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Séméiologie angiotomographique des tumeurs cérébrales | WMT16 | Scientific |
RÉSUMÉ In obesity, adipocyte hypertrophy is often associated with recrutement of new fat cells (adipogenesis) under the control of circulating and local regulatory factors Among the different lipids released in the extracellular compartment of adipocytes, our group found the presence of lysophosphatidic acid (LPA) LPA is a bioactive phospholipid able to regulate several cell responses via the activation of specific G-protein coupled membrane receptors Our group found that LPA increases preadipocyte proliferation and inhibits adipogenesis via the activation of LPA1 receptor subtype Extracellular LPA-synthesis is catalyzed by a lysophospholipase D secreted by adipocytes : autotaxin (ATX) Adipocyte ATX expression strongly increases with adipogenesis as well as in individuals exhibiting type 2 diabetes associated with massive obesity A possible contribution of ATX and LPA as paracrine regulators of adipogenesis and obesity associated diabetes is proposed SUMMARY Secretion and role of autotaxin and lysophosphatidic acid in adipose tissue PRODUCTION DE LPA DANS LE MILIEU EXTRACELLULAIRE DES ADIPOCYTES Plusieurs études ont montré que des milieux de culture conditionnés par des adipocytes ont la capacité d'augmenter la prolifération de préadipocytes en culture Nous avons montré qu'une partie de cet effet prolifératif pouvait être bloqué par un pré-traitement de ces milieux conditionnés par une enzyme hydrolysant spécifiquement les lysophospholipides : la phospholipase B Une analyse qualitative, basée sur le pré-marquage des phospholipides cellulaires au [ 32 P]) du contenu en phospholipides des milieux conditionnés, a révélé la présence de plusieurs lysophospholipides, en particulier l'acide lysophosphatidique (LPA) ) La mise au point d'un dosage radioenzymatique spécifique du LPA a permis de confirmer sa pré-sence et de le quantifier ) Le LPA est un phospholipide bioactif connu pour réguler certains évènements cellulaires (prolifération, migration, apoptose. ) via l'activation de récepteurs membranaires spécifiques couplés aux protéines G hété-rotrimériques A ce jour, quatre récepteurs au LPA ont été identifiés et clonés : LPA-1, -2, -3, -4 Parallèlement, bien que controversées, certaines études ont proposé que le LPA pouvait également être un ligand d'un facteur de transcription connu pour son rôle crucial dans le processus d'adipogenèse : PPAR ) Le LPA est également présent dans le plasma (Saulnier- ) Cependant il n'existe aucune corrélation entre les taux plasmatiques de LPA et l'état de masse grasse chez l'animal ou chez l'Homme Ceci montre que le LPA produit par le tissu adipeux ne semble pas contribuer de façon significative aux taux circulants de LPA Ainsi, la production de LPA par le tissu adipeux semble être principalement de nature locale, suggérant des effets autocrines et/ou paracrines plutôt qu'endocrines LES RÉCEPTEURS AU LPA DANS LE TISSU ADIPEUX Le LPA étant connu pour agir via l'activation de récepteurs spécifiques, leur présence dans le tissu adipeux a été étudiée Sur la base de la quantification des ARNm, le récepteur LPA1 est apparu comme le soustype le plus abondant dans le tissu adipeux (humain et murin) Le sous-type LPA2 est également présent, mais de façon très minoritaire Les récepteurs LPA3 et LPA4 sont absents ) Bien que le facteur de transcription PPAR2 soit abondamment exprimé dans l'adipocyte, l'activation de PPAR2 par le LPA n'a pas pu être mis en évidence dans l'adipocyte ) L'expression du récep-teur LPA1 est 3 à 5 fois plus faible dans la fraction adipocytaire que dans la fraction stromale-vasculaire du tissu adipeux Cette fraction contient des préadipocytes ainsi que des macrophages et des cellules endothéliales L'expression relative du récepteur LPA1 dans les diffé-rents types cellulaires de la fraction stromale-vasculaire n'a pas été précisément déterminée En culture, la diffé-rentiation des préadipocytes en adipocytes, s'accompagne d'une forte réduction de l'expression des ARNm du récepteur LPA1 Ainsi, via ce récepteur, le préadipocyte apparat comme une des cibles possibles du LPA au sein du tissu adipeux EFFETS PROLIFÉRATIF ET ANTI-ADIPOGÉNIQUE DU LPA L'expression du récepteur LPA1 dans les préadipo-cytes nous a conduits à tester l'action du LPA sur ces cellules Des préadipocytes de la lignée murine 3T3F442A ou des préadipocytes en culture primaire issus de la fraction stromale-vasculaire de tissu adipeux ont été traités par une des espèces moléculaires les plus actives de LPA : le 1-oléoyl-LPA (C18 : 1) Ces études ont permis de confirmer que le LPA augmentait la croissance des préadipocytes ) De plus, le traitement au LPA inhibe la différenciation des préadipocytes en adipocytes (adipogenèse) ) Cet effet anti-adipogénique se caractérise par une inhibition de l'accumulation de triglycérides et une diminution d'expression de plusieurs gènes adipocytaires parmi lesquels le facteur de transcription PPAR2 Les préadipocytes isolés du tissu adipeux de souris invalidées pour le récepteur LPA1 possèdent une plus grande propension à se différencier en adipocytes que les préadi-pocytes de souris sauvages De plus, l'effet anti-adipogénique du LPA disparat après invalidation du récepteur LPA1 ) Enfin, les souris invalidées pour le récepteur LPA1 présentent une augmentation significative du pourcentage de masse grasse comparativement aux souris sauvages ) L'ensemble de ces observations suggèrent que le LPA (via son effet anti-adipogénique dépendant du récepteur LPA1) produit dans le milieu extracellulaire des adipocytes, pourrait exercer un effet inhibiteur local sur le recrutement de nouveaux adipocytes au sein du tissu adipeux IMPLICATION DE LA SÉCRÉTION D'UNE LYSOPHOSPHOLIPASE D DANS LA SYNTHÈSE DE LPA PAR L'ADIPOCYTE Parallèlement à l'étude des effets biologiques du LPA, il était important d'identifier les voies métaboliques impliquées dans sa synthèse Au plan biochimique, plusieurs enzymes (phospholipases A, glycérolphosphate acyltransférase, monoacylglycérol kinase, lysophospholipases) sont susceptibles de catalyser la synthèse de LPA Le LPA étant un phospholipide très polaire pou-vant difficilement traverser la membrane plasmique, sa présence dans le compartiment extracellulaire semble devoir résulter de l'action d'une enzyme ectopique ou sécrétée, plutôt que d'une enzyme intracellulaire Nous avons observé qu'après séparation des cellules, les concentrations de LPA dans les milieux conditionnés d'adipocytes n'étaient pas stables et augmentaient avec le temps ) Cette observation suggérait l'existence d'une activité de synthèse du LPA (LPA-SA) sécrétée par les adipocytes Une telle activité enzymatique avait déjà été décrite dans le plasma de rat ( La caractérisation biochimique de la LPA-SA adipocytaire a révélé qu'il s'agissait d'une activité de type lysophospholipase D (lysoPLD) soluble catalysant l'hydrolyse de lysophosphatidylcholine (LPC) (produite également en grande quantité par les adipocytes) en LPA et choline Cette activité lysoPLD étant dépendante de la présence de métaux lourds (particuliè-rement le cobalt), elle peut être inhibée par la phénan-throline ) L'ACTIVITÉ LYSOPHOSPHOLIPASE D SÉCRÉTÉE PAR L'ADIPOCYTE EST CATALYSÉE PAR L'AUTOTAXINE A l'époque de ces observations, aucune enzyme capable de catalyser une activité lysoPLD sécrétée n'avait été identifiée L'activité lysoPLD sécrétée dans les milieux de culture d'adipocytes a été purifiée, microséquencée et identifiée comme étant catalysée par l'autotaxine (ATX) L'ATX est une glycoprotéine de 100-110 kDa appartenant à la famille des ecto-nucléotides pyrophosphatases phosphodiestérases (enpp) ( L'ATX a initialement été identifiée comme un puissant activateur de motilité cellulaire sécrété dans les milieux de culture d'une lignée de mélanome humain Cette enzyme a d'abord été décrite pour ses capacités d'hydrolyse des liaisons phosphodiesters de nucléotide comme l'ATP ou l'UDP-glucose ( Plus récemment, il a été démontré que l'ATX possédait également une activité de type lysophospholipase D (lyso-PLD) conduisant à la synthèse de LPA ou de sphingosine-1-phosphate (un autre phospholipide bioactif) à partir de la lysophosphatidylcholine (LPC) ou de la la sphingosylphosphorylcholine (SPC) ( Les activités PDE et lyso-PLD de l'ATX sont portées par le même site catalytique Cependant, l'activité PDE semble être minoritaire par rapport à l'activité lyso-PLD, probablement en raison de l'accessibilité différentielle des substrats (LPC vs SPC) ) Chez l'individu normal (Homme et Souris), l'ATX est présente dans plusieurs tissus (cerveau, placenta, rein, pancréas, tissu adipeux) avec une expression plus importante dans le système nerveux central ( , o elle pourrait être impliquée dans la neurogenèse et la myélinisation des oligodendrocytes ( L'ATX est également présente au niveau plasmatique , mais le type cellulaire et/ou le tissu à l'origine de cette ATX circulante reste inconnue L'expression de l'ATX est augmentée dans plusieurs types de cancers humains (carcinomes mammaires, hépa-tiques, thyroïdiens, neuroblastomes) ) Les mécanismes impliqués dans ces augmentations restent inconnus Par ailleurs, l'ATX a été décrite pour augmenter la tumorigenèse et l'angiogenèse in vitro et in vivo ) Ces effets biologiques sont imputables à la synthèse de LPA et à l'activation de ses récepteurs Les propriétés pro-métastasiantes et pro-angiogéniques de l'ATX pourraient favoriser l'invasion des cellules cancéreuses et participer à la néovascularisation des tumeurs RÉGULATIONS D'EXPRESSION DE L'ATX DANS LE TISSU ADIPEUX L'identification de l'ATX comme enzyme responsable de la synthèse de LPA dans le milieu extracellulaire des adipocytes, nous a conduits à rechercher les situations physiopathologiques associées à des modifications de son expression dans le tissu adipeux En culture, alors que l'expression (ARNm et protéine) de l'ATX est très faible (voire indétectable) dans les pré-adipocytes (lignée 3T3F442A ou culture primaire), elle augmente fortement au cours de la différenciation adipocytaire Cette augmentation a éga-lement été observée au cours de la différenciation adipocytaire de cellules souches embryonnaires de souris en culture ) Cette augmentation ne semble pas directement attribuable au processus d'adipogenèse car, contrairement à d'autres gènes adipocytaires, l'expression de l'ATX est très fortement diminuée par un traitement avec un ligand du facteur de transcription PPAR Inversement, le TNF, cytokine connue pour son puissant effet anti-adipogénique, augmente l'expression de l'ATX ) Les facteurs et les mécanismes impliqués dans l'augmentation d'expression de l'ATX avec la différenciation adipocytaire restent à clarifier L'expression de l'ATX a été mesurée dans le tissu adipeux de divers modèles murins d'obésité Parmi les différents modèles étudiés (souris engraissées par un régime hyperlipidique, souris traitées à l'aurothioglucose, souris db/db) seules les souris db/db présentent une augmentation importante de l'expression de l'ATX adipocytaire ) Ces souris se distinguent des autres modèles d'obésité par une hyper-insulinémie supérieure associée à une forte diminution de la sensibilité à l'insuline de ses adipocytes Chez l'Homme, aucune corrélation significative n'a été retrouvée entre l'indice de masse corporelle (IMC) et l'expression de l'ATX du tissu adipeux Par contre, une augmentation significative d'expression de l'ATX a été observée dans le tissu adipeux de patientes associant obésité massive (IMC supérieur à 40) et intolérance au glucose ) L'ensemble de ces observations montrent que l'expression de l'ATX du tissu adipeux n'est pas directement liée à l'état d'engraissement des individus, mais pourrait être dépendante de l'état de résistance à l'insuline des adipocytes et/ou à l'inflammation du tissu adipeux CONCLUSIONS -PERSPECTIVES Ces études montrent que l'ATX, par l'intermédiaire du LPA et du récepteur LPA1, pourrait participer à la régu-lation paracrine de l'adipogenèse et/ou à l'étiologie du diabète associé à l'obésité Cependant, des études complémentaires doivent être menées pour vérifier ces hypothèses Il sera nécessaire de parfaire nos connaissances des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les changements d'expression de l'ATX et du récep-teur LPA1 au cours de la différenciation adipocytaire ainsi que dans le diabète associé à l'obésité Il sera éga-lement nécessaire de développer des modèles de souris transgéniques o l'expression de l'ATX et du récepteur LPA1 du tissu adipeux est modifiée (invalidation, surexpression) et d'en déterminer les conséquences phéno-typiques Si nos hypothèses sont vérifiées, l'ATX et le récepteur LPA1 pourraient constituer des cibles pharmacologiques intéressantes dans le traitement de l'obé-sité et/ou de certaines pathologies associées comme le diabète. | ISTEX | Scientific |
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Rôle de l'hypoxia-inducible factor-1 dans la susceptibilité myocardique à l'ischémie-reperfusion induite par l'hypoxie intermittente Sophie Moulin To cite this version : Sophie Moulin. Rôle de l'hypoxia-inducible factor-1 dans la susceptibilité myocardique à l'ischémie- reperfusion induite par l'hypoxie intermittente. Physiologie [q-bio. TO]. Université Grenoble Alpes, 2018. Français. NNT : 2018GREAV034. tel-02048461 HAL Id : tel-02048461 Submitted on 25 Feb 2019 HAL is a multi-disciplinary open access L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est archive for the deposit and dissemination of sci- destinée au dépôt et à la diffusion de documents entific research documents, whether they are pub- scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, lished or not. The documents may come from émanant des établissements d'enseignement et de teaching and research institutions in France or recherche français ou étrangers, des laboratoires abroad, or from public or private research centers. publics ou privés. THÈSE Pour obtenir le grade de DOCTEUR DE LA COMMUNAUTE UNIVERSITE GRENOBLE ALPES Spécialité : Physiologie, Physiopathologie, Pharmacologie Arrêté ministériel : 25 mai 2016 Présentée par Sophie MOULIN Thèse dirigée par Pr. Diane GODIN-RIBUOT, codirigée par Dr. Elise BELAIDI, préparée au sein du Laboratoire HP2 - INSERM U1042 dans l'École Doctorale Chimie et Sciences du Vivant Rôle de l'hypoxia-inducible factor-1 dans la susceptibilité myocardique à l'ischémie-reperfusion induite par l'hypoxie intermittente Thèse soutenue publiquement le 5 novembre 2018, devant le jury composé de : Mr Jeremy FAUCONNIER CRCN CNRS, Université de Montpellier, Rapporteur Mr Michel GALINIER PU-PH, Université Paul Sabatier, CHU Toulouse, Rapporteur Mr Henri BENOIT PU, Université Grenoble Alpes, Président Mme Sophie GIORGETTI-PERALDI CR Inserm, Université Nice, Examinatrice Mr Jean-Louis PEPIN PU-PH, Université Grenoble Alpes, CHU Grenoble Alpes, Examinateur Rôle de l'hypoxia-inducible factor-1 da s la sus epti ilité o a di ue à l'is hé ie-reperfusion i duite pa l'h po ie i te itte te Résumé : Le s d o e d'ap es o st u tives du so eil (SAOS) est un problème de santé publique majeur qui est considéré comme un facteur indépendant de risque de survenue d'u i fa tus du o a de (IM). Les altérations cardiovasculaires associées au SAOS sont principalement dues à l'h po ie intermittente (HI) chronique. E pa ti ulie , l'HI i duit l'a tivatio du facteur de transcription hypoxia- inducible factor-1 (HIF-1), sus epti le d' t e i pli u da s la vul a ilit a ue du o a de à l'is h ie- reperfusion. L'o je tif de ette th se était d' tudie le ôle de HIF-1 da s les a is es i duits pa l'HI et impliqués da s l'aug e tatio de la taille de l'infarctus suite à une ischémie-reperfusion. Ces travaux ont mis en évidence deux nouveaux effets délétères de l'HI, à savoir l'i du tio d'un stress du réticulum endoplasmique (RE) et d'altérations mitochondriales. A t ave s, l'i hi itio g ti ue et/ou pharmacologique de HIF-1, nous avons montré que HIF-1 apparat comme un acteur primordial dans l'e se le des a is es délétères de l'HI, incluant ceux découverts lors de cette thèse. De plus, HIF-1 joue un rôle majeur da s l'aug e tatio de la taille de l'IM induite par l'HI chronique. Parallèlement, son activation myocardique est corrélée à l'i de d'ap es-hypopnées chez des patients apnéiques atteints d'u e aladie o o a ie e ( o pa ativement aux non-apnéiques). Par conséquent, l'activation de HIF-1 pourrait être utilisée comme marqueur diagnostic du SAOS chez les patients à risque cardiovasculaire. HIF-1 pourrait également représenter une cible pour le développement de nouvelles thérapies complémentaires ou substitutives aux traitements actuels. Mots clés : hypoxia-inducible factor-1, s d o e d'ap es o st u tives du so eil, h po ie i te itte te, infarctus du myocarde, stress du réticulum endoplasmique, mitochondrie, mitochondria-associated ER membranes Role of hypoxia-inducible factor-1 in myocardial susceptibility to ischemia-reperfusion induced by intermittent hypoxia Summary : Obstructive sleep apnea syndrome (OSAS) is a major public health problem that is considered an independent risk factor for the occurrence of myocardial infarction (MI). The cardiovascular alterations associated with OSA are mainly due to the chronic intermittent hypoxia (IH). In particular, activation by IH, the hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) transcription factor likely contributes to enhance myocardial vulnerability to ischemia-reperfusion injury. The aim of this thesis was to study the role of HIF-1 in the mechanisms involved in the increase in MI induced by chronic IH. This work has highlighted two new deleterious consequences of IH exposure, namely endoplasmic reticulum (ER) stress and mitochondrial alterations. Through genetic and/or pharmacological inhibition of HIF-1, we have shown that HIF-1 appears to be a primordial actor in all the deleterious mechanisms of IH, including those discovered during this thesis. HIF-1 also appears to play a major role in the IH-induced increase in MI size. In parallel, its myocardial activation is correlated with the apnea-hypopnea index in apnoeic, compared to non-apnoeic, patients with coronary heart disease. Therefore, HIF-1 activation could serve as a diagnostic marker of OSA in patients with cardiovascular risk. HIF-1 could also be a target for new therapeutic approaches, in complement or replacement of standard treatments. Key words : hypoxia-inducible factor-1, obstructive sleep apnea syndrome, intermittent hypoxia, myocardial infarction, endoplasmic reticulum stress, mitochondria, mitochondria-associated ER membranes TABLE DES MATIERES TABLE DES MATIERES . 1 REMERCIEMENTS . 4 LISTE DES ABREVIATIONS . 6 LISTE DES FIGURES. 8 INTRODUCTION. 9 1. Infarctus du myocarde . 10 a. Prévalence et facteurs de risque . 10 b. Définition et physiopathologie . 10 c. Taille de l'infarctus . 12 d. Acteurs cellulaires de l'ischémie-reperfusion myocardique . 14 i. Ischémie . 14 ii. Reperfusion . 17 e. Mécanismes cellulaires de la réponse à l'ischémie-reperfusion . 19 i. Stress du réticulum endoplasmique . 20 Définition du réticulum endoplasmique . 20 Définition du stress du réticulum endoplasmique . 22 Implication dans la réponse à l'ischémie-reperfusion . 25 ii. Mitochondria-associated ER membranes . 27 Définition . 27 Implication dans la réponse à l'ischémie-reperfusion . 29 iii. Mitochondrie . 31 Définition et métabolisme mitochondrial . 31 Dynamique mitochondriale. 33 Cycle du renouvellement des mitochondries . 34 Implication dans la réponse à l'ischémie-reperfusion . 36 2. Syndrome d'apnées obstructives du sommeil . 38 a. Prévalence et facteurs de risque . 38 b. Définition et physiopathologie . 39 c. Diagnostic, critère de définition . 40 d. Traitements . 41 e. Conséquences cardiovasculaires du SAOS et de l'HI chronique . 43 i. Conséquences vasculaires . 43 Hypertension artérielle . 43 Dysfonction endothéliale . 44 Athérosclérose . 44 ii. Conséquences cardiaques . 45 Arythmies . 45 Infarctus du myocarde . 45 Remodelage ventriculaire . 46 Insuffisance cardiaque . 46 f. SAOS, HI chronique et mécanismes principaux . 48 i. Activation sympathique . 48 ii. Inflammation . 48 iii. Stress oxydant . 49 iv. Hypoxia-inducible factor-1 . 50 Définition . 50 Régulation . 52 Implication de HIF-1 dans la réponse à l'HI chronique . 54 3. Objectifs . 59 MATERIEL ET METHODES . 62 1. Design expérimentaux. 63 a. Etude 1. 63 b. Etude 2. 64 c. Etude 3. 65 2. Matériel . 66 a. Patients atteints d'une maladie coronarienne avec ou sans apnées du sommeil. 66 b. Animaux. 66 3. Méthodes . 67 a. Modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente . 67 b. Ischémie-reperfusion in vivo et taille de l'infarctus . 68 c. Isolation des cardiomyocytes de souris adultes . 68 i. Flux calciques inter-organites . 69 ii. Proximity Ligation Assay par la méthode Duolink . 70 d. Isolation de mitochondries de cœur . 70 i. Consommation d'oxygène . 71 ii. Production de peroxyde d'hydrogène . 71 iii. Potentiel de membrane . 71 v. Dosage de l'activité de la citrate synthase . 72 vi. Dosage de l'activité des complexes mitochondriaux . 73 e. Histologie . 74 i. Microscopie électronique à transmission. 74 ii. Coloration au dihydroéthidium . 74 iii. Immunohistochimie . 75 f. Biologie des protéines . 76 i. Extraction de protéines . 76 ii. Western Blot. 76 iii. Co-immunoprécipitation . 77 g. Biologie moléculaire de l'ADN . 78 i. Extraction de l'ARN . 78 ii. PCR quantitative en temps réel couplé à une transcription réverse (RT-qPCR) 78 h. Analyses statistiques . 79 RESULTATS . 80 1. Etude 1 : Rôle de HIF-1 dans l'altération des MAM, le stress du RE et l'augmentation de la taille d'infarctus induits par l'HI chronique . 81 2. Etude 2 : Rôle de HIF-1 dans les altérations mitochondriales induites par l'HI chronique . 121 a. Dysfonction mitochondriale . 124 b. Altérations de la dynamique et du renouvellement des mitochondries . 128 c. Activation de l'AMPK et effet bénéfique de la metformine . 130 3. Etude 3 : Rôle de HIF-1 dans les mécanismes d'adaptation délétères induits par l'HI chronique. Effets d'un inhibiteur de l'activité de HIF-1, la curcumine. . 133 a. Curcumine et taille de l'infarctus . 135 b. Curcumine et mécanismes délétères de l'HI. 135 DISCUSSION. 138 1. Axe HIF-1 - stress du RE en HI chronique . 140 a. HI, stress du RE . 140 a. HI, HIF-1, stress du RE . 141 b. HI, HIF-1, stress du RE, taille de l'infarctus. 142 c. SAOS, HIF-1, stress du RE . 142 2. Rôle de HIF-1 dans l'altération des MAM et de l'homéostasie calcique induite par l'HI chronique . 143 a. HI, MAM, homéostasie calcique . 143 b. HI, HIF-1, MAM, homéostasie calcique . 146 3. Rôle de HIF-1 dans la dysfonction mitochondriale et la mitophagie induites par l'HI chronique . 147 a. HI, fonction mitochondriale . 147 b. HI, HIF-1, fonction mitochondriale . 148 c. HI, biogénèse et dynamique . 149 d. HI, HIF-1, dynamique . 150 e. HI, mitophagie . 151 f. HI, HIF-1, mitophagie. 152 4. HI chronique et altérations mitochondriales, effets protecteurs de la metformine . 153 a. HI, AMPK. 153 b. HI, metformine, taille de l'infarctus . 154 c. HI, metformine, dynamique et mitophagie . 154 5. Rôle pivot de HIF-1 dans la susceptibilité myocardique à l'ischémie-reperfusion, induite par l'HI chronique . 156 a. Mécanismes de l'HI . 156 b. HI, curcumine, HIF-1 . 157 a. HI, curcumine, taille de l'infarctus . 158 6. Conclusion . 160 BIBLIOGRAPHIE . 162 ANNEXE . 187 LISTE DES PUBLICATIONS ET COMMUNICATIONS . 201 REMERCIEMENTS Tout d'abord, je tiens à remercier le Dr. Jeremy FAUCONNIER et le Pr. Michel GALINIER d'avoir acceptés d'être rapporteurs de ma thèse et de m'avoir donnés leur regard d'expert sur mon travail. Merci au Pr. Henri BENOIT d'avoir accepté de présider ce jury de thèse, en représentant l'Université Grenoble Alpes. Je remercie le Dr. Sophie GIORGETTI-PERALDI pour l'intérêt qu'elle a porté à mon travail, en participant chaque année à mes comités de suivi de thèse et en acceptant d'examiner celle- ci. Mes remerciements vont aussi au Pr. Jean-Louis PEPIN, examinateur dans ce jury et directeur du laboratoire HP2, pour m'avoir accueilli dans le laboratoire et donné les moyens de réaliser cette thèse dans d'excellentes conditions. Merci à ma co-directrice, la Pr. Diane GODIN-RIBUOT, de m'avoir intégrée dans son équipe, de son suivi et de sa disponibilité tout au long de ma thèse. Mes plus grands remerciements vont au Dr. Elise BELAIDI, co-directrice de ma thèse. Merci de m'avoir fait partager ton dynamisme, ta persévérance, ton amour de la recherche, et aussi de l'enseignement. Ton encadrement m'a permis de réaliser cette thèse dans les meilleures conditions. Je remercie l'ensemble de l'équipe fondamentale du laboratoire, et en particulier Claire pour tes conseils lors de nos réunions hebdomadaires, le Pr. Christophe RIBUOT d'avoir été mon tuteur pour l'enseignement, tous les membres du personnel technique ayant contribué à mes travaux (Sophie, Emeline, Sandrine, Brigitte, Guillaume), ainsi qu'Audrey pour ta disponibilité. Merci aux Dr. Marion PAULY, Dr. Hervé DUBOUCHAUD, Dr. Fred LAMARCHE et Dr. Guillaume VIAL pour leurs aides lors de la réalisation des expérimentations au laboratoire LBFA. Je remercie les doctorants passés et présents (Amandine, Jessica, Marielle, Guillaume, Mélanie, Maximin, Yann), ce fut un plaisir de partager des moments au laboratoire comme à l'extérieur. Merci spécifiquement à Amandine, tu as été ma grande sœur de la recherche, même à l'autre bout du monde. Merci aux étudiants que j'ai encadré pour leur participation à ce travail (Oscar, Marie, Martin, Chloé). Un grand merci à tous mes amis, pour leur soutien et leur présence au quotidien. Je tiens à profondément remercier ma famille qui a toujours été là pour moi, dans les bons et les mauvais moments. Merci d'avoir partagé et participé à ce long parcours. Votre fierté, votre confiance et votre soutien ont été un moteur pour moi. C'est aussi grâce à vous que j'en suis arrivé là. Je vous en suis très reconnaissante. Enfin, merci à Benoit, mon pilier de chaque jour. Merci pour ta patience et ton soutien. LISTE DES ABREVIATIONS 4PBA : 4-phenylbutyrate ERRs : estrogen-related receptors acétyl-CoA : acétylcoenzyme A ERSE : endoplasmic reticulum stress ADP : adénosine biphosphate response element Ambra1 : activating molecule in BECN1- ET-1 : endothéline 1 regulated autophagy protein 1 FADH2 : flavine adénine dinucléotide AMPK : AMP-activated protein kinase FCCP : p-trifluoromethoxy-carbonyl- ASK1 : apoptosis signal regulating kinase 1 cyanide-phenyl hydrazone ATF : activating transcriptor factor FDH : fumarate hydratase ATP : adénosine triphosphate FIH : facteur d'inhibition de HIF-1 Bak : Bcl2 homologous antagonist killer FiO2 : fraction inspirée en oxygène Bax : Bcl2 associated X Fis1 : mitochondrial fission 1 protein Bcl2 : Bcell lymphoma 2 FUNDC1 : fun14 domain containing 1 Bim : Bcl2like protein 11 G : glutamate Bip : immunoglobulin-binding protein Grp75 : glucose-regulated protein 75 kDa BNIP3 : Bcl2/adenovirus E1B 19 kDa Grp78 : glucose-regulated protein 78 kDa protein-interacting protein 3 GSK3 : glycogen synthase kinase 3 BNIP3L : Bcl2/adenovirus E1B 19 kDa H : proton protein-interacting protein 3-like H2O2 : peroxyde d'hydrogène BSA : sérum bovin d'albumine HCO3 : ion bicarbonate Ca2 : ion calcium HI : hypoxie intermittente CaMK : protéines kinases Ca2 /calmoduline- HIF : hypoxia-inducible factor dépendantes HIF-1 : hypoxia-inducible factor 1 CBP : p300/Creb-Binding Protein HLH : basic-helix-loop-helix CAGB : pontage aortocoronarien HRE : hypoxia response element CHOP : C/EBP homologous protein HRP : peroxydase de raifort CK1 : casein kinase 1 hsp90 : heat shock protein 90 CRC : capacité de rétention calcique HTA : hypertension artérielle CsA : cyclosporine A IAH : index apnées-hypopnées CypD : cyclophiline D ID : domaine d'inhibition DAG : diacylglycérol IDH : isocitrate déshydrogénase DCIP : 2, 6-dichlorophenolindophenol IM : infarctus du myocarde DHE : dihydroéthidium IP3 : inositol 1, 4, 5-triphosphate Drp1 : dynamin related protein 1 IP3R : inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor DTT : dithiothreitol IRE1 : inositol requirement enzyme 1 EEG : électroencéphalogramme IRF : interferon regulatory factor eIF2 : eukaryotic initiation factor 2 ISGF3 : interferon-stimulated gene factor 3 ELISA : enzyme-linked immunosorbent JNK : c-Jun N-terminal kinases assay K : ion potassium Elongin BC/Cul/Rbx1 : Elongin LC3 : microtubule-associated protein 1 light BC/Cullin/RING domain protein 1 chain 3 EMG : électromyogramme LSD1 : lysine-specific demethylase-1 EPO : érythropoïétine M : malate ERAD : endoplasmic reticulum-associated MAM : mitochondria-associated ER degradation membranes ERO : espèces réactives de l'oxygène MAPK : mitogen-activated protein kinases MARCH5 : ubiquitin ligase membrane interacting protein-51 associated RING-CH protein 5 PTPm : pore de transition de perméabilité MCU : mitochondrial calcium uniporter mitochondriale Mff : mitochondrial fission factor pVHL : peptide Von Hippel-Lindeau Mfn : mitofusine RACK1 : receptor for activated C kinase 1 MiD : mitochondrial dynamics proteins RCR : respiratory control rate mTOR : mammalian target of rapamycin RE : réticulum endoplasmique N : normoxie REL : réticulum endoplasmique lisse Na : ion sodium RER : réticulum endoplasmique rugueux NADH : nicotinamide adénine dinucléotide RS : réticulum sarco/endoplasmique NADPH : nicotinamide adénine RSUME : RWD-containing SUMOylation dinucléotide phosphate enhancer NCX : échangeur ion soduim/ion calcium RT-qPCR : PCR quantitative en temps réel NF-B : nuclear factor kappa B couplé à une transcription réverse NHE : échangeur ion soduim/proton RyR : récepteurs à la ryanodine NQO1 : NADPH quinone oxidoreductase 1 S : succinate NRF : nuclear respiratory factors SAOS : syndrome d'apnées obstructives du NRF1 : NF-E2-related factor 1 sommeil O2 : dioxygène SDB : sleep disordered-breathing O2. - : anions superoxyde SDH : succinate déshydrogénase OCT : Optimal Cutting Temperature SENP : sentrin/SUMO-specific protease ODD : oxygen degradation domain SERCA : pompe sarco/endoplasmique Ca2 - OMS : organisation mondiale de la santé ATPase OPA1 : optic atrophy 1 Sirt : sirtuine OXPHOS : phosphorylation oxydative STAT : signal transduceur and activator of p38 : p38 mitogen-activated protein transcription kinases SUMO1 : sumoylation par small ubiquitin- PAS : Per-Arnt-Sim like modifier type 1 PCAF : p300/CBP-associated factor TAD : domaines d'activation de la PCR : polymerase chain reaction traduction PERK : protein kinase RNA (PKR)like ER TBARS : thiobarbituric acid reactive kinase substances PGC-1 : peroxisome proliferator-activated Tfam : mitochondrial transcription factor A receptor co-activator 1 TMPD : N, N, N, N-tetramethyl-p- PHD : prolyl-4-hydroxylases phenylenediamine PI3K : phosphoinositide 3-kinase TMRM : tétraméthylrodamine Pink1 : PTEN-induced putative kinase 1 TRAF2 : TNF receptor associated 2 PIP2 : phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate TUDCA : acide tauroursodésoxycholique PKC : protéine kinase C UPR : unfolded protein response PLA : Proximity Ligation Assay VAPB : vesicle-associated membrane PLB : phospholamban protein-associated protein B/C PLC : phospholipase C VDAC : voltage-dependent anion channel 1 PLK3 : polo-like kinase 3 VEGF : vascular endothelial growth factor PPARs : peroxisome proliferator-activated WT : wild-type receptors XBP1 : X-box binding protein 1 PPC : pression positive continue PTPIP51 : protein tyrosine phosphatase- LISTE DES FIGURES Figure 1 : Classification de l'infarctus du myocarde . 11 Figure 2 : Coupes de cœur illustrant la propagation de la mort cellulaire en ischémie . 13 Figure 3 : Modifications des échanges ioniques pendant l'ischémie . 15 Figure 4 : Lésions du myocarde induites par l'ischémie-reperfusion . 16 Figure 5 : Structure du réticulum endoplasmique dans une cellule myocardique . 22 Figure 6 : Activation de la réponse UPR suite à un stress du réticulum endoplasmique, . 25 Figure 7 : L'échanges de lipides et de calcium au niveau des MAM . 28 Figure 8 : Le métabolisme mitochondrial . 32 Figure 9 : La biogénèse, la fusion, la fission et la mitophagie . 39 Figure 11 : Tracé d'enregistrement polysomnographique . 41 Figure 12 : Régulation de l'activité du facteur de transcription HIF-1 par le taux d'O2 . 51 Figure 13 : Structure de HIF-1 et sa régulation . 53 Figure 14 : Les différentes voies de signalisation régulant l'activation de HIF-1 en HI . 55 Figure 15 : Les mécanismes physiopathologiques du SAOS et de l'HI chronique . 57 Figure 16 : Design expérimental de l'étude 1 . 63 Figure 17 : Design expérimental de l'étude 2 . 64 Figure 18 : Design expérimental de l'étude 3 . 65 Figure 19 : Dispositif d'exposition à l'HI de rongeurs . 67 Figure 20 : Tableau des anticorps primaires utilisés en Western Blot. 77 Figure 21 : Design expérimental et méthodologie de l'étude 1. . 83 Figure 22 : Schéma de conclusion de l'étude 1 . 120 Figure 23 : Design expérimental et méthodologie de l'étude 2 . 123 Figure 24 : HI, HIF-1 et fonction mitochondriale. 125 Figure 25 : HI, HIF-1 et capacité de rétention calcique . 126 Figure 26 : HI, HIF-1 et expression des complexes mitochondriaux . 127 Figure 27 : HI, HIF-1 et actvité des complexes mitochondriaux . 127 Figure 28 : HI, HIF-1 et biogénèse, dynamique . 128 Figure 29 : HI, HIF-1 et mitophagie. . 129 Figure 30 : HI, HIF-1 et AMPK . 130 Figure 31 : HI, metformine, dynamique . 131 Figure 32 : HI, metformine, mitophagie. . 131 Figure 33 : Schéma de conclusion de l'étude 2. . 132 Figure 34 : Design expérimental et méthodologie de l'étude 3 . 134 Figure 35 : HI, curcumine, taille d'infarctus . 135 Figure 36 : HI, HIF-1 et curcumine. 136 Figure 37 : Schéma de conclusion de l'étude 3. . 137 Figure 38 : HI, HIF-1 et stress oxydant . 149 Figure 39 : Schéma de conclusion de la thèse . 161 Figure 40 : Schéma de conclusion de l'étude en annexe . 200 INTRODUCTION 1. Infarctus du myocarde a. Prévalence et facteurs de risque D'après l'organisation mondiale de la santé (OMS), les maladies cardiovasculaires restent la première cause mondiale de morbidité et mortalité avec 17, 7 millions de personnes décédées chaque année, soit 31% des décès [1]. En particulier, l'infarctus du myocarde (IM) est responsable de 7 millions de décès par an. En France, entre 2000 et 2007, plus de 25 000 évènements d'IM diagnostiqués et autres décès d'origine coronaire ont été recensés chez des personnes de 35 à 74 ans. Dans cette étude, 55% des cas étaient des IM diagnostiqués, les autres étant des décès d'origine coronarienne sans IM avec antécédents de maladie coronarienne, ou des décès sans antécédents de maladie coronarienne et sans autre cause évidente de décès ou encore des décès avec des données insuffisantes. De plus, parmi les IM diagnostiqués, 86% des personnes n'avaient pas d'antécédents connus d'IM [2]. L'étude de Framingham [3] a mis en évidence de nombreux facteurs de risque d'IM, tels que le sexe, l'âge, les antécédents familiaux, le tabac, le diabète, le syndrome métabolique, l'hypertension artérielle ou encore la cholestérolémie. Récemment, le syndrome d'apnées obstructives du sommeil a aussi été identifié comme un facteur de risque indépendant d'IM [4]. b. Définition et physiopathologie En 2000, la première définition mondiale de l'IM a été publiée par un groupe de travail (Task Force) en cardiologie, constitué par l'American College of Cardiology et l'American Heart Association. Avec le développement de nouvelles technologies de diagnostic et de pronostic, cette définition a été affinée plusieurs fois en moins de 20 ans, et une classification des infarctus est apparue. L'IM est défini comme la mort des cardiomyocytes suite à une ischémie prolongée, résultant d'un déséquilibre de l'apport sanguin et de la demande nécessaire au fonctionnement du myocarde [5]. Cette ischémie est due à un rétrécissement ou à une obstruction de la lumière d'une artère coronaire, entrainant une réduction ou une interruption du débit sanguin. La plupart des IM sont de type I. Ces IM découlent d'une pathologie vasculaire, l'athérosclérose. En effet, l'athérosclérose est caractérisée par la formation de plaques d'athérome dans les artères, entrainant un rétrécissement de la lumière du vaisseau. La plaque d'athérome peut se fissurer, s'éroder ou se rompre, engendrant la formation d'un thrombus dans la circulation sanguine. Ce thrombus est à l'origine d'une occlusion artérielle, provoquant une ischémie myocardique, puis la mort cellulaire (Figure 1). L'IM de type II, également appelé IM secondaire, est causé par une inadéquation entre les apports et la demande myocardique en oxygène et en nutriments. Ce déséquilibre est notamment lié à une anémie, une hypertension ou à un rétrécissement de la lumière de l'artère coronaire, engendré par une plaque d'athérome stable, un vasospasme, une dysfonction endothéliale (Figure 1). L'IM de type III est la mort subite cardiaque, caractérisée par des symptômes cliniques d'IM, comme une élévation du segment ST sur l'ECG ou un bloc de branche gauche, sans élévations des biomarqueurs (décès avant prélèvement ou prélèvement trop précoce). Les IM de type IV et V sont des complications associées à des chirurgies, tel qu'une angioplastie (IVa), une thrombose de stent (IVb) ou un pontage aortocoronarien (CAGB, V) [1]. Figure 1 : Classification de l'infarctus du myocarde (MI) en classe 1 ou 2 selon l'origine de l'ischémie, d'après Thygesen et al. [6]. Le diagnostic et la classification de l'IM sont basés sur l'évaluation des symptômes cliniques (douleurs thoraciques, dans les membres, nausées, vomissements), le dosage de biomarqueurs sanguins (troponine cardiaque I et T, fraction muscle-cerveau (MB) de la créatine kinase), le suivi électrocardiographique, et l'imagerie (échographie IRM, SPECT). La mort cellulaire engendrée par l'IM n'est pas immédiate, elle peut apparatre après plusieurs heures [6]. L'étendue de la mort cellulaire définit la taille de l'infarctus et dépend de divers facteurs. c. Taille de l'infarctus La taille d'infarctus est définie par la zone de cellules mortes suite à l'ischémie et à la reperfusion du myocarde. Elle est également souvent appelée zone nécrosée. La mort cellulaire a lieu de différentes manières, elle peut être due à une apoptose, une nécrose ou à une autophagie des cellules. L'apoptose est caractérisée par une condensation et un fractionnement de la chromatine, un rétrécissement des cellules et, une fragmentation en corps apoptotiques qui seront éliminés par les macrophages [7]. La nécrose est liée au gonflement mitochondrial engendré par l'ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale (PTPm, mécanisme détaillé par la suite). La rupture de la membrane mitochondriale déclenche une perte de l'intégrité de la cellule et une nécrose cellulaire [7]. Bien que les voies de signalisation de l'apoptose et la nécrose soient différentes, elles comportent des étapes identiques, telle que l'activation des caspases. Ainsi la chronologie de leur activation et la prépondérance d'un mécanisme sur l'autre pendant l'ischémie ou la reperfusion restent encore mal définies [7, 8]. L'autophagie est un mécanisme identifié plus récemment comme impliqué dans la mort cellulaire lors d'une ischémie-reperfusion. L'autophagie est caractérisée par une dégradation des cellules non fonctionnelles par les lysosomes [9]. La taille de la zone infarcie dépend de la durée d'ischémie, de la localisation et du degré d'obstruction de l'artère impliquée, et de la présence ou non de vaisseaux collatéraux. Le dysfonctionnement cellulaire est réversible pour des ischémies de courte durée (moins de 15-20 min), au-delà il devient irréversible, entrainant la mort cellulaire [7]. Par conséquent, comme le montre la Figure 4 (détaillée par la suite), l'expansion de la taille d'infarctus se fait proportionnellement à la durée de l'ischémie [10]. De plus, la taille de la zone nécrosée est corrélée positivement avec celle de la zone à risque [11], correspondant à la région irriguée par l'artère obstruée. Ainsi, plus la quantité de myocarde irriguée par l'artère est importante, plus la zone à risque et la taille d'infarctus seront importantes. Tel qu'illustré ci-dessous dans la Figure 2, la mort cellulaire s'étend de l'endocarde vers l'épicarde, selon un front d'onde (wavefront) [12], mettant en évidence une hétérogénéité de la réponse des cellules myocardiques à un stress ischémique et ce, en fonction de leur localisation dans le cœur. Ce phénomène varie selon l'espèce et l'importance du réseau de coronaires collatérales. En effet, lorsqu'une artère est touchée par une ischémie, d'autres artères peuvent prendre le relais pour limiter l'hypoperfusion tissulaire et réduire la zone infarcie [13]. Le réseau de coronaires est plus ou moins ramifié selon les espèces ; par exemple il est bien développé chez l'Humain et peu chez la souris. Figure 2 : Coupes de cœur illustrant la propagation de la mort des cellules myocardiques au cours de l'ischémie selon le phénomène de wavefront allant de l'endocarde vers l'épicarde, d'après Frangogianni et al. [7]. A la suite de l'infarctus, la zone nécrosée devient un tissu cicatriciel non contractile, constitué de collagène, permettant de garder l'intégrité du cœur. Ce tissu peut induire un défaut de contractilité, et engendrer un remodelage ventriculaire, pouvant aboutir au développement d'une insuffisance cardiaque [14]. La limitation de la taille de l'infarctus représente donc un enjeu important pour réduire les conséquences cardiaques. d. Acteurs cellulaires de l'ischémie-reperfusion myocardique L'ischémie et la reperfusion myocardique contribuent toutes les deux au développement de l'infarctus. Les principaux mécanismes cellulaires impliqués lors de ces deux phases sont décrits ci-dessous. i. Ischémie L'ischémie altère rapidement l'intégrité structurelle du myocyte et la fonction cardiaque. Lors d'une ischémie de courte durée, le ralentissement de la fonction cardiaque permet de préserver les réserves énergétiques. Lors d'une ischémie de plus longue durée, les lésions deviennent irréversibles, provoquant la mort cellulaire [7]. Au bout de 60 secondes d'ischémie, la contractilité cardiaque diminue, malgré les nombreuses réserves en adénosine triphosphate (ATP) des cardiomyocytes. L'absence brutale d'oxygène altère le fonctionnement métabolique en passant d'un métabolisme aérobie à un métabolisme anaérobie. Le stock d'ATP est plus difficilement renouvelable. Ainsi, les cardiomyocytes tentent de produire de l'ATP différemment qu'en condition aérobie, notamment, à partir de la phosphocréatine, dont le stock est rapidement utilisé. L'absence de perfusion sanguine empêche l'apport en glucose, la production d'ATP est donc aussi réalisée à partir des stocks de glycogène par la glycolyse anaérobie. Une autre voie de production d'ATP est effectuée par l'adénylate kinase à partir de l'adénosine biphosphate (ADP) [15]. Néanmoins, l'efficacité du métabolisme anaérobie étant beaucoup plus faible que celui de la phosphorylation oxydative, l'ATP est plus vite consommé que produit. Cette réduction d'apport énergétique provoque des lésions irréversibles des cardiomyocytes. De plus, la glycolyse anaérobie entraine une acidose intracellulaire, à cause de l'accumulation de métabolites acides (lactate, CO2, protons). Cette glycolyse est donc ralentie au bout de 15-20 minutes d'ischémie [7]. L'acidose intracellulaire induit une activation de l'échangeur Na /H (NHE, sortie d'un proton H en échange de l'entrée d'un ion sodium Na ) (figure 3) [16]. Le pH acide active aussi le co- transporteur Na -HCO3- (entrée d'un ion Na et d'un ion bicarbonate, HCO3-) [17]. Ces deux mécanismes sont à l'origine d'une augmentation de la concentration intracellulaire de Na . L'altération du fonctionnement de la pompe Na /K -ATPase (sortie de 3 ions Na en échange de l'entrée de 2 ions potassium, K ) par le déficit en ATP contribue également à la surcharge sodique intracellulaire (figure 3). Cette surcharge sodique diminue l'activité de l'échangeur Na /Ca2 (NCX, sortie d'un ion calcium, Ca2 , en échange de l'entrée d'un ion Na ) (figure 3), et favorise son fonctionnement en mode inverse, participant ainsi une surcharge calcique intracellulaire. Le déficit en ATP induit aussi la surcharge calcique intracellulaire, en réduisant l'extrusion active du calcium hors de la cellule (pompe Ca2 -ATPase) et la recapture active du calcium dans le réticulum sarcoplasmique par la pompe sarco/endoplasmique Ca2 - ATPase (SERCA) (figure 2). Ces altérations de l'homéostasie ionique sont propices à l'apparition d'une hypercontracture. Elles favorisent également la survenue d'arythmies, en induisant une dépolarisation membranaire, une altération de la durée du potentiel d'action et l'apparition de post-dépolarisations [7]. Figure 3 : Modifications des échanges ioniques pendant l'ischémie d'après Sanada et al. [16]. 1 : canaux échangeurs Na /H , 2 : pompe Na /K -ATPase et pompe Ca -ATPase de la membrane plasmique et du réticulum endoplasmique (SERCA), 3 : l'échangeur Na /Ca . De plus, lors d'une ischémie prolongée, l'acidose intracellulaire diminue la fonction contractile systolique, en inhibant la fixation du calcium sur les protéines contractiles, par compétition entre les protons et les ions Ca2 [18]. L'effet délétère de l'ischémie sur la fonction contractile est également dû à une protéolyse des protéines contractiles [19]. En plus de la dysfonction systolique, nous venons de voir que l'ischémie myocardique pouvait entrainer une dysfonction diastolique, puisqu'elle altère directement les acteurs de l'homéostasie calcique (pompe SERCA et Ca2 -ATPase de la membrane plasmique). Par ailleurs, il a été montré que l'environnement hyperosmolaire diminue la compliance des ventricules [20]. Les conséquences de l'ischémie sont donc un changement métabolique et une altération de l'homéostasie ionique, provoquant des altérations de la contractilité cardiaque. Depuis une vingtaine d'années, la taille d'infarctus n'est plus définie comme étant la zone nécrosée due aux lésions de l'ischémie, mais elle est, celle, induite par les lésions de l'ischémie et de la reperfusion (figure 4). En effet, tel qu'illustré par la figure 4, la taille d'infarctus est proportionnelle à la durée de l'ischémie sans reperfusion, elle correspond théoriquement à la zone à risque (en rouge). La reperfusion, à l'aide d'agents thrombolytiques ou par une intervention coronarienne percutanée, réduit théoriquement la taille d'infarctus (en vert), mais en réalité, les lésions myocardiques induites par la reperfusion induisent une expansion de la taille d'infarctus (en noir). Figure 4 : Lésions du myocarde induites par l'ischémie-reperfusion, d'après Hausenloy et al. [10]. PPCI : reperfusion du myocarde par thérapie thrombolytique ou une intervention coronarienne percutanée. ii. Reperfusion L'unique option thérapeutique suite à une ischémie est la reperfusion. Elle est essentielle pour réduire la taille d'infarctus (figure 4), mais elle a lieu de manière brutale, avec un retour rapide de l'oxygène et des nutriments, provoquant potentiellement quatre types de conséquences myocardiques [10]. La première conséquence, réversible, est l'apparition d'arythmies ventriculaires, dont le traitement est maitrisé [21]. La deuxième conséquence, irréversible, est le phénomène de no-reflow , aussi appelé, obstruction microvasculaire. Elle est liée à un défaut de reperfusion, en raison d'une mauvaise dilatation de l'artère coronaire ou d'une compression de celle-ci par les cellules endothéliales ou les cardiomyocytes gonflés [22]. La troisième lésion de reperfusion, réversible, est la sidération myocardique, caractérisée par la dysfonction mécanique contractile pouvant perdurer jusqu'à plusieurs jours ou semaines après l'ischémie. Tel que décrit plus haut, cette dysfonction est causée par la surcharge calcique lors de l' ischémie [23]. La quatrième lésion de reperfusion, irréversible, est la mort de cardiomyocytes ayant survécus à l'ischémie. Cette conséquence est engendrée principalement par les paradoxes de l'oxygène, du pH et du calcium , contribuant tous à l'ouverture du PTPm, et consécutivement à la mort des cardiomyocytes. Le paradoxe de l'oxygène est lié à l'arrivée brutale d'oxygène dans la cellule, entrainant une hypercontracture et un stress oxydant. La déplétion en oxygène pendant l'ischémie et la réoxygénation rapide au début de la reperfusion provoquent une hypercontracture des myofibrilles, suivie d'une altération structurelle du sarcolemme et de la mort cellulaire. En effet, la restauration des stocks d'ATP a lieu avant le rééquilibrage ionique, notamment pour le calcium, induisant une activation de la contraction sans relâchement des sarcomères, et l'ouverture du PTPm [24]. D'autre part, l'arrivée d'oxygène induit la production d'espèces réactives de l'oxygène (ERO) dès les premières minutes de la reperfusion. Les ERO sont des espèces moléculaires oxygénées, possédant des électrons libres, les rendant hautement réactives. Ces ERO sont d'abord produits par la xanthine oxydase des cellules endothéliales puis, après plusieurs heures, par la nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) oxydase des neutrophiles [25]. L'accumulation de ces radicaux a pour conséquence d'altérer le fonctionnement des canaux, d'endommager les membranes par la peroxydation des lipides membranaires, de dénaturer les enzymes et, de causer des lésions oxydatives à l'ADN. Les ERO déclenchent surtout l'ouverture du PTPm. Le paradoxe du pH est causé par une restauration trop rapide du pH intracellulaire. Cette restauration est permise par l'élimination des protons, via l'échangeur NHE, et par l'apport des ions bicarbonates, via le symport Na /HCO3- de la membrane plasmique (figure 4). Le retour à un pH physiologique active des enzymes (protéases, phospholipases) responsables d'une dégradation des membranes, contribuant à la mort cellulaire. L'augmentation également de l'activité des protéines contractiles compromet l'apport énergétique, en augmentant la demande en ATP, ce qui découple la phosphorylation oxydative mitochondriale [26]. Cette dysfonction mitochondriale participe aussi à l'ouverture du PTPm. Le paradoxe du calcium est dû à l'accumulation de calcium pendant l'ischémie, qui est potentialisée pendant la reperfusion. En effet, la restauration des stocks d'ATP rétablit le fonctionnement de canaux, comme les pompes SERCA, Ca2 -ATPase de la membrane plasmique et Na /K -ATPase. En revanche, le stress oxydant, en causant des dommages aux membranes et des dysfonctionnements des canaux, provoque une accumulation de calcium intracellulaire. De plus, à la reperfusion, l'échangeur NCX fonctionne en mode inverse afin d'éliminer le Na , rentré avec le NHE pour restaurer le pH, induisant une entrée de calcium et aggravant l'accumulation de calcium intracellulaire [16]. La surcharge calcique intracellulaire couplée à la ré-énergisation du myocarde induit une force excessive et incontrôlable de contraction, ce qui provoque une hypercontracture des sarcomères. De plus, l'accumulation de calcium cytosolique et le rétablissement du potentiel de membrane mitochondrial à la reperfusion entrainent une entrée de calcium par le mitochondrial calcium uniporter (MCU) dans la mitochondrie. Etant sensible à une accumulation de calcium, le PTPm s'ouvre et induit la mort cellulaire [25], [24]. Enfin, brièvement, l'inflammation joue un rôle important dans les lésions myocardiques à la reperfusion. En effet, celle-ci déclenche une infiltration et une accumulation de neutrophiles dans le myocarde. Au début de la reperfusion, les neutrophiles sont concentrés dans la zone à risque, puis leur migration dans le myocarde est facilitée par l'augmentation de la quantité de molécules d'adhésions cellulaires (intégrines, sélectines, ICAM-1). L'accumulation des neutrophiles peut amplifier la taille de la zone nécrosée en obstruant des vaisseaux (ischémie secondaire), mais surtout les neutrophiles produisent des ERO, contribuant à l'ouverture PTPm, comme vu précédemment [27]. L'effecteur final des lésions de reperfusion est le PTPm. C'est un canal non sélectif, dont la structure n'est pas bien définie. L'acidose en ischémie bloque l'ouverture du PTPm [28], donc le PTPm est un acteur de la mort cellulaire spécifique de la reperfusion. Ainsi, dès le rétablissement du pH à la reperfusion, l'accumulation de calcium et la production d'ERO induisent l'ouverture du PTPm [29]. A travers le PTPm, qui laisse passer toutes les molécules inférieures à 1, 5 kDa, de nombreux ions et molécules d'eau entrent dans la matrice mitochondriale. A l'inverse, des facteurs pro-apoptotiques, comme le cytochrome c de l'espace inter-membranaire, sont libérés dans le cytosol, activant la voie apoptotique des caspases [28]. Les conséquences fonctionnelles sont un découplage de la phosphorylation oxydative avec une diminution de la production d'ATP, et au niveau structurel, un gonflement et une destruction de la mitochondrie. Le relargage du contenu mitochondrial dans le cytosol provoque la mort cellulaire. Ainsi, l'ouverture du PTPm va déterminer les lésions de reperfusion [30]. A ce jour, une seule molécule est connue pour réguler l'ouverture du PTPm, la cyclophiline D (CypD). Cette protéine de la matrice mitochondriale est transloquée à la membrane mitochondriale interne pour induire l'ouverture du PTPm. De plus, son abolition génétique ou son inhibition par la cyclosporine A (CsA) retarde l'ouverture du PTPm [31, 32]. De nombreuses études chez l'animal ont montré un effet protecteur de la CsA sur l'IM [33]. Cliniquement, un effet bénéfique a été observé lors d'une étude unicentrique sur un petit nombre de patients présentant un IM [34], mais une étude multicentrique sur un grand nombre de patients n'a pas mis en évidence une action cardioprotectrice de la CsA [35]. e. Mécanismes cellulaires de la réponse à l'ischémie- reperfusion Ces dernières années, la prise en charge des patients a bien évolué, permettant de diminuer l'incidence de l'IM, avec de nouvelles stratégies de reperfusion et de traitements pharmacologiques. En revanche, l'accroissement de l'incidence des pathologies cardiométaboliques, tels que le syndrome d'apnées du sommeil, l'obésité et le diabète, aggrave la prévalence et la taille de l'IM. Ainsi, dans le contexte des pathologies chroniques, la recherche continue pour explorer d'autres mécanismes de la réponse à l'ischémie- reperfusion, et ceux qui font l'objet de cette thèse sont : le stress du réticulum endoplasmique associé à une perturbation de l'homéostasie calcique, une modification des points de contact entre le réticulum endoplasmique et la mitochondrie, et les altérations mitochondriales. i. Stress du réticulum endoplasmique Définition du réticulum endoplasmique Le réticulum endoplasmique (RE) est un organite intracellulaire des cellules eucaryotes, formant un réseau continu de membranes internes interconnectées, participant à de nombreuses fonctions cellulaires essentielles. Le RE peut être différencié en trois parties [36]. Le réticulum endoplasmique rugueux (RER) est sous forme de sacs entourés de ribosomes et est impliqué dans la synthèse de protéines. En effet, les protéines arrivent dans le RE sous forme de chanes polypeptidiques dépliées. Le RE donne aux protéines leur structure 3D fonctionnelle, et permet des modifications post-traductionnelles si nécessaire. Le repliement est réalisé à l'aide de chaperonnes qui se lient aux protéines avec leur domaine hydrophobe. Les protéines sont ensuite sécrétées et envoyées vers leur localisation cellulaire. Le flux de protéines est variable, puisqu'il est ajusté en fonction des besoins cellulaires. Ainsi, l'activité du RE est régulée en permanence. Le RE participe à la maturation d'environ 30% des protéines [37, 38]. Le réticulum endoplasmique lisse (REL) est allongé et cylindrique. Il contribue à la synthèse de lipides, en contenant des enzymes clés de la synthèse des phospholipides, du cholestérol et de ses dérivés. Le REL régule aussi l'homéostasie calcique dans la cellule, en stockant le calcium et en le libérant dans le cytosol ou d'autres organites, à l'aide de protéines tampon captant le calcium dans son espace intracellulaire et d'échangeurs calciques au niveau de sa membrane. Enfin, l'enveloppe nucléaire est aussi une extension du RE, dotées de ribosomes. Cette partie du RE contribue à réguler l'expression des gènes. La proportion du RE ou de chacune de ces trois parties du RE varie selon le type cellulaire. Dans les cellules musculaires striés, telles que les cellules myocardiques, le REL est majoritaire et il est nommé le réticulum sarco/endoplasmique (RS). Le RS est une version morphologiquement différente du REL, spécialisé dans la régulation du calcium pour le couplage excitation-contraction. Il est composé de tubes allongés (le RS longitudinal), terminés par des bourgeons larges nommées citernes terminales (le RS jonctionnel) au niveau des invaginations de la membrane plasmiques, les tubules T (figure 5). Le tubule T et la citerne terminale forme ainsi une structure appelée diade. Le RS jonctionnel est impliqué pendant la phase de contraction musculaire, avec la présence des récepteurs à la ryanodine (RyR), qui permettent un relargage massif du calcium du RE dans le cytosol. En revanche, la phase de relaxation musculaire est permise par les pompes SERCA qui se trouvent au niveau du RS longitudinale (figure 5). D'autres échangeurs comme le canal inositol 1, 4, 5- trisphosphate receptor (IP3R) sont répartis de part et d'autres du RE [36, 39]. Dans toutes les cellules, et encore plus pour les cellules musculaires striées, la régulation du calcium du RE est un facteur majeur déterminant le bon fonctionnement de cet organite [40]. En effet, une déplétion en calcium dans le RE altère le fonctionnement de nombreuses protéines chaperonnes dépendantes du calcium, entrainant une accumulation de protéines mal conformées, et activant consécutivement le stress du RE. Ainsi, le RE est divisé en diverses parties avec des fonctions spécifiques, mais la continuité de cet organite entraine qu'une altération d'une fonction a des répercussions sur les autres fonctions du RE. Figure 5 : Structure du réticulum endoplasmique dans une cellule myocardique, d'après Kane et al. [41]. Les récepteurs RyR sont présents au niveau du RS jonctionnel, alors que la pompe SERCA est au niveau du RS longitudinal. Le canal IP3R se trouve sur toute la continuité du RE. Les échangeurs calciques LTCC et NCX sont des canaux de la membrane plasmique. Définition du stress du réticulum endoplasmique Le stress du RE est activé par une accumulation de protéines mal repliées ou/et une perturbation de l'homéostasie calcique [42]. Afin de répondre à cette dysfonction du RE, des voies de signalisations intracellulaires sont stimulées et cette réponse est nommée l'unfolded protein response (UPR) (figure 6). Pour diminuer la quantité de protéines mal conformées, l'UPR a pour but de diminuer l'arrivée de nouvelles protéines dans le RE, via une atténuation de la synthèse protéique et une augmentation de la maturation des protéines, ou d'éliminer des protéines non réparables, par la hausse de l'activité transcriptionnelle de gènes codant pour les protéines chaperonnes ou des protéines de dégradation (endoplasmic reticulum-associated degradation, ERAD). Trois voies de signalisation composent la réponse UPR, chaque voie étant activée par une protéine transmembranaire du RE : inositol requirement enzyme 1 (IRE1), activating transcriptor factor (ATF) 6 et protein kinase RNA (PKR)like ER kinase (PERK) (figure 6) [43]. En conditions normales, ces protéines transmembranaires sont liées à la protéine chaperonne du RE, l'immunoglobulin-binding protein/glucose-regulated protein 78 kDa (Bip ou Grp78), ce qui les maintient dans un état inactif des protéines [44]. L'activité de la Grp78 est dépendante du calcium, qui capte 25% du calcium du RE [38]. La Grp78 est la protéine senseur du stress du RE, régulant l'activation des différentes voies de l'UPR. Ainsi, lors d'un stress du RE, IRE1, ATF6 et PERK sont activées par la dissociation de Grp78, qui va se fixer sur les protéines mal conformées [45]. La voie d'IRE1 est la plus conservée chez les eucaryotes [46]. IRE1 possède une double activité, de protéine kinase et d'endoribonucléase spécifique, régulée par phosphorylation. Ainsi, le détachement de Grp78 et IRE1 entraine l'homodimérisation et l'autophosphorylation d'IRE1. IRE1 activé réalise l'épissage de l'ARNm d'un facteur de transcription nommé X-box binding protein 1 (XBP1), induisant la traduction de la forme active de la protéine XBP1s (spliced) [47]. La protéine XPB1s se fixe sur les gènes cibles de la réponse UPR par reconnaissance des séquences endoplasmic reticulum stress response element (ERSE), dans la région promotrice des gènes. La voie d'IRE1 augmente notamment l'expression de la protéine chaperonne Grp78, des protéines de la voie de dégradation ERAD, responsable de l'export des protéines du RE vers le cytoplasme, afin qu'elles soient dégradées par le protéasome [42]. En ce qui concerne la voie d'ATF6, le détachement de Grp78 induit sa translocation vers l'appareil de Golgi par un transport vésiculaire. La protéine est alors clivée sur deux sites S1P et S2P par des protéases, libérant son fragment N-terminal [48]. Puis, la partie N-terminale d'ATF6 est transloquée dans le noyau, o elle exerce son action de facteur de transcription en se fixant sur les domaines ERSE, induisant l'expression du même type de protéines que la voie d'IRE1. De manière intéressante, ATF6 est une protéine interagissant avec la calréticuline, protéine sensible au calcium intracellulaire. Lors d'une déplétion en calcium induisant un stress du RE, l'interaction entre ATF6 et la calréticuline est réduite, participant à la translocation d'AT6 vers l'appareil de Golgi et à son activation [49]. La voie de PERK est initiée par l'homodimérisation de PERK, ainsi que son autophosphorylation par son activité protéine kinase. Phospho-PERK activé induit la phosphorylation de la sous-unité de la protéine d'initiation eukaryotic initiation factor 2 (eIF2), ce qui inhibe son activité. Ainsi, phospho-eIF2 réduit la synthèse protéique en diminuant l'entrée des chaines polypeptidiques dans le RE et la formation du complexe de pré-initiation de la traduction. De plus, la phosphorylation d'eIF2 provoque l'activation du facteur de transcription ATF4, régulant les gènes de la réponse UPR (figure 6) [42]. Ces trois voies de la réponse UPR permettent de réparer ou de dégrader les protéines mal conformées et d'atténuer la synthèse protéique. Mais si l'homéostasie du RE ne peut être rétablie, une activation prolongée du stress du RE ou un stress du RE trop intense induisent l'activation d'un signal pro-apoptotique via la réponse UPR. L'augmentation du niveau de phosphorylation d'eIF2 et l'activation continue d'ATF4 provoquent l'activation du facteur de transcription C/EBP homologous protein (CHOP) [50]. CHOP régule l'activité de nombreux gènes pro-apoptotiques. Notamment son activation inhibe l'expression de la protéine anti- apoptotique B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) [51] et active la transcription et la translocation à la membrane de Bcl-2-like protein 11 (Bim), une protéine pro-apoptotique de la famille de Bcl2 [52]. De plus, CHOP induit un changement de conformation des protéines pro- apoptotiques Bcl-2-associated X (Bax) et Bcl-2 homologous antagonist killer (Bak) entrainant un efflux de calcium du RE vers le cytosol [53]. La hausse du calcium cytosolique active une protéase dépendante du Ca2 , la m-calpaïne, qui clive la procaspase-12 localisée à la membrane du RE [54]. La caspase-12 clivée active clive à son tour la procaspase-9 en caspase-9 clivée active, qui va à son tour cliver et activer la caspase3, l'eecteur nal de cette voie pro-apoptotique [55]. En plus d'ATF4, ATF6 peut activer la transcription de CHOP. Par ailleurs, IRE1 active l'apoptose par son interaction avec les protéines TNF receptor associated 2 (TRAF2) et apoptosis signal regulating kinase 1 (ASK1), qui stimulent les protéines c-Jun N-terminal kinases (JNK) et p38 mitogen-activated protein kinases (p38). Puis, directement ou par l'intermédiaire de la protéine Bax, ces protéines activent le facteur CHOP et, donc la cascade des caspases [56]. Figure 6 : Activation de la réponse UPR suite à un stress du réticulum endoplasmique, d'après Groenendyk et al. [43]. L'accumulation de protéines mal conformées dans la lumière du RE entraine le recrutement de la protéine chaperonne GRP78 vers les protéines altérées. Le détachement de GRP78 des trois effecteurs membranaires de la réponse UPR, IRE1, ATF6 et PERK, active leurs voies de signalisation afin de restaurer l'homéostasie du RE. Implication dans la réponse à l'ischémie-reperfusion Le stress du RE est impliqué entre autres dans les pathologies cardiovasculaires, et en particulier dans la développement de l'IM [43]. Plusieurs publications montrent une activation du stress du RE en ischémie ou après l'ischémie-reperfusion [57-59]. Cependant, son rôle bénéfique ou délétère n'est pas clairement défini et dépend de sa durée d'activation. La protéine senseur du stress du RE, la Grp78, a un rôle essentiel pour le système cardiovasculaire, puisque sa délétion complète entraine de nombreux problèmes de développement embryonnaire, notamment au niveau de la cariogenèse, provoquant la mort in utéro de l'embryon. De même sa délétion cardiaque spécifique chez la souris adulte entraine la mort en trois semaines. Enfin, la surexpression de Grp78 induit un remodelage cardiaque pouvant aboutir à une insuffisance cardiaque [60]. L'ischémie-reperfusion augmente l'expression de Grp78 in vitro et in vivo. De plus, lorsque Grp78 est surexprimée par un adénovirus dans des myocytes ventriculaires néonataux de rat ou par un système Cre-Lox spécifiquement dans le cœur de souris, les lésions dues à l'ischémie-reperfusion sont diminuées à travers une atténuation de la production d'ERO et une activation de la voie de signalisation Akt [61]. Comme Grp78, la voie IRE1 est aussi activée en ischémie, notamment avec la surexpression de XBP1 montrée in vivo, in vitro et dans le cœur de patients en ischémie [58, 62, 63]. La délétion cardiaque spécifique de XBP1 augmente la taille d'infarctus suite à une IR et altère la fonction cardiaque, alors que sa surexpression diminue la taille d'infarctus et améliore la fonction cardiaque. Ensuite, la surexpression cardiaque spécifique d'ATF6 diminue les lésions induites par l'ischémie-reperfusion [64] alors que le blocage de son activité par un micro-ARN augmente la mort des cardiomyocytes néonataux de rat en réponse à l'hypoxie-réoxygénation [65]. En utilisant des modèles d'animaux transgéniques, l'ensemble des données précédentes a montré que l'activation de la Grp78 et des voies IRE1 et ATF6 est bénéfique dans la réponse à l'ischémie-reperfusion. Néanmoins, la délétion de CHOP protège le cœur en diminuant la taille d'infarctus [66], démontrant ainsi que le stress du RE peut potentiellement avoir un rôle délétère. La voie PERK participe aussi à la réponse à l'ischémie avec une activation chronologique des éléments de la voie de signalisation en fonction de la durée de l'ischémie, d'abord la phosphorylation d'eIF2, puis l'augmentation de l'expression d'ATF4 et après de CHOP [67]. Ainsi, la durée de l'ischémie détermine l'effet du stress du RE, qui semble être cardioprotecteur pour une ischémie de courte durée par l'activation des voies ATF6, IRE1 et PERK-eIF2, et, pour des ischémies de plus longue durée, devenir pro-apoptotique avec l'activation de CHOP par la voie PERK-eIF2-ATF4, et également des voies ATF6 et IRE1 [68]. Ces différents travaux affirment que le stress du RE est activé lors d'une ischémie- reperfusion, mais surtout que sa régulation avant l'ischémie-reperfusion peut moduler la réponse du myocarde à ce stimuli. En effet, l'induction d'un stress du RE par divers agents pharmacologiques, tels que la tunicamycine, la thapsigargine ou encore le dithiothreitol (DTT), perturbe l'homéostasie calcique et induit un stress du RE responsable d'une augmentation de la mort cellulaire [69-71]. En revanche, l'inhibition du stress du RE par un agent pharmacologique, le 4-phenylbutyrate (4PBA), avant une ischémie-reperfusion est cardioprotectrice [69]. Plusieurs inhibiteurs du stress du RE ont été testés chez l'animal dans le cadre de l'ischémie-reperfusion, mais aussi dans le contexte d'autres maladies cardiovasculaires, comme l'insuffisance cardiaque [56]. De plus, l'état du RE dans les cardiomyocytes peut notamment être altéré par des pathologies augmentant la susceptibilité du myocarde à l'ischémie-reperfusion. Par exemple, dans un modèle de rat diabétique, l'augmentation des marqueurs Grp78 et CHOP est associée à une aggravation de la mort cellulaire suite à une ischémie-reperfusion, et cet effet est aboli par la délétion de CHOP [72]. Un récent article suggère également qu'un stress du RE activé dans les cellules musculaires lisses des vaisseaux, accroit le risque de spasme au niveau des artères coronaires, qui peut être à l'origine d'un IM [73]. Le stress du RE est donc un acteur majeur de la réponse à l'ischémie-reperfusion, en modifiant le fonctionnement des cellules cardiaques. Comme précédemment évoqué, la mitochondrie joue également un rôle majeur dans la réponse à l'IR. De plus, récemment, il a été montré que dès la phase précoce du stress du RE, les mitochondries se rapprochent du RE [74]. Ces points de contacts RE-mitochondries sont nommés les mitochondria-associated ER membranes (MAM) et semblent eux-aussi jouer un rôle majeur dans la réponse à l'ischémie-reperfusion. ii. Mitochondria-associated ER membranes Définition Les MAM sont des rapprochements du RE et de la mitochondrie. Dans la cellule myocardique, ce rapprochement a lieu au niveau du RS longitudinal [36]. Alors que leur découverte a eu lieu depuis plus de cinquantaine d'années [75], l'étude approfondie de ces interactions a lieu depuis une vingtaine d'années. Les points de contact RE-mitochondrie sont des zones membranaires avec une composition lipidique riche en cholestérol et sphingolipides, conférant à ces domaines une résistance aux détergents [76]. Cet enrichissement lipidique favorise aussi les interactions protéiques, expliquant le rôle des MAM dans de nombreuses voies de signalisation. Les MAM sont composés de plusieurs complexes protéiques. Le complexe impliqué dans les échanges calciques entre le RE et la mitochondrie est composé du canal inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor (IP3R) 1 de la membrane du réticulum endoplasmique, du canal anionique voltage-dependent anion channel (VDAC) 1 de la membrane externe de la mitochondrie et de la protéine cytosolique glucose-regulated protein 75 kDa (Grp75) reliant la protéine VDAC1 et IP3R1 [77]. Ce complexe IP3R1/Grp75/VDAC1 permet le transport du calcium entre le RE et l'espace intermembranaire mitochondrial, puis le MCU de la membrane interne de la mitochondrie transfère le calcium dans la matrice mitochondriale [78] (figure 7). Dans ce complexe, les autres isoformes du récepteur IP3R ou les récepteurs à la ryanodine (RyR) peuvent participer aux interactions. Le rapprochement des deux organites implique aussi la mitofusine (Mfn) 2, une protéine du RE, qui interagit avec les Mfn 1 ou 2 mitochondriales pour faire un pont [79] (figure 7). Un troisième complexe est composé de la protéine du RE vesicle-associated membrane protein-associated protein B/C (VAPB) et de la protéine mitochondriale protein tyrosine phosphatase-interacting protein-51 (PTPIP51) [80]. Figure 7 : L'échanges de lipides et de calcium au niveau des MAM est permis par la formation de complexes protéiques, IP3R-Grp75-VDAC, VAPB-PTPIP51 et les mitofusines 1 et 2, adapté de Burte et al. [81]. Les points de contact RE-mitochondrie sont régulés, en fonction des besoins cellulaires, à la fois par des signaux du RE et de la mitochondrie. En effet, l'état du RE peut renforcer ou amoindrir les MAM [74, 82]. La production de facteurs pro- ou anti-apoptotiques dans la mitochondrie régule aussi la présence des MAM [83]. Les mitochondries peuvent donc s'éloigner ou se rapprocher du RE. En particulier, les MAM sont impliqués dans des échanges calciques de haute intensité [84-87] (figure 7). En conditions physiologiques, le métabolisme mitochondrial induit la formation d'un potentiel électrochimique transmembranaire, avec des charges négatives dans la matrice mitochondriale, permettant ainsi l'entrée de calcium [88]. Ainsi, les échanges calciques se font du RE vers la mitochondrie, mais également lors d'un stress du RE, o le RE se vidange en calcium, la mitochondrie capte rapidement le calcium [89]. Les MAM participent aussi à la régulation de la dynamique mitochondriale et plus globalement à la signalisation cellulaire [90]. Les points de contact RE-mitochondrie contrôlent par exemple, le recrutement de la protéine dynamin related protein 1 (Drp1) pour la fission mitochondriale [91], la réplication et la distribution de l'ADN mitochondrial lors de la séparation des mitochondries filles [92], ainsi que la mitophagie (dégradation de la mitochondrie par autophagie) [93]. Implication dans la réponse à l'ischémie-reperfusion L'étude de ces interactions étant récente, de nouvelles protéines sont peu à peu découvertes comme appartenant aux MAM et leur rôle dans certaines pathologies commence à être exploré, notamment dans les maladies cardiovasculaires [94]. En particulier, deux études ont très récemment montré un rôle des MAM dans la susceptibilité à l'ischémie-reperfusion. La première étude a montré une implication des MAM dans la vidange du calcium du RE vers la mitochondrie lors de l'ischémie-reperfusion et a aussi mis en évidence l'implication d'un nouveau partenaire des MAM dans le cœur, à savoir la CypD [95]. En effet, sur des myoblastes cardiaques de rat (cellules H9C2), l'utilisation d'un inhibiteur pharmacologique de la CypD, le NIM811, ou d'un siARN dirigé contre CypD diminue les interactions du complexe IP3R1/Grp75/VDAC1, et ceci est associé à une diminution de la vidange calcique du RE vers la mitochondrie induite par l'histamine (activateur de l'IP3R). Ces résultats ont été confirmés sur des cardiomyocytes isolés de souris délétées pour le gène codant pour la CypD ou traitées par le NIM811 ou la CsA, montrant l'implication de la CypD dans les MAM. Ensuite, sur ces modèles cellulaires, l'exposition des cellules à une hypoxie-réoxygénation (le modèle d'ischémie-reperfusion in vitro), induit une augmentation du nombre d'interactions du complexe IP3R1/Grp75/VDAC1/CypD, contribuant à la surcharge calcique de la mitochondrie, à l'ouverture du PTPm et consécutivement à l'augmentation de la mort cellulaire. Ces effets de l'hypoxie-réoxygénation sont prévenus par l'inhibition pharmacologique de la CypD et de l'IP3R ou par l'utilisation de siARN dirigés contre Grp75 ou de Mfn2 [95]. Tel que détaillé auparavant dans les mécanismes de la reperfusion, la CypD est une protéine de la matrice mitochondriale connue pour être transloquée à la membrane interne mitochondriale, et en particulier au niveau du PTPm, à la reperfusion ce qui participe à l'activation de l'ouverture du pore et à la mort cellulaire [96]. Le travail de Paillard et al. [95] met donc en évidence un nouveau rôle de la CypD lors de la réponse à l'ischémie- reperfusion mais surtout démontre que la disruption des contacts RE-mitochondrie préserve les cardiomyocytes des lésions dues à une ischémie-reperfusion. La deuxième étude confirmant l'implication des MAM dans la susceptibilité des cardiomyocytes à l'ischémie-reperfusion, a mis en évidence le rôle de la protéine glycogen synthase kinase 3 (GSK3) [97]. Sur des cardiomyocytes isolés de souris, la protéine GSK3, localisée dans le RE, interagit avec le complexe IP3R1/Grp75/VDAC1/CypD par le récepteur IP3R1. L'utilisation d'un inhibiteur de la GSK3, le SB21 montre que l'interaction de GSK3 avec l'IP3R1 est essentielle pour que l'IP3R1 interagisse avec les autres membres du complexe IP3R1/Grp75/VDAC1/CypD, permettant le relargage de calcium du RE dans la mitochondrie. Lors d'une hypoxie-réoxygénation, la phosphorylation de l'IP3R1 par la GSK3, active la protéine, permettant le passage de calcium entre le RE et la mitochondrie en renforçant les MAM, induisant ainsi une surcharge calcique mitochondriale et cytosolique, responsable d'une aggravation de la mort cellulaire. Ainsi, l'utilisation de SB21 diminue la taille d'infarctus suite à une ischémie-reperfusion en diminuant la phosphorylation d'IP3R et son interaction avec les autres protéines des MAM [97]. Enfin le complexe Mfn1/Mfn2 peut lui aussi être impliqué dans la réponse à l'ischémie- reperfusion, puisque la délétion spécifiquement cardiaque de ces deux protéines protège le cœur de ces lésions [98]. Ces différentes études montrent donc que les points de contact RE-mitochondrie semblent jouer un rôle majeur dans les dommages myocardiques d'une ischémie-reperfusion. iii. Mitochondrie Définition et métabolisme mitochondrial Les mitochondries sont des organites dynamiques de la cellule, régulant des réactions cataboliques, menant à la production d'ATP. Ces organites représentent 25% du volume des cellules cardiaques humaines et produisent 6 kg d'ATP par jour pour la fonction cardiaque [99]. Dans les cardiomyocytes, les mitochondries sont localisées sous la membrane plasmique (mitochondries subsarcolemmales) ou entre les myofibrilles (mitochondries interfibrillaires). La mitochondrie, en plus de produire l'énergie cellulaire, contribue à diverses fonctions, allant de la croissance à la mort cellulaire. La majeure partie de la production d'ATP est réalisée par la chaine respiratoire, qui est l'association de la chaine de transport d'électrons et de la phosphorylation oxydative (OXPHOS), au niveau de la membrane interne de la mitochondrie (figure 8). Son alimentation dépend de la formation de l'acétyl-coenzyme A (acétyl-CoA), qui est généré par la glycolyse à partir de substrats glucidiques et par la -oxydation des acides gras. Ensuite, l'acétyl-CoA est utilisé par le cycle de Krebs, aussi appelé le cycle de l'acide citrique. L'ensemble de réactions du cycle de Krebs produit des électrons à haute énergie, contenus dans le nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) ou le flavine adénine dinucléotide (FADH2). Via l'utilisation du NADH et FADH2, ces électrons sont transférés le long de la chaine de transport d'électrons avec une série de réactions redox. La chaine de transport d'électrons comprend 5 complexes et deux navettes. Tout d'abord, le NADH est utilisé par le complexe I (NADH déshydrogénase) et le FADH2 est consommé par le complexe II (succinate déshydrogénase), puis les électrons passent du complexe I ou II au complexe III (coenzyme Q-cytochrome c réductase) par la navette, le coenzyme Q (ubiquinone). Le dernier transfert d'électrons a lieu en direction du complexe IV (cytochrome C oxydase), réalisé par la navette, le cytochrome C. Au niveau du complexe IV, les électrons sont acceptés par le dioxygène (O2), qui est réduit sous forme d'eau. Les réactions redox produisent de l'énergie, entrainant l'extrusion de protons dans l'espace inter-membranaire, et la création d'un gradient électrochimique de protons autour de la membrane interne mitochondriale. Ce gradient de protons est utilisé par le complexe V (ATP-synthase), afin de phosphoryler l'ADP en ATP [100] (figure 8). Au cours du transfert d'électrons, des anions superoxyde (O2. -) sont produits, par la fuite d'électrons au niveau du complexe I et III, principalement [101, 102]. Cette fuite d'électrons entraine une réduction incomplète de l'oxygène, à l'origine de la fabrication d'anions superoxyde. Physiologiquement, des défenses antioxydantes sont présentes pour contrebalancer cette production d'ERO. La fonction mitochondriale résulte donc d'un équilibre entre la production d'ATP et d'ERO, qui sont tous deux des éléments dont l'homéostasie est perturbée en conditions pathologiques, notamment lors d'une ischémie-reperfusion [103]. Figure 8 : Le métabolisme mitochondrial. A partir des nutriments, le glucose est utilisé par la glycolyse (violet) et les lipides par la -oxydation (bleu clair), pour former de l'acétyl-coenzymeA (acetyl-CoA, en rouge) utilisé par le cycle de de Krebs (bleu foncé) qui, couplé à la la phosphorylation oxydative (vert), produit de l'ATP à partir de l'oxygène, d'après Nsiah-Sefaa et al. [104]. Les mitochondries sont des organites dotés d'une dynamique et d'un cycle de renouvellement qui régulent la bioénergétique mitochondriale, et mobiles pour former ou diminuer les points de contacts RE-mitochondrie, comme vu précédemment [105, 106]. Dynamique mitochondriale La dynamique mitochondriale est composée de la fusion et de la fission (figure 9) [107], régulées par des protéines GTPases hautement conservées [108]. La fusion mitochondriale est la fusion de deux mitochondries en une grosse mitochondrie. Elle est régulée par les protéines Mfn 1 et 2, responsables de la fusion de la membrane mitochondriale externe, et par la protéine optic atrophy 1 (OPA1), responsable de la fusion de la membrane mitochondriale interne [109]. La fusion mitochondriale est un mécanisme essentiel de l'organisme, puisque, la délétion totale de chaque mitofusine ou d'OPA1 est létale au stade embryonnaire [110, 111]. Précédemment décrit, les mitofusines sont des GTPases, impliquées aussi dans les MAM et formant des homo- ou des hétéro-complexes. Leur expression est donc redondante, et l'expression de l'une peut remplacer l'autre [110]. OPA1 est aussi une GTPase, dont le fonctionnement requiert la présence des mitofusines [112]. OPA1 existe sous plusieurs isoformes, une forme longue, et d'autres formes courtes, dues au clivage par des protéases, Oma1 et Yme1L. En conditions physiologiques, un équilibre a lieu entre les formes courtes et longues. Une altération de la balance en faveur de la forme courte d'OPA1 entraine une activation de la fission, alors que la forme longue favorise la fusion [113, 114]. A l'inverse de la fusion, la fission sépare une mitochondrie endommagée en deux mitochondries filles, une fonctionnelle et une dysfonctionnelle qui va être dégradée par mitophagie (figure 9) [115]. La protéine GTPase majeure de la fission est la protéine Drp1 déjà citée avant. Sa délétion totale est létale au stade embryonnaire, alors que sa délétion cardiaque spécifique est létale environ 10 jours après la naissance (Ishihara et al. 2009 ; Ikeda et al. 2015 ; Kageyama et al. 2014 ; Song et al. 2015), signifiant l'importance de la dynamique mitochondriale dans le fonctionnement cellulaire. Lors de la fission d'une mitochondrie, Drp1 est transloquée du cytosol à la membrane externe mitochondriale. Ensuite, l'assemblage de Drp1 crée un anneau constricteur, divisant la mitochondrie en deux [116, 117]. L'importation de Drp1 à la mitochondrie est réalisée par différentes protéines [118, 119], mitochondrial fission 1 protein (Fis1) [120], mitochondrial fission factor (Mff) [121] et les mitochondrial dynamics proteins (MiD) de 49 et 51 kDa (MiD49, MiD51) [122, 123]. L'activité de Drp1 est contrôlée par sa phosphorylation avec des effets opposés. La phosphorylation sur la sérine 616 augmente l'activité GTPase de Drp1, entrainant la fission, alors que la phosphorylation sur la sérine 637 diminue l'activité GTPase de Drp1, en faveur de la fusion. De nombreuses kinases et phosphatases régulent l'état de phosphorylation de Drp1 selon les processus cellulaires [124, 125]. Par ailleurs, la stabilité et le recrutement de Drp1 est aussi régulé par ubiquitination par l'ubiquitin ligase membraneassociated RING-CH protein 5 (MARCH5) [126], et par sumoylation par small ubiquitin-like modifier type 1 (SUMO1) [127]. La dynamique mitochondriale permet d'améliorer la qualité des mitochondries. La fusion améliore la synthèse d'ATP, en diluant les protéines oxydées et les mutations de l'ADN mitochondrial, qui ont un impact beaucoup plus délétère sur le fonctionnement cellulaire que les mutations nucléaires. En revanche, la fission crée deux petites mitochondries, dont une est fonctionnelle, et l'autre est facilement dégradables par mitophagie, afin d'éliminer les mitochondries endommagées produisant beaucoup de stress oxydant [128-130]. Cycle du renouvellement des mitochondries Le cycle mitochondrial permet le renouvellement des mitochondries, et participe ainsi à la régulation du métabolisme mitochondrial. Il est composé de la biogénèse mitochondriale et de la mitophagie (figure 9). La biogénèse mitochondriale est la synthèse de nouvelles mitochondries. Même si les mitochondries ont leur propre génome (ADNmt), elles ne sont pas autonomes. La biogénèse mitochondriale est la coordination des génomes nucléaire et mitochondrial [131]. L'acteur majeur de la biogénèse mitochondriale est le facteur de transcription peroxisome proliferator-activated receptor co-activator 1 (PGC-1), activé en réponse à des signaux cellulaires, tels qu'une privation d'énergie (Finck 2006). PGC-1 interagit avec de nombreux co-activateurs pour activer la transcription de nombreux gènes nucléaires et mitochondriaux, appartenant notamment aux familles des peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs), des estrogen-related receptors (ERRs) et des nuclear respiratory factors (NRF) [132, 133]. Les cibles de PGC1 sont aussi les gènes régulant la machinerie transcriptionnelle, la traduction et la réplication des gènes mitochondriaux, tels que la protéine mitochondrial transcription factor A (Tfam), dont la stabilisation est nécessaire à la réplication de l'ADN [134]. La régulation de la biogénèse se fait aussi en contrôlant le passage de nombreuses protéines au niveau de la membrane mitochondriale [135]. La mitophagie correspond à la dégradation des mitochondries par autophagie (figure 9) [136]. Elle est régulée par différentes voies, dont une impliquant Parkin. En conditions physiologiques, la protéine PTEN-induced putative kinase 1 (Pink1) est transloquée à la membrane externe mitochondriale o elle est rapidement clivée et dégradée. Lorsque la membrane mitochondriale est dépolarisée, Pink1 s'accumule à la membrane mitochondriale et recrute la protéine ligase ubiquitine E3, Parkin [137]. Parkin ubiquitine diverses protéines de la membrane externe de la mitochondrie, reconnues par la protéine p62, un adaptateur, faisant le lien entre les protéines ubiquitinylées et la protéine microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3), permettant le recrutement d'un autophagosome qui va absorber la mitochondrie ubiquitinylée [138]. D'autres protéines sont impliquées dans ce mécanisme de mitophagie [139], comme la protéine activating molecule in BECN1-regulated autophagy protein 1 (Ambra1), protéine interagissant avec la protéine Beclin1 (protéine initiatrice de l'autophagie) [140]. L'autophagosome fusionne avec les lysosomes pour terminer la dégradation de la mitochondrie. D'autres voies de la mitophagie dépendantes d'une interaction avec LC3 pour le recrutement des autophagosomes existent, tel que les cardiolipines, fun14 domain containing 1 (FUNDC1), et Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDa protein- interacting protein 3 (BNIP3), Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3-like (BNIP3L ou NIX). Les cardiolipines sont des dimères de phospholipides synthétisés dans la membrane interne de la mitochondrie et transloqués à la membrane externe lors d'une dépolarisation, pour activer la mitophagie par interaction avec LC3 [141]. De façon intéressante, la mitophagie dépendante de BNIP3 et BNIP3L est surtout activée en hypoxie [142, 143]. En effet, une augmentation de l'expression de BNIP3 est observée dans de nombreuses situations hypoxiques sous l'influence de l'activation de l'hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) [144, 145]. La mitophagie médiée par FUNDC1 est aussi activée par l'hypoxie [146]. Dans les pathologies cardiovasculaires, la dynamique et le renouvellement mitochondrial sont de plus en plus investigués [106, 147, 148]. Figure 9 : L'homéostasie mitochondriale est régulée par la biogénèse, la fusion, la fission et la mitophagie, adapté de Boland et al. [149]. Implication dans la réponse à l'ischémie-reperfusion L'étude récente des acteurs de la dynamique et du renouvellement mitochondrial a permis de montrer leur rôle dans la bioénergétique mitochondriale, ainsi que leur impact dans différentes pathologies, comme la réponse à une ischémie-reperfusion. Comme vu précédemment, la délétion cardiaque de Mfn 1 et 2 protège le cœur d'une ischémie-reperfusion, avec une résistance de l'ouverture du PTPm, par une atténuation du stress oxydant et de la surcharge calcique mitochondriale, même en présence de mitochondries fragmentées, une diminution de la respiration et une altération de la fonction contractile [98]. De observations similaires ont été réalisées lors de la délétion cardiaque de Mfn 1 ou Mfn 2 chez des souris et sur des modèles cellulaires, challengés par des modèles d'ischémie-reperfusion [150-152]. En revanche, la délétion partielle d'OPA1 augmente la taille d'infarctus, sans modification de la morphologie des mitochondries, de la respiration mitochondriale et de la sensibilité du PTPm, mais avec des altérations de l'homéostasie calcique [111]. Avec le vieillissement des souris, cette délétion partielle induit des altérations de structure et de fonction des mitochondries associées au développement d'une dysfonction cardiaque [153, 154]. Ensuite pour la fission mitochondriale, l'utilisation de modèles animaux génétiques modifiés pour Drp1, de modèles cellulaires ou l'utilisation de traitements inhibant Drp1 (Mdivi-1), ont mis en évidence qu'une absence de Drp1 diminue la respiration mitochondriale, la production d'ATP, la mitophagie et augmente la taille des mitochondries. De plus, l'inhibition de la fission permet de protéger le cœur des lésions d'une ischémie-reperfusion [150, 155- 158]. Au niveau de la biogénèse mitochondriale, la délétion ou la surexpression de PGC-1 a montré des modifications de fonctionnement mitochondrial pouvant amener à des dysfonctions cardiaques, mais son implication directe dans le contexte de l'ischémie- reperfusion n'a jamais été étudiée [159-162]. En revanche, l'implication de la mitophagie dans la réponse à l'ischémie-reperfusion a été plus explorée. La délétion totale de Parkin augmente la susceptibilité à l'ischémie- reperfusion, alors que sa surexpression protège les cardiomyocytes isolés de souris contre la mort cellulaire induite par l'hypoxie [163]. Les souris délétées pour Parkin ont un phénotype normal, avec une respiration mitochondriale normale, mais les mitochondries sont désordonnées et une accumulation de mitochondries endommagées apparait avec l'âge [163-166]. La réponse à l'ischémie-reperfusion est donc bien régulée par le métabolisme mitochondrial, dont l'état dépend de la structure, de la fonction, de la dynamique et du renouvellement mitochondrial. En conclusion de cette première partie, les maladies cardiovasculaires restent la première cause mondiale de morbidité et mortalité et la recherche ne cesse d'explorer les mécanismes impliqués dans la mort cellulaire induite par l'ischémie-reperfusion. Bien souvent, les mécanismes étudiés et impliqués sont communs à d'autres pathologies et notamment à des pathologies associées à la survenue de l'infarctus du myocarde. Parmi elles, le syndrome d'apnées obstructives du sommeil est considéré comme un facteur de risque indépendant de risque d'infarctus. En effet, la présence de cette maladie peut altérer le fonctionnement des cardiomyocytes, expliquant l'augmentation de la sévérité et du nombre d'évènements cardiovasculaires chez les patients apnéiques. 2. Syndrome d'apnées obstructives du sommeil a. Prévalence et facteurs de risque Le syndrome d'apnées obstructives du sommeil (SAOS) appartient aux troubles respiratoires du sommeil (sleep disordered-breathing, SDB). Cette maladie représente l'une des pathologies respiratoires chroniques les plus fréquentes puisque, selon les données de l'OMS, elle touche plus de 100 millions de personnes [167]. Le SAOS est considéré comme un problème majeur de santé publique avec une prévalence continuant de crotre à cause de son meilleur diagnostic et de l'augmentation de ses comorbidités comme le surpoids et l'obésité [168]. D'après l'étude de Levy et al, la prévalence du SAOS est variable et comprise entre 5 et 25% dans les pays industrialisés. Mais il est à noter que le SAOS touche toutes les populations, même s'il est souvent sous diagnostiqué dans certaines régions du monde [168]. Les principaux facteurs de risque du SAOS sont le sexe, l'âge, l'obésité et le rétrécissement des voies aériennes supérieures [168]. Une revue récente de 2016, reprenant les résultats de 24 études cliniques, montre que le SAOS touche 13 à 33% d'hommes et 6 à 19% de femmes. La proportion de patients apnéiques passe également de 6-17% dans une population adulte à 49 % dans une population âgée [169]. Cette pathologie provoque une dégradation de la qualité de vie (somnolence diurne, déficiences cognitives) Elle joue aussi un rôle prépondérant dans le développent de maladies cardiovasculaires [170] et métaboliques [171]. b. Définition et physiopathologie En 2012, la première définition mondiale réalisée par le groupe de travail (Task Force) en recherche sur les troubles du sommeil, constitué par l'American Academy of Sleep Medicine, définit le SAOS comme étant la répétition de collapsus pharyngés au cours du sommeil [172]. Le diamètre des voies aériennes supérieures est régulé par de nombreux paramètres anatomiques, neurologiques et hormonaux [168]. Chez les patients apnéiques, la réduction de voies aériennes supérieures est souvent due à une accumulation de graisse au niveau du cou liée à l'obésité, ou à la structure maxillo-faciale, mais également à un phénomène de fluid shift lié à une dérégulation de la balance hydrosodée (le liquide interstitiel remontant au niveau du cou en position allongée) ou encore à une diminution de l'activité neuromusculaire pharyngée. Le SAOS peut être associé ou non à des ronflements liés aux collapsus pharyngés entrainant une vibration du palais mou, de la luette ou/et des parois latérales du pharynx. Tel qu'illustré dans la figure 10, lorsque l'obstruction des voies aériennes est totale, l'apnée est caractérisée par une diminution du débit aérien de 90% pendant au moins 10 secondes. Une obstruction partielle est appelée hypopnée. Elle est définie par une diminution du débit aérien de 30% de plus de 10 secondes, associée à une diminution d'au moins 3% de la saturation artérielle en O2 ou à un microéveil [172] (figure 10). Figure 10 : Les différents stades de sévérité des évènements respiratoires selon le collapsus pharyngé, le flux oronasal et la pression œsophagienne caractérisant les efforts respiratoires et la désaturation artérielle nocturne, adapté de Dematteis et al. [173]. c. Diagnostic, critère de définition Parmi les différents signes cliniques d'un SAOS, le principal est la somnolence diurne excessive, due à une altération du sommeil causée par les nombreux microéveils induits par les évènements apnéiques. D'autres symptômes peuvent être associés comme des ronflements, des céphalées au réveil, une asthénie chronique, une baisse des performances intellectuelles, physiques et sexuelles, des troubles de l'humeur et du comportement, ou encore la manifestation de pathologies cardiovasculaires et/ou métaboliques. La diversité des symptômes et des comorbidités associées rend cette maladie difficile à diagnostiquer. Ainsi, pendant de nombreuses années, l'implication du SAOS dans les pathologies cardiovasculaires n'était pas recherchée, puisque ces patients présentent souvent d'autres comorbidités (obésité, hypertension artérielle) pouvant masquer l'effet propre du SAOS. Par ailleurs, les patients sous-estiment les symptômes du SAOS. L'examen clinique de référence permettant le diagnostic du SAOS est la polysomnographie, validant la survenue d'apnées ou d'hypopnées durant le sommeil. Lors de ce diagnostic, d'autres examens sont réalisés : un électroencéphalogramme (EEG), un électromyogramme (EMG) des jambes et du menton, des mesures des mouvements respiratoires par pléthysmographie d'inductance au niveau du thorax et de l'abdomen ainsi que des mesures de saturation artérielle en O2, fréquence cardiaque et pression artérielle. Comme illustré dans la figure 11 [174], chaque apnée est accompagnée d'un microéveil visible sur l'EEG induisant une fragmentation du sommeil. Lors du microéveil, des efforts respiratoires permettent de reprendre la respiration et de lutter contre le collapsus pharyngé (variations des pressions intrathoraciques). Les apnées sont aussi accompagnées d'une élévation transitoire de la pression artérielle et de la fréquence cardiaque. Les cycles de désaturation- resaturation artérielle en O2 provoquent des cycles d'hypoxie-réoxygénation générant une hypoxie intermittente chronique (HI). En résumé, le SAOS induit une fragmentation du sommeil, des efforts respiratoires et une HI chronique. Le diagnostic et la sévérité du SAOS sont déterminés par l'index apnées-hypopnées (IAH), c'est à dire le nombre d'apnées et d'hypopnées par heure de sommeil. Le diagnostic est posé lorsque le patient présente des signes cliniques et un IAH supérieur à 5 ou en absence de signe clinique avec un IAH supérieur à 15. La sévérité du SAOS est qualifiée de légère quand l'IAH est inférieur à 15, modérée lorsqu'il est compris entre 15 et 30, et sévère quand il est supérieur à 30 [172]. Figure 11 : Tracé d'enregistrement polysomnographique illustrant la fragmentation du sommeil, la fluctuation de la saturation en O2, l'augmentation des efforts respiratoires thoracoabdominaux et les modifications de la pression artérielle à chaque épisode apnéique, d'après Thomson et al. [174]. d. Traitements Le traitement du SAOS permet de réduire les symptômes et d'améliorer la qualité de vie des patients, tout en étant adapté à la sévérité de la maladie et aux comorbidités associées. En première intention sont prescrites des règles hygiéno-diététiques : une perte de poids, l'arrêt de consommation d'alcool, de tabac et de sédatif et la pratique d'une activité physique régulière. Ensuite, divers traitements alternatifs chirurgicaux ou mécaniques existent. Néanmoins le traitement de référence reste l'application d'une pression positive continue (PPC) pendant le sommeil. Pour les règles hygiéno-diététiques, par exemple, un article reprenant cinq études cliniques montre une diminution de l'IAH de 6, 3 évènements par heure avec l'exercice physique [175]. Les bénéfices de l'exercice physique sont attribués à une diminution de l'accumulation de liquide dans le cou et permettent aussi une amélioration de la qualité de vie. De même, plusieurs travaux ont montré une atténuation de l'IAH suite à la réduction du poids [176]. Cependant ces changements du mode de vie peuvent aider à réduire les apnées/hypopnées et atténuer les symptômes, mais leur effets sont limités et doivent souvent être associés à la PPC. Chez des patients jeunes non obèses présentant des anomalies craniofaciales avec un avancement maxillo-facial marqué, une chirurgie maxillo-faciale avec un bon taux de réussite peut être réalisée. Par ailleurs, la chirurgie la plus fréquente est l'uvulo-palato- pharyngoplastie, consistant en la résection des tissus mous de la gorge (luette, amygdales, partie du palais) afin d'élargir le diamètre des voies aériennes supérieures [168]. Cette chirurgie concerne des patients ayant un rétrécissement rétropalatal, dont le diagnostic est souvent complexe, et son bénéfice à long terme peut s'estomper. Enfin le traitement mécanique, par l'orthèse d'avancée mandibulaire, permet d'avancer la mandibule et de retenir la langue afin de garder les voies aériennes supérieures ouvertes [177]. Cette prothèse est efficace pour des SAOS légers à modérés en réduisant l'IAH, mais sa compliance à long terme est mal connue et son efficacité reste moins bonne par rapport à la PPC. L'application de la PPC permet de maintenir l'ouverture des voies aériennes supérieures, afin de réduire les apnées et rétablir un sommeil normal. L'appareil est composé d'un masque recouvrant le nez ou le nez et la bouche et d'un système de tuyaux reliant le masque à un dispositif générant un flux d'air. La PPC diminue le nombre et la sévérité des évènements respiratoires, en normalisant la saturation en oxygène. Les bénéfices de la PPC sont une amélioration du sommeil et des fonctions cognitives [178]. La qualité de vie est améliorée chez 80 à 100% des patients observant à la PPC, mais le taux d'abandon ou de refus est élevé, atteignant jusqu'à 40% des patients à cause des contraintes d'utilisation [179]. Au niveau du risque cardiovasculaire associé au SAOS, une diminution de la pression artérielle a été observée avec la PPC [180, 181]. Néanmoins, une méta-analyse a suggéré que cet effet n'était pas associé à une réduction du risque d'évènements cardiovasculaires et de mortalité [182]. Ceci a été confirmé par l'étude SAVE, incluant plus de 2700 patients, montrant que la PPC n'a pas d'effet sur la survenue d'évènements cardiovasculaires associés au SAOS, chez des patients atteints d'un SAOS modéré à sévère et d'une maladie cardiovasculaire [183]. Cependant, l'observance des patients au traitement n'était que de 3, 3h/nuit dans cette étude, or l'efficacité de la PPC est étroitement liée à son observance. En particulier une utilisation au minimum de 4h/nuit cinq fois par semaine est considérée comme nécessaire pour une efficacité du traitement. Ainsi, le SAOS est une maladie sous-diagnostiquée, dont le traitement de référence, la PPC ne prévient que partiellement ses conséquences, faisant de cette maladie un problème majeur de santé publique. La compréhension des mécanismes sous-jacents impliqués dans cette pathologie représente donc un enjeu majeur pour développer des thérapeutiques complémentaires ou substitutives à la PPC et améliorer la prise en charge des patients SAOS. e. Conséquences cardiovasculaires du SAOS et de l'HI chronique Comme vu précédemment, le SAOS est aujourd'hui reconnu comme un facteur indépendant de risque cardiovasculaire. En effet de nombreuses études ont montré un lien de causalité entre le SAOS et les maladies cardiovasculaires, notamment avec une étude récente sur l'impact du SAOS sur l'hypertension, la maladie coronarienne, les accidents vasculaires cérébraux, l'insuffisance cardiaque et les arythmies [4]. Parmi les conséquences physiopathologiques du SAOS précédemment citées, l'HI semble être la plus délétère en termes de complications cardiovasculaires. Ainsi, l'utilisation de modèles expérimentaux, tels que l'exposition d'animaux de façon chronique (plusieurs jours) à l'HI, permet de reproduire les conséquences cardiovasculaires du SAOS et de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents [173]. i. Conséquences vasculaires Hypertension artérielle L'élévation de la pression artérielle est corrélée positivement à la sévérité du SAOS, indépendamment de facteurs confondants [184]. Par ailleurs, le risque de développer une HTA est lié à la sévérité du SAOS, avec une multiplication du risque par trois pour des patients ayant un IAH > 15 [185]. La première démonstration du développement d'une HTA induite par l'HI a été réalisée par Fletcher et al. sur des rats exposés à 35 jours d'HI [186]. L'augmentation de la pression artérielle induite par l'HI a depuis été confirmée sur d'autres modèles animaux, comme des souris ou des rats exposées à 14 jours d'HI [187], mais aussi chez des volontaires sains exposés pendant 14 jours à des cycles d'HI [188]. Dysfonction endothéliale La dysfonction endothéliale résulte d'un déséquilibre entre vasodilatation et vasoconstriction, dont l'endothélium vasculaire est le régulateur principal. Chez les patients apnéiques, l'altération de la fonction endothéliale est caractérisée par une détérioration de la vasodilatation endothéliumdépendante. De plus, en dehors de tous facteurs confondants, la sévérité du SAOS est corrélée positivement à l'aggravation de cette dysfonction [189]. La diminution de la vasodilatation endothéliumdépendante est aussi retrouvée chez des rats exposés à 28 jours d'HI [190]. De plus, une réponse accrue à un agent vasoconstricteur, l'endothéline 1 (ET-1), a été observé dans les aortes, les artères carotidiennes, les artères mésentériques ou les artères pulmonaires de rats ou souris exposés entre 1 et 5 semaines d'HI [191-193] [194, 195]Guo [196, 197] [198]. Bien que la vasoconstriction induite par l'ET-1 n'ait pas été étudiée, des taux élevés d'ET-1 ont été retrouvés dans le plasma et les tissus de patients apnéiques, [199-205], comme chez les animaux exposés à l'HI [198, 206-208]. Athérosclérose Le SAOS est aussi un inducteur majeur de progression de l'athérosclérose, directement liée à la sévérité de la pathologie [209, 210]. Des marqueurs de remodelage vasculaire et d'athérosclérose, comme l'augmentation de l'épaisseur intima-média carotidienne et la présence de plaques athéromateuses carotidiennes, ont été d'avantage observés chez les patients apnéiques que chez les non-apnéiques [211-213]. Aussi, chez des souris exposées à 14 jours [214] ou 6 semaines d'HI [215], l'épaisseur intima-media est augmentée via l'induction d'un stress oxydant et d'une inflammation [214]. L'inflammation a également été démontrée comme impliquée dans l'augmentation des lésions athéromateuses induites par l'HI avec une augmentation de l'infiltration des lymphocytes dans les plaques d'athérome [216, 217]. ii. Conséquences cardiaques Arythmies Plus généralement, le risque de mort subite est plus élevé chez les patients apnéiques [218] et, contrairement aux patients non-apnéiques, est plus fréquent pendant la nuit que le matin [219]. Le risque d'arythmies ventriculaires est également plus élevé pendant la nuit [220, 221]. De plus, l'incidence de la fibrillation auriculaire est deux fois plus importante chez les patients apnéiques par rapport aux patients non apnéiques [222]. L'une des causes majeures de la mort subite est l'IM, engendrant des arythmies ventriculaires (tachycardie ou fibrillation). De plus, une étude animale récente montre un risque plus élevé de mort subite lié aux arythmies ventriculaires suite à une ischémie, chez des rats exposés à 14 jours d'HI. Ces arythmies sont dues à une activation du système nerveux sympathique associée à une altération de la repolarisation ventriculaire et à une augmentation de l'expression des canaux calciques endocardiques [223]. Par ailleurs, un article récent confirme également, chez le rat soumis à 7 jours d'HI, l'augmentation de la susceptibilité à la fibrillation auriculaire [224]. Infarctus du myocarde L'ensemble des conséquences vasculaires du SAOS contribuent à la prévalence de l'IM [225]. Chez les patients apnéiques, l'infarctus du myocarde est plus sévère, avec une ischémie prolongée, une mort cellulaire plus importante et un remodelage ventriculaire gauche et droit aggravé [225]. L'incidence de l'IM est plus importante la nuit que le matin (nuit : 32%, levée du jour : 17%), contrairement aux patients non apnéiques (nuit : 7%, levée du jour : 47%) et 91% des patients avec un IM pendant la nuit ont un SAOS [226]. De plus, trois mois après un infarctus du myocarde, la fraction d'éjection ventriculaire gauche est plus basse et la taille d'infarctus plus étendue chez les patients apnéiques comparés à des patients non apnéiques [227]. Par ailleurs, une étude à moyen terme montre que 40% des patients avec un IM avaient un SAOS sévère (IAH > 30) et que ce SAOS sévère est lié à une moins bonne survie à 18 mois [228]. Sur du plus long terme, 6 ans post-IM, plusieurs études ont montré que les patients avec un SAOS ont un moins bon pronostic vital avec une augmentation de la survenue d'évènements cardiovasculaires parfois fatals [229-231]. De plus, Buchner et al. ont démontré que la taille d'infarctus est corrélée positivement à l'IAH [227] signifiant l'impact de l'HI dans cette maladie coronarienne. Le rôle de l'HI dans l'augmentation de la susceptibilité myocardique à l'ischémie-reperfusion a été exploré dans quelques études chez l'animal. Alors qu'une HI aigue de 4h réduit les lésions d'une ischémie-reperfusion [232], l'exposition d'animaux de 14 jours à 5 semaines d'HI entraine une augmentation de la taille d'infarctus [198, 233]. Les différents mécanismes impliqués seront évoqués dans la partie suivante puisqu'ils font l'objet du travail de cette thèse. Remodelage ventriculaire Comme vu précédemment, le SAOS aggrave le remodelage ventriculaire gauche post-IM [227]. L'hypertrophie ventriculaire gauche est liée à de nombreux facteurs confondants du SAOS, tels que l'hypertension artérielle et l'obésité [234]. Quelques études montrent que le SAOS est associé à des signes d'hypertrophie ventriculaire gauche indépendamment d'un IM ou d'une hypertension artérielle [235, 236]. Ce remodelage ventriculaire a aussi été observé dans des modèles animaux exposés à l'HI. Notamment dans un modèle de chien, 1 à 3 mois d'HI augmentent le volume d'éjection systolique et réduisent la fraction d'éjection du ventricule gauche [237]. Chez des souris exposées à 10 jours d'HI, une étude montre l'importance de la gp91phox, composant de la NADPH oxydase, dans le développement d'un remodelage ventriculaire dû au stress oxydant [238]. Par ailleurs, l'échangeur NCX1 a aussi été montré comme étant un acteur majeur dans le remodelage ventriculaire après 8 semaines d'HI chez la souris [238, 239]. Insuffisance cardiaque Un 11 est indépendamment associé au risque de développer une insuffisance cardiaque [240]. Le SAOS est également un facteur indépendant de risque de mortalité chez les patients insuffisants cardiaques [241, 242]. Le SAOS, en augmentant l'activité sympathique, serait responsable d'une accélération de la maladie [243, 244]. Dans un modèle de rats insuffisants cardiaques par constriction aortique abdominale, une exposition de 4 semaines à l'HI exacerbe le développement de l'insuffisance cardiaque, observé par une diminution des fractions d'éjection et de raccourcissement du ventricule gauche. Cet effet de l'HI semble être lié à une inflammation soutenue [245]. Par ailleurs, au laboratoire, le développement d'un modèle d'insuffisance cardiaque par ligature permanente de l'artère coronaire gauche chez le rat, a montré qu'une exposition de 4 à 12 semaines d'HI aggrave la dysfonction contractile. Ceci est caractérisé par une réduction du débit cardiaque, du volume d'éjection systolique et de la fraction d'éjection du ventricule gauche (travaux de thèse de G. Bourdier). Cette diminution de la fonction systolique est associée à une hypertrophie précoce du ventricule gauche et à une accélération de la dilatation. Il a été montré aussi que l'HI altérait la structure du ventricule gauche avec l'apparition d'une fibrose plus importante chez les animaux HI (travaux de thèse de G. Bourdier). Le SAOS semble donc un facteur aggravant pour de nombreuses pathologies cardiovasculaires, et en particulier pour l'infarctus du myocarde. Une meilleure compréhension des mécanismes induits par l'HI permettrait sans doute un meilleur diagnostic et une meilleure prise en charge des patients apnéiques, en particulier dans le but de limiter ce risque cardiovasculaire. Dans le paragraphe suivant nous aborderons, de façon générale, les principaux mécanismes déjà connus pour être impliqués dans le développement des maladies cardiovasculaires associées au SAOS : l'activation sympathique, l'inflammation et le stress oxydant. A la fin, nous évoquerons aussi l'implication du facteur de transcription, HIF-1, puisqu'il joue un rôle majeur dans la réponse à l'hypoxie et ce, de concert avec les trois mécanismes cités ci-dessus. f. SAOS, HI chronique et mécanismes principaux i. Activation sympathique Le système nerveux autonome est composé d'une branche cardio-stimulante , le système nerveux orthosympathique, et d'une branche cardio-inhibant , le système nerveux parasympathique. Pendant le sommeil, en condition normale, le système sympathique est diminué au profit du système parasympathique. Or chez un patient SAOS, à chaque microéveil, le système sympathique est activé et ceci est associé à des concentrations plasmatiques et urinaires en catécholamines élevées [246] (figure 15). La répétition chronique des apnées-hypopnées entraine une altération de cette balance du système nerveux autonome au profit du système orthosympathique [247], associé à une augmentation de l'activité nerveuse sympathique musculaire [248] et une diminution de la sensibilité du baroréflexe [249] (figure 15). L'exposition de volontaires sains à 14 jours d'HI a permis de reproduire l'activation sympathique induite par le SAOS, caractérisée par une augmentation de l'activité nerveuse sympathique musculaire, de la pression artérielle et une diminution de la sensibilité du baroréflexe [188] (figure 15). L'exposition d'animaux à l'HI montre que le stress oxydatif est le principal activateur du système nerveux sympathique, en augmentant la sensibilité du chémoréflexe, en diminuant le baroréflexe et en augmentant la sécrétion de catécholamines par les glandes surrénales [250] (figure 15). L'activation sympathique est reconnue pour augmenter la prévalence de l'insuffisance cardiaque [251] et de la fibrillation atriale [222] associées au SAOS, mais actuellement aucune donnée ne l'associe à la susceptibilité du myocarde à l'ischémie-reperfusion. ii. Inflammation Le SAOS est considéré comme une maladie induisant une inflammation systémique de bas grade. De nombreuses études ont mis en évidence des taux élevés de marqueurs dinflammation circulants, corrélés à la sévérité du SAOS, comme IL-6, IL-8, IL 10, ICAM-1, MCP-1 [252-255]. De manière intéressante, ces marqueurs peuvent être différent selon le sexe, ce qui pourrait améliorer le diagnostic du SAOS avec des biomarqueurs dépendant du genre [256] (figure 15). Comme dans la pathologie apnéique, l'HI induit une inflammation chez des souris mince ou obèse. Les mécanismes impliqués sont notamment une activation du facteur de transcription pro-inflammatoire nuclear factor-B (NF-B) [217, 257, 258], une augmentation de l'expression de cytokines et chémokines pro-inflammatoires [217], le recrutement et la polarisation en profil M1 pro-inflammatoire des macrophages [259, 260] (figure 15). Alors que l'impact du statut inflammatoire en HI a été étudié sur les altérations métaboliques et sur l'athérosclérose, son impact cardiaque a été peu étudié. iii. Stress oxydant Le stress oxydant, engendré par la répétition des cycles d'hypoxie-réoxygénation, est la conséquence la plus étudiée en HI et chez les patients SAOS. De plus, son implication dans le développement des maladies cardiovasculaires associé au SAOS est bien connu [261]. En effet, chez les patients apnéiques, des anions O2. - sont produits par les leucocytes circulants [262, 263] (figure 15). De plus, l'expression de la NADPH oxydase, produisant des anions O2. -, est augmentée dans le sérum de patients SAOS et dans le tissus cardiaque de rats exposés 14 jours à l'HI [190, 264, 265] (figure 15). Par ailleurs, chez les patients apnéiques, la biodisponibilité du monoxyde d'azote (NO), estimée à partir de la quantité de nitrite et nitrate, est diminuée dans le sérum [266, 267]. Ceci a été confirmé par une mesure directe dans le cœur de rats exposés 8 sem à l'HI [268] (figure 15). Un autre marqueur du stress oxydant est l'augmentation la peroxydation des lipides et de l'ADN retrouvée dans le sérum de patients SAOS [266, 269-271] et dans le cœur ou le foie de rongeurs à l'HI [268, 272] (figure 15). Enfin, une diminution des capacités antioxydantes est observée dans le sérum de patients apnéiques, caractérisée par exemple avec une diminution de la vitamine A et de l'enzyme superoxide dismutase [273-276]. De même, l'expression cardiaque de la superoxide dismutase est diminuée chez des rats exposés à 14 jours d'HI, reflétant une diminution des propriétés antioxydantes [190] (figure 15). Au niveau cardiaque, le stress oxydant a été ciblé pour prévenir la vulnérabilité du cœur à l'ischémie-reperfusion, induite par l'HI. En effet, chez le rat exposé à 14 jours d'HI, l'utilisation du tempol, de la mélatonine, ou de l'atorvastatine abolit l'augmentation de la taille d'infarctus [190, 265]. Bien que l'ensemble des mécanismes ci-dessus soient clairement impliqués dans les conséquences de l'HI. A part le stress oxydant, peu d'entre eux ont été montré pour être impliqué dans l'augmentation de la taille d'infarctus, qui fait l'objet de ce travail de thèse. Par ailleurs, les beta-bloquants, les antioxydants ou les anti-inflammatoires n'ont à ce jour pas été montré pour améliorer les conséquences du SAOS [277-280]. Ainsi, la compréhension d'autres mécanismes de l'HI est primordial, et en particulier au laboratoire, nous nous intéressons au facteur de transcription, HIF-1. iv. Hypoxia-inducible factor-1 Définition HIF-1 est un facteur de transcription, découvert en 1991 [281], appartenant à la famille des facteurs induits par l'hypoxie (hypoxia-inducible factor, HIF), qui sont des hétérodimères composés de HIF-1, s'hybridant avec HIF-1, HIF-2 ou HIF-3, pour former HIF-1, HIF-2 ou HIF-3, respectivement. Les sous-unités HIF-1 et HIF-1 sont composées dans la région N- terminale, d'un domaine basic-helix-loop-helix (HLH), permettant la fixation de HIF-1 à l'ADN. Ces protéines sont également pourvues de deux domaines Per-Arnt-Sim (PAS) permettant la fixation à l'ADN, et contribuant à l'hétérodimérisation des deux sous-unités. Pour la sous- unité HIF-1, ce domaine participe aussi à sa rétention cytosolique en normoxie (figure 13). HIF-1 est constituée de deux domaines d'activation de la traduction (TAD) situés en position N- et C-terminales (figure 13). Les deux sous-unités HIF-1 et HIF-1 sont constitutivement exprimées. La sous-unité est labile, ainsi l'activation de HIF-1 est dépendante de la stabilisation de HIF-1. En effet, HIF-1 est sensible à la pression partielle ou taux d'oxygène [282]. En normoxie, la protéine HIF-1 est hydroxylée sur une ou deux prolines en position 402 et 564 dans la région oxygen degradation domain (ODD), par des dioxygénases, les prolyl-4- hydroxylases (PHD) [283-285] (figure 12-13). Parmi les différentes PHD, 1, 2 ou 3, dans le cœur, la forme prédominante est la PHD3 [284, 285]. Les hydroxylations sont reconnues par le peptide Von Hippel-Lindeau (pVHL) [286], entrainant la fixation de l'ensemble du complexe VHL d'ubiquitinylation, contenant Elongin BC/Cullin/RING domain protein 1 (Elongin BC/Cul/Rbx1) [287]. Ensuite, HIF-1 ubiquitinylé est dégradé par le protéasome 26S . Par ailleurs, une autre protéine intervient dans la régulation de la transcription des gènes cibles, le facteur d'inhibition de HIF-1 (FIH-1), qui hydroxyle l'aspargine en position 803, dans le domaine C-TAD (figure 12-13). Ce facteur bloque le recrutement du co-activateur, l'acétyltransferase p300/Creb-Binding Protein (CBP), inhibant ainsi l'activité de HIF-1 (figure 12) [288]. En hypoxie, l'activité des dioxygénases est réduite, HIF-1 est stabilisé , puis transloqué dans le noyau, o il interagit avec HIF-1 pour former l'hétérodimère HIF-1 (figure 12) [283]. L'initiation de la transcription de centaines de gènes est régulée par HIF-1, et ce, à travers sa fixation sur les séquences hypoxia response element (HRE) dotés d'un motif 5'(A/G)CGTG3', localisés dans la région promotrice de chaque gène cible [198, 289] (figure 12). L'activité de HIF-1 consiste à la régulation de l'expression de gènes impliqués dans diverses fonctions, attribuant à ce facteur de transcription un rôle majeur dans l'angiogénèse, la production d'érythrocytes, la croissance, la prolifération, la survie, le métabolisme glucidique Figure 12 : Régulation de l'activité du facteur de transcription HIF-1 par le taux d'oxygène, d'après Koyasu et al. [290]. Régulation Comme vu précédemment, l'activité de HIF-1 est régulée par les hydroxylations de HIF-1 dépendantes des PHD et du FIH. Mais il existe aussi des voies de régulations de HIF-1 indépendantes de l'oxygène [290](figures 12-13). Si l'on s'intéresse plus précisément d'abord aux voies de régulation 02 dépendantes, il apparat que selon la profondeur de l'hypoxie, l'activité de HIF-1 est modulée. Par exemple, sur différents types cellulaires, une hypoxie modérée, avec 1% O2 pendant 5h, inhibe les PHD alors qu'il faut une hypoxie plus sévère pour bloquer la fixation du FIH, 0, 2% O2 pendant 5h [291]. Le fonctionnement des PHD dépend de deux substrats, l'oxygène et l'- ketoglutarate, ainsi que de deux cofacteurs, l'ion ferrique et l'ascorbate. Outre la régulation de l'oxygène, la disponibilité en -ketoglutarate, un intermédiaire du cycle de Krebs, régule l'activité des PHD. Sa production dépend de l'activité de certaines enzymes de ce cycle, la succinate déshydrogénase (SDH), la fumarate hydratase (FDH) et les isocitrate déshydrogénase 1-2 (IDH), et de l'IDH3 cytosolique (figure 13). La fixation des PHD peut être empêchée par la fixation de la protéine NADPH quinone oxidoreductase 1 (NQO1) sur le domaine ODD. En revanche, l'activité de certaines PHD comme la PHD2 peut aussi être favorisée par la sirtuine (Sirt) 2, une déacétylase, qui en enlevant un groupe acétyle dans le domaine d'inhibition (ID), augmente l'interaction de la PHD2 avec HIF-1. Le FIH est aussi sensible à la présence l'-ketoglutarate et d'ion ferrique, ainsi il est aussi régulé par l'IDH3 (figure 12-13). Pour ce qui est de la régulation de HIF-1 indépendante de l'oxygène, elle peut avoir lieu au niveau de sa transcription, avec la fixation au niveau du promoteur du gène de facteurs activateurs, tels que le complexe interferon-stimulated gene factor 3 (ISGF3, composé du signal transduceur and activator of transcription (STAT) 1, STAT2, interferon regulatory factor (IRF) 9) ou STAT3 ou NF-B, ou encore inhibiteur, comme NF-E2-related factor 1 (NRF1). La traduction de HIF-1 est aussi régulée par la voie phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/Akt/mammalian target of rapamycin (mTOR). Par ailleurs, illustré sur la figure 13, la translocation nucléaire de HIF-1 est inhibée par la mitogen-activated protein kinases (MAPK), en phosphorylant des sérines à proximité du signal d'export de la protéine vers le noyau. De plus, l'hétérodimérisation avec HIF-1 est empêché par la phosphorylation d'une sérine par la protéine casein kinase 1 (CK1) dans le domaine PAS. L'activité transcriptionnelle est aussi renforcée par l'acétylation du domaine C-TAD due à p300/CBP-associated factor (PCAF), ainsi la déacétylation de HIF-1 par la Sirt1 a été montrée pour diminuer l'activité de HIF-1, en inhibant la fixation de l'acétyltransferase p300/CBP. Néanmoins, l'impact majoritaire de la modulation de l'activité de HIF-1 est au niveau de la stabilité de la protéine HIF-1. Par exemple, la protéine heat shock protein 90 (hsp90) protège HIF-1 d'une dégradation, par sa fixation sur le domaine PAS, mais la protéine receptor for activated C kinase 1 (RACK1) peut dissocier hsp90 par compétition, induisant ainsi la déstabilisation de HIF-1 en se substituant au pVHL dans le complexe d'ubiquitinylation [292]. La protéine HIF- 1 est déstabilisée par des phosphorylations induites par les protéines glycogen synthase kinase 3 (GSK3) et polo-like kinase 3 (PLK3) dans les domaines ID et N-TAD ; par la méthylation dû à l'histone methyltransferase Set7/9, ainsi la démétylation par lysine-specific demethylase-1 (LSD1) stabilise HIF-1 dans le domaine HLH (figure 13). Enfin, l'effet de la sumonylation sur la stabilité de HIF-1 est encore controversé, puisque la sumonylation par le RWD-containing SUMOylation enhancer (RSUME) et la désumonylation par la sentrin/SUMO-specific protease (SENP) augmentent sa stabilité (figure 13). Figure 13 : Structure de HIF-1 et sa régulation par hydroxylation (OH), acétylation (Ac), méthylation (Me), phosphorylation (P) et sumonylation (SUMO) d'après Koyasu et al. [290]. L'activité du facteur de transcription HIF-1 est donc régulée de différentes manières. Néanmoins sa régulation conventionnelle est O2 dépendant, avec une activation accrue de HIF-1 en hypoxie. Nous allons voir par la suite que l'intermittence de l'hypoxie est également un puissant activateur de HIF-1. Implication de HIF-1 dans la réponse à l'HI chronique Même si HIF-1 est connu pour ces effets protecteurs lorsqu'il est activé par de brefs épisodes d'hypoxie, par exemple lors du pré- ou post-conditionnement myocardique, son activation chronique et plus particulièrement en HI est délétère pour le système cardiovasculaire. Sur des cellules PC12 (cellules originaires d'un phéochromocytome de la medullosurrénale de rat), l'exposition à des cycles d'HI (30 secondes d'hypoxie à 1, 5% et 4 minutes de normoxie à 20% d'oxygène) augmente proportionnellement en fonction du nombre de répétition de cycles d'HI (10, 30, 60, 120 fois) à la fois l'expression nucléaire de HIF-1 et son activité transcriptionnelle. De plus, l'activité de HIF-1 est 2, 5 fois plus importante avec 120 cycles d'HI qu'après une heure d'hypoxie continue à 1, 5% d'oxygène [293] (figure 15). Enfin, la même équipe sur des cellules PC12, a montré qu'après 5 heures d'hypoxie continue, moins de 10 minutes de réoxygénation suffisaient pour dégrader la protéine HIF-1, alors que la stabilisation de HIF-1 perdure au moins 90 minutes après 60 cycles d'HI [294] (figure 15). Ainsi, l'HI est un stimulus robuste, entrainant une activation de HIF-1 persistante et chronique. Ce postulat s'appuie sur le fait que HIF-1 est bien connu pour être activé par le stress oxydant généré par l'HI, comme vu précédemment (figure 15). En effet, en HI, la production d'O2. - par la NADPH oxidase inhibe directement les PHD, ou indirectement en activant la protéine kinase C (PKC) [282]. La PKC est produite par l'activation ROS-dépendante de la phospholipase C (PLC), une enzyme membranaire, qui clive le phosphatidylinositol-4, 5- biphosphate (PIP2) en inositol tri-phosphate (IP3) et diacylglycérol (DAG). Le DAG active la PKC, alors que l'IP3 se lie aux canaux calciques de la membrane du réticulum endoplasmique (IP3R), impliqués dans l'efflux calcique du RE vers le cytosol. Le calcium active les protéines kinases Ca2 /calmoduline-dépendantes (CaMK), ainsi que la PKC, dont l'activité dépend de la concentration calcique intracellulaire [293]. Enfin, les ERO entrainent, une activation de la synthèse de HIF-1 par la voie PI3K/Akt/mTOR activée par la PKC [294], une stabilisation de HIF-1 par l'inhibition des PHD, et une transactivation de HIF-1 par la phosphorylation du coactivateur, l'acétyltransferase p300/CBP, dû à la CaMK [282, 295](figure 14). Figure 14 : Les différentes voies de signalisation régulant l'activation de HIF-1 par le stress oxydant en HI, d'après Belaidi et al. [295]. En clinique, chez les patients SAOS, les gènes cibles de HIF-1 ont souvent été étudiés. Par exemple, la concentration plasmatique de l'érythropoïétine (EPO) est plus élevée chez les patients apnéiques par rapport aux patients contrôles, et cette différence est abolie par le traitement à la PPC [296]. De même, plusieurs études se sont intéressées à l'augmentation des taux plasmatiques du vascular endothelial growth factor (VEGF) et de l'ET-1 chez les patients SAOS, et ont montré une corrélation positive entre l'IAH et ces taux de molécules circulantes [202, 297-299]. Cependant, seulement deux études ont mesuré directement des éléments du facteur de transcription sur de petits effectifs (figure 15). Dans des biopsies de peau, l'expression des transcrits codant pour HIF-1 est augmentée chez les patients atteints d'un SAOS sévère [300]. De même, dans le sérum de patients SAOS sévère, la quantité de protéine HIF-1 est augmentée, par rapport aux patients contrôles ou avec un SAOS léger à modéré, et est positivement corrélée avec l'IAH [301]. Les modèles animaux et cellulaires d'HI ont permis de confirmer que ce facteur de transcription pouvait jouer un rôle majeur dans la physiopathologie du SAOS, voir même dans les pathologies associées. En effet, l'HI chronique est reconnue pour augmenter l'expression de HIF-1 dans divers organes : cœur [198, 302], vaisseaux [258, 303], intestin [304], cerveau [305], foie ou poumons [306] (figure 15). En particulier, dans notre contexte, l'activation de HIF-1 a été montrée pour être impliquée dans les conséquences cardiovasculaires délétères de l'HI. Des travaux du laboratoire ont mis en évidence que chez le rat, l'exposition à 14 jours d'HI induit une augmentation de l'activité de HIF-1 et la fixation de HIF-1 sur le HRE du gène codant pour l'ET-1. Ceci est renforcé par une élévation de la quantité d'ET-1 au niveau cardiaque, qui est associé à une augmentation de la taille dinfarctus et de la pression artérielle [198]. Par ailleurs, au laboratoire, l'utilisation de souris partiellement déficientes pour le gène HIF-1 a montré que 14 jours d'HI entrainent un remodelage vasculaire, induit par une augmentation de l'activité de NF-B dépendante de HIF-1 [258]. Dans ces deux études, l'administration du bosantan (un antagoniste mixte des récepteurs à l'ET-1) pendant l'exposition à l'HI a prévenu ces conséquences délétères pour le système cardiovasculaires, révélant le rôle délétère de HIF-1, à travers l'activation du gène codant pour l'ET-1 et l'intérêt d'étudier plus précisément ce facteur de transcription [198, 258]. Comme vu au début de ce chapitre l'activation de HIF-1 par le stress oxydant est donc bien décrite. A ce jour, HIF-1 est connu pour être un mécanisme secondaire de l'HI, mais il pourrait être placé en amont des mécanismes principaux du SAOS. En effet, la délétion partielle de HIF-1 dans un modèle de souris exposées à l'HI empêche la genèse d'un stress oxydant, évalué avec un marqueur de la peroxydation des lipides, les thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) [307]. Dans ce même article, la délétion de HIF-1 abolit aussi l'activation sympathique, en préservant la sensibilité des chémorécepteurs et des barorécepteurs et la production des catécholamines [307]. Ainsi, l'abolition par HIF-1 du stress oxydant et de l'activation sympathique empêche l'augmentation de la pression artérielle [307] (figure 15). De plus, dans le même type de modèle expérimental, la délétion de HIF-1 empêche le développement de l'inflammation induit par l'HI, responsable du remodelage vasculaire, en prévenant l'altération de l'épaisseur intima-média, la migration des splénocytes et la suractivité de NF-B [258] (figure 15). Ainsi, ces deux articles suggèrent donc que HIF-1 pourrait être le mécanisme clé de l'HI, et préviendrait aussi ses conséquences CV délétères. Mécanismes du SAOS et Modèle de SAOS Marqueurs Références de l'HI chronique Déséquilibre de la balance du système nerveux autonome au profit du système sympathique Patients SAOS Concentrations élevés en catécholamines Review [246] Augmentation de l'activité nerveuse sympathique musculaire Diminution de la sensibilité du baroréflexe Volontaires sains Augmentation de l'activité nerveuse sympathique musculaire [188] Activation sympathique exposés à l'HI Diminution de la sensibilité du baroréflexe Concentrations élevés en catécholamines Animaux exposés Augmentation de l'activité nerveuse sympathique musculaire Review [250] à l'HI Diminution de la sensibilité du baroréflexe Augmentation de la sensibilité du chémoréflexe Activation sympathique causée par le stress oxydant Patients SAOS Exemple de biomarqueurs inflammatoires potentiels du SAOS chez les adultes : taux plasmatiques IL-6 et IL-10 Review [253] Différences de variations des biomarqueurs du SAOS selon le genre [256] Inflammation Animaux exposés Activation du facteur de transcription pro-inflammatoire NF-B [217, 257, 258] à l'HI Augmentations de l'expression des cytokines et chémokines pro-inflammatoires [217] Recrutement et polarisation en profil M1 pro-inflammatoire des macrophages [259, 260] . - Augmentation de la production d'anions O2 [263, 299] Augmentation de l'expression NADPH oxydase plasmatique [264, 266, 267] Patients SAOS [266, 269-271] Diminution de la biodisponibilité du NO plasmatique [273-276] Augmentation de la peroxydation des lipides et de l'ADN plasmatiques Stress oxydant Diminution des capacités antioxydantes plasmatiques (vitamine A, superoxyde dismutase) Augmentation de l'expression NADPH oxydase cardiaque [190, 265] Animaux exposés Diminution de la biodisponibilité du NO cardiaque [268] à l'HI Augmentation de la peroxydation des lipides et de l'ADN dans le cœur ou le foie [268, 272] Diminution de l'expression de la superoxide dismutase cardiaque [190] Patients SAOS Augmentation l'ARNm HIF-1 dans la peau chez les patients SAOS sévères [300] Augmentation de la protéine HIF-1 plasmatique chez les patients SAOS sévères [301] Animaux exposés [198, 258, 302-306] Augmentation de l'expression de HIF-1 dans le cœur, les vaisseaux, l'intestin, le cerveau, le foie ou les poumons HIF-1 à l'HI [258, 307] Délétion partielle de HIF-1 abolit l'activation sympathique, l'inflammation et le stress oxydant Cellules exposées Activation de HIF-1 plus importante en HI qu'en hypoxie continue [293] à l'HI Activation persistante de HIF-1 après un retour à la normoxie [294] Activation de HIF-1 causée par le stress oxydant [282] Figure 15 : Les mécanismes physiopathologiques du SAOS et de l'HI chronique En conclusion de cette partie, parmi les conséquences du SAOS, l'HI est la conséquence la plus délétère pour le système cardiovasculaire. Notamment dans le contexte de l'infarctus du myocarde, que ce soit chez l'homme ou dans des modèles d'ischémie-reperfusion chez l'animal, l'HI semble fortement responsable d'une aggravation de la taille d'infarctus. L'activation persistante et chronique de HIF-1 aurait un rôle clé dans cette réponse délétère à l'HI chronique au niveau cardiaque. Nous avons vu que HIF-1 était étroitement lié aux mécanismes principaux du SAOS. Par ailleurs, les traitements ciblant l'activité sympathique, l'inflammation, le stress oxydant n'ont pas été montré pour améliorer les conséquences du SAOS, et peu d'entre eux ont été étudiés dans le contexte de l'infarctus du myocarde. Ainsi, la compréhension de l'implication de HIF-1 et de nouveaux mécanismes en HI représente un enjeu majeur pour développer des thérapeutiques complémentaires ou substitutives à la PPC et améliorer la prise en charge des patients SAOS, ayant un risque accru d'infarctus du myocarde. 3. Objectifs L'objectif général de cette thèse est d'étudier les mécanismes induits par une exposition chronique à l'HI, susceptibles d'expliquer l'augmentation de la taille d'infarctus suite à une ischémie-reperfusion. Ces dernières années, les traitements ciblant les mécanismes principaux du SAOS, que sont l'activité sympathique, l'inflammation et le stress oxydant, n'ont pas montré d'amélioration des pathologies associées au SAOS, notamment dans l'augmentation de la taille de l'infarctus. Ainsi, dans le contexte de l'HI chronique, une conséquence majeure du SAOS, nous nous sommes intéressés à HIF-1, un facteur de transcription clé de la réponse à l'hypoxie. Par ailleurs, dans le contexte de l'infarctus du myocarde, notre intérêt s'est porté sur l'homéostasie de deux organites qui ont été peu étudiés dans le cadre de l'HI chronique, le RE et la mitochondrie. Ce travail s'articule donc autour de trois études présentées dans ce manuscrit (1 en cours de soumission, 1 en cours de finalisation et 1 en cours de réalisation). Dans la première étude, nous nous sommes intéressés au stress du RE, connu pour son rôle dans la vulnérabilité du myocarde à l'ischémie-reperfusion et ce, indépendamment de l'HI. Au démarrage de ce travail, quelques publications montraient que l'HI induisait un stress du RE dans le cœur [308, 309] et le cerveau [310-312]. Il avait également été montré que l'HI n'induit plus d'augmentation de l'expression cérébrale de HIF-1 chez des souris dépourvues du gène codant pour un facteur pro-apoptotique de la réponse au stress du RE (CHOP-/-). De plus, une étude du laboratoire (à laquelle j'ai participé en Master 2 et en début de thèse, présentée en Annexe) a mis en évidence que l'HI entraine des perturbations de l'homéostasie calcique liées à un stress du RE, lui-même responsable d'une activation de HIF-1 et d'une aggravation de la taille de l'infarctus suite à un protocole d'ischémie- reperfusion myocardique [313]. Ceci suggérait un lien probable entre HIF-1 et le stress du RE [312, 313]. Par ailleurs, quelques études rapportaient que HIF-1 était impliqué dans l'expression ou l'activation d'acteurs de l'homéostasie calcique tels que de VDAC1, SERCA, NCX1 [314-316]. De plus, il avait été montré que HIF-1 pouvait se fixer dans la région promotrice du gène codant pour CHOP et activer sa transcription [317]. Ainsi, HIF-1 pourrait être impliqué dans la genèse du stress du RE induit par l'HI, via une altération de l'homéostasie calcique, ce qui contribueraient à expliquer l'augmentation de la mort cellulaire suite à l'ischémie-reperfusion myocardique. Dans cette première étude, les objectifs ont donc été de caractériser le rôle de HIF-1 dans l'augmentation de la taille d'infarctus induite par l'HI, en déterminant son implication dans des mécanismes connus pour être impliqués dans la mort cellulaire suite à une ischémie- reperfusion, tels que l'intégrité des MAM, les échanges calciques entre le RE et la mitochondrie et le stress du RE. A travers les MAM, les altérations du RE sont susceptibles d'impacter le fonctionnement mitochondrial. Notre intérêt s'est donc ensuite porté sur la mitochondrie, bien connue pour son rôle dans la réponse à l'ischémie-reperfusion et peu étudiée dans le contexte de l'HI. Les quelques études effectuées rapportent une augmentation de la production mitochondriale d'ERO dans le cerveau [318-320] et les corps carotidiens [321] et une diminution de la biogénèse mitochondriale dans le muscle génioglosse [322]. En revanche, un rôle majeur de HIF-1 dans la réponse mitochondriale à l'hypoxie continue a été décrit [323] : adaptation de l'activité du complexe IV mitochondrial [324], activation du métabolisme glycolytique [325- 327], réduction de la biogénèse et de la respiration mitochondriales [328-330] et déclenchement de la mitophagie [145]. Les objectifs de ce deuxième travail ont donc été de caractériser l'impact de l'HI sur la structure, la fonction, la dynamique et le renouvellement mitochondrial des cardiomyocytes ainsi que le rôle de HIF-1 dans ces altérations potentielles. Pour terminer, en parallèle de ces travaux, nous avons initié une étude permettant de statuer sur le rôle majeur de HIF-1 dans la physiopathologie du SAOS. En effet, comme nous l'avons vu dans l'introduction et dans nos trois études précédentes, les mécanismes d'adaptations à l'HI sont étroitement liés à l'activation de HIF-1. Ainsi, nous avons voulu savoir si HIF-1 pouvait être en amont de ces mécanismes en utilisant un inhibiteur pharmacologique de son activité, la curcumine. De plus, plusieurs études ont démontré que la curcumine diminue l'expression de HIF-1 en conditions hypoxiques [331-339]. Cette dernière étude, en cours de réalisation, a donc pour objectif de montrer que HIF-1 joue un rôle central dans les mécanismes délétères de la réponse à l'HI, à savoir l'activation sympathique, l'inflammation, le stress oxydant, le stress du RE et les altérations mitochondriales. MATERIEL ET METHODES Dans cette partie, tout le matériel utilisé et toutes les méthodes auxquelles j'ai eu recours sont décrits. Néanmoins, dans la partie résultat , avant chaque étude, le design expérimental de l'étude est rappelé et les méthodes sont référencées. 1. Design expérimentaux a. Etude 1 : rôle de HIF-1 dans l'altération des MAM, le stress du RE et l'augmentation de la taille d'infarctus induits par l'HI chronique Dans cette étude, des souris mâles Swiss/SV129, WT ou HIF-1 /-, âgés de 7 à 8 semaines, ont été exposées 21 jours à des cycles d'HI ou de N. A la fin de l'exposition, l'expression de HIF-1, les flux calciques inter-organites, l'intégrité des MAM, le stress du RE, et la taille d'infarctus après ischémie-reperfusion ont été évalués. Cette partie animale explore les mécanismes cellulaires et moléculaires de l'HI, et sont associés à l'évaluation de l'axe HIF- 1-stress du RE sur des biopsies d'appendice d'auricule droit de patients atteints de maladie coronarienne avec ou sans sleep disordered-breathing (SDB). Exposure Ischemia Reperfusion 21 days 45 min 90 min WT or HIF-1 /- N or IH Ca2 imaging Infarct size MAM ER stress HIF-1 Figure 16 : Design expérimental de l'étude 1 : rôle de HIF-1 dans l'altération des MAM, le stress du RE et l'augmentation de la taille d'infarctus induits par l'HI chronique. b. Etude 2 : rôle de HIF-1 dans les altérations mitochondriales induites par l'HI chronique Cette étude a été réalisée avec le même design animal expérimental que l'étude précédente, soit des souris mâles Swiss/SV129 WT ou HIF-1 /-, âgés de 7 à 8 semaines, exposées 21 jours à des cycles d'HI ou de N. A la fin de l'exposition, la structure, la fonction, la dynamique et le renouvellement mitochondrial ont été investigués après prélèvements du cœur. Nos résultats nous ont poussé à traiter des souris WT avec de la metformine (300 mg. kg-1, Sigma-Aldrich, Etats-Unis), un activateur de l'AMP-activated protein kinase (AMPK) ou le véhicule (carboxyméthyl-cellulose sodium, CMC-Na 0, 1%), par gavage, chaque jour pendant l'exposition en HI ou N. Ces souris ont été soumises à un protocole d'ischémie-reperfusion pour estimer la taille d'infarctus, ainsi qu'à des prélèvements cardiaques pour évaluer la dynamique et le renouvellement mitochondrial. A Exposure 21 days WT or HIF-1 /- N or IH Mitochondria : structure function dynamics turnover Exposure Ischemia Reperfusion B 21 days 45 min 90 min WT N or IH /- Metformine 300 mg/kg Mitochondria : dynamics Infarct size turnover Figure 17 : Design expérimental de l'étude 2 : rôle de HIF-1 dans les altérations mitochondriales induites par l'HI chronique c. Etude 3 préliminaire : rôle de HIF-1 dans les mécanismes d'adaptation délétères induits par l'HI chronique. Effets d'un inhibiteur de l'activité de HIF-1, la curcumine. Pour cette étude menée en parallèle des trois précédentes, afin de confirmer le rôle majeur de HIF-1 dans les conséquences de l'HI, des souris Swiss/SV129, âgés de 7 à 8 semaines, ont été traitées avec de la curcumine (100 mg. kg-1, Sigma-Aldrich, Etats-Unis), issue de la plante Curcuma Longa, un inhibiteur de la fixation de HIF-1 sur le HRE dans le promoteur des gènes cibles ou avec le véhicule (CMC-Na 0, 1%, Sigma-Aldrich, Etats-Unis), par gavage, chaque jour, pendant l'exposition de 21 jours à l'HI ou à la N. A la fin de l'exposition, ces souris ont été soumises à un protocole d'ischémie-reperfusion pour mesurer la taille d'infarctus, ainsi qu'à des prélèvements cardiaques pour évaluer l'expression de HIF-1 et les marqueurs clés de l'activation sympathique, de l'inflammation et du stress oxydant, du stress du RE, des altérations mitochondriales. Cette étude étant en cours de réalisation, une seule partie a été réalisée et est présentée. Exposure Ischemia Reperfusion 21 days 45 min 90 min WT N or IH /- Curcumine 100 mg/kg HIF-1 Infarct size Sympathetic activation Inflammation Oxydative stress ER stress Mitochondrial alterations Figure 18 : Design expérimental de l'étude 3 préliminaire : rôle de HIF-1 dans les mécanismes d'adaptation délétères induits par l'HI chronique et effets d'un inhibiteur de l'activité de HIF-1, la curcumine. 2. Matériel a. Patients atteints d'une maladie coronarienne avec ou sans apnées du sommeil 39 patients subissant un pontage coronarien ont été prospectivement inclus dans une étude approuvée par le comité d'éthique local, à l'Hôpital Universitaire de Regensburg (Allemagne). Les patients ont été informés et ont signés des consentements conformes à la déclaration d'Helsinki pour leur inclusion dans l'étude. Les biopsies d'appendice auriculaire droit ont été réalisées lors du pontage coronarien et la polysomnographie a eu lieu la nuit avant l'opération à l'aide du dispositif ApneaLink (ResMed Inc. , Allemagne) en mesurant le débit nasal, la saturation en oxygène et les efforts thoraciques respiratoires. Les apnées sont définies comme une diminution du débit d'air de 80 % pendant plus de 10 s, une diminution du débit d'air entre 50-80 % par rapport à la base pendant 10 s ; la désaturation est définie par une diminution de 4 % de la saturation en oxygène ; le SDB est défini par un IAH 15/h. b. Animaux Les études ont été approuvées par le Ministère Français de l'éducation nationale de l'enseignement supérieur et de la recherche (2015061813053181, 8956- 2017020809146998). Les animaux ont été hébergés dans l'animalerie du laboratoire HP2 (numéro : A3851610006) avec des conditions réglementaires de température, d'hygrométrie, avec des cycles d'alternance jour/nuit de 12h. La nourriture et la boisson sont données ad libitum. Toutes les expérimentations respectent la Convention européenne sur la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales ou à d'autres fins scientifiques (décret 2013-118 du 1er février 2013). Pendant l'ensemble des études, le poids des souris a été suivi et l'hématocrite mesurée pour vérifier l'efficacité de l'hypoxie intermittente, décrite ci-dessous. 3. Méthodes a. Modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente Le dispositif à hypoxie intermittente du laboratoire permet de mimer les épisodes répétitifs d'hypoxie-réoxygénation des patients atteints d'apnée du sommeil. Pour cela, l'appareil régule la fraction inspirée en oxygène (FiO2) directement dans les cages d'hébergement des animaux. L'hypoxie est obtenue par l'injection d'azote dans les cages avec un système d'électrovannes. L'ouverture et la fermeture des électrovannes sont commandées par un système de pilotage informatisé programmable, permettant d'obtenir des cycles d'hypoxie/normoxie de courte durée. Les souris hypoxiques sont exposées à l'HI 8h par jour (de 6h à 14h) avec des cycles d'une minute, composé de 30 secondes d'hypoxie avec une FiO2 à 5 % et 30 secondes de normoxie avec une FiO2 à 21 % (figure 19). Ces cycles d'hypoxie intermittente induisent une désaturation correspondant aux apnées sévères chez des patients, avec une saturation artérielle en dioxygène d'environ 60 %. En parallèle, les souris normoxiques sont exposées aux mêmes flux d'air avec une FiO2 à 21 %, et ont donc le même stress pour le bruit et les mouvements d'air que les souris soumise à l'HI. Figure 19 : Dispositif d'exposition à l'HI de rongeurs, présent au laboratoire HP2. Les cages sont placées dans un portoir ventilé (A) permettant de contrôler l'air injecté (flèche bleu) (B). La flèche rouge représente le flux d'air sortant (B). La fraction inspirée en oxygène (FiO2) des animaux est modulée par un enrichissement en azote permettant d'obtenir les cycles d'HI, composés de 30 secondes d'hypoxie avec une FiO2 à 5 % et 30 secondes de normoxie avec une FiO2 à 21 % (C). b. Ischémie-reperfusion in vivo et taille de l'infarctus Les souris sont anesthésiées par une injection en intrapéritonéale de pentobarbital sodique (70 mg. kg-1). La ventilation est maintenue par intubation (volume courant 170 l avec de l'air ambiant). La température corporelle est régulée à 37C par une sonde rectale reliée à une plaque chauffante. Après une thoracotomie gauche, l'artère coronaire gauche est ligaturée pendant 45 min, entrainant une ischémie, puis la ligature est relâchée pendant 90 min, déterminant la période de reperfusion. A la fin, la ligature est resserrée définitivement, une injection intraveineuse par la veine fémorale de colorant bleu Uniperse permet de colorer la zone non touchée par l'ischémie et donc de déterminer la zone à risque. Le cœur est prélevé, congelé et découpé en tranches pour être incubé 20 min dans du triphenyltetrazolium chloride (1 %) colorant en blanc la zone nécrosée. Les zones à risque et nécrosée sont mesurées par planimétrie sur Image J et rapportées au poids du cœur. c. Isolation des cardiomyocytes de souris adultes Les souris sont anesthésiées avec une injection en intrapéritonéale de pentobabital sodique (70 mg. kg-1), suivie d'une injection en intrapéritonéale d'héparine (50 UI. kg-1) pour fluidifier le sang. Les cœurs sont rapidement prélevés et rétro-perfusés par l'aorte (méthode de Langendorff) avec un tampon de perfusion (PB contenant 113 mM NaCl, 4, 7 mM KCl, 0, 6 mM KH2PO4, 1, 2 mM MgSO4-7H20, 0, 032 mM Phenol Rouge, 12 mM NaHCO3, 10 mM KHCO3, 10 mM HEPES, 30 mM Taurine, 10 mM Butanedione monoxime, 5, 5 mM glucose, pH 7, 46) à 37C pendant 5 minutes. Les cœurs sont ensuite digérés avec un cocktail enzymatique appelé Liberase (0, 17 mg. mL-1, Roche Diagnostics, France) pendant environ 20 minutes selon le débit coronaire. La digestion est arrêtée par incubation du cœur dans un tampon PB additionné de 12, 5 M CaCl2, 10 % sérum prémium de veau (PAA Cell Culture Company, Grande Bretagne). Les cardiomyocytes sont isolés par mouvement et aspiration, puis filtrés sur une membrane à 200 m. La remontée en concentration calcique se fait progressivement de 50 à 1000 M Ca2 , ensuite les cellules sont transférées dans un milieu de culture (M199, Life Technologies, Etats-Unis) additionné de pénicilline-streptomycine (1 U. mL-1, Life Technologies, Etats-Unis) et insuline-transferrine-sélénium (1 U. mL-1, Sigma- Aldrich, USA). Enfin, les cardiomyocytes sont fixés dans des chambres à lames en verre de Lab-Tek, pré-coatées avec 1 g. cm-2 de laminine (Sigma-Aldrich, Etats-Unis) pendant 2 h dans un incubateur humide à 5 % CO2 - 95 % O2 à 37 C. i. Flux calciques inter-organites Les cardiomyocytes isolés sont transférés dans une solution de Tyrode (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM glucose) pendant 20 minutes à 37 C avec du Fluo4-AM (3 mol. L-1, Life Technologies, Etats-Unis) et Rhod2-AM (6 mol. L-1, Life Technologies, Etats-Unis), ou du Fluo5-AM (3 mol. L-1, Life Technologies, Etats-Unis) et Rhod2-AM. Fluo4-AM, Fluo5-AM et Rhod2-AM sont des sondes fluorescentes indicatrices du calcium cytosolique, du réticulum endoplasmique et de la mitochondrie, respectivement. Après 30 min d'incubation, la fluorescence est mesurée en utilisant un microscope confocal Zeiss LSM 710 couplé à un laser (x630 immersion à huile ; exciter laser scanning, excitation 488 nm et émission Fluo4-AM 506 nm ; Fluo5-AM 516 nm ; Rhod2-AM 581 nm séparés par un mode spectral, HFT488 beamsplitter dichroïque). L'acquisition spectrale et la déconvolution ont été effectuées dans l'intervalle spectral spécifique en utilisant le spectre individuel de chaque sonde. La résolution est de 9, 7 nm et la mesure des sondes est faite simultanément, afin d'éviter des erreurs de mesures dues aux mouvements cellulaires, en utilisant le détecteur de spectre Quasar (Carl Zeiss, Oberkoren, Allemagne). L'acquisition et l'analyse ont été réalisées avec l'aide d'un ingénieur Mr Grichine, à la plateforme du laboratoire IAB. Après enregistrement de la fluorescence basale, l'histamine (100 M, Sigma-Aldrich, Etats- Unis) est ajoutée sur les cellules pour induire la vidange du calcium du réticulum endoplasmique par le récepteur IP3R, pour visualiser le passage du calcium du réticulum endoplasmique dans la mitochondrie. La fluorescence est normalisée par rapport à la fluorescence basale avant l'application de l'histamine (F1/F0) et la vitesse de fluorescence est calculée entre 250 et 50 secondes après l'application de l'histamine (F1/F0 slope250-50). ii. Proximity Ligation Assay par la méthode Duolink La proximité entre deux protéines de moins de 40 nm est mesurée par la technique de Duolink Proximity Ligation Assay (PLA, Sigma-Aldrich, Etats-Unis) sur des cardiomyocytes isolés fixés par du paraformaldéhyde 4 % et perméabilisés (0, 1 % de Triton X-100). Les cellules sont incubées avec 2 g de deux anticorps primaires, provenant de différentes espèces, toute la nuit à 4C. Ensuite, les sondes PLA (1 h), les enzymes de ligation (30 min) et d'amplification (polymérase 100 min) sont successivement appliqués à 37 C dans une chambre humide. Après montage avec un milieu contenant du DAPI marquant le noyau en bleu (DAPImounting medium, Sigma-Aldrich, Etats-Unis), les spots rouges représentant les interactions ont été photographiés par un microscope à fluorescence utilisant l'axiocam et son logiciel (Zeiss, Allemagne, x400), et analysés par le logiciel BlobFinder (The Centre for Image Analysis, Suède). Le nombre d'interactions par cellule a été quantifié. d. Isolation de mitochondries de cœur Après le sacrifice de la souris par dislocation cervicale, le cœur est prélevé, coupé et broyé au potter verre-verre dans un tampon (50 mM Tris-Base, 10 mM EGTA, 1 mM EDTA, 70 mM saccharose, 210 mannitol, pH 7, 4) à 4C, auquel est rajouté de la subtilisine A (2, 7 mg/g de cœur, Sigma-Aldrich, Etats-Unis). Après centrifugation de l'homogénat à 800 g (10 min, 4C), les mitochondries se retrouvent dans le surnageant, centrifugé à 8000 g (10 min, 4C). Les mitochondries sont alors dans le culot, puis resuspendues dans le tampon précédent, et centrifugées une dernière fois à 8000 g (10 min, 4C). Après cette procédure standard de trois centrifugations différentielles, la quantité de protéines des mitochondries isolées est dosée par la méthode de Bradford (Réactif de Bradford, Sigma-Aldrich, Etats-Unis). Les mitochondries isolées sont utilisées fraichement pour mesurer la consommation d'oxygène (O2), la production de peroxyde d'hydrogène (H2O2), le potentiel de membrane et la capacité de rétention calcique (CRC). Ensuite, elles sont congelées et utilisées pour doser l'activité de la citrate synthase et l'activité des complexes mitochondriaux. i. Consommation d'oxygène La consommation d'oxygène est mesurée à 30C avec une électrode de Clark (Hansatech Instruments, Grande Bretagne), dans une chambre fermée, agitée et contenant du tampon de respiration (125 mM KCl, 20 mM Tris-Base, 1 mM EGTA, 10 mM Pi, 0, 15 % sérum bovin d'albumine BSA, pH 7, 2) et 100 ou 200 g. mL-1 de mitochondries. Différents substrats ont été utilisés glutamate/malate (GM : 5/2, 5 mM), succinate/roténone (S/Rot : 5/2 mM) ou du N-tetramethyl-p-phenylenediamine/ascorbate (TMPD/Asc : 0, 5/2, 5 mM) pour alimenter préférentiellement les complexes I, II ou IV, respectivement (état 2). Ensuite, de l'ADP (100 mM) est ajouté pour atteindre la respiration maximale couplée à la synthèse d'ATP (état 3), suivie de l'oligomycine (4g. mL-1, état 4) afin de vérifier le retour à l'état non phosphorylant. Les vitesses de consommation d'oxygène sont rapportées à la quantité de protéines mitochondriales. Le respiratory control rate (RCR) est le rapport de l'état 3 sur l'état 2. Il est calculé afin de d'évaluer l'état de couplage des mitochondries. ii. Production de peroxyde d'hydrogène La production de ROS est estimée à travers la production d'H2O2, qui est évaluée à 30C par un suivi de fluorescence par un spectrophotomètre (F-7000 FL ; Hitachi, Etats-Unis), dans une chambre contenant du tampon de respiration avec une sonde fluorescente Amplex Red (1M, excitation 560 nm, émission 584 nm), de la peroxydase de raifort (HRP 5 unités) et 200 g. mL-1 de mitochondries. Les mesures ont été faites avec les substrats des complexes I (GM : 5/2, 5 mM) et II (S : 5 mM), puis ajout successif de roténone (3 M) pour inhiber le flux reverse des électrons, et ensuite d'antimycine A (3 M) pour inhiber le flux d'électrons après le complexe III. Les vitesses de production de H2O2 sont rapportées à la quantité de protéines mitochondriales. iii. Potentiel de membrane Le potentiel de membrane est mesuré à 30C par un suivi de fluorescence de la sonde tétraméthylrodamine (TMRM, 0, 2 M, excitation 550 nm, émission 580 nm, Life technologie, Etats-Unis) par un spectrophotomètre (F-7000 FL ; Hitachi, Etats-Unis), dans une chambre contenant du tampon de respiration, 260 g. mL-1 de mitochondries et le substrat du complexe I (GM : 5/2, 5 mM ). Ensuite l'ADP (2 mM) est ajouté, puis le p-trifluoromethoxy- carbonyl-cyanide-phenyl hydrazone (FCCP : 3M) pour découpler les mitochondries. Le potentiel de membrane est exprimé en ratio de fluorescence (unité arbitraire) par rapport à la fluorescence basale (sans substrat et mitochondrie). iv. Capacité de rétention calcique La CRC est mesurée à 30C par un suivi de fluorescence de la sonde Calcium Green-5N (0, 5 M, excitation 506 nm, émission 530 nm, Life technologie, Etats-Unis) par un spectrophotomètre (F-7000 FL ; Hitachi, États-Unis), dans une chambre contenant du tampon spécifique de la mesure de CRC (20 mM Tris-Base, 150 mM saccharose, 50 mM KCl, 2 mM KH2PO4, pH 7, 2), , 260 g. mL-1 de mitochondries, le substrat du complexe II (S : 10 mM). Les mesures sont réalisées en présence ou non d'un inhibiteur de l'ouverture du pore de transition mitochondrial, la CsA (2 M), puis plusieurs pulses de calcium (10 nmol/pulse) sont appliqués jusqu'au relargage du calcium par les mitochondries. La CRC est quantifiée par la quantité de calcium ajoutée rapportée à la quantité de mitochondrie. v. Dosage de l'activité de la citrate synthase Le dosage de la citrate synthase a été fait sur des mitochondries isolées, afin d'évaluer évaluer la qualité de l'extraction des mitochondries, respectivement. Les mitochondries isolées subissent 3 cycles de congélation-décongélation avant le dosage de la citrate synthase. Ce dosage est réalisé à 37C avec un suivi d'absorbance à 412 nm par un spectrophotomètre. 4 g de mitochondries isolées sont incubés dans un tampon (150 mM Tris-Base, 0, 15 mM acide dithiobis-5, 5'nitro-2-benzoique, 0, 25 mM acétyl-CoA, 0, 1 % Triton X100, pH 8). L'activité de la citrate synthase est mesurée par la différence de pente entre l'absorbance de base et après l'ajout d'oxaloacétate (10 mM), entrainant l'oxydation de l'acétyl-CoA, rapportée à la quantité de protéines mitochondriales. vi. Dosage de l'activité des complexes mitochondriaux A partir de mitochondries isolées (4-12 g) ayant subies 3 cycles de congélation- décongélation, l'activité des complexes I, II, III et IV a été mesuré à 37C avec un suivi d'absorbance par un spectrophotomètre. L'activité du complexe I, NADH-ubiquinone oxydoréductase est évaluée en utilisant 0, 1 M de décylubiquinone (l'accepteur d'électrons), 0, 1 M de NADH (le donneur d'électrons) dans un tampon contenant 50 mM KH2PO4/K2HPO4 et 3, 75 % BSA (pH 7, 4). L'oxydation du NADH est quantifiée à 340 nm par la différence de pente entre l'absorbance de base et après l'ajout de roténone (0, 01 M), rapportée à la quantité de mitochondrie, évaluant l'activité spécifique de la partie sensible à la roténone, la caractéristique du complexe I. L'activité du complexe II, succinate-ubiquinone réductase est estimée avec 0, 05 mM de décylubiquinone, 30 mM de succinate (le donneur d'électrons), 0, 0093 mM d'antimycine A, 0, 005 mM de roténone, 0, 1 mM de 2, 6-dichlorophenolindophenol (DCIP, l'accepteur d'électrons), dans un tampon contenant 50 mM KH2PO4-K2HPO4 et 3, 75 % BSA (pH 7, 4). La pente décroissante de la réduction du DCIP à 600 nm permet de mesurer l'activité du complexe II, rapportée à la quantité de mitochondries. L'activité du complexe III, coenzyme Q-cytochrome C-oxydoréductase est quantifié en présence de 0, 05 mM EDTA, 1 mM de KCN, 0, 2 mM de décylubiquinone réduit avec de la dithionite (le donneur d'électrons) 0, 1 mM de cytochrome C oxydé (l'accepteur d'électrons) dans un tampon contenant 150 mM KH2PO4/K2HPO4 et 0, 1% BSA (pH 7, 4). L'activité du complexe III, modélisé par la réduction du cytochrome C est quantifiée à 550 nm par la différence de pente entre l'absorbance de base et après l'ajout d'antimycine A (5 g. mL-1), rapportée à la quantité de mitochondries. L'activité du complexe IV, coenzyme Q-cytochrome C-oxydase est mesurée à 550 nm par la pente décroissante, rapportée à la quantité de mitochondries, reflétant l'oxydation de 0, 08 mM de cytochrome C (précédemment réduit avec de la dithionite, le donneur d'électrons) dans un tampon contenant 50 mM KH2PO4/K2HPO4 (pH 7, 4). e. Histologie Pour la suite des expériences, le cœur a été prélevé après le sacrifice des souris par dislocation cervicale. i. Microscopie électronique à transmission La microscopie électronique à transmission a été utilisée pour visualiser la structure des mitochondries, et réalisée par la plateforme du laboratoire IBS. Les cœurs ont été coupés en petites pièces d'environ 1 mm3, et fixés dans une solution de fixation (paraformaldéhyde 2 % / glutaraldéhyde 0, 2 % dans 0, 1 M de tampon PHEM contenant 60 mM PIPES, 25 mM HEPES, 10 mM EGTA, 4 mM MgSO4/7H20, pH : 7, 2) durant 3 h à température ambiante. Ensuite les échantillons sont transférés 1 h sous agitation, dans une solution d'osmium (1 % osmium, 1, 5 % potassium hexaferrocyanate dans 0, 1 M de tampon PHEM). Après des rinçages à l'eau, les échantillons sont marqués avec de l'acétate d'uranyle (5 % dans l'eau) sous agitation. La déshydratation des échantillons est réalisée par une série de bains d'éthanol croissante (50 à 100 %) avant substitution et imprégnation dans la résine Embed 812 (EPON substitute, Electron Microscopy Sciences). Après 18 h de polymérisation à 65 C, les blocs sont taillés et coupés avec un ultramicrotome UC7 (Laica) et une lame en diamant, DiATOME. Les coupes sont de 60 nm, recueillies sur des grilles de cuivre revêtues de formvar pour être observer avec du marquage citrate, en utilisant le microscope à transmission électronique FEI Tecnai G2 Spirit BioTwin (120 kV) et une camera Orius SC1000B CCD. L'analyse a été réalisée avec le logiciel Image J et une macro réalisée par Mr Usson du laboratoire IAB. ii. Coloration au dihydroéthidium La coloration au dihydroéthidium (DHE) est utilisée pour détecter la production d'anions superoxydes. Des morceaux de cœur ont été inclus dans un milieu de montage OCT (Optimal Cutting Temperature). Les coupes de 14 m ont été incubées avec 10 M de DHE pendant 5 minutes dans une chambre humide, à l'abri de la lumière, à température ambiante. Après lavage, la réaction est arrêtée avec de l'acétone à -20 C. Les coupes ont été photographiées au microscope confocale (Zeiss, Allemagne) avec un signal fluorescent de la DHE. L'analyse a été réalisée avec le logiciel Image J et le signal de DHE est exprimé en pourcentage de la surface totale de tissus cardiaque. iii. Immunohistochimie Des morceaux de cœur ont été inclus dans un milieu de montage OCT, pour évaluer l'expression de HIF-1. Les coupes de 8 m ont été fixées à l'acétone 100 %. Le marquage est réalisé dans une chambre humide, à l'abri de la lumière, à température ambiante. Le blocage des peroxydases endogènes a été réalisé avec du peroxyde d'hydrogène (3 %), celui des avidines-biotines avec un kit avidine-biotine (Vectorlab, Abcys, France), celui des fixations non-spécifiques avec du serum (10 %) dépendant de l'anticorps primaire. L'anticorps primaire de HIF-1 (1/100, Abcam, Grande Bretagne), Grp78 (1/50, Covalab, France), CHOP (1/50, Santa-Cruz, Etats-Unis) ou NF-B (1/1500, Abcam, Grande Bretagne) ont été incubé 30 min. Puis l'incubation de l'anticorps secondaire couplé à la biotine (1/200 ou 1/500, Vectorlab, Abcys, France) est réalisée pendant 30 min. Ensuite, les coupes ont été traitées avec le complexe d'amplification du signal avidine-biotine (AB, Vectorlab, Abcys, France) pendant 30 min, puis avec le substrat de révélation pendant 5 min (Histo Green, Abcys, France), pour une visualisation du marquage en vert. Un contre-marquage a été effectué avec une coloration des coupes à l'hématoxyline pour visualiser la structure globale des tissus (marquage des noyaux en violet et du cytoplasme en rose). La déshydratation des échantillons est réalisée par une série de bains d'éthanol (100%) et de xylène (100%). Les coupes ont été photographiées au microscope optique couplé à l'axiocam et son logiciel (x200, Zeiss, Allemagne) et analysé par le logiciel Image J. La quantité de marquage est exprimée en pourcentage par rapport la surface totale de tissus cardiaque. f. Biologie des protéines i. Extraction de protéines Les protéines sont extraites pour réaliser des Western Blot, des co-immunoprécipitation ou le dosage de l'activité de HIF-1. 30 à 50 mg de cœur de souris ou 10 mg d'appendice auriculaire droit d'Homme ont été homogénéisés (Precellys 24, 6000 rpm, 3X10s-5s, Bertin Technologies, France). Selon les protéines d'intérêt, l'extraction de protéines est soit totale, soit en fraction noyau et cytoplasmique. L'extraction de protéines totales est réalisée avec un tampon de lyse (1 % NP40, 20 mM Tris-HCl, 138 mM NaCl, 2, 7 mM MgCl2, 5 % glycerol, 5 EDTA, 1 Na3VO4, 20 NaF, 1 DTT, 1X inhibiteur de protéases (Sigma Aldrich, Etats-Unis), pH 8). L'extraction en fraction noyau et cytoplasmique est effectuée avec le kit Nuclear extract (Active Motif, Belgique). La concentration en protéines est évaluée avec un dosage de Bradford (réactif de Bradford, Sigma-Aldrich, Etats-Unis). ii. Western Blot Le Western Blot est une technique permettant de mesurer la quantité de protéines. Les échantillons protéiques (15-100 g) sont séparés par un gel d'électrophorèse SDS-PAGE (8- 12 %) et transférés sur des membranes nitrocellulose ou PVDF (polyvinylidene fluoride) avec le Trans Blot, transfert semi-sec (Bio-Rad, Etats-Unis). Selon l'anticorps primaire, les membranes sont bloquées pendant 1 h avec du lait ou de la BSA à 5 %. L'anticorps primaire (figure 20) est incubé sur la nuit à 4C, puis l'incubation de l'anticorps secondaire couplé à une peroxydase de raifort (HRP) est réalisée pendant 1 h à température ambiante. Les bandes sont visualisées par chimiluminescence par l'ajout du substrat (ECL Western-Blot detection kit, Bio-Rad, Etats-Unis). Les images sont photographiées par le système ChemiDoc XRS (Bio-Rad, Etats-Unis) et analysées sur le logiciel Image J. La quantification est exprimée en fonction du groupe contrôle (fold increase). Anticorps Fournisseur Dilution ACC 1/250 phospho-ACC AMPK Cell signaling 1/1000 phospho-AMPK ATF4 ATF6 Santa Cruz 1/250 Beclin-1 Cell signaling 1/500 BNIP3 Sigma-Aldrich 1/1000 caspase-3 Cell signaling caspase-3 clivée 1/500 cyclophiline D Abcam 1/4000 Drp1 BD Biosciences 1/1000 eIF2 Cell signaling 1/500 phospho-eIF2 Grp75 1/1000 Grp78 Santa Cruz HIF-1 IP3R1 LC3I-II 1/500 Cell signaling MCU Mfn2 Sigma-Aldrich NCX1 Millipore OPA1 BD Biosciences 1/2000 OXPHOS Abcam 1/4000 p62 Sigma-Aldrich 1/1000 Parkin Cell signaling PERK Santa Cruz 1/500 phospho-PERK PGC-1 Millipore PLB phospho-PLB (Ser 16) Santa Cruz 1/1000 Serca2 VDAC1 Abcam -tubuline Santa Cruz 1/2000 Figure 20 : Tableau des anticorps primaires utilisés en Western Blot. iii. Co-immunoprécipitation La co-immunoprécipitation permet d'identifier l'interaction entre deux protéines. 500 g de protéines totales sont incubées avec 2 g d'anticorps primaire de notre protéine d'intérêt dans du tampon de lyse, toute la nuit à 4C, sous agitation. Ensuite des billes magnétiques (SureBeads Protein G Magnetic Beads, Bio-Rad, Etats-Unis) reconnaissant l'anticorps primaire, sont ajoutées pendant 2h. Après séparation des billes, les échantillons contenant toutes les protéines liées à notre protéine d'intérêt peuvent être utilisés en Western blot pour détecter ces autres protéines. g. Biologie moléculaire de l'ADN i. Extraction de l'ARN L'ARN total a été extrait à partir d'environ 10 mg de coeur en utilisant le protocole d'isolation d'ARN Tri Reagent (Sigma-Aldrich, Etats-Unis). ii. PCR quantitative en temps réel couplé à une transcription réverse (RT-qPCR) Le RT-qPCR est une technique pour déterminer l'expression d'un gène (la quantité d'ARNm). 0, 5 g d'ARN est soumis à une transcription reverse avec une enzyme de retrotranscription (iScript Reverse Transcription Supermix, Bio-Rad, Etats-Unis), pour obtenir de l'ADN complémentaire, utilisé à son tour pour la polymerase chain reaction (PCR) quantitative en temps réel avec le SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Etats-Unis) et amplifié par la thermocycleur CFX96 Touch Real-Time PCR Detection Systems (Bio-Rad, Etats-Unis). Les différents couples d'amorces déterminant les gènes cibles sont : XBP1s : 5'GAGTCCGCAGCAGGTG3'/3'GCGTCAGAATCCATGGGA5', HPRT : 5TCTTTGCTGACCTGCTGGATTACAT3'/3CCAGGGAAAGCAAAGTTTGCATT5 RN18S : 5'GGAAGAATAACTTCAGACCGCCC3'/3'TGCAGCGGACAGTGTCTTGTTT5'. La quantification de l'expression du gène est réalisée avec la méthode 2Ct. h. Analyses statistiques Les statistiques et les graphiques sont obtenus avec le logiciel Graph Pad Prism (Etats-Unis). Les résultats des expériences animales sont exprimés en moyenne SEM. Les analyses des expérimentations animales sont des ANOVA deux voies avec le post-hoc approprié ou des tests de Student. Les résultats des patients sont exprimés en médiane et en écart interquartile, et analysés par des tests de Student. L'analyse de la régression linéaire univariable mais aussi multivariable ajustée à l'IAH, l'âge, le taux de NT-proBNP a été réalisée pour confirmer le test de Student. Un résultat est significatif à partir de p RESULTATS 1. Etude 1 : Rôle de HIF-1 dans l'altération des MAM, le stress du RE et l'augmentation de la taille d'infarctus induits par l'HI chronique Publication : HIF-1 disrupts mitochondria-associated ER membranes leading to calcium homeostasis disturbance, ER stress and myocardial infarct size expansion under intermittent hypoxia. Moulin S, Thomas A, Arnaud C, Arzt M, Wagner S, Maier L, Korichneva I, Tamisier R, Pépin J- L, Godin-Ribuot D, Belaidi E. Int J Cardiol. International Journal of Cardiology. Soumis [4. 034] L'hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) est connu pour réguler l'expression de protéines impliquées dans l'homéostasie calcique et le stress du réticulum endoplasmique (RE), deux acteurs majeurs de la réponse à l'ischémie-reperfusion. Nous nous sommes intéressés en particulier aux mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes (MAM), parce que leur altération est susceptible d'engendrer un stress du RE, et surtout parce qu'il a récemment été démontré qu'ils régulaient la susceptibilité du myocarde à l'ischémie- reperfusion. L'objectif de cette étude a donc été de déterminer le rôle potentiel de HIF-1 dans les effets de l'HI sur les échanges calcique entre le RE et la mitochondrie, l'intégrité des MAM et le stress du RE. Puis, son rôle a aussi été évalué dans l'augmentation de la taille d'infarctus induite par lHI. Des souris Swiss/SV129, HIF-1 /- et leurs contrôles WT, wild-type (WT) ont été exposées à 21 jours d'HI ou de normoxie (N). A la fin de l'exposition, l'enregistrement des flux calciques inter-organites et l'évaluation de l'intégrité des MAM ont été réalisés sur des cardiomyocytes isolés. L'expression de HIF-1, des protéines de l'homéostasie calcique et du stress du RE, ainsi que la taille d'infarctus suite à une ischémie-reperfusion in vivo ont aussi été quantifiées. L'expression de HIF-1 et de marqueurs du stress du RE a aussi été mesurée dans des biopsies d'appendice d'auricule droit de patients apnéiques atteints de maladie coronarienne. L'HI entraine une augmentation de l'accumulation calcique dans le RE et le cytosol suite à la vidange du RE, associée à une altération de l'intégrité des MAM et de l'expression des régulateurs majeurs de l'homéostasie calcique. Ces résultats sont liés à une activation d'un stress du RE pro-apoptotique et consécutivement, à l'augmentation de la taille d'infarctus. La délétion partielle de HIF-1 abolit la grande majorité des effets de l'HI. De plus, l'activation myocardique de HIF-1 est corrélée positivement à l'index d'apnées-hypopnées (IAH) des patients apnéiques et les marqueurs clés du stress du RE sont augmentés chez ces patients. En HI, l'activation chronique de HIF-1 joue un rôle majeur dans les perturbations de l'homéostasie calcique, contribuant à l'activation du stress du RE, ainsi qu'à la vulnérabilité du myocarde à l'ischémie-reperfusion. L'implication de HIF-1 et du stress du RE semblent être confirmée chez des patients à haut risque cardiovasculaire atteints d'apnée du sommeil. Marqueur Méthodes Taille d'infarctus Ischémie-reperfusion in vivo 3. b Exposure Ischemia Reperfusion Imagerie calcique Isolation cardiomyocytes 3. c 21 days 45 min 90 min Flux Ca2 inter-organites 3. c. i WT or HIF-1 /- MAM Duolink PLA 3. c. ii N or IH Co-immunoprécipitation 3. f. iii Stress du RE Extraction de l'ARN 3. g. i Ca2 imaging Infarct size RT-qPCR 3. g. ii MAM Extraction de protéines 3. f. i ER stress HIF-1 Western blot 3. f. ii HIF-1 Immunohistochimie 3. e. iii Figure 21 : Design expérimental et méthodologie de l'étude 1. Figure 22 : Schéma de conclusion de l'étude 1 illustrant le rôle de HIF-1 dans l'altération des MAM, le stress du RE et l'augmentation de la taille d'infarctus induits par l'HI chronique. 2. Etude 2 : Rôle de HIF-1 dans les altérations mitochondriales induites par l'HI chronique La mitochondrie est l'organite le plus sensible à l'oxygène. Étonnamment, peu d'études se sont intéressées à la mitochondrie dans le contexte de l'hypoxie intermittente (HI). Celles-ci rapportent une augmentation de la production mitochondriale d'espèces réactives de l'oxygène (ERO) dans le cerveau et les corps carotidiens de souris exposées à l'HI, ainsi qu'une diminution de la biogénèse mitochondriale dans le muscle génioglosse. L'hypoxia- inducible factor-1 (HIF-1) est, quant à lui, bien connu pour induire des adaptations mitochondriales en réponse à l'hypoxie continue, telle que l'activation d'un métabolisme glycolytique. Cette étude a donc eu pour but de caractériser l'impact de l'HI sur la structure, la fonction, la dynamique et le renouvellement des mitochondries cardiaques, ainsi que le rôle de HIF-1 dans ces éventuelles altérations. Des souris Swiss/SV129, HIF-1 /- et leurs contrôles, wild type (WT) ont été exposées à 21 jours d'HI ou de normoxie (N). La structure des mitochondries a été analysée par microscopie électronique à transmission. Sur des mitochondries cardiaques isolées, la fonction mitochondriale a été évaluée par la mesure de la consommation d'oxygène, de la production de peroxyde d'hydrogène, du potentiel de membrane et de la capacité de rétention calcique. Les marqueurs clés du cycle et la dynamique ont aussi été évalués. Suite aux résultats obtenus, nous avons observé les effets d'un activateur de l'AMP-activated protein kinase (AMPK), la metformine, (300 mg/kg/jr, gavage) ou de son véhicule (CMC-Na 0, 1%), sur la dynamique et le renouvellement mitochondrial et sur la taille d'infarctus. L'HI induit une diminution de la respiration et de la production d'ERO mitochondriales, une augmentation de la sensibilité des mitochondries au calcium et une mitophagie. Elle diminue également l'activité de l'AMPK myocardique. La délétion partielle de HIF-1 abolit les altérations induites par l'HI. De plus, le traitement par la metformine prévient l'induction de la mitophagie et l'augmentation de la taille d'infarctus induites par l'HI. En conclusion, l'activation chronique de HIF-1 est impliquée dans les altérations mitochondriales induites par l'HI qui semblent être fortement associées à une diminution de l'activité de l'AMPK. A Exposure 21 days WT or HIF-1 /- N or IH Marqueur Méthodes Taille d'infarctus Ischémie-reperfusion in vivo 3. b Mitochondria : structure Structure Microscopie électronique à function 3. e. i dynamics transmission turnover Fonction Isolation mitochondries et 3. d investigation 3. d. i-vi Exposure Ischemia Reperfusion Dynamique et Extraction de protéines 3. f. i B 21 days 45 min 90 min renouvellement Western blot 3. f. ii WT N or IH /- Metformine 300 mg/kg Mitochondria : dynamics Infarct size turnover Figure 23 : Design expérimental et méthodologie de l'étude 2. a. Dysfonction mitochondriale L'hypoxie intermittente modifie la respiration mitochondriale chez les souris WT. Elle diminue la consommation maximale d'oxygène, dépendante de la phosphorylation oxydative, de 35 à 40% en complexe I (CI) et II (CII) (CI : 13, 51, 9 vs. 21, 62, 3 mmol d'O2/min/mg et CII : 27, 63, 5 vs. 42, 13, 9 mmol d'O2/min/mg, dans les groupes HI et N, respectivement), ainsi que le RCR (CI : 4, 020, 4 vs. 5, 720, 5 et CII : 2, 420, 1 vs. 3, 030, 1, dans les groupes HI et N, respectivement) (figure 24A, C). Ces effets sont abolis par la délétion de HIF-1. Les mêmes tendances sont observées lors de la mesure de la consommation d'oxygène en complexe IV (figure 24E). Nous avons ensuite, avec les mêmes substrats, évalué la production d'ERO. Chez les souris WT, l'HI diminue la production de ERO mitochondriales de 45 % en complexe II uniquement (1917303 vs. 3504423 pmol d'H2O2/min/mg, dans les groupes HI et N, respectivement) (figure 24B, D), et cet effet est aboli par l'ajout de roténone. La production mitochondriale d'ERO n'est pas affectée par l'HI chez les souris HIF-1 /-. Le potentiel de membrane mitochondrial n'est pas modifié par l'HI (figure 24F). Par contre le temps de repolarisation membranaire après ajout d'ADP, est multiplié par 1, 5 chez les souris WT (936, 794, 5 vs. 622, 346, 7 s dans les groupes HI et N, respectivement) et par 2 chez les souris HIF-1 /- (745, 6134, 9 vs. 348, 6109, 2 s dans les groupes HI et N, respectivement) (figure 24G). Cette réponse à l'HI semble donc indépendante de HIF-1. A 30 8 * 4 /- /- /- /- WT HIF-1 WT HIF-1 WT HIF-1 WT HIF-1 State 2 State 3 State 4 Mito GM GM Rot GM Rot AA C D * /- /- /- /- WT HIF-1 WT HIF-1 WT HIF-1 WT HIF-1 State 2 State 3 State 4 Mito S S Rot S Rot AA E F G 1500 /- WT HIF-1 State 2 Figure 24 : HIF-1 est impliqué dans la diminution de la respiration mitochondriale et la production de ROS induits par l'hypoxie intermittente (HI) chronique. La consommation d'oxygène a été évaluée sur des /- mitochondries isolées de cœur de souris sauvage wild-type (WT) ou HIF-1 exposées à 21 jours d'HI ou de normoxie (N). Mesures effectuées en présence de glutamate/malate (A), de succinate (C) ou de TMPD-Asc (E) (State 2) suivi de l'ajout successif d'ADP (State 3) puis d'oligomycine (State 4). Le respiratory control ratio est le rapport de l'état 3 sur l'état 2 (State 3/State 2). La production de ROS (B et D) a été mesurée en basal (Mito) puis en présence de glutamate/malate (GM) ou de succinate (S) avec ajout successif de roténone (Rot) et antimycine A (AA), en utilisant la sonde Amplex Red. Le potentiel de membrane basal des mitochondries (F) ainsi que le temps de repolarisation après ajout d'ADP (G) ont été quantifiés en présence de glutamate/malate avec la sonde TMRM. Les valeurs sont exprimées en moyenne SEM (n 7-12). *p /- *p HI vs. N ; p p souris HIF-1 vs. WT. Enfin, la capacité de rétention calcique basale tend à être diminuée par l'exposition à l'HI (figure 25A). Cette différence est exacerbée (diminution de 30%) lorsque la mesure est effectuée en présence de CsA (figure 25B). Ces effets sont abolis par la délétion de HIF-1. A B * 950 /- WT HIF-1 Figure 25 : HIF-1 est impliqué dans la diminution de la capacité de rétention calcique (CRC) induite par l'hypoxie intermittente (HI) chronique. Sur des mitochondries isolées de cœur de souris sauvage wild-type /- (WT) ou HIF-1 exposées à 21 jours d'HI ou de normoxie (N), la CRC a été évaluée avec des pics de calcium de 10 nmol en présence de succinate seul (A) ou avec de la cyclosporine A (B), en utilisant la sonde Calcium Green-5N. Les valeurs sont exprimées en moyenne SEM (n 7-11). *p HI vs. N. En parallèle de ces altérations de la chane respiratoire globale, l'expression des complexes de la chane de respiration n'est pas modifiée par l'HI (figure 26). En revanche, chez les souris WT, les activités individuelles des complexes I et II (CI : 2862164 vs. 2373119 et CII : 174185 vs. 155248 mmol d'O2/min/mg, dans les groupes HI et N, respectivement) sont augmentées de 15-20 % par l'HI (figure 27A, B) alors que les activités des autres complexes et de la citrate synthase mitochondriale ne sont pas modifiées (figure 27C-E). Ces modifications d'activité sont abolies par la délétion partielle de HIF-1. Figure 26 : L'expression des complexes mitochondriaux n'est pas modifiée par l'hypoxie intermittente (HI) /- chronique. Sur des extraits protéiques de cœur de souris sauvage wild-type (WT) ou HIF-1 exposées à 21 jours d'HI ou de normoxie (N), l'expression des complexes CI (B), CII (C), CIII (D), CIV (E) et CV (F) de la chaine de respiration mitochondriale a été évaluée par Western blot et rapportée au Ponceau (blots représentatifs /- en A). Les valeurs sont exprimées en moyenne SEM (n 5-6). p souris HIF-1 vs. WT. A B C Complex II activity (mmol/min/g) /- WT HIF-1 D E /- WT HIF-1 Figure 27 : HIF-1 est impliqué dans l'augmentation de l'activité des complexes I et II de la mitochondrie, induite par l'hypoxie intermittente (HI) chronique. Sur des mitochondries isolées de cœur de souris sauvage /- wild-type (WT) ou HIF-1 exposées à 21 jours à d'HI ou de normoxie (N), l'activité de chaque complexe CI (A), CII (B), CIII (C) et CIV (D) de la chaine de respiration mitochondriale et de la citrate synthase (E) ont été évaluée en présence de substrats spécifiques. Les valeurs sont exprimées en moyenne SEM (n 7-11). *p HI vs. N b. Altérations de la dynamique et du renouvellement des mitochondries Sur des extraits protéiques nucléaires de cœur, nous avons évalué un marqueur clé de la biogénèse mitochondriale, le facteur de transcription PGC-1, non modifié par l'HI (figure 28A). Ensuite, sur des extraits protéiques cytoplasmiques de cœur, chez les souris WT, l'HI n'altère pas l'expression d'OPA1 (figure 28B), diminue l'expression de Mfn2 (HI : 0, 840, 04 fold increase vs. WTN, figure 28C), deux marqueurs de la fusion mitochondriale. L'HI ne modifie pas l'expression de Drp1, une protéine majeure de la fission mitochondriale (figure 28D). Chez les souris HIF-1 /-, l'HI n'a aucun impact sur ces marqueurs de biogénèse et de dynamique mitochondriales (figure 28). Figure 28 : L'hypoxie intermittente (HI) chronique n'altère pas la biogénèse et la dynamique mitochondriales. /- Sur des extraits protéiques de cœur de souris wild-type (WT) ou HIF-1 exposées à 21 jours d'HI ou de normoxie (N), la biogénèse mitochondriale, la fusion et la fission sont évalués par Western blot avec les marqueurs PGC1 rapporté à la TBP (A), OPA1 (B), Mfn2 (C), Drp1 (D) rapporté à la tubuline. Les valeurs sont exprimées en moyenne par rapport au groupe WTN, SEM (n 5-6). *p HI vs. N ; p souris HIF- /- 1 vs. WT. Le renouvellement des mitochondries a également été étudié avec la mitophagie et plus globalement avec l'autophagie. Chez les souris WT, l'HI diminue l'expression de p62 (HI : 0, 790, 04 fold increase vs. WTN, figure 29A), et augmente la quantité des protéines BNIP3, et Parkin (BNIP3 : 1, 30, 09, Parkin : 1, 40, 08, fold increase vs. WTN, figure 29D, E), sans modifications significatives de Beclin1 et du rapport LC3II/I (figure 29B, C). Ces effets de l'HI sont abolis chez les souris HIF-1 /- (figure 29). Figure 29 : HIF-1 est impliqué dans l'activation de la mitophagie induite par l'hypoxie intermittente (HI) /- chronique. Sur des extraits protéiques de cœur de souris wild-type (WT) ou HIF-1 exposées à 21 jours d'HI ou de normoxie (N), la mitophagie est évaluée par Western blot avec les marqueurs p62 (A), Beclin1 (B), LC3II/LC3I (C), BNIP3 (D), Parkin (E), rapporté à la tubuline. Les valeurs sont exprimées en moyenne par rapport au groupe WTN, SEM (n 5-6). *p *p HI vs. N ; p p p souris /- HIF-1 vs. WT. Par conséquent, l'HI diminue la respiration et la production d'ERO mitochondriale, mais les activités des complexes I et II sont augmentées. Ces résultats suggèrent que la mitochondrie tente d'augmenter le fonctionnement de sa chane respiratoire sans s'y parvenir. L'apport en substrats pourrait donc être insuffisant. L'un des régulateurs majeurs de l'apport en substrat est l'AMPK. Nos résultats nous ont poussés à aller évaluer cette protéine au niveau myocardique, qui avait déjà été quantifié dans le muscle au sein du laboratoire. c. Activation de l'AMPK et effet bénéfique de la metformine Au niveau de la régulation de l'apport de substrat mitochondrial, chez les souris WT, l'HI diminue la phosphorylation de l'AMPK (HI : 0, 800, 06 fold increase vs. WTN, figure 30A), mais la phosphorylation d'ACC n'est pas modifié significativement (figure 31B). La délétion partielle de HIF-1 empêche l'effet de l'HI sur la phosphorylation d'AMPK. De plus, le traitement avec la metformine, un activateur de l'AMPK, pendant l'HI, diminue la taille d'infarctus induite par l'HI (32, 04, 0 vs. 54, 13, 4 % dans les groupes MetHI et VehHI, respectivement, figure 30C). La metformine prévient l'effet de l'HI sur la fusion mitochondriale et la mitophagie, à travers l'expression de Mfn2 et p62, BNIP3, Parkin (Mfn2 : 1, 20, 09 vs. 0, 840, 04, p62 : 0, 700, 07 vs. 0, 790, 04, BNIP3 : 0, 860, 04 vs. 1, 30, 09, Parkin : 0, 830, 26 vs. 1, 40, 08, fold increase vs. WTN, dans les groupes MetHI et VehHI, respectivement) (figure 31A-B, 32A-C). A B C PAMPK/AMPK (fold increase vs. WTN) PACC/ACC (fold increase vs. WTN) 1. 5 1. 5 1. 0 1. 0 * * 0. 5 0. 5 0. 0 0. 0 WT HIF-1 /- WT HIF-1 /- Figure 30 : HIF-1 est impliqué dans la diminution d'activité de l'AMPK induite par l'hypoxie intermittente (HI) chronique, et son activation par la metformine, protège des lésions myocardiques induite par l'HI. Sur des /- extraits protéiques de cœur de souris wild-type (WT) ou HIF-1 exposées à 21 jours d'HI ou de normoxie (N), les activités de l'AMPK (A) et de l'ACC (B) ont été mesurées par Western blot avec le rapport de la quantité phosphorylation et totale (n 5-6). Sur des souris wild-type (WT) traitées à la metformine (Met, 300 -1 mg. kg ) ou le véhicule (Veh, CMC-Na 0, 1 %) et exposées 21 jours à l'hypoxie intermittente (HI) ou à la normoxie (N), la taille d'infarctus a été mesurée par colorimétrie et planimétrie, suite à un protocole d'ischémie (45 min) et de reperfusion (90 min) in vivo. zone nécrosée (AN), zone à risque (AAR), ventricule gauche (LV) (n 8-11). Les valeurs sont exprimées en moyenne SEM. *p *p HI vs. N ; p souris Met vs. Veh. A B Figure 31 : La metformine prévient les effets de l'hypoxie intermittente (HI) chronique sur la dynamique mitochondriale. Sur des extraits protéiques de cœur de souris wild-type (WT) traitées à la metformine (Met, -1 300 mg. kg ) ou le véhicule (Veh, CMC-Na 0, 1 %) et exposées à 21 jours d'HI ou de normoxie (N), la dynamique est évaluée par Western blot avec les marqueurs Mfn2 (A) et Drp1 (B) rapporté à la tubuline. Les valeurs sont exprimées en moyenne SEM (n 3-6). *p HI vs. N ; p p souris Met vs. Veh. A B C BNIP3/Tub (fold increase vs. WTN) 1. 5 2. 0 1. 5 * 1. 0 * 1. 0 0. 5 0. 5 0. 0 0. 0 Veh Met Veh Met Figure 32 : La metformine prévient les effets de l'hypoxie intermittente (HI) chronique sur la mitophagie. Sur -1 des extraits protéiques de cœur de souris wild-type (WT) traitées à la metformine (Met, 300 mg. kg ) ou le véhicule (Veh, CMC-Na 0, 1 %) et exposées à 21 jours d'HI ou de normoxie (N), la mitophagie est évaluée par Western blot avec les marqueurs p62 (A), BNIP3 (B), Parkin (C), rapporté à la tubuline. Les valeurs sont exprimées en moyenne SEM (n 3-6). *p HI vs. N ; p p souris Met vs. Veh. Figure 33 : Schéma de conclusion de l'étude 2 illustrant le rôle de HIF-1 dans les altérations mitochondriales induites par l'HI chronique. 3. Etude 3 : Rôle de HIF-1 dans les mécanismes d'adaptation délétères induits par l'HI chronique. Effets d'un inhibiteur de l'activité de HIF-1, la curcumine. Les traitements ciblant les principaux mécanismes délétères du syndrome d'apnées obstructives du sommeil (SAOS), que sont l'activation sympathique, l'inflammation et le stress oxydant, n'ont pas mis en évidence une amélioration des pathologies associées au SAOS. Même si différentes études montrent un lien entre l'hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) et ces mécanismes, il apparat encore aujourd'hui difficile d'élucider clairement le cheminement qui mène aux conséquences délétères de l'hypoxie intermittente (HI) chronique. De plus, à travers les 3 précédentes études, nous avons pu également voir que HIF-1 est impliqué dans deux nouveaux mécanismes myocardiques de l'HI : le stress du réticulum endoplasmique (RE) et les altérations mitochondriales. L'objectif de cette étude est de montrer que HIF-1 joue un rôle central dans la réponse à l'HI, en amont de l'activation sympathique, l'inflammation, le stress oxydant, le stress du RE, et les altérations mitochondriales. Les souris Swiss/SV129 ont été exposées à 21 jours d'HI ou de normoxie (N) et traitées avec la curcumine (100 mg/kg/jr, gavage), un inhibiteur pharmacologique de l'activation de HIF-1, ou le véhicule (CMC-Na 0, 1%). Sur ces souris, l'expression myocardique de HIF-1, les marqueurs clés des mécanismes de l'HI et la taille d'infarctus suite à une ischémie- reperfusion in vivo ont été mesurées. La curcumine prévient l'aggravation de la taille d'infarctus, induite par l'HI. De plus, la curcumine rétablit les augmentations de l'expression de HIF-1, de production d'anions superoxydes, de l'expression de NF-B, Grp78 et CHOP, induites par l'HI. En conclusion, l'activation chronique de HIF-1 est essentielle pour les mécanismes d'adaptations à l'HI, et pourrait représenter une potentielle cible thérapeutique pour prévenir les dommages myocardiques chez les patients SAOS. Cependant il reste des expérimentations complémentaires à réaliser pour ces mécanismes, ainsi que pour l'activation sympathique et les altérations mitochondriales. Exposure Ischemia Reperfusion 21 days 45 min 90 min Marqueur Méthodes WT N or IH /- Curcumine 100 mg/kg Taille d'infarctus Ischémie-reperfusion in vivo 3. b HIF-1 Immunohistochimie 3. e. iii HIF-1 Infarct size Stress du RE Immunohistochimie 3. e. iii Sympathetic activation Inflammation Inflammation Immunohistochimie 3. e. iii Oxydative stress ER stress Stress oxydant Coloration au DHE 3. e. ii Mitochondrial alterations Figure 34 : Design expérimental et méthodologie de l'étude 3. a. Curcumine et taille de l'infarctus L'HI augmente la taille d'infarctus dans le groupe traité au véhicule (54, 13, 4 vs. 45, 44, 0 % dans les groupes HI et N, respectivement, figure 35), alors que le gavage avec la curcumine durant l'exposition abolit l'augmentation des lésions myocardiques induite par l'HI (45, 14, 0 vs. 54, 13, 4 %, dans les groupes CurcHI et VehHI, respectivement, figure 35). Figure 35 : La curcumine prévient l'augmentation de la taille d'infarctus induite par l'hypoxie intermittente -1 (HI) chronique. Sur des souris wild-type (WT) traitées avec de la curcumine (Curc, 100 mg. kg ) ou le véhicule (CMC-Na 0, 1 %) et exposées à 21 jours d'HI ou de normoxie (N), la taille d'infarctus a été mesurée par colorimétrie et planimétrie, suite à un protocole d'ischémie (45 min) et de reperfusion (90 min) in vivo. zone nécrosée (AN), zone à risque (AAR), ventricule gauche (LV). Les valeurs sont exprimées en moyenne SEM (n 9-11). *p vs. le groupe N correspondant ; p souris Curc vs. Veh. b. Curcumine et mécanismes délétères de l'HI Chez les souris WT, l'HI augmente l'expression de HIF-1 (4, 01, 0 vs. 2, 140, 45 %, dans les groupes HI et N, respectivement, figure 36A), la production de stress oxydant (5, 10, 9 vs. 2, 10, 3 %, dans les groupes HI et N, respectivement, figure 36B), l'expression de NF-B (4, 71, 1 vs. 2, 30, 5 %, dans les groupes HI et N, respectivement, figure 36C), un marqueur de l'inflammation, et l'expression de Grp78 et CHOP (Grp78 : 5, 31, 7 vs. 1, 60, 6 %, CHOP : 4, 50, 6 vs. 0, 70, 4 %, dans les groupes HI et N, respectivement, figure 36D-E), deux marqueurs clés du stress du RE. Le traitement à la curcumine prévient l'augmentation de HIF-1, la production d'anions superoxyde, l'augmentation de l'expression de NF-B, de Grp78 et CHOP (HIF-1 : 0, 380, 4 vs. 4, 01, 0 %, DHE : 1, 30, 3 vs. 5, 10, 9 %, NF-B : 0, 430, 3 vs. 4, 71, 1 %, Grp78 : 0, 10, 1 vs. 5, 31, 7 %, CHOP : 1, 81, 2 vs. 4, 50, 6 %, dans les groupes CurcHI et VehHI, respectivement) (figure 36). A B C D E Figure 36 : La curcumine prévient les augmentations de HIF-1 et des marqueurs du stress oxydant, du stress du RE, et de l'inflammation, induites par l'hypoxie intermittente (HI) chronique. Sur coupes de cœur des -1 souris wild-type (WT) traitées ou pas avec de la curcumine (Curc, 100 mg. kg ) et exposées à 21 jours d'HI ou de normoxie (N), HIF-1 (A), NF-B (C), Grp78 (D) et CHOP (E) ont été quantifié par immunohistochimie, ainsi que la production d'anions superoxydes (B) par une coloration au DHE. Les valeurs sont exprimées en moyenne SEM (n 9-11). *p *p vs. le groupe N correspondant ; p p souris Curc vs. WT. Figure 37 : Schéma de conclusion de l'étude 3 préliminaire illustrant le rôle de HIF-1 dans les mécanismes d'adaptation délétères induits par l'HI chronique et les effets d'un inhibiteur de l'activité de HIF-1, la curcumine. DISCUSSION Les maladies cardiovasculaires restent la première cause mondiale de morbidité et mortalité. Parmi elles, l'infarctus du myocarde (IM) dont l'incidence est souvent associée à dautres pathologies, telles que le syndrome d'apnées obstructives du sommeil (SAOS). Le SAOS est d'ailleurs aujourd'hui considéré comme un facteur de risque indépendant de la survenue d'un infarctus [4]. En effet, la présence de cette maladie peut altérer le fonctionnement des cardiomyocytes, expliquant l'augmentation de la sévérité et du nombre d'évènements cardiovasculaires chez les patients apnéiques [231]. Bien que ces dernières années, la connaissance de la physiopathologie du SAOS s'est améliorée, les traitements, visant les mécanismes principaux découverts jusqu'ici, n'ont pas montré d'amélioration de la maladie. De plus, peu de ces traitements ont été testés dans le contexte de l'augmentation de la susceptibilité du myocarde à l'ischémie-reperfusion. Grace à des modèles expérimentaux, mes travaux ont mis en évidence l'implication de nouveaux acteurs de la réponse à l'hypoxie intermittente (HI), tels qu'un stress du réticulum endoplasmique (RE), une perturbation de l'homéostasie calcique sans doute associée à une altération des mitochondria-associated ER membranes (MAM), ainsi que des atteintes mitochondriales. Surtout l'ensemble de ce travail souligne l'importance de l'activation myocardique de l'hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1), comme conséquence délétère de l'HI, responsable de la vulnérabilité accrue du myocarde à l'ischémie-reperfusion. 1. Axe HIF-1 - stress du RE en HI chronique a. HI, stress du RE En premier, notre intérêt s'est porté sur le stress du RE. D'une part, le stress du RE est impliqué dans de nombreuses pathologies associées au SAOS, telles que l'athérosclérose [340], l'obésité ou le diabète [341]. D'autre part, comme l'HI, le stress du RE a un rôle ambivalent dans la réponse à l'IM. En effet, alors que 4h d'HI est cardioprotecteur en termes de taille d'infarctus [232], l'exposition chronique d'animaux à l'HI augmente la susceptibilité du myocarde à l'ischémie-reperfusion [198, 233]. De la même manière, pour le stress du RE, l'utilisation de nombreux modèles génétiques a permis de mettre en évidence un rôle cardioprotecteur du stress du RE dans la réponse à l'ischémie-reperfusion, à travers l'activation de certaines protéines de la réponse UPR, telles que Grp78 [61], ATF6 [64] et XBP1s [58]. A l'opposé, grâce à l'activation pharmacologique du stress du RE, celui-ci a été montré pour être délétère en termes de taille d'infarctus [69]. Dans l'étude 1, nous montrons que 21 jours d'HI entrainent un stress du RE myocardique, caractérisé par une augmentation de l'expression de Grp78, de la phosphorylation de PERK, d'eIF2, de l'expression d'ATF4 et de CHOP, alors que les expressions d'ATF6 ou de XBP1s n'étaient pas modifiées. Donc, l'HI induit un stress du RE délétère avec l'activation de la voie pro-apoptotique PERK-ATF4-CHOP, au détriment de l'activation des voies de sauvetage du RE comprenant les protéines ATF6 et XBP1s, permettant de réduire la synthèse protéique, ou d'activer celle responsable de la réparation ou de la dégradation des protéines mal- conformées. Ceci est en accord avec deux précédentes études du laboratoire montrant un stress du RE myocardique après une exposition de 14 jours à l'HI chez des souris [313] et 21 jours d'HI chez des rats [342], ainsi qu'avec la littérature, puisque assez récemment, l'induction d'un stress du RE par l'HI a aussi été montré dans divers organes : le cœur [308, 309, 343], les vaisseaux [344], le cerveau [310-312, 345, 346], le foie [347], le tissus adipeux [348], et le rein [349]. Donc, l'HI provoque un stress du RE myocardique. a. HI, HIF-1, stress du RE Par ailleurs, nous avons déjà montré que l'HI est responsable d'une activation myocardique chronique et persistante de HIF-1 [313]. Ce facteur de transcription est aussi délétère en termes de taille de l'infarctus dans le contexte de l'HI chronique suivie d'une ischémie- reperfusion. Par exemple, HIF-1, en se fixant sur le hypoxia response element (HRE) du gène de l'endothéline 1 (ET-1), active l'expression de l'ET-1, qui elle-même est responsable de l'augmentation de la taille d'infarctus induite par l'HI [198]. De plus, d'après la littérature, HIF-1 pourrait cibler des gènes de réponse au stress du RE, notamment par sa fixation sur un HRE de CHOP [317]. Ainsi, dans l'étude 1, nous avons étudié si HIF-1 était impliqué dans l'activation du stress du RE en HI. Chez les souris HIF-1 /-, excepté pour les expressions de Grp78 et ATF4, tous les autres marqueurs du stress du RE ne sont plus surexprimés en réponse à l'HI (étude 1), traduisant que l'HI provoque donc un stress du RE délétère dépendant de HIF-1 (figure 39A). La protéine Grp78 est la protéine senseur et déclencheur du stress du RE. Pour autant, l'augmentation ou la diminution de l'expression de cette protéine n'est pas forcément le reflet de la présence ou l'absence du stress du RE, respectivement. En effet, il a été montré que l'inhibition du stress du RE par la surexpression de Grp78 protège le myocarde des lésions d'une ischémie-reperfusion [61, 350], et que l'activation d'un stress du RE délétère est associée à une réduction de l'expression de la Grp78 [65]. Ainsi, le maintien de son expression chez les souris HIF-1 /- exposées à l'HI n'est pas en désaccord avec le rôle de HIF-1 dans l'induction du stress du RE. Par ailleurs, comme pour les autres marqueurs de la voie PERK-ATF4-CHOP, nous nous attendions à une diminution de l'expression d'ATF4 chez les souris HIF-1 /- soumises à l'HI. Cependant, la régulation d'ATF4 en hypoxie peut impliquer d'autres voies de signalisation que le stress du RE. En effet, la protéine p300 est capable d'inhiber la dégradation d'ATF4 [351], or l'activation de cette protéine est augmentée en HI [293], suggérant que la dégradation d'ATF4 pourrait être inhibée par p300 en HI, expliquant ainsi les résultats obtenus chez les souris HIF-1 /-. Donc, HIF-1 est impliqué dans l'induction du stress du RE myocardique par l'HI (figure 39A). b. HI, HIF-1, stress du RE, taille de l'infarctus Dans l'étude 1, la délétion partielle de HIF-1 abolit l'augmentation de la taille d'infarctus induite par l'HI, reflétant le rôle délétère de HIF-1 dans l'augmentation de la taille d'infarctus (étude 1) (figure 39). Nous avons déjà montré que l'inhibition du stress du RE par le traitement au TUDCA pendant l'exposition abolit l'augmentation de la taille d'infarctus induite par l'HI [313]. Ceci met en évidence que le stress du RE généré lors de l'HI participe à l'augmentation de la taille de l'infarctus après l'ischémie-reperfusion, chez les animaux hypoxiques. Dans le contexte de l'HI, l'effet délétère du stress du RE a aussi été montré dans le cœur, avec d'autres traitements pharmacologique [308, 309, 343] ou avec l'exercice physique [342], puisque ces thérapeutiques ont montré que parallèlement à la diminution des lésions cellulaires suite à l'ischémie-reperfusion, l'expression des marqueurs pro- apoptotique de l'UPR était aussi réduite. En revanche, notre étude est la première à utiliser un inhibiteur direct du stress du RE [313]. Donc, l'HI induit une activation de HIF-1, responsable du stress du RE, et consécutivement de la susceptibilité accrue du myocarde à l'ischémie-reperfusion (figure 39A). c. SAOS, HIF-1, stress du RE L'activation de l'axe HIF-1-stress du RE a été confirmé sur un petit échantillon de biopsies d'appendice auriculaire droit de patients atteints d'apnées du sommeil et de maladies coronaires. En effet, chez les patients apnéiques, une augmentation de l'expression de HIF- 1 et de CHOP, et une tendance à l'augmentation de l'expression de Grp78 sont observées au niveau myocardique (étude 1). De plus, nous avons montré qu'indépendamment des facteurs confondants, l'activation de HIF-1 est corrélée positivement à l'index d'apnées- hypopnées (IAH), suggérant l'implication majeure de ce facteur de transcription dans cette pathologie. Ces résultats sont en accord avec un récent article de Lu et al, montrant une augmentation de l'expression de HIF-1 sérique chez les patients atteins d'un SAOS sévère par rapport au groupe contrôle ou SAOS modéré, ainsi qu'une corrélation entre l'expression de HIF-1 et l'IAH [301]. Donc, l'activation myocardique de HIF-1 est aussi présente chez les patients apnéiques atteints de maladie coronaire. D'un point de vue thérapeutique, en ce qui concerne le stress du RE, certains inhibiteurs comme le TUDCA ont été testés chez l'homme dans le cadre de pathologies hépatiques [352] et ophtalmiques [353]. Même si cet inhibiteur semble bien toléré, il n'a encore pas été utilisé en clinique dans le cadre de l'ischémie-reperfusion seule [56]. Néanmoins, pour mon travail de thèse, nous avons plutôt choisi d'améliorer la compréhension du rôle délétère de HIF-1 dans les mécanismes induits par l'HI et ce, afin d'éventuellement proposer de nouvelles cibles thérapeutiques. 2. Rôle de HIF-1 dans l'altération des MAM et de l'homéostasie calcique induite par l'HI chronique a. HI, MAM, homéostasie calcique Le stress du RE est connu pour être activé par une altération de l'homéostasie calcique [40]. Les MAM sont un lieu d'échanges calciques de haute intensité entre le RE et la mitochondrie. De ce fait, l'état du RE régule ces points de contact. Par exemple, lors de la phase précoce du stress du RE, les points de contacts RE-mitochondries sont renforcés [74]. De plus, les MAM ont récemment été montrés comme impliqués dans la réponse à l'ischémie-reperfusion [95, 97]. L'HI induisant un stress du RE délétère, responsable de l'augmentation de la taille d'infarctus, nous nous sommes intéressés à l'intégrité des MAM en HI. Pour cela, comme décrit dans d'autres études, nous avons enregistré les flux calciques entre le RE, la mitochondrie et le cytosol, après une stimulation à l'histamine [89, 95]. Deux-cent-cinquante secondes après la vidange du RE, l'HI induit une rapide accumulation calcique dans le RE et le cytosol par rapport à la condition normoxique, témoignant d'une altération de l'homéostasie calcique probablement à l'origine du stress du RE [40]. Par conséquent, ceci est susceptible d'expliquer l'augmentation de la taille d'infarctus, induite par l'HI. En revanche, bien qu'une surcharge de calcium mitochondrial aurait pu aisément expliquer la susceptibilité du myocarde à l'ischémie-reperfusion [354], nous ne l'avons pas observé après l'incubation de l'histamine. Afin de mieux comprendre les altérations des échanges inter-organites, nous avons évalué l'intégrité des MAM et l'expression de régulateurs majeurs de l'homéostasie calcique. Un des complexes des MAM connu pour réguler les échanges calciques est composé du canal IP3R1 de la membrane du réticulum endoplasmique, du canal VDAC1 de la membrane externe de la mitochondrie, et de la protéine cytosolique Grp75, reliant la protéine VDAC1 et IP3R1 [77]. Récemment, la protéine mitochondriale CypD a été montrée comme appartenant à ce complexe [95]. Dans l'étude 1, l'HI augmente les interactions entre Grp75/IP3R1 et Grp75/VDAC1, signifiant que la protéine cytosolique est proche de ses partenaires directs. Cependant, l'HI diminue les interactions entre IP3R1/VDAC1 et Grp75/CypD, reflétant un éloignement entre le RE et la mitochondrie. En effet, nous avons observé une diminution de l'expression de la Grp75, la protéine pont entre le RE et la mitochondrie, ce qui peut expliquer la perte d'intégrité des MAM. De plus, il a été montré, dans le vieillissement cardiaque et l'hypertrophie cardiaque, qu'un éloignement du RE et de la mitochondrie est à l'origine d'altérations du métabolisme mitochondrial et de l'homéostasie calcique, mettant en évidence l'importance de l'intégrité des MAM [355, 356]. Les expressions de VDAC1 et IP3R1 sont quant à elles, augmentées en HI. Nous pouvons donc penser que ces augmentations de l'expression des autres acteurs des MAM en HI seraient potentiellement une compensation pour rétablir les points de contacts RE- mitochondrie, essentiels au fonctionnement cardiaque. Par ailleurs, la diminution des interactions entre Grp75 et CypD témoigne d'une absence de la CypD dans les MAM [95], ce qui participe probablement à l'absence de modification du calcium au niveau de la mitochondrie en HI. Donc, l'HI entraine une perturbation des flux calciques inter-organites et une altération des MAM, susceptible d'expliquer l'augmentation de la taille dinfarctus. A l'interface des MAM et des acteurs classiques de l'homéostasie calcique, on trouve la CypD. De la même manière que pour les autres composants des MAM, l'expression de CypD est augmentée après 21 jours d'HI (étude 1). Cette protéine étant aussi connue pour son rôle dans la réponse à l'ischémie-reperfusion, en induisant l'ouverture du PTPm, ce résultat peut à lui seul expliquer l'augmentation de la mort cellulaire après une ischémie-reperfusion [31]. Cette hypothèse est en accord avec la diminution la capacité de rétention calcique (CRC) des mitochondries induite par l'HI, qui est accentuée en présence de la CsA (inhibiteur de la CypD), reflétant une augmentation de la sensibilité au calcium du PTPm (étude 1). En ce qui concerne les autres acteurs de l'homéostasie calcique, l'HI augmente la phosphorylation du phospholamban et l'expression de SERCA (étude 1). Ces deux modifications traduisent une activité accrue de la pompe SERCA, pouvant expliquer la surcharge du RE en calcium, suite à sa vidange, dans les cardiomyocytes isolés de souris soumises à l'HI. L'expression du NCX1 est aussi augmentée en HI (étude 1), ce qui avait déjà été observée chez des souris exposées 8 sem à l'HI [239]. Or, la surexpression de NCX1 est délétère pour le myocarde [357]. Ainsi, un fonctionnement inverse du NCX1 [357] pourrait participer à la surcharge calcique cytosolique après la vidange du RE. De plus, l'expression du MCU, permettant le transfert de calcium de l'espace inter-membranaire vers la matrice mitochondriale, n'est pas modifiée par l'HI. Ceci est en accord avec l'absence de modification du calcium au niveau de la mitochondrie. Donc, l'HI engendre une perturbation des flux calciques inter-organites, des MAM, et des autres acteurs majeurs de l'homéostasie calcique, susceptible d'expliquer la vulnérabilité myocardique à l'ischémie-reperfusion. b. HI, HIF-1, MAM, homéostasie calcique Pour ce qui est de HIF-1, la délétion partielle de la sous-unité abolit la plupart des effets de l'HI sur les flux calciques et l'intégrité des MAM (figure 39B). Le rôle de HIF-1 dans la régulation de l'homéostasie calcique est encore peu étudié. Néanmoins, de récents articles montrent qu'en hypoxie, Grp75 interagit avec HIF-1 pour induire la localisation du complexe à la membrane mitochondriale externe, ce qui entrainerait la coupure de VDAC1 puis son activation [358]. Le lien entre HIF-1 et la forme tronquée de VDAC1 a d'ailleurs déjà été montré dans le contexte de cellules cancéreuses résistantes à l'apoptose [315]. En revanche, notre étude serait la première à mettre en évidence un lien entre HIF-1 et les expressions de IP3R1 et CypD. A propos des autres acteurs de l'homéostasie calcique, bien que HIF-1 ait déjà été montré pour réguler la transcription du gène codant pour SERCA [316], dans notre contexte d'HI, cela ne semble pas être le cas, puisque la surexpression de SERCA est aussi présente chez les souris HIF-1 /- hypoxiques. Par contre, la délétion partielle de HIF-1 abolit les effets de l'HI sur la phosphorylation du phospholamban et sur l'expression de NCX1. Ceci est en accord avec la littérature puisque la stabilisation de HIF-1 augmente la phosphorylation du phospholamban [359] et que HIF-1 peut se fixer sur le HRE dans le promoteur du gène codant pour NCX1 [314, 360]. Donc, l'HI induit une activation de HIF-1, contribuant à la perte d'intégrité des MAM, associée à des perturbations des flux calciques inter-organites et de l'expression des acteurs majeurs de l'homéostasie calcique. Ceci peut expliquer le rôle de HIF-1 dans l'induction du stress du RE par l'HI et par conséquent dans l'augmentation de la susceptibilité du myocarde à l'ischémie-reperfusion (figure 39A-B). Il convient de préciser que nous avons mesuré des modifications relatives des charges de calcium intra-organites (assez tardivement après l'incubation de l'histamine). Nous pourrions par la suite utiliser des sondes ratiométriques, a minima, pour attester d'une surcharge calcique intra-cytosolique qui pourrait expliquer les atteints myocardiques induites par l'HI chronique. Pour continuer à comprendre l'implication de HIF-1 dans les conséquences de l'HI, nous avons continué à étudier les conséquences de son activation et ce, au niveau de la mitochondrie. 3. Rôle de HIF-1 dans la dysfonction mitochondriale et la mitophagie induites par l'HI chronique a. HI, fonction mitochondriale Illustré notamment à travers les MAM, un lien étroit existe entre le RE et la mitochondrie, donc l'altération du fonctionnement de l'un, a des conséquences sur le fonctionnement de l'autre. De ce fait après avoir étudié le stress du RE, nous nous sommes intéressé à la mitochondrie. L'étude 2 révèle que l'HI diminue la respiration mitochondriale à travers tous les complexes. Une seule étude a aussi montré une diminution de la consommation en oxygène dans le cerveau après 14 jours d'HI [319]. Pourtant, l'hypoxie est bien connue pour réduire la respiration mitochondriale, et ainsi adapter le fonctionnement de la chane respiratoire à la diminution d'02 [361]. Ensuite, l'HI diminue la production myocardique d'ERO mitochondriales lorsque le complexe II est alimenté en substrat. Cette différence est abolit par l'ajout de roténone (un inhibiteur du complexe I), suggérant que l'HI altère le flux reverse des électrons vers le complexe I. En effet, au cours de l'activité de la chane respiratoire, la production d'anions O2-. a lieu essentiellement au niveau du complexe I, via le flux reverse des électrons et au niveau du complexe III [101, 102]. Ces diminutions de respiration et production d'ERO mitochondriales sont en accord avec un ralentissement du fonctionnement de la mitochondrie, observé lors de la mesure du potentiel de membrane. En effet, lors de cette expérience, après l'ajout d'ADP, le temps de retour au potentiel de membrane est plus long en HI qu'en normoxie. Donc, l'HI diminue la respiration et la production d'ERO mitochondriales. b. HI, HIF-1, fonction mitochondriale Chez les souris HIF-1 /-, la respiration et la production d'ERO mitochondriales ne sont pas modifiées par l'HI (étude 2). En hypoxie continue, Zhang et al. ont en effet démontré que les diminutions de respiration et de production d'ERO mitochondriales étaient dépendantes de HIF-1 [145, 330]. Ainsi, HIF-1 serait aussi impliquée dans la réduction de la respiration et la production dERO mitochondriales en HI (figure 39C). Donc, HIF-1 est impliqué dans la diminution de respiration et production d'ERO mitochondriales induite par l'HI (figure 39C). En revanche, il apparat intéressant de discuter ces résultats, car l'HI est bien connue pour produire des ERO [320, 362, 363]. D'ailleurs, dans le myocarde, nous avons observé une augmentation la production d'ERO tissulaire en HI, uniquement chez les souris WT (figure 39). De plus, une étude avec un modèle semblable d'HI (1, 5 % pendant 15 s puis 21 % pendant 5 min) a mis en évidence une augmentation de la production d'ERO mitochondriale dans le cerveau, chez des rats exposés 10 jours à l'HI [318]. Néanmoins, il a été suggéré qu'une réduction de production d'ERO mitochondriale est nécessaire en hypoxie continue quand celle-ci est prolongée dans le temps, afin de permettre la survie cellulaire [145]. Ainsi notre stimulus étant plus long que l'étude précédente, la diminution de production d'ERO mitochondriale pourrait être une adaptation à la chronicité de l'HI, pour réduire le stress oxydant tissulaire. Par ailleurs, la production d'ERO peut provenir du cytosol, produite par exemple, par la NADPH oxydase, dont l'expression myocardique est augmentée en HI [190, 265]. De plus, les défenses antioxydantes sont diminuées en HI [190, 364], ce qui peut aggraver le stress oxydant. HI DHE (fold increase vs. WTN) 3 * /- WT HIF-1 Figure 38 : HIF-1 est impliqué dans l'augmentation du stress oxydant induite par l'hypoxie intermittente (HI) /- chronique. Sur des coupes de cœur de souris wild-type (WT) ou HIF-1 exposées à 21 jours d'HI ou de normoxie (N), la production d'anions superoxydes (B) a été évaluée par une coloration au DHE. Les valeurs sont exprimées en moyenne par rapport au groupe WTN, SEM (n 7-8). *p vs. N. c. HI, biogénèse et dynamique Les mitochondries sont dotées d'une dynamique et d'un renouvellement mitochondrial, susceptible d'expliquer les modifications de la fonction mitochondriale [105, 107]. La biogénèse mitochondriale, dont l'évaluation a été réalisée à travers le marqueur clé PCG1- [365], ne semble pas être altérée par l'HI (étude 2). Pour ce qui est de la dynamique [109], l'acteur majeur de la fusion, à savoir OPA1 n'est pas modifié en HI, mais l'HI diminue l'expression de la Mfn2, suggérant peut être que l'HI limite la fusion mitochondriale (étude 2). La fusion mitochondriale sert à améliorer la synthèse d'ATP et à diminuer la production d'ERO. Il est aussi intéressant de noter que comme décrit en introduction, la Mfn2 a aussi un rôle dans les MAM [79]. Dans l'étude 1, nous avons vu que l'HI induit une perte d'intégrité des MAM. Ainsi la diminution de Mfn2 induite par l'HI pourrait aussi expliquer l'altération des MAM. En revanche, l'HI tend à augmenter l'expression de Drp1 (étude 2), la protéine principale de la fission mitochondriale, qui pour mémoire permet de créer deux petites mitochondries à partir d'une, dont l'une est fonctionnelle, et l'autre, endommagée, est facilement dégradable par mitophagie [109]. En accord avec un récent article, l'exposition de 6 sem à l'HI chez le rat a montré une augmentation de la fission et une diminution de la fusion au niveau du myocarde, caractérisées par une augmentation du nombre de mitochondries fragmentées, une diminution de l'expression de Mfn2 et une augmentation de Drp1 [366]. Cette altération de la dynamique mitochondriale contribuerait à une augmentation de la mort cellulaire, et consécutivement à un dysfonctionnement cardiaque [366]. Nous pouvons donc penser que les modifications de la dynamique pourraient contribuer à expliquer la dysfonction mitochondriale et la susceptibilité du myocarde à l'ischémie-reperfusion. En revanche, les modifications observées ne sont pas aussi soutenues que celles observées dans l'étude de Han et al. Notre exposition n'est peut-être pas assez longue pour visualiser des modifications significatives de la dynamique mitochondriale. Dans les cardiomyocytes adultes, une double délétion cardiaque de Mfn1 et Mfn2 induit les premières modifications de la dynamique au bout de 16 jours [367], or notre stimulus étant moins délétère qu'une modification génétique, l'adaptation du cycle fusion/fission pourrait prendre plus de 21 jours en HI. A l'avenir, nous pourrions aussi nous intéresser à d'autres protéines de la fission, comme la protéine Fis1 ou l'état de phosphorylation de la protéine Drp1. Donc, l'HI pourrait altérer la dynamique mitochondriale. d. HI, HIF-1, dynamique Même s'il est difficile de conclure précisément sur l'effet de l'HI dans la dynamique, chez les souris HIF-1 /-, l'HI n'a pas d'effet. Cela suggère que si l'étude de la dynamique est approfondie, HIF-1 pourrait être important pour ces adaptations à l'HI (figure 39C). Cette hypothèse est confortée par la mise en évidence que HIF-1 est responsable d'une augmentation de la fission mitochondriale en induisant la phosphorylation de Drp1, dans différents modèles d'activation de HIF-1 (hypoxie continue, exposition au chlorure de cobalt ou monocrotaline) [368]. En revanche, la relation entre HIF-1 et Mfn2 n'a pas encore été étudiée. Donc, HIF-1 pourrait être impliqué dans les altérations éventuelles de la dynamique mitochondriale, induites par l'HI (figure 39C). e. HI, mitophagie Dans la continuité nous avons évalué, quelques marqueurs de l'autophagie, qui est un mécanisme complexe, mettant en jeu de nombreuses protéines [369]. Dans notre étude, nous nous sommes intéressés aux protéines de l'autophagie, contribuant à l'induction de la mitophagie, une autophagie spécifique de la mitochondrie, telles que Beclin1 (une protéine initiatrice de l'autophagie), p62 (un marqueur du flux autophagique) et la conversion de LC3I en LC3II (un marqueur de la formation des autophagosomes). Ainsi, l'HI diminue l'expression de p62, alors que l'expression de Beclin1 et la conversion de LC3I en LC3II ne sont pas modifiées (étude 2). Ceci pourrait s'expliquer par le fait que lors d'une hypoxie simulée (cobalt sur des myotubes C2C12), la diminution de p62 apparat plus précocement que l'augmentation de la conversion LC3I en LC3II dans l'activation de l'autophagie [370]. Pour ce qui est de la mitophagie, l'HI augmente les expressions de Bnip3 et Parkin. Alors que Bnip3 a d'abord été découvert pour induire la mort cellulaire, il a été récemment mis en évidence que Bnip3 active la mitophagie, en interagissant avec LC3 [371]. De plus, cette mitophagie médiée par Bnip3 a été montré pour induire une diminution de respiration et de production d'ERO mitochondriales en hypoxie continue [145], suggérant que la mitophagie permettrait d'adapter la fonction mitochondriale à l'HI. Par ailleurs, la protéine majeure dans l'induction de la mitophagie est Parkin. Quelques travaux rapportent un lien étroit entre Bnip3 et Parkin pour induire la mitophagie, avec l'implication essentielle ou facultative de Pink1 [372, 373]. Un article montre aussi que l'induction par Bnip3 de la mitophagie est dépendante de la présence d'une fission médiée par Drp1 et du recrutement de Parkin [147]. Ainsi, il pourrait être intéressant de déterminer l'implication de Pink1 ou Drp1 dans la mitophagie médiée par Bnip3 et Parkin en HI, via la quantification de l'expression de Pink1 ou l'utilisation d'un traitement inhibiteur de Drp1, la mdivi1. Donc, l'HI induit une mitophagie médiée par Bnip3 et Parkin, susceptible d'expliquer la dysfonction mitochondriale. f. HI, HIF-1, mitophagie Par ailleurs, en hypoxie continue chronique, Zhang et al. ont démontré que HIF-1 induisait une mitophagie dépendante de Bnip3 [145]. D'ailleurs, chez les souris HIF-1 /, l'HI n'altère pas l'expression des protéines de l'autophagie et de la mitophagie (étude 3)(figure 39C). Alors que la régulation de p62 et Parkin par HIF-1 est peu étudiée, celle de Bnip3 est bien connue. En effet, la présence d'un HRE dans le promoteur du gène de Bnip3 signifie que Bnip3 est une cible transcriptionelle directe de HIF-1 [144]. De ce fait, en HI, HIF-1 pourrait activer directement la mitophagie par son activité transcriptionnelle sur Bnip3, afin d'adapter la fonction mitochondriale à l'HI. De plus, la fonction mitochondriale est bien connue pour être impliquée dans la réponse à l'ischémie-reperfusion, ne serait-ce qu'à travers l'ouverture du PTPm. Détaillé auparavant, l'étude 2 révèle que l'HI induit une augmentation de la sensibilité au calcium du PTPm, dépendante de HIF-1. Ainsi, la dysfonction mitochondriale est susceptible d'expliquer l'augmentation des lésions cellulaires suite à une ischémie-reperfusion, induite par l'HI. Donc, HIF-1 est impliqué dans l'induction de la mitophagie, susceptible d'expliquer la dysfonction mitochondriale et l'augmentation de la susceptibilité du myocarde à l'ischémie-reperfusion (figure 39C). Ainsi, l'étude de la dynamique et du renouvellement mitochondrial nécessite d'être approfondie, afin d'apporter des informations plus précise sur l'implication de HIF-1 dans les altérations mitochondriale induites par l'HI. Notamment, la microscopie électronique à transmission pourrait permettre de déterminer si le nombre de mitochondrie est diminué en HI par la mitophagie, ou la proportion de grosses ou petites mitochondries. 4. HI chronique et altérations mitochondriales, effets protecteurs de la metformine a. HI, AMPK Afin d'expliquer la diminution de la respiration et la production d'ERO mitochondriales, nous nous avons mesuré l'expression et à l'activité des complexes de la chane respiratoire. De façon intrigante, alors que l'expression des complexes n'est pas atteinte pas l'HI, l'activité des complexes I et II est augmentée. Par ailleurs, le potentiel de membrane n'est pas altéré par l'HI, suggérant un bon couplage de la phosphorylation oxydative et de la chaine de transport d'électrons. Nous avons donc pensé que l'augmentation de l'activité des complexes I et II pourrait être une compensation afin de maintenir la production d'ATP. En particulier, la contractilité cardiaque est permise grâce à une capacité importante du cardiomyocyte à réguler le statut énergétique cellulaire, afin d'adapter l'apport en substrats en fonction de la demande. Ainsi, nous nous sommes intéressés à l'AMPK, connue pour détecter un stress énergétique, et induire une réponse métabolique capable de maintenir un niveau d'énergie nécessaire pour le fonctionnement cellulaire [374]. De plus, indépendamment d'une exposition à l'hypoxie, l'AMPK est aussi impliqué dans la réponse à l'ischémie-reperfusion, en préservant l'équilibre métabolique en ischémie et l'intégrité mitochondriale à la reperfusion [374]. Ainsi, nous avons évalué le niveau d'activation myocardique de l'AMPK en HI. L'HI induit une diminution de la phosphorylation de l'AMPK et tend à diminuer la phosphorylation d'ACC, une des protéines cible de l'AMPK (étude 2). Ce résultat est en accord avec une étude récente, qui a mis en évidence que l'HI diminue la phosphorylation de l'AMPK myocardique, chez des rats exposés 8 sem à l'HI [375]. Ces modifications sont abolies par la délétion de HIF-1 (étude 2)(figure 39C). Ainsi, l'HI réduit l'activité myocardique de l'AMPK sous le contrôle de HIF-1, alors que l'on sait qu'en hypoxique, HIF-1 oriente les cellules vers un métabolisme glycolytique [282]. Ces résultats attestent d'un stress énergétique myocardique induit par l'HI chronique. Cette réduction d'activation de l'AMPK, à elle seule, est susceptible d'expliquer la mauvaise récupération à l'ischémie-reperfusion, puisque l'utilisation de modèle animaux génétiquement modifiés a montré les effets cardioprotecteurs de l'activation de l'AMPK [376-378]. Donc, l'HI diminue l'activation myocardique de l'AMPK. b. HI, metformine, taille de l'infarctus Ces résultats nous ont donc amenés à traiter les animaux à la metformine (un activateur de l'AMPK) pendant l'exposition à l'HI ou la normoxie. Nous avons observé que la metformine abolit l'augmentation de la mort cellulaire suite à l'ischémie-reperfusion chez les animaux exposés à l'HI seulement (étude 2) (figure 39D). La metformine étant un antidiabétique, c'est avec des modèles animaux diabétiques qu'elle a été testée en chronique pour son effet potentiellement cardioprotecteur. De ce fait, seulement deux études suggèrent une réduction de la taille d'infarctus par le traitement chronique de 2 et 4 sem de la metformine (300mg/kg) chez le rat [379, 380]. En revanche, notre résultat est spécifique de l'HI, puisque la metformine n'a pas d'effet chez les animaux normoxiques. Ceci n'est pas en désaccord avec les résultats cardioprotecteurs controversés de la metformine. Mais cela pourrait aussi s'expliquer par le fait qu'afin de s'affranchir d'un effet aigu de la metformine, nos souris n'ont pas été traitées le jour des expérimentations. Donc, la metformine prévient l'augmentation de la vulnérabilité du myocarde à l'ischméie- reperfusion, induite par l'HI (figure 39D). c. HI, metformine, dynamique et mitophagie En ce qui concerne la dynamique mitochondriale, la metformine prévient les modifications d'expression de Mfn2 et Drp1, induites par l'HI (étude 2) (figure 39D). Dans des fibroblastes fœtaux humains, il a été observé que la metformine rétablit la fusion, en empêchant la diminution de Mfn2 et OPA1 [381]. La metformine a aussi été montré pour inhiber la fission médié par Drp1 chez des souris diabétiques [382, 383]. Ainsi, l'approfondissement de l'étude de la dynamique en HI pourrait confirmer l'effet de la metformine sur celle-ci, dont la littérature se résume aux trois études citées précédemment. Ensuite, la metformine abolit la diminution de p62 et les augmentations de l'expression de Bnip3 et de Parkin induites par l'HI (étude 2), signifiant que la metformine prévient l'induction de la mitophagie en HI (figure 39D). Généralement, l'activation d'AMPK est associée à une autophagie bénéfique. En effet, Xie et al. , ont montré que l'activation de l'AMPK par l'AICAR, induit une autophagie responsable d'une réduction de la mort cellulaire, dans des cellules H9C2 exposées à 5 jours d'HI [375]. De plus, en hypoxie continue couplée à une restriction en acides aminés, l'AMPK induit la dégradation de Bnip3 par autophagie, en inhibant mTORC1 et en activant la phosphorylation de ULK1 [384]. De ce fait, en activant l'AMPK, la metformine pourrait induire une autophagie bénéfique pour le myocarde, empêchant ainsi l'induction de la mitophagie médiée par Bnip3 et Parkin en l'HI chronique. Donc, la metformine prévient la mitophagie et consécutivement la susceptibilité du myocarde à l'ischémie-reperfusion, induites par l'HI (figure 39D). Etant donné que cette étude sur l'AMPK est préliminaire, il convient d'énoncer quelques perspectives à ce travail. La metformine active l'AMPK, de manière indirecte, en inhibant le complexe I mitochondrial [385, 386], ce qui suggère que la metformine pourrait aussi prévenir la dysfonction mitochondriale et l'augmentation de l'activité du complexe I, induites par l'HI. De ce fait, l'effet de la metformine sur la fonction mitochondriale en HI sera étudié. De plus, la metformine étant un activateur indirect de l'AMPK, son action sur la phosphorylation de l'AMPK et ses cibles, telles qu'ACC, ULK1, mTOR est à évaluer. Pour contrôler le rôle de la metformine, en tant qu'inhibiteur spécifique de l'AMPK cardiaque, nous pourrons vérifier l'absence de son effet chez des souris exposées à l'HI avec une délétion myocardique de l'isoforme AMPK2 (isoforme spécifique cardiaque). Cette étude sur l'AMPK a permis d'explorer une nouvelle cible thérapeutique, ainsi nous pourrions réaliser une étude rétrospective pour évaluer l'incidence et la fréquence des infarctus du myocarde chez des patients apnéiques traités ou non avec la metformine. Par ailleurs, en conditions hypoxiques, la metformine a été montré pour diminuer l'activation de HIF-1 [387-393]. De ce fait, l'AMPK et HIF-1 pourrait être intimement liés en HI, et la metformine pourrait agir sur l'activation de HIF-1, ce qui pourrait expliquer les effets cardioprotecteurs en termes de taille d'infarctus de la metformine. 5. Rôle pivot de HIF-1 dans la susceptibilité myocardique à l'ischémie-reperfusion, induite par l'HI chronique a. Mécanismes de l'HI A travers ces travaux de thèse, nous avons confirmé que l'HI chronique pendant 21 jours est délétère pour la réponse à l'ischémie-reperfusion. Ceci avait déjà été démontré chez des rongeurs, après une exposition à l'HI de 7 jours [394], 12 jours [395], 14 jours [190, 198, 265, 313, 394], 21 jours [342] et 5 sem [233]. Pour rappel, les mécanismes induits par le SAOS et/ou l'HI sont l'activation sympathique, le stress oxydant et l'inflammation. Les études 1 et 2 ont permis de mettre en évidence de nouveaux mécanismes, susceptibles d'expliquer l'augmentation de la vulnérabilité cardiaque, à savoir le stress du RE éventuellement causé par une perturbation des MAM et de l'homéostasie calcique, ainsi que les altérations mitochondriales. Alors qu'une précédente étude du laboratoire montrait que l'HI induit une activation de HIF- 1, impliquée dans la susceptibilité accrue du myocarde [198]. Ces travaux ont permis de mettre en évidence son rôle essentiel dans les deux nouveaux mécanismes sus-cités et dans l'augmentation de la taille d'infarctus, induits par l'HI chronique. Jusqu'ici, l'activation de HIF-1 a surtout été décrit comme une conséquence du stress oxydant généré par l'HI [363] et en relation étroite avec l'activation sympathique [307] ou l'inflammation vasculaire [258] induits par l'HI. Pourtant, l'inhibition partielle génétique de HIF-1 dans les études 1 et 2 suggère que HIF-1 est aussi impliqué dans l'induction du stress du RE et des altérations mitochondriale consécutifs à l'HI. De ce fait dans l'étude 3, nous avons décidé d'inhiber HIF-1 avec un outil pharmacologique, afin d'une part d'appuyer l'importance de son activation dans les conséquences du SAOS et/ou de l'HI, et d'autre part, d'observer si son inhibition pharmacologique pouvait améliorer la réponse à l'ischémie-reperfusion. Pour cela, nous avons choisi un inhibiteur de l'activation nucléaire de HIF-1, la curcumine qui est connue pour induire la dégradation protéosomale de HIF-1 [396]. Comme pour la metformine, afin de s'affranchir d'un effet éventuellement bénéfique aigu de la curcumine, les souris n'ont pas été traitées avant d'être soumises aux expérimentations. b. HI, curcumine, HIF-1 Tout d'abord, la curcumine prévient l'augmentation de l'expression myocardique de HIF-1, induite par l'HI (étude 3)(figure 39E). En effet, la curcumine a été montré pour réduire l'expression de HIF-1 dans plusieurs modèles de cancer, mais aussi dans d'autres pathologies chroniques comme la fibrose hépatique et l'obésité [331-339]. En revanche, cette étude est la première à montrer l'effet de la curcumine sur l'expression de HIF-1 dans le myocarde. Ensuite, dans l'étude 4, nous montrons que l'inhibition pharmacologique de HIF-1 abolit le stress oxydant et l'inflammation, induits par l'HI (figure 39E). Indépendamment de l'HI, la curcumine est bien connue pour son activité antioxydante et anti-inflammatoire [397]. De plus, le traitement à la curcumine empêche l'augmentation de l'expression des protéines clés du stress du RE induite par l'HI (étude 3)(figure 39E). Ceci est en accord avec l'inhibition d'un stress du RE-pro-apoptotique par la curcumine, démontrée dans le cas d'une myocardite aigue [398]. Des expériences complémentaires telles que l'analyse de la variabilité de la fréquence cardiaque (pour l'activation sympathique) ou l'évaluation de la fonction mitochondriale restent à réaliser pour terminer cette étude. Néanmoins, dans la littérature, il a été montré que la curcumine diminue l'activité sympathique dans un modèle de rats obèses [399]. De la même façon, plusieurs études ont mis en évidence que la curcumine rétablit le fonctionnement mitochondrial, notamment dans un modèle d'ischémie-reperfusion [400]. Enfin, la curcumine est aussi capable d'activer l'AMPK dans les pathologies chroniques, telle que le cancer, le diabète ou l'athérosclérose [401]. Donc, l'inhibition de l'activation de HIF-1 pourrait prévenir toutes les conséquences délétères de l'HI (figure 39E). a. HI, curcumine, taille de l'infarctus D'ailleurs, le traitement par la curcumine pendant l'exposition abolit l'augmentation de la taille d'infarctus induite par l'HI seulement (étude 3)(figure 39E). Ceci est en accord avec l'effet bénéfique de la curcumine sur les lésions cérébrales induite par l'HI [402] et aussi sur les effets cardioprotecteurs de la curcumine vis-à-vis de l'ischémie-reperfusion seule [403]. Donc, cette étude suggère que la curcumine pourrait être en mesure de prévenir l'ensemble des mécanismes de l'HI, en prévenant l'activation myocardique de HIF-1, responsable de l'augmentation de la vulnérabilité du myocarde à l'ischémie-reperfusion (figure 39E). Ce traitement pharmacologique avec la curcumine présente cependant des limites, puisque comme évoqué précédemment la curcumine n'est pas un inhibiteur spécifique de HIF-1. De par sa formulation chimique, la curcumine est un antioxydant. De plus, la curcumine, en déstabilisant HIF-1, peut empêcher la régulation de la transcription des gènes dépendant de HIF-1, mais aussi de HIF-2 ou HIF-3. Au laboratoire, une étude parallèle a été mise en place afin de trouver des analogues de la curcumine plus spécifique de la modulation de HIF- 1, qui seront d'abord testés sur un modèle de mort cellulaire, puis sur des cellules exposées à l'HI, et enfin chez des rongeurs exposés à l'HI. Par ailleurs, la curcumine est testée dans plusieurs pathologies comme le cancer, chez l'animal et chez l'homme, mais sa biodisponibilité étant très faible, des encapsulations et des dérivés sont aussi essayés pour améliorer son efficacité [404]. L'utilisation des souris partiellement délétées pour HIF-1 est un bon outil pour étudier le rôle de HIF-1 dans les mécanismes de l'HI, par rapport à la pharmacologie moins spécifique de HIF-1. En revanche, en accord avec le rôle basal de HIF-1, ces souris présentent des altérations cellulaires en basal, touchant l'intégrité des MAM, la respiration et la production d'ERO mitochondriales. Pour réduire ces compensations, il serait intéressant d'évaluer les conséquences de l'HI chez des souris dont la délétion de HIF-1 est réalisé au moment de l'exposition à l'HI. De plus, la comparaison d'une délétion cardiaque ou totale apporterait des informations, sur l'importance de l'activation myocardique chronique de HIF-1 dans les effets systémiques de l'HI. Le recours au modèle cellulaire récemment développé au laboratoire pourrait nous permettre de répondre plus rapidement à des questions concernant les différentes voies impliquées, en utilisant par exemple des siRNA ciblant directement HIF-1 ou les protéines altérées par l'HI comme la Grp75, Bnip3, AMPK 6. Conclusion Le SAOS est une maladie sous-diagnostiquée, qui est considéré comme un facteur de risque indépendant de la survenue d'une pathologie coronaire. En effet, la présence de cette pathologie accroit la sévérité et le nombre d'évènements cardiovasculaires. Par ailleurs, le traitement de référence du SAOS, la PPC ne prévient que partiellement ses conséquences, faisant de cette maladie un problème majeur de santé publique. La conséquence du SAOS considérée comme étant la plus délétère pour le système cardiovasculaire est l'HI chronique. Ainsi la compréhension des mécanismes sous-jacents impliqués dans cette pathologie et induits par l'HI, représente un enjeu majeur pour développer des thérapeutiques complémentaires ou substitutives à la PPC, et améliorer la prise en charge des patients SAOS. Ces travaux de thèse ont confirmé que l'HI chronique est délétère pour le myocarde, en augmentant la susceptibilité à l'ischémie-reperfusion, et ce, à travers l'activation de HIF-1. En effet, l'inhibition de HIF-1 par la génétique (étude 1) et la pharmacologie directe (curcumine, étude 3) est cardioprotectrice en termes de taille d'infarctus. Afin d'expliquer cette réponse à l'ischémie-reperfusion en HI, nous avons mis en évidence deux nouveaux acteurs de l'HI, à savoir, le stress du RE (potentiellement associé à l'altération des MAM et de l'homéostasie calcique) et les perturbations mitochondriales (étude 1-2). L'inhibition génétique de HIF-1 a permis de montrer que ce facteur de transcription joue un rôle central dans l'induction de ces deux nouveaux mécanismes (étude 1 et 2). A l'aide de l'inhibition pharmacologique de HIF-1 (étude 3), nous avons conforté le rôle de HIF-1 à l'origine de l'ensemble des mécanismes délétères de l'HI. Parallèlement à cela, nous avons mis en évidence une augmentation de son activation myocardique corrélée à l'IAH chez les patients apnéiques atteints d'une maladie coronarienne (comparativement aux non apnéiques). Ainsi, l'activation de HIF-1 pourrait correspondre à un marqueur de diagnostic de la sévérité du SAOS chez les patients à haut risque cardiovasculaire. De plus, dans cette même population, HIF-1 pourrait être une cible importante pour le développement de nouvelles thérapeutiques complémentaires ou substitutives aux traitements actuels, et ce, dans le but de réduire la gravité de la survenue d'un événement coronarien. Figure 39 : Schéma de conclusion de la thèse illustrant le rôle central de HIF-1 dans la susceptibilité myocardique à l'ischémie-reperfusion induite par l'HI chronique ; en activant le stress du RE (A) via une altération des MAM et de l'homéostasie calcique (B) ; et en induisant des altérations mitochondriales (C) prévenues par un traitement à la metformine. Le traitement à la curcumine (E), en inhibant l'activation de HIF-1, prévient l'augmentation de la taille d'infarctus induite par l'HI chronique. BIBLIOGRAPHIE [1] Reed GW, Rossi JE, Cannon CP. 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Un des mécanismes susceptibles d'expliquer la vulnérabilité du cœur à l'ischémie- reperfusion est le stress du réticulum endoplasmique (RE). D'ailleurs, les résultats d'une étude sur l'impact de l'HI au niveau cérébral suggèrent un lien entre le stress du RE et HIF-1. Les objectifs de ce travail ont donc été de déterminer si l'HI entraine des altérations de l'homéostasie calcique liées à un stress du RE myocardique, mais également d'identifier si ce stress du RE peut être à l'origine d'une activation de HIF-1. Enfin, l'implication de ces mécanismes cellulaires dans l'augmentation de la taille d'infarctus par l'HI a été évaluée. Des souris C57bl6/j et Swiss/SV129 (HIF-1 /- et leurs contrôles wild-type, WT), ont été exposées à 14 jours d'HI ou de normoxie (N). L'activation de HIF-1, les flux calciques inter- organites sur cardiomyocytes isolés, le stress du RE et la taille d'infarctus suite à une ischémie-reperfusion in vivo ont été mesurés. Les effets du l'acide tauroursodésoxycholique (TUDCA, 75 mg/kg/jour, injection intrapéritonéale) sur la taille de l'infarctus et l'activation de HIF-1 ont également été évalués. Chez les souris HIF-1 /-, la taille d'infarctus a été quantifiée. L'HI exacerbe l'accumulation de calcium dans le RE suite à sa vidange et elle induit un stress du RE et une activation de HIF-1 associés à une augmentation de la taille d'infarctus. Le traitement au TUDCA et la délétion partielle de HIF-1 abolissent l'effet délétère de l'HI en termes de taille d'infarctus. De plus, le traitement au TUDCA empêche l'activation de HIF-1 par l'HI. En conclusion, l'HI entraine des perturbations de l'homéostasie calcique liées à un stress du RE, lui-même responsable d'une activation de HIF-1 et d'une aggravation de la taille de l'infarctus suite à un protocole d'ischémie-reperfusion myocardique. Figure 40 : Schéma de conclusion de l'étude en annexe illustrant le rôle du stress du réticulum endoplasmique dans l'activation de HIF-1 et l'augmentation de la taille d'infarctus induite par l'HI chronique. LISTE DES PUBLICATIONS ET COMMUNICATIONS PUBLICATIONS : - Moulin S, Thomas A, Arnaud C, Arzt M, Wagner S, Maier L, Korichneva I, Tamisier R, Pépin J-L, Godin-Ribuot D, Belaidi E. HIF-1 disrupts mitochondria-associated ER membranes leading to calcium homeostasis disturbance, ER stress and myocardial infarct size expansion under intermittent hypoxia. Int J Cardiol. [4. 034] [soumis] - Thomas A, Belaidi E, Moulin S, Horman S, van der Zon GC, Viollet B, Levy P, Bertrand L, Pepin JL, Godin-Ribuot D, Guigas B. Chronic Intermittent Hypoxia Impairs Insulin Sensitivity but Improves Whole-Body Glucose Tolerance by Activating Skeletal Muscle AMPK. Diabetes. 2017 Dec ; 66(12) : 2942-2951. doi : 10. 2337/db17-0186 [7. 273] - Belaidi E, Thomas A*, Bourdier G*, Moulin S, Lemarié E, Levy P, Pépin JL, Korichneva I, Godin-Ribuot D, Arnaud C. Endoplasmic reticulum stress as a novel inducer of hypoxia inducible factor-1 activity : its role in the susceptibility to myocardial ischemia-reperfusion induced by chronic intermittent hypoxia. Int J Cardiol. 2016 May 1 ; 210 : 45-53. doi : 10. 1016/j. ijcard. 2016. 02. 096 [4. 034] COMMUNICATIONS ORALES : - Résultats de 3ème année de Thèse (Anglais) - GRRC (Groupe de réflexion sur la recherche Résultats de troisième de T hèse (Ang cardiovasculaire), Montpellier, 2017 - Résultats de thèse (Anglais), Gottlieb Laboratory, Etats-Unis, 2017 - Résultats de 1ère année de Thèse - GRRC, Dijon, 2016 COMMUNICATIONS AFFICHEES : - Résultats 3ème année de Thèse (Anglais) - International Society for Heart Research Résultats de troisième année de Thèse ( ais Amsterdam, 2018 Résultats de troisième anné èse (Anglais) - GRRC, Montpellier, 2018 - Résultats de 2ème année de Thèse (Anglais) - American Thoracic Society, Etats-Unis, 2017 s Résultats de dee année de Thès e (An gl - Journée des doctorants, Grenoble, 2017 Résultats de deuxième année de Thè nglais) - GRRC, Nantes, 2017 - Résultats de 1ère année de Thèse (Anglais) - New Frontiers in Basic Cardiovascular Research, Résultats de troisième année de Thèse ( s) Paris, 2016 Résultats de première année de Thèse - GRRC, Dijon, 2016 - Résultats de Master 2 - GRRC, Toulouse, 2015 | HAL | Scientific |
Les aspects cardiaques des endocardites bactériennes d'évolution prolongée | WMT16 | Scientific |
Intoxications accidentelles par l'acide cyanhydrique et par des cyanures | WMT16 | Scientific |
Hémoglobinopathies. Diagnostic au laboratoire | WMT16 | Scientific |
La biodisponibilité absolue de Pegasys est de 84% et est similaire à celle de l'interféron alfa-2a. | EMEA_V3 | Medicinal |
InductOs n'assure pas la stabilité mécanique et ne doit pas être utilisé pour remplir un espace en présence de forces de compression. | EMEA_V3 | Medicinal |
Utilisation et besoins des médecins de l'agglomération Marseillaise concernant l'offre sanitaire et sociale de soins dans les situations gériatriques complexes. T H È S E A R T I C L E Présentée et publiquement soutenue devant LA FACULTÉ DE MÉDECINE DE MARSEILLE Le 9 Novembre 2017 Par Monsieur Ugo FARGUES Né le 27 septembre 1989 à Toulon (83) Pour obtenir le grade de Docteur en Médecine D. E. S. de MÉDECINE GÉNÉRALE Membres du Jury de la Thèse : Madame le Professeur BONIN-GUILLAUME Sylvie Monsieur le Professeur FRANCES Yves Madame le Professeur GENTILE Stéphanie Monsieur le Docteur NACASS Michal Madame le Docteur MOLINES Catherine Président Assesseur Assesseur Assesseur Directeur Utilisation et besoins des médecins de l'agglomération Marseillaise concernant l'offre sanitaire et sociale de soins dans les situations gériatriques complexes. T H È S E A R T I C L E Présentée et publiquement soutenue devant LA FACULTÉ DE MÉDECINE DE MARSEILLE Le 9 Novembre 2017 Par Monsieur Ugo FARGUES Né le 27 septembre 1989 à Toulon (83) Pour obtenir le grade de Docteur en Médecine D. E. S. de MÉDECINE GÉNÉRALE Membres du Jury de la Thèse : Madame le Professeur BONIN-GUILLAUME Sylvie Monsieur le Professeur FRANCES Yves Madame le Professeur GENTILE Stéphanie Monsieur le Docteur NACASS Michal Madame le Docteur MOLINES Catherine Président Assesseur Assesseur Assesseur Directeur AIX-MARSEILLE UNIVERSITE Président : Yvon BERLAND FACULTE DE MEDECINE Doyen : Georges LEONETTI Vice-Doyen aux Affaires Générales : Patrick DESSI Vice-Doyen aux Professions Paramédicales : Philippe BERBIS Assesseurs : Chargés de mission : * aux Etudes : Jean-Michel VITON * à la Recherche : Jean-Louis MEGE * aux Prospectives Hospitalo-Universitaires : Frédéric COLLART * aux Enseignements Hospitaliers : Patrick VILLANI * à l'Unité Mixte de Formation Continue en Santé : Fabrice BARLESI * pour le Secteur Nord : Stéphane BERDAH * aux centres hospitaliers non universitaire : Jean-Nol ARGENSON * 1er cycle : Jean-Marc DURAND et Marc BARTHET * 2ème cycle : Marie-Aleth RICHARD * 3eme cycle DES/DESC : Pierre-Edouard FOURNIER * Licences-Masters-Doctorat : Pascal ADALIAN * DU-DIU : Véronique VITTON * Stages Hospitaliers : Franck THUNY * Sciences Humaines et Sociales : Pierre LE COZ * Préparation à l'ECN : Aurélie DAUMAS * Démographie Médicale et Filiarisation : Roland SAMBUC * Relations Internationales : Philippe PAROLA * Etudiants : Arthur ESQUER Responsable administratif : Chefs de service : * Déborah ROCCHICCIOLI * Communication : Laetitia DELOUIS * Examens : Marie-Thérèse ZAMMIT * Intérieur : Jolle FAVREGA * Maintenance : Philippe KOCK * Scolarité : Christine GAUTHIER DOYENS HONORAIRES M. Yvon BERLAND M. André ALI CHERIF M. Jean-François PELLISSIER Mis à jour 16/11/2016 MM AGOSTINI Serge ALDIGHIERI René ALLIEZ Bernard AQUARON Robert ARGEME Maxime ASSADOURIAN Robert AUTILLO-TOUATI Amapola BAILLE Yves BARDOT Jacques BARDOT André BERARD Pierre BERGOIN Maurice BERNARD Dominique BERNARD Jean-Louis BERNARD Pierre-Marie BERTRAND Edmond BISSET Jean-Pierre BLANC Bernard BLANC Jean-Louis BOLLINI Gérard BONGRAND Pierre BONNEAU Henri BONNOIT Jean BORY Michel BOURGEADE Augustin BOUVENOT Gilles BOUYALA Jean-Marie BREMOND Georges BRICOT René BRUNET Christian BUREAU Henri CAMBOULIVES Jean CANNONI Maurice CARTOUZOU Guy CAU Pierre CHAMLIAN Albert CHARREL Michel CHOUX Maurice CIANFARANI François CLEMENT Robert COMBALBERT André CONTE-DEVOLX Bernard CORRIOL Jacques COULANGE Christian DALMAS Henri DE MICO Philippe DEVIN Robert DEVRED Philippe DJIANE Pierre DONNET Vincent DUCASSOU Jacques DUFOUR Michel DUMON Henri FARNARIER Georges FAVRE Roger PROFESSEURS HONORAIRES MM GALLAIS Hervé GAMERRE Marc GARCIN Michel GARNIER Jean-Marc GAUTHIER André GERARD Raymond GEROLAMI-SANTANDREA André GIUDICELLI Roger GIUDICELLI Sébastien GOUDARD Alain GOUIN François GRISOLI François GROULIER Pierre HADIDA/SAYAG Jacqueline HASSOUN Jacques HEIM Marc HOUEL Jean HUGUET Jean-François JAQUET Philippe JAMMES Yves JOUVE Paulette JUHAN Claude JUIN Pierre KAPHAN Gérard KASBARIAN Michel KLEISBAUER Jean-Pierre LACHARD Jean LAFFARGUE Pierre LEVY Samuel LOUCHET Edmond LOUIS René LUCIANI Jean-Marie MAGALON Guy MAGNAN Jacques MALLAN- MANCINI Josette MALMEJAC Claude MATTEI Jean François MERCIER Claude METGE Paul MICHOTEY Georges MILLET Yves MIRANDA François MONFORT Gérard MONGES André MONGIN Maurice MONTIES Jean-Raoul NAZARIAN Serge NICOLI René NOIRCLERC Michel OLMER Michel OREHEK Jean PAPY Jean-Jacques PAULIN Raymond PELOUX Yves PENAUD Antony Mis à jour 16/11/2016 PENE Pierre PIANA Lucien PICAUD Robert PIGNOL Fernand POGGI Louis POITOUT Dominique PONCET Michel FIECHI Marius FIGARELLA Jacques FONTES Michel FRANCOIS Georges FUENTES Pierre GABRIEL Bernard GALINIER Louis MM POYEN Danièle PRIVAT Yvan QUILICHINI Francis RANQUE Jacques RANQUE Philippe RICHAUD Christian ROCHAT Hervé ROHNER Jean-Jacques ROUX Hubert ROUX Michel RUFO Marcel SAHEL José SALAMON Georges SALDUCCI Jacques SAN MARCO Jean-Louis SANKALE Marc SARACCO Jacques SARLES Jean-Claude SCHIANO Alain SCOTTO Jean-Claude SEBAHOUN Gérard SERMENT Gérard SERRATRICE Georges SOULAYROL René STAHL André TAMALET Jacques TARANGER-CHARPIN Colette THOMASSIN Jean-Marc UNAL Daniel VAGUE Philippe VAGUE/JUHAN Irène VANUXEM Paul VERVLOET Daniel VIALETTES Bernard VIGOUROUX Robert WEILLER Pierre-Jean Mis à jour 16/11/2016 PROFESSEURS HONORIS CAUSA DADI (Italie) CID DOS SANTOS (Portugal) MAC ILWAIN (Grande-Bretagne) T. A. LAMBO (Suisse) O. SWENSON (U. S. A. ) Lord J. WALTON of DETCHANT (Grande- Bretagne) P. FRANCHIMONT (Belgique) Z. J. BOWERS (U. S. A. ) 1967 MM. les Professeurs 1974 MM. les Professeurs 1975 MM. les Professeurs 1976 MM. les Professeurs 1977 MM. les Professeurs 1978 1980 MM. les Professeurs 1981 MM. les Professeurs 1982 M. le Président F. HOUPHOUET-BOIGNY (Côte d'Ivoire) C. GAJDUSEK-Prix Nobel (U. S. A. ) C. GIBBS (U. S. A. ) J. DACIE (Grande-Bretagne) A. MARGULIS (U. S. A. ) R. D. ADAMS (U. S. A. ) H. RAPPAPORT (U. S. A. ) M. SCHOU (Danemark) M. AMENT (U. S. A. ) Sir A. HUXLEY (Grande-Bretagne) S. REFSUM (Norvège) M. le Professeur W. H. HENDREN (U. S. A. ) 1985 MM. les Professeurs 1986 MM. les Professeurs S. MASSRY (U. S. A. ) KLINSMANN (R. D. A. ) E. MIHICH (U. S. A. ) Mis à jour 16/11/2016 1987 T. MUNSAT (U. S. A. ) LIANA BOLIS (Suisse) L. P. ROWLAND (U. S. A. ) M. le Professeur P. J. DYCK (U. S. A. ) R. BERGUER (U. S. A. ) W. K. ENGEL (U. S. A. ) V. ASKANAS (U. S. A. ) J. WEHSTER KIRKLIN (U. S. A. ) A. DAVIGNON (Canada) A. BETTARELLO (Brésil) 1988 MM. les Professeurs 1989 1990 MM. les Professeurs 1991 MM. les Professeurs 1992 MM. les Professeurs 1994 MM. les Professeurs 1995 MM. les Professeurs 1997 MM. les Professeurs 1998 MM. les Professeurs M. le Professeur P. MUSTACCHI (U. S. A. ) J. G. MC LEOD (Australie) J. PORTER (U. S. A. ) J. Edward MC DADE (U. S. A. ) W. BURGDORFER (U. S. A. ) H. G. SCHWARZACHER (Autriche) D. CARSON (U. S. A. ) T. YAMAMURO (Japon) G. KARPATI (Canada) W. J. KOLFF (U. S. A. ) D. WALKER (U. S. A. ) M. MULLER (Suisse) V. BONOMINI (Italie) C. DINARELLO (U. S. A. ) D. STULBERG (U. S. A. ) A. MEIKLE DAVISON (Grande-Bretagne) P. I. BRANEMARK (Suède) O. JARDETSKY (U. S. A. ) Mis à jour 16/11/2016 1999 MM. les Professeurs 2000 MM. les Professeurs 2001 MM. les Professeurs 2002 MM. les Professeurs 2003 2004 J. BOTELLA LLUSIA (Espagne) D. COLLEN (Belgique) S. DIMAURO (U. S. A. ) D. SPIEGEL (U. S. A. ) C. R. CONTI (U. S. A. ) P-B. BENNET (U. S. A. ) G. HUGUES (Grande Bretagne) J-J. O'CONNOR (Grande Bretagne) M. ABEDI (Canada) K. DAI (Chine) M. le Professeur Sir T. MARRIE (Canada) G. K. RADDA (Grande Bretagne) M. le Professeur M. DAKE (U. S. A. ) 2005 M. le Professeur L. CAVALLI-SFORZA (U. S. A. ) 2006 M. le Professeur 2007 M. le Professeur A. R. CASTANEDA (U. S. A. ) S. KAUFMANN (Allemagne) Mis à jour 16/11/2016 EMERITAT 2013 M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur BRANCHEREAU Alain CARAYON Pierre COZZONE Patrick DELMONT Jean HENRY Jean-François LE GUICHAOUA Marie-Roberte RUFO Marcel SEBAHOUN Gérard 2014 FUENTES Pierre M. le Professeur M. le Professeur GAMERRE Marc M. le Professeur MAGALON Guy M. le Professeur M. le Professeur WEILLER Pierre-Jean PERAGUT Jean-Claude 2015 COULANGE Christian COURAND François FAVRE Roger M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur MATTEI Jean-François M. le Professeur M. le Professeur OLIVER Charles VERVLOET Daniel 2016 M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur BONGRAND Pierre BOUVENOT Gilles BRUNET Christian CAU Pierre COZZONE Patrick FAVRE Roger FONTES Michel JAMMES Yves NAZARIAN Serge OLIVER Charles POITOUT Dominique SEBAHOUN Gérard VIALETTES Bernard 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2017 31/08/2017 31/08/2017 31/08/2017 31/08/2017 31/08/2018 31/08/2018 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2019 31/08/2017 31/08/2019 31/08/2019 31/08/2017 31/08/2017 31/08/2019 31/08/2019 31/08/2019 31/08/2017 31/08/2019 31/08/2017 31/08/2019 Mis à jour 16/11/2016 PROFESSEURS DES UNIVERSITES-PRATICIENS HOSPITALIERS CHAUMOITRE Kathia CHAUVEL Patrick Surnombre CHINOT Olivier CHOSSEGROS Cyrille CLAVERIE Jean-Michel Surnombre COLLART Frédéric COSTELLO Régis COURBIERE Blandine COWEN Didier AGOSTINI FERRANDES Aubert CHARPIN Denis Surnombre ALBANESE Jacques ALESSANDRINI Pierre Surnombre ALIMI Yves AMABILE Philippe AMBROSI Pierre ARGENSON Jean-Nol ASTOUL Philippe ATTARIAN Shahram AUDOUIN Bertrand AUFFRAY Jean-Pierre Surnombre AUQUIER Pascal AVIERINOS Jean-François AZORIN Jean-Michel AZULAY Jean-Philippe BAILLY Daniel BARLESI Fabrice BARLIER-SETTI Anne BARTHET Marc BARTOLI Jean-Michel BARTOLI Michel BARTOLIN Robert Surnombre BARTOLOMEI Fabrice BASTIDE Cyrille BENSOUSSAN Laurent BERBIS Philippe BERDAH Stéphane BERLAND Yvon BERNARD Jean-Paul CRAVELLO Ludovic CUISSET Thomas CURVALE Georges DA FONSECA David DAHAN-ALCARAZ Laetitia DANIEL Laurent DARMON Patrice D'ERCOLE Claude D'JOURNO Xavier DEHARO Jean-Claude DELARQUE Alain DELPERO Jean-Robert DENIS Danièle DESSEIN Alain Surnombre DESSI Patrick DISDIER Patrick DODDOLI Christophe DRANCOURT Michel DUBUS Jean-Christophe BEROUD Christophe BERTUCCI François BLAISE Didier BLIN Olivier BLONDEL Benjamin BONIN/GUILLAUME Sylvie BONELLO Laurent BONNET Jean-Louis BOTTA Alain Surnombre BOTTA/FRIDLUND Danielle DUFFAUD Florence DUFOUR Henry DURAND Jean-Marc DUSSOL Bertrand ENJALBERT Alain EUSEBIO Alexandre FAKHRY Nicolas FAUGERE Gérard FELICIAN Olivier FENOLLAR Florence BOUBLI Léon BOYER Laurent BREGEON Fabienne BRETELLE Florence BROUQUI Philippe BRUDER Nicolas BRUE Thierry BRUNET Philippe BURTEY Stéphane FIGARELLA/BRANGER Dominique FLECHER Xavier FOURNIER Pierre-Edouard FRAISSE Alain Disponibilité FRANCES Yves Surnombre FRANCESCHI Frédéric FUENTES Stéphane GABERT Jean GAINNIER Marc GORINCOUR Guillaume GRANEL/REY Brigitte GRILLO Jean-Marie Surnombre GRIMAUD Jean-Charles GROB Jean-Jacques GUEDJ Eric GUIEU Régis GUIS Sandrine GUYE Maxime GUYOT Laurent GUYS Jean-Michel HABIB Gilbert HARDWIGSEN Jean HARLE Jean-Robert HOFFART Louis HOUVENAEGHEL Gilles JACQUIER Alexis JOLIVET/BADIER Monique JOUVE Jean-Luc KAPLANSKI Gilles KARSENTY Gilles KERBAUL François LAFFORGUE Pierre LANCON Christophe LA SCOLA Bernard LAUGIER René LAUNAY Franck LAVIEILLE Jean-Pierre LE CORROLLER Thomas LE TREUT Yves-Patrice Surnombre LECHEVALLIER Eric LEGRE Régis LEHUCHER-MICHEL Marie- Pascale LEONE Marc LEONETTI Georges LEPIDI Hubert LEVY Nicolas MACE Loïc MAGNAN Pierre-Edouard MARANINCHI Dominique Surnombre MARTIN Claude Surnombre MATONTI Frédéric MEGE Jean-Louis MERROT Thierry METZLER/GUILLEMAIN Catherine MEYER/DUTOUR Anne MICCALEF/ROLL Jolle MICHEL Fabrice Mis à jour 16/11/2016 CARCOPINO-TUSOLI Xavier CASANOVA Dominique CASTINETTI Frédéric CECCALDI Mathieu CHABOT Jean-Michel CHAGNAUD Christophe CHAMBOST Hervé CHAMPSAUR Pierre CHANEZ Pascal CHARAFFE-JAUFFRET Emmanuelle CHARREL Rémi GARCIA Stéphane GARIBOLDI Vlad GAUDART Jean GENTILE Stéphanie GERBEAUX Patrick GEROLAMI/SANTANDREA René GILBERT/ALESSI Marie-Christine GIORGI Roch GIOVANNI Antoine GIRARD Nadine GIRAUD/CHABROL Brigitte GONCALVES Anthony REYNAUD Rachel RICHARD/LALLEMAND Marie-Aleth RIDINGS Bernard Surnombre ROCHE Pierre-Hugues ROCH Antoine ROCHWERGER Richard ROLL Patrice ROSSI Dominique ROSSI Pascal CHIARONI Jacques NICOLLAS Richard OLIVE Daniel OUAFIK L'Houcine PAGANELLI Franck PANUEL Michel PAPAZIAN Laurent PAROLA Philippe PARRATTE Sébastien PAUT Olivier PELISSIER-ALICOT Anne-Laure ROUDIER Jean PELLETIER Jean PETIT Philippe PHAM Thao PIARROUX Renaud PIERCECCHI/MARTI Marie- Dominique PIQUET Philippe PIRRO Nicolas POINSO François POUGET Jean Surnombre RACCAH Denis RAOULT Didier REGIS Jean REYNAUD/GAUBERT Martine SALAS Sébastien SAMBUC Roland SARLES Jacques SARLES/PHILIP Nicole SASTRE Bernard Surnombre SCAVARDA Didier SCHLEINITZ Nicolas SEBAG Frédéric SEITZ Jean-François SERRATRICE Jacques SIELEZNEFF Igor SIMON Nicolas STEIN Andréas PROFESSEUR DES UNIVERSITES ADALIAN Pascal AGHABABIAN Valérie BELIN Pascal CHABANNON Christian CHABRIERE Eric FERON François LE COZ Pierre LEVASSEUR Anthony RANJEVA Jean-Philippe SOBOL Hagay MICHEL Gérard MICHELET Pierre MILH Mathieu MOAL Valérie MONCLA Anne MORANGE Pierre-Emmanuel MOULIN Guy MOUTARDIER Vincent MUNDLER Olivier NAUDIN Jean NICCOLI/SIRE Patricia NICOLAS DE LAMBALLERIE Xavier TAIEB David THIRION Xavier THOMAS Pascal THUNY Franck TRIGLIA Jean-Michel TROPIANO Patrick TSIMARATOS Michel TURRINI Olivier VALERO René VEY Norbert VIDAL Vincent VIENS Patrice VILLANI Patrick VITON Jean-Michel VITTON Véronique VIEHWEGER Heide Elke VIVIER Eric XERRI Luc Mis à jour 16/11/2016 PROFESSEUR CERTIFIE BRANDENBURGER Chantal PRAG TANTI-HARDOUIN Nicolas PROFESSEUR ASSOCIE DE MEDECINE GENERALE A MI-TEMPS FILIPPI Simon PROFESSEUR ASSOCIE A TEMPS PARTIEL ALTAVILLA Annagrazia BURKHART Gary Mis à jour 16/11/2016 MAITRE DE CONFERENCES DES UNIVERSITE - PRATICIEN HOSPITALIER ACHARD Vincent ANDRE Nicolas ANGELAKIS Emmanouil ATLAN Catherine BACCINI Véronique BARTHELEMY Pierre BARTOLI Christophe BEGE Thierry BELIARD Sophie BERBIS Julie BERGE-LEFRANC Jean-Louis BEYER-BERJOT Laura BOUCRAUT Joseph BOULAMERY Audrey BOULLU/CIOCCA Sandrine BUFFAT Christophe CALAS/AILLAUD Marie-Françoise CAMILLERI Serge CARRON Romain CASSAGNE Carole CHAUDET Hervé COZE Carole DADOUN Frédéric (disponibilité) DALES Jean-Philippe DAUMAS Aurélie DEGEORGES/VITTE Jolle DEL VOLGO/GORI Marie-José DELLIAUX Stéphane DESPLAT/JEGO Sophie DEVEZE Arnaud Disponibilité DUFOUR Jean-Charles EBBO Mikal FABRE Alexandre FOUILLOUX Virginie FRERE Corinne GABORIT Bénédicte GASTALDI Marguerite GAUDY/MARQUESTE Caroline GELSI/BOYER Véronique GIUSIANO Bernard GIUSIANO COURCAMBECK Sophie GOURIET Frédérique GRAILLON Thomas GREILLIER Laurent GRISOLI Dominique GUIDON Catherine HAUTIER/KRAHN Aurélie HRAIECH Sami JOURDE CHICHE Noémie KASPI-PEZZOLI Elise KRAHN Martin L'OLLIVIER Coralie MOTTOLA GHIGO Giovanna NGUYEN PHONG Karine NINOVE Laetitia NOUGAIREDE Antoine OUDIN Claire OVAERT Caroline PAULMYER/LACROIX Odile PERRIN Jeanne RANQUE Stéphane REY Marc ROBAGLIA/SCHLUPP Andrée ROBERT Philippe SABATIER Renaud SARI-MINODIER Irène SARLON-BARTOLI Gabrielle SAVEANU Alexandru SECQ Véronique SOULA Gérard TOGA Caroline TOGA Isabelle TREBUCHON/DA FONSECA Agnès VALLI Marc VELLY Lionel LABIT-BOUVIER Corinne LAFAGE/POCHITALOFF-HUVALE Marina TROUSSE Delphine LAGIER Aude LAGIER Jean-Christophe LAGOUANELLE/SIMEONI Marie-Claude VELY Frédéric LEVY/MOZZICONACCI Annie LOOSVELD Marie MANCINI Julien MARY Charles MASCAUX Céline MAUES DE PAULA André MILLION Matthieu VION-DURY Jean ZATTARA/CANNONI Hélène MAITRES DE CONFERENCES DES UNIVERSITES (mono-appartenants) DESNUES Benot LIMERAT/BOUDOURESQUE Françoise MARANINCHI Marie ABU ZAINEH Mohammad BARBACARU/PERLES T. A. BERLAND/BENHAIM Caroline BERAUD/JUVEN Evelyne (retraite octobre 2016) BOUCAULT/GARROUSTE Françoise MINVIELLE/DEVICTOR Bénédicte BOYER Sylvie DEGIOANNI/SALLE Anna POGGI Marjorie RUEL Jérôme MERHEJ/CHAUVEAU Vicky MAITRE DE CONFERENCES DES UNIVERSITES DE MEDECINE GENERALE GENTILE Gatan STEINBERG Jean-Guillaume THOLLON Lionel THIRION Sylvie Mis à jour 16/11/2016 MAITRES DE CONFERENCES ASSOCIES DE MEDECINE GENERALE à MI-TEMPS ADNOT Sébastien BARGIER Jacques BONNET Pierre-André CALVET-MONTREDON Céline GUIDA Pierre JANCZEWSKI Aurélie MAITRE DE CONFERENCES ASSOCIE à MI-TEMPS REVIS Joana Mis à jour 16/11/2016 PROFESSEURS ET MAITRES DE CONFERENCES DES UNIVERSITES - PRATICIENS HOSPITALIERS PROFESSEURS ASSOCIES, MAITRES DE CONFERENCES DES UNIVERSITES (mono-appartenants) ANATOMIE 4201 CHAMPSAUR Pierre (PU-PH) LE CORROLLER Thomas (PU-PH) PIRRO Nicolas (PU-PH) LAGIER Aude (MCU-PH) THOLLON Lionel (MCF) (60ème section) ANTHROPOLOGIE 20 ADALIAN Pascal (PR) DEGIOANNI/SALLE Anna (MCF) BACTERIOLOGIE-VIROLOGIE ; HYGIENE HOSPITALIERE 4501 CHARREL Rémi (PU PH) DRANCOURT Michel (PU-PH) FENOLLAR Florence (PU-PH) FOURNIER Pierre-Edouard (PU-PH) ANATOMIE ET CYTOLOGIE PATHOLOGIQUES 4203 NICOLAS DE LAMBALLERIE Xavier (PU-PH) CHARAFE/JAUFFRET Emmanuelle (PU-PH) DANIEL Laurent (PU-PH) FIGARELLA/BRANGER Dominique (PU-PH) GARCIA Stéphane (PU-PH) XERRI Luc (PU-PH) DALES Jean-Philippe (MCU-PH) GIUSIANO COURCAMBECK Sophie (MCU PH) LABIT/BOUVIER Corinne (MCU-PH) MAUES DE PAULA André (MCU-PH) SECQ Véronique (MCU-PH) LA SCOLA Bernard (PU-PH) RAOULT Didier (PU-PH) ANGELAKIS Emmanouil (MCU-PH) GOURIET Frédérique (MCU-PH) NOUGAIREDE Antoine (MCU-PH) NINOVE Laetitia (MCU-PH) CHABRIERE Eric (PR) (64ème section) LEVASSEUR Anthony (PR) (64ème section) DESNUES Benoit (MCF) ( 65ème section ) MERHEJ/CHAUVEAU Vicky (MCF) (87ème section) BIOCHIMIE ET BIOLOGIE MOLECULAIRE 4401 ANESTHESIOLOGIE ET REANIMATION CHIRURGICALE ; MEDECINE URGENCE 4801 BARLIER/SETTI Anne (PU-PH) ALBANESE Jacques (PU-PH) AUFFRAY Jean-Pierre (PU-PH) Surnombre BRUDER Nicolas (PU-PH) KERBAUL François (PU-PH) LEONE Marc (PU-PH) MARTIN Claude (PU-PH) Surnombre MICHEL Fabrice (PU-PH) MICHELET Pierre (PU-PH) PAUT Olivier (PU-PH) GUIDON Catherine (MCU-PH) VELLY Lionel (MCU-PH) ENJALBERT Alain (PU-PH) GABERT Jean (PU-PH) GUIEU Régis (PU-PH) OUAFIK L'Houcine (PU-PH) BUFFAT Christophe (MCU-PH) MOTTOLA GHIGO Giovanna (MCU-PH) SAVEANU Alexandru (MCU-PH) Mis à jour 16/11/2016 ANGLAIS 11 BRANDENBURGER Chantal (PRCE) BURKHART Gary (PAST) BIOLOGIE CELLULAIRE 4403 ROLL Patrice (PU-PH) GASTALDI Marguerite (MCU-PH) KASPI-PEZZOLI Elise (MCU-PH) LEVY/MOZZICONNACCI Annie (MCU-PH) BIOLOGIE ET MEDECINE DU DEVELOPPEMENT ROBAGLIA/SCHLUPP Andrée (MCU-PH) ET DE LA REPRODUCTION ; GYNECOLOGIE MEDICALE 5405 METZLER/GUILLEMAIN Catherine (PU-PH) PERRIN Jeanne (MCU-PH) BIOPHYSIQUE ET MEDECINE NUCLEAIRE 4301 CARDIOLOGIE 5102 GUEDJ Eric (PU-PH) GUYE Maxime (PU-PH) MUNDLER Olivier (PU-PH) TAIEB David (PU-PH) BELIN Pascal (PR) (69ème section) RANJEVA Jean-Philippe (PR) (69ème section) CAMMILLERI Serge (MCU-PH) VION-DURY Jean (MCU-PH) AVIERINOS Jean-François (PU-PH) BONELLO Laurent (PU PH) BONNET Jean-Louis (PU-PH) CUISSET Thomas (PU-PH) DEHARO Jean-Claude (PU-PH) FRAISSE Alain (PU-PH) Disponibilité FRANCESCHI Frédéric (PU-PH) HABIB Gilbert (PU-PH) PAGANELLI Franck (PU-PH) THUNY Franck (PU-PH) BARBACARU/PERLES Téodora Adriana (MCF) (69ème section) CHIRURGIE DIGESTIVE 5202 BERDAH Stéphane (PU-PH) HARDWIGSEN Jean (PU-PH) BIOSTATISTIQUES, INFORMATIQUE MEDICALE LE TREUT Yves-Patrice (PU-PH) Surnombre ET TECHNOLOGIES DE COMMUNICATION 4604 SASTRE Bernard (PU-PH) Surnombre SIELEZNEFF Igor (PU-PH) BEYER BERJOT Laura (MCU-PH) CHIRURGIE GENERALE 5302 DELPERO Jean-Robert (PU-PH) MOUTARDIER Vincent (PU-PH) SEBAG Frédéric (PU-PH) TURRINI Olivier (PU-PH) BEGE Thierry (MCU-PH) Mis à jour 16/11/2016 CLAVERIE Jean-Michel (PU-PH) Surnombre GAUDART Jean (PU-PH) GIORGI Roch (PU-PH) CHAUDET Hervé (MCU-PH) DUFOUR Jean-Charles (MCU-PH) GIUSIANO Bernard (MCU-PH) MANCINI Julien (MCU-PH) SOULA Gérard (MCU-PH) ABU ZAINEH Mohammad (MCF) (5ème section) BOYER Sylvie (MCF) (5ème section) CHIRURGIE ORTHOPEDIQUE ET TRAUMATOLOGIQUE 5002 ARGENSON Jean-Nol (PU-PH) BLONDEL Benjamin (PU-PH) CURVALE Georges (PU-PH) FLECHER Xavier (PU PH) PARRATTE Sébastien (PU-PH) ROCHWERGER Richard (PU-PH) TROPIANO Patrick (PU-PH) CHIRURGIE INFANTILE 5402 ALESSANDRINI Pierre (PU-PH) Surnombre GUYS Jean-Michel (PU-PH) JOUVE Jean-Luc (PU-PH) LAUNAY Franck (PU-PH) MERROT Thierry (PU-PH) VIEHWEGER Heide Elke (PU-PH) CANCEROLOGIE ; RADI | HAL | Scientific |
Actrapid doit être injecté sous la peau (voie sous-cutanée). | EMEA_V3 | Medicinal |
Cet article est destiné à recevoir le solde découlant du compte de résultat de l'exercice écoulé, conformément à l'article 16 du règlement financier de l'Agence. | EMEA_V3 | Medicinal |
Valeur de l'examen ophtalmologique dans les traumatismes craniens fermés | WMT16 | Scientific |
Infection du tractus urinaire | EMEA_V3 | Medicinal |
Une augmentation de l' incidence des tumeurs rénales liées au traitement n' a pas été retrouvée dans les études de cancérogenèse après administration orale de rispéridone chez le rat Wistar (Wiga) ou la souris Swiss. | EMEA_V3 | Medicinal |
un sachet en aluminium / PVC enrobé d' une matrice appétissante | EMEA_V3 | Medicinal |
- Patients nécessitant un niveau élevé de stimulation se traduisant par : Une durée de vie inférieure à 30 mois après primo-implantation d'un neurostimulateur médullaire implantable non rechargeable ; ou une longévité estimée de la batterie du stimulateur inférieure à 30 mois. L'estimation de la longévité de la batterie est réalisée sur la base des paramètres de stimulation définis à l'issue de la phase de stimulation test et conformément aux instructions du fabricant (manuels d'utilisation ou logiciels de contrôle et programmation des dispositifs). - Douleur chronique d'origine neuropathique, après échec des alternatives thérapeutiques secondaires à : un syndrome douloureux chronique radiculaire persistant depuis au moins un an en post-opératoire ; un syndrome douloureux chronique tronculaire (d'origine diabétique, zostérienne, traumatique ou chirurgicale) persistant depuis au moins un an ; un syndrome régional douloureux complexe de type I ou II persistant depuis au moins 6 mois. - Douleur d'origine ischémique, en échec des alternatives thérapeutiques secondaires à la maladie de Buerger. | CNEDIMTS | Regulation |
Traitement du SAHOS par orthèse d'avancée mandibulaire (OAM) | WMT16 | Scientific |
Les médicaments orphelins commercialisés en France (2001-2005) : information officielle et spécificités | WMT16 | Scientific |
Grossesse et sexualité | WMT16 | Scientific |
Sédation par propofol à débit constant chez le traumatisé crânien. Résultats préliminaires | WMT16 | Scientific |
BASES PHYSIOPATHOLOGIQUES DU CHOIX DES DIUR'ETIQUES DANS LES OED'EMES DU CIRRHOTIQUE | WMT16 | Scientific |
Le service médical rendu par ALKOSALEN reste faible dans les dermatoses corticosensibles à composante kératosique ou squameuse. | BDPM | Medicinal |
Croscarmellose de sodium Cellulose microcristalline Laurylsulfate de sodium Hydroxypropylcellulose Lactose monohydraté Stéarate de magnésium. | EMEA_V3 | Medicinal |
1 flacon de 5, 0 ml d' eau pour préparations injectables. | EMEA_V3 | Medicinal |
Valeur diagnostique du test à l'insuline avec administration de propranolol | WMT16 | Scientific |
Epanchements gazeux anormaux de l'abdomen du nourrisson | WMT16 | Scientific |
INTRODUCTION A ce jour, la faune phlébotomienne connue de Madagascar comporte cinq espèces : Grassomyia squamipleuris , G madagascariensis MATÉRIEL ET MÉTHODES Les phlébotomes étudiés proviennent de trois localités distinctes Pour les exemplaires de P fertei 20 exemplaires ont pu être examinés et mesurés (tableau I) Tête Suture interoculaire incomplète Cibarium armé de 15 à 30 denticules disposés de manière anarchique et parfois de quelques dents postérieures centrales Armature pharyngienne formée de dents de petite taille disposées sur sept ou huit arcs de cercles concentriques Cavité pharyngienne brune Formule palpale : 1, 4, 3, 2, 5 Épines de Newstead lancéolées Formule antennaire : 2/III-XV, avec de longs ascoïdes atteignant l'interligne articulaire suivant A III long, toujours supérieur à (A IV A V) ; A III < F Labium pigmenté en grandes taches brunes ThoraxPrésence de une ou deux soies antéro-inférieures sur le mésanépisteme Spermathèques ( Un exemplaire examiné Tête Suture interoculaire incomplète Cibarium armé d'une dizaine de dents orientées vers l'arrière et d'une dizaine de denticules antérieurs Thorax ( Pattes non examinées Armature génitale Un exemplaire examiné et mesuré (tableau I) Tête Suture interoculaire incomplète Cibarium armé de quatre dents antérieures pointues, dirigées vers lanière, les médianes étant nettement plus développées que les latérales, et d'une trentaine de denticules postérieurs disposés de manière anarchique Armature pharyngienne formée de petites dents disposées sur des lignes plus ou moins concentriques Thorax Vestiture du mésanépisterne non examinée Spermathèques réserve du Bemaraha Au vu de l'isolement des massifs desquels les échantillons étudiés proviennent, nous imputons ces mutations à des variations de niveau infraspécifique, comme cela a déjà été observé chez diverses populations de P sergenti ). | ISTEX | Scientific |
Expérimentation sur l'homme | WMT16 | Scientific |
Insuffisance cardiaque de l'angine de poitrine. Approche hémodynamique et incidences thérapeutiques | WMT16 | Scientific |
Traitement des infections sévères : faut-il toujours administrer un aminoglycoside ? | WMT16 | Scientific |
Cancer du sein chez la jeune femme : traitements adjuvants et désir de grossesse | WMT16 | Scientific |
Epidémiologie des morsures de serpent dans les plantations de cannes à sucre de Kwilu Ngongo en République Démocratique du Congo | WMT16 | Scientific |
Possibilités et limites de l'imagerie pour l'appréciation des implants mammaires | WMT16 | Scientific |
Cellulites et phlegmons d'origine dentaire au C. H. U. de Yaoundé | WMT16 | Scientific |
MÉDICAMENTS VÉTÉRINAIRES ADMINISTRÉS AVANT L' EFFET INDÉSIRABLE SUSPECTÉ (si le nombre de produits administrés dépasse le nombre de cases disponibles, veuillez dupliquer ce formulaire) | EMEA_V3 | Medicinal |
Panorama des options prothétiques en implantologie ostéo-intégrée | WMT16 | Scientific |
Cas pour diagnostic : métastase cutanée d'un adénocarcinome mammaire | WMT16 | Scientific |
Méthadone et syndrome d'apnées du sommeil | WMT16 | Scientific |
Chirurgie carotidienne sous bloc plexique cervical. 405 interventions consécutives | WMT16 | Scientific |
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