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|---|---|---|
5 Médicaments pouvant augmenter la kaliémie ou entraner une hyperkaliémie (par exemple inhibiteurs de l' enzyme de conversion, diurétiques d' épargne potassique, suppléments potassiques, sels de régime contenant du potassium, cyclosporine ou autres médicaments tels que l' héparine sodique). | EMEA_V3 | Medicinal |
Ne pas exposer à une chaleur excessive ou au soleil. | EMEA_V3 | Medicinal |
Myalgie Douleur musculosquelettique Dorsalgie | EMEA_V3 | Medicinal |
Troubles de la fonction diastolique au cours de l'insuffisance ventriculaire gauche chronique | WMT16 | Scientific |
Le service médical rendu par SOLUPRICK contrôle négatif est important. | BDPM | Medicinal |
Le choix de la posologie devra donc être fait avec précaution et il est recommandé que la fonction rénale soit surveillée. | EMEA_V3 | Medicinal |
Chez certains d'entre eux, l'hyperglycémie était sévère et parfois accompagnée d'une acido-cétose (perturbation de la concentration des métabolites dans le sang). | EMEA_V3 | Medicinal |
Instructions sur la préparation de la dilution de XYREM | EMEA_V3 | Medicinal |
Nodule rhumatoïde pulmonaire | WMT16 | Scientific |
Développement de la moelle épinière, du rachis et de la fosse posterieure | WMT16 | Scientific |
1/5. La sclérose en plaques | WMT16 | Scientific |
DOLKO 1 g, comprimé sécable - Résumé des caractéristiques du produit. ANSM - Mis à jour le : 08/07/2021 DOLKO 1 g, comprimé sécable Paracétamol. 1 g Pour un comprimé sécable. Pour la liste complète des excipients, voir rubrique 6. 1. Comprimé blanc, oblong. Cette présentation est RESERVEE A L'ADULTE et l'ENFANT à partir de 50 kg (à partir d'environ 15 ans). La posologie usuelle est de 1 demi à 1 comprimé à 1 g par prise, à renouveler en cas de besoin au bout de 4 heures minimum. Il n'est généralement pas nécessaire de dépasser 3 g de paracétamol par jour, soit Cependant, en cas de douleurs plus intenses, la posologie maximale peut être augmentée jusqu'à 4 g par jour, soit par jour. Toujours respecter un intervalle de 4 heures entre les prises. : voir rubrique 4. 4. Fréquence d'administration Les prises systématiques permettent d'éviter les oscillations de douleur ou de fièvre : chez l'adulte, elles doivent être espacées de 4 heures minimum. Insuffisance rénale En cas d'insuffisance rénale sévère (clairance de la créatinine inférieure à 10 ml/min), l'intervalle entre deux prises sera au minimum de . La dose de paracétamol ne devra pas dépasser par jour, soit 3 comprimés. Mode d'administration Voie orale. Les comprimés sont à avaler, si besoin après les avoir cassés en deux, tels quels avec une boisson (par exemple eau, lait, jus de fruit). Insuffisance hépatocellulaire. Pour éviter un risque de surdosage, vérifier l'absence de paracétamol dans la composition d'autres médicaments. Doses maximales recommandées : , LA DOSE TOTALE DE PARACETAMOL NE DOIT PAS EXCEDER 4 GRAMMES PAR JOUR ( ). faisant l'objet de précautions d'emploi Risque d'augmentation de l'effet de l'anticoagulant oral et du risque hémorragique en cas de prise de paracétamol aux doses maximales (4 g/j) pendant au moins 4 jours. Contrôle régulier de l'INR. Adaptation éventuelle de la posologie de l'anticoagulant oral pendant le traitement par le paracétamol et après son arrêt. Interactions avec les examens paracliniques La prise de paracétamol peut fausser le dosage de la glycémie par la méthode à la glucose oxydase-peroxydase en cas de concentrations anormalement élevées. La prise de paracétamol peut fausser le dosage de l'acide urique sanguin par la méthode à l'acide phosphotungstique. Grossesse Allaitement Aux doses thérapeutiques, l'administration de ce médicament est possible pendant l'allaitement. Quelques rares cas de réactions d'hypersensibilité à type de choc anaphylactique, œdème de Quincke, érythème, urticaire, rash cutané ont été rapportés. Leur survenue impose l'arrêt définitif de ce médicament et des médicaments apparentés. De très rares cas de réactions cutanées graves ont été signalés. De très exceptionnels cas de thrombopénie, leucopénie et neutropénie ont été signalés. Déclaration des effets indésirables suspectés La déclaration des effets indésirables suspectés après autorisation du médicament est importante. Elle permet une surveillance continue du rapport bénéfice/risque du médicament. Les professionnels de santé déclarent tout effet indésirable suspecté via le système national de déclaration : Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé (ANSM) et réseau des Centres Régionaux de Pharmacovigilance - Site internet : Symptômes Nausées, vomissements, anorexie, pâleur, douleurs abdominales apparaissent généralement dans les 24 premières heures. Un surdosage, à partir de 10 g de paracétamol en une seule prise chez l'adulte et 150 mg/kg de poids corporel en une seule prise chez l'enfant, provoque une cytolyse hépatique susceptible d'aboutir à une nécrose complète et irréversible se traduisant par une insuffisance hépatocellulaire, une acidose métabolique, une encéphalopathie pouvant aller jusqu'au coma et à la mort. Simultanément, on observe une augmentation des transaminases hépatiques, de la lactico-déshydrogénase, de la bilirubine et une diminution du taux de prothrombine pouvant apparatre 12 à 48 heures après l'ingestion. Conduite d'urgence Transfert immédiat en milieu hospitalier. Prélever un tube de sang pour faire le dosage plasmatique initial de paracétamol. Evacuation rapide du produit ingéré, par lavage gastrique, en cas de prise orale. Le traitement du surdosage comprend classiquement l'administration aussi précoce que possible de l'antidote N-acétylcystéine par voie I. V. ou voie orale si possible la dixième heure. Traitement symptomatique. (N : Système nerveux central). L'absorption du paracétamol par voie orale est complète et rapide. Les concentrations plasmatiques maximales sont atteintes 30 à 60 minutes après ingestion. Distribution Le paracétamol se distribue rapidement dans tous les tissus. Les concentrations sont comparables dans le sang, la salive et le plasma. La liaison aux protéines plasmatiques est faible. Métabolisme Le paracétamol est métabolisé essentiellement au niveau du foie. Les 2 voies métaboliques majeures sont la glycuroconjugaison et la sulfoconjugaison. Cette dernière voie est rapidement saturable aux posologies supérieures aux doses thérapeutiques. Une voie mineure, catalysée par le cytochrome P 450, est la formation d'un intermédiaire réactif (le N-acétyl benzoquinone imine), qui, dans les conditions normales d'utilisation, est rapidement détoxifié par le glutathion réduit et éliminé dans les urines après conjugaison à la cystéine et à l'acide mercaptopurique. En revanche, lors d'intoxications massives, la quantité de ce métabolite toxique est augmentée. Elimination L'élimination est essentiellement urinaire. 90 % de la dose ingérée est éliminée par le rein en 24 heures, principalement sous forme glycuroconjuguée (60 à 80 %) et sulfoconjuguée (20 à 30 %). Moins de 5 % est éliminé sous forme inchangée. La demi-vie d'élimination est d'environ 2 heures. Variations physiopathologiques : : en cas d'insuffisance rénale sévère (clairance de la créatinine inférieure à 10 ml/min), l'élimination du paracétamol et de ses métabolites est retardée. : la capacité de conjugaison n'est pas modifiée. 3 ans. 8 comprimés sécables sous plaquette thermoformée (PVC/Aluminium). dans la population 18 RUE CAMILLE PELLETAN 92300 LEVALLOIS-PERRET Sans objet. Médicament non soumis à prescription médicale. | BDPM | Medicinal |
Exposition aux endotoxines : influence de l'alimentation et rôle dans le vieillissement cognitif Perrine Andre To cite this version : Perrine Andre. Exposition aux endotoxines : ment cognitif. Médecine humaine et pathologie. Université de Bordeaux, 2020. Français. 2020BORD0177. tel-03123144 influence de l'alimentation et rôle dans le vieillisse- NNT : HAL Id : tel-03123144 Submitted on 27 Jan 2021 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. THÈSE PRÉSENTÉE POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DE BORDEAUX ÉCOLE DOCTORALE SOCIÉTÉS, POLITIQUE, SANTÉ PUBLIQUE SPÉCIALITÉ SANTÉ PUBLIQUE OPTION ÉPIDÉMIOLOGIE EXPOSITION AUX ENDOTOXINES : INFLUENCE DE L'ALIMENTATION ET RÔLE DANS LE VIEILLISSEMENT COGNITIF Par Perrine ANDRÉ Sous la direction de Catherine FÉART Soutenue le 9 novembre 2020 Membres du jury M. David-Alexandre Tregoet DR, Inserm U1219, Bordeaux Président Mme. Fatemeh Nourhashemi PUPH, Toulouse Rapportrice Mme. Marie-Caroline Michalski DR, INRAE, Lyon Rapportrice M. Stéphane Walrand PUPH, CRNH, Clermont-Ferrand Examinateur M. Benjamin Allès CR, EREN, Paris Examinateur EXPOSITION AUX ENDOTOXINES : INFLUENCE DE L'ALIMENTATION ET RÔLE DANS LE VIEILLISSEMENT COGNITIF Résumé. La forme sporadique de la maladie d'Alzheimer représente l'une des maladies neurodégénératives les plus répandues à travers le monde, demeurant toutefois incurable de nos jours ; les traitements pharmacologiques ne permettant que d'en atténuer les symptômes sans pour autant freiner la progression de la maladie. Dans un modèle vie-entière d'interaction entre prédisposition génétique et facteurs environnementaux, les endotoxines - des substances toxiques d'origine bactérienne à fort potentiel pro-inflammatoire - émergent en tant que facteurs préjudiciables dans le concept de vieillissement en bonne santé. L'alimentation, théoriquement capable d'agir à la fois sur la composition du microbiote intestinal (principal réservoir à endotoxines de l'organisme) et d'influencer le passage des endotoxines vers la circulation sanguine, représente une stratégie prometteuse dans la modulation de l'exposition aux endotoxines. Les objectifs de cette thèse ont été d'une part (i) d'évaluer l'association entre des profils alimentaires et un biomarqueur de l'exposition plasmatique aux endotoxines, et d'autre part (ii) d'évaluer l'association entre des biomarqueurs de l'exposition plasmatique aux endotoxines et le risque de maladie d'Alzheimer, au sein d'une population âgée. Compte-tenu de la nature multidimensionnelle de l'alimentation, deux approches complémentaires ont été utilisées pour définir l'exposition nutritionnelle. Le score d'adhérence au régime Méditerranéen (construit selon une approche confirmatoire a priori) ainsi que l'adhérence à un régime de type prudent (dérivé d'une approche exploratoire a posteriori) caractérisé principalement par une consommation riche en fruits et légumes et pauvre en biscuits, étaient inversement associés aux taux circulants d'acides gras 3-hydroxylés, un proxy de la quantification totale en endotoxines plasmatiques. À l'inverse, un régime de type sud-ouest caractérisé principalement par une consommation riche en alcool, viande, charcuterie et dans une moindre mesure en légumineuses et céréales était associé à des taux plus élevés d'acides gras 3-hydroxylés. Ces résultats suggéraient que l'alimentation pourrait être une piste prometteuse ciblant l'endotoxémie, et donc les processus inflammatoires en découlant, chez la personne âgée. Alors qu'aucune association n'a été mise en évidence entre les taux d'acides gras 3-hydroxylés à l'inclusion et le risque de survenue d'une maladie d'Alzheimer, des élevés de Lipopolysaccharides-Binding Protein (LBP) - protéine de transport des endotoxines - étaient associés à un sur-risque de maladie d'Alzheimer plus d'une décennie après. Étant donné que la LBP, essentielle dans l'initiation de la réponse immunitaire et inflammatoire aux endotoxines, est considérée comme un biomarqueur de l'activité biologique effective des endotoxines comparativement à la quantité totale en endotoxines circulantes, ces résultats suggéraient l'implication de l'endotoxémie dans la pathogenèse de la maladie d'Alzheimer. taux plasmatiques plus Mots clés. Endotoxémie ; Lipopolysaccharides ; Démence ; Maladie d'Alzheimer ; Alimentation ; Profils alimentaires Unité de recherche Unité INSERM U1219 - Université de Bordeaux ISPED 146 rue Léo Saignat 33076 Bordeaux, France ENDOTOXIN EXPOSURE : DIET INFLUENCE AND ROLE IN COGNITIVE AGING Abstract. The sporadic form of Alzheimer's disease is one of the most widespread neurodegenerative diseases worldwide, yet remains incurable today ; pharmacological treatments only alleviate the symptoms without slowing down the disease progression. In a life-course model of interaction between genetic predisposition and environmental factors, endotoxins - toxic substances of bacterial origin with strong pro-inflammatory potential - emerge as detrimental factors in the concept of healthy aging. Diet, theoretically capable of acting both on the composition of the gut microbiota (the body's main endotoxin reservoir) and of influencing the passage of endotoxins into the bloodstream, represents a promising strategy in modulating endotoxin exposure. The objectives of this thesis were (i) to assess the association between dietary patterns and a biomarker of total plasma endotoxin exposure, and (ii) to assess the association between biomarkers of plasma endotoxin exposure and the risk of Alzheimer's disease, in an elderly population. Given the multidimensional nature of diet, two complementary approaches were used to assess dietary exposure. The adherence to the Mediterranean diet (based on a a priori confirmatory approach) as well as adherence to a prudent type diet (derived from a a posteriori exploratory approach) mainly characterized by a high consumption of fruits and vegetables and a low one in cookies, were inversely associated with circulating levels of 3- hydroxy fatty acids, a proxy of the total plasma endotoxins exposure. Conversely, a south-west diet mainly characterized by a high consumption of alcohol, meat, processed meat and to a lesser extent legumes and cereals was associated with higher levels of 3-hydroxy fatty acids. These results suggested that the diet could be a promising strategy to target endotoxemia and its consequence on inflammatory processes. While no association has been observed between the baseline levels of 3-hydroxy fatty acids and the risk of Alzheimer's disease, higher plasma levels of Lipopolysaccharides-Binding Protein (LBP) - an endotoxin transport protein - were associated with an increased risk of Alzheimer's disease more than a decade later. Given that LBP is considered as a biomarker of the current biological activity of endotoxins compared with the total amount of circulating endotoxins, and essential in the initiation of the immune and inflammatory response to endotoxins, these results suggested the involvement of endotoxemia in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Key words. Endotoxemia ; Lipopolysaccharides ; Dementia ; Alzheimer's disease ; Diet ; Dietary profiles Unité de recherche Unité INSERM U1219 - Université de Bordeaux ISPED 146 rue Léo Saignat 33076 Bordeaux, France REMERCIEMENTS Une montagne. Mais pas n'importe quelle montagne. Non. Le genre de montagne entourée d'un épais nuage opaque, nous empêchant d'en voir le sommet. Le genre de montagne empli de sinueux sentiers à l'horizon inconnu. Le genre de montagne qui nous ébahi par son incommensurable grandeur. Le genre de montagne qu'on ne gravit qu'une fois dans sa vie. Ce genre de montagne. Ce genre de montagne que ma directrice de thèse m'a dessiné il y a de cela 3 ans comme métaphore du doctorat que j'allais entreprendre. Et quelle belle métaphore. De la base symbolisant le début de cette aventure en septembre 2017, jusqu'à son sommet, symbole de la ligne d'arrivée. Et enfin, une montagne car j'ai une montagne de remerciements à faire. À ma directrice de thèse, Catherine Féart À l'instar d'un guide, tu as su m'orienter à travers chemins et après 3 belles années, ça y est, nous y sommes au sommet de cette montagne. Et aujourd'hui, si tu me le permets, j'aimerais ajouter un petit drapeau en son pic. De là-haut, on peut apercevoir tout le chemin que l'on a parcouru pour en arriver jusqu'ici. Un chemin qui, après coups, n'a pas toujours été le choix le plus simple ! Mais quelle belle aventure. Je ne te remercierai jamais assez pour ta confiance, ta bienveillance infaillible et ton partage d'expérience. Merci pour ton optimiste, pour ces réunions passionnantes et pour toutes ces incroyables expériences que j'ai pu vivre durant ces 3 années grâce à toi. Au-delà de tes qualités en tant que directrice de thèse, tu es une personne inspirante et rayonnante comme on en rencontre peu dans une vie. Tu sais tout le bien que je pense de toi. Ce fut un honneur d'être ta première doctorante. Aux membres de mon jury de thèse, Merci à vous, M. David-Alexandre Tregoet, Mme Fatemeh Nourhashemi, Mme Marie-Caroline Michalski, M. Benjamin Allès et M. Walrand pour l'enthousiasme dont vous avez fait preuve en acceptant d'évaluer ces travaux de thèse. Vos expertises complémentaires seront, j'en suis convaincue, à l'origine de discussions des plus intéressantes. C'est un honneur de défendre ma thèse face à vous. À l'équipe pédagogique de l'ISPED Mes sincères remerciements à toute l'équipe pédagogique de l'ISPED pour les enseignements de qualité dont j'ai pu bénéficier. Des outils qui m'ont été essentiels pour gravir cette montagne. Et c'est avec je l'avoue un peu de nostalgie que je me retourne désormais en admirant tout le chemin parcouru jusqu'ici. Un chemin qui a été rempli de belles rencontres. À l'équipe LEHA et autres collaborateurs du centre BPH Tout d'abord, je souhaiterais remercier l'équipe LEHA et les autres collaborateurs du centre BPH : Cécile, Catherine F, Cécilia, Catherine H, Karine, Sylvie, Luc, Audrey, Mélanie, Bénédicte M, Marie-Hélène, Corinne, Jean-François Dartigues Merci à vous pour votre accueil chaleureux, votre bienveillance et votre expertise. Il est rare d'être aussi vite, et aussi bien, intégrée dans une équipe. À l'ensemble de mes collaborateurs J'adresse mes infinis remerciements à l'ensemble des personnes avec qui j'ai eu l'honneur de collaborer pour mener à bien ces travaux de thèse mais également d'autres projets ancillaires. Plus particulièrement, Mme Fabienne Laugerette merci pour votre expertise précieuse et votre accueil au sein du laboratoire CarMeN. M. Jean-Paul Pais de Barros, merci pour votre disponibilité, votre expertise et votre intérêt dans mes recherches. Mme Martine Morzel, M. Éric Neyraud, M. Gordon Proctor, M. David Gomez-Cabrero, M. Fernando Rodriguez-Artalejo, Mme Esther Lopez-Garcia, Mme Esther Garcia-Esquinas, merci à vous pour cette belle collaboration, votre dynamisme, votre bienveillance et nos échanges toujours plus intéressants les uns que les autres. Aux membres de mon comité de suivi de thèse Pour votre regard expert et vos conseils précieux, merci à vous d'avoir accepté de faire partie de mon comité de suivi de thèse : M. Luc Letenneur, Mme Lucile Capurron et Mme Linda Wittkop. Aux patients, famille de patients et aux personnes engagées dans la recherche Je souhaiterais également dédier cette thèse aux patients et aux familles des patients atteints de la maladie d'Alzheimer, ainsi qu'à l'ensemble des personnes qui accorde chaque jour de leur temps dans le seul but de faire avancer la recherche. Aux responsables pédagogiques et étudiants Le partage scientifique étant probablement l'une des plus belles choses que je pouvais offrir durant ma thèse, je souhaiterais sincèrement remercier les responsables pédagogiques des parcours IADE, sages-femmes, M1 EAD de l'ISPED et DU Méthodes statistiques en santé qui m'ont fait confiance en me permettant d'encadrer et de dispenser les cours d'épidémiologie et de statistiques à leurs étudiants tout au long de ces années. Merci également à l'ensemble des étudiants pour votre dynamisme et vos attentions touchantes tout au long des cours. Au bureau Michou J'aimerais ensuite tout particulièrement remercier le bureau Michou - et sa version élargie - o j'ai passé le plus clair de mon temps durant ces 3 dernières années. Un bureau qui pourrait s'apparenter à un refuge o se ressourcer, sur les sentiers sinueux de cette montagne. J'ai eu la chance d'y rencontrer bien plus que de simples collègues. Des personnes bienveillantes et attentionnées qui illuminent vos journées du matin au soir. On devrait tous avoir un petit bureau Michou dans sa vie. Merci à vous Bénédicte, Virginie N, Morgane, Aline, Hermine, Sophie, Maude, Soufiane, Leslie, Gwendoline, Camille, Corentin, Jocelyn, Virginie C, Quentin, Jérémie, Marine, Marie-Gabrielle Ne changez rien, vous êtes exceptionnels tous autant que vous êtes. Par cette thèse, je succède à certains d'entre vous (qui ont d'ailleurs placé la barre très haute ! ), et c'est à mon tour avec beaucoup d'humilité et de bienveillance que je souhaite encourager ceux et celles qui vont me succéder dans cette aventure, avec une pensée toute particulière pour Morgane, et mes 2 co-doctorantes Hermine & Virginie C. À vous, futurs doctorants, je vous souhaite de trouver votre propre voie qui vous mènera au sommet, et bien plus loin encore. Ce n'est qu'un au revoir, bureau Michou ! À mes amis Une énorme pensée à mes chers amis et Matres Buveurs toujours présents malgré l'éloignement géographique. Vous êtes la famille que j'ai choisie : Mathou, Hina, Sel, le Bozec, Salanon, p'tit Seb, Pq, Alizée, Caleca, Dzierzbicki, Charles, Alix, Élo, Caro, Fr, Freud, Flo, G-lo, Jo, Mayeul, Caro, Vincent, Margaux, Barri, Besson, Aymeric, Élodie, Aurèle, Astrid, Zielcke, Kéo, Lulu, Dodo, Marie-Laure, Jojo, Gégé, Mallow, Laury, Beber Merci de faire partie de ma vie depuis tant d'années. À ma petite sœur À toi ma petite sœur, mon yin et mon yang à la fois, à toutes nos chamailleries mais surtout à tout cet amour et cette bienveillance que je te porte. À tous mes êtres proches À mes grands-parents et à tous mes êtres proches dont certains sont partis trop tôt, je vous dédie cette thèse. La vie a peut-être le pouvoir de nous éloigner physiquement, mais ne pourra me priver de ce que vous m'avez donné et enseigné. À mes parents Et enfin, que serait une montagne sans ses puissantes bases. A vous, mes parents. De vrais piliers dans une vie. Une thèse entière ne suffirait pas pour vous dire à quel point vous comptez pour moi. Merci d'avoir fait de moi ce que je suis. Merci de m'avoir transmis vos valeurs, votre positivité sans faille, et tant de choses encore. Grâce à vous et votre soutien indéfectible, je serais capable d'en déplacer des centaines, des montagnes comme celle-là ! Table des matières TABLE DES MATIERES VALORISATION SCIENTIFIQUE LISTE DES TABLEAUX LISTE DES FIGURES LISTE DES ANNEXES LISTE DES ACRONYMES ET ABREVIATIONS NOTATIONS AVANT-PROPOS : INTRODUCTION GÉNÉRALE ET OBJECTIFS CHAPITRE I. INTRODUCTION ET ÉTAT DES CONNAISSANCES 1 1 1. 1. SYNDROME DEMENTIEL ET DECLIN COGNITIF LIE A L'AGE 1 1. 1. 1. ÉVOLUTION DU CONCEPT HISTORIQUE 2 1. 1. 2. HETEROGENEITE DU TABLEAU CLINIQUE 2 1. 1. 2. 1. Diagnostic clinique du syndrome démentiel 3 1. 1. 2. 2. Etiologies principales du syndrome démentiel 4 1. 1. 2. 3. Diagnostic clinique de la maladie d'Alzheimer 5 1. 1. 3. SIGNES NEUROPATHOLOGIQUES DE LA MALADIE D'ALZHEIMER 9 1. 1. 4. PREVALENCE, INCIDENCE ET TENDANCES EVOLUTIVES 11 1. 1. 5. PRISE EN CHARGE ET TRAITEMENTS PHARMACOLOGIQUES 13 1. 1. 6. UN PROCESSUS MULTI-PATHOGENIQUE VIE-ENTIERE 13 1. 1. 6. 1. Facteurs de risques non modifiables 15 1. 1. 6. 2. Facteurs de risques modifiables 15 1. 1. 6. 2. 1. Facteurs cardio-vasculaires 16 1. 1. 6. 2. 2. Facteurs psycho-sociaux 17 1. 1. 6. 2. 3. Facteurs de mode de vie 20 1. 1. 6. 2. 4. Intérêt des études multi-domaines 21 1. 1. 7. SYSTEME IMMUNITAIRE INNE ET COMPOSANTE INFLAMMATOIRE DANS LA MALADIE D'ALZHEIMER 23 1. 1. 7. 1. Neuro-inflammation 26 1. 1. 7. 2. Voies de communication entre le système nerveux central et la périphérie 28 1. 1. 7. 3. Inflammation systémique 28 1. 1. 7. 3. 1. Association entre inflammation systémique et maladie d'Alzheimer 29 1. 1. 7. 3. 2. Hypothèse infectieuse dans la composante inflammatoire de la maladie d'Alzheimer 1. 1. 7. 3. 3. L'inflammation systémique comme dénominateur commun de nombreux facteurs de risque de la maladie d'Alzheimer 30 1. 1. 7. 4. Prédisposition génétique associée aux composants du système immunitaire et à l'inflammation 1. 1. 7. 5. Traitements anti-inflammatoires non stéroïdiens 31 32 1. 2. LES ENDOTOXINES : DES SUBSTANCES TOXIQUES UBIQUITAIRES 1. 2. 1. DEFINITION, STRUCTURE ET ORIGINE 1. 2. 2. LE MICROBIOTE INTESTINAL : RESERVOIR ENDOGENE D'ENDOTOXINES 1. 2. 3. ENDOTOXEMIE 1. 2. 4. REPONSE IMMUNITAIRE ET PROCESSUS INFLAMMATOIRE EN REPONSE A L'ENDOTOXEMIE 1. 2. 5. UN LARGE SPECTRE DE PATHOLOGIES ASSOCIEES 1. 2. 6. ROLE DANS LES TROUBLES COGNITIFS ET LA DEMENCE 35 35 36 38 39 44 48 1. 2. 7. 1. Contribution des modèles d'inoculation d'endotoxines dans la compréhension de la pathologie 48 de la démence 48 1. 2. 7. 1. 1. Modèles expérimentaux chez l'animal 1. 2. 7. 1. 2. Inoculation systémique d'endotoxines chez l'Homme 50 1. 2. 7. 2. Expositions vie-entière aux endotoxines, troubles cognitifs et syndrome démentiel : études observationnelles 52 1. 3. LA NUTRITION : UN FACTEUR CLE DANS L'EXPOSITION VIE-ENTIERE AUX ENDOTOXINES 1. 3. 1. DU MACRONUTRIMENT CANDIDAT 1. 3. 2. VERS UNE APPROCHE PAR PROFIL ALIMENTAIRE CHAPITRE II. HYPOTHÈSES ET OBJECTIFS SPÉCIFIQUES DU PROJET DE THÈSE CHAPITRE III. DONNÉES DISPONIBLES 3. 1. LA COHORTE DES 3-CITES 3. 1. 1. OBJECTIF ET POPULATION 3. 1. 2. RECUEIL DE DONNEES 3. 1. 2. 1. Données générales 3. 1. 2. 2. Données cognitives, d'imagerie et de diagnostic de démence 3. 1. 2. 3. Données nutritionnelles 3. 2. PROJET ENIMA 3. 2. 1. SELECTION DE L'ECHANTILLON ET DESIGN D'ETUDE 3. 2. 2. DOSAGE DES MARQUEURS DE L'ENDOTOXEMIE ET DE L'INFLAMMATION 3. 3. PROJET NUTENDEM 3. 3. 1. SELECTION DE L'ECHANTILLON D'ETUDE 3. 3. 2. DOSAGE DU MARQUEUR DE L'ENDOTOXEMIE CHAPITRE IV. PROFILS ALIMENTAIRES ET ENDOTOXÉMIE 4. 1. INTRODUCTION 4. 2. METHODOLOGIE STATISTIQUE 4. 2. 1. IDENTIFICATION DES PROFILS ALIMENTAIRES A PRIORI ET A POSTERIORI 4. 2. 1. 1. Le régime Méditerranéen a priori 4. 2. 1. 2. Profils alimentaires a posteriori 4. 2. 2. MINI NUTRITIONAL ASSESSMENT 4. 2. 3. SYNDROME METABOLIQUE 4. 2. 4. METHODOLOGIE STATISTIQUE 4. 2. 4. 1. Codage des covariables 4. 2. 4. 2. Analyses statistiques 4. 3. RESULTATS 4. 3. 1. CARACTERISTIQUES DESCRIPTIVES 4. 3. 1. 1. Caractéristiques descriptives des participants 4. 3. 1. 2. Caractéristiques descriptives des profils alimentaires 4. 3. 1. 3. Caractéristiques descriptives des taux d'acides gras 3-hydroxylés 4. 3. 2. ASSOCIATION ENTRE PROFILS ALIMENTAIRES ET TAUX CIRCULANTS D'ACIDES GRAS 3-HYDROXYLES 4. 3. 3. ANALYSES DE SENSIBILITE 4. 3. 4. ANALYSES SECONDAIRES 4. 3. 4. 1. Risque de malnutrition et taux circulants d'acides gras 3-hydroxylés 4. 3. 4. 2. Syndrome métabolique et taux circulants d'acides gras 3-hydroxylés 55 55 58 61 64 64 64 64 64 66 69 72 72 74 75 75 75 76 76 76 76 77 79 80 82 82 82 83 84 84 84 88 92 94 96 96 96 96 4. 4. DISCUSSION CHAPITRE V. ENDOTOXÉMIE ET RISQUE DE DÉMENCE 97 101 5. 1. INTRODUCTION 5. 2. METHODOLOGIE ET RESULTATS DU PROJET ENIMA 5. 2. 1. METHODOLOGIE STATISTIQUE 5. 2. 1. 1. Codage des covariables 5. 2. 1. 2. Analyses statistiques 5. 2. 2. RESULTATS 5. 2. 2. 1. Caractéristiques descriptives 5. 2. 2. 2. Association entre biomarqueurs de l'exposition aux endotoxines et risque de maladie d'Alzheimer 5. 2. 2. 3. Analyses de sensibilité 5. 3. METHODOLOGIE ET RESULTATS DU PROJET NUTENDEM 5. 3. 1. METHODOLOGIE STATISTIQUE 5. 3. 1. 1. Codage des covariables 5. 3. 1. 2. Analyses statistiques 5. 3. 2. RESULTATS 5. 3. 2. 1. Caractéristiques descriptives 5. 3. 2. 2. Association entre biomarqueurs de l'exposition aux endotoxines et risque de démence ou de maladie d'Alzheimer 5. 4. DISCUSSION 106 109 111 111 111 112 113 113 101 101 102 102 102 104 104 114 116 CHAPITRE VI. DISCUSSION GÉNÉRALE ET PERSPECTIVES RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ANNEXES 121 126 162 Valorisation scientifique Articles scientifiques et communications dans le cadre du projet de thèse Articles publiés : André P, Samieri C, Buisson C, Dartigues JF, Helmer C, Laugerette F, Féart C. Lipopolysaccharide-Binding Protein, Soluble CD14, and the Long-Term Risk of Alzheimer's Disease : A Nested Case-Control Pilot Study of Older Community Dwellers from the Three-City Cohort. J Alzheimers Dis. 2019 ; 71(3) : 751-761. DOI : 0. 3233/JAD-190295. André P, Laugerette F, Féart C. Metabolic Endotoxemia : A Potential Underlying Mechanism of the Relationship between Dietary Fat Intake and Risk for Cognitive Impairments in Humans ? Nutrients. 2019 Aug 13 ; 11(8) : 1887. DOI : 10. 3390/nu11081887. Article en cours de soumission : André P, Pais de Barros JP, Samieri C, Merle B, Helmer C, Delcourt C, Féart C. Mediterranean diet and prudent diet are both associated with low circulating esterified 3-hydroxy fatty acids, a proxy of lipopolysaccharide (LPS) burden, among older adults. (soumis à The American Journal of Clinical Nutrition). Communications orales : André P, Samieri C, Buisson C, Pierre V, Helmer C, Laugerette F, Féart C. Plasma endotoxemia, inflammation and long-term risk of Alzheimer's disease among elderly community-dwellers. International Life Science Institute. Nutrition for the ageing brain : Moving towards clinical applications. 30-31 août 2018. Madrid (Espagne). André P, Samieri C, Buisson C, Pierre V, Helmer C, Laugerette F, Féart C. Rôle de l'endotoxémie dans la maladie d'Alzheimer. Séminaire de recherche : approches et expertises croisées dans l'étude du vieillissement. Bordeaux Population Health Center. 24 janvier 2019. Bordeaux (France). André P, Bergheim I, Weber D, Brandt A, Helmer C, Féart C. Lipopolysaccharide (LPS)- Binding Protein, marqueur de l'activation immunitaire en réponse aux LPS, et syndrome métabolique chez la personne âgée. Journées Francophones de la Nutrition. 27-29 novembre 2019. Rennes (France). Communications affichées : André P, Samieri C, Buisson C, Pierre V, Helmer C, Laugerette F, Féart C. Plasma endotoxemia, inflammation and long-term risk of Alzheimer's disease among elderly community-dwellers. Alzheimer's Association International Conference. 26-30 juillet 2019. Los Angeles (États-Unis). André P, Pais de Barros JP, Merle B, Helmer C, Delcourt C, Féart C. Mediterranean and a posteriori Prudent diets are associated with low circulating 3-hydroxy fatty acids, a proxy of Lipopolysaccharide (LPS) burden. ESPEN Congress on Clinical Nutrition and Metabolism. 19- 21 septembre 2020. Congrès Virtuel. Communication récompensée par un prix : André P, Samieri C, Buisson C, Pierre V, Helmer C, Laugerette F, Féart C. Plasma endotoxemia, inflammation and long-term risk of Alzheimer's disease among elderly community-dwellers. Mind Mood Microbes. 17-18 janvier 2019. Amsterdam (Pays-Bas) (prix du meilleur poster). Partage scientifique : Co-responsable avec Morgane Linard de la mise en place de réunions mensuelles sur la thématique Infection, Inflammation et Démence' (2ID) regroupant des épidémiologistes, cliniciens, virologues et biologistes. Club 2ID Infection, Inflammation et Démence. Réunions mensuelles de 2019 à 2020. Bordeaux (France). Participation à un comité éditorial d'analyse critique d'articles scientifiques dans le domaine de la démence, au profit des cliniciens. Biblio Démence. Réunions mensuelles de 2017 à 2020. Bordeaux (France). Articles scientifiques et communications en dehors du projet de thèse Articles publiés : G Proctor, André P, Lopez-Garcia E, Gomez-Cabrero D, Neyraud E, Féart C, Rodriguez- Artalejo F, Garcia Esquinas E, Morzel M. The SALAMANDER project : SALivAry bioMarkers of mediterraneAN Diet associated with long-tERm protection against type 2 diabetes. British Nutrition Foundation Nutrition Bulletin, 42, 369-374. 2017. Butcher L, Pérès K, André P, Morris R, Walter S, Dartigues JF, Rodriguez-Maas L, Féart C, Erusalimsky J, FRAILOMIC consortium. Association between plasma CCL11 (eotaxin-1) and cognitive status in older adults : Differences between rural and urban dwellers. Exp Gerontol. 2018 ; 113 : 173-179. DOI : 10. 1016/j. exger. 2018. 10. 004. André P, Proctor G, Driollet B, Garcia-Esquinas E, Lopez-Garcia E, Gomez-Cabrero D, Neyraud E, Rodriguez-Artalejo F, Morzel M, Féart C. The role of overweight on the association between Mediterranean diet and risk of type 2 diabetes mellitus : a mediation analysis among 21 585 UK Biobank participants. Int J Epidemiol. 2020. DOI : 10. 1093/ije/dyaa103. Article en préparation : Chambon C, Neyraud E, Sayd T, Bros P, Di Biagio R, Hyvrier F, Féart C, André P, Rodriguez- Artalejo F, Lopez-Garcia E, Garcia-Esquinas E, Gomez-Cabrero D, Proctor G, Morzel M. Salivary protein markers of dietary intakes in diabetic and non-diabetic elderly community- dwellers from two European cohorts. (en préparation). Communications orales : André P, Proctor G, Rodriguez Artalejo F, Lopez-Garcia E, Gomez-Cabrero D, Neyraud E, Garca-Esquinas E, Morzel M, Féart C. Adhérence au régime Méditerranéen, indice de masse corporelle et risque de diabète de type 2 : Résultats de l'étude UK Biobank. Société Francophone du Diabète. 26-29 mars 2019. Marseille (France). Communications affichées : André P, Proctor G, Rodriguez-Artalejo F, Lopez-Garcia E, Gomez-Cabrero D, Neyraud E, Bros P, Garcia-Esquinas E, Morzel M, Féart C. Adherence to a Mediterranean diet, body mass index and risk of type 2 diabetes mellitus : results from the UK Biobank. EGEA VIII Nutrition et santé : de la science à la pratique. 7-9 novembre 2018. Lyon (France). André P, Proctor G, Rodriguez Artalejo F, Lopez-Garcia E, Gomez-Cabrero D, Neyraud E, Garca-Esquinas E, Morzel M, Féart C. Mediation analysis to understand the role of overweight on the relationship between Mediterranean diet and risk of type 2 diabetes mellitus : evidence from 21 612 UK Biobank participants. ICTRHN International Congress of Translational Research in Human Nutrition. 20-21 juin 2019. Clermont-Ferrand (France). Réalisation de vidéo diffusée lors de congrès : André P, Proctor GB, Rodriguez Artalejo F, Lopez-Garcia E, Gomez-Cabrero D, Neyraud E, Garca-Esquinas E, Morzel M, Féart C et avec l'aide de l'équipe médiatisation de l'université de Bordeaux. The SALAMANDER project. 5th intenational conference of Joint Programming Initiative A Healthy Diet for a Healthy Life'. 30 février 2019. Bruxelles (Belgique). Liste des tableaux Tableau 1. Recodage des données alimentaires qualitatives issues du fréquentiel alimentaire dispensés au suivi à 2 ans (S1) dans l'étude 3C-Bordeaux en données quantitatives. . 70 Tableau 2. Description des 20 catégories d'aliments constitutifs du fréquentiel alimentaire dispensés au suivi à 2 ans (S1) dans l'étude 3C-Bordeaux. . 71 Tableau 3. Attribution des points du score Méditerranéen selon les portions des différents groupes alimentaires caractéristiques de ce régime. . 78 Tableau 4. Attribution des points pour les items de A à F (première partie) de la version adaptée du questionnaire MNA dans 3C-Bordeaux. . 81 Tableau 5. Caractéristiques à l'inclusion des participants du projet NutEnDem (n 698). . 86 Tableau 6. Consommation moyenne pour chaque groupe d'aliment issu du questionnaire de fréquence alimentaire, en portion par semaine ou nombre de verre d'alcool, selon les terciles de profil Méditerranéen (n 698). . 88 Tableau 7. Structure des profils alimentaires identifiés a posteriori par analyse en composante principale selon les 20 groupes d'aliments du questionnaire de fréquence alimentaire (n 698). . 89 Tableau 8. Consommation moyenne pour chaque groupe d'aliment issu du questionnaire de fréquence alimentaire, en portion par semaine ou nombre de verre d'alcool, selon les terciles de profils alimentaires identifiés a posteriori par analyse en composante principale (n 698). . 91 Tableau 9. Taux plasmatiques moyens d'acides gras 3-hydroxylés selon le sexe et selon les terciles de profils alimentaires (n 698). . 93 Tableau 10. Associations multivariables entre profils alimentaires et taux plasmatiques d'acides gras 3-hydroxylés (n 698). . 95 Tableau 11. Caractéristiques à l'inclusion des participants selon le statut de maladie d'Alzheimer sur 12 ans de suivi, étude cas-témoin nichée dans la cohorte 3C-Bordeaux (n 636). . 105 Tableau 12. Taux plasmatiques d'acides gras 3-hydroxylés (AG 3-OH), Lipopolysaccharides- Binding Protein (LBP), forme soluble du Cluster of Differentitation-14 (sCD14) et d'Interleukin- 6 (IL-6) selon le statut de maladie d'Alzheimer sur 12 ans de suivi, étude cas-témoin nichée dans la cohorte 3C-Bordeaux (n 636). . 106 Tableau 13. Associations multivariables entre les taux plasmatiques d'acides gras 3-hydroxylés (AG 3-OH), de Lipopolysaccharides-Binding Protein (LBP), de la forme soluble du Cluster of Differentitation-14 (sCD14), de l'Interleukine-6 (IL-6) et le risque de développer une maladie d'Alzheimer sur 12 ans de suivi, étude cas-témoin nichée dans la cohorte 3C-Bordeaux (n 636). . 108 Tableau 14. Associations multivariables entre les taux plasmatiques de Lipopolysaccharides- Binding Protein (LBP), considérés en terciles, et le risque de développer une maladie d'Alzheimer sur 12 ans de suivi, étude cas-témoin nichée dans la cohorte 3C-Bordeaux (n 636). . 110 Tableau 15. Distribution des cas incidents de démence toutes étiologies confondues (n total 698) et de maladie d'Alzheimer (n total 674) selon la médiane d'AG 3-OH. . 113 Tableau 16. Associations multivariables entre les taux d'acides gras 3-hydroxylés et le risque de maladie d'Alzheimer ou de démence toutes étiologies confondues sur 17 ans de suivi. . 115 Liste des figures Figure 1. Illustration des plaques amyloïdes et des dégénérescences neurofibrillaires au niveau neuronal dans la pathologie d'Alzheimer. 6 Figure 2. Coupes frontales d'un cerveau sain et d'un cerveau atteint de maladie d'Alzheimer observés par autopsie . 6 Figure 3. Modèle d'évolution dynamique des biomarqueurs de la cascade pathologique de la maladie d'Alzheimer. . 8 Figure 4. Taux de prévalence standardisés sur l'âge pour la maladie d'Alzheimer et les autres démences à travers le monde, par sexe en 2016. . 9 Figure 5. Vue d'ensemble schématique des gènes liés à la maladie d'Alzheimer. . 14 Figure 6. Modèle de cercle vicieux reliant le stress oxydatif, l'inflammation et la neurodégénérescence dans la maladie d'Alzheimer. . 25 Figure 7. Représentation schématique de la barrière hémato-encéphalique. . 26 Figure 8. Représentation schématique de la structure moléculaire du lipopolysaccharide. . 35 Figure 9. Représentation schématique simplifiée de la cascade de signalisation en réponse aux endotoxines d'origine intestinale. . 40 Figure 10. Vue d'ensemble des effets spécifiques aux organes résultant de l'injection intraveineuse de LPS de l'ordre de 2-4 ng/kg chez l'Homme. . 47 Figure 11. L'administration de LPS augmente significativement l'activation microgliale, mesurée par IRM PET-[11C]PBR28, par rapport à la référence anatomique (rangée du haut). 51 Figure 12. Représentation schématique des données du centre Bordelais de la cohorte des Trois- Cités utilisées dans le cadre des travaux de thèse. . 66 Figure 13. Représentation des tests neuropsychologiques du Mini Mental State Examination (A), Benton Visuel Retention Test (B), Isaacs' Set Test (C) et Trail Making Test (D et E) dispensés dans la cohorte des Trois-Cités. . 68 Figure 14. Radar Graphs superposés des profils alimentaires a posteriori de type prudent (en vert) et sud-ouest (en rouge) selon les factor loadings des 20 groupes alimentaires du FFQ. . 90 Liste des annexes Annexe 1. Critères diagnostiques de la démence de type Alzheimer du DSM-IV-TR (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th edition, Text Revision), American Psychiatric Association 2000. . 162 Annexe 2. Critères diagnostiques de la maladie d'Alzheimer, NINCDS-ADRDA (National Institute for the Neurological and Communication Disorders and Stroke - Alzheimer's Disease and Related Diseases Association), McKhann 1984. . 163 Annexe 3. Metabolic endotoxemia : a potential underlying mechanism of the relationship between dietary fat intake and risk for cognitive impairments in humans ? . 164 Annexe 4. Évaluation de l'état nutritionnel par le Mini Nutritional Assessment (MNA). . 188 Annexe 5. Profils alimentaires, réalisés séparément chez les hommes et chez les femmes, et taux circulants d'acides gras 3-hydroxylés (AG 3-OH). . 189 Annexe 6. Mediterranean diet and prudent diet are both associated with low circulating esterified 3-hydroxy fatty acids, a proxy of lipopolysaccharide (LPS) burden, among older adults. . 196 Annexe 7. Lipopolysaccharide-Binding Protein, soluble CD14 and the long-term risk of Alzheimer's disease : a nested case-control pilot study of older community dwellers from the 3- City cohort . 221 Liste des acronymes et abréviations 3C : Trois-Cités A : Amyloïde-bêta ACP : Analyse en Composantes Principales ADRDA : Alzheimer's Disease and Related Diseases Association AG : Acides Gras AGPI : Acides Gras Polyinsaturés AGMI : Acides Gras Monoinsaturés AGPI-3 : Acides Gras Polyinsaturés Oméga-3 AGPI-6 : Acides Gras Polyinsaturés Oméga-6 AGS : Acides Gras Saturés AINS : Anti-Inflammatoires Non Stéroïdiens ALIENOR : Antioxydants, Lipides Essentiels, Nutrition et maladies OculaiRes ANC : Apports Nutritionnels Conseillés ApoE-4 : Allèle 4 du gène de l'Apolipoprotéine E APP : Amyloid Precursor Protein ATC : Anatomical Therapeutic Chemical classification system AVC : Accident Vasculaire Cérébral BHE : Barrière Hémato-Encéphalique BPI : Bactericidal Permeability-Increasing protein BVRT : Benton Visual Retention Test CD14 : Cluster of Differentiation-14 CD33 : Cluster of Differentiation-33 CES-D : Center for Epidemiological Studies-Depression CLU : Clusterine COX : Cyclo-oxygénase CR1 : Complement Receptor 1 CRP : C-Reactive Protein DAMP : Damage-Associated Molecular Pattern DASH : Dietary Approaches to Stop Hypertension DHA : Acide docosahéxaénoïque DSM-IV-TR : Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th edition, Text Revision DT2 : Diabète de Type 2 ELISA : Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay EPA : Acide eicosapentaénoïque FFQ : Food Frequency Questionnaire HDL : High Density Lipoprotein IC 95% : Intervalle de Confiance à 95% IL-1 : Interleukin 1 beta precursor IL-6 : Interleukin 6 IMC : Indice de Masse Corporelle IRM : Imagerie à Résonance Magnétique IST : Isaacs' Set Test LAL : Limulus Amebocyte Lysate LC : Chromatographie en phase liquide LC-MS/MS : Liquid Chromatography coupled to tandem Mass Spectrometry LCR : Liquide Céphalo-Rachidien LDL : Low Density Lipoprotein LBP : Lipopolysaccharides-Binding Protein LPS : Lipopolysaccharides MA : Maladie d'Alzheimer MAP : Mitogen-Activated Protein kinase MCI : Mild Cognitive Impairment (troubles cognitifs légers) MIND : Mediterranean-DASH Intervention for Neurodegenerative Delay MMSE : Mini Mental State Examination MD2 : Myeloid Differentiation protein 2 MS : Spectrométrie de Masse NCEP ATP III : National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III NF-B : Nuclear Factor-kappa B NINCDS : National Institute for the Neurological and Communication Disorders and Stroke OMS : Organisation Mondiale de la Santé PAMP : Pathogen-Associated Molecular Pattern PET : Positron Emission Tomography PLTP : Phospholipid Transfer Protein PNNS : Plan National Nutrition Santé PRR : Pattern-Recognition Receptors PS1 : Presenilin 1 PS2 : Presenilin 2 ROS : Reactive Oxygen Species (espèces réactives de l'oxygène) RC : Rapport de Cotes RR : Risque Relatif SD : Standard Deviation (écart-type) SIRS : Syndrome de Réponse Inflammatoire Systémique SNC : Système Nerveux Central SOCS : Suppressor Of Cytokine Signaling TAU : Tubulin Associated Unit TEP : Tomographie par Emission de Positons TLR4 : Toll-Like Receptor 4 TMT : Trail Making Test TNF : Tumor Necrosis Factor VIH : Virus de l'Immunodéficience Humaine VLDL : Very Low Dentisity Lipoprotéin (lipoprotéine à très faible densité) Notations c. -à-d. c'est-à-dire ex. exemple n effectif AVANT-PROPOS : INTRODUCTION GÉNÉRALE ET OBJECTIFS Plus de 703 millions, soit une personne sur onze. Il s'agit du nombre de personnes âgées de 65 ans et plus à travers le monde en 2019. D'après les projections tendancielles ce chiffre est amené a considérablement s'accrotre, atteignant plus d'une personne sur six à l'horizon 2050. Ce vieillissement démographique majeur tire principalement son origine de l'amélioration des conditions de vie, des progrès scientifiques ou encore de la transition du front des maladies infectieuses vers celui des maladies cardiovasculaires puis du grand-âge, notamment dans les pays en voie de développement. En France, au cours des six dernières décennies, l'espérance de vie s'est allongée d'environ 13 ans pour les hommes et 12 ans pour les femmes, avec une espérance de vie moyenne de 83 ans ; 5 ans de plus que ce que Jean Bourgeois-Pichat - ancien démographe Français et directeur de l'INED 1 - estimait, il y a plus d'un demi-siècle, être la limite biologique infranchissable. Une évolution démographique qui mène toutefois immanquablement à l'accroissement concomitant de pathologies associées au vieillissement. Principale maladie neurodégénérative liée à l'âge, la démence affecterait plus de 50 millions de personnes à travers le monde et une nouvelle personne serait diagnostiquée toutes les 3 secondes environ. Sous l'influence du vieillissement de la population générale, et sans modifications majeures des stratégies préventives ou thérapeutiques, la prévalence de la démence est amenée à tripler à l'horizon 2050 (1). Pour autant, le vieillissement est-il a priori pathologique ? Bien que la question reste encore en suspens, on distingue généralement le processus du vieillissement en soi, la sénescence, considéré comme inéluctable et que l'on qualifie de normal , du vieillissement pathologique caractérisé par l'occurrence de maladies et l'altération des facultés physiques et psychiques avec des retentissements plus ou moins invalidants dans la vie quotidienne. Dans un contexte o l'Homme sera amené à passer de plus en plus de temps à un âge avancé, le concept de healthy aging ou vieillissement en bonne santé devient ainsi un véritable enjeu de santé publique. Un concept défini par le Bureau régional de l'OMS pour l'Europe (2) comme étant un processus qui permet aux personnes de réaliser leur potentiel de bien-être physique, social et mental tout au long de leur vie et de participer à la société, tout en leur fournissant une protection, une sécurité et des soins adéquats quand elles ont besoin d'aide . 1 Institut National d'Études Démographiques La qualité du vieillissement, et notamment du vieillissement cérébral, étant influencée tout au long de la vie par la coexistence et l'interaction entre la prédisposition génétique et les facteurs environnementaux, l'amélioration de la compréhension des processus sous-jacents de la maladie s'avère essentielle afin de proposer, à terme, des recommandations efficaces dans un modèle d'exposition vie-entière . Bien que la finalité soit de guérir, voire reverser, les effets préjudiciables de la démence, toute stratégie visant à limiter ou prévenir la progression de la maladie pourrait avoir un impact non négligeable pour la personne elle-même mais aussi pour son entourage et la société. Basés sur une approche épidémiologique, ces travaux de thèse s'inscrivent dans cet enjeu majeur de santé publique, en contribuant à approfondir les connaissances de l'influence de l'alimentation dans l'exposition aux endotoxines, et du rôle de ces dernières dans le cadre du vieillissement cognitif pathologique de la maladie d'Alzheimer. CHAPITRE I. INTRODUCTION ET ÉTAT DES CONNAISSANCES 1. 1. Syndrome démentiel et déclin cognitif lié à l'âge 1. 1. 1. Évolution du concept historique Le terme de démence, dont l'étymologie dérive du latin demens signifiant perte de l'esprit , était jadis utilisé pour désigner littéralement les individus empreints d'aliénation mentale ; un terme qui restera synonyme de folie jusqu'à la fin du XVIIIème siècle. L'époque de la psychiatrie naissante, au début du XIXème siècle, est notamment marquée par Etienne Esquirol (1772-1840) qui, approfondissant la classification nosographique de son prédécesseur Philippe Pinel (1745-1826), distingua l'idiotie de la démence : L'homme en démence est privé des biens dont il jouissait autrefois ; c'est un riche devenu pauvre : l'idiot a toujours été dans l'infortune et la misère. L'état de l'homme en démence peut varier, celui de l'idiot reste le même [] (1838). Avec cette définition de la démence, décrite comme un phénomène acquis altérant progressivement les facultés intellectuelles et distinct de toutes psychoses fonctionnelles, Etienne Esquirol posa ainsi les prémices de ce qui est aujourd'hui considéré comme une véritable entité clinique. Il faudra attendre 1906 pour que la maladie éponyme, forme majoritaire de démence, soit cliniquement identifiée pour la première fois par le Dr. Aloïs Alzheimer (1864-1915). Lors de la 37ème conférence des psychiatres à Tbingen, il évoqua le cas de sa patiente, Auguste D. (1850-1906), admise à l'hôpital psychiatrique suite à une dégradation sévère de ses facultés cognitives et la présence de confusion mentale, d'hallucinations et d'inaptitude psychosociale. L'examen histologique post-mortem du cerveau de sa patiente, alors âgée de 56 ans, révéla les caractéristiques anatomopathologiques de la maladie : une importante atrophie cérébrale et l'accumulation de deux types d'anomalies du tissu cérébral, à savoir la présence de plaques amyloïdes et de dégénérescences neurofibrillaires. Le Dr. Aloïs Alzheimer décrira alors la maladie comme étant une maladie particulière du cortex cérébral . A la même époque, plusieurs cas de maladie d'Alzheimer furent décrits par une multitude de neuropathologistes, dont certains cas étaient rapportés chez des patients plus âgés remettant en considération la maladie d'Alzheimer comme une entité spécifique de la période présénile. 1 C'est seulement à la fin du XXème siècle qu'une distinction sera faite sur le caractère héréditaire (forme précoce, apparaissant avant 65 ans) ou sporadique (forme tardive, apparaissant après 65 ans) de la maladie. Dès lors, avec l'avancée scientifique et l'homogénéisation du concept, la définition du syndrome démentiel évolua peu à peu au fil du temps jusqu'à prendre son sens médical actuel, permettant ainsi d'en identifier les critères de diagnostic clinique. 1. 1. 2. Hétérogénéité du tableau clinique 1. 1. 2. 1. Diagnostic clinique du syndrome démentiel Le diagnostic clinique du syndrome démentiel repose sur des critères dont les plus couramment utilisés sont ceux du DSM-IV-TR (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th edition, Text Revision) publié en 2000 (3) (Annexe 1). Ces critères sont basés sur l'apparition de déficits neuropsychologiques multiples : - (i) l'altération de la mémoire et - (ii) l'altération d'au moins une des quatre fonctions cognitives suivantes : les fonctions exécutives, l'aphasie, l'agnosie et l'apraxie. Les défaillances de la mémoire comptent parmi les signes éminents de la forme typique de la maladie d'Alzheimer, impactant progressivement l'assimilation d'informations nouvelles (mémoire antérograde) et récentes puis, selon la sévérité de la maladie, la mémoire plus ancienne jusqu'à effacer des pans entiers de la mémoire passée (mémoire rétrograde). Les fonctions exécutives correspondent aux capacités d'adaptation à une situation nouvelle. Ces fonctions font notamment appel aux habiletés de logique, à l'élaboration de stratégie, à la planification de tâches et aux aptitudes de raisonnement. L'aphasie représente la perte des capacités de compréhension ou d'expression, menant à l'utilisation de circonlocutions, de répétitions ou encore à la difficulté de nommer les objets les plus usuels. Avec l'évolution de la maladie, ces troubles de la communication peuvent s'aggraver, isolant progressivement les personnes dans un langage non verbal. J'essaie de lire le livre que je tiens entre les mains, mais les mots refusent de former des phrases 2 2 Bernlef J. , Chimères, Editions Calmann-Lévy 1988, p. 24 2 L'agnosie est définie comme étant un trouble de la reconnaissance des objets ou des visages, résultant d'une incapacité du cerveau à traiter les informations malgré des fonctions sensorielles intactes. En d'autres termes, le malade ne peut donner de signification à ce qu'il perçoit. Enfin, l'apraxie est l'incapacité à coordonner volontairement ses mouvements malgré des fonctions motrices intactes. Selon la sévérité de l'atteinte cognitive, l'apraxie peut impacter les gestes quotidiens les plus complexes, comme la conduite d'une voiture, jusqu'aux plus simples, tels que porter une fourchette à sa bouche. Ces critères diagnostic du DSM-IV-TR stipulent également que l'altération de ces déficits cognitifs doit : - (iii) représenter un déclin significatif par rapport à un niveau antérieur et - (iv) être suffisamment sévère pour interférer avec l'indépendance dans les activités de la vie quotidienne de la personne. - (v) Enfin, lorsque d'autres maladies ou affections pouvant expliquer ces déficits cognitifs ont été écartées, le diagnostic de démence est établi. 1. 1. 2. 2. Etiologies principales du syndrome démentiel Le syndrome démentiel constitue le noyau sémiologique commun aux différentes démences dont les causes possibles sont multiples. En l'absence de biomarqueurs spécifiques de la maladie, l'identification de l'étiologie de la démence repose sur un diagnostic probabiliste, visant à en déduire la forme la plus probable. Sur le plan étiologique, on distingue classiquement deux types de démence : les démences d'origine neurodégénérative (ex. maladie d'Alzheimer, démence à corps de Lewy et démence fronto-temporale) et les démences d'origine non-neurodégénérative, survenant principalement à la suite de lésions cérébrales d'origine vasculaire (ex. démence vasculaire). La coexistence de lésions de type Alzheimer et de lésions cérébrovasculaires, dénommée démence mixte, serait également fréquente bien qu'il soit difficile de déterminer si la convergence de ces lésions résulte d'une dépendance des deux processus ou si elle est liée à l'émergence de lésions vasculaires liée au vieillissement cérébral normal (4, 5). La principale étiologie de la démence est la maladie d'Alzheimer, représentant de 50 à 75% de l'ensemble des cas de démence, suivi ensuite de la démence vasculaire (20 à 30%), de la démence fronto-temporale (5 à 10%) puis de la démence à corps de Lewy (< 5%) (6). Du fait d'une large hétérogénéité des manifestations cliniques du syndrome démentiel, rendant le diagnostic étiologique difficile à établir sur la seule base de critères cliniques, ces estimations de fréquence des différentes étiologies sont à prendre avec précaution. A cet effet, il a été estimé que près de 15 à 20% des diagnostics pré-mortem de maladie d'Alzheimer n'étaient pas 3 confirmés par l'examen histopathologique des tissus cérébraux réalisé à l'autopsie, tandis que des lésions cérébrales caractéristiques de la maladie d'Alzheimer étaient présentes chez près de 40% des démences non-Alzheimer (7). En France, on estime que seule une personne sur deux atteinte de démence serait aujourd'hui identifiée, avec un délai moyen d'environ 24 mois entre l'apparition des premiers signes cliniques et l'établissement du diagnostic de démence (7). 1. 1. 2. 3. Diagnostic clinique de la maladie d'Alzheimer Il existe une forme héréditaire de la maladie d'Alzheimer, dite également familiale ou à transmission autosomique dominante, causée majoritairement par des mutations génétiques sur le gène de la protéine précurseur amyloïde (APP), le gène Presenilin 1 (PS1) ou le gène Presenilin 2 (PS2) (8, 9). Cette forme héréditaire, dont les manifestations cliniques apparaissent précocement avant 65 ans, représenterait environ 5% des cas de maladie d'Alzheimer (10). La forme sporadique de la maladie d'Alzheimer résulterait quant à elle d'un déséquilibre entre processus pathologiques et mécanismes de compensation induits par l'interaction de facteurs génétiques et environnementaux tout au long de la vie. Cette forme sporadique de la maladie d'Alzheimer, d'apparition généralement plus tardive après 65 ans, représenterait la majorité des cas de démence. En 1984, le National Institute for the Neurological and Communication Disorders and Stroke (NINCDS) et l'Alzheimer's Disease and Related Diseases Association (ADRDA) ont collectivement publiés les critères de diagnostic de la maladie d'Alzheimer (11) (Annexe 2). Présupposant la présence d'un syndrome démentiel, ces critères NINCDS-ADRDA permettent d'établir un diagnostic clinique de maladie d'Alzheimer probable (tableau clinique typique sans confirmation histopathologique) ou possible (tableau clinique atypique, sans autre diagnostic apparent, sans confirmation histopathologique) ; le diagnostic définitif nécessitant une confirmation histopathologique post-mortem. En 2011, ces critères NINCDS-ADRDA ont été révisés par The National Institute on Aging et l'Alzheimer's Association (critères NIA-AA) et reconnaissent désormais trois stades de progression : un stade préclinique asymptomatique, un stade intermédiaire prodromal symptomatique, également appelé troubles cognitifs légers (MCI, Mild Cognitive Impairment) et un stade avancé et symptomatique de la démence o les troubles cognitifs sont suffisamment sévères pour impacter les activités de la vie quotidienne (12, 13). Alors que l'altération de la mémoire antérograde et rétrograde représente l'une des expressions cliniques prédominantes de la démence de type Alzheimer, ces critères NIA-AA reconnaissent désormais l'existence d'expressions non-mnésiques de la maladie dérivant de troubles du 4 langage et de l'altération des capacités visuo-spatiales et exécutives, renforçant par ailleurs l'hétérogénéité du tableau clinique. Enfin, le recours aux biomarqueurs, permettant de mesurer in vivo les caractéristiques anatomopathologiques de la maladie, est désormais reconnu. Initialement destinés à des fins de recherche, les biomarqueurs pourraient ouvrir de nouvelles perspectives dans le raisonnement diagnostic de la maladie d'Alzheimer. 1. 1. 3. Signes neuropathologiques de la maladie d'Alzheimer Au niveau neuropathologique, la maladie d'Alzheimer est caractérisée par deux types de lésions cérébrales, dont l'intensité et la répartition topographique sont relativement spécifiques : les plaques amyloïdes et les dégénérescences neurofibrillaires. Les plaques amyloïdes, anciennement appelées plaques séniles, dérivent de l'accumulation extracellulaire anormale de protéines amyloïde-. Dans les conditions physiologiques normales, la protéine amyloïde- qui est libérée par clivage séquentiel de son précurseur, la protéine APP (Amyloid Precursor Protein), va se dégrader progressivement dans l'organisme. L'amyloïde-, tout comme l'APP, est un composé naturellement retrouvé dans le système nerveux central bien que sa fonction reste encore mal élucidée de nos jours. Dans le cadre de la maladie d'Alzheimer, la protéine amyloïde- est retrouvée agrégée sous formes de fibrilles insolubles, formant ainsi des plaques amyloïdes dans le milieu environnant des neurones (Figure 1) ; un phénomène que l'on sait aujourd'hui résulter d'un déséquilibre entre une clairance insuffisante et une production excessive. Ces dépôts, dans un premier temps diffus, vont ensuite se généraliser provoquant à terme une neuro-toxicité et un dysfonctionnement des connexions entre les neurones, partiellement médiés par une réaction inflammatoire. Les dégénérescences neurofibrillaires résultent de l'enchevêtrement intracellulaire de protéine Tau (Tubulin Associated Unit) anormalement hyperphosphorylée, cette fois-ci à l'intérieur même du neurone. Concrètement, les neurones sont composés de dendrites par lesquels ils intègrent l'ensemble des influx nerveux, d'un corps cellulaire (ou soma) permettant le traitement de l'information et d'un axone par lequel l'influx nerveux va être transmis à une autre cellule. Ce système neuronal est constitué de microtubules, des composants essentiels du cytosquelette cellulaire participant à l'organisation spatiale et au transport intracellulaire de vésicules, eux-mêmes stabilisés par la protéine Tau. Dans la maladie d'Alzheimer, une hyperphosphorylation (c. -à-d. , une fixation de groupe phosphate jusqu'à 3 ou 4 fois plus élevée que la normale) de la protéine Tau est observée. Cette hyperphosphorylation entraine l'enchevêtrement de la protéine Tau sous forme de filaments et sa dissociation des microtubules (Figure 1). En l'absence de stabilisation, le cytosquelette du neurone se désorganise en une dégénérescence neurofibrillaire, pouvant provoquer à terme la mort neuronale. 5 Figure 1. Illustration des plaques amyloïdes et des dégénérescences neurofibrillaires au niveau neuronal dans la pathologie d'Alzheimer. Une atrophie cérébrale notamment localisée au niveau des lobes frontaux et temporaux, aspécifique de la maladie mais traduisant la dégénérescence des synapses et la mort neuronale, peut également s'observer dans la maladie d'Alzheimer (Figure 2). Figure 2. Coupes frontales d'un cerveau sain et d'un cerveau atteint de maladie d'Alzheimer observés par autopsie Image tirée et adaptée de 2020 Alzheimer's Association. Tous droits réservés. Illustration par Stacy Jannis. 6 Ces lésions neuropathologiques progressent de façon insidieuse dans le cerveau et pourraient débuter des années, si ce n'est des décennies, avant l'apparition des premiers symptômes cliniques de la maladie (14). La sévérité et la progression de ces lésions, reflet des changements neuropathologiques traditionnellement reconnus pour définir la maladie d'Alzheimer, peuvent être appréciées grâce à l'utilisation de biomarqueurs. Parmi ceux-ci, on peut citer : - l'imagerie structurelle (ex. IRM) permettant de mettre en évidence une atrophie cérébrale, notamment du lobe temporal médian ou de plus petites structures telles que l'hippocampe dont la fonction est essentielle dans la mémoire. - l'imagerie fonctionnelle (ex. tomographie par émission de positons (TEP) permettant de mesurer le métabolisme glucidique au niveau cérébral, reflet de l'activité cérébrale. La TEP peut également être utilisée de façon concomitante avec des ligands radio-marqués pour analyser quantitativement les lésions amyloïdes (TEP-amyloïde) ou l'activation microgliale. - l'analyse du liquide céphalo-rachidien, relativement peu utilisée du fait du caractère invasif de la ponction lombaire, permettant le dosage de biomarqueurs des lésions cérébrales amyloïde et Tau (ex. protéine amyloïde- ou protéine Tau hyperphosphorylée) ou de mort neuronale (ex. protéine Tau totale). Bien que l'origine et la séquence temporelle des altérations observées dans la maladie restent non élucidés, l'hypothèse de la cascade amyloïde a représenté pendant longtemps la vision prédominante de l'étiologie de la maladie d'Alzheimer (15, 16). Cette doctrine postule que l'accumulation de fibrilles amyloïdes serait, selon une séquence d'évènement encore non élucidée, l'évènement initiateur de la maladie d'Alzheimer. Les processus d'altérations des protéines Tau, de dégénérescence et de mort neuronale ou encore de déficits cognitifs seraient alors considérés comme résultant d'une succession de réactions, notamment inflammatoires, dues à l'accumulation de plaques amyloïdes. En ce sens, Jack et collaborateurs (14) ont proposé un modèle hypothétique de l'évolution des biomarqueurs au cours du développement de la maladie d'Alzheimer (Figure 3). 7 Figure 3. Modèle d'évolution dynamique des biomarqueurs de la cascade pathologique de la maladie d'Alzheimer. Image tirée et adaptée de Jack et collaborateurs (14). Dans ce modèle, la pathologie amyloïde (mesurée dans le liquide céphalorachidien (violet) ou par neuroimagerie (rouge) précède le développement de la pathologie Tau (mesurée dans le liquide céphalorachidien (bleu) et la neurodégénérescence (mesurée par neuroimagerie structurale et fonctionnelle (orange) ; les troubles cognitifs apparaissant plus tardivement dans le processus pathologique (illustré dans la zone verte opposant les profils à haut risque et à faible risque, mettant en évidence que deux patients avec le même profils de biomarqueurs à un temps donné peuvent avoir des troubles cognitifs différents). Biomarker abnormality Anomalie du biomarqueur ; MRI Imagerie par Résonance Magnétique ; Cognitive Impairment Déficits cognitifs ; CSF Liquide céphalorachidien ; High risk Risque élevé ; Low risk Risque faible ; Dementia Démence ; MCI troubles neurocognitifs légers. Or, cette hypothèse de cascade amyloïde est aujourd'hui largement débattue (16, 17). Fondée sur la physiopathologie des formes héréditaires de la maladie d'Alzheimer, dont les gènes identifiés sont tous les trois impliqués dans le métabolique de l'amyloïde-, le caractère causal de la protéinopathie amyloïde n'est cependant pas avéré dans la forme sporadique de la maladie. Par ailleurs, l'hypothèse de la cascade amyloïde ne peut à elle seule expliquer pleinement les dommages neuronaux observés dans la maladie d'Alzheimer. Plusieurs hypothèses étiologiques suggèrent l'implication de mécanismes synergiques ou qui interviendraient en amont des protéinopathies amyloïde- et Tau, mais dont la séquence causale n'est pas élucidée. Parmi celles-ci, on peut par exemple citer l'hypothèse vasculaire, de la réserve cérébrale/cognitive ou encore de l'activation du système immunitaire et de l'inflammation (1820) ; cette dernière hypothèse sera notamment abordée dans le chapitre 1. 1. 7. 8 1. 1. 4. Prévalence, incidence et tendances évolutives Prévalence et incidence En 2018, la prévalence mondiale du syndrome démentiel, c'est-à-dire le nombre (ou le taux) de personnes atteintes de démence dans la population à un instant donné, est estimée à plus de 50 millions de personnes, représentant environ 5% de la population (21). En France, on estime que près de 1, 2 million de personnes seraient atteintes de démence, toutes causes confondues (22 24). La prévalence du syndrome démentiel augmente inéluctablement avec l'âge, et doublerait en moyenne tous les 5 ans après 65 ans, les femmes étant davantage touchées que les hommes (Figure 4). Dans les âges très avancés, les taux de prévalence sont plus hétérogènes. Figure 4. Taux de prévalence standardisés sur l'âge pour la maladie d'Alzheimer et les autres démences à travers le monde, par sexe en 2016. Prévalence exprimée en pourcentage de la population à risque. Les tracés ombragés représentent les intervalles de confiance à 95%. Figure tirée et adaptée de GBD 2016 dementia collaborators (25). 9 En termes d'incidence, c'est-à-dire de vitesse d'apparition de la maladie, la démence affecterait chaque année près de 10 millions de personnes dans le monde, soit environ une nouvelle personne toutes les 3 secondes (2224). En France, l'incidence de la démence est estimée à 225 000 nouveaux cas chaque année (23, 26). Projections tendancielles D'après un rapport mondial sur le vieillissement de la population (27), on estime qu'en 2050 une personne sur six dans le monde aura plus de 65 ans (16%) contre une sur onze en 2019 (9%). Sans évolution concrète des stratégies préventives ou thérapeutiques, les projections tendancielles estiment que la prévalence du syndrome démentiel devrait être amenée à tripler d'ici à 2050, atteignant plus de 152 millions de personnes dans le monde. Sous l'influence du vieillissement croissant de la population, la démence pourrait ainsi tendre vers un véritable caractère épidémique. Ces estimations restent toutefois à interpréter avec précaution. En effet, bien que l'inflation des taux de prévalence et d'incidence subsiste dans certains pays comme la Chine ou le Japon (28, 29), de récentes études ont révélé des tendances à la baisse aux Etats-Unis et en Europe au cours des dernières décennies (30, 31). Ces bénéfices résulteraient en partie d'une meilleure prise en charge des facteurs de risque de la démence (ex. hypertension à l'âge adulte, diabète, statut tabagique (32), suggérant l'importance des stratégies de prévention dans la maladie d'Alzheimer. Cependant, l'imminence de la vague pandémique d'obésité et de diabète, tous deux considérés comme des facteurs de risque importants de démence, pourrait contrecarrer ces bénéfices dans les prochaines décennies. Espérance de vie Du fait d'une variabilité importante, la rapidité d'évolution de la maladie reste difficilement prévisible à l'échelle individuelle (33). On estime cependant qu'une personne atteinte de maladie d'Alzheimer passera en moyenne près de 40% de son nombre total d'années restants à vivre dans le stade le plus sévère (34). Au-delà de la qualité de vie, l'espérance de vie en elle- même est également affectée. La survie après diagnostic de la forme sporadique de la maladie serait d'environ 4 à 7 ans, soit une espérance de vie réduite d'environ 4 ans comparée à la population générale (3537). Coûts liés à la démence En 2015, le coût sociétal annuel de la démence était de 818 milliards de dollars (US), une augmentation de 35% par rapport à 2010 (38). D'après les estimations, le coût global de la démence a franchi le seuil des 1000 milliards de dollars (US) en 2018, représentant 1, 1% du produit intérieur brut mondial, et est amené à doubler d'ici 2030. 10 Ces coûts économiques peuvent être divisés en trois catégories : - (i) les coûts sociaux directs englobant les services formels tels que les soins professionnels à domicile, l'approvisionnement et le transport alimentaires ainsi que les résidences et institutions spécifiques (40, 1 % des coûts totaux), - (ii) les coûts informels liés aux aidants, bien que plus difficiles à estimer, tels que l'aide aux activités de la vie quotidienne (ex. toilette, courses, préparation des repas) ou encore la gestion et la prévention des symptômes et chutes (40, 4 % des coûts totaux) - (iii) les coûts médicaux directs comprenant les visites médicales, les médicaments et les soins hospitaliers (19, 5 % des coûts totaux) (38). Ce déséquilibre entre les coûts médicaux directs et les coûts sociaux et informels peut en partie s'expliquer par l'absence de traitement curatif. 1. 1. 5. Prise en charge et traitements pharmacologiques De nos jours, la maladie d'Alzheimer, tout comme les autres formes de démence, demeure incurable ; les traitements pharmacologiques ne permettant que d'en atténuer temporairement les symptômes sans toutefois freiner la progression de la maladie. Ces traitements peuvent se diviser en deux familles : - les inhibiteurs de la cholinestérase, incluant Donepezil, Rivastigmine et Galantamine. Ces médicaments permettent de retarder la dégradation d'un neurotransmetteur, l'acétylcholine, dont la concentration diminue dans la maladie d'Alzheimer. Ce neurotransmetteur est notamment impliqué dans le maintien des capacités de mémoire, d'apprentissage ou de raisonnement. - les antagonistes du récepteur N-Méthyl-D-Aspartate (NMDA) tels que la Mémantine, dont l'objectif est de limiter l'excitotoxicité du neurotransmetteur glutamate, en bloquant son action par fixation concurrentielle à son récepteur NMDA. Bien que le glutamate ait un rôle majeur dans la plasticité synaptique au cours de l'apprentissage et de la mémoire, il est retrouvé en excès dans la maladie d'Alzheimer o il devient neurotoxique en raison d'une stimulation continue de ses récepteurs. Bien qu'incurable, l'établissement rapide du diagnostic de maladie d'Alzheimer s'avèrerait toutefois essentiel dans la mesure o ces traitements se révéleraient d'autant plus efficaces que leur administration serait précoce. Cependant, leur efficacité thérapeutique aurait tendance à diminuer au cours du temps (39). Pouvant induire des effets secondaires variés non négligeables (ex. nausée, vomissement, troubles du sommeil, perte d'appétit ou encore état confusionnel), 11 ces médicaments ne peuvent être prescrits que par un gériatre, un neurologue ou un psychiatre, et nécessitent une surveillance de leur tolérance. Initialement pris en charge à hauteur de 15% par la Sécurité Sociale en France, ces médicaments ont cependant été déremboursés en 2018 par le ministère de la santé sur les recommandations de la Haute Autorité de Santé, en raison d'un intérêt médical leur prise en charge (40) ; un déremboursement pouvant être à l'origine d'une rupture du lien thérapeutique entre les patients et leurs médecins ou de l'aggravation précipitée des troubles liés à la maladie lors d'un arrêt de la prise médicamenteuse inhérent au coût financier engendré. insuffisant pour justifier Pour autant, la recherche de nouveaux composés thérapeutiques dans la maladie d'Alzheimer ne cesse de se poursuivre. Néanmoins, sur plus d'une décennie de tests de traitements pharmacologiques, soit un total de 244 composés testés au travers de 413 essais cliniques (dont 124 essais de phase I, 206 essais de phase II et 83 essais de phase III), le taux de succès des interventions était estimé à moins de 1% (41). Depuis 2004, seule la Mémantine, décrite ci- dessus, a été approuvée. L'échec récent des médicaments qui ciblent l'amyloïde- pourrait résulter en partie d'une fenêtre temporelle d'action trop tardive dans le processus pathologique pour en modifier le cours clinique (42). A cet effet, la recherche orientée sur la prévention du déclin cognitif et les stades prodromaux voire précliniques de la maladie est en pleine expansion, rendue possible grâce au développement de biomarqueurs. De larges essais cliniques prometteurs ont ainsi vu le jour ces dernières années, consistant à administrer des anticorps monoclonaux à des volontaires présentant un PET-amyloïde positif (4345). L'objectif étant de déterminer l'évolution pathologique, comparé à un groupe placebo. Actuellement en cours, si ces essais s'avèrent négatifs, ils pourraient marquer les limites du recours aux monothérapies et l'intérêt de tendre vers des thérapies ciblant simultanément plusieurs mécanismes tels que l'amyloïde, tau ou encore la neuro-inflammation et la nécessité d'améliorer la compréhension des composants non-amyloïdes dans la pathogenèse de la maladie d'Alzheimer. En complément des traitements pharmacologiques spécifiques aux déficits cognitifs, la prescription de psychotropes et de neuroleptiques peut également être envisagée dans les stades sévères de la démence afin de palier à la survenue de troubles psycho-comportementaux (ex. symptomatologie dépressive, troubles du sommeil, hallucination, agitation). En effet, au-delà de l'évolution des troubles cognitifs, la survenue de troubles psycho- comportementaux et d'incapacité dans les activités de la vie quotidienne représente un impact considérable à la fois pour le patient lui-même mais également pour ses proches aidants (46). Dans ce contexte, un diagnostic précoce permet d'anticiper ces complications, qui viennent immanquablement émailler l'évolution de la maladie, et d'évaluer le besoin d'aide à domicile ou d'institutionnalisation. L'objectif étant de maintenir autant que possible l'intégrité physique et morale du patient, de favoriser les capacités d'interaction et de communication, et de garantir une qualité de vie suffisante aux patients mais également à leurs proches. Bien que trop souvent négligé, l'impact de la démence représente une charge lourde pour l'entourage du patient, qui 12 d'une part se voit perdre insidieusement son identité de conjoint ou d'enfant, mais se doit également de revêtir le lourd rôle de co-thérapeute. 1. 1. 6. Un processus multi-pathogénique vie-entière Les pharmacothérapies actuelles n'offrant qu'un bénéfice symptomatique modeste et transitoire, il est dès lors primordial de se tourner vers des stratégies préventives afin de retarder voire d'éviter le développement du processus pathologique de la démence. A cet effet, plusieurs facteurs de risque de la maladie d'Alzheimer ont été identifiés, dont certains d'entre eux sont évitables. Âge 1. 1. 6. 1. Facteurs de risques non modifiables L'âge, et l'immunosénescence qui l'accompagne, représente le principal facteur de risque de la maladie d'Alzheimer et des autres formes de démences ; la prévalence de la démence augmentant de façon exponentielle avec l'âge, affectant environ 2 à 3% des personnes âgées de 65 à 69 ans et jusqu'à 30% des personnes de 80 ans et plus (4750). Sexe Le sexe impacterait de manière différentielle sur la prévalence, les manifestations cliniques, l'évolution et le pronostic de la maladie (51). Bien que la différence tend à s'amenuiser dans les pays développés, les femmes sont davantage touchées par la maladie d'Alzheimer que les hommes et compteraient pour environ deux tiers des cas (52). Toutefois l'espérance de vie après le diagnostic clinique serait plus faible chez les hommes (53). Facteurs génétiques Certaines caractéristiques génétiques peuvent prédisposer le développement de la maladie d'Alzheimer. Au-delà des facteurs génétiques de la forme héréditaire de la maladie d'Alzheimer (c. -à-d. , les mutations sur les gènes PSEN1, PSEN2 et APP), l'hérédité de l'allèle 4 codant pour l'apolipoprotéine E (ApoE, impliquée dans le métabolisme des lipoprotéines) augmenterait la susceptibilité de développer notamment la forme sporadique de la maladie d'un facteur 2-3 à plus de 5, respectivement selon le caractère hétérozygote (c. -à-d. , présence d'un seul allèle ApoE-4) ou homozygote (c. -à-d. , présence des deux allèles ApoE-4) du gène (53 56). 13 Bien que retrouvés à plus large échelle dans la population, contrairement aux gènes impliqués dans la forme héréditaire de la maladie d'Alzheimer dont la prévalence est rare (57), la présence de l'ApoE-4 n'est ni nécessaire ni suffisante pour provoquer la maladie. Par ailleurs, des études GWAS (Genome Wide Association Studies) ont récemment identifié plus d'une vingtaine de loci génétiques associés au risque de développer une maladie d'Alzheimer, impliqués dans différences voies telles que l'activation du système immunitaire et les réponses inflammatoires, le métabolisme du cholestérol et des lipides ainsi que dans le recyclage des vésicules endosomales (Figure 5) (58). Figure 5. Vue d'ensemble schématique des gènes liés à la maladie d'Alzheimer. Figure tirée et adaptée de Scheltens P et coll. (58). 14 Néanmoins, l'âge, le sexe ou la prédisposition génétique étant des facteurs de risques intrinsèques - non modifiables ils ne présentent pas d'opportunité d'actions. 1. 1. 6. 2. Facteurs de risques modifiables Alors que les projections tendancielles supputent une augmentation de la prévalence de la maladie dans les prochaines décennies, l'identification de facteurs de risques modifiables apparat alors comme une stratégie de santé publique prioritaire afin de retarder l'apparition de la maladie ou d'en limiter la progression. A cet effet, de nombreux facteurs de risque environnementaux, présentant une opportunité d'action, ont été mis en évidence. Il a notamment été suggéré que près d'un tiers des cas de maladie d'Alzheimer à travers le monde pourrait être attribuable à sept facteurs de risque modifiables, incluant des facteurs cardiovasculaires (diabète, obésité en milieu de vie et hypertension), des facteurs de mode de vie (sédentarité et statut tabagique) et des facteurs psycho-sociaux (niveau d'éducation et symptomatologie dépressive) (32, 59). 1. 1. 6. 2. 1. Facteurs cardio-vasculaires Diabète Véritable pandémie dans le domaine des maladies non-contagieuses, le diabète affecterait près d'une personne sur 11 à travers le monde, dont seulement la moitié serait diagnostiquée. De nombreuses études épidémiologiques suggèrent que le diabète serait fortement associé à la survenue de troubles cognitifs et de démence, avec un risque de développer une maladie d'Alzheimer de 50 à 60% plus élevée chez les personnes souffrant d'un diabète de type 2 comparativement à des personnes présentant une normo-glycémie (32, 60, 61). De nombreux médiateurs pourraient sous-tendre cette physiopathologie incluant des mécanismes vasculaires et inflammatoires ou l'altération des voies du glucose, de l'insuline et de l'amyloïde (62). Toutefois, la part respective de chacun de ces mécanismes n'est pas clairement identifiée. Obésité L'obésité à l'âge adulte, généralement caractérisée par un profil cardiométabolique défavorable (ex. état inflammatoire, hypertension, hyperglycémie ou encore hypercholestérolémie), serait associée à un risque d'environ 1, 6 fois supérieur de survenue d'une démence (32, 6365). Il est par ailleurs largement établi que cette association varie avec l'âge. Chez les personnes âgées, l'obésité apparaitrait comme protectrice tandis qu'une faible masse corporelle serait associée à un sur-risque de démence d'un facteur 2, 5 (66) ; une relation pouvant potentiellement 15 s'expliquée par une perte de poids généralement observée dans les phases précoces de la maladie d'Alzheimer et s'accélérant à l'approche du diagnostic (67). En effet, près de 50 à 60% des patients souffrant de maladie d'Alzheimer présenteraient une modification du comportement alimentaire (68) et de 18 à 80% un état nutritionnel insatisfaisant (69). Pression artérielle L'hypertension notamment à l'âge adulte, communément définie par une tension artérielle systolique 140 mmHg et diastolique 90 mmHg, serait associée à un sur-risque d'un facteur 1, 2 de développer une démence (32, 70, 71), notamment par sa contribution délétère aux mécanismes vasculaires du syndrome démentiel (ex. microlésions de la substance blanche, infarctus lacunaires, sténose ou occlusion carotidienne) (72). Au-delà d'un diagnostic unique d'hypertension, une large amplitude de variation de la pression sanguine au cours du temps semblerait également impacter significativement la survenue d'une démence (73). Dyslipidémie les triglycérides. La dyslipidémie contribue à La dyslipidémie est définie comme étant un dysfonctionnement de la régulation des taux de lipides sanguins incluant le cholestérol total et ses sous-fractions HDL (High Density Lipoprotein ou bon cholestérol ) et LDL (Low Density Lipoprotein ou mauvais cholestérol ), ainsi que l'apparition d'athérosclérose (c. -à-d. , au dépôt lipidique dans les artères sanguines) et à ses complications telles que l'ischémie cérébrale. Des taux faibles de HDL et des taux élevés de LDL ou triglycérides ont été associés au déclin cognitif et au risque de développer une démence, avec toutefois des résultats parfois contradictoires entre les études (7478). Par ailleurs, les taux plasmatiques de cholestérol total et de LDL augmenteraient avec l'âge, tandis que les taux de HDL diminueraient (79) ; la présence du variant génétique ApoE-4 pouvant par ailleurs altérer la régulation du cholestérol notamment au niveau des cellules cérébrales (80). 1. 1. 6. 2. 2. Facteurs psycho-sociaux Niveau d'éducation Le niveau d'éducation est étroitement lié à la santé, notamment cérébrale. Largement utilisé comme proxy de la réserve cérébrale/cognitive, un haut niveau d'éducation serait associé à un plus faible risque de développer une démence. Une récente méta-analyse suggérerait par ailleurs un effet dose-réponse, avec un risque diminué de 7% pour chaque année supplémentaire d'éducation (81). Au-delà d'encourager des comportements plus sains et de favoriser des contextes de vie moins risqués, un haut niveau d'éducation serait également associé à une plus 16 grande capacité de réserve cérébrale/cognitive permettant de compenser, jusqu'à un certain seuil, l'accumulation des lésions neurodégénératives et de maintenir des fonctions cognitives efficientes à plus long terme (82). Dépression La dépression majeure est associée à un risque accru de démence toutes causes confondues (d'un facteur 1, 9), de maladie d'Alzheimer (d'un facteur 1, 7) et de démence vasculaire (d'un facteur 2, 5) (83) ; un risque qui semblerait exacerbé chez l'homme (84). Bien que la survenue d'une dépression fasse partie du tableau symptomatique de la maladie d'Alzheimer (85), des preuves soutiennent des changements neurobiologiques similaires entre les deux entités, en particulier des modifications de la substance blanche (c. -à-d. , la région du système nerveux composée des axones neuronaux), suggérant que la dépression pourrait intervenir en amont en tant que facteur de risque de démence (86). Toutefois, ces relations entre dépression et démence sont complexes et la nécessité d'études longitudinales s'avère essentielle pour bien décrire l'histoire naturelle de la dépression. 1. 1. 6. 2. 3. Facteurs de mode de vie Statut tabagique impactant La morbidité liée au tabagisme s'étendrait au-delà des maladies cardiovasculaires, des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ou des cancers, la survenue d'anomalies neurobiologiques et neurocognitives non attribuables à ces conditions médicales (ex. atrophie cérébrale, altération de la vitesse d'apprentissage et de la mémoire) (87, 88). Une revue systématique a notamment mis en évidence que les fumeurs étaient davantage susceptibles de présenter en fin de vie un déclin cognitif et une démence comparés aux non-fumeurs (89). Par ailleurs, l'arrêt du tabac depuis plusieurs années permettrait vraisemblablement de réduire le risque des anciens fumeurs à un niveau comparable aux non-fumeurs (8992). Le tabagisme pourrait être impliqué dans la pathogenèse de la démence de par sa capacité à favoriser des mécanismes inflammatoires et de stress oxydant cérébraux (93, 94). A noter cependant que dans plusieurs études de type cas-témoins, le statut tabagique apparait comme protecteur du risque de démence ou de maladie d'Alzheimer ; une association qui serait expliquée par un risque compétitif par le décès (95). En effet, les personnes fumeuses sont davantage susceptibles de décéder prématurément, potentiellement avant de développer une démence comparativement aux témoins non-fumeurs ; un risque compétitif par le décès qui ne se limite d'ailleurs pas seulement à ce seul facteur de risque. 17 Alcool La consommation excessive d'alcool est associée à des modifications structurales au niveau du cerveau, à la survenue de troubles cognitifs et à un risque accru de démence toutes causes confondues (96, 97). Toutefois, il semblerait que l'association entre consommation d'alcool et risque de démence ne soit pas linéaire mais apparatrait davantage sous forme de parabole inversée (courbe en J) (96, 97). Une récente méta-analyse a notamment rapporté qu'une consommation légère à modérée (c. -à-d. , 12, 5 g/j d'alcool soit environ un verre ou moins d'alcool par jour) serait associée à un moindre risque de démence, tandis qu'une consommation excessive (c. -à-d. , 38 g/j soit environ trois verres ou plus d'alcool par jour) augmenterait le risque de démence d'environ 10%, par rapport à une abstinence (97). Toutefois, tous les alcools ne semblent pas conférer cet effet protecteur qui serait principalement attribué au vin, probablement du fait de sa teneur riche en polyphénols (98) lui conférant des propriétés neuroprotectrices et anti-inflammatoires. Il convient cependant de noter que la causalité entre une consommation d'alcool légère à modérée et un effet protecteur sur le risque de démence n'ayant pas pu être établie (99), il n'existe aucun consensus actuel sur la recommandation de consommation d'alcool, quel qu'il soit, dans le cadre du syndrome démentiel. Activité physique tabagique non-fumeur et Plusieurs méta-analyses d'études observationnelles ont rapporté qu'une activité physique régulière serait associée à un risque plus faible de déclin cognitif et de démence (100, 101). L'activité physique régulière est généralement associée à un mode de vie sain (ex. alimentation saine, statut faible consommation d'alcool), un profil cardiométabolique favorable (ex. statut pro-inflammatoire faible et moindre hypertension, hyperglycémie et dyslipidémie) et une amélioration du flux sanguin cérébral (102, 103) ; une pléthore de médiateurs potentiels qui pourrait contribuer indirectement à minorer le risque de démence. Toutefois, du fait d'un niveau de preuve insuffisant, les études actuelles ne permettent pas de formuler précisément des recommandations spécifiques concernant le type, la fréquence, l'intensité ou la durée de l'activité physique pouvant procurer des effets bénéfiques contre la maladie d'Alzheimer (91, 104). Néanmoins, dans un contexte plus global de bien-être et de santé, les recommandations générales de promotion de la santé préconisent la pratique hebdomadaire d'au moins 150 minutes d'activité physique d'intensité modérée (correspondant approximativement à 75 minutes d'activité physique d'intensité soutenue) chez les personnes âgées de 65 ans et plus. Alimentation De par ses propriétés pléiotropiques lui conférant la capacité d'agir sur de multiples composantes du vieillissement cérébral (ex. apports en macro et micronutriments indispensables aux besoins structuraux et régulation des processus inflammatoires), l'alimentation suscite un intérêt croissant dans la prévention de la démence qu'elle soit d'origine dégénérative ou vasculaire. Par ailleurs, l'alimentation apparait comme fonctionnels, 18 un dénominateur commun de nombreux facteurs de risque de démence préalablement cités tels que l'obésité, le diabète de type 2, l'hypertension ou encore la dyslipidémie. A l'échelle des nutriments, de nombreux arguments physiopathologiques ou dérivés d'études observationnelles ont été rapportés en faveur d'un rôle protecteur des acides gras polyinsaturés de type oméga 3 (AGPI-3), des vitamines B et D ainsi que des antioxydants de type caroténoïdes, polyphénols, vitamines C et E dans le vieillissement cérébral (105, 106). Toutefois, la plupart des essais de complémentation ont rapporté des résultats décevants probablement liés à une large hétérogénéité entre les études en termes de sélection de la population ou de type de complémentation, à une durée d'intervention relativement faible rendant peu probable la mise en évidence d'un bénéfice cognitif ou même à l'existence au préalable d'un déficit effectif ou non chez les participants (106). Majoritairement apportés par la consommation de poissons et crustacés ainsi que par les huiles végétales (apport de précurseurs des AGPI-3), les AGPI-3 possèderaient des propriétés anti- inflammatoires et seraient impliqués dans les mécanismes de plasticité synaptique et de neurogenèse (107). Les vitamines B (notamment B6, B12 et folates) sont apportées par des sources alimentaires variées de sorte qu'elles ne peuvent se substituer les unes aux autres : céréales complètes, foie et oléagineux pour la vitamine B6, produits exclusivement d'origine animale (abats, viande et poisson) pour la vitamine B12 et légumes verts, foie et légumineuses pour les folates. Elles réguleraient notamment l'hyperhomocystéinémie (un facteur de risque cardio-vasculaire avéré favorisant l'athérosclérose et associé à la survenue de troubles cognitifs et de démence). La vitamine D est principalement synthétisée suite à une exposition solaire ( 80%), la consommation de poisson, d'œufs et de produits laitiers ne contribuant qu'à hauteur de 20% des apports. La vitamine D serait notamment impliquée dans la survie neuronale, la transmission synaptique, via son rôle de régulation de l'expression génique de plusieurs neurotransmetteurs, et dans la modulation des médiateurs inflammatoires impliqués dans la réponse immunitaire (108, 109). Les principales sources de composés antioxydants (ex. caroténoïdes, polyphénols, vitamines C et E) dans l'alimentation sont les fruits, les légumes, les huiles végétales, les oléagineux ou le vin rouge. Les polyphénols représentent les antioxydants les plus abondants de l'alimentation d'origine végétale, avec un apport pouvant atteindre 1g par jour, soit près de 10 fois l'apport en vitamine C. Les polyphénols participeraient à la neuro-protection, la réduction de la charge amyloïde cérébrale et favoriseraient les capacités de mémoire et d'apprentissage (110). La vitamine C serait quant à elle impliquée dans la modulation de l'état inflammatoire, la neuro-modulation et la transmission synaptique (111). La vitamine E, possèderait également des propriétés anti-inflammatoires, jouant un rôle dans la régulation du stress oxydant (112). Enfin, les antioxydants de type caroténoïdes sont des pigments végétaux naturels, précurseurs de la vitamine A, possédant des propriétés anti- inflammatoires et anti-apoptotiques (113). En raison des interactions complexes existant entre ces différents nutriments, la recherche s'est orientée vers l'étude des profils alimentaires, considérant l'alimentation comme un ensemble indissociable. L'un des profils alimentaires les plus étudiés dans la prévention des maladies chroniques est le régime Méditerranéen, caractérisé par (i) une consommation riche en aliments 19 d'origine végétale (ex. fruits, légumes, légumineuses et céréales) et en huile d'olive, (ii) une consommation modérée de poissons et crustacés, (iii) une consommation faible à modérée de produits laitiers, volailles et œufs, (iv) une faible consommation de produits carnés et de pâtisseries et (v) une consommation modérée de vin, principalement lors les repas. L'adhérence au régime Méditerranéen est notamment associée à un statut cardio-vasculaire, inflammatoire et oxydatif favorable ; autant de facteurs qui pourraient sous-tendre les effets bénéfiques d'une diète Méditerranéenne dans le vieillissement cognitif et le risque de démence en contribuant à limiter la charge lésionnelle cérébrale (114119). D'autres régimes alimentaires, modélisés d'après des objectifs plus spécifiques, suscitent également un intérêt croissant comme le régime DASH (Dietary Approaches to Stop Hypertension) développé pour la prévention et le traitement de l'hypertension (120, 121). Visant à privilégier une consommation alimentaire saine et variée notamment riche en fruits et légumes, et faible en sodium et en matières grasses saturées, une meilleure adhérence au régime DASH (c. -à-d. , tercile supérieur comparé au tercile inférieur) a été associée à une diminution de 39% du risque de démence sur un suivi moyen de 4, 5 ans (122). Le régime MIND (Mediterranean-DASH Intervention for Neurodegenerative Delay) combinant les effets prometteurs des régimes Méditerranéen et DASH dans la préservation des fonctions cérébrales et mettant l'accent sur la consommation de produits d'origine végétale ainsi que les baies et les légumes verts à feuilles, serait d'autant plus efficace dans la prévention de la maladie d'Alzheimer : les second et troisième terciles de score d'adhérence au régime MIND étant respectivement associés à une diminution de 35% et 53% du risque de maladie d'Alzheimer, tandis que seuls les troisièmes terciles du régime Méditerranéen (54%) et du régime DASH (39%) étaient significativement associés à un moindre risque de maladie d'Alzheimer (122). Toutefois, le caractère émergent du régime MIND et la faible quantité de données actuellement disponibles ne permettent pas d'en tirer des conclusions définitives. A noter cependant que malgré l'abondance d'arguments biologiquement plausibles, la question de la causalité de la nutrition dans la maladie d'Alzheimer reste débattue (123, 124), notamment appuyée par une susceptibilité accrue de malnutrition ou de perte d'appétit s'observant dans les phases précliniques et s'accentuant avec l'évolution de la pathologie. 1. 1. 6. 2. 4. Intérêt des études multi-domaines Alors que la part de risque attribuable est susceptible d'être faible lorsque ces facteurs environnementaux sont pris isolément, leurs effets combinés au cours du temps pourraient être considérables comme le soulignent plusieurs études ayant étudié conjointement ces facteurs dans une stratégie préventive multi-domaine. A cet effet les individus présentant un mode de vie sain à l'âge adulte (c. -à-d. , associant des comportements bénéfiques de santé cardio- vasculaires sur le plan du statut tabagique, de la consommation d'alcool, de l'activité physique et de l'alimentation) présentaient un risque de démence diminué de 64% en fin de vie (125). Par ailleurs, l'amélioration d'un point sur un indicateur plus global considérant 7 composantes 20 (c. -à-d. , 1 point attribué pour chaque composante bénéfique parmi le statut tabagique (non- fumeur), l'indice de masse corporelle (IMC, entre 18, 5 et 25 kg/m), l'activité physique (régulière et adaptée), l'alimentation (notamment la consommation quotidienne de fruits et légumes), l'hypertension (pression artérielle systolique < 120 mmHg et diastolique < 80 mmHg, sans traitements), la cholestérolémie (< 200 mg/dL sans traitements) et la glycémie (< 100 mg/dL à jeun) était associée à un risque diminué d'environ 10 à 20% démence toutes causes, de maladie d'Alzheimer et de déclin cognitif (123, 126128). Fait intéressant, les effets bénéfiques sembleraient consistants, qu'ils soient évalués à l'âge adulte ou chez la personne âgée, soulignant ainsi l'intérêt de contrôler ces facteurs même à un âge avancé. Par ailleurs, de récents travaux ont mis en évidence que l'adoption d'un mode de vie sain (défini comme un statut non-fumeur, une consommation modérée d'alcool, une alimentation équilibrée et la pratique d'une activité physique régulière) permettrait d'annihiler le risque de démence inhérent à une prédisposition génétique (129). 1. 1. 7. Système immunitaire inné et composante inflammatoire dans la maladie d'Alzheimer Dans ce modèle vie-entière d'interaction entre prédisposition génétique et facteurs environnementaux, l'activation du système immunitaire inné et la composante inflammatoire associée émergent, bien qu'encore largement sous-estimées, en tant que voies pathologiques dans la maladie d'Alzheimer. Le système immunitaire représente l'ensemble des mécanismes de défense de l'organisme, défini selon deux types d'immunité : - l'immunité innée (naturelle) caractérisée par une réponse immédiatement fonctionnelle mais non-spécifique, notamment face à un agent pathogène. Garant de l'intégrité de l'organisme, l'inflammation correspond à la réaction stéréotypée universelle de défense de l'organisme, déclenchée suite à l'activation du système immunitaire inné. - l'immunité adaptative (acquise) dont la réponse est spécifique et adaptée face à un antigène particulier. Plus tardive, l'immunité adaptative présente une capacité de mémorisation de l'antigène permettant l'induction d'une réponse plus rapide et plus efficace lors d'une exposition ultérieure à l'antigène. C'est notamment sur cette propriété du système immunitaire que sont fondés les vaccins. 21 L'immunité innée constitue la première ligne de défense de l'organisme vis-à-vis des agents stressants, et notamment infectieux, de notre environnement (130). La capacité de reconnaissance de ces agents stressants par les cellules immunitaires du soi (c. -à-d. , propre à l'organisme) provient de leurs récepteurs PRRs (Pattern-Recognition Receptors) permettant de détecter les motifs moléculaires associés aux micro-organismes pathogènes (PAMPs, Pathogen-Associated Molecular Pattern) ou résultant de dommages cellulaires (DAMPs, Damage-Associated Molecular Pattern). Suite à la reconnaissance de ces motifs par les cellules immunitaires, ces dernières vont déclencher une réaction inflammatoire caractérisée par la libération de nombreuses molécules telles que des cytokines pro-inflammatoires (ex. IL-6, TNF, IL-1), des chimiokines (ex. CCL2, CCL5, CXCL1), des messagers secondaires (ex. prostaglandines ou oxyde nitrique) ou encore des radicaux libres (agents oxydants). Bien que possédant un fort potentiel cytotoxique ubiquitaire, la sécrétion de ces molécules est essentielle au recrutement des moyens de défense de l'organisme permettant ainsi d'éliminer l'agent stressant et par conséquence de résorber la réponse inflammatoire via la production secondaire de molécules anti-inflammatoires (ex. IL- 10, TGF, protéines d'inhibition de la signalisation des cytokines (SOCS, Suppressor Of Cytokine Signaling protein) (131). Toutefois, de par son caractère non-spécifique, le mode d'action de l'inflammation est peu discriminant entre l'agent stressant et les cellules saines environnantes, entrainant des atteintes collatérales dommageables lorsque l'inflammation, non résorbée, se pérennise (132). L'allure chronique d'un état inflammatoire peut relever soit de l'exposition récurrente voire indéfectible à l'agent stressant, soit de l'incapacité ou de la défaillance du système immunitaire à éliminer l'agent stressant. L'exposition récurrente à un agent stressant (ex. endotoxines bactériennes, décrites dans le chapitre 1. 2) peut résulter de facteurs environnementaux tels que l'occurrence d'infections bactériennes non prises en charge. D'autre part, avec le vieillissement, une diminution progressive des capacités de l'organisme à lutter contre les agents stressants s'installe, caractérisée par l'augmentation concomitante de marqueurs pro-inflammatoires (133). Ce phénomène d'inflammation chronique à bas bruit, appelé inflamm'aging , s'oppose ainsi à l'inflammation aigu de par son absence d'évolution vers la rémission totale et de sa tendance à entrainer progressivement une destruction tissulaire, source de séquelles irréversibles au sein de l'organisme (133). Qualifiée par certains scientifiques de Dr Jekyll et Mr Hyde (134, 135), l'inflammation est donc un mécanisme à double tranchant, exerçant des effets tant protecteurs que préjudiciables. En outre, les preuves s'accumulent suggérant que l'inflammation chronique contribuerait à la neurodégénérescence et la pathogenèse de nombreux troubles neurologiques incluant la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson ou encore la sclérose latérale amyotrophique (136, 137). Plus particulièrement, ces dernières décennies, l'importance de l'inflammation dans l'étiologie de la maladie d'Alzheimer a considérablement évoluée au point de faire natre le terme spécifique d' hypothèse inflammatoire de la maladie d'Alzheimer (138). 22 Sans prétendre à l'exhaustivité, les sous-chapitres suivants mettent en exergue l'intérêt émergeant des processus inflammatoires - et notamment de leur versant pathologique - dans le cadre de la maladie d'Alzheimer. Les forces motrices de l'hypothèse inflammatoire dans la maladie d'Alzheimer seront abordées au travers de quatre concepts, décrits ci-dessous : la neuro-inflammation, l'inflammation systémique, l'apport de la génétique et les traitements anti- inflammatoires. 1. 1. 7. 1. Neuro-inflammation Le système nerveux central (SNC) possède son propre système de défense dont la capacité immunitaire est majoritairement médiée par la microglie. Apparentées aux macrophages, les cellules de la microglie sont considérées comme les cellules immunocompétentes du SNC, représentant approximativement 10% de l'ensemble des cellules cérébrales (139). Dans les conditions physiologiques normales, les cellules microgliales sont retrouvées sous forme quiescente ; un terme néanmoins réducteur dans le sens o elles assurent en permanence un rôle de sentinelle, sondant l'ensemble du parenchyme cérébral à la recherche d'éventuelles anomalies (c. -à-d. , la présence de motifs PAMPs ou DAMPs) (140). On estime que l'intégralité du volume cérébral serait sondé par les cellules microgliales toutes les 4 à 5 heures (140). Dans leur phénotype quiescent, caractérisé par la production de facteurs anti- inflammatoires et neurotrophiques (141), le rôle des cellules microgliales est d'éliminer les métabolites et les débris cellulaires en excès et de favoriser la réparation tissulaire (140). Dans des conditions pathologiques (c. -à-d. , suite à la reconnaissance de motifs PAMPs ou DAMPs), les cellules microgliales initient la réponse immunitaire innée et adoptent un phénotype morphologique activé caractérisé notamment par une capacité de phagocytose (c. -à- d. , d'internalisation et de dégradation de substances étrangères) et la sécrétion massive de médiateurs inflammatoires à l'origine de la réponse neuro-inflammatoire (ex. cytokines, chimiokines, radicaux libres, oxyde nitrique, protéines du complément). A noter que dans la maladie d'Alzheimer, le phénotype habituellement quiescent des cellules microgliales s'apparenterait davantage à un phénotype intermédiaire, dit partiellement activé ou amorcé, conférant une convergence accrue vers un phénotype entièrement activé ainsi qu'une réaction inflammatoire exacerbée en réponse à un agent stressant (142, 143). Les caractéristiques typiques de la neuro-inflammation (c. -à-d. , activation microgliale et abondance de médiateurs pro-inflammatoires tels que l'IL-6, le TNF et l'IL-1) sont fréquemment décrites au niveau des tissus cérébraux de patients atteints de maladie d'Alzheimer ou de troubles cognitifs légers comparés à des individus cognitivement sains de même âge (144150). Entre autres, la cytokine pro-inflammatoire IL-1 serait surexprimée jusqu'à un facteur 3 dans le cerveau des patients atteints de maladie d'Alzheimer par rapport aux sujets témoins, notamment au niveau de la microglie (144, 151), et serait associée à la formation de plaques amyloïdes, la phosphorylation de la protéine Tau et l'enchevêtrement neurofibrillaire (152). 23 Parallèlement, des études menées en post-mortem ont révélé que la microglie activée colocalise avec les plaques amyloïdes et les dégénérescences neurofibrillaires dans la maladie d'Alzheimer (151, 153157), suggérant un lien entre la neuro-inflammation et les pathologies amyloïde et Tau. Cependant, ce lien semble complexe. À l'instar de l'inflammation, la neuro-inflammation ne serait que transitoirement bénéfique dans la maladie d'Alzheimer : elle participerait précocement à la clairance et l'élimination des plaques amyloïdes par mécanisme de phagocytose par les cellules microgliales (158, 159) et les astrocytes (cellules gliales les plus abondantes du SNC, impliquées dans la régulation de la neurotransmission ainsi que dans le soutien et la protection neuronale) (160) et participerait également à la mobilisation de précurseurs neuronaux impliqués dans la réparation, la remyélinisation ou la régénérescence axonale (161). Toutefois, la pérennisation de la neuro-inflammation entrainerait l'apparition d'effets délétères pouvant exacerber la progression de la pathologie Alzheimer et conduire à un risque de décès prématuré (162167). En effet, des preuves issues de modèles in vivo et in vitro rapportent que l'effet neurotoxique d'une exposition soutenue aux facteurs pro-inflammatoires serait à l'origine d'une altération de l'homéostasie métabolique (c. -à-d. , du maintien de l'équilibre du milieu intérieur), de dysfonctionnements neuronaux, de perte synaptique et de mort neuronale pouvant sous-tendre la pathologie d'Alzheimer (168171). Cet environnement neurotoxique altérerait également les capacités de phagocytose des cellules microgliales, en régulant à la baisse leurs récepteurs de phagocytose, conduisant à une clairance insuffisante des peptides amyloïde- (172). Une étude a également rapporté que les astrocytes du cortex entorhinal des patients atteints de maladie d'Alzheimer accumulaient les peptides amyloïde-, et que cette accumulation serait corrélée positivement à la progression de la pathologie (173). Par ailleurs, la microglie activée, de par la production de cytokines pro-inflammatoires, d'oxyde nitrique et de radicaux libres, faciliterait la synthèse d'APP, son clivage amyloïdogénique en peptide amyloïde- et l'agrégation de ces derniers sous forme de plaques amyloïdes (174, 175). La microglie activée serait aussi impliquée dans l'hyperphosphorylation de Tau conduisant à l'enchevêtrement neurofibrillaire (176). Fait intéressant, d'un point de vue mécanistique les peptides amyloïde- et les protéines Tau apparaissent capables d'induire l'activation des cellules microgliales et donc la production de médiateurs pro-inflammatoires (177), suggérant que les pathologies amyloïde et Tau contribueraient au maintien du processus de neuro-inflammation. 24 On assiste donc ici à un véritable cercle vicieux au sein duquel les relations entre neuro- inflammation et développement des lésions neuropathologiques associées à la maladie d'Alzheimer se stimuleraient réciproquement au cours du temps (Figure 6). Figure 6. Modèle de cercle vicieux reliant le stress oxydatif, l'inflammation et la neurodégénérescence dans la maladie d'Alzheimer. Image tirée et adaptée de Gamba P et coll. (178). Abréviation : DNF dégénérescences neurofibrillaires 25 1. 1. 7. 2. Voies de communication entre le système nerveux central et la périphérie Le SNC a longtemps été considéré comme un site privilégié sur le plan immunologique car isolé du reste de l'organisme par la barrière hémato-encéphalique (BHE). La BHE, ou barrière hémato-méningée, est une barrière physiologique séparant la circulation sanguine du liquide céphalo-rachidien (LCR), fluide dans lequel baigne le cerveau et la moelle épinière. Constituée de cellules endothéliales scellées entre-elles par des jonctions serrées, et entourée de péricytes en contact avec les pieds astrocytaires (Figure 7), la BHE constitue un filtre hautement sélectif protégeant le SNC de nombreuses substances nocives (ex. agents pathogènes, toxines) tout en permettant le passage de nutriments essentiels au fonctionnement du cerveau et l'élimination des déchets (179). Figure 7. Représentation schématique de la barrière hémato-encéphalique. Figure tirée et adaptée de Ce concept historique d'indépendance entre le système nerveux central et la périphérie a laissé un héritage qui a conduit à considérer la recherche sur l'inflammation du SNC de manière isolée de son homologue systémique, se produisant à l'extérieur du SNC. Un concept réducteur si l'on tient compte du fait que l'Homme est continuellement exposé à une multitude d'agents stressants capables de déclencher une inflammation systémique, dont les conséquences peuvent impacter le SNC. En effet, à la suite d'une infection systémique d'origine bactérienne ou virale une réponse centrale caractérisée par une constellation de symptômes cliniques est déclenchée, définie sous le terme de sickness behavior ou comportement de maladie (180). Le sickness behavior est 26 un ensemble coordonné de changements de comportements adaptatifs permettant à l'organisme de faire face à une infection, incluant généralement de la fièvre, une sensation de malaise, un état léthargique, une perte d'appétit, un état dépressif, de la somnolence, une tachycardie ou encore une diminution des facultés de concentration. Bien que la grande majorité des médiateurs pro-inflammatoires soit physiquement incapable de traverser la BHE du fait de leur poids moléculaire élevé, plusieurs voies de communication alternatives, humorales ou neuronales, ont été identifiées, permettant la transmission d'une signalisation de la périphérie vers le SNC (181). Parmi les mécanismes identifiés on peut citer : - la voie des organes circumventriculaires. Il s'agit de régions situées autour des ventricules cérébraux o la BHE, ne comportant pas de jonctions serrées, est perméable à la diffusion passive directe de médiateurs inflammatoires d'origine systémique et la propagation de la réponse inflammatoire à travers le parenchyme cérébral (182, 183). - la voie des prostaglandines. En présence de BHE intacte, les cytokines pro-inflammatoires d'origine systémique s'avèrent capables de stimuler directement l'endothélium vasculaire cérébral, induisant la synthèse de messagers secondaires tels que les prostaglandines et l'oxyde nitrique, qui à leur tour peuvent activer la microglie et l'axe du stress hypothalamo-hypophyso- surrénalien (184, 185). - l'entrée directe de cellules immunocompétentes de la périphérie vers le parenchyme cérébral, et en particulier la migration des progéniteurs des cellules du système immunitaire favorisant la prolifération de la microglie dans le SNC (186). - la voie du transport actif des cytokines, permettant le passage des cytokines à travers la BHE par un système de transporteurs (187189). Toutefois, il convient de noter que ce mécanisme de transport, en raison de sa lenteur et de son caractère saturable, semble difficilement conciliable avec la réponse rapide du SNC en réponse à une inflammation systémique. - la voie du nerf vague. Les médiateurs pro-inflammatoires peuvent agir indirectement sur l'hypothalamus via le nerf vague, principal composant du système nerveux parasympathique, dont les afférences se projettent au niveau du noyau du tractus solitaire, qui coordonne les réflexes végétatifs (190). Par ces voies de communication, qui ne s'excluent pas mutuellement, l'inflammation systémique serait ainsi capable d'induire une activation microgliale et astrocytaire favorisant l'hyperphosphorylation de la protéine Tau, l'oligomérisation des peptides amyloïdes- et l'activation du complément ; autant de mécanismes pouvant sous-tendre la pathologie de la maladie d'Alzheimer (191). 27 Par ailleurs, l'intégrité de la BHE ne semble pas immuable, et deviendrait davantage perméable aux molécules d'origine systémique au cours du vieillissement. L'inflamm'aging pourrait, par sa capacité à affaiblir la résistance des jonctions serrées des cellules épithéliales, expliquer en partie l'altération de l'intégrité de la BHE liée à l'avancée en âge (192). D'autre part, une méta- analyse a rapporté une altération exacerbée de la BHE chez les patients atteints de maladie d'Alzheimer ou de démence vasculaire comparés à des individus cognitivement sains (192, 193). Cette perte d'intégrité de la BHE semblerait apparaitre précocement dans la pathologie (194, 195), précédent l'atrophie hippocampique (193), la survenue de troubles cognitifs (196) et s'intensifierait à mesure que la maladie progresse (192, 197). Ainsi, certains individus pourraient être davantage vulnérables aux phénomènes inflammatoires systémiques ; un facteur de susceptibilité qui pourrait bien contribuer, voire prédisposer, au développement de la maladie d'Alzheimer. 1. 1. 7. 3. Inflammation systémique 1. 1. 7. 3. 1. Association entre inflammation systémique et maladie d'Alzheimer Au-delà des mécanismes neuro-inflammatoires de la maladie d'Alzheimer abordés précédemment, de nombreuses études épidémiologiques ont mis en évidence une association entre des taux sériques ou plasmatiques de médiateurs pro-inflammatoires et la maladie d'Alzheimer. Notamment, une méta-analyse portant sur 14 études épidémiologiques (198) a rapporté des concentrations circulantes significativement plus élevées d'IL-6, de TNF-, d'IL- 1, de TGF-, d'IL-12 ou encore d'IL-18 chez des patients présentant une maladie d'Alzheimer comparativement à des sujets témoins. Des niveaux de CRP (C-Reactive Protein) plus élevés (c. -à-d. , > 3, 3 mg/L correspondant au quartile supérieur de distribution) ont été associés à la présence de troubles cognitifs légers (dont le taux de conversion annuelle vers le stade de démence est estimé entre 5 et 10% (199) par rapport à des témoins cognitivement sains (200). A l'instar de la CRP, des niveaux plus élevés de TNF et d'IL-6 circulants ont été rapportés chez des patients atteints de maladie d'Alzheimer et de troubles cognitifs légers (198, 201203). A l'appui d'un rôle majeur de l'inflammation dans la pathogenèse de la maladie d'Alzheimer, plusieurs études ont examiné le lien entre les niveaux circulants de biomarqueurs pro- inflammatoires et la survenue d'une maladie d'Alzheimer au travers d'études longitudinales, sans pour autant établir de consensus sur leur part respective dans la prédiction de la pathologie Alzheimer. Notamment, les taux circulants de CRP et d'IL-6 se sont révélés être associés à un sur-risque de démence et de maladie d'Alzheimer (204206). Une étude récente a révélé que les personnes ayant des niveaux circulants plus élevés de CRP à l'âge adulte (c. -à-d. , > 4, 69 mg/L correspondant au quartile supérieur de distribution) présentaient un déclin cognitif 11, 6% plus prononcé dans les deux décennies suivantes comparativement au quartile inférieur de distribution ( 1, 04 mg/L) (207). Dans une autre étude, des taux plasmatiques élevés de CRP à l'âge adulte (c. -à-d. , > 1, 0 mg/L correspondant au quartile supérieur) étaient associés à un sur- 28 risque, d'un facteur 3, de maladie d'Alzheimer jusqu'à 25 ans plus tard (208). Par ailleurs, une fois le diagnostic de maladie d'Alzheimer posé, un taux élevé de TNF (c. -à-d. , quartile supérieur de la distribution correspondant à un taux sérique > 2, 4 pg/mL) était associé à un sur- risque multiplié par 4 de déclin cognitif à 6 mois, contrairement aux sujets présentant de faibles taux de TNF qui n'ont montré aucun signe de déclin cognitif durant les 6 mois (209). De plus, des sujets âgés cognitivement sains présentant une production cellulaire plus importante d'IL- 1 ou de TNF (c. -à-d. , dans les terciles intermédiaires ou supérieurs par rapport au tercile inférieur) avaient un risque accru multiplié par près de 3 de développer une maladie d'Alzheimer dans les années qui suivaient (210). Toutefois, les preuves directes d'un lien causal entre inflammation systémique et maladie d'Alzheimer restent limitées avec des résultats parfois contradictoires (211) ; certaines études ne mettant en évidence aucune différence dans la concentration de médiateurs pro- inflammatoires (211, 212) voire même des taux réduits de TNF chez les patients présentant une pathologie Alzheimer comparés à des sujets témoins (213). 1. 1. 7. 3. 2. Hypothèse infectieuse dans la composante inflammatoire de la maladie d'Alzheimer L'inflammation étant un mécanisme fondamental de défense contre les agents pathogènes invasifs, l'hypothèse infectieuse dans la maladie d'Alzheimer stipule que les changements neuropathologiques observés dans la maladie d'Alzheimer pourraient être le reflet clinique d'infections cérébrales ou périphériques (214). L'accent sur le rôle des maladies infectieuses a permis de mettre en évidence que la voie inflammatoire dans la maladie d'Alzheimer serait partiellement médiée par l'occurrence d'infections bactériennes, virales ou encore fongiques chroniques (214, 215). La présence d'une ou plusieurs infections toutes causes confondues sur une période de suivi de 5 ans multiplierait par 1, 4 le risque de développer une maladie d'Alzheimer ; un risque qui augmenterait par ailleurs avec l'âge (216). L'une des hypothèses est basée sur le concept de la dissémination systémique de médiateurs pro-inflammatoires tels que la CRP, l'IL-6 et le TNF dans le cadre d'infections localisées comme observé dans le cas de la parodontite (c. -à-d. , l'infection du parodonte, tissu de soutien des dents) (217). La parodontite chronique étant une affection immuno-inflammatoire périphérique répandue, il a été proposé qu'elle jouerait un rôle significatif en tant que facteur de risque potentiel dans le développement de la maladie d'Alzheimer et le déclin cognitif associé (218220). De même, Helicobacter pylori, une bactérie fréquemment retrouvée au niveau intestinal, a été identifiée comme un facteur de risque possible de maladie d'Alzheimer (221223), bien que l'ensemble des études ne soient pas concordantes (224). 29 Une étude d'association portant sur 128 patients atteints de maladie d'Alzheimer et 135 témoins a observé que la charge infectieuse (évaluée par le titrage des anticorps dirigés contre des pathogènes infectieux communs incluant des virus (cytomégalovirus et virus de l'Herpès simplex de type 1) et des bactéries (Borrelia burgdorferi, Chlamydophila pneumoniae et Helicobacter pylori) serait associée à une probabilité multiplié par 4 de présenter une maladie d'Alzheimer (225). Enfin, le sepsis, désignant une réponse inflammatoire généralisée faisant suite à une infection grave de l'organisme causée par des agents infectieux (226), serait également associé à l'augmentation de l'expression cytokinique au niveau cérébral (227) et l'activation microgliale (228). Il convient néanmoins d'interpréter ces résultats avec prudence, compte-tenu de la relation de causalité inverse qui peut exister entre la présence d'infection et la maladie d'Alzheimer. En effet la maladie, caractérisée par une dépendance progressive et une perte de l'état de conscience de soi, confère une susceptibilité accrue au développement d'infections (209). 1. 1. 7. 3. 3. L'inflammation systémique comme dénominateur commun de nombreux facteurs de risque de la maladie d'Alzheimer A l'appui de l'hypothèse selon laquelle l'inflammation systémique pourrait avoir un caractère causal dans le développement de la maladie d'Alzheimer, un certain nombre de facteurs de risque intrinsèques et environnementaux connus dans le développement de la maladie partage un phénotype pro-inflammatoire systémique commun. L'âge, principal facteur de risque de maladie d'Alzheimer, est notamment associé au phénomène d'inflamm'aging ; une régulation à la hausse de la réponse inflammatoire systémique résultant d'un déséquilibre de la balance entre facteurs pro- et anti-inflammatoires en faveur d'un état inflammatoire chronique de bas grade (229). Le vieillissement s'accompagne également d'une augmentation généralisée des dommages oxydatifs, probablement en raison d'un affaiblissement des défenses anti-oxydantes de l'organisme (230). D'autre part, un état inflammatoire chronique de bas grade peut être favorisé par une alimentation déséquilibrée (c. -à-d. , riche en graisses saturées, pauvre en fruits et légumes ou en fibres) (231), une dysbiose du microbiote intestinal (232) ou encore la sédentarité (233). Ce dénominateur inflammatoire commun est par ailleurs fréquemment observé dans diverses maladies et complications qui leurs sont associées telles que l'obésité (234), le diabète (235), la dépression (236) ou encore les maladies cardio-vasculaires (237), tous considérés comme des facteurs de risque de démence. Globalement, ces résultats fournissent un aperçu de la relation temporelle entre l'inflammation systémique et la survenue de la maladie d'Alzheimer, suggérant que l'inflammation systémique 30 survenant des décennies avant l'âge typique d'apparition de la maladie d'Alzheimer pourrait favoriser la progression des processus neurodégénératifs et précipiter le stade symptomatique clinique. Étant donné que l'inflammation systémique est une caractéristique importante du vieillissement, qu'il soit naturel ou pathologique, une meilleure caractérisation des phénomènes inflammatoires dans la neurodégénérescence et la maladie d'Alzheimer pourrait avoir des répercussions considérables dans la mise en place de stratégies préventives ou thérapeutiques, touchant une population cible en pleine expansion. 1. 1. 7. 4. Prédisposition génétique associée aux composants du système immunitaire et à l'inflammation Alors que l'inflammation est largement reconnue comme faisait partie intégrante du processus de neurodégénérescence dans la maladie d'Alzheimer, les données génétiques suggèrent un rôle encore plus précoce des mécanismes immunitaires et inflammatoires dans le développement de la maladie. La stratégie la plus couramment utilisée dans l'identification de gènes candidats dans une maladie, et notamment dans la maladie d'Alzheimer, est l'étude d'association à l'échelle du génome (GWAS), dans laquelle jusqu'à plusieurs millions de polymorphismes nucléotidiques sont simultanément testés en association avec différents outcomes comme le risque de maladie, les mesures d'imagerie cérébrale ou encore les paramètres neuropathologiques (238). Jusque récemment, le seul facteur de risque génétique établi de manière sans équivoque dans le développement de la forme sporadique de la maladie d'Alzheimer était ApoE-4. Au-delà de son rôle majeur dans le métabolisme du cholestérol, il a été rapporté que le variant ApoE-4 serait également impliqué dans le déclenchement d'une cascade inflammatoire qui affaiblirait la BHE et la rendrait plus perméable aux molécules périphériques (239, 240). Depuis, d'autres facteurs de susceptibilité génétique ont été identifiées dans la survenue de la forme sporadique de la maladie d'Alzheimer, dont nombre d'entre eux sont impliqués dans l'activation du système immunitaire inné et l'inflammation (ex. TREM2, CD33) (Figure 5, légende bleue) (58, 241243). Fait intéressant, ces gènes seraient impliqués dans la régulation à la fois des aspects centraux et périphériques du fonctionnement immunitaire. A noter qu'aucune corrélation de ce type n'a été rapportée entre les gènes codant pour l'APP, PSEN1 ou PSEN2 et l'incidence de la forme sporadique de la maladie (244). Parmi ces autres facteurs de susceptibilité identifiés, certaines variantes hétérozygotes du polymorphisme génétique de TREM2 (Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells 2), un récepteur membranaire exprimé par les cellules microgliales ayant pour rôle la stimulation de la phagocytose et la répression de la production cytokinique, seraient plus fréquemment observées chez les patients atteints de maladie d'Alzheimer. La présence du variant hétérozygote TREM2 serait notamment associée à un risque multiplié par 3 de développer une maladie d'Alzheimer (245, 246), et serait également impliqué dans d'autres maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson, la démence fronto-temporale ou encore 31 la sclérose latérale amyotrophique (247), renforçant l'hypothèse d'un lien causal entre les composants du système immunitaire inné et les maladies neurodégénératives. Le gène CD33 (Cluster of Differentiation-33) est un gène codant pour une protéine transmembranaire appartenant à la famille des récepteurs immunitaires notamment exprimé à la surface des cellules myéloïdes (incluant les cellules microgliales). CD33 s'est avéré être retrouvé en abondance dans le cerveau de patients atteints de maladie d'Alzheimer, et dont la quantité corrélait avec la charge amyloïde et la sévérité de la maladie (248, 249). Par ailleurs, CD33 altérerait la clairance des peptides amyloïde- médiée par la microglie (249). La Clusterine (CLU), également connue sous le nom d'apolipoprotéine J, est une glycoprotéine impliquée dans la lyse cellulaire médiée par le complément, le transport lipidique et l'apoptose (c. -à-d. , le processus de mort cellulaire programmée). Originellement décrite en raison de sa capacité à induire l'agrégation cellulaire, la CLU serait capable d'interagir avec les peptides amyloïde-, jouant un rôle majeur dans l'agrégation et la toxicité de l'amyloïde- (250). Par ailleurs, une concentration plus élevée de CLU dans le plasma et le LCR de patients atteints de maladie d'Alzheimer a été rapportée, comparativement à des sujets témoins, associée à l'atrophie du cortex entorhinal et la progression clinique de la maladie (250252). Également, seuls ou en association avec l'ApoE-4, des polymorphismes génétiques dans la région régulatrice de gènes codant pour des médiateurs pro-inflammatoires prédisposeraient au développement de la maladie d'Alzheimer. Ces polymorphismes incluent notamment des cytokines pro-inflammatoire telles que l'IL-6 et l'IL-1 ou encore le TNF (253257). D'autres facteurs de risque génétiques associés aux composants de l'immunité, non décrits dans ce sous- chapitre tels que CR1, HLA-DRB5/DRB1, INPP5D ou encore MEF2C ont également été impliqués dans le développement de la maladie d'Alzheimer (250). L'identification de voies multi-génétiques dans le cadre de la maladie d'Alzheimer soutiendrait ainsi l'hypothèse d'un caractère causal du système immunitaire et de la réponse inflammatoire associée dans le cadre de la maladie d'Alzheimer. Le risque génétique pourrait ainsi refléter l'incapacité de certains individus à développer une réponse immunitaire adéquate contre les infections, favorisant, en interaction avec les facteurs environnementaux tout au long de la vie, le développement de la maladie d'Alzheimer. 1. 1. 7. 5. Traitements anti-inflammatoires non stéroïdiens L'hypothèse que la prise d'anti-inflammatoires non-stéroïdiens (AINS) sur le long terme pourrait retarder la survenue d'un diagnostic de maladie d'Alzheimer tire son origine d'une part des mécanismes inflammatoires associés à la maladie d'Alzheimer (tels que décrits ci-dessus) et d'autre part de l'incidence de maladie d'Alzheimer considérablement réduite, d'environ 40%, chez les personnes souffrant de polyarthrite rhumatoïde (258). La polyarthrite rhumatoïde, 32 forme la plus courante de polyarthrite inflammatoire, se manifeste par une inflammation persistante des articulations. Alors qu'aucune preuve d'association causale n'a pu être mise en évidence entre la polyarthrite rhumatoïde et la maladie d'Alzheimer, il a été suggéré que l'effet bénéfique pourrait partiellement s'expliquer par la prise d'AINS généralement très soutenue chez les patients (258). Les AINS sont les agents anti-inflammatoires les plus couramment utilisés dont certains sont disponibles sans ordonnance (ex. aspirine, ibuprofène). Bien que plusieurs actions distinctes aient été décrites, le mécanisme d'action principal des AINS repose sur l'inhibition de l'activité de la cyclo-oxygénase (COX). La COX est une enzyme, exprimée sous deux formes (COX-1 et COX-2), intervenant au sommet d'une cascade de signalisation aboutissant à la formation de substances impliquées notamment dans l'inflammation systémique et centrale. D'autres mécanismes d'actions plus spécifiques des AINS incluent l'inhibition de l'agrégation des fibrilles amyloïdes-, par affinité de liaison (259). Selon les données épidémiologiques issues de plusieurs méta-analyses (260265), la prise d'AINS réduirait le risque de développer une démence ou une maladie d'Alzheimer d'approximativement 30% comparé à la non-consommation d'AINS, et l'effet bénéfique serait d'autant plus important lorsque l'exposition perdure sur plusieurs années (261, 266). Toutefois, l'utilisation d'AINS dans la maladie d'Alzheimer reste controversée, notamment car les conclusions de nombreuses études épidémiologiques rapportant l'apparition tardive de la maladie d'Alzheimer chez les utilisateurs d'AINS n'ont pas été corroborées dans les essais cliniques (267, 268). Une explication spéculative proviendrait du fait que la majorité de ces essais cliniques ciblent les phases précoces de la maladie d'Alzheimer, une période o l'inflammation semble essentielle dans l'initiation de la clairance de l'amyloïde- et la mise en place des stratégies de défense de l'organisme (241). A l'heure actuelle, bien qu'une accumulation de preuves semble montrer un intérêt de la prise régulière d'AINS il n'existe aucun consensus que ce soit en termes de durée, de dosage ou de fenêtre temporelle, pour l'utilisation des AINS en tant que stratégie préventive ou thérapeutique dans la maladie d'Alzheimer. En outre, toute prise de médicaments peut conduire à l'apparition d'effets secondaires potentiellement néfastes (ex. intolérance digestive, nausée, saignements ou encore hypertension) (268), dont la balance bénéfique-risque n'est pas clairement établie dans le cadre des AINS et de la maladie d'Alzheimer. 33 Pour conclure sur ces sous-chapitres, il devient désormais évident que l'inflammation ne peut plus être considérée comme un simple épiphénomène de la maladie d'Alzheimer. Alors que les études génétiques ont fourni des preuves convaincantes d'un rôle étiologique de la fonction immunitaire dans la maladie d'Alzheimer, les résultats de la recherche épidémiologique et translationnelle suggèrent que l'inflammation centrale et systémique est capable de favoriser, si ce n'est déclencher, une pathologie neurodégénérative de type Alzheimer. Bien que la connaissance du rôle de l'inflammation systémique dans le développement et la progression de la maladie d'Alzheimer n'en soit encore qu'à ses balbutiements, il existe des preuves croissantes et convaincantes que l'inflammation du SNC et l'inflammation systémique ne peuvent être considérées isolément. L'état inflammatoire, reflet de l'interaction entre facteurs endogènes, exogènes et de prédisposition génétique, pourrait ainsi représenter une stratégie prometteuse dans l'identification de nouvelles approches préventives, thérapeutiques, voire même diagnostiques de la maladie d'Alzheimer. Toutefois, les facteurs responsables de l'initiation ou du maintien des phénomènes d'inflammation chronique de bas grade restent peu élucidés dans le cadre de la maladie d'Alzheimer. L'un des modèles les plus largement répandus dans l'étude de l'inflammation repose sur l'exposition aux endotoxines bactériennes, un motif typique de PAMPs décrit ci- dessous. 34 endotoxines : des 1. 2. Les ubiquitaires 1. 2. 1. Définition, structure et origine substances toxiques Les lipopolysaccharides (LPS, ou couramment appelés endotoxines) sont des composants majeurs de la membrane externe des bactéries dites à Gram-négatif 3. Ils figurent parmi les substances biologiques les plus toxiques que l'on connaisse, activant la forme primitive de défense de l'organisme qu'est l'immunité innée. On dénombrerait pas moins de trois millions de molécules LPS par bactérie, recouvrant ainsi jusqu'à de 75% de la surface bactérienne (269). Les LPS sont des complexes macromoléculaires, constitués de trois éléments : (i) le lipide A, une ancre hydrophobe ayant la particularité de contenir des acides gras hydroxylés, (ii) un noyau oligosaccharide (core) et (iii) un polysaccharide distal (ou antigène O) (Figure 8). Figure 8. Représentation schématique de la structure moléculaire du lipopolysaccharide. 3 La coloration de Gram doit son nom au bactériologiste Hans Christian Gram qui mit au point cette une méthode de classification des bactéries en 1884. Fréquemment utilisée, elle permet de différencier les bactéries selon la composition de leur paroi. 35 Le lipide A est responsable de l'activité immunologique (c. -à-d. , de la nature toxique) des LPS, tandis que la partie polysaccharidique est responsable de la spécificité antigénique (269, 270). Ces deux éléments moléculaires peuvent varier en fonction de la souche ou de l'espèce bactérienne. Par conséquent, il existe une multitude de molécules LPS dont l'activité biologique diffère du fait de leur diversité structurelle, expliquant le caractère plus ou moins virulent des bactéries. Omniprésentes dans notre environnement, les bactéries sont capables de coloniser tous les types de biotopes, faisant d'elles et de leurs LPS des contaminants ubiquitaires. Chez l'homme, ces bactéries se retrouvent dans de nombreuses parties de l'organisme incluant les voies gastro- intestinales, la peau, les muqueuses ou encore la salive ; le microbiote intestinal étant l'un des écosystèmes les plus denses jamais étudiés. 1. 2. 2. Le microbiote intestinal : réservoir endogène d'endotoxines Le microbiote intestinal (anciennement appelé flore intestinale) représente l'ensemble des micro-organismes du tractus gastro-intestinal, dont la principale composante est d'origine bactérienne. D'après les estimations, plus de dix mille milliards de bactéries colonisent le microbiote intestinal humain. Par comparaison, cela équivaut approximativement à 1, 3 fois plus de cellules bactériennes que de cellules eucaryotes nous composant en tant qu'humain (271). La répartition des bactéries dans le tractus digestif suit un gradient de concentration de proximal en distal ; la densité bactérienne la plus élevée se situant au niveau du côlon. Avec une taille plus faible que celle d'une cellule eucaryote (c. -à-d. , de 1 à 10 m pour une bactérie et de 10 à 100 m pour une cellule eucaryote), la biomasse totale du microbiote intestinal est estimée à environ 1, 5 kg par individu. Sur le plan phylogénétique, on estime que trois phyla bactériens (c. -à-d. , lignées d'espèces issues d'une même souche) composent la majorité de la composante bactérienne du microbiote intestinal : le phylum des Firmicutes (60 à 80%), des Bacteroidetes (20 à 30%) et des Actinobacteria (< 10%) (272, 273). Toutefois, la composition du microbiote intestinal, en terme de quantité mais aussi de qualité, est propre à chaque individu (272, 274). En dehors des bactéries, d'autres micro-organismes tels que les champignons, archées et virus composent également le microbiote intestinal, bien que leurs fonctions restent mal caractérisées. L'hôte humain et le microbiote sont un exemple parfait de symbiose (c. -à-d. , de coopération biologique, durable et réciproquement profitable entre les deux organismes). Bien que la composition microbienne diffère d'un individu à l'autre, des propriétés communes sont partagées. Le recours à des animaux axéniques (c. -à-d. , dépourvus de microbiote intestinal) a 36 notamment permis de mettre en évidence l'implication de ce microbiote dans diverses fonctions physiologiques d'ordre métabolique, trophique ou protectrice. Fonctions métaboliques Une des fonctions majeures du microbiote intestinal est d'assurer la digestion de substrats et de résidus alimentaires complexes non digestibles par l'organisme seul, incluant notamment les fibres alimentaires contenues dans les céréales, les fruits et les légumes. De ces processus de digestion et de fermentation résultent la production de gaz et de nombreux métabolites dont les acides gras à chane courte (AGCC) servant de substrats énergétiques à la fois pour le microbiote mais également pour l'hôte (275, 276). D'autre part, le microbiote intestinal participe à la synthèse de certaines vitamines (ex. vitamines K, B12, B8), favorise l'absorption de nutriments et joue un rôle non négligeable dans le métabolisme des stérols (ex. cholestérol, acides biliaire) (277279). Fonctions trophiques Le microbiote intestinal participe à l'intégrité et la maturation de la muqueuse du tube digestif. En particulier, son effet trophique réside dans sa capacité à stimuler la prolifération et la différenciation des cellules épithéliales, la production de mucus ou encore la vascularisation (280). Fonctions protectrices Les bactéries commensales, de par leur présence, stimulent le système immunitaire de l'hôte et préviennent l'invasion et la colonisation d'opportunistes pathogènes dans le tractus digestif par des phénomènes de compétition et par la production de substances bactéricides (281283). Considéré comme un véritable organe à part entière, le microbiote intestinal est un écosystème complexe dont l'équilibre apparat essentiel au maintien de diverses fonctions de l'organisme. Bien que relativement stable au cours du temps, la richesse et la diversité du microbiote peuvent être influencées par de nombreux facteurs exogènes et endogènes. Parmi ceux-ci, l'alimentation représente l'un des facteurs environnementaux majeurs susceptibles d'influencer l'équilibre de l'écosystème microbien (284, 285). Une équipe de chercheurs internationaux impliqués dans le projet MetaHit (Metagenomics of the Human Intestinal Tract, lancé en 2008 (286) a notamment identifié trois signatures de composition bactérienne distinctes, appelées entérotypes, notamment associées aux habitudes alimentaires sur le long terme. La présence d'un entérotype de type 1 (caractérisé par l'abondance de 37 Bacteroidetes) étant associée à un régime riche en lipides et en protéines d'origine animale, tandis qu'un régime riche en glucides favoriserait un entérotype de type 2 (caractérisé par l'abondance de Prevotella) (287). Cette opposition dans la composition du microbiote intestinal entre régimes riches en lipides (caractérisés par une prévalence élevée de Bacteroidetes et Actinobacteria) versus régimes riches en glucides et notamment en fibres (caractérisés par une prévalence élevée de Firmicutes et Proteobacteria) a également été rapportée par Wu et ses collaborateurs (287). Un constat qui pourrait offrir de nouvelles possibilités prometteuses dans la compréhension du microbiote et son impact sur la santé. Par ailleurs, il semble que la composition du microbiote intestinal soit également influencée par des changements alimentaires à très courts termes (c. -à-d. , de quelques jours à quelques mois) (288). Parmi les autres facteurs capables de moduler la composition du microbiote intestinal, on peut citer notamment le mode d'accouchement (c. -à-d. , par césarienne ou par voie basse), le type d'allaitement (c. -à-d. , au sein ou au biberon), le stress, le tabagisme, la consommation excessive d'alcool ou encore la prise de certains médicaments et plus particulièrement d'antibiotiques dont le mode d'action est de bloquer les mécanismes essentiels à la multiplication ou la survie bactérienne. Toutefois, le microbiote est doté d'une capacité de résilience lui permettant de revenir, après plusieurs semaines voire plusieurs mois, à son état initial après avoir subi une période de perturbations. Néanmoins, cette aptitude peut être limitée par l'occurrence d'antibiothérapies chroniques, une alimentation déséquilibrée sur le long terme ou par la présence de comorbidités, augmentant ainsi la susceptibilité de l'impact négatif qu'un déséquilibre du microbiote intestinal pourrait avoir sur la santé de l'hôte. La sélection d'un microbiote qui manque de résilience et de diversité a notamment été proposée pour expliquer une partie de l'augmentation drastique des maladies auto-immunes et inflammatoires (232). Une altération qualitative et fonctionnelle du microbiote intestinal, qualifiée de dysbiose, a été rapportée dans de nombreuses et diverses maladies telles que l'obésité (289), le diabète (290, 291), le syndrome métabolique (292), les maladies inflammatoires de l'intestin (293), l'autisme (294), la dépression (295) ou encore la maladie d'Alzheimer (296299). 1. 2. 3. Endotoxémie Les bactéries naturellement retrouvées dans le microbiote intestinal libèrent leurs endotoxines non seulement lors de la mort cellulaire, mais également lors de la croissance et de la division bactérienne (lyse membranaire), faisant du tractus digestif un véritable réservoir à endotoxines au sein de l'organisme. Dans les conditions physiologiques normales, l'immense majorité des endotoxines sont maintenues dans le tractus digestif, et donc par conséquent à l'extérieur de notre organisme. 38 Toutefois, elles possèdent la capacité de traverser les barrières physiologiques pour atteindre la circulation sanguine. Parmi les mécanismes de passage élucidés on peut citer : - la co-absorption, consistant en un transport facilité du LPS par les chylomicrons (c. -à-d. , les lipoprotéines responsables du transport des lipides, et notamment des triglycérides, apportés par l'alimentation) sécrétés dans le plasma lors de la digestion lipidique (300302). - la diffusion passive paracellulaire (c. -à-d. , entre les cellules épithéliales de la barrière intestinale), concomitante à la diminution de l'expression des gènes codant pour les protéines de jonction serrées (ex. Zonula Occludens) (303). Ce phénomène d'hyperperméabilité intestinale étant également - et au-delà du vieillissement - étroitement associé à l'alimentation. - la translocation bactérienne, généralement observé lors d'agression de la muqueuse, permettant le passage de bactéries vers les ganglions mésentériques puis vers les organes périphériques (304). Toutefois, ce mécanisme n'a pu être observé qu'in vitro. Bien que majoritairement favorisé par à l'alimentation, le passage d'endotoxines dans le sang peut résulter de situations banales telles que le brossage des dents, les soins dentaires, une plaie ouverte, ou plus rarement être consécutif à une infection (ex. infections urinaires, pulmonaires, parodontale ou digestives) ou une intervention chirurgicale. La présence d'endotoxines dans le sang est ainsi qualifiée d'endotoxémie. On distingue l'endotoxémie métabolique, caractérisée par une inflammation sub-clinique de bas grade en l'absence de toute source évidente d'infection bactérienne et dont les manifestations cliniques sont peu prononcées voire inexistantes, de l'endotoxémie faisant suite à une infection sévère, de source généralement exogène, et pouvant mener au choc septique. Ces travaux de thèses ont notamment porté sur le concept d'endotoxémie métabolique. 1. 2. 4. Réponse immunitaire et processus inflammatoire en réponse à l'endotoxémie Les endotoxines, et plus particulièrement leur lipide A, sont l'exemple typique de motifs pathogènes PAMPs d'origine bactérienne reconnus par les récepteurs PRRs des cellules du système immunitaire inné. La présence de ces endotoxines dans la circulation sanguine, véritable signal d'alerte pour l'hôte d'une infection bactérienne, va dès lors induire l'activation du système immunitaire inné et la réaction inflammatoire associée (décrite préalablement dans le chapitre 1. 1. 7). It is our response that makes the disease 4 (Thomas Lewis, 1972) 4 C'est notre réponse qui crée la maladie 39 Concrètement, une fois dans la circulation sanguine, les molécules de LPS vont rapidement être captées par la LPS-Binding Protein (LBP) et délivrées aux cellules du système immunitaire o elles vont initier, via un complexe trimoléculaire composé du Cluster of Differentiation 14 (CD14), du Toll-Like Receptor 4 (TLR4) et de la Myeloid Differentiation protein 2 (MD2), la cascade de signalisation aboutissant à la production de médiateurs inflammatoires (Figure 9). Figure 9. Représentation schématique simplifiée de la cascade de signalisation en réponse aux endotoxines d'origine intestinale. Abréviations : LPS Lipopolysaccharides ; LBP Lipopolysaccharides-Binding Protein ; CD14 Cluster of Differentiation-14 ; TLR4 Toll-Like Receptor-4. 40 Lipopolysaccharide-Binding Protein Initialement décrite dans les années 1980, la Lipopolysaccharide-Binding Protein a été nommée ainsi de par son aptitude à se lier avec une forte affinité aux LPS. Principalement synthétisée par le foie, mais également par le tissu adipeux blanc (305), la LBP est sécrétée de manière consécutive dans la circulation sanguine à des taux moyens de l'ordre de 7 à 20 g/mL chez des sujets sains ; des taux augmentant notamment avec l'âge ou la présence de comorbidité (ex. obésité, syndrome métabolique, bactériémie, syndrome de réponse inflammatoire systémique) (306315). En réponse à un afflux d'endotoxines dans le sang, les taux circulants de LBP augmentent rapidement et restent relativement élevés jusqu'à 72h après exposition (316318). le potentiel Étant donné leur architecture conservée, la plupart des molécules de lipide A sont détectées à des niveaux de l'ordre du picomolaire par le système immunitaire inné ; une faculté qui serait en partie médiée par la LBP, qui, à de faibles niveaux, est capable d'augmenter considérablement immunostimulant des LPS (319, 320). Ce mécanisme d'amplification biologique de la toxicité des LPS permet notamment à l'hôte de détecter des quantités infimes de LPS, signal d'une invasion bactérienne, afin d'activer en conséquence son système immunitaire et d'initier une réponse appropriée. Ce mécanisme est basé sur la capacité de la LBP à transférer les molécules de LPS vers le co-récepteur CD14 des cellules immunitaires, décrit ci-dessous (321, 322). À noter par ailleurs que la LBP serait capable de se lier à des composés bactériens autres que le LPS (318, 323). Cluster of Differentiation 14 CD14 est une protéine agissant tel un co-récepteur (avec TLR4, décrit ci-dessous) dans la détection et la transmission du signal en réponse aux LPS. Son rôle crucial dans la signalisation du LPS a été mis en évidence à partir d'un modèle expérimental de souris knock-out pour le gène CD14 (c. -à-d. , dont le gène CD14 a été totalement invalidé) qui se sont montrées résistantes au choc septique induit par l'injection de LPS ou de bactéries vivantes (324). Par ailleurs, CD14 a une large spécificité de ligand, reconnaissants les motifs structurels de plusieurs composés microbiens (325). CD14 existe sous 2 formes distinctes mais complémentaires : la forme membranaire (mCD14) et la forme soluble (sCD14). Le mCD14 est une glycoprotéine ancrée à la surface membranaire des cellules immunitaires de la lignée myéloïde (notamment macrophages et monocytes), généralement exprimée et synthétisée pour faire face à la présence éventuelle de LPS circulants. Son homologue soluble sCD14 serait quant à lui produit en réponse à un afflux important de LPS, soit par clivage de la forme membranaire soit directement sécrété par certaines cellules notamment endothéliales, dans le but d'activer les cellules dépourvues de mCD14 (326328). D'un point de vue métabolique, les deux formes de CD14 sont capables de se lier au complexe LPS-LBP, permettant par la suite le transfert des LPS au complexe TLR4-MD2 et l'initiation de la réponse inflammatoire. 41 Toll-Like Receptor 4 Le mécanisme exact impliqué après liaison du complexe LPS-LBP à CD14 est resté insaisissable pendant des années ; l'identification du récepteur aux LPS fut l'une des découvertes les plus importantes dans le domaine des endotoxines et de l'activation du système immunitaire inné depuis les années 1990, et a notamment été récompensée par l'attribution du prix Nobel de physiologie ou de médecine 2011 à ses auteurs, Bruce Beutler et Jules Hoffmann. Il s'agit du récepteur TLR4 (Toll-Like Receptor 4) appartenant à la famille des récepteurs PRRs de l'immunité innée. Suite à la reconnaissance du lipide A (ou du complexe lipide A-CD14), et en association avec MD2, le récepteur TLR4 va adopter un changement de conformation entrainant son activation : il s'agit de l'étape initiatrice de la cascade de signalisation intracellulaire conduisant à la production et à la sécrétion dans la circulation sanguine de médiateurs inflammatoires. Mesure des biomarqueurs de l'endotoxémie En pratique, la mesure de l'endotoxémie s'effectue majoritairement via le dosage des endotoxines par test LAL (Limulus Amebocyte Lysate). Dans cette thèse, excepté lorsque spécifié, les études rapportant des mesures de l'endotoxémie font référence à ce test. Cette méthode de dosage utilise un extrait LAL dont la propriété est de coaguler en présence d'endotoxines bactériennes. Le degré d'activation de la cascade de coagulation étant lié à l'activité des endotoxines, le test LAL permet ainsi de mesurer la fraction biologiquement active des LPS. L'endotoxémie est ainsi exprimée en unités d'endotoxines/mL (EU/mL), avec une équivalence de 1 EU/mL pour approximativement 100 pg/mL de LPS, qui diffère selon la nature du LPS. Malgré son utilisation largement répandue, le test LAL présente des inconvénients inhérents à la préparation saisonnière et à la contamination par le 1-3 -D glucane conduisant respectivement à une diminution de la sensibilité et de la spécificité (329). Par ailleurs, différents facteurs plasmatiques (ex. sels biliaires, lipoprotéines) peuvent interférer avec les LPS à l'origine de faux positifs/faux négatifs ou d'une non-détectabilité avec le test LAL ; les fournisseurs eux-mêmes avertissent sur le fait que l'utilisation du test LAL peut être limité sur des échantillons sanguins (329, 330). Sans prétendre à l'exhaustivité des méthodes de dosage des LPS, d'autres techniques existent par ailleurs comme la méthode LC-MS/MS (Liquid Chromatography coupled to tandem Mass Spectrometry), notamment utilisée dans ces travaux de thèse, permettant la quantification directe des acides-gras 3-hydroxylés estérifiés du lipide A des LPS circulants (331, 332). Cette méthode, moins contraignante en termes d'interférence et présentant des seuils de détection plus faibles, permet la quantification totale (formes active et inactive) des LPS circulants généralement exprimée en mol/mL. Toutefois cette méthode ne permet pas d'estimer le potentiel immunostimulant des endotoxines. L'intérêt de la méthode LC-MS/MS provient du fait que la concentration plasmatique en acides gras 3-hydroxylés des LPS reste stable au cours du temps, alors que la réactivité du test LAL décrot rapidement après un afflux d'endotoxines 42 (331), suggérant que le dosage des LPS par la méthode LC-MS/MS représenterait un indicateur à plus long terme de la charge plasmatique en LPS. Les concentrations circulantes de LBP et de sCD14, impliqués dans la cascade de signalisation des LPS, ont toutes deux été proposées comme des biomarqueurs cliniquement pertinents de l'exposition cellulaire effective aux endotoxines (333335). Le ratio LBP : sCD14 a également été rapporté comme particulièrement pro-inflammatoire lorsqu'il combine des niveaux élevés de LBP et des niveaux faibles de sCD14 (336). La méthode de dosage standard de la LBP et du sCD14, exprimés généralement en g/mL, est le test ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay, Hycult Biotechnology). Réponse immunitaire aux endotoxines Bien que l'évolution de la réponse immunitaire engendrée par les endotoxines soit difficilement estimable à l'échelle individuelle, des études menées sur des volontaires sains ont permis d'établir que suite à une exposition aux endotoxines (c. -à-d. , injection systémique unique de 0, 2 à 4 ng/kg de LPS) (337) : - (i) les taux de médiateurs pro-inflammatoires (généralement IL-6, TNF, IL-1 ou encore IL- 18), culminent principalement dans les 1, 5 à 4, 5 heures suivant l'exposition aux endotoxines (dont l'ampleur de la variation et la cinétique varient selon les médiateurs) et diminuent progressivement 6 à 12 heures après l'exposition, - (ii) le pic de sécrétion de cytokines anti-inflammatoires (ex. IL-10, IL-1Ra ou encore IL-4) s'initie dans les 2 heures après l'afflux d'endotoxines, restant modérément élevée pendant plus de 6 heures, - (iii) les symptômes du sickness behavior apparaissent généralement dans l'heure qui suit avec une intensité plus marquée dans les 2 à 6 heures. La réponse semblerait d'autant plus élevée que la dose de LPS est importante. Au-delà de la production de cytokines pro-inflammatoires (ex. IL-6, TNF, IL-1, IL-18), d'autres molécules telles que les chimiokines (CXCL8, CCL2 and CCL5), les protéines du complément (C3, récepteurs C3a et C5a), les thromboxanes, les prostaglandines, l'oxyde nitrique synthase ou les catécholamines peuvent être sécrétées en réponse aux endotoxines, agissant comme des mécanismes alternatifs dans la signalisation d'une présence bactérienne à l'organisme (142). A noter cependant que l'étendue et l'évolution de la réaction immunitaire en réponse aux endotoxines est dépendante de nombreux facteurs incluant la sévérité de l'agression en termes de quantité d'endotoxines, de qualité (c. -à-d. , caractère plus ou moins virulent des endotoxines (338, 339), de durée d'exposition, mais aussi de l'aptitude de l'hôte à faire face à l'agression 43 notamment influencée par la capacité immunitaire, la prédisposition génétique ou encore la présence de comorbidité. De plus, certains mécanismes de régulation ont été identifiés. Alors que de faibles concentrations de LBP exacerbent la bioactivité des LPS, une augmentation aigu et de forte amplitude des concentrations de LBP (ex. dans le cas de septicémie sévère ou de choc septique) favoriserait le transfert du LPS vers des voies de détoxification par les HDL ou LDL, limitant ainsi l'activité des LPS (340342). La prise en charge des LPS par la forme soluble du CD14 inhiberait également l'activité des LPS par la voie de détoxification par les HDL (342). Cette neutralisation résulterait de la liaison des lipoprotéines à leurs récepteurs dans le foie, induisant la clairance du LPS avec sécrétion de bile (343, 344). La Phospholipid Transfer Protein (PLTP) et la protéine Bactericidal Permeability-Increasing (BPI) figurent également parmi les protéines capables de neutraliser les LPS circulants (345, 346). 1. 2. 5. Un large spectre de pathologies associées Du fait de leur capacité à traverser les barrières physiologiques de l'organisme, les endotoxines sont naturellement retrouvées en faible quantité dans la circulation sanguine de tous les êtres humains. Ces endotoxines (et plus précisément la fraction biologiquement active de ces endotoxines, mesurée par LAL) varient à des niveaux de l'ordre de 10 20 pg/mL dans les conditions physiologiques (19) ; une exposition de très bas grade, tolérée, contrôlée et ayant des propriétés immunostimulantes pour l'organisme. Toutefois, l'élévation de l'endotoxémie est fréquemment associée à un large spectre de pathologies, et émerge en tant que facteur préjudiciable dans le concept de vieillissement en bonne santé (347). il n'existe actuellement aucun consensus sur Toutefois, l'établissement d'un seuil d'endotoxémie considéré comme potentiellement pathologique. Étant donné la difficulté de hiérarchiser les pathologies associées aux endotoxines, puisque dépendantes de nombreux facteurs tels que la gravité de l'exposition ou encore l'origine des endotoxines, ce sous-chapitre abordera les relations entre l'endotoxémie et les pathologies associées selon 2 axes différenciant l'endotoxémie liée à une infection grave, avec l'exemple du sepsis, de l'endotoxémie sub- clinique qualifiée de métabolique. Endotoxémie liée à une infection grave Les bactéries Gram négatif, porteuses d'endotoxines, représentent l'une des causes majeures de maladies infectieuses chez l'Homme incluant les gastro-entérites d'origine bactérienne (Escherichia coli, Shigella, Salmonella, Vibrio cholera), les infections pulmonaires (Klebsiella pneumoniae, Legionella, Coqueluche, Pseudomonas aeruginosa), les infections des voies urinaires (Escherichia coli, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, 44 Bacteroidetes), les ulcères gastroduodénaux (Helicobacter pylori), les infections sexuellement transmissibles (Neisseria gonorrhoeae), la méningite (Neisseria meningitidis) ou encore les maladies parodontales (Porphyromonas gingivalis) ; autant de sources d'endotoxines pouvant diffuser à travers la circulation sanguine et favoriser l'initiation ou le maintien d'un état inflammatoire de bas grade. Lorsque non pris en charge, ces foyers infectieux initiaux, localisés, peuvent essaimer et se généraliser à l'ensemble de l'organisme ; cette réponse inflammatoire généralisée étant qualifiée de sepsis ou septicémie. S'en suit une véritable tempête cytokinique au sein de l'organisme pouvant mener à l'apparition de lésions cellulaires, tissulaires, de défaillances multi-organes et dans les cas les plus graves, conduire au décès. La mortalité attribuée au sepsis serait de 27%, atteignant les 50% dans la forme la plus grave (c. -à-d. , le choc septique). Chez les patients présentant une forme sévère de sepsis, des niveaux d'endotoxines considérablement élevés ont été rapportés de l'ordre de 581 pg/mL ( 49 pg/mL) en moyenne ; ces niveaux étant inversement proportionnels à la durée de survie des patients (348). Les personnes fragiles, et en particulier les personnes immunodéprimées, sont tout particulièrement exposées au risque de sepsis. Chez la personne âgée, la prévalence du sepsis est élevée (1220 cas de sepsis pour 100 000 habitants chez les plus de 65 ans comparativement à 95 cas pour 100 000 habitants chez les moins de 65 ans) et le pronostic généralement plus sévère compte-tenu de la baisse des capacités immunitaires et du caractère pauci-symptomatique de l'état septique, masqué par les comorbidités et la polymédication. Endotoxémie sub-clinique En l'absence de toute source infectieuse évidente, l'élévation de l'endotoxémie à des niveaux sub-cliniques qualifiée d'endotoxémie métabolique (c. -à-d. , niveaux 10 à 50 fois inférieurs à ceux observés dans les cas de sepsis (349, 350), serait étroitement liée à l'alimentation, notamment de type obésogène, et aux complications qui peuvent lui être attribuées (ex. obésité, diabète de type 2 ou syndrome métabolique). Parmi la multitude de pathologies associées, ce sous-chapitre se focalisera plus précisément sur les pathologies associées à une altération du statut nutritionnel, qui représentent la majorité de la littérature scientifique. L'influence de l'alimentation en tant que facteur clé dans l'exposition aux endotoxines sera détaillée dans le chapitre 1. 3. L'obésité, le diabète de type 2 ou encore le syndrome métabolique sont tous trois des maladies cardiométaboliques complexes dont l'expansion au cours de ces dernières décennies tend à prendre des proportions épidémiques. Par ailleurs, ces conditions apparaissent parmi les principales causes de morbidités et de mortalité dans le monde. D'après l'OMS (Organisation Mondiale de la Santé), plus d'un tiers de la population mondiale adulte serait en surpoids (c. -à- d. , IMC > 25 kg/m) et 11% en obésité (c. -à-d. , IMC > 30 kg/m) ; un chiffre qui a presque triplé depuis 1975 (351). La prévalence du diabète serait quant à elle estimée à plus de 5% de la population mondiale dont la majorité ( 90%) des cas de diabète sont de type 2 ; un chiffre qui est toutefois largement sous-estimé puisqu'il ne tient pas compte des personnes non- 45 diagnostiquées ou non-traitées (352). Le syndrome métabolique, désignant la coexistence de plusieurs troubles d'origine lipidique, glucidique ou vasculaire associés à une surcharge pondérale, affecterait 20 à 25% de la population mondiale, avec des taux qui diffèrent selon les pays, le sexe et qui augmente avec l'âge (353, 354). Étroitement liés à un état inflammatoire chronique de bas grade, de plus en plus d'études suggèrent que l'endotoxémie métabolique apparaitrait comme un déterminant majeur dans la pathogenèse inflammatoire de ces maladies, exacerbant la progression et les risques de complications associés (329, 347, 349, 355361). A noter que ces maladies sont fréquemment associées à une alimentation déséquilibrée, une dysbiose intestinale ou encore une perméabilité accrue de la barrière intestinale ; autant de mécanismes qui pourraient sous-tendre ces relations (347, 356). Par ailleurs, une étude menée auprès de 192 individus âgés de 40 à 59 ans a rapporté que l'activité biologique des LPS serait positivement associée à de nombreux facteurs de risques cardio-vasculaires tels que le rapport taille/hanche, le taux de cholestérol total, la triglycéridémie et serait négativement corrélée avec les taux de HDL (362). Une étude cas- cohorte a notamment rapporté qu'un ratio LPS/HDL élevé était associé à un risque presque doublé de survenue d'évènements cardio-vasculaires, incluant notamment les AVC ou les infarctus du myocarde, indépendamment de nombreux facteurs de risques cardio-vasculaires (363). D'autre part, dans un modèle expérimental d'endotoxémie menés chez des volontaires sains, l'injection de faibles doses de LPS entre 0, 2 et 2 ng/kg a entrané une altération dans le métabolisme et l'homéostasie du glucose, une insulino-résistance, une inflammation du tissu adipeux ; des caractéristiques typiques observées dans les états à risque de maladies cardiovasculaires (364, 365), suggérant l'implication des endotoxines dans la pathogenèse de complications cardiovasculaires. Les maladies cardio-vasculaires demeurent aujourd'hui la principale cause de décès à travers le monde, représentant environ 31, 5% des décès toutes causes confondues et jusqu'à 45% des décès inhérents aux maladies non-transmissibles (366). Plusieurs études prospectives ont rapporté un lien entre l'activité biologique des endotoxines et l'incidence de maladies cardio- vasculaires. Plus spécifiquement, une étude menée chez plus de 500 sujets âgés de 50 à 79 ans a rapporté qu'une endotoxémie élevée (c. -à-d. , correspondant au 90ème percentile de distribution, soit 50 pg/mL) était associée à un risque multiplié par 3 de développer une maladie cardio-vasculaire ou une athérosclérose dans les 5 ans de suivi, indépendamment de facteurs de risque vasculaires et notamment de l'IMC ; un risque qui apparaissait exacerbé chez les individus sujets aux infections chroniques ainsi que chez les fumeurs (367). D'autre part, une étude menée sur près de 2300 adultes sans antécédents cardio-vasculaires et suivis pendant 10 ans a rapporté un risque doublé de maladie coronarienne chez les individus dont les taux de LPS se situaient dans les quartiles supérieurs de distribution comparativement au quartile inférieur, indépendamment de facteurs de risque cardiométaboliques (ex. obésité, syndrome métabolique, diabète, hypertension ou encore cholestérol) et de l'apport calorique (368). 46 Par ailleurs, une élévation de l'endotoxémie a été rapportée dans diverses autres pathologies incluant notamment la néphropathie diabétique, la stéatose hépatique non-alcoolique, les maladies la schizophrénie ou encore les maladies neurodégénératives (347). l'intestin, certains cancers, inflammatoires de l'autisme, la dépression, Bien que les mécanismes sous-jacents liant l'endotoxémie à un si large panel de pathologies restent peu élucidés, des études interventionnelles rapportent que l'injection de LPS est capable d'induire une importante hétérogénéité de modifications dans les paramètres physiologiques et la survenue de dysfonctionnements multi-organes, dont les manifestations les plus fréquemment observées ont été présentées dans la Figure 10. Ainsi, les effets pro- inflammatoires ubiquitaires des endotoxines les rendent théoriquement capables d'affecter l'ensemble de l'organisme, y compris le SNC. Figure 10. Vue d'ensemble des effets spécifiques aux organes résultant de l'injection intraveineuse de LPS de l'ordre de 2-4 ng/kg chez l'Homme. Image tirée et adaptée de Dirk van Lier et coll. (369). Abréviations : FEV1 Volume respiratoire renforcé en 1s ; FVC Capacité vitale forcée 47 1. 2. 6. Rôle dans les troubles cognitifs et la démence 1. 2. 7. 1. Contribution des modèles d'inoculation d'endotoxines dans la compréhension de la pathologie de la démence 1. 2. 7. 1. 1. Modèles expérimentaux chez l'animal Les endotoxines sont-elles capables d'initier ou de contribuer à la neurodégénérescence et autres caractéristiques typiques des maladies neurodégénératives ? Alors que des raisons éthiques interdisent de tester directement cette hypothèse au niveau du SNC chez l'Homme, cette hypothèse a pu être testée chez l'animal (370). Comme le rapportent plusieurs revues, l'injection de LPS directement au niveau du cerveau de rongeurs est capable d'induire une perte neuronale (371, 372). En outre, plusieurs mécanismes liant les endotoxines à la neurodégénérescence ont été identifiés (19, 371) parmi lesquels on peut citer : - (i) leur capacité à promouvoir la production d'amyloïde- et de protéine Tau, - (ii) via l'interaction avec le récepteur TLR4, les endotoxines sont capables d'activer la microglie - et de la rendre plus sensible à l'exposition d'agents pathogènes ultérieurs - induisant la production de cytokines pro-inflammatoires ou d'oxyde nitrique au niveau central, - (iii) leur contribution à la dysfonction mitochondriale des neurones ou encore - (iv) leur capacité d'altérer l'intégrité de la BHE favorisant le passage de molécules toxiques de la circulation périphérique vers le SNC. Spécifiquement, suite à l'injection intra-hippocampique unique de LPS chez des rats (10 g dans 4 L de solution), une pathologie axonale amyloidogène ainsi qu'une dégénérescence dendritique ont été observées 30 jours post-injection (373). Utilisant le même procédé (intra- hippocampique unique de 10 g de LPS dans 4 L de solution), d'autres auteurs ont rapporté une altération de l'apprentissage spatial et des capacités de mémorisation chez des rats traités au LPS par rapport à des rats contrôles (374). Suivant une injection chronique de LPS pendant 4 semaines chez de jeunes rats (0, 25 g/h), une activation de la microglie et des astrocytes a été observée, associée à une dégénérescence des neurones pyramidaux hippocampiques et une altération de la mémoire spatiale (375). Sur une exposition plus courte de 5 jours, une activation soutenue de la microglie a également été rapportée, concomitante à une exacerbation de la production d'IL-1 et de TNF ainsi qu'à l'apparition de déficits d'apprentissage et de mémoire chez le rat (376). Par ailleurs, l'exposition aux endotoxines dans un modèle animal de type Alzheimer contribuerait à favoriser le développement des signes neuropathologiques caractéristiques de la 48 maladie, comme le suggèrent les études décrites ci-dessous. L'un des enjeux majeurs de ce domaine de recherche réside dans le choix du modèle animal le plus approprié pour explorer les phénomènes d'inflammation dans la maladie d'Alzheimer. A ce jour, la plupart des modèles animaux de type maladie d'Alzheimer ont été développés autour de l'hypothèse de la cascade amyloïde. Chez un modèle de souris transgéniques APPV717F dont la caractéristique est de présenter un dépôt exacerbé d'amyloïde- via une surexpression de l'APP humaine, l'injection chronique intracérébroventriculaire de LPS pendant 2 semaines a induit une astrocytose réactive ainsi qu'une accélération marquée du dépôt amyloïde chez ces souris, comparé à des animaux ayant reçu une injection de type placebo (377). Dans un modèle de souris Tg2576, surexprimant une forme mutante d'APP, des taux d'A1-40/42 jusqu'à 3 fois plus élevés, et d'APP jusqu'à 1, 8 fois plus élevés, étaient rapportés chez les souris traitées au LPS (10 l/g de poids corporel) comparativement à un même modèle de souris contrôle (378). Lors d'injection intrapéritonéale (c. -à-d. , en périphérie, à l'intérieur du péritoine, membrane recouvrant la cavité abdomino-pelvienne) de LPS (0. 1 mg/ml), une hyperphosphorylation de la protéine Tau (379), une activation soutenue de la microglie pouvant persister jusqu'à plusieurs mois (380, 381) ainsi qu'une neuro-inflammation (notamment caractérisée par l'augmentation des niveaux d'IL-1, de TNF, d'IL-6) ont été rapportés au niveau central (382384). Par ailleurs, une exacerbation de la réponse cytokinique au niveau cérébral était observée chez les souris âgées mais pas chez les souris jeunes suite à l'injection périphérique de LPS (25 g), confortant l'hypothèse d'une vulnérabilité accentuée liée à l'âge (385) ; une hypothèse corroborée par d'autres auteurs (386) qui ont suggéré que le vieillissement crée un environnement cérébral favorisant l'occurrence de complications cognitives suite à l'exposition aux endotoxines. Dans l'ensemble ces résultats suggèrent que la manipulation des endotoxines, au niveau du SNC ou en périphérie, est capable d'entrainer une altération substantielle des processus pathologiques, favorisant l'apparition de caractéristiques typiques de la maladie d'Alzheimer chez l'animal. Toutefois, bien que les modèles animaux d'endotoxémie expérimentale présentent des avantages par rapport aux modèles humains en termes de coût, de faisabilité et de manipulation génétique, des différences physiologiques entre espèces limitent l'applicabilité des études animales à l'Homme. En outre, de tous les animaux étudiés, l'Homme est le plus sensible à l'exposition des endotoxines ; les rongeurs tolérant des doses systémiques de LPS plusieurs centaines de fois plus importantes (387). 49 1. 2. 7. 1. 2. Inoculation systémique d'endotoxines chez l'Homme Une question majeure a été de savoir, chez l'Homme, si une très faible dose supplémentaire d'endotoxines (c. -à-d. , par rapport aux niveaux initiaux observés dans les conditions physiologiques chez des individus sains) pourrait entrainer des effets significatifs dans l'organisme, y compris au niveau cérébral. Alors que le microbiote intestinal contient près d'1 g d'endotoxines (388), il a été démontré que l'injection de doses de l'ordre de 10 pg/mL était suffisante pour activer le système immunitaire et provoquer une réponse inflammatoire soutenue (369, 389). Globalement, l'injection systémique de faibles doses de LPS à de jeunes volontaires sains s'accompagne dans les heures qui suivent d'une augmentation des taux plasmatiques de médiateurs inflammatoires et en particulier d'IL-6 et de TNF, d'une activation de la microglie ainsi que de modifications comportementales caractéristiques du sickness behavior, soulignant la mise en place d'une réponse périphérique mais aussi centrale face à l'exposition aigu d'endotoxines. Toutefois, la mesure dans laquelle les fonctions cognitives pourraient être impactées suite à une exposition aigu de LPS est peu concordante entre les études, décrites ci- dessous selon un ordre croissant de dose de LPS injectée. Suite à l'injection de très faibles doses de LPS (0, 2 ng/kg, équivalent approximativement à 3 pg/mL distribué au sein de l'organisme), et indépendamment de la présence avérée de symptômes du sickness behavior, les niveaux de TNF et d'IL-6 étaient augmentés respectivement de 2 et 7 fois par rapport à leurs taux initiaux chez 12 hommes volontaires sains (390). Une corrélation négative a été rapportée entre les niveaux accrus d'IL-6 et la mémoire déclarative dans les 4, 5 à 6h suivant l'injection (390). Les performances de mémoire de travail, de fonctions exécutives ou d'attention n'étaient cependant pas affectées. Suivant l'injection de dose légèrement plus élevées de 0, 4 ng/kg de LPS à 12 hommes volontaires sains, Grigoleit et collaborateurs (391) ont mis en évidence une réponse physiologique transitoire profonde de l'organisme, marquée par l'augmentation de la température corporelle (en moyenne 37, 4C versus 36, 7C pour les personnes contrôles, 4h post-injection) et l'augmentation soutenue des taux plasmatiques d'IL-6, de TNF et d'IL-10, de noradrénaline et de cortisol. Toutefois, ces modifications des paramètres immunitaires et neuroendocriniens n'étaient pas associées à l'altération de l'attention, des capacités de mémoire (verbale, visuelle) ou des fonctions exécutives. Dans une étude de type cross-over réalisée en double insu, ces auteurs ont même observé une amélioration du temps de réaction à des doses plus élevées (0, 8 ng/kg), qui n'était pas observée avec la dose de 0. 4 ng/kg. L'injection de dose élevée était notamment accompagnée d'une baisse de l'humeur et d'une augmentation des niveaux d'anxiété qui n'étaient pas rapportées avec la dose plus faible, suggérant un effet dose- dépendant des endotoxines sur les fonctions neurocomportementales (392). Dans une autre étude de type cross-over menée chez 20 volontaires sains, une altération significative des capacités de mémoires verbale et non-verbale était rapportée, persistante jusqu'à 10h après l'injection de 0. 8 ng/kg de LPS, même en l'absence de symptômes avérés du 50 sickness behavior (393). Suivant l'injection d'une dose similaire de LPS, une diminution des performances de mémoire déclarative ainsi qu'une amélioration de la mémoire de travail ont été rapportées, concomitantes à une réponse exacerbée au stress cholinergique périphérique, comparativement à une injection saline (394). L'attention et les fonctions exécutives n'étaient cependant pas cliniquement affectées par l'injection. L'injection systémique de 1ng/kg (équivalent approximativement à 15pg/mL distribué au sein de l'organisme) à des volontaires sains a résulté en l'augmentation des concentrations sanguines de cytokines pro-inflammatoires (IL-6, IL-8 et TNF) dans les 2 à 3 heures suivant l'injection, accompagnée de phénomènes du sickness behavior (notamment de fatigue, de maux de tête, de douleurs musculaires et de frissons) (395). Fait intéressant, dans cette même étude, une activation microgliale robuste a été observée 3h après injection, variant de 31% à 63% par rapport à la référence anatomique selon les régions cérébrales (incluant notamment le thalamus, l'amygdale, l'hippocampe, les régions fronto-temporales, occipitales et pariétales), soulignant qu'une élévation relativement faible de l'endotoxémie (c. -à-d. , à des niveaux inférieurs à ceux observés chez des patients atteints de maladie d'Alzheimer, de l'ordre de 60pg/mL (396) est capable de causer une importante réponse systémique mais surtout centrale, diffuse à travers de nombreuses régions cérébrales (Figure 11). Figure 11. L'administration de LPS augmente significativement l'activation microgliale, mesurée par IRM PET-[11C]PBR28, par rapport à la référence anatomique (rangée du haut). Image tirée et adaptée de Sandiego C et coll. (395) L'exposition à une dose plus élevée de LPS (2 ng/kg) n'a cependant pas induit de changement cliniquement pertinent sur les performances cognitives incluant la mémoire de travail, la vitesse de lecture, la capacité de traitement de l'information et les capacités psychomotrices, jusqu'à 10h post-injection (397). Une amélioration de l'attention, a cependant été mis en évidence chez les sujets ayant reçu le LPS, accompagnée d'une augmentation doublée de cortisol et de 51 symptômes caractéristiques du sickness behavior (ex. augmentation de la température de 1, 4 C et du pouls de 27 bpm, en moyenne), suggérant un état d'alerte exacerbé. Dans l'ensemble, ces résultats appuient le fait qu'une exposition systémique unique aux LPS, même à de très faibles doses, est capable d'induire une activation du système immunitaire et une réponse inflammatoire contrôlée transitoire systémique et centrale chez l'Homme. Du fait de la nature fluctuante et d'une large hétérogénéité dans les valeurs physiologiques de niveaux d'endotoxines chez des sujets sains (pour rappel, 10 20 pg/mL), le spectre de l'endotoxémie inclurait donc des niveaux suffisants pour activer chroniquement le système immunitaire. Toutefois, on ignore encore dans quelle mesure les fonctions cognitives pourraient être affectées lors d'une activation immunitaire transitoire, induite par l'injection unique de LPS. Il convient également de noter que ces études d'interventions sont généralement réalisées chez de jeunes volontaires sains, en raison des restrictions imposées par la Food and Drug Administration quant à l'utilisation des endotoxines dans la recherche humaine. Également, l'injection de LPS ne mime probablement pas fidèlement la réponse physiologique complexe qui peut être observée lors d'une infection ou d'une endotoxémie métabolique faisant suite à l'ingestion alimentaire (décrite dans le chapitre 1. 3), que ce soit en termes de dose, de durée d'exposition (c. -à-d. , aigu, par intermittence ou chronique), de voie d'administration, de type d'endotoxine (les LPS purifiés de la bactérie Escherichia Coli généralement utilisés pour les injections étant particulièrement pro-inflammatoires comparativement à d'autres souches bactériennes) ou encore de potentiels mécanismes compensatoires et de tolérance sur le long terme. De plus, le délai réduit entre l'injection et la mesure des performances cognitives ne permet pas d'évaluer l'effet sur le long terme. Par opposition à ces études interventionnelles dont l'objectif est d'améliorer la compréhension de la cinétique et des mécanismes sous-jacents liés à l'exposition aux endotoxines, les études observationnelles à visée analytique permettent de mettre en exergue les relations entre endotoxémie et troubles cognitifs/syndrome démentiel qui peuvent exister à l'échelle populationnelle. 1. 2. 7. 2. Expositions vie-entière aux endotoxines, troubles cognitifs et syndrome démentiel : études observationnelles Troubles cognitifs Concernant les associations entre endotoxémie et troubles cognitifs, la majorité des études se sont portées sur des patients atteints de VIH (Virus de l'Immunodéficience Humaine), dont l'une des caractéristiques est de présenter un état immunodéprimé. Chez 179 patients infectés par le VIH, les taux médians de LPS à jeun étaient significativement plus élevés parmi ceux présentant des troubles cognitifs comparativement aux patients sans troubles neurocognitifs (116, 1 pg/mL versus 98, 2 pg/mL), sans toutefois être associés à la sévérité des atteintes 52 cognitives (398). Une seconde étude a rapporté que les taux de LPS ne variaient pas selon le score de cognition global (c. -à-d. , batterie de tests neuropsychologiques évaluant plusieurs domaines cognitifs incluant la motricité, la vitesse de traitement de l'information, l'attention, l'apprentissage, la mémoire, la fluence verbale et les fonctions exécutives) chez 97 patients infectés par le VIH (399). Toutefois, une corrélation négative a été mise en évidence entre les taux de sCD14 et le score de cognition globale dans cette étude. Plus récemment, Jespersen et collaborateurs (400) n'ont rapporté aucune association entre les taux systémiques de LPS et des marqueurs de dommages axonaux au niveau du SNC chez 62 adultes infectés par le VIH sans preuve de fonction cognitive altérée. Dans cette étude, le LPS n'était pas détectable dans le liquide céphalo-rachidien (LCR), cependant, une corrélation positive a été rapportée au niveau du LCR entre les taux de sCD14 et les marqueurs d'inflammation et de dommages axonaux, indépendamment de l'âge des patients ou du nombre de cellules CD4, reflet de la sévérité de l'atteinte VIH. Dans ce sens, de nombreuses autres études ont rapporté une association entre les taux circulants de sCD14 et la prévalence de troubles cognitifs (401404). Moins souvent étudiés, mais qui semblent pourtant tout aussi pertinents, les taux circulants de LBP étaient associés à l'altération de l'intégrité de la substance blanche du SNC et à une plus faible performance de la mémoire de travail et de la mémoire verbale chez 24 sujets obèses et non- obèses âgés d'une cinquantaine d'années (314). Syndrome démentiel Alors que les taux moyens d'activité biologique des LPS se situaient autour de 21 6 pg/mL chez des participants en bonne santé cognitive, des taux près de 3 fois plus élevés ont été rapportés chez 18 patients atteints de maladie d'Alzheimer (c. -à-d. , 61 42 pg/mL) (396). Des taux de LPS, ainsi que de sCD14, significativement plus élevés ont également été rapportés chez des patients présentant une démence liée au VIH indépendamment de la charge virale et du taux de CD4 comparé à des patients sans troubles cognitifs (405). Toutefois, dans une récente étude, les taux de LBP ne semblaient cependant pas différer entre des personnes âgés en moyenne de 76 ans souffrant de maladie d'Alzheimer (n 115), de troubles cognitifs légers (n 115) ou ne présentant aucun déficit cognitif (n 115) (406). Fait intéressant, alors que le passage des endotoxines à travers la BHE est limité par leur haut poids moléculaire, les présences de LPS et de la séquence ADN d'Escherichia coli ont été rapportées de manière post-mortem dans le cerveau de patients atteints de maladie d'Alzheimer mais aussi chez certains sujets contrôles, sans déficits cognitifs cliniques (407). Plus spécifiquement, l'étude immunocytochimique a révélé que les LPS et cette séquence ADN bactérienne étaient détectés dans la quasi-totalité - et en quantité supérieure - des patients présentant une maladie d'Alzheimer par rapport aux personnes contrôles. Les LPS colocaliseraient notamment avec A1-40/42 au niveau des plaques amyloïdes et des vaisseaux sanguins chez les patients atteints de maladie d'Alzheimer (407). Une autre étude a rapporté une abondance moyenne de LPS 3 fois plus élevée dans l'hippocampe (n 4 cas de maladie d'Alzheimer et 2 témoins), une région anatomique généralement précocement et profondément altérée dans la maladie d'Alzheimer, et 2 fois plus élevée dans le néocortex de cerveaux de 53 patients atteints de maladie d'Alzheimer (n 6) par rapport à des cerveaux de sujets témoins de même âge (n 6) (408). A noter que chez certains patients à un stade avancé de la maladie (critères non définis dans l'étude), le lysat hippocampique présentait des taux de LPS jusqu'à 26 fois plus élevé. Bien que basé sur une faible littérature, l'ensemble des résultats des études interventionnelles et observationnelles suggèrent que non seulement l'activation immunitaire transitoire induite par les LPS mais également des niveaux chroniques plus élevés de LPS (provenant de différentes sources) pourraient en partie être impliqués dans la pathogenèse de la démence. Néanmoins, il est important de souligner qu'au vu du caractère transversal des études observationnelles, les données actuelles disponibles ne permettent pas de conclure sur le caractère potentiellement causal d'une éventuelle association. La nécessité d'études longitudinales apparat ainsi cruciale pour tester cette hypothèse. Nonobstant le rôle non prouvé des endotoxines dans la pathologie d'Alzheimer, elles n'en demeurent pas moins des toxines à caractère ubiquitaire impliquées dans de nombreux processus délétères pour l'organisme. L'identification de stratégies préventives visant à limiter l'exposition vie-entière aux endotoxines pourrait ainsi s'avérer bénéfique pour la santé sur le long terme. 54 1. 3. La nutrition : un facteur clé dans l'exposition vie- entière aux endotoxines Théoriquement capable d'agir à la fois sur la composition du microbiote intestinal, et donc sur la richesse de celui-ci en bactéries Gram négatif porteuses de LPS, mais aussi sur l'aptitude des endotoxines à traverser la barrière intestinale pour rejoindre la circulation sanguine (comme préalablement décrit dans le chapitre 1. 2. 3), l'alimentation apparait dès lors comme une stratégie prometteuse dans l'exposition vie-entière aux endotoxines. Initialement décrite par Cani et ses collaborateurs en 2007, l'endotoxémie métabolique fait référence à l'augmentation des concentrations circulantes d'endotoxines induite par l'alimentation, notamment riche en lipides (350). Dans leurs modèles expérimentaux menés sur des rongeurs, les auteurs ont notamment démontré que les souris soumises à un régime riche en lipides pendant 4 semaines présentaient des taux plasmatiques de LPS similaires à ceux observés chez les souris soumises à une perfusion sous-cutanée de 300 g/kg/jour de LPS pendant 4 semaines ; une augmentation de la concentration d'un facteur 2 à 3 qui apparaissait suffisante pour induire un état inflammatoire de bas grade. Dès lors le concept d'endotoxémie métabolique a été investigué chez l'Homme : la suite de ce chapitre abordera l'état de l'art actuel de l'influence de l'alimentation sur l'endotoxémie, du macronutriment candidat jusqu'aux profils alimentaires. 1. 3. 1. Du macronutriment candidat En comparant plusieurs repas isocaloriques (c. -à-d. , de 300kcal chacun) mais de qualité nutritionnelle différente (boisson sucrée, jus de fruit ou boisson riche en lipides saturés sous forme de crème) administrés à 42 volontaires sains, Deopurkar et collaborateurs (409) ont tenté de déterminer quel macronutriment serait le plus à même d'induire une endotoxémie métabolique chez l'Homme. Dans cette étude, les auteurs ont rapporté que seule la consommation de boisson riche en lipides saturés augmentait les taux plasmatiques médians de LPS d'environ 45%, suggérant un rôle majeur des lipides alimentaires dans l'endotoxémie métabolique, à l'instar des expérimentations menées chez le modèle animal de Cani et collaborateurs. Par ailleurs, plusieurs études ont rapporté une élévation, d'au moins 35 %, de l'endotoxémie faisant suite à l'ingestion de repas riches en lipides. Plus spécifiquement, dans une étude menée auprès de 12 volontaires sains présentant des niveaux initiaux d'endotoxines moyens de 8, 2 pg/mL, l'ingestion de pain grillé accompagné de 50g de beurre a induit une augmentation de près de 50% de l'endotoxémie plusieurs heures après le repas (389). Une augmentation des taux de LPS a également été rapportée après ingestion d'un repas composé de 33% de lipides (c. -à-d. , 200mL de Fortimel, 23g de margarine, 9, 4g de beurre, 1g d'huile d'olive, 85g de pain, 20g de jambon et 200g de banane), dont les concentrations atteignaient un pic à 1h postprandial (0, 34 EU/mL comparativement à l'endotoxémie à jeun de 0, 17 EU/mL) 55 (301). L'élévation des niveaux d'endotoxines, suffisante pour induire l'activation du système immunitaire (0, 1 EU/mL correspondant approximativement à 10 pg/mL (19), était notamment accompagnée d'une augmentation du marqueur inflammatoire IL-6 (301). De manière similaire, les auteurs ont rapporté une augmentation des taux de sCD14 dès les premières heures suivant la prise du repas et persistante jusqu'à au moins 4h postprandial. Plus récemment, Schmid et collaborateurs (410) ont mis en évidence une augmentation des niveaux de LPS persistante jusqu'à 6h postprandial suite à la consommation de repas composés à 60% de lipides majoritairement sous forme saturée, accompagnée d'une augmentation de l'insulinémie (pic entre 1 et 2h après le repas) et de la triglycéridémie (augmentation progressive dans les premières heures et pic 4h après le repas). Quantité de lipides Dans une étude comparative de différentes quantités caloriques d'un même régime riche en lipides majoritairement saturés et mono-insaturés (c. -à-d. , 500, 1000 ou 1500 kcal correspondant de 34 à 102g de matières grasses), Schwander et collaborateurs (411) ont observé une association positive suggérant un effet dose-réponse entre la quantité de lipides ingérés et la réponse endotoxémique résultante dans les heures suivant le repas ; un effet dose-réponse qui a par ailleurs été rapportée pour d'autres facteurs cardiométaboliques comme l'insuline, les triglycérides ou encore l'IL-6. Plus récemment, Vors et son équipe (412) ont révélé des niveaux postprandiaux plus élevés de LPS après l'ingestion de 40g de lipides par rapport à 10g de lipides, majoritairement saturés, chez des participants obèses concomitant avec l'enrichissement des chylomicrons en LPS ; une association qui n'était pas observée chez les participants de corpulence normale. Qualité des lipides Au-delà de la quantité, la qualité des lipides semble également jouer un rôle majeur sur la réponse endotoxémique. Dans une étude randomisée de type cross-over menée auprès de 20 jeunes adultes en bonne santé, Lyte et collaborateurs (413) ont démontré que les taux sériques de LPS étaient diminués de près de 50% suite à la consommation d'un repas riche en AGPI-3 et augmentés de près de 60% suite à la consommation d'un repas isocalorique riche en AGS, comparé aux taux initiaux (0. 365 0. 09 EU/mL). À contrario, l'ingestion d'un repas riche en AGPI-6 n'affectait pas l'endotoxémie. Fait intéressant, les auteurs ont également observé une réponse plus soutenue (jusqu'à plus de 3h après le repas) suivant l'ingestion d'un régime riche en lipides saturés (33 à 61% des lipides sous forme saturée) par rapport à régime faible en lipides saturés (20% des lipides sous forme saturée). 56 Structure des lipides La structure des lipides pourrait également être un facteur clé dans la modulation de l'endotoxémie métabolique. En effet, suite à l'ingestion d'un bolus alimentaire composé de 40g de lipides ne différant que par leur structure, émulsionnés ou non, la consommation de graisses émulsionnées a favorisé le transport précoce des endotoxines par les chylomicrons uniquement chez des hommes souffrant d'obésité comparé aux hommes normo-pondérés (414). Supplémentation des repas riches en lipides limiter Alors qu'un régime riche en lipides notamment saturés est capable d'augmenter les niveaux postprandiaux d'endotoxines, des études suggèrent que l'ajout de composants alimentaires considérés comme sains, notamment riches en fibres, pourrait la réponse endotoxémique. Dans cette optique, Ghanim et collaborateurs (415) ont rapporté que l'augmentation des taux de LPS à la suite d'un repas riche en lipides et glucides ( 47% 14% par rapport aux taux initiaux (416) pouvait être annihilée par la supplémentation de 30g de fibres, suggérant que la contenance en fibres de régimes alimentaires sains pourrait contribuer à leurs propriétés anti-inflammatoires. A noter parallèlement, qu'aucune élévation des LPS n'a été rapportée suite à l'ingestion d'un repas riche en fruits et en fibres tel que recommandé par l'American Heart Association (AHA), renforçant cette hypothèse (416). Toutefois, bien qu'une tendance à la hausse ait été rapportée, Milan et collaborateurs (417) n'ont pas réussi à reproduire l'effet postprandial obtenu après ingestion du même repas riche en lipides et glucides proposé par Ghanim et son équipe, ni chez des sujets jeunes (20-25 ans) ni même chez des sujets âgés (60-75 ans). Enfin, dans une autre étude, l'ingestion d'une boisson riche en lipides supplémentée en arachides à haute teneur oléique (dont les propriétés ont été associées à une amélioration du profil métabolique comme l'amélioration de la sensibilité à l'insuline et de l'inflammation (418) était associée à une diminution de l'endotoxémie comparée à une boisson contrôle de qualité nutritionnelle équivalente (c. -à-d. , en moyenne de 0, 7 (SD 0, 5) EU/mL et 1, 6 (SD 1, 2) EU/mL respectivement à 3h postprandial par rapport aux taux initiaux d'environ 1, 4 EU/mL) (418). Repas riches en lipides dans le contexte des troubles métaboliques Comme décrit dans le chapitre 1. 2. 5, l'altération du profil métabolique (ex. obésité, syndrome métabolique ou diabète de type 2) a été fréquemment associée à une endotoxémie plus élevée à jeun et à un état chronique pro-inflammatoire de bas grade. Fait intéressant, la réponse endotoxémique postprandiale semblerait également exacerbée chez les patients présentant ces troubles, comme le démontre plusieurs études. Spécifiquement, par rapport à des participants non-obèses, Harte et son équipe (419) ont constaté une exacerbation de la réponse endotoxémique suite à l'ingestion d'un repas riche en lipides (75g de lipides, 5g de carbohydrates et 6g de protéine) allant de 20% chez les sujets obèses ou présentant une intolérance au glucose, et jusqu'à 125% chez les sujets atteints de diabète de type 2. Par ailleurs, chez 40 adultes souffrant d'obésité morbide (c. -à-d. , IMC > 40 kg/m), l'ingestion d'une charge 57 lipidique de 50g (dont 10g d'acides gras saturés, 30g de mono-insaturés et 10g de polyinsaturés) a augmenté les taux de LPS sériques et l'enrichissement des chylomicrons en LPS uniquement chez les participants présentant l'hypertriglycéridémie postprandiale la plus élevée (> 80 mg/dL) (420). Plus récemment, Al-Disi et collaborateurs (421) ont démontré qu'un régime riche en lipides (75g de lipides/m de surface corporelle) augmentait l'endotoxémie postprandiale chez l'ensemble des participants qu'ils soient de corpulence normale ou présentant un diabète de type 2. Toutefois, les effets sur la santé cardiométabolique faisant suite à l'ingestion du repas semblaient plus défavorables chez les sujets souffrants de diabète avec une exacerbation postprandiale de la triglycéridémie et de l'insulinémie et une diminution des fractions HDL et LDL du cholestérol, comparé aux individus non-diabétiques. 1. 3. 2. Vers une approche par profil alimentaire Interventions alimentaires sur le moyen terme Dans une étude d'intervention menée par Laugerette et collaborateurs (336), l'augmentation de l'apport énergétique (c. -à-d. , 70g de matières grasses - dont plus de 46% sous forme saturée - par jour pendant huit semaines chez 18 volontaires sains) a été associée à une augmentation accrue des taux de LPS à l'état postprandial. Les taux de LPS à jeun n'étaient toutefois pas affectés par la période de suralimentation. A noter cependant qu'une augmentation de près de 40% du ratio LBP : sCD14 à jeun a été rapportée ; une combinaison de taux élevés de LBP et de taux faibles de sCD14 particulièrement pro-inflammatoire comme le démontre l'augmentation des taux d'IL-6 de plus de 26% chez les participants se situant dans le tercile supérieur de ratio LBP : sCD14 comparé au tercile inférieur (336). Plus récemment, il a été démontré que 3 semaines d'une intervention basée sur un régime pauvre en lipides mais riche en glucides et enrichi en AGPI-3 augmentait les taux postprandiaux de LPS, mais diminuaient les taux à jeun de LPS, par rapport à un régime Méditerranéen enrichi en AGM ou un régime riche en AGS, chez des sujets âgés en bonne santé (422). Cette étude suggérerait que le délai au cours duquel les niveaux d'endotoxines varient pourrait être un élément important et partiellement expliquer les différences de résultats entre les études. Dans une étude comparant 4 types de régimes suivis pendant 3 semaines (c. -à-d. , riche en lipides saturés, riche en lipides mono-insaturés, faible en lipides mais riche en glucides enrichi ou non en AGPI-3), menée chez 75 sujets présentant un syndrome métabolique, seul le régime riche en lipides saturés augmentait les taux postprandiaux de LPS (423). Toutefois, l'endotoxémie à jeun n'était affectée par aucun des 4 régimes. Dans une étude de type cross-over réalisée chez 8 personnes âgées de 55 ans et plus, en bonne santé apparente, Pendyala et collaborateurs (424) ont démontré que suivre un régime de type occidental (c. -à-d. , 40% de l'énergie totale provenant des lipides, dont 21% de lipides saturés, 40% de glucides, 20% de protéines et 13% de fibres) pendant 4 semaines augmentait significativement les taux plasmatiques de LPS à jeun de près de 71%, tandis qu'une diminution de près de 38% des taux plasmatiques à jeun a été observée après 4 semaines d'un régime isocalorique de type prudent (c. -à-d. , 20% de l'énergie totale provenant 58 des lipides, dont 6% de lipides saturés, 60% carbohydrates, 20% protéines et 31% fibre). Enfin, Breusing et son équipe (425) ont mis en évidence une augmentation de 31% de l'endotoxémie à jeun après une semaine de suralimentation ( 50% du besoin énergétique) indépendamment de l'index glycémique ; augmentation qui était par ailleurs annihilée par trois semaines de restriction calorique (- 50% du besoin énergétique) chez 15 adultes en bonne santé. Habitudes alimentaires Bien que d'un intérêt majeur dans la compréhension de l'impact vie-entière de l'alimentation dans l'exposition aux endotoxines, seul un faible nombre d'études ont investigué la relation entre les habitudes alimentaires, reflet d'une exposition alimentaire sur le très long terme, et l'endotoxémie à jeun. Dans un sous-échantillon de 201 hommes en bonne santé, l'apport calorique total et l'apport calorique provenant des lipides, mais pas des glucides ou des protéines, étaient positivement associés aux niveaux de LPS à jeun (426). Plus récemment, Kallio et son équipe (368) ont rapporté une association positive significative entre l'apport énergétique total et les niveaux circulants de LPS, et, en revanche, une association négative significative entre l'apport en glucides et les niveaux de LPS chez des personnes de faible corpulence. De manière surprenante, aucune association entre l'apport lipidique et les taux de LPS à jeun n'a été observée dans cette étude. D'autre part, bien que les apports habituels alimentaires en fibres et en lipides étaient respectivement associés de façon positive et négative à la diversité et à la richesse du microbiote intestinal (427), aucune association n'a été rapportée avec les taux de LPS à jeun chez des femmes enceintes présentant un surpoids ou une obésité (427) ou chez des patients présentant un diabète de type 1 (428). Néanmoins, dans cette dernière étude, une consommation plus élevée de poisson, de collations saines (c. -à-d. , fruits et baies, légumes frais, boissons non alcoolisées, yaourts, fromage à faible teneur en matière grasse) ou encore une adhérence plus élevée à un régime de type moderne (c. -à-d. , légumes frais, pâtes, riz, volaille, produits carnés et aliments frits ou grillés) étaient significativement associées à des taux sériques plus faibles de LPS à jeun (428). De plus, une étude menée chez des patients âgés atteints de fibrillation atriale non valvulaire a démontré qu'une adhérence plus élevée à un régime de type Méditerranéen était inversement corrélée aux taux de LPS à jeun (429). Parmi les composants alimentaires caractéristiques du régime Méditerranéen, une consommation plus élevée de fruits et de légumineuses a montré une association majeure avec des niveaux plus faibles de LPS. Enfin, dans une étude menée chez 171 sujets obèses, des taux plus élevés de LBP ont été rapportés chez les participants ayant un profil alimentaire à index inflammatoire élevé (riche en lipides saturés et faible en lipides insaturés et en fibres) comparativement aux participants ayant un profil alimentaire à index inflammatoire faible (308). 59 Dans l'ensemble, ces arguments suggèrent qu'un unique repas riche en lipides, et en particulier en lipides saturés et dépourvu de composants sains, a une capacité indéniable à augmenter l'endotoxémie postprandiale de façon transitoire chez l'Homme ; cette réponse étant plus prononcée chez les individus présentant un trouble métabolique. Un constat qui reste toutefois à nuancer dans le cadre d'une alimentation diversifiée prenant en considération un large panel d'aliments. En effet, les études suggèrent que l'effet matrice de l'alimentation, prenant en compte les phénomènes d'interaction, de synergie ou d'antagonisme entre divers nutriments ou aliments, représenterait un facteur clé complexe dans l'exposition aux endotoxines induite par l'alimentation. Dans ce sens, et bien que les lipides - macronutriments les plus étudiés à ce jour - soient considérés comme les principaux médiateurs dans la réponse endotoxémique, il convient de noter que d'autres nutriments pourraient jouer un rôle tout aussi important dans la réponse endotoxémique. Spécifiquement, une alimentation riche en fibres contribuerait au maintien d'un microbiote sain en termes de diversité et de richesse (284, 430). Les fibres sont en effet des substrats essentiels favorisant la production d'AGCC ; source énergétique majeure du microbiote intestinal. Un apport élevé en fibres favoriserait notamment la production de mucus, de peptides antimicrobiens ainsi que l'expression de protéines de jonctions serrées ; autant de facteurs contribuant à limiter le développement de bactéries pathogènes et le passage des endotoxines à travers la barrière intestinale (430). Au contraire, un apport élevé en sucres raffinés favoriserait l'apparition de dysbiose du microbiote intestinal et l'augmentation de la perméabilité pouvant contribuer à l'élévation chronique de l'endotoxémie (431). 60 CHAPITRE II. HYPOTHÈSES ET OBJECTIFS SPÉCIFIQUES DU PROJET DE THÈSE Capable d'induire une élévation de l'endotoxémie à des niveaux suffisants pour activer le système immunitaire et déclencher une réponse inflammatoire, l'endotoxémie métabolique pourrait-elle précipiter le développement de maladies neurodégénératives tel que la maladie d'Alzheimer ? L'alimentation pourrait-elle être considérée comme un levier d'action potentiel, capable de moduler l'exposition aux endotoxines et leur possible impact sur le développement des troubles neurocognitifs liés à la maladie d'Alzheimer ? La revue narrative de la littérature (c. -à-d. , le premier objectif de ces travaux de thèse, exposée dans le chapitre I) n'a mis en évidence aucune étude s'intéressant à cette approche dans son intégralité (c. -à-d. , alimentation et endotoxémie et troubles cognitifs/démence). Un premier résultat soulignant l'émergence seulement très récente de l'hypothèse de l'endotoxémie métabolique en tant que voie pathologique potentielle dans le développement de troubles cognitifs. Cette revue de la littérature a été valorisée sous la forme d'un article scientifique : André P, Laugerette F, Féart C. Metabolic Endotoxemia : A Potential Underlying Mechanism of the Relationship between Dietary Fat Intake and Risk for Cognitive Impairments in Humans ? Nutrients. 2019 Aug 13 ; 11(8) : 1887. DOI : 10. 3390/nu11081887 (Annexe 3). Initialement clôturée en février 2019, une mise à jour de cet algorithme a toutefois permis de mettre en évidence une étude datée de juin 2020 s'étant intéressée à l'approche dans son ensemble. Spécifiquement, une étude de type cross-over en double insu a été menée auprès de 51 femmes âgées en moyenne de 53 ans et présentant des anomalies mammaires (cancer du sein sous traitement ou tumeur bénigne) (402). Dans cette étude, l'ingestion d'un repas riche en lipides saturés induisait une altération des performances cognitives, comparativement à l'ingestion d'un repas riche en lipides mono-insaturés. Par ailleurs, les femmes ayant des niveaux élevés de LBP ou de ratio LBP : sCD14 avant le repas (c. -à-d. , quartile supérieur de distribution par rapport au quartile inférieur) présentaient des capacités plus faibles d'attention et de maintien de la vitesse de réponse lors d'un test de reconnaissance de stimuli cibles et non- cibles. Fait intéressant, chez les femmes ayant de faibles taux de LBP ou de ratio LBP : sCD14 avant le repas (c. -à-d. , quartile inférieur de distribution), les auteurs ont rapporté une altération des performances cognitives suivant l'ingestion d'un repas riche en lipides saturés, comparativement au repas isocalorique riche en lipides mono-insaturés. En revanche, chez les femmes présentant des taux élevés de LBP ou de ratio LBP : sCD14 en amont du repas, les capacités cognitives n'étaient pas différemment impactées par le repas riche en lipides saturés comparé au repas riche en lipides mono-insaturés. Ces résultats suggèreraient donc que les repas 61 riches en lipides d'une part, et l'endotoxémie d'autre part, interféreraient avec les capacités cognitives ; la combinaison d'une faible endotoxémie associée à des choix alimentaires peu sains - même lors d'un unique repas - pouvant être particulièrement préjudiciable dans les processus attentionnels à court terme (5h). D'après l'analyse des travaux incluent dans la revue narrative, une large hétérogénéité dans les interventions nutritionnelles a notamment limité la reproductibilité des études entres elles et la possibilité de poser une conclusion définitive sur la cinétique de la réponse endotoxémique en réponse à l'alimentation. Par ailleurs, la majorité des études s'intéressant à investiguer l'approche entre alimentation et endotoxémie étant focalisée sur les lipides alimentaires, elles ne permettent pas de prendre en compte des effets potentiellement agonistes ou antagonistes pouvant subvenir entre les différents composés de l'alimentation ; des effets qui ont pourtant été démontrés comme pouvant impacter différemment la réponse endotoxémique. Concernant l'approche entre endotoxémie et santé cognitive, une large hétérogénéité a également été rapportée dans l'évaluation des performances cognitives au travers des études, limitant considérablement la reproductibilité et l'établissement de conclusions. En outre, seules quelques études se sont intéressées à la relation entre endotoxémie et santé cognitive, dont le design transversal a limité la possibilité de conclure sur un effet potentiellement causal ; le risque de causalité inverse (c. -à-d. , que ce soit la maladie qui influence l'endotoxémie et non l'inverse) étant d'autant plus important dans les maladies neurodégénératives dont les processus physiologiques peuvent se dégrader plusieurs années avant l'apparition des premiers symptômes cliniques, et conduire à une susceptibilité accrue à l'exposition aux endotoxines. Ce premier travail a ainsi permis de mettre en évidence les limites et les questions restant en suspens dans ces approches ; un constat qui a contribué à la mise en place des objectifs de ces travaux de thèse, axés sur deux approches visant à améliorer d'une part la compréhension des relations entre alimentation et endotoxémie et d'autre part le rôle de l'endotoxémie dans la pathogenèse de la maladie d'Alzheimer. Dans la première partie de ces travaux de thèse, les objectifs ont donc été d'évaluer, au sein d'une population âgée : - (i) les associations entre profils alimentaires et biomarqueur de l'exposition plasmatique aux endotoxines Et, dans un objectif secondaire, - (ii) d'évaluer les associations entre des pathologies généralement associées à un statut nutritionnel altéré (syndrome métabolique et malnutrition) et biomarqueur de l'exposition plasmatique aux endotoxines. L'approche utilisée pour répondre à ces objectifs ainsi que les résultats et la discussion ont été détaillés dans le chapitre IV. 62 Parallèlement, et alors que l'inflammation ne peut plus être considérée comme un épiphénomène dans la maladie d'Alzheimer, le rôle des endotoxines dans cette maladie neurodégénérative reste cependant peu élucidé. A cet effet, l'objectif de la seconde partie de ces travaux de thèse a été : - (iii) d'évaluer les associations entre biomarqueurs de l'exposition plasmatique aux endotoxines et risque de maladie d'Alzheimer ou de démence toutes étiologies confondues. L'approche utilisée pour répondre à cet objectif, abordée sous deux projets différents mais complémentaires, ainsi que les résultats et la discussion ont été détaillés dans le chapitre V. 63 CHAPITRE III. DONNÉES DISPONIBLES 3. 1. La cohorte des 3-cités 3. 1. 1. Objectif et population L'ensemble des travaux de thèse a été réalisé sur les données de l'étude des Trois-Cités (3C), notamment sur le centre Bordelais de 3C. Initiée en 1999-2000 dans 3 villes Française (Bordeaux, Dijon et Montpellier), l'étude 3C a pour objectif d'estimer le risque de démence et de déclin cognitif attribuables aux facteurs de risque vasculaires (432). Pour être éligibles, les individus devaient être inscrits sur les listes électorales de l'une des 3 villes susmentionnées ou de leurs proches banlieues, être âgés de 65 ans ou plus et être non-institutionnalisés. Après tirage au sort aléatoire sur les listes électorales, 34922 individus ont été invités à participer à l'étude. Parmi ces derniers, 76% ont pu être contactés avec succès dont 37% ont accepté de participer. Au total, 9294 individus ont finalement été inclus entre mars 1999 et mars 2000, dont 2104 à Bordeaux, 4931 à Dijon et 2259 à Montpellier. Le protocole d'étude a été approuvé initialement par le Comité Consultatif de Protection des Personnes qui se prêtent à une Recherche Biomédicale (CCPPRB) de l'hôpital universitaire Kremlin-Bicêtre. 3. 1. 2. Recueil de données 3. 1. 2. 1. Données générales Données générales, psychologiques et cognitives Un questionnaire standardisé, commun aux 3 centres, a été délivré à l'inclusion et au cours du suivi aux participants lors d'entretiens en face-à-face, menés par des psychologues ou des infirmières préalablement formées. Ce questionnaire visait à recueillir des données sociodémographiques (ex. âge, sexe, niveau d'étude, statut familial ou encore catégorie socio- professionnelle), de mode de vie (ex. fréquence de consommation alimentaire, statut tabagique, consommation d'alcool, activité physique) ainsi que les antécédents personnels ou familiaux de maladies cardiovasculaires ou de démence. Au cours du même entretien, les performances cognitives, les troubles dépressifs ainsi que les incapacités fonctionnelles ont été évalués respectivement par une batterie de tests neuropsychologiques, une échelle de symptomatologie dépressive et des échelles spécifiques. 64 Données médicales Les données médicales ont été recueillies soit à domicile soit dans un centre d'examen ou lors d'une seconde visite à domicile pour les participants ne pouvant se déplacer au centre. L'examen répertoriait l'inventaire des médicaments consommés dans le mois précédent avec leur codage ATC (Anatomique, Thérapeutique et Chimique) selon la classification de l'OMS, les antécédents médicaux personnels ainsi que les facteurs de risque de maladies cardiovasculaires (ex. hypertension, hypercholestérolémie, diabète, accident vasculaire cérébral (AVC) ou encore infarctus du myocarde). L'examen a été complété par la prise de mesures anthropométriques (ex. poids, taille, tour de taille et tour de hanche) et vasculaires (pression artérielle systolique et diastolique). Données biologiques Une biobanque (plasma, sérum et ADN, stockés et conservés à -80C) a été réalisée chez les participants ayant accepté le prélèvement sanguin à l'inclusion (n 1881 pour le centre Bordelais), permettant le dosage biologique de la glycémie, de la cholestérolémie (cholestérol total et ses fractions HDL et LDL), de la triglycéridémie ainsi que du génotypage ApoE. Données de suivi Des visites de suivi ont été réalisées tous les 2 à 3 ans après l'inclusion. Le suivi des participants du centre Bordelais est toujours en cours, allant jusqu'à ce jour à un suivi de 17 ans après l'inclusion, tandis que les suivis des centres de Dijon et Montpellier ont été interrompus après 12 ans. L'examen neuropsychologique, l'évaluation de l'état fonctionnel ainsi que la visite médicale ont été répétés à chaque suivi (Figure 12). Les évènements incidents tels que la survenue d'une démence, de maladies cardiovasculaires, de placement en institution ou de décès étaient systématiquement recherchés et répertoriés. 65 Figure 12. Représentation schématique des données du centre Bordelais de la cohorte des Trois-Cités utilisées dans le cadre des travaux de thèse. 3. 1. 2. 2. Données cognitives, d'imagerie et de diagnostic de démence Performances cognitives Les performances cognitives, précocement altérées dans la démence et dont le déclin est largement associé au vieillissement cérébral, ont été évaluées par des psychologues au moyen d'une batterie de tests neuropsychologiques validés, permettant de couvrir plusieurs domaines cognitifs incluant la mémoire, l'attention, le langage et les capacités visuo-spatiales. Parmi ceux-ci figurent notamment le Mini Mental State Examination (MMSE), le Benton Visual Retention Test (BVRT), l'Isaacs' Set Test (IST) ainsi que le Trail Making Test (TMT), décrits ci-après. Le MMSE est un test d'évaluation du fonctionnement cognitif global, incluant l'appréciation de la mémoire, de l'attention et du calcul, de la concentration, de l'orientation spatio- temporelle, du langage et des praxies (c. -à-d. , la coordination et l'adaptation des mouvements volontaires dans un but précis) (433) (Figure 13, A). Le score MMSE varie de 0 (performances très altérées) à 30 (performances normales). Le MMSE est largement utilisé en pratique clinique afin de dépister et suivre l'évolution des troubles cognitifs. Il possède une bonne sensibilité et spécificité pour discriminer une démence modérée d'un individu cognitivement sain, mais reste peu sensible à la détection de troubles cognitifs légers ou de stade précoce de démence de par son effet plafond . 66 Le BVRT est un test utilisé pour évaluer les capacités visuo-constructives, l'attention ainsi que la mémoire visuelle de travail (434). La mémoire de travail représente l'un des troubles cognitifs significatifs du vieillissement cérébral. Le BVRT consiste à reconnatre, suivant une procédure à choix multiple, une figure préalablement présentée (Figure 13, B). Un total de 15 figures sont successivement présentées, permettant d'établir un score variant de 0 (aucune figure reconnue, performances très altérées) à 15 (toutes les figures reconnues, performances normales). L'IST permet d'estimer les capacités de fluence verbale, mesurée par la quantité de mot qu'un individu est capable de citer à partir de 4 catégories sémantiques successivement proposées : villes, fruits, animaux et couleurs (435) (Figure 13, C). La mémoire sémantique peut être perturbée précocement dans la pathogenèse de la démence, et est caractérisée d'un point de vue clinique par une difficulté d'élocution ou l'utilisation de circonlocutions (c. -à-d. , remplacement d'un terme précis par une expression). Afin d'éviter un effet plafond , une limite de 15 secondes, pour chaque catégorie sémantique, est fixée. Dans l'étude 3C, la tâche prenait fin lorsque l'individu avait cité un maximum de 10 mots pour chaque catégorie sémantique, ou qu'il n'était plus capable d'en citer davantage. Le score IST varie ainsi de 0 (performances très altérées) à 40 (performances normales). Le TMT évalue les fonctions exécutives, désignant les habiletés cognitives de logique, de stratégie, de planification et de raisonnement (436). La première tâche, le TMT-A, consiste à relier sans lever le stylo des nombres de 1 à 25, répartis de façon semi-aléatoire sur une feuille, dans un ordre croissant (Figure 13, D). La seconde tâche, le TMT-B, consiste à relier des nombres de 1 à 13 et des lettres de A à L, dans un ordre croissant et alphabétique, en respectant une alternance nombre-lettre (Figure 13, E). Le score obtenu au TMT correspond au temps de réalisation de chaque partie du test, généralement rapporté au nombre de bons déplacements. 67 Figure 13. Représentation des tests neuropsychologiques du Mini Mental State Examination (A), Benton Visuel Retention Test (B), Isaacs' Set Test (C) et Trail Making Test (D et E) dispensés dans la cohorte des Trois-Cités. 68 Imagerie cérébrale Des examens d'imagerie médicale au niveau cérébral ont également été proposés à l'inclusion, puis au suivi à 4 et 7 ans pour les participants du centre Bordelais de 3C. Parmi ceux-ci, 650 ont acceptés et réalisés l'IRM à l'inclusion, 420 au suivi à 4 ans et 230 au suivi à 10 ans, permettant l'estimation des volumes cérébraux, des hypersignaux de la substance blanche ou encore la dilatation des espaces périvasculaires. Diagnostic de démence A l'inclusion, les participants du centre Bordelais ont été examinés par un neurologue afin de diagnostiquer les éventuels cas prévalents de démence. Lors des visites de suivi, seuls les individus cliniquement suspectés de démence ont été ultérieurement évalués par un neurologue. En cas de suspicion de démence, le neurologue s'appuyait sur les performances aux tests neuropsychologiques, la sévérité des troubles cognitifs évaluée par l'échelle CDR (Clinical Dementia Rating scale), l'impact sur les activités de la vie quotidienne et éventuellement sur les données d'imagerie cérébrale lorsqu'elles étaient disponibles, afin d'affirmer ou d'infirmer un diagnostic de démence selon les critères du DSM-IV-TR (3). Un comité d'experts indépendants, composé de neurologues et de gériatres, devait ensuite valider le diagnostic et établir l'étiologie la plus plausible du sous-type de démence : maladie d'Alzheimer probable, maladie d'Alzheimer possible, démence vasculaire, démence mixte, démence à corps de Lewy, démence de type Parkinson, ou autre, selon les critères du DSM-IV et du NINCDS-ADRDA. A noter que dans le but d'établir un diagnostic de démence stable et comparatif au cours du temps, les critères du DSM-IV-TR ont été pris comme référence tout au long des suivis de 3C bien qu'une version plus récente, le DSM-V, a été publiée en 2013. Ces travaux de thèse ne traitent ainsi que du diagnostic basé sur les critères du DSM-IV-TR. 3. 1. 2. 3. Données nutritionnelles Des données supplémentaires, spécifiques à chaque centre, pouvaient être collectées dans le cadre d'études ancillaires. A cet effet, le centre Bordelais de 3C a fait l'objet d'un volet nutritionnel approfondi lors de la première vague de suivi à 2 ans. Celui-ci incluait le dosage (rétrospectif) de biomarqueurs nutritionnels à l'inclusion ainsi qu'une enquête nutritionnelle détaillée comprenant un fréquentiel alimentaire (FFQ) et un rappel des 24h. 69 Le questionnaire de fréquentiel alimentaire (FFQ) Parmi les 2104 participants Bordelais inclus en 1999-2000, 1811 (86%) ont été revus au suivi à 2 ans. Un FFQ qualitatif (c. -à-d. , sans recueil des portions) a été enregistré chez la quasi- totalité de ces derniers, soit chez 1796 participants, par des diététiciens spécifiquement formés pour le recueil de données alimentaires chez les personnes âgées de manière à favoriser un recueil standardisé des données. Le FFQ permettait d'évaluer la fréquence habituelle de consommation de 40 aliments et boissons les plus couramment consommés au cours des 3 repas principaux (le petit déjeuner, déjeuner et diner) et de 3 collations hors repas (c. -à-d. , entre le petit déjeuner et le déjeuner, entre le déjeuner et le diner, et après le diner) au choix selon 11 catégories prédéfinies (une à sept fois par semaine ; une à trois fois par mois ; moins d'une fois par mois). Les fréquences relatives d'apport d'autres composés alimentaires tels que l'ajout de sel, de sucre ou d'édulcorant, la consommation de surgelés ou de conserves, ou encore l'utilisation de matières graisses (beurres, margarines, graisses et huiles de différents types) pour la cuisson, l'assaisonnement ou en accompagnement sur les tartines, étaient recueillies par des items à 4 catégories prédéfinies (toujours ; le plus souvent ; rarement ; jamais). Afin d'exploiter l'ensemble des données nutritionnelles du FFQ au travers d'analyses multidimensionnelles, les fréquences de consommation de chaque aliment ont été converties en portions par semaines (0 pour moins d'1 fois/mois ; 0, 25 pour 1 fois/mois ; 0, 5 pour 2 fois/mois ; 0, 75 pour 3 fois/mois ; et de 1 à 7 pour 1 à 7 fois/semaine) (Tableau 1) (437). Tableau 1. Recodage des données alimentaires qualitatives issues du fréquentiel alimentaire dispensés au suivi à 2 ans (S1) dans l'étude 3C-Bordeaux en données quantitatives. Aliment Codage en portion par semaine Jamais ou par mois Nombre de fois par mois Nombre de fois par semaine 1 2 3 1 2 3 4 5 6 7 0 0. 25 0. 5 0. 75 1 2 3 4 5 6 7 Ces apports alimentaires, exprimés en portions par semaine, ont ensuite été agrégés en 20 groupes alimentaires définis selon des critères de similarités nutritionnelles. Afin de palier à la présence de données manquantes pouvant conduire à la perte entière de l'information ou à une estimation biaisée des apports alimentaires de par l'attribution d'une valeur nulle, une procédure d'imputation a été mise en œuvre (438). Cette procédure visait à imputer une valeur en fonction de l'âge et du sexe pour les 202 participants (11. 3%) présentant seulement une 70 donnée manquante. Les 66 sujets (3. 6%) présentant 2 données manquantes ou plus ont été exclus des analyses. Ces 20 groupes alimentaires, intégralement renseignés après la procédure d'imputation chez 1730 participants, comprenaient : légumes crus ; légumes cuits ; fruits ; légumineuses ; pain et céréales ; œufs ; poissons et crustacés ; volaille ; viande ; charcuterie ; pâtes ; riz ; pomme de terre ; pizza et sandwich ; biscuits ; sucreries ; produits laitiers ; alcool ; thé ; café (Tableau 2). Tableau 2. Description des 20 catégories d'aliments constitutifs du fréquentiel alimentaire dispensés au suivi à 2 ans (S1) dans l'étude 3C-Bordeaux. Groupe alimentaire Légumes crus Légumes cuits Fruits Poisson et crustacés Légumineuses Pain et céréales Œufs Volaille Pâtes Riz Produits laitiers Pommes de terre Pizza & sandwich Biscuits Sucreries Alcool * Charcuterie Viande Café Thé Aliments constitutifs Crudités, salade Légumes cuisinés, soupes Fruits, compotes de fuit, jus de fruit Poisson et crustacés Légumineuses Pain, céréales prête à consommer Œufs Volaille Pâtes Riz Lait, fromage, yaourt, boisson chocolatée Pommes de terre Pizza, sandwich, tarte salée, quiche Viennoiseries, biscuits secs, gâteaux, biscuits au chocolat ou à la confiture Bonbons, confiture, soda, sucre Boissons alcoolisées Charcuterie Viande, jambon Café Thé * La consommation d'alcool (nombre de verres alcoolisés par semaine) est issue du questionnaire général dispensé réalisé à l'inclusion dans l'étude 3C-Bordeaux 71 Le rappel des 24h Le rappel des 24h, enregistré chez 1786 participants Bordelais lors de la visite à 2 ans, visait à recenser l'ensemble des aliments et boissons consommés la veille de l'entretien (hors week- end). Les quantités consommées ont été estimées à l'aide d'un recueil de photographies proposant différentes tailles de portions pour 236 aliments et boissons (439), converties par la suite en grammes à l'aide d'une table de correspondance. Une estimation de la quantité de nutriments consommés (glucides, lipides, protéines, fibres, vitamines et minéraux) a été obtenue grâce au logiciel de conversion BILNUT incluant diverses tables de composition des aliments (439). Le rappel des 24h permettait ainsi d'estimer l'apport calorique total. Nutriments liposolubles Parmi les 1881 participants du centre Bordelais ayant accepté le prélèvement sanguin à l'inclusion, le dosage de 22 nutriments a été effectué, à différents temps et de façon rétrospective, dans des sous-échantillons de 3C-Bordeaux incluant : la concentration en 25(OH)D (n 955), les 6 espèces majeures de caroténoïdes (c. -à-d. , -carotène, -carotène, - cryptoxanthine, lutéine, zéaxanthine, lycopène, n 1092), deux formes de vitamine E ( et - tocophérol) et le rétinol (n 1351) ainsi que 12 acides gras majeurs (acide myristique , acide palmitique, acide stéarique, acide palmitoléique, acide oléique, acide linoléique, acide - linolénique, acide arachidonique, acide -linolénique, acide eicosapentaénoïque, acide docosapentaénoïque, acide docosahexaénoïque, n 1416) Dans ce projet de thèse, les données du centre Bordelais de l'étude 3C ont été exploitées au travers de deux projets, le projet EnIMA et le projet NutEnDem, décrits ci-après. 3. 2. Projet EnIMA 3. 2. 1. Sélection de l'échantillon et design d'étude Le projet EnIMA Endotoxémie et Inflammation dans le cadre de la Maladie d'Alzheimer a pour objectif d'évaluer le lien entre des biomarqueurs de l'endotoxémie et de l'inflammation et le risque de survenue d'un diagnostic de maladie d'Alzheimer. Un design d'étude de type cas-témoin niché dans la cohorte 3C-Bordeaux a été privilégié pour ce projet puisqu'il permet d'estimer plus précisément l'effet des expositions (ici, les biomarqueurs de l'endotoxémie et de l'inflammation), tout en limitant les coûts inhérents au dosage biologique de ces biomarqueurs. 72 Le principe d'une étude cas-témoin nichée consiste à recruter, au sein d'une même cohorte, d'une part des participants présentant l'évènement de santé d'intérêt (c. -à-d. , les cas) et d'autre part des participants comparables mais ne présentant pas l'évènement de santé d'intérêt (c. -à- d. , les témoins) afin d'étudier de façon rétrospective l'effet d'une exposition sur la survenue de la maladie. Dans le but de réduire les différences entre les cas et les témoins, et ainsi d'augmenter la puissance statistique permettant de mettre en évidence une différence d'exposition (si elle existe), les cas peuvent être appariés aux témoins selon des caractéristiques communes appelées variables d'appariement. Ainsi, un témoin sera tiré au sort parmi l'ensemble des sujets à risque ayant la même valeur que le cas sur la variable d'appariement. Dans le cadre du projet EnIMA, les cas incidents de maladie d'Alzheimer possible, probable ou mixte survenant entre l'inclusion et le suivi à 12 ans (suivi maximal disponible lors de la conception de l'étude) ont été inclus. Chaque cas était ensuite apparié individuellement en densité d'incidence à 2 témoins, selon un échantillonnage aléatoire avec remise. Les variables d'appariement, préalablement identifiées comme étant des facteurs importants dans l'étude de la maladie d'Alzheimer et pour lesquels nous ne souhaitions pas étudier l'impact, incluaient l'âge, le sexe et le niveau d'étude. Spécifiquement, pour être éligible en tant que témoin, un participant devait respecter les critères suivants : (i) être indemne de démence (à risque de démence) au moment du diagnostic du cas, (ii) avoir un âge à l'inclusion similaire ( 1, 5 ans) à celui du cas, (iii) être de même sexe que le cas, (iv) avoir un niveau d'éducation similaire (études primaires ou moins versus études secondaires ou supérieures) et enfin (v) une dernière condition visait à ce que le témoin ne puisse pas être apparié 2 fois au même cas. A souligner cependant qu'un participant est éligible comme témoin à tous les temps o il est à risque de démence, ce qui signifie par conséquence qu'un témoin peut être de nouveau sélectionné pour un autre cas à un temps t'>t. Il contribuera ainsi comme des sujets différents avec des données censurées selon le moment o il a été apparié au cas. Afin de s'affranchir de tous biais statistiques, l'appariement n'a pas été conditionné sur le devenir du témoin, et les cas n'ont pas été exclus des ensembles à risques, préalablement à leurs diagnostics de démence. Parmi les 288 cas incidents de maladie d'Alzheimer possible, probable ou mixte survenant entre l'inclusion et le suivi à 12 ans, 212 cas ont pu être appariés avec succès à 2 témoins chacun, portant l'échantillon d'étude du projet EnIMA à 636 participants. Les 76 cas de cas incidents de maladie d'Alzheimer non inclus dans cet échantillon font suite à une valeur manquante sur une ou plusieurs variables d'appariement ou un diagnostic de démence à un âge très avancé, limitant les possibilités d'appariement avec un participant indemne de démence au même âge ( 1, 5 ans). 73 3. 2. 2. Dosage des marqueurs de l'endotoxémie et de l'inflammation Initialement, 2 biomarqueurs relatifs à l'endotoxémie ont été dosés et étudiés dans le cadre du projet EnIMA : la LBP et le sCD14. Impliqués dans la cascade de signalisation en réponse aux endotoxines (décrite dans le chapitre 1. 2. 4), la LBP et le sCD14 sont considérés comme des biomarqueurs cliniquement pertinents de l'exposition cellulaire aux endotoxines. Les taux de LBP et de sCD14 ont été déterminés par la méthode immuno-enzymatique ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay, Hycult Biotechnology, Uden, Pays-Bas) et exprimés en g/mL. Les coefficients de variation intra et inter essais étaient respectivement de 2, 2% et 4, 1% pour la LBP, et de 5, 5% et 6, 3% pour le sCD14. Les dosages de LBP et de sCD14 ont été réalisés par le laboratoire CarMeN (Cardiovascular Metabolism diabetes & Nutrition, INRAE UMR1397 - INSERM U1060). L'obtention de financements supplémentaires au cours de la thèse a par la suite permis de mesurer un autre marqueur de l'endotoxémie, à la fois chez l'ensemble des 636 participants du projet EnIMA, mais également dans une étude ancillaire de 3C-Bordeaux décrite ultérieurement dans le projet NutEnDem. Les niveaux plasmatiques d'endotoxines ont été évalués par la concentration en acides gras 3- hydroxylés estérifiés (AG 3-OH), composants spécifiques du lipide A des LPS, par la méthode LC-MS/MS (332). Ces dosages ont été réalisés par la plateforme de lipidomique de Dijon (INSERM UMR1231 - LabEx LipSTIC). Brièvement, du fait que les AG 3-OHs peuvent être retrouvés sous forme libre dans le plasma (c. -à-d. , non liés aux LPS), les niveaux d'endotoxines ont été calculés comme étant la différence entre la quantité totale en AG 3-OH, déterminée après une forte hydrolyse acide de 100 l de plasma, et la quantité libre non-associés aux LPS, déterminée après extraction directe de 100 l de plasma sans l'étape d'hydrolyse acide. Les taux de AG 3-OHs estérifiés résultant, exprimés en mol/mL, représentant la quantification totale (formes biologiquement active et inactive) des LPS dans le plasma. Par ailleurs, les taux sériques d'IL-6, une cytokine pro-inflammatoire et dont la production peut résulter de la cascade de signalisation de l'endotoxémie, ont été déterminés par kit ELISA (Quantikine, Abingdon, UK) par le laboratoire CarMeN (INRAE UMR1397 - INSERM U1060). Les taux d'IL-6 étaient exprimés en pg/mL. Les coefficients de variation intra et inter essais étaient respectivement de 7, 2% et 8, 3%. Un second biomarqueur de l'état inflammatoire, le TNF, était initialement prévu dans ce projet mais dont les concentrations plasmatiques se retrouvaient être en deçà des seuils de détections du kit ELISA après plusieurs années de conservation (440). Ce dernier n'a donc pas pu être utilisé dans les analyses ultérieures. Les dosages de la LBP, du sCD14 et de l'IL-6 ont été dupliqués et la moyenne des 2 dosages a été utilisée pour les analyses statistiques. Les échantillons ont été randomisés selon le statut cas-témoin sur les plaques de dosage afin de limiter les variations inhérentes aux analyses biologiques. Les dosages ont été réalisés sur les prélèvements sanguins effectués à l'inclusion de 3C-Bordeaux, chez les 636 participants du projet EnIMA. 74 3. 3. Projet NUTENDEM Le projet NutEnDem, anagramme de Nutrition, Endotoxémie et syndrome Démentiel , a été mis en œuvre dans l'objectif d'évaluer les relations entre profils alimentaires, taux plasmatiques de AG 3-OHs, utilisés comme un proxy de l'endotoxémie, et syndrome démentiel. 3. 3. 1. Sélection de l'échantillon d'étude Après discussion au sein de l'équipe, et au vu d'un intérêt commun partagé pour les endotoxines, l'étude ancillaire de 3C-Bordeaux Alienor, a été choisie pour la réalisation du projet NutEnDem, et notamment pour le dosage des AG 3-OHs. L'étude Alienor correspond au volet ophtalmologique du centre Bordelais de 3C, dont l'objectif est d'étudier les associations entre facteurs nutritionnels et pathologies oculaires liées à l'âge (441). L'examen ophtalmologique, en parallèle des visites inhérentes à l'étude 3C, a été proposé à tous les participants du suivi à 7 ans du centre Bordelais de 3C. Parmi les 1450 participants revus à 7 ans, 963 (66%) ont accepté de participer à l'étude Alienor dont 785 avaient accepté le prélèvement sanguin à l'inclusion de 3C. Les caractéristiques détaillées des participants de l'étude Alienor ont été décrites précédemment (441). La conception de l'étude a été approuvée par le comité d'éthique de Bordeaux (Comité de Protection des Personnes Sud-ouest et Outre- mer III). C'est donc parmi les 785 participants de l'étude Alienor qu'ont été mesurés rétrospectivement les AG 3-OHs plasmatiques des LPS. Plus spécifiquement, le projet NutEnDem s'est focalisé sur 698 participants dont les données de fréquentiel alimentaire et de potentiels facteurs de confusion (c. -à-d. , âge, sexe, niveau d'éducation, statut tabagique, IMC, hypertension, diabète, taux plasmatiques de HDL, LDL et triglycérides, antécédents de maladies cardiovasculaires et prise de médicaments) étaient intégralement renseignées. 3. 3. 2. Dosage du marqueur de l'endotoxémie Au sein du projet NutEnDem, le dosage des AG 3-OHs des endotoxines a été obtenue. Celui- ci a été réalisé de manière similaire, concomitante et par le même laboratoire que pour le projet EnIMA, tel que décrit dans la partie 3. 2. 2. Ce chapitre de données disponibles visait à décrire l'ensemble des données disponibles pour ces travaux de thèse. La façon dont ces données ont par la suite été exploitées pour répondre spécifiquement aux objectifs du projet de thèse a été décrite dans les parties méthodologies des chapitre IV et V, décrits ci-dessous. 75 CHAPITRE IV. PROFILS ALIMENTAIRES ET ENDOTOXÉMIE 4. 1. Introduction De par leur fort potentiel immunostimulant, les endotoxines pourraient participer au déclenchement ou au maintien des phénomènes d'inflammation de bas grade, dont le rôle délétère émerge dans de nombreuses pathologies liées à l'âge. Dans un contexte d'exposition vie-entière aux endotoxines, l'alimentation représenterait une stratégie prometteuse, ciblant l'endotoxémie métabolique comme source substantielle d'inflammation. Alors que la majorité des études se sont focalisées sur l'impact d'un aliment ou un nutriment de manière isolée, l'effet matrice de l'alimentation apparait comme un facteur clé dans la modulation de la réponse endotoxémique. Bien que d'intérêt majeur dans la compréhension de l'exposition vie-entière aux endotoxines, la relation entre profils alimentaires et endotoxémie reste toutefois peu élucidée, notamment chez les personnes âgées davantage sujettes à l'inflamm'aging et à l'occurrence de multi-comorbidités. L'objectif principal de cette présente étude a donc été d'évaluer l'association entre les profils alimentaires et les taux circulants d'AG 3-OH, utilisés comme proxy de la quantification totale de LPS plasmatiques, chez les personnes âgées. Les associations entre les niveaux d'AG 3-OH et d'une part la présence d'un syndrome métabolique (incluant une composante d'obésité viscérale) ou d'autre part un état à risque de malnutrition, reflets courants d'un statut nutritionnel altéré, ont été évaluées dans un objectif secondaire. 4. 2. Méthodologie statistique Cette étude a été réalisée au sein du projet NutEnDem, préalablement décrit (voir chapitre 3. 3), portant sur un total de 698 participants. 4. 2. 1. Identification des profils alimentaires a priori et a posteriori Étant donné la nature multidimensionnelle de l'alimentation, les données nutritionnelles issues du FFQ ont été exploitées au travers de deux approches complémentaires, a priori et a posteriori décrites ci-dessous, permettant de synthétiser l'ensemble des données alimentaires disponibles et d'en identifier des profils alimentaires. 76 4. 2. 1. 1. Le régime Méditerranéen a priori L'approche a priori est une approche permettant d'évaluer l'adhérence à un régime alimentaire, ou à des recommandations spécifiques, fondée sur la base de connaissances scientifiques. L'un des profils alimentaires a priori les plus étudiés en épidémiologie nutritionnelle est le régime Méditerranéen. Dans cette étude, l'adhérence au régime Méditerranéen a été évaluée selon le score de Sofi et collaborateurs dont les seuils de consommation ont été dérivés d'une méta-analyse (442). Concrètement, le score d'adhérence au régime Méditerranéen a été calculé à partir de la fréquence de consommation de 8 groupes d'aliments (c. -à-d. , légumes (crus et cuits), fruits, poissons, légumineuses, céréales (pâtes, riz, pain et céréales prêtes-à-consommer), produits laitiers, viande et huile d'olive) et de la consommation d'alcool. Pour chaque groupe d'aliments, un nombre de points variant de 0 à 2 a été attribué selon la fréquence de consommation (c. -à- d. , 0 point pour une consommation faible d'un aliment considéré comme bénéfique pour la santé ou pour une consommation élevée d'un aliment considéré comme néfaste pour la santé, et jusqu'à 2 points pour une consommation élevée d'un aliment considéré comme bénéfique pour la santé ou pour une consommation faible d'un aliment considéré comme néfaste pour la santé). Spécifiquement pour l'huile d'olive, l'approche suivante a été utilisée pour l'attribution des points : 2 points pour une consommation régulière considérée comme étant la consommation d'huile d'olive de manière exclusive pour l'assaisonnement ou pour la cuisson ; 1 point pour une consommation exclusive ou préférentielle parmi d'autres types de graisses pour l'assaisonnement et/ou pour la cuisson ; 0 point pour une consommation rare ou une non- consommation pour l'assaisonnement et/ou pour la cuisson. Concernant l'alcool, 2 points ont été accordés pour une consommation légère à modérée (c. -à-d. , 1 à 2 verres par jour, consommation considérée comme bénéfique), 1 point pour une consommation inférieure à un verre par jour et 0 point pour une consommation supérieure à 2 verres par jour. Les seuils de fréquence de consommation pour chaque groupe alimentaire ont été présentés dans le Tableau 3. L'adhérence au régime Méditerranéen variait ainsi de 0 (non-adhérence) à 18 (adhérence la plus élevée). 77 Tableau 3. Attribution des points du score Méditerranéen selon les portions des différents groupes alimentaires caractéristiques de ce régime. Adapté de Sofi et collaborateurs (442). Groupes alimentaires Légumes Fruits Légumineuses Poissons et crustacés Viandes et charcuterie Alcool Produits laitiers Céréales Huile d'olive < 1 portion/jour 1-2. 5 portions/jour > 2. 5 portions/jour 0 1 2 < 1 portion/jour 1-1. 5 portions/jour > 1. 5 portions/jour 0 1 2 < 1 portion/semaine 1-2 portions/semaine > 2 portions/semaine 0 1 2 < 1 portion/semaine 1-2. 5 portions/semaine > 2. 5 portions/semaine 0 1 2 < 1 portion/jour 1-1. 5 portions/jour > 1. 5 portions/jour 2 1 0 < 1 verres/jour 1-2 verres/jour > 2 verres/jour 1 2 0 < 1 portion/jour 1-1. 5 portions/jour > 1. 5 portions/jour 2 1 0 < 1 portion/jour 1-1. 5 portions/jour > 1. 5 portions/jour 0 1 2 Consommation occasionnelle Consommation fréquente Consommation régulière 0 1 2 78 4. 2. 1. 2. Profils alimentaires a posteriori L'approche a posteriori fait quant à elle référence à l'utilisation de méthodes statistiques permettant de mettre en évidence les dimensions sous-jacentes communes de différents groupes alimentaires. Autrement dit, elle permet d'identifier les groupes d'aliments habituellement consommés de manière concomitante ou au contraire de manière opposée, reflétant ainsi les habitudes et comportements alimentaires au sein d'un échantillon d'étude, qualifiés de profils alimentaires a posteriori et dérivés des données d'observation. Dans cette étude, ces profils alimentaires a posteriori ont été dérivés d'une analyse factorielle de type analyse en composantes principales (ACP). L'ACP est une méthode statistique de réduction de dimensions particulièrement utile lorsque les variables sont fortement corrélées entre elles, comme c'est le cas pour les données nutritionnelles. Les variables inclues dans la procédure d'analyse factorielle allaient au-delà des 8 groupes d'aliments du régime Méditerranéen et comprenaient la fréquence de consommation normalisée de l'ensemble des 20 groupes d'aliments préalablement décrits dans le chapitre 3. 1. 2. 3 à savoir : légumes crus, légumes cuits, fruits, légumineuses, pain et céréales, œuf, poissons et crustacés, volaille, viande, charcuterie, pâtes, riz, pomme de terre, pizza et sandwich, biscuits, sucreries, produits laitiers, alcool, thé et café (Tableau 2). L'analyse factorielle permet ainsi de synthétiser l'ensemble de l'information disponible (ici, les données nutritionnelles issues des 20 groupes d'aliments) en un certain nombre de composantes (ici, dénommées profils alimentaires) expliquant le maximum de variance au sein de l'échantillon. Par définition les composantes obtenues sont statistiquement indépendantes les unes des autres. Par conséquent, la première composante explique la variation maximale au sein de l'échantillon, la seconde composante reflétant la variation maximale non prise en compte dans la première composante et ainsi de suite. Chaque nouvelle composante prendra alors progressivement en compte des quantités de plus en plus faibles de variance. Une méthode de rotation orthogonale de type Varimax a été appliquée, visant à minimiser le nombre de variables fortement corrélées pour chaque composante afin d'en faciliter l'interprétation. Le nombre de composantes retenues a été déterminé en fonction de leurs valeurs propres > 1, 5 et de leur interprétabilité, conduisant, à partir des 20 groupes d'aliments prédéfinis, à l'obtention de 3 profils alimentaires a posteriori. Le degré de corrélation entre les groupes d'aliments et chacun des 3 profils alimentaires identifiés est donné par les factor loadings. La valeur d'un factor loading varie entre -1 et 1. Un factor loading positif indique une corrélation positive entre la fréquence de consommation d'un groupe d'aliment et l'adhérence au profil alimentaire obtenu (c. -à-d. , plus la fréquence de consommation du groupe d'aliment en question est élevée, plus l'adhérence au profil alimentaire est élevée). En revanche, un factor loading négatif indique une corrélation inverse entre la fréquence de consommation d'un groupe d'aliment et l'adhérence au profil alimentaire obtenu (c. -à-d. , plus la fréquence de consommation du groupe d'aliment en question est élevée, plus l'adhérence au profil alimentaire est faible). 79 La contribution d'un groupe d'aliment à un profil alimentaire est d'autant plus importante que sa valeur absolue de factor loading est élevée. Dans cette étude, les groupes d'aliments ayant des valeurs absolues de factor loadings élevées, basées sur un seuil arbitrairement établi de | 0, 40 |, ont été considérés comme contribuant significativement à la caractérisation du profil alimentaire et ont donc été utilisés pour nommer les 3 profils alimentaires a posteriori selon notre interprétation : le profil de type glucides complexes , de type sud-ouest et de type prudent , décrits ultérieurement. Néanmoins, tous les groupes alimentaires (c. -à-d. , incluant ceux ayant des valeurs de factor loadings supérieures ou inférieures à | 0, 40 |) ont été inclus dans le calcul des scores de profils alimentaires. Pour chaque participant, un score pour chaque profil alimentaire a été calculé en additionnant les apports des 20 groupes alimentaires pondérés par leurs factor loadings. Plus le score à un profil alimentaire est élevé, plus l'adhérence à ce profil est élevée. Contrairement aux approches par clusters (438), ces profils ne sont pas mutuellement exclusifs. 4. 2. 2. Mini Nutritional Assessment Utilisé en pratique clinique, le MNA (Mini Nutritional Assessment) est un questionnaire de 18 items regroupés en 4 catégories (c. -à-d. , mesures anthropométriques, évaluation de l'état global, questionnaire diététique et auto-évaluation) permettant d'identifier les personnes âgées à risque de malnutrition ou malnutries (443). Une procédure en 2 étapes est appliquée pour classer les sujets (444). La première partie du questionnaire (Annexe 4, items A à F et Tableau 4) permet de discriminer les personnes à risque de malnutrition (c. -à-d. , ayant un score 11 sur 14 points) de celles présentant un état nutritionnel normal (c. -à-d. , ayant un score supérieur à 11 sur 14 points). La seconde partie du questionnaire (Annexe 4, items G à R) est administrée spécifiquement aux personnes considérées précédemment comme étant à risque de malnutrition : sur un score total variant de 0 à 30 points, un score supérieur à 23, 5 indique un état nutritionnel normal, un score compris entre 17 et 23, 5 indique un risque de malnutrition et enfin un score inférieur à 17 indique une malnutrition avérée. Dans l'étude 3C, le MNA n'a pas été strictement administré, cependant des items similaires recueillis à travers les questionnaires généraux ont permis de construire un équivalent du MNA à partir d'items proxy, présentant une bonne concordance avec le MNA standard. La validation de ces proxys a fait l'objet d'une étude publiée précédemment (445). En raison d'un faible nombre de personnes considérées comme dénutries dans la cohorte 3C (445), seule la première partie du questionnaire a été utilisée dans cette étude, discriminant les personnes considérées comme à risque de malnutrition de celles ayant un état nutritionnel satisfaisant. L'attribution des points selon les items A à F a été décrite dans le Tableau 4. Dans la présente étude, le score MNA a pu être calculé chez 681 participants (soit près de 98% de l'échantillon). 80 Tableau 4. Attribution des points pour les items de A à F (première partie) de la version adaptée du questionnaire MNA dans 3C-Bordeaux. MNA Item A Items proxy du MNA de 3C-Bordeaux Item 2 du CES-D : Au cours de la semaine dernière, je n'ai pas eu envie de manger, j'ai manqué d'appétit : 0 : Fréquemment ou tout le temps 1 : Souvent 2 : Occasionnellement, très rarement voire jamais Item B Item C Item D Item E Item F Perte de poids au cours des 3 derniers mois : 0 : Perte de plus de 3kg 1 : Ne sait pas 2 : Perte entre 1 et 3kg 3 : Pas de perte de poids Restriction de la mobilité : 0 : Confiné au lit 1 : Confiné à la maison 2 : Confinement limitée au quartier, difficulté simple à utiliser les transports voire aucune restriction Présence d'un stress psychologique ou d'une maladie aigu au cours des 3 derniers mois : 0 : Oui 2 : Non Présence de troubles neuropsychologiques : 0 : Diagnostic de démence et MMSE < 10, ou présence de symptomatologie dépressive 1 : Diagnostic de démence et MMSE compris entre 10 et 20, absence de symptomatologie dépressive 2 : Pas de diagnostic de démence et MMSE > 20, absence de symptomatologie dépressive Indice de masse corporelle (IMC) : 0 : IMC < 19 kg/m 1 : 19 kg/m IMC < 21 kg/m 2 : 21 kg/m < IMC 23 kg/m 3 : IMC 23 kg/m Abréviations : MNA Mini Nutritional Assessment ; CES-D Center for Epidemiological Studies-Depression ; MMSE Mini Mental State Examination. 81 4. 2. 3. Syndrome métabolique Le syndrome métabolique est un ensemble de 5 composantes (c. -à-d. , obésité viscérale, résistance à l'insuline, pression artérielle élevée, faible taux de HDL et taux élevé de triglycérides) reconnues comme des facteurs de risque qui, lorsqu'ils sont combinés, vont majorer le risque de maladies (ex. cardio-vasculaires, diabète de type 2 ou certains cancers) et de mortalité, plus que ne le voudrait l'effet individuel de chacun des facteurs pris séparément. Dans cette présente étude, le syndrome métabolique a été défini tel que préalablement décrit dans 3C (446), selon les critères du National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III (NCEP ATP III) nécessitant la présence d'au moins 3 altérations parmi les paramètres cardiométaboliques suivant, dichotomisés en présence ou absence (447) : - (i) une tension artérielle systolique élevée (> 130 mmHg), une tension artérielle diastolique élevée (85 mmHg) ou la prise de médicaments antihypertenseurs, - (ii) un tour de taille élevé (> 88 cm chez les femmes et > 102 cm chez les hommes), - (iii) un taux de triglycérides élevé ( 150 mg/dL soit environ 1, 7 mmol/L), - (iv) un faible taux de cholestérol HDL (< 50 mg/dL chez les femmes, soit environ 1, 3mmol/L, et < 40 mg/dL chez les hommes, soit environ 1 mmol/L) et - (v) une glycémie élevée ( 110 mg/dL à jeun, soit environ 6, 1 mmol/L, ou 200 mg/dL non à jeun) ou la prise de médicaments antidiabétiques. Un total de 684 participants (soit près de 98% de l'échantillon) disposait de l'ensemble des données permettant de définir la présence ou l'absence d'un syndrome métabolique dans cette étude. L'obésité viscérale a également été étudiée comme un paramètre d'exposition isolée, considérant la prévalence de cette affection dans les populations âgées et les données de la littérature faisant état d'un lien étroit entre corpulence et endotoxémie. 4. 2. 4. Méthodologie statistique 4. 2. 4. 1. Codage des covariables Afin de caractériser l'échantillon d'étude et d'estimer au mieux la relation entre profils alimentaires, statuts nutritionnels altérés et taux circulants d'AG 3-OH, plusieurs covariables (recueillies à l'inclusion) ont été prises en compte dans cette étude parmi lesquelles (i) des caractéristiques sociodémographiques incluant l'âge, le sexe et le niveau d'éducation (définis en 3 catégories : niveau inférieur à l'école primaire, intermédiaire, universitaire ou équivalent), (ii) des données médicales incluant le diabète (c. -à-d. , diabète auto-déclaré ou glycémie à jeun 7 mmol/L ou glycémie non à jeun 11 mmol/L ou prise d'un traitement antidiabétique oral), l'hypertension (pression artérielle supérieure à 140/90 mmHg ou prise d'un traitement 82 l'artérite ou accident vasculaire cérébral), antihypertenseur), les antécédents cardiovasculaires (y compris l'infarctus du myocarde ou la chirurgie cardiaque et vasculaire ou la symptomatologie dépressive (définie comme un score Centre for Epidemiological Studies Depression Scale (CES-D) > 17 pour les hommes et > 23 pour les femmes (448), l'IMC (considéré en 3 catégories : insuffisance pondérale < 21 kg/m, corpulence normale 21-27 kg/m et surpoids ou obésité > 27 kg/m ; seuils adaptés aux personnes âgées (449), le nombre de médicaments consommés par semaine (classés en faible consommation (< 5 médicaments), polymédication (5 à 9 médicaments) ou hyper-polymédication (> 9 médicaments) et le nombre de médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens et/ou corticoïdes, la santé subjective perçue (considérée en 3 catégories : très bonne ou bonne, moyenne, mauvaise ou très mauvaise), (iii) le statut tabagique (considéré comme non-fumeur, ancien fumeur ou fumeur actuel) et enfin (iv) des données biologiques incluant les taux de LDL, HDL et de triglycérides, exprimés en mmol/L. 4. 2. 4. 2. Analyses statistiques Les associations entre les profils alimentaires (Méditerranéen ou a posteriori) et les taux circulants d'AG 3-OH ont été évaluées à l'aide de modèles de régressions linéaires multivariables. Les modèles ont été ajustés pour les covariables d'intérêt identifiées dans la littérature et tenant compte de la disponibilité des données dans notre étude. Le premier modèle a été ajusté sur l'âge, le sexe et le niveau d'éducation (Modèle 1). Le second modèle a été ajusté sur les covariables du Modèle 1 ainsi que sur le statut tabagique, l'IMC, l'hypertension, le diabète, le profil lipidique (c. -à-d. , taux de LDL, HDL et triglycérides), la symptomatologie dépressive, les antécédents de maladies cardiovasculaires, le nombre de médicaments par semaine et la prise d'anti-inflammatoires ou de corticoïdes. Les modèles visant à évaluer la relation entre un profil alimentaire a posteriori et les taux d'AG 3-OH ont été mutuellement ajustés sur les 2 autres profils a posteriori. Le coefficient de régression ajusté et les intervalles de confiance à 95% [IC 95%] ont été présentés. Les conditions d'application du modèle statistique, et notamment la normalité des variables d'intérêt, ont été vérifiées. Les scores aux profils alimentaires Méditerranéen et a posteriori ont été utilisés sous la forme de variables continues (augmentation d'un point) dans les analyses, et divisés en terciles (c. -à-d. , adhérence faible, intermédiaire et élevée) à des fins descriptives. Afin de respecter le caractère Gaussien de la distribution, la racine carrée des taux circulants d'AG 3-OH a été utilisée dans les analyses et considérée comme une variable continue (augmentation d'une unité). A des fins descriptives, les taux d'AG 3-OH ont été divisés en terciles. Les interactions entre la présence de diabète et les profils alimentaires ont été testées. 83 Des analyses de sensibilité ont été réalisées : - (i) en considérant chacun des 20 groupes alimentaires non pas en tant que profil mais de manière isolée et mutuellement ajustés sur les 19 autres groupes alimentaires, - (ii) en excluant les participants avec des taux très élevés d'AG 3-OH (c. -à-d. , > 550 mol/mL, déterminé graphiquement en l'absence de seuil établi dans la littérature, n 9) et - (iii) en identifiant des profils alimentaires a posteriori séparément chez les hommes et chez les femmes à des fins exploratoires (ces dernières données sont présentées en Annexe 5). En analyses secondaires, ont été testées les associations (i) entre les taux d'AG 3-OH et l'état à risque de malnutrition (sans ajustement sur l'IMC, faisant partie intégrante du calcul du score MNA), ainsi que (ii) les associations entre la présence d'un syndrome métabolique ou de chacune de ces composantes mutuellement ajustées (sans ajustement sur les variables composant le syndrome métabolique, à savoir la tension artérielle, le diabète, les taux d'HDL et de triglycérides ainsi que l'IMC). Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel SAS version 9. 4 (SAS Institute Inc. , Cary, 134 NC, USA) et du logiciel R version 3. 3. 2 (R Foundation for Statistical Computing, Vienne, Autriche). 4. 3. Résultats 4. 3. 1. Caractéristiques descriptives 4. 3. 1. 1. Caractéristiques descriptives des participants Les caractéristiques à l'inclusion des 698 participants de la présente étude, globales et selon les terciles d'AG 3-OH, ont été décrites dans le Tableau 5. Les participants étaient âgés en moyenne de 73, 1 ans (range 65, 4 87, 0) et étaient principalement (62%) représentés par des femmes. Globalement, les participants présentant des taux élevés d'AG 3-OH (c. -à-d. , tercile supérieur de distribution comparé au tercile inférieur) étaient majoritairement des hommes et présentaient un tableau clinique plus défavorable. Toutefois, la santé subjective perçue ne semblait pas différer selon les taux circulants d'AG 3-OH, avec en moyenne seulement 3% des participants se considérant en bonne voire très bonne santé et plus de 60% se considérant en mauvaise voire très mauvaise santé. Environ 7% des sujets présentaient un diabète ; la proportion étant significativement d'autant plus importante que les niveaux circulants d'AG 3-OH étaient élevés (c. -à-d. , de 3, 5% à 13, 3%, respectivement pour les terciles inférieur et supérieur d'AG 3-OH). Des antécédents cardio-vasculaires étaient rapportés chez près de 8% des participants, et dont la fréquence tendait à augmenter selon les taux d'AG 3-OH (c. -à-d. , de 5, 2% à 10, 7%, respectivement pour les terciles inférieur et supérieur d'AG 3-OH). L'indice de masse 84 corporelle moyen était de 26, 3 kg/m, avec près de 40% des participants présentant un surpoids ou une obésité. Au total, plus de 10, 1% des participants étaient considérés comme à risque de malnutrition à l'inclusion et près de 15% présentaient un syndrome métabolique. Plus de 6% des participants présentaient une hyper-polymédication ; le nombre moyen de médicaments consommés par semaine étant de 4, 1 (SD 2, 6). Une symptomatologie dépressive était rapportée chez 6% des participants, avec une fréquence plus faible chez les participants présentant des taux élevés d'AG 3-OH (c. -à-d. , 6, 9% et 5, 2%, respectivement pour le tercile inférieur et supérieur d'AG 3-OH). Le profil lipidique différait peu selon les terciles de distribution des AG 3-OH, toutefois les taux de triglycérides et de LDL étaient légèrement plus élevés dans le tercile supérieur d'AG 3-OH. 85 Tableau 5. Caractéristiques à l'inclusion des participants du projet NutEnDem (n 698). Caractéristiques à l'inclusion Total (n 698) Sociodémographiques Age (années) Sexe (Femmes) Niveau d'éducation < Etudes primaires Intermédiaire Université ou équivalent Cliniques Indice de masse corporelle (kg/m) Corpulence faible ( kg/m) Corpulence normale (21-27 kg/m) Surpoids (>27 kg/m) Santé perçue Bonne ou très bonne Moyenne Mauvaise ou très mauvaise Diabète Hypertension Antécédents cardiovasculaires Symptomatologie dépressive Statut tabagique Non-fumeur Ancient fumeur Fumeur 73, 1 (4, 4) 432 (61. 9) 207 (29, 7) 346 (49, 6) 145 (20, 7) 51 (7, 3) 369 (52, 9) 278 (39, 8) 21 (3, 0) 239 (34, 2) 438 (62, 8) 50 (7, 2) 529 (75, 8) 55 (7, 9) 42 (6, 0) 448 (64, 2) 219 (31, 4) 31 (4, 4) Ter1 AG 3-OH * Ter2 AG 3-OH * Ter3 AG 3-OH * (n 232) 73, 2 (4, 3) 169 (72, 8) 76 (32, 8) 116 (50, 0) 40 (17, 2) 18 (7, 8) 125 (53, 9) 89 (38, 4) 7 (3, 0) 85 (36, 6) 140 (60, 3) 8 (3, 5) 168 (72, 4) 12 (5, 2) 16 (6, 9) 162 (69, 8) 64 (27, 6) 6 (2, 6) (n 233) 72, 9 (4, 4) 143 (61, 4) 68 (29, 2) 115 (49, 4) 50 (21, 4) 13 (5, 6) 122 (52, 4) 98 (42, 1) 7 (3, 0) 78 (33, 5) 148 (63, 5) 11 (4, 72) 174 (74, 7) 18 (7, 7) 14 (6, 0) 155 (66, 5) 70 (30, 0) 8 (3, 5) (n 233) 73, 0 (4, 5) 120 (51, 5) 63 (27, 0) 115 (49, 4) 55 (23, 6) 20 (8, 6) 122 (52, 4) 91 (39, 0) 7 (3, 0) 76 (32, 6) 150 (64, 4) 31 (13, 3) 187 (80, 3) 25 (10, 7) 12 (5, 2) 131 (56, 2) 85 (36, 5) 17 (7, 3) 86 Consommation médicamenteuse 5-9 (polymédication) >9 (hyper-polymédication) Médicaments anti-inflammatoires LDL (mmol/L) HDL (mmol/L) Triglycérides (mmol/L) Alimentaire Score de régime Méditerranéen (/18) 422 (60, 5) 232 (33, 2) 44 (6, 3) 110 (15, 8) 3, 6 (0, 9) 1, 6 (0, 4) 1, 2 (0, 6) 10, 7 (2, 0) 142 (61, 2) 73 (31, 5) 17 (7, 3) 44 (19, 0) 3, 6 (0, 8) 1, 6 (0, 4) 1, 2 (0, 5) 136 (58, 4) 86 (36, 9) 11 (4, 7) 35 (15, 0) 3, 6 (0, 8) 1, 6 (0, 4) 1, 2 (0, 5) 144 (61, 8) 73 (31, 3) 16 (6, 9) 31 (13, 3) 3, 7 (0, 9) 1, 6 (0, 4) 1, 3 (0, 7) 10, 9 (1, 9) 10, 6 (2, 0) 10, 5 (2, 1) Les valeurs représentent les moyennes (écart-types) ou effectifs (pourcentages). * Ter1 [101, 4 219, 9 mol/mL], Ter2 [220, 0 286, 9 mol/mL] et Ter3 [287, 0 926, 0 mol/mL]. Abréviations : AG 3-OH acides gras 3-hyxroxylés ; LDL Low Density Lipoprotein ; HDL High Density Lipoprotein. 87 4. 3. 1. 2. Caractéristiques descriptives des profils alimentaires Le score moyen d'adhérence au régime Méditerranéen était de 10, 7 (SD 2, 0) sur un total de 18 pour l'ensemble de l'échantillon de l'étude, avec un score légèrement plus faible pour les participants se situant dans le tercile supérieur d'AG 3-OH comparativement au tercile inférieur (c. -à-d. , une différence moyenne de -0, 4 point) mais de manière non significative (Tableau 5). Les portions hebdomadaires moyennes de chacun des 20 groupes alimentaires selon les terciles du régime Méditerranéen ont été présentées dans le Tableau 6. Tableau 6. Consommation moyenne pour chaque groupe d'aliment issu du questionnaire de fréquence alimentaire, en portion par semaine ou nombre de verre d'alcool, selon les terciles de profil Méditerranéen (n 698). Faible adhérence ( 9 sur 18) Profil Méditerranéen Adhérence intermédiaire (10-11 sur 18) Forte adhérence ( 12 sur 18) n 187 Légumes crus Légumes cuits Fruits Légumineuses Pizza et sandwich Pomme de terre Pâte Riz Œuf Volaille Poisson et crustacés Viande Charcuterie Alcool Coffee Thé Produits laitiers Pain et céréales Sucreries Biscuits Tous les groupes d'aliments sont considérés en nombre de portions par semaine. Les valeurs représentent les moyennes (écart-types). n 264 9, 9 (5, 2) 9, 9 (4, 1) 13, 4 (6, 6) 0, 6 (0, 7) 0, 4 (0, 8) 2, 6 (1, 7) 2, 1 (1, 6) 1, 3 (1, 2) 1, 7 (1, 2) 1, 8 (1, 4) 2, 9 (1, 7) 4, 4 (2, 4) 1, 7 (2, 2) 10, 0 (11, 6) 6, 3 (5, 4) 3, 1 (4, 9) 15, 8 (6, 8) 18, 6 (5, 0) 8, 5 (6, 6) 1, 7 (2, 9) 7, 3 (5, 0) 8, 4 (4, 0) 9, 1 (6, 6) 0, 5 (0, 5) 0, 5 (1, 0) 2, 7 (1, 9) 2, 0 (1, 6) 1, 2 (1, 2) 1, 2 (1, 0) 1, 6 (1, 1) 1, 9 (1, 3) 5, 8 (3, 0) 1, 7 (2, 3) 13, 9 (16, 2) 6, 0 (5, 4) 2, 1 (4, 2) 18, 0 (7, 6) 17, 1 (6, 0) 8, 2 (6, 3) 2, 5 (3, 6) n 247 11, 1 (4, 8) 11, 8 (4, 0) 15, 6 (5, 4) 0, 7 (0, 6) 0, 4 (0, 6) 2, 9 (1, 6) 2, 1 (1, 3) 1, 4 (1, 1) 1, 5 (1, 0) 1, 9 (1, 1) 3, 6 (1, 6) 4, 4 (1, 9) 1, 4 (1, 9) 8, 6 (8, 6) 5, 8 (5, 1) 3, 1 (4, 8) 16, 3 (7, 6) 19, 4 (4, 3) 8, 4 (6, 6) 2, 0 (3, 2) 88 Les 3 profils alimentaires a posteriori dérivés de l'analyse factorielle représentaient 27, 6% de la variance totale de l'échantillon. Le Tableau 7 présente les groupes d'aliments et la matrice de factor loadings associés à chacun des trois profils alimentaires a posteriori retenus. Tableau 7. Structure des profils alimentaires identifiés a posteriori par analyse en composante principale selon les 20 groupes d'aliments du questionnaire de fréquence alimentaire (n 698). Profil Profil Profil Glucides complexes Sud-Ouest Prudent Factor loadings Légumes crus Légumes cuits Fruits Légumineuses Pizza et sandwich Pomme de terre Pâte Riz Œuf Volaille Poisson et crustacés Viande Charcuterie Alcool Coffee Thé Produits laitiers Pain et céréales Sucreries Biscuits Variance expliquée (%) Tous les groupes d'aliments sont considérés en nombre de portions par semaine. En gras, les factor loadings | 0. 4|. 0, 231 0, 190 -0, 005 0, 275 0, 109 0, 427 0, 639 0, 672 0, 500 0, 436 0, 396 -0, 057 0, 128 -0, 075 0, 041 0, 162 0, 184 0, 285 0, 260 0, 211 10, 5 0, 443 0, 661 0, 402 0, 008 -0, 259 0, 045 -0, 187 -0, 152 0, 041 0, 156 0, 297 -0, 131 -0, 264 -0, 162 0, 034 -0, 137 0, 034 0, 300 -0, 223 -0, 526 7, 9 0, 128 -0, 044 -0, 203 0, 475 0, 074 0, 313 0, 132 -0, 011 -0, 009 -0, 055 0, 009 0, 543 0, 557 0, 591 0, 117 -0, 402 -0, 181 0, 414 0, 056 -0, 290 9, 2 Le premier profil alimentaire était caractérisé par une fréquence de consommation hebdomadaire élevée en riz, pâtes, œufs, volaille, de pommes de terre et de poisson et représentait 10, 5% de la variance totale. Ce profil alimentaire a été qualifié de glucides complexes . Le second profil alimentaire se caractérisait principalement par des apports élevés en alcool, charcuterie et viande et dans une moindre mesure en légumineuses, pain et céréales prêtes à consommer, ainsi qu'une faible consommation de thé. Par conséquent, cette composante a été qualifiée de profil alimentaire de type sud-ouest et expliquait 9, 2% de la variance totale. En revanche, le profil alimentaire dénommé prudent était caractérisé par une fréquence de consommation élevée de fruits et légumes et une consommation faible de biscuits. Ce profil alimentaire représentait 7, 9% de la variance totale. 89 Figure 14. Radar Graphs superposés des profils alimentaires a posteriori de type prudent (en vert) et sud-ouest (en rouge) selon les factor loadings des 20 groupes alimentaires du FFQ. Afin de faciliter la représentation de chacun des trois profils alimentaires a posteriori en termes de consommation, les portions hebdomadaires moyennes de chacun des 20 groupes d'aliments ont été décrites selon les terciles de profils alimentaires glucides complexes , sud-ouest et prudent (Tableau 8). 90 Tableau 8. Consommation moyenne pour chaque groupe d'aliment issu du questionnaire de fréquence alimentaire, en portion par semaine ou nombre de verre d'alcool, selon les terciles de profils alimentaires identifiés a posteriori par analyse en composante principale (n 698). Profil Glucides complexes Profil Sud-ouest Ter1 n 232 Ter2 n 233 Ter3 n 233 Ter1 n 232 Ter2 n 233 Ter3 n 233 Ter1 n 232 Profil Prudent Ter2 n 233 9, 7 (4, 8) 9, 8 (2, 9) 12, 6 (5, 9) 0, 6 (0, 5) 0, 4 (0, 8) 2, 7 (1, 7) 2, 1 (1, 5) 1, 3 (1, 2) 1, 5 (1, 2) 1, 8 (1, 2) 2, 9 (1, 7) 5, 0 (2, 5) 1, 4 (1, 8) 10, 2 (10, 2) 6, 0 (5, 2) 3, 0 (4, 5) 15, 6 (6, 6) 19, 0 (4, 6) 8, 5 (6, 1) 1, 4 (2, 2) Tous les groupes d'aliments sont considérés en nombre de portions par semaine. Les valeurs représentent les moyennes (écart-types). En gras, les factor loadings | 0. 4|. 7, 0 (4, 4) 7, 3 (3, 5) 10, 2 (6, 1) 0, 6 (0, 7) 0, 6 (1, 0) 2, 7 (1, 8) 2, 4 (1, 6) 1, 5 (1, 3) 1, 4 (1, 1) 1, 6 (1, 1) 2, 3 (1, 3) 5, 0 (2, 7) 2, 3 (2, 7) 13, 2 (15, 5) 6, 0 (5, 3) 3, 1 (5, 3) 16, 7 (7, 7) 16, 7 (5, 6) 9, 8 (7, 1) 4, 0 (4, 2) 10, 2 (5, 2) 9, 8 (4, 1) 11, 5 (6, 5) 0, 9 (0, 8) 0, 5 (0, 7) 3, 4 (1, 6) 2, 3 (1, 4) 1, 3 (1, 1) 1, 5 (1, 0) 1, 7 (1, 1) 2, 9 (1, 6) 6, 3 (2, 6) 2, 9 (2, 7) 18, 5 (16, 0) 6, 7 (5, 2) 1, 3 (2, 9) 15, 1 (7, 1) 20, 4 (3, 3) 8, 8 (6, 6) 1, 2 (2, 4) 10, 9 (5, 0) 11, 1 (4, 5) 13, 0 (6, 1) 0, 8 (0, 7) 0, 6 (0, 8) 3, 5 (1, 8) 3, 2 (1, 4) 2, 2 (1, 4) 2, 1 (1, 3) 2, 5 (1, 5) 3, 5 (1, 8) 4, 5 (2, 3) 1, 8 (2, 1) 9, 3 (10, 1) 6, 2 (5, 6) 3, 8 (5, 4) 18, 3 (7, 5) 19, 9 (4, 1) 10, 3 (7, 0) 2, 8 (3, 8) 8, 1 (4, 9) 9, 4 (4, 0) 12, 9 (7, 3) 0, 4 (0, 4) 0, 3 (0, 8) 1, 9 (1, 4) 1, 0 (0, 8) 0, 6 (0, 6) 1, 0 (0, 8) 1, 3 (0, 9) 2, 2 (1, 4) 4, 8 (2, 8) 1, 3 (1, 9) 11, 4 (13, 7) 5, 5 (4, 9) 2, 0 (3, 6) 15, 4 (7, 0) 16, 5 (6, 0) 6, 6 (5, 7) 1, 4 (2, 7) 10, 0 (5, 4) 10, 0 (4, 0) 13, 3 (6, 8) 0, 6 (0, 6) 0, 5 (0, 8) 2, 8 (1, 6) 2, 1 (1, 2) 1, 1 (0, 8) 1, 4 (0, 9) 1, 7 (1, 0) 3, 0 (1, 5) 5, 0 (2, 3) 1, 6 (2, 3) 10, 9 (12, 4) 6, 4 (5, 3) 2, 7 (4, 7) 15, 9 (7, 3) 19, 1 (4, 6) 8, 2 (6, 3) 1, 8 (2, 9) 8, 6 (5, 3) 10, 2 (4, 3) 14, 6 (7, 1) 0, 3 (0, 4) 0, 4 (0, 8) 2, 1 (1, 6) 1, 9 (1, 6) 1, 3 (1, 3) 1, 6 (1, 4) 1, 9 (1, 4) 2, 8 (1, 8) 3, 4 (2, 0) 0, 6 (1, 1) 4, 4 (5, 7) 5, 1 (5, 2) 5, 2 (6, 1) 18, 3 (7, 9) 15, 7 (6, 2) 7, 6 (6, 4) 3, 2 (4, 0) 10, 2 (5, 0) 10, 5 (4, 2) 13, 2 (6, 2) 0, 6 (0, 5) 0, 4 (0, 8) 2, 7 (1, 7) 2, 0 (1, 4) 1, 3 (1, 0) 1, 4 (0, 9) 1, 8 (1, 2) 2, 9 (1, 6) 4, 6 (1, 9) 1, 2 (1, 4) 8, 7 (7, 8) 6, 3 (5, 3) 2, 1 (3, 5) 16, 2 (6, 7) 19, 4 (4, 2) 8, 7 (6, 6) 1, 6 (2, 6) Légumes crus Légumes cuits Fruits Légumineuses Pizza et sandwich Pomme de terre Pâte Riz Œuf Volaille Poisson et crustacés Viande Charcuterie Alcool Coffee Thé Produits laitiers Pain et céréales Sucreries Biscuits 91 Ter3 n 233 12, 2 (5, 2) 13, 4 (3, 6) 16, 3 (6, 8) 0, 6 (0, 6) 0, 3 (0, 4) 2, 8 (1, 7) 1, 8 (1, 2) 1, 1 (1, 0) 1, 5 (1, 0) 2, 1 (1, 4) 3, 5 (1, 7) 4, 3 (2, 3) 1, 0 (1, 5) 8, 2 (10, 0) 6, 1 (5, 4) 2, 4 (4, 1) 17, 3 (7, 7) 19, 8 (4, 7) 6, 8 (5, 9) 0, 7 (1, 6) 4. 3. 1. 3. Caractéristiques descriptives des taux d'acides gras 3-hydroxylés Au sein de l'échantillon d'étude, les taux plasmatiques moyens d'AG 3-OH étaient de 266, 4 mol/mL (SD 100, 3 mol/mL) (Tableau 9), avec des taux légèrement plus élevés chez les participants ayant la plus faible adhérence au régime Méditerranéen (tercile inférieur, 276, 7 mol/mL), par rapport à ceux ayant une adhérence intermédiaire (261, 8 (SD 92, 9) mol/mL) ou élevée (263, 7 (SD 99, 7) mol/ mL) de manière non significative. Au niveau des profils a posteriori, les taux circulants d'AG 3-OH étaient en moyenne significativement plus faibles chez les participants ayant une adhérence élevée au profil de type prudent (de 283, 0 à 255, 3 mol/mL (soit approximativement - 10%), respectivement pour les terciles inférieurs et supérieurs) et significativement plus élevés chez les participants ayant une adhérence plus élevée au profil de type sud-ouest (de 249, 9 à 290, 8 mol/mL (soit approximativement 16%), respectivement pour les terciles inférieurs et supérieurs) (Tableau 9). En revanche, aucune variation évidente dans les taux circulants d'AG 3-OH n'a été observée selon le degré d'adhérence au profil de type glucides complexes . 92 Tableau 9. Taux plasmatiques moyens d'acides gras 3-hydroxylés selon le sexe et selon les terciles de profils alimentaires (n 698). Total (n 698) Profil Méditerranéen Faible Adhérence Forte adhérence intermédiaire adhérence Profil Glucides complexes Profil Sud-ouest Profil Prudent Ter1 Ter2 Ter3 Ter1 Ter2 Ter3 Ter1 Ter2 Ter3 AG 3-OH (mol/mL) 266, 4 (100, 3) 261, 1 (85, 2) Les valeurs représentent les moyennes (écart-types). P-value de tendance : pour les profils alimentaires Sud-ouest et Prudent . Abréviation : AG 3-OH acides gras 3-hyxroxylés. Faible adhérence : 9 sur 18, adhérence intermédiaire 10-11 sur 18 et forte adhérence 12 sur 18. 283, 0 (114, 6) 270, 6 (118, 7) 290, 8 (118, 4) 276, 7 (110, 4) 266, 1 (87, 2) 262, 6 (92, 6) 249, 9 (83, 4) 258, 6 (91, 4) 261, 8 (92, 9) 263, 7 (99, 7) 255, 3 (97, 3) 93 4. 3. 2. Association entre profils alimentaires et taux circulants d'acides gras 3-hydroxylés régime Méditerranéen Le Tableau 10 présente les résultats des analyses de régressions linéaires multivariables des associations entre les profils alimentaires et les taux circulants d'AG 3-OH. Globalement, une adhérence plus élevée au : -0, 13 [-0, 23 ; -0, 03] pour chaque point supplémentaire de score) et au profil prudent (coefficient [IC 95%] : -0, 28 [-0, 48 ; -0, 07] pour chaque point supplémentaire de score) était significativement associée à des taux plasmatiques plus faibles d'AG 3-OH, après ajustement sur l'âge, le sexe et le niveau d'étude (Modèle 1). Dans le même modèle d'ajustement, une adhérence plus élevée à un profil de type sud-ouest était significativement associée à des taux plasmatiques plus élevés d'AG 3-OH (coefficient [IC 95%] : 0, 31 [0, 08 ; 0, 53] pour chaque point supplémentaire de score) (Tableau 10, Modèle 1). (coefficient [IC 95%] L'ensemble de ces associations persistaient après ajustement sur le profil lipidique (c. -à-d. , HDL, LDL et triglycérides), les facteurs de risques cardio-vasculaires (c. -à-d. , antécédents cardio-vasculaires, IMC, hypertension, diabète, statut tabagique), la symptomatologie dépressive et la consommation médicamenteuse (Tableau 10, Modèle 2). Aucune association significative n'a été observée entre l'adhérence au profil glucides complexes et les taux d'AG 3-OH. Par ailleurs, aucune interaction significative entre les profils alimentaires et le diabète n'a été mise en évidence dans cette étude. 94 Tableau 10. Associations multivariables entre profils alimentaires et taux plasmatiques d'acides gras 3-hydroxylés (n 698). Profils a posteriori Profil Glucides complexes * Modèle 1 IC 95% p-value * Modèle 2 IC 95% -0, 121 [-0, 328 ; 0, 085] 0, 250 -0, 086 [-0, 292 ; 0, 119] Profil Sud-ouest Profil Prudent Profil a priori 0, 305 [0, 078 ; 0, 532] 0, 009 0, 223 [0, 006 ; 0, 457] -0, 275 [-0, 482 ; -0, 069] 0, 009 -0, 271 [-0, 476 ; -0, 066] p-value 0, 408 0, 044 0, 010 Profil Méditerranéen * Coefficients de régression pour la racine carrée d'AG 3-OH. Modèle 1 ajusté sur l'âge, le sexe et le niveau d'éducation. Modèle 2 ajusté sur les covariables du Modèle 1 le statut tabagique, l'IMC, l'hypertension, le diabète, la symptomatologie dépressive, HDL, LDL, triglycérides, antécédents cardiovasculaires, nombre de médicaments total par semaine et médicaments anti-inflammatoires. Un ajustement supplémentaire sur les autres profils alimentaires a posteriori a été réalisé (excepté pour le profil Méditerranéen). Abréviations : AG 3-OH acides gras 3-hydroxylés ; IMC Indice de masse corporelle ; LDL low density lipoprotein ; HDL high density lipoprotein. [-0, 220 ; -0, 014] -0, 117 0, 027 -0, 130 [-0, 233 ; -0, 026] 0, 014 95 4. 3. 3. Analyses de sensibilité Après exclusion des participants présentant des taux élevés d'AG 3-OH, dont la majorité (c. -à- d. , 6 participants sur les 9) souffraient de diabète, les associations persistaient pour les profils alimentaires prudent et sud-ouest (coefficients [IC 95%] : -0, 24 [-0, 43 ; -0, 06] et 0, 22 [0, 02 ; 0, 42] respectivement pour chaque point supplémentaire de score), mais l'association devenait non significative pour le régime Méditerranéen (coefficients [IC 95%] : -0, 09 [-0, 18 ; 0, 01], p-value 0, 073). Lorsque les groupes alimentaires ont été considérés de manière individualisée et mutuellement ajustés dans les analyses, aucune association significative entre les taux d'AG 3-OH n'a été mise en évidence avec un groupe alimentaire en particulier, que ce soit dans le modèle partiellement (Modèle 1) ou entièrement (Modèle 2) ajusté. 4. 3. 4. Analyses secondaires 4. 3. 4. 1. Risque de malnutrition et taux circulants d'acides gras 3-hydroxylés Aucune association n'a été mise en évidence entre les taux d'AG 3-OHs et le fait d'être considéré à risque de malnutrition (n 69 soit près de 10% des participants), que ce soit dans le Modèle 1 ( 0, 065 IC95% [-0, 627 ; 0, 758], p-value 0, 853) ou le Modèle 2 ( 0, 078 IC95% [- 0, 646 ; 0, 802], p-value 0, 833). 4. 3. 4. 2. Syndrome métabolique et taux circulants d'acides gras 3-hydroxylés La présence d'un syndrome métabolique (n 102 participants présentant un syndrome métabolique soit près de 15% des participants) était significativement associée à des taux plus élevés d'AG 3-OH ( 0, 732 IC95% [0, 123 ; 1, 341], p-value 0, 019, Modèle 2). Lorsque les composantes du syndrome métabolique ont été inclues de manière individuelle mais mutuellement ajustées dans le modèle, seule la glycémie était significativement associée à des taux plus élevés d'AG 3-OH ( 1, 534 IC95% [0, 829 ; 2, 239], p-value Pour information, la présence d'une obésité viscérale (n 235 participants soit 34% de l'échantillon d'étude) n'était pas associée aux taux d'AG 3-OH ( 0, 114 IC95% [-0, 352 ; 0, 581], p-value 0, 631). 96 4. 4. Discussion En utilisant des approches complémentaires dans l'identification de profils alimentaires, cette présente étude souligne que la qualité de l'alimentation semblerait être un facteur clé associé à l'endotoxémie chez la personne âgée. Plus précisément, une meilleure adhérence à des régimes alimentaires considérés comme sains, selon les connaissances scientifiques actuelles, a été associée à des niveaux d'AG 3-OH plasmatiques moins élevés, reflet d'une plus faible endotoxémie. Une tendance que l'on retrouve en cohérence avec la littérature, mettant en évidence qu'un régime alimentaire sain tel que le régime Méditerranéen était associée à une endotoxémie (et plus précisément une activité biologique des LPS) plus faible chez l'adulte (416, 424, 428). En ce qui concerne les personnes âgées, l'adoption d'un régime alimentaire de type prudent (c. -à- d. , faible en lipides saturés, riche en carbohydrates et en fibres) pendant 1 mois était associée à une diminution de plus d'un tiers de l'endotoxémie à jeun (424). D'autre part, une adhérence plus élevée à un régime Méditerranéen était inversement corrélée à l'endotoxémie chez 912 personnes âgées souffrant de fibrillation atriale non valvulaire (429). Cette dernière étude a notamment rapporté que la consommation de fruits et de légumineuses, parmi les autres composants alimentaires du régime Méditerranéen, était davantage associée à une faible activité endotoxémique ; un résultat qui semble cohérent avec le régime prudent dans notre analyse majoritairement caractérisé par une fréquence de consommation élevée en fruits et associé à une plus faible endotoxémie. Par ailleurs, les régimes a priori ou a posteriori riches en fruits et légumes sont fréquemment associés à un moindre état inflammatoire de bas grade (117, 450 452), soutenant l'hypothèse biologiquement plausible de l'exposition réduite aux endotoxines dans ces régimes sains, comparativement à un régime riche en graisses notamment saturées. En effet, des régimes alimentaires de type obésogènes ainsi que des profils alimentaires identifiés a posteriori et caractérisés par une consommation riche en produits carnés et en alcool (bière) sont régulièrement associés à un statut pro-inflammatoire plus important (ex. IL6 ou CRP) (117, 450, 451, 453, 454). Dans notre étude, une adhérence plus élevée à un régime alimentaire de type sud-ouest était associée à une concentration plus importante en AG 3- OH ; des résultats là-aussi cohérents avec la littérature scientifique, relatant que des régimes de type Western (c. -à-d. , riches en produits carnés et en sucres raffinés) ou pro-obésogènes étaient associés à une activité endotoxémique plus importante (416, 424). Bien qu'il existe un degré de corrélation élevé entre les groupes alimentaires d'un même régime, rendant difficile l'attribution des effets sur la réponse endotoxémique à des composants alimentaires uniques, plusieurs constituants au sein de ces régimes sains ou sud-ouest pourraient expliquer, tout du moins en partie, les résultats d'associations obtenus avec les niveaux d'AG 3-OH ; l'effet matrice de l'alimentation pouvant exacerber les effets de chaque constituant. 97 légère à modérée (c. -à-d. , généralement Tout d'abord, les lipides alimentaires ont été reconnus comme des facteurs majeurs favorisant le passage des endotoxines à travers la barrière intestinale, facilitée par l'incorporation des régions lipidiques du LPS dans les chylomicrons en formation lors de la digestion lipidique (300, 412). Parallèlement à cela, la théorie d'un transport passif du LPS est avancée, qui pourrait être facilité par la capacité des régimes riches en lipides saturés à compromettre l'intégrité et la perméabilité de la barrière intestinale. En effet, une alimentation de type sud-ouest sur le long terme est fréquemment associée à l'installation progressive d'un microbiote pro- inflammatoire ainsi qu'une hyperperméabilité intestinale, induisant un passage plus important d'endotoxines vers la circulation sanguine tout au long de la vie (285, 303, 455). Concernant l'alcool, une consommation inférieure à 140g/semaine ; 1 verre d'alcool correspondant approximativement à 10-12g d'alcool pur) a été associée à une plus faible activité endotoxémique comparée à une abstinence (456). Dans cette même optique, une étude a révélé une diminution par rapport aux niveaux initiaux des niveaux d'endotoxines et de LBP sériques suite à la consommation de 272mL de vin rouge (soit environ 2 verres) pendant 20 jours, corrélée à des modifications au niveau du microbiote intestinal (457). Cependant, dans cette étude, la consommation de 272mL de vin rouge concomitante à l'ingestion de 50g de lipides n'a pas atténué les niveaux d'endotoxémie induit par la charge lipidique. Par ailleurs, une consommation excessive d'alcool chez des personnes considérées comme alcooliques a été associée à un taux de LPS jusqu'à 5 fois plus élevé par rapport à des sujets contrôles (458). À l'instar des lipides saturés, une consommation excessive d'alcool est généralement associée à une dysbiose intestinale et une hyperperméabilité de la barrière intestinale (458, 459) ; un résultat qui pourrait en partie sous-tendre la relation observée entre régime sud-ouest et taux élevés d'AG 3-OH dans cette présente étude. Par ailleurs, nos résultats ont permis d'observer des taux plus élevés d'AG 3-OH chez les personnes diabétiques ; un résultat cohérent avec la littérature soulignant le caractère inflammatoire de la pathologie fréquemment associée à une dysbiose du microbiote intestinal et des niveaux plus élevés d'endotoxines (358, 359, 460462). De plus, l'augmentation de la perméabilité intestinale et des modifications dans la composition et la diversité du microbiome intestinal ont également été proposés comme mécanismes potentiels pour expliquer l'augmentation des endotoxines circulantes dans le syndrome métabolique (463, 464). À l'inverse, un apport élevé en fibres ou en polyphénols (omniprésents dans les produits végétaux), parmi d'autres caractéristiques du régime Méditerranéen ou prudent , pourrait contribuer à limiter l'endotoxémie de par leurs propriétés anti-inflammatoires et prébiotiques favorisant un microbiote sain (347, 465, 466). Enfin, les phénomènes de détoxification ou encore d'élimination des endotoxines peuvent également être influencées par des facteurs nutritionnels. Par exemple, l'expression de la phosphatase alcaline intestinale (IAP), ayant un rôle crucial dans la détoxification des endotoxines et l'inflammation associée, serait réduite par l'occurrence de régimes alimentaires industrialisés ou de mauvaise qualité nutritionnelle (ex. apport sous-optimale en micronutriments et faible teneur en fibres alimentaires) (347). Ainsi, la quantité d'endotoxines du microbiote intestinal, le passage à travers les barrières physiologiques et les phénomènes de neutralisation et d'élimination seraient tous influencés par l'alimentation. Un effet pléiotrope de l'alimentation qui souligne l'importance des stratégies 98 nutritionnelles dans la modulation de l'endotoxémie en tant que source d'inflammation chez la personne âgée. En partie en désaccord avec la littérature, lorsque les apports alimentaires ont été considérés individuellement dans nos analyses, aucune association avec les taux d'AG 3-OH n'a été observée dans notre échantillon, suggérant que l'effet de matrice de l'alimentation apporterait des propriétés plus importantes sur l'endotoxémie qu'un groupe alimentaire spécifique. Dans ce sens, une précédente étude portant sur 668 individus présentant un diabète de type 1 a rapporté une association entre les profils alimentaires a posteriori reflétant des choix alimentaires sains (c. -à-d. , régime à base de poisson, collations saines et régimes modernes) et des niveaux circulants plus faibles de LPS, alors qu'aucune association de ce type n'a été observée avec l'apport en macronutriments (428). Bien que nos résultats fournissent des preuves importantes sur l'association entre les profils alimentaires et la charge plasmatique en LPS chez les personnes âgées, certaines limites doivent être reconnues. Premièrement, le design transversal de la présente étude ne permet pas de conclure sur la causalité de l'association. Ensuite, en raison d'une multitude de molécules LPS dont les effets biologiques diffèrent selon leur structure, il est difficile de traduire les taux d'AG 3-OH évalués par LC-MS/MS (quantification totale des formes actives et inactives) en endotoxémie réellement effective. Bien que largement répandue, la méthode de dosage LAL mesurant uniquement la fraction biologiquement active des endotoxines est susceptible d'induire des résultats faussement positifs ou négatifs, en particulier en cas de neutralisation des LPS par les lipoprotéines (467, 468). Le choix de la méthode LC-MS/MS appliquée ici a toutefois permis de réduire les limites de détection et de quantification, comparativement à la méthode LAL. De plus, alors que l'activité biologique diminue rapidement suite à un pic de LPS dans la circulation sanguine, la concentration en AG 3-OH reste stable dans le temps et pourrait ainsi représenter un indicateur plus fiable de la charge en LPS à plus long terme, et notamment à jeun (331). Enfin, malgré la prise en compte d'un large éventail de facteurs de confusion potentiels, nous ne pouvons pas exclure que certains facteurs résiduels puissent expliquer ces observations, comme la taille des portions des groupes alimentaires - non disponibles dans le FFQ de 3C. Les points forts de cette présente étude incluent l'originalité de la population cible, à savoir les personnes âgées, une taille d'échantillon importante ainsi que l'utilisation d'approches complémentaires dans l'identification des profils alimentaires. En outre, le caractère a posteriori de cette approche, ne se basant sur aucune hypothèse prédéfinie, est notamment utile à des fins exploratoires puisqu'il permet de prendre en compte une diversité alimentaire plus importante qui ne se limite pas aux connaissances actuelles. Par ailleurs, le choix du score d'adhérence au régime Méditerranéen a priori, dont les seuils de consommation pour chacun des groupes alimentaires ont été dérivés d'une revue de la littérature ont permis d'éviter le recours à des seuils dépendants de l'échantillon (ex. basé sur la médiane de consommation), favorisant ainsi la possibilité de reproductibilité de l'étude. 99 Conclusion Les résultats de cette étude mettent ainsi en évidence que l'alimentation, considérée comme un ensemble et non stigmatisée sur un aliment en particulier, pourrait représenter une stratégie prometteuse ciblant l'endotoxémie comme source majeure d'inflammation chez la personne âgée, susceptibles de présenter des multi-comorbidités. Ces résultats ont été valorisés lors de congrès Européens (voir partie valorisation scientifique) et sous la forme d'un article scientifique (Annexe 6), actuellement soumis au journal American Journal of Clinical Nutrition. Dans la continuité de ce projet, et pour répondre au second objectif de thèse, les relations entre biomarqueurs de l'endotoxémie plasmatique et risque de démence ont été évaluées et décrites dans le chapitre V, ci-dessous. 100 CHAPITRE V. ENDOTOXÉMIE ET RISQUE DE DÉMENCE 5. 1. Introduction Alors que les preuves s'accumulent sur un rôle potentiellement majeur du système immunitaire et notamment de l'exposition aux endotoxines dans la pathologie d'Alzheimer, la longue phase préclinique de la maladie pouvant s'étendre sur plusieurs années avant l'apparition des manifestations cliniques incite à interpréter les résultats avec précaution. En effet, il reste difficile de séparer dans les études transversales dont on dispose aujourd'hui la cause de la conséquence ou même du potentiel rôle aggravateur que pourrait induire l'exposition chronique de bas grade aux endotoxines. L'objectif a donc été d'évaluer les associations entre les biomarqueurs plasmatiques de l'exposition aux endotoxines mesurés à l'inclusion et le risque de survenue de démence ou de maladie d'Alzheimer au sein de deux études complémentaires de design longitudinal : le projet EnIMA et le projet NutEnDem. 5. 2. Méthodologie et résultats du projet EnIMA La première analyse a été réalisée au sein du projet cas-témoin niché EnIMA, préalablement décrit (voir chapitre 3. 2), portant sur un total de 212 cas incidents de maladie d'Alzheimer (probable, possible ou mixte) sur 12 ans de suivi appariés en densité d'incidence sur l'âge, le sexe et le niveau d'étude à l'inclusion à 2 témoins chacun indemnes de démence. Un total de 636 participants a été inclus dans cette analyse de type cas-témoin niché dans la cohorte 3C- Bordeaux. Dans cette présente étude, les biomarqueurs plasmatiques de l'exposition aux endotoxines suivants étaient disponibles : les acides gras 3-hydroxylés des LPS (AG 3-OH), la Lipopolysaccharides-Binding Protein (LBP) et la forme soluble du Cluster of Differentiation- 14 (sCD14). Un marqueur inflammatoire, l'Interleukin-6 (IL-6) a également été dosé chez tous les participants inclus. 101 5. 2. 1. Méthodologie statistique 5. 2. 1. 1. Codage des covariables Plusieurs covariables ont été prises en compte dans les analyses afin d'estimer au mieux les relations entre biomarqueurs de l'exposition aux endotoxines circulantes et risque de maladie d'Alzheimer incluant (i) le génotypage ApoE4, (ii) la présence de multi-comorbidités défini à l'aide d'un score continu représentant le nombre de comorbidités parmi les suivantes (les participants présentant 4 comorbidités ou plus ont été regroupés en une seule catégorie 4) : cancer toutes causes confondues, le diabète (c. -à-d. , diabète auto-déclaré ou glycémie à jeun 7 mmol/L ou glycémie non à jeun 11 mmol/L ou prise d'un traitement antidiabétique oral), l'hypertension (pression artérielle supérieure à 140/90 mmHg ou prise d'un traitement antihypertenseur), les antécédents cardiovasculaires (y compris l'infarctus du myocarde ou la chirurgie cardiaque et vasculaire ou la symptomatologie dépressive (définie comme un score Center for Epidemiological Studies Depression Scale (CES-D) > 17 pour les hommes et > 23 pour les femmes (448), l'asthme et hypercholestérolémie traitement hypocholestérolémiant), (iii) l'IMC (considéré en 3 catégories : insuffisance pondérale < 21 kg/m, corpulence normale 21-27 kg/m et surpoids ou obésité > 27 kg/m ; seuils adaptés aux personnes âgées (449), (iv) le nombre de médicaments consommés par semaine (classés en faible consommation (< 5 médicaments), polymédication (5 à 9 médicaments) ou hyper- polymédication (> 9 médicaments) et le nombre de médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens et/ou corticoïdes et enfin (v) le score d'adhérence au régime Méditerranéen (range de 0 à 18, considéré comme une variable continu et tel que décrit dans le chapitre 4. 2. 1. 1). l'artérite ou accident vasculaire cérébral), (cholestérol 6, 2 mmol/L ou la prise d'un 5. 2. 1. 2. Analyses statistiques Les variables quantitatives et qualitatives ont été exprimées sous forme de médianes intervalles interquartiles (IQR) ou de fréquences (pourcentages) et comparées à l'aide du test t de Student pour données appariées (test de Wilcoxon pour les variables non gaussiennes ou test 2 de McNemar basé sur le statut cas-témoins, respectivement). Les associations entre biomarqueurs de l'endotoxémie et risque de maladie d'Alzheimer à 12 ans ont été évaluées à l'aide de modèles de régressions logistiques conditionnelles multivariables tenant compte du design cas-témoin niché et apparié en densité d'incidence. 102 Pour chaque individu i de la strate k (chaque strate étant composée d'un cas et de ses témoins), le modèle s'écrit : O yik 1 si un participant i appartenant à la strate k est un cas et yik 0 si un participant i appartenant à la strate k est un témoin, xkij est la valeur observée de la jème (j variant de 1 à p) variable explicative Xj pour le participant i appartenant à la strate k, et j (j variant de 1 à p) est le paramètre de régression associé à la variable Xj. Les variables Xj représentant les variables d'exposition principale et d'ajustement incluses dans le modèle. Le paramètre j a la même valeur pour toutes les strates (j ne dépend pas de k) et représente l'effet de la variable Xj sur le logit de P. Son exponentielle étant égale au rapport de cotes (RC) associé à la variable Xj. k (k variant de 1 à k) est le seul paramètre propre à la strate k. Sa valeur varie d'une strate à l'autre mais est la même pour tous les sujets i d'une même strate (ak ne dépend pas de i). Ce paramètre k représente ainsi tous les facteurs pour lesquels tous les sujets i de la strate k ont la même valeur, en particulier les variables d'appariement (par définition, chaque cas et ses témoins qui lui sont appariés ont la même valeur sur les variables d'appariement). C'est la raison pour laquelle on n'inclut pas les variables d'appariement individuelles comme variables d'ajustement dans le modèle de régression logistique conditionnel. Lorsque les témoins sont sélectionnés dans la cohorte en densité d'incidence, le RC obtenu dans l'étude cas-témoin est une estimation du rapport des taux d'incidence, également dénommé par abus de langage risque relatif (RR) . Les modèles ont été ajustés sur les covariables d'intérêt identifiées dans la littérature et tenant compte de la disponibilité des données dans notre étude. Le premier modèle a été ajusté sur le génotypage ApoE4, l'IMC et le score de multi-comorbidités (Modèle 1). Le second modèle a été ajusté sur les covariables du Modèle 1 ainsi que sur le nombre de médicaments par semaine et la prise d'anti-inflammatoires ou de corticoïdes (Modèle 2). Dans les Modèles 1 et 2, les biomarqueurs de l'endotoxémie et de l'inflammation ont été analysés séparément ; le dernier modèle étant ajusté sur les covariables du Modèle 2 et simultanément ajusté sur l'ensemble des biomarqueurs de l'endotoxémie (c. -à-d. , AG 3-OH, LBP et sCD14) et inflammatoire (c. -à-d. , IL-6) (Modèle 3). Suite à la recherche d'éventuelles données aberrantes sur les variables d'intérêt (c. -à-d. , AG 3-OH, LBP et sCD14), un participant présentant un taux d'AG 3-OH inférieur à 0 a été exclu des analyses spécifiques à cette variable d'exposition. Étant donné le design apparié et du fait que ce participant était un cas de maladie d'Alzheimer, les 2 témoins étant spécifiquement appariés à ce cas ont dû être également exclus de ces analyses, conduisant à un total de 3 participants exclus pour les analyses relatives aux AG 3-OH. Les données manquantes sur les covariables représentant moins de 4% de l'échantillon de l'étude, les valeurs 103 de la catégorie de référence pour les variables qualitatives ou de médiane pour les variables quantitatives ont été attribuées aux données manquantes. Les RC ajustés et les intervalles de confiance à 95% [IC 95%] ont été présentés. L'augmentation d'un écart-type des biomarqueurs de l'endotoxémie et de l'inflammation a été utilisée dans l'ensemble des analyses. Des analyses de sensibilité ont été réalisées : - (i) avec le ratio LBP : sCD14 et le risque de maladie d'Alzheimer, et - (ii) avec les terciles de distribution des biomarqueurs de l'endotoxémie et le risque de maladie d'Alzheimer. Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel SAS version 9. 4 (SAS Institute Inc. , Cary, 134 NC, USA). 5. 2. 2. Résultats 5. 2. 2. 1. Caractéristiques descriptives Les caractéristiques à l'inclusion des 636 participants selon le statut cas-témoin ont été décrites dans le Tableau 11. Les participants étaient âgés en moyenne de 76, 4 ans (range 66, 3 87, 0) et majoritairement (72%) représentés par des femmes. Près de 44% des participants avaient un faible niveau d'éducation. La durée moyenne de suivi était de 8, 6 ans (range 0, 76 13, 3) et l'âge moyen de diagnostic de maladie d'Alzheimer était de 82, 4 ans. Dans l'ensemble, les cas incidents de maladie d'Alzheimer ne différaient pas significativement des témoins en ce qui concerne les données médicales (c. -à-d. , IMC, présence de multi-comorbidités, diabète, hypertension, symptomatologie dépressive et antécédents cardio-vasculaires). Globalement, 9% des participants présentaient une symptomatologie dépressive, 11, 5% présentaient un diabète et 9, 3% un antécédent de maladies cardio-vasculaires. L'IMC moyen était de 26, 2 kg/m avec respectivement 33, 2% des cas d'Alzheimer et 39, 4% des témoins présentant un surpoids. Par ailleurs, les cas incidents de maladie d'Alzheimer consommaient davantage de médicaments à l'inclusion que les témoins (c. -à-d. , respectivement 5, 3 et 4, 5 médicaments par semaine) et étaient plus susceptibles de présenter un génotype ApoE-4 (c. -à-d. , 28, 4% des cas et 14, 4% des témoins). 104 Tableau 11. Caractéristiques à l'inclusion des participants selon le statut de maladie d'Alzheimer sur 12 ans de suivi, étude cas-témoin nichée dans la cohorte 3C-Bordeaux (n 636). Caractéristiques à l'inclusion maladie d'Alzheimer Cas incidents de Génotypage ApoE4 Indice de masse corporelle (kg/m) Corpulence faible (< 21) Corpulence normale (21-27) Surpoids (> 27) Multi-comorbidités 0 1 2 3 4 Diabète Antécédents cardio-vasculaires Hypertension Symptomatologie dépressive Hypercholestérolémie Consommation médicamenteuse < 5 5-9 (polymédication) > 9 (hyper-polymédication) Médicaments anti-inflammatoires (n 212) 60 (28, 4) 20 (9, 6) 119 (57, 2) 69 (33, 2) 24 (11, 3) 88 (41, 5) 67 (31, 6) 23 (10, 9) 10 (4, 7) 31 (15, 0) 23 (10, 9) 165 (77, 8) 25 (11, 9) 74 (34, 9) 85 (40, 1) 95 (44, 8) 32 (15, 1) 43 (20, 3) Témoins (n 424) 61 (14, 4) 27 (6, 4) 228 (54, 2) 166 (39, 4) 51 (12, 0) 193 (45, 5) 124 (29, 3) 48 (11, 3) 8 (1, 9) 41 (9, 8) 36 (8, 5) 334 (78, 8) 32 (7, 6) 152 (35, 9) 216 (51, 0) 177 (41, 7) 31 (7, 3) 66 (15, 7) p-value 0, 001 0, 092 0, 762 0, 199 0, 237 0, 708 0, 250 0, 835 0, 017 0, 553 Les valeurs représentent les médianes (IQR) ou effectifs (pourcentages). Abréviations : ApoE-4 Apolipoprotéine 4. 105 En ce qui concerne les taux médians circulants de marqueurs d'endotoxémie plasmatique, les taux de LBP à l'inclusion étaient significativement plus élevés chez les cas incidents de maladie d'Alzheimer que chez les témoins, alors que les taux d'AG 3-OH et de sCD14 à l'inclusion ne différaient pas selon le statut cas-témoin (Tableau 12). Les niveaux d'IL-6 étaient légèrement plus élevés chez les cas que chez les témoins, mais cette différence n'était pas statistiquement significative. Les coefficients de corrélation de Spearman entre les différents biomarqueurs de l'endotoxémie et de l'inflammation étaient : LBP et AG 3-OH r : 0, 01 (p-value 0, 76), LBP et sCD14 r : 0, 41 (p-value LBP et IL-6 r : 0, 22 ( AG 3-OH et sCD14 r : 0, 12 ( AG 3-OH et IL-6 r : 0, 14 (p-value et sCD14 et IL-6 r : 0, 20 (p-value Tableau 12. Taux plasmatiques d'acides gras 3-hydroxylés (AG 3-OH), Lipopolysaccharides-Binding Protein (LBP), forme soluble du Cluster of Differentitation-14 (sCD14) et d'Interleukin-6 (IL-6) selon le statut de maladie d'Alzheimer sur 12 ans de suivi, étude cas-témoin nichée dans la cohorte 3C-Bordeaux (n 636). Biomarqueurs Cas incidents de maladie d'Alzheimer (n 212) Témoins (n 424) p-value AG 3-OH (mol/mL) * 222, 9 99, 0 221, 9 87, 8 0, 844 LBP (g/mL) sCD14 (g/mL) IL-6 (g/mL) 35, 0 20, 3 30, 2 20, 6 3, 2 1, 6 3, 8 5, 5 3, 0 1, 8 3, 2 5, 6 0, 072 0, 179 Les valeurs représentent les médianes ranges interquartiles. * n 633. 5. 2. 2. 2. Association entre biomarqueurs de l'exposition aux endotoxines et risque de maladie d'Alzheimer Le Tableau 13 présente les résultats des analyses de régressions logistiques conditionnelles multivariables des associations entre les biomarqueurs de l'exposition plasmatique aux endotoxines, le biomarqueur de l'inflammation et le risque de maladie d'Alzheimer à 12 ans de suivi. L'augmentation d'un écart-type de LBP était associée à un sur-risque de plus de 30% de développer une maladie d'Alzheimer (RC [IC 95%] : 1, 33 [1, 10 ; 1, 60]) après ajustement sur le génotype ApoE4, l'IMC et le score de comorbidités (Modèle 1). Cette association persistait après ajustement sur la consommation médicamenteuse et les autres biomarqueurs d'endotoxémie et d'inflammation (c. -à-d. , AG 3-OH, sCD14 et IL-6) avec un RC de 1, 30 (IC 95% [1, 07 ; 1, 59]). 106 Aucune association n'a été mise en évidence entre l'augmentation d'un écart-type d'AG 3- OH (RC [IC 95%] : 0, 91 [0, 75 ; 1, 09]), de sCD14 (RC [IC 95%] : 0, 98 [0, 81 ; 1, 17]) ou d'Il-6 (RC [IC 95%] : 1, 09 |0, 93 ; 1, 29]) et le risque de maladie d'Alzheimer, dans le Modèle 2 (Tableau 13). 107 Tableau 13. Associations multivariables entre les taux plasmatiques d'acides gras 3-hydroxylés (AG 3-OH), de Lipopolysaccharides-Binding Protein (LBP), de la forme soluble du Cluster of Differentitation-14 (sCD14), de l'Interleukine-6 (IL-6) et le risque de développer une maladie d'Alzheimer sur 12 ans de suivi, étude cas-témoin nichée dans la cohorte 3C-Bordeaux (n 636). Modèle 1 Modèle 2 Modèle 3 Risque de maladie d'Alzheimer * Biomarqueurs RC [IC 95%] p-value RC [IC 95%] p-value RC [IC 95%] p-value AG 3-OH (mol/mL) * 0, 97 [0, 91 ; 1, 04] LBP (g/mL) sCD14 (g/mL) IL6 (pg/mL) 1, 33 [1, 10 ; 1, 60] 1, 09 [0, 92 ; 1, 28] 1, 09 [0, 92 ; 1, 29] 0, 378 0, 004 0, 316 0, 305 0, 91 [0, 96 ; 1, 09] 1, 29 [1, 07 ; 1, 57] 1, 06 [0, 89 ; 1, 25] 1, 10 [0, 93 ; 1, 31] 0, 323 0, 009 0, 537 0, 283 0, 91 [0, 75 ; 1, 09] 1, 30 [1, 07 ; 1, 59] 0, 98 [0, 81 ; 1, 17] 1, 09 [0, 93 ; 1, 29] 0, 285 0, 010 0, 787 0, 279 * Coefficient estimé pour l'augmentation d'un écart-type. * n 633 pour les modèles d'AG 3-OH. Les Modèles 1 et 2 ont été réalisés séparément pour chaque biomarqueur. Modèle 1 : ajusté sur le génotypage ApoE4, l'IMC et le score de multi-comorbidité. Modèle 2 : ajusté sur les covariables du Modèle 1 nombre de médicaments total et spécifique (anti-inflammatoires non stéroïdiens et corticoïdes) consommés par semaine. Modèle 3 : ajusté sur les covariables du Modèle 2 ajustement simultané sur AG 3-OH, LBP, sCD14 et IL-6 (n 633). Abréviations : AG 3-OH acides gras 3-hydroxylés ; LBP Lipopolysaccharides-Binding Protein ; sCD14 forme soluble du Cluster of Differentiation-14 ; IL-6 Interleukin-6 ; ApoE-4 Apolipoprotéine 4 ; IMC Indice de Masse Corporelle. 108 5. 2. 2. 3. Analyses de sensibilité Aucune association n'a été rapportée entre le ratio LBP : sCD14 et le risque de maladie d'Alzheimer (RC [IC 95%] : 1, 14 [0, 96 ; 1, 36], p-value 0, 143). Lorsque considérés en terciles, des taux élevés de LBP (c. -à-d. , dans le tercile supérieur de distribution comparativement au tercile inférieur) étaient associés à un sur-risque de maladie d'Alzheimer (RC [IC 95%] : 1, 83 [1, 16 ; 2, 91]) dans le Modèle 2 (Tableau 14). L'ajustement supplémentaire sur les AG 3-OH, le sCD14 et l'IL-6 n'a pas modifié la force de l'association (Modèle 3). Lorsque les AG 3-OH ou sCD14 ont été considérés en terciles, aucune association n'a été mise en évidence. 109 Tableau 14. Associations multivariables entre les taux plasmatiques de Lipopolysaccharides-Binding Protein (LBP), considérés en terciles, et le risque de développer une maladie d'Alzheimer sur 12 ans de suivi, étude cas-témoin nichée dans la cohorte 3C-Bordeaux (n 636). LBP (g/mL) Modèle 1 Modèle 2 Model 3 RC [IC 95%] p-value RC [IC 95%] p-value RC [IC 95%] p-value Risque de maladie d'Alzheimer Tercile 1 (< 24, 97) Tercile 2 (24, 97 - 39, 03) Tercile 3 (> 39, 03) 1, 00 [Référence] 1, 56 [1, 00 - 2, 44] 1, 97 [1, 25 - 3, 09] 0, 048 0, 003 0, 013 * 1, 00 [Référence] 1, 50 [0, 96 - 2, 34] 1, 83 [1, 16 - 2, 91] 0, 075 0, 010 0, 034 * 1, 00 [Référence] 1, 52 [0, 97 - 2, 37] 1, 87 [1, 15 - 3, 05] 0, 069 0, 012 0, 038 * * p-value globale. Modèle 1 : ajusté sur le génotypage ApoE4, IMC et le score de multi-comorbidité. Modèle 2 : ajusté sur les covariables du Modèle 1 nombre de médicaments total et spécifique (anti-inflammatoires non stéroïdiens et corticoïdes) consommés par semaine. Modèle 3 : ajusté sur les covariables du Modèle 2 ajustement simultané sur AG 3-OH, LBP, sCD14 et IL-6 (n 633). Abréviations : IMC Indice de Masse Corporelle ; ApoE-4 Apolipoprotéine 4. 110 Parallèlement, les associations entre les taux plasmatiques d'AG 3-OH et le risque de maladie d'Alzheimer et de démence toutes étiologies confondues ont été analysées de façon complémentaire au sein des participants du projet NutEnDem (c. -à-d. , le même projet que celui utilisé dans les analyses d'association entre profils alimentaires et taux d'AG 3-OH présentées dans le chapitre IV) disposant d'un suivi longitudinal de 17 ans pour le diagnostic de démence, et hors du design cas-témoin niché du projet EnIMA. Dans cette étude, seul le dosage des AG 3-OH était disponible (et non la LBP ou le sCD14). Le dosage des AG 3-OH ayant été réalisé de manière concomitante dans les projets EnIMA et NutEnDem, le choix de ce marqueur n'a donc pas été conditionné sur les résultats présentés préalablement dans le projet EnIMA (ci-dessus), mais a été déterminé selon les priorités, les financements disponibles et les besoins et collaborations entre membres de l'équipe. 5. 3. Méthodologie et résultats du projet NutEnDem 5. 3. 1. Méthodologie statistique La seconde analyse a été réalisée au sein du projet NutEnDem (préalablement décrit dans le chapitre 3. 3), portant sur un total de 698 participants disposant d'un suivi maximal de 17 ans après l'inclusion. 5. 3. 1. 1. Codage des covariables Les covariables à l'inclusion comprenaient (i) des caractéristiques sociodémographiques incluant le sexe et le niveau d'éducation (défini en 3 catégories : niveau inférieur à l'école primaire, intermédiaire, universitaire ou équivalent), (ii) le génotypage ApoE4, (iii) des données médicales incluant le diabète (c. -à-d. , diabète auto-déclaré ou glycémie à jeun 7 mmol/L ou glycémie non à jeun 11 mmol/L ou prise d'un traitement antidiabétique oral), l'hypertension (pression artérielle supérieure à 140/90 mmHg ou prise d'un traitement antihypertenseur), les antécédents cardiovasculaires (y compris l'infarctus du myocarde ou la chirurgie cardiaque et vasculaire ou l'artérite ou accident vasculaire cérébral), la symptomatologie dépressive (définie comme un score Center for Epidemiological Studies Depression Scale (CES-D) > 17 pour les hommes et > 23 pour les femmes (448), l'IMC (considéré en 3 catégories : insuffisance pondérale < 21 kg/m, corpulence normale 21-27 kg/m et surpoids ou obésité > 27 kg/m ; seuils adaptés aux personnes âgées (449), le nombre de médicaments consommés par semaine (classés en faible consommation (< 5 médicaments), polymédication (5 à 9 médicaments) ou hyper-polymédication (> 9 médicaments) et le nombre de médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens et/ou corticoïdes, (iv) le statut tabagique (considéré comme non-fumeur, ancien fumeur ou fumeur actuel), (v) des données biologiques incluant les taux de LDL, HDL et de 111 triglycérides, exprimés en mmol/L et enfin (vi) le score d'adhérence au régime Méditerranéen (range de 0 à 18, considéré comme une variable continu et tel que décrit dans le chapitre 4. 2. 1. 1). 5. 3. 1. 2. Analyses statistiques Les associations entre les taux circulants d'AG 3-OH et le risque de développer une démence ou une maladie d'Alzheimer ont été évaluées à l'aide d'un modèle à risques proportionnels de Cox à entrée retardée. Ce modèle permet de modéliser le risque instantané de survenue d'un évènement (ici, la démence ou la maladie d'Alzheimer) associée à l'exposition principale (ici, les taux d'AG 3-OH), tout en prenant en compte différents facteurs de confusion potentiels. Ce risque est exprimé par le Hazard Ratio ou risque relatif (RR). Le modèle s'écrit ainsi : Avec représentant la fonction de risque instantané au temps t pour le sujet i ayant les caractéristiques X1i, , Xpi. Le paramètre 0(t) correspond au risque instantané de base au temps t pour un sujet i dont toutes les valeurs des variables X seraient égales à 0. Les paramètres 1, , p sont les coefficients de régression quantifiant l'effet de chaque variable X sur le risque instantané d'évènement ajusté sur toutes les autres variables. L'âge a été choisi comme axe du temps, et une troncature à gauche a été réalisée sur l'âge à l'inclusion (correspondant à la date d'origine). Les cas prévalents de démence ont été exclus des analyses. L'âge au diagnostic de démence ou de maladie d'Alzheimer a été censuré par intervalles. Autrement dit, l'âge au diagnostic a été calculé comme étant l'âge moyen du participant entre la dernière visite de suivi sans démence et la visite de suivi à laquelle le diagnostic a été posé. Pour les participants ne présentant pas de démence incidence, les données ont été censurées à la date de la dernière visite de suivi. La médiane des taux circulants d'AG 3-OH a été utilisée dans les analyses, discriminant les participants présentant des taux inférieurs à la médiane d'échantillon de ceux présentant des taux supérieurs ou égaux à la médiane d'échantillon. L'hypothèse de proportionnalité des risques a été évaluée graphiquement selon la médiane des AG 3-OH. Les modèles ont été ajustés pour les covariables d'intérêt identifiées dans la littérature et tenant compte de la disponibilité des données dans notre étude. Le premier modèle a été ajusté sur le sexe, le niveau d'étude et le génotypage ApoE-4 (Modèle 1). Le second modèle a été ajusté sur les covariables du Modèle 1 ainsi que sur l'IMC, l'hypertension, le diabète, le profil lipidique (c. -à-d. , taux de LDL, HDL et de triglycérides), le statut tabagique, les antécédents de maladies cardio-vasculaires, la symptomatologie dépressive, le score d'adhérence au régime Méditerranéen, le nombre médicaments par semaine et la prise d'anti-inflammatoires ou de corticoïdes (Modèle 2). 112 Un total de 698 participants a été inclus dans les analyses d'association entre les taux circulants d'AG 3-OH et le risque de démence toutes étiologies confondues et un total de 674 participants a été inclus dans les analyses entre les taux circulants d'AG 3-OH et le risque de maladie d'Alzheimer de type probable, possible ou mixte, excluant dans cette analyse spécifique les participants présentant d'autres types de démences incidentes (n 24). 5. 3. 2. Résultats 5. 3. 2. 1. Caractéristiques descriptives Les caractéristiques à l'inclusion des participants du projet NutEnDem ont été préalablement décrites dans le tableau 5 (voir chapitre 4. 3. 1). Parmi les 698 participants, 162 (soit 23, 2%) ont développé une démence incidente toutes étiologies confondues au cours des 17 ans de suivi (suivi moyen 13, 0 3, 9 ans), avec un âge moyen au diagnostic de 84, 9 ans ( 5, 3 ans). Plus spécifiquement, 138 (soit 19, 8%) participants ont développé une maladie d'Alzheimer de type probable, possible ou mixte, 14 participants (soit 2, 0%) ont développés une démence de type vasculaire, 2 participants ont développés une démence de type Parkinson, 1 participant a développé une démence à corps de Lewy et 7 participants ont développés un autre type de démence ou une démence inclassable. La médiane d'AG 3-OH était de 253, 3 mol/mL (range interquartile : 104, 2 mol/mL) à l'inclusion chez l'ensemble des participants. Dans l'ensemble, des taux significativement plus faibles d'AG 3-OH à l'inclusion étaient observés chez les cas incidents de démence (médiane 242 mol/mL, range interquartile : 97, 3 mol/mL) ou de maladie d'Alzheimer (médiane 239, 7 mol/mL, range interquartile : 105, 0 mol/mL) comparé aux participants ne développant pas de démence dans les 17 ans de suivi (médiane 260, 3 mol/mL, range interquartile 103, 6 mol/mL). Parmi les participants présentant des taux d'AG 3-OH supérieurs à la médiane, 19, 2% étaient des cas incidents de démence toutes étiologies confondues et 16, 8% des cas incidents de maladie d'Alzheimer (Tableau 15). Tableau 15. Distribution des cas incidents de démence toutes étiologies confondues (n total 698) et de maladie d'Alzheimer (n total 674) selon la médiane d'AG 3-OH. Cas incidents Cas incidents de démence (toutes étiologies confondues) Cas incidents de maladie d'Alzheimer AG 3-OH (mol/mL) < médiane (< 253, 3) médiane ( 253, 3) 95 (27, 2) 81 (24, 2) 67 (19, 2) 57 (16, 8) Les valeurs représentent les effectifs (pourcentage). Abréviation : AG 3-OH acides gras 3-hydroxylés. 113 5. 3. 2. 2. Association entre biomarqueurs de l'exposition aux endotoxines et risque de démence ou de maladie d'Alzheimer Le Tableau 16 présente les résultats des analyses multivariables entre les taux circulants d'AG 3-OH et le risque de démence toutes étiologies confondues ou de maladie d'Alzheimer. Dans l'ensemble, aucune association n'a été rapportée entre des taux élevés d'AG 3-OH (c. -à-d. , supérieurs à la médiane de distribution) et le risque de démence (RR [IC 95%] : 0, 80 [0, 58 ; 1, 11], Modèle 2) ou de maladie d'Alzheimer (RR [IC 95%] : 0, 81 [0, 56 ; 1, 15], Modèle 2) sur une période de suivi de 17 ans comparativement à des taux faibles d'AG 3-OH. 114 Tableau 16. Associations multivariables entre les taux d'acides gras 3-hydroxylés et le risque de maladie d'Alzheimer ou de démence toutes étiologies confondues sur 17 ans de suivi. Biomarqueur AG 3-OH (mol/mL) < médiane (< 253, 3) médiane ( 253, 3) Risque de démence toutes étiologies confondues Risque de maladie d'Alzheimer * Modèle 1 Modèle 2 Modèle 1 Modèle 2 RR [IC 95%] p-value RR [IC 95%] p-value RR [IC 95%] p-value RR [IC 95%] p-value 1, 00 [Référence] 0, 82 [0, 60 ; 1, 14] 0, 235 1, 00 [Référence] 0, 80 [0, 58 ; 1, 11] 0, 183 1, 00 [Référence] 0, 82 [0, 58 ; 1, 17] 0, 278 1, 00 [Référence] 0, 81 [0, 56 ; 1, 15] 0, 234 * n 674 participants pour le risque de maladie d'Alzheimer. Modèle 1 ajusté sur le sexe, le niveau d'étude et le génotypage ApoE4. Modèle 2 ajusté sur les covariables du Modèle 1 le statut tabagique, l'IMC, l'hypertension, le diabète, la symptomatologie dépressive, HDL, LDL, triglycérides, antécédents cardiovasculaires, nombre de médicaments total par semaine et médicaments anti-inflammatoires et score d'adhérence au régime Méditerranéen. Abréviations : IMC Indice de Masse Corporelle ; ApoE-4 Apolipoprotéine 4. 115 5. 4. Discussion Au sein de 2 larges études complémentaires de design longitudinal, les résultats obtenus ne mettent en évidence aucune association entre les taux d'AG 3-OH mesurés à l'inclusion et le risque de démence toutes étiologies confondues ou le risque de maladie d'Alzheimer, plus d'une décennie après. Étant donné la faible littérature sur les relations entre biomarqueurs de l'endotoxémie, et en particulier les AG 3-OH, et syndrome démentiel, la comparaison de la présente étude avec la littérature scientifique est limitée. Le résultat le plus proche provient de l'étude de Zhang et collaborateurs (396) qui ont observé des niveaux de LPS en moyenne 3 fois plus élevés chez des patients présentant une maladie d'Alzheimer comparativement à des témoins indemnes de la maladie (61 42 pg/mL versus 21 6 pg/mL, respectivement), suggérant une possible implication de l'endotoxémie dans les processus pathologiques de la maladie d'Alzheimer. A noter cependant que dans cette étude, le nombre de patients était limité (n 18) et probablement atteints de formes sévères de maladie d'Alzheimer, puisqu'issus d'une clinique spécialisée sur la mémoire. D'autre part, le design transversal de l'étude ne permet pas d'écarter l'hypothèse d'une relation de causalité inverse c'est-à-dire que ce soit la maladie qui puisse être responsable de l'augmentation des taux circulants d'endotoxines et non l'inverse. En effet, du fait du caractère progressif et irréversible de la maladie d'Alzheimer, celle-ci peut mener dans les stades les plus sévères à une perte de l'état de conscience de soi, une détérioration de l'hygiène due à l'installation d'un état de dépendance ou encore à une prise de risque accrue (ex. coupures, chutes, infections) ; autant de facteurs qui pourraient favoriser une exposition aux endotoxines exacerbée chez ces personnes fragilisées. Par ailleurs, alors que la méthode de dosage utilisée dans notre étude permet une quantification totale (formes active et inactive) des endotoxines circulantes, seule la fraction biologiquement active des LPS, mesurée par LAL, a été dosée dans l'étude de Zhang et son équipe (396). Or, ce dosage est susceptible d'induire des faux positifs ou négatifs notamment en cas de neutralisation des endotoxines par les lipoprotéines. Bien que le dosage classique par LAL n'ait pas pu être réalisé dans notre échantillon d'étude du fait qu'il requiert des conditions de prélèvements spécifiques n'ayant pas été prévues lors de la visite de prélèvement sanguin à l'inclusion (c. -à-d. , en 1999-2000), la combinaison de ces 2 méthodes de dosages (c. -à-d. , LAL et LC-MS/MS) dans les recherches futures pourrait permettre d'estimer d'une part le potentiel immunostimulant de l'ensemble des endotoxines plasmatiques et d'autre part le degré de neutralisation, pouvant différer d'un individu à l'autre. A noter également qu'au-delà de ces paramètres, le potentiel inflammatoire est également souche-dépendant. En effet, il a été rapporté que l'activité toxique des LPS de Bacteroidetes fragilis serait 100 à 1000 fois plus faible que celle des LPS de la famille Enterobacteriaceae (ex. Escherichia coli) ou Desulfovibrionaceae, mais n'en demeurant pas moins de puissants stimulateurs du système immunitaire inné (469, 470). Contrairement aux taux d'AG 3-OH, des taux plus élevés de LBP à l'inclusion étaient associés à un sur-risque de développer une maladie d'Alzheimer dans les 12 ans, indépendamment de nombreux facteurs de confusion dont l'IL-6. Étant donné le rôle crucial de la LBP dans l'initiation de la réponse immunitaire et inflammatoire face aux endotoxines, celle-ci est 116 considérée comme un biomarqueur cliniquement pertinent de l'exposition cellulaire effective des endotoxines. Plusieurs études ont en effet démontré le rôle critique de la LBP dans la réponse pro-inflammatoire liée aux endotoxines (471). Nos résultats suggéreraient que la qualité des endotoxines circulantes, et en particulier leur potentiel immunostimulant, serait d'autant plus importante que la quantité circulante dans la pathologie d'Alzheimer. Les taux de LBP observés dans notre étude, de l'ordre de 30-35 g/mL, apparaissent plus élevés que chez des participants sains (c. -à-d. , de l'ordre de 7 à 20 g/mL (306, 307). Ces valeurs s'approcheraient de celles observées dans le cas d'obésité ou de syndrome de réponse inflammatoire systémique (SIRS) (307, 314) tout en restant en deçà des valeurs observées dans les cas de bactériémies (c. -à-d. , 101, 4 g/mL en moyenne (311). Ainsi, les valeurs de LBP observées au sein des participants de cette présente étude laisseraient suggérer un état inflammatoire de bas grade. Confortant l'hypothèse d'un potentiel rôle de l'endotoxémie dans la santé cognitive, une précédente étude menée auprès de 44 adultes a notamment mis en évidence que des niveaux plus élevés de LBP étaient associés à une altération de l'intégrité de la substance blanche et des performances cognitives (mémoire de travail et mémoire verbale) indépendamment de l'âge, du biomarqueur inflammatoire CRP ou encore de l'IMC (314). Des taux élevés de LBP (c. -à- d. , dans le quartile supérieur de distribution comparativement au quartile inférieur) ont également été associés à de plus faibles performances d'attention et de la vitesse de réponse lors d'un test de reconnaissance de stimuli cibles et non-cibles auprès de 51 femmes âgées de 53 ans en moyenne (402). Toutefois, une récente étude n'a pas rapporté de différence entre les niveaux circulants de LBP chez des participants présentant une maladie d'Alzheimer, atteints de troubles cognitifs légers ou cognitivement sains (406). Alors que de très faibles doses de LPS sont capables d'activer le système immunitaire et d'initier une réponse périphérique et centrale, la pertinence clinique de la différence de LBP observée entre les cas et les témoins dans notre étude doit être discutée. En l'absence de seuil établi permettant de discriminer des niveaux de LBP considérés comme pathologiques de ceux considérés comme physiologiques, en particulier pour les personnes âgées, les analyses de sensibilité effectuées dans notre étude (c. -à-d. , avec les terciles de LBP) ont suggéré un effet dose-réponse entre les niveaux de LBP à l'inclusion et le risque de survenue d'une maladie d'Alzheimer. Des études complémentaires, notamment chez les personnes âgées, sont nécessaires afin de tirer une conclusion définitive et de proposer un seuil cliniquement pertinent de LBP. Enfin, une dysbiose du microbiote intestinal a été observée chez les patients atteints de maladie d'Alzheimer comparativement à des sujets témoins, qui pourrait moduler partiellement le caractère pro-inflammatoire des endotoxines et expliquer certains de nos résultats (296, 299, 472). Par ailleurs, il est de plus en plus évoqué que la maladie d'Alzheimer pourrait s'initier dans l'intestin et serait étroitement liée au déséquilibre du microbiote intestinal (473). Contrairement à la LBP, aucune association n'a été observée entre les taux plasmatiques de sCD14 et le risque de maladie d'Alzheimer dans cette présente étude ; des résultant allant à l'encontre d'une étude plus récente, portant sur plus de 4700 participants âgés d'environ 70 ans et issus de 2 cohortes Européennes, rapportant que l'augmentation d'un écart-type de sCD14 117 était associée à une plus forte atrophie cérébrale, à un déclin cognitif accéléré ainsi qu'un risque accru de 12% de développer une démence incidente dans les années ultérieures (en moyenne de 6 à 10 ans selon la cohorte), indépendamment de l'âge, du sexe, du génotype ApoE-4 et de facteurs de risques vasculaires (474). Toutefois, les taux de sCD14 rapportés dans cette étude étaient très hétérogènes entre les 2 cohortes (c. -à-d. , taux médians de sCD14 : 16, 6 ng/mL (Q1 - Q3 : 14, 5 19, 2 ng/mL) dans la cohorte Framingham Heart Study et de 1, 6 ng/mL (Q1 - Q3 : 1, 4 1, 8 ng/mL) dans la cohorte Cardiovascular Health Study) ; des taux qui apparaissaient largement inférieurs à ceux de la littérature actuelle (de l'ordre du g/mL). Une possible explication proviendrait de la différence de méthode de quantification utilisée (c. -à-d. , test multiplex à base de billes Luminex (Austin, TX) contrairement au dosage classique par méthode Elisa). Étant donné l'absence d'autres marqueurs inflammatoires dans cette étude, il est difficile de juger si les cas incidents de démence présentaient un état inflammatoire exacerbé à l'inclusion contrairement aux sujets indemnes de démence. L'étude concomitante du mCD14, complémentaire à celle du sCD14, pourrait permettre d'évaluer l'exposition globale au CD14 ; cependant, cette mesure n'était pas disponible dans notre étude. En ce qui concerne le marqueur inflammatoire IL-6, aucune association n'a été observée entre les niveaux à l'inclusion et le risque de maladie d'Alzheimer dans notre échantillon ; un résultat qui apparat partiellement en désaccord avec la littérature actuelle. En effet, alors que la plupart des études ont rapporté qu'une élévation des taux d'IL-6 était associée au risque de développer une maladie d'Alzheimer (198, 203, 475477), d'autres travaux dont une récente méta-analyse ne rapportent aucune association (211, 212, 478) voire seulement une association avec la forme précoce de la maladie d'Alzheimer, survenant avant 65 ans (479). Des résultats globalement inconsistants mettant en lumière la complexité des relations entre mécanismes inflammatoires et maladie d'Alzheimer et la nécessité de poursuivre les investigations sur la problématique de l'inflammation dans la maladie d'Alzheimer, depuis les sources d'inflammation potentielles jusqu'à la mise en place des processus inflammatoires mis en évidence par les niveaux de cytokines pro-inflammatoires. Étant donné que la production d'IL-6 résulte en partie des voies de signalisation induites par les endotoxines, nous nous attendions à observer des niveaux d'IL-6 plus élevés chez les cas incidents de maladie d'Alzheimer à l'instar des taux de LBP. Du fait que la demi-vie de la LBP est plus élevée (12 à 24h) que celle de l'IL-6 (4 à 6h), ces résultats pourraient suggérer l'implication de facteurs environnementaux tel que l'alimentation, augmentant seulement transitoirement l'endotoxémie plasmatique et l'inflammation associée dans la période postprandiale (333, 480). Les échantillons sanguins étant obtenus après un jeûne d'une nuit, cette période de jeun pourrait avoir influencée les niveaux de l'IL-6 à la baisse contrairement aux niveaux de LBP demeurant élevés plus d'une dizaine d'heures après. Toutefois inhérent à une quantité importante de données nutritionnelles manquantes (c. -à-d. , plus de 30% de l'échantillon dans le projet spécifique EnIMA), l'hypothèse de l'alimentation n'a pas pu être spécifiquement testée dans les analyses d'association avec la LBP due à un manque de puissance statistique, toutefois l'ajustement sur le score d'adhérence au régime Méditerranéen 118 ne changeait pas l'association avec les AG 3-OH. Par ailleurs, le stockage à -80C pendant plusieurs années a pu altérer la stabilité de ce biomarqueurs (440). Alors que ces études s'inscrivent dans les prémices de l'hypothèse de l'exposition aux endotoxines dans la pathogenèse du syndrome démentiel, certaines limites doivent être soulignées. La limite majeure provient de la mesure unique des biomarqueurs à l'inclusion ne permettant pas de refléter d'éventuelles variations dans l'exposition aux endotoxines sur le long terme. Citronberg et collaborateurs (481) ont fourni des informations sur la fiabilité temporelle satisfaisante de la LBP plasmatique à moyen terme, sur plusieurs mois ; cependant la pertinence et la variation sur plusieurs années reste inconnue. Dans le cas o les mesures de LBP seraient impactées après plusieurs années de congélation, on pourrait toutefois s'attendre à un biais non différentiel (c. -à-d. , une variation de la même importance) entre les cas et les témoins, n'impactant donc pas les mesures d'associations observées dans cette présente étude. Par ailleurs, un seul marqueur de l'inflammation a pu être utilisé dans notre étude. Un autre marqueur inflammatoire, le TNF, a été considéré et mesuré mais ses taux étant inférieurs à la limite de détection du kit ELISA, ce biomarqueur n'a donc pas pu être analysé dans la présente étude. Enfin, en raison d'une multitude de molécules LPS dont les effets biologiques diffèrent selon leur structure, les taux d'AG 3-OH évalués par LC-MS/MS (quantification totale des formes actives et inactives) ne permettent pas d'estimer le potentiel immunostimulant des endotoxines. Cependant, alors que la fraction biologiquement active diminue rapidement suite à une exposition aigu aux LPS, les taux d'AG 3-OH restent stables dans le temps et pourraient ainsi représenter un biomarqueur de l'exposition aux endotoxines à plus long terme (330, 331). Les atouts évidents de ces études reposent notamment sur leur conception longitudinale avec un suivi de plus d'une décennie, minimisant les risques de causalité inverse - sans toutefois pouvoir les annihiler entièrement - la taille importante des échantillons d'études et la prise en considération d'un large panel de facteurs socio-économiques, cliniques, biologiques et de mode de vie dans les analyses contribuant à limiter les biais de confusion potentiels. Par ailleurs, le diagnostic de démence ou de maladie d'Alzheimer étant activement recherché et selon une méthodologie commune aux études et tout au long des suivis, cela a permis de limiter considérablement le biais d'information inhérent aux diagnostics. Conclusion Alors qu'aucune association n'a été mise en évidence entre les taux plasmatiques d'AG 3-OH à l'inclusion, reflet de la quantité totale en endotoxines, et le risque de survenue d'une maladie d'Alzheimer, des taux plasmatiques plus élevés de LBP, reflet de l'activation du système immunitaire en réponse aux endotoxines, étaient associés à un sur-risque de maladie d'Alzheimer plus d'une décennie après. Ces résultats suggèreraient l'implication des voies de l'endotoxémie dans la pathogenèse de la maladie d'Alzheimer, dont les mécanismes complexes mériteraient une plus large investigation. 119 Les résultats du projet EnIMA ont été valorisés lors de congrès Européens et internationaux (voir partie valorisation scientifique) et sous la forme d'un article scientifique (excepté pour les analyses relatives aux acides gras 3-hydroxylés dont les données n'étaient pas encore disponibles au moment de la rédaction et de la soumission de l'article). Cet article a été publié dans Journal of Alzheimer's Disease en 2019 : André P, Samieri C, Buisson C, Dartigues JF, Helmer C, Laugerette F, Féart C. Lipopolysaccharide-Binding Protein, Soluble CD14, and the Long-Term Risk of Alzheimer's Disease : A Nested Case-Control Pilot Study of Older Community Dwellers from the Three- City Cohort. J Alzheimers Dis. 2019 ; 71(3) : 751-761. DOI : 0. 3233/JAD-190295 (Annexe 7). Les autres résultats présentés dans ces travaux de thèse feront l'objet d'une valorisation ultérieure. 120 CHAPITRE VI. DISCUSSION GÉNÉRALE ET PERSPECTIVES D'après le rapport mondial Alzheimer 2019 (482), deux personnes sur trois pensent que la démence est la résultante d'un vieillissement normal et une personne sur quatre estime qu'il n'y a rien que l'on puisse faire pour prévenir la démence ; un constat qui met en exergue le fait que les messages de santé publique sur la réduction des risques ne parviennent pas à toucher l'ensemble de la population (483). Une stratégie de plus en plus considérée serait de placer les personnes au cœur de leur santé, de leur prise en charge et du système de santé à plus large échelle, pour qu'elles puissent disposer de l'ensemble des connaissances scientifiques - vulgarisées - leur permettant de faire des choix éclairés pour leur santé, y compris cérébrale, tout au long de la vie. L'étiologie de la maladie d'Alzheimer étant multifactorielle, nombreux sont les leviers d'action potentiels permettant de limiter la survenue ou la progression de la maladie. Bien que les mécanismes sous-jacents de la pathogenèse de la maladie restent peu élucidés, leur compréhension pourrait permettre d'apporter des arguments supplémentaires visant à appuyer des recommandations efficientes pour maintenir une bonne santé cérébrale dans un modèle d'exposition vie-entière. En ce sens, ces travaux de thèse ont été menés afin d'approfondir les connaissances d'une part de l'influence de l'alimentation dans l'exposition aux endotoxines, ces dernières étant considérées comme de puissants facteurs pro-inflammatoires, et d'autre part du rôle de l'exposition aux endotoxines dans le cadre du vieillissement cognitif pathologique de la maladie d'Alzheimer. Let food be thy medicine and medicine be thy food Cet adage souvent cité d'Hippocrate, traditionnellement considéré comme le père de la médecine , et datant d'il y a plus de deux mille ans pourrait être toujours aussi pertinent aujourd'hui, à une époque o l'on devient de plus en plus conscient de l'importance de l'alimentation pour maintenir la santé. Toutefois, appliqué à la santé cérébrale, l'intérêt de l'alimentation reste encore largement sous-estimé. Pourtant, de par ses effets pléiotropiques la rendant théoriquement capable d'agir sur de multiples composantes à la fois périphériques et centrales de l'organisme, l'alimentation apparait comme un facteur contrôlable prometteur dans des perspectives préventives voire même thérapeutiques visant à retarder la sénescence et l'apparition de maladies, dont la démence. 121 Apportant pas moins de 25 000 composés, la complexité de l'alimentation ne peut toutefois se résumer à une approche visant à étudier les nutriments ou les aliments de manière isolée. À cet effet, ces dernières décennies ont été marquées par l'émergence de l'approche par profils alimentaires, qui peuvent être définis selon deux types d'approches. D'une part, l'approche dite confirmatoire consistant à évaluer l'adhérence à un régime alimentaire a priori basé sur les connaissances scientifiques actuelles, et d'autre part, l'approche plus exploratoire permettant de prendre en compte une plus large diversité des apports alimentaires. En s'appuyant sur cette double approche de l'exposition alimentaire, ces travaux de thèse suggèrent qu'une alimentation riche en produits d'origine végétale pourrait contribuer à maintenir un environnement systémique favorable en ciblant l'endotoxémie comme source substantielle d'inflammation. Loin de stigmatiser un aliment préjudiciable ou bénéfique en particulier, ces travaux mettent en exergue l'importance de l'effet matrice de l'alimentation et inciteraient plutôt à favoriser la transition d'une alimentation de type pro-obésogène (notamment riche en lipides saturés, sucres raffinés et alcool) vers une alimentation plus saine et diversifiée, riche en fibres et en lipides polyinsaturés (principalement apportés par les poissons gras), dans le but de limiter l'émergence ou le maintien d'un état inflammatoire de bas grade. Il convient cependant de noter que les retombées de ces travaux en termes de santé publique ne sont pas immédiates ; l'approche du lien entre alimentation et biomarqueur de l'endotoxémie s'inscrivant dans une démarche exploratoire visant à améliorer les connaissances scientifiques. Néanmoins nos résultats apportent des preuves supplémentaires de l'importance de l'alimentation notamment chez les personnes âgées, davantage sujettes aux complications liées à l'inflamm'aging. Étant donné que l'état postprandial représente une condition stressante dans laquelle notre société actuelle passe la plupart de son temps, la portée de ces travaux, sous réserve de réplication, pourrait s'étendre au-delà de la population âgée. Si l'on suppose que l'apport en termes de bénéfices puisse être d'autant plus important que l'intervention est menée précocement dans la vie, l'identification d'un régime alimentaire adapté à l'individu (ex. tenant compte de ses préférences, de la présence éventuelle de comorbidité voire même de son microbiote intestinal) et associé à un moindre profil pro-inflammatoire représente une opportunité prometteuse pour de futures recherches axées sur le large panel que représente les maladies métaboliques ou chroniques à composante inflammatoire. Dans ce contexte, l'utilisation de profil alimentaire basé selon une approche a priori dans ces travaux de thèse, et dont les seuils de consommation ne sont pas dépendants de la population d'étude, favorisera la reproductibilité et la comparabilité de futures études avec la nôtre dans un objectif commun d'améliorer les connaissances dans ce domaine émergeant. Ces résultats sont également à intégrer dans un contexte d'évolution constante des tendances alimentaires qui accompagne les transitions technologiques, scientifiques, sociologiques, économiques mais aussi culturelles de notre société. La tendance à l'industrialisation des repas et au prêt-à-consommer, la prise de compléments alimentaires, de pro- et prébiotiques, ou encore l'émergence croissante de pratiques alimentaires limitant (fléxitarisme) ou excluant la consommation de chair animale (végétarisme) voire de tous produits d'origine animale (véganisme), sont susceptibles d'entrainer des changements majeurs dans la santé dans les 122 prochaines décennies. À l'interface entre les facteurs environnementaux (et en particulier l'alimentation) et la santé, la recherche sur le microbiote intestinal est en plein essor et pourrait offrir de nouvelles possibilités prometteuses dans un contexte de médecine personnalisée. Pour n'en citer qu'un exemple, chez les personnes végétariennes ou véganes, l'apport élevé en fibres provenant de la consommation accrue de produits d'origine végétale résulterait en l'augmentation de la production d'AGCC par les bactéries commensales ayant pour conséquence de réduire le pH local (484). Or, la réduction d'une unité de pH (de 6, 5 à 5, 5) contribuerait à prévenir le développement d'une flore pathogène (ex. Escherichia coli et autres bactéries de la famille Enterobacteriaceae) (485). Toutefois, il convient de rappeler qu'une alimentation riche en produits d'origine végétale n'est pas forcément synonyme de qualité nutritionnelle (ex. mode de cuisson, transformation industrielle), renforçant la complexité de l'évaluation de l'exposition alimentaire (486). En ce sens, les recommandations de santé publique actuelles, au-delà de promouvoir une alimentation équilibrée et la pratique d'une activité physique régulière, encouragent le fait-maison , la consommation de produits peu voire non-transformés, issus de l'agriculture biologique ou de productivités locales. Alors que l'évaluation de l'exposition alimentaire peut être soumise à un biais de mémorisation ou de désirabilité sociale (c. -à-d. , omission ou réponse erronée en vue de projeter une image valorisante de soi se ramenant à des normes sociales), l'approche non-ciblée de type métabolomique (c. -à-d. , l'identification et la quantification non-ciblées de tous les métabolites dérivés de la digestion et de la biotransformation des aliments et de leurs constituants, présents dans un échantillon biologique) (487, 488) pourrait être envisagée comme une perspective à moyen terme de ces travaux de thèse dans l'identification de profils multi-nutriments ou dérivés de l'exposome alimentaire en association avec une plus faible endotoxémie. Les graines d'un vieillissement en bonne santé se sèment tôt (Kofi Annan, 2001, Assemblée mondiale sur le vieillissement) Bien que les endotoxines émergent en tant que facteur préjudiciable dans de nombreuses et diverses pathologies, il existe un réel besoin de recherche pour comprendre dans quelle mesure l'exposition aux endotoxines pourrait impacter le système nerveux central sur le long terme et contribuer à la pathogenèse ou la progression de la maladie d'Alzheimer. Dans ce contexte, ces travaux de thèse apportent des premiers éléments de réponse en suggérant que l'activation du système immunitaire en réponse aux endotoxines pourrait représenter une composante non négligeable dans la pathogenèse de la maladie d'Alzheimer, sur laquelle il serait possible d'agir en amont (notamment par l'alimentation). Par ailleurs, nos travaux soutiendraient que le potentiel immunostimulant (estimé par la LBP), plus que la quantité en elle-même d'endotoxines (estimée par les AG 3-OH), s'avèrerait davantage préjudiciable dans cette maladie neurodégénérative. Toutefois, ces résultats seraient à confirmer dans d'autres études. Une perspective à court-terme de ce projet de thèse est d'évaluer l'impact des niveaux de biomarqueurs de l'endotoxémie à l'inclusion sur le déclin cognitif, qu'il soit d'origine 123 pathologique ou non, et l'évolution de biomarqueurs de l'atrophie cérébrale. En effet, les dommages neurologiques, et le déclin des performances cognitives qu'ils suscitent, peuvent débuter précocement dans le vieillissement, bien que plus présents à un âge avancé, et impacter différents domaines cognitifs aspécifiques de la maladie d'Alzheimer. Ils apparaissent généralement concomitants à une qualité de vie défavorable, impactant les activités de la vie quotidienne ou encore la prise de décision. En l'absence de seuil considéré comme préjudiciable ou pathologique, la répétition de mesures de biomarqueurs de l'endotoxémie au cours du temps permettrait de mieux modéliser l'exposition chronique aux endotoxines ; l'évolution chez une personne prévalant, d'un point de vue clinique, sur une mesure d'exposition unique qui serait dans le spectre normal ou pathologique de valeurs. Par ailleurs, l'origine des endotoxines étant multifactorielle, les biomarqueurs dont on dispose aujourd'hui ne permettent pas de faire la part entre l'endotoxémie issue du microbiote intestinal, et influencée par l'alimentation, de l'endotoxémie induite par la dissémination à partir d'un foyer infectieux insidieux. En conséquence, l'hypothèse d'une relation de causalité inverse ne peut être exclue malgré l'utilisation d'études au design longitudinal ; les personnes âgées et notamment celles en phase préclinique de la démence étant davantage susceptibles de présenter des infections bactériennes. En réalité, il s'agit probablement d'un mix entre causalité vraie et causalité inverse, mais nos résultats étant basés sur des études de cohortes observationnelles, aucune conclusion définitive sur la causalité ne peut être établie. En théorie, seules les études d'intervention permettent de répondre aux préoccupations de causalité. Classiquement mises en œuvre pour évaluer les effets individuels d'une intervention dans un cadre strict (c. -à-d. , étude contrôlée, randomisée et généralement en double insu), elles s'avèrent difficiles à mettre en place dans le domaine de la démence, nécessitant une évaluation de l'intervention sur le très long terme (c. -à-d. , plusieurs années voire dizaines d'années avant de mettre en évidence un potentiel bénéfice) qui peut être onéreuse et peu réalisable (ex. perte de vue des participants, données manquantes, difficulté de suivre l'observance à l'intervention). Le recours aux études longitudinales s'avère donc aujourd'hui essentiel pour améliorer la compréhension des processus sous-jacents à la maladie d'Alzheimer. Enfin, l'intégration de l'épidémiologie qualitative à l'épidémiologie quantitative mérite à mon sens d'être plus largement considérée. Du latin patiens signifiant celui qui endure ou celui qui souffre , la médecine du XXIème siècle, ou médecine 5P (préventive, prédictive, participative, personnalisée, et des preuves) se veut de placer le patient en tant qu'acteur clé de sa santé et non plus comme un acteur passif. En effet, lorsqu'il est question d'apporter des preuves scientifiques permettant de formuler des recommandations auprès des décideurs politiques, l'apport du patient, de ses besoins ou de ses préférences est encore trop souvent considéré comme ayant peu de valeur (489). 124 Conclusion générale Alors que de plus en plus d'arguments sont en faveur d'un rôle majeur de l'alimentation dans la qualité du vieillissement cérébral, les mécanismes sous-jacents restent peu compris. Par une approche épidémiologique et exploratoire, ces travaux de thèse contribuent à étayer les connaissances liant l'alimentation, l'exposition aux endotoxines et le vieillissement cérébral pathologique de la maladie d'Alzheimer ; des résultats qui doivent s'intégrer dans une vision holistique de la santé, selon laquelle l'Homme doit être considéré comme un tout, interagissant tout au long de la vie avec son environnement. Une relation bidirectionnelle qui contribuera à façonner la qualité du vieillissement. Un état de complet bien-être physique, mental et social, [qui] ne consiste pas seulement en une absence de maladie ou d'infirmité , définition de la santé, OMS. 125 RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. Alzheimer's Disease International (ADI). World Alzheimer Report 2018 - The state of the art of dementia research : New frontiers. Londres : Alzheimer's Disease International (ADI) ; septembre 2018. 2. Vieillir en restant actif : cadre d'orientation. Genève, Organisation mondiale de la santé, 2002 ( 3. American Psychiatric Association. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders : DSM-IV. Washington DC : American Psychiatric Association ; 1994. 4. Schneider JA, Arvanitakis Z, Bang W, Bennett DA. Mixed brain pathologies account for most dementia cases in community-dwelling older persons. Neurology. 2007 Dec 11 ; 69(24) : 2197204. 5. Iturria-Medina Y, Sotero RC, Toussaint PJ, Mateos-Pérez JM, Evans AC, Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative. 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Critères diagnostiques de la démence de type Alzheimer du DSM-IV-TR (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th edition, Text Revision), American Psychiatric Association 2000. 162 ANNEXE 2 Annexe 2 Critères diagnostiques de la maladie d'Alzheimer, NINCDS-ADRDA (National Institute for the Neurological and Communication Disorders and Stroke - Alzheimer's Disease and Related Diseases Association), McKhann 1984. 163 ANNEXE 3 Annexe 3 Metabolic endotoxemia : a potential underlying mechanism of the relationship between dietary fat intake and risk for cognitive impairments in humans ? 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 ANNEXE 4 Annexe 4 Évaluation de l'état nutritionnel par le Mini Nutritional Assessment (MNA). 188 ANNEXE 5 Annexe 5 Profils alimentaires, réalisés séparément chez les hommes et chez les femmes, et taux circulants d'acides gras 3-hydroxylés (AG 3-OH). Caractéristiques descriptives selon le sexe Dans l'ensemble, par rapport aux femmes (n 432), les hommes (n 266) étaient plus susceptibles de présenter un surpoids (42, 5% contre 38, 2% pour les femmes), un diabète (12, 4% contre 3, 9% pour les femmes) et des antécédents de maladies cardiovasculaires (11, 3% contre 5, 8% pour les femmes). En revanche, les femmes consommaient davantage de médicaments anti-inflammatoires ou corticoïdes (18, 3% contre 11, 6% pour les hommes) et étaient plus susceptibles de présenter en moyenne des niveaux plus élevés de HDL et des taux inférieurs de triglycérides. Les taux d'AG 3-OH étaient significativement plus élevés chez les hommes (289, 3 mol/mL (SD 118, 4 mol/mL) que chez les femmes (252, 4 mol/mL (SD 84, 5 mol/mL). En ce qui concerne le score d'adhérence au régime Méditerranéen, les femmes avaient un score légèrement plus élevé (10, 8 sur 18 points (SD 2, 0) que les hommes (10, 4 sur 18 points (SD 2, 0). Identification des profils alimentaires a posteriori Chez les femmes, le premier profil identifié était caractérisé principalement par une fréquence de consommation hebdomadaire élevée en pâtes, riz, pomme de terre et œufs ainsi qu'en sucreries et biscuits (Tableau A1). Ce profil a été qualifié de glucides simples et complexes et représentait 10, 1% de la variation de l'échantillon total. Le second profil obtenu, dénommé prudent était caractérisé par une consommation élevée en légumes et poissons et comptait pour 8, 8% de la variation totale. Enfin, le dernier profil retenu était caractérisé par des apports élevés en alcool, viande et charcuterie. Ce dernier a été qualifié de sud-ouest et représentait 8, 3% de la variation totale. Chez les hommes, le premier profil identifié correspondait à des apports élevés en pâtes, riz, pomme de terre, légumineuses, œufs et volaille et a été qualifié de profil diversifié et comptait pour 10, 9% de la variation totale (Tableau A2). Expliquant 8, 6% de la variation, le second profil identifié était caractérisé par une fréquence de consommation hebdomadaire élevée en biscuits et faible en céréales et légumes cuits. Celui-ci a été dénommé profil grignotage . Enfin, le troisième et dernier profil retenu chez les hommes et comptant pour 8, 4% de la variation totale était caractérisé par un apport élevé en poisson et en fruits et un apport faible en viande et en charcuterie. Ce profil a été qualifié de prudent . 189 Tableau A1. Structure des profils alimentaires identifiés a posteriori par analyse en composante principale selon les 20 groupes d'aliments du questionnaire de fréquence alimentaire chez les femmes (n 432). Profil Glucides simples et complexes Profil Profil Prudent Sud-ouest Factor loadings Légumes crus Légumes cuits Fruits Légumineuses Pizza et sandwich Pomme de terre Pâte Riz Œuf Volaille Poisson et crustacés Viande Charcuterie Alcool Coffee Thé Produits laitiers Pain et céréales Sucreries Biscuits Variance expliquée (%) Tous les groupes d'aliments sont considérés en nombre de portions par semaine. En gras, les factor loadings | 0. 4|. 0, 039 -0, 079 -0, 310 0, 390 0, 005 0, 390 0, 009 -0, 080 -0, 071 -0, 145 0, 067 0, 462 0, 541 0, 559 0, 045 -0, 361 -0, 265 0, 391 0, 111 -0, 311 8, 3 0, 507 0, 597 0, 318 0, 276 -0, 241 0, 276 0, 144 0, 195 0, 236 0, 332 0, 576 -0, 074 0, 062 -0, 059 -0, 028 -0, 012 0, 067 0, 345 -0, 194 -0, 385 8, 8 0, 037 -0, 029 -0, 198 0, 199 0, 300 0, 414 0, 687 0, 606 0, 410 0, 276 0, 075 0, 177 0, 181 -0, 064 0, 149 0, 112 0, 141 0, 279 0, 453 0, 434 10, 1 190 Tableau A2. Structure des profils alimentaires identifiés a posteriori par analyse en composante principale selon les 20 groupes d'aliments du questionnaire de fréquence alimentaire chez les hommes (n 266). Profil Profil Profil Diversifié Grignotage Prudent Factor loadings Légumes crus Légumes cuits Fruits Légumineuses Pizza et sandwich Pomme de terre Pâte Riz Œuf Volaille Poisson et crustacés Viande Charcuterie Alcool Coffee Thé Produits laitiers Pain et céréales Sucreries Biscuits Variance expliquée (%) Tous les groupes d'aliments sont considérés en nombre de portions par semaine. En gras, les factor loadings | 0. 4|. 0, 282 0, 350 0, 509 -0, 105 0, 014 -0, 107 -0, 200 0, 067 0, 054 0, 054 0, 513 -0, 640 -0, 544 -0, 236 0, 194 0, 082 0, 168 -0, 074 0, 002 0, 114 8, 4 -0, 267 -0, 522 -0, 019 0, 279 0, 187 -0, 170 -0, 055 0, 031 0, 147 -0, 169 0, 293 -0, 119 0, 337 0, 381 -0, 014 0, 227 0, 064 -0, 612 0, 022 0, 619 8, 6 0, 274 0, 165 -0, 001 0, 448 0, 046 0, 540 0, 585 0, 615 0, 547 0, 481 0, 373 -0, 019 0, 273 0, 015 -0, 039 0, 128 0, 167 0, 235 0, 161 -0, 003 10, 9 Associations entre profils alimentaires et taux circulants d'acides gras 3-hydroxylés Chez les femmes, aucune association significative n'a été mise en évidence entre les profils alimentaires identifiés a posteriori et les taux d'AG 3-OH, que ce soit pour le profil glucides simples et complexes (coefficient [IC 95%] : 0, 02 [-0, 22 ; 0, 27]), le profil prudent (coefficient [IC 95%] : -0, 058 [-0, 30 ; 0, 19]) ou le profil sud-ouest (coefficient [IC 95%] : 0, 12 [-0, 12 ; 0, 37]) dans le Modèle 2 (Tableau A3). De la même façon, une meilleure adhérence au profil Méditerranéen n'était pas significativement associée aux niveaux d'AG 3- OH plasmatiques chez les femmes (coefficient [IC 95%] : -0, 15 [-0, 14 ; 0, 11]). En revanche, chez les hommes, une meilleure adhérence à un profil de type prudent ou à un régime Méditerranéen était significativement associée à des taux plus faibles d'AG 3-OH (coefficient [IC 95%] : -0, 68 [-1, 05 ; -0, 32] et -0, 28 [-0, 46 ; -0, 10], respectivement) dans le Modèle 2 (Tableau A4). Bien qu'une tendance entre une meilleure adhérence au profil grignotage et un taux plus élevé d'AG 3-OH était observée chez les hommes, celle-ci 191 demeurait statistiquement non significative (coefficient [IC 95%] : 0, 30 [-0, 06 ; 0, 66]). De même, une adhérence plus élevée au profil diversifié n'était pas associé aux niveaux circulants d'AG 3-OH (coefficient [IC 95%] : -0, 13 [-0, 49 ; 0, 24]). 192 Tableau A3. Associations multivariables entre profils alimentaires et taux plasmatiques d'acides gras 3-hydroxylés chez les femmes (n 432). Profils a posteriori Profil glucides simples et complexes Profil prudent Profil sud-ouest Profil a priori * Modèle 1 IC 95% 0, 011 [-0, 230 ; 0, 253] -0, 071 [-0, 310 ; 0, 168] 0, 162 [-0, 077 ; 0, 402] p-value 0, 927 0, 562 0, 184 * Modèle 2 IC 95% 0, 024 [-0, 223 ; 0, 272] -0, 058 [-0, 303 ; 0, 188] 0, 124 [-0, 120 ; 0, 369] p-value 0, 846 0, 645 0, 319 Profil Méditerranéen * Coefficients de les covariables du Modèle 1 le statut tabagique, l'IMC, l'hypertension, le diabète, la symptomatologie dépressive, HDL, LDL, triglycérides, antécédents cardiovasculaires, nombre de médicaments total par semaine et médicaments anti-inflammatoires. Un ajustement supplémentaire sur les autres profils alimentaires a posteriori a été réalisé (excepté pour le profil Méditerranéen). Abréviations : AG 3-OH acides gras 3-hydroxylés ; IMC Indice de masse corporelle ; LDL low density lipoprotein ; HDL high density lipoprotein. -0, 015 le niveau d'éducation. Modèle 2 ajusté sur 0, 799 l'âge et [-0, 137 ; 0, 106] régression pour la racine carrée d'AG 3-OH. Modèle 1 ajusté sur -0, 016 [-0, 141 ; 0, 110] 0, 809 193 Tableau A4. Associations multivariables entre profils alimentaires et taux plasmatiques d'acides gras 3-hydroxylés chez les hommes (n 266). Profils a posteriori Profil diversifié Profil grignotage Profil prudent Profil a priori * Modèle 1 IC 95% -0, 107 [-0, 483 ; 0, 268] 0, 475 [0, 101 ; 0, 849] p-value 0, 575 0, 013 * Modèle 2 IC 95% -0, 129 [-0, 493 ; 0, 235] 0, 304 [-0, 055 ; 0, 663] p-value 0, 487 0, 097 -0, 711 [-1, 090 ; -0, 334] 0, 0003 -0, 683 [-1, 048 ; -0, 319] 0, 0003 Profil Méditerranéen * Coefficients de les covariables du Modèle 1 le statut tabagique, l'IMC, l'hypertension, le diabète, la symptomatologie dépressive, HDL, LDL, triglycérides, antécédents cardiovasculaires, nombre de médicaments total par semaine et médicaments anti-inflammatoires. Un ajustement supplémentaire sur les autres profils alimentaires a posteriori a été réalisé (excepté pour le profil Méditerranéen). Abréviations : AG 3-OH acides gras 3-hydroxylés ; IMC Indice de masse corporelle ; LDL low density lipoprotein ; HDL high density lipoprotein. -0, 282 le niveau d'éducation. Modèle 2 ajusté sur 0, 001 l'âge et [-0, 500 ; -0, 126] régression pour la racine carrée d'AG 3-OH. Modèle 1 ajusté sur -0, 313 [-0, 459 ; -0, 105] 0, 002 194 195 Interprétation spéculative Étant donné que la différence de réponse endotoxémique suite à une exposition notamment aigu de LPS entre les hommes et les femmes fait encore débat (490, 491), et en l'absence de littérature évaluant les associations entre profils alimentaires et biomarqueurs de l'endotoxémie à jeun séparément chez les hommes et chez les femmes, seules des hypothèses spéculatives peuvent être proposées pour expliquer de tels résultats. Nous suggérons que du fait que le profil prudent chez les hommes soit à la fois caractérisé par une faible consommation d'aliments considérés comme préjudiciables pour la santé (c. -à-d. , factor loadings négatifs pour la consommation de viande et de charcuterie) mais également par une consommation élevée d'aliments considérés comme sains (c. -à-d. , factor loadings positifs pour la consommation de poisson et de fruits), cela pourrait doublement contribuer à limiter l'endotoxémie plasmatique. Cette hypothèse d'un effet renforcé pourrait ainsi annihiler en partie la perte de puissance statistique, inhérente à la séparation de l'échantillon selon le sexe. Par ailleurs, les dénominations de profil prudent qui existent à la fois chez les hommes et les femmes dans cette étude ne sont que des indicatrices permettant de résumer l'information selon notre interprétation. En effet, les factor loadings ayant contribués différemment aux deux profils prudent chez les hommes et chez les femmes, ces profils ne sont pas comparables entre eux, en termes de quantité ou de qualité. 195 196 ANNEXE 6 Annexe 6 Mediterranean diet and prudent diet are both associated with low circulating esterified 3-hydroxy fatty acids, a proxy of lipopolysaccharide (LPS) burden, among older adults. Authors : Perrine André1* MPH, Jean-Paul Pais de Barros2 PhD, Bénédicte MJ Merle1 PhD, Cécilia Samieri1 PhD, Catherine Helmer1 3 MD PhD, Cécile Delcourt1 PhD, Catherine Féart1 PhD Affiliations : 1 Univ. Bordeaux, INSERM, BPH, U1219, F-33000 Bordeaux, France 2 Plateforme de Lipidomique, INSERM UMR1231, Université de Bourgogne Franche Comté, F-21000 Dijon, France. 3 INSERM, Clinical Investigation Center Clinical Epidemiology 1401, F-33000 Bordeaux, France Corresponding author : Catherine Féart Address : Team Lifelong Exposures, Health and Aging INSERM U1219 - Bordeaux Population Health Research Center, Bordeaux University, ISPED 146 rue Léo-Saignat, Bordeaux CedexFrance E-mail : catherine. feart-couret@u-bordeaux. fr Phone : 33 5 47 304 204 Short running head : Dietary patterns and LPS burden Abbreviations : 3-OH FAs : 3-hydroxy fatty acids DPs : Dietary Patterns LPS : Lipopolysaccharide 196 197 Abstract Background. Lipopolysaccharide (LPS)-type endotoxins, released by the disruption of Gram- negative bacteria naturally found in the gut microbiota, are recognized as triggers of inflammation and emerge as detrimental factors of healthy aging. Nutrition represents a promising strategy to reduce LPS burden, yet little is known about the relation of diet to circulating LPS levels in humans. Objective. To evaluate the associations between dietary patterns (DPs) and circulating esterified 3-hydroxy fatty acids (3-OH FAs), a proxy of LPS burden. Design. In a cross-sectional study of 698 older community-dwellers, plasma 3-OH FA levels were measured by LC-MS/MS. DPs were determined using food frequency questionnaires. Adherence to Mediterranean DP a priori was computed according to the consumption of 8 food groups (fruits, vegetables, legumes, cereals, fish, olive oil, meat and dairy products) and alcohol intake (range 0, low adherence, to 18, high adherence). Three a posteriori DPs were derived from factor analysis and identified as complex carbohydrate diet (mainly rich in rice, pasta, eggs, poultry and potatoes), traditional diet (mainly rich in alcohol, meat, charcuterie and legumes) and prudent diet (mainly rich in vegetables and fruits and low in biscuits). Linear regression models were applied. Results. Greater adherence to both the Mediterranean diet and the a posteriori prudent diet were both significantly associated with lower circulating esterified 3-OH FAs (multivariate- adjusted coefficient [95% CIs] for each additional point of score : -0. 12 [-0. 22 ; -0. 01] and - 0. 27 [-0. 48 ; -0. 07], respectively). In contrast, greater adherence to the traditional diet was significantly associated with higher level of 3-OH FAs ( [95% CIs] 0. 22 [0. 001 ; 0. 46]). The adherence to the complex carbohydrates diet was not associated with 3-OH FAs levels. Conclusions. Both a priori and a posteriori healthy DPs were significantly associated with lower 3-OH FAs levels, and thus a lower LPS burden, which is considered a potent trigger of inflammatory response, in this sample of older community dwellers. Keywords : Dietary pattern ; Mediterranean diet ; Principal component analysis ; Lipopolysaccharides (LPS) ; Endotoxins ; Elderly ; 3C study ; Alienor study 197 198 1. Introduction Lipopolysaccharide (LPS)-type endotoxins, major components of the outer membrane of Gram negative bacteria, are naturally found in large amounts in the human gut microbiota (1). LPS are released during the growth and death of bacteria cells and thus are ubiquitous toxins. The LPS structure consists of an O-antigen polysaccharide, an oligosaccharide core and a pathogen- associated molecular pattern, called lipid A, containing 3-hydroxy fatty acids (3-OH FAs) of variable length linked by ester and amide bonds to a glucosamine disaccharide backbone (24). The lipid A component carries the potent toxic inflammatory capacity of LPS, known to trigger the activation of the host immune system, which results in the secretion of proinflammatory cytokines (e. g. , IL-6, TNF- and CRP) and oxidative stress (5). Experimental studies have reported that a mild dose of LPS in adults (e. g. , intravenous injection of 1 ng/kg, approximately 15 g/mL distributed through the blood) induces transient proinflammatory cytokine production (5), nonspecific behavioral effects called sickness behavior (e. g. , including fatigue, fever, lethargy, headache and depression) (5) and activation of microglia in the brain, known as an actor of neuroinflammation (6). Elevated levels of LPS in the bloodstream in the absence of an obvious infection, defined as metabolic endotoxemia, has been reported in a broad variety of inflammatory-related chronic diseases such as obesity, diabetes, cardiovascular diseases and Alzheimer's disease (7). Therefore, metabolic endotoxemia might be an underlying mechanism maintaining the inflamm aging, characterized by an age-related progressive immunosenescence concomitant with chronic low-grade inflammation (8), and associated with increased risk of morbidity and mortality (9). Known to be able to modulate the gut microbiota composition, and therefore the relative abundance of LPS-contained bacteria as well as the translocation of LPS into the blood, nutrition represents one of the most promising strategies to target inflamm-aging (1012). Among the most studied nutrients, dietary fats emerge as potent regulators of metabolic endotoxemia, and accumulating evidence suggested that the consumption of meals rich in saturated fats has the ability to enhance postprandial LPS activity (13, 14). Interestingly, the addition of healthy foods rich in fiber to such high-saturated fat meals has been reported to counterbalance this increase in metabolic endotoxemia (15). Regarding dietary patterns (DPs), Western-like DPs have been associated with exacerbated circulating levels of LPS (16, 17), whereas some studies reported that adopting a healthy diet such as the Mediterranean diet is likely to limit the increase in metabolic endotoxemia (16, 18). Taken together, these results suggest that some DPs may lead to an increased level of LPS and that the matrix effect of particular food groups consumed together could be a key player of the metabolic endotoxemia response. Although of major interest, the relationship between DPs and metabolic endotoxemia remains poorly studied, in particular among older adults who are yet more prone to inflamm- aging and multicomorbidity. The aim of the present study was to assess the association between dietary habits and plasma 3-OH FAs used as a proxy of LPS burden (19) among older community-dwellers. Given the paucity of data on DPs and endotoxemia, we examine dietary habits through two complementary a priori and a posteriori approaches to identify DPs. 198 199 2. Subjects and methods 2. 1 Study sample The Three-City (3C) study is a French population-based prospective cohort study initiated in 1999 to study the vascular risk factors for dementia. The 3C study includes 9, 294 community dwellers aged 65 and over from three French cities : Bordeaux (n 2, 104), Dijon (n 4, 931), and Montpellier (n 2, 259). The protocol was approved by the Consultative Committee for the Protection of Persons participating in Biomedical Research at Kremlin-Bicêtre University Hospital (Paris, France). All participants provided written informed consent. The protocol of the 3C study and the participants' baseline characteristics were described previously (20). The present study is based on the 3C-Bordeaux center, which underwent an in-depth nutritional survey. For cost reasons inherent in the assay of the endotoxemia biomarker, this present study focused on a subsample of 3C-Bordeaux : the Alienor study. The Alienor (Antioxydants, Lipides Essentiels, Nutrition et maladies OculaiRes) study is an ancillary prospective study that was implemented in the Bordeaux center of the 3C study (20, 21). The Alienor study, consisting of 963 participants at baseline, aims to study the relationships between nutritional habits and age-related ocular diseases. At baseline, participants provided sociodemographic and lifestyle information, health and anthropometric- related characteristics and neuropsychological testing during face-to-face interviews. Blood samples were obtained at baseline after the participant fasted overnight, and derivatives were stored at 80C. Participants were followed-up about every 2 to 3 years since baseline. In the first wave of follow-up (e. g. , 2 years after baseline), a comprehensive dietary survey was conducted, including a broad food frequency questionnaire (FFQ). Detailed characteristics of participants of the Alienor study have been described previously (21). The design of the Alienor study has been approved by the Ethics Committee of Bordeaux (Comité de Protection des Personnes Sud-Ouest et Outre-Mer III). From the initial sample of 963 participants, we identified 785 participants with available blood samples at baseline. Then, we excluded 59 participants without nutritional data from an FFQ and 28 participants with missing data for covariates considered potential cofounders, leading to a study sample of 698 participants for the present cross-sectional analysis. 2. 2 Assessment of circulating LPS levels by LC-MSMS Endotoxin levels were assessed by measuring esterified 3-OH-FAs concentrations by LC- MS/MS as previously described (19, 22). In brief, as circulating free 3-OH-FAs can be detected in plasma, LPS concentrations were calculated as the difference between the amounts of total 3-OH-FAs released after strong acidic hydrolysis of 100 l of plasma and the amounts of free 3-OH FAs (e. g. , non LPS, free 3-OH-FAs) determined after direct extraction of 100 l of plasma without the strong acidic hydrolysis step. The resulting esterified 3-OH-FA levels, expressed in mol/mL, reflect the LPS concentrations in plasma. To achieve normal distribution of the variable, the square root of esterified 3-OH FAs concentrations was used. 2. 3 Nutritional data Dietary data were obtained from an FFQ administered at the first follow-up by registered dietitians who received collective training and monitoring. The frequency of consumption of 40 categories of food and non-alcoholic beverages was recorded for each of the three main meals and three between-meal snacks (including 148 items). Frequencies of consumption were recorded in 11 categories as follows : 0 for never or less than once a week, 0. 25 for once a 199 200 month, 0. 5 for twice a month, 0. 75 for three times a month, 1 for once a week, and from 2 for twice a week to 7 for seven times a week (23). The number of glasses of alcohol consumed per week was also recorded. The food and beverage items were then classified into 20 predefined groups : raw vegetables ; cooked vegetables ; fruits including compotes and fruit juices ; legumes ; pizza, sandwich, salty pies and quiche ; potatoes ; pasta ; rice ; eggs ; meat excluding poultry ; poultry ; fish and shellfish ; charcuterie ; bread and ready-to-eat cereals ; all kinds of sweet products including sodas ; biscuits, cakes, cookies, and Viennese pastries ; total dairy products including milk, cheese, fresh dairy products, and chocolate drink ; alcohol ; coffee ; and tea (as described elsewhere (23). 2. 4 Identification of a priori and a posteriori dietary patterns As already proposed in the nutritional epidemiology field, two complementary approaches have been used to identify dietary patterns of participants. The a priori approach is a hypothesis- oriented approach offering the possibility to assess adherence to a specific dietary pattern or recommendation based on prior scientific knowledge (24, 25). In contrast, the a posteriori approach is entirely agnostic, and aims at characterizing, through multidimensional statistical approaches, main dietary patterns in a specific population (25). As described by Sofi et al. (26) a priori Mediterranean diet adherence was assessed by the frequency of consumption of 8 selected food groups and alcohol (27). This Mediterranean diet score ranged from 0 (poor adherence) to 18 (highest adherence) with 0 to 2 points for the usual servings of fruits (2 points for a consumption of 1. 5 servings/d or more) ; raw and cooked vegetables (2 points for a consumption of 2. 5 servings/d or more) ; legumes (2 points for a consumption of 2 servings/week or more) ; cereals including pasta, rice bread, bread and ready- to-eat cereals (2 points for a consumption of 1. 5 servings/d or more) ; fish (2 points for a consumption of 2. 5 servings/week or more) ; and olive oil (2 points for a preferential consumption of olive oil among other types of fats for seasoning and cooking), for which the higher the score, the better the diet quality ; meat and meat products (2 points for a consumption of 1 serving/d or less) and dairy products (2 points for a consumption of 1 serving/d or less), for which the lower, the better ; and alcohol (2 points were attributed for a moderate consumption of 1 to 2 glasses per day considered as beneficial, 1 point for a consumption less than 1 glass per day and 0 point for a consumption higher than 2 glasses per day) (for detailed thresholds according to each food group, see (26). A posteriori dietary patterns were derived using principal component analysis (PCA)-type factor analysis with orthogonal transformation (e. g. , varimax rotation) for an easier understanding of the obtained components. Input variables of the PCA procedure included standardized frequency consumption of all of the 20 food groups, described above. The number of DPs was determined according to scree plot examination and interpretation, leading to the identification of three characterized a posteriori DPs. The correlation between food groups and each component (e. g. , a posteriori identified DPs) are given by factor-loadings. Food groups with positive loadings indicate positive relationship with the component and in contrast, food groups with negative loadings indicate an inverse relationship with the component. The greater the absolute factor-loading for a specific food item, the greater the contribution of the food item to the component. Variables with higher factor-loadings, based on an arbitrary cutoff of | 0. 40 |, were considered to significantly contribute to the component and used to label a posteriori DPs. Nevertheless, all factor-loadings (e. g. , those above and below |0. 40|) were included in 200 201 calculating component scores. For each participant, a factor score for each DP was calculated by summing the intakes of the 20 food groups weighted by their factor-loadings. The a priori and a posteriori DP scores were used as continuous variables ( 1 point) in subsequent analyses and divided into tertiles (e. g. , low, intermediate and high adherence for each DP) for descriptive purposes. 2. 5 Covariates Sociodemographic characteristics were collected at study inclusion, including age, sex and educational level (defined in 3 categories : less than primary school, intermediate, university or equivalent). Medical variables including diabetes (e. g. , fasting blood glucose 7 mmol/L or non-fasting glucose 11 mmol/L or oral diabetes medication), hypertension (blood pressure above 140/90 mmHg or taking antihypertensive medication), cardiovascular history (e. g. , including myocardial infarction or cardiac and vascular surgery or arteritis or stroke), depressive symptomatology (defined as Center for Epidemiologic Studies Depression Scale (CES-D)-scores of > 17 for men and > 23 for women, based on French-validated thresholds (28), body mass index (BMI) (considered in 3 categories : < 21 kg/m for underweight, 21-27 kg/m for normal weight and > 27 kg/m for overweight, e. g. , relevant cutoffs for the elderly (29), number of drugs consumed several times a week (classified as low consumption (< 5), poly-medication (5-9) or hyper poly-medication (> 9), and the number of specific systemic anti-inflammatory drugs used (nonsteroidal anti-inflammatory drugs and/or corticosteroids) were also assessed. The smoking status (considered as nonsmoker, former smoker or current smoker) and subjective health (classified as good or very good, intermediate, bad and very bad) were also reported. Biological data included the measurement of low-density lipoprotein cholesterol (LDL), high-density lipoprotein cholesterol (HDL), and triglycerides, expressed in mmol/L. 2. 6 Statistical analysis The associations between Mediterranean-type diet or a posteriori DPs and circulating level of esterified 3-OH FAs (with square root transformation) were evaluated using linear regression models. Models were adjusted for covariates of interest identified in the literature and considering the availability of data in the dataset : age, sex, and educational level (Model 1) smoking status, BMI, depressive symptomatology, hypertension, diabetes, lipid profile (e. g. , LDL, HDL and triglyceride levels considered separately in the model), and history of cardiovascular diseases and number of total drugs and anti-inflammatory drugs (Model 2). Multivariable-adjusted coefficient and 95% confidence intervals [95%CIs] are presented. Coefficient represents the change of 1 unit of square root of 3-OH FAs levels for each increase of 1 point DP score. Interactions between diabetes and DPs, as well as between BMI and DPs, were tested. Statistical analyses were performed using SAS software version 9. 4 (SAS Institute Inc. , Cary, 134 NC, USA) and R software version 3. 3. 2 (R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria). 201 202 3. Results 3. 1. Characteristics of the study sample The baseline characteristics of the 698 participants included in the study, overall and by tertiles of 3-OH FAs, are described in Table 1. Participants were 73. 1 years old on average (range 65. 4 - 87. 0) and mainly women (62%). Overall, participants with high levels of 3-OH FAs (upper tertile of distribution compared with the lower tertile) were predominantly men and more often exhibited an unhealthy clinical status. However, perceived subjective health did not seem to differ according to the circulating levels of 3-OH FAs, with 3% of participants on average considering themselves in good or very good health and over 60% considering themselves in poor or very poor health. Approximately 7% of the participants suffered from diabetes ; this proportion was higher among participants with the higher circulating levels of 3-OH FAs (from 3. 5% to 13. 3% for the lower and upper tertiles of 3-OH FAs, respectively). A history of cardiovascular disease was reported in nearly 8% of participants, and the frequency tended to be higher with higher levels of 3-OH FAs (5. 2% to 10. 7% for the lower and upper tertiles of 3- OH FAs, respectively). The average BMI was 26. 3 kg/m, with almost 40% of the participants being overweight or obese. More than 6% of participants reported hyper polymedication ; the average number of drugs consumed per week was 4. 1. Depressive symptomatology was reported by 6% of participants, with a lower frequency among participants with higher levels of 3-OH FAs (6. 9% and 5. 2% for the lower and upper tertiles of 3-OH FAs, respectively). The lipid profile appeared to slightly differ across the tertiles of 3-OH FAs, with a trend toward higher triglycerides and LDL levels in the upper tertile of 3-OH FAs than in the lower tertile. 202 Table 1. Baseline sociodemographic and clinical characteristics of the participants' study (n 698). Ter1 3-OH FAs Ter2 3-OH FAs Ter3 3-OH 203 Baseline characteristics Total (n 698) (n 232) (n 233) Age (years) Sex (women) Educational level Low (< primary school) Intermediate High (university or equivalent) Body mass index (kg/m) Underweight ( kg/m) Normal weight (21-27 kg/m) Overweight (>27 kg/m) Subjective health Good or very good Intermediate Bad or very bad Diabetes Hypertension History of cardiovascular diseases Depressive symptomatology Smoking status Nonsmoker Former smoker Current smoker 73. 1 (4. 4) 432 (61. 9) 207 (29. 7) 346 (49. 6) 145 (20. 7) 51 (7. 3) 369 (52. 9) 278 (39. 8) 21 (3. 0) 239 (34. 2) 438 (62. 8) 50 (7. 2) 529 (75. 8) 55 (7. 9) 42 (6. 0) 448 (64. 2) 219 (31. 4) 31 (4. 4) 73. 2 (4. 3) 169 (72. 8) 76 (32. 8) 116 (50. 0) 40 (17. 2) 18 (7. 8) 125 (53. 9) 89 (38. 4) 7 (3. 0) 85 (36. 6) 140 (60. 3) 8 (3. 5) 168 (72. 4) 12 (5. 2) 16 (6. 9) 162 (69. 8) 64 (27. 6) 6 (2. 6) 72. 9 (4. 4) 143 (61. 4) 68 (29. 2) 115 (49. 4) 50 (21. 4) 13 (5. 6) 122 (52. 4) 98 (42. 1) 7 (3. 0) 78 (33. 5) 148 (63. 5) 11 (4. 72) 174 (74. 7) 18 (7. 7) 14 (6. 0) 155 (66. 5) 70 (30. 0) 8 (3. 5) FAs (n 233) 73. 0 (4. 5) 120 (51. 5) 63 (27. 0) 115 (49. 4) 55 (23. 6) 20 (8. 6) 122 (52. 4) 91 (39. 0) 7 (3. 0) 76 (32. 6) 150 (64. 4) 31 (13. 3) 187 (80. 3) 25 (10. 7) 12 (5. 2) 131 (56. 2) 85 (36. 5) 17 (7. 3) 203 204 Number of drugs consumed 5-9 (poly-medication) >9 (hyper-poly-medication) Anti-inflammatory drug consumption LDL (mmol/L) HDL (mmol/L) Triglycerides (mmol/L) Mediterranean diet score (/18) 422 (60. 5) 232 (33. 2) 44 (6. 3) 110 (15. 8) 3. 6 (0. 9) 1. 6 (0. 4) 1. 2 (0. 6) 10. 7 (2. 0) 142 (61. 2) 73 (31. 5) 17 (7. 3) 44 (19. 0) 3. 6 (0. 8) 1. 6 (0. 4) 1. 2 (0. 5) 10. 9 (1. 9) 136 (58. 4) 86 (36. 9) 11 (4. 7) 144 (61. 8) 73 (31. 3) 16 (6. 9) 35 (15. 0) 31 (13. 3) 3. 6 (0. 8) 1. 6 (0. 4) 1. 2 (0. 5) 10. 6 (2. 0) 3. 7 (0. 9) 1. 6 (0. 4) 1. 3 (0. 7) 10. 5 (2. 1) Values are mean (standard deviation) or number (percentage). Abbreviations : LDL low-density lipoprotein ; HDL high density lipoprotein ; Diabetes considered as fasting blood glucose 7 mmol/L or non-fasting glucose 11 mmol/L or oral diabetes medication ; hypertension considered as blood pressure above 140/90 mmHg or taking antihypertensive medication ; cardiovascular history included myocardial infarction or cardiac and vascular surgery or arteritis or stroke ; Depressive symptomatology considered as Center for Epidemiologic Studies Depression Scale (CES-D)-scores of > 17 for men and > 23 for women. 204 205 3. 2 Description of a priori Mediterranean diet and a posteriori dietary patterns The mean score for adherence to the Mediterranean diet was 10. 7 (SD 2. 0) out of a total of 18 for the whole study sample, with slightly lower average scores for participants in the upper tertile of 3-OH FAs than for those in the lower tertile (an average difference of -0. 4 point) (Table 1). Information on the average weekly servings of each of the 20 food groups according to the tertiles of Mediterranean diet score is available in Table 2. Table 2. Description of the food consumption in servings per week based of the food frequency questionnaire according to the tertiles of the Mediterranean diet score in the study sample (n 698). Servings per week Raw vegetables Cooked vegetables Fruits Legumes Pizza and sandwich Potatoes Pasta Rice Eggs Poultry Fish and shellfish Meat Charcuterie Alcohol Coffee Tea Dairy products Bread and cereals Sweets Biscuits Mediterranean diet Low adherence ( 9 / 18) n 187 Moderate adherence (11-12 / 18) n 264 High adherence ( 12 / 18) n 247 7. 3 (5. 0) 8. 4 (4. 0) 9. 1 (6. 6) 0. 5 (0. 5) 0. 5 (1. 0) 2. 7 (1. 9) 2. 0 (1. 6) 1. 2 (1. 2) 1. 2 (1. 0) 1. 6 (1. 1) 1. 9 (1. 3) 5. 8 (3. 0) 1. 7 (2. 3) 13. 9 (16. 2) 6. 0 (5. 4) 2. 1 (4. 2) 18. 0 (7. 6) 17. 1 (6. 0) 8. 2 (6. 3) 2. 5 (3. 6) 9. 9 (5. 2) 9. 9 (4. 1) 13. 4 (6. 6) 0. 6 (0. 7) 0. 4 (0. 8) 2. 6 (1. 7) 2. 1 (1. 6) 1. 3 (1. 2) 1. 7 (1. 2) 1. 8 (1. 4) 2. 9 (1. 7) 4. 4 (2. 4) 1. 7 (2. 2) 10. 0 (11. 6) 6. 3 (5. 4) 3. 1 (4. 9) 15. 8 (6. 8) 18. 6 (5. 0) 8. 5 (6. 6) 1. 7 (2. 9) 11. 1 (4. 8) 11. 8 (4. 0) 15. 6 (5. 4) 0. 7 (0. 6) 0. 4 (0. 6) 2. 9 (1. 6) 2. 1 (1. 3) 1. 4 (1. 1) 1. 5 (1. 0) 1. 9 (1. 1) 3. 6 (1. 6) 4. 4 (1. 9) 1. 4 (1. 9) 8. 6 (8. 6) 5. 8 (5. 1) 3. 1 (4. 8) 16. 3 (7. 6) 19. 4 (4. 3) 8. 4 (6. 6) 2. 0 (3. 2) Three a posteriori DPs derived from PCA were built from the whole dataset, which account for 27. 6% of the total variance. Table 3 presents the factor-loadings matrix of each food group associated with each of the three DP components. 205 Table 3. Pattern structure and variance explained by the 20 food groups based on the food frequency questionnaire for the first three food patterns in the study sample (n 698). 206 Food groups* Raw vegetables Cooked vegetables Fruits Legumes Pizza and sandwich Potatoes Pasta Rice Eggs Poultry Fish and shellfish Meat Charcuterie Alcohol Coffee Tea Dairy products Bread and cereals Sweets Biscuits Proportion of total variation (%) Complex carbohydrates dietary pattern Factor loadings Traditional dietary pattern Prudent dietary pattern 0. 231 0. 190 -0. 005 0. 275 0. 109 0. 427 0. 639 0. 672 0. 500 0. 436 0. 396 -0. 057 0. 128 -0. 075 0. 041 0. 162 0. 184 0. 285 0. 260 0. 211 10. 5 0. 128 -0. 044 -0. 203 0. 475 0. 074 0. 313 0. 132 -0. 011 -0. 009 -0. 055 0. 009 0. 543 0. 557 0. 591 0. 117 -0. 402 -0. 181 0. 414 0. 056 -0. 290 9. 2 0. 443 0. 661 0. 402 0. 008 -0. 259 0. 045 -0. 187 -0. 152 0. 041 0. 156 0. 297 -0. 131 -0. 264 -0. 162 0. 034 -0. 137 0. 034 0. 300 -0. 223 -0. 526 7. 9 *All food groups were considered as servings per week for the principal component analysis. In bold, factor loadings | 0. 4|. Total explained variance was 27. 6%. The first component, accounting for 10. 5% of the total variance, was characterized by higher consumption of rice, pasta, eggs, poultry and potatoes and was therefore labeled the complex carbohydrates DP. The second DP was predominantly characterized by higher intakes of alcohol, charcuterie, meat, legumes, bread and ready-to-eat cereals and a low intake of tea. Accordingly, this component was labeled the traditional DP and explained 9. 2% of the total variance. By contrast, the prudent DP was characterized by high intakes of vegetables and fruits and by a low intake of biscuits. This DP accounted for 7. 9% of the total variance. To translate factor loadings into usual diets, the average number of weekly servings of each of the 20 food groups across tertiles of complex carbohydrates, traditional and prudent DPs for the whole sample have been presented in Table 4. 206 Table 4. Description of the food consumption in servings per week based of the food frequency questionnaire according to the tertiles of the 3 retained dietary patterns derived from principal component analysis in the study sample (n 698). * Values are mean (SD). Ter3 (upper tertile) represents a higher adherence to the dietary pattern. In bold, food groups for which factor loadings are | 0. 4| for each dietary pattern. 207 Servings per week * Raw vegetables Cooked vegetables Fruits Legumes Pizza and sandwich Potatoes Pasta Rice Eggs Poultry Fish and shellfish Meat Charcuterie Alcohol Coffee Tea Dairy products Bread and cereals Sweets Biscuits Complex carbohydrates dietary pattern Traditional dietary pattern Prudent dietary pattern Ter1 n 232 8. 1 (4. 9) 9. 4 (4. 0) 12. 9 (7. 3) 0. 4 (0. 4) 0. 3 (0. 8) 1. 9 (1. 4) 1. 0 (0. 8) 0. 6 (0. 6) 1. 0 (0. 8) 1. 3 (0. 9) 2. 2 (1. 4) 4. 8 (2. 8) 1. 3 (1. 9) 11. 4 (13. 7) 5. 5 (4. 9) 2. 0 (3. 6) 15. 4 (7. 0) 16. 5 (6. 0) 6. 6 (5. 7) 1. 4 (2. 7) Ter2 n 233 10. 0 (5. 4) 10. 0 (4. 0) 13. 3 (6. 8) 0. 6 (0. 6) 0. 5 (0. 8) 2. 8 (1. 6) 2. 1 (1. 2) 1. 1 (0. 8) 1. 4 (0. 9) 1. 7 (1. 0) 3. 0 (1. 5) 5. 0 (2. 3) 1. 6 (2. 3) 10. 9 (12. 4) 6. 4 (5. 3) 2. 7 (4. 7) 15. 9 (7. 3) 19. 1 (4. 6) 8. 2 (6. 3) 1. 8 (2. 9) Ter3 n 233 10. 9 (5. 0) 11. 1 (4. 5) 13. 0 (6. 1) 0. 8 (0. 7) 0. 6 (0. 8) 3. 5 (1. 8) 3. 2 (1. 4) 2. 2 (1. 4) 2. 1 (1. 3) 2. 5 (1. 5) 3. 5 (1. 8) 4. 5 (2. 3) 1. 8 (2. 1) 9. 3 (10. 1) 6. 2 (5. 6) 3. 8 (5. 4) 18. 3 (7. 5) 19. 9 (4. 1) 10. 3 (7. 0) 2. 8 (3. 8) Ter1 n 232 8. 6 (5. 3) 10. 2 (4. 3) 14. 6 (7. 1) 0. 3 (0. 4) 0. 4 (0. 8) 2. 1 (1. 6) 1. 9 (1. 6) 1. 3 (1. 3) 1. 6 (1. 4) 1. 9 (1. 4) 2. 8 (1. 8) 3. 4 (2. 0) 0. 6 (1. 1) 4. 4 (5. 7) 5. 1 (5. 2) 5. 2 (6. 1) 18. 3 (7. 9) 15. 7 (6. 2) 7. 6 (6. 4) 3. 2 (4. 0) 207 Ter2 n 233 10. 2 (5. 0) 10. 5 (4. 2) 13. 2 (6. 2) 0. 6 (0. 5) 0. 4 (0. 8) 2. 7 (1. 7) 2. 0 (1. 4) 1. 3 (1. 0) 1. 4 (0. 9) 1. 8 (1. 2) 2. 9 (1. 6) 4. 6 (1. 9) 1. 2 (1. 4) 8. 7 (7. 8) 6. 3 (5. 3) 2. 1 (3. 5) 16. 2 (6. 7) 19. 4 (4. 2) 8. 7 (6. 6) 1. 6 (2. 6) Ter3 n 233 10. 2 (5. 2) 9. 8 (4. 1) 11. 5 (6. 5) 0. 9 (0. 8) 0. 5 (0. 7) 3. 4 (1. 6) 2. 3 (1. 4) 1. 3 (1. 1) 1. 5 (1. 0) 1. 7 (1. 1) 2. 9 (1. 6) 6. 3 (2. 6) 2. 9 (2. 7) 18. 5 (16. 0) 6. 7 (5. 2) 1. 3 (2. 9) 15. 1 (7. 1) 20. 4 (3. 3) 8. 8 (6. 6) 1. 2 (2. 4) Ter1 n 232 7. 0 (4. 4) 7. 3 (3. 5) 10. 2 (6. 1) 0. 6 (0. 7) 0. 6 (1. 0) 2. 7 (1. 8) 2. 4 (1. 6) 1. 5 (1. 3) 1. 4 (1. 1) 1. 6 (1. 1) 2. 3 (1. 3) 5. 0 (2. 7) 2. 3 (2. 7) 13. 2 (15. 5) 6. 0 (5. 3) 3. 1 (5. 3) 16. 7 (7. 7) 16. 7 (5. 6) 9. 8 (7. 1) 4. 0 (4. 2) Ter2 n 233 9. 7 (4. 8) 9. 8 (2. 9) 12. 6 (5. 9) 0. 6 (0. 5) 0. 4 (0. 8) 2. 7 (1. 7) 2. 1 (1. 5) 1. 3 (1. 2) 1. 5 (1. 2) 1. 8 (1. 2) 2. 9 (1. 7) 5. 0 (2. 5) 1. 4 (1. 8) 10. 2 (10. 2) 6. 0 (5. 2) 3. 0 (4. 5) 15. 6 (6. 6) 19. 0 (4. 6) 8. 5 (6. 1) 1. 4 (2. 2) Ter3 n 233 12. 2 (5. 2) 13. 4 (3. 6) 16. 3 (6. 8) 0. 6 (0. 6) 0. 3 (0. 4) 2. 8 (1. 7) 1. 8 (1. 2) 1. 1 (1. 0) 1. 5 (1. 0) 2. 1 (1. 4) 3. 5 (1. 7) 4. 3 (2. 3) 1. 0 (1. 5) 8. 2 (10. 0) 6. 1 (5. 4) 2. 4 (4. 1) 17. 3 (7. 7) 19. 8 (4. 7) 6. 8 (5. 9) 0. 7 (1. 6) 208 The average circulating esterified 3-OH FAs level was 266. 4 mol/mL in the whole study sample, with slightly higher levels for participants with the lowest adherence to the Mediterranean diet (lower tertile, 276. 7 mol/mL) compared to those with moderate (261. 8 mol/mL) or higher (263. 7 mol/mL) adherence. Regarding the a posteriori DPs, the circulating levels of esterified 3-OH FAs were, on average, slightly lower among participants with a higher adherence to the prudent DP (from 283. 0 to 255. 3 mol/mL (approximately - 10%), for the lower and upper tertiles respectively) and slightly higher among those with a higher adherence to the traditional DP (from 249. 9 to 290. 8 mol/mL (approximately 16%) for the lower and upper tertiles, respectively) (Table 5). In contrast, no obvious average change in circulating esterified 3-OH FAs was reported regarding adherence to the complex carbohydrates DP. 208 Table 5. Average circulating level of esterified 3-hydroxy fatty acids according to tertiles adherence of the dietary patterns in the study sample (n 698). Total (n 698) Mediterranean diet Low adherence ( 9 / 18) Moderate adherence (11-12 / 18) High adherence ( 12 / 18) Complex carbohydrates diet Traditional diet Prudent diet Ter1 Ter2 Ter3 Ter1 Ter2 Ter3 Ter1 Ter2 Ter3 209 3-OH FAs (mol/mL) 266, 4 (100, 3) 249, 9 (83, 4) 258, 6 (91, 4) 290, 8 (118, 4) 261, 1 (85, 2) 255, 3 (97, 3) Values are mean (SD). Ter3 (upper tertile) represents a higher adherence to the diet. P-for-trend for Non-prudent and Prudent diets. Abbreviation : 3-OH FAs esterified-3-hydroxy fatty acids 283, 0 (114, 6) 270, 6 (118, 7) 266, 1 (87, 2) 262, 6 (92, 6) 276, 7 (110, 4) 261, 8 (92, 9) 263, 7 (99, 7) 209 210 3. 3 Multivariate associations between dietary patterns and circulating esterified 3-OH FAs Table 6 presents results from the multivariate linear regression analyses of associations between DPs and circulating esterified 3-OH FAs. Overall, a greater adherence to plant-based diets such as the Mediterranean diet (multivariate-adjusted coefficient [95% CI] : -0. 13 [-0. 23 ; -0. 03] for each additional score point) or prudent DP (coefficient [95% CI] : -0. 28 [-0. 48 ; -0. 07] for each additional score point) was significantly associated with lower circulating 3-OH FAs levels, after adjustment for age, sex and level of education level (Model 1). Adjusted for these later confounders, greater adherence to a traditional DP was significantly associated with higher circulating 3-OH FA levels (multivariate-adjusted coefficient [95% CI] : 0. 31 [0. 08 ; 0. 53] for each additional score point) (Table 6, Model 1). Such significant associations persisted after additionally adjusting for lipid profile (HDL, LDL, and triglycerides), cardiovascular risk factors (cardiovascular history, BMI, hypertension, diabetes, smoking status), depressive symptomatology and drug use (Table 6, Model 2). Regardless of which confounders were considered, no significant association was observed between adherence to the complex carbohydrates DP and esterified 3-OH FAs levels. When dietary intakes were considered as individual food groups mutually adjusted (all 20 food groups in a single statistical model), no significant association with esterified 3-OH FAs levels was reported, either in the partly (Model 1) or fully (Model 2) adjusted model. Furthermore, no significant interaction between dietary patterns and diabetes or between dietary patterns and BMI were observed in this study. 210 211 Table 6. Multivariate analyses between dietary patterns derived from principal component analysis and Mediterranean diet score and levels of total circulating esterified-3-hydroxy fatty acids, a proxy of plasma lipopolysaccharides burden (n 698). Complex carbohydrates dietary pattern * -0. 121 Modèle 1 IC 95% [-0. 328 ; 0. 085] p-value 0. 250 * Modèle 2 IC 95% p-value -0. 086 [-0. 292 ; 0. 119] 0. 408 Traditional dietary pattern 0. 305 [0. 078 ; 0. 532] 0. 009 0. 223 [0. 006 ; 0. 457] 0. 044 Prudent dietary pattern -0. 275 [-0. 482 ; -0. 069] 0. 009 -0. 271 [-0. 476 ; -0. 066] Mediterranean diet score -0. 130 [-0. 233 ; -0. 026] 0. 014 -0. 117 [-0. 220 ; -0. 014] 0. 010 0. 027 * Regression coefficients for the relation of each additional point of DP score with the square root of esterified-3-OH FAs. Model 1 was adjusted on age, sex and educational level. Model 2 was adjusted for Model 1 covariables smoking status, body mass index, hypertension, diabetes, depressive symptomatology, HDL, LDL, triglycerides, history of cardiovascular diseases, number of regular drugs intake per week and anti- inflammatory drugs consumption. 211 212 4. Discussion Using a complementary approach to identify dietary patterns among older community-dwellers, we observed that a greater adherence to plant-based diets was associated with lower circulating levels of esterified-3-OH FAs, a proxy of total plasma LPS burden. A trend towards a plant- based diet such as a Mediterranean-like diet, characterized by a high intake of healthy food groups (e. g. , vegetables, fruits and fish) and low-to-moderate intake of unhealthy food groups (e. g. , alcohol, meat and processed meat and refined sugars), was previously associated with lower endotoxemia (circulating levels of LPS measured by LAL assay) among adults (16, 30, 31). Research on elderly individuals, who are more likely to present immune system weakness and higher intestinal permeability to LPS, has remained relatively limited. The adoption of a diet low in saturated fats and rich in fiber and carbohydrates over one month was associated with a decrease in fasting endotoxemia by more than a third among 8 healthy volunteers aged 55-66 years (16). Among 912 elderly individuals with nonvalvular atrial fibrillation, greater adherence to a Mediterranean diet was inversely correlated with endotoxemia (circulating levels of LPS measured by LAL assay) (32). This last study reported that the highest consumption of fruits and vegetables, among the other food components of the Mediterranean diet, was specifically associated with lower endotoxemia ; a result that seems consistent with those of the present study, where adherence to the prudent diet, mainly characterized by a high frequency of consumption of fruits and vegetables, was significantly associated with lower 3-OH FAs levels. Interestingly, greater adherence to a priori or a posteriori diets rich in fruits and vegetables are often reported to be associated with a lower inflammatory state (3336). Therefore, our results reinforced these observations by studying a potential trigger of inflammation. Our findings also suggested a significant association between a greater adherence to a traditional diet and higher level of esterified 3-OH FAs. Accordingly, some evidence suggested that Westernized DPs (e. g. , rich in meat, processed meat and refined sugars) are associated with increased endotoxemia (circulating levels of LPS measured by LAL assay) in adults (16, 30). Moreover, numerous previous studies reported that Western-like diets and a posteriori diets identified by PCA and characterized by high intake of red meat, processed meat and alcohol (beer) were consistently associated with a higher inflammatory state (e. g. , higher IL6 and CRP levels) (3335, 37, 38). Here, we added that these associations remained relevant among older adults. As components of DPs and food groups, several constituents within these healthy or traditional diets could explain, all at least in part, the results of associations obtained with the levels of 3-OH FAs. Among components that might contribute to elevated metabolic endotoxemia, dietary fats are of growing interest in the current literature. In healthy humans, several studies reported that even a single high-fat meal, especially devoid of healthy food groups, is enough to increase metabolic endotoxemia as evaluated by the biological activity of LPS and proinflammatory cytokine IL-6 (39, 40). In a comparative study using three different high-fat meals consisting of 500, 1000 and 1500 kcal (composed of bread, palm fat, salami, and boiled eggs with 60. 5% energy from fat, corresponding to 34 to 102 g of fat), Schwander et al. observed a positive dose-response relationship between fat calorie meals and increased serum LPS (41), suggesting that the quantity of fats could play a central role in this relationship. The biological plausibility of a link between dietary fat intake and endotoxemia is strong. Among the possible involved mechanisms, previous studies reported a correlation between lipemia and endotoxemia, suggesting that the active absorption of LPS through the intestinal barrier would be facilitated by the incorporation of lipids regions of LPS into the forming chylomicrons during lipid digestion (42, 43). Additionally, the theory of a passive transport of LPS is advanced : their 212 213 entrance into the bloodstream could be facilitated by the ability of high-fat diets to compromise the integrity and permeability of the intestinal barrier (4447). The amount of LPS reaching the blood could be further increased by lifelong consumption of obesogenic diets, known to promote the gut microbiota dysbiosis and the proliferation of LPS-containing bacteria in the gut microbiota (13, 44), in contrast to plant-based diets, rich in fiber (48, 49). Finally, excessive alcohol consumption has also been reported to promote disturbance of the gut microbiota and intestinal hyperpermeability to luminal bacterial products (50). Additionally, in a randomized crossover study, Lyte et al. reported that while endotoxemia (circulating levels of LPS measured by LAL assay) increased by 60% following the consumption of a high-saturated-fat meal, a 50% decrease in endotoxemia was observed following the intake of a meal rich in n-3 polyunsaturated fatty acids (51). These results suggested that not all fats lead to an increase in endotoxemia and that the quality of dietary fats, beyond quantity, could modulate the endotoxemic response. Accordingly, as part of the Mediterranean diet, a higher intake of fish, rich in n-3 polyunsaturated fatty acids, concomitant with a lower intake of saturated fatty acids, might contribute to the observed inverse association with esterified-3-OH FAs. Additionally, higher intake of fiber found in a large quantity in plant- based diets could reduce endotoxin exposure not only via its ability to enhance gut microbiota richness and diversity but also through the production of short-chain fatty acids, which have been found to reduce gut permeability (52). Finally, previous reports suggested that high- saturated-fat diets and refined sugars were associated with increased levels of LPS and dysbiosis of the gut microbiota (13, 53). Therefore, a lower intake of these unhealthy food groups as a part of greater adherence to healthy diets identified in the present study could result in a supplemental benefit in lowering metabolic endotoxemia. When dietary intake was considered in individual food groups, we reported no relevant association between food groups and 3-OH FAs, suggesting that the matrix effect of dietary patterns would bring more properties than a specific food group on metabolic endotoxemia. A previous study found an association between a posteriori dietary patterns reflecting healthy food choices (e. g. , fish-based diet, healthy snacks and modern diets) and lower circulating levels of LPS, whereas no such association was reported with the usual intake of macronutrient level (31). According to the existing literature, impaired metabolic diseases could represent a key endogenous factor. One feature is that diabetes and obesity, both closely related to unhealthy diets and low-grade inflammatory state (54, 55), are associated with higher intestinal permeability and dysbiosis that could increase the absolute quantity of LPS in the microbiota as well as the translocation across the intestinal barrier, causing LPS to end up in the bloodstream (56). Elevated LPS levels among individuals with type 2 diabetes or obesity have consistently been reported (5759). Interestingly, some studies reported a more pronounced increase in endotoxemia among diabetics or obese individuals compared with endotoxemia among healthy individuals following the consumption of a similar high-fat meal (60). However, no interaction was reported between diabetes or obesity and DPs adherence in our study. Our results provide important insights into the association between DPs and a proxy of plasma LPS burden, although limitations should be acknowledged. First, the cross-sectional design of the present study prevented us from drawing a definite conclusion on the temporality of the association between DPs and circulating esterified-3-OH FAs levels. However, we already reported that the dietary habits of elderly individuals remain relatively stable over time, which counterbalanced this limit (61). We considered a wide range of potential cofounders but cannot exclude that some residual confounders or sources of misclassification, such as the portion size of the food groups, could explain our observations. Moreover, translating the total amount of esterified-3-OH FAs assessed by LC-MS/MS into LPS exposure appears difficult, as there is a wide range of LPS molecules whose biological effects differ according to their structure. 213 214 However, the widely used LAL method only measures the active fraction of LPS and may be susceptible to inducing false positive or negative results, especially in case of LPS neutralization by lipoproteins (62, 63). Therefore, our choice of the LC-MS/MS quantification method of esterified-3-OH-FAs improved the performance of the LAL technique by reducing the detection and quantification limits. Moreover, while LAL reactivity decreases rapidly following a spike in LPS in the bloodstream, the 3-OH FA concentration remains stable over time and may represent a better proxy of LPS burden in the longer term (22). Obvious strengths of the study include the target population of older adults who are more vulnerable to inflamm-aging, the sample size and the use of complementary approaches to identify DPs in relation to plasma esterified-3-OH FAs. The a priori approach used to assess Mediterranean diet adherence encourages comparison given its nonsample-dependent property to define thresholds of consumption. Moreover, the data-driven DP approach represents an essential complementary method to a priori methods considering a wider range of food groups and real-life practices. Conclusion Our results provide new insights into healthy dietary patterns, which could be key components in the LPS burden response in the elderly population, and the potential of food combinations should be considered in the endotoxemic response in future studies. Nutrition, and especially a greater adherence to plant-based dietary patterns, may represent a promising strategy to target metabolic endotoxemia as a root cause of inflammation across the lifespan and in individuals with various health conditions. 214 Reference 1. Savage DC. Microbial ecology of the gastrointestinal tract. Annu Rev Microbiol. 1977 ; 31 : 10733. 2. Mayeux PR. Pathobiology of lipopolysaccharide. J Toxicol Environ Health. 1997 ; 51 : 415 35. 3. Gutsmann T, Schromm AB, Brandenburg K. The physicochemistry of endotoxins in relation to bioactivity. Int J Med Microbiol IJMM. 2007 ; 297 : 34152. 4. Larsson L. 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This work has been supported by the FRAILOMIC Initiative (FP7- HEALTH-2012-Proposal No. 305483-2) and the ITMO Santé Publique - Alliance nationale pour les sciences de la vie et de la santé (AVIESAN) (ISP05 2014). Declarations of interest : None. The authors declare that they have no conflicts of interests in relation to the presented work. Author's contributions : CF, CH, CS, CD, BM and PA contributed to study concept and design. JP PdB performed biological analyses. PA performed statistical analysis and interpretation of data. PA prepared the manuscript. All authors critically reviewed and approved the manuscript for important intellectual content. 220 ANNEXE 7 Annexe 7 Lipopolysaccharide-Binding Protein, soluble CD14 and the long-term risk of Alzheimer's disease : a nested case-control pilot study of older community dwellers from the 3- City cohort Article proposé dans sa version non mise en forme, afin de respecter les conditions du Journal of Alzheimer's Disease dans lequel l'article est publié. Authors : Perrine André1* MPH, Cécilia Samieri1 PhD, Charline Buisson2, Jean-François Dartigues1 MD PhD, Catherine Helmer3 MD PhD, Fabienne Laugerette2 PhD, Catherine Féart1 PhD Affiliations : 1 Univ. Bordeaux, Inserm, Bordeaux Population Health Research Center, team Lifelong Exposure Health and Aging, U1219, F-33000 Bordeaux, France 2 Univ-Lyon, CarMeN laboratory, INRA U1397, Inserm U1060, Université Claude Bernard Lyon 1, INSA Lyon, Charles Mérieux Medical School, FR-69600 Oullins, France 3 INSERM, Clinical Investigation Center Clinical Epidemiology 1401, F-33000 Bordeaux, France Corresponding author : Perrine André Address : Team Lifelong Exposures, Health and Aging INSERM U1219 - Bordeaux Population Health Research Center, Bordeaux University, ISPED 146 rue Léo-Saignat, Bordeaux CedexFrance E-mail : perrine. andre@u-bordeaux. fr Phone : (33) 05 57 57 12 99 Declarations of interest : None. The authors declare that they have no conflicts of interests. 221 Funding : The Three-City Study is conducted under a partnership agreement between the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Victor Segalen Bordeaux2 University and the Sanofi-Synthélabo company. The Fondation pour la Recherche Médicale funded the preparation and beginning of the study. The 3C-Study is also sponsored by the Caisse Nationale Maladie des Travailleurs Salariés, Direction Générale de la Santé, Conseils Régionaux of Aquitaine and Bourgogne, Fondation de France, Ministry of Research-INSERM Program Cohortes et collections de données biologiques, the Fondation Plan Alzheimer (FCS 2009- 2012), and the Caisse Nationale pour la Solidarité et l'Autonomie (CNSA). This specific project was supported by ITMO Santé Publique - Alliance nationale pour les sciences de la vie et de la santé (AVIESAN) (ISP05 2014). 222 ABSTRACT Background. Identifying the mechanisms involved in the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD) remains crucially important. Chronic age-related low-grade inflammation is considered to be one such mechanism, although its causes are unclear. Lipopolysaccharide (LPS)-type endotoxins, a major component of the outer membrane of Gram-negative bacteria, are known as potent pro-inflammatory molecules. Therefore, we hypothesized that greater exposure to circulating LPS, potentially mediated by the inflammatory pathway, would be a key step of the onset of AD. Objective. The aim of this study was to investigate the link between plasma endotoxin- exposure, inflammation and AD. Methods. Applying a nested case-control design, we evaluated the associations among baseline plasma endotoxin-exposure (assessed by measuring LPS-Binding Protein (LBP) and soluble Cluster of Differentiation-14 (sCD14) levels), inflammation (assessed by measuring Interleukin-6 (IL6) levels), and the odds of developing AD over 12 years. Selected from a population-based cohort, 212 incident cases of AD were matched with 424 controls without dementia with regard to age, gender and education level. Results. After adjusting for a large set of confounders, including the use of anti-inflammatory drugs, only higher LBP levels were significantly associated with a 30% higher odds ratio of developing AD over 12 years (OR 1. 30, 95%CIs [1. 07 - 1. 59]), regardless of IL6 levels. Conclusion. This large case-control study provides preliminary results concerning plasma endotoxin-exposure among the elderly and suggests that higher LBP levels, an acute-phase reactant involved in the pro-inflammatory response to LPS, are associated with a higher odds of developing AD. Key words : (1) Alzheimer's disease, (2) LPS, (3) Endotoxins, (4) Inflammation, (5) Lipopolysaccharide-Binding Protein, (6) LBP, (7) sCD14, (8) Interleukin-6, (9) Dementia. 223 BACKGROUND Chronic systemic exposures to bacterial infections might play a role in the etiology of the chronic low-grade inflammation, involved in the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD) [1 4]. Endotoxins (Lipopolysaccharides, LPS), which are a major component of the outer membrane of Gram-negative bacteria [5, 6], trigger a potent inflammatory response by the host immune system. Home to a complex consortium of approximatively 100 trillion (1014) microorganisms, the gut microbiota is considered as the main reservoir of pro-inflammatory LPS. LPS are released from the bacteria membrane when bacteria are lysed. Although the gastro-intestinal barrier acts at the interface between the host and the environment to avoid LPS translocation into the bloodstream, some endogenous or exogenous factors might alter this protective function [79]. For instance, the immune system is weakened with aging, offering the possibility for microbiota bacteria to act as opportunistic pathogens [7]. Moreover, diseases such as diabetes or obesity, as well as the intake of antibiotics or unhealthy dietary habits have been associated with gut microbiota dysbiosis, which might contribute to elevate the amount of LPS in the gut and promote LPS translocation (especially during lipid digestion) [814]. Gut dysbiosis has also been suggested as playing a role AD [3, 15], and might affect the total amount of circulating LPS. LPS might also originate from the skin, mucous membranes or local sites of infection such as periodontal infection, chronic bacterial gingivitis, which are both suggested to be associated with AD [1618]. The toxic nature of plasma endotoxemia, which is defined as the presence of LPS in the bloodstream, results from the binding and transport of LPS to co-receptor effector cells to activate potent pro-inflammatory signaling pathways. Briefly, LPS are supported in the plasma by the LPS-Binding Protein (LBP) and transported to the co-receptor Cluster-of-Differentiation 14 (CD14), which is present either in a membrane-anchored form (mCD14) or in a soluble circulating form (sCD14). Thus, LPS could contribute to amyloidogenesis, oxidative stress burden and age-related inflammatory processes via the activation of the nuclear factor-kappa B (NF-B) pathway and the overproduction of pro-inflammatory cytokines such as Interleukin-6 (IL6) or Tumor Necrosis factor (TNF) [1923]. Inflammatory processes are likely involved in the pathogenesis of AD as a triggering factor [2427], inducing irreversible tissue sequelae such as neurofibrillary degeneration, neuronal death and impaired cognitive function [25, 26, 28]. However, the vast majority of studies examining the association between endotoxemia and cognitive performances are limited to animal studies. In fact, systemic LPS administration inducing neuroinflammation and neurodegeneration in animals [29, 30], as well as the hallmark disorders of AD [28, 3133]. However, the extrapolation of results obtained from animal models to humans is likely inappropriate and largely unexplored [34]. In a cross-sectional study of humans, Zhang et al. observed LPS circulating levels 3 times higher in patients with AD (n 18) than in healthy participants (n 18) [1]. Another cross-sectional study reported an average level of LPS that was two to three times higher in the neocortex and hippocampus of patients with AD compared with age-matched controls, and up to 26 times higher in patients with severe forms of AD [4]. In particular, LPS seems to colocalize with A1-40/42 in amyloid plaques and with A1-40/42 in AD brains [2]. When injected, a low-dose of LPS (0. 2 ng/kg) in healthy young volunteers is is a widely accepted model for 224 significantly associated with the circulating increase of inflammatory markers (IL6 and TNF), inversely correlated with declarative memory performance after 24 h [35], whereas larger dose of endotoxin (1 mg) into adult human reproduces all the manifestations of septic shock syndrome, followed by multi-organ dysfunction within 2h (hepatic and renal function abnormalities, hypotension and non-cardiogenic pulmonary edema, for example) [36]. Circulating LBP was also recently found negatively associated with white matter integrity and cognitive performance among 44 obese or healthy participants [37]. Based on the existing literature, we hypothesized that higher exposure to circulating LPS might be associated with the pathogenesis of AD, and potentially mediated by the inflammatory pathway. To the best of our knowledge, no study to date has investigated the long-term effects of plasma endotoxemia in the elderly, especially in the pathological context of AD. In the present nested case-control study, we evaluated the associations between baseline plasma LBP and sCD14 levels, which have been both suggested as clinically relevant markers of LPS-related exposure [3840], baseline plasma IL6 as a marker of inflammation, and the odds of developing AD among elderly community dwellers who were followed up for 12 years. 225 METHODS Study population The Three-City (3C) study is a French population-based prospective cohort initiated in 1999 to study the vascular risk factors of dementia. It includes 9294 community dwellers aged 65 and over from three French cities : Bordeaux (n 2104), Dijon (n 4931) and Montpellier (n 2259). The protocol was approved by the Consultative Committee for the Protection of Persons participating in Biomedical Research at Kremlin-Bicêtre University Hospital (Paris, France). All participants provided written informed consent. The protocol of the 3C study and the participants' baseline characteristics were described previously [41]. The baseline data collected during face-to-face interviews included sociodemographic and lifestyle factors, health and anthropometric-related characteristics, neuropsychological testing and blood sampling. Follow-up examinations were conducted at regular intervals 2, 4, 7, 10 and 12 years after baseline along with an active diagnosis of dementia. The present study took place at the Bordeaux center, where an ancillary study of plasma endotoxemia and AD was initiated in 2015. Diagnosis of dementia The diagnosis of dementia was based on a three-step procedure based on the criteria from the Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (Fourth Edition) [42]. We choose to keep this scale over time, although updated, to avoid a misclassification bias due to the differences in diagnosis criteria. The first step involved a battery of neuropsychological tests conducted by a trained psychologist that including the Mini Mental State Examination (MMSE), the Isaacs Set Test (IST), the Benton Visual Retention Test (BVRT), the Trail Making Test A&B (TMT A&B) and the Free and Cued Selective Reminding Test (FCRST) (for detailed see [41]). For cases of suspected dementia, the second step was initiated by a neurologist who performed a clinical exam to establish a diagnosis. The final step included a review of all potential cases of dementia by an independent committee of neurologists to validate the diagnosis and etiology of dementia based on the guidelines of the National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke and the Alzheimer's Disease and Related Disorders Association (NINCDS-ADRDA). Study sample This study used a nested case-control design using the 3C-Bordeaux cohort, which had participants who were followed for 12 years. All incident cases classified as probable or possible AD or mixed dementia according to the NINCDS-ADRDA criteria as well as those who had an available plasma blood sample at baseline were selected and matched with controls at a 1 : 2 ratio. For each case, a control pool was selected among living participants who were free from dementia at the same age when the cases were diagnosed. Therefore, 212 incident cases were successfully matched with 424 controls based on age at baseline 1. 5 years, gender and education level (considered as low vs high, i. e. , less than 10 years of school and greater than 10 years of school respectively), which resulted in a study sample of 636 participants. 226 Assessment of LBP, sCD14 and IL6 levels Blood samples were obtained at baseline after fasting overnight and stored at -80C until they were analyzed. LPS exposure is difficult to assay and requires specific sampling conditions. Therefore, we chose to assess LBP levels in this exploratory study. This protein plays a critical role in the pro-inflammatory response to LPS [43, 44], and is a better long-term marker of endotoxin-related exposure than LPS themselves [45]. Thus, LBP measurements are likely to be more reliable for assessing the transient kinetics of endotoxin translocation [45], although they do not really reflect the activity of LPS. Both LBP and sCD14 have been proposed as clinically relevant markers of LPS-related exposure [3840]. Sandwich ELISA kits (Hycult Biotechnology, Uden, Netherlands) were used to determine the circulating levels of LBP and sCD14. Serum IL6 levels were measured using ELISA kits (Quantikine, Abingdon, UK). Intra- and inter-assay CVs were respectively 2. 2% and 4. 1% for LBP, 5. 5% and 6. 3% for CD14 and 7. 2% and 8. 3% for IL6. Samples were randomized by diagnosis across plates to minimize the variation effects during biological analyses. Duplicate samples were measured, and the mean value was used in the subsequent statistical analyses. Covariates Sociodemographic and lifestyle characteristics were collected, including age, gender and education level, at study inclusion. These data were complemented by the Apolipoprotein 4 (Apo4) genotype, which was defined as the presence of at least one 4 allele versus no 4 allele. Mini Mental State Examination (MMSE) test scores were used to determine global cognitive performance at baseline (this score ranges from 0 to 30, with higher scores indicating better performance) [46]. Multi-comorbidity was defined using a continuous score (representing the number of comorbidities among the following : all-cause cancer, hypertension (blood pressure above 140/90 mmHg or taking antihypertensive medication), hypercholesterolemia (cholesterol 6. 2 mmol/L or taking anti-cholesterol medication), cardiovascular history (including myocardial infarction or cardiac and vascular surgery or arteritis or stroke), diabetes (including reported diabetes or fasting blood glucose 7 mmol/L or non-fasting glucose 11 mmol/L or oral diabetes medication), depressive symptomatology (defined as Center for Epidemiologic Studies Depression Scale (CES-D)-scores of > 17 for men and > 23 for women, based on a threshold validated using a French sample [47]) and asthma. The presence of 4 or more comorbidities was grouped into one category due to the low number of participants with more than 4 comorbidities. Body Mass Index (BMI) (considered in 3 categories : < 21 kg/m for underweight, 21-27 kg/m for normal weight and > 27 kg/m for overweight, i. e. , cutoffs adapted to the elderly [48]), total drug consumption (classified as low consumption, poly-medication or hyper-poly-medication for the regular consumption, i. e. , taken several times a week, of < 5, 5-9 or > 9 regular drugs, respectively) and specific anti- inflammatory drug consumption (nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) and/or corticosteroids) were also collected. 227 Statistical analyses Quantitative and qualitative variables were expressed as medians interquartile ranges (IQRs) or frequencies (percentages) and compared using Student's t-test for paired data (Wilcoxon test for non-Gaussian variables) or McNemar's Chi2 test based on the AD status, respectively. Conditional logistic regressions were used to evaluate the multivariate associations between 1 standard deviation (SD) of LBP, sCD14 or IL6, which were also considered individually, and the incidence of AD over 12 years. The model was first adjusted for the Apo4 genotype, BMI and the number of comorbidities (Model 1). The model was further adjusted for the number of drugs used regularly per week and the specific consumption of NSAIDs and corticoids (Model 2). A final model (Model 3) included the covariates from Model 2 and all three exposures simultaneously (i. e. , LBP, sCD14 and IL6). Sensitive analyses were performed with LBP, sCD14 or IL6, separately, which were considered as tertiles. The statistical significance was set at P < 0. 05. Missing data represented less than 4% of the study sample, we thus assigned the reference category for qualitative variables or the median for quantitative. Statistical analyses were performed using SAS version 9. 4 (SAS Institute Inc. , Cary, 134 NC, USA). RESULTS Sample characteristics Participants were 76. 4 years old on average (range : 66. 3 - 87. 0) at baseline, and 72% were women. Almost 44% had a low education level. The follow-up duration was 8. 6 years (range : 0. 76 13. 2) and the average age at AD diagnosis was 82. 4 years. The average MMSE scores were 26. 6 and 27. 4 out of 30 for incident cases and controls, respectively. Overall, AD cases did not significantly differ from controls with regard to clinical data (BMI category, number of multi-comorbidities and the presence of diabetes, hypertension, depressive symptomatology and history of cardiovascular diseases) (Table 1). However, AD cases consumed more drugs than those who did not have dementia. The genotype Apo4 was present in 28. 4% of all AD cases and in 14. 4% of their counterparts. The consumption of specific anti-inflammatory drugs at baseline was higher among AD cases than controls, but this difference was not significant. 228 Table 1. Baseline characteristics of the participants based on the Alzheimer's disease status over 12 years, nested case-control in the 3C Bordeaux cohort (n 636). Baseline characteristics Incident AD cases (n 212) Controls (n 424) Apo4 genotype BMI (kg/m) Underweight (< 21kg/m) Normal weight (21-27 kg/m) Overweight (> 27kg/m) Multi-comorbidity 0 1 2 3 4 Diabetes History of cardiovascular diseases Hypertension Depressive symptomatology Drug consumption < 5 5-9 (poly-medication) > 9 (hyper-poly-medication) Anti-inflammatory drug consumption 60 (28. 4) 20 (9. 6) 119 (57. 2) 69 (33. 2) 24 (11. 3) 88 (41. 5) 67 (31. 6) 23 (10. 9) 10 (4. 7) 31 (15. 0) 23 (10. 9) 165 (77. 8) 25 (11. 9) 85 (40. 1) 95 (44. 8) 32 (15. 1) 43 (20. 3) 61 (14. 4) 27 (6. 4) 228 (54. 2) 166 (39. 4) 51 (12. 0) 193 (45. 5) 124 (29. 3) 48 (11. 3) 8 (1. 9) 41 (9. 8) 36 (8. 5) 334 (78. 8) 32 (7. 6) 216 (51. 0) 177 (41. 7) 31 (7. 3) 66 (15. 7) p-value 0. 001 0. 092 0. 762 0. 199 0. 237 0. 708 0. 250 0. 017 0. 553 Values are median IQR or number (%). Abbreviations : Apo4 Apolipoprotein 4, BMI Body Mass Index. 229 Regarding the circulating median rates of plasma endotoxemia markers, LBP levels were significantly higher among AD cases than controls, whereas sCD14 levels were not (Table 2). IL6 levels were slightly higher among AD cases than controls, but this difference was not significant. Table 2. Baseline levels of Lipopolysaccharide Binding Protein (LBP), soluble cluster of differentiation-14 (sCD14) and Interleukin-6 (IL6) based on the Alzheimer's disease status over 12 years, nested case-control in the 3C Bordeaux cohort (n 636). Incident AD cases (n 212) Controls (n 424) LBP (g/mL) 35. 0 20. 3 30. 2 20. 6 sCD14 (g/mL) IL6 (g/mL) 3. 2 1. 6 3. 8 5. 5 3. 0 1. 8 3. 2 5. 6 p-value 0. 072 0. 179 Values are median IQR. Abbreviations : LBP Lipopolysaccharide Binding Protein, sCD14 soluble Cluster of Differentiation 14, IL6 Interleukin 6. Multivariate associations between LBP, sCD14, or IL6 and the odds of developing Alzheimer's disease In Model 1, one additional SD of LBP was significantly associated with a 33% higher odds of developing AD over 12 years (OR 1. 33, 95%CIs [1. 10 - 1. 60]) (Table 3). This result was virtually unchanged after an additional adjustment was made for drug consumption (total and specific in anti-inflammatory drugs) in Model 2 (OR 1. 29, 95%CIs [1. 07 - 1. 57]). Finally, the simultaneous adjustment for IL6 and sCD14 in Model 3 did not affect the association between LBP levels at baseline and a higher odds of AD (OR 1. 30, 95%CIs [1. 07 - 1. 59]). We did not find an association between baseline sCD14 levels and the odds of AD, as well as between IL6 levels and the odds of AD over 12 years in either partial or fully adjusted models. Again, when LBP, sCD14 and IL6 levels were considered in the model simultaneously, no significant association was observed between baseline sCD14 levels and the odds of AD (OR 0. 98, 95%CIs [0. 81 - 1. 17]) or between IL6 levels and the odds of AD (OR 1. 09, 95%CIs [0. 93 - 1. 29]). 230 Table 3. Multivariate associations between Lipopolysaccharide Binding Protein (LBP), soluble cluster of differentiation-14 (sCD14), Interleukin-6 (IL6) and the odds of developing Alzheimer's disease over 12 years, nested case-control in the 3C Bordeaux cohort (n 636). Odds of Alzheimer's disease (OR [95% CIs]) * Model 1 Model 2 Model 3 OR [95% CIs] p-value OR [95% CIs] p-value OR [95% CIs] p-value LBP (g/mL) 1. 33 [1. 10 - 1. 60] 0. 004 1. 29 [1. 07 - 1. 57] 0. 009 1. 30 [1. 07 - 1. 59] 0. 010 sCD14 (g/mL) IL6 (pg/mL) 1. 09 [0. 92 - 1. 28] 0. 316 1. 06 [0. 89 - 1. 25] 0. 537 0. 98 [0. 81 - 1. 17] 0. 787 1. 09 [0. 92 - 1. 29] 0. 305 1. 10 [0. 93 - 1. 31] 0. 283 1. 09 [0. 93 - 1. 29] 0. 279 * For each one additional standard deviation of the exposure variable. Models 1 and 2 are separated models for each marker. Model 1 : adjusted for Apo4, BMI and score of multi- comorbidity. Model 2 : covariates from Model 1 plus number of regular drugs consumed per week and intake of non-steroidal anti-inflammatory or corticoids drugs. Model 3 : covariates from Model 2 plus simultaneous adjustment for other exposure variables (LBP, sCD14 and IL6 considered simultaneously). Abbreviations : Apo4 Apolipoprotein 4, BMI Body Mass Index, LBP Lipopolysaccharide Binding Protein, sCD14 soluble Cluster of Differentiation 14, IL6 Interleukin 6, SD standard deviation. Sensitive analyses When considered as tertiles, the highest tertile of LBP was significantly associated with an increased odds of AD compared with the lowest tertile (OR 1. 83, 95%CIs [1. 16 - 2. 91]) in Model 2 (Table 4). An additional adjustment for sCD14 and IL6 levels (Model 3) did not change the overall significant association between LBP tertiles and the odds of AD. When sCD14 and IL6 were considered as tertiles of exposure, we did not find any significant association with regard to the odds of AD, regardless of the model being considered (Supplementary Table 1). 231 Table 4. Multivariate association between Lipopolysaccharide Binding Protein (LBP) levels considered as tertiles and the odds of developing Alzheimer's disease over 12 years, nested case-control in the 3C Bordeaux cohort (n 636). LBP (g/mL) Tertile 1 (< 24. 97) Tertile 2 (24. 97 - 39. 03) Tertile 3 (> 39. 03) Odds of Alzheimer's disease (OR [95% CIs]) Model 1 OR [95% CIs] 1. 00 [Reference] 1. 56 [1. 00 - 2. 44] 1. 97 [1. 25 - 3. 09] p-value 0. 048 0. 003 Model 2 Model 3 0. 013 * OR [95% CIs] 1. 00 [Reference] 1. 50 [0. 96 - 2. 34] 1. 83 [1. 16 - 2. 91] p-value OR [95% CIs] p-value 0. 034 * 0. 075 0. 010 1. 00 [Reference] 1. 52 [0. 97 - 2. 37] 1. 87 [1. 15 - 3. 05] 0. 038 * 0. 069 0. 012 * Overall p-value. Models 1 and 2 are separated models for each marker. Models 1 and 2 are separated models for each marker. Model 1 : adjusted for Apo4, BMI and score of multi-comorbidity. Model 2 : covariates from Model 1 plus number of regular drugs consumed per week and intake of non-steroidal anti-inflammatory or corticoids drugs. Model 3 : covariates from Model 2 plus simultaneous adjustment for other exposure variables (LBP, sCD14 and IL6 considered simultaneously). Abbreviations : Apo4 Apolipoprotein 4, BMI Body Mass Index, LBP Lipopolysaccharide Binding Protein, sCD14 soluble Cluster of Differentiation 14, IL6 Interleukin 6. 232 DISCUSSION To the best of our knowledge, this nested case-control study is the first to investigate the relationship between plasma-endotoxin exposure and the odds of AD incidence among elderly community dwellers over 12 years. Our results suggest that higher baseline levels of LBP, considered as a relevant long-term marker of plasma endotoxin-exposure, were significantly associated with a 30% higher odds of developing AD after controlling for a large set of potential clinical and lifestyle confounders. A comparison of the present results with those in the existing literature is difficult ; no author has yet evaluated the same association as us. The most similar result comes from the cross- sectional study of Zhang et al. , who observed LPS levels 3 times higher among participants with AD compared with controls [1]. However, this result was limited by the small number of participants and the selection of cases from a memory clinic, which led to the recruitment of severely affected participants. The conditions required to specifically assess LPS levels were not anticipated at the time blood samples were collected for the 3C study, which prevented us from measuring LPS and strictly comparing our results with those of Zhang et al. ; however, both sets of results suggest that elevated endotoxin-exposure could be involved in the pathological processes of AD. LBP is a secreted acute-phase reactant, whose expression is induced 10- to 50-fold during the immunologic response to Gram-negative bacterial infection ; it binds with high affinity to LPS thereby ensuring its transport to elicit immune responses by presenting LPS to the cell surface pattern recognition receptors CD14 and TLR4 [49, 50]. Several studies have demonstrated the critical role of LBP in the pro-inflammatory response to LPS [43, 44]. The present findings corroborate previous results indicating that higher LBP levels are associated with impaired white matter integrity and cognitive performance [37], and they are observed in pathological conditions in general, such as among individuals who are overweight or obese [51] as well as those who have bacterial infections [13], type 2 diabetes mellitus [52], stroke [53], coronary artery disease [14] and sepsis [12]. Interestingly, the present study found no significant difference regarding LBP levels based on diabetic status. Furthermore, considering diabetes as a single covariate (and not as an item of comorbidities variable) did not change our results (data not shown). The levels of LBP measured here remain difficult to compare with the available literature, especially because of the heterogeneity of studied groups (i. e. , age, disease considered), the small number of participants and the broad spectrum of LBP values among studies varying from 4 to 97 g/mL in the previous literature [37, 5456]. Overall, the LBP levels measured in the present study are somewhat higher than those found among healthy adults, and are close to those observed in patients with systemic inflammatory response syndrome [57, 58]. The clinical relevance of the observed difference in LBP levels between cases and controls in our study needs to be discussed. Because no clinical threshold has been currently defined for plasma endotoxins as a marker of pathological processes, especially for elderly individuals, we performed sensitive analyses using tertiles of LBP levels and observed a dose-response trend between baseline LBP levels and an increased odds of developing AD. Thus, our results suggest the presence of a linear relationship between LBP levels and the odds of developing AD, 233 although further research is still required to draw a definite conclusion and propose a relevant threshold to potentially predict the odds of developing AD using this marker. Finally, a recent gut dysbiosis was reported among patients with AD compared with controls [15] that might partially modulate LPS translocation and explain some of our results. In contrast with LBP, no association was observed between baseline sCD14 levels and the odds of developing AD in our study. In the absence of available literature on this topic, we have no obvious explanation for these findings, and can only propose speculative assumptions. One possible explanation for the null association between sCD14 and AD might rely on the fact that this marker represents only the soluble part of the CD14 receptor [59]. CD14 exists in two distinct and complementary forms. The membrane-anchored form (mCD14) is generally expressed and synthesized to respond to the eventual presence of LPS, whereas the soluble circulating form (sCD14) would be in an unusual and important influx of LPS. More precisely, sCD14 would be produced either by the cleavage of the membrane form or secreted directly by certain cell types (especially endothelial cells) to activate cells that do not present the membrane-anchored form mCD14 [59, 60]. It would have been interesting to study mCD14 and the soluble circulating form to assess overall CD14 exposure in the present sample, however this measure was not available due to the specific sampling conditions required for mCD14 assessment. Another explanation could be the lack of relevance for sCD14 as a marker of endotoxins exposure, specifically among elderly individuals. More research is required to interpret these findings. Regarding the inflammatory marker, no association was observed between baseline IL6 levels and the odds of developing AD in the present sample ; furthermore this association appears to be inconsistent in the current literature. Although most studies have reported that high levels of IL6 increase the risk of AD [61, 62], others have found no association [63, 64] or only found an association between IL6 levels and early AD (i. e. , before 65 years), which was not represented in our study [65]. Because the production of pro-inflammatory cytokines likely partially results from the LPS- induced signaling pathways, we expected to observe higher IL6 levels in future AD cases based on LBP levels. However, LBP was considered to be a clinically relevant marker of long-term endotoxin-related exposure and potential pro-inflammatory outcomes, as long as the half-life is longer (12-24 h) than IL6 (4-6 h) after LPS exposure [38, 66, 67]. Higher LBP levels in patients with AD, rather than IL6 levels, might suggest the involvement of environmental factors such as diet on plasma endotoxemia, which increases the transitory translocation of LPS into the bloodstream during lipid digestion [6870]. The blood samples obtained after an overnight fast might have influenced the levels of the studied biomarkers. A significant amount of missing nutritional data limit the ability of this case-control study to explore this hypothesis ; although speculative, this hypothesis would benefit from complementary analyses. Certain limitations of the present work should be emphasized. First, given the specific sampling conditions for LPS that were not anticipated at the time of the baseline blood collection and the lack of reproducibility associated with LPS measures in human blood, these measures were not assayed. LBP was considered as a longer-term marker of endotoxin-related exposure than LPS given the brief plasma half-life of LPS and its irregular translocation from the gastrointestinal 234 barrier into the bloodstream [45]. However, LBP does not actually reflect the biological activity of LPS, which differs because their molecular structures vary in composition according to the considered bacterial species and might have different cellular effects. The endotoxin-associated activity assessed by the Limulus Amebocyte Lysate (LAL) test could be proposed as a perspective to go a step forward the observations of this exploratory study. Second, only one measure of the biomarker was available at baseline in our study. Citronberg et al. provided information on the temporal reliability of plasma LBP to reflect moderate-term exposure to endotoxins over months [54] ; however, the relevance and variation of this marker to reflect long-term exposure (over years) remains unknown. Finally, another inflammatory marker (i. e. , the Tumor Necrosis Factor (TNF) was considered and measured, but its levels were below the detection limit of the ELISA kit and therefore not analyzed in the present study. Our study also has important strengths. Its obvious strengths include its longitudinal design with a 12-year follow-up (which minimizes the risk of conclusions of reverse causation between LBP and the odds of developing AD), large sample size and the nested case-control study design using a population-based cohort. Furthermore, the consideration of a large range of sociodemographic, lifestyle, clinical and biological factors reduced confounding effects, however, confounding factors might persist in this observational study. Conclusions We observed a significant association between higher LBP levels at baseline, a biomarker of endotoxins exposure, and a higher odds of developing AD over 12 years in a large population- based sample of elderly French people. No association was observed between the soluble co- receptor CD14 or IL6 levels at baseline and the odds of developing AD. These first exploratory results regarding plasma endotoxins exposure in an elderly sample will provide potential pathways to investigate AD, which has complex mechanisms that warrant further investigation. 235 REFERENCES [1] Zhang R, Miller RG, Gascon R, Champion S, Katz J, Lancero M, Narvaez A, Honrada R, Ruvalcaba D, McGrath MS (2009) Circulating endotoxin and systemic immune activation in sporadic amyotrophic lateral sclerosis (sALS). J Neuroimmunol 206, 121124. [2] Zhan X, Stamova B, Jin L-W, DeCarli C, Phinney B, Sharp FR (2016) Gram-negative bacterial molecules associate with Alzheimer disease pathology. Neurology 87, 23242332. [3] Zhuang Z-Q, Shen L-L, Li W-W, Fu X, Zeng F, Gui L, L Y, Cai M, Zhu C, Tan Y-L, Zheng P, Li H-Y, Zhu J, Zhou H-D, Bu X-L, Wang Y-J (2018) Gut Microbiota is Altered in Patients with Alzheimer's Disease. 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Odds of Alzheimer's disease (OR [95% CIs]) Model 1 Model 2 Model 3 sCD14 (g/mL) OR [95% CIs] p-value OR [95% CIs] p-value OR [95% CIs] p-value Tertile 1 (< 2. 62) Tertile 2 (2. 62 3. 66) Tertile 3 (> 3. 66) 1. 00 [Reference] 1. 32 [0. 85 2. 05] 1. 46 [0. 97 2. 20] 0. 221 0. 073 0. 190 a 1. 00 [Reference] 1. 33 [0. 86 - 2. 08] 1. 37 [0. 90 - 2. 09] 0. 205 0. 143 0. 285 a 1. 00 [Reference] 1. 17 [0. 74 - 1. 86] 1. 12 [0. 71 - 1. 77] 0. 788 a 0. 500 0. 624 IL6 (g/mL) OR [95% CIs] p-value OR [95% CIs] p-value OR [95% CIs] p-value Tertile 1 (< 1. 97) Tertile 2 (1. 97 5. 62) Tertile 3 (> 5. 62) 1. 00 [Reference] 1. 25 [0. 83 - 1. 90] 1. 34 [0. 87 - 2. 08] 0. 293 0. 188 0. 390 a 1. 00 [Reference] 1. 26 [0. 83 - 1. 92] 1. 31 [0. 84 - 2. 04] 0. 285 0. 232 0. 433 a 1. 00 [Reference] 1. 20 [0. 79 - 1. 84] 1. 18 [0. 74 - 1. 88] 0. 670 a 0. 398 0. 482 a Overall p-value. Models 1 and 2 are separated models for each marker. Model 1 : adjusted for Apo4, BMI and score of multi-comorbidity. Model 2 : covariates from Model 1 plus number of regular drugs consumed per week and intake of non-steroidal anti-inflammatory or corticoids drugs. Model 3 : covariates from Model 2 plus simultaneous adjustment for other exposure variables (LBP, sCD14 and IL6 considered simultaneously). Abbreviations : Apo4 Apolipoprotein 4, BMI Body Mass Index, LBP Lipopolysaccharide Binding Protein, sCD14 soluble Cluster of Differentiation 14, IL6 Interleukin 6. 243 | HAL | Scientific |
Indications a l'imagerie dans la lombalgie chez l'adulte | WMT16 | Scientific |
Etude épidémiologique des helminthiases intestinales à l'le de la Tortue (Haiti). 2. Evaluation de la charge parasitaire par la méthode de Kato | WMT16 | Scientific |
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MEDECIN General Inspecteur Charles Dopter (2 décembre 1873-4 mai 1950) | WMT16 | Scientific |
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COMMISSION DE LA TRANSPARENCE Avis 27 juin 2018 sildénafil BALCOGA 20 mg, comprimé pelliculé B/ 90 (CIP : 34009 301 381 9 9) Laboratoire SANDOZ Code ATC G04BE03 (sildenafil) Motif de l'examen Inscription Listes concernées Collectivités (CSP L. 5123-2) Adultes Traitement des patients adultes atteints d'hypertension artérielle pulmonaire de classe fonctionnelle II et Ill de l'OMS, afin d'améliorer la capacité d'effort. L'efficacité a été démontrée dans l'hypertension artérielle pulmonaire idiopathique et dans l'hypertension artérielle pulmonaire associée à une maladie du tissu conjonctif. Indications concernées Population pédiatrique Traitement de l'hypertension artérielle pulmonaire chez les patients pédiatriques âgés de 1 an a 17 ans. L'efficacité en termes d'amélioration de la capacité d'effort ou de l'hémodynamique pulmonaire a été montrée dans l'hypertension artérielle pulmonaire idiopathique et dans l'hypertension artérielle pulmonaire associée à une cardiopathie congénitale HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 1/2 Avis1 01 INFORMATIONS ADMINISTRATIVES ET REGLEMENTAIRES AMM Date initiale (procédure décentralisée) : 15 février 2018 Conditions de Liste I prescription et de Médicament soumis à prescription hospitalière. délivrance / statut Prescription réservée aux spécialistes en pneumologie, en cardiologie ou particulier en médecine interne. 02 CONTEXTE Il s'agit d'une demande d'inscription sur la liste des médicaments agréés aux collectivités de la spécialité BALCOGA 20 mg, comprimé pelliculé, générique de REVATIO 20 mg, comprimé pelliculé. 03 CONCLUSIONS DE LA COMMISSION Considérant l'ensemble de ces données et informations et après débat et vote, la Commission estime : 03. 1 Service Médical Rendu La Commission considère que le service médical rendu par BALCOGA 20 mg, comprimé pelliculé, est modéré dans les indications de l'AMM. La Commission donne un avis favorable à l'inscription sur la liste des spécialités agréées à l'usage des collectivités dans les indications et aux posologies de l'AMM. 03. 2 Amélioration du Service Médical Rendu En tant que médicament générique, BALCOGA 20 mg, comprimé pelliculé, n'apporte pas d'amélioration du service médical rendu (ASMR V) par rapport REVATIO 20 mg, comprimé pelliculé. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 2/2 Avis1 | HAS | Scientific |
Le lactosérum ( petit-lait , partie liquide du lait) a ensuite été concentré afin de donner le produit Locatim. | EMEA_V3 | Medicinal |
Hôpital multisite : une solution d'avenir ? | WMT16 | Scientific |
Une étude multicentrique non-comparative de phase II en ouvert de la clofarabine a été menée afin de déterminer le taux de rémission globale (RG) chez des patients lourdement prétraités ( 21 ans au moment du diagnostic initial) avec LAL en rechute ou réfractaire selon la classification FAB (French- American-British classification). | EMEA_V3 | Medicinal |
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Le vaccin ne contient aucun PCV2 vivant. | EMEA_V3 | Medicinal |
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A propos de l'âge maternel dans la trisomie 21 | WMT16 | Scientific |
7 radioactif conformément aux exigences locales. | EMEA_V3 | Medicinal |
Nul n'est censé ignorer . comment faire face a l'accusation de polypragmasie | WMT16 | Scientific |
Aucune accumulation de la substance active n' a été observée dans le plasma après l'administration de doses multiples tous les 28 jours. | EMEA_V3 | Medicinal |
Nécrose utérine après embolisation hémostatique des artères utérines | WMT16 | Scientific |
Phénomène de Raynaud et sclérodermie | WMT16 | Scientific |
247 une infection ou une maladie (en particulier des diarrhées ou vomissements) ; des changements de vos besoins en insuline ; une insuffisance rénale ou hépatique en voie d'aggravation. | EMEA_V3 | Medicinal |
Rôle de la lysyl-ARNt synthétase mitochondriale humaine dans la réplication du VIH-1 Lydia Kobbi To cite this version : Lydia Kobbi. Rôle de la lysyl-ARNt synthétase mitochondriale humaine dans la réplication du VIH-1. Sciences agricoles. Université Paris Sud - Paris XI, 2011. Français. tel- 00684390 NNT : 2011PA114827. HAL Id : tel-00684390 Submitted on 2 Apr 2012 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. UNIVERSITÉ PARIS-SUD 11 ECOLE DOCTORALE : INNOVATION THÉRAPEUTIQUE : DU FONDAMENTAL A L'APPLIQUÉ PÔLE : INGENIERIE DES PROTEINES ET CIBLES THERAPEUTIQUES DISCIPLINE : Sciences ANNÉE 2011 - 2012 SÉRIE DOCTORAT THÈSE DE DOCTORAT soutenue le 07/11/2011 par Lydia KOBBI Rôle de la lysyl-ARNt synthétase mitochondriale humaine dans la réplication du VIH-1. Directeur de thèse : Marc MIRANDE Composition du jury : Président du jury : Rapporteurs : Examinateurs : DR-CNRS (Gif-sur-Yvette) Herman VAN THILBEURGH Carine TISNE Roland MARQUET Maryléne MOUGEL PR-UPS (Orsay) DR-CNRS (Paris) DR-CNRS (Strasbourg) DR-CNRS (Montpellier) A ma grand-mère Mamas A mes parents Ferroudja et Mohamed Remerciements Je remercie sincèrement le Dr Carine TISNE et le Dr Roland MARQUET de m'avoir fait l'honneur et pris le temps de juger le manuscrit de ce travail de thèse. Vos remarques et suggestions auront contribués à améliorer la qualité de ce dernier. Je remercie également le Dr Marylène MOUGEL d'avoir accepté d'être examinateur de cette thèse. Enfin, je remercie tout particulièrement le Pr Herman VAN THILBEURGH pour avoir accepté de présider le jury et pour sa gentillesse lors de nos entretiens annuels. Je remercie vivement le Dr Jacqueline CHERFILS de m'avoir accueillie au LEBS durant ces trois années de thèse. Je la remercie également pour son implication dans le suivi annuel de tous les étudiants de son laboratoire. C'est avec beaucoup de reconnaissance que je souhaite remercier mon directeur de thèse le Dr Marc MIRANDE, pour la formation scientifique de qualité qu'il m'a donné. Sa grande rigueur scientifique et sa passion pour les synthétases m'ont beaucoup appris. Je voudrais aussi le remercier pour le temps qu'il m'a accordé tout au long de ces années, pour sa présence et sa modestie. Merci de m'avoir guidée et conseillée, je pars avec un bagage scientifique très enrichi. Je remercie très chaleureusement l'ensemble de mon équipe. Je commence par Martine parce que c'est elle qui a le plus supporté ma présence durant ces trois années, vraiment merci pour tout ce que tu as fait pour moi tant au labo qu'à l'extérieur ! C'est beaucoup, j'espère sincèrement qu'on restera en contact. Les post-doc Guillaume (guigui) et José (l'indien). Votre présence dans l'équipe au début de ma thèse était pour moi d'un grand réconfort merci pour votre aide précieuse et pour toutes les anneries que vous m'avez appris surtout toi l'indien . A ton tour Svéta (ou lana, ça dépend des labo o tu te trouvais mais j'ai le mérite d'avoir été la seule à pouvoir prononcer Svitlana correctement et sans accent), merci pour ta gentillesse et surtout de m'avoir aidé à maitriser les Macs grâce à tes doigts de fée. A l'arrivée de nos stagiaires M2 Azaria et Aurélien, l'équipe a pris une autre tournure et surtout pour moi depuis le début j'étais la plus jeune de l'équipe, la dernière arrivée mais avec vous ça a bien changé j'étais enfin la plus vieille des étudiantes j'étais vraiment comblée à ce moment là et on a bien rigolé ensemble ; ) sans oublier Ricardo, Amadou, Antoine et Tania. Je tiens également à remercier tous les membres de l'équipe 06. Amira (Mirou), Merci pour tout, tes conseils, ta joie de vivre, les fous rires qu'on a eu ensemble et tout les moments mémorables que nous avons partagé. Une vraie amitié est née et je t'adore . Kaheina ma compatriote, tu es un exemple de pureté d'esprit, Audrey, Marcia, Isaline, les filles merci de m'avoir incluses dans votre clan ! Je n'oublierais jamais nos sorties à travers la France et toutes les fois o nous avions pris un verre nocturne tardif. Valérie. C, merci pour ta bonne humeur, tu es la meilleure ! Dominique (Hassan), merci pour nos le mouhahahahahahaha. Je termine par Aline et Philippe (Fliflou) de l'équipe 010, votre arrivée à l'étage a boosté l'ambiance et a apporté une bouffée d'oxygène. Je remercie mes autres collègues du laboratoire, Jocelyne, merci pour tout surtout pour la fin, je te souhaite une bonne retraite. Tracy, Corine merci pour toutes les fois o je vous ai embêté avec mon PEG4000 70% et pour tout le reste. Un grand merci à Pascal pour ses blagues. conversations dans longs débats et le RER et pour Je remercie l'ensemble des étudiants du LEBS, tout spécialement Chafika (Kika), tu as été pour moi la grande sœur que j'ai toujours rêvé d'avoir. Ton absence au labo a été pesante mais je suis très contente pour le petit bout de chou. Je remercie chaleureusement dans l'ordre des équipes : Jozsef, Andréa, Lionel, Jérémie, Manu, Carla, Goran, Amandine, Moutsé, Samantha, Laura, Yannik, Armelle, Olivier, Samira, Jakub, Joaquin et Sarah. Merci pour nos pots étudiants et pour toutes les fois o nous avons fait le chemin Paris-Gif, Gig-Paris ensemble. Je cite aussi mes compatriotes algériens des autres labo de Gif et d'Orsay : Mounir, Abder et Mehdi. Je remercie très chaleureusement Daniel KERN qui a permis mon inscription en master à l'université de Strasbourg et pour l'effort qu'il a fournit pour caser ses étudiants en thèse. Je tiens également à remercier infiniment Philippe DUMAS et Dominique BURNOUF pour leur encadrement ainsi que toute l'équipe de cristallo et l'ensemble des équipes du 4eme étage de l'IBMC et plus particulièrement Pascale ROMBY, Serena BERNACCHI, Jean-Christophe PAILLARD et Gaelle MERCENNE pour leur aide précieuse. Je remercie également le Dr Fadila AMRANI de l'USTHB pour son encadrement et sa sympathie ainsi que le Pr Fatima Zahra ARJOUN, première femme algérienne et arabe à occuper le poste de général des armées qui m'a accueillies dans son service pour mon stage de fin d'étude à l'hôpital central de l'armée. Ca a été un grand honneur pour moi d'être formée par ces deux femmes qui sont un très bel exemple de l'émancipation de la femme algérienne, arabe et africaine. Je remercie chaleureusement mes amies de toujours, The team , les desperate housewives . Je commence par Yasmine (ma yaya), tu as été pour moi le service après vente accrochée au tél tous les jours pendant 3 ans c'est un record ! Zineb (ma zinette), nous avons beaucoup partagé ces dernières années de bons et moins bons moments merci d'avoir été là pour moi coloc. Nissa (ninahhhh) et Sarah (Sar), je vous ai moins vu ces dernières années mais mon affection pour vous est intacte. Je fini par Kahina (kakou) mon amie d'enfance plus de 20 ans ma grande ! Je remercie également tous mes amis algérois, strasbourgeois, tunisiens et parisiens ainsi que Pierre pour les moments magiques que nous avons passé ensemble. Je remercie toute ma famille en Algérie et en France, merci à Nazim d'avoir pris la relève au près des parents après mon départ, je t'aime mon petit frère. Merci à mes deux tantes chéries Karima et Saliha et mon oncle Mohand pour leur soutien tout au long de ces 5 années passées en France loin des miens. Une mention spéciale pour mon petit bout de chou Naél mouah. Je remercie du plus profond de mon âme ma grand-mère qui a toujours pensé à moi avant même de penser à elle. Mes parents chéris, ces deux personnes qui se sont donnés corps et âme pour m'offrir une éducation hors pair. Sans eux je ne serais pas ce que je suis et tous les mots du monde ne pourront pas exprimer l'amour et la reconnaissance que je leur dois. INTRODUCTION GENERALE. 1 I. Le virus de l'immunodéficience humaine. 1 A. Une nouvelle maladie : Le SIDA. 1 1. La découverte du virus . 1 2. Les origines simiennes du VIH et son évolution. 2 3. Les modes de transmission. 2 4. Les traitements antirétroviraux. 3 5. Le SIDA aujourd'hui dans le monde et en France. 4 B. Le virus VIH-1. 5 1. La structure du VIH-1 . 5 a. Le génome viral . 6 b. Les protéines de l'enveloppe. 9 La protéine gp120. 9 La protéine gp41. 9 c. Les protéines de structure . 10 La protéine de la matrice . 10 La protéine de la capside . 10 La nucléocapside . 11 d. Les protéines enzymatiques. 11 La protéase. 11 La transcriptase inverse . 12 L'intégrase. 13 e. Les protéines régulatrices et accessoires . 14 La protéine Tat. 14 La protéine Rev . 15 La protéine Vpr. 16 La protéine Nef. 17 La protéine Vif. 18 La protéine Vpu. 18 2. Le cycle réplicatif du VIH-1 . 19 a. La phase précoce du cycle réplicatif du VIH-1 . 19 L'attachement à la cellule hôte et l'entrée. 19 La décapsidation et transcription inverse du génome viral . 22 L'import vers le noyau. 22 L'intégration. 23 b. La phase tardive du cycle réplicatif du VIH-1 . 23 L'expression de l'ADN proviral et l'export des ARN transcrits . 23 La traduction des précurseurs. 25 L'assemblage des virions . 26 Le bourgeonnement . 27 La maturation. 28 3. La transcription inverse de l'ARN viral. 28 a. Les étapes de la transcription inverse . 29 Le début de la transcription inverse et la synthèse de l'ADN sb Strong-Stop (-). 29 Le premier transfert de brin. 29 La synthèse du brin d'ADN (-) . 31 La synthèse du brin d'ADN ( ) et second transfert de brin. 31 La synthèse des deux brins d'ADN et terminaison de la transcription inverse . 32 b. L'initiation de la transcription inverse . 32 Les modalités de l'initiation de la transcription inverse . 32 Les exemples d'ARNt servant d'amorce à l'initiation de la transcription inverse. 33 c. L'ARNtLys et son encapsidation dans le VIH-1. 33 L'assemblage et la concentration des ARNtLys dans le VIH-1. 33 Les mécanismes possibles d'encapsidation des ARNtLys. 35 La Lysyl-ARNt synthétase, transporteur des ARNtLys . 35 II. Les aminoacyl-ARNt synthétases (aaRS). 36 A. Généralités sur les aminoacyl-ARNt synthétases . 36 1. La réaction d'aminoacylation . 36 a. L'activation de l'acide aminé. 36 b. L'édition pré-transfert . 38 c. Le transfert de l'aminoacyl. 38 d. L'édition post transfert . 38 2. Les ARN de transfert. 38 3. L'organisation modulaire des aaRS et structure. 41 4. Les classes des aminoacyl-ARNt synthétases. 43 a. La classe I . 44 b. La classe II. 44 B. Formation de complexes multiprotéiques chez les eucaryotes . 46 1. Chez la levure : Le complexe Arc1p/MetRS/GluRS. 46 2. Chez les mammifères . 47 a. Le complexe multisynthétase MARS . 48 b. Le complexe VEGA ValRS/EF1H . 49 C. L'évolution et les rôles non canoniques des aaRS. 51 1. Les aaRS et la régulation de leur propre expression . 51 a. La ThrRS et la régulation au niveau de la traduction . 52 b. L'AlaRS et la régulation au niveau de la transcription. 52 2. Les LeuRS, TyrRS et leur implication dans l'épissage . 52 3. La TyrRS, et son activité cytokine . 52 4. La GluProRS et la formation du complexe GAIT. 53 5. Les protéines non catalytiques de MARS, rôles non canoniques. 53 6. La LysRS et la synthèse du diadénosine polyphosphates . 54 III. La Lysyl-ARNt synthétase et la réplication du VIH-1. 55 A. Généralités sur la Lysyl-ARNt synthétase (LysRS) . 55 1. La LysRS est de classe I ou de classe II. 55 2. La LysRS bactérienne . 55 3. La LysRS humaine . 57 a. La Fonction et la structure . 57 b. Les propriétés de l'extension N-terminale de la LysRS humaine. 58 c. Le motif de liaison de l'ARNt . 58 4. La Lysyl-ARNt synthétase mitochondriale humaine . 60 Lys dans les particules du VIH-1 . 62 1. Le rôle du précurseur GagPol. 62 2. La source de LysRS encapsidé dans les particules virales. 63 B. Rôle de la LysRS dans l'encapsidation de l'ARNt3 Chapitre I : Etude de l'association entre la LysRS mitochondriale humaine et le précurseur GagPol du VIH-1 . 67 I. Description des protéines utilisées dans cette étude . 67 A. Les précurseurs Gag et GagPol. 67 1. Le décalage du cadre de lecture -1 et la traduction de GagPol . 67 2. L'encapsidation des précurseurs Gag et GagPol. 68 B. Les différentes LysRS et leurs domaines. 70 C. L'interaction entre cLysRS et p38 dans le complexe MARS . 70 D. Parenté structurale entre la LysRS et l'AspRS. 72 Lys. 72 A. L'importance de la LysRS et l'espèce encapsidée dans les virions. 72 Lys. 74 B. Gag n'est pas suffisant à l'encapsidation de l'ARNt3 III. Analyse du complexe d'encapsidation de l'ARNt3 Lys. 75 A. L'approche du double hybride . 75 1. Description du système . 76 2. Nos résultats . 77 3. Les tests contrôles . 77 B. L'immunoprécipitation. 78 C. Les conclusions et perspectives . 79 II. Etude du complexe d'encapsidation de l'ARNt3 Article 1 : Association of Mitochondrial Lysyl-tRNA Synthetase with HIV-1 GagPol Involves Catalytic Domain of the Synthetase and Transframe and Integrase Domains of Pol. 81 Chapitre II : Activation de la lysyl-ARNt synthétase mitochondriale humaine après maturation de son précurseur prémitochondrial . 97 I. Généralités sur la protéosynthèse chez l'homme. 98 A. La synthèse protéique chez la mitochondrie est de type bactérien. 98 1. Le génome mitochondrial. 98 2. La synthèse protéique mitochondriale. 98 3. L'origine endosymbiotique . 99 4. Les aminoacyl-ARNt synthétases mitochondriales. 99 B. La maturation de la pmLysRS humaine. 99 C. Les autres activités potentielles de la LysRS mitochondriale. 100 II. Activation de la LysRS lors de son import dans la mitochondrie . 100 A. L'identification du site de maturation de la LysRS mitochondriale. 101 B. La détermination de la séquence minimale de la pmLysRS permettant son import mitochondrial . 101 1. Par microscopie confocale. 101 2. Par complémentation dans les cellules de levure après sporulation. 102 3. Conclusion. 102 C. Caractérisation biochimique des deux formes de la LysRS mitochondriale . 103 1. L'activité d'aminoacylation. 103 Lys. 103 2. La capacité d'interaction avec l'ARNt3 Lys . 104 III. Rôle de la mLysRS dans l'encapsidation de l'ARNt3 Article 2 : Activation of human mitochondrial lysyl-ARNt synthetase upon maturation of its premitochondrial precursor. 107 Chapitre III : Analyse du rôle potentiel des protéines auxiliaires du VIH-1 dans l'association entre lysyl-ARNt synthétase et GagPol. 137 I. Etude des interactions binaires entre les protéines auxiliaires du VIH-1 et la lysyl-ARNt synthétase humaine et ses domaines. . 137 A. L'approche du double Hybride. 138 1. Vérification de la localisation nucléaire des différentes protéines virales . 138 2. Recherche des interactions par le double hybride. 139 B. L'immunoprécipitation . 140 C. Conclusion . 140 II. Reconstitution in vitro du complexe d'encapsidation de l'ARNt. 140 A. Expression des protéines. 140 B. Vérification de l'interaction entre Pol et mLysRS. 141 C. Lys sur la formation du complexe Pol-mLysRS. 141 D. GagPol : mLysRS : ARNt3 Implication de l'ARNt3 Implication de Rev et Vpr dans la formation du complexe d'encapsidation de Lys. 141 III. Conclusion générale . 142 Article 3 : Interaction of HIV-1 Rev and Vpr with mitochondrial lysyl-tRNA synthetase does not impact its association with Pol. 143 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES . 173 REFERENCES . 181 INTRODUCTION Introduction générale INTRODUCTION GENERALE I. Le virus de l'immunodéficience humaine A. Une nouvelle maladie : Le SIDA 1. La découverte du virus L'histoire commença en 1981 lorsque les premiers cas reconnus de syndrome d'immunodéficience acquise ont été décrits aux États-Unis par Gottlieb et collaborateurs. Il rapporte les premiers cas d'une immunodéficience sévère accompagnée d'une pneumonie due à Pneumocistis Carrinii qui touche des jeunes hommes homosexuels (Gottlieb et al, 1981). À la fin de cette même année, on sait que cette maladie se transmet par voie sexuelle et sanguine. On sait également qu'elle ne touche pas seulement les homosexuels mais également des toxicomanes, des hémophiles et des hétérosexuels. À cette époque, le SIDA n'avait pas encore de nom, mais il était vite devenu évident que ces personnes présentaient un syndrome commun. C'est en 1983, que la première description du virus à l'origine de cette immunodéficience est rendue publique, dans la revue Science. La découverte du virus a été réalisée à l'Institut Pasteur de Paris par l'équipe de Luc Montagnier. L'essentiel des travaux a été mené par Françoise Barré-Sinoussi. Le virus a été isolé à partir de lymphocytes ganglionnaires d'un patient atteint de lymphoadénopathie ; on lui donna le nom de LAV Lymphadenopathy Associated Virus (Barre-Sinoussi et al, 1983). La même année, une équipe américaine dirigée par Robert Gallo du National Cancer Institute isole un virus qu'ils appelèrent HTLV-III Human T-cell Lymphotropic Virus Type III et qui s'avère être identique au LAV (Gallo et al, 1984). Une dénomination commune au virus ne sera donnée qu'en 1986 : HIV pour Human Immunodeficiency Virus en désignation anglaise. Au courant de cette année, le Pr Montagnier identifie un deuxième VIH isolé à partir de sujets originaires d'Afrique de l'ouest. Il fut appelé VIH-2 et le premier découvert est alors nommé le VIH-1. 1 Introduction générale 2. Les origines simiennes du VIH et son évolution Le clonage du génome du VIH (Alizon et al, 1984) en 1984 et son séquençage (Wain- Hobson et al, 1985) en 1985 prouvent définitivement qu'il appartient à la famille des rétrovirus, et plus précisément à la classe des lentivirus. Il est génétiquement très proche du SIV (Simian Immunodeficiency Virus) qui infecte des primates d'Afrique. Des études par alignement de séquences génomiques ont permis d'établir un arbre phylogénétique des lentivirus de primates (Figure 1). La grande question qui se pose est quelle est exactement l'espèce de primate qui est à l'origine du passage de ce virus à l'homme. D'après les analyses phylogénétiques, la première observation fût que les VIH-1 et VIH-2 ont une distance phylogénétique importante. Ils sont clairement plus proches d'autres lentivirus retrouvés chez différents primates qu'ils ne le sont l'un l'autre. Le VIH-1 semble être proche de SIV-cpz (SIV du chimpanzé) (Gao et al, 1999), tandis que le VIH-2 est proche du SIVsm/SIVmac (SIV de sooty mangabey/SIV du macaque) (Santiago et al, 2005). De plus, ces deux types de VIH ont chacun une origine géographique différente. Le VIH-1 est originaire de l'Ouganda, le Burundi et le Rwanda, et le VIH-2 de l'Afrique occidentale. Le VIH-1 est divisé en quatre groupes : le groupe M (Major), le groupe O (Outlier), le groupe N (non-M, non O), et le groupe P, dernier identifié en 2009. Ce sont les VIH-1 de sous type M qui sont responsables de la pandémie mondiale du SIDA, il en existe 9 sous-types caractérisés et plus de 43 formes recombinantes entre ces sous-types ont été identifiées, dont certaines très récemment. Ces sous-types sont retrouvés dans les populations d'Afrique, d'Europe, d'Amérique du Nord et d'Australie. Le VIH-2 est quant à lui responsable de cas de SIDA principalement en Afrique de l'ouest et est composé de sept sous-types. 3. Les modes de transmission Le VIH infecte les lymphocytes T pour se répliquer et se multiplier. Il conduit à l'affaiblissement du système immunitaire de la personne infectée et au développement du SIDA. Ce virus est présent dans les liquides biologiques de l'organisme tels le sang, le sperme ou le liquide séminal d'un homme infecté. Chez une femme infectée, il est retrouvé dans les secrétions vaginales ou le lait maternel. 2 Introduction générale Figure 1. Arbre phylogénétique des lentivirus. L'arbre phylogénétique est établi selon des études de comparaison de séquences de virus de différentes espèces animales. La première cause de contamination par le VIH est la transmission sexuelle (Quinn, 1989). Le virus peut également être transmis en utilisant des seringues contaminées lors d'une injection par voie intraveineuse chez les toxicomanes, ou accidentellement par transfusion sanguine dans les hôpitaux. La transmission de la mère à l'enfant est dite verticale, elle peut se produire à différents stades : in utéro, lors de l'accouchement, ou pendant l'allaitement. Pour prévenir la contamination mère-enfant, il existe des traitements antiviraux qui sont administrés au cours du dernier trimestre de la grossesse et qui diminuent le taux de contamination de 25 à 10% (Royce et al, 1997). 4. Les traitements antirétroviraux Dès la découverte de l'agent étiologique en 1983, les scientifiques du monde entier se sont mobilisés pour l'étude de ce virus. La première molécule antirétrovirale admise par la FDA Food and Drug Administration en 1987 est mise sur le marché. Il s'agit de l'AZT Azidothymidine , c'est un inhibiteur de la transcriptase inverse du virus (Frick et al, 1988). L'administration d'un seul antirétroviral ou monothérapie montre vite ses limites dans le 3 Introduction générale traitement de la maladie. Ce n'est qu'en 1991 qu'une deuxième molécule est admise par la FDA, il s'agit du dideoxyinosine ou Videx. Tout comme l'AZT, c'est un inhibiteur nucléotidique de la transcriptase inverse. La détermination de la structure tridimensionnelle de la protéase du VIH-1 a permis de donner naissance à une autre classe d'inhibiteurs antirétroviraux. Ce sont les inhibiteurs de la protéase. Ils ont été approuvés par la FDA en 1995 (Dorsey et al, 1994). D'autres études sur le virus ont permis par la suite de découvrir les récepteurs du VIH sur les cellules infectées. Les CCR5 Chemokine C-C motif Receptor 5 des lymphocytes T ont été isolés et démontrés comme nécessaires à l'entrée du virus dans la cellule (Deng et al, 1996). En 1996 également fût découvert le premier inhibiteur non nucléosidique de la transcriptase inverse (Genin et al, 1996). Ces découvertes successives ont amené l'ère des trithérapies. Elles représentent l'association de trois molécules. Deux inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse et un inhibiteur de la protéase généralement. Ces trithérapies limitent durablement la multiplication du virus permettant la reconstitution partielle du système immunitaire pour réduire de ce fait les maladies opportunistes (Visier, 2005). Un développement continu s'opère de 1998 à nos jours, de nouvelles molécules et de nouvelles classes thérapeutiques d'anti-rétroviraux sont identifiées, des inhibiteurs de fusion tel que le T20 (Burton, 2003), des inhibiteurs de l'intégrase comme le Raltegravir qui inhibe le transfert de brin, ou des antagonistes du co-récepteur CCR5 en 2007, le Maraviroc qui bloque l'entrée du virus via ces co-récepteurs. 5. Le SIDA aujourd'hui dans le monde et en France D'après les données de l'ONU Organisation des Nations Unies en 2007, le pourcentage mondial des personnes vivant avec le VIH s'est stabilisé. Plus de 33 millions de personnes vivent avec le VIH (Figure 2). 4 Introduction générale Figure 2. Distribution géographique du VIH-1 en 2007. Les avancées, vers un accès universel aux traitements, aux soins et aux services d'assistance étaient un accomplissement significatif en 2009, étant donné les défis considérables. Plus de personnes dans le monde reçoivent les thérapies antivirales grâce à la consolidation mondiale pour des programmes VIH. En décembre 2009, plus de 5. 2 millions de personnes des pays en voie de développement recevaient les thérapies antirétrovirales (Worls Health Organization) : 37% en Afrique subsaharienne, 42% en Amérique centrale et Amérique du sud, 51% en Océanie, 48% dans les Caraïbes, 15 à 21% en Europe de l'est et l'Asie centrale. Ces chiffres représentent 30% de personnes en plus recevant le traitement que 12 mois plus tôt (Unaids). En France, au 31 décembre 2007 plus de 120 000 personnes vivent avec le VIH. Le nombre de nouveaux cas de SIDA est de 1200 personnes infectées cette année-là. Le nombre de décès s'élève à 35 140 personnes cette même année. Les modes de contamination de personnes ayant découvert leur séropositivité cette année restent classiques (60% ont été contaminés par des rapports hétérosexuels, 38% lors de rapports homosexuels et 2% avec l'usage de drogues injectables). B. Le virus VIH-1 1. La structure du VIH-1 Le virus infecte principalement les cellules lymphocytes T CD4 du système immunitaire humain. Il cause leur destruction avec une demi-vie de moins de deux jours 5 Introduction générale (Perelson et al, 1996 ; Wei et al, 1998). Il infecte également les monocytes et macrophages. Pour mieux comprendre sa cytotoxicité, les recherches se sont basées entre autre sur les informations obtenues grâce à la résolution des structures cristallographiques de ses protéines. Le virion mature se présente au microscope électronique sous forme d'une particule sphérique de 80 à 120 nm de diamètre (Figure 3). Le VIH-1 a les caractéristiques des lentivirus et présente des morphologies assez hétérogènes. Les virions infectieux montrent les caractéristiques suivantes : une enveloppe externe hérissée de spicules, elle entoure la matrice et la capside. La capside est aussi appelée core et donne la forme conique au virus. Dans la capside se trouve d'une part le génome viral, composé de deux molécules d'ARN monocaténaires recouvertes et protégées par la protéine de nucléocapside. Le génome viral est un ARN dont la transcription inverse est réalisée par une ADN polymérase ARN-dépendant, la transcriptase inverse. D'autre part, il y a également les protéines enzymatiques (la protéase virale et l'intégrase) mais aussi d'autres types de protéines : des protéines régulatrices (Rev et Tat) et des protéines auxiliaires (Vpu, Vif, Vpr et Nef) et quelques molécules d'origine cellulaire. Par convention, toutes les protéines virales (p) sont désignées avec un nombre correspondant à leur taille en kDa. a. Le génome viral Le génome du VIH-1 comprend deux molécules homologues d'ARN simple brin de polarité positive. Il a une taille de 9181 nucléotides. Il possède neuf cadres ouverts de lecture (Open Reading Frames, ORFs) et code pour 16 protéines virales (Figure 4). Trois d'entre eux codent pour les polyprotéines Gag, GagPol et Env spécifiant respectivement les protéines de structure, les enzymes et les protéines de l'enveloppe. Les six autres ORFs codent pour des protéines régulatrices Tat (Transactivator of transcription) et Rev (Regulator of viral expression) et des protéines accessoires Vpu (Viral protein U), Vif (Viral infectivity factor), Vpr (Viral protein R) et Nef (Negatif factor). Ces dernières protéines régissent la capacité du VIH-1 à infecter une cellule (McCune, 1991). 6 Introduction générale Figure 3. La structure du virus : Le virion mature est sous forme conique, il porte le génome ARN et les protéines auxiliaires. Figure 4. Génome du VIH-1 : Le génome viral code pour trois polyprotéines Gag, GagPol et Env. Il code également pour les protéines régulatrices Tat, Rev et accessoires Nef , Vif, Vpu et Vpr. 7 Introduction générale La dimérisation de l'ARN est indispensable pour son encapsidation lors du bourgeonnement. Elle se fait d'une manière non covalente en 5' de l'ARN. Dans cette région 5'UTR de l'ARN viral se trouve aussi une tige boucle appelée , elle joue également un rôle important dans l'encapsidation du génome viral. et une région en aval riche en ribonucléotides AG sont également requises pour la dimérisation de l'ARN génomique (Russell et al, 2003). Le site de dimérisation est appelé DLS Dimer Linkage Sequence , il est situé en aval du principal site donneur d'épissage SD . Plus récemment, un autre site de dimérisation a été caractérisé, le DIS Dimer Initiation Site , situé en amont de SD (Figure 5A) (Clever et al, 1996). La dimérisation de l'ARN viral est initiée par la formation d'un complexe transitoire de type boucle-boucle appelé Kissing-loop complex . Il donnera un duplex plus stable de 22 paires de bases (Figure 5B) (Ennifar et al, 2001 ; Ennifar et al, 1999). Le kissing-loop complex a été pris comme cible antirétrovirale potentielle, des études ont démontré la liaison spécifique de certains aminoglycosides sur le DIS ce qui préviendrait la dimérisation de l'ARN viral et de ce fait son encapsidation dans de nouvelles particules virales (Ennifar et al, 2006). Figure 5. La région 5' UTR de l'ARN viral et l'initiation de la dimérisation de l'ARN viral : (A) : La région 5' non traduite porte de nombreuses structures ayant chacune une fonction spécifique au cours du cycle viral. La région Leader soulignée par des pointillées porte quatre tiges boucles, la première tige boucle SL1 correspond au site d'initiation de la dimérisation de l'ARN viral. (B) : La dimérisation est initiée par un contact boucle-boucle kissing-loop coFmplex qui est rapidement converti en un duplex étendu de 22 paires bases. 8 Introduction générale Les régions codantes de l'ADN proviral issu de la transcription inverse sont entourées par deux régions non codantes longues et répétées, elles sont identiques et appelées LTR Long Terminal Repeat . Ces régions additionnelles contiennent plusieurs éléments génétiques permettant de réguler la transcription du génome viral. Elles sont composées de 3 régions U3 (Unique en 3'), R (Redondante) et U5 (Unique en 5'). D'une manière générale, le génome viral porte plusieurs motifs au niveau des LTR. Ils sont impliqués dans la régulation de sa réplication mais aussi dans la transcription et l'expression de ses gènes. Cette régulation nécessite l'intervention de facteurs cellulaires et de certaines protéines virales, conduisant à une forte ou faible production de particules du VIH- 1. C'est le cas de la protéine Tat, qui se lie au motif retrouvé dans le LTR et va induire des modifications de la chromatine. b. Les protéines de l'enveloppe L'enveloppe est en grande partie d'origine cellulaire, elle est issue de la membrane plasmique de la cellule infectée et est formée lors du bourgeonnement des particules virales. L'enveloppe est constituée d'une double couche lipidique dans laquelle sont insérés 72 spicules. Chaque spicule est composé des protéines suivantes : la protéine de surface SU de 120 kDa (ou gp120) et la protéine transmembranaire TM de 41 kDa (ou gp 41). Elles sont issues du gène Env enveloppe après maturation. Ces deux protéines sont glycosylées et forment des trimères à la surface de la particule virale (Prabakaran et al, 2007). La protéine gp120 La structure tridimensionnelle de la protéine gp120 a été résolue. Elle montre que cette protéine interagit avec le récepteur CD4 du lymphocyte T et engage la pénétration du virus dans la cellule. Cette liaison est néanmoins insuffisante pour une infection optimale et requiert l'implication de corécepteurs CXCR4 et CCR5. La gp120 interagit aussi avec le récepteur de type lectinique exprimé par les cellules dendritiques et les macrophages. La protéine gp41 La protéine gp41 est composée de trois parties, un ectodomaine N-terminal, un domaine transmembranaire et un segment C-terminal intraviral, qui interagit avec la protéine de matrice. La structure tridimensionnelle de domaines correspondant à des portions de l'ectodomaine N-terminal est connue (Chan et al, 1997 ; Tan et al, 1997 ; Weissenhorn et al, 9 Introduction générale 1997). Elle montre que cette protéine est principalement impliquée dans la pénétration de la capside virale dans la cellule infectée grâce au peptide N-terminal qui est nécessaire à la fusion de l'enveloppe virale à la membrane cellulaire. Ce sont ces complexes qui reconnaissent les récepteurs des cellules à infecter et permettent la fusion des deux membranes. c. Les protéines de structure Les protéines de structure sont issues du clivage protéolytique du précurseur Pr55Gag codé par le gène Gag ( Group-Specific Antigen ). Le précurseur est myristyllé puis clivé au cours de la maturation donnant ainsi les protéines structurales matures ; la protéine de matrice MA de 17 kDa (ou p17), de capside CA de 24 kDa (ou p24), de nucléocapside NC de 7 kDa (ou p7) et les peptides p2 et p6. La protéine de la matrice La protéine de matrice MA est de 17 kDa. Sa structure cristallographique a été déterminée (Hill et al, 1996), elle cristallise en monomère et en trimère. Elle possède un groupement myristate sur le résidu Gly en N-terminal lui permettant de se lier à la bicouche lipidique de l'enveloppe virale. Ces protéines tapissent la partie intérieure de l'enveloppe virale pour former la matrice par oligomérisation. MA va intervenir à différentes étapes du cycle viral : elle facilite l'import du complexe de préintegration vers le noyau, elle participe à l'intégration et permet l'incorporation de la gp120 et de la gp41 dans l'enveloppe virale lors de l'assemblage des virions (Bukrinskaya, 2007). La protéine de la capside La protéine de capside CA de 24 kDa (ou p24) est composée de deux domaines. Un domaine de dimérisation C-terminal (CTD) (Gamble et al, 1997) et un domaine N-terminal d'assemblage (NTD). Cette protéine forme des dimères et lors de l'oligomérisation donne une capside ou core du virus, de forme conique, qui entoure un complexe ribonucléoprotéique (ARN génomique, la nucléocapside et le reste des protéines virales). 10 Introduction générale La protéine de capside intervient dans l'infectivité du virus et participe à la réplication. Elle participe aussi à l'assemblage des virions. En effet, elle se lie via son domaine NTD à une proline isomérase d'origine cellulaire, la Cyclophiline A (CypA) qui est encapsidée grâce à sa liaison à CA à raison de 200 copies de CypA par virion (Braaten et al, 1996). CypA est une chaperonne et aiderait à modifier la structure de la capside et faciliterait l'étape de décapsidation. La nucléocapside La nucléocapside de 7 kDa (ou p7) est une petite protéine basique, contenant deux motifs en doigts de zinc de type CCHH (Darlix et al, 2011). Elle a la capacité d'interagir avec les acides nucléiques grâce aux deux doigts de zinc participant ainsi à l'encapsidation de l'ARN viral. La nucléocapside joue le rôle de reconnaissance et d'emballage de l'ARN viral (Aldovini & Young, 1990) en réunissant les deux brins d'ARN entre eux. Elle s'y fixe spécifiquement et forme ainsi la nucléocapside. Elle peut aussi lier l'ARNt amorce (Tisné et al, 2001). d. Les protéines enzymatiques Les protéines enzymatiques sont issues du clivage du domaine Pol Polymerase du précurseur GagPol (Pr160GagPol). En effet, la traduction de GagPol met en jeu un mécanisme de glissement du cadre de lecture de type -1 au niveau d'une séquence riche en uracile. C'est un phénomène rare, se produisant avec une fréquence inférieure à 10%. L'autocatalyse de la région pol va générer 4 protéines : la protéase (PR), l'intégrase (IN), la transcriptase inverse (Reverse Transcriptase, RT) et un peptide transframe TF ou p6*. La protéase La protéase PR de 12 kDa (ou p12) est la première protéine virale a avoir été structuralement caractérisée (Navia et al, 1989). Par la suite, se sont des complexes avec des inhibiteurs qui ont été cristallisés dans le but d'aider au développement de ces inhibiteurs (Wlodawer & Erickson, 1993) (Figure 6). 11 Introduction générale Figure 6. Structure cristallographique de la protéase : La protéase est un homodimère. Le site actif est localisé à l'interface des deux sous-unités, il est recouvert par une région flap (Navia et al, 1989). La protéase est un homodimère symétrique, elle est structuralement similaire aux aspartyl protéases de la famille des pepsines. Le site actif de l'enzyme se trouve à l'interface des deux sous unités et contient la triade catalytique (Asp25-Thr26-Gly27) responsable des réactions de clivage protéolytique. La protéase est l'une des enzymes clés du virus. En effet, elle est produite à partir du précurseur GagPol (Pr160GagPol) par un phénomène d'autocatalyse. Une fois maturée dans les virions, elle va permettre à son tour de catalyser la maturation des pré-protéines pour donner ainsi les protéines de structure et les enzymes après l'étape de bourgeonnement des nouvelles particules virales. Elle participe de ce fait au changement de morphologie des virions et conduit à leur maturation et infectivité. La transcriptase inverse La transcriptase inverse RT (ou p66/p51) est l'enzyme qui catalyse la synthèse de l'ADN proviral à partir du génome ARN. Cet enzyme est issu d'un clivage protéolytique du précurseur GagPol (Pr160GagPol) après assemblage des nouveaux virions. La RT est produite initialement sous forme d'un homodimère de deux molécules de p66 et subit une étape supplémentaire de maturation formant ainsi la RT mature. Elle se présente sous forme d'un hétérodimère formé par les deux sous unités p66 et p51 (Figure 7). La sous unité p66 porte l'activité ADN polymérase capable d'incorporer les désoxyribonucléotides sur une molécule d'ADN ou d'ARN. Elle contient une grande partie analogue à celle du fragment de Klenow de 12 Introduction générale l'ADN polymérase I d'E. coli (Kohlstaedt et al, 1992). Elle porte également l'activité endonucléase ADN/ARN dépendante (RNAse H) qui dégrade l'ARN dans les duplex ARN/ADN. La sous-unité p51 quant à elle résulte d'un clivage en C-terminal du domaine RNAse H. Elle est catalytiquement inactive (Le Grice et al, 1991) mais elle interagit avec le domaine RNAse H de l'hétérodimère, conférant ainsi une stabilité structurale à l'enzyme. La RT est une polymérase lente, elle incorpore entre 1 à 100 nucléotides par seconde. Elle montre également une faible fidélité (10-4 erreurs par base incorporée) et est dépourvue d'une activité de correction d'erreurs. Elle génère une mutation par génome et par cycle de transcription inverse. Ceci confère au virus une grande variabilité génétique. Figure 7. Structure cristallographique de la transcriptase inverse : La partie représentée en gris correspond à la sous-unité p55 tandis que la partie colorée représente la sous-unité p66. Sur cette figure est également représentée l'interaction de la RT à l'ARN amorce (en rose) et à l'ARN matrice (en bleu) (Kohlstaedt et al, 1992). L'intégrase La protéine intégrase IN de 32 kDa (ou p32) est une protéine essentielle pour l'incorporation de l'ADN proviral dans l'ADN chromosomique de la cellule hôte. Cette protéine est constituée de trois domaines fonctionnels et structuraux bien distincts ; un domaine N-terminal présentant un motif de type His-His-Cys-Cys et fixant le zinc pour 13 Introduction générale faciliter l'oligomérisation. Un domaine central catalytique dont le site actif appartient à la famille des polynucléotidyl-réductases et un domaine C-terminal de liaison à l'ADN (Van Wamel & Berkhout, 1998) (Figure 8). L'association de l'intégrase au coactivateur in vitro. Une unité transcriptionnel LEDGF/p75 augmente fonctionnelle d'intégration comprend deux dimères asymétriques d'intégrase et deux molécules de LEDGF/p75. Au niveau de l'ADN, dans chaque dimère, une première molécule d'intégrase réalise la réaction catalytique tandis que la deuxième molécule positionne l'ADN viral dans le site actif du dimère opposé (Michel et al, 2009). l'activité d'intégration Figure 8. Structure cristallographique de l'intégrase : L'intégrase est un homodimère. La forme active de cet enzyme est un tétramère. C'est un dimère de l'homodimère. Chaque homodimère est constitué de deux sous- unités identiques avec un site catalytique localisé dans la région centrale (Van Maele & Debyser, 2005). e. Les protéines régulatrices et accessoires Les protéines régulatrices et accessoires du VIH-1 interviennent à différents niveaux du cycle réplicatif. Les protéines Tat et Rev ont un effet important dans l'expression du virus. Elles contrôlent l'expression du VIH-1 au niveau transcriptionnel et post-transcriptionnel respectivement. D'autres études ont montré que lorsqu'il y avait de petits changements dans l'expression de Vif, Vpr ou Vpu cela affectait l'infectivité et la réplication du virus (Bour & Strebel, 2000 ; Zhao et al, 2007). La protéine Tat Tat est une petite protéine de 14 kDa (ou p14). Elle est appelée Tat car son rôle principal est la transactivation de la transcription du VIH-1. Elle est codée par deux exons. 14 Introduction générale L'exon 1 code pour les acides aminés 1 à 72 et l'exon 2 code pour les aa 73 à 86. Tat 66 (66 premiers aa) contient à elle seule les fonctions de transactivation (Kuppuswamy et al, 1989). Elle possède un segment basique (R49KKRRQRR57) lui permettant d'interagir avec l'élément agissant en cis, appelé TAR trans-activation-responsive region retrouvé dans la région R du LTR. Cette interaction, va induire des modifications de la chromatine au niveau du promoteur de l'ADN proviral. En effet, l'ADN proviral est intégré dans la chromatine cellulaire et recouvert par des nucléosomes. La transcription n'est rendue possible uniquement par un remodelage de la chromatine et le détachement des nucléosomes. Le remodelage des nucléosomes est initié par des évènements cellulaires. Tat a la capacité d'interagir avec des protéines cellulaires et contribue à la transcription du génome viral. Elle recrute certains de ces facteurs comme SWI/SNF, p300/CREB-binding Protein (CBP), p300/CBP-associated factor (PCAF) et hGCN5 au niveau du promoteur. Elle se lie aussi au facteur positif d'élongation de la transcription b (P-TEFb) et à la TATA-binding protein (TBP), TFIIB, TFIIH et P-TEFb. Tat se lie au promoteur pour former le complexe de préinitiation actif qui va permettre d'activer l'initiation de la transcription (Gatignol, 2007). La protéine Rev La protéine Rev (ou p19) est une petite protéine phosphorylée de 116 aa. Rev peut être divisée en deux domaines bien distincts ; un domaine N-terminal contenant un motif riche en arginine (NRRRRW) (Malim et al, 1989a) qui sert à la fois de signal de localisation nucléaire (NLS), et de domaine de liaison de l'ARN (RBD). Ce domaine est flanqué par des séquences moins bien définies servant à la multimérisation de Rev. Le domaine C-terminal est riche en leucine. Il a été originalement considéré comme domaine activateur ou effecteur et contient un signal d'export nucléaire (NES) (Pavlakis & Felber, 1990). Rev effectue la navette entre le noyau et le cytoplasme grâce à ses signaux de localisation et d'export nucléaire. Il représente un élément très important pour le transfert des ARNm viraux incomplètement épissés du noyau vers le cytoplasme o est réalisée l'étape de la traduction des protéines virales. Rev assure l'export et la stabilité de ces ARNm non épissés ou incomplètement épissés. La liaison de Rev à ces ARNm est hautement spécifique, Rev se lie à un élément cis-acting hautement structuré localisé dans un intron de l'ARNm Env (Daly et al, 1989 ; Malim et al, 1989b). Il est appelé motif RRE Rev Responsive Element . Un premier monomère de Rev se lie avec une grande affinité au site RRE. Des molécules additionnelles de Rev vont par la suite s'y lier et se multimériser via une coopération entre des interactions protéine-protéine et ARN-protéine. 15 Introduction générale La protéine Vpr Vpr est une protéine accessoire d'un poids moléculaire de 12 kDa, produite aux derniers stades de l'infection virale. Vpr est hautement conservée chez le VIH, le SIV mais est absente dans d'autres lentivirus (Tristem et al, 1998). La structure tridimensionnelle de Vpr a été analysée par RMN. Vpr contient un domaine hélice -tour-hélice , retrouvé en N- terminal entre les résidus 17 à 46. Une longue hélice est également retrouvée entre les résidus 53 à 78 en C-terminal (Schler et al, 1999). Ces trois hélices forment un cœur hydrophobe donnant à la protéine Vpr la possibilité de former de multiples interactions avec différentes protéines cellulaires (Morellet et al, 2003). Ces interactions permettent à Vpr d'agir comme un facteur pathogène. Vpr intervient principalement à deux niveaux dans la cellule hôte. Elle participe au transport de l'ADN viral vers le noyau (Heinzinger et al, 1994), et cause l'arrêt du cycle cellulaire en phase G2 (He et al, 1995). Vpr est aussi impliquée dans la mort cellulaire programmée (apoptose) (Stewart et al, 1997) . Transport nucléaire du complexe de préintégration Dans les cellules infectées, l'ADN proviral double brin doit être transporté du cytoplasme vers le noyau o il sera intégré au génome cellulaire. Cette étape est réalisée via la formation d'un complexe de préintégration (PIC). Vpr est l'un des régulateurs de l'import nucléaire (Heinzinger et al, 1994). Une petite fraction de Vpr est phosphorylée. La phosphorylation de la Ser79 de Vpr est critique pour son activité lors de l'importation nucléaire. Induction de l'arrêt du cycle cellulaire à la transition G2/M La transition de la phase G2 à M est contrôlée par la phosphorylation d'une protéine kinase cyclin-dépendante CDK . Cette protéine régule le cycle cellulaire dans toutes les cellules eucaryotes. Vpr va induire l'arrêt en phase G2 du cycle cellulaire de la cellule hôte. Vpr agit en provoquant l'hyperphosphorylation de la protéine kinase CDK1 (Zhao et al, 1996), en inhibant la protéine phosphatase Cdc 25 (Bartz et al, 1996) et en activant la protéine kinase Wee 1 (Elder et al, 2001). 16 Introduction générale Induction de l'apoptose La voie majeure de l'induction de l'apoptose par Vpr se fait via la mitochondrie. Ce phénomène est initié par la perméabilisation de la membrane mitochondriale (Green & Kroemer, 2004). Vpr va s'associer à l'ANT (adénine nucléotide translocator), une protéine localisée sur la membrane interne de la mitochondrie (Jacotot et al, 2001 ; Jacotot et al, 2000). Le relargage des facteurs mitochondriaux proapoptotiques pourrait aussi impliquer la liaison de Vpr au facteur HAX-1 (facteur anti-apoptotique) qui se trouve dans la membrane externe de la mitochondrie ce qui provoquerait son inhibition (Yedavalli et al, 2005). Vpr peut se lier à d'autres protéines cellulaires mais on ne connat pas précisément l'impact de ces associations sur la réplication du virus et sur sa pathogénicité dans la cellule hôte. On peut citer pour exemple la protéine HHR23A humaine (protéine se liant au protéasome) (Gragerov et al, 1998), l'uracil-DNA glycosylase UNG (enzyme qui excise l'uracile de l'ADN) (Bouhamdan et al, 1996) ou des coactivateurs de la transcription (Kino et al, 2002). La protéine Nef Le facteur négatif du VIH-1, Nef, est une protéine de 27 kDa. C'est un facteur de régulation dont l'extrémité N-terminale est myristoylée. Il est exprimé en grandes quantités lors de l'infection virale (Goldsmith et al, 1995). Cette protéine permet d'atteindre et de maintenir une haute charge virale dans les cellules infectées. Nef joue deux rôles bien distincts : augmenter et promouvoir la réplication virale et stimuler la réduction du nombre des récepteurs CD4 à la surface de la cellule infectée (Goldsmith et al, 1995). Un rôle dans l'entrée du virus a été proposé, quelques études sur des pseudo particules virales suggèrent que Nef puisse promouvoir la fusion à la membrane cellulaire à pH neutre (Chazal et al, 2001). La majorité des résultats obtenus concerne sa fonction intracellulaire dans la réplication virale. Nef pourrait stimuler la transcription inverse du génome viral (Aiken & Trono, 1995). Toutefois, des études plus récentes suggèrent que l'incorporation de Nef dans les virions n'est pas nécessaire pour augmenter la réplication et l'inféctivité des virions (Fackler et al, 2006). 17 Introduction générale Une des fonctions peut être la plus physiologique de Nef pourrait être la régulation négative de la concentration du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC) et des CD4 à la surface cellulaire (Stove et al, 2005). Ceci limiterait la surinfection par le VIH-1. La protéine Vif Vif est une protéine basique de 23 kDa, elle est produite en phase tardive du cycle réplicatif et son expression est dépendante de Rev (Garrett et al, 1991 ; Schwartz et al, 1991). Des délétions de Vif sont associées à une réduction ou une perte de l'infectivité des virions (Strebel et al, 1987). Malim et ses collaborateurs avaient identifié une protéine cellulaire qui provoquait l'inhibition de l'infection par le VIH-1, cette inhibition était levée par l'expression de la protéine Vif (Sheehy et al, 2002). Cette protéine, APOBEC3G, est une cytidine déaminase qui induit des mutations C à U dans les brins négatifs de l'ADN nouvellement synthétisé. L'ADN hypermuté sera ensuite dégradé (Strebel, 2007). Vif va induire l'ubiquitination et la dégradation d'APOBEC3G via les protéines Cullin5, Elongin B et C qui forment un complexe E3 ubiquitine ligase (Harris et al, 2003 ; Marin et al, 2003). Vif, en provoquant la dégradation d'APOBEC3G, empêche son encapsidation dans les particules virales naissantes, ce qui prévient la déamination de l'ADN viral néosynthétisé (Sheehy et al, 2003). La protéine Vpu Vpu est une protéine membranaire intégrale de 16 kDa. Elle est composée de deux domaines. Le domaine hydrophobe retrouvé en N-terminal assure deux fonctions, celle de peptide signal et d'encrage dans la membrane cellulaire. Le domaine retrouvé en C-terminal est hydrophile. Il est exposé à l'intérieur du virus. Vpu et Env sont exprimées par un ARNm bicistronique sous la dépendance de la protéine Rev (Schwartz et al, 1990). Vpu est exprimée tardivement dans le cycle viral. Vpu est impliquée dans le relargage des particules virales lors du bourgeonnement en interagissant avec les composants des canaux K (Hsu et al, 2004). Son action est probablement de former des pores dans la membrane cellulaire (Bour et al, 1996). Vpu peut aussi réguler négativement l'expression et augmenter la dégradation des CD4 (Lenburg & Landau, 1993). Vpu contrecarre également l'action d'une protéine membranaire appelée BST-2 ou tetherin. Cette protéine, qui a été identifiée comme étant un acteur cellulaire antiviral qui empêche la libération des particules virales lors du bourgeonnement, 18 Introduction générale participe à l'immunité antivirale innée (Neil et al, 2008). Les modalités selon lesquelles Vpu bloque la tetherin sont encore méconnues (Douglas et al, 2010). Vpu pourrait séquestrer la tetherin dans les endosomes car les deux protéines y sont co-localisées (Neil et al, 2008) et le taux de la tetherin est diminué à la surface des cellules (Van Damme et al, 2008). 2. Le cycle réplicatif du VIH-1 Comme pour l'ensemble des lentivirus, le cycle réplicatif du VIH-1 passe par une étape d'intégration de son génome dans les chromosomes de la cellule hôte. L'intégration lui permettra d'acquérir une résistance permanente en tant que provirus et de pouvoir par la suite se répliquer et donner des particules virales filles. Ces dernières vont permettre à ces nouveaux virus d'infecter d'autres cellules seines et d'assurer leur survie. Le cycle réplicatif du VIH-1 schématisé par la figure 9, débute par l'entrée du virus dans la cellule hôte, suivie de la transcription inverse de l'ARN génomique qui donnera un ADN complémentaire ADNc viral. Après la translocation du double brin d'ADN dans le noyau et l'intégration dans le génome de la cellule hôte, la première phase du cycle viral prend fin. La transcription de l'ADN proviral intégré marque le début de la phase tardive, qui inclue d'autres événements qui sont l'export des ARNs viraux vers le cytoplasme, leur traduction, l'assemblage et le bourgeonnement des particules virales filles. a. La phase précoce du cycle réplicatif du VIH-1 L'attachement à la cellule hôte et l'entrée L'entrée rétrovirale est un mécanisme complexe à multi étapes. Il a été particulièrement bien étudié pour le VIH-1. Premièrement, les glycoprotéines de l'enveloppe gp120, présentes à la surface des particules virales en trimères gp41/gp120 vont reconnatre les récepteurs CD4 retrouvés à la surface des lymphocytes T, des macrophages, des cellules dendritiques et des cellules gliales. Cette interaction conduit à un changement conformationnel des CD4 et gp120. Les réarrangements des domaines de gp120 exposent les sites de liaison aux corécepteurs CCR5 et CXCR4 puis provoquent leur recrutement (Rizzuto et al, 1998) (Figures 10, 11). Cette seconde interaction va aboutir à de nouveaux changements conformationnels de gp120 (Kwong et al, 1998). Ensemble, CD4 et les corécepteurs vont induire des changements conformationnels additionnels de gp41 incluant l'exposition du 19 Introduction générale peptide de fusion qui est le premier à être déplacé vers la membrane cellulaire et y être inséré par la suite (Doms & Moore, 2000). Il va en résulter la fusion des membranes virale et cellulaire et l'entrée de la capside virale dans le cytoplasme. Figure 9. Cycle réplicatif du VIH-1 : La première étape du cycle viral est la reconnaissance et la fusion avec la membrane de la cellule hôte. Le génome viral est rétrotranscrit et intégré au génome cellulaire. Le provirus est transcrit et les protéines virales sont produites. La dernière étape est celle de l'assemblage, bourgeonnement et maturation. Figure modifiée à partir de (Sherman & Greene, 2002). 20 Introduction générale Figure 10. La glyprotéine Env : La glycoprotéine Env est un hétérodimère formé du domaine gp120 attaché non covalemment au domaine transmembranaire gp41 (Tagliamonte et al, 2011). Figure 11. Modèle d'attachement du virion et entrée : gp120 se lie au récepteur CD4 puis aux corécepteurs CCR5/CXCR4 conduisant à la fusion des membranes et à l'entrée dans la cellule (Tagliamonte et al, 2011). 21 Introduction générale La décapsidation et la transcription inverse du génome viral Lys La fusion des membranes virale et cellulaire délivre la capside virale dans le cytoplasme, o l'ARN viral sera rétrotranscrit générant un ADN double brin appelé ADN proviral ou provirus (Telesnitsky & Goff, 1997). L'essentiel du processus est réalisé par la transcriptase inverse virale (RT). Elle requiert la présence de l'ARN viral, qui sert de matrice, et de l'ARNt3 cellulaire qui sert d'amorce. La synthèse de l'ADN proviral est principalement cytoplasmique, au sein d'un complexe nucléoprotéique, mais l'étape essentielle d'initiation se fait dans le milieu clos de la capside virale avant libération de l'ARN viral dans le cytoplasme de la cellule hôte. En plus de la RT, d'autres facteurs cellulaires et viraux contribuent à l'efficacité de la transcription inverse. Les détails de cette étape seront retrouvés dans le paragraphe concernant la transcription inverse de l'ARN viral . L'import vers le noyau L'ADN viral est acheminé vers le noyau sous forme de complexe avec des protéines virales. Il est appelé complexe de préintégration PIC (Figure 12). Le complexe PIC est capable de traverser la membrane nucléaire (Bukrinsky et al, 1992). Il est composé d'un ADN double brin linéaire associé aux protéines virales MA, RT, IN et Vpr et à quelque protéines cellulaires comme LEDGF. Le diamètre de PIC est plus grand que celui du pore nucléaire. Le VIH a développé un mécanisme de transport actif. Les protéines virales associées au PIC, qui possèdent des signaux de localisation nucléaire (NLS), jouent un rôle significatif dans l'entrée dans le noyau. Une structure à trois brins d'ADN retrouvée au centre de l'ADN viral et appelée DNA flap est également requise pour l'import nucléaire (Zennou et al, 2000). Figure 12. Complexe de préintegration PIC : PIC est composé des protéines IN, MA, RT et Vpr. Ces protéines aident l'import de l'ADNc dans le noyau de la cellule infectée (Sherman & Greene, 2002). 22 Introduction générale L'intégration L'intégration de l'ADN proviral représente la seule façon pour le virus de maintenir l'information génétique dans la cellule hôte. Plus de 500 sites d'intégration ont été identifiés dans le génome de lignées de cellules T, révélant que les sites préférentiels de l'intégration du VIH-1 sont les gènes hautement transcrits par l'ARN pol II (Pryciak & Varmus, 1992). C'est l'intégrase du virus qui va médier l'intégration de l'ADN proviral dans le génome de l'hôte (Asante-Appiah & Skalka, 1997). L'intégrase va interagir avec des protéines de l'hôte qui ont la capacité de se lier à l'ADN pour diriger le PIC aux sites cibles pour l'intégration (Van Maele & Debyser, 2005). Ces protéines sont par exemple la protéine Ini1 et la sous-unité du complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF (Kalpana et al, 1994), ou le cofacteur transcriptionnel LEDGF. Le travail de l'intégrase commence dans le cytoplasme (Figure 13), elle va reconnatre un fragment d'ADN de 20 pb situé aux extrémités 3' et 5' des séquences LTR et va cliver un dinucléotide GT sur les deux brins d'ADN. Le résultat est une molécule d'ADN bicaténaire, portant aux extrémités un groupement hydroxyle (Farnet & Haseltine, 1990). Une fois le complexe PIC dans le noyau, l'intégrase va cliver l'ADN cellulaire en un site cible et procède à une réaction de transestérification entre les extrémités 3' hydroxyle (OH) de l'ADN viral et 5' phosphate de l'ADN cellulaire. Les enzymes cellulaires de réparation de l'ADN vont finir l'intégration en clivant les nucléotides non associés et en réparant le double brin d'ADN (Yoder & Bushman, 2000) b. La phase tardive du cycle réplicatif du VIH-1 L'expression de l'ADN proviral et l'export des ARN transcrits Le provirus est inséré dans des structures de la chromatine cellulaire réprimant sa transcription et l'obligeant à rester sous forme latente. Le provirus va parasiter la machinerie transcriptionnelle de la cellule hôte pour l'expression de ses gènes. Ce phénomène se produit lors de changements physiologiques de la cellule comme un stress ou une activation immunitaire. Le provirus se comporte comme un gène cellulaire. En effet, il possède dans sa région U3 du LTR les éléments structuraux caractéristiques des promoteurs des gènes eucaryotiques. Ce promoteur va faciliter le fonctionnement de l'ARN Pol II cellulaire lors de l'initiation de la transcription. Les ARNm viraux seront coiffés en 5', polyadénylés en 3' et épissés comme les ARNm eucaryotes. 23 Introduction générale Figure 13. Mécanisme d'intégration de l'ADN viral dans le génome de la cellule hôte : L'intégrase virale se lie aux extrémités des LTR des deux côtés de l'ADN viral et par attaque nucléophilique, les deux nucléotides GT sont enlevés, libérant une extrémité 3'-hydroxyle. L'intégrase clive également l'ADN de l'hôte et les extrémités 3'-hydroxyle de l'ADN proviral sont liguées aux extrémités 5' phosphate de l'ADN hôte par l'intégrase. Les sites de ligation sont réparés par les enzymes cellulaires (Abbink & Berkhout, 2007). La synthèse des ARNm à partir du provirus est continue, très efficace et contrôlée par un système de régulation très puissant via la protéine Tat et des protéines d'origine cellulaire. Des étapes distinctes peuvent être décrites pour l'expression des gènes du VIH-1 : la première est sous la dépendance exclusive des facteurs de transcription cellulaire. 24 Introduction générale L'élongation par l'ARN Pol II n'y est pas très efficace et donne des ARNm abortifs, non polyadenylés. Ces ARNm viraux sont multi-épissés et traduits par la machinerie cellulaire. Ils vont conduire à la production des protéines virales Tat, Rev et Nef. La seconde étape dépend de l'activation par la protéine Tat. Tat une fois synthétisée va retourner dans le noyau et stimuler très fortement (x 100) la transcription de l'ADN proviral en augmentant la processivité du complexe transcriptionnel formé par l'ADN Pol II (Strebel, 2003). Tat se lie à la tige boucle TAR, en début de la synthèse de l'ARN viral. Elle agit comme une molécule adaptatrice qui dirige des composants de la machinerie transcriptionnelle au niveau de l'ARN viral pour promouvoir la processivité de la polymérase cellulaire. Elle permet de recruter le facteur d'élongation P-TEFb (Figure 14). Les ARNm produits lors de cette étape sont de taille variable. Ils sont issus d'un seul transcrit par un mécanisme d'épissages alternatifs (Schwartz et al, 1992). Les ARNm non épissés codent pour les polyprotéines Gag et GagPol tandis que les mono-épissés codent pour les protéines Vif, Vpr, Vpu et les glycoprotéines de l'enveloppe. La protéine Rev permet l'export des ARNm non épissés et mono-épissés de grande taille dans le cytoplasme (Strebel, 2003). Ce phénomène est observé en phase tardive du cycle viral et permet l'accumulation des ARNm viraux de haut poids moléculaire dans le cytoplasme. La traduction des précurseurs La traduction des ARNm viraux est réalisée dans le cytoplasme et se fait en parasitant la machinerie cellulaire. Elle permet la synthèse des précurseurs protéiques Gag et GagPol à partir d'un même transcrit, tout comme la synthèse des protéines de l'enveloppe et Vpu. La traduction des deux précurseurs ne se fait pas de la même manière. La protéine GagPol est obtenue grâce à un décalage du cadre de lecture de type -1 des ribosomes en fin de traduction du précurseur Gag. La présence d'une séquence de glissement associée à une tige boucle permet un décalage d'un nucléotide vers le 5' du cadre de lecture (Jacks et al, 1988) avec un rapport entre la synthèse de Gag et de GagPol (20 : 1) qui est critique pour la propagation du virus (Karacostas et al, 1993). La synthèse des protéines Env et Vpu est obtenue à partir d'un ARNm bi-cistronique. Il contient deux ORF, Vpu et Env qui se suivent et se chevauchent. La traduction de Env se fait grâce à un mécanisme appelé Leaky scanning . Il consiste à sauter le codon d'initiation 25 Introduction générale de Vpu, ce dernier ne se trouvant pas dans un contexte nucléotidique très efficace au démarrage de la traduction (Schwartz et al, 1990). Figure 14. Modèle de l'action de la Tat : 1 : Synthèse d'un faible taux d'ARN messagers viraux non polyadénylés. 2 : Fixation de Tat sur TAR en 5' de l'ARNv et recrutement du complexe P-TEFb (Cycline T1 et la protéine kinase Cdk 9) 3 : Hyperphosphorylation du domaine C-terminal de l'ARN polymérase II par Cdk9 ; 4 : Dissociation du complexe Tat-TAR-Cycline T1 : Cdk9 et synthèse de longs transcrits polyadénylés augmentant la production de protéines virales. L'assemblage des virions L'assemblage est un processus très sélectif, le virus encapside l'ARN non épissé, l'ARN génomique ARNg , une espèce minoritaire d'ARN qui sert aussi d'ARNm à Gag et GagPol. C'est le précurseur Gag aussi appelé Pr55Gag qui joue le rôle central dans la formation des particules et conduit à l'assemblage des complexes protéine-protéine, protéine-ARN et protéine-lipide. Il orchestre ainsi l'incorporation des composants principaux dans les virions. Pr55Gag est l'unique composant du virus qui peut s'auto-assembler par une multimérisation de ces monomères et peut former les GagVLPs Virus-like particles . Ce sont des structures sphériques qui forment des particules virales immatures (Gheysen et al, 1989). 26 Introduction générale L'assemblage se fait au niveau du site du bourgeonnement du virus qui est la membrane plasmique. Le domaine MA du précurseur Pr55Gag est démontré comme étant le déterminant majeur responsable de l'adressage et l'attachement de Gag à la membrane plasmique. Ce domaine est myristylé et va ancrer Pr55Gag dans la membrane plasmique grâce au groupement myristyl qui s'enchâsse dans la bicouche lipidique (Gttlinger et al, 1989). L'assemblage des autres composants du virus requiert l'intervention de Pr55Gag. La protéine Env est synthétisée sous forme de précurseur gp160 qui transite par le réticulum endoplasmique o il est glycosylé. Après maturation, gp120 et gp41 s'associent au domaine MA de Gag. L'encapsidation des ARNg non épissés se fait grâce au domaine NC de Pr55Gag. La région de Pol spécifiant les enzymes PR, RT et IN est incorporée grâce à des interactions entre les précurseurs Pr55Gag et la portion Gag du Pr160GagPol. Durant l'assemblage, d'autres composants sont également incorporés dans les particules virales à savoir des protéines virales et cellulaires. Elles ne sont pas indispensables à l'assemblage proprement dit mais absolument nécessaires pour convertir le virion en particule virale infectieuse. Vpr est encapsidée par une interaction avec la partie N-terminale du domaine p6 du précurseur Pr55Gag. La protéine Vif ayant la capacité de se lier à la fois avec l'ARN viral (Dettenhofer et al, 2000 ; Zhang et al, 2000) et avec les précurseurs Pr55Gag et Pr160GagPol (Huvent et al, 1998) pourrait jouer un rôle dans l'assemblage. La protéine Nef qui est retrouvée au niveau du core de la particule virale est incorporée selon un mécanisme encore inconnu. Les composants cellulaires qui sont également retrouvés dans les particules Lys qui est l'amorce de la transcription inverse du génome du VIH-1 et la virales sont : l'ARNt3 lysyl-ARNt synthétase qui sert de co-transporteur à cet ARNt, ainsi que d'autres protéines cellulaires qui sont des partenaires potentiels de Pr55Gag à savoir la cyclophiline A, la protéine Hsp70 et Tsg101. Le bourgeonnement Le virion assemblé doit bourgeonner de la cellule productrice pour pouvoir infecter de nouvelles cellules du système immunitaire de l'hôte. Cette dernière étape met en jeu le domaine L late de Pr55Gag dont le motif Pro-Thr/Ser-Ala-Pro est hautement conservé. Il est localisé en N-terminal de la région p6 du Pr55Gag (Gttlinger et al, 1991 ; Huang et al, 1995). Plusieurs protéines cellulaires ont été favorisant le bourgeonnement des virions et leur libération dans le milieu extracellulaire. Ce sont des identifiées comme 27 Introduction générale protéines qui sont impliquées dans le trafic membranaire et la dégradation par le protéasome (Morita & Sundquist, 2004 ; Pornillos et al, 2002). La région p6 de Pr55Gag est mono- ubiquitinilée. La mono-ubiquitination sert de signal pour recruter les protéines membranaires notamment la protéine Tsg101 Tumor Suppressor Gene 101 , une protéine de conjugaison de l'ubiquitine E2. Le virus en se liant à cette protéine pourrait accéder à la machinerie qui catalyse le bourgeonnement des vésicules VPS (ESCRT) Endosomal Sorting Complexes Required for Transport et ainsi permettre le bourgeonnement des particules virales. La maturation Pendant le bourgeonnement ou peu de temps après, les virus naissant vont subir des changements structuraux et morphologiques conduisant à leur maturation. Pendant l'assemblage, l'interaction de deux précurseurs Pr160GagPol permet la dimérisation des domaines protéase ce qui conduit à la formation d'une protéase homodimérique active. Elle sera libérée par un mécanisme autocatalytique (Debouck et al, 1987). Les précurseurs Pr55Gag et Pr160GagPol sont clivés par la protéase virale. La libération de la protéine CA mature va permettre un changement morphologique significatif du virus. Elle permet de former la capside virale (Briggs et al, 2004). La génération de NC et MA ont également des conséquences significatives dans la maturation des virus. La NC mature permet de condenser le complexe ribonucléoprotéique (RNP) et de stabiliser l'ARN viral dimérique. Ces deux propriétés sont importantes pour la réplication rétrovirale (Rein et al, 1998). La MA mature s'organise et forme l'enveloppe interne. Les virus formés sont viables et infectieux. 3. La transcription inverse de l'ARN viral La transcription inverse ou rétrotranscription est une étape centrale du cycle réplicatif du VIH-1. La conversion du génome viral ARN en ADN double brin est réalisée essentiellement par la RT. Cet enzyme requiert un ARNt cellulaire spécifique, l'ARNt3 qui lui servira d'amorce pour la rétrotranscription du génome viral. Les modalités exactes du démarrage de la réplication ne sont pas encore clairement comprises. Plusieurs données montrent que l'initiation de la réplication se fait avant la libération de l'ARN viral dans le cytoplasme des cellules infectées. Lys 28 Introduction générale a. Les étapes de la transcription inverse La transcription inverse de l'ARNg du VIH-1 se déroule selon les étapes communes aux rétrovirus. Ces étapes sont décrites dans ce paragraphe et illustrées par la figure 15. Le début de la transcriptio12n inverse et la synthèse de l'ADN sb Strong-Stop (-) La transcription inverse commence par l'attachement de l'ARNt3 Lys à l'ARN viral Lys possède une séquence de 18 nucléotides terminaux (Figure 15a). L'extrémité 3' de l'ARNt3 appelée anti-PBS (Figure 16A). Elle est strictement complémentaire au site de liaison de l'amorce PBS Primer Binding Site retrouvé en position ( 182 à 199) dans la région 5' UTR de l'ARN viral (Figure 16B). Cette étape requière également d'autres appariements entre les deux molécules d'ARN (Isel et al, 1995). La RT reconnat un homoduplex ARN- Lys et l'ARN viral (Figure 16C), puis elle ARN formé et correctement replié entre l'ARNt3 catalyse l'extension de l'extrémité 3' de l'amorce ARNt en utilisant l'ARN viral comme matrice. L'ADNc synthétisé jusqu'à l'extrémité 5' de l'ARNg est un intermédiaire appelé minus strand strong-stop DNA ou ADNss (-) (Figure 15b). Le domaine RNaseH de la RT dégrade l'ARN matrice qui avait servi à la synthèse de l'ADNss (-). Sans dégradation complète de ces fragments, le transfert de brin qui doit suivre cette étape n'est pas possible. Par contre, l'homoduplex ARN/ARN n'est pas dégradé par la RNaseH et servira d'amorce à une étape ultérieure. Le premier transfert de brin L'ADNss (-) est transloqué sur la région R à l'extrémité 3' du génome viral (Figure 15c). Cette étape est considérée comme le premier transfert de brin. Des études suggèrent que le premier transfert de brin peut être intra- ou intermoléculaire étant donné la nature dimérique du génome viral (Aldovini & Young, 1990 ; Van Wamel & Berkhout, 1998). Lors de cette étape, la NC et éventuellement l'actine facilitent le transfert de brin. Après transfert et hybridation totale, l'ADNss (-) va servir d'amorce à la synthèse du brin (-). 29 Introduction générale Figure 15. Transcription inverse du VIH-1 : Ce phénomène est multi étapes. Les différentes étapes sont illustrées sur ce schéma et indiquées de a à i. Le produit final est un ADN double brin, il servira de matrice à la synthèse des protéines virales (Abbink & Berkhout, 2007). 30 Introduction générale Lys est montré en rouge la région anti- Figure 16. Structures secondaires des ARNt et ARNv : (A) : Sur l'ARNt3 PBS de 18 nucléotides qui reconnat en (B) la région PBS de l'ARNv et va s'y hybrider pour former le complexe ARNv-ARNt3 Lys présenté en (C). (Isel et al, 1995). La synthèse du brin d'ADN (-) La transcription inverse se poursuit jusqu'au PBS (Figure 15d). La RNaseH dégrade l'ARN viral matrice à l'exception de deux fragments qui résistent au clivage : ce sont les polypurine tracts , des séquences riches en purines et longues de 15 nucléotides. Elles sont respectivement retrouvées dans la région U3 (PPT3') et au centre de la matrice ARN (PPTc) (Figure 15e). La synthèse du brin d'ADN ( ) et second transfert de brin L'ADN (-) servira à son tour de matrice pour la synthèse du brin d'ADN de polarité positive, ADN ( ). Les séquences ARN persistantes (PPT3', PPTc) vont quant à elles servir d'amorce (Figure 15f). La synthèse d'ADN ( ) à partir du PPT3' va continuer d'avancer jusqu'à l'ARNt3 Lys, ce dernier étant toujours attaché à l'ADN (-). Ses 18 nucléotides 3'-terminaux sont donc retrotranscrits et la synthèse va s'arrêter à sa première base modifiée. Il s'agit d'une Lys. Cette méthylation est méthylation en position 1 du nucléotide A58 de l'ARNt3 Lys par la indispensable pour éviter l'obtention de produits trop longs. Le clivage de l'ARNt3 RNaseH s'effectue entre les ribonucléotides A et C 3' terminaux de cet ARNt, laissant le A lié 31 Introduction générale à l'ADN (Figure 15g). Cette excision conduit au second saut de brin, il consiste à transférer l'ADN positif strong stop ou ADNss ( ) à l'extrémité 3' du brin complet d'ADN (-) et hybridé sur la séquence PBS (Figure 15h). La synthèse des deux brins d'ADN et terminaison de la transcription inverse La transcription inverse se poursuit le long du brin négatif jusqu'à ce que la RT rencontre le PPTc ( ). L'élongation va alors s'arrêter au niveau du PPTc par un mécanisme appelé strand displacement jusqu'à ce que la RT atteigne un site voisin (80-100 nts en aval) : une séquence centrale de terminaison appelée CTS, riche en ribonucléotides A et T (Figure 15i). La fin de la transcription inverse donne un ADN proviral double brin qui est flanqué par deux régions identiques comprenant les séquences U3-R-U5, appelées LTR Long Terminal Repeat . Il contient aussi un ADN ( ) discontinu, appelé DNA flap au centre. Cette structure à trois brins est spécifique aux lentivirus et est importante à l'étape de l'import nucléaire et à la réplication virale dans des cellules qui ne sont pas en division. b. L'initiation de la transcription inverse Les modalités de l'initiation de la transcription inverse Les modalités exactes du démarrage de la réplication ne sont pas encore clairement comprises. Il existe une régulation spatio-temporelle de l'initiation de la transcription inverse du génome viral dans la cellule hôte. Un démarrage précoce de la rétrotranscription lors de la phase tardive du cycle réplicatif y est empêché par l'action de la nucléocapside. Lorsque l'un ou les deux doigts de zinc de NC sont delétés, il a été observé la synthèse d'ADN viral dans la cellule hôte avant encapsidation. L'encapsidation de l'ADN viral dans les particules donne des virions non infectieux (Houzet et al, 2008). D'autres données soulignent la possibilité du déroulement des premières étapes dans la capside des particules virales peu avant l'étape d'attachement du virus à la cellule cible (Huang et al, 1997 ; Lori et al, 1992 ; Oude Essink et al, 1996 ; Trono, 1992), ou dans le cytoplasme de la cellule infectée avant la décapsidation. Des études ont montré la présence d'ADN viral court de polarité négative dans les virions, il correspond à l'allongement de l'ARNt amorce jusqu'au premier signal d'arrêt (Lori et al, 1992 ; Zhang et al, 1995). Les mécanismes responsables de cette restriction sont méconnus, mais certains motifs et structures de l'ARN viral seraient impliqués tout comme la faible concentration des dNTP à l'intérieur de la capside (Beerens & Berkhout, 2002b ; Beerens & 32 Introduction générale Berkhout, 2002a ; Cobrinik et al, 1991 ; Cobrinik et al, 1988 ; Isel et al, 1995 ; Liang et al, 1997). Indirectement, une autre étude montre que Vif est moins efficace pour bloquer l'action d'APOBEC3G si cette dernière est incorporée dans les virions (Liu et al, 2004). Ceci démontre qu'il y a de l'ADN nouvellement synthétisé dans les virions et pouvant être modifié par APOBEC3G. Enfin, lorsque l'ARNt amorce n'est pas encapsidé, l'infectivité des virions en est réduite (Guo et al, 2003). Ces arguments démontrent la nécessité d'encapsider l'ARNt amorce sélectivement lors de l'assemblage des virions. Les exemples d'ARNt servant d'amorce à l'initiation de la transcription inverse Ce phénomène ne se limite pas au VIH-1, d'autres rétrovirus et rétrotransposons dont la synthèse de l'ADNc nécessite une amorce complémentaire à leur région PBS utilisent des ARNt cellulaires pour initier la transcription inverse de leur ARN génomique. Pour exemple, l'ARNtTrp est utilisé comme amorce par les virus de sarcome aviaire (ASV) Avian Sarcoma Virus et (ALV) Avian Leukosis Virus (Sawyer & Dahlberg, 1973 ; Waters et al, 1975). L'ARNtPro est utilisé par le virus de la leucémie murine de Moloney (Mo-MuLV) (Peters et al, 1977). c. L'ARNtLys et son encapsidation dans le VIH-1 L'ARNt3 Lys et ARNt2 Lys est utilisé comme amorce par le VIH-1. Il existe trois isoformes majeures de l'ARNt Lys dans les cellules de mammifères (Raba et al, 1979) (Figure 17A. B). Les Lys différent l'un de l'autre par une paire de bases située dans la tige de ARNt1 l'anticodon et sont les amorces de plusieurs rétrovirus incluant le virus Mason-Pfizer du singe Lys sert d'amorce au virus des ou le virus humain Human Foamy Virus (HFV). L'ARNt3 tumeurs mammaires de souris (Waters & Mullin, 1977). Il sert aussi d'amorce aux lentivirus. A savoir, au virus de l'anémie infectieuse du cheval, au virus de l'immunodéficience féline (FIV), au virus de l'immunodéficience simienne (SIV) et aux virus de l'immunodéficience humaine de type 1 et 2. L'assemblage et la concentration des ARNtLys dans le VIH-1 Les ARNtLys sont encapsidés sélectivement durant l'assemblage des rétrovirus. Des études produisant le VIH-1 dans les cellules COS7 transfectées par de l'ADN proviral ont montré que les trois isoformes d'ARNtLys sont très majoritairement retrouvées encapsidées Lys équivalents à ceux qui dans les virions. Ils sont retrouvés à des ratios ARNt3 Lys /ARNt1, 2 33 Introduction générale prévalent dans le cytoplasme des cellules infectées (Huang et al, 1997). Il a été estimé qu'il y avait 20 molécules d'ARNtLys par virion (pour deux molécules d'ARN génomique) (Huang et al, 1997). La concentration en ARNtLys dans les particules virales est un des facteurs contrôlant l'infectivité des populations du VIH-1 (Gabor et al, 2002). L'altération du ratio ARNt3 Lys affecte l'infectivité. Lys /ARNt1, 2 Figure 17. Les trois isoformes de l'ARNtLys : (A) : L'ARNt1 l'anticodon tandis que l'ARNt2 ms2t6 A (Raba et al, 1979). Pour l'ARNt3 nucléotides entourés pour les trois ARNt sont les bases qui différent les ARNt1, 2 requis à l'hybridation sur la région PBS du génome du VIH-1. Lys a une paire de base G-C au milieu de la tige de Lys : S est mcm5s2U, et R est Lys, la région indiquée en rouge correspond à l'anti-PBS. Les Lys et qui sont Lys a une paire A-U à cet emplacement. (B) L'ARNt3 Lys de l' ARNt3 Les ARNt1, 2 Lys qui différent de l'ARNt3 Lys de 14 ou 16 nucléotides ne peuvent pas servir d'amorce à la rétrotranscription du génome viral, car leur séquence dans la partie 3' anti-PBS diffère de 5 nucléotides sur les 18 nucléotides de la séquence PBS. Leur fonction éventuelle dans le VIH-1 n'est pas connue. Des études récentes suggèrent qu'ils pourraient jouer un rôle lors de l'import du complexe de préintégration vers le noyau des cellules infectées (Zaitseva et Lys servira d'amorce, on ne sait pas si sa liaison au génome viral se fait al, 2006). L'ARNt3 avant ou après l'étape de bourgeonnement du virus. D'autres études menées par Tisné et Lys qui sont collaborateurs se sont focalisées sur la recherche des nucléotides de l'ARNt3 indispensables à l'initiation de la transcription inverse. Le groupement 2-thio en position 34 34 Introduction générale Lys semble jouer un rôle important dans ce processus (Isel et al, 1993 ; Tisné et al, de l'ARNt3 2000). Le placement de l'amorce ARNt sur le génome viral est facilité par l'activité chaperonne de la NC. Elle agit en deux étapes. Elle facilite l'échange de brin au niveau de la Lys, et agit également en déstabilisant les interactions tertiaires tige acceptrice de l'ARNt3 hautement stables au niveau de la boucle TC de l'ARNt (Tisné, 2005 ; Tisné et al, 2004). Les mécanismes possibles d'encapsidation des ARNtLys Comme la séquence d'hybridation à la région PBS n'est pas retrouvée dans les Lys, l'appariement des ARNt à la séquence PBS ne peut être impliquée dans ARNt1, 2 l'encapsidation de ces ARNt. Des études ont montré que l'ARN génomique n'est pas requis pour l'incorporation de l'amorce ARNt par le virus VIH-1 (Jiang et al, 1993 ; Mak et al, 1994). Cette observation est aussi valable pour les virus ASV (Prats et al, 1988) et Mo-MuLV (Levin & Seidman, 1981). Plusieurs études in vitro indiquent que la séquence de la RT des rétrovirus est impliquée dans l'encapsidation des ARNt. La RT mature lierait l'anticodon et les Lys (Barat et al, 1989 ; Mishima & Steitz, 1995). D'autres boucles D et TC de l'ARNt3 protéines comme la NC (Mely et al, 1995) et la polyprotéine Gag (Feng et al, 1999) ont été décrites comme pouvant interagir avec l'ARNt3 Lys. Toutefois, les associations décrites ne sont pas très spécifiques des ARNtLys car ces protéines ont une haute affinité pour les acides nucléiques d'une manière générale. Aucune donnée actuelle ne montre que ces protéines sont directement impliquées dans l'encapsidation Lys. Elles sont probablement impliquées dans les étapes de placement et de l'ARNt3 d'hybridation de l'amorce sur la séquence PBS dans les virions matures. La Lysyl-ARNt synthétase, transporteur des ARNtLys L'encapsidation sélective des ARNtLys cellulaires ne semble pas être dictée par une association spécifique et directe à une protéine virale. Elle implique l'intervention d'une protéine de la cellule hôte. L'incorporation des ARNtLys se ferait sous forme d'un complexe avec l'un de ses partenaires naturels de la synthèse protéique car cet ARNt n'est jamais libre dans une cellule Lys proposé a été la lysyl-ARNt o la synthèse protéique est active. Le partenaire de l'ARNt3 synthétase (LysRS) car les trois isoformes de l'ARNtLys sont retrouvées encapsidées dans le virus. Des anticorps polyclonaux dirigés contre la LysRS cytoplasmique humaine ont permis 35 Introduction générale d'identifier un polypeptide immunoréactif de 70 kDa dans des extraits de particules virales purifiées du VIH-1 (Cen et al, 2001). II. Les aminoacyl-ARNt synthétases (aaRS) A. Généralités sur les aminoacyl-ARNt synthétases La très grande conservation du code génétique universel suggère que les aminoacyl- ARNt synthétases (aaRS) ont été développées très tôt et sont parmi les premières protéines douées d'une activité enzymatique du RNA world . Les aaRS sont des enzymes clés de la synthèse protéique chez les organismes eucaryotes mais aussi procaryotes. Ce sont des adaptateurs entre le langage des protéines et le langage des acides nucléiques. Elles aminoacylent spécifiquement les ARN de transfert (ARNt) qui pourront être acheminés vers le ribosome et se fixer spécifiquement sur les ARN messagers (Figure 18). Cette réaction d'aminoacylation est spécifique, elle est en général catalysée par une famille de 20 aminoacyl-ARNt synthétases (aaRS). Chaque enzyme de cette famille reconnat un acide aminé et un ou plusieurs ARNt isoaccepteurs. Cette réaction est appelée aminoacylation de l'ARNt. Les aaRS sont modulaires : elles présentent un domaine catalytique, site actif de l'aminoacylation, ainsi que d'autres modules peptidiques dont le rôle est de reconnaitre et lier l'ARNt. Il existe deux classes d'aaRS, les classe I et II. Les aaRS sont classées selon leur structure hautement conservée (Eriani et al, 1990). Chez les eucaryotes, plusieurs supramoléculaires (multisynthétases). d'entre-elles complexes sont retrouvées dans des 1. La réaction d'aminoacylation Les aaRS assurent la synthèse d'aminoacyl-ARNt (aa-ARNt) en plusieurs étapes, dont la contribution relative à la spécificité varie d'un enzyme à un autre. a. L'activation de l'acide aminé L'aaRS lie l'acide aminé sélectivement et positionne son groupement carboxyle pour attacher le phosphate de l'ATP. Mg2 aa ATP aaRS (aaAMP) : aaRS PPi 36 Introduction générale Figure 18. Rôle des aminoacyl-ARNt synthétases dans la synthèse protéique : Les aaRS aminoacylent les ARNt spécifiquement lors de la biosynthèse des protéines. L'ARNt forme ensuite un complexe ternaire EF1A/GTP/aa-ARNt qui est le donneur d'ARNt pour la synthèse protéique ribosomale. L'ATP attaché lors de cette étape d'activation de l'acide aminé est dans une conformation caractéristique à ce type de protéines : 5' phosphate étendu pour les enzymes de classe I (Perona et al, 1993) ou replié en arrière de la base pour la classe II (Cusack et al, 1990). La réaction chimique parat similaire pour les deux classes vis à vis du déplacement du pyrophosphate de l'ATP par le groupement carboxyle de l'acide aminé. Le rôle catalytique des aaRS de classe I et II est également similaire. Elles vont créer plusieurs liaisons entre ces substrats en utilisant des groupements conservés retrouvés dans les sites actifs des synthétases. De plus, les éléments conservés des synthétases de classes I et II offrent des groupements polaires qui stabilisent spécifiquement le pyrophosphate et l'état de transition 37 Introduction générale pour la formation de l'adenylate (aaAMP). Les deux types d'aaRS utilisent des métaux divalents et des acides aminés polaires comme l'arginine, la lysine et l'histidine pour catalyser cette étape. Dans chacune des deux classes de synthétases, les sites actifs se superposent parfaitement et les éléments structuraux jouant le même rôle ont été identifiés (Arnez & Moras, 1997). b. L'édition pré-transfert Un acide aminé activé par la synthèse de son adenylate ne va pas forcement servir à charger un ARNt. Certaines synthétases de type I ont une fonction d'édition. Elles hydrolysent les aminoacyl-adenylates misactivés avant leur transfert vers l'ARNt (Fersht, 1977). (aaAMP) : aaRS aa AMP aaRS (ARNt) c. Le transfert de l'aminoacyl L'aminoacyl-ARNt est formé suite à l'attaque de l'hydroxyle 2' ou 3' du ribose terminal de l'ARNt sur le carbone de la fonction carbonyle de l'aminoacyl-adénylate lié à l'enzyme (Perona et al, 1993). (aaAMP) : aaRS ARNt aa-ARNt aaRS AMP d. L'édition post transfert Même après le transfert de l'aminoacyl, l'aa-ARNt n'est pas nécessairement conduit vers le ribosome. Une édition hydrolytique de l'ARNt mischargé est possible (Eldred & Schimmel, 1972). A ce stade, l'aaRS peut encore corriger les erreurs qui n'ont pas été détectées auparavant. Ce dernier niveau d'édition, dépendant des aaRS et de l'acide aminé non apparenté (Freist & Sternbach, 1989), permet une aminoacylation exacte et stricte. 2. Les ARN de transfert Prédits par F. Crick en 1955, les ARNt ont été découverts par Hoagland et collaborateurs en 1958. Depuis, les séquences de gènes d'ARNt chez différents organismes sont répertoriés dans la banque d'ARNt (Sprinzl & Vassilenko, 2005) ( bayreuth. de). Plus de 80 modifications post-transcriptionnelles ont été identifiées (Sprinzl & Vassilenko, 2005). La structure 2D en feuille de trèfle des ARNt a été prédite grâce au 38 Introduction générale séquençage du premier ARNt, l'ARNtAla (Holley et al, 1965). La première structure cristallographique résolue est celle de l'ARNtPhe de levure (Kim et al, 1974 ; Robertus et al, 1974). Chez les procaryotes, les gènes d'ARNt sont généralement organisés en opéron tandis que chez les eucaryotes, ils sont isolés et transcrits pas l'ARN Pol III. Après leur transcription, les ARNt transcrits subissent six étapes de maturation majeures (Hopper & Phizicky, 2003), il s'agit essentiellement de l'addition de la séquence CCA en 3' pour les ARNt d'eucaryotes, de plusieurs bactéries ainsi que de quelques archae et d'organelles (Levinger et al, 2004). Une seconde modification est l'épissage des introns de certains ARNt d'eucaryotes et de quelques archae (Abelson et al, 1998). Ils sont aussi le site de nombreuses modifications post- transcriptionnelles. La taille des ARNt varie d'environ 60 (chez certains ARNt mitochondriaux) à une centaine de nucléotides (pour les ARNt ayant une longue boucle variable). Ils adoptent une structure secondaire canonique en feuille de trèfle (Figure 19A) mettant en évidence leurs différents domaines : un bras accepteur qui porte la séquence simple brin CCA, site d'attachement de l'acide aminé. Une boucle TC qui est le domaine le plus conservé chez les ARNt, une boucle DhU qui contient le dihydrouridine, une région variable dont la longueur varie selon les deux classes d'ARNt. Enfin, une boucle de l'anticodon qui porte le triplet de nucléotide appelé l'anticodon. Cette séquence est comprise entre les nucléotides 34 et 36. Ces trois nucléotides sont complémentaires au codon présent sur l'ARNm. La structure tridimensionnelle de l'ARNt en forme de L (Figure 19B. C) a été déterminée grâce aux structures cristallographiques d'ARNt. Elles montrent que certains des résidus sont impliqués dans des interactions tertiaires, en plus des interactions secondaires, donnant un repliement tridimensionnel en forme de L . La forme L présente une branche acceptrice, issue du repliement des bras accepteur et du bras TC ainsi qu'une branche de l'anticodon issue du repliement du bras accepteur et du bras DhU. 39 Introduction générale Figure 19. La structure des ARNt : Les ARNt sont généralement représentés par leur structure secondaire sous forme de feuille de tréfle (A) ou sous forme de L (B, C). La forme 3D (C) est issue des associations tertiaires au sein des structures (A) et (B). Ces interactions sont représentées en lignes continues et discontinues. La sélection des ARNt est le résultat d'interactions spécifiques entre l'ARNt et sa synthétase homologue. Ces interactions sont médiées par des éléments positifs qui définissent la reconnaissance et sont appelés déterminants d'identité . Des interactions non spécifiques entre l'ARNt et une synthétase non homologue sont empêchées par des éléments négatifs qui définissent le rejet, ils sont appelés anti-déterminants d'identité (Giegé et al, 1998). De manière générale, la structure en L des ARNt permettrait la présentation correcte de ces éléments à l'enzyme. Les structures tridimensionnelles de complexes aaRS-ARNt montrent 40 Introduction générale que cette interaction conduit à des changements conformationnels de l'ARNt au niveau de l'extrémité acceptrice et de la boucle de l'anticodon (Rould et al, 1989). La majorité de ces déterminants d'identité se situent dans ces régions de l'ARNt et la plupart d'entre eux ne sont pas nécessairement conservés d'un ARNt à un autre. Ces signaux peuvent être un nucléotide, dont très souvent le N73, une paire de base, souvent parmi les 5 dernières paires de bases de la tige acceptrice, un motif structural particulier comme la boucle D et la région variable de l'ARNtPhe (Perret et al, 1992), ou encore la modification post-transcriptionnelle d'une base comme celle en position 34 de l'ARNtIle chez E. coli (Muramatsu et al, 1988). 3. L'organisation modulaire et structure des aaRS Les aaRS sont des enzymes modulaires de tailles, de structures oligomériques et de séquences en acides aminés très hétérogènes. La taille des sous-unités chez E. coli varie de 344 pour la TrpRS à 951 aa pour la ValRS (Freist et al, 1997 ; Shiba et al, 1997). Les structures quaternaires des aaRS sont composées de monomères (), d'homodimères et de tétramères (2, 4) mais aussi d'hétérotétramères (22). L'AlaRS est un tétramère 4 alors que la PheRS adopte une structure tétramérique 22 pour l'enzyme cytoplasmique chez tous les organismes procaryotes et eucaryotes connues, alors que la forme mitochondriale chez la levure et l'homme est sous forme de monomère (Bullard et al, 1999). Elles sont globalement composées de deux modules principaux : le premier est le domaine catalytique (CAT) ancestral , qui est le siège de l'activation et du transfert de l'acide aminé. Le second est un domaine de liaison de l'anticodon de l'ARNt Anticodon-Binding Domain (ABD) (Figure 20). La réaction d'aminoacylation n'est efficace que lorsque ces deux domaines sont liés de manière covalente (Zhang & Hou, 2005). Aux deux domaines fonctionnels peuvent s'ajouter une soixantaine de modules peptidiques additionnels de structures variées en C- ou N-terminal. Ils sont impliqués dans les fonctions canoniques des aaRS ou encore confèrent de nouvelles propriétés à l'enzyme, indépendantes de la synthèse protéique (O'Donoghue & Luthey-Schulten, 2003 ; Schimmel & dePouplana, 1999 ; Wolf et al, 1999). Les modules additionnels chez les eucaryotes confèrent la possibilité d'une forte liaison aux acides nucléiques et sont souvent impliqués dans la rétention de l'ARNt. Effectivement, ces domaines fusionnés ne vont pas déformer ou réorienter les complexes aaRS-ARNt mais augmenter le taux on et diminuer le taux off de l'association avec 41 Introduction générale l'ARNt (Kaminska et al, 2001 ; Morales et al, 1999). Pour exemple, le motif coiled-coil est retrouvé en N- ou C-terminal des GluProRS, GlyRS, HisRS, TrpRS, ProRS, GluRS et MetRS (Cahuzac et al, 2000) et des séquences riches en lysine à l'extrémité N-terminale des AspRS et LysRS d'eucaryotes (Francin et al, 2002 ; Frugier et al, 2000). Figure 20. Evolution des aaRS : La forme ancestrale des aaRS consiste en un domaine catalytique (CAT), auquel se serait ajouté le domaine de liaison de l'ARNt (ABD) au cours de l'évolution ainsi que d'autres domaines additionnels, de façon concomitante à l'évolution de l'ARNt. 42 Introduction générale 4. Les classes des aminoacyl-ARNt synthétases De part leur grande variabilité, de nombreuses études tentèrent d'unifier la famille des aaRS en cherchant des corrélations structurales et fonctionnelles. Les aaRS ont pu être divisées en deux grandes classes I et II de 10 membres chacune (Figure 21) selon la présence de motifs peptidiques mutuellement exclusifs en séquence d'acides aminés (Arnez & Moras, 1997 ; Cusack, 1997 ; Eriani et al, 1990). Cette division reflète des topologies structuralement distinctes de leur site catalytique (Figures 21, 22). Figure 21. Classification des aaRS : Les deux classes des aaRS sont représentées avec les membres de chaque famille, leurs caractéristiques et les sous classes. 43 Introduction générale a. La classe I Les aaRS de ce groupe sont pour la plupart monomériques ou homodimériques. Le domaine catalytique des enzymes de la classe I est constitué par une cage / et d'un cœur interne formé par cinq brins parallèles. Il est appelé domaine de Rossman . Il est connu pour être un élément de liaison des nucléotides. Ce dernier a été caractérisé lors de la résolution de la première structure d'aaRS, la TyrRS de Bacillus stearothermophilus (Brick & Blow, 1987). Les synthétases de ce groupe présentent deux motifs consensus HIGH (His-Ile-Gly- His) et KMSKS (Lys-Met-Ser-Lys-Ser). Ces motifs sont des éléments cruciaux dans la structure du site actif pour la synthèse de l'aminoacyl-adenylate. Les aaRS de classe I approchent l'ARNt du côté du petit sillon et catalysent l'attachement de l'acide aminé en position 2' OH de l'adénosine A76 terminale de l'ARNt (Figures 21, 22A). Les aaRS de la classe I sont divisées en 3 sous-classes à partir d'alignement des séquences (Cusack et al, 1991 ; Eriani et al, 1990). La répartition des différentes aaRS est basée sur des similarités de séquences. Elle est corrélée avec la classification des acides aminés qu'elles fixent. La classe Ia (MetRS, IleRS, LeuRS, ValRS, CysRS, ArgRS) regroupe les aaRS spécifiques des acides aminés hydrophobes, la classe Ib (GluRS, GlnRS) est spécifique quant à elle d'un acide aminé chargé et de son dérivé amide, tandis que la dernière sous classe Ic est spécifique des acides aminés aromatiques, regroupant les TyrRS et TrpRS. Ces dernières sont dimériques et cette dimérisation est essentielle à leur activité enzymatique (Brick et al, 1989 ; Doublie et al, 1995). b. La classe II Les enzymes de classe II sont multimériques, essentiellement dimériques à l'exception de la PheRS mitochondriale humaine et de levure qui est monomérique. Contrairement à la classe I, la structure du site catalytique des aaRS de classe II ne possède pas de domaine de Rossman. Il se replie en un feuillet de 9 brins antiparallèles entourés par des hélices . Elles ne sont pas caractérisées par un haut degré de similarité mais partagent trois motifs plus ou moins 44 Introduction générale conservés : les motifs 1, 2 et 3. Le motif 1 participe à la dimérisation et est caractérisé par la présence d'une proline invariable. La substitution de ce résidu affecte l'activité catalytique ainsi que la dimérisation des monomères. Les motifs 2 et 3 participent à la formation du site catalytique et présentent chacun une arginine dans un contexte précis (Figures 21, 22B). Figure 22. Les deux classes des aminoacyl-ARNt synthétases : L'organisation structurale et les modes d'interaction avec l'ARNt des aaRS des deux classes sont représentés. Les structures tridimensionnelles de la GlnRS, classe I (A) et de l'AspRS classe II (B) d'E coli sont représentées. 45 Introduction générale Tout comme les aaRS de classe I, les enzymes de classe II peuvent être subdivisés en 3 groupes d'après leur similarité de séquence. Les aaRS de la sous classe IIa ont la même organisation en feuillet de leur domaine C-terminal à l'exception de la SerRS. Les trois aaRS de la sous classe IIb conservent la même organisation de leur domaine de liaison à l'anticodon de l'ARNt en tonneau . Enfin, la classe IIc est constituée par défaut des synthétases ne répondant pas aux critères (structure oligomérique non conservée) (Figure 21). Les synthétases de classe II ainsi que la TyrRS et la TrpRS de la classe I fixent l'acide aminé sur le 3'OH du ribose de l'adénosine terminale de l'ARNt. Elles fixent l'ARNt par le grand sillon à l'exception de la PheRS et fixent l'ATP sous sa forme coudée. B. Formation de complexes multiprotéiques chez les eucaryotes L'évolution moléculaire des aaRS eucaryotiques se traduit par l'acquisition de modules protéiques. Elles sont sous forme d'extensions polypeptidiques localisées généralement aux extrémités N- ou C-terminales de ces enzymes. Elles ont des tailles variables allant de 50 à 200 résidus. Ces domaines sont parfois impliqués dans le renforcement de l'interaction des synthétases avec leur ARNt homologue. Elles peuvent aussi être engagées dans des interactions protéine-protéine avec les autres constituants de la machinerie de synthèse des protéines. 1. Chez la levure : Le complexe Arc1p/MetRS/GluRS Ce complexe est retrouvé chez Saccharomyces cerevisiae. Il est composé de trois protéines : la protéine Arc1p Aminoacyl tRNA synthetase Cofactor 1 Protein et les synthétases MetRS et GluRS (Simos et al, 1996a) (Figure 23A, B). Arc1p interagt avec les deux synthétases par son domaine N-terminal. Les MetRS et GluRS s'y lient également via leurs extensions N-terminales (Figure 23B). Ces interactions sont nécessaires et suffisantes pour former ce complexe (Galani et al, 2001). Arc1p est composée de trois régions, une partie N-terminale responsable de l'interaction avec MetRS et GluRS mais aussi de deux autres parties : M et C-terminale. Le domaine M est riche en lysines. Il est décrit comme pouvant lier les ARNt mais sans spécificité. La région C-terminale est un domaine EMAPII-like, pouvant lier spécifiquement les ARNt (Simos et al, 1998). Arc1p libre peut se lier à une large panoplie d'ARNt tandis que quand elle est en complexe, celui-ci lie uniquement les ARNtMet et ARNtGlu in vitro (Deinert et al, 2001) et in vivo (Simos et al, 1996a). L'activité catalytique des 46 Introduction générale synthétases est augmentée de 100 fois pour la MetRS (Simos et al, 1996a) et 10 fois pour la GluRS dans le complexe avec Arc1p (Graindorge et al, 2005). Arc1p joue également un rôle dans la localisation cytoplasmique du complexe (Golinelli-Cohen & Mirande, 2007). Effectivement, la GluRS mitochondriale est maintenue dans le cytoplasme par sa liaison à Arc1p qui constitue une plateforme subcellulaire. C'est un nouveau mécanisme de régulation de la localisation cytoplasme/mitochondrie qui piège la forme mitochondriale de la GluRS dans le cytoplasme (Frechin et al, 2009). Figure 23. Structure du complexe Arc1p/MetRS/GluRS : (A) Composition polypeptidique du complexe. (B) Modèle de l'organisation du complexe. 2. Chez les mammifères Chez les mammifères, deux types d'assemblages supramoléculaires ont été retrouvés, il s'agit du complexe multisynthétase MARS regroupant 9 synthétases, et du complexe VEGA comprenant une seule synthétase la ValRS (Cirakoglu et al, 1985a). Ces associations sont impliquées directement dans l'organisation cellulaire de la traduction dans les cellules des eucaryotes supérieures (Mirande, 2005). 47 Introduction générale a. Le complexe multisynthétase MARS MARS pour Multi-Aminoacyl-tRNA Synthetases complex contient 11 composants avec des masses moléculaires apparentes allant de 20 à 171 kDa. Les 9 synthétases qui forment MARS sont les ArgRS, AspRS, GluRS, GlnRS, IleRS, LeuRS, LysRS, MetRS et la ProRS. Trois autres polypeptides qui ne sont pas des synthétases sont également retrouvés dans ce complexe. Ils sont nommés selon leur masse moléculaire : p43, p38 et p18 (Figure 24A) (Mirande, 2005). Figure 24. Complexe multisynthétases MARS : (A) Le complexe MARS a été purifié à partir de foies de lapin. Les 9 synthétases et 3 protéines non synthétases sont séparées sur un gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes. La taille et le ratio de chaque composant sont représentés. (B) Une cartographie des interactions protéiques entre les différents composants a été proposée (Kaminska et al, 2009). (C) modèle tridimensionnel du complexe obtenu par cryoEM (Wolfe et al, 2005). 48 Introduction générale MARS a été isolé à partir de tissus et d'organismes différents avec un ratio constant des 11 polypeptides. Les interactions entre les protéines de MARS ont été étudiées par double hybride, co-sédimentation, pull down , des méthodes de pontages covalents, et une cartographie des interactions protéine-protéine a été proposée (Figure 24B). A ce jour, la structure à haute résolution de ce complexe n'est pas connue à cause de sa grande taille. Un modèle a été obtenu par microscopie électronique (Figure 24C). MARS y apparat comme une particule dont les paramètres sont 190x160x100 (Wolfe et al, 2005). La protéine p38 a été caractérisée comme la protéine d'échafaudage du complexe. Des expériences par double hybride montrent que p38 peut interagir avec la plupart des composants du complexe (Quevillon et al, 1999). Des études in vitro montrent que les partenaires de la protéine p38 interagissent avec différentes régions de cette dernière (Robinson et al, 2000). En absence de p38, deux sous-complexes stables peuvent se former in cellulo (Kaminska et al, 2009). Le sous-complexe I contient les GluProRS, IleRS, LeuRS, MetRS et p18. Le sous-complexe II contient les ArgRS, GlnRS et p43 (Figure 24). La protéine p43, protéine homologue d'Arc1p de levure, a deux fonctions principales au sein de MARS. C'est un élément structural important pour la formation du sous-complexe II. Les premiers 106 acides aminés de la partie N-terminale de p43 sont nécessaires pour l'association au complexe (Kaminska et al, 2009). p43 confère également la capacité d'interaction aux ARNt. Les données suggèrent qu'il agit comme cofacteur en trans de l'aminoacylation de l'un des composants de MARS comme Arcp1 chez la levure (Guigou et al, 2004). En C-terminal de p43 est retrouvé un domaine EMAPII qui est décrit comme une cytokine proinflammatoire (Shalak et al, 2001). La protéine p18 est quant à elle nécessaire pour l'ancrage de la MetRS dans MARS (Kaminska et al, 2009). En dehors du complexe MARS, p18 peut interagir avec l'ATM kinase. Cette dernière est impliquée dans la régulation du suppresseur de tumeur p53 (Park et al, 2005). b. Le complexe VEGA ValRS/EF1H Le deuxième complexe identifié dans les cellules eucaryotiques est le complexe ValRS/EF1H. Il est composé de la ValRS et de la forme lourde du facteur d'élongation 1 de la traduction (Bec et al, 1989 ; Jiang et al, 2005) (Figure 25A). EF1H est un complexe 49 Introduction générale tétramérique formé de 4 sous-unités A, B, B et B avec un ratio 2 : 1 : 1 : 1 (Janssen et al, 1994). Le complexe ValRS/EF1H a une masse de 700 kDa, il contient deux monomères de ValRS et deux modules de EF1H (Figure 25B). Les sous-unités EF1B sont fortement attachées à la ValRS, tandis que l'association avec EF1A est transitoire. La ValRS est associée à EF1H via son domaine GST-like (retrouvé en N-terminal) à la sous unité EF1B (Bec et al, 1994). L'organisation structurale tridimensionnelle du complexe VEGA a été étudiée par microscopie électronique (Jiang et al, 2005). Ses dimensions sont de 120x80 (Figure 25C). Figure 25. Structure du complexe VEGA : (A) Composition polypeptidique du complexe. (B) Modèle de l'organisation du complexe VEGA. (C) L'organisation structurale tridimensionnelle du complexe VEGA a été étudiée par microscopie électronique (Jiang et al, 2005). 50 Introduction générale C. L'évolution et les rôles non canoniques des aaRS Les aaRS sont des enzymes très étudiées. Elles constituent une famille de protéines intéressantes car elles sont impliquées dans de nombreux mécanismes. En effet, bien que leur rôle principal opère lors de l'aminoacylation des ARNt, ces enzymes ubiquitaires montrent un rôle essentiel dans d'autres fonctions cellulaires. Ci-dessous sont indiqués quelques un des rôles non canoniques des aaRS comme l'épissage, la régulation de l'expression génique ou la transduction du signal (Figure 26). Figure 26. Rôles non canoniques des aaRS : Les aaRS interviennent à de nombreux niveaux dans la cellule, quelques exemples sont cités sur ce schéma mais leur fonction principale reste l'aminoacylation lors de la synthèse protéique. 1. Les aaRS et la régulation de leur propre expression Certaines aaRS se lient spécifiquement à leur ARNm ou à l'ADN et régulent leur propre expression à différents stades. 51 Introduction générale a. La ThrRS et la régulation au niveau de la traduction La ThrRS d'E. coli régule sa propre expression au niveau de la traduction. Elle se lie à deux domaines repliés en épingle à cheveux de l'opérateur de l'ARNm. Ces domaines séparément vont mimer la tige boucle de l'anticodon de l'ARNtThr (Romby et al, 1996). L'enzyme va réprimer sa propre traduction en inhibant la liaison du ribosome à l'ARNm grâce à une compétition pour la fixation des ribosomes et de la ThrRS sur l'ARNm (Sacerdot et al, 1998). b. L'AlaRS et la régulation au niveau de la transcription L'AlaRS d' E. coli se lie à une séquence palindromique sur le promoteur de son propre gène, alaS, et réprime la transcription in vitro (Putney et al, 1981). La PheRS de T. thermophilus a également été retrouvée comme pouvant se lier spécifiquement à l'ADN, les implications fonctionnelles de cette interaction sont indéfinies (Lechler & Kreutzer, 1998). 2. Les LeuRS, TyrRS et leur implication dans l'épissage l'épissage de certains Les LeuRS et TyrRS sont essentielles pour introns mitochondriaux. Ces aaRS favorisent le repliement des introns dans les pré-ARNm pour leur conférer une structure catalytiquement active. Trois synthétases mitochondriales facilitent l'épissage des introns (Lambowitz & Perlman, 1990). Il s'agit de la TyrRS de Neurospora crassa (Akins & Lambowitz, 1987) et de Podospora anserina (Kamper et al, 1992) ainsi que de la LeuRS de S. cerevisiae (Labouesse, 1990). Le rôle de la LeuRS dans la levure semble être tout a fait distinct de celui de la TyrRS dans N. crassa o un domaine particulier contribue à l'épissage (Cherniack et al, 1990). 3. La TyrRS, et son activité cytokine La TyrRS humaine peut être divisée en deux cytokines bien distinctes résultantes des domaines N et C-terminaux (Wakasugi & Schimmel, 1999a ; Wakasugi & Schimmel, 1999b). L'enzyme native est inactive pour une large variété d'activités de cytokine. Les dérivés cytokines de la TyrRS sont libérés après clivage de l'enzyme native en un site situé entre les deux domaines. Le domaine EMAP II-Like Endothelial-Monocyte Activating Polypeptide II C-terminal (Kleeman et al, 1997) perd son rôle dans l'aminoacylation mais lorsqu'il est libéré du domaine N-terminal, il présente une activité chimiotactique leucocytaire et 52 Introduction générale monocytaire significative. Le domaine C-terminal libéré va induire la production de myeloperoxidase, de TNF et des facteurs tissulaires. 4. La GluProRS et la formation du complexe GAIT La GluProRS est une synthétase atypique. Elle est composée de deux synthétases bien distinctes, la GluRS et la ProRS, reliées entre-elles par des domaines répétés. En plus de l'aminoacylation, cette aaRS joue un rôle clé dans la régulation de la traduction de certains ARNm. Suivant la réponse à l'interféron, la GluProRS est capable de contrôler l'expression de l'oxydase ou de la céruloplasmine (Cp), ce qui limite la réponse inflammatoire (Sampath et al, 2004). Il a été démontré que la GluProRS est le composant principal du complexe GAIT interferon-Gamma-Activated Inhibitor of Translation . Ce complexe inhibe la traduction de la Cp, une protéine plasmatique synthétisée et secrétée par les hépatocytes et qui active les macrophages. Le traitement des cellules par INF- induit la phosphorylation et la libération de la GluProRS du complexe MARS. Elle va se lier à la ribonucléoprotéine NSAP1et former le précomplexe GAIT. Ce précomplexe est incapable d'inhiber la traduction de Cp, il requière la liaison de deux composants additionnels ; la protéine ribosomale L13a et la GAPDH GlycerAldehyde 3-Phosphate DeHydrogenase . Le complexe GAIT formé peut alors se lier à la région 3'-UTR de l'ARNm de Cp et bloquer sa traduction (Sampath et al, 2004). 5. Les protéines non catalytiques de MARS, rôles non canoniques La protéine p43 porte un domaine EMAPII en C-terminal. EMAPII est décrit comme étant une cytokine proinflammatoire. Il active la migration chimiotactique des granulocytes polymorphonucléaires et des phagocytes mononucléaires. Il induit également l'activité de facteurs tissulaires dans les cellules endothéliales (Kao et al, 1992). Lors de l'apoptose, ce domaine C-terminal de p43 est clivé, donnant une cytokine active. Ce processus bloque la machinerie traductionnelle et initie l'apoptose dans les cellules (Shalak et al, 2007 ; Shalak et al, 2001). La protéine p38 est impliquée dans la maladie de Parkinson. Il a été démontré que Parkin, une protéine-ubiquitine ligase E3 interagit avec p38 et provoque son ubiquitinylation et sa dégradation (Corti et al, 2003). La délétion du gène de p38 cause la létalité néonatale 53 Introduction générale chez la souris. Une étude a démontré les mécanismes moléculaires sous-jacents de la létalité des mutants p38. Les souris déficientes présentent des défauts dans la différenciation des poumons et le syndrome de détresse respiratoire (Kim et al, 2003). p38 lie le facteur activateur de c-myc3, qui est le FBP FUSE-binding protein et cause son ubiquitinylation puis sa dégradation. c-myc (requis pour la différenciation des cellules alvéolaires de type II) sera sous régulé. La protéine p18 interagit avec la protéine kinase ATM qui est impliquée dans l'activation du suppresseur de tumeur p53 (Park et al, 2005). Plus récemment, la structure tridimensionnelle de p18 a été déterminée (Kim et al, 2008). Comme suggéré précédemment (Quevillon & Mirande, 1996), p18 adopte une conformation GST-like, et est composée de deux domaines. Les données cristallographiques suggèrent que p18 peut rentrer dans deux types d'interactions qui impliquent deux interfaces : une similaire à ce que l'on observe dans un dimère de GST, et une seconde qui ressemble à l'interaction entre GluRS et Arc1p dans le complexe Arc1p/MetRS/GluRS. 6. La LysRS et la synthèse du diadénosine polyphosphates La LysRS est requise pour la synthèse d'un diadénosine polyphosphate, le 5', 5'- diadenosine tetraphosphate (Ap4A) qui est une molécule de signalisation intracellulaire. Dans les cellules souches, l'Ap4A est un régulateur négatif de la formation des complexes protéiques Hint-MITF ou Hint-USF2. La dissociation de Hint de MITF ou USF2 permet à ces facteurs de transcription d'initier la transcription de leurs gènes cibles en réponse à un stimulus spécifique. Ces données suggèrent que la LysRS est un régulateur positif des facteurs de transcription via l'Ap4A dans les cellules eucaryotes (Lee et al, 2004 ; Yannay-Cohen et al, 2009). La LysRS sous forme libre est six fois plus active dans la production de Ap4A que lorsqu'elle est liée à MARS (Wahab & Yang, 1985). Une étude plus récente montre que dans des cellules immunoactivées, la LysRS est phosphorylée sur la Ser207 d'une manière MAPK dépendante, elle est dissociée de MARS et transloquée vers le nucléole o elle régule l'activité des deux facteurs de transcription. 54 Introduction générale Comme détaillé dans la partie III, la LysRS est impliquée dans un autre mécanisme cellulaire. Lors de l'infection des lymphocytes par le VIH-1, la LysRS est détournée de sa voie naturelle et sera l'un des maillons importants de la réplication du virus. III. La Lysyl-ARNt synthétase et la réplication du VIH-1 A. Généralités sur la Lysyl-ARNt synthétase (LysRS) 1. La LysRS est de classe I ou de classe II La LysRS est un membre spécial parmi la famille des synthétases. Elle est retrouvée dans les deux classes (LysRSI, LysRSII). La majorité des bactéries et tous les eucaryotes contiennent la LysRSII. Tandis que la majorité des archaea et quelques bactéries contiennent la LysRSI. Chez les bactéries, la LysRSI est retrouvée uniquement chez certaines espèces pathogènes, comme les spirochètes : Borrelia burgdoferi et Treponema pallidum. Chez les archaea, la forme majoritaire est l'enzyme de classe I comme chez Methanococcus maripaludis ou Methanococcus jannaschii (Ibba et al, 1997a ; Ibba et al, 1997b). Les caractérisations fonctionnelles et structurales ont montré que les LysRS de classe I et II sont fonctionnellement équivalentes mais structuralement différentes. Le fait que ces deux formes ne partagent pas la même séquence, elles peuvent néanmoins reconnaitre les même substrats, acide aminé et ARNt (Figure 27A. B). Elles représentent un exemple de convergence dans l'évolution (Terada et al, 2002). La LysRSII aborde l'hélice acceptrice de l'ARNtLys par le sillon opposé par rapport à la LysRSI. 2. La LysRS bactérienne La LysRS bactérienne est essentiellement de classe II. Chez E coli, elle est codée par deux gènes distincts : lysS et lysU. Le gène lysS est constitutivement exprimé. Le gène lysU par contre, est surexprimé en conditions de stress physiologique de type choc thermique (Clark & Neidhardt, 1990). La LysRS bactérienne est composée de 504 acides aminés divisés en deux domaines, un domaine ABD N-terminal en tonneaux et un domaine CAT C- terminal plus large portant les trois motifs signature caractéristiques de la classe II des synthétases (Figure 28). Les deux LysRS issues des deux gènes ont 88% d'identité de séquence, et ont des activités catalytiques similaires. Les éléments majeurs d'identité de la reconnaissance de l'ARNtLys sont les bases U35U36 de l'anticodon ainsi que la base A73 chez 55 Introduction générale E. coli (Commans et al, 1998). La structure 3D des deux LysRS bactériennes a été déterminée. La structure de la LysRS (LysS) a été résolue à 2. 7 pour une forme libre de la synthétase ou en complexe avec son substrat, la lysine (Onesti et al, 2000). La comparaison des deux structures montre un changement conformationnel lors de la liaison de la lysine. Figure 27. Convergence structurale de modules structuralement différents : (A) Modèle d'interaction avec l'ARNt de la LysRSI de P. horikoshii. (B) Modèle d'interaction avec l'ARNt de la LysRSII d'E. coli. Les LysRS sont en gris et l'ARNt en jaune. Les résidus mentionnés sont les déterminants d'identité de l'ARNtLys. Figure 28. Les lysyl-ARNt synthétases bactérienne et eucaryotique : La forme eucaryotique possède en plus une extension de 70 aa en N-terminal par rapport à son homologue bactérien. 56 Introduction générale 3. La LysRS humaine a. La Fonction et la structure Lys, l'ARNt2 Comme cité dans les paragraphes précédents, la LysRS eucaryotique aminoacyle trois isoformes d'ARNtLys : l'ARNt1 Lys. Elle fait partie de la sous classe IIb des aminoacyl-ARNt synthétases qui regroupe l'AspRS et l'AsnRS. Elle a 43% d'identité de séquence avec la forme d'E. coli. La LysRS est l'une des neuf synthétases retrouvées dans le complexe MARS. Elle interagit directement avec la protéine p38 (Kaminska et al, 2009 ; Quevillon et al, 1999 ; Robinson et al, 2000). Lys et l'ARNt3 Elle est composée du domaine catalytique CAT de 360 acides aminés, retrouvé en C- terminal et d'un domaine ABD de 167 acides aminés. La LysRS des eucaryotes possède une extension polypeptidique N-terminale, module supplémentaire retrouvé uniquement chez les eucaryotes et absent chez les LysRS procaryotiques. L'extension eucaryotique est un polypeptide de 71 acides aminés (Figure 28, 29). Ce domaine est appelé ESD Eukaryotic Specific Domain , il est formé en majorité d'hélices amphiphiles. Figure 29. Modèle d'interaction de la LysRS humaine avec l'ARNtLys : La LysRS humaine est formée de trois modules ; le domaine catalytique, le domaine de liaison de l'ARNt et l'extension N-terminale spécifique des eucaryotes. 57 Introduction générale b. Les propriétés de l'extension N-terminale de la LysRS humaine Les affinités de liaison de l'ARNt3 Lys des formes complètes et tronquées de la LysRS humaine ont été déterminées par des expériences de retard sur gel. L'interaction de la forme Lys est 100 fois plus faible que celle de la forme native (Francin et al, N-LysRS à l'ARNt3 2002). Les constantes de dissociation apparentes sont de 60 nM et 6 M pour la LysRS et la N-LysRS respectivement. Ces données combinées aux analyses de l'activité d'aminoacylation démontrent clairement que l'extension N-terminale est un nouveau domaine de liaison de l'ARNt (Figure 29). La délétion de cette extension ne change pas les valeurs de kcat et de KM pour la lysine et l'ATP dans la réaction d'activation de l'acide aminé, suggérant que le site actif de la LysRS Lys est 3. 9 n'est pas significativement affecté par cette délétion. Par contre, le KM pour l'ARNt3 fois plus élevé pour la forme tronquée comparée à la forme sauvage. L'efficacité catalytique Lys humain, transcrit et purifié in vitro. Elle (kcat/ KM) a été déterminée en utilisant de l'ARNt3 est 3 fois plus importante pour la forme sauvage que celle obtenue pour la forme tronquée. En conclusion, ces données montrent que l'extrémité N-terminale additionnelle de la LysRS eucaryotique est un module fonctionnel de liaison de l'ARNtLys (Francin et al, 2002). De part sa forme allongée, l'extension N-terminale de la LysRS optimise l'association entre la LysRS et l'ARNtLys. Des minihélices synthétiques mimant les domaines accepteur et Lys ont été utilisés pour des expériences de retard sur gel. Ces études de l'anticodon de l'ARNt3 montrent une association fonctionnelle entre l'AccLys et la LysRS. Cette association n'est pas observée dans le cas de la N-LysRS. Cette dernière est incapable d'aminoacyler la minihélice mimant le bras accepteur de l'ARNt, suggérant l'importance de l'acquisition au cours de l'évolution de l'extension eucaryotique. Elle va promouvoir le positionnement du CCA de l'extrémité 3' de l'ARNt dans le site actif de l'enzyme (Francin et al, 2002). c. Le motif de liaison de l'ARNt L'analyse des séquences de l'extension N-terminale de la LysRS montre qu'elle est riche en résidus lysine et arginine, ces derniers lui confère un caractère basique. Pour pouvoir identifier les résidus de l'extension N-terminale impliqués dans la liaison avec l'ARNt, des LysRS mutantes ont été construites par le remplacement des lysines et des arginines par des alanines. Un motif de liaison a été déterminé, il s'agit des résidus suivants [KxxxK(K/R)xxK] 58 Introduction générale (Figure 30). Ce motif lie non spécifiquement la tige boucle TC du domaine accepteur de l'ARNt et confère la capacité la liaison de l'ARNt à l'enzyme (Francin & Mirande, 2003). Figure 30. Les différentes formes de la lysyl-ARNt synthétase : trois formes de LysRS sont retrouvées chez l'homme. Un site potentiel de maturation de la forme prémitochondriale était prédit après le 16éme résidus. Ce motif peut être généralisé aux enzymes de la classe II. Des études sur l'AspRS cytoplasmique de levure (Frugier et al, 2000) ont démontré que l'extension N-terminale de l'AspRS participait à l'interaction avec l'ARNt. Une séquence de 11 résidus riche en lysine (29)LSKKALKKLQK(39) a été identifiée. Cette donnée a été généralisée à tous les membres de la sous classe IIb par une comparaison de séquences de ces trois synthétases eucaryotiques (AspRS, LysRS et AsnRS), et un consensus xSKxxLKKxxK a été dégagé pour ces synthétases de la classe IIb. Des travaux beaucoup plus récents sur l'AsnRS (Crepin et al, 2011) ont déterminé la structure par RMN des 75 premiers résidus de l'extension N-terminale de l'AsnRS de Brugia malayi. Elle contient le motif xSKxxLKKxxK des synthétases de la classe IIb décrit précédemment. Ce domaine N-terminal contient une région structurée avec un nouveau dispositif de repliement, il est riche en lysines et il a été démontré par RMN comme interagissant avec le bras accepteur de l'ARNt. Ces données viennent compléter celles obtenues pour l'AspRS et la LysRS déterminant ainsi la structure de l'extrémité N terminale (Figure 31). 59 Introduction générale Figure 31. L'extension N-terminale de l'AsnRS : Le motif 55SKxxLKKxxK64 est représenté en rouge. 4. La Lysyl-ARNt synthétase mitochondriale humaine Le gène de la LysRS humaine est localisé sur le chromosome 16q23, sa taille est de 20 kpb (exons et introns). Il est composé de 15 exons, les deux premiers exons localisés dans la région amont du gène déterminent, par épissage alternatif du prémessager, la synthèse de deux ARNm spécifiant la forme cytoplasmique ou mitochondriale de la LysRS. Elles sont appelées cLysRS ou pmLysRS, respectivement (Figure 32, 33A). La majeure partie de ces deux formes enzymatiques, à savoir les domaines CAT, ABD et la majeure partie de l'extension N-terminale est commune. Les extrémités N-terminales sont différentes par leurs tailles et leurs séquences (Figure 33, B). 60 Introduction générale Figure 32. Gène KARS et la localisation subcellulaire des LysRS : L'épissage alternatif des ARNm issus du gène KARS donne les deux formes cLysRS et pmLysRS. La cLysRS rejoint le complexe MARS tandis que la pmLysRS sera dirigée vers la mitochondrie o elle sera maturée et donnera la forme mature mLysRS. Figure 33. Les différentes formes de la lysyl-ARNt synthétase : (A) L'épissage alternatif des ARNm issus du gène KARS donnent les deux formes cLysRS et pmLysRS. (B) La composition en acides aminés des extrémités N terminales de chaque forme est montrée. Les régions qui ont servi à la synthèse des anticorps spécifiques de 61 Introduction générale chaque forme sont soulignés par des pointillés (Kaminska et al, 2007b). Le site putatif de maturation de la pmLysRS est également indiqué. Les séquences des LysRS de hamster (Cl), de souris (Mm) et de l'homme (Hs) sont indiquées. Pour la forme cLysRS, les 21 acides aminés de l'extrémité N-terminale sont issus du démarrage de la traduction dans l'exon 1 lorsque l'exon 2 est enlevé par épissage alternatif. Pour le cas de la forme pmLysRS, composée de 49 acides aminés spécifiques en N-terminal, le démarrage de la traduction dans l'exon 1 est abortive, au niveau d'un codon stop localisé en 5' de l'exon 2, et un autre démarrage de la traduction localisé dans l'exon 2, est utilisé pour générer la forme prémitochondriale de l'enzyme. Un site potentiel de maturation de la pmLysRS après translocation dans la mitochondrie a été proposé (Figure 33, B), conduisant à la délétion des 16 résidus N-terminaux qui sont le peptide putatif d'adressage mitochondrial. La forme mitochondriale mature est appelée mLysRS (Kaminska et al, 2007a ; Tolkunova et al, 2000) (Figure 30, 33B). Le site exact de coupure et de maturation n'était pas déterminé, nous avons entrepris l'étude de la maturation de la pmKRS. Les résultats seront présentés dans le chapitre II de cette thèse. Rôle de la LysRS dans l'encapsidation de l'ARNt3 B. particules du VIH-1 Lys dans les Comme indiqué dans la première partie de cette introduction, la LysRS humaine est Lys dans les particules du VIH-1 sous forme de complexe requise pour le transport de l'ARNt3 Lys. Ce complexe est dévié de sa voie naturelle dans la cellule infectée et dirigé LysRS-ARNt3 vers le site d'assemblage des virions. Il sera encapsidé en même temps que les composants viraux lors du bourgeonnement. Ce complexe serait associé à une ou plusieurs protéines virales permettant son acheminement dans les particules virales naissantes. 1. Le rôle du précurseur GagPol La polyprotéine GagPol est requise pour l'encapsidation de l'ARNtLys dans les GagVLPs ou dans les particules virales du VIH-1 (Mak et al, 1994). Plus spécifiquement, le domaine structural thumb (TH) de la RT joue un rôle important dans l'interaction entre GagPol et l'ARNtLys (Khorchid et al, 2000). Les études antérieures suggéraient que bien que GagPol semble jouer un rôle dans l'incorporation de l'ARNtLys, la protéine Gag pourrait être suffisante pour l'incorporation des ARNtLys dans les GagVLPs. Cette sélection n'est pas directe, mais serait médiée par des interactions spécifiques avec la LysRS (Javanbakht et al, 2003). Gag a lui seul semble suffisant pour encapsider la LysRS dans les GagVLPs (Cen et al, 2001) et GagPol serait requis quant à lui pour l'incorporation des ARNtLys (Mak et al, 1994). 62 Introduction générale L'encapsidation des trois isoformes d'ARNtLys requiert l'interaction avec la LysRS (Cen et al, 2004) mais pas l'aminoacylation de ces derniers (Javanbakht et al, 2002). Les domaines d'interaction entre Gag et la LysRS ont été déterminés. Des données publiées suggéraient que le motif 1 de la LysRS et le domaine C-terminal de la protéine CA seraient responsables de cette interaction (Javanbakht et al, 2003). Ces régions sont impliquées dans l'homodimérisation de ces deux protéines. Des études ont démontré que la dissociation des homodimères LysRS et CA est nécessaire à l'interaction entre ces deux protéines (Kovaleski et al, 2006 ; Kovaleski et al, 2007), suggérant la possibilité de formation d'hétérodimères Gag/LysRS in vivo. Au vue de la stabilité des diméres de LysRS (Cirakoglu & Waller, 1985b ; Robinson et al, 2000), ce modèle semblait peu probable. D'autre part, l'association CA : LysRS semblait être peu spécifique par rapport à CA : TrpRS pris comme couple contrôle dans ces expériences (Kovaleski et al, 2006). 2. La source de LysRS encapsidée dans les particules virales Tous les résultats rapportés dans le paragraphe 1 ci-dessus ont porté sur la forme cytoplasmique de la LysRS, cLysRS, forme qui semblait être encapsidée dans le virus (Cen et al, 2001). Les anticorps utilisés pour identifier la LysRS dans les virus étaient dirigés contre la LysRS cytoplasmique. Ils reconnaissent les 576 acides aminés communs aux espèces cytoplasmique et mitochondriale de LysRS et ne permettent donc pas de discriminer ces deux formes. D'autres expériences ont montré que la surexpression exogène de la cLysRS dans des cellules transfectées par le VIH-1 conduit à son encapsidation dans les virions (Gabor et al, 2002 ; Guo et al, 2003). Dans ces conditions d'expression ectopique, la cLysRS cellulaire n'est plus entièrement associée à MARS et pourrait devenir une cible pour l'une des protéines virales. En effet, aucune des protéines se trouvant avec la cLysRS au sein de MARS n'est retrouvée dans les particules virales. Au laboratoire, il a été démontré que c'est la forme mitochondriale de LysRS qui est la source de la LysRS virale (Kaminska et al, 2007a ; Kaminska et al, 2007b). Des anticorps dirigés contre les extensions N-terminales spécifiques de chaque forme cLysRS et mLysRS montrent que, dans les virions du VIH-1, seule la forme mitochondriale est détectée. 63 Introduction générale Nous avons donc ré-analysé les interactions potentielles entre les deux formes de LysRS et la protéine GagPol pour déterminer si cette association est sélective de l'une de ces deux formes. Ces résultats seront décrits dans le chapitre I. Ils montrent que la région Pol du précurseur GagPol forme une pince moléculaire, les domaines TF et IN interagissant avec le domaine catalytique de la LysRS. Dans le chapitre III, nous avons mis en jeu l'ensemble des protéines virales du VIH-1 pour identifier d'autres partenaires potentiels de la LysRS. 64 CHAPITRE I Etude de l'association entre la LysRS mitochondriale humaine et le précurseur GagPol du VIH-1 65 Chapitre I : Intercation LysRS/GagPol CHAPITRE I : ETUDE DE L'ASSOCIATION ENTRE LA LysRS MITOCHONDRIALE HUMAINE ET LE PRECURSEUR GagPol DU VIH-1 Comme décrit dans l'introduction, l'ARNt3 Lys sert d'amorce à la transcription inverse du génome du VIH-1. L'initiation de cette étape débute dans les particules virales avant infection de nouvelles cellules d'o la nécessité d'encapsider l'amorce cellulaire. Les travaux Lys était encapsidé en même temps qu'une de l'équipe de Kleiman avaient montré que l'ARNt3 forme de LysRS qui avait été attribuée à la LysRS cytoplasmique (Cen et al, 2001). Ces études avaient suggéré que l'encapsidation de la LysRS se faisait via la formation d'un complexe entre la LysRS et les précurseurs Gag et GagPol via la région C-terminale du domaine CA de Gag (Javanbakht et al, 2003). Compte tenu des données actuelles montrant que la forme de LysRS encapsidée dans les virions est la forme mitochondriale de l'enzyme (Kaminska et al, 2007a), nous avons re- analysé in vitro les associations possibles entre les différentes espèces de LysRS et la polyprotéine GagPol et ses domaines. I. Description des protéines utilisées dans cette étude A. Les précurseurs Gag et GagPol 1. Le décalage du cadre de lecture -1 et la traduction de GagPol Comme décrit précédemment, les régions codantes gag et pol du génome du VIH-1 sont codées par un même gène. La région pol n'est pas exprimée en tant que telle, mais sous forme de fusion avec gag. La traduction de l'ARNm spécifiant la protéine Gag s'arrête normalement après la protéine p6. Pour qu'il y ait traduction de Pol, il faut qu'il y ait un évènement de glissement du cadre de lecture de -1 qui s'opère avant la traduction de p6. La polyprotéine Pol n'est synthétisée que sous forme d'une protéine de fusion GagPol et fait appel à un phénomène de glissement du ribosome appelé décalage du cadre de lecture ou frameshift (Figure 34A). La traduction de cette autre cadre de lecture donne naissance à la protéine p6* (ou transframe) correspondant au polypeptide alternatif à p6. 67 Chapitre I : Intercation LysRS/GagPol Seule une petite portion des ribosomes effectue le frameshift en -1 pour l'expression de Pol (Ratner et al, 1985 ; Wain-Hobson et al, 1985). Le frameshift s'opère à un niveau de 5- 10% de la synthèse de Gag (Jacks et al, 1988) assurant le maintien d'un ratio de 20 molécules de Gag pour une molécule de GagPol. Ce ratio 20 : 1 est critique pour la dimérisation de l'ARN génomique, l'assemblage viral, la réplication et l'infectiosité du virus (Park & Morrow, 1991). Le frameshift s'opère au niveau de deux séquences agissant en cis. Il s'agit de la séquence heptamèrique UUU UUU A qui est hautement conservée, et une séquence en tige boucle de 12 pb. Les deux séquences sont séparées par 8 nucléotides (Biswas et al, 2004) (Figure 34B). Bien que le mécanisme exact du frameshift ne soit pas complètement compris, la fonction la plus probable de la structure secondaire est le ralentissement de la progression du ribosome et sa pause sur cette séquence pour qu'il puisse entamer la traduction de Pol. 1. L'encapsidation des précurseurs Gag et GagPol Gag et GagPol sont synthétisés dans le cytoplasme de la cellule hôte, myristylés, puis transportés à la membrane plasmique o les particules virales seront formées. Gag est responsable du transport et de l'encapsidation de GagPol. Des études ont montré que Gag et GagPol non myristylés peuvent être encapsidés dans les virions si elles sont co-exprimées avec un Gag myristylé (Chen et al, 1997 ; Park & Morrow, 1991). Des analyses suggèrent que les polyprotéines Gag forment de petits multimères dans le cytoplasme et sont assemblées dans des complexes plus grands à la membrane cytoplasmique, incluant GagPol. Gag contient plusieurs interfaces protéine : protéine qui promeuvent des interactions Gag : Gag. L'incorporation de GagPol lors de l'assemblage requiert des interactions avec les domaines CA de Gag et GagPol (Wills & Craven, 1991). Une incorporation efficace spécifique de GagPol se fait grâce au domaine MHR (Major Homology Region) de CA et à ses séquences adjacentes en C-terminal (Huang & Martin, 1997). Dans Pol, des séquences sont également importantes pour l'encapsidation de GagPol, elles sont situées dans le domaine N-terminal de RT (Bukovsky & Gttlinger, 1996). 68 Chapitre I : Intercation LysRS/GagPol Figure 34. Traduction de la polyprotéine GagPol : (A) : La polyprotéine GagPol est traduite grâce à un phénomène de décalage de cadre de lecture de type -1 et uniquement sous forme de protéine de fusion avec la partie Gag434 de Gag (correspond aux premiers 434 résidus de Gag) selon ce schéma. (B) : La séquence o s'opère le frameshift est la séquence UUUUUUA. Elle est séparée de la tige boucle (seconde séquence du FS) par 8 nucléotides. 69 Chapitre I : Intercation LysRS/GagPol La polyprotéine Pol peut être encapsidée dans les particules virales à elle seule lorsqu'elle est exprimée hors du contexte de la protéine de fusion GagPol (Cen et al, 2004b). PR et IN ont été démontrés comme indispensables pour l'encapsidation de Pol tronquée dans les Gag-VLPs (Cen et al, 2004b). L'assemblage de Pol se fait à 70% par rapport au niveau d'assemblage de GagPol. C'est également le cas de Pol du virus de la leucémie murine de Moloney qui peut être encapsidée en dehors du contexte de GagPol. Ceci dit, l'activité de la RT y est diminuée dans les virions suggérant une déficience dans l'encapsidation de Pol (Buchschacher et al, 1999). B. Les différentes LysRS et leurs domaines Les différentes formes de la LysRS humaine partagent plusieurs domaines ; le domaine catalytique (CAT) en C-terminal, le domaine de liaison de l'ARNt (ABD) et l'extension N- terminale spécifique des eucaryotes (ESD). Ces trois domaines sont composés de 576 acides aminés. De plus, la forme cLysRS possède une extrémité N-terminale spécifique composée des 21 acides aminés suivants : N-MAAVQAAEVKVDGSEPKLSKN (Figure 35). L'extension N-terminale spécifique de la forme pmLysRS est composée des 49 résidus N- terminaux spécifiques de cette forme : N-L'ESD de la cLysRS contient le motif 20KxxxKRxxK28 qui lui confère des propriétés de rétention de l'ARNt (Francin et al, 2002). La première lysine de ce motif est codée par le peptide N-terminal spécifique. La forme pmLysRS possède également ce motif sauf que la première lysine est remplacée par une arginine 48RxxxKRxxK56. Le rôle potentiel des résidus spécifiques de l'extension de pmLysRS sur la fixation des ARNt n'était pas connu. La forme pmLysRS est maturée lors de sa translocation mitochondriale pour donner la forme mLysRS mature. Le site de maturation protéolytique de mLysRS n'était pas déterminé et sera analysé dans ce chapitre. L'interaction entre cLysRS et p38 dans le complexe MARS C. Il a été montré que dans le complexe MARS, la protéine p38 interagissait avec la LysRS mais aussi avec les GluProRS, GlnRS, ArgRS, AspRS et p43 (Quevillon et al, 1999). Les interactions qui impliquent p38 en tant que protéine d'échafaudage sont considérées comme des interactions centrales, en opposition aux interactions latérales entre les enzymes périphériques dans le complexe (Figure 36A). Les paramètres cinétiques de certaines de ces interactions ont été déterminés. La LysRS a une forte affinité pour p38, la constante de 70 Chapitre I : Intercation LysRS/GagPol dissociation Kd étant de l'ordre de 0. 3 nM. Sa faible vitesse d'association (kon de 90 x 103 M-1s-1) est contrebalancée par une dissociation lente (koff de 30 x 10-6 s-1) (Robinson et al, 2000). Figure 35. Les extrémités N-terminales des LysRS : Les séquences des extrémités N-terminales des cLysRS- Hs et pmLysRS-Hs sont représentées sur la figure. Les acides aminés en vert représentent les résidus spécifiques de la forme cytoplasmique tandis que ceux qui sont en bleu sont spécifiques de la forme prémitochondriale. En rouge est représenté le motif 20KxxxKRxxK28 retrouvé dans la cLysRS. Pour la pmLysRS le résidus K à la position 20 est remplacé par une R. Les autres acides aminés en violet représentent les résidus basiques de l'extenion N-terminale de la pmLysRS. La relativement faible vitesse d'association observée pourrait être due à un besoin de changement de conformation du site de fixation de la LysRS à p38 induit après son interaction à p38 (Robinson et al, 2000). Il a également été démontré que la délétion de l'extension polypeptidique de la LysRS n'avait aucune conséquence sur son association à p38. Figure 36. Interaction entre la LysRS et la protéine p38 : (A) : L'association de cLysRS au sein de MARS se fait grâce à des interactions avec p38. (B) : La protéine p38 est dimérique. Chaque monomère de p38 s'associerait à un dimère de LysRS (Feng et al, 2011). 71 Chapitre I : Intercation LysRS/GagPol Basée sur ces résultats, une étude plus récente propose un modèle d'architecture du complexe LysRS-p38 au sein de MARS. Ce complexe serait sous forme 21 : 21. Deux dimères de LysRS (2)2 seraient juxtaposés et retenus dans une configuration parallèle. Chaque peptide N-terminal d'un monomère de p38 se lierait à un dimère de LysRS (Fang et al, 2011). D. Parenté structurale entre la LysRS et l'AspRS Les AspRS et LysRS font partie de la même sous classe IIb des aminoacyl-ARNt synthétases et ont évolué à partir d'un ancêtre commun. Des similitudes entre ces deux protéines ont été observées par alignement de leurs séquences (Eriani et al, 1990). Cet alignement montre une forte similarité de séquence tout particulièrement dans l'extrémité C- terminale correspondant au domaine catalytique des deux enzymes (Figure 37A). Sur la figure 37 sont représentées les structures cristallographiques d'un monomère de la LysRS humaine (Guo et al, 2008) (Figure 37B) ainsi que d'un monomère de l'AspRS de levure (Ruff et al, 1991) (Figure 37C), révélant une très forte parenté structurale. L'AspRS humaine étant la synthétase la plus proche possible de la LysRS, elle sera prise comme témoin de spécificité des interactions entre LysRS et protéines virales. II. Etude du complexe d'encapsidation de l'ARNt3 Lys L'importance de la LysRS et de l'espèce encapsidée dans les A. virions Javanbakht et collaborateurs avaient montré que l'anticodon de l'ARNt3 Lys, qui est aussi le principal déterminant de la reconnaissance des ARNtLys par la LysRS, est un déterminant crucial pour son encapsidation dans le VIH-1 (Javanbakht et al, 2002). Cet ARNt est retrouvé sous forme aminoacylée dans les particules virales. De plus, les taux de LysRS et Lys dans les virions sont similaires : 20 molécules de chacun d'entre eux par virion. d'ARNt3 Lys Ces données supportent un rôle important de la LysRS dans l'encapsidation de l'ARNt3 (Javanbakht et al, 2002). Gabor et collaborateurs, ont également démontré que la LysRS était Lys (Gabor et al, 2002). La surexpression de un facteur limitant dans l'incorporation de l'ARNt3 la LysRS amène à une incorporation deux fois plus grande des 3 isoformes d'ARNtLys dans les particules virales. 72 Chapitre I : Intercation LysRS/GagPol Figure 37. Comparaison entre les LysRS et AspRS : (A) : Schéma mettant en évidence les formes complètes des deux enzymes cytoplasmiques chez l'homme. Les pourcentages indiquent les similarités de séquences au niveau des domaines catalytiques et de liaison à l'ARNt de ces enzymes. Les structures tridimensionnelles des (B) Hs-LysRS (Guo et al, 2008) et (C) Sc-AspRS (Ruff et al, 1991) sont indiquées. C'est renforce la présence du module N-terminal ESD qui l'association enzyme : ARNt et qui permet à la LysRS de jouer le rôle de transporteur de l'un de ses substrats. En règle générale, une aminoacyl-ARNt synthétase a une activité moléculaire de l'ordre de 1 à 5, elle peut catalyser l'aminoacylation de 1 à 5 molécules d'ARNt par seconde. Deux situations peuvent à priori faciliter la fonction d'un enzyme dans le transport de l'un de ses substrats : lorsque la dissociation du produit de la réaction est l'étape limitante de la réaction catalytique ; lorsque l'interaction avec un autre partenaire bloque l'étape de 73 Chapitre I : Intercation LysRS/GagPol dissociation du produit de la réaction. La séquence 20KxxxKRxxK28 de cLysRS constitue un motif d'interaction protéine-ARNt qui procure un nouveau point d'encrage de l'ARNt sur l'enzyme et confère à l'enzyme une très forte affinité pour l'ARNt (Kd 60 nM, contre plus de 1 M pour la forme tronquée) (Francin & Mirande, 2003). La capacité d'encapsidation de Lys dans les particules du VIH-1 par la LysRS met en jeu la faculté à former un l'ARNt3 complexe stable avec l'ARNt. En effet, une forme N-LysRS dont le domaine N-terminal est tronqué et qui ne peut former qu'un complexe très transitoire avec l'ARNt (Francin et al, 2002 ; Francin & Mirande, 2003), n'est plus capable d'encapsider efficacement l'ARNtLys (Cen et al, 2004a). D'autre part si l'interaction LysRS : ARNt est déstabilisée par mutation des résidus U35 ou U36 de l'ARNt, le complexe ne se forme pas il n'y a pas d'encapsidation de ces ARNt mutants (Javanbakht et al, 2002). Par contre, une LysRS ayant perdu sa capacité à aminoacyler l'ARNtLys peut encore former un complexe stable si son extension N-terminale est présente, et conserve sa capacité d'encapsidation (Cen et al, 2004a). Toutes les données qui avaient été obtenues jusqu'à présent sur l'encapsidation de Lys, ne prenaient en compte que la cLysRS comme source de LysRS encapsidée. C'est l'ARNt3 le groupe de Kleiman qui, par un test immunochimique à l'aide d'anticorps contre la forme cytoplasmique, a démontré en premier la présence de LysRS dans les virions. Or, les anticorps polyclonaux dirigés contre la forme cytoplasmique reconnaissent la forme mitochondriale avec une efficacité similaire (Kaminska et al, 2007b) et dans les particules du VIH-1 aucune autre aaRS (IleRS, ProRS, TrpRS, ArgRS, GlnRS et la TyrRS) n'a été détectée (Javanbakht et al, 2003). Les expériences du groupe de Kleiman ne pouvaient pas distinguer entre les deux formes de LysRS retrouvées dans les particules virales et ce n'est que dans notre groupe, que Kaminska et collaborateurs ont pu démontrer la présence exclusive de la LysRS mitochondriale dans les particules virales en utilisant des anticorps monospécifiques (Kaminska et al, 2007b). B. Gag n'est pas suffisant à l'encapsidation de l'ARNt3 Lys Les premières données indiquaient que le précurseur Gag était capable d'interagir avec Lys (Gabor et al, 2002 ; Mak et la LysRS et le précurseur GagPol pouvait interagir avec l'ARNt3 al, 1994). Il a également été proposé que des interactions protéine-protéine entre Gag ou Lys. La surexpression de GagPol et la LysRS étaient requises pour l'encapsidation de l'ARNt3 cLysRS dans une cellule humaine infectée par le VIH-1 suggérait qu'elle était capable d'interagir avec Gag et qu'elle était incorporée dans les particules virales (Cen et al, 2002 ; 74 Chapitre I : Intercation LysRS/GagPol Javanbakht et al, 2002). La constante de dissociation déterminée pour l'interaction de cLysRS avec Gag (Kd ~ 300 nM) suggère toutefois que cette association n'est pas hautement spécifique (Kovaleski et al, 2006). Ces données mettent en doute la participation de Gag dans l'encapsidation de l'ARNt3 Lys dans les particules virales. III. Analyse du complexe d'encapsidation de l'ARNt3 Lys Les expériences précédentes posent un grand nombre de questions concernant les Lys. Les modèles actuels suggèrent que ce mécanismes possibles de l'encapsidation de l'ARNt3 processus pourrait utiliser une ou plusieurs protéines virales comme transporteur, et la mLysRS comme co-transporteur. Pour mieux comprendre les modalités d'encapsidation de la LysRS dans les particules virales et la façon dont cette dernière est détournée de sa voie cellulaire, piégée puis transportée dans les virions, nous avons étudié son interaction avec les précurseurs Gag et GagPol. En effet, nous avons voulu savoir comment le complexe LysRS- Lys est transporté dans le virus ? Nous avons voulu caractériser les interactions entre la ARNt3 LysRS et les protéines virales. En premier lieu, nous nous sommes intéressés à Gag et GagPol car comme cité dans l'introduction, c'est Gag qui est directement impliqué dans le rassemblement des composantes virales à la membrane plasmique de la cellule lors de l'assemblage des nouveaux virions. Dans le but d'analyser les interactions potentielles entre les polyprotéines Gag, Pol ou GagPol et les différentes formes de LysRS, ainsi que de déterminer les domaines des deux partenaires mis en jeu, nous avons utilisé le système double hybride puis vérifié les interactions positives par immunoprécipitation. A. L'approche du double hybride Le système du double hybride dans la levure S. cerevisiae que nous avons utilisé a été développé par R. Brent et collaborateurs (Gyuris et al, 1993). Nous avons introduit les séquences codant pour les différentes protéines virales fusionnées au domaine de liaison à l'ADN LexA (DNA Binding Domain) dans le vecteur de levure pEG202 et exprimé les protéines LysRS et leurs domaines fusionnés au domaine activateur B42 (Activator Domain) dans le vecteur pJG4-5. Les gènes rapporteurs (LEU2 ou LacZ) qui contiennent les sites de liaison de LexA ont été introduits dans la souche de levure EGY48. 75 Chapitre I : Intercation LysRS/GagPol 1. Description du système Le gène LEU2 du génome de EGY48 est utilisé comme gène rapporteur. En amont de LEU2, ont été introduit les séquences correspondant au site de liaison de l'opérateur LexA (LexAop) se trouvant à la place de la séquence activatrice naturelle. Le gène LexAop-LEU2 n'est pas exprimé quand l'activateur de la transcription LexA-B42 n'est pas reconstitué (EGY48 est auxotrophe pour la leucine). Le plasmide pEG202 porte le gène de sélection HIS3. L'expression des protéines de fusion dans le plasmide pJG4-5, contenant aussi une séquence de localisation nucléaire et un épitope HA en plus du domaine activateur B42, est placé sous le contrôle du promoteur GAL1, il requière un milieu avec galactose pour être activé. Il porte également le gène de sélection TRP1. La souche de levure EGY48 a été transformée par les deux plasmides successivement. Nous avons utilisé le milieu minimum YNB avec galactose (YNB-Gal) pour initier l'expression des protéines de fusion, les protéines virales ProtVir-LexA et les LysRS-B42. Si les deux protéines interagissent cela va reconstituer le complexe ProtVir-LexA : LysRS-B42 qui va activer la transcription du gène rapporteur LEU2. Les cellules sont alors capables de pousser sur un milieu galactose sans leucine (Figure 38). Figure 38. Principe du double hybride. 76 Chapitre I : Intercation LysRS/GagPol 2. Nos résultats Nous avons introduit les séquences codantes des protéines virales dans le pEG202, pour obtenir pEG202/Gag, pEG202/Gag434, pEG202/Pol, pEG202/IN, pEG202/RT, pEG202/PR, pEG202/p6*. Les séquences codantes des cLysRS, pmLysRS et mLysRS ainsi que les domaines communs des LysRS à savoir le domaine catalytique CAT , de liaison de l'ARNt ABD et des domaines spécifiques de chaque forme cESD, pmESD et mESD sont insérés dans le pJG4-5. Nous avons sélectionné les transformants qui poussent sur milieu YNB-Gal en absence de leucine. Le galactose active la transcription des protéines de fusion codées par le pJG4-5. En absence de leucine, dans un milieu YNB-Gal, nous avons observé que les cLysRS, mLysRS et pmLysRS n'interagissaient pas avec Gag ou Gag434. Cette donnée nous montre que la protéine Gag n'est pas essentielle à l'incorporation de la LysRS dans les particules virales. Par contre, les levures ont poussé en présence des LysRS et de Pol montrant que les trois formes de LysRS interagissent avec Pol. Ces résultats prouvent que Pol est un composant important et essentiel du VIH-1 pour le recrutement de la LysRS. GagPol en entier n'a pas pu être testé de par sa grande taille, il ne pouvait pas rentrer dans le noyau. Seule la protéine Pol interagit avec les LysRS, nous avons voulu connatre par la suite quels étaient les domaines de Pol impliqués dans cette interaction. Nous avons trouvé que les sous domaines p6* et IN interagissaient avec les trois formes de LysRS. Cette association pourrait donc impliquer un domaine commun à ces trois formes. Pour déterminer le domaine des LysRS mis en jeu dans l'association à Pol, nous avons également testé les interactions entre les domaines des LysRS contre Pol et ses domaines. Nous avons observé que c'est le domaine catalytique CAT des LysRS qui est impliqué dans l'interaction avec Pol par les domaines p6* et IN. Le domaine CAT est commun aux trois formes ce qui explique l'interaction possible des trois formes de LysRS in vitro avec Pol. 3. Les tests contrôles Pour estimer la spécificité d'interaction des LysRS aux protéines virales, nous avons choisi d'étudier l'interaction entre l'AspRS et les polyprotéines Gag et GagPol. Aucune interaction n'a été observée entre l'AspRS et Pol, p6* ou IN, prouvant ainsi que l'interaction de Pol avec le domaine catalytique des LysRS est hautement spécifique. 77 Chapitre I : Intercation LysRS/GagPol Nous avons également testé l'interaction des LysRS avec la protéine p38. Cette interaction a été étudiée pour comprendre comment se faisait la liaison de la cLysRS à p38 dans MARS et de ce fait s'il existait une compétition entre la fixation de la protéine p38 et la polyprotéine Pol. Tout comme Pol, p38 interagit avec les trois LysRS par leur domaine catalytique, mais l'association entre cLysRS et p38 semble être la plus robuste. In vivo, seule la cLysRS est retrouvée dans MARS et seule la mLysRS est encapsidée dans les virions du VIH-1, montrant ainsi une compétition possible entre p38 et Pol pour l'encapsidation de la cLysRS et pour le routage de ces enzymes dans le cytoplasme de ces cellules. B. L'immunoprécipitation La deuxième méthode que nous avons utilisé au laboratoire pour confirmer nos résultats a été l'immunoprécipitation. Les séquences codant pour les protéines virales Pol, IN et p6* fusionnées à un peptide FLAG ont été insérées dans le plasmide de levure pRS315- PGK (CEN/ARS, LEU2). Elles ont été exprimées dans la levure W303-1B puis exposées à la résine ANTI-FLAG agarose et incubées en présence des protéines LysRS purifiées (Figure 39). L'immunoprécipitation confirme l'interaction entre les LysRS et Pol. Cette interaction est robuste et tout comme par double hybride les trois formes de LysRS interagissent avec Pol. L'interaction entre les LysRS et les p6* et IN est, quant à elle, plus labile. Effectivement, les deux domaines pris séparément semblent interagir moins bien que Pol avec les LysRS. Il existe donc une synergie d'interaction entre les deux domaines de Pol et la LysRS. Figure 39. Principe de l'immunoprécipitation. 78 Chapitre I : Intercation LysRS/GagPol C. Les conclusions et perspectives À partir de toutes les données recueillies, un modèle de l'encapsidation de l'ARNt3 Lys a été proposé. C'est la région Pol et, plus précisément, IN et p6* du précurseur GagPol qui interagissent avec le domaine catalytique CAT de la LysRS mitochondriale lors de l'assemblage de nouveaux virions. C'est la synergie entre IN et p6* qui permet à Pol de jouer Lys. Dans ce modèle, on peut rajouter le rôle de pince moléculaire pour la capture de l'ARNt3 que le domaine RT de Pol, de par son affinité pour les acides nucléiques, pourrait avoir un rôle potentiel dans la stabilisation du complexe avec l'ARNt3 Lys. Plusieurs modèles doivent être pris en compte pour une meilleure compréhension de l'encapsidation de la LysRS dans les particules virales. En effet, nous savons que c'est uniquement l'espèce mitochondriale qui est retrouvée encapsidée dans les virions même si les trois formes ont la capacité intrinsèque d'interagir in vitro avec Pol. Il existe donc une compartimentalisation cellulaire qui fait que Pol ne voit pas la cLysRS avant son interaction avec p38 ou qu'il existe une compétition entre Pol et p38 pour l'interaction avec la cLysRS. Une question qui n'est pas résolue par ces données concerne la forme de LysRS Lys mitochondriale qui s'associe à Pol. Soit c'est la forme pmLyRS qui s'associerait à l'ARNt3 et à Pol avant son transfert dans la mitochondrie, soit c'est la forme mitochondriale maturée mLysRS qui, après importation mitochondriale et clivage de son peptide signal, s'associerait à Lys et à Pol et transporterait cet ARNt au virion. Dans les deux cas, l'infection par le l'ARNt3 VIH-1 modifie les propriétés de la membrane mitochondriale via l'action de Vpr et pourrait avoir un impact négatif sur la translocation de la pmLysRS vers la mitochondrie ou faciliterait le relargage de mLysRS du compartiment mitochondrial. Pour essayer de déterminer directement quelle forme mitochondriale de LysRS est retrouvée dans les virions, nous avons dirigé des anticorps contre un peptide spécifique de la forme prémitochondriale, anticorps qui ne reconnatrait donc qu'un épitope retrouvé dans le peptide signal. Il pourrait ainsi discriminer la forme pmLysRS de la forme mLysRS. Malheureusement, après plusieurs tentatives de reconnaissance des protéines pmLysRS ou mLysRS purifiées, la faible antigénicité du peptide utilisé n'a pas permis de reconnatre la forme pmLysRS. 79 Chapitre I : Intercation LysRS/GagPol Dans le chapitre suivant, nous avons déterminé le site de maturation de pmLysRS en mLysRS, et nous avons isolé et caractérisé les propriétés catalytiques des pmLysRS et mLysRS. Ces données ont permis de conclure que c'est la forme mLysRS maturée qui est encapsidée dans les virions. 80 ARTICLE 1 Association of Mitochondrial Lysyl-tRNA Synthetase with HIV-1 GagPol Involves Catalytic Domain of the Synthetase and Transframe and Integrase Domains of Pol Lydia KOBBI, Guillaume OCTOBRE, José DIAS, Martine COMISSO and Marc MIRANDE J Mol Biol, Vol. 410, pp. 875-886 (2011) 81 doi : 10. 1016/j. jmb. 2011. 03. 005 J. Mol. Biol. (2011) 410, 875886 Contents lists available at Journal of Molecular Biology j o u r n a l h o m e p a g e : h t t p : / / e e s . e l s e v i e r. c o m . j m b Association of Mitochondrial Lysyl-tRNA Synthetase with HIV-1 GagPol Involves Catalytic Domain of the Synthetase and Transframe and Integrase Domains of Pol Lydia Kobbi, Guillaume Octobre, José Dias, Martine Comisso and Marc Mirande Laboratoire d'Enzymologie et Biochimie Structurales, Centre de Recherche de Gif, CNRS, 1 Avenue de la Terrasse, 91190 Gif-sur-Yvette, France Received 19 January 2011 ; received in revised form 18 February 2011 ; accepted 2 March 2011 Edited by M. F. Summers Keywords : HIV-1 ; tRNA packaging ; lysyl-tRNA synthetase ; cellular routing Cytosolic and mitochondrial lysyl-tRNA synthetases (LysRS) are encoded by a single gene and can be distinguished only according to their very N-terminal sequences. It was believed that cytosolic LysRS is packaged into HIV-1 virions via its association with Gag. Using monospecific antibodies, it was later shown that only the mitochondrial LysRS is taken up in viral particles along with Lys, the primer for reverse transcription of the HIV-1 genome. In this tRNA3 work, we re-analyzed the interaction between LysRS and GagPol to determine whether the particular N-terminal sequence of mitochondrial LysRS triggers a specific recognition with GagPol, or if differential routing of the two LysRS species in vivo could explain specific and exclusive packaging of the mitochondrial species. Here, we show that LysRS associates with the Pol domain of GagPol. More specifically, the transframe (TF or p6) and integrase (IN) domain proteins of Pol interact with the catalytic domain of LysRS. A LysGagPol packaging complex is model of the assembly of the LysRStRNA3 proposed, which is consistent with the release of its different components after maturation of GagPol in the virions. The cytoplasmic and mitochondrial LysRS species share an identical catalytic domain. Accordingly, we found that both enzymes have the intrinsic capacity to bind to GagPol in vitro. In addition, both enzymes interact with p38 in vitro, the scaffold protein of the cytoplasmic multi- aminoacyl-tRNA synthetase complex, even though only the cytoplasmic species of LysRS is a bona fide component of this complex. These results suggest that the different LysRS species are strictly targeted in vivo, and open new perspectives for the search of a new class of inhibitors of the HIV-1 development cycle that would block the packaging of tRNA3 Lys into viral particles. 2011 Elsevier Ltd. All rights reserved. *Corresponding author. E-mail address : Marc. Mirande@lebs. cnrs-gif. fr. Contributed equally to this work. Abbreviations used : PBS, primer-binding site ; LysRS, Lysyl-tRNA synthetase ; tRBD, tRNA-binding domain ; c-, cytoplasmic ; m-, mitochondrial ; pm-, premitochondrial ; MARS, multi-aminoacyl-tRNA synthetase complex ; MA, matrix ; CA, capsid ; NC, nucleocapsid ; CAT, C-terminal catalytic domain of LysRS ; ABD, tRNA anticodon-binding domain of LysRS ; ESD, N-terminal eukaryote-specific domain of LysRS ; RT, reverse transcriptase. 0022-2836/$ - see front matter 2011 Elsevier Ltd. All rights reserved. 876 Introduction Lys and tRNA2 Reverse transcription of the RNA genome of HIV-1, the human immunodeficiency virus type 1, into a DNA copy that integrates into the genome of the host cell is an essential step in its life cycle. Initiation of reverse transcription, which requires Lys from the host cell, starts soon after primer tRNA3 budding of new viral particles, and many aspects of this process are known. 1 The primer RNA for Lys, reverse transcription, and tRNA1 which do not carry a 3-extremity complementary to the primer binding site (PBS), are packaged during viral assembly. 2 Thus, specific pairing of tRNA with a sequence on viral RNA complemen- tary to the primer RNA is not a prerequisite for tRNA packaging. Accordingly, the PBS region of viral RNA has been shown to be dispensable for tRNA packaging, and viral particles containing unprocessed GagPol, but not those that expressed only Gag, have been shown to selectively incorpo- rate tRNALys. 3 Lysyl-tRNA synthetase (LysRS), the enzyme of the host cell that specifically recognizes and aminoacylates the different tRNALys species to give the aminoacyl-tRNA used for protein synthe- sis, is also packaged into HIV-1 particles. 4 Human LysRS is a potent tRNA-binding protein. In eukaryotic cells, cytosolic LysRS possesses an N-terminal polypeptide extension made of 73 amino acid residues, as compared to the bacterial enzyme. 5 This appended domain is a functional tRNA- binding domain (tRBD)6 that contributes to the processivity of translation in the eukaryote cell. 7 When its tRBD is removed, the affinity of LysRS for its tRNA is lowered by two orders of magnitude, 5 and tRNALys packaging into viruses is defective. 8 Thus, the efficiency of tRNA-binding correlates with that of tRNA packaging, suggesting that the two processes are linked. Because antibodies directed to the cytosolic enzyme revealed a cross-reacting LysRS species in viral particles, it was thought that the cytosolic enzyme is the source of LysRS packaged into the virions. 4 However, the KARS gene, which encodes LysRS, together with the GARS gene, which encodes GlyRS, comprise one of the two exceptions to the rule that distinct genes encode the cytoplasmic and mitochondrial species of an aminoacyl-tRNA syn- thetase in human cells. Indeed, two mRNAs are produced by alternative splicing of exon 2 of the KARS gene. 9 As a consequence, the cytoplasmic (cLysRS) and premitochondrial (pmLysRS) LysRS, the mitochondrial species produced in the cyto- plasm before maturation during mitochondrial transport, share 576 amino acid residues and display a cross immunological response. 10 The pmLysRS and cLysRS species have specific N-terminal poly- peptide extensions of 49 and 21 amino acid residues, The tRNA3 LYS Packaging Complex respectively. When monospecific antibodies directed to these specific sequences were used to identify the LysRS species packaged into the HIV-1 virions, only the mitochondrial enzyme was detected. 10 In human cells, cLysRS is one of the components of the multi-aminoacyl-tRNA synthetase complex (MARS). 11 By contrast, in the mitochondria, mLysRS does not associate into MARS because other compo- nents of this complex are strictly cytosolic proteins. The other aminoacyl-tRNA synthetases associated with cLysRS into MARS are encoded by two distinct genes, one for the cytosolic and one for the mitochondrial enzyme. Owing to the endosymbiotic origin of mitochondria, mitochondrial synthetases are more similar to their prokaryotic than to their eukaryotic counterparts. The fact that cLysRS is a member of a huge macromolecular complex could explain the selection of mLysRS as a carrier of tRNALys during the packaging process. However, the presence of cLysRS and an increase in tRNALys packaging was observed following over-expression of cLysRS in human cells. 12 The Gag and Pol polyproteins are involved in the process of cLysRStRNALys packaging. 13, 14 Dissociation of the dimeric LysRS into monomers appears to be a prerequisite for assembly. 15 Interestingly, over-expression of cLysRS in human cells generates a free enzyme. 16 The subcellular mobility of this enzyme, in excess as compared to its partners within MARS, is increased, suggesting that its cellular compartmentalization is affected. These findings suggest that even if free cLysRS has the intrinsic ability to serve as a carrier of tRNALys, its cellular association with MARS prevents its interac- tion with a viral protein during the packaging process. In support of this hypothesis, and to assess the role of cellular compartmentalization in the process of proteinprotein interaction in vivo, we analyzed in vitro association between the different LysRS species and the components of the GagPol polyprotein. Results Lysyl-tRNA synthetase associates specifically with the Pol domain of GagPol Association of the mitochondrial species of human LysRS with the Gag or GagPol polyprotein pre- cursors was examined by the yeast two-hybrid method (Fig. 1). Because a single gene encodes the cytoplasmic and mitochondrial species of LysRS in human, 9 we wanted to determine if the mitochon- drial-specific sequences enable Gag or GagPol to discriminate between the different LysRS species. The single KARS gene encodes by means of alternative splicing the cLysRS and premitochon- drial pmLysRS species of LysRS, and thus these two The tRNA3 LYS Packaging Complex 877 Fig. 1. Two-hybrid analysis of LysRSGagPol interaction. (a) Top : the polyproteins Gag and GagPol are translated from the same mRNA. To express GagPol in the yeast two-hybrid system, a deletion was introduced to circumvent the requirement for a 1 frameshifting event. The polyproteins Gag, Gag434 (corresponding to the Gag sequences of GagPol) and Pol (corresponding the Pol sequence of GagPol) were expressed fused to LexA in pEG202. The three LysRS species for the cytoplasmic (cLysRS), mitochondrial (mLysRS), and premitochondrial (pmLysRS) enzymes were expressed fused to the B42 transcription activator, under the control of a galactose-inducible promoter in pJG4-5. Bottom : the two-hybrid proteinprotein interaction assay between Gag, Gag434 or Pol, and cLysRS, mLysRS or pmLysRS was conducted in EGY48 strain plated on YNB-Gal. A proteinprotein interaction resulted in the expression of the LEU2 gene, as observed following co-expression of any of the three LysRS with Pol. As controls, all the strains grew on a galactose medium in the presence of leucine (YNB-Gal Leu) and none grew on a glucose medium (YNB) in the absence of galactose and leucine (all the strains grew on YNB in the presence of leucine ; data not shown). (b) Expression and stability of the fusion proteins produced in yeast. Top : western blot analysis of the fusion proteins expressed in yeast from the pEG202 plasmid. The Gag (78. 3 kDa), Gag434 and Pol (135. 9 kDa) domains of GagPol were expressed fused to the LexA DNA-binding domain. Bottom : western blot analysis of the fusion proteins expressed in yeast from the pJG4-5 plasmid. The cLysRS, mLysRS or pmLysRS species (80 kDa) were expressed fused to the B42 transcription activator and to the HA11 hemagglutinin epitope. enzymes share 576 amino acid residues. The human cLysRS and pmLysRS have distinct N-terminal sequences, consisting of 21 and 49 amino acid residues, respectively. The putative maturation site of pmLysRS that gives the mitochondrial LysRS species (mLysRS) after transfer into the mitochon- dria corresponds to a cleavage of the mitochondria- targeting sequence between Lys16 and Thr17. 9 The different LysRS species, cLysRS, mLysRS and pmLysRS, were expressed in yeast fused with the B42 transcription activation domain. These con- structs also contain an HA11 hemagglutinin epitope that allows identification of the fusion proteins expressed in yeast (Fig. 1b). The viral Gag and GagPol sequences were expressed fused with the LexA DNA-binding domain (Fig. 1b). The complete GagPol polyprotein precursor, consisting of 1435 amino acid residues, was expressed in yeast but could not pass the nuclear barrier, as assessed by the repression assay developed by Brent (data not shown). 17 Thus, only the fusion proteins with Gag, with the first 434 amino acid residues of Gag found in the GagPol polyprotein before 1 frameshifting occurs, and with the Pol region of GagPol were analyzed (Fig. 1a). All these constructs were scored positive by the repression assay, and thus entered the nucleus. Neither Gag, 434 containing the matrix (MA), capsid (CA) and nucleocapsid (NC) domains, nor Gag, containing the additional p6 protein, displayed interaction with any of the three forms of LysRS, by the two-hybrid system. By contrast, expression of Pol and of any of the three LysRS 878 The tRNA3 LYS Packaging Complex Fig. 2. (a) Yeast two-hybrid anal- ysis of interaction of the p6, PR, RT or IN domains of Pol with cLysRS, mLysRS or pmLysRS. For the seek of clarity, only the YNB-Gal selec- tion plate is presented, showing the p6 and IN domains that interact with the three LysRS spe- cies. No growth was observed on YNB plates. Figure 3 also shows that p6 and IN do not activate transcription when the catalytic domain of LysRS is not expressed in yeast. (b) Western blot analysis of the fusion proteins expressed in yeast from the pEG202 plasmid. The p6 (28. 8 kDa), PR (33. 4 kDa), RT (86. 9 kDa) or IN (54. 8 kDa) domains of GagPol were expressed fused to the LexA DNA-binding domain. To test for the specificity of the association of LysRS with Pol and with its p6 or IN domains in the yeast two-hybrid system, human aspartyl-tRNA synthetase was fused to B42 and used as a control. LysRS and AspRS, two aminoacyl-tRNA synthe- tases from the class IIB enzymes, evolved from a common ancestor and thus display a high level of sequence and 3D-structure similarity. Among 476 amino acid residues that could be aligned, 196 are similar (109 are identical). This 41% similarity is even higher when only the catalytic domains are compared, reaching a level of 48% (81 identical amino acid residues among 297). AspRS is the synthetase that is the most closely related to LysRS, and thus could be the most difficult to discriminate by Pol, p6 and IN. Even if the expression level of the HA11-AspRS fusion protein in yeast is similar or even slightly higher than that of HA11-LysRS (Fig. 4), co-expression of AspRS with Pol, p6 or IN (as well as with Gag, Gag434, PR or RT) in the yeast two- hybrid system did not reveal any interaction between these proteins (Fig. 4). The p6 and IN domains act synergistically to build a stable anchoring platform for LysRS on Pol Association of LysRS with Pol was confirmed by immunoprecipitation of LysRS with FLAG-tagged species allowed the yeast to grow, suggesting that a domain common to all LysRS species was involved in the association. To identify the protein domains of the Pol polyprotein precursor involved in this interaction, the four domains of Pol, the transframe protein p6, the viral protease PR, reverse transcriptase RT and integrase IN (Fig. 2a) were independently expressed fused to LexA (Fig. 2b). Expression of the p6 or of the IN domain of Pol with any of the three LysRS species revealed a proteinprotein interaction by the two-hybrid assay (Fig. 2a). To delineate the protein domains of LysRS required for association with Pol or with its p6 or IN domains, the structural domains of LysRS (Fig. 3a) were independently expressed fused to B42 (Fig. 3a). This includes the C-terminal catalytic domain of LysRS (CAT), its tRNA anticodon-binding domain (ABD), and its N-terminal eukaryote-specific se- quences (ESD) that promotes the formation of a stable complex between tRNALys and LysRS in humans. 5 The cESD, mESD and pmESD domains also contain the cytoplasmic-, mitochondrial- and premitochondrial-specific sequences, respectively. Expression of CAT, but of none of the other cESD, mESD, pmESD, or ABD domains, with Pol, p6 or IN, revealed a proteinprotein interaction (Fig. 3b). No interaction was detected with Gag. The tRNA3 LYS Packaging Complex 879 Fig. 3. Two-hybrid analysis of the LysRS domains interacting with Pol. (a) The cytoplasmic (cLysRS), mitochondrial (mLysRS) and premitochondrial (pmLysRS) species of LysRS as well as the cytoplasmic- (cESD), mitochondrial- (mESD) or premitochondrial- (pmESD) eukaryote-specific domains, the anticodon-binding domain (ABD), and the catalytic domain (CAT) of LysRS were expressed fused to the B42 transcription activator, under the control of a galactose-inducible promoter in pJG4-5. Expression of the fusion proteins in yeast was analyzed by western blot. The cESD, mESD, pmESD (21 kDa), ABD (31. 1 kDa) or CAT (53. 1 kDa) domains of LysRS were expressed fused to the B42 transcription activator and to the HA11 hemagglutinin epitope. Note that the CAT domain is expressed much less than the other LysRS domains. (b) The two-hybrid proteinprotein interaction assay between the LysRS constructs and Pol, p6, IN and Gag expressed fused to LexA in pEG202, was done in the EGY48 strain. Expression of the CAT domain alone was as efficient as expression of the three full-length LysRS species to restore growth in the presence of Pol, p6 or IN. No growth was observed on YNB plates. As a control, none of the LysRS or LysRS domains revealed a proteinprotein interaction with Gag in the yeast two-hybrid assay. These data show also that none of the HA-LysRS fusions activates transcription of the reporter gene in the absence of a suitable B42-fusion protein. For clarity, only the YNB-Gal selection plate is shown. Pol produced in yeast. We set up an immunopre- cipitation assay allowing the recovery of interacting proteins with a specific elution step because we observed that full-length LysRS species have the tendency to be adsorbed non-specifically on agarose beads. The Pol domain of GagPol was expressed in yeast with a FLAG-tag appended to its N-terminus, and purified by adsorption on an anti-FLAG agarose. The resulting FLAG-Pol bound to the anti-FLAG agarose was incubated in the presence of purified cLysRS, mLysRS or pmLysRS (Fig. 5). In parallel, a sample of anti-FLAG agarose saturated with FLAG peptide was incubated with the different LysRS species. After washing the agarose beads, specific elution of interacting proteins was accom- plished by adding an excess of FLAG peptide that released FLAG-Pol from the agarose matrix by competition. The three forms of LysRS were recovered after interaction with FLAG-Pol, but only trace amounts were recovered from the matrix saturated with FLAG (Fig. 5a). Thus, interaction detected by the two-hybrid analysis was verified by an immunoprecipitation assay. This suggests that the three LysRS species interact directly with Pol. As a control, LysRS was replaced by purified AspRS in this assay. As shown in Fig. 5b, AspRS did not bind to FLAG or to FLAG-Pol. Thus, the LysRSPol association detected by two-hybrid and immuno- precipitation analyses is specific. Association of LysRS to the p6 and IN domains of Pol was assessed by this immunoprecipitation assay, under exactly the same experimental condi- tions used for Pol. The two constructs FLAG-p6 and FLAG-IN were isolated on anti-FLAG agarose beads and incubated with mLysRS. After two washes with 50 mM NaCl, mLysRS was eluted by increasing the concentration of NaCl to 250 mM or after an additional wash with 50 mM NaCl, by adding FLAG peptide to elute the FLAG-tagged proteins (Fig. 6). When incubated on FLAG-Pol, pmLysRS was eluted by FLAG peptide, but its interaction with FLAG-Pol was not disrupted by 880 The tRNA3 LYS Packaging Complex Fig. 4. Two-hybrid analysis of AspRSGagPol interaction. Aspar- tyl-tRNA synthetase (AspRS) was expressed fused to the B42 tran- scription activator, under the con- trol of a galactose-inducible promoter in pJG4-5. The two-hy- brid proteinprotein interaction assay between AspRS and the Gag434, Gag, Pol, p6, PR, RT or IN domains of GagPol expressed fused to LexA in pEG202, was done in the EGY48 strain. On the YNB- Gal selection plate, none of the GagPol domains revealed a pro- teinprotein interaction with AspRS in the yeast two-hybrid assay. As controls, all the strains grew on galactose medium in the leucine (YNB-Gal presence of Leu), all the strains grew on glucose medium in the presence of leucine (YNB Leu) and none grew on glucose medium in the absence of leucine (YNB). The relative expression level of the B42-LysRS and B42-AspRS fusion proteins in the EGY48 strains, as assessed by western blot analysis with anti-HA11 antibodies, is shown at the right. incubation with 250 mM NaCl. By contrast, interac- tion of pmLysRS with FLAG-IN was completely dissociated in the presence of 250 mM NaCl, and its interaction with FLAG-p6 was too weak to be visualized by this approach. Thus, association of LysRS with p6 or IN is much weaker than that between pmLysRS and Pol, suggesting that these two domains of Pol act synergistically to build a strong and stable anchoring platform for LysRS with the Pol domain of GagPol. Do p38 and Pol compete for association with LysRS ? The cytoplasmic form of LysRS is a member of the MARS complex. 18 It binds to the p38 scaffold protein of the complex with high affinity (KD ~ 0. 3 nM). 19 No trace of mitochondrial LysRS was recovered from the purified MARS fraction. The association of LysRS with p38 was analyzed in more detail. A yeast two- hybrid analysis showed that p38 is able to associate with cLysRS or with itself (p38 is a dimer), as reported, 20 and with mLysRS or pmLysRS (Fig. 7a). Association of p38 with LysRS was revealed when analyzing its interaction with the catalytic domain alone, but was not observed with the cESD, mESD, pmESD or ABD domains (Fig. 7a). By contrast, because the conserved catalytic domain of LysRS is also involved in the association of LysRS with Pol (Fig. 3), cLysRS and pmLysRS interact with Pol as found by the two-hybrid and immunoprecipitation assays (Figs. 1 and 5). How- ever, the mitochondrial species of LysRS is the only species recovered in HIV-1 virions. 10 We tried to evaluate the relative strength of association of cLysRS, pmLysRS and its CAT domain with p38, Pol, p6 or IN (Fig. 7b) by introducing the lacZ reporter gene into the two-hybrid assay. We observed earlier that activation of the two reporter genes lacZ and LEU2 in this yeast two-hybrid assay20 is correlated with a high affinity of interaction between the two proteins tested (KD 50 nM), 19 whereas only the LEU2 gene is activated with proteins interacting more weakly. Co-expression of cLysRS and p38 resulted in very strong activation (deep indigo color) of the two reporter genes (Fig. 7b) as reported. 20 By contrast, a weak activation (light blue color) of the lacZ gene was observed when CAT and p38 or pmLysRS and p38 were co-expressed. No expression of -galactosidase was detected in strains co-expressing cLysRS, pmLysRS or CAT with Pol, p6 or IN (Fig. 7b). Interestingly, sequences located in the cESD domain of cLysRS stabilize association of the CAT domain with the p38 scaffold protein of the cytoplasmic MARS complex. By contrast, the se- quences located in the pmESD domain of pmLysRS (or in the mESD domain of mLysRS, not shown), do not appear to contribute to stabilize the association of pmLysRS with Pol, p6 or IN (Fig. 7b). Thus, the same domain of LysRS, its catalytic domain, is involved in the interaction of pmLysRS with Pol and in the interaction of cLysRS with p38 in vivo. To test for a possible overlap between the two binding sites, immunoprecipitation of cLysRS by FLAG-Pol was conducted as described above (Fig. 5a), in the absence or in the presence of an excess of p38 (Fig. 8). Addition of p38 to excess did not impair association of cLysRS with FLAG-Pol. After The tRNA3 LYS Packaging Complex 881 Fig. 6. Co-immunoprecipitation assay of LysRS with the p6 and IN domains of Pol. Anti-FLAG agarose beads carrying the FLAG-IN fusion protein (FLAG-IN), the FLAG-p6 fusion protein (FLAG-p6), the FLAG-Pol fusion protein (FLAG-Pol) or the FLAG peptide (FLAG) were incubated with the mitochondrial form (mKRS) of LysRS (Input). After several washes with a buffer contain- ing 50 mM NaCl (Wash), beads were incubated with the same buffer containing 250 mM NaCl (Elution 250 mM NaCl), washed again with 50 mM NaCl (Wash) before the addition of excess FLAG peptide (FLAG elution). LysRS present in these fractions was analyzed by western blotting with anti-KRS antibodies. conditions ; 10 that is, when no LysRS species is over- expressed in the host cell and when wild type viruses are produced, as opposed to Gag viral-like particles (VLPs), prompted us to re-investigate the role of GagPol and of its individual components in this process. Our results are consistent with the following model of LysRStRNALysGagPol association (Fig. 9). The N-terminal, eukaryote-specific, tRNA-binding domain (tRBD) of LysRS, is required to provide a strong tRNA-anchoring platform on LysRS5 and to package tRNA into HIV-1 particles. 8 This stable LysRStRNALys complex is hijacked into virions after interaction of the catalytic domain of LysRS (CAT) with the p6 and IN domains of unprocessed polyprotein GagPol. The reverse transcriptase (RT) domain of Pol, which appears to have a limited specificity for tRNA-binding21 but to be required for efficient packaging of tRNA into HIV-1 particles, 3 could provide an additional tRNA-binding site to stabilize association of tRNA within the LysRS tRNALysGagPol ternary complex. This model is consistent with the finding that unprocessed GagPol is required for selective packaging of tRNALys because the p6 and IN domains of Pol act synergistically to contribute a stable anchoring platform to LysRS. Deletion of reverse transcriptase and integrase se- quences is accompanied by an eightfold decrease in Lys packaging. 3 It is noteworthy that a mutation tRNA3 Fig. 5. Co-immunoprecipitation of LysRS with Pol. (a) Anti-FLAG agarose beads carrying the FLAG peptide (FLAG) or the FLAG-Pol fusion protein (FLAG-Pol) were incubated with the cytoplasmic (cKRS), mitochondrial (mKRS) or premitochondrial (pmKRS) forms of LysRS (Input). After several washes, beads were incubated with excess FLAG peptide and the eluted fraction was recovered (FLAG elution). LysRS present in these fractions was analyzed by western blotting with anti-KRS anti- bodies. (b) Anti-FLAG agarose beads carrying the FLAG peptide (FLAG) or the FLAG-Pol fusion protein (FLAG- Pol) were incubated with AspRS (Input). After several washes, beads were incubated with excess FLAG peptide and the eluted fraction was recovered (FLAG elution). AspRS present in these fractions was analyzed by western blotting with anti-DRS antibodies. incubation of cLysRS with p38, both proteins were recovered associated with FLAG-Pol (p38 alone did not bind to FLAG-Pol ; data not shown). This result shows that the p38- and Pol-binding sites on LysRS are distinct and can be occupied simultaneously on the protein. Discussion The detailed knowledge of proteinprotein interac- tions between the cellular and viral proteins involved Lys packaging complex is a in the assembly of the tRNA3 prerequisite to search for molecules that could inhibit this step of the HIV-1 life cycle. Our finding that the mitochondrial LysRS species is the only cellular LysRS recovered in HIV-1 particles under physiological 882 The tRNA3 LYS Packaging Complex Fig. 7. Two-hybrid analysis of the association of LysRS with MARS or with GagPol. (a) The cytoplasmic (cLysRS), mitochondrial (mLysRS) and premitochondrial (pmLysRS) species of LysRS, the p38 component of the cytoplasmic MARS complex (p38) as well as the cytoplasmic- (cESD), mitochondrial- (mESD) or premitochondrial- (pmESD) eukaryote-specific domains, the anticodon-binding domain (ABD) and the catalytic domain (CAT) of LysRS were expressed fused to the B42 transcription activator, under the control of a galactose-inducible promoter in pJG4-5. The two- hybrid proteinprotein interaction assay between these constructs and p38 expressed fused to LexA in pEG202, was conducted in strain EGY48. Only the YNB-Gal selection plate is shown. (b) The robustness of interaction between cKRS, pmKRS or the CAT domain of KRS fused to B42 and the p38, Pol, p6 or IN proteins fused to LexA in the two-hybrid assay was assessed by monitoring activation of the LEU2 gene (YNB-Gal) or of the lacZ gene ( X-Gal). Note the strong indigo color when the cKRS and p38 fusion proteins are co-expressed. C130S in IN that does not affect the enzyme activity of IN in vitro has been reported to abolish the ability of the virus to initiate reverse transcription. 22 These data indicated that IN plays an important, but undefined, role during reverse transcription. Our results suggest that disruption of LysRSIN interaction could be one of the defects caused by the C130S substitution in IN. In addition, the finding that Pol binds LysRS in a pincers-like manner between its two p6 and IN branches also suggests a mechanism of release of LysRSGagPol association. Indeed, after maturation of GagPol in the virions, which dismantles the pincers and annihilates the synergy effect, the weak associa- tion of LysRS with the two individual proteins p6 and IN should lead to their dissociation. These results are not in accord with earlier reports suggesting that LysRS interacts with the Gag domain of GagPol, and more specifically with the C-terminal region of the CA domain of Gag. 13, 15 Despite several attempts, we could not detect an interaction between any of the LysRS used in this study and Gag. The experiments reported here provide some indication on possible sources of the discrepancies. Perhaps crucially, the ability of LysRS to be Fig. 8. Co-immunoprecipitation of LysRS with Pol in the presence of p38. Anti-FLAG agarose beads were loaded with FLAG-Pol fusion protein (FLAG-Pol) or with FLAG peptide (FLAG) and incubated with the cytoplasmic form of LysRS in the absence (cKRS) or in the presence of p38 (cKRS p38) (Input). After several washes, beads were incubated with excess FLAG peptide (FLAG elution). LysRS and p38 present in these fractions was analyzed by western blotting with anti-KRS or anti-p38 antibodies. The tRNA3 LYS Packaging Complex 883 that study is also very weak when compared to the dissociation constant of 0. 3 nM determined for the LysRSp38 interaction, 19 which questions the spec- ificity of the LysRSGag interaction reported earlier. In their model, the LysRSGag interaction involves the hydrophobic, dimeric interface of LysRS. 15 Because LysRS is a very stable dimer that requires incubation with chaotropic salts to be dissociated into monomers, 19, 25 the weak association of LysRS with Gag makes it unlikely that LysRS will spontaneously dissociate into monomers in the presence of Gag in vivo. Our data also show that cLysRS interacts more strongly than mLysRS or pmLysRS with the p38 scaffold protein of the MARS complex. This result suggests that association of cLysRS within MARS is a clearly favored pathway in vivo, as compared to pmLysRS. Because our data show that all LysRS species have the intrinsic property to associate within MARS or to bind to GagPol, they suggest that cellular compartmentalization is a key mechanism for the selective targeting of mitochondrial LysRS to HIV-1 virions. These results have strong implications on compart- mentalization of proteins in the cytoplasm of human cells. The data available are consistent with a model according to which, after translation in the cytoplasm, cLysRS, which does not contain the N-terminal mitochondrial targeting sequence of pmLysRS, is targeted to MARS and pmLysRS is targeted to the mitochondria (Fig. 10). Despite its ability to bind to p38 (Fig. 7), pmLysRS was never detected within the cytoplasmic MARS complex using monospecific antibodies directed to its N-terminal specific peptide. 10 Following HIV-1 infection, the GagPol polyprotein is produced and selects a LysRStRNALys species for packaging into virions. The cLysRS and pmLysRS species have the intrinsic capacity to bind GagPol, but cLysRS is not recovered into the virions, 10 suggesting that its interaction with p38 and its routing to MARS prevents its ability to be sequestered by GagPol and to be packaged. The other components of MARS have not been found in viral particles (our unpublished results). 4 The mitochondrial species of LysRS, the only free LysRS species present in the cell, could interact with GagPol for packaging. Hijacking of the mitochondrial but not of the cytoplasmic LysRS species could also be functionally advantageous for the virus. Production of a large amount of virus from each infected cell requires an active translation machinery in the host cell. The cytoplasmic enzyme, which is not recruited by GagPol, would retain its translational capacity. The finding that within the host cell the catalytic domain of mitochondrial LysRS interacts specifically with the p6 and IN domains of GagPol for its packaging into HIV-1 particles opens new perspec- tives toward the search of inhibitors of this specific step in the HIV-1 life cycle. Fig. 9. Model of the tRNALys packaging complex. The major protein domains of Pr160GagPol polyprotein, MA, CA, NC, p6, PR, RT and IN are indicated. The catalytic (CAT) and anticodon-binding (ABD) domains of mito- chondrial LysRS are indicated in yellow (large and small domain, respectively) and the ESD domain in blue. The p6 and IN domains of GagPol (in orange) interact with the catalytic domain of LysRS. Association of tRNALys with LysRS could be stabilized by an additional interac- tion with the RT domain of GagPol. packaged into virions was determined after over- expression of cytoplasmic LysRS and LysRS variants into the host cell and analysis of its incorporation into GagVLPs. Over-expression of cLysRS in human cells produces a free enzyme that is not associated within MARS. 16 This ectopic enzyme could then be packaged into virions as efficiently as the natural mitochondrial LysRS (our unpublished results). Analysis of the packaging process into GagVLPs appears to lack the specificity of wild type HIV-1. A recent re-evaluation of tRNAs packaged into HIV-1 particles using a microarray analysis showed that tRNA packaging is reduced by 80% in GagVLPs compared to wild-type HIV-1. 23 In this study, authors assume that tRNAs recovered in GagVLPs represent nonselective packaging. In our immunoprecipitation analysis, specific elution of the LysRSPol complexes from the anti- FLAG matrix by competition between the FLAG sequences appended to Pol and a FLAG peptide added in excess was a key factor to eliminate the nonspecific interactions we observed between LysRS and the matrix. The interaction between LysRS and Pol reported here proved to be specific, when compared with experiments performed with AspRS, another class IIb aminoacyl-tRNA synthe- tase that is closely related to LysRS in evolution. 24 By contrast, the equilibrium binding constant reported for the LysRSGag interaction (310 nM) was only fivefold lower than that determined for association of Gag with TrpRS (1550 nM), a class I aminoacyl-tRNA synthetase completely unrelated to LysRS. 15 The LysRSGag interaction reported in 884 The tRNA3 LYS Packaging Complex Fig. 10. The cellular routes of LysRS. The cytoplasmic and mitochondrial species of LysRS, translated in the cytoplasm, would be strictly targeted to MARS where cyto-LysRS interacts with p38 or to mitochondria via interaction with components of the import machinery. Even if mito-LysRS has the intrinsic capacity to bind to p38, mito-LysRS is never routed to MARS in vivo. Even if cyto-LysRS has the intrinsic capacity to bind to GagPol, its routing to MARS prevents its routing to HIV-1 particles. Materials and Methods Yeast two-hybrid analysis We used the yeast two-hybrid system developed by Brent et al. 17 The cDNAs encoding the human cytoplasmic, premitochondrial and mitochondrial forms of LysRS, the catalytic (CAT, Asp238 Val597), anticodon-binding (ABD, Val71 Asn237) or eukaryotic-specific (cESD, mESD, pmESD, from the N-terminus to Ser70) domains of LysRS, human cytoplasmic AspRS or p38, were introduced between the EcoRI and XhoI sites of pJG4-5. The B42 activation domain-fused proteins in pJG4-5 also carry a hemagglutinin epitope tag, and are expressed under the control of a galactose-inducible promoter. The GagPol, Gag, Gag434 and Pol polyproteins, the p6, PR, RT and IN domains of Pol, and human p38 were introduced between the EcoRI and XhoI sites of pEG202. For frameshifting-independent expression of GagPol, a 5T- deletion (nucleotides 2086 2090 in pNL4-3) was introduced into the coding sequence. For expression of GagPol, Pol and PR, a GAT (Asp) to CGT (Arg) double mutation was introduced at positions 2325-2326 to inactivate viral protease. The LexA DBD-fused proteins in pEG202 are expressed under the control of a constitutive promoter. The repression assay with the pJK101 reporter was used to test whether the LexApVIH-1 fusion proteins are able to enter the nucleus and bind LexA operators. 17 The yeast strain EGY48 (Mat his3 leu2 : 3LexAop-LEU2 ura3 trp1), which contains a chromosomal LEU2 gene placed under the control of LexA operators was trans- formed to ura with pSH18-34, the LexAop-LacZ reporter plasmid, to his with pEG202-derivatives and to trp with pJG4-5 derivatives. At least four independent colonies were analyzed for their ability to grow in the absence of leucine (expression of Lexop-LEU2) or to show blue color on 5-bromo-4-chloro-3-indolyl -D-galactopyranoside (X-Gal)-containing medium (expression of LexAop-LacZ). A pair of interactive proteins was scored as positive when transformants did not grow on glucose medium lacking leucine (no expression of B42-fusions) but grew on galactose medium lacking leucine (expression of B42- fusions that interacted with LexA-fusions). These interac- tions were scored as strong when colonies were also blue on galactose medium containing X-Gal. Enzymes, antibodies and western blot analysis The different human LysRS species, pmLysRS, mLysRS, or cLysRS were expressed in yeast or in insect cells, and The tRNA3 LYS Packaging Complex 885 purified essentially as described. 5 Monoclonal antibodies directed to the hemagglutinin epitope were from BAbCo. Antibodies to LexA were a gift from Patrice Moreau (Laboratoire de Chimie Bactérienne, Marseille). Polyclonal anti-LysRS, anti-AspRS and anti-p38 antibodies have been described. 26 Western blot analysis was done with goat anti-rabbit or goat anti-mouse secondary antibodies conjugated with peroxidase (Chemicon) and the ECL detection reagents (GE Healthcare). Immunoprecipitation The Pol domain of GagPol was inserted into the BglII site of pRS315-PGK25 (CEN/ARS, LEU227). FLAG-Pol was expressed with an N-terminal MGDYKDDDDKPW se- quence corresponding to the FLAG epitope (underlined). Plasmids pRS315-PGK-FLAG or pRS315-PGK-FLAG-Pol were used to transform yeast W303-1B strain (leu2, his3, trp1, ura3, ade2). Cells were grown at 28 C in 1 l of minimal YNB medium (0. 7% (w/v) yeast nitrogen base without amino acid, 2% (w/v) glucose) supplemented with uracil, adenine, histidine and tryptophan, to an A600 of 1. Cells were washed, suspended in 5 ml of ice-cold extraction buffer (100 mM TrisHCl pH 8. 0, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT) an lysed at 2100 bar (1 bar 0. 1 Mpa) in a One Shot cell disrupter (Constant Systems Ltd) in the presence of 1 mM benzamidine and 1 mM PMSF. Extracts were clarified by centrifugation at 12, 000g for 15 min at 4 C, followed by centrifugation for 40 min at 160, 000g at 4 C. The supernatant was incubated for 2 h, at 4 C, after addition of 120 l of a 1 : 1 slurry of ANTI-FLAG M2 affinity gel (Sigma). The matrix was washed extensively and suspended in NETN50 (20 mM TrisHCl pH 8. 0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0. 5% (v/v) NP40). Anti-FLAG agarose incubated with an extract of yeast transformed with pRS315-PGK-FLAG-Pol is denoted FLAG- Pol matrix, or FLAG matrix when incubated with the control extract of yeast transformed with pRS315-PGK-FLAG. Before incubation with purified proteins, a fraction of the matrix was treated with SDS and analyzed by Western blotting with anti- FLAG antibodies to check that similar amounts of the different FLAG-proteins were bound to the matrix. Purified proteins (0. 1 ml at 2 M) were incubated with 30 l of FLAG or FLAG-Pol matrix in NETN50 containing BSA at 10 g/ml. The mixture was incubated for 1 h at 4 C with constant shaking. After centrifugation for 1 min at 13, 000g at 4 C, agarose beads were washed twice with 200 l of NETN50, once with 200 l of NETN250 (NETN50 containing 250 mM NaCl) and twice with 200 l of NETN50. Beads were suspended in 36 l of NETN50 and specific elution from an ANTI-FLAG M2 affinity gel was done after addition of 4 l of FLAG peptide (5 mg/ml ; Sigma). After incubation for 30 min at 4 C, the supernatant was recovered by centrifugation and fractions were analyzed by Western blotting. Acknowledgements We thank Riccardo Freguja and Sebastian Flisiak for their involvement in the early stages of this study. This work was supported by grants from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), the Agence Nationale de Recherches sur le SIDA (ANRS) and the Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC). L. K. is the recipient of a doctoral fellowship of Ministère de l'éducation nationale, de l'enseignement supérieur et de la recherche. G. O. and J. D. were the recipients of postdoctoral fellowships of Agence Nationale de Recherches sur le SIDA and of Centre National de la Recherche Scientifique, respectively. References 1. Abbink, T. E. & Berkhout, B. (2008). HIV-1 reverse transcription initiation : a potential target for novel antivirals ? Virus Res. 134, 418. 2. Jiang, M. , Mak, J. , Ladha, A. , Cohen, E. , Klein, M. , Rovinski, B. & Kleiman, L. (1993). Identification of tRNAs incorporated into wild-type and mutant human immunodeficiency virus type-1. J. 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CHAPITRE II Activation de la lysyl-ARNt synthétase mitochondriale humaine après maturation de son précurseur prémitochondrial 95 Chapitre II : Activation de la LysRS mitochondriale CHAPITRE II : ACTIVATION DE LA LYSYL ARNt SYNTHETASE MITOCHONDRIALE HUMAINE APRES MATURATION DE SON PRECURSEUR PREMITICHONDRIAL Comme présenté dans l'introduction, c'est la forme mitochondriale de la LysRS qui est Lys dans les particules du VIH-1. Sa responsable du transport et de l'encapsidation de l'ARNt3 capacité à former un complexe d'encapsidation avec GagPol met en jeu plusieurs paramètres : la capacité de son domaine catalytique à interagir avec les régions TF et IN du domaine Pol de GagPol, la disponibilité de la LysRS, et sa capacité d'interaction avec l'ARNt. Dans le cadre de notre étude, nous avons voulu savoir à quel stade la LysRS mitochondriale est capturée et acheminée vers les virions. Cela se fait-il lorsqu'elle est sous forme de précurseur pmLysRS avant son entrée dans la mitochondrie, ou après son clivage et sa maturation, donnant ainsi la forme mature ? Cette dernière doit-elle être relarguée de la mitochondrie pour interagir avec GagPol ? (Figure 40). Figure 40. L'encapsidation de la LysRS mitochondriale : GagPol interagit avec la LysRS mitochondriale soit avant soit après son import mitochondrial. Pour tenter de répondre à ces questions, nous avons étudié la maturation de la mLysRS à partir de son précurseur pmLysRS lors de la translocation mitochondriale. Nous avons recherché quel était le site de maturation de cet enzyme, et nous avons caractérisé les deux 97 Chapitre II : Activation de la LysRS mitochondriale formes mitochondriales de la LysRS en déterminant leurs paramètres catalytiques dans la réaction d'aminoacylation de l'ARNt et nous avons étudié leur interaction avec l'ARNt3 Lys. I. Généralités sur la protéosynthèse chez l'homme A. La synthèse protéique chez la mitochondrie est de type bactérien 1. Le génome mitochondrial La mitochondrie contient plusieurs copies d'un ADN circulaire (ADNmt) double brin. C'est un génome très compact, il ne contient aucune séquence intronique. Il code pour 13 protéines qui sont les constituants de la chane respiratoire. Il code également pour 22 ARNt et 2 ARNr (Figure 41). Toutes les autres protéines mitochondriales sont codées par le génome nucléaire de la cellule et sont transloquées vers la mitochondrie. Figure 41. Génome mitochondrial humain : Le génome mitochondrial code pour les protéines de la chaine respiratoire (régions en vert) et pour les ARNt et ARNr (régions en jaune). 2. La synthèse protéique mitochondriale La traduction des ARNm mitochondriaux se fait au niveau de la membrane mitochondriale interne (Liu & Spremulli, 2000). Le mécanisme de la traduction dans la mitochondrie est proche du système eubactérien, mais il présente certaines particularités ; en 98 Chapitre II : Activation de la LysRS mitochondriale effet, le code génétique mitochondrial possède des variations par rapport au code universel. Pour le génome mitochondrial des mammifères, le codon stop opale UGA est réassigné en codon tryptophane, le codon AUA en codon méthionine et les codons AGA et AGG en codons stop. Enfin, les ribosomes mitochondriaux sont particuliers, ils ont une faible teneur en ARNr. 3. L'origine endosymbiotique L'endosymbiote original de la mitochondrie actuelle serait une -protéobactérie (Margulis, 1981). Au cours de l'évolution, il aurait subi un transfert massif de ses gènes vers le génome de la cellule hôte réduisant ainsi drastiquement le génome mitochondrial. 4. Les aminoacyl-ARNt synthétases mitochondriales Les partenaires de la synthèse protéique mitochondriale sont issus de compartiments différents. Les ARNt sont en grande majorité synthétisés à partir de gènes mitochondriaux tandis que les synthétases sont toutes codées par le génome nucléaire, synthétisées dans le cytoplasme puis importées dans la mitochondrie. Les aaRS mitochondriales sont codées par des gènes distincts de ceux qui codent pour les aaRS cytoplasmiques sauf pour deux synthétases : la GlyRS et la LysRS. Pour la GlyRS, deux sites d'initiation de la traduction permettent de donner deux formes de l'enzyme (Mudge et al, 1998) tandis que pour la LysRS, les deux formes sont issues d'un épissage alternatif (Tolkunova et al, 2000). Les aaRS mitochondriales ont des structures oligomériques semblables aux aaRS bactériennes sauf dans le cas des GlyRS (2) et PheRS (). Elles conservent les motifs permettant de les définir comme classe I ou II. Les déterminants d'identité pour la reconnaissance des ARNt peuvent être différents de ceux de leurs homologues cytoplasmiques. B. La maturation de la pmLysRS humaine La mLysRS est la forme mitochondriale mature ; elle est générée à partir du précurseur pmLysRS qui contient en N-terminal les 49 acides aminés spécifiques de cette forme. La maturation de la pmLysRS a lieu lors de sa translocation dans la mitochondrie par l'intervention des protéases membranaires mitochondriales. Les modalités exactes de cette 99 Chapitre II : Activation de la LysRS mitochondriale maturation ne sont pas encore connues. Le programme Mitoprot prédit une localisation mitochondriale à cette protéine (Claros, 1995). Il identifie également un site de coupure potentiel entre les résidus Lys16 et Thr17, ce qui conduit à la forme m*LysRS, forme prédite de mLysRS. C. Les autres activités potentielles de la LysRS mitochondriale Tout comme la cLysRS, la forme mitochondriale de l'enzyme joue des rôles non canoniques dans la cellule, en plus de son implication dans la formation du complexe d'encapsidation de l'ARNt3 Lys. Une mutation de la Cu, Zn-superoxide dismutase (SOD1), est à l'origine de la sclérose latérale amyotrophique (ALS). Cette mutation dans SOD1 conduit à des interactions aberrantes avec des protéines codées par le noyau et destinées à un import mitochondrial (Kunst et al, 1997). Dans les cellules de mammifères, le mutant de SOD1 interagit préférentiellement avec la pmLysRS (Kawamata et al, 2008). En présence du mutant de SOD1, la pmLysRS montre une grande instabilité, elle est mal repliée et forme des agrégats avant son importation dans la mitochondrie, devenant ainsi une cible pour la dégradation par le protéasome. L'importation de la pmLysRS vers la mitochondrie étant affectée, la synthèse protéique mitochondriale est de ce fait diminuée. En fin de compte, les interactions anormales entre le mutant de SOD1 et la pmLysRS aboutissent à des anomalies morphologiques mitochondriales et à la toxicité cellulaire. La pmLysRS est la première protéine mitochondriale dont l'interaction avec le mutant de SOD1 contribue au dysfonctionnement mitochondrial dans l'ALS. II. Activation de la LysRS lors de son import dans la mitochondrie Dans un premier temps, nous avons étudié la maturation de la pmLysRS. Nous avons voulu déterminer le site de coupure exacte du peptide d'adressage vers la mitochondrie car nos résultats suggéraient que le site prédit de clivage était erroné. Par la suite, nous avons déterminé les paramètres cinétiques dans la réaction d'aminoacylation de l'ARNt des formes mitochondriales de la LysRS ainsi que leurs capacités d'interaction avec l'ARNt3 Lys. La comparaison des données obtenues pour l'enzyme avant et après sa maturation a permis de 100 Chapitre II : Activation de la LysRS mitochondriale déterminer à quel stade cette dernière est le plus efficace et donc utilisable pour le transport de Lys. l'ARNt3 A. mitochondriale L'identification du site de maturation de la LysRS L'observation in cellulo dans des cellules HeLa en culture d'une forme mitochondriale maturée de plus petite taille que la mLysRS prédite, nous a conduit à rechercher le site exacte de maturation de la pmLysRS. A partir de ces observations, nous avons voulu déterminer expérimentalement le site de maturation de la pmLysRS in vivo. La pmLysRS a été surexprimée dans les cellules HeLa. Les produits de maturation de pmLysRS ont été purifiés. Trois produits de maturation ont été observés et soumis à l'analyse N-terminale par dégradation d'Edman et LC-MS/MS. Il s'agit d'un produit majeur issu de coupures entre les Gly30 et Gln31 et de deux produits mineurs issus de coupure entre les Glu26 et Leu27 ainsi qu'entre les Phe44 et Ser45 (Figure 42). Lorsque la pmLysRS a été produite dans les cellules d'insectes High Five, un seul produit maturé a été observé, il correspond également au clivage entre la Gly30 et Gln31, qui serait le site de maturation de la pmLysRS. Figure 42. Sites putatifs de maturation de la pmLysRS en N-terminal : Le N-terminal de la pmLysRS complète est indiqué. La forme maturée putative prédite par Mitoprot est indiquée (m*LysRS). Les 3 sites de coupure déterminés expérimentalement dans les produits de maturation in vivo sont également indiqués. C'est la coupure entre G30 et Q31 qui est le site véritable de maturation de la pmLysRS. La détermination de la séquence minimale de la pmLysRS B. permettant son import mitochondrial 1. Par microscopie confocale Pour déterminer la séquence signal minimale permettant l'import mitochondrial, des régions N-terminales de tailles croissantes de la pmLysRS ont été fusionnées à la GFP. Ces séquences correspondent aux 8, 16, 27, 38, 49 et 83 résidus N-terminaux de la pmLysRS. Par microscopie confocale, une localisation mitochondriale complète a été observée pour la fusion 101 Chapitre II : Activation de la LysRS mitochondriale GFP qui porte 38 résidus N-terminaux. La plupart de ces résidus sont enlevés durant l'import mitochondrial (coupure entre la Gly30 et Gln31). 2. Par complémentation dans les cellules de levure après sporulation Nous avons aussi abordé le problème de la translocation mitochondriale de la pmLysRS humaine par une approche de complémentation in vivo de la LysRS cytoplasmique endogène de levure (yLysRS). En effet, nous avions observé que les cLysRS et m*LysRS humaines peuvent complémenter la délétion du gène KRS1 de levure. Or, l'expression de la pmLysRS humaine ne conduit pas à une complémentation de la LysRS cytoplasmique de levure, car le produit de traduction est transloqué dans les mitochondries de levure. Nous avons utilisé cette propriété pour déterminer quelles délétions N-terminales de la pmLysRS pourraient empêcher son adressage mitochondrial, et donc permettre la complémentation. Six séquences de la pmLysRS humaine ont été clonées dans le vecteur de levure pYeDP10 ; elles correspondent à des régions N-terminales de tailles décroissantes de la pmLysRS (Figure 43). La souche de levure diploïde ccdYK dont l'un des allèles du gène KRS1 est remplacé par le gène TRP1 a été transformée par les six plasmides exprimant les formes délétées de la pmLysRS. Après sporulation des levures diploïdes transformées, les spores ont été disséquées et isolées. Si la forme de pmLysRS délétée dans son extrémité N- terminale est capable de complémenter le délétion du gène KRS1 de levure, et n'est donc pas transloquée dans les mitochondries, alors les 4 spores sont viables. La présence dans les souches haploïdes isolées de LysRS humaine et l'absence de la forme endogène yLysRS ont été vérifiées par western blot. Nous avons observé que la délétion des 3 premiers résidus de pmLysRS empêche son adressage mitochondrial. 3. Conclusion Les deux approches décrites sont complémentaires. L'étude par microscopie confocale montre que la séquence minimale permettant une localisation mitochondriale totale est composée des 38 résidus N-terminaux de la pmLysRS. La deuxième approche, utilisant la complémentation endogène chez la levure a permis de mettre en évidence l'importance des premiers résidus N-terminaux dans le processus d'import mitochondrial. 102 Chapitre II : Activation de la LysRS mitochondriale Figure 43. Complémentation cytoplasmique de la pmLysRS dans la levure : Les six séquences de pmLysRS portant des délétions N-terminales qui ont servi à nos travaux sont indiquées. Surlignées en bleu sont indiquées les séquences spécifiques de pmLysRS. Les sites de maturation putatif (m*LysRS) et déterminé expérimentalement (mLysRS) de pmLysRS sont indiqués. Caractérisation biochimique des deux formes de la LysRS C. mitochondriale 1. L'activité d'aminoacylation Les paramètres catalytiques de la cLysRS ainsi que ceux de la forme NLysRS avaient déjà été déterminés (Francin et al, 2002). Nous avons voulu déterminer l'impact de la mutation du motif 20KxxxKRxxK28 de cLysRS en un motif RxxxKRxxK, o la lysine en position 20 est remplacée par une arginine, dans les formes mitochondriales de LysRS. Les paramètres déterminés pour la forme mitochondriale mature mLysRS sont similaires à ceux Lys est 4 fois plus de la forme cLysRS. Tandis que pour la forme pmLyRS le KM pour l'ARNt3 élevé comparé à celui retrouvé pour la cLysRS, de plus elle se rapproche plus du KM de la NLysRS. 2. La capacité d'interaction avec l'ARNt3 Lys Lys Nous avons analysé la capacité d'interaction des pmLysRS et mLysRS avec l'ARNt3 Lys par des expériences de retard sur gel. La mLysRS interagit 4 fois moins bien avec l'ARNt3 que la cLysRS avec ce même ARNt, cela suggère que la substitution de la K20 par une R dans le motif consensus 20KxxxKRxxK a un impact négatif sur l'association avec l'ARNt3 Lys. Lys nous montre que les 30 résidus L'étude de l'interaction de la pmLysRS avec l'ARNt3 Lys. impliqués dans l'import mitochondrial bloquent complètement l'association avec l'ARNt3 L'activation de la mLysRS se fait par sa maturation et donc par la coupure du peptide signal correspondant aux 30 acides aminés de l'extension N-terminale. 103 Chapitre II : Activation de la LysRS mitochondriale Lys III. Rôle de la mLysRS dans l'encapsidation de l'ARNt3 Au laboratoire, Kaminska et collaborateurs ont déterminé que seule l'espèce mitochondriale de la LysRS était retrouvée dans les particules virales du VIH-1, servant de Lys (Kaminska et al, 2007b). Comme la cLysRS qui est dans MARS transporteur de l'ARNt3 est indisponible pour l'encapsidation, l'interrogation était de savoir à quel moment la forme mitochondriale de LysRS était disponible pour une interaction avec GagPol : sous forme de précurseur pmLysRS ou après maturation donnant la forme activée de l'enzyme. En étudiant les paramètres catalytiques des formes pmLysRS et mLysRS ainsi que Lys, nous avons observé que le motif de liaison de leur capacité d'interaction avec l'ARNt3 l'ARNt des LysRS mitochondriales était moins efficace que celui de la cLysRS conduisant à une moins forte liaison des ARNtLys. À cet effet, il faut considérer que la synthèse protéique dans la mitochondrie est de type bactérien. Si la mLysRS avait une affinité pour l'ARNt aussi forte que la cLysRS, la dissociation de l'ARNt aminoacylé serait une étape limitante de la réaction d'aminoacylation. Le facteur d'élongation eFTu de type bactérien ne peut remplacer le facteur EF1A dans ce processus de canalisation de l'ARNt (Negrutskii et al, 1999). Une Lys sera plus facilement autre conséquence de cette interaction plus faible c'est que l'ARNt3 Lys que la RT relargué dans le virion. Une fois GagPol maturé, il y aura relargage de l'ARNt3 pourra utiliser comme amorce pour la transcription inverse du génome viral. Ces mêmes données démontrent qu'il faut une activation de la pmLysRS pour qu'elle Lys. La séquence d'adressage mitochondriale de puisse jouer le rôle de transporteur de l'ARNt3 la pmLysRS neutralise le domaine ESD de la LysRS probablement en masquant la séquence d'interaction avec l'ARNt (Figure 44). En résumé, la pmLysRS ne forme pas de complexe stable avec l'ARNt et constitue Lys. Son activation lors de sa maturation par le donc un mauvais transporteur de l'ARNt3 clivage du peptide signal par les protéases mitochondriales lui permet d'interagir avec les ARNt Lys. La mLyRS, une fois libérée de la mitochondrie pourra interagir avec les ARNtLys cellulaires, et sera recrutée par la protéine GagPol (Figure 45). 104 Chapitre II : Activation de la LysRS mitochondriale Figure 44. Activation de la pmLysRS : La maturation de la pmLysRS en N-terminal conduit à son activation et à l'exposition du motif d'interaction avec l'ARNt symbolisé ici par des de couleur rouge. La sortie de la mLysRS de la mitochondrie est rendue possible grâce à l'intervention de la protéine virale Vpr, qui agit sur la perméabilisation de la membrane mitochondriale. Il est connu que Vpr est capable d'induire les cellules en apoptose et par conséquent de permettre le relargage des protéines mitochondriales hors de la mitochondrie (Jacotot et al, 2000). Kaminska et collaborateurs, ont démontré que l'addition de Vpr à des cellules humaines en culture à de très faibles concentrations provoquait l'arrêt de la croissance et menait à l'apoptose (Kaminska et al, 2007a). Dans leurs expériences, lorsqu'ils rajoutaient Vpr dans le milieu de culture de cellules HeLa exprimant stablement la pmLysRS fusionnée à la GFP, ils observaient que le marquage mitochondrial diminuait drastiquement au bout de 48h de traitement par Vpr. Ses résultats suggéraient que Vpr pouvait induire la relocalisation de la LysRS mitochondriale. L'action de Vpr ne se ferait pas par une interaction directe avec la LysRS mais se résumerait à un effet indirect sur la localisation de la LysRS mitochondriale. 105 Chapitre II : Activation de la LysRS mitochondriale Figure 45. Schéma récapitulatif de l'étape de capture de la LysRS mitochondriale par le VIH-1 : La pmLysRS est un mauvais transporteur de l'ARNt. Une fois transloquée dans la mitochondrie, elle sera maturée et suite à l'expression de Vpr, la mLysRS pourra quitter la mitochondrie et formera le complexe d'encapsidation avec l'ARNt3 Lys et GagPol et sera dirigée vers les virions. 106 ARTICLE 2 Activation of human mitochondrial lysyl-ARNt synthetase upon maturation of its premitochondrial precursor José DIAS, Guillaume OCTOBRE, Lydia KOBBI, Martine COMISSO, Sebastian FLISIAK and Marc MIRANDE Soumis 107 Activation of human mitochondrial lysyl-tRNA synthetase requires maturation of its pre-mitochondrial precursor * José Dias, Guillaume Octobre, Lydia Kobbi, Martine Comisso, Sebastian Flisiak and Marc Mirande Laboratoire d'Enzymologie et Biochimie Structurales, Centre de Recherche de Gif, C. N. R. S. , 1 Avenue de la Terrasse, 91190 Gif-sur-Yvette, France. *This work was supported by grants from the Centre National de la Recherche Scientifique , and the Agence Nationale de Recherches sur le Sida . J. D. and G. O. were the recipients of postdoctoral fellowships of Centre National de la Recherche Scientifique and of Agence Nationale de Recherches sur le SIDA , respectively. L. K. and S. F. were the recipients of a doctoral fellowship of Ministère de l'éducation nationale, de l'enseignement supérieur et de la recherche . Corresponding author. email : Marc. Mirande@lebs. cnrs-gif. fr phone : 33 1 69 82 35 05 fax : 33 1 69 82 31 29 Running title : Human mitochondrial LysRS 1 ABSTRACT : The cytoplasmic and mitochondrial species of human lysyl-tRNA synthetase are encoded by a single gene by means of alternative splicing of the KARS1 gene. The cytosolic enzyme possesses a eukaryotic-specific N-terminal polypeptide extension that confers on the native enzyme potent tRNA-binding properties require for the vectorial transfer of tRNA from the synthetase to elongation factor EF1A within the eukaryotic translation machinery. The mitochondrial enzyme is maturated from its precursor upon its targeting to that organelle. To understand how the two enzymes are adapted to participate in two distinct translation machineries, of eukaryotic or bacterial origin, respectively for the cytoplasmic and the mitochondrial enzymes, we characterized the mitochondrial LysRS species. Here we report that cleavage of the precursor of mitochondrial LysRS leads a mature enzyme with reduced tRNA-binding properties as compared to the cytoplasmic counterpart. This adaptation mechanism may prevent inhibition of translation through sequestration of lysyl-tRNA on the synthetase in a compartment where the bacterial-like elongation factor EF-Tu could not assist its dissociation from the synthetase. We also observed that the RxxxKRxxK tRNA-binding motif is completely inactive in the precursor form of mitochondrial LysRS, its activation requires cleavage of the mitochondrial targeting sequence. The finding that maturation of the precursor is needed to activate the tRNA-binding properties of this enzyme has strong implications on the spatio-temporal regulation of its activities, and is consistent with previous studies suggesting that the only LysRS species able to promote tRNALys packaging into HIV- 1 viral particles is the mature form of the mitochondrial enzyme. 2 INTRODUCTION Aminoacyl-tRNA synthetases (aaRS) activate amino acids and transfer them on cognate tRNAs (1). These enzymes are ubiquitous to all living cells that generally possess the full set of twenty enzymes, one for each amino acid. In eukaryotic cells, in addition to the cytosolic translation machinery, a distinct translation system is found in mitochondria and in plant chloroplasts. Because these two organelles are of endosymbiotic origin, from an - proteobacteria or from a cyanobacteria, for mitochondria and chloroplasts, respectively, two or three sets of tRNA and aminoacyl-tRNA synthetases are required in these organisms (2). All aaRS are nucleus encoded, and routed to the appropriate cellular compartment. In human cells, most mitochondrial aaRSs are of prokaryotic origin and are more similar in sequence to the bacterial enzymes than to the cytosolic counterparts. There are two exceptions, where the cytosolic and mitochondrial synthetases are expressed from a single gene. This is the case of glycyl-tRNA synthetase, where the two species are translated from a single mRNA from two in-frame initiation codons (3), and of lysyl-tRNA synthetase (LysRS) which is produced from two mRNA arising by alternative splicing of the unique KARS gene (4). Cytosolic LysRS (cLysRS) is composed of a core enzyme, corresponding to the catalytic and anticodon-binding domains, that shares 43% identical amino acid residues with bacterial LysRS, and possesses a eukaryote-specific, N-terminal polypeptide extension of 73 residues that provides the core synthetase with potent tRNA-binding capacities (5, 6). A peptide from this extension may adopt an -helical conformation, providing a tRNA- anchoring platform (7, 8) for the acceptor-T C stem-loop of tRNA (6, 9). The structural model of the complete Brugia malayi asparaginyl-tRNA synthetase (10), a synthetase closely evolutionary related to LysRS, recapitulates the properties ascribed to the polypeptide extensions of class IIb eukaryotic aaRSs. These polypeptide appendices are believed to mediate processivity of tRNA handling in translation, from the synthetase to elongation factor EF1A (11). The cLysRS species is also a component of the multi-aminoacyl-tRNA synthetase 3 complex (MARS) containing eight other aaRSs (arginyl-, aspartyl-, isoleucyl-, glutaminyl-, glutamyl-, leucyl-, methionyl- and prolyl-tRNA synthetases) and three auxiliary proteins (p18, p38 and p43) involved in complex assembly (12-14). Association of cLysRS to MARS primarily involves interaction of the catalytic domain of the enzyme with the N-terminal 42- amino acid residues of p38, the scaffold protein of the complex (13-15). The complex is believed to accommodate two LysRS dimers per p38 dimer (16). The crystal structure of the core enzyme, lacking its eukaryotic-specific N-terminal polypeptide extension, has been determined (17). A 3D-model of the LysRS : p38 subcomplex, comprising one p38 dimer and two LysRS dimers, has been proposed (18). Even if the main structural state of cLysRS is its associated form within MARS, and its main physiological role is tRNA aminoacylation within the cytosolic translation machinery, other alternative functions have been ascribed to cLysRS. For example, it has been shown that cLysRS in one of the most efficient synthetase in synthesizing diadenosine tetraphosphate (Ap4A), and that this efficiency is increased after its dissociation from MARS (19). It was recently reported that cLysRS is released form MARS after MAPK-dependent phosphorylation in activated mast cells, and is translocated into the nucleus where it activates the transcription factor MITF in an Ap4A-dependent manner (20). Moreover, the activity of cLysRS has been described to be regulated by syntenin-1, a PDZ protein involved in various cellular functions, such as transcription, cellular trafficking or cell adhesion (21), or has been reported to be secreted in response to TNF- to trigger proinflammatory response (22). The translation product for the premitochondrial species of LysRS (pmLysRS) possesses a specific N-terminal sequence of 49-amino acid residues which is predicted to be processed between Lys16 and Thr17 during mitochondrial import to give the mature species (mLysRS) (4). Whereas pmLysRS and mLysRS, which share the catalytic domain of cLysRS, have the intrinsic capacity to bind p38, they are never recovered within MARS (15). This suggests that pmLysRS is strictly routed in cellulo, which prevents its interaction with cytosolic proteins. Mitochondrial LysRS has also additional functions in addition to aminoacylation. A mutation in Cu, Zn-superoxide dismutase (SOD1), that causes amyotrophic 4 lateral sclerosis (ALS), induces an aberrant interaction between SOD1 and mLysRS, resulting in mitochondrial disorders (23). The mitochondrial species of LysRS is also a key element for the biology of the human immunodeficiency virus (HIV-1). Cytosolic tRNA3 Lys, the primer for reverse transcription of the HIV-1 genome, is hijacked into viral particles as a complex containing the viral protein GagPol and mLysRS (15, 24). The involvement of cLysRS and mLysRS in several functional pathways beyond translation, suggests that the spatio-temporal organization of the translation machinery is a key element for the regulation of their functions and of cellular homeostasis. To understand how pmLysRS reaches the mitochondrial compartment without interfering with cytosolic translation, we determined the signal sequences of pmLysRS involved in its mitochondrial targeting and processing, and characterized the aminoacylation activity and tRNA-binding capacity of the precursor (pmLysRS) and mature (mLysRS) mitochondrial LysRS species. Our data show that mLysRS is activated upon pmLysRS processing 5 MATERIALS AND METHODS Expression and purification of LysRS expressed in E. coli, yeast or insect cells. Human cytosolic and mitochondrial LysRS were expressed in the yeast Saccharomyces cerevisiae (24) and purified (6) as described previously. The premitochondrial form of human LysRS was either expressed in High Five insect cells after subcloning its cDNA into pFastBac1, or in BL21(DE3) E. coli cells after subcloning into pET28b. When expressed in insect cells, crude extract was prepared in 100 mM Tris-HCl pH 8. 0, 10 mM MgCl2, 100 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% glycerol, 10 mM 2- mercaptoethanol, 1% Triton X-100, 10 mM benzamidine, and 1mM Pefabloc, sonicated, and the in vivo maturated mitochondrial LysRS was purified essentially as described previously (6), by chromatography on S-Sepharose FF, Mono Q HR 5/5 and Mono S HR 5/5 columns (GE Healthcare). This procedure gave 2. 5 mg of homogeneous protein per liter of culture. Analysis by nanoESI-Q-TOF indicated that the purified protein was cleaved after Gly30. When expressed in E. coli, premitochondrial LysRS was not processed and was purified as described below. The protein was expressed in E. coli BL21(DE3) grown in LB medium supplemented with kanamycin (50 g/ml). Culture (6 liters) was grown at 37 C to an A600 0. 4, transferred at 20 C to an A600 1. 0, and expression was induced by addition of 1 mM IPTG for 5 hours. Cells were washed twice with ice-cold extraction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8. 0, 100 mM KCl, 5 mM EDTA, 10 mM MgCl2, 10% glycerol, 10 mM 2-mercaptoethanol), resuspended in the same buffer (1ml per g of cell pellet) containing 2 mM diisopropyl-fluorophosphate, 2 mM PMSF, and 2 g/ml of antipain and chymostatin, and lysed in an Eaton Press. All subsequent steps were conducted at 4 C. After a two-fold dilution with extraction buffer, extract was sonicated to fragment nucleic acids, diluted by addition of 1 vol. of dilution buffer containing 800 mM KCl, cell debris were removed by centrifugation at 48, 000g for 30 min. Nucleic acids were removed by precipitation with Polymin P at 0. 5%. The clear supernatant was diluted by addition of 2 vol. of extraction buffer without KCl, and applied to a 65 ml S- Sepharose FF column (GE Healthcare). pmLysRS was eluted by a linear gradient (20 column 6 vol. ) of NaCl from 150 to 600 mM in 20 mM Tris-HCl (pH 7. 5) containing 1 mM EDTA, 10% glycerol and 10 mM 2-mercaptoethanol. After dialysis against the same buffer containing 75 mM NaCl, fractions were applied to a 4. 6 ml SOURCE 15Q column (GE Healthcare), equilibrated in the same buffer and eluted by a linear gradient (20 column vol. ) of NaCl from 75 to 500 mM. Fractions containing pmLysRS were directly applied on a Mono S HR 5/5 column (GE Healthcare), equilibrated in the same buffer containing 200 mM NaCl and eluted by a linear gradient (50 column vol. ) of NaCl from 200 to 800 mM. Fractions containing pmLysRS were concentrated by ultrafiltration, dialyzed against 25 mM potassium phosphate pH 7. 5, 2 mM DTT, 55% glycerol, and stored at -20 C. Protein concentration was determined by using a calculated absorption coefficient of 0. 77 A280 units mg-1 cm2. Analysis by nanoESI-Q-TOF and by automatic Edman degradation showed that the purified protein corresponded to pmLysRS with the removal of the N-terminal Met residue. Expression of LysRS in HeLa cells. The cDNA of human premitochondrial LysRS (pmLysRSHs), cytoplasmic LysRS (cLysRSHs), and the cDNA of a 529 amino acids long N-terminally truncated version of cLysRSHs ( NLysRSHs) including the anticodon-binding domain (ABD) and the catalytic domain (CAT) were amplified by PCR. The sense oligonucleotides used wereandfor pmLysRSHs, cLysRSHs and NLysRSHs respectively. The antisense oligonucleotide was common to the three reactions and was GGGGAATTCCTAGACAGAACTGCCAACTGTTG. The PCR products were digested by EcoRI, and inserted into the EcoRI site of the eukaryotic expression vector pSG5. The encoded proteins correspond to the full-length pmLysRSHs, cLysRSHs and to the N-terminally truncated version of cLysRSHs ( NLysRSHs). The sequence of the recombinant plasmids was verified by DNA sequencing. Confocal imaging. HeLa cells were grown in F12 medium (Invitrogen) supplemented with 10% fetal calf 7 serum, 2 mM glutamine, 100 g/ml of penicillin and streptomycin. Cells were transfected with Effectene (QIAGEN). For localization experiments, cells were cotransfected with a pEGFP-N1 derivative and with pDsRed2-Mito (BD Biosciences). Cells were grown into 8- well Lab-Tek II chambers (Nalge Nunc International) and observed by confocal laser scanning microscopy using a Leica TCS SP2 confocal microscope equipped with a DD488/543 mirror. GFP was excited using laser line 488 nm of an Ar laser, and detected at 500-535 nm. DsRed was excited at 543 nm with a He-Ne laser, and detected at 584-659 nm. Imaging of GFP and DsRed fluorescence was performed in a sequential manner. The expression and the stability of the fusion proteins in HeLa cells was checked by Western blot analysis with anti-GFP and anti-DsRed antibodies. Purification of mitochondrial LysRS expressed in HeLa cells. The cDNA of human premitochondrial LysRS (pmLysRS) was PCR-amplified between oligonucleotidesand GGGGAGATCTACAGAACTGCCAACTGTTG. The PCR product was digested by EcoRI and BglII, and inserted into the EcoRI-BamHI sites of the eukaryotic expression vector pSG5(His). The encoded protein corresponds to the full-length pmLysRS bearing an additional C-terminal His6 sequence and was verified by DNA sequencing. The 6His-tagged pmLysRS was expressed in HeLa cells. Cells were grown to 50% confluency in 25x145mm-diameter Petri dishes (approx. 2x108 cells), and transfected by the CaCl2 method with pSG5-KRSpm-6His. The cells were harvested 48h post-transfection, lysed in extraction buffer (20 mM Tris-HCl pH 7. 5, 10 mM imidazole, 500 mM NaCl, 5 mM 2- mercaptoethanol, 0. 5% Triton X-100 and 2. 5 mM benzamidine) and homogenized by sonication to disrupt mitochondria. After lysis, the supernatant recovered after centrifugation at 10, 000 x g for 15 min was loaded on a 0. 5-ml nickel-nitrilotriacetic acid Superflow matrix (Qiagen) charged with Ni2 . After washing with buffer A (20 mM Tris-HCl pH 7. 5, 10 mM imidazole, 500 mM NaCl and 5 mM 2-mercaptoethanol), bound material was eluted by addition of 5 ml buffer B (20 mM Tris-HCl pH 7. 5, 200 mM imidazole, 500 mM NaCl and 5 mM 2-mercaptoethanol). 1 ml fractions were collected, and fractions containing mLysRS- 8 His6 were pooled (~2 ml), and dialyzed against 20 mM Tris-HCl pH 7. 5, 100 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and 1 mM dithiothreitol (DTT). After dialysis, mLysRS-His6 was applied to a MonoQ HR 5/5 anion exchange column (GE Healthcare) equilibrated in dialysis buffer. Bound material was eluted by a 20-ml linear gradient of 100 to 500 mM NaCl in the same buffer. 500 L fractions were collected and frozen at -80 C. Gel retardation assay. Plasmid ptRNA3 Lys was linearized with FokI and subjected to in vitro transcription with T7 RNA polymerase as described (6). Protein-RNA interactions were analyzed using a band shift assay. Homogeneous LysRS proteins were incubated at increasing concentrations with radiolabeled-RNA (25, 000 cpm per point) in a 11 l volume containing 20 mM Tris-HCl pH 7. 5, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 10 mM 2-mercaptoethanol, 10% glycerol and BSA at 0. 1 mg/ml. After incubation at 25 C for 30 min, the mixture was placed on ice and loaded on a 6% polyacrylamide gel (mono : bis, 29 : 1) containing 5% glycerol in 0. 5 TBE pH 8. 0 at 4 C. After electrophoresis, the gel was fixed, dried and subjected to autoradiography. Free and bound tRNA was quantified by densitometry measurements. tRNA aminoacylation assay. Initial rates of tRNA aminoacylation were measured at 25 C in 0. 1 ml of 20 mM Imidazole-HCl buffer (pH 7. 5), 100 mM KCl, 0. 5 mM DTT, 12 mM MgCl2, 2 mM ATP, 180 M 14C-labeled lysine (NEN ; 16. 66 Ci/mol) and saturating amounts of tRNA (5). Human tRNA3 Lys expressed in E. coli (lysine acceptance of 780 pmol/A260) was used as tRNA substrate. The incubation mixture contained catalytic amounts (1-5 nM) of enzymes appropriately diluted in 10 mM Tris-HCl (pH 7. 5), 10 mM 2-mercaptoethanol, containing bovine serum albumin at 4 mg/ml. One unit of activity is the amount of enzyme producing 1 nmol of lysine-tRNALys/min, at 25 C. For the determination of Km values for tRNA, tRNALys concentrations of 0. 150 M were used. Michaelian parameters were obtained by non-linear regression of the theoretical Michaelis-Menten equation to the experimental curve using the KaleidaGraph 3. 6. 5 software (Abelbeck Software). 9 RESULTS Identification of the N-terminal maturation site of mitochondrial LysRS. Mitochondrial LysRS is expressed as a precursor protein (pmKRS) containing a specific N-terminal sequence made of 49 amino acid residues, as compared with the cytoplasmic protein encoded by the same gene by a mechanism of alternative splicing (Fig. 1a). The program Mitoprot predicted that maturation of the mitochondrial precursor of LysRS might occur between residues Lys16 and Thr17, leading to the putative mature mitochondrial species of LysRS, m*KRS. When m*KRS was expressed in HeLa cells, a polypeptide migrating with an electrophoretic mobility slower than the endogenous cytoplasmic form of LysRS (cKRS) was observed with antibodies directed to the sequences common to cytosolic and mitochondrial LysRS (Fig. 1b), consistent with its larger size. This polypeptide was not directed to mitochondria because it lacks the targeting sequence (see below). By contrast, when pmKRS was expressed in HeLa cells, no polypeptide displaying an electrophoretic mobility similar to m*KRS was observed, but the intensity of the polypeptide corresponding to the migration of cKRS was increased (Fig. 1b), suggesting that maturation of pmKRS occurred beyond Lys16. This gene product was directed to the mitochondria (24) (see below), and thus the polypeptide recovered after expression in HeLa cells corresponds to the naturally in vivo processed, mature mitochondrial LysRS. When the same samples were probed with antibodies directed to the peptide Arg25 to Lys42 of pmKRS, the intensity of the polypeptide corresponding to the endogenously cleaved pmKRS was much weaker than the intensity of the non processed m*KRS species. These data suggested that the maturation site of pmKRS could be located between Arg25 and Lys42, leading to the loss of one part of the antigenic peptide in the mature protein. To experimentally determine the maturation site of pmKRS in vivo, pmKRS was overexpressed in HeLa cells with a C-terminal His-tag. After 48h of expression, the endogenously processed LysRS species were purified. Three maturation products were observed (Fig. 2). The N-terminal sequence of the purified products was determined by automated Edman degradation and LC-MS/MS analysis. One minor product was cleaved 10 between Glu26 and Leu27. It might correspond to an incomplete maturation product, due to overexpression of pmKRS. The two major products were cleaved between Gly30 and Gln31, and between Phe44 and Ser45. Because the maturation product identified in crude extract from HeLa cells comigrates with cKRS, and no smaller maturation product could be observed (Fig. 1), we surmise that the product cleaved between Phe44 and Ser45 is the result of uncontrolled proteolysis that occurred during purification of the mitochondrial species of LysRS. When pmKRS was expressed in High Five insect cells and purified to homogeneity, a single maturation product was recovered, corresponding to a cleavage between Gly30 and Gln31 (Fig. 2). When pmKRS was expressed in E. coli, the purified protein corresponded to a non mature mitochondrial LysRS containing all the presequence required for its targeting into mitochondria, as assessed by automated Edman degradation analysis. Determination of the extant of the N-terminal sequence required for mitochondrial targeting of LysRS. To identify the minimal amino-terminal sequence necessary for mitochondrial targeting of pmKRS in human cells, N-terminal sequences of pmKRS of variable lengths were fused to GFP (Fig. 3). The fusion of full-length pmLysRS with GFP led to a classical pattern of complete mitochondrial localization. The GFP fusion proteins containing only 8 or 16 N- terminal residues of pmKRS were not targeted to mitochondria. Addition of 27 or of 38 N- terminal residues of pmKRS to GFP, led to partial (27 residues) or complete (38 residues) mitochondrial localization of the GFP fusion proteins. Insertion of additional residues of pmKRS did not change the pattern of GFP localization. Thus, the 38 N-terminal residues of pmKRS are sufficient to trigger mitochondrial localization. Most of this mitochondria targeting sequence is removed (cleavage between Gly30 and Gln31) during the import process. Aminoacylation activity of premitochondrial and mitochondrial LysRS. The eukaryote-specific tRNA-binding domain of the cytoplasmic form of human LysRS increases the catalytic efficiency of the enzyme, and provides the core synthetase with a potent tRNA-binding capacity (5). The tRNA-binding motif has been mapped to the peptide 20KxxxKRxxK28 of cLysRS, with the four basic residues being essential for tRNA-binding 11 (6). From this consensus sequence, the N-terminal K20 residue belongs to the cytoplasmic- specific, N-terminal sequence of 21 residues encoded by exon 1 (Fig. 4). In the mitochondrial species of LysRS, this Lys-residue is replaced by an Arg-residue encoded by exon 2. To analyze the consequence of this amino-acid substitution on the functioning of the enzyme, the catalytic parameters of cLysRS, pmLysRS and mLysRS in the tRNALys aminoacylation reaction were determined, and compared with the kinetic constants of LysRS with a deletion of the complete eukaryote-specific domain, N-LysRS (Table 1). The catalytic parameters determined for the mature mitochondrial species, mLysRS, were similar to those determined for the cytoplasmic enzyme. In contrast, the non-mature mitochondrial species, pmLysRS, showed a 4-fold increase in KM for tRNA3 Lys as compared to cLysRS, with a value of 6. 4 M very similar to that determined for N-LysRS (7. 7 M). These data suggest that mitochondria targeting sequences of pmLysRS neutralize the tRBD of LysRS, presumably by masking the tRNA-binding motif. The tRNA-binding capacity of mitochondrial LysRS is revealed upon maturation of its premitochondrial precursor. Because N-LysRS displays a markedly reduced affinity for tRNA (Kd ~ 6 M) as compared with native, cytoplasmic LysRS (Kd 60 nM, expressed as monomer concentration) (5), we analyzed the capacity of pmLysRS and mLysRS to bind tRNA3 Lys in a gel retardation assay (Fig. 5). The mature mitochondrial species of LysRS interacted with tRNA3 Lys with an apparent dissociation constant of 250 40 nM of monomers of LysRS. This Kd value was about 4-fold higher than that reported for association of cLysRS with tRNA3 Lys, suggesting that the replacement of the lysine residue at position 20 by an arginine significantly weakens the interaction between the tRNA and the synthetase. More surprisingly, the presence of the mitochondria targeting sequence of 30 amino acid residues into pmLysRS completely occulted the tRNA-binding properties of the enzyme, which bound tRNA as weakly as N-LysRS does. Therefore, activation of mLysRS for tRNA binding occurs following maturation and removal of the 30 first amino acid residues of pmLysRS. 12 DISCUSSION It is remarkable that, despite the fact that the two LysRS species present in the cytoplasm and in the mitochondria of human cells, are encoded by the same gene by means of alternative splicing and share 576 amino acid residues, they show a clear adaptation to the translation machinery of the compartment they are directed to. Indeed, a major difference between cytosolic and mitochondrial translation results from the endosymbiotic origin of mitochondria. While eukaryotic translation evolved an integrated system where tRNA is vectorially transferred from the synthetase, to elongation factor 1A, to ribosome (25), such a subcellular organization does not exist in bacteria. To ensure that aminoacyl-tRNA are not released in the cellular fluid after aminoacylation on the synthetases and before they form a ternary complex with EF1A : GTP, aaRS acquired in evolution additional protein domains that sequester aminoacyl-tRNA to ensure processivity of tRNA handling in translation from the synthetase to elongation factor EF1A (11). The tRNA-binding domain of cLysRS, carrying the 20KxxxKRxxK28 tRNA-binding motif, has been extensively studied and characterized (5, 6, 8, 9). In human mitochondria, most aaRS are bacterial-like enzymes, and do not possess these additional tRBD. Because mLysRS is a eukaryotic-like enzyme, it was interesting to understand how a member of the eukaryotic translation apparatus can participate in mitochondrial translation. Indeed, the presence of a potent tRBD on mLysRS would introduce a limiting step in tRNA release and inhibit mitochondrial translation. In this context, it is noteworthy that the tRNA-binding motif of mLysRS (Kd 250 nM) is a significantly less potent tRNA-binding motif as compared to cLysRS (Kd 60 nM). The replacement of the first Lys-residue in the KxxxKRxxK motif, encoded by exon 1 in cLysRS, by an Arg-residue, encoded by exon 2 in mLysRS, could be an adaptation mechanism to prevent sequestration of aa-tRNA by the synthetase in the mitochondrial compartment. Previous studies have shown that this Lys-residue is especially important for tRNA binding, its replacement by an Ala-residue led to a significant increase in the dissociation constant for tRNA (Kd 300 nM) (6). During functional characterization of mLysRS, we have also discovered that its 13 precursor protein, the pmLysRS species produced in the cytosol before proteolytic maturation during mitochondrial import, behaves as the N-terminal truncated derivative of LysRS. This means that pmLysRS does not possess the tRNA-binding capacity of cLysRS or even of mLysRS. This implies that its tRBD is neutralize by the very N-terminal signal sequence of pmLysRS involved in mitochondria targeting. Its activation requires removal of the first 30 N-terminal residues occurring during mitochondrial import (Fig. 6), a maturation step resulting in the exposure of the RxxxKRxxK motif of mLysRS. The reason why the cell uses this strategy to preclude that the pmLysRS species could interfere with cytosolic translation is unclear, but may be related to a need to efficiently segregate cytosolic and mitochondrial translation, to achieve a strict compartmentalization of the two mechanisms. Because cLysRS and mLysRS are also involved in other cellular functions beyond translation, such as the immune response (20), signal transduction (22) or HIV-1 replication (24), the finding that mLysRS needs to be activated during its maturation process, also suggests that this strategy might be a prerequisite for the spatio-temporal regulation of its activities. It is noteworthy that a similar mechanism has been recently observed for another LysRS species, the mitochondria- specific LysRS from the kinetoplastid Trypanosoma brucei (26). In this organism, cytosolic and mitochondrial LysRS are encoded by distinct genes. The mitochondrial gene product possesses a specific C-terminal polypeptide extension, and is completely inactive for amino acid activation and tRNA-aminoacylation. It is activated upon removal of this C-terminal extension, probably by a mitochondrial protease. The finding that pmLysRS is a poor tRNA-binding protein is also of prime interest for the understanding of the role of mitochondrial LysRS in the packaging of tRNA3 Lys into HIV- 1 viral particles (24). We show here that pmLysRS functionally mimics N-LysRS for tRNA binding. However, N-terminally truncated LysRS, which binds poorly to tRNALys, is not able to promote tRNALys packaging into viral particles (27). We previously observed that the electrophoretic mobility of the mitochondrial LysRS species recovered into HIV-1 particles was not consistent with the packaging of the pmLysRS precursor or of the predicted m*LysRS mature species (cleavage between Lys16 and Thr17), but was similar to that of cLysRS (24). The data that we report here provide a rational explanation to these 14 observations. Maturation of pmLysRS upon translocation into mitochondria does not occur after Lys16, but after Gly30, leading to a mLysRS species similar in size to cLysRS (Fig. 2). The very weak tRNA-binding capacity of pmLysRS is enhanced after maturation into mLysRS, that could then serve as a carrier for tRNALys into viral particles, after its Vpr- assisted release from the mitochondria (28). Because tRNA should be readily released in the virions to participate into initiation of reverse transcription of the viral RNA genome, the weaker tRNA-binding properties of mLysRS, as compared to cLysRS, should favor its effectiveness in the replication process. 15 Acknowledgments We thank Paulette Decottignies (Institut de Biochimie et Biophysique Moléculaire et Cellulaire, Orsay), and David Cornu and Manuela Argentini (SICaPS facility of the CNRS campus of Gif-sur-Yvette) for performing amino acid sequence and LC-MS/MS analyses. We thank Spencer Brown and Marie-Nolle Soler for access to the confocal microscope facility (Institut des Sciences du Végétal, Gif-sur-Yvette). We also thank Peng Tu and Marie-Pierre Golinelli for their involvement during early stages of this study. 16 LEGENDS TO FIGURES Figure 1. Expression of the cytoplasmic and mitochondrial forms of LysRS in HeLa cells. (a) The 576 C-terminal amino acid residues encoded by exons 3 to 15 of human KARS1 gene are common ( ) to the cytoplasmic (cKRS) and mitochondrial (pmKRS) species of LysRS. The 21 N-terminal residues of cKRS are encoded by exon 1, the 49 N-terminal residues of pmKRS are encoded by exon 2. The peptide sequence used to raise antibodies specific for the mitochondrial species of human LysRS are indicated by ( ). The putative maturation site of pmKRS (m*KRS) is indicated. (b, c) The two gene products m*KRS and pmKRS were expressed in HeLa cells. Total extracts were analyzed by Western blotting using antibodies directed to the core domain of LysRS (anti-KRS N IgG) (b) or to the synthetic peptide specific for the mitochondrial form of human LysRS (anti-PepMitoKRS IgG) (c). Figure 2. Analysis of pmLysRS expressed in human, insect, or bacterial cells. The pmKRS gene product was expressed in human cells (HeLa), in insect cells (High Five), or in bacteria (E. coli), and purified to homogeneity. The cKRS gene product expressed in yeast is shown on the left. (a), (b) and (c) represent the three polypeptides recovered after expression in HeLa cells. Their corresponding N-terminal cleavage sites determined by Edman degradation and LC-MS/MS analyses are indicated. Figure 3. Determination of the minimal sequence signal for targeting pmLysRS to mitochondria in human cells. The subcellular localization of GFP-fusion proteins was analyzed by confocal laser scanning microscopy. HeLa cells were cotransfected with plasmids expressing GFP alone, or the LysRS-GFP fusion proteins, and with pDsRed2-Mito, a plasmid that expresses a mitochondrial protein marker. The pmKRS-GFP fusion protein contains the full pmKRS sequence, the pmx-GFP fusion proteins contain the 8, 16, 27, 38, 49 or 83 N- terminal residues of pmKRS, as indicated. Differential interference contrast (DIC), GFP fluorescence and DsRed fluorescence imaging are shown. The merge image shows a perfect match between GFP and DsRed imaging when at least 38 residues of pmKRS are fused to GFP. The amino acid sequences from the mitochondria targeting sequence are shown in 17 green, from the pmKRS-specific sequence in yellow, and those common to cKRS and pmKRS in white. Figure 4. The domain-structure of the three LysRS species from human cells. The three major domains of LysRS are indicated : the catalytic domain (CAT ; amino acid residues 241597) ; the anticodon binding domain (ABD ; amino acid residues 74240) ; the eukaryote-specific domain (ESD ; amino acid residues 2373). Numbering is given for the cytoplasmic enzyme. The N-domains of 21, 49 or 19 amino acid residues, specific for the cytoplasmic (cytoLysRS), pre-mitochondrial (pre-mitoLysRS) or mitochondrial (mitoLysRS) forms of LysRS are shown. The tRNA-binding motif identified in cytoLysRS is indicated ; the Lys residue at position 20, which is an arginine in the mitochondrial species, is shown in red. It corresponds to Arg48 or Arg18 in pre-mitoLysRS or mitoLysRS, respectively. Figure 5. The tRNA-binding properties of the three LysRS species from human cells. 32P- Labeled in vitro transcribed tRNA3 Lys was incubated with cytoLysRS, with mitoLysRS, or with pre-mitoLysRS, at different concentrations (0-1000 nM, expressed as monomer concentrations). After electrophoresis at 4 C on a 6% native polyacrylamide gel, the mobility shift of tRNA was visualized by autoradiography. In each assay, the bottom band corresponds to the free tRNA species. The deduced dissociation constants (Kd) for tRNA are indicated. Figure 6. Maturation of premitochondrial LysRS reveals its tRNA-binding domain. The 48RxxxKRxxK56 tRBD motif of pmLysRS is masked by the mitochondria import sequence. Its removal upon proteolytic maturation leads to its functional exposure in mLysRS. 18 REFERENCES 1. Ibba, M. , and Sll, D. (2000) Aminoacyl-tRNA synthesis. Annu. Rev. Biochem. 69, 617-650. 2. Duchene, A. M. , Pujol, C. , and Marechal-Drouard, L. (2009) Import of tRNAs and aminoacyl-tRNA synthetases into mitochondria. Curr. Genet. 55, 1-18. 3. Mudge, S. J. , Williams, J. H. , Eyre, H. J. , Sutherland, G. R. , Cowan, P. J. , and Power, D. A. (1998) Complex organisation of the 5'-end of the human glycine tRNA synthetase gene. Gene 209, 45-50. 4. Tolkunova, E. , Park, H. , Xia, J. , King, M. P. , and Davidson, E. (2000) The human lysyl-tRNA synthetase gene encodes both the cytoplasmic and mitochondrial enzymes by means of an unusual alternative splicing of the primary transcript. J. Biol. Chem. 275, 35063-35069. 5. Francin, M. , Kaminska, M. , Kerjan, P. , and Mirande, M. (2002) The N-terminal domain of mammalian lysyl-tRNA synthetase is a functional tRNA-binding domain. J. Biol. 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Kinetic constantsa of cytoplasmic (cLysRS), pre-mitochondrial (pmLysRS), Lys mitochondrial aminoacylation (mLysRS), and N-terminal tRNA3 truncated LysRS in LysRS cLysRS pmLysRS mLysRS N-LysRS KM (M) (tRNA3 Lys)b kcat (s-1) kcat/KM (s-1 M-1) 1. 5 0. 3 6. 4 0. 7 2. 8 0. 5 7. 7 0. 9 4. 3 0. 8 6. 8 0. 9 4. 9 0. 8 8. 1 0. 8 2. 87 1. 06 1. 75 1. 05 aStandard errors were determined from at least two independent data sets. btRNA3 Lys acceptance of 780 pmol/A260. pmKRS m*KRS cKRS m*KRS - cKRS - - cKRS maturated pmKRS m*KRS - - maturated pmKRS anti-KRS N IgG anti-PepMitoKRS IgG (a) (b) (c) (a) : Glu26 Leu27 (b) : Gly30 Gln31 (c) : Phe44 Ser45 Fig. 1 Fig. 2 DIC GFP (fusions) DsRed (mito) Merge GFP pm1-GFP pm2-GFP pm3-GFP pm4-GFP pm5-GFP pm6-GFP pmKRS -GFP pmKRS(625)pm1 (8) MLTQAAVR pm2 (16) MLTQAAVRLVRGSLRK pm3 (27) MLTQAAVRLVRGSLRKTSWAEWGHREL pm4 (38)pm5 (49)pm6 (83)Fig. 3 tRNA-binding motif : 20KxxxKRxxK28 22 73 240 597 cytoLysRS pre-mitoLysRS mitoLysRS 21 aa 48R 49 aa 18R 19 aa Fig. 4 0 5 1 1 3 2 6 5 2 1 0 5 2 0 0 5 0 0 0 1 nM LysRS Kd 60 nM Kd 250 nM Kd 1 M S R s y L o t y c S R s y L o t i m S R s y L o t i m - e r p 50 101 268 625 48RxxxKRxxK56 pre-mitoLysRS Maturation mitoLysRS 18RxxxKRxxK26 Fig. 5 Fig. 6 CHAPITRE III et GagPol Analyse du rôle potentiel des protéines auxiliaires du VIH-1 dans l'association entre la lysyl-ARNt synthétase 135 Chapitre III : Rôle des protéines auxiliaires du VIH-1 CHAPITRE III/ ANALYSE DU ROLE POTENTIEL DES PROTEINES AUXILIAIRES DU VIH-1 DANS L4ASSOCIATION ENTRE LA LYSYL-ARNt SYNTHETASE ET GagPol Nous avons mis en évidence que le complexe d'encapsidation de l'ARNt3 Lys met en jeu la LysRS mitochondriale mature et la polyprotéine virale GagPol. GagPol permettrait la capture du complexe mLysRS-ARNt3 Lys dans les particules naissantes du VIH-1. Comme l'association entre LysRS et GagPol ne semble pas être spécifique in vitro de la seule forme mitochondriale mature de LysRS, mLysRS, nous nous sommes demandés si une autre des protéines virales pouvait être impliquée dans la formation d'un complexe sélectif. Comme cité dans l'introduction de ce manuscrit, les protéines accessoires et la polyprotéine Env du VIH-1 remplissent des rôles multiples tout au long du cycle réplicatif, la plupart d'entre eux ayant été identifiés. Aucune interaction entre ces protéines virales et la LysRS humaine n'a été observée à ce jour, sauf pour Vpr, qui a été décrite comme pouvant interagir avec la LysRS et inhiber son activité catalytique (Stark & Hay, 1998). Toutefois, l'effet de Vpr sur l'activité de la LysRS a été remis en cause dans une autre étude (Kaminska et al, 2007a). Au cours de notre étude, nous avons voulu savoir si ces protéines pouvaient à un Lys en interagissant avec la certain moment rejoindre le complexe d'encapsidation de l'ARNt3 Lys. Pour cela, nous mLysRS au sein du complexe d'encapsidation GagPol : mLysRS : ARNt3 avons d'abord recherché des interactions binaires entre la LysRS et l'ensemble des protéines auxiliaires (Vif, Vpu, Tat, Rev, Vpr et Nef) ainsi que Env. Par la suite, nous avons reconstitué Lys avec ces différents partenaires. Ces in vitro le complexe d'encapsidation de l'ARNt3 résultats nous ont permis de définir quelles sont les protéines virales impliquées dans ce processus, et suggèrent que Vpr et Rev puissent être régulées par l'action de la LysRS. I. Etude des interactions binaires entre les protéines auxiliaires du VIH-1 et la lysyl-ARNt synthétase humaine et ses domaines. La mise en évidence d'interactions protéine-protéine par le test du double hybride implique que les protéines virales d'intérêt soient localisées dans le compartiment nucléaire. 137 Chapitre III : Rôle des protéines auxiliaires du VIH-1 A. L'approche du double Hybride 1. Vérification de la localisation nucléaire des différentes protéines virales L'entrée des protéines de fusion formées des protéines auxiliaires et de Env dans le noyau n'avait pas été étudiée au laboratoire auparavant, contrairement à Pol, Gag et les LysRS. Nous avons donc vérifié que les protéines virales fusionnées au domaine LexA dans le plasmide pEG202 étaient bien localisées en partie dans le noyau avant de commencer les tests du double hybride, car ce test est basé sur l'activation de la transcription d'un gène rapporteur suite à l'interaction des deux protéines d'intérêt. Le principe du test de localisation nucléaire mis au point par Brent et al (Gyuris et al, 1993) consiste en la répression de l'expression du gène lacZ placé sous le contrôle du promoteur GAL1 (Figure 46). Un opérateur LexA (LexAop) est aussi inséré dans la région promotrice. La fixation d'une protéine contenant un domaine LexA sur l'opérateur LexAop conduit à la répression de la transcription du gène lacZ, et donc à une réduction de la synthèse de -galactosidase. Le test est réalisé dans la souche de levure EGY48 après introduction du plasmide pJK101 portant le gène lacZ. Si la protéine fusionnée à LexA réussit à traverser l'enveloppe nucléaire, elle pourra se fixer sur l'opérateur LexAop et la transcription du gène lacZ sera réprimée. Le taux de répression est mesuré par l'activité -galactosidase. Pour estimer ce taux de répression, nous avons utilisé deux plasmides témoins. Le plasmide pRS313 qui n'exprime pas LexA conduit à une activité -galactosidase maximale ; cette valeur sera attribuée aux protéines qui ne vont pas dans le noyau. Le pEG202 exprime fortement le domaine LexA seul. La teneur en LexA dans le noyau étant importante, l'activité - galactosidase mesurée sera minimale, c'est le témoin des protéines qui vont dans le noyau et répriment l'expression du gène lacZ. L'activité -galactosidase mesurée dans les souches exprimant les différentes protéines virales a montré que Vpr, Vif, Vpu, Tat, Rev et Env fusionnées à LexA conduisent à la répression de l'expression de lacZ. Elles sont donc au moins en partie localisées dans le noyau. La valeur obtenue pour Nef est supérieure à celle obtenue en absence de LexA (transformation par pRS313). Le domaine LexA de Nef n'inhibe donc pas la transcription de lacZ. Comme observé ci-dessous dans le test du double hybride, Nef se comporte comme un activateur de la transcription. 138 Chapitre III : Rôle des protéines auxiliaires du VIH-1 Figure 46. Schéma récapitulatif du principe du test de localisation nucléaire : S'il y a fixation de la protéine de fusion LexA, il y a répression du gène lacZ et la synthèse de la -galactosidase est inhibée. En absence de LexA-ProtX dans le noyau, il n'y a pas de répression et la synthèse de la - galactosidase est minimale. 2. Recherche des interactions par le double hybride Nous avons commencé par l'étude des interactions des protéines auxiliaires et de Env avec les trois formes de LysRS. La coexpression de la LysRS (cLysRS, mLysRS ou pmLysRS) fusionnée au domaine activateur B42, avec les protéines Vif, Vpu et Env fusionnées à LexA, ne conduit pas à l'expression du gène LEU2, suggérant que ces protéines n'interagissent pas avec la LysRS. Nous avons observé que l'expression des protéines Tat, Env, Rev et Vpr avec la LysRS s'accompagne de l'expression de LEU2, suggérant que ces quatre protéines virales interagissent avec la LysRS. Dans le cas de Nef, la croissance des levures, et donc l'expression de LEU2, était également observée dans un milieu sans galactose, condition dans laquelle les LysRS ne sont pas exprimées. Nef a lui seul permet donc l'initiation de la transcription du gène LEU2 en agissant comme un activateur de la transcription (également observé dans les expériences de localisation nucléaire). Nous n'avons donc pas pu conclure pour l'interaction de Nef aux LysRS par cette approche. La deuxième étape a été de rechercher les domaines des LysRS qui pourraient interagir avec ces protéines virales. Nous avons trouvé que les protéines Tat, Rev, et Vpr interagissaient avec le domaine catalytique des LysRS. 139 Chapitre III : Rôle des protéines auxiliaires du VIH-1 B. L'immunoprécipitation Nous avons utilisé l'immunoprécipitation comme deuxième approche pour confirmer nos résultats du double hybride. Nous avons testé l'interaction des protéines Tat, Rev, et Vpr avec la forme mitochondriale mature, mLysRS, exprimée dans les cellules d'insectes. L'association entre Nef et mLysRS a également été testée par cette approche. Par immunoprécipitation, les interactions des protéines Rev et Vpr avec la mLysRS ont été confirmées. Tat et Nef ne montrent pas d'interaction significative avec la mLysRS. C. Conclusion Les expériences de double hybride et d'immunoprécipitation ont dévoilé une interaction spécifique des protéines accessoires Rev et Vpr avec la mLysRS et plus précisément avec le domaine catalytique de cette dernière. Par contre, ces expériences ne montraient pas si ces interactions de la mLysRS avec Rev et Vpr se faisaient en même temps que son interaction avec GagPol dans le complexe d'encapsidation. Pour déterminer si ces deux protéines virales pouvaient être des partenaires de la mLysRS au sein du complexe d'encapsidation, nous avons procédé à la reconstitution du complexe d'encapsidation de l'ARNt3 Lys. Reconstitution in vitro du complexe d'encapsidation de II. l'ARNt Le complexe d'encapsidation de l'ARNt3 Lys a été reconstitué au laboratoire in vitro pour vérifier si il pouvait aussi contenir les protéines Rev et Vpr, ces dernières ayant la capacité d'interagir avec la mLysRS. Nous avons reconstitué le complexe minimum (Pol : mLysRS) Lys pour voir si il pouvait renforcer l'interaction entre puis nous avons rajouté l'ARNt3 mLysRS et Pol. Nous avons enfin rajouter Rev et Vpr pour analyser leur impact potentiel sur la formation du complexe d'encapsidation de l'ARNt3 Lys. A. Expression des protéines L'ensemble des protéines utilisées au cours de cette étude ont été produites dans des cellules d'insecte. Les séquences virales ont été introduites dans le plasmide pFastBac1 par un clonage SLIC. Les protéines virales GagPol et Pol utilisées dans cette étude présentent une étiquette de six histidines à l'extrémité C-terminale qui permet de les sélectionner sur la résine NiNTA. La formation des bacmides recombinants a été réalisée par transposition des séquences des pFastBac recombinants dans EMBacY. Les bacmides recombinants ont servi à 140 Chapitre III : Rôle des protéines auxiliaires du VIH-1 transfecter des cellules d'insecte Sf21. Les baculovirus ainsi obtenus ont été utilisés pour infecter des cellules d'insecte High Five pour produire les protéines recombinantes. B. Vérification de l'interaction entre Pol et mLysRS Avant de procéder à la reconstitution du complexe d'encapsidation de l'ARNt3 Lys, nous avons d'abord voulu vérifier que l'approche envisagée permet de reproduire l'interaction entre Pol et mLysRS. Comme GagPol était moins fortement exprimé que Pol et plus sensible à la dégradation protéolytique, nous avons utilisé Pol dans les études décrites ci-dessous. Pour cela, des extraits bruts de cellules exprimant l'une ou l'autre de ces deux protéines ont été mélangés, puis la protéine Pol a été sélectionnée sur colonne NiNTA. Pol est la seule protéine étiquetée histidine en C-terminal. L'analyse des éluats par western blot montre que la mLysRS est co-purifiée avec Pol-H6 sur résine NiNTA. Implication de l'ARNt3 C. mLysRS Lys sur la formation du complexe Pol- Le complexe d'encapsidation a pour rôle l'acheminement de l'ARNt3 particules virales. Par conséquent, nous nous sommes demandés si la présence de l'ARNt3 avait une incidence sur la formation du complexe entre mLysRS et Pol-H6. Lys au sein des Lys L'ARNt3 Lys a été ajouté aux extraits bruts en concentration saturante par rapport à la Lys. La protéine mLysRS afin que tous les complexes formés avec Pol-H6 contiennent l'ARNt3 Pol a ensuite été sélectionnée sur colonne NiNTA. Nous avons observé que la quantité de mLysRS co-purifiée avec Pol-H6 ne varie pas Lys. Ce dernier n'a donc pas d'effet sur l'interaction entre selon que l'on ajoute ou non l'ARNt3 Pol-H6 et mLysRS donc sur la formation du complexe d'encapsidation. Implication de Rev et Vpr dans la formation du complexe D. d'encapsidation de GagPol : mLysRS : ARNt3 Le complexe d'encapsidation GagPol : mLysRS : ARNt3 Lys Lys implique l'interaction entre les domaines TF et IN de Pol et le domaine catalytique de mLysRS. Il a également été mis en évidence une interaction Rev : mLysRS et Vpr : mLysRS. Nous nous sommes alors demandés si ces interactions intervenaient dans le complexe d'encapsidation GagPol : mLysRS : ARNt3 Lys. 141 Chapitre III : Rôle des protéines auxiliaires du VIH-1 La possible intervention de Rev et Vpr dans le complexe d'encapsidation Lys a été analysée en reconstituant le complexe Pol : mLysRS en GagPol : mLysRS : ARNt3 présence des protéines Vpr ou Rev. Des extraits cellulaires issus de cellules d'insecte infectées par des baculovirus exprimant Pol, mLysRS, mais aussi Rev, Vpr, ont été mélangés avant d'être sélectionnés sur résine NiNTA. Nous avons observé que Vpr et Rev n'interagissent pas avec Pol, ni avec la LysRS dans le complexe Pol : mLysRS. D'autre part, la présence de Vpr ou Rev n'influe par sur la quantité de mLysRS associée à Pol dans l'éluat de la NiNTA. Ces protéines ne renforcent donc pas l'association entre Pol et mLysRS, mais n'induisent pas non plus la dissociation de la pince moléculaire formée par TF et IN. Par conséquent, les interactions Rev : mLysRS et Vpr : mLysRS ne semblent pas devoir être impliquées lors de l'assemblage du complexe d'encapsidation de l'ARNt3 Lys. III. Conclusion générale Le complexe d'encapsidation de l'ARNt3 Lys a été reconstitué. Les différentes protéines impliquées dans son assemblage ont été identifiées. GagPol et la mLysRS semblent être les deux seuls partenaires requis pour l'assemblage de ce complexe. L'absence d'implication des protéines Rev et Vpr dans la formation de ce complexe a été mise en évidence, et permet de supposer que la LysRS puisse être impliquée dans la régulation des fonctions de ces deux protéines au cours de cycle viral, mais à une étape distincte de l'assemblage du complexe d'encapsidation. 142 ARTICLE 3 Interaction of HIV-1 Rev and Vpr with mitochondrial lysyl-tRNA synthetase does not impact its association with Pol Lydia KOBBI, Aurélien NAIL, Martine COMISSO and Marc MIRANDE Soumis 143 Interaction of HIV-1 Rev and Vpr with mitochondrial lysyl-tRNA synthetase does not impact its association with Pol Running title : Association of Rev and Vpr with mitochondrial LysRS Lydia Kobbi, Aurélien Nail, Martine Comisso, and Marc Mirande* Laboratoire d'Enzymologie et Biochimie Structurales, Centre de Recherche de Gif, CNRS, 1 Avenue de la Terrasse, 91190 Gif-sur-Yvette, France. *Corresponding author. email : Marc. Mirande@lebs. cnrs-gif. fr phone : 33 1 69 82 35 05 fax : 33 1 69 82 31 29 1 ABSTRACT : Packaging of tRNA3 Lys into HIV-1 viral particles is an essential step to produce infectious virions with the capacity to initiate reverse transcription of their RNA genome. The mature form of human mitochondrial lysyl-tRNA synthetase (mLysRS) is taken up in viral particles along with tRNA3 Lys. The transframe and integrase domains or the Pol region of the GagPol polyprotein precursor form molecular tweezers that interact with the catalytic domain of mLysRS to build the GagPol : mLysRS : tRNA3 Lys packaging complex. In this work we searched for the possible association of one of the seven other viral proteins, Env, Vif, Vpr, Tat, Rev, Vpu and Nef of HIV-1, with mLysRS, and analyzed the significance of these interactions in the context of the formation of a specific packaging complex. Our data show that Vpr and Rev are able to interact with mLysRS, but that this association does not take place at the level of the assembly of the GagPol : mLysRS : tRNA3 Lys packaging complex. Keywords : HIV-1 ; tRNA3 Lys ; lysyl-tRNA synthetase ; packaging complex 2 Introduction An essential process in the viral life cycle of HIV-1, the human immunodeficiency virus type 1, is the conversion of its retroviral genomic RNA (vRNA) into proviral DNA. One of the crucial step of this mechanism is the packaging of tRNA3 Lys from the host cell, a molecule that serves as a primer for initiation of reverse transcription (Abbink & Berkhout, 2008). Even though formation of a specific vRNA/tRNA3 Lys complex primarily involves annealing of the 3'-terminal 18 nucleotides of tRNA3 Lys to the complementary sequence located in the 5'-untranslated region of vRNA corresponding to the primer binding site (PBS), the complete process of initiation and transition to elongation requires a more complex pattern of interactions (Isel et al, 2010). Because initiation of reverse transcription starts soon after budding of new viral particles, packaging of tRNA3 Lys during viral assembly is essential to produce effective virions (Gabor et al, 2002). Lysyl-tRNA synthetase (LysRS) from infected cells, the enzyme that aminoacylates tRNA3 Lys to give the aminoacyl-tRNA used for protein synthesis, is also packaged into HIV-1 particles (Cen et al, 2001). Human LysRS possesses a 73 amino acid residue N- terminal polypeptide extension that contributes a potent tRNA-binding domain (Francin et al, 2002 ; Francin & Mirande, 2003) required for efficient tRNA packaging (Cen et al, 2004). Although it has long been believed that cytosolic LysRS was involved in this process (Cen et al, 2001), the actual source of LysRS present in the virions is the mitochondrial enzyme (Kaminska et al, 2007b). Maturation of pmLysRS, the precursor of mitochondrial LysRS (mLysRS), after clavage of its mitochondria-targeting sequence between Gly30 and Gln31 upon translocation into mitochondria, generates an active enzyme with potent tRNA-binding properties (Dias et al, 2011). The transframe (TF or p6*) and integrase (IN) subunits or the Pol domain of the GagPol polyprotein precursor form molecular tweezers that interact with the catalytic domain of mLysRS to build the GagPol : mLysRS : tRNA3 Lys packaging complex (Kobbi et al, 2011). Whereas cLysRS, pmLysRS and mLysRS, which are produced by alternative splicing 3 of exon 2 of the KARS gene (Tolkunova et al, 2000), share the same catalytic domain, and have the intrinsic capacity to bind Pol (Kobbi et al, 2011), only the mLysRS species is recovered within the virions (Dias et al, 2011 ; Kaminska et al, 2007b). This suggests that the three LysRS species are strictly routed in cellulo, which prevents the interaction of cLysRS and pmLysRS with GagPol in HIV-1 infected cells (Kobbi et al, 2011). Alternatively, another yet unidentified viral protein could be involved in the assembly of a specific packaging complex. To explore this possibility, we analyzed the capacity of the Env polyprotein precursor, and of the auxiliary proteins Vif, Vpr, Tat, Rev, Vpu and Nef of HIV-1 to interact with LysRS, and to participate in the assembly of the GagPol : mLysRS : tRNA3 Lys packaging complex. 4 Materials and Methods Yeast two-hybrid analysis. The yeast two-hybrid system developed by Brent et al. was used (Gyuris et al, 1993). The Vif, Tat, Rev, Vpu and Env coding regions from pNL4-3 were introduced between the EcoRI and XhoI sites of pEG202. The Vpr and Nef coding regions were introduced between the BamHI and XhoI sites, or EcoRI and NcoI sites of pEG202, respectively. The LexA DNA-binding domain-fused proteins in pEG202 are expressed under the control of a constitutive promoter. To test whether the LexA : pVIH-1 fusion proteins are able to enter the nucleus and bind LexA operators, the repression assay with the pJK101 reporter was used (Gyuris et al, 1993). The cDNAs encoding the human cytoplasmic, premitochondrial and mitochondrial forms of LysRS, the catalytic (CAT, from Asp238 to Val597), anticodon-binding (ABD, from Val71 to Asn237), or eukaryotic-specific (cESD, mESD, pmESD, from their respective N-terminus to Ser70) domains of LysRS introduced between the EcoRI and XhoI sites of pJG4-5 have been described (Kobbi et al, 2011). The B42 activation domain-fused proteins in pJG4-5 also carry an hemagglutinin epitope tag, and are expressed under the control of a galactose-inducible promoter. The yeast strain EGY48 (Mat his3 leu2 : 3LexAop-LEU2 ura3 trp1) which contains a chromosomal LEU2 gene placed under the control of LexA operators was transformed to his with pEG202-derivatives and to trp with pJG4-5 derivatives. At least four independent colonies were analyzed for their ability to grow in the absence of leucine (expression of Lexop-LEU2). A pair of interactive proteins was scored as positive when transformants did not grow on glucose medium lacking leucine (no expression of B42- fusions) but grew on galactose medium lacking leucine (expression of B42-fusions that interacted with LexA-fusions). Immunoprecipitation. The Rev, Vpr, Tat and Nef coding sequences from pNL4-3 were inserted into the BglII site of pRS315-PGK (CEN/ARS, LEU2 (Golinelli-Cohen et al, 2004). FLAG-tagged proteins were expressed with an N-terminal MGDYKDDDDKPW sequence corresponding 5 the FLAG epitope (underlined). Plasmids pRS315-PGK-FLAG or pRS315-PGK-FLAG-(Rev, Vpr, Tat, or Nef) were used to transform yeast W303-1B strain (leu2, his3, trp1, ura3, ade2). Cells were grown at 28C in 1 liter of minimal YNB medium (0. 7% yeast nitrogen base without amino acid, 2% glucose) supplemented with uracil, adenine, histidine and tryptophan, to an A600 of 1. Cells were washed, resuspended in 5 ml of ice-cold extraction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8. 0, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT) and lysed at 2100 bar in a One Shot cell disrupter (Constant Systems Ltd) in the presence of 1 mM benzamidine and 1 mM PMSF. Extracts were clarified by centrifugation at 12, 000 g for 15 min at 4C, followed by a 40 min centrifugation step at 160, 000 g, at 4C. The supernatant was incubated 2 hours, at 4C, after addition of 120 l of a 1 : 1 slurry of ANTI-FLAG M2 affinity gel (Sigma). The matrix was extensively washed and resuspended in NETN50 (20 mM Tris-HCl pH 8. 0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0. 5 % NP40). Anti-FLAG agarose incubated with an extract of yeast transformed with pRS315-PGK-FLAG-Pol is denoted FLAG-Pol matrix, or FLAG matrix when incubated with the control extract of yeast transformed with pRS315-PGK-FLAG. Before incubation with purified proteins, a fraction of the matrix was treated with SDS and analyzed by Western blotting with anti- FLAG antibodies to assess that similar amounts of the different FLAG-proteins were bound to the matrix. Purified mLysRS expressed in insect cells and purified as described (Dias et al, 2011) was incubated (0. 1 ml at 2 M) with 30 l of FLAG or FLAG-(Rev, Vpr, Tat, or Nef) matrix in NETN50 containing BSA at 10 g/ml. The mixture was incubated 1 hour at 4C with constant shaking. After centrifugation 1 min at 4C (13, 000 x g), agarose beads were washed twice with 200 l NETN50, once with 200 l NETN250 (NETN50 containing 250 mM NaCl), and twice with 200 l NETN50. Beads were resuspended in 36 l NETN50 and specific elution from ANTI-FLAG M2 affinity gel was performed after addition of 4 l of FLAG peptide (Sigma) at 5 mg/ml. After incubation for 30 min at 4C, the supernatant was recovered by centrifugation. Fractions were analyzed by Western blotting. 6 Reconstitution of protein complexes The Pol, IN, Rev and Vpr coding regions from pNL4-3 and mLysRS sequences were introduced between the EcoRI and XhoI sites of pFastBac1. The Pol and IN sequences contain a His6 tag at the C-terminus. Recombinant plasmids were integrated at the Tn7 transposition site of EMBacY (gift from Imre Berger, EMBL, Grenoble) to give the recombinant bacmids (Trowitzsch et al, 2010). Initial baculoviruses were obtained after transfection of adhesive Sf21 cells grown in Grace medium supplemented with 10% FCS. Baculovirus amplification was performed by infection of Sf21 cells grown in suspension in SF-900 II medium (Invitrogen). To express recombinant proteins, baculoviruses were used to infect High Five cells grown in suspension in Express Five SFM medium (Invitrogen). After 48-56 h of culture at 27C, cells were harvested by centrifugation, washed with ice-cold PBS, and the cell pellet was stored at -80C. Cells were lysed by addition of 1 vol. of ice-cold extraction buffer (20 mM K-phosphate pH 7. 5, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole, 5% glycerol, 5 mM 2-mercaptoethanol, 1% Triton X-100) in the presence of 1 mM Pefabloc, 10 mM benzamidine and 10 mM PMSF. Extracts were clarified by centrifugation at 12, 000 g for 15 min at 4C. The cell extracts containing different recombinant proteins were mixed as described, incubated 1h at 4C. After addition of 1 vol. of buffer A-NiNTA (20 mM K-phosphate pH 7. 5, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole, 5% glycerol, 5 mM 2-mercaptoethanol), the mixture was incubated with 20 l of a 1 : 1 slurry of Ni-NTA Superflow (Qiagen), during 1h at 4C. Beads were washed with 4 x 1 ml of buffer A-NiNTA, and elution was performed by adding 2 x 200 l of buffer B-NiNTA (20 mM K-phosphate pH 7. 5, 500 mM NaCl, 400 mM imidazole, 5% glycerol, 5 mM 2- mercaptoethanol). Eluted proteins were analyzed by western blotting. Where indicated, tRNA3 Lys was added during incubation of cell extracts. Human tRNA3 Lys was produced in E. coli JM101Tr transformed with plasmid pBSTK3 (Tisné et al, 2000) and purified as described (Meinnel et al, 1992). Antibodies and Western blot analysis. Monoclonal antibodies directed to the hemagglutinin epitope were from BAbCo. Polyclonal antibodies to LexA were a gift of Patrice Moreau (Laboratoire de Chimie 7 Bactérienne, Marseille). Polyclonal anti-NLysRS antibodies have been described previously (Mirande et al, 1982). Monoclonal anti-IN and anti-Rev antibodies were from Abcam. Polyclonal anti-Vpr antibodies were a gift from Uwe Tessmer (Heinrich-Pette- Institute, Hamburg, Germany). Western blot analyses were conducted with goat anti- rabbit or goat anti-mouse secondary antibodies conjugated with peroxidase (Chemicon) and the SuperSignal West Pico chemiluminescent substrates (Pierce). 8 Results Search for viral proteins interacting with lysyl-tRNA synthetase LysRS interacts with the TF and IN domains of the Pol region of GagPol to form the tRNALys packaging complex (Kobbi et al, 2011). We investigated the putative role of the other HIV-1 viral proteins in establishing a specific tRNA packaging complex. Among the putative candidates were the Env polyprotein precursor, gp160, specifying the surface (SU, gp120) and transmembrane (TM, gp41) glycoproteins, as well as the auxiliary proteins Vif, Vpr, Tat, Rev, Vpu and Nef (Fig. 1). Association of LysRS with these viral proteins was first screened by the yeast two-hybrid method. The viral sequences were expressed fused with the LexA DNA-binding domain, and fusion proteins of the expected sizes were detected by western blot (Fig. 1C). To ascertain that the encoded proteins were translocated into the yeast nucleus, we used the repression assay developed by Brent et al. (Gyuris et al, 1993). A lacZ reporter gene is placed under the control of a GAL1 promoter that also contains a LexA operator. When LexA or a LexA-fusion protein binds LexA operator, expression of lacZ in repressed, leading to a reduced synthesis of - galactosidase. With the exception of LexA-Nef, all other fusion proteins repressed lacZ expression to different extents, exemplifying their nuclear localization (Table I). The cytoplasmic, mitochondrial and premitochondrial LysRS species, cLysRS, mLysRS and pmLysRS, were expressed in yeast fused with the B42 transcription activation domain. These constructs also contain a nuclear localization signal and an HA11 hemagglutinin epitope that allows identification of the fusion proteins expressed in yeast (Fig. 1C). Expression LexA-Tat, LexA-Rev, LexA-Vpr or LexA-Nef with B42-cLysRS, B42- mLysRS or B42-pmLysRS allowed yeast EGY48 to grow in the presence of galactose, but in the absence of leucine, suggesting that all these protein pairs are able to associate through protein : protein interactions (Fig. 1B). However, expression of LexA-Nef alone on a glucose medium where LysRS are not expressed, proved to be sufficient to activate the LEU2 gene (Fig. 1B). Thus, LexA-Nef by itself activates transcription, which is consistent with the results of the repression assay (Table I), showing that the level of - 9 galactosidase expressed in the presence of LexA-Nef was higher than the level observed with pRS313, when no repression occurs. Expression of Vif, Vpu or Env with any of the three forms of LysRS did nor lead to expression of LEU2. Identification of the protein domain of LysRS involved in its interaction with viral proteins. Because Tat, Rev, and Vpr were scored positive by the yeast two-hybrid test with any of the three forms of LysRS, this suggested that a domain common to all LysRS species was involved in their association. The structural domains of LysRS (Fig. 2A) were independently expressed fused to B42 (Fig. 2B). This includes the C-terminal catalytic domain of LysRS (CAT), its tRNA anticodon-binding domain (ABD), and its N-terminal eukaryote-specific sequences (ESD) that promotes the formation of a stable complex between tRNALys and LysRS in humans (Francin et al, 2002). The cESD, mESD and pmESD domains also contain the cytoplasmic-, mitochondrial- and premitochondrial-specific sequences, respectively. Expression of CAT, but of none of the other cESD, mESD, pmESD, or ABD domains, with Tat, Rev or Vpr, revealed a protein-protein interaction (Fig. 2A). No interaction was detected with Vif, Vpu or Env. As observed above, expression of Nef leads to the constitutive expression of the LEU2 gene. Assessing protein : protein interactions by immunoprecipitation. To validate interactions of Tat, Rev and Vpr with LysRS, as suggested by the two- hybrid assays, and to test for the interaction of Nef with LysRS that could not be appraised by the yeast two-hybrid approach, association of mLysRS with any of these four proteins was controlled by immunoprecipitation of LysRS with FLAG-tagged viral proteins produced in yeast. The viral proteins were expressed in yeast with a FLAG-tag appended to their N- terminus, and purified by adsorption on an anti-FLAG agarose. The resulting FLAG- 10 proteins bound to the anti-FLAG agarose, or an aliquot of anti-FLAG agarose saturated with FLAG peptide, were incubated in the presence of purified mLysRS (Fig. 3). After washing of agarose beads, specific elution of interacting proteins was accomplished by adding an excess of FLAG peptide that released FLAG-proteins from the agarose matrix by competition. FLAG-Rev and FLAG-Vpr specifically adsorbed mLysRS, but only trace amounts of mLysRS were recovered from FLAG-Tat and FLAG-Nef (Fig. 3). Thus, only Rev and Vpr were selected as possible protein partners of mLysRS. Reconstitution of the tRNALys packaging complex To assemble and isolate the tRNALys packaging complex, containing GagPol, mLysRS and tRNALys, the GagPol protein precursor, or the Pol polyprotein only, and mLysRS were expressed in insect cells. The baculovirus expression system allows expression or coexpression of proteins in a eukaryotic expression system closely mimicking the expression machinery of a human cell. The level of expression of GagPol was low, and the polyprotein was rapidly degraded by cellular proteases into individual components. Thus, we chose to associate mLysRS with Pol (Fig. 4). Pol was expressed with a C- terminal His-tag allowing its recovery on a NiNTA column. An extract of insect cells expressing Pol was mixed with an extract of insect cells expressing mLysRS in excess as compared to Pol, and incubated before recovery of Pol on a NiNTA matrix. As observed Fig. 4, mLysRS was recovered with Pol, showing that the Pol : mLysRS complex easily forms between the two proteins. When the two proteins were coexpressed in insect cells after coinfection with the two baculovirus species, the Pol : mLysRS complex recovered on NiNTA matrix directly after cell lysis displayed the same Pol/mLysRS ratio (not shown). To test whether presence of tRNA3 Lys could interfere with the interaction between Pol and mLysRS within the Pol : mLysRS : tRNA3 Lys complex, extracts of insect cells containing Pol or mLysRS were mixed in the absence of tRNA3 Lys or in the presence of a 3-fold molar excess of tRNA3 Lys as compared to mLysRS (Fig. 5). As observed after isolation of Pol on NiNTA matrix, the presence of tRNA did not interfere with the recovery 11 of mLysRS into the Pol : mLysRS complex. Association of Rev and Vpr with Pol and mLysRS in the tRNALys packaging complex To test for the possible involvement of Rev and Vpr in the assembly of the GagPol : mLysRS : tRNA3 Lys packaging complex, Vpr and Rev were expressed in the baculovirus expression system, and the effect of the addition of these two proteins on the recovery of mLysRS with Pol on NiNTA matrix was analyzed (Fig. 6). As a control, the integrase (IN) domain of Pol, corresponding to one of the two domains of Pol interacting with mLysRS (Kobbi et al, 2011), was also expressed in insect cells with a C-terminal His-tag. The additional viral proteins IN, Vpr or Rev were incubated alone, with Pol, with mLysRS, or with Pol and mLysRS (Fig. 6A). The protein samples recovered on NiNTA matrix contained the His-tagged proteins Pol and IN, where applicable, but did not contain Vpr or Rev, showing that Vpr and Rev do not interact with Pol, or with mLysRS into the Pol : mLysRS complex (Fig. 6B). The amount of mLysRS recovered with Pol in the Pol : mLysRS complex was not affected by the presence of Vpr or Rev (Fig. 6C), showing that their presence did not impair association of mLysRS with Pol. By contrast, when IN was added in excess, more mLysRS was recovered from the NiNTA matrix (Fig. 6C), showing that IN in excess, carrying a His-tag, is also able to associate with mLysRS. Altogether, these data show that the functional significance of the interaction between mLysRS and Rev or Vpr is likely not to be involved in the assembly of the tRNALys packaging complex. 12 Discussion We previously showed that association of HIV-1 GagPol with the cellular protein mLysRS to form the GagPol : mLysRS : tRNA3 Lys complex involves interaction of the TF and IN domains of the Pol region of GagPol with the catalytic domain of mLysRS (Kobbi et al, 2011). Because a single gene encodes the cytoplasmic and mitochondrial species of LysRS in human by means of alternative splicing (Tolkunova et al, 2000), the three cellular species of LysRS, cLysRS, pmLysRS, and mLysRS, share 576 amino acid residues, corresponding to the catalytic and anticodon-binding domains. Accordingly, association of GagPol to the catalytic domain of LysRS is not restricted, in vitro, to the mLysRS species (Kobbi et al, 2011). However, cLysRS, a member of the cytosolic multisynthetase complex MARS (Mirande, 2005), is never recovered into the virions (Kaminska et al, 2007b), suggesting that its interaction with the p38 scaffold protein of MARS and its routing to this complex prevents its interaction with GagPol in HIV-1 infected cells (Kobbi et al, 2011). In this study, we explored an alternative explanation. We analyzed the possibility that association of another viral protein to the GagPol : mLysRS complex could render association of GagPol with LysRS specific for only the mature, mitochondrial species. We found that LysRS is also able to interact with the Rev and Vpr proteins, and determined that this association also involves the catalytic domain of LysRS common to the three LysRS species. Association of cytoplasmic LysRS with Vpr was already described in another study (Stark & Hay, 1998). However, interaction of Rev and Vpr with mLysRS does not occur within the GagPol : mLysRS complex, suggesting that these interactions are not involved in the assembly of the GagPol : mLysRS : tRNA3 Lys packaging complex. Therefore, cellular compartmentalization appears to be a key mechanism for the selective targeting of mLysRS to HIV-1 virions. Viral protein R (Vpr), one of the regulatory/accessory proteins encoded by HIV-1 genome, is involved in several aspects of host-virus interactions (Zhao et al, 2007). One of the main cellular role of Vpr seems to be induction of cell cycle arrest in G2 following 13 HIV-1 infection. Vpr causes hyperphosphorylation of Cdc2, a cyclin-dependent kinase which regulates the cell cycle, through inhibition of the Cdc25 phosphatase and activation of the Wee1 kinase. A small fraction of Vpr is also phosphorylated on Ser79 and is essential for nuclear import of the HIV-1 genomic DNA preintegration complex. An important role of Vpr in induction of apoptosis through permeabilization of the mitochondrial membrane has also been reported. Finally, association of Vpr with numerous cellular proteins was observed. It is therefore conceivable that association of Vpr with LysRS could regulate one or several of these processes. For instance, association of Vpr with mLysRS could be required to induce relocalization of mLysRS in the cytoplasm of HIV-1 infected cells, as previously observed following exposure of HeLa cells to endogenous Vpr (Kaminska et al, 2007a). The Vpr-assisted release of mLysRS from mitochondria would be a prerequisite for its association with tRNA3 Lys and GagPol to form the packaging complex. Alternatively, binding of cLysRS to Vpr could be a regulatory mechanism that controls the other functions of Vpr, in cell cycle arrest or nuclear import. Rev, the Regulator of Expression of Virion proteins, is an essential component of HIV involved in nuclear export of intron-containing viral RNAs (Felber et al, 2007). Rev is a nucleo-cytoplasmic shuttling protein containing four functional domains : a nuclear localization signal and a nuclear export signal for efficient trafficking, an RNA binding domain and an oligomerization domain involved in binding the Rev-responsive elements located on unspliced or partially unspliced mRNAs. In the absence of Rev, unspliced RNAs are not efficiently exported, and GagPol and Env are poorly expressed. Rev functions as a molecular switch for the translation of viral proteins from unspliced transcripts, and several cellular proteins were shown to regulate its activity. For instance, a component of the translation machinery, the eukaryotic initiation factor 5A (eIF-5A) has been shown to be essential for Rev-mediated viral RNA export (Hofmann et al, 2001). Whether cLysRS, mLysRS or pmLysRS could also be involved in regulation of Rev functions is an intriguing possibility. 14 Acknowledgements This work was supported by grants from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), and the Agence Nationale de Recherches sur le SIDA (ANRS). L. K. is the recipient of a doctoral fellowship of Ministère de l'éducation nationale, de l'enseignement supérieur et de la recherche . 15 Legends to Figures Fig. 1. Two-hybrid analysis of LysRS : pHIV-1 interaction. (A) The sequences for the polyprotein Env, and for proteins Vif, Vpr, Tat, Rev, Vpu and Nef are encoded on the three reading frames of the viral genome. The viral (pHIV-1) proteins were expressed fused to LexA in pEG202. The three LysRS species for the cytoplasmic (cLysRS), mitochondrial (mLysRS), and premitochondrial (pmLysRS) enzymes were expressed fused to the B42 transcription activator, under the control of a galactose-inducible promoter in pJG4-5. (B) The two-hybrid protein : protein interaction assay between pHIV-1, and cLysRS, mLysRS, or pmLysRS, was conducted in EGY48 strain. As a control, all the strains grew on a galactose medium in the presence of leucine (YNBG L). When the strains were plated on a galactose medium in the absence of leucine (YNBG), a protein : protein interaction resulted in the expression of the LEU2 gene, as observed following coexpression of any of the three LysRS species with Nef, Vpr, Rev or Tat. If the expression of LEU2 requires interaction between LysRS and pHIV-1, then none grew in the absence of leucine on a glucose medium (YNB) where LysRS is not expressed. All the strains grew on YNB in the presence of leucine (not shown). (C) Expression and stability of the fusion proteins produced in yeast. Left : Western blot analysis of the fusion proteins expressed in yeast from the pJG4-5 plasmid. The cLysRS, mLysRS or pmLysRS species (80 kDa) were expressed fused to the B42 transcription activator and to the HA11 hemagglutinin epitope. Right : Western blot analysis of the fusion proteins expressed in yeast from the pEG202 plasmid. The Vif (45. 3 kDa), Vpu (31. 8 kDa), Tat (32. 5 kDa), Rev (35. 7 kDa), Vpr (34. 4 kDa), Nef (46 kDa) and Env (119. 7 kDa) proteins were expressed fused to the LexA DNA-binding domain. Fig. 2. Two-hybrid analysis of the LysRS domains interacting with pHIV-1. (A) The cytoplasmic- (cESD), mitochondrial- (mESD), or premitochondrial- (pmESD) eukaryote- specific domains, the anticodon-binding domain (ABD), and the catalytic domain (CAT) of LysRS were expressed fused to the B42 transcription activator, under the control of a galactose-inducible promoter in pJG4-5. The two-hybrid protein : protein interaction assay 16 between the LysRS constructs and the pHIV-1 constructs expressed fused to LexA in pEG202, was conducted in EGY48 strain. Expression of the CAT domain alone was as efficient as the expression of the three full-length LysRS species to restore growth in the presence of Nef, Vpr, Rev, or Tat. No growth was observed on YNB plates, except for the strain expressing the Nef construct. These data also show that none of the HA-LysRS fusions activate transcription of the reporter gene in the absence of a suitable B42-fusion protein. For clarity, only the YNBGal selection plate is shown. (B) Expression of the fusion proteins in yeast was analyzed by Western blot. The cESD, mESD, pmESD (21 kDa), ABD (31. 1 kDa) or CAT (53. 1 kDa) domains of LysRS, were expressed fused to the B42 transcription activator and to the HA11 hemagglutinin epitope. Fig. 3. Co-immunoprecipitation of mLysRS with HIV-1 proteins. Anti-FLAG agarose beads carrying FLAG peptide (FLAG) or the FLAG-Nef, FLAG-Tat, FLAG-Vpr or FLAG-Rev fusion proteins were incubated with the mitochondrial species of LysRS (Input). After removal of the unbound fraction, beads were washed and then incubated with FLAG peptide in excess, and the eluted fraction was recovered (FLAG elution). LysRS present in these fractions was analyzed by Western blotting with anti-NLysRS antibodies. The 'Input' and 'Unbound' fractions were diluted 10x. Fig. 4. Co-purification of mLysRS with Pol. The mLysRS species and Pol with a C-terminal His-Tag (Pol-H6) were expressed independently in insect cells, and extracts were mixed (Pol-H6 mLysRS), and subjected to NiNTA purification. The fractions obtained before (Input) or after (Output) NiNTA purification were analyzed by Western blotting with anti- IN or anti-LysRS antibodies. Fig. 5. Effect of tRNA3 Lys on the interaction of mLysRS with Pol. The mLysRS species and Pol with a C-terminal His-Tag (Pol-H6) were expressed independently in insect cells, and extracts were mixed (Pol-H6 mLysRS), and subjected to NiNTA purification in the absence (-tRNA3 Lys) or in the presence ( tRNA3 Lys) of tRNA3 Lys. The fractions obtained after (Output) NiNTA purification were analyzed by Western blotting with anti-LysRS 17 antibodies. Fig. 6. Rev and Vpr do not copurify with the mLysRS : Pol complex. The mLysRS species, Pol or IN with a C-terminal His-Tag (Pol, IN), Vpr and Rev were expressed independently in insect cells. Extracts were mixed as indicated, and subjected to NiNTA purification. The fractions obtained before (A : Input) or after (B : Output) NiNTA purification were analyzed by Western blotting with anti-IN (for Pol and IN), anti-Vpr, anti-Rev, or (C) with anti-LysRS antibodies. 18 References Abbink TE, Berkhout B (2008) HIV-1 reverse transcription initiation : a potential target for novel antivirals ? 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Adv Pharmacol 55 : 233-260 21 Table 1. -galactosidase activity in the repression assaya Plasmid used pRS313b pEG202c pEG202-Vif pEG202-Vpu pEG202-Tat pEG202-Rev pEG202-Vpr pEG202-Nef pEG202-Env % 100 17 79 67 21 23 21 121 75 aActivity is expressed as the percentage of activity in the given strain as compared to the activity determined in the control strain that does not express LexA (pRS313). bControl plasmid that does not express LexA. cControl plasmid that expresses wild-type LexA. A * *$ ! ')$ ! #$ ! '($ (% ! $ %& ! $ &%#$ B cKRS mKRS pmKRS Vif Vpu Tat Rev Vpr Nef Env Vif Vpu Tat Rev Vpr Nef Env Vif Vpu Tat Rev Vpr Nef Env YNBG L YNB YNBG YNBG L YNB YNBG YNBG L YNB YNBG C S R s y L c S R s y L m S R s y L m p */%&'(% f i V u p V t a T v e R r p V f e N v n E ). #, %&'(% ! -%&'(% ! #$%&'(% $ #, %&'(% $ ! # ! %&'(% $)#*%&'(% $ # %&'(% WB : HA11 antibodies ! WB : LexA antibodies ! A cESD mESD pmESD ABD CAT Vif Vpu Tat Rev Vpr Nef Env $#)%&'(% $)#)%&'(% )#/%&'(% YNBGal B D S E c D S E m D S E m p D B A T A C WB : HA11 antibodies ! Fig. 1 Fig. 2 d n u o b n U t u p n I h s a W n o i t u l E G A L F FLAG-Rev FLAG-Vpr FLAG-Tat FLAG-Nef FLAG WB : ! NLysRS antibodies ! Protein extracts added 6 H - l o P S R s y L m 6 H - l o P S R s y L m Input NiNTA Output NiNTA Pol-H6 mLysRS Pol-H6 mLysRS WB-IN WB-LysRS WB-IN WB-LysRS Fig. 3 Fig. 4 Protein extracts added - tRNALys, 3 tRNALys, 3 S R s y L m 6 H - l o P S R s y L m 6 H - l o P S R s y L m S R s y L m 6 H - l o P 6 H - l o P mLysRS WB-LysRS Output NiNTA Fig. 5 Protein extracts added r p V S R s y L m v e R S R s y L m l o P l o P N I S R s y L m N I l o P N I r p V S R s y L m v e R S R s y L m r p V l o P r p V Protein extracts added v e R l o P v e R CD356% CD356% CD3789% CD3 : ; v e R l o P v e R CD356% CD356% CD3789% CD3 : ; N I S R s y L m l o P N I S R s y L m S R s y L m l o P S R s y L m l o P A % @ B A 6 6 % ? > 8 5 01234-% 5634-% 789% : ; B % @ B A 6 6 % ? > 8 ? > E 01234-% 5634-% 789% : ; C r p V S R s y L m l o P l o P v e R S R s y L m l o P N I S R s y L m N I l o P N I r p V S R s y L m v e R S R s y L m r p V l o P r p V Protein extracts added N I S R s y L m l o P S R s y L m l o P S R s y L m r p V S R s y L m l o P v e R S R s y L m l o P N I S R s y L m r p V S R s y L m v e R S R s y L m Input NiNTA FGHI : J% Output NiNTA FGHI : J% WB-LysRS WB-LysRS Fig. 6 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 171 Conclusions et perspectives CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES La transcription inverse du génome du VIH-1 est initiée par la transcriptase inverse au Lys sein de la capside virale. L'initiation de ce processus requiert un ARN amorce, l'ARNt3 (Wain-Hobson et al, 1985), dont la séquence 3'-terminale est complémentaire de la séquence Lys au PBS localisée près de l'extrémité 5' de l'ARN viral. Le rôle essentiel dévolu à l'ARN3 cours de l'initiation de la transcription inverse est maintenant bien décrit, les mécanismes moléculaires impliqués dans les étapes conduisant à son encapsidation étaient encore peu Lys qui est encapsidé au sein des caractérisés. Des premières études ont démontré que l'ARNt3 particules virales est complexé à son partenaire cellulaire, la lysyl-ARNt synthétase humaine (LysRS) (Cen et al, 2001). La LysRS possède des partenaires cellulaires et viraux dans les cellules infectées par le VIH-1. La forme cytoplasmique est liée à la protéine p38 dans le complexe MARS alors que la forme mitochondriale est libre dans l'organelle. Ces deux protéines sont très similaires, elles partagent notamment le même domaine catalytique car elles sont issues d'un même gène par un mécanisme d'épissage alternatif. Seule la forme Lys mitochondriale est encapsidée dans le VIH-1 et sert de co-transporteur de l'ARNt3 (Kaminska et al, 2007b). La recherche de partenaires viraux nécessaires à l'encapsidation du Lys avait suggéré que la polyprotéine Gag pourrait interagir avec la complexe mLysRS : ARNt3 LysRS par son domaine CA. Toutefois, la constante de dissociation déterminée pour l'interaction entre Gag et la LysRS, de l'ordre de 310 80 nM (Kovaleski et al, 2006), n'était pas en faveur d'une association robuste entre ces deux protéines. intervenir comme transporteur du complexe formé de Les objectifs de cette thèse étaient dans un premier temps de rechercher des protéines la LysRS virales pouvant Lys pour acheminer vers le virion lors du bourgeonnement viral mitochondriale et de l'ARNt3 l'amorce ARN nécessaire à l'initiation de la transcription inverse. Par des approches de double hybride et par immunoprécipitation, nous avons établi un modèle des interactions protéine- Lys. En protéine impliquées dans la formation du complexe d'encapsidation de l'ARNt3 recherchant les interactions des précurseurs Gag et GagPol avec les LysRS et leurs domaines, nous avons démontré que seul le domaine Pol du précurseur GagPol a la capacité de s'associer à la LysRS. Ce sont les sous-domaines transframe TF et intégrase IN du domaine Pol qui permettent l'association entre la LysRS et GagPol. Cette association se fait via le domaine catalytique de l'enzyme. 173 Conclusions et perspectives Lors de cette même étude, nous avons également recherché le domaine de la LysRS qui interagit avec p38, la protéine d'échafaudage du complexe MARS. L'interaction de LysRS à p38 se fait aussi via le domaine catalytique de l'enzyme. A partir des différentes interactions des LysRS avec leurs partenaires cellulaires et viraux, nous avons conclu qu'il devait y avoir in vivo un phénomène de compartimentation des LysRS dans la cellule humaine. Lors de l'infection par le VIH-1, Pol ne pourrait pas interagir avec la cLysRS car elle intègre le complexe MARS, en se liant à p38 par son domaine catalytique. Cette forme cytoplasmique de LysRS complexée à MARS n'est plus disponible pour une interaction avec Pol. L'association de mLysRS à Pol serait liée à la disponibilité de cette dernière. Les mécanismes exacts de cette interaction restent encore méconnus. Dans un deuxième temps, nous nous sommes focalisé sur la caractérisation de l'un des partenaires du complexe d'encapsidation, la LysRS mitochondriale. Les données que nous avions obtenu auparavant ne permettaient pas d'établir à quel stade l'encapsidation de la LysRS mitochondriale avait lieu, soit avant sa translocation mitochondriale sous forme de précurseur pmLysRS, soit après sous forme mLysRS maturée. Nous avons déterminé le site de maturation du précurseur pmLysRS puis caractérisé les deux formes mitochondriales de la Lys. Alors que LysRS, en déterminant leurs paramètres cinétiques et leur affinité pour l'ARNt3 la forme pmLyRS ne forme pas de complexe stable avec l'ARNt, la forme maturée mLysRS Lys. Ce serait donc la mLysRS qui serait impliquée est la plus apte à interagir avec l'ARNt3 dans le transport de l'ARNt3 Lys dans les particules virales lors du bourgeonnement. Après avoir identifié les composants principaux du complexe d'encapsidation de Lys, nous avons Lys, à savoir GagPol comme transporteur du complexe mLysRS : ARNt3 l'ARNt3 recherché si d'autres protéines virales pourraient intervenir dans la formation d'un complexe d'encapsidation spécifique qui ne pourrait interagir qu'avec la mLysRS au détriment des deux autres formes de LysRS. Nous avons montré que les protéines auxiliaires Rev et Vpr sont capables d'interagir avec l'ensemble des LysRS en s'associant à leur domaine catalytique. Elles ne montrent pas de sélectivité particulière pour la forme mitochondriale de l'enzyme. Pour déterminer si Rev et Vpr font partie du complexe d'encapsidation de l'ARNt3 Lys, nous avons reconstitué ce complexe in vitro. Nous avons pu montrer que la mLysRS et 174 Conclusions et perspectives Lys dans ce complexe d'encapsidation. Les GagPol sont les deux seuls partenaires de l'ARNt3 protéines Rev et Vpr ne peuvent s'y associer. Ces deux protéines virales n'étant pas impliquées dans le complexe d'encapsidation de l'ARNt, mais ayant la capacité d'interagir avec la LysRS (cLysRS, pmLysRS et/ou mLysRS), pourraient intervenir lors d'une étape distincte du cycle viral. Entre autres hypothèses de travail, Vpr pourrait avoir un rôle dans le relargage de la mLysRS de la mitochondrie avant son association à GagPol dans la cellule hôte. Vpr et Rev pourraient aussi contribuer avec la protéase virale à la dislocation de la pince Lys au cours de moléculaire formée de TF et IN, et au relargage du complexe mLysRS : ARNt3 la maturation des virions, puis la protéase pourrait cliver l'extension N-terminale de la Lys pour amorcer la transcription inverse du génome viral. mLysRS et libérer ainsi l'ARNt3 L'une des formes de LysRS pourrait également être impliquée dans la régulation de l'activité de Vpr ou Rev dans d'autres processus viraux, tels que la translocation nucléaire du complexe de preintégration, ou le transport nucléo-cytoplasmique des ARN viraux non épissés, mécanisme qui implique de constantes allées et venues de la protéine Rev. Ces nouveaux rôles potentiels de la LysRS cellulaire, schématisés sur la Figure 47, doivent maintenant être caractérisés en détail. L'ensemble des données recueillies au cours de cette thèse, nous a permis de faire Lys. La forme mitochondriale de évoluer le modèle du complexe d'encapsidation de l'ARNt3 LysRS maturée sert de co-transporteur de cet ARNt dans les particules virales du VIH-1. Cet enzyme est détourné de sa voie naturelle et relargué de la mitochondrie par l'action de Vpr dont l'effet pro-apoptotique a déjà été démontré (Kaminska et al, 2007a). La mLysRS interagit via son domaine catalytique avec GagPol. GagPol, et plus précisément une synergie entre les domaines TF et IN de Pol, conduit à l'assemblage du complexe d'encapsidation contenant mLysRS : ARNt3 Lys. Aucune autre protéine virale n'intervient lors de cette étape. A l'issue de cette étude et pour approfondir les connaissances sur l'encapsidation du Lys, il serait nécessaire d'identifier les motifs protéiques et les acides complexe mLysRS : ARNt3 aminés présents sur le domaine catalytique de l'enzyme et qui participent d'une part aux interactions GagPol : mLysRS, induisant l'encapsidation de la mLysRS, et d'autre part, les résidus impliqués dans l'interaction cLysRS-p38, induisant la rétention de la cLysRS dans MARS. L'identification des motifs d'interaction protéine-protéine impliquant les LysRS et leurs divers partenaires pourrait servir à l'élaboration d'inhibiteurs spécifiques et sélectifs 175 Conclusions et perspectives d'une interaction donnée, qui seraient susceptibles de bloquer cette étape du cycle viral à des fins thérapeutiques. mLysRS pmLysRS Figure 47 Implication potentielle de la lysyl-ARNt synthétase à diverses étapes du cycle viral du VIH-1 : Le cycle réplicatif du VIH-1 débute par l'entrée du virus dans la cellule hôte. Les étapes de rétrotranscription se déroulent dans le cytoplasme. Cette étape est suivie par l'import nucléaire du complexe de préintegration PIC qui contient entre autre la protéine virale Vpr. La LysRS pourrait se lier à Vpr à ce stade de l'infection réguler la fonction de Vpr dans le transport de ce complexe. Une fois dans le noyau, l'ADN viral va s'intégrer au génome de la cellule hôte. Lorsque l'expression des gènes viraux s'opère, donnant des transcrits de différentes tailles, les transcrits non épissés qui serviront à la traduction de certaines protéines virales vont être transportés vers le cytoplasme à l'aide de la protéine Rev. Son interaction avec la LysRS pourrait réguler la fonction de Vpr dans l'export de ces ARN. Les protéines virales sont produites dans le cytoplasme en utilisant la machinerie traductionnelle de la cellule hôte. Tous les composants des nouveaux virions sont acheminés vers la membrane Lys est également encapsidé. Il est transporté cytoplasmique. En plus du génome et des protéines virales, l'ARNt3 par la mLysRS mature qui provient du précurseur pmLysRS aprés translocation et maturation mitochondriale. Par la suite, Vpr provoque la dislocation de la membrane mitochondriale et pourrait également intervenir dans le relargage de la mLysRS mature de la mitochondrie. Une fois dans le cytoplasme, mLysRS sera interceptée par GagPol et transportera l'ARNt3 Lys dans les particules virales naissantes du VIH-1. 176 Conclusions et perspectives La reconstitution in vitro du complexe Pol : mLysRS, en présence ou non de l'ARNt3 Lys, est maintenant matrisée au laboratoire, sa purification est envisageable à plus grande échelle. La détermination de la structure cristalline de ce complexe pourrait permettre de conduire l'évolution dirigée de molécules inhibitrices spécifiques des interactions qui sont à l'origine de Lys dans les particules virales du VIH-1. Ces molécules inhibitrices l'encapsidation de l'ARNt3 qui cibleraient exclusivement une composante de traductionnelle mitochondriale sans affecter la machinerie traductionnelle cytoplasmique pourraient permettre à long terme d'élargir le spectre des molécules anti-VIH-1 car, rappelons-le, lorsque l'amorce de la transcription inverse n'est pas encapsidée au sein des particules virales, l'infectivité de ces dernières est abaissée de façon drastique (Gabor et al, 2002). la machinerie 177 REFERENCES 179 Abbink T, Berkhout B (2007) HIV-1 reverse transcription : close encounters between the viral genome and a cellular tRNA. Adv Pharmacol 55 : 99-135 Abelson J, Trotta C, Li H (1998) tRNA splicing. J Biol Chem 273 : 12685-12688 Aiken C, Trono D (1995) Nef stimulates human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA synthesis. 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PÔLE : INGENIERIE DES PROTEINES ET CIBLES THERAPEUTIQUES UNIVERSITÉ PARIS-SUD 11 UFR FACULTÉ DE PHARMACIE DE CHATENAY-MALABRY 5, rue Jean Baptiste Clément 92296 CHÂTENAY-MALABRY Cedex | HAL | Scientific |
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INTRODUCTION Free-living amoebae have been detected in many man-made water systems ( , including drinking water distribution systems , hospital water networks ), thermal and hydrotherapy baths ( , swimming pools ( , or cooling towers ( They present two developmental stages : a vegetative stage, called trophozoïte, and a resistance form, the cyst, which allows them to survive in aggressive environments or in the absence of nutrients These amoebae mainly feed on the bacteria fixed in biofilms However, it is now well established that some bacteria have developed resistance mechanisms allowing them not only to survive, but also to rapidly grow and proliferate inside amoebae This resistance capacity has been demonstrated for a number of pathogens, including Legionella (figure 1), Listeria, Salmonella, Campylobacter, or Mycobacteria , as well as for emerging pathogens such as Parachlamydia acanthamoebae ), or Simkania negevensis This mechanism is probably at the origin of the rapid re-colonization of cooling or domestic water systems by Legionella, generally observed immediately after stopping a disinfection programme ) For some of these pathogens, especially Legionella, it has also been demonstrated that this resistance mechanism is associated with the expression of virulence traits ) Thus, free-living amoebae constitute a potential reservoir for these pathogens, allowing the survival, the multiplication, and the dissemination of virulent bacteria in water systems, despite the application of disinfection or thermal treatments Therefore, controlling free-living amoebae in artificial water systems should also allow a better control of the associated bacterial pathogens, especially Legionella pneumophila In addition to the application of good practices for the cleaning and maintenance of private installations (e. g domestic water systems or cooling towers), it is thus important to limit as much as possible the presence of these microorganisms in drinking water Preventing the risk related to free-living amoebae in drinking water requires to evaluate their numbers in the raw waters used for drinking water production, and to adapt the treatment consequently However, the application of a risk management approach in this case is today limited by the lack of information on the level of contamination of water resources, and on the effectiveness of water treatment processes to remove or inactivate these microorganisms In this context, the objectives of this study were to : -Quantify the amoebae present in different raw waters used for drinking water production, -Assess the effectiveness of different treatments applied in drinking water production or distribution, in removing or inactivating free-living amoebae MATERIALS AND METHODS Amoebae enumeration Amoebae were enumerated by zone assay on a coliform culture, according to the filtration method described by Due to the fragility of amoebae in their trophozoite state, this method allows to enumerate essentially encysted amoebae For each sample, three different volumes were filtered in triplicate and incubated 10 days at 30C Quantification was achieved by using a 3 x 3 Most Probable Number (MPN) matrix The detection limit of the method for volumes of 10, 100 and 1000 mL was 0. 3 cyst/L On-site sampling The effectiveness of clarification and filtration in removing amoebae was assessed at seven production sites located in northern and southern Europe (respectively 39 J. -F LORET, M JOUSSET, S ROBERT, C ANSELME, G SAUCEDO, F RIBAS, L MARTINEZ, V CATALAN Atlantic and Mediterranean climate) These seven units produce drinking water from surface waters (three river waters and two lakes in northern Europe, two river waters in southern Europe) with conventional treatment techniques The five sites that treat river waters use aluminium-based coagulants, whereas the two others use ferric chloride All these sites apply different settling technologies (static, sludge blanket or sludge re-circulation) and use different filter media (sand, granular activated carbon or biolite) Each site was sampled several times from January 2005 to August 2007 for amoebae quantification in the raw, settled and filtered water Treatment studies at laboratory and pilot scale The treatment studies were conducted on a wild strain of Acanthamoeba polyphaga The reason for selecting this microorganism is that it has been identified as very resistant to disinfection in previous studies ) An additional reason is that Acanthamoeba is identified to-day as the main host for intra-amoebal bacteria ( A stock solution of A polyphaga cysts was prepared by culturing the strain on a coliform culture, according to the enumeration method described above Amoebae were harvested and washed three times in sterile water (centrifugation 10 minutes at 6000 g), re-suspended in sterile water, and preserved for a minimum 24 hours at 4C for encystment The amoebae concentration was determined by counting the cysts in a Thoma cell The stability of the stock solution was assessed with the enumeration method before starting the treatment studies No significant loss of culturable amoebae was observed over ten days For each treatment study, the initial concentration of amoebae was also verified according to the enumeration method Except for the ultra-filtration experiments, each treatment study was conducted only once The uncertainty on the log reduction of A polyphaga cysts after treatment was estimated from the 95% confidence intervals of the MPN enumeration method Coagulation/settling Jar-tests were performed on a FLH6 laboratory flocculator (Orchidis, France) with water from the river Seine The water was filtered on a 5 m membrane in order to eliminate as much as possible the amoebae that were naturally present The concentration of the remaining amoebae in these conditions was 46 cysts/L Two commercial coagulants were tested : an aluminium chlorosulphate (8, 3% of Al 2 O 3 ), and a ferric chloride (41% of FeCl 3 ) Preliminary tests demonstrated that the optimum dosage (expressed as commercial product) was 20 mg/L and 120 mg/L respectively For the Jar-tests, a range of concentrations of 10 to 40 mg/L and 80 to 150 mg/L respectively, including these optimum doses, was applied The tests were conducted on water volumes of 1L, seeded with approximately 10 4 cysts/L of A polyphaga After adding the coagulant, the water was stirred 3 minutes at 200 rpm, then 17 minutes at 45 rpm Ten minutes after stopping the stirring, the supernatant was sampled for amoebae enumeration Ultra-filtration The study was conducted on a pilot installation equipped with a module composed of 18200 fibres, offering a total filtering surface of 64 m 2 (Aquasource, France) The system was operated in the cross-flow mode, with a water flow of 40 m 3 /h in the re-circulation loop, and of 8 m 3 /h for the feed water The integrity of the module was verified before and after each experiment The feed water was a de-chlorinated potable water seeded with approximately 2000 cysts/L of A polyphaga Two 40-minute experiments were realized For each experiment, four samplings were realized in the permeate (one every 10 min), for amoebae enumeration Due to the concentration effect in the re-circulation loop during the experiment, the amoebae concentration after 40 min of operation was 10 5 cysts/L Ultraviolet UV experiments were realized on a cylindrical 1. 85 litre LP02011 reactor (Ozonia, Switzerland) equipped with a 95W low pressure lamp (254 nm), at room temperature The feed water was a de-chlorinated potable water seeded with approximately 10 4 cysts/L of A polyphaga The necessary water flows allowing to reach the targeted doses (30 to 1500 L/h) were deduced from experiments conducted with a collimated beam apparatus on a suspension of MS2 phage UV doses of 26, 36, 213, 618 and 1212 mJ/cm 2 were applied Chemical disinfection The experiments with chlorine and chlorine dioxide were conducted on a dechlorinated potable water seeded with approximately 10 6 cysts/L of A polyphaga, in batch reactors continuously stirred and thermo-regulated at 20C Sodium hypochlorite solutions were produced by diluting a commercial solution and adjusting the pH at 7. 5 Concentrations of 8, 15, 25, 50 and 100 mg/L free chlorine were applied A 0. 5 g/L chlorine dioxide stock solution was generated by mixing equal volumes of a 25% sodium chlorite solution and of a 32% hydrochloric acid solution Concentrations of 0. 5, 2, 5 and 7 mg/L chlorine dioxide were tested Ozone was produced with a Labo76 generator (Trailigaz, France) Concentrations of 0. 5, 0. 8, 0. 9, 1. 2 and 1. 7 mg/L were applied in a continuous flow bubble column at room temperature (approximately 20C) For all disinfectants, sampling was realized at contact times of 5, 15, 30, 60 and 120 min Disinfectant residuals were checked at each sampling, in order to determine the Ct (concentration x time) really applied Both chlorine and chlorine dioxide were tested according to the diethyl-phenylene diamine (DPD) spectrophotometric method (ISO 7393-2) Ozone was measured according to the indigo colorimetric method (APHA Standard Method) Prior to amoebae enumeration, the disinfectant residual was neutralized by adding sodium thio-sulphate For each series of experiments, a nontreated control sample was kept in order to verify the stability of the amoebae suspension Thermal treatment Flasks containing de-chlorinated potable water were placed in a thermo-regulated water-bath Once the targeted temperature reached in the flasks, each of them was seeded with a quantity of A polyphaga cysts allowing to obtain an initial concentration of approximately 10 6 cysts/L Temperatures of 50, 60, 62, 65, and 70C were tested, for contact times of 5, 15, 30, 60, and 120 min Each sampled flask was quickly cooled under a cold water flow before amoebae enumeration RESULTS Quantification of amoebae in water resources Amoebae were detected in the 23 raw water samples analysed, at concentrations between 11 and 4600 cysts/L . Although amoebae loads were significantly higher in the southern waters, compared to the northern waters (P 0. 01), globally no significant correlation was found between amoebae counts and water temperature (R 2 < 0. 01) Assessment of clarification at laboratory scale The results of the Jar-tests conducted with the two commercial coagulants are presented on Depending on the coagulant used, a reduction of 0. 7 to 1. 8 log of A polyphaga was observed at the optimum dosage, with a better effectiveness of ferric chloride, compared to aluminium chlorosulphate presents the reduction observed at the seven treatment plants, at the settling step (18 values), and globally after settling and filtration These results demonstrate the importance of the coagulation and settling steps, where a mean reduction of 1. 5 log is achieved (median : 1. 4 log), whereas filtration brings an additional mean reduction of only 0. 5 log, leading to an overall amoebae removal for coagulation, settling and filtration of 2. 0 log (median : 2. 1 log) No difference in effectiveness is observed between the different settling processes or filter media in place at these treatment plants On-site assessment of clarification and filtration Reduction (log N0/N) Frequency Ultra-filtration No amoebae were detected in any of the permeate samples Considering the maximum amoebae concentration in the re-circulation loop at the end of the experiment (10 5 cysts/L), and the detection limit of the analytical method (0. 3 cyst/L), the amoebae reduction was higher than 5. 5 log Ultraviolet The amoebae log reduction observed as a function of the UV dose is presented on table 1 No A polyphaga was detected at the outlet of the reactor for doses higher than 36 mJ/cm 2 Chemical disinfection Examples of experimental inactivation curves obtained with the three tested oxidants are presented on A significant reduction of A polyphaga cysts was observed only for free chlorine concentrations equal to or higher than 25 mg/L, and chlorine dioxide concentrations equal to or higher than 2 mg/L Such threshold effect however was not observed with ozone Culturable A polyphaga were still detectable after a 2-hour exposure of the cysts to all disinfectants, at all the tested concentrations All inactivation curves were composed of two slopes, corresponding to a first phase of rapid inactivation, followed by a second phase of slow decrease, suggesting the presence of organisms at different stages of encystment The expected log reductions of A polyphaga cysts as a function of the applied Ct or UV dose are summarized on table 2 44 ELIMINATION OF FREE-LIVING AMOEBAE BY DRINKING WATER TREATMENT PROCESSES Thermal treatment The inactivation curves obtained as a function of temperature are presented on A significant reduction of A polyphaga cysts was observed only for temperatures equal to or higher than 62 C Above this limit, a contact time of more than 1 hour allowed a reduction of about 5 log Culturable A polyphaga were still detectable after a 2-hour exposure to 62 or 65 C No amoebae however were detected after a 1-hour exposure to 70 C The reduction at this temperature is thus potentially higher than 5 log 45 J. -F LORET, M JOUSSET, S ROBERT, C ANSELME, G SAUCEDO, F RIBAS, L MARTINEZ, V CATALAN Acanthamoeba (log N/N0) DISCUSSION These results confirm the presence of amoebae in surface waters used for drinking water production Free-living amoebae have been detected in all the raw water samples analysed in this study This is consistent with the observations performed on other rivers or lakes in Europe or the USA, which indicate a presence of free-living amoebae in 40 to 95% of the samples ) Complementary investigations on the samples collected in this study have been performed with the aim of identifying the amoebae and the intra-amoebal bacterial species The application of a PCR and sequencing approach, after amoebal enrichment, as described by , demonstrated that these amoebae belong to a large variety of genera, including Naegleria, Vannella, Acanthamoeba, Vahlkampfia, Hartmannella, Echinamoeba, Platyamoeba and Glaeseria, and that intra-amoebal bacteria, including Mycobacteria and Parachlamydia are present in some of them ) The effectiveness of the treatment processes applied for drinking water production in removing or inactivating these amoebae, and hence controlling the risk associated with intra-amoebal bacteria, is poorly documented in the literature One study conducted on six drinking water treatment plants in Germany demonstrated the importance of the clarification and filtration steps for the elimination of these microorganisms, with an overall reduction observed for these two steps of 1 to 2 log Despite the large confidence intervals related to the results obtained with the MPN quantification method, our results provide similar orders of magnitude, with a reduction for coagulation and settling, as observed with Jar-tests, of 0. 7 to 1. 8 log, and a mean reduction by conventional treatment (including coagulation, settling and filtration) of 2. 0 log, as observed at seven treatment plants, representing a total of five different treatment chains The effectiveness of conventional treatment is mainly due to the coagulation and settling steps, which provide a mean log reduction of 1. 5 log, whereas filtration brings an additional reduction of only 0. 5 log The filtration effectiveness in that case seems very modest, compared to its efficiency on other protozoa such as Cryptosporidium or Giardia, for which a reduction of 1. 5 to 2 log is generally observed ) The limited effect of filtration on free-living amoebae could be explained by the colonization of the filter media by these microorganisms, leading to temporary breakthroughs and releases in the filtered water This hypothesis is supported by the observation on several occasions of amoebae concentrations at the outlet of the filters that were equal to or higher than those in the inlet water As a consequence, a special attention must be given to filter backwash management, in order to limit as much as possible the development of these microorganisms in filter media The results of the ultra-filtration studies confirm the expected effectiveness of this technique, with an observed reduction of more than 5. 5 log, provided that the membranes are intact Taking into account the potential presence of damaged fibres in the ultra-filtration modules, a minimum reduction of 4 log under operational conditions is however generally attributed to this process Little information is available through the literature on disinfection effectiveness A few studies indicate a strong resistance of Acanthamoeba to chemical disinfectants and UV ), while showing important differences in resistance from one species to the other Our experiments realized on A polyphaga cysts confirm that under the conditions of application of disinfectants, in drinking water production and treatment of domestic water systems as well, chlorine and chlorine dioxide have no effect on this microorganism This can explain the observed persistence of amoebae in domestic water systems submitted to continuous treatment with these disinfectants ) On the other hand, ozone and UV can lead to a significant reduction Thermal treatment is also applicable to domestic hot water systems This treatment however is efficient against A polyphaga only for temperatures above 62C In these conditions, for contact times of more than 1 hour, the reduction can reach 5 log or more summarizes the expected reduction at the different treatment steps in drinking water production, under operational conditions (with the following hypotheses for disinfection : ozone and chlorine residuals 0. 3 mg/L, contact time 10 to 20 min for ozone, 1 to 2 h for chlorine, low pressure UV dose 40 mJ/cm 2 ) CONCLUSION This study confirms that the risk related to the presence of free-living amoebae and intra-amoebal bacteria must be taken into account in the management of drinking water production and distribution processes Due to their capacity to encyst, these microorganisms are highly resistant to disinfectants In these conditions, control strategies in drinking water production should be principally based on physical removal processes such as settling and granular or membrane filtration Management of filter backwash however must be optimized in order to avoid any excessive development of these microorganisms in the filter media Ozone and UV can also generate a significant inactivation For domestic hot water systems, thermal treatment is particularly efficient, provided that temperatures above 62 C are applied REFERENCES Barbaree, J M. , Fields, B S. , Feeley, J C. , Isolation of protozoa from water associated with a legionellosis outbreak and demonstration of intracellular multiplication of Legionella pneumophila Applied and Environmental Microbiology, 51(2), 422-424 Pathogenic potential of novel Chlamydiae and diagnostic approaches to infections due to these obligate intracellular bacteria Clinical Microbiology Reviews, 19(2), 283-297 47 J. -F LORET, M JOUSSET, S ROBERT, C ANSELME, G SAUCEDO, F RIBAS, L MARTINEZ, V CATALAN | ISTEX | Scientific |
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RECOMMANDER LES BONNES PRATIQUES FICHE Pour le médecin de premier recours : évaluation du risque podologique et traitement podologique pour un patient diabétique Outil n11 Validée par le Collège le 26 novembre 2020 Ce document est extrait de la recommandation de bonne pratique Le pied de la personne âgée : approche médicale et prise en charge en pédicurie-podologie . Se référer aux chapitres 2. 2. 8. 1 et 3. 6. 3 de la recommandation Le diabète . Ces recommandations peuvent s'appliquer à tous les patients, quel que soit leur âge. Évaluation du risque podologique : gradation Il est recommandé de réaliser chez tous les patients diabétiques un dépistage annuel du risque podo- logique. Pour le patient diabétique, il existe un risque accru de plaies pouvant conduire à des amputa- tions. Ce dépistage annuel permet de : définir le grade de risque lésionnel (qui conditionne le remboursement des soins) ; d'orienter le patient sur une prise en charge spécifique. Ce dépistage permet de grader1 le risque selon une classification et ainsi de définir une stratégie de prévention adaptée. Cette stratégie repose sur la reconnaissance des facteurs de risque et s'appuie sur l'examen clinique. Il est recommandé de se référer au tableau ci-dessous pour les professionnels concernés. Les me- sures préventives et le suivi sont à effectuer selon le niveau de graduation de risque diabétique. 1 Le pédicure-podologue réalise et engage sa responsabilité lors de la cotation et de l'évaluation du grade du pied du patient diabétique selon le décret de compétences de la loi L. 4322-1, arrêté du 24/12/2007 Grade Définition Mesures préventives Professionnels : fréquence de suivi Grade 0 Absence de neuropathie Examen de dépistage an- Dépistage du risque podolo- sensitive nuel gique (au moins une fois par an) Examen des pieds, évalua- tion de la marche et du Médecin généraliste, et/ou chaussage podologue Éducation (hygiène, auto- et/ou diabétologue examen des pieds et des ongles par le patient, con- seils de chaussage non traumatisant, mesures de prévention dans les situa- tions à risque selon le mode de vie, conduite à tenir en cas de plaie) Grade 1 Neuropathie sensitive iso- Examen des pieds, et éva- Médecin généraliste (à lée (a) luation de la marche et du chaque consultation chaussage Diabétologue Éducation (hygiène, auto- Podologue (tous les 6 mois et examen des pieds et des plus selon avis médical, ce ongles par le patient, con- nombre pouvant être adapté seils de chaussage non pour les patients en situation traumatisant, mesures de de handicap et pour la per- prévention dans les situa- sonne âgée2) tions à risque selon le mode de vie, conduite à tenir en Infirmier cas de plaie) Aide de l'entourage Grade 2 Neuropathie sensitive as- Mêmes mesures préven- Médecin généraliste (à sociée à une artériopathie tives que pour le grade 1 chaque consultation) des membres inférieurs Diabétologue (b) et/ou à une déforma- tion du pied (c) Soins de pédicurie réguliers Podologue (tous les 3 mois pour les soins instrumentaux Correction des anomalies et tous les 6 mois pour soins biomécaniques orthétiques) Avis sur l'indication d'or- Infirmier thèses et d'un chaussage approprié Médecine physique et réa- daptation Se référer à l'avis n 2018. 0056/AC/SEAP du 12 décembre 2018 du collège de la Haute Autorité de santé relatif à l'inscription sur la liste des actes et prestations, mentionnée à l'article L. 162-1-7 du Code de la Sécurité sociale, des actes réalisés par le pédicure- podologue pour la prévention des lésions des pieds à risque de grade 1, chez le patient diabétique tail/upload/docs/application/pdf/2018-12/ac 2018 0056 pied diabetique. pdf HAS Pour le médecin de premier recours : évaluation du risque podologique et traitement podologique pour un patient diabétique no- vembre 2020 2 Grade Définition Mesures préventives Professionnels : fréquence de suivi Prise en charge de l'artério- Podo-orthésiste pathie, si existante Réseau de santé Grade 3 Antécédent d'ulcération Renforcement des mesures Mêmes professionnels et fré- du pied évoluant depuis préventives définies pour le quence de suivi que pour le plus de 4 semaines et/ou grade 2 grade 2 d'amputation des Appareillage systématique membres inférieurs (voire (défini par le centre spécia- une partie d'un orteil) Centre spécialisé/centre de lisé) cicatrisation (bilan annuel) Surveillance régulière par Soins instrumentaux podolo- un centre spécialisé ou par giques (au moins tous les 2 un diabétologue mois) Soins orthétiques (a ) : définie par l'anomalie du test au monofilament de Semmes-Weinstein (10 g). (b) : définie par l'absence d'au moins un des deux pouls du pied ou par un IPS (c ) : hallux valgus, orteil en marteau ou en griffe, proéminence de la tête des métatarsiens, déformations post-chirurgicales ou liées à une neuro-arthropathie (pied de Charcot). Le bilan-diagnostique annuel préventif en pédicurie-podologie est recommandé chez tous les patients diabétiques âgés de plus de 60 ans dès le grade zéro en regard du poids des complications (amputa- tions, plaies) et de l'impact sur la qualité de vie. Pour les grades 2 et 3, une consultation de suivi de 6 mois pour les soins orthétiques peut s'avérer insuffisante. A-t-il des déformations des orteils, des pieds, des proéminences des têtes métatarsiennes, des kératoses (qui signent un trouble de la statique du pied) et des troubles de la marche ? Il est recommandé : de rechercher toutes déformations du pied ; d'évaluer les limitations des amplitudes articulaires du membre inférieur ; d'évaluer les troubles de la marche. Ces déformations et troubles sont à l'origine d'hyperpression (plantaire) et de zones de conflits (faces latérales et dorsales des orteils). La prévention du risque podologique repose sur l'éducation théra- peutique du patient, par le pédicure-podologue et les autres professionnels de santé. Elle a pour but de réduire le taux d'ulcérations du pied. HAS Pour le médecin de premier recours : évaluation du risque podologique et traitement podologique pour un patient diabétique no- vembre 2020 3 Évaluation du patient en présence d'une plaie aux pieds Il est recommandé de rechercher les facteurs déclenchants, d'informer les patients sur les si- tuations à risque : une chaussure inadaptée ; la marche pieds nus ; des chaussettes ou des bas/collants dont les coutures distales créent des pathologies pulpaires ou unguéales ; des dispositifs de compression veineuse trop serrés, mal positionnés, usagés, déchirés qui peuvent générer des strictions/frictions/hyperpressions avec des lésions cutanées ; une sécheresse cutanée ; des anomalies pré-lésionnelles (fissures, mycose, crevasses) ; les auto-soins (par exemple : l'utilisation de coricides) ; un ongle traumatisant ; une hyperkératose ou un conflit mécanique. Il est recommandé, devant toute demande du pédicure-podologue d'un avis concernant une plaie du pied chez un patient diabétique, de prendre en charge ce patient sans délai. Travailler en réseau (infirmière, médecin généraliste, pédicure-podologue), afin de partager les données médicales nécessaires à la prise en charge rapide du patient. Si besoin, connatre les coordonnées des centres de prise en charge du pied du patient diabé- tique. Chaussage du patient diabétique Chaussage standard : conseils à donner au patient Il est recommandé de donner aux patients diabétiques des conseils pour le chaussage standard com- portant les informations suivantes : les chaussures, en matériau souple, doivent avoir un volume adapté à celui des pieds, avec une semelle antidérapante, sans couture intérieure et avec des lacets ou Velcro. Sauf indication particulière, les talons ne doivent pas dépasser 4 cm et être suffisamment larges pour une bonne stabilité ; le pied doit toujours être protégé dans la chaussure par des chaussettes ou des bas. Les chaus- settes doivent être changées tous les jours, sans trous, ni reprises. Les chaussettes doivent être assez épaisses, sans coutures saillantes. Évitez que les bas ou chaussettes serrent trop les jambes pour faciliter la circulation ; les tongs, sandales, espadrilles et mules, etc. et toute chaussure ouverte doivent être évitées, ne jamais garder des chaussures neuves toute la journée ; il est préférable d'avoir deux paires de chaussures, afin de changer tous les jours de chaus- sures. ; les chaussures doivent être achetées en fin de journée en raison de l'œdème de déclivité (pieds enflés le soir) ; en cas de port d'orthèses plantaires (semelles), il est conseillé de les placer dans les chaus- sures pour les essayer en vérifiant que le volume soit suffisant ; HAS Pour le médecin de premier recours : évaluation du risque podologique et traitement podologique pour un patient diabétique no- vembre 2020 4 les orthèses plantaires, les orthoplasties et les chaussures orthopédiques doivent être portées toute la journée, y compris à la maison, sauf en cas de nouvelle plaie. Pour les chaussures thérapeutiques La chaussure thérapeutique à usage prolongé est destinée à des patients dont les déformations de- mandent un maintien, un chaussant particulier ou un volume que ne peut assurer une chaussure ordi- naire. Le médecin traitant du patient peut prescrire un chaussage thérapeutique de série dans les cas sui- vants : déformation de l'avant-pied : hallux valgus et déformation d'orteils ; port d'orthèses plantaires ; en postopératoire ; en présence de douleur ou de plaie ; lorsque le chaussage en chaussures ordinaires n'est plus possible. Afin d'adapter au mieux les orthèses plantaires et d'éviter les conflits avec le chaussant, les chaussures thérapeutiques de série pour un usage temporaire (CHUT) ou prolongé (CHUP) peuvent être conseil- lées par le pédicure podologue et peuvent être prescrites par lui, mais ne bénéficieront pas dans ce cas d'une prise en charge des organismes de remboursement. La prescription peut être demandée au médecin traitant. Les antécédents d'ulcération ou d'amputation placent le pied dans une catégorie à haut risque podo- logique (grade 3). En cas d'amputation, si les chaussures conventionnelles sont totalement inadap- tées, la prescription de chaussures en podo-orthèse est nécessaire. La réévaluation du chaussant et des orthèses plantaires tous les 3 mois est recommandée dans une approche multi professionnelle. Orthèses plantaires pour le patient diabétique Dans le cas du diabète, l'objectif thérapeutique est la prévention des ulcères plantaires. Les orthèses appliquées aux pieds du patient diabétique sont thermoformées et entières. La prescrip- tion des orthèses plantaires par un médecin est indispensable pour la prise en charge par les organismes sociaux. Il est recommandé d'informer le patient de porter en permanence les orthèses plantaires utilisées dans le cadre de la prévention primaire et secondaire des maux perforants plantaires. Le suivi est d'autant plus nécessaire que le risque podologique est élevé. Si un patient est inapte à l'autosurveillance podologique, celle-ci doit pouvoir être faite par un tiers. En cas de rougeur, douleur, conflit avec l'orthèse, le port de celle-ci sera interrompu et une modification de cette dernière devra rapidement être faite. Les orthèses plantaires doivent être portées en permanence, y compris au domicile dans un chaus- sage adapté, en précisant au patient du lever au coucher. Elles peuvent être renouvelées une à deux fois par an. Il est primordial de s'assurer de la bonne adaptation à chaque type de chaussant et de prévoir, le cas échéant, plusieurs paires d'orthèses. Leur durée de vie maximale est de 1 an. HAS Pour le médecin de premier recours : évaluation du risque podologique et traitement podologique pour un patient diabétique no- vembre 2020 5 Les orthèses plantaires ont un rôle capital dans le devenir du patient diabétique à risque podologique. Il est recommandé : que les patients diabétiques fassent l'objet d'une attention toute particulière lors de la remise d'une orthèse (d'orteil ou plantaire) et dans les 10 jours qui suivent la pose ; d'informer le patient, les professionnels de santé en charge du patient et/ou l'aidant sur la né- cessité de le consulter rapidement dès l'apparition de douleur, rougeur, phlyctène, plaie, afin de contrôler le dispositif médical. Haute Autorité de santé novembre 2020 Ce document présente les points essentiels de la recommandation de bonne pratique : HAS Pour le médecin de premier recours : évaluation du risque podologique et traitement podologique pour un patient diabétique no- vembre 2020de la personne âgée : approche médicale et prise en charge thérapeutique en pédicurie-podologie, novembre 2020 Le pied 6 Toutes nos publications sont téléchargeables sur | HAS | Scientific |
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UNIVERSITE DE PICARDIE JULES VERNE - FACULTE DE MEDECINE ANNEE 2020 N de thèse : 2020 215 Distribution du volume érythrocytaire et évaluation du canal artériel du prématuré THESE POUR LE DIPLOME D'ETAT DE DOCTEUR EN MEDECINE- SPECIALITE PEDIATRIE Présentée et soutenue le 18 décembre 2020 par Fanny Sohouenou Président du jury : Pr Djamal-Dine DJEDDI Membres du jury : Pr Antoine GALMICHE Pr Loïc GARCON Pr Elodie HARAUX Dr André LEKE Directeur de thèse : Dr Guy KONGOLO A mon président de jury, Monsieur le Professeur Djamal-Dine DJEDDI Professeur des Universités Praticien Hospitalier (Pédiatrie) Responsable du centre d'activité Médecine Pédiatrique Pôle Femme - Couple - Enfant Vous me faites l'honneur de présider ce jury et d'évaluer mon travail. Je vous témoigne ma profonde et respectueuse reconnaissance. 2 Monsieur le Professeur Antoine GALMICHE Professeur des Universités - Praticien Hospitalier Chef du Service de Biochimie Centre de biologie humaine A, qui me fait l'honneur d'être membre du jury. Je vous remercie de l'intérêt que vous avez porté à mon travail. 3 A, Monsieur le Professeur Antoine GALMICHE Professeur des Universités - Praticien Hospitalier Chef du Service de Biochimie Centre de biologie humaine Je vous exprime toute ma gratitude pour l'honneur que vous me faites d'être membre de ce jury et d'évaluer ainsi mon travail. 4 A, Monsieur le Professeur Loïc GARCON Professeur des Universités Praticien Hospitalier (Hématologie Transfusion) Chef du service d'Hématologie Biologique Chef du service de Génétique Constitutionnelle Je suis honorée de votre présence parmi le jury et vous suis reconnaissante d'avoir accepté d'évaluer mon travail. 5 A, Madame le Professeur Elodie HARAUX Professeur des Universités Praticien Hospitalier (Chirurgie infantile) qui a eu la gentillesse de se rendre disponible pour faire partie de mon jury et évaluer ce travail. Avec toute ma gratitude 6 A, Monsieur le Docteur André LEKE Praticien Hospitalier Chef du service de Soins intensifs de néonatalogie et Médecine néonatale Pour son soutien et ses conseils. Je vous suis reconnaissante pour tout ce que vous m'avez appris. Travailler à vos côtés m'a beaucoup apporté scientifiquement et humainement. Je vous en remercie infiniment. 7 A mon directeur de thèse, Monsieur le Docteur Guy KONGOLO Praticien Hospitalier Unité de Réanimation Néonatale Service de réanimation Pédiatrique et Soins Continus pédiatriques Pour sa supervision bienveillante mais néanmoins rigoureuse pendant toutes ses longues heures de travail si enrichissantes. Merci de m'avoir proposée et dirigée pour cette thèse malgré un emploi du temps des plus chargés. 8 Aux équipes des différents services de pédiatrie, A mes parents : A mon père pour sa relecture attentive, ses conseils pleins de bon sens, A ma mère partie trop tôt, A mes frères, pour leur soutien inébranlable, A mon conjoint, à mes enfants pour toute l'affection dont ils m'entourent, A toute ma famille et belle-famille. 9 Table des matières 1. Introduction . 12 A/ Généralités sur le canal artériel du prématuré . 12 B/ Shunt ductal et sévérité du canal artériel . 13 C/ Marqueurs de sévérité et mécanismes de décision pour traiter le canal artériel. 13 1. 1. 1. marqueurs cliniques . 13 1. 1. 2. marqueurs biochimiques . 13 1. 1. 3. marqueurs pléthysmographiques . 14 1. 1. 4. marqueurs hématologiques . 14 1. 1. 5. marqueurs échographiques . 16 1. 1. 6. intérêt de l'évaluation de la sévérité du canal artériel . 18 D/ Modalités et limites des traitements du canal artériel . 18 E/ Corrélations cliniques entre les critères de sévérité échographiques du canal artériel et le pronostic d'évolution des prématurés . 20 2. Matériel et méthodes . 22 A/ Population de l'étude . 22 B/ Protocole de l'étude . 24 C/ Analyses statistiques . 25 3. Résultats . 25 4. Discussion . 31 5. Conclusion . 33 6. Références bibliographiques . 35 7. Résumé . 39 10 Abréviations PCA : canal artériel persistant CAHS : canal artériel hémodynamiquement significatif RDW : distribution du volume des globules rouges RPR : rapport RDW/ numération plaquettaire CHUAP : Centre Hospitalier Universitaire Amiens-Picardie SA : semaine d'aménorrhée GA : âge gestationnel CRIB : Index de Risque Clinique pour les Bébés (Clinical Risk Index for Babies) BDP : bronchodysplasie PCA : canal artériel persistant ECUN : entérocolite ulcéro-nécrosante HIV : hémorragie intra-ventriculaire AUDIPOG : Association des utilisateurs de dossiers informatisés en pédiatrie, obstétrique et gynécologie LISA : Procédure moins invasive d'administration de surfactant (Less Invasive Surfactant Administration) 11 1. Introduction A/ Généralités sur le canal artériel du prématuré Le canal artériel est une communication vasculaire reliant l'aorte et l'artère pulmonaire (cf figure 1 (1). Figure 1 Représentation anatomique du canal artériel et de ses rapports avec les gros vaisseaux thoraciques. Adapté de : Cardiologie des enfants - Les principales malformations congénitales du coeur chez l'enfant - Communications anormales - Cliniques universitaires Saint-Luc , consulté le 25 novembre 2020 (1) Chez le fœtus, le canal artériel a un rôle physiologique : il offre une issue vers l'aorte au sang éjecté par la contraction du ventricule droit ; la circulation pulmonaire leur étant fermée du fait de résistances vasculaires élevées provoquées notamment par l'hypoxie fœtale. La fermeture du canal artériel pendant la vie intra-utérine entraine une insuffisance cardiaque sévère susceptible de compromettre rapidement le pronostic vital du fœtus (2). A la naissance la fermeture spontanée du canal artériel est programmée et survient sous la stimulation de facteurs comme la baisse de la concentration de prostaglandines et l'augmentation de l'oxygénation du sang artériel. A 72h de vie, la fermeture spontanée du canal artériel est effective chez 95% des nouveau-nés à terme (3). Chez le prématuré par contre, la persistance de canal artériel est très fréquente (4), son incidence est d'autant plus élevée que le terme de naissance est faible (5). Après la naissance, la pression aortique est supérieure à la pression dans l'artère pulmonaire orientant le flux de la gauche (aorte) vers la droite (artère pulmonaire) (6). Chez les prématurés nés avant 29 semaines d'aménorrhée (SA) l'incidence de la persistance du canal artériel (PCA) varie entre 40 et 70% ; après 30 SA ce phénomène est plus rare, tendant vers moins de 30% chez les enfants nés prématurément (5). 12 B/ Shunt ductal et sévérité du canal artériel Le shunt ductal correspond au sang qui passe de l'aorte vers l'artère pulmonaire par le canal artériel et la taille du shunt se réfère au volume de sang ainsi dévié. Le sang éjecté du ventricule gauche est saturé en oxygène. Il est normalement destiné aux organes systémiques (notamment les reins, le tube digestif et le système nerveux central) (6). L'action du canal artériel soustrait une partie du débit du ventricule gauche vers la circulation pulmonaire, soustrait une partie de l'irrigation artérielle des organes systémiques qui de ce fait souffrent d'hypoxie-ischémie alors que les poumons sont au contraire en surcharge circulatoire. L'intensité de la souffrance ischémique provoquée dans les organes par le canal artériel est supposée être directement en rapport avec le volume de sang dévié dans le shunt ductal. L'évaluation de la sévérité du canal artériel correspond pratiquement à la détermination du volume de sang qui passe dans le shunt ductal. Etant donné que la mesure directe du volume sanguin qui passe dans le shunt ductal n'est pas accessible directement, plusieurs méthodes ont été proposées pour l'approcher. Le plus souvent, il s'agit de méthodes d'o l'on pense dégager la proportion du débit cardiaque qui est détourné dans le shunt ductal. Les critères tirés de l'évaluation de la taille du shunt ductal, avec d'autres éléments cliniques et évolutifs, constituent la base de l'évaluation de la sévérité du canal artériel. C/ Marqueurs de sévérité et mécanismes de décision pour traiter le canal artériel 1. 1. 1. Marqueurs cliniques Les signes cardiaques (souffle cardiaque, tachycardie persistante, hypotension artérielle, choc de pointe) ou respiratoires (cardiomégalie ou syndrome alvéolaire, augmentation des besoins ventilatoires) sont non spécifiques et parfois tardifs. 1. 1. 2. Marqueurs biochimiques Le BNP (- natriuretic peptide) et le NT pro BNP (N-terminal pro-B-type natriuretic peptide, son précurseur inactif) ont montré une corrélation forte avec la sévérité du shunt ductal, le pronostic respiratoire, la mortalité et le pronostic neurodéveloppemental (7). Ces deux hormones qui s'élèvent rapidement dans le sang en cas d'insuffisance cardiaque. Martinovici et al. (8) ont montré une diminution significative de leur taux sanguin lorsque le canal artériel est fermé (9). 13 1. 1. 3. Marqueurs pléthysmographiques Les caractéristiques de la propagation de l'onde de pouls artérielle est dépendante des propriétés mécaniques des vaisseaux sanguins (diamètre interne et rigidité) et de la viscosité selon la loi Moens-Korteweg. Goudjil et al (10) ont ainsi montré que la persistance du canal artériel était associée à une augmentation de la différence d'onde de pouls entre le membre supérieur droit (territoire pré-ductal) et un membre inférieur (territoire post-ductal). Par ailleurs, l'indice de perfusion cutanée est obtenu par l'analyse des rayons lumineux émis par des LED infra-rouges et transmis par le capteur d'oxymétrie de pouls. (technique non invasive) (11). Gomez-Pomar et al. ont montré une différence significative de l'index de perfusion entre des prématurés de moins de 29 SA avec ou sans PCA d'index de perfusion chez des prématurés de moins de 29 SA (12). Enfin, la saturation cérébrale en oxygène mesurée par la NIRS (spectroscopie dans le proche infrarouge) permet d'estimer la perfusion tissulaire (13). Lemmers et al. ont montré que la saturation cérébrale en oxygène était plus faible chez les prématurés présentant un PCA comparativement à ceux dont le canal artériel était fermé (14). 1. 1. 4. Marqueurs hématologiques Numération des plaquettes : Les études publiées dans la littérature sont discordantes en ce qui concerne la numération plaquettaire (15). Echtler et al. (16) ont montré qu'une thrombopénie le premier jour de vie était significativement associée à un canal artériel persistant (étude rétrospective chez des prématurés de 24 à 30 semaines d'aménorrhée) contrairement à Bas-Suarez et al(17) qui n'ont pas pu aboutir à la même conclusion. L'existence d'une corrélation négative entre la numération et la taille des plaquettes a nécessité de développer le concept de masse plaquettaire (nombre moyen de plaquettes multiplié par le volume plaquettaire moyen) comme meilleur prédicteur de production/ régulation de la coagulation. Akar et al. (18), cependant n'ont pas pu trouver d'association entre la masse plaquettaire et la persistance du canal artériel. 14 Numération des globules blancs : Le rapport PNN/Lymphocytes est utilisé comme marqueur de l'inflammation dans les maladies cardiovasculaires chez l'adulte (19). Un taux élevé de neutrophiles ou un faible taux de lymphocytes est associé à une augmentation de la réponse inflammatoire. Temel et al. (20) ont montré une corrélation positive entre l'âge gestationnel, le poids corporel et la persistance du canal artériel chez des prématurés de 25 à 37 semaines d'aménorrhée. Distribution du volume érythrocytaire : L'incidence du canal artériel persistant augmente en cas de chorioamniotite et de sepsis correspondant à un état inflammatoire important en association avec une hypoxie à l'origine d'une augmentation de l'indice de distribution des globules rouges (RDW). Le RDW correspond à la mesure de la variabilité de la taille des globules rouges circulant (21, 22). Il est exprimé en pourcentage du coefficient de variation du volume de distribution des globules rouges (valeur de référence entre 11-14% chez l'adulte). Garofoli et al. (23) ont montré une augmentation significative du RDW chez les prématurés nécessitant un traitement médical ou chirurgical de canal artériel. Par ailleurs, le RDW était de 17. 86 % pour les prématurés de 32 à 34 semaines d'aménorrhée et 16. 65 % pour les nouveau-nés de 37 à 42 SA. Figure 2 Illustration du principe de la détermination de l'anisocytose et du RDW. Adapté de : Ning Li, Heng Zhou, et Qizhu Tang, Red Blood Cell Distribution Width : A Novel Predictive Indicator for Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases , Disease Markers 2017 (2017)(22) 15 Distribution du volume érythrocytaire et numération plaquettaire : L'index combiné (red cell distribution width-to-platelet ratio : RPR) défini par le rapport RDW/Numération plaquettaire est un nouvel index facilement calculable, qui a montré une haute valeur prédictive des maladies inflammatoires hépatiques et cardiaques chez l'adulte (23). zer Bekmez et al. (24) ont ainsi montré qu'un RPR élevé était associé avec un canal artériel persistant hémodynamiquement significatif. 1. 1. 5. Marqueurs échographiques Depuis plus de 10 ans, l'échographie est donc devenue essentielle pour le diagnostic du canal artériel et pour l'évaluation des critères de sévérité du shunt ductal (25). La définition actuelle d'un canal hémodynamiquement significatif est problématique car elle est basée exclusivement sur la taille du shunt ductal sans prendre en compte le poids du prématuré ou son âge gestationnel. Ainsi, le rapport OG/Ao 1. 5 est un critère simple et utile. Cependant, son utilisation dans les 24 premières heures n'est pas recommandée en raison du risque de faux négatif (CIA, FOP). Le shunt ductal gauche-droit est visualisé entre l'isthme aortique et l'artère pulmonaire. Un canal artériel persistant est considéré comme significatif lorsqu'il est associé à au moins un des deux critères échographiques principaux de sévérité (10) : diamètre du canal > 2 mm et/ ou le rapport oreillette gauche/ diamètre de l'aorte > 1. 4) et au moins un autre critère secondaire de sévérité (une vitesse maximale du canal < 1, 2 m/s, une vitesse moyenne dans l'artère pulmonaire gauche > 0, 4 m/s avec une vitesse diastolique dans l'artère pulmonaire gauche > 0, 2 m/s. Marqueurs de la phase d'évaluation des critères de sévérité du shunt ductal : l'étude de Su et al. en 1999 (26) a permis d'établir les phases d'évolution du canal artériel selon l'aspect du flux ductal : 1- hypertension pulmonaire avec un flux bidirectionnel (shunt droit- gauche prédominant), 2- flux bidirectionnel (shunt gauche- droit prédominant) en cours d'installation ; 3- CA significatif gauche-droit avec un profil pulsatile de Vmax > 1. 5 m/s : stigmate de sévérité ; et 4- CA en voie de fermeture gauche -droit, avec un profil de flux rapide (Vmax > 1. 5 m/s). Par ailleurs, un flux diastolique inversé dans l'aorte descendante ou un flux nul ou inversé dans les artères cérébrales ou rénales peut aussi indiquer un shunt ductal hémodynamiquement significatif. 16 L'association de ces critères et la répétition de leur mesure dans le temps augmentent la performance clinique de l'échographie. En effet, de précédentes études ont montré qu'un diamètre de plus 2 mm était associé dans 41. 2% des cas avec un canal artériel persistant d'hypertension pulmonaire qui a été traité alors qu'il demeurait non significatif et aurait probablement pu se fermer spontanément. MacNamara et al ont ainsi proposé des critères cliniques et échographiques de canal artériel hémodynamiquement significatif (Figure 2) (5, 25). Figure 3 Critères échographiques de sévérité pour le canal artériel. Adapté de : P. J McNamara et A. Sehgal, Towards Rational Management of the Patent Ductus Arteriosus : The Need for Disease Staging , Archives of Disease in Childhood - F424-27(5) Fetal novembre Edition and Neonatal 6 (1 92, no 2007) : Figure 4 Images échographiques d'un canal artériel persistant avec un shunt gauche- droit (flux rouge à droite) Adapté de : Arvind Sehgal et Patrick J. McNamara, Does Echocardiography Facilitate Determination of Hemodynamic Significance Attributable to the Ductus Arteriosus ? , European Journal of Pediatrics 168, no 8 (août 2009) : 907-14(25) 17 1. 1. 6. Intérêt de l'évaluation de la sévérité du canal artériel Une conception acceptée d'une grande partie des praticiens est celle de la responsabilité du canal artériel dans l'augmentation du risque des complications néonatales associées. Le corollaire est qu'obtenir d'interrompre le canal artériel aiderait à prévenir les complications ou à les atténuer. Cette interprétation même si elle est répandue reste encore très discutée, car beaucoup d'autres praticiens pensent que le canal artériel et les complications associées sont toues des conséquences de mécanismes plus complexes ; il n'existerait donc pas entre eux de relation directe de cause à effet. D/ Modalités et limites des traitements du canal artériel L'ibuprofène est utilisé en première ligne du traitement médical du canal artériel (27). De 1976 à 2004, l'indométacine a été l'AINS utilisé pour le traitement du PCA jusqu'à ce que la forme IV de l'ibuprofène obtienne son autorisation de mise sur le marché dans les années 2000. Les données de la littérature ont montré que l'ibuprofène était aussi efficace que l'indométacine pour la fermeture du PCA avec notamment moins d'altération sur la circulation cérébrale, intestinale et rénale (28). L'administration prophylactique d'indométacine dans les douze premières heures de vie, diminue le risque d'hémorragie pulmonaire et d'hémorragie cérébrale intraventriculaire de grade 3 ou 4 mais n'améliore pas le développement psychomoteur à long terme ou le pronostic respiratoire (29). La diminution du risque d'hémorragie intraventriculaire précoce peut ne pas être liée à la fermeture du PCA sachant que cette neuroprotection n'est pas reproductible dans les études en cas de traitement curatif du PCA avec l'ibuprofène. L'efficacité de l'ibuprofène pour la fermeture du CA en elle-même, et dans la prévention de l'hémorragie pulmonaire précoce est bien documentée (30). En revanche, les bénéfices sur la mortalité, la bronchodysplasie et le devenir neurocognitif avec l'utilisation d'ibuprofène sont encore débattus (29). Malgré les bénéfices, le traitement par ibuprofène chez les nouveau-nés prématurés comprend également des risques. Les types d'effets adverses habituellement attribués à l'ibuprofène peuvent également être observés comme conséquences des désordres circulatoires associés au PCA (5). Les risques inhérents à l'ibuprofène sont largement répertoriés dans la littérature. 18 Le traitement par ibuprofène peut entraner des effets secondaires gastro-intestinaux (perforation intestinale spontanée, entérocolite nécrosante), une insuffisance rénale transitoire (oligurie, augmentation de l'urée et de la créatinine dans le sang, insuffisance rénale), une hyperbilirubinémie, et une altération de la perfusion cérébrale. Les contre-indications au traitement par ibuprofène sont donc : l'infection mettant en jeu le pronostic vital ; toute hémorragie, en particulier hémorragie intracrânienne ou gastro-intestinale ; la thrombocytopénie ou troubles de la coagulation ; l'insuffisance rénale significative ; la cardiopathie congénitale quand l'ouverture du canal artériel est nécessaire pour assurer un débit sanguin pulmonaire ou systémique satisfaisant (par exemple atrésie pulmonaire, tétralogie de Fallot grave, coarctation de l'aorte grave) ; et l'entérocolite nécrosante connue ou suspectée. Ainsi, malgré plusieurs décennies de recherche, il semble toujours difficile d'établir un consensus sur la prise en charge optimale des nouveau-nés avec PCA (31). Malgré des données pharmacocinétiques rassurantes, le traitement oral par ibuprofène est encore peu utilisé, alors qu'une forte dose d'ibuprofène oral était associée dans les études à une fermeture du PCA plus importante qu'avec des doses IV d'ibuprofène ou d'indométacine et qu'il n'est pas associé à une augmentation du risque d'entérocolite ulcéro-nécrosante ; suggérant qu'un PCA est en lui-même un facteur de risque significatif d'entérocolite nécrosante (28). La prise en charge du canal artériel a évolué en 40 ans passant du traitement prophylactique au traitement conservateur qui consistait au départ en un traitement médical ou chirurgical en cas de critères cliniques et échocardiographiques de sévérité à récemment l'absence de traitement spécifique (traitement symptomatique uniquement : restriction hydrique ou assistance ventilatoire). Mitra and al (28) ont montré qu'un traitement placebo ou conservateur n'était pas associé avec une augmentation de la mortalité, du nombre d'entérocolite nécrosante ou une hémorragie cérébrale. D'autres études restent nécessaires pour évaluer si le traitement du PCA améliore le pronostic d'évolution du prématuré. L'alternative au traitement médicamenteux est la ligature chirurgicale permettant une fermeture rapide et définitive avec cependant le risque post-opératoire d'une instabilité hémodynamique et d'une défaillance respiratoire nécessitant une escalade de soins de support intensifs (29). Les risques à long terme incluent la paralysie des cordes vocales par lésion du nerf récurrent ou la paralysie diaphragmatique, un chylothorax et une scoliose. 19 Le risque de bronchodysplasie, de rétinopathie et de trouble neuro-développemental est par ailleurs augmenté. Ainsi une technique de fermeture du PCA percutanée (cathétérisme) a été développée et montre des résultats prometteurs. E/ Corrélations cliniques entre les critères de sévérité échographiques du canal artériel et le pronostic d'évolution des prématurés Le consensus tacite qui voudrait que tout canal artériel persistant soit pathologique est trop simple (25). Dans certaines situations cliniques il peut être non symptomatique alors que dans d'autres situations il peut être à l'origine de conséquences pathologiques importantes avec la nécessité d'une détection et d'un traitement précoces pour prévenir une morbidité néonatale. A court terme la présence d'un canal artériel hémodynamiquement significatif entraine une hypotension précoce avec nécessité d'introduire des amines vasopressives comme la dopamine ou la dobutamine. Cependant ces traitements pourraient majorer le shunt ductal gauche-droit en augmentant les résistances vasculaires systémiques. Le manque d'évidence sur la relation de cause à effet, d'échec du traitement médical et de risque inhérent au traitement médical ou chirurgical ont amené les cliniciens à se demander quand une prise en charge était réellement nécessaire. Il est nécessaire de considérer la présence d'un canal artériel hémodynamiquement significatif comme un continuum physiologique avec un spectre d'effets cliniques dépendant du volume du shunt transductal et de la capacité du myocarde immature à s'adapter. De récentes études sur les AINS n'ont pas montré une diminution significative de la morbidité néonatale chez les prématurés avec un PCA. Bien que la présence d'un canal artériel hémodynamiquement significatif soit liée à d'importantes morbidités néonatales comme une insuffisance respiratoire chronique ou une entérocolite nécrosante, il y a peu d'évidence que le traitement améliore le pronostic à court et long terme. Cela peut être expliqué par le fait que la définition de l'insuffisance respiratoire chronique est multifactorielle et ne prend pas en compte les différents stades de sévérité de la maladie. Dans les principales études, les prématurés nécessitant une faible oxygénothérapie sont catégorisés de la même manière que ceux nécessitant une ventilation par oscillations à haute fréquence ou du monoxyde d'azote inhalé. Malgré d'âpres discussions existant concernant l'intérêt ou le danger d'activer la fermeture du canal artériel (31), le traitement par inhibiteurs de COX1 (ibuprofène, indométacine), paracétamol et le traitement chirurgical restent de pratique courante (27). 20 Les critères échographiques classiquement appliqués (25) pour orienter la prise en charge du canal artériel restent faiblement corrélés avec le devenir ultérieur des prématurés traités (29) ; ce qui explique l'activité très intense qui existe dans la recherche des marqueurs alternatifs reposant sur des principes indépendants de l'échographie. Ainsi, les caractéristiques de la distribution statistique du volume des hématies (RDW) sont l'objet d'études visant à dégager des corrélations intéressantes pour la sévérité de l'état du patient dans certaines maladies chez l'adulte et l'enfant (23). Les caractéristiques de RDW ont été bien étudiées chez le nouveau-né sain à terme, en cas de retard de croissance intra-utérin et chez le nouveau-né prématuré. Des résultats sont peu nombreux et restent contradictoires sur l'intérêt de la détermination de RDW et du ratio RPR RDW/Numération plaquettaire chez le prématuré pour évaluer la sévérité du canal artériel (24). L'objectif principal de notre projet actuel est d'évaluer les corrélations entre le ratio-RPR (RDW/Taux des plaquettes) et le statut de sévérité du shunt ductal déterminé par les critères classiques d'échographie doppler trans-thoracique chez les prématurés au cours de la surveillance du canal artériel. Tout ceci pour vérifier, la reproductibilité des résultats publiés par d'autres auteurs avant nous, sur notre population de prématurés de moins de 32 semaines d'aménorrhée hospitalisés au CHU Amiens-Picardie en 2018 et 2019. L'objectif secondaire était de vérifier si les corrélations étudiées persistaient même après la prise en compte des facteurs confondants tels que l'âge gestationnel, le poids de naissance, l'hémorragie intraventriculaire, le sexe, la détresse respiratoire et le traitement par amines vasoactives et par lipides intraveineux. 21 2. Matériel et méthodes A/ Population de l'étude Nous avons mené une étude rétrospective, observationnelle, descriptive et monocentrique. Les dossiers médicaux électroniques sur DXCare de tous les enfants admis dans le service de réanimation néonatale du CHUAP entre le 1er janvier 2018 et le 31 décembre 2019 ont été examinés. Les nouveau-nés prématurés d'âge gestationnel inférieur à 32 semaines d'aménorrhée ont été inclus dans l'étude. Les critères d'exclusion étaient : la présence de malformations congénitales dont cardiaques, le décès durant les 48 premières heures de vie, le transfert au CHUAP après la première semaine de vie. La direction de la recherche locale avait approuvé l'étude. Nous avons relevé les données cliniques des patients (âge gestationnel, sexe, poids/taille/périmètre crânien de naissance), ainsi que les caractéristiques périnatales et néonatales (chorioamnionite, oligoamnios, hydramnios, pathologie placentaire vasculaire ou hémorragique, grossesse simple/gémellaire, corticothérapie anténatale pour la maturation foetale et la neuro-protection fœtale par sulfate de magnésium, mode d'accouchement, inborn/outborn, survenue d'anomalies du rythme cardiaque fœtal, score d'Apgar, index de risque clinique pour le nouveau-né (CRIB), présence d'un PCA, traitement par ibuprofène ou ligature chirurgicale, hémorragie pulmonaire, dysplasie bronchopulmonaire (DBP, définie par la dépendance à l'oxygène à 36 semaines d'aménorrhée conjuguée à des symptômes respiratoires cliniques persistants et à des anomalies compatibles aux radiographies pulmonaires (33), traitement antibiotique, support respiratoire, administration de surfactant par la sonde d'intubation trachéale, administration du surfactant par la technique LISA, entérocolite ulcéro-nécrosante (ECUN) codée selon la classification de Bells modifiée (figure 5) (34), hémorragie intra-ventriculaire (HIV) selon la classification de Papile (figure 6) (35), hydrocéphalie post-hémorragique et dérivation ventriculaire, support circulatoire par amines vasopressives, monoxyde d'azote inhalé dans les 72 premières heures de vie, la survenue du décès, et la durée d'hospitalisation. La significativité du CA a été définie selon les critères communément admis dans la littérature (25), et la qualité de la croissance pondérale a été évaluée par le petit poids pour l'âge gestationnel selon les courbes AUDIPOG. 22 Les données biologiques recueillies avant et après le début de traitement d'un PCA par ibuprofène correspondaient à la créatininémie, le taux d'hémoglobine, le volume globulaire moyen, le taux de globules rouges, les caractéristiques de la distribution statistique du volume des hématies (RDW), la numération plaquettaire et le ratio RPR RDW/PLT (109/L) a été calculé. Figure 5 Classification de Bell pour les entérocolites ulcéro-nécrosantes. Adapté de : M. J. Mller, T. Paul, et S. Seeliger, Necrotizing enterocolitis in premature infants and newborns , Journal of Neonatal-Perinatal Medicine 9, no 3 (16 septembre 2016) : 233-42 (34) Figure 6 Classification de Papile sur les hémorragies intraventriculaires. Adapté de : Marie-Amélie Rocchisani, Hémorragies intra ventriculaires fœtales de grade III et devenir neurologique , s. d. , 80. (35) 23 B/ Protocole de l'étude 1) Classification de patients dans 2 groupes selon qu'il existait (CAHS) un canal artériel significatif ou pas (Non-CAHS) Le CHUAP, est l'un des deux hôpitaux universitaires de la région Hauts-de-France, comprend une unité de réanimation de niveau 3 apportant des soins aux nouveau-nés prématurés à partir de 23 semaines d'aménorrhée. Dans cette unité, l'évaluation écho cardiographique du canal artériel débute au 2ème jour de vie, puis toutes les 24 heures pour les enfants prématurés nés avant 28 semaines APC et toutes les 48 heures pour les enfants prématurés nés après 28 semaines APC. Tous les pédiatres de l'unité sont formés à la pratique de l'échographie trans- thoracique. L'évaluation du canal artériel, à l'aide de critères échographiques (Figure 7) (25), a permis une classification en 2 catégories : CA hémodynamiquement significatif et CA hémodynamiquement non significatif. Les enfants sont traités avec de l'ibuprofène lorsque le CA montre des critères de significativité à l'échographie, associés à des symptômes cliniques, et en l'absence de contre- indication à ce produit. 2) Appariement des patients en fonction du terme de naissance Plusieurs études montrent que la maturation de l'enfant est un déterminant qui influence fortement diverses caractéristiques hématologiques. Ce facteur n'a pas été pris en compte dans la plupart d'études que nous avons pu trouver dans la littérature. Pour y pallier dans notre étude actuelle, nous avons procédé à un appariement (1 : 1, c. à. d. 1 cas d'enfant cahs pour 1 témoin non-cahs ) des patients avec la contrainte de l'âge gestationnel à la naissance qui ne devait pas différer de plus de 0. 5 semaines (c. à. d. 3 j) entre les deux enfants d'une même dyade. Dans cette étude, toutes les évaluations ont été réalisées avec le même échographe CX 50 POC (Philips, Amsterdam, Pays-Bas). Figure 7 Critères échographiques de sévérité du canal artériel au CHUAP (à gauche : flux sanfuin dans l'artère pulmonaire gauche, au milieu : taille du canal artériel, à droite : vitesse du shunt ductal) 24 C/ Analyses statistiques La description des variables quantitatives a été effectuée par la moyenne et l'écart type. Nous avons utilisé le test t pour la comparaison des groupes 2 par 2 pour les variables quantitatives. La description des variables qualitatives a été effectuée par la proportion et l'effectif ; la comparaison des groupes pour les proportions a été effectuée par le test du chi carré. Les tests non paramétriques ont été appliqués pour les variables qui n'étaient pas gaussiennes. La régression logistique conditionnelle univariée et multivariée a été utilisée pour étudier la liaison entre RPR et le statut du canal artériel en tenant compte des facteurs confondant. Le seuil de significativité statistique (erreur-) était fixé à 5% (p Les analyses statistiques ont toutes été effectuées à l'aide des bibliothèques statistiques du langage de programmation R. 25 4. Résultats Deux cent quatre-vingt-douze nouveau-nés prématurés d'âge gestationnel inférieur à 32 semaines d'aménorrhée ont été admis dans l'unité de réanimation du CHUAP entre le 1er janvier 2018 et le 31 décembre 2019. Parmi eux, 21 n'ont pas été inclus dans notre étude pour différentes raisons : cardiopathies congénitales (n 5), malformations congénitales majeures (n 2), transfert au CHUAP après la première semaine de vie (n 3) et enfin la survenue d'un décès avant 48 heures de vie (n 11). Parmi ces 11 enfants décédés, 4 ont souffert de troubles hémodynamiques, 3 d'une hypertension pulmonaire, 3 d'une anoxie périnatale, 1 d'un choc septique et 1 d'une hémorragie pulmonaire. Ainsi, 271 prématurés (129 F / 142 M) ont été inclus dans notre étude. Parmi eux quatorze n'ont pas été inclus dans les analyses à cause de données manquantes. Il restait 257 patients pour l'étude : 163 n'avaient pas de canal artériel hémodynamiquement significatif (CAHS) et 94 présentaient un CAHS. Les deux groupes étant très différents par rapport à l'âge gestationnel (29. 2 en cas d'absence de CAHS vs 26. 6 en cas de CAHS) et sachant que le RDW est très influencé par l'âge gestationnel, nous avons procédé à une analyse appariée. Dans un premier temps, nous avons recherché les couples d'enfant dont l'âge gestationnel ne différait pas de plus de 0. 5 semaines l'un de l'autre et qui appartenaient chacun aux deux groupes. Nous avons donc gardé uniquement pour cette analyse 132 enfants (figure 8). Les caractéristiques cliniques et biologiques de ces prématurés sont présentées dans les tableaux 1 à 4. Le terme de naissance des patients de notre étude était de 27. 5 0. 3 SA ; les deux groupes appariés étaient comparables pour le terme de naissance ainsi que pour la plupart des caractéristiques périnatales de base (Tableau 1). La première détermination de RPR était de 0. 12 0. 21 dans l'ensemble de la population (Tableau 2) ; elle n'était pas différente (p 0. 23) entre les deux groupes : 0, 10 0. 07 (Non-CAHS) et 0. 14 0. 29 (CAHS). La numération des globules rouges était plus élevée chez les patients du groupe Non-CAHS (3. 9 0. 7/mm3) que chez ceux du groupe CAHS (3. 6 0. 5/mm3). Les deux groupes différaient également dans la même façon pour la valeur de la concentration d'hémoglobine à l'admission dans le service. Les valeurs de RPR, GR et Hb sur les bilans réalisés à J3 environ (après le début du traitement) étaient comparables à ceux du premier jour de vie et les résultats de la comparaison des deux groupes figurent dans le tableau 3. 26 Dans le tableau 4, peuvent être trouvés les résultats de l'analyse multivariée qui englobe RPR et les différents autres facteurs susceptibles de modifier sa valeur et qui s'étaient révélés significatifs à p en analyse univariée. Seuls le taux de globules rouges et la qualité de croissance staturale montraient une association indépendante avec le canal artériel significatif. En analyse multivariée, aucune caractéristique obstétricale n'a montré d'association avec la valeur de RPR, de même que les analyses biochimiques sur le sang du nouveau-né à l'admission (protidémie, créatininémie et lactates). La deuxième détermination de RPR réalisée correspondant à la situation après traitement par ibuprofène, n'était pas non plus différente dans les 2 groupes (CAHS vs Non-CAHS). Figure 8 Flux des patients dans notre étude 292 prématurés < 32 SA hospitalisés au CHUAP en 2018 et 2019 5 cardiopathies congénitales 2 malformations congénitales majeures 3 transferts au CHUAP après 7 j de vie 11 dèces < 48h de vie 14 données incomplètes 257 prématurés 125 sans appariement 132 prématurés appariés pour l'AG 0. 5 SA 27 Tableau 1 Caractéristiques démographiques néonatales Caractéristiques Non-CAHS CAHS N 66 N 66 Total N 132 P (entre Non-CAHS et CAHS) AGN (SA) 27. 6 1. 7 27. 3 1. 8 27. 5 0. 3 PN audipog 48. 6 32. 3 53. 6 30. 6 51. 1 31. 5 TN audipog 43. 7 28. 6 43. 8 29. 2 46. 2 29. 9 Genre F % (n) 56. 1% (37) 45. 4% (30) 50. 8% (67) Apgar 1 Apgar 5 6. 6 2. 7 5. 8 3. 4 6. 2 3. 1 8. 2 1. 7 7. 4 2. 8 7. 8 2. 4 0. 45 0. 36 0. 33 0. 20 0. 20 0. 08 Lisa (%) 27. 7%(18) 10. 8%(7) 19. 2%(25) 0. 014 CRIB 9. 63. 3 10. 13. 5 9. 93. 4 Hgie pulmonaire (%) 6. 1%(4) 13. 6%(9) 9. 8%(13) 0. 41 0. 14 Bronchodysplasie 32. 620. 3 43. 533. 4 3828 0. 02 CAN (%) 67. 7%(44) 43. 9%(29) 55. 7%(73) 0. 006 Sulfate. Magnésium (%) Chorioamniotite (%) 73. 8%(48) 57. 6%(38) 65. 8%(86) 0. 05 31. 8(21) 21. 2%(14) 26. 5%(35) 0. 17 ECUN 2 9. 1%(6) 16. 7%(11) 12. 9%(17) 0. 19 HIV3-4 (%) 24. 2%(16) 24. 2%(16) 24. 2%(32) 1 72h (%) 84. 8%(56) 92. 4%(61) 88. 6%(117) 0. 17 Transfusion > 1 (%) 21. 2%(14) 27. 3%(18) 24. 2%(32) 0. 41 Décès (%) 20%(13) 31. 8%(21) 25. 9%(34) 0. 12 AGN : âge gestationnel à la naissance ; PN : poids de naissance ; TN : taille de naissance ; Genre F : féminin ; CRIB : Clinical Risk Index for Babies ; LISA : Less invasive surfactant administration ; Hgie : hémorragie ; CAN : corticothérapie anténatale ; ECUN : entérocolite ulcéronécrosante ; HIV : hémorragie intraventriculaire ; ATB : antibiothérapie 28 Tableau 2 Caractéristiques hématologiques avant traitement du canal artériel Caractéristiques Non- CAHS N 66 CAHS N 66 Total N 132 P (entre Non-CAHS et CAHS) Hb 1 (mmol/l) 14. 3 2. 1 13. 3 2. 0 13. 8 0. 4 GR 1 (/mm3) 3. 9 0. 7 3. 6 0. 5 3. 8 0. 6 VGM 1 114. 8 9. 3 114. 9 8. 5 114. 9 8. 9 Plq1 x103(/mm3) 201. 4 63. 6 190. 9 65. 3 196. 2 64. 4 Vol-Plaq 1 9. 20. 9 9 0. 8 9. 1 0. 8 RDW 1 17. 3 1. 4 17. 31. 4 17. 3 1. 4 RPR 1 0. 10 0. 07 0. 14 0. 29 0. 12 0. 21 0. 005 0. 016 0. 93 0. 35 0. 43 0. 85 0. 23 Hb : Hémoglobine ; GR : globules rouges ; VGM : volume globulaire moyen ; Plq : plaquettes ; RDW distribution du volume érythrocytaire Tableau 3 Caractéristiques hématologiques après le début du traitement du canal artériel Caractéristiques Non- CAHS N 66 CAHS N 66 Total N 132 P (entre Non-CAHS et CAHS) Hb 2 (mmol/l) 13. 3 2. 6 11. 6 2. 0 12. 6 2. 4 GR 2 (/mm3) 3. 76 0. 73 3. 35 0. 59 3. 55 0. 69 VGM 2 112. 3 9. 5 110. 7 13. 6 111. 5 11. 7 Plq2 x103(/mm3) 298 108 178 79. 9 188 75. 4 Vol-Plaq 2 10. 11. 1 10. 4 2. 9 10. 3 2. 2 RDW 2 18. 3 2. 2 18. 42. 3 18. 3 2. 3 RPR 2 0. 12 0. 1 0. 14 0. 11 0. 13 0. 09 0. 0005 0. 0007 0. 44 0. 24 0. 41 0. 75 0. 25 Hb : Hémoglobine ; GR : globules rouges ; VGM : volume globulaire moyen ; Plq : plaquettes ; RDW distribution du volume érythrocytaire 29 Tableau 4 Analyse multivariée Caractéristiques Coeff. (a) P univarié Coeff. (b) P multivarié RPR1 GR1 Croissance staturale ARCF Outborn CAN Sulfate Mg Chorioamniotite Apgar1 CRIB LISA 1. 46 -0. 8 0. 009 -0. 61 1. 4 -0. 86 -0. 87 -0. 56 -0. 1 0. 12 -1. 2 0. 32 0. 021 0. 21 0. 13 0. 005 0. 024 0. 039 0. 152 0. 155 0. 21 0. 04 -2. 61 0. 15 6. 5 -0. 76 2. 43 0. 04 0. 02 0. 08 0. 053 0. 068 (a) analyse univariée ; (b) analyse multivariée GR : globules rouges ; ARCF : Anomalie du rythme cardiaque fœtal ; Outborn : nés hors du CHU ; CAN : Corticothérapie anténatale ; Mg : magnésium, CRIB : Clinical Risk Index for Babies ; LISA : Less invasive surfactant administration 30 5. Discussion Notre objectif principal était d'évaluer les corrélations entre le ratio-RPR (RDW/Taux des plaquettes) et le statut de sévérité du shunt ductal déterminé par les critères classiques d'échographie doppler chez les prématurés au cours de la surveillance du canal artériel. Les analyses effectuées dans le cadre de notre étude actuelle n'ont pas retrouvé de corrélation entre le ratio-RPR et le statut de sévérité du canal artériel. zer Bekmez et al. (24) avait cependant montré qu'un RPR élevé était associé avec un canal artériel persistant hémodynamiquement significatif. (CAHS) ; La publication de zer Bekmez rapportait une étude rétrospective non appariée sur l'âge gestationnel. Nous n'avons pas non plus trouvé de corrélation entre le taux de plaquettes et la présence de CAHS. Cependant, certaines études rétrospectives ont montré une corrélation modérée entre le canal artériel persistant (PCA) et la thrombopénie (34). Une étude de cohorte prospective a mis en évidence une corrélation entre un PCA à 7 jours de vie chez des prématurés < 34 SA et une thrombopénie ( 000/mm3). Cette étude présentait cependant plusieurs limites notamment un effectif de faible taille, une médiane d'âge gestationnel élevé (31-32 SA) (35). Dans notre étude actuelle, le seul critère hématologique significatif même après l'analyse multivariée était le nombre de globules rouges (p 0. 04) sur la numération sanguine réalisée dans les tous premiers jours de vie, lors de l'admission dans le service. La concentration d'hémoglobine sur le même bilan qui était également très significative en analyse uni-variée, n'a pas été incluse dans le modèle multivariée car elle était fortement corrélée au nombre de globules rouges (0, 80, p ; ceci pouvait poser un problème de redondance. Le taux d'érythroblastes (globules rouges nucléés) à la naissance était également significativement corrélé avec un PCA dans la littérature (34) ; Les auteurs de cet article avaient émis l'hypothèse que l'augmentation du taux d'érythroblastes était liée à une hypoxémie chronique intra-utérine. En effet, le canal artériel est très sensible au taux d'oxygène dans le sang et une hypoxémie intra-utérine significative pourrait être à l'origine de la persistance du canal artériel chez le nouveau-né. Une grande étude de cohorte, chez des prématurés de moins de 31 SA, a montré un taux d'érythroblaste plus élevé chez les enfants avec CAHS (3770/mm3) par rapport à la valeur trouvée chez les enfants dont le canal artériel était fermé (865/mm3). Un taux d'érythroblastes de 3750/mm3 était lié à la présence d'un CAHS, avec une spécificité de 88% et une sensibilité de 57% (36). 31 Par ailleurs, le RDW n'était pas un facteur de risque de PCA retrouvé dans notre étude. Garofoli et al. (23) avait cependant montré une augmentation significative du RDW chez les prématurés nécessitant un traitement médical ou chirurgical pour un canal artériel persistant. La figure 8 montre quelques circonstances physiopathologiques d'altération du RDW. Figure 9 Circonstances physiopathologiquesd'altération du RDW. Adapté de : Ning Li, Heng Zhou, et Qizhu Tang, Red Blood Cell Distribution Width : A Novel Predictive Indicator for Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases , Disease Markers 2017 (2017) (22) L'anémie sévère est une cause connue d'hétérogénéité de la taille des globules rouges et d'augmentation du taux de distribution des globules rouges (22). Il a été prouvé que l'anémie est un facteur de risque de maladie cardiovasculaire, les principaux mécanismes incluant un stress inflammatoire, une production inadéquate d'érythropoïèse (39). Les précédentes études ont montré que les cytokines inflammatoires inhibent la maturation de l'érythropoïétine induite par l'érythrocyte en inhibant la moelle osseuse (inhibition des proérythroblastes), ce qui peut être à l'origine de l'augmentation du RDW (40). Les cytokines de l'inflammation peuvent aussi inhiber la synthèse d'EPO (TNF-, IL-1b, and IL-6) et de l'hémoglobine à l'origine d'une anémie inflammatoire chronique (41). L'inhibition des progéniteurs érythrocytaires de la moelle osseuse désensibilise les récepteurs cellulaires de l'EPO et donc diminue la production des globules rouges (42). L'anémie sévère serait à l'origine d'hypertension pulmonaire secondaire et d'hémolyse secondaire. La présence d'hémoglobine libre plasmatique inactive les vasodilatateurs intrinsèques : NO et arginase-1 ce qui augmente le RDW (par inhibition de la NO synthétase qui diminue la déformabilité des globules rouges) (43). La taille des globules rouges diminue avec leur maturation, ce qui augmente le RDW. Les globules rouges matures ont une capacité d'adhésion aux cellules endothéliales et sont donc thrombogènes. Les données de la littérature confirmerait la corrélation entre les effets prothrombogènes et l'augmentation du RDW dans les maladies vasculaires cérébrales (par activation du système rénine-angiotensine via l'angiotensine II) (44). La croissance staturale était la seule variable clinique indépendamment associée avec la présence d'un canal artériel significatif. Nous n'avons pas d'explication à proposer pour cette corrélation. 32 D'autres études sont nécessaires pour confirmer ce résultat et en comprendre la signification physiologique. Les modifications constatées sur la numération des globules rouges selon le statut du canal artériel sont probablement la conséquence d'une perturbation du foie et de la rate par la baisse du débit splanchnique relatif au shunt ductal ; en effet, le foie et la rate jouent encore un rôle non négligeable sur l'érythropoïèse du prématuré. En analyse univariée, le taux de césarienne, la gémellité, l'oligoamnios, l'hydramnios, l'hémorragie placentaire, les pathologies vasculaires du placenta, la dystocie des épaules, les amines vasopressives, le monoxyde d'azote inhalé, la dérivation ventriculaire et le traitement antifongique n'étaient pas des facteurs de risque de CAHS (0. 05). L'anomalie du rythme cardiologique fœtal était à la limite de la significativité en univarié (p 0. 07) mais pas en multivarié (tableau 5). Concernant les données biologiques biochimiques (lactates, protidémie, créatininémie) : il y avait une différence statistiquement significative entre les deux groupes uniquement pour la créatininémie (p 0. 01) mais pas en multivarié. Par ailleurs, l'évaluation de la bronchodysplasie dans notre étude est sûrement sous-estimée, la plupart des prématurés étant transférés dans des hôpitaux généraux plus proches de leur domicile avant l'âge de 36 semaines d'âge post-conceptionnel. L'Apgar à 1 minute de vie, le score de CRIB et le fait de natre en dehors du CHU étaient à la limite de la significativité en analyse univariée, même si elle n'était pas confirmée en analyse multivariée ; ces résultats pourraient être compatibles avec une sévérité clinique du prématuré en anténatal. Une des limites de notre étude est la nature rétrospective et monocentrique. Cependant, notre hôpital est le centre de référence pour les nouveau-nés prématurés de très faible poids de naissance dans la région Picardie. Les données hématologiques ont été recueillies avant et après le début du traitement (soit environ J1 et J3). Nous n'avons pas de données biologiques après confirmation échographique de la fermeture du canal artériel. Nous reconnaissons que notre effectif était faible (132/ 271 51% des prématurés inclus), cependant, une analyse appariée était indispensable pour éliminer un éventuel biais de confusion sur l'âge gestationnel. En effet, les deux groupes avant appariement étaient très différents par rapport à l'âge gestationnel (29. 2 SA en cas d'absence de CAHS vs 26. 6 SA en cas de CAHS). Nous notons également que le seul traitement pharmacologique utilisé au CHUAP est l'ibuprofène, alors que d'autres molécules sont utilisées dans les données de la littérature. 33 7. Conclusion Les résultats de notre étude actuelle n'ont pas confirmé le ratio-RPR comme critère hématologique discriminant pour le statut de sévérité du canal artériel, tout comme le RDW ou le taux de plaquettes. Le seul critère hématologique indépendant était le taux de globules rouges. D'autres études sont nécessaires pour confirmer cette corrélation et en trouver la signification physiopathologique. La prise en charge du PCA reste controversée, du fait des variations individuelles de la réponse au traitement. Actuellement, les décisions thérapeutiques sont guidées essentiellement par des critères échographiques et des signes d'insuffisance respiratoire. La poursuite de la recherche pour découvrir de nouveaux critères diagnostiques efficaces semble indispensable pour développer des approches individualisées pour assurer une meilleure prise en charge des troubles hémodynamiques et des complications associés au canal artériel. 34 8. Références bibliographiques 1. Cardiologie des enfants - Les principales malformations congénitales du coeur chez l'enfant - Communications anormales - Cliniques universitaires Saint-Luc [Internet]. [cité 25 nov 2020]. Disponible sur : coeur-malade/malformations-congenitales/malformations-congenitales. html 2. Hung Y-C, Yeh J-L, Hsu J-H. Molecular Mechanisms for Regulating Postnatal Ductus Arteriosus Closure. Int J Mol Sci. 25 juin 2018 ; 19(7). 3. Gentile R, Stevenson G, Dooley T, Franklin D, Kawabori I, Pearlman A. 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Inflammatory cytokine inhibition of erythropoiesis in patients implanted with a mechanical circulatory assist device. Perfusion. mars 2005 ; 20(2) : 83 90. 41. Melgar-Lesmes P, Garcia-Polite F, Del-Rey-Puech P, Rosas E, Dreyfuss JL, Montell E, et al. Treatment with chondroitin sulfate to modulate inflammation and atherogenesis in obesity. Atherosclerosis. févr 2016 ; 245 : 82 7. 42. Tanyong DI, Panichob P, Kheansaard W, Fucharoen S. Effect of Tumor Necrosis Factor-Alpha on Erythropoietin and Erythropoietin Receptor-Induced Erythroid Progenitor Cell Proliferation in -Thalassemia/Hemoglobin E Patients. Turk J Haematol. déc 2015 ; 32(4) : 304 10. 43. Patel KV, Mohanty JG, Kanapuru B, Hesdorffer C, Ershler WB, Rifkind JM. Association of the Red Cell Distribution Width with Red Blood Cell Deformability. Adv Exp Med Biol. 2013 ; 765 : 211 6. 44. Oxidative stress and hypertension - Karthikeyan - 2006 - International Journal of Clinical Practice - Wiley Online Library [Internet]. [cité 25 nov 2020]. Disponible sur : 38 9. Résumé Distribution du volume érythrocytaire et évaluation du canal artériel du prématuré Introduction : La recherche des critères de sévérité du shunt ductal est importante pour argumenter la décision de traiter médicalement ou chirurgicalement le canal artériel. Les critères indépendants de l'échographie sont recherchés en particulier pour compléter cette technique de référence dont les limites sont constatées par la faiblesse des corrélations du diagnostic échographique avec l'incidence des complications. Le rapport de la dispersion du volume des globules rouges par le taux de plaquettes (RPR) a été récemment proposé dans plusieurs publications comme indicateur efficace de canal artériel hémodynamiquement significatif (CAHS). Les conclusions sont contradictoires puisque ces résultats ne sont pas retrouvés dans d'autres recherches. Objectif : Déterminer les corrélations entre la survenue de CAHS et la valeur du ratio-RPR déterminé sur le bilan sanguin à la naissance et dans les premiers jours de vie. Matériel et Méthode : Etude rétrospective, monocentrique réalisée sur les enfants prématurés < 32 SA hospitalisés au CHU Amiens-Picardie en 2018 et 2019. Résultats : Au total, 292 patients ont été répertoriés parmi lesquels 35 ont été exclus de l'analyse pour malformation congénitales graves et décès précoces Le reste de patients étaient étudiés dans une approche d'analyse appariée sur le terme de naissance 0. 5 SA. Après élimination de 125 patients, les 132 restants ont été testés pour l'association entre le CAHS et la valeur de RPR : aucune corrélation significative n'a été trouvée en univariée, ni en analyse multivariée englobant divers autres facteurs périnataux. Le taux de globules rouges et la qualité de la croissance staturale ont été les seuls facteurs indépendamment associés au CAHS. Conclusion : Le ratio-RPR n'est pas associé au statut hémodynamique du canal artériel. La signification de l'association retrouvée entre CAHS et la numération des GR et la croissance somatique nécessite des recherches supplémentaires plus approfondies. Mots-clés : canal artériel, PCA, nouveau-né prématuré, ratio-RPR, Unités néonatales de soins intensifs 39 Red blood cell distribution width and assessment of the ductus arteriosus in preterm infants Introduction : The search for the criteria of severity of the ductal shunt is important to justify the decision to treat medically or surgically the arterial duct. Criteria independent from ultrasound are sought in particular to complete this technique of reference, the limits of which are noted by the weak correlations of ultrasound diagnosis with the incidence of complications. The red cell distribution width-to-platelet ratio (RPR) has recently been proposed in several publications as an effective indicator of hemodynamically significant ductus arteriosus. The conclusions are contradictory since these results are not found in other research. Objective : To determine the correlations between the occurrence of a significant ductus arteriosus and the value of the ratio-RPR determined on the blood test at birth and in the first days of life. Material and Method : Retrospective, single-center study carried out on premature infants WG hospitalized at the Amiens-Picardie CHU in 2018 and 2019. Results : A total of 292 patients were listed, of which 35 were excluded from the analysis for serious congenital malformation and early death hours. The data from the remaining patients were analyzed in a conditional logistic regression matched by birth term 0. 5 WG. After eliminating 125 patients, the remaining 132 were tested for the association between CAHS and RPR ratio : no significant correlation was found in univariate nor in multivariate analysis even after including various perinatal factors. The level of red blood cells and the quality of growth in height were the only factors independently associated with CAHS. Conclusion : RPR ratio is not associated with the hemodynamic severity of the ductus arteriosus. The mechanisms of the association found between CAHS and RBC count and somatic growth requires further investigation. Keywords : ductus arteriosus, PDA, preterm infant, ratio-RPR, NICU 40 Distribution du volume érythrocytaire et évaluation du canal artériel du prématuré Introduction : La recherche des critères de sévérité du shunt ductal est importante pour argumenter la décision de traiter médicalement ou chirurgicalement le canal artériel. Les critères indépendants de l'échographie sont recherchés en particulier pour compléter cette technique de référence dont les limites sont constatées par la faiblesse des corrélations du diagnostic échographique avec l'incidence des complications. Le rapport de la dispersion du volume des globules rouges par le taux de plaquettes (RPR) a été récemment proposé dans plusieurs publications comme indicateur efficace de canal artériel hémodynamiquement significatif (CAHS). Les conclusions sont contradictoires puisque ces résultats ne sont pas retrouvés dans d'autres recherches. Objectif : Déterminer les corrélations entre la survenue de CAHS et la valeur du ratio-RPR déterminé sur le bilan sanguin à la naissance et dans les premiers jours de vie. Matériel et Méthode : Etude rétrospective, monocentrique réalisée sur les enfants prématurés < 32 SA hospitalisés au CHU Amiens-Picardie en 2018 et 2019. Résultats : Au total, 292 patients ont été répertoriés parmi lesquels 35 ont été exclus de l'analyse pour malformation congénitales graves et décès précoces Le reste de patients étaient étudiés dans une approche d'analyse appariée sur le terme de naissance 0. 5 SA. Après élimination de 125 patients, les 132 restants ont été testés pour l'association entre le CAHS et la valeur de RPR : aucune corrélation significative n'a été trouvée en univariée, ni en analyse multivariée englobant divers autres facteurs périnataux. Le taux de globules rouges et la qualité de la croissance staturale ont été les seuls facteurs indépendamment associés au CAHS. Conclusion : Le ratio-RPR n'est pas associé au statut hémodynamique du canal artériel. La signification de l'association retrouvée entre CAHS et la numération des GR et la croissance somatique nécessite des recherches supplémentaires plus approfondies. Mots-clés : canal artériel, PCA, nouveau-né prématuré, ratio-RPR, Unités néonatales de soins intensifs Red blood cell distribution width and assessment of the ductus arteriosus in preterm infants Introduction : The search for the criteria of severity of the ductal shunt is important to justify the decision to treat medically or surgically the arterial duct. Criteria independent from ultrasound are sought in particular to complete this technique of reference, the limits of which are noted by the weak correlations of ultrasound diagnosis with the incidence of complications. The red cell distribution width-to-platelet ratio (RPR) has recently been proposed in several publications as an effective indicator of hemodynamically significant ductus arteriosus. The conclusions are contradictory since these results are not found in other research. Objective : To determine the correlations between the occurrence of a significant ductus arteriosus and the value of the ratio-RPR determined on the blood test at birth and in the first days of life. Material and Method : Retrospective, single-center study carried out on premature infants WG hospitalized at the Amiens-Picardie CHU in 2018 and 2019. Results : A total of 292 patients were listed, of which 35 were excluded from the analysis for serious congenital malformation and early death hours. The data from the remaining patients were analyzed in a conditional logistic regression matched by birth term 0. 5 WG. After eliminating 125 patients, the remaining 132 were tested for the association between CAHS and RPR ratio : no significant correlation was found in univariate nor in multivariate analysis even after including various perinatal factors. The level of red blood cells and the quality of growth in height were the only factors independently associated with CAHS. Conclusion : RPR ratio is not associated with the hemodynamic severity of the ductus arteriosus. The mechanisms of the association found between CAHS and RBC count and somatic growth requires further investigation. Keywords : ductus arteriosus, PDA, preterm infant, ratio-RPR, NICU 41 | HAL | Scientific |
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