNOS des fibroblastes dans le processus de cicatrisation ont par exemple été décrits à de multiples reprises. Chez la souris, les fibroblastes cicatriciels produisent des quantités importantes de NO qui augmentent leur synthèse de collagène et diminuent leur activité contractile594, 595. Le NO libéré par les fibroblastes dans la zone lésée stimule aussi la production de TGF- qui favorise l'angiogenèse et la cicatrisation596, 597. Chez l'Homme, NO augmente la migration des fibroblastes et le dépôt de collagène au niveau des lésions cutanées597. Les isoformes TAp73 et le TGF- pourraient aussi jouer un rôle dans certaines pathologies o l'activité iNOS fibroblastique est impliquée. Les fibroblastes localisés au niveau de la membrane synoviale sont une source importante de NO et contribuent à l'inflammation dans certaines pathologies articulaires telles que la polyarthrite rhumatoïde et l'ostéoarthrite598 600. Au niveau vasculaire, les fibroblastes du tissu conjonctif de l'adventice exposés à NO se différencient en myofibroblastes et migrent vers l'intima, o ils deviennent de nouveaux composants cellulaires de la plaque d'athérome601. De plus, l'hypertension aigu provoquée 209 Chapitre V : Discussion et perspectives chez le rat par constriction aortique entraine l'induction de la iNOS dans les fibroblastes de l'adventice en réponse à la production d'IL-1 par les macrophages, ce qui est à l'origine d'une fibrose de l'adventice602. 3 Le cas des isoformes Np73, vers un modèle global d'intégration de la famille p53 dans les fonctions du TGF- ? Les résultats préliminaires que nous avons obtenus dans des macrophages BMDM Np73-/- indiquent que ces isoformes n'affectent pas l'effet répresseur exercé par le TGF- sur la iNOS lorsque les cellules sont traitées dans des conditions similaires aux 3T3 (ajout du TGF- 1 exogène seulement 1h avant l'induction de la iNOS par les cytokines et le LPS). En revanche, la répression de la iNOS par le TGF- est perdue dans les BMDM Np73-/- suite à un prétraitement de 48h des BMDM avec du TGF-1 exogène, suivi d'un traitement supplémentaire de 24h avec le LPS et l'IFN-, toujours en présence de TGF-. Le TGF-1 est une cytokine connue pour orienter la polarisation des macrophages vers un phénotype de type M2. Il est probable que ces résultats puissent refléter une altération du processus de polarisation par les isoformes Np73, car dans cette situation les macrophages sont soumis à un stimulus pro-M2 (TGF-) avant de recevoir simultanément des signaux pro-M1 (LPS IFN-) et pro- M2 (TGF-). Les isoformes Np73 sont une cible transcriptionnelle des isoformes TAp73 mais aussi du TGF-465, 603. Il serait intéressant de savoir si le traitement de 48h avec le TGF- permet effectivement d'induire l'expression des isoformes Np73 dans ce modèle cellulaire. De plus, il n'est pas exclu que l'effet des isoformes TAp73 dans les cellules 3T3 puisse aussi provenir de l'induction des isoformes Np73 qui ne devrait plus avoir lieu dans les 3T3 TAp73-/-. Une étude datant de 2012 a démontré que les isoformes Np73 peuvent se lier à SMAD3 et SMAD4 pour promouvoir l'induction de plusieurs gènes cibles du TGF- (Pai-1, Pten et Col1A)550. D'après leurs auteurs, la formation de ces complexes en réponse à un traitement avec du TGF- stabiliserait l'interaction de SMAD3 et SMAD4 avec les sites SBE. A la différence de p53 cependant, cet effet ne nécessite pas la présence d'éléments p53RE dans le promoteur des gènes cibles pour être opérant. Les isoformes TAp73 et Np73 possèdent toutes le même domaine de liaison à l'ADN. Il serait donc très intéressant de comparer la dépendance de ces 210 Chapitre V : Discussion et perspectives deux catégories d'isoformes à la présence de p53RE dans le promoteur de gènes cibles du TGF- ainsi qu'à la présence d'un domaine de liaison à l'ADN fonctionnel. Les travaux précédemment évoqués ont été réalisés dans plusieurs lignées tumorales soumises à une surexpression ectopique des isoformes Np73, ce qui ne présageait pas de l'existence d'une telle coopération in vivo. Les résultats que nous avons obtenus dans des fibroblastes pulmonaires primaires semblent cependant confirmer que cette coopération se produit lors de l'induction d'un sous-ensemble spécifique de gènes cibles du TGF-. Ainsi, l'induction des gènes Nox4, -Sma, Mmp9 et Mmp13 est apparue significativement réduite en réponse au TGF- 1 dans les fibroblastes pulmonaires Np73-/-, tandis que celle des gènes Pai-1, Timp1 et Col1A n'était pas affectée par la présence des isoformes Np73. Le fait que les isoformes Np73 soient nécessaires à une induction efficace de Spsb1 par le TGF- rend aussi particulièrement intéressante l'étude de la régulation de l'expression de la iNOS dans ces cellules. Au vu de l'importance de toutes ces cibles dans de nombreux phénomènes physiologiques et physiopathologiques (cicatrisation, EMT, fibrose, formation de métastases, etc)570, 604606, l'étude des interactions entre les différentes isoformes de p73 et la réponse génique dépendante du TGF- devra obligatoirement être poursuivie, notamment par l'emploi d'approches plus globales de transcriptomique et de protéomique, ou de techniques telles que le ChIP-on-chip qui combine immunoprécipitation de chromatine et puces à ADN pour rendre possible la localisation des sites de liaison à l'ADN de protéines d'intérêt à l'échelle du génome entier. A l'issue de ces travaux et de l'analyse de la littérature, il nous apparait finalement que la protéine p53 et ses homologues forment un réseau complexe et intégré de protéines qui régulent et orientent les fonctions du TGF- en fonction du contexte cellulaire ou tissulaire. Il ne fait aucun doute que la compréhension approfondie de ces mécanismes moléculaires permettra à terme de proposer de nouvelles approches thérapeutiques pour les nombreuses pathologies dans lesquelles l'activité et les fonctions de la iNOS, de la famille p53 et du TGF- sont altérées. 211 Chapitre V : Discussion et perspectives 212 Chapitre V : Discussion et perspectives a l e d n o i s s e r p x e ' l e d n o i t c u d n i ' l r e m i r p é r r u o p 3 7 p A T s e m r o f o s i s e l t e - F G T e l e r t n e n o i t a r é p o o c e n u e c n e d i v é n e t n e t t e m x u a v a r t s o N e r i o t a m m a l f n i o r p i l u m i t s s e d à e s n o p é r n e e t i u d n i S O N i a l e d n o i s s e r p x e ' l t n e m e v i t a g é n t n e l u g é r - F G T e l t e 3 7 p A T s e m r o f o s i s e L . S O N i n o i t a t n e m g u a e n u t e 2 s o N e n è g u d s t i r c s n a r t e d u a e v i n u d n o i t c u d é r e n u : s e m s i n a c é m x u e d r a p s n i o m u a ) - F N T , - N F I , 1 - L I , S P L ( e d n o i t c u d n i ' l à s e r i a s s e c é n t n o s 3 7 p A T s e m r o f o s i s e l e u q é t a t s n o c s n o v a s u o N . e m o s a é t o r p e l r a p S O N i e n i é t o r p a l e d n o i t a d a r g é d a l e d s n a d e é v r e s b o S O N i e n i é t o r p a l e d é t i l i b a t s a l e d e s s u a h a l e d e l b a s n o p s e r t n e m e l b a b o r p t s e e m s i n a c é m e C . - F G T u a e s n o p é r n e 1 b s p S u a S O N i e n i é t o r p a l e d e g a s s e r d a ' l e d s r o l r u e j a m e l ô r u a e x e l p m o c n u t s e 1 B S P S e s a g i l e n i t i u q i b u 3 E e x e l p m o c e l r a c , - / - 3 7 p A T 3 T 3 s e l . e m o s a é t o r p t e 3 5 p c e v a r i g a r e t n i r u o p s e u n n o c t n o s i u q , 3 / 2 D A M S s e n i é t o r p s e l t e 3 7 p A T e r t n e e l l e n n o i t c n o f n o i t c a r e t n i e n u ' d e s è h t o p y h ' l s n o s i a f s u o n s i a m , n o i t a g i t s e v n i ' d s r u o c n e t s e 3 7 p A T s e m r o f o s i s e l t e - F G T e l r a p 2 s o N e d e l l e n n o i t p i r c s n a r t n o i s s e r p é r e d e m s i n a c é m e L 213 n o i t c u d o r p a L . - F G T e l r a p S O N i a l e d n o i s s e r p é r a l e d s e l b a s n o p s e r t n o s s e l l e ' u q é r t n o m é d é t é a l i t n o d t e , s e u g o l o m o h s e s e d s n i a t r e c u r a p p a t s e 2 D A M S e d n o i t a l y r o h p s o h p e d l a s a b u a e v i n e l s i a m , 3 7 p A T s e m r o f o s i n e e c n e i c i f é d a l r a p e é r é t l a s a p t s e ' n - F G T e d e l a t o t . - F G T e l t e 3 7 p A T s e m r o f o s i s e l r a p S O N i a l e d n o i s s e r p x e ' l e d n o i t a l u g é r e d e r i o s i v o r p e l è d o M : 1 - V e r u g i F e d e c n e s é r p a l t n a r é g g u s , m u r é s n e s n o i t a r t n e c n o c s e t r o f e d c e v a e é g n o l o r p n o ç a f e d s e é v i t l u c / 3 7 p A T s e l u l l e c s e l s n a d é v e l é s u l p e c n e d i v é n e e s i m s n o v a s u o n e u q n o i t a l u g é r a L . 3 T 3 s e l u l l e c s e d s e r i a t i s a r a p - i t n a s t e f f e s e l t e 2 f r N e d e t n a d n e p é d e c i r t c e t o r p o t y c e s n o p é r . - F G T u d n o i t c a ' l à s e s i m u o s s e l u l l e c s e l s n a d S O N i a l r a p s e é c r e x e s n o i t c n o f s e s u e r b m o n s è r t s e l r e r é t l a ' d e l b i t p e c s u s c n o d t s e a l t n e m e t c e r i d e t c a p m i - F G T e l t e 3 7 p A T s e m r o f o s i s e l r a p O N e d n o i t c u d o r p a l e d n o i t a l u d o m a l e u q é r t n o m é d s n o v a s u o n , n i f n E . s r u e t p e c é r s e s e d u a e v i n u a - F G T u d n o i t a s i l a n g i s a l e d n o i t a l u g é r e d s e r i a t n e m é l p p u s s e m s i n a c é m REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Jackson, M. I. et al. Kinetic feasibility of nitroxyl reduction by physiological reductants and biological implications. Free Radic. Biol. Med. 47, 11301139 (2009). Thomas, D. D. , Liu, X. , Kantrow, S. P. & Lancaster, J. R. The biological lifetime of nitric oxide : implications for the perivascular dynamics of NO and O2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 355 360 (2001). Lancaster, J. R. A Tutorial on the Diffusibility and Reactivity of Free Nitric Oxide. Nitric Oxide 1, 1830 (1997). Porterfield, D. M. et al. Proteins and lipids define the diffusional field of nitric oxide. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 281, L904-912 (2001). Pacher, P. , Beckman, J. S. & Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol. Rev. 87, 315424 (2007). Lancaster, J. R. Nitric oxide : a brief overview of chemical and physical properties relevant to therapeutic applications. Future Sci. OA 1, FSO59 (2015). Thomas, D. D. , Liu, X. , Kantrow, S. P. & Lancaster, J. R. The biological lifetime of nitric oxide : Implications for the perivascular dynamics of NO and O2. Proc. Natl. Acad. Sci. 98, 355360 (2001). Thomas, D. D. Breathing new life into nitric oxide signaling : A brief overview of the interplay between oxygen and nitric oxide. Redox Biol. 5, 225233 (2015). Beckman, J. S. & Koppenol, W. H. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite : the good, the bad, and ugly. Am. J. Physiol. 271, C1424-1437 (1996). 10. Heinrich, T. A. et al. Biological nitric oxide signalling : chemistry and terminology. Br. J. Pharmacol. 169, 14171429 (2013). 11. Jourd'heuil, D. et al. The oxidative and nitrosative chemistry of the nitric oxide/superoxide reaction in the presence of bicarbonate. Arch. Biochem. Biophys. 365, 92100 (1999). 12. Derbyshire, E. R. & Marletta, M. A. Structure and regulation of soluble guanylate cyclase. Annu. Rev. Biochem. 81, 533559 (2012). 13. Drapier, J. C. & Bouton, C. Modulation by nitric oxide of metalloprotein regulatory activities. BioEssays News Rev. Mol. Cell. Dev. Biol. 18, 549556 (1996). 14. Goretski, J. & Hollocher, T. C. Trapping of nitric oxide produced during denitrification by extracellular hemoglobin. J. Biol. Chem. 263, 23162323 (1988). 15. Castro, C. E. & Bartnicki, E. W. The Interconversion of Nucleic Acid Bases by Iron(III) Porphyrins and Nitric Oxide. J. Org. Chem. 59, 40514052 (1994). 16. Marletta, M. A. Mammalian synthesis of nitrite, nitrate, nitric oxide, and N-nitrosating agents. Chem. Res. Toxicol. 1, 249257 (1988). 17. Guittet, O. et al. Peroxynitrite-mediated nitration of the stable free radical tyrosine residue of the ribonucleotide reductase small subunit. Biochemistry (Mosc. ) 39, 46404648 (2000). 18. Guittet, O. , Roy, B. & Lepoivre, M. Nitric oxide : a radical molecule in quest of free radicals in proteins. Cell. Mol. Life Sci. CMLS 55, 10541067 (1999). 19. Murata, M. , Thanan, R. , Ma, N. & Kawanishi, S. Role of nitrative and oxidative DNA damage in inflammation-related carcinogenesis. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 623019 (2012). 20. Martnez-Ruiz, A. & Lamas, S. S-nitrosylation : a potential new paradigm in signal transduction. Cardiovasc. Res. 62, 4352 (2004). 21. Physiology or Medicine at : (Accessed : 8th February 2017) Available for 1998 - Press Release. 22. Furchgott, R. F. & Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature 288, 373376 (1980). 23. Arnold, W. P. , Mittal, C. K. , Katsuki, S. & Murad, F. Nitric oxide activates guanylate cyclase and increases guanosine 3' : 5'-cyclic monophosphate levels in various tissue preparations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 32033207 (1977). 24. Palmer, R. M. , Ferrige, A. G. & Moncada, S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature 327, 524526 (1987). 25. Ignarro, L. J. , Buga, G. M. , Wood, K. S. , Byrns, R. E. & Chaudhuri, G. Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84, 92659269 (1987). 26. Alderton, W. K. , Cooper, C. E. & Knowles, R. G. Nitric oxide synthases : structure, function and inhibition. Biochem. J. 357, 593615 (2001). 27. Chambliss, K. L. & Shaul, P. W. Estrogen modulation of endothelial nitric oxide synthase. Endocr. Rev. 23, 665686 (2002). 28. Harris, M. B. , Blackstone, M. A. , Ju, H. , Venema, V. J. & Venema, R. C. Heat-induced increases in endothelial NO synthase expression and activity and endothelial NO release. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285, H333-340 (2003). 29. Laughlin, M. H. et al. Training induces nonuniform increases in eNOS content along the coronary arterial tree. J. Appl. Physiol. Bethesda Md 1985 90, 501510 (2001). 30. Lam, C. -F. et al. Increased blood flow causes coordinated upregulation of arterial eNOS and biosynthesis of tetrahydrobiopterin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 290, H786-793 (2006). 31. Roberts, P. J. et al. The physiological expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in the human colon. J. Clin. Pathol. 54, 293297 (2001). 32. Asano, K. et al. Constitutive and inducible nitric oxide synthase gene expression, regulation, and activity in human lung epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 1008910093 (1994). 33. McNaughton, L. et al. Distribution of nitric oxide synthase in normal and cirrhotic human liver. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 1716117166 (2002). 34. Villanueva, C. & Giulivi, C. Subcellular and cellular locations of nitric oxide synthase isoforms as determinants of health and disease. Free Radic. Biol. Med. 49, 307316 (2010). 35. Barouch, L. A. et al. Nitric oxide regulates the heart by spatial confinement of nitric oxide synthase isoforms. Nature 416, 337339 (2002). 36. Loughran, P. A. et al. Monomeric inducible nitric oxide synthase localizes to peroxisomes in hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 1383713842 (2005). 37. Glynne, P. A. , Darling, K. E. A. , Picot, J. & Evans, T. J. Epithelial inducible nitric-oxide synthase is an apical EBP50-binding protein that directs vectorial nitric oxide output. J. Biol. Chem. 277, 3313233138 (2002). 38. Oess, S. , Icking, A. , Fulton, D. , Govers, R. & Mller-Esterl, W. Subcellular targeting and trafficking of nitric oxide synthases. Biochem. J. 396, 401409 (2006). 39. Hecker, M. , Mlsch, A. & Busse, R. Subcellular localization and characterization of neuronal nitric oxide synthase. J. Neurochem. 62, 15241529 (1994). 40. Spratt, D. E. , Taiakina, V. , Palmer, M. & Guillemette, J. G. Differential binding of calmodulin domains to constitutive and inducible nitric oxide synthase enzymes. Biochemistry (Mosc. ) 46, 82888300 (2007). 41. Fulton, D. et al. Regulation of endothelium-derived nitric oxide production by the protein kinase Akt. Nature 399, 597601 (1999). 42. Chen, P. -F. & Wu, K. K. Structural elements contribute to the calcium/calmodulin dependence on enzyme activation in human endothelial nitric-oxide synthase. J. Biol. Chem. 278, 5239252400 (2003). 43. Roman, L. J. et al. The C termini of constitutive nitric-oxide synthases control electron flow through the flavin and heme domains and affect modulation by calmodulin. J. Biol. Chem. 275, 2922529232 (2000). 44. Crane, B. R. et al. Structure of Nitric Oxide Synthase Oxygenase Dimer with Pterin and Substrate. Science 279, 2121 (1998). 45. Fischmann, T. O. et al. Structural characterization of nitric oxide synthase isoforms reveals striking active-site conservation. Nat. Struct. Biol. 6, 233242 (1999). 46. Klatt, P. et al. Structural analysis of porcine brain nitric oxide synthase reveals a role for tetrahydrobiopterin and L-arginine in the formation of an SDS-resistant dimer. EMBO J. 14, 3687 3695 (1995). 47. Raman, C. S. et al. Crystal structure of constitutive endothelial nitric oxide synthase : a paradigm for pterin function involving a novel metal center. Cell 95, 939950 (1998). 48. Hemmens, B. , Goessler, W. , Schmidt, K. & Mayer, B. Role of bound zinc in dimer stabilization but not enzyme activity of neuronal nitric-oxide synthase. J. Biol. Chem. 275, 3578635791 (2000). 49. Stuehr, D. J. Mammalian nitric oxide synthases. Biochim. Biophys. Acta 1411, 217230 (1999). 50. Siddhanta, U. et al. Domain swapping in inducible nitric-oxide synthase. Electron transfer occurs between flavin and heme groups located on adjacent subunits in the dimer. J. Biol. Chem. 273, 1895018958 (1998). 51. Panda, K. , Ghosh, S. & Stuehr, D. J. Calmodulin activates intersubunit electron transfer in the neuronal nitric-oxide synthase dimer. J. Biol. Chem. 276, 2334923356 (2001). 52. Tejero, J. & Stuehr, D. Tetrahydrobiopterin in nitric oxide synthase. IUBMB Life 65, 358365 (2013). 53. Morris, S. M. Recent advances in arginine metabolism. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care 7, 45 51 (2004). 54. Tran, C. T. L. , Leiper, J. M. & Vallance, P. The DDAH/ADMA/NOS pathway. Atheroscler. Suppl. 4, 3340 (2003). 55. Pou, S. , Keaton, L. , Surichamorn, W. & Rosen, G. M. Mechanism of superoxide generation by neuronal nitric-oxide synthase. J. Biol. Chem. 274, 95739580 (1999). 56. Mason, M. G. , Nicholls, P. , Wilson, M. T. & Cooper, C. E. Nitric oxide inhibition of respiration involves both competitive (heme) and noncompetitive (copper) binding to cytochrome c oxidase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 708713 (2006). 57. Fulton, D. , Gratton, J. P. & Sessa, W. C. Post-translational control of endothelial nitric oxide synthase : why isn't calcium/calmodulin enough ? J. Pharmacol. Exp. Ther. 299, 818824 (2001). 58. Thomas, D. D. et al. The chemical biology of nitric oxide : implications in cellular signaling. Free Radic. Biol. Med. 45, 1831 (2008). 59. Thomas, D. D. et al. Hypoxic inducible factor 1alpha, extracellular signal-regulated kinase, and p53 are regulated by distinct threshold concentrations of nitric oxide. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 88948899 (2004). 60. Arnelle, D. R. & Stamler, J. S. NO , NO, and NO- donation by S-nitrosothiols : implications for regulation of physiological functions by S-nitrosylation and acceleration of disulfide formation. Arch. Biochem. Biophys. 318, 279285 (1995). 61. Dunn, J. et al. S-nitrosation of arginase 1 requires direct interaction with inducible nitric oxide synthase. Mol. Cell. Biochem. 355, 8389 (2011). 62. Xu, L. , Han, C. , Lim, K. & Wu, T. Activation of cytosolic phospholipase A2alpha through nitric synthase and inducible nitric-oxide oxide-induced S-nitrosylation. cyclooxygenase-2. J. Biol. Chem. 283, 30773087 (2008). Involvement of 63. Iwakiri, Y. S-nitrosylation of proteins : a new insight into endothelial cell function regulated by eNOS-derived NO. Nitric Oxide Biol. Chem. 25, 95101 (2011). 64. Mitchell, D. A. , Michel, T. & Marletta, M. A. Effects of S-nitrosation of nitric oxide synthase. in Advances in Experimental Biology (ed. Trimmer, B. T. and B. ) 1, 151456 (Elsevier, 2007). 65. Kornberg, M. D. et al. GAPDH mediates nitrosylation of nuclear proteins. Nat. Cell Biol. 12, 1094 1100 (2010). 66. Jia, J. et al. Target-selective protein S-nitrosylation by sequence motif recognition. Cell 159, 623 634 (2014). 67. Smith, B. C. & Marletta, M. A. Mechanisms of S-nitrosothiol formation and selectivity in nitric oxide signaling. Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 498506 (2012). 68. Stoyanovsky, D. A. et al. Thioredoxin and lipoic acid catalyze the denitrosation of low molecular weight and protein S-nitrosothiols. J. Am. Chem. Soc. 127, 1581515823 (2005). 69. Benhar, M. Nitric oxide and the thioredoxin system : a complex interplay in redox regulation. Biochim. Biophys. Acta 1850, 24762484 (2015). 70. Ben-Lulu, S. , Ziv, T. , Admon, A. , Weisman-Shomer, P. & Benhar, M. A substrate trapping approach identifies proteins regulated by reversible S-nitrosylation. Mol. Cell. Proteomics MCP 13, 2573 2583 (2014). 71. Ben-Lulu, S. , Ziv, T. , Weisman-Shomer, P. & Benhar, M. Nitrosothiol-Trapping-Based Proteomic Analysis of S-Nitrosylation in Human Lung Carcinoma Cells. PloS One 12, e0169862 (2017). 72. Forrester, M. T. , Foster, M. W. , Benhar, M. & Stamler, J. S. Detection of protein S-nitrosylation with the biotin-switch technique. Free Radic. Biol. Med. 46, 119126 (2009). 73. Seth, D. & Stamler, J. S. The SNO-proteome : causation and classifications. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 129136 (2011). 74. Matthews, J. R. , Botting, C. H. , Panico, M. , Morris, H. R. & Hay, R. T. Inhibition of NF-kappaB DNA binding by nitric oxide. Nucleic Acids Res. 24, 22362242 (1996). 75. Metzen, E. , Zhou, J. , Jelkmann, W. , Fandrey, J. & Brne, B. Nitric oxide impairs normoxic degradation of HIF-1alpha by inhibition of prolyl hydroxylases. Mol. Biol. Cell 14, 34703481 (2003). 76. Yasinska, I. M. & Sumbayev, V. V. S-nitrosation of Cys-800 of HIF-1alpha protein activates its interaction with p300 and stimulates its transcriptional activity. FEBS Lett. 549, 105109 (2003). 77. Krncke, K. D. Zinc finger proteins as molecular targets for nitric oxide-mediated gene regulation. Antioxid. Redox Signal. 3, 565575 (2001). 78. Gu, Z. et al. S-nitrosylation of matrix metalloproteinases : signaling pathway to neuronal cell death. Science 297, 11861190 (2002). 79. Hart, J. D. & Dulhunty, A. F. Nitric oxide activates or inhibits skeletal muscle ryanodine receptors depending on its concentration, membrane potential and ligand binding. J. Membr. Biol. 173, 227236 (2000). 80. Hess, D. T. & Stamler, J. S. Regulation by S-nitrosylation of protein post-translational modification. J. Biol. Chem. 287, 44114418 (2012). 81. Juedes, M. J. & Wogan, G. N. Peroxynitrite-induced mutation spectra of pSP189 following replication in bacteria and in human cells. Mutat. Res. 349, 5161 (1996). 82. Brown, G. C. & Cooper, C. E. Nanomolar concentrations of nitric oxide reversibly inhibit synaptosomal respiration by competing with oxygen at cytochrome oxidase. FEBS Lett. 356, 295 298 (1994). 83. Clementi, E. , Brown, G. C. , Feelisch, M. & Moncada, S. Persistent inhibition of cell respiration by nitric oxide : crucial role of S-nitrosylation of mitochondrial complex I and protective action of glutathione. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 76317636 (1998). 84. Li, C. -Q. & Wogan, G. N. Nitric oxide as a modulator of apoptosis. Cancer Lett. 226, 115 (2005). 85. Brne, B. , von Knethen, A. & Sandau, K. B. Nitric oxide (NO) : an effector of apoptosis. Cell Death Differ. 6, 969975 (1999). 86. Moriya, R. , Uehara, T. & Nomura, Y. Mechanism of nitric oxide-induced apoptosis in human neuroblastoma SH-SY5Y cells. FEBS Lett. 484, 253260 (2000). 87. Yabuki, M. , Tsutsui, K. , Horton, A. A. , Yoshioka, T. & Utsumi, K. Caspase activation and cytochrome c release during HL-60 cell apoptosis induced by a nitric oxide donor. Free Radic. Res. 32, 507514 (2000). 88. Li, C. -Q. et al. Apoptotic signaling pathways induced by nitric oxide in human lymphoblastoid cells expressing wild-type or mutant p53. Cancer Res. 64, 30223029 (2004). 89. Wang, Y. , Vodovotz, Y. , Kim, P. K. M. , Zamora, R. & Billiar, T. R. Mechanisms of hepatoprotection by nitric oxide. Ann. N. Y. Acad. Sci. 962, 415422 (2002). 90. Sciorati, C. et al. Autocrine nitric oxide modulates CD95-induced apoptosis in gammadelta T lymphocytes. J. Biol. Chem. 272, 2321123215 (1997). 91. DeMeester, S. L. et al. Nitric oxide inhibits stress-induced endothelial cell apoptosis. Crit. Care Med. 26, 15001509 (1998). 92. Kim, Y. M. et al. Nitric oxide protects PC12 cells from serum deprivation-induced apoptosis by cGMP-dependent inhibition of caspase signaling. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 19, 67406747 (1999). 93. Brne, B. et al. Superoxide formation and macrophage resistance to nitric oxide-mediated apoptosis. J. Biol. Chem. 272, 72537258 (1997). 94. Jaiswal, A. K. Nrf2 signaling in coordinated activation of antioxidant gene expression. Free Radic. Biol. Med. 36, 11991207 (2004). 95. Uruno, A. & Motohashi, H. The Keap1-Nrf2 system as an in vivo sensor for electrophiles. Nitric Oxide Biol. Chem. 25, 153160 (2011). 96. Kang, M. -I. , Kobayashi, A. , Wakabayashi, N. , Kim, S. -G. & Yamamoto, M. Scaffolding of Keap1 to the actin cytoskeleton controls the function of Nrf2 as key regulator of cytoprotective phase 2 genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 20462051 (2004). 97. Motohashi, H. & Yamamoto, M. Nrf2-Keap1 defines a physiologically important stress response mechanism. Trends Mol. Med. 10, 549557 (2004). 98. Lin, W. et al. Sulforaphane suppressed LPS-induced inflammation in mouse peritoneal macrophages through Nrf2 dependent pathway. Biochem. Pharmacol. 76, 967973 (2008). 99. McNally, S. J. , Harrison, E. M. , Ross, J. A. , Garden, O. J. & Wigmore, S. J. Curcumin induces heme oxygenase 1 through generation of reactive oxygen species, p38 activation and phosphatase inhibition. Int. J. Mol. Med. 19, 165172 (2007). 100. Andreadi, C. K. , Howells, L. M. , Atherfold, P. A. & Manson, M. M. Involvement of Nrf2, p38, B-Raf, induction of in and nuclear hemeoxygenase-1 by dietary polyphenols. Mol. Pharmacol. 69, 10331040 (2006). factor-kappaB, but not phosphatidylinositol 3-kinase, 101. Bloom, D. A. & Jaiswal, A. K. Phosphorylation of Nrf2 at Ser40 by protein kinase C in response to antioxidants is not required for Nrf2 stabilization/accumulation in the nucleus and transcriptional activation of antioxidant response element-mediated NAD(P)H : quinone oxidoreductase-1 gene expression. J. Biol. Chem. 278, 4467544682 (2003). leads to the release of Nrf2 from INrf2, but 102. Wakabayashi, N. et al. Protection against electrophile and oxidant stress by induction of the phase 2 response : fate of cysteines of the Keap1 sensor modified by inducers. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 20402045 (2004). 103. Kobayashi, A. et al. Oxidative and electrophilic stresses activate Nrf2 through inhibition of ubiquitination activity of Keap1. Mol. Cell. Biol. 26, 221229 (2006). 104. Pei, D. -S. , Sun, Y. -F. & Song, Y. -J. S-nitrosylation of PTEN Invovled in ischemic brain injury in rat hippocampal CA1 region. Neurochem. Res. 34, 15071512 (2009). 105. Fujii, S. et al. The critical role of nitric oxide signaling, via protein S-guanylation and nitrated cyclic GMP, in the antioxidant adaptive response. J. Biol. Chem. 285, 2397023984 (2010). 106. Um, H. -C. , Jang, J. -H. , Kim, D. -H. , Lee, C. & Surh, Y. -J. Nitric oxide activates Nrf2 through S- nitrosylation of Keap1 in PC12 cells. Nitric Oxide Biol. Chem. 25, 161168 (2011). 107. Motohashi, H. , Katsuoka, F. , Shavit, J. A. , Engel, J. D. & Yamamoto, M. Positive or negative MARE- dependent transcriptional regulation is determined by the abundance of small Maf proteins. Cell 103, 865875 (2000). 108. Frstermann, U. & Sessa, W. C. Nitric oxide synthases : regulation and function. Eur. Heart J. 33, 829837 (2012). 109. Huang, P. L. et al. Hypertension in mice lacking the gene for endothelial nitric oxide synthase. Nature 377, 239242 (1995). 110. Zhao, Y. , Vanhoutte, P. M. & Leung, S. W. S. Vascular nitric oxide : Beyond eNOS. J. Pharmacol. Sci. 129, 8394 (2015). 111. Griffith, T. M. , Edwards, D. H. , Davies, R. L. , Harrison, T. J. & Evans, K. T. EDRF coordinates the behaviour of vascular resistance vessels. Nature 329, 442445 (1987). 112. Graham, A. et al. Peroxynitrite modification of low-density lipoprotein leads to recognition by the macrophage scavenger receptor. FEBS Lett. 330, 181185 (1993). 113. Beckmann, J. S. et al. Extensive nitration of protein tyrosines in human atherosclerosis detected by immunohistochemistry. Biol. Chem. Hoppe. Seyler 375, 8188 (1994). 114. Zeiher, A. M. , Fisslthaler, B. , Schray-Utz, B. & Busse, R. Nitric oxide modulates the expression of monocyte chemoattractant protein 1 in cultured human endothelial cells. Circ. Res. 76, 980986 (1995). 115. Kubes, P. , Suzuki, M. & Granger, D. N. Nitric oxide : an endogenous modulator of leukocyte adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88, 46514655 (1991). 116. Alheid, U. , Frlich, J. C. & Frstermann, U. Endothelium-derived relaxing factor from cultured human endothelial cells inhibits aggregation of human platelets. Thromb. Res. 47, 561571 (1987). 117. Rudic, R. D. et al. Direct evidence for the importance of endothelium-derived nitric oxide in vascular remodeling. J. Clin. Invest. 101, 731736 (1998). 118. Aicher, A. et al. Essential role of endothelial nitric oxide synthase for mobilization of stem and progenitor cells. Nat. Med. 9, 13701376 (2003). 119. Tsutsui, M. et al. Significance of nitric oxide synthases : Lessons from triple nitric oxide synthases null mice. J. Pharmacol. Sci. 127, 4252 (2015). 120. Landmesser, U. et al. Oxidation of tetrahydrobiopterin leads to uncoupling of endothelial cell nitric oxide synthase in hypertension. J. Clin. Invest. 111, 12011209 (2003). 121. Zou, M. -H. , Shi, C. & Cohen, R. A. Oxidation of the zinc-thiolate complex and uncoupling of endothelial nitric oxide synthase by peroxynitrite. J. Clin. Invest. 109, 817826 (2002). 122. Simon, A. et al. Role of neutral amino acid transport and protein breakdown for substrate supply of nitric oxide synthase in human endothelial cells. Circ. Res. 93, 813820 (2003). 123. Xu, W. et al. Increased arginase II and decreased NO synthesis in endothelial cells of patients with pulmonary arterial hypertension. FASEB J. Off. Publ. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 18, 17461748 (2004). 124. Antoniades, C. et al. Association of plasma asymmetrical dimethylarginine (ADMA) with elevated vascular superoxide production and endothelial nitric oxide synthase uncoupling : implications for endothelial function in human atherosclerosis. Eur. Heart J. 30, 11421150 (2009). 125. Chen, C. -A. et al. S-glutathionylation uncouples eNOS and regulates its cellular and vascular function. Nature 468, 11151118 (2010). 126. Lange, M. , Enkhbaatar, P. , Nakano, Y. & Traber, D. L. Role of nitric oxide in shock : the large animal perspective. Front. Biosci. Landmark Ed. 14, 19791989 (2009). 127. Wood, J. & Garthwaite, J. Models of the diffusional spread of nitric oxide : implications for neural nitric oxide signalling and its pharmacological properties. Neuropharmacology 33, 12351244 (1994). 128. Nitric Oxide Contribution in the CNS | Cayman Chemical. Available at : (Accessed : 15th April 2017) 129. Vincent, S. R. Nitric oxide neurons and neurotransmission. Prog. Neurobiol. 90, 246255 (2010). 130. Dolji, E. , Grbatini, I. & Kosti, V. Why is nitric oxide important for our brain ? Funct. Neurol. 30, 159163 (2015). 131. O'Dell, T. J. , Hawkins, R. D. , Kandel, E. R. & Arancio, O. Tests of the roles of two diffusible substances in long-term potentiation : evidence for nitric oxide as a possible early retrograde messenger. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88, 1128511289 (1991). 132. Izumi, Y. & Zorumski, C. F. Nitric oxide and long-term synaptic depression in the rat hippocampus. Neuroreport 4, 11311134 (1993). 133. Bhme, G. A. et al. Altered synaptic plasticity and memory formation in nitric oxide synthase inhibitor-treated rats. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 91919194 (1993). 134. Hlscher, C. & Rose, S. P. An inhibitor of nitric oxide synthesis prevents memory formation in the chick. Neurosci. Lett. 145, 165167 (1992). 135. Costa, E. D. , Rezende, B. A. , Cortes, S. F. & Lemos, V. S. Neuronal Nitric Oxide Synthase in Vascular Physiology and Diseases. Front. Physiol. 7, 206 (2016). 136. Rajfer, J. , Aronson, W. J. , Bush, P. A. , Dorey, F. J. & Ignarro, L. J. Nitric oxide as a mediator of in response to nonadrenergic, noncholinergic relaxation of the corpus cavernosum neurotransmission. N. Engl. J. Med. 326, 9094 (1992). 137. Steinert, J. R. , Chernova, T. & Forsythe, I. D. Nitric oxide signaling in brain function, dysfunction, and dementia. Neurosci. Rev. J. Bringing Neurobiol. Neurol. Psychiatry 16, 435452 (2010). 138. Brown, G. C. & Neher, J. J. Inflammatory neurodegeneration and mechanisms of microglial killing of neurons. Mol. Neurobiol. 41, 242247 (2010). 139. Lefebvre, R. A. Pharmacological characterization of the nitrergic innervation of the stomach. Verh. - K. Acad. Voor Geneeskd. Van Belg. 64, 151166 (2002). 140. Hibbs, J. B. , Vavrin, Z. & Taintor, R. R. L-arginine is required for expression of the activated macrophage effector mechanism causing selective metabolic inhibition in target cells. J. Immunol. Baltim. Md 1950 138, 550565 (1987). 141. Hibbs, J. B. , Taintor, R. R. & Vavrin, Z. Macrophage cytotoxicity : role for L-arginine deiminase and imino nitrogen oxidation to nitrite. Science 235, 473476 (1987). 142. Mills, C. D. , Kincaid, K. , Alt, J. M. , Heilman, M. J. & Hill, A. M. M-1/M-2 macrophages and the Th1/Th2 paradigm. J. Immunol. Baltim. Md 1950 164, 61666173 (2000). 143. Sica, A. & Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization : in vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787795 (2012). 144. Gordon, S. & Martinez, F. O. Alternative activation of macrophages : mechanism and functions. Immunity 32, 593604 (2010). 145. Biswas, S. K. & Mantovani, A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets : cancer as a paradigm. Nat. Immunol. 11, 889896 (2010). 146. Murray, P. J. et al. Macrophage activation and polarization : nomenclature and experimental guidelines. Immunity 41, 1420 (2014). 147. Bogdan, C. Nitric oxide synthase in innate and adaptive immunity : an update. Trends Immunol. 36, 161178 (2015). 148. Richardson, A. R. et al. Multiple targets of nitric oxide in the tricarboxylic acid cycle of Salmonella enterica serovar typhimurium. Cell Host Microbe 10, 3343 (2011). 149. Savidge, T. C. et al. Host S-nitrosylation inhibits clostridial small molecule-activated glucosylating toxins. Nat. Med. 17, 11361141 (2011). 150. Olekhnovitch, R. , Ryffel, B. , Mller, A. J. & Bousso, P. Collective nitric oxide production provides tissue-wide immunity during Leishmania infection. J. Clin. Invest. 124, 17111722 (2014). 151. Mller, A. J. et al. Photoconvertible pathogen labeling reveals nitric oxide control of Leishmania major infection in vivo via dampening of parasite metabolism. Cell Host Microbe 14, 460467 (2013). 152. Zwaferink, H. , Stockinger, S. , Reipert, S. & Decker, T. Stimulation of inducible nitric oxide synthase expression by beta interferon increases necrotic death of macrophages upon Listeria monocytogenes infection. Infect. Immun. 76, 16491656 (2008). 153. Herbst, S. , Schaible, U. E. & Schneider, B. E. Interferon gamma activated macrophages kill mycobacteria by nitric oxide induced apoptosis. PloS One 6, e19105 (2011). 154. Nairz, M. et al. Nitric oxide-mediated regulation of ferroportin-1 controls macrophage iron homeostasis and immune function in Salmonella infection. J. Exp. Med. 210, 855873 (2013). 155. Ramphul, U. N. , Garver, L. S. , Molina-Cruz, A. , Canepa, G. E. & Barillas-Mury, C. Plasmodium falciparum evades mosquito immunity by disrupting JNK-mediated apoptosis of invaded midgut cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 12731280 (2015). 156. Bogdan, C. Regulation of lymphocytes by nitric oxide. Methods Mol. Biol. Clifton NJ 677, 375393 (2011). 157. Bronte, V. & Zanovello, P. Regulation of immune responses by L-arginine metabolism. Nat. Rev. Immunol. 5, 641654 (2005). 158. Niedbala, W. et al. Nitric oxide preferentially induces type 1 T cell differentiation by selectively up-regulating IL-12 receptor beta 2 expression via cGMP. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 16186 16191 (2002). 159. Niedbala, W. et al. Nitric oxide enhances Th9 cell differentiation and airway inflammation. Nat. Commun. 5, 4575 (2014). 160. Jianjun Yang, null et al. T cellderived inducible nitric oxide synthase switches off Th17 cell differentiation. J. Exp. Med. 210, 14471462 (2013). 161. Obermajer, N. et al. Induction and stability of human Th17 cells require endogenous NOS2 and cGMP-dependent NO signaling. J. Exp. Med. 210, 14331445 (2013). 162. Jayaraman, P. et al. iNOS expression in CD4 T cells limits Treg induction by repressing TGF1 : combined iNOS inhibition and Treg depletion unmask endogenous antitumor immunity. Clin. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc. Cancer Res. 20, 64396451 (2014). 163. Predonzani, A. , Cal, B. , Agnellini, A. H. & Molon, B. Spotlights on immunological effects of reactive nitrogen species : When inflammation says nitric oxide. World J. Exp. Med. 5, 6476 (2015). 164. Giordano, D. , Draves, K. E. , Li, C. , Hohl, T. M. & Clark, E. A. Nitric oxide regulates BAFF expression and T cell-independent antibody responses. J. Immunol. Baltim. Md 1950 193, 11101120 (2014). 165. Eriksson, S. , Chambers, B. J. & Rhen, M. Nitric oxide produced by murine dendritic cells is cytotoxic for intracellular Salmonella enterica sv. Typhimurium. Scand. J. Immunol. 58, 493502 (2003). 166. Aldridge, J. R. et al. TNF/iNOS-producing dendritic cells are the necessary evil of lethal influenza virus infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 53065311 (2009). 167. De Trez, C. et al. iNOS-producing inflammatory dendritic cells constitute the major infected cell type during the chronic Leishmania major infection phase of C57BL/6 resistant mice. PLoS Pathog. 5, e1000494 (2009). 168. Ryan, B. J. , Nissim, A. & Winyard, P. G. Oxidative post-translational modifications and their involvement in the pathogenesis of autoimmune diseases. Redox Biol. 2, 715724 (2014). 169. Birnboim, H. C. , Lemay, A. -M. , Lam, D. K. Y. , Goldstein, R. & Webb, J. R. Cutting edge : MHC class II-restricted peptides containing the inflammation-associated marker 3-nitrotyrosine evade central tolerance and elicit a robust cell-mediated immune response. J. Immunol. Baltim. Md 1950 171, 528532 (2003). 170. Ohmori, H. et al. Immunogenicity of autologous IgG bearing the inflammation-associated marker 3-nitrotyrosine. Immunol. Lett. 96, 4754 (2005). 171. Kalluri, R. , Cantley, L. G. , Kerjaschki, D. & Neilson, E. G. Reactive oxygen species expose cryptic epitopes associated with autoimmune goodpasture syndrome. J. Biol. Chem. 275, 2002720032 (2000). 172. Binder, C. J. et al. Pneumococcal vaccination decreases atherosclerotic lesion formation : molecular mimicry between Streptococcus pneumoniae and oxidized LDL. Nat. Med. 9, 736743 (2003). 173. Khan, F. & Siddiqui, A. A. Prevalence of anti-3-nitrotyrosine antibodies in the joint synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis, osteoarthritis and systemic lupus erythematosus. Clin. Chim. Acta Int. J. Clin. Chem. 370, 100107 (2006). 174. Ahsan, H. 3-Nitrotyrosine : A biomarker of nitrogen free radical species modified proteins in systemic autoimmunogenic conditions. Hum. Immunol. 74, 13921399 (2013). 175. Ribbons, K. A. et al. Potential role of nitric oxide in a model of chronic colitis in rhesus macaques. Gastroenterology 108, 705711 (1995). 176. Balkwill, F. & Mantovani, A. Inflammation and cancer : back to Virchow ? Lancet Lond. Engl. 357, 539545 (2001). 177. Porta, C. , Riboldi, E. & Sica, A. Mechanisms linking pathogens-associated inflammation and cancer. Cancer Lett. 305, 250262 (2011). 178. Hanahan, D. & Coussens, L. M. Accessories to the crime : functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell 21, 309322 (2012). 179. Solinas, G. , Germano, G. , Mantovani, A. & Allavena, P. Tumor-associated macrophages (TAM) as major players of the cancer-related inflammation. J. Leukoc. Biol. 86, 10651073 (2009). 180. Molon, B. et al. Chemokine nitration prevents intratumoral infiltration of antigen-specific T cells. J. Exp. Med. 208, 19491962 (2011). 181. Bingisser, R. M. , Tilbrook, P. A. , Holt, P. G. & Kees, U. R. Macrophage-derived nitric oxide regulates T cell activation via reversible disruption of the Jak3/STAT5 signaling pathway. J. Immunol. Baltim. Md 1950 160, 57295734 (1998). 182. Burke, A. J. , Sullivan, F. J. , Giles, F. J. & Glynn, S. A. The yin and yang of nitric oxide in cancer progression. Carcinogenesis 34, 503512 (2013). 183. Choudhari, S. K. , Chaudhary, M. , Bagde, S. , Gadbail, A. R. & Joshi, V. Nitric oxide and cancer : a review. World J. Surg. Oncol. 11, 118 (2013). 184. Kim, J. et al. Regulation of STAT3 and NF-B activations by S-nitrosylation in multiple myeloma. Free Radic. Biol. Med. 106, 245253 (2017). 185. Yang, Y. et al. Nitric oxide synthase inhibitors : a review of patents from 2011 to the present. Expert Opin. Ther. Pat. 25, 4968 (2015). 186. Ganzarolli de Oliveira, M. S-Nitrosothiols as Platforms for Topical Nitric Oxide Delivery. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 119 Suppl 3, 4956 (2016). 187. Hickok, J. R. & Thomas, D. D. Nitric oxide and cancer therapy : the emperor has NO clothes. Curr. Pharm. Des. 16, 381391 (2010). 188. Bettaieb, A. et al. S-Nitrosylation in Cancer Cells : To Prevent or to Cause ? in Nitric Oxide and Cancer : Pathogenesis and Therapy 97109 (Springer, Cham, 2015). doi : 10. 1007/978-3-319- 13611-0 7 189. Pautz, A. et al. Regulation of the expression of inducible nitric oxide synthase. Nitric Oxide Biol. Chem. 23, 7593 (2010). 190. Zhang, X. et al. Transcriptional basis for hyporesponsiveness of the human inducible nitric oxide synthase gene to lipopolysaccharide/interferon-gamma. J. Leukoc. Biol. 59, 575585 (1996). 191. Gross, T. J. et al. Epigenetic silencing of the human NOS2 gene : rethinking the role of nitric oxide in human macrophage inflammatory responses. J. Immunol. Baltim. Md 1950 192, 23262338 (2014). 192. Chan, G. C. et al. Epigenetic basis for the transcriptional hyporesponsiveness of the human inducible nitric oxide synthase gene in vascular endothelial cells. J. Immunol. Baltim. Md 1950 175, 38463861 (2005). 193. de Vera, M. E. et al. Transcriptional regulation of human inducible nitric oxide synthase (NOS2) gene by cytokines : initial analysis of the human NOS2 promoter. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 10541059 (1996). 194. Chu, S. C. , Marks-Konczalik, J. , Wu, H. P. , Banks, T. C. & Moss, J. Analysis of the cytokine- stimulated human inducible nitric oxide synthase (iNOS) gene : characterization of differences between human and mouse iNOS promoters. Biochem. Biophys. Res. Commun. 248, 871878 (1998). 195. Xie, Q. W. , Whisnant, R. & Nathan, C. Promoter of the mouse gene encoding calcium- independent nitric oxide synthase confers inducibility by interferon gamma and bacterial lipopolysaccharide. J. Exp. Med. 177, 17791784 (1993). 196. Fukuda, K. , Akao, S. , Ohno, Y. , Yamashita, K. & Fujiwara, H. Inhibition by costunolide of phorbol ester-induced transcriptional activation of inducible nitric oxide synthase gene in a human monocyte cell line THP-1. Cancer Lett. 164, 713 (2001). 197. Kolyada, A. Y. , Savikovsky, N. & Madias, N. E. Transcriptional regulation of the human iNOS gene in vascular-smooth-muscle cells and macrophages : evidence for tissue specificity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 220, 600605 (1996). 198. Rico, D. , Vaquerizas, J. M. , Dopazo, H. & Boscá, L. Identification of conserved domains in the promoter regions of nitric oxide synthase 2 : implications for the species-specific transcription and evolutionary differences. BMC Genomics 8, 271 (2007). 199. Taylor, B. S. & Geller, D. A. Molecular regulation of the human inducible nitric oxide synthase (iNOS) gene. Shock Augusta Ga 13, 413424 (2000). 200. L, X. et al. [A short tandem repeat polymorphism in the inducible nitric oxide synthase gene in Chinese population]. Yi Chuan Xue Bao 29, 290293 (2002). 201. Xu, W. et al. Survey of the allelic frequency of a NOS2A promoter microsatellite in human populations : assessment of the NOS2A gene and predisposition to infectious disease. Nitric Oxide Biol. Chem. 4, 379383 (2000). 202. Goldring, C. E. , Reveneau, S. , Algarté, M. & Jeannin, J. F. In vivo footprinting of the mouse inducible nitric oxide synthase gene : inducible protein occupation of numerous sites including Oct and NF-IL6. Nucleic Acids Res. 24, 16821687 (1996). 203. Xie, Q. W. , Kashiwabara, Y. & Nathan, C. Role of transcription factor NF-kappa B/Rel in induction of nitric oxide synthase. J. Biol. Chem. 269, 47054708 (1994). 204. Taylor, B. S. et al. Multiple NF-kappaB enhancer elements regulate cytokine induction of the human inducible nitric oxide synthase gene. J. Biol. Chem. 273, 1514815156 (1998). 205. Farlik, M. et al. Nonconventional initiation complex assembly by STAT and NF-kappaB transcription factors regulates nitric oxide synthase expression. Immunity 33, 2534 (2010). 206. Kleinert, H. et al. Cytokine induction of NO synthase II in human DLD-1 cells : roles of the JAK- STAT, AP-1 and NF-kappaB-signaling pathways. Br. J. Pharmacol. 125, 193201 (1998). 207. Guo, Z. , Shao, L. , Du, Q. , Park, K. S. & Geller, D. A. Identification of a classic cytokine-induced enhancer upstream in the human iNOS promoter. FASEB J. Off. Publ. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 21, 535542 (2007). 208. Jantsch, J. et al. Toll-like receptor activation and hypoxia use distinct signaling pathways to stabilize hypoxia-inducible factor 1 (HIF1A) and result in differential HIF1A-dependent gene expression. J. Leukoc. Biol. 90, 551562 (2011). 209. Kleinert, H. , Euchenhofer, C. , Ihrig-Biedert, I. & Frstermann, U. Glucocorticoids inhibit the induction of nitric oxide synthase II by down-regulating cytokine-induced activity of transcription factor nuclear factor-kappa B. Mol. Pharmacol. 49, 1521 (1996). 210. Pance, A. , Chantome, A. , Reveneau, S. , Bentrari, F. & Jeannin, J. -F. A repressor in the proximal human inducible nitric oxide synthase promoter modulates transcriptional activation. FASEB J. Off. Publ. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 16, 631633 (2002). 211. Linker, K. et al. Involvement of KSRP in the post-transcriptional regulation of human iNOS expression-complex interplay of KSRP with TTP and HuR. Nucleic Acids Res. 33, 48134827 (2005). 212. Pautz, A. et al. Similar regulation of human inducible nitric-oxide synthase expression by different isoforms of the RNA-binding protein AUF1. J. Biol. Chem. 284, 27552766 (2009). 213. Guo, Z. et al. miRNA-939 regulates human inducible nitric oxide synthase posttranscriptional gene expression in human hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 58265831 (2012). 214. Zhu, H. et al. NPM-ALK up-regulates iNOS expression through a STAT3/microRNA-26a-dependent mechanism. J. Pathol. 230, 8294 (2013). 215. Felley-Bosco, E. , Bender, F. C. , Courjault-Gautier, F. , Bron, C. & Quest, A. F. Caveolin-1 down- regulates inducible nitric oxide synthase via the proteasome pathway in human colon carcinoma cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 1433414339 (2000). 216. Felley-Bosco, E. , Bender, F. & Quest, A. F. G. Caveolin-1-mediated post-transcriptional regulation of inducible nitric oxide synthase in human colon carcinoma cells. Biol. Res. 35, 169176 (2002). 217. Hausel, P. , Latado, H. , Courjault-Gautier, F. & Felley-Bosco, E. Src-mediated phosphorylation regulates subcellular distribution and activity of human inducible nitric oxide synthase. Oncogene 25, 198206 (2006). 218. Musial, A. & Eissa, N. T. Inducible nitric-oxide synthase is regulated by the proteasome degradation pathway. J. Biol. Chem. 276, 2426824273 (2001). 219. Kolodziejski, P. J. , Musial, A. , Koo, J. -S. & Eissa, N. T. Ubiquitination of inducible nitric oxide synthase is required for its degradation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 1231512320 (2002). 220. Matsumoto, K. et al. The ECS(SPSB) E3 ubiquitin ligase is the master regulator of the lifetime of inducible nitric-oxide synthase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 409, 4651 (2011). 221. Kuang, Z. et al. The SPRY domain-containing SOCS box protein SPSB2 targets iNOS for proteasomal degradation. J. Cell Biol. 190, 129141 (2010). 222. Nishiya, T. et al. Regulation of inducible nitric-oxide synthase by the SPRY domain- and SOCS box- containing proteins. J. Biol. Chem. 286, 90099019 (2011). 223. Lewis, R. S. et al. TLR regulation of SPSB1 controls inducible nitric oxide synthase induction. J. Immunol. Baltim. Md 1950 187, 37983805 (2011). 224. Jones, R. J. , Jourd'heuil, D. , Salerno, J. C. , Smith, S. M. E. & Singer, H. A. iNOS regulation by calcium/calmodulin-dependent protein kinase II in vascular smooth muscle. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, H2634-2642 (2007). 225. Yoshida, M. & Xia, Y. Heat shock protein 90 as an endogenous protein enhancer of inducible nitric-oxide synthase. J. Biol. Chem. 278, 3695336958 (2003). 226. Ratovitski, E. A. et al. An inducible nitric-oxide synthase (NOS)-associated protein inhibits NOS dimerization and activity. J. Biol. Chem. 274, 3025030257 (1999). 227. Ratovitski, E. A. et al. Kalirin inhibition of inducible nitric-oxide synthase. J. Biol. Chem. 274, 993 999 (1999). 228. Zhang, Y. , Alexander, P. B. & Wang, X. -F. TGF- Family Signaling in the Control of Cell Proliferation and Survival. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 9, (2017). 229. Meng, X. -M. , Nikolic-Paterson, D. J. & Lan, H. Y. TGF- : the master regulator of fibrosis. Nat. Rev. Nephrol. 12, 325338 (2016). 230. Travis, M. A. & Sheppard, D. TGF- activation and function in immunity. Annu. Rev. Immunol. 32, 5182 (2014). 231. Vaidya, A. & Kale, V. P. TGF- signaling and its role in the regulation of hematopoietic stem cells. Syst. Synth. Biol. 9, 110 (2015). 232. Sanjabi, S. , Oh, S. A. & Li, M. O. Regulation of the Immune Response by TGF- : From Conception to Autoimmunity and Infection. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 9, (2017). 233. Vodovotz, Y. Control of Nitric Oxide Production by Transforming Growth Factor-1 : Mechanistic Insights and Potential Relevance to Human Disease. Nitric Oxide 1, 317 (1997). 234. Massagué, J. TGF signalling in context. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 616630 (2012). 235. Hata, A. & Chen, Y. -G. TGF- Signaling from Receptors to Smads. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 8, (2016). 236. Heldin, C. -H. & Moustakas, A. Signaling Receptors for TGF- Family Members. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 8, (2016). 237. Membrane-anchored and soluble forms of betaglycan, a polymorphic proteoglycan that binds transforming growth factor-beta. J. Cell Biol. 109, 31373145 (1989). 238. Heldin, C. H. , Miyazono, K. & ten Dijke, P. TGF-beta signalling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins. Nature 390, 465471 (1997). 239. Macias, M. J. , Martin-Malpartida, P. & Massagué, J. Structural determinants of Smad function in TGF- signaling. Trends Biochem. Sci. 40, 296308 (2015). 240. Chaikuad, A. & Bullock, A. N. Structural Basis of Intracellular TGF- Signaling : Receptors and Smads. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 8, (2016). 241. Nakao, A. et al. Identification of Smad7, a TGFbeta-inducible antagonist of TGF-beta signalling. Nature 389, 631635 (1997). 242. Miyazawa, K. & Miyazono, K. Regulation of TGF- Family Signaling by Inhibitory Smads. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 9, (2017). 243. Zwaagstra, J. C. , Collins, C. , Langlois, M. -J. & O'Connor-McCourt, M. D. Analysis of the contribution of receptor subdomains to the cooperative binding and internalization of transforming growth factor-beta (TGF-beta) type I and type II receptors. Exp. Cell Res. 314, 2553 2568 (2008). 244. Huang, T. et al. TGF- signalling is mediated by two autonomously functioning TRI : TRII pairs. EMBO J. 30, 12631276 (2011). 245. Feng, X. -H. & Derynck, R. Specificity and versatility in tgf-beta signaling through Smads. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 659693 (2005). 246. Lo, R. S. , Chen, Y. G. , Shi, Y. , Pavletich, N. P. & Massagué, J. The L3 loop : a structural motif determining specific interactions between SMAD proteins and TGF-beta receptors. EMBO J. 17, 9961005 (1998). 247. Xiao, Z. , Latek, R. & Lodish, H. F. An extended bipartite nuclear localization signal in Smad4 is required for its nuclear import and transcriptional activity. Oncogene 22, 10571069 (2003). 248. Xiao, Z. , Liu, X. & Lodish, H. F. Importin beta mediates nuclear translocation of Smad 3. J. Biol. Chem. 275, 2342523428 (2000). 249. Xu, L. , Kang, Y. , Cl, S. & Massagué, J. Smad2 nucleocytoplasmic shuttling by nucleoporins CAN/Nup214 and Nup153 feeds TGFbeta signaling complexes in the cytoplasm and nucleus. Mol. Cell 10, 271282 (2002). 250. Kurisaki, A. , Kose, S. , Yoneda, Y. , Heldin, C. H. & Moustakas, A. Transforming growth factor-beta induces nuclear import of Smad3 in an importin-beta1 and Ran-dependent manner. Mol. Biol. Cell 12, 10791091 (2001). 251. Weiss, A. & Attisano, L. The TGFbeta superfamily signaling pathway. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 2, 4763 (2013). 252. Blahna, M. T. & Hata, A. Smad-mediated regulation of microRNA biosynthesis. FEBS Lett. 586, 19061912 (2012). 253. Zhang, Y. E. Non-Smad Signaling Pathways of the TGF- Family. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 9, (2017). 254. Lai, C. -F. & Cheng, S. -L. Signal transductions induced by bone morphogenetic protein-2 and transforming growth factor-beta in normal human osteoblastic cells. J. Biol. Chem. 277, 15514 15522 (2002). 255. Chen, X. -F. et al. Transforming growth factor-1 induces epithelial-to-mesenchymal transition in human lung cancer cells via PI3K/Akt and MEK/Erk1/2 signaling pathways. Mol. Biol. Rep. 39, 35493556 (2012). 256. Galliher, A. J. & Schiemann, W. P. Src phosphorylates Tyr284 in TGF-beta type II receptor and regulates TGF-beta stimulation of p38 MAPK during breast cancer cell proliferation and invasion. Cancer Res. 67, 37523758 (2007). 257. Sorrentino, A. et al. The type I TGF-beta receptor engages TRAF6 to activate TAK1 in a receptor kinase-independent manner. Nat. Cell Biol. 10, 11991207 (2008). 258. Yamashita, M. et al. TRAF6 mediates Smad-independent activation of JNK and p38 by TGF-beta. Mol. Cell 31, 918924 (2008). 259. Thiery, J. P. , Acloque, H. , Huang, R. Y. J. & Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell 139, 871890 (2009). 260. Yan, C. et al. Epithelial to mesenchymal transition in human skin wound healing is induced by tumor necrosis factor-alpha through bone morphogenic protein-2. Am. J. Pathol. 176, 22472258 (2010). 261. Zhang, J. , Tian, X. -J. & Xing, J. Signal Transduction Pathways of EMT Induced by TGF-, SHH, and WNT and Their Crosstalks. J. Clin. Med. 5, (2016). 262. Schfer, M. & Werner, S. Cancer as an overhealing wound : an old hypothesis revisited. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 628638 (2008). 263. Micalizzi, D. S. , Farabaugh, S. M. & Ford, H. L. Epithelial-mesenchymal transition in cancer : parallels between normal development and tumor progression. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia 15, 117134 (2010). 264. Lamouille, S. & Derynck, R. Cell size and invasion in TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition is regulated by activation of the mTOR pathway. J. Cell Biol. 178, 437451 (2007). 265. Masszi, A. et al. Central role for Rho in TGF-beta1-induced alpha-smooth muscle actin expression during epithelial-mesenchymal transition. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 284, F911-924 (2003). 266. Bakin, A. V. , Tomlinson, A. K. , Bhowmick, N. A. , Moses, H. L. & Arteaga, C. L. Phosphatidylinositol 3-kinase function is required for transforming growth factor beta-mediated epithelial to mesenchymal transition and cell migration. J. Biol. Chem. 275, 3680336810 (2000). 267. Ungefroren, H. , Witte, D. & Lehnert, H. The role of small GTPases of the Rho/Rac family in TGF- -induced EMT and cell motility in cancer. Dev. Dyn. Off. Publ. Am. Assoc. Anat. (2017). doi : 10. 1002/dvdy. 24505 268. Robertson, I. B. & Rifkin, D. B. Regulation of the Bioavailability of TGF- and TGF-Related Proteins. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 8, (2016). 269. Saharinen, J. , Taipale, J. & Keski-Oja, J. Association of the small latent transforming growth factor- beta with an eight cysteine repeat of its binding protein LTBP-1. EMBO J. 15, 245253 (1996). 270. Gleizes, P. E. , Beavis, R. C. , Mazzieri, R. , Shen, B. & Rifkin, D. B. Identification and characterization of an eight-cysteine repeat of the latent transforming growth factor-beta binding protein-1 that mediates bonding to the latent transforming growth factor-beta1. J. Biol. Chem. 271, 29891 29896 (1996). 271. Dubois, C. M. , Laprise, M. H. , Blanchette, F. , Gentry, L. E. & Leduc, R. Processing of transforming growth factor beta 1 precursor by human furin convertase. J. Biol. Chem. 270, 1061810624 (1995). 272. Fontana, L. et al. Fibronectin is required for integrin alphavbeta6-mediated activation of latent TGF-beta complexes containing LTBP-1. FASEB J. Off. Publ. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 19, 17981808 (2005). 273. Dallas, S. L. et al. Fibronectin regulates latent transforming growth factor-beta (TGF beta) by controlling matrix assembly of latent TGF beta-binding protein-1. J. Biol. Chem. 280, 18871 18880 (2005). 274. Isogai, Z. et al. Latent transforming growth factor beta-binding protein 1 interacts with fibrillin and is a microfibril-associated protein. J. Biol. Chem. 278, 27502757 (2003). 275. Neptune, E. R. et al. Dysregulation of TGF-beta activation contributes to pathogenesis in Marfan syndrome. Nat. Genet. 33, 407411 (2003). 276. Munger, J. S. et al. The integrin alpha v beta 6 binds and activates latent TGF beta 1 : a mechanism for regulating pulmonary inflammation and fibrosis. Cell 96, 319328 (1999). 277. Mu, D. et al. The integrin alpha(v)beta8 mediates epithelial homeostasis through MT1-MMP- dependent activation of TGF-beta1. J. Cell Biol. 157, 493507 (2002). 278. Yang, Z. et al. Absence of integrin-mediated TGFbeta1 activation in vivo recapitulates the phenotype of TGFbeta1-null mice. J. Cell Biol. 176, 787793 (2007). 279. Henderson, N. C. et al. Targeting of v integrin identifies a core molecular pathway that regulates fibrosis in several organs. Nat. Med. 19, 16171624 (2013). 280. Travis, M. A. et al. Loss of integrin alpha(v)beta8 on dendritic cells causes autoimmunity and colitis in mice. Nature 449, 361365 (2007). 281. Worthington, J. J. et al. Integrin v8-Mediated TGF- Activation by Effector Regulatory T Cells Is Essential for Suppression of T-Cell-Mediated Inflammation. Immunity 42, 903915 (2015). 282. Abe, M. , Oda, N. & Sato, Y. Cell-associated activation of latent transforming growth factor-beta by calpain. J. Cell. Physiol. 174, 186193 (1998). 283. Jenkins, G. The role of proteases in transforming growth factor-beta activation. Int. J. Biochem. Cell Biol. 40, 10681078 (2008). 284. Brown, P. D. , Wakefield, L. M. , Levinson, A. D. & Sporn, M. B. Physicochemical activation of recombinant latent transforming growth factor-beta's 1, 2, and 3. Growth Factors Chur Switz. 3, 3543 (1990). 285. Ehrhart, E. J. , Segarini, P. , Tsang, M. L. , Carroll, A. G. & Barcellos-Hoff, M. H. Latent transforming growth factor beta1 activation in situ : quantitative and functional evidence after low-dose gamma-irradiation. FASEB J. Off. Publ. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 11, 9911002 (1997). 286. Barcellos-Hoff, M. H. , Derynck, R. , Tsang, M. L. & Weatherbee, J. A. Transforming growth factor- beta activation in irradiated murine mammary gland. J. Clin. Invest. 93, 892899 (1994). 287. Barcellos-Hoff, M. H. & Dix, T. A. Redox-mediated activation of latent transforming growth factor- beta 1. Mol. Endocrinol. Baltim. Md 10, 10771083 (1996). 288. Ahamed, J. et al. In vitro and in vivo evidence for shear-induced activation of latent transforming growth factor-beta1. Blood 112, 36503660 (2008). 289. Amarnath, S. , Dong, L. , Li, J. , Wu, Y. & Chen, W. Endogenous TGF-beta activation by reactive oxygen species is key to Foxp3 induction in TCR-stimulated and HIV-1-infected human CD4 CD25- T cells. Retrovirology 4, 57 (2007). 290. Wang, H. & Kochevar, I. E. Involvement of UVB-induced reactive oxygen species in TGF-beta biosynthesis and activation in keratinocytes. Free Radic. Biol. Med. 38, 890897 (2005). 291. Oreffo, R. O. , Mundy, G. R. , Seyedin, S. M. & Bonewald, L. F. Activation of the bone-derived latent TGF beta complex by isolated osteoclasts. Biochem. Biophys. Res. Commun. 158, 817823 (1989). 292. Jullien, P. , Berg, T. M. & Lawrence, D. A. Acidic cellular environments : activation of latent TGF- beta and sensitization of cellular responses to TGF-beta and EGF. Int. J. Cancer 43, 886891 (1989). 293. Ding, A. et al. Macrophage deactivating factor and transforming growth factors-beta 1 -beta 2 and -beta 3 inhibit induction of macrophage nitrogen oxide synthesis by IFN-gamma. J. Immunol. Baltim. Md 1950 145, 940944 (1990). 294. Haregewoin, A. , Alexander, E. , Black, P. M. & Loeffler, J. S. Autocrine regulation of the production of the gaseous messenger nitric oxide in a glioblastoma cell line. Exp. Cell Res. 210, 137139 (1994). 295. Roland, C. R. , Goss, J. A. , Mangino, M. J. , Hafenrichter, D. & Flye, M. W. Autoregulation by eicosanoids of human Kupffer cell secretory products. A study of interleukin-1, interleukin-6, tumor necrosis factor-alpha, transforming growth factor-beta, and nitric oxide. Ann. Surg. 219, 389399 (1994). 296. Vodovotz, Y. et al. Control of nitric oxide production by endogenous TGF-beta1 and systemic nitric oxide in retinal pigment epithelial cells and peritoneal macrophages. J. Leukoc. Biol. 60, 261270 (1996). 297. Blanco, F. J. , Geng, Y. & Lotz, M. Differentiation-dependent effects of IL-1 and TGF-beta on human articular chondrocyte proliferation are related to inducible nitric oxide synthase expression. J. Immunol. Baltim. Md 1950 154, 40184026 (1995). 298. Nussler, A. K. et al. Further characterization and comparison of inducible nitric oxide synthase in mouse, rat, and human hepatocytes. Hepatol. Baltim. Md 21, 15521560 (1995). 299. Oswald, I. P. , Gazzinelli, R. T. , Sher, A. & James, S. L. IL-10 synergizes with IL-4 and transforming growth factor-beta to inhibit macrophage cytotoxic activity. J. Immunol. Baltim. Md 1950 148, 35783582 (1992). 300. Junquero, D. C. , Scott-Burden, T. , Schini, V. B. & Vanhoutte, P. M. Inhibition of cytokine-induced nitric oxide production by transforming growth factor-beta 1 in human smooth muscle cells. J. Physiol. 454, 451465 (1992). 301. Vodovotz, Y. , Bogdan, C. , Paik, J. , Xie, Q. W. & Nathan, C. Mechanisms of suppression of macrophage nitric oxide release by transforming growth factor beta. J. Exp. Med. 178, 605613 (1993). 302. Schoedon, G. , Schneemann, M. , Blau, N. , Edgell, C. J. & Schaffner, A. Modulation of human endothelial cell tetrahydrobiopterin synthesis by activating and deactivating cytokines : new perspectives on endothelium-derived relaxing factor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 196, 13431348 (1993). 303. Arany, I. , Brysk, M. M. , Brysk, H. & Tyring, S. K. Regulation of inducible nitric oxide synthase mRNA levels by differentiation and cytokines in human keratinocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 220, 618622 (1996). 304. Chesrown, S. E. , Monnier, J. , Visner, G. & Nick, H. S. Regulation of inducible nitric oxide synthase mRNA levels by LPS, INF-gamma, TGF-beta, and IL-10 in murine macrophage cell lines and rat peritoneal macrophages. Biochem. Biophys. Res. Commun. 200, 126134 (1994). 305. Perrella, M. A. et al. Suppression of Interleukin-1-induced Nitric-oxide Synthase Promoter/Enhancer Activity by Transforming Growth Factor-1 in Vascular Smooth Muscle Cells EVIDENCE FOR MECHANISMS OTHER THAN NF-B. J. Biol. Chem. 271, 1377613780 (1996). 306. Pinsky, D. J. et al. The lethal effects of cytokine-induced nitric oxide on cardiac myocytes are blocked by nitric oxide synthase antagonism or transforming growth factor beta. J. Clin. Invest. 95, 677685 (1995). 307. Hausmann, E. H. , Hao, S. Y. , Pace, J. L. & Parmely, M. J. Transforming growth factor beta 1 and lipopolysaccharide-activated mouse interferon provide opposing signals gamma macrophages. Infect. Immun. 62, 36253632 (1994). to 308. Stenger, S. , Thring, H. , Rllinghoff, M. & Bogdan, C. Tissue expression of inducible nitric oxide synthase is closely associated with resistance to Leishmania major. J. Exp. Med. 180, 783793 (1994). 309. Shull, M. M. et al. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-beta 1 gene results in multifocal inflammatory disease. Nature 359, 693699 (1992). 310. Kulkarni, A. B. et al. Transforming growth factor beta 1 null mutation in mice causes excessive inflammatory response and early death. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 770774 (1993). 311. Vodovotz, Y. et al. Spontaneously increased production of nitric oxide and aberrant expression of the inducible nitric oxide synthase in vivo in the transforming growth factor beta 1 null mouse. J. Exp. Med. 183, 23372342 (1996). 312. Perrella, M. A. et al. Arrest of endotoxin-induced hypotension by transforming growth factor beta1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 20542059 (1996). 313. Barral, A. et al. Transforming growth factor-beta in human cutaneous leishmaniasis. Am. J. Pathol. 147, 947954 (1995). 314. de Belder, A. et al. Megakaryocytes from patients with coronary atherosclerosis express the inducible nitric oxide synthase. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 15, 637641 (1995). 315. Grainger, D. J. et al. The serum concentration of active transforming growth factor-beta is severely depressed in advanced atherosclerosis. Nat. Med. 1, 7479 (1995). 316. Rachmilewitz, D. et al. Enhanced colonic nitric oxide generation and nitric oxide synthase activity in ulcerative colitis and Crohn's disease. Gut 36, 718723 (1995). 317. Babyatsky, M. W. , Rossiter, G. & Podolsky, D. K. Expression of transforming growth factors alpha and beta in colonic mucosa in inflammatory bowel disease. Gastroenterology 110, 975984 (1996). 318. Ohtani, H. , Kagaya, H. & Nagura, H. Immunohistochemical localization of transforming growth factor-beta receptors I and II in inflammatory bowel disease. J. Gastroenterol. 30 Suppl 8, 7677 (1995). 319. Mokhtarian, F. et al. Defective production of anti-inflammatory cytokine, TGF-beta by T cell lines of patients with active multiple sclerosis. J. Immunol. Baltim. Md 1950 152, 60036010 (1994). 320. B, L. et al. Induction of nitric oxide synthase in demyelinating regions of multiple sclerosis brains. Ann. Neurol. 36, 778786 (1994). 321. Dorheim, M. A. , Tracey, W. R. , Pollock, J. S. & Grammas, P. Nitric oxide synthase activity is elevated in brain microvessels in Alzheimer's disease. Biochem. Biophys. Res. Commun. 205, 659 665 (1994). 322. Vodovotz, Y. et al. Inducible nitric oxide synthase in tangle-bearing neurons of patients with Alzheimer's disease. J. Exp. Med. 184, 14251433 (1996). 323. Flanders, K. C. , Lippa, C. F. , Smith, T. W. , Pollen, D. A. & Sporn, M. B. Altered expression of transforming growth factor-beta in Alzheimer's disease. Neurology 45, 15611569 (1995). 324. Boutard, V. et al. Transforming growth factor-beta stimulates arginase activity in macrophages. Implications for the regulation of macrophage cytotoxicity. J. Immunol. Baltim. Md 1950 155, 20772084 (1995). 325. Arsura, M. , Wu, M. & Sonenshein, G. E. TGF beta 1 inhibits NF-kappa B/Rel activity inducing apoptosis of B cells : transcriptional activation of I kappa B alpha. Immunity 5, 3140 (1996). 326. Takaki, H. et al. TGF-beta1 suppresses IFN-gamma-induced NO production in macrophages by suppressing STAT1 activation and accelerating iNOS protein degradation. Genes Cells Devoted Mol. Cell. Mech. 11, 871882 (2006). 327. Mitani, T. , Terashima, M. , Yoshimura, H. , Nariai, Y. & Tanigawa, Y. TGF-beta1 enhances degradation of IFN-gamma-induced iNOS protein via proteasomes in RAW 264. 7 cells. Nitric Oxide Biol. Chem. 13, 7887 (2005). 328. Sugiyama, Y. et al. Smad2 and Smad3 are redundantly essential for the suppression of iNOS synthesis in macrophages by regulating IRF3 and STAT1 pathways. Int. Immunol. 24, 253265 (2012). 329. Berg, D. T. et al. Negative regulation of inducible nitric-oxide synthase expression mediated through transforming growth factor-beta-dependent modulation of transcription factor TCF11. J. Biol. Chem. 282, 3683736844 (2007). 330. Lane, D. P. & Crawford, L. V. T antigen is bound to a host protein in SV40-transformed cells. Nature 278, 261263 (1979). 331. Linzer, D. I. & Levine, A. J. Characterization of a 54K dalton cellular SV40 tumor antigen present in SV40-transformed cells and uninfected embryonal carcinoma cells. Cell 17, 4352 (1979). 332. DeLeo, A. B. et al. Detection of a transformation-related antigen in chemically induced sarcomas and other transformed cells of the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 76, 24202424 (1979). 333. Scheffner, M. , Werness, B. A. , Huibregtse, J. M. , Levine, A. J. & Howley, P. M. The E6 oncoprotein encoded by human papillomavirus types 16 and 18 promotes the degradation of p53. Cell 63, 11291136 (1990). 334. Werness, B. A. , Levine, A. J. & Howley, P. M. Association of human papillomavirus types 16 and 18 E6 proteins with p53. Science 248, 7679 (1990). 335. Eliyahu, D. , Raz, A. , Gruss, P. , Givol, D. & Oren, M. Participation of p53 cellular tumour antigen in transformation of normal embryonic cells. Nature 312, 646649 (1984). 336. Parada, L. F. , Land, H. , Weinberg, R. A. , Wolf, D. & Rotter, V. Cooperation between gene encoding p53 tumour antigen and ras in cellular transformation. Nature 312, 649651 (1984). 337. Malkin, D. et al. Germ line p53 mutations in a familial syndrome of breast cancer, sarcomas, and other neoplasms. Science 250, 12331238 (1990). 338. Donehower, L. A. et al. Mice deficient for p53 are developmentally normal but susceptible to spontaneous tumours. Nature 356, 215221 (1992). 339. Olivier, M. , Hollstein, M. & Hainaut, P. TP53 mutations in human cancers : origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, a001008 (2010). 340. Bártek, J. et al. Aberrant expression of the p53 oncoprotein is a common feature of a wide spectrum of human malignancies. Oncogene 6, 16991703 (1991). 341. Pflaum, J. , Schlosser, S. & Mller, M. p53 Family and Cellular Stress Responses in Cancer. Front. Oncol. 4, 285 (2014). 342. Lane, D. P. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature 358, 1516 (1992). 343. Lane, D. & Levine, A. p53 Research : the past thirty years and the next thirty years. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, a000893 (2010). 344. Hollstein, M. , Sidransky, D. , Vogelstein, B. & Harris, C. C. p53 mutations in human cancers. Science 253, 4953 (1991). 345. Kandoth, C. et al. Mutational landscape and significance across 12 major cancer types. Nature 502, 333339 (2013). 346. Kaghad, M. et al. Monoallelically expressed gene related to p53 at 1p36, a region frequently deleted in neuroblastoma and other human cancers. Cell 90, 809819 (1997). 347. Yang, A. et al. p63, a p53 homolog at 3q27-29, encodes multiple products with transactivating, death-inducing, and dominant-negative activities. Mol. Cell 2, 305316 (1998). 348. Nedelcu, A. M. & Tan, C. Early diversification and complex evolutionary history of the p53 tumor suppressor gene family. Dev. Genes Evol. 217, 801806 (2007). 349. Pankow, S. & Bamberger, C. The p53 tumor suppressor-like protein nvp63 mediates selective germ cell death in the sea anemone Nematostella vectensis. PloS One 2, e782 (2007). 350. Belyi, V. A. et al. The origins and evolution of the p53 family of genes. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, a001198 (2010). 351. Mills, A. A. et al. p63 is a p53 homologue required for limb and epidermal morphogenesis. Nature 398, 708713 (1999). 352. Yang, A. et al. p63 is essential for regenerative proliferation in limb, craniofacial and epithelial development. Nature 398, 714718 (1999). 353. Yang, A. et al. p73-deficient mice have neurological, pheromonal and inflammatory defects but lack spontaneous tumours. Nature 404, 99103 (2000). 354. Khoury, M. P. & Bourdon, J. -C. p53 Isoforms : An Intracellular Microprocessor ? Genes Cancer 2, 453465 (2011). 355. Sayan, A. E. et al. Generation of DeltaTAp73 proteins by translation from a putative internal ribosome entry site. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1095, 315324 (2007). 356. Mller, M. et al. One, two, three-p53, p63, p73 and chemosensitivity. Drug Resist. Updat. Rev. Comment. Antimicrob. Anticancer Chemother. 9, 288306 (2006). 357. Murray-Zmijewski, F. , Lane, D. P. & Bourdon, J. -C. p53/p63/p73 isoforms : an orchestra of isoforms to harmonise cell differentiation and response to stress. Cell Death Differ. 13, 962972 (2006). 358. Ethayathulla, A. S. , Nguyen, H. T. & Viadiu, H. Crystal structures of the DNA-binding domain tetramer of the p53 tumor suppressor family member p73 bound to different full-site response elements. J. Biol. Chem. 288, 47444754 (2013). 359. Ethayathulla, A. S. et al. Structure of p73 DNA-binding domain tetramer modulates p73 transactivation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 60666071 (2012). 360. Coutandin, D. et al. Conformational stability and activity of p73 require a second helix in the tetramerization domain. Cell Death Differ. 16, 15821589 (2009). 361. Di Como, C. J. , Gaiddon, C. & Prives, C. p73 function is inhibited by tumor-derived p53 mutants in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 19, 14381449 (1999). 362. Brachmann, R. K. , Vidal, M. & Boeke, J. D. Dominant-negative p53 mutations selected in yeast hit cancer hot spots. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 40914095 (1996). 363. Inga, A. et al. Simple identification of dominant p53 mutants by a yeast functional assay. Carcinogenesis 18, 20192021 (1997). 364. Monti, P. et al. Tumour p53 mutations exhibit promoter selective dominance over wild type p53. Oncogene 21, 16411648 (2002). 365. Xu, J. et al. Gain of function of mutant p53 by coaggregation with multiple tumor suppressors. Nat. Chem. Biol. 7, 285295 (2011). 366. Chan, W. M. , Siu, W. Y. , Lau, A. & Poon, R. Y. C. How many mutant p53 molecules are needed to inactivate a tetramer ? Mol. Cell. Biol. 24, 35363551 (2004). 367. Silva, J. L. , De Moura Gallo, C. V. , Costa, D. C. F. & Rangel, L. P. Prion-like aggregation of mutant p53 in cancer. Trends Biochem. Sci. 39, 260267 (2014). 368. Grob, T. J. et al. Human delta Np73 regulates a dominant negative feedback loop for TAp73 and p53. Cell Death Differ. 8, 12131223 (2001). 369. Stiewe, T. , Theseling, C. C. & Ptzer, B. M. Transactivation-deficient Delta TA-p73 inhibits p53 by direct competition for DNA binding : implications for tumorigenesis. J. Biol. Chem. 277, 14177 14185 (2002). 370. Billant, O. et al. The dominant-negative interplay between p53, p63 and p73 : A family affair. Oncotarget 7, 6954969564 (2016). 371. Monti, P. et al. N-P63 and TA-P63 exhibit intrinsic differences in transactivation specificities that depend on distinct features of DNA target sites. Oncotarget 5, 21162130 (2014). 372. Liu, G. , Nozell, S. , Xiao, H. & Chen, X. DeltaNp73beta is active in transactivation and growth suppression. Mol. Cell. Biol. 24, 487501 (2004). 373. Dohn, M. , Zhang, S. & Chen, X. p63alpha and DeltaNp63alpha can induce cell cycle arrest and apoptosis and differentially regulate p53 target genes. Oncogene 20, 31933205 (2001). 374. Tanaka, Y. , Kameoka, M. , Itaya, A. , Ota, K. & Yoshihara, K. Regulation of HSF1-responsive gene expression by N-terminal truncated form of p73alpha. Biochem. Biophys. Res. Commun. 317, 865872 (2004). 375. Tanaka, Y. , Ota, K. , Kameoka, M. , Itaya, A. & Yoshihara, K. Up-regulation of NFkappaB-responsive gene expression by DeltaNp73alpha in p53 null cells. Exp. Cell Res. 312, 12541264 (2006). 376. Nikulenkov, F. et al. Insights into p53 transcriptional function via genome-wide chromatin occupancy and gene expression analysis. Cell Death Differ. 19, 19922002 (2012). 377. Chang, G. S. et al. A comprehensive and high-resolution genome-wide response of p53 to stress. Cell Rep. 8, 514527 (2014). 378. el-Deiry, W. S. , Kern, S. E. , Pietenpol, J. A. , Kinzler, K. W. & Vogelstein, B. Definition of a consensus binding site for p53. Nat. Genet. 1, 4549 (1992). 379. Funk, W. D. , Pak, D. T. , Karas, R. H. , Wright, W. E. & Shay, J. W. A transcriptionally active DNA- binding site for human p53 protein complexes. Mol. Cell. Biol. 12, 28662871 (1992). 380. Hearnes, J. M. et al. Chromatin immunoprecipitation-based screen to identify functional genomic binding sites for sequence-specific transactivators. Mol. Cell. Biol. 25, 1014810158 (2005). 381. Wei, C. -L. et al. A global map of p53 transcription-factor binding sites in the human genome. Cell 124, 207219 (2006). 382. Kaneshiro, K. , Tsutsumi, S. , Tsuji, S. , Shirahige, K. & Aburatani, H. An integrated map of p53- binding sites and histone modification in the human ENCODE regions. Genomics 89, 178188 (2007). 383. Menendez, D. et al. Diverse stresses dramatically alter genome-wide p53 binding and transactivation landscape in human cancer cells. Nucleic Acids Res. 41, 72867301 (2013). 384. Ramos, A. , Tse, P. -W. , Wang, J. , Ethayathulla, A. S. & Viadiu, H. Sequence Variation in the Response Element Determines Binding by the Transcription Factor p73. Biochemistry (Mosc. ) 54, 69616972 (2015). 385. Avantaggiati, M. L. et al. Recruitment of p300/CBP in p53-dependent signal pathways. Cell 89, 11751184 (1997). 386. Gu, W. & Roeder, R. G. Activation of p53 sequence-specific DNA binding by acetylation of the p53 C-terminal domain. Cell 90, 595606 (1997). 387. Inga, A. , Storici, F. , Darden, T. A. & Resnick, M. A. Differential transactivation by the p53 transcription factor is highly dependent on p53 level and promoter target sequence. Mol. Cell. Biol. 22, 86128625 (2002). 388. Weinberg, R. L. , Veprintsev, D. B. , Bycroft, M. & Fersht, A. R. Comparative binding of p53 to its promoter and DNA recognition elements. J. Mol. Biol. 348, 589596 (2005). 389. Samuels-Lev, Y. et al. ASPP proteins specifically stimulate the apoptotic function of p53. Mol. Cell 8, 781794 (2001). 390. Harms, K. , Nozell, S. & Chen, X. The common and distinct target genes of the p53 family transcription factors. Cell. Mol. Life Sci. CMLS 61, 822842 (2004). 391. Guo, X. et al. TAp63 induces senescence and suppresses tumorigenesis in vivo. Nat. Cell Biol. 11, 14511457 (2009). 392. Tomasini, R. et al. TAp73 knockout shows genomic instability with infertility and tumor suppressor functions. Genes Dev. 22, 26772691 (2008). 393. Costanzo, A. et al. TP63 and TP73 in cancer, an unresolved family' puzzle of complexity, redundancy and hierarchy. FEBS Lett. 588, 25902599 (2014). 394. Fontemaggi, G. et al. Identification of direct p73 target genes combining DNA microarray and chromatin immunoprecipitation analyses. J. Biol. Chem. 277, 4335943368 (2002). 395. Petrenko, O. , Zaika, A. & Moll, U. M. deltaNp73 facilitates cell immortalization and cooperates with oncogenic Ras in cellular transformation in vivo. Mol. Cell. Biol. 23, 55405555 (2003). 396. Flores, E. R. et al. Tumor predisposition in mice mutant for p63 and p73 : evidence for broader tumor suppressor functions for the p53 family. Cancer Cell 7, 363373 (2005). 397. Tomasini, R. et al. TAp73 regulates the spindle assembly checkpoint by modulating BubR1 activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 797802 (2009). 398. Fulco, M. et al. p73 is regulated by phosphorylation at the G2/M transition. J. Biol. Chem. 278, 4919649202 (2003). 399. Talos, F. , Nemajerova, A. , Flores, E. R. , Petrenko, O. & Moll, U. M. p73 suppresses polyploidy and aneuploidy in the absence of functional p53. Mol. Cell 27, 647659 (2007). 400. Inoue, S. et al. TAp73 is required for spermatogenesis and the maintenance of male fertility. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18431848 (2014). 401. Holembowski, L. et al. TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis. J. Cell Biol. 204, 11731190 (2014). 402. Melino, G. et al. p73 Induces apoptosis via PUMA transactivation and Bax mitochondrial translocation. J. Biol. Chem. 279, 80768083 (2004). 403. Buhlmann, S. & Ptzer, B. M. DNp73 a matter of cancer : mechanisms and clinical implications. Biochim. Biophys. Acta 1785, 207216 (2008). 404. Ishimoto, O. et al. Possible oncogenic potential of DeltaNp73 : a newly identified isoform of human p73. Cancer Res. 62, 636641 (2002). 405. Stiewe, T. , Zimmermann, S. , Frilling, A. , Esche, H. & Ptzer, B. M. Transactivation-deficient DeltaTA-p73 acts as an oncogene. Cancer Res. 62, 35983602 (2002). 406. Wilhelm, M. T. et al. Isoform-specific p73 knockout mice reveal a novel role for delta Np73 in the DNA damage response pathway. Genes Dev. 24, 549560 (2010). 407. Tannapfel, A. et al. Autonomous growth and hepatocarcinogenesis in transgenic mice expressing the p53 family inhibitor DNp73. Carcinogenesis 29, 211218 (2008). 408. Rocco, J. W. , Leong, C. -O. , Kuperwasser, N. , DeYoung, M. P. & Ellisen, L. W. p63 mediates survival in squamous cell carcinoma by suppression of p73-dependent apoptosis. Cancer Cell 9, 4556 (2006). 409. Zaika, A. I. et al. DeltaNp73, a dominant-negative inhibitor of wild-type p53 and TAp73, is up- regulated in human tumors. J. Exp. Med. 196, 765780 (2002). 410. Stiewe, T. et al. Inactivation of retinoblastoma (RB) tumor suppressor by oncogenic isoforms of the p53 family member p73. J. Biol. Chem. 278, 1423014236 (2003). 411. Yoshikawa, H. et al. Mutational analysis of p73 and p53 in human cancer cell lines. Oncogene 18, 34153421 (1999). 412. Nomoto, S. et al. Search for mutations and examination of allelic expression imbalance of the p73 gene at 1p36. 33 in human lung cancers. Cancer Res. 58, 13801383 (1998). 413. Becker, K. et al. Patterns of p73 N-terminal isoform expression and p53 status have prognostic value in gynecological cancers. Int. J. Oncol. 29, 889902 (2006). 414. Concin, N. et al. Transdominant DeltaTAp73 isoforms are frequently up-regulated in ovarian cancer. Evidence for their role as epigenetic p53 inhibitors in vivo. Cancer Res. 64, 24492460 (2004). 415. Guan, M. & Chen, Y. Aberrant expression of DeltaNp73 in benign and malignant tumours of the prostate : correlation with Gleason score. J. Clin. Pathol. 58, 11751179 (2005). 416. Tuve, S. , Wagner, S. N. , Schittek, B. & Ptzer, B. M. Alterations of DeltaTA-p 73 splice transcripts during melanoma development and progression. Int. J. Cancer 108, 162166 (2004). 417. Casciano, I. et al. Expression of DeltaNp73 is a molecular marker for adverse outcome in neuroblastoma patients. Cell Death Differ. 9, 246251 (2002). 418. Mller, M. et al. TAp73/Delta Np73 influences apoptotic response, chemosensitivity and prognosis in hepatocellular carcinoma. Cell Death Differ. 12, 15641577 (2005). 419. Puig, P. et al. p73 Expression in human normal and tumor tissues : loss of p73alpha expression is associated with tumor progression in bladder cancer. Clin. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc. Cancer Res. 9, 56425651 (2003). 420. Crook, T. , Nicholls, J. M. , Brooks, L. , O'Nions, J. & Allday, M. J. High level expression of deltaN- p63 : a mechanism for the inactivation of p53 in undifferentiated nasopharyngeal carcinoma (NPC) ? Oncogene 19, 34393444 (2000). 421. Berkers, C. R. , Maddocks, O. D. K. , Cheung, E. C. , Mor, I. & Vousden, K. H. Metabolic regulation by p53 family members. Cell Metab. 18, 617633 (2013). 422. Cantor, J. R. & Sabatini, D. M. Cancer cell metabolism : one hallmark, many faces. Cancer Discov. 2, 881898 (2012). 423. Du, W. et al. TAp73 enhances the pentose phosphate pathway and supports cell proliferation. Nat. Cell Biol. 15, 9911000 (2013). 424. Haupt, Y. , Maya, R. , Kazaz, A. & Oren, M. Mdm2 promotes the rapid degradation of p53. Nature 387, 296299 (1997). 425. Momand, J. , Zambetti, G. P. , Olson, D. C. , George, D. & Levine, A. J. The mdm-2 oncogene product forms a complex with the p53 protein and inhibits p53-mediated transactivation. Cell 69, 1237 1245 (1992). 426. Conforti, F. , Sayan, A. E. , Sreekumar, R. & Sayan, B. S. Regulation of p73 activity by post- translational modifications. Cell Death Dis. 3, e285 (2012). 427. Urist, M. , Tanaka, T. , Poyurovsky, M. V. & Prives, C. p73 induction after DNA damage is regulated by checkpoint kinases Chk1 and Chk2. Genes Dev. 18, 30413054 (2004). 428. Pediconi, N. et al. Differential regulation of E2F1 apoptotic target genes in response to DNA damage. Nat. Cell Biol. 5, 552558 (2003). 429. Ozaki, T. , Okoshi, R. , Sang, M. , Kubo, N. & Nakagawara, A. Acetylation status of E2F-1 has an important role in the regulation of E2F-1-mediated transactivation of tumor suppressor p73. Biochem. Biophys. Res. Commun. 386, 207211 (2009). 430. Jones, E. V. , Dickman, M. J. & Whitmarsh, A. J. Regulation of p73-mediated apoptosis by c-Jun N- terminal kinase. Biochem. J. 405, 617623 (2007). 431. Gong, J. G. et al. The tyrosine kinase c-Abl regulates p73 in apoptotic response to cisplatin- induced DNA damage. Nature 399, 806809 (1999). 432. Yuan, Z. M. et al. p73 is regulated by tyrosine kinase c-Abl in the apoptotic response to DNA damage. Nature 399, 814817 (1999). 433. Agami, R. , Blandino, G. , Oren, M. & Shaul, Y. Interaction of c-Abl and p73alpha and their collaboration to induce apoptosis. Nature 399, 809813 (1999). 434. Wang, X. et al. A positive role for c-Abl in Atm and Atr activation in DNA damage response. Cell Death Differ. 18, 515 (2011). 435. Sanchez-Prieto, R. , Sanchez-Arevalo, V. J. , Servitja, J. -M. & Gutkind, J. S. Regulation of p73 by c- Abl through the p38 MAP kinase pathway. Oncogene 21, 974979 (2002). 436. Costanzo, A. et al. DNA damage-dependent acetylation of p73 dictates the selective activation of apoptotic target genes. Mol. Cell 9, 175186 (2002). 437. Gaiddon, C. et al. Cyclin-dependent kinases phosphorylate p73 at threonine 86 in a cell cycle- dependent manner and negatively regulate p73. J. Biol. Chem. 278, 2742127431 (2003). 438. Nyman, U. et al. Protein kinase C-dependent phosphorylation regulates the cell cycle-inhibitory function of the p73 carboxy terminus transactivation domain. Mol. Cell. Biol. 29, 18141825 (2009). 439. Ren, J. et al. p73beta is regulated by protein kinase Cdelta catalytic fragment generated in the apoptotic response to DNA damage. J. Biol. Chem. 277, 3375833765 (2002). 440. Ongkeko, W. M. et al. MDM2 and MDMX bind and stabilize the p53-related protein p73. Curr. Biol. CB 9, 829832 (1999). 441. Dobbelstein, M. , Wienzek, S. , Knig, C. & Roth, J. Inactivation of the p53-homologue p73 by the mdm2-oncoprotein. Oncogene 18, 21012106 (1999). 442. Bálint, E. , Bates, S. & Vousden, K. H. Mdm2 binds p73 alpha without targeting degradation. Oncogene 18, 39233929 (1999). 443. Zeng, X. et al. MDM2 suppresses p73 function without promoting p73 degradation. Mol. Cell. Biol. 19, 32573266 (1999). 444. Watson, I. R. , Blanch, A. , Lin, D. C. C. , Ohh, M. & Irwin, M. S. Mdm2-mediated NEDD8 modification of TAp73 regulates its transactivation function. J. Biol. Chem. 281, 3409634103 (2006). 445. Rossi, M. et al. The ubiquitin-protein ligase Itch regulates p73 stability. EMBO J. 24, 836848 (2005). 446. Levy, D. , Adamovich, Y. , Reuven, N. & Shaul, Y. The Yes-associated protein 1 stabilizes p73 by preventing Itch-mediated ubiquitination of p73. Cell Death Differ. 14, 743751 (2007). 447. Wu, H. & Leng, R. P. MDM2 mediates p73 ubiquitination : a new molecular mechanism for suppression of p73 function. Oncotarget 6, 2147921492 (2015). 448. Asher, G. , Lotem, J. , Sachs, L. , Kahana, C. & Shaul, Y. Mdm-2 and ubiquitin-independent p53 proteasomal degradation regulated by NQO1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 1312513130 (2002). 449. Watanabe, K. et al. Physical interaction of p73 with c-Myc and MM1, a c-Myc-binding protein, and modulation of the p73 function. J. Biol. Chem. 277, 1511315123 (2002). 450. Strano, S. et al. Physical interaction with Yes-associated protein enhances p73 transcriptional activity. J. Biol. Chem. 276, 1516415173 (2001). 451. Basu, S. , Totty, N. F. , Irwin, M. S. , Sudol, M. & Downward, J. Akt phosphorylates the Yes- associated protein, YAP, to induce interaction with 14-3-3 and attenuation of p73-mediated apoptosis. Mol. Cell 11, 1123 (2003). 452. Irwin, M. et al. Role for the p53 homologue p73 in E2F-1-induced apoptosis. Nature 407, 645 648 (2000). 453. Seelan, R. S. et al. The human p73 promoter : characterization and identification of functional E2F binding sites. Neoplasia N. Y. N 4, 195203 (2002). 454. Fontemaggi, G. et al. The transcriptional repressor ZEB regulates p73 expression at the crossroad between proliferation and differentiation. Mol. Cell. Biol. 21, 84618470 (2001). 455. Wu, S. , Murai, S. , Kataoka, K. & Miyagishi, M. Yin Yang 1 induces transcriptional activity of p73 through cooperation with E2F1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 365, 7581 (2008). 456. Vossio, S. et al. DN-p73 is activated after DNA damage in a p53-dependent manner to regulate p53-induced cell cycle arrest. Oncogene 21, 37963803 (2002). 457. Kartasheva, N. N. , Contente, A. , Lenz-Stppler, C. , Roth, J. & Dobbelstein, M. p53 induces the expression of its antagonist p73 Delta N, establishing an autoregulatory feedback loop. Oncogene 21, 47154727 (2002). 458. Nakagawa, T. et al. Autoinhibitory Regulation of p73 by Np73 To Modulate Cell Survival and Death through a p73-Specific Target Element within the Np73 Promoter. Mol. Cell. Biol. 22, 25752585 (2002). 459. Nakagawa, T. et al. Autoinhibitory regulation of p73 by Delta Np73 to modulate cell survival and death through a p73-specific target element within the Delta Np73 promoter. Mol. Cell. Biol. 22, 25752585 (2002). 460. Kartasheva, N. N. , Contente, A. , Lenz-Stppler, C. , Roth, J. & Dobbelstein, M. p53 induces the expression of its antagonist p73 Delta N, establishing an autoregulatory feedback loop. Oncogene 21, 47154727 (2002). 461. Sayan, B. S. et al. Differential control of TAp73 and DeltaNp73 protein stability by the ring finger ubiquitin ligase PIR2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 1287712882 (2010). 462. Toh, W. H. , Siddique, M. M. , Boominathan, L. , Lin, K. W. & Sabapathy, K. c-Jun regulates the stability and activity of the p53 homologue, p73. J. Biol. Chem. 279, 4471344722 (2004). 463. Danovi, S. A. et al. Yes-associated protein (YAP) is a critical mediator of c-Jun-dependent apoptosis. Cell Death Differ. 15, 217219 (2008). 464. Stantic, M. et al. TAp73 suppresses tumor angiogenesis through repression of proangiogenic cytokines and HIF-1 activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 220225 (2015). 465. Fernandez-Alonso, R. et al. p73 is required for endothelial cell differentiation, migration and the formation of vascular networks regulating VEGF and TGF signaling. Cell Death Differ. 22, 1287 1299 (2015). 466. Sabapathy, K. p73 : a Positive or Negative Regulator of Angiogenesis, or Both ? Mol. Cell. Biol. 36, 848854 (2015). 467. Marin, M. C. & Marques, M. M. Novel role of p73 as a regulator of developmental angiogenesis : Implication for cancer therapy. Mol. Cell. Oncol. 3, e1019973 (2016). 468. Senoo, M. , Pinto, F. , Crum, C. P. & McKeon, F. p63 Is essential for the proliferative potential of stem cells in stratified epithelia. Cell 129, 523536 (2007). 469. Keyes, W. M. et al. p63 deficiency activates a program of cellular senescence and leads to accelerated aging. Genes Dev. 19, 19861999 (2005). 470. Su, X. et al. TAp63 prevents premature aging by promoting adult stem cell maintenance. Cell Stem Cell 5, 6475 (2009). 471. Koster, M. I. , Kim, S. , Mills, A. A. , DeMayo, F. J. & Roop, D. R. p63 is the molecular switch for initiation of an epithelial stratification program. Genes Dev. 18, 126131 (2004). 472. Medawar, A. et al. DeltaNp63 is essential for epidermal commitment of embryonic stem cells. PloS One 3, e3441 (2008). 473. Lee, H. & Kimelman, D. A dominant-negative form of p63 is required for epidermal proliferation in zebrafish. Dev. Cell 2, 607616 (2002). 474. Truong, A. B. , Kretz, M. , Ridky, T. W. , Kimmel, R. & Khavari, P. A. p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes. Genes Dev. 20, 31853197 (2006). 475. Guerrini, L. , Costanzo, A. & Merlo, G. R. A symphony of regulations centered on p63 to control development of ectoderm-derived structures. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 864904 (2011). 476. Celli, J. et al. Heterozygous germline mutations in the p53 homolog p63 are the cause of EEC syndrome. Cell 99, 143153 (1999). 477. Pozniak, C. D. et al. An anti-apoptotic role for the p53 family member, p73, during developmental neuron death. Science 289, 304306 (2000). 478. Lee, A. F. et al. Evidence that DeltaNp73 promotes neuronal survival by p53-dependent and p53- independent mechanisms. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 24, 91749184 (2004). 479. Walsh, G. S. , Orike, N. , Kaplan, D. R. & Miller, F. D. The invulnerability of adult neurons : a critical role for p73. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 24, 96389647 (2004). 480. Pozniak, C. D. et al. p73 is required for survival and maintenance of CNS neurons. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 22, 98009809 (2002). 481. Yankner, B. A. , Lu, T. & Loerch, P. The aging brain. Annu. Rev. Pathol. 3, 4166 (2008). 482. Flores, E. R. p73 is critical for the persistence of memory. Cell Death Differ. 18, 381382 (2011). 483. Fujitani, M. et al. TAp73 acts via the bHLH Hey2 to promote long-term maintenance of neural precursors. Curr. Biol. CB 20, 20582065 (2010). 484. De Laurenzi, V. et al. Induction of neuronal differentiation by p73 in a neuroblastoma cell line. J. Biol. Chem. 275, 1522615231 (2000). 485. Hooper, C. et al. TAp73 isoforms antagonize Notch signalling in SH-SY5Y neuroblastomas and in primary neurones. J. Neurochem. 99, 989999 (2006). 486. Napoli, M. & Flores, E. R. Unifying the p73 knockout phenotypes : TAp73 orchestrates multiciliogenesis. Genes Dev. 30, 12531254 (2016). 487. Fliegauf, M. , Benzing, T. & Omran, H. When cilia go bad : cilia defects and ciliopathies. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 880893 (2007). 488. Marshall, C. B. et al. p73 Is Required for Multiciliogenesis and Regulates the Foxj1-Associated Gene Network. Cell Rep. 14, 22892300 (2016). 489. Nemajerova, A. et al. TAp73 is a central transcriptional regulator of airway multiciliogenesis. Genes Dev. 30, 13001312 (2016). 490. Muoz-Fontela, C. , Mandinova, A. , Aaronson, S. A. & Lee, S. W. Emerging roles of p53 and other tumour-suppressor genes in immune regulation. Nat. Rev. Immunol. 16, 741750 (2016). 491. Takaoka, A. et al. Integration of interferon-alpha/beta signalling to p53 responses in tumour suppression and antiviral defence. Nature 424, 516523 (2003). 492. Muoz-Fontela, C. et al. Transcriptional role of p53 in interferon-mediated antiviral immunity. J. Exp. Med. 205, 19291938 (2008). 493. Rivas, C. , Aaronson, S. A. & Munoz-Fontela, C. Dual Role of p53 in Innate Antiviral Immunity. Viruses 2, 298313 (2010). 494. Taura, M. et al. p53 regulates Toll-like receptor 3 expression and function in human epithelial cell lines. Mol. Cell. Biol. 28, 65576567 (2008). 495. Mori, T. et al. Identification of the interferon regulatory factor 5 gene (IRF-5) as a direct target for p53. Oncogene 21, 29142918 (2002). 496. Yan, W. et al. Transcriptional analysis of immune-related gene expression in p53-deficient mice with increased susceptibility to influenza A virus infection. BMC Med. Genomics 8, 52 (2015). 497. O'Shea, C. C. & Fried, M. Modulation of the ARF-p53 pathway by the small DNA tumor viruses. Cell Cycle Georget. Tex 4, 449452 (2005). 498. Pampin, M. , Simonin, Y. , Blondel, B. , Percherancier, Y. & Chelbi-Alix, M. K. Cross talk between PML and p53 during poliovirus infection : implications for antiviral defense. J. Virol. 80, 8582 8592 (2006). 499. Menendez, D. , Shatz, M. & Resnick, M. A. Interactions between the tumor suppressor p53 and immune responses. Curr. Opin. Oncol. 25, 8592 (2013). 500. Gudkov, A. V. , Gurova, K. V. & Komarova, E. A. Inflammation and p53. Genes Cancer 2, 503516 (2011). 501. Komarova, E. A. et al. p53 is a suppressor of inflammatory response in mice. FASEB J. Off. Publ. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 19, 10301032 (2005). 502. Menendez, D. et al. The Toll-like receptor gene family is integrated into human DNA damage and p53 networks. PLoS Genet. 7, e1001360 (2011). 503. Shatz, M. , Menendez, D. & Resnick, M. A. The human TLR innate immune gene family is differentially influenced by DNA stress and p53 status in cancer cells. Cancer Res. 72, 39483957 (2012). 504. Shatz, M. , Shats, I. , Menendez, D. & Resnick, M. A. p53 amplifies Toll-like receptor 5 response in human primary and cancer cells through interaction with multiple signal transduction pathways. Oncotarget 6, 1696316980 (2015). 505. Mills, K. H. G. TLR-dependent T cell activation in autoimmunity. Nat. Rev. Immunol. 11, 807822 (2011). 506. Takatori, H. , Kawashima, H. , Suzuki, K. & Nakajima, H. Role of p53 in systemic autoimmune diseases. Crit. Rev. Immunol. 34, 509516 (2014). 507. Herkel, J. et al. Autoimmunity to the p53 protein is a feature of systemic lupus erythematosus (SLE) related to anti-DNA antibodies. J. Autoimmun. 17, 6369 (2001). 508. Yamanishi, Y. et al. Regulation of joint destruction and inflammation by p53 in collagen-induced arthritis. Am. J. Pathol. 160, 123130 (2002). 509. Kovacs, B. et al. Antibodies against p53 in sera from patients with systemic lupus erythematosus and other rheumatic diseases. Arthritis Rheum. 40, 980982 (1997). 510. Kuhn, H. M. et al. p53 autoantibodies in patients with autoimmune diseases : a quantitative approach. Autoimmunity 31, 229235 (1999). 511. Lowe, J. M. et al. p53 and NF-B coregulate proinflammatory gene responses in human macrophages. Cancer Res. 74, 21822192 (2014). 512. Zheng, S. -J. , Lamhamedi-Cherradi, S. -E. , Wang, P. , Xu, L. & Chen, Y. H. Tumor suppressor p53 inhibits autoimmune inflammation and macrophage function. Diabetes 54, 14231428 (2005). 513. Arandjelovic, S. & Ravichandran, K. S. Phagocytosis of apoptotic cells in homeostasis. Nat. Immunol. 16, 907917 (2015). 514. Elliott, M. R. & Ravichandran, K. S. Clearance of apoptotic cells : implications in health and disease. J. Cell Biol. 189, 10591070 (2010). 515. Medina, C. B. & Ravichandran, K. S. Do not let death do us part : find-me' signals in communication between dying cells and the phagocytes. Cell Death Differ. 23, 979989 (2016). 516. Yoon, K. W. et al. Control of signaling-mediated clearance of apoptotic cells by the tumor suppressor p53. Science 349, 1261669 (2015). 517. Jung, D. -J. et al. Foxp3 expression in p53-dependent DNA damage responses. J. Biol. Chem. 285, 79958002 (2010). 518. Le Mercier, I. , Lines, J. L. & Noelle, R. J. Beyond CTLA-4 and PD-1, the Generation Z of Negative Checkpoint Regulators. Front. Immunol. 6, 418 (2015). 519. Deng, L. et al. Irradiation and anti-PD-L1 treatment synergistically promote antitumor immunity in mice. J. Clin. Invest. 124, 687695 (2014). 520. Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat. Rev. Cancer 12, 252264 (2012). 521. Sharma, P. & Allison, J. P. Immune checkpoint targeting in cancer therapy : toward combination strategies with curative potential. Cell 161, 205214 (2015). 522. Wang, L. et al. VISTA, a novel mouse Ig superfamily ligand that negatively regulates T cell responses. J. Exp. Med. 208, 577592 (2011). 523. Cui, Y. & Guo, G. Immunomodulatory Function of the Tumor Suppressor p53 in Host Immune Response and the Tumor Microenvironment. Int. J. Mol. Sci. 17, (2016). 524. Martinez, F. O. , Sica, A. , Mantovani, A. & Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front. Biosci. J. Virtual Libr. 13, 453461 (2008). 525. Tomasini, R. et al. TAp73 is required for macrophage-mediated innate immunity and the resolution of inflammatory responses. Cell Death Differ. 20, 293301 (2013). 526. Davis, D. W. , Weidner, D. A. , Holian, A. & McConkey, D. J. Nitric oxide-dependent activation of p53 suppresses bleomycin-induced apoptosis in the lung. J. Exp. Med. 192, 857869 (2000). 527. Okada, H. & Mak, T. W. Pathways of apoptotic and non-apoptotic death in tumour cells. Nat. Rev. Cancer 4, 592603 (2004). 528. Li, C. -Q. , Trudel, L. J. & Wogan, G. N. Nitric oxide-induced genotoxicity, mitochondrial damage, and apoptosis in human lymphoblastoid cells expressing wild-type and mutant p53. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 1036410369 (2002). 529. Brne, B. Nitric oxide : NO apoptosis or turning it ON ? Cell Death Differ. 10, 864869 (2003). 530. Wang, X. , Michael, D. , de Murcia, G. & Oren, M. p53 Activation by nitric oxide involves down- regulation of Mdm2. J. Biol. Chem. 277, 1569715702 (2002). 531. Hofseth, L. J. et al. Nitric oxide-induced cellular stress and p53 activation in chronic inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 143148 (2003). 532. Schneiderhan, N. , Budde, A. , Zhang, Y. & Brne, B. Nitric oxide induces phosphorylation of p53 and impairs nuclear export. Oncogene 22, 28572868 (2003). 533. Wang, X. , Zalcenstein, A. & Oren, M. Nitric oxide promotes p53 nuclear retention and sensitizes neuroblastoma cells to apoptosis by ionizing radiation. Cell Death Differ. 10, 468476 (2003). 534. Yakovlev, V. A. , Bayden, A. S. , Graves, P. R. , Kellogg, G. E. & Mikkelsen, R. B. Nitration of the tumor suppressor protein p53 at tyrosine 327 promotes p53 oligomerization and activation. Biochemistry (Mosc. ) 49, 53315339 (2010). 535. Tebbi, A. , Guittet, O. , Cottet, M. -H. , Vesin, M. -F. & Lepoivre, M. TAp73 induction by nitric oxide : regulation by checkpoint kinase 1 (CHK1) and protection against apoptosis. J. Biol. Chem. 286, 78737884 (2011). 536. Forrester, K. et al. Nitric oxide-induced p53 accumulation and regulation of inducible nitric oxide synthase expression by wild-type p53. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 24422447 (1996). 537. Ambs, S. et al. Up-regulation of inducible nitric oxide synthase expression in cancer-prone p53 knockout mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 88238828 (1998). 538. Murphy, M. et al. Transcriptional repression by wild-type p53 utilizes histone deacetylases, mediated by interaction with mSin3a. Genes Dev. 13, 24902501 (1999). 539. Zhang, Y. et al. Repression of hsp90beta gene by p53 in UV irradiation-induced apoptosis of Jurkat cells. J. Biol. Chem. 279, 4254542551 (2004). 540. Lin, T. et al. p53 induces differentiation of mouse embryonic stem cells by suppressing Nanog expression. Nat. Cell Biol. 7, 165171 (2005). 541. Ho, J. S. L. , Ma, W. , Mao, D. Y. L. & Benchimol, S. p53-Dependent transcriptional repression of c- myc is required for G1 cell cycle arrest. Mol. Cell. Biol. 25, 74237431 (2005). 542. Wu, W. -S. et al. Slug antagonizes p53-mediated apoptosis of hematopoietic progenitors by repressing puma. Cell 123, 641653 (2005). 543. Lee, K. C. , Crowe, A. J. & Barton, M. C. p53-mediated repression of alpha-fetoprotein gene expression by specific DNA binding. Mol. Cell. Biol. 19, 12791288 (1999). 544. St Clair, S. et al. DNA damage-induced downregulation of Cdc25C is mediated by p53 via two independent mechanisms : one involves direct binding to the cdc25C promoter. Mol. Cell 16, 725 736 (2004). 545. Oida, T. & Weiner, H. L. Depletion of TGF- from fetal bovine serum. J. Immunol. Methods 362, 195198 (2010). 546. Grygielko, E. T. et al. Inhibition of gene markers of fibrosis with a novel inhibitor of transforming growth factor-beta type I receptor kinase in puromycin-induced nephritis. J. Pharmacol. Exp. Ther. 313, 943951 (2005). 547. Abdollah, S. et al. TRI Phosphorylation of Smad2 on Ser465 and Ser467 Is Required for Smad2- Smad4 Complex Formation and Signaling. J. Biol. Chem. 272, 2767827685 (1997). 548. Vincendeau, P. & Daulouède, S. Macrophage cytostatic effect on Trypanosoma musculi involves an L-arginine-dependent mechanism. J. Immunol. Baltim. Md 1950 146, 43384343 (1991). 549. Gugssa, A. , Gebru, S. , Lee, C. M. , Baccetti, B. & Anderson, W. Apoptosis of Trypanosoma musculi co-cultured with LPS activated macrophages : enhanced expression of nitric oxide synthase INF- gamma and caspase. J. Submicrosc. Cytol. Pathol. 37, 99107 (2005). 550. Niemantsverdriet, M. et al. Np73 Enhances Promoter Activity of TGF- Induced Genes. PLoS ONE 7, (2012). 551. Ravi, R. et al. p53-mediated repression of nuclear factor-kappaB RelA via the transcriptional integrator p300. Cancer Res. 58, 45314536 (1998). 552. Reardon, C. & McKay, D. M. TGF-beta suppresses IFN-gamma-STAT1-dependent gene not transcription monocytes/macrophages. J. Immunol. Baltim. Md 1950 178, 42844295 (2007). STAT1-PIAS1 by enhancing interactions in epithelia but 553. Ishida, Y. , Kondo, T. , Takayasu, T. , Iwakura, Y. & Mukaida, N. The essential involvement of cross- talk between IFN-gamma and TGF-beta in the skin wound-healing process. J. Immunol. Baltim. Md 1950 172, 18481855 (2004). 554. Bitzer, M. et al. A mechanism of suppression of TGF/SMAD signaling by NF-B/RelA. Genes Dev. 14, 187197 (2000). 555. Freudlsperger, C. et al. TGF- and NF-B signal pathway cross-talk is mediated through TAK1 and SMAD7 in a subset of head and neck cancers. Oncogene 32, 15491559 (2013). 556. Brandl, M. et al. IKK() controls canonical TGF()-SMAD signaling to regulate genes expressing SNAIL and SLUG during EMT in panc1 cells. J. Cell Sci. 123, 42314239 (2010). 557. He, Y. et al. LPS/TLR4 Signaling Enhances TGF- Response Through Downregulating BAMBI During Prostatic Hyperplasia. Sci. Rep. 6, 27051 (2016). 558. Ricote, M. , Li, A. C. , Willson, T. M. , Kelly, C. J. & Glass, C. K. The peroxisome proliferator-activated receptor-gamma is a negative regulator of macrophage activation. Nature 391, 7982 (1998). 559. Li, M. , Pascual, G. & Glass, C. K. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma-dependent repression of the inducible nitric oxide synthase gene. Mol. Cell. Biol. 20, 46994707 (2000). 560. Scirpo, R. et al. Stimulation of nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor- limits NF-B-dependent inflammation in mouse cystic fibrosis biliary epithelium. Hepatol. Baltim. Md 62, 15511562 (2015). 561. Gong, K. et al. Smad3-mSin3A-HDAC1 Complex is Required for TGF-1-Induced Transcriptional Inhibition of PPAR in Mouse Cardiac Fibroblasts. Cell. Physiol. Biochem. Int. J. Exp. Cell. Physiol. Biochem. Pharmacol. 40, 908920 (2016). 562. Lakshmi, S. P. , Reddy, A. T. & Reddy, R. C. Transforming growth factor suppresses peroxisome proliferator-activated receptor expression via both SMAD binding and novel TGF- inhibitory elements. Biochem. J. 474, 15311546 (2017). 563. Frederick, J. P. , Liberati, N. T. , Waddell, D. S. , Shi, Y. & Wang, X. -F. Transforming growth factor beta-mediated transcriptional repression of c-myc is dependent on direct binding of Smad3 to a novel repressive Smad binding element. Mol. Cell. Biol. 24, 25462559 (2004). 564. Kerr, L. D. , Miller, D. B. & Matrisian, L. M. TGF-beta 1 inhibition of transin/stromelysin gene expression is mediated through a Fos binding sequence. Cell 61, 267278 (1990). 565. Elston, R. & Inman, G. J. Crosstalk between p53 and TGF- Signalling. J. Signal Transduct. 2012, 294097 (2012). 566. Wyllie, F. S. et al. Correlated abnormalities of transforming growth factor-beta 1 response and p53 expression in thyroid epithelial cell transformation. Mol. Cell. Endocrinol. 76, 1321 (1991). 567. Cordenonsi, M. et al. Links between tumor suppressors : p53 is required for TGF-beta gene responses by cooperating with Smads. Cell 113, 301314 (2003). 568. Overstreet, J. M. , Samarakoon, R. , Meldrum, K. K. & Higgins, P. J. Redox control of p53 in the transcriptional regulation of TGF-1 target genes through SMAD cooperativity. Cell. Signal. 26, 14271436 (2014). 569. Kawarada, Y. et al. TGF- induces p53/Smads complex formation in the PAI-1 promoter to activate transcription. Sci. Rep. 6, 35483 (2016). 570. Bedard, K. & Krause, K. -H. The NOX Family of ROS-Generating NADPH Oxidases : Physiology and Pathophysiology. Physiol. Rev. 87, 245313 (2007). 571. Boudreau, H. E. , Casterline, B. W. , Burke, D. J. & Leto, T. L. Wild-type and mutant p53 differentially regulate NADPH oxidase 4 in TGF-mediated migration of human lung and breast epithelial cells. Br. J. Cancer 110, 25692582 (2014). 572. Boudreau, H. E. et al. Histone modifications affect differential regulation of TGF- induced NADPH oxidase 4 (NOX4) by wild-type and mutant p53. Oncotarget 8, 4437944397 (2017). 573. Wilkinson, D. S. , Tsai, W. -W. , Schumacher, M. A. & Barton, M. C. Chromatin-bound p53 anchors activated Smads and the mSin3A corepressor to confer transforming-growth-factor-beta- mediated transcription repression. Mol. Cell. Biol. 28, 19881998 (2008). 574. Adorno, M. et al. A Mutant-p53/Smad complex opposes p63 to empower TGFbeta-induced metastasis. Cell 137, 8798 (2009). 575. Ji, L. et al. Mutant p53 promotes tumor cell malignancy by both positive and negative regulation of the transforming growth factor (TGF-) pathway. J. Biol. Chem. 290, 1172911740 (2015). 576. Werner, F. et al. Transforming growth factor-beta 1 inhibition of macrophage activation is mediated via Smad3. J. Biol. Chem. 275, 3665336658 (2000). 577. Thakur, A. K. et al. TAp73 loss favors Smad-independent TGF- signaling that drives EMT in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Death Differ. 23, 13581370 (2016). 578. Zi, Z. , Chapnick, D. A. & Liu, X. Dynamics of TGF-/Smad signaling. FEBS Lett. 586, 19211928 (2012). 579. You, T. et al. Crystal structure of SPSB2 in complex with a rational designed RGD-containing cyclic peptide inhibitor of SPSB2-iNOS interaction. Biochem. Biophys. Res. Commun. 489, 346352 (2017). 580. Yap, B. K. et al. A potent cyclic peptide targeting SPSB2 protein as a potential anti-infective agent. J. Med. Chem. 57, 70067015 (2014). 581. Harjani, J. R. et al. Design, Synthesis, and Characterization of Cyclic Peptidomimetics of the Inducible Nitric Oxide Synthase Binding Epitope That Disrupt the Protein-Protein Interaction Involving SPRY Domain-Containing Suppressor of Cytokine Signaling Box Protein (SPSB) 2 and Inducible Nitric Oxide Synthase. J. Med. Chem. 59, 57995809 (2016). 582. Huang, Y. & Ratovitski, E. A. Phosphorylated TP63 induces transcription of RPN13, leading to NOS2 protein degradation. J. Biol. Chem. 285, 4142241431 (2010). 583. Lewis, R. S. et al. TLR regulation of SPSB1 controls inducible nitric oxide synthase induction. J. Immunol. Baltim. Md 1950 187, 37983805 (2011). 584. Liu, S. , Nheu, T. , Luwor, R. , Nicholson, S. E. & Zhu, H. -J. SPSB1, a Novel Negative Regulator of the Transforming Growth Factor- Signaling Pathway Targeting the Type II Receptor. J. Biol. Chem. 290, 1789417908 (2015). 585. Fagerberg, L. et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Mol. Cell. Proteomics MCP 13, 397406 (2014). 586. Sikorski, E. M. , Hock, T. , Hill-Kapturczak, N. & Agarwal, A. The story so far : Molecular regulation of the heme oxygenase-1 gene in renal injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286, F425-441 (2004). 587. Soriano, F. X. et al. Transcriptional regulation of the AP-1 and Nrf2 target gene sulfiredoxin. Mol. Cells 27, 279282 (2009). 588. Korashy, H. M. & El-Kadi, A. O. S. NF-kappaB and AP-1 are key signaling pathways in the modulation of NAD(P)H : quinone oxidoreductase 1 gene by mercury, lead, and copper. J. Biochem. Mol. Toxicol. 22, 274283 (2008). 589. Kim, M. G. et al. Regulation of Toll-like receptor-mediated Sestrin2 induction by AP-1, Nrf2, and the ubiquitin-proteasome system in macrophages. Toxicol. Sci. Off. J. Soc. Toxicol. 144, 425435 (2015). 590. Vannini, F. , Kashfi, K. & Nath, N. The dual role of iNOS in cancer. Redox Biol. 6, 334343 (2015). 591. Wada, S. et al. Loss of p53 in stromal fibroblasts enhances tumor cell proliferation through nitric- oxide-mediated cyclooxygenase 2 activation. Free Radic. Res. 49, 269278 (2015). 592. Menegon, S. , Columbano, A. & Giordano, S. The Dual Roles of NRF2 in Cancer. Trends Mol. Med. 22, 578593 (2016). 593. Lieke, T. , Steeg, C. , Graefe, S. E. B. , Fleischer, B. & Jacobs, T. Interaction of natural killer cells with Trypanosoma cruzi-infected fibroblasts. Clin. Exp. Immunol. 145, 357364 (2006). 594. Schffer, M. R. et al. Nitric oxide, an autocrine regulator of wound fibroblast synthetic function. J. Immunol. Baltim. Md 1950 158, 23752381 (1997). 595. Shi, H. P. et al. The role of iNOS in wound healing. Surgery 130, 225229 (2001). 596. Kitano, T. et al. Impaired Healing of a Cutaneous Wound in an Inducible Nitric Oxide Synthase- Knockout Mouse. Dermatol. Res. Pract. 2017, 2184040 (2017). 597. Han, G. et al. Nitric oxide-releasing nanoparticles accelerate wound healing by promoting fibroblast migration and collagen deposition. Am. J. Pathol. 180, 14651473 (2012). 598. Grabowski, P. S. , Macpherson, H. & Ralston, S. H. Nitric oxide production in cells derived from the human joint. Br. J. Rheumatol. 35, 207212 (1996). 599. McInnes, I. B. et al. Production of nitric oxide in the synovial membrane of rheumatoid and osteoarthritis patients. J. Exp. Med. 184, 15191524 (1996). 600. Grabowski, P. S. et al. Immunolocalization of inducible nitric oxide synthase in synovium and cartilage in rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Br. J. Rheumatol. 36, 651655 (1997). 601. Cai, X. et al. Adiponectin inhibits lipopolysaccharide-induced adventitial fibroblast migration and transition to myofibroblasts via AdipoR1-AMPK-iNOS pathway. Mol. Endocrinol. Baltim. Md 24, 218228 (2010). 602. Zhang, G. et al. Macrophages activate iNOS signaling in adventitial fibroblasts and contribute to adventitia fibrosis. Nitric Oxide Biol. Chem. 61, 2028 (2016). 603. Nakagawa, T. et al. Autoinhibitory Regulation of p73 by Np73 To Modulate Cell Survival and Death through a p73-Specific Target Element within the Np73 Promoter. Mol. Cell. Biol. 22, 25752585 (2002). 604. Richter, K. , Konzack, A. , Pihlajaniemi, T. , Heljasvaara, R. & Kietzmann, T. Redox-fibrosis : Impact of TGF1 on ROS generators, mediators and functional consequences. Redox Biol. 6, 344352 (2015). 605. Boudreau, H. E. , Casterline, B. W. , Rada, B. , Korzeniowska, A. & Leto, T. L. Nox4 involvement in TGF-beta and SMAD3-driven induction of the epithelial-to-mesenchymal transition and migration of breast epithelial cells. Free Radic. Biol. Med. 53, 14891499 (2012). 606. Krstic, J. & Santibanez, J. F. Transforming growth factor-beta and matrix metalloproteinases : functional interactions in tumor stroma-infiltrating myeloid cells. ScientificWorldJournal 2014, 521754 (2014). Titre : Coopération entre les isoformes TAp73 la voie de signalisation du TGF- dans la régulation de l'expression de la NO Synthase inductible. Mots clés : Monoxyde d'azote (NO) ; iNOS ; p73 ; TGF- ; Nrf2 Résumé : Le monoxyde d'azote (NO) est une molécule gazeuse synthétisée par les NO Synthases à partir de L-arginine. NO est une puissante molécule de signalisation dans de nombreux processus physiologiques comme la vasodilatation et la neurotransmission. Il module l'activité de multiples protéines (ex : guanylate cyclase soluble et ribonucléotide réductase) grâce à la nitrosylation de groupements thiol ou de métaux de transition. En tant que radical libre, NO peut réagir avec de nombreuses espèces comme l'oxygène moléculaire, et ainsi former des dérivés réactifs. Grâce à ces propriétés, NO est un acteur majeur de l'immunité innée et de l'inflammation. Les phagocytes produisent de grandes quantités de NO en réponse à des stimuli proinflammatoires, via l'activité NO Synthase inductible (iNOS). En raison des effets délétères des dérivés de NO, l'activité iNOS doit être finement régulée. lui-même activé en Le suppresseur de tumeur p53 est capable de réprimer l'expression du gène Nos2 après avoir été réponse à une accumulation de NO. La protéine p73 est un homologue de p53 encodé par un gène qui génère à la fois des isoformes actives (TAp73) et des isoformes qui sont dépourvues du domaine de transactivation N-terminal et exercent un effet dominant négatif (Np73). Cette étude se focalise sur le rôle des isoformes TAp73 dans la régulation de l'expression de la iNOS. Nous démontrons que les isoformes TAp73 régulent négativement l'expression de la iNOS aux niveaux transcriptionnel et post-traductionnel en potentialisant l'effet répresseur du TGF-, ce qui résulte en une forte surexpression de la iNOS dans résultats confortent le rôle de la famille p53 comme un réseau essentiel de protéines régulatrices des fonctions du TGF-. les cellules TAp73-/-. Ces Title : TAp73 isoforms and TGF- signaling cooperate to suppress inducible Nitric Oxide Synthase expression Keywords : Nitric oxide (NO) ; iNOS ; p73 ; TGF- ; Nrf2 Because of the harmful effects of NO derivatives on cellular components, iNOS activity needs to be tightly regulated. The p53 tumor suppressor has been shown to repress Nos2 after being activated by NO itself. The p73 protein is an homologous encoded by the TP73 gene that generate transcriptionally active TAp73 isoforms and Np73 isoforms that lack the transactivation domain and exert a dominant negative effect. This study focuses on the role of TAp73 isoforms in iNOS expression. We demonstrate that TAp73 isoforms potentiate the repressive effect of TGF- on iNOS expression at transcriptional and post-traductional levels, resulting in a substantial iNOS overexpression in TAp73-/- cells. These results emphasize the emerging role of p53 family as a master regulator of TGF- functions. regulation of and neurotransmission. Abstract : Nitric oxide (NO) is a gaseous molecule synthesized from L-arginine by Nitric Oxide Synthases. NO acts as a potent signaling molecule in various physiological processes like vasorelaxation It modulates the activity of many proteins (e. g. soluble guanylate cyclase and ribonucleotide reductase) through nitrosylation of thiol moieties or transition metal ions. As a free radical, NO can also react with a number of cellular species, notably molecular oxygen, to form reactive oxygen species and reactive nitrogen species. Thanks to these properties, NO appears as a major component of innate immune response and inflammation. Phagocytes large amounts of NO in response to proinflammatory through inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS) activity. produce Université Paris-Saclay Espace Technologique / Immeuble Discovery Route de l'Orme aux Merisiers RD 128 / 91190 Saint-Aubin, France | HAL | Scientific |
Mise en relief de la singularité du discours d'enfants à traits psychotiques Virginie Besançon, Anouck Billy-Jacques To cite this version : Virginie Besançon, Anouck Billy-Jacques. Mise en relief de la singularité du discours d'enfants à traits psychotiques : intérêt d'une mise en lien entre approche psychanalytique et pratique orthophonique pour l'élaboration d'épreuves de langage oral. Médecine humaine et pathologie. 2010. hal-01884702 HAL Id : hal-01884702 Submitted on 1 Oct 2018 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. AVERTISSEMENT l'ensemble de Ce document est le fruit d'un long travail approuvé par le jury de soutenance et mis à disposition de la communauté universitaire élargie. Il est soumis à la propriété intellectuelle de l'auteur. Ceci implique une obligation de citation et de référencement lors de l'utilisation de ce document. D'autre part, toute contrefaçon, plagiat, reproduction illicite encourt une poursuite pénale. Contact : ddoc-theses-contact@univ-lorraine. fr LIENS Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 122. 4 Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 335. 2- L 335. 10 UNIVERSITE HENRI POINCARE FACULTE DE MEDECINE ÉCOLE D'ORTHOPHONIE DE LORRAINE Directeur : Professeur C. SIMON Mise en relief de la singularité du discours d enfants à traits psychotiques Intérêt d une mise en lien entre approche psychanalytique et pratique orthophonique pour l élaboration d épreuves de langage oral MEMOIRE Présenté en vue de l'obtention du CERTIFICAT DE CAPACITE D'ORTHOPHONISTE Par Virginie Besançon et Anouck Billy-Jacques JURY Monsieur Sibertin-Blanc, Professeur Madame Sevrain, Orthophoniste Madame Morel, Orthophoniste Madame Aubert, Psychologue Président Rapporteur Assesseur Assesseur Année universitaire 2009/2010 UNIVERSITE HENRI POINCARE FACULTE DE MEDECINE ÉCOLE D'ORTHOPHONIE DE LORRAINE Directeur : Professeur C. SIMON Mise en relief de la singularité du discours d enfants à traits psychotiques Intérêt d une mise en lien entre approche psychanalytique et pratique orthophonique pour l élaboration d épreuves de langage oral MEMOIRE Présenté en vue de l'obtention du CERTIFICAT DE CAPACITE D'ORTHOPHONISTE Par Virginie Besançon et Anouck Billy-Jacques JURY Monsieur Sibertin-Blanc, Professeur Madame Sevrain, Orthophoniste Madame Morel, Orthophoniste Madame Aubert, Psychologue Président Rapporteur Assesseur Assesseur Année universitaire 2009/2010 1 Inspecter l'invisible et entendre l'inouï. Arthur Rimbaud 2 Summary Highlighting the singularity of discourse in children with psychotic traits, with an interest to linking a psychoanalytic approach and speech therapy in order to develop oral language tests. This end of course study presents our thoughts regarding the language of children and adolescents who tend towards psychotic self construction. It would appear that specific speech therapy tools for these patients are non existent. And yet, from infantile psychosis come a line of investigation and the need for adaptation which are both necessary and fascinating. Our interest is therefore focused on the singularity of these children's language, and in this perspective, towards a possible link between a psychoanalytic approach and our own practise. Indeed, this approach makes possible an understanding of the psychological processes - pathological or other - that have been put in place in the constitution of the subject and by the language. It therefore also allows a more pertinent highlighting of certain particularities of language in children with a tendency to self construct in a psychotic mode. From this theoretic support which entails certain therapeutic techniques, and our desire to observe and dismantle the very same particularities in order to adapt our treatment, our line of questioning focused on the difficulty to 'precisely' exhibit them. Our work led us to elaborate an adapted tool, consistent with a ten test protocol, which allows us to reveal and highlight the singularity of the relationship between the senses and the language of children showing psychotic traits. Working to make the results standout from children of all backgrounds, other questions arose regarding how the language in the psychotic subject positioned itself differently, and the role of the speech-therapist during the sessions, and therefore how best to develop the subject's psychological structure. 3 Remerciements Nous remercions tout d'abord Monsieur le Professeur Sibertin-Blanc de nous avoir fait l'honneur de présider notre jury. Nous souhaitons remercier Madame Sevrain pour nous avoir proposé le champ de recherche de notre mémoire, nous avoir permis de rencontrer les enfants de l'I. T. E. P. , et de nous avoir soutenues dans ce projet. Merci pour sa bienveillance, et ces discussions intéressantes enrichies de son expérience et de sa pratique. Nos remerciements s'adressent ensuite à Mesdames Morel et Aubert qui nous ont accompagnées tout au long de ce travail et qui nous ont consacré beaucoup de leur temps. La pertinence de leurs remarques a nourri notre mémoire. Un grand merci aux enfants. Une pensée pour eux. Merci également à toute l'équipe pour son accueil. Nous remercions aussi nos familles qui nous ont encouragées durant cette année et les trois précédentes. Merci à mes parents qui m'ont permis de reprendre ces passionnantes études. Merci à Mathias qui m'a toujours soutenue et encouragée dans ma démarche et merci à Brigitte qui s'est si souvent occupée de Jeanne pendant que je révisais. Un remerciement particulier à ma petite Jeanne, source de motivation infinie. Merci à Anouck avec qui il est si simple de travailler dans la bonne humeur et la gentillesse. Merci à Axel pour tout le reste. Merci à mes parents pour leur enthousiasme face à cette profession. Un remerciement pour mes amis, leur bienveillance et leurs encouragements dans cette étape importante. Vraiment merci à Virginie. Je suis contente d'avoir partagé ces quatre années et ce travail avec elle. Merci enfin à Tristan, pour sa patience, son soutien et son aide. 4 Sommaire Introduction . 12 Fondements théoriques. 15 I. Quelques repères préalables. 15 1. Historique : Évolution du langage autour du concept de psychose . 15 2. Classification. 16 2. 1. Les Troubles Envahissants du Développement d'après le DSM IV. 17 2. 2. Les Troubles Envahissants du Développement non spécifiés y compris autisme atypique d'après le DSM IV . 18 II. L'avènement du sujet dans le langage . 19 1. Éléments de linguistique et formation de l'inconscient. 19 1. 1. Le signe linguistique. 20 1. 2. La valeur du signe linguistique chez Saussure. 21 1. 3. Le point de capiton chez Lacan . 22 1. 4. Métaphore et métonymie. 24 1. 5. L'inconscient structuré comme un langage . 29 2. La constitution du sujet par l'accès au Symbolique . 30 2. 1. L'Autre. 31 2. 2. Les concepts . 32 2. 3. L'accès au langage et au Symbolique. 35 3. La phase du miroir. 37 3. 1. Étapes. 37 3. 2. Identifications. 39 3. 3. Psychose et stase du miroir . 40 4. L'Œdipe . 40 4. 1. Étapes. 41 4. 2. Métaphore paternelle et accès au symbolique. 43 5. L'impossible avènement dans le langage : la structuration psychotique. 45 5. 1. La forclusion du Nom-du-Père, une première approche des processus psychotiques. 45 5. 2. Seconde approche des processus psychotiques . 47 III. Pensée et langage dans la psychose . 54 1. Particularités de la pensée psychotique . 55 1. 1. Le rapport a la temporalité . 55 1. 2. L'indifférenciation entre vivant et non-vivant . 57 1. 3. Une expérience relative de la réalité. 58 5 2. La question du savoir. 60 2. 1. L'organisation du savoir psychotique. 61 2. 2. L'errance du sujet psychotique. 63 2. 3. Psychose et signification. 64 3. Singularités dans le langage du sujet psychotique . 65 3. 1. Une constitution altérée du signe. 65 3. 2. La destruction du sens. 68 3. 3. Psychose et communication . 71 Approche expérimentale : . 75 I. But et démarche de notre travail. 75 1. Motivation et questionnement de départ. 75 2. Hypothèses de travail. 76 3. Méthodes. 77 II. Choix de la population . 78 1. La population . 78 1. 1. Les enfants présentant des traits psychotiques . 78 1. 2. Les enfants tout-venant . 78 2. Les critères d'inclusion et d'exclusion . 79 2. 1. Les critères d'inclusion . 79 2. 2. Les critères d'exclusion . 79 2. 3. Les éléments que nous avons notés . 79 III. Le matériel . 80 1. Le déroulement du protocole . 80 1. 1. La passation du protocole avec les enfants de l'I. T. E. P. . 80 1. 2. La passation du protocole avec les enfants tout-venant. 81 1. 3. Le protocole. 81 2. Le choix et les objectifs des épreuves . 82 2. 1. Généalogie : état civil et situation familiale. 82 2. 2. Temps. 83 2. 3. Histoires en images. 84 2. 4. Images absurdes. 86 2. 5. Définition de mots . 88 2. 6 Intégration morphosyntaxique. 90 2. 7. Métaphores . 91 2. 8. Publicité. 93 2. 9. Intonation . 94 2. 10. Expression écrite libre. 95 6 3. Récapitulatif des épreuves . 96 4. Récapitulatif des objectifs d'observation. 97 Analyse des résultats. 99 I. L'épreuve Généalogie : état-civil et situation familiale . 100 1. Présentation de la cotation . 100 2. Analyse quantitative . 100 3. Analyse qualitative . 101 II. L'épreuve Temps . 103 1. Présentation de la cotation . 103 2. Analyse quantitative . 103 3. Analyse qualitative . 104 III. L'épreuve Histoires en images . 105 1. Présentation de la cotation . 105 2. Analyse quantitative . 106 3. Analyse qualitative . 108 IV. L'épreuve Images absurdes . 112 1. Présentation de la cotation . 112 2. Analyse quantitative . 112 3. Analyse qualitative . 116 V. L'épreuve Définitions de mots . 120 1. Présentation de la cotation . 120 2. Analyse quantitative . 122 3. Analyse qualitative . 122 VI. L'épreuve Intégration morphosyntaxique . 125 1. Présentation de la cotation . 125 7 2. Analyse quantitative . 127 3. Analyse qualitative . 127 VII. L'épreuve Métaphores . 129 1. Présentation de la cotation . 129 2. Analyse quantitative . 129 3. Analyse qualitative . 130 VIII. L'épreuve Publicité . 133 1. Présentation de la cotation . 133 2. Analyse quantitative . 134 3. Analyse qualitative . 134 IX. L'épreuve Intonation . 135 1. Présentation de la cotation . 135 2. Analyse quantitative . 136 3. Analyse qualitative . 137 X. L'épreuve Expression écrite libre . 138 XI. Scores généraux. 140 XII. Profils . 141 1. Profil de K. 141 2. Profil de Do. 143 3. Profil de Jo. . 146 Discussion . 149 I. L'épreuve Généalogie : état-civil et situation familiale . 149 1. Mise en relief des résultats des deux populations . 149 2. Critiques. 149 3. Propositions. 150 8 II. L'épreuve Temps . 151 1. Mise en relief des résultats des deux populations . 151 2. Critiques. 151 3. Propositions. 151 III. L'épreuve Histoires en images . 152 1. Mise en relief des résultats des deux populations . 152 2. Critiques. 152 3. Propositions. 152 IV. L'épreuve Images absurdes . 153 1. Mise en relief des résultats des deux populations . 153 2. Critiques. 153 3. Propositions. 153 V. L'épreuve Définitions . 154 1. Mise en relief des résultats des deux populations . 154 2. Critiques. 154 3. Propositions. 154 VI. L'épreuve Intégration morphosyntaxique . 155 1. Mise en relief des résultats des deux populations . 155 2. Critiques. 155 3. Propositions. 156 VII. L'épreuve Métaphores . 156 1. Mise en relief des résultats des deux populations . 156 2. Critiques. 156 3. Propositions. 157 VIII. L'épreuve Publicité . 157 1. Mise en relief des résultats des deux populations . 157 9 2. Critiques. 157 3. Propositions. 158 IX. L'épreuve Intonation . 158 1. Mise en relief des résultats des deux populations . 158 2. Critiques. 158 3. Propositions. 159 X. L'épreuve Expression écrite libre . 159 XI. Scores généraux. 159 XII. Ouvertures possibles. 160 Conclusion . 161 Bibliographie. 162 Annexes . 165 I. Généalogie : état civil et situation familiale . 165 1. Les enfants de l'I. T. E. P. . 165 2. Les enfants tout-venant. 170 II. Temps. 173 1. Les enfants de l'I. T. E. P. . 173 2. Les enfants tout-venant. 177 III. Histoires en images . 179 1. Les enfants de l'I. T. E. P. . 179 2. Les enfants tout-venant. 182 IV. Images absurdes . 185 1. Les enfants de l'I. T. E. P. . 185 2. Les enfants tout-venant. 191 10 V. Définitions de mots . 195 1. Les enfants de l'I. T. E. P. . 195 2. Les enfants tout-venant : . 199 VI. Intégration Morphosyntaxique. 201 1. Les enfants de l'I. T. E. P. . 201 2. Les enfants tout-venant. 204 VII. Métaphores . 206 1. Les enfants de l'I. T. E. P. . 206 2. Les enfants tout-venant. 211 VIII. Publicité. 213 1. Les enfants de l'I. T. E. P. . 213 2. Les enfants tout-venant. 215 IX. Intonation . 217 1. Les enfants de l'I. T. E. P. . 217 2. Les enfants tout-venant. 220 X. Expression écrite libre. 222 1. Les enfants de l'I. T. E. P. . 222 2. Les enfants tout-venant. 226 11 Introduction Le langage, manifestation de nos représentations et réflexions, tient un rôle essentiel dans notre développement. Il apparat comme le médiateur du fonctionnement de la pensée, et celui qui perd le lien qui unit les mots aux choses, perd aussi le lien qui le relie aux autres et à la société. C'est ce qui semble se produire chez l'enfant qui présente des traits psychotiques, et dont le langage se caractérise, entre autres, par une difficulté dans la constitution du signe, c'est-à-dire dans le lien entre signifiant et signifié. La relation à l'autre semble alors perturbée, tant la question du sens fait défaut. Les mots sont désincarnés, ne peuvent être expliqués, socialisés. Le discours des sujets psychotiques peut être le reflet d'un monde centré sur une intuition, une association, une interprétation. La plupart du temps pourtant, ces patients semblent s'adapter au langage normosé, pouvant ainsi nous leurrer. Dans le cadre d'une réflexion sur la clinique orthophonique dans sa rencontre avec la psychose, nous nous sommes ainsi intéressées au profil de l'enfant qui tend à se structurer sur le mode psychotique, ce qui a conduit notre travail et notre interrogation sur la nature de son rapport au langage. Quel est son lien à la langue, mais aussi à la parole, témoin de sa vision subjective ? Les confusions de signifiants chez les sujets psychotiques ne sont pas anodines : elles sont orientées par leurs préoccupations, mises au service de leurs craintes. Il sera donc intéressant au préalable de prendre en considération la nature de ces préoccupations et angoisses. En effet, pour aborder le rapport de l'enfant à traits psychotiques au langage, au sens qui lui fait défaut, il semble important d'envisager la psychose dans la singularité de son rapport au monde, et non nécessairement en termes de déficits. C'est la théorie psychanalytique, tant elle permet une compréhension de la structuration psychotique - en opposition avec la structure névrotique -, qui a permis ce regard. Car, concevant la construction du sujet comme un avènement dans et par le langage, elle permet d'appréhender de manière très éclairante les particularités du rapport de l'enfant présentant des traits psychotiques à la langue. Une mise en lien entre cette même approche psychanalytique et la pratique orthophonique - centrée, par nature, sur le langage - nous a paru des plus enrichissantes. La stricte observation parat alors être un bon outil de travail pour tenter d'aborder et de comprendre l'enfant qui tend à se construire sur le mode psychotique. Les structures 12 surgissant au détour de phrases non spécialement étudiées, les particularités peuvent être ainsi mises en relief. Cependant, dans l'optique d'un outil clinique, et constatant les lacunes dans ce domaine, il nous a semblé plus nécessaire et intéressant encore de tenter d'élaborer un certain cadre thérapeutique et des épreuves précises permettant de mettre en exergue ces mêmes particularités. Quelles situations vont mettre en évidence le point de rupture de sens ? Quelles expressions vont mettre l'enfant psychotique en porte-à-faux par rapport à la signification ? Comment, peut-être même, fait-il pour nous prouver le contraire ? Dans son mémoire de fin d'études, Sophie Mahenc propose certains outils révélateurs et éclairants. Voici la liste des thèmes qu'elle a entre autres retenus : - situation familiale, état civil, généalogie - le temps - histoires en images - images absurdes - définitions de mots Ces notions et épreuves, au regard de nos fondements théoriques basés sur la psychanalyse, nous ont semblé intéressantes et pertinentes, tant elles révèlent les particularités des enfants à traits psychotiques. Nous avons donc décidé de les développer et y avons ajouté d'autres épreuves encore. L'intérêt sera donc d'élaborer des instruments qui pourraient permettre de révéler, entre autres, le fonctionnement de la métonymie et de la métaphore chez l'enfant à traits psychotiques, et peut-être ainsi de mieux toucher à la particularité de son langage, ou en tout cas de nous mettre sur la voie pour répondre à ses difficultés. Nous tenterons ainsi de mettre au point un protocole, reflet de ce qui nous a semblé révélateur au regard de la théorie psychanalytique, qui mettra en exergue ses capacités et difficultés, intérêts et tolérances, mais surtout ce qui le singularise dans son rapport au monde et la langue. Ce protocole, en amont d'une prise en charge orthophonique et fonctionnant telle une photographie' du langage de l'enfant à un moment donné, pourra peut-être alors servir à un meilleur ajustement du cadre thérapeutique, et à l'élaboration d'une possible ligne directrice. Il s'agira, pour cela, de tenter de décoder ce que l'enfant psychotique a perçu plus que de vouloir injecter du signifiant , nous faisant ainsi secrétaire[s] de l'aliéné comme 13 l'expliquait Lacan. Il est probable ainsi que nous nous interrogions sur le statut même de la parole, ce dont elle procède, et ce qu'elle dit. Ainsi, pour conduire cette recherche, nous étudierons les fondements théoriques qui permettront de comprendre notre démarche expérimentale, laquelle sera exposée dans un second temps. Puis, nous procéderons à l'analyse des résultats, recueillis auprès de notre population d'enfants présentant des traits psychotiques et d'enfants tout-venant, ainsi qu'à une discussion autour du choix de nos épreuves. 14 Fondements théoriques Nous nous sommes essentiellement intéressées aux fondements théoriques basés sur la psychanalyse. En effet, l'angle proposé par la psychanalyse sur l'enfant présentant des traits psychotiques nous a paru être le plus éclairant quant au lien avec son langage. La mise en lien de cet angle avec la pratique orthophonique fut source d'une réflexion plus appropriée et plus adaptée à la pratique orthophonique, et c'est de cette mise en lien qu'a pu se faire l'élaboration de notre protocole. Néanmoins, nous avons tout de même souhaité aborder, succinctement, quelques points sous l'angle psychiatrique, afin de permettre une vision certes non exhaustive, mais tout du moins plus globale de ce qu'est la psychose infantile. I. Quelques repères préalables 1. Historique : Évolution du langage autour du concept de psychose Au Moyen-Âge, le fou est celui qui est dépourvu d'esprit. Le terme folie comporte une forte connotation négative d'un point de vue moral, il signifie la démesure, l'excès, l'absence de raisonnement. Au début du XIXe siècle, Philipe Pinel (1745-1826), médecin aliéniste, à qui l'on doit la première classification des maladies mentales bouleversera le regard sur les fous en affirmant qu'ils peuvent être compris et soignés. Il proposera donc de ne plus parler de folie pour éviter le jugement trop négatif qui lui est intrinsèquement attribué, mais remplacera ce terme par aliénation mentale - personne étrangère à elle-même. Néanmoins, cela ne suffira pas à bouleverser le regard négatif et hostile qui restera posé sur ce type de pathologie. 15 Jean-Pierre Falret (1794-1870), médecin psychiatre disciple de Pinel, proposera un autre terme, peut-être moins dramatique, moins fort avec l'appellation maladie mentale . En suggérant ce terme, le docteur Falret souhaite introduire le malade mental dans la même catégorie que tous les autres malades. Malgré cette démarche pour une terminologie, et donc une opinion, moins stigmatisante, ce vocable n'aura pas de succès car il est vite considéré comme trop général, trop global et ne distingue pas les différents seuils de gravité. Le terme psychose , lui, fut introduit au XXe siècle et employé pour la première fois par un médecin autrichien, le baron Ernst Von Feuchtersleben, en 1845, comme alternative aux termes vus précédemment. Il dérive du grec psyche , esprit, et osis qui signifie condition maladive ou anormale. C'est un terme qui désigne les affections mentales les plus graves, caractérisées par une atteinte globale de la personnalité. Le terme est souvent utilisé avec un adjectif qui indique la nature, l'étiologie ou un caractère dominant de la pathologie. Selon les courants psychiatriques et le système psychopathologique auquel il se réfère le mot peut prendre plusieurs sens : on parlera de structures psychotiques, de pôle d'organisation de la personnalité psychotique, etc. C'est le psychiatre allemand, Emil Kraeplin qui posera les fondements d'une séparation nette entre troubles psychotiques et troubles névropathiques. Plus tard, Sigmund Freud a repris la séparation entre psychose et névrose dans son système psychopathologique. Par exemple, Eugène Minkovski a abordé les psychoses sous un angle phénoménologique, Henri Ey sous celui de l'organodynamisme, etc. 2. Classification Le diagnostic de psychose est source de nombreux questionnements, voire conflits entre les professionnels de santé, psychiatres. En effet, depuis la publication du DSM-III, en 1981, le terme psychose a disparu de la classification internationale des maladies (CIM version X) et de la classification américaine des troubles mentaux (DSM IV TR) car le terme était devenu très ambigu et très controversé au niveau international. La psychose désigne, selon les auteurs, soit la gravité d'une pathologie au sens psychiatrique du terme, soit la précocité de l'atteinte du développement psychologique et affectif de l'enfant, soit la structuration psychopathologique du sujet en référence aux approches psychanalytiques (freudienne, kleinienne, lacanienne, ) . 16 Dans notre approche théorique, nous avons fait le choix de développer l'angle psychanalytique. Cependant, il nous a paru important de présenter, succinctement, le diagnostic précis qui a été posé par le pédopsychiatre des enfants et adolescents que nous avons rencontrés. Ce diagnostic est le suivant : selon la DSM IV, il s'agit de Troubles Envahissants du Développement (T. E. D. ) non spécifié ; la CIM X, elle, parle d' autisme atypique . Nous savons que, selon les pédopsychiatres, le diagnostic de ces enfants peut être source de débat et ne fait pas consensus. Cependant, n'étant pas habilitées à en juger les fondements et ayant découvert au fur et à mesure de notre mémoire ce type de pathologies, nous avons accepté pleinement le diagnostic qui nous a été communiqué et qui a servi de base à notre recherche. En voici la définition donnée par la classification internationale. 2. 1. Les Troubles Envahissants du Développement d'après le DSM IV Les troubles envahissants se caractérisent par des déficits sévères et une altération envahissante de plusieurs secteurs du développement - capacités d'interactions sociales réciproques, capacités de communication - ou par la présence de comportements, d'intérêts et d'activités stéréotypés. Les déficiences qualitatives qui définissent ces affections sont en nette déviation par rapport au stade de développement ou à l'âge mental du sujet. Ce chapitre comprend le Trouble autistique, le Syndrome de Rett, le Trouble désintégratif de l'enfance, le Syndrome d'Asperger et le Trouble Envahissant du Développement non spécifié. Ces troubles apparaissent habituellement au cours des premières années de la vie et sont souvent associés à un certain degré de Retard mental qui, s'il est présent doit être codé []. Les Troubles envahissants du développement s'observent parfois en association avec un groupe varié d'affections médicales générales (p. ex. , anomalies chromosomiques, maladies infectieuses congénitales, lésions structurelles du système nerveux central). Lorsqu'existent de telles affections, il faut les coder []. Bien que les termes de Psychose et de Schizophrénie infantile aient été un temps utilisés pour désigner ces affections, on dispose maintenant d'un nombre considérable d'arguments suggérant que les Troubles envahissants du développement sont distincts de la Schizophrénie. [. ] 1 1 Guelfi J. D. et al (1996) 17 2. 2. Les Troubles Envahissants du Développement non spécifiés y compris autisme atypique d'après le DSM IV On doit se servir de cette catégorie quand existent soit une altération sévère et envahissante du développement de l'interaction sociale réciproque ou des capacités de communication verbale et non verbale, soit des comportements, des intérêts et des activités stéréotypés. Il ne faut pas alors que les critères d'un Trouble envahissant du développement spécifique, d'une Schizophrénie, d'une Personnalité schizoïde ou d'une Personnalité évitante soient remplis. Par exemple, cette catégorie inclut sous le terme d' autisme atypique des tableaux cliniques qui diffèrent de celui du Trouble autistique par un âge de début plus tardif, par une symptomatologie atypique ou sous le seuil, ou par l'ensemble de ces caractéristiques. (Dans la CIM-10, l'autisme atypique est codé F84. 1) Il s'agit de Troubles Envahissants du Développement qui diffèrent de l'autisme infantile par l'âge de survenue ou parce qu'il ne répond pas à l'ensemble des trois groupes de critères diagnostiques d'un autisme infantile. Ainsi soit les anomalies ou altérations du développement se manifestent après l'âge de trois ans, soit les manifestations pathologiques ne sont pas suffisantes dans un ou deux des trois domaines psychopathologiques nécessaires au diagnostic d'autisme. Pour rappel, ceux-ci relèvent des interactions sociales, de la communication, d'un comportement restreint, stéréotypé et répétitif. Nous venons de vous exposer les repères issus de la pédopsychiatrie. Cependant, nous avons fait le choix de garder le terme de psychose qui s'inscrit dans l'approche psychanalytique. Il s'agit d'un choix institutionnel, qui nous a semblé plus qu'intéressant. En effet, il permet, d'une part, un regard approfondi quant à la structuration de ces enfants, un regard dans lequel la question du langage, par nature essentielle à notre pratique, y est vive. D'autre part, cette approche psychanalytique, au vu de nos discussions avec l'équipe, et de nos lectures, a d'emblée suscité notre enthousiasme, tant elle permet une réflexion passionnante. Elle correspondait également à nos centres d'intérêt, et répondait à nos attentes quant à ce choix de recherche. Nous y avons donc pleinement adhéré. 18 II. L'avènement du sujet dans le langage Il nous a semblé intéressant, suite à ce premier point sur l'approche psychiatrique de la psychose, d'aborder cette dernière non plus en termes de désordres et de pathologies, mais en termes de structure, afin de mieux comprendre la manière dont elle se noue. La théorie psychanalytique, qui aborde le concept même de psychose, permet cet éclairage et donne, dans une perspective plus clinique, les outils de réflexion nécessaires à l'orthophoniste dans sa rencontre avec la psychose infantile. Jacques Lacan, dans la perspective d'un retour à Freud et d'un éclairage de la psychanalyse au regard des données de la linguistique et du structuralisme, pose l'idée que la structuration du sujet se fait par l'accès au symbolisme et par là même dans l'avènement du langage. Il définit de plus la psychose comme un trouble dans l'ordre du langage . Ce sont les raisons pour lesquelles nous nous sommes orientées principalement vers la théorie lacanienne. Celle-ci a mis en relief la question de la constitution psychique du sujet afin de comprendre ce qui détermine ou entrave l'accès au symbolisme. Aussi nous permet-elle un regard thérapeutique adapté au sujet psychotique et à son rapport à l'ordre des choses, au langage et au sens, posant ainsi certains des fondements de notre réflexion, de notre travail et de nos choix cliniques. Nous ne prétendons pas ici faire le tour de la question, ni même donner à l'orthophoniste le rôle d'un psychanalyste en herbe. Nous tentons plutôt de poser les bases d'une réflexion que nous avons jugée intéressante et utile pour aborder les enfants psychotiques. Cette mission ne fut pas aisée, en raison de la complexité même des travaux psychanalytiques, ainsi que de leur étendue. Nous avons donc eu à faire certains choix, et avons tenté ici d'étayer notre projet, c'est-à-dire un outil permettant une meilleure appréhension de la manière dont ces enfants se positionnent dans le langage, et ce dans l'optique d'une pratique orthophonique adaptée à la structure psychotique. 1. Éléments de linguistique et formation de l'inconscient Il s'agit d'introduire certaines notions qui permettront d'éclairer les parties à venir, ainsi que d'aborder la formule désormais célèbre de Lacan : L'inconscient est structuré comme 19 un langage . Celle-ci, comme l'explique Bernard Golse2, exprime le fait qu'inconscient et réalité entretiennent entre eux un même rapport que signifiant et signifié, ou encore que les fantasmes, le discours et le comportement du sujet sont les signifiés d'un signifiant inconscient . Avec F. de Saussure émerge la dimension synchronique dans l'étude de la langue, dimension qui se voit alors être privilégiée aux dépens d'une perspective purement diachronique (qui envisage les phénomènes linguistiques du point de vue de leur évolution historique). Apparat ainsi l'idée que c'est du système de la langue que dépend la signification, système régi par un certain nombre de lois d'équilibre et de propriétés radicalement nouvelles. Ce point de vue, dit 'structuraliste', va permettre d'apprécier le rapport fondamental qu'il existe entre sens et signe. Lacan va adopter certaines de ces propriétés de la linguistique structurale et les appliquer sur le terrain de la psychanalyse. A la structure de la langue va alors se voir rapportée la structure de l'inconscient. En effet, c'est l'acte de langage lui-même qui fait advenir l'inconscient et le lieu o il s'exprime . 3 Nous nous intéresserons en premier lieu aux principales notions abordées en linguistique structurale. Ensuite, nous verrons en quoi la structuration de l'inconscient peut être rapportée à celle du langage. 1. 1. Le signe linguistique F. de Saussure4 pose au début du siècle le fait que le signe n'unit pas un terme à une chose, mais un concept à une image acoustique. Cette dernière n'est pas le son matériel, chose purement physique, mais l'empreinte psychique de ce son, la représentation que nous en donne le témoignage de nos sens ; elle est sensorielle et s'il nous arrive de l'appeler matérielle', c'est seulement dans ce sens et par opposition à l'autre terme de l'association, le concept, généralement plus abstrait. 5 Certains termes préfigurent ici la dissociation fondamentale entre langage, langue et parole, et Saussure de préciser que la langue est pour nous le langage moins la parole 6. 2 Golse B. (2008), Jacques-Marie Lacan, pp. 159-165 3 Dor J. (2002), p. 34 4 de Saussure F. , Cours de linguistique générale, cité dans l'édition critique (1980), Paris : Payot in Dor J. (2002) 5 Ibid. , première partie : Principes généraux , chap. I, p. 98. in Dor J. (2002), p. 35 6 Ibid, p. 112, in Dor J. (2002), p. 35 20 Le signe linguistique se présente comme une entité psychique à deux faces , dont les deux éléments que sont le signifié (le concept) et le signifiant (l'image acoustique) s'inscrivent dans un rapport d'association. Ce rapport n'est pas fixe, et le signe, élément fondamental de la langue, présente certaines particularités. Le signe est arbitraire, c'est-à-dire immotivé. En effet, bien qu'il soit commun à tous les membres d'une communauté linguistique donnée, on ne peut parler de lien de nécessité entre le concept et l'image acoustique qui sert à le représenter. Le signe est immuable. A partir du moment o il y a consensus sur le signifiant, ce dernier s'impose à la communauté linguistique, qui s'y voit liée en raison des conventions. Mais ces conventions installent également le signe dans un certain temps, ce qui nous amène à la propriété suivante. Le signe est altérable, du fait notamment de la pratique sociale. Si c'est parce que le signe linguistique est immuable qu'il peut perdurer, c'est tout aussi bien parce qu'il perdure dans le temps qu'il peut s'altérer. 7 Le signifiant a un caractère linéaire. Il correspond a une suite phonémique qui se déploie dans le temps, et la langue se déploie dans une direction orientée que l'on appelle axe syntagmatique'. Lacan désigne cette suite orientée dans l'organisation signifiante par le terme de chane signifiante. Cette dimension temporelle, car nécessaire au déroulement de la parole, est essentielle en psychanalyse pour nourrir la notion de structure. La langue est par conséquent dite structurée, d'une part en raison des signes qui la composent, d'autre part en raison des lois qui gouvernent ces signes entre eux. 1. 2. La valeur du signe linguistique chez Saussure F. de Saussure présente la chane parlée comme une double chane, celle des concepts et celle des images acoustiques. Il existerait alors une correspondance simultanée entre des délimitations introduites dans la première chane et des délimitations subséquentes dans la seconde. Nous pourrions alors penser que la signification resterait entièrement présente et garantie lorsque le signe est isolé dans la chane. Or, il s'avère qu'une image acoustique ne permet d'avoir une signification que lorsqu'elle est en contexte, et donc en présence d'autres signes. La délimitation du signe est donc coextensive à la délimitation de la signification 7 Dor J. (2002), pp. 40-41 21 et le signe n'est signe qu'en fonction du contexte 8 : c'est ce que F. de Saussure appelle la valeur du signe. La valeur' c'est ce qui fait qu'un fragment acoustique devient réel et concret, qu'il est délimité en faisant sens, donc qu'il devient signe linguistique 9, notion qui justifie une fois encore l'idée d'un système structural. Comme l'explique F. de Saussure10, les signes sont significatifs au-delà de leur contenu par les rapports d'opposition qu'ils entretiennent alors entre eux au sein de la chane parlée. Son et pensée ne peuvent être isolés, une idée se fixe dans un son en même temps qu'une suite phonique se constitue comme le signifiant d'une idée 11. Ainsi, de la série de divisions introduites simultanément dans le flux phonique et dans le flux des pensées nat le langage. Ces divisions apparaissent comme des coupures (terme employé par F. de Saussure lui-même) qui interviendraient dans les deux flux, définissant ainsi la structure du signe linguistique. 1. 3. Le point de capiton chez Lacan Lacan apporte trois modifications principales à la théorie saussurienne précédemment évoquée sur la valeur du signe. Tout d'abord, le signifiant est, pour lui, différent : il n'est pas qu'une image acoustique, il est aussi une image olfactive, tactile, cénesthésique et acoustique. Cette représentation acoustique intègre toutes les sensations perceptives d'un corps et leur donne un symbole, un imaginaire qui peut circuler dans la chane signifiante. Ensuite, Lacan rapporte le flux des pensées au flux des signifiés, et de la même manière le flux des sons au flux des signifiants. Enfin, le schéma saussurien qui mettait les concepts s au dessus des images acoustiques S se voit être inversé. Désormais, dans l'écriture lacanienne, le signifiant S et placé au-dessus du signifié s : S/s. Quelle est alors la mise en rapport entre flux de signifiants et flux de signifiés ? Lacan introduit un nouveau concept, celui du point de capiton, et en découd avec l'idée d'une coupure qui unirait le signifiant au signifié tout en déterminant chacun des deux. C'est alors le point de capiton, opération par laquelle le signifiant arrête le glissement 8 Dor J. (2002), p. 46 9 Dor J. (2002), p. 47 10 de Saussure F. , op. cit. 11 Dor J. (2002), p. 47 22 autrement indéfini de la signification 12, qui prend la valeur de délimitation exprimée par F. de Saussure. C'est la raison pour laquelle le signifiant s'associe au signifié dans la chane du discours. 13 Il est à noter que l' expérience psychotique appuie la notion de délimitation par le point de capiton car elle capitalise l'idée que c'est précisément ce type de nouage qui fait défaut dans la psychose. La chane signifiante SS' est crochetée en deux points par le vecteur $. C'est ce dernier qui matérialise le point de capiton. Avec le point de capiton s'instaure un rapport à la séquence parlée en général et non plus seulement entre les unités élémentaires successives comme c'est le cas chez Saussure. En outre, il apparat que c'est rétroactivement, c'est-à-dire dans l'après-coup, que le point de capiton arrête le glissement de la signification et par conséquent que le signe fait sens (cf le sens rétrograde de $). En effet, la signification d'un message n'advient qu'au terme de l'articulation signifiante elle-même . 14 Ce n'est donc qu'avec le dernier terme que la phrase boucle sa signification, chaque terme étant à la fois anticipé et scellant le sens des autres par son effet rétroactif . 15 12 Lacan J. (1966), Subversion du sujet et dialectique du désir , Ecrits, Paris : Seuil, in Dor J. (2002), p. 49 13 Schématisation du point de capiton proposée in Dor J. (2002), p. 50 14 Dor J. (2002), p. 50 15 Chemama R. , Vandetmersch B. (2009), p. 544 23 Revenons sur l'écriture lacanienne du signe linguistique dans laquelle le signifiant est noté en majuscule et placé au-dessus du signifié. Cette notation atteste du caractère primordial du signifiant. Il est à noter que sur le plan psychanalytique, le signifiant est en quelque sorte une trace dans l'inconscient. Cela peut être par exemple une odeur ou une image, qui renvoie à un signifié (fait décrit dans le souvenir). Lacan explique que c'est le signifiant qui gouverne dans le discours du sujet, revenant ainsi sur l'idée commune selon laquelle c'est le signifié qui doit être mis au premier plan de l'analyse. La définition du signifiant que donne le Dictionnaire de la Psychanalyse 16 est d'ailleurs la suivante : élément du discours, repérable au niveau conscient et inconscient, qui représente le sujet et le détermine . Lacan accentue alors l'idée d'autonomie et de suprématie du signifiant, portant ainsi une attention particulière au rôle de la parole et au langage. Le signifiant prend une valeur qui va au-delà même de sa commune identification à une séquence phonématique : c'est à partir de leur effet de sens, et surtout du rôle qu'ils jouent dans une économie subjective, que des éléments du discours peuvent avoir [eux-mêmes] valeur de signifiants. 17 Deux principaux procédés attestent alors de la suprématie du signifiant, il s'agit de la métaphore et de la métonymie. 1. 4. Métaphore et métonymie Les deux axes du langage Le double découpage du système du langage est une innovation saussurienne, mais étant donnée la reprise qu'en fait Lacan, il semble plus approprié d'en suivre les notions à partir des travaux de Jakobson. 18 Pour ce dernier, le langage peut se découper selon deux directions, celle des sélections et celle des combinaisons, deux événements qui s'opèrent simultanément lorsque l'on parle. L'axe des combinaisons, tout d'abord, correspond à l'axe syntagmatique que nous avons évoqué lors de l'explication du caractère linéaire du signifiant. Il relève de l'ordre dans les unités de signification (phonème, monème, mot, phrase), et représente l'articulation au sein même des unités linguistiques. Cet axe, horizontal, intéresse donc la parole : c'est en ce lieu qu'interviennent une utilisation et un agencement particuliers des termes lexicaux 16 Ibid. , p. 530 17 Ibid. , p. 534 18 Jakobson R. (1963), Essai de linguistique générale, Paris : Minuit, in Dor J. (2002), pp. 42-44 24 préalablement choisis. C'est en ce lieu également que les éléments significatifs s'installent dans un rapport de contiguïté entre eux. Un terme peut en amener un autre par contiguïté, c'est ce que nous appelons le processus métonymique. A cet axe des combinaisons se trouve associé l'axe des sélections, dit paradigmatique', qui est lui vertical. C'est sur cet axe que s'opèrent les différents choix lexicaux que nous faisons, et que nous avons la possibilité de substituer certains termes à d'autres. Nous nous situons alors au niveau du système de la langue et non plus de la parole comme précédemment, et les choix lexicaux se font dans des rapports associatifs, de similitude. C'est là qu'intervient le processus métaphorique : un terme en amène un autre par rapport de similarité. La métaphore () Quand la pluie étalant ses immenses tranées D'une vaste prison imite les barreaux Et qu'un peuple muet d'infâmes araignées Vient tendre ses filets au fond de nos cerveaux () Spleen, C. Baudelaire, 1856 Les Fleurs du Mal Par la métaphore, qui joue sur les rapports de similarité donc, un mot va prendre une signification qui n'est pas la signification propre, originaire de ce mot. Ce procédé ne fonctionne alors que si cet autre sens donné au mot relève d'une comparaison implicite. M. le Guern19 explique qu'il est possible d'identifier le mécanisme métaphorique à la suppression, ou plus exactement à la mise entre parenthèses d'une partie des sèmes constitutifs du lexème employé . Mais la dérivation métaphorique permet également une mise en relief d'éléments connotatifs : parfois, le sens primitif du mot se maintient sous forme de trace connotative . 20 Loin d'un vocabulaire concret et purement descriptif, la 19 Le Guern M. , Sémantique de la métaphore et de la métonymie, p. 15, in Lehmann A. , Martin-Berthet F. (2005), p. 89 20 Kebrat-Orecchioni C. (1986), L'implicite : Armand Collin, p. 109, in Lehmann A. , Martin-Berthet F. (2005), p. 89 25 métaphore permet la traduction d'une pensée riche ; elle est ainsi utilisée dans la littérature, et plus particulièrement dans le langage poétique. On songera par exemple à Baudelaire qui, à travers l'image de L'Albatros , révèle sa vision du poète, si différent et inadapté à la vie en société Nous allons cependant en donner des exemples simples mais éclairants de la manière dont cette figure procède. Une relation métaphorique peut, ainsi, unir l'acception A de perle à l'acception dérivée B en vertu d'une ressemblance (/rareté/ et /excellence/) entre les deux acceptions : Perle A : petite bille de nacre , B : personne remarquable dans un domaine . 21 Certaines métaphores vont devenir des expressions d'usage commun, des formes lexicalisées ( les bras d'un fauteuil ), ou encore vont natre d'inventions verbales. Lacan explique que la métaphore n'est pas une simple permutation de signifiant, opération qui donnerait un nouveau signe. En réalité, un signifiant vient à la place d'un autre (quelque chose est ainsi désigné au moyen d'une autre chose), et S1/s1 - ainsi que son association originaire - devient le nouveau signifié de S2. S1/s1 est donc maintenu en tant que signifié (c'est là l'essence même de la métaphore selon Lacan), et s2, lui, se voit être expulsé. 22 L'auteur écrit d'autre part que la métaphore se place au point précis o le sens se produit dans le non-sens . 23 L'interprétation métaphorique d'un terme ne peut alors se faire de la même manière que ses interprétations ordinaires. Elle nat donc de la reconnaissance 21 Lehmann A. , Martin-Berthet F. (2005), p. 87 22 Schématisation du processus métaphorique proposée in Dor J. (2002), p. 55 23 Lacan J. (1966), L'Instance de la lettre dans l'inconscient ou la raison depuis Freud , in Ecrits, Paris : Seuil, p. 508, in Dor J. (2002), p. 58 26 et du traitement interprétatif des certaines incompatibilités sémantiques . 24 Les métaphores opèrent en effet par des transgressions de l'usage ordinaire, allant ainsi à l'encontre des frontières logiques et préétablies. La métonymie La métonymie désigne le phénomène par lequel un terme est mis à la place d'un autre terme auquel il est lié par une relation nécessaire. De manière générale et schématique, le tout est désigné par la partie. Les deux signifiants sont alors dans une relation de contiguïté, et peuvent être placés sur le même axe syntagmatique. Pour Lacan, cette opération consiste en un transfert de dénomination. Un objet est alors désigné au moyen d'un autre terme que celui qui lui est habituellement attribué. Cependant, certaines conditions de liaison doivent être respectées. A ce propos, l'ouvrage Introduction à la lexicologie 25 propose, en s'inspirant de la classification de Fontanier (Les figures du discours), de distinguer les métonymies suivantes, ainsi que d'en donner des exemples : - - de la cause pour l'effet (un Picasso, pour un tableau de Picasso) de l'instrument pour l'utilisateur de l'instrument (une fine lame, pour celui qui manie finement une lame) - de la matière pour l'objet (les cuivres, pour les instruments de cuisine en cuivre ou pour les instruments de musique en cuivre) - du contenant pour le contenu (il a mangé toute la bote, pour il a mangé tous les bonbons contenus dans la bote) - - - - du lieu pour la chose - produit ou institution - (Wall Street, pour la Bourse de New York) du signe pour la chose signifiée (la couronne, pour la réalité symbolisée par la royauté) du physique pour le moral ou pour la personne (faire le joli cœur, pour faire le galant) de l'attribut vestimentaire pour la désignation de la personne à laquelle cette chose est liée (les casques bleus, pour les soldats de l'ONU) 24 Riegel M. , Pellat J. -C. , Rioul R. (2005), p. 123 25 Lehmann A. , Martin-Berthet F. (2005), pp. 90-91 27 Lacan schématise l'opération métonymique de la manière suivante : 26 S2 vient se substituer à S1 et, dans la métonymie, le sens est assujetti au maintien de S1 en contiguïté immédiate avec S2 et en association avec S1 . 27 s2, lui, est temporairement expulsé. Le signifiant évincé ne passe donc pas sous la barre de signification (comme c'est le cas dans la métaphore), mais reste au-dessus. La métonymie, dans laquelle on réduit l'ensemble à un détail, le primordial à l'anodin, est complexe et difficile à repérer. Elle est à la fois peu familière et commune, florissante. Aussi, lorsqu'elle est lexicalisée, elle échappe à notre conscience. Alors que chez Saussure il était question d'un rapport de liaison entre signifiant et signifié, chez Lacan c'est l'idée d'un rapport barré, de résistance, qui prime. Le signifiant est autonome, sa raison d'être n'est pas le signifié. A méconnatre le rôle médiateur primordial du signifiant, à méconnatre que c'est le signifiant qui est en réalité l'élément-guide, non seulement nous déséquilibrons la compréhension originelle des phénomènes névrotiques, l'interprétation des rêves elle-même28, mais nous nous rendons absolument incapables de comprendre ce qui se passe dans les psychoses . 29 Or, métaphore et métonymie attestent de cette même suprématie du signifiant, et l'observation du maniement de ces deux figures par le sujet psychotique conduira à s'interroger sur le rapport de ce dernier à la parole. Toute cette approche lacanienne autour du signifiant et du signifié, de la métaphore et de la métonymie, semble donc très intéressante pour l'orthophoniste qui, dans sa rencontre avec le sujet 26 Schématisation du processus métonymique proposée in Dor J. (2002), p. 60 27 Dor J. (2002), p. 60 28 A ce propos, les mécanismes linguistiques que sont la métaphore et la métonymie sont à rapprocher respectivement des notions de condensation du rêve et de déplacement dans le rêve dans la théorie freudienne, notions qui sous-tendent le fonctionnement psychique selon le processus primaire, de l'ordre de l'inconscient et déterminé par le principe de plaisir. 29 Lacan J. (séminaire du 2 mai 1956), Les Psychoses, séminaire, livre III (1955-1956), Paris : Seuil, p. 247, in Dor J. (2002), p. 53 28 psychotique, s'interroge sur le langage de celui-ci. Aussi, le choix de nos épreuves et l'analyse des résultats des enfants s'appuieront, entre autres, sur ces différentes notions. En outre, dans la perspective lacanienne, les notions de métaphore et de métonymie constituent les deux points primordiaux appuyant la conception structurale du processus inconscient. Elles mettent en évidence l'aptitude particulière du langage à dire autre chose que ce qu'il dit à la lettre. Elles sont donc essentielles si l'on considère, comme Lacan, que l'inconscient est structuré comme un langage . 1. 5. L'inconscient structuré comme un langage L'inconscient est la structure psychique découverte par Freud. Celui-ci le décrit comme le lieu des représentations refoulées qui se sont vu refuser l'accès à la conscience. Seules les formations de l'inconscient que sont, entre autres, l'oubli, le mot d'esprit, le rêve, le lapsus, ou encore le symptôme, peuvent permettre un certain accès au savoir inconscient. Ce sont des manifestations involontaires et énigmatiques qui font effraction dans la parole ou les comportements. Ces formations de l'inconscient sont toutes des formations langagières qui relèvent du signifiant, et sont structurées comme un langage car soumises à des lois. En effet, l'inconscient est fait d'éléments signifiants élémentaires, ce qui place le signifiant au niveau de l'Inconscient, et le signifié au niveau de l'exprimé. C'est dire que notre discours (verbal ou non) n'exprime pas un sens caché dans notre inconscient mais plutôt qu'il est en lui-même le sens d'un signifiant profond . 30 Le signifiant peut être considéré comme la trace porteuse de sens, et le signifié comme ce à quoi la trace renvoie. D'ordre mnésique, il est donc également, au-delà d'être langagier et comme nous l'avons évoqué précédemment, sensoriel (visuel, auditif ou encore olfactif) ou cénesthésiques. Les signifiants sont alors organisés en un réseau placé sous le signe du processus primaire et dont les combinaisons échappent à toute logique. Comme le langage inconscient est précisément régi par le processus primaire, il ne peut être assimilé au langage conscient sur le plan de son fonctionnement. En effet, comme il est expliqué dans l'ouvrage de Bernard Golse, les termes qui le composent (signifiants) peuvent reporter leur énergie sur d'autres par déplacement ou condensation et c'est d'ailleurs 30 Golse B. (2008), p. 160 29 par ce moyen que - de manière plus ou moins sinueuse - le discours et le désir inconscients se fraient un passage jusqu'à la conscience en se véhiculant d'un signifiant à l'autre, tout au long de cette trame de signifiants élémentaires . 31 L'Inconscient est soumis à des lois, et selon Lacan, il est possible d'établir des règles pour l'Inconscient, tout comme la linguistique l'a fait pour la langue. Il est, ou plutôt ses formations, ce qui s'écrit dans la parole, mais sous la forme d'une écriture que l'on pourrait qualifier de chiffrée, et à déchiffrer. C'est ce qu'explique Marie-Josée Lapeyrère dans son article. 32 Cette écriture est de l'ordre du jeu de lettres , les mots sont alors à traiter comme des choses et valent par leur tissage et leurs connexions littérales comme dans la poésie . 2. La constitution du sujet par l'accès au Symbolique Selon Lacan, l'ordre symbolique est constitutif de la réalité humaine et donc du sujet. Il fait de l'homme un animal [] fondamentalement régi, subverti par le langage, lequel détermine les formes de son lien social et plus essentiellement de ses choix sexués . 33 Il est donc attaché à la fonction du langage, et plus précisément à celle du signifiant. Cette structure - qui comporte une part consciente et une part inconsciente - témoigne de la relation première de l'homme au signifiant, et de sa reconnaissance comme être de langage. Dès sa venue au monde, l'infans (c'est-à-dire sans parole, terme désignant donc l'enfant qui n'a pas encore acquis le langage) est immergé dans un bain de langage qui lui préexiste. Il s'y trouve imprégné par le discours de l'Autre, par la demande et le désir de ce dernier pour lequel il fait en quelque sorte figue d' objet'. Cette entrée du jeune enfant dans l'ordre symbolique va le façonner et le faire accéder au statut de sujet. L'individu est ainsi en quelque sorte constitué en tant que sujet par l'ordre symbolique dans lequel il s'insère. Autrement dit encore, la spécificité du sujet humain serait plus son aptitude à s'inscrire dans le registre symbolique pour y fonder sa subjectivité qu'une capacité de symbolisation au sens strict (création de symboles) . 34 31 Ibid. 32 Lapeyrère M. -J. (2002) 33 Chemama R. , Vandermersch B. (2009), p. 559 34 Golse B. (2008), p. 148 30 2. 1. L'Autre L'enfant est d'emblée inscrit dans un système signifiant : on parle de lui bien avant qu'il naisse. Il est pris dans l'Autre, ordre radicalement antérieur et extérieur dont il dépend et qui le détermine. L'Autre est une entité empreinte de richesses signifiantes et déterminantes de la vie psychique du nouveau-né. De l'ordre, entre autres, des inconscients paternel et maternel, il est en lien avec un certain héritage transgénérationnel : l'infans s'inscrit dans une histoire, celle de ses parents, qui en ont eux-mêmes une avec les leurs. Lorsque nous évoquons la notion d' Autre (à distinguer du petit autre , partenaire imaginaire, semblable, altérité qui, d'une certaine manière se résorbe), nous posons d'emblée l'accent sur la place et la fonction de ceux par rapport auxquels se forme le désir de l'enfant, c'est-à-dire le père et la mère. Sophie de Mijolla-Mellor, dans sa lecture de l'œuvre de Piera Aulagnier35, explique que la relation du Je à lui-même passe nécessairement à un moment par l'image, l' ombre parlée (terme employé par Piera Aulagnier elle-même) que la mère projette sur l'infans qui pourra ainsi Advenir 36 et se constituer comme sujet. La mère va s'ériger en porte-parole - notion tributaire de l'accent mis par Lacan sur le langage dans l'inconscient -, et se place entre le monde et l'infans. Pour Piera Aulagnier toujours, les objets alors présentés à la psyché de l'enfant sont, consciemment ou non, modelés par les désirs, les attentes, voire les craintes de la mère. La relation au monde est donc tributaire de la relation à l'autre, la mère en l'occurrence. La psychanalyste reconnat par là l'apport dû à la théorie de Lacan : on pourrait en effet dire que l'objet n'est métabolisable par l'activité psychique de l'infans que si, et tant que, le discours de la mère l'a doté d'un sens dont sa nomination témoigne. Dans ce sens avalé' avec l'objet Lacan verra l'introjection originaire d'un signifiant, l'inscription d'un trait unaire37 . 38 Par conséquent, l'Autre est constitué de ce qui fait sens au niveau inconscient des parents. Il renferme le sens donné à l'enfant (à sa conception, à sa naissance) et le détermine en tant que sujet. 35 de Mijolla-Mellor (2006) 36 Terme de Piera Aulagnier repris par Jacques Lacan 37 Concept introduit par J. Lacan, à partir de S. Freud, pour désigner le signifiant sous sa forme élémentaire et pour rendre compte de l'identification symbolique du sujet. , définition donnée par Chemama R. et Vandermersch B. (2009), p. 583 38 Aulagnier P. La Violence de l'interprétation. Du pictogramme à l'énoncé, Paris : PUF, coll. Le fil rouge , p. 132, in De Mijolla-Mellor S. (2006), p. 12 31 Lorsque le nourrisson a faim, il crie, ce qui fait advenir la mère et la nourriture. Comme l'explique Anny Cordié39, ce cri prend valeur d'appel pour l'enfant, et devient signifiant. Cependant, ce signifiant est aux mains de l'Autre, qui lui donne du sens. Le sujet, in initio, commence au lieu de l'Autre, en tant que là surgit le premier signifiant . 40 Cette idée signe l'impuissance et l'indépendance absolue de l'infans à la volonté de l'Autre. A cette dernière, l'enfant est capable d'une grande adaptation, mais si d'une part ses besoins trouvent une mauvaise interprétation, ou si d'autre part leur satisfaction n'est pas suffisamment relayée par la fonction symbolique, son corps manifestera son intolérance. S'il est débordé par l'incohérence, la perversion de l'Autre ou victime de son indifférence, sa réponse pourra être l'autisme ou la psychose . 41 Les besoins du corps et les activités physiologiques sont donc d'emblée pris dans les signifiants de l'Autre, Autre qui inscrit l'enfant dans le référent symbolique. C'est ainsi que s'élabore la langue maternelle, s'imprégnant des affects qui soulignent le message du grand Autre, lieu du signifiant. Ce qui constitue pour le sujet l'ordre autre auquel il se réfère, [] c'est le langage lui-même. Ainsi l'Autre, à la limite se confond avec l'ordre du langage . 42 Le sujet va alors chercher à se situer dans l'Autre du langage, car c'est de ce lieu, parental ou social, que vient pour le sujet son message langagier. 2. 2. Les concepts Dans cette perspective lacanienne et fondatrice de l'accès de l'enfant à l'ordre symbolique, il semble intéressant de distinguer les trois concepts que sont le besoin, le désir et la demande. Le besoin Le besoin, élément organique et somatique, est ressenti par le sujet comme manque vécu. Nous considérons par le terme de manque' ce qui fait défaut, ce qui a été perdu. Il existe une interdépendance entre le manque et le signifiant qui le symbolise, laissant ainsi la 39 Cordié A. (2007) 40 Lacan, Le séminaire, Livre XI, p. 180, in Cordié A. (2007), p. 64 41 Cordié A. (2007), p. 64 42 Chemama R. , Vandermersch B. (2009), p. 80 32 marque indélébile du manque dans la parole. En effet, le nom qui nomme l'objet manquant laisse apparatre ce manque, et en nommant cet objet, le sujet le rate nécessairement. Malgré tout, c'est par le langage que la chose manquante accède au rang de concept. Le symbolique dans la fonction signifiante telle qu'elle désigne la perte en général s'élabore donc sur fond d'absence, de manque. Ce manque va induire le besoin organique. Le besoin est une fonction biologique rythmée, à distinguer de la notion de pulsion avancée par Freud, qui prend une dimension libidinale ou agressive. L'enfant, assujetti à l'ordre d'exigences du besoin, passera à la demande. Le désir Le désir est une dimension liée à un manque qui ne peut être comblé par un objet du monde. Il est plus précisément défini comme Manque inscrit dans la parole et effet de la marque du signifiant sur l'être parlant . 43 Il est donc ce que devient la pulsion une fois aliénée dans un signifiant. Selon Lacan, la mise en mots, l'impression d'une marque symbolique signifiante, s'accompagne nécessairement d'une certaine mise à mort de la chose (mise à mort par ailleurs capable d'élever la chose manquante au rang de concept). En effet, il existe un écart infranchissable entre ce qui est ressenti et ce qui est dit, et la verbalisation du manque et du besoin n'en est qu'insatisfaisante. Cela est contrariant, mais définit malgré tout le langage : à nommer l'objet, on le perd nécessairement. Aussi, l'objet pulsionnel ne peut être qu'un objet métonymique de l'objet du désir lui-même. Notre manque à être fondamental ne peut alors se traduire qu'au travers du défilé des signifiants : le déplacement d'un signifiant à un autre se fixe momentanément sur un mot censé représenter l'objet désirable, ce qui est de l'ordre de la métonymie. Lacan nomme de manière générale l'objet cause du désir l'objet a, objet non réel, perdu et éternellement manquant. Ce dernier nat de l'espace ouvert par la demande - et donc le langage - au-delà du besoin initial. Il deviendrait, comme il est expliqué dans le Dictionnaire de la Psychanalyse44, plus précieux que la satisfaction même du besoin. En revanche, le sujet 43 Ibid. , p. 148 44 Ibid. , p. 402 33 psychotique, lui, n'aurait pas perdu cet objet cause du désir (Lacan dit même du psychotique qu'il a l'objet a dans sa poche ). Il ne subirait donc pas de manque, et par là même n'aurait pas de désir ; cela va fortement entraver son accession au statut de sujet. En effet, c'est la dimension du désir [qui] va contribuer à assurer, pour l'enfant, captif d'un organisme inféodé à l'ordre du besoin, la promotion du stade d'objet à celui de sujet dans la mesure même o le désir ne semble devoir s'inscrire que dans le registre d'une relation symbolique à l'Autre et à travers le désir de l'Autre . 45 Le désir ne peut donc natre que dans une relation à l'Autre. Aussi l'enfant, captif des signifiants de l'Autre, se trouve irrémédiablement inscrit dans l'univers du désir de ce dernier, d'o la formule suivante : le désir du sujet parlant, c'est le désir de l'Autre. Enfin, c'est au terme de l'expérience de satisfaction [permise par la mère] que l'enfant est mis en situation de pouvoir désirer par la médiation d'une demande à l'Autre. 46 La demande La demande est l'expression d'un souhait qui témoigne de l'entrée de l'enfant dans l'univers du désir, et à partir de laquelle ce dernier se distingue du besoin. A la différence de l'animal, l'être humain doit trouver les mots audibles par l'autre pour faire entendre sa demande ; c'est dans cette adresse que se constitue l'Autre. La réponse de l'autre à quelque chose qui a été supposé demande est possible grâce à l'intervention de l'autre, ce qui inscrit ainsi l'enfant dans un univers sémantique, de communication, et donc dans un référent symbolique. Mais cela inscrit également l'enfant dans une certaine dépendance à l'autre. En effet, le cri qui devient appel puis demande dépend de l'interprétation de la mère. La réponse à cette demande compte alors plus que la satisfaction du besoin car il s'agit avant tout d'une demande d'amour et de reconnaissance. En outre, la demande désigne pour Lacan sous un terme générique le lieu symbolique signifiant o s'aliène progressivement le désir primordial . 47 45 Dor J. (2002), p. 185 46 Ibid. , p. 187 47 Golse B. (2008), p. 149 34 2. 3. L'accès au langage et au Symbolique La Spaltung, ou division originaire du sujet par l'ordre signifiant La Spaltung, terme qui provient de Spalt qui signifie fente' en allemand, se définit comme la division originaire de l'être entre le Soi intime et le sujet du discours conscient. Autrement dit, elle correspond à la disjonction qui s'établit entre le je , sujet de l'énoncé, et le (Je), sujet de l'énonciation. 48 Pour Lacan, elle est ce par quoi le sujet advient. En effet, elle est ce qui définit la subjectivité, et la raison par laquelle le sujet accède au langage à partir, en quelque sorte, du passage du manque au désir. La Spaltung introduit le sujet au symbolique par la formulation du désir. Or celle-ci ne peut que marquer la transcription du besoin. 49 La division du sujet mène donc au langage et au symbolique, mais ce au prix d'une perte irréparable puisque dans le symbole le besoin du sujet ne peut être que représenté et donc réduit, parcellisé, déformé ou falsifié . 50 C'est au moyen d'un substitut symbolique que nous signifions le réel : c'est le propre du langage. Comme nous l'avons déjà évoqué, il s'accomplit alors une scission entre le réel vécu et ce qui va venir le signifier, d'o l'idée d'une perte par division du discours. C'est en ce sens que Lacan a écrit qu'il fallait que la chose se perde pour être représentée . Dans de telles conditions, le rapport du sujet à son propre discours se soutiendra du même effet de scission. Ce qui veut dire que le sujet ne figure dans son propre discours qu'au prix de cette même scission : il disparat comme sujet pour s'y trouver seulement représenté en l'espèce d'un symbole . 51 La notion de Spaltung, ou division par l'ordre signifiant donc, trouve ainsi se raison d'être dans le fait que le sujet, dans le discours conscient qu'il tient sur lui-même, s'éloigne progressivement de la vérité de son essence. C'est ainsi que le sujet S est noté par Lacan $ (sujet barré). Car c'est dans la division originaire que le sujet se barre : en sujet de l'énoncé à l'endroit du discours conscient (l'exprimé), et en sujet de l'énonciation au lieu du discours inconscient (l'éprouvé). 52 48 Golse B. (2008), p. 149 49 Cf. supra Le désir 50 Golse B. (2002), p. 150 51 Dor J. (2002), pp. 136-137 52 Mahenc S. (2000), p. 23 35 La Refente, ou l'aliénation du sujet dans le langage Nous devons comprendre ici qu'à peine advenu dans le langage, le petit être s'y perd déjà. En tant que nouvel exprimant, il fait l'expérience de la perte fondamentale. Fait de la division originaire, plus il va exprimer de lui, plus il va s'éloigner de lui-même et s'aliéner. C'est cette aliénation du sujet dans son propre discours que l'on nomme la Refente du sujet. Elle correspondrait au passage du désir à la demande. En effet, le désir inconscient - inarticulable dans la parole - s'aliène dans la demande du fait des déplacements multiples d'un signifiant à l'autre et des sublimations. Le sujet circule d'un signifiant à l'autre, se faisant représenter par l'un pour un autre, soumis à l'impossibilité de se ranger sous la bannière d'un signifiant ultime qui lui donnerait la clé de son être . 53 La Refente est donc ce qui définit par excellence le rapport d'aliénation du parlêtre54 à la chane des signifiants. Le sujet, sous la domination du signifiant, n'est alors qu'un effet du langage, un effet du langage qui le fait exister pour aussitôt l'éclipser dans l'authenticité de son être . 55 Il n'est donc en aucun cas cause du signifiant. De cette conséquence, la notion lacanienne de sujet barré $ tire tout son fondement. Plus encore qu'il n'existe au langage, le sujet ex-siste au langage 56. En effet au prix de la perte originaire il se tient hors langage : il n'y est que représenté, et ce de par la médiation du signifiant. Le sujet est donc divisé et soumis à l'aliénation, aliénation sous-tendue par le défilé des signifiants à travers lequel le sujet cherchera vainement l'unité de son être. Bernard Golse explique que la Spaltung renvoie à une relation immédiate du sujet à lui-même. En revanche, la Refente, elle, entrane un détour par autrui ; elle implique donc une relation médiate, médiatisée. Elle sous-tend les identifications du sujet. En effet, la vérité sur soi que le langage ne peut [] lui fournir, le sujet la cherchera dans les images d'autrui auxquelles il va s'identifier 57 au cours noramment du stade du miroir et de l'Œdipe. 53 Genet S. (2009) 54 Notion initiée par Lacan pour situer l'être même de l'homme dans la parole 55 Dor J. (2002), p. 137 56 Concept élaboré par Lacan, repris par Chemama R. et Vandermersch B. (2009), p. 554 57 Golse B. (2008), p. 149 36 3. La phase du miroir Au départ, l'enfant vit son corps comme morcelé (vécu psychique dont nous retrouverons des vestiges dans les processus de destruction psychotique), et non comme une totalité unifiée. Avec le stade du miroir58, seuil spécifique du processus de maturation de l'enfant, ce dernier part à la conquête de l'image de son propre corps par la reconnaissance de son image dans le miroir. C'est un moment particulier du vécu psychique de l'enfant que Lacan considère comme souche des identifications secondaires et amorce du complexe d'Œdipe. L'identification primordiale de l'enfant à l'image de son propre corps va mettre un terme au vécu psychique que Lacan désigne par le terme de fantasme du corps morcelé . Ainsi, va s'amorcer la structuration du Je , neutralisation de la dispersion angoissante du corps. En effet, le stade du miroir est formateur de la fonction du Je . Aussi, la constitution de ce dernier n'est plus à considérer comme un acte de pure aperception, et permet de préciser la signification du corps propre. 59 Le repérage chronologique de ce processus est imprécis. Nous retenons cependant généralement la période qui s'étend de 6 mois (alors que le bébé, dépendant du nourrissage, est encore dans un état d'impuissance et d'incoordination motrice) jusqu'à 18 mois, période caractérisée par l'immaturité nerveuse. 3. 1. Étapes La phase du miroir, qui situe la constitution du moi unifié dans la dépendance d'une identification aliénante à l'image spéculaire 60, s'organise en trois temps fondamentaux. Les trois temps de cette conquête de l'identité vont se nouer aux trois grands registres du psychisme humain : le Réel, l'Imaginaire et le Symbolique. Le premier temps est celui de la confusion première entre soi et l'autre. L'enfant se voit morcelé, ne fait pas de différence entre ce qui est lui et le corps de sa mère, entre lui et le monde extérieur. Il perçoit son reflet dans le miroir comme autre réel, fait de chair et d'os, 58 Lacan utilise soit le terme de phase, soit le terme de stade ; ce dernier renvoie peut-être simplement à une dimension plus dynamique du processus. 59 Golse B. (2008), p. 151 60 Chemama R. , Vandermersch B. (2009), p. 351 37 qu'il s'efforce d'approcher ou d'appréhender. Il ne reconnat alors pas l'image comme la sienne mais la vit comme celle d'un autre, et inversement l'image de l'autre peut être prise pour la sienne, ce qui constitue une double confusion. 61 L'image est vécue comme un être réel, est ce temps est à rapporter au registre du Réel, à ne pas confondre avec la réalité. Ce registre correspond à ce que le symbolique expulse lorsqu'il s'installe. De l'ordre de l'impossible et du hors langage, il est ce contre quoi nous nous heurtons toujours. La seconde étape est décisive dans le processus identificatoire. L'enfant comprend à ce moment que l'autre du miroir n'est pas un être réel, mais une image. Outre qu'il ne cherche plus à s'en saisir, l'ensemble de son comportement indique qu'il sait désormais distinguer l'image de l'autre, de la réalité de l'autre . 62 En revanche, bien qu'il saisisse que cette est image est spéculaire, irréelle et imaginaire, il ne la reconnat pas encore comme sienne. Cette étape est par conséquent celle du registre de l'Imaginaire, registre qui désigne le rapport à l'image du semblable, qui se supporte du reflet du semblable au semblable. L'image est perçue comme fictive. Enfin, lors de la troisième étape, l'enfant saisit que le reflet du miroir n'est qu'une image qui est son image. Il accède par là même à la représentation de corps propre en tant que totalité unifiée et non plus dispersée, morcelée. D'autre part, cette compréhension vaut également pour les autres images spéculaires qu'il perçoit, et notamment celle de sa mère. L'enfant se retourne d'ailleurs vers cette dernière qui authentifie sa découverte, et qui le nomme : le c'est toi implique ainsi le c'est moi . Cette intervention du signifiant fait qu'il prend rang dans la famille, et dans le registre symbolique : l'image est reçue comme représentation de soi-même. Le passage à ce registre est indispensable car il permet la régulation de l'Imaginaire, et de trouver une issue à la relation immédiate. D'une part, c'est tout d'abord en tant qu'autre qu'il se vit et s'éprouve. D'autre part, la reconnaissance de son image dans le miroir est possible grâce à la mère, son amour, ses étayages, l'ordre du regard qu'elle porte sur lui. Il faut donc que l'enfant ait une place dans l'Autre, incarné ici par la mère. C'est en effet par la parole et le regard d'autrui que nous est 61 Golse B. (2008), p. 151 62 Dor J. (2002), p. 101 38 conférée notre identité, regard qui nous identifie dans cette dialectique de la connaissance de soi par la reconnaissance d'autrui . 63 3. 2. Identifications Par le stade du miroir, l'enfant part à la conquête de son identité, mais n'accéderait finalement qu'à l'identification. L'identification primordiale de l'enfant à sa propre image expliquée précédemment correspond à l'identification primaire. Celle-ci peut être considérée comme imaginaire. En effet, il ne s'agit à ce moment que d'une reconnaissance imaginaire par ailleurs justifiée par des faits objectifs, et non une connaissance spécifique de son corps propre. En effet, tout est sous-tendu par la dimension de l'Imaginaire. La conquête de l'identité passe par une identification à partir de quelque chose de virtuel, d'indices extérieurs et symétriquement inversés (l'image optique) qui n'est pas lui comme tel mais dans quoi il se re-connat. Aussi, cette re-connaissance présuppose dans son principe constitutif le destin d'aliénation du Je dans l'imaginaire. Du même coup, c'est [] l'unité du corps elle-même qui s'ébauche comme extérieure à soi et inversée. La dimension même de cette re-connaissance préfigure ainsi, pour le sujet qui advient dans la conquête de son identité, le caractère de son aliénation imaginaire d'o s'esquisse la méconnaissance chronique qu'il ne cessera d'entretenir avec lui-même . 64 L'enfant anticipe donc imaginairement la forme totale de son corps, et la capacité de leurre de l'image indique déjà la fonction de méconnaissance du moi. L'avènement du schéma corporel sera permis plus tard, lorsque la maturation de l'enfant le permettra. Dans cette phase, s'instaure une dialectique, une ligne fictive de départage entre Imaginaire et Symbolique ; Lacan distingue l'identification imaginaire constitutive du moi de l'identification symbolique fondatrice du sujet. En effet, à l'aliénation dans l'Imaginaire par le stade du miroir va succéder l'accès au symbolisme, au moment o l'image dans le miroir est saisie comme représentation de soi. Par cet accès ainsi que par le langage, et au prix du détour par l'Imaginaire et par l'Autre, l'enfant parvient donc à sa fonction de sujet, sujet de l'énoncé et sujet de l'énonciation. 65 Ensuite interviendront les identifications secondaires, plus partielles, et notamment oedipiennes. 63 Golse B. (2008), p. 154 64 Ibid. 65 Ibid. , p. 157 39 3. 3. Psychose et stase du miroir Pour Lacan, la constitution du sujet est inséparable de la relation à sa propre image, notion amenée par la phase du miroir. Les psychoses infantiles seraient alors, pour Lacan toujours, un échec de l'expérience de ce stade. L'image du miroir n'est pas reconnue par l'enfant comme sa propre image, car il n'y pas médiatisation par le langage. Le sujet psychotique reste alors dans une certaine lutte que provoque cette collusion non médiatisée : le seul choix possible, c'est lui ou moi'. 66 Le sentiment d'identité et l'image du corps propre sont alors très altérés, et peuvent réapparatre des manifestations que Lacan rattache au fantasme du corps morcelé, comme les fantasmes archaïques d'écartèlement, d'éventration, ou encore de démembrement. 67 4. L'Œdipe Le désir, moteur et principe actif de la vie psychique, est lié aux premières traces de satisfaction de cette dernière. Il nat de l'expérience du manque par la séparation d'avec le corps maternel. Par cette perte, le désir de la mère, impossible à satisfaire, s'inscrit. Mais pour que l'enfant advienne en tant que sujet, le désir de la mère né de la symbiose initiale ne peut se prolonger. L'enfant ne doit pas, en effet, s'installer dans une relation duelle à la mère. C'est à ce moment qu'intervient l'interdit de l'inceste, structurant, ainsi que la mise en place de la triangulation père-mère-enfant par l'Œdipe. L'interdit de l'Œdipe apparat comme la structure sous-jacente à l'organisation apparente des sociétés. En effet, l'accès normal ou pathologique de l'enfant au statut d'être social, tout comme la conscience de son autonomie de sujet, va dépendre de la résolution du problème oedipien. Lacan va reprendre le complexe d'Œdipe de Freud par le biais des structures langagières et de leur processus, et va insister sur le rôle de l'Œdipe dans l'accès au Symbolique. 66 Mahenc S. (2000), p. 67 67 Exemples cités par Golse B. (2002), p. 153 40 4. 1. Étapes Lacan repère trois moments principaux dans le développement de l'Œdipe. Premier moment Même si l'enfant s'esquisse comme sujet par la phase identificatoire du miroir, il reste dans une relation d'indistinction quasi fusionnelle à la mère, et d'immédiateté, de dépendance totale à cette dernière. Cependant, ce n'est pas tant avec la mère qu'il est en relation, mais avec le désir de la mère. En effet, l'enfant cherche à s'identifier à ce qu'il suppose être l'objet du désir de la mère, et par là même se fait objet de ce qui est supposé manquer à la mère, c'est-à-dire le phallus68. Pour plaire à la mère et la combler, il se fait donc désir de désir. Le désir de l'enfant est ainsi radicalement assujetti au désir de la mère, et l'enfant est aliéné d'emblée à la problématique phallique sur le mode d'une oscillation dialectique : être ou ne pas être le phallus. Second moment Il est initié par l'intrusion paternelle dans la configuration du rapport mère-enfant- phallus. Le père intervient sur trois registres : sur le mode de l'interdiction (se présentant comme un ayant-droit , il interdit la satisfaction de l'impulsion 69), sur le mode de la privation (il prive la mère de l'objet phallique, manque réel d'un objet symbolique), et enfin sur le mode de la frustration ( la mère, comme elle est à lui, elle n'est pas à l'enfant. () Le père frustre bel et bien l'enfant de la mère 70, manque imaginaire d'un objet réel). Le père entre ainsi en scène sur la fonction fondamentale de père castrateur (la castration étant le manque symbolique d'un objet imaginaire). Le père apparat ici en tant qu'autre dans le rapport intersubjectif mère-enfant, mais aussi et surtout, pour l'enfant, en tant qu'objet possible du désir de la mère, c'est-à-dire en tant qu'objet phallique possible. De cette idée nat une rivalité imaginaire, dont l'enjeu est coextensif à un déplacement de l'objet phallique qui amène l'enfant à rencontrer la loi du 68 L'objet phallique est avant tout un objet dont la nature est d'être un élément signifiant. L'objet se trouve souvent évoqué par l'attribut phallique , et bien que primitivement l'élaboration de l'objet phallique se soutient en quelque sorte à partir de la réalité anatomique du pénis, cet attribut est à référer à une fonction symbolique. Le phallus n'est donc prévalent que comme référent symbolique, et il est l'élément signifiant attribué au père, ce qui lui confère le rôle de tiers dans la situation oedipienne. La promotion de l'objet phallique est occasionnée par la notion de manque ( le manque du pénis ). La question de la différence des sexes, réel élaboré psychiquement par l'enfant, surgit au moment o ce dernier persiste à vouloir qu'il manque quelque chose, construction imaginaire qui assigne au phallus sa nature imaginaire. (Dor J. (2002), pp. 93-95) 69 Lacan J. , Les Formations de l'inconscient , séminaire du 15 janvier 1958, in Dor J. (2002), p. 104 70 Ibid. 41 père . 71 L'enfant est confronté à cette dernière car il découvre que la mère en est tributaire en ce qui concerne la satisfaction qu'elle peut apporter à ses demandes. En d'autres termes, l'adresse du désir de l'enfant interpelle inévitablement la loi de l'autre à travers la mère . 72 L'enfant découvre alors la dimension la plus essentielle qui structure le désir comme ce qui soumet le désir de chacun à la loi du désir de l'autre 73 : c'est ce qui se passe pour la mère, soumise à cette loi. L'enfant va être détaché de son identification à l'objet du désir de la mère, et son désir va être lui-même dépendant d'un objet que l'autre, c'est-à-dire, ici, le père, est supposé avoir ou ne pas avoir. En effet, l'enfant perçoit que le désir est du côté du père, détenteur du phallus. Le père déloge alors l'enfant de sa position d'être le phallus. Ainsi, se fait le passage de la logique d'être ou ne pas être le phallus, à la logique d'avoir ou ne pas avoir le phallus. En résumé, l'enfant n'est plus l'objet phallique désiré par la mère, et doit même accepter de ne pas avoir le phallus. La possibilité d'être castré est essentielle dans l'assomption du fait d'avoir le phallus, car pour l'avoir, il faut déjà qu'il ait été supposé qu'on ne peut pas l'avoir. Enfin, pour que ce second temps ait lieu, il faut que le père intervienne de manière efficace, qu'il soit reconnu par la mère comme porteur de la Loi - écho de la Loi du groupe -. En effet, la mère doit reconnatre la parole du père, et porter ce dernier dans son discours. Troisième moment Il signe le déclin du complexe d'Œdipe. En effet, ce dernier temps permet l'anéantissement de la rivalité phallique dans laquelle, d'une part s'est installé l'enfant, et, d'autre part, dans laquelle l'enfant a installé le père. Le père intervient comme celui ayant le phallus, et non pas comme l'étant, et l'enfant accède à la symbolisation de la loi, accès hautement structurant. Cet accès passe par le fait que l'enfant a, à ce moment, la possibilité de repérer la place exacte du désir de la mère. Aussi, comme l'explique J. Dor74, l'enfant, comme la mère, se trouve [] inscrit dans la dialectique de l'avoir : la mère qui n'a pas le phallus peut le désirer auprès de celui qui le détient ; l'enfant qui en est également dépourvu, pourra ainsi le convoiter là o il se trouve . L'enjeu phallique entrane une certaine logique identificatoire, dans laquelle s'inscrira différemment l'enfant selon son sexe. Le garçon s'engage dans la dialectique d'avoir le 71 Dor J. (2002), p. 108 72 Ibid. 73 Lacan J. , Les Formations de l'inconscient , séminaire du 22 janvier 1958, in Dor J. (2002), p. 109 74 Dor J. (2002), p. 112 42 phallus en s'identifiant au père. La fille, elle, s'y engage sur le mode de ne pas l'avoir, et va s'identifier à la mère, qui sait de quel côté aller pour prendre le phallus. 4. 2. Métaphore paternelle et accès au symbolique Lors du second temps de l'Œdipe, le père réel, représentant de la Loi, est élevé au rang de père symbolique. En effet, d'une part la mère souscrit à l'énonciation de sa loi et, d'autre part, il est investi par l'enfant d'une signification nouvelle. A ce point, l'enfant est [] amené à se déterminer par rapport à cette fonction signifiante du Père qui est, à proprement parler, le signifiant symbolique Nom-du-Père . 75 Le refoulement originaire Lorsque l'enfant, lors de l'Œdipe, accède à la dimension de l' avoir (avoir ou ne pas avoir le phallus), il se soustrait à un vécu immédiat (dialectique de l'être, être l'objet du désir de la mère) pour lui en donner un substitut. Cette substitution marque la symbolisation primordiale de la Loi, symbolisation qui s'accomplit dans la substitution du signifiant Nom- du-Père au signifiant phallique. Cette métaphorisation constitue ce qu'on appelle le refoulement originaire, événement fondateur et structurant. Par cette opération inaugurale de langage, l'enfant, refoulant le signifiant phallique, s'applique à désigner symboliquement le renoncement à l'objet perdu. Ainsi, il ne se pose plus seulement comme objet du désir de l'Autre, mais bel et bien comme sujet . Le refoulement originaire peut alors se définir comme la mise à l'écart d'une signification qui, en vertu de la castration, se voit refuser la prise en charge par le conscient : la signification symbolique supportée par le phallus, objet imaginaire 76, et, au-delà-même, comme l'intervention intrapsychique qui va assurer le passage du réel immédiatement vécu à sa symbolisation dans le langage . 77 En outre, comme nous l'avons évoqué précédemment, et comme le souligne si bien Lacan, la parole est le meurtre de la chose , et si on ne peut 75 Ibid. , p. 110 76 Chemama R. , Vandermersch B. (2009), p. 493 77 Dor J. (2002), p. 117 43 avoir la chose (l'objet perdu) on la tue en la symbolisant par la parole . 78 C'est ce refoulement originaire qui va instituer la métaphore paternelle. La métaphore paternelle : le Nom-du-Père La fonction du père a émergé dans la psychanalyse au travers d'une élaboration mythique : le père est une vérité sacrée dont pourtant rien dans la réalité vécue n'indique la fonction ni la dominance car il reste d'abord une vérité inconsciente . 79 L'expression Nom- du-Père , à connotation religieuse, est celle que choisit Lacan pour mettre à jour le fait qu'il s'agit toujours d'une croyance : l'enfant doit donc accorder sa foi en la parole de la mère qui, en nommant le père, signifie qu'elle accorde elle-même sa foi à ce dernier. Le Nom-du-Père est une désignation s'adressant à la reconnaissance d'une fonction symbolique circonscrite au lieu d'o s'exerce la loi . 80 Cette désignation est le produit d'une métaphore, métaphore paternelle qui permet d'apporter un savoir (paternel) sur la Demande imaginaire maternelle dont l'enfant est objet. Le père devient ici le sujet supposé savoir, supposé restituer le phallus à l'endroit o la mère doit le chercher ; le Nom-du-Père limite ainsi la Demande maternelle. La métaphore paternelle se constitue de la manière suivante. S1, signifiant phallique, est, en premier lieu, associé au concept de phallus, s1. Ce signe S1/s1 est celui du désir de la mère. Un autre rapport signifiant s'élabore lorsque l'enfant se représente, en quelque sorte, la raison des absences de sa mère et qu'il peut la désigner en convoquant la référence du père symbolique. Il se figure ainsi une loi symbolique (concept) dont le signifiant S2 est le Nom- du-Père. Vient à ce moment la substitution métaphorique : le signifiant S2 n'est plus associé au concept s2, mais au signe linguistique S1/s1. On obtient ainsi S2/S1/s1. Le nouveau signifiant S2 s'est alors substitué, pour l'enfant, au signifiant du désir de la mère S1. Ce dernier fait l'objet d'un refoulement (le refoulement originaire), et devient inconscient. L'enfant, en nommant le Père nomme toujours l'objet fondamental de son désir, mais de manière métaphorique car il est désormais devenu inconscient. Le symbole du langage a donc pour vocation d'exprimer la pérennité de l'objet fondamental du désir dans une désignation s'effectuant à l'insu du sujet . 81 78 Lacan J. , in Dor J. (2002), p. 117 79 Chemama R. , Vandermersch B. (2009), p. 390 80 Dor J. (2002), p. 119 81 Ibid. , p. 120 44 L'accès au Symbolique L'enfant, par cette métaphore de l'ordre paternel, est introduit à l'ordre symbolique (notamment au langage) : le Nom-du-Père érige la parole sous les effets du refoulement et de la castration symbolique, enjeu intrinsèque du complexe d'Œdipe. L'enfant peut alors advenir comme sujet désirant et être social ; il peut se déprendre de l'assujettissement à la mère, relation duelle propre au registre imaginaire, pour passer à une relation ternaire médiate, propre au registre symbolique. Pour accéder à cet ordre symbolique, il faut que l'enfant accepte la Loi et que la mère reconnaisse au père cette position. Toute cette partie s'attache donc à révéler la manière dont le sujet advient au cours, si l'on peut l'exprimer ainsi, de deux naissances. La première est celle de la venue au monde, début de la vie indépendante de l'organisme maternel. La seconde serait celle de l'avènement dans et par le langage - langage qui apparat bien, d'ailleurs, comme trace de l'endroit o en est l'enfant de sa structuration psychique -. Mais il y a un certain mode de structuration psychique pour lequel la division par le langage ne se fait pas, pour lequel cette seconde naissance n'intervient pas ; il s'agit de la psychose, dont nous avons déjà évoqué certains aspects au cours de la précédente partie. Aussi allons-nous nous intéresser à, précisément, ce qui ne se fait pas pour les sujets psychotiques. Car, si fondé sur le langage social, l'interdit oedipien fait émerger le langage individuel de l'enfant par le biais du refoulement originaire , de l'absence de métaphore paternelle, découle la fixation de l'enfant à la relation duelle, à l'Imaginaire et l'inaccession au Symbolique qui définit la psychose . 82 5. L'impossible avènement dans le langage : la structuration psychotique 5. 1. La forclusion du Nom-du-Père, une première approche des processus psychotiques Freud, novateur, pose la nature du processus psychotique sur le terrain de la perte de la réalité . Le sujet serait coupé de la réalité, et il y aurait ainsi nécessité pour lui de la reconstruire sur un mode délirant. A la fin de son œuvre, Freud nuance ses propos quant à la question de la perte de la réalité : le névrosé fuirait la réalité, alors que le psychotique la 82 Golse B. (2008), p. 159 45 dénierait. Cependant, il ne parviendra pas à spécifier clairement l'étiologie du processus psychotique ainsi qu'à différencier structurellement psychose et névrose. A partir des travaux de Freud, Lacan va apporter une réflexion originale autour de l'échec du refoulement originaire dans la psychose, et de la métaphore paternelle qui, par conséquent, n'advient pas. Il parle alors de carence du signifiant lui-même : Essayons de concevoir maintenant une circonstance de la position subjective o, à l'appel du Nom-du- Père réponde, non pas l'absence du père réel, car cette absence est plus que compatible avec la présence du signifiant, mais la carence du signifiant lui-même () . 83 C'est alors la forclusion qui apparatrait comme ce qui peut faire échec au refoulement originaire, et comme ce qui serait à l'origine du fonctionnement psychotique. En effet, Lacan explique que, dans la psychose, le Nom-du-Père est forclos à la place de l'Autre, ce qui d'une part, neutralise l'avènement du refoulement originaire et, d'autre part, entrane l'échec de la métaphore paternelle. Le Père, au titre de sa fonction symbolique de castration, est ignoré. Or, c'est lui qui, dans l'ordre du langage, instaure la limite, la coupure et, du même coup, la vectorisation de la chane ou son sens . 84 Dans la psychose alors, le sujet, par l'effet de la forclusion, rencontre un pur et simple trou ouvert dans le Symbolique. Ce trou est à situer au niveau du réseau de signifiants élémentaires inconscient, et B. Golse le compare à une maille manquante dans une étoffe . Il ajoute également que la forclusion n'est pas le refoulement de quelque chose qui aurait existé, c'est l'empreinte, la trace, l'inscription en négatif d'un signifiant qui n'a jamais pris sa place . 85 L'enfant reste alors captif de l'ordre imaginaire : son accès au Symbolique se trouve fortement compromis, voire impossible et, dans une organisation archaïque, il reste esclave de la relation duelle à la mère. En effet, le Nom-du-Père n'advenant pas, l'enfant ne peut pas traiter la Demande imaginaire de la mère : le désir de la mère se présente alors comme sans limite, jouissance incontrôlable pour un sujet qui ne possède pas le signifiant phallique qui lui apporterait une signification. Le mécanisme de la forclusion, de manière générale et comme l'expliquent Laplanche et Pontalis dans le Vocabulaire de la psychanalyse 86, correspond donc à un rejet primordial d'un signifiant fondamental (par exemple : le phallus en tant que signifiant du complexe de castration) hors de l'univers symbolique du sujet . Ainsi, à la différence du processus de refoulement, les signifiants qui sont forclos ne sont pas intégrés à l'inconscient 83 Lacan J. (1966), D'une question préliminaire à tout traitement possible de la psychose , Ecrits, Paris : Seuil, pp. 531-583, in Dor J. (2002), p. 123 84 Chemama R. , Vandermersch B. (2009), p. 209 85 Golse B. (2008), p. 160 86 Laplanche J. , Pontalis J. -B. (2009), pp. 163-167 46 du sujet ; ils sont rejetés du symbolique, et réapparaissent dans le réel, sur le mode hallucinatoire par exemple. Les signifiants reviennent ainsi dans le réel sous forme d'une réalité marquée par le sceau de l'imaginaire et privée de dimension signifiante. Lors de ce rejet, le signifiant ne peut faire retour au lieu d'o il a été exclu, à l'inverse encore du refoulement au sein duquel le signifiant peut faire retour dans son lieu d'origine, le Symbolique, o il a primitivement été admis. C'est ainsi en raison de l'échec de l'Œdipe et de la forclusion que le sujet se structure sur un mode psychotique. L'enfant reste alors rivé à l'imaginaire, se voit privé de sa subjectivité et n'accède pas à l'ordre symbolique. L'accès au langage ne peut alors s'opérer convenablement. 5. 2. Seconde approche des processus psychotiques Lacan, toujours dans l'idée d'un retour à Freud , souligne l'importance, en ce qui concerne la réalité humaine, des trois registres distincts que sont le Symbolique, l'Imaginaire et le Réel. L'interaction de ces trois instances découle, entre autres, du stade du miroir, de la dialectique oedipienne et du complexe de castration, ainsi que de la métaphore du Nom-du- Père. Ces trois instances sont nouées entre elles selon le nœud borroméen, façon qu'a choisi Lacan de représenter la structure du sujet. 87 La caractéristique de ce nœud tient du fait que la coupure d'un seul des cercles entrane la déliaison des trois. Le rapport des catégories du réel, du symbolique et de l'imaginaire sont désormais à appréhender dans un rapport qui n'est plus contingent de trois rapports duels. Nous ne détaillerons pas les différents éléments qui s'articulent dans ce nouage. Nous noterons cependant que le sujet n'y est pas noté en tant que tel. C'est qu'il n'est que le 87 Nœud borroméen, tel qu'on le trouve traditionnellement représenté 47 résultat de l'opération : il est le nouage par lui-même, en même temps qu'il en est le référentiel . 88 Cette sorte de nouage ébauche le mode de structuration de la subjectivité. Dans son article D'une question préliminaire à tout traitement possible de la psychose 89, Lacan présente la dialectique de ce qu'il appelle le schéma R, schéma qui reprend cette même structuration subjective. A ce moment, il propose également une autre symbolisation de l'évolution psychotique, symbolisation qui va résider dans la transformation du schéma R en schéma I. Ce sont ces deux schémas que nous allons tenter d'expliquer. La complexité de leur infrastructure interne demanderait une explication plus détaillée et approfondie, mais dans un souci de clarté et de brièveté, nous resterons succinctes et schématiques quant aux différentes phases qui concourent à leur construction, et nous intéresserons principalement à leurs grandes lignes. De plus, les différentes étapes de la constitution du sujet commentées dans les parties précédentes permettent l'allégement de la démonstration qui va suivre. Il sera donc parfois nécessaire de s'en remémorer certaines grandes notions. Le schéma R En premier lieu, lors du stade du miroir, l'enfant est dans une relation d'indistinction fusionnelle avec sa mère et, s'identifiant au phallus, se trouve être aliéné au désir de cette dernière. Mais ce n'est que vis-à-vis du manque et de l'existence imaginaire du phallus - objet du manque - que cette interaction dynamique du désir entre la mère et l'enfant se nourrit et trouve sa cohérence. C'est alors, dans série de composantes imaginaires, que se met en place une triangulation mère enfant (considéré à ce stade comme assujet') phallus (représenté par le symbole ). La cellule de base du schéma R réside en ce triangle, et ce triangle va représenter le registre imaginaire. La figure paternelle va ensuite s'introduire dans cette dialectique oedipienne. Se produit ainsi la remise en question de l'identification phallique. L'enfant, se rendant compte de l'intérêt que porte la mère au père (ce dernier est celui qui mobilise le désir de cette première), s'aperçoit qu'il n'est pas tout pour elle. Il va ainsi mettre en place certaines corrélations signifiantes, si et seulement si la mère lui fait entendre le rôle privilégié du père à l'endroit de son désir, et que le père lui-même se positionne comme celui qui est dépositaire 88 Chemama R. , Vandermersch B. (2009), p. 386 89 Lacan J. (1966), D'une question préliminaire à tout traitement possible de la psychose (décembre 1957- janvier 1958), in Ecrits, Paris : Seuil, pp. 531-583 48 de la Loi. Avec l'arrivée du père, et la fluctuation de la place du phallus, la configuration imaginaire originaire est modifiée. S'opère ainsi un déplacement du lieu primitif imaginaire de la mère [] corrélé à l'intrusion du père sous l'emprise de la réalité . 90 Par la médiation signifiante suscitée par la mère entranant l'irruption de la dimension symbolique dans la dialectique oedipienne, l'enfant effectue lui-même un déplacement. Le registre symbolique survient dans le nouveau rapport qu'institue l'enfant entre le père et la mère. L'enfant, renonçant à s'identifier à l'objet du désir de la mère, s'en désassujettit ; il entre dans la dialectique de l'avoir et abandonne sa position initiale d'assujet au bénéfice de la position de sujet désirant qui s'ébauche . 91 Ainsi, la triangulation d'origine soumise initialement à la dimension imaginaire se voit modifiée, et la liaison mère-enfant déplacée. En effet, au-delà de l'épreuve de la réalité, cette liaison s'ancre dans l'espace symbolique o se trouvent désormais référés le père et la mère . 92 93 Comme l'explique J. Dor94, de ces déplacements restent des incidences dans la structuration subjective de l'enfant. Au départ, la ligne de liaison mère-enfant était le signe d'une relation strictement imaginaire. Mais le déplacement de ces deux figures va laisser deux lieux vacants o se cristalliseront, dans l'organisation psychique, des vestiges toujours présents de ces places imaginaires antérieures . D'une part, au lieu primitif o l'enfant avait situé la mère, l'image spéculaire i' va prendre place, c'est-à-dire la représentation imaginaire de l'objet fondamental du désir (la mère). D'autre part, au lieu o l'enfant s'était premièrement placé, on va désormais trouver son moi m', autrement dit une représentation imaginaire de lui-même qui va non sans rappeler son ancien statut aliéné d'assujet. A 90 Dor J. (2002), p. 284 91 Ibid. , p. 287 92 Ibid. 93 Schématisation proposée in Dor J. (2002), p. 287 94 Dor J. (2002), pp. 287-288 49 l'inverse, à la nouvelle position de l'enfant (c'est-à-dire à l'autre pôle de m' qui se situe dans l'espace symbolique, et sous l'incidence symbolique du père), s'esquisse l'Idéal du moi I'. Ainsi, triangle imaginaire et triangle symbolique se répartissent de part et d'autre de la bande de la réalité (appelée plus tard par Lacan le réel). 95 Enfin, l'ultime phase de la construction du schéma R coïncide avec le dénouement de la dialectique oedipienne, c'est-à-dire l'accession à la métaphore du Nom-du-Père. C'est le père symbolique qui est présumé détenir l'objet qui manque à la mère et le lui donner. Aussi, la translation de l'espace imaginaire à l'espace symbolique traduit la circulation de l'objet phallique sans laquelle l'enfant ne saurait pas repérer la place exacte de l'objet du désir de la mère qui lui permet de passer de l'état d'assujet à celui de sujet . 96 Au lieu d'inscription du phallus symbolique on retrouve alors le signifiant Nom-du-Père représenté par le symbole P, et l'enfant advenant en tant que sujet à la place de son identification originaire et imaginaire au phallus , on peut repérer au lieu du phallus imaginaire l'inscription du symbole S. 97 95 Schématisation proposée in Dor J. (2002), p. 289 96 Dor J. p. 289 97 Configuration du schéma R telle qu'elle est proposée in Dor J. (2002), p. 291 50 Voici d'autres éclairages et notions sur les différents symboles et éléments présents sur cette configuration complète du schéma R98 : - Avec les places i (l'image spéculaire) et m (le moi), la prégnance de l'imaginaire demeure. - Le symbole a, en M, désigne l'autre imaginaire. - Le symbole a', en I, désigne les identifications imaginaires formatrices du moi. - A, symbole du Grand Autre, se trouve au lieu P. - Le triangle imaginaire et le triangle symbolique sont disjoints par la bande du Réel MimI', mais cette bande les sépare tout aussi bien qu'elle les lie. - Dans cette même bande du Réel, si nous joignons i à I, et m à M, nous lui conférons une structure dite mbienne , obtenant ainsi une surface unilatère (une seule face et un seul bord). Ainsi, il est possible de parcourir cette surface en totalité sans ne jamais franchir aucun bord. Par voie de conséquence les espaces Imaginaire et Symbolique constituent une seule rondelle' suturée en totalité à cette bande du réel en raison du seul bord définissant la surface de la bande de Mbius (le schéma R, en deux dimensions, est une mise à plat'). L'on saisit alors un peu mieux l'organisation structurale du sujet, que la bande du réel semble représenter. Symbolique et Imaginaire sont liés entre eux par le réel de telle manière à ce que l'on puisse passer de l'un à l'autre et de l'autre à l'un de façon continue. Nous avons d'ailleurs vu, lors de l'explication de ce qui se joue au moment de l'Œdipe, combien la conquête du Symbolique renvoie tout aussi bien à l'Imaginaire , comme l'exprime si bien J. Dor. Le schéma I La dynamique du schéma I traduit la forclusion du Nom-du-Père expliquée précédemment. En effet, dans la psychose, le signifiant Nom-du-Père ne s'inscrit pas - au niveau de l'organisation subjective - au lieu de l'Autre, c'est-à-dire en A sur le schéma R. Toute la structure de la bande du Réel s'en voit altérée. Expliquons alors en quoi le reste du processus va être, en effet, modifié. Lorsque l'accession au Père Symbolique est défaillante, c'est-à-dire, lorsque la métaphore paternelle, qui inaugure normalement la chane signifiante pour un sujet parlant, n'advient pas, l'enfant ne peut ni accéder au Symbolique, ni se repérer par rapport au phallus imaginaire . Aussi, en l'absence de référence paternelle, l'enfant reste captif d'une relation d'immédiateté à la mère. Le schéma suivant reflète ces deux défauts d'inscription : 98 Dor J. (2002), pp. 290-293 51 99 Le mode de liaison exclusif entre l'enfant et la mère, c'est-à-dire la relation qui s'établit entre le moi et la mère, peut être représenté par la ligne m M. En raison toujours de la forclusion du Nom-du-Père, le sujet S n'advient pas comme $, sujet barré par le signifiant de la castration . Chaque message est authentifié symboliquement au lieu de l'Autre en tant que lieu du signifiant. En ce sens la fonction du père, à travers le processus de la métaphore paternelle, introduit donc, au premier chef, l'enfant au registre qui garantit une telle authentification. Pour peu que le signifiant matre Nom-du-Père n'advienne pas dans le procès de cette substitution métaphorique, alors tout le rapport que le sujet entretient avec l'ordre symbolique s'en trouve d'autant perturbé . 100 C'est alors au niveau même du point de capiton que se représente schématiquement cette faille dans l'accès au Symbolique. 101 On peut remarquer sur ce schéma que le trait, sur le vecteur $, est interrompu, signe d'un trou' dans le procès symbolique. Car, en l'absence du Nom-du-Père, l'authentification symbolique du message au point ne peut être garantie par A. C'est alors auprès de la mère, 99 Schématisation proposée in Dor J. (2002), p. 294 100 Dor J. (2002), p. 295 101 Schématisation proposée in Dor J. (2002), p. 295 52 instituée comme Autre, que le moi de l'enfant va chercher l'authentification symbolique. Mais Lacan dit de la mère psychotisante qu'elle est hors la loi ou encore qu'elle fait la loi , ce qui signifie qu'elle devient dépositaire d'une loi qui n'est pas la sienne, d'une loi qui n'est pas référée à la loi symbolique paternelle. Il ne lui est donc possible de garantir une quelconque authentification, et c'est ce défaut d'authentification symbolique qui sous-tend fondamentalement la relation de l'enfant à la mère sous la forme d'une rupture entre m et M . 102 Aussi, la structure de l'articulation de l'Imaginaire et du Symbolique par le Réel va être entièrement modifiée. Le franchissement réciproquement continu de l'Imaginaire au Symbolique ne peut se concevoir que si on appréhende la bande mimI selon une structure mbienne et, donc, que s'il est possible d'ériger une correspondance point par point entre I et i, et entre m et M. Or, une rupture apparat entre m et M. Par conséquent, la jonction i I va se tordre autour de cette cassure ; une continuité réciproque entre l'Imaginaire et le Symbolique est alors impossible. Nous obtenons ainsi deux branches d'hyperbole qui ne pourront jamais se joindre en s'ouvrant sur deux trous' : l'un schématisant l'absence du signifiant Nom-du-Père au lieu de l'Autre Po ; l'autre signifiant l'absence de phallus imaginaire permettant à l'enfant de se structurer comme sujet au regard de l'Autre o . 103 Voici alors le schéma I, dont la configuration est basée sur le schéma R : 104 102 Dor J. (2002), p. 296 103 Ibid. , pp. 296-297 104 Configuration du schéma I telle qu'elle est proposée in Dor J. (2002), p. 297 53 La structure du sujet en est donc plus qu'affectée, et des désordres vont apparatre, tant sur le versant symbolique que sur le versant imaginaire. Comment alors ces perturbations vont-elles se manifester sur le plan clinique ? III. Pensée et langage dans la psychose L'unicité de la structuration psychotique nous amène nécessairement à nous questionner sur les fonctions que sont le langage et la pensée. Car si cette seconde naissance' dans et par le langage s'avère compromise, et si le fonctionnement psychotique est si particulier, qu'en est-il également de la singularité du discours des sujets à traits psychotiques ? En quoi le langage témoigne-t-il de la spécificité même de leur pensée ? En outre, quel chemin le patient psychotique prend-il pour accéder au savoir, et par là même à la signification, au sens et à la fonction de communication ? Enfin, et de manière plus générale, en quoi le sujet psychotique se positionne-t-il dans le langage d'une manière si différente du névrosé ? Cette partie ne se veut nullement être exhaustive. Elle relate simplement les points qui ont attiré notre attention dans cette relation, elle aussi si singulière, avec les enfants qui tendent à se structurer sur le mode psychotique. Les thèmes ainsi dégagés tentent de révéler au mieux ce en quoi le langage de ces enfants témoigne d'une pensée, d'un certain rapport au monde, au savoir, mais également ce en quoi, de ces particularités dans le langage, est induit un rapport si singulier à la réalité. Cette partie présente alors des notions qui nous ont semblées intéressantes : elles requièrent toute notre attention en tant que futures orthophonistes. Ces notions pourront, peut-être, servir de base de réflexion à l'orthophoniste dans sa rencontre avec l'enfant à traits psychotiques, son langage, sa réalité. Elles ont été, en tout cas, celles qui, pour nous, ont permis de révéler et d'éclairer les grandes singularités de son rapport au langage, et ainsi, d'orienter le choix des épreuves du protocole. A certains moments, nous évoquerons les tendances paranoïaque et schizophrénique. Ce sont des diagnostics adultes, mais certaines caractéristiques permettront d'éclairer les particularités que nous aurons pu relever chez les enfants à traits psychotiques. 54 1. Particularités de la pensée psychotique 1. 1. Le rapport a la temporalité Le sujet de réflexion initial de Piera Aulagnier, quant au temps, se situait autour du travail de construction/reconstruction qu'opère l'analyse, et des conditions nécessaires pour parvenir à un tel travail. De là, elle s'est ensuite préoccupée de la possibilité ou de l'incapacité (comme c'est le cas dans la psychose) du sujet à prendre en considération la dimension temporelle. Grâce à l'ouvrage de S. de Mijolla-Mellor105, qui propose une lecture de l'œuvre de P. Aulagnier, nous allons nous intéresser à la question du temps et du rapport des sujets psychotiques à la temporalité. L'ignorance du temps, selon Freud, serait le propre des processus inconscients, qui ne sont ni ordonnés, ni modifiés dans et par le temps. En effet, il ne s'agit pas ici, lorsque l'on parle de processus, de l'inscription d'empreintes liées à des événements de vie, ni même de subir ce que suggère l'écoulement du temps, soit le vieillissement puis la mort. L'on peut donc parler d'atemporalité du temps de ces processus inconscients qui ne suivent pas l'évolution de l'individu. Cependant, cela ne veut pas dire que notre conscience, elle, marche au pas de l'horloge . En effet, la perception du temps est en fait une durée vécue, dans un conflit permanent ou une adaptation toujours à refaire, entre d'une part le temps soumis au principe de plaisir [], et d'autre part le temps de la réalité, qu'elle soit biologique, avec le vieillissement, ou sociale lorsque celle-ci en vient même à l'identifier à l'argent (Time is money) . 106 La temporalité, en psychanalyse, suppose les effets de décalage liés à une certaine dichotomie entre ignorance du temps d'une part, et soumission à celui-ci d'autre part. Mais, plus que l'ignorance du temps, ce serait sa connaissance qui pourrait poser problème. Pour P. Aulagnier, au même titre que l'accès à la temporalité est le propre du Je, le temps est un acquis auquel certains ne peuvent accéder. Elle cite, à ce sujet, les propos de l'un de ses patients : Le temps est un faux mouvement, on croit qu'il bouge mais ce n'est pas vrai. Je vous l'ai déjà dit, pour moi le temps est circulaire, je ne peux pas faire une différence entre le passé et le futur. Je ne peux plus faire une différence entre la vie et la mort. Je ne comprends rien à toutes ces dualités : passé/présent, vie/mort, présent/futur, homme et femme S'il y a 105 De Mijolla-Mellor S. (2006), pp. 166-181 106 Ibid. , p. 172 55 quelque chose de différent de la vie, ce n'est pas la mort mais autre chose, je ne sais pas quoi. 107 Très particulière et étonnante est cette façon qu'ont les sujets psychotiques de suggérer le temps, à la manière des cosmologies indigènes telles que les anthropologues ont pu les rapporter. Plus obscurément, cela rappelle également, d'une certaine manière, la logique enfantine, refoulée pour nous depuis longtemps, mais dont on peut trouver encore certaines traces dans nos rêves. Cette représentation circulaire, cyclique du temps peut, enfin, évoquer la théorie stoïcienne selon laquelle le temps est un incorporel , c'est-à-dire qu'il est purement conçu par la pensée. Le temps est alors un mouvement dans lequel chaque chose se répète, revient, au cours duquel rien de nouveau n'est produit, et o se déploie à chaque fois ce qui était avant ; ce que Nietzsche reprendra par l'expression l' éternel retour . Pour le patient de P. Aulagnier que nous avons cité précédemment, c'est toute la notion de différence qui semble abolie. Cela signe, pour l'auteur, l'impossible distance, distance qu'en effet la mère du futur sujet psychotique n'a pu imposer' entre elle et cette partie d'elle- même qu'est son enfant. La différence, si elle existe, dit [ce même patient], est ailleurs, peut-être reconstructible par le délire, mais à cette non-vie, cette vie atemporelle, rien ne peut être opposé parce qu'elle contient tout et ne peut donc être complétée par rien. 108 Le patient psychotique peut alors se situer dans une certaine dissociation entre un temps exclusivement abstrait (sans projet ni désir), et une solution délirante, intentionnellement hors du temps, de la mort, et, de manière générale, hors des contingences. Le temps propre à l'individu est étayé par le temps de l'histoire, ou de la société, mais l'individu doit également avoir été reconnu comme sujet à part entière, un sujet inscrit d'abord comme maillon au sein d'une généalogie, mais qui a pu, ensuite, opérer une sortie hors de l'univers familial. C'est ce qui, précisément, semble faire défaut chez le sujet psychotique, exclu de la vie dès l'origine , et qui par là même, ne peut élaborer une relation à la temporalité car celle-ci supposerait, entre autres, qu'il puisse l'endosser dans une mémoire et un projet. Il est intéressant alors de faire le rapprochement avec l'absence de résolution du conflit oedipien dans la psychose. L'expérience oedipienne permet la compréhension de notre inscription dans une lignée généalogique, les générations se succédant. Le temps est alors scandé par la succession d | HAL | Scientific |
Processus histopathologiques au cours de la phase initiale de l'inflammation parodontale | WMT16 | Scientific |
Résistance Des isolats cliniques de sensibilité diminuée au posaconazole ont été identifiés. | EMEA_V3 | Medicinal |
Le syndrome de compression du nerf saphène externe (ou nerf suralis) | WMT16 | Scientific |
Indications récentes de la chirurgie dans la maladie de Parkinson | WMT16 | Scientific |
Il n'est donc pas recommandé de recourir à de telles associations. | EMEA_V3 | Medicinal |
Institut Tropical Suisse de Bâle : pour les infirmières et les sages-femmes. Une nouvelle possibilité de formation | WMT16 | Scientific |
Les réactions d'hypotension graves nécessitent une intervention immédiate conformément aux principes en vigueur de la thérapie de choc. | EMEA_V3 | Medicinal |
Les microfistules coronaro-ventriculaires gauches | WMT16 | Scientific |
États des lieux et expertise de l'usage hors AMM du méthotrexate en gynécologie-obstétrique : travail du CNGOF | WMT16 | Scientific |
Vascularisation du bulbe caverneux. Aspect normal et pathologique (cas particulier du diabète) | WMT16 | Scientific |
Cette démarche peut nécessiter une biopsie endométriale afin d' éliminer une pathologie maligne. | EMEA_V3 | Medicinal |
Maternités précoces : profils sociodémographiques de 220 mères adolescentes en Seine-Saint-Denis Louise Genest, Hélène Decroix, Daniel Rotten, Laurence Simmat-Durand To cite this version : Louise Genest, Hélène Decroix, Daniel Rotten, Laurence Simmat-Durand. Maternités précoces : profils sociodémographiques de 220 mères adolescentes en Seine-Saint-Denis. Journal de Gyné- cologie Obstétrique et Biologie de la Reproduction, Elsevier Masson, 2014, 43 (5), pp. 351-360. 10. 1016/j. jgyn. 2013. 03. 009. inserm-00818831 HAL Id : inserm-00818831 Submitted on 29 Apr 2013 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. Résumé. Objectif : Dans le cadre de grossesses chez des adolescentes, il est souvent constaté une grande vulnérabilité et un suivi de grossesse de moindre qualité. Cette enquête vise à établir des profils de jeunes femmes et à évaluer ce suivi. Méthodes : Étude rétrospective (2007-2011) de 220 accouchements de femmes de 12 à 17 ans. Résultats : Le suivi de grossesse chez ces adolescentes reste globalement inférieur en qualité aux moyennes nationales françaises, mais des différences significatives sont observées lorsque l'on prend en compte des éléments sociodémographiques. Trois profils apparaissent : 66 adolescentes (groupe A) déclarent une surveillance de grossesse chaotique, avec une situation sociale, professionnelle, familiale peu renseignée. 102 adolescentes (groupe B) présentent un suivi de meilleure qualité mais la grossesse est très souvent non désirée avec une situation sociale instable. Enfin 52 adolescentes (groupe C) présentent un suivi plutôt de bonne qualité avec un investissement de la grossesse légèrement plus affirmé. Conclusion Tenir compte des conditions de vie de ces adolescentes est essentielle pour étudier les maternités précoces et pallier les vulnérabilités propres à cette population fragile. Un repérage des facteurs favorisant une surveillance de grossesse optimale chez ces jeunes femmes est mis en parallèle avec une réduction des risques obstétricaux et sociaux. Mots clefs : maternité précoce, adolescence, suivi de grossesse. 1 Summary. Objective : As part of teenage pregnancies, it is often found a vulnerability and a pregnancy follow-up of poorer quality. This investigation aims to establish profiles of young women and to assess what followed. Methods : A retrospective study (2007-2011) of 220 births to women aged 12 to 17. Results : The monitoring of these teenage pregnancies remains generally lower than France national averages, but significant differences are observed when one takes into account the socio-demographic factors. Three profiles appear : 66 teenagers (group A) reported a chaotic pregnancy monitoring, with a social, professional, family somewhat knowledgeable. 102 teenagers (group B) have a better follow-up but pregnancy is often unwanted with an unstable social situation. Finally 52 teenagers (group C) have a rather good quality monitoring with a more assertive investment of pregnancy. Conclusion To consider the lives of these young women is essential to study early motherhood and mitigate the vulnerabilities of this fragile population. An identification of factors favoring an optimal monitoring of pregnancy among young women is paralleled with reduced obstetric and social risks. Keywords : early motherhood, teenage years, pregnancy monitoring. 2 Introduction : La tendance observée en France entre 1980 et 2000 d'un recours plus fréquent à l'Interruption Volontaire de Grossesse (IVG) en cas de grossesse chez les mineures (de 1/3 à 2/3 des conceptions) s'est encore accentuée aujourd'hui. Les IVG représentent 75 % des conceptions de 2011 chez les jeunes femmes de moins de 18 ans (chaque année environ 4500 naissances sont observées contre 11 000 en 1980) [1-5]. Les maternités adolescentes restent donc un phénomène relativement modéré et en diminution constante depuis quelques décennies. Le département de la Seine saint Denis est le plus fécond de France avec en moyenne 2, 38 enfants par femme. Sur 2954 naissances en Ile-de-France en 2010 chez les moins de vingt ans, les données statistiques récentes font état de 627 naissances uniquement sur le département de la Seine-Saint-Denis. Le centre hospitalier de Saint-Denis est l'hôpital qui a vu natre le plus d'enfants issus de jeunes femmes de moins de 20 ans, soit 134 naissances sur l'année 2010. Parmi celles-ci notre enquête nous a permis d'identifier 45 mineures (Cf supra méthode). Il est très difficile d'obtenir des données chiffrées sur le nombre de grossesses chez les moins de 18 ans. Très souvent les découpages statistiques incluent des jeunes femmes de 19 et 20 ans, et c'est notamment le cas pour notre région d'étude [6]. Au niveau international, il existe évidemment des disparités mais dans la plupart des pays occidentaux, le nombre des naissances adolescentes tend à se réduire. Les taux les plus bas (5 à 7 naissances pour 1000 adolescentes de moins de 20 ans) se situent en Italie, en Suisse, aux Pays Bas, en Suède et en Slovénie. La France, l'Espagne et le Danemark occupent une position moyenne en Europe (autour de 11 ). Les taux les plus élevés sont ceux de la Roumanie (37) et du Royaume-Uni (27 ) [7-9]. La grossesse chez l'adolescente en France est considérée comme une situation particulière, dérangeante, qui soulève des problèmes médicaux et sociaux, posant la question de la contraception et celle de sa capacité à être mère. Notre intérêt particulier pour les jeunes mères s'appuie sur de nombreuses études nous indiquant qu'elles forment une population 3 cumulant plusieurs facteurs de vulnérabilité. En effet, la littérature tend à démontrer que les grossesses chez les adolescentes sont caractérisées essentiellement par un risque majeur d'accouchement prématuré et la naissance d'enfants de faible poids [10-15]. Ce phénomène s'expliquerait par l'immaturité biologique de ces jeunes filles (leur corps et la capacité à porter la vie n'est pas physiologiquement mature) et le manque de suivi médical au moment de leur grossesse. Selon le chercheur A. Khashan, la majorité de ces adolescentes a découvert sa grossesse tardivement et n'a pas effectué les examens prénataux nécessaires au bon déroulement de l'accouchement [10]. Cependant, l'incidence de ces risques s'infléchit sous l'influence d'un suivi optimal de la grossesse. D'autre part, certains facteurs socio démographiques récurrents, comme l'arrêt précoce de la scolarisation, l'absence d'activité professionnelle ou de relations familiales et sociales stables, semblent être inhérents aux mères adolescentes. Ces facteurs influent notablement sur le nombre de visites prénatales et la qualité du suivi obstétrical et périnatal. La présente enquête vise à présenter les caractéristiques sociodémographiques d'une population de mères adolescentes dans une étude rétrospective de 2007 à 2011 à l'hôpital Delafontaine (Saint-Denis, département de la Seine- Saint-Denis, Ile-de-France). Elle cherchera également à définir des profils sociaux à partir de cette population et à évaluer la prise en charge obstétricale de ces jeunes femmes. Méthodologie et population étudiée. 1) Le premier objectif de cette recherche quantitative a été tout d'abord de présenter une description la plus complète possible d'une population de jeunes femmes mineures ayant accouché au sein de la maternité du centre hospitalier de Saint-Denis (Hôpital Delafontaine) sur une durée de 5 années (1 janvier 2007 - 31 décembre 2011). L'ensemble de cette étude a été réalisée au sein même de ce service pendant un peu plus d'une année (de décembre 2010 à janvier 2012). 4 À partir des cahiers de naissances utilisés dans le service de la maternité, nous avons pu déterminer le nombre de jeunes femmes âgées de moins de 18 ans ayant donné naissance à un enfant, vivant ou non (Mort Fœtale In Utero MFIU- incluses), au sein de cet hôpital pendant ces années (nous n'avons pas tenu compte des IVG dans le cadre de cette recherche). Ainsi, 220 dossiers de femmes âgées de moins de 18 ans au jour de leur début de suivi de grossesse à la maternité ont été analysés de manière rétrospective : soit une quarantaine de grossesses par an. Sur la période de recueil, 15132 naissances ont été enregistrées à l'hôpital Delafontaine, l'un des plus importants centres hospitaliers du département de la Seine-Saint-Denis ; disposant d'une maternité de type III [16]. Les dossiers obstétricaux des jeunes femmes ont servi de base de recueil à partir des questions pré-imprimées et surtout des notes des soignants en marge du dossier. La base de données renseignée comportait 158 variables décrivant les conditions de vie de l'adolescente, ses comportements (consommation de tabac et contraception), son passé obstétrical, le suivi de sa grossesse (nombre d'échographies et de consultations), les conditions de l'accouchement, les caractéristiques du nouveau-né, des données sur le père de l'enfant. Une variable score de vulnérabilité a été créée pour évaluer le nombre d'éléments psychosociaux jugés préoccupants par l'équipe obstétricale pour chaque jeune mère mineure : le logement de la jeune mère pendant la grossesse, l'existence de violences subies, des antécédents de placements ou mesures éducatives, un rejet familial à l'annonce de la grossesse, la qualité de la relation mère/fille, la situation conjugale et enfin la parité. Le score est ainsi compris entre 0 et 9 pour chaque femme. Seront considérées comme vulnérables les adolescentes obtenant un score supérieur ou égal à 2. Les traitements statistiques ont été réalisés avec le logiciel Modalisa6 (Kynos, Paris, France) et le test du Khi2 a été utilisé pour comparer les effectifs. 2) Notre second objectif de recherche consistait à créer une typologie des profils de jeunes mères, construite à partir de variables sociodémographiques significativement associées à la 5 qualité du suivi de grossesse (soit : l'âge de la mère, l'année d'accouchement, le niveau d'éducation, l'activité professionnelle, la situation conjugale, la couverture sociale, l'origine ethnique, le logement, la prévision de la grossesse et son investissement). Une analyse factorielle des correspondances (AFC) a été utilisée pour mesurer les distances entre modalités. Dans Modalisa6, les classifications automatiques sont construites sur la base des distances entre individus sur les cartes d'AFC, le logiciel permet ensuite de créer une question fermée à partir des typologies : chaque profil présenté (A, B ou C) correspond alors à un type. 3) Enfin, notre dernier objectif a été d'évaluer les modalités de prise en charge de ces jeunes femmes en tenant compte des profils sociodémographiques créés antérieurement. La prise en charge a été modifiée au cours des années d'observation. En effet, une consultation spécialisée pour les jeunes femmes mineures enceintes a été mise en place depuis 2010. Entourée d'une équipe pluridisciplinaire, les jeunes femmes sont suivies très régulièrement et rencontrent successivement médecins, sages-femmes, puéricultrices, psychologues, assistantes sociales pour préparer la venue de leur enfant ; suivi qui peut se prolonger en suite de couches si les adolescentes le désirent. Ce travail en équipe a nettement influencé la qualité et la précision des données recueillies dans les dossiers qui se sont améliorées ces dernières années. Par contre les données recueillies sur les consommations de substances sont restées extrêmement lacunaires et imprécises, ne nous permettant pas de les exploiter, ni de les mentionner. Enfin précisons qu'une des variables de notre questionnaire concerne l'entretien prénatal précoce. Nous sommes partis du principe que toute les adolescentes qui ont débuté précocement la surveillance de leur grossesse (par exemple en PMI) ont bénéficié de cet entretien prénatal. Pour celles qui sont arrivées en maternité au 6e mois de leur grossesse, et qui n'en n'avaient pas bénéficié, le médecin référent le réalisait de manière systématique. 6 Ainsi, seules les adolescentes débutant un suivi de grossesse très tardif voire sans suivi n'en ont pas bénéficié. Résultats : Description de la population étudiée. Les adolescentes sont âgées en moyenne de 16 ans. La plus jeune mère est âgée de 12 ans et la plus vieille de 17 ans (Tab1). Majoritairement d'origine étrangère, seules 21 % des jeunes filles sont originaires de France métropolitaine et 10 % des DOM-TOM, un tiers est né en Afrique et essentiellement au Mali, Cap Vert et Congo, et 11 % dans une autre région. Dans une grande majorité, les adolescentes sont déscolarisées au moment de l'enquête. Seules 39 % d'entre elles déclarent être encore à l'école ou envisagent de poursuivre leurs études après la naissance de l'enfant et seulement 2 % déclarent occuper un emploi. 51 % de notre effectif s'est déclaré célibataire mais certaines peuvent avoir un compagnon sans vie commune. 69 % des adolescentes étudiées vivent chez leurs parents au moment de la grossesse, pourcentage stable en fin de grossesse. Parmi celles-ci 28 % des adolescentes ont déclaré vivre dans une caravane, au moment de leur grossesse comme après leur accouchement, ce qui correspond aux jeunes filles originaire de l'Europe de l'Est (Roumanie essentiellement). 16 % des adolescentes de notre étude rétrospective, ont-elles-mêmes vécu un placement, soit en famille d'accueil, soit en foyer de l'Aide Sociale à l'Enfance (ASE). 7 % des jeunes mères ont également été mises à la porte par leur famille au moment de l'annonce de la grossesse. 14 % ont déclaré avoir subi des violences physiques au cours de leur vie : plus de la moitié décrivent des violences familiales régulières (tante, oncle, beau-père /belle-mère et parents) mais aussi des violences de la part de leur conjoint. 7 jeunes filles ont déclaré avoir été violées. Parmi celles-ci, 5 ont souhaité garder leur enfant et 2 ont choisi une interruption médicale de grossesse. 4 adolescentes ont accouché sous X. Enfin le score de vulnérabilité révèle que 59 % de jeunes filles de notre étude rétrospective cumulent au minimum un facteur 7 de vulnérabilité pendant leur grossesse (Cf méthode). En ce qui concerne les pères de ces enfants, ils sont âgés en moyenne de 22 ans (écart-type 5, 4 ans) mais nous observons un taux de non réponse de 20 %, notamment lié au fait que les équipes soignantes s'intéressent trop peu aux conjoints des adolescentes, d'autant plus qu'ils restent majoritairement absents. Typologie de mères adolescentes. Afin d'affiner notre analyse, une typologie des femmes a été créée distinguant trois profils d'adolescentes. Les modalités décrites dans le tableau 1 permettent de spécifier les différences entre les profils de jeunes femmes. Le profil A correspond à 66 femmes essentiellement âgées de 12 à 15 ans. Ces adolescentes sont très largement déscolarisées (91 %), leur revenu propre ou leur activité professionnelle demeurent souvent inconnus, de même, elles déclarent rarement une protection sociale. Cependant leur situation conjugale et les rapports entretenus avec la famille apparaissent positifs : souvent en couple (73 %) ou déjà mariées (42 %), leur conjoint et leurs proches sont présents autour d'elles. Essentiellement originaires d'Europe de l'Est et plus précisément de Roumanie, ces adolescentes appartiennent à la communauté des gens du voyage : ces jeunes filles vivent principalement en caravane pendant la grossesse et après leur accouchement. Elles déclarent, presque unanimement, ne pas avoir utilisé de moyens de contraception avant d'être enceintes et sont plutôt réticentes à la proposition d'en prendre un après la naissance. Leur suivi de grossesse est très souvent inexistant ou chaotique : elles n'ont eu que peu de contacts avec l'équipe obstétricale. Les consultations obstétricales et les échographies sont très insuffisantes, tardives et il y a rarement de suivi précoce. Ces adolescentes donnent naissance à leur enfant très souvent par voie basse naturellement (86 %), généralement sans aucun analgésique (notamment parce qu'elles n'ont pas consulté l'anesthésiste avant l'accouchement). Seulement 54 % d'entre elles ont donné naissance à leur enfant au-delà des 37 semaines d'aménorrhée. 8 Le profil B regroupe 102 femmes majoritairement âgées de 15 à 17 ans. Encore scolarisées pour une large majorité (72 %), ces jeunes femmes ont un niveau secondaire et souhaitent souvent reprendre leurs études après la naissance de leur enfant. Elles déclarent être célibataires à 79 % et le père de leur enfant est peu présent ou investi dans la grossesse. De même, les reconnaissances anticipées sont très rares pour leurs enfants. Ces adolescentes sont originaires plus souvent de France métropolitaine (44 %), vivent encore chez leurs parents à 77 %, mais nombreuses sont celles qui sont aussi hébergées (20 %), notamment dans des structures d'accueil type foyer de l'Aide Sociale à l'Enfance (14 %). Elles ne déclarent presque aucune ressource financière propre mais disposent d'une protection sociale. neuf adolescentes sur dix ont déclaré ne pas avoir désiré la grossesse actuelle mais l'ont fait suivre convenablement : le nombre de consultations et d'échographies semble répondre aux exigences légales. De même, 74 % d'entre elles ont déclaré avoir été prises en charge avant leur entrée à la maternité de l'hôpital (notamment par le service de PMI). Elles sont souvent en contact avec les professionnels de santé. Elles ont bénéficié à 57 % de l'entretien prénatal précoce du 4e mois et 31 % d'entre elles ont participé aux cours de préparation à l'accouchement. 77 % de ces jeunes mères donneront naissance à un enfant à terme. Enfin, le profil C correspond à 52 femmes en majorité âgées de 17 ans. Seul un quart d'entre elles est encore à l'école au moment du suivi de grossesse et 6 % travaillent déjà. Majoritairement d'origine sub-saharienne (40 %), ces adolescentes sont en couple à 67 %. Elles vivent presque majoritairement hébergées (48 %) au sein de leur famille ou chez des amis. 23 % vivent avec leur partenaire dans un logement qui leur est propre. Notons un pourcentage non négligeable d'adolescentes vivant à la rue ou dans un squat (10 %). Le père de l'enfant occupe souvent un emploi (54 %) et participe financièrement au bien-être du couple. De même, il s'investit plus souvent dans la grossesse et la venue de l'enfant. Les grossesses sont un peu plus désirées dans ce groupe de jeunes femmes (36 %). La surveillance 9 de la grossesse parat convenable avec un nombre de consultations et d'échographies à peu près satisfaisant. De même, elles sont nombreuses à déclarer un suivi précoce de grossesse avant l'entrée en maternité (notamment en PMI) et un contact régulier avec les équipes soignantes (71 % d'entre elles ont vu au moins une fois un psychologue). Leur grossesse est menée à son terme dans 83 % des cas. Caractéristiques des divers types. - L'analyse de ces 3 profils révèle des différences sociodémographiques notables : la variable de l'âge reste peu révélatrice mais les adolescentes du groupe C sont légèrement plus âgées. De même, des différences d'origines géographiques apparaissent très distinctement. La situation conjugale de ces adolescentes est aussi très contrastée : ce sont les jeunes femmes du groupe A qui déclarent vivre en couple le plus souvent (73 %) dont 43 % déjà mariées, versus 3 % dans le groupe B. La situation professionnelle révèle également des divergences importantes : Ce sont les adolescentes du groupe B qui sont encore scolarisées dans une large majorité (72 %) par rapport aux autres jeunes mères (et notamment les adolescentes du groupe A massivement déscolarisées). Ce sont elles aussi qui vivent le plus souvent encore chez leurs parents au moment de leur grossesse, à l'inverse du groupe C dont un quart déclare vivre dans un logement personnel. Enfin la variable score de vulnérabilité révèle des disparités notables : alors que les jeunes filles du groupe A sont susceptibles d'être davantage exposées à divers facteurs de vulnérabilité, notamment parce que le suivi de leur grossesse est inexistant et leur situation sociale, professionnelle, familiale, médicale est extrêmement peu documentée, ce sont celles qui apparaissent être les moins vulnérables. Les adolescentes du groupe B sont celles qui apparaissent les plus vulnérables (66 %), suivies de près par les jeunes filles du groupe C (65 %). Pour ces deux derniers profils, des violences répétées ont été observées pour presque 20 % d'entre elles et 9 % de ces jeunes femmes ont été mises à la porte à l'annonce 10 de leur grossesse. Enfin, 12 % des adolescentes du groupe C ont déjà vécu un placement antérieur. - La majorité des adolescentes n'a pas fait usage de contraception avant la grossesse (66 %), avec des différences significatives selon le profil social et 64 % ont déclaré ne pas avoir prévu la grossesse. Ce sont les adolescentes du profil C qui sont les plus nombreuses à exprimer un désir d'enfant (36 %). A l'inverse les jeunes mères pour lesquelles la grossesse n'a pas été planifiée ni désirée, sont significativement plus souvent seules, décrivant une défaillance de leur partenaire, et appartiennent au groupe du profil B (90 %) : elles sont généralement scolarisées. Ce sont également des jeunes femmes qui vivent encore chez leurs parents avec des ressources financières faibles ou inexistantes. Les prises en charges obstétricales. - A propos de la surveillance de la grossesse, une jeune fille sur deux a été prise en charge avant l'entrée à la maternité de l'hôpital. Parmi celles-ci, 35 % ont été prises en charge par le service de PMI1, 10 % par un médecin généraliste de ville, 9 % par un autre hôpital et enfin 1 % par un service social scolaire, avec cependant un taux de non réponse très important (45 %). Cependant des différences persistent : les jeunes femmes du profil B et C sont bien plus nombreuses (73 % et 69 %) à engager un suivi précoce de leur grossesse que celles du profil A (seulement 11 %). Cette prise en charge précoce semble influencer la qualité du suivi de toute leur grossesse car elles ont eu un nombre de consultations obstétricales et d'échographies plus important. De même, elles ont été plus souvent en contact avec les professionnels de santé et sont davantage impliquées dans la préparation de la venue de leur enfant en participant plus souvent au cours de préparation à l'accouchement : les différences sont ici flagrantes si l'on compare le profil A avec les profils B et C. Enfin, cette prise en charge précoce est fortement corrélée au terme de la grossesse : les adolescentes ayant eu un 1 Centre de PMI Protection Maternelle et Infantile 11 suivi précoce de leur grossesse avant l'entrée à l'hôpital sont significativement plus nombreuses que les autres à donner naissance à un enfant à terme. Au niveau du suivi obstétrical, les adolescentes ont bénéficié de cinq consultations prénatales en moyenne (5, 9- écart type 4, 2) et de deux échographies en moyenne (2, 36 écart type 1, 77) mais près de 47 % en ont eu moins de trois. Ici, les femmes les moins bien suivies étaient les femmes appartenant au groupe A, puisque près d'une adolescente sur deux n'a bénéficié d'aucune consultation obstétricale. Au sein de notre étude rétrospective, seules 41 % des jeunes filles ont bénéficié d'un entretien prénatal précoce, avec un net avantage pour les profils B et C. Presque la totalité des adolescentes appartenant au groupe A n'a pas bénéficié de l'entretien prénatal du 4e mois (98 %). Discussion. Le recueil rétrospectif de données au sein du centre hospitalier de Saint Denis nous a permis d'avoir un aperçu du phénomène des maternités précoces dans ce département de l'Ile-de-France qui concentre le plus grand nombre de grossesses adolescentes. Sans pour autant affirmer traiter le sujet dans sa globalité, notamment parce que nos données recueillies reposent sur le déclaratif des adolescentes comme des professionnels de santé, cette première étude nous a permis de déterminer trois profils de jeunes femmes et d'évaluer la qualité du suivi de leur grossesse. Il est également important de signaler qu'une partie du suivi de grossesse de ces jeunes femmes peut nous avoir échappé, surtout s'il était chaotique (adolescentes du groupe A par exemple) et réalisé par plusieurs acteurs de santé. Ces éléments peuvent conduire à une sous-évaluation de la qualité effective du suivi entre les groupes. Par ailleurs, le contexte de la grossesse ainsi que son suivi vont dépendre fortement du temps que les soignants accordent à chaque femme ainsi que la qualité de la communication établie avec elle. De même, comme évoqué en méthode, la qualité des données recueillies s'est améliorée entre 2007 et 2011, suite à la mise en place d'une consultation spécialisée pour ces adolescentes. Il est donc probable qu'il existe des erreurs de classement entre différentes 12 modalités d'une caractéristique étudiée. Enfin la minorité des adolescentes a été évaluée au moment du début de la prise en charge de la grossesse. Les jeunes femmes non suivies ou très tardivement, mineures en début de grossesse mais pas à la fin n'auront pas été incluses. Nous avons vu que les adolescentes de notre étude rétrospective se répartissent notablement au sein des trois profils créés : les plus jeunes appartiennent au groupe A et les plus âgées au groupe C. Pour autant, la variable de l'âge n'a pas révélé dans nos traitements statistiques de réels impacts sur la qualité du suivi de grossesse. En effet, l'hypothèse selon laquelle des adolescentes âgées de 17 ans seraient plus aptes que les plus jeunes à surveiller correctement leur grossesse en raison d'une maturité supposée n'a pas été vérifiée dans cette étude. La littérature tend à démontrer que globalement les grossesses chez les mineures sont moins bien suivies que les grossesses adultes, sans distinction précise de l'âge de ces adolescentes. Nos données corroborent ces résultats et nous le soulignerons par la suite [14, 17]. D'autres éléments sociodémographiques semblent bien plus pertinents pour évaluer le suivi de grossesse. Effectivement, la variable de l'origine géographique s'est révélée ici très significative : les jeunes femmes concernées par ces grossesses précoces sont plus souvent originaires d'Europe de l'Est et d'Afrique sub-saharienne. Nous constatons que ces observations semblent correspondre aux statistiques fournies par l'INED (entre 2005 et 2010) qui décrivent une répartition mondiale des grossesses adolescentes assez différenciée avec une fécondité très élevée en Afrique subsaharienne. De même, en Europe, la Roumanie présente, chez les jeunes femmes, l'un des taux de fécondité les plus élevés de l'Union [18]. Dès lors, la question se pose d'une grossesse précoce qui pourrait répondre à un phénomène culturel. Ce constat a été largement repris par des sociologues mais aussi des médecins qui évoquent le mariage et la maternité précoces chez des jeunes filles mineures (d'origine étrangère très souvent) comme une réponse à une dimension culturelle importante. Le professeur Michel Uzan évoque alors le concept de grossesses culturelles , qui s'avère ici très caractéristique : 13 dans de nombreuses sociétés africaines, Est-européennes ou maghrébines, avoir un enfant est très valorisant. La grossesse est un rite de passage au cours duquel les jeunes filles deviennent des femmes adultes. Ces grossesses sont alors très souvent programmées, attendues par un couple ou une famille. Ainsi, la maternité précoce est très différente chez ces adolescentes puisqu'elle s'insère dans un cadre culturel, social et familial favorable à la naissance d'enfants chez des jeunes mères [19-21]. Ces observations ont été vérifiées au sein de notre étude : c'est notamment le cas des profils A et C. Ces adolescentes sont bien souvent déjà mariées ou en couple. Ces grossesses apparaissent alors plus souvent désirées, investies (notamment les adolescentes du profil C) et se déroulent globalement de façon simple. Dans son travail ethnographique sur des roms roumains vivant en le-de-France, C. Knaff indique que les jeunes filles présentes sur le campement choisissent leur mari et se marient globalement vers 14-15 ans. Ce mariage, très important, doit perdurer toute la vie et ces femmes se doivent d'avoir beaucoup d'enfants. Compte tenu de l'âge précoce au mariage et de la faible couverture contraceptive, il est donc fréquemment observé des grossesses parmi les adolescentes roms [22]. Bien que les profils B et C se rejoignent sur ce sujet, nous verrons que leur suivi de grossesse est en tous points très différents. Il est donc tout à fait important de tenir compte du contexte culturel et social dans lequel la grossesse évolue [23]. Le taux de scolarisation nous a aussi interpellés : il est souvent évoqué un risque de déscolarisation important et une mauvaise intégration sociale chez les mères adolescentes. Nombre d'auteurs évoquent la survenue d'une grossesse à l'adolescence comme un risque d'exacerbation des difficultés socioéconomiques avec la déscolarisation en tête : notre étude tend à le confirmer puisque majoritairement les jeunes filles étudiées sont en dehors du circuit scolaire au moment de leur grossesse. Selon Faucher et al (2002), devenir mère pour une adolescente peut s'avérer être une stratégie d'adaptation pour échapper à une scolarité peu 14 valorisante : cela pourrait être un moyen de valorisation puisqu'accéder à un statut de mère confère un statut social. Avoir un enfant leur octroierait une situation plus enviable d'autonomie et de respect par l'entourage [3]. Nous avons malheureusement peu d'information sur le taux de scolarisation après accouchement des jeunes femmes de notre étude et seule une minorité d'entre elles a fait part d'un projet professionnel ultérieur à l'équipe obstétricale. Ce phénomène est en lien avec le jeune âge de ces mères qui, comme beaucoup d'adolescents, vivent très souvent dans l'instantanéité, avec une difficulté à se projeter sur le long terme [24]. L'éviction scolaire risque alors d'aggraver le pronostic social ultérieur de la jeune femme et de son enfant par conséquent. Pour de nombreux auteurs, c'est un risque psychosocial important dont une menace d'inadaptation sociale et professionnelle, des difficultés de logement, une précarisation des conditions de vie, une absence de ressources financières propres [25-27]. Enfin, nos données montrent que ces adolescentes sont minoritaires à déclarer vivre dans un logement qui leur est propre (5%) ce qui est habituel pour ce groupe d'âge [21, 24]. Par contre nous constatons une multiplication des situations d'hébergement (amis, familles, structures d'accueil) voire de jeunes femmes à la rue. Ces fragilités se sont vérifiées au travers de notre variable score qui révèle que plus de la moitié des jeunes filles de notre cohorte cumule au moins deux facteurs de vulnérabilité pendant la grossesse. Les plus concernées, rappelons-le, sont les adolescentes du profil B, qui loin de mener une grossesse culturellement encouragée et souhaitée sont celles qui apparaissent les plus vulnérables. Leur grossesse ne présente donc pas le même dessein : plus souvent accidentelles, survenant dans le cadre d'une sexualité mal ou non protégée, elle pourrait être le résultat d'une conduite à risque et vue comme une solution pour échapper à une scolarité ou un milieu familial perturbé. La naissance de l'enfant risque alors d'aggraver leur précarité et leur isolement [2, 3]. La question de la contraception a également été soulevée dans cette étude mais majoritairement 15 les jeunes filles n'en ont pas fait usage avant leur grossesse. Les adolescentes du profil A sont celles qui paraissent les plus réticentes face à la contraception, même après la naissance de leur enfant : l'association Médecins du Monde estime que les femmes roms sont généralement peu demandeuse de moyen de contraception même si cela tend à changer (notamment parce que l'information autour de la contraception comme outil de régulation des naissances est fortement déficiente en Roumanie). L'enquête, conduite en 1999 par questionnaire quantitatif auprès de 78 personnes roms de nationalité roumaine vivant sur trois terrains à Gennevilliers, permet d'apporter des précisions. Parmi les femmes interrogées, 97 % ont déclaré n'avoir jamais eu recours à un moyen contraceptif. L'âge moyen à la naissance du premier enfant était de 17 ans. Les femmes ont déclaré en moyenne 6, 2 grossesses. Le recours à l'IVG (autorisé depuis 1957 en Roumanie) constitue alors le principal mode de régulation des naissances ce qui pose de larges problèmes pour les autorités de santé [22]. Bien que la problématique paraisse différente pour les profils B et C, les explications sur cette absence de moyens de contraception ou sa mauvaise utilisation sont multiples et tendent à mettre en évidence un paradoxe dérangeant : en France o la couverture contraceptive est la plus élevée au monde, o l'âge moyen au premier enfant approche des trente ans, le nombre d'IVG chez les mineures reste toujours très élevé [28]. Et c'est bien là que se situe la contradiction : les adolescentes françaises ne sont pas des contraceptives assidues. Des problèmes d'observance, d'utilisation, de coût ou la crainte d'un rendez-vous gynécologique avec tout ce que cela suggère (peur de l'examen ou d'un secret professionnel non respecté) peuvent expliquer ce constat [29]. De même, nombreuses sont celles qui associent la prise de la pilule à de nombreux préjugées obsolètes comme la prise de poids ou la stérilité. Enfin, bien souvent les histoires amoureuses sont, à cet âge, de courte durée. L'utilisation de la pilule n'est pas alors forcément adéquate. Ces explications omettent la dimension inconsciente du désir de grossesses chez certaines jeunes femmes pour lesquelles la maternité offre une 16 échappée, la promesse valorisante d'un statut et d'une identité sociale, une tentative de réparation d'une enfance tumultueuse [26]. Le principe de réalité va alors agir comme un couperet dans leurs illusions prénatales. Être enceinte peut être aussi un moyen de tester sa fertilité, de vérifier l'intégralité de son corps, de s'assurer que ce dernier fonctionne correctement [29]. Le suivi de grossesse des adolescentes de notre étude et le nombre de consultations prénatales et d'échographies réalisées restent globalement inférieurs aux données nationales françaises. Dans l'enquête nationale périnatale, plus de neuf femmes sur dix ont bénéficié d'au moins sept visites prénatales en 2010 [30]. Au sein de notre étude rétrospective, le nombre de visites n'est que de cinq consultations prénatales en moyenne. Il convient cependant de modérer ces données en fonction de la durée de gestation et du moment de la déclaration de grossesse : les femmes accouchant prématurément consultent moins en raison d'une grossesse plus courte et quand la déclaration est tardive, les premiers examens n'ont pas pu avoir lieu. Ainsi, au sein de notre étude rétrospective, 43 % des déclarations de grossesse sont faites au cours du 2e trimestre. En ce qui concerne le nombre d'échographies, les données nationales estiment qu'en France en 2010, les femmes ont eu recours à un peu plus de cinq échographies en moyenne, alors qu'au sein de notre étude, les jeunes femmes ont eu deux échographies en moyenne. De même, la surveillance de grossesse débute majoritairement tardivement, autour du 2e trimestre. Cependant, la typologie laisse apparatre des différences caractéristiques qui ont un impact majeur sur le suivi de la grossesse. Notre étude a montré que le mauvais suivi des grossesses, ou un suivi insuffisant reste inhérent aux jeunes filles appartenant au groupe A. Nous avons vu que la grossesse chez une adolescente est culturellement valorisée dans ce groupe et s'inscrit dans le maintien d'une identité collective. Pour autant, le suivi de grossesse reste insuffisant et tardif, bien qu'il ne semble pas être propre aux mères adolescentes mais bien aux femmes enceintes de cette origine en général. Le constat, commun aux acteurs 17 intervenant auprès des roms, est la quasi-absence de suivi des femmes roms pendant leur grossesse. Selon les données de Médecins du Monde recueillies auprès des femmes roms en 2007, seule une femme sur dix était suivie durant sa grossesse. Il n'est ainsi pas rare que des femmes viennent aux urgences des maternités le jour de l'accouchement, sans consultations prénatales préalables. Cette enquête révèle également une tendance des femmes à ne pas percevoir la grossesse comme nécessitant une médicalisation [22]. Dès lors, les risques pour le nouveau-né d'une prise en charge tardive sont notables et plus fréquents dans ce groupe de jeunes femmes. Méfiance ou souhait volontaire d'éviter les circuits de prise en charge de la grossesse, leurs motivations sont peu connues tant leurs contacts avec les équipes soignantes sont rares. Ce même rapport met en relief différents éléments explicatifs : l'accès aux soins est souvent tardif en raison de l'absence d'ouverture de droit et de l'irrégularité de leur situation sur le territoire. La logique de l'urgence est très différence au sein de la population roms qui va parfois privilégier d'autres situations du quotidien à celui du suivi de grossesse, surtout si tout parat normal (le logement, trouver des ressources ). L'absence de stabilité des lieux de vie propre aux populations roms constitue également une rupture dans le processus du suivi de ces femmes et fragilise fortement les liens établis avec les équipes soignantes. Enfin, leur rapport au corps est particulier : le recours au soin semble se faire lorsque le problème de santé constitue un handicap dans le quotidien [] les roms ne sont à l'écoute de leur corp que lorsque ce dernier crie une souffrance intolérable [22]. A l'inverse, les adolescentes du groupe B et C ont eu un suivi de grossesse de meilleure qualité et l'état de santé de leur enfant est moins préoccupant. Pour les jeunes filles du groupe B, cette meilleure prise en charge pourrait s'expliquer par le fait qu'elles sont encore scolarisées massivement (72 %), souffrant ainsi d'une exclusion sociale moins forte que leurs congénères, les rendant davantage informées sur les offres de soin et les circuits de santé. Quant aux jeunes filles du groupe C, elles sont un peu plus nombreuses que les autres à 18 déclarer désirer leur grossesse, elles sont majoritairement en couple et leur investissement est plus notable avec une surveillance de grossesse engagée avant l'entrée en maternité. Autant d'éléments qui influencent la qualité d'un suivi de grossesse et le pronostic vital de l'enfant. Par ailleurs, comme évoqué antérieurement, nous n'avons pas développé la question de la consommation de substances ni avant ni pendant la grossesse, bien que notre questionnaire contenait ces items. Les dossiers obstétriques consultés ne renseignaient pas suffisamment les usages de substances pour qu'ils soient exploitables. Moins d'1% des jeunes filles ont déclaré consommer de l'alcool, du cannabis ou des drogues pendant leur grossesse. Le tabac reste le plus consommé, occasionnellement ou tous les jours pour 19, 5 % des adolescentes en début de grossesse (pourcentage non varié en fin de grossesse) et concerne essentiellement les jeunes femmes du profil A. Les effets du tabac sur la prématurité, le retard de croissance intra utéro mais aussi le risque de mort subite du nourrisson sont aujourd'hui extrêmement bien documentés. Or cette variable s'est avérée très mal renseignée dans notre questionnaire [31]. D'autre part, nous avons vu qu'une prise en charge précoce influence notablement la qualité du suivi de grossesse et le pronostic vital de l'enfant à natre. Depuis deux ans déjà, l'hôpital Delafontaine, a mis en place une consultation spécialisée et exclusivement réservée à la surveillance de la grossesse chez des jeunes femmes mineures. Une équipe pluridisciplinaire, constituée de sage-femmes, psychologues, assistantes sociales, puéricultrices, propose un accompagnement précoce et continue pour ces adolescentes, notamment caractérisé par la mise en contact de la jeune mère avec divers acteurs sociaux et de santé. Ainsi, une consultation avec une assistante sociale et une psychologue est proposée obligatoirement à toute mineure enceinte au cours de sa grossesse. L'entretien prénatal précoce est aussi un outil qui trouve toute sa place dans l'accompagnement du suivi de grossesse chez une jeune mineure, tout en tenant compte de son histoire de vie. Proposé à toutes les femmes enceintes, au cours du 4ème mois de grossesse, il doit permettre de préparer avec elles les meilleures 19 conditions possibles de la venue au monde de leur enfant, notamment en repérant la vulnérabilité de certaines populations dites à risque que sont, entre autres, les mères adolescentes. Il convient d'insister sur l'extrême diversité de ces grossesses adolescentes et sur l'importance de l'entourage et du contexte culturel dans lequel l'adolescente évolue pour préparer au mieux avec elle la naissance de son enfant. Pour autant, il ne faut pas perdre de vue que ces adolescentes se font suivre tardivement et il ne faut donc pas réduire cet entretien à une limite temporelle fixe mais plutôt permettre aux soignants comme à l'adolescente de pouvoir s'exprimer lorsque le moment sera le plus juste. De même, un partenariat avec les équipes de réseaux (PMI, planning familial, centre hospitalier etc. ) semble renforcer l'étayage nécessaire à une meilleure surveillance de grossesse chez une très jeune femme. La qualité du suivi de grossesse est un facteur important à analyser avant d'étudier les éventuelles complications obstétricales chez les mères adolescentes. L'exploitation de cette enquête va donc être poursuivie à ces fins, pour examiner l'influence de ces profils de jeunes mères sur les caractéristiques de leurs nouveau-nés. Remerciements. Ce travail bénéficie d'un soutien financier de la région Ile-de-France, sous forme d'une allocation doctorale pour une durée de trois années. 20 Tableau 1 : caractéristiques sociodémographiques et contexte de la survenue de la grossesse/ Socio~démographic characteristics and context of the pregnancy Caractéristiques Pop totale Profil A Profil B Profil C sociodémographiques : N 220 N 66 N 102 N 52 % de primipares 89, 0 75, 8 98, 0 88, 2 Age moyen à l'accouchement 16, 1( 0, 9) 15, 9( 1, 5) 16, 2(0, 9) 16, 4( 0, 6) 1, 1 ( 0, 3) 1, 2 ( 0, 5) 1, 0 ( 0, 2) 1, 1( 0, 3) 0, 08 ( 0, 3) 1, 2 ( 0, 5) 0, 1 ( 0, 3) 0, 08( 0, 3) 0, 07( 0, 2) 0, 02 ( 0, 1) 0, 1( 0, 2) 0, 1( 0, 5) Parité moyenne Nombre d'IVG2 Nombre de FCS3 Age à l'accouchement 12-14 ans 15-16 ans 17 ans Origine géographique : France métropolitaine Dom Tom Afrique Europe de l'Est Autre région Situation conjugale : en couple : -dont mariée célibataire 51, 4 ignoré Situation professionnelle : Non scolarisée 2, 3 50, 9 2 IVG : interruption volontaire de grossesse. 3 FCS : Fausse couche spontanée. P * * ns ns ns * * * 21 5, 5 47, 7 46, 8 20, 9 9, 5 25, 0 32, 7 11, 9 46, 3 17, 7 10, 6 53, 0 36, 4 0 0 3, 0 95, 5 1, 5 4, 9 45, 1 50, 0 39, 2 17, 6 31, 4 2, 0 9, 8 72, 7 18, 6 42, 4 22, 7 4, 5 90, 8 2, 9 79, 4 2, 0 21, 8 0 46, 2 53, 8 11, 5 5, 8 40, 4 13, 5 28, 8 67, 3 15, 4 32, 7 0 57, 7 Scolarisée Sans activité Travaille 39, 4 7, 3 2, 4 Logement durant la grossesse : Chez ses parents : -dont caravane (gens du voyage) Hébergée : -dont structures -dont famille, amis Personnel Rue, squatt Ignoré Variable vulnérabilité : Non vulnérable Vulnérable Grossesse désirée : Oui Non Ignoré Conflits familiaux : * Mise à la porte Violences -dont viols Placements antérieurs 69, 1 28, 2 20, 9 6, 8 14, 1 5, 5 2, 7 1, 8 40, 7 59, 3 14, 5 63, 6 21, 8 6, 8 14, 1 3, 2 16, 2 0 7, 7 1, 5 95, 5 93, 9 1, 5 0 1, 5 0 1, 5 1, 5 57, 4 42, 6 9, 1 28, 8 62, 1 1, 5 3, 0 0 0 *Totaux différents de 100 % car variables multiples. 72, 3 4, 0 2, 0 77, 5 0 19, 6 14, 7 4, 9 0 0 2, 9 33, 7 66, 3 6, 9 90, 2 2, 9 8, 8 19, 6 4, 9 28, 7 25, 0 11, 5 5, 8 19, 2 0 48, 1 0 48, 1 23, 1 9, 6 0 35, 4 64, 6 36, 5 55, 8 7, 7 9, 6 17, 3 3, 8 11, 8 * * * ns * * * 22 Tableau 2 : Le suivi prénatal/ Prenatal Care. Suivi de grossesse Pop totale Profil A Profil B Profil C N 220 N 66 N 102 N 52 1, 5 81, 8 16, 7 10, 8 89, 2 15, 4 81, 5 3, 1 56, 7 38, 3 5, 0 18, 8 12, 5 68, 8 1, 5 98, 5 0 28, 4 53, 9 17, 6 73, 5 26, 5 4, 1 43, 9 52, 0 7, 1 61, 6 31, 3 13, 3 60, 2 26, 5 56, 9 41, 2 2, 0 19, 2 69, 2 11, 5 69, 2 30, 8 2, 0 46, 0 52, 0 2, 0 66, 7 31, 4 10, 0 64, 0 26, 0 59, 6 38, 5 1, 9 Contraceptif avant la grossesse Oui Non Ignoré 18, 2 65, 9 15, 9 Suivi antérieur à la maternité : Oui Non 53, 9 46, 1 Nombre total de consultations : Aucune De 1 à 6 Sept et Nombre d'échographies : Aucune De 1 à 3 Plus de 3 7, 0 55, 9 37, 1 20, 0 56, 2 23, 8 AG4 à la 1ere échographie : 1er trimestre 2e trimestre 3e trimestre 13, 3 52, 8 33, 9 Entretien prénatal précoce : Oui Non Ignoré 40, 9 57, 7 1, 4 4 AG : Age gestationnel. * * * * * * 23 Prise de contact avec une psychologue Oui Non Ignoré Accouchement 60, 9 38, 2 0, 9 15, 2 84, 8 0 85, 3 13, 7 1, 0 71, 2 26, 9 1, 9 AG : Moyenne en SA5 37, 8 ( 4, 1) 37, 7 ( 3) 37, 6 (4, 8) 38, 1 (3, 5) AG < 37 SA (en %) Voie d'accouchement : Voie basse naturelle Voie basse instrumentale Césarienne Analgésie Péridural ou rachi anesthésie Anesthésie générale Rien 71, 4 71, 5 17, 3 11, 2 56, 7 4, 7 38, 6 54, 5 85, 7 9, 5 4, 8 20, 6 4, 8 74, 6 76, 5 71, 0 19, 0 10, 0 70, 2 5, 0 24, 8 82, 7 54, 9 23, 5 21, 6 74, 5 3, 9 21, 6 ns : non significatif ; * p 05 ; * p ; *p * ns * * * 5 SA : Semaine d'aménorrhée. 24 Références. 1. Aubin, C. and D. Jourdain Menninger, Rapport Igas : La prévention des grossesses non désirées : contraception et contraception d'urgence. 2009, Inspection générale des affaires sociales : Paris. 2. Filou, A. , La maternité à l'adolescence : une prise en charge spécifique ? Etude comparative 1998-2010 sur une population d'adolescentes ayant menées leur grossesse à terme dans la même maternité. , ed. E. U. Europeennes. 2011, Paris. 3. Nisand, I. and L. Toulemon, Pour une meilleure prévention de l'IVG chez les mineures. 2006, Haut conseil de la population et de la famille : Paris. 4. Dugeny, F. , Fécondité soutenue en Ile-de-France. Note rapide Population-Mode de vie, 2008. 443. 5. Galaup, K. , Parcours de santé et interruption volontaire de grossesse, A. R. d. Santé, Editor. 2012, ARS. p. 22-28. flux périnatalité. 2010 : Paris. Bajos, N. , A. Guillaume, and O. Kontula, Le comportement des jeunes européens face à la santé génésique. Etudes démographiques, 2004. 1(42) : p. 149. 6. 7. 8. Daguerre, A. , Les grossesses adolescentes en France et en Grande-Bretagne. Un phénomène dérangeant pour les pouvoirs publics. Informations sociales, 2010(157) : p. 96-102. 9. Pison, G. , Les maternités précoces en recul dans le monde. Population & sociétés. Bulletin mensuel d'information de l'Institut national d'études démographiques. , 2012(490) : p. 1-4. 25 10. S Khashan, A. , P. N Baker, and L. C Kenny, Preterm birth and reduced birthweight in first and second teenage pregnancies : a register-based cohort study. BMC Pregnancy and Childbirth 2010. 10(36) : p. 10. 11. Berrewaerts, J. and F. Noirhomme-Renard, Les grossesses à l'adolescence : quels sont les facteurs explicatifs identifiés dans la litterature ? , E. p. l. santé, Editor. 2006, UCL - RESO, faculté de médecine de Louvain : Louvain. p. 36. 12. Godeau, E. , et al. , Facteurs associés à une initiation sexuelle précoce chez les filles : données françaises de l'enquête internationale Health Behaviour in School-aged Children (HBSC)/OMS. Gynécologie Obstétrique & Fertilité, 2008. 36(2) : p. 176-182. 13. OMS, Adolescentes enceintes : apporter une promesse d'espoir dans le monde entier, UNFPA, Editor. 2007 : Suisse. p. 26. 14. Scheidegger, S. and A. Vilain, Disparités sociales et surveillance de grossesse. Etudes et résultats, 2007(552) : p. 1-8. 15. Moutquin, J. -M. , Classification and heterogeneity of preterm birth. BJOG : An International Journal of Obstetrics & Gynaecology, 2003. 110(20) : p. 30-33. 16. Insee, Bilan démographique 2009. Pages de profils, Nord Pas-de-calais. , 2010. 72 : p. 4. 17. Charreire, H. , Impact conjugué des déterminants sociaux et géographiques sur le suivi de la grossesse en milieu urbanisé. , in Congrès national des Observatoires régionaux de la santé. 2008 : Marseille. 18. Pison, G. , Communication à la 3e journée humanitaire sur la santé des femmes. , G. s. frontière, Editor. 2011 : Paris. 26 19. Dedecker, F. , et al. , Etude des facteurs de risques obstétricaux dans le suivi de 365 grossesses primipares adolescentes à l'le des la Réunion. J Gynecol Obstet Biol Reprod, 2005. 34 : p. 694-701. 20. Uzan, M. , Rapport sur la prévention et la prise en charge des grossesses des adolescentes. 1998, Université Paris XIII, Assistance Publique - Hôpitaux de Paris, INSERM U 361 : Bondy. p. 31. 21. Faucher, P. , S. Dappe, and P. Madelenat, Maternité à l'adolescence : analyse obstétricale et revue de l'influence des facteurs culturels, socio-économique et psychologiques à partir d'une étude rétrospective de 62 dossiers. Gynécologie Obstétrique & Fertilité. , 2002. 30 : p. 944-952. 22. Halfen, S. , Situation sanitaire et sociale des Rroms migrants en le-de-France. Rapport de l'Observatoire régional de santé d'le-de-France. 2012, ORS le-de- France : Paris. p. 146. 23. Hamada, H. , Grossesse et accouchement chez l'adolescente : caractéristiques et profil. J Gynecol Obstet Biol Reprod, 2004. 33 : p. 5. 24. Le Van, C. , Les grossesses à l'adolescence. Normes sociales, réalités vécues. , ed. L'Harmattan. 1998, Paris. 204. 25. Mottrie, C. , L. de Coster, and I. Duret, Devenir mère : transformations des liens et des lieux familiaux lors des grossesses survenant à l'adolescence. Cahiers critiques de thérapie familiale et de pratiques de réseaux, 2006. 37(2) : p. 121-137. 26. Mouras, J. -P. , Être mère à l'adolescence. Figures de la psychanalyse, 2004. 9(1) : p. 97-101. 27 27. Verdure, F. , et al. , Connaissances, besoins et attentes des adolescents en éducation sexuelle et affective. Étude réalisée auprès d'adolescents de classes de troisième. Archives de Pédiatrie, 2010. 17(3) : p. 219-225. 28. Alvin, P. , Contraception chez l'adolescente : le grand paradoxe. Archives de Pédiatrie, 2006. 13(4) : p. 329-332. 29. Bajos, N. and M. Ferrand, De la contraception à l'avortement. Sociologie des grossesses non prévues. Questions en santé publique, ed. Inserm. 2002, Paris. 30. Brocas, A. -M. , La situation périnatale en France en 2010. Etudes et résultats. . 2011, Dress : Paris. 31. Delcroix, M. -H. , C. Gomez, and B. Dautzenberg, Grossesse et tabac : les leçons de trois études pour améliorer les pratiques professionnelles. La revue Sage-Femme, 2012. 11 : p. 81-86. 28 | HAL | Scientific |
Syncopes associées au prolapsus mitral. Mécanismes | WMT16 | Scientific |
L'intérêt de l'examen cytologique des frottis de surface dans le diagnostic des cancers O. R. L | WMT16 | Scientific |
Comment conserver Bondronat 6. | EMEA_V3 | Medicinal |
La signification sociale du message humain | WMT16 | Scientific |
Les mycines curarisantes | WMT16 | Scientific |
En raison des données de tolérance et d'efficacité limitées, filgrastim doit être administré avec précaution chez les patients atteints de LAM secondaire. | EMEA_V3 | Medicinal |
Suivi thérapeutique pharmacologique du felbamate | WMT16 | Scientific |
Le service médical rendu par RISPERIDONE ARROW 1mg/ml, solution buvable est insuffisant dans le traitement de courte durée (jusqu'à 6 semaines) de l'agressivité persistante chez les patients présentant une démence d'Alzheimer modérée à sévère ne répondant pas aux approches non-pharmacologiques et lorsqu'il existe un risque de préjudice pour le patient lui-même ou les autres, compte-tenu de l'importance de la prise en charge non médicamenteuse, de l'usage déconseillé des antipsychotiques chez les personnes atteintes d'une maladie d'Alzheimer ou d'une maladie apparentée, des effets indésirables de la rispéridone et de sa faible efficacité en cas de comportement agressif, de la difficulté à mettre en place un traitement de courte durée. | BDPM | Medicinal |
Une analyse par un modèle de régression logistique sur la valeur prédictive du génotype (ajustée aux valeurs à l'inclusion de la charge virale plasmatique ARN VIH-1 [ARNv], du taux de lymphocytes CD4 , et du nombre et de la durée des traitements antirétroviraux précédents) a montré une réponse réduite à la semaine 4 lorsqu' au moins 3 mutations associées à une résistance aux INTI étaient présentes (p 0, 015) et à la semaine 24 lorsqu' au moins 4 mutations étaient présentes (p 0, 012). | EMEA_V3 | Medicinal |
Détermination des paramètres de complexation Les mesures polarographiques ont été réalisées avec un polarographe de type 626 Polarecord associé à un stand de type 623A Stand de Metrohm en utilisant le mode SMDE (Static Mode Dropping Electrode) Il permet de suivre la teneur en métal libre dans la solution de polymères On dispose dans la cellule de mesure de trois électrodes plongeant dans la solution à étudier : -une électrode de référence Ag : AgCI avec une double jonction, -une électrode auxiliaire (anode) en platine, -une électrode de travail (cathode) à goutte de mercure constituée par un capillaire de faible diamètre alimenté par une colonne de mercure Les conditions de mesure sont les suivantes : dans la cellule de mesure à 22 2 C : -10 mL d'eau ultra pure, -10 mL de tampon HEPES à pH 7 (Sigma Aldrich) 10 1 M Le tampon HEPES est souvent utilisé car il * G Guibaud, S Dupuy, S Comte, F Bordas, M Baudu * est reconnu qu'il ne se complexe pas avec les métaux -1 mL de KN0 (1 M) comme électrolyte support, -1 à 3 mL de PEC (pour obtenir une masse sèche d'environ de 0, 5 mg) les paramètres de mesure du polarographe sont les suivants : -mode SMDE -balayage des potentiels : Pb : -0, 20 à -0, 50 V et Ni : -0, 65 à -1, 15 V, -taille de la goutte de mercure : intermédiaire, -temps de chute de la goutte ls Des courbes de titration polarographique des PEC par le métal sont réalisées Elle consiste à mesurer l'évolution de la concentration en métal libre dans la solution Après chaque ajout de métal (20 à 50 uL à 10 2 M, pH 4), la solution est placée sous agitation pendant 15 min, puis laissée au repos 5 min (temps nécessaire pour obtenir l'équilibre de complexation) avant la mesure L'étude théorique de l'équilibre de complexation peut être décrite de la manière suivante en supposant la formation d'un complexe de ratio 1 : 1 (Ruzic, 1996) : La spectrométrie infra-rouge placeholder formula Les spectres infra-rouge obtenus avec les 8 PEC étudiés présentent des allures identiques Des exemples de spectres infra-rouge obtenus avec des PEC des bactéries sont présentés à la figure 1 L'analyse des spectres à partir des données de la littérature permet d'identifier les groupements fonctionnels suivants : OH, N-H, 0-C-N, C 0, 0-C 0, C-H Ces groupes fonctionnels sont présents dans les protéines et les polysaccharides L'analyse spectrale confirme bien la composition biochimique des PEC déterminée précédemment (tableau 2) et montre la présence de groupements ionisables capables de se complexer avec des métaux Détermination des pKa Le tableau 3 montre les résultats obtenus sur les différentes solutions de PEC C Guibaud, S Dupuy, S Comte, F Bordas, M Baudu Le nombre de sites de complexation obtenu permet de comparer la capacité des PEC à lier les métaux Les résultats obtenus à partir des deux méthodes de modélisation des titrages polarographiques, sont identiques Ils montrent une différence de capacité de complexation entre les différents PEC étudiés Les PEC extraits des bactéries, à l'exception des PEC issus de la souche 8, présentent un nombre de sites de complexation plus élevé pour le plomb que pour le nickel (figure 3) Cette différence peut s'expliquer par le fait que les PEC sont issus du seul bacille gram positif de cette étude Les essais de corrélation entre le nombre de sites de complexation et la composition biochimique des PEC (protéines, polysaccharides, acides uroniques, acides nucléiques) ne montrent pas de résultats significatifs Cependant, comme le présente la figure 4, une corrélation significative apparat entre la teneur en phosphore et le nombre total de sites de complexation Cela montre que plus la teneur en phosphore augmente, plus les PEC complexent le plomb et le nickel présente la corrélation linéaire simple significative obtenue entre l'état de dissociation des sites de complexation calculé à partir de la CEP pour un pH de 7 et le nombre de site de complexation obtenu pour le plomb ai) ' aï ' aï ' ai ' 04 ' as ' a Sites des PEC dissociés (pmol. g' 1 MS) FIGURE 5. -Corrélation entre l'état de dissociation des sites de complexation (en mmol. g 1 de MS) calculé à partir de la CEP pour un pH de 7 et le nombre de site de complexation obtenu pour le plomb (en mmol. g 1 de MS), (Intervalle de confiance à 95 %, n 7, r 0, 79, p 0, 038) La corrélation significative (si on ne tient pas compte des résultats obtenus avec les PEC issus de la souche 3) obtenue entre l'état de dissociation des sites de complexation calculé à partir de la CEP pour un pH de 7 et le nombre de sites de complexation obtenu pour le plomb souligne le rôle des fonctions protonables portées par les PEC dans leur aptitude à complexer les métaux Ces résultats sont en accord avec les résultats et qui montrent l'importance des fonctions carboxyliques et phosphoriques dans l'aptitude des PEC à complexer des métaux De plus, la corrélation de la figure 5 montre que le nombre de sites dissociés à pH 7 est inférieur au nombre de sites de complexation du Pb Ces résultats soulignent que les fonctions protoniques ne sont pas la seule explication aux mécanismes de fixation des métaux des PEC D'autres mécanismes peuvent intervenir tel que la précipitation, les échanges ioniques, les interactions électrosta-tiques CONCLUSION Cette étude confirme que la composition et les propriétés des PEC dépendent de leur origine La spectrométrie infra-rouge a permis de mettre en évidence la présence de fonctions carboxyliques, phosphoriques, phénoliques, aminés et hydroxyles L'état de dissociation des groupements fonctionnels des PEC peut expliquer en partie la capacité des PEC de la boue à complexer les métaux (cas du Pb) à pH 7 D'autres mécanismes comme les interactions électrosta-tiques, la précipitation, les échanges ioniques peuvent intervenir dans la fixation des métaux par les PEC Cette étude de laboratoire réalisée sur du matériel biologique issu de bactéries isolées de l'environnement a permis de mettre en évidence quelques paramètres affectant l'aptitude des PEC à fixer des métaux La composition et les caractéris-tiques des polymères utilisés dans ce travail sont vraisemblablement proches des polymères pouvant être extrait de biofilms présent dans les canalisations Cependant, les facteurs physico-chimiques influençant la fixation des métaux sont à vérifier sur des PEC issus directement de biofilms présents dans les | ISTEX | Scientific |
Cancer du rein avancé et/ ou métastatique (CRm) | EMEA_V3 | Medicinal |
Contribution des hôpitaux de jour en psychiatrie dans le champ contemporain de la santé mentale au Québec | WMT16 | Scientific |
OU EN EST LE TRAITEMENT DU CANCER PROSTATIQUE | WMT16 | Scientific |
Entérite sévère à cytomégalovirus au cours du SIDA. Evolution favorable sous traitement médical | WMT16 | Scientific |
La prise en charge du sida chez les femrnmes | WMT16 | Scientific |
Métabolisme du granulocyte dans l'inflammation | WMT16 | Scientific |
Contribution 2013 du CCAFU au référentiel INCa : Sarcomes du rétropéritoine | WMT16 | Scientific |
Etiologie et diagnostic des phlébites profondes méconnues. Indications thérapeutiques | WMT16 | Scientific |
Tumeur de l'orbite par spongioblastome du nerf optique | WMT16 | Scientific |
Hémangiome avec syndrome de Turner | WMT16 | Scientific |
Injection intra musculaire ou sous cutanée de 0. 25 ml, 0. 5 ml ou 1 ml en fonction de l' âge et de l' espèce. | EMEA_V3 | Medicinal |
A propos de la deipidation des lipoprotéines par la technique à l'alcool-éther | WMT16 | Scientific |
Très rare : dyspnée | EMEA_V3 | Medicinal |
De l'emploi des antigènes du tréponème Reiter dans la sérologie de la syphilis et dans l'étude des phénomènes de sensibilisation allergique | WMT16 | Scientific |
Etude, par lectrophorése en gel de polyacrylamide et par immunoélectrophorèse, des protéines du lobe antrieur de l'hypophyse des têtards d'Alytes obstetricans Laur | WMT16 | Scientific |
Trachéostomies médiastinales par lambeau myocutané du grand pectoral en lot | WMT16 | Scientific |
7, 3%) et de 0, 1 sous placebo (valeur initiale : | EMEA_V3 | Medicinal |
Thrombopénie et mononévrite multiple | WMT16 | Scientific |
L'infarctus du myocarde " ; rudimentaire" ; ou non transmural. Lésions coronariennes, évolution et pronostic | WMT16 | Scientific |
Le sexisme dans la science moderne se traduit par une représentation biaisée des hommes et des femmes dans le discours scientifique, censé pourtant respecter un principe de neutralité. Les femmes sont définies par rapport à l'homme, ou inscrites dans une hiérarchie et infériorisées, ou assignées à un rôle unique (celui de reproductrices par exemple) ; le choix des thèmes de recherche peut également révéler un parti pris sexiste. Les sciences modernes, tout particulièrement les sciences de la vie, ont ainsi perpétué des stéréotypes de genre, et justifié quelquefois les inégalités entre hommes et femmes, . L'intervention de valeurs sociales androcentriques dans la production du savoir scientifique a été mise en lumière depuis les années 1990 par les gender studies. Cet article aborde ces questions pour la période du XIXe au XXIe siècle.
Les biais de genre qui affectent la connaissance peuvent éventuellement s'expliquer par la prépondérance des hommes dans les milieux scientifiques ; le problème de la sous-représentation des femmes dans les échelons supérieurs des institutions scientifiques est traité dans un article séparé, Place des femmes en sciences.
La question de la neutralité de la science
L'étude du sexisme dans le discours scientifique s'est longtemps heurtée à une forte résistance parce qu'elle suppose que des valeurs ou des idéologies interviennent dans la production, l'acceptation et la validation d'hypothèses savantes, en contradiction avec l'idéal de neutralité de la science. Quelques avancées ont eu lieu dans ce sens dès les années 1950-1960 ; le philosophe des sciences Ernest Nagel esquisse en 1961 une réflexion générale (sans rapport avec le sexisme) sur cette question, affirmant : les difficultés générées dans l'enquête scientifique par des biais inconscients et des orientations tacites en matière de valeur sont rarement résolues par de pieuses résolutions d'éliminer les biais. Elles sont en général surmontées, et souvent seulement progressivement, par les mécanismes auto-correcteurs de la science, en tant qu'entreprise sociale . Ce sont surtout les historiennes féministes des sciences qui ont montré l'importation des valeurs dominantes dans le contenu des sciences, et souligné la prégnance d'une idéologie sexiste dans le discours académique.
Malgré ses prétentions à l'objectivité, le discours scientifique subit les effets des rapports sociaux ; dans un contexte de domination masculine, la pratique de la science tend à promouvoir les intérêts et le point de vue des hommes. Plus le groupe producteur du savoir est homogène, plus les biais risquent d'être prononcés.
Biais au XIXe siècle
Au XIXe siècle se met en place dans la science une hiérarchisation des différences entre les sexes ; l'homme apparat comme un modèle achevé, tandis que la femme est présentée en comparaison comme physiologiquement immature, intellectuellement inférieure et moins évoluée.
Immaturité physique de la femme
Le naturaliste Julien-Joseph Virey (1775-1846) est un de ceux qui fondent la dévalorisation des femmes sur l'idée de leur croissance physiologique incomplète : la femme est semblable à l'enfant et condamnée à demeurer dans la dépendance de l'homme. La femme se rapporte à l'enfance en beaucoup de choses , écrit Virey, qui compare à titre d'exemple la dentition des hommes et des femmes : On a remarqué, dit-il dans son Histoire naturelle du genre humain (1800), que la femme avait souvent un plus petit nombre de dents molaires que l'homme (les dents dites de sagesse ne sortant pas toujours dans plusieurs femmes) .
L'absence de sperme est un autre exemple de l'incomplétude des femmes toujours selon Virey : la femme est semblable à l'individu privé de sperme, ou telle que l'eunuque ou l'enfant ; or pour ce même auteur le sperme dont la femme est dépourvue est la condition de l'accomplissement physique et moral : le sperme, et l'ardeur, l'énergie qu'il imprime à tout le corps viril, fortifie les muscles, tend le système nerveux, grossit la voix, fait sortir les poils et la barbe, () inspire le courage, les hautes pensées, rend le caractère franc, simple, magnanime . L'homme donne, la femme reçoit ; elle a besoin d'un partenaire masculin, lequel jouit d'une surabondance de force.
Influence du physique sur le moral
L'infériorité intellectuelle des femmes est présentée au début du XIXe siècle comme la conséquence d'une croissance physiologique avortée avant que l'étude du crâne et du cerveau des femmes n'apporte dans la deuxième moitié du siècle de nouvelles preuves en ce sens , . Ainsi toujours selon Julien-Joseph Virey, toute la constitution morale du sexe féminin dérive de la faiblesse innée de ses organes ; tout est subordonné à ce principe par lequel la nature a voulu rendre la femme inférieure à l'homme . La femme sera nécessairement toujours au-dessous de la perfection dans les sciences, les lettres ou les arts . Inférieure par la faiblesse de la physiologie de ses organes, la femme l'est donc aussi par ses capacités intellectuelles : par nature, sensibilité, mobilité et maternité rendent la femme incapable de raison ; à l'inverse, force, profondeur, persévérance font de l'homme un être principalement créé pour l'exercice de la pensée et de l'industrie (Virey, article homme ).
Crâne et cerveau
Dans la deuxième moitié du XIXe siècle la craniologie (étude des formes du crâne) prend son essor ; les comparaisons de crânes d'Européens et de non-Européens conduit à mettre au point des critères scientifiques qui dévalorisent des peuples dits primitifs ; ces mêmes critères, repris dans des études comparatives de crânes d'hommes et de femmes, servent ensuite à établir l'infériorité intellectuelle des femmes.
Le prognathisme, ou projection en avant de la mâchoire, est ainsi promu comme un indice caractéristique des nations les plus dégradées d'Afrique et des sauvages de l'Australie selon les termes du médecin anglais James Cowles Prichard en 1849 ; puis le prognathisme devient le propre des femmes : les femmes sont dans l'humanité plus prognathes [. ] que les hommes , écrit Paul Topinard dans les années 1870 ; le biais raciste et le biais sexiste se conjuguent en définitive, et Topinard peut conclure que les femmes sont moins intelligentes que les hommes : la femme est à l'homme, ce que l'Africain est à l'Européen, et le singe à l'humain .
Les scientifiques de l'époque reproduisent cette démarche dans leur analyse d'autres traits physiologiques comme le poids du cerveau, le degré de développement des lobes ou de la moelle épinière. Le poids du cerveau par exemple, déclaré supérieur chez les individus des nations européennes, est présenté comme la marque d'une supériorité intellectuelle des Blancs par rapport aux non-Blancs ; ensuite Gustave Le Bon, Paul Broca et d'autres en déduisent que les femmes blanches, dotées d'un cerveau moins lourd que celui des hommes, sont moins intelligentes que les hommes, et la classification des races renforçant la hiérarchie entre les sexes, ces scientifiques ajoutent que les capacités intellectuelles des femmes blanches sont comparables à celles des Noirs.
Certaines de ces théories craniologiques ont été réfutées par des scientifiques dès le XIXe siècle, notamment par Léonce Manouvrier.
Femmes reproductrices
Les femmes sont destinées à la procréation est un axiome fondamental de la science au XIXe siècle. La femme ne vit pas pour elle-même, mais pour la multiplication de l'espèce, conjointement avec l'homme. Voilà le seul but que la Nature, la Société et la Morale avouent , écrit Virey. Pour le médecin Paul Julius Mbius également, la procréation et le soin apporté aux enfants constituent le but ultime de l'existence féminine, c'est pourquoi la Nature a doté la femme de tous les attributs utiles à sa destinée et lui a refusé les facultés spirituelles et intellectuelles de l'homme .
Maladies des femmes
Au cours du XIXe siècle et au début du XXe siècle, des médecins et psychiatres misogynes ont présenté la fonction reproductrice comme un facteur favorisant la folie féminine. Dans un ouvrage intitulé De la Débilité mentale physiologique chez la femme (1900) le neurologue allemand Paul Julius Mbius écrit : tout en n'étant pas une véritable maladie, les menstruations et la grossesse troublent profondément l'équilibre mental et portent atteinte à la capacité de discernement et au sens juridique ; il était contre l'accès des jeunes filles aux études de médecine ; son argumentation visait à mettre en doute les aptitudes intellectuelles des femmes tentées par la carrière médicale.
L'hystérie, analysée au XIXe siècle comme une affection de l'utérus, renforce l'association entre féminité et pathologie. En 1840, le neurophysiologiste anglais Thomas Laycock est un de ces scientifiques qui contribuent à féminiser et sexualiser l'hystérie, . Alors même que des hommes, certes minoritaires, étaient diagnostiqués hystériques au XIXe siècle, la thèse utérine connaissait une telle vogue que le philosophe autrichien Otto Weininger pouvait déclarer en s'y référant, en 1903 : l'hystérie est la crise organique de la duplicité organique des femmes .
Les hommes aussi sont, pour les médecins du XIXe siècle, affectés par une maladie qui leur est propre : il s'agit de l'hypocondrie ; cependant, cette affection touche surtout les littérateurs et les savants, c'est une maladie noble, liée à un surmenage intellectuel, à la différence de l'hystérie expliquée parfois par une surexcitation de la matrice et associée à une sexualité lascive.
Les menstruations ont pu être présentées comme un handicap et une cause de pathologie ; ainsi l'anthropologue anglais James McGrigor Allan (en) affirme en 1869 devant la London Anthropological Society : Dans ces moments-là, les femmes souffrent d'une langueur et d'une dépression qui les disqualifient pour la pensée ou l'action ; il est douteux que l'on puisse les considérer comme des êtres responsables, tant que la crise dure. Une grande partie de la conduite inconséquente des femmes, leur pétulance, leur caprice et leur irritabilité sont directement liés à cette cause. Des cas de cruauté féminine (qui nous surprennent comme incompatibles avec la douceur normale du sexe) peuvent probablement être attribués à l'excitation menstruelle causée par cette maladie périodique .
Biais aux XXe et XXIe siècle
L'idéologie sexiste qui imprégnait les discours scientifiques au XIXe siècle continue d'exercer une action également sur les contenus de la science du XXe et du XXIe siècle, selon plusieurs spécialistes, .
Rôle des neurosciences
Les nouvelles techniques d'imagerie cérébrale par résonance magnétique (IRM) ont permis d'accomplir de grands progrès notamment dans l'analyse des fonctions cognitives, toutefois, ces techniques d'exploration donnent lieu à une utilisation médiatique qui vise le sensationnalisme et qui conforte bien souvent les stéréotypes de genre. Certaines interprétations hâtives des différences entre les sexes dans le fonctionnement du cerveau ne tiennent pas compte du dynamisme cérébral ; l'IRM ne donnant qu'une image instantanée du cerveau ne permet pas d'affirmer que telle différence entre des hommes et des femmes était inscrite dans leur cerveau depuis leur naissance ; cette différence peut avoir été induite par l'éducation. De plus, la portée des expériences d'IRM demeure limitée, parce qu'elles sont effectuées sur un petit nombre de sujets (entre 10 et 40 personnes). De nombreux biais peuvent affecter certaines conclusions. Catherine Vidal parle de dérive sexiste à propos des méthodes de chercheurs comparant les cerveaux pour y trouver des traits psychologiques prétendument féminins et masculins . Cette dérive est accentuée lorsque des chercheurs en neurosciences établissent des résultats propres au fonctionnement du cerveau, sans mesurer les différences cognitives ou comportementales qui pourraient y être liées, mais suggèrent qu'un tel lien existe : les médias retiennent en priorité cette suggestion, l'affirmant comme prouvée ou en inventent d'autres, . Le terme de neurosexisme (en) est passé dans l'usage ; il a été forgé en 2010 par Cordelia Fine qui désigne par là des mythes neuroscientifiques ayant pour effet de catégoriser les hommes et les femmes, .
Perception de l'espace, mathématiques
D'anciennes études d'imagerie cérébrale par résonance magnétique menées dans les années 1990 ont diffusé l'idée selon laquelle les hommes auraient une meilleure perception des relations spatiales et qu'ils seraient plus doués pour les mathématiques que les femmes, .
Cette prétendue infériorité des femmes est alléguée pour justifier leur sous-représentation dans les plus hauts échelons des carrières scientifiques ; ainsi, Lawrence Summers, président de l'université de Harvard, affirme en 2005 : Le faible nombre de femmes dans les disciplines scientifiques s'explique par leur incapacité innée à réussir dans ces domaines , . Cette théorie a été contestée. Selon Catherine Vidal, la découverte de la plasticité cérébrale ne permet plus de définir des capacités cognitives spécifiquement masculines ou féminines ; l'apprentissage dispensé aux garçons et aux filles est différent, c'est lui qui favorise chez les filles un intérêt plus grand pour le langage que pour les mathématiques ou la physique, . Cette plasticité du cerveau qui évolue en fonction de l'environnement entrane d'importantes variabilités individuelles indépendamment du sexe ; en revanche, parmi les milliers d'études réalisées, moins de 3 % ont montré des différences entre les sexes d'après Catherine Vidal, et il est possible que ces 3 % d'études aient négligé les effets des expériences vécues par les sujets analysés. A contrario, les chercheurs Franck Ramus et Nicolas Gauvrit considèrent que la synthèse que fait Catherine Vidal des recherches scientifiques portant sur le cerveau et sur les différences entre les sexes est extrêmement biaisée, incomplète, et que les arguments qu'elle utilise ne viennent pas à l'appui de ses conclusions . Selon eux, si la plasticité cérébrale montre que la culture et l'éducation ont un impact parfois flagrant
sur le cortex, elle ne montre en aucun cas que cet impact explique toutes les différences entre les individus.
Jugement moral, empathie
Des chercheurs ont voulu montrer en se fondant sur des études d'IRM que les femmes avaient une appréciation moins sûre du caractère moral ou immoral des conduites humaines, parce qu'elles activaient des zones cérébrales impliquées dans les émotions, à la différence des hommes, qui activent des aires cérébrales impliquées dans les processus rationnels. Ainsi Harenski et Kiehl concluent en 2009 que cette comparaison confirme le clivage entre les sexes dans le jugement moral, les femmes étant portées sur le care et l'empathie, et les hommes sur l'évaluation rationnelle des règles de justice . Ces études sont considérées comme peu probantes, en raison de leur protocole expérimental discutable.
Rôle de l'endocrinologie
Hormones mâles et femelles
Les hormones stéroïdes ont été considérées dès leur découverte au début du XXe siècle comme des hormones mâles et femelles, et appelées par conséquent androgènes ( qui développent le caractère masculin ) et œstrogènes (en rapport avec la fécondité féminine). Malgré les recherches ultérieures qui ont montré qu'androgènes et œstrogènes sont présents chez tous les individus et qu'ils sont importants pour l'organisme entier, ils sont toujours catégorisés comme hormones sexuelles . Pour Anne Fausto-Sterling, la loyauté envers le système à deux genres explique la persistance de la dichotomie entre hormones mâles et femelles ; selon cette chercheuse, l'endocrinologie contribue à imprégner le corps de signification genrées . Rebecca Jordan-Young, auteur de Testosterone. An Unauthorized Biography (2020), montre que la testostérone, réputée favoriser l'agressivité masculine, produit des effets très variés, et intervient notamment dans la fertilité des femmes.
Le désir de naturaliser la différence entre hommes et femmes s'est traduit notamment par l'élaboration de la théorie hormonale de l'organisation cérébrale ; selon cette théorie, l'exposition aux hormones pendant la période de développement prénatal expliquerait les centres d'intérêt masculins et féminins de l'individu et ses orientations sexuelles. Cette théorie est contestée ; Rebecca Jordan-Young, auteur de Hormones, sexe, cerveau (2016), rappelle qu'elle a été conçue à partir d'expériences sur les animaux, et qu'elle n'a pas été validée pour les humains ; elle souligne le fait que les études sur cette question passent sous silence le rôle de l'environnement.
Femmes victimes de leurs hormones
Le discours scientifique a présenté les femmes comme victimes de leurs hormones , et le corps féminin comme défaillant, fragile, nécessitant une réparation hormonale. Les chercheuses féministes ont critiqué notamment la pathologisation de la femme ménopausée dans les années 1960, période o le traitement hormonal substitutif (THS) a été préconisé pour toutes les femmes ménopausées, même pour celles qui ne souffraient d'aucun symptôme, dans le but de pallier un manque d'œstrogène ; le gynécologue Robert Wilson par exemple, auteur du best-seller Feminine Forever (Eternellement féminine, 1966) avait présenté la femme à l'âge de la ménopause comme un être dépourvu de sexualité, misérable, apathique, ayant perdu la joie de vivre , du fait de la carence en œstrogène. Les féministes américaines se sont opposées à la généralisation de ce traitement hormonal, arguant du fait que la ménopause n'est pas une maladie. Selon la spécialiste de médecine préventive et sociologue Maria De Koninck, l'image répandue par les scientifiques d'un corps féminin inadéquat colore bien des attitudes sociales .
Rôle de la psychologie évolutionniste
La psychologie évolutionniste a pour objectif d'expliquer les comportements humains en prenant appui sur la théorie de l'évolution de Charles Darwin. Pendant la longue période de la préhistoire, la sélection naturelle aurait favorisé certains types de comportement et en aurait éliminé d'autres ; les adaptations qui se seraient produites à cette époque se seraient inscrites génétiquement. La psychologie évolutionniste s'est développée à partir des années 1990 ; elle est issue d'un rapprochement entre une approche évolutionniste de l'esprit humain et la psychologie cognitive.
L'étude des hommes et des femmes par la psychologie évolutionniste privilégie la très longue durée (l'échelle est celle de centaines de milliers d'années) ; elle minimise l'effet des variations historiques. Selon certains spécialistes, la psychologie évolutionniste aurait même tendance, notamment dans sa version vulgarisée, à nier le rôle de l'Histoire et des facteurs sociaux, et à tout expliquer par le déterminisme génétique, . Dans son approche des différences de sexe, en particulier, la psychologie évolutionnisme marquerait le retour d'une pensée essentialiste, qui figerait les identités masculine et féministe, et procèderait à leur renaturalisation.
Qualités liées à la sélection génétique
Les psychologues évolutionnistes affirment que l'évolution aurait forgé différemment les cerveaux des femmes et des hommes pour une meilleure adaptation à l'environnement . Ainsi, les hommes ayant pratiqué la chasse pendant des centaines de milliers d'années auraient développé pour cette raison une meilleure représentation de l'espace, et cette habileté spatiale se serait transmise génétiquement, de même que le goût pour la compétition. Les femmes de leur côté, demeurées dans les grottes pour s'occuper de leurs enfants, auraient développé plutôt des aptitudes langagières, ainsi qu'un talent particulier pour la coopération ; là encore les gènes transmis auraient préservé de telles prédispositions. Irène Jonas critique une dichotomie rigide à fondements biologiques , et voit dans l'apparente valorisation des femmes, prétendument plus humaines, conciliantes et pacificatrices que les hommes, un sexisme bienveillant. Les qualités dites féminines seraient selon cet auteur acquises au cours de l'éducation, à l'échelle d'une vie humaine, et non innées, contrairement à ce que prétend la psychologie évolutionniste. La philosophe de la biologie Elisabeth Lloyd a contesté l'approche réductrice de l'évolution telle qu'elle est mise en œuvre par la psychologie évolutionniste, selon laquelle seuls les gènes favorisant une meilleure adaptation à l'environnement seraient sélectionnés au cours du temps ; l'évolution fait intervenir d'autres facteurs que la seule sélection naturelle (la dérive génétique aléatoire par exemple).
Choix d'un partenaire protecteur
La psychologie évolutionniste, comme la sociobiologie dont elle a pris la suite, analyse l'infidélité et la violence des mâles comme des stratégies de reproduction naturelles : les premiers hommes auraient augmenté leur succès reproductif en s'accouplant avec des partenaires multiples, par le moyen de la coercition si nécessaire, et ces prédispositions se seraient transmises à leurs descendants masculins. Les femmes, quant à elles, auraient développé des stratégies pour éviter le viol, comme la préférence accordée au partenaire qui est un garde du corps efficace contre d'autres hommes ; elles préfèreraient ainsi les hommes physiquement et socialement dominants. Le psychologue évolutionniste David Buss (auteur de The Evolution of Desire) écrit à ce sujet : à ce stade de l'histoire, nous ne pouvons plus douter que les hommes et les femmes diffèrent dans leur choix d'un conjoint : l'homme privilégie principalement dans son choix, la jeunesse et l'attractivité physique ; la femme privilégie le statut, la maturité et les ressources économiques . La recherche féministe a critiqué les biais sexistes qui sous-tendent cette vision des relations entre hommes et femmes. Mari Ruti (en) en particulier (auteur de The Age of Scientific Sexism) reproche à la psychologie évolutionniste son déterminisme biologique : les conduites masculines et féminines s'expliqueraient ainsi exclusivement par le désir de reproduction et la sélection génétique, alors même que les recherches en sciences sociales montrent le caractère prépondérant des facteurs historiques et culturels. Mari Ruti souligne le caractère rétrograde des stéréotypes de genre dans les versions vulgarisées de la psychologie évolutionniste, qui glorifient le mariage, stigmatisent les célibataires, et refusent d' envisager différentes façons de vivre et d'aimer.
Rôle de la primatologie et de la paléoanthropologie
Soumission au mâle dominant
Des scientifiques féministes ont reproché aux primatologues d'avoir longtemps proposé une description biaisée des primates non-humains ; cette description faisait des mâles les individus dominants, agressifs, par opposition aux femelles effacées et dépendantes, et servait à justifier la division genrée des rôles dans les sociétés humaines. Selon Donna Haraway, la primatologie reconstruit régulièrement l'hétérosexualité et la famille monogame comme modèle social , elle est gangrenée par l'hétérosexisme . Des femmes primatologues ayant observé le comportement des primates femelles ont montré qu'il pouvait être également dominant ; de plus, les guenons pouvaient avoir des rapports sexuels entre elles, ainsi, leur sexualité n'était pas soumise à l'impératif de la reproduction. La diversité des comportements sexuels des primates ne permet pas d'en proposer un modèle unique, affirme Donna Haraway. Quant à l'analogie entre les sociétés de primates non-humains et les sociétés humaines, qui a alimenté certaines théories de la sociobiologie, elle relèverait de l'amalgame, .
Effacement des premières femmes
La paléoanthropologie a traditionnellement retrouvé dans l'organisation sociale des premiers hominidés (Homo habilis etc. ) l'équivalent du patriarcat et a postulé une domination de l'homme chasseur qui reléguait les femmes dans une position subalterne. Ainsi, le paléontologue Jean Chaline attribue l'acquisition de la bipédie aux mâles, qui apparaissent toujours comme les principaux acteurs l'évolution. Selon Pascal Picq, la paléoanthropologie reproduit les représentations les plus archaïques de la femme dans le but de légitimer la prééminence actuelle des hommes : Voyez, disent les scientifiques, il en était ainsi dans la préhistoire ; par conséquent le statut inférieur des femmes est un fait de nature .
Dès les années 1970, des chercheuses comme Nancy Tanner et Adrienne L. Zihlman ont contesté l'idéologie de la domination masculine immémoriale ; à la théorie du chasseur masculin, elles ont opposé celle de la femme cueilleuse, et montré que nombre des premières sociétés dépendaient pour leur subsistance de la cueillette plus que de la chasse ; en outre, pour ces deux activités la séparation des rôles n'était pas systématique ; les femmes pouvaient chasser également.
Dans le langage de la biologie
Description de la fécondation
La philosophie féministe des sciences a décelé l'intervention de biais androcentriques dans l'élaboration de modèles reproductifs, et d'une saga du sperme ( sperm saga ) en biologie jusqu'au début des années 1980 ; la fécondation mettait en jeu d'une part des spermatozoïdes actifs , assimilés par le langage métaphorique à de vaillants héros conquérants et, d'autre part des ovules passifs , endormis , . Ce type de discours confère une autorité scientifique aux stéréotypes de genre, estime l'anthropologue Emily Martin.
Des analyses récentes ayant présenté l'ovule comme pleinement acteur dans le processus de fécondation les spermatozoïdes étant, quant à eux, piégés par l'ovule , ce modèle a donné lieu à une nouvelle forme de dévalorisation du gamète femelle : l'ovule correspond désormais au cliché de la femme fatale qui, de manière agressive, capture un gamète mâle. Une description dépouillée de ces stéréotypes de genre a conduit à mettre en évidence un processus beaucoup plus interactif entre le spermatozoïde et l'ovule .
Alors que dans les discours scientifiques, la sécrétion des spermatozoïdes est toujours un signe de vitalité, la menstruation au contraire apparat comme un échec parce que la fécondation de l'ovule aurait été manquée . Emily Martin suggère qu'il est tout aussi légitime d'envisager la menstruation comme une réussite : la femme qui a ses règles a pu garder le contrôle de sa maternité.
Analyse de la différenciation sexuelle
La différenciation sexuelle, processus par lequel se développent les ovaires et les testicules, fait l'objet de recherches scientifiques qui privilégient l'étude du développement des testicules, bien que les ovaires jouent un rôle tout aussi important dans la reproduction. Les testicules sont présentées comme des événements supplémentaires qui produisent du mâle ; le sexe femelle est, lui, le sexe par défaut. Ainsi, les scientifiques de manière quasi unanime parlent de gène de détermination du sexe pour désigner en réalité le gène de détermination du sexe mâle ; cet usage linguistique suggère que le sexe véritable est le sexe mâle. Les biais qui grèvent la biologie du développement sexué expliquent selon Nicolas Mathevon que pendant plus de vingt-cinq ans, la détermination du sexe femelle n'ait pas été un sujet de recherche, et qu'il ait fallu attendre les années 2000 pour que la différenciation ovarienne commence à être étudiée.
Dans le diagnostic et la recherche médicale
Les médecins ont tendance à sous-diagnostiquer chez les femmes les maladies cardiovasculaires, selon Catherine Vidal, auteur de Femmes et santé, encore une affaire d'hommes ? ; pourtant, ces maladies sont la première cause de mortalité chez les femmes dans le monde, loin devant le cancer du sein, qui arrive en dixième position ; 56% des femmes meurent des suites de maladies cardiovasculaires, contre 46% des hommes. Cependant l'infarctus du myocarde demeure considéré comme une maladie masculine , caractéristique des hommes d'âge moyen stressés au travail . Ce biais diagnostique entrane une prise en charge médicale plus tardive. Il existe toutefois des biais inverses qui conduisent à sous-diagnostiquer certaines maladies chez les hommes, en particulier la dépression et l'ostéoporose.
Les femmes sont sous-représentées dans les essais cliniques d'après une étude de 2019 portant sur 43 000 articles de recherche ; or la pratique médicale consistant à prescrire les mêmes doses pour les hommes et les femmes expose les femmes à des effets secondaires plus graves, selon une étude, publiée en 2020 dans Biology of Sex Differences. En France, comme au niveau international, les femmes sont incluses dans les protocoles de recherche médicale à hauteur de 33, 5% seulement. Les causes de ce biais affectant les essais cliniques pourraient être en partie liées à des raisons pratiques : certains tests conduits dans les années 1970-80 aux États-Unis avaient eu des conséquences par la suite sur les fœtus ; et le cycle hormonal des femmes peut faire varier les résultats.
Formes du biais de genre
Les biais de genre en sciences peuvent intervenir à différentes étapes d'un travail de recherche, au moment de l'élaboration des hypothèses de départ, de la sélection des objets étudiés, de la collecte des données, ou de l'analyse et de l'interprétation de ces données.
La sociologue Margrit Eichler a proposé une typologie des formes que prend le sexisme scientifique, ; elle distingue en particulier les procédés suivants :
la généralisation d'une perspective masculine : les données concernant les hommes sont étendues à l'ensemble de l'humanité ; la norme est masculine ;
la dichotomisation sexuelle : les différences entre hommes et femmes sont présentées comme fondamentales et réifiées aux dépens des ressemblances ;
le double standard homme-femme : le recours à des critères différents selon le sexe, pour aboutir à des résultats plus favorables aux hommes ;
l' insensibilité à la sexuation : ce type de distorsion, à l'opposé de la dichotomisation sexuelle , repose sur une négation de la variable sexuelle et de son importance sociale ou médicale.
La plupart des descriptions des biais de genre relèvent principalement deux cas de figures : une uniformité supposée entre les femmes et les hommes quand il y aurait en fait des différences ; et des différences supposées lorsqu'il n'y en aurait pas en réalité , .
Moyens de remédier au biais de genre
La philosophe des sciences Helen Longino suggère de favoriser le débat dans les communautés de chercheurs et de chercheuses dans le but d'identifier les biais sexistes et de les soumettre à la discussion. Plus grande est la diversité des points de vue, plus les interactions critiques auront de chances de détecter l'effet de préférences subjectives dans le choix des thèmes de recherche et des théories. La communauté scientifique doit donc mieux intégrer les femmes, ainsi que les divers groupes minorisés, pour que soient remplies les conditions de dialogue favorables à la production d'une science plus objective.
Un exemple souvent invoqué est celui de la primatologie, o l'intervention de scientifiques ayant une conscience féministe a permis de corriger des biais et modifié l'orientation des recherches. Auparavant, les primatologues étudiaient principalement le comportement des primates mâles, dont le rôle était considéré comme décisif dans la structuration des sociétés de primates. L'arrivée de scientifiques qui ne partageaient pas les stéréotypes de genre dominants a conduit à déconstruire cette description qui ne faisait que projeter le fonctionnement des sociétés humaines sur celui de sociétés animales.
Critiques du concept de sexisme scientifique
Notes
Références
Bibliographie
Pauline Gandré, Les sciences : un nouveau champ d'investigation pour les gender studies , Idées économiques et sociales, vol. 1, no 167, 2012, p. 52-58 (lire en ligne)
Evelyne Peyre et Jolle Wiels, De la nature des femmes' et de son incompatibilité avec l'exercice du pouvoir : le poids des discours scientifiques depuis le XVIIIe siècle , Les cahiers du CEDREF. Centre d'enseignement, d'études et de recherches pour les études féministes, no Hors série 2, 1er janvier 1996, p. 127157 (ISSN 1146-6472, DOI 10. 4000/cedref. 1642, lire en ligne, consulté le 10 décembre 2020)
Nicole Edelman, Discours médical et construction des catégories homme/femme, masculin/féminin , sur Sens public, 10 juin 2003 (consulté le 10 décembre 2020)
Stéphanie Ruphy, Rôle des valeurs en science : contributions de la philosophie féministe des sciences , Écologie & politique, vol. 2, no 51, 2015, p. 41-54 (lire en ligne)
Elisabeth Kerr et Wendy Faulkner, De la vision des Brockenspectres. Sexe et genre dans la science du XXe siècle , Les cahiers du CEDREF. Centre d'enseignement, d'études et de recherches pour les études féministes, no 11, 1er janvier 2003, p. 89114 (ISSN 1146-6472, DOI 10. 4000/cedref. 511, lire en ligne, consulté le 10 décembre 2020)
Heidi Safia Mirza, Race, Gender and IQ : the social consequence of a pseudoscientific discourse , Race Ethnicity and Education, vol. 1, no 1, 1er mars 1998, p. 109126 (ISSN 1361-3324, DOI 10. 1080/1361332980010108, lire en ligne, consulté le 11 décembre 2020)
Ina Wagner, Rapport d'expert pour le Comité de bioéthique (DH-BIO) sur les droits de l'Homme en biomédecine : Introduction d'une perspective d'égalité de genre , sur councilofeurop, février 2020
Catherine Vidal, Cerveau, sexe et idéologie , Diogène, vol. 4 Mythes et genres , no 208, 2004, p. 146-156 (lire en ligne)
Catherine Vidal, Le genre à l'épreuve des neurosciences , Recherches féministes, vol. 26, no 2, 2013, p. 183191 (lire en ligne)
Catherine Vidal et Dorothée Benoit-Browaeys, Cerveau Sexe & Pouvoir, Éditions Belin, 30 juin 2014 (ISBN 978-2-7011-7830-1, lire en ligne)
(en) Cordelia Fine, Delusions of gender : How our minds, society, and neurosexism create difference/The real sciencebehind sex differences, New York, W. W. Norton/Icon, 2010
Rebecca Jordan-Young et Raffaella Rumiati (en), Hardwired for sexism ? Approaches to sex/gender in neuroscience, Neuroethics5(3), 2012, 305-15.
Gina Rippon (en), The Gendered Brain : The New Neuroscience That Shatters The Myth Of The Female Brain, The Bodley Head, 2019.
Cynthia Kraus, Études critiques du cerveau sexué. Une critique de quoi et pour qui ? , Revue d'anthropologie des connaissances, 2013/3 (Vol. 7, n 3), p. 693-716, lire en ligne
(en) Cliodhna O'Connor et Helene Joffe, Gender on the Brain : A Case Study of Science Communication in the New Media Environment , PLOS ONE, vol. 9, no 10, 29 octobre 2014, e110830 (ISSN 1932-6203, PMID 25354280, PMCID PMC4212998, DOI 10. 1371/journal. pone. 0110830, lire en ligne, consulté le 11 décembre 2020)
Mari Ruti (en), The Age of Scientific Sexism. How Evolutionary Psychology Promotes Gender Profiling and Fans the Battle of the Sexes , Bloomsbury Academic, 2015, présentation en ligne
Sharyn Clough (en), Scientific Sexism and Racism, The Wiley Blackwell Encyclopedia of Gender and Sexuality Studies, résumé en ligne
Artemisa Flores Espnola, Subjectivité et connaissance : réflexions sur les épistémologies du point de vue' , Cahiers du Genre, 2012/2 (n 53), p. 99-120, lire en ligne
Artemisa Flores Espnola, Rapports sociaux de sexe dans la recherche biomédicale : une lecture de la production de savoirs dans les publications féministes anglophones , Sociologie et sociétés, vol. 49, no 1, 2017, p. 6187 (ISSN 0038-030X et 1492-1375, DOI 10. 7202/1042806ar, lire en ligne, consulté le 10 décembre 2020)
Londa Schiebinger, Has Feminism Changed Science ? , Harvard University Press, Cambridge, 2001,
Evelyn Fox Keller et Helen Longino (dir. ), Feminism and Science, Oxford University Press, Oxford, 1996.
(en) Nancy Tuana, Feminism and Science, Indiana University Press, 22 novembre 1989 (ISBN 978-0-253-11338-2, lire en ligne)
Nancy Tuana, The Less Noble Sex : Scientific, Religious, and Philosophical Conceptions of Woman's Nature, Indiana University Press, 1993.
(en) Bonnie Spanier, Im/partial Science : Gender Ideology in Molecular Biology, Indiana University Press, 1995 (ISBN 978-0-253-20968-9, lire en ligne)
Delphine Gardey et Ilana Lwy (sous la dir. ), L'invention du naturel, les sciences et la fabrication du féminin et du masculin, Paris, Éd. des Archives contemporaines, 2000 (recueil d'articles)
(en) Thomas Laqueur, Making Sex. Body and gender from the Greeks to Freud, President and Fellows of Harvard College, 1990, 355 p. (ISBN 978-2-07-072599-1)
Thomas Laqueur (trad. de l'anglais), La fabrique du sexe, Folio, 2013, 517 p. (ISBN 978-2-07-045078-7)
Eva Rodriguez, La différence sexuelle au cabinet des anthropologues parisiens à la fin du XIXe siècle , Émulations - Revue de sciences sociales, no 15, 2015, p. 7386 (ISSN 1784-5734, DOI 10. 14428/emulations. 015. 005, lire en ligne, consulté le 11 décembre 2020)
Elizabeth Fee, Nineteenth Century Craniology ; The Study of the Female Skull, Bulletin of the History of Medicine, 53, 1980, pp. 415-433
Portail des femmes et du féminisme Portail des sciences Portail de l'histoire des sciences Portail de la biologie Portail du genre | WIKIPEDIA | Wiki |
L'examen médical périodique, mise à jour 1989 : 4. Surveillance électronique du foetus pendant l'accouchement et prévention de l'herpès chez le nouveau-né. Groupe d'étude canadien sur l'examen médical périodique | WMT16 | Scientific |
Approche anatomo-histologique de la radio-anatomie mammaire | WMT16 | Scientific |
Lors de la décision du choix d' EVISTA ou d' autres thérapeutiques, incluant les estrogènes, pour une femme ménopausée, il conviendra de prendre en compte les symptômes de la ménopause, les effets sur l' utérus et le sein, et les risques et bénéfices cardio-vasculaires (voir rubrique 5. 1). | EMEA_V3 | Medicinal |
Le syndrome hépatorénal chez le patient cirrhotique | WMT16 | Scientific |
Caractéristiques épidémiologiques des PVVIH suivies au Centre Hospitalier de Mayotte (CHM) du 01/01/2014 au 31/12/2015 Eroan Degrez To cite this version : Eroan Degrez. Caractéristiques épidémiologiques des PVVIH suivies au Centre Hospitalier de Mayotte (CHM) du 01/01/2014 au 31/12/2015. Médecine humaine et pathologie. 2017. dumas-01627013 HAL Id : dumas-01627013 Submitted on 31 Oct 2017 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. Année 2017 1 Université de Bordeaux - Collège Sciences de la Santé Département de Médecine Générale Thèse n103 Thèse pour l'obtention du DIPLOME d'ETAT de DOCTEUR en MEDECINE Présentée et soutenue le 21 Septembre 2017 à Bordeaux Par DEGREZ Eroan Né le 08/02/1985 à Nantes Caractéristiques épidémiologiques des PVVIH suivies au Centre Hospitalier de Mayotte (CHM) du 01/01/2014 au 31/12/2015 Directeur de thèse : Dr Michaud Céline Rapporteur de thèse : Dr Joseph Jean-Philippe Membres du jury : Monsieur le Pr Bonnet Fabrice . Président Monsieur le Pr Joseph Jean-Philippe . Jury Monsieur le Pr Aubry Pierre . Jury Monsieur le Pr Migliani René . Jury Monsieur le Pr Cazenave Charles . Jury Monsieur le Dr Soloy Jean-Charles. Jury Madame le Dr Michaud Céline . Jury 2 Il fait plus beau quand on sourit Milton Hyland Erickson (1901-1980) 3 REMERCIEMENTS : A mon président de thèse, Monsieur le Professeur BONNET Fabrice : Veuillez recevoir toute ma reconnaissance d'avoir accepté de présider mon jury de thèse. Soyez assuré de mon profond respect. A mon rapporteur de thèse, Monsieur le Professeur JOSEPH Jean-Philippe : Merci d'avoir accepté d'être le rapporteur de ma thèse. Je vous suis profondément reconnaissant d'avoir jugé mon travail et d'avoir rédigé un rapport encourageant. A Monsieur le Professeur AUBRY Pierre : Vous me faites l'honneur de siéger à ce jury. Merci de l'intérêt que vous portez à Mayotte. Merci aussi pour votre dévouement à l'enseignement des pathologies tropicales, notamment lors du DU de médecine tropicale dans les pays de l'océan Indien. A Monsieur le Professeur MIGLIANI René : Veuillez recevoir toute ma reconnaissance d'avoir accepté de siéger dans ce jury. Merci de l'intérêt que vous portez à ce travail. Merci aussi pour toutes ces connaissances transmises lors du DU de médecine tropicale. A Monsieur le Professeur CAZANAVE Charles : Merci d'avoir accepté de faire partie de ce jury. Merci pour votre disponibilité et votre compréhension et merci pour l'intérêt porté à ce travail. Au Docteur SOLOY Jean-Charles : Merci d'avoir accepté de participer à ce jury. Merci de l'intérêt porté à ce travail et à la lutte contre le VIH en général. Et surtout merci pour cette découverte merveilleuse de la médecine générale et pour les encouragements à réaliser mes projets, à Mayotte ou ailleurs. A ma directrice de thèse, le Docteur MICHAUD Céline : Peu de mots pourraient décrire toute l'aide apportée à la réalisation de cette thèse. En passant par de la rigueur, de la bienveillance, de la justesse ou de l'humour, je n'aurais pu espérer un meilleur encadrement. Sans toi, sans ton soutien sans faille, je n'aurais jamais pu arriver à cet objectif. En espérant que cette aventure, qui aura duré au final trois ans, puisse se prolonger dans d'autres projets. 4 Merci à toutes les personnes du service de médecine adulte du Centre Hospitalier de Mayotte, toutes les secrétaires, les ASH, les aide-soignant(e)s et les infirmier(e)s pour leur accueil chaleureux et sincère et le travail accompli ensemble au cours de ces six mois de stage. Merci de m'avoir fait découvrir Mayotte, sa médecine, son mode de vie et sa culture. Ce fut la plus belle conclusion possible de ma vie d'interne. Merci à tous les acteurs de santé rencontrés à Mayotte pour leur aide et leur soutien : Ismal Barbet (Infirmier coordinateur adulte au CHM), Annaïck Millot (Praticienne Hygiéniste, CHM), Pierre Millot (Hépatologue référent des hépatites virales, CHM), Nizard Bejaoui (Pharmacien, CHM) et Valérie Thomas (Urgentiste, CHM). Merci tout particulièrement au Dr Mireille Vernier (infectiologue au CHM) et au Dr Mathilde Alzai (médecin généraliste), pour le travail accompli ensemble et leur soutien sans limite. Merci à tous les médecins qui m'ont encadré et soutenu du premier au dernier stage. De Oloron Sainte-Marie à Dax, de Bergerac à Mayotte, en passant par Bordeaux, ce fut un plaisir de vous connatre et d'avoir appris médicalement et humainement à vos côtés. De même, merci à toutes les équipes paramédicales des différents services, pour l'accueil chaleureux, pour ces rencontres enrichissantes qui ont souvent débouché sur des amitiés : Oriane, Emilie, Romain, Siam, Anne, Cédric, Arnaud, Alexis et tous ceux que j'oublie. A mes amis nantais et nazairiens qui m'ont toujours soutenu et qui m'ont permis de décompresser quand c'était nécessaire : Mathieu Badaud, Olivier Parrot, Romain Baudry, Victor Belbeoc'h, Léa Faydi, Pierre Maheo, Romain Bahier, Xavier Gouy, Jérémie Lethiec, Henry Cuziat, Tristan Boucher, Yohann Lechene, Mama, Margot, Clémence, Camille et Jo Pionnier pour ne citer que les meilleur(e)s. A Julien Cuziat, ami de la première heure, mon guide spirituel, celui qui m'a donné envie d'étudier les pathologies tropicales. A toutes ces amitiés nées durant l'internat et particulièrement la team Oloron avec Antoine Etcheverry, Max Johan, Grégoire Evrard, Zoé Vella, Nico Tena ; la team Dax avec Romain Vanoverloop, mon deuxième mentor, Julie Deraedt, Anne-Sophie Darrigade, Alexis Gillet ; la team Bergerac avec Aurélie Vollaire, Géraud et enfin la team Mayotte avec Houssin, Romain, Jacques, Armelle, Marie-Laure, Tiana, Olivier A mes amis de Mayotte, Jeffou, Claire Dumont, Claire Bertrand, Eleonor, Katia, Delphine ma dernière chef, Kareen et Seb, Moinesha, Loan, Saindou, Chaarmane, Paulin et à tous les ami(e)s que je n'ai pas cité(e)s A ma famille, proche ou lointaine, qui m'a toujours soutenu durant ces 15 ans de médecine. A mes parents, soutiens indéfectibles, qui m'ont éduqué de la meilleure façon possible. A mon père, qui m'a donné le goût de la nature et à ma mère, relectrice attentionnée, sans qui je n'aurais pu réaliser de si belles rédactions. A ma petite sœur Sonia, avocate renommée, soutien logistique et surtout moral indispensable. A mes grands frères mahorais Mahamine Gué et Abdou Hamissi dit Zabama, pour l'adoption. A ma merveilleuse femme Julia, pour ces belles années pleines d'aventure à tes côtés. Pour ton soutien dans les moments difficiles, pour ta gentillesse et ta joie de vivre, merci pour le bonheur que tu m'apportes à chaque instant. 5 SOMMAIRE 1. Introduction . 10 2. Epidémiologie actuelle du VIH dans le monde . 11 2. 1. Etat des lieux des politiques sanitaires publiques . 11 2. 2. 2. 3. 2. 4. 2. 5. Les inégalités dans la répartition et la dynamique de l'épidémie . 13 Zoom sur l'Afrique sub-saharienne à l'est de Mayotte . 17 Zoom sur Madagascar, à l'ouest de Mayotte et les autres les de la sous-région. 18 Zoom sur la France métropolitaine et ses Départements et Régions d'outre-mer. 19 2. 5. 1. La France métropolitaine . 19 2. 5. 2. Dans les Départements et Régions d'outre-mer . 22 2. 5. 3. A Mayotte . 23 3. Particularités et enjeux de Mayotte . 24 3. 1. Un carrefour de civilisations . 24 3. 2. 3. 3. Le département le plus dense et le plus jeune de France . 27 Le département le plus pauvre de France . 30 3. 4. Un système de santé à améliorer . 32 3. 4. 1. Secteur public . 32 3. 4. 2. Secteur libéral . 33 3. 4. 3. Le Conseil général . 34 3. 4. 4. Suivi des PVVIH . 34 3. 4. 5. Implication du milieu associatif dans le domaine du VIH . 35 3. 5. Des représentations de la maladie particulières . 36 4. Objectifs de notre étude . 37 4. 1. Objectif principal . 37 4. 2. Objectifs secondaires . 37 5. Matériel et méthode . 37 5. 1. 5. 2. Type d'étude . 37 Population . 37 5. 3. Définitions . 38 5. 4. 5. 5. Critères d'exclusion . 38 Recueil des données . 38 5. 6. Analyses statistiques . 38 6. Résultats . 39 6. 1. 6. 2. 6. 3. 6. 4. File active au 31/12/2015 . 39 Caractéristiques socio-économiques de la file active au 31/12/2015 . 39 Caractéristiques de l'infection . 41 Caractéristiques immuno-virologiques et thérapeutiques . 43 6 6. 5. Description du sous-groupe des nouveaux patients . 45 6. 5. 1. Caractéristiques socio-épidémiologiques des nouveaux patients . 45 6. 5. 2. Caractéristiques de l'infection chez les nouveaux patients . 47 6. 5. 3. Caractéristiques immuno-virologiques et thérapeutiques des nouveaux patients . 49 6. 6. Comparaisons des caractéristiques des PVVIH et identification des facteurs de vulnérabilité . 51 6. 6. 1. Différences significatives entre anciens et nouveaux patients . 51 6. 6. 2. Différences significatives dans notre population d'étude selon le pays de naissance . 54 6. 6. 3. Facteurs de vulnérabilité . 57 6. 6. 3. 1. Facteurs de risque d'être non contrôlé au 31/12/2015 . 57 6. 6. 3. 2. Facteurs de risque d'être diagnostiqué ou d'atteindre le stade SIDA . 59 7. Discussion . 61 7. 1. Une épidémie de type africaine . 61 7. 1. 1. Surreprésentation des femmes : l'efficacité du dépistage prénatal . 61 7. 1. 2. Diagnostics tardifs des hommes . 62 7. 1. 3. Un virus et des co-infections reflets de l'épidémiologie régionale . 63 7. 1. 3. 1. Importance des co-infections VIH/VHB . 63 7. 1. 3. 2. Importance des IST . 63 7. 1. 3. 3. Réminiscence de la lèpre . 64 7. 1. 3. 4. Une le finalement relativement épargnée mais pour combien de temps . 65 7. 2. Vulnérabilité des PVVIH : un miroir grossissant des problématiques à Mayotte . 66 7. 2. 1. Difficile accès aux soins et aux droits pour les étrangers . 66 7. 2. 2. Précarité et isolement . 67 7. 2. 2. 1. Taux de chômage explosif . 67 7. 2. 2. 2. Isolement des femmes . 68 7. 2. 3. Violences sexuelles et prostitution . 69 7. 2. 4. Une jeunesse en perte de repère, de plus en plus touchée . 70 7. 3. Forces et faiblesses de notre étude . 71 7. 3. 1. Les forces . 71 7. 3. 2. Les limites . 71 7. 4. Recommandations . 72 7. 4. 1. Renforcement du dépistage dans les populations clés . 72 7. 4. 2. Renforcement de l'efficacité du traitement, treatment as prévention (TasP) et amélioration de la prise en charge des patients . 73 7. 4. 3. Renforcement de la prévention des IST et du VIH dès le plus jeune âge . 73 7. 4. 4. Renforcer les financements . 75 8. Conclusion . 76 9. Bibliographie . 77 7 TABLE DES ILLUSTRATIONS : FIGURES : Figure 1 Estimation du nombre d'adultes et d'enfants vivants avec le VIH en 2015 (données ONUSIDA, juillet 2016) . 11 Figure 2 Situation géographique du sud-ouest de l'océan Indien (données University of Texas Austin et google maps) . 24 Figure 3 Représentation des différentes migrations vers Mayotte (d'après Allibert, C) . 25 Figure 4 Pyramide des âges à Mayotte (source INSEE) versus France métropolitaine (données INED, Pison, G, 2014) . 27 CARTES : Carte 1 Prévalence du VIH dans le monde chez les 15-49 ans (données ONU 2004) . 13 Carte 2 Nombre de décès liés au SIDA chez les PVVIH (données ONU 2004) . 14 Carte 3 Prévalence de l'infection à VIH dans le monde (données ONU 2012) . 14 Carte 4 Pourcentage d'évolution des nouvelles infections à VIH chez les adultes de plus de 15 ans, de 2005 à 2015 (données UNAIDS 2016) . 15 Carte 5 Répartition des différentes populations de PVVIH selon le lieu géographique (données UNAIDS 2016) . 16 Carte 6 Nombre de découvertes de séropositivité par millions d'habitants en 2015 (données InVS DO VIH corrigées au 31/12/2015) . 20 Carte 7 Répartition des secteurs sanitaires à Mayotte (source CHM) . 32 GRAPHIQUES : Graphique 1 Impact de la cible 90-90-90 sur les infections dues au VIH et les décès liés au SIDA, 2016- 2030 (source ONUSIDA 2014) . 12 Graphique 2 Cascade de la répartition des PVVIH en Afrique sub-saharienne, chez les plus de 15 ans, en 2013 (données UNAIDS 2014) . 17 Graphique 3 Evolution du nombre de découvertes de séropositivité VIH chez les jeunes de 18 à 24 ans en France, selon le mode de contamination, le sexe et le lieu de naissance (données InVS au 31/12/13) . 19 Graphique 4 Cascade de prise en charge des PVVIH en France en 2013 (Supervie, V, mars 2013) . 21 Graphique 5 Cascade de prise en charge des PVVIH en France en 2013, selon les différentes populations de PVVIH (d'après Supervie, V, mars 2013) . 21 Graphique 6 Nombre de nouveaux PVVIH par an à Mayotte, de 1990 à 2010 (Rougerie, S, 2011) . 23 Graphique 7 Nombre de nouveaux PVVIH par an à Mayotte, selon le sexe de 1990 à 2010 . 23 Graphique 8 Evolution de la population à Mayotte, 1958-2012 (source INSEE). 27 Graphique 9 Prévision de l'évolution du nombre d'habitants à Mayotte pour 2022 (source INSEE) . 28 Graphique 10 Répartition de la population selon la scolarisation et le diplôme (source INSEE) . 31 Graphique 11 Répartition des PVVIH selon l'année de découverte de la séropositivité, au 31/12/2015 . 39 Graphique 12 Répartition des PVVIH selon le pays de naissance, au 31/12/2015 . 40 Graphique 13 Classification CDC des PVVIH à la découverte de la séropositivité . 41 Graphique 14 Répartition des PVVIH classées SIDA à la découverte, selon le sexe . 42 Graphique 15 Répartition des PVVIH selon le nombre de CD4 et la charge virale au 31/12/2015. 43 Graphique 16 Pays de naissance des nouveaux PVVIH 2014/2015 . 45 Graphique 17 Répartition des nouveaux patients classés SIDA à la découverte selon le sexe. 48 Graphique 18 Répartition des nouveaux patients selon la CV et le nombre de CD4 au 31/12/2015. 50 Graphique 19 Age chez les anciens et nouveaux patients . 51 Graphique 20 Sexe chez des anciens et nouveaux patients . 52 Graphique 21 Affiliation à la sécurité sociale chez les anciens et nouveaux patients. 52 8 Graphique 22 Pays de naissance des anciens et nouveaux patients . 53 Graphique 23 Age selon le pays de naissance des PVVIH . 54 Graphique 24 Sexe selon le pays de naissance des PVVIH . 55 Graphique 25 Affiliation à la sécurité sociale selon le pays de naissance des PVVIH . 55 Graphique 26 Nombre de perdus de vue selon le pays de naissance des PVVIH . 56 Graphique 27 Contrôle de la charge virale selon l'âge des PVVIH . 57 Graphique 28 Contrôle de la charge virale selon l'affiliation à la sécurité sociale . 58 Graphique 29 Contrôle de la charge virale selon le pays de naissance des PVVIH . 58 Graphique 30 Sexe chez le PVVIH classées SIDA au 31/12/2015 . 59 Graphique 31 Age chez les PVVIH classées SIDA au 31/12/2015 . 60 Graphique 32 Pays de naissance chez les PVVIH classées SIDA au 31/12/2015 . 60 TABLEAU : Tableau 1 Caractéristiques socio-économiques des PVVIH au 31/12/2015 . 40 Tableau 2 Caractéristiques de l'infection chez les PVVIH au 31/12/2015 . 41 Tableau 3 Affections classant SIDA à la découverte et co-infections, au 31/12/15 . 42 Tableau 4 Caractéristiques immuno-virologiques des PVVIH au 31/12/2015 . 43 Tableau 5 Caractéristiques thérapeutiques des PVVIV au 31/12/2015 . 44 Tableau 6 Caractéristiques socio-épidémiologiques des nouveaux PVVIH 2014/2015 . 46 Tableau 7 Caractéristiques de l'infection chez les nouveaux patients . 47 Tableau 8 Affections classant SIDA à la découverte et co-infections chez les nouveaux patients . 48 Tableau 9 Caractéristiques immuno-virologiques des nouveaux patients . 49 Tableau 10 Caractéristiques thérapeutiques des nouveaux patients . 50 Tableau 11 Différences significatives entre les nouveaux et les anciens patients . 51 Tableau 12 Différences significatives dans notre population d'étude selon le pays de naissance . 54 Tableau 13 Facteur de risque de non contrôle de la charge virale au 31/12/2015 . 57 Tableau 14 Facteur de risque d'être au stade SIDA au 31/12/2015 . 59 LEXIQUE DES ABREVIATIONS : 9 - ADN - AES : - Ag - AGD - AIDS - ARN - ARS - ARS OI - ARV - ALD - AME - CDAG - CDC - CHM - CLAT - CMU - CMU-c - CMV - CV - DFA - DROM - DPI - EBM - GEU - HAD - HSH - IDH - II - INSEE - INTI - INNTI - IP - IRM - IST - IREPS - IVG - MAC - NR - ODD - OMD - OMS - ONU - PIB - PMI - PrEP - PVVIH - RDC - SIDA - SSR - STR - TasP - TMF - TPE - TROD - UDIV - UE - UNAIDS - VIH - VHB - VHD - VHC - VIS : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : Acide Désoxyribonucléique Accident d'Exposition au Sang Antigène Affection Grave et Durable Acquired Immune Deficiency Syndrome Acide Ribonucléique Agence Régionale de Santé Agence Régionale de Santé de la zone océan Indien Anti-Rétroviraux Affection Longue Durée Aide Médicale d'Etat Centre de Dépistage Anonyme et Gratuit Centers for Disease Control and Prevention Centre Hospitalier de Mayotte Centre de Lutte Anti-Tuberculeuse Couverture Maladie Universelle Couverture Maladie Universelle Complémentaire Cytomégalovirus Charge Virale Départements Français d'Amérique Département et Régions d'outre-mer Dossier Patient Informatisé Evidence Based Medecine Grossesse Extra Utérine Hospitalisation A Domicile Hommes ayant des rapports Sexuels avec des Hommes Indice de Développement Humain Inhibiteur d'Intégrase Institut National de la Statistique et des Etudes Economiques Inhibiteur Nucléosidique de la Transcriptase Inverse Inhibiteur Non-Nucléosidique de la Transcriptase Inverse Inhibiteur de Protéase Imagerie par Résonnance Magnétique Infection Sexuellement Transmissible Instance Régionale d'Education et de Promotion de la Santé Interruption Volontaire de Grossesse Mycobactérie Atypique Complexe Non Renseigné Objectif de Développement Durable Objectif du Millénaire pour le Développement Organisation Mondiale de la Santé Organisation des Nations Unies Produit Intérieur Brut Protection Maternelle Infantile Pre-Exposition Prophylaxie Personne Vivant avec le VIH République Démocratique du Congo Syndrome d'ImmunoDéficience Acquise Soins de Suite et de Réadaptation Single Tabs Regiment Treatment as Prevention Transmission MaternoFoetale Traitement post-exposition Test Rapide d'Orientation Diagnostique Usagers de Drogues Intra-Veineuses Union Européenne United Nation AIDS Virus d'Immunodéficience Humaine Virus de l'Hépatite B Virus de l'Hépatite D Virus de l'Hépatite C Virus d'Immunodéficience Simienne 10 1. Introduction L'histoire du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) a maintenant plus de 35 ans. Depuis la description des premiers cas aux Etats Unis en 1981 et la découverte du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) en France en 1983, l'infection par le VIH a touché 70 millions de personnes. Avant sa diffusion mondiale, le virus du VIH, dérivé du virus de l'immunodéficience simienne (VIS), circulait déjà probablement depuis au moins 1959 en République Démocratique du Congo (RDC), ex Congo belge. Les recherches phylogénétiques estiment le passage du virus du singe à l'homme aux alentours de 1908(1)(2). Cette pandémie majeure a jusqu'à présent causé la mort de presque la moitié des 70 millions de personnes contaminées. En 2015, 37 millions de personnes vivent avec le VIH (PVVIH). Parmi elles, presque la moitié ne connaissent pas encore leur statut virologique, soit 17. 1 millions de personnes, continuant ainsi à propager l'épidémie(3). La lutte contre le VIH a connu bien des révolutions depuis l'utilisation pour la première fois de la zidovudine comme traitement antiviral en 1986, puis des premières combinaisons thérapeutiques efficaces en 1996. L'évolution de cette pandémie a résolument pris un nouveau visage durant ces dernières années avec de nombreux progrès accomplis, aussi bien sur le plan diagnostique que thérapeutique. Ainsi, de nombreux décès et de nombreuses nouvelles infections ont pu être évités. L'épidémie de VIH est actuellement mondiale, avec des disparités fortes entre les différents pays mais aussi au sein des différentes populations. Dans un contexte de prévention ciblée, d'amélioration de la prise en charge voire d'espoir d'éradication, il est indispensable d'affiner les connaissances épidémiologiques et immuno-virologiques sur l'ensemble des territoires touchés par l'épidémie. Ainsi, Mayotte, petite le française de l'océan Indien, n'est pas épargnée. Si les connaissances sur l'épidémie en France métropolitaine sont importantes, les données pour ce jeune département français sont très restreintes. Le contexte socio-culturel particulier de ce territoire, son évolution rapide et intense et sa position géographique dans une zone de forte prévalence du VIH, nous a conduits à réaliser cette étude. Il s'agissait d'obtenir des données fiables sur les personnes vivant avec le VIH déjà suivies à Mayotte mais aussi sur celles nouvellement diagnostiquées et ce dans le but d'améliorer la prise en charge globale du VIH dans le cadre d'une restructuration hospitalière. 11 2. Epidémiologie actuelle du VIH dans le monde 2. 1. Etat des lieux des politiques sanitaires publiques En 2015, le VIH reste une pandémie majeure avec 36, 7 millions de personnes vivant avec le VIH (PVVIH) à travers le monde. Les différentes régions OMS sont inégalement touchées et c'est l'Afrique sub-saharienne qui paye le plus lourd tribu avec 25. 5 millions de PVVIH. L'Asie-Pacifique est la deuxième région la plus touchée avec 5. 1 millions de PVVIH (Figure 1). Figure 1 Estimation du nombre d'adultes et d'enfants vivants avec le VIH en 2015 (source ONUSIDA, juillet 2016) Le nombre de PVVIH continue d'augmenter, à la fois grâce à l'amélioration du dépistage mais aussi grâce à l'allongement de l'espérance de vie et au meilleur accès aux traitements antirétroviraux (ARV). Ainsi, 18. 2 millions de personnes bénéficiaient d'un traitement en juin 2016(4). Malheureusement, le nombre de décès liés au sida et le nombre de nouvelles infections restent trop importants. Deux virgule un million de personnes sont nouvellement infectées par le VIH et 1, 1 millions de décès imputables au SIDA surviennent chaque année. Pourtant de réels progrès ont été réalisés à travers le monde. Les objectifs du millénaire pour le développement1 (OMD), créés par les nations unies en 2000 et dont le but est d'améliorer la santé globale des populations, ont été atteints en 2015 (5). L'objectif de l'OMD 6 était d'enrayer la propagation du VIH/SIDA, d'inverser la tendance de l'époque et de permettre un accès universel au traitement (6). 1 Eliminer l'extrême pauvreté et la faim, assurer l'éducation primaire pour tous, promouvoir l'égalité des sexes et l'autonomisation des femmes, réduire la mortalité pour les enfants de moins de 5 ans, améliorer la santé maternelle, combattre le VIH/SIDA, le paludisme et d'autres maladies, assurer un environnement durable et enfin mettre en place un partenariat mondial pour le développement. 12 Ainsi, depuis l'an 2000, on constate une diminution globale de 35% des nouvelles infections et de 58% chez les enfants. Depuis 2009, la tendance s'est accélérée avec une baisse de 50% des nouvelles infections chez les jeunes de 15 à 24 ans et de 90% chez les enfants. Le nombre de décès liés au VIH a diminué de 42% depuis le pic de 2004, o le nombre de décès se situait à 2. 3 millions de décès par an. Enfin, depuis 2009, la mortalité liée à la tuberculose chez les PVVIH a reculé de 50%. Même si la couverture universelle par un traitement antirétroviral n'a pas été atteinte, elle a toutefois augmenté de 86% depuis 2010. On est ainsi de passé de 1% des PVVIH sous traitement en 2000 à 40% en juin 2015, soit 15, 8 millions de PVVIH. L'intensification de la riposte contre le VIH a été rendue possible grâce à l'effort permanent des pouvoirs publics et des financements internationaux en constante augmentation. En 2015, 17 objectifs de développement durable (ODD) ont été créés par les Nations Unies. L'ODD3, santé et bien-être, vise la fin de l'épidémie de VIH/SIDA d'ici 2030 (7). L'objectif intermédiaire de la stratégie dite 90-90-90 est élaboré pour 2020, soit : - 90% de PVVIH qui connaissent leur statut, - 90% des personnes dépistées positives qui reçoivent un traitement, - 90% des personnes recevant un traitement qui ont une charge virale indétectable (8). Cette cible est novatrice dans la mesure o elle ne cherche pas seulement un gain de morbidité ou de mortalité mais qu'elle intègre les avantages thérapeutiques et préventifs du traitement pour le VIH. Les prévisions de l'impact de cette stratégie s'avèrent prometteuses en termes de nouvelles infections et de décès (Graphique 1). Graphique 1 Impact de la cible 90-90-90 sur les infections dues au VIH et les décès liés au SIDA, 2016-2030 (source ONUSIDA 2014) 2. 2. Les inégalités dans la répartition et la dynamique de l'épidémie 13 La caractéristique principale de l'infection à VIH/SIDA est son hétérogénéité en termes de prévalence et d'incidence, à la fois entre les différentes régions du monde mais aussi au sein d'une même région. De même, certaines populations à risque sont fortement touchées, malgré une prévalence basse en population générale. Ce phénomène est parfaitement illustré sur deux cartes anamorphiques, élaborées avec des données datées de 2004, année du pic historique de décès imputables au SIDA. Elles suivent la distribution spatiale précise des PVVIH en nombre absolu dans les différentes régions du monde. La taille du pays est proportionnelle au nombre de personnes concernées par l'indicateur et le code couleur est donné selon l'index de développement humain, l'IDH. Les pays avec des couleurs de la gamme chaude ont un IDH faible, comme par exemple le Botswana en rouge foncé. Les couleurs de la gamme froide ont un IDH élevé, comme par exemple les Etats-Unis en violet. La première carte compare le nombre de PVVIH dans la tranche d'âge de 15 à 49 ans (9). Il ressort de cette carte que l'épidémie concerne beaucoup plus fortement les pays pauvres et peu développés que les pays riches. L'Afrique est la plus touchée, suivie de loin par le continent asiatique. L'Europe et l'Amérique sont beaucoup plus faiblement impactées. (Carte 1) Carte 1 Prévalence du VIH dans le monde chez les 15-49 ans (données ONU 2004) La deuxième carte qui compare la répartition des décès liés au SIDA chez les adultes de plus de 15 ans est encore plus troublante (10). On mesure ici pleinement l'importance du niveau de développement dans l'efficacité de la prise en charge des PVVIH. (Carte 2) Carte 2 Nombre de décès liés au SIDA chez les PVVIH (données ONU 2004) 14 Dix ans après, même si globalement d'énormes progrès ont été réalisés en terme de diminution de la mortalité et des nouvelles infections, les prévalences dans le monde sont toujours très inégales et l'Afrique, berçeau de l'épidémie, reste toujours autant touchée. (Carte 3) Carte 3 Prévalence de l'infection à VIH dans le monde (données ONU 2012) 15 Toutefois, du point de vue de la dynamique de l'épidémie, on constate que l'Afrique est un des endroits du monde qui a le plus progressé. La majorité des pays de l'Afrique sub-saharienne enregistre des progrès. De même, d'autres régions du monde fortement touchées par l'épidémie comme les Caraïbes et l'Asie enregistrent aussi une diminution du nombre de nouvelles infections. A contrario, certaines régions du monde voient l'épidémie évoluer dans le mauvais sens. En Asie centrale, Europe de l'est, Afrique du nord et Moyen-Orient, on observe ainsi une forte augmentation du nombre de nouvelles infections. (Carte 4) Carte 4 Pourcentage d'évolution des nouvelles infections à VIH chez les adultes de plus de 15 ans, de 2005 à 2015 (données UNAIDS 2016) Dans la plupart des pays, certains sous-groupes vulnérables focalisent une part importante des nouvelles infections. Il s'agit, selon les zones, principalement des hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes (HSH), mais aussi des usagers de drogues intraveineuses (UDIV), des travailleurs du sexe ou d'autres sous-groupes comme les jeunes femmes ou les adolescents. Les programmes de prévention ciblée ont permis de faire baisser le nombre de nouveaux cas, par exemple chez les travailleuses du sexe en Asie ou chez les nouveau-nés de mères infectées par le VIH et bénéficiant de la prévention mère/enfant dans les Caraïbes. En Europe de l'est et Asie centrale, faute de programme de prévention, l'épidémie explose chez les UDIV et leurs partenaires. La prévalence dans cette population est de plus de 20% en Ukraine et en Russie et 50% en Estonie contre 1% en population générale. En Afrique du nord et au Moyen Orient, l'épidémie augmente chez les UDIV avec des prévalences dans cette population allant de 7% en Egypte à 87% en Lybie. Les HSH sont aussi de plus en plus 16 touchés avec une prévalence allant de 5 à 10% de même que les travailleuses du sexe avec une prévalence à 5% en Somalie. En Europe et en Amérique du nord, l'épidémie est hors de contrôle chez les HSH, avec un risque relatif d'être un PVVIH de 19 par rapport à la population générale (11). Ainsi, même si l'épidémie tend à diminuer mondialement, des inégalités se creusent selon les zones et selon les groupes de populations, avec des populations à risques fortement touchées par le VIH et ayant un accès plus difficile aux programmes de prévention et de prise en charge. (Carte 5) Carte 5 Répartition des différentes populations de PVVIH selon le lieu géographique (données UNAIDS 2016) 2. 3. Zoom sur l'Afrique sub-saharienne à l'est de Mayotte 17 L'Afrique sub-saharienne est donc la région la plus touchée du monde avec 70% des PVVIH et 4 000 nouvelles infections par jour. Dix pays de cette zone représentent à eux seuls 81% du total de la zone : le Nigéria, l'Ethiopie, le Kenya, le Malawi, la Tanzanie, la Zambie, Zimbabwe, le Mozambique, l'Ouganda et Afrique du Sud avec la moitié originaire du Nigéria ou d'Afrique du Sud (12). En Afrique l'épidémie touche d'abord les populations vulnérables ; 58% sont des femmes et près de 2. 9 millions sont des enfants de 1à 14 ans et autant des jeunes adultes de 15 à 24 ans. Les conflits armés sont un facteur fragilisant pour 1. 5 millions de PVVIH africaines (sur les 1. 8 de PVVIH se trouvant en zone de conflit dans le monde). Malgré la diminution des décès liés au SIDA de près de 40% en 15 ans et l'amélioration de la couverture en ARV avec 86% des PVVIH connaissant leur statut qui bénéficient d'un traitement ARV, le nombre de PVVIH qui ignorent leur statut est encore très important, atteignant presque 55% (12). (Graphique 2) Graphique 2 Cascade de la répartition des PVVIH en Afrique sub-saharienne, chez les plus de 15 ans, en 2013 (données UNAIDS 2014) 2. 4. Zoom sur Madagascar, à l'ouest de Mayotte et les autres les de la sous-région 18 A la différence de l'Afrique ou de l'Inde, l'épidémie à VIH/SIDA n'a jamais été un problème de santé publique majeur dans les les du sud-ouest de l'océan Indien. Cela peut paratre paradoxal au regard de la prévalence des infections sexuellement transmissibles (IST). Aujourd'hui cela reste globalement vrai sauf à Madagascar et sur l'Ile Maurice (13). A Madagascar, la prévalence officielle est de 0. 4% mais aucune étude épidémiologique à grande échelle n'a été réalisée ces 10 dernières années. Ces chiffres sont largement sous-estimés au regard du retour des soignants et du nombre de personnes originaires de ce pays et diagnostiquées à Mayotte ou à la Réunion. L'épidémie se concentre dans les grandes villes o la prévalence pourrait dépasser les 1% (14). A Maurice, près de 1% de la population est atteinte, avec une contamination essentiellement liée à la toxicomanie. L'incidence de l'infection chez les UDIV qui était de 2% en 2000, a explosé pour atteindre 92% en 2005. Ce taux diminue actuellement pour atteindre 31. 1% en 2014 (15). Aux Seychelles, la prévalence estimée est de 0. 87%. L'épidémie touche surtout les HSH et les UDIV avec des prévalences dans ces groupes de respectivement 14% et 4% (16) Il n'existe pas de données récentes publiées concernant les Comores. La dernière étude, publiée en 1997, retrouvait une prévalence de 0. 014%. Le dernier rapport de l'ONUSIDA parle d'une incidence annuelle qui est passée de 0. 12% en 2011 à 0. 53% en 2014 (17)(18). Après avoir fait ce rappel sur l'épidémie mondiale et les zones avoisinant Mayotte, il parat intéressant de se focaliser sur le cas de la France métropolitaine et de ses départements et régions d'outre-mer (DROM). 2. 5. Zoom sur la France métropolitaine et ses départements et régions d'outre-mer 2. 5. 1. La France métropolitaine 19 En France métropolitaine, en 2015, environ 150 000 PVVIH sont présentes sur le territoire. La prévalence estimée est de 0. 37%. Le nombre de nouveaux cas par an s'est stabilisé autour de 6 000 découvertes chaque année avec environ 10 000 sérologies positives (19)(20). La répartition de l'infection dans la population générale est inégale. Les hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes et les hétérosexuels nés à l'étranger restent les deux groupes les plus touchés. Ils représentent respectivement 43 et 38% des découvertes en 2015. Les trois-quarts des hétérosexuels nés à l'étranger sont nés dans un pays d'Afrique sub-saharienne et 58% sont des femmes. Les hétérosexuels nés en France et les UDIV représentent respectivement 17 et 1% des PVVIH (20)(21). Le nombre de découvertes de séropositivité chez les jeunes femmes de 15 à 24 ans a diminué presque de moitié entre 2003 et 2010 alors que celui des hommes jeunes a doublé sur la même période. Les chiffres sont stables depuis 2011 sauf chez les HSH o les nouveaux diagnostics continuent d'augmenter significativement. En particulier chez les jeunes adultes HSH, la progression est de 157% depuis 2003. L'ensemble des jeunes de 15/24 ans représente 11% des découvertes en 2013 (22)(23). (Graphique 3) Graphique 3 Evolution du nombre de découvertes de séropositivité VIH chez les jeunes de 18 à 24 ans en France, selon le mode de contamination, le sexe et le lieu de naissance (données InVS au 31/12/13) En 2015, 5. 4 millions de sérologies ont été réalisées soit environ 80/1 000 habitants. Ce nombre est en légère augmentation, 3% depuis 2013. Le nombre de sérologies confirmées positives est de 11 013, soit 167 sérologies positives par million d'habitants (20)(24). 20 Six pourcents de ces sérologies ont été effectuées dans un cadre anonyme et gratuit. Parmi ces sérologies, le taux de sérologies positives pour mille sérologies y est plus important qu'en population générale, 3. 3/1 000 chez les anonymes versus 1. 9/1 000 chez les non anonymes. La répartition géographique du nombre de découvertes de séropositivité est hétérogène. En France métropolitaine, l'Ile de France est la région la plus touchée. Les départements d'outre- mer, excepté l'le de la Réunion, ont globalement un taux plus élevé que la moyenne nationale (25). (Carte 6) Carte 6 Nombre de découvertes de séropositivité par millions d'habitants en 2015 (données InVS DO VIH corrigées au 31/12/2015) On estime qu'en France, fin 2010, 29 000 PVVIH ne connaissaient pas leur statut sérologique soit environ 20%. Supervie et al ont ainsi mis en évidence la cascade de la prise en charge des PVVIH en France et l'ont détaillée selon les différents sous-groupes des PVVIH (26). (Graphique 4), (Graphique 5) Ces modélisations ont renforcé le plaidoyer pour une intensification et une diversification du dépistage pour tenter d'atteindre tous les PVVIH qui s'ignorent. Récemment l'avènement des tests rapides d'orientation diagnostique (TROD) a permis de faire progresser le dépistage, en particulier dans les populations les plus difficiles d'accès, et ce notamment grâce au tissu associatif. Les 62 200 TROD réalisés en 2015 ne représentent qu'une très faible partie de l'ensemble des tests mais leur taux de positivité est plus important que les sérologies standards, de l'ordre de 7. 7 positifs pour 1 000 tests réalisés. De plus, le nombre de TROD a doublé depuis 2012. Disponibles depuis septembre 2015 en pharmacie, 90 000 autotests ont été vendus en un an. Les résultats en termes de taux de positivité ne sont pas encore connus (27). 21 Graphique 4 Cascade de prise en charge des PVVIH en France en 2013 (d'après Supervie, V, mars 2013) Graphique 5 Cascade de prise en charge des PVVIH en France en 2013, selon les différentes populations de PVVIH (d'après Supervie, V, mars 2013) 22 2. 5. 2. Dans les départements et régions d'outre-mer Les départements et régions d'outre-mer sont des aires géographiques très hétérogènes et différentes aussi bien sur le plan socio-démographique que sur le plan épidémiologique. L'incidence et la prévalence du VIH sont en diminution ces 10 dernières années mais restent globalement supérieures à celles de la France métropolitaine. Malgré un dispositif et des recommandations identiques au niveau national, on constate un retard de prise en charge des PVVIH et des moins bons résultats thérapeutiques. En effet, le taux de succès thérapeutique (CV copies/mL) était de 78. 8% des personnes traitées en 2001, variant de 69. 9% en Guyane à 87. 7% à la Réunion contre 90. 4% en France métropolitaine (28). La population infectée par le VIH dans les DROM est globalement plus féminine, plus âgée, plus fréquemment née à l'étranger et avec des conditions sociales plus dégradées qu'en Métropole. Le retard diagnostique est plus important et entrane une prise en charge à un stade plus avancé de la maladie avec des différences selon les DROM. La Guyane, seul DROM non insulaire, a la prévalence de la maladie la plus importante en France, loin devant la Guadeloupe, la Martinique et l'Ile de France. Elle est supérieure à 1% et l'incidence est de 90 cas/100 000 habitants/an. Les PVVIH sont constituées majoritairement de jeunes adultes avec un sex-ratio de 1. Les rapports hétérosexuels concernent 95% des infections. Les PVVIH sont principalement nées à l'étranger, 30% du Brésil, 35% du Suriname et 25% d'Haïti, et 30% sont découvertes à un stade tardif (29). En Martinique et en Guadeloupe, situées dans la zone des Caraïbes, les découvertes de séropositivité par million d'habitants sont supérieures à la moyenne nationale, de l'ordre de respectivement 1. 5 et 2 fois le niveau national. En Guadeloupe, 65% des nouvelles PVVIH sont des hommes et 75% ont été contaminées par des rapports hétérosexuels. Les PVVIH de 25 à 49 ans représentent 55% des nouvelles contaminations, et 39% sont découvertes à un stade tardif. Quarante pourcents sont nées à Haïti et 50% en France métropolitaine. La Martinique est la moins touchée des DFA avec un taux de découverte de la séropositivité équivalent à celui de l'Ile de France. Le profil des nouveaux patients est similaire à la Guadeloupe avec une surreprésentation des 25-49 ans et une majorité d'hommes. Un quart des nouveaux patients sont nés à Haïti et 70% en France métropolitaine. (30) La Réunion fait exception avec un taux de découverte de séropositivité deux fois plus bas que la moyenne nationale (43/millions d'habitants contre 100 au niveau national). Cette situation favorable contraste avec les pays avoisinants de la zone comme Madagascar, Maurice et l'Afrique de l'est o l'épidémie est très active mais aussi avec les autres DROM malgré un contexte socio- économique proche. Soixante-dix pourcents des PVVIH sont des hommes et 35% de HSH. Le nombre de nouveaux diagnostics, entre 25 et 45 par an, est stable depuis 2000. Ce sont pour moitié des hétérosexuels étrangers ou des personnes contaminées à l'étranger et pour moitié des hommes français majoritairement homosexuels. Sur le plan thérapeutique, 97% des patients sont traités et 94% ont une charge virale indétectable (31). 23 2. 5. 3. A Mayotte Ce département ultramarin a recensé les premiers cas d'infection à VIH entre 1985 et 1989 mais c'est seulement en 2003 que Receveur et al ont fait le premier descriptif de l'épidémie. La file active des PVVIH comptait 50 personnes en 2001 dont 30 femmes et la moyenne d'âge était de 34 ans. En 2006, le nombre de personnes suivies était de 76 dont 5 enfants (13)(32)(33). Au 31 décembre 2010, 236 patients différents avaient été suivis sur l'le depuis 1990 (34). Depuis, l'augmentation du nombre de nouveaux cas a été régulière avec 109 nouveaux diagnostics déclarés entre 2008 et 2013 (31). (Graphique 6) Graphique 6 Nombre de nouveaux PVVIH par an à Mayotte, de 1990 à 2010 (d'après Rougerie, S, 2011) La file active des PVVIH est devenue fortement féminine à partir de 2007. (Graphique 7) Graphique 7 Nombre de nouveaux PVVIH par an à Mayotte, selon le sexe de 1990 à 2010 (d'après Rougerie, S, 2011) L'augmentation régulière des nouveaux cas conjuguée à une forte prévalence des IST sont des facteurs propices à une explosion de l'épidémie (35). D'autres facteurs propres à Mayotte interviennent aussi et c'est ce que nous allons tenter d'expliciter dans la partie suivante. 24 3. Particularités et enjeux de Mayotte 3. 1. Un carrefour de civilisations Mayotte est une petite le volcanique de 375 km2. C'est la 4ème et plus ancienne le de l'archipel des Comores, au cœur de l'océan Indien, entre l'Equateur et le Tropique du Capricorne. A l'entrée nord du Canal du Mozambique, à 250 km de Madagascar et 450 km de l'Afrique de l'Est, le 101ème et dernier département français depuis 2011 possède l'un des plus beaux et grands lagons du monde, bordé par une barrière extérieure de plus de 160 km. (Figure 2) Devenue une région ultrapériphérique de l'Union Européenne (UE) depuis le 01/01/2014, cette le reste un carrefour maritime entre l'Europe et l'océan Indien (36). Figure 2 Situation géographique du sud-ouest de l'océan Indien (University of Texas Austin et google maps) L'histoire de Mayotte avec la France est récente et débute autour du XIXème siècle. Les 15 siècles précédents ont façonné l'le au niveau socio-culturel et religieux. En effet, Mayotte fut un relais important des migrations des différentes populations africaines, arabes et indonésiennes vers Madagascar depuis l'Antiquité (37)(38). C'est ainsi que l'le s'est construite autour d'un métissage permanent des populations, des cultures et des traditions. (Figure 3) Figure 3 Représentation des différentes migrations vers Mayotte (d'après Allibert, C) 25 Les premières traces archéologiques prouvent que les premiers habitants de l'le étaient des bantous, originaires d'Afrique de l'Est. Leurs traces, datant d'entre le Vème et le Xème siècle, témoignent de leur installation pacifique (car elle n'a été précédée d'aucun autre peuple) et aussi l'existence d'un commerce avec les pays voisins (39). Ils ont importé leur modèle organisationnel africain tribal et matrilinéaire ainsi qu'une culture et une religion animiste (40)(41)(42). Au IXème siècle, l'arrivée de marchands arabo-persans entrane l'importation des principes de l'Islam et d'un modèle oriental, bouleversant l'organisation sociale de l'le. Vers 1500, les Portugais, à la recherche de nouvelles routes vers l'Inde, s'installent brièvement dans l'archipel mais sont en concurrence avec une population musulmane récemment installée. Ces derniers s'imposent et le canal du Mozambique est partagé entre deux zones d'influence. Les cheikhs arabes s'allient par le mariage aux chefs traditionnels africains et créent le système des sultanats, favorisant par la même les conflits internes pour le pouvoir. L'époque de l'arrivée des Européens dans la zone correspond aussi à une époque d'intensification de l'esclavage et de son commerce. L'archipel des Comores, de par sa localisation géographique, commerce avec les Arabes et les Européens. La population de l'archipel s'est ainsi aussi construite, grâce à des déplacements forcés de population, et ce jusqu'à l'abolition de l'esclavage en 1848 (43). 26 A partir du XVème siècle, un nouveau flux de population arrive de Madagascar. Ils s'installent majoritairement dans le sud de l'le et contribuent au développement du shibushi2 qui reste encore aujourd'hui très utilisé par une partie de la population. A partir du XVIIIème siècle, l'insécurité provoquée par les pillages réguliers de pirates poussent les sultans à demander une protection extérieure. Les occidentaux, déjà présents dans la zone, vont être sollicités. La France s'intéresse à Mayotte d'autant plus qu'elle vient de perdre l'le Maurice, Rodrigues et les Seychelles au profil de la couronne britannique à la fin des guerres napoléoniennes. Le commandant Passot, qui prospecte pour la France, réussi à se faire céder, pour une somme modique, l'le de Mayotte, par le dernier sultan malgache de Mayotte, Andriantsoli, le 25 Avril 1841. Le traité définitif de cession à la France est ratifié en juin 1843, permettant la poursuite de la colonisation dans l'océan Indien avec Madagascar puis les les Eparses. De 1900 à 1912, la France établit un protectorat sur les trois autres les de l'archipel et l'ensemble deviendra un territoire d'outre-mer en 1946. Mayotte a toujours revendiqué son attachement à la France alors que les trois autres les de l'archipel demandaient leur indépendance depuis les années 1950. En 1974, une consultation est organisée dans les quatre les portant sur le choix de l'indépendance. Le non obtient 65% à Mayotte alors que le oui obtient 95% globalement sur l'ensemble des 4 les (44). Le résultat de ce référendum est interprété le par le et non globalement comme le préconise le droit international. Dès lors des tensions se créent. La France accepte de reconduire une deuxième consultation pour Mayotte mais les trois autres les se déclarent indépendantes entre temps et forment la République indépendante des Comores en 1975. En octobre 1975, l'ONU tranche et considère l'état comorien dans ses limites antérieures à 1975. Mais la France organise une consultation en février 1976 o la population mahoraise confirme à 99, 4 % son choix de rester française. La décision est entérinée en décembre 1976 avec un statut de collectivité territoriale à statut particulier, malgré les protestations de l'ONU et de l'Union Africaine. La France ne cède pas et Mayotte devient collectivité départementale en 2001 par référendum. La voie à la départementalisation est ouverte en 2009 et l'le devient en 2011 le 5ème DROM. La départementalisation a entrané des changements majeurs au sein de la société mahoraise. Changements toujours en cours aujourd'hui, avec notamment une révision de l'état civil, une réforme de la justice et un alignement des prestations sociales sur celles de la Métropole. Quant à la République des Comores, une vingtaine de coups d'état s'y sont succédés depuis 25 ans sur un fond d'instabilité politique permanente, contribuant à ruiner l'économie et à retarder globalement le développement des trois les. Cela ne l'empêche pas de continuer de revendiquer Mayotte, jusqu'à ce jour. Mayotte, fruit d'un brassage des populations et des cultures, reste aujourd'hui un carrefour important, avec des flux permanents de population, des autres les des Comores mais aussi de Madagascar et de l'Afrique de l'Est, de la France et dans une moindre mesure de l'Europe. 2 Deuxième langue la plus parlée à Mayotte, d'origine malgache 27 3. 2. Le département le plus dense et le plus jeune de France Une des particularités de Mayotte est sa démographie. Avec une population estimée fin 2015 à 226 215 habitants, c'est le département français hors Ile de France qui a la plus forte densité de population avec 570 habitants au Km2, et le deuxième de la région après l'le Maurice (45). L'INSEE effectue un recensement tous les 5 ans, le prochain est prévu pour 2017 et permettra de corriger l'estimation 2015. Les données chiffrées officielles citées ci-après datent du recensement de 2012, o 212 600 personnes vivaient officiellement à Mayotte (46). Avec la moitié de sa population qui a moins de 17. 5 ans, contre 23 ans en Guyane et 39 ans en France métropolitaine, Mayotte est aussi le département le plus jeune de France (47). Six habitants sur dix ont moins de 25 ans et trois sur dix moins de 10 ans. La part des plus de 60 ans ne représente de 4%, soit six fois moins qu'en Métropole. (Figure 4) Figure 4 Pyramide des âges à Mayotte (source INSEE) versus France métropolitaine (source INED, Pison, G, 2014) C'est aussi un département avec une très forte croissance, résultat d'une natalité forte, d'une mortalité qui diminue et d'une immigration importante. La population a été multipliée par 10 en 50 ans et a triplé depuis 1985 (48). (Graphique 8) Graphique 8 Evolution de la population à Mayotte, 1958-2012 (source INSEE) La croissance démographique a diminué sur les 15 dernières années. Ainsi entre 2007 et 2012, la croissance était 2. 7% contre 4. 1% entre 1997 et 2002 et 3. 1% entre 2002 et 2007. C'est actuellement l'équivalent de la croissance démographique à Madagascar et aux Comores mais moins qu'en Guyane, 3. 7 % et beaucoup plus qu'à la Réunion, 1. 5% ou en Métropole, 0. 7%. Les simulations de l'INSEE pour 2022 tendent vers 280 000 habitants. (Graphique 9) 28 Graphique 9 Prévision de l'évolution du nombre d'habitants à Mayotte pour 2022 (source INSEE) Il faut noter que l'accroissement de la population se fait uniquement grâce à l'excédent des naissances sur les décès car le solde migratoire apparent est négatif. L'indice de fécondité est très important, 4. 1 enfants par femme, se rapprochant de celui des Comores, contre 2 en Métropole. Le nombre de naissances par an est le plus élevé des départements français : 6 800 naissances en 2012. Et ce nombre augmente, 7 306 en 2014, et 8 997 en 2015. L'année 2016 bat le record avec 9 514 naissances(49)(50). Le nombre de décès est faible, du fait du faible âge de la population et de l'amélioration continue du système de soins. Le solde migratoire apparent, découlant du recensement, est de -4 700 personnes. Il est positif pour les natifs de France, 6 700, et pour les natifs de l'étranger, 3 500 mais négatifs pour les natifs de Mayotte, -14 900. Les natifs de Mayotte quittent l'le en nombre, pour poursuivre leurs études ou s'insérer professionnellement. L'augmentation du nombre des natifs de l'étranger est faible, même si l'immigration clandestine est très intense entre Anjouan et Mayotte, séparées de seulement 70 km. Le nombre de reconduites aux frontières sur Mayotte est équivalent au nombre de personnes expulsées sur la Métropole entière. Environ 26 000 en 2010, année record et pas loin de 20 000 en 2014, avec plus de la moitié en mer et près de 600 kwassa kwassa3 interceptés (51)(52). Auparavant, les migrations étaient fluides entre les quatre les et la France, notamment vers Marseille et Dunkerque. En effet la nationalité française avait été accordée aux habitants de 3 Barque de pêcheur servant à la traversée clandestine depuis les les avoisinantes vers Mayotte 29 l'archipel qui en faisaient la demande. La diaspora comorienne représente ainsi aujourd'hui 200 000 personnes en France métropolitaine. A partir de l'indépendance en 1975 et encore plus après la mise en place du visa Balladur en 1995, le durcissement des conditions d'attribution des visas a fait exploser la voie illégale. Il subsiste toujours une zone d'ombre sur le nombre réel d'étrangers présents sur l'le en plus de ceux recensés. Dans le recensement de 2012, la part des étrangers se stabilise à 40% de la population totale soit 84 600 personnes. Elle était de 35% en 2002 et 41% en 2007. Parmi eux, 95% sont d'origine comorienne et 4 sur 10 sont nés à Mayotte, principalement des mineurs qui acquerront la nationalité française à leur majorité (53). Mayotte est ainsi le département français avec la part d'étrangers la plus importante, devant la Guyane qui en comptabilise 35%. Des chiffres, évoquant jusqu'à 300 000 ou 400 000 habitants, circulent à Mayotte. Ils auraient été estimés à partir du tonnage de riz importé sur l'le. Ils sont bien entendu invérifiables, ne faisant pas l'objet de données publiées. A noter enfin qu'il n'existe pas non plus d'études évaluant le nombre d'étrangers entrant illégalement sur le territoire par voie maritime ou kwassa kwassa. Pour anecdote, les décès chez les personnes en situation irrégulière ne font pas systématiquement l'objet de certificat de décès. Deux récents travaux de thèse ont essayé d'étudier la migration du point de vue sanitaire, à la fois par la voie légale mais aussi la voie illégale entre les Comores et Mayotte. Cette raison d'immigration reste minoritaire avec seulement 7% du total des migrations. Ces chiffres se rapprochent des données connues en France et en Europe sur les populations de migrants mais ne nous permettent pas non plus d'estimer le nombre d'arrivées (54)(55). 30 3. 3. Le département le plus pauvre de France Le Produit Intérieur Brut (PIB) par habitant à Mayotte est de 6 575 euros contre 31 059 pour la France métropolitaine. Il reste néanmoins huit fois supérieur à celui des Comores. Si on regarde l'indice de développement humain (IDH), Mayotte est à 0. 653. A titre d'exemple, c'est 0. 822 en Guadeloupe, 0. 813 en Martinique, 0. 883 en Métropole, 0. 750 à la Réunion et 0. 739 en Guyane. Les Comores sont quant à elles à 0. 503 en 2014 (56). La précarité est importante avec deux habitations principales sur trois qui ne possèdent pas le confort de base contre 1. 5% en Métropole. Un logement est considéré sans confort de base s'il ne dispose pas, à l'intérieur, d'au moins un des équipements suivants : eau courante, électricité, toilettes et douche ou bain. Soixante-dix pourcents des logements possèdent aujourd'hui un point d'eau alors qu'ils n'étaient que 30%, en 2007. L'amélioration de l'habitat est lente. Même si le nombre de constructions en dur a augmenté de 18% depuis 2007, un logement sur trois, reste aujourd'hui construit en tôle, majoritairement dans les zones fortement peuplées autour de la capitale, o la proportion atteint 40%. Le banga de célibataire qui était traditionnellement construit par le jeune à son adolescence pour s'isoler de la fratrie tend à disparaitre. La pauvreté de Mayotte s'explique aussi par le fait que Mayotte est le département français avec le taux de chômage le plus important. Sur 52 300 actifs, 36% se déclarent au chômage, ce qui est le taux le plus élevé des DROM (de 28. 1% à la Martinique à 34. 4% à la Réunion). Les inactifs représentent 54% de la population des 15 à 64 ans alors que cette proportion ne dépasse jamais les 50% dans les DROM et est de 28% en Métropole. Les femmes sont majoritairement touchées avec 60% d'inactives et seulement 2 sur 10 qui déclarent travailler. Elles occupent 37% des postes soit 10 points de moins qu'en France métropolitaine. Les jeunes de 15 à 29 ans sont aussi touchés avec seulement 29% d'actifs contre deux fois plus en Métropole. L'évolution se fait vers une économie de services, notamment avec l'emploi informel qui progresse. Le secteur primaire enregistre la plus forte baisse sur 5 ans, -79%, l'agriculture ne représentant plus que 1. 4% des emplois. Le secteur tertiaire progresse plus vite que le secondaire, en particulier grâce aux salariés de l'administration publique, de l'éducation nationale ou d'établissements sanitaires et sociaux qui en représentent 50%. Ce secteur représente actuellement 83% des emplois totaux et 95% des emplois féminins. Enfin le secteur touristique, au potentiel énorme, ne représente que 2% des emplois salariés, en partie à cause du déficit d'infrastructures d'accueil et de logements. Le dernier problème qui accentue la précarité est le faible niveau d'éducation. 31 Plus de 35% de la population de plus de 15 ans n'a jamais été scolarisée contre moins de 2% en Métropole. La proportion est de 1 sur 5 pour les moins de 30 ans. La part des non-scolarisés diminue néanmoins. Parmi eux, 59% sont nés à l'étranger, 39% à Mayotte et 2% en Métropole. Parmi les scolarisés, 56% sortent du système éducatif sans diplôme qualifiant contre 32% en Métropole. Cela porte à 71%, la part de la population totale sans diplôme qualifiant. (Graphique 10) Graphique 10 Répartition de la population selon la scolarisation et le diplôme (source INSEE) Les principales difficultés du système éducatif primaire sont des effectifs surchargés, un défaut de matériels éducatifs et des problèmes de barrière linguistique. Les jeunes en difficultés finissent par être exclus du système. Ainsi, le français, langue de scolarité, est souvent la deuxième langue maternelle derrière le shimaoré et le shibushi. Parmi la population mahoraise qui a été scolarisée, une personne sur trois est en situation d'illettrisme. Le pourcentage de personnes en âge de travailler qui ne matrisent pas les compétences de base à l'écrit en français est de 58%, ce qui aggrave les problématiques d'insertion socio- professionnelle et donc la précarité (57). 32 3. 4. Un système de santé à améliorer 3. 4. 1. Secteur public Les moyens, en dépit des efforts qui ont été accomplis ces dernières années, sont insuffisants tant en termes de matériels que de structures d'accueil et de possibilités de prises en charge médico- sociales. L'offre de soins reste très limitée dans tous les secteurs, public et libéral, avec un déficit criant en professionnels médicaux. La tendance va à l'aggravation avec actuellement seulement 187 postes de médecin équivalents temps plein dont seulement 50% sont pourvus par des médecins installés de façon pérenne. Le turn-over permanent des remplaçants sur les autres 50% aggrave la situation, notamment vis-à-vis du suivi des patients (58). Le secteur public domine l'offre de soins de l'le même s'il reste incomplet. Le Centre Hospitalier de Mayotte (CHM) se situe à Mamoudzou et regroupe l'ensemble du plateau technique avec la biologie et la radiologie. On y assure aussi l'ensemble des consultations spécialisées, les hospitalisations, la chirurgie et la moitié des accouchements de l'le. Depuis 2010, quatre centres de référence de niveau intermédiaire situés dans le nord (Dzoumogné), le sud (Mramadoudou), le centre (Kahani), et enfin sur Petite-Terre (Dzaoudzi) assurent une permanence médicale 24h/24 et 7j/7, pour pallier aux premières urgences. Ces centres assurent aussi en journée des consultations de médecine générale, quelques fois de spécialistes et possèdent des lits de maternité et quelques lits de médecine pour Dzaoudzi. Enfin un réseau de 13 dispensaires répartis sur l'le assure des soins primaires de proximité et des actions de prévention (59). (Carte 7) Carte 7 Répartition des secteurs sanitaires à Mayotte (source CHM) 33 L'offre de soins en termes de lits d'hospitalisation complète en médecine, chirurgie et obstétrique est très insuffisante avec seulement 15 lits pour 10 000 habitants contre 35 pour la Réunion et la Guyane et 81 pour le Limousin. Pour la psychiatrie, c'est pire avec 0. 3 lit pour 10 000 habitants contre 9 en Métropole. Ce faible nombre de places, conjugué à l'absence de structures post-hospitalisation comme les soins de suite et de réadaptation (SSR) ou l'hospitalisation à domicile (HAD), contribue à maintenir une forte pression sur le secteur public. Une particularité de Mayotte est son régime de sécurité sociale, qui a été mis en place en avril 2004. Il a permis l'introduction de l'assurance maladie dans les mêmes conditions que le régime de base de sécurité sociale de Métropole (60). Néanmoins, il n'existe pas encore de couverture maladie universelle (CMU), de couverture maladie universelle complémentaire (CMU-c) ni d'aide médicale d'état (AME). La gratuité des soins dans le secteur public a été maintenue pour les Français et étrangers en situation régulière. En revanche, pour lutter contre l'immigration clandestine, un forfait de 10 euros a été introduit pour les étrangers en situation irrégulière ou les non-affiliés à la sécurité sociale. Valable sept jours, il donne accès à une consultation médicale, ainsi qu'aux examens complémentaires d'imagerie et de biologie et à la délivrance de médicaments dans les pharmacies du CHM. Sur le même principe, 15 euros donne accès à une consultation dentaire ou de spécialiste, 30 euros pour les urgences et 300 euros pour un accouchement. Il existe un équivalent de l'AME pour les personnes sans ressources et avec des affections graves et durables (AGD), c'est le bon d'AGD. C'est un simple petit bout de papier qui doit être signé par un médecin pour donner accès aux soins gratuits. Ce système ne permet pas toujours un accès facilité aux soins pour les personnes précaires. Il est trop souvent tributaire des agents administratifs à l'accueil et a même été menacé quelques mois par la direction du CHM4. Pour améliorer la situation sanitaire sur l'le, le programme de l'Agence Régionale de Santé de la zone océan Indien (ARS OI) 2013/2017, recommande la création de partenariats avec la Réunion et la France métropolitaine, le développement de la télé radiologie, et enfin le renforcement et l'amélioration des structures existantes (61). 3. 4. 2. Secteur libéral La situation est encore plus critique dans le secteur libéral que pour le secteur public. On dénombre seulement 13 médecins généralistes pour 100 000 habitants ce qui est 9 fois moins qu'à la Réunion et 8 fois moins qu'en Métropole. Pour les spécialistes, la densité est de 6 pour 100 000 soit une densité 10 fois plus faible qu'à la Réunion et 16 fois plus faible qu'en Métropole. Et la tendance est à la décroissance avec 23 généralistes seulement en 2014 contre 27 en 2012 et 6 spécialistes en 2014 contre 12 en 2012. Il existe un seul laboratoire privé et un seul centre d'imagerie privé dans la préfecture. Le centre d'imagerie possède un scanner mais loue l'IRM du CHM. 4 Le 31/11/2015, dans une note de service, le CHM a exclu de ce système, avant de se rétracter, les enfants et ramené le forfait accouchement à 10 euros. Cette problématique d'accès aux soins est aggravée par cette situation et l'absence de CMU, CMU-c, et d'AME. Ce système d'inégalité d'accès à la CMU-c contribue à bloquer toute possibilité de rééquilibrage des prises en charge entre le système public et libéral. La majorité de la population précaire étant obligée de se rabattre sur le système public, elle aggrave la pression sur un système déjà saturé. 34 3. 4. 3. Le Conseil général Le Conseil général assure quant à lui le financement des services de protection infantile et maternelle. Vingt-deux PMI réparties sur l'le assurent le suivi et la vaccination des enfants de moins de 6 ans ainsi que le suivi des femmes enceintes. Jusqu'en 2009, le Conseil général assurait la gestion du service des actions de santé avec le centre de dépistage anonyme et gratuit (CDAG), la lutte contre les maladies sexuellement transmissibles, le centre de lutte antituberculeuse (CLAT), et la consultation léproserie. En 2009, ces missions de santé publique ont été transférées au pôle santé public du CHM. Ces structures subissent les mêmes travers que le reste du système de santé, à savoir la centralisation sur Mamoudzou et la pénurie de personnels médicaux. 3. 4. 4. Suivi des PVVIH Initialement, le suivi des PVVIH sur l'le se faisait au CHM qui assurait le dépistage, la prise en charge et la délivrance des médicaments. Entre 2009 et 2013, le suivi a été transféré au pôle santé public, à travers le CDAG. Depuis 2014, les PVVIH sont de nouveau suivies au CHM, par le service de médecine, grâce au recrutement progressif d'une équipe pluridisciplinaire dont deux médecins infectiologues. L'équipe paramédicale du CHM se compose d'un infirmier coordinateur et d'éducation thérapeutique depuis début 2015 ainsi que d'une traductrice dédiée. Les recrutements d'une psychologue ainsi que d'une nutritionniste sont toujours en attente à ce jour. L'informatisation des dossiers médicaux qui s'est développée avec la mise en place du logiciel NADIS fin 2014 permettra d'inclure Mayotte dans les futures recherches épidémiologiques de l'océan Indien. L'activité de dépistage du CDAG s'est recentrée sur la prévention et le dépistage des IST. Les patients dépistés et positifs pour le VIH sont ensuite systématiquement adressés au CHM. Le réseau institutionnel et associatif autour du VIH reste insuffisant. D'autant que les restructurations liées à l'évolution du statut de Mayotte ont parfois fragilisé des actions de prévention en matière de VIH et d'IST. L'ARS est l'institution de tutelle chargée de mettre en œuvre les plans nationaux VIH et IST au niveau local. Son rôle, à Mayotte, est d'assurer une qualité de prise en charge, tant sur le plan 35 médical, que sur l'accompagnement, égale à celle de Métropole. Elle appuie financièrement les différentes structures associatives et œuvre au rapprochement ville/hôpital. L'Instance régionale d'éducation et de promotion de la santé (IREPS) a, quant à elle, un rôle d'éducation à la santé. Les thèmes VIH/SIDA et les IST ont longtemps été des thèmes privilégiés dans les établissements scolaires et les associations villageoises. Récemment l'ARS a réorienté son action sur un rôle de coordination des activités existantes et de renforcement des capacités des associations et des travailleurs sociaux et de la santé. L'IREPS continue néanmoins de recevoir des outils éducatifs de Métropole comme des documents, affiches, préservatifs ou gels, mais est moins présente sur le terrain. 3. 4. 5. Implication du milieu associatif dans le domaine du VIH Le tissu associatif autour de la santé reste peu développé à Mayotte. En matière de VIH, en dehors des projets institutionnels, peu d'associations existent. Nariké M'Sada, est la seule association, exclusivement dédiée à l'accompagnement des personnes séro-concernées et à la prévention. Créée en 2000, elle est présente dans les écoles, les associations sportives et de m'biwi5, pour mener des actions de prévention, mais aussi sur les réseaux sociaux et au téléphone pour une aide et un accompagnement personnalisé des PVVIH. Depuis 2016, l'association se renforce et se professionnalise. Elle est ainsi présente chaque semaine pour un accompagnement des PVVIH à l'hôpital, au cours d'échanges de groupe ou d'entretiens individuels. Depuis le 1er décembre 2016, elle organise aussi des campagnes de dépistage avec des TROD, permettant de compléter l'offre existante. Le but est à terme de pouvoir faire des maraudes hors les murs pour intervenir auprès des travailleurs du sexe et des HSH dans certains lieux de rencontres. Plus récemment, d'autres associations se sont impliquées dans la sensibilisation, le renforcement des capacités et le dépistage en matière de VIH. C'est notamment le cas de Fahamou Maecha 976, basée au sud, qui a contribué à des campagnes d'information et à la mise en place de distributeurs de préservatifs sur l'ile. Par ailleurs, le planning familial basé à Sada, remplit des missions d'information en termes de santé sexuelle, auprès des publics scolaires et associatifs mais aussi lors d'entretiens en conseil conjugal à son local. L'association est aussi en train de renforcer ses capacités, afin de pouvoir proposer un dépistage grâce au TROD, ce qui permettrait à terme un meilleur quadrillage de l'ile. 5 Petits bâtons de bambou traditionnels, que les femmes entrechoquent entre eux, pour produire un rythme accompagnant une danse axée sur le bassin. Cet art est pratiqué dans de nombreuses cérémonies, religieuses ou autres. 36 3. 5. Des représentations de la maladie particulières Du fait de son héritage multiculturel, le rapport à la maladie de la population reste différent de la conception occidentale. L'islam modéré qui domine à 97% entrane un véritable tabou vis-à-vis du corps humain. L'imaginaire collectif ainsi que l'animisme présent sur l'le dès l'origine, façonnent un rapport aux soins et à la maladie, éloigné de l'Evidence Based Medecine (EBM), qui prévaut en Europe. La médecine traditionnelle est le premier recours aux soins dans presque 100% des cas. Le système occidental, implanté depuis peu, ne reçoit donc les patients qu'après échec de la voie traditionnelle, pouvant entraner des retards dans la prise en charge particulièrement préjudiciables, en particulier pour les pathologies infectieuses ou pour des pathologies chroniques comme le diabète et l'hypertension. Ainsi, le concept de maladie chronique n'existe pas dans la médecine traditionnelle. La prise en charge initiale traditionnelle est basée principalement sur la phytothérapie, avec une automédication par rapport à un savoir empirique, acquis dans la famille. Ensuite, on peut s'adresser au mwalimu , un savant ou matre, guérisseur et devin. Il exerce son art en manipulant des textes religieux ou magico-religieux en arabe. Il récite des prières adaptées et fabrique des amulettes avec des versets du Coran, mais surtout, identifie l'affection, une maladie à traiter en dispensaire ou une pathologie liée aux djinns , c'est-à-dire liée aux esprits. Il oriente donc ensuite le patient vers le thérapeute adapté et au moment opportun, le fundi . Le fundi est un matre, un savant dans une discipline particulière, qui peut utiliser ou transmettre ses connaissances. C'est aussi un titre, une fonction. Ainsi on peut appeler le mwalimu, fundi, aussi bien que le forgeron ou l'instituteur. Le fundi thérapeute peut être spécialiste dans différents domaines : pathologies gynéco- obstétricales, ventouses, troubles urinaires, dermatoses, etc. Certains sont spécialistes des pathologies liées aux djinns, qui sont assez fréquentes à Mayotte. Le fundi des djinns est lui-même possédé par un djinn thérapeute qu'il a su accepter et utiliser à des fins thérapeutiques devenant ainsi matre des cérémonies de possessions. Enfin, il faut noter la présence de sorciers, les mutsayi ou mgangi , qui ne s'affichent pas ouvertement mais qui peuvent lancer des sorts sur commande et que l'on peut combattre avec le Fundi spécialiste. La phytothérapie est administrée sous différentes formes et peut être à visée préventive ou curative (62). Ainsi, après avoir détaillé toutes ces particularités de Mayotte, on comprend mieux l'intérêt de bien connatre les caractéristiques des PVVIH, afin de pouvoir les atteindre efficacement à la fois sur le plan thérapeutique et sur le plan de la prévention. 37 4. Objectifs de notre étude 4. 1. Objectif principal L'objectif principal de notre étude est de caractériser les PVVIH suivies au Centre Hospitalier de Mayotte (CHM), entre le 01/01/2014 et le 31/12/2015. 4. 2. Objectifs secondaires L'objectif secondaire est : - définir les profils des patients nouvellement diagnostiqués sur notre période d'étude. - définir les profils des sous-groupes les plus vulnérables. 5. Matériel et méthode 5. 1. Type d'étude L'étude réalisée est une étude épidémiologique descriptive transversale au 01/01/2014 de la file active des PVVIH, puis ensuite prospective jusqu'au 31/12/2015. 5. 2. Population La population étudiée est l'ensemble de la file active des PVVIH de plus de 15 ans suivies au CHM du 01/01/2014 au 31/12/2015. Le sous-groupe des nouveaux patients est constitué des PVVIH ayant débuté un suivi au cours de la période d'étude. Le suivi des grossesses et des nouveau-nés de mères séropositives pour le VIH a déjà été traité dans la thèse de Alzai Mathilde, présentée en 2016. Nous avons ainsi pris le parti de ne pas le redévelopper dans notre travail. 5. 3. Définitions Les nouveaux patients sont les PVVIH ayant débuté un suivi au cours de la période d'étude, soit du 01/01/2014 au 31/12/2015. Les PVVIH sont définies comme perdues de vue à compter l'absence de suivi depuis plus de 12 mois à la fin de l'étude. 38 5. 4. Critères d'exclusion N'ont pas été inclues dans notre étude, les PVVIH : - diagnostiquées après le 31/12/2015. - perdues de vue au 01/01/2014. - suivies en médecine ambulatoire. - n'ayant pas eu de confirmation diagnostique sur un deuxième prélèvement et/ou n'ayant pas débuté de suivi. - suivies exclusivement à la Réunion ou en France métropolitaine. - âgées de moins de 15 ans au 31/12/2015. 5. 5. Recueil des données Les données ont été récoltées à partir du logiciel NADIS et complétées à partir du logiciel de biologie du CHM, du logiciel de Dossier Patient Informatisé (DPI) : Dx CARE, ainsi que par l'analyse des dossiers cliniques papiers. L'ensemble des patients a donné son accord à l'utilisation du logiciel NADIS qui autorise l'utilisation de leurs données médicales à des fins de recherche. 5. 6. Analyses statistiques Les données ont été compilées dans un fichier Excel puis analysées par le logiciel R. Les comparaisons intergroupes ont été effectuées grâce à ce logiciel. Les tests ont été sélectionnés en fonction de la nature des variables et en respect des conditions d'application des tests (Wilcoxon Mann Whitney, Chi2, Fisher et régression linéaire). Le seuil de significativité sélectionné est de 0, 05. 39 6. Résultats 6. 1. File active au 31/12/2015 Au début de notre étude, au 01/01/2014, la file active des PVVIH suivies au CHM était de 146 personnes. Au 31/12/2015, elle est constituée de 211 personnes, ce qui représentent l'ensemble de notre population d'étude. En 2014 et 2015, respectivement 30 et 35 nouveaux patients ont intégré la file active. Ces 65 personnes forment le sous-groupe des nouveaux patients de notre étude. Plus d'un quart des PVVIH suivies au CHM ont été récemment diagnostiquées dans les deux dernières années. (Graphique 11) Graphique 11 Répartition des PVVIH selon l'année de découverte de la séropositivité, au 31/12/2015 6. 2. Caractéristiques socio-économiques de la file active au 31/12/2015 Notre population d'étude au 31/12/2015 est composée de 59. 2% de femmes et de 40. 8% d'hommes avec âge médian de 37 ans [29-45]. (Tableau 1) La majorité des patients est née à l'étranger, 41. 7% des PVVIH sont nées aux Comores, 12% à Madagascar et 11% dans d'autres pays d'Afrique sub-saharienne. Seulement 23. 7% des PVVIH sont nées à Mayotte et 10. 9% en France métropolitaine. (Graphique 12) Graphique 12 Répartition des PVVIH selon le pays de naissance, au 31/12/2015 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Nb 40 Près des deux tiers des PVVIH sont en couple (52. 1% sont mariées et 13. 7% en concubinage). Les PVVIH sont pour la plupart en situation précaire, avec près de 47. 9% qui sont sans emploi et seulement 68. 3% qui ont une affiliation à la sécurité sociale au 31 décembre 2015. (Tableau 1) Tableau 1 Caractéristiques socio-économiques des PVVIH au 31/12/2015 Sex ratio H/F n 211 % Caractéristiques sociologiques Age médian (années) Pays de naissance - Comores - Mayotte - France métropolitaine - Autres pays de naissance - dont Madagascar - dont Rwanda - dont Congo - dont Burundi - dont Cameroun - dont Sénégal - dont Togo - dont Tanzanie - Réunion Statut marital Marié/ée Célibataire Concubinage Veuf/veuve Affiliation à la sécurité sociale Oui Non Sans emploi Emploi Etudiant Situation professionnelle 0. 69 37 [29-45 ans] 88 50 23 49 26 11 4 2 2 2 1 1 1 110 54 29 10 144 67 101 79 15 (41. 71) (23. 69) (10. 90) (23. 22) (12, 32) (5. 21) (1. 90) (0. 95) (0. 95) (0. 95) (0. 47) (0. 47) (0. 47) (52. 13) (25. 59) (13. 74) (4, 74) (68. 25) (31. 75) (47. 87) (37. 44) (7. 11) NR 8 NR 16 NR non renseigné 41 6. 3. Caractéristiques de l'infection Le mode de contamination est par voie hétérosexuelle pour 84. 3%, auquel il faut ajouter 4. 3% suite à un viol. Seulement 3. 8% déclarent des relations homosexuelles pouvant être à l'origine de la contamination. L'usage de drogues intraveineuses (UDIV) représente 1. 4% des contaminations. La découverte de la séropositivité se fait le plus souvent lors d'une grossesse, 34. 6% dont 26, 5% lors du suivi de grossesse, 7. 6% lors d'une interruption volontaire de grossesse (IVG) et 0. 5% lors d'une grossesse extra-utérine (GEU). Le dépistage sur proposition médicale représente quant à lui 28%. A noter que la découverte suite à l'enquête familiale autour d'un cas de PVVIH, que ce soit le conjoint ou un enfant, représente 12. 8% des découvertes. Seule une personne sur cinq s'est faite dépister spontanément. (Tableau 2) Tableau 2 Caractéristiques de l'infection chez les PVVIH au 31/12/2015 n 211 % Mode de découverte Mode de contamination Grossesse Dont : - Suivi de grossesse - IVG - GEU Proposition médicale Volontaire Dépistage familial AES TMF Hétérosexuelle Viol Homosexuelle UDIV TMF Transfusion Sex worker 73 56 16 1 59 42 27 3 1 178 9 8 3 2 1 1 34 (34. 6) (26. 5) (7. 6) (0. 5) (28) (19. 9) (12. 8) (1. 4) (0. 5) NR 6 (84. 3) (4. 3) (3. 8) (1. 4) (0. 9) (0. 5) (0. 5) NR 8 (16. 1) NR non renseigné Nb de PVVIH diagnostiquées au stade SIDA Les patients sont majoritairement diagnostiqués au stade A de la classification CDC (70. 6%) dont 2. 4% (n 5) au stade de primo-infection. (Graphique 13) 80 60 40 Nb 20 0 Nb Graphique 13 Classification CDC des PVVIH à la découverte de la séropositivité stade 1 stade 2 stade 3 nc A B C Mais 16. 1% des PVVIH sont diagnostiquées tardivement au stade SIDA, il s'agit majoritairement des hommes. (Graphique 14) 42 120 100 80 60 40 20 0 Nb Graphique 14 Répartition des PVVIH classées SIDA à la découverte, selon le sexe non sida sida hommes femmes Parmi les patients découverts au stade SIDA, les infections opportunistes les plus fréquemment rencontrées sont la tuberculose et la candidose disséminée. Certains patients présentent plusieurs affections opportunistes à la découverte. Six virgule six pourcents des PVVIH (n 14) sont co-infectées avec VHB dont une surinfection par le VHD. Il y a 1. 6% de co-infectées VHC (n 3) et aucune co-infection VHB/VHC. Deux patients (1%) présentent une lèpre, et un antécédent de syphilis est retrouvé chez 9% de la file active. (Tableau 3) Tableau 3 Affections classant SIDA à la découverte et co-infections, au 31/12/15 n 211 % Diagnostic au stade SIDA Primo-infection Tuberculose Candidose disséminée Cryptococcose Pneumocystose Rétinite à Cytomégalovirus (CMV) Toxoplasmose cérébrale Kaposi Cachexie Mycobactérie atypique (MAC) Co-infections Co-infection VHB - Dont surinfection VHD Co-infection VHC Syphilis Lèpre Clinique à la découverte Type d'affections classant SIDA 34 5 12 10 6 5 5 3 3 3 3 14 1 3 19 2 (16. 1) (2. 4) NR 3 (5. 7) (4. 7) (2. 8) (2. 4) (2. 4) (1. 4) (1. 4) (1. 4) (1. 4) (6. 6) (0. 5) (1. 4) (9. 0) (0. 95) NR non renseigné 43 6. 4. Caractéristiques immuno-virologiques et thérapeutiques Tous les patients étudiés sont infectés avec le VIH de type 1 dont 55% par un sous-type non B. Trente pourcents des génotypes n'ont pu être retrouvés dans les dossiers ou réalisés (par exemple, patient prétraité qui intègre la file active avec une charge virale indétectable). (Tableau 4) Le nombre de CD4 médian au moment du diagnostic est de 373/mm3 [155-584] et la charge virale initiale est de 27 400 copies/mL [5 762-136 476]. Tableau 4 Caractéristiques immuno-virologiques des PVVIH au 31/12/2015 n 211 % CD4 initiaux médians (mm3) Statut immuno-virologique au diagnostic CD4 médians au 31/12/15 (mm3) Charge virale VIH initiale médiane (cop/mL) Nombre de patients avec CV indétectable au 31/12/15 129 Sous-type B Sous-type non B Sous-type du VIH 30 116 373 [155 - 584] 600 NR 31 [390 - 875] NR 8 27 400 [5 762 - 136 476] NR 28 (61. 1) NR 4 (14. 2) (55) NR 65 NR non renseigné Fin 2015, 95. 7% des PVVIH de la file active (n 202) bénéficient d'un traitement antirétroviral mais parmi eux, seulement 63. 9% ont une charge virale (CV) indétectable et 17. 3% une CV entre 35 et 400 copies/mL. Plus de la moitié des patients ont des CD4 supérieurs à 500/mm3. (Graphique 15) 140 120 100 80 60 40 20 0 Nb Graphique 15 Répartition des PVVIH selon le nombre de CD4 et la charge virale au 31/12/2015 CV CD4 cv 500 35 400cop/mL CD4 NR 200 44 Parmi les patients détectables sur le plan virologique, 8. 4% sont traités depuis moins de 6 mois dont 5. 7% depuis moins de 3 mois. Quatre-vingt-dix pourcents des patients sont sous trithérapie antirétrovirale. Différents schémas thérapeutiques se distinguent, avec principalement une combinaison avec deux Inhibiteurs Nucléosidiques de la Transcriptase Inverse (INTI), et un Inhibiteur de Protéase (IP), 48. 3%, ou deux INTI et un Inhibiteur Non-Nucléosidique de la Transcriptase Inverse (INNTI), 35. 1%. Peu de patients bénéficient d'un allègement thérapeutique. Un tiers des tri-thérapies est conditionné en Single Tablet Regiment (STR), dont 97% sont des combinaisons à base d'INNTI. La durée médiane de traitement est d'environ trois ans et demi. Le nombre médian de ligne de traitement médian est de deux. (Tableau 5) Tableau 5 Caractéristiques thérapeutiques des PVVIV au 31/12/2015 n 211 % Types de traitement antirétroviral Tri-thérapie - Dont mono-prise - combinaison avec IP - combinaison avec INNTI - combinaison avec Inhibiteur d'Intégrase (II) - combinaisons autres Quadrithérapie Bithérapie - Dont bithérapie d'IP - Monothérapie d'IP Absence de traitement Durée de traitement en mois Nombre de ligne de traitement médian Durée de traitement médiane (mois) 190 70 102 74 7 7 9 4 2 3 9 2 44 (90) (33. 2) (48. 3) (35. 1) (3. 3) (3. 3) (4. 3) (1. 9) (0. 9) (1. 4) (4. 3) [1-3] [18-96] NR non renseigné 6. 5. Description du sous-groupe des nouveaux patients 45 Pour mémoire, le sous-groupe des nouveaux patients comprend ceux ayant débuté leur suivi en 2014 et 2015. Ils sont au nombre de 65. 6. 5. 1. Caractéristiques socio-épidémiologiques des nouveaux patients Trente patients ont intégré la file active en 2014 et de 35 en 2016. 54% sont des femmes et 46% des hommes. L'âge médian était de 30 ans [25-37ans]. Parmi ces nouveaux patients, 71% sont d'origine étrangère : 36. 9% sont nés aux Comores, 21. 5% à Madagascar et 12. 3% d'autres pays d'Afrique sub-saharienne. Un quart de nouvelles PVVIH sont nées à Mayotte. Celles nées en France métropolitaine sont minoritaires (3. 1%). (Graphique 16) 30 25 20 15 10 5 0 Nb Graphique 16 Pays de naissance des nouveaux PVVIH 2014/2015 Deux tiers des nouvelles personnes suivies sont en couple (46. 2% mariées et 21. 5% en concubinage). Beaucoup sont précaires avec 57% sans emploi et autant non-affiliées à la sécurité sociale. (Tableau 6) 46 Tableau 6 Caractéristiques socio-épidémiologiques des nouveaux PVVIH 2014/2015 Caractéristiques sociologiques n 65 % Sexe ratio H/F Age médian (années) 0. 86 30 Pays de naissance - Comores - Mayotte - Autres pays de naissance - dont Madagascar - dont Rwanda - dont Congo - dont Cameroun - dont Tanzanie - France métropolitaine Statut marital Marié/ée Célibataire Concubinage Veuf/veuve Oui Non Sans emploi Emploi Etudiant Affiliation à la sécurité sociale Situation professionnelle 24 17 22 14 3 3 1 1 2 30 14 14 2 28 37 37 14 9 [25-37 ans] (36. 9) (26. 2) (33. 9) (21. 5) (4. 6) (4. 6) (1. 5) (1. 5) (3. 1) (46. 2) (21. 5) (21. 5) (3. 1) NR 5 (43) (57) (56. 9) (21. 5) (13. 9) NR 5 NR non renseigné 47 6. 5. 2. Caractéristiques de l'infection chez les nouveaux patients Le mode de contamination est hétérosexuel pour 88% dont 3% par viol et une personne travailleuse du sexe. La contamination lors de relations homosexuelles HSH, est retrouvée chez deux PVVIH. Une PVVIH a subi une transmission materno-foetale (TMF). Le mode de découverte principal est le dépistage sur proposition médicale avec 34%. Suit le dépistage lors d'une grossesse (29. 2% y compris les GEU et les IVG). Le dépistage spontané ne représente que 13. 8%. Dix-sept pourcents des nouveaux patients de la file active ont été dépistés du fait de l'infection VIH chez un proche (père/mère/ conjoint(e). (Tableau 7) Tableau 7 Caractéristiques de l'infection chez les nouveaux patients n 65 % Mode de découverte Grossesse dont Suivi de grossesse IVG GEU Proposition médicale Dépistage familial Volontaire TMF Mode de contamination Hétérosexuelle Viol Homosexuelle TMF Sex working Nb de PVVIH diagnostiquées au stade SIDA 19 14 4 1 22 11 9 1 54 2 2 2 1 14 (29. 2) (21. 5) (6. 2) (1. 5) (33. 8) (16. 9) (13. 8) (1. 5) NR 3 (83. 1) (3. 1) (3. 1) (3. 1) (1. 5) NR 4 (21. 5) NR non renseigné Vingt et un virgule cinq pourcents des PVVIH ont amorcé leur suivi en 2014 et 2015 au stade SIDA. Il s'agit majoritairement d'hommes. (Graphique 17) Graphique 17 Répartition des nouveaux patients classés SIDA à la découverte selon le sexe homme femme non sida sida NR 48 35 30 25 20 15 10 5 0 Nb L'affection classant SIDA la plus fréquente est la tuberculose, représentant 10 % des PVVIH. Quatre PVVIH sont co-infectées avec le VHB soit 6. 2% des nouveaux patients. Les antécédents de syphilis sont retrouvés dans 4. 6% des cas (Tableau 8) Tableau 8 Affections classant SIDA à la découverte et co-infections chez les nouveaux patients n 65 % Diagnostic au stade SIDA Primo-infection Clinique à la découverte Type d'affections classant SIDA Tuberculose Rétinite CMV Candidose disséminée Pneumocystose MAC Kaposi Cryptococcose Encéphalite VIH Cachexie Co-infections Co-infection VHB Syphilis 14 3 (21. 5) (4. 6) NR 1 7 3 2 2 2 2 1 1 1 4 3 (10. 8) (4. 6) (3. 1) (3. 1) (3. 1) (3. 1) (1. 5) (1. 5) (1. 5) (6. 2) (4. 6) NR non renseigné 6. 5. 3. Caractéristiques immuno-virologiques et thérapeutiques des nouveaux patients 49 Toutes les PVVIH nouvellement diagnostiquées et ayant amorcé un suivi sont infectées avec un VIH de type 1, dans les mêmes proportions entre les sous-types B et non B, que le reste de la file active. Le nombre de CD4 médian au moment du diagnostic pour ce sous-groupe est de 359/mm3 [137- 623]. La charge virale initiale médiane est de 32 846 copies/mL [10 199-164 769]. (Tableau 9) Tableau 9 Caractéristiques immuno-virologiques des nouveaux patients n 65 % Statut immuno-virologique au diagnostic CD4 initiaux médians (mm3) CD4 médians au 31/12/2015 (mm3) Charge virale VIH initiale médiane (cop/mL) Nombre de patients avec CV indétectable au 31/12/15 Sous-type B Sous-type non B Sous-type du VIH 359 420 [137 - 623] NR 8 [260 - 673] NR 5 32 846 [10 199 - 164 769] 24 11 36 NR 3 (37) NR 2 (16. 9) (55. 4) NR 18 NR non renseigné Fin 2015, près de 9 nouvelles PVVIH sur 10 (87. 7%) bénéficient d'un traitement antirétroviral mais seulement 37% ont une charge virale indétectable. A noter que 29. 8% d'entre elles, 17 sur 57, ont bénéficié d'une instauration de traitement depuis moins de 6 mois. Un peu moins d'un tiers des patients a des CD4 supérieurs à 500/mm3. (Graphique 18) Graphique 18 Répartition des nouveaux patients selon la charge virale et le nombre de CD4 au 31/12/2015 30 25 20 15 10 5 0 Nb CV CD4 cv 500 35 400cop/mL CD4 NR 200 50 Parmi les différents traitements utilisés, différents schémas thérapeutiques prédominent. Quatre-vingt-un virgule cinq pourcents des patients sont sous tri-thérapie, avec soit une combinaison avec deux INTI et un IP, 50. 8%, soit deux INTI et un INNTI, 26. 2%. 100% des trithérapies intégrant un INNTI sont conditionnées en Single Tablet Regiment (STR). La durée médiane de traitement est de 8 mois. (Tableau 10) Tableau 10 Caractéristiques thérapeutiques des nouveaux patients n 65 % Types de traitement antirétroviral Trithérapie -Dont mono-prise -combinaison avec IP -combinaison avec INNTI -combinaison avec II -combinaisons autres Quadrithérapie Bithérapie - Dont bithérapie d'IP Monothérapie d'IP Absence de traitement Durée de traitement en mois Nombre de ligne de traitement médian Durée de traitement médiane (mois) 53 17 33 17 2 1 3 4 2 2 8 1 8 (81. 5) (26. 2) (50. 8) (26. 2) (3. 1) (1. 5) (4. 6) (6. 2) (3. 1) (3. 1) (12. 3) [1-1] [4-17] NR non renseigné 6. 6. Comparaisons des caractéristiques des PVVIH et identification des facteurs de vulnérabilité 51 6. 6. 1. Différences significatives entre anciens et nouveaux patients Comme on peut le constater dans le tableau ci-dessous (Tableau 11), les personnes diagnostiquées en 2014 et 2015 sont plus jeunes (Graphique 19), et le sexe ratio se rapproche de la parité (Graphique 20), sans que ce dernier paramètre ne soit statistiquement significatif. L'accès aux soins dans cette sous-population est plus précaire. Le taux d'affiliation à la sécurité sociale est statistiquement plus faible chez les nouveaux patients (Tableau 11), en partie dû à une arrivée récente sur l'le, mais aussi lié à la complexité des démarches administratives sur l'le. Tableau 11 Différences significatives entre les nouveaux et les anciens patients Différences significatives entre les nouveaux patients et les anciens patients Anciens Nouveaux Test utilisé Variable testée Age (moyenne) * Sexe (nb) (%) Pays de naissance (nb) * 40. 2 31. 4 - Femmes - Hommes 90 (61. 6) 56 (38. 4) 35 (53. 9) 30 (46. 1) - Comores - Etrangers hors Comores - Mayotte - France métropolitaine 64 27 33 22 79. 5 24 22 17 2 43. 1 Wilcoxon Mann Whitney Chi2 Fisher Chi2 P value 0. 0000002* 0. 2872 0. 0093* 0. 00000016* 0. 00000014* Affiliation à la sécurité sociale (%) * Dernière charge virale moyenne (cop/mL) * 2763. 06 111889 Wilcoxon Mann Whitney Perdus de vue (nb) 4 2 Fisher 0. 3818 *p significatif si p Graphique 19 Age chez les anciens et nouveaux patients Graphique 20 Sexe chez des anciens et nouveaux patients 52 Graphique 21 Affiliation à la sécurité sociale chez les anciens et nouveaux patients Ensuite, la distribution des pays de naissance se répartit de façon significativement différente, entre le sous-groupe anciens patients et le sous-groupe nouveaux patients . Le nombre de nouveaux patients nés aux Comores tend à diminuer au profil de celui des patients nés en Afrique sub- saharienne et à Madagascar. (Graphique 22) 53 Graphique 22 Pays de naissance des anciens et nouveaux patients 6. 6. 2. Différences significatives dans notre population d'étude selon le pays de naissance 54 Dans notre population d'étude, on constate des différences significatives selon le pays de naissance. (Tableau 12) Tableau 12 Différences significatives dans notre population d'étude selon le pays de naissance Différences significatives dans notre population d'étude selon le pays de naissance Variable testée Mayotte Comores Age (Moyenne) * Sexe (nb) (%) * - Femmes - Hommes Taux d'affiliation à la sécurité sociale (%) * Dernière charge virale moyenne (cop/mL) - Suivies à Mayotte (nb) * - Perdues de vue (nb)* - Suivies à la Réunion ou France métropolitaine (nb) * Etranger hors Comores 38, 65 28 (57. 1) 21 (42. 9) France métropolitaine 48, 29 3 (12. 5) 21 (87. 5) Test utilisé Kruskall Wallis Fisher p value 0. 000006* 0. 000003* 37, 76 31 (62) 19 (38) 92 33, 70 63 (71. 6) 25 (28. 4) 51. 1 61. 2 95. 8 Fisher 0. 00000002* 113701 13893 17626 1270 Kruskall Wallis 0. 0858 48 2 0 85 2 1 42 1 6 20 1 3 Fisher 0. 0071* *p significatif si p Ainsi, les personnes nées aux Comores sont principalement des femmes jeunes, contrairement aux patients nés en France métropolitaine, qui sont plus âgés et principalement des hommes. (Graphique 23), (Graphique 24) Graphique 23 Age selon le pays de naissance des PVVIH Graphique 24 Sexe selon le pays de naissance des PVVIH 55 Le taux d'affiliation à la sécurité sociale diffère très significativement avec seulement la moitié des patients nés aux Comores affiliés, versus la quasi-totalité des patients nés à Mayotte ou en France métropolitaine. Les patients nés à l'étranger hors Comores semblent aussi mieux affiliés que les patients nés aux Comores. (Graphique 25) Graphique 25 Affiliation à la sécurité sociale selon le pays de naissance des PVVIH Le nombre de perdus de vue au cours de notre période d'étude est faible. Néanmoins, le taux est statistiquement plus élevé parmi les personnes nées à Mayotte ou aux Comores, même s'il doit être interprété avec prudence. Les patients poursuivant leur suivi à la Réunion ou en France métropolitaine sont quant à eux principalement nés à l'étranger hors Comores. ( Graphique 26) 56 Graphique 26 Nombre de perdus de vue selon le pays de naissance des PVVIH 57 6. 6. 3. Facteurs de vulnérabilité 6. 6. 3. 1. Facteurs de risque d'être non contrôlé au 31/12/2015 Comme nous le constatons dans le tableau ci-dessous (Tableau 13), les principaux facteurs de risque d'avoir une charge virale détectable, sont l'âge (Graphique 27) et l'absence d'affiliation à la sécurité sociale. (Graphique 28) Par contre, dans notre étude, le pays de naissance n'influe pas de manière significative dans l'absence de contrôle de l'infection, même si le p se rapproche du seuil de significativité. (Graphique 29) Tableau 13 Facteur de risque de non contrôle de la charge virale au 31/12/2015 Facteur de risque de non contrôle de la charge virale au 31/12/2015 Variable testée Age (Moyenne) * Sexe (nb) (%) Pays de naissance (nb) Indétectable Détectable 38, 85 35, 42 - Femmes - Hommes 74 (60. 7) 55 (64. 7) 48 (39. 3) 30 (35. 3) - Comores - Etrangers hors Comores - Mayotte - France métropolitaine 53 26 30 20 34 23 17 4 78. 3 51. 3 Taux d'affiliation à la sécurité sociale (%) * Test utilisé Wilcoxon Mann Whitney Chi2 Fisher p value 0. 03611* 0. 5541 0. 08649 Chi2 Odd ratio 3. 43, IC 95 [1. 86 - 6. 31] 0. 000053* Charge virale initiale moyenne (cop/mL) CD4 initiaux moyen (mm3) * 195022, 2 243167, 6 447, 75 340, 94 Wilcoxon Mann Whitney Wilcoxon Mann Whitney 0. 2506 0. 01611* *p significatif si p Graphique 27 Contrôle de la charge virale selon l'âge des PVVIH Graphique 28 Contrôle de la charge virale selon l'affiliation à la sécurité sociale Graphique 29 Contrôle de la charge virale selon le pays de naissance des PVVIH 58 6. 6. 3. 2. Facteurs de risque d'être diagnostiqué ou d'atteindre le stade SIDA 59 Dans notre étude, le principal facteur de risque d'avoir ou de développer une infection au stade SIDA est le sexe, et dans une moindre mesure l'âge. (Tableau 14) Ainsi, les hommes ont un risque bien plus important d'être au stade SIDA que les femmes. (Graphique 30) Les personnes avec une infection avancée sont aussi plus âgées. (Graphique 31) Tableau 14 Facteur de risque d'être au stade SIDA au 31/12/2015 Facteur de risque d'être au stade SIDA au 31/12/2015 Variable testée Age (moyenne) * Sexe (nb) (%) * Pays de naissance (nb) - Comores Non SIDA 36, 57 111 (88. 8) 59 (68. 6) SIDA 41, 22 14 (11. 2) 27 (31. 4) - Femmes - Hommes - Etrangers hors Comores - Mayotte - France métropolitaine Taux d'affiliation à la sécurité sociale (%) Charge virale initiale moyenne (cop/mL) * CD4 initiaux moyen (mm3) * 72 38 39 21 70 16 11 11 3 61 140429 508480 475, 02 151, 65 Test utilisé Wilcoxon Mann Whitney Chi2 Odd ratio 3. 63 [1. 77-7. 45] Fisher p value 0. 0128* 0. 0002693* 0. 7455 0. 2652 Wilcoxon Mann Whitney Wilcoxon Mann Whitney 0. 01339* 0. 00000000005* *p significatif si p Graphique 30 Sexe chez le PVVIH classées SIDA au 31/12/2015 Graphique 31 Age chez les PVVIH classées SIDA au 31/12/2015 60 En revanche, le pays de naissance n'influe pas dans la gravité de l'infection (tout comme c'était le cas pour le non contrôle de l'infection). (Graphique 32) L'absence d'affiliation à la sécurité sociale non plus, même si les patients non-affiliés ont plus de risque d'être détectables. Graphique 32 Pays de naissance chez les PVVIH classées SIDA au 31/12/2015 61 7. Discussion 7. 1. Une épidémie de type africaine 7. 1. 1. Surreprésentation des femmes : l'efficacité du dépistage prénatal Dans notre étude, on constate que la file active mahoraise de PVVIH est principalement féminine à 59, 2%. Il s'agit de femmes jeunes, majoritairement diagnostiquées au cours d'une grossesse. Le profil de nos patientes présente des similitudes avec les femmes décrites dans d'autres études réalisées en Afrique, notamment en Afrique du Sud et de l'est (11). Le dépistage au cours d'une grossesse qui concerne près de deux femmes sur trois, contribue à la féminisation de la file active. Ce type de dépistage est aussi prédominant dans l'ensemble des pays d'Afrique sub-saharienne. La grossesse est en effet souvent un mode d'entrée précoce dans le système de soins, pour des populations souvent précaires. A Mayotte, la découverte à l'occasion d'une grossesse a tendance à augmenter au cours des dernières années. Alors qu'il était de 38 % entre 1990 et 2010, il atteint fin 2015, 58%, témoin d'une intensification et d'une efficacité du dépistage systématique mais probablement aussi d'une augmentation du nombre de PVVIH. En France métropolitaine, ce mode de découverte diminue. Alors qu'il se situait aux environs de 50% en 1990, il ne représentait plus que 14 % en 2010 (63)(34). L'âge moyen au cours de la grossesse des femmes vivant avec le VIH à Mayotte en 2014 était de 28 ans. Dans une étude menée en Afrique du Sud, en Ouganda, au Burkina Faso et en Zambie, il était de 27 ans. En France métropolitaine, cet âge se situe plutôt entre 32 et 33 ans (64)(65)(66). Dans l'étude de Traoré et al, le taux de célibat des femmes est de 22% versus 16% à Mayotte. En France métropolitaine, les femmes sont plus souvent seules, de l'ordre de 40%. Lorsqu'elles sont en couple, elles dévoilent plus facilement leur statut aux conjoints, dans 73. 8% des situations. Du fait de la stigmatisation et des tabous entourant la maladie, seulement 47% des femmes à Mayotte, avaient communiqué leur séropositivité en 2014 (67)(64). En France métropolitaine, 80% des femmes enceintes séropositives sont originaires d'Afrique sub- saharienne. La plupart sont sans emploi, comme à Mayotte ou dans l'étude africaine précitée (63)(65). Les femmes dans notre file active sont principalement nées à Mayotte, aux Comores ou à Madagascar et sont plutôt jeunes. Leur profil correspond donc à celui de l'épidémie en Afrique. Le taux de natalité à Mayotte est élevé, 4. 1 enfants par femme. C'est un taux comparable à celui des Comores et de Madagascar ou des pays d'Afrique de l'est. En France métropolitaine la natalité est moindre avec seulement 2 enfants par femme Cette natalité importante, associée à un dépistage systématique par la PMI permet un screening efficace de la population féminine (50). Dans une étude de l'Enquête Périnatal Française (EPF) sur 30 ans, l'amélioration de la santé maternelle au fil des années est reflétée par le taux de grossesses antérieures sous ARV. Dans cette étude, 50 % des femmes inclues en 2010, l'ont été pour une deuxième ou une troisième grossesse. Dans la thèse de Alzai , 42% des femmes ont déjà eu une ou plusieurs grossesses sous ARV, à mettre aussi en parallèle avec le taux de fécondité important sur l'le (64)(63). 62 7. 1. 2. Diagnostics tardifs des hommes Dans notre étude, les hommes sont minoritaires, comme dans la plupart des cohortes africaines. La principale raison est l'absence de dépistage systématique, contrairement aux femmes. On sait qu'ils fréquentent moins les systèmes de santé et se font moins dépister. De plus, du fait du tabou autour du VIH encore très fort à Mayotte, ils bénéficient moins des propositions de dépistage lorsque leur(s) partenaire(s) est (sont) séropositive(s). Il y a donc nécessairement une sous- évaluation du nombre de PVVIH masculines. On constate néanmoins que parmi le sous-groupe des nouveaux patients , le sexe ratio tend à augmenter, preuve de l'efficacité de propositions répétées auprès des femmes pour le dépistage de leur(s) partenaire(s). L'organisation de l'offre de dépistage à Mayotte accentue le sous-dépistage des hommes, dans la mesure o, jusqu'à récemment, le centre de vaccination des jeunes enfants (principalement accompagnés par des mères, grands-mères) se trouvait au même endroit que le CDAG, constituant un frein psychologique. Ce sous-dépistage des hommes induit, de fait, un retard de prise en charge. Leur séropositivité est ainsi découverte plus tardivement que les femmes et plus souvent au stade d'affections classant SIDA. Dans notre étude, le risque d'être au stade SIDA est presque 4 fois plus important chez les hommes que chez les femmes (OR 3. 63, IC95 [1. 77-7. 45]), montrant le retard de la prise en charge dans cette population. Dans l'étude VESPA 2, on constate que dans les autres DROM, les hommes sont aussi diagnostiqués plus tardivement. Ils ont également de moins bons résultats thérapeutiques quand l'âge est supérieur à 40 ans ou quand ils ont été diagnostiqués à un stade tardif. (28) Dans notre étude, l'âge moyen est de 42 ans, ce qui est plus jeune qu'en France métropolitaine, en particulier chez les patients nés à l'étranger. Les quelques patients nés en Métropole et qui se sont souvent installés transitoirement à Mayotte pour des raisons professionnelles, ont un profil épidémiologique proche des cohortes françaises. Ils sont majoritairement HSH et sont plus âgés. Pour le reste de la file active, la contamination est déclarée hétérosexuelle dans la quasi-totalité des cas. Seulement 3. 8% des PVVIH de notre file active se revendiquent ouvertement homosexuels, versus 40% des hommes suivi en France et originaires d'Afrique sub-saharienne. Seulement 6% des hommes sont des HSH en Afrique de l'est et du Sud (22)(11). Ce pourcentage est probablement sous-estimé au vu des tabous entourant le VIH et surtout l'homosexualité. La discrimination et les stigmatisations envers cette population poussent les HSH à se cacher. Les rencontres se font via des sites internet, et la plupart du temps, les HSH ont des alibis hétérosexuels pour la société, créant un fort risque d'échappement de la maladie (68)(69). De la même manière, de nombreux tabous culturels et religieux existent autour du corps et de la sexualité. Pourtant, les rapports sont nombreux et très précoces. La polygamie, aujourd'hui légalement interdite, est encore courante en pratique et l'adultère est presque considéré normal chez l'homme (69). 7. 1. 3. Un virus et des co-infections reflets de l'épidémiologie régionale 7. 1. 3. 1. Importance des co-infections VIH/VHB 63 L'épidémie par le VIH de type 1 à Mayotte est majoritairement de sous-type non B comme habituellement en Afrique sub-saharienne. Seulement 14% des virus sont de sous-type B dans la file active et seulement 17% chez les nouveaux patients. Cela se rapproche des données de France métropolitaine o on trouve 30% de sous-type B dans les infections à VIH de type 1 chez les jeunes originaires d'Afrique sub-saharienne et contaminés par rapports hétérosexuels (23). Le nombre de co-infections VIH/VHB est aussi très élevé. En effet, selon l'OMS, Mayotte, bordée par des zones de forte prévalence pour l'hépatite B, est classée zone de prévalence intermédiaire. Les données des PMI, et des quelques études existantes sur la prévalence de l'antigène HBs (Ag HBs) chez les femmes enceintes, indiquent des prévalences allant de 3. 2 à 3. 7% (70)(35). Les derniers résultats des données des laboratoires de l'le, estiment le taux de tests positifs rapportés à la population de 217 pour 100 000 personnes, contre 34 pour 100 000 en France métropolitaine (70). Le dépistage systématique, chez tous les patients hospitalisés dans le service de médecine, sur un an, de l'infection à VHB et VIH, retrouve un portage de l'Ag HBs chez 4. 2% des patients. Une autre étude de Saindou et al chez 670 femmes enceintes retrouve 3. 5% d'infections récentes ou anciennes à VHB (71)(72). En France métropolitaine, la prévalence n'est que de 0. 6%, alors qu'elle atteint 5. 3% chez les populations nées en Afrique sub-saharienne. Cela monte jusqu'à 7 à 15% parmi les migrants précaires (73). Des efforts ont été faits pour augmenter la couverture vaccinale, et doivent se poursuivre. Elle est estimée aujourd'hui à 95% chez les 2-5 ans, 91% chez les 7-11 ans et 75% des 14-15 ans, mais seulement 83% des nourrissons nés de mère Ag HBs positif ont reçu une sérovaccination complète en 2011 (70). 7. 1. 3. 2. Importance des IST On observe une recrudescence des IST un peu partout dans le monde. Initialement, l'augmentation était prépondérante chez les HSH, mais l'épidémie a évolué, et s'est diffusée à l'ensemble de la population. Il n'y a pas de réseau de surveillance des IST à Mayotte. Dans les autres DROM, la Réunion, la région Antilles-Guyane, et la France Métropolitaine, cette surveillance passe par le Réseau RésIST, basé sur le volontariat des médecins et services déclarants. Cependant, les laboratoires du réseau, Renachla et Renago, consacrés respectivement aux infections à Chlamydiae et aux gonococcies, ne sont pas présents à la Réunion. Les derniers chiffres montrent une résurgence de la syphilis avec 25 % des nouveaux cas chez les jeunes femmes, de même que de nombreuses infections à chlamydiae et gonocoque, avec des contaminations très précoces, et une très faible utilisation des 64 préservatifs. Contrairement à la France métropolitaine o 85% des syphilis et 60% des gonococcies sont détectées chez des HSH, la diffusion hétérosexuelle est très présente à la Réunion et à Mayotte (21)(25). Le dépistage systématique de tous les patients hospitalisés dans le service de médecine, sur un an, retrouve un antécédent de syphilis active chez 2% des patients. De même dans l'étude de Saindou et al sur des femmes enceintes, on retrouve un antécédent de syphilis chez 2, 1% des patientes (71)(35). Les IST sont aussi fortement présentes dans les pays d'Afrique de l'est, comme dans cette étude de Chengo Masha et al, sur une population de femmes accédant aux centres de soins prénataux au Kenya. L'étude retrouve une IST chez 20. 8% des femmes. La prévalence de C. Trachomatis était de 14. 9% et celle de N. Gonorrhoeae de 1% (74). Le dernier problème est la faible connaissance de ces maladies. La thèse de Cuziat réalisée dans un CDAG de la Réunion en 2014 montre qu'une faible proportion des usagers connaissent l'hépatite B, la syphilis et les chlamydioses uro-génitales. Des données similaires sont retrouvées à Madagascar ou aux Comores (75)(14)(17). 7. 1. 3. 3. Réminiscence de la lèpre Une lèpre tuberculoïde (TT) paucibacillaire est retrouvée chez deux de nos patients VIH, témoin de l'épidémiologie de Mayotte. La lèpre est connue à la Réunion depuis 1726. Elle y est depuis passée sous le seuil d'éradication, tout comme en France métropolitaine. Elle persiste néanmoins dans quelques foyers du monde, en zone intertropicale, notamment en Afrique et dans les les de la sous-région, comme aux Comores, à Madagascar et Mayotte o elle est endémique (76)(77)(13). La prévalence est de 5/10 000 habitants et le taux de détection annuelle moyen est de 2. 6/10 000 habitants, classant de loin Mayotte comme le département français avec le plus fort taux de détections, devant la Guyane. C'est le deuxième taux le plus important des pays de la zone océan Indien, derrière Anjouan et un des plus importants au monde. Près de 80% des infections sur l'le sont autochtones et la tendance sur ces dix dernières années est plutôt à la diminution à la fois de la prévalence mais aussi de l'incidence (78)(79). La symptomatologie de la lèpre est dépendante de l'état du système immunitaire du patient. On a montré que maladie évoluait souvent plus, lors d'une co-infection avec le VIH. De plus, les patients co-infectés sont plus à risque de faire une réaction de type 1 à l'introduction des ARV (80)(81)(82). 7. 1. 3. 4. Une le finalement relativement épargnée mais pour combien de temps ? 65 En dépit des éléments évoqués précédemment, à savoir l'importance du nombre de co-infections VHB, l'importance du nombre d'IST, et du nombre de personnes nées dans des pays de forte endémie du VIH, la prévalence du VIH ne semble pas si élevée. Bien qu'aucune étude de séroprévalence n'ait jamais été réalisée, l'épidémie semble faible, même si le nombre de nouveaux cas augmente régulièrement. Cette tendance était similaire dans les autres les de la sous-région, Madagascar, les Comores, Maurice, la Réunion, les Seychelles, dans les années 2000. Les prévalences extrêmement faibles de l'époque, 0. 4% pour Madagascar, 0. 014% pour les Comores, et moins de 1% pour les Seychelles et Maurice, avaient fait natre le concept du paradoxe de l'océan Indien (13)(83). Ce paradoxe, par rapport à l'ampleur de l'épidémie sur les côtes de l'Afrique de l'Est, n'est aujourd'hui plus totalement vrai partout. En effet on assiste à une l'explosion de l'épidémie à Madagascar, o la prévalence parat sous-estimée et dépasse 1% dans les grandes villes, à Maurice o la prévalence est de 1% et explose chez les UDIV, ou encore aux Seychelles o la prévalence est de 0. 87% et augmente chez les HSH et les UDIV. Aux Comores, la prévalence estimée actuelle reste plus basse à 0. 5% (14)(17)(18)(16)(15). Pourtant, les pratiques à risques comme la polygamie, qui concerne près d'un homme sur dix, ou encore la très faible utilisation des préservatifs, pourraient faire exploser l'épidémie, même si cela ne semble pas être le cas actuellement (84)(85). Ainsi, une étude de séroprévalence chez des femmes enceintes retrouve un taux élevé d'infections VHB et de syphilis mais aucun cas d'infection à VIH (35). De même, dans une campagne de dépistage hors les murs réalisée le 1 décembre 2016, un TROD VIH a été proposé à 200 personnes. Aucune n'avait de test positif pour le VIH. L'explication est probablement multifactorielle, en commençant par l'insularité qui offre une protection physique relative vis-à-vis des zones de forte prévalence. La religion musulmane, prédominante sur l'ile, et qui prône la circoncision systématique des jeunes enfants, pourrait être un autre facteur protecteur. Enfin, le dépistage systématique des femmes enceintes, au sein du service de médecine du CHM notamment, contribue à détecter précocement les PVVIH et à limiter rapidement la propagation. 7. 2. Vulnérabilité des PVVIH : un miroir grossissant des problématiques à Mayotte 7. 2. 1. Difficile accès aux soins et aux droits pour les étrangers 66 En 2015, la part des adultes qui ne sont pas nés à Mayotte a dépassé la barre des 50%. Près de 30% sont nés sur l'le voisine de 70 km, Anjouan. Si on regarde dans la population des 18-79 ans, il y a 4 personnes sur 10 qui sont nées à l'étranger et parmi eux, 50% sont en situation irrégulière alors même que le VIH permet théoriquement l'obtention d'un titre de séjour pour soins (85). Entre le début de l'étude fin 2014 et la fin du recueil des données, en août 2016, le climat social sur l'le s'est dégradé. Des collectifs d'habitants Mahorais ont procédé à des expulsions illégales d'étrangers en situation irrégulière ou non. Ces expulsions ont eu lieu dans le contexte d'insécurité grandissante que connat Mayotte depuis quelques années déjà. Cette insécurité, conjuguée à cette pression migratoire, a attisé les tensions entre communautés. Ces épisodes récents de violence ont très certainement aggravé encore les difficultés déjà existantes pour les étrangers en situation irrégulière. On peut penser que les ruptures de traitement ont été plus fréquentes, que les actions de dépistage et de prévention ont été moins efficaces, voire même que le climat social a compté pour certaines PVVIH perdues de vue. Les étrangers en situation irrégulière ont naturellement moins accès aux soins. Leur précarité économique pose des problèmes pour financer le logement et les transports et leur situation administrative entrane une peur des contrôles de police, impactant à la fois sur le dépistage mais aussi sur la qualité du suivi des patients déjà connus. Pour accéder à ces étrangers en situation irrégulière, qui souvent ont peur de sortir de jour, le travail sur le terrain autour de lieu sanctuaire comme à la Croix Rouge ou à Médecins du Monde, ou directement sur place comme avec l'association des Enfants de Julie, est indispensable. Il permet d'évaluer les besoins sanitaires, de tenter d'éduquer et d'informer sur les risques des IST, mais pourrait aussi dépister via des TROD ou orienter vers des structures existantes, gratuites et anonymes si possible. La complexité administrative à Mayotte est plus importante qu'en France métropolitaine. Des dérogations au droit français permettent de demander plus de documents qu'habituellement, spécifiquement pour compliquer l'obtention des titres de séjours (86). L'accès à la sécurité sociale sur l'le est normalement facilité pour les PVVIH, mais reste conditionné à l'obtention du titre de séjour. Dans notre étude, les patients nés aux Comores ont plus de difficultés à s'affilier à la sécurité sociale que les patients nés dans d'autres pays d'Afrique ou à Madagascar. La délivrance plus facile de titre de séjour pour les demandeurs d'asile est une des explications. Néanmoins, on voit que le taux d'affiliation à la sécurité sociale de ces étrangers n'est pas optimal et reste moins bon que celui des Mahorais, traduisant une inégalité flagrante dans l'accès aux soins. Pourtant, on sait que les personnes qui bénéficient d'une affiliation à la sécurité sociale, ont de meilleurs résultats dans le contrôle de l'infection à VIH. Comme nous le montrons dans notre étude, le risque d'avoir une charge virale détectable est de près de 4 fois plus important chez une personne non-affiliée, par rapport à une personne affiliée (Odd ratio 3. 43 [1. 86 - 6. 31]). 67 La plupart des étrangers à Mayotte sont originaires des Comores. Viennent ensuite les personnes nées à Madagascar. La part des demandeurs d'asile de la région des grands lacs d'Afrique, si elle est moins importante, est préoccupante par la vulnérabilité de ces personnes. Elles ont toujours subi des traumatismes psychologiques et des violences physiques ou sexuelles. Leur nombre a augmenté ces dernières années suite à l'explosion des conflits armés dans la région, en parallèle des conflits de la péninsule arabique et de la montée en puissance des terroristes de DAESH. L'OMS considère ces personnes comme des populations clefs. En effet, le fait de subir des violences, physiques ou sexuelles augmente fortement le risque d'être PVVIH (87). Il n'y a pas de différence dans notre étude dans le contrôle de l'infection selon le pays de naissance des PVVIH. On sait que traditionnellement dans les études françaises, les PVVIH nées à l'étranger ont plus de mal à se faire suivre, et sont moins contrôlées sur le plan de l'infection. On peut donc s'interroger sur l'existence d'une réelle égalité dans la prise en charge des PVVIH sur l'le ou si cela n'est pas plutôt l'effet du mauvais contrôle immuno-virologiques des patients nés en France métropolitaine. On voit en tout cas que seulement 61% des PVVIH sont indétectables sous traitement ARV et 37% chez les nouvelles PVVIH. C'est beaucoup moins bien qu'en France métropolitaine ou dans les DROM qui ont habituellement des taux de succès de contrôle de l'infection plutôt bons, respectivement 90. 4% et 78. 7%. Ce taux varie dans les DROM, de 69. 9% en Guyane, à 87. 7% à la Réunion. Si égalité il y a, cela met en lumière les mauvais résultats globaux du contrôle de l'infection (28). 7. 2. 2. Précarité et isolement 7. 2. 2. 1. Taux de chômage explosif Mayotte est le département le plus pauvre de France. Une grande partie de sa population est précaire. Le PIB par habitant à Mayotte est l'équivalent du cinquième de celui de la France métropolitaine, mais reste néanmoins huit fois supérieur à celui des Comores, expliquant l'attrait suscité. Au niveau de l'IDH, Mayotte est loin derrière la Guyane, 0. 653 versus 0. 739. La France métropolitaine se situe elle, à 0. 883. A Mayotte, les PVVIH sont précaires, comme l'ensemble de la population. Une majorité est sans emploi et une grande partie n'est pas affiliée à la sécurité sociale. La précarité économique entrane une difficulté dans la prise en charge, le suivi et le dépistage. Les difficultés pour financer les transports pour se rendre à l'hôpital de Mamoudzou, o se déroule le suivi ou la délivrance des traitements, se cumulent avec des conditions de vie difficiles. Vivant souvent dans des logements en tôles ou des bidonvilles, beaucoup de foyers n'ont pas accès à l'eau potable ou au confort de base. La mise en place progressive de la société de consommation sur l'le a contribué à la hausse des prix. Conjuguée à des prix de base déjà élevés, les denrées alimentaires étant principalement importées, cela aggrave la pression financière sur les populations et entrane des déséquilibres nutritionnels. La tolérance des traitements dans un contexte de déséquilibre alimentaire est plus dure et fragilise encore plus ces populations (88)(89). 68 De plus, dans certaines données sur des populations de PVVIH précaires, touchées par l'insécurité alimentaire, on observe une augmentation des comportements sexuels à risque, de la consommation de drogues ou d'alcool, mais aussi du taux de dépression (90). Des études dans les DROM ont montré que la précarité économique était un facteur de vulnérabilité. Cela entrane des difficultés d'accès aux soins et au dépistage. Le succès de la prise en charge est moindre chez les personnes déclarées sans emploi (OR 0. 3, IC95 [0. 1-0. 9]) (28). Ce problème d'accès à l'emploi, qui touche un peu plus les femmes, ne semble pas prêt à évoluer favorablement dans un marché de l'emploi dominé par le secteur public et o les investissements dans des secteurs stratégiques, comme le tourisme, manquent cruellement. Une grande partie de la population survit grâce à l'entraide financière intra-familiale. C'est deux fois plus à Mayotte que dans les autres DROM. Quatre personnes sur dix à Mayotte apportent une aide non financière, particulièrement dans la garde d'enfants ou de personnes âgées (85). 7. 2. 2. 2. Isolement des femmes A Mayotte, le modèle familial traditionnel repose sur le mariage coutumier à 98% et une natalité forte. Pour être reconnue comme une adulte, la femme cherche à se marier et à avoir des enfants le plus rapidement possible, avant 20-22 ans. Mais du fait de l'occidentalisation des modes de vie, de la meilleure scolarisation des jeunes femmes, ce schéma traditionnel a tendance à évoluer (69). Néanmoins aujourd'hui, encore plus de 9 Mahorais sur 10 de plus de 35 ans sont ou ont été mariés (85). Traditionnellement le fait d'être en couple est un facteur protecteur mais pas à Mayotte. Une des explications pourrait être le multi-partenariat, sériel ou concomitant : les femmes dont le mari est polygame se retrouvent finalement assez isolées. Le mari n'est finalement pas souvent présent et assure quelquefois juste une aide financière ou matérielle (69). Une autre explication est que même en couple, la précarité économique est très importante et l'emporte finalement sur ce facteur protecteur. Parmi les femmes isolées, on peut aussi citer les femmes étrangères qui traversent seules sur des kwassa kwassa pour accoucher ou qui traversent pour essayer de trouver une vie meilleure, trouver un mari et fonder une famille. Elles se retrouvent alors dans le schéma traditionnel mahorais qui prône le mariage. Elles peuvent donc passer par des multi-partenariats sériels et se retrouvent donc, entre chaque relation, très isolées (69). 69 7. 2. 3. Violences sexuelles et prostitution Les femmes isolées sont aussi plus vulnérables à cause de la violence, physique ou sexuelle qu'elles peuvent subir. A Mayotte particulièrement, beaucoup des femmes sont victimes de violences. Quatre virgule trois pourcents des PVVIH de la file active ont été contaminées suite à un viol. Il s'agit dans l'ensemble des cas de femmes originaires d'Afrique de l'est et centrale o des exactions sont en cours, comme le Congo ou le Rwanda. La violence est ainsi très présente dans la sous- région, beaucoup plus qu'en France métropolitaine. On estime que dans le monde, une femme sur trois aura au cours de sa vie, une expérience de violence sexuelle ou autre. Au Zimbabwe, un quart des femmes de 15 à 49 ans, en couple, ont subi de la violence sexuelle ou physique de leur partenaire, sur les 12 derniers mois. Ces chiffres très élevés sont similaires en Tanzanie, au Mozambique ou au Malawi (87). A Mayotte, les viols et les agressions sexuelles sont difficilement quantifiables, car probablement fortement sous-déclarées. En effet, dans le schéma traditionnel mahorais, tout ascendant a du pouvoir sur les plus jeunes, en particulier les grands parents. Ils ont le droit de s'approprier le corps des petits-enfants. Dans ce contexte, les attouchements ou les plaisanteries des hommes ou femmes d'âge mûr vis-à-vis des enfants sont fréquents. Cette tradition renforce l'idée qu'un adulte qui commet des attouchements, que la loi française désigne comme abuseur, aurait initié l'enfant et serait dans son droit. Si la famille de l'enfant se plaint, il peut tenter d'étouffer l'affaire en donnant de l'argent. Souvent les agressions sexuelles ne sont déclarées à la police que si aucun arrangement entre les familles n'a pu être trouvé (69). Dans le rapport sur les violences faites aux femmes par la délégation du droit des femmes et à l'égalité, remis en 2014, il ressort qu'environ 10% des femmes subissent des violences conjugales et ce chiffre augmente dans les DROM, étant précisé que les données de Mayotte n'ont pas été prises en compte. Les chiffres sont aussi élevés dans le reste de l'océan Indien, notamment à Madagascar. Dans une étude à Antananarivo, 43% des femmes sont ainsi victimes de violences conjugales (91). Suite à ce rapport, l'enquête DEVIFF apporte la première estimation de la fréquence des situations de violence faite aux femmes à Mayotte. Cette étude montre que 41. 7% des femmes interrogées ont subi une situation de violence globale. Dix-neuf virgule deux pourcents ont subi des violences physiques et 12. 4% des violences sexuelles. Les femmes qui subissent le plus de violence sont celles qui sont en union libre ou célibataires, ainsi que celles qui déclarent une situation de polygamie (91)(92). Quant à la prostitution, elle semble plutôt marginale dans notre étude. Une seule PVVIH se déclare travailleuse du sexe alors que la prostitution est fortement présente à Mayotte. Elle n'est pas organisée comme en Europe avec des réseaux structurés et est donc moins visible, bien que ce type de prostitution existe, notamment à Mamoudzou. On assiste plutôt, dans la plupart des cas, à une prostitution de circonstance, sous la forme d'échanges économico-sexuels ponctuels. Souvent dans un contexte de précarité sociale, la prostitution peut parfois être assimilée à un système d'entraide, un peu construit comme sur les modèles d'aides intrafamiliaux ou intracommunautaires qui existent déjà. Quatre personnes sur dix apportent une aide non financière à l'entourage et on peut très bien imaginer une sorte de contrepartie d'ordre sexuel. (69)(68)(85). 70 De nombreux échanges économico-sexuels ont aussi lieu dans des bars ou des botes de nuit de l'le, avec différents publics. C'est plutôt le fait de femmes jeunes et qui cherchent des métropolitains avec de l'argent. Ces femmes ne sont souvent pas les plus pauvres et déshéritées. En effet pour accéder à ces lieux, il faut souvent un minimum de ressources (transports, coiffure, vêtements). Ensuite, une grande partie de la classe moyenne et supérieure, mahoraise et métropolitaine se rend à Madagascar ou aux Comores pour obtenir du sexe tarifé. Nosy Be est la destination privilégiée des hommes à Mayotte qui ont les moyens d'y séjourner. Le travail du sexe à destination des touristes ou des hommes de passage pour affaires est répandu sur différents sites du pays. Aux Comores, la prostitution n'est ni légale, ni autorisée, mais existe et aucun plan d'action ciblé en direction des travailleuses du sexe n'existe. Il arrive que quelques femmes vivant dans ces pays arrivent aussi sur Mayotte pour y travailler (69). 7. 2. 4. Une jeunesse en perte de repère, de plus en plus touchée La moyenne d'âge chez les PVVIH nouvellement suivies est plus basse que chez les anciens patients. En effet, la tendance est à l'augmentation du nombre d'adolescents suivis. Les jeunes de 15 à 24 ans représentent 25% des nouveaux patients de notre étude, dont 57% de femmes (9 femmes pour 16 jeunes). Ils représentent 12% de l'ensemble de la file active, avec les femmes représentant cette fois 81. 5% (22 femmes sur 27 jeunes). C'est une tendance que l'on observe aussi en France et dans les DROM, o une grande partie des nouvelles infections concerne les jeunes (23). Les adolescents semblent être découverts de façon précoce dans notre étude. Les jeunes adultes et les adolescents sont une population clé à cibler, notamment sur le plan de l'éducation et de la prévention. La population qui a moins de 18 ans représente la moitié de la population de l'le et l'avenir de Mayotte. Leurs comportements influenceront de façon certaine la dynamique de l'épidémie. A Mayotte, les mineurs isolés et les adolescents sont particulièrement vulnérables. Nombre de ces adolescents sont très précaires, avec beaucoup de mineurs isolés, au moins 3 000 recensés. De plus ils sont faiblement éduqués et se retrouvent livrés à eux même une fois sortis du système scolaire. De ce fait, leurs comportements à risques sont nombreux, sur le plan sexuel et au niveau de la consommation de substances illicites. Une augmentation du dépistage dans cette population pourrait permettre de découvrir de nouveaux PVVIH et d'obtenir de meilleurs résultats des mesures de prévention. En effet des études en Afrique montre que les mesures de prévention dirigées vers les jeunes et l'adolescent sont plus coût-efficaces que celles dirigées vers les adultes en général (93). 71 7. 3. Forces et faiblesses de notre étude 7. 3. 1. Les forces La plus grande force de notre étude est sa bonne exhaustivité. Cette étude est mono-centrique mais du fait de la petite taille de l'le et de la centralisation du suivi des PVVIH sur Mamoudzou, la quasi- totalité des PVVIH adultes a été inclue. L'ensemble des patients sont suivi par la même équipe qui connat individuellement chaque patient, ce qui a limité les items non renseignés. Ensuite, la taille de la population de l'étude, suffisamment importante, donne une puissance statistiquement significative pour des analyses en sous-groupe. Enfin, la dernière grande force est que cette étude de type recherche-action a accompagné la réorganisation de la prise en charge des PVVIH sur le CHM courant 2014. Les données ont été recueillies de manière rétrospective et prospective, permettant une bonne exhaustivité. En effet, du fait du transfert de la prise en charge d'un lieu à l'autre et de changement de médecin référent, un certain nombre de patients avait abandonné leur suivi. Cette base solide a permis de limiter, de rattraper des perdus de vue et d'optimiser leur suivi. La poursuite de la collecte de façon prospective, après décembre 2015, permettra le suivi de l'évolution de l'épidémie sur les prochaines années et un ajustement précoce du suivi et du dépistage. 7. 3. 2. Les limites Nous sommes face à un certain nombre de données manquantes, notamment au niveau de certains paramètres biologiques ou virologiques. Cela s'explique par le suivi défaillant de quelques patients qui ratent les bilans biologiques prévus, ou au contraire, du bon contrôle virologique de certains qui intègre la file active avec une charge virale indétectable et chez qui le génotypage du virus est impossible. De plus, certaines données socio-démographiques étaient introuvables dans les dossiers médicaux. Peut-être aurions-nous dû faire un questionnaire standardisé français/shimaore à faire remplir à chaque patient pour compléter les données manquantes. Cela devra être intégré dans les prochaines études qui suivront. Pour finir, nos données sont malheureusement uniquement descriptives. Le vrai plus serait de s'intéresser à la qualité de vie des PVVIH. C'est un facteur important de bonne prise en charge et d'efficacité thérapeutique qui pourrait faire l'objet d'un prochain travail de thèse. 72 7. 4. Recommandations 7. 4. 1. Renforcement du dépistage dans les populations clés En premier lieu, il faut améliorer le dépistage chez les personnes contacts des PVVIH. Dans notre étude, seulement 11% des PVVIH sont découvertes suite à l'enquête familiale autour d'un cas séropositif. Du fait des tabous liés à la maladie et de la discrimination existante, l'absence de divulgation du diagnostic au partenaire est fréquente. Il en est de même au sein de la famille. Améliorer l'éducation et la communication avec les patients et leur entourage, lors des consultations, ou en organisant des groupes de parole, permettrait de diminuer la stigmatisation. Il faut aussi renforcer le dépistage dans les populations clés identifiées précédemment, c'est à dire les patients précaires, les étrangers en situation irrégulière, les jeunes femmes et adolescentes isolées, les travailleuses du sexe, les victimes de violences, les adolescents et surtout à Mayotte, les hommes, avec un effort particulier pour les HSH, fortement stigmatisés et sous-estimés. Pour atteindre ces populations, le milieu associatif est une porte d'entrée très intéressante. Les TROD, qui sont réalisés depuis peu dans quelques associations agréées, ont habituellement des taux de positivité pour 1 000 tests, très élevés, de l'ordre de 7. 7/1 000. Grâce à l'ARS, Nariké M SADA, la première, a pu commencer à réaliser des TROD début janvier 2017, et avec un très bon accueil et une bonne adhésion de la population. L'arrivée des TROD combinés VIH, syphilis et VHB serait particulièrement indiquée dans le contexte de Mayotte. L'augmentation de leur utilisation dans les associations actuelles, l'augmentation du nombre d'agréments pour les associations, et la possibilité de former plus de membres dans les associations, permettraient de toucher un plus large public d'hommes, des personnes précaires, des travailleuses du sexe, d'étrangers en situation irrégulière, ou tout simplement de personnes stigmatisées qui ne rentrent souvent pas dans les circuits classiques du soin. De plus, le développement des TROD dans les dispensaires de l'le, avec une formation des personnels de santé paramédicaux, médicaux et administratifs, permettrait de proposer plus systématiquement le dépistage aux patients qui consultent. La pression médicale sur ces structures diminuant le temps de consultation par patients. Cette stratégie permettrait un gain de temps et de logistique par rapport à une sérologie VIH standard et pourrait permettre de dépister plus systématiquement, notamment les étrangers, et probablement d'éviter des perdus de vue dans ces populations précaires. Dernière innovation technologique à faire son entrée en France depuis septembre 2015, l'autotest est désormais disponible dans quelques pharmacies à Mayotte. C'est une alternative qui pourrait toucher un autre type de population, un peu moins précaire. Cela peut également être intéressant pour une femme qui soupçonne que son mari la trompe. Enfin, il faut pérenniser les circuits de dépistage qui sont efficaces, comme le dépistage systématique des femmes enceintes, au sein du CDAG, ou au sein des services du CHM. Les premiers résultats des protocoles de dépistage systématique du VIH, associé aux IST, mis en place lors de la réorganisation du suivi des PVVIH, montrent en effet une prévalence des IST très importante et des découvertes de séropositivité. Les PMI, qui sont très efficaces dans le dépistage, sont à l'heure actuelle menacées financièrement. Leur intérêt est grand, de par le fait qu'elles touchent non seulement les femmes enceintes, mais aussi des jeunes femmes et adolescentes. Il faut continuer à orienter les femmes enceintes dans le circuit du dépistage systématique et augmenter le dépistage au sein de la population des jeunes femmes et adolescentes en conservant ces structures. 73 7. 4. 2. Renforcement de l'efficacité du traitement, treatment as prévention (TasP) et amélioration de la prise en charge des patients Le dépistage systématique des femmes enceintes est bien organisé, et leur traitement précoce permet de limiter la propagation de l'épidémie Il faut pérenniser ce système qui fonctionne en poursuivant les nouveaux protocoles mis en place en 2014 et réaliser une évaluation de leur efficacité et des solutions pour les améliorer. Il faut aussi pouvoir être disponible pour les PVVIH, autour d'une équipe pluridisciplinaire, pour surveiller l'efficacité et la tolérance des traitements, et assurer un support psychologique, nutritionnel, administratif, et social (64). Il pourrait aussi être intéressant de réaliser une étude sur la qualité de vie des PVVIH. Pour ce qui est du traitement à proprement parler, il faut essayer de toucher 90% des PVVIH, et d'améliorer la prise ne charge pour obtenir 90% de patients indétectables. Il faut continuer à suivre les recommandations en vigueur, et privilégier un conditionnement des ARV en une prise quotidienne afin de faciliter l'observance. Il faut enfin améliorer la délivrance en donnant la possibilité de pouvoir dispenser les traitements ARV dans les pharmacies des dispensaires périphériques, et dans les pharmacies privées. Pour l'égalité de la prise en charge entre les patients, il faut améliorer l'affiliation à la sécurité sociale. La mise en place de la CMU, CMU-c et de l'AME permettrait aux médecins généralistes libéraux de s'intégrer pleinement dans le dispositif déjà existant et ainsi de devenir un véritable relai du CHM. 7. 4. 3. Renforcement de la prévention des IST et du VIH dès le plus jeune âge Le premier pilier de la prévention est comme nous venons de le voir, le traitement ARV, TasP. Le deuxième est l'éducation. Bien comprendre la physiopathologie de l'infection à VIH, des IST, leurs risques, et les moyens de se prémunir, est le meilleur moyen d'empêcher les contaminations. Et cela doit se faire dès le plus jeune âge, afin de créer des automatismes protecteurs, comme l'utilisation du préservatif, la consultation en urgence en cas de rapport à risque pour obtenir le traitement post-exposition (TPE) et le dépistage. D'autant plus que nous avons vu que les jeunes et adolescents sont une population clé, qui augmente parmi les nouvelles contaminations, et qui s'expose particulièrement à des conduites à risques et à des consommations de substances psychoactives. La tendance est similaire en France métropolitaine et dans les DROM, o l'augmentation des nouveaux cas chez les jeunes est inquiétante. On peut y voir peut-être le reflet d'un relâchement des efforts d'éducation. 74 Les structures comme l'IREPS et l'éducation nationale ont un rôle à jouer dans cette problématique. L'éducation doit bien sûr aussi toucher l'ensemble de la population, via des campagnes publicitaires ou des journées d'information comme la journée mondiale contre le SIDA. C'est par de telles manifestations, relayées par les médias, que l'on parvient à toucher le plus de personnes. L'effort associatif doit permettre de toucher les personnes précaires et isolées, de même que les travailleuses du sexe, en intervenant directement au contact de ces populations. Les efforts de prévention se focalisent actuellement en Europe sur la population la plus touchée, soit les HSH, en se concentrant sur le dépistage et la prophylaxie pré-exposition (PrEP). A Mayotte, la PrEP est intéressante pour les HSH, bien qu'ils ne soient pas nombreux. Elle l'est aussi pour les femmes soupçonnant leur mari d'infidélité bien que l'AMM n'existe pas encore dans cette indication. L'acceptabilité de cette solution semble bonne si elle est intégrée avec l'ensemble des moyens de prévention existants. En effet, en Ile de France, une récente étude sur l'acceptabilité et les freins à l'utilisation de cette PrEP, dans les populations africaines et caribéennes, a identifié un intérêt chez les hommes avec partenaires multiples et chez les femmes soupçonnant leur mari d'infidélités. L'acceptabilité était satisfaisante quand elle était combinée à d'autres stratégies comme l'usage du préservatif et le dépistage. L'obligation de consulter pour la délivrance du traitement était un des freins à son utilisation dans cette étude. Probablement que ce critère serait un obstacle à son utilisation à Mayotte (94). Un moyen simple et efficace de réduire les infections à VIH et les IST serait l'utilisation systématique et massive du préservatif. Comme le montre le rapport d'activité du CDAG en 2013, une très faible proportion de la population qui consulte au CDAG, moins de 20%, utilisent les préservatifs. Ces proportions très faibles se retrouvent dans des études d'adultes en Afrique ou dans les DROM (84)(25)(95). Cela est aggravé par leur mise à disposition de la population qui n'est pas facilitée. En effet, on peut en acheter en supermarché ou en pharmacie mais seulement aux horaires ouvrables. Il n'y avait lors de notre étude aucun distributeur 24h/24 dans l'le. Plusieurs ont été implantés dans le nord, le centre et le sud, gérés par l'association Fahamou Maecha. Il n'existe pas encore à notre connaissance encore d'évaluation du dispositif. Il faudrait renforcer la distribution gratuite dans les lycées et collèges, les dispensaires, le CHM, le CDAG, les associations. Il faudrait bien sûr aussi énormément communiquer, par affiches, par la presse bien que peu représentée, par la radio, la télévision et bien sûr sur internet. Il faut insister sur ce moyen de prévention car c'est le seul qui permet de se prémunir à la fois des IST et de l'infection à VIH, parce qu'il est aussi facile d'utilisation et est bon marché. La circoncision médicale volontaire est l'une des stratégies existantes, recommandée par l'OMS dans son plan 90-90-90, notamment en Afrique. La population de Mayotte, fortement musulmane, aura d'autant plus de facilités à intégrer ces recommandations (96)(11). Enfin, même s'ils ne sont pas nombreux dans la file active et sur l'le en général, la réduction des risques pour les usagers de drogues doit exister. A Mayotte, il s'agit principalement de drogues de synthèse chimique qui sont fumées et/ou inhalées et génèrent des comportements à risque. 75 7. 4. 4. Renforcer les financements Toutes ces recommandations ont un coût à estimer afin de pouvoir renforcer le lobbying pour les financements. Une des priorités est le maintien en pleine activité des PMI, structures clés du dépistage mais qui est en déficit budgétaire. Ensuite, il pourrait être judicieux d'investir dans la création d'un Réseau RésIST à Mayotte, et inclure les deux laboratoires de l'le dans les réseaux Renago et Renachla. Enfin, le financement de recherche sur l'épidémie est primordial. Les études épidémiologiques mais aussi sur la qualité de vie, qui permettent une meilleure compréhension de la dynamique de l'épidémie, doivent se multiplier. Il serait notamment intéressant de faire une grande étude de séroprévalence à l'heure o les résultats du recensement 2017 de la population vont tomber. La dotation annuelle forfaitaire de financement du CHM en 2011 et 2012 était d'un peu plus de 40 545 657 euros. Seulement 130 000 euros étaient alloués au programme national de lutte contre le VIH et les IST. Auxquels s'ajoutent les 304 956 euros du CDAG. Or, selon l'OMS, le budget prévention doit représenter au minimum un quart du budget total. Si on extrapole au budget du CHM, cela représente un peu plus de 100 000 euros (11)(84). L'Etat français peine à injecter massivement de l'argent pour rattraper le retard de son département. L'enveloppe pour le projet Mayotte 2025, financé à la suite des grandes grèves de 2015-2016, avoisine seulement les 350 millions d'euros, auquel s'ajoute 350 millions de l'UE. Pour comparaison, la Guyane a réussi à négocier et signer un projet à 3 milliards d'euros. Le développement de Mayotte en général, et la lutte contre l'infection à VIH et les IST plus particulièrement, s'amélioreront si la volonté est forte du côté des pouvoirs publics (97). 76 8. Conclusion Après avoir réalisé de nombreux progrès dans la lutte contre l'infection à VIH/SIDA, l'épidémie progresse et est même hors de contrôle dans certaines zones du monde et dans certaines populations clés. Mayotte, fortement touchée par les IST semble relativement épargnée par le VIH, bien que le nombre de cas augmente régulièrement au cours des dernières années. Notre étude de l'épidémie à Mayotte a mis en évidence des ressemblances avec les caractéristiques de l'épidémie en Afrique sub-saharienne. Il existe des inégalités entre les différentes populations de PVVIH, qui reflètent tout simplement les problèmes de la société mahoraise. Cette transition sociétale qui accompagne Mayotte depuis quelques années, conjuguée à l'immigration clandestine massive qui ne décroit pas, est en train de modifier le schéma traditionnel familial et les habitudes de vie de la population. Ainsi, personne ne peut prédire l'évolution de la situation dans 15 ans. Les progrès que nous avons pu accomplir durant cette étude, à la fois pour mieux comprendre l'épidémie et dans l'amélioration de l'organisation de prise en charge des PVVIH, nous ont permis de limiter le nombre de perdus de vue et de poser les bases pour poursuivre efficacement la surveillance épidémiologique. Enfin, si l'effort de financement des pouvoirs publics est suffisant et si l'ensemble de la population lutte contre les discriminations et les stigmatisations, nous pouvons avoir espoir d'éradiquer l'infection à VIH d'ici 2030. 77 9. Bibliographie 1. Worobey M, Gemmel M, Teuwen DE, et al. Direct evidence of extensive diversity of HIV-1 in Kinshasa by 1960. Nature. 2 oct 2008 ; 455(7213) : 6614. 2. Gierstorfer C. Sida, un héritage de l'époque coloniale [Internet]. ZDF, Doc Days Productions, Yuzu Productions, Congoo Productions ; 2014 [cité 10 avr 2017]. Disponible sur : 3. Le sida en chiffres 2015 [Internet]. ONUSIDA ; 2015 p. 12. Disponible sur : 4. AIDS by the numbers AIDS is not over, but it can be | UNAIDS [Internet]. UNAIDS ; 2016 p. 28. Disponible sur : by-the-numbers 5. Objectifs du Millénaire pour le développement Rapport 2015 [Internet]. ONU ; 2015 p. 75. Disponible sur : 6. Kofi A. Rapport du Millénaire du Secrétaire général des Nations Unies [Internet]. 2000 [cité 30 avr 2016]. Disponible sur : 7. Transformer notre monde : le Programme de développement durable à l'horizon 2030 sur : [Internet]. Disponible ONU ; 41. 2015 août p. 8. 90-90-90 : Une cible ambitieuse de traitement pour aider à mettre fin à l'épidémie du sida sur : [Internet]. ONUSIDA ; Disponible 2014. 9. Ngonzi K. HIV prevalence, map 227 [Internet]. 2004. Disponible sur : 10. Ngonzi K. HIV/AIDS Deaths, map 374 [Internet]. 2004. Disponible sur : 11. UNAIDS. Prévention gab record [Internet]. 2016 p. 286. Disponible sur : 12. UNAIDS. The gab report [Internet]. 2014 juill p. 422 ; 28-47. Disponible sur : 13. Gazère BA, Aubry P. History of human epidemic and endemic diseases in the southwest Indian Ocean. Med Sante Trop. 1 mai 2013 ; 23(2) : 14557. 14. Country progress Report 2015, Madagascar [Internet]. UNAIDS ; 2015 p. 37. Disponible sur : 015. pdf 78 15. Country progress Report 2015, Ile Maurice [Internet]. UNAIDS ; 2015 p. 87. Disponible sur : 15. pdf 16. Country progress Report 2015, Seychelles [Internet]. UNAIDS ; 2015 p. 70. Disponible sur : 5. pdf 17. Country progress Report 2015, Union de Comores [Internet]. UNAIDS ; 2015 p. 15. Disponible sur : 15. pdf 18. Toyb M, Lombart JP, Binti Abdou A, et al. AIDS and HIV infection in the Federal Islamic Republic of Comores (1988-1995). Med Trop Rev Corps Sante Colon. 1997 ; 57(1) : 5961. 19. Supervie V, Ekouevi DK. Overview of the HIV epidemics in France and worldwide. Rev Prat. oct 2014 ; 64(8) : 10606. 20. Cazein F, Le Start Y, Sarr A, et al. Dépistage de l'infection par le VIH en France, 2003- 2015. Bull Epidémiol Hebd. 2016 ; (4142) : 7458. 21. Santé Publique France. Infection par 2016 [Internet]. le VIH et épidémiologiques IST/Infection-a-VIH-et-sida/Actualites/Infection-par-le-VIH-et-les-IST-bacteriennes. - Point-epidemiologique-du-29-novembre-2016 Disponible nov les IST bactériennes données p. sur : 8. 22. France, Ministère des affaires sociales et de la santé (2012- . ), Morlat P. Prise en charge médicale des personnes vivant avec le VIH Rapport 2013 : recommandations du groupe légale et administrative : La d'experts. Paris : DILA - Direction de documentation française ; 2013. 478 p. l'information 23. lot F, Smati J, Montlahuc C, et al. Découvertes de séropositivité VIH chez les jeunes en France, 2003-2013. Bull Epidémiol Hebd. 1 déc 2015 ; (40-41) : 744-51. 24. Cazein F, Le Start Y, Ramus C, et al. Dépistage de l'infection par le VIH dans les laboratoires d'analyses médicales, 2003-2014. Bull Epidémiol Hebd. 1 déc 2015 ; (4041) : 76971. 25. Cire océan Indien. Situation du VIH, Sida et des IST, à la Réunion et à Mayotte, données actualisées au 31/12/2014. BVS. déc 2015 ; (29) : 32. 26. Supervie V, Ndawinz JDA, Lodi S, et al. The undiagnosed HIV epidemic in France and its implications for HIV screening strategies. AIDS Lond Engl. 31 juill 2014 ; 28(12) : 1797804. 27. Sarr A, Itodo O. Dépistage communautaire par tests rapides (TROD) VIH en France sur une période de trois ans, 2012-2014. 1 déc 2015 ; (4041) : 7728. 28. Kayigan d'Almeida W, Cabie A, Gaud C. Infection à VIH dans les DOM : Facteurs associés à la réponse virologique au traitement dans l'enquête ANRS-VESPA2, 2011. Bull Epidémiol Hebd. 1 déc 2015 ; (4041) : 75968. 79 29. Epelboin L, Chroboczek T, Mosnier E, et al. L'infectiologie en Guyane : le dernier bastion de la médecine tropicale française [Internet]. 2016 sept [cité 12 avr 2017] p. 18. Disponible sur : dernier bastion de la medecine tropicale francaise 30. CIRE Antilles Guyane. IST-VIH. BVS. déc 2016 ; (3) : 35. 31. Cire océan Indien. Surveillance des infections à VIH et Sida à la Réunion et Mayotte, région océan Indien de 2003 à 2014, données actualisées au 31/12/2014. Bull Veille Sanit. déc 2015 ; (29) : 32. 32. Receveur MC, Coulaud X, Ali R, et al. Prevalence of HIV in Mayotte. Bull Soc Pathol Exot 1990. août 2003 ; 96(3) : 23840. 33. Lartigau-Roussin C, Receveur MC, Hebert JC, et al. Update on HIV infection in Mayotte. Med Trop Rev Corps Sante Colon. avr 2007 ; 67(2) : 11922. 34. Rougerie S. Dépistage et prévention de l'infection par le VIH à Mayotte [Thèse de médecine générale]. [Rennes] : Rennes 1 ; 2011. 35. Saindou M, Bénet T, Troalen D, et al. Prevalence and risk factors for HIV, hepatitis B virus, and syphilis among pregnant women in Mayotte, Indian Ocean, 2008-2009. Int J Gynaecol Obstet Off Organ Int Fed Gynaecol Obstet. oct 2012 ; 119(1) : 615. 36. Panorama de Mayotte. Institut d'Emission des Département d'outre-mer (IEDOM) ; 2014 juill p. 4. Report No. : 277. 37. Verin P, Martin J, Allibert C. Mayotte, plaque tournante et microcosme de l'océan Indien Son histoire avant 1841. 1985 ; 72(269) : 5067. 38. Hébert JC. Le premier peuplement de Mayotte dévoilé par le proto-malgache. nov 2010 ; (2) : 941. 39. Said S. Pratique de la conjugaison du shimaore : parler shimaore. Paris : Menaibuc ; 2011. 40. Florence S, Lebas J, Lesieur S, et al. Santé et migration à Mayotte. INSERM ; 2008 avr p. 148. 41. Pierre V, Jean M. Allibert (Claude) : Mayotte, plaque tournante et microcosme de l'océan Indien Son histoire avant 1841. Rev Fr Hist O-m. 1985 ; 72(269) : 5067. 42. Allibert C. Migration austronésienne et mise en place de la civilisation malgache. Diogène. 1 févr 2008 ; (218) : 617. 43. Chanudet C. Peuplement des les de l'océan Indien occidental et traites négrières. nov 2010 ; (2) : 4253. 44. Loi n74-965 du 23 novembre 1974 organisant une consultation des populations des sur : Comores 1. Disponible 23, 1974 p. [Internet]. JO, 74965 nov 80 45. INSEE. Estimation de la population au 1er janvier par région, département, sexe et âge de sur : 1975 Disponible [Internet]. 2016 2015 févr. à 46. INSEE. Insee - Population - Estimation de la population au 1er janvier par région , département (1975-2015), sexe et âge (quinquennal, classes d'âge) - Estimation de la population au 1er janvier par région, département, sexe et âge de 1975 à 2015 [Internet]. 2016 [cité sur : Disponible 2016]. juill 24 47. Balicchi J, Bini JP. Mayotte, département le plus jeune de France. févr 2014 ; (1488) : 4. 48. Bini JP, Daudin V, Levet A. Recensement : 212 600 habitants à Mayotte en 2012. INSEE Mayotte Infos. nov 2012 ; (61) : 4. 49. Mayotte première. Mayotte : nouveau record absolu de naissances en 2016 [Internet]. outre- mer 1ère. [cité 13 avr 2017]. Disponible sur : record-absolu-naissances-2016-432413. html 50. INSEE. Insee - Naissances, décès et mariages par département de domicile et sur : d'enregistrement 2017]. Disponible [Internet]. [cité avr 13 51. SENAT. Mayotte : un nouveau département confronté à de lourds défis [Internet]. 2012 [cité 24 juill 2016]. Disponible sur : 52. magazine LP. Mayotte : Délinquance en hausse de 7%, près de 20. 000 expulsions [Internet]. Le sur : 20-000-expulsions-10-04-2015-1920262 683. php Disponible 2016]. Point. 2015 [cité juill 24 53. INSEE. Insee - Population - Mayotte : Recensement de la population de 2007 - Une population multipliée par quatre en 30 ans [Internet]. [cité 21 août 2016]. Disponible sur : 54. Thocaven C. État des Lieux du Processus de Migration Sanitaire Programmé des Comores vers Mayotte [Thèse de médecine générale]. [Bordeaux] : Université de Bordeaux ; 2014. 55. Gaussein M. Étude descriptive aux Urgences du Centre Hospitalier de Mayotte d'une population migrant pour raison de santé [Thèse de médecine générale]. [Bordeaux] : Université de Bordeaux ; 2014. 56. La santé dans les outre-mer, une responsabilité de la République [Internet]. cour des comptes ; 2014 juin p. 287. Disponible sur : sante-dans-les-outre-mer-une-responsabilite-de-la-Republique 57. Daudin V, Michaïlesco F. Les difficultés face à l'écrit en langue française. févr 2014 ; (70) : 6. 58. CNOM. Rapport de mission pour le conseil national de l'ordre des médecins dans la région de l'océan Indien du 10 au 15 Février 2014. [Internet]. CNOM ; 2014 août p. 8. Disponible sur : 81 59. CHM. Rapport d'activité 2013 Centre Hospitalier de Mayotte [Internet]. 2014 janv. Disponible sur : 60. Société - Les outre-mer [Internet]. [cité 26 juill 2016]. Disponible sur : mer. gouv. fr/ ? societe-mayotte. html 61. ARSOI, CHM. Contrat pluriannuel d'objectif et de moyen 2013/2017 [Internet]. 2013 p. 139. Disponible sur : 62. Lartigau-Roussin C. Une approche de la Médecine traditionnelle à Mayotte : Des plantes en question. Bull Nat-Hist&Géo Mayotte. juill 2002 ; (6) : 6. 63. Blanche S, Dollfus C, Faye A, et al. Le sida pédiatrique, 30 ans plus tard. Arch Pédiatrie. août 2013 ; 20(8) : 8906. 64. Alzai M. Suivi des femmes enceintes VIH du Centre Hospitalier de Mamoudzou de janvier 2013 à décembre 2014 et de leurs nourrissons [Thèse de médecine générale]. [Bordeaux] : Université de Bordeaux ; 2016. 65. Traore H, Meda N, Nagot N, et al. Déterminants du faible poids de naissance chez des enfants nés de mères séropositives pour le VIH, non éligibles au traitement antirétroviral, en Afrique. Rev DÉpidémiologie Santé Publique. oct 2013 ; 61(5) : 41320. 66. Jasseron C. Prise en charge des femmes enceintes infectées par le VIH en France à l'ère des multithérapies : des recommandations aux pratiques [Internet] [Thèse de Santé publique et épidémiologie]. [Paris] : Université Paris Sud ; 2012. Disponible sur : ouvertes. fr/tel-00783714/document 67. Dollfus C, Leverger G. Les enjeux actuels de la prévention de la transmission materno-foetale du VIH [Internet]. EPU Trousseau ; 2015 p. 4. Disponible sur : content/blogs. dir/146/files/2015/03/01-ENJEUX-ACTUELS-DE-LA-PREVENTION- DE-LA-TRANSMISSION-MATERNOFOETALE-DU-VIH. pdf 68. AIDES. Mission Exploratoire Mayotte [Internet]. 2012 déc p. 27. Disponible sur : yotte-1. pdf 69. Guillemaut F. Prévention combinée du VIH, des IST et des hépatites, réduire les freins à l'accès universel : prostitution et échanges économico-sexuels à Mayotte, des réponses à co- construire. 2013. 70. Millot P. Egalité des soins face aux Hépatites B à Mayotte. Présentation présenté à : 13ème colloque VIH/Hépatites océan Indien ; 2014 oct ; La Réunion. 71. Michaud C, Vernier M, Ahmad D, Diallo A, Millot P, Olivier S, et al. HEP-03 - Évaluation du dépistage systématique du VIH, des hépatites B, C et de la syphilis dans un service de médecine ultramarin de juillet 2014 à juin 2015. Médecine Mal Infect. juin 2016 ; 46(4) : 51. 72. Saindou M, Voirin N, Troalen D, et al. Socio-demographic and behavioral determinants of hepatitis B vaccination and infection in pregnant women on Mayotte Island, Indian Ocean. Vaccine. 9 oct 2013 ; 31(43) : 494652. 82 73. Dray-Spira R, Gigonzac G, Vignier N, et al. Caractéristiques des personnes originaires d'Afrique subsaharienne suivies pour une hépatite B chronique en le-de- France en 2012- 2013. données de l'enquête ANRS-Parcours. Bull Epidémiol Hebd. 2015 ; (1920) : 33947. 74. Masha SC, Wahome E, Vaneechoutte M, et al. High prevalence of curable sexually transmitted infections among pregnant women in a rural county hospital in Kilifi, Kenya. PloS One. 2017 ; 12(3) : e0175166. 75. Cuziat J. Connaissances des patients du CDAG de St-Denis de la Réunion à propos de l'hépatite B, de la Syphilis et des Chlamydioses uro-génitales [Thèse de médecine générale]. [Bordeaux] : Université de Bordeaux ; 2014. 76. OMS. Situation de la lèpre dans le monde, 2015 : l'heure est à l'action, à la responsabilisation et à l'inclusion. Relevé Épidémiologique Hebd. 2 sept 2015 ; 91(35) : 40520. 77. Camuset G, Lafarge S, Borgherini G, et al. Leprosy on Reunion Island, 2005-2013 : Situation and Perspectives. PLoS Negl Trop Dis. avr 2016 ; 10(4) : e0004612. 78. De Carsalade GY, Achirafi A, Flageul B. Lèpre et dermatoses courantes en pays tropical. L'expérience de Mayotte [Internet]. 2008. Disponible sur : 1599-1. html 79. Raslan-Loubatié J, Achirafi A, Oussaïd D. La lèpre, une maladie endémique à Mayotte : état des lieux en 2006-2011. Bull Epidémiol Hebd. 10 déc 2013 ; (4142) : 5416. 80. Ae M, Ka A, Ea N. Effect of HIV infection on the clinical spectrum of leprosy in Maiduguri. Niger Postgrad Med J. juin 2001 ; 8(2) : 747. 81. Moses AE, Adelowo KA, Ajayi BB. Prevalence of HIV-1 infection among patients with leprosy and pulmonary tuberculosis in a semi-arid region, Nigeria. J R Soc Promot Health. juin 2003 ; 123(2) : 1179. 82. Menezes VM, Nery JAC, Sales AM, et al. Epidemiological and clinical patterns of 92 patients co-infected with HIV and Mycobacterium leprae from Rio de Janeiro State, Brazil. Trans R Soc Trop Med Hyg. févr 2014 ; 108(2) : 6370. 83. Dada Y, Milord F, Frost E, et al. The Indian Ocean paradox revisited : HIV and sexually transmitted infections in the Comoros. Int J STD AIDS. sept 2007 ; 18(9) : 596600. 84. CHM. Contrat Pluriannuel d'Objectifs et de Moyens 2013-2017. Rapport d'activité 2013 sur : Hospitalier Disponible Mayotte ; 2013. [Internet]. Centre 85. Marie CV, Breton D. Migrations, natalité et solidarités familiales La société de Mayotte en pleine mutation. INSEE Anal Mayotte. mars 2017 ; (12) : 6. 86. Ordonnance du 29 mars 2011 modifiant l'organisation judiciaire dans le département de sur : Mayotte 2017]. Disponible - MOM [Internet]. [cité 28 avr 83 87. UNAIDS. When women lead, change happens, international women's day [Internet]. 2017 p. 36. Disponible sur : lead-change-happens en. pdf 88. McKay FH, Lippi K, Dunn M. Investigating Responses to Food Insecurity Among HIV Positive People in Resource Rich Settings : A Systematic Review. J Community Health. 17 avr 2017 ; 89. Masa R, Chowa G, Nyirenda V. Prevalence and Predictors of Food Insecurity among People Living with HIV Enrolled in Antiretroviral Therapy and Livelihood Programs in Two Rural Zambian Hospitals. Ecol Food Nutr. 18 avr 2017 ; 121. 90. Pellowski JA, Huedo-Medina TB, Kalichman SC. Food Insecurity, Substance Use, and Sexual Transmission Risk Behaviour Among People Living with HIV : A Daily Level Analysis. Arch Sex Behav. 20 avr 2017 ; 91. Dupray O, Thomas V. Enquête DeViFFe 2014 : Dépister la violence faite aux femmes en consultation non programmée à Mayotte [Internet]. Présentation présenté à : Congrès de médecine générale de l'océan Indien ; 2016 avr. Disponible sur : content/uploads/2016/08/CS16 4-6. pdf 92. Dupray O. Les violences faites aux femmes à Mayotte - Enquête DEVIFFE 2014 - Première approche exploratoire multidisciplinaire [Thèse de médecine générale]. [La Réunion] : Université de Bordeaux ; 2017. 93. Alsallaq RA, Buttolph J, Cleland CM, et al. The potential impact and cost of focusing HIV prevention on young women and men : A modeling analysis in western Kenya. PloS One. 2017 ; 12(4) : e0175447. 94. Hadj L, Desgrées du Loû A, Dupont J. Acceptabilité et freins chez les populations africaines et caribéennes vivant en le-de-France d'une nouvelle offre de prévention du VIH : le Truvada en prophylaxie pré-exposition (PrEP). Une enquête exploratoire. Bull Epidémiol Hebd. 7 mars 2017 ; (6) : 1104. 95. Mnyika KS, Makwaya CK, Lyamuya EF, et al. Prevalence of HIV-1 infection in Zanzibar : results from a national HIV-1 serosurvey 2002. East Afr J Public Health. sept 2012 ; 9(3) : 1237. 96. Bourdillon F. Prévention et dépistage de l'infection par le VIH. oct 2014 ; 64 : 106772. 97. Mayotte 2025 une ambition pour la république [Internet]. Préfecture de Mayotte ; 2015 p. 26. sur : Disponible %20Une%20ambition%20pour%20la%20R%C3%A9publique%20- %20document%20strat%C3%A9gique. pdf 84 Le Serment d'Hippocrate : Au moment d'être admis à exercer la médecine, je promets et je jure d'être fidèle aux lois de l'honneur et de la probité. Mon premier souci sera de rétablir, de préserver ou de promouvoir la santé dans tous ses éléments, physiques et mentaux, individuels et sociaux. Je respecterai toutes les personnes, leur autonomie et leur volonté, sans aucune discrimination selon leur état ou leurs convictions. J'interviendrai pour les protéger si elles sont affaiblies, vulnérables ou menacées dans leur intégrité ou leur dignité. Même sous la contrainte, je ne ferai pas usage de mes connaissances contre les lois de l'humanité. J'informerai les patients des décisions envisagées, de leurs raisons et de leurs conséquences. Je ne tromperai jamais leur confiance et n'exploiterai pas le pouvoir hérité des circonstances pour forcer leurs consciences. Je donnerai mes soins à l'indigent et à quiconque me les demandera. Je ne me laisserai pas influencer par la soif du gain ou la recherche de la gloire. Admis dans l'intimité des personnes, je tairai les secrets qui me sont confiés. Reçu à l'intérieur des maisons, je respecterai les secrets des foyers et ma conduite ne servira pas à corrompre les mœurs. Je ferai tout pour soulager les souffrances. Je ne prolongerai pas abusivement les agonies. Je ne provoquerai jamais la mort délibérément. Je préserverai l'indépendance nécessaire à l'accomplissement de ma mission. Je n'entreprendrai rien qui dépasse mes compétences. Je les entretiendrai et les perfectionnerai pour assurer au mieux les services qui me seront demandés. J'apporterai mon aide à mes confrères ainsi qu'à leurs familles dans l'adversité. Que les hommes et mes confrères m'accordent leur estime si je suis fidèle à mes promesses : que je sois déshonoré et méprisé si j'y manque. 85 Title : Epidemiological characteristics of people living with HIV(PLWH) followed up at the Mayotte Hospital Center, from 01/01/2014 to 12/31/2015. Abstract BACKGROUND AND AIMS : Mayotte is a French island located in the Indian ocean and surrounded by areas of high HIV-prevalence. Socio-economics conditions are deteriorated and population movements are important, leading to the spread of the epidemic. The small number of available publications prompted us to carry out this study based on the epidemiological characteristics of PLWH followed up in Mayotte. METHODS : This is a retrospective and descriptive epidemiological study on the 01/01/2014 and a prospectively epidemiological study until the 31/12/2015, based on the medical files of HIV- positive patients followed up at the Hospital Center of Mayotte. RESULTS : 212 PLWH were included. The studied population is predominantly female. The median age is 37 years, with a quarter of newly diagnosed people aged between 15-24 years. PLWH were born mainly in the Comoros (47%). Men are four times more likely to be at the AIDS stage (OR 3. 63, IC95 [1. 77 - 7. 45]). Precariousness is important with 48% of PLWH being unemployed and 30% without social security. Only 63% of treated patients have an undetectable viral load. People without medical coverage are almost four times more likely to be uncontrolled (OR 3. 43, IC95 [1. 86 - 6. 31]). CONCLUSION : PLWH followed up in Mayotte present the characteristics of the african epidemic. While routine screening and early treatment of pregnant women are well organized, epidemic is less well controlled than in metropolitan France with only two-thirds of undetectable patients and vulnerable subgroups : young people, people in precarious situations and men who have an increased risk of reaching the AIDS stage. Screening efforts, particularly through rapid diagnostic orientation tests, should help to better target these populations and limit people lost to follow-up. The others major public health issues are health education and the limitation of risky practices. KEY WORDS : PLWH Mayotte Precariousness 86 Titre : Caractéristiques épidémiologiques des Personnes Vivant avec le VIH (PVVIH), suivies au Centre Hospitalier de Mayotte (CHM), du 01/01/2014 au 31/12/2015. Résumé : INTRODUCTION : Mayotte est une le française de l'océan Indien entourée de zones de forte prévalence pour le VIH. Les conditions socio-économiques y sont dégradées et les mouvements de populations importants, favorisant la propagation de l'épidémie. Le faible nombre de publications disponibles nous a poussés à réaliser cette étude portant sur les caractéristiques épidémiologiques des PVVIH suivies à Mayotte. MATERIEL ET METHODE : Il s'agit d'une étude épidémiologique descriptive rétrospective au 01/01/2014 puis prospective jusqu'au 31/12/2015, réalisée à partir des dossiers des patients séropositifs suivis au Centre Hospitaliser de Mayotte. RESULTATS : 212 PVVIH ont été inclues. La file active est majoritairement féminine. L'âge médian est 37 ans, avec un quart des personnes nouvellement diagnostiquées entre 15 et 24 ans. Les PVVIH sont nées principalement aux Comores (47%). Les hommes ont quatre fois plus de risques d'être au stade SIDA (OR 3. 63 ; IC95 [1. 77 - 7. 45]). La précarité est importante avec 48 % des PVVIH sans emploi et 30% sans sécurité sociale. Seulement 63% des patients traités ont une charge virale indétectable. Les personnes sans couverture médicale ont près de quatre fois plus de risques d'être non-contrôlées (OR 3. 43, IC95 [1. 86 - 6. 31]). CONCLUSION : La file active mahoraise présente les caractéristiques de l'épidémie africaine. Si le dépistage systématique des femmes enceintes et leur traitement précoce sont bien organisés, l'épidémie est moins bien contrôlée qu'en Métropole avec seulement deux tiers des patients indétectables et des sous-groupes vulnérables : les jeunes, les personnes précaires et les hommes qui ont un sur-risque d'atteindre le stade SIDA. Des efforts de dépistage, en particulier grâce aux tests rapides d'orientation diagnostique (TROD), devraient permettre de mieux cibler ces populations et de limiter les perdus de vue. Les autres enjeux majeurs de santé publique sont l'éducation à la santé et la limite des pratiques à risque. TITLE : Characteristics and health care pathway of people living with HIV(PLWH) followed up at the Mayotte Hospital Center from 01/01/2014 to 12/31/2015. DISCIPLINE : Médecine Générale MOTS CLES : PVVIH Mayotte Précarité | HAL | Scientific |
Asthme et hormones ovariennes ; étude expérimentale | WMT16 | Scientific |
Etude de la fréquence relative des diverses formes cliniques du glaucome (3, 269 observations) | WMT16 | Scientific |
Subsets and Splits
No community queries yet
The top public SQL queries from the community will appear here once available.