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[Trattamento di grave avvelenamento ipnotico con emoperfusione extracorporea (trad. dell'autore)].Quattro pazienti con grave intossicazione ipnotica, due volte dopo l'assunzione suicida di barbital, una volta di barbital, metaqualone e carbromal, e una volta di carbromal, sono stati trattati con sei emoperfusione di carbone attivo. Tre pazienti hanno mostrato un rapido miglioramento del livello di coscienza seguito da un completo recupero. Una paziente è morta in coma cerebrale a causa di cerebromalacia acuta completa a seguito di ipossia. Non si sono verificate gravi complicanze dovute all'emoperfusione. L'uso corretto del carbone attivo per emoperfusione arricchisce lo spettro terapeutico delle gravi intossicazioni esogene.
Effetto dell'insufficienza epatica sulla risposta ventilatoria all'ipossia nell'uomo e nella capra.1. Le risposte ventilatorie all'ipossia transitoria e allo stato stazionario sono state misurata in dieci pazienti con cirrosi epatica e in dieci soggetti sani di controllo. Misurazioni successive di queste risposte sono state ottenute anche in sei capre prima e dopo la produzione sperimentale di insufficienza epatica. Cambiamenti nell'effetto dell'ipossia allo stato stazionario sulla risposta ventilatoria all'ipercapnia sono stati valutati da studi successivi in un'altra capra 2. Nonostante un'alcalosi respiratoria durante l'insufficienza epatica, la risposta all'ipossia transitoria è stata maggiore nei pazienti rispetto ai soggetti di controllo. Questa risposta è stata aumentata dopo l'inizio dell'insufficienza epatica in tutti i capre 3. Negli esseri umani sani e nelle capre le risposte all'ipossia transitoria e allo stato stazionario erano di entità simile. Durante l'insufficienza epatica c'era una disparità tra le dimensioni di queste risposte, poiché il ventilatore L'incremento di ry evocato dall'ipossia allo stato stazionario è rimasto invariato nonostante l'aumento della risposta all'ipossia transitoria. L'ipossia allo stato stazionario ha costantemente migliorato la risposta ventilatoria all'ipercapnia in una capra sana, ma spesso ha ridotto la risposta all'ipercapnia durante l'insufficienza epatica. 4. I risultati suggeriscono che l'insufficienza epatica aumenta la sensibilità dei chemocettori periferici allo stimolo ipossico, ma può aumentare la tendenza dei centri midollari a diventare depressi nell'ipossia.
Intolleranza all'acetato durante l'emodialisi.L'acetato è spesso sostituito dal bicarbonato nelle soluzioni per emodialisi. Le concentrazioni plasmatiche di acetato e bicarbonato sono state misurate in nove pazienti con insufficienza renale cronica sottoposti a emodialisi con dialisi contenente acetato. In tre pazienti (2 bambini e 1 adulto) le concentrazioni plasmatiche di acetato hanno superato i 15 mEq/litro durante la dialisi. I meccanismi che portano all'intolleranza all'acetato sono probabilmente molteplici. Non si può presumere che la dialisi con soluzioni contenenti acetato possa ripristinare il deficit di anioni tampone caratteristico dell'insufficienza renale cronica.
Sottopopolazioni di linfociti. Rosette di globuli rossi umani.I globuli rossi umani (HRBC) anche senza un precedente trattamento con neuraminidasi, potrebbero formare rosette con sangue periferico umano linfociti in vitro. Le condizioni ottimali per la formazione di queste rosette erano un pH di 7-0 e un terreno con albumina di siero bovino (BSA) al 5%. Le proporzioni delle rosette sono diventate molto inferiori a un pH diverso o utilizzando concentrazioni più basse di BSA o sostituendo BSA con sieri fetali di vitello (FCS) o sieri umani. La formazione di rosette è stata anche promossa dal precedente trattamento di HRBC o linfociti con neuraminidasi. Rosette miste di HRBC e globuli rossi di pecora (SRBC) hanno mostrato che i recettori HRBC erano rilevabili solo sui linfociti che possedevano SRBC recettori, suggerendo che le cellule formanti rosetta HRBC erano probabilmente cellule derivate dal timo (T). Successivamente, le proprietà dei globuli rossi umani (HRBC) e dei globuli rossi di pecora (SRBC) sono state studiate confrontando la capacità di morte umana linfociti del sangue ferale per formare questi due tipi di rosette dopo il trattamento con vari reagenti inibitori. Le rosette HRBC erano relativamente più resistenti all'inibizione con: (1) agenti proteolitici, come tripsina, alfa-chimotripsina e pronasi; (2) siero anti-timociti (ATS); (3) inibitori metabolici, come sodio azide e 2,4-dinitrofenolo (DNP); (4) citocalasina B. In un'ulteriore incubazione dopo la tripsinizzazione, i linfociti hanno recuperato una certa capacità di formare rosette SRBC, ma hanno continuato a perdere più della loro capacità di formare rosette HRBC. Tutti questi risultati sono stati considerati come prove circostanziali che le rosette HRBC potrebbero rappresentare una sottopopolazione di linfociti T umani.
Accelerazione dell'autoimmunità nei topi NZB/NZW F1 da parte della malattia del trapianto contro l'ospite.La malattia cronica del trapianto contro l'ospite (GVH) è stata indotta in topi femmina ibridi NZB/NZW F1 (B/W) mediante l'iniezione settimanale di cellule di milza NZB parentali. I topi di controllo hanno ricevuto iniezioni solo di cellule di milza singeniche. I topi sono stati saggiati per gli anticorpi contro [3H]DNA e [3H]poliadenilico- acido poliuridilico mediante un test radioimmunologico con filtro di estere di cellulosa e per l'anticorpo verso i timociti mediante un metodo di citotossicità. La malattia di GVH ha accelerato lo sviluppo di tutti e tre gli anticorpi nei topi B/W. Inoltre, l'ultracentrifugazione in gradiente di densità di saccarosio di sieri raggruppati ha suggerito che un passaggio accelerato da La produzione di anti-DNA da 19S a 7S può essere un effetto precoce del GVH. Il meccanismo di accelerazione è discusso in termini di fattori immunologici e virali generati dalla reazione GVH.
Rilevazione immunologica di isoferritine nel siero e nei tessuti umani normali.Viene descritto un metodo che consente di rilevare le isoferritine nel siero e nei tessuti umani normali. Il Questa tecnica utilizza anticorpi monospecifici anti-fegato umano-ferritina marcati con 125I per dimostrare le isoferritine dopo focalizzazione isoelettrica della ferritina purificata in gel di poliacrilammide. tecnica utilizzando solo 50 ng di ciascun campione di ferritina. È stato anche dimostrato che la ferritina sierica di soggetti sani normali mostra una microeterogeneità alla focalizzazione isoelettrica; sono stati rilevati sei picchi di isoferritina chiaramente definiti nell'intervallo di pH compreso tra 5,04 e 5,62. Questo profilo di isoferritina del siero normale conteneva isoferritine su tutta la gamma delle varie isoferritine tissutali, suggerendo che un certo numero di organi può contribuire al normale pool di ferritina sierica.
Esperienza con un metodo semplice per il dosaggio dei recettori degli estrogeni nel cancro al seno.Descrizione di una semplice procedura per il dosaggio di specifici recettori degli estrogeni nel tessuto del cancro al seno I recettori degli estrogeni sono stati rilevati nel 74% dei tumori primari, nel 71% delle metastasi cutanee e nel 63% delle metastasi linfonodali. Le pazienti in postmenopausa e le donne ooforectomizzate più giovani avevano tumori contenenti recettori per gli estrogeni più frequentemente e a livelli più elevati rispetto a quelli non castrati, in premenopausa, pazienti. La stabilità dei recettori degli estrogeni non è stata influenzata dal trasporto di campioni da ospedali distanti, a condizione che fossero sempre congelati in tampone Tris, pH 8,0.
[Studi sulle attività delle peptidasi da leucociti umani e macrofagi alveolari umani e di cavia (transl dell'autore\'s)].Le attività delle peptidasi erano confrontati in leucociti umani, cavia e macrofagi alveolari umani. Sono stati caratterizzati diversi endo ed esopeptidi; alcuni di essi erano attivi a pH acido e altri a pH neutro e alcalino. Leucociti e macrofagi alveolari avevano attività proteoligica per emoglobina, fibrinogeno, collagene e elastina Utilizzando substrati sintetici, sono stati caratterizzati diversi enzimi: arilamidasi, aminopeptidasi, carbossipeptidasi A e B e catepsine A e C. Le attività enzimatiche erano molto più elevate nei macrofagi alveolari che nei leucociti.
Semplificazioni metodologiche nel dosaggio radioimmunologico dell'aldosterone urinario.Si è tentato di semplificare le procedure di dosaggio radioimmunologico dell'aldosterone-18-glucuronide urinario, tenendo in considerazione gli aspetti implicati da l'idrolisi dell'urina e il saggio stesso La procedura standardizzata per la fase di idrolisi (campioni diluiti con un volume doppio di 0,2 N HCl e incubati a 30 gradi C per 16-24 h) si è dimostrata idonea in termini di praticabilità e accuratezza. Gli antisieri dell'aldosterone, allevati nel coniglio contro un coniugato di aldosterone-3-albumina bovina, sono stati selezionati in base alla loro specificità nei confronti degli steroidi concorrenti, a seconda delle caratteristiche degli antisieri utilizzati, un dosaggio di estratti, o anche misurazioni dirette delle urine idrolizzate escludendo qualsiasi estrazione, sono stati trovati per dare risultati affidabili. Nel caso di un antisiero di alta qualità, evidenza per l'adeguatezza del dosaggio su estratti di urina non idrolizzati per la misurazione di t L'escrezione di aldosterone non coniugato è stata fornita da alcuni dati preliminari. I risultati degli esperimenti, diretti alla validazione metodologica e clinica delle procedure semplificate, sono riportati e discussi in questo lavoro.
Saggio radioimmunologico diretto del cortisolo plasmatico.La semplificazione della misurazione del cortisolo circolante mediante saggio radioimmunologico diretto su campioni di plasma pone il problema dell'inibizione delle proteine carrier in competizione con anticorpi. Ciò è stato ottenuto sfruttando l'efficacia molto più elevata delle variazioni di pH e temperatura sul legame degli steroidi alle proteine di trasporto rispetto ai siti anticorpali. È stato istituito un sistema in fase solida, utilizzando antisieri ai coniugati cortisolo-21-BSA accoppiati a CNBr- cellulosa attivata. La procedura standardizzata consisteva in un'incubazione a pH 3,5 e temperatura ambiente, dosando direttamente 10 mul di plasma. Una validazione metodologica e clinica della misura è stata effettuata attraverso una serie di test volti a valutare l'attendibilità dei risultati (saggio di plasma deprivato di steroidi, test di recupero e diluizione seriale dei campioni, confronto tra diversi antisieri e con metodi diversi tra cui l'estrazione, la risposta al situazioni fisiologiche consolidate). Vengono riportati i risultati ottenuti e discussa la validità del metodo in termini di applicabilità più generale al dosaggio degli steroidi.
Lipoamide deidrogenasi nel siero: un rapporto preliminare.La lipoammide deidrogenasi è stata identificata nel siero e sono state definite le condizioni ottimali per il suo dosaggio a 30 gradi C. Il pH ottimale nel tampone tris(idrossimetil)amminometano è 7,8 e l'attività è inibita se la concentrazione del tampone supera 100 mmol/litro Le concentrazioni di saturazione dei substrati NAD+ e lipoammide sono rispettivamente 3 mmol/litro e 5 mmol/litro. otto volte quando l'acido lipoico viene sostituito dalla lipoammide. L'attività è linearmente correlata alla concentrazione dell'enzima fino al limite della variazione di assorbanza di 0,300 a 340 nm, e sia la precisione giornaliera che giornaliera sono soddisfacenti. I dati suggeriscono un intervallo normale (2 DS). ) di 3-19 kU/litro. Il valore più alto misurato nel siero è stato di 473 kU/litro. È stata trovata una correlazione con le concentrazioni di bilirubina diretta (r uguale a 0,435, P inferiore a 0,01).
Procedura dell'idrazide dell'acido P-idrossibenzoico per la glicemia adattata al Technicon "SMA 12/60," e confrontata con altri metodi del glucosio.Abbiamo adattato la procedura dell'idrazide dell'acido p-idrossibenzoico per il glucosio sierico per l'uso con l'AutoAnalyzer Technicon SMA 12/60. Come il metodo o-toluidina, questo metodo si basa su una reazione generale dei carboidrati tranne per il fatto che si verifica in un mezzo leggermente alcalino e il il colore giallo intenso formato è misurato a 400 nm. I vantaggi di questo reagente rispetto all'o-toluidina includono minor costo, minore tossicità e maggiore purezza. A parte quei carboidrati che sono presenti nel siero in quantità insignificanti, non ci sono interferenze da vari composti fisiologici o farmaci (agenti ipoglicemizzanti) riscontrati nelle persone normali o nei diabetici. I valori intra-run e giornalieri avevano coefficienti di variazione rispettivamente dell'1,39% e del 3,44%; i recuperi variavano dal 100 al 102% (media, 101%) I dati comparativi hanno mostrato eccellenti t accordo con l'esochinasi (r è uguale a 0,998; y è uguale a 0,950x + 5,91) e glucosio ossidasi (r è uguale a 0,996; y è uguale a 0,986x + 5,34) metodi enzimatici ("vero") del glucosio, e con la procedura o-toluidina (r è uguale a 0,998; y è uguale a 0,979x + 3.14).
Saggio radioimmunologico dell'attività della renina plasmatica.Descriviamo un metodo di saggio radioimmunologico sensibile e semplificato per la determinazione dell'attività della renina plasmatica. Il plasma è stato acidificato al pH ottimale ( 6.0) di generazione di angiotensina l con la minima diluizione possibile, utilizzando una singola aggiunta di acido cloridrico e l'inibitore enzimatico idrossichinolina. Il recupero di angiotensina l non marcata aggiunta al plasma è stato del 92-97%, quello di angiotensina l monoiodurata ha superato il 90%, indicando protezione soddisfacente dagli enzimi proteolitici I costituenti del plasma hanno interferito poco con il dosaggio radioimmunologico I valori blandi per il plasma mantenuto a 0 gradi C erano 10,7 +/- 2,3 (media +/- DS) percento dei valori di attività per i campioni conservati a +37 gradi C ( n è uguale a 63). Nell'impostazione di routine, sono state rilevate 6,25 pg di angiotensina l o 10 (-6) unità Goldblatt di renina umana standard. Riportiamo i risultati delle misurazioni dell'attività della renina plasmatica e un confronto con sette kit di renina e con bioa saggio per l'attività della renina plasmatica.
Saggio migliorato per 17-idrossicorticosteroidi urinari.Descriviamo un metodo semplice, rapido e affidabile per la determinazione dei 17-idrossicorticosteroidi urinari. Una resina neutra (Amberlite XAD-2), che è un polistirene reticolato non ionico, viene utilizzato per estrarre e concentrare gli steroidi, che vengono poi determinati quantitativamente con la reazione di Porter-Silber. L'uso della resina elimina la necessità di idrolisi enzimatica e n- estrazioni di butanolo, diminuendo così notevolmente il tempo di analisi; i risultati possono essere ottenuti entro 3 h dalla ricezione dei campioni. La maggior parte dei cromogeni Porter-Silber non steroidei viene rimossa, risultando in un metodo altamente specifico e sensibile, anche a basse concentrazioni (0,6 mg /litro) e quindi più accurati e riproducibili dei metodi attualmente utilizzati.
Effetto dell'anestesia con alotano sui test di funzionalità muscolare, epatica, tiroidea e surrenale nell'uomo.Sette volontari uomini sani hanno ricevuto 6,6 +/- 1,3 (SD) percentuale di ore di anestesia con alotano ossigeno senza intervento chirurgico. La bilirubina sierica, l'alanina aminotransferasi e l'aspartato aminotransferasi sono aumentate significativamente dopo l'anestesia, il che può indicare un danno subclinico delle cellule epatiche. La creatina chinasi di origine del muscolo scheletrico è aumentata oltre 90 U/litro in sei soggetti, indicando un danno subclinico delle cellule muscolari. Il cortisolo, l'assorbimento di triiodotironina, la tiroxina e l'indice di tiroxina libera sono aumentati significativamente immediatamente dopo l'anestesia. Le concentrazioni sieriche di bromuro erano aumentate di cinque volte il secondo giorno dopo l'anestesia, e il nono giorno era ancora quadruplicato. La temperatura orale è aumentata di 0,7 gradi C 6 ore dopo l'anestesia, probabilmente a causa dell'aumento dell'attività della tiroxina Lattato deidrogenasi, idrossibutirrato deidrogenasi e gamma-glutamiltransfer Queste attività non sono cambiate in modo significativo. Nessun farmaco somministrato nel corso di questo studio ha interferito chimicamente con nessuno dei metodi di prova utilizzati.
Analisi dei composti indolici nelle urine mediante cromatografia liquida ad alta prestazione con rilevamento fluorometrico.Descriviamo un sistema cromatografico che coinvolge un legante chimico ad alte prestazioni colonna a fase inversa e rilevamento della fluorescenza per la misurazione degli indolo nelle urine. Abbiamo controllato la ritenzione e la selettività ottimizzando il contenuto di metanolo e il pH della fase mobile. Sei indoli di riferimento sono stati separati in meno di 20 min;tre 5-idrossiindoli sono stati eluiti in meno di 7 min Si possono rilevare circa 5-15 ng di soluzioni acquose di questi composti La combinazione di selettività (dall'uso della colonna cromatografica) e rivelazione a fluorescenza ha permesso l'analisi per cinque dei sei indoli dopo un singolo passaggio di deproteinizzazione delle urine.
Assorbimento molare di beta-NADH e beta-NADPH.Riesame dell'accuratezza dei valori comunemente usati per l'assorbimento molare (epsilon) di beta -NADH e beta-NADPH a Hg 334, Hg 365 o 340 nm, abbiamo ottenuto i seguenti risultati: Il massimo di assorbanza di NADH è spostato da circa 340 nm a 0 gradi C a circa 338,5 nm a 38 gradi C; il corrispondente massimi di NADPH si trovano a lunghezze d'onda più lunghe di circa 0,5 nm. Inoltre, le curve di assorbimento di entrambi i coenzimi si allargano con l'aumentare della temperatura. Per questi motivi, i valori di epsilon di NADH e NADPH sono generalmente diversi l'uno dall'altro e sono temperatura- dipendenti. Solo a 334 nm sono quasi identici e quasi indipendenti dalla temperatura. Pertanto questa lunghezza d'onda è consigliata per misurazioni precise. I valori di epsilon di questi coenzimi sono influenzati dalla forza ionica e dal pH. Per determinare i valori assoluti delle assorbimenti molari, abbiamo eseguito il glutammato dosaggio della deidrogenasi o della lattato deidrogenasi con acido 2-ossoglutarico o acido piruvico accuratamente purificati in presenza di un eccesso di coenzima. La purezza dei substrati è stata verificata mediante calorimetria a scansione differenziale, analisi dell'umidità, cromatografia gas-liquido, gascromatografia in combinazione con spettrometria di massa e spettroscopia di risonanza magnetica nucleare. I valori di epsilon osservati nelle varie condizioni sono circa l'1-7% superiori a quelli attualmente utilizzati.
Determinazione dell'assorbimento molare di NADH.L'assorbimento molare di NADH a 340 nm è stato determinato mediante una procedura indiretta in cui il glucosio di elevata purezza è fosforilata dall'ATP in presenza di esochinasi, accoppiata all'ossidazione del glucosio-6-fosfato da parte di NAD+ in presenza di glucosio-6-fosfato deidrogenasi. Il valore medio di 85 determinazioni indipendenti è 6317 litri mol-1 cm-1 a 25 gradi C e pH 7,8. L'incertezza complessiva è da -4,0 a +5,5 ppt (da 6292 a 6352 litri mol-1 cm-1), basata su un errore standard della media di 0,48 ppt e una stima dell'errore sistematico di -2,6 a +4.1 ppt. Sono riportati anche gli effetti di pH, tampone e temperatura sull'assorbimento molare.
Via neurale afferente nella regolazione delle risposte cardiopolmonari all'ipermetabolismo tissutale.Abbiamo studiato il ruolo della trasmissione neurale dai tessuti periferici ipermetabolici nella regolazione dell'attività cardiaca gittata e ventilazione polmonare in cani anestetizzati con clorosio. Tecniche di circolazione incrociata con anastomosi femoro-femorale o femoro-aortica sono state utilizzate per produrre un 2,4-Dinitrofenolo (DNP) isolato vascolare, ma normalmente innervato, degli arti posteriori o della metà inferiore. è stato infuso nel lato arterioso del circuito di perfusione per triplicare il consumo di ossigeno e per aumentare la produzione di lattato da parte dell'area di perfusione incrociata. Dopo l'infusione di DNP, la gittata cardiaca e la pressione arteriosa sistemica media sono aumentate, ma né la frequenza cardiaca né la pressione di incuneamento dell'arteria polmonare è cambiata in modo significativo. Anche la ventilazione minuto polmonare e il pH arterioso sono aumentati, mentre la PCO2 arteriosa è diminuita. Questi cambiamenti sono stati aboliti quando le connessioni nervose tra il perfu arto ed il suo corpo genitore sono stati recisi. La normale soluzione salina, quando somministrata in modo simile, non ha aumentato né la ventilazione né la gittata cardiaca, e anche la semplice denervazione senza precedenti infusioni di DNP non ha avuto alcun effetto. Questi risultati indicano che ci sono recettori sensibili ai cambiamenti metabolici nel tessuto e che la trasmissione neurale è un importante collegamento afferente nella regolazione delle risposte cardiopolmonari all'aumento del metabolismo tissutale.
Ultracitochimica dei nastri sinaptici nell'organo pineale di ratto.I complessi sinaptici dei pinealociti di ratto non sono né colinergici né adrenergici. Nelle vescicole sinaptiche, non è stata riscontrata una sostanza trasportatrice di neurotrasmettitori di natura lipidica che reagisce con la miscela OsO4-Zn I2 (simile a quella presente sia nelle vescicole colinergiche che adrenergiche) Inoltre, non sono emerse indicazioni di attività glucosio-6-fosfatasi o tiamina-pirofosfatasi nel vescicole sinaptiche. Quindi, sembra che le vescicole sinaptiche non abbiano origine dal reticolo endoplasmatico ruvido o liscio. I nastri sinaptici non contengono carboidrati, sono di natura proteica e possiedono una certa somiglianza chimica con i microtubuli e i mazzi microtubulari. Le reazioni ultracitochimiche appropriate non hanno mostrato quantità rilevabili di ioni sodio e calcio nei complessi sinaptici pinealociti.
Siti di deposito di monoamine nel ganglio cervicale superiore di ratto a seguito di inibizione della sintesi.Siti di deposito di monoamine nelle cellule paragangliari (PG-) del ganglio cervicale superiore di ratto sono stati studiati mediante microscopia elettronica e a fluorescenza dopo il trattamento con p-clorofenilalanina (pCPA), disulfiram o guanetidina rispettivamente. Le vescicole con nucleo denso nelle cellule PG sono significativamente diminuite (p inferiore a 0,001) in numero dopo pCPA e nella maggior parte di queste cellule in seguito a disulfiram e guanetidina. Tuttavia in una porzione minore di cellule PG questi ultimi agenti causano un aumento del numero e delle dimensioni delle vescicole del nucleo denso, in parallelo con alterazioni strutturali. In accordo con questi risultati al microscopio elettronico, le valutazioni microscopiche e citofotometriche di fluorescenza rivelano un diminuzione generale del contenuto di catecolamine con poche cellule che mostrano un aumento. I risultati forniscono una base morfologica per l'ipotesi, che la monoamine stora I siti ge nelle cellule PG possono essere ridotti mediante l'inibizione della sintesi delle monoamine, in seguito alla somministrazione di pCPA, disulfiram e guanetidina. Tuttavia i due tipi di risposte delle cellule PG che si verificano dopo disulfiram e guanetidina dimostrano un'eterogeneità funzionale di questo sistema cellulare nel ganglio cervicale superiore di ratto di cui si discute.
Aumento dell'attività della fosfatasi alcalina nel fegato di topi portatori di tumore dell'ascite di Ehrlich.Nei topi portatori di tumori dell'ascite di Ehrlich, l'attività della fosfatasi alcalina è stata aumentata di cinque volte in nel fegato e del 50% nel rene Nei topi portatori di tumori solidi causati dall'inoculazione di cellule tumorali nella regione ascellare, l'attività di questo enzima nel fegato è aumentata di 11 volte, mentre l'attività nel rene non è cambiata. L'attività della fosfatasi alcalina nel fegato e nel rene non è stata alterata dalla somministrazione di steroidi surrenali L'adrenalectomia, il digiuno e la gravidanza non hanno influenzato l'attività della fosfatasi alcalina nel fegato e nei reni Il trattamento con estratti tumorali o liquido di ascite di topi normali ha aumentato l'alcalinità del fegato attività della fosfatasi Questi risultati hanno suggerito che l'elevazione dell'attività della fosfatasi alcalina epatica è stata causata principalmente dal tumore stesso e non da uno squilibrio ormonale provocato secondariamente dalla presenza di o per il tumore.
Ausili di laboratorio alla diagnosi--enzimi.Viene presentato un riassunto di quei dosaggi enzimatici organo-specifici tradizionalmente utilizzati nella valutazione del paziente con cancro. In Inoltre, viene delineato l'uso di alcuni enzimi sierici come la gamma-glutamil transpeptidasi, il fosfoesoso isomerasi o la 5\'-nucleotidasi come ausilio nel seguire il decorso della malattia, in particolare nei pazienti con diffusione metastatica al fegato. dell'analisi enzimatica in tessuti bioptici, fluidi biologici e lavaggi delle cavità corporee. Sono considerati enzimi più recenti che potrebbero, in futuro, essere sviluppati come strumenti diagnostici o come sonde per la comprensione dell'eziologia del cancro.
Biologia del cancro dell'intestino crasso. Stato attuale e frontiere della ricerca.L'uomo e i roditori di laboratorio esposti a cancerogeni chimici mostrano entrambi cambiamenti nelle caratteristiche di crescita dell'epiteliale del colon cellule durante la trasformazione neoplastica. Fasi progressive di sviluppo cellulare anormale compaiono nelle cellule epiteliali del colon che acquisiscono una maggiore capacità di proliferare e accumularsi nella mucosa. Queste fasi nell'espressione della trasformazione neoplastica delle cellule del colon sono meglio definite nella malattia ereditaria dominante dell'uomo come adenomatosi del colon e del retto. Gli individui con adenomatosi ereditaria e quelli nelle categorie di rischio minore possono essere classificati per fenotipo cellulare in base ai cambiamenti nella proliferazione e maturazione delle cellule del colon e di altre cellule. Queste classificazioni stanno portando a nuovi indici predittivi che identificano gradi più elevati della suscettibilità degli individui ad aumentato rischio di cancro al colon e dello stadio di sviluppo della loro malattia. Gli indici vengono utilizzati anche per studiare il contributo di elementi specifici nell'ambiente che modificano o accelerano la progressione della malattia.
Studi sul bromuro di fazadinio (ah 8165): un nuovo agente bloccante neuromuscolare non depolarizzante.Le relazioni dose-risposta endovenose sono state utilizzate per correlare la paralisi neuromuscolare con gli effetti del fazadinio (AH 8165) sui meccanismi autonomici nei gatti anestetizzati e nelle scimmie rhesus e con effetti cardiovascolari nell'uomo Nei gatti e nelle scimmie la paralisi neuromuscolare delle risposte di contrazione del muscolo gastrocnemio da parte del fazadinio è stata accompagnata da una compromissione della bradicardia indotta vagamente , ma i disturbi cardiovascolari erano piccoli. Il blocco dei meccanismi simpatici e l'ipotensione erano evidenti solo con dosi sovra-massime. Nell'uomo la tachicardia era un evento comune e in alcuni pazienti si è verificata ipertensione con dosi del farmaco necessarie per la paralisi neuromuscolare completa. Fazadinio era da tre a quattro volte più potente nelle scimmie rhesus che nei gatti e il suo corso d'azione è stato considerevolmente più lungo. La potenza del farmaco nell'uomo correspo ha trovato più vicino a quello nei gatti che nelle scimmie rhesus ma il suo corso d'azione nei pazienti era simile a quello nelle scimmie. Nell'uomo, sono state costruite curve dose-risposta per le contrazioni dei muscoli adduttori del pollice provocate da stimoli tetanici e a contrazione singola applicati ai corrispondenti nervi ulnari. L'insorgenza della paralisi delle contrazioni tetaniche dopo l'iniezione endovenosa di fazadinio (0,4 mg/kg) è avvenuta entro due minuti, ma il recupero è stato lento e sono stati necessari circa 50 minuti per il suo completamento. La depressione delle risposte alle contrazioni registrate simultaneamente era meno marcata, più lenta nell'insorgenza e il recupero era leggermente più rapido. Questi effetti erano simili a quelli ottenuti con la tubocurarina (0,2 mg/kg) ma l'azione del fazadinio era leggermente più breve. I rapporti tetanico-tensione sono stati calcolati dopo il 30 e il 50 per cento di recupero dal blocco neuromuscolare nell'uomo. Questi rapporti erano più bassi con il fazadinio che con la tubocurarina e indicavano che la dissolvenza tetanica era maggiore e più persistente dopo il fazadinio che dopo la tubocurarina.
Lorazepam come premedicazione.Uno studio casuale in doppio cieco ha confrontato gli effetti di lorazepam e pantopon su una premedicazione intramuscolare in donne sane per il curettage uterino (D \& C) L'ansia, come valutata da un test di autovalutazione da parte del paziente e da un osservatore esperto, ha mostrato una riduzione significativa a un'ora e mezza dopo il lorazepam e una riduzione minore dopo pantopon, che non era significativa La sedazione è stata soddisfacente senza differenze significative tra i due farmaci nel cambiamento prima e dopo la premedicazione Il lorazepam ha mostrato molta più amnesia del pantopon (p inferiore a 0,001) I pazienti che avevano ricevuto lorazepam hanno richiesto dosi più elevate di tiopentone per l'operazione e questo, in parte, ha portato a intervalli più lunghi nei tempi di recupero dopo il lorazepam. Tuttavia, si suggerisce che il lorazepam stesso sia stato in parte responsabile del recupero più lungo. Il pantopon è stato seguito da più nausea, vomito e mal di testa, rispetto al lorazepam. l'iniezione uscolare di lorazepam ha danneggiato più pazienti rispetto a pantopon, ma altre complicanze locali erano trascurabili e comparabili in entrambi i gruppi. I risultati di questo studio mostrano che il lorazepam produce una migliore riduzione dell'ansia e molta più amnesia rispetto al pantopon, con una sedazione comparabile e molta meno nausea e vomito. L'unico svantaggio del lorazepam è la mancanza di analgesia e, quindi, la necessità di più anestesia durante l'operazione. La conclusione è che il lorazepam è una premedicazione molto soddisfacente e merita un uso maggiore in quanto tale.
[L'effetto degli amminoacidi sull'eccitabilità dei neuroni giganti autoattivi identificati di Achatina fulica Férussac].Gli effetti dei seguenti amminoacidi sono stati esaminati su l'attività elettrica dei due neuroni giganti (PON e TAN) identificati nei gangli subesofagei di Achatina fulica Férussac : L-Asp, L-Thr, L-Ser, L-Glu, L-Pro, Gly, L-alpha-Ala , beta-Ala, L-cisteina, L-cistina, L-Val, L-Met, L-Ileu, L-Leu, L-Tyr, L-Phe, L-Lys, L-His, L-Arg, L -Cit, L-Try, GABA e GABOB. Tra queste sostanze, abbiamo osservato un effetto inibitorio di GABA e GABOB sull'eccitabilità del TAN. Il GABA ha mostrato un effetto più forte sul TAN rispetto al GABOB. Questo effetto del GABA era dovuto alla produzione di iperpolarizzazione sul Membrana TAN. Il GABA ha mostrato un leggero effetto eccitatorio sul PON. L'effetto di GABOB sul PON era molto debole e instabile.
[Metabolismo ossidativo del tessuto funicolare. II. Determinazione dell'attività di alcuni enzimi del ciclo di Krebs].Precedenti esperimenti hanno suggerito un blocco metabolico parziale potrebbe limitare il metabolismo ossidativo del tessuto cordonale tra la decarbossilazione del piruvato e l'ossidazione del succinato. Alcune delle deidrogenasi del ciclo di Kreb\'s sono state saggiate su polveri di acetone preparate da cordoni umani. Isocitrato deidrogenasi (sia NAD che NADP-specifiche) hanno attività molto più basse delle alfa-chetoglutarato- e malato deidrogenasi; un blocco parziale potrebbe essere localizzato a questo livello. Inoltre, l'enzima malico ha un'attività piuttosto elevata, e potrebbe svolgere un ruolo significativo rigenerando NADPH in un tessuto dove altre fonti di questo coenzima sono praticamente assenti.
[Valore della "camera gastrica", nuova tecnica eseguita ex vivo, per lo studio della mucosa gastrica del ratto].La tecnica della "camera gastrica", eseguita nel ratto anestetizzato, consente lo studio della fragilità della mucosa gastrica indotta da dosi di fenilbutazone, che di per sé non provocano ulcerazioni o esulcerazioni. La perfusione di soluzione tamponata a pH 2-8 nello stomaco mostra che la precedente somministrazione orale di fenilbutazone 50 mg/kg aumenta la fragilità della mucosa. Il ritardo ottimale che separa questa somministrazione dal momento della sperimentazione è di 6 ore. Gli effetti osservati sono essenzialmente disturbi vascolari.
Variazioni evolutive della tirosina idrossilasi e dell'acetilcolinesterasi nei gangli simpatici di pollo embrionali e post-schiusa.Le variazioni evolutive della tirosina idrossilasi (TH) e dell'acetilcolinesterasi (AChE) sono stati studiati nei gangli simpatici di pollo embrionale e post-cova. Diversi livelli di attività TH sono stati trovati in due diversi allevamenti di pollo livornese bianco, che probabilmente dipendono da differenze genetiche. Queste differenze enzimatiche, tuttavia, non diventano evidenti prima schiusa e può indicare un effetto combinato di variazione genetica e richieste funzionali. Durante il periodo di incubazione, l'attività del TH è caratterizzata da un aumento pronunciato e costante dal dodicesimo giorno di incubazione fino al giorno 2 dopo la schiusa. Ciò corrisponde ad un periodo di intensa maturazione del neurone simpatico. Nel periodo successivo alla schiusa, il \'fenomeno di caduta del quarto giorno\' precedentemente descritto da noi per DOPA decarbox l'ilasi (DDC), la dopamina-beta-idrossilasi (DBH) e la monoamino ossidasi (MAO) non sono presenti nella curva TH. Invece, l'attività TH tende a rimanere costante tra i giorni 2 e 14 dopo la schiusa (ah). Sia la proteina gangliare che il peso rimangono costanti in questo periodo, indicando una fase di pausa generale nella sintesi proteica. L'attività dell'AChE aumenta costantemente dall'ottavo al ventunesimo giorno di incubazione. Un improvviso e significativo calo dell'attività dell'AChE è stato riscontrato al giorno 2h seguito da un periodo di rapido aumento al giorno 3h e un livellamento dell'attività fino al giorno 30h. Confrontando le attuali variazioni con quelle osservate nei nostri precedenti studi su DBH, si osserva una relazione temporale tra attività TH e DBH durante le fasi di sinaptogenesi e maturazione ma non durante la fase di intensa attività funzionale. I nostri risultati suggeriscono fortemente che prima della schiusa nei gangli simpatici dell'embrione di pollo, i terminali presinaptici colinergici svolgono un ruolo nella regolazione dello sviluppo dei neuroni adrenergici. Nel periodo successivo alla schiusa, invece, i livelli di DBH e TH nei corpi cellulari sembrano essere principalmente regolati dall'attività funzionale. Ciò si traduce nell'esaurimento di DBH, ma non di TH, attraverso la liberazione insieme al neurotrasmettitore alla periferia. L'esaurimento del DBH ai terminali può comportare un aumento del trasporto e quindi l'esaurimento nel corpo cellulare. Questo meccanismo è probabilmente responsabile della differenza nei profili di attività di DBH e TH nei corpi cellulari osservati nella prima settimana dopo la schiusa.
Valutazione nell'ileo di cavia e nel dotto deferente di topo di benzomorfani che hanno una forte attività antinocicettiva ma non sostituiscono la morfina nella scimmia dipendente.1 Quattro benzomorfani che hanno una potente attività antinocicettiva nei test con piastra calda e contorcersi nel topo, ma non sopprimono o accelerano i sintomi di astinenza nella scimmia morfina-dipendente, sono stati esaminati per le loro azioni farmacologiche nell'ileo di cavia e nei vasi del topo deferenti.2 Nell'ileo di cavia le loro potenze agoniste sono da 1,5 a 400 volte superiori a quelle della normorfina della morfina mentre nei vasi deferenti di topo le loro potenze relative alla morfina sono da 0,3 a 100. Non mostrano attività antagonista in nessuna delle due preparazioni. che sostituiscono la morfina nella scimmia morfina-dipendente non mostrano tali differenze tra le loro potenze relative nell'ileo di cavia e nel topo vas diferens. 3 Le potenze relative del f i nostri benzomorfi per inibire il legame stereospecifico della [3H]-diidromorfina da parte dei frammenti di membrana del cervello di ratto, sono più strettamente correlati alle loro relative potenze agoniste nel dotto deferente di topo rispetto a quelli trovati nell'ileo di cavia. 4 Per antagonizzare l'azione agonista di questi benzomorfi, il naloxone è richiesto in concentrazioni da 3 a 7 volte superiori a quelle necessarie per l'antagonismo della normorfina o della morfina o dei benzomorfi che sopprimono l'astinenza nelle scimmie morfina-dipendenti. 5 Potrebbe essere possibile utilizzare i tre saggi, vale a dire, rapporto tra la potenza relativa dell'agonista nel dotto deferente di topo rispetto a quello nell'ileo di cavia, il rapporto tra la potenza relativa dell'agonista e l'affinità relativa ai recettori degli oppiacei e la concentrazione di nalozone richiesta per l'antagonismo, per la previsione del potenziale di nuovi composti per produrre dipendenza fisica.
Prostaglandine nel liquido piometriale di vacca, cagna e furetto.1 La piometra è una malattia dell'utero solitamente associata a infezione batterica e ostruzione.2 Grandi quantità di liquido spesso si raccolgono nell'utero durante questa condizione.3 Il liquido piometriale ottenuto da tre specie è stato trovato contenere prostaglandina F2alfa, solitamente in grandi quantità.4 La prostaglandina E2 era presente in quantità minori in cinque dei sei campioni.5 Questi risultati sono discussi in relazione alla presenza nota di prostaglandine nel liquido infiammatorio e al problema dell'infertilità.
Evoluzione dei disturbi respiratori funzionali in diversi tipi di pneumoconiosi.Tre gruppi omogenei di pazienti con silicosi, lavoratori del carbone\' pneumoconiosi e saldatori ad arco\' pneumoconiosi era stata riesaminata dopo un intervallo di sei anni. Gli stessi esami sono stati ripetuti di volta in volta allo scopo di valutare l'evoluzione delle alterazioni radiografiche e funzionali. Il decorso clinico, i reperti radiografici e i risultati dei test funzionali differivano nei tre gruppi. In silicosi e pneumoconiosi dei lavoratori del carbone\' i cambiamenti radiografici hanno mostrato una progressione distinta. Questa progressione era meno evidente nella pneumoconiosi dei lavoratori del carbone\', ma il deterioramento della funzione polmonare era più pronunciato rispetto alla silicosi, apparentemente dovuto all'enfisema. Nella pneumoconiosi dei saldatori i cambiamenti radiografici hanno mostrato una chiara tendenza alla regressione e la funzione respiratoria non è stata compromessa.
[Ultrastruttura delle sinapsi neuromuscolari nella sindrome miastenica di Lambert-Eaton].È stato effettuato uno studio sull'ultrastruttura delle sinapsi neuromuscolari in i pazienti con la sindrome miastenica di Lambert-Eaton. La maggior parte delle sinapsi mostrava un aumento del contenuto di vescicole sinaptiche nei terminali degli assoni e le pieghe sinaptiche anastomotiche erano aumentate in numero e profondità. Modifiche distruttive locali sono state trovate nei terminali di alcune sinapsi. I dati ottenuti hanno confermato il fatto che questa sindrome era alla base di un disordine del rilascio del trasmettitore dalle strutture presinaptiche.
Immobilizzazione enzimatica su fibrina.Si possono trarre le seguenti conclusioni sull'utilizzo della fibrina nei sistemi enzimatici immobilizzati. La fibrina può essere utilizzata sia come polvere o membrana, per immobilizzare in modo covalente la tripsina con ritenzione di attività. La tripsina marcata con carbonio 14 può essere utilizzata per stimare la quantità di enzima immobilizzato su un supporto proteico. Sulla superficie del supporto sono presenti quantità significative di enzima accoppiato non covalentemente (adsorbito). L'attività dell'esterasi della tripsina marcata immobilizzata era inversamente proporzionale alla quantità di enzima attaccato. L'idrolisi ottimale del TAME si è verificata a pH 8-8,4. La stabilità alla conservazione della tripsina è stata migliorata. L'inibizione dell'attività dell'esterasi della tripsina si è verificata a concentrazioni di substrato superiori a 30 mM.
Studi sulla tripsina immobilizzata in alte concentrazioni di solventi organici.La tripsina è stata immobilizzata covalentemente su vetro poroso in presenza e assenza di un substrato specifico e ha reagito in vari solventi organici di diverse costanti dielettriche. Sono stati determinati la concentrazione ottimale del solvente, il profilo del pH, Km (app), Vmax (app), la produttività in funzione della temperatura, l'attività e le velocità di reazione. Sono state confrontate le velocità di reazione di sei lisil dipeptidi. La tripsina cristallina è stata dansylated per studi con tecniche di fluorescenza a nanosecondi per determinare gli effetti dell'introduzione di alte concentrazioni di solventi organici sulla molecola. I risultati hanno indicato che sono state osservate velocità di reazione maggiori con dipeptidi aventi gruppi carbossilici più acidi. I dati hanno anche indicato che sono state osservate velocità di reazione maggiori in concentrazioni più elevate di solventi con costanti dielettriche inferiori Spettroscopia a fluorescenza a nanosecondi della tripsina in concentrazioni elevate di un solvente a bassa costante dielettrica indica una disidratazione maggiore anche se in queste condizioni è stata raggiunta la massima attività enzimatica.
L'autoassociazione dell'adenosina-5\'-trifosfato studiata mediante dicroismo circolare a basse forze ioniche.L'autoassociazione dell'adenosina-5 \'-trifosfato (ATP) è stato studiato in funzione del pH, dei controioni aggiuntivi, della concentrazione e della temperatura. Le misurazioni del dicroismo circolare sono state impiegate come misura dell'impilamento delle basi. L'autoassociazione dell'ATP è dipendente dal pH con la protonazione del anello di adenina aiutando a stabilizzare l'associazione. Controioni altamente caricati alterano questa aggregazione. A pH 2,8 e 20 gradi C, si ottiene una costante di dimerizzazione di 88 M-1, mentre un modello isodesmico porta ad una costante di equilibrio di 158 M-1. Con l'aumentare pH, le costanti di associazione diminuiscono. A pH 2,8 c'è una forte dipendenza dalla temperatura dell'ampiezza CD. Questi risultati indicano l'esistenza di un'ulteriore stabilizzazione elettrostatica per l'impilamento degli anelli di adenina. A pH acidi, vengono proposti modelli per spiegare questo alto D grado di stabilità e un calcolo del contributo elettrostatico approssimativo all'aggregazione mostra che è della giusta grandezza.
Indagini termodinamiche sulle proteine. III. Descrizione termodinamica del lisozima.Funzioni standard dell'entalpia, dell'entropia e dell'energia di Gibbs del lisozima nativo e denaturato nel intervallo di 0-100 gradi C e pH 1,5-7,0 sono rappresentati in proiezioni tridimensionali. Il cambiamento di energia di Gibbs denaturazionale raggiunge 16 kcal mol-1 in condizioni di massima stabilità proteica (0 gradi C, pH 4,5-7,0) ed è uguale a 14,5 kcal mol-1 a 25 gradi C e pH neutro. Questo risultato è stato trovato in accordo con i dati riportati dagli studi di denaturazione del cloridrato di guanidina Le funzioni termodinamiche parziali dei cambiamenti conformazionali e ionizzanti della proteina sono ottenute dall'entropia e dall'energia di Gibbs cambiamenti nella denaturazione. L'entropia parziale conformazionale e il cambiamento di energia di Gibbs sono risultati indipendenti dal pH. L'entropia di ionizzazione parziale dipendente dal pH e i cambiamenti di energia di Gibbs sono indotti dalla normalizzazione del comportamento di ionizzazione r di gruppi sepolti e causano una diminuzione della stabilità proteica.
Indagini termodinamiche su proteine. I. Funzioni standard per proteine con lisozima come esempio.Si propone un metodo diretto per ottenere funzioni standard termodinamiche per e proteine denaturate utilizzando dati sperimentali da calorimetria a scansione, calorimetria isotermica e titolazioni potenziometriche. La possibilità di questo approccio è dimostrata sull'esempio di lisozima nell'intervallo di pH 1,5-7,0 e temperatura 0-100 gradi C. Test per la validità del le funzioni ottenute di entalpia ed entropia sono presentate sotto forma di processi ciclici utilizzando dati sperimentali ottenuti da percorsi termodinamicamente diversi. La funzione di Gibbs viene verificata confrontando i risultati di un metodo indipendente. Sono discussi i problemi metodici nella determinazione e nel controllo delle funzioni standard per le proteine in dettaglio.
Cinetica della trasformazione disordinata da catena a beta di poli(L-tirosina) in soluzione acquosa.La cinetica della trasformazione di poli( L-tirosina) dalla catena disordinata alla struttura beta intramolecolare in soluzione acquosa. La reazione è indotta da un salto isotermico del pH ed è seguita da metodi convenzionali di dicroismo circolare. Dopo l'applicazione di procedure di adattamento della curva, si è riscontrato che la cinetica è scarsamente rappresentata da un singolo processo del primo ordine, ma è adeguata un'equazione del primo ordine sequenziale in due fasi. Sono stati trovati massimi dipendenti dal pH nelle costanti di velocità fenomenologiche e nell'ampiezza frazionaria del passaggio rapido proposto di attribuire questi fenomeni a una transizione negli stati iniziali che si è dimostrato verificarsi nello stesso intervallo di pH all'interno del dominio della transizione disordinata a beta. Non sono state osservate curve transitorie sigmoidi, indicando che non sono riconoscibili eventi di nucleazione lenta in questo sistema. Queste osservazioni contrastano sorprendentemente con il meccanismo elaborato per la formazione di beta in (Lys)n [R. Hartman et al. , J. Mol. Biol. 90 (1974) 415].
Trasporto dell'ossigeno da parte dell'emoglobina. Confronto tra sangue intero, eritrociti lavati e soluzione di emoglobina.Le proprietà del trasporto dell'ossigeno dell'emoglobina sono state confrontate in tre diverse condizioni : globuli rossi nel loro ambiente naturale, cioè plasma (sangue intero), globuli rossi lavati ed emoglobina A, il primo sospeso, il secondo sciolto in tampone tris iso-osmotico L'affinità dell'emoglobina dell'ossigeno (espressa come P50) e il Bohr respiratorio le variazioni dell'effetto sono state studiate con mezzi modificati e pH invariato e concentrazione di 2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG). Se si riferiscono al pH intra-eritrocitario, nessuno di questi valori è stato modificato al variare dell'ambiente. Questi risultati suggeriscono che il L'interazione dei tre principali ligandi (ioni H+, 2,3-DPG e CO2) con l'emoglobina è in gran parte predominante su altri fattori che interferirebbero e può spiegare completamente il trasporto di ossigeno da parte dell'emoglobina.
clearance PAH, escrezione di sodio e rapporto di estrazione di PAH in agnelli a breve termine con acidosi trattati con bicarbonato di sodio ipertonico.I cambiamenti degli elettroliti e l'aggiustamento dell'emodinamica renale al bicarbonato di sodio ipertonico (NaHCO3) è stata studiata la correzione di un'acidosi metabolica in 4 agnelli neonati e in 2 controlli. La clearance della PAH è aumentata da 0,92 a 1,65 ml/min/kg (p inferiore a 0,05), flusso di urina da 0,37 a 0,61 ml/ min/kg (p inferiore a 0,05) ed escrezione di Na da 8,4 a 23,7 muEq/min/kg (p inferiore a 0,05) durante l'infusione di NaHCO3. Questi aumenti sono stati transitori e sono tornati ai livelli pre-infusione dopo l'infusione di NaHCO3. L'assunzione e la produzione di Na hanno rivelato una ritenzione netta di 5,1 mEq/kg negli agnelli dello studio che si è riflesso in un aumento del Na sierico e dell'osmolarità (Osm) durante il periodo successivo all'infusione di NaHCO3. Il rapporto di estrazione del p-aminoippurato di sodio (EPAH ) e la sua relazione con il pH arterioso sono stati studiati in altri 4 agnelli L'EPAH non è cambiato con l'acidosi metabolica, ma per ragioni sconosciute, l'infusione di NaHCO3 ha provocato una depressione temporanea dell'EPAH (p inferiore a 0,001).
[Formazione di fibrille in soluzioni di collagene solubilizzato].L'influenza dei preparati di proteinasi batteriche, protorisina e prototerrisina, è stata studiata sulla stabilità del collagene maturo della pelle bovina. È stato dimostrato che la composizione chimica del tessuto viene modificata in modo trascurabile da questi enzimi. Il tessuto trattato con orisina e terrisina viene completamente sciolto in acido acetico 0,5 M (collagene solubilizzato). Quando le soluzioni di tale collagene sono riscaldate a 37 gradi nell'intervallo di pH da 4 a 10 alla forza ionica di 0,25 fibrille si formano al microscopio elettronico le fibre sono cross-striate che è tipico delle fibre di collagene nativo con periodicità di circa 640 A. Dopo il raffreddamento a 4 gradi, una parte delle fibrille viene nuovamente sciolta. La neflometria è stata utilizzata per studiare la velocità di formazione delle fibrille in funzione dei valori di pH e temperatura. Si è giunti alla conclusione che la collagene matura si è sciolta dopo l'incubazione con batterica pr oteinases è vicino alla frazione di collagene solubile in acido nella capacità di produrre fibre per riscaldamento.
[Studio comparativo delle glutammato deidrogenasi della clorella].Le proprietà cinetiche della costitutiva doppia specifica glutammato deidrogenasi (NAD(P)--GDH) e la glutammato deidrogenasi NADP-specifica inducibile (NADP--GDH) di Chlorella pyrenoidosa Pringsheim 82T (ceppo termofilo) in una reazione di deaminazione NAD(P)-GDH si comporta in una deaminazione come un enzima di Michaelis-Menten. La GDH mostra un certo periodo di latenza prima di una fase di stato stazionario. La durata di questa latenza dipende dalla concentrazione del substrato. Inoltre, è stato studiato un effetto di tutti i substrati sull'inattivazione termica sia della GDH che sull'inibizione del prodotto. substrati ad eccezione dei cofattori ridotti proteggono efficacemente GDH dall'inattivazione termica, in particolare il termolabille NADP-GDH. Al contrario, NAD(P)-H promuovono l'inattivazione termica di entrambi GDH. L'analisi di inibizione del prodotto mostra che il NADP- inducibile GDH agisce in vivo come un enzima sintetico n il documento precedente (V. R. Shatilov et all. , 1974, Dokl. Acad. Nauk URSS, 216,223) è stato dimostrato per il GDH costitutivo che p-CMB fortemente inibisce una desaminazione e leggermente (se presente) influenza un'amminazione. In questo articolo viene mostrato che l'azione del p-CMB sull'amminazione dipende dalla presenza di NAD+ (non NADP+ o L-glutammato). p-CMB e NAD+ influenzano l'amminazione in maniera fortemente sunergetica. Vengono forniti alcuni suggerimenti sulla localizzazione intracellulare della clorella GDH.
[Purificazione e alcune proprietà delle varianti elettroforetiche della 6-fosfogluconato deidrogenasi da eritrociti di ratto].Procedura di purificazione delle varianti elettroforetiche FF e SS di 6- viene descritta la fosfogluconato deidrogenasi (6-PGD). Il metodo include il frazionamento (NH4)2SO4 e la cromatografia su DEAE- e CM-cellulosa. Gli isoenzimi sono stati purificati circa 5000 volte e sono stati trovati omogenei mediante elettroforesi su disco in gel di poliacrilammide al 7%. È stato trovato da studi comparativi sulle attività delle varianti FF e SS, che il pH ottimale era 8,2 per la variante FF e 8,8 per la variante SS. Km per il 6-fosfogluconato è risultato essere 17,5-10(-5) M per le varianti SS e FF rispettivamente.
[Purificazione, molteplicità molecolare e proprietà cinetiche della "biosintetica" L-treonina deidratasi da E. coli K-12]." La L-treonina deidratasi biosintetica è stata purificata allo stato omogeneo con una resa del 29% dell'attività totale da E. coli K-12. Le cellule sono state distrutte mediante ultrasuoni. Gli acidi nucleici e le nucleoproteine sono stati precipitati con solfato di protamina, le proteine sono state frazionato con (NH4)2SO4, mediante gel filtrazione su Sephadex G-25 seguita da cromatografia su DEAE-cellulosa mediante eluizione a gradini modificando i valori di pH. L'omogeneità dell'enzima è stata dimostrata mediante elettroforesi su disco di gel di poliacrilammide in presenza di dodecilsolfato. L'enzima è costituito da subunità uguali aventi un peso molecolare di circa 57000. L'elettroforesi del disco su gel di poliacrilammide aveva dimostrato che l'enzima nativo è costituito da un insieme di forme oligomeriche. La molteplicità dell'organizzazione molecolare dell'enzima è stata riflessa in complicate cinetiche comportamento: a pH maggiore di 9 sui grafici della velocità di reazione iniziale (upsilon) rispetto alla concentrazione iniziale del substrato ([S]0) c'erano quattro punti di inflessione (due plateaux intermedi) la cui posizione e profondità dipendevano dalla concentrazione dell'enzima. Le proprietà cinetiche dell'enzima altamente purificato e dell'enzima negli estratti cellulari grezzi a pH 9,3 e 7,4 erano identiche. A pH 8,3 sui grafici upsilon versus [S]0 sono comparsi due punti di inflessione (un plateau intermedio), la cui posizione praticamente non dipendeva dalla concentrazione dell'enzima nella miscela di reazione ma dipendeva fortemente dalla concentrazione dell'enzima nella soluzione madre. L'elettroforesi ripetuta del disco di gel di poliacrilammide di diverse forme oligomeriche isolate dalla prima elettroforesi aveva mostrato che le forme oligomeriche subivano una lenta polimerizzazione. Si suggerisce che la L-treonina deidratasi "biosintetica" di E. coli K-12 sia un insieme di molteplici forme oligomeriche con diversi parametri cinetici. Probabilmente, ogni forma dell'enzima ha una cinetica "semplice" caratterizzata da una forma iperbolica o sigmoidale di grafici upsilon contro [S]0. La velocità di equilibrio tra le forme oligomeriche è piccola rispetto alla velocità della reazione enzimatica, che porta alle complesse curve cinetiche che appaiono come risultato della sommatoria delle cinetiche inerenti alle singole forme.
[Effetto di IAA sulla fotofosforilazione di cloroplasti isolati dai piselli].Effetto di IAA (10(-10)-10(-3) M ) sulla fotofosforilazione, viene studiata la riduzione di NADP e lo scambio di ossigeno. È dimostrato che basse concentrazioni di IAA (10(-10)-10(-7) M) aumentano la reazione di fotofosforilazione e il flusso di elettroni a NADP nelle condizioni di fosforilazione nei cloroplasti, e il loro effetto sullo scambio di O2 non è lo stesso in diversi tipi di fotofosforilazione. Si suppone che l'effetto di IAA sulla fotofosforilazione sia connesso con il metabolismo di H292 nei cloroplasti e con le funzioni catalasi e perossidasi.
[Capacità di reazione e cinetica di alchilazione dei gruppi solfidruri della succinato deidrogenasi solubile].Cinetica di inibizione del succinato - un accettore dell'attività ossidoriduttasi del succinato solubile viene studiata la deidrogenasi da parte della N-etilmaleimmide. La reazione di alchilazione è descritta dall'equazione cinetica del primo ordine, il cui coefficiente stechiometrico è 1. Il legame dei gruppi solfidruri enzimatici da parte del p-cloromercuriobenzoato blocca l'alchilazione enzimatica e la sua inibizione da parte dell'ossalacetato. Il succinato protegge succinato deidrogenasi dall'effetto inibitorio della N-etilmaleimmide. La reazione dell'enzima con un agente alchilante in presenza di diverse concentrazioni di substrato corrisponde cineticamente al modello, secondo il quale un gruppo solfidrico agisce nel sito attivo dell'enzima. pKa di questo gruppo è 7,0 a 20 gradi C. La dipendenza della velocità massima di reazione di ossidazione del substrato e quella della velocità di alchilazione dell'enzima dal pH coi nside nell'intervallo di pH 5,8--7,8. La presenza di anioni nel mezzo di alchilazione diminuisce la capacità di reazione del sito attivo rispetto alla N-etilmaleimmide. Si ipotizza un meccanismo della fase iniziale dell'ossidazione del succinato con la cooperazione del gruppo solfidrico del sito attivo dell'enzima.
[Analisi dell'aptoglobina nel siero del sangue di pecora].Tre tipi di aptoglobina (Hp), che differiscono per il numero di bande del complesso Hp-Hb su gel di poliacrilammide si trovano elettroforegrammi nel siero di sangue di pecora. Le frazioni HpA, HpB e HpC includevano rispettivamente una, due-tre e sei-otto bande. Viene descritta una procedura modificata per l'isolamento dell'HpC. Effetti di urea, sodio dodecilsolfato, beta-mercaptoetanolo , pH e maleinizzazione sul comportamento di HpC sotto elettroforesi su gel di poliacrilammide. I dati ottenuti suggeriscono che la molecola di HpC è costituita da due subunità (di tipo alfa e beta), legate con legami S--S in un alfabeto-dimero, che formare un'intera molecola di HpC a spese dei legami non covalenti.
[Isolamento e proprietà di una preparazione omogenea di L-asparaginasi da Pseudomonas fluorescens AG].L-asparaginasi altamente purificata con un'attività specifica di 500+ da cellule di Pseudomonas fluorescens AG viene isolata la proteina +/-40 IU. /mg. La procedura di purificazione comprende il frazionamento dell'isopropanolo, la gel filtrazione su Sephadex G-100, la cromatografia su colonne di idrossiapatite e DEAE-cellulosa. base dei dati dell'elettroforesi su gel di poliacrilammide. Il pH ottimale risulta essere 8,0-9,0, il punto isoelettrico e il peso molecolare sono rispettivamente 4,5+/-0,05 e 70.000+/-5.000, Km per L-asparagina essendo -4,1-10(-4 )M. L'enzima non idrolizza la L-glutammina. La velocità di idrolisi della D-glutammina è inferiore all'1% della velocità di deamidazione dell'isomero L. p-cloro-mercurio benzoato ad una concentrazione di 10(-4) M completamente inibisce l'attività dell'asparaginasi Asparaginasi da Ps. fluorescens AG possiede e an attività tileucosica, inibendo l'incorporazione della 3H-timidina nel DNA delle cellule di linfoma di Berkit.
[Varie proprietà del sistema di trasporto della creatina e posizione della creatina chinasi nei mitocondri del muscolo scheletrico].Il contenuto di acqua e creatina è stato studiato nello scheletro di ratto mitocondri muscolari dopo la loro incubazione di 5 minuti in soluzioni di creatina, pH 7,2 o 8,4 Il contenuto di acqua e creatina nei mitocondri è risultato essere più alto a pH 8,4 rispetto a pH 72, il contenuto di creatina era correlato al contenuto di acqua. analoghi, contenenti amminogruppi con pKa maggiore o uguale a 9,5 o gruppi carbossilici, inibiscono più fortemente l'infusione di creatina nei mitocondri rispetto a sostanze aventi amminogruppi con pKa minore di 5. La forma penetrante è creatina anfiione, l'effetto del pH sulla permeabilità è probabilmente a causa dell'attivazione del trasmettitore di creatina. I mitocondri del muscolo scheletrico di ratto contengono creatina chinasi su entrambi i lati della membrana interna. Questa conclusione si basa sul fatto che in condizioni, supplyi ng il corso diretto della reazione della creatinchinasi (il mezzo di incubazione contiene Ca2+ e creatina; pH 7,8), l'ADP produce la stimolazione della respirazione mitocondriale fino all'esaurimento dell'ossigeno in un'unità polarografica. Allo stesso modo, l'ADP stimola irreversibilmente la respirazione mitocondriale in presenza di 1 mM EDTA, se EDTA e ADP vengono aggiunti dopo la preincubazione dei mitocondri in un mezzo contenente creatina e dopo aver accumulato piccole quantità di Ca2+ da parte dei mitocondri.
[Purificazione parziale e proprietà della proteasi da Torula thermophila].La preparazione di proteasi purificata 11 volte è isolata dal terreno di coltura di Torula thermophila UzPT-1 mediante precipitazione di solfato di ammonio e cromatografia su gel tramite Sephadex G-100. L'elettroforesi su gel di poliacrilammide su disco ha rivelato due componenti della porteasi, uno dei quali dotato di attività proteolitica. L'intervallo di pH per l'attività della proteasi è risultato essere 3,5-12, l'attività massima è stata osservata a pH 8,5-11, la più alta resistenza enzimatica - a pH 6-8. L'enzima ha conservato quasi completamente la sua attività per 1 ora in acqua distillata a 60 gradi C. La temperatura massima dell'attività enzimatica era di 70 gradi a pH 8. enzima può essere riferito a proteasi di natura serina, perché completamente inattivato con diisopropilfosfofluoruro, ma mantiene l'attività in presenza di agenti chelanti (EDTA, o-fenantrolina, ditizone) e inibitori dei gruppi SH (sod ium p-cloromercurio benzoato, acido iodoacetico). L'enzima non è stato inattivato con il fenilmetilsulfonilfluoruro e l'inibitore della tripsina della soia. La proteasi ha studiato in modo più efficiente la caseina e l'emoglobina idrolizzate, in misura minore, l'albumina sierica umana e il fibrinogeno e quasi non ha attaccato l'albume dell'uovo. L'enzima subisce associazione-dissociazione al variare del pH durante la filtrazione su gel tramite Sephadex.
Il tasso di assorbimento del calcio nel reticolo sarcoplasmatico del muscolo cardiaco e del muscolo scheletrico. Effetti della proteina chinasi ciclica AMP-dipendente e della fosforilasi b chinasi.Calcio È stato studiato il trasporto in frammenti del reticolo sarcoplasmatico isolati dal muscolo cardiaco e scheletrico misto (quadricipite) del cane e dai muscoli scheletrici misti veloci (tibiale), puro veloce (caudofemoralis) e puro lento (soleo) del gatto. la fosforilasi b chinasi ha stimolato la velocità di trasporto del calcio sebbene sia stata osservata una certa variabilità. Un inibitore specifico della proteina chinasi ha impedito l'effetto della proteina chinasi ma non della fosforilasi b chinasi. L'aggiunta di AMP ciclico alle preparazioni del reticolo sarcoplasmatico in assenza di proteina chinasi aveva solo un leggero effetto stimolante nonostante la presenza di protein chinasi endogena La protein chinasi ciclica AMP-dipendente ha catalizzato la fosforilazione di diversi componenti presenti nel frammenti di reticolo sarcoplasmatico; un picco da 19000 a 21.000 dalton è stato fosforilato con un'elevata attività specifica in preparazioni di reticolo sarcoplasmatico isolate dal cuore e dal muscolo scheletrico lento, ma non dal muscolo scheletrico veloce. La fosforilasi b chinasi ha fosforilato un picco di peso molecolare 95000 in tutte le preparazioni. La fosforilazione stimolata dalla proteina chinasi ciclica AMP-dipendente era ottimale a pH 6,8; la fosforilazione della fosforilasi b chinasi aveva una curva bifasica nel muscolo scheletrico cardiaco e lento con ottimi a pH 6,8 e 8,0. L'aggiunta di fosforilasi b chinasi esogena o protein chinasi ha aumentato il livello endogeno di fosforilazione del 25-100%. Tutti i preparati del reticolo sarcoplasmatico contenevano quantità variabili di adenilato ciclasi, fosforilasi b e a (b:a = 30.1), enzima "debrancher" e glicogeno (0,3 mg/mg di proteine), nonché quantità variabili di protein chinasi e fosforilasi b chinasi responsabili di una significativa fosforilazione endogena. Pertanto, i due enzimi fosforilanti hanno stimolato l'assorbimento del calcio nel reticolo sarcoplasmatico di una varietà di muscoli che possiedono diverse caratteristiche fisiologiche e diverse risposte ai farmaci. Inoltre, la fosforilazione catalizzata da questi enzimi è avvenuta in due diverse frazioni proteiche che rendono difficile l'interpretazione fisiologica del ruolo della fosforilazione. Mentre il ruolo della fosforilazione in questi meccanismi è complesso, la presenza di un sistema enzimatico glicogenolitico può essere un collegamento importante in questo fenomeno. Il reticolo sarcoplasmatico rappresenta un nuovo substrato per la fosforilasi b chinasi.
Aggregazione di particelle intramembrana nei fantasmi di eritrociti. II. L'influenza dell'aggregazione di spectrina.Le proprietà fisico-chimiche di miscele di spectrina e actina estratte da fantasmi di eritrociti umani hanno stato correlato con i cambiamenti ultrastrutturali osservati nelle membrane degli eritrociti fratturati per congelamento (1) Le miscele estratte di spectrina e actina hanno una solubilità molto bassa (meno di 30 mug/ml) vicino al loro punto isoelettrico, pH 4,8. Queste miscele sono anche precipitate da bassi concentrazioni di Ca2+, Mg2+, polilisina o proteine basiche (2) Tutte le condizioni che precipitano estratti di spectrina e actina inducono anche l'aggregazione delle particelle intramembrana negli eritrociti spettrali impoveriti Precipitazione delle molecole residue di spettrina in piccole macchie sulla superficie citoplasmatica della membrana fantasma si pensa sia la causa di aggregazioni di particelle, implicando un'associazione tra le molecole di spectrina e le particelle intramembrana. ( 3) Quando i fantasmi freschi sono esposti a condizioni che fanno precipitare estratti di spectrina e actina, si verifica solo un'aggregazione di particelle limitata. Invece, la contrazione del reticolo spettrale intatto indotto dalle condizioni di precipitazione comprime il doppio strato lipidico della membrana, provocandone la fuoriuscita di vescicole prive di particelle e proteine. (4) L'assenza di proteine in queste vescicole lipidiche implica che tutte le proteine della membrana eritrocitaria siano immobilizzate per associazione con il reticolo spettrale o con le particelle intramembrana.
Reazione di derivati dell'uracile e della timina con bisolfito di sodio. Studi sul meccanismo e riduzione dell'addotto.Le velocità e gli equilibri per l'aggiunta di sodio bisolfito a uracile, timina e i loro nucleosidi sono stati studiati per l'intervallo di pH 3-9,5. La velocità di aggiunta per l'uracile è proporzionale alla concentrazione di ione solfito e uracile sindacato. La costante di equilibrio (25 gradi C) per la reazione è (1,0 +/- 0,15) X 10(3) 1 - mol-1 per uracile e 0,62 +/- 0,03 1- mol-1 per timina Un pH di 6-7, con un'elevata concentrazione di bisolfito è suggerito per applicazioni biochimiche della reazione dell'uracile. La reazione dell'uracile, che procede facilmente in condizioni fisiologiche e ha un'elevata costante di equilibrio, può essere una concausa degli effetti biochimici del bisolfito e dell'anidride solforosa. Ulteriori prove sulla struttura dell'addotto timina-bisolfito sono state ottenuta mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare il suo spettro supporta l'assegnazione della struttura come diidrotimina-6-solfonato. L'addotto uracil-bisolfito viene ridotto dal sodio boroidruro a sodio 3-ureido-propanol-2-solfonato. Questa reazione è suggerita per la modificazione chimica degli acidi nucleici.
Alcune proprietà termodinamiche e cinetiche dei reagenti fotochimici primari in un complesso di un batterio fotosintetico verde.Abbiamo esaminato il complesso centro di reazione della batterioclorofilla di Chlorobium limicola f. thiosulfatophilum, ceppo Tassajara. I nostri risultati indicano che il potenziale del punto medio della batterioclorofilla primaria donatrice di elettroni del centro di reazione è +250 mV a pH 6,8, mentre quello del citocromo c-553 è +165 mV. Ci sono due citocromi c-553 emi per centro di reazione e l'ossidazione indotta dalla luce di ciascuno è bifasica (t1/2 inferiore a 5 mus e circa 50 mus). Noi crediamo che questo indichi un equilibrio a due stati con ciascun eme del citocromo che è vicino a , o un po' rimosso dalla batterioclorofilla del centro di reazione. Abbiamo anche titolato l'accettore di elettroni primario del centro di reazione. Il suo potenziale di punto medio di equilibrio a pH 6,8 è inferiore a -450 mV. Questo è molto più basso del precedente es tempo per i batteri verdi, e anche sostanzialmente inferiore ai valori ottenuti per i batteri viola. Un tale accettore primario a basso potenziale sarebbe termodinamicamente in grado di ridurre direttamente il NAD+ attraverso la ferredossina in modo analogo al fotosistema I nei cloroplasti e nelle alghe blu-verdi.
Studi cinetici sulla citocromo c ossidasi mediante spettroscopia combinata di epr e riflettanza dopo congelamento rapido.1. Vengono descritte tecniche ed esperimenti relativi alla cinetica del millisecondo di Variazioni rilevabili EPT nella citocromo c ossidasi per riduzione del citocromo c e, dopo riduzione con vari agenti, per riossidazione con O2 o ferricianuro. Sono riportati anche alcuni esperimenti in presenza di ligandi. L'assorbimento della luce è stato monitorato mediante spettroscopia di riflettanza a bassa temperatura 2. Nella rapida fase di riduzione della citocromo c ossidasi da parte del citocromo c (meno di 50 ms) circa 0,5 elettroni equivalenti per eme a vengono trasferiti principalmente al componente eme a basso spin della citocromo c ossidasi e in parte all'EPR- rame rilevabile. In una fase lenta (meno di 1 s) il rame si riossida e compaiono segnali di eme ferrico ad alto spin con una componente rombica predominante. Contemporaneamente la banda di assorbimento a 655 nm diminuisce e la banda di Soret a 444 nm compare tra la banda di Soret divisa (442 e 447 nm) del citocromo a ridotto. 3. Alla riossidazione dell'enzima ridotto da parte dell'ossigeno, tutte le caratteristiche EPR e ottiche vengono ripristinate entro 6 ms. Alla riossidazione da parte dell'O2 in presenza di un eccesso di citocromo c ridotto, si possono osservare stati in cui i segnali dell'eme a basso spin e del rame sono in gran parte assenti ma l'assorbimento a 655 nm è massimo, indicando che i componenti dell'eme e del rame a basso spin sono sul lato del substrato e il/i componente/i rappresentato/i nell'assorbimento di 655 nm sul lato O2 del sistema. Alla riossidazione con ferricianuro l'assorbimento di 655 nm non viene prontamente ripristinato ma si accumula un eme ferrico ad alto spin, rappresentato da un forte segnale rombico. 4. Alla riossidazione dell'enzima parzialmente ridotto da parte dell'ossigeno, i segnali rombici ad alto spin scompaiono entro 6 ms, mentre i segnali assiali scompaiono più lentamente, indicando che queste specie non sono in rapido equilibrio. Osservazioni simili vengono fatte quando l'enzima parzialmente ridotto viene miscelato con CO. 5. I risultati di questo e del documento allegato vengono discussi e su questa base viene proposta un'assegnazione dei principali segnali EPR e dell'assorbimento di 655 nm, che in sostanza è che pubblicato in precedenza (Hartzell, CR, Hansen, RE e Beinert, H. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. US 70, 2477-2481). Sia i segnali a basso spin (g=o; 2.2; 1.5) che ad alto spin (g=6; 2) che appaiono lentamente sono attribuiti al citocromo ferrico a, mentre si pensa che l'assorbimento di 655 nm derivi dal citocromo ferrico a3, quando è presente in uno stato di interazione con rame non rilevabile EPR. Vengono discusse possibilità alternative e possibili incongruenze con questa proposta.
Effetto di NADP sui cambiamenti del citocromo indotti dalla luce nei frammenti di membrana di un'alga blu-verde.L'effetto di NADP+ sui cambiamenti del citocromo indotti dalla luce cambiamenti di stato redox dei citocromi legati alla membrana sono stati studiati in frammenti di membrana preparati dalle alghe blu-verdi Nostoc muscorum (ceppo 7119) che avevano alti tassi di trasporto di elettroni dall'acqua a NADP+ e da un donatore di elettroni artificiale, ridotto diclorofenolindofenolo (DCIPH2) a NDAP+. I frammenti di membrana contenevano pochissima ficocianina e avevano eccellenti proprietà ottiche per i saggi spettrofotometrici. Con DCIPH2 come donatore di elettroni, NADP+ non aveva alcun effetto sui cambiamenti redox indotti dalla luce dei citocromi: con o senza NADP+, 715- o 664-nm l'illuminazione ha provocato principalmente l'ossidazione del citocromo f e di altri componenti che possono includere un citocromo di tipo c con un picco alfa a 549 nm Con un'illuminazione a 664 nm e l'acqua come donatore di elettroni, NADP+ ha avuto un effetto pronunciato su lo stato redox dei citocromi, causando uno spostamento verso l'ossidazione di un componente con un picco a 549 nm (possibilmente un citocromo di tipo c), il citocromo f, e in particolare il citocromo b559. Il citocromo b559 sembrava essere un componente della principale catena di trasporto degli elettroni non ciclici ed è stato fotoossidato a temperature fisiologiche dal Photosystem II. Questa fotoossidazione era evidente solo in presenza di un accettore terminale (NADP+) per il flusso di elettroni dall'acqua.
Reazioni primarie del fotosistema II a pH basso. I. Fluorescenza rapida e ritardata.La fluorescenza della clorofilla pronta e ritardata è stata studiata in cloroplasti di spinaci spezzati a Valori di pH fino a 2,6. Non è stato osservato alcun effetto diretto del pH basso sulla separazione della carica primaria nel Fotosistema II. È stata dimostrata l'inattivazione irreversibile di un donatore di elettroni secondario in un intervallo di pH ristretto intorno a pH 4,5. A valori di pH più bassi la forma fotoossidata di un donatore di elettroni più primario, rivelato dalla sua efficiente estinzione della fluorescenza, è stato ridotto con un tempo dimezzato di circa 200 mus, il 25% da un altro donatore di elettroni e il 75% dalla reazione di ritorno con l'accettore ridotto. La donazione di elettroni ha avuto un tempo dimezzato di 800 mus ed era praticamente irreversibile. La reazione di ritorno ha avuto un tempo di dimezzamento pH dipendente: circa 270 mus a pH 4 e crescente verso il pH inferiore. La competizione di entrambe le reazioni ha determinato un'efficienza netta della separazione di carica a pH 4 del 25%, aumentandoverso un pH più basso.
Un possibile meccanismo di generazione di ossigeno molecolare singoletto nella perossidazione lipidica microsomiale nadph-dipendente.Un sistema semplificato, costituito da NADPH, Fe3+-ADP , EDTA, liposomi, NADPH-citocromo c reduttasi e tampone Tris - HCl (pH 6.8), sono stati impiegati negli studi sulla generazione di ossigeno singoletto nella perossidazione lipidica microsomiale NADPH-dipendente La luce emessa dal sistema coinvolge ossigeno molecolare di tipo 1deltag identificabile dal suo caratteristico spettro di emissione e dal suo comportamento con il beta-carotene. La generazione di un'altra specie eccitata (un composto allo stato di tripletto) potrebbe essere dimostrata in questo sistema da cambiamenti di intensità luminosa e spettri di emissione che derivano dal fotosensibilizzatore (9,10 -dibromoantracene solfonato, eosina, Rose-Bengala)-trasferimenti di energia mediati La chemiluminescenza nella regione visibile è stata marcatamente spenta da vari radicali trapper e da un inibitore della NADPH-citocromo c reduttasi, ma non da superox ide dismutasi. Durante la fase iniziale della perossidazione lipidica, l'intensità della chemiluminescenza era proporzionale al quadrato della concentrazione di perossido lipidico. Queste caratteristiche suggeriscono che l'ossigeno singoletto e un composto allo stato di tripletta (probabilmente un composto carbonilico) sono generati da un'auto-reazione dei radicali lipidi perossidici.
Relazioni tra potenziale elettrico, gradiente di pH, flusso di protoni e fosforilazione nella membrana fotosintetica.Il potenziale elettrico transmembrana (deltaphi), il flusso di protoni (H+), la velocità di trasporto degli elettroni (e), il gradiente di pH (deltapH) e la velocità di fosforilazione (ATP) sono state misurate nei cloroplasti degli spinaci. La fotosintesi è stata eccitata periodicamente con lampi di frequenza e intensità variabili. Un nuovo metodo è descritto per determinare la velocità di trasporto degli elettroni e il flusso di protoni In condizioni in cui la velocità di trasporto di elettroni e il flusso di protoni non sono controllati dal pH, le seguenti correlazioni sono state trovate nell'intervallo 50 mV inferiore o uguale a deltaphi inferiore o uguale a 125 mV e 1,8 minore o uguale a deltapH minore o uguale a 2,7: (1) Il gradiente di pH, deltapH, aumenta con H+ indipendentemente da Phout tra 7 e 9. (2) La velocità di fosforilazione, ATP, dipende esponenzialmente da deltapH ( a d. costante eltaphi) ed è indipendente da pHout tra 7-9. (3) La velocità di fosforilazione, ATP, dipende anche dal deltaphi (a deltapH costante ea flusso di protoni H+ costante). (4) Il flusso di protoni attraverso la via ATPasi, Hp+, dipende in modo non lineare dal rapporto delle concentrazioni di protoni: Hp+ approssimativamente (Hin+/Hout+)b, (b=2.3--2.6). Il flusso di protoni attraverso la via basale, Hb+, dipende linearmente dal rapporto delle concentrazioni di protoni: Hb+ circa (Hin/Hout). (5) Il rapporto deltaH+/ATP (e/ATP, cioè il rapporto tra il flusso totale di protoni, Hp+ + Hb+, e la velocità di formazione di ATP, ATP, dipende fortemente da deltaphi e da deltapH. Il rapporto è approssimativamente deltaH+/ATP 3 (e/ATP circa 1,5) a deltapH 2.7 e deltaphi = 125 mV (6) Si suppone che la ragione della dipendenza di deltaH+/ATP da deltaphi edeltapH sia la diversa dipendenza funzionale del flusso protonico basale Hb+ e flusso protonico fosforilante Hp+ su deltapH e deltaphi. Il calcolo di deltaH+/ATP sulla base di questa ipotesi è in buon accordo con i valori sperimentali. Anche gli effetti "soglia" possono essere spiegati in questo modo. (7) Il rapporto di deltaHp+/ATP, ovvero il rapporto tra il flusso di protoni fosforilanti Hp+ e l'ATP, è deltaHp+/ATP CIRCA 2,4.
Effetto inibitorio del p-nitrotiofenolo alla luce sull'attività del fotosistema II dei cloroplasti di spinaci.Il trattamento dei cloroplasti di spinaci con p-nitrotiofenolo nel la luce a pH acido e neutro provocava una specifica inibizione dell'attività del Fotosistema II, mentre lo stesso trattamento al buio non ne influenzava affatto l'attività. L'attività del fotosistema I non era inibita dal p-nitrotiofenolo sia alla luce che al L'inibizione è stata accompagnata da variazioni di fluorescenza da cloroplasti. Come osservato a temperatura ambiente, la banda di 685 nm è stata abbassata dal trattamento con p-nitrotiofenolo alla luce e, alla temperatura dell'azoto liquido, l'altezza relativa dei 695 nm banda alla banda 685 nm è aumentata e la banda 695 nm si è spostata a lunghezze d'onda più lunghe. Gli spettri di azione per questi effetti del p-nitrotiofenolo sull'attività e sulla fluorescenza hanno mostrato un picco a 670 nm con una caduta rossa a lunghezze d'onda maggiori. concluso t ha la luce assorbita dal Fotosistema II è responsabile della modificazione chimica dei cloroplasti con p-nitrotiopehnolo per causare l'inibizione specifica del Fotosistema II.
Meccanismo di restringimento attivo nei mitocondri. II. Accoppiamento tra forti flussi elettrolitici.1. L'aggiunta di succinato ai mitocondri trattati con valinomicina incubati in KCL causa una grande penetrazione dell'elettrolita. Il processo dipende da un apporto costante di energia e comporta una continua estrusione netta di protoni. Le velocità di respirazione e di penetrazione dell'elettrolita procedono in modo parallelo. 2. Una penetrazione passiva del sale K+ degli anioni permeanti avviene nelle vie respiratorie -mitocondri inibiti dopo aggiunta di valinomicina. L'aggiunta di succinato al termine del rigonfiamento passivo avvia un'estrusione attiva di anioni e cationi con ripristino del volume iniziale. Il ritiro è accompagnato da una lenta ricaptazione dei protoni. L'inizio del ritiro attivo correla con il grado di stiramento della membrana interna. L'estrusione di elettroliti è inibita dalla nigericina, mentre è solo leggermente sensibile alle variazioni della valinomicina c oncentrazioni maggiori di due ordini di grandezza. 3. Rigonfiamento passivo e ritiro attivo si verificano anche quando il K+ è sostituito da una grande varietà di cationi organici. La velocità di penetrazione dei cationi organici è aumentata dal tetrafenilboro, mentre la velocità di estrusione dell'elettrolita è insensibile alla variazione della concentrazione di tetrafenilboro. 4. Il ritiro attivo, sia con K+ che con sali cationici organici, è inibito dagli acidi deboli. L'inibizione del fosfato viene rimossa dagli inibitori dell'SH. Il ritiro attivo è inoltre inibito dal mersalil in misura di circa il 60%. 5. Vengono discussi tre modelli di ritiro attivo: (a) meccanoproteina, (b) pompa protonica elettrogenica e (c) pompa anionica cationica guidata da protoni.
Stimolazione della sintesi di ATP in Halobacterium halobium R1 mediante gradienti di potenziale elettrochimico di protoni indotti dalla luce o creati artificialmente attraverso la membrana cellulare.La relazione tra il movimento dei protoni e la fosforilazione in Halo-bacterium halobium R1 è stata studiata in condizioni anaerobiche. I cambiamenti indotti dalla luce nella batteriorodopsina sono accompagnati da movimenti di protoni attraverso la membrana che provocano cambiamenti di pH nel mezzo di sospensione. Lo spostamento alcalino iniziale è dimostrato essere molto vicino parallela (e quindi correlata con) alla sintesi di ATP. L'acidificazione del terreno in presenza di valinomicina, in condizioni di basso potassio esterno, provoca la sintesi di ATP al buio.
Separazione delle particelle di membrana dei subcloroplasti mediante distribuzione controcorrente.Distribuzione controcorrente in un sistema acquoso a due fasi di destrano-polietilenglicole per frazionare frammenti di membrana ottenuti per trattamento in pressa di cloroplasti di classe II. Con la tecnica di distribuzione in controcorrente le particelle di membrana vengono separate in base alle loro proprietà superficiali quali carica e idrofobicità. Le frazioni ottenute sono state analizzate rispetto alle attività fotochimiche, clorofilla e P- 700. L'arricchimento del Fotosistema II dopo la distribuzione in controcorrente era migliore di quello ottenuto dalla centrifugazione differenziale dei cloroplasti disgregati. Tuttavia, la migliore separazione delle particelle arricchite del Fotosistema I e II si poteva ottenere se la centrifugazione differenziale fosse combinata con la controcorrente tecnica di distribuzione Ogni frazione centrifuga potrebbe essere ulteriormente separata in Fotosistemi I e II arricchiti frazioni poiché le particelle del Fotosistema II preferivano la fase inferiore ricca di destrano mentre le particelle del Fotosistema I preferivano la fase superiore ricca di glicole polietilenico. Con questo procedimento è stato possibile, senza l'uso di detergenti, ottenere vescicole più arricchite in Fotosistema II rispetto a cataste di grana intatte. Il comportamento di partizione dei cloroplasti di classe II ininterrotti e della frazione centrifuga del fotosistema I era lo stesso. Questa somiglianza indicava che la membrana esposta ai polimeri circostanti dai cloroplasti di classe II è la membrana ricca di fotosistema I delle lamelle dello stroma.
La biosintesi del multi-L-arginil-poli(acido L-aspartico) nel cianobatterio filamentoso Anabaena cylindrica.I cianobatteri producono multi-L -arginil-poli (acido aspartico), un polipeptide ramificato ad alto peso molecolare (Mr=25 000-125 000) costituito da un nucleo di poli(acido aspartico) con residui di L-arginile peptide legato a ciascun gruppo carbossilico libero del poli(acido aspartico) acido). Un enzima che allungherà Arg-poli(Asp) è stato isolato e purificato 92 volte dal cianobatterio filamentoso Anabaena cylindrica. L'enzima incorpora arginina e acido aspartico in Arg-poli(Asp) in una reazione che richiede ATP, KCl, MgCl2 e un reagente sulfidrilico L'incorporazione enzimatica dell'arginina dipende dalla presenza di acido L-aspartico ma non viceversa, una scoperta che suggerisce l'ordine di addizione dell'amminoacido al polipeptide ramificato-acido aspartico viene aggiunto al nucleo seguito dall'attaccamento di un ramo di arginina. L'allungamento di Arg-poly(Asp) in vitro è insensibile all'aggiunta di inibitori della sintesi proteica e all'aggiunta di nucleasi. Questi risultati supportano la nozione precedentemente suggerita da studi in vivo che Arg-poly (Asp) è sintetizzato tramite una via non ribosomiale e dimostrano anche che gli RNA di trasferimento ammino-acetilati non svolgono alcun ruolo in almeno una fase del meccanismo biosintetico.
Purificazione e caratterizzazione di una eso-D-galatturonanasi di Aspergillus niger.Una D-galatturonanasi (EC 3.2.1.67) che catalizza la degradazione di I D-galatturonani mediante pattern di azione terminale sono stati purificati da un filtrato di coltura di Aspergillus niger mediante una procedura che includeva la salatura con solfato di ammonio, la precipitazione mediante etanolo, la cromatografia su DEAE-cellulosa e la cromatografia su gel su Sephadex G-100. La preparazione ottenuta è stato leggermente contaminato da una frazione proteica enzimaticamente inattiva. La massima attività e stabilità dell'enzima è stata osservata a pH 5,2. L'enzima degrada l'acido digalatturonico, il p-nitrofenil-alfa-D-galattopiranuronide, nonché gli oligogalattoronidi contenenti all'estremità non riducente 4- deossi-L-treo-esa-4-enopiranosiluronato. Differisce da tutti gli enzimi di A. niger finora descritti che degradano i D-galaturonani per il pattern di azione terminale, nel preferire non chiaramente substrati a basso peso molecolare. quindi classificato come exo-D-galatturonanasi.
La solfatasi del fegato di bue. XIX. Sulla natura delle forme polimeriche della solfatasi A presenti nelle soluzioni diluite.Volumi di eluizione medi ponderali di La solfatasi A (un arilsolfato sulfoidrolasi, EC 3.1.6.1) da Sephadex G-200 è stata determinata in funzione della concentrazione proteica, del pH, della forza ionica e della temperatura. I risultati vengono utilizzati per calcolare le costanti di equilibrio di associazione apparente per la formazione di tetrameri e le associate parametri termodinamici allo stato standard. Mentre la costante di associazione apparente diminuiva da 10(28) a 10(21) M-3 all'aumentare del pH da 4,5 a 5,6 a forza ionica 0,1, a qualsiasi particolare valore di pH studiato era relativamente insensibile alla temperatura variazione in modo tale che deltaH è vicino allo zero e la formazione di tetrameri in soluzione è associata ad una variazione positiva di entropia A pH 5,0, aumentando la forza ionica da 0,1 a 2 si riduce la costante di associazione di un fattore di 100. Metilumbelliferone sulfa non ha alcun effetto sull'associazione della solfatasi A. I risultati dell'equilibrio vengono utilizzati per definire il grado di associazione della solfatasi A che si può incontrare in esperimenti volti a chiarirne le proprietà cinetiche. Nel lisosoma epatico, il tetramero è probabilmente la specie dominante. Il monomero e il tetramero della solfatasi A hanno attività specifiche simili, o identiche, con nitrocatecolo solfato e 4-metilumbelliferone solfato come substrati. Con il nitrocatecolo solfato, la solfatasi A mostra la cinetica di Michaelis in condizioni in cui il monomero è la specie dominante e la cinetica non di Michaelis in cui è dominante il tetramero. Apparentemente c'è una cooperatività negativa tra le unità monomeriche nel tetramero. In sodio taurodesossicolato 2 mM e MnCl2 0,035 M, ma non in NaCl 0,1 M, il tetramero mostra la cinetica di Michaelis. Ciò non è dovuto alla dissociazione del tetramero. La concentrazione micellare critica di sodio taurodesossicolato è di circa 0,8 mM sia in 0,1 M NaCl che 0,035 M McCl2, ma il numero di aggregazione è maggiore in quest'ultimo.
Conformazioni dell'aspartochinasi sensibile alla lisina.1. La tecnica dell'inattivazione differenziale termica e proteolitica è stata impiegata come sonda conformazionale per l'aspartochinasi sensibile alla lisina aspartochinasi (EC 2.7.2.4) di Escherichia coli B. 2. Gli inibitori di L-amminoacido di questo enzima inducono ciascuno una caratteristica conformazione enzimatica, come evidenziato dai tassi di inattivazione termica e proteolitica e dalle energie di attivazione di Arrhenius per l'inattivazione termica che sono caratteristici di l'amminoacido presente 3. Il legame di fenilalanina e leucina si escludono a vicenda come evidenziato dal comportamento competitivo negli esperimenti di inattivazione termica, suggerendo un sito di legame idrofobico degli amminoacidi con ampia specificità 4. La conformazione dipendente dalla fenilalanina e la conformazione dipendente dalla leucina differiscono considerevolmente. In confronto con l'enzima nativo, il primo è più labile alla proteolisi da tripsina mentre il secondo è più stabile. Tasso di primo ordine co i nstanti per l'inattivazione termica delle conformazioni fenilalanina- e leucina-dipendenti sono, rispettivamente, circa la metà e un decimo di quelli dell'enzima nativo. 5. I punti 3 e 4 presi insieme suggeriscono che le conformazioni sono indotte dal ligando e non sorgono attraverso la stabilizzazione del ligando di conformeri che si formano spontaneamente.
Purificazione e alcune proprietà della cisteina ossidasi del fegato di ratto (cisteina diossigenasi).La cisteina ossidasi (cisteina diossigenasi, EC 1.13.11.20) è stata purificata per circa 1000 -fold dal fegato di ratto. L'enzima purificato (proteina-B) è stato ottenuto come una forma inattiva, che è stata attivata dalla preincubazione anaerobica con L-cisteina. La forma attiva della proteina-B è stata inattivata durante l'incubazione aerobica per produrre cisteina sulfinato. Questo l'inattivazione della proteina-B è stata protetta da una proteina distinta nel citoplasma del fegato di ratto, vale a dire la proteina stabilizzante (proteina-A). I valori di Ka e Km per L-cisteina erano 0.8-10(-3) M e 1.3-10(-3 ) M rispettivamente. L'enzima era fortemente inibito dagli agenti chelanti Cu+ e/o Fe2+ ma non dall'agente chelante Cu2+. Il pH ottimale della reazione enzimatica era 8,5-9,5 mentre quello dell'attivazione enzimatica era 6,8-9,5, con un picco ampio.
Studi sull'ATPasi attivata da (Na+ + K+). XXXVIII. Una proteina di 100.000 peso molecolare come intermedio fosforilato a bassa energia dell'enzima.La fosforilazione dei microsomi della corteccia cerebrale bovina trattati con NaI da parte di fosfato inorganico in presenza di Mg2+ e ouabaina è stata studiata a 0 gradi C (pH 7,4) e 20 gradi C (pH 7,0). Quasi massimale (90%) e metà massimale la fosforilazione viene raggiunta a 20 gradi C entro 2 min con 50--155 e 5,6--17 muM 32Pi, rispettivamente, e a 0 gradi C entro 75 s con 300--600 e 33--66 muM 32Pi, rispettivamente. produce 146 pmol 32P - mg-1 di proteina Senza ouabaina (20 gradi C, pH 7,0) si raggiunge meno del 25% dell'incorporazione osservata in presenza di ouabaina Preincubazione dei microsomi nativi con Mg2+ e K+, per la decomposizione eventualmente presenti legami fosforilici ad alta energia prima del trattamento con ouabain, non influisce sull'incorporazione massima di fosfato. Questo indica t ome l'incorporazione di fosfati inorganici non è dovuta a uno scambio con legami fosforilici ad alta energia, che potrebbero essere stati conservati nelle preparazioni microsomiali. La fosforilazione dei microsomi nativi da parte dell'ATP in presenza di Mg2+ e Na+ raggiunge i livelli massimi del 90 e 50% entro 15-30 s a 0 gradi C e pH 7,4 a concentrazioni di [gamma-32P]ATP di 5-32 e 0,5 --3.5 muM, rispettivamente. Il livello massimo di fosforilazione è di 149 pmol 32P-mg-1 di proteina, uguale a quello dei microsomi trattati con ouabaina fosforilati da fosfato inorganico. Sia il fosfato inorganico che il fosforilato di ATP in loco per subunità enzimatica attiva di 135.000 peso molecolare. Dalle costanti di equilibrio per la fosforilazione dei microsomi trattati con ouabaina da parte di fosfato inorganico a 0 gradi C e 20 gradi C si calcolano variazioni standard di energia libera di -5,4 e -6,8 kcal/mol, rispettivamente. Questi valori producono una variazione di entalpia standard di 14 kcal/mol e una variazione di entropia di 70 cal/mol - grado K. Questo caratterizza la reazione come un processo guidato da una variazione di entropia. L'intermedio formato dalla fosforilazione con Pi ha la massima stabilità a pH acido, come nel caso dell'intermedio formato con ATP. La solubilizzazione in sodio dodecil solfato stabilizza il legame fosforilico nell'intervallo di pH di 4-7. Il preparato non solubilizzato ha una stabilità ottimale a pH 2-4, il cui livello è pari a quello dell'intermedio detergente-solubilizzato. L'elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato dei microsomi a pH 3, dopo l'incorporazione di 32Pi, produce 11 bande proteiche, solo una delle quali (mol. 100.000--106 000) porta l'etichetta radioattiva. Questa proteina ha lo stesso peso molecolare della proteina, che è fosforilata dall'ATP in presenza di Mg2+ e Na+.
Purificazione parziale e proprietà di una fosfoprotein chinasi associata alla cromatina da nuclei di fegato di ratto.A fosfoprotein chinasi (EC 2.7.1.37) KIVb, da ratto nuclei epatici, è stato purificato 75 volte mediante cromatografia di fosfocellulosa e filtrazione su gel su Sephadex G-200. L'enzima, che ha un peso molecolare apparente di 55.000, fosforila la caseina e le proteine non istoniche legate alla cromatina più facilmente degli istoni o delle proteine ribosomiali. mostra un requisito assoluto di catione bivalente con attività ottimale a 15-20 mM Mg2+. L'attività massima della chinasi si ottiene a 100 mM NaCl. La curva pH vs attività è bifasica con Optima a pH 6,5 e pH 8,0. Il valore Km per la caseina è 280 mug/ml e il Km per l'ATP è 6-10(-6) M. La chinasi KIVb fosforila numerose proteine nucleari non istoniche come mostrato dall'analisi elettroforetica L'aggiunta della chinasi KIVb a miscele di reazione contenenti proteine non istoniche determina la fosforilazione di un spettro di f polipeptidi simili a quelli fosforilati dalle chinasi nucleari endogene. Le proteine non istoniche legate alla cromatina sembrano essere substrati migliori per KIVb rispetto ai non istoni dissociati dalla cromatina. Un confronto delle fosfoproteine nucleari fosforilate sia nell'animale intatto che in vitro (mediante l'aggiunta della chinasi KIVb) indica alcune differenze e alcune somiglianze nei modelli di fosforilazione.
Isolamento e caratterizzazione della beta-glucosidasi dal citosol della corteccia renale di ratto.Viene descritta una procedura per la preparazione di beta-D- ampiamente purificato glucosidasi (EC 3.2.1.21) dalla frazione citosolica del rene di ratto L'attività specifica della beta-glucosidasi nella frazione del surnatante ad alta velocità (100 000 X g, 90 min) dell'omogenato di rene di ratto è 700 volte maggiore di quella la stessa frazione da cuore, muscolo scheletrico, polmone, milza, cervello o fegato Attività beta-glucosidasica co-cromatografi con attività beta-D-galattosidasi, beta-D-fucosidasi, alfa-L-arabinosidasi e beta-D-xilosidasi attraverso gli ultimi quattro passaggi di colonna della purificazione e le loro attività specifiche sono rispettivamente 0,26, 0,39, 0,028 e 0,017 rispetto a quella della beta-glucosidasi L'attività specifica della beta-glucosidasi apparentemente omogenea è di 115 000 nmol di glucosio rilasciato da 4- metilumbelliferil-beta-D-glucopiranoside per mg di proteine per h. Tutte e cinque le attività della glicosidasi possiedono una dipendenza dal pH simile (pH ottimale, 6--7) e labilità al calore e co-migrano su gel di dischi di poliacrilammide a pH 8,9 (RF, 0,67). L'attività della beta-glucosidasi è inibita in modo competitivo dal glucono-(1 porta a 5)-lattone (KI, 0,61 mM) e in modo non competitivo da una varietà di reagenti sulfidrilici tra cui N-etilmaleimmide, p-cloromercuribenzoato, 5,5\'-ditio -bis(acido 2-nitrobenzoico) e acido iodoacetico. Sebbene l'enzima rilasci glucosio dai derivati p-nitrofenile e 4-metilumbelliferile del beta-D-glucosio, non idrolizzerà la xilosil-O-serina, il beta-D-glucocerebroside, il lattosio, la galattosilovalbumina o il trealosio. L'enzima è costituito da una singola catena polipeptidica con un peso molecolare di 50.000-58.000, ha un coefficiente di sedimentazione di 4,41 S e contiene un numero relativamente elevato di amminoacidi acidi. Uno studio sulla distribuzione dell'attività della beta-glucosidasi in varie regioni del rene di ratto sezionato indica che l'enzima è probabilmente contenuto nelle cellule del tubulo contorto prossimale. L'enzima è anche presente in quantità relativamente elevate nelle cellule dei villi, ma non nelle cellule della cripta, dell'intestino. Il substrato fisiologico e la funzione dell'enzima sono sconosciuti.
Purificazione e specificità della prolil dipeptidasi dal rene bovino.Prolil dipeptidasi (iminodipeptidasi, L-prolil-amminoacido idrolasi, EC 3.4.13.8) è stata purificato 180 volte da rene bovino. L'enzima che è stato ottenuto con una resa del 10% è stato completamente separato da un numero di peptidasi renali note incluso un enzima con specificità di substrato molto simile, la prolina aminopeptidasi (L-prolil-peptide idrolasi, EC 3.4. 11.5). L'attività specifica dell'enzima con L-prolilglicina come substrato è di 1600 unità di attività per mg di proteina. L'attività ottimale dell'enzima è a pH 8,75 e il peso molecolare sulla filtrazione su gel è stato stimato essere 100.000. Il punto isoelettrico dell'enzima è pH 4,25. Studi sulla specificità del substrato hanno mostrato che l'enzima idrolizza preferenzialmente dipeptidi e dipeptidilammidi con L-prolina o idrossi-L-prolina all'N-terminale. Substrati a catena più lunga con prolina N-terminale non sono stati idrolizzati.
Purificazione e proprietà di un inibitore dell'alfa-amilasi dal frumento.Quattro inibitori dell'alfa-amilasi (EC 3.2.1.1) sono stati separati da un alcol estratto di frumento mediante cromatografia a scambio ionico su DE52-cellulosa Un inibitore, che ha mostrato la maggiore specificità per l'amilasi salivare umana rispetto all'amilasi pancreatica umana, è stato purificato mediante le seguenti fasi: (a) frazionamento dell'alcol (60--90% ) di estratto acquoso (b) cromatografia a scambio ionico su QAE-Sephadex A-50; (c) ri-cromatografia su DE52-cellulosa e (d) filtrazione su gel su Sephadex G-50. L'inibitore purificato è 100 volte più specifico per amilasi salivare umana rispetto all'amilasi pancreatica umana. Mostra una mobilità elettroforetica di 0,2 all'elettroforesi su gel su disco e un peso molecolare di circa 21.000. Questo inibitore contribuisce per circa il 16% al potere di inibizione dell'amilasi salivare totale dell'estratto di grano.
Attività adenosina fosforilasi distinta dall'attività inosina-guanosina fosforilasi nelle cellule di Sarcoma 180 e nel fegato di ratto.Adenosina fosforilasi (EC 2.4.2. -) l'attività presente nelle cellule di Sarcoma 180 cresciute in coltura e nel fegato di ratto, si è dimostrata distinta dall'inosina-guanosina fosforilasi in base a diversi criteri: (a) il trattamento dell'estratto di cellule di Sarcoma 180 con p-cloromercuribenzoato ha inibito le due attività in misura diversa, (b) l'adenina ha protetto selettivamente l'attività dell'adenosina fosforilasi del Sarcoma 180 e dell'estratto di fegato di ratto contro l'inattivazione del calore, mentre l'ipoxantina ha protetto selettivamente l'attività dell'inosina-guanosina fosforilasi, (c) a concentrazioni di substrato quasi saturanti e utilizzando l'estratto di Sarcoma 180, i tassi di ribosilazione di una miscela di adenina + ipoxantina o adenina + guanina, ma non di ipoxantina + guanina, è risultata essere quasi uguale alla somma dei loro tassi individuali misurati separatamente, (d) inos ine ha inibito selettivamente la ribosilazione di ipoxantina e guanina catalizzata da Sarcoma 180 ed estratto di fegato di ratto mentre la 2-cloroadenosina ha inibito selettivamente la ribosilazione di adenina e N6-furfuriladenina, (e) le curve di pH vs attività erano simili con ipoxantina o guanina come substrato ma erano marcatamente differenti dalla curva con adenina come substrato. Viene discusso il ruolo potenziale dell'attività dell'adenosina fosforilasi in vivo.
Purificazione parziale e caratterizzazione dell'enzima di scissione post-prolina: inattivazione enzimatica degli ormoni neuroipofisari da parte di preparati renali di varie specie.L'inattivazione degli ormoni neuroipofisari sono state studiate arginina vasopressina e ossitocina, entrambe marcate con 14C nel residuo C-terminale di glicina, da enzimi presenti negli omogenati renali di varie specie, e alcuni degli enzimi responsabili sono stati parzialmente purificati e caratterizzati. l'ossitocina è generalmente scissa più efficacemente dagli omogenati renali, sebbene con alcune specie l'attività enzimatica che idrolizzi il legame Pro-Leu sia significativa La degradazione dell'arginina vasopressina è più lenta dell'ossitocina in tutte le specie studiate e sembra avvenire con un meccanismo generale diverso poiché la scissione il legame Pro-Arg è più significativo dell'idrolisi del legame Arg-Gly. L'enzima che rilascia la glicinamide dall'ossitocina e il "Post-Prolin e Cleaving Enzyme", che rilascia il dipeptide C-terminale da ossitocina e arginina vasopressina, sono stati parzialmente purificati dal rene di agnello mediante frazionamento con solfato di ammonio e cromatografia su colonna. I due enzimi hanno dimostrato di essere entità separate con diversi profili di pH. L'attività della prolil peptidasi ha rilasciato i dipeptidi C-terminali dall'ossitocina e dall'arginina vasopressina a velocità simili ed è stata inibita dall'acido p-cloromercurifenilsolfonico, 1,10-fenantrolina, L-1-tosilammido-2-feniletilclorometilchetone, Co2+, Ca2+ e Zn2+ , ma significativamente potenziato dal ditiotreitolo. La preparazione di prolil peptidasi scinde i substrati peptidici contenenti prolina in corrispondenza del legame Pro-X. Il tasso di scissione dipende dalla natura del residuo X e con le condizioni utilizzate non c'è scissione quando X è uguale a Pro; tuttavia, la scissione si verifica quando X è un isomero D: la vasopressina [Mpr1, D-Arg8] viene inattivata a una velocità simile alla vasopressina [Mpr1, Arg8] e [Mpr1, Lys8], suggerendo che la nota azione biologica prolungata di [Mpr1 , D-Arg8] la vasopressina non è dovuta alla resistenza alla prolil peptidasi. In tutte le caratteristiche testate, la prolil peptidasi del rene di agnello era identica all'enzima di scissione post-prolina isolato in precedenza dall'utero umano. Esperimenti in vivo nel gatto hanno suggerito che sia l'enzima di rilascio della glicinamide che l'enzima di scissione post-prolina sono presenti ed efficaci nell'inattivare gli ormoni neuroipofisari nell'animale intatto.
Rilascio e attivazione di una fosfatasi acida particolata da Tetrahymena pyriformis.Una forma sedimentabile di fosfatasi acida (EC 3.1.3.2) da Tetrahymena pyriformis è stata trovato per essere solubilizzato da Triton X-100. L'attività enzimatica totale nella frazione cellulare insolubile è aumentata di quasi il 200% dopo la solubilizzazione con Triton X-100 o Nonidet P-40. Rimozione dei lipidi di membrana e Triton X-100 dalla soluzione di lavaggio del particolato con un'estrazione con cloroformio ha determinato un'aggregazione enzima-proteina non specifica che era reversibile dopo l'aggiunta di Triton X-100. I risultati indicano che questa fosfatasi acida è una proteina di membrana integrale. Il pH ottimale per questa fosfatasi acida legata al particolato era 3,5 con o -carbossifenilfosfato e 4,0 con p-nitrofenilfosfato come substrati. I valori di Km di ciascun substrato erano rispettivamente 3,1 e 0,031 mM.
Evitare eluenti fortemente caotropici per la cromatografia di immunoaffinità mediante modificazione chimica del ligando immobilizzato.La necessità di eluenti caotropici nella cromatografia di immunoaffinità è una conseguenza dell'elevata affinità degli anticorpi verso i loro antigeni. Questa affinità è diminuita e l'eluizione degli anticorpi antiglucagone da una colonna di glucagone immobilizzato può essere ottenuta in condizioni blande quando la complementarità sterica al sito di legame dell'anticorpo è perturbata dalla modifica chimica selettiva dell'ormone. sono state studiate reazioni con 2-idrossi-5-nitrobenzil bromuro, tetranitrometano e perossido di idrogeno. Al contrario, il trattamento di anticorpi immobilizzati con 2-idrossi-5-nitrobenzil bromuro facilita l'eluizione del glucagone durante la cromatografia di immunoaffinità. Le implicazioni generali di questi risultati sono discusso.
Partizione incrociata e determinazione della carica netta degli isoenzimi dell'enolasi.L'enolasi del lievito di panetteria\' è stata separata in tre isoenzimi mediante distribuzione controcorrente. gli isoenzimi sono stati ripartiti in sistemi acquosi polimerici bifasici contenenti trimetilammino poli(etilenglicole) o poli(etilenglicole) solfonato caricato negativamente. I grafici del coefficiente di ripartizione di ciascun isoenzima rispetto al pH nei due sistemi bifasici si intersecano a pH pari a il punto isoelettrico. Dalle pendenze dei grafici, la carica netta degli isoenzimi a pH 6,57 è stata determinata essere rispettivamente +2, -3 e -8.
Cytochrome P450cam e suoi complessi. Parametri Mössbauer del ferro eme.La spettroscopia Mössbauer è stata utilizzata per studiare il ferro eme in vari stati del citocromo P450cam dal sistema idrossilante della canfora del batterio Pseudomonas putida. P450cam nativo, privo di canfora, contiene ferro ferrico a basso spin, parte del quale (circa il 50-70%) viene convertito allo stato ferrico ad alto spin dopo l'aggiunta di canfora. Gli spettri Mössbauer dell'enzima privo di canfora (S uguale a 1/2) e del componente ad alto spin (S uguale a 5/2) del complesso di canfora sono stati simulati con successo utilizzando un modello basato sulla teoria del campo cristallino e sulla semplice convalenza Considerazioni. Lo stato ferrico nativo a basso spin di P450cam forma un complesso con 2-fenilimidazolo, con piccole variazioni dei valori g e degli spettri Mössbauer. Questi cambiamenti possono essere spiegati in modo coerente nel modello del campo cristallino di cui sopra. L'aggiunta di putidaredoxin al complesso di canfora, ossidato P4 50cam diminuisce l'intensità della componente ad alto spin e cambia la sua suddivisione del quadrupolo. La forma ridotta di P450cam contiene ferro ferroso ad alto spin, sia in presenza che in assenza di canfora. Il complesso di P450cam ridotto con ossigeno molecolare è diamagnetico e ha una combinazione di scissione del quadrupolo e spostamento dell'isomero che è insolito per un complesso ferroso, ma assomiglia molto a quello dell'ossiemoglobina. Questi risultati sono compatibili con il superossido legato, Fe3+-O-2, modello proposto per l'ossiemoglobina (Weiss, J. J. (1964) Nature 202, 83-84). La P450cam ridotta e i suoi complessi, oxyP450cam-CO, sono tutti analoghi sotto alcuni aspetti ai corrispondenti complessi di emoglobina.
Studi sul legame dell'emoglobina da parte dell'aptoglobina mediante elettrofocalizzazione ed elettroforesi a gradiente.1. L'elettrofocalizzazione su gel seguita da elettroforesi su gradiente di gel ha separato le aptoglobine e i loro complessi con l'emoglobina nei caratteristici modelli bidimensionali delle bande proteiche 2. Sono stati ottenuti pesi molecolari di 107 000, 139 000 e 168 000 per le tre bande osservate dopo che una preparazione purificata di aptoglobina di tipo 1 è stata parzialmente saturata con emoglobina. erano presenti aptoglobina, il complesso intermedio aptoglobina-emoglobina contenente una semiemoglobina e il complesso saturo con due semiemoglobine 3. Le tre proteine mostravano una notevole microeterogeneità e fornivano un numero di punti isoelettrici negli intervalli di pH 4,58-4,77, 5,20- 5,40 e 5,74-5,93, essendo l'aptoglobina libera di tipo 1 il gruppo più basso Questi intervalli erano tutti 0,15-0,30 unità pH inferiori se si prendessero altri valori per l'isoelettrico p punti di marcatori utilizzati per calibrare il gradiente di pH. 4. Tutte e tre le proteine erano presenti in un'ampia gamma di concentrazioni di emoglobina, dallo 0,5% al 92% di quella richiesta per la saturazione. Ciò è prevedibile se entrambi i siti di legame hanno affinità simili per l'emoglobina.
Proteina acida fibrillare gliale da cervello bovino e ratto. Degradazione nei tessuti e negli omogenati.Confronto con proteina acida fibrillare gliale isolata da bovino, ratto e il cervello di topo era notevolmente omogeneo e migrato come una singola banda a 54.000 moli di peso su elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato. non rapidamente congelato L'ulteriore degradazione del polipeptide da 54 000 mol in peso nei tessuti bovini incubati a 24 gradi C ha portato a preparazioni essenzialmente identiche a quelle precedentemente isolate da materiale autoptico umano e che si sono separate in una serie di polipeptidi immunologicamente attivi con peso molecolare compreso tra 54 000 a circa 40 500. Il modello della banda di gel ottenuto dopo periodi progressivamente più lunghi di autolisi ha suggerito che piccoli frammenti erano cl staccato dal polipeptide originale in fasi successive di degradazione. Come nel cervello umano, i prodotti a peso molecolare inferiore nell'intervallo 45 000-40 500 erano più resistenti alla proteolisi e ancora presenti dopo periodi prolungati di autolisi tissutale. L'effetto del pH e degli inibitori della proteinasi sulla degradazione è stato studiato in omogenati di tronco encefalico bovino incubati a 37 gradi C. A pH 8,0 PROTEOLISI DI La proteina acida fibrillare gliale ha seguito essenzialmente lo stesso schema del tessuto. La scissione delle specie principali non è stata impedita dall'aggiunta di inibitori della proteinasi. A pH 6.0 e 6.5 è stato osservato un diverso tipo di degradazione, con rapida degradazione della proteina e perdita di attività immunologica. L'aumento della solubilità nelle soluzioni tampone era un altro effetto dell'autolisi. Rispetto alla corteccia cerebrale e al tronco cerebrale, dove la maggior parte della proteina era solubile in acqua, solo una piccola frazione è stata estratta con tampone dalla sostanza bianca bovina. Tuttavia, la solubilità è notevolmente aumentata dopo l'incubazione e quantità comparabili sono state estratte in tampone e in urea 6 M.
Isolamento e caratterizzazione della frazione del bordo a spazzola da cellule del tubulo prossimale renale di ratto neonato.Una frazione del bordo a spazzola renale è stata isolata da ratti Sprague-Dawley appena nati , e le sue caratteristiche morfologiche ed enzimatiche sono state studiate rispetto a quelle dell'adulto. Le strutture microvillari definite sono osservate al microscopio elettronico e le preparazioni di confine del neonato sono arricchite di enzimi marcatori noti. Sebbene lo sviluppo morfologico sia più avanzato e le attività enzimatiche specifiche siano maggiore nell'adulto, l'elettroforesi su gel di poliacrilammide delle proteine di membrana non rivela cambiamenti significativi nel pattern con l'aumentare dell'età. Questi studi suggeriscono che il bordo a spazzola della cellula del tubulo prossimale è presente alla nascita come una struttura significativamente sviluppata.
Isolamento e caratterizzazione di due ribonucleasi alcaline da siero di vitello.Trattamento di siero di vitello a 60 gradi C e pH 3,5 seguito da cromatografia su carbossimetil (CM ) cellulosa ha provocato la separazione di due picchi principali di attività RNAsi alcalina. Uno è stato eluito da CM-cellulosa a 0,075 M KCl con una purificazione complessiva di 5400 volte e l'altro è stato eluito a 0,25 M KCl con una purificazione di 6700 volte. L'RNAsi eluita dalla CM-cellulosa a 0,075 M KCl è stata quasi completamente inibita dal siero anti-RNAsi A e dall'inibitore endogeno dell'RNAsi ed è stata osservata un'inibizione del 33% in presenza di 5 mM MgCl 2. Questo enzima sembra essere simile o identico alla RNAsi A. L'altra RNAsi, eluita dalla CM-cellulosa a 0,25 M KCl non è stata inibita dall'anti-RNAsi A o 5 mM MgCl2 ed era molto meno sensibile all'inibitore endogeno. Entrambi gli enzimi hanno degradato l'RNA endonucleoliticamente e i monofosfati nucleosidici ottenuti dopo idrolisi parziale di L'RNA delle due RNAasi sieriche era principalmente 2\'- o 3\' -CMP e 2\'- o 3\' -UMP. Poly(A), DNA nativo e DNA denaturato sono stati degradati lentamente o per niente. L'enzima RNAasi A-like ha degradato la poli(C) a una velocità significativamente maggiore e la poli(U) a una velocità inferiore rispetto all'RNA. Tuttavia, l'altra RNAasi sierica era più attiva con la poli(U) che con l'RNA e quasi inattiva con la poli(C) come substrato.
Dispersione della luce da sospensioni di frammenti di membrana derivati dalla sonicazione dei mitocondri del cuore di manzo.L'intensità della diffusione della luce da sospensioni di frammenti di membrana preparati mediante sonicazione di i mitocondri del cuore di manzo in presenza di EDTA a pH alcalino (ESMP) sono stati determinati a 45, 90 e 135 gradi con luce di lunghezza d'onda 546 nm Il rapporto di dissimmetria Z = I45 gradi c/I135 gradi c, dove I45 gradi c e I135 gradi c sono le intensità di scattering a 45 e 135 gradi estrapolate alla concentrazione di particelle zero e corrette per gli effetti di riflettanza, è stato utilizzato per calcolare la dimensione delle particelle dalla teoria di Rayleigh-Gans-Debye È stato ottenuto un diametro medio delle particelle D di 184-190 nm , all'interno dell'intervallo di diametro delle particelle 50-300 nm determinato in precedenza mediante microscopia elettronica. Questo diametro medio determinato dalla diffusione della luce è un parametro utile per la caratterizzazione della dimensione delle particelle ESMP. Proponiamo il termine: light sca misurando il diametro medio delle particelle, DLS, per questo parametro. L'indice di rifrazione di ESMP è stato determinato in 1,443 misurando l'intensità di dispersione in soluzioni tampone con concentrazione di saccarosio variabile. Il valore di Z era indipendente dalla concentrazione di saccarosio in questa determinazione, mostrando che le particelle sono osmoticamente inattive nei confronti del saccarosio. I valori del diametro medio delle particelle DLS e dell'indice di rifrazione rientrano nell'intervallo di validità della teoria di Rayleigh-Gans-Debye, per la quale le variazioni di diffusione della luce sono attribuibili esclusivamente alla variazione delle dimensioni, piuttosto che alla variazione dell'indice di rifrazione delle particelle. L'assorbimento di acqua che accompagna l'assorbimento di sale legato all'energia in ESMP è stato calcolato dalle variazioni di dispersione della luce a 0,18 mul di H2O/mg di proteina, rispetto a 0,49 mul di H2O/mg di proteina misurata dall'inaccessibilità del destrano. La misurazione delle variazioni di diffusione della luce fornisce un metodo rapido e sensibile per determinare le variazioni di volume di ESMP. L'entità della variazione di volume osservata durante l'assorbimento di acqua e sale legato all'energia e il grado iniziale di idratazione suggeriscono che gli ESMP sono analoghi ai gel di polielettroliti per quanto riguarda l'assorbimento di elettroliti forti e che la formulazione di Donnan per gli equilibri di scambio ionico può essere utilmente applicata a questi processi in ESMP.
Influenze ioniche sulla transizione di fase della dipalmitoilfosfatidilserina.La ionizzazione e il comportamento di fase della 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoserina hanno stato studiato in una varietà di condizioni con diversi metodi. Come misurato dalle variazioni di torbidità, la temperatura della transizione di fase cristallo-cristallo liquido di questo lipide è influenzata dal pH e dalle concentrazioni di cationi mono e bivalenti. La curva della temperatura di transizione pH è congruente con la curva relativa alla temperatura al grado di ionizzazione del gruppo carbossilico della forma cristallina. La temperatura di transizione scende da un plateau superiore di 72 gradi C a bassi valori di pH, dove il gruppo carbossilico è completamente protonato, ad un plateau inferiore di 55 gradi C ad alti valori di pH, dove questo gruppo è completamente ionizzato. Il pK apparente (pH al 50% di ionizzazione) della forma cristallina passa da 6,0 a 4,6 a 3,7 con un aumento della concentrazione di NaCl da 10(-3) a 0,1 a l.0 M, res pectoriosamente. Queste osservazioni sono in accordo con una semplice analisi teorica che utilizza la teoria del doppio strato diffuso e l'influenza del potenziale superficiale sulla concentrazione superficiale dei protoni. In termini qualitativi, un aumento della concentrazione dell'elettrolita riduce il potenziale superficiale, il cui risultato è una diminuzione della differenza di pH superficiale-massa e un abbassamento del pK apparente. Assumendo un'area di 50 A2/molecola, il pKa intrinseco (pK apparente corretto per il pH superficiale) del gruppo carbossilico è 2,7. Un cambiamento di 1000 volte della concentrazione di NaCl produce un cambiamento molto grande nel potenziale di superficie senza influenzare la temperatura di transizione della forma ionizzata del lipide.
Procarbossipeptidasi A bovina: cinetica dell'idrolisi di peptidi ed esteri.La procarbossipeptidasi A bovina mostra un'attività idrolitica intrinseca verso gli amminoacidi aloacilici (Behnke e Vallee, 1972) , così come verso substrati peptidici ed esteri convenzionali per la carbossipeptidasi A (Bezzone, 1974; Uren e Neurath, 1974). La cinetica di idrolisi di una serie di tali substrati da parte della procarbossipeptidasi nativa è stata ora esaminata in dettaglio per accertare l'entità a cui i siti di legame e catalitici della carbossipeptidasi preesistono nello zimogeno Differenze distinte nei siti di legame del substrato dello zimogeno rispetto all'enzima sono evidenti dai loro rispettivi profili cinetici e dagli effetti dei modificatori sulle loro attività. i dipeptidi BzGly-L-Phe e CbzGly-L-Phe, ben noti per la carbossipeptidasi, sono esibiti anche dallo zimogeno, ma la corrispondente inibizione del substrato da parte di CbzGly-L-Phe e BzGly-Ophe è assente. Inoltre, l'inibizione del substrato della carbossipeptidasi da parte di CbzGlyGly-L-Phe e BzGly-Ophe è sostituita dall'attivazione del substrato nello zimogeno...
Biosintesi del glicogeno batterico. Purificazione e proprietà dell'Escherichia coli B ADPglucose:1,4-alfa-D-glucano 4-alfa-glucosiltransferasi.La glicogeno sintasi di Escherichia coli B è stata purificata ad apparente omogeneità con l'uso di una colonna di 4-amminobutil-sefarosio. Sono state ottenute due frazioni dell'enzima: la glicogeno sintasi I con un'attività specifica di 380 mumol mg-1 e priva di ramificazione attività enzimatica e glicogeno sintasi II avente un'attività specifica di 505 mumol mg-1 e contenente un'attività enzimatica ramificata che era lo 0,1% dell'attività osservata per la glicogeno sintasi. Solo una banda proteica è stata trovata nell'elettroforesi su gel del disco per ciascuna frazione di glicogeno sintasi e erano coincidenti con l'attività della glicogeno sintasi. Una banda proteica principale e una banda proteica molto debole che si muoveva a malapena nel gel sono state osservate nell'elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato delle frazioni di glicogeno sintasi. La subunità molecolare il peso della banda proteica principale nell'elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato di entrambe le frazioni di glicogeno sintasi è stato determinato pari a 49 000 +/- 2 000. I pesi molecolari degli enzimi nativi sono stati determinati mediante ultracentrifugazione in gradiente di densità di saccarosio. La glicogeno sintasi I aveva un peso molecolare di 93 000 mentre la glicogeno sintasi II aveva un peso molecolare di 200.000. Stando a 4 gradi C o a -85 gradi C entrambi gli enzimi si trasformano in specie con pesi molecolari di 98 000, 135.000 e 185 000. Pertanto, possono esistere forme attive della glicogeno sintasi di E. coli B come dimeri, trimeri e tetrameri della subunità. È stato dimostrato che l'enzima catalizza il trasferimento di glucosio dall'ADPglucosio al maltosio e agli oligosaccaridi superiori della serie delle maltodestrine ma non al glucosio. L'1,5-gluconolattone ha dimostrato di essere un potente inibitore della reazione della glicogeno sintasi. La reazione della glicogeno sintasi si è dimostrata reversibile. La formazione di ADPglucosio marcato si è verificata da [14C]ADP o da [14C]glicogeno. Il rapporto tra ADP e ADPglucosio all'equilibrio a 37 gradi C è stato determinato e si è riscontrato che varia di tre volte nell'intervallo di pH di 5,27-6,82. Da questi dati il rapporto tra ADP2- e ADPglucosio all'equilibrio è stato determinato in 45,8 +/- 4,5. Supponendo che i gradi deltaF dell'idrolisi del legame alfa-1,4-glucosidico siano -4,0 kcal, i gradi deltaF dell'idrolisi del legame glicosidico nell'ADPglucosio sono -6,3 kcal.
Purificazione e proprietà della proteasi acida termostabile di Penicillium duponti.Una proteasi acida prodotta dal fungo termofilo Penicillium duponti K 1014 è stata purificata mediante cromatografia a scambio ionico e permeazione su gel e cristallizzata da una soluzione acquosa di acetone. L'endopeptidasi purificata ha dato un picco di schlieren simmetrico per velocità di sedimentazione ed è risultata omogenea all'elettroforesi su gel del disco a pH 9,5. L'enzima era più attivo a pH 2,5 contro caseina del latte e ha mostrato elevata termostabilità. Un punto isoelettrico di 3,81 è stato trovato mediante focalizzazione isoelettrica. Un peso molecolare minimo di 41.590 è stato calcolato dalla composizione amminoacidica, adottando un contenuto di arginina di un residuo per mole di enzima. Questo peso molecolare minimo è in buon accordo con il valore di 41.000 precedentemente rilevato mediante permeazione di gel (Hashimoto, H. , Iwaasa, T. e Yokotsuka, T. (1973), Appl. Microbiol. 25, 578). Oltre al termostabilità, la proteasi di P. duponti purificata differisce da altre proteasi acide ben caratterizzate in quanto contiene carboidrati, 4,33% espressi come glucosio. L'enzima non è stato influenzato dal p-bromofenacil bromuro, ma è stato completamente inattivato da alfa-diazo-p-bromoacetofenone, diazoacetil-DL-norleucina metil estere e diazoacetilglicina etil estere, in presenza di Cu2+. La completa inattivazione della proteasi da parte del diazoacetil-DL-norleucina metil estere ha portato all'incorporazione specifica di 1 mole di norleucina/mole di enzima. Sulla base del comportamento simile di altre proteasi acide verso questo inattivatore, i risultati suggeriscono la presenza nel sito attivo di un gruppo carbossilico insolitamente reattivo, coinvolto nella funzione catalitica. L'inibitore naturale della pepsina di Streptomyces naniwaensis [Murao, S. e Satoi, S. (1970), Agric. Biol. chimica. 34, 1265] inibiva anche la proteasi, con un eccesso molare triplo rispetto all'enzima.
Isolamento, proprietà chimiche e fisiche dell'alfa-1-antitripsina.Un metodo di isolamento dell'alfa-1-antitripsina (alfa-1- AT) in buona resa da plasma umano normale è descritto. Un passaggio chiave è stata la cromatografia di affinità impiegando un antisiero che era stato impoverito di anticorpi alfa-1-AT. Le preparazioni finali erano omogenee secondo criteri immunologici e fisico-chimici. L'attività specifica del purificato alfa-1-AT era 0,363 mg di tripsina bovina attiva inibita per 1,0 mg di inibitore. I modelli di gel di poliacrilammide a pH sia alcalino che acido di preparazioni altamente pure spesso, ma non invariabilmente, hanno mostrato più mani. Studi di peso molecolare mediante ultracentrifugazione all'equilibrio di sedimentazione in tampone acquoso e in 6 M guanidina così come l'elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecil solfato suggeriscono che l'alfa-1-AT è una singola catena polipeptidica avente un peso molecolare di 49.500. Altre proprietà fisiche e chimiche dell'inh ibitore sono descritti. È stata ottenuta una sequenza N-terminale limitata (Glu-Asp-Pro-Gln-Gly-Asx-Ala-Ala). È stato scoperto che l'alfa-1-AT forma facilmente polimeri e aggregati superiori quando esposto ad agenti denaturanti come l'urea 8 M e la guanidina 6 M. I risultati suggeriscono che l'aggregazione è determinata da forze sia covalenti che non covalenti.
Proprietà di ossidoriduzione della proteina ferro-zolfo ad alto potenziale di Chromatium vinosum.Le proprietà di ossidoriduzione della proteina ad alto potenziale ferro-zolfo (HIPIP ) da Chromatium vinosum sono state studiate. Sia le misurazioni dell'equilibrio che quelle cinetiche dimostrano che il trasporto di elettroni da parte di HIPIP è indipendente dal pH nell'intervallo di pH 7-11. La cinetica di riduzione (ferrocianuro di potassio, SO2, S2O42-, ascorbato di sodio e Rhodospirillum rubrum citocromo c2 ) e ossidazione (ferricianuro di potassio e Rhodospirillium rubrum citocromo c2) di HIPIP Sulla base dei dati ottenuti con diversi reagenti e dell'influenza della forza ionica, del pH e della temperatura sulla cinetica di ossidazione e riduzione, si possono trarre alcune conclusioni (1) HIPIP subisce un rapido trasferimento di elettroni dalla sfera esterna senza evidenza di complessità cinetica e nessuna indicazione di formazione di complessi con vari reagenti. (2) Il sito di ossidazione dell'HIPIP ridotto ha una carica apparente negativa mentre il sito di riduzione dell'HIPIP ossidato è scarico. (3) HIPIP sembra interagire con un reagente fisiologico (R. rubrum citocromo c2) nello stesso sito di ossidanti o riducenti non fisiologici, suggerendo singole vie di energia minima per i processi di ossidazione e riduzione. (4) Sulla base di un confronto delle velocità di ossidazione e riduzione con diversi reagenti, sembra che le restrizioni steriche e le differenze nel potenziale di ossidoriduzione siano meno importanti dell'attrazione e/o repulsione elettrostatica nel determinare le costanti di velocità assolute. (5) I parametri di attivazione termodinamica indicano che sia l'ossidazione che la riduzione da parte degli esacianuri di ferro sono guidate entropicamente con i termini entalpici che non contribuiscono all'ossidazione di HIPIP e un piccolo contributo alla riduzione di HIPIP. Sulla base dei dati qui riportati e delle informazioni strutturali e fisico-chimiche disponibili, vengono discussi i possibili meccanismi di ossidazione e riduzione di HIPIP e analizzati i relativi meriti. I meccanismi più probabili includono il trasferimento di elettroni tramite un residuo di tirosina, il trasferimento di elettroni attraverso un mezzo non acquoso al cromoforo ferro-zolfo e l'interazione diretta tra il cromoforo ferro-zolfo e i diversi ossidanti e riducenti.
Forma a pH basso e alto di cadmio anidrasi carbonica determinata dall'interazione del quadrupolo nucleare.La dipendenza dal pH dell'interazione del quadrupolo nucleare tra i 247-keV eccitati Lo stato in 111Cd legato al sito attivo dell'anidrasi carbonica umana B e l'ambiente proteico più vicino è stato studiato mediante la tecnica spettroscopica nucleare di correlazione angolare perturbata dei raggi gamma. L'enzima è stato studiato nella regione del pH 5,6-11,0 a 22 e -196 gradi C. I risultati mostrano che l'enzima Cd cambia da una forma a pH basso a un'altra forma a pH alto sia a 22 che a -196 gradi C. Il pK della transizione è 8,9 +/- 0,2 a -196 gradi C e vicino a 9 a 22 gradi C. Parallelamente a questa trasformazione, l'attività esterasica dell'enzima Cd per l'idratazione del p-nitrofenil acetato mostra una dipendenza dal pH con un pH di 9,1 +/- 0,2. L'inibitore della sulfonamide acetazolamide inibisce completamente questa attività dell'enzima Cd. Il quad i parametri di interazione rupolo per l'enzima Cd non sono significativamente differenti a -196°C da quelli ottenuti a 22°C. Una misurazione a 0°C pH 5,7 mostra, tuttavia, una forma diversa da quelle a 22°C pH 5,6 e -196 gradi C pH 5,7. Il cambiamento nell'interazione del quadrupolo con il pH è, in un modello semplice, coerente con una ionizzazione di una molecola d'acqua legata al metallo.
Conformazione dell'ormone di rilascio delle gonadotropine.La conformazione dell'ormone di rilascio delle gonadotropine (Gn-RH), la cui sequenza primaria è pGlu-His-Trp- Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 e di molti dei suoi analoghi strutturali sono stati studiati mediante dicroismo circolare, dispersione ottica rotatoria e spettroscopia di fluorescenza. Gli effetti del pH, della guanidina e della temperatura sull'emissione di fluorescenza hanno anche stati esaminati. I dati di titolazione dimostrano che i residui di istidina e tirosina sono privi di qualsiasi interazione reciproca. La somiglianza degli spettri di emissione in acqua e nelle soluzioni di cloridrato di guanidina preclude interazioni significative tra i gruppi fluorescenti e altri residui. Né la temperatura né i profili di pH di le intensità di emissione di tirosina o triptofano rivelano qualsiasi struttura secondaria fissa in Gn-RH Sia l'entità dell'estinzione alcalina che la distanza di 10-11 A calcolata dalla teoria del trasferimento di energia di Förster sono in accordo con una struttura a spirale casuale con un solo residuo tra tirosina e triptofano. Inoltre, lo spettro di dicroismo circolare e la dispersione ottica rotatoria non mostrano alcun contributo dai legami peptidici in una struttura ordinata, sebbene vi sia una perturbazione della regione di assorbimento del peptide dovuta a bande sovrapposte da cromofori a catena laterale. Il Gn-RH, quindi, sembra comportarsi come un polipeptide a spirale casuale in acqua privo di interazioni con i residui intracatena. Questa struttura non ordinata in Gn-RH e la mancanza di differenze significative nelle proprietà fisico-chimiche degli analoghi ormonali indicano che una conformazione della soluzione predeterminata non è richiesta per l'attività biologica. Contrariamente al suo comportamento in acqua, il Gn-RH nel trifluoroetanolo mostra una transizione conformazionale, con la formazione di una struttura beta. Le differenze nei cambiamenti conformazionali mostrati da diversi analoghi nel trifluoroetanolo possono essere rilevanti per le loro attività biologiche relative al sito del recettore.
ATPasi di Escherichia coli: purificazione, dissociazione e ricostituzione del complesso attivo dalle subunità isolate.Una semplice procedura per la purificazione di Mg2+- Viene descritta l'ATPasi stimolata di Escherichia coli mediante frazionamento con poli(etilenglicoli) e filtrazione su gel. L'enzima ripristina le reazioni legate all'ATPasi alle preparazioni di membrana prive di queste attività. Cinque diversi polipeptidi (alfa, beta, gamma, delta, epsilon) sono osservati in elettroforesi del sodio dodecilsolfato. Il congelamento in soluzioni saline scinde il complesso enzimatico in subunità che non possiedono alcuna attività catalitica. La presenza di diverse subunità è confermata da metodi elettroforetici e immunologici. Il complesso enzimatico attivo può essere ricostituito diminuendo la forza ionica nel campione dissociato Temperatura, pH, concentrazione proteica e presenza di substrato sono importanti determinanti della velocità e dell'entità della ricostituzione. L'enzima dissociato è stato separato mediante cromatografia a scambio ionico in due frammenti maggiori. Il frammento IA ha un peso molecolare di circa 100000 e contiene i polipeptidi alfa, gamma ed epsilon. Il frammento minore, IB, ha circa lo stesso peso molecolare ma contiene, oltre ad alfa, gamma ed epsilon, il polipeptide delta. Il frammento II, con un peso molecolare di circa 52000, sembra essere identico al polipeptide beta. L'attività dell'ATPasi può essere ricostituita dai frammenti IA e II, mentre la capacità dell'ATPasi di guidare i processi dipendenti dall'energia nelle vescicole di membrana esaurite viene ripristinata solo dopo l'incubazione di queste due frazioni con la frazione IB, che contiene la subunità delta.
Proteasi legata alla cromatina: degradazione delle proteine cromosomiche in condizioni di dissociazione della cromatina.Proteasi legata alla cromatina, attiva in 2 M NaCl-5 M urea o 5 M di urea da sola, è stata dimostrata nel fegato, nei reni, nei testicoli, nel cervello, nel midollo osseo di coniglio, nei reticolociti di pollo e nella cromatina ascite di Ehrlich di ratto. la cromatina epatica in sale e urea è risultata essere indipendente dai metodi di preparazione della cromatina. La proteasi può essere inibita dai reagenti specifici della serina fenilmetansolfonil fluoruro e diisopropilfluorofosfato e dal reagente alchilante, carbobenzossifenilalanina clorometilchetone, in presenza di solventi organici a 1 concentrazione mM Le inibizioni della proteasi legata alla cromatina nel fegato di ratto da parte di questi composti sono irreversibili D'altra parte, carbobenzossifenilalanina e p-nitrofenil acetato hanno dimostrato di essere inibitori reversibili della proteasi legata alla cromatina del fegato di ratto. L'applicazione di questi inibitori durante la dissociazione della cromatina da parte del sale e dell'urea può essere utile ai ricercatori interessati a purificare varie proteine cromosomiche o ai ricercatori che stanno effettuando studi di ricostituzione con cromatine labili.
La configurazione assoluta degli amminoacidi nella delta-(alfa-aminoadipyl)cysteinylvaline da Penicillium chrysogenum.Radioactive carbon-14 L-alpha-aminoadipic acido, L-cisteina o L-valina sono stati prontamente incorporati nel tripeptide intracellulare, delta-(alfa-aminoadipil)cisteinilvalina (ACV), da cellule lavate affamate di Penicillium chrysogenum. L'ACV marcato in ogni caso è stato ossidato con acido performico e isolato come il suo corrispondente derivato dell'acido solfonico. Dopo l'idrolisi acida, la configurazione degli acidi componenti è stata determinata dalle ossidasi L- e D-amminoacidi, che hanno mostrato che il tripeptide (ACV) da P. chrysogenum è delta-(L-aminoadipyl) -L-cisteinil-D-valina.
La struttura dell'addotto covalente formato dall'interazione del 3-dimetilammino-1-propino e della flavina dell'ammino ossidasi mitocondriale.3-Dimetilammino -1-propine inattiva irreversibilmente la monoamino ossidasi mitocondriale dal fegato bovino L'inattivazione provoca la perdita di assorbimento nella regione 450-500 nm dello spettro della flavina e un concomitante aumento dell'assorbanza a 410 nm Per l'addotto legato all'enzima epsilon410 = 28000. Le proprietà spettrali dell'addotto dell'enzima epatico con 3-dimetilammino-1-propina sono simili a quelle osservate quando l'enzima del rene di maiale viene inattivato con la pargilina (Chuang et al. (1974), J. Biol. Chem. 249, 2381). Da un digerito proteolitico dell'enzima inattivato con inibitore marcato è stato isolato un peptide di flavina che contiene 1 mole di inattivatore/mole di flavina. Le proprietà chimiche e spettrali dell'addotto sono quelle dei composti contenenti la struttura - -N--CH==CH--CH==N+ inferiore a. Si è concluso che l'addotto dell'inibitore della flavina è una diidroflavina N-5 sostituita e la sua struttura è stata determinata.
Il legame della ridotta nicotinammide adenina dinucleotide alla citrato sintasi di Escherichia coli K12.Citrato sintasi da Escherichia coli aumenta la fluorescenza del suo inibitore allosterico, NADH , e sposta il picco di emissione del coenzima da 457 a 428 nm. Questi effetti sono stati usati per misurare il legame di NADH a questo enzima in varie condizioni. La costante di dissociazione per il complesso NADH-citrato sintasi è di circa 0,28 muM a pH 6.2, ma aumenta verso il pH alcalino come se il legame dipendesse dalla protonazione di un gruppo con un pKa di circa 7,05. Nell'intervallo di pH 6,2-8,7, il numero di siti di legame diminuisce da circa 0,65 a circa 0,25 per subunità citrato sintasi. di questa transizione è a circa pH 7,7 e può essere un riflesso della parziale depolimerizzazione dell'enzima che è noto che si verifica in questo intervallo di pH. È stato utilizzato un metodo di filtrazione su gel per verificare che la tecnica di miglioramento della fluorescenza accura tely rivela tutte le molecole di NADH legate all'enzima nell'intervallo di concentrazione di interesse. NAD+ e NADP+ erano deboli inibitori competitivi del legame di NADH a pH 7,8 (valori di Ki superiori a 1 mM), ma una maggiore inibizione è stata mostrata da 5\'-AMP e 3\'-AMP, con valori di Ki di 83 +/- 5 e 65 +/- 4 muM, rispettivamente. Acetil-CoA, uno dei substrati, e KCl, un attivatore, inibiscono anche il legame in modo debolmente cooperativo. Tutti questi effetti sono coerenti con le osservazioni cinetiche su questo sistema. Interpretiamo i nostri risultati in termini di due tipi di siti di legame per i nucleotidi sulla citrato sintasi: un sito attivo che lega l'acetil-CoA, il substrato, o il suo analogo 3\'-AMP; e un sito allosterico che lega NADH o il suo analogo 5\'-AMP e ha una minore affinità per altri nicotinammide adenina dinucloetidi. Quando il sito attivo è occupato, proponiamo che NADH non possa legarsi al sito allosterico, ma 5\'-AMP può; viceversa, quando NADH è nel sito allosterico, il sito attivo non può essere occupato. Oltre a queste due classi di siti, devono esserci punti di interazione con KCl e altri sali. L'ossalacetato, il secondo substrato, e l'alfa-chetoglutarato, un inibitore la cui modalità d'azione è ritenuta allosterica, non hanno alcun effetto sul legame del NADH alla citrato sintasi a pH 7,8. Quando il NADH è legato alla citrato sintasi, estingue la fluorescenza intrinseca del triptofano dell'enzima. La quantità di spegnimento è proporzionale alla quantità di NADH legato, almeno fino a un rapporto di legame di 0,50 NADH per subunità enzimatica. Questa quantità di legame porta all'estinzione del 53 +/- 5% della fluorescenza enzimatica, il che significa che una molecola di NADH può estinguere tutta la fluorescenza intrinseca della subunità a cui si lega.
Attività dell'esterasi delle proteasi neutre dello zinco.L'idrolisi di una serie di depsipeptidi dimostra che le endopeptidasi neutre dello zinco dei batteri sono esterasi attive. Esteri come BzGly-OPhe-Ala, BzGly-OLeu-Ala e FA-Gly-OLeu-NH2 vengono idrolizzati a velocità da tre a otto volte più lente dei loro esatti analoghi peptidici, quando idrolizzati dalla termolisina, dalla proteasi neutra del Bacillus subtilis e dalla proteasi neutra da Aeromonas proteolytica. L'idrolisi dell'estere da parte delle proteasi neutre dello zinco segue la caratteristica preferenza per gli amminoacidi idrofobici adiacenti al sito di scissione, individuati dall'idrolisi dei substrati peptidici. La rimozione dello zinco dalla termolisina abolisce l'attività esterasi dell'enzima nativo. Tra i metalli esaminati , solo Co2+ e Zn2+ ripristinano l'attività esterasica in misura significativa, Co2+ ripristinando il 50% e Zn2+ il 100% dell'attività termolisina nativa L'idrolisi di esteri e peptidi da parte della termolisina non t differiscono rispetto ai passaggi di legame o catalitici. La specificità del substrato, i profili di velocità del pH, l'inibitore e gli effetti dell'isotopo del deuterio sono identici per entrambi i tipi di substrati.