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Attività tirosina idrossilasi cerebrale e pressione sanguigna sistolica in ratti trattati con deossicorticosterone e sale o angiotensina.L'ipertensione indotta nei ratti maschi adulti da doca/ è stato riscontrato che il sale è accompagnato da un aumento significativo dell'attività della tirosina idrossilasi (TH) dell'intero cervello. Un effetto ipertensivo minore, prodotto dall'angiotensina (750 ng kg-1 al giorno) è stato anche accompagnato da un aumento proporzionale dell'attività dell'TH dell'intero cervello. gli antagonisti specifici spironolattone e saralasina hanno bloccato completamente entrambe le risposte rispettivamente negli animali trattati con doca/sale e angiotensina e lo spironolattone ha mostrato una parziale inibizione degli effetti dell'angiotensina. In tutti gli animali trattati c'era una chiara correlazione tra pressione sanguigna sistolica e cervello intero Attività TH. Il significato di questi cambiamenti è discusso alla luce del meccanismo centrale dell'ipertensione.
Un metodo per lo screening di agenti diuretici nel topo: un'indagine sulle differenze sessuali.Acetazolamide, aminofilina, fusemide, acido etacrinico e triamterene sono stati testati per azione diuretica a dosaggi di 3, 10 e 30 mg kg-1 (sc) in topi maschi e femmine. Ogni farmaco ha aumentato significativamente l'escrezione di sodio e tutti tranne l'acetazolamide hanno aumentato il volume delle urine e l'escrezione di cloruro. L'escrezione di potassio è stata significativamente aumentata da acetazolamide e furosemide. L'acetazolamide e il triamterene hanno provocato l'alcalinizzazione urinaria, mentre la furosemide e l'acido etacrinico hanno ridotto il pH urinario. I topi femmine erano notevolmente più sensibili dei maschi alle azioni diuretiche, natriuretiche, cloruretiche e acidificanti dell'urina dell'acido etacrinico.
Metilmercurio e recettore del muscolo scheletrico.Metilmercurio alla concentrazione del bagno di 2 X 10(-5) M era in grado di inibire le contrazioni muscolari dell'isolato preparazione dell'emidiaframma del nervo frenico di ratto. Al culmine dell'inibizione, il potenziale d'azione del nervo poteva ancora essere registrato e i muscoli continuavano a rispondere alla stimolazione diretta. L'inibizione non era reversibile con L-cisteina o D-penicillamina, ma era possibile una protezione limitata mediante precedente trattamento con (+)-tubocurarina Il trattamento dei muscoli retti di rana con metilmercurio (0-2 mM per 15 min) ha determinato uno spostamento a destra di 1 unità logaritmica nella curva dose-risposta all'acetilcolina e una riduzione della risposta massima di il tessuto. L'azione inibitoria osservata del metilmercurio sulla trasmissione neuromuscolare può essere spiegata da un'azione sul legame disolfuro che si ritiene sia presente su un recettore colinergico.
Analisi colorimetrica delle impurezze immunogeniche nell'acido acetilsalicilico.Viene descritto un metodo colorimetrico rapido e conveniente per la determinazione quantitativa delle impurezze immunogeniche nell'acido acetilsalicilico, acido acetilsalicilsalicilico e anidride acetilsalicilica. Il metodo prevede l'aminolisi iniziale dei composti da parte dell'ammoniaca per dare la salicilammide e successivo accoppiamento di questa con il 4-ammino-fenazone in presenza di un agente ossidante. In combinazione con un metodo precedentemente descritto per l'analisi dell'anidride il metodo consente una determinazione specifica dell'acido acetilsalicilsalicilico in concentrazioni fino allo 0-005% Applicando i metodi a 15 diversi campioni e formulazioni di acido acetilsalicilico commerciale, l'anidride acetilsalicilica e l'acido acetilsalicilico sono risultati presenti in quantità comprese tra 0-001 e 0 -024% e da 0-006 a 0-58% (p/p), rispettivamente.
Proprietà interfacciali di polimetil alfa-cianoacrilato e polibutil alfa-cianoacrilato.Diverse proprietà fisiche di due polialchil alfa-cianoacrilati rilevanti per il loro uso nel dosaggio farmaceutico forme sono state studiate. La formazione di film polimerici a diverse interfacce olio-acqua rivela film di diversa morfologia. Il ritardo del trasferimento di soluto attraverso un'interfaccia olio-acqua causato dalla presenza di film polimerici formati in situ dai monomeri ha rivelato che il metile derivato costituisce la barriera più efficace al soluto in esame, il violetto di genziana Sono state studiate le proprietà stabilizzanti dell'emulsione del polimero metilico e le proprietà filmogene dei monomeri diffusi dal benzene sulle superfici dell'acqua sono state esaminate utilizzando un bilancio superficiale.
L'affidabilità dei valori di pH nei campioni di sangue fetale - Uno studio della seconda fase.In 119 casi è stata eseguita l'analisi del sangue fetale (FBA) negli ultimi 15 minuti prima della nascita insieme al prelievo di sangue dall'arteria ombelicale (UA) immediatamente dopo il parto prima del primo respiro Utilizzando i valori di pH misurati abbiamo studiato la relazione tra queste variabili, in particolare il grado di influenza di un considerevole caput succedaneum sui valori di pH nel sangue periferico. La nostra indagine è stata eseguita nel periodo immediatamente precedente il parto, quando il disturbo della circolazione sanguigna nella parte fetale presentante avrebbe la massima influenza sui valori di pH misurati da campioni di sangue periferico. Abbiamo tenuto presente soprattutto le critiche di FBA da parte di WULF et al. [21] e ASSALI [2]. Come altri autori hanno concluso, abbiamo riscontrato un alto grado di correlazione tra il pH valutato da FBA e quello determinato nel sangue dell'arteria ombelicale. Il coefficiente di correlazione zione era: pHact r=0.82 pHqu40 r=0.78. La relazione tra i corrispondenti valori di pH nel sangue periferico (FBA) e arterioso (UA) è riportata in Fig. 1 a e Fig. 1 b. La correlazione dei quadranti ha mostrato sia per il pH effettivo che per pHqu40 p inferiore a 0,01. Come derivato da questo, si può vedere un alto grado di correlazione tra i valori di pH. I valori medi di pH erano: (vedi articolo) 42 dei bambini avevano un caput succedaneum grave o moderato. Le Fig. 2a e 2b mostrano la relazione tra i valori di pH centrali e periferici in questi casi. Anche in questo caso è stata osservata una buona correlazione tra i valori di pH come in tutto il collettivo. Il coefficiente di correlazione era: pHact r=0.78 pHqu40 r=0.79. Caput succedaneum sembra avere solo un'influenza minima sul pH del sangue ottenuto dalla parte fetale che si presenta. Questi risultati ci portano a concludere che il prelievo di sangue dalla parte fetale che si presenta nella seconda fase fornisce valori di pH quasi identici a quelli del sangue fetale centrale.
Ausili fisiologici e farmacologici nella diagnosi differenziale del tremore.Sono riportati studi fisiologici e farmacologici su oltre 150 pazienti con disturbi del movimento. Particolare attenzione è pagato alla differenziazione di vari tipi di tremore sulla base della frequenza, del ritmo e del modello di attività EMG nei muscoli antagonisti. Il tipico \'tremore a riposo\' del morbo di Parkinson - attività a 3-7 Hz che si alterna tra i muscoli antagonisti - viene soppresso, almeno brevemente, durante l'attività volontaria, momento in cui si può osservare un tipico tremore fisiologico a 8-12 Hz. Il tremore essenziale e le sue varianti familiari o senili hanno anche un caratteristico pattern EMG durante attività: esplosioni di attività a 5-8 Hz che sono sincrone nei muscoli antagonisti. Questo tipo di tremore può essere presente anche in pazienti con malattia di Parkinson e in alcune parentele con polineuropatia di Charcot-Marie-Tooth. Altro i tremori associati alla polineuropatia (\'tremore neuropatico\') hanno caratteristiche fisiologiche diverse. Il mioclono è essenzialmente di due tipi (\'positivo\' con scoppi EMG e \'negativo\' con brevi pause nell'attività in corso, come con l'asterissi) e può, a volte, mimare il tremore. Alcuni tremori specifici rispondono in modo prevedibile a una terapia farmacologica specifica.
Attività elettrodermica, cardiaca e respiratoria alla stimolazione ripetuta del pressore freddo nei tossicodipendenti.Risposte di conduttanza cutanea (SCR), frequenza cardiaca (HR), e la respirazione sono state registrate in varie fasi di riposo, pressore freddo (CP) e recupero di PC in 20 ex tossicodipendenti (DG) e 20 controlli Ss (CG), abbinati per sesso ed età in un disegno a misure ripetute. farmaci (barbiturici e analgesici narcotici), è stata testata l'ipotesi che le risposte autonomiche siano diminuite dopo l'uso a lungo termine di barbiturici e analgesici narcotici. I risultati hanno parzialmente supportato tale ipotesi: (a) SCR, variazione della FC e decelerazione della FC erano significativamente inferiori in DG rispetto al controllo Ss; (b) HR basale, frequenza respiratoria e ampiezza, tuttavia, tendevano ad essere aumentati in DG nelle fasi di riposo e CP Una seconda ipotesi, indirizzata a diversi tassi di assuefazione di SCR e HR in entrambi i gruppi, è stato confermato per gli SCR e in parte per le risorse umane, indicando che il i tassi di assuefazione di SCR, variazione della FC e decelerazione della FC erano maggiori in DG che in CG. Una terza domanda riguardava la coerenza dei risultati SCR e HR in entrambe le sessioni. È stata riscontrata una tendenza per risultati coerenti poiché la direzione delle differenze di gruppo era la stessa nelle sessioni 1 e 2. I risultati della PC sono stati confrontati con risultati simili nelle stesse S durante la stimolazione visiva e uditiva.
La regolazione del trasporto della glutammina e della glutammina sintetasi nella Salmonella typhimurium.Il trasporto della glutammina da parte del sistema di trasporto ad alta affinità è regolato dallo stato di azoto di mezzo. Con alte concentrazioni di ammoniaca il trasporto è represso; mentre con i Casaminoacidi il trasporto è elevato, mostrando un comportamento simile alla glutammina sintetasi. ammoniaca (e glutammina). Questo suggerisce che la glutammina sintetasi è coinvolta nella regolazione del sistema di trasporto. Un mutante con bassa attività di glutammato sintasi aveva un basso trasporto di glutammina e attività di glutammina sintetasi, che non potevano essere derepresse. Un mutante nell'alta affinità il sistema di trasporto della glutammina ha mostrato una normale regolazione della glutammina sintasi e della glutammina sintetasi. Vengono discussi i possibili meccanismi per questa regolazione.
Formazione di etilene da Escherichia coli.Escherichia coli ceppo SPA O converte la metionina in etilene mediante un sistema enzimatico inducibile. L-cisteina, L-omocisteina , i derivati della metionina e gli analoghi contenenti zolfo della L-metionina agiscono anche come precursori dell'etilene. L'etilene è prodotto da sospensioni cellulari solo in presenza di aria; i preparati privi di cellule possono produrre etilene aerobicamente e anaerobicamente, ma la misura in cui essi ciò dipende dalla modalità di crescita della coltura. La luce stimola la produzione di etilene da parte delle sospensioni cellulari e la sua presenza è essenziale per la produzione da parte di preparati privi di cellule. La cinetica della biogenesi dell'etilene e il suo pH e temperatura ottimali suggeriscono che l'etilene è un metabolita secondario".
Produzione e utilizzo di acetil-CoA durante la crescita del metilotropo facoltativo Pseudomonas AM1 su etanolo, malonato e 3-idrossibutirrato.In Pseudomonas AM1, conversione di Il 3-idrossibutirrato ad acetil-CoA è mediato da una 3-idrossibutirrato deidrogenasi inducibile, un acetoacetato: succinato coenzima A transferasi (specifico per succinil-CoA) e una beta-chetotiolasi inducibile L'etanolo viene ossidato ad acetato dagli stessi enzimi coinvolti in ossidazione del metanolo a formiato È stata parzialmente purificata e caratterizzata una acetil-CoA sintetasi inducibile, essenziale per la crescita solo su etanolo, malonato e acetato più gliossilato, come dimostrato dalle caratteristiche di crescita di un mutante (ICT54) privo di questo enzima. L'acetato libero non è coinvolto nell'assimilazione dell'acetil-CoA e l'idrossipiruvato reduttasi non è coinvolta nell'ossidazione dell'acetil-CoA a gliossilato durante la crescita su 3-idrossibutirrato. Un mutante (ICT51), privo di \'malate syn tale attività è stata isolata e le sue caratteristiche indicano che questa attività è normalmente essenziale per la crescita di Pseudomonas AM1 su etanolo, malonato e 3-idrossibutirrato, ma non per la crescita su altri substrati come piruvato, succinato e composti C1. Le proprietà di crescita di un revertant (ICT51R) e di un mutante privo di malil-CoA liasi (PCT57) indicano che deve esistere una via alternativa per l'assimilazione di composti metabolizzati esclusivamente tramite acetil-CoA.
Studi spettrofotometrici sul pH del muscolo scheletrico di rana. Variazione del pH durante e dopo l'attività contrattile.Le caratteristiche spettrali dei coloranti pH-sensibili rosso neutro (NR) e porpora di bromcresolo (BCP) sono stati utilizzati per studi sul cambiamento del pH intracellulare (pHi) dei muscoli sartori di Rana pipiens, sia nel corso di una contrazione isometrica che durante il metabolismo di recupero successivo a un treno di contrazioni. i due coloranti dissimili correlati per confermare la metodologia. Né la rapida ricalcalinizzazione osservata durante una contrazione né la lenta fase alcalinizzante del metabolismo di recupero sono stati influenzati in modo ovvio quando l'idrolisi della fosfocreatina (PC) è stata bloccata dall'1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (FDNB). L'acido iodoacetico (IAA) ha inibito la lenta fase acida del metabolismo di recupero. La conclusione è che le reazioni alcalinizzanti diverse dalla degradazione del PC devono essere considerate operative a questi livelli di attività. Hype le soluzioni rtoniche hanno alterato la tensione della contrazione e il decorso temporale senza alterare gli spostamenti di pHi osservati fino all'abolizione di circa il 75% dell'ampiezza della contrazione. Vengono proposti molteplici effetti delle soluzioni ipertoniche come approccio muscolare all'equilibrio tonico.
Il mediatore dell'immunità cellulare. XII. Inibizione delle cellule T attivate dal virus della malattia di Newcastle.Il virus della malattia di Newcastle (NDV) può interagire almeno in due modi con le cellule T di ratto. Adsorbendo ai linfociti circolanti, il virus può deviare transitoriamente le cellule dai linfonodi e dagli essudati infiammatori indotti nella cavità peritoneale. Le cellule T sono colpite indipendentemente dall'età, dallo stato di attivazione o dalla posizione nel ciclo mitotico L'effetto è reversibile ed è mediato non solo dall'(I)-NDV infettivo, ma anche dall'UV-NDV che non può raggiungere un ciclo di replicazione completo negli ovuli. Ma l'I-NDV ha un altro effetto duraturo sulle cellule T attivate. nell'incapacità dei linfociti del dotto toracico trattati con virus di trasferire la resistenza cellulare a Listeria monocytogenes, nell'ipersensibilità di tipo ritardato agli antigeni solubili del parassita e nell'esclusione permanente dai focolai infiammatori dei linfociti marcati in fase S. Le cellule T attivate sono inibite da moltiplicati virali che hanno poco o nessun effetto sul potenziale proliferativo delle cellule T sensibili all'antigene o sulla localizzazione di piccoli linfociti marcati nei linfonodi. Il meccanismo sottostante non è stato determinato; tuttavia, ci sono ragioni per pensare che NDV abbia un effetto letale sulle cellule T attivate, perché queste ultime sono permissive per la replicazione del virus.
Un metodo migliorato per la determinazione dell'attività della creatinchinasi nel siero.Un metodo migliorato per la determinazione dell'attività della creatinchinasi (EC 2.7.3.2) Per la riattivazione della creatinchinasi, il siero viene prima preincubato nella soluzione in esame in presenza di ditioeritritolo, quindi viene avviata la reazione enzimatica mediante l'aggiunta di creatina fosfato, ottimizzando le concentrazioni nella soluzione in esame e modificando la procedura di misurazione mediante ditioeritritolo come riattivatore, il test viene reso più sensibile e viene misurata un'attività enzimatica nel siero molto più elevata rispetto ad altri test raccomandati. La velocità di reazione è lineare per dieci minuti fino a 700 U/l. Un aumento dell'attività per diluizione enzimatica è stato non osservato. In questo studio è stata raggiunta una sensibilità di rilevamento di 0,9 U/l. Ciò sarebbe particolarmente vantaggioso nella rilevazione degli isoenzimi della creatina chinasi dopo cromatografia. La precisione intra-serie era 1 0,2% (CV), la precisione giornaliera è stata del 2,0% (CV). La soluzione di prova è stabile per almeno 24 ore.
Dimostrazione in vitro di una particolare affinità della membrana basale glomerulare e del collagene per il DNA. Una possibile base per una formazione locale di complessi DNA-anti-DNA nel lupus eritematoso sistemico." In vitro, è stato dimostrato che il collagene e il materiale simile al collagene nel GBM hanno un'affinità particolarmente elevata per qualsiasi DNA testato (mammifero, batterico, virale e vegetale). GBM fissava il DNA 40-80 volte di più rispetto a HGG e BSA e 10-40 volte più dell'LPS batterico. GBM ha una maggiore affinità per SSDNA rispetto a DSDNA. Questo legame è stato inibito a basso pH, bassa forza ionica e in presenza di detergenti anionici, indicando che l'alta carica negativa Il DNA può interagire con il sito di base su collagene o GBM da forze elettrostatiche. Questa interazione è stata interferita in modo competitivo da proteine che legano il DNA come Clq. I complessi formati da DNA e anticorpi anti-DNA non hanno mostrato la stessa proprietà di legame del DNA libero. Tuttavia, il DNA che era già stato boun d al GBM o al collagene potrebbe legare in modo molto efficiente gli anticorpi anti-DNA e formare immunocomplessi che rimarrebbero su queste strutture. Il significato biologico del legame del DNA al GBM o al collagene dovrebbe essere particolarmente considerato in relazione alla patogenesi del LES. È possibile che il DNA rilasciato da cellule distrutte o degenerate si leghi alle fibre di collagene circostanti o alle membrane basali e quindi agisca come immunoassorbente per gli anticorpi anti-DNA circolanti. Alcune prove per un legame in vivo di SSDNA alle strutture renali sono state ottenute in topi trattati con LPS batterico 2 giorni prima dell'iniezione di SSDNA.
Acidificazione renale nell'anemia falciforme.L'acidificazione renale è stata valutata in pazienti con anemia falciforme (HvSS) sia con NH4CI orale che con NaHC03 e i risultati sono stati confrontati con quelli di soggetti con tratto falciforme (HbAS) e controlli. Il pH del sangue arterioso era normale nei soggetti HbSS ma il loro PC02 e [HC03] erano inferiori a quelli dei controlli. In risposta a NH4CI, sei dei 20 soggetti HbSS avevano un pH urinario minimo anomalo (superiore a 5,3) e l'intero gruppo HbSS aveva un valore medio più alto rispetto ai controlli o ai soggetti HbAS Poiché nessuno dei sei soggetti HbSS aveva evidenza di anomalie tubulari prossimali, si è concluso che hanno mostrato la sindrome di acidosi tubulare renale distale incompleta. Solo uno dei sei volontari HbSS con una risposta anormale a NH4CI e due su sette con una risposta normale hanno aumentato normalmente la loro PC02 urinaria dopo il carico di bicarbonato. La clearance della PAH era significativamente più alta e l'inulina clea La rance tendeva ad essere più alta nei soggetti HbSS rispetto ai controlli o ai soggetti HbAS. La capacità di concentrazione massima è stata ridotta in entrambi i gruppi di cellule falciformi, ma ancora di più nell'HbSS. Non si sono verificati effetti avversi e nessuna comparsa o aumento della percentuale di cellule falciformi è stata causata da un caricamento acido di NH4CI di breve durata. Non sono state riscontrate differenze né nelle caratteristiche cliniche né nelle variabili ematologiche, renali e acido-base tra i soggetti HbSS con e senza una normale risposta al carico acido. Il meccanismo dell'anomalia osservata dell'acidificazione renale rimane sconosciuto.
Reazione infiammatoria e danno delle vie aeree nella fibrosi cistica.Nella fibrosi cistica vi è infezione cronica e reazione infiammatoria nelle vie aeree, accompagnata da distruzione e eliminazione di epitelio delle vie aeree. I leucociti migrano nelle vie aeree e alcuni si disintegrano, liberando la desossiribonucleoproteina che viene incorporata nella struttura gel del muco bronchiale. Abbiamo confrontato lo stato di questi processi nella fibrosi cistica con quello nella bronchite cronica e nelle bronchiectasie, esaminando l'espettorato sollevato da le vie aeree inferiori. Le misurazioni sono state effettuate anche sull'espettorato indotto in soggetti normali. I risultati indicano che la migrazione dei leucociti nelle vie aeree e lo spargimento di epitelio delle vie aeree danneggiato erano minimi nei soggetti normali;erano significativi nei pazienti con bronchite cronica, maggiore nei quelli con bronchiectasie, e ancora più elevati in quelli con fibrosi cistica I grandi aumenti riscontrati nel contenuto totale di DNA e solidi nella fibrosi cistica l'espettorato era dovuto ad aumenti della frazione insolubile contenente i leucociti interi e i detriti particolati rimasti quando il gel di muco dell'espettorato era solubilizzato con mercaptoetanolo. Nonostante i grandi aumenti del contenuto totale di DNA e solidi, i contenuti dei componenti del gel di muco e della desossiribonucleoproteina dei leucociti disintegrati effettivamente presenti nella struttura del gel di muco dell'espettorato della fibrosi cistica non erano significativamente superiori a quelli dell'espettorato dei pazienti con bronchite o brochiectasie.
Degradazione della gastrina da parte delle cellule della mucosa gastrica.È stato rilevato ed esaminato il legame specifico della gastrina radiomarcata da parte delle cellule della mucosa gastrica preparate da cavie. Legame cellulare specifico di gastrina è risultato essere dipendente sia dal pH che dalla temperatura. Il massimo legame della gastrina radiomarcata da parte delle cellule della mucosa gastrica è stato dimostrato a pH 7,4 e a 4 gradi C. Durante l'incubazione con le cellule della mucosa gastrica si è verificata una degradazione sostanziale della gastrina 125I. È stata rilevata la degradazione della gastrina sia per perdita di reattività immunologica con anticorpi alla gastrina sia per abolizione del successivo legame specifico dopo precedente incubazione con cellule della mucosa gastrica. La degradazione della gastrina è stata più marcata con incubazioni condotte a pH 7,4 e a pH basso (pH 2.0), suggerendo le attività di almeno due sistemi enzimatici di degradazione della gastrina nella preparazione delle cellule della mucosa gastrica.
Purificazione, specificità e sequenza della regione ipervariabile di anticorpi anti-polisaccaride anti-pneumococcico elicitati in un singolo coniglio.Quattro anticorpi omogenei per il polisaccaride pneumococcico di tipo VIII ( S8) sono stati isolati dal siero di un singolo coniglio (3322) mediante cromatografia di affinità su un immunoaderente S8 utilizzando l'eluizione in gradiente con cellobiosio e NaCl. Le proprietà di legame di questi anticorpi sono state determinate mediante un test radioimmunologico con 125I-gamma-globulina bovina-S8 Il cellobiosio (un'unità disaccaridica di S8) era il gruppo immunodominante di ciascuno dei quattro anticorpi, ma ciascun anticorpo si legava a questo disaccaride con affinità relative diverse. Le sequenze di amminoacidi (posizioni 0-40) di tre delle quattro catene leggere anticorpali erano differenti sia nella struttura che nelle sequenze della prima regione ipervariabile. La quarta catena leggera dell'anticorpo ha un terminale amminico bloccato. Questi risultati indicano che gli anticorpi suscitati da un antigene semplice ed esaminato contemporaneamente durante il corso dell'immunizzazione in un singolo coniglio può presentare specificità comuni per un determinante oligosaccaride, ma avere affinità di legame diverse per quel determinante così come diverse strutture primarie nelle regioni di complementarietà (ipervariabili) e nelle regioni quadro.
Partecipazione di cellule T sensibili alla ciclofosfamide nelle reazioni del trapianto contro l'ospite.La ciclofosfamide (CY)3 è tossica per una popolazione di cellule T di topo che è attivo nelle risposte graft vs host (GVH). Questa osservazione contrasta con i rapporti precedenti che indicano che il trattamento di topi con regimi CY, simili a quelli utilizzati in questo studio, aumenta la reattività delle cellule T che mediano l'ipersensibilità di tipo ritardato al rosso di pecora cellule del sangue. La capacità di indurre GVH delle cellule T non viene alterata dalla rimozione delle cellule B da colonne di lana di nylon. Suggeriamo che le cellule T sensibili al CY possano essere "cellule regolatrici" e che l'effetto che hanno dipende da, tra le altre cose, la natura dell'antigene stimolante a cui le cellule stanno rispondendo e/o il dosaggio utilizzato per lo studio.
Capacità delle regioni H-2 di indurre la malattia del trapianto contro l'ospite.Singoli topi ibridi F1 adulti giovani sono stati irradiati con 500 R e 24 ore successivamente iniettato con 5 X 10 (7) cellule di milza ottenute da un donatore parentale di sesso corrispondente. Gli animali iniettati sono stati quindi seguiti per un periodo di 3 mesi e perdita di peso corporeo, tasso di mortalità e altri segni di innesto fatale. sono state registrate la malattia vs-ospite (GVHD) Le combinazioni di ceppi donatore-ricevente sono state selezionate in modo tale da fornire differenze genetiche nell'intero complesso H-2, nelle sole regioni K o D, nell'estremità K o D e le sole regioni centrali (I). I dati ottenuti solo su poche combinazioni indicano che una forte GVHD (tasso di mortalità del 100% entro il primo mese dopo l'iniezione) si verifica solo in quelle combinazioni donatore-ricevente che differiscono nell'intero complesso H-2 o nell'estremità K (regioni K + I) GVHD molto più debole (tasso di mortalità di solo il 50% o meno e morte di singoli topi diffusa nel intero periodo di osservazione) si osserva quando il donatore e l'ospite differiscono nella sola regione K, I o D. Il grado di GVHD indotto da tre regioni, se preso singolarmente, è circa lo stesso. Sorprendentemente, la GVHD della regione K era un po' più forte nelle combinazioni di ceppi mutanti rispetto alle combinazioni di ceppi ricombinanti.
Separazione della sostanza anafilattica a reazione lenta (SRS-A) dal polmone umano in quattro frazioni biologicamente attive.Sostanza anafilattica a reazione lenta (SRS- A) è stato rilasciato dal polmone umano sensibilizzato passivamente con l'anticorpo di ambrosia e sfidato con l'antigene specifico E. Dopo purificazione mediante estrazione con etanolo, incubazione con alcali (0,1 M NaOH per 30 min a 37 gradi C) e cromatografia su acido silicico e DEAE-cellulosa, L'SRS-A umano è stato separato in quattro frazioni biologicamente attive (frazioni da I a IV) Arylsulfatase (Tipo H-1) in tampone acetato di sodio 0,1 M, pH 4,5, ha distrutto l'attività biologica della sola frazione I. Tutte e quattro le frazioni, come SO4 =, ha inibito l'attività dell'arilsulfatasi a pH 4,5 ma non a pH 6,0 quando il p-nitrocatecolo solfato è stato utilizzato come substrato. Questi risultati suggeriscono che l'SRS-A contiene un gruppo di zolfo e che l'STS-A umano, come le prostaglandine, può essere un famiglia di composti L'instabilità del purificato SRS- A per lo stoccaggio rimane una delle principali barriere alla loro ulteriore purificazione e identificazione chimica.
Enzimi che sintetizzano le monoammine nei neuroni dopaminergici, noradrenergici e serotoninergici. Localizzazione immunocitochimica mediante microscopia ottica ed elettronica.Gli enzimi che sintetizzano le monoammine tirosina idrossilasi ( TH), dopamina-beta-idrossilasi (DBH) e triptofano idrossilasi (TrH) sono stati immunocitochimici localizzati nei neuroni dopaminergici, noradrenergici e serotoninergici del cervello di ratto mediante microscopia ottica ed elettronica Nei neuroni dopaminergici e serotoninergici, i rispettivi enzimi di sintesi. , sono stati distribuiti in tutto il citoplasma del perikarya neuronale, dendriti, assoni e terminali. L'accumulo più selettivo del prodotto di reazione per l'enzima specifico è stato associato: (a) nel perikarya con reticolo endoplasmatico, apparato di Golgi e microtubuli, (b) nei processi con microtubuli, e (c) in terminali con granuli densi o vescicole chiare I terminali marcati erano caratterizzati dal loro contenuto di organelli marcati s e l'assenza di giunzioni sinaptiche. Nei neuroni noradrenergici, sia il TH che il DBH erano localizzati nel perikarya, in modo simile al TH nei neuroni dopaminergici. TH e DBH differivano nella loro localizzazione all'interno degli assoni prossimali e dei dendriti in quanto TH era associato ai microtubuli ma DBH no. Questi risultati forniscono prove ultrastrutturali che suggeriscono che le monoamine possono essere: (a) sintetizzate da enzimi associati a diversi organelli a seconda della porzione del neurone e del tipo di enzima; (b) sintetizzato sia negli assoni che nei dendriti e (c) rilasciato dai terminali senza specializzazioni di membrana postsinaptica.
Aspetti biologici dei fattori leucotattici.La quantificazione della leucotassi implica la visualizzazione diretta delle cellule migrate come numero totale di cellule o in base alla profondità di penetrazione delle cellule nel filtri. Approcci più recenti utilizzano cellule marcate radioattivamente o movimento nel gel. Esistono notevoli controversie sugli attributi strutturali dell'attività chemiotattica, sebbene i peptidi sintetici enfatizzino l'importanza della struttura primaria. I fattori leucotattici, sia derivati dal complemento che generati dai linfociti, sono stati trovati in molte condizioni sia in vitro che in vivo. Vi sono prove crescenti che il sistema leucotattico svolge un ruolo importante nella patogenesi dell'infiammazione.
Ripristino indotto dall'attivazione delle funzioni sensomotorie in ratti con lesioni cerebrali che riducono la dopamina.Lesioni elettrolitiche bilaterali dell'ipotalamo laterale o iniezioni intraventricolari di 6-idrossidopamina ha prodotto sostanziali depauperazioni di dopamina striatale nei tassi. Tutti gli animali con danni cerebrali hanno mostrato marcati menomazioni sensomotorie. Tuttavia, hanno cominciato a muoversi e rispondere in modo appropriato agli stimoli ambientali quando posti in un lavandino d'acqua, in un bagno di ghiaccio poco profondo, o tra una colonia di gatti o ratti. Un'inversione delle disfunzioni sensomotorie era ancora evidente poco dopo che gli animali erano stati rimossi da ogni situazione di attivazione. Tuttavia, gli effetti terapeutici si sono dissipati rapidamente e entro 4 ore dall'esposizione i ratti hanno risposto così male come prima dell'attivazione Questi risultati sono sorprendentemente simili alla "cinesia paradossale" osservata nel parkinsonismo, un disturbo clinico attribuito alla degenerazione del ne centrale contenente dopamina uroni. Collettivamente, suggeriscono l'importanza dell'attivazione nel mantenere la reattività agli stimoli senoriali nei ratti a seguito di lesioni cerebrali che riducono la dopamina.
Ph del sistema nervoso centrale nell'uremia ed effetti dell'emodialisi.L'emodialisi rapida di animali uremici può indurre una sindrome caratterizzata da aumento del liquido cerebrospinale (CSF) pressione, crisi epilettiche di grande male e anomalie elettroencefalografiche. Vi è una diminuzione del pH e della concentrazione di bicarbonato nel liquido cerebrospinale e l'osmolalità cerebrale supera quella del plasma, con conseguente movimento netto di acqua nel cervello. Questa sindrome è stata chiamata sindrome da dialisi sperimentale da disequilibrio La caduta del pH del liquido cerebrospinale può essere secondaria a una caduta del pH intracellulare (pHi) nel cervello Poiché le variazioni del pH possono alterare l'osmolalità intracellulare in altri tessuti, si è deciso di studiare il pHi cerebrale nell'uremia e gli effetti dell'emodialisi. Il pHi cerebrale è stato misurato valutando la distribuzione del dimetadione marcato con 14C nel cervello rispetto al liquido cerebrospinale, mentre lo spazio extracellulare è stato calcolato come spazio 35504=/4 rispetto al liquido cerebrospinale. Negli animali con insufficienza renale acuta, b pioggia (corteccia cerebrale) il pHi era 7,06+/-0,02 (+/-SE) mentre quello nel liquido cerebrospinale era 7,31+/-0,02, entrambi valori non diversi dal normale. Dopo una rapida emodialisi (100 min) di animali uremici, la creatinina plasmatica è scesa da 11,8 a 5,9 mg/dl. Il pHi cerebrale era 6,89 +/- 0,02 e il pH del liquido cerebrospinale e 7,19 +/- 0,02, entrambi valori significativamente inferiori rispetto agli animali uremici (P inferiore a 0,01) e c'è stato un aumento del 12% del contenuto di acqua cerebrale. Dopo emodialisi lenta (210 min), il pHi cerebrale (7,01+/-0,02) e il pH nel liquido cerebrospinale (7,27+/-0,02) erano entrambi significativamente maggiori dei valori osservati dopo l'emodialisi rapida (P inferiore a 0,01) e il contenuto di acqua cerebrale era normale. Nessuna delle manovre di cui sopra ha avuto alcun effetto sul pHi del muscolo scheletrico o sulla sostanza bianca sottocorticale. I dati mostrano che l'emodialisi rapida dei cani uremici è accompagnata da un calo significativo del pH del liquido cerebrospinale e del pHi nella corteccia cerebrale. Ad accompagnare la caduta del pHi cerebrale c'è l'edema cerebrale.
Metabolismo energetico in coltura di fibroblasti di criceto cinese con deficit di respirazione e wild type.Questo documento presenta un confronto tra metabolismo energetico in wild type e respirazione- cellule di criceto cinese carenti. Dal lavoro precedente (DeFrancesco et. al. , \'75) si è concluso che il mutante soddisfa essenzialmente tutti i suoi requisiti energetici dalla glicolisi e in questo studio misuriamo con precisione la quantità di glucosio consumato e lattato prodotto per milligrammo incremento di proteine in colture a crescita esponenziale. Da queste misurazioni calcoliamo che la quantità di ATP derivata dalla glicolisi (e quindi il fabbisogno energetico totale per la normale proliferazione) è di 105 +/- 15 mumoli di proteina ATP/delta mg nel mutante. 63 +/- 10 mumoli ATP/delta mg proteina derivata dalla glicolisi in cellule wild type Presentiamo prove che il fabbisogno energetico totale delle cellule wild type è simile a quello del mutante suggerendo che circa il 40% o f il fabbisogno energetico è derivato dalla respirazione. L'ossidazione della glutammina sembra essere più significativa della completa ossidazione del glucosio in CO2 in questi fibroblasti di criceto cinese. La quantità di ATP richiesta dalle cellule mutanti per milligrammo di incremento di proteina è relativamente indipendente dal pH.
La sostituzione parziale del fabbisogno di fattore di crescita sierico delle cellule SV3T3 con l'idrolizzato di lattoalbumina.Idrolizzato di lattoalbumina (LH), un digerito enzimatico commercialmente preparato di una frazione proteica del latte, può sostituire parzialmente il fabbisogno di siero delle cellule SV3T3. In un basso, ma obbligatorio, fondo di siero di vitello (0,15% v/v), l'LH determina un forte aumento della densità cellulare finale (5-10 volte più il controllo) stimolando modestamente il tasso di crescita effettivo. L'idrolizzato di lattoalbumina non contiene attività di sopravvivenza per le cellule SV3T3 e non influisce sulla crescita delle cellule 3T3. Poiché anche l'esposizione prolungata a pH 4 o 2 provoca l'abolizione completa dello stimolatore del tasso di crescita capacità senza influenzare la capacità di aumentare la densità cellulare finale, è possibile che l'attività di crescita dell'LH possa consistere di due componenti dissociabili. Tutta l'attività di crescita dell'LH è solubile in acqua, autoclavabile e resiste al trattamento proteolitico. Su Sephadex G15 gro con attività appare come un singolo picco al volume vuoto ma su G25 viene trattenuto oltre il volume vuoto come un picco ampio e distorto. L'intervallo di peso molecolare rilevante è compreso tra 1.500 e 4.000. Il presunto materiale resistente a basso pH è fortemente adsorbito a Dowex 1 x 2 e può essere spostato dalla colonna mediante una riduzione del pH. Un confronto delle proprietà dei fattori LH con quelle di noti agenti promotori della crescita isolati dal siero e da vari digeriti enzimatici indica che questi nuovi fattori non corrispondono a nessuno di questi agenti.
Scintiscanning citrato di gallio-67 nella neoplasia testicolare.Citrato di gallio-67 è stato utilizzato per valutare 19 pazienti con tumori maligni dei testicoli. Cinque pazienti con captazione anormale del radiotracciante nell'addome ha dimostrato di avere altre prove che confermano la diffusione metastatica a questo sito. Otto pazienti, con risultati di scansione normali, chirurgia e linfangorografia, non hanno fornito prove contrastanti di malattia sebbene uno di questi pazienti abbia successivamente sviluppato un aumento della gonadotropina urinaria concentrazioni. La chirurgia ha causato una scansione anormale e tali pazienti sono stati esclusi dall'analisi indicando la necessità di una valutazione preoperatoria. La tecnica della scintigrafia con 67 gallio appare utile nella valutazione della diffusione intra-addominale dei tumori maligni dei testicoli.
Associazione del locus Ah con cambiamenti specifici nel legame di metirapone ed etilisocianuro ai microsomi del fegato di topo.Il tratto genetico della "reattività" che si riferisce alla capacità di induzione del citocromo P-448 e di numerose attività monoossigenasiche da parte di alcuni idrocarburi aromatici, è noto segregare quasi esclusivamente come un singolo gene autosomico dominante tra la progenie di incroci appropriati originati dal reattivo C57BL/6 e dal non responsivo DBA/2 ceppi di topi consanguinei. In questo rapporto l'allele per la reattività è mostrato essere associato con (a) aumenti dei valori KS apparenti per il metirapone legato al ridotto P-450; (b) aumenti nel rapporto di differenza di etilisocianuro (deltaA455-490/deltaA430 -490);(c) aumenti del deltaA455-490 per mg di proteina microsomiale ma non del deltaA430-490 per mg di proteina dal complesso ridotto P-450-etilisocianuro; (d) uno spostamento ipsocromico di circa 2 nm in la massima spettrale um nella regione di 446 nm per il complesso ridotto P-450-metyrapone; (e) uno spostamento ipsocromico di circa 2 nm del massimo di assorbimento nella regione di 455 nm, ma non del massimo nella regione di 430 nm, per il complesso ridotto P-450-etilisocianuro; e (f) aumenti maggiori nel deltaA455-490 rispetto al deltaA430-490 per mg di proteina microsomiale per il complesso P450-etilisocianuro ridotto in funzione dell'aumento del pH. Si ritiene che tutti questi fenomeni siano associati all'induzione geneticamente regolata del citocromo microsomiale P-448 del fegato da parte di composti aromatici policiclici. Mentre gli aumenti del contenuto totale di P-450 epatico sembrano essere espressi quasi esclusivamente come un singolo carattere autosomico dominante, l'aumento del valore KS apparente per il metirapone legato al P-450 ridotto sembra essere espresso in modo additivo. La ragione di questa scoperta non è chiara. È noto che l'aumento del valore KS apparente del metirapone nei ratti trattati con 3-metilcolantrene si verifica anche quando il processo di induzione è presumibilmente bloccato trattando il ratto in concomitanza con cicloesimide. Diverse linee di evidenza in questo rapporto indicano che, sebbene il contenuto totale di P-450 non aumenti nei topi C57BL/6N trattati con 3-metilcolantrene più cicloesimide, si verifica l'induzione epatica di P-448; L'induzione di P-448 non si verifica nei topi DBA/2N in queste stesse condizioni. Questi risultati indicano che l'induzione del citocromo P-448 è relativamente resistente all'inibizione della sintesi proteica e che un animale responsivo trattato con 3-metilcolantrene più cicloesimide non può essere considerato sperimentalmente lo stesso di un animale geneticamente non responsivo trattato con solo 3-metilcolantrene.
Identificazione della flavina legata in modo covalente della tiamina deidrogenasi.La tiamina deidrogenasi, una flavoproteina isolata da un batterio del suolo non identificato, contiene 1 mole di FAD legata in modo covalente /mol di enzima. Un peptide flavinico, isolato dal digestato triptico-chimotriptico dell'enzima e idrolizzato al livello FMN, mostra una resa di fluorescenza dipendente dal pH che è massima a pH 3,5-4,0 e diminuisce di oltre il 90% a pH 7,5 con un pKa di 5.8. L'idrolisi acida del peptide risulta in un'amminoacilflavina che mostra un pKa di estinzione della fluorescenza di 5.2. I dati spettrali di assorbimento e di risonanza paramagnetica elettronica mostrano che il sostituente covalente si trova nella posizione 8alfa della flavina come nel caso di tutti gli enzimi noti contenente flavina legata in modo covalente. L'aminoacilflavina dà una reazione di Pauly negativa ma produce 1 mole di istidina per drastica idrolisi acida, mostrando così un anello imidazolico azoto come sostituente 8alfa della flavina. la cilflavina differisce dall'8alfa-[N(3)-istidil]riboflavina sintetica o dalla sua forma acido-modificata per il pKa di estinzione della fluorescenza, per la mobilità elettroforetica, per essere ridotta dal boroidruro e per essere labile allo stoccaggio, producendo 8-formilriboflavina. In tutte queste proprietà, tuttavia, l'8alfa-istidilriboflavina isolata dalla tiamina deidrogenasi è indistinguibile dall'8alfa-[N(1)-istidil]riboflavina. Si conclude quindi che la porzione FAD della tiamina deidrogenasi è legata in modo covalente tramite il gruppo 8alfa-metilene alla posizione N(1) dell'anello imidazolico dell'istidina.
Ridotta nicotinammide adenina dinucleotide fosfato, una sonda strutturale e conformazionale della sintetasi degli acidi grassi del fegato di pollo.L'organizzazione strutturale e conformazionale della sintetasi degli acidi grassi del fegato di pollo ha stato sondato utilizzando il suo coenzima fluorescente, NADPH. Tre siti di legame NADPH per mole del complesso enzimatico, di costante di dissociazione apparentemente identica (KD = 0,6 muM) possono essere titolati a temperature superiori a 12 gradi. Questi risultati sono in disaccordo con gli studi precedenti di Hsu e Wagner (Hsu, RY, and Wagner, BJ (1970) Biochemistry, 9, 245-251) in cui potevano essere titolati quattro di questi siti. A 12 gradi, i siti compositi si dividono in due sottoinsiemi: una coppia di siti con un KD di 0,3 muM e un terzo sito con un Kd di 1,1 muM. A temperature più basse (5 gradi o 2 gradi), il sito con debole affinità scompare, lasciando una coppia di siti con un Kd di 0,5 muM. Osservazioni simili sono state fatte quando l'enzima è stato modificato con ph enilmetilsulfonil fluoruro, un inibitore specifico e selettivo dell'acil-CoA deacilasi (s) grasso del complesso enzimatico del fegato di piccione (Kumar, S. (1975) J. Biol. chimica. 250, 5150-5158). La modifica parziale con fenilmetilsulfonil fluoruro suscita una risposta di legame NADPH simile al legame osservato a 12 gradi, cioè due serie di siti di legame con costanti di dissociazione non identiche. Un'ulteriore modifica corrispondente alla completa perdita della funzione di deacilasi risulta in un insieme di due siti di legame apparentemente identici e il terzo sito non è disponibile per la titolazione. L'enzima modificato mantiene le due funzioni reduttasi misurate dai substrati modello, acetoacetil-N-acetilcisteamina e crotonil-CoA. Inoltre, l'aggiunta di acetil- e malonil-CoA (100 muM ciascuno) all'enzima modificato riduce l'affinità di legame NADPH di un fattore 3. Altre osservazioni mostrano che la resa quantica, misurata dal rapporto tra intensità di fluorescenza di legame e NADPH libero, cambia con la temperatura e la forza ionica. L'abbassamento della temperatura da 30 gradi a 2 gradi aumenta il rapporto di potenziamento del 50%, mentre l'aumento della forza ionica da 0,05 a 0,2 M di fosfato di potassio lo abbassa al 50% del livello originale. La misurazione del legame NADPH in presenza di NADP+, NADH, NAD+ e adenosina-2\'-monofosfo-5\'-difosforibosio dimostra che NADP+ mostra un comportamento competitivo per i siti NADPH (KD = 10,6 muM), mentre NADH e NAD+ mostrano un comportamento non competitivo (KD (apparente) = quasi 600 muM) e interazioni piuttosto complicate che implicano un'alterazione conformazionale non specifica del complesso enzimatico. Il comportamento dell'adenosina 2\'-monofosfo-5\'-difosforibosio è intermedio tra NADP+ e NADH. Questi dati sono discussi in termini di cambiamenti conformazionali mediati dal substrato e le moli di ciascuno degli enzimi reduttasi per mole del complesso enzimatico, la polarità della regione di legame del NADPH e la probabile struttura della porzione di nicotinammide quando legata all'enzima.
Caratterizzazione del legame del calcio alle membrane plasmatiche degli adipociti.Il legame del calcio alle membrane plasmatiche degli adipociti è stato valutato mediante dialisi all'equilibrio e mediante tecniche di filtrazione su membrana. era specifico e saturabile, mostrando due classi distinte di siti di legame. Le costanti di affinità e le capacità di legame massime in presenza di 0,1 M KCl erano 4,5 X 10(4) M-1 e 1,8 nmol/mg di proteina e 2,0 X 10(3 ) M-1 e 13,7 nmol/mg rispettivamente per i siti ad alta e bassa affinità. Il calcio legato era totalmente dissociato in presenza di calcio in eccesso entro 11,0 min in due fasi distinte corrispondenti alle due classi di siti. Costanti di velocità di associazione e dissociazione per i siti ad alta affinità erano 7,7 X 10(2) M-1S-1 e 9,2 X 10(-3S-1 rispettivamente. Le variazioni di energia libera a 24 gradi erano +6,4 kcal mol-1 per i siti ad alta affinità e +4,5 kcal mol-1 per i siti a bassa affinità I siti ad alta affinità hanno dimostrato un pH ottimale di 7,0 mentre il legame ai siti a bassa affinità aumentava progressivamente tra pH 6,0 e 9,0. Basse concentrazioni di MgCl2 (meno di 300 muM) hanno aumentato leggermente il legame con il calcio, mentre alte concentrazioni di KCl e MgCl2 erano inibitori non competitivi del legame con il calcio. La procaina e il rosso rutenio non avevano alcun effetto sul legame con il calcio e il lantanio era un inibitore scadente del legame con il calcio. Questo rappresenta il primo rapporto sul legame del calcio alle membrane plasmatiche degli adipociti e la prima analisi cinetica del legame del calcio alle membrane biologiche. La specificità di questo sistema legante il calcio nelle membrane plasmatiche degli adipociti suggerisce la sua importanza nella bioregolazione cellulare.
Interazione dei fenoli con il vecchio enzima giallo. Evidenza fisica per i complessi di trasferimento di carica.Viene presentata la prova che i cambiamenti nello spettro di assorbimento ottenuti sulla formazione dei complessi tra Old Yellow Enzyme e composti fenolici sono dovute a interazioni di trasferimento di carica. La correlazione positiva tra l'energia della transizione di lunghezza d'onda lunga e la costante para di Hammett con una serie di fenoli para-sostituiti indica che il fenolo è il donatore di trasferimento di carica e la flavina ossidata dell'enzima è l'accettore di trasferimento di carica. La stessa conclusione è tratta da studi in cui la flavina dell'enzima nativo, flavin mononucleotide, è stata sostituita da una varietà di flavine artificiali di diverso potenziale di ossidoriduzione. Il pH sulla costante di dissociazione per il legame enzima-ligando indica anche che è l'anione fenolato, piuttosto che l'acido coniugato, che è responsabile dell'interazione di trasferimento di carica n. Il significato di questi risultati è discusso rispetto alle specie che assorbono lunghezze d'onda lunghe rilevate con altre flavoproteine.
Fosforilazione ossidativa in vescicole di membrana di Escherichia coli con il lato destro verso l'esterno.Fosforilazione ossidativa in vescicole di membrana di Escherichia coli con orientamento verso l'esterno e caricato con ADP è stato studiato. I substrati della catena di trasporto degli elettroni potrebbero eccitare la fosforilazione di ADP, con l'ordine di efficacia essendo D-lattato maggiore del ridotto fenazinemetosolfato maggiore del succinato maggiore del ridotto nicotinammide adenina dinucleotide. Inibitori dell'ossidazione del D-lattato, i conduttori protonici e l'inibitore della Mg2+ATPasi (EC 3.6.1.3) hanno tutti inibito la fosforilazione ossidativa quando accoppiati all'ossidazione del lattato D. La sintesi di ATP era assente nelle vescicole di membrana preparate da un ceppo mutante privo di Mg2+ATPasi. Valinomicina o nigericina parzialmente inibizione della fosforilazione ossidativa in presenza di potassio Valinomicina più nigericina inibiscono completamente la sintesi di ATP L'effetto di vari agenti sulla respirazione È stato anche esaminato l'instaurazione n-dipendente di un gradiente di pH transmembrana. NaCN e carbonil cianuro p-trifluorometossifenilidrazone hanno inibito la creazione di un gradiente di pH mentre la dicicloesilcarbodiimmide non ha avuto effetto. Questi risultati sono in buon accordo con un modello chemiosmotico per la fosforilazione ossidativa.
Digestione di collagene nativo, collagene denaturato e frammenti di collagene mediante estratti di lisosomi di fegato di ratto.Estratti di lisosomi altamente purificati di fegato di ratto sono stati esaminati per la loro capacità di degradare il collagene nativo e il collagene denaturato termicamente a valori di pH compresi tra 3,5 e 7,0 Dopo una digestione di 24 ore a 36 gradi con l'estratto lisosomiale a un pH di 5,5 o inferiore (collagene/proteina lisosomiale; 2/1 o 8/ 1), sia il collagene nativo che quello denaturato sono stati degradati in misura equivalente al 60-70% di quella osservata durante l'idrolisi acida totale in HCl 6 N misurata dalla reazione della ninidrina (570 nm). Ad un pH di 6,0, il collagene nativo e il collagene denaturato è stato degradato dalla miscela di proteinasi lisosomiale rispettivamente all'11% e al 40% dell'idrolisi acida totale. A pH 6,5 E 7,0, i valori corrispondenti erano rispettivamente del 3% contro il 33% e dello 0,3% contro l'11%. (TCA e TCB) sono prodotti quando la collagenasi dei mammiferi degrada la co nativa llagene a 25 gradi. Questi frammenti sono stati degradati dall'estratto lisosomiale a 36 gradi in misura equivalente al 28% e all'8% dell'idrolisi acida totale a pH 6,5 e 7,0, rispettivamente. Gli esperimenti a pH 6,5 e 7,0 sono stati condotti utilizzando un rapporto collagene/proteina lisosomiale di 2/1. A pH 5,0 (un pH che si trova all'interno dei lisosomi secondari), il lisosomiale estrae il collagene degradato in una miscela di amminoacidi liberi e piccoli peptidi. L'analisi degli amminoacidi ha stabilito che circa il 30% dei residui amminoacidici del collagene è apparso nell'idrolizzato lisosomiale come amminoacidi liberi. L'idrossiprolina e forse l'idrossilisina erano gli unici amminoacidi presenti nel collagene che non apparivano almeno in una certa misura come amminoacido libero in questo idrolizzato.
Reattività dei gruppi fosfopiridossale della cistationasi.Aminoossiacetato e alfa-ammino-gamma-amminoossibutirrato (canalina) reagiscono specificamente con i gruppi P-piridossale di cistationasi per produrre cambiamenti caratteristici nelle proprietà di assorbimento e fluorescenza del cofattore legato. L'aumento della fluorescenza a 450 nm è stato utilizzato per monitorare la reazione. L'aminoossiacetato attacca il legame di base di Schiff dell'enzima più volte più velocemente (k1 = 3700 M-1 min-1 e k2 = 1000 M-1 min-1) che attacca il carbonio aldeidico del P-piridossale libero (k = 290 M-1 min-1). Risultati simili sono stati ottenuti con la canalina. Gli studi cinetici indicano che un legame di base di Schiff nell'enzima cistationasi dovrebbe offrire un vantaggio cinetico diretto durante la reazione tra il substrato e il cofattore. È anche dimostrato che l'inibitore L-alfa-gamma-amminobutirrato reagisce con il P-piridossale legato per formare la P-piridossamina libera Il tasso di formazione di La P-piridossamina è parallela alla velocità di inattivazione dell'enzima.
Studi sull'attivazione alfa-andrenergica della produzione di glucosio epatico. II. Indagine sui ruoli dell'adenosina 3\':5\'-monofosfato e dell'adenosina 3\':5 \'-proteina chinasi monofosfato-dipendente nelle azioni della fenilefrina negli epatociti isolati.Gli effetti dell'agonista alfa-adrenergico fenilefrina sui livelli di adenosina 3\':5\'-monofosfato (cAMP) e l'attività della protein chinasi cAMP-dipendente in cellule parenchimali di fegato di ratto isolate sono state studiate. L'AMP ciclico era leggermente aumentato (dal 5 al 13%) nelle cellule incubate con fenilefrina ad una concentrazione (10(-5) M) che era massimamente efficace sulla glicogenolisi e sulla gluconeogenesi. Tuttavia, l'aumento è stato significativo solo a 5 min. I livelli di AMP ciclico con fenilefrina 10(-5) M misurati in questo momento sono stati ridotti dal propranololo antagonista beta-adrenergico, ma non sono stati influenzati dall'alfa-bloccante fenossibenzamina, indicando che l'elevazione era d a causa della debole attività beta dell'agonista. Quando dosi di glucagone, epinefrina e fenilefrina che producevano la stessa stimolazione della glicogenolisi o della gluconeogenesi venivano aggiunte agli stessi lotti di cellule, si verificavano aumenti marcati di cAMP con glucagone, aumenti minimi con epinefrina e cambiamenti minimi o nulli con fenilefrina, indicando che le due catecolamine stimolavano questi processi in gran parte mediante meccanismi che non implicavano l'accumulo di cAMP. La cromatografia con DEAE-cellulosa degli omogenati delle cellule epatiche ha rivelato due picchi principali dell'attività della proteina chinasi cAMP-dipendente. Questi eluivano a concentrazioni di sale simili a quelle degli isoenzimi di tipo I e II dal cuore di ratto. Sono state determinate le condizioni ottimali per la conservazione degli effetti ormonali sull'attività dell'enzima nelle cellule. Alte concentrazioni di fenilefrina (10(-5) M e 10(-4) M) hanno prodotto un piccolo aumento (10 tp 16%) nel rapporto di attività (-cAMP/+cAMP) dell'enzima. Questo è stato abolito dal propranololo, ma non dalla fenossibenzamina, indicando che era dovuto alla debole attività beta dell'agonista. L'aumento del rapporto di attività della chinasi con fenilefrina 10(-5) M era molto più piccolo di quello prodotto da una dose glicogenoliticamente equivalente di glucagone. I cambiamenti nella protein chinasi indotti dalla fenilefrina e dai bloccanti e dal glucagone erano quindi coerenti con quelli del cAMP. La teofillina e l'1-metil-3-isobutilxantina, che inibiscono la fosfodiesterasi del cAMP, hanno potenziato gli effetti della fenilefrina sulla glicogenolisi e sulla gluconeogenesi. I potenziamenti sono stati bloccati dalla fenossibenzamina, ma non dal propranololo. La metilisobutilxantina ha aumentato i livelli di cAMP e ha potenziato l'attivazione della protein chinasi nelle cellule incubate con fenilefrina. Questi effetti sono stati ridotti o aboliti dal propanololo, ma non sono stati influenzati dalla fenossibenzamina. Da questi dati si conclude che l'attivazione alfa-adrenergica della glicogenolisi e della gluconeogenesi in cellule parenchimali di fegato di ratto isolate avviene mediante meccanismi che non comportano un aumento del cAMP cellulare totale o l'attivazione della protein chinasi cAMP-dipendente. I risultati mostrano anche che gli inibitori della fosfodiesterasi potenziano le azioni alfa-adrenergiche negli epatociti principalmente attraverso uno o più meccanismi che non comportano un aumento del cAMP.
Studi sull'attivazione alfa-adrenergica della produzione di glucosio epatico. I. Studi sull'attivazione alfa-adrenergica della fosforilasi e della gluconeogenesi e sull'inattivazione della glicogeno sintasi in cellule parenchimali di fegato di ratto isolate .L'adrenalina e l'agonista alfa-adrenergico fenilefrina hanno attivato la fosforilasi, la glicogenolisi e la gluconeogenesi dal lattato in modo dose-dipendente in cellule parenchimali epatiche di ratto isolate. La dose massima attiva di epinefrina era 10-7 M e di fenilefrina era 10(-6) M. Questi effetti sono stati bloccati dagli antagonisti alfa-adrenergici inclusa la fenossibenzamina, ma erano in gran parte non influenzati dagli antagonisti beta-adrenergici incluso il propranololo L'adrenalina ha causato un aumento transitorio di 2 volte dell'adenosina 3\': 5\'-monofosfato (cAMP) che è stato abolito dal propranololo e da altri beta-bloccanti, ma non è stato influenzato dalla fenossibenzamina e da altri alfa-bloccanti. È stato dimostrato che la fenossibenzamina e il propranololo essere specifici per i rispettivi recettori adrenergici e non influenzare l'azione del glucagone o del cAMP esogeno. Né l'adrenalina (10-7 M), né la fenilefrina (10-5 M), né il glucagone (10-7 M) hanno inattivato la glicogeno sintasi nelle cellule epatiche di ratti nutriti. Quando il rapporto di attività della glicogeno sintasi (-glucosio 6-fosfato/+ glucosio 6-fosfato) è stato aumentato da 0,09 a 0,66 mediante preincubazione di tali cellule con glucosio 40 mM, questi agenti hanno sostanzialmente inattivato l'enzima. L'incubazione di epatociti da ratti nutriti ha determinato una deplezione del glicogeno che è stata correlata con un aumento del rapporto di attività della glicogeno sintasi e una diminuzione dell'attività della fosforilasi alfa. Negli epatociti di animali a digiuno, il rapporto di attività della glicogeno sintasi era 0,32 +/- 0,03 e l'adrenalina, il glucagone e la fenilefrina erano in grado di abbassarlo significativamente. Gli effetti dell'adrenalina e della fenilefrina sull'enzima sono stati bloccati dalla fenossibenzamina, ma sono stati in gran parte non influenzati dal propranololo. L'attivazione massima della fosforilasi negli epatociti da ratti a digiuno incubati con fenilefrina 10(-5) M ha preceduto la massima inattivazione della glicogeno sintasi. L'aggiunta di glucosio ha ridotto rapidamente, in modo dose-dipendente, l'attività della fosforilasi alfa sia basale che elevata da fenilefrina negli epatociti preparati da ratti a digiuno. Il glucosio ha anche aumentato il rapporto di attività della glicogeno sintasi, ma questo effetto è rimasto indietro rispetto alla variazione della fosforilasi. Fenilefrina (10-5 M) e glucagone (5 x 10(-10) M) sono diminuiti della metà della caduta nell'attività della fosforialsi alfa osservata con glucosio 10 mM e hanno marcatamente soppresso l'elevazione dell'attività della glicogeno sintasi. Da questi risultati si traggono le seguenti conclusioni. (a) Gli effetti dell'adrenalina e della fenilefrina sul metabolismo dei carboidrati nelle cellule parenchimali del fegato di ratto sono mediati principalmente dai recettori alfa-adrenergici. (b) La stimolazione di questi recettori da parte dell'adrenalina o della fenilefrina determina l'attivazione della fosforilasi e della gluconeogenesi e l'inattivazione della glicogeno sintasi mediante meccanismi che non comportano un aumento del cAMP cellulare. (c) L'attivazione dei recettori beta-adrenergici da parte dell'adrenalina porta all'accumulo di cAMP, ma questo è associato ad un'attivazione minima della fosforilasi o all'inattivazione della glicogeno sintasi...
Comportamento di titolazione di singoli residui di tirosina di mioglobine di capodoglio, cavallo e canguro rosso.Il comportamento di titolazione di singoli residui di tirosina di mioglobine è stato studiata osservando la dipendenza dal pH degli shift chimici di Czeta e Cgamma di questi residui in abbondanza naturale di spettri NMR in trasformata di Fourier 13C (a 15,18 MHz, in provette da 20 mm, a 37 gradi) di cianoferrimioglobine da capodoglio, cavallo, e canguro rosso. Un confronto tra la dipendenza dal pH degli spettri delle tre proteine ha prodotto assegnazioni specifiche per la risonanza di Tyr-151 (capodoglio) e Tyr-103 (capodoglio e cavallo). Il disaccoppiamento protonico selettivo ha fornito assegnazioni specifiche per Czeta di Tyr-146 delle cianoferrimioglobine di cavallo e canguro, ma non l'assegnazione corrispondente per il capodoglio. La dipendenza dal pH degli spostamenti chimici indicava che solo Tyr-151 e Tyr-103 sono residui di tirosina titolabili. Anche a pH 12, Tyr- 146 non ha iniziato a titolare. Il comportamento di titolazione di C zeta e Cgamma di Tyr-151 della cianoferrimioglobina di capodoglio ha prodotto un singolo valore pK di 10.6. La dipendenza dal pH dello spostamento chimico di ciascuna delle risonanze di Tyr-103 delle cianoferrimioglobine di cavallo e capodoglio non poteva essere misurata con l'uso di un singolo valore di pK, ma era coerente con due valori di pK (circa 9,8 e 11,6). Inoltre, le risonanze di Czeta e Cgamma di Tyr-103 si sono ampliate a pH elevato. È stato anche esaminato il comportamento di titolazione delle tirosine della mioglobina di monossido di carbonio di capodoglio e della ferrimioglobina di cavallo. Un confronto di tutti i risultati sperimentali ha indicato che Tyr-151 è esposto al solvente, Tyr-146 non è esposto e Tyr-103 mostra un comportamento intermedio. Questi risultati per le mioglobine in soluzione sono coerenti con le aspettative basate sulla struttura cristallina.
Effetto dei tamponi dell'acido etansulfonico e del pH sull'accumulo di una proteina specifica del sistema nervoso (S-100) e di un enzima gliale arricchito in una linea clonale di astrociti di ratto ( C6).Colture in fase stazionaria di una linea clonale di astrociti di ratto (C6) sono state mantenute a valori di pH compresi tra 6,0 e 8,4 utilizzando mezzi tamponati con varie combinazioni di tamponi organici o concentrazioni graduate di ione bicarbonato a un tensione costante di CO2 L'accumulo di una proteina acida solubile unica del sistema nervoso (S-100) in terreni tamponati con tamponi organici era ottimale nell'intervallo di pH da 6,4 a 6,8, significativamente più acido di quello ottimale per la crescita cellulare (pH da 7,0 a 7.8) Le cellule mantenute in terreni tamponati con CO2-bicarbonato hanno mostrato un pH ottimale più alto e meno marcato per l'accumulo della proteina S-100 e una minore efficienza di accumulo della proteina. Questi dati suggeriscono che gli stessi ioni tampone organici, a parte la loro funzione come tamponi, sono influenti l'accumulo di S-100. L'attività specifica (dosata al pH enzimatico ottimale) di un enzima legato alla membrana arricchito in cellule gliali e mielina, 2\',3\'-nucleotide ciclico 3\'-fosfoidrolasi, era marcatamente dipendente dal pH. L'intervallo di pH ottimale era compreso tra 6,4 e 6,7 in terreni controllati con tampone organico. Nei terreni controllati da CO2-bicarbonato l'intervallo di pH ottimale era solo leggermente più alto (pH da 6,6 a 7,0), ma le attività specifiche erano ridotte rispetto alle cellule cresciute in tampone organico. Si nota la relazione strutturale di alcuni dei tamponi di acido amminoetansolfonico utilizzati in questi esperimenti con alcuni composti di interesse neurochimico (come la taurina e l'alfa-flupentixolo).
Meccanismo della desaturasi microsomiale stearil-CoA del fegato di ratto. Studi sulla specificità del substrato, sulle interazioni enzima-substrato e sulla funzione dei lipidi.I tre proteine purificate necessarie per la desaturazione microsomiale stearil-CoA, NADH-citocromo b5 reduttasi, citocromo b5 e desaturasi, sono state combinate con lecitina d'uovo o vescicole di lecitina dimiristil per ricostruire un sistema di trasporto di elettroni funzionale in grado di utilizzare NADH e O2 nella desaturazione di stearil-CoA. Tali preparazioni sembrano consistere in vescicole fosfolipidiche che contengono le tre proteine legate alla superficie esterna delle vescicole. Derivati di acil-CoA contenenti da 12 a 19 catene di acile grasso di carbonio sono necessari per l'attività desaturasi mentre derivati contenenti da 9 a 20 i carboni sono in grado di legarsi all'enzima. Derivati di acil-CoA a catena più corta, CoA libero e acidi grassi liberi non sembrano legarsi all'enzima. Studi di inibizione e analoghi suggeriscono th alla catena metilenica dello stearil-CoA assume una conformazione eclissata ("gauche") agli atomi di carbonio 9,10 nel complesso enzima-substrato. Inoltre, gli effetti sul tasso di isotopi ottenuti con derivati deuterati di stearil-CoA indicano che la rimozione dell'idrogeno è la fase limitante della desaturazione. Lo stearil-CoA si lega ai liposomi puri e ai liposomi contenenti desaturasi, ed è questa forma di stearil-CoA che sembra essere il substrato per la desaturasi. I grafici di Arrhenius dell'attività desaturasi ottenuti utilizzando desaturasi legata a liposomi di lecitina d'uovo, in cui la temperatura di transizione di fase da liquido cristallino a cristallino è di -5 gradi, era lineare tra 15 e 35 gradi, mentre quella ottenuta utilizzando desaturasi legata a liposomi di lecitina di lecitina ha mostrato un rottura a 24 gradi in coincidenza con la temperatura di transizione di fase da liquido cristallino a cristallino per questo lipide. La diminuzione osservata nell'effetto della velocità dell'isotopo del deuterio al di sotto della temperatura di transizione indica che un passaggio nella sequenza di reazione diverso dall'estrazione dell'idrogeno diventa limitante quando il lipide è allo stato cristallino. In questo sistema la diffusione traslazionale non emerge come fattore limitante. I liposomi contenevano una quantità sufficiente di reduttasi e citocromo b5 in modo che la diffusione traslazionale non fosse limitante.
La regolazione allosterica dell'esochinasi C dal fegato degli anfibi.Esochinasi di tipo C (ATP:D-esoso-6-fosfotransferasi EC 2.7.1.1) è stato parzialmente purificato dal fegato della rana Calyptocephalella caudiverbera. L'enzima è inibito da livelli di glucosio nell'intervallo delle normali concentrazioni di zucchero nel sangue. L'entità dell'inibizione da parte del glucosio dipende dalla concentrazione di ATP, essendo più marcata tra 1 e 5 mM ATP. Il fruttosio, sebbene sia un substrato, non inibisce la propria fosforilazione. L'effetto inibitorio di alti livelli di glucosio ha mostrato una forte dipendenza reversibile dal pH essendo più marcato a pH 6,5. A pH 7,5 l'inibizione da alti livelli di glucosio era una funzione di concentrazione enzimatica, l'effetto è più forte ad alte concentrazioni enzimatiche, mentre non è stata osservata alcuna inibizione nel dosaggio di preparati molto diluiti. A tutte le concentrazioni enzimatiche studiate, alti livelli di glucosio non hanno causato inibizione a pH 8,5, mentre a pH 6,5 stro l'inibizione di ng è stata sempre osservata. Brevi tempi di fotoossidazione dell'esochinasi C e incubazione con basse concentrazioni di p-cloromercuribenzoato hanno portato alla perdita dell'inibizione per eccesso di glucosio. Il glucosio-6-fosfato è risultato essere un forte inibitore dell'esochinasi C, ma solo ad alti livelli di glucosio. L'effetto inibitorio del glucosio-6-P segue la cinetica sigmoidale a basse concentrazioni di glucosio (circa 0,02 mM), il coefficiente di Hill è 2,3. La cinetica dell'inibizione diventa iperbolica a livelli di glucosio elevati (maggiori di 0,2 mM). Questi risultati suggeriscono che l'inibizione dell'esochinasi C da parte del glucosio in eccesso è dovuta all'interazione del glucosio con un secondo sito regolatorio, aldosio-specifico, sull'enzima. La modifica dell'effetto inibitorio da parte di ATP, glucosio-6-P, concentrazione enzimatica e pH, tutti a livelli fisiologici, indica un ruolo importante dell'esochinasi C nella regolazione dell'utilizzo del glucosio da parte del fegato.
Formazione e proprietà del galattosio retinilfosfato.Frazioni grezze di membrana cellulare da un certo numero di tessuti possono formare glicolipidi acidi. La formazione di lipidi acidi galattosio e mannosio i lipidi erano notevolmente ridotti in caso di carenza di vitamina A, principalmente nei tessuti noti per la produzione di muco. Il tessuto del mastocitoma di topo era attivo nella formazione di lipidi di galattosio acidi con UDP-galattosio come substrato. Uno dei prodotti è stato identificato come retinilfosfato galattosio. La reazione di sintetasi produce questo composto ha mostrato un pH apparente ottimale a 6,3. La presenza di detergente e retinolo ha stimolato la reazione di sintetasi, che ha mostrato un requisito assoluto di Mn2 + o Mg2 +. La reazione di sintetasi era facilmente reversibile. L'incubazione dell'enzima particolato con retinilfosfato galattosio e UDP ha prodotto UDP- galattosio e un composto identificato provvisoriamente come retinilfosfato. Il lipide di galattosio è stato isolato mediante cromatografia su colonna su DEAE-cellulosa a nd gel di silice. Il galattosio retinilfosfato era omogeneo quando esaminato mediante cromatografia su strato sottile. L'idrolisi acida lieve del galattosio retinilfosfato marcato produce [14C]galattosio, mentre l'idrolisi alcalina e l'idrogenolisi hanno prodotto il [14C]galattosio 1-fosfato. Retinilfosfato galattosio legato a una proteina che si lega al retinolo impoverito di vitamina.
Reazioni di addizione nucleofila di deazaflavina libera e legata all'enzima.La glicolato ossidasi contenente DeazaFMN è stata preparata e ha dimostrato di catalizzare il trasferimento stereospecifico dell'alfa -idrogeno da substrato a deazaFMN legato all'enzima È stata esaminata la reazione di solfito, cianuro e idrossilammina con diversi enzimi contenenti deazaflavina (glicolato ossidasi, D-amminoacido ossidasi, glucosio ossidasi, N-metilglutammato sintetasi) e deazaFMN libera. Tutti i sistemi di deazaflavina testati formano complessi reversibili 1:1 con solfito e cianuro. La dipendenza dal pH della reazione di deazaFMN libero con cianuro indica che l'anione cianuro è il nucleofilo che reagisce. I complessi di idrossilammina si formano con deazaFMN glicolato ossidasi e deazaFAD glucosio ossidasi. l'efficacia dei vari reagenti nucleofili nella formazione dei complessi decresce nel seguente ordine: solfito maggiore del cianuro maggiore dell'idrossilammina La stabilità relativa ob servito per i complessi solfito e cianuro formati con vari sistemi di deazaflavina (glicolato ossidasi maggiore della D-amminoacido ossidasi maggiore della deazaFMN libera) segue lo stesso andamento osservato per la stabilità dei complessi solfito formati con il corrispondente sistema flavinico. Si osserva inoltre una correlazione tra il potenziale di riduzione (E\'o) del sistema della deazaflavina (glicolato ossidasi (-170 mV) maggiore della D-aminoacido ossidasi (-240 mV) maggiore della deazaFMN libera (-178 mV) e la stabilità dei complessi deazaflavina-nucleofili. Le seguenti prove indicano che i sistemi deazaflavina sono generalmente più suscettibili all'attacco nucleofilo rispetto al corrispondente sistema flavinico: (a) con l'eccezione della glucosio ossidasi, le costanti di dissociazione per i complessi deazaflavina-solfito sono almeno di 1 ordine di grandezza inferiore ai corrispondenti complessi flavin solfito; (b) il nucleofilo meno reattivo, l'idrossilammina, non forma un complesso con nessuno dei sistemi flavinici. Nel caso del cianuro, un complesso si forma solo con la glicolato ossidasi nativa, che è il sistema contenente flavino più suscettibile all'attacco del solfito più reattivo. La formazione dei vari complessi (deaza)flavino-nucleofili è caratterizzata da uno sbiancamento del l banda di assorbimento della lunghezza d'onda del cromoforo e aumento dell'assorbimento al di sotto del punto isosbestico della reazione nella regione quasi ultravioletta dello spettro. Questi risultati sono coerenti con la formazione di addotti covalenti tramite attacco dei vari nucleofili in posizione 5 della (deaza)flavina. La reazione con il cianuro fornisce il primo esempio di aggiunta reversibile di carbanione alla (deaza)flavina legata all'enzima.
Purificazione, proprietà e specificità di substrato della fosfoproteina fosfatasi dal fegato di coniglio.La fosfoproteina fosfatasi che agisce sulla fosforilasi a muscolare è stata purificato dal fegato di coniglio mediante precipitazione acida, centrifugazione ad alta velocità, cromatografia su DEAE-Sephadex A-50, Sephadex G-75 e Sepharose-istone L'attività enzimatica è stata recuperata nella fase finale come due picchi distinti indicati provvisoriamente come fosfoproteina fosfatasi I e II. Ogni fosfatasi ha mostrato una singola banda larga quando esaminata mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato; i pesi molecolari derivati da questo metodo erano circa 30.500 per la fosfoproteina fosfatasi I e 34.000 per la fosfoproteina fosfatasi II. Il valore s20, w per ciascun enzima era 3,40 Utilizzando questo valore e i valori per i raggi di Stokes, il peso molecolare per ciascun enzima è stato calcolato pari a 34.500. Entrambe le fosfatasi, oltre a catalizzare la conversione della fosforilasi a in b, ha anche catalizzato la defosforilazione della glicogeno sintasi D, della fosforilasi chinasi attivata, dell'istone fosforilato, della caseina fosforilata e del componente inibitorio fosforilato della troponina (TN-I). Le attività relative delle fosfatasi rispetto alla fosforilasi a, alla glicogeno sintasi D, all'istone e alla caseina sono rimaste sostanzialmente costanti durante la purificazione. L'attività di entrambe le fosfatasi con substrati diversi è diminuita parallelamente quando sono state denaturate mediante incubazione a 55 gradi e 65 gradi. I valori di Km della fosfoproteina fosfatasi I per la fosforilasi a, l'istone e la caseina erano inferiori ai valori ottenuti per la fosfoproteina fosfatasi II. Con la glicogeno sintasi D come substrato, ogni enzima ha dato essenzialmente lo stesso valore di Km. Utilizzando entrambi gli enzimi, si è scoperto che l'attività verso un dato substrato era inibita in modo competitivo da ciascuno dei substrati alternativi. I risultati suggeriscono che le fosfoproteine fosfatasi I e II sono attive verso tutti i substrati testati.
5-Iodo-5\'-amino-2\',5\'-dideoxyuridine-5\'-N\'-trifosfato. Sintesi, proprietà chimiche e effetto sull'attività della timidina chinasi di Escherichia coli.5-Iodo-5\'-amino-2\',5\'-dideoxyuridine-5\'-N\'-trifosfato (AIdUTP), un fosforamidato analogo della 5-iodo-2\',5\'-dideossiuridina 5\'-trifosfato (IdUTP), è stato sintetizzato e sono state studiate alcune delle sue proprietà chimiche e biologiche. Anche se AIdUTP è stabile in soluzioni alcaline, al di sotto di pH 8 subisce degradazione da una nuova reazione di fosforilisi che mostra cinetica di primo ordine. L'inclusione di ione magnesio nella miscela di reazione ha ridotto la velocità di degradazione. La protonazione di un gruppo su AIdUTP che ha un pKa di 6.10, presumibilmente l'ossigeno ionizzato secondario sul gamma fosfato, precede fosforilisi Gli unici prodotti di reazione rilevabili sono il nucleoside, 5-iodo-5\'-amino-2\',5\'-dideossiuridina (AIdUrd), e trim etafosfato. Viene proposto un meccanismo per la fosforilisi catalizzata da acido di AIdUTP. AIdUTP, come TTP, converte la timidina chinasi di Escherichia coli in un dimero inattivo con un coefficiente di sedimentazione di 5,78 S. AIdUTP è, tuttavia, 60 volte più potente come inibitore allosterico di TTP a pH 7,8. Sebbene l'effetto inibitorio di TTP sia notevolmente ridotto a pH elevato, l'attività di AIdUTP è ridotta solo leggermente. Gli effetti allosterici di AIdUTP differiscono anche da quelli di IdUTP, che è un inibitore a pH basso ma un forte attivatore sopra pH 7,4. 5-Iodo-2\'-deossicitidina 5\'-trifosfato, un potente attivatore enzimatico, non può invertire completamente l'inibizione dell'AIdUTP, anche se presente con un eccesso molare di 150 volte.
I tassi di fosforilazione e defosforilazione di fosfoglicerato mutasi e sintasi bisphosphoglycerate", fosfoglicerato mutasi e sintasi bisphosphoglycerate (mutasi) può sia essere fosforilata da una glicerato-1 , 3-P2 o glicerato-2,3-P2 agli enzimi forma phosphohistidine. il presente studio utilizza un procedimento di raffreddamento rapido per determinare se, per ciascun enzima, la formazione dell'enzima fosforilata e trasferimento fosfato dall'enzima può avvenire a velocità costanti con le reazioni generali. con sintasi bisphosphoglycerate da cellule di cavallo globuli rossi (lead glicerato-1,3-P2 a glicerato-2,3-P2) a pH 7,5, 25 gradi, fosforilazione dell'enzima appare limitante la velocità, k \ = 13,5 s-1, rispetto kcat \ = 12,5 s-1 per il tasso sintasi complessiva. trasferimento fosforile da enzima fosfoglicerato avviene a 38 s-1 a 4 gradi ed era troppo veloce per misurare a 25 gradi. con pollo fosfoglicerato muscolare mutasi le mezze tempi erano troppo breve per misurare in condizioni ottimali. Il tasso di enzima fosforilazione da glicerato-2,3-P2 a pH 5,5, 4 gradi, potrebbe spiegare la velocità di reazione complessivo di 170 s-1. La velocità di trasferimento fosforile da enzima glicerato-3-P era troppo rapido per misurare nelle stesse condizioni. Si è concluso che gli enzimi fosforilati hanno proprietà cinetiche coerenti con la loro partecipazione come intermedi nelle reazioni catalizzate da questi enzimi.
Evidenza di molteplici siti di riduzione del ferricianuro nei cloroplasti.Vari siti di riduzione del ferricianuro sono stati studiati nei cloroplasti degli spinaci. È stato riscontrato che in presenza di dibromotimochinone una frazione della riduzione del ferricianuro era sensibile al dibromotimochinone, il che implica che il ferricianuro può essere ridotto dal fotosistema I e dal fotosistema II. Per separare i siti di riduzione del ferricianuro nel fotosistema II, le inibizioni dell'ortofenantrolina e della diclorofenil dimetilurea sono state confrontate a vari pH. la riduzione del ferricianuro a basso pH non è stata completamente inibita dall'orotofenantrolina. Ad alti pH\', tuttavia, l'inibizione della riduzione del ferricianuro da parte dell'ortofenantrolina è stata completa. È stato riscontrato che la variazione della concentrazione di ortofenantrolina a un pH costante ha mostrato diversi gradi di inibizione. Nello studio di riduzione del ferricianuro da parte del fotosistema II sono stati eseguiti vari trattamenti che interessano la plastocianina è stato scoperto che i trattamenti Tween-20 o KCN che inattivavano la plastocianina non inattivavano completamente la riduzione del ferricianuro. Questi dati supportano la conclusione che il ferricianuro accetta elettroni sia prima che dopo il plastochinone nel fotosistema II.
Influenza dei potenziali di superficie sulla pompa mitocondriale H+ e sulle transizioni di fase lipidica.È stato dimostrato che il potenziale di superficie delle membrane lipidiche, come così come dei mitocondri, può essere spostato in modo più positivo dall'assorbimento di alchilbiguanidi. Sia le vescicole fosfolipidiche che le membrane naturali rispondono in modo analogo a questo spostamento. Le attività ioniche sulla superficie della membrana immediata sono influenzate dal segno e dall'entità della carica superficiale. Effetti corrispondenti sul trasporto ionico e sul legame della sonda di fluorescenza si può osservare. La pompa mitocondriale H+ è inibita quando la carica superficiale è spostata più positiva. Al contrario, la densità di carica assoluta determina la temperatura della transizione ordinata-fluido. Quest'ultima è aumentata di biguanides, suggerendo che la membrana è resa più rigida. Gli esperimenti rendono ovvio che le relazioni fisiche derivate da sistemi modello si applicano ugualmente bene alle membrane naturali contenenti lipidi.
Trasferimento di carica mediato dalla nigericina nelle membrane lipidiche nere.Nigericina, nell'intervallo di concentrazione (10(-6) M o superiore) a cui disaccoppia i mitocondri intatti, è stato scoperto che aumenta la conduttanza delle membrane lipidiche nere (BLM) di diversi ordini di grandezza. La dipendenza della conduttanza di membrana dal pH e dalla concentrazione di K+ suggerisce un meccanismo per il trasferimento di carica mediato da questo ionoforo basato su un dimero con entrambe le molecole di nigericina protonate e complessate con un K+. Questo complesso carico spiega l'effetto di disaccoppiamento osservato nei mitocondri intatti.
Purificazione, cristallizzazione e alcune proprietà della creatina amidinoidrolasi da Pseudomonas putida.È stato sviluppato un metodo per la purificazione e la cristallizzazione della creatinasi [creatina amidinoidrolasi, EC 3.5.3.3] da Pseudomonas putida var. naraensis C-83. La preparazione purificata appariva omogenea all'elettroforesi su disco e all'ultracentrifugazione e aveva un peso molecolare di 94.000. Era più attiva a pH 8 e stabile tra pH 6 e 8 per 24 ore a 37 gradi. L'elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS indicava che l'enzima nativo era costituito da due monomeri subunità, i cui pesi molecolari erano stimati in 47.000. Gli esperimenti di inibizione suggerivano che un gruppo sulfidrilico si trovava all'interno o vicino al sito attivo dell'enzima.
Stima dell'esposizione al triptofilo e al tirosile nelle proteine ricche di triptofano mediante spettrofotometria a differenza ultravioletta. Lisozima e chimotripsinogeno.Gli spettri di assorbimento della differenza ultravioletta prodotti dal glicole etilenico sono stati misurati per il lisozima di gallina [EC 3.2.1.17] e il chimotripsinogeno bovino. N-acetil-L-triptofanamide e N-acetil-L-tirosinamide sono stati impiegati come composti modello rispettivamente per i residui di triptofilo e tirosile, e sono stati misurati anche i loro spettri di differenza ultravioletta in funzione della concentrazione di glicole etilenico. Confronto delle pendenze dei grafici dei coefficienti di estinzione della differenza molare (delta epsilon) rispetto alla concentrazione di glicole etilenico per le proteine con quelli dei composti modello alle posizioni di picco (291-293 e 284-287 nm) negli spettri di differenza, è stato possibile stimare il numero medio di residui tirosilici e triptofili negli stati esposti. I risultati hanno dato 2,7 triptofili e 1,9 residui tirosilici esposti per lisozima a pH 2.1 e 2.6 residui di triptofilo e 3.4 tirosile esposti per chimotripsinogeno a pH 5.4. L'esposizione al tirosile leggermente superiore del chimotripsinogeno, rispetto ai risultati della titolazione spettrofotometrica e della modifica chimica, non era inaspettata, perché delta epsilon285 era maggiore di delta epsilon292, e la situazione è discussa con riferimento all'interazione preferenziale del glicole etilenico con i residui tirosile e /o catene laterali in prossimità del cromoforo nella proteina. La procedura impiegata nel presente lavoro sembra essere adatta per la stima del numero medio di residui triptofili e tirosile esposti nelle proteine ricche di triptofano. Sono stati studiati anche gli effetti del glicole etilenico sugli spettri di dicroismo circolare del lisozima a pH 2,1 e del chimotripsinogeno a pH 5,4. Ad alte concentrazioni di glicole etilenico, è stato scoperto che entrambe le proteine subiscono cambiamenti conformazionali nella direzione di strutture più ordinate, presumibilmente più elicoidali per il lisozima e più beta-strutturate per il chimotripsinogeno.
Purificazione e proprietà della destransucrasi extracellulare da Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299.Attività della destratransucrasi [EC 2.4.1.5] da surnatante di coltura priva di cellule di Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299 è stato purificato mediante frazionamento (NH4)2SO4, adsorbimento su idrossiapatite, cromatografia su DEAE-cellulosa e gel filtrazione su Sephadex G-75. L'enzima extracellulare è stato separato in due forme principali, enzimi I e N, e quest'ultimo ha dimostrato di essere una forma aggregata del protomero, l'enzima I. Gli enzimi I e N erano entrambi elettroforeticamente omogenei e le loro attività relative hanno raggiunto rispettivamente 820 e 647 volte quella del surnatante di coltura. Su gel di sodio dodecilsolfato (SDS)-poliacrilammide elettroforesi, l'enzima N si è dissociato nel protomero enzima I, con un peso molecolare di 48.000. L'enzima I è stato gradualmente convertito in enzima N con l'invecchiamento e questa conversione è stata stimolata in presenza di NaCl. Il pH e la temperatura dell'attività dell'enzima I erano pH 6,0 e 40 gradi, rispettivamente, mentre quelli dell'enzima N erano pH 5,5 e 35 gradi. I valori di Km degli enzimi I e N erano rispettivamente di 13,9 e 13,1 mM. Ca2+, Mg2+, Fe2+ e Co2+ hanno stimolato l'attività dell'enzima N e l'EDTA ha mostrato un potente effetto inibitorio su questo enzima. Inoltre, l'attività dell'enzima N è stata stimolata più efficacemente dai destrani esogeni rispetto all'enzima I.
Purificazione e caratterizzazione della metioninasi da Pseudomonas putida.La metioninasi di Pseudomonas putida è stata purificata all'omogeneità, come giudicato dall'elettroforesi su gel di poliacrilammide, con un'attività specifica 270 volte superiore a quello dell'estratto grezzo 1. L'enzima purificato aveva un S20,w di 8,37, un peso molecolare di 160.000 e un punto isoelettrico di 5,6. 2. È stata osservata una rottura nel diagramma di Arrhenius a 40 gradi e le energie di attivazione al di sotto e al di sopra di questa temperatura erano rispettivamente di 15,5 e 2,97 kcal per mole 3. Oltre alla L-metionina, vari derivati S-sostituiti dell'omocisteina e della cisteina potrebbero servire come substrati. Il 4-metiltiobutanoato e i relativi amminoacidi non contenenti zolfo erano inerti È stata osservata formazione equimolare di alfa-chetobutirrato e CH3SH con metionina come substrato 4. Oltre al picco proteico a 278 nm, sono stati osservati due massimi di assorbimento a 345 e 430 nm a p H 7.5. L'idrossilammina ha rimosso il piridossalfosfato legato all'enzima, determinando una risoluzione quasi completa con la concomitante scomparsa di entrambi i picchi. La ricostruzione dell'enzima trattato potrebbe essere ottenuta mediante l'aggiunta del cofattore; il valore Km è stato calcolato essere 0,37 muM. 5. L'enzima purificato riportato deve essere designato come L-metionina metantioliasi (deaminante).
Trasporto attivo di alanina da parte di vescicole di membrana termostabili isolate da un batterio termofilo.1. Vescicole di membrana termostabili che erano in grado di trasportare attivamente alanina in dipendenza da o la respirazione o un potenziale di membrana artificiale sono stati isolati dal batterio aerobico termofilo PS3 2. L'assorbimento di alanina dipendeva dall'ossidazione del metosolfato di ascorbato-fenazina o dal NADH generato o esogeno, ma il succinato e il malato non sono riusciti a guidare l'assorbimento. la temperatura per l'assorbimento di alanina guidato dalla respirazione era da 45 a 60 gradi 3. Le vescicole caricate con ioni di potassio sono state preparate incubando le vescicole a 55 gradi in fosfato di potassio 0,5 M. L'aggiunta di valinomicina ha provocato un assorbimento rapido e transitorio di alanina nelle condizioni di prova L'assorbimento di alanina in risposta alla valinomicina è stato progressivamente potenziato dall'aggiunta di diciloesilcarbodiimmide, ma è stato completamente abolito in presenza di un proto n conduttore o catione permeabile sintetico. L'effetto della dicicloesilcarbodiimmide dipendeva dalla sua concentrazione ed era massimo a una concentrazione di 0,4 mM. 4. La permeabilità protonica delle vescicole di membrana è stata ridotta dall'aggiunta di dicicloesilcarbodiimmide. Una piccola ma significativa differenza è stata trovata nei tassi iniziali di assorbimento del protone in presenza di dicicloesilcarbodiimmide con e senza alanina. I risultati suggeriscono che i protoni alanina sono trasportati simultaneamente in un rapporto stechiometrico di 1 : 1. 5. L'assorbimento di alanina è stato anche guidato da un gradiente di pH indotto da un calo istantaneo del pH in una sospensione di vescicole cariche di alcali. Pertanto, l'accumulo di alanina è stato guidato non solo da un potenziale elettrico ma anche da un gradiente di pH. 6. L'aggiunta di ATP ha determinato l'inibizione dell'assorbimento di alanina dipendente dal potenziale di membrana artificiale. L'idrolisi dell'ATP da parte dell'ATPasi di membrana ha creato un potenziale di membrana che era positivo all'interno e questo potrebbe ridurre l'effettivo potenziale di membrana (generato dall'efflusso di K+ mediato dalla valinomicina) disponibile per guidare l'assorbimento dell'alanina.
Attività xilanasica di un'endocellulasi di tipo carbossimetilcellulasi da Irpex lacteus (Polyporus tulipiferae).Un'endocellulasi [EC 3.2.1.4. ] di tipo carbossimetilcellulasi (F-1) che è stato frazionato dal filtrato di coltura di Irpex lacetus e purificato per omogeneità elettroforetica e ultracentrifuga, è risultato mostrare attività della xilanasi [EC 3.2.1.8. ] L'attività non è stata rimossa da nessuna delle frazioni intermedie durante la purificazione del picco iniziale di FI e l'attività radio della xilanasi a cellulasi è rimasta quasi invariata attraverso i processi di purificazione. L'attività della xilanasi di FI ha mostrato non solo lo stesso pH ottimale, stabilità al calore e stabilità del pH del suo attività di cellulasi, ma anche la stessa mobilità dell'attività di cellulasi su film di acetato di cellulosa e elettroforesi della zona di amido. Le velocità complessive di idrolisi di miscele di varie concentrazioni di CM-cellulosa e xilano da parte di F-1 hanno coinciso bene con quelle c derivato dal trattamento di Michaelis-Menten di due sostanze che competono per lo stesso sito attivo dell'enzima. Questi risultati indicano che l'attività xilanasica di F-1 è intrinseca alla cellulasi stessa.
Purificazione e proprietà di una endocellulasi di tipo avicelasi da Irpex lacteus (Polyporus tulipiferae).Un filtrato di coltura di Irpex lacteus (Polyporus tulipiferae) è stata frazionata inizialmente mediante salatura con solfato di ammonio, e una frazione di cellulasi [EC 3.2.1.4. ] con elevata attività idrolizzante di Avicel (precedentemente chiamata Avicelase) è stata ampiamente purificata mediante una serie di procedure di cromatografia su colonna. Questa endocellulasi purificata ha mostrato una meccanismo idrolitico meno casuale, ed è stato ottenuto con una resa dello 0,04% rispetto al materiale di partenza. La sua attività specifica è stata potenziata di circa 30 volte rispetto a quella del materiale di partenza. Il componente cellulasi ha mostrato un unico picco sia su ultracentrifuga che su disco di acrilammide elettroforetico analisi. Il suo peso molecolare è stato stimato in 56.000. Conteneva il 12,2% di carboidrati; i principali costituenti degli zuccheri erano glucosio e mannosio. Per quanto riguarda la composizione aminoacidica, il contenuto di l'acido aspartico e la glicina erano più alti, seguiti da quelli di acido glutammico, serina e teonina. Il componente cellulasi non è stato marcatamente inibito dalla maggior parte degli ioni metallici testati ad eccezione di Hg2+. Questa endocellulasi purificata ha attaccato una serie di cellooligosaccaridi, beta-cellobioside, CM-cellulosa e substrati cellulosici insolubili. Nei digeriti da substrati insolubili, erano rilevabili glucosio, cellobiosio, cellotriosio e cellotetraosio, ma la quantità di cellobiosio era di gran lunga la più grande. Al contrario, cellobiosio e glucosio sono stati prodotti in quantità quasi uguali dal beta-cellobioside.
Proteolisi parziale di alcuni componenti della cellulasi da Trichoderma viride e specificità del substrato dei prodotti modificati.Un componente dell'endocellulasi [EC 3.2.1.4] o di tipo casuale, F II, è stato ottenuto da "Cellulase Onozuka," un prodotto commerciale di Trichoderma viride ed è stato sottoposto a proteolisia parziale con una preparazione di proteasi della stessa origine fungina. La cellulasi modificata risultante è stata frazionata mediante due passaggi di sono stati esaminati la cromatografia su colonna e i pattern risultanti, insieme alla specificità del substrato espressa in termini di casualità dell'idrolisi della CMC e alle proprietà immunologiche contro il siero di coniglio anti-F II. I pattern cromatografici erano molto simili a quelli della cellulasi sottofrazioni senza trattamento proteolitico. Inoltre, la risposta immunologica delle cellulasi modificate da F II è stata per lo più positiva e la loro casualità di idrolisi CMC era generalmente inferiore, rispetto alle sottofrazioni di F II che non sono stati sottoposti a proteolisi. Le sottofrazioni del Picco III, ottenute da F II mediante proteolisi, hanno mostrato una risposta immunologica per lo più negativa e una maggiore casualità dell'idrolisi della CMC rispetto alle sottofrazioni del Picco III che non erano state sottoposte a proteolisi. Pertanto, una certa proteolisi limitata dei componenti della cellulasi può, almeno in parte, essere responsabile della sua molteplicità in vivo.
Rilascio di calcio indotto dalla depolarizzazione da frammenti del reticolo sarcoplasmatico. II. Rilascio di calcio incorporato con ATP.Ca2\& incorporato in vescicole di frammenti del reticolo sarcoplasmatico (SRF) per diffusione potrebbe essere rilasciato rapidamente cambiando l'ambiente ionico, per diluizione da metansolfonato (MS) a cloruro. Questo scambio ionico è considerato per rendere negativo il potenziale di membrana di SRF all'interno. È stato anche osservato un rilascio molto più veloce di Ca2t su cambiamento osmotico da alto a basso. Queste risposte erano molto simili al rilascio di Ca2\& da SRF dopo l'assorbimento con ATP, ma la velocità di rilascio era lenta nel caso dello scambio anionico. Il comportamento di K\&, Na\&, saccarosio e inulina incorporata in SRF sono stati seguiti con un trattamento simile. Questi ioni e nolecole non sono stati rilasciati durante lo scambio ionico, ma sono stati immediatamente rilasciati dal trattamento osomtico. Pertanto, il rilascio di Ca\& durante lo scambio anionico non era dovuto allo scoppio di SR F, ma ad un effetto diretto come un cambiamento del potenziale di membrana della SRF. Il comportamento di anioni come C1- e propionato non può essere seguito con lo stesso metodo a causa della grande permeabilità di questi anioni. È stato anche dimostrato che il rilascio di Ca\& durante lo scambio ionico non era un effetto diretto del cambiamento di pH. I microsomi epatici non hanno mostrato rilascio di Ca\& con lo stesso trattamento di SRF.
Rilascio di calcio indotto dalla depolarizzazione dai frammenti del reticolo sarcoplasmatico. I. Rilascio di calcio assorbito dall'uso di ATP.Ca2\& assorbito dal reticolo sarcoplasmatico frammenti di membrana (SRF) dopo l'utilizzo di ATP potrebbero essere rilasciati rapidamente cambiando l'anione all'esterno delle vescicole da metansolfonato a cloruro. Si ritiene che questo scambio anionico abbia causato la depolarizzazione della membrana del reticolo sarcoplasmatico. Rilascio rapido simile di Ca2\& assorbito da SRF è stata causata anche da un cambiamento da alta a bassa pressione osmotica, probabilmente dovuto allo scoppio della membrana. Sulla base di esperimenti in cui sono stati discriminati questi due tipi di rilascio di Ca2\&, si è concluso che Ca2\& legato all'interno della membrana è stato rilasciato direttamente dallo scambio anionico (depolarizzazione). Tuttavia, il rilascio di Ca2\& non è stato causato dallo scambio di cationi. Il saccarosio ha inibito questi due tipi di rilascio di Ca2\&. Cia2\& ripreso in presenza di ossalato non può essere r liberato da qualsiasi trattamento utilizzato. La frazione del microsoma epatico ha anche attività di assorbimento di Ca2\&. Tuttavia, Ca2\& non è stato rilasciato per scambio anionico, ma è stato rilasciato per cambiamento osmotico. Questi risultati mostrano che il rilascio di Ca2\& da SRF in seguito a scambio anionico è specifico della membrana del reticolo sarcoplasmatico. In conclusione, la membrana SRF conserva la capacità di rispondere alla depolarizzazione causata dallo scambio ionico e può rilasciare il Ca2\& accumulato.
Studi sui perossisomi. VI. Relazione tra il nucleo perossisomiale e l'urato ossidasi.Il nucleo perossisomiale dal fegato dei ratti è stato purificato 450 volte come un marker dell'attività dell'urato ossidasi [EC 1.7.3.3. ] Questo preparato ha un'elevata attività specifica dell'urato ossidasi ma non di altri enzimi perossisomiali: D-amminoacido ossidasi [EC 1.4.3.3. ], L-alfa-idrossi acido ossidasi [EC 1.1.3.15], o catalasi [EC 1.11.1.6] Nessuna attività di enzimi marcatori per altre particelle subcellulari, citocromo c ossidasi [EC1.9.3.1] (mitocondri), fosfatasi acida [EC 3.1.3.2] ( lisosomi), o glucosio-6-fosfatasi [EC 3.1.3.9] (microsomi), è stato rilevato in questa preparazione. Il nucleo ottenuto ha mostrato una singola banda proteica in elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide e la posizione della banda è stata trovata a corrispondono a un peso molecolare 35.000. Quando il nucleo perossisomiale è stato sottoposto a trattamento a vari pH\' con tampone carbonato 0,1 M, urato ossida e era quasi completamente solubilizzato a pH 11,0, sebbene circa il 35% della proteina del nucleo rimanesse ancora nel pellet Dopo la solubilizzazione del nucleo a pH 11,0, l'attività specifica dell'urato ossidasi nel surnatante è aumentata di circa 1,6 volte; la densità della proteina insolubile rimanente nel pellet era identica a quella del nucleo originale sulla centrifugazione in gradiente di densità di saccarosio.
Polimerasi dell'acido desossiribonucleico dall'estremo termofilo Thermus aquaticus.Una polimerasi dell'acido desossiribonucleico (DNA) stabile (EC 2.7.7.7) con una temperatura ottimale di 80°C è stato purificato dall'estremo termofilo Thermus aquaticus. L'enzima è privo di fosfomonoesterasi, fosfodiesterasi e attività di esonucleasi a filamento singolo. L'attività massima dell'enzima richiede tutti e quattro i desossiribonucleotidi e il DNA del timo di vitello attivato. Un requisito assoluto per il cofattore cationico bivalente è stato soddisfatto da Mg2+ o in misura minore da Mn2+. I cationi monovalenti a concentrazioni fino a 0,1 M non hanno mostrato un effetto inibitorio significativo. Il pH ottimale era 8,0 in tampone tris(idrossimetil)amminometano-cloridrato. Il peso molecolare dell'enzima è stato stimato mediante centrifugazione in gradiente di saccarosio e filtrazioni su gel su Sephadex G-100 da circa 63.000 a 68.000. Il requisito di temperatura elevata, le dimensioni ridotte e la mancanza di attività nucleasica distinguono questa polimerasi dalla DNA polimerasi di Escherichia coli.
Attività dell'ornitina delta-transaminasi in Escherichia coli: sua identità con l'acetilornitina delta-transaminasi.Procedure sviluppate per la purificazione dell'acetilornitina delta- transaminasi da Escherichia coli W portano anche alla purificazione simultanea dell'ornitina delta-transaminasi. Queste due attività enzimatiche hanno la stessa mobilità elettroforetica e sono identiche immunochimicamente. Studi di cinetica di inibizione dimostrano che i due substrati, acetilornitina e ornitina, competono per lo stesso attivo sito dell'acetilornitina delta-transaminasi; quindi, l'attività dell'ornitina delta-transaminasi in E coli è dovuta all'acetilornitina delta-transaminasi e non a una specifica ornitina delta-transaminasi separata.
L'isolamento e la caratterizzazione della diidropteridina reduttasi da specie di Pseudomonas.La diidropteridina reduttasi isolata dal batterio Pseudomonas species (ATCC 11299a) è stata purificata circa 450 volte precipitazione con solfato di ammonio e procedure cromatografiche con dietilamminoetilcellulosa. La preparazione è pura almeno all'80% come giudicato dai gel di poliacrilammide. Il suo peso molecolare è stato determinato essere di circa 44.000. Sia l'attività della diidropteridina reduttasi che quella della fenilalanina idrossilasi sono risultate più elevate nelle cellule adattate a un terreno contenente L-fenilalanina o L-tirosina come unica fonte di carbonio rispetto a quelli coltivati in L-asparagina. Il substrato della reduttasi è la chinonoide diidropteridina e il prodotto è provvisoriamente identificato come tetraidropteridina per la sua capacità di fungere da cofattore per la fenilalanina idrossilasi. L'enzima non mostra una marcata specificità per il cofattore pteridina che si trova naturalmente in th è organismo, L-treo-neopterina. Il pH ottimale per la reduttasi è 7,2 e il cosubstrato preferito è la nicotinammide adenina dinucleotide, in forma ridotta. È stata osservata l'inibizione dell'enzima ridotto e non trattato da parte di diversi reagenti sulfidrilici. Non è stato possibile dimostrare un requisito di metallo per la reduttasi. La diidropteridina reduttasi è risultata inibita dall'aminopterina in modo competitivo rispetto alla forma chinonoide diidro della 2-ammino-4-idrossi-6,7-dimetil-5,6,7,8-tetraidropteridina.
Fattori che influenzano la crescita e la fissazione dell'azoto di Spirillum lipoferum.Spirillum lipoferum cresce vigorosamente su malato, succinato, lattato o piruvato, moderatamente su galattosio o acetato , e scarsamente su glucosio o citrato. Riduce 15N2. I tassi di riduzione dell'acetilene diminuiscono rapidamente quando il pH della coltura sale sopra 7,8. L'organismo è altamente aerobico e ha avuto tempi di raddoppio fino a 2 h quando coltivato su NH4+. Tuttavia, S. lipoferum riduce bene l'N2 solo in condizioni microaerofile. La pO2 ottimale per la riduzione dell'acetilene mediante colture stagnanti era compresa tra 0,006 e 0,02 atm a seconda della densità cellulare; le colture aerate sono cresciute bene alla concentrazione di O2 disciolto corrispondente a una pO2 di circa 0,008 atm. con l'aria inattiva temporaneamente la sua nitrogenasi, la riattivazione è inibita dal cloramfenicolo L'organismo ha assimilato da 20 a 24 mg di N/g di acido organico ossidato durante la crescita I ceppi studiati possono essere raggruppati in due gruppi basati su u sulla loro morfologia e caratteristiche fisiologiche.
Sintesi di acidi grassi omega-aliciclici da precursori ciclici in Bacillus subtilis.Un mutante di Bacillus subtilis sintetizza una varietà di acidi grassi omega-aliciclici quando alimentati con i rispettivi acidi carbossilici aliciclici. Questi acidi grassi sono: acidi grassi omega-ciclopropano, omega-ciclobutano, omega-ciclopentano, omega-cicloesano e omega-cicloesene. Questi acidi grassi insoliti non hanno portato a un'inibizione della crescita a 37 gradi C e pH 7. Il vantaggio selettivo di questi acidi grassi in condizioni estrene è stato studiato rispetto al batterio acidofilo e termofilo B. acidocaldarius, che normalmente contiene un'elevata percentuale di acidi grassi omega-cicloesano.
Caratterizzazione dei sistemi di trasporto di L-asparagina in Stemphylium botryosum.L'assorbimento di L-asparagina da parte di Stemphylium botryosum è mediato da due distinti dipendenti dall'energia e dalla temperatura sistemi di trasporto Una permeasi è relativamente specifica per L-asparagina e L-glutammina ed è presente nel micelio sufficiente per i nutrienti. La permeasi specifica mostra un pH ottimale a 5,2, cinetica di saturazione (Km = 4,4 x 10(-4) M, Vmax = 1,1 mumol/g per min), gradiente competitivo di L-asparagina e maggiore affinità verso l'isomero L di asparagina Derivati ammidici di L-asparagina (5-diazo-4-oxo-L-norvaline o L- aspartil idrossammato) sono i concorrenti più efficaci, l'alfa-ammino derivato (N-acetil asparagina) è un moderato concorrente e l'alfa-carbossil derivato (L-asparagina-t-butilester) mostra solo una leggera inibizione della permeasi specifica. -glutammina sono concorrenti significativamente meno efficaci di quelli della L-aspartina della permeasi specifica è influenzata dalle fonti di azoto e aumenta di circa tre volte dopo la fame. La permeasi non specifica possiede un pH ottimale a 6,8, cinetica di saturazione (Km = 7 x 10(-5) M, Vmax = 5 mumol/g per min, Kt = 7,4 x 10(-5) M per L-leucina ), e un'elevata affinità verso vari tipi di amminoacidi.
Enzimi costitutivi e repressivi della via comune della biosintesi aromatica in Escherichia coli K-12: regolazione della sintesi enzimatica a differenti velocità di crescita.Sintesi di cinque degli enzimi della via comune della biosintesi aromatica hanno dimostrato di non essere influenzati né dagli amminoacidi aromatici - il prodotto della prima reazione (acido 3-desossi-D-arabinoeptulosonico-7-fosfato) o dal prodotto del ultima reazione (corismato)--o dallo stato della località del gene regolatore R. D'altra parte, la velocità di sintesi di questi enzimi, e di molti altri enzimi per i quali il controllo della repressione era inattivo a causa di mutazioni nei geni regolatori rilevanti, era si è scoperto che cambiano con il tasso di crescita. È stato scoperto che questi cambiamenti sono correlati a tassi di crescita più rapidi di quelli osservati nel mezzo minimo di glucosio con le alterazioni nelle frequenze relative dei corrispondenti geni strutturali che si verificano a questi tassi di crescita. Si è scoperto che quando cellule wild-type sono state coltivate a questi tassi di crescita più rapidi in un mezzo privo di aminoacidi aromatici, si è verificata una completa derepressione della 3-desossi-D-arabinoeptulosonico acido-7-fosfato sintetasi, in forte contrasto con la situazione in cui le cellule di tipo sono cresciute in un mezzo minimo di glucosio.
Influenza degli aminoacidi sulla crescita di Bacteroides melaninogenicus.L'aggiunta di singoli aminoacidi a un terreno di Trypticase-estratto di lievito-emina ha influenzato i tassi di crescita e rese finali di un ceppo asaccarolitico e di un ceppo saccarolitico di Bacteroides melaninogenicus. L-aspartato o L-asparagina hanno prodotto il massimo miglioramento della crescita per entrambi i ceppi. L-[14C]aspartato è stato fermentato da cellule a riposo del ceppo asaccarolitico. L-cisteina o L -serina ha anche migliorato la crescita per il ceppo saccarolitico. Tuttavia, la crescita del ceppo saccarolitico è stata inibita da L-lisina, L-glutammato, L-glutammina, L-isoleucina, L-leucina e L-prolina; crescita del ceppo asaccarolitico è stato inibito da DL-valina e L-serina. Entrambi i ceppi sono stati inibiti da L-istidina, DL-metionina, L-triptofano, L-arginina e glicina.
Purificazione delle proprietà della diidroorotasi, un metalloenzima contenente zinco in Clostridium oroticum.Diidroorotasi +4,5-L-diidro-orotato amidoidrolasi [EC 3.5.2.3]), che catalizza la ciclizzazione reversibile di N-carbamil-L-aspartato a L-diidroorotato, è stato purificato da Clostridium oroticum coltivato con orotato. L'enzima è omogeneo quando sottoposto a elettroforesi su gel di poliacrilammide ed è stabile a pH 7,6 in 0,3 M NaCl contenente 10 muM ZnSO4. L'enzima ha un peso molecolare di circa 110.000. L'elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato, utilizzando tre diversi sistemi tampone, ha indicato che l'enzima è composto da due subunità, ciascuna avente un peso molecolare di 55.000. La diidroorotasi è dimostrato dalla spettroscopia di assorbimento atomico essere un metalloenzima contenente zinco con 4 g-atomi di zinco per 110.000 g di proteina Il pH ottimale per la conversione di N-carbamil-L-aspartato in L-diidroorotato e per L-diidroorotato in N -carbamil-L-as il partato sono pH 6.0 e 8.2, rispettivamente. I valori di Km per N-carbamil-L-aspartato e per L-diidroorotato sono rispettivamente 0,13 e 0,07 mM. Gli studi sugli inibitori indicano che lo zinco può essere coinvolto nell'attività catalitica dell'enzima.
Studi che legano l'acido desossiribonucleico sul repressore di capanna e sulle forme mutanti del repressore di capanna di Salmonella typhimurium.In Salmonella typhimurium i geni che codificano per gli enzimi di utilizzo dell'istidina (hut) sono raggruppati in due operoni adiacenti, hutMIGC e hut(P,R,Q)UH. Un singolo repressore, il prodotto del gene C, regola entrambi gli operoni legandosi a due siti operatore, uno vicino a M e uno in (P,R,Q). L'attività di legame dell'acido desossiribonucleico (DNA) del repressore è stata misurata utilizzando DNA\' contenenti operatori separati. Il repressore ha avuto una maggiore attività quando analizzato utilizzando DNA contenente l'operatore del (P,R ,Q)UH operone rispetto a quando è stato analizzato utilizzando DNA contenente l'operatore dell'operone MIGC. Il legame a entrambi gli operatori era assente in presenza dell'induttore, urocanato. Le attività di legame al DNA sono state determinate anche per due super-repressori. Il super -i repressori avevano proprietà di legame al DNA alterate, sebbene l'autoregolato la natura dei repressori ha complicato l'analisi dei risultati. Viene presentata una procedura di purificazione per il repressore wild-type. Il repressore purificato era alquanto instabile e non sono stati eseguiti ulteriori esperimenti utilizzandolo.
Caratteristiche e fabbisogno energetico di un sistema di trasporto di acido alfa-aminoisobutirrico in Streptococcus lactis.Cellule di Streptococcus lactis coltivate con galattosio ML3 accumulate di acido alfa-aminoisobutirrico (AIB) utilizzando l'energia derivata dalla glicolisi e dal catabolismo dell'arginina. Il sistema di trasporto ha mostrato una cinetica di saturazione di Michaelis-Menten a bassa affinità. Utilizzando galattosio o arginina come fonti di energia, sono stati ottenuti valori simili di V max e K m per l'ingresso di AIB, ma su incubazione la concentrazione intracellulare di AIB allo stato stazionario nelle cellule che metabolizzano l'arginina era solo del 65-70% rispetto a quella raggiunta dalle cellule glicolizzanti. L'efflusso di AIB DA CELLULE PRECARICATE era dipendente dalla temperatura e mostrava le caratteristiche di una reazione di primo ordine. La velocità di uscita dell'AIB è stato accelerato da due a tre volte in presenza di fonti di energia metabolizzabili Inibitori metabolici inclusi p-cloromercuribenzoato, dinitrofenolo, azide, arsentato e N, N\'-diciclo l'esilcarbodiimmide ha impedito o notevolmente ridotto l'assorbimento di AIB. Fluoro, iodoacetato e N-etilmaleimmide hanno abolito l'assorbimento di AIB dipendente dal galattosio, ma non energizzato dall'arginina. K+ e Rb+ hanno ridotto la concentrazione di AIB intracellulare allo stato stazionario di circa il 40% e questi cationi hanno anche indotto un rapido efflusso di soluto dalle cellule che trasportano attivamente. Le concentrazioni equivalenti (10 mM) di Na+, Li+ o NH4+ erano molto meno inibitorie. Gli ionofori conduttori di protoni tetraclorosalicilanilide e carbonilcianuro m-clorofenliidrazone hanno abolito l'assorbimento e indotto l'efflusso di AIB anche se la glicolisi e il catabolismo dell'arginina sono continuati rispettivamente al 60 e al 140% dei tassi di controllo. Una forza protonica è molto probabilmente coinvolta nel trasporto attivo dell'AIB, mentre i dati degli studi sull'efflusso suggeriscono che l'energia è accoppiata all'uscita dell'AIB nelle cellule di S. lactis ML3.
Controllo della respirazione nell'uremia: risposta ventilatoria alla CO2 dopo emodialisi.I meccanismi responsabili dell'alcalosi respiratoria transitoria che segue l'emodialisi clinica sono stati valutati studiando la risposta ventilatoria all'anidride carbonica nei pazienti uremici cronici e nelle capre uremiche normali e croniche non anestetizzate Un aumento significativo della sensibilità alla CO2 è stato riscontrato nei pazienti uremici acidosi immediatamente (entro 30 min) dopo l'emodialisi (P inferiore a 0,01). La CO2 è tornata al valore di predialisi entro 24 ore. Il volume polmonare e la capacità respiratoria massima sono rimasti invariati. Un simile aumento della sensibilità alla CO2 è stato osservato nelle capre uremiche non acidotiche dopo l'emodialisi. Nelle capre, questi cambiamenti nella sensibilità non possono essere spiegati da cambiamenti nella stato acido-base del liquido cerebrospinale L'aggiunta di urea sufficiente al dializzato per prevenire una caduta della concentrazione plasmatica di urea, ha eliminato questo aumento della sensibilità alla CO2 sia nei pazienti uremici che nelle capre. Questi risultati suggeriscono che l'alcalosi respiratoria transitoria dopo l'emodialisi è dovuta ad un aumento della sensibilità della risposta ventilatoria all'anidride carbonica ed è una conseguenza dello squilibrio osmotico indotto dalla dialisi.
Adattamenti respiratori nei roditori tascabili scavatori dal livello del mare e dall'alta quota.Per esaminare gli adattamenti a basso O2 e ad alto CO2 tra roditori fossori e non fossori, i parametri ematologici sono stati determinati per i ratti di laboratorio, il gopher tascabile di valle (Thomomys bottae) da 250 m e il gopher tascabile di montagna (T. umbrinus melanotis) da 3150 m. L'ematocrito, la concentrazione di emoglobina e la capacità di O2 erano più alti nei gopher tascabili rispetto ai ratti. La PO2 nel sangue al 50% di saturazione e pH 7,4 era 33 mmHg per entrambi i gopher e 39 mmHg per i ratti. I fattori di Bohr per tutti e tre i roditori erano simili (da -0,55 a -0,61) ma il valore del tampone, delta log PCO2/delta pH, era -2,54 per T. umbrinus, -1,97 per T. bottae e -0,98 per Rattus. Le concentrazioni di fosfati solubili in acido totali erano del 50-75% superiori nei roditori rispetto ai ratti, mentre i valori di bicarbonato rientravano nella gamma normale dei mammiferi. tre roditori avevano concentrazioni di mioglobina simili nel muscolo cardiaco le concentrazioni di globina erano significativamente più elevate nei muscoli scheletrici (diaframma, gastrocnemio) di T. umbrinus rispetto a T. bottae e significativamente più elevate in entrambi i roditori rispetto ai ratti. Queste differenze possono costituire importanti adattamenti all'ipossia e all'ipercapnia nelle tane; alcuni di questi fattori nei roditori tascabili rispondono allo stress aggiuntivo dell'ipossia ad alta quota.
Punti propagati e secrezione in un epitelio ghiandolare celenterato.La rete mirabile di Ippopodi (Cl. Hydrozoa, O. Siphonophora) è un lenzuolo di gigante cellule endodermiche penetrate da rami del canale radiale ventrale. Le cellule sembrano essere altamente poliploidi. L'ER ruvido è molto ricco e cisterne ER espanse contenenti materiale amorfo (presumibilmente proteine sintetizzate) sono osservate vicino alla superficie cellulare esterna. Le cellule sono elettricamente accoppiati e sono collegati da giunzioni gap. La rete è eccitabile elettricamente e si osserva la conduzione da cellula a cellula di potenziali d'azione a 10 cm/s. I potenziali d'azione sono tutti o nessuno, eventi ad andamento positivo, che mostrano ampiezze di circa 70 mV e derivanti da un potenziale di riposo di 44 mV. Si osservano anche depolarizzazioni secondarie che si sviluppano e decadono lentamente, in grado di sommarsi al livello di 20 mV. Dopo il passaggio di un treno di impulsi, le cellule della rete si rigonfiano e compaiono gocce di secrezione superficie, questi cambiamenti diventano evidenti in pochi secondi. In 15 mM Mn2+ la risposta non si verifica e non si osservano depolarizzazioni secondarie ("potenziali di secrezione"). La propagazione del picco non è influenzata. Nelle soluzioni senza Na+ i picchi sono ridotti e la propagazione alla fine fallisce. Si suggerisce che i picchi siano eventi sodio-dipendenti che innescano un processo secretorio calcio-dipendente. La composizione e l'attività biologica della secrezione sono incerte, ma prove indirette suggeriscono un possibile ruolo difensivo o repellente per la risposta.
N-actylation selettiva di antibiotici gentamicina-sintesi di derivati 1-N-acil.Trattamento di sali di addizione acida di antibiotici aminoglicoside-aminociclitolo del classe gentamicina-sisomicina, con un equivalente di trietilammina e un agente acilante determina la formazione selettiva di 1-N-acil derivati, in contrasto con l'acilazione delle basi libere antibiotiche che determina l'acilazione preferenziale di altri centri basici nella molecola. Vengono discusse le origini della selettività osservata e vengono riportate le attività antibatteriche in vitro di diversi nuovi derivati 1-N-aci1 di gentamicina, sisomicina e verdamicina.
Attività inibitoria del piridindololo sulla beta-galattosidasi.È stata studiata l'attività del piridindololo nell'inibire le beta-galattosidasi ottenute da varie fonti. Considerando che bovino acido la beta-galattosidasi epatica (pH ottimale 4,0) non è stata influenzata da questo composto, la beta-galattosidasi neutra del fegato bovino (pH ottimale = 7,0) è stata inibita dal piridindololo in miscele di reazione di pH 4,0 circa 5,0. Non c'è stata inibizione a pH 7,0 Il tipo di inibizione è non competitivo per formazione di un complesso piridindololo-enzima Poiché le beta-galattosidasi di altre fonti non sono influenzate dal piridindololo, l'azione inibitoria di questo composto sembra essere piuttosto specifica per la beta-galattosidasi neutra del fegato bovino.
Gestione del protocollo delle infezioni genito-urinarie maschili.Come parte di uno studio dimostrativo, 567 pazienti di sesso maschile si sono presentati in una clinica "walk-in" con i disturbi genito-urinari comuni sono stati intervistati da assistenti sanitari guidati da un protocollo. L'esame indipendente di 19 pazienti da parte di un assistente sanitario e di un medico ha dimostrato formalmente che gli assistenti sanitari erano in grado di raccogliere i dati clinici in modo accurato. Quarantaquattro pazienti sono stati quindi scelti a caso per essere esaminati, diagnosticata e curata da un assistente sanitario guidato dal protocollo e supportato da un medico disponibile, o solo da un medico. Utilizzando cartelle cliniche e un colloquio di follow-up, abbiamo valutato la completezza della cartella clinica, l'adeguatezza della diagnosi e del trattamento, sollievo dai sintomi, soddisfazione del paziente ed educazione del paziente: il sistema di protocollo dell'assistente sanitario si è dimostrato sicuro ed efficace quanto il sistema solo MD e gli assistenti sanitari sono stati in grado di gestire il 68% dei pazienti senza ut coinvolgendo il medico. Lo studio suggerisce che assistenti sanitari formati brevemente possono aiutare a risparmiare tempo a medici e infermieri e che lo sviluppo di protocolli può aiutare a stabilire standard per la gestione medica di problemi definiti fornendo al contempo un meccanismo per creare rapidamente una cartella clinica completa che può essere facilmente verificata per la conformità agli standard.
Misurazione citochimica quantitativa dell'attività della gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi.È stato sviluppato un sistema per la misurazione quantitativa dell'attività della gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi nei tessuti Un ostacolo allo studio istochimico di questo enzima è stato il fatto che il substrato, la gliceraldeide 3-fosfato, è molto instabile. Nel presente sistema un composto stabile, il fruttosio 1,6-difosfato, viene utilizzato come substrato primario e la dimostrazione dell'attività della gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi dipende dalla conversione di questo composto nel substrato specifico da parte dell'aldolasi presente nel tessuto. Le caratteristiche dell'attività deidrogenasica derivanti dall'aggiunta di fruttosio 1,6-difosfato, assomigliano molto a quelle proprietà note della gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi L'uso di alcol polivinilico nel mezzo di reazione impedisce il rilascio di enzimi dalle sezioni, come avviene in un media acquosi. Sebbene in questo studio l'attività intrinseca dell'aldolasi sia risultata adeguata per la rapida conversione del fruttosio 1, 6-difosfato nel substrato specifico per la deidrogenasi, l'uso dell'aldolasi esogena può essere di particolare vantaggio nella valutazione dell'intergrità dell'enzima Embden-Meyerhof percorso.
[Localizzazione ultrastrutturale delle attività della fosfatasi acida e della tiamina pirofosfatasi e della colorazione fosfotungstica a pH basso nel labirinto placentare del gatto].Le localizzazioni di L'attività della fosfatasi acida (ACPasi) e della tiamina pirofosfatasi (TPPasi) è stata studiata nel labirinto placentare del gatto durante gli ultimi giorni di gestazione. L'attività dell'ACPasi è stata osservata essenzialmente nel sinciziotrofoblasto e nella "sostanza inerte interstiziale" (SII) che separa i tessuti materni da quelli fetali Il prodotto della reazione era localizzato nei lisosomi, nei corpi multivescicolari e nella rete di tubuli a membrana liscia che si aprono sulla superficie cellulare del sinciziotrofoblasto rivolto verso il SII I SII mostrano una forte attività, probabilmente di origine sinciziotrofoblastica. attività sono state trovate nel sinciziotrofoblasto, raramente nell'apparato del Golgi ma sempre nel lume della rete di tubuli a membrana liscia. era un'attività moderata. Questi tubuli TPPasi positivi essendo frequentemente osservati molto vicino alle cisterne del Golgi, si propone che derivino dal complesso del Golgi e convogliano le fosfatasi al S. I. I. Dopo la colorazione con acido fosfotungstico a pH basso, il rivestimento superficiale luminale dell'endotelio materno è sempre fortemente e continuamente visualizzato, mentre la membrana plasmatica del sinciziotrofoblasto rivolta verso il S. I. I. non è mai macchiato. La colorazione è intensa nel lume dei tubuli e continua con la colorazione del S. I. I. ACPasi attività del S. I. I. potrebbe essere implicato nella degradazione enzimatica delle molecole materne durante il loro trasferimento dal sangue materno a quello fetale. Il S. I. I. può corrispondere alla zona tampone immunologica all'interfaccia tra i tessuti materni e fetali.
Uno studio microspettrofluorometrico preliminare sulla riduzione del NAD(P) in singole cellule viventi trattate con dibenzo(a,e).L'aumento della fluorescenza, dovuto alla riduzione del NAD(P), dopo iniezione microelettroforetica di glucosio 6-P (G6P) in cellule viventi singole EL2 e NCTC 8739 trattate con diBenzo(ae)Fluorantene (diB(ae)F) e non trattate, è stato studiato con un microspettrofluorimetro rapido. Questo studio mostra la maggiore capacità delle cellule trattate di utilizzare dosi maggiori (6-10 volte di più) di G6P rispetto alle cellule di controllo. L'andamento temporale del ritorno al livello iniziale di fluorescenza è essenzialmente correlato all'entità della dose di iniezione Ci sono alterazioni (es. rosso \& spostamento verso il blu) nello spettro di fluorescenza delle cellule trattate con diB(ae)F prima dell'iniezione e nello spettro di aumento dopo l'iniezione di G6P, rispetto agli stessi spettri nel diB(ae)F -cellule non trattate Questo è discusso in riferimento alla metabolizzazione di diB(ae)F as una via alternativa per la riossidazione di NAD(P)H.
Studi sulla tossicità acuta di mezzi di contrasto ionici e non ionici a seguito di iniezione endovenosa rapida. Uno studio sperimentale sui topi.L'influenza dell'iniezione è stato studiato il tasso di tossicità endovenosa acuta (LD50) sui topi del mezzo di contrasto ionico ad alta osmosi Isopaque Coronar (370 mg I/ml) e Amipaque non ionico a bassa osmosi (370 mg I/ml). ml/sec). Amipaque aveva una LD50 significativamente più alta di Isopaque Coronar (17,3 rispettivamente 9,8 gm I/kg). Anche a iniezione rapida (2 ml/10 sec). Amipaque era significativamente meno tossico di Isopaque Coronar (13,4 rispettivamente 6,1 g I /kg). Quindi Isopaque Coronar ha aumentato di circa il 60% la tossicità mentre Amipaque è aumentato del 28% quando la velocità di iniezione è stata aumentata. Questa differenza era statisticamente significativa (p inferiore a 0,001). Diversi possibili meccanismi che potrebbero spiegare questa differenza, con particolare interesse nei disturbi sulla circolazione polmonare fo vengono discusse le possibilità di iniezione di mezzi di contrasto.
Interpretazione e applicazioni degli spettri di differenza termica delle proteine.La tecnica della spettroscopia della differenza di perturbazione termica per l'esame dei cromofori nelle proteine è stata impostata su un livello più accettabile fondamenti teorici e sperimentali. (i) Le origini dell'effetto termico sono state analizzate per spiegare i cambiamenti nella larghezza di banda spettrale e nella lunghezza d'onda per cromofori semplici in vari solventi. Il confronto con le curve teoriche mostra che l'effetto del riscaldamento delle soluzioni cromoforiche è principalmente accoppiato all'allargamento spettrale con uno spostamento verso il blu quasi trascurabile. Il comportamento apparentemente anomalo del triptofano e della tirosina in solventi acquosi, dove l'effetto principale è uno spostamento verso il rosso per riscaldamento, è riconducibile al legame idrogeno con l'acqua. Un modello in cui la tirosina agisce contemporaneamente come donatore di H ( Tipo I) e H-accettore (Tipo II) e il secondo è il più sensibile alla temperatura, riesce a spiegare tutti i dati disponibili per una varietà di soluti der ivativi e solventi. (ii) Il contributo dei cromofori all'interno della proteina è stato valutato utilizzando film di alcol polivinilico di diverso contenuto di acqua. I modelli simulano la rigidità e la bassa espansività termica dell'interno della proteina e confermano che i cromofori sepolti contribuiscono in modo trascurabile se non del tutto agli spettri di differenza termica. (iii) Le procedure di adattamento della curva sono state utilizzate per abbinare gli spettri di differenza proteica su un intervallo di lunghezze d'onda, a quelli per le miscele di modelli, piuttosto che fare affidamento come finora sui dati misurati agli estremi.
La dipendenza dal pH del legame dell'acido alfa,alfa\'-dibromo-p-xilenesolfonico al lisozima.La modificazione chimica del lisozima (I) è stato realizzato con acido alfa, alfa\'-dibromo-p-xilenesolfonico (DBX) a cinque diversi valori di pH. Sono stato alchilato da DBX a temperatura ambiente (28 gradi C) con diminuzione dell'attività enzimatica. Il tasso di inattivazione dipendeva da il pH al quale è stata effettuata l'alchilazione. La velocità massima è stata osservata a valori di pH alcalini, la più bassa a valori di pH più acidi. Le analisi degli amminoacidi hanno mostrato che - due lisine e due residui di triptofano erano stati modificati a pH 9; due lisina, uno triptofano e una metionina avevano reagito a pH 8. Un residuo di istidina è stato legato a pH 6.5 insieme ad un residuo di triptofano. Ai valori di pH inferiori (2.7, 4.5, 6.5), si è verificata l'alchilazione con un singolo residuo di triptofano ciascuno. Dati di fluorescenza e CD entrambi hanno escluso la partecipazione dei triptofani 62 o 108. Gli esperimenti di etichettatura hanno mostrato che a due residui di DBX-35S sono stati legati per molecola di I sia a pH9 che a pH8; un residuo di DBX è stato legato per molecola di I agli altri valori di pH. I coefficienti di sedimentazione erano caratteristici del lisozima nativo. La stechiometria del legame e della modifica dei residui ha indicato che sono stati stabiliti legami incrociati intramolecolari. La dipendenza dal pH della reticolazione fornisce mezzi per misurare diverse distanze intramolecolari consentite. I risultati qui presentati sono coerenti con l'esistenza del movimento della catena laterale nel lisozima.
Studio quantitativo della spermatogenesi in topi vasectomizzati.Topi adulti sono stati vasectomizzati in condizioni semi-sterili ed esaminati cinque settimane dopo. Il peso dell'epididimo era aumentato ma nessuno degli animali aveva sviluppato granulomi spermatici. La vasectomia non ha alterato la concentrazione di testosterone nel plasma, il peso corporeo e il peso dei testicoli. Sezioni trasversali dei testicoli sono state preparate per l'esame istologico e i nuclei dei vari tipi di cellule germinali sono stati enumerati allo stadio VII della spermatogenesi. La vasectomia ha causato una piccola, ma statisticamente significativa, diminuzione del numero di spermatociti preleptotene, spermatociti pachitene e spermatidi passaggio 7.
Un nuovo modello per l'autoimmunità antisperma nei porcellini d'India.I porcellini d'India maschi adulti sono stati autoimmunizzati senza adiuvante. Gli omogenati sono stati preparati con uno dei loro testicoli precedentemente sottoposti a lesioni termiche "in vivo" e "in vitro". Gli animali hanno ricevuto un'iniezione intradermica ripetuta singola o giornaliera senza aggiunta di adiuvante, in uno o più siti cutanei. Porcellini d'India sensibilizzati quotidianamente nello stesso sito per 30 giorni hanno mostrato la presenza di: a) granuloma dermico nel sito di iniezione; b) numerosi focolai di tipica orchite allergica; c) ipersensibilità ritardata rilevata mediante inibizione della migrazione dei macrofagi; d) titoli moderati di spermagglutinine e livelli trascurabili di anticorpi emoagglutinanti. Porcellini d'India ricevendo una singola dose in un sito solo sviluppato ipersensibilità ritardata. Animali sensibilizzati giornalmente con la stessa dose di antigene alterato in siti diversi, o con antigene testicolare normale in uno o diversi siti, hanno mostrato negat cinque risultati. Viene discussa la correlazione tra lesione testicolare, granuloma dermico e immunità cellulare. Si conclude che l'autosensibilizzazione del testicolo si ottiene in assenza di adiuvante aggiunto a condizione che una gonade termicamente danneggiata utilizzata come antigene sia iniettata ripetutamente nello stesso sito.
Fosfatasi alcalina, arilsulfatasi e beta-glucuronidasi nella saliva delle donne cicliche.I livelli degli enzimi fosfatasi alcalina, arilsulfatasi e beta-glucuronidasi sono stati misurato in campioni di saliva intera non stimolata raccolti giornalmente durante i normali cicli mestruali. Il contenuto cellulare della saliva ha dimostrato di essere una delle principali fonti dei tre enzimi. Gli enzimi sono risultati avere livelli massimi di attività durante la fase periovulatoria del ciclo. Questa osservazione può essere attribuita alla presenza di un aumento del numero di cellule esfoliate dalla mucosa orale derivanti dallo stimolo estrogeno pre-ovulatorio alla proliferazione cellulare.
Risposta ipofisaria e testicolare all'ormone di rilascio dell'LH ipotalamico (LH-RH) in uomini normali e oligospermici.È stato effettuato uno studio comparativo del basale e livelli post-stimolazione LH-RH di LH, FSH e Testosterone (T) in 10 volontari sani di sesso maschile, di età compresa tra 24-35 anni, e in 25 uomini oligospermici normogonadotropi di età compresa tra 23 e 43 anni nei quali altri soggetti endocrini, urologici e/o malattie vascolari erano state escluse. Diciassette di quest'ultimo gruppo sono stati sottoposti a biopsia testicolare bilaterale. Ogni soggetto ha ricevuto un'iniezione endovenosa rapida di 50 tazze di LH-RH sintetico alle 8:00 AM I livelli sierici di LH, FSH e T sono stati determinati mediante dosaggio radioimmunologico su campioni ottenuti immediatamente prima e 30 e 45 minuti dopo l'iniezione. Rispetto ai normali, gli uomini oligospermici avevano una risposta LH media inferiore, sebbene i valori basali non differissero significativamente dal normale. I livelli di FSH non differivano significativamente tra i gruppi, sebbene alcuni singoli pazienti mostrassero valori più elevati e un po' basso er rispetto ai valori normali. È stata confermata la possibilità di stimolare la secrezione di T con LH-RH. I livelli sierici medi di T sono aumentati più lentamente e hanno raggiunto livelli più bassi negli uomini oligospermici rispetto agli uomini normali. Non c'era correlazione tra l'aumento di LH e FSH. Si ipotizza che alcuni pazienti con oligospermia normogonadotropa possano avere un'insufficienza latente della riserva funzionale gonadotropica ipofisaria per uno o entrambi gli ormoni e/o della funzione delle cellule di Leydig. Viene commentata la necessità di un'analisi individuale dei risultati e la loro correlazione con i risultati della biopsia testicolare.
Fattori immunologici e test post-coitale nell'infertilità inspiegata.Ventiquattro coppie affette da infertilità primaria o secondaria di lunga data sono state sottoposte ad analisi del seme, PCT, valutazione funzionale di ciclo mestruale, isterosalpingografia e laparscopia. Tutti i risultati clinici erano normali ad eccezione della PCT che era positiva in 13 e negativa in 11. Tutte le donne sono state sottoposte a un approccio multiplo di indagine sulla produzione di anticorpi locali e circolanti e sull'immunità cellulo-mediata contro la vita spermatozoi Test di immobilizzazione spermatica (SIT) e test di spermatotossicità (STT) sono stati eseguiti in un unico disegno sperimentale su muco cervicale e siero sanguigno. Test di inibizione della migrazione leucocitaria in presenza di spermatozoi (LMIT) è stato eseguito su leucociti periferici Attività antispermatica locale nel il muco cervicale era negativo in tutti i casi positivi al PCT e positivo in sei casi negativi al PCT su 11. SIT e STT erano entrambi positivi nel muco cervicale a nd nel sangue in un solo caso. Non è stata trovata alcuna correlazione tra PCT e SIT sierica, STT o LMIT. Il pattern di fertilità espresso dal numero di gravidanze per anni di esposizione, già basso nell'intero gruppo, era ancora più basso nei sottogruppi con fattori immunologici positivi. I fattori immunologici positivi non escludono la possibilità di concepimento, ma sembrano essere associati a un tasso ridotto di concepimento.
L'effetto delle prostaglandine F1 alfa e F2 alfa sulla spermatogenesi.L'effetto delle prostaglandine F1 alfa e F2 alfa sulla spermatogenesi nel topo maschio maturo La somministrazione di prostaglandine F1 alfa e F2 alfa per via sottocutanea alla dose di 3 mg/kg una volta al giorno per 15 giorni ha prodotto una marcata diminuzione della spermatogenesi principalmente durante la fase meiotica, come riflesso da una significativa diminuzione degli spermatidi allo stadio 7 rispetto ai controlli. PGF2 alfa ha prodotto una soppressione più forte rispetto a PGF1 alfa. Anche i pesi delle ghiandole riproduttive accessorie sembravano essere ridotti dalle prostaglandine, sebbene non in modo coerente. L'esame istopatologico ha rivelato un aumento del numero di cellule germinali immature esfoliate nei tubuli seminiferi e nell'epididimo delle prostaglandine trattate Quando l'effetto di PGF1 alfa e PGF2 alfa sono stati confrontati con quelli di PGE1 e PGE2 è stato riscontrato che PGE2 ha prodotto il più forte suppressi on, con PGF2 alpha, PGE1 e PGF1 che seguono rispettivamente in ordine decrescente.
Distribuzione e rimozione dell'acrosina degli spermatozoi di toro.Gli effetti di Hyamine 2389, Triton X-100, Nadesossicolato, acido acetico e KCl ipertonico e MgCl2, nonché congelamento, scongelamento e sonicazione sono stati studiati sulla solubilizzazione dell'acrosina da spermatozoi di toro lavati, da spermatozoi pretrattati con iamina (privo di cellula e membrana acrosomiale esterna e di materiale acrosomiale) e da cappucci e vescicole acrosomiali isolati. sono stati osservati. Hyamine, Triton, KCl e acido acetico hanno efficacemente solubilizzato l'acrosina da interi spermatozoi, ma MgCl2 ha avuto un effetto scarso. La membrana acrosomiale esterna e il materiale acrosomiale estratto da Hyamine contenevano circa il 35-40% dell'attività totale dell'acrosina e tre quarti di esso era solubile Il resto dell'acrosina situata nella membrana acrosomiale interna o nel segmento equatoriale è stato estratto meglio da KCl ipertonico e MgCl2, ma i detergenti erano inefficaci in questo caso indican g che l'acrosina è legata in modo diverso alle parti esterna e interna dell'acrosoma. L'effetto opposto di MgCl2 sulle attività di acrosina estratte da queste due parti potrebbe anche essere un suggerimento di molteplici forme di acrosina. L'aumento dell'attività totale dell'acrosina durante il trattamento con Hyamine indica che l'acrosina è parzialmente in forma inattiva. sia per ingombro sterico, complesso inibitore dell'esistenza di una proacrosina.
Caso clinico: sterilità dovuta all'autoagglutinazione dello sperma.L'autoagglutinazione nel liquido seminale dei mariti in tre coppie sterili inspiegabili è stata trovata nell'analisi di routine dello sperma. Inoltre l'esplorazione ha mostrato che i sieri e il liquido seminale di questi mariti agglutinano lo sperma di donatori\', mentre le loro mogli\' sieri no. I test post-coitale non erano significativi. Dopo il fallimento del trattamento conservativo con vitamina C, due coppie hanno accettato di AIUTARE seguite prontamente da gravidanze e parti. Viene discussa la possibile connessione tra sterilità e autoagglutinazione spermatica, sottolineando la giustificazione per guardare a questi fenomeni più attentamente e con più attenzione.
L'effetto delle gondadotropine esogene sul periodo preimpianto nel ratto.E' ben stabilito che l'impianto di uova nel ratto dipende da un aumento della secrezione di gonadotropine il giorno 4 di gravidanza. I presenti esperimenti sono stati progettati per dimostrare il possibile effetto della somministrazione esogena di gonadotropine durante il periodo preimpianto in ratti pseudogravidanza, resi gravidi dopo il trasferimento di uova. Gruppi di ratti pseudogravidanza mediante accoppiamento sterile sono state iniettate diverse dosi di LH e FSH, tra le 9:00 e le 12:00 del giorno 4 di pseudogravidanza; le blastocisti sono state trasferite su di esse la mattina del giorno 6, invece del giorno 5. Il tasso di impianto e il numero di giovani nati a termine sono stati i criteri del riuscito allungamento del periodo sensibile dell'endometrio da parte delle gonadotropine esogene Dai risultati ottenuti si può concludere che il solo LH agisce sulla sensibilità uterina per estensione dell'impianto periodo ionico.
Effetto anti-fertilità reversibile dovuto a bobine di rame oviduttali non occludenti nel coniglio.Posizionamento di due bobine di rame (Cu) da 1 cm intorno alla metà -regione di ciascun ovidotto in un gruppo di cinque conigli femmine con comprovata fertilità, 34 giorni prima dell'accoppiamento, ha praticamente impedito l'impianto fetale in questi animali. Gli ovidotti sono rimasti pervi durante un periodo di impianto di 47 giorni e dopo la rimozione delle bobine di Cu, riaccoppiata è rimasta incinta. In due di questi esemplari è stato osservato un tasso di impianto (feti vivi/corpo lutei) del 33% (7/21) e una femmina post-impianto di Cu ha avuto una cucciolata di 2. Tra quattro femmine portatrici di una singola bobina di Cu sul loro ovidotto sinistro per 28 giorni prima dell'accoppiamento si è verificato un impianto del 19% (4/21) del lato sinistro e del 56,3% (9/16) del lato destro non trattato, suggerendo un'azione locale da parte del metallo. I risultati indicano che Cu è un efficace agente antifertilità quando impiantato intorno agli ovidotti e, come corollario, è evidente che il metallo non è limitato al posizionamento nell'utero per prevenire la gravidanza nei conigli. I dispositivi contenenti Cu non occlusivi possono offrire un nuovo approccio al controllo reversibile della fertilità nella femmina che merita ulteriori indagini.
Quindici anni di esperienza con l'inseminazione artificiale.L'inseminazione artificiale è oggi una procedura accettata per aggirare la sterilità. Negli ultimi anni questa procedura ha guadagnato molta popolarità in quanto il numero dei bambini disponibili per l'adozione è diminuito costantemente a causa delle leggi liberali sull'aborto. Viene presentata una revisione di 15 anni di esperienza pratica (autore senior). In tutti i casi descritti (168 donne) l'inseminazione artificiale è stata eseguita personalmente dall'autore. L'alto tasso di il successo (80% dei casi presentati) è attribuito a un approccio molto meticoloso e altamente individualizzato a ciascun caso. Viene presentata una rassegna della letteratura.
Mancanza di effetti del testosterone sul turnover della noradrenalina e sull'attività della tirosina idrossilasi dei dotti deferenti e dell'epididimo di ratto.Verificare gli effetti del testosterone su alcuni aspetti del metabolismo della noradrenalina (NE) nei neuroni adrenergici corti del tratto genitale maschile, i ratti orchiectomizzati hanno ricevuto 500 tazze di propionato di testosterone due volte al giorno per un massimo di 18 giorni. Il trattamento con androgeni non ha influenzato i livelli, l'assorbimento o l'efflusso di NE né ha modificato il attività della tirosina idrossilasi nel dotto deferente e nell'epididimo. Allo stesso modo, la fluorescenza indotta dalla formalina e l'ultrastruttura delle terminazioni nervose sono rimaste invariate dopo la somministrazione di testosterone. Questi dati suggeriscono che i neuroni adrenergici corti del tratto genitale maschile sono relativamente insensibili agli androgeni.
Ribonucleasi del seme umano. Posizione, proprietà e inibizione di sodio dodecil solfato, zinco solfato e EDTA.Sono state stabilite condizioni ottimali per la misurazione dell'attività della RNasi. Il L'enzima è stato misurato nel plasma seminale umano e negli spermatozoi. I risultati suggeriscono che l'enzima spermatico può provenire dalla contaminazione del plasma seminale e che l'RNasi può essere utilizzato come enzima marcatore per la contaminazione del plasma seminale. Sodio dodecilsolfato, un reagente utilizzato per produrre la solubilizzazione di gli spermatozoi, hanno prodotto un'inibizione molto forte della RNasi a basse concentrazioni (530 muM). Anche il solfato di zinco e l'EDTA hanno prodotto l'inibizione dell'attività della RNasi. Tale inibizione può essere molto utile in futuri studi sul metabolismo dell'RNA negli spermatozoi umani.
Controllo della fertilità con capsule silastiche subdermiche contenenti un nuovo progestinico (ST-1435).L'azione contraccettiva degli impianti silastici contenenti un nuovo progestinico ST -1435 è stato studiato in 285 donne in età riproduttiva. Un gruppo di 52 donne (gruppo A) ha ricevuto tre capsule contenenti ciascuna 35 mg di steroide. Un secondo gruppo di 48 donne (gruppo B) ha ricevuto quattro capsule e un terzo e più grande gruppo di 185 donne (gruppo C) hanno ricevuto cinque capsule. Nessuna gravidanza si è verificata durante i 530 mesi di utilizzo nel gruppo A. Nei 502 mesi di utilizzo registrati per il gruppo B, si è verificata una gravidanza. Nel gruppo C, sono stati registrati 2.142 mesi. È stata segnalata una gravidanza alla fine di 11 mesi di utilizzo e un altro alla fine di 19 mesi di utilizzo. L'effetto collaterale più comune è stato l'alterazione del pattern di sanguinamento mestruale.
Effetti biologici del lipopolisaccaride (LPS) di Escherichia coli in vivo. I. Selezione nel timo di cellule killer e helper.Nel presente studio abbiamo studiato gli effetti biologici sui linfociti del timo derivanti dal trattamento con Escherichia coli lipopolisaccaride (LPS) in topi giovani adulti. È stato stabilito che LPS induce i seguenti effetti: (a) una riduzione dose-dipendente del peso del timo contemporanea ad un aumento la risposta anticorpale anti-LPS; (b) un aumento dell'attività killer delle cellule del timo; (c) un aumento dell'attività helper dei timociti; (d) una riduzione delle cellule theta-positive nel timo; (e) una deplezione cellulare la corteccia del timo. Questi dati, che indicano che LPS seleziona nel timo una popolazione di cellule più efficienti nell'esprimere le funzioni sia killer che helper, sono interpretati come causati da un aumento del tasso di secrezione di cortisolo indotto dal trattamento con LPS.