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Indagine sulle interazioni delle subunità nella malato deidrogenasi.Le dissociazioni dei mitocondri del cuore suino, dei mitocondri del cuore bovino e dei dimeri della malato deidrogenasi del citoplasma del cuore suino (L -malato: NAD+ossidoreduttasi, EC 1.1.1.37) sono stati esaminati mediante cromatografia di filtrazione su gel Sephadex G-100 e ultracentrifugazione a velocità di sedimentazione. L'enzima mitocondriale suino è stato trovato alla cromatografia come subunità quando applicato a una colonna di filtrazione su gel ad una concentrazione di. 02 muM o meno a pH 7,0. La presenza di coenzimi ha spostato l'equilibrio di dissociazione a basse concentrazioni di enzimi a favore della formazione di dimeri. La formazione di monomeri è stata favorita anche quando l'enzima mitocondriale procina è stato incubato a pH 5,0 anche a concentrazioni fino a 120 muM. lo spostamento nell'equilibrio è stato correlato con l'aumento della velocità e della specificità della modifica del residuo sulfidrilico con N-etilmaleimmide a pH 5,0 (Gregory, EM, Yost, FJ, Jr. , Rohrbach, M. S. , e Harrison, J. H. (1971) J. Biol. chimica. 246, 5491-5497). L'enzima mitocondriale bovino non ha mostrato una dissociazione concentrazione-dipendente nelle condizioni esaminate. Tuttavia, a pH 5,0 è stata favorita la formazione di monomeri, e si possono nuovamente tracciare correlazioni con la modifica del residuo sulfidrilico (Gregory, E. M. (1975) J. Biol. Chem. 250, 5470-5474). In entrambi gli enzimi mitocondriali, il legame del coenzima è stato trovato in grado di superare gli effetti del pH sull'equilibrio di dissociazione ed è stata favorita la formazione di dimeri. A differenza di uno degli enzimi sopra menzionati, la malato deidrogenasi citoplasmatica suina non si è dissociata nella sua forma monomerica in nessuna delle condizioni studiate.
La purificazione e la caratterizzazione dell'alfa-L-fucosidasi lisosomiale del fegato di ratto.L'alfa-L-fucosidasi dai lisosomi del fegato di ratto è stata purificata per circa 27.000- piega (da estratto citoplasmatico) mediante una procedura rapida che richiede solo 7 ore e fornisce l'enzima con una resa del 20%. La procedura si basa sulla cromatografia di affinità con agarosio-epsilon-aminocaproil-fucosamina. L'enzima isolato è risultato puro da un l'enzima purificato presenta una colorazione positiva dell'acido periodico di Schiff, suggerendo che si tratta di una glicoproteina. mumol/min/mg di proteina, e un Km di 0,19 mM con p-nitrofenil alfa-L-fucopiranoside come substrato. L-fucosio era l'unico effettore possibile fisiologico dell'enzima che è stato identificato; mostrava un Ki di 1,6 mM, con p-nitrofenil alfa-L-fucopiranoside as substrato. L'enzima ha un peso molecolare della subunità di circa 55.000 mediante elettroforesi con Na dodecil-SO4 in una varietà di sistemi di gel. Il peso molecolare dell'enzima nativo è stato indicato essere di circa 160.000 mediante centrifugazione a densità di saccarosio, 300.000 mediante cromatografia a setaccio molecolare su Sephadex G-200 e 217.000 mediante centrifugazione all'equilibrio di sedimentazione. Il peso delle prove suggerisce che l'enzima è un tetramero. L'incubazione in assenza di reagenti sulfidrilici in condizioni appropriate genera una seconda banda di attività dell'alfa-L-fucosidasi su gel corrispondente ad un peso molecolare compreso tra circa 40.000 e 50.000. Questo risultato suggerisce che la subunità è relativamente stabile e può riassociarsi per formare l'enzima attivo. L'alfa-L-fucosidasi richiede un'elevata concentrazione di proteine e la presenza di un reagente sulfidrilico per la stabilizzazione. È rapidamente inattivato dall'acido p-cloromercurifenil solfonico, questa inattivazione essendo rapidamente reversibile mediante l'aggiunta di 10 mM di 2-mercaptoetanolo. L'enzima ha catalizzato l'idrolisi di 1 porta a 2, 1 porta a 3 e 1 porta a 4 legami fucosil ed è risultato attivo sui glicopeptidi ma non sulle glicoproteine native. È stata determinata la composizione in aminoacidi e carboidrati dell'enzima. L'enzima nativo contiene i seguenti zuccheri (residui per tetramero): fucosio (3.5), mannosio (32), galattosio (8), glucosio (9), glucosamina (32) e acido sialico (8). L'alfa-glucosidasi lisosomiale del fegato di ratto, anch'essa prodotta nella procedura di isolamento rapido qui descritta, conteneva meno di 0,1 residui di acido sialico per subunità.
Un percorso piruvato-acetato a risparmio energetico in Entamoeba histolytica. Piruvato sintasi e una nuova acetato tiochinasi.In condizioni anaerobiche, cellule di Entamoeba histolytica coltivata con batteri produce H2 e acetato mentre le cellule cresciute axenically non producono né l'uno né l'altro. Aerobicamente, viene prodotto acetato e O2 viene consumato dalle amebe di entrambi i tipi di cellule. Gli estratti centrifugati, 2,4 x 106 xgx min, da entrambi i tipi di cellule contengono piruvato sintasi ( CE 1.2.7.1) e una acetato tiochinasi che, insieme, formano un sistema in grado di convertire il piruvato in acetato. La piruvato sintasi catalizza la reazione: piruvato + CoA porta a CO2 + acetil-CoA + 2E. Gli accettori di elettroni che funzionano con questo enzima sono FAD, FMN, riboflavina, ferredossina e metil viologeno, ma non NAD o NADP. L'amebal acetato tiochinasi catalizza la reazione acetil-CoA + ADP + Pi porta ad acetato + ATP + CoA. Per questo enzima apparentemente nuovo suggeriamo il nome banale acetil-CoA- sintetasi (formante ADP). Gli estratti di amebe axeniche non contengono idrogenasi, ma gli estratti di cellule cresciute con batteri sì. Si ipotizza che nelle amebe coltivate da batteri gli elettroni generati nella fase della piruvato sintasi siano utilizzati anaerobicamente per produrre H2 attraverso l'idrogenasi e che l'acetil-CoA venga convertito in acetato in una fase di conservazione dell'energia catalizzata dall'amebal acetil-CoA sintetasi. A livello aerobico, le cellule cresciute sotto entrambi i regimi possono utilizzare la via piruvato-acetato che conserva l'energia poiché l'O2 funge quindi da accettore di elettroni definitivo.
Saggio e caratterizzazione parziale del recettore della superficie cellulare solubilizzato per l'immunoglobulina E.Il componente della superficie cellulare (recettore) che lega specificamente l'immunoglobulina E (IgE) presumibilmente forma parte integrante della catena funzionale coinvolta nella degranulazione IgE mediata dall'antigene dei mastociti e dei basofili contenenti istamina. Questo documento descrive un semplice test di predipitazione (NH4)2SO4 con il quale l'interazione delle IgE con i recettori solubilizzati nel detergente può essere quantificato in modo riproducibile. È stata dimostrata la saturazione del recettore e ottenuta una risposta lineare alla concentrazione del recettore su un intervallo di almeno 30 volte. Mediante il test è stato dimostrato che (a) tutti i recettori analizzabili delle cellule di leucemia basofila di ratto sono espressi sulla superficie cellulare ; (b) la specificità del recettore rimane intatta durante la solubilizzazione; (c) le costanti di legame dei recettori delle IgE solubilizzate sono simili a quelle determinate sulle cellule intatte. zione, stime preliminari del peso molecolare del recettore attivo libero solubilizzato e del suo complesso con le IgE suggeriscono che il recettore sia univalente.
Studi sulla reazione ciclica della proteina chinasi del fegato di maiale stimolata da 3\':5\'-AMP con piruvato chinasi come substrato.La fosforilazione di È stata studiata la piruvato chinasi del fegato di maiale mediante adenosina ciclica 3\':5\'-chinasi monofosfato dipendente. Per confronto, sono stati utilizzati anche istoni misti e un eptapeptide sintetico come substrati. La proteina chinasi è stata purificata mediante cromatografia su DEAE-cellulosa, idrossiapatite e Sephadex G-200. L'enzima è stato stimolato dall'AMP ciclico con valori di Ka apparenti di 2,5 e 0,8 x 10-7 M rispettivamente per la piruvato chinasi e per i substrati dell'istone. I cationi bivalenti erano essenziali per l'attività della proteina chinasi. della concentrazione di ATP ha prodotto linee approssimativamente rette nei grafici Lineweaver-Burk per la fosforilazione sia della piruvato chinasi che dell'istone misto. I valori Km apparenti per l'ATP erano rispettivamente di 21 e 11 muM. Il tasso di fosforilazione aumentava con la concentrazione ione della piruvato chinasi anche ad una concentrazione di 2 muM piruvato chinasi. Ad un'elevata forza ionica, il tasso di fosforilazione sia della piruvato chinasi che dell'istone è diminuito. Il tasso di fosforilazione variava notevolmente con il pH nei tamponi imidazolo/HC1 e Tris/HC1. A valori di pH leggermente alcalini, la piruvato chinasi è stata fosforilata a una velocità molto più elevata di pH7, ma non è stato il caso dell'istone. A pH 8,5, il tasso di fosforilazione della piruvato chinasi era 3,5 volte il tasso a pH 7, mentre il corrispondente aumento per la fosforilazione dell'istone era del 50%. Nei tamponi di fosfato di potassio, la velocità di fosforilazione di entrambi i substrati non è cambiata in modo significativo nell'intervallo di pH studiato. I grafici di Arrhenius\' della reazione della proteina chinasi hanno provocato un'interruzione a circa 10 gradi quando la piruvato chinasi è stata utilizzata come substrato, mentre è stata ottenuta una linea retta quando si è utilizzato l'istone. Gli effettori allosterici negativi di piruvato chinasi, alanina e fenilalanina, hanno aumentato il tasso di fosforilazione della piruvato chinasi a pH 8 rispettivamente del 50 e del 120 per cento. Gli stessi effettori non hanno influenzato il tasso di fosforilazione dell'istone misto o di un eptapeptide sintetico. Si conclude che le conformazioni adottate dalla piruvato chinasi in presenza di inibitori allosterici la rendono un substrato migliore per la proteina chinasi.
Attivazione della guanilato ciclasi nella corteccia cerebrale di ratto da parte dell'idrossilammina.Guanilato ciclasi attivata dall'idrossilammina nella frazione particolata della corteccia cerebrale di ratto. L'attivazione è stata più notevole nella frazione mitocondriale grezza. Quando la frazione mitocondriale grezza è stata sottoposta a shock osmotico e frazionata, l'attività della guanilato ciclasi recuperata nelle sottofrazioni saggiate con idrossilammina era solo un terzo del materiale di partenza. Tuttavia, la ricombinazione della frazione solubile e del particolato, ripristinato l'attività della guanilato ciclasi allo stesso livello di quello del materiale di partenza. Quando sono state combinate quantità variabili delle frazioni particolato e solubile, l'attività enzimatica era proporzionale alla quantità della frazione solubile. Riscaldamento della frazione solubile o particolato a 55 gradi per 5 min di guanilato ciclasi inattivata La frazione di particolato riscaldata ha notevolmente attivato l'attività della guanilato ciclasi nel solubile nativo frazione, mentre la frazione solubile riscaldata non ha stimolato l'attività enzimatica nel particolato. La frazione particellare è stata preincubata con idrossilammina a 37 gradi per 5 min, seguita dal lavaggio dell'attività della guanilato ciclasi attivata nella frazione solubile in assenza di idrossilammina. L'ulteriore frazionamento della frazione mitocondriale grezza ha rivelato che il/i fattore/i necessario/i per l'attivazione da parte dell'idrossilammina è associato ai mitocondri. La frazione mitocondriale della corteccia cerebrale ha attivato la guanilato ciclasi nel surnatante di cervello, fegato o rene in presenza di idrossilammina. La frazione mitocondriale preparata dal fegato o dal rene, a sua volta, ha attivato la guanilato ciclasi solubile nel cervello. L'attivazione della guanilato ciclasi da parte dell'idrossilammina è stata confrontata con quella della sodio azide. L'azide ha attivato la guanilato ciclasi nella frazione solubile sinaptosomiale, mentre l'idrossilammina l'ha inibita. La frazione particellare preincubata con azide seguita da lavaggio non stimolava l'attività della guanilato ciclasi in assenza di azide. L'attivazione della guanilato ciclasi da parte dell'idrossilammina non è dovuta a un cambiamento nella concentrazione del substrato GTP. L'aggiunta di idrossilammina non ha alterato il valore Km apparente della guanilato ciclasi per GTP. La guanilato ciclasi è diventata meno dipendente dal manganese in presenza di idrossilammina. Quindi l'attivazione della guanilato ciclasi da parte dell'idrossilammina è dovuta alla variazione della Vmax della reazione.
Forme multiple a basso spin del citocromo c ferrihemocromo. Spettri EPR di vari citocromi eucariotici e procariotici c.1. Nonostante la stessa metionina-zolfo: struttura eme-ferro:imidazolo-azoto emocromo osservata mediante cristallografia a raggi X in quattro dei sette citocromi eucariotici e procariotici di tipo c esaminati, e la presenza della caratteristica banda di assorbimento di 695 nm correlata alla presenza di una metionina-zolfo:eme -ligando assiale del ferro in tutte e sette le proteine, cadono in due classi distinte in base al loro EPR e spettri ottici. Il cavallo, il tonno e i panettieri\' lievito iso-1 citocromi c hanno una forma EPR a pH neutro predominante con g1\ =3.06, g2=2.26 e g3=1.25, mentre i panettieri\' lievito iso-2 e Euglena citocromi c, Rhodospirillum rubrum citocromo c2 e Paracoccus denitrificans citocromo c550 hanno tutti un pH neutro predominante EPR modulo con g1=3.2, g2=2.05 e g3=1. 39. I ferricitocromi con g1=3.06 hanno una scissione B-Q che è circa 150 cm-1 più grande dei ferricitocromi con g1=3.2. 2. Ciascuno dei citocromi mostra fino a quattro forme EPR a basso spin che sono in equilibrio pH-dipendente e possono essere tutte osservate a pH quasi neutro. All'aumentare del pH, la forma a pH neutro predominante viene convertita in due forme con g1=3.4 e g1=3.6, identificate mediante confronto con composti modello e altre proteine eme come epsilon-ammino:eme-ferro:imidazolo e bis -epsilon-amino:ferriemocromi eme-ferro, rispettivamente. 3. Il pK per la conversione della forma EPR a pH neutro predominante nelle forme alcaline a pH è lo stesso del pK per la scomparsa della banda di assorbimento di 695 nm per i citocromi, anche se questi valori di pK sono superiori a 2 unità di pH. Ciò conferma che le forme g1=3.06 e g1=3.2 contengono il ligando assiale metionina-zolfo:eme-ferro mentre le forme g1=3.4 e g1=3.6 no. 4. A valori di pH estremi, le proteine iso-1 del lievito del cavallo e del panettiere mostrano diverse forme ad alto e basso spin che vengono identificate, dimostrando che una varietà di ligandi derivati dalle proteine si coordinerà con il ferro eme tra cui metionina e cisteina zolfo, istidina imidazolo e lisina epsilon-ammina. 5. È stato anche esaminato lo spettro del citocromo c di cavallo con aggiunta di azide, cianuro, idrossido o imidazolo come ligandi assiali. 6. Da un confronto delle caratteristiche EPR e spettrali ottiche di questi gruppi di citocromi con composti modello, si suggerisce che la differenza tra loro sia dovuta a un cambiamento nel legame idrogeno o forse anche nella protonazione di N-1 del eme istidina imidazolo legato al ferro.
Purificazione e proprietà di un fattore di attivazione della glucocerebrosidasi termostabile dal controllo e dalla milza di Gaucher.La malattia di Gaucher è una malattia da accumulo lisosomiale causata da un carenza dell'enzima glucocerebrosidasi È stata osservata una piccola glicoproteina termostabile ottenuta per la prima volta dalla milza di Gaucher (Ho, MW e O\'Brien, JS (1971) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68, 2810-2813). per stimolare l'attività della glucocerebrosidasi isolata dal tessuto normale È stato suggerito che questo materiale potrebbe essere importante nel catabolismo fisiologico del glucocerebroside in individui normali (Ho, MW (1974) in Enzyme Therapy in Lysosomal Storage Diseases (Tager, JM, Hooghwinkel) , GJM e Daems, W. Th. , eds) pp.239-246, North-Holland Publishing Co. , Amsterdam). Per indagare su questo suggerimento, i fattori attivanti la glucocerebrosidasi sono stati isolati e purificati dal controllo e dalla milza di Gaucher e caratterizzati Anche se a approssimativamente la stessa massa di attivatore è stata isolata da entrambe le milze, i due attivatori differiscono l'uno dall'altro in una serie di importanti aspetti: (a) l'attivatore della milza di controllo è solo il 6% attivo (su base proteica) come il attivatore dalla milza di Gaucher; (b) le composizioni amminoacidiche degli attivatori purificati sono significativamente differenti; e (c) l'analisi dei carboidrati degli attivatori purificati indica che l'attivatore della milza di Gaucher è una glicoproteina, mentre quello della milza di controllo non lo è. Studi cinetici comparativi dimostrano che il detergente anionico, il sodio taurocolato e il fosfolipide acido, il fosfatidilinositolo, stimolano entrambi l'attività della glucocerebrosidasi in misura maggiore rispetto alla sostanza attivatrice della milza di Gaucher. L'attivatore della milza di Gaucher e la glucocerebrosidasi epatica umana sembrano entrambi contenere un significativo carattere idrofobico. Concludiamo che l'attivatore probabilmente non è fisiologicamente importante nel catabolismo del glucocerebroside nei tessuti normali. Il significato della presenza di questo attivatore glicoproteico apparentemente unico nella milza di Gaucher rimane oscuro; tuttavia, la sua presenza rappresenta un altro aspetto interessante della malattia di Gaucher che merita ulteriori indagini.
Purificazione e proprietà dell'acetil coenzima A sintetasi da panettieri\' lievito.Acetil-CoA sintetasi, utilizzata in un sistema di reazione accoppiata, è stata dimostrata applicabile alla determinazione spettrofotometrica degli acidi propionico e metilmalonico nei fluidi biologici. L'isolamento dell'acetil-CoA sintetasi dal lievito è più semplice della purificazione da fonti di mammifero. Questo studio presenta anche alcune proprietà dell'enzima del lievito e lo confronta con il più enzima ampiamente studiato isolato da tessuto ammmalico. L'isolamento e la purificazione hanno prodotto una preparazione con un'attività specifica di 44 unità/mg a 25 gradi. L'acetil-CoA sintetasi purificata era apparentemente omogenea mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide con una subunità stimata peso molecolare di 78.000. L'elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di ATP ha rivelato una singola banda proteica che conteneva tutta l'attività enzimatica. studi con centrifuga ra hanno indicato la presenza di una singola proteina con un valore molecolare di 151.000 e l'analisi della velocità di sedimentazione ha rivelato un singolo picco con un coefficiente di sedimentazione di 8,65 So20,w. Simile all'enzima da fonti di mammiferi, l'acetil-CoA sintetasi di lievito ha un alto grado di specificità del substrato ed è attivo solo su acetato e propionato. Inoltre, il meccanismo di reazione, come dimostrato dai modelli di velocità iniziali ottenuti da coppie di substrati, sembrava essere identico all'enzima del cuore bovino. Tuttavia, le apparenti costanti di Michaelis per i substrati erano significativamente diverse dall'enzima dei mammiferi. L'enzima derivato dal lievito differiva anche dal mammifero in termini di peso molecolare, composizione amminoacidica, pH ottimale, effetto dei cationi monovalenti e caratteristiche di stabilità. Pertanto, l'acetil-CoA sintetasi di lievito è più facilmente purificata rispetto all'enzima dei mammiferi e fornisce un'eccellente preparazione per il dosaggio degli acidi propionico e metilmalonico.
NADPH-citocromo P-450 reduttasi. Dicroismo circolare e studi fisici.NADPH-citocromo P-450 reduttasi è stata purificata da microsomi epatici di fenobarbital e ratti trattati con idrocortisone mediante solubilizzazione con detergente e cromatografia su colonna. Questa proteina di membrana contiene il 31 percento in moli di residui di amminoacidi idrofobici, 6 residui di semicistina e un singolo residuo di triptofano come determinato mediante analisi di amminoacidi dopo idrolisi di acidi minerali o organici. la mobilità della citocromo P-450 reduttasi nel sodio dodecilsolfato era identica a quella di diverse proteine solubili utilizzate come standard (ovvero ovalbumina, albumina sierica bovina, eritrocupreina, beta-galattosidasi). Stime del peso molecolare da studi sull'equilibrio di sedimentazione in presenza di guanidina cloridrato (76.500) sono coerenti con quelli determinati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di sodio dodecilsolfato a varie concentrazioni di gel percentuali (79,00 da 0 a 80.000). L'analisi al computer degli spettri di dicroismo circolare della citocromo P-450 reduttasi nella regione del lontano ultravioletto ha indicato la presenza di una struttura alfa elicoidale del 34% e del 16% beta. La quantità di struttura casuale è stata calcolata pari al 50%.
Stati conformazionali pH-dipendenti dell'alcol deidrogenasi del fegato di cavallo.L'estinzione della fluorescenza della proteina alcol deidrogenasi del fegato a pH alcalino indica due stati conformazionali dell'enzima con un pKa di 9,8+/-0,2, spostato a 10,6+/-0,2 in D2O. NAD+ e 2-p-toluidinonaftalen-6-solfonato, una sonda fluorescente competitiva con il coenzima, si legano alla conformazione acida dell'enzima. della curva di estinzione della fluorescenza della proteina viene spostata verso 7,6 in presenza di NAD+ e la formazione del complesso ternario con NAD+ e trifluoroetanolo determina un'estinzione massima indipendente dal pH. A pH (pD) 10,5, la costante di velocità per il legame di NAD+ era di 2,6 volte più veloce in D2O2 che in H2O a causa dello spostamento del pKa Sulla base di questi risultati è stato proposto uno schema in cui lo stato di protonazione di un gruppo funzionale enzimatico con un pKa di 9,8 controlla lo stato conformazionale dell'enzima. si lega alla conformazione acida e successivamente y provoca un altro cambiamento conformazionale con conseguente perturbazione del pKa a 7.6. L'alcol si lega quindi alla forma non protonata del gruppo funzionale con un pKa di 7,6 nel complesso binario enzima-NAD+ e converte l'enzima nella conformazione alcalina. Pertanto, a pH neutro, l'alcol deidrogenasi del fegato subisce due cambiamenti conformazionali lungo il percorso verso il complesso ternario in cui avviene il trasferimento di idruro.
Purificazione di lectine su colonne di affinità contenenti disaccaridi amminati riduttivamente.Descrizione di un metodo per isolare lectine in forma pura e resa quantitativa in un unico passaggio per affinità cromatografia su gel di amminoetil poliacrilammide contenenti residui di disaccaride amminati riduttivamente Le colonne di affinità sono state preparate in due fasi: (a) amminazione riduttiva diretta del disaccaride e del gel di amminoetile con sodio cianoboroidruro in soluzione acquosa a pH 9; (b) N-acetilazione dell'eccesso gruppi amminici Colonne di affinità preparate mediante amminazione riduttiva di lattosio, melibiosio, maltosio e di-N-acetilchitobiosio sono state utilizzate per purificare le seguenti lectine: lattosio, arachidi, semi di ricino, melibiosio, Bandeiraea simplicifolia, maltosio, fagiolo di jack, lenticchia comune; di-N-acetilchitobiosio, germe di grano. Queste colonne sono estremamente stabili, hanno buone portate ed elevate capacità di legame.
Reticolazione del collagene. Effetto della D-penicillamina sulla reticolazione in vitro.Si ritiene che la D-pencillamina inibisca la biosintesi della reticolazione del collagene formando anelli tiazolidinici con aldeidi derivate da lisil che sono intermedi nella sintesi di cross-link bifunzionale Recentemente, abbiamo dimostrato che la biosintesi delle aldeidi catalizzata dalla lisil ossidasi avviene dopo l'inizio della formazione di fibrille e che le aldeidi nascenti formano legami incrociati a base di Schiff rapidamente in Questo ha suggerito che l'accessibilità della D-penicillamina alla maggior parte delle aldeidi formate durante la sintesi del cross-link potrebbe essere limitata. Per studiarlo, le fibrille di collagene di osso di pollo ricostituite sono state incubate in vitro con lisil ossidasi altamente purificata e D-penicillamina. studi precedenti in vivo, il contenuto di allisina è aumentato e la sintesi di cross-link polifunzionali è diminuita con la D-penicillamina. Tuttavia, la concentrazione di cross-link bifunzionali è aumentata piuttosto che diminuita a causa di un Aumento di 2 volte di N6:6\'-deidro-5,5\'-diidrossilisinonorleucina. L'idrossilisina, un intermedio nella formazione di questa base di Schiff, è diminuita. Uno studio temporale ha indicato che i livelli di allisina sono aumentati principalmente dopo la sintesi della base di Schiff. Questi risultati indicano che la D-penicillamina non inibisce la sintesi del cross-link bifunzionale come suggerito in precedenza. Il suo effetto principale è quello di bloccare la sintesi di prodotti di reticolazione polifunzionale dai precursori di reticolazione base di Schiff e di provocare l'accumulo di questi precursori. Questo effetto può essere dovuto all'interferenza con l'impaccamento molecolare ravvicinato richiesto per la sintesi di reticolazione polifunzionale. Questi risultati suggeriscono anche un meccanismo per la relativa insensibilità dei tessuti come l'osso con un alto contenuto di idrossilisina alla D-penicillamina. In questo studio, la D-penicillamina ha causato un accumulo selettivo di residui di allysyl e non di residui di hydroxyallysyl. Nell'osso, al contrario dei tessuti molli, i residui idrossililici sono intermedi nella sintesi di quasi tutti i legami incrociati.
Attività mannosiltransferasica nei microsomi del pancreas di vitello. Formazione di oligosaccaridi legati ai lipidi marcati con 14C da mannosio PIL-D-[14C] e dolichil beta-D-[14C]mannopiranosile pancreatico fosfato.I microsomi del pancreas di vitello hanno incorporato il D-mannosio radioattivo dal PIL-D-[14C]mannosio in oligosaccaridi legati ai lipidi estratti con cloroformio/metanolo/acqua (10/10/2.5, v/v). Diversi prodotti, che probabilmente differivano nelle dimensioni della frazione oligosaccaridica, sono stati marcati. Questi potrebbero essere parzialmente risolti mediante cromatografia su strato sottile e cromatografia con DEAE-cellulosa. Gli oligosaccaridi legati ai lipidi etichettati sono stati trattenuti sulla DEAE-cellulosa più fortemente rispetto al dolichil alfa sintetico -D-[14C]mannopiranosil fosfato. Erano stabili agli alcali deboli, ma labili agli alcali acidi e caldi. Il trattamento con acido ha prodotto una frazione di oligosaccaride marcata con 14C neutra che è stata stimata mediante filtrazione su gel per avere un minimo di 8 residui di monosaccaridi. trattamento alcalino mento ha prodotto una miscela di oligosaccaridi marcati con 14C neutri e acidi che potrebbero essere trasformati in prodotti neutri mediante fosfatasi alcalina. I residui di D-[14C]mannosio erano legati all'alfa al capolinea non riducente degli oligosaccaridi poiché potevano essere rimossi completamente con l'alfa-mannosidasi. La maggior parte degli oligosaccaridi marcati con D-[14C]mannosio sono stati trattenuti su concanavalina A Sepharose ed eluiti con metil alfa-D-mannopiranoside. Il dolichil beta-D-[14C]mannopiranosil fosfato pancreatico incubato con microsomi di pancreas di vitello in presenza di sodio taurocolato è stato efficacemente utilizzato come donatore di residui di alfa-D-mannosile negli oligosaccaridi legati ai lipidi. I prodotti formati dal dolichil beta-D-[14C]mannopiranosil fosfato erano identici a quelli formati dal PIL-D-[14C]mannosio e sono state ottenute prove per dimostrare che il dolichil beta-D-[14C]mannopiranosil fosfato fungeva da donatore senza previa conversione in GDP-D-[14C]mannosio. Il trasferimento del mannosio dal dolichil beta-D-[14C]mannopiranosil fosfato agli oligosaccaridi legati ai lipidi è avvenuto a un pH ottimale di 7,3, mentre il trasferimento al precipitato contenente le glicoproteine è stato maggiore a pH 6,0 in tampone Tris/maleato. L'aggiunta di cationi bivalenti non era richiesta, ma basse concentrazioni di EDTA erano estremamente inibitorie. La composizione in carboidrati degli oligosaccaridi legati ai lipidi delle membrane microsomiali è stata studiata mediante cromatografia gas-liquido e mediante riduzione con sodio borotritide. Con glucosamina all'estremità riducente è stata ottenuta una miscela eterogenea di oligosaccaridi contenenti N-acetil-D-glucosamina, D-mannosio e D-glucosio in proporzioni variabili da circa 1/2,5/0,5 a 1/5/1,5. Il trattamento acido della frazione oligosaccaridica legata ai lipidi ha prodotto dolichil pirofosfato, suggerendo che almeno alcuni degli oligosaccaridi erano legati al dolicolo attraverso un gruppo pirofosfato.
Purificazione e proprietà dell'enzima di scissione 3-cheto-5-amminoesanoato da un Clostridium che fermenta la lisina.Il Clostridium SB4 che fermenta la lisina ha dimostrato di contengono un nuovo tipo di enzima di degradazione dell'acido beta-cheto che converte il 3-cheto-5-amminoesanoato e l'acetil-CoA in modo reversibile in L-3-amminobutirril-CoA e acetoacetato Dopo lo sviluppo di un saggio radiochimico sensibile, l'enzima è stato purificato 175 -piega a circa il 90% di omogeneità con una resa del 44%. L'attività specifica dell'enzima purificato è di 44 UI/mg di proteina a 30 gradi. La costante di equilibrio per la reazione diretta è risultata essere 0,68 a 30 gradi e pH 7,0, corrispondente a un deltaG0\' di 0,23 kcal/mol. L'enzima è altamente specifico del substrato. Di diversi analoghi del substrato testati nelle reazioni forward e back solo il beta-alanil-CoA e il D-3-amminobutirril-CoA sono utilizzati circa il 130% e 1,7% più veloce di L-3-amminobutirril-CoA, rispettivamente. Il prodotto formato da beta-alanil-CoA un d acetoacetato è un beta-chetoacido neutro, presumibilmente acido 3-cheto-5-amminopentanoico; il suo prodotto di riduzione del boroidruro è stato parzialmente caratterizzato come un idrossi-amminoacido mediante vari metodi cromatografici e di scambio ionico. L'attività dell'enzima purificato è aumentata di circa 5 volte dall'aggiunta di 0,1 mM Co2+ e in misura minore da Mn2+. L'attività è inibita da ortofosfato, reagenti tiolici e EDTA; tuttavia, l'esposizione dell'enzima a quest'ultimo composto prima dell'aggiunta di Co2+ aumenta l'attività, presumibilmente rimuovendo i cationi bivalenti concorrenti. Esperimenti con traccianti hanno mostrato che gli atomi di carbonio 1 e 2 dell'acetoacetato sono derivati dagli atomi di carbonio 1 e 2 del 3-cheto-5-amminoesanoato mentre gli atomi di carbonio 3 e 4 sono derivati dall'acetil-CoA. La frazione amminoacidica del 3-amminobutirril-CoA è derivata dagli atomi di carbonio da 3 a 6 del 3-cheto-5-amminoesanoato. Poiché non è stato possibile ottenere alcuna evidenza di intermedi covalente enzima-substrato dallo studio di quattro possibili reazioni di scambio di gruppo, viene considerata una reazione concertata tra 3-cheto-5-amminoesanoato e acetil-CoA. L'enzima ha un peso molecolare di circa 97.000 e probabilmente contiene quattro subunità identiche. L'attività specifica relativamente elevata dell'enzima negli estratti di Clostridium SB4 indica che funziona nella principale via di degradazione della lisina. Questo enzima relativamente stabile fornisce un metodo conveniente e specifico per la stima quantitativa di quantità nanomolari di L- e D-3-amminobutirril-CoA e beta-alanil-CoA.
L'emoproteina legante il monossido di carbonio riducibile dal perossido di idrogeno nelle frazioni microsomiali dei semi di pisello.Esistono almeno due tipi di emoproteine leganti la CO in frazioni microsomiali di semi germinanti di pisello (Pisum sativum). Uno di questi è il citocromo P-450 e l'altro è anche una proteina protoeme (a giudicare dal suo spettro emocromo piridinico), che finora non è riportato. Il contenuto della nuova emoproteina è molto superiore a quella del citocromo P-450 nella fase iniziale della germinazione. Durante la germinazione il primo diminuisce e il secondo aumenta. La nuova emoproteina non viene sensibilmente ridotta dal solo ditionito di sodio in pochi minuti, ma è facilmente ridotta dalla ditionite in la presenza di metil viologeno e anche di perossido di idrogeno quando è presente CO. L'aggiunta di perossido di idrogeno ai microsomi di pisello in assenza di CO provoca la distruzione dell'emoproteina e anche la decolorazione del carotenoide endogeno. di questi componenti è determinata da idroperossidi organici indipendentemente dalla presenza di CO. In presenza di idrossilammina, l'aggiunta di idroperossidi ai microsomi porta alla formazione di uno spettro di assorbimento simile agli spettri dei complessi ferroso-NO delle proteine protoeme. Quando è presente la N,N-dimetil p-fenilendiammina, la reazione dei microsomi di pisello con gli idroperossidi fornisce uno spettro simile a quello della mioglobina sotto forma di traghetto. Le reazioni dell'emoproteina con gli idroperossidi sono inibite da alfa,alfa\'-dipiridile e anilina, con cui i microsomi di pisello formano spettri di legame. I microsomi formano uno spettro di differenza piuttosto stabile con l'idrossilammina. Tuttavia, l'emoproteina viene distrutta quando l'idrossilammina viene aggiunta ai microsomi allo stato ridotto.
Adenosina deaminasi umana. Purificazione e struttura delle subunità.L'adenosina deaminasi umana è stata purificata di circa 800.000 volte fino all'apparente omogeneità mediante cromatografia di affinità anticorpale. È stato dimostrato che l'enzima è una singola catena polipeptidica con un peso molecolare stimato di circa 38.000. Le tre forme elettroforetiche di eritrociti adenosina deaminasi purificate simultaneamente da questa tecnica erano indistinguibili mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide in condizioni riducenti. l'adenosina deaminasi purificata, compreso il pH ottimale, il Km per il substrato, il Ki per il prodotto, il raggio di Stokes, il coefficiente di sedimentazione e l'apparente specificità del substrato erano identiche alle proprietà osservate con una preparazione impura dell'enzima.
Studi sulle catepsine di lisosomi di fegato di ratto. III. Idrolisi di peptidi e inattivazione di angiotensina e bradichinina da parte della catepsina A.Analisi sistematica dell'idrolisi di benzilossicarbonil (Cbz)-dipeptidi da parte della catepsina A [EC 3.4.12.1] purificata da lisosomi di fegato di ratto ha mostrato che più forme di catepsina A scindono preferenzialmente i legami peptidici con leucina, metionina e fenilalanina. , -Phe-Met e -Phe-Ala sono stati idrolizzati da 6 a 8 volte più velocemente rispetto ai substrati standard, Cbz-Glu-Phe e Cbz-Glu-Tyr. Il pH ottimale delle idrolisi era compreso tra 4,6 e 5,8. Idrolisi dei legami peptidici con glicina, isoleucina e prolina era molto lenta, ma la velocità dipendeva dalla natura degli amminoacidi adiacenti. Proteine come albumina, citocromo c, gamma-globulina, emoglobina, istone, mioglobina e miosina erano scarsamente degradate. , come il glucagone e l'ormone adrenocorticotropo (ACTH) sono stati idrolizzati notevolmente con h pH ottimale\' di 4,5 e 4,6, rispettivamente. Anche l'angiotensina I, II, la bradichinina, la Lys- e Met-Lysbradykinin (kallidin e Met-kallidin) e la sostanza P sono state idrolizzate a velocità apprezzabili. Il pH ottimale per questi ormoni peptidici era compreso tra 5,2 e 5,6. D'altra parte, l'insulina e la sua catena A, l'ormone di rilascio dell'ormone luteinizzante (LH-RH), l'ossitocina e la vasopressina sono stati scissi lentamente. Nelle idrolisi del glucagone e di altri peptidi, molteplici forme di catepsina lisosomiale A del fegato di ratto hanno mostrato nuovamente una natura di carbossipeptidasi, scindendo i legami peptidici in sequenza dal terminale carbossilico. Quasi tutti gli amminoacidi sono stati scissi durante un'incubazione prolungata. Le vaso-attività dell'angiotensina II e della bradichinina sono state rapidamente perse per idrolisi da parte della catepsina A. Anche la catepsina C lisosomiale [dipeptidilaminopeptidasi I, EC 3.4.14.1] ha attivato l'angiotensina II, ma non ha inattivato la bradichinina. La catepsina A, quindi, può essere considerata come una delle angiotensinasi e chinasi lisosomiali. Non sono state osservate differenze distinte tra le molteplici forme di catepsina A in queste idrolisi e inattivazioni di peptidi.
effetti del pH sul lattato e sull'eccesso di lattato in relazione al deficit di O2 nei cani ipossici.Sia l'ipossiemia che l'alcalemia aumentano i livelli di lattato arterioso, ma l'eccesso di lattato ( XL) può essere meglio correlato al vero deficit di O2 e meno soggetto all'effetto del pH sulla glicolisi. Per verificare questa idea, 50 cani anestetizzati (30 ml/kg di pentobarbital sodico) e paralizzati in cinque gruppi sono stati ventilati con miscele a basso contenuto di O2. Il pH è stato alterato da CO2, iperventilazione e HCO3- in modo che il pH medio dei cinque gruppi fosse 6,99, 7,21, 7,34, 7,53 e 7,54 (+ propranololo). I livelli di piruvato e lattato sono aumentati a tassi approssimativamente corrispondenti al pH. animali, l'aumento di lattato (deltaL), XL e il deficit netto di O2 erano lineari nel tempo e la pendenza descriveva accuratamente il tasso di aumento. Quando il rapporto tra il tasso di deltaL del tasso XL è stato tracciato contro il pH, è aumentato verso l'unità quando il pH è sceso a 6,9 Anche il rapporto tra il tasso deltaL e il tasso di deficit di O2 reale ha mostrato un pH. significativo effetto aumentando con il pH. Il rapporto tra il tasso di XL e il tasso di deficit di O2 reale, d'altra parte, era indipendente dal pH. XL può correggere la produzione di lattato nei globuli rossi che non è influenzata dall'apporto di O2 ma è influenzata dal pH.
Respirazione rapida e superficiale dopo l'inalazione dell'antigene Ascaris suum: ruolo dei nervi vaghi.In cinque cani non sedati che praticavano il tapis roulant, abbiamo studiato l'effetto di aerosol di antigene Ascaris suum inalato su volume minuto di ventilazione (VE), frequenza respiratoria (f), volume corrente (VT), resistenza polmonare totale (RL) e compliance polmonare dinamica (CLdyn), prima e durante il raffreddamento dei nervi vaghi. Con il vagi caldo, l'antigene inalato ha aumentato VE (media + 62%; P inferiore a 0,01) aumentando f (media + 180%; P inferiore a 0,01), nonostante una diminuzione della TV (media - 42%; P inferiore a 0,01 RL è aumentato (media + 170%; P inferiore a 0,001) e CLdyn è diminuito (media - 43%; P inferiore a 0,005). Con il vagi freddo, l'antigene inalato non ha più influenzato VE, f o VT (P maggiore di 0,5), sebbene RL sia ancora aumentato e CLdyn sia ancora diminuito. L'inalazione di un broncodilatatore, la terbutalina, ha impedito la broncocostrizione indotta dall'antigene ma non ha impedito la ventilazione ria risposta. Concludiamo che le vie afferenti vagali mediano la risposta ventilatoria all'antigene inalato e suggeriscono che lo stimolo primario per questa risposta non è il restringimento delle vie aeree.
Catabolismo dell'adenosina trifosfato negli omogenati di organi dello smalto secretorio di ratto incubati in terreni istochimici di piombo.Per indagare su come il piombo, quando usato come agente di cattura, influenza la Idrolisi dell'ATP e per studiare come l'ATP viene catalizzato nei sistemi istochimici, gli organi dello smalto secretorio omogeneizzati sono stati incubati in terreni istochimici [3H]-ATP. Aliquote dai terreni sono state prelevate dopo 3, 10, 20 e 30 minuti, l'ATP e i metaboliti formati sono stati separato mediante elettroforesi e quantificato radiometricamente. In terreni privi sia di piombo che di omogenato il 2% dell'ATP è stato idrolizzato spontaneamente durante 30 min di incubazione a temperatura ambiente. La presenza di piombo ha causato un'ulteriore idrolisi dell'8% a pH 7,2 e un'ulteriore idrolisi del 20% a pH 9,4. In presenza di omogenato, tuttavia, il piombo ha causato una netta diminuzione dell'idrolisi dell'ATP, nonché dell'ADP e dell'AMP. Questa inibizione enzimatica variava da circa zero a circa l'80%, a seconda del pH e dell'inv del substrato. olvato. In mezzi di piombo contenenti omogenato, sia a pH 7,2 che a 9,4, l'ATP è stato rapidamente idrolizzato principalmente in ADP e successivamente in AMP e adenosina e/o inosina. Dopo 5-10 min l'ADP costituiva il substrato predominante ad entrambi i pH:s. A pH 7,2 l'ADP è rimasto tale per il resto dell'incubazione, mentre a pH 9,4 l'AMP era il substrato predominante alla fine dell'incubazione. L'AMP era il prodotto catabolico finan negli esperimenti a pH 7,2 e l'adenosina e/o l'inosina a pH 9,4. Il fosfato inorganico è stato liberato in modo quasi lineare durante l'intero periodo di incubazione. I risultati indicano che gli studi istochimici delle ATP-asi substrato specifiche dovrebbero essere eseguiti con tempi di incubazione brevi e, quando sono presenti attività specifiche elevate, in grandi quantità di mezzi di incubazione per ridurre l'interferenza da parte degli enzimi che idrolizzano l'ADP e l'AMP.
Trattamento delle aritmie ventricolari croniche [procedimento].Il trattamento delle aritmie ventricolari in questo momento è difficile e richiede un forte impegno da parte del medico e il paziente. In ogni caso, dovrebbe essere eseguita un'adeguata documentazione dell'aritmia con registrazioni ECG continue (registrazioni Holter), preferibilmente per 24 ore. Il test da sforzo può essere utilizzato in pazienti selezionati, ma è generalmente inferiore alla tecnica Holter. la patologia cardiaca deve essere ricercata, utilizzando l'ecocardiografia in tutti i pazienti e l'angiografia coronarica e la ventricolografia sinistra nei pazienti con tachicardie ventricolari più gravi La stima del significato prognostico dei VPB deve essere effettuata nel contesto della malattia di base e gli obiettivi del trattamento devono Il trattamento in tutti i casi richiede prima misure per evitare fattori scatenanti noti Se viene utilizzata la terapia antiaritmica, un sistema empirico dovrebbe essere intrapresa una prova degli agenti disponibili, utilizzando il monitoraggio Holter ripetuto per documentare l'efficacia. I livelli sierici dei farmaci antiaritmici devono essere misurati nella maggior parte dei casi. Combinazioni di agenti antiaritmici possono essere impiegate se la necessità è grande, ma gli agenti singolarmente sono inefficaci. Se il trattamento è ritenuto inefficace, deve essere interrotto. Le tecniche chirurgiche possono essere utili nei casi di tachicardia ventricolare refrattaria e comprendono stimolazione overdrive, simpatectomia chirurgica o aneurismectomia ventricolare con o senza bypass coronarico. Il solo bypass coronarico o la resezione di un'area ipocinetica ma non aneurismatica del miocardio può avere successo in alcuni casi, ma i risultati sono meno prevedibili rispetto alla resezione di un aneurisma vero. Gli studi elettrofisiologici, eseguiti nell'ambito della valutazione preoperatoria e provocando una tachicardia ventricolare autoperpetuante, possono consentire la selezione di pazienti idonei alla ventricolotomia per interrompere la via di rientro. Attualmente, questo deve essere considerato sperimentale e viene eseguito solo in pochi centri attrezzati per la mappatura epicardica complessa richiesta. Non è stato dimostrato che la chirurgia influisca sui VPB complessi al di fuori del contesto dell'ischemia acuta. Il controllo delle aritmie ventricolari richiede un approccio altamente individualistico con documentazione di efficacia.
Metenamina e suoi sali come antisettici delle vie urinarie: variabili che influenzano l'attività antibatterica di formaldeide, acido mandelico e acido ippurico in vitro.Le attività di formaldeide e degli acidi mandelico e ippurico, da soli e in combinazione, sono stati testati contro circa 300 ceppi di batteri tipici di quelli che causano infezioni del tratto urinario. In un mezzo chimicamente definito, che assomiglia per molti aspetti alle urine, la formaldeide aveva una concentrazione inibitoria minima media di 13 mug per ml. L'attività era diverse volte inferiore nei terreni (agar nutriente e agar triptico di soia) che contenevano quantità significative di proteine. L'attività della formaldeide non è praticamente influenzata dal pH nell'intervallo da 5 a 8. Acidi mandelico e ippurico ( 2 mg per ml) hanno un'attività antimicrobica limitata solo a valori di pH acido. La combinazione di formaldeide con acido mandelico (2 mg per ml) era additiva, più marcatamente a pH 5; la combinazione di formaldeide-acido ippurico , tuttavia, non sembrava essere additivo. I nostri risultati suggeriscono che, a valori di pH compresi tra 5 e 6, una concentrazione antibatterica di formaldeide sarà generata dalla metenamina entro circa 1 ora dopo essere stata escreta nelle urine.
Stabilità della fosfofructochinasi del cristallino di mammifero.Due forme di fosfofruttochinasi (PFK) interconvertibili sono state trovate nelle lenti di ratto e umano; mentre solo una forma predominante è stata trovata in lente di vitello. Il PFK isolato da queste lenti possedeva una proprietà comune, cioè la labilità al freddo (o acido) dipendente dal pH. L'inattivazione è stata prevenuta includendo adenosina trifosfato (ATP) o fruttosio-6-fosfato (fru-6-P) nel mezzo di incubazione. L'effetto protettivo di ATP o fru-6-P era completo nelle lenti di ratto o vitello. Nella lente umana, sebbene fru-6-P fosse completamente protettivo, l'ATP lo proteggeva solo parzialmente. L'inattivazione potrebbe essere invertita mediante aggiunta di fru-6-P, ma non di ATP, al terreno di incubazione a 37,5 gradi C. Gli studi sulla coltura dell'organo del cristallino hanno mostrato che l'esaurimento dell'ATP lenticolare sembrava accelerare la perdita di PFK.
Effetti collaterali sul feto e sul neonato dell'uso di psicofarmaci durante la gravidanza.Gli psicofarmaci sono usati frequentemente per il trattamento di disturbi emotivi e di altro tipo. Con l'uso così diffuso, molte donne in gravidanza ricevono farmaci psicotropi. L'ingestione materna di questi farmaci può produrre, nel feto, effetti collaterali inclusi sintomi di astinenza. Segni di astinenza nel feto a seguito dell'assunzione materna di oppiacei, ipnotici, analgesici e triciclici sono stati segnalati farmaci antidepressivi. Gli effetti collaterali fetali possono verificarsi per ingestione materna di farmaci nurolettici, litio, antidepressivi, sedativi ansiolitici, anticonvulsivanti e bromuri. L'autore ritiene che anche se questi farmaci sono generalmente sicuri, devono essere somministrati solo a donne in gravidanza quando assolutamente necessario, e poi sotto vigilanza.
Produzione e rilevamento dell'elastasi stafilococcica.Sono state determinate le condizioni ottimali per la produzione e l'individuazione dell'elastasi stafilococcica da Staphylococcus epidermidis. La produzione e il recupero ottimali sono stati effettuati luogo quando la tecnica della membrana di dialisi è stata utilizzata con agar cervello cuore infusione incubato per 44 h sotto il 15% di CO2 e raccolto in soluzione fisiologica. La produzione quasi ottimale ha avuto luogo entro 28 h, e questo è stato trovato più utile per l'uso di routine. Incorporazione di elastina nel terreno di coltura o nell'inoculo non ha determinato livelli più elevati di produzione di elastasi. Il sistema di rilevamento consisteva in 0,25% di elastina particellare sospesa in un terreno solidificato tamponato con tris(idrossimetil)amminometano-cloridrato di pH 7,0,0,05 M. Elastasi non dializzata grezza è stato rilevato meglio quando il terreno conteneva agarosio e calcio 10(-3) M o agar purificato senza additivi aggiuntivi. L'elastasi dializzata grezza è stata rilevata meglio quando it il terreno conteneva agarosio e acido etilendiamminotetraacetico disodico 10(-3) M.
Produzione di glucosiltransferasi da parte di Streptococcus sanguis 804 (NCTC 10904).Streptococcus sanguis 804 (NCTC 10904) è stato coltivato in lotti di coltura a pH costante. l'attività della glucosiltransferasi del surnatante è stata analizzata in un periodo di crescita di 40 ore. Il pH ottimale per la produzione di enzimi era compreso tra 7,0 e 7,2. Durante la crescita della coltura, sono state osservate tre fasi riproducibili dell'attività enzimatica. I polisaccaridi sintetizzati durante ciascuna di queste fasi sono stati caratterizzati come glucani simili al destrano mediante analisi di idrolizzati acidi, cromatografia gas-liquido e una tecnica di aggregazione specifica. I glucani sono stati ulteriormente studiati mediante spettroscopia infrarossa, degradazione enzimatica e ossidazione del periodato. Differenze nelle proporzioni di alfa-(1 porta a Sono stati osservati legami 3)- e alfa-(1 porta a 6). I risultati suggeriscono che la sintesi del glucano da parte di S. sanguis coinvolge un sistema multienzimatico.
Effetti del mucopeptide pneumococcico e del polisaccaride capsulare sulla fagocitosi.La parete cellulare pneumococcica e i prodotti capsulari di otto sierotipi sono stati testati per la loro capacità di inibire l'uccisione dei neutrofili polimorfonucleati degli stessi otto ceppi di pneumococco. Le preparazioni grezze della parete cellulare di pneumococco da tutti i sierotipi hanno inibito l'uccisione fagocitaria di diversi sierotipi di pneumococco ed erano altrettanto efficaci con ceppi eterologhi che con ceppi omologhi. La fagocitosi dipendente da fattori sierici termolabili è stata inibita, mentre la fagocitosi non dipendente sui fattori termolabili non è stato influenzato in modo significativo. Questi risultati erano compatibili con l'inibizione del consumo del complemento. L'attività inibitoria è stata trovata in un mucopeptide purificato della parete cellulare, mentre i polisaccaridi capsulari purificati non sono riusciti a inibire la fagocitosi.
Ruolo dei soluti urinari nell'immunità naturale alla gonorrea.La resistenza naturale dell'uretra maschile ai gonococchi non è stata spiegata dai meccanismi immunitari classici, ma potrebbe risultare dalle proprietà antibatteriche dell'urina. Di conseguenza, abbiamo misurato la sopravvivenza nell'urina di metà mattina di 10 (7) gonococchi F-62 T2 per ml mediante diluizioni seriali e conteggi su piastra. Quindici urine killer di otto persone tutte uccise per più di 3 log (media, 5,3) , e 13 su 15 sono state sterilizzate. Quattordici urine non killer (inibitori) di sette soggetti non hanno permesso la crescita. Le urine killer erano più acide (pH 5,4 contro 6,4) e più concentrate (861 contro 717 mosmol/kg) rispetto ai non killer. Dopo l'aggiunta di idrogeno ione, urea e cloruro di sodio alle urine e al brodo, il pH si è rivelato il principale fattore di uccisione, ma anche urea e NaCl erano battericidi. La suscettibilità al potere battericida delle urine non variava con il tipo di colonia (T2 contro T4) o il ceppo (F- 62 contro due isolati freschi). s rapido (da 0,5 a 3 h) e non batteriolitico. Escherichia coli si è moltiplicato 10 volte nelle urine che ha inibito la crescita dei gonococchi. Pertanto, l'effetto batteriostatico dell'urina può spiegare perché i gonococchi non infettano la vescica e il rene durante la gonorrea. Le proprietà battericide dell'urina possono contribuire alla resistenza contro l'uretrite gonococcica.
[Vaccino contro il vaiolo, ieri e oggi. Dalla "linfa di vacca" al vaccino per colture cellulari].Ci sono stati pochi cambiamenti nella preparazione del vaccino contro il vaiolo da quando Eduard Jenner descrisse il suo metodo di inoculazione preventiva nel 1798. Il vaccino di Jenner, "la questione", fu mantenuto nel passaggio da braccio a braccio. L'unico risultato importante nei metodi di produzione fu l'introduzione di un animale ospite per la propagazione del virus. La pelle di vitelli vivi o pecore è stata inoculata con il virus del seme e la "polpa" raccolta tre o quattro giorni dopo. Gli svantaggi di questa procedura sono evidenti: massiccia contaminazione batterica nonostante la rigorosa pulizia e quantità eccessive di residui di tessuto indesiderati nel materiale grezzo da utilizzare per la produzione di vaccini. Nonostante questi ovvi svantaggi il metodo è ancora in uso in tutto il mondo. I progressi nelle tecniche di coltura dei tessuti hanno portato alla produzione di tutti i moderni vaccini per uso negli animali e nell'uomo da questo substrato a basso contenuto iniziale di proteine estranee e di sterilità primaria. L'unica eccezione oggi è il vaccino contro il vaiolo convenzionale. Tentativi sporadici di produrre un vaccino contro il vaiolo in colture di tessuti sono stati recentemente e con successo realizzati in Inghilterra, Olanda e Jugoslavia. L'Istituto statale di vaccinazione bavarese ha adottato il ceppo di Vaccinia Elstree nelle colture primarie di fibroblasti di embrioni di pollo. La propagazione del virus in flaconi a rullo consente la produzione economica di un vaccino ad alto titolo con una stabilità pari a quella di origine bovina. Il raccolto di colture cellulari è batteriologicamente sterile e ha un contenuto minimo di proteine estranee. Negli ultimi due anni questo vaccino per colture cellulari ha completamente sostituito la vecchia "linfa di vitello". I tempi di vaccinazione sono uguali, le complicazioni finora non sono arrivate alla nostra attenzione.
[Lo sviluppo della vaccinazione come dimostrato sullo sviluppo dell'Istituto statale di vaccinazione bavarese nel XIX e XX secolo].Nel 1801 la vaccinazione contro il vaiolo è stato introdotto in Baviera per ordine del Duca Francesco Giuseppe che nominò un Soprintendente Medico, responsabile delle vaccinazioni contro il vaiolo per tutto il Paese. Questa fu l'ora della nascita anche per l'Istituto. L'Istituto si sviluppò rapidamente fino a cristallizzarsi in nel campo della medicina profilattica, della ricerca sulle malattie infettive e della pediatria sociale. Da questo Istituto fu introdotto il "Retrovaccino" contro il vaiolo 1856. 1967 - 1976 è stato sviluppato un vaccino contro il vaiolo a vita attenuata (MVA). Alcuni anni fa il l'attività dell'Istituto si è incentrata sulla ricerca delle complicanze post vaccinali e, fino ad oggi, sulla patogenesi della Sclerosi Multipla. Una rassegna storica dimostra lo sviluppo dell'Istituto nel passato fino a mo derne attività nella ricerca, nell'insegnamento agli studenti e nell'istruzione post-laurea e nella pratica medica.
[Il bambino con spina bifida con particolare riferimento alle malattie urologiche].Dal punto di vista delle malattie urologiche una nuova concezione della spina bifida cystica è La prima parte contiene informazioni sull'eziologia, l'anatomia patologica e la fisiopatologia Considerando le malattie urologiche (vescica neurogena con incontinenza e urina residua, reflusso vescico ureterale e pielonefrite cronica) particolare importanza è attribuita alla patogenesi. Nei metodi terapeutici il viene enfatizzato il trattamento con l'agente alfa-bloccante Phenoxybenzamin (Dibenzyran, Röhm Pharma GmbH, Darmstadt) come terapia vera e propria della vescica neurogena Viene menzionata l'indicazione operativa del condotto ileo (Bricker-) Un'analisi di 125 spina bifida- viene somministrato ai pazienti con reperti patologici a livello dei reni e delle vie urinarie.
[La diagnosi radiologica del polmone da shock (trad. dell'autore\')].Il cosiddetto "polmone da shock" presenta tipici reperti patologici; radiologicamente è caratterizzata dapprima da edema interstiziale, poi da edema polmonare alveolare, come dimostrato da numerosi casi clinici, ma oltre allo shock alcune intossicazioni e tutte le forme di scompenso cardiaco sinistro producono le alterazioni radiologiche dell'edema polmonare. L'iperidratazione transitoria dei polmoni a seguito di terapia infusionale provoca segni di edema polmonare che scompaiono non appena il bilancio idrico si normalizza. I reperti radiografici dell'edema polmonare ben si correlano con l'intensità e l'entità delle alterazioni patologiche. Il radiologo è quindi in grado di valutare la gravità dello shock polmonare;questo è un prezioso complemento ai riscontri clinici e ai risultati dei test fisiologici e dell'emogasanalisi. Va sottolineato che le alterazioni radiologiche si manifestano ad un n fase iniziale, in ogni caso molto prima delle caratteristiche cliniche. I reperti radiologici possono essere presenti senza anomalie all'oscultazione o alla percussione. Le radiografie dei polmoni sono quindi indicate in tutti i pazienti che possono essere soggetti a shock polmonare, in particolare se soffrono di iperventilazione non diagnosticata.
[Effetti di un derivato delle benzodiazepine, MS4101, sul comportamento emotivo dei gatti selvatici].Sono stati studiati gli effetti di MS4101 sul comportamento emotivo nei gatti selvatici e rispetto a quelli del diazepam. Comportamento offensivo, vale a dire, risposta lamentosa a un'asta presentata davanti al muso e soffiando aria sul pelo della schiena è stata osservata in modo marcato, e in questi gatti risposte piagnucolose, attaccanti e mordenti al picchiettare con un'asta sulla schiena sono stati marcati. Comportamento difensivo, cioè, sibilo, corpo accovacciato, appiattimento dell'orecchio per soffiare aria sui capelli posteriori, un'asta presentata e picchiettio è stato notevolmente osservato. Da 30 min dopo MS4101 e diazepam in dosi di 2 circa 4 mg/kg ip, offensivo comportamento offensivo nei gatti selvatici era depresso. ID50 (50% della dose di inibizione) di comportamento offensivo per MS4101 e diazepam era rispettivamente di 2,40 (1,95 circa 2,95) mg/kg ip e 0,96 (0,69 circa 1,34) mg/kg ip, MS4101 e diazepam in dosi di 2 circa 4 mg/kg ip decr facilitato il comportamento offensivo. L'ID50 del comportamento difensivo per MS4101 e diazepam era 3,00 (2,46 circa 3,66) mg/kg i. p. e 1,45 (1,14 circa 1,84) mg/kg i. p. , rispettivamente. Sia MS4101 che diazepam hanno mostrato effetti miorilassanti. Qui, il diazepam era più efficace di MS4101. La ED50 dell'attività miorilassante per MS4101 e diazepam era 4,30 (3,03 circa 6,11) mg/kg i. p. , 7,40 (5,04 circa 10,66) mg/kg i. p. , rispettivamente. Una singola somministrazione di MS4101 e di diazepam in dosi 2 mg/kg i. p. maggiore assunzione di cibo.
[Azione pressoria del propranololo; con particolare riferimento alla relazione tra azione pressoria e tono vascolare periferico].In studi precedenti abbiamo dimostrato che il pro pranololo ha prodotto un'azione pressoria nel ratto e che questa azione è stata osservata anche nel ratto spinale infuso con adrenalina, noradrenalina e una miscela di isoproterenolo e vasopressina, ma non con la sola vasopressione. L'azione è stata osservata anche nella cavia infusa con adrenergici beta-stimolanti Nel presente lavoro, le condizioni nei vasi periferici in cui il propranololo osservato nel ratto spinale è stato infuso con una miscela di varie dosi di isoproterenolo e vasopressina L'effetto del propranololo sulla pressione sanguigna in cavie e conigli con una ridotta è stato studiato il tono vasocostrittore nei letti vascolari periferici con alfa-blocco. Il propranololo ha prodotto un'azione pressoria nel ratto spinale infuso con una miscela di isoproterenolo e vasopressina, e il magn l'entità dell'aumento dipendeva dalla velocità di miscelazione delle dosi di questi due farmaci. Il farmaco ha anche prodotto un aumento prolungato della pressione sanguigna nelle cavie e nei conigli trattati con alfa-bloccanti. Quindi, si conclude che il propranololo produce una marcata azione pressoria quando i vasi periferici sono mantenuti in condizioni con un appropriato tono vasodilatatore costrittivo e beta-adrenocettivo.
Deossinucleotidil transferasi terminale come marker biologico per la leucemia umana.Alti livelli di deossinucleotidil transferasi terminale sono stati osservati nei leucociti di 7 su 20 pazienti con leucemia mieloide cronica nella fase acuta blastica della malattia. Questi livelli sono paragonabili ai livelli osservati nel timo umano e del vitello e nelle linee cellulari con alcune caratteristiche delle cellule T (Molt 4 e 8402). Livelli trascurabili di questa attività sono stati osservati nella malattia mieloide cronica leucemia non in fase blastica acuta della malattia, leucemia linfatica cronica, cellule B umane, cellule T mature e la popolazione mista di linfociti presenti nel sangue umano normale La rilevazione di questo enzima in alcuni pazienti con leucemia mieloide cronica in fase acuta blastica fase della malattia suggerisce che la proliferazione blastica possa coinvolgere cellule staminali primitive che hanno caratteristiche più linfoidi che mielogene. Questo test enzimatico può essere utile come metodo biologico marker per seguire i pazienti durante il trattamento e in remissione.
Effetti della calcitonina per via endovenosa sul movimento di acqua, elettroliti e calcio attraverso il digiuno e l'ileo di coniglio in vivo.L'influenza della calcitonina di salmone sintetica somministrata per via endovenosa su Sono stati esaminati i flussi di acqua, elettroliti e calcio nel digiuno e nell'ileo di coniglio in vivo. I conigli sono stati divisi in quattro gruppi: quelli che ricevevano (1) soluzione salina per via endovenosa mentre una soluzione salina isotonica priva di glucosio perfuse il digiuno e l'ileo; (2) calcitonina per via endovenosa mentre lo stesso perfusato intestinale è stato utilizzato come nel gruppo 1; (3) soluzione salina endovenosa mentre una soluzione salina isotonica di glucosio 10 mM perfuso digiuno e ileo; e (4) calcitonina endovenosa mentre il perfusato intestinale era della stessa composizione del gruppo 3. Calcitonina ha provocato un aumento significativo della secrezione di acqua, sodio e bicarbonato digiunale e ileale sia nel gruppo perfusato privo di glucosio sia in quello contenente glucosio. Non è stata osservata alcuna influenza sul movimento del calcio. Questi risultati, si simile ai risultati di Gray et al. (J Clin Invest 52:3084-3088, 1975) nel digiuno umano, suggeriscono che la calcitonina possa svolgere un ruolo nella patogenesi della diarrea acquosa osservata in circa un terzo dei pazienti con carcinoma midollare della tiroide. Inoltre, questi studi dimostrano l'utilità del coniglio come modello animale con cui indagare ulteriormente gli effetti della calcitonina sul trasporto di fluidi intestinali ed elettroliti.
Monitoraggio della frequenza cardiaca fetale in caso di diminuzione dei movimenti fetali.Trenta donne in gravidanza nel terzo trimestre di gravidanza in cui i movimenti fetali sono stati ridotti fino alla cessazione , per almeno 12 ore, sono stati monitorati per la FCF. La FCF 12-48 ore dopo la cessazione dei movimenti fetali era patologica in 21 casi e normale in 9 casi. Le alterazioni patologiche più frequenti della FCF erano perdita di variazione battito per battito e variabile decelerazioni. Nelle 48 ore successive altri quattro casi hanno mostrato alterazioni patologiche della FHR. Da uno a quattro giorni prima della riduzione dei movimenti fetali solo sei casi su 15 mostravano alterazioni patologiche della FHR che erano LBBV Meconio è stato trovato solo nel 50% dei casi. suggerito che le donne in gravidanza, in particolare i casi ad alto rischio, dovrebbero registrare i movimenti fetali come metodo di screening. Il monitoraggio FHR è anche un metodo prezioso per rilevare il disagio fetale prenatale e dovrebbe essere utilizzato in aggiunta alla registrazione dei movimenti fetali. Quando è stato stabilito un disagio fetale acuto con la sola MAS o con il cambiamento della FHR, il feto deve essere prontamente consegnato.
Rilevazione di antigeni tumore-specifici nel cistoadenocarcinoma mucinoso umano dell'ovaio mediante immunodiffusione.Antisiero di coniglio per un estratto tissutale di cistoadenocarcinoma mucinoso umano dell'ovaio ha reagito con estratti di tessuto di ovaio normale e varie neoplasie ovariche e fluidi ascitici o cistici di origine ovarica mediante tecniche di diffusione del doppio gel di Ouchterlony e di inibizione della precipitina. non erano presenti nell'estratto tissutale di ovaie normali riunite e nel liquido cistico della cisti tubo-ovarica benigh. Un antigene tumorale associato all'organo così come l'antigene tumorale tipo-specifico possono esistere nel cistoadenocarcinoma mucinoso dell'ovaio. Il cistoadenocarcinoma mucinoso non era molto immunologicamente diverso ma era distinguibile dal cistoadenocarcinoma sieroso e da altri tipi di cancro ovarico mediante doppia diffusione del gel. azioni hanno dimostrato che l'antisiero adsorbito al cistoadenocarcinoma mucinoso ovarico umano mescolato con estratti tissutali di disgerminoma e cistoadenocarcinoma sieroso e fluido ascitico di adenocarcinoma embrionale papillare dell'ovaio non poteva eliminare la linea specifica di precipina sviluppata con estratto di tessuto di cistoadenocarcinoma mucinoso.
Carcinoma in situ della cervice trattata con conizzazione epiteliale guidata da colposcopia. Report di uno studio di follow-up di 4-7 anni.Venti- cinque pazienti con diagnosi di carcinoma in situ (CIS) della cervice sono stati trattati con colposcopia guidata conizzazione epiteliale. Durante lo studio di follow-up di 4-7 anni \ ' durata, non vi era alcuna recidiva di CIS 20 del 25 pazienti. Tra 6 e 12 mesi dopo la conizzazione, 3 pazienti hanno mostrato recidiva di CIS. Due di questi pazienti sono stati trattati con ulteriore conizzazione epiteliale senza evidenza di ulteriore recidiva 4 anni dopo il secondo trattamento. Il terzo paziente ha rifiutato di accettare un'ulteriore conizzazione epiteliale e l'isterectomia radicale modificata è stata eseguita senza alcuna evidenza di tumore residuo nel campione di isterectomia. Un paziente ha mostrato invasione stromale sia nella biopsia guidata colposcopicamente che nella biopsia ossea. Il campione di isterectomia radicale modificata ha mostrato residui di invasione stromale. Un paziente w lo striscio di classe IV non ha mostrato alcuna zona di trasformazione atipica e la cervicite è stata dimostrata sulla biopsia guidata dalla colposcopia dopo il trattamento con Flagyl. Per due dei 25 pazienti, la citologia era classe II e non è riuscito quindi di diagnosticare la condizione pre-maligne; ma la colposcopia ha mostrato una zona di trasformazione atipica di grado 3 e la presenza di CIS è stata confermata istologicamente. L'uso simultaneo di citologia, colposcopia e biopsia colposcopica guidata ha confermato la diagnosi di CIS in tutti i casi. Gli autori raccomandano la conizzazione epiteliale guidata colposcopicamente nei pazienti più giovani, a condizione che la lesione maligna sia strettamente intraepiteliale e limitata all'ectocervice. Il follow-up di routine con l'ausilio della citocolposcopia rimane il fattore chiave in questo programma di terapia.
Ritodrina cloridrato ha indotto alterazioni emodinamiche cardiopolmonari e placentari in gravidanza normale e ipertensiva.Parametri cardiopolmonari (volume minuto, frequenza cardiaca, gittata sistolica, cuore destro , polmonare e del cuore sinistro), la pressione sanguigna e il flusso sanguigno placentare sono stati valutati in 20 pazienti normali, nove pazienti con malattia preeclamptica e 12 con ipertensione essenziale nella tarda gravidanza prima e 60 minuti dopo una singola dose im di 10 mg di ritodrina cloridrato Il farmaco ha causato un aumento statisticamente significativo della frequenza cardiaca in tutti i gruppi di pazienti, mentre la pressione sistolica e diastolica sono state solo leggermente influenzate. Il volume minuto è rimasto invariato nel gruppo dei pazienti normali, ma in entrambi i gruppi ipertesi si è registrato un aumento significativo L'indice di perfusione placentare è stato statisticamente quasi significativamente diminuito nel gruppo di gravidanze non complicate, aumentato in modo statisticamente significativo nei pazienti preeclampsici, e non affetti nel gruppo con ipertensione essenziale. Ci si può aspettare che il farmaco con ritodrina cloridrato abbia un effetto positivo sul flusso sanguigno placentare solo nella malattia preeclamptica, e quindi probabilmente nelle forme più lievi della malattia.
L'effetto del trattamento con un progestinico a basso dosaggio (Lynestrenol) sulla citologia ormonale.L'effetto della terapia progestinica continua a basse dosi sull'endogeno la produzione di estrogeni e l'ovulazione nelle donne, è stata studiata in termini di citologia vaginale. Il metodo di contrasto di fase è stato utilizzato per stabilire l'indice cariopknotico da 482 strisci di pazienti che utilizzano lynestrenolo 0,5 mg per la contraccezione orale. I risultati sono presentati come la media degli indici cariopicnotici, con deviazione standard ed errore standard della media, valutati su ogni periodo di tre giorni del ciclo mestruale e, nel caso di mestruazioni ritardate, su periodi più lunghi durante tutto il ciclo prolungato. Graficamente, i risultati sono mostrati come livelli medi rispetto ai controlli I nostri risultati mostrano che nei pazienti che hanno utilizzato il preparato per un massimo di tre mesi, la produzione ciclica di estrogeni varia solo leggermente, la media è entro il limite inferiore della norma e suggerisce FSH sup pressione. Nelle pazienti che utilizzano il preparato per periodi più lunghi, l'indice cariopicotico diventa durante tutto il ciclo simile a quello dei controlli, essendo chiaramente bifasico e generalmente suggestivo di ovulazione. Nel primo gruppo, il ritardo delle mestruazioni sembra essere causato principalmente dalla soppressione transitoria dell'FSH. Quando si verifica nel gruppo trattato per un periodo più lungo, il disturbo sembra essere causato da una condizione anovulatoria normo o iperestrogenica, dovuta inizialmente alla soppressione dell'LH con impostazione della soppressione dell'FSH in seguito, se il disturbo persiste più a lungo.
Analgesia epidurale nell'aborto a metà trimestre.L'analgesia epidurale è stata eseguita in 78 donne con aborto a metà trimestre o parto pretermine fino a 27 settimane di gravidanza. Le pazienti sono state divise in tre gruppi. Il primo gruppo comprendeva trenta donne con segni di aborto inevitabile. Il secondo gruppo comprendeva 9 casi di aborto indotto e il terzo di 39 casi di parto prematuro. I tre gruppi erano statisticamente valutati in relazione al momento dell'aborto o del travaglio, peso fetale, settimane di gravidanza, parità ed età della paziente e sono stati conseguentemente confrontati con 90 donne suddivise in tre gruppi di controllo simili. L'effetto dell'analgesia epidurale è stato soddisfacente in tutti i casi nel tre gruppi sperimentali, e non sono state osservate complicanze o effetti collaterali. I vantaggi dell'uso dell'analgesia epidurale erano la diminuita reazione psicologica all'aborto, la possibilità di eseguire procedure chirurgiche senza un ogni ulteriore anestesia e la riduzione della durata dell'aborto o del travaglio. Questi vantaggi giustificano a nostro avviso l'uso della procedura.
Rapporto lecitina/sfingomielina rispetto al test rapido dei tensioattivi nelle gravidanze normali e diabetiche.Il rapporto lecitina/sfingomielina (L/S) è stato misurato e il test rapido dei tensioattivi (RST) è stato eseguito su campioni di liquido amniotico prelevati da 60 gravidanze normali e 18 gravidanze diabetiche, per la determinazione della maturità polmonare fetale. I risultati sono stati confrontati con l'esito neonatale. Il confronto tra rapporto L/S e RST dimostra una buona correlazione (95%) tra i due test nelle gravidanze normali. Nelle gravidanze diabetiche, invece, la correlazione è notevolmente inferiore (54%). -65% di risultati falsi negativi. Nelle gravidanze diabetiche il rapporto L/S era affidabile come nelle gravidanze normali, ma l'RST era meno affidabile, con un tasso di previsione RDS del 18%. Si presume che l'aumento del volume del liquido amniotico in gravidanze diabetiche, provoca la diluizione del tensioattivo gi Vivendo più falsi negativi nella RST di quanti se ne riscontrano con il rapporto L/S, in quanto in quest'ultimo, misurando il rapporto tra i due costituenti del liquido amniotico, viene abolito il fattore di diluizione. Nelle gravidanze diabetiche, un RST positivo è affidabile, ma con risultati negativi è necessario determinare il rapporto L/S per una corretta valutazione della maturità polmonare fetale.
Actinomicosi pelvica.Case report di ascesso tubo-ovarico dovuto ad Actinomyces israeli viene presentato con revisione della letteratura riguardo a patogenesi, difficoltà diagnostiche e trattamento. La diagnosi è stata stabilita coltivando l'organismo dall'essudato ottenuto durante l'intervento chirurgico. La patogenesi dell'actinomicosi pelvica è ancora controversa. La penetrazione del tratto gastrointestinale con successiva infezione dei visceri pelvici sembra essere la modalità più probabile di infezione. La penicillina ha un ruolo importante ruolo nel trattamento di questa malattia. Non cura, ma ritarda il decorso dell'infezione. L'estirpazione chirurgica del tessuto infetto in combinazione con la penicillina offre i migliori risultati terapeutici. Quando la malattia infiammatoria pelvica cronica non risponde alla terapia, quando la sedimentazione il tasso rimane alto e la debolezza generale del paziente è progressiva, si deve sospettare un'infezione actinomicotica.
Ovaio policistico. Presentazione e risposta alla resezione a cuneo.La malattia dell'ovaio policistico è stata riconosciuta da molto tempo, anche se le sue presentazioni variano da luogo a luogo In un rapporto di casi di ovaio policistico osservati presso l'University College Hospital, Ibadan, Nigeria, in un periodo di sei anni, è stato dimostrato che la sindrome di Stein-Leventhal identifica solo una frazione molto piccola e probabilmente artificiale del numero molto maggiore di pazienti che hanno effettivamente malattia dell'ovaio policistico. È stato inoltre dimostrato che il beneficio derivato dalla resezione a cuneo nei nostri casi è stato notevole. Dei casi che sono stati successivamente osservati al follow-up, c'è stato il ripristino del regolare flusso mestruale ovulatorio in 83,3% e raggiungimento della gravidanza nel 33,3%. Quindi, l'osservazione che la resezione a cuneo è benefica e, a volte, curativa nella malattia dell'ovaio policistico sembra avere solide basi.
Linfoma di Burkitt che si manifesta durante l'allattamento.Sono presentati le difficoltà diagnostiche e i fallimenti terapeutici del linfoma di Burkitt che si manifesta durante l'allattamento. Tutti e 5 i casi presentati come gonfiore del seno, mimando la mastite carcinomatosa; quei pazienti che allattavano attivamente avevano una malattia fulminante, fatale nel giro di poche settimane. C'era un diffuso coinvolgimento degli organi interni. È stata sottolineata l'importanza di una corretta diagnosi precoce e i medici sono allertati sulla possibilità di linfoma di Burkitt che si verificano durante l'allattamento senza presentazione della mandibola o dell'addome. Che la manifestazione fulminante del linfoma di Burkitt che si verifica durante l'allattamento sia stata una coincidenza o meno, esiste la possibilità che si sia prodotto un ambiente favorevole per la crescita del tumore o che il meccanismo immunitario del corpo sia stato abbassato.
Un confronto tra laparoscopia e culdoscopia per la sterilizzazione interna.Negli ultimi anni, l'aumento della domanda di sterilizzazione da parte delle donne che hanno raggiunto la dimensione familiare desiderata ha ha sottolineato la necessità di migliorare sia i metodi esistenti di occlusione tubarica sia i mezzi di accesso alle tube di Falloppio L'utilizzo di strumenti diagnostici come il laparoscopio e il culdoscope per eseguire la sterilizzazione riduce al minimo il trauma associato alla laparotomia e alla colpotomia standard e promette di ridurre la morbilità che si verifica come risultato della sterilizzazione. Al fine di valutare e confrontare le tecniche migliorate di laparoscopia e culdoscopia per la sterilizzazione a intervalli elettivi, tra gennaio e agosto 1973 presso l'ospedale Siriraj di Bangkok sono state studiate 722 donne. Per 279 pazienti (gruppo I), la sterilizzazione è stata eseguita mediante legatura delle tube culdoscopica utilizzando una tecnica Pomeroy modificata; per 443 pazienti (Gruppo II), la procedura utilizzata è stata laparoscopica delle tube c auterizzazione e taglio. Tutte le procedure sono state eseguite in anestesia locale in regime ambulatoriale. I tassi di complicanze e il tempo chirurgico richiesto erano simili per entrambe le procedure e confrontati favorevolmente con i tassi riportati da altri ricercatori. A causa della bassa incidenza di complicanze e dell'eliminazione della necessità di anestesia generale e ricovero ospedaliero, entrambe le procedure endoscopiche sembrano essere di particolare valore nei paesi in via di sviluppo dove le strutture ospedaliere e il tempo del medico scarseggiano.
Concentrazioni feto-materne di diazepam e W-demetildiazepam dopo iniezione intra-amniotica di diazepam.Dieci milligrammi di diazepam sono stati iniettati per via intraamniotica in 8 madri prima della aborto terapeutico tra 12 e 19 settimane. Le concentrazioni di diazepam nel plasma materno erano paragonabili a quelle riscontrate dopo la stessa dose di diazepam intramuscolare alla madre. La concentrazione di diazepam nel liquido amniotico da 12 a 18 ore dopo l'iniezione non era più significativamente più alta rispetto al plasma materno. Le concentrazioni di diazepam nel plasma, nel fegato e nel cervello fetali erano paragonabili alle concentrazioni risultanti da una dose intramuscolare di diazepam di 10 mg alla madre circa 2 ore prima dell'aborto legale. Il rapporto feto-materno di diazepam era di stessa grandezza come dopo l'applicazione intramuscolare alla madre I risultati indicano che la scomparsa del diazepam dal liquido amniotico in questa fase della gravidanza avviene extra placentare, attraverso le membrane, nella circolazione uterina. Nel trattamento di un feto con farmaci aventi proprietà simili al diazepam, la somministrazione intra-amniotica non è migliore della somministrazione intramuscolare alla madre.
Virus dell'herpes di tipo 2 e neoplasie ginecologiche.Numerosi studi siero-epidemiologici hanno rilevato un'associazione tra il virus dell'Herpes di tipo 2 (HT-2) e carcinoma della cervice In uno studio per valutare il ruolo di questo virus, se presente, sull'eziologia delle neoplasie pelviche extracervicali in Ibadan, la prevalenza degli anticorpi del virus HT-2 è risultata non essere significativamente diversa nei pazienti con neoplasie pelviche (carcinoma della vulva e malattia trofoblastica maligna) e casi di cervicite cronica rispetto ai controlli sani. Si è quindi concluso che non è stata trovata alcuna associazione tra il virus HT-2 e le neoplasie pelviche extracervicali.
Valutazione di ostetriche addestrate in un programma di inserimento di IUD in rame-T a Isfahan, Iran.Da quattro centri di Isfahan, i dati di 252 inserimenti del Vengono confrontati il Cu-T-200 effettuato dalle ostetriche e 646 inserimenti dello stesso dispositivo effettuati dai medici. Anche se il tasso cumulativo netto di continuazione a un anno per le donne che hanno avuto un rame-T inserito da un'ostetrica è significativamente inferiore a quello per le donne che hanno avuto un rame-T inserito da un medico non ci sono differenze significative tra i tassi di eventi a un anno per i due gruppi di pazienti. Questi dati suggeriscono che un ruolo ampliato per le ostetriche nei programmi di inserimento di IUD sarebbe un uso efficiente del personale sanitario".
Confronto tra cannule di plastica flessibili e non flessibili per eseguire l'aborto del primo trimestre.La sicurezza e l'efficacia delle cannule di plastica flessibili e non flessibili utilizzate nell'aborto con aspirazione sotto vuoto per i pazienti da 6 a 12 settimane\' di gestazione sono stati valutati in uno studio su 1100 donne fisicamente sane a Lubiana, in Jugoslavia. Per ridurre al minimo i bias dello studio, ogni tipo di cannula è stato assegnato in modo casuale a 550 pazienti. Per ridurre al minimo il bias del valutatore, un secondo medico che era tenuto all'oscuro di quale cannula fosse stata utilizzata per un particolare paziente era responsabile della valutazione dei pazienti dopo le procedure. Entrambi i gruppi di pazienti erano simili per quanto riguarda l'età, la parità, lo stato civile, l'istruzione formale e l'età gestazionale. Tassi più elevati di tessuto trattenuto e ostruzione della cannula sono stati ottenuti con la cannula flessibile. I due tipi di cannule non erano significativamente differenti rispetto ad altri criteri di valutazione.
Studio di follow-up sugli accettori di contraccettivi orali nel distretto di Howrah in India.Nel distretto di Howrah in India, tre cliniche, una in ciascuna delle le aree urbane, baraccopoli e rurali della città - sono state avviate dalla Humanity Association of Howrah nel novembre del 1968 per fornire contraccettivi orali (OC) alle donne dai 15 ai 45 anni di età. Il progetto è stato interrotto nel settembre 1972 Dei 1700 pazienti ancora attivi al termine del progetto, 1527 sono stati contattati per l'indagine di follow-up. I risultati indicano che la maggior parte delle donne in questo distretto era soddisfatta dei CO e continuerebbe ad usarli se fossero disponibili. A conferma di ciò, è stato riscontrato che il 43% delle donne aveva utilizzato OC\'S ottenuto da altre fonti dopo l'interruzione del progetto, mentre il 35,5% delle donne che non hanno utilizzato alcun metodo contraccettivo dopo la fine del progetto ha riferito di essere incinta o sospettava di essere incinta al momento dell'intervista, solo il 4,2% di chi ha riferito utilizzando una qualche forma di contraccezione segnalata gravidanza o sospetta gravidanza. L'impatto demografico del progetto sarà valutato sulla base dei dati da ottenere in una successiva indagine sulle stesse comunità.
Selezione dei globuli rossi in topi chimerici.Elettroforesi su gel di amido di un gran numero di tessuti e organi da C3H in equilibrio Le chimere di aggregazione C57BL suggeriscono che il Predomina la popolazione di globuli rossi C57BL, mentre per gli altri tessuti le proporzioni dei due componenti sono pressoché uguali. Una simile predominanza dei globuli rossi (C57BL X C3H)F1 si osserva nelle chimere recessive (C57BL X C3H)F1 in equilibrio. di campioni di sangue prelevati dagli stessi animali in tempi diversi suggerisce che uno spostamento temporale nelle proporzioni delle popolazioni di globuli rossi dei due componenti si verifica in alcune chimere adulte e si traduce in un fenotipo chimerico sbilanciato. Si suggerisce che l'attività mitotica differenziale contribuisce al ceppo- pressioni di selezione tessuto-specifiche dipendenti nel tessuto eritropoietico.
Rilassamento delle strisce delle arterie coronarie da adenosina e acidosi.Curve cumulative dose-risposta degli incrementi di tensione indotti da Ca2+ sono state studiate in strisce elicoidali depolarizzate da K+ delle arterie coronarie del cane. L'adenosina 10(-4) M ha ridotto la sensibilità al Ca2+ delle strisce senza alterare la tensione massima con la piena attivazione del Ca2+. Al contrario, l'acidosi di pH 7,05 ha ridotto significativamente la tensione massima con la piena attivazione del Ca2+. L'effetto rilassante di l'acidosi è stata quasi completamente abolita dall'adenosina 10(-4) M. Si conclude che l'adenosina inibisce l'afflusso di Ca2+, mentre l'acidosi deprime direttamente il processo contrattile della muscolatura liscia vascolare.
Farmacologia di un nuovo ftalano (Lu 10-171), con proprietà specifiche di inibizione della captazione di 5-HT.Il profilo farmacologico di una nuova sostanza biciclica , Lu 10-171 (1-(3-(dimetilammino)propil)-1-(p-fluorofenil)-5-ftalancarbonitril), è descritto e confrontato con quello dei timolettici triciclici esistenti. Nei topi e nei ratti il composto ha mostrato contrassegnato 5 -HT potenzia le proprietà sia in vivo che in vitro, essendo 5-10 volte più attivo della clorimipramina. I test includevano 5-HT-, 5-HTP- e potenziamento del triptofano. In cani e conigli trattati con inibitori delle monoamino ossidasi il composto ha causato un marcata ipertermia Nei conigli questo effetto è stato completamente bloccato dal pretrattamento con l'inibitore della triptofano idrossilasi, la p-clorofenilalanina. aumento di temperatura indotto da H 75/12. Reserpina- e tetrabenazina La ptosi indotta da e e l'immobilità indotta dalla tetrabenazina nei topi erano antagonizzate da dosi relativamente basse di timolettici triciclici esistenti, mentre Lu 10-171 era molto debole a questo riguardo. Per Lu 10-171 sono state registrate anche proprietà anticolinergiche e antistaminergiche in vitro molto deboli. Si conclude che Lu 10-171 è un potenziatore molto potente e altamente specifico di 5-HT sia in vivo che in vitro, probabilmente a causa dell'inibizione dell'assorbimento di 5-HT. Quindi questo composto potrebbe essere un agente utile nello studio del ruolo dei sistemi neuronali 5-HT nel controllo dell'umore. La sostanza non possiede le proprietà di potenziamento dell'NA e anticolinergiche e antistaminergiche caratteristiche degli antidepressivi triciclici.
Metabolismo della perlapina e della dopamina: previsione dell'efficacia antipsicotica.Un modello per la previsione dell'efficacia antipsicotica basato sull'aumento dose-dipendente dei livelli di 3 Viene presentato l'acido ,4-diidrossifenilacetico (DOPAC) nello striato e nel tuberculum olfactorium del ratto. L'effetto della perlapina, un agente sedativo e stimolante del sonno segnalato come privo di efficacia antipsicotica, è stato confrontato in questo sistema con aloperidolo, clorpromazina e clozapina. Tutti e quattro i farmaci hanno prodotto un aumento dose-dipendente del DOPAC nelle due strutture ricche di dopamina. La potenza della perlapina era simile a quella della clorpromazina. La dopamina, dosata nello striato e nel tubercolo olfattivo mediante una nuova procedura gascromatografica non è stata alterata dalla perlapina Le curve tempo-azione per la perlapina e la clozapina erano praticamente identiche sia nello striato che nel tuberculum olfattorio Tutti e quattro i farmaci hanno anche elevato l'acido omovanillico in misura simile. Ciò indica che la perlapina dovrebbe essere rivalutata clinicamente. Prevediamo che tali studi riveleranno che la perlapina possiede un'efficacia antipsicotica.
Confronto degli effetti dell'adifenina e del TRH sul rilascio di TSH da parte dell'ipofisi di ratto in vitro.Il meccanismo d'azione dell'adifenina sul rilascio di TSH dell'ipofisi anteriore di ratto in vitro. è stato confrontato con quello dello stimolatore fisiologico TRH. Lo studio comparativo ha mostrato che l'adifenina e il TRH erano in grado di aumentare il rilascio di TSH in modo dose-dipendente, avevano tempi d'azione simili per concentrazioni stimolanti equipotenti e producevano aspetti simili delle cellule stimolate di TSH. Tuttavia, c'erano molte differenze tra gli effetti dell'adifenina e del TRH. L'azione dell'adifenina era inibita da 20 mM K+; non era dipendente dal calcio; non era inibita né dagli ormoni tiroidei né dalla somatostatina; era poco influenzata dalla depressione energetica. Si conclude che probabilmente l'adifenina agisce vicino alle fasi finali del percorso di rilascio del TSH e potrebbe essere un utile strumento farmacologico per studiare il meccanismo del rilascio del TSH.
Studi iontoforetici sull'istamina e sugli antagonisti dell'istamina nei nuclei vestibolari felini.L'attività di singoli neuroni nel complesso neuronale vestibolare di gatti decerebrati mediocollicolari e decerebellectomizzati sono stati registrati e la loro risposta all'istamina applicata iontoforeticamente e ad altri agenti determinata. La maggior parte delle cellule testate è stata inibita dalla iontoforesi dell'istamina mentre il 24% è stato eccitato da questo agente. I neuroni che mostrano risposte inibitorie sono stati ampiamente distribuiti nei quattro nuclei vestibolari e nel reticolo adiacente mentre le risposte eccitatorie all'istamina sono state ottenute principalmente nella regione del nucleo vestibolare laterale. Gli agenti bloccanti i recettori H2 metiamide e cimetidina sono stati esaminati per la loro azione sulle cellule che sparano spontaneamente e sulle cellule colpite dall'istamina. La metiamide era selettiva nel bloccare l'istamina- inibizione indotta ma non eccitazione mentre la cimetidina era inefficace in blo cking entrambe le risposte. Questi risultati suggeriscono che l'istamina ha azioni sia inibitorie che eccitatorie sui neuroni del tronco cerebrale e la metiamide è un efficace antagonista dell'inibizione indotta dall'istamina.
Effetto ipotensivo acuto del blocco combinato dei recettori beta1-adrenergici e della stimolazione dei recettori beta2-adrenergici in ratti spontaneamente ipertesi (SHR).L'effetto sulla frequenza cardiaca (HR) ) e la pressione sanguigna (PA) di metoprololo, propranololo e terbutalina, applicati da soli o in combinazione sono stati studiati in ratti spontaneamente ipertesi. La terbutalina ha avuto scarso effetto su PA e FC. Il propranololo combinato con terbutalina non ha avuto alcun effetto mentre il metoprololo combinato con terbutalina ha ridotto la PA di 48 mm Hg senza influenzare la frequenza cardiaca. Pertanto, l'aumento mediato da beta2 della resistenza vascolare periferica dopo terbutalina è stato rivelato da un calo della pressione arteriosa dopo il blocco beta1 da parte del metoprololo, ma non quando entrambi i recettori beta1 e beta2 sono stati bloccati dal propranololo.
Trasporto di ciclitoli da parte di un protone in Klebsiella aerogenes.La respirazione e il contenuto di ATP di Klebsiella aerogenes in presenza di vari inibitori sono stati confrontati con il trasporto dello scillo-inositolo. L'ATPasi è risultata inibita dalla dicicloesil carbodiimmide. Il trasporto è stato testato in anaerobiosi e aerobiosi. Dai risultati ottenuti si conclude che sia l'ATP che la respirazione possono sostenere l'attività di trasporto in modo indipendente. 2 L'energia derivata dalle reazioni a catena respiratoria o dall'idrolisi dell'ATP determina l'estrusione elettrogenica di protoni. Il potenziale elettrochimico creato determina l'accumulo di scillo-inositolo, come dimostrato da un aumento del pH del mezzo in seguito all'aggiunta del substrato alle cellule in anaerobiosi Con le cellule non indotte non si verifica alcuna variazione del pH, il che dimostra che il flusso di protoni è realmente legato al trasporto Non si osserva alcuno scambio H+/Na+ o K+ e la condotta protonica o il carbonilcianuro m-clorofenilidrazone abolisce lo spostamento del pH causato dall'aggiunta del substrato. La stechiometria del symport H+/ciclitolo è 1 e il valore semi-massimo della variazione di pH in funzione della quantità di scillo-inositolo aggiunta corrisponde ad una concentrazione di scillo-inositolo molto vicina al KT di afflusso.
Effetto Bohr ligando-dipendente delle emoglobine Chrionomus.Gli effetti Bohr O2 e CO delle emoglobine monomeriche e dimeriche dell'insetto Chironomus thummi thummi sono stati determinati come rilascio di protoni dopo ligazione. Per l'effetto O2 Bohr dell'emoglobina monomerica III è stato ottenuto un valore massimo di 0,20 H+/eme a pH 7,5. Tuttavia, dopo ligazione con CO, allo stesso pH sono stati rilasciati solo 0,04 H+/eme. con questa scoperta esperimenti di focalizzazione isoelettrica hanno rivelato diversi punti isoelettrici per gli stati leganti O2 e CO-legati dell'emoglobina III. Risultati analoghi sono stati ottenuti nel caso dell'emoglobina monomerica IV e delle emoglobine dimeriche di Chironomus thummi thummi, qui effetti di O2 Bohr di 0,43 e 0,86 H+/eme. Per i corrispondenti effetti di CO Bohr sono stati ottenuti valori rispettivamente di 0,08 e 0,31 H+/eme. Sulla base dei dati strutturali disponibili l'effetto ridotto di CO Bohr nell'emoglobina III è discusso come ari cantano da un impedimento sterico del ligando CO da parte della catena laterale dell'isoleucina-E11, ostruendo il movimento del ferro eme dopo la reazione con il monossido di carbonio. Va tuttavia notato che i ligandi, a seconda delle loro diverse proprietà di donatori e accettori di elettroni, possono generalmente indurre diversi cambiamenti conformazionali e quindi diversi effetti di Bohr, in quelle emoglobine in cui non si sono evoluti vincoli terziari e/o quaternari distinti. L'utilizzo generale di CO invece di O2 come effettore allosterico è escluso dai risultati qui riportati.
Lisozima delle uova dell'insetto Ceratitis capitata.1. Il lisozima delle uova del Dittero Ceratitis capitata (Wiedeman) è stato purificato mediante cromatografia a scambio ionico e gel filtrazione e le sue proprietà fisico-chimiche. Questo è il primo lisozima di insetto caratterizzato finora e presenta alcune proprietà diverse da quelle descritte per altri lisozimi animali. 2. Il lisozima dalle uova di insetto ha un peso molecolare di circa 23200 e un coefficiente di sedimentazione di 2,4 S. La determinazione del peso molecolare mediante elettroforesi su gel di sodio decilsolfato indica che la molecola è costituita da una singola catena polipeptidica 3. Questa preparazione di lisozima mostra una notevole stabilità a valori di pH acidi e labilità a valori di pH alcalini Mostra un unico pH ottimale a circa 6.5.4. Il rapporto di attività specifica chitinasi/muramidasi è circa 350 volte superiore per il lisozima dell'insetto rispetto all'enzima albume d'uovo di gallina. 5. La composizione amminoacidica mostra la presenza di un residuo di triptofano per molecola di enzima. Questo fatto differenzia il lisozima dalle uova di insetti da altri lisozimi animali e vegetali. Dalla composizione amminoacidica si calcolano il coefficiente di assorbimento e il volume specifico parziale. 6. La glicina è il residuo N-terminale.
Cinetica e regolazione dell'ATPasi del reticolo sarcoplasmatico.La misurazione del legame dell'ATP alla membrana del reticolo sarcoplasmatico rivela che la pompa del calcio possiede un'alta affinità (Kd = 2--3 muM). La competizione con gli analoghi del substrato mostra l'elevata specificità di quel sito. Ad alte concentrazioni di ATP può essere rilevata un'altra classe di siti con una costante di dissociazione molto più alta (Kd circa 500 muM). Questa classe di siti è di bassa specificità e l'ATP è facilmente spostato da altri polifosfati. Il tasso di scissione dell'ATP allo stato stazionario è misurato in presenza di analoghi dell'ATP. È dimostrato che la catalisi è dovuta al sito ad alta affinità. L'attivazione del tasso di idrolisi a un'elevata concentrazione di substrato può essere correlata all'effetto del legame dell'ATP ai siti deboli. L'effetto degli analoghi dell'ATP per varie concentrazioni di ATP supporta questa ipotesi.
Sull'attività ottica dei residui tirosilici ionizzati nella lutropina ovina.L'effetto degli alcali sugli spettri dicroici circolari (CD) della lutropina ovina e dei suoi subunità è stata studiata. Il pH leggermente alcalino induce la comparsa di una nuova banda otticamente attiva nella regione di 250 nm degli spettri della lutropina senza alcuna alterazione rilevabile nella struttura secondaria della proteina. Questo cambiamento è reversibile e può essere correlato con la ionizzazione di 2--3 residui di tirosile esposti nell'ormone intatto. In un precedente rapporto di questo laboratorio si è concluso che i tre residui di tirosile esposti si trovano nella subunità alfa, nelle posizioni 21, 92 e 93 [Burleigh, BD, Liu, W. -K e Ward, DM (1976) J. Biol. Chem. 251, 308--315]. La nitrazione di questi residui abbassa il pH al quale l'intensità della banda di 250 nm è massima. L'importanza della residui tirosile di lutropina alfa (al contrario di quelli di lutropina beta) è supportato anche dal simil arità dell'effetto degli alcali sugli spettri CD di lutropina e lutropina alfa. Ulteriori prove di questo coinvolgimento sono state ottenute anche confrontando i cambiamenti indotti dagli alcali della lutropina ripiegata (alfa + beta ricombinante) e il prodotto ottenuto dalla ricombinazione della des-(92--96)-lutropina alfa (ottenuta dal trattamento con carbossipeptidasi di subunità alfa) e lutropina beta. I risultati indicano che la rimozione delle tirosine alfa 92 e alfa 93 determina una diminuzione dell'intensità della banda di 235 nm della lutropina ovina (a pH 7,5) e di quella della banda di 250 nm osservata in condizioni alcaline. Si conclude quindi che la banda di 250 nm osservata nelle soluzioni alcaline di lutropina deriva (almeno parzialmente) dallo spostamento verso il rosso prodotto nella banda otticamente attiva a lunghezza d'onda corta delle tirosine alfa 21, alfa 92 e alfa 93 al momento della ionizzazione.
Idrolisi ciclica di nucleotidi nella ghiandola tiroide. Proprietà generali e ruolo chiave nelle interrelazioni tra le concentrazioni di adenosina 3\':5\'-monofosfato e guanosina 3\':5 \'-monophosphate.Le attività della fosfodiesterasi della frazione solubile tiroidea del cavallo (e del cane) sono state confrontate con l'AMP ciclico (adenosina 3\':3\'-monofosfato) o con il GMP ciclico (guanosina 3\': 5\'-monofosfato) come substrato. L'attività ottimale per l'idrolisi dell'AMP ciclico è stata osservata a pH 8 e a pH 7,6 per GMP ciclico. L'aumento delle concentrazioni di acido etilenglicole bis(2-amminoetil)-N,N\'-tetraacetico ha inibito entrambi attività fosfodiesterasica; in presenza di Ca2+ esogeno, questo effetto è stato spostato a concentrazioni più elevate del chelante. In una preparazione surnatante dializzata, Ca2+ non ha avuto un effetto stimolante significativo, ma sia Mg2+ che Mn2+ hanno aumentato la disgregazione dei nucleotidi ciclici. Mn2+ ha promosso l'idrolisi dei nucleotidi ciclici AMP di più efficace rispetto a quello del GMP ciclico. Per entrambi i substrati, le curve di velocità del substrato hanno mostrato un modello a due pendenze in un diagramma di Hofstee. Il GMP ciclico ha stimolato l'idrolisi dell'AMP ciclico, essendo entrambi i nucleotidi a concentrazioni micromolari. Al contrario, a nessuna concentrazione l'AMP ciclico ha avuto alcun effetto stimolante sull'idrolisi ciclica di GMP. 1-metil-3-isobutilxantina e teofillina hanno bloccato l'attivazione da parte di GMP ciclico di GMP ciclico di idrolisi di AMP ciclico, mentre Ro 20-1724 (4-(3-butossi-4-metossibenzil)-2-imidazolidinone), un non-metilxantina inibitore delle fosfodiesterasi, non ha alterato questo effetto. Nelle fette di tiroide del cane, la carbamoilcolina, che promuove un accumulo di GMP ciclico, inibisce l'aumento dell'AMP ciclico indotto dalla tireotropina. Questo effetto inibitorio della carbamoilcolina è stato bloccato dalla teofillina e dall'1-metil-3-isobutilxantina, ma non da Ro 20-1724. Si suggerisce che l'effetto inibitorio colinergico sull'accumulo di AMP ciclico sia mediato dal GMP ciclico, attraverso un'attivazione diretta dell'attività della fosfodiesterasi.
Studio di risonanza magnetica nucleare protonica della conformazione della neurotossina II dal veleno di cobra dell'Asia centrale (Naja naja oxiana).Un nucleare protonico È stato eseguito lo studio di risonanza magnetica (NMR) a 100 e 300 MHz della neurotossina II dal veleno del cobra medio-asiatico Naja naja oxiana in soluzioni 2H2O e H2O Mediante modificazione chimica e doppia risonanza sono state assegnate tutte le risonanze dei residui aromatici Dalle curve di titolazione NMR sono stati determinati i valori di pK dei residui di istidina 4 e di istidina 31. Per uno dei due residui di triptofano adiacenti è stata rivelata la dipendenza dal pH (nell'intervallo 2-8-pH) degli spostamenti chimici dei protoni indolici In base alla diversa sensibilità della larghezza di riga delle risonanze NH dell'indolo al pH in soluzione di H2O, è stata stimata l'accessibilità di ciascuno dei residui di triptofano È stata osservata la dipendenza dalla temperatura per la larghezza di riga delle risonanze aromatiche del residuo di tirosina 24. I tassi di cambio del deuterio sono stati misurati per i protoni ammidici e per le risonanze dell'istidina C(2)H. I dati NMR ottenuti hanno permesso di trarre le conclusioni che i due residui di istidina e uno dei residui di triptofano dovrebbero essere localizzati sulla superficie del globulo proteico, che i residui di arginina dovrebbero essere presenti nell'ambiente dell'istidina 4, che l'istidina 31 e il triptofano sepolto è probabilmente localizzato in stretta prossimità spaziale e che la catena laterale della tirosina 24 è sepolta all'interno del globulo proteico.
Studi magnetici sul ferri-eme undecapeptide del citocromo c.La dipendenza dal pH del momento magnetico di un ferri-eme undecapeptide, prodotto da La digestione peptica del citocromo c, è stata misurata in soluzione acquosa utilizzando un metodo di risonanza magnetica nucleare. Al di sotto di pH 3 il momento magnetico è coerente con la presenza di dimeri a ponte idrossido di ferro(III) ad alto spin. Al di sopra di pH 7 il ferro( III) è a basso spin, lo spin crossover conforme a una semplice curva di titolazione con pK 6.3 (n=1). Questa transizione è discussa con riferimento a studi spettrofotometrici sul legame del ligando all'eme.
Metabolismo di gamma-glutamil aminoacidi e peptidi nel fegato e nei reni di topo in vivo.Il metabolismo in vivo di gamma-glutamil aminoacidi e peptidi è stato studiato nel topo dopo la somministrazione di dosi di carico di L-gamma-glutamil-2-amminobutirrato e diversi altri composti gamma-glutamilici, incluso il glutatione. È stato osservato un grande e rapido accumulo di glutammato, glutammina, aspartato e pirrolidone carbossilato nel rene Allo stesso modo, dopo la somministrazione di una dose tracciante di L-gamma-[14C]glutamil-L-2-amminobutirrato è stata trovata una rapida incorporazione del marcatore nel glutammato renale, glutammina e aspartato. Questi risultati suggeriscono che sia l'idrolitico che il gamma-glutamil le reazioni di trasferimento catalizzate dalla gamma-glutamil transpeptidasi sono attive nella manipolazione renale dei composti gamma-glutamil. È stata ottenuta una prova indiretta che l'L-gamma-glutamil-2-amminobutirrato è parzialmente assorbito dalla cellula renale in forma intatta. il renale, la somministrazione di diversi gamma-glutamil derivati non ha provocato un aumento del glutammato epatico, della glutammina e del pirrolidone carbossilato. Dopo somministrazione di L-gamma-glutamil-2-amminobutirrato è stato osservato solo un leggero aumento dell'aspartato epatico e del pirrolidone carbossilato. Esperimenti con L-gamma-[14C]glutamil-L-2-amminobutirrato suggeriscono che questo derivato è in gran parte prima degradato nei suoi amminoacidi componenti (probabilmente nel rene) prima di entrare nel metabolismo della cellula epatica. La gamma-glutamil transpeptidasi può funzionare nel metabolismo e nel trasporto del glutatione e di altri composti gamma-glutamile in modo analogo alla funzione delle dipeptidasi e delle disaccaridasi nel metabolismo e nel trasporto rispettivamente di dipeptidi e disaccaridi.
Effetto dell'ambiente immediato sulla reattività del gruppo -SH essenziale della papaina.L'effetto del microambiente sulla reattività dell'essenziale - - Il gruppo SH della papaina è stato studiato mediante alchilazione con ioduro di metile e con la più polare iodoacetammide. Parametri di velocità e di attivazione per queste reazioni sono stati determinati con due forme del gruppo --SH: lo ione mercaptide libero a pH 10.0, e il mercaptide- imidazolium a pH 5,5. La coppia ionica della papaina reagisce con lo ioduro di metile a una velocità 1470 volte inferiore a quella della tiolsubtilisina. Questa sorprendente differenza tra le reattività dei due enzimi suggerisce che, contrariamente alla tiolsubtilisina, dove un non- l'ambiente polare aumenta la velocità, nel caso della papaina un ambiente più polare inibisce in qualche modo la reazione con lo ioduro di metile non polare. L'entropia di attivazione positiva per la reazione della papaina può indicare una struttura \'ordinata\' di acqua legata intorno d l'atomo di zolfo. L'alta velocità e la bassa entropia di attivazione (stato di transizione organizzato) della reazione della papaina con iodoacetammide possono essere spiegate in termini di formazione di legami idrogeno tra l'enzima e il gruppo ammidico dell'agente alchilante.
La dissociazione dei coenzimi flavinici dalla NADPH/citocromo c (P-450) reduttasi solubilizzata con tripsina dei microsomi del fegato di maiale.Il cambiamento nella fluorescenza l'emissione a 520 nm dopo l'eccitazione a 365 nm è stata utilizzata per studiare l'effetto del pH e della forza ionica sulla dissociazione dei cofattori flavinici dalla NADPH/citocromo c (P-450) reduttasi microsomiale Nell'enzima non modificato sono apparse sia la frazione FAD che FMN per dissociarsi a una velocità simile e ha seguito la cinetica del primo ordine. La costante di velocità per la dissociazione è stata aumentata da un pH basso e un'elevata forza ionica, in particolare nell'intervallo pH 4,4-3,8 (0,02 M tampone acetato) dove le costanti di velocità sono aumentate di 80- La modifica dell'enzima mediante trattamento con p-cloromercuribenzoato ha aumentato la velocità di dissociazione della flavina e, nella regione del pH 4, ha determinato un aumento bifasico della fluorescenza coerente con due dissociazioni parallele del primo ordine simultanee. Si è concluso che p- cloro Il trattamento con rcuribenzoato ha modificato la proteina in modo che i due cofattori della flavina si siano dissociati a velocità diverse. Utilizzando le costanti di velocità misurate per le dissociazioni e la nota variazione nella fluorescenza dei nucleotidi flavina con il pH, una simulazione analogica al computer della dissociazione e una procedura di adattamento della curva manuale hanno mostrato che la risposta bifasica potrebbe essere spiegata come una rapida dissociazione simultanea di FAD e una perdita più lenta di FMN dalla proteina.
Levansucrase of Bacillus subtilis. Caratterizzazione di un complesso fruttosile-enzima stabilizzato e identificazione di un residuo aspartico come sito di legame del gruppo fruttosile.A Il complesso fruttosil-enzima legato covalentemente è stato isolato da una miscela di reazione di enzima e saccarosio sottoposta all'effetto di spegnimento di una forte diminuzione del pH. Il legame fruttosil-enzima si è dimostrato stabile in condizioni acide e neutre in presenza di alte concentrazioni di urea e di sodio dodecilsolfato. Questo intermedio non ha trasferito ad una velocità misurabile il suo gruppo fruttosile agli usuali accettori fruttosile della reazione enzimatica nelle condizioni usuali di attività enzimatica. Tuttavia misurazioni di stabilità del legame fruttosil-enzima indicavano una marcata labilità a valori di pH superiori a 8,5. La costante di velocità apparente della reazione idrolitica di questo legame valutata nello stato standard di concentrazione molare dello ione idrossido era dello stesso ordine er di grandezza come la costante di velocità apparente della reazione idrolitica del fruttosil-enzima transitorio postulato dall'analisi cinetica della levansucrasi. Inoltre, agenti nucleofili come l'imidazolo hanno potenziato la reazione idrolitica del legame fruttosile-enzima. L'identificazione del sito di legame del fruttosile sull'enzima è stata ottenuta mediante idrolisi proteolitica del complesso intrappolato. La digestione peptica seguita dalla digestione con pronasi ha rilasciato un composto fruttosil-aspartato che abbiamo isolato in un elevato stato di purezza. La labilità del legame fruttosile-aspartato in condizioni leggermente alcaline suggeriva che il fruttosile fosse legato attraverso un legame estereo che coinvolgeva il beta-carbossile del residuo aspartato. Il trattamento del complesso intrappolato con bromuro di cianogeno ha rilasciato solo un peptide fruttosilato. Il peso molecolare apparente di questo peptide è stato stimato essere inferiore a 10.000.
Cinetica dell'interazione tra amminotransferasi aspartica e anioni.Cinetica dell'interazione tra amminotransferasi aspartica supernatante deionizzata e vari anioni (cacodilato, fosfato e cloruro) ) sono stati studiati con la tecnica del salto di temperatura. La concentrazione di anioni nell'intervallo coperto dai nostri esperimenti non influenza la velocità di transaminazione. D'altra parte la transizione conformazionale, recentemente osservata nel sito attivo dell'enzima, è ostacolata da un eccesso di anioni. Un singolo effetto di rilassamento è stato osservato alla lunghezza d'onda del cromoforo dell'enzima in sistemi contenenti la forma aldiminica dell'enzima e gli anioni di cui sopra. È dimostrato che questo effetto corrisponde alla protonazione del cromoforo. I tempi di rilassamento erano di circa 10 mus con fosfato, 20-100 mus con cacodilato e 1-2 ms con cloruro. Sono stati studiati il pH e la dipendenza dalla concentrazione di questo effetto. Gli adattamenti dei dati sperimentali a un tasso equat ioni per vari modelli sono stati testati da un'analisi chi2. Il miglior adattamento è stato ottenuto con modelli in cui gli anioni si legano rapidamente a un sito vicino al cromoforo, in modo che il pK del cromoforo sia influenzato dal legame degli anioni. La velocità del rilassamento osservato aumenta considerevolmente quando l'anione ha capacità tampone; ciò indica, nel caso del cacodilato e del fosfato, che il componente acido del tampone scambia direttamente un protone con l'enzima cromoforo.
Interazione del DNA con proteine leganti il DNA. Caratterizzazione della proteina HD di Escherichia coli e dei suoi complessi di acidi nucleici.Proteina legante il DNA HD con dalle cellule di Escherichia coli è stato isolato un monomero del peso molecolare di 9000. La proteina si presenta come un tetramero in condizioni native e si lega al DNA a singolo e doppio filamento e anche all'RNA. Il DNA complessato con la proteina HD è uno stampo scadente per la sintesi del DNA da parte di E. coli polimerasi I, II o III oloenzima. L'esonucleasi III è ostacolata nella degradazione del DNA a doppio filamento ricoperto di proteina HD, mentre l'esonucleasi I può digerire il DNA a filamento singolo complessato. La trascrizione è leggermente stimolata in presenza della proteina HD.
Indagini di risonanza di spin elettronico del trasporto di elettroni mitocondriali in Neurospora crassa. Caratterizzazione di intermedi paramagnetici in un ceppo standard.1. Particelle sottomitocondriali da ceppo Neurospora inl -89601 sono stati analizzati mediante spettroscopia di risonanza di spin elettronico (ESR). Numerosi segnali dovuti a proteine ferro-zolfo si osservano a basse temperature. L'analisi di questi segnali ESR a varie temperature consente l'assegnazione di risonanze ai centri ferro-zolfo 1-5 che sono stati descritti in altri organismi. Non ci sono discrepanze tra i segnali visti in Neurospora e quelli descritti in altri organismi ed è probabile che i mitocondri di Neurospora contengano gli stessi centri ferro-zolfo che si osservano altrove. 2. NADPH e NADH agiscono per ridurre i centri ferro-zolfo del complesso respiratorio I. 3. Il farmaco pirrolnitrina [3-cloro-4-(2\'-nitro-3\'-clorfenil)pirrolo] è un efficace inibitore sia del supporto NADH ed e trasporto di elettroni supportato da succinato in Neurospora. 4. L'analisi delle curve di inibizione della pirrolnitrina, degli studi sulla respirazione, degli spettri ESR e del livello di riduzione del citocromo b allo stato stazionario in presenza e assenza del farmaco mostra che la pirrolnitrina agisce per inibire il trasporto di elettroni nei mitocondri di Neurospora in più siti nella regione tra ubichinone e citocromo b.
Equilibri protonici nel legame di Zn2+ e ioduro metilmercurico alla papaina.La liberazione di protoni nel legame del cloruro di zinco e ioduro metilmercurico alla ( essenziale) è stato esaminato il gruppo tiolico della papaina in funzione del pH. Questo è stato effettuato mediante (a) titolazione diretta dei protoni sull'aggiunta del composto metallico alla papaina attiva e (b) misurazione del grado di inibizione dell'enzima attività del composto metallico in funzione del pH. Si è scoperto che nell'intervallo di pH neutro il gruppo tiolico o il vicino gruppo imidazolico nell'enzima libero trasporta un protone, a pH basso entrambi i gruppi lo fanno, mentre a pH alto nessun gruppo porta un protone. I valori di pK dell'enzima libero che regolano il rilascio del protone, 4.2 e 8.5, corrispondono a quelli che regolano l'attività complessiva. Sia dagli esperimenti con ioduro metilmercurico sia dalle misurazioni di fluorescenza della papaina metilmercurica, si è stabilito che l'imidazolo gro up in quest'ultimo composto esibisce un pK di 5,4. Prendendo in considerazione i dati recenti, si è ritenuto che la coppia ionica dell'anione tiolato e del catione imidazolo, proposta da Polgar, sia la migliore approssimazione per descrivere la distribuzione di carica nel centro attivo e per spiegare il meccanismo di reazione.
Caratterizzazione spettrofotometrica a flusso interrotto di intermedi di reazione enzimatica nella riduzione anaerobica della benzilammina ossidasi da parte di substrati amminici.Riduzione della benzilammina ossidasi mediante p -metossibenzilammina in condizioni anaerobiche porta a cambiamenti di assorbanza bifasica a 470 nm. Questi riflettono la formazione intermedia di un complesso substrato enzimatico con proprietà spettrali diverse da quelle dell'enzima nativo e dell'enzima completamente ridotto. Il complesso enzima-substrato modificato spettralmente mostra un'ampia differenza di assorbimento banda centrata intorno a 360 nm. L'accumulo transitorio di questo intermedio durante la reazione può essere convenientemente seguito da tecniche di flusso interrotto a lunghezze d'onda comprese tra 320 e 360 nm, dove i contributi dalla successiva riduzione del cromoforo enzimatico a 470 nm sono di minore importanza.2 Intermedi analoghi che mostrano spettri di assorbimento simili sembrano formarsi sulla riduzione dell'enzima da parte del benz ilammina e altri substrati amminici che sono stati testati. La sostituzione della benzilammina come substrato riducente con [alfa, alfa-2H]benzilammina determina un accumulo ridotto dell'intermedio modificato spettralmente. Ciò indica che la sua formazione è preceduta dalla deprotonazione del carbonio alfa del substrato amminico. 3. Gli spettri di dicroismo circolare della benzilammina ossidasi mostrano una banda positiva a 360 nm, a sostegno della precedente conclusione che la benzilammina ossidasi è un enzima piridossale. La formazione del complesso enzima-substrato modificato spettralmente riflette molto probabilmente lo spostamento prototropico che converte una base di Schiff ammina-piridossale ottenuta mediante un rapido pre-equilibrio tra enzima e substrato in una base di Schiff aldeide-piridossamina.
Un'interazione pH-dipendente tra gli istoni H2A e H2B che coinvolge ripiegamento secondario e terziario.È stata dimostrata dalla risonanza magnetica protonica ad alta risoluzione (PMR ) spettroscopia e dicroismo circolare (CD) che un complesso istonico H2A/H2B esiste dopo l'estrazione con sale di questi istoni dalla cromatina e che questo complesso può essere completamente rinaturato sia da estratti con acido denaturato con urea che da istoni estratti con sale denaturato con urea. È dimostrato che il complesso istonico coinvolge una specifica struttura secondaria e terziaria. Si osserva che la formazione di questo complesso dipende in modo critico dal pH, che si verifica a pH 5. È dimostrato che il complesso H2A/H2B contiene circa il 37% di alfa elica ma nessuna struttura beta, quest'ultima confermata dalla spettroscopia infrarossa nella regione delle mammelle 6. Gli spettri PMR mostrano che la regione strutturata include la maggior parte dei residui aromatici di entrambi gli istoni,almeno due residui di istidina di H2B e probabilmente istidine 31 e 82 dell'istone H2A. La struttura secondaria degli istoni H2A e H2B viene prevista utilizzando la procedura Chou e Fasman e vengono effettuati confronti tra le previsioni per gli istoni di specie diverse. Questi risultati unitamente alle evidenze sperimentali portano alla conclusione che almeno i residui 31-95 di H2A e i residui 37-114 di H2B, ovvero le regioni più apolari delle molecole, sono coinvolti nella struttura terziaria del complesso H2A/H2B.
L'effetto del fosfato endogeno sul rapporto H+/Mn2+ e sullo stato di Mn2+ nella matrice mitocondriale.1. Cinetica e stechiometria dell'estrusione di H+ e la ricaptazione e l'assorbimento e il rilascio di Mn2+ sono stati misurati nei mitocondri epatici che respirano in assenza di Pi aggiunto esterno. I flussi di H+ e Mn2+ sono paralleli durante l'assorbimento aerobico di cationi ma non durante il rilascio di cationi indotto dal disaccoppiatore. L'H+/Mn2+ è 1,24. I reagenti SH, in concentrazioni che inibiscono il vettore Pi, modificano la cinetica di estrusione di H+ e di captazione e rilascio di Mn2+. La fase lenta di rilascio di Mn2+ indotta dal disaccoppiatore è diminuita. L'H+/Mn2+ è aumentato a 1,72. Aggiunta di reagenti SH, dopo la la fase di assorbimento aerobico è completata, si traduce in una riduzione significativa dell'entità del rilascio di Mn2+ indotto dal disaccoppiatore L'entità della ricaptazione del Pi endogeno durante l'assorbimento aerobico di Mn2+ è di circa 8 nmol x mg di proteina 1. 2. Captazione aerobica di Mn2+ in assenza di esterno nal Pi si traduce in uno spettro di risonanza di spin elettronico che è la somma di due componenti. Uno, indicato come S, corrisponde a Mn(H2O)2+(6). Un altro indicato come E, riflette il restringimento dello scambio di spin. Contrariamente alle rivendicazioni precedenti, le seguenti evidenze suggeriscono che la componente di scambio di spin è dovuta al precipitato di Mn3(PO4)2: (a) la dimensione dello spettro di scambio di spin è notevolmente ridotta dall'abolizione del trasporto di Pi; (b) lo spettro di scambio di spin viene rilasciato molto lentamente mediante l'aggiunta di disaccoppiatori in condizioni in cui i disaccoppianti provocano una rapida diseccitazione dei mitocondri, ricaptazione di H+ e rilascio di cationi; (c) la matrice libera Mn2+ viene rilasciata lentamente dopo l'aggiunta del disaccoppiatore se c'è un grande segnale di scambio di spin; tuttavia la matrice libera Mn2+ viene abolita rapidamente dal disaccoppiatore quando viene impedita la formazione del segnale di scambio di spin mediante pretrattamento con Ca2+; (d) la larghezza di banda della frazione di scambio di spin è indipendente dal rapporto Mn2+/proteina sia in condizioni cinetiche che stazionarie; (e) lo spettro sperimentale ricorda da vicino quello ottenuto dalla simulazione al computer assumendolo come una combinazione di Mn(H2O)2+(6) e Mn3(PO4)2. 3. Si conclude che il Pi endogeno influenza il processo di assorbimento aerobico del catione bivalente. Una parte dell'assorbimento di Mn2+ in assenza di anioni aggiunti esternamente è costituita da un precipitato di Mn3(PO4)2. Questo spiega un rapporto H+/Mn2+ inferiore a 2.
Isolamento, struttura della subunità e proprietà della desossiribonucleasi ATP-dipendente di Bacillus subtilis. Stato della proteina in un mutante privo di attività.Una procedura è stato sviluppato per la purificazione della desossiribonucleasi ATP-dipendente di Bacillus subtilis 168. Comprende il frazionamento del solfato di ammonio, la filtrazione su gel di Sephadex, la cromatografia con DEAE-cellulosa e l'elettroforesi su gel su un gradiente discontinuo di poliacrilammide. L'enzima è stato ottenuto in uno stato omogeneo. il peso molecolare è stato stimato essere 270000 mediante elettroforesi su disco. L'elettroforesi su gel di dodecilsolfato-poliacrilammide ha mostrato la presenza di cinque subunità non identiche dei seguenti pesi molecolari: 81000, 70000, 62000, 52500 e 42500. Questi valori danno 308000 come peso molecolare del nativo Il pH ottimale dell'enzima purificato è 9,6. Le concentrazioni ottimali di Mg2+ e ATP per l'attività esonucleasica sul DNA nativo di B. subtilis sono state determinate ined. Il requisito dell'ATP per l'idrolisi del DNA a singolo filamento è meno rigoroso. L'enzima possiede anche un'elevata attività ATPasi DNA-dipendente. La procedura di purificazione è stata applicata ad estratti di un mutante privo di attività per questo enzima (ceppo GSY 1290). È stata isolata una proteina molto simile alla DNAasi attiva per quanto riguarda mobilità elettroforetica, reazione con antisieri specifici e dimensione di quattro delle subunità. Manca una subunità (Mr 700000) ed è sostituita da un polipeptide più piccolo (Mr 565000). Gli ultimi risultati suggeriscono che il mutante è affetto nel locus genetico che codifica per la subunità 70000-Mr.
Acetil-coenzima-A carbossilasi di Candida lipolytica. 2. Regolazione del contenuto cellulare e sintesi dell'enzima.Il livello di acetil-coenzima- Un'attività carbossilasi in Candida lipolytica subisce grandi variazioni a seconda della fonte di carbonio su cui viene coltivato il lievito. Le cellule cresciute su n-alcani o acidi grassi mostrano un livello di attività inferiore rispetto alle cellule cresciute sul glucosio. Tra gli n-alcani e gli acidi grassi testati, n-eptadecano, n-ottadecano, acido oleico e acido linoleico riducono l'attività enzimatica ai livelli più bassi, che sono il 16-18% del livello di attività nelle cellule cresciute in glucosio. Titolazioni immunochimiche e analisi Ouchterlony a doppia diffusione con specifiche anticorpi e studi cinetici hanno indicato che la diminuzione osservata del livello di attività dell'acetil-CoA carbossilasi è dovuta a una riduzione del contenuto cellulare dell'enzima. Inoltre, studi sull'incorporazione della leucina isotopica con l'uso della tecnica di immunoprecipitazione ique hanno dimostrato che il tasso relativo di sintesi dell'enzima nelle cellule cresciute con acido oleico è diminuito al 12% di quello nelle cellule cresciute con glucosio. Sono state anche ottenute prove a sostegno dell'opinione che l'enzima in questo lievito non viene degradato a una velocità sufficientemente elevata da contribuire alla marcata diminuzione del contenuto cellulare dell'enzima. Pertanto, si conclude che la riduzione del contenuto di acetil-CoA carbossilasi nelle cellule cresciute con acidi grassi è dovuta alla ridotta sintesi dell'enzima.
Acetil-coenzima-A carbossilasi di Candida Lipolytica. 1. Purificazione e proprietà dell'enzima.Acetil-coenzima-A carbossilasi è stata isolata in forma omogenea da Candida lipolytica. L'omogeneità della preparazione enzimatica è evidenziata dall'ultracentrifugazione analitica, dall'elettroforesi su gel di dodecil-solfato-poliacrilammide e dall'analisi a doppia diffusione di Ouchterlony. L'enzima purificato mostra un'attività specifica di 8,0 U/mg di proteina a 25 gradi C e contiene 1 mol di biotina/263000 g di proteine. Il coefficiente di sedimentazione (S20,W) dell'enzima è 18 S. È stato dimostrato mediante elettroforesi su gel di dodecil-solfato-poliacrilammide che l'enzima possiede un solo tipo di subunità con un peso molecolare di 230000. Questa scoperta, insieme al contenuto di biotina, indica che l'enzima C. lipolytica ha una struttura di subunità altamente integrata. L'enzima C. lipolytica è molto labile, ma è stabilizzato dal glicerolo. L'enzima è marcatamente attivato da poli(etilenglicole), l'attivazione essendo dovuta principalmente ad una diminuzione dei valori di Km per i substrati. Anche in presenza di questo attivatore, il valore Km dell'acetil-CoA dell'enzima C. lipolytica è molto più alto di quello dell'enzima da Saccharomyces cerevisiae e dai tessuti animali. L'enzima C. lipolytica, a differenza dell'enzima dei tessuti animali, non viene attivato dal citrato.
Attività esterolitiche della mucosa intestinale di ratto. 2. Purificazione e proprietà di una glicerolo-estere idrolasi.Una glicerolo-estere idrolasi da cellule intestinali di ratto ha purificato mediante cromatografia su carbossiesanoil-Sepharose-glyceryldioctanoate ed elettroforesi preparativa su gel. L'enzima fornisce una singola banda mediante elettroforesi analitica su gel, è un monomero di peso molecolare 68000. Il pH ottimale per la sua azione sul tributirato di glicerile è compreso tra 8,0 e 8,5; l'energia di attivazione è stata calcolata pari a 8,7 kcal x mol-1 (36,4 kJ/mol). La sua specificità di substrato è principalmente diretta contro gli esteri del glicerolo e dei monoalcoli primari. Analogamente alla lipasi pancreatica ma contrariamente all'esterasi epatica, è inibita dalla bile sali; il sollievo di questa inibizione da parte della colipasi si osserva solo per la lipasi pancreatica. Viene discusso il possibile ruolo della glicerolo-estere idrolasi nell'assorbimento dei trigliceridi a catena corta e media.
Attività esterolitiche della mucosa intestinale di ratto. 1. Caratterizzazione, distribuzione cellulare e localizzazione subcellulare di una idrolasi glicerolo-estere.La distribuzione cellulare preferenziale nel villi tip e la localizzazione subcellulare nel reticolo endoplasmatico di una glicerolo-estere idrolasi intestinale da mucosa di ratto. L'enzima risulta non essere di origine né pancreatica né batterica, catalizza l'idrolisi dei trigliceridi a catena corta e media e di p-nitrofenilacetato Contrariamente alla specificità riscontrata per la lipasi intestinale del maiale (Serrero, Négrel e Ailhaud, 1975), non è rilevabile alcuna attività contro l'acilCoA; è stata dimostrata un'idrolasi tiolestere diversa dalla glicerolo-estere idrolasi dopo solubilizzazione differenziale e separazione cromatografica. Nel lume intestinale è presente un'elevata percentuale di glicerolo-estere idrolasi; viene discusso il suo possibile ruolo complementare nella degradazione dei lipidi.
Effetto degli ormoni tiroidei sulla sintesi dell'allungamento della catena degli acidi grassi microsomiali nel fegato di ratto.Viene presentata la prova che la sintesi e la desaturazione dell'allungamento della catena degli acidi grassi microsomiali del fegato di ratto , così come l'acetil-CoA carbossilasi e la sintetasi degli acidi grassi, sono fortemente influenzati dal livello dell'ormone tiroideo. Al contrario, il sistema di allungamento della catena degli acidi grassi nei mitocondri, a differenza della capacità ossidativa di palmitato, NADH, succinato e malato, non sembra influenzato in modo significativo nello stato tireotossico. Nell'ipertiroidismo indotto da triiodotironina o tiroxina, le reazioni di acetil-CoA carbossilasi del fegato di ratto, sintetasi degli acidi grassi e allungamento e desaturazione della catena microsomiale non sono molto influenzate dopo i primi 10 giorni di trattamento, mentre dopo intervalli più lunghi un rispettivo aumento di queste attività è mostrato fino a 87, 116 e 65% dopo 22 giorni Nell'ipotiroidismo indotto da propiltiouracile, tutte le attività sintetiche di cui sopra sono forti la glicemia si è ridotta immediatamente dopo tre giorni di somministrazione del farmaco e non è diminuita ulteriormente dopo periodi più lunghi. Sebbene il pattern degli acidi grassi sintetizzati allo stato tireotossico sia simile a quello ottenuto dalle normali frazioni subcellulari di ratto, il processo di esterificazione degli acidi grassi nei lipidi microsomiali sembra essere leggermente inibito nei ratti ipotiroidei e aumentato dopo la somministrazione di triiodotironina o tiroxina. Infine, dopo 19 giorni di somministrazione di triiodotironina ai ratti, viene riportata una riduzione del livello di AMP ciclico epatico di circa il 41%. Sulla base dell'insensibilità osservata del sistema di allungamento della catena mitocondriale degli acidi grassi allo stato tireotossico, si ipotizza un'interpretazione provvisoria del suo ruolo nella cellula epatica.
Un metodo per misurare il pH interno nei cloroplasti illuminati basato sulla stimolazione dell'assorbimento di protoni da parte delle ammine.Un metodo semplice per misurare il pH interno di cloroplasti durante illuminazioni stazionarie basate sulla stimolazione dell'assorbimento di protoni da parte di ammine monofunzionali sono state sviluppate previsioni di derivazione matematica riguardanti la dipendenza della stimolazione dalla concentrazione di ammina, dal volume interno, dal pK dell'ammina e dal pH esterno verificato sperimentalmente. Per evitare il disaccoppiamento e il rigonfiamento dovuti al grande accumulo interno di ammine, è stata suggerita l'estrapolazione della stimolazione a basse concentrazioni di ammina, che si è dimostrata portare a valori validi. In alternativa, il rigonfiamento potrebbe essere ampiamente ridotto in un mezzo contenente aspartato di potassio e valinomicina.
Studi sulla 3-desossi-d-arabinoeptulosonato-7-fosfato sintetasi(phe) da escherichia coli k12. 3. Studi strutturali.1. Indagini con analoghi strutturali della fenilalanina hanno indicato un requisito assoluto per l'anello aromatico e entrambi i gruppi alfa-carbossilico e alfa-amminico della fenilalanina per l'inibizione dell'attività 3-desossi-D-arabinoeptulosonato-7-fosfato sintetasi (fe). L'atomo di alfa-H con un gruppo metilico non riduce notevolmente l'inibizione. Sono stati osservati vari gradi di inibizione con o, m e p mono-sostituiti fluoro, cloro e idrossi fenilalanina. D-fenilalanina e diversi metaboliti delle vie biosintetiche aromatiche non lo fanno inibire l'attività enzimatica. 2. Studi di dicroismo circolare hanno indicato che l'enzima nativo possiede circa il 26% di alfa-elica. Sia gli spettri di differenza dicroici circolari che quelli ultravioletti hanno indicato che l'aggiunta di fenilalanina alla sintetasi induce un conformati cambiamento onale che comporta una piccola alterazione della struttura secondaria e grandi alterazioni nelle interazioni di alcuni dei residui aromatici dell'enzima. In particolare, un residuo di triptofano si sposta da un ambiente estremamente idrofobo ad uno meno idrofobo. 3. La Kd per il legame della fenilalanina all'enzima è stata determinata spettrofotometricamente a 75 muM. 4. Studi di modificazione chimica hanno suggerito che un gruppo sulfidrilico e possibilmente un residuo di lisina possono essere implicati nell'attività catalitica dell'enzima.
Studi sulla 3-desossi-D-arabinoeptulosonato-7-fosfato sintetasi(phe) da Escherichia coli K12. 2. Proprietà cinetiche.1. Co2+ non è un cofattore per la 3-desossi-D-arabinoeptolosonato-7-fosfato sintetasi (fe) 2. I seguenti analoghi del fosfoenolpiruvato sono stati testati come inibitori della 3-desossi-D-arabinoeptolosonato-7-fosfato sintetasi (fe): piruvato, lattato, glicerato, 2-fosfoglicerato, 2,3-bisfosfoglicerato, 3-metilfosfoenolpiruvato, 3-etilfosfoenolpiruvato e 3,3-demetilfosfoenolpiruvato. I risultati ottenuti indicano che il legame del fosfoenolpiruvato al gruppo fosfoenolpiruvato sull'enzima richiede un fosfoenolpiruvato 2 posizione del substrato e un atomo di idrogeno libero nella posizione C 3. 3. Il modello di inibizione del vicolo cieco osservato con l'analogo del substrato 2-fosfoglicerato quando il fosfoenolpiruvato o l'eritrosio 4-fosfato erano il substrato variabile non è coerente con un ping -pong meccanismo e indica che la reazione meccanismo per questo enzima deve essere sequenziale. Sono state determinate le seguenti costanti cinetiche: Km per fosfoenolpiruvato, 0,08 +/- 0,04 mM; Km per eritrosio 4-fosfato, 0,9 +/- 0,3 mM; K è per l'inibizione competitiva del 2-fosfoglicerato rispetto al fosfoenolpiruvato, 1,0 +/- 0,1 mM. 4. È stato osservato che l'enzima ha un PROFILO di pH a campana CON UN PH OTTIMALE DI 7,0. Gli effetti del pH ON V e V/(Km per fosfoenolpiruvato) hanno indicato che un gruppo ionizzante di pKa 8.0-8.1 è coinvolto nell'attività catalitica dell'enzima. Il pKa di questo gruppo non è influenzato dal legame del fosfoenolpiruvato.
Studi sulla 3-desossi-D-arabinoeptulosonato-7-fosfato sintetasi(phe) da Escherichia coli K12. 1. Purificazione e struttura delle subunità.1. La 3-desossi-D-arabinoeptulosonato-7-fosfato sintetasi (phe) da Escherichia coli K12 è stata purificata fino a raggiungere l'omogeneità. L'enzima purificato ha un'attività specifica di 67 unità/mg che è circa 1000 volte quella che si trova nelle cellule estratti liberi di E. coli K12 wild-tupe 2. Il peso molecolare minimo dell'enzima è stato stimato mediante elettroforesi su gel di dodecilsolfato pari a 33000. La nuova stima del peso molecolare nativo mediante filtrazione su gel ha confermato il valore precedentemente determinato di 110000. 3. Le impronte digitali dell'aminoacido anaktsus e del triptico hanno indicato che le subunità dell'enzima sono molto simili e forse identiche. 4. L'enzima purificato non contiene Co2+.
Riduzione enzimatica dei legami disolfuro mediante tioredossina. La reattività dei legami disolfuro nella coriogonadotropina umana e nelle sue subunità.La riduzione enzimatica NADPH-dipendente dei legami disolfuro in coriogonadotropina umana e le sue due subunità, alfa e beta, è stato esaminato con tioredossina e tioredossina reduttasi da Escherichia coli. Con 12 muM tioredossina e 0,1 muM tioredossina reduttasi a pH 7 tutti i legami disolfuro nella subunità alfa potrebbero essere ridotti in 15 min. la riduzione dei legami disolfuro è stata registrata mediante un semplice saggio spettrofotometrico a 340 nm, che ha permesso di quantificare la velocità di riduzione e il numero di legami disolfuro ridotti. Riduzione parziale della subunità alfa con tioredossina seguita da S-carbossimetilazione con iodolo[2-3H] l'acido acetico e l'analisi dei peptidi triptici hanno indicato che tutti i legami SS nella subunità alfa erano orientati alla superficie e ugualmente reattivi. L'utilità della riduzione della tioredossina dei legami disolfuro come la sonda chimica della struttura proteica è stata dimostrata dalla reazione molto più lenta dei legami disolfuro nell'ormone intatto rispetto alle sue due subunità biologicamente inattive.
Efficace purificazione e proprietà molecolari del cloroplasto fruttosio 1,6-bisfosfatasi.È stata sviluppata una procedura relativamente semplice per la purificazione della cloroplasto fruttosio bisfosfatasi dalle foglie di spinaci all'apparente omogeneità e con resa dell'80%. Il peso molecolare dell'enzima era di circa 160 000. La fruttosiobisfosfatasi del cloroplasto è costituita da quattro subunità possibilmente identiche e, a pH 8,8, SI DISSOCIA FACILMENTE IN METÀ UGUALI CON attività RIDOTTA Curve di saturazione sigmoideo con Per il fruttosio 1,6-bisfosfato e Mg2+ sono stati ottenuti coefficienti di Hill compresi tra 3,0 e 3,7. L'incubazione dell'enzima con ditiotreitolo 20 mM ha alterato lentamente la risposta al pH da nessuna attività misurata a pH 7,5 e piena attività a pH 8,8 a uguale attività ad ogni di questi valori di pH; allo stesso tempo il numero di gruppi sulfidrilici liberamente disponibili è aumentato da quattro a dodici per molecola. Queste proprietà sono considerate nel con testo dell'attivazione osservata di questo enzima in seguito all'illuminazione dei cloroplasti.
Purificazione e proprietà della fosfofruttochinasi del muscolo adduttore dall'ostrica, Crassostrea virginica. La transizione aerobica/anaerobica: ruolo dell'arginina fosfato nel controllo enzimatico.Fosfofruttochinasi dal muscolo adduttore dell'ostrica (Crassostrea virginica) si presenta in una singola forma elettroforetica con un'attività di 8,1 mumol di prodotto formato al minuto per grammo di peso umido L'enzima è stato purificato all'omogeneità mediante un nuovo metodo che prevede l'estrazione in etanolo diluito e la successiva precipitazione con polietilene la fosfofruttochinasi dell'adduttore di ostriche ha un peso molecolare di 3400000 +/- 20000 misurato mediante cromatografia su gel Sephadex. Mg2+ o Mn2+ possono soddisfare il fabbisogno di ioni bivalenti mentre ATP, GTP o ITP possono fungere da donatori di fosfato per la reazione. mostra una cinetica di saturazione iperbolica rispetto a tutti i substrati (fruttosio 6-fosfato, ATP e Mg2+) a pH 7,9 OPPURE a pH 6,8. è costante per il fruttosio 6 fosfato a pH 6,8, il pH cellulare dei tessuti di ostriche anossiche è 3,5 mM. In presenza di AMP, di gran lunga il più potente attivatore e deiinibitore dell'enzima, questo scende a 0,70 mM. Molti effettori tradizionali della fosfofruttochinasi tra cui citrato, NAD(P)H,Ca2+, fruttosio 1,6-bisfosfato, 3-fosfoglicerato, ADP e fosfoenolpiruvato non alterano l'attività enzimatica quando testati alle loro concentrazioni fisiologiche. Gli ioni monovalenti (K+, NH4+) sono attivatori dell'enzima. ATP e arginina fosfato sono gli unici composti trovati per inibire l'enzima adduttore. L'azione inibitoria di entrambi può essere invertita da concentrazioni fisiologiche di AMP (0,2-1,0 mM) e in misura minore da alte concentrazioni di Pi (20 mM) e adenosina 3\':5\'-monofosfato (0,1 mM). I due inibitori mostrano un pH molto diverso rispetto ai profili di inibizione. Il Ki (ATP) diminuisce da 5,0 mM a 1,3 mM quando il pH diminuisce da 7,9 a 6,8, mentre il Ki per l'arginina fosfato aumenta da 1,3 mM a 4,5 mM per la stessa caduta di pH. Di tutti i composti testati, solo l'AMP, all'interno del suo range fisiologico, ha attivato significativamente la fosfofruttochinasi adduttore a bassi valori di pH. I dati cinetici supportano la proposta che l'arginina fosfato, non l'ATP o il citrato, sia il regolatore più probabile dell'adduttore fosfofruttochinasi in vivo in condizioni aerobiche, ad alto pH dei tessuti. Nell'anossia, l'esaurimento delle riserve di arginina fosfato e l'aumento delle concentrazioni di AMP nel tessuto, insieme all'aumento del Ki per l'arginina fosfato determinato da condizioni di basso pH, serve ad attivare la fosfofruttochinasi per aiutare il mantenimento della produzione di energia anaerobica.
Riduzione di CO2 a formiato da NADH catalizzata da formiato deidrogenasi da Pseudomonas oxalaticus.La riduzione diretta di CO2 a formiato è catalizzata dal formiato: NAD ossidoriduttasi in la presenza di quantità di substrato di NADH. La prova di questa reazione è fornita dalla rilevazione di un'ossidazione di NADH dipendente da CO2 e dall'identificazione di [14c] formiato come prodotto di una riduzione di [14c]carbonato dipendente da NADH. la riduzione della CO2 catalizzata dall'enzima da parte del NADH raggiunge l'equilibrio previsto da considerazioni termodinamiche, uno stato che viene raggiunto anche dal lato del formiato. La costante di Michaelis per la CO2 è di circa 40 mM che indica la bassa affinità dell'enzima per questo substrato. Il valore corrispondente per il formiato è 0,1 mM. Nelle condizioni speciali impiegate, l'enzima catalizza l'ossidazione del formiato circa 30 volte più velocemente della riduzione di CO2. Che CO2 e non HCO3- è la specie attiva nella riduzione è stato dimostrato confrontando il ph depe ndità delle velocità delle reazioni avanti e indietro e osservando la cinetica della riduzione della CO2 durante il raggiungimento simultaneo dell'equilibrio CO2-HCO3-.
Biosintesi del peptidoglicano in Gaffkya homari. L'incorporazione del peptidoglicano nella parete cellulare e la direzione della transpeptidazione.Preparati enzimatici della membrana murale di Gaffkya homari catalizzano la formazione di peptidoglicano dalle coppie precursori: UDP-N-acetilglucosamina + UDP-N-acetilmuramil-pentapeptide (UDP-MurNAc-Ala-DGlu-Lys-DAla-DAla) e anche da UDP-N-acetilglucosamina + UDP-N- acetilmuramil-tetrapeptide (UDP-MurNAc-Ala-DGlu-Lys-DAla). Una parte dei prodotti di reazione è solubile in dodecilsfulfato di sodio al 2% mentre l'altra parte è legata al peptidoglicano della parete cellulare preesistente. L'incorporazione nella parete cellulare avviene da una reazione di transpeptidazione in cui le sequenze D-alanil-D-alanina nella parete cellulare preesistente funzionano come donatori e i gruppi epsilon-ammino dei residui di lisina nei filamenti di peptidoglicano appena sintetizzati funzionano come accettori. si formano legami -lisina A concentrazione saturante zione di UDP-N-acetilglucosamina, il sistema enzimatico mostra valori Km apparenti simili (30--80 muM) per UDP-MurNAc-pentapeptide e UDP-MurNAc-tetrapeptide sia per la formazione di peptidoglicano legato alla parete cellulare che totale (cioè solubile + legato alla parete cellulare) peptidoglicano. Anche i valori di V sono dello stesso ordine di grandezza (270-650 pmol x min-1 x mg di proteina -1). Tuttavia, l'UDP-MurNAc-tetrapeptide era un substrato leggermente migliore dell'UDP-MurNAc-pentapeptide per la formazione del peptidoglucano legato alla parete cellulare. La sintesi del peptidoglicano totale e legato alla parete cellulare da UDP-MurNAc-pentapeptide è stata inibita in modo competitivo da UDP-MurNAc-tetrapeptide e viceversa. UDP-MurNAc-tripeptide e sia UDP-Mur-NAc-pentapeptide che UDP-Mur-NAc-tetrapeptide in cui il gruppo epsilon-ammino del residuo di lisina è stato sostituito da un gruppo acetile sono stati utilizzati in modo meno efficiente di UDP-MurNAc-pentapeptide e UDP-MurNAc-tetrapeptide per la formazione di peptidoglicano solubile; erano substrati estremamente poveri per la formazione del peptidoglicano legato alla parete cellulare.
1, 4-alfa-glucano fosforilasi dalla purificazione di Klebsiella pneumoniae, struttura delle subunità e composizione amminoacidica.1. A 1,4-alfa- glucano fosforilasi da Klebsiella pneumoniae è stata purificata di circa 80 volte con una resa complessiva superiore al 35%. L'enzima purificato ha dimostrato di essere omogeneo mediante elettroforesi su gel a diversi valori di pH, mediante focalizzazione isoelettrica, mediante elettroforesi con dodecilsolfato e mediante ultracentrifugazione 2. Il peso molecolare dell'enzima nativo è stato determinato in 180 000 da studi di ultracentrifugazione, in buon accordo con il valore di 189 000 stimato mediante cromatografia a permeazione di gel 3. L'enzima si dissocia in presenza di 0,1% dodecilsolfato o guanidina cloridrato 5 M in catene polipeptidiche. Il peso molecolare di queste catene polipeptidiche è risultato essere 88 000 mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide dodecilsolfato e 99 000 mediante studi sull'equilibrio di sedimentazione, indicando che il enzima nativo è composto da due catene polipeptidiche. 4. L'enzima contiene piridossalfosfato con una stechiometria di due moli per 180 000 g di proteina, confermando che l'1,4-alfa-glucano fosforilasi di Klebsiella pneumoniae è un enzima dimerico. 5. E' stata determinata la composizione amminoacidica dell'enzima e si discute la sua corrispondenza con quella delle 1,4-alfa-glucano fosforilasi di altre fonti. 6. È stato dimostrato che il pI dell'enzima è 5,3 e il suo pH ottimale è di circa 5,9. L'enzima è stabile nell'intervallo da pH 5,9 a 10,5.
Traduzione di mRNA da polisomi di fegato di ratto in tirosina aminotransferasi e triptofano ossigenasi in un sistema di sintesi proteica da germe di grano. Effetti del cortisolo sui livelli traducibili di mRNA per questi due enzimi.Messenger RNA è stato isolato da polisomi di fegato di ratto mediante estrazione con fenolo/cloroformio e successiva cromatografia con oligo(dT)-cellulosa. L'mRNA è stato tradotto in un sistema di sintesi proteica in vitro derivato dal germe di grano. Il il sistema è stato ottimizzato rispetto a Mg2+ e K+. La presenza di spermidina o spermina è necessaria per la sintesi di polipeptidi con pesi molecolari superiori a 20 000. In assenza delle basi si formano solo prodotti di piccolo peso molecolare. La quantità di proteine sintetizzate è linearmente dipendente dalla quantità di mRNA aggiunto fino a concentrazioni di 80 mug mRNA/ml La sintesi di tirosina aminotransferasi e triptofano ossigenasi nel sistema in vitro è stata dimostrata da im munoprecipitazione ed elettroforesi su gel di poliacrilammide sodio-dodecilsolfato del precipitato con proteine enzimatiche come marker. La quantità di prodotto specifico formato è linearmente dipendente dalla quantità di mRNA presente. La quantità di mRNA traducibile tirosina aminotransferasi e mRNA triptofano ossigenasi aumenta dopo la somministrazione di idrocortisone a ratti adrenalectomizzati. A basse dosi di ormone (2 mg/100 g di peso corporeo) si osservano valori massimi a 4 h, i livelli di controllo vengono raggiunti a 6-8 h dopo l'applicazione dell'ormone. Con dosi più elevate di idrocortisone (20 mg/100 g di peso corporeo) i valori massimi si raggiungono a 6 h, tendendo a controllare i livelli 14 h dopo il trattamento. Le curve dell'attività enzimatica sono parallele alle curve dell'mRNA, il picco dell'attività enzimatica si verifica 2 ore dopo il picco dell'attività dell'mRNA.
La determinazione del potenziale di membrana di Chlorella vulgaris. Evidenza del trasporto elettrogenico dello zucchero.Dai dati sull'accumulo di tetrafenilfosfonio all'interno delle cellule di Chlorella vulgaris, è si può stimare che queste cellule possiedano un potenziale di membrana da -120 a -150 mV (interno negativo). In condizioni anaerobiche così come in presenza di agenti disaccoppianti il potenziale di membrana scende a circa -60 a -80 mV. (50 mug/ml) lo abolisce quasi completamente. Poiché è stata necessaria più di 1 ora prima che fosse raggiunto l'equilibrio del tetrafenilfosfonio, questo metodo non può essere utilizzato per misurare cambiamenti transitori relativamente rapidi nel potenziale di membrana. Tuttavia, la velocità di afflusso di tetrafenilfosfonio è anche direttamente dipendente dal potenziale di membrana e può essere seguito in pochi minuti Utilizzando questo fenomeno come indicatore del potenziale di membrana è stata rilevata una breve depolarizzazione transitoria dopo l'aggiunta di zuccheri captati da Clo rella tramite il sistema di cotrasporto protonico. La depolarizzazione era assente dalle cellule non indotte per l'assorbimento dello zucchero e le cellule indotte non la mostravano con sostanze non trasportate, come il mannitolo. La massima depolarizzazione osservata è stata di circa 70 mV; dopo 1 min, tuttavia, il potenziale di membrana è tornato ad un valore di circa 25 mV meno negativo di quello prima dell'aggiunta degli zuccheri. I risultati dimostrano che l'assorbimento di zucchero nella clorella è elettrogenico. Il delta pH più il potenziale di membrana misurato per la clorella coprono completamente l'energia necessaria per spiegare l'accumulo di 1600 volte di 6-desossiglucosio osservato sperimentalmente.
cambiamenti di pK di gruppi reporter ionizzabili come indice di cambiamenti conformazionali nelle proteine. Uno studio sulla ribonucleasi marcata con fluoresceina A.Un derivato chimico del bovino La ribonucleasi pancreatica A (RNasi A) è stata preparata per reazione con fluoresceina-isotiocianato a pH 6. Questo derivato ha un gruppo fluoresceinico legato covalentemente al gruppo alfa-amminico della proteina. Le proprietà enzimatiche della proteina modificata sono simili a quelle di RNasi A. È dimostrato che il pK del gruppo fluoresceina può essere utilizzato come indice di conformazione proteica per monitorare i cambiamenti strutturali nella proteina. In questo lavoro, il legame di un inibitore specifico (citidina 2\'-monofosfato) alla RNasi A, il processo di isomerizzazione che avviene nell'RNasi A intorno a pH 6, e lo sviluppo termico dell'RNasi A, sono stati studiati mediante le variazioni di pK del gruppo della fluoresceina. I risultati ottenuti con questo metodo sono pienamente coerenti con quelli ottenuti con altri metodi. è p ha proposto che l'uso di gruppi reporter ionizzabili e dei loro cambiamenti nella pK per monitorare i cambiamenti conformazionali nelle proteine potrebbe essere uno strumento sensibile sia negli studi di equilibrio che cinetici.
Biosintesi del peptidoglicano in Gaffkya homari. La modalità d'azione della penicillina G e della mecillina.L'effetto degli antibiotici beta-lattamici penicillina G e mecillina sull'incorporazione del peptidoglicano nella parete cellulare preformata il peptidoglicano è stato studiato con preparazioni enzimatiche della membrana della parete da Gaffkya homari. Utilizzando UDP-N-acetilglucosamina (UDP-GlcNAc) e UDP-N-acetilmuramil-pentapeptide (UDP-MurNAc-pentapeptide) come precursori l'incorporazione del peptidoglicano nella parete cellulare preesistente di G. homari è stata inibita nella misura del 50% (valore ID50) ad una concentrazione di 0,25 mug di penicillina G/ml Con UDP-GlcNAc e UDP-MurNAc-tetrapeptide come precursori il valore ID50 era circa 2500 volte maggiore (630 mug/ml). L'inibizione da parte della penicillina G dell'incorporazione del peptidoglicano da UDP-MurNAc-[14C]Lys-pentapeptide potrebbe essere superata dall'aggiunta di UDP- non radioattivo MurNAc-tetrapeptide alla miscela di incubazione In presenza di 5 m ug di penicillina G/ml l'incorporazione del peptidoglicano formato dalla miscela di UDP-MurNAc-Ala-DGlu-Lys-D-[14C]Ala-D[14C]Ala e UDP-MurNAc-tetrapeptide non radioattivo è proceduto praticamente senza rilascio di D-[14C]alanina dall'attività della transpeptidasi. La preparazione enzimatica ha anche mostrato un'attività della DD-carbossipeptidasi che era solo leggermente più sensibile alla penicillina G e alla mecillina rispetto all'incorporazione del peptidoglicano nella parete cellulare. Poiché i valori ID50 per gli antibiotici beta-lattamici sono simili alle concentrazioni richieste per inibire la crescita di G. homari fino al 50%, la DD-carbossipeptidasi deve essere il sito di uccisione sia della penicillina G che della mecillina.
Acidemia metilmalonica congenita: una variante della forma B12 \'non-responsive\' con evidenza di ridotta affinità della metilmalonil-CoA mutasi per il suo coenzima B12.Il metabolismo del metilmalonato è stato studiato nei fibroblasti e nei leucociti di due pazienti non imparentati con un tipo di acidemia metilmalonica congenita non responsiva alla B12. I fibroblasti intatti di entrambi i pazienti hanno mostrato un metabolismo difettoso del metil-14 c-malonato in 14CO2, mentre tale difetto non era trovato nei loro leucociti periferici intatti Nei fibroblasti distrutti, la conversione del metilmalonil coenzima A in succinil coenzima A è stata notevolmente ridotta ma è stata completamente normalizzata dall'aggiunta di 5\'-desossiadenosilcobalamina (AdoCb1; 10(-5) mol/l), il coenzima specifico della mutasi del metilmalonil coenzima A. Saggi con concentrazioni decrescenti di AdoCbl (10(-5)-10(-11) mol/l) hanno suggerito una ridotta affinità dell'apoenzima mutasi per il suo coenzima, implicando un'altra variante di questa malattia eterogenea.