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Uno studio sulla fenfluramina nel trattamento del paziente alcolista cronico.In uno studio in doppio cieco, 50 pazienti maschi alcolisti cronici sono stati trattati con fenfluramina in una dose di 60 mg o 120 mg al giorno, o con compresse placebo preparate in modo identico. I pazienti sono stati intervistati al momento dell'ammissione allo studio e poi a intervalli di quattro settimane per un periodo di un anno e i livelli ematici di delta-aminolevulinico deidratasi (ALAD ) e gamma-glutamil transpeptidasi (gammaGT) e fenfluramina sono state determinate. L'efficacia della fenfluramina ai due livelli di dose è stata confrontata con placebo sulla base del numero di decadimenti indicati dall'anamnesi e anche da alterazioni degli indici biochimici. -sette pazienti hanno completato il periodo di osservazione, di cui 9 in ciascuno dei tre gruppi. Quelli che hanno ricevuto 120 mg di fenfluramina al giorno hanno mostrato un numero significativamente inferiore di interruzioni rispetto a uno degli altri due gruppi (p inferiore a 0-01) su biochimica ma non su criteri clinici. La valutazione complessiva ha rivelato che 3 dei 9 pazienti che hanno ricevuto la dose elevata di fenfluramina hanno avuto un buon risultato durante il periodo dello studio, ma non ce n'erano nel gruppo da 60 mg o in quelli che hanno ricevuto placebo. Sono indicati studi più approfonditi sulla fenfluramina nel trattamento dell'alcolismo cronico.
Recettori H2 dell'istamina nella circolazione periferica umana.L'istamina (10 mug/min per 3 min) infusa nell'arteria brachiale ha causato un aumento flusso sanguigno dell'avambraccio che è stato ridotto dalla mepiramina (25 mg). Questo effetto è stato più marcato nel primo minuto dell'infusione. La metiamide (25 mg) non ha avuto effetto sulla dilatazione durante l'infusione ma ha causato un ritorno più rapido del flusso al La risposta è stata abolita quando entrambi i farmaci sono stati somministrati in combinazione. Si conclude che la risposta è iniziata principalmente dalla stimolazione dei recettori H1 e mantenuta dai recettori H1 e H2; l'attività continuata dei recettori H2 può spiegare la lenta ritorno del flusso al livello pre-infusionale.
Sul meccanismo d'azione della clozapina sul neurone adrenergico.1 Il farmaco antipsicotico, la clozapina, la noradrenalina ridotta e le concentrazioni di metaraminolo (MA) nel cuore di ratto. Questa azione è stata bloccata dalla presenza di un farmaco bloccante gangliare. 2 Altri farmaci bloccanti gli alfa-adrenorecettori (fenossibenzamina, fentolamina) non hanno abbassato significativamente le concentrazioni di amine cardiache. Un inibitore dell'assorbimento neuronale dell'amina (desipramina) ha causato solo un leggero abbassamento La combinazione di fentolamina e desipramina ha mostrato una notevole attività e questa azione è stata bloccata dal blocco gangliare.3 La clozapina ha avuto poca o nessuna azione nel bloccare l'assorbimento dell'amina, ma ha notevolmente potenziato il rilascio di amina causato dalla combinazione fentolamina-desipramina.4 Altri farmaci antipsicotici ( aloperidolo, clorpromazina, tioridazina) o altri agenti (propranololo, atropina) non hanno condiviso questa azione della clozapina.5 Blocco gangliare marcatamente ritardato rilascio di ammina indotto da somministrazione di reserpina. 6 Si suggerisce che la clozapina possa avere un effetto incompleto simile alla reserpina specificamente sul neurone adrenergico, facilitando il rilascio di ammina indotto dall'impulso.
La dipendenza dal pH dell'aggregazione piastrinica quantitativa indotta da ristocetina: implicazioni teoriche e pratiche: un nuovo dispositivo per il mantenimento del pH del plasma ricco di piastrine.Quantitativo L'aggregazione piastrinica indotta da ristocetina del normale plasma ricco di piastrine (PRP) è diminuita con il tempo dopo la preparazione del PRP. Un aumento del pH del PRP nel tempo si è dimostrato responsabile di questo risultato. La diffusione di CO2 dal plasma è il principale determinante del variazione del pH. Poiché una complessa combinazione di fattori influenza la diffusione della CO2 (rapporto superficie-volume, capping, miscelazione, ecc. ) La variazione del pH è variabile nel tempo. Pertanto, l'aggregazione quantitativa della ristocetina dovrebbe essere controllata dal pH. Un semplice dispositivo per mantenere costante il pH del PRP mediante il controllo della pCO2 ambiente è stato progettato e trovato efficace nel mantenere costante sia il pH che l'aggregazione quantitativa della ristocetina per un periodo di tempo prolungato. Può essere adattato per l'uso in studi di aggregazione piastrinica muore impiegando altri reagenti. La dipendenza dal pH dell'aggregazione piastrinica indotta da ristocetina è coerente con altri dati che supportano un'interazione elettrostatica tra piastrine, fattore di von Willebrand e ristocetina. Preferiamo un modello in cui la ristocetina neutralizza alcuni dei cambiamenti negativi delle piastrine e consente al fattore di von Willebrand di collegare siti su piastrine separate per indurre l'agglutinazione.
Studi sulla gamma-glutamil transpeptidasi negli eritrociti umani e di coniglio.La gamma-glutamil transpeptidasi trasferisce la frazione gamma-glutamil del glutatione a una varietà di accettori amminoacidi. Attraverso il funzionamento del ciclo gamma-glutamil-ciclotransferasi, questo enzima è stato implicato nel trasporto di amminoacidi nelle cellule, specialmente nelle cellule dei tubuli prossimali del rene. È stato segnalato per essere presente negli eritrociti di coniglio. Tuttavia, utilizzando preparazioni prive di globuli bianchi, non siamo stati in grado di dimostrare la presenza di gamma-glutamil transpeptidasi negli eritrociti umani o di coniglio né misurando l'utilizzo di GSH né seguendo la formazione del prodotto. utilizzato come amminoacido accettore, ed è stata seguita la formazione di gamma-glutamil-14C-L-metionina Utilizzando condizioni simili, siamo stati in grado di dimostrare la presenza di gamma-glutamil transpeptidasi nei leucociti umani e di coniglio e in h rene umano. Contrariamente a un rapporto precedente, non siamo stati in grado di trovare l'accumulo di 5-ossoprolina, un intermedio della via della gamma-glutamil-ciclotransferasi nei globuli rossi umani incubati nella soluzione di Krebs-Ringer. Studi immunologici hanno dimostrato che le membrane dei globuli rossi umani non contenevano proteine antigenicamente simili alla gamma-glutamil transpeptidasi renale. Pertanto i nostri studi hanno indicato che negli eritrociti umani e di coniglio la via gamma-glutamil transpeptidasi-ciclotransferasi non era operativa.
La determinazione spettrometrica gascromatografica di massa dell'acido trifluoroacetico in un fluido biologico. Applicazione al metabolismo dell'alotano.L'estere metilico dell'acido trifluoroacetico è stato preparato per reazione con N,N\'-dimetilformammide dimetilacetale ed è stato fatto passare con successo attraverso un gascromatografo. L'acido trifluoroacetico è stato rilevato mediante l'uso di gascromatografia e spettrometria di massa gascromatografica a bassa e alta risoluzione in un estratto acido di un mezzo di incubazione contenente microsomi, nicotinammide adenina ridotta dinucleotide fosfato, ossigeno e alotano. Tuttavia, l'acido trifluoroacetico non può essere rilevato quando la nicotinammide adenina dinucleotide o l'ossigeno sono stati omessi dal sistema di incubazione. Da questi risultati, è stato dimostrato che l'alotano viene metabolizzato ossidativamente in acido trifluoroacetico dai microsomi epatici.
[Influenza reciproca della reazione del trapianto contro l'ospite e della gravidanza].La reazione del trapianto contro l'ospite (GVHR) è stata indotta in femmine ibridi di topo F1 (CBA X C57BL/6) mediante iniezione endovenosa di sospensione delle cellule linfoidi della milza e dei linfonodi di femmine di topo C57BL/6. La gravidanza è risultata dall'incrocio delle femmine di prova con maschi singenici 1--5 giorni prima, e 1--10, 10--20, 30--40 e più di 40 giorni dopo il momento dell'iniezione di cellule linfoidi, ha aggravato la malattia da trapianto indotta da GVHR Allo stesso tempo il GVHR in queste condizioni ha diminuito la percentuale di animali gravidi e portato alla disfunzione fertile degli animali di prova (nati morti, morte di femmine gravide, aborto spontaneo). In alcuni dei topi di prova è stato osservato un aggravamento del GVHR dopo il parto. La sopravvivenza della progenie è diminuita.
Steroli marini. III--Le composizioni di steroli delle meduse oceaniche. L'uso di tecniche di spettrometria di massa gascromatografica per identificare i componenti irrisolti.Le composizioni di steroli di tre meduse oceaniche sono state determinate utilizzando tecniche di spettrometria di massa gascromatografica che prevedono l'uso di due sistemi gascromatografici separati di colonne. È stato scoperto che l'animale di mezz'acqua, Periphylla periphylla, contiene un profilo di steroli molto complesso e insolito che include rari 5alfa-stanoli, mentre altre due meduse oceaniche Pelagia noctiluca e Atolla wyvillei contenevano miscele simili di steroli delta5 a quelle precedentemente isolate dalle specie costiere.
Trapianto di tessuto linfoide intraepatico: decorso della reazione Gvh indotta dai cerotti di Peyer\'s.Indagare la competenza immunitaria timo-dipendente di Peyer\'s cerotti, il decorso della splenomegalia e l'infiltrazione perivascolare epatica (PVI) sono stati studiati come criteri di reazione del trapianto contro l'ospite (GvhR). I tessuti linfoidi parentali o ibridi F1, sono stati impiantati intraepaticamente e la capacità dei cerotti di Peyer\'s di indurre un GvhR è stato confrontato con quello della milza, dei linfonodi e del timo. Un lieve ma significativo aumento ritardato dell'indice di milza è stato osservato al 40° giorno postoperatorio dopo l'impianto dei cerotti di Peyer mentre il timo non ha indotto alcuna modifica di questo parametro. D'altra parte, il PVI è stato un criterio molto precoce e preciso nel monitoraggio della reazione Gvh indotta dai cerotti di Peyer e ha permesso di postulare che almeno una funzione delle cellule T sia presente all'interno dei cerotti di Peyer.
Attività adiuvanti e immunostimolanti di sostanze idrosolubili estratte da Mycobacterium tuberculosis (var. hominis).Da due ceppi sono state estratte sostanze idrosolubili di Mycobacterium tuberculosis var. hominis: la parte idrosolubile nativa (polisaccaride e peptidoglicano), sostanza in cui la frazione polisaccaridica è meno abbondante rispetto a quest'ultima, il peptidoglicano acetilato e, infine, un tetrasaccaride-eptapeptide. Tutti e quattro i tipi di sostanze, quando sono stati iniettati insieme all'adiuvante incompleto di Freund\'s, hanno esercitato un effetto adiuvante sulla produzione di ipersensibilità di tipo ritardato all'ovoalbumina nella cavia e sulla produzione di anticorpi anti-virus dell'influenza nel coniglio. Iniettati per via endovenosa nel topo, essi aumentato il numero di cellule che producono anticorpi nella milza e migliorato la reazione del trapianto contro l'ospite; nessun effetto è stato osservato sull'attività fagocitaria del reticolo-endotelio sistema. Al contrario della cera D, le sostanze idrosolubili erano prive di attività che induce l'artrite nel ratto. Complessivamente, queste sostanze idrosolubili sembrano essere dotate almeno di alcune delle attività adiuvanti dell'adiuvante completo di Freund e di alcune delle attività immunostimolanti di un micobatterio vivo come il BCG.
[Caratterizzazione di alcune attività idrolasiche nel succo digestivo di Achatina balteata].Il succo digestivo di Achatina balteata, una lumaca gigante della costa dell'Africa occidentale catalizza l'idrolisi di numerosi composti naturali e sintetici Attività enzimatiche su lattosio, o- e p-nitrofenil-beta-D-galattoside, p-nitrofenil-beta-D-glucoside, p-nitrofenil-beta-D (e alfa-L -) è stata dimostrata la presenza di fucoside, o-nitrofenil-beta-D-xiloside, p-nitrofenil-N-acetil-beta-D-glucosaminide e fenolftaleina-glucuronide L'effetto del pH e della concentrazione del substrato su queste attività è stato studiato Le attività della galattosidasi, della glucosidasi e della fucosidasi sono state studiate rispetto alla temperatura, all'inattivazione al calore, alla stabilità del pH e all'incubazione con tripsina Esperimenti cinetici suggeriscono la presenza di diverse attività di galattosidasi Questa ipotesi è confermata dalla colorazione specifica dopo elettroforesi su gel di poliacrilammide. un'ampia specificità verso galattosidi e glucosidi. Il succo digestivo non ha mostrato alcuna azione sugli esteri etilici dell'acetil-L-tirosina e della benzoil-L-arginina. Tuttavia è stata osservata una piccola attività proteasica sull'emoglobina. Non è stata trovata attività lipasica. Il contenuto di solfatasi era basso rispetto a quello di Helix pomatia.
[Purificazione e proprietà della decarbossilasi dell'aminoacido L-aromatico (4.1.1.28) del cervello di ratto].La decarbossilasi dell'aminoacido L-aromatico è stata purificata più di mille volte da omogenati di cervello di ratto, in più fasi: centrifugazione, DEAE-cellulosa, CM cellulosa, idrossiapatite, DEAE sephadex. Le sue proprietà sono state studiate, la maggior parte su una frazione intermedia della purificazione, a causa dell'instabilità del l'enzima purificato nonostante l'aggiunta di diversi agenti stabilizzanti: l'enzima decarbossila 5-idrossitriptofano (5 HTP) e DOPA in un rapporto costante durante tutta la purificazione ma non decarbossila triptofano, tirosina, istidina a una velocità misurabile. , Vm, sono stati misurati con 5 HTP e DOPA come substrati. L'enzima ha un peso molecolare di 115.000, un punto isoelettrico apparente di 6,4-6,5. E' inibito da serotonina, dopamina, alcuni cationi: Cu++, Fe++ , Ni++ da N-etilmaleimmide, sodio dode cilsolfato. Alcuni piridossal-5 fosfato (PLP) rimangono fortemente legati all'enzima. Per concentrazioni relativamente deboli di substrato, l'enzima è inibito da un eccesso di PLP; per deboli concentrazioni di PLP, l'enzima viene inibito da un eccesso di substrato, in particolare di DOPA. Si osserva inoltre una decarbossilazione spontanea dei substrati che raggiunge un plateau ed è potenziata da alte concentrazioni di PLP, da serotonina, dopamina, Cu++ e ridotta da mercaptoetanolo e dalla presenza di omogenati grezzi o bolliti. Vengono fornite diverse possibili spiegazioni della decarbossilazione spontanea e delle inibizioni enzimatiche da un eccesso di PLP e dai substrati.
[Interazioni degli analoghi della fosforiletanolammina con la fosforiletanolammina-citidylyltransferase].Sono stati condotti studi cinetici sull'etanolaminafosfato-citidylyltransferase (EC 2.7.7.14) dal fegato di ratto in presenza di analoghi strutturali dell'etanolaminafosfato : questi composti hanno agito da inibitori dell'enzima: - il 2-amminoetilfosfonato si è comportato come un substrato e un inibitore competitivo della fosforiletanolammina: il valore Km del 2-amminoetilfosfonato era quasi uguale al suo valore Ki, a pH = 5,5 (30 X 10 (-3) M e 24 x 10 (-3) M, rispettivamente). - Anche il 3-amminopropilfosfonato era un inibitore competitivo. Sembrava essere il miglior inibitore a pH ottimale (pH = 7,7). - L'1-amminoetilfosfonato si comportava come un inibitore non competitivo. Tuttavia, la citidililtransferasi era relativamente specifica, le inibizioni erano sempre deboli. Il potere inibitorio dei fosfonati era stimolato dal Mg++.
[Acido decanoico, nuovo precursore per la biosintesi in vitro dell'acido oleico da parte di una frazione subcellulare vegetale].Varie frazioni membranose preparate da un omogenato di cavolfiore sintetizzano acido oleico radioattivo quando vengono incubati in una soluzione di 14C-decanolato. La frazione più attiva è costituita da vescicole che sedimentano a 30.000 gx 20 mn (microsomi pesanti). Il precursore marcato viene trasformato da questa frazione principalmente in acido oleico e idrossiacidi. ATP, Per queste reazioni sono necessari NADPH, CoA e ossigeno. Gli acidi grassi marcati, più lunghi del laurico e (cioè gli acidi 14C-miristico, 14C-palmitico e 14C-stearico) non vengono trasformati in acido oleico dalla frazione subcellulare studiata in questo documento.
Possibile presenza di residui istidilici e cistelici nel centro catalitico del mitocondriale D (-)-beta-idrossibutirrato deidrogenasi di fegato di ratto.1. Fegato di ratto La D(-)-beta-idrossibutirrato deidrogenasi mitocondriale (particelle sottomitocondriali e preparato parzialmente purificato) è inibita da alcuni dicarbossilati, in particolare da malonato e succinato. L'inibizione è reversibile e competitiva con beta-idrossibutirrato mentre non competitiva con acetoacetato, NAD e NADH: la l'inibizione è massima a pH 6 e diminuisce all'aumentare del pH 2. Il dietilpirocarbonato (che reagisce preferenzialmente con i residui istidilici a pH 6,6) inattiva la deidrogenasi a pH 6,1, il beta-idrossibutirrato protegge dall'inattivazione, questa inattivazione essendo quasi completamente rilasciata dall'idrossilammina. L'enzima trattato con dietilpirocarbonato mostra un aumento dell'assorbanza a 242 nm che è caratteristico della reazione tra dietilpirocarbonato e residuo istidilico. Il pH ottimale dell'enzima per l'ossidazione del beta-idrossibutirrato è intorno a 8,2, mentre per la riduzione dell'acetoacetato il pH ottimale è intorno a 7. 4. Tutti questi risultati favoriscono l'esistenza di un residuo istidilico nel centro catalitico e tenendo conto dei precedenti risultati riguardanti l'effetto dei reagenti tiolici sullo stesso enzima e, soprattutto, l'effetto protettivo di NAD+ e NADH contro questi reagenti [11] discutiamo la possibile presenza di, almeno, un residuo istidilico e un residuo cistelico sul centro catalitico.
[Acetilcolinesterasi. II. Aspetti sperimentali dell'interazione con effettori reversibili in condizioni di elevata forza ionica].Interazione di effettori usuali con acetilcolinesterasi (EC 3.1 .1.7) da eritrociti bovini è stata esaminata in condizioni di elevata forza ionica (gamma/2 maggiore o uguale a 0,1) L'indagine cinetica dettagliata dell'idrolisi dell'acetilcolina da parte dell'acetilcolinesterasi in presenza di modificatori mostra che gli effetti prodotti da numerosi i composti azotati quaternari sull'enzima possono essere spiegati in base al legame degli effettori al sottosito anionico del centro attivo. I vari comportamenti cinetici, che si osservano, dipendono dai valori relativi della costante di velocità di deacetilazione ak del complesso modificatore dell'enzima acetilato e della costante di velocità k-2 definita da: (vedi articolo) rispetto al valore della costante di velocità di deacetilazione K dell'enzima acetilato. Se uguale a [1-- (k/k-2)]-1, si dimostra che l'interazione dell'enzima con ioni tetraetilammonio, pentametonio, esametonio e gallamina è caratterizzata da: a maggiore di a e k-2 maggiore di k quindi, questi modificatori accelerano la deacetilazione. D'altra parte, l'inibizione dell'acetilcolinestasi da parte di metilpiridinio, d-tubocurarina, tetra-n-propilammonio, tetra-n-butilammonio, decametonio e succinilbiscolina è compatibile con una delle condizioni: a minore di a e k-2 maggiore o uguale a k o a maggiore di a e k-2 minore di k e l'inibizione da parte degli ioni tetrametilammonio, feniltrimetilammonio, 3-idrossifenil-trietilammonio, N-metilacridinio e bis (3-amminopiridinio)-1,10-decano concorda con uno dei due condizioni precedenti o con : (vedi articolo) di conseguenza, l'effetto di questi ligandi sulla fase di deacetilazione è indeterminato. Tuttavia, gli effetti del cloruro di colina, del tiazinamio metil solfato e della tioridazina cloridrato non sono del tutto coerenti con questo meccanismo, ma supportano l'esistenza di un sito anionico periferico funzionale che è distinto dal sito anionico del centro attivo.
[Meccanismo di formazione del legame glutaraldeide-proteina].Le soluzioni acquose commerciali di glutaraldeide al 25% non contengono derivati stabili di questa aldeide, ma composti di variabile molecolare peso che ritorna facilmente a glutaraldeide. L'effetto del pH sulla reazione della glutarldeide con gli amminoacidi e sulla stabilità dei prodotti in condizioni acide, mostra l'importanza della modificazione della struttura della dialdeide che si verifica all'aumentare del pH, e porta addirittura a precipitazione in soluzioni altamente alcaline. Questo precipitato risulta dalla condensazione aldolica di molecole di glutaraldeide. Contiene gruppi aldeidici coniugati con doppi legami etilenici. Tale struttura reagisce con gruppi amminici per dare un legame imino, stabilizzato per risonanza con il legame etilenico, e non subiscono reazioni di addizione di tipo Michael. Pertanto, la glutaraldeide non reagisce con le proteine sotto forma libera, ma come un polimero insaturo, che dà legame imino s stabilizzato dalla coniugazione.
Captazione del fosfato in Chlorella pyrenoidosa: II. Effetto del pH e dei reagenti SH.La sensibilità del sistema di trasporto del fosfato a pCMPS dopo la carenza di fosfato è dipendente dalla sintesi proteica. Questo fatto è correlato allo sviluppo dell'attività di trasporto a pH alcalino. In cellule non affamate, è stata osservata la presenza di un solo picco di attività massima per l'assorbimento di fosfato a pH neutro (a bassa e alta concentrazione) Tuttavia, nelle cellule deprivate di fosfato, sono presenti due picchi di attività massima (a bassa concentrazione di fosfato) a pH neutro e alcalino Nelle cellule affamate, il pCMPS inibisce più intensamente l'attività di trasporto del fosfato a pH alcalino che a pH neutro. Il NEM inibisce il trasporto di fosfato più fortemente a pH neutro che a pH alcalino. L'assorbimento di fosfato a pH neutro e alcalino è sensibile allo shock osmotico, ma l'assorbimento di fosfato a pH alcalino è diminuito più che a pH neutro. I risultati potrebbero essere in interpretato o assumendo che l'ambiente della membrana cambi durante la carenza di fosfato o che due sistemi di trasporto siano presenti nelle cellule affamate mentre esiste un solo sistema di trasporto nelle cellule non affamate.
[Fosfolipasi A di membrana plasmatica di fegato di ratto].La fosfolipasi A2 di membrana plasmatica studiata in situ mostra una sensibilità molto ridotta alle variazioni di pH; la concentrazione ottimale per Ca++ è 5 mM , la cinetica enzimatica è di tipo Michaelis Esiste uno stato inattivo della fosfolipasi A2 : quando i ratti vengono iniettati con eparina, le loro membrane plasmatiche contengono un'attività fosfolipasi A2 molto bassa. Queste membrane recuperano un'elevata attività A2 se vengono incubate in presenza di un lisato di piastrine di ratto Il trattamento delle membrane con NaCl 1 M spiazza la fosfolipasi A1 e la fosfolipasi A2 ma per quest'ultima solo quando è in stato attivo Il trattamento degli animali, le condizioni di preparazione e di incubazione delle membrane influenzano le rispettive quantità di fosfolipasi A1 e A2 presenti in queste membrane e sono discusse in questo articolo La localizzazione di queste proteine enzimatiche all'interno della membrana secondo il modello membranoso proposto da Singer e t al. [18] è anche discusso.
Purificazione completa e studi sulle proprietà strutturali e cinetiche di due forme di lievito valyl-tRNA sintetasi.Due forme di baker\'s yease valyl- La tRNA sintetasi è stata purificata ad apparente omogeneità con metodi classici. È stato dimostrato che una delle due forme dell'enzima origina dall'altra per proteolisi, le rispettive quantità di ciascuna forma dipendono dallo stato fisiologico del lievito. Le specie principalmente isolate da cellule di lievito a crescita esponenziale è un monomero di 130.000 dalton di peso molecolare Nelle cellule in fase stazionaria o nel lievito commerciale la specie principale è un monomero degradato di 120.000 dalton di peso molecolare, tuttavia quando la purificazione viene effettuata in presenza di fenilmetil-solfonil fluoruro , o diisopropilfluorofosfato si possono ottenere grandi quantità del monomero non degradato Di grande utilità pratica è il fatto che si possono ottenere grandi quantità dell'enzima nativo puro af ter solo due passaggi cromatografici su DEAE-cellulosa e idrossiapatite. Sono state determinate le costanti cinetiche per valina, ATP e tRNAVal, nonché le condizioni ottimali di aminoacilazione. Si è riscontrato che l'attività specifica della valil-tRNA sintetasi non degradata è superiore a quella dell'enzima proteolizzato per la reazione di amminoacilazione. Al contrario, entrambe le forme hanno la stessa attività di scambio ATP-piroposfato. È stata stabilita la composizione in amminoacidi dell'enzima nativo. Sono state studiate le impronte triptiche delle due valyl-tRNA sintetasi. Sono state ottenute mappe sostanzialmente simili. Il numero delle macchie nelle impronte digitali indica che gli enzimi contengono un'alta percentuale di sequenze ripetute.
17 beta-idrossisteroide deidrogenasi dell'ovaio di pecora: purificazione, proprietà e sito di legame del substrato.La 17 beta HSDH dell'ovaio di pecora è stata purificata circa 1000 volte ad un'attività specifica di 0,5 IU/mg di proteina, utilizzando la cromatografia su cellulosa DEAE, la cromatografia di affinità su estrone-amino caproato-Sefarosio e una seconda cromatografia su cellulosa DEAE Il peso molecolare è 70.000, il pH ottimale per l'attività è 9,2 e l'energia di attivazione è 16,5 Kcal/mole. La cinetica dell'ossidazione dell'estradiolo e di molti analoghi è stata studiata a varie concentrazioni e in presenza di differenti quantità di coenzima. I dati sono in accordo con un meccanismo di ordine obbligatorio con il legame di NAD+ come primo substrato. L'ovaio di pecora 17 beta HSDH accetta sottotitoli in posizione C3, C11, C13 ; il sito di legame del substrato è aperto in questa regione. Al contrario, i requisiti di legame sono rigorosi per la regione di C10 poiché la presenza o f un gruppo metilico C19 altera il legame e (o) l'ossidazione dello steroide. L'ovaio di pecora e la placenta umana 17 beta HSDH hanno strette analogie: peso molecolare, pH ottimale, requisiti del sito di legame del substrato. I loro meccanismi di reazione sono diversi: casuale per il 17 beta HSDH placentare, ordine obbligatorio per il 17 beta HSDH ovarico: questo può essere spiegato dall'effetto del coenzima sul legame del substrato: senza effetto sull'enzima placentare, la fissazione del coenzima aumenta l'affinità dell'ovaio 17 beta HSDH per qualsiasi substrato.
Modelli eme. I. Comportamento in soluzione di una porfirina di ferro solubile in acqua.Un sistema ferro-porfirina solubile in acqua, meso-tetra- (4-carbossifenil) porfinato ferro (III) è stato sintetizzato. Il suo comportamento in soluzione è descritto utilizzando la spettroscopia di risonanza paramagnetica (EPR) visibile ed elettronica. Il complesso esiste in soluzione come tre forme distinte di dimeri a ponte, oxo, idrossi e aquo, con la seguente pK\'s: oxo + H+ in equilibrio idrossido, pK = 9,58; idrossido + H+ in equilibrio aquo, pK = 6,72. In presenza di un eccesso di imidazolo il secondo pK risulta essere 7,05. Analisi dettagliata dell'interazione di viene presentata la forma a ponte idrossido con imidazolo Si scopre che un'unità dimerica lega contemporaneamente due molecole di imidazolo, con una costante di equilibrio complessiva log Keq = -1,22. Gli spettri EPR sono presentati per le varie forme di ferro-porfirina discusse.
Flusso di piruvato in fantasmi risigillati da eritrociti umani.La cinetica del trasporto del piruvato attraverso la membrana isolata dei globuli rossi è stata studiata mediante uno spettrofotometro semplice e preciso metodo: in seguito all'ossidazione di NADH tramite lattato deidrogenasi intrappolata all'interno di fantasmi risigillati. La velocità iniziale di ingresso del piruvato era lineare. L'afflusso era limitato dalla saturazione ad alta concentrazione di piruvato. L'afflusso di piruvato era fortemente stimolato dall'aumento della forza ionica nell'esterno ma non nell'interno compartimento acquoso Il Km variava da 15,0 mM a mu = 0,05 a 3,7 mM a mu = 0,01, mentre il V andava da 0,611 - 10(15) a 0,137 - 10(-15) mol - min-1 - ghost- 1. È stato dimostrato che la forza ionica influisce sulla fase di traslocazione e non sul legame del piruvato. L'energia di attivazione del flusso di piruvato nei fantasmi risigillati era di 25 kcal/mol, simile a quella trovata nei globuli rossi intatti. Gli inibitori dell'afflusso di piruvato includevano anioni come tiocianato, cloruro ide, bicarbonato, alfa-cianocinnamato, salicilato e chetomalonato (ma non acetato); gli inibitori non competitivi erano floretina, 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene, 4-acetamido-4\'-isotiocianato-stilbene-2,2\'-acido disolfonico e miscele di o-fenantrolina/CuSO4. L'ultimo reagente, noto per indurre legami disolfuro in alcune proteine di membrana, ha bloccato la stimolazione della forza ionica dell'afflusso di piruvato in questo studio.
L'assorbanza a 520 nm cambia in Scenedesmus obliquus e la sua relazione con il fotosistema I.La cinetica (regione dei secondi) dei 520 nm indotti dalla luce le variazioni di assorbanza e la sua dark reversal sono state studiate in dettaglio nel wild type e in alcuni pigmenti e mutanti fotosintetici di Scenedesmus obliquus Le seguenti 5 linee di evidenza ci hanno portato a concludere che il segnale è interamente dovuto alla reazione del fotosistema I modificata dall'elettrone flusso dal Fotosistema II. Il blocco graduale del trasporto degli elettroni con 3(3,4-diclorofenil)-1,1-dimetilurea ha portato alla diminuzione e alla definitiva eliminazione della natura bifasica del segnale senza ridurre l'entità della variazione di assorbanza o del cinetica del buio Al contrario, bloccando il flusso di elettroni sul lato ossidante del plastochinone con 2,5-dibromo-3-metil-6-isoprophyl-p-benzochinone o inattivando la plastocianina con KCN, prolungava l'inversione del buio del cambiamento di assorbanza da abo la natura bifasica del segnale. Gli spettri di azione indicano chiaramente che il segnale principale (I) è dovuto al flusso di elettroni nel Fotosistema I e che la sua modifica (Segnale II) è dovuta all'azione del Fotosistema II. Il segnale I è indipendente dal pH, mentre il segnale II mostra una forte dipendenza dal pH, parallela alla capacità di evoluzione dell'O2 delle cellule. Le particelle di cloroplasto isolate dalle cellule di Scenedesmus wild type hanno dimostrato in assenza di qualsiasi donatore o accettore di elettroni artificiali aggiunto e anche in condizioni di non fosforilazione, l'assorbanza di 520 nm cambia con approssimativamente la stessa ampiezza delle cellule intere. La cinetica oscura delle particelle era relativamente più lenta. La rimozione della plastocianina e di altri portatori di elettroni mediante lavaggio con Triton X-100 ha rallentato in misura maggiore la cinetica della reazione di inversione del buio. Una simile variazione positiva dell'assorbanza a 520 nm e una lenta inversione del buio è stata osservata anche nelle particelle del fotosistema I preparate con il metodo Triton. Il mutante C-6E, che non contiene né carotenoidi né clorofilla b e manca di attività del fotosistema II, mostra un normale segnale I del cambiamento di assorbanza di 520 nm. Quest'ultimo risultato contraddice il postulato che i carotenoidi siano la possibile causa del cambiamento di assorbanza di 520 nm.
L'accumulo di radicale superossido durante l'azione aerobica della xantina ossidasi. Un requiem per H2O4.L'azione della xantina ossidasi sull'acetaldeide o sulla xantina a pH 10.2 ha dimostrato di essere accompagnato da un sostanziale accumulo di O2- durante i primi minuti della reazione. H2O2 riduce questo accumulo di O2- presumibilmente a causa della reazione di Haber-Weiss (H2O2+O2- porta a OH- +OH+O2 ) e piccolissime quantità di superossido dismutasi lo eliminano. Questo accumulo di O2- è stato dimostrato in termini di burst di riduzione del citocromo c, visto quando quest'ultimo composto è stato aggiunto dopo preincubazione aerobica della xantina ossidasi con il suo substrato. Le peculiarità cinetiche di la luminescenza osservata in presenza di luminol, che in precedenza ha portato alla proposta di H2O4-, può ora essere spiegata in modo soddisfacente interamente sulla base di noti radicali intermedi.
Evidenza contro la formazione di gradienti di protoni che è la causa dell'estinzione della fluorescenza della clorofilla da parte del metosolfato di N-metilfenazonio.In forte illuminazione, 3-(3, 4-) I cloroplasti avvelenati da diclorofenil)-1,1-dimetilurea (DCMU) mostrano un'elevata resa di fluorescenza della clorofilla mentre il turnover del P-700, l'assorbimento del protone e la fosforilazione sono inibiti e un gradiente di pH non è rilevabile. Quando 10muM N-metilfenazonio metosolfato (PMS) è incluso, la resa della fluorescenza in luce è sostanzialmente ridotta, e quando è incluso anche 100 muM di ascorbato, la resa è diminuita approssimativamente al livello nell'oscurità. Solo lievi aumenti nel turnover del P-700 e nell'assorbimento del protone (ma nessun gradiente di pH rilevabile ) accompagnano il declino della resa della fluorescenza. Quando 10muM PMS e 15 mM di ascorbato vengono aggiunti ai cloroplasti avvelenati (la concentrazione di ossigeno viene notevolmente ridotta), il turnover del P-700, l'assorbimento di protoni, il gradiente di pH e la fosforilazione raggiungono tutti livelli elevati. in questo caso, la resa della fluorescenza della clorofilla è bassa ed è la stessa sia alla luce che al buio. L'ulteriore aggiunta di un disaccoppiatore elimina l'assorbimento del protone, il gradiente di pH e la fosforilazione, ma non aumenta significativamente la resa della fluorescenza. Da queste osservazioni suggeriamo che, nei cloroplasti avvelenati da DCMU, l'estinzione della fluorescenza con PMS avviene tramite un meccanismo non correlato alla generazione di un potenziale di fosforilazione. Con i cloroplasti non avvelenati da DCMU, la PMS estingue la fluorescenza e stimola notevolmente l'assorbimento di protoni, il gradiente di pH e la fosforilazione. Tuttavia, in questo caso, la PMS serve a ripristinare il trasporto netto di elettroni.
Il fattore di accoppiamento della fotofosforilazione e le proprietà elettriche della membrana tilacoide.La velocità di sintesi dell'ATP dei cloroplasti illuminati è correlata alla conduttanza elettrica di loro membrane interne. In accordo con studi precedenti è dimostrato che la sintesi di ATP è accompagnata da un aumento della conduttanza della membrana tilacoide. Questa conduttanza insieme alla capacità di formare ATP viene abolita se i cloroplasti vengono trattati con un anticorpo contro il fattore di accoppiamento CF1. Non è influenzato dall'anticorpo monovalente frammentato. Ciò è parallelo alla mancanza di influenza dell'anticorpo frammentato sulla sintesi di ATP in contrasto con la sua influenza sull'idrolisi e sulle reazioni di scambio. Concludiamo che ci sono diversi siti per l'interazione del fattore di accoppiamento con l'adenina nucleotidi. L'estrazione del fattore di accoppiamento è mostrato per aumentare la conduttanza della membrana di più di due ordini di grandezza. Reincorporazione di th Il fattore di accoppiamento grezzo ripristina parzialmente la conduttanza netta della membrana (aumento della resistenza di un fattore 2,5), mentre è stato osservato un grado di ripristino più elevato per la sintesi di ATP e la conduttività protonica della membrana. Concludiamo che la procedura di estrazione apre diversi canali conduttivi nella membrana; uno specifico protone, eventualmente associato alla proteina legante per il fattore di accoppiamento, più altri canali per "non-protoni" che, contrariamente al canale protonico, non possono essere tappati mediante reincorporazione del fattore di accoppiamento.
L'effetto del formiato sul citocromo aa3 e sul trasporto di elettroni nella catena respiratoria intatta.1. Il formiato inibisce l'attività della citocromo c ossidasi sia nei mitocondri intatti e particelle subcondriali, e nel citocromo aa isolato 3. L'inibizione aumenta con la diminuzione del pH, indicando che HCOOH può essere la specie inibitoria 2. Il formiato induce uno spostamento verso il blu nello spettro di assorbimento del citocromo ossidato aa3 (a3 + a33+) e nella metà -specie ridotte (a2 + a33+). Il confronto con gli spostamenti spettrali indotti da cianuro, verso il rosso, indica che formiato e cianuro hanno effetti opposti sullo spettro aa3, sia nello stato completamente ossidato che in quello semi-ridotto. Gli spettri del formiato forniscono un nuovo metodo per ottenere lo spettro differenza di a32+ meno a33+, esente dalle difficoltà con il cianuro (che induce marcati high porta a bassi spostamenti spettrali di spin nel citocromo a33+) e azide (che induce spostamenti di picco del citocromo a2+ verso t lui blu in entrambe le regioni alfa e Soret). 3. La velocità di dissociazione del formiato dal citocromo a2+ a33+ -HCOOH è più veloce della velocità di dissociazione da a3+ a33+ -HCOOH, specialmente in presenza del citocromo c. Il Ki per l'inibizione della respirazione con il formiato è una funzione dello stato di riduzione del sistema, che varia da 30 mM (riduzione al 100%) a 1 mM (ossidazione al 100%) a pH 7,4, 30 gradi C. 4. Succinato-citocromo c reduttasi l'attività è inibita anche dal formiato, in una reazione competitiva con il succinato e dipendente dal [formato]2. 5. L'inibizione del formiato dell'ascorbato più l'ossidazione di N, N, N\', N\'-tetrametil-p-fenilendiammina da parte dei mitocondri intatti di fegato di ratto è parzialmente rilasciata mediante l'aggiunta di un disaccoppiatore. Il formiato è permeabile attraverso la membrana mitocondriale interna e non sono state osservate differenze nei tassi di inibizione \'on\' o \'off\' quando i mitocondri intatti sono stati confrontati con le particelle submitocondriali. 6. L'attività della NADH-citocromo c reduttasi non è influenzata dal formiato nelle particelle submitocondriali, ma l'ossidazione mitocondriale di glutammato più malato è soggetta sia all'inibizione terminale a livello del citocromo aa3 sia a una lenta inibizione extra da parte del formiato dopo l'aggiunta del disaccoppiatore, indicando un terzo sito di azione formata nel mitocondrio intatto.
Stimolazione dell'ossidazione indotta dal fotosistema I del cloroplasto citocromo b-559 mediante preilluminazione e a pH basso.(1) La proporzione di cloroplasto vegetale citocromo b-559 ossidabile durante l'illuminazione con luce a bassa intensità 732 nm aumenta quando il pH scende al di sotto di 6,5 A pH 5,0-5,3 si osserva l'ossidazione totale e la successiva luce rossa può causare una riduzione fino a 2/3 del citocromo ossidato L'ossidazione da luce rossa di gran lunga a pH 5 è inibita da 2 muM 2,5-dibromo-3-metil-6-isopropil-ro-benzochinone mentre la riduzione indotta da luce rossa è inibita da 3-(3,4-diclorofenile )-1,1-dimetilurea. In questo intervallo di pH il citocromo ferricianuro-ossidato b-559 esiste in una forma non riducibile dal ferrocianuro. (2) Un aumento dell'ampiezza dell'ossidazione indotta dal rosso lontano si verifica anche a pH più elevati (fino a pH 7,8) dopo il pretrattamento dei cloroplasti con livelli di luce sostanzialmente più elevati (circa 10(6) ergs-cm-2-s-1). Il grado di attivazione della luce è Dipendente dal pH, essendo più pronunciato a pH più basso. Dopo l'attivazione della luce, il citocromo b-559 può essere completamente ossidato dalla luce rossa in modo reversibile dalla luce rossa fino a valori di pH di 6, e la curva che descrive l'ampiezza dell'ossidazione del rosso lontano in funzione del pH è spostata di 0,5-1,0 unità di pH verso un pH più alto. L'ossidazione del far-red e la riduzione della luce rossa sono nuovamente inibite rispettivamente dal 2,5-dibromo-3-metil-6-isopropil-p-benzochinone e dal 3-(3,4-diclorofenil)-1,1-dimetilurea. (3) L'attivazione della luce a pH 5,2-6,0 si manifesta anche in una piccola diminuzione dell'ampiezza della successiva riduzione del ferrocianuro scuro, e questa diminuzione è inibita dalla 3-(3,4-diclorofenil)-1,1-dimetilurea (10 muM ). (4) Viene discusso l'effetto dell'acidità intramembrana sul potenziale redox effettivo del citocromo b-559 e sulla sua funzione.
Purificazione di molteplici forme di adenosina deaminasi dall'intestino di coniglio.Due forme di adenosina deaminasi (adenosina aminoidrolasi, EC 3.5.4.4), che differiscono per molecolare dimensione, sono stati purificati ed ottenuti in forma omogenea dall'intestino di coniglio. Le procedure di purificazione hanno previsto estrazione con tampone acetato, pH 5,5, precipitazione e riestrazione frazionata con (NH4)2SO4, cromatografia a scambio ionico su DEAE-cellulosa e gel filtrazione su Sephadex G -75 e Sephadex G-200. L'analisi delle filtrazioni su gel ha fornito stime del peso molecolare di 265 000 e 32 000 rispettivamente per le deaminasi grandi e piccole. Le due forme di enzimi avevano valori di pH ottimali e di stabilità del pH simili.
Catepsine B1 da membrane fetali umane.Le catepsine B1 (EC 3.4.22.1) sono state isolate dalle membrane fetali della placenta umana, cioè amnion e corion- decidua. La purificazione degli enzimi è stata ottenuta mediante la tecnica del congelamento-scongelamento, il frazionamento del solfato di ammonio e la filtrazione su gel di Sephadex. La catepsi B1 separata dall'amnio o dal corion-decidua ha mostrato un'attività ottimale a pH 6,2 e una temperatura ottimale tra 42-45 gradi C. Sono stati inibiti da metalli pesanti e composti che reagiscono con i gruppi tiolici. La focalizzazione isoelettrica ha dimostrato tre isoenzimi della catepsina B1 originati dal corion-decidua, mentre è stata trovata solo una banda per l'enzima dall'amnio.
Proprietà della principale carbossipeptidasi nelle larve della Tineola bisselliella.Le larve della Tineola bisselliella contengono due carbossipeptidasi (EC 3.4.12-) e uno di questi è stato purificato mediante elettroforesi preparativa su gel di poliacrilammide. Il suo pH ottimale per l'idrolisi della N-benzilossicarbonil-glicil-leucina era pH 7,5-7,7 e il suo peso molecolare come giudicato dalla filtrazione su gel era 72 000. È fortemente inibito dal disopropilfluorofosfato, dai reagenti tiolici e da alcuni cationi metallici e anche dalla fenantrolina 1:10 ma non dall'EDTA. Sono stati determinati i valori di Km e V per l'idrolisi di 13 N-acil dipeptidi. L'enzima ha una forte preferenza per residui di amminoacidi alifatici neutri e non idrolizza prolina C-terminale, arginina o lisina È una vera carbossipeptidasi, richiede un L-amminoacido in posizione C-terminale, con un gruppo carbossilico libero e substrati peptidici idrolizzanti consecutivamente dall'estremità C-terminale. I dipeptidi vengono scissi molto più lentamente dei tripeptidi o degli N-acil dipeptidi.
Alfa-fucosidasi umana. Forma enzimatica residua singola in fucosidosi.Quattro forme principali di attività alfa-fucosidasi (EC 3.2.1.51) sono state separate da isoelettrofocalizzazione da sieri di soggetti normali di controllo. Tutte le forme si sono spostate verso valori di pI meno acidi dopo il trattamento con neuraminidasi. In due pazienti affetti da fucosidosi, è stato osservato un solo picco acido maggiore e questo è stato influenzato in misura minore dal trattamento con neuraminidasi. La cinetica di l'inattivazione al calore dell'attività residua riscontrata in questi due pazienti ha mostrato due tassi di decadimento mentre i controlli hanno mostrato un solo tasso. Questi dati sono considerati in relazione all'ipotesi dell'esistenza di forme interconvertibili termolabili e termostabili dell'enzima di cui si è discusso nel carta precedente. L'alfa-fucosidasi residua trovata nei pazienti potrebbe essere strutturalmente alterata in modo che la sua capacità di formare gli aggregati termostabili di peso molecolare più elevato sia compromessa.
Separazione di due PZ-peptidasi dal follicolo dentale bovino.Due PZ-peptidasi (EC 3.4. -) (A e B) che scindono un substrato per collagenasi, 4-fenilazobenzilossicarbonil-L-Pro-L-Leu-Gly-L-Pro-D-Arg (PZ-peptide) sono stati separati dalla frazione particellare del follicolo dentale bovino. PZ-peptidasi A aveva un peso molecolare di 220.000, un pH ottimale a 8,0-8,5 e un valore Km di 67 muM verso il peptide PZ a pH 7,1, mentre la PZ-peptidasi B aveva un peso molecolare di 20 000, un pH ottimale a 6,5-6,7 e un Valore Km di 400 muM verso il peptide PZ a pH 7,1. Dalla frazione solubile sono stati isolati anche due enzimi simili, poiché la curva pH-attività delle preparazioni tissutali grezze come l'omogenato, i microsomi e il surnatante solubile aveva due picchi a 6,5-6,7 e 8.0-8.5, sia la PZ-peptidasi A che la B possono esistere in situ come due enzimi attivi indipendenti.
Attività dell'acido ascorbico-2-solfato solfoidrolasi dell'arilsolfatasi umana A.È stato riscontrato che l'arilsolfatasi A umana pura (EC 3.1.6.1) idrolizza l'acido ascorbico 2-solfato ad acido ascorbico e solfato inorganico a tassi da 200 a 2000 mumol/mg per h a seconda del metodo di dosaggio. Questo tasso era inferiore a quello osservato con il substrato sintetico 4-nitrocatecolo solfato, ma superiore a quello osservato con il substrato fisiologico cerebroside solfato. È stato anche dimostrato che estratti di fibroblasti coltivati da soggetti normali idrolizzano l'acido ascorbico 2-solfato; estratti di fibroblasti da pazienti con leucodistrofia metacromatica, notoriamente carenti di arilsolfatasi A, no. Analogamente, l'idrolisi dell'acido ascorbico 2 -solfato non è stato osservato quando una preparazione parzialmente purificata di arilsolfatasi umana è stata testata in una varietà di condizioni. Quindi, nell'uomo, l'arilsolfatasi A sembra essere il principale, se non l'unico, solfoidro acido ascorbico-2-solfato alia.
Forme multiple di fosfodiesterasi di nucleotidi ciclici nell'epidermide di maiale.Le fosfodiesterasi di nucleotidi ciclici epidermici di maiale (EC 3.1.4.16) sono state parzialmente purificate da DEAE-cellulosa cromatografia su colonna. Sono state identificate almeno tre diverse forme delle fosfodiesterasi epidermiche: erano GMP cicliche-specifiche, GMP-ciclico e AMP-idrolizzante e apparentemente un enzima ciclico AMP-specifico: le prime due forme erano solubili e l'ultima era la enzima particolato La frazione solubile specifica per GMP ciclico aveva un Km relativamente basso, la frazione idrolizzante di GMP ciclico e AMP ciclico aveva un Km elevato per i rispettivi substrati e il terzo enzima particolato aveva valori di Km sia alti che bassi per l'AMP ciclico. L'enzima ciclico di idrolisi del GMP è stato localizzato quasi interamente nella frazione solubile, mentre l'enzima ciclico di idrolisi dell'AMP è stato distribuito sia nella frazione solubile che in quella particellare, quindi i nostri studi mostrano che le molteplici forme di maiale Gli enzimi epidermici differiscono nettamente nell'affinità del substrato, nella specificità e nella distribuzione subcellulare.
Rimozione di gruppi fosfato dalla caseina con fosfatasi acida di patata.La fosfatasi acida di patata (EC 3.1.3.2) è stata utilizzata per rimuovere gli otto gruppi fosfato da alphas1-caseina A differenza della maggior parte delle fosfatasi acide, che sono attive a pH 6,0 o inferiore, la fosfatasi acida della patata può catalizzare la defosforilazione dell'alfas1-caseina a pH 7,0 Sebbene l'inibizione del fosfato sia considerevole (K1=0,42 mM fosfato), il fosfato Gli ioni prodotti dalla defosforilazione della caseina possono essere rimossi mediante dialisi, consentendo il completamento della reazione. L'alfas1-caseina defosforilata è omogenea all'elettroforesi su gel con una mobilità più lenta rispetto all'alfas1-caseina nativa e ha una composizione amminoacidica identica a quella alfa-caseina nativa 1. Quindi la rimozione dei gruppi fosfato dalla caseina non altera la sua struttura primaria. La fosfatasi acida della patata ha anche rimosso i gruppi fosfato da altre fosfoproteine, come la beta-caseina, la proteina legante la riboflavina, pepsinogeno, ovoalbumina e fosvitina.
Presenza e controllo androgeno di una fosfatasi alcalina nel nucleo della prostata ventrale di ratto.La presenza dell'attività della fosfatasi alcalina (EC 3.1.3.1) ha è stata dimostrata nei nuclei della prostata ventrale di ratto. Questa attività enzimatica è rimasta dopo lavaggio dei nuclei isolati con 0,5% Triton X-100; una fosfatasi acida inizialmente presente con la frazione nucleare è stata rimossa da questo trattamento. La fosfatasi alcalina nucleare, esaminata utilizzando p -nitrofenilfosfato come substrato, aveva un pH ottimale di 9,5-10,3 e un'ampia specificità di substrato: p-nitrofenilfosfato maggiore della fosfotreonina maggiore del beta-glicerofosfato maggiore della fosfoserina La fosfatasi nucleare era sensibile alla denaturazione da trattamenti termici o con urea e è stato anche inibito da Pi, L-fenilalanina, omoarginina, ditiotreitolo ed EDTA. L'enzima inibito dall'EDTA è stato riattivato al massimo da Zn2+, sebbene Mg2+ o Ca2+ fossero efficaci anche a c oncentrazioni. L'orchiectomia di ratti adulti ha determinato un aumento dell'attività della fosfatasi alcalina nucleare (2-3 volte dopo 24 o 48 ore dopo l'orchiectomia). Un calo del rapporto proteine: DNA si è verificato anche dopo l'orchiectomia, ma l'aumento dell'attività specifica della fosfatasi era evidente sia che si esprimesse per unità di proteina sia per unità di DNA. La sostituzione del testosterone dopo l'orchiectomia ha abolito l'aumento dell'attività della fosfatasi nucleare. I risultati suggeriscono che la fosfatasi alcalina nucleare prostatica può essere coinvolta in eventi legati all'inattivazione del nucleo prostatico a seguito di deprivazione androgenica.
Uno studio ESR sull'influenza di alcuni fattori fisico-chimici sulla conformazione di un'acetilcolinesterasi postsinaptica.1. In un precedente studio ESR di un acetilcolinesterasi di membrana (EC 3.1.1.7) abbiamo trovato, contrariamente alle osservazioni di altri autori, spettri indicanti che la serina attiva potrebbe essere localizzata in una tasca della superficie dell'enzima. Per indagare su questa possibilità, sono stati studiati spettri ESR sotto l'influenza di diversi fattori fisico-chimici noti per causare un dispiegamento delle proteine 2. La serina attiva dell'acetilcolinesterasi di membrana postsinaptica dell'organo elettrico Torpedo marmorata è stata marcata mediante spin usando 1-ossil-2, 2, 6, 6-tetrametil-4-piperidiniletossifosfonofluoridato 3. L'effetto dei fattori fisico-chimici scelti è stato un aumento della libertà di rotazione delle etichette di spin; questo risultato conferma l'ipotesi che il centro attivo della nostra preparazione di acetilcolinesterasi si trovi in una tasca.
Studi su una 3beta-idrossisteroide sulfotransferasi dal fegato di ratto.Una sulfotransferasi steroidea (EC 2.8.2.2) è stata parzialmente purificata dal fegato di ratto femmina. l'enzima era attivo nei confronti dei substrati, deidroepiandrosterone, epiandrosterone e pregnenolone ma era inattivo nei confronti di estrogeni, colesterolo ed ergocalciferolo. È stato registrato un pH ottimale di 5,0 ma l'enzima era instabile a pH basso. L'enzima è stato leggermente stimolato con l'aggiunta di agenti riducenti e inibito da p-cloromercuribenzoato e HgCl2. L'attività enzimatica grezza è stata notevolmente stimolata da cationi bivalenti ma questo effetto non è stato osservato con l'enzima purificato. È stato calcolato un Km di 13 muM per il substrato donatore 3\'-fosfoadenil solfato e il substrato accettore, deidroepiandrosterone aveva un valore Km di 6 muM. L'enzima sembrava essere altamente suscettibile all'inibizione del prodotto da parte dell'adenosina 3\', 5\'-difosfato.
Formazione di disolfuro indotta da denaturazione nell'enzima rodanese.L'effetto dei denaturanti sulla quantificazione dei gruppi sulfidrilici liberi nell'enzima rodanese (tiosolfato sulfurtransferasi, EC 2.8.1.1) è stato riesaminato in dettaglio. Il saggio sulfidrilico con il reagente colorimetrico 5, 5\'-ditio-bis (acido 2-nitrobenzoico) Nbs2 mostra quattro gruppi sulfidrilici per molecola di enzima (mol. 32 300) quando il reagente colorimetrico viene aggiunto alla miscela del saggio prima del denaturante, sodio dodecil solfato. D'altra parte, si osservano solo due gruppi sulfidrilici per molecola quando si aggiunge Nbs2 dopo l'inizio della denaturazione. La dipendenza dal tempo osservata in quest'ultima procedura indica che la perdita dei due gruppi è rapida e permanente. I risultati dipendono dal denaturante utilizzato: l'urea si comporta come il sodio dodecilsolfato mentre la guanidina rivela quattro gruppi sulfidrilici indipendentemente dall'ordine dei reagenti. Il saggio fornisce anche quattro solfidrilici l gruppi indipendenti dall'ordine dei reagenti. Il saggio fornisce anche quattro gruppi sulfidrilici indipendenti dall'ordine dei reagenti con urea o sodio dodecil solfato in condizioni che dovrebbero limitare l'ossidazione catalizzata da ioni metallici dei gruppi sulfidrilici (ad esempio esclusione dell'ossigeno o chelazione di ioni metallici). Recenti studi hanno dimostrato che il rodanese ha un peso molecolare di 32 600, nessun disolfuro e quattro gruppi sulfidrilici per molecola. Questi risultati insieme alle osservazioni qui riportate sono presi per indicare che un disolfuro può formarsi durante la denaturazione del rodanese e che il percorso di denaturazione determina il risultato ottenuto.
Studi cinetici comparativi sulla piruvato chinasi di tipo L dal fegato di ratto e sull'enzima fosforilato dalla proteina chinasi ciclica 3\', 5\'-stimolata da AMP.La cinetica della piruvato chinasi di tipo L del fegato di ratto (EC 2.7.1.40), fosforilata con proteina chinasi stimolata da AMP ciclico dalla stessa fonte, e l'enzima non fosforilato sono stati confrontati. Gli effetti del pH e varie concentrazioni di sono stati studiati substrati, Mg2+, K+ e modificatori In assenza di fruttosio 1, 6-difosfato a pH 7,3, la piruvato chinasi fosforilata sembrava avere una minore affinità per il fosfoenolpiruvato (K0,5=0,8 mM) rispetto all'enzima non fosforilato (K0.5=0.3 mM). L'attività enzimatica rispetto alla curva di concentrazione del fosfoenolpiruvato era più sigmoidale per l'enzima fosforilato con un coefficiente di Hill di 2,6 rispetto a 1,6 per l'enzima non fosforilato. Il fruttosio 1, 6-difosfato ha aumentato l'affinità apparente di entrambe le forme enzimatiche per la fosfoenolpir uvato. A concentrazioni saturanti di questo attivatore, la cinetica di entrambe le forme enzimatiche è stata trasformata approssimativamente nella stessa curva iperbolica, con un coefficiente di Hill di 1,0 e K0,5 di circa 0,04 mM per il fosfoenolpiruvato. L'apparente affinità dell'enzima per il fruttosio 1, 6-difosfato era elevata a 0,2 mM di fosfoenolpiruvato con un K0,5=0,06 muM per la piruvato chinasi non fosforilata e 0,13 muM per l'enzima fosforilato. Tuttavia, in presenza di 0,5 mM alanina più 1,5 mM ATP, per l'attivazione era necessaria una maggiore concentrazione di fruttosio 1, 6-difosfato, con K0,5 di 0,4 muM per l'enzima non fosforilato e di 1,4 muM per l'enzima fosforilato. I risultati ottenuti indicano fortemente che la fosforilazione della piruvato chinasi può anche inibire l'enzima in vivo. Tale inibizione dovrebbe essere importante durante la gluconeogenesi.
Purificazione e proprietà della glutammato deidrogenasi NADP-dipendente da frazioni nucleari di lievito.1. Glutammato deidrogenasi NADP-dipendente (EC 1.4.1.4) estratto da le frazioni nucleari di Saccharomyces cerevisiae sono state parzialmente purificate. La purificazione finale ottenuta è stata di oltre 100 volte superiore all'estratto iniziale. 2. L'elettroforesi dell'acetato di cellulosa mostra che la preparazione è vicina all'omogeneità e che l'enzima è leggermente più anionico della glutammato deidrogenasi citoplasmatica. 3 È stata studiata la risposta dell'attività nucleare alla variazione del pH, della concentrazione di fosfato inorganico e di altri elettroliti e della concentrazione dei substrati di reazione. Sono state rilevate diverse differenze rispetto alla glutammato deidrogenasi citoplasmatica.
Alchilazione di residui cisteinici di isocitrato deidrogenasi NAD-specifico del cuore di maiale mediante iodoacetato.Isocitrato deidrogenasi NAD-specifico del cuore di maiale viene inattivato mediante reazione con iodoacetato a pH 6.0 La perdita di attività può essere attribuita alla formazione di 1-2 moli di carbossimetil-cisteina per catena peptidica La velocità di inattivazione è notevolmente ridotta dall'aggiunta combinata di Mn2+ e isocitrato, ma non dall'alfa-chetoglutarato, il coenzima NAD o attivatore allosterico ADP. La dipendenza dalla concentrazione del substrato della ridotta velocità di inattivazione produce una costante di dissociazione di 1,6 mM per il complesso enzima-manganoso-isocitrato dibasico, un valore che è 50 volte superiore al Km per questo substrato. Questo risultato suggerisce che nel proteggere l'enzima contro lo iodoacetato, l'isocitrato può legarsi a una regione distinta dal sito catalitico. Isocitrato e Mn2+ impediscono anche la denaturazione termica, con un'affinità per l'enzima vicina a quella osservato per il sito sensibile allo iodoacetato. I residui di cisteina alchilabili possono contribuire a un sito di legame manganoso-isocitrato che è responsabile della stabilizzazione di una conformazione attiva dell'enzima.
Diacetil reduttasi del fegato di piccione. Effetti del pH sui parametri cinetici della reazione.(1) La dipendenza dal pH dei parametri cinetici della reazione catalizzata dalla diacetil reduttasi del fegato di piccione (EC 1.1.1.5) è stata studiata nel range di pH 5,1-8,6 (2) Dai risultati ottenuti si postula che: (a), un gruppo di pK intorno a 7, attivo in forma protonata , partecipa all'interazione dell'enzima con NADH e NAD. (b), un secondo gruppo con un pK di 8,4, attivo anche in forma protonata, partecipa al legame del diacetile con E-NADH. (c) Un terzo gruppo di pK circa 4.7-5, attivo nella forma non protonata, è coinvolto almeno nella dissociazione del complesso E-NAD e nell'attaccamento del diacetile all'E-NADH.
Glicopid glicosil transferasi di una linea cellulare di criceto in coltura. I. Costanti cinetiche, specificità del substrato e dello zucchero nucleotidico donatore.Le proprietà degli enzimi che catalizzano il Sono stati studiati il trasferimento di un galattosio da UDP-galattosio a ceramide monoesoside esogeno e ceramide diesoside derivato dalla linea cellulare di criceto siriano NIL 2. I prodotti di questi enzimi sono stati caratterizzati con metodi chimici ed enzimatici. Le analisi cinetiche hanno mostrato che gli enzimi sono sensibili all'inibizione e all'attivazione da parte di un numero di analoghi del substrato. Sono state studiate le costanti cinetiche e di inibizione, la specificità del substrato glicolipidico e la specificità del donatore di zucchero nucleotidico.
Attivazione della tirosina idrossilasi da parte di polianioni e sali. Un effetto elettrostatico.L'attività di un preparato parzialmente purificato di tirosina idrossilasi (EC 1.14.16.2) dal nucleo caudato bovino è stato aumentato da eparina, condroitin solfato, fosfatidilserina, acido poliacrilico, acido polivinil solforico e sia poli-D- che poli-L-glutammico, tutti polianioni. Una varietà di sali attivava l'enzima e preveniva la attivazione da parte dei polianioni. Le osservazioni che l'attività aumenta quando l'enzima interagisce con i sali e con macromolecole ad alta densità di carica negativa vengono utilizzate per dedurre un modello per queste interazioni e per il cambiamento strutturale nell'enzima che accompagna l'attivazione.
Separazione e proprietà degli isoenzimi legati a NAD e NADP della semialdeide deidrogenasi succinica in Euglena gracilis z.Euglena gracilis z conteneva due semialdeidi succiniche deidrogenasi (EC 1.2.1.16), uno che richiedeva NAD e l'altro NADP, e questi isoenzimi sono stati separati l'uno dall'altro e parzialmente purificati. L'isoenzima legato al NAD era relativamente stabile allo stoccaggio a 5 gradi C mentre quello legato al NADP era estremamente instabile a meno che non sia stato aggiunto il 30% di glicerolo o glicole etilenico. Il pH ottimale era 8,7 e la temperatura ottimale di 35-45 gradi C per entrambi gli isoenzimi. Sono stati inibiti da Zn2 + e attivati, in particolare l'enzima legato al NAD, da K +. I reagenti sulfidrilici hanno attivato entrambi gli isoenzimi I valori di Km per la semialdeide succinica erano 1,66 - 10(-4) M con l'isoenzima legato al NAD e 1,06 - 10 (-3) M con quello legato al NADP. L'isoenzima legato al NADP è stato indotto dal glutammato mentre il NAD -linked non lo era. Probabili ruoli di questi isoenzimi nella fisiologia di Euglena gracilis sono discussi.
Proprietà cinetiche dell'enzima di conversione dell'angiotensina polmonare. Idrolisi dell'ippurilglicilglicina.Alcune delle proprietà cinetiche dell'enzima di conversione dell'angiotensina (peptidil-dipeptide idrolasi, EC 3.4.15.1) purificati da hog lung sono stati determinati utilizzando hippurylglycylglycine come substrato. Gli effetti del pH e dell'ambiente ionico sull'attività enzimatica sono complessi e interdipendenti. A 0,1 M NaCl, la curva pH-attività mostra una brusca diminuzione in V/Km quando il pH sale da 6 a 6,5, il che implica che la ionizzazione di un gruppo nell'enzima con un pK in questo intervallo aiuta a legare il substrato. Il cloruro è necessario per l'attività dell'enzima; ci sono due fasi nell'effetto di NaCl. In entrambi pH 6 E 8, LA PRIMA FASE (FINO A 0,1 M NaCl) è l'attivazione La seconda fase (oltre 0,1 M) a pH 6 è l'inibizione, mentre a pH 8 c'è un'ulteriore attivazione che sembra dipendere dalla forza ionica piuttosto che uno specifico effetto Cl Attivazione da cobalto e inibizione on da EDTA sono in qualche modo più efficaci a pH 6 che a pH 8. L'inibitore non apeptidico inferiore a Glu-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile-Pro-Pro è quasi equipotente sia a pH 6 che a 8, ma Arg- Pro-Pro è più inibitorio a pH 8 che a pH 6.
[Fosfarasi alcalina del latte vaccino. II. Struttura della subunità, natura metalloproteica e parametri cinetici (trad. autore\'s)].Fosfatasi alcalina ( CE 3.1.3.1) dal latte di mucca come dimero comprendente due subunità identiche o molto simili di circa 85 000 peso molecolare. L'enzima contiene 4,9 +/- 0,6 gatomi di zinco per mole di proteina. Le proprietà cinetiche essenziali sono le stesse come quelle di altre fosfatasi alcaline: variazione del valore ottimale di pH, mancanza di specificità, aumento di Km e V con il valore di pH. L'attività della fosfotransferasi è aumentata, a concentrazione costante di accettore, con una concentrazione crescente di donatore. Le piccole dimensioni di molecole e la presenza di idrossili e gruppi amminici aumentano la percentuale di fosfato di trasferimento. La reazione della fosfotransferasi è migliore con l'isomero D della serina e l'enzima possiede un'affinità più importante per la D-fosfoserina.
Caratterizzazione dell'esterasi intracellulare A da Bacillus subtilis.Esterasi A (EC 3.1.1.1) ottenuta mediante interruzione sonica di Bacillus subtilis SR22 (spoA12, trpC2 ) è stato purificato circa 400 volte mediante precipitazione chimica e termica differenziale, cromatografia DEAE-cellulosa e cromatografia di filtrazione su gel Bio-Rad P-150, con una resa complessiva del 59%. L'enzima purificato ha idrolizzato gli esteri di acetato sia alifatici che aromatici al substrato concentrazioni di 0,25 M ma non idrolizzano gli esteri degli amminoacidi. Gli alcoli alifatici non inibiscono l'idrolisi del p-nitrofenil acetato; i più potenti inibitori dell'attività esterasi erano cloruro mercurico, diisopropilfluorofosfato, eserina e fluoruro di sodio.
Uno studio sulla natura polipeptidica del rodanese. Un confronto tra diverse preparazioni.L'enzima rodanese (EC 2.8.1.1) appare come un singolo proteina della catena polipeptidica all'elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide Il peso molecolare di questa specie è di circa 33.000. peso molecolare di 18 500. Abbiamo studiato questa apparente discrepanza isolando l'enzima mediante le due diverse procedure di preparazione utilizzate nelle indagini di cui sopra. I due campioni cristallini sono stati sottoposti a cromatografia di filtrazione su gel in un'ampia varietà di condizioni e a disco di sodio dodecil solfato elettroforesi su gel Le due preparazioni hanno prodotto rodanese che si è comportato in modo identico e nessuna prova per la specie monomerica è stata ottenuta in qualsiasi condizione sperimentale zione testata. La cromatografia su gel su strato sottile di omogenati epatici chiarificati non ha dato evidenza di specie rodanesi diverse da quelle presenti nei campioni purificati. La variazione dei pesi molecolari osservata nella cromatografia di filtrazione su gel può essere un riflesso della mobilità conformazionale dell'enzima che porta a cambiamenti dipendenti dal solvente nel raggio di Stokes. Se il rodanese è dimerico, interazioni speciali devono stabilizzarlo nelle condizioni testate qui.
Caratterizzazione di protein chinasi da ghiandole parotidee bovine. L'effetto della tolbutamide e dei suoi derivati su questi enzimi parzialmente purificati.1. Quattro frazioni di protein chinasi (EC 2.7.1.37) (Peak IH, IIH, IIIC e IVC) sono state risolte e parzialmente purificate dalla frazione surnatante di 100 000 X g delle ghiandole parotide bovine mediante cromatografie DEAE-cellulosa e fosfocellulosa. 2. Le protein chinasi di Peak IH e IIH erano adenosina 3\',5\'-monofosfato (AMP ciclico) -dipendenti e avevano proprietà enzimatiche simili. Le attività enzimatiche del picco IIIC e IVC erano indipendenti dall'AMP ciclico, ma c'erano alcune differenze distinte tra le loro proprietà. La protein chinasi nel picco IIIC è stata attivata da 0,2 M NaCl o KCl e caseina fosforilata preferenzialmente come substrato, utilizzando solo ATP come donatore di fosfato. D'altra parte, la protein chinasi nel picco IVC è stata inibita da sali univalenti e la fosvitina preferita acaseina, utilizzando ATP o GTP come donatore di fosfato. 3. La tolbutamide ha aumentato il valore di Km per l'ATP e la costante di dissociazione per l'AMP ciclico, determinando l'inibizione dell'attività della proteina chinasi dipendente dall'AMP ciclico in presenza di AMP ciclico. La tolbtamide e il suo derivato carbossilico, l'1-butil-3-p-carbossifenilsulfonilurea, non hanno esercitato quasi alcun effetto inibitorio sulle attività della proteina chinasi dipendente dall'AMP ciclico in assenza di AMP ciclico o sulle attività della proteina chinasi indipendente dall'AMP ciclico.
Attivazione dei linfociti murini da parte della guanosina ciclica 3\',5\'-monofosfato: specificità e ruolo nell'attività mitogena.Guanosina ciclica 3\' ,5\'-monofosfato (GMP ciclico) stimola la sintesi dell'acido nucleico nei linfociti ed è stato implicato come effettore intracellulare delle azioni degli agenti mitogeni su queste cellule. Nel presente studio, abbiamo esaminato la specificità dell'attività mitogenica di GMP e dei suoi derivati 8-bromo (Br), e gli effetti dei mitogeni delle cellule T, concanavalina A, fitoemoagglutinina ed entertossina stafilococcica B (SEB) sul contenuto ciclico di GMP e sull'attività della guanilato ciclasi dei linfociti splenici di topo. la guanosina ha aumentato modestamente l'incorporazione di [3H] timidina nel DNA da parte dei linfociti in coltura, ma è stata molto meno efficace della loro 8-Br-guanosina e 8-Br-5\'-GMP ha superato quella dell'8-Br-GMP ciclico, quando testati in presenza e assenza di siero nei terreni di coltura. L'aggiunta combinata di dosi massime di questi nucleotidi non ha dato effetti stimolatori additivi, suggerendo un'azione su una sottopopolazione comune di cellule e forse un meccanismo comune. Al contrario, l'AMP ciclico, l'AMP 8-Br-ciclico, l'8-Br-adenosina, la tossina del colera e la prostaglandina E1 sopprimevano sia l'incorporazione di [3H]timidina basale che la stimolazione di questo parametro da parte dei mitogeni delle cellule T e dei nucleotidi della guanina. Non è stato possibile dimostrare i rapidi effetti di concanavalina A, fitoemoagglutinina, SEB, guanosina, 5\'-GMP, 8-Br-guanosina e 8-Br-5\'-GMP sul contenuto ciclico di GMP dei linfociti murini. Allo stesso modo, concanavalina A, fitoemoagglutinina e SEB non sono riusciti ad alterare l'attività della guanilato ciclasi quando aggiunti direttamente agli omogenati cellulari o pre-incubati con cellule intatte. Al contrario, la carbamilcolina ha aumentato rapidamente la GMP ciclica dei linfociti, ma non era mitogenica. Questi risultati sono coerenti con l'ipotesi che GMP ciclico e AMP ciclico siano antagonisti nella loro influenza sulla mitogenesi dei linfociti. Tuttavia, dimostrano anche che i nucleotidi correlati sono mitogeni più potenti della stessa GMP ciclica e suggeriscono che l'attivazione dei linfociti murini da parte di concanavalina A, fitoemoagglutinina e SEB potrebbe non essere mediata da rapidi aumenti del contenuto di GMP ciclico cellulare. Poiché per influenzare la sintesi del DNA devono essere utilizzate alte concentrazioni di GMP ciclico esogeno e relativi nucleotidi, il significato biologico di questo effetto rimane incerto.
Ph intracellulare del muscolo sartorio di rana.Una base debole, la morfolina, è stata marcata con 3H e testata per la sua idoneità come indicatore del pH intracellulare , per distribuzione nell'acqua tissutale del muscolo sartorio di rana nella specie Hyla litoria. Il suo pK\'a a 20 gradi C in una soluzione della stessa forza ionica del Ringer di rana è risultato essere 8,45 +/- 0,02, che è nel range di massima sensibilità. Morfolina equilibrata con il tessuto in 17 h; è stato dimostrato che non si legava a costituenti intracellulari, che non era metabolizzata né tossica nelle concentrazioni utilizzate; pertanto è stata giudicata idonea come indicatore di pH. pH intracellulare è stata quindi misurata la distribuzione della morfolina (6.985 +/- 0,08), della nicotina (6.915 +/- 0,03) e dell'acido debole 5,5\'-dimetil-2,4-ossazolidinedione (7,10 +/- 0,05) e il pH -microelettrodi sensibili (5.9, il valore di equilibrio). È stato dimostrato che i quattro valori significativamente differenti potrebbero n non possono essere conciliati in termini di errore sperimentale, eterogeneità del pH intracellulare, differenze di potenziale di giunzione liquida o legame di molecole indicatrici all'interno della fibra. Potrebbero, tuttavia, essere riconciliati se l'acqua della fibra avesse una struttura e proprietà solventi diverse dall'acqua extracellulare e tutti gli ioni fossero distribuiti attraverso la membrana come tra due fasi liquide contenenti solventi diversi. Quindi l'H+ sarebbe in equilibrio, come mostrato dalla misurazione del microelettrodo, ma il pH intracellulare sarebbe indeterminabile e probabilmente maggiore di 6.
Uno studio dell'apoproteina Folch-Pi. II. Relazione tra stato di polimerizzazione e conformazione.Confronto della conformazione dell'apoproteina Folch-Pi in organico solvente e in soluzioni acquose sono stati effettuati studi di spettroscopia ESR, infrarosso e dicroismo circolare. Sono state effettuate elettroforesi e ultracentrifugazione per correlare peso molecolare e carica della molecola con la sua conformazione. Sembra che la proteina sia monomerica in soluzione organica Nell'acqua è presente un solo componente ma le molecole si comportano come un sistema polidisperso di molecole associanti. L'interazione idrofobica sembra essere importante per questa polimerizzazione che non sembra essere accompagnata dalla formazione di struttura beta. Dopo il trasferimento del proteina da soluzione organica ad acqua, gli spettri ESR della proteina marcata sui gruppi SH liberi mostrano un'eterogeneità nell'ambiente di movimento del marcatore che permette di assumere che esistono diverse aree di associazione nella molecola polimerica.
Risposta della glicolisi degli eritrociti umani alla transizione dallo stato ossigenato a quello deossigenato a pH intracellulare costante.L'andamento temporale della velocità di la glicolisi degli eritrociti umani e di alcuni metaboliti sono stati determinati prima e dopo rapida deossigenazione a pH intracellulare costante. A tale scopo è stata utilizzata l'emoglobina deossigenata strippata come accettore rapido di ossigeno. La deossigenazione provoca un aumento del tasso glicolitico del 26%. Glucosio 6- fosfato è diminuito mentre i nucleotidi adenina e il 2,3-bisfosfoglicerato rimangono costanti. Il fruttosio 1,6-bisfosfato e i fosfati triosi diminuiscono transitoriamente prima di aumentare. I dati possono essere spiegati dall'aumento del legame dei fosfocomposti all'emoglobina deossigenata rispetto all'emoglobina ossigenata. gli enzimi di controllo esochinasi e fosfofruttochinasi sono influenzati Si conclude che in condizioni fisiologiche cambiamenti nello stato di ossigenazione dell'emog la lobina di per sé altera il tasso glicolitico.
Studi fluorimetrici sull'esposizione al triptofilo in concanavalina A.Studi sull'estinzione dello ione ioduro della fluorescenza intrinseca della concanavalina A indicano che il 50% del triptofilo la fluorescenza origina da residui esposti. Ciò concorda con la determinazione cristallografica a raggi X che due dei quattro residui di triptofano in un monomero di Concanavalina A sono sulla superficie. Precedenti studi hanno indicato che i cambiamenti conformazionali indotti dal legame dello zucchero alterano l'ambiente dei residui aromatici. La presente indagine rileva che né il legame specifico dell'alfa-metil-D-mannoside né l'alterazione della struttura quaternaria di Concanavalina A modificano il numero o l'accessibilità dei residui di triptofano esposti al solvente. non influenzano l'accesso sterico ai triptofani di superficie e gli effetti precedentemente osservati possono essere attribuiti al triptofano strutturalmente interno r residui.
Equilibrio e cinetica dello sviluppo dell'alfa-lattoalbumina da parte della guanidina cloridrato (II).Lo sviluppo reversibile dell'alfa-lattoalbumina da parte della guanidina cloridrato, è stato studiato a 25,0 gradi C in un intervallo di concentrazione relativamente basso del denaturante (0,80-2,00 mol/l) mediante spettri di differenza e misurazioni del salto di pH. È stato dimostrato che lo sviluppo si verifica tra due stati, N e D, perché la velocità apparente - le costanti delle reazioni di unfolding e refolding dipendevano solo dal pH. Tutte le curve tracciate come costante di equilibrio logaritmica log KD contro pH potrebbero cadere sulla stessa curva di base spostando ciascuna curva lungo l'asse log KD. Dalla dipendenza della velocità logaritmica costante sul pH, le curve principali potrebbero essere realizzate anche per le reazioni in avanti e all'indietro. La dipendenza di queste curve principali dal pH indica che i gruppi che influenzano la dipendenza dal pH dello sviluppo sono tre residui con pKN = 3.3 e pKA = pKD = 4.4, un residuo con pKN = pKA = 3.8 e pKD = 4.4 e un residuo con pKN = 5.8 e pKA = pKD = 6.3, dove A indica lo stato attivato. D'altra parte, dalla dipendenza dall'attività denaturante dei fattori di spostamento richiesti per la realizzazione delle curve master, il valore della costante intrinseca di legame del denaturante alla proteina è risultato simile a quello ottenuto da precedenti misurazioni a pH 5,5. È stato dimostrato che le differenze tra i numeri dei siti di legame del denaturante sulle proteine denaturate e native e tra quelli sulle proteine attivate e su quelle native sono rispettivamente di 5,3 e 2,1. L'energia libera di stabilizzazione nell'ambiente nativo mostra anche che la proteina allo stato nativo è più instabile del lisozima.
Legame di norgestrel alle proteine plasmatiche umane.Il legame di [14, 15-3H](+/-)-norgestrel alle proteine plasmatiche umane ha Norgestrel ha mostrato una maggiore affinità per il plasma rispetto all'albumina sierica umana, indicando una o più specifiche proteine leganti il norgestrel nel plasma. La glicoproteina alfa1-acida ha mostrato un'elevata affinità per il norgestrel rispetto all'albumina sierica umana. La proteina legante è stata eluita a pH 5,8 eluizione passo dopo passo su colonna DEAE-cellulosa Il legame di Norgestrel alle proteine plasmatiche non è stato alterato a 60 gradi C. Il legame ottimale si è verificato tra pH 7 e 8. La specificità del ligando della proteina legante ha rivelato che il progesterone era in grado di competere per il siti di legame del norgestrel, mentre corticosterone, testosterone, estradiolo e acetato di noretindrone non hanno mostrato molta competizione. Il peso molecolare della proteina di legame è risultato essere di circa 43 000. L'analisi del gradiente di densità del saccarosio ha indicato che norgestrel bou nd a un componente macromolecolare del coefficiente di sedimentazione 2,9 S. La costante di associazione (Kass) e la costante di dissociazione (Kdiss) della proteina plasmatica che si lega al norgestrel è risultata essere 1,4-10(6) M-1 e 0,7-10(-6) rispettivamente M. Il numero di siti di legame era 0,5-10(-9) mol/mg di proteina. La proteina legante il norgestrel nel plasma sembrava essere una proteina diversa dall'albumina sierica umana, dalla globulina legante i corticosteroidi e dalla proteina legante gli steroidi sessuali. Questa proteina legante ha mostrato alcune somiglianze con la glicoproteina alfa1-acida.
Anomala fluorescenza della 3-fosfoglucerato chinasi.La 3-fosfoglicerato chinasi (EC 2.7.2.3) del lievito che contiene due triptofili e otto tirosile residui per molecola, hanno mostrato uno spettro di emissione di fluorescenza insolitamente con un massimo a 308 nm quando eccitato a 280 nm. Il picco di emissione si è spostato a 329 nm quando eccitato a 295 nm. Potremmo confermare che era dovuto all'efficiente estinzione della fluorescenza triptofila come nonché al trasferimento incompleto di energia dal tirosile ai residui triptofili. La resa quantica media di fluorescenza di questa proteina era 0,076 (eccitazione a 280 nm) e quella dei residui triptofili era 0,046 (eccitazione a 295 nm). Poiché il pH della soluzione era abbassata, l'intensità di fluorescenza della fosfoglicerato chinasi a 329 nm è aumentata notevolmente tra pH 5 e 4, mentre la posizione del picco è rimasta invariata. Quando denaturata in guanidina cloridrato 4 M, la proteina ha mostrato due picchi di emissione, uno a 343 nm e l'altro a 303 nm.
La struttura della monellina e la sua relazione con la dolcezza della proteina.È stato dimostrato che la proteina dolce monellina [1-3] è costituita da due subunità non identiche di 50 e 42 residui amminoacidici, che sono state separate elettroforeticamente e cromatograficamente. La degradazione sequenziale automatica di Edman ha fornito la sequenza completa della subunità più lunga e una sequenza parziale di quella più corta. È stato riscontrato che la dolcezza della monellina richiede la molecola indissociata. Le singole subunità non erano dolci, né bloccavano la sensazione dolce di saccarosio o monellina. Il blocco del singolo SH di monellina ne aboliva la dolcezza così come la reazione del singolo residuo metionile con CNBr. Poiché il cisteinile e il metionile i residui sembrano essere adiacenti, si suggerisce che questa parte della molecola sia essenziale per la sua dolcezza.
Cinetica della traslocazione ionica attraverso membrane cariche mediata da un meccanismo di trasporto a due siti. Effetti dei cationi polivalenti sull'assorbimento del rubidio nelle cellule di lievito.(1 ) Viene studiato teoricamente l'effetto della carica superficiale sulla cinetica della traslocazione di cationi monovalenti attraverso un meccanismo a due siti (2) Secondo il modello trattato, sono previste relazioni tipiche per la dipendenza dei parametri cinetici del processo di traslocazione dal concentrazione di un catione polivalente, sostanzialmente diverse da quelle ricavate per il caso in cui la membrana non presenti carica in eccesso (3) Anche quando un catione polivalente non compete con il catione substrato per il legame ai siti di traslocazione, può verificarsi un'inibizione apparentemente competitiva quando la membrana è caricata negativamente (4) Il modello viene testato sperimentalmente studiando gli effetti dei cationi polivalenti Mg2+, Sr2+, Ca2+, Ba2+ e Al3+ sull'assorbimento di Rb+ nelle cellule di lievito a pH 4.5 Si trova una buona applicabilità. (5) Concentrazioni equivalenti di cationi polivalenti riducono la velocità di assorbimento di Rb+ nelle cellule di lievito nell'ordine Mg2+ inferiore a Sr2+ inferiore a Ca2+ inferiore a Ba2+ inferiore a Al3+. (6) Si giunge alla conclusione che la riduzione della velocità di assorbimento di Rb+ causata dai cationi polivalenti applicati deriva principalmente dallo screening delle cariche fisse negative sulla superficie della membrana e dal legame a questi siti negativi piuttosto che dalla competizione con Rb+ per i siti di trasporto. (7) I risultati della nostra indagine indicano che l'affinità dei cationi alcalino-terrosi per le cariche fisse negative sulla superficie della membrana cellulare di lievito aumenta nell'altro Mg2+ meno di Sr2 meno di Ca2+ meno di Ba2+. (8) Probabilmente principalmente gruppi fosforilici determinano la carica netta sulla membrana della cellula di lievito a un pH medio di 4,5.
Confronto tra membrane viola da Halobacterium cutirubrum e Halobacterium halabium.È stato effettuato un confronto diretto tra preparazioni di membrane viola da Halobacterium cutirubrum e Halobacterium halobium. Entrambe le preparazioni sono risultati essere essenzialmente identici per quanto riguarda il loro peso molecolare, contenuto retinico, composizione lipidica, impronte digitali dei peptidi dalla digestione dei peptidi, micrografie elettroniche e modelli di diffrazione dei raggi X e comportamento come una pompa protonica attivata dalla luce. non ci sono differenze di specie nelle membrane viola di questi due batteri.
L'effetto del legame degli ioni d'argento e del pH sulla densità di galleggiamento del DNA e il suo uso nel frazionamento del DNA eterogeneo.1. L'effetto del pH su la densità di galleggiamento dei complessi di Ag+ con DNA è stata studiata utilizzando DNA umano marcato con 3H e diversi DNA batterici per determinare le condizioni necessarie per la massima risoluzione dell'eterogeneità compositiva In gradienti di densità CS2SO4 neutri, complessi Ag+ con (G - C) i componenti ricchi di (A - T) sono sempre più densi di quelli con i componenti ricchi di (A - T), poiché i DNA ricchi di (G - C) hanno un'affinità maggiore per il DNA ricco di Ag+ rispetto ai DNA ricchi di (A - T) e i loro complessi sono più densi di (A - Complessi ricchi di T. Nei gradienti CS2SO4 alcalini (pH maggiore di 9), la densità di galleggiamento del complesso Ag+ - DNA non è una semplice funzione della composizione delle basi. L'affinità Ag+ del DNA ricco di (A - T) è maggiore di quello del DNA ricco di (G - C) ma la densità di un complesso ricco di (G - C) è maggiore, quindi l'ordinamento della densità di galleggiamento cambia dipende ds sulla quantità di Ag+ aggiunto. 2. Viene esplorato il problema della risoluzione dell'eterogeneità della densità all'interno di un DNA tracciante e dei componenti minori del DNA e vengono sviluppate utili tecniche di frazionamento.
Transfer RNA metiltransferasi in paramecium aurelia.Sono state studiate le tRNA metiltransferasi da Paramecium aurelia. Gli effetti della variazione delle concentrazioni di Mg2+ e NH4+, pH, e la temperatura sulla metilazione del tRNA di Escherichia coli B utilizzando estratti di P. aurelia è stata osservata l'attività ottimale della tRNA metiltransferasi a pH 7,8 e 37 gradi C. L'optimum di Mg2+ si è verificato a 0,66 mM in assenza di NH4+ mentre si è verificato l'optimum di NH4+ a 100 mM in assenza di Mg2+ L'analisi delle basi metilate nel tRNA (E. coli B) mediante estratti di P. aurelia ha mostrato la presenza di 1-metiladenina, 1-metilguanina, N2-metilguanina, N2,N2-dimetilguanina e nucleotidi pirimidinici metilati. In confronto, un'analisi della metilazione in vivo del tRNA di P. aurelia ha mostrato la presenza di 1-metiladenina, 6-metiladenina, 6,6-dimetiladenina, 1-metilguanina, N2-metilguanina, N2,N2- dimetilguanina, 7-metilguanina e m nucleotidi pirimidinici etilati. Il modello di metilazione del tRNA in P. aurelia è simile a quello osservato in altri eucarioti.
Proprietà enzimatiche della cloacina DF13 e cinetica dell'inattivazione dei ribosomi.1. L'inattivazione dei ribosomi indotta dalla cloacina DF13 in vitro può essere descritta come un enzima -reazione catalizzata secondo l'equazione di Michaelis-Menten Molto probabilmente la cloacina agisce come un'unica endoribonucleasi 2. A pH 7,8 e 37 gradi C il valore Km per la reazione della cloacina DF13 con i ribosomi è 13,2 - 10(-6) M Se in queste condizioni la miscela di reazione viene addizionata con tutti i componenti necessari alla sintesi proteica, il Km passa a 17,7 - 10(-6) M. 3. L'attività in vitro della cloacina DF13 ha una temperatura ottimale di 43 gradi C a pH 7,8 e un pH ottimale di 8,4 a 37 gradi C. 4. Esperimenti con la proteina dell'immunità della cloacina DF13 come inibitore dell'attività della cloacina in vitro hanno indicato che la proteina dell'immunità potrebbe essere considerata non competitiva e virtualmente "irreversibile". "inibitore.
[Studio del meccanismo dell'effetto del pH extracellulare sulla sintesi del complesso ossidativo (citocromo a+a3) di Bacillus coagulans: relazione con l' "effetto glucosio\ " e ruolo della coproporfirina III escreta (autore\'s transl)].Durante l'"adattamento respiratorio" di Bacillus coagulans, è stato possibile dissociare la cinetica della sintesi del citocromo a e a3 con il monossido di carbonio La sintesi del citocromo a3 è preferibilmente repressa quando il pH del mezzo di incubazione è pH 6,5 anziché pH 5,5 Tuttavia, sebbene la sintesi totale dei composti del tetrapirrolo sia la stessa ad entrambi i valori di pH, l'escrezione di coproporfirina III è molto aumentata a pH 6.5. Bacillus coagulans, sensibile all'"effetto glucosio", mostra l'"effetto pH" solo in presenza di elevate concentrazioni di glucosio. Appare direttamente la repressione della sintesi del complesso ossidasi mediante un leggero aumento del pH extracellulare correlato all'aumento di e coproporfirina III xtracellulare.
Determinazione dei rapporti H+/e- nei cloroplasti con luce lampeggiante.Utilizzando un elettrodo pH rapido, sono state effettuate misurazioni del trasporto protonico indotto dal flash in cloroplasti isolati di spinaci. Per calibrare il sistema, abbiamo ipotizzato che in presenza di ferricianuro e in stato stazionario di luce lampeggiante, ogni lampo libera dall'acqua un protone per catena di reazione. Abbiamo concluso che con ferricianuro e metilviologeno come accettori due protoni per gli elettroni vengono traslocati dalla catena di trasporto degli elettroni che collega il fotosistema II e I. Con il metil viologeno ma non con il ferricianuro come accettore, vengono assorbiti due protoni aggiuntivi per elettrone a causa dell'attività del fotosistema I. Uno di questi ultimi protoni viene traslocato all'interno di il tilacoide mentre l'altro viene assorbito nella formazione di H2O2 Assumendo che il protone rilasciato durante la scissione dell'acqua rimanga all'interno del tilacoide, calcoliamo i rapporti H+/e- di 3 e 4 per ferricianuro e metilviologe n, rispettivamente. In luce continua di bassa intensità, abbiamo ottenuto gli stessi rapporti H+/e-. Tuttavia, con intensità più elevate in cui il trasporto degli elettroni diventa limitato dal pH interno, il rapporto H+/e- si avvicina a 2 come limite per entrambi gli accettori. Viene presentato un modello funzionante che include due siti di traslocazione protonica, uno tra i fotoatti, l'altro connesso al Fotosistema I, ognuno dei quali trasloca due protoni per elettrone. Ogni sito presenta una barriera di diffusione di circa 30 ms al passaggio del protone che può essere abbassata dai disaccoppiatori a 6-10 ms.
Effetto del campo elettrico transmembrana sulle proprietà fotochimiche e di spegnimento del fotosistema II in vivo.La fase intermedia del rilassamento della fluorescenza (lms-ls) (Joliot, P. , Joliot, A. , Bouges, B, and Barbieri, G. (1971) Photochem. Photobiol. 14, 287-305), dopo un singolo lampo di saturazione, si mostra controllato da una lenta fase di la riossidazione del Q- da parte di un accettore secondario e, in vivo, dal campo elettrico transmembrana. La cinetica di riossidazione del Q- viene rallentata dall'abbassamento del pH. Questo effetto rallentante viene interpretato in termini di formazione reversibile a pH basso di QH che non è ossidabile dall'accettore secondario. Il campo elettrico trasforma i centri del Fotosistema II in uno stato fotochimicamente inattivo di non spegnimento che non può essere attribuito ad un accumulo di Q-. I centri sono inegualmente sensibili al campo. Un'intensità di campo critica può essere definita per ogni centro sopra il quale quel centro è bloccato e sotto il quale h il centro è fotochimicamente attivo. La trasformazione dallo stato attivo a inattivo avviene in un intervallo ristretto di intensità di campo. I centri sensibili vengono bloccati dal campo in meno di 1 ms e tornano attivi in meno di 10 ms quando l'intensità del campo diminuisce. Vengono proposte due ipotesi per il meccanismo di blocco dei centri da parte del campo: (1) un cambiamento conformazionale indotto dal campo nei centri, (2) la formazione o soppressione di un dipolo critico per la funzione di un centro. L'attività dell'ATP sintetasi, determinando la velocità di rilassamento del campo, era controllata da un trattamento luce-buio o da un metodo chimico che utilizzava il p-benzochinone.
Purificazione e proprietà di un fattore proteico a basso peso molecolare delle funzioni legate all'energia mitocondriale.1. Una proteina solubile con un peso molecolare di 11- 12-10(3) è stato isolato dai mitocondri del cuore bovino, che stimola le seguenti reazioni ATP-dipendenti di particelle subcondriali trattate con 0,6 mM EDTA e 1 M NH4OH: trasferimento inverso di elettroni da succinato a NAD, transidrogenazione da NADH a NADP, e scambio ATP-Pi. Il fattore non ha alcun effetto sulle attività NADH ossidasi, succinato ossidasi e ATPasi delle particelle 2. L'effetto stimolante del fattore nella riduzione ATP-dipendente del NAD da parte del succinato è 12 mumol-min-1 -mg-1 della proteina del fattore. Tuttavia, le particelle trattate con NH4OH-EDTA sono saturate per la massima attivazione della reazione di cui sopra da quantità molto piccole del fattore (circa 20-40 mug di fattore per mg di particella). 3. Elettroforesi del la preparazione del fattore su gel di poliacrilammide ha mostrato una singola prote in banda più un materiale non proteico che si è mosso sul fronte del colorante ed è stato debolmente colorato con Coomassie Blue. È stato dimostrato che la proteina è necessaria per l'attivazione delle particelle; non è noto se sia necessario anche il materiale non proteico in rapido movimento. 4. Il fattore è inibito da mercuriali e N-etilmaleimmide. La prima, ma non la seconda, l'inibizione è completamente annullata dall'1,4-ditiotreitolo. 5. Le particelle trattate con NH4OH-EDTA sono anche stimolate dalla rutamicina fino a circa 0,1 nmol di rutamicina per mg di particella; concentrazioni più elevate di rutamicina inibiscono. A seconda della preparazione delle particelle, il fattore stimola fino a circa 3 nmol per mg di particella, ma non inibisce a concentrazioni più elevate. Inoltre, in determinate condizioni in cui concentrazioni appropriate di rutamicina non riescono a stimolare le particelle, il fattore lo fa ancora.
Preparazione del frammento Fv dall'immunoglobulina XRPC-25 del mieloma di topo che possiede attività anti-dinitrofenile.La proteina IgA del mieloma prodotta dal plasmocitoma XRPC-25, è stato isolato mediante cromatografia di affinità su dinitrofenillisina-sefarosio. La costante di affinità della proteina intatta o del suo Fab\' verso 2,4-dinitrofenil-L-lisina (Dnp) è risultata essere 2,6 X 10(5) M-1. per preparare un frammento Fv (Hochman, J. , Inbar, D. e Givol, D. (1973), Biochemistry 12, 1130) da questa proteina, le catene pesanti e leggere sono state separate e la catena leggera è stata digerita con tripsina a pH 8,2 per produrre metà catena leggera. Questo digerito è stato riassociato con la catena pesante e il ricombinante è stato digerito con papaina a pH 5,7. Il frazionamento di questo digerito su una colonna Sephadex G-75 e Dnp-lisina-Sepharose ha portato all'isolamento di un frammento Fv che possiede un sito di legame per Dnplysine (Ka = 2.0 X 10(5) M-1). Il frammento Fv attivo ha un peso molecolare di 23.400 ed è composto da due catene peptidiche, ciascuna avente un peso molecolare di circa 12.000. I residui N-terminali di queste catene sono gli acidi aspartico e glutammico, che sono anche N-terminali nelle catene pesanti e leggere, indicando che la Fv è composta da VL e VH.
L'esterificazione del dolicolo da parte dei microsomi di fegato di ratto.L'incubazione di 1-[3H)dolicoli con preparazioni prive di cellule da vari tessuti di ratto ha portato a la formazione di un materiale marcato che possedeva le caratteristiche del palmitato di dolicolo sintetico. I microsomi di fegato di ratto sono risultati essere una buona fonte dell'attività dell'aciltransferasi e le proprietà della reazione sono state studiate utilizzando preparazioni microsomiali. La reazione non ha richiesto ATP, CoA , o Mg2+ ed è stato stimolato dall'aggiunta di fosfatidilcolina. L'esterificazione del dolicolo sembra essere simile all'esterificazione del retinolo. Il fatto che l'esterificazione del dolicolo non sia depressa anche in presenza di un eccesso di retinolo più volte che le due reazioni sono catalizzate da enzimi diversi.
Glutammina sintetasi adeniltransferasi da Escherichia coli: purificazione e proprietà fisiche e chimiche.La glutammina sintetasi adeniltransferasi (EC 2.7.7.42), CHE catalizza l'adenililazione e deadenililazione della glutammina sintetasi in E. coli, è stata stabilizzata e purificata di 2200 volte fino all'apparente omogeneità. Gli studi di sedimentazione ed elettroforesi mostrano che l'enzima nativo è una singola catena polipeptidica di 115.000 +/- 5000 peso molecolare con un pH isoelettrico (PL ) OF 4,98, un coefficiente di sedimentazione (S20. w0) di 5,6S e un coefficiente di attrito molare (f/f0) di 1,52. e circa pari al 47% di strutture a spirale casuale sono state stimate da misurazioni di dicroismo circolare. La composizione aminoacidica della proteina è stata determinata. La fluorescenza intrinseca del residuo triptofanile dell'adeniltransferasi è due volte g superiore a quello di L-triptofano; questa proprietà è stata utilizzata per monitorare i cambiamenti conformazionali indotti dal ligando nell'enzima. Gli attivatori della reazione di adenililazione (ATP, L-glutammina o la proteina regolatoria PII di E. coli) hanno prodotto un miglioramento della fluorescenza; l'alfa-chetoglutarato, un inibitore dell'adenililazione e un attivatore della deadenulylation, ha causato una netta diminuzione della fluorescenza. L'adenilitransferasi ha siti di interazione separati per la L-glutammina e la proteina PII regolatoria.
Un'analisi dell'autofosforilazione delle membrane degli eritrociti di coniglio e umani.L'autofosforilazione delle membrane degli eritrociti di coniglio e umane è stata studiata in varie condizioni sperimentali. i fosfopeptidi delle membrane degli eritociti sono stati identificati mediante elettroforesi su gel a lastre di sodio dodecil solfato-poliacrilammide seguita da ratioautografia. Il pattern di fosforilazione dei componenti della membrana differisce rispetto al donatore di fosforile utilizzato (ATP o GTP) e al pH a cui viene condotta la reazione Entrambe le specie sembrano contenere almeno due distinte protein chinasi legate alla membrana. La membrana eritrocitaria umana contiene una protein chinasi ciclica adenosina 3\'5\'-monofosfato (AMP ciclico)-dipendente e diversi substrati per questa chinasi. Solo l'ATP può essere utilizzato come donatore di fosforile per questa chinasi. Al contrario, la membrana eritrocitaria di coniglio non contiene una proteina chinasi dipendente dall'AMP ciclico ma contiene una chinasi che utilizza solo ATP come donatore di fosforile ed è specifica per alcuni substrati endogeni a basso pH. Sia la membrana eritrocitaria umana che quella di coniglio contengono una chinasi che utilizza GTP, forse anche ATP, come donatore di fosforile. I substrati di queste chinasi sono simili in entrambe le specie.
Studio di risonanza magnetica nucleare 31P della fosfatasi alcalina: il ruolo del fosfato inorganico nel limitare il tasso di turnover enzimatico a pH alcalino.Risonanza magnetica nucleare 31P ( NMR) è stato utilizzato per osservare direttamente il legame del fosfato inorganico alla fosfatasi alcalina. Viene presentato Evidencq per il legame stretto di 1,5-2,0 moli di fosfato inorganico per dimero di fosfatasi alcalina. Si osservano due forme distinte di fosfato legato, una che predomina al di sopra del pH 7 e che rappresenta il complesso E-P1 non covalente e l'altro che predomina al di sotto del pH 5 e che rappresenta il complesso E-P1 covalente La larghezza della linea 31P NMR del complesso E-P1 indica che la dissociazione del fosfato non covalente è il fattore limitante passo nel turnover dell'enzima ad alto pH.
Studio di risonanza magnetica nucleare al fluoro-19 della fosfatasi alcalina fluorotirosina: l'influenza dello zinco sulla struttura delle proteine e un cambiamento conformazionale indotto dal legame con il fosfato.19F La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) è stata utilizzata per studiare una fosfatasi alcalina fluorotirosina di E. coli completamente attiva. Le risonanze della fluorotirosina forniscono sonde sensibili degli stati conformazionali della proteina. Sono state utilizzate per seguire l'aggiunta di zinco o cobalto all'apoproteina , e la titolazione della proteina con fosfato inorganico o l'inibitore 2-idrossi-5-nitrobenzilfosfonato. I risultati indicano che sono necessarie 2 molecole di fosfato inorganico per dimero di fosfatasi alcalina per completare un cambiamento conformazionale generale nella proteina che comporta perturbazioni al ambiente di diverse tirosine. Gli spettri dell'enzima cobalto indicano che su tirosina specifica per subunità può essere vicino al sito del metallo. I risultati 19F NMR, c combinati con i risultati 31P NMR nel documento allegato, portano direttamente alla conclusione che la dissociazione del fosfato inorganico legato in modo non covalente dall'enzima è il processo limitante nella catalisi enzimatica a pH elevato. Viene discusso anche l'ambiente locale delle singole fluorotirosine.
La distribuzione subcellulare di adenilato e guanilato ciclasi nelle cellule linfoidi murine.Le vescicole di membrana possono essere preparate da cellule linfoidi murine mediante cavitazione di azoto e frazionate per sedimentazione attraverso gradienti di densità di saccarosio non lineari. Due sottopopolazioni di vescicole di membrana, PMI e PMII, possono essere distinte in base alla velocità di sedimentazione. La distribuzione subcellulare di adenilato e guanilato ciclasi in queste sottopopolazioni di membrana è stata confrontata con la distribuzione di un certo numero di enzimi marcatori Circa il 20-30% dell'attività totale dell'adenilato e della guanilato ciclasi si trova nella parte superiore del gradiente di saccarosio (enzima solubile), il resto dell'attività è distribuito nelle frazioni PMI e PMII (enzima legato alla membrana). Il 90% delle attività 5\'-nucleotidasi e NADH ossidasi rilevate negli omogenati di cellule linfoidi si trova nelle frazioni PMI e PMII, mentre il citocromo c reducta succinato Questa attività viene rilevata solo nelle frazioni PMII. Inoltre, l'attività della beta-galattosidasi è distribuita nelle frazioni solubili e PMII dei gradienti di densità del saccarosio. Sulla base dei modelli di frazionamento di queste varie attività enzimatiche, sembra che le frazioni PMI contengano vescicole di membrana plasmatica e reticolo endoplasmatico, mentre le frazioni PMII contengano mitocondri, lisomi e vescicole di membrana plasmatica. Circa il 30-40% delle attività di adenilato e guanilato ciclasi in PMII può essere convertito in una forma simile a PMI dopo la dialisi e la risedimentazione attraverso un secondo gradiente di saccarosio non lineare. L'adenilato e la guanulato ciclasi possono essere distinte in base alla sensibilità ai detergenti non ionici.
Condizioni ottimali e specificità di interazione di una classe distinta di proteine cromosomiche non istoniche con il DNA.Una sottoclasse di proteine della cromatina non istoniche con elevata affinità per il DNA è stata isolato dal fegato di ratto. L'interazione delle proteine isolate con il DNA in vitro è stata caratterizzata utilizzando una tecnica di legame del filtro di nitrocellulosa. Sono state caratterizzate la temperatura, il tempo, la concentrazione, la forza ionica e la dipendenza dal pH. L'interazione ottimale è stata osservata a 0,19 M naCl, pH 7.5 con un rapporto proteina/DNA di 13 (p/p). Esperimenti di equilibrio e competizione cinetica hanno indicato che queste proteine interagiscono in modo ottimale con DNA ricco di AT ea filamento singolo. I dati suggeriscono anche che queste proteine potrebbero influenzare il transitorio dell'elica del DNA.
Specificità di aumento della velocità con alfa-chimotripsina: dipendenza dalla temperatura della deacilazione.La velocità relativa dell'idrolisi del 2-(5-n-alchile) la furoil-alfa-chimotripsina raggiunge un massimo con il derivato propilico. I grafici di Arrhenius per le idrolisi del 2-furoil-, 2-(5-etil)furoil- e 2-(5-n-propil)furoil-alfa- le chimotripsina mostrano una discontinuità, mentre i grafici ottenuti con i rimanenti derivati furoilici 5-metile, 5-n-butile e 5-n-amile sono lineari. Concludiamo che la deacilazione dei derivati furoilici dell'alfa-chimotripsina comporta un minimo di due fasi di reazione elementari. A seconda delle condizioni di reazione, la specificità dell'aumento della velocità sembra essere controllata dall'entropia o dall'entalpia.
Un trattamento quantitativo della cinetica della transizione di ripiegamento della ribonucleasi A.Nuovi dati sperimentali e un trattamento teorico quantitativo per la cinetica del transizione termica del ripiegamento della ribonucleasi A a pH 3.0 Un meccanismo a tre specie viene utilizzato come punto di partenza per l'analisi: U1 (lento) in equilibrio U2 (rapido) in equilibrio N, dove U1 e U2 sono due forme dell'enzima non ripiegato con tassi di ripiegamento marcatamente diversi e N è l'enzima nativo. Questo meccanismo si basa su alcuni fatti stabiliti in precedenti studi di ripiegamento. La cinetica di spiegamento e ripiegamento mostra due fasi una fase veloce e una fase lenta, su un intervallo di temperature che si estende sopra il punto medio di transizione, Tm. Il meccanismo delle tre specie può essere utilizzato in questo intervallo. A temperature più elevate si osserva anche una nuova fase cinetica molto più veloce corrispondente alla formazione transitoria di un nuovo intermedio (I). Sebbene la soluzione generale per un meccanismo a quattro specie è complesso non è difficile estendere l'analisi a tre specie per il caso speciale qui trovato, in cui la reazione veloce (I in equilibrio N) è ben separata dalle altre due reazioni. A temperature inferiori alla zona di transizione, la fase lenta del ripiegamento diventa cineticamente complessa. Non è stato fatto alcun tentativo di estendere l'analisi per includere questo effetto. Il test di base dell'analisi a tre stati è la previsione in funzione della temperatura di alpha2, l'ampiezza relativa della fase veloce, sia per l'unfolding che per il refolding. A temperature superiori a Tm per le quali l'analisi a tre stati deve essere estesa per includere il nuovo intermedio I, viene prevista una quantità corrispondente alfa2(cor) e confrontata con i valori misurati. I dati utilizzati nella previsione a tre stati sono i valori di tau2 e tau1, le costanti di tempo delle fasi cinetiche veloci e lente, più un singolo valore di alpha2 misurato quando tau2 e tau1 sono ben separati. I valori osservati e previsti di alfa2 concordano all'interno dell'errore sperimentale. L'analisi prevede correttamente che, per questi esperimenti, alpha2 dovrebbe avere lo stesso valore nell'unfolding come nel refolding nelle condizioni finali. L'analisi prevede anche in modo soddisfacente la curva di transizione di equilibrio dai soli dati cinetici. Quattro proprietà sorprendenti della cinetica sono spiegate o correlate dall'analisi: (a) la caduta di alfa2 ad un minimo vicino a Tm così come l'aumento ritardato di alfa2 sopra Tm;(b) la scomparsa di alfa1 al di sopra della zona di transizione; (c) il forte calo di tau1 all'interno della zona di transizione seguito da un parziale livellamento al di fuori di tale zona; e (d) il passaggio di tau2 attraverso un massimo vicino a Tm. Attraverso un confronto dei valori osservati e previsti di alfa2, l'analisi esclude anche il meccanismo alternativo a tre specie U1 (lento) in equilibrio N (rapido) in equilibrio U2. Infine, viene discussa la dipendenza dalla temperatura dell'ampiezza per la reazione veloce (I in equilibrio N); il comportamento di I è come quello degli U2 e potrei essere una specie spiegata popolata in equilibrio...
La decomposizione acido-catalizzata della fenacilcobalamina: evidenza della formazione di un intermedio del complesso enol-Co(III).La fenacilcobalamina è stata sintetizzata e caratterizzato da cromatografia su strato sottile e spettroscopia UV-visibile, nonché dall'identificazione dei prodotti contenenti cobalto e organici della sua scissione in acido e base e mediante fotolisi aerobica. Il principale prodotto organico di tutte e tre le reazioni di scissione è l'acetofenone e il Il prodotto contenente cobalto è l'acquacobalamina (o idrossicobalamina, la sua base coniugata). In soluzione acquosa acida (pH da 0 a 7,3, forza ionica 1,0 M e 25,0 gradi C), la cinetica della formazione di acquacobalamina è bifasica e rappresenta la somma lineare di due termini esponenziali. La dipendenza dal pH della costante di velocità del primo ordine di entrambe le fasi mostra una dipendenza del primo ordine dalla concentrazione di protoni ma con un punto di flesso a pH 3,55 per la fase più veloce e a pH 4,03 per la fase più lenta. comportamento è interpretato in termini di specifica formazione catalizzata dall'acido di un intermedio sia dalla fenacilcobalamina "base on" che "base off" con diverse costanti di velocità del secondo ordine per ciascuna forma, seguita da una fase di decomposizione intermedia con un simile meccanismo formale. La natura dell'intermedio è discussa e si conclude che è un pi-complesso tra la cob(III)alamin e l'enolo dell'acetofenone.
Lo stato di energizzazione della membrana di Escherichia coli come influenzato da condizioni fisiologiche e colicina K.La proteina batterica colicina K, quando aggiunta a Escherichia coli in presenza di 3,3\'-dihexyloxacarbocianine, provoca un raddoppio della fluorescenza della sonda. Glucosio e ossigeno provocano una diminuzione della fluorescenza mentre anossia e cianuro provocano un aumento della fluorescenza. Questi risultati in collaborazione con il lavoro di altri laboratori suggeriscono che la colicina K provoca una depolarizzazione del potenziale elettrico transmembrana La fluorescenza in assenza di colicina K era relativamente indipendente dalle concentrazioni di KCl, NaCl e MgCl2 inferiori a 0,1 M. Sebbene la colicina K abbia causato un rapido efflusso dell'analogo K+ 86Rb+, l'aumento della fluorescenza è stato solo parzialmente bloccato da 0,13 M KCl. Il livello di fluorescenza causato dall'azione della colcina K era inversamente proporzionale al logaritmo della concentrazione di MgCl2 nell'intervallo da 2 muM a 4 mm. Ciò suggerisce che un potenziale elettrochimico di Nernst per un anione può contrastare una depolarizzazione della membrana causata dalla colcina. Dopo l'azione della colcina K, la fluorescenza della carbocianina potrebbe essere ulteriormente aumentata dall'anossia o dal cianuro. La distribuzione della base debole dimetilossazolidinedione indicava che il pH all'interno dell'E. coli aerobico fornito con lattato era alcalino di 0,1 unità e non era influenzato dalla colicina. Questi risultati suggeriscono che la colicina K non depolarizza completamente il potenziale di membrana e non interferisce con la componente di eccitazione della membrana generata dal trasporto di elettroni. La colicina K non agisce come cationoforo. La parziale depolarizzazione della membrana può spiegare l'inibizione del trasporto attivo di soluti causata dalla colicina K.
La disponibilità di folati nell'uomo: effetto dell'integratore di succo d'arancia sulla coniugasi intestinale.I meccanismi della scarsa disponibilità di folati endogeni nel succo d'arancia e gli effetti inibitori sulla disponibilità di pteroileptaglutammato (PteGlu7) causati dagli integratori di succo d'arancia sono stati studiati nell'uomo mediante l'uso di succo d'arancia simulato (contenente i componenti principali: acido citrico, acido malico, ecc. ) con diversi pH. nel succo d'arancia sono stati identificati principalmente derivati 5-metil ridotti di pteroilpoliglutammati (40-45% pentaglutammato, 10-15% tetraglutammato, 30-40% monoglutammato e il resto erano tri- e diglutammati). La disponibilità di PteGlu7 è ridotta a 54% con l'integrazione con 600 g di succo d'arancia concentrato (pH 3,7) e al 39% e 66% con l'integrazione di 24 g e 12 g di acido citrico (pH 3,7), rispettivamente. La neutralizzazione di 12 g di acido citrico a pH 6,4 inverte ampiamente l'effetto inibitorio. La disponibilità di pteroilmonoglutammato (PteGlu) non è invece influenzata da un supplemento di succo d'arancia o acido citrico. I risultati suggeriscono che la bassa disponibilità di PteGlu7 è dovuta all'inibizione della coniugasi intestinale causata dal basso pH. Queste osservazioni suggeriscono che il pH degli alimenti può essere un fattore importante nell'assorbimento delle forme poliglutammate di folato.
Effetti dell'agente bloccante cardioselettivo del recettore beta-adrenergico metoprololo nell'angina pectoris. Studio subacuto con test da sforzo.L'effetto di un beta-adrenergico cardioselettivo L'agente bloccante, il metoprololo, sui sintomi e sulla tolleranza all'esercizio è stato studiato in 16 pazienti con angina pectoris. Il metroprololo è stato confrontato con placebo a due livelli di dose (20 mg tds e 50 mg tds) in uno studio in doppio cieco su 14 pazienti. , il metroprololo ha causato una significativa riduzione della frequenza cardiaca e della pressione arteriosa sistolica durante l'esercizio, e di conseguenza una riduzione del prodotto frequenza-pressione. La riduzione è stata maggiore con 50 mg tds rispetto a 20 mg tds La tolleranza all'esercizio misurata come lavoro totale è aumentato significativamente di 21% durante il trattamento con metroprolol 20 mg tds e del 17% durante il trattamento con 50 mg tds vi è stata una riduzione del numero di attacchi di angina e del consumo di nitroglicerina, e subje miglioramento attivo dell'angina pectoris a entrambi i livelli di dosaggio del metroprololo. Nessun segno di insufficienza cardiaca è apparso durante nessuno dei quattro periodi di trattamento. Il volume del cuore non ha mostrato cambiamenti significativi. Gli effetti indesiderati sono stati della stessa frequenza e gravità durante il trattamento con metroprololo a entrambi i livelli di dose del placebo.
Permeabilità al calcio di eritrociti \'ghosts\' di piccione studiata utilizzando la proteina luminescente attivata dal calcio, obelin.1. Obelin, il Ca( La proteina luminescente 2+)-attivata dall'idroide Obelia geniculata, è stata sigillata all'interno di eritrociti di piccione ;ghosts\' per studiare gli effetti sulla loro permeabilità di diversi metodi di preparazione e del catione bivalente ionoforo A23187. 2. Variazioni di Ca( 2+) all'interno dei ;fantasmi\' sono stati studiati seguendo il tasso di luminescenza dell'obelina. La possibilità che l'obelina possa essere stato rilasciato dai ;fantasmi\' durante un esperimento è stata studiata studiando il rilascio di inulina e piruvato chinasi da i ;fantasmi\'. Meno del 10% dell'inulina o piruvato chinasi sigillata all'interno dei ;fantasmi\' è stato rilasciato in una qualsiasi delle condizioni sperimentali. 3. Triton X-100 (0,1-10%, v/v) ha reso il ;fantasmi\' altamente permeabile al Ca(2+). In presenza di 1mm-Ca(2+) un nd Triton, il 95-100% dell'obelin è stato utilizzato entro 10-20 secondi. 4. Un andamento temporale della risigillatura dei ;fantasmi\' a 37 gradi C ha mostrato che in un periodo di 90 minuti, i ;fantasmi\' sono diventati gradualmente meno permeabili al Ca(2+). ;I fantasmi\' che sono rimasti a 0 gradi C hanno mantenuto solo una piccola concentrazione di obelina e ATP ed erano altamente permeabili al Ca(2+). 5. Gli eritrociti ;fantasmi\' risigillati per 30 minuti a 20 gradi C anziché 37 gradi C erano più permeabili al Ca(2+), come dimostrato dal fatto che il 92% dell'obelina nei ;fantasmi\' è stato utilizzato durante il primi 60 anni dopo l'aggiunta di 1 mm-Ca(2+), rispetto al 44% per i ;fantasmi\' risigillati a 37 gradi C. 6. L'emolisi a pH 6,0 anziché 7,0 ha prodotto ;fantasmi\' che erano altamente permeabili a Ca(2+) dopo aver richiuso per 60 minuti a 37 gradi C. Dell'obelina nei ;fantasmi\', prodotta dall'emolisi a pH 6,0, il 90% è stato utilizzato nei primi anni '60 dopo l'aggiunta di 1 mm-Ca(2 +) rispetto al 23% per ;fantasmi\' prodotti a pH7.0. 7. Il catione bivalente ionoforo A23187 ha aumentato la permeabilità dei ;fantasmi\' a Ca(2+). Gli effetti massimi dello ionoforo (16mug/ml) sono stati ottenuti preincubando i ;ghosts\' con lo ionoforo A23187 (16mug/ml) in presenza di una bassa concentrazione di Mg(2+) e in assenza di Ca(2+ ).
L'azione del tributilstagno sull'accoppiamento energetico nelle particelle subcondriali carenti di fattore di accoppiamento.1. Tributilstagno a concentrazioni di circa 1nmol/mg di proteina induce il controllo respiratorio e diminuisce la permeabilità proteica delle particelle sottoposteriocondriali carenti del fattore di accoppiamento 2. A queste concentrazioni o inferiori, aumenta il rapporto P/O delle particelle in piccola misura e inibisce l'attività dell'adenosina trifosfatasi senza aumentarne notevolmente la sensibilità agli agenti disaccoppianti 3. Non riesce a stimolare il trasporto di elettroni inverso guidato dall'ATP o la transidrogenasi, ma stimola la transidrogenasi guidata dall'ossidazione aerobica del succinato 4. I risultati indicano che, a differenza dell'oligomicina, la tributilstagno non discrimina tra la sintesi di ATP danneggiata e intatta complessi 5. Viene discussa la relazione tra i siti di legame dell'oligomicina e del tributilstagno.
Il metabolismo microbico dell'acetofenone. Metabolismo dell'acetofenone e di alcuni cloroacetofenoni da parte di una specie di Arthrobacter.1. Un organismo che utilizza l'acetofenone come unica fonte di carbonio e l'energia è stata isolata in coltura pura e provvisoriamente identificata come un Arthrobacter sp. 2. Gli estratti privi di cellule dell'organismo coltivato con acetofenone contenevano un enzima, l'acetofenone ossigenasi, che catalizzava un consumo di O(2) dipendente dal NADPH in presenza di il substrato di crescita; sono stati consumati circa 1 mol di O(2) e 1 mol di NADPH per mole di acetofenone ossidato 3. Gli estratti privi di cellule contenevano anche un enzima in grado di idrolisi dell'acetato di fenile a fenolo e acetato. La quantità di questo esterasi è stata aumentata notevolmente dalla crescita su acetofenone. 4. I prodotti osservati della reazione acetofenone ossigenasi da parte di estratti grezzi privi di cellule erano fenolo e acetato. Tuttavia, l'inibizione della fenil acetato esterasi da parte del paraoxon ha portato alla formazione n di fenil acetato da acetofenone. 5. Viene proposta una sequenza degradativa in cui l'acetofenone viene metabolizzato da una reazione di inserimento di ossigeno per formare acetato di fenile. L'ulteriore metabolismo avviene per idrolisi di questo estere. 6. È stato dimostrato che l'organismo e gli estratti metabolizzano gli acetofenoni clorurati. Le implicazioni ambientali di questa osservazione sono discusse.
Equilibrio della creatinchinasi e contenuto di lattato rispetto al pH muscolare in campioni di tessuto ottenuti dopo esercizio isometrico.Le biopsie muscolari prelevate dal muscolo quadricipite femorale dell'uomo sono state analizzati per pH, ATP, ADP, AMP, creatina fosfato, creatina, lattato e piruvato. Le biopsie sono state eseguite a riposo, dopo occlusione circolatoria e dopo contrazione isometrica. Il pH muscolare è diminuito da 7,09 a riposo a 6,56 dopo esercizio isometrico fino alla fatica. il pH muscolare è stato correlato linearmente all'accumulo di lattato più piruvato. Un aumento di 22mumol di lattato più piruvato per g di muscolo ha provocato una caduta di 0,5 unità di pH. L'apparente costante di equilibrio della reazione della creatina chinasi (K(CK) apparente) è aumentata dopo contrazione isometrica ed è stata ottenuta una relazione lineare tra log(apparente K(CK)) e pH muscolare. Il basso contenuto di creatina fosfato nel muscolo dopo la contrazione, come analizzato da campioni di biopsia con ago, è ritenuto essere un conseguenza di un alterato stato di equilibrio della reazione della creatinchinasi. Questo a sua volta è attribuito principalmente a un cambiamento nel pH intracellulare.
Idrolisi enzimatica dell'acetilcarnitina nel fegato di ratti, pecore e mucche.1. L'utilizzo enzimatico dell'O-acetil-l-carnitina diverso dalla via la carnitina acetiltransferasi (EC 2.3.1.7) è stata studiata in omogenati di fegato di ratti, pecore e mucche in asciutta 2. Un utilizzo enzimatico della O-acetil-l-carnitina tramite idrolisi del legame estere per produrre quantità steicheiometriche di acetato e l-carnitina è stato dimostrato; sono stati utilizzati 0,55, 0,53 e 0,30 mumol di acetil-l-carnitina/min per g peso fresco di omogenati epatici rispettivamente di ratto, pecora e vacca in asciutta. 3. L'attività di idrolisi dell'acetilcarnitina non era dovuta a un esterasi o colinesterasi non specifica. La O-acetil-d-carnitina non è stata utilizzata. 4. L'attività è stata associata alla frazione arricchita della membrana mitocondriale esterna dal fegato di ratto. L'isolamento di questa frazione ha portato a una purificazione di otto volte dell'attività dell'acetilcarnitina idrolasi. 4 Il K(m) per questa acetilcarnitina utiliz l'azione era di 2 mm e 1,5 mm rispettivamente per gli omogeneizzati di fegato di ratto e di pecora. 6. Si è verificato un aumento significativo dell'acetilcarnitina idrolasi nei ratti affamati e nelle vacche durante l'allattamento e una diminuzione significativa nelle pecore gravemente alloxan-diabetiche. 7. Viene discusso il ruolo fisiologico di un'acetilcarnitina idrolasi in relazione all'accoppiamento con la carnitina acetiltransferasi per il sollievo della ;pressione dell'acetil\'.
Adsorbimento della gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi su monostrati condensati di fosfolipide.L'adsorbimento di [14C] gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi alchilata dal muscolo di coniglio al monostrati condensati di acido fosfatidico sono stati studiati in una varietà di condizioni 2. La costante di velocità per l'associazione a 20 gradi C dipendeva dalla forza ionica. A I/2=60mM la costante di velocità era 0,39min-1. A I/2=260mM è diminuito a 0,27 min-1 3. La costante di associazione apparente (Kass. ) per l'adsorbimento a I/2=60mM era 1,06 X 10(6)M-1 ed era fortemente influenzata dalle variazioni della sottofase del pH e della forza ionica. di Kass. a 20 gradi e 5 gradi C ha fornito un valore per la variazione di entalpia apparente all'adsorbimento di -33kJ-mol-1. I calcoli della variazione apparente dell'energia libera e della variazione di entropia apparente per il processo di adsorbimento hanno fornito valori di -34kJ- mol-1 e +2J-K-1-mol-1 rispettivamente 4. Diminuzione della quantità di fosfatidi L'acido c nel monostrato mediante sostituzione con fosfatidilcolina ha causato il cambiamento della forma dell'isoterma di adsorbimento da iperbolica apparente a sigmoide. I cambiamenti di sottofase nel pH o nella forza ionica non hanno influenzato la forma dell'isoterma di adsorbimento. Tuttavia, l'adsorbimento dell'enzima su monostrati di acido fosfatidico al 100% in presenza di 1mM-CaCl2 era di natura sigmoide. 5. Si conclude che la gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi si lega a monostrati carichi condensati mediante interazioni elettrostatiche multiple. A basse concentrazioni di acido fosfatidico nel monostrato o in presenza di Ca2+, questo avviene in un processo in due fasi e dipende dalla diffusione laterale dell'acido fosfatidico affinché avvenga un forte legame.
Una collagenasi neutra dalla mucosa gastrica umana.Campioni bioptici di mucosa gastrica umana, mantenuti in coltura per 7 giorni in assenza di siero, hanno rilasciato un enzima di degradazione del collagene nel mezzo. La resa dell'enzima attivo ha raggiunto il massimo dopo 2-3 giorni e il tessuto vitale, capace di sintesi proteica, era essenziale per la sua produzione. 2. A 25 gradi C l'enzima ha attaccato il collagene non denaturato in soluzione , determinando una perdita del 55% della viscosità specifica e producendo i due prodotti TCA e TCB caratteristici dell'azione della collagenasi neutra 3. La microscopia elettronica dei cristalliti a spaziatura lunga di questi prodotti di reazione ha mostrato l'esatto luogo di scissione delle molecole di collagene per essere tra le bande 43 e 44 (I-43). I prodotti TCA più grandi e TCB più piccoli erano frammenti che rappresentano rispettivamente il 77 e il 23% della lunghezza della molecola di collagene. 4. È stata osservata un'attività enzimatica ottimale nell'intervallo di pH 7,5-8,5 e un peso molecolare di circa 38 000 è stato derivato da studi di filtrazione su gel. 5. È stato dimostrato che l'enzima è inibito dalle proteine sieriche umane alfa2-macroglobulina e da un componente più piccolo del peso molecolare. ca. 40000; alfa1-anti-tripsina non era inibitoria. 6. EDTA, 1, 10-fenantrolina, cisteina e ditiotreitolo hanno tutti inibito l'attività della collagenasi. 7. L'enzima gastrico ha proprietà simili ad altre collagenasi ben caratterizzate, ma esistono differenze rispetto alla sua dimensione molecolare e al sito di attacco alla molecola di collagene.
Ph del sangue e PaCO2 come fattori chimici nel controllo del flusso sanguigno miocardico.L'effetto dell'acidosi metabolica e ipercapnica sul flusso sanguigno miocardico è stato studiato durante le infusioni endovenose di soluzioni di acido cloridrico (n = 12) e durante la ventilazione passiva con CO2 al 5% (n = 5) in cani anestetizzati a torace chiuso Al di sotto di un pH di 7,2 l'acidosi metabolica a normali tensioni di CO2 arteriose ha causato un aumento del sangue coronarico flusso sanguigno e una diminuzione della resistenza vascolare coronarica associata a una differenza di O2 arterovenosa miocardica ristretta, che indica vasodilatazione a consumo di ossigeno miocardico invariato. Nei cani pretrattati con propranololo il flusso sanguigno miocardico e la differenza AV coronarica di ossigeno sono rimasti inalterati, suggerendo che l'effetto dilatatore coronarico del metabolismo l'acidemia coinvolge la stimolazione beta adrenergica. La vasodilatazione coronarica indotta dall'aumento della pCO2 arteriosa è risultata significativamente maggiore rispetto all'effe dilatatore ct di acidosi metabolica allo stesso livello di pH del sangue. Il blocco dei recettori beta non ha ridotto la risposta coronarica all'aumento delle tensioni di CO2 arteriose. Si conclude che la vasodilatazione coronarica osservata durante l'acidosi ipercapnica non è né mediata da una stimolazione beta adrenergica né dipendente dalla concomitante variazione del pH del sangue. Vengono discussi i possibili siti delle azioni dilatatorie coronariche di aumento delle tensioni di CO2 arteriose.
Indice fisiologico come aiuto nello sviluppo di schemi di pianificazione dei piloti di linea.Una formula moltiplicativa e additiva è stata sviluppata per assistere nello sviluppo di orari per le compagnie aeree piloti e ingegneri di volo. La formula si basa su dati di freschezza/stanchezza derivati da equipaggi di volo sui voli mondiali. Dovrebbe aiutare materialmente coloro che sviluppano gli orari per evitare, ove possibile, di finalizzare quei modelli di equipaggio che imporrebbero un grave carico fisiologico al personale di cabina di pilotaggio L'obiettivo dell'applicazione della formula è quello di assicurare che i membri dell'equipaggio mantengano un'adeguata "riserva fisiologica" nel corso del volo dei vari segmenti di una rotta. Ciò consente loro di assorbire lo stress di ritardi o interruzioni degli orari, nonché problemi operativi imprevisti ed emergenze di volo.
[Istologia e istochimica delle ovaie di foca e cambiamenti legati all'età nelle ovaie della foca della Groenlandia].Sono stati utilizzati metodi istologici e istochimici studiare le ovaie della foca della Groenlandia (Pagophoca groenlandica) dalla nascita fino ai 30 anni di età e femmine mature di Phoca vitulina e Erignathus barbatus. L'ovaio della neonata foca della Groenlandia ha sostanza midollare fetale che è una ghiandola endocrinosa provvisoria producendo non solo ormoni sessuali ma anche corticosterone. In altre specie di foche le cellule intestinali della sostanza midollare sono l'equivalente di questa ghiandola. Entro 3-4 settimane dopo la nascita si completa la riduzione della sostanza midollare fetale che viene sostituita dalla tessuto connettivo e l'ovaio acquisiscono la sua struttura tipica. Il resto della sostanza midollare fetale si trova nella profondità della corteccia e vicino all'infundibolo dell'ovaio come cellule contenenti lipofuscine. Quando si avvicina il periodo di maturazione, il processo dell'atresia del follicolo cambia regolarmente: l'epitelio muore più velocemente e la moltiplicazione delle cellule intestinali aumenta. Le ovaie delle foche sono ricche di cellule interstiziali. La loro quantità cambia ciclicamente. Le cellule che producono ormoni steroidei idrolizzano sempre bene gli AS naftil-fosfati, la reazione con il glicerofosfato è più variabile. Il tessuto connettivo è povero di mucopolisaccaridi acidi, la sua sostanza amorfa nella corteccia ovarica è ricca di proteine. Nel sigillo si notano alterazioni senili dell'ovaio a partire dai 20 anni di età.
Tranquillanti o antidepressivi per schizofrenici cronici: uno studio a lungo termine.L'efficacia relativa di 4 tranquillanti è stata studiata in 66 schizofrenici cronici che erano stati ricoverato in ospedale per 10,01 anni (media). È stato studiato anche il ruolo dell'aggiunta di un antidepressivo. Dopo un periodo di placebo di 4 settimane, sono stati somministrati tranquillanti ad alto dosaggio per 16 settimane e l'amitriptilina è stata aggiunta per le successive 16 settimane. Analisi statistiche dei vari le misure di cambiamento hanno rivelato che i pazienti sono peggiorati significativamente con il placebo, tutti e 4 i tranquillanti erano significativamente migliori del placebo per la riduzione dei sintomi e il miglioramento massimo è stato raggiunto entro 16 settimane dalla somministrazione del tranquillante. Non sono state osservate differenze significative nell'efficacia tra i 4 tranquillanti e l'aggiunta di amitriptilina non ha conferire alcun vantaggio terapeutico aggiuntivo.
[Cellule endocrine della mucosa gastrica].Al fine di ottenere un'ulteriore informazione su un possibile ruolo funzionale dei principali tipi di cellule (EC ed ECL) su campioni bioptici di aspirazione prelevati dal terzo medio dello stomaco in pazienti con malattia ulcerativa del duodeno e gastrite cronica è stato effettuato Cambiamenti nella morfologia, distribuzione e numero delle cellule endocrine nella patologia del mucosa e in varie acidità del succo gastrico. In base ai dati ottenuti si conclude che le cellule produttrici di serotonina (CE) sembrano non avere nulla a che fare con la regolazione dell'attività delle ghiandole del fondo, mentre le cellule enterocromaffini (ECL) influenzano la produzione di acido cloridrico da parte delle cellule del pavimento.
[Controimmunoelettroforesi nella diagnosi di meningoencefalite da Diplococcus pneumoniae e Hemophilus influenzae].La presenza dell'antigene di D. pneumoniae e H. influenzae è stata rilevata mediante controimmunoelettroforesi (CIE) in 113 LCR di bambini con infezione del sistema nervoso centrale (SNC) (17 virali, 70 batteriche e 6 tubercolari). Da 41 bambini normali è stato prelevato e utilizzato come controllo il liquido spinale. La banda di precipitazione non è stata osservati in bambini normali casi di meningite virale e tubercolare. In 21 casi di meningite batterica, D. pneumoniae e H. influenzae sono stati isolati in sei casi ciascuno. In sei casi di meningite batterica sono risultati positivi sia lo studio batteriologico che il CIE. In 49 casi in quale coltura era negativa solo 13 ha dato CIE positivo. Quando altri ceppi di batteri sono stati isolati, nessuna banda positiva è stata rilevata con CIE. Questa tecnica è stata considerata utile per rilevare l'agente eziologico nella meningite purulenta.
Aggregazione piastrinica nella cirrosi portale.L'aggregazione piastrinica primaria e secondaria in risposta all'adenosina difosfato è stata studiata in 24 pazienti con cirrosi portale (Laënnec) e confrontata con aggregazione piastrinica in 14 soggetti normali. In 12 pazienti con cirrosi, l'aggregazione piastrinica era diminuita rispetto ai controlli. Dei 12 pazienti con aggregazione ridotta, 6 avevano livelli elevati di prodotti di degradazione del fibrinogeno-fibrina (FDP), 11 avevano trombocitopenia, 10 avevano tempi di lisi dell'euglobulina ridotti, 11 avevano tempi di sanguinamento prolungati, 4 avevano ipofibrinogenemia e tutti avevano tempi di coagulazione della trombina prolungati. I dati suggeriscono che livelli elevati di FDP sierici non spiegano completamente la compromissione dell'aggregazione piastrinica o il prolungamento del tempo di coagulazione della trombina che è stato osservato in pazienti con malattia epatica avanzata. Una possibile spiegazione per il prolungamento del tempo di coagulazione della trombina è la presenza di fibrina plasmatica "alterata" gen.
Emoperfusione di resina per intossicazione acuta da farmaci.Otto pazienti con intossicazione da farmaci sono stati emoperfusi in dieci occasioni a un flusso sanguigno di 300 ml/min con una colonna da 650 g di resina Amberlite XAD-4, che è una resina macroreticolare con un'attrazione adsorbente specifica per le molecole organiche liposolubili La clearance della colonna di glutetimide e una varietà di barbiturici variava da 207 a 300 ml/min per sessioni di trattamento che andavano da 2 Da 1/2 a dieci ore. Dopo l'ingestione di 75 g di glutetimide, una paziente ha ricevuto emoperfusione per tre giorni consecutivi rispettivamente per nove, dieci e otto ore. Si è ripresa dopo che la colonna ha rimosso oltre 30 g di farmaco. I pazienti hanno dimostrato un effetto drammatico risposte cliniche senza evidenza di reazioni tossiche significative. L'emoperfusione a colonna con resina Amberlite XAD-4 è risultata più semplice ed efficace di qualsiasi metodo noto per rimuovere barbiturici e glutetimide dal sangue di pazienti con overdose di farmaci.