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Uso del test del salto del topo per stimare le potenze antagoniste degli antagonisti della morfina.Le potenze di 19 antagonisti della morfina di riferimento sono state confrontate in una versione modificata di il test del salto del topo. I topi sono stati impiantati per via sottocutanea con un pellet da 75 mg di morfina. La sfida dell'antagonista ha avuto luogo 72 ore dopo e l'incidenza del salto verticale ripetitivo è stata monitorata per 1 ora. Un alto coefficiente di correlazione di Pearson (r = 0,997) è stato trovato tra dosaggi quantitativi basati sul numero totale di salti per topo e test quantali basati su topi che saltano almeno 6 volte. Un confronto delle potenze relative ottenute con il test del topo e con scimmie morfina-dipendenti non ritirate ha dato un ordine di rango di Spearman coefficiente di 0,91 mentre un analogo confronto con valori ottenuti con il preparato di ileo isolato di cavia ha dato anche un elevato coefficiente di correlazione (r= 0,92). Mentre è difficile valutare gli antagonisti c componente di buprenorfina e ciclorfano con la preparazione dell'ileo, entrambi i composti possono essere saggiati in modo soddisfacente nel test di salto del topo. Le proprietà antagoniste riportate di chetociclazocina e profadolo non possono essere confermate nel modello murino.
L'influenza della forma cristallina sulle caratteristiche di trasmissione dello stress radiale dei materiali farmaceutici.Varie forme cristalline di sulfatiazolo, barbitale e aspirina sono state compresse in un unico -punch tablet machine strumentata per monitorare le forze applicate assialmente e radialmente trasmesse e il movimento del punzone superiore. Le variazioni dello stress radiale durante il ciclo di compressione dipendevano dalla forma polimorfa del materiale compresso. I risultati sono stati razionalizzati in termini di grado di flusso plastico /schiacciamento che si è verificato con ciascun materiale e il grado di compressione elastica del compatto finale Si ipotizza che la riduzione della temperatura di transizione delle forme polimorfe di sulfatiazolo e barbitale e la transizione polimorfa del sulfatiazolo Forma II sia dovuta alla produzione di dislocazioni nel cristallo e i cristalli ai bordi cristallini formati nei materiali compressi.
Alcune proprietà farmacologiche del veleno, frazioni di veleno e tossina pura del serpente di mare dal ventre giallo Pelamis platurus.Gli effetti del veleno grezzo, Sono state esaminate quattro frazioni di veleno parzialmente purificate e la tossina pura (tossina Pelamis alfa) del serpente di mare dal ventre giallo, Pelamis platurus, sulla respirazione, la pressione sanguigna, il cuore e il muscolo scheletrico di conigli. I risultati hanno indicato che il veleno grezzo, una frazione tossica parzialmente purificata e la tossina Pelamis alfa ha causato effetti stimolanti respiratori iniziali seguiti da paralisi respiratoria. Nella maggior parte dei casi, la paralisi respiratoria si è verificata prima di una profonda caduta della pressione arteriosa. Depressione della risposta della contrazione alla stimolazione nervosa è stata osservata nel muscolo tibiale anteriore. Nessun cambiamento significativo nel è stato osservato un elettrocardiogramma. Tre frazioni non tossiche parzialmente purificate del veleno grezzo hanno indotto effetti stimolanti respiratori transitori. Si è concluso che il veleno grezzo e Pelamis t l'ossina alfa ha avuto un meccanismo d'azione identico e ha causato la paralisi respiratoria nei conigli.
Il trasporto delle tetracicline attraverso l'ileo di topo in vitro: l'effetto di cationi e altri agenti.Il trasferimento intestinale di diverse tetracicline disciolte in calcio- e la soluzione tampone di bicarbonato di Krebs priva di magnesio, pH 7,4, è stata studiata utilizzando l'ileo estroflesso del topo. Le velocità di trasferimento di clortetraciclina e demetilclortetraciclina erano inferiori a quelle di tetraciclina e ossitetraciclina, questi ultimi composti trasferiti alla stessa velocità. di calcio e magnesio al tampone riduceva notevolmente il trasferimento della tetraciclina; questa inibizione potrebbe essere antagonizzata dall'EDTA. La presenza di ferro inibiva anche il trasferimento della tetraciclina. L'effetto inibitorio di questi ioni sul trasferimento della tetraciclina sembrava dovuto alla chelazione del farmaco. Glucosamina e acetilmetionina, ma non acetil glucosamina, hanno diminuito il trasferimento intestinale delle tetracicline. I primi due agenti non hanno influenzato l'assorbimento dei fluidi tissutali. La tetraciclina è stata anche trasferita dal rivestimento sieroso a quello mucoso nel sacco intestinale non estroflesso dei topi. Le osservazioni di cui sopra hanno suggerito che l'assorbimento delle tetracicline non fosse dovuto esclusivamente alla diffusione passiva.
Studi con l'International Pyrogen Standard sulla sensibilità e riproducibilità dei test sui pirogeni della farmacopea.I conigli, 27 o 36 in ciascun esperimento, sono stati iniettati con International Pyrogen Standard (IPSt. ) nelle diverse stagioni Gli aumenti massimi di temperatura sono stati registrati, randomizzati e interpretati secondo i requisiti della BP (1973), USP (1970), P. Hung (1970) e P. Nord. (1962). Sebbene la dose di 3,5 ng kg(-1) IPSt. si sia dimostrata apirogena come testata in estate, quando testata in inverno la stessa dose è stata qualificata come pirogena (da rifiutare) fino a un terzo della le combinazioni secondo i criteri delle quattro Farmacopee. Nell'esperimento primaverile predominavano le qualifiche "da scartare" in quanto basate sulla risposta di grandi gruppi di conigli. L'esclusione dei conigli che mostravano bassa sensibilità (prima della randomizzazione) influenzava appena i risultati con 3.5 ng kg(-1) IPSt. nell'esperimento in cui la media l'aumento della temperatura è stato di 0,49 gradi. Se, invece, l'aumento della temperatura media è stato superiore (0,57 o 0,69 gradi), tale selezione ha praticamente comportato la scomparsa delle qualifiche "accettabili" nei gruppi di terzine e una grande predominanza delle qualifiche "da rifiutare" in i gruppi più grandi. La dose di 7,0 ng kg(-1) si è costantemente dimostrata pirogena in grandi gruppi di conigli.
Assorbimento gastrointestinale di carbenoxolone nel ratto determinato in vitro e in situ: deviazioni dall'ipotesi della ripartizione del pH.L'assorbimento di [14C] carbenoxolone da ileo estroflesso di ratto in vitro e da stomaco di ratto e ileo in situ è stato esaminato La velocità del suo trasferimento dalla mucosa alla sierosa in vitro aumenta all'aumentare del pH da 5 a 8 mentre la quantità legata al tessuto ileale diminuisce con l'aumentare del pH; assorbimento strettamente parallelamente alla solubilità del farmaco. L'assorbimento del carbenoxolone in situ è bi-esponenziale e sono state calcolate le costanti di velocità per i due processi. L'assorbimento in situ e l'escrezione biliare del farmaco aumentano all'aumentare del pH da 5,0 a 7,4. Il legame tissutale all'ileo in situ non dipende dal pH tranne che al di sotto di pH 5,0 quando si verifica un ampio accumulo tissutale di carbenoxolone a causa della sua bassa solubilità. Il legame tissutale allo stomaco aumenta notevolmente con la diminuzione del pH da 7,4 a 6,5 e a Il pH 6,5 è 80 volte maggiore del legame all'intestino. La velocità di assorbimento dallo stomaco, a pH 6,5-7,4, era molto inferiore a quella dell'intestino in situ. Quando si tiene conto del legame del carbenoxolone allo stomaco, contrariamente all'ipotesi della ripartizione del pH, è evidente una correlazione tra il suo assorbimento e la quantità presente nella forma ionizzata.
Effetti della fosvitina sui cambiamenti dell'ecg indotti da ipossia nel ratto.L'effetto della fosvitina (1 g kg(-1), ip) sui cambiamenti ecg indotti nei ratti da una riduzione della pressione parziale dell'ossigeno nella miscela respiratoria è stato studiato anche fosfocreatina, fosfoserina, ATP e Na2HPO42H2O per confronto intraperitoneale. La fosvitina da sola è stata trovata per prevenire i cambiamenti dell'onda T indotti dall'ipossia (appiattimento o scomparsa), che sono stati anche temporaneamente aggravati dall'iniezione di noradrenalina. Per quanto riguarda le alterazioni metaboliche del miocardio indotte dall'ipossia, vengono discusse due ipotesi: un rilascio di radicali fosvitina fosfato pronti per l'utilizzo immediato o un'azione del farmaco mediata da un sistema intrinseco delle proteinchinasi.
Fattori che influenzano il legame dei tranquillanti triciclici e degli antidepressivi all'albumina sierica umana.Il modello lineare correlato all'energia libera per le relazioni struttura-attività sviluppato da Hansch \ & Fujita (1964) è stato utilizzato per correlare il legame dei tranquillanti triciclici e degli antidepressivi all'albumina sierica umana (HSA) con parametri idrofobici ed elettronici. I parametri scelti sono il parametro cromatografico (Rm) e l'affinità di formazione del complesso a trasferimento di carica (kc ). L'importanza relativa di questi fattori è stata valutata mediante analisi di regressione lineare e multipla. I risultati mostrano che il fattore principale nel legame è elettronico con solo un contributo minore del parametro idrofobico.
Alcuni fattori di formulazione che influenzano la resistenza alla trazione, la disintegrazione e la dissoluzione delle compresse di ossitetraciclina non rivestite.È stato effettuato uno studio sugli effetti dell'agente legante la gelatina e contenuto di umidità sulla resistenza alla trazione, sui tempi di disintegrazione e dissoluzione delle compresse di ossitetraciclina. Tutte queste proprietà aumentano con il contenuto di gelatina e la massima resistenza alla trazione si verifica quando le compresse contengono tra il 2,5 e il 4,5% p/p di umidità. Le proprietà delle compresse dipendono sulla loro frazione di confezionamento ed in generale, i tempi di disgregazione e dissoluzione sono minimi quando la frazione di confezionamento è compresa tra 0,77 e 0,82. .
Una valutazione della simpatectomia cardiovascolare indotta da guanetidina.Trattamento del tasso di guanetidina (30 mg kg(-1), ip al giorno per 6 settimane) ha prodotto una profonda riduzione delle catecolamine presenti (come indicato dall'istochimica a fluorescenza e dalle determinazioni delle catecolamine) nei tessuti prelevati dal sistema cardiovascolare, ma vi è stata evidenza del ritorno delle catecolamine entro 8 settimane. Mentre questi cambiamenti sono coerenti con una simpatectomia, l'inalterato le risposte pressorie alla fisostigmina (100 mug kg(-1), iv) e all'occlusione carotidea indicano un'inalterata capacità funzionale dei nervi noradrenergici che irrorano il sistema cardiovascolare, sebbene parte della risposta possa essere attribuita al midollo surrenale non affetto potenziato dalla presenza di notevole supersensibilità come dimostrato alla noradrenalina esogena, sembrerebbe esserci una dissociazione tra i risultati ottenuti dai test fisici e funzionali della simpatectomia indotto dalla guanetidina.
L'effetto di alcuni macrolidi polienici sull'assorbimento dall'intestino tenue nel ratto.L'effetto di tre macrolidi polienici, candicidina, anfotericina B e nistatina sull'assorbimento del colesterolo [3H] è stato studiato nel ratto utilizzando la tecnica di perfusione dell'ansa intestinale in situ. Il trattamento cronico con candicidina e la sua presenza a varie concentrazioni negli esperimenti di perfusione dell'ansa intestinale hanno inibito l'assorbimento del colesterolo [3H] sebbene un effetto minore fosse ottenuto anche con amfotericina B e nistatina a concentrazioni più elevate. Un'azione simile ma molto meno pronunciata della candicidina è stata osservata anche sull'assorbimento di [3H] corticosterone e [14C] fenitoina.
Sintesi di chininogeno e chininogenasi da parte del fegato di ratti normali e feriti.Fegati isolati di ratti normali o di altri a 2 giorni dopo l'iniezione sottocutanea di trementina sono stati perfusi con un terreno semplificato. La stima di chininogeno, chininogenasi e 2 proteine plasmatiche nei perfusati così ottenuti indica che sia chininogeno che chininogenasi sono sintetizzati nel fegato. Inoltre, poiché il doppio del chininogeno e della chininogenasi è stato sintetizzato dai fegati dal ratti a cui era stata iniettata trementina come da quelli dei ratti normali, queste due proteine devono essere considerate membri del gruppo di proteine plasmatiche note come reagenti di fase acuta.
Rilascio di materiale simile alla prostaglandina dai vasi sanguigni mesenterici perfusi dei conigli.Infusioni di noradrenalina (1-3 mug ml(-1) min (-1)) nella preparazione vascolare mesenterica del coniglio ha causato un aumento da 2 a 5 volte della pressione di perfusione e un rilascio di materiale simile alla prostaglandina (3,23 +/- 0,65 (se) ng PGE2 equivalenti ml(-1)) L'indometacina (3 mug ml(-1)) ha impedito mentre l'acido arachidonico (0,2 mug ml(-1)) ha aumentato il rilascio di un materiale simile alla prostaglandina E. Le pareti delle arteriole o dei vasi precapillari sono il sito proposto della generazione di prostaglandine.
La persistenza del destrano 70 nel plasma sanguigno a seguito della sua infusione, durante l'intervento chirurgico, per la profilassi contro il tromboembolismo.Un'infusione di destrano (peso molecolare medio 70000 ) in soluzione fisiologica normale (1 litro o 500 ml) è stato somministrato a pazienti sottoposti a isterectomia. L'infusione è stata avviata all'induzione dell'anestesia e continuata per tutta l'operazione e fino a 5 ore successive. La velocità di eliminazione del destrano era indipendente dalla dose somministrata. Il tempo per eliminare metà della dose è stato di quasi due giorni e fino al 10% era ancora presente in circolo dopo una settimana. La persistenza di destrano nel plasma in queste quantità e per questo periodo di tempo può avere notevoli implicazioni in la profilassi della trombosi venosa profonda postoperatoria.
Rilascio di un farmaco da unguenti omogenei contenenti il farmaco in soluzione.Il tasso di rilascio di resorcina (5%) da idrogel (Carbopol, sodio sono stati esaminati carbossimetilcellulosa, amido), lipogel (base alcolica, basi esteriche contenenti diverse quantità di cera d'api con e senza additivo spalmabile, rispettivamente) e Labrafils Per il disegno sperimentale adottato il rilascio del farmaco è lineare tra 10 e 70 % della quantità di farmaco rilasciato. I risultati concordano bene con il modello matematico postulato da Higuchi (1962) per il rilascio di un farmaco da unguenti omogenei contenenti il farmaco in soluzione.
L'assorbimento e l'eliminazione della metoclopramide in tre specie animali.L'assorbimento e l'eliminazione della metoclopramide sono stati studiati nel ratto, nel coniglio e nel cane. Sottile Per l'analisi del farmaco immodificato e dei suoi metaboliti è stata utilizzata la cromatografia su strato seguita da fotodensitometria. La N-deetilazione è un'importante reazione metabolica di fase I e la coniugazione con acido glucronico e solfato è una delle principali vie di metabolismo, in particolare nel coniglio. I parametri farmacocinetici dopo somministrazione endovenosa hanno mostrato piccole variazioni interspecie. Sono state osservate cinetiche di eliminazione di primo ordine con emivite brevi e volumi di distribuzione apparenti elevati (maggiori di 1,1 kg(-1)). Sono state osservate importanti variazioni interspecie dopo somministrazione orale di dosi elevate del farmaco. La metoclopramide è stata eliminata lentamente dopo somministrazione orale ai ratti. I risultati nel coniglio e nel cane suggeriscono che il fegato svolge un ruolo attivo nel ridurre la disponibilità sistemica di metoclopramide immodificata dopo somministrazione orale.
Cambiamenti nella distribuzione delle dimensioni delle particelle durante la pastigliatura della polvere di sulfatiazolo.Cinque frazioni dimensionali di polvere di sulfatiazolo (diametro medio della superficie del volume 155, 133, 86, 50 e 41 mamma) sono stati compressi in compresse di 12 mm di diametro su una comprimitrice strumentata a perforazione singola. L'analisi dimensionale del materiale della compressa dopo la compressione ha mostrato un attrito della frazione più grossolana e un agglomerato della frazione più fine. Si ipotizza che vi sia una granulometria critica in cui gli effetti di frantumazione e incollaggio si annullano a vicenda. I cambiamenti nella granulometria sono discussi in relazione ad alcune delle caratteristiche di compressione della polvere.
La stabilità della cannabis e dei suoi preparati allo stoccaggio.Soluzioni di cannabinoidi puri, nove campioni di cannabis a base di erbe e due di resina di cannabis (uno appena preparato) sono stati conservati in condizioni variabili per un massimo di 2 anni. L'esposizione alla luce (non alla luce solare diretta) ha dimostrato di essere il singolo fattore maggiore nella perdita di cannabinoidi, specialmente nelle soluzioni, che dovrebbero quindi essere protette dalla luce durante le operazioni analitiche e fitochimiche. non è stato dimostrato che le soluzioni in etanolo fossero stabili. L'effetto della temperatura, fino a 20 gradi, era insignificante, ma l'ossidazione dell'aria ha portato a perdite significative. Queste potrebbero essere ridotte se si avesse cura di ridurre al minimo i danni alle ghiandole che fungono da \ "contenitori ben riempiti e ben chiusi". La perdita di tetraidrocannabinolo dopo l'esposizione alla luce non porta ad un aumento del cannabinolo, ma l'ossidazione dell'aria al buio lo fa. Si conclude che il cannabi a base di erbe o resina preparato con cura s o estratti sono ragionevolmente stabili da 1 a 2 anni se conservati al buio a temperatura ambiente.
Ipomagnesemia nei neonati di madri diabetiche: studi perinatali.Cinquantasei madri diabetiche e i loro bambini sono stati studiati in modo prospettico dalla nascita. Ventuno su 56 IDM aveva Mg sierico inferiore o uguale a 1,5 mg/dl, in almeno un'occasione durante i primi 3 giorni. Il Mg sierico in questi neonati ipomagnesemici non ha dimostrato il normale aumento con l'età postnatale che era presente nei neonati normomagnemici. Il Mg era correlato all'aumento della gravità del diabete materno, delle giovani madri, delle madri per gravità inferiore e della prematurità. La diminuzione di Mg sierica, da sola o con diminuzione del Ca ionizzato o totale, non era correlata con l'irritabilità neuromuscolare nei neonati. La diminuzione del Mg sierico nell'IDM era associata a diminuzione del Mg sierico materno, diminuzione neonatale ionizzata e Ca totale, aumento del P sierico e diminuzione della funzione paratiroidea. la pomagnesemia si verifica nell'IDM; si ipotizza che i fattori che causano la HM possano includere la HM materna o l'iperfosfatemia neonatale e che la HM sia correlata all'ipocalcemia e all'ipoparatiroidismo funzionale dell'IDM.
Danno da lisozima causato da prodotti di degradazione secondaria durante il processo di autossidazione dell'acido linoleico.LA autossidata è classificata in quattro gruppi, LA, LAHPO, SP e FP. Il lisozima viene inattivato da questi prodotti nell'ordine crescente come segue: FP inferiore a LA inferiore a LAHPO inferiore a SP. Vengono esaminati gli effetti di questi prodotti sulla composizione aminoacidica del lisozima. Tutti i tipi di residui di aminoacidi non sono stati danneggiati fino a quando il lisozima è stato incubato con LA e LAHPO a 45 gradi C per 100 giorni. I residui di amminoacidi sensibili attaccati dai prodotti autoossidati sono triptofano, lisina e istidina. La perdita specifica di metionina da parte di SP si verifica durante l'idrolisi acida. L'effetto di SP era il più forte tra i prodotti autoossidati. FP era quasi inefficace. Le azioni distruttive di BP, MA e PA sono state confrontate con quelle dei prodotti autoossidati. Gli effetti di questi composti non assomigliavano a quelli dei prodotti autoossidati. Era con ha concluso che i residui di triptofano, lisina e istidina sono stati specificamente attaccati da SP.
Precursore nucleotidico della guanosina per la flavinogenesi di Eremothecium Ashbyii.Il precursore della purina nella via biosintetica della riboflavina in Eremothecium ashbyii è stato esaminato utilizzando un analogo della guanina, 8- azaguanina, con sistemi cellulari non in crescita 1. La formazione di riboflavina nel filtrato di coltura è stata determinata a 0, 5, 10 e 20 ore dopo l'inizio dell'incubazione delle cellule non in crescita in presenza di xantina o 8-azaguanina (1 mM, rispettivamente). A 20 ore di incubazione, l'aggiunta di xantina ha stimolato la formazione di riboflavina del 36% e l'aggiunta di 8-azaguanina ha inibito la formazione del 57%. 2. I pool di nucleotidi solubili in acido nelle cellule sono stati seguiti a 0, 5 , 10 e 20 ore del periodo di incubazione in presenza di xantina o 8-azaguanina mediante cromatografia su colonna a scambio anionico. Il risultato ha mostrato che il pool di GTP è cambiato notevolmente nonostante il fatto che il pool di nucleotidi di adenosina fosse quasi costante indipendentemente dalla presenza o addominali enza di queste purine fino a 10 ore di incubazione. Ma la diminuzione della prima è stata in parte superata dall'aggiunta di xantina flavinogena. Inoltre, le quantità totali di GTP e guanosina accumulate nelle cellule in presenza di 8-azaguanina hanno raggiunto il massimo già a 5 ore, raggiungendo un livello doppio rispetto al contenuto di GTP del controllo. 3. Il ruolo del pool di nucleotidi della guanosina nella formazione della riboflavina è stato ulteriormente esaminato utilizzando l'8-azaguanina. In questo esperimento il farmaco è stato aggiunto alla sospensione di cellule non in crescita a 3 o 6 ore dall'inizio dell'incubazione e la reazione è stata continuata fino alla 12a ora. Questo esperimento ha osservato una correlazione più chiara tra la formazione di riboflavina e il pool di nucleotidi di guanosina. Il pool di nucleotidi di guanosina (costituito da GMP, PIL e GTP) è aumentato contemporaneamente all'inibizione della formazione di riboflavina. Dei pool di nucleotidi di guanosina, il pool di GMP è aumentato di 2,7 volte rispetto al normale con l'aggiunta di 8-azaguanina durante l'incubazione per 6 ore e 5,3 volte per 9 ore. Mentre, il pool di GTP è aumentato di 1,9 volte rispetto al normale per 6 ore\' di incubazione nella supplementazione di questo farmaco, ma è diminuito a metà del normale nel periodo di incubazione di 9 ore. In questi casi, le quantità ridotte di GTP erano uguali alle quantità aumentate di GMP durante i periodi di incubazione di 6 ore e 9 ore in presenza di 8-azaguanina aggiunta. 4. I risultati di cui sopra suggeriscono fortemente che il GTP è un precursore immediato della riboflavina sotto forma di nucleotide.
Sequenza temporale dei cambiamenti lipogenici nel tessuto adiposo dei ratti quando convertiti dall'alimentazione ad libitum al consumo di pasti.Questo studio è stato intrapreso per stabilire il tempo sequenza di cambiamenti lipogenici nel tessuto adiposo dei ratti quando convertiti dall'alimentazione ad libitum al consumo di pasti. I ratti sono stati alimentati con una dieta ricca di carboidrati 2 ore/giorno per 0-10 giorni (consumo di pasto). La frazione supernatante ad alta velocità dall'epididimo omogeneizzato cuscinetti di grasso è stato testato per l'enzima di scissione del citrato, l'acetil CoA carbossilasi, la sintetasi degli acidi grassi e le attività dell'enzima malico. Gli effetti dell'alimentazione con i pasti sui tassi in vitro e in vivo della sintesi degli acidi grassi nel tessuto adiposo e sulle quantità di glicogeno depositato nel tessuto adiposo è stato misurato il tessuto adiposo. Durante i primi 10 giorni di alimentazione del pasto, le attività enzimatiche lipogeniche erano effettivamente diminuite o invariate nei ratti nutriti con pasto, ma durante questo periodo i tassi in vitro e in vivo di sintesi degli acidi grassi erano progressivamente aumentati ed nei ratti nutriti con cibo. I livelli di glicogeno nel tessuto adiposo dei ratti nutriti con farina erano maggiori dei livelli nelle roditrici. L'iniziale iperlipogenesi osservata nel ratto nutrito con pasto sembra essere dovuta a cambiamenti nell'assorbimento del substrato da parte del tessuto adiposo e/o ad alterazioni nell'attivazione enzimatica nel tessuto adiposo piuttosto che a cambiamenti nella quantità di enzima presente nel tessuto.
Necrosi del muscolo scheletrico in seguito a farmaci attivi sulla membrana più serotonina.La somministrazione di imipramina più serotonina (5-HT) ai ratti è stata proposta come animale modello di distrofia muscolare di Duchenne Abbiamo studiato la necrosi del muscolo scheletrico prodotta in ratti maschi trattati con 5-HT dopo pretrattamento con imipramina, altri antidepressivi triciclici o antistaminici, che come gli antidepressivi triciclici, possono bloccare la ricaptazione neuronale di 5-HT. questi agenti più 5-HT, 20 mg/kg per via sottocutanea (sc), la necrosi era più grave nel muscolo soleo rispetto al quadricipite. Non c'era alcuna differenza significativa nell'incidenza di necrosi nei muscoli soleo e quadricipite dopo uno di questi agenti più 5-HT, 100 mg/kg, per via intraperitoneale (ip) Dopo uno di questi agenti più 5-HT ip, ma non 5-HT sc, la necrosi estesa era significativamente più frequente e grave nel muscolo quadricipite che dopo 5-HT sc Clorfeniramina (CP) più 5-HT, 2,5 mg/kg per via endovenosa, ha prodotto meno necrosi muscolare rispetto a CP più 5-HT s. c. o i. p. La necrosi prodotta da CP plus 5-HT s. c. era paragonabile omolaterale e controlaterale al sito di iniezione. La necrosi a seguito di CP più 5-HT i. p. era massima a 24 ore ed è rimasta abbastanza costante fino a 5 giorni. La rigenerazione era prominente da 7 giorni. La necrosi muscolare prodotta da CP più 5-HT è bloccata da alcuni bloccanti 5-HT, ad esempio methiotepina e metisergide. È anche parzialmente bloccato dalla denervazione. La capacità degli antidepressivi triciclici e degli antistaminici di bloccare la ricaptazione neuronale di 5-HT tendeva ad essere correlata negativamente con la capacità di potenziare la necrosi muscolare prodotta con 5-HT, il che suggerisce che il blocco della captazione di 5-HT non è il meccanismo della patologia prodotto dal trattamento combinato. Gli antidepressivi triciclici e gli antistaminici sono "stabilizzanti-labilizzanti di membrana". Altri farmaci che sono "stabilizzatori-labilizzatori di membrana" come il triesifenidile e la procaina hanno anche promosso la necrosi del muscolo scheletrico quando somministrati prima della 5-HT. Si propone che gli effetti dell'imipramina più 5-HT sul muscolo scheletrico non siano dovuti al blocco dell'assorbimento neuronale di 5-HT e alla successiva ischemia indotta vascolare, ma riflettano gli effetti tossici diretti di questi agenti sul muscolo scheletrico.
Mortalità e metabolismo cerebrale dopo legatura bilaterale dell'arteria carotide in ratti normotesi e spontaneamente ipertesi.Mortalità e metabolismo glicolitico cerebrale sono stati studiati dopo legatura bilaterale del comune carotide nei ratti Wistar normotesi (NTR) e nei ratti spontaneamente ipertesi (SHR) derivati dal ceppo Wistar. Nelle prime 24 ore dopo l'occlusione delle arterie carotidi, il 72% di 108 SHR è morto, mentre è stato fatale solo nel 16% di 43 NTR. In SHR, il rapporto lattato cerebrale e lattato cerebrale/piruvato (rapporto L/P) è aumentato di 12,4 e 12,1 volte rispetto al controllo, rispettivamente da cinque a sei ore dopo la legatura, ed è rimasto elevato anche nei ratti sopravvissuti per due o tre giorni successivi. I cambiamenti nel lattato cerebrale e nel rapporto L/P erano minimi in NTR. L'ATP cerebrale è diminuito notevolmente da cinque a sei ore dopo la legatura nello studio SHR. Questi risultati indicano che la legatura dell'arteria carotidea bilaterale causa gravi danni cerebrali ge in SHR ma non in NTR, suggerendo che l'ipertensione di per sé è operativa per lo sviluppo dell'ischemia cerebrale.
Accumulo e stoccaggio di Zn2+ da parte di Candida utilis.Le cellule affamate di Candida utilis hanno accumulato Zn2+ mediante due processi diversi. Il primo era un rapido, energetico- e sistema indipendente dalla temperatura che probabilmente rappresentava il legame alla superficie cellulare. Le cellule possedevano anche un sistema dipendente dall'energia, dal pH e dalla temperatura che era in grado di accumulare quantità molto maggiori del catione rispetto al processo di legame. Il sistema era inibito da KCN, Na2HAsO4, m-clorofenil carbonilcianuro idrazone, N-etilmaleimmide, EDTA e acido dietilentriaminopenta-acetico Il sistema era specifico in quanto Ca2+, Cr3+, Mn2+, Co2+ o Cu2+ non erano in competizione, inibivano o potenziavano il processo, l'assorbimento di Zn2+ è stato inibito da Cd2+. Il sistema ha mostrato una cinetica di saturazione con un valore di semisaturazione di 1,3 muM e una velocità massima di 0,21 (nmol Zn2+) min(-1) (mg peso secco(-1)) a 30 gradi C. L'assorbimento di Zn2+ ha richiesto membrane intatte poiché solo il legame ing è stato osservato in presenza di nistatina, toluene o sodio dodecil solfato. Le cellule non hanno scambiato toluene accumulato di recente o sodio dodecil solfato. Le cellule non hanno scambiato il 65Zn recentemente accumulato in seguito all'aggiunta di un grande eccesso di Zn2+ non radioattivo. Allo stesso modo, le cellule precaricate con 65Zn non hanno perso il catione durante il digiuno e l'efflusso non si è verificato quando il glucosio e lo Zn2+ esogeno sono stati forniti dopo il periodo di fame. L'efflusso è stato osservato solo dopo l'aggiunta di toluene o nistatina, o quando le cellule sono state riscaldate a 100 gradi C. Le cellule alimentate con una grande quantità di Zn2+ contenevano una frazione proteica simile alla metallotioneina delle cellule animali. Nella coltura batch, le cellule di C. hanno accumulato Zn2+ solo durante la fase di latenza e l'ultima metà della fase di crescita esponenziale.
Diminuzione della permeabilità come meccanismo di resistenza al metil benzimadazol-2-il carbammato (MBC) in Sporobolomyces roseus.Mutanti di Sporobolomyces roseus resistenti al benzimidazolo fungicidi variavano nelle loro risposte a 2-(tiazol-4-il)benzimidazolo (tiabendazolo, TBZ), metil 1-(butilcarbamoil)-benzimidazolo-2-il carbammato (benomil) e metil benzimidazolo-2-il carbammato (carbendazim, MCB L'incorporazione di [14C] MBC negli estratti di acido tricloroacetico del ceppo sensibile S4 è aumentata durante un periodo di incubazione di 2 ore, mentre l'incorporazione nel mutante resistente M55 è rimasta invariata. L'assorbimento di [14C] MBC da parte delle cellule S4 è stato cinque volte superiore a quello delle cellule S4. M55. MBC è stato identificato come il principale composto radioattivo all'interno delle cellule S4 e ha raggiunto un livello di 2,4 mug/100 mg di peso secco Il composto MBC entra nelle cellule di Sp. roseus in base a temperatura, energia, pH e concentrazione. sistema di trasporto dipendente che può essere specifico per composti contenenti un benzim nucleo di idazolo. Si suggerisce che la tolleranza di M55 a MBC sia dovuta alla ridotta permeabilità della cellula a questo composto.
L'effetto della limitazione dell'azoto sulla repressione da parte dei cataboliti di amidasi, istidasi e urocanasi in Pseudomonas aeruginosa.In Pseudomonas aeruginosa, la sintesi di istidasi, urocanasi e l'amidasi viene severamente repressa quando il succinato viene aggiunto a una coltura che cresce in terreno piruvato + sali di ammonio. Quando la crescita è limitata dall'azoto, la repressione dei cataboliti da parte del succinato della sintesi dell'istidasi e dell'urocanasi non si verifica ma persiste la repressione della sintesi dell'amidasi da parte del succinato. regolata allo stesso modo della sintesi dell'istidasi dalla disponibilità di altri composti azotati per la crescita. La crescita del ceppo PACI di P. aeruginosa in terreni succinato + istidina è limitata dall'azoto poiché questo ceppo è difettoso in un sistema di trasporto dell'istidina. Quando cloruro di metil-ammonio viene aggiunto al terreno succinato + istidina, si verifica l'inibizione della crescita I mutanti isolati da piastre succinato + istidina + cloruro di metilammonio sono risultati resistenti per catabolire la repressione da succinato anche in mezzi di sali di ammonio. Si suggerisce che i geni hut di P. aeruginosa possano essere regolati allo stesso modo di Klebsiella aerogenes, mediante induzione da parte dell'urocanato e attivazione da parte della proteina attivatrice ciclica AMP-dipendente o dalla glutammina sintetasi.
Le caratteristiche di produzione e crescita di lieviti e forme miceliali di Candida albicans in coltura continua.Sono state esaminate le caratteristiche di crescita di Candida albicans CM145.348 in condizioni aerobiche in coltura continua A diversi stati stazionari l'ambiente è stato controllato rispetto alle concentrazioni di ossigeno disciolto, carbonio e azoto, pH e temperatura Sostanza secca, concentrazione del substrato, resa, consumo specifico di ossigeno, anidride carbonica specifica quoziente di rilascio e respirazione sono stati esaminati in funzione della velocità di diluizione. La morfologia dipendeva dalla fonte di carbonio. Il maltosio ha prodotto una morfologia miceliale, mentre con il lattato si è ottenuta una coltura di lievito. Con fruttosio o glucosio come fonte di carbonio una morfologia mista di lievito , sono state prodotte forme pseudo-miceliali e miceliali. Un numero maggiore di diverse condizioni di crescita è stato esaminato in coltura in batch, ma è stata sempre ottenuta una morfologia mista.
Formazione e isolamento di leucocidina da Pseudomonas aeruginosa.Una sostanza tossica, che distruggeva i leucociti dell'uomo ma era inattiva contro gli eritrociti, è stata dimostrata in colture di quattro dei 110 ceppi di Pseudomonas aeruginosa testati. La tossina, denominata \'leucocidin\', era legata alle cellule come tossina precursore, presentando poca o nessuna tossicità. È stata convertita in tossina con la massima attività da varie proteasi tra cui un'elastasi endogena. La produzione di leucocidina era direttamente proporzionale al numero di batteri e non era influenzata dalle variazioni dei terreni, della concentrazione di ferro, del pH o della temperatura. Il metodo migliore per la produzione su larga scala di leucocidina era l'autolisi dei batteri lavati.
Distribuzione della rodopsina e del retinocromo nella retina del calamaro.La retina dei cefalopodi contiene due tipi di fotopigmenti, la rodopsina e il retinocromo. Per molti anni il retinocromo è stato pensato per essere localizzato nei segmenti interni delle cellule visive, mentre la rodopsina è nei segmenti esterni. Tuttavia, è ormai chiaro che il retinocromo può essere estratto anche da frammenti di segmenti esterni. Nella retina adattata al buio di Loligo pealei il retinocromo è distribuito metà e metà nei segmenti interno ed esterno. Todarodes pacificus contiene molto più retinocromo di Loligo, ed è più abbondante nei segmenti esterni che nei segmenti interni. I segmenti esterni di Loligo contengono retinocromo e metarodopsina oltre alla rodopsina, se i calamari sono tenuti al buio o alla luce. Ma c'è pochissima metarodopsina (circa il 3% di rodopsina) anche negli occhi adattati alla luce. I segmenti interni contengono solo retinocromo e molto meno alla luce che al buio. D'altra parte, il retinocromo nei segmenti esterni aumenta notevolmente durante l'adattamento alla luce. Questi fatti suggeriscono la possibilità che un po' di retinocromo si muova in avanti dai segmenti interni a quelli esterni durante l'adattamento alla luce e reagisce con la metarodopsina per promuovere la rigenerazione della rodopsina.
Trasporto di protoni per diffusione di fosfato - un meccanismo di trasferimento facilitato di CO2.Abbiamo misurato i flussi di CO2 attraverso soluzioni di fosfato a diverse concentrazioni di anidrasi carbonica, bicarbonato gradienti di concentrazione, concentrazioni di fosfato e mobilità. La temperatura era di 22-25 gradi C, il pH delle soluzioni di fosfato era 7,0-7,3. Abbiamo scoperto che in condizioni fisiologiche di pH e pCO2 si verifica una diffusione facilitata di CO2 oltre alla diffusione libera quando (a) è presente una quantità sufficiente di anidrasi carbonica e (b) viene stabilito un gradiente di concentrazione di HCO3- insieme a un gradiente di pCO2 e (c) il tampone fosfato ha una mobilità paragonabile a quella del bicarbonato. Particelle di cellulosa lunghe 0,25 mm, non è stata rilevata alcuna facilitazione della diffusione della CO2 Sulla base di questi risultati è stato proposto un meccanismo di diffusione facilitata della CO2 nelle soluzioni di fosfato analogo a quello nelle soluzioni di albumina s: diffusione del bicarbonato insieme ad un trasporto facilitato di protoni per diffusione di fosfato. È stato formulato un modello matematico di questo meccanismo. I flussi di CO2 previsti dal modello concordano quantitativamente con i flussi determinati sperimentalmente. Si conclude che un meccanismo di trasporto protonico altamente efficace agisce in soluzioni di tamponi fosfato mobili. Con questo meccanismo; Il trasferimento di CO2 può essere aumentato fino a cinque volte e il trasferimento di protoni può essere aumentato fino a 10.000 volte.
Peli gustativi sulla zanzara, Culiseta inornata.I peli gustativi sono stati studiati sulle zampe e sull'apparato boccale di Culiseta inornata (Williston) (Diptera: Culicidae) Sulle gambe è stato trovato un tipo di pelo, ciascuno innervato da quattro neuroni. Due dei neuroni hanno risposto alla stimolazione con NaCl, un neurone alla stimolazione dell'acqua e un neurone alla stimolazione del saccarosio. Tre tipi di capelli designati Tipo I (T1) Sulla labella sono stati analizzati il tipo 2 (T2) e il tipo 3 (T3). I capelli T1 sono innervati da un neurone zucchero, un meccanocettore, due neuroni sale e un neurone acqua. I capelli T2 sono innervati da due neuroni sale e uno meccanorecettore. I peli T3, situati sulla superficie orale della labella, sono innervati da un numero variabile (2-5) di neuroni. L'identificazione precisa dei neuroni chemiosensoriali T3 non è stata effettuata a causa delle piccole dimensioni e dell'inaccessibilità dei capelli T3 I peli chemiosensoriali sulla punta del labrum sono stati testati elettrofisiologici icamente. la sequenza di efficacia decrescente per i tre sali testati era KCl maggiore di NaCl maggiore di LiCl. Anche i chemocettori labrali hanno risposto positivamente al saccarosio.
Ventilazione e tasso metabolico della giovane trota iridea (Salmo gairdneri) esposta a pH ambientale subletale.Differenze tra risposta ventilatoria e tassi metabolici della giovane trota iridea testati nell'intervallo subletale da pH 6 a pH 9 sono stati osservati utilizzando un respirometro ad acqua corrente Il consumo di ossigeno è stato monitorato a velocità di nuoto di 12 cm/sec e 24 cm/sec. I tassi di consumo di ossigeno a 24 cm/sec e pH 6 (423 mg/kg-ora) e pH 9 (367 mg/kg-ora) erano considerevolmente più alti di quelli determinati vicino alla neutralità (328 mg/kg-ora). La velocità di ventilazione è aumentata su entrambi i lati della neutralità, ma significativamente meno inversioni respiratorie , o "tosse," sono stati osservati a pH 6 e un numero maggiore a pH 9 rispetto a quello verificatosi a pH 7 e 8 o nei pesci non testati. Si è dimostrato che la risposta respiratoria-tosse dipende dal pH nella trota iridea e può quindi non essere un'indicazione altrettanto affidabile dello stress causato dagli inquinanti negli studi in cui il pH sperimentale ha n non è stato specificato o controllato.
[Formazione e purificazione dell'inibitore dell'ossidoreduttasi dal NAD (AUTHOR\'S TRANSL)].L'inibitore dell'ossidoreduttasi non è formato da NADH come si pensava in precedenza , ma solo dal NAD in condizioni alcaline Gli analoghi del NAD (es. NADP) e i componenti della molecola del NAD (es. ADP) non hanno effetto sulla formazione dell'inibitore Il pH, la temperatura, la durata dell'incubazione, il tipo di tampone più favorevoli e la concentrazione di NAD per la formazione dell'inibitore sono stati studiati. Il metodo per la formazione e l'isolamento cromatografico dell'inibitore dell'ossidoreduttasi è brevemente descritto.
Le azioni di alcuni presunti neurotrasmettitori sulla ghiandola salivare dello scarafaggio.1. Alcuni presunti trasmettitori sono stati applicati alla ghiandola salivare innervata dello scarafaggio e i loro effetti su sono stati osservati il potenziale di riposo e il potenziale secretorio evocato dal punto di vista neuronale delle cellule acinari 2. L'acido gamma-aminobutirrico, il glutammato, la glicina, l'aspartato e l'alanina non hanno avuto effetti significativi sul potenziale di riposo. Tuttavia, l'acido gamma-aminobutirrico e il glutammato hanno ridotto il potenziale neuronale potenziale secretorio evocato ma solo a concentrazioni superiori a 10(-3) M3. Acetilcolina e carbacolo sembravano agire modificando l'uscita del trasmettitore dai nervi salivari. Queste sostanze non hanno avuto alcun effetto sul potenziale di riposo. 4. Le ammine biogene, l'adrenalina, dopamina, noradrenalina, 5-idrossi-triptamina e octopamina, hanno prodotto risposte iperpolarizzanti, graduate secondo la concentrazione 5. Si suggerisce che la dopamina, la più potente delle ammine biogene s testato, il trasmettitore è a questo incrocio.
Captazione ionica ramificata nel temolo artico: valori di riposo ed effetti del disturbo acido-base.1. Tecniche per la misurazione dei flussi unidirezionali nei pesci che non richiedono anestesia o chirurgia sono descritti 2. I valori a riposo per l'assorbimento di Cl- a 10 e 17 gradi C erano 8-03 +/- 1-11 e 13-52 +/- 0-95 mu-equiv. 200 g- 1 h-1 (+/- SE), rispettivamente, e per Na+ i tassi erano rispettivamente 15-49 +/- 0-40 e 26-30 +/- 0-36 3. L'acidosi ipercapnica ha causato un aumento di Na+ assorbimento, presumibilmente attraverso lo scambio Na+/H+ (o NH+4). Si suggerisce che questo sia un meccanismo di compensazione che porta all'aumento del tampone ematico osservato in risposta all'ipercapnia. 4. L'alcalosi è stata osservata in seguito ad un aumento acuto della temperatura ed è stata accompagnata da un aumento della velocità di scambio Cl-/HCO-3 e anche un aumento dello scambio Na+/H+. 5. Viene discusso il ruolo di questi meccanismi di scambio ionico branchiale nella regolazione acidobase complessiva.
Uno studio sui flussi unidirezionali di Na e Cl attraverso le branchie dello spinarolo Scyliorhinus canicula (Chondrichthyes).Le branchie dello spinarolo Scyliorhinus canicula sono più permeabili al Cl che al Na. Nell'acqua di mare, l'afflusso di Na e Cl ha superato l'efflusso di questi ioni. In queste condizioni i pesci erano leggermente elettronegativi, di circa 2 mV, alla soluzione esterna. L'accumulo netto di Cl potrebbe dovuto alla diffusione lungo il gradiente elettrochimico osservato, il movimento di Na nel pesce era più coerente con un meccanismo di trasporto del Na attivo elettricamente neutro (usando il criterio del rapporto di flusso di Ussing). Quando il pH esterno è stato modificato da 7-8 a 6-9, gli afflussi di Na e Cl sono stati depressi, mentre gli efflussi sono rimasti inalterati e il pesce è diventato leggermente meno elettronegativo Nelle soluzioni artificiali, in cui le concentrazioni di Na e Cl sono state abbassate e sostituite con urea per mantenere l'osmotico totale concentrazione zione, l'afflusso di Na mostrava una cinetica di saturazione, mentre l'efflusso di Na aumentava con la diminuzione delle concentrazioni di Na. L'afflusso di Cl è diminuito linearmente, mentre l'efflusso di Cl è rimasto costante. L'efflusso di Cl non può essere riconciliato con un processo di diffusione passiva lungo nessuno dei gradienti elettrochimici osservati e quindi potrebbe riflettere la presenza di un meccanismo di trasporto attivo.
La mobilitazione di calcio e bicarbonato mediante elevate concentrazioni di potassio nell'emolinfa della lumaca, Helix pomatia.1. Dopo la concentrazione di potassio in l'emolinfa di Helix pomatia è stata sollevata dall'infusione di KCl, cade in modo esponenziale per un certo tempo e poi tende a salire. L'aumento e la diminuzione della concentrazione di calcio possono essere adattati a un semplice modello matematico. 2. La mobilitazione del calcio è accompagnata dalla generazione di bicarbonato in quantità equivalenti, senza grandi variazioni di pH o Pco 2. 3. Probabilmente in questo momento c'è un aumento della produzione o ritenzione di anidride carbonica, ma la causa principale delle variazioni di calcio e bicarbonato non è respiratoria acidosi 4. La concentrazione di potassio aumenta nello snalis che è stato infuso con CaCl 2. 5. Le reazioni avverse visibili nelle lumache infuse con KCl sono in gran parte prevenute quando CaCl2 viene infuso contemporaneamente 6. L'omeostasi sembra per coinvolgere il mantenimento di un corretto equilibrio delle concentrazioni di calcio e potassio.
sull'interazione di NH + 4 e Na + flussi nelle trote branchiali isolate.", . "1 afflusso di sodio è stata misurata in isolati, archi branchiali precedenza perfusi di trota arcobaleno, Salmo gairdneri, misurando l'incorporazione di 22Na nel tessuto gill seguito all'esposizione a tempo su un supporto 1 mM 22NaCl. Trasporti tassi approssimata quelli stimati per i pesci intatto ed erano lineare per almeno un minuto. 2. NH4Cl contenenti perfusates a pH 7 e 8 stimolato Na + afflusso altrettanto, indicando che l'ammoniaca solo ionizzato è importante nel processo di trasporto a Na + / NH4 + cambio in basale e / o membrane laterali delle cellule che trasportano suggerito 3. dietetico Ringer perfusato aumentata Na + afflusso.. ; in un gruppo di branchie il tasso di trasporto era più del doppio di quella dei controlli NaCl Ringer. l'incremento del trasporto indotto da interno NH4 + non è stato additivo con l'aumento basso contenuto di sodio. una riduzione intracellulare (Na +) viene postulato come il funzionamento meccanismo sia casi. 4. ouabain avuto alcun effetto apprezzabile sul Na + afflusso, con o senza NH4 + nel perfusato. Diamox parzialmente bloccato l'aumentata Na + afflusso indotta da NH4 +. Amiloride completamente inibita Na + afflusso, sia con che senza NH4 + nel perfusato.
Due sistemi a conduzione lenta coordinano il comportamento di arrampicarsi sulle conchiglie nell'anemone di mare Calliactis parasitica.1. Impulsi in due sistemi a conduzione lenta, l'ectodermico L'SS 1 e l'endodermico SS 2 sono stati registrati durante il comportamento di arrampicata sul guscio. L'intervallo medio degli impulsi SS 1 era di 7-4 s e quello degli impulsi SS 2 era di 6-4 s. L'attività in entrambi i sistemi può manifestarsi come un risposta dei tentacoli al contatto con il guscio, ma SS 1 e SS 2 potrebbero non condividere gli stessi recettori 2. La stimolazione elettrica di SS 1 e SS 2 insieme, a una frequenza di 1 shock ogni 5 s, provoca il comportamento di arrampicarsi sul guscio in l'assenza di un guscio 3. L'attività della rete nervosa a bassa frequenza (circa 1 impulso ogni 15 s) accompagna la flessione della colonna durante le risposte sia normali che provocate elettricamente. Questa attività deriva probabilmente dalla flessione della colonna e non è dovuta a un risposta sensoriale al guscio.
Controllo dell'insediamento di conchiglie nell'anemone di mare nuoto Stomphia coccinea.1. L'attività elettrica è stata registrata da Stomphia coccinea durante la sequenza comportamentale in cui il l'anemone distaccato si deposita su un guscio di Modiolus 2. Quando un tentacolo sensibile entra in contatto con il guscio, viene suscitato un breve e complesso scoppio di impulsi. Questi rimangono confinati nella regione di contatto. Il sistema endodermico a lenta conduzione (SS2) inizia quindi a sparare ripetutamente (un tipico esempio è 16 impulsi SS2 a un intervallo medio tra gli impulsi di 5 s) fino a quando il disco del pedale inizia a gonfiarsi. Il contatto guscio-tentacolo è essenziale per la stimolazione dell'attività SS2 3. La risposta completa, a parte la flessione locale del la colonna, può essere riprodotta mediante stimolazione elettrica del solo SS2. Sono necessari solo 10 stimoli a frequenze comprese tra 1 shock/se 1 shock/10 s per suscitare la risposta.
Metodi migliorati per lo studio della HMG CoA reduttasi epatica: isolamento in un'unica fase del mevalonolattone e preparazione rapida del reticolo endoplasmatico.Sono descritti due nuovi metodi per lo studio della 3-idrossi-3-metilglutaril coenzima A (HMG CoA) reduttasi epatica. (1) Il reticolo endoplasmatico è stato preparato rapidamente diluendo un surnatante di 10.000 g con un tampone contenente cloruro di calcio 8 mM. La resa della proteina e l'attività specifica di HMG CoA reduttasi nel pellet successivamente ottenuto mediante centrifugazione a bassa velocità erano quasi identici a quelli nel pellet microsomiale preparato mediante ultracentrifugazione. Questa tecnica può essere particolarmente utile negli studi sulla rapida modulazione in vitro dell'enzima. (2) Il mevalonolattone è stato estratto in benzene dalla miscela del test della HMG CoA reduttasi con un'efficienza del 58%. C'era meno dell'1% di estrazione di HMG CoA, acetoacetato o beta-idrossibutirrato. Il mevalonolattone estratto era puro almeno al 98% come giudicato dalla cromatografia su strato sottile con quattro diversi sistemi di solventi. Questi metodi migliorati dovrebbero aiutare in modo significativo gli studi sull'importanza fisiologica della HMG CoA reduttasi.
Il metabolismo dell'acido 3alfa, 7alfa, 12alfa-triidrossi-5beta-colestan-26-oico in colico: un saggio enzimatico che utilizza omogenati del fegato umano.È stato sviluppato un test enzimatico per misurare la conversione del precursore dell'acido biliare, acido 3alfa, 7alfa, 12alfa-triidrossi-5beta-colestan-26-oico (THCA), in acido colico utilizzando omogenati di biopsie epatiche umane. Il tasso medio del metabolismo del THCA in acido colico è risultato essere di 3,9 +/- 0,5 (+/- 1 DS) pmole di acido colico formate/mg fegato/minuto in dodici biopsie epatiche normali. Questo sistema di analisi può essere utilizzato per determinare se la sindrome della colestasi neonatale associata a un blocco metabolico nella conversione del THCA in acido colico viene trasmessa come tratto genetico.
L'uso di vescicole fosfolipidiche per studi in vitro sull'idrolisi dell'estere del colesterolo.Il colesterolo oleato radiomarcato è stato incorporato in vescicole preparate con lecitina di tuorlo d'uovo e utilizzato come un substrato per studi di idrolasi di esteri di sterolo presenti in omogenati di fegato di ratto. Il colesterolo oleato ha dimostrato di essere associato a vescicole (liposomi unilamellari) mediante cromatografia Sepharose 4B. Con questo substrato, sono stati dimostrati due diversi enzimi idrolitici di esteri di colesterolo in frazioni subcellulari dal omogenati epatici. Nella frazione ricca di lisosoma era presente un'idrolasi acida, mentre nella frazione citosolica (150.000 g surnatante) è stata dimostrata attività idrolitica con un pH ottimale compreso tra 8 e 8,5. Il substrato è stato caratterizzato mediante cromatografia Sepharose sia prima e dopo l'incubazione con la frazione epatica e non è stato drammaticamente alterato anche da rigorose condizioni di incubazione. L'enzima lisosomiale preparatio n era in grado di idrolizzare quasi tutto il colesterolo oleato nelle vescicole. L'idrolisi del fosfolipide era proporzionalmente molto inferiore a quella del colesterolo oleato. Sono stati eseguiti confronti tra la preparazione della vescicola e una preparazione del substrato alternativa che prevedeva l'aggiunta diretta di colesterolo oleato in soluzione di acetone. Le vescicole sembravano essere un substrato migliore per l'enzima lisosomiale, mentre l'attività nella frazione del citosol non distingueva tra le due preparazioni di substrato. Le sospensioni non soniche di colesterolo oleato e lecitina non servivano come substrati adatti per gli enzimi. Questi studi dimostrano l'applicabilità delle vescicole contenenti esteri del colesterolo come substrato utile per studiare l'idrolisi dell'estere del colesterolo in vitro.
Effetto dell'insulina sulla fosforilazione ossidativa mitocondriale e sulla carica energetica del fegato perfuso di cavia.L'effetto dell'insulina è stato studiato nel fegato isolato di cavia perfuso con tampone bicarbonato di Krebs-Ringer contenente globuli rossi e albumina Nei mitocondri isolati da fegati perfusi con 10 unità di insulina all'ora, l'attività fosforilativa con glutammato come substrato è aumentata a circa il 160 per cento del controllo 60 minuti dopo l'inizio di perfusione (p inferiore a 0,01). Tale maggiore attività fosforilativa è stata accompagnata da aumenti del rapporto di controllo respiratorio, respirazione di stato 3 e rapporto P/O. D'altra parte, nel fegato perfuso con insulina, i livelli di la carica energetica e il quoziente nucleotidico di adenina sono aumentati in misura significativa rispetto al fegato senza insulina (p inferiore a 0,01 e p inferiore a 0,05, rispettivamente). Si suggerisce che l'insulina svolga un ruolo importante e come fattore portale nella regolazione della fosforilazione ossidativa mitocondriale e dei livelli dei nucleotidi adenina fosforilata.
Metabolismo dell'istamina. I. Saggi radiocromatografici su strato sottile per le attività enzimatiche dell'istaminasi e dell'istidina decarbossilasi.Metodi radiocromatografici su strato sottile per la misurazione dell'istaminasi e sono state sviluppate attività di istidina decarbossilasi. I test sono specifici per i rispettivi enzimi, sono sensibili e riproducibili e possono essere eseguiti utilizzando substrati disponibili in commercio. Il test di istaminasi consente la determinazione dell'attività enzimatica da 2,5 mul di sieri di gravidanza, 1-2 X 10 (6) granulociti umani e quantità di microgrammi di istaminasi placentare umana parzialmente purificata con un errore inferiore al 5%. Il test dell'istidina decarbossilasi consente la misurazione di quantità di nanogrammi di istamina appena formata da un minimo di 2 X 10 (4) peritoneale di ratto mastociti o cellule di leucemia basofila di ratto con un errore inferiore al 5%.
Effetto della 9-beta-D-arabinofuranosylhypoxanthine 5\'-monophosphate su lesioni genitali ed encefalite indotte da Herpesvirus hominis di tipo 2 in topi femmina.La 9-beta-D-arabinofuranosilipoxantina 5\'-monofosfato, somministrata per via orale o topica, ha aumentato il numero di sopravvissuti e il giorno medio di morte nei topi inoculati per via intravaginale con Herpesvirus hominis di tipo 2. L'applicazione topica del farmaco in unguento ha ridotto significativamente la gravità del lesioni genitali. Il farmaco somministrato per via orale non ha ridotto in modo apprezzabile le lesioni genitali, ma ha causato un aumento significativo del numero di sopravvissuti e del giorno medio di morte, anche quando la somministrazione è stata iniziata fino a tre giorni dopo l'inoculazione del virus. Il farmaco applicato sia topico che per via orale era più efficace del farmaco applicato da entrambe le vie lungo. Per l'applicazione topica un unguento è risultato essere un veicolo migliore dell'alcool polivinilico o del dimetilsolfossido. In alcune circostanze il veh la stessa somministrazione del farmaco ha avuto una certa efficacia.
Due modelli cellulari distinti nell'angioite necrotizzante cutanea.Due modelli cellulari distinti di angioite necrotizzante che coinvolgono le venule nella pelle di pazienti con lesioni cutanee clinicamente identiche sono stati apprezzati con la tecnica della sezione 1 mamma-spessa. In quegli individui con ipocomplementemia sierica, vi era un inflitrato perivenulare composto prevalentemente da neutrofili con deposizione di fibrina e detriti nucleari. In pazienti con livelli normali di complemento sierico, oltre a un infiltrato di neutrofili e fibrina deposizione, i linfociti perivenulari in vari stadi di attivazione erano prominenti In entrambi i modelli erano interessate le venule e non le arteriole, i mastociti mostravano vari gradi di ipogranulazione e solo raramente i basofili e gli eosinofili erano riconosciuti. paziente e un paziente normocomplementemico hanno mostrato modelli cellulari coerenti, così come un singolo raccolto di lesioni sottoposto a biopsia due volte, a distanza di 24 ore, in un paziente con ipocomplementemia. Nessun paziente con ipocomplementemia è diventato normocomplementemico o viceversa con persistenza delle lesioni.
espressioni biologici di attivazione linfocitaria V. Caratterizzazione di un immune solubile risposta soppressore (SIRS) prodotti da splenociti concanavalina-attivato."., Fluidi surnatante da colture di cellule di milza murine incubate con concanavalina A per 48 ore contengono un fattore(i), soppressore della risposta immunitaria solubile (SIRS), che sopprime le risposte delle cellule che formano la placca agli eritrociti di pecora da parte delle cellule della milza murina in vitro. delle proprietà biochimiche e biofisiche di SIRS stati studiati SIRS stato non dializzabili,. l'attività soppressiva era stabile a 56 ° C per 30 min, ma è stato distrutto per trattamento a 70 ° C per 30 min, 80 ° C per 10 min, o a pH 2. L'attività soppressiva non è stata assorbita dall'antigene stimolante, SRBC o antisieri contro le IgG murine o la catena mu, suggerendo che SIRS non contiene determinanti delle immunoglobuline. Tuttavia, la milza e il timo murini, ma non le cellule renali, assorbono d Attività SIRS. I trattamenti enzimatici hanno rivelato che la SIRS era resistente alla DNasi e alla RNasi, ma era distrutta dalla tripsina e dalla chimotripsina. In gel filtrazione con Sephadex G-100, l'attività SIRS eluita nella frazione corrispondente al p. m. nell'intervallo tra 48.000 e 67.000. Con l'elettroforesi su gel di poliacrilammide, l'attività SIRS è migrata nella regione catodica verso l'albumina. centrifugazione isopicnica in un gradiente di cloruro di cesio suggerito che SIRS è una glicoproteina. Questi fluidi surnatante con attività SIRS sono stati trovati anche per contenere fattore di inibizione della migrazione dei macrofagi (MIF). Negli esperimenti che utilizzano la filtrazione su gel, l'elettroforesi su gel di poliacrilammide e la centrifugazione isopicnica per frazionare i fluidi supernatanti, l'attività SIRS e MIF è stata trovata nelle stesse frazioni e fino ad oggi non siamo stati in grado di dissociare definitivamente l'attività SIRS dall'attività MIF.
Struttura fine di tre diversi siti di combinazione anti-fluoresceina: dicroismo circolare indotto di aptene legato a ricombinanti autologhi ed eterologhi.Abbiamo precedentemente riportato il sequenziale comparsa nei conigli iperimmunizzati di tre tipi distinti di siti di combinazione dell'antifluoresceina che possono essere distinti per il caratteristico dicroismo circolare indotto (CD) dell'aptene legato, fluoresceina. Tale CD indotto dipende dalla configurazione dei residui circostanti e, nel caso di anti-fluoresceina, può essere localizzato alla configurazione del sottosito che lega la frazione idrossixantenone della fluoresceina. Nella presente indagine, abbiamo studiato la struttura fine dei siti ricombinanti sia autologhi che eterologhi e delle catene libere misurando la CD indotto di aptene legato Dimeri a catena pesante a pH 5,4 legati alla fluoresceina che hanno mostrato una debole banda CD negativa diversa da quella osservata in qualsiasi anticorpi. Nessun CD indotto è stato osservato con le catene leggere. Pertanto, il sottosito idrossixantenone non esiste intatto in nessuna delle catene isolate. La fluoresceina legata a ricombinanti autologhi purificati, quando studiata a pH 7,5, ha mostrato spettri CD molto simili a quelli osservati per gli anticorpi originali. Più significativamente, la fluoresceina legata a ricombinanti eterologhi purificati, preparati in tutte le possibili combinazioni, ha mostrato spettri CD più simili a quelli esibiti dai siti da cui è stata derivata la catena pesante. Pertanto, il microambiente del sottosito sembra essere dovuto principalmente alla catena pesante.
Effetto di sei trasfusioni settimanali su innesti di midollo canino: test di sensibilizzazione e abrogazione della sensibilizzazione da parte della procarbazina e del siero antitimocitario.Abbiamo precedentemente dimostrato che il sangue le trasfusioni possono immunizzare un cane e portare al rigetto di un successivo trapianto di midollo nonostante l'irradiazione corporea totale letale (TBI). La sensibilizzazione agli antigeni di istocompatibilità indotta da due precedenti trasfusioni di sangue intero potrebbe essere superata da un regime di procarbazina e siero anti-timociti (ATS ) precedente TBI Il presente studio ha indagato a) se questo regime potesse abrogare la sensibilizzazione indotta da sei trasfusioni settimanali somministrate dai giorni --50 a --15 precedenti un trapianto di midollo, e b) se studi di sopravvivenza piastrinica e due test di immunità in vitro potrebbe predire il rigetto del trapianto di midollo. Tutte le coppie donatore-ricevente erano istoincompatibili, non imparentate e di razza diversa. Ventidue riceventi ricevettero trasfusioni di concentrato di piastrine e otto ricevettero trasfusioni di sangue intero. Ai destinatari sono stati somministrati 1200 R TBI e un innesto di midollo e leucociti del sangue periferico dal donatore di trasfusione il giorno 0. Tre dei 15 destinatari (20%) hanno ricevuto procarbazina, 12,5 mg/kg i. v. nei giorni --8, --6 e --4, e ATS, 0,6 ml/kg per via sottocutanea nei giorni --7, --5 e --3, hanno rifiutato i loro innesti, mentre 11 cani su 15 (73%) non somministrata procarbazina e ATS hanno rifiutato i loro innesti (p inferiore a 0,01). Gli anticorpi linfocitotossici sierici, l'inibizione della migrazione dei leucociti periferici e il recupero e la sopravvivenza delle piastrine del donatore in vivo sono stati studiati in quei riceventi che ricevevano sei trasfusioni settimanali e in altri 18 riceventi che ricevevano una trasfusione da un singolo donatore 3 mesi prima dell'innesto di midollo. Non è stata trovata alcuna correlazione significativa tra questi test di sensibilizzazione in vitro e in vivo. La sensibilizzazione agli innesti di midollo non è stata rilevata in modo affidabile dalla presenza di anticorpi citotossici o dall'inibizione della migrazione dei leucociti. La sopravvivenza piastrinica, tuttavia, è stata positivamente correlata con i risultati dell'innesto di midollo in 12 su 15 (80%) riceventi valutabili (p circa 0,15).
Fattori che influenzano la sensibilità della replicazione delle cellule McCoy nell'isolamento e nella crescita della clamidia A (agenti TRIC).Le normali colture cellulari McCoy non irradiate forniscono un metodo sensibile e riproducibile per l'isolamento di ceppi oculo-genitali di clamidia A direttamente dalle secrezioni umane e per studi di laboratorio con questi agenti Dal settembre 1973, la clamidia è stata isolata da 175 su 562 donne (32-1%) affette da malattie veneree Sono stati utilizzati ceppi appena isolati e a basso passaggio per determinare l'importanza della centrifugazione, della costituzione e del pH del terreno di coltura tissutale e della temperatura di incubazione nel controllo dell'efficienza della placcatura nel metodo.
La pulizia e la disinfezione mediante calore delle padelle in macchine automatiche e semiautomatiche.Questo lavoro riguarda la pulizia e la disinfezione mediante calore di - padelle in acciaio e polipropilene, che erano state sporche con un contaminante biologico, albumina sierica umana (HSA) marcata con tecnezio-99m 99m(Tc), o un contaminante batteriologico, streptococcus faecalis miscelato con HSA marcato con Tc. Risultati della pulizia e si riportano la disinfezione ottenuta con una Test Machine e quelle ottenute con procedure adottate in otto diversi reparti di un ospedale generale Le lavapadelle installate nei reparti sono risultate meno efficienti della Test Machine, almeno in parte a causa di una manutenzione inadeguata. e le padelle in polipropilene hanno dato essenzialmente gli stessi risultati.
[Studio della frequenza cardiaca fetale nei parti complicati da acidosi fetale].E' stato effettuato uno studio sui parametri del grafico del feto frequenza cardiaca (frequenza basale e cali) in 44 casi di sofferenza fetale acuta con pH inferiore a 7,2 nel sangue e in 30 parti normali L'analisi statistica conferma che c'è un aumento significativo del numero di anomalie della frequenza cardiaca come bradicardia persistente o tachicardia persistente e con cali durante i parti con acidosi fetale. La frequenza di queste anomalie aumenta con il grado di acidosi. A volte le anomalie della frequenza cardiaca fetale precedono la comparsa dell'acidosi. Tuttavia, la scoperta di queste anomalie fa non di per sé fare una diagnosi precisa di sofferenza fetale perché troviamo queste anomalie in un certo numero di casi anche in parti normali Solo la misurazione del pH fetale in un momento definito può stabilire la diagnosi di malattia fetale treccia e la gravità della condizione.
Sepsi/shock urologico.Al Columbia-Presbyterian Medical Center durante il sessennio 1968-1973, ci sono stati 1236 casi di sepsi da Gram -patogeni negativi; 124 di questi hanno avuto origine nel tratto urinario. Di questi 124 pazienti, 19 sono morti - un tasso di mortalità del 15,3%. Ci sono stati 205 decessi tra i 1236 pazienti con sepsi da organismi Gramnegativi - un tasso di mortalità del 16,6%. In precedenza , nei periodi 1959-1964 e 1965-19067, i tassi di mortalità erano stati rispettivamente del 56,3 percento e del 19,6 percento. Il tasso di mortalità più basso durante il 1968-1973 per sepsi/shock urologico è stato associato a migliori procedure di gestione: a) misure preventive come il rinvio della strumentazione urologica e dell'intervento chirurgico in pazienti infetti da urea splitter resistenti ai farmaci, fino a quando l'infezione non sia sotto controllo, con pazienti chirurgici d'urgenza trattati con farmaci testati per la suscettibilità per controllare eventuali complicanze postoperatorie; b ) diagnosi precoce e trattamento della sepsi e somministrazione immediata di antibiotici battericidi per via parenterale; c) ripristino immediato dell'equilibrio idro-elettrolitico, con monitoraggio della funzionalità renale e polmonare e dell'acidosi metabolica; e d) somministrazione precoce di grandi dosi farmacologiche di glucocorticoidi, con monitoraggio del microcircolo e uso di isoproterenolo beta-adrenergico.
Gastrite ed emorragia gastrointestinale indotta da aspirina.Gastrite ed emorragia gastrointestinale indotta da aspirina sono state esaminate e discusse sulla base della letteratura attualmente disponibile. Emorragica acuta la gastrite si verifica dal 50% al 70% di tutti i pazienti che assumono aspirina, non è direttamente correlata alle dimensioni della dose e può essere abbastanza grave da causare la morte in alcuni casi. Non sembra mai svilupparsi alcuna tolleranza. Il meccanismo che causa questo sanguinamento è non definito, ma la responsabilità primaria sembra essere la retrodiffusione degli ioni H+ attraverso la barriera gastrica, con possibile spiegazione anche dell'erosione fisica, del sanguinamento piastrinico prolungato e dell'effetto di bassi valori di pH. Sembra esserci meno acido presente nello stomaco quando si verifica sanguinamento, ma questo è un effetto di mascheramento dell'aspirina che provoca un aumento dell'assorbimento degli ioni H+. I fattori importanti nel determinare la formulazione farmaceutica sono il metodo di somministrazione, la dimensione delle particelle aspirina, durata del contatto tra il farmaco e la mucosa, presenza di tamponi nel farmaco per aumentare il pH gastrico, velocità di dissoluzione del farmaco nello stomaco e caratteristiche di ionizzazione del farmaco stesso. La perdita di sangue gastrointestinale causata dall'aspirina può essere minimizzata somministrando il farmaco in una di queste forme:--una soluzione diluita di acetilsalicilato;--una soluzione iniettata per via endovenosa;--una compressa che si dissolve e si assorbe rapidamente;--una soluzione con aggiunta di quantità sufficientemente grandi di antiacido;--una compressa di aspirina a grana fine, altamente tamponata;--una compressa con rivestimento enterico che non si dissolve nello stomaco; oppure un sostituto dell'aspirina come il paracetamolo.
Effetti della polpa di agrumi in alte razioni di urea per i manzi.Effetti della polpa di agrumi in pellet e convenzionale in sostituzione del mais, con aggiunta di farina di soia mantenere la proteina comparabile, sono stati testati in razioni con 5% di urea e 33,33% di bagassa di canna da zucchero per i manzi fistolati. Così, tutte le razioni erano a basso contenuto di carboidrati prontamente fermentati diversi da quelli di mais o polpa di agrumi. I criteri di valutazione erano le concentrazioni di urea nel sangue e di pH, ammoniaca e acidi grassi volatili del fluido ruminale La polpa di agrumi per le diete 1, 2, 3 e 4 era 0, 19, 38 o 55% Il fluido ruminale e il sangue sono stati campionati 1 ora prima e 2, 4, 7 , e 12 ore dopo il mangime è stato posto direttamente nel rumine. Nessuna differenza tra polpa pellettata e convenzionale o tra le tendenze temporali è stata significativa tranne che per entrambe le forme l'ammoniaca ruminale era inferiore con le due percentuali più alte di polpa di agrumi. Aggiunta di polpa di agrumi a 0 , 19, 38 o il 55% della razione ha ridotto il pH ruminale (6,85, 6,65, 6,61, 6,51). d L'urea e l'ammoniaca ruminale sono diminuite nei bovini alimentati con 19, 38 o 55% di polpa; quindi, il rapporto acetico/propionico era più alto. L'acido butirrico è cambiato solo nell'andamento del tempo. Le concentrazioni totali di acidi grassi volatili erano superiori a 19, 38 e 55% rispetto allo 0% di polpa. Erano più alti a 38 e 55 che al 19%.
Il ruolo dei meccanismi adrenergici nel substrato e nella risposta ormonale all'ipoglicemia indotta dall'insulina nell'uomo.Determinazioni sequenziali del deflusso e dell'afflusso di glucosio e velocità della gluconeogenesi da alanina, prima, durante e dopo l'ipoglicemia insulino-indotta sono state ottenute in relazione ad alterazioni della circolazione di adrenalina, norepinefrina, glucagone, cortisolo e ormone della crescita in sei soggetti normali. L'insulina ha ridotto la glicemia media (+/-SEM) da 89 +/- 3 a 39 +/- 2 mg/dl 25 min dopo l'iniezione, ma questo declino è cessato nonostante i livelli sierici di insulina di 153 +/- 22 μl. /-7,1 mg/kg per h. 15 min dopo l'insulina, il deflusso medio di glucosio è aumentato di tre volte, ma poi è diminuito a 25 min, raggiungendo un tasso inferiore del 15% rispetto al tasso di preinsulina L'afflusso di glucosio è diminuito dell'80% 15 min dopo l'insulina, ma è aumentato a 25 min, raggiungendo un massimo del doppio della velocità basale da alanina è diminuito del 68% 15 minuti dopo l'insulina, ma è tornato ai tassi di preinsulina a 25 minuti ed è rimasto costante per i successivi 25 minuti, dopo di che è aumentato linearmente. Un aumento di quattro volte dell'adrenalina plasmatica media è stato riscontrato 20 minuti dopo l'insulina, con livelli massimi 50 volte quelli basali. Le concentrazioni plasmatiche di noradrenalina sono aumentate significativamente a 25 min dopo l'insulina, mentre i livelli significativamente aumentati di cortisolo e glucagone si sono verificati a 30 min e l'ormone della crescita a 40 min dopo l'insulina. Pertanto, l'ipoglicemia indotta dall'insulina nell'uomo deriva sia da una diminuzione della produzione di glucosio che da un aumento dell'utilizzo del glucosio. La glicogenolisi accelerata ha prodotto gran parte dell'incremento postipoglicemico iniziale nella produzione di glucosio. Il contributo della glicogenolisi è diminuito nel tempo, mentre quello della gluconeogenesi da alanina è aumentato. Degli ormoni studiati, solo gli incrementi delle catecolamine plasmatiche hanno preceduto o coinciso con l'aumento misurato della produzione di glucosio dopo l'ipoglicemia. Sembra quindi probabile che i meccanismi adrenergici svolgano un ruolo importante nell'inizio delle risposte controregolatorie all'ipoglicemia indotta dall'insulina nell'uomo.
recettori beta-adrenergici nel cervello di ratto.125I-Iodoidrossibenzilpindololo ([125I] IHYP), un potente antagonista del recettore beta-adrenergico, è stato utilizzato per studiare i recettori beta-adrenergici nel cervello di ratto. Il legame di [125I] IHYP (30 pM) a una frazione di membrana min e la dissociazione ha avuto luogo con un tempo dimezzato di circa 16 min. La fentolamina (10(-4) M) è diminuita non- legame al recettore ma non ha avuto effetto sul legame di [125I] IHYP ai recettori beta-adrenergici nella corteccia, nel cervelletto o nel caudato. In presenza di legame specifico della fentolamina (definito come legame che è stato bloccato da 0,3 muM dl-propranololo) ha rappresentato 70 -85% del legame totale. Il legame di [125I] IHYP è stato inibito da agonisti e antagonisti beta-adrenergici. I d-stereoisomeri erano 2-3 ordini di grandezza meno potenti dei corrispondenti isomeri 1. La densità di [125I] IHYP i siti di legame sono stati studiati nelle frazioni di membrana della corteccia cerebrale, del cervelletto e del nucleo caudato mediante Scatchard analisi. La K(D) di [125I] IHYP era simile nelle tre regioni studiate e la densità dei siti di legame [125I] IHYP era di circa il 50% maggiore nella corteccia e nel caudato rispetto al cervelletto. Il coefficiente di Hill per il legame di [125I] IHYP alle membrane della corteccia cerebrale era 1,02. Le proprietà del legame di [125I] IHYP sono simili a quelle che ci si aspetterebbe dal legame ai recettori beta-adrenergici in vitro.
Base enzimatica per l'accumulo ciclico di GMP nelle cellule degenerative dei fotorecettori della retina di topo.Le attività della guanilato ciclasi, guanosina 3\', 5\'- monofosfato (GMP ciclico) fosfodiesterasi e 5\'-nucleotidasi sono state misurate durante lo sviluppo postnatale nelle retine dei topi di controllo e C3H/HeJ. Nella retina di controllo, ciascuna di queste attività enzimatiche aumenta in concomitanza con la differenziazione e la maturazione delle cellule dei fotorecettori. Nella retina C3H, le attività della guanilato ciclasi e della 5-nucleotidasi aumentano con lo sviluppo delle cellule dei fotorecettori e diminuiscono con la morte delle cellule dei fotorecettori. Tuttavia, l'attività di una classe di fosfodiesterasi GMP ciclica che distingue le cellule fotorecettrici dei topi di controllo e quelle di diverse altre specie non è dimostrabile nella retina di Topi C3H a qualsiasi età Si suggerisce che la carenza di attività fosfodiesterasica GMP ciclica possa spiegare l'accumulo di GMP ciclico che è stato dimostrato verificarsi nelle cellule dei fotorecettori C3H prima che degenerino.
L'effetto dell'iperventilazione sulla secrezione di ioni idrogeno del nefrone distale.Questo studio è stato progettato per determinare l'effetto dell'iperventilazione acuta sulla secrezione di ioni idrogeno del nefrone distale. La PCO2 nel sangue è diminuita e si è stabilizzata rapidamente quando i ratti carichi di bicarbonato erano iperventilati. Al contrario, la PCO2 nelle urine è diminuita lentamente, con conseguente aumento precoce della PCO2 nelle urine meno sangue (UB) che non poteva essere cancellata dall'infusione di anidrasi carbonica. Entro circa 50 min, la PCO2 UB nei ratti iperventilati e infusi con anidrasi carbonica si avvicinava allo zero. Di conseguenza si presumeva che esistesse un equilibrio tra la PCO2 del dotto collettore e la PCO2 del sangue arterioso. Questo ha fornito le basi per gli studi successivi su una serie di ratti. è diminuito da un controllo di 22+/-1 mm Hg (media+/-SEM) a 11+/-2 mm Hg (media +/- SEM) con ipocapnia, ed è tornata al suo valore di controllo quando la PCO2 nel sangue è tornata alla pre-iperventilazione va lu. Questo calo della PCO2 U-B con iperventilazione acuta non può essere attribuito a cambiamenti nel flusso urinario, nell'escrezione di fosfato o bicarbonato, suggerendo, quindi, una diminuzione della secrezione di ioni idrogeno del nefrone distale (probabilmente dotto collettore) con iperventilazione acuta. Sono illustrate le possibili insidie nell'interpretazione della PCO2 UB.
La citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente in malattie autoimmuni selezionate.La citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente mediata dai linfociti del sangue periferico è stata studiata in pazienti con lupus eritematoso sistemico, poliarterite nodosa. Sindrome di Sjogren\'s e artrite reumatoide. Le cellule bersaglio erano eritrociti di pollo rivestiti con anticorpi anti-eritrociti di pollo. L'attività citotossica cellulo-mediata anticorpo-dipendente era normale nella sindrome di Sjogren\'s e nell'artrite reumatoide, ma significativamente ridotta (P è inferiore a 0,001) nel lupus eritematoso sistemico attivo e in due pazienti con poliarterite nodosa Una parziale rigenerazione dell'attività citotossica cellulo-mediata anticorpo-dipendente è stata ottenuta mediante trattamento con pronasi e DNasi seguito da incubazione notturna. con lupus eritematoso sistemico ha inibito l'attività citotossica cellulo-mediata anticorpo-dipendente dei linfociti normali. tivity è stata studiata mediante immunoadsorbimento specifico e ultracentrifugazione geadient densità di saccarosio. La rimozione di IgG ma non di IgM ha notevolmente ridotto l'inibizione. I fattori inibitori erano presenti in 7S e frazioni più pesanti contenenti IgG. Cinque pazienti con lupus eritematoso sistemico sono stati studiati in serie per determinare se il miglioramento dello stato clinico potesse essere correlato con una diminuzione dei fattori inibitori del siero come studiato dall'inibizione della normale citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente. Infatti, in ogni paziente è stata riscontrata una maggiore capacità inibitoria sierica durante i periodi di maggiore attività della malattia.
Caratterizzazione dell'attività proteasica nell'inattivatore del fattore chemiotattico.L'inattivatore del fattore chemiotattico (CFI) isolato dal siero umano contiene un'attività chinasica che causa un'estesa idrolisi della bradichinina. Il peptide sintetico altamente chemiotattico Met-Leu-Phe è stato completamente idrolizzato dalle preparazioni CFI. Il rilascio degli amminoacidi costituenti da questo peptide ha coinciso con una perdita della sua attività chemiotattica. L'N-formile, ma non il derivato ammidico , del peptide leucotattico Met-Leu-Phe era resistente all'azione del CFI, come evidenziato da saggi chemiotattici e biochimici. L'esame della specificità della proteolisi CFI ha rivelato che substrati polipeptidici corti vengono degradati sequenzialmente dal terminale amminico. I peptidi più grandi sono meno ampiamente idrolizzato e i modelli di idrolisi sono più complessi L'inattivazione dei fattori chemiotattici batterici da parte del CFI è stata superata dall'aggiunta di alte concentrazioni di p eptidi che sono stati substrati per CFI. Le preparazioni di CFI hanno prontamente idrolizzato il peptide Arg-Phe-Ala. Gli amminoacidi costituenti sono stati opportunamente identificati mediante il metodo della cromatografia su strato sottile. Questa procedura ha fornito un saggio rapido per misurare l'attività CFI nell'intero siero umano e nelle frazioni durante le fasi di purificazione. Inoltre, CFI ha anche idrolizzato L-leucyl-beta-napthylamide a velocità paragonabili ai peptidi. Pertanto, L-leucyl-beta-napthylamide è servito come substrato utile per stimare l'attività CFI nelle preparazioni a vari stadi di purificazione. Questo substrato è stato utile anche negli studi cinetici. I risultati di questi studi indicano che l'attività dell'aminopeptidasi è il meccanismo mediante il quale il CFI inibisce l'attività dei substrati chemiotattici.
Regolazione dell'equilibrio acido-base nell'ipocapnia cronica. Evidenza che la risposta del rene non è orientata alla difesa degli extracellulari (H+).Si ritiene generalmente che la riduzione dell'[HCO3] plasmatica caratteristica dell'ipocapnia cronica derivi da meccanismi omeostatici renali atti a minimizzare l'alcalemia prodotta dallo stato ipocapneico. Per verificare questa ipotesi, abbiamo indotto ipocapnia cronica nei cani in cui il plasma [HCO3 ] era stata in precedenza notevolmente ridotta (da 21 a 15 meq/litro) dalla somministrazione prolungata di HCl La PaCO2 di animali alimentati cronicamente con acido è stata ridotta da 32 a 15 mm Hg ponendo gli animali in una grande camera ambientale contenente il 9% ossigeno. In risposta a questa riduzione di PaCO2, plasma [HCO3] medio è diminuito di 8,6 meq/litro, raggiungendo un nuovo livello allo stato stazionario di 6,4 meq/litro. Questo decremento nel plasma [HCO3] è quasi identico a 8,1 meq/litro. decremento di litri precedentemente osservato in condizioni normali (non alimentate con acidi) animali in cui era stato indotto lo stesso grado di ipocapnia cronica. Pertanto, sia negli animali normali che in quelli alimentati con HCl, la risposta renale all'ipocapnia cronica provoca una diminuzione dell'[HCO3] plasmatico di circa 0,5 meq/litro per ogni millimetro di Hg di riduzione della tensione di CO2. Al contrario, la risposta del plasma [H+] nei due gruppi era nettamente diversa. Invece della diminuzione dell'[H+] che si osserva durante l'ipocapnia cronica negli animali normali, l'[H+] negli animali alimentati con HCl è aumentato significativamente da 53 a 59 neq/litro (pH 7,28-7,23). Questa risposta apparentemente paradossale è, ovviamente, un'espressione dei vincoli imposti dall'equazione di Henderson e riflette il fatto che la caduta percentuale di [HCO3] negli animali alimentati con HCl era maggiore della caduta percentuale di PaCO2. Questi risultati indicano chiaramente che nell'ipocapnia cronica il rene non può essere considerato come l'arto effettore in un sistema di feedback omeostatico orientato alla difesa dell'acidità sistemica.
Descrizione di un coniugato polivalente e di un nuovo sierogruppo di Bacteroides melaninogenicus mediante colorazione con anticorpi fluorescenti.Un coniugato polivalente (reattivo anticorpale marcato con isotiocianato di fluoresceina) contenente sono stati preparati i coniugati dei sierogruppi A, B e C. Questo coniugato polivalente ha fornito una colorazione positiva dell'anticorpo fluorescente (FA) con 49 macchie di Bacteroides melaninogenicus che rappresentano i sierogruppi A, B e C. Quando altri ceppi (92 ceppi) delle tre sottospecie di B. melaninogenicus sono stati esaminati con la colorazione FA, con A, B e C, e coniugati polivalenti, nove ceppi di B. melaninogenicus subsp. intermedius non hanno fornito una colorazione positiva con alcun coniugato. Pertanto, è stato preparato un coniugato FA con il antisiero a uno di questi ceppi (532-70A); tutti e nove i ceppi si sono colorati positivamente con questo coniugato. Questi nove ceppi erano biochimicamente caratteristici di B. melaninogenicus subsp. intermedius; quindi, questi ceppi sono stati designati come un nuovo sierogruppo, sierogruppo C-1. È stato preparato un nuovo coniugato polivalente contenente i sierogruppi A, B, C e C-1. Questo coniugato polivalente si è colorato positivamente con 23 ceppi rappresentativi dei sierogruppi A, B, C e C-1. I nuovi coniugati non sono riusciti a colorarsi positivamente con altri anaerobi e aerobi testati. I quattro singoli coniugati, così come il coniugato polivalente, possono essere utilizzati per un'identificazione più rapida di B. melaninogenicus di quanto sia possibile con i test biochimici.
Il MIF sintetico non ha effetto sull'ipersecrezione di beta-MSH e ACTH nella sindrome di Nelson\'s.L'effetto del MIF sintetico (H-Pro-Leu -Gly-NH2) sulla secrezione di beta-MSH è stato studiato in cinque pazienti con sindrome di Nelson\' e in un paziente con malattia di Addison\'. Due milligrammi di tripetide sono stati iniettati per via endovenosa (1 mg in un'iniezione acuta, seguito da 30 -infusione al minuto di 1 mg in 20 ml di soluzione salina). Nei 90 minuti successivi all'inizio dell'infusione, non è stato possibile osservare alcun effetto consistente. Negli stessi pazienti, la stimolazione della LVP e i test di soppressione del desametasone hanno determinato cambiamenti significativi nella i livelli plasmatici di beta-MSH e ACTH.
Variazione dell'attività dell'idrocarburo arilico (benzo(a)pirene) idrossilasi in cellule epatiche di ratto eteroploidi e prevalentemente diploidi in coltura.Idrocarburo arilico (benzo( a) pirene) idrossilasi è presente e inducibile nelle cellule epatiche di ratto di bufalo in coltura. Vi è una variazione sostanziale nelle attività dell'idrossilasi sia basale che inducibile tra i subcloni eteroploidi isolati da una popolazione genitore eteroploide e tra i subcloni diploidi isolati da una popolazione genitore diploide. la variazione non è correlata alle differenze nelle caratteristiche di crescita dei subcloni, o alle differenze nel loro numero di cromosomi. I risultati indicano che una sostanziale eterogeneità nell'attività dell'idrossilasi sia basale che indotta si sviluppa durante la crescita di ceppi di cellule sia eteroploidi che diploidi in coltura. Questi i risultati indicano che le popolazioni di cellule diploidi non sono necessariamente omogenee rispetto all'attività di idrocarburi arilici idrossila Questa osservazione può compl icare l'interpretazione di esperimenti che coinvolgono l'ibridazione di cellule somatiche o la trasformazione e/o la citotossicità indotta da idrocarburi policiclici. Questa eterogeneità nell'attività dell'idrossilasi si sviluppa piuttosto rapidamente (2-3 mesi di coltura), in assenza di qualsiasi apparente stress mutazionale.
Le basi contrattili del movimento ameboide. II. Struttura e contrattilità di estratti mobili e fantasmi di plasmalemma-ectoplasma.Il ruolo di calcio e magnesio-ATP sulla struttura e la contrattilità in estratti mobili di Amoeba proteus e plasmalemma-ectoplasma "fantasmi" di Chaos carolinensis è stata studiata correlando osservazioni al microscopio ottico ed elettronico con misurazioni di torbidità e birifrangenza. L'estratto non è mobile e contiene pochissime F-actina filamenti e aggregati di miosina quando preparati in presenza di basse concentrazioni di ioni calcio e ATP a una forza ionica di I = 0,05, pH 6,8 L'aggiunta di cloruro di magnesio 1,0 mM, ATP 1,0 mM, in presenza di uno ione calcio basso concentrazione (soluzione di rilassamento) ha indotto la formazione di alcuni fasci fibrosi di actina senza contrarsi, mentre l'aggiunta di una concentrazione micromolare di calcio oltre a 1,0 mM di magnesio-ATP (soluzione di contrazione) (Ta ylor, D. L. , J. S. Condeelis, P. L. Moore e R. D. Allen. 1973. J. Cell Biol. 59:378-394) ha avviato la formazione di grandi schiere di filamenti di F-actina seguite da contrazioni. Inoltre, i fantasmi di plasmalemma-ectoplasma preparati nella soluzione di rilassamento hanno mostrato pochissimi filamenti di F-actina diritti e aggregati di miosina. Al contrario, i fantasmi di plasmalemmaectoplasma trattati con la soluzione di contrazione contenevano molti filamenti di F-actina diritti e aggregati di miosina. L'aumento della struttura del citoplasma di ameba all'interfaccia endoplasma-ectoplasma può essere spiegato da una combinazione della trasformazione dell'actina da uno stato meno filamentoso a uno più strutturato filamentoso che può comportare la reticolazione dell'actina per formare array fibrillari (vedi sopra riferimento menzionato) seguito da contrazioni dell'actina e della miosina lungo una distanza indeterminata dell'endoplasma e/o dell'ectoplasma.
La reazione di carbammato di glicilglicina, plasma ed estratti di tessuto valutata da un apparato di pH a flusso interrotto.Abbiamo usato un apparato di pH a reazione rapida a flusso interrotto studiare l'equilibrio del carbammato nelle soluzioni di glicilglicina e in tre tessuti biologici, plasma umano, muscolo di pecora e cervello di pecora, nonché studiare la cinetica della formazione di carbammato nella soluzione di gliglicina e nel plasma umano. L'apparato di reazione rapida era dotato di un Elettrodo di vetro sensibile al pH per seguire l'andamento temporale del pH da 0,005 a 100 s dopo la rapida miscelazione di una soluzione di ammina o proteina e CO2 Sono state osservate due fasi della curva del pH: una fase veloce che rappresenta la formazione di carbammato e una lenta fase dovuta all'idratazione della CO2 non catalizzata in quanto alle soluzioni biologiche è stato aggiunto un inibitore dell'anidrasi carbonica Dall'andamento temporale della variazione del pH durante la fase veloce K2, la costante di ionizzazione R-NH2, e Kc, il carba costante di equilibrio mate così come la costante di velocità per la formazione di carbammato, ka potrebbe essere calcolata da dati a pH e pCO2 differenti. Il carbammato formato in soluzioni di glicilglicina su un'ampia gamma di pH e pCO2 è stato trovato coerente con la teoria della formazione di carbammato e con i dati pubblicati. A forza ionica 0,16 e 37 gradi pK è 7,67. pKc 4.58. Il calore della reazione del carbammato (deltaH) è stato calcolato essere -3,2 kcal/mol tra 20 gradi e 37 gradi. Kt di glicilglicina dipende quantitativamente dalla forza ionica come previsto dalla teoria di Debye-Huckel. Con forza ionica 0,16 ku è risultato essere 2.500 M1 S1 a 37 gradi. L'energia di attivazione della formazione del carbammato è di 6,7 kcal/mol. Misure di carbammato nel plasma umano a pCO2 da 38 a 359 Torr. Il pH da 6,9 a 8,3, la temperatura di 37 gradi e la forza ionica di 0,15 hanno fornito la prova che due tipi di gruppi amminici partecipano alla formazione dei carbammati. Dalle costanti di equilibrio calcolate per le due specie si potrebbero identificare come gruppi alfa ed epsilon-amminici. Sulla base di un peso molecolare proteico di 69.000. 0,6 gruppi/molecola alfa-amino con pKz=7.0 e pKc=4.2 e 5,9 gruppi/molecola epsilon-ammino con pKz=9.0 e pKc=4.3 contribuiscono alla formazione di carbammato. La costante di velocità ka è stata stimata in 4.950 M1 S1 per i gruppi alfa-amminici e 13.800 M1 S1 per i gruppi epsilon-amminici. In condizioni fisiologiche (pCO2=40 Torr. pH=7.4). La concentrazione di carbammato nel plasma è 0,6 mM e l'emivita di formazione del carbammato è 0,05 s. Negli estratti preparati dal cervello di pecora a 37 gradi pH=7 e pCO2=35 Torr. la formazione di carbammato è stata stimata in 0,8 mM. Con pCO2=70 Torr e lo stesso pH e temperatura la concentrazione di carbammato nel muscolo si avvicina a 0,3 mM e aumenta a 7 mM quando il pH sale a 8. Si conclude che, come nel plasma, un numero considerevole di gruppi epsilon-ammino sembra essere disponibile per la formazione di carbammato in questi tessuti.
beta-Mannosidase dal fungo Polyporus sulfureus.beta-D-Mannosidase (EC 3.2.1.25), uno strumento utile per gli studi strutturali di catene di eterosaccaridi, è stato isolato in forma altamente purificata dai corpi fruttiferi del fungo Polyporus sulfureus. Questo fungo è unico tra le fonti segnalate di questo enzima in quanto ha il vantaggio di essere quasi privo di attività alfa-mannosidasi. La procedura di purificazione comporta il frazionamento del solfato di ammonio seguito da filtrazione Sephadex G-100 e cromatografia su colonne di DEAE-cellulosa e idrossiapatite. La preparazione enzimatica finale fornisce essenzialmente una singola banda su elettroforesi su gel su disco. L'enzima purificato libera l'unità beta-D-mannopiranosile da varie substrati come il glicopeptide centrale, Man(GlcNAc)2-Asn isolato dall'ovoalbumina, dalla Taka-amilasi A e dalla glicoproteina acida alfa1 umana. Inoltre idrolizza (Man)2-GlcNAc dall'urina di un alfa-uomo paziente con nosidosi, 1,4-D-mannobiosio e mannotriosio isolati da mannano di noce d'avorio, 4-O-beta-D-mannopiranosil-L-ramnosio, 6-O-beta-D-mannopiranosil-D-galattosio e 4-O- beta-D-mannopiranosil-N-acetilglucosamina. Il peso molecolare di questo enzima è stimato in circa 64.000 mediante filtrazione su gel. Per il p-nitrofenil-beta-D-mannopiranoside, il pH ottimale è compreso tra 2,4 e 3,4 e il Km è 1,6 mM.
Lo studio delle reazioni di ossidoriduzione equivalenti a 1 elettrone mediante generazione rapida di reagenti ad impulsi. Sistema citocromo c/ferrocianuro di ferro.Il metodo di la radiolisi a impulsi è stata utilizzata per generare reagenti in situ in tempi (da 500 ns a 1,5 mus) brevi rispetto ai tassi dei processi biochimici osservati. Questa tecnica di miscelazione "istantanea" viene confrontata con misurazioni di flusso interrotto rapidamente (limitato in velocità e concentrazioni ) e misure T-jump (limitate al rilassamento nelle vicinanze dell'equilibrio) per il sistema ferro-ferricitocromo c (C(II)-C(III))/ferro-ferricyanide (FCN(II)-FCN(III)). I reagenti generati in situ erano C(II) o FCN(III). Esistono siti di legame cineticamente indistinguibili su C(II) e C(III) per anioni esacianuro. Il trasferimento riduttivo di elettroni alla proteina procede all'interno del FCN(II)-C (III) complesso, con una velocità di 400 s-1. Il legame di FCN(II) su C(II) rallenta l'ossidazione di C(II) da parte di FCN(III). I siti di inte la reazione su C(II) o C(III) con FCN(III) mostra cariche effettive di circa +2. La costante di associazione per sito di legame derivata dalla cinetica del trasferimento di elettroni è maggiore o uguale a 10(4) M-1 per FCN(II)-C(II) e minore o uguale a 10(4) M-1 per FCN(III)-C(III). Come siti di legame vengono suggeriti cluster specifici di amminoacidi nel modello del citocromo C. Le reazioni di ossidoriduzione di FCN sembrano implicare il trasferimento di elettroni equivalenti da e verso tali siti di legame alquanto remoti sulla proteina. A questi si legano anche anioni come fosfato o solfato, meno fortemente degli esacianuri. In presenza di perclorato la cinetica mostra la risoluzione del pK=9.3 di C(III) in due parti: (a) cambiamenti ottici a 695 nm dovuti allo scambio di ligandi sull'eme-ferro, non influenzato dal perclorato e (b ), un cambiamento cinetico che porta all'ossidazione bifasica di C(II), con pK=7.4. Ciò è attribuito all'effetto del perclorato sulla struttura dell'acqua nell'ambiente vicino ai siti di legame. L'alto tasso di ossidazione di C(II) rilassato da parte di FCN(III), (2 X 10(8) M-1 S-1 a mu=0) non è in accordo con un meccanismo di Marcus a sfera esterna. C(II) non rilassato con una struttura più vicina a C(III) trasferisce l'elettrone a FCN(III) ancora più velocemente (k=3 X 10 (9) M-1 S-1 a mu=0).
Un analogo dello stato di transizione della catalisi del lisozima preparato dal tetrasaccaride della parete cellulare batterica.Il trattamento del tetrasaccaride della parete cellulare GlcNAcbeta(1 porta a 4)- MurNAc-beta(1 porta a 4)-GlcNAc-beta(1 porta a 4)-MurNAc con alcali ha portato alla formazione del tetrasaccaride insaturo GlcNAc-beta(1 porta a 4)-MurNAc-beta(1 porta a 4) -GlcNAc-beta(1 porta a 4)-delta2,3-2-acetamido-2-deossi-D-glucoseen. Lo stesso composto è stato formato anche per transglicosilazione dopo incubazione del tetrasaccaride non modificato con il disaccaride insaturo GlcNAc-beta(1 porta a 4)-delta2,3-2-acetamido-2-deossi-D-glucosio (Tipper, DJ (1968) Biochemistry 7, 1441-1449) e lisozima di albume d'uovo di gallina. Il tetrasaccaride insaturo è stato ulteriormente caratterizzato mediante elettroforesi su carta, analisi degli ammino zuccheri e NMR Dall'analisi NMR si conclude che il delta2,3-2-acetamido-2-deossi-D-glucoseen all'estremità riducente del tetrasaccaride insaturo ha è una conformazione a mezza sedia. Questa conformazione è simile a quella proposta per lo zucchero nel sottosito D nel complesso lisozima-substrato nello stato di transizione. L'aggiunta del tetrasaccaride insaturo a una soluzione di lisozima di albume d'uovo di gallina ha spento la fluorescenza dell'enzima e spostato il massimo di fluorescenza sul blu, simile all'effetto prodotto dal composto originario. La costante di associazione del tetrasaccaride insaturo e del lisozima è stata misurata a pH 6,0 e 24 gradi mediante spettrofluorimetria e microcalorimetria ed è risultata essere 1,45 X 10 (5) M-1 e 2,5 X 10 (5) M-1, rispettivamente. Il valore medio è 100 volte superiore a quello riscontrato per il legame del tetrasaccaride non modificato all'enzima nelle stesse condizioni. Il tetrasaccaride insaturo si è dimostrato un migliore inibitore della lisi delle cellule di Micrococcus luteus rispetto al composto progenitore di un fattore 35. Questi risultati supportano l'ipotesi che il sito attivo dell'enzima sia costruito in modo da legare lo stato di transizione per la reazione catalizza più saldamente del substrato stesso.
Adrenodossina reduttasi. Proprietà dei complessi dell'enzima ridotto con NADP+ e NADPH.La riduzione anaerobica della flavoproteina adrenodossina reduttasi con NADPH produce uno spettro con lungo assorbanza della lunghezza d'onda, 750 nm e superiore. Non si osserva alcun segnale EPR. Questo spettro è prodotto dalla titolazione dell'adrenodossina reduttasi ossidata con NADPH, o dell'adrenodossina reduttasi ridotta con ditionito con NADP+. Entrambe le titolazioni producono un punto finale netto a 1 NADP(H) aggiunto per flavina. La riduzione con altri riducenti, tra cui ditionite, eccesso di NADH e NADP+ catalitico con un sistema di generazione di NADPH, produce un tipico spettro di flavina completamente ridotto, senza assorbimento di lunghezze d'onda lunghe. La specie formata sulla riduzione di NADPH sembra essere un due elettroni- contenente complesso, con una bassa costante di dissociazione, tra adrenodossina reduttasi ridotta e NADP+, denominato ARH2-NADP+. ve spettro, con un punto finale acuto a 1 NADPH aggiunto per flavina ridotta, che indica la formazione di un complesso contenente quattro elettroni tra adrenodossina reduttasi ridotta e NADPH. La titolazione dell'adrenodossina reduttasi con NADH, invece di NADPH, fornisce un grafico di titolazione curvo piuttosto che l'interruzione netta osservata con NADPH e consente il calcolo di un potenziale per la coppia AR/ARH2 di -0.291 V, vicino a quello di NAD(P) H (-0,316 V). L'adrenodossina reduttasi ossidata lega NADP+ molto più debolmente (Kdiss=1.4 X 10(-5) M) rispetto all'adrenodossina reduttasi ridotta, con un singolo sito di legame. Il legame preferenziale di NADP+ all'enzima ridotto permette di prevedere un potenziale di ossidoriduzione più positivo della flavoproteina in presenza di NADP+; una variazione di circa + 0,1 V è stata dimostrata mediante titolazione con safranina T. Da questa alterazione di potenziale, viene calcolato un Kdiss di 1,0 X 10(-8) M per il legame di NADP+ all'adrenodossina reduttasi ridotta. Si conclude che il forte legame di NADP+ all'adrenodossina reduttasi ridotta fornisce la forza trainante termodinamica per la formazione di una forma di flavoproteina completamente ridotta in condizioni in cui sarebbe altrimenti prevista una riduzione incompleta. Gli studi sul flusso interrotto dimostrano che la riduzione dell'adrenodossina reduttasi da parte del NADPH equimolare per formare il complesso ARH2-NADP+ è del primo ordine (k=28 s-1). Quando viene utilizzato un grande eccesso di NADPH, si osserva un secondo processo apparentemente del primo ordine (k=4.25 s-1), che viene interpretato come sostituzione di NADPH per NADP+ nel complesso ARH2-NADP+. Il confronto di queste costanti di velocità con i numeri di turnover della flavina catalitica per la riduzione di vari ossidanti da parte del NADPH, suggerisce un meccanismo sequenziale ordinato in cui la riduzione dell'ossidante è realizzata dal complesso ARH2-NADP+, seguito dalla dissociazione di NADP+. L'assoluta dipendenza della riduzione del NADPH-citocromo c sia dall'adrenodossina reduttasi che dall'adrenodossina è confermata...
Dissociazione di CO dalla carbossiemoglobina.La reazione tra carbossiemoglobina e microperossidasi (MP) ridotta: Hb4(CO)4 + 4MP=Hb4 + 4MPCO, da noi recentemente riportato, è stato ulteriormente studiato generando le specie Hb4(CO), Hb4(CO)2 e Hb(CO)3 nella cuvetta a flusso interrotto per reazione della ditionite con le specie di formula generale Hb4(O2 )x(CO)y(x + y=4) in presenza di microperossidasi è stato possibile determinare le costanti di velocità di dissociazione della CO l4, l3, l2 e l1. La costante di velocità di dissociazione della CO complessiva l, che è la lo stesso in questo sistema come l4, non è influenzato dall'acido 2,3-difosfoglicerico. L'energia di attivazione della reazione è 21.400 cal in un intervallo di 15-25 gradi. Il rapporto deltal/deltapH è di circa 3 nell'intervallo di pH da 6,5 a 7,5. i dati cinetici indicano che, rispetto all'HbO2, il contributo alla cooperatività delle costanti di velocità di dissociazione della carbossiemoglobina è notevolmente ridotto. differenze dipendenti nelle reazioni di Hb con CO, O2 e NO suggeriscono che nelle reazioni di combinazione il ligando svolge un ruolo attivo nella fase limitante della velocità.
Emoglobine del girino della rana toro, Rana catesbeiana. Dipendenza dalla temperatura del legame dell'ossigeno e dipendenza dal pH della dissociazione delle subunità.La dipendenza dalla temperatura dell'ossigeno l'equilibrio dell'emoglobina girino è stato determinato tra 0 gradi e 32 gradi per il lisato non frazionato ma privo di fosfati e tra 12 gradi e 32 gradi per ciascuno dei quattro componenti isolati tra pH 6 e 10 in 0,05 M cacodilato, Tris o tamponi glicina contenente 0,1 M NaCl e 1 mM EDTA. In queste condizioni l'effetto Bohr (definito come deltalog p50/deltapH) del lisato non frazionato è positivo a basse temperature comprese tra pH 6 e 8,5 ed è negativo sopra pH 8,5-8,8 a qualsiasi temperatura. la temperatura aumenta l'effetto Bohr al di sotto di pH 8,5 cambia notevolmente Nell'intervallo da pH 7,0 a 7,5, l'entità dell'effetto Bohr diminuisce da + 0,28 a 0 gradi a zero a circa 24 gradi e diventa negativo, come nell'emoglobina dei mammiferi s, al di sopra di questa temperatura. Le misurazioni con i componenti isolati mostrano che la dipendenza dalla temperatura del legame dell'ossigeno per i componenti I e II e per i componenti III e IV è molto simile. Per entrambi i gruppi di componenti l'entalpia complessiva apparente di ossigenazione a pH 7,5 è di circa -16,4 kcal/mol e -12,6 kcal/mol a pH 9,5. Le entalpie misurate includono i contributi dei gruppi di Bohr attivi, gli ioni tampone stessi, i gruppi dell'emoglobina che contribuiscono al tampone e qualsiasi legame di ioni dipendente dal pH e dall'ossigenazione come il cloruro da parte dell'emoglobina. Resta da determinare la ripartizione dell'entalpia totale tra questi vari processi. Tra pH 8 e 10,5 girino l'ossiemoglobina subisce una dissociazione pH-dipendente da tetramero a dimero. La dipendenza dal pH dell'apparente costante di dissociazione tetramero-dimero indica che a pH 9,5 la dissociazione di ciascun tetramero è accompagnata dal rilascio di circa 2 protoni. In questo intervallo di pH le misurazioni dell'equilibrio dell'ossigeno indicano che viene rilasciato circa 0,5 protoni per ogni molecola di ossigeno legata. I risultati sono coerenti con la conclusione che un gruppo acido per dimero alfabetico cambia il suo pK da circa 10 a 8 o meno in seguito alla dissociazione del tetramero.
Purificazione della penicillinasi di membrana plasmatica da Bacillus licheniformis 749/C e confronto con l'esoenzima.La penicillinasi di membrana di Bacillus licheniformis 749/C ha dimostrato di essere una fosfolipoproteina. L'enzima omogeneo dà una reazione positiva per il fosforo e per gli acidi grassi insaturi, ha un peso molecolare di 33.000 contro 29.000 per l'esoenzima e contiene da 8 a 9 ulteriori residui di aspartato o asparagina, da 4 a 5 di serina , 7 di glutammato o glutammina e da 4 a 5 di glicina per mole. La sequenza COOH-terminale sia della membrana che degli esoenzimi è -Met-Asn-Gln-Lys-COOH; quindi la porzione extra peptidica presente nell'enzima di membrana non è attaccato al COOH-terminale dell'esoenzima. Le procedure che hanno rilevato prontamente il residuo di lisina all'estremità NH2 dell'esoenzima non hanno prodotto un test positivo con la forma a membrana. L'estremità NH2 dell'enzima di membrana può essere bloccato o collegato al ph osfolipide. Sono stati sviluppati una procedura per la preparazione della penicillinasi di membrana su larga scala e un metodo migliorato per la purificazione dell'esoenzima.
Caratterizzazione biochimica di forme mutanti della DNA polimerasi I da Escherichia coli. I. La mutazione polA12.La DNA polimerasi I è stata purificata a più di 90 % di omogeneità da un ceppo di Escherichia coli K12 che porta la mutazione della DNA polimerasi I sensibile alla temperatura, polA12. L'enzima mutante ha una mobilità elettroforetica e una velocità di sedimentazione ridotte. È anormalmente termolabile e viene rapidamente inattivato a basse concentrazioni di sale. La sua polimerasi e 5\' porta a 3\' le attività di esonucleasi non sono gravemente difettose a 30 gradi, tuttavia la sua capacità di promuovere la 5\' concertata porta alla polimerizzazione 3\' e la 5\' porta all'idrolisi esonucleolitica 3\' dei nucleotidi a un nick ("nick translation") è diminuito di 10 volte. Questi effetti sono probabilmente il risultato di una significativa alterazione nella struttura terziaria dell'enzima.
Guanilato ciclasi dello sperma di riccio di mare. Purificazione e perdita di cooperatività.La guanilato ciclasi dispersa da Lubrol dallo sperma di riccio di mare è stata purificata e isolata essenzialmente priva di detergente mediante cromatografia di affinità GTP, cromatografia DEAE-Sephadex e filtrazione su gel. Dopo la rimozione del detergente, l'enzima è rimasto in soluzione in presenza di glicerolo al 20%. L'attività specifica dell'enzima purificato era di circa 12 mumol di guanosina 3\' :5\'-monofosfato (GMP ciclico) forma - min-1 - mg di proteina-1 a 30 gradi, un'attività circa 4600 volte quella di una guanilato ciclasi solubile purificata recentemente da Escherichia coli (Macchia V. , Varrone, S. , Weissbach, H. , Miller, DL, e Pastan, I. (1975) J. Biol. Chem. 250, 6214-6217). L'attività della fosfodiesterasi GMP ciclica era trascurabile e l'adenosina 3\':5\'-monofosfato ( AMP ciclico) fosfodiesterasi non era rilevabile nella preparazione purificata Formazione di AMP ciclico da ATP si è verificato ad un tasso dello 0,002% di quello della guanilato ciclasi. In assenza di inibitori della fosfodiesterasi o della guanosina trifosfatasi, il 100% del GTP aggiunto è stato convertito in GMP ciclico. L'enzima purificato richiedeva Mn2+ per la massima attività, i tassi relativi in presenza di Mg2+ o Ca2+ erano inferiori allo 0,6% dei tassi con Mn2+. L'enzima purificato ha mostrato la classica cinetica di Michaelis-Menten rispetto a MnGTP (il Km apparente è approssimativamente uguale a 170 muM) in contrasto con il comportamento cinetico positivamente cooperativo mostrato dalla guanilato ciclasi non purificata, dispersa nel detersivo o particolato. Il peso molecolare dell'enzima purificato era di circa 182.000 come stimato su colonne Bio-Gel A-0,5 m equilibrate in presenza o assenza di NaCl 0,1 M. Anche l'enzima non purificato, disperso nel detergente, è migrato con un peso molecolare apparente di 182.000 su colonne equilibrate con 0,5% Lubrol WX e 0,1 M NaCl, ma è migrato come un grande aggregato (il peso molecolare è maggiore di 5 X 10(5)) su colonne equilibrate in assenza dell'uno o dell'altro detergente di NaCl. Dopo la filtrazione su gel, l'enzima disperso non purificato produceva ancora modelli cinetici cooperativi positivi in funzione di MnGTP. L'elettroforesi su gel di Na dodecil-SO4 dell'enzima dopo il DEAE-Sephadex o le fasi di filtrazione su gel ha prodotto due bande proteiche principali con pesi molecolari stimati di 118.000 e 75.000. Al momento non è noto se queste bande proteiche rappresentino o meno i pesi molecolari delle subunità della guanilato ciclasi.
Cinetica del legame delle lectine tossiche abrina e ricina ai recettori di superficie delle cellule umane.Parametri cinetici dell'interazione delle lectine tossiche abrina e ricina con eritrociti umani e cellule HeLa. Il legame di abrina e ricina marcati con 125I agli eritrociti umani e alle cellule HeLa a 37 gradi era massimo intorno a pH 7, mentre a 0 gradi il legame era simile in un ampio intervallo di pH. il legame si è verificato a velocità simili a 0 gradi e 37 gradi con costanti di velocità nell'intervallo da 0,9 a 3,0 X 10 (5) M-1 s-1. La dissociazione era fortemente dipendente dalla temperatura con costanti di velocità nell'intervallo da 3,4 a 45 X 10 (-4) s-1 a 0 gradi e da 3,9 a 18 X 10(-3) s-1 a 37 gradi. La presenza di lectine non etichettate e lattosio ha aumentato il tasso di dissociazione. Le costanti di associazione misurate all'equilibrio o calcolate dalle costanti di velocità erano tra 0,64 X 10(8) M-1 e 8,2 X 10(8) M-1 per abrus lectine, e betw een 8,0 X 10(6) M-1 e 4,2 X 10(8) M-1 per le lectine di ricinus. Le costanti di associazione per le tossine erano inferiori a 37 gradi rispetto a 0 gradi. La catena B isolata della ricina sembrava legarsi con affinità simile a quella della ricina intatta. Il numero di siti di legame è stato stimato da 2 a 3 X 10(6) per eritrocita e da 1 a 3 X 10(7) per cellula HeLa. I siti di legame delle cellule HeLa mostravano tutti un'affinità uniforme verso abrina e ricina, sia a 0 gradi che a 37 gradi. Lo stesso era il caso con i siti di legame degli eritrociti a 0 gradi. Tuttavia, i dati hanno indicato che a 20 gradi gli eritrociti possedevano siti di legame con due diverse affinità. Solo una frazione della tossina legata alle cellule sembrava essere legata in modo irreversibile e non poteva essere rimossa lavando con 0,1 M di lattosio. La frazione della quantità totale di tossina legata che si è legata irreversibilmente alle cellule HeLa era per entrambe le tossine di circa 2 X 10(-3)/min a 37 gradi, mentre nessuna tossina era legata in modo irreversibile a 0 gradi. Nel caso degli eritrociti nessuna tossina si è legata in modo irreversibile, né a 0 gradi né a 37 gradi, il che indica che le tossine non sono in grado di penetrare in queste cellule.
Misura dei potenziali di ossidoriduzione per la riduzione a due e quattro elettroni della lipoammide deidrogenasi dal cuore di maiale.Il potenziale di ossidoriduzione, E2, per la coppia lipoammide deidrogenasi ossidata/2 lipoammide deidrogenasi elettron ridotta è stata determinata misurando gli equilibri di queste specie enzimatiche con lipoammide e diidrolipoammide o con coloranti azinici ossidati e ridotti. E2 è -0,280 V a pH 7, e deltaE2/ deltapH è -0,06 V nell'intervallo di pH da 5,5 a 7,6. I valori per E1, il potenziale di ossidoriduzione per la coppia enzima ridotto a 2 elettroni/4 enzima ridotto a 2 elettroni, sono stati ottenuti dalle misurazioni dell'entità della dismutazione di 2 elettroni enzima ridotto per formare miscele contenenti enzima ossidato e a 4 elettroni ridotto. E1 è -0,346 V a pH 7 e deltaE1/deltapH è -0,06 V nell'intervallo di pH da 5,7 a 7,6. Spettri dell'enzima ossidato e dell'enzima ridotto a 4 elettroni do non mostrano variazioni con il pH in questo intervallo, ma lo spettro dell'enzima ridotto a 2 elettroni è dipendente dal pH, con l'estinzione molare a 530 nm che cambia da 3250 M-1 cm-1 a pH 8 a 2050 M-1 cm-1 a pH 5,2. Le variazioni pH-dipendenti che si osservano nelle proprietà di assorbimento dell'enzima ridotto a 2 elettroni sono coerenti con la scomparsa di un complesso di trasferimento di carica tra una catena laterale dell'amminoacido e la flavina ossidata ai valori di pH inferiori, con il pK apparente di la catena laterale a pH 5. È stato suggerito che l'assorbanza di 530 nm dell'enzima ridotto a 2 elettroni sia dovuta a un complesso di trasferimento di carica tra l'anione tiolato e la flavina ossidata, e proponiamo che l'anione tiolato sia stabilizzato dall'interazione con un protonato base. I dati termodinamici prevedono che la quantità di enzima ridotto a 4 elettroni formato quando l'enzima viene ridotto dall'eccesso di NADH sarà pH-dipendente, con le maggiori quantità osservate a bassi valori di pH. Questi dati supportano prove precedenti (Matthews, RG, Wilkinson, KD, Ballou, D,P. e Williams, CH, Jr. (1976) in Flavins and Flavoproteins (Singer, TP, ndr) pp. 464-472; Elsevier Scientific Publishing Co. , Amsterdam) che il ruolo del NAD+ nella reazione NADH-lipoammide reduttasi catalizzata dalla lipoammide deidrogenasi è quello di prevenire l'accumulo di enzima ridotto a 4 elettroni inattivo mediante semplice inversione della riduzione dell'enzima ridotto a 2 elettroni da parte del NADH.
Effetti di due gruppi ionizzanti sul sito attivo dell'anidrasi carbonica umana B.L'indagine su alcune proprietà dipendenti dal pH dell'anidrasi carbonica umana eritrocitaria B indica che il sito attivo è influenzato da almeno due gruppi carichi. Le proprietà studiate includono la dipendenza dal pH dell'inibizione degli enzimi nativi, monocarbossamidometile e monocarbossimetilico da parte dello ione ioduro e la dipendenza dal pH degli spettri visibili dei derivati del cobalto di questi enzimi. Uno Il gruppo ionizzante ha un pKa di circa 7,3 nell'enzima nativo, 8,2 nell'enzima carbossimidometile e 9,0 nell'enzima carbossimetilico. Ha una grande influenza sull'attività e sull'inibizione degli anioni e sugli spettri visibili degli enzimi cobalto. Un secondo gruppo ha un pKa di circa 6,1 negli enzimi nativi e modificati. Quando lo zinco si trova nel sito attivo, il gruppo secondario nella sua forma acida diminuisce il Ki per I-. Con gli enzimi carbossimidometile e carbossimetilico, il Ki diminuisce b y circa un ordine di grandezza. Tuttavia, se il cobalto sostituisce lo zinco negli enzimi modificati, questo gruppo non influenza il Ki per I- e il legame di I- non influenza il pKa delle transizioni spettrali causate dalla ionizzazione di questo gruppo secondario. Nel caso dell'enzima Co2+ non alchilato, un altro gruppo ionizzante con un pK di circa 6,2 impedisce l'abbuffata di I- a pH basso. Questi risultati mostrano che il sito attivo viene alterato quando il cobalto viene sostituito dallo zinco nell'anidrasi carbonica B.
Purificazione e caratterizzazione dell'alfa-D-mannosidasi del citosol del fegato di ratto.Tre forme di alfa-D-mannosidasi sono state precedentemente identificate nel ratto fegato, e ciascuno è localizzato in una diversa frazione subcellulare: lisosomi, membrane del Golgi e citosol. Questa comunicazione riporta la purificazione e la caratterizzazione della forma citosolica. L'enzima è stato purificato 12.000 volte con una buona resa a circa il 90% di purezza con l'aiuto di l'inibitore competitivo mannosilamina e ditioeritritolo come stabilizzanti. Il peso molecolare dell'enzima è compreso tra 372.000 e 490.000 a seconda del metodo utilizzato. Poiché il peso molecolare della subunità è di 110.000 mediante elettroforesi di poliacrilammide di sodio dodecilsolfato, l'enzima è probabilmente un tetramero. Il pH ottimale è risultato essere compreso tra 5,5 e 5,9 (in presenza di 1 mM CoCl2) con il substrato p-nitrofenil-alfa-D-mannoside La normale cinetica di Michaelis-Menten è stata osservata con un Km di 0,14 m M. La mannosilamina era un inibitore competitivo con un Ki di 0,007 mM. L'enzima purificato, stabilizzato da Co2+, Mn2+ e Fe2+ in alcune condizioni, era instabile a basse concentrazioni di proteine. Poiché un campione sottoposto a elettroforesi ha mostrato una colorazione di acido periodico-Schiff positiva, l'enzima può contenere carboidrati. La disponibilità di alfa-D-mannosidasi citosolica purificata dovrebbe ora consentire di condurre studi sulla specificità del substrato, immunologici e strutturali che potrebbero far luce sul ruolo biologico di questo enzima.
Rivalutazione della cinetica dell'ossidazione della catena catalizzata dalla lattato deidrogenasi della nicotinammide adenina dinucleotide da parte dei radicali superossido in presenza di etilendiamminotetraacetato.L'ossidazione della catena di NADH legato alla lattato deidrogenasi iniziato da radicali superossido e propagato dall'ossigeno è stato studiato con radiolisi pulsata I parametri cinetici sono stati rivalutati in un sistema con reagenti accuratamente purificati (acqua e altri prodotti chimici) e in presenza di EDTA. per l'ossidazione del NADH legato all'enzima da parte di O2- è calcolato dalla scomparsa osservata di pseudo-primo ordine di NADH e dalla lunghezza della catena (molecole di NADH ossidate per anione O2- generato nell'impulso). 0,2) X 10(5) M-1 S-1, coerente con una variazione di 13 volte della lattato deidrogenasi Concentrazione del complesso NADH e con lunghezza della catena variabile fino a 6,1 Sulla base di esperimenti con valori di pH variabili da 4,5 a 9,0, il costante di velocità per o Si stima che l'ossidazione del NADH legato all'enzima da parte di HO2 sia 2.0 X 10(6) M-1 S-1.
Chetopantoato idrossimetiltransferasi. II. Proprietà fisiche, catalitiche e regolatorie.Alcune proprietà fisiche, catalitiche e regolatorie della ketopantoato idrossimetiltransferasi (5,10- metilentetraidrofolato: sono descritti alfa-chetoisovalerato idrossimetiltranferasi) da Escherichia coli. Questo enzima catalizza la sintesi reversibile del ketopantoato (Reazione 1), un precursore essenziale dell'acido pantotenico. (1) HC(CH3)2COCOO- + 5,10-metilene tetraidrofolato f in equilibrio r HOCH2C(CH3)2COCOO- + tetraidrofolato Ha un peso molecolare all'equilibrio di sedimentazione di 255.000, un coefficiente di sedimentazione (S20,w) di 11 S, un volume specifico parziale di 0,74 ml/g, un punto isoelettrico di 4,4, e un'assorbanza, (vedi articolo), di 0,85. L'elettroforesi su gel di poliacrilammide in analisi di sodio dodecil solfato e amminoacidi fornisce un peso molecolare della subunità di 27.000 e 25.700, rispettivamente; entrambe le procedure indicano la presenza di 10 identici subunità. La sequenza NH2-terminale è Met-Tyr---. L'enzima è stabile e attivo in un ampio intervallo di pH, con un valore ottimale compreso tra 7,0 e 7,6. Richiede Mg2+ per l'attività; Mn2+, Co2+, Zn2+ sono progressivamente meno attivi. L'enzima non viene inattivato dalla riduzione del boroidruro in presenza di substrati in eccesso, cioè è un'aldolasi di classe II. La reazione 1f è parzialmente inibita da concentrazioni di formaldeide (0,8 mM) e tetraidrofolato (0,38 mM) inferiori o vicine ai valori Km, i valori Km apparenti sono rispettivamente 0,18, 1,1 e 5,9 mM per tetraidrofolato, alfa-chetoisovalerato e formaldeide. Per la reazione 1r, i valori di Km apparenti sono 0,16 e 0,18 mM, rispettivamente, per chetopantoato e tetraidrofolato e le curve di saturazione per entrambi i substrati mostrano una cooperatività positiva. Le reazioni dirette e inverse si verificano a velocità massime simili (Vmax approssimativamente uguale a 8 mumol di chetopantoato formato o decomposto al minuto per mg di enzima a 37 gradi). Solo l'1-tetraidrofolato è attivo nella reazione 1; d-tetraidrofolato, folato e metotrexato non erano né attivi né inibitori. Tuttavia, l'1-tetraidrofolato è stato efficacemente sostituito con coniugati contenenti da 1 a 6 ulteriori residui di glutammato; di questi, il tetraidropterolpenta-, il tetra- e il triglutammato erano efficaci a concentrazioni inferiori rispetto al tetraidrofolato stesso; erano anche i coniugati predominanti del tetraidrofolato presente in E. coli. L'alfa-chetobutirrato, l'alfa-chetovalerato e l'alfa-cheto-beta-metilvalerato hanno sostituito l'alfa-chetoisovalerato come substrati; il piruvato era inattivo come substrato, ma come l'isovalerato, il 3-metil-2-butanone e la D- o L-valina, ha inibito la reazione 1. la transferasi ha proprietà regolatorie attese da un enzima che catalizza il primo passaggio impegnato in una via biosintetica. Il pantoato (maggiore o uguale a 500 muM) e il coenzima A (sopra 1 mM) inibiscono tutti; il Vmax è diminuito, il Km è aumentato e la cooperatività per il substrato (chetopanteato) è aumentata. L'attività catalitica della transferasi è quindi regolata dai prodotti del percorso di reazione di cui è un componente; la sintesi della transferasi non è repressa dalla crescita in presenza di pantotenato.
Proprietà conformazionali e termodinamiche dell'apo A-1 delle lipoproteine ad alta densità del plasma umano.Modifiche conformazionali dell'apo A-1, la principale apoproteina umana lipoproteine plasmatiche ad alta densità, sono state studiate mediante calorimetria differenziale a scansione e spettroscopia a differenza ultravioletta in funzione della temperatura, del pH, della concentrazione di apoproteina e della concentrazione di urea. La calorimetria mostra che l'apo A-1 (da 5 a 40 mg/ml, pH 9,2) subisce una denaturazione reversibile a due stati (entalpia = 64 +/- 8,9 kcal/mole), tra 43--71 gradi (temperatura del punto medio, Tm = 54 gradi), associata ad un aumento della capacità termica (deltaCvd) di 2,4 +/- 0,5 kcal/mole/gradi C. Apo A-1 (da 0,2 a 0,4 mg/ml, pH 9,2) sviluppa uno spettro di differenza negativo tra 42--70 gradi, con Tm = 53 gradi. L'entalpia (deltaH = 59 +/- 5,7 kcal/mole a Tm) e la variazione della capacità termica (2,7 +/- 0,9 kcal/mole/gradi C) negli esperimenti spettroscopici non erano significativamente diverso dai valori calorimetrici. Sotto pH 9 e sopra pH 11, la Tm calorimetrica e il deltaH di denaturazione sono diminuiti. Nell'intervallo di pH della denaturazione reversibile (6,5-11,8), delatH e Tm sono correlati linearmente, dimostrando che la variazione della capacità termica (ddeltaH/dT) associata alla denaturazione è indipendente da Tm. Nelle soluzioni di urea, la Tm calorimetrica e il deltaH di denaturazione sono diminuiti. A 25 gradi, l'apo A-1 sviluppa uno spettro di differenza negativo tra 1,4 e 3 M di urea. Il cinquanta per cento della variazione spettrale si verifica in 2,4 M di urea, che corrisponde alla concentrazione di urea ottenuta per estrapolazione della Tm calorimetrica a 25 gradi. In una soluzione di urea inferiore a 0,75 M c'è ipercromicità a 285 nm (delta epsilon = 264 in 0,75 M di urea), che indica una forte interazione dei residui di amminoacidi aromatici nella molecola nativa con il solvente. La titolazione spettrofotometrica dell'apo A-1 mostra che 6,6 dei 7 gruppi tirosina dell'apo A-1 titolano a pH inferiore a 11,9, con curve di titolazione simili ottenute in soluzioni acquose e in urea 6 M. L'energia libera di stabilizzazione (deltaG) della conformazione nativa di apo A-1 è stata stimata, (a) a 37 gradi, utilizzando il calorimetrico deltaA e deltaCvd, e (b) a 25 gradi, mediante estrapolazione dei dati spettroscopici a zero urea concentrazione. I valori (deltaG (37 gradi) = 2,4 e deltaG (25 gradi) = 2,7 kcal/mole) sono piccoli rispetto alle tipiche proteine globulari, indicando che l'apo A-1 nativo ha una struttura terziaria leggermente piegata. I bassi valori di deltaG riflettono l'alto grado di esposizione delle aree idrofobiche nella molecola proteica nativa. La conformazione debolmente piegata dell'apo A-1 consente un ampio legame dei lipidi, poiché questo può coinvolgere sia siti idrofobici superficiali che aree idrofobiche esposte da un processo di sviluppo cooperativo a bassa energia.
La conversione enzimatica del protoporfirinogeno IX in protoporfirina IX nei mitocondri dei mammiferi.Protoporfirinogeno ossidasi, un enzima che catalizza l'ossidazione del protoporfirinogeno IX in protoporfirina IX in cellule di lievito, è stato trovato in diversi tessuti di mammiferi. È stato estratto dai mitocondri di fegato di ratto mediante sonicazione in presenza di sale e detergente e parzialmente purificato. L'enzima è simile per molti aspetti alla protoporfirinogeno ossidasi del lievito. In base al suo comportamento su Sephadex G-200 il peso molecolare dell'enzima è di circa 35.000. La catalisi mediante protoporfirinogeno ossidasi era specifica per il proteoporfirinogeno IX (Km apparente di 11 muM) e procedeva al massimo a pH da 8,6 a 8,7. L'effetto della temperatura sull'attività enzimatica tracciato secondo Arrhenius ha dato un valore di E di 9.100 calorie per mole L'attività enzimatica è stata inibita in presenza di elevate concentrazioni di sale e temperature superiori a 45 gradi L'ossigeno era ess non è stato ancora trovato un accettore di elevtron alternativo per l'attività del protoporfirinogeno ossidasi. Non è stato possibile dimostrare alcun requisito per un metallo o altro cofattore. È stata indicata la presenza di gruppi monotiolici; tuttavia, non è noto se i gruppi tiolici siano coinvolti direttamente nel legame del substrato all'enzima.
Citocromo P-450 dei mitocondri surrenalici bovini. Legante del ligando a due forme risolte mediante spettroscopia EPR.Legame del colest-5-ene-3beta Il 20alfa-diolo (20alfa-idrossicolesterolo), l'11-desossicorticosterone e l'aminoglutetimide rispetto al citocromo P-450 nei mitocondri surrenali bovini sono stati misurati mediante variazioni degli spettri ottici a temperatura ambiente e mediante spettri EPR a 14 K. I due metodi hanno fornito una quantificazione quasi identica di queste interazioni con il citocromo P-450. Due distinte forme ad alto spin del citocromo P-450 sono state rivelate dagli spettri EPR. La specie ad alto spin predominante (g = 8.2) è stata diminuita dall'aggiunta di 20alfa-idrossicolesterolo e pH elevato ma è stata aumentata mediante aggiunta di colesterolo. Le specie minori ad alto spin (g = 8.1) sono state aumentate dall'aggiunta di desossicorticosterone ma diminuite da basse concentrazioni di metirapone. Le due forme evidentemente non erano in equilibrio e sono state assegnate a forme distinte di citocro me P-450 coinvolti, rispettivamente, nella scissione della catena laterale del colesterolo (P-450scc) e nell'idrossilazione dello steroide 11beta (P-450(11)beta). Gli stati ad alto spin derivano da complessi di questi citocromi P-450 con substrati endogeni, che sono, rispettivamente, colesterolo e desossicorticoidi. È stata osservata una transizione da alto a basso di spin quando questi complessi sono stati capovolti avviando l'idrossilazione con il malato. Anche i contributi dei citocromi P-450(11)beta e P-450scc allo spettro a basso spin sono stati risolti con mezzi simili. Almeno il 20% di P-450scc è in stato di basso spin mentre circa il 90% di P-450(11)beta è a basso spin nei mitocondri surrenali di manzo isolati. I complessi a basso spin del citocromo P-450scc con 20alfa-idrossicolesterolo e 3beta-idrossipregn-5-ene-20-one (pregnenolone) hanno fornito spettri EPR distinti. L'aminoglutetimide ha interagito con il contenuto totale di citocromo P-450 dei mitocondri surrenali bovini formando complessi a basso spin. Sia i dati ottici che quelli EPR hanno indicato il legame a due forme di citocromo P-450. Questi risultati suggeriscono una correlazione dettagliata tra lo stato di spin e i cambiamenti di assorbanza osservati a temperatura ambiente, illustrano che EPR consente la distinzione di due forme principali di P-450 e suggeriscono che non vi è alcun cambiamento apprezzabile nello stato di spin di entrambi i citocromi tra 14 K e 300 K.
Purificazione e caratterizzazione di una endo-beta-galattosidasi prodotta da Diplococcus pneumoniae.Una endo-beta-galattosidasi che agisce su sostanze del gruppo sanguigno A e B è stato trovato nel fluido di coltura di Diplococcus pneumoniae. L'enzima è stato purificato 1000 volte e le sue proprietà sono state studiate in dettaglio. La preparazione enzimatica, così ottenuta, era praticamente esente da varie esoglicosidasi, endo-beta-N-acetilglucosaminidasi e proteasi. L'enzima rilascia trisaccaridi dalle mucine attive del gruppo sanguigno A e B purificate dal fluido della cisti ovarica Le strutture dei trisaccaridi liberate dalle mucine attive A e B sono state chiarite come GalNAcalpha1 conduce a 3 (Fucalpha1 conduce a 2) Gal e Galalpha1 conduce a 3 (Fucalpha1 porta a 2)Gal, rispettivamente. L'enzima idrolizza anche gli oligosaccaridi attivi del gruppo sanguigno A e B composti da catene di tipo 2, producendo gli stessi prodotti come nel caso delle sostanze del gruppo sanguigno della cisti ovarica. Una mucina H attiva da il fluido della cisti ovarica, gli oligosaccaridi attivi H e gli oligosaccaridi attivi A e B con catene di tipo 1 non sono stati idrolizzati dall'enzima. Di conseguenza, l'enzima catalizza la seguente reazione, con conseguente degradazione dei determinanti del gruppo sanguigno A e B. (vedi articolo).
Interazioni tiroxina-proteina. Interazione di tiroxina e triiodotironina con globulina legante la tiroxina umana.L'effetto della temperatura sul legame di tiroxina e triiodotironina a La globulina legante la tiroxina è stata studiata mediante la dialisi di equilibrio L'inclusione dell'ovoalbumina nella miscela di dialisi ha stabilizzato la globulina legante la tiroxina contro le perdite nell'attività di legame che si erano verificate durante la dialisi di equilibrio L'ovoalbumina da sola legava molto debolmente gli ormoni tiroidei e il suo legame potrebbe essere trascurato quando si analizzano i risultati sperimentali. A pH 7,4 e 37 gradi in tampone fosfato di potassio 0,06 M / tampone EDTA 0,7 mM, la tiroxina era legata alla globulina legante la tiroxina in un singolo sito di legame con costanti di associazione apparenti: a 5 gradi, K \ = 4,73 +/- 0,38 X 10(10) M-1; a 25 gradi, K = 1,55 +/- 0,17 X 10(10) M-1; e a 37 gradi, K = 9,08 +/- 0,62 X 10(9) M-1 Grafici Scatchard dei dati vincolanti per la triiodotironina ha indicato che il legame di questo composto alla globulina legante la tiroxina era più complesso di quello trovato per la tiroxina. I dati per il legame della triiodotironina potrebbero essere adattati assumendo l'esistenza di due diverse classi di siti di legame. A 5 gradi e pH 7,4 l'analisi di regressione non lineare dei dati ha prodotto i valori n1 = 1,04 +/- 0,10, K1 = 3,35 +/- 0,63 X 10 (9) M-1 e n2 = 1,40 +/- 0,08, K2 = 0,69 +/- 0,20 X 10 (8) M-1. A 25 gradi, i valori per le costanti di legame erano n1 = 1,04 +/- 0,38, K1 = 6,5 +/- 2,8 X 10 (8) M-1 e n2 = 0,77 +/- 0,22, K2 = 0,43 +/- 0,62 X 10(8) M-1. A 37 gradi dove è stata osservata una minore curvatura, le costanti di legame stimate erano n1 = 1,02 +/- 0,06, K1 = 4,32 +/- 0,59 X 10(8) M-1 e n2K2 = 0,056 +/- 0,012 X 10 (8) M-1. Quando n1 è stato fissato a 1, i valori risultanti ottenuti per le altre tre costanti di legame erano a 25 gradi, K1 = 6,12 +/- 0,35 X 10(8) M-1, n2 = 0,72 +/- 0,18, K2 \ = 0,73 +/- 0,36 X 10(8) M-1; e a 37 gradi K1 = 3,80 +/- 0,22 X 10 (8) M-1, n2 = 0,44 +/- 0,22 e K2 = 0,43 +/- 0,38 X 10 (8) M-1. I valori termodinamici per il legame della tiroxina con la globulina legante la tiroxina a 37 gradi e pH 7,4 erano deltaG0 = -14,1 kcal/mole, deltaH0 = -8,96 kcal/mole e deltaS0 = +16.7 cal degree-1 mole-1. Per la triiodotironina a 37 gradi, i valori termodinamici per il legame nel sito di legame primario erano deltaG0 = -12,3 kcal/mole, deltaH0 = -11,9 kcal/mole e deltaS0 = +1,4 gradi cal-1 mole-1. La misurazione della dipendenza del legame dal pH ha indicato che sia la tiroxina che la triiodotironina erano legate al massimo nella regione del pH fisiologico, pH da 6,8 a 7,7.
Reattività differenziale dei due residui di cisteina del sito attivo generati sulla riduzione della lipoammide deidrogenasi del cuore di maiale.Riduzione del legame disolfuro del centro attivo nel maiale flavoproteina la lipoammide deidrogenasi del cuore genera due porzioni di zolfo che sono chimicamente inequivalenti nella forma ridotta dell'enzima a 2 elettroni. Quindi 1 residuo di cisteina è almeno 13 volte più reattivo del suo partner verso la iodoacetamide a pH 7,6. Questa selettività è stata dimostrata dalla reazione di l'enzima 2-elettrone ridotto a bassa concentrazione di iodo[1-14C]acetammide in condizioni anaerobiche La formazione di un derivato monomarcato è accompagnata dalla ricomparsa di uno spettro di flavina legata ossidata, nettamente differente da quella dell'enzima nativo. L'alchilazione dei residui di cisteina rimanenti con iodo[12C]acetamide ha permesso l'isolamento di una versione triptica del peptide disolfuro del centro attivo. Una singola scissione chimotriptica tra i 2 residui di cisteina alchilata hanno generato un frammento cationico e uno anionico contenente rispettivamente il 7% e il 93% della radioattività del peptide triptico purificato. Il derivato monomarcato è cataliticamente inattivo verso la lipoammide ridotta o ossidata, ma è circa 2 volte migliore come transidrogenasi rispetto alla proteina nativa utilizzando NADH e acetilpiridina adenina dinucleotide come substrati. La titolazione anaerobica con NADH porta alla riduzione della flavina con concomitante formazione di assorbimento a lunghezze d'onda lunghe di bassa intensità. In questa titolazione non sono stati rilevati stati ridotti intermedi analoghi alla forma a 2 elettroni rossi osservata con l'enzima nativo. Allo stesso modo, non sono stati rilevati intermedi durante la riduzione dell'enzima di 1 eq di ditionito.
Lievito alfa-isopropilmalato isomerasi. Fattori che influenzano la stabilità e l'attività enzimatica.Il lievito alfa-isopropilmalato isomerasi è risultato essere notevolmente stabilizzato da alte concentrazioni di glicerolo e (NH4)2SO4. Tali condizioni di elevata forza ionica hanno inibito l'enzima, stabilizzato l'enzima al calore e influenzato i parametri cinetici. È stato scoperto che l'isomerasi mostra un'isteresi dipendente dalla forza ionica quando l'enzima, totalmente ma reversibilmente inibito dalla conservazione in condizioni di elevata forza ionica di (NH4)2SO4, è stata trasferita a una concentrazione inferiore di (NH4)2SO4. L'alfa-isopropilmalato isomerasi è risultata sensibile al KCN e ad alcuni altri chelanti. L'inattivazione da parte del KCN è stata impedita da alte concentrazioni di (NH4) 2SO4. Queste osservazioni implicavano un coinvolgimento del metallo ma la natura del metallo non è stata rivelata. Il coinvolgimento del metallo e alcune delle altre proprietà dell'alfa-isopropilmalato isomerasi rivelano una somiglianza con l'aconitasi. Le somiglianze nelle proprietà tra l'isomerasi e l'aconitasi sono riassunte. Gli studi sull'alfa-isopropilmalato isomerasi del lievito hanno indicato che si tratta di un singolo polipeptide di circa Mr = 90.000.
Regolazione della glutaminasi B in Escherichia coli. I. Purificazione, proprietà e labilità al freddo.Escherichia coli contiene due glutaminasi, A e B, con pH ottimale rispettivamente inferiore a pH 5 e superiore a pH 7. Né la glutaminasi A né la B vengono rilasciate da E. coli per shock osmotico. La glutamminasi B è stata purificata 6.000 volte e si stima che la preparazione purificata contenga circa il 40% di glutaminasi B. L'enzima ha un peso molecolare di 90.000 e un punto isoelettrico di 5,4. La glutammina B mostra un ampio pH ottimale tra 7,1 e 9,0. Solo la L-glutammina è deamidata dalla glutaminasi B, L-asparagina e D-glutammina non sono deamidate. La saturazione del substrato la curva per la glutaminasi B mostra una regione di plateau intermedio. Come molti enzimi regolatori, la glutaminasi B è labile al freddo. L'enzima viene inattivato dal raffreddamento e attivato dal riscaldamento; entrambi i processi sono di primo ordine rispetto al tempo. L'energia di attivazione per l'attivazione mediante riscaldamento è stato calcolato t o essere 5900 cal/mol. L'attivazione mediante riscaldamento ha aumentato la Vmax e ridotto la S0.5 per la L-glutammina, ma non ha alterato il peso molecolare dell'enzima cataliticamente attivo. Borato e glutammato hanno protetto la glutaminasi B dall'inattivazione dovuta al freddo.
Effetti dello ionoforo catione bivalente A23187 sulla permeabilità al potassio degli eritrociti di ratto.A23187 trasporta rapidamente il calcio negli eritrociti di ratto, apparentemente mediante uno scambio elettroneutro con il magnesio intracellulare e protoni. Quando i globuli rossi vengono incubati in assenza di cationi bivalenti aggiunti, A23187 trasporta il magnesio interno fuori dalle cellule, in cambio di protoni extracellulari. L'assorbimento di magnesio negli eritrociti è prodotto da A23187, a condizione che la concentrazione extracellulare di questo catione superi quella intracellulare livelli e lo ionoforo trasporta anche lo stronzio, ma non il bario, nei globuli rossi. A23187 produce una rapida ed estesa perdita di potassio intracellulare dagli eritrociti durante l'assorbimento di calcio o stronzio, ma non di magnesio. Quando i globuli rossi sono incubati in assenza di qualsiasi cationi bivalenti esogeni, A23187 produce ancora un efflusso di potassio e questo è completamente inibito da piccole quantità di glicole etilenico bis(bet a-amminoetil etere)-N,N\'-acido tetraacetico e ripristinato mediante aggiunta di calcio in eccesso del chelante. Sebbene l'EDTA aumenti l'entità del rilascio di magnesio dagli eritrociti incubati con A23187, previene l'efflusso di potassio. Il dipiridamolo e l'acido 4-acetamid-4\'-isotiociano-stilbene-2,5\'-disolfonico, che riducono la premebilità del cloruro degli eritrociti, inibiscono la perdita di potassio indotta da A23187 dai globuli rossi. Rutamicina, peliomicina, venturicidina e A23668B inibiscono anche l'efflusso di potassio dalle cellule intatte incubate con A23187, ma questo effetto non è correlato alla loro capacità di inibire varie ATPasi nelle preparazioni della membrana dei globuli rossi. Si conclude che A23187 non trasporta il potassio direttamente attraverso la membrana plasmatica degli eritrociti, ma consente a piccole quantità di calcio endogeno di interagire con alcuni componenti della membrana per migliorare la permeabilità al potassio della cellula.
Acclerazione dell'autoossidazione dell'ossiemoglobina umana da parte dell'anilina e sua relazione con l'idrossilazione dell'anilina catalizzata dall'emoglobina.Cambiamenti nello spettro ultravioletto/visibile dell'ossiferroemoglobina umana su l'aggiunta di anilina era indicativa di un'interazione concentrazione-dipendente dell'anilina con l'emoglobina, con conseguente autoossidazione accelerata dell'emoproteina. È stato riscontrato che l'ossigeno inibisce notevolmente questa interazione dell'anilina con l'ossiemoglobina. La dipendenza del tasso di autoossidazione dalla concentrazione dell'anilina ha seguito la cinetica di saturazione e ha mostrato una risposta semi-massima all'anilina 8 mM. Questo valore è uguale al valore di Km per l'anilina come substrato per la reazione di idrossilazione catalizzata dall'emoglobina O2-dipendente che produce p-amminofenolo (Mieyal, JJ, Ackerman, RS, Blumer, JL e Freeman, LS (1976) J. Biol. Chem. 241, 3436-3441. Pertanto, un complesso anilina-ossiemoglobina è implicato nella reazione catalitica complessiva. Il p-amminofenolo si è formato quando l'anilina è stata combinata con l'ossiemoglobina in assenza di un donatore di elettroni, ma l'idrossilazione dell'anilina si verifica quando vengono aggiunti anche NADPH, NADPH più P-450 reduttasi o Na2S2O4.
Il sistema di attivazione della chitina sintetasi da Saccharomyces cerevisiae. Purificazione e proprietà del fattore di attivazione.La proteinasi del lievito che provoca l'attivazione dello zimogeno della chitina sintetasi è stato purificato mediante una procedura che include la cromatografia di affinità su una colonna di agarosio a cui l'inibitore proteico dell'enzima era stato attaccato covalentemente L'enzima purificato ha prodotto una singola banda sull'elettroforesi su gel del disco a pH 4,5 in presenza di urea. pH, ma senza urea, è stata rilevata una debole banda in coincidenza con l'attività enzimatica, mentre a pH 9,5, sia in assenza che in presenza di sodio dodecilsolfato, non è stata rilevata alcuna zona proteica. Dai dati di sedimentazione e gel filtrazione, un è stato stimato un peso molecolare di 44.000. La proteinasi era attiva in un ampio intervallo di valori di pH, con un valore ottimale tra pH 6,5 E 7. Titolazione dell'attività con l'inibitore proteico da lievito richiesto 1 mole di inibitore/mole di enzima. Un risultato simile è stato ottenuto con il fenilmetilsolfonil fluoruro, indicazione che è necessario 1 residuo di serina per l'attività enzimatica. L'enzima ha mostrato attività idrolitica con diverse proteine e attività esterolitica con molti substrati sintetici, tra cui l'estere etilico della benzoilarginina e l'estere etilico dell'acetiltirosina. identico all'enzima precedentemente designato come proteinasi B (EC 3.4.22.9). È la prima volta che si ottiene e si caratterizza una preparazione omogenea di proteinasi B.
Meccanismo di inibizione irreversibile dell'aspartato aminotransferasi da parte della tossina batterica acido L-2-amino-4-metossi-trans-3-butenoico.L'acido L-2-amino-4-metossi-trans-3-butenoico (AMB) presente in natura inibisce irreversibilmente l'aspartato aminotransferasi legata al piridossalfosfato L'inibitore è un substrato per l'enzima e come tale viene convertito in un agente altamente reattivo intermedio che reagisce chimicamente con un residuo del sito attivo, inattivando così in modo irreversibile l'enzima. Sono presentati studi enzimatici e modello sull'AMB che consentono di determinare il preciso meccanismo d'azione di questa tossina. Il meccanismo prevede la formazione della base di Schiff tra l'enzima e la tossina seguita mediante scissione del legame alfa-C--H e isomerizzazione dell'aldimina per generare un accettore di Michael bifunzionale. Questa molecola alchila un residuo del sito attivo per via di addizione ed eliminazione.
Proprietà dell'apoglutammato sintasi e confronto con glutammato deidrogenasi.Il glutammato sintasi di Escherichia coli K-12 mostra un'attività NH3-dipendente. L'attività NH3-dipendente è aumenta di circa 5 volte l'apoglutammato sintasi privo di flavina e di ferro non eme. Mentre la glutammina più 2-ossoglutarato ha la capacità di riossidare il flavoenzima chimicamente ridotto, tale riossidazione non si ottiene con 2-ossoglutarato più NH3. Questi risultati stabiliscono che la glutammina - e le sintesi NH3-dipendenti del glutammato si verificano attraverso diverse vie di trasferimento di elettroni da NADPH. L'attività NH3-dipendente della sintasi nativa e dell'apoglutammato mostra proprietà catalitiche simili. Alcune proprietà dell'apoglutammato sintasi sono simili a quelle della glutammato deidrogenasi. Queste proprietà includono il pH optima per la sintesi e la deaminazione ossidativa del glutammato, inattivazione mediante reagenti alchilanti e p-mercuribenzoato, una maggiore velocità di inattivazione b y reagenti alchilanti e p-mercuribenzoato a basso pH, protezione del 2-ossoglutarato contro l'inattivazione da parte del p-mercuribenzoato e riattivazione dell'enzima trattato con p-mercuribenzoato da parte del 2-mercaptoetanolo. Il 2-ossoglutarato protegge dall'alchilazione della glutammato sintasi da parte della iodo[1-14C]acetammide e riduce l'incorporazione della metil[1-14C]carbossammide nella piccola subunità dell'enzima.
Glutamato sintasi. Proprietà dell'attività dipendente dalla glutammina.Le proprietà della glutammato sintasi dipendente dalla glutammina sono state studiate utilizzando l'enzima omogeneo di Escherichia coli K- 12. In contrasto con i risultati con l'enzima del ceppo B di E. coli (Miller, RE e Stadtman, ER (1972) J. Biol. Chem. 247, 7407-7419), questo enzima catalizza l'attività del glutammato sintasi NH3-dipendente. l'inattivazione dell'attività dipendente dalla glutammina è stata ottenuta mediante trattamento con l'analogo della glutammina acido L-2-amino-4-oxo-5-cloropentanoico (clorochetone). La iodoacetammide, altri composti alfa-alocarbonilici e i reagenti sulfidrilici hanno fornito un'inattivazione selettiva simile dell'attività dipendente dalla glutammina La cinetica di saturazione non è stata ottenuta per l'inattivazione da parte della iodoacetammide ma la protezione da parte della glutammina ha mostrato k competitivo inetica. La stechiometria per l'alchilazione mediante clorochetone e iodoacetammide era di circa 1 residuo per protomero di peso molecolare di circa 188.000. Il singolo residuo alchilato con iodo[1-14C]acetammide è stato identificato come cisteina mediante isolamento di S-carbossimetilcisteina. Questa cisteina del sito attivo si trova nella subunità grande di peso molecolare di circa 153.000. La cisteina del sito attivo era sensibile all'ossidazione da parte dell'H2O2 generata dall'autoossidazione della flavina ridotta e determinava l'inattivazione selettiva dell'attività enzimatica dipendente dalla glutammina. Simile ad altre glutammina amidotransferasi, la glutammato sintasi esibisce l'attività della glutamminasi. L'attività della glutamminasi dipende dall'integrità funzionale della cisteina del sito attivo, ma non dipende interamente dalla flavina e dal ferro non eme. Collettivamente, questi risultati dimostrano che la glutammato sintasi è simile ad altre glutammina amidotransferasi rispetto a siti distinti per l'utilizzo di glutammina e NH3 e nella funzione obbligatoria di un residuo di cisteina sito attivo per l'utilizzo di glutammina.
Sistema enzimatico solubile per la carbossilazione dipendente dalla vitamina K.Il sistema carbossilativo dipendente dalla vitamina K è stato solubilizzato dal trattamento Lubrol PX o Triton X-100 di microsomi di fegato di ratto carenti di vitamina K. Come ottenuto da fegato di ratto carente di vitamina K, questa preparazione solubile dipende dall'aggiunta in vitro di vitamina K1 per l'attività carbossilante. Il sistema enzimatico è complesso e dipende da NADH e ditiotreitolo per la massima Mentre i detergenti usati per solubilizzare il complesso enzimatico inibiscono marcatamente l'attività del sistema, il sistema solubilizzato è ancora altamente reattivo all'aggiunta di vitamina K e può essere utilizzato per ulteriori studi sul sistema enzimatico carbossilante. Il fabbisogno di ditiotreitolo e l'inibizione da p-idrossimercuribenzoato indicano il coinvolgimento di un enzima --SH nel sistema carbossilante.
Trasporto di riboflavina nelle cellule di lievito.I mutanti di Saccharomyces cerevisiae che richiedono riboflavina sono in grado di trasportare nella cellula riboflavina marcata con 14C, sebbene non significativi il trasporto è osservato nel lievito commerciale o nel ceppo genitore da cui sono stati derivati i mutanti. L'attività di trasporto è maggiore nella fase da inizio a metà log della crescita anaerobica e diminuisce bruscamente nella fase tardiva logaritmica. Nelle cellule coltivate aerobicamente l'attività è sostanzialmente inferiore in tutte le fasi della crescita Nel saggio ideato per la sua misurazione, l'attività di trasporto mostra un forte pH ottimale a pH 7,5, una forte dipendenza dalla temperatura (EA = 23.100 cal/mol) e una cinetica di saturazione rispetto alla riboflavina (Km = 15 muM), caratteristiche coerenti con un meccanismo mediato da carrier. I cationi inorganici monovalenti, in particolare K+ e Rb+, stimolano l'assorbimento della riboflavina, mentre alcuni cationi organici sono inibitori. Oltre alla riboflavina solo 7-metilriboflavina, 8-metil si è scoperto che la riboflavina e la 5-deazaflavina servono come substrati, mentre la lumiflavina, la tetraacetilriboflavina e la N10-[4\'-carbossibutil]-7,8-dimetilisoallossazina non lo fanno, sebbene un certo numero di analoghi della flavina in cui la catena laterale ribitilica è modificato sono buoni inibitori competitivi dell'assorbimento della riboflavina. I composti che assomigliano alla catena laterale ribitlica, come zuccheri e alcoli di zucchero, non inibiscono. Un'apparente inibizione dell'assorbimento da parte di D-glucosio, D-mannosio e D-fruttosio, che si sviluppa nel corso dell'analisi, è risultata dalla stimolazione di un processo opposto, il rilascio di riboflavina dalle cellule.