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Fattori nell'evoluzione della funzione dell'emoglobina.Il confezionamento delle emoglobine del sangue dei vertebrati all'interno delle cellule pone sottili limiti all'evoluzione dell'emoglobina. Poiché la concentrazione di emoglobina è vicino al limite di solubilità dovrebbe esistere un vantaggio selettivo per una topologia esterna non complementare di residui amminoacidici. Inoltre, qualsiasi cambiamento di carica sulla proteina dovrebbe alterare la distribuzione degli ioni attraverso la membrana cellulare e quindi modificare il trasporto di ossigeno sensibile agli ioni. Un'emoglobina efficiente non deve si combinano facilmente con l'ossigeno alle pressioni ambientali prevalenti dell'ossigeno, ma devono anche rilasciarlo a pressioni metabolicamente appropriate. Questi adattamenti spesso impiegano strategie diverse per raggiungere lo stesso obiettivo in animali diversi. Alcune emoglobine hanno sviluppato proprietà speciali non correlate al trasporto dell'ossigeno al metabolismo tessuti. Così molti pesci teleostei hanno emoglobine che scaricano gran parte del loro ossigeno a pH basso anche a pressioni di ossigeno elevate. Questa proprietà sembra aiutare a riempire di ossigeno la vescica natatoria. Le emoglobine degli elasmobranchi hanno evocato una resistenza unica all'urea come conseguenza dell'alto contenuto di urea nel loro sangue. A volte gli adattamenti funzionali delle emoglobine sono ottenuti da più emoglobine nelle stesse cellule. Spesso, tuttavia, diverse popolazioni di globuli rossi con emoglobine funzionalmente uniche sorgono in sequenza durante l'ontogenesi.
Proprietà degli enzimi da Clostridium thermoaceticum e Clostridium formicoaceticum.Metilenetetraidrofolato deidrogenasi da C. thermoaceticum e C. formicoaceticum sono state purificate e confrontate. due enzimi sono molto simili fisicamente, chimicamente e cineticamente, ma l'enzima C. thermoaceticum ha una maggiore termostabilità, che è una proprietà intrinseca della proteina. Gli enzimi della forma deidrogenasi di entrambi i batteri richiedono selenite e tungstato per la formazione e questi enzimi sembrano anche hanno proprietà simili, sebbene il C. thermoaceticum sia stabile a 70 gradi C per più di un'ora. L'acetato chinasi di C. thermoaceticum sembra essere sotto controllo metabolico. Si può concludere che gli enzimi di C. thermoaceticum, sebbene siano più termostabili , sono molto simili ai corrispondenti enzimi degli organismi mesofili.
Mantenimento della specificità, informazione e termostabilità nella glutammina sintetasi termofila di Bacillus sp.La glutammina sintetasi è stata purificata all'omogeneità da B. subtilis (37 gradi) B. stearothermophilus (55 gradi) e B. caldolyticus (75 gradi). Queste caratteristiche confrontate includono dimensioni (6.0 +/- 0.3 X 10(5) dalton), struttura quaternaria (12 SU) contenuto di amminoacidi, substrato Km \' e specificità per analoghi strutturali, attivazione di ioni metallici, numero e tipo di siti modificatori di feedback separati e complessità delle interazioni modificatore-substrato e modificatore-sito modificatore. Anche se i sistemi di 37 gradi e 55 gradi sono abbastanza simili, i 75 gradi Il sistema mostra importanti alterazioni nella specificità del substrato e nelle modalità di azione del modificatore. Mentre a 37 gradi e 55 gradi l'AMP inibisce sinergicamente con gli amminoacidi (glicina, glutammina, istidina), l'enzima a 75 gradi è inibito direttamente dai prodotti ADP, (wh ich assume il ruolo di AMP) e glutammina, più altri ligandi. I domini di legame del ligando vengono confrontati e risultano essere molto diversi. La termostabilizzazione avviene mediante (a) protezione da L-glutammato legato, (b) aggregazione proteica, (c) tendenze nel contenuto di residui polari totali, residui totali di Asx + Flx, idrofobicità media e (d) reticolazione del legame disolfuro. Tali studi forniscono approfondimenti sull'evoluzione molecolare che si verifica con i cambiamenti nello stress ambientale.
Purificazione e alcune proprietà della NADP+ -specifica isocitrato deidrogenasi da un termofilo estremo, Thermus flavus AT-62.Termostabile NADP+ -specifica isocitrato deidrogenasi (EC 1.1.1.42) è stato purificato dall'estratto grezzo di un batterio estremamente termofilo Thermus flavus AT-62 tramite colonna DEAE-cellulosa, frazionamento dell'acetone, colonna DEAE-Sephadex A-50 e focalizzazione isoelettrica. L'enzima è stato purificato di circa 500 volte nella sua specifica l'attività e la purezza sono risultate essere di circa il 96%. L'enzima non è stato inattivato dopo 60 minuti a 70°C, ma il 20 e l'80% dell'attività sono stati persi dopo 60 minuti a 80°C e 90°C, rispettivamente. Ossalacetato più gliossilato (ogni 1 nM) ha dimostrato il 75% di inibizione dell'attività in modo concertato. Il grado di inibizione e l'affinità dell'enzima per l'isocitrato e NADP+ diminuivano con l'aumento della temperatura, specialmente sopra i 60 gradi C. L'energia di attivazione al di sotto e al di sopra 60 de grees C erano rispettivamente di 14.500 e 8.000 cal per mole. Negli spettri CD sono state osservate bande negative a 210 e 220 nm e il contenuto di alfa-elica è stato calcolato pari a circa il 26%. Nel corso del riscaldamento fino a 60 gradi non si osserva praticamente alcun cambiamento nelle bande CD, ma sopra i 60 gradi la profondità delle bande CD è diminuita gradualmente e notevolmente al di sopra degli 80 gradi C. L'effetto della temperatura sui parametri cinetici e sulle strutture secondarie dell'enzima è stato discusso in relazione all'adattamento alla temperatura dell'organismo.
Flusso sanguigno cerebrale, metabolismo cerebrale e biochimica del liquido cerebrospinale in pazienti con lesioni cerebrali dopo esposizione a ossigeno iperbarico.Una serie di pazienti con lesioni alla testa, in coma, sono stati trattati con ossigeno iperbarico (OHP) a 2,5 atm. Flusso sanguigno cerebrale (CBF), tassi metabolici cerebrali di ossigeno (CMRO2), glucosio (CMRGL) e lattato (atto CMRL) e vari liquidi cerebrospinali (CSF) i parametri sono stati misurati prima e 2 ore dopo il trattamento. I valori medi pre-OHP e post-OHP di sangue arterioso e lattato CSF e CMRL act erano più alti del normale, mentre CBF, CMRO2 e pressione dell'ossigeno CSF (PO2) erano più bassi. tendeva ad aumentare dopo l'OHP in alcuni pazienti e a diminuire in altri. Questa discrepanza e i risultati contrastanti della letteratura possono essere spiegati provvisoriamente assumendo che ci sia un effetto diverso dell'OHP sulla normale circolazione cerebrale rispetto alla circolazione cerebrale alterata. i tassi metabolici cerebrali erano incoerenti e non si riferiva a cambiamenti di CBF, tranne che con studi ripetuti sullo stesso paziente. È stata trovata una correlazione tra le variazioni di CMRGL e quelle del sangue arterioso e del contenuto di glucosio nel liquido cerebrospinale. La PO2 nel liquor, l'equilibrio acido-base nel liquido cerebrospinale e il contenuto di lattato nel liquido cerebrospinale non sono variati e la PO2 arteriosa ha mostrato un calo consistente. In due pazienti che erano migliorati neurologicamente dopo l'esposizione a OHP, il CBF e i cambiamenti metabolici non erano gli stessi.
Glicosidasi di molluschi. Purificazione e proprietà dell'alfa-L-fucosidasi da Chamelea gallina L.Un'alfa-L-fucosidasi è stata purificata circa 300 -piega dal fegato (epatopancreas) del mollusco marino Chamelea gallina L. (= Venus gallina L. ). Durante le diverse fasi della procedura di purificazione era difficile rimuovere l'attività N-acetilglucosaminidasi del contaminante; ma, dopo l'elettrofocalizzazione, si ottiene un preparato finale esente da questo e da altri glicosidadi presenti nell'estratto grezzo. L'enzima purificato ha un'ampia specificità, idrolizza il p-nitrofenil alfa-L-fucoside e substrati naturali come oligosaccaridi contenenti residui fucosidici con alfa 1--2 , alfa 1--3 e alfa 1--4; inoltre idrolizza i glicopeptidi contenenti fucosio, come il glicopeptide della tireoglobulina, e le glicoproteine come la mucina sottomascellare procina (precedentemente priva di acido sialico). L'enzima ha un pH ottimale di 5,2 +/ - 0,2, con un Km di 7 X 10(-5) M utilizzando come substrato p-nitrofenil L-fucoside. È inibito da Hg2+ e da alcuni zuccheri e attivato da CN-, Zn2+, Ca2+ ed EDTA. Mostra due picchi mediante focalizzazione isoelettrica (a 6.3 e 6.6). Il peso molecolare dell'alfa-L-fucosidasi mediante filtrazione su gel era superiore a 2000000.
Influenza dell'acidificazione del DNA sulla prefusione del DNA e sulle proprietà del templato.L'acidificazione di un campione di DNA T7 è risultata parzialmente irreversibile in quanto gli spettri di differenza ultravioletti misurati a varie temperature di subfusione erano diverse da quelle osservate per un campione di DNA \'normale\'. Ciò implica qualche sottile cambiamento conformazionale che non viene invertito dal ritorno al pH neutro. Nelle stesse condizioni, solo poli(purina)-poli(pirimidina) I polimeri si sono comportati in modo diverso, durante la prefusione, a seconda che fossero stati precedentemente acidificati o meno. Sono state inoltre studiate le proprietà del DNA T7 acidificato e rineutralizzato per il legame e la trascrizione dell'RNA polimerasi di Escherichia coli. È stata osservata un'inibizione della sintesi dell'RNA e dell'inizio della catena I risultati suggeriscono che il legame dell'enzima è influenzato. L'RNA sintetizzato è specifico ma c'è una diminuzione del numero e della stabilità dei complessi RNA-polimerasi-DNA.
Interconversione tra 17 beta-idrossi-5alfa-androstan-3-one (5alfa-diidrotestosterone) e 5alfa-androstano-3alfa, 17 beta-diolo nel rene di ratto: eterogeneità di 3alfa-idrossisteroide ossidoriduttasi.3alfa-idrossisteroide ossidoriduttasi che catalizzano l'interconversione tra 17 beta-idrossi-5alfa-androstan-3-one (5alfa-diidrotestosterone) e 5alfa-androstano-3alfa, 17 beta-diolo (3alfa -androstanediolo) sono stati studiati nel rene di ratto. Si possono distinguere tre enzimi: un'ossidoreduttasi solubile NADPH-dipendente, un enzima microsomiale NADPH-dipendente e un enzima microsomiale legato al NADH. Tracce degli enzimi microsomiali sono costantemente osservate nel 108 000 X g surnatante. Gli studi sui preparati grezzi rivelano che questi enzimi differiscono non solo per la localizzazione subcellulare e il fabbisogno di cofattori, ma anche per pH ottimale, caratteristiche cinetiche, sensibilità a potenziali inibitori steroidei e sensibilità ai detergenti, forza ionica e d temperatura. Inoltre, esistono differenze di sesso salienti nell'attività di tutti e tre gli enzimi renali. L'enzima solubile NADPH-dipendente è più attivo nelle femmine di ratto mentre entrambi gli enzimi microsomiali sono considerevolmente più attivi negli animali maschi. L'ossidoriduttasi microsomiale NADH-dipendente mostra caratteristiche favorevoli per catalizzare la 3alfa-deidrogenazione del 3alfa-androstanediolo. Viene presentata la prova che è principalmente questo enzima che consente al rene di utilizzare il 3alfa-androstanediolo come precursore efficiente per la formazione locale di 5alfa-diidrotestosterone.
Sintesi enzimatica di precursori della lignina. Purificazione e proprietà di un cinnamoil-CoA: NADPH reduttasi da colture in sospensione cellulare di soia (Glycinemax).A cinnamoyl -coenzima A reduttasi che catalizza la riduzione NADPH-dipendente degli esteri tiolici cinnamoil-CoA sostituiti alle corrispondenti cinnamaldeidi è stata isolata da colture in sospensione cellulare di soia (Glycine max L. var. Mandarin). (NH4)2SO4 frazionamento, cromatografia su DEAE-cellulosa, idrossiapatite e Sephadex G-100 e cromatografia di affinità su 5\'-AMP-Sepharose. Il peso molecolare apparente della reduttasi è risultato essere di circa 38.000 sulla base dell'eluizione volume da una colonna Sephadex G-100. La velocità massima di reazione è stata osservata tra pH 6,0 e 6,2 in tampone citrato 0,1-0,2 M a 30 gradi C. L'enzima è stato notevolmente inibito dai reagenti tiolici. La reduttasi ha mostrato un alto grado di specificità per cinnamoile -CoA esteri. Il feruloil-CoA era il substrato con il valore Km più basso (73 muM) e il V più alto (230 nkat/mg) seguito da 5-idrossi-feruloil-CoA, sinapoil-CoA, p-cumaroil-CoA, caffeoil-CoA e cinnamoil- CoA. Nessuna reazione ha avuto luogo con acetil-CoA. Il valore Km per NADPH variava con il tipo di substrato. Sono stati trovati valori di km di 28, 120 e 290 muM con feruloil-CoA, sinapoil-CoA e p-cumaroil-CoA, rispettivamente. La velocità di reazione osservata con NADH era solo circa il 5% di quella riscontrata con NADPH. I prodotti di reazione CoASH e NADP+ hanno inibito la reazione. I valori di Ki erano nell'intervallo 0,5-1 mM e l'inibizione era di tipo non competitivo (misto). Viene discusso il ruolo della reduttasi nella biosintesi dei precursori della lignina.
Un'indagine spettroscopica sull'S-trifluoroetiltiopapaina. Un'indagine sul sito attivo della papaina.La dipendenza dal pH dello spostamento chimico del 19F e dello spettro di fluorescenza di S-2,2,2-trifluoro-1,1-dideuteroetil-tio-paapaina sono analizzati in termini di dipendenza dalla ionizzazione dell'acido aspartico-158 e dell'istidina-159. La sonda 19F provoca cooperatività negativa tra questi gruppi, e non rileva alcuna ionizzazione a pH elevato. I tassi di scambio chimici intermedi per la ionizzazione dell'acido aspartico-158 e dell'istidina-159 consentono di calcolare le costanti di velocità approssimate per il trasferimento di protoni. Le costanti di velocità piuttosto basse sono spiegate in termini di l'idrofobicità della regione del sito attivo e la carica netta positiva sull'enzima derivante dal suo alto punto isoelettrico.
Studio calorimetrico sulla glicolisi eritrocitaria umana. Produzione di calore in varie condizioni metaboliche.La produzione di calore degli eritrociti umani è stata misurata su un microcalorimetro a flusso con analisi simultanee di lattato e altri metaboliti. La produzione di calore connessa alla formazione di lattato era di circa 17 kcal (71 kJ) per mol di lattato formato che corrispondeva alla somma della produzione di calore dovuta alla formazione di lattato dal glucosio e della produzione di calore dovuta alla neutralizzazione. La velocità di produzione di calore aumentava all'aumentare del pH della sospensione, corrispondente all'aumento della formazione di lattato. Gli inibitori glicolitici come fluoruro e monoiodoacetato causavano una diminuzione della velocità di produzione di calore, mentre l'arsenato induceva un forte aumento transitorio della produzione di calore associato a un aumento transitorio della formazione di lattato. La diminuzione della concentrazione di piruvato era solitamente associata ad un aumento della produzione di calore, sebbene il de la concentrazione di piruvato piegata è stata accoppiata con la formazione di 2,3-bisfosfoglicerato. Quando inosina, diidrossiacetone o D-gliceraldeide sono stati utilizzati come substrato, è stato osservato un aumento della velocità di produzione di calore. L'aggiunta di blu di metilene ha causato un assorbimento di ossigeno che è stato accompagnato da un notevole aumento della velocità di produzione di calore corrispondente a circa 160 kcal (670 kJ) per mole di ossigeno consumato. Il valore per la produzione di calore nei globuli rossi nelle condizioni metaboliche sopra menzionate è stato considerato in relazione ai precedenti dati noti sull'energia libera e sui cambiamenti di entalpia dei diversi passaggi metabolici nella via glicolitica.
Studi sulla glutammato deidrogenasi. La regolazione della glutammato deidrogenasi da Candida utilis mediante una transizione conformazionale dipendente dal pH e dalla temperatura.La glutammato deidrogenasi da Candida utilis subisce un transizione conformazionale reversibile tra uno stato attivo e uno inattivo a pH basso E bassa temperatura. Questa transizione conformazionale può anche essere seguita da misurazioni di fluorescenza. L'equilibrio dipendente dalla temperatura tra lo stato attivo e inattivo è caratterizzato da una temperatura di transizione di 10,7 gradi C e un valore delta H di 148 kcal/mol (620 kJ/mol). La dipendenza dalla temperatura dell'attività enzimatica sopra i 15 gradi C produce un'energia di attivazione di 15 kcal/mol (63 kJ/mol), un valore maggiore di quello per l'enzima del fegato di manzo (9 kcal/mol; 38 kJ/mol) A differenza dell'enzima di lievito il diagramma di Arrhenius è lineare e, quindi, l'enzima del fegato di manzo non si trasforma in una conformazione inattiva a basse temperature. L'analisi della sedimentazione mostra che l'inattivazione dell'enzima Candida utilis non è causata da un cambiamento nella struttura quaternaria. La dipendenza dal pH della transizione conformazionale a pH basso misurata mediante variazione di fluorescenza è caratterizzata da un valore pK di 7,01 per l'enzima in assenza e di 6,89 per l'enzima in presenza di 2-ossoglutarato con un coefficiente di Hill di 3,4 in entrambi i casi. Risultati simili si trovano quando si analizza la dipendenza dal pH dell'attività enzimatica. Con l'enzima del fegato bovino si ottiene lo stesso valore di pK ma con un coefficiente di Hill pari a 1 che indica cooperatività solo nel caso dell'enzima Candida utilis. Il miglior adattamento della dipendenza dal pH delle costanti di velocità delle variazioni di fluorescenza è stato ottenuto con valori di pK di 7,45 e 6,45 rispettivamente per lo stato attivo e inattivo. In questo modello la costante di tempo più bassa che si ottiene al pH dell'equilibrio è risultata essere 0,05 s-1. Esperimenti di preincubazione con il substrato 2-ossoglutarato ma non con il coenzima spostano l'equilibrio verso la conformazione attiva. Il coenzima ovviamente riduce la costante di velocità della transizione conformazionale. Il coefficiente di sedimentazione (SO20, w) e il peso molecolare sono risultati rispettivamente 11,0 S e 276 000. La molecola dell'enzima è costituita da sei catene polipeptidiche aventi ciascuna un peso molecolare di 47.000.
Controllo dei livelli di acidi grassi sintetasi mediante acidi grassi esogeni a catena lunga nei lieviti Candida lipolytica e Saccharomyces cerevisiae.Biosintesi endogena degli acidi grassi nel due specie di lievito, Saccharomyces cerevisiae e Candida lipolytica è completamente repressa dall'aggiunta di acidi grassi a catena lunga al mezzo di crescita. In Candida lipolytica, questa repressione è accompagnata da una corrispondente perdita di attività di sintetasi degli acidi grassi nell'omogenato cellulare, quando il cellule sono state coltivate su acidi grassi come unica fonte di carbonio. L'attività della sintetasi degli acidi grassi Saccharomyces cerevisiae, tuttavia, non viene influenzata dall'aggiunta di acidi grassi a un mezzo di crescita contenente glucosio. Da cellule di Candida lipolytica coltivate con acidi grassi no complesso di acidi grassi sintetasi può essere isolato, né è rilevabile alcuna proteina sintetasi di acidi grassi immunologicamente cross-reattivi nell'estratto di cellule grezze Da ciò si conclude che il labbro di Candida olytica, ma non Saccharomyces cerevisiae, è in grado di adattarsi alla crescita sugli acidi grassi sia mediante repressione della biosintesi degli acidi grassi sintetasi sia mediante degradazione proteolitica indotta da acidi grassi del complesso multienzimatico. Allo stesso modo, il complesso degli acidi grassi sintetasi scompare rapidamente dalle cellule di Candida lipolytica in fase stazionaria anche dopo la crescita in un mezzo privo di acidi grassi. Infine, è stato scoperto che i complessi di acido grasso sintetasi di Saccharomyces cerevisiae e Candida lipolytica, sebbene molto simili per dimensioni e composizione delle subunità, erano immunologicamente diversi e non avevano determinanti antigenici comuni.
Ulteriori osservazioni sulle proprietà della guanasi sierica e tissutale dell'uomo e di alcune specie animali. pH ottimale ed energia di attivazione in presenza di 8-azaguanina.L'energia di attivazione e il pH ottimale della guanina deaminasi nell'uomo, nel ratto, nella cavia e nel topo sono stati studiati utilizzando l'8-azaguanina come substrato. La guanasi sierica nell'uomo e in tutte le specie animali studiate differisce nell'energia di attivazione dalla guanasi del fegato. Nell'uomo, inoltre, la guanasi sierica è anche diversa dall'enzima cerebrale e renale. Nel ratto e nella cavia l'enzima cerebrale ha un'energia di attivazione termica diversa dall'enzima epatico e renale. La guanasi del siero e dei tessuti della cavia differisce dall'enzima del siero e dei tessuti dell'uomo, del ratto e del topo per un pH ottimale.
Attività dell'adenilato ciclasi nei tessuti ovarici. I. Omogeneizzazione e condizioni di dosaggio nei follicoli di Graaf e nei corpi lutei di conigli, ratti e maiali: regolazione dell'ATP e alcune proprietà comparative .La reattività delle adenilciclasi ovariche all'ormone luteinizzante (LH), riscontrata da 5 a 10 volte nelle preparazioni prive di cellule in condizioni ottimali, ha richiesto delicate omogeneizzazioni e conservazione in terreni contenenti saccarosio. Condizioni del test richiedeva l'uso di un sistema di rigenerazione dell'ATP costituito da creatina chinasi, creatina fosfato e miochinasi per la conservazione dei livelli di ATP. L'adenilciclasi (AC) stimolata da LH nel CL di coniglio ha mostrato le seguenti proprietà: 1) Il pH ottimale dell'attività basale era di circa 8,0; quella dell'attività stimolata da LH era di circa 7,5. 2) La risposta relativa all'LH era bassa (da 1,5 a 2 volte) a 0,1 mM di ATP e aumentava con l'aumento di ATP, ma non con l'aumento di GTP. mM) ATP, GTP maggiore efficacia catalitica del sistema, sia in assenza che in presenza di LH (nessun effetto sulla stimolazione relativa). 3) La stimolazione relativa ottimale da parte dell'LH è stata ottenuta a circa 1,0 mM MgCl2 in eccesso rispetto agli ingredienti leganti il magnesio aggiunti. 4) La sensibilità alla stimolazione da parte dell'LH (circa 0,2 mug/ml NIH-LH-B8) non è stata influenzata né dal pH, né dai nucleotidi (ATP e GTP) né dalla concentrazione di MgCl2. 5) Nelle condizioni di analisi utilizzate, l'attività è stata stimolata dalla prostaglandina E1 (PGE1) da 1,5 a 2 volte circa e dall'adrenalina da 3 a 4 volte circa. In tutti gli aspetti testati, l'AC stimolata con LH nel CL di ratto assomigliava a quello nel CL di coniglio, tranne per il fatto che erano necessarie concentrazioni circa 5 volte più elevate di NIH-LH-B8 per la stimolazione semi-massima. L'attività dell'AC nei follicoli di Graaf di maiale, tuttavia, differiva da quella nel CL di coniglio in quanto 1) la concentrazione di ATP necessaria per la stimolazione ottimale da parte dell'LH era inferiore (nell'intervallo micromolare piuttosto che nell'intervallo millimolare); 2) le catecolamine hanno suscitato solo una stimolazione da 1,3 a 1,4 volte; e 3) NIH-LH-B8 ha suscitato una stimolazione semimassima da 0,008 a 0,020 mug/ml. Non siamo stati in grado di rilevare l'attività AC sensibile all'LH negli omogenati o nelle particelle lavate di CL provenienti da maiali in bicicletta o gravide. Sono state testate frazioni di LH di tre origini (umana, bovina e ovina) e con attività specifiche variabili (da 0,041 a 2,0 unità NIH-LH-S18/mg) e le relative potenze mediante il test OAAD sono risultate ben correlate con le relative potenze nei test dell'adenilato ciclasi (CL di ratto, CL di coniglio e follicoli di maiale), coerentemente con la possibilità che i recettori AC siano responsabili delle azioni biologiche dell'LH.
Attività del fattore di rilascio e di inibizione della prolattina nella ghiandola pineale bovina, ratto e umana: studi in vitro e in vivo.Gli effetti di estratti grezzi di ghiandola pineale bovina, ratto e umana sul rilascio di prolattina (PRL) sono stati studiati utilizzando un sistema in vitro. Inoltre, gli effetti di un noto costituente pineale, l'arginina vasotocina (AVT) e l'estratto pineale grezzo bovino (bPE ) sulla secrezione di PRL sono stati studiati in vivo Gli emipituitari maschi normali di ratto (HP), incubati con bPE (13 mg di tessuto/HP) rilasciavano il 200%, 150% e 285% in più di PRL nel terreno rispetto alle corrispondenti metà di controllo non trattate incubate rispettivamente nel solo Medium 199, nell'estratto ipotalamico o nell'estratto corticale cerebrale. HP incubato con estratto pineale di ratto (6 mg di tessuto/HP) o umano (25 mg di tessuto/HP) ha rilasciato il 110% e il 75% in più di PRL, rispettivamente, rispetto alle corrispondenti metà di controllo non trattate HP esposte a 10 mg di tessuto eq di entrambi i pini bovini La frazione A1 o la frazione pineale bovina A3 ha rilasciato rispettivamente l'88% e il 63% di PRL in meno rispetto alle corrispondenti metà di controllo non trattate incubate in terreno Krebs-Ringer Bicarbonate (KRB). Quantità di melatonina, ormone di rilascio della tireotropina (TRH) o estrogeni, paragonabili a quelli trovati nella pineale, non hanno avuto effetti significativi sulla secrezione di PRL in vitro. L'iniezione ev di bPE (90 mg di tessuto/ratto) o di AVT (10 tazze/ratto) in ratti maschi trattati con estrogeni e progesterone ha determinato un aumento rispettivamente del 40% e del 138% dei titoli di PRL plasmatica, 10 minuti dopo l'iniezione , oltre i livelli di controllo pre-iniezione. La percentuale di aumento dei livelli plasmatici di PRL in questi animali era significativamente maggiore di quella osservata nei ratti di controllo che ricevevano soluzione salina o estratto corticale. I risultati suggeriscono che estratti grezzi di ghiandole pineali di tre specie diverse contengono un'attività del fattore di rilascio della prolattina (PRF) che probabilmente non è dovuta a melatonina endogena, TRH o estrogeni che potrebbero essere presenti. Al contrario, due frazioni pineali bovine, A1 e A3, sembravano mostrare attività del fattore di inibizione della prolattina (PIF). Abbiamo concluso che la ghiandola pineale può servire come fonte alternativa o supplementare di PRF e/o PIF.
Lung carbonato deidratasi (anidrasi carbonica), depositi di CO2 e trasporto di CO2.Uno studio sullo stoccaggio di CO2 nei polmoni asportati e dissanguati ha rivelato che i depositi di CO2 includono un compartimento che raggiunge l'equilibrio molto rapidamente (meno di 3 s) e un compartimento più lento che si equilibra con un tempo di dimezzamento di circa 15 s L'inibizione della carbonato deidratasi (anidrasi carbonica, EC 4.2.1.1) non modifica la pendenza della CO2 totale curva di dissociazione del polmone ma aumenta il compartimento lento a spese del veloce. La diffusione della CO2 attraverso la pleura è circa 20 volte più veloce di quella dell'O2, una relazione che non è influenzata dall'inibizione della carbonato deidratasi. Il ruolo della CO2 tissutale riserve nel limitare le fluttuazioni respiratorie di PCO2 o pH nel sangue arterioso è solo minore e può essere significativo solo nell'inspirazione rapida e profonda. L'assorbimento o il rilascio di CO2 da parte delle riserve è sfasato rispetto allo scambio di CO2 nel sangue. Di conseguenza, il ti Il corso dello scambio di CO2 alla bocca durante l'espirazione non può essere utilizzato per prevedere lo scambio di CO2 alveolare o capillare.
Trasporto ionico e flusso d'acqua nel polmone dei mammiferi.L'accoppiamento del flusso d'acqua sfuso al trasporto ionico attivo è stato descritto in vari epiteli; prove presentate qui suggerisce che questa è anche una caratteristica del polmone dei mammiferi. Le misurazioni della composizione ionica del liquido polmonare e della sua velocità di formazione nell'agnello fetale in vivo hanno permesso di stimare il flusso netto di ogni ione e, con misurazioni del tracciante dell'acqua di flussi ionici unidirezionali, per calcolare i rapporti di flusso Quando questi vengono confrontati con i rapporti previsti dall'equazione del rapporto di flusso di Ussing è chiaro che la secrezione di liquido polmonare è legata al trasporto attivo di Cl- dal plasma, il sodio si muove passivamente. Inoltre vi è un apparente trasferimento in salita di HCO2- fuori dal liquido polmonare. In una preparazione in vitro di trachea canina adulta, Cl- viene attivamente trasportato verso il lume ed è associato a un piccolo flusso netto di Na+ nella direzione opposta. acetilcolina in increspa il flusso netto di Cl- verso il lume ma inverte l'orientamento del flusso netto di Na+. Cambiamenti come questi possono essere importanti determinanti del flusso di liquidi sfusi in vivo e in vitro.
Trasporto ionico attraverso il polmone degli anfibi.La semplice architettura del polmone degli anfibi consente di studiare il movimento delle sostanze attraverso una barriera con permeabilità e bioelettrico proprietà che sono dominate dall'epitelio alveolare. Quando montato come un foglio planare tra soluzioni di Ringer identiche, il polmone asportato della rana toro ha mostrato una differenza di potenziale elettrico transmurale di quasi 20 mV (superficie pleurica positiva) e una resistenza di circa 700 omega cm2. i flussi di 36Cl, Br-, I- e SCN- attraverso il polmone cortocircuitato erano asimmetrici. Il flusso netto di 36Cl- dalla pleura al lume corrispondeva alla corrente di cortocircuito dopo 1,5 h di clampaggio della tensione, seguiva la cinetica di un flusso saturabile processo ed è stato ridotto dagli inibitori del metabolismo ossidativo. Questi risultati suggeriscono che l'alogenuro e alcuni anioni pseudoalogenuri sono secreti dall'epitelio alveolare della rana. Flussi di Na+, K+, Ca+, HCO3-, TcO4-, SO42-, p-aminohippura te, gluconato, dinitrofenolato e acqua erano compatibili con la diffusione passiva delle molecole della sonda attraverso la barriera. Le misurazioni del consumo di ossigeno polmonare, dei flussi ionici e delle proprietà bioelettriche hanno aiutato a individuare possibili siti e modalità di azione di agenti aerodispersi, come metalli pesanti, solfati e nitrati, che possono danneggiare la barriera polmonare dei mammiferi.
Accoppiamento dell'acqua al movimento dei soluti nella mucosa gastrica isolata.L'osmosi è apparentemente il meccanismo responsabile dell'accoppiamento dell'acqua al trasporto dei soluti nelle membrane biologiche. Spesso un fluido secreto o assorbito è essenzialmente iso-osmotico con la soluzione di origine, o con il plasma, e vari modelli sono stati costruiti da Curran, Diamond e altri per rendere conto di tali osservazioni. Sono necessarie maggiori informazioni, tuttavia, per testare ulteriormente il predizioni di questi modelli e per facilitare la correlazione con i dettagli strutturali noti. Questo studio si occupa della secrezione gastrica e degli effetti della soluzione luminale sulla sua composizione. Sebbene il succo gastrico puro raccolto in vivo sia praticamente iso-osmotico con il plasma, Teorell, Obrink e altri trovato che l'instillazione di una soluzione tampone (glicina) nel lume ha portato ad un doppio aumento della concentrazione di acido gastrico. Questo effetto non è limitato alle soluzioni tampone: la normalità di H+ secernono d in una soluzione isotonica (120 mM) di NaCl che bagna la mucosa gastrica della rana toro isolata era 276 +/- 19 mmol/1 (13 esperimenti). Chiaramente la soluzione luminale influenza la concentrazione della secrezione gastrica, probabilmente riducendo un gradiente osmotico endogeno. Quindi i siti responsabili del trasporto di H+ devono essere accessibili dalla soluzione luminale.
Trasporto di ioni e acqua attraverso l'epitelio delle branchie dei pesci.La branchia teleostea è caratterizzata da una permeabilità all'acqua eccezionalmente bassa. L'acqua si muove lungo il gradiente osmotico attraverso la branchia, che viene acquisito in acqua dolce e perso nell'acqua di mare. L'accoppiamento del movimento dell'acqua con il movimento dei soluti non è stato segnalato. In acqua dolce, la branchia è il sito di assorbimento attivo indipendente di sodio e cloruro. L'assorbimento di Na+ è accoppiato all'escrezione di H+ o NH4+, l'assorbimento di Cl- nell'escrezione di HCO3- L'amiloride blocca il trasporto del sodio e il tiocianato inibisce la pompa del cloro Nell'acqua di mare, gli scambi di sodio e cloruro attraverso la branchia sono circa 100 volte più veloci che in acqua dolce, fino a 100 % di sodio o cloruro interno scambiato all'ora Il cloruro viene escreto attivamente, mentre il movimento del sodio può essere passivo La pompa del cloruro è associata a un meccanismo per lo scambio Na/K; sia la pompa che lo scambio Na/K sono bloccati dal tiocianato e possibilmente da ouabain. Tre enzimi sono coinvolti nelle pompe ioniche: carbonato deidratasi (EC 4.2.1.1; anidrasi carbonica), adenosina-trifosfatasi stimolata da sodio/potassio (EC 3.6.1.3, ATPasi) e ATPasi stimolata da anioni. Cellule specializzate (\'cellule cloruro\') sono presumibilmente il sito del trasporto attivo.
Terapia dell'ansia nel paziente neoplastico.Uno studio clinico è stato condotto su 73 pazienti neoplastici affetti da ansia e altri disturbi emotivi per valutarne l'efficacia e tolleranza al lorazepam. Ai pazienti sono state somministrate dosi giornaliere individualizzate che vanno da 1,5 mg a 3 mg di lorazepam per 15-60 giorni. I risultati, valutati dalla risposta di ansia, tensione, eretismo e insonnia, hanno mostrato che solo 4 (5%) pazienti hanno fallito per ottenere un certo sollievo C'era la completa scomparsa di tutti i sintomi in 29 (40%) dopo 15 giorni, sollievo di almeno un sintomo principale e riduzione degli altri in 27 (37%) e leggera riduzione di uno o più sintomi in 13 (18%) pazienti. Gli effetti collaterali sono stati minimi e sono scomparsi in pochi giorni con il proseguimento del trattamento.
Trasmissione sinaptica dai fotorecettori alle cellule bipolari e orizzontali nella retina della carpa.Le osservazioni più importanti nel presente studio possono essere riassunte come segue: 1 Nelle cellule orizzontali e bipolari, il blocco della trasmissione chimica ha causato cambiamenti di potenziale di membrana della stessa polarità delle risposte all'illuminazione in ciascun tipo di cellula 2. L'accelerazione del rilascio del trasmettitore dai terminali del recettore ha depolarizzato le cellule orizzontali, che è la polarità opposta alla risposta alla luce 3. La stimolazione da parte della corrente transretinica che fluisce dal lato del recettore al lato vitreo depolarizzava i terminali del recettore e innescava il rilascio del trasmettitore, che a sua volta evocava potenziali postsinaptici transitori nelle cellule orizzontali e bipolari. La polarità delle risposte postsinaptiche era l'opposto di quello di le risposte evocate dalla luce in ciascun tipo di cellula 4. Iperpolarizzazione dei terminali del recettore da parte del flusso di corrente di durata relativamente lunga g dal lato vitreo al lato recettore ha ridotto il rilascio del trasmettitore, come dimostrato dall'iperpolarizzazione cellulare orizzontale. 5. Da queste osservazioni si deduce che i recettori rilasciano il trasmettitore al buio e che la trasmissione depolarizza le cellule bipolari orizzontali e decentrate aumentando la permeabilità della membrana principalmente a Na+ e iperpolarizza la cellula bipolare centrale diminuendo la permeabilità della membrana a Na+.
Sovradosaggio di antidepressivi triciclici: studi sperimentali sulla gestione delle complicanze circolatorie.Il sovradosaggio di antidepressivi triciclici può essere complicato da aritmie cardiache, talvolta difficili da trattare prima dell'uso del bicarbonato di sodio. Sono stati fatti esperimenti con diversi antiaritmici nel tentativo di definire il trattamento ottimale. Il bicarbonato di sodio si è dimostrato il più efficace sperimentalmente e questo supporta la nostra esperienza clinica. La fisostigmina è un utile secondo farmaco, avendo effetti benefici contro le aritmie e manifestazioni di tossicità del sistema nervoso centrale. Il practololo, sebbene inverta le aritmie, tende a causare ipotensione. Altri farmaci provati sono stati meno efficaci.
Effetti della prazosina nei pazienti con ipertensione.Un percorso crossover con placebo in doppio cieco (2 periodi, ciascuno di 6 settimane) è stato effettuato in 12 pazienti. Nel primo periodo i pazienti sono stati assegnati in modo casuale alla loro dose individuale stabilita di prazosina o allo stesso numero di compresse di placebo; il trattamento è stato annullato dopo 6 settimane. La pressione sanguigna era più alta di 17/8 mm H in posizione sdraiata e di 24/14 mm Hg in posizione eretta durante il trattamento con placebo che durante il trattamento con prazosina La frequenza cardiaca e il peso corporeo in piedi erano più alti e l'attività della renina plasmatica era inferiore durante il trattamento con prazosina L'ipotensione posturale che si verificava da 1 a 2 ore dopo le prime dosi è stata osservata in un terzo dei pazienti quando hanno ripreso il trattamento con prazosina dopo il corso del placebo.
L'influenza del cibo sulla biodisponibilità della nitrofurantoina.L'effetto del cibo sull'assorbimento di cinque forme di dosaggio commerciali di nitrofurantoina che variano ampiamente nel rilascio e nella dissoluzione del farmaco caratteristiche sono state valutate nell'uomo dopo somministrazione orale Quattro soggetti maschi sani a digiuno e non a digiuno hanno ricevuto, in modo incrociato, una singola dose di 100 mg di nitrofurantoina microcristallina come sospensione acquosa, tre diverse compresse compresse e una singola dose di 100 mg di nitrofurantoina macrocristallina in una capsula Sia l'assorbimento che la durata delle concentrazioni urinarie terapeutiche di nitrofurantoina erano significativamente aumentate dopo la somministrazione dei cinque prodotti a soggetti non a digiuno L'aumento della biodisponibilità del farmaco in presenza di cibo variava dal 20% al 400 %, con il maggiore effetto di potenziamento dell'assorbimento che si verifica con quelle forme di dosaggio che presentano le caratteristiche di dissoluzione più scarse. ed che studi comparativi di biodisponibilità a dose singola di prodotti farmaceutici normalmente somministrati con il cibo dovrebbero essere eseguiti sia in soggetti non a digiuno che a digiuno.
Livelli ematici ed effetti elettroencefalografici di diazepam e bromazepam.I livelli ematici e i dati elettroencefalografici (EEG) sono stati raccolti per 2 ore dopo singole dosi orali di bromazepam (9 mg), diazepam (10 mg) e placebo in 13 volontari adulti maschi. Entrambi i farmaci hanno causato un aumento dell'attività beta (oltre 13 Hz) e una diminuzione dell'attività alfa (da 9 a 11 Hz) nell'EEG. Livelli ematici di 100 ng/ml di diazepam o 50 ng/ml di bromazepam sono stati associati a cambiamenti significativi nell'attività EEG beta. I cambiamenti temporali nell'EEG dopo la somministrazione di diazepam o bromazepam sono stati paralleli allo sviluppo dei livelli plasmatici di questi farmaci. trovato tra i livelli ematici misurabili di diazepam e la quantità di attività EEG beta aumentata, la relazione tra i livelli ematici misurabili di bromazepam e il grado di cambiamenti EEG non era significativa L'EEG quantitativo è una misura di risposta continua sensibile, utile per definire c attività cerebrale, latenza di risposta e potenza relativa delle benzodiazepine psicoattive.
Livelli plasmatici ed effetti del metoprololo sulla pressione sanguigna, sul blocco del recettore beta adrenergico e sull'attività della renina plasmatica nell'ipertensione essenziale.Gli effetti del metoprololo, un antagonisti selettivi dei recettori beta adrenergici, sulla pressione sanguigna, sul blocco dei recettori beta (antagonista di isoproterenolo e tachicardia da sforzo) e sull'attività della renina plasmatica (PRA) sono stati confrontati con quelli del placebo in 16 pazienti con ipertensione essenziale. La dose di metroprololo era di 25 mg tre volte al giorno per 1 settimana e successivamente 100 mg tre volte al giorno per 5 settimane La diminuzione media della pressione sanguigna durante il trattamento con metoprololo è stata di 24 +/- 3,8 (SEM)/10 +/- 2,1 mm Hg in posizione sdraiata e 23 +/- 4,4/9 +/- 3,1 mm Hg dopo 1 min in posizione eretta Alla dose di 2,9-5,4 mg/kg, le concentrazioni plasmatiche di metoprololo allo stato stazionario variavano di 17 volte (da 20 a 341 ng/ml ) tra i pazienti e correlato con la variabilità interindividuale nell'antagonismo dell'isoproterenolo ( r = 0,58, p inferiore a 0,05) e diminuzione della tachicardia da sforzo (r = 0,65, p inferiore a 0,01). Al contrario, nessuna di queste variabili era correlata alla dose di metoprololo in mg/kg. Il metoprololo ha ridotto la PRA di 67 +/- 1,9 e 71 +/- 1,2% rispettivamente in posizione sdraiata e in piedi. La diminuzione della pressione arteriosa media in posizione sdraiata era significativamente correlata al PRA durante il periodo del placebo (r = 0,61, p inferiore a 0,05) ma non ai livelli plasmatici di metoprololo allo stato stazionario, il grado di recettore beta blocco e la diminuzione del PRA.
Valutazione dell'attività funzionale dei linfociti umani nella malattia maligna mediante la reazione locale del trapianto contro l'ospite nei ratti e il test delle cellule formanti rosette T.La reazione locale del trapianto contro l'ospite (GVHR) e il test delle cellule formanti rosette spontanee (RFC) sono stati utilizzati per testare l'attività funzionale dei linfociti nel sangue ottenuto da venti donatori normali e trenta pazienti con tumori maligni. I linfociti di tutti e venti i donatori di controllo hanno dato un GVHR positivo e avevano valori di RFC normali. In ventidue dei trenta pazienti con tumori maligni il GVHR era negativo; di questi, solo cinque avevano valori di RFC bassi. Nei restanti otto pazienti il GVHR era positivo e RFC i valori erano normali. Si conclude che il GVHR locale costituisce un test sensibile per la misurazione dell'attività funzionale dei linfociti, mentre il test RFC può essere utilizzato solo come test quantitativo.
Stabilità e precisione di un nuovo sistema di controllo qualità amplificato per misurazioni di pH ed emogas.Descriviamo una valutazione della stabilità in uso e precisione a breve termine di un sistema di controllo della qualità con amplificazione a tre livelli per il monitoraggio delle misurazioni di pH, pCO2 e pO2 su emogasanalizzatori clinici. In tre laboratori ospedalieri, 324 di tali ampolle sono state aperte e lasciate riposare con il loro contenuto esposto a condizioni atmosferiche per intervalli accuratamente temporizzati fino a 240 s. I contenuti sono stati quindi analizzati per pH, pCO2 e pO2. È stato utilizzato il test t di Student per valutare la significatività delle differenze osservate nei recuperi dopo l'esposizione temporale. Ad un livello significativo di P inferiore o uguale a 0,05, gli unici cambiamenti significativi osservati durante il primo minuto di esposizione sono stati aumenti medi di pO2 di 180 Pa (1,4 mmHg) (+ 1,4%) e 230 Pa (1,7 mmHg) (+ 2,9%) a livelli di 13,4 e 7,7 kPa kPa (101 e 58 mmHg), rispettivamente. Il sistema amplificato era f sembra che sia stabile preciso conveniente e adatto per l'uso nel laboratorio di routine.
Determinazione dell'acido ossalico nelle urine mediante spettrofotometria ad assorbimento atomico.Viene descritto un metodo per la determinazione dell'acido ossalico nelle urine mediante spettrofotometria ad assorbimento atomico. La concentrazione di acido ossalico urinario si calcola utilizzando la differenza tra due determinazioni di calcio: primo, l'eccesso di calcio nel surnatante dopo la precipitazione come ossalato di calcio a pH 5, e secondo, il calcio totale determinato a pH inferiore a 1 (endogeno e aggiunto I parametri analitici (pH di precipitazione, temperatura, calcio e ossalato aggiunti, tempo di precipitazione, sostanze interferenti) sono stati studiati con l'ausilio dell'acido [14C]ossalico. Un recupero costante del 95% dell'acido ossalico totale consente l'utilizzo di un correttore fattore. L'accuratezza e la riproducibilità del metodo lo rendono utile per la determinazione di routine dell'acido ossalico urinario.
Misurazione del contenuto d'acqua delle feci con il metodo Karl Fischer.Descriviamo una tecnica per misurare il contenuto d'acqua delle feci con il metodo Karl Fischer. Il l'analisi si basa sulla rimozione dell'acqua in una miscela di metanolo/cloroformio (1/2), previa dispersione delle feci mediante sonicazione in presenza di solvente. Un'aliquota della soluzione così ottenuta viene posta nella cella di misura di un apparato Karl Fischer e quindi analizzato nel modo classico. Descriviamo ulteriormente i vantaggi di questo metodo (inodore, preciso, riproducibile) rispetto ad altri metodi attuali. Inoltre la stessa soluzione organica può essere utilizzata anche per determinare il contenuto lipidico delle feci.
Metodo semplificato, totalmente enzimatico per la determinazione dei trigliceridi sierici con un analizzatore centrifugo.Descriviamo un metodo totalmente enzimatico per la determinazione dei trigliceridi sierici (triacilgliceroli) specificatamente adattabile al sistema CentrifiChem Il metodo prevede la lipolisi con lipasi da solo Rhizopus arrhizus e la quantificazione del glicerolo risultante con glicerolo deidrogenasi in modalità cinetica a tempo fisso L'idrolisi da parte della lipasi è completa, per concentrazioni fino ad almeno 5,0 g /litro, in 10 min a temperatura ambiente. L'equilibrio sfavorevole per l'ossidazione del glicerolo viene superato aumentando il pH e aggiungendo l'eccesso di NAD+. In queste condizioni la determinazione del glicerolo è lineare ad almeno 4,0 g di glicerolo per litro, come trigliceride. Il test mostra un'accuratezza e una precisione accettabili e i risultati si correlano bene con quelli di una procedura totalmente enzimatica alternativa Il presente metodo non è influenzato dai fosfati e viene utilizzato un reagente notevolmente semplificato.
Reazione differenziale dei fosfolipidi e delle proteine della membrana cellulare con sonde chimiche.Gli obiettivi principali di questo studio erano determinare il grado di asimmetria fosfolipidica e il vicino analisi dei fosfolipidi in diversi tipi di membrane cellulari. Per questo studio sono state utilizzate una sonda penetrante (FDNB), una sonda non penetrante (TNBS) e una sonda reticolante (DFDNB). La reazione di emoglobina, proteina di membrana e PE di membrana e PS di eritrociti con DFNB e TNBS è stato studiato in un intervallo di concentrazione compreso tra 0,5 e 10 mM. Il TNBS reagisce in misura estremamente ridotta con l'emoglobina nell'intervallo di concentrazione tra 0,4 e 4 mM mentre FDNB reagisce con l'emoglobina in misura molto ampia (50 piega più di TNBS). La reazione della proteina di membrana degli eritrociti intatti raggiunge un plateau acuto a 1 mM TNBS mentre la reazione della proteina di membrana va in misura molto maggiore con FDNB senza plateau visto fino a 4 mM FDNB. Questi dati mostrano che TNBS non ot penetrare in modo significativo nella cellula nelle nostre condizioni mentre FDNB penetra nella cellula. I risultati mostrano che ci sono quattro volte più siti reattivi sulle proteine localizzate sulla superficie interna della membrana degli eritrociti rispetto alla superficie esterna. Il TNBS a una concentrazione da 0,5 a 2 mM non etichetta il PS della membrana ed etichetta il PE della membrana in misura ridotta. La reazione del PE con TNBS mostra un plateau iniziale alla sonda di 2 mM e un secondo plateau leggermente più alto tra la sonda da 4 a 10 mM. TNBS da 0,5-2,0 mM non reagisce con PS, ma tra 3 e 10 mM di concentrazione, una quantità molto piccola di PS reagisce con TNBS. Quindi sopra 2 mM TNBS o FDNB si verifica una perturbazione nella membrana tale che più PE e PS sono esposti e reagiscono con queste sonde. Questi risultati dimostrano che essenzialmente nessun PS è localizzato sulla superficie esterna della membrana e solo il 5% del totale della membrana PE è localizzato sulla superficie esterna della membrana degli eritrociti. TNBS e FDNB sono stati fatti reagire con cellule di lievito, E. coli e Acholeplasma. Con le cellule di lievito, FDNB reagisce in misura molto maggiore con PE rispetto a TNBS, indicando che FDNB penetra nella cellula ed etichetta più molecole di PE. Con E. coli, ma non con eritrociti o cellule di lievito, l'attività della fosfolipasi A era molto pronunciata a pH 8,5 dando origine a una grande quantità di DNP-GPE da DNP-PE. Era presente anche una fosfodiesterasi che idrolizzava DNP-GPE a DNP-etanolammina. La struttura multistrato dell'involucro delle cellule di E. coli non ha consentito un'interpretazione definitiva dei risultati. È chiaro, tuttavia, che TNBS e FDNB reagiscono in misura diversa con PE in questa cella. La membrana di Acholeplasma non aveva PE o PS rilevabili ma contiene esteri di amminoacidi di fosfatidilglicerolo. La reazione di questi componenti con TNBS e FDNB indica che questi aminoacil-PG sono localizzati su entrambe le superfici della membrana, con il 31% sulla superficie esterna e il 69% sulla superficie interna...
La forma e la funzione delle spirocisti cnidari. 2. Ultrastruttura della punta e della parete della capsula e meccanismo di scarica.La punta della capsula ad alta densità di elettroni ( cappuccio apicale) di anemoni di mare e spirocisti di corallo è di struttura diversa rispetto alla parete della capsula. La parete della capsula è composta da un doppio strato di materiali fibrosi che si incrociano approssimativamente ad angolo retto. Lo strato più interno è caratterizzato da numerose dentellature , le cui estremità sporgono nel lume della capsula. All'interno di ciascuna dentellatura, una banda di materiale finemente striato circonda la capsula ad angolo retto rispetto al suo asse longitudinale. La membrana che riveste il lume della capsula sembra essere continua con il parete del filo non scaricato. Lo strato esterno della parete della capsula è costituito da microfilamenti ravvicinati (cnidofilamenti) che sono orientati nell'asse longitudinale della capsula. I cnidofilamenti sembrano fondersi con il materiale del cappuccio apicale. Contrariamente ad alcuni precedenti In letteratura, è stato riscontrato che le spirocisti normalmente si scaricano per eversione, così come le nematocisti. Viene discussa la relazione tra la sottostruttura della parete della capsula e il processo di scarico della spirocisti.
Effetti del mezzo di contrasto angiografico sulla funzione del nodo seno-atriale.Iniezione di diatrizoato di meglumina (Renografin-76) nell'arteria del nodo senoatriale selettivamente perfusa di il cane produce bradicardia che non è alterata dal blocco autonomico o dalle variazioni della pressione arteriosa nel nodo seno-atriale I mezzi di contrasto e altre sostanze iperosmolari prolungano l'intervallo RR in proporzione alla loro osmolarità L'iniezione selettiva di mezzi di contrasto in altri segmenti cannulati dell'albero coronarico non produce variazione della frequenza cardiaca. L'arteriografia transfemorale, tuttavia, produce bradicardia con iniezioni coronariche sia di destra che di sinistra. Sia la depressione del nodo sinusale diretta che riflessa si verificano con l'arteriografia coronarica nel cane. Gli effetti diretti sono mediati dall'iperosmolarità.
Modelli per enzimi depolimerizzanti: criteri per la discriminazione dei modelli.Sono stati proposti diversi modelli per l'azione dell'alfa amilasi per spiegare la distribuzione non casuale di oligosaccaridi nei digest di amilasi dei polisaccaridi. Il modello di attacco preferito tenta di spiegare la distribuzione non casuale assumendo che la probabilità di rottura del legame dipende dalla posizione del legame nella catena. Il modello di attacco ripetitivo, o multiplo, suggerisce che la distribuzione non casuale degli oligosaccaridi si verifica perché un'amilasi può formare un complesso a gabbia con un substrato e attaccarlo più volte durante un singolo incontro. Il modello a più enzimi o a doppio sito suggerisce che la resa non casuale di oligosaccaridi deriva dall'azione combinata di eso- ed endo-enzimi Gli effetti del pH, degli inibitori e della lunghezza della catena del substrato sull'azione enzimatica sono stati studiati in diversi laboratori per determinare quale delle tre azioni- pattern descrive al meglio l'azione dell'alfa amilasi. L'influenza di queste variabili sulla distribuzione del prodotto o sui modelli di azione enzimatica è modellata matematicamente nell'Appendice. I dati sperimentali sull'alfa amilasi pancreatica suina sono discussi alla luce delle derivazioni.
Xerostomia indotta da radiazioni in pazienti oncologici. Effetto sugli elettroliti salivari e sierici.Le concentrazioni di saliva e di elettroliti sierici sono state monitorate in 30 pazienti trattati con un ciclo di radioterapia del cancro che produce xerostomia. La portata media della saliva intera stimolata è diminuita dell'83,3% durante un periodo di trattamento di 6 settimane. La notevole riduzione della produzione di saliva è stata accompagnata da aumenti significativi della saliva Na+, Cl-, Ca++, Mg++ e Prot. - concentrazioni e da una diminuzione del contenuto di HCO3 nella saliva. La saliva xerostomica era più concentrata e aveva una salinità maggiore rispetto alla saliva pretrattamento in ogni caso. Al contrario, nessuno degli elettroliti sierici misurati è stato significativamente alterato dall'arresto salivare subtotale.
Il dolore come causa principale di nausea postoperatoria.L'incidenza della nausea in relazione al dolore è stata registrata in 104 pazienti dopo operazioni addominali. Il 10% dei pazienti ha avuto episodi di nausea non correlati al dolore. Centoquattordici episodi di dolore e nausea concomitanti sono stati registrati in 61 pazienti (58,6%). L'iniezione endovenosa di morfina o chetobemidone ha alleviato la nausea e il dolore nell'80% degli episodi. Il sollievo dal dolore con la persistenza della nausea era raro e se il sollievo dal dolore era inadeguato, la nausea non diminuiva. La nausea è stata provocata dal 3,4% delle iniezioni di morfina, ma tutti i pazienti hanno tollerato dosi simili di morfina in altre occasioni senza nausea. spesso accompagna il dolore nel primo periodo postoperatorio e può essere alleviato in concomitanza con il dolore mediante l'uso endovenoso di oppiacei in dosi adeguate in un'alta percentuale di casi.
Confronto dell'attività antipertensiva dei farmaci beta-bloccanti durante il trattamento cronico.È stata confrontata l'attività ipotensiva di cinque antagonisti dei recettori beta-adrenergici con diverse proprietà farmacologiche ausiliarie in uno studio fattoriale randomizzato in doppio cieco su 25 pazienti non trattati con ipertensione essenziale stabile e non complicata A dosi che hanno prodotto riduzioni simili della tachicardia da sforzo, tutti i farmaci hanno mostrato un'attività di riduzione della pressione sanguigna simile, maggiore alla pressione sistolica rispetto a quella diastolica e maggiore durante l'esercizio. ad eccezione dell'attività vasodilatatrice, il possesso di una particolare combinazione di proprietà farmacologiche ausiliarie non ha influenzato significativamente l'attività antipertensiva specifica di questi composti.
Indagini per caratterizzare un nuovo farmaco antiaritmico, ORG 6001 compreso un semplice test per l'antagonismo del calcio.1 Il composto Org 6001 (3alfa-amino -2beta-idrossi-5alfa-androstan-17-one cloridrato) è stato trovato in recenti esperimenti per esibire attività antiaritmica. In questo documento sono presentate prove relative alla sua modalità d'azione.2 Org 6001 era 1,8 volte più potente della procaina come un anestetico locale sul nervo di rana sguainato.3 Org 6001 non ha avuto effetto sul potenziale di riposo del muscolo cardiaco isolato di coniglio, ma ha notevolmente ridotto la velocità massima di depolarizzazione (MRD). La durata del potenziale d'azione TAPD) ERA MARGINALMENTE PROLUNGATA IN ATRIALE E VENTRICOLARE MUSCLE.
Gli effetti del pentobarbitale e della petidina sui movimenti respiratori fetali nelle pecore.1 Piccole dosi di pentobarbitale (4 mg/kg iv) somministrate a pecore in l'ultimo terzo della gravidanza ha avuto effetti poco evidenti sulle madri. Nel feto hanno causato l'arresto dei movimenti respiratori, un'alterazione del carattere dell'elettrocorticogramma e cambiamenti cardiovascolari che variavano con l'età gestazionale.2 Al contrario, dosi relativamente elevate di petidina ( 100-200 mg) somministrati alla madre non hanno avuto un effetto consistente sui normali movimenti respiratori fetali, sebbene abbiano abolito la risposta fetale all'ipercapnia. 3 I risultati sono discussi in relazione allo stato di sonno fetale.
Selettività di agonisti e antagonisti dei recettori beta-adrenergici sui muscoli bronchiali, scheletrici, vascolari e cardiaci nel gatto anestetizzato.1 Le potenze di quindici beta- agonisti dei recettori adrenergici di strutture chimiche ampiamente differenti sono stati confrontati con quelli della (-)-isoprenalina sul muscolo bronchiale, sul muscolo soleo, sulla pressione sanguigna e sulla frequenza cardiaca nel gatto anestetizzato. Le potenze antagoniste dei recettori beta-adrenergici del propranololo e del practololo sono state determinate contro (-) -isoprenalina nello stesso modello.2 (-)-isoprenalina era l'agonista più potente e la sua azione era essenzialmente non selettiva. Pertanto, su tutti e quattro i parametri la dose efficace minima era 0,003-0,01 mug/kg e sono state prodotte risposte massime o quasi massime di 0,3-1 tazza/kg. Anche il trimetochinolo era un agonista essenzialmente non selettivo.3 Per tredici dei quattordici agonisti rimanenti, la potenza era simile sui muscoli bronchiali, sul muscolo soleo e sulla pressione sanguigna, ma significativamente più bassa sulla frequenza cardiaca.4 Th Anche l'agonista rimanente - AH 7616 (4-idrossi-alfa1-[[(1-metil-3,3-difenil-propil)ammino]-metil]-m-xilene-alfa1, alfa3-diolo, acetato) - era significativamente meno potente sulla frequenza cardiaca rispetto agli altri parametri; inoltre, era chiaramente meno potente sul muscolo soleo e sulla pressione sanguigna rispetto al muscolo bronchiale quando la 5-idrossitriptamina (5-HT) veniva usata per indurre il broncospasmo. Tuttavia, quando l'acetilcolina è stata utilizzata al posto della 5-HT, la potenza di AH 7616 sull'induzione del broncospasmo. Tuttavia, quando è stata utilizzata l'acetilcolina al posto della 5-HT, la potenza dell'AH 7616 sul muscolo bronchiale, sul muscolo soleo e sulla pressione sanguigna era molto simile. AH 7616 può quindi possedere una specifica azione antagonista della 5-HT in aggiunta alla sua azione agonista sui beta-adrenorecettori. 5 I quindici agonisti del test avevano un'azione più lunga della (-)-isoprenalina e questo era particolarmente vero per il trimetochinolo e il soterenolo. 6 La potenza dell'antagonista dei recettori beta-adrenergici del propranololo era quasi identica sul muscolo bronchiale, sul muscolo soleo e sulla pressione sanguigna e molto leggermente inferiore sul cuore. Practolol era 10-12 volte più potente sul cuore che sul muscolo bronchiale, sul muscolo soleo e sulla pressione sanguigna. 7 Questi risultati suggeriscono che potrebbe non essere possibile separare le proprietà broncodilatatrici e tremoreranti degli agonisti dei recettori beta-adrenergici. I risultati con agonisti e antagonisti sono in accordo con la sottoclassificazione di Lands\' dual beta-adrenoceptor.
[Un metodo di registrazione continua su microcampioni della curva di associazione Hb-O2. II. Uno studio sull'effetto Bohr e sulla formazione di carbamino (autore\'s trad.)]." Gli autori hanno elaborato un adattamento a microcampioni (200-400 mul) del metodo DUVELLEROY et al. , consentendo la registrazione continua della curva di associazione O2-Hb. Il microcampione essendo diluito in soluzione tampone, è è possibile predeterminare il suo pH e PCO2. Le condizioni prefissate vengono mantenute durante la fase iniziale di deossigenazione, e lungo tutta la registrazione della curva. Inoltre, l'adeguamento ai valori desiderati di pH e PCO2 consente la quantificazione dell'effetto BOHR totale, BOHR protonico effetto e formazione di carbamino, nel corso dell'ossigenazione.
Un metodo di registrazione continua su microcampioni della curva di associazione Hb-O2. I. Tecnica e registrazione diretta dei risultati standard.Una tecnica modificata per viene proposta la registrazione continua della curva di associazione Hb-O2 per i campioni di sangue Sono state studiate e convalidate le seguenti alterazioni al metodo classico di Duvelleroy et al. (5): 1) diluizione di microcampioni di sangue (200-400 mul) per 10 ml di una soluzione tamponata di fosfato;2) utilizzo di una miscela (CO2, O2) che consente il mantenimento di condizioni standard (pH=7.40, PCO2=40 Torr) durante l'intero processo di ossigenazione. I vantaggi di tali modifiche sono stati: 1) ridurre il tempo necessario sia alla deossigenazione che al tracciamento della curva di associazione Hb-O2 (a circa 20 min), consentendo quindi di elaborare grandi serie di campioni; 2) evitando la necessità di imprecise correzioni a posteriori, consentendo così l'analisi delle diverse componenti dell'effetto BOHR.
[Effetto del blocco dell'assorbimento neuronale ed extraneuronale delle bioamine sull'azione adrenosensibilizzante degli antidepressivi triciclici].Test condotti su preparati isolati e denervati del dotto seminale di ratto ha evidenziato che gli antidepressivi triciclici (melipromina, noverile e azafene) quando impiegati a basse concentrazioni (1-10(-9) g/ml) producevano un effetto adrenosensibilizzante. Denervazione con successivo blocco da parte del desossicorticosterone (1-10(-) 5) g/ml) di captazione di ammina exteraneuronale non ha alterato la posizione, la forma e l'inclinazione delle curve "concentrazione-effetto" della noradrenalina ricevute in presenza di novelile e cocaina. Si ritiene che esista una predominanza del postsinaptico meccanismo dell'azione aminosensibilizzante degli antidepressivi triciclici sull'organo muscolare liscio.
L'influenza dei fosfati organici sull'effetto Bohr degli ibridi di valenza dell'emoglobina umana.L'effetto Bohr dell'emoglobina e quello degli ibridi di valenza aquomet e cianomet è stata misurata in presenza e assenza di IHP (inositolo esafosfato) e DPG (2,3-difosfoglicerato). In assenza di questi fosfati organici i quattro ibridi mostrano effetti Bohr simili, ma soppressi rispetto all'emoglobina. Aggiunta di IHP e Il DPG determina in tutti i casi un aumento dell'effetto Bohr. L'effetto Bohr aggiuntivo indotto da fosfato degli ibridi con catena alfa in forma ossidata è quasi identico a quello dell'emoglobina, mentre questo effetto degli ibridi con catene beta ossidate è leggermente inferiore a quello dell'emoglobina. I risultati suggeriscono (a) che l'effetto Bohr è correlato allo stato di legatura della molecola di emoglobina piuttosto che alla sua struttura quaternaria (b) che l'effetto Bohr aggiuntivo indotto dal fosfato è correlato al ch ange nella struttura quaternaria del tetramero, e (c) che rispetto all'effetto Bohr degli ibridi non c'è differenza tra specie ad alto e basso spin.
Termodinamica delle reazioni catalizzate da esochinasi. II. Misura e calcolo delle entalpie di reazione in funzione della concentrazione di ioni magnesio.Entalpie di fosforilazione del glucosio da l'adenosina 5\'-trifosfato è stata misurata in funzione delle concentrazioni di cloruro di magnesio nel tampone TRIS/TRIS-HCl nell'intervallo di pH da 8,64 a 8,98. Queste misurazioni vengono confrontate con i risultati dei calcoli di queste entalpie che utilizzano un formalismo di equilibrio accoppiato con dati di equilibrio e valori di entalpia selezionati dalla letteratura. I risultati sperimentali spaziano nell'intervallo di concentrazioni di ioni magnesio 1 X 10(-6) a 0,3 mol alfa-1 e mostrano una variazione totale dell'entalpia di reazione di quasi 10 kJ mol- 1, con la reazione più esotermica che si verifica a una concentrazione di ioni magnesio di 6,0 X 10 (-4) mol alfa-1. Le entalpie di reazione calcolate, ad eccezione dell'intervallo di concentrazione di ioni magnesio da 4 X 10 (-6) a 5 X 10 (-4) mol alfa- 1, sono, entro intervalli di incertezza stimati (da 0,8 a 10,2 kJ mol-1), in accordo con i valori misurati.
Relazioni struttura-volume nell'emoglobina. Uno studio densitometrico e dilatometrico dell'ossi porta alla trasformazione deossi.Sono state eseguite misurazioni parziali del volume dell'emoglobina umana , sia sulle forme ossigenate che deossigenate. Le misurazioni della densità (mediante picnometria) danno vHbO2 = 0,752 +/- 0,002 e vHb =0.753 +/- 0,006 per il volume specifico parziale e non distinguono tra le due diverse strutture. le misurazioni, mediante dilatometria, mostrano invece un volume molare significativamente più alto (di circa 50 cm3/mol di emoglobina tetramero) per il deossi rispetto all'ossigenato a partire da pH 7. La stessa reazione, a pH 9, dà un aumento molto minore o addirittura un diminuzione di volume. Le diverse variazioni di volume a pH 7 e a pH 9 non sono dovute alla cosiddetta ionizzazione di Bohr ma all'indebolimento, a pH 9 rispetto a pH 7, dei legami stabilizzanti del sale nella struttura deossi.
Proprietà leganti il Ca++ della protrombina umana.Il legame del Ca++ alla protrombina umana è stato studiato mediante dialisi all'equilibrio. La proteina ha mostrato un fenomeno di cooperatività positivo per i primi tre legami Ca++. Sono stati trovati da undici a dodici siti di legame Ca++. Potrebbero essere differenziati in termini di due classi di siti rispetto alla loro affinità Ca++: 5 siti di legame forte (log Kassoc = 3.9) e 7 siti di legame debole (log Kassoc = 2.9). Abbiamo tentato di determinare il coefficiente di Hill dei siti di forte legame responsabili della cooperatività. I risultati sono stati confrontati con i dati precedentemente riportati per la protrombina bovina.
Reazioni primarie del fotosistema II a pH basso. 2. Cambiamenti indotti dalla luce dell'assorbanza e della risonanza dello spin elettronico nei cloroplasti degli spinaci.Gli effetti dell'abbassamento il pH sul Fotosistema II è stato studiato misurando i cambiamenti nell'assorbanza e nella risonanza di spin elettronico nei cloroplasti degli spinaci. A valori di pH intorno a 4 è stata osservata un'ossidazione della clorofilla reversibile al buio indotta dalla luce da parte del Fotosistema II. Questa clorofilla è presumibilmente il principale donatore di elettroni di sistema II. A valori di pH compresi tra 5 e 4, l'illuminazione allo stato stazionario ha indotto un segnale ESR, simile per forma e ampiezza al segnale II, che è stato rapidamente invertito al buio. Ciò può riflettere l'accumulo del donatore secondario ossidato all'inibizione dell'evoluzione dell'ossigeno Vicino a pH 4 il segnale rapidamente reversibile e le componenti stabili e a lento decadimento del segnale II scomparvero irreversibilmente in concomitanza con il rilascio di manganese legato I risultati sono discussi in relazione all'effetto s di pH basso su fluorescenza immediata e ritardata riportati in precedenza (van Gorkom, H. J. , Pulles, M. P. J. , Haveman, J. e den Haan, G. A. (1976) Biochim. Biofisi, Acta 423, 217-226).
Traslocazioni protoniche guidate dalla luce in Halobacterium halobium.La membrana viola di Halobacterium halobium agisce come una pompa protonica guidata dalla luce, espellendo i protoni dalla cellula interno nel mezzo e generando un gradiente protonico elettrochimico attraverso la membrana cellulare. Tuttavia, la risposta tipo delle cellule alla luce misurata con un elettrodo di pH nel mezzo consiste in un afflusso netto iniziale di protoni che si attenua e viene quindi sostituito da un deflusso netto che si avvicina in modo esponenziale a un nuovo livello di pH allo stato stazionario più basso. Quando la luce si spegne si verifica una piccola acidificazione transitoria prima che il pH ritorni al livello scuro originale. Presentiamo esperimenti che suggeriscono che l'afflusso iniziale di protoni è innescato dall'espulsione iniziale di protoni attraverso la membrana viola e che la velocità di afflusso iniziale è maggiore del continuo deflusso guidato dalla luce. Quando l'afflusso iniziale è diminuito esponenzialmente a un piccolo valore, il deflusso domina tes e provoca l'acidificazione netta del mezzo. L'afflusso iniziale è apparentemente guidato da un gradiente elettrochimico preesistente attraverso la membrana, che le cellule possono mantenere per periodi prolungati in assenza di luce e ossigeno. I trattamenti che riducono questo gradiente, come l'aggiunta di piccole concentrazioni di disaccoppiatori, aboliscono l'afflusso iniziale. L'afflusso innescato avviene attraverso l'ATPasi ed è accompagnato dalla sintesi di ATP. Gli inibitori dell'ATPasi come N,N\'-dicicloesilcarbodiimmide (DCCD) inibiscono la sintesi di ATP e aboliscono l'afflusso. Inoltre aboliscono l'acidificazione transitoria a luce spenta, che è apparentemente causata da un breve scoppio di idrolisi dell'ATP prima che l'enzima venga bloccato dal suo inibitore endogeno. Afflussi e deflussi transitori simili di protoni si osservano anche quando le cellule anaerobiche sono esposte a brevi impulsi di ossigeno.
Fotosintesi in un sistema di cloroplasti ricostituiti da spinaci. Alcuni fattori che influenzano l'evoluzione dell'ossigeno CO2-dipendente con fruttosio-1,6-bisfosfato come substrato.Quando i cloroplasti di spinaci privi di busta vengono incubati con proteina stromale, NADP catalitico, ADP catalitico, bicarbonato radioattivo e fruttosio 1,6-bisfosfato, la fissazione di 14CO2 inizia immediatamente dopo l'illuminazione ma l'evoluzione dell'ossigeno è ritardata. Il ritardo è aumentato dall'aggiunta di fruttosio 6- fosfato e da una varietà di fattori noti (o ritenuti) per aumentare l'attività della fruttosio bisfosfatasi (come ditiotreitolo, pH più alcalino, [Mg] più alto e antimicina A). Al contrario, il ritardo può essere ridotto o eliminato con l'aggiunta di un ATP -sistema generatore. Tenendo presente la nota inibizione, da parte dell'ADP, della riduzione del sn-fosfo-3-glicerato (3-fosfoglicerato) si conclude che il ritardo nell'evoluzione dell'O2 deriva dalla produzione di ribulosio 5-fosfato dal fruttosio bisfosfato e e che questo a sua volta inibisce la riossidazione del NADPH influenzando negativamente il rapporto ADP/ATP. I risultati sono discussi in relazione alla modalità d'azione dell'antimicina A e alla regolazione della via riduttiva del pentoso fosfato.
Fattori che influenzano il rapporto ADP/O nei cloroplasti isolati.(1) L'effetto della rottura graduale della membrana esterna dei cloroplasti intatti sulla fissazione della CO2 , il trasporto degli elettroni e la fosforilazione sono stati studiati. I risultati hanno suggerito che mentre le quantità di ferricianuro e substrato di ADP entrano nei cloroplasti intatti solo molto lentamente, il metil viologeno penetra rapidamente nella membrana esterna. (2) I preparati di cloroplasti di pisello intatti hanno avuto una reazione di consumo di ATP che ha portato in rapporti ADP/O ridotti quando il trasporto di elettroni non ciclico è stato misurato dopo la rottura della membrana esterna. La reazione che consuma ATP è stata rimossa nel surnatante dopo aver lavato i cloroplasti distrutti. I cloroplasti lavati risultanti hanno fornito rapporti ADP/O di 1,5-1,6 per il ferricianuro e 1,9-2,0 per il metil viologeno (3) Le preparazioni di cloroplasti di spinaci intatti avevano una minore attività della reazione di consumo di ATP e fornivano rapporti ADP/O simili ai cloroplasti di pisello lavati. I rapporti ADP/O dei cloroplasti di spinaci non si sono modificati in modo significativo dopo il lavaggio. (4) Un'indagine sull'effetto di varie condizioni di dosaggio sul rapporto ADP/O ha mostrato che la concentrazione di fosfato era fondamentale per ottenere valori ottimali per il rapporto ADP/O. Diminuendo la concentrazione di fosfato al di sotto di 10 mM si riduceva significativamente il rapporto ADP/O. (5) Si suggerisce che il rapporto ADP/O massimo dei cloroplasti sia 2,0 ma che valori inferiori possono essere ottenuti in presenza di una reazione che consuma ATP, in condizioni di analisi subottimali o dove i cloroplasti sono strutturalmente danneggiati.
Ossidazione della sarcosina e dei derivati N-alchilici della glicina mediante D-amminoacido ossidasi.1. La sarcosina è stata ossidata mediante D-amminoacido ossidasi (D-amminoacido: O2 ossidoreduttasi (deaminante), EC 1.4.3.3) per produrre metilammina e acido gliossilico. Anche una serie di N-alchilglicine è stata ossidata da questo enzima. 2. N-acetil- e N-fenilglicina ha inibito l'ossidasi competendo con il substrato, mentre la N-metil-N-acetilglicina non si è legata all'enzima. Ciò suggerisce la necessità di almeno un atomo di idrogeno non sostituito al gruppo amminico della glicina per il legame. La reazione è stata il rilascio di un protone dal substrato, che indica la formazione di un imminoacido sostituito, che è stato spontaneamente idrolizzato ad acido gliossilico e un'ammina.
Proprietà della lisil ossidasi altamente purificata dalla cartilagine embrionale di pollo.Lysil ossidasi l'enzima che ossida i residui di lisina nel collagene e nell'elastina, è stato purificato da cartilagine di pulcino impiegando una colonna di affinità di collagene latiritico di pelle di ratto accoppiato a Sepharose, seguita da separazione su DEAE-cellulosa. Si ottenne una preparazione enzimatica che era pura come dimostrato dall'elettroforesi su gel di poliacrilammide. L'attività specifica era 1800 volte superiore a quella di l'estratto originale. L'enzima puro utilizzava sia il substrato di collagene che quello di elastina. Inoltre, i rapporti di attività enzimatica con il substrato di elastina rispetto a quello con il substrato di collagene erano gli stessi in tutte le fasi di purezza. Solo una banda proteica è stata trovata dopo l'elettroforesi su gel di poliacrilammide del pura lisil ossidasi in sodio dodecil solfato e mercaptoetanolo. Il peso molecolare è stato stimato essere 28000. Si è riscontrato che l'enzima conteneva un grande nu mber di cisteina e tirosina residui. Sono state ottenute prove dell'eterogeneità molecolare della lisil ossidasi. L'enzima eluito da DEAE-cellulsoe in almeno quattro regioni distinte. Quando i picchi sono stati ricromatografati separatamente, sono stati eluiti a concentrazioni di sale simili a quelle del cromatogramma originale. Tuttavia, la specificità del substrato e la mobilità elettroforetica sul gel di poliacrilammide erano le stesse per tutte le frazioni enzimatiche.
Guanilato ciclasi. Esistenza di diverse forme e loro regolazione da parte dei nucleotidi nell'utero del vitello.L'attività della guanilato ciclasi dell'utero del vitello (EC 4.6.1.2) esiste in almeno due e molto probabilmente tre forme distinte. L'enzima citosolico presenta curve di substrato iperbolico rispetto a GTP e Mn2+, mentre le ciclasi particolato (nucleare e microsomiale) mostrano relazioni sigmoidale (GTP) e iperbolica (Mn2+). Il coefficiente di Hill per la dipendenza da GTP è 0,9 per il citosolico, 1,5 per il nucleare e 1,4 per l'enzima microsomiale L'enzima citosolico ha un Km per GTP di 70 muM mentre la metà della velocità massima si verifica a 90 e 100 muM GTP per gli enzimi nucleari e microsomiali , rispettivamente. Il Ka per Mn2+ è 0,57, 0,71 o 0,75 mM per l'enzima citosolico, nucleare o microsomiale, rispettivamente.
Importanza dei gruppi SH nella catalisi da fosfatasi acida cerebrale bovina.Il tasso di inattivazione della fosfatasi acida (EC 3.1.3.2) dal cervello bovino da parte ditiobis-(acido 2-nitrobenzoico) (Nbs2) è identico alla velocità di titolazione di uno dei due gruppi SH di questo enzima. La velocità di inattivazione dell'enzima da parte di Nbs2 è pH dipendente e, a 300 mM NaCl, può essere descritto dalla reazione di un singolo gruppo SH di pK 8,4. A bassa forza ionica il pK determinato dall'inattivazione k rispetto al profilo pH è 7,7 e i risultati si discostano notevolmente dai valori previsti a valori di pH inferiori o uguali a 6. la diminuzione di V dopo l'aggiunta di sali è parallela alla diminuzione del tasso di inattivazione da parte di Nbs2. La rilevanza dei gruppi SH nella catalisi da parte della fosfatasi acida cerebrale bovina è discussa in termini di questi dati.
Le reazioni di trasferimento protonico catalizzate dalla piruvato chinasi di lievito.1. Sono state studiate le reazioni di trasferimento protonico della piruvato chinasi di lievito (EC 2.7.1.40) Il trasferimento del protone dal C-3 del fosfoenolpiruvato all'acqua avviene solo in presenza dell'ADP accettore del fosforo Il trasferimento del protone dal C-3 del piruvato all'acqua avviene solo in presenza dell'ATP Tuttavia, il trasferimento del protone in quest'ultimo si verifica 10-100 volte più velocemente del trasferimento di fosforile; questo supporta un meccanismo in cui il trasferimento di protoni precede il trasferimento di fosfori nella reazione inversa della piruvato chinasi 2. Le caratteristiche delle reazioni di trasferimento di protoni della piruvato chinasi di lievito sono state confrontate con quelle precedentemente riportate per piruvato chinasi del muscolo di coniglio (Robinson, JL. e Rose, IA (1972) J. Biol. Chem. 247, 1096-1105) I profili di pH e le dipendenze da cationi bivalenti erano simili per Fru-1,6-P2 attivato lievito piruvato chinasi e l'enzima muscolare enolizzazione del piruvato da parte di ye L'ast piruvato chinasi ha un requisito assoluto di ATP in contrasto con l'enolizzazione da parte dell'enzima muscolare che procede quando l'ATP viene sostituito da Pi o altri dianioni. 3. È stato dimostrato che il fruttosio-1,6-bisfosfato influenza le fasi catelitiche della piruvato chinasi del lievito oltre al legame dei substrati. Il suo ruolo dipende dal catione bivalente utilizzato per attivare l'enzima.
Reazioni secondarie della chinasi catalizzate dalla piruvato chinasi del lievito.1. La piruvato chinasi del lievito (EC 2.7.1.40) catalizza, oltre alla prima, fisiologicamente importante reazione, tre reazioni secondarie della chinasi, le fosforilazioni ATP-dipendenti di fluoruro (fluorochinasi), idrossilammina (idrossilammina chinasi) e glicolato (glicolato chinasi). 2. Queste reazioni sono accelerate dal fruttosio-1,6-bisfosfato, l'attivatore allosterico di la reazione primaria. Con Mg2+ come catione bivalente richiesto, nessuna di queste reazioni si osserva in assenza di fruttosio-bifosfato. Con Mn2+, il fruttosio-bisfosfato è richiesto per la reazione della glicolato chinasi, ma semplicemente stimola le altre reazioni. 3. La è stato inoltre esaminato l'effetto di altri cationi bivalenti e il pH su tre reazioni secondarie della chinasi 4. I risultati vengono confrontati con quelli ottenuti dalla piruvato chinasi muscolare e vengono discusse le implicazioni dei risultati per il meccanismo dell'enzima del lievito.
dipendenza dal pH delle costanti di accoppiamento 13C-15N di amminoacidi altamente arricchiti di 14N isolati dalla coltivazione di massa di alghe.L'alga Ankistrodesmus braunii è stata coltivata con [14N]nitrato in condizioni ottimizzate di una coltivazione di massa su larga scala. Il 19,7% delle alghe essiccate è stato isolato come una miscela di amminoacidi. Gli amminoacidi marcati con 15N (contenuto di 15N fino al 98%) sono stati separati mediante cromatografia a scambio ionico utilizzando gradienti di acetato di piridina. Il contenuto di 15 N dell'amminoacido analiticamente puro è stato determinato mediante cromatografia gassosa-liquida-spettrometria di massa degli esteri metilici trifluoroacetilati e mediante spettroscopia di emissione nell'analizzatore 15 N. Utilizzando la risonanza magnetica nucleare 13C con trasformata di Fourier a impulsi, la dipendenza dal pH delle costanti di accoppiamento 13C-15N di Asp, Pro, Ser, Glu, Gly, Ala, Val, Ile e Leu sono state determinate in soluzioni acquose Costanti di accoppiamento crescenti sono state trovate rispettivamente con pH e densità elettronica decrescente. ione di Binsch et al. (Binsch, G. , Lambert, JB, Roberts, BW e Roberts, JD (1964) J. Am. Chem. Soc. 86,5564-5570) tra la costante di accoppiamento e il prodotto della parte S del 13C e L'ibridazione 15N SC - SN = 80 - J (13C-45X) si adatta meglio al mezzo acido. L'entità delle costanti di accoppiamento si correla bene con le densità di elettroni calcolate da Del Re et al. (Del Re, G. , Pullman, B. e Yonezawa, T. (1963) Biochim. Biophys. Acta 75, 153-182). La registrazione degli spettri di risonanza magnetica nucleare 13C sull'intero intervallo di pH non ha rivelato alcun cambiamento nel segno delle costanti di accoppiamento 13C-15N degli amminoacidi.
Sistema recettore-adenilato ciclasi dell'istamina (H2) nella pelle di maiale (epidermide).Adenilato ciclasi attivata dall'istamina in fette di pelle di maiale (epidermide), risultante nell'accumulo di AMP ciclico. Questo effetto è stato fortemente potenziato dall'aggiunta di inibitori ciclici dell'AMP-fosfodiesterasi (teofillina, papaverina). Un inibitore specifico del recettore H2 (metiamide) ha inibito completamente l'effetto dell'istamina, mentre altri antistaminici (difenidramina, acetofenazina, perfenazina, flufenazina, prometazina) hanno inibito l'effetto dell'istamina in vari gradi minori. È stato dimostrato che sia l'adrenalina che la prostaglandina E stimolano l'adenilato ciclasi epidermica. I nostri dati utilizzando agenti bloccanti specifici indicano che l'istamina, l'adrenalina e la prostaglandina E2 agiscono indipendentemente sull'epidermide sistema adenilato ciclasi.
La dissociazione della deossiemoglobina umana e dell'emoglobina allo stato misto in monomero.Le ibridazioni sperimentali tra emoglobine umane e canine completamente deossigenate e tra emoglobina umana semilegata e la cianometemoglobina canina mostrano che nuovi due ibridi oltre alle emoglobine progenitrici si sono chiaramente formati nelle miscele ad alta concentrazione di KI. Pertanto, la deossiemoglobina umana nelle condizioni attuali è in equilibrio con tre specie, tetramero in equilibrio dimero in equilibrio monomero Ciò significa che la deossiemoglobina è in equilibrio RT e nelle condizioni attuali si sposta considerevolmente verso lo stato R. D'altra parte, l'emoglobina semilegata in 1,5 M KI diventa molto più dissociabile dello stato deossi T e sembra essere completamente trasformato nello stato R. Tuttavia, la cooperazione, n, è ancora alta (n = 2.0).
L'interazione della riboflavina con una proteina isolata dall'albume di gallina: uno studio spettrofluorimetrico.L'interazione della riboflavina con una proteina isolata dall'uovo il bianco è stato studiato spettrofluorimetricamente a diversi valori di pH. In tampone fosfato 0,1 M pH 7,0;La formazione del complesso 1:1 avviene con la costante di associazione Ka = 7,7-10(7) M-1. In presenza di 0,033% di sodio dodecilsolfato , il complesso si è dissociato con una costante di velocità di 4-10(-2) sec-1 a 29 gradi C. Il legame era sensibile al pH e agli anticorpi prodotti contro la proteina. Abbassando il pH da 7 a 4 l'affinità di legame diminuito di circa 100 volte e al di sotto di pH 4, il legame non è stato affatto rilevato. Questi dati, insieme a quelli ottenuti misurando le intensità di fluorescenza della riboflavina in presenza di apoproteina ossidata N-bromosuccinimide e ridotta disolfuro, suggeriscono che le funzioni carbossiliche , 1-2 residui di triptofano e 2-3 di i ponti di solfuro sono essenziali per il legame. Gli spettri di emissione della proteina in diverse condizioni all'eccitazione a 280 e 295 nm sono stati analizzati per calcolare la resa quantica (Q) e l'efficienza del trasferimento di energia (e) dalla tirosina ai residui di triptofano. Da questi dati si è concluso che il trasferimento di energia non è avvenuto con uguale efficienza in tutte le condizioni e che i residui di triptofano responsabili del legame con la riboflavina sono più accessibili di altri all'ossidazione della N-bromosuccinimide.
Proteine di ferro non eme. La sequenza amminoacidica della rubredossina da Desulfovibrio vulgaris.Una proteina di ferro non eme, la rubredossina è stata isolata dal batterio solfato-riduttore, Desulfovibrio vulgaris, ceppo Hildenborough. La sequenza aminoacidica completa è stata stabilita. I 52 residui aminoacidici della proteina sono stati allineati con l'ausilio di peptidi triptici e chimotriptici e di un frammento prodotto dalla scissione dell'Asn-Gly legame (22-23) da idrossilammina. La sequenza dei primi 30 residui della molecola è stata determinata utilizzando un sequenziatore automatico, previa rimozione della metionina N-terminale da parte di CNBr. Nel confrontare questa sequenza con quelle di Micrococcus aerogenes, Clostridium pasteurianum e Peptostreptococcus elsdenii rubredoxins, è stato osservato un alto grado di mutazione tra queste proteine omologhe. È stato dimostrato che 20 residui di amminoacidi si sono verificati in posizioni identiche. Le posizioni dei quattro residui di cisteina erano fo ed essere invariabile. È in corso uno studio cristallografico della rubredoxina Desulfovibrio vulgaris.
Caratteristiche strutturali della luliberina (fattore di rilascio dell'ormone luteinizzante) dedotte dalle misurazioni della fluorescenza.Gli spettri di fluorescenza ed eccitazione della luliberina (fattore di rilascio dell'ormone luteinizzante) ) in 0,005 M acquoso di acetato di ammonio sono identici nella forma a quelli dell'N-acetiltriptofano ammide e sono correlati alla catena laterale dell'indolo di Trp3. l'aumento del pH da 4 a 7,5 è seguito da un aumento di circa il 50% dell'intensità di fluorescenza dovuto alla deprotonazione della catena laterale dell'imidazolo di His 2. La curva di titolazione fluorimetrica in questa regione del pH rivela un valore di pK per His2 di 5,95. Aumento del pH da 8 a 11 determina l'estinzione di circa il 40% della fluorescenza dovuta al trasferimento elettronico di energia dall'indolo eccitato di Trp3 alla catena laterale fenolata di Tyr5. Il valore di pK di Tyr5, ottenuto indipendentemente dai titoli fluorimetrici e fotometrici ons indicano che a pH 7-8 lubiberin contiene un solo residuo carico, Arg8, che è nelle immediate vicinanze sia di His2 che di Tyr5. Le catene laterali di His2, Tyr5 e Arg8 presumibilmente formano un'unità combinata che può svolgere un ruolo attivo nell'azione dell'ormone. Trp3 si trova alla massima distanza da questa unità e può quindi agire come un'unità attiva indipendente.
Dicroismo magnetico circolare dei complessi mioglobina-tiolato.Vari complessi di mioglobina (Mb) con tiolato sono stati studiati mediante l'uso del dicroismo magnetico circolare (MCD) spettroscopia 1. I complessi MetMb-etile, n-propile e isopropilmercaptano hanno offerto spettri MCD simili a quelli del citocromo P-450 (P-450) rispetto alla forma e al rapporto di intensità di Soret MCD e Q0-0 MCD. Gli spettri MCD hanno fatto non mostrano alcuna dipendenza dal pH. I complessi ridotti dal ditionito di sodio hanno mostrato lo spettro MCD di deoxyMb, indicativo del rilascio di anione tiolato dal ferro eme 2. Cisteina e cisteina metil estere coordinati al ferro eme a pH 9,18 ma non a pH 6,86 e 11.45. Il complesso formato a pH 9.18 ha fornito uno spettro MCD simile a quello di P-450 e uno spettro MCD di deossi Mb sulla riduzione con ditionito di sodio. 3. Il complesso del 2-mercaptoetanolo mostrava tre termini A associati al Q0- 0-1, e le transizioni di Soret a pH 6,86 simili a quelle di Fe(II) cy tocromo c, che indica che Mb è stato ridotto da questo reagente a pH 6,86. A pH 9,18 il 2-mercaptoetanolo ha fornito uno spettro MCD simile a quello dell'alchil mercaptano subito dopo l'aggiunta. Con il tempo si è trasformato in deossi Mb attraverso qualche intermedio del complesso Mb-tiolato ridotto. A pH 11,45 il 2-mercaptoetanolo formava un complesso che mostrava uno spettro MCD simile a quello di altri alchilmercaptani. 4. Il solfuro di sodio ha fornito uno spettro MCD che assomigliava a quello del normale complesso tiolo Mb subito dopo l'aggiunta a pH 6,86. Il complesso è stato gradualmente ridotto per dare un trogolo di 610 nm oltre al MCD di deossi Mb. Il complesso Mb-zolfo formato a pH 9,18 è stato gradualmente ridotto per dare uno spettro MCD abbastanza diverso da quello del deossi Mb. Uno spettro MCD simile è stato osservato a pH 11,45 subito dopo l'aggiunta di Na2S. Questi risultati sono stati considerati suggerire la saturazione di uno dei doppi legami coniugati della porfirina da parte dello zolfo.
Studi sull'emoglobina di cammello. 1. Proprietà fisico-chimiche e alcuni aspetti strutturali dell'emoglobina di cammello (Camelus dromedarius).Emoglobina di un cammello adulto ( Camelus dromedarius) è stato preparato dal lisato di globuli rossi mediante cromatografia CM- e DEAE-cellulosa. L'emoglobina purificata ha mostrato una mobilità minore all'elettroforesi su gel di amido a pH 8,5 rispetto a quella dell'emoglobina umana C. L'emoglobina di cammello nativo contiene 95-99% di alcali- emoglobina resistente e solubile in tampone K2HPO4/KH2PO4 2,94 M. Diverse forme di emoglobina di cammello mostrano curve di precipitazione di solfato di ammonio simili. Prove indirette della stabilità delle soluzioni di emoglobina di cammello sono state ottenute da diverse fonti. La formazione spontanea di metemoglobina è estremamente lenta e minima quantità di prodotti di degradazione compaiono sull'elettroforesi su gel di amido e sulla separazione cromatografica Le catene alfa e beta dell'emoglobina A di cammello sono state separate su una colonna CM-23 mediante l'uso di un py gradiente di formiato ridine. Grandi frammenti peptidici sono stati ottenuti mediante digestione triptica di catene alfa e beta maleilate. Viene presentata la struttura N-terminale delle catene alfa e beta e dei peptidi triptici maleilati derivati dalle catene alfa e beta. Tra l'emoglobina di cammello adulto e l'emoglobina umana adulta sei differenze di aminoacidi nei 20 residui di aminoacidi N-terminali della catena alfa, ai residui: 4, 5, 12, 14, 17 e 19; otto sostituzioni di amminoacidi sono state trovate nella catena beta nelle posizioni: 4, 5, 6, 9, 12, 13, 16 e 19. Le sostituzioni in alfa5 Ala portano a Lys e beta19 Asn porta a Lys, aumentano la carica netta positiva di emoglobina di cammello per due, mentre altre sostituzioni non comportano differenze di carica. Viene discussa la base molecolare della stabilità dell'emoglobina adulta di cammello.
Un'indagine su un insolito residuo istidilico nell'Escherichia coli B L-asparaginasi attraverso l'estinzione della fluorescenza.La fluorescenza triptofanilica di Escherichia coli B L-asparaginasi è parzialmente spento dalla forma protonata di una base con pKa 6,0 a 25 gradi C, mu = 0,1. Questa base è stata identificata come residuo istidilico per effetto della forza ionica e della polarità del solvente sul pKa. Inoltre dietilpirocarbonato che modifica due residui istidilici nell'enzima abolisce la titolazione fluorescente e riduce l'attività enzimatica del 90%. La dipendenza dalla temperatura del pKa dell'istidina è insolita, mostrando un minimo a 25 gradi C, un'analisi termodinamica dei dati mostra che ciò è dovuto a un grande negativo termine delta Cp associato alla ionizzazione. Questo viene interpretato in termini di movimento di residui idrofobici nell'enzima sulla deprotonazione del residuo istidilico. La resa quantica della L-asparaginasi e la sua temperatura La dipendenza è stata misurata. La resa quantica è elevata e c'è una bassa energia di attivazione per la disattivazione senza radiazioni dello stato eccitato, entrambi coerenti con un ambiente triptofanile lontano dal solvente.
Un sulfonolipide e nuovi glucosamidi glicolipidi dal Bacillus acidocaldarius estremo termoacido.Il contenuto lipidico totale del Bacillus acidocaldarius termoacido estremo comprende circa l'8,1% del peso secco cellulare Il lipide totale aveva una distribuzione del 15,7% componente neutro linique inizialmente caratterizzato come un N-acilglucosamina beta-legato all'idrossile primario di un insolito tetrolo pentaciclico triterpenico completamente saturo (C35H62O4, Mr 546), che sembra essere un derivato del triterpene opano pentacilico sostituito in C-29 con un 1,2,3,4-tetraidrossi pentano Altri importanti glicolipidi presenti sono stati parzialmente caratterizzati come O-beta-D-glucopiranosil-(1 porta a 4)-O-2 -acilammido-2-deossi-beta D-glucopiranosildiacilglicerolo e O-beta-D-glucopiranosil-(1 porta a 4)-O-2-acilammido-2-deossi-beta-D-glucopiranosilmonoacilglicerolo Componenti minori della frazione glicolipidica inclusi O-beta-D-glucopiranosil-(1 porta a 4)-O-2-acil amido-2-deossi-beta-D-glucopiranosilglicerolo, O-2-ammino-2-deossi-beta-D-glucopiranosil tetrolo pentaciclico e tetrolo pentaciclico libero. Le distribuzioni degli acidi grassi esterificati e ammidici erano simili, essendo costituite principalmente da acidi ramificati eptadecanoico, 11-cicloesundecanoico e 13-cicloesiltridecanoico. I lipidi acidi erano composti da un sulfonoglicosildiacilglicerolo (43,2%), difosfatidilglicerolo (32,3%), lisodifosfatidilglicerolo (5,3%), acido fosfatidico (5,8%) e fosfatidilglicerolo (13,4%).
Un triterpene pentaciclico sostituito da 1,2,3,4-tetraidrossi pentano da Bacillus acidocaldarius.È stato isolato un polialcol (poliolo) a catena lunga dalla frazione glicolipidica del termoacidofilo estremo Bacillus acidocaldarius. Il poliolo e i suoi prodotti di degradazione di Smith, così come gli alcani derivati da questi composti sono stati caratterizzati da mobilità su strato sottile e cromatografia gas-liquido, e da spettrometria infrarossa e di massa. si propone che il poliolo sia un tetrolo pentaciclico completamente saturo (C35H62O4, Mr 546) contenente un 1,2,3,4-tetraidrossi pentano sostituito con un nucleo triterpenico pentaciclico derivato dall'opano.
Biosintesi di estrogeni e 1beta-idrossilazione utilizzando precursori C19 e 19-nor steroidei.(1) Per studiare la relazione tra aromatizzazione (biosintesi di estrogeni ) e 1beta-idrossilazione, sono stati valutati gli effetti di una varietà di fattori su questi processi. (2) Utilizzando il substrato C18, 4-estrene-3,17-dione, è stato riscontrato che il monossido di carbonio, SU-4885, amfenone B , cianuro di potassio, 4-androstene-3,17-dione e 1,4-androstadiene-3,17-dione hanno inibito le suddette trasformazioni in modo significativo e in varia misura. Tuttavia, all'interno di un dato esperimento l'inibizione di ciascun processo era simile. ( 3) L'SKF-525A non ha inibito nessuna delle due trasformazioni. Inoltre, i tamponi fosfato, Tris e barbital, così come le variazioni di pH da 6,9 a 7,7, non hanno avuto alcun effetto stimolante o inibitorio sulla produzione di estrogeni e composti 1beta-idrossilici. (4) ) Al contrario, diversi inibitori hanno influenzato l'aromatizzazione degli steroidi C19 e C18 in modo diverso, tra cui l'auto monossido di bon, SU-4885 e amfenone B. (5) Quando una miscela di 4-[7beta-3Hi1estrene-3,17-dione e 19-[4-14C]nortestosterone è stata incubata insieme, il primo è stato preferibilmente convertito in estrogeno. Questa preferenza per la forma steroidea 17-cheto imita i risultati osservati per i substrati C19. (6) Concludiamo che mentre la biosintesi degli estrogeni e la 1beta-idrossilazione sembrano essere mediate dallo stesso sistema enzimatico, non si può trarre la stessa conclusione per l'aromatizzazione dei substrati C19 e C18.
Coinvolgimento di una singola specie di idrossilasi nell'idrossilazione del palmitato nelle posizioni omega-1, omega-2 e omega-3 da una preparazione di Bacillus megaterium.Una preparazione enzimatica solubile da Bacillus megaterium, che richiede NADPH e O2 per l'attività e contiene componenti sostituibili con ferredossina e citocromo P-450, è stata precedentemente dimostrata per catalizzare la conversione dell'acido palmitico in una miscela isomerica di omega-1, omega-2 e omega-3 idrossipalmitato È stato ora dimostrato che il rapporto di questi tre isomeri posizionali nel prodotto enzimatico rimane invariato nonostante la parziale diminuzione dell'attività idrossilasi totale per trattamento termico, variazione del pH o inibizione da p-idrossi- mercuribenzoato o monossido di carbonio. Questi risultati supportano fortemente l'ipotesi che una singola idrossilasi con un sito di legame al substrato sia responsabile dell'idrossilazione in tutte e tre le posizioni del palmitato.
Purificazione e proprietà di due lipasi dal tessuto adiposo di maiale.Due lipasi sono state purificate dal tessuto adiposo di maiale dopo la delipidazione mediante una procedura delicata ed efficace utilizzando miscele di cloroformio e butanolo. Segue cromatografia ad adsorbimento idrofoba su amminoesil-sefarosio 4B accoppiato con acido ottanoico, gel filtrazione su Sephadex G-100 e focalizzazione isoelettrica. Si ottengono due enzimi elettroforeticamente e cromatograficamente puri, aventi lo stesso peso molecolare ( 60 000 +/- 3000) e attività specifica, e composizioni di amminoacidi quasi identiche; i punti isoelettrici, cioè 5,2 e 5,5, differivano.
Regolazione a lungo termine da parte della teofillina della sintetasi degli acidi grassi, dell'acetil-CoA carbossilasi e della sintesi dei lipidi in cellule gliali in coltura.La regolazione a lungo termine di sintetasi degli acidi grassi e acetil-CoA carbossilasi e della sintesi di acidi grassi e steroli è stata studiata in cellule gliali C-6 in coltura Quando la teofillina (10(-3) M) è stata aggiunta al mezzo di coltura di queste cellule, i tassi di sintesi dei lipidi da acetato e le attività di sintetasi e carbossilasi sono diventate nettamente inferiori rispetto alle cellule non trattate. Questo effetto è apparso dopo circa 12 ore e dopo 48 ore le attività enzimatiche sono state ridotte di circa 2 volte e i tassi di sintesi lipidica da acetato da 3 a 4 La probabilità che la diminuzione della sintesi degli acidi grassi da acetato sia stata causata dalla diminuzione delle attività dell'acido grasso sintetasi e dell'acetil-CoA carbossilasi è stata stabilita da diverse osservazioni, le quali indicavano che il luogo dell'effetto probabilmente non risiedeva al livello di f assorbimento dell'acetato nella cellula, alterazioni delle dimensioni del pool di acetato o conversione dell'acetato in acetil-CoA. Inoltre, la sintesi de novo degli acidi grassi è risultata essere la via predominante in queste cellule gliali, trattate o meno con teofillina. Il meccanismo dell'effetto della teofillina sulla sintetasi degli acidi grassi è stato dimostrato mediante tecniche immunochimiche comportare un'alterazione nel contenuto di enzima piuttosto che nell'efficienza catalitica. Il cambiamento nel contenuto dell'acido grasso sintetasi è stato dimostrato da esperimenti isotopici-immunochimici implicare una diminuzione della sintesi dell'enzima. Il meccanismo per cui la teofillina porta a una diminuzione della lipogenesi e della sintesi dell'acido grasso sintetasi potrebbe non essere mediato interamente dall'inibizione della fosfodiesterasi e da un aumento dei livelli di AMP ciclico, perché l'AMP ciclico dibutirrile (10(-3) M) si riproduce solo parzialmente l'effetto.
Rapporti NADPH/NADP+ nei cloroplasti ricostituiti fotosintetizzanti.I livelli di nucleotidi trifosfopiridinici ridotti e ossidati sono stati determinati in cloroplasti di spinaci ricostituiti e confrontati con i livelli in interi cloroplasti isolati durante la fotosintesi e al buio. Il rapporto di NADPH/NADP+ raggiunge valori leggermente superiori a 1,0 all'inizio della fotosintesi, meno della metà del rapporto raggiunto con i cloroplasti interi. Tuttavia questi rapporti inferiori sono sufficienti per mantenere alti tassi di fissazione dell'anidride carbonica fotosintetica e riduzione, che sono paragonabili nei cloroplasti ricostituiti ai tassi riscontrati con i cloroplasti interi Come per i cloroplasti interi si ha una diminuzione del rapporto di NADPH/NADP+ in funzione del tempo di fotosintesi L'effetto dell'aggiunta di bicarbonato (6 mM) nel provocare un calo transitorio del rapporto NADPH/NADP/ è descritto e discusso in termini di reversibilità della riduzione di 3-fosfo glicerato in trioso fosfato. Il rapporto NADPH/NADP+ può essere migliorato con l'aggiunta di più lamelle prima o durante il corso della fotosintesi, e questo miglioramento del rapporto è accompagnato da una migliore velocità di fissazione della CO2 o una velocità più sostenuta di fissazione della CO2 con il tempo della fotosintesi. Viene discussa l'importanza del rapporto NADPH/NADP+ non solo per la riduzione del 3-fosfoglicerato a trioso fosfato, ma anche per l'attivazione della fase mediata da ribulosio-1,5-difosfato carbossilasi.
Purificazione e proprietà dell'inibitore dell'ATPasi dai mitocondri del fegato di ratto.(1) La proteina dell'inibitore dell'ATPasi è stata isolata dai mitocondri del fegato di ratto in forma purificata. Il peso molecolare determinato mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato è di circa 9500 e il punto isoelettrico è 8,9. (2) La proteina inibisce sia l'ATPasi solubile che l'ATPasi legata alle particelle dai mitocondri del fegato di ratto. Inibisce anche le attività dell'ATPasi di F1 solubile , e particelle subcondriali impoverite dall'inibitore derivate dai mitocondri del cuore bovino. (3) Sull'ATPasi legata alle particelle l'inibitore ha il suo effetto massimo se incubato in presenza di Mg2+. ATP a pH leggermente acido. (4) L'inibitore ha un effetto minimo sull'attività di scambio di Pi-ATP nelle particelle subcondriali sonicate. Tuttavia, inaspettatamente l'inibitore stimola notevolmente l'attività di scambio di Pi-ATP in tutti i mitocondri mentre la bassa attività di ATPasi dei mitocondri non è influenzata. Viene offerto il possibile meccanismo d'azione dell'inibitore sui mitocondri intatti.
Doppia richiesta di cationi bivalenti per l'attivazione della piruvato chinasi; ruoli essenziali degli ioni metallici legati sia all'enzima che al nucleotide.La piruvato chinasi del muscolo di coniglio richiede due cationi bivalenti per sito attivo per la catalisi dell'enolizzazione del piruvato in presenza di adenosina 5\'-trifosfato (ATP). Un catione bivalente è legato direttamente all'enzima e forma una seconda sfera complessa con l'ATP legato (sito 1). Il secondo catione bivalente è direttamente coordinato ai gruppi fosforilici dell'ATP e non interagisce con l'enzima (sito 2). Il ruolo essenziale del catione bivalente nel sito 1 è dimostrato dalla richiesta di Mg2+ o Mn2+ per l'enolizzazione del piruvato in la presenza del complesso inerte di sostituzione Cr3+-ATP La velocità di detritizione del piruvato mostra una dipendenza iperbolica della concentrazione di Mn2+ in presenza di elevate concentrazioni di enzima e Cr3+-ATP Una costante di dissociazione per Mn2+ dalla piruvato chinasi-Mn2+-AT Il complesso P-Cr3+-piruvato di 1,3 +/- 0,5 muM è determinato dalla cinetica di detritizione del piruvato e da studi paralleli di legame Mn2+ mediante risonanza paramagnetica elettronica. Il ruolo essenziale del catione bivalente nel sito 2 è mostrato dalla dipendenza sigmoidale del tasso di detritiazione del piruvato dalla concentrazione di Mn2+ in presenza di alte concentrazioni di enzima e ATP che produce una costante di dissociazione di 29 +/- 9 muM per Mn2+ da sito 2. Questo valore è simile alla costante di dissociazione del complesso binario Mn-ATP (14 +/- 6 muM) determinato in condizioni simili. Il tasso di detritiazione del piruvato è proporzionale alla concentrazione del complesso piruvato chinasi-Mn2+-ATP-Mn2+-piruvato, come determinato da studi cinetici e di legame paralleli. La variazione della natura del catione bivalente nel sito 1 in presenza di CrATP provoca solo un doppio cambiamento nel tasso di detritiazione del piruvato che non è correlato con il pKa dell'acqua legata al metallo. La variazione della natura del catione bivalente in entrambi i siti in presenza di ATP provoca una variazione di sette volte nel tasso di detritiazione o piruvato che si correla con il pKa dell'acqua legata al metallo. La maggiore velocità di enolizzazione osservata con CrATP si adatta a questa correlazione, indicando che l'elettrofilia del metallo legato al nucleotide (nel sito 2) determina la velocità di enolizzazione del piruvato.
Risonanza magnetica nucleare 15N di flavine.Il novantanove per cento di flavine arricchite di 15N sono state sintetizzate e sono state osservate le loro risonanze 15N disaccoppiate da protoni. I composti arricchiti erano [1,3-15N]riboflavina, [1,3,5-15N]riboflavina, [1,3-15N]riboflavina 5\'-fosfato, [1,3,5-15N]riboflavina 5\'-fosfato , e [1,3,5-15N] flavin adenin dinucleotide, [1,3,5-15N] lumiflavin e [1,3,5-15N] luminchrome. Confrontando i loro spettri e dall'effetto Overhauser nucleare dati ogni picco di risonanza di 15 N potrebbe essere assegnato a ciascun nucleo di 15 N. L'ordine degli spostamenti chimici corrisponde bene a quello delle densità di elettroni pi calcolati. Il nucleo N-3 fornisce il picco invertito più intenso e il nucleo N-5 un piccolo picco non invertito Modificando il pH da neutro ad alcalino, lo spostamento chimico e l'intensità del segnale sono stati maggiormente influenzati nella risonanza N-3 di riboflavina 5\'-fosfato. Il segnale N-5 di flavina adenina dinucleotide ha mostrato un fa irly ampio spostamento verso il basso con l'aumento della temperatura. Queste osservazioni possono essere ben interpretate dalla struttura chimica e dalla conformazione proposta di riboflavina 5\'-fosfato e flavina adenina dinucleotide.
Analisi dell'interazione dei fosfati organici con l'emoglobina.L'interazione dei fosfati organici con l'emoglobina viene studiata mediante un semplice approccio termodinamico. Un modello -viene impiegata un'analisi indipendente per valutare l'accuratezza delle costanti di Adair determinate in presenza di 2,3-difosfoglicerato (DPG). utilizzati per estrarre tali costanti di legame dalle misurazioni dell'equilibrio dell'ossigeno. La variazione dell'effetto Bohr in presenza di fosfati e il legame competitivo di anidride carbonica e DPG vengono trattati quantitativamente. Il legame dei fosfati organici è incorporato in un modello allosterico, in cui il è incluso l'effetto del fosfato sui cambiamenti della struttura sia terziaria che quaternaria. Utilizzando questo modello, i fattori che possono essere responsabili dell'aumento dell'eterogeneità funzionale delle catene alfa e beta in presenza di fosfati vengono chiarite.
N-(1-pirene)maleimmide: un reagente reticolante fluorescente.N-(1-pirene)maleimide non è fluorescente in soluzione acquosa ma forma addotti fortemente fluorescenti con gruppi sulfidrilici di composti organici o proteine. Le reazioni di coniugazione di N-(1-pirene)maleimmide sono relativamente veloci e possono essere monitorate dall'aumento dell'intensità di fluorescenza del cromoforo pirenico. Nei casi in cui gruppi amminici primari sono presenti anche nel sistema, abbiamo osservato uno spostamento verso il rosso degli spettri di emissione degli addotti fluorescenti successivo alla coniugazione iniziale, caratterizzato dalla scomparsa di tre picchi di emissione a 376, 396 e 416 nm, e dalla comparsa di due nuovi picchi a 386 e 405 nm Studi modello con addotti N-(1-pirene)maleimmide di L-cisteina e cisteamina indicano che lo spostamento spettrale è il risultato di un'aminolisi intramolecolare dell'anello succinimido negli addotti. analisi e risonanza magnetica nucleare gli studi di sonance dei prodotti di addizione supportano questo schema di reazione. Gli addotti N-(1-Pirene)maleimmide di N-acetil-L-cisteina e beta-mercaptoetanolo, che non hanno gruppi amminici liberi, non mostrano uno spostamento spettrale. Tra diversi coniugati proteici solo l'addotto N-(1-pirene)maleimmide dell'albumina sierica bovina (PM-BSA) mostra lo spostamento spettrale simile a quello della PM-cisteina. N-(1-Pirene)maleimmide reagisce con il gruppo solfidrilico del singolo residuo di cisteina in posizione 34 in BSA. La scoperta che il gruppo alfa-amminico dell'N-terminale in PM-BSA è bloccato dopo che lo spostamento spettrale è completato suggerisce fortemente che N-(1-pirene)maleimmide reticola l'N-terminale e il residuo di cisteina in BSA. La relativa vicinanza dei gruppi sulfidrilico e amminico è molto critica nella reticolazione, come dimostrato dall'osservazione che lo spostamento spettrale osservato con PM-BSA può essere prevenuto mediante l'aggiunta di reagenti denaturanti come l'1% di sodio dodecilsolfato immediatamente dopo l'etichettatura, e dall'incapacità del PM-glutatione di subire l'aminolisi intramolecolare. Poiché il riarrangiamento intramolecolare degli addotti del PM è associato a caratteristici cambiamenti di fluorescenza, la N-(1-pirene)maleimmide può fungere da reagente di reticolazione fluorescente che fornisce informazioni sulla vicinanza spaziale dei gruppi sulfidrilici e amminici nelle proteine.
Effetti del legame del substrato e dell'inibitore sull'inattivazione termica e proteolitica della transidrogenasi del fegato di ratto.È stata studiata la termostabilità e l'inattivazione proteolitica della transidrogenasi delle particelle submitocondriali del fegato di ratto in presenza di substrati di piridina dinucleotide e una varietà di metalli bivalenti e inibitori nucleotidici. Relativamente all'enzima non legato, il complesso enzimatico NADPH era più termostabile e mostrava una velocità di inattivazione triptica doppiamente maggiore, mentre il complesso enzimatico NADP+ era più termolabile e solo leggermente più suscettibile all'inattivazione del triptico. NAD + né NADH hanno influenzato significativamente la termostabilità o la proteolisi. Effetti simili di questi ligandi sono stati osservati per le reazioni transidrogenasi non legate all'energia e legate all'energia, indicando che entrambe le attività sono catalizzate dallo stesso enzima In esperimenti termici, acetil-CoA, 2\'-AMP e NMNH stabilizzati, palmitoil-CoAlabilizzati e defosfo ho-CoA, CoA, NMN+ e 5\'-AMP hanno avuto scarsi effetti sulla stabilità dell'enzima. L'inattivazione triptica è stata inibita da 2\'-AMP e NMN+ ma non è stata influenzata dagli altri inibitori nucleotidici. Gli inibitori di ioni metallici bivalenti (Mg2+, Ca2+, Mn2+, Ba2+ e Sr2+) hanno stabilizzato la transidrogenasi contro l'inattivazione termica e hanno promosso l'inattivazione triptica.
Reazione della citidina con semicarbazide in presenza di bisolfito. Una rapida modificazione specifica per il polinucleotide a filamento singolo.Semicarbazide ha reagito rapidamente con 5,6- diidrocitidina-6-solfonato, che è stato formato dalla citidina per aggiunta di bisolfito attraverso il 5,6-doppio legame. Il prodotto transaminato, 5,6-diidro-4-semicarbazido-2-chetotopirimidina-6-solfonato ribofuranoside, è stato identificato da confronto con quello formato dal trattamento del 4-semicarbazido-2-chetopirimidina ribofuranoside con bisolfito. L'andamento della transaminazione è stato monitorato spettrofotometricamente mediante l'utilizzo di una forte assorbanza del prodotto in alcali. La reazione tra citidina e la miscela semicarbazide-bisolfito è stata ottimale a pH 4,5 La trasformazione completa della citidina nel prodotto ha richiesto solo 5 minuti con l'uso di bisolfito di sodio 3M semicarbazide-1M, pH 5,0, alla temperatura di reazione 37 gradi C. Il prodotto era stabile in soluzione non tamponata ma in tamponi fosfato ha subito l'eliminazione del bisolfito per dare 4-semicarbazido-2-chetopirimidina ribofuranoside. La velocità di eliminazione a pH 7,0 e 37 gradi C aumentava proporzionalmente con l'aumento della concentrazione di fosfato. L'eliminazione completa è stata ottenuta mediante trattamento con fosfato di sodio 1 M per 2 h. Quando il DNA di timo di vitello denaturato al calore è stato trattato con 3 M semicarbazide-1 M bisolfito a 37 gradi C e pH 5,0, la transaminazione dei residui di citosina reattiva è stata completata da 10 min di incubazione. A 20 gradi C, sono stati necessari 85 minuti di incubazione. I residui di citosina nel DNA nativo non hanno reagito affatto anche con incubazioni prolungate. I campioni di DNA modificato sono stati ulteriormente trattati con un tampone fosfato a pH 7, producendo residui di 4-semicarbazido-2-chetopirimidina nel DNA. L'analisi delle composizioni di base di questi campioni mediante idrolisi dell'acido perclorico ha mostrato che la modifica era selettiva per la citosina, come ci si aspettava da studi con monomeri. Ha anche mostrato che i residui di citosina reattiva nel DNA denaturato costituiscono circa l'80% della citosina totale, il che era coerente con l'idea che il DNA denaturato con il calore contenga ancora una notevole quantità di struttura secondaria. La modifica del semicarbazide-bisolfito dovrebbe essere un metodo sensibile per localizzare i residui di citosina nelle regioni a filamento singolo di polinucleotidi.
Studi di risonanza magnetica nucleare ad ampio raggio della cloroperossidasi.La cloroperossidasi, una glicoproteina eme isolata dallo stampo Caldariomyces fumago, è stata studiata mediante tecniche di rilassamento NMR. L'interazione del substrato di ioni cloruro con l'enzima può essere analizzata come costituita da almeno tre contributi: un'interazione debole con l'atomo di ferro, interazioni anionico-proteina non specifiche e un'interazione specifica generata a basso pH. I dati indicano che un'interazione specifica , che si sviluppa in parallelo con l'attività enzimatica a pH basso, non si verifica nel sito della prima sfera di coordinazione dell'atomo di ferro. I risultati sono riassunti in termini di un meccanismo enzimatico che non coinvolge la coordinazione dello ione cloruro con l'atomo di ferro.
Secrezione gastrica e fermentazione nel maialino.1. Il contributo all'acidificazione del contenuto dello stomaco dei suini mediante secrezione di acido cloridrico o acido lattico prodotto dalla fermentazione è stato studiato in quindici maialini da latte di sei cucciolate nate e allevate in un ambiente \'convenzionale\' o in un ambiente \' pulito\' isolato. contenuto di cloruro e acido lattico, pH e acidità totale titolabile Questi valori hanno fornito una misura rispettivamente degli acidi organici e inorganici 2. Sei suini di due cucciolate nati e allevati in un ambiente \'pulito\' avevano secrezione acida nello stomaco a 2 giorni di età e le concentrazioni di acido lattico nel contenuto dello stomaco sono rimaste basse (0-40 mmol/l) per tutto il periodo dell'allattamento 3. Otto suini di tre cucciolate nati e allevati in un ambiente \'convenzionale\' e un nono suino nato in questo ambiente ma trasferito nell'ambiente \'pulito\' a 24 ore di età, aveva acido lattico in concentrazioni fino a 250 mmol/l nel contenuto dello stomaco entro la 1a settimana di vita. Il modello di produzione di acido lattico (e quindi l'acidità del contenuto dello stomaco) era governato dalla frequenza della suzione. 4. La variazione sia tra che all'interno della cucciolata nell'età di insorgenza della secrezione di HC1 era evidente nel gruppo allevato in un ambiente \'convenzionale\', e quando si verificava la secrezione di HC1 era solitamente accompagnata da una riduzione della produzione di acido lattico. 5. Si conclude: (1) che l'ambiente alla nascita è importante nel determinare la capacità fermentativa della flora gastrica; (2) che se l'acido lattico viene prodotto in grandi quantità nello stomaco, può inibire parzialmente o completamente l'acidificazione da parte dell'HC1.
[Inibizione in vitro della N-demetilazione ossidativa con disolfuro di carbonio].Risultati precedenti hanno dimostrato che negli animali da esperimento (ratto) e nell'uomo inalato il disolfuro di carbonio (CS2) inibisce in modo reversibile il metabolismo ossidativo non specifico dei farmaci causato dagli enzimi microsomiali epatici. Si sa molto poco sul meccanismo sottostante. Le presenti indagini sono state intraprese per gettare luce su questo problema. Dopo l'aggiunta di un sistema rigenerante NADPH a microsomi epatici isolati da femmine adulte di ratto Wistar, la N-demetilazione ossidativa dell'aminopirina è stata misurata sotto esposizione simultanea a CS2 determinando quantitativamente la formaldeide ottenuta, i dati risultanti sono stati valutati utilizzando parametri cinetici enzimatici secondo Lineweaver-Burk: esposizione a concentrazioni di CS2 di basso e medio grado (20-400 ppm/8 h), il pattern di inibizione nei microsomi epatici di ratto è identico a quello ottenuto nei normali microsomi epatici a cui era stato aggiunto CS2. Questa scoperta sembra suggerire che il processo inibitorio in condizioni in vivo e in vitro si basi su un unico meccanismo molecolare. 2. Dopo l'aggiunta di CS2, il pattern di inibizione in vitro corrisponde a una forte inibizione di tipo misto. 3. Dal comportamento cinetico enzimatico si conclude che CS2 attacca in due diversi siti della molecola enzimatica: il legame al primo sito è seguito da inibizione, come evidenziato dall'aumento di Km; dopo la saturazione di questo sito, viene occupato un secondo sito determinando una riattivazione e, oltre questa, un'attivazione della produzione enzimatica, come mostrato dalla diminuzione di Km. CS2 mostra un'elevata affinità per il primo sito e una bassa affinità per il secondo sito. La rilegatura nel primo sito è reversibile. È esclusa la possibilità che il centro attivo nella molecola dell'enzima sia il sito in cui si verifica il legame dell'inibitore. 4. Una diminuzione continua di Vmax all'aumentare della concentrazione dell'inibitore è causalmente correlata alla formazione di un complesso enzima/inibitore substrato. 5. La CS2 aggiunta ai microsomi può essere eliminata mediante elio gassoso; questo è seguito dal ritorno dell'attività enzimatica originale. Da questo comportamento si conclude che in condizioni in vitro CS2 stesso (piuttosto che i suoi metaboliti) agisce come inibitore. 6. Il trattamento con ossigeno della miscela di reazione contenente microsomi aumenta l'inibizione. Nelle miscele di controllo prive di substrato, l'aggiunta di CS2 è stata seguita dalla formazione dose-dipendente di formaldeide; una spiegazione causale non è prontamente disponibile in questo momento.
[L'influenza dei farmaci neurolettici sull'escrezione urinaria di azoto non proteico (autore\'s trad.)].Durante il trattamento con tioxanteni o fenotiazine di pazienti schizofrenici è stato misurato l'azoto non proteico nelle urine I valori sono stati calcolati in relazione all'escrezione di creatinina a) Flupentixolo o flufenazina applicati in dosaggio ottimale, hanno aumentato l'escrezione di urea e degli aminoacidi asp, glu + gln, e gly b) Inoltre, se il farmaco induce un parkinsonoide (tioridazina) aumenta anche l'escrezione di ser e thr. La consueta procedura di desalinizzazione mediante resine scambiatrici di ioni prima della cromatografia aumenta il contenuto di diversi amminoacidi, ad esempio asp, asn, ala , gly, cys, ser, thr, indicando una rottura di alcuni prodotti instabili.
[Degradazione metabolica della cartilagine da parte degli enzimi leucocitari sotto l'influenza di farmaci antireumatici (autore\'s trad.)].Ultimamente l'importanza e la partecipazione dei leucociti nell'artrite reumatoide. Per studiare le reazioni cataboliche nel tessuto connettivo abbiamo studiato la liberazione autolitica di mucopolisaccaridi nella sola cartilagine e in presenza di enzimi leucocitari Fattori di condizioni sperimentali ottimali, come pH e costituenti del mezzo di incubazione, incubazione sono stati determinati il tempo e il numero di leucociti. In ulteriori esperimenti abbiamo studiato l'influenza di farmaci antireumatici, come salicilato di sodio, fenilbutazone, pentosanpoli-solfato e tiopolipeptide d'oro, sulla degradazione della cartilagine. Nei nostri esperimenti solo fenilbutazone e pentosanpoli-solfato hanno esercitato un effetto inibitorio sulla degradazione della cartilagine stimolata dai leucociti La rilevanza di questo risultato per l'uso terapeutico di questi farmaci s viene valutato.
[Possibilità e problemi galenici nel prolungamento degli effetti dei farmaci (transl.autore\'s)].Negli ultimi anni si sono ottenute forme farmaceutiche a rilascio prolungato un'importanza significativa. Le possibilità tecnologiche per la produzione sono descritte come procedure di rivestimento, inclusione e matrice. La gamma di sostanze ausiliarie, che sono responsabili del ritardo dell'attività del farmaco, arriva da composti lipofili come lipoidi, alcoli grassi e composti che stanno formando idrogel come derivati della cellulosa e polisaccaridi naturali ai polimeri sintetici derivati dall'acido acrilico. La formulazione delle forme farmaceutiche richiede particolare cura per quanto riguarda la quantità di dosi iniziali e di mantenimento. A causa di processi tecnologici, ad esempio durante la produzione di compresse, in determinate circostanze il tasso di liberazione è alterato I metodi di prova in vitro consentono confronti solo quando i risultati possono essere contro-controllati da in vitro e esperimenti. Il rilascio del farmaco segue diversi meccanismi, che vengono descritti, in tutto o in parte, come reazioni che seguono la legge del tempo di zero o del primo ordine. In casi particolari si osserva una correlazione lineare in funzione della radice quadrata del tempo. Il calcolo di determinate equazioni speciali per eventi all'interno della forma di dosaggio è fattibile dai valori dei livelli ematici.
[Interazioni farmacologiche (transl.autore\'s)].Questa breve descrizione delle interazioni farmacologiche non pretende di coprire l'intero campo Il compito di questo lavoro è quello di illustrare i principi più importanti delle interazioni farmacologiche mediante paradigmi tratti dall'esperienza del professionista. Una conseguenza delle interazioni farmacologiche è il cambiamento dei parametri farmacolinetici importanti per l'effetto terapeutico dei farmaci nel organismo. Molto spesso la delucidazione dei meccanismi delle interazioni farmacologiche nell'uomo è impossibile, pertanto per i farmacologi clinici gli esperimenti sugli animali rimangono lo strumento per acquisire maggiori conoscenze in questo campo.
Analogi fosfonometilici di esosofosfati.L'analogo del fruttosio 1,6-bisfosfato in cui il gruppo fosfato, -O-PO3H2, su C- 6 è sostituito dal gruppo fosfonometile, -CH2-PO3H2, è stato prodotto enzimaticamente dal corrispondente analogo del fosfoglicerato 3-Era un substrato per l'aldolasi, che è stato utilizzato per formarlo, ma non per il fruttosio 1,6-bisfosfatasi. è stato idrolizzato chimicamente per dare il corrispondente analogo del fruttosio 6-fosfato [cioè 6-deossi-6-(fosfonometil)-D-fruttosio, o, più strettamente, 6,7-dideossi-7-fosfono-D-arabino-2- eptulosio]. Questo si è rivelato un substrato per le azioni sequenziali di glucosio 6-fosfato isomerasi, glucosio-6-fosfato deidrogenasi e 6-fosfogluconato deidrogenasi. Così sette dei nove enzimi delle vie glicolitica e pentoso fosfato finora testati catalizzano le reazioni degli isosteri fosfonometilici dei loro substrati.
Comportamento del gruppo polare in monostrati misti di fosfolipidi e lipidi fusogeni.1. I potenziali di superficie di monostrati misti di fosfolipidi sintetici con lipidi fusogeni per gli eritrociti di gallina sono stati studiati 2. A pH 5,6 e 10, ma non a pH2, monostrati misti del lipide fusogeno, glicerolo mono-oleato, con fosfatidilcolina hanno mostrato deviazioni negative dalla regola dell'idealità nel potenziale di superficie per molecola che sono state accompagnate da negative deviazioni nell'area molecolare media 3. Interazioni di questo tipo non sono state osservate con lipidi chimicamente correlati ma non fusogeni, né sono state trovate in monostrati misti di alcuno dei lipidi con fosfatidiletanolammina 4. Indicati esperimenti con diesadecil fosfato e esadeciltrimetil-ammonio che il gruppo di testa completo della fosfatidilcolina è necessario per il suo comportamento osservato con i lipidi fusogeni 5. Cationi bivalenti (Ca2+, UO2(2+) o Zn2+) nella sottofase a pH 5,6 sig modificato in modo significativo il comportamento di monostrati misti di lipidi fusogeni con fosfolipidi; c'era un effetto perturbante parallelo dei lipidi fusogeni sulle interazioni tra monostrati di fosfolipidi e cationi bivalenti. 6. Vengono discusse le possibili interazioni molecolari dei lipidi fusogeni con i fosfolipidi di membrana e il ruolo del Ca2+ che possono essere rilevanti per la fusione cellulare negli eritrociti indotta da lipidi a basso punto di fusione in presenza di Ca2+.
Catepsina umana G. Proprietà catalitiche e immunologiche.1. La specificità della catepsina G, una proteinasi neutra della milza umana, è stata esaminata mediante l'uso di substrati a basso peso molecolare L'enzima è risultato idrolizzare diversi substrati sintetici anche idrolizzati dalla chimotripsina, ma con diverse costanti cinetiche 2. L'attività massima contro benzoil-DL-fenilalanina 2-naftol estere e azo-caseina era nell'intervallo pH 7.5-8.0 3. È stata determinata la sensibilità della catepsina G all'azione di potenziali inibitori e confrontata con quella della chimotripsina e della subtilisina bovina. La catepsina G ha mostrato le caratteristiche di una proteinasi serina, ma è stata meno influenzata dal clorometilchetone della tosilfenilalanina rispetto alla chimotripsina 4. È stato allevato un siero anti-(catepsina G umana) di coniglio e le linee di precipitina formate nel gel di agarosio sono state colorate per l'attività dell'enzima 5. La catepsina G ha dimostrato di essere immunologicamente identica alla chimotripsina enzima simile dei granuli azzurrofili dei granulociti neutrofili.
Proteinasi neutre della milza umana. Purificazione e criteri per l'omogeneità di elastasi e catepsina G.1. È stato riscontrato che la milza umana contiene proteinasi attive contro l'azo -caseina a pH neutro e alcalino 2. L'attività è stata stimolata da un'elevata forza ionica e da alcuni detergenti 3. L'estrazione ottimale delle proteinasi dal tessuto è stata ottenuta con 1.0M-NaCl contenente 0.1% Brij 35 e 0.1% trisodio EDTA 4. Le proteinasi sono state efficacemente adsorbite su materiale insolubile in assenza di sale nelle fasi iniziali della purificazione 5. Due distinte proteinasi sono state separate mediante cromatografia su DEAE-cellulosa, un'elastasi e un enzima simile alla chimotripsina denominato catepsina G. 6 Entrambi gli enzimi sono stati altamente purificati mediante ulteriore cromatografia su colonna 7. I pesi molecolari degli enzimi sono stati stimati mediante cromatografia su gel ed elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato 8. È stato dimostrato mediante focalizzazione isoelettrica ed elettroforesi su gel che entrambi gli enzimi sono proteine cationiche che si presentano in forme multiple.
Isolamento e proprietà dell'alfa-D-mannosidasi dal rene umano.L'attività dell'alfa-D-mannosidasi esiste in tre forme che possono essere separate dalla DEAE -Cromatografia su cellulosa, l'alfa-D-mannosidasi è stata isolata dal rene umano in uno stato omogeneo ed è stata purificata 2100 volte, con p-nitrofenil alfa-D-mannoside come substrato. L'alfa-D-mannosidasi purificata era praticamente esente da tutto altre glicosidasi testate. Il Km del substrato sintetico con l'enzima era 1 X 10(-3) M e il pH ottimale 4.5. Era inibito da metalli pesanti, sodio dodecilsolfato, urea e composti che reagiscono con i gruppi tiolici, e è stato attivato da Zn2+, Na+, 2-mercaptoetanolo, albumina umana e gamma-globulina. Il peso molecolare dell'enzima è stato stimato in 180 000 +/- 4500. Dopo pretrattamento con 2-mercaptoetanolo e sodio dodecilsolfato, alfa- D-mannosidasi dissociata in subunità di peso molecolare rispettivamente di 58 000 +/- 600 e 30 000 +/- 380. Subunità di gli stessi pesi molecolari sono stati ottenuti anche dopo che l'enzima è stato riscaldato a 100 gradi C.
Alcune proprietà di una desaturasi microsomiale oleato dalle foglie.1. Quando [1-14C]oleoil-CoA è stato incubato con un omogenato di foglie di pisello l'oleato è stato sia incorporato nella 3-sn-fosfatidilcolina microsomiale che rilasciato come acido grasso non esterificato. La proporzione di oleato incorporato in questo fosfolipide dipendeva dalle quantità relative di estere tiolico e dalla preparazione microsomiale presenti nelle reazioni. 2. Alle concentrazioni di microsomiale preparato e [14C]oleoil-CoA utilizzato per studiare la desaturazione dell'oleato il metabolismo dell'estere tiolico era essenzialmente completo dopo 5 minuti di incubazione, ma la perdita di etichetta da 3-sn-fosfatidilcolina oleato e il concomitante aumento della radioattività nel linoleato di questo il fosfolipide procedeva a velocità approssimativamente lineari per un periodo di 60 minuti. La cinetica di etichettatura del linoleato non esterificato era coerente con l'opinione che questo acido grasso marcato fosse derivato dalla 3-sn-fosfatidilcolina. La desaturazione richiedeva ossigeno e con le frazioni microsomiali non lavate è stata stimolata dal NADPH o dal surnatante di 105 000 g. Le preparazioni microsomiali lavate non hanno catalizzato la desaturazione, ma sono state ripristinate attivamente mediante l'aggiunta di NADPH, surnatante 105.000 G o surnatante trattato con Sephadex. NADPH potrebbe essere sostituito da NADH o NADP+, ma non da NAD+. 4. Anche le frazioni microsomiali della lamina di mais matura e immatura e le foglie di spinaci in espansione hanno rapidamente incorporato l'oleato di ([14C]oleoil-CoA nella 3-sn-fosfatidilcolina, ma la desaturazione dell'oleato di 3-sn-fosfatidilcolina è stata rilevata solo con preparazioni microsomiali da lamina di mais 5. Si propone che i preparati microsomiali fogliari possiedano una desaturasi oleata per la quale l'oleato di 3-sn-fosfatidilcolina è il substrato o un precursore immediato del substrato.
Dipendenza dal pH della velocità allo stato stazionario di una reazione enzimatica in due fasi.1. La dipendenza dal pH è considerata di una reazione tra E e S che procede attraverso un ES intermedio in condizioni "Briggs-Haldane\', cioè c'è uno stato stazionario in ES e [S]o maggiore di [E]T, dove [S]o è la concentrazione iniziale di S e [E]T è la concentrazione totale di tutte le forme di E. Si presume che i reagenti e gli intermedi si interconvertino in tre stati protonici (E equilibrio ES; EH equilibrio EHS; EH2 equilibrio EH2S), ma solo EHS fornisce prodotti da una reazione irreversibile il cui la costante di velocità è kcat. Si presume che le protonazioni siano così veloci da essere tutte in equilibrio. 2. L'equazione della velocità per questo modello risulta essere v = d[P]/dt = (kcat. [E]T[S]o/A)/[(KmBC/DA) + [S]o] , dove Km è il consueto insieme di costanti di velocità attorno a EHS e AD sono funzioni della forma (1 + [H]/K1 + K2/[H]), in cui K1 e K2 sono: in A, le costanti di ionizzazione molecolare di ES; in B, le analoghe costanti di E; in C e D, costanti di ionizzazione apparente composte da costanti di ionizzazione molecolare (di E o ES) e insiemi di costanti di velocità. 3. Come nei precedenti trattamenti di questo tipo di reazione che implicano l'assunzione che i reagenti e l'intermedio siano in equilibrio o l'assunzione di Peller \& Alberty [(1959) J. Am. chimica. Soc. 81, 5907-5914] che solo EH ed EHS convertono direttamente, la dipendenza dal pH di kcat. è determinata solo da A. 4. La dipendenza dal pH di Km è determinata in generale da B-C/A-D, ma quando i reagenti e l'intermedio sono in equilibrio, C identico a D e questa espressione si semplifica in B/A. 5. La dipendenza dal pH di kcat. /Km, cioè della velocità quando [S]o minore di Km, non è necessariamente una semplice curva a campana caratterizzata solo dalle costanti di ionizzazione di B, ma è una curva complessa caratterizzata da D/BC. 6. Vengono discusse varie situazioni in cui la dipendenza dal pH di kcat. /Km è determinata da assiemi più semplici di D/B-C. Viene delineata la situazione speciale in cui un profilo kcat. /Km-pH fornisce i valori di pKa molecolare del complesso ES intermedio.
Isolamento, mediante digestione parziale con pepsina, delle tre regioni collagenosimili presenti nel sottocomponente Clq del primo componente del complemento umano.1. Digestione del sottocomponente umano C1q con pepsina a pH 4,45 per 20 ore a 37 gradi C ha frammentato la maggior parte delle sequenze di amminoacidi non collagene-simili nella molecola in piccoli peptidi, mentre le intere regioni della sequenza simile al collagene che costituivano il 38% in peso del sottocomponente C1q sono stati lasciati intatti 2. La frazione simile al collagene del digerito è stata eluita nel volume vuoto di una colonna Sephadex G-200, è risultata composta da due frammenti principali quando esaminata mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide in tamponi contenenti sodio dodecil solfato Questi frammenti sono stati separati su CM-cellulosa a pH 4,9 in tamponi contenenti 7,5 M-urea 3. Il sottocomponente umano C1q alla riduzione e alchilazione produce quantità equimolari di tre catene, che sono state designate A, B e C [Reid et al. (1972) Bioch em. J. 130, 749-763]. È stato dimostrato che uno dei frammenti di pepsina è composto dai residui N-terminali 95 della catena A legati, tramite il residuo A4, da un singolo legame disolfuro ad un residuo nella sequenza B2-B6 nei residui N-terminali 91 della catena B. È stato dimostrato che il secondo frammento di pepsina è composto da un dimero disolfuro dei residui N-terminale 94 della catena C, l'unico legame disolfuro essendo localizzato al residuo C4.4. Il mole. wt. dei frammenti di pepsina non ossidata e ossidata sono stati stimati dalle loro composizioni di amminoacidi in 20 000 e 18 200 per i dimeri A-B e C-C e 11 400, 8800 e 9600 per i frammenti simili al collagene delle catene A, B e C rispettivamente. La stima dei pesi molecolari dei frammenti peptici mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide eseguita in presenza di sodio dodecilsolfato ha fornito valori di ca. 50% in più rispetto a quanto previsto dai dati sulla sequenza di amminoacidi. Ciò è probabilmente dovuto all'alto contenuto di sequenze simili al collagene di questi frammenti.
Interazioni dei siti di legame dei lantanidi e degli aptene nel frammento Fv della proteina del mieloma MOPC 315.1. Le interazioni dei metalli lantanidi e dinitrofenil spin-label apteni con il frammento Fv della proteina del mieloma di topo MOPC 315 sono stati studiati mediante le tecniche di fluorescenza, esr (risonanza di spin elettronico) e nmr (risonanza magnetica nucleare) ad alta risoluzione 2. La fluorescenza proteica del frammento Fv a 340 nm viene spento dagli apteni (miglioramento della fluorescenza, epsilon=0.15) e potenziato da Gd(III) (epsilon=1.14) e altri lantanidi. Il legame degli apteni qui studiati è insensibile al pH nell'intervallo 5,5- 7.0 (costante di dissociazione KH=0.3-1.0 muM) e mostra steicheiometria 1: 1. Il legame di Gd(III) mostra anche steicheiometria 1: 1, ma dipende dal pH; la costante di legame (KM) varia da 10 muM a pH7,0 a 700 muM a pH4,8. Il legame La(III) è meno sensibile al pH. Le dipendenze del pH del metallo-b L'individuazione delle costanti implica che nel legame sia coinvolto un gruppo nella proteina con pKa maggiore o uguale a 6.2, e probabilmente anche altri gruppi con valori pKa inferiori. 3. Il legame apparente degli apteni è indebolito di circa 20 volte da Gd(III), e viceversa. Uno schema di equilibrio che coinvolge un complesso ternario con un'interazione tra i due siti di legame è derivato nell'Appendice I per spiegare i risultati sperimentali a due valori di pH. 4. Si osservano cambiamenti di fluorescenza dipendenti dal tempo in presenza di Gd(III) a pH 5,5. Uno schema cinetico a due stati che coinvolge un cambiamento conformazionale \'lento\' nel frammento Fv è derivato nell'Appendice II per spiegare questa dipendenza dal tempo. Questo schema è coerente con il comportamento di equilibrio antagonista. 5. L'e. s. r. cambiamenti negli apteni spin-label sul legame al frammento Fv e sulla successiva aggiunta di lantanidi sono coerenti con lo schema di legame per apteni e lantanidi proposto dagli studi di fluorescenza. Una differenza tra la tempra limite dell'e. s. r. il segnale dagli apteni legati in presenza di concentrazioni saturanti di Gd(III) e La(III) è attribuito alle interazioni dipolari tra Gd(III) legato e la frazione nitrossido dell'aptene legato. L'estinzione residua con Gd(III) permette di stimare la distanza tra i due centri paramagnetici di 1.2nm. 6. Lo spettro di differenza protonica di 270 MHz del frammento Fv risultante dall'aggiunta di La(III) suggerisce che qualsiasi cambiamento conformazionale indotto dal metallo è piccolo e coinvolge relativamente pochi residui di amminoacidi sul frammento Fv...
Trasporto di L-lattato nelle cellule tumorali di ascite di Ehrlich.Le cellule tumorali di ascite di Ehrlich sono state studiate per quanto riguarda la loro stabilità al trasporto di L-lattato mediante misurando la distribuzione del [14C]lattato o movimenti concomitanti di ioni H+. Il movimento del lattato dipendeva dalla differenza di pH attraverso la membrana cellulare ed era elettroneutro, come evidenziato da un'antiporta osservata 1:1 per ioni OH- o 1:1 symport con ioni H+ 2. Esperimenti cinetici hanno mostrato che il trasporto del lattato era saturabile, con un Km apparente di circa 4,68 mM e un Vmax fino a 680 nmol/min per mg di proteina a pH 6,2 e 37 gradi C. 3. Il trasporto del lattato ha mostrato un'elevata dipendenza dalla temperatura (energia di attivazione = 139 kJ/mol) 4. Il trasporto del lattato è stato inibito in modo competitivo da (a) una varietà di altri acidi monocarbossilici sostituiti (ad es. piruvato, Ki = 6,3 mM), che erano essi stessi trasportato, (b) gli analoghi non trasportabili alfa-ciano-4-idrossicinnamat e (Ki = 0,5 mM), alfa-ciano-3-idrossicinnamato (Ki = 2mM) e DL-p-idrossifenil-lattato (Ki = 3,6 mM) e (c) il reagente del gruppo tiolico mersalil (Ki \ = 125 mM). 5. Il trasporto di acidi monocarbossilici semplici, inclusi acetato e propionato, era insensibile a questi inibitori; presumibilmente attraversano la membrana mediante un meccanismo diverso. 6. Gli esperimenti che utilizzano quantità saturanti di mersalile come "arresto dell'inibitore" hanno permesso di misurare i tassi iniziali di afflusso netto e di efflusso netto di [14C]lattato. L'afflusso e l'efflusso di lattato sono stati giudicati reazioni simmetriche in quanto hanno mostrato una dipendenza dalla concentrazione simile. 7. Si conclude che il trasporto del lattato nelle cellule tumorali di ascite di Ehrlich è mediato da un vettore in grado di trasportare un certo numero di altri acidi monocarbossilici sostituiti, ma non acidi alifatici a catena corta non sostituiti.