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Inibizione della L-asparagina sintetasi da parte degli acidi mucoclorico e mucobromico.Gli acidi mucoclorico e mucobromico sono potenti inibitori delle sintetasi tumorali e pancreatiche dell'L-asparagina. Due donatori di azoto, L-glutammina e ammoniaca, possono essere utilizzati da questi enzimi, alla concentrazione di 1 mmol/l, gli acidi mucoclorico e mucobromico inibiscono preferenzialmente l'utilizzo dell'ammoniaca rispetto alla L-glutammina in vitro. l'analisi ha rivelato che l'acido mucoclorico produceva un'inibizione che era apparentemente non competitiva con l'ammoniaca ma competitiva con la L-glutammina. Nell'eccesso molare, la L-glutammina e il ditiotreitolo hanno antagonizzato efficacemente tale inibizione; la dialisi, tuttavia, non è riuscita a invertire l'inibizione stabilita. Questi risultati suggeriscono che il i farmaci agiscono per legame covalente con funzioni cruciali sulfidriliche sull'enzima.
Isocitrato deidrogenasi mitocondriale e ossidazione dell'isocitrato della prostata ventrale di ratto.Preparazioni mitocondriali isolate dalla prostata ventrale di ratto erano in grado di ossidare l'isocitrato mediante NADP isocitrato deidrogenasi (NADP-IDH) e NAD-IDH. L'attività di NAD-IDH richiedeva l'attivazione di ADP. Le risposte del pH per NAD-IDH e NADP-IDH erano piuttosto diverse. I risultati indicavano che due diversi enzimi erano coinvolti nel NAD- e NADP- Attività di IDH. Evidenze indirette hanno indicato che l'attività della transidrogenasi NADPH-NAD potrebbe anche essere coinvolta nella via mitocondriale per l'ossidazione dell'isocitrato. L'attività di NADP-IDH era significativamente maggiore dell'attività di NAD-IDH. L'ossidazione dell'isocitrato attraverso l'attività di IDH era accoppiata al sistema del citocromo dalle attività di NADPH- e NADH-citocromo C reduttasi Citrato, tramite isocitrato, l'ossidazione procedeva a una velocità molto più lenta suggerendo che l'attività dell'aconitasi potrebbe essere limitante nell'ossidazione del citrato e. Rispetto ad altri tessuti, le attività degli enzimi ossidativi della prostata sono notevolmente inferiori. I risultati suggeriscono che l'accumulo di livelli elevati di citrato prostatico non è dovuto a una limitazione imposta dalla mancanza di attività IDH nei mitocondri prostatici.
Mancanza di effetto del glucosio sull'induzione della 5-aminolevulinato sintetasi e della tirosina aminotransferasi nel fegato di ratto perfuso isolato.Nel fegato di ratto perfuso isolato, sia la 5-aminolevulinato sintetasi che la tirosina aminotransferasi sono state indotte dall'aggiunta di 3,5 mmol/l di allilisopropilacetammide e 58 mumol/l di desametasone al mezzo di perfusione. Il glucosio (40 mmol/l) non ha influenzato né l'induzione di questi enzimi né il livello intraepatico di AMP ciclico. I risultati suggeriscono che l'effetto del glucosio sull'induzione della 5-aminolevulinato sintetasi e della tirosina aminotransferasi in vivo è mediato da fattori extraepatici.
Trattamento neonatale con steroidi sessuali: relazione tra la risposta uterotropica e il "recettore" degli estrogeni nei ratti prepuberi.Abbiamo testato l'ipotesi che il neonato il trattamento dei ratti con testosterone propionato (TP) o estradiolo benzoato (EB) riduce la reattività uterina all'estradiolo e riduce la concentrazione del "recettore" estrogenico prima della pubertà, e che entrambi questi eventi precedono l'insorgenza della sindrome dell'estro persistente. Ratti femmine di tre giorni sono stati iniettati con 100 tazze di EB, TP o olio di sesamo (controlli) e a 23 e 31 giorni di età (prima dell'inizio della pubertà) è stato misurato il contenuto citoplasmatico uterino della specifica proteina 8S che lega l'estradiolo gradienti di densità del saccarosio. Il legame da parte della frazione nucleare è stato anche misurato utilizzando un test di scambio. In un sottogruppo di ratti trattati anche neonatali, 2 mug/kg di peso corporeo di estradiolo-17beta sono stati iniettati a 22 e 30 giorni di età e i pesi uterini sono stati misurati come un test per r reattività uterina. A 23 e 31 giorni di età il "recettore" dell'estrogeno 8S citoplasmatico uterino era significativamente ridotto nei ratti trattati con EB, ma la risposta uterotropica all'estradiolo era bloccata solo nei ratti di 23 giorni; la risposta uterina a 31 giorni era leggermente, ma non significativamente, ridotta. Al contrario, la TP somministrata neonatale non ha avuto alcun effetto né sulla concentrazione dei siti di legame dell'estradiolo citoplasmatico né sulla reattività uterina. Il legame nucleare dell'estradiolo non è stato influenzato dal trattamento con TP o EB in entrambi i gruppi di età. In un ulteriore esperimento in ratti ovariectomizzati a 9 giorni di età, quelli trattati neonatali con EB avevano un utero significativamente più piccolo rispetto ai loro controlli ovariectomizzati non trattati, fornendo così un'evidenza indiretta di un fattore extravariante influenzato dal trattamento neonatale. Questi dati supportano l'ipotesi che il trattamento dell'EB neonatale possa inibire direttamente la sintesi o il rifornimento del "recettore" dell'estradiolo 8S prima dello sviluppo della sindrome dell'estro persistente (estro vaginale persistente, anovulazione e ovaie policistiche). Un disturbo neuroendocrino indotto dal neonato che colpisce la secrezione di steroidi da parte dell'ovaio o del surrene può anche esistere in età prepuberale per spiegare i difetti uterini.
Effetto differenziale dell'ipofisectomia sulla sintesi della beta-glucuronidasi e di altri enzimi inducibili dagli androgeni nel rene di topo.I livelli di diversi enzimi sensibili agli androgeni, inclusi beta-glucuronidasi, alcol deidrogenasi, D-aminoacido ossidasi e arginasi, sono stati confrontati nei reni di topi femmina normali e ipofisectomizzati dopo il trattamento con testosterone. Mentre l'ipofisectomia non ha alterato il livello basale di glucuronidasi, l'accumulo androgeno-mediato di beta-reni la glucuronidasi è stata notevolmente ridotta nei topi ipofisectomizzati. Le misurazioni della velocità di sintesi della glucuronidasi hanno mostrato che dopo il trattamento con androgeni l'enzima è stato sintetizzato nel rene di topi ipofisettati solo al 5% della velocità normale. L'attività della glucuronidasi in altri sette organi non è stata sensibilmente influenzata dal trattamento con androgeni o per ipofisectomia A differenza dell'effetto dell'ipofisectomia sulla glucuronidasi renale, non vi è stata riduzione dell'accumulo ione di alcol deidrogenasi o D-aminoacido ossidasi nel rene di topi ipofisettati dopo trattamento con androgeni. L'ipofisectomia ha causato una grande riduzione dell'attività dell'arginasi renale. Tuttavia, la successiva somministrazione di testosterone ha ripristinato gran parte di questa attività. Si conclude che ci sono almeno due meccanismi attraverso i quali gli androgeni aumentano l'attività enzimatica nel rene. Il normale aumento dell'attività o della velocità di sintesi della beta-glucuronidasi a seguito della somministrazione di androgeni richiede ormoni ipofisari e/o prodotti di questi ormoni, mentre l'aumento dell'attività di enzimi come l'alcol deidrogenasi e la D-aminoacido ossidasi non richiede ormoni ipofisari.
Varianti di cellule HTC con bassa inducibilità della tirosina aminotransferasi e recettori glucorticoidi apparentemente normali.Varianti di cellule HTC che mostrano poca o nessuna induzione della tirosina aminotransferasi in risposta ai glucorticoidi sono stati isolati mediante cloni ripetuti senza pressioni selettive deliberate. In questo articolo vengono descritte la derivazione e alcune proprietà di queste cellule, confrontate sia con i cloni ad alta induzione che con le cellule wild-type. Le cellule non inducenti sono cresciute bene , e non sono stati indotti nemmeno da concentrazioni insolitamente elevate di steroidi. L'attività enzimatica ha avuto una normale emivita di decadimento e inattivazione al calore. È stata inattivata dall'antisiero contro l'autentica tirosina aminotransferasi e non è stata trovata alcuna prova di enzima antigenicamente attivo, enzimaticamente inattivo Nessuna grande variabilità è stata osservata nelle poche altre attività enzimatiche testate I recettori glucocorticoidi erano presenti in tutti i cloni, Per quanto riguarda la concentrazione, assorbimento, legame privo di cellule ai nuclei e localizzazione intracellulare, non sono state riscontrate differenze tra i recettori dei cloni inducibili e non inducibili. Queste sono le prime cellule derivate da un tipo inducibile ad essere caratterizzate come aventi un recettore normale mentre diventano resistenti agli steroidi. Sembrano essere bloccati in una fase avanzata della risposta allo steroide e quindi potrebbero rivelarsi utili nell'analisi di questi passaggi successivi.
Effetti dell'estradiolo-17beta sull'induzione del rilascio di gonadotropine mediante stimolazione elettrica dell'ipotalamo nelle scimmie rhesus.LH e FSH sierici sono stati misurati a 60 , 30 e 0 min prima, a 5, 15 e 30 min durante e a 10, 45 e 90 min dopo la stimolazione elettrica bilaterale (ES) di varie regioni ipotalamiche in 12 scimmie rhesus ovariectomizzate non anestetizzate. i nuclei ventromediali (ipotalamo basale mediale; MBH) inducevano un rapido aumento dell'LH sierico che persisteva durante la stimolazione e tornava ai livelli basali entro 90 minuti successivi. Anche l'FSH veniva rilasciato, ma il rilascio era più lento e meno drammatico di quello dell'LH. Stimolazione simulata (0muA) non ha causato alcun cambiamento nelle gonadotropine sieriche. La quantità di LH rilasciata dopo MBH-ES dipendeva dall'intensità della corrente (1,0 mA maggiore di 0,5 o 0,7 mA). Tre prove MBH-ES sequenziali di 30 minuti a intervalli di 90 minuti ha indotto risposte LH comparabili e 3 h di mantenimento continuo di MBH-ES ned elevati livelli sierici di LH durante il periodo di stimolazione, suggerendo che questo periodo di stimolazione, suggerendo che questi parametri di stimolazione non hanno completamente esaurito le riserve ipofisarie di LH rilasciabile. Il carattere della risposta dell'LH era simile nelle singole scimmie in 3-24 prove per 4-18 mesi. Sono stati confrontati gli effetti del trattamento con estradiolo-17beta (E2) a diverse dosi e per diversi intervalli di tempo prima dell'MBH-ES. Il rilascio di LH indotto da ES non è stato influenzato da bassi livelli (25 e 55 pg/ml) di E2 per 48 ore, ma è stato ridotto da concentrazioni più elevate di E2 (100 o 230 pg/ml). Le concentrazioni di E2 di 100 pg/ml non hanno avuto effetto a 24 ore, ma hanno ridotto il rilascio di LH attivato da MBH-ES a 48-96 ore; il grado di depressione era correlato al tempo (48 h meno di 72 h meno di 96 h). Anche l'ES della regione preottica-sovrachiasmatica (ipotalamo rostrale; RH) nelle scimmie non trattate con E2 ha rilasciato LH, ma questo aumento è stato inferiore rispetto a MBH-ES. Il rilascio di FSH non era misurabile dopo RH-ES. In contrasto con la risposta LH depressa a MBH-ES dopo 48 ore di E2 (100 pg/ml), la risposta a RH-ES non è stata inibita da questo regime E2. Questi dati suggeriscono che l'ES di un'area che si estende caudalmente dall'ipotalamo rostrale alla regione dell'eminenza mediana arcuata evocherà il rilascio di LH nelle scimmie rhesus. Questo rilascio di gonadotropine indotto elettricamente era influenzato dalla somministrazione di livelli fisiologici di E2, ma la natura dell'effetto dipendeva dalla regione specifica stimolata: distinta inibizione della risposta gonadotropica a MBH-ES e leggera facilitazione della risposta a RH-ES.
Secrezione di gonadotropine negli arieti criptorchidi e castrati e gli effetti acuti del trattamento con steroidi esogeni.Secrezione di gonadotropine negli arieti criptorchidi e castrati e l'acutve è stata determinata. I montoni trattati con criptorchide a 6 settimane di età avevano un aumento dei livelli sierici di ormone luteinizzante (LH) e ormone follicolo-stimolante (FSH) quando determinati a 9 mesi di età. Questi livelli si avvicinavano a quelli dell'animale castrato, eppure i livelli sierici di testosterone (T ) sono rimasti invariati. Anche se le concentrazioni sieriche medie di LH sono state elevate da sei a otto volte rispetto a quelle dei livelli di ariete intatto, è stata osservata una relazione temporale tra questo ormone e T simile a quella riportata nel montone intatto. Le iniezioni intramuscolari di diidrotestosterone non hanno avuto effetto sulla circolazione livelli di LH o FSH in entrambi i montoni criptorchidi o castrati, mentre T riduceva efficacemente queste gonadotropine nei montoni castrati ma non nei montoni criptorchidi. Solo l'estradiolo-17beta (E2) era efficace ve sia in criptorchidi che in arieti castrati. L'estradiolo era un potente inibitore della secrezione di LH; tuttavia, il suo effetto sui livelli di FSH è stato meno drammatico. Ciò suggerisce che i prodotti testicolari diversi dall'E2 possono essere importanti nella regolazione della produzione e/o del rilascio di FSH. È importante sottolineare che l'inibizione della secrezione di LH è durata meno di 12 ore; mentre gli effetti negativi di E2 sulla secrezione di FSH sono durati da 72 a 144 ore. In conclusione, i risultati di questo studio mostrano che T non è l'unico fattore responsabile della regolazione della secrezione di LH e FSH negli ovini maschi. L'estradiolo può essere un importante regolatore della secrezione di gonadotropine, ma la 5alfa-riduzione non gioca alcun ruolo apparente in questo processo.
Attività antimicrobica del tibezonio (TBZ).L'attività in vitro del tibezonio (Rec 15-0691), un nuovo derivato 1,5-benzodiazepinico , è stato studiato. Il farmaco è stato trovato attivo soprattutto contro i ceppi di Streptococcus, Diplococcus e Corynebacterium che sono agenti di malattie orofaringee. L'attività del tibezonio era pH dipendente contro Staphylococcus aureus SG 511 e Streptococcus pyogenes 821 (a pH 8,0-8,5 Era più attivo) e la presenza di siero di cavallo ha provocato una piccola diminuzione delle proprietà antimicrobiche. Nessuna interferenza sull'attività del tibezonio è stata riscontrata in presenza di saliva di fumatori e non fumatori.
Fosfomicina nella meningite pneumococcica.È stato condotto uno studio su 12 pazienti con meningite pneumococcica di età compresa tra 12 mesi e 59 anni. In tutti i casi pneumococco è stato isolato nel liquido cerebrospinale (CSF). Diciassette pneumococchi sono stati studiati per la loro sensibilità a fosfomicina, ampicillina e gentamicina, inclusa la loro MIC. Tutti erano sensibili a fosfomicina e ampicillina e 7 alla gentamicina. D'altra parte è stato anche fatto uno studio sull'interazione tra fosfomicina più ampicillina e fosfomicina più gentamicina. È stata determinata la concentrazione di antibiotici nel plasma e nel liquido cerebrospinale. In alcuni casi è stata studiata anche l'associazione tra fosfomicina e penicillina o ampicillina, a seconda che il paziente fosse più giovane o più anziano di 2 anni, e in altri casi, l'associazione di fosfomicina con gentamicina Le concentrazioni di antibiotici nel liquido cerebrospinale variavano a seconda dello stadio di evoluzione della meningite. ds risultati clinici, sono state ottenute 10 cure e 2 fallimenti. Il pneumococco è stato eradicato dal liquido cerebrospinale in tutti i casi, compresi i due fallimenti, nel controllo effettuato 2-3 giorni dopo l'inizio del trattamento, il resto dei dati analitici del liquido cerebrospinale è tornato normale entro 5 e 17 giorni di trattamento.
Fosfomycin: Assorbimento ed escrezione.Sono riportati i risultati riassuntivi di assorbimento ed escrezione di fosfomicina dopo somministrazione orale ed endovenosa ottenuti da ospedali e istituzioni in Giappone. La fosfomicina viene rapidamente assorbita ed escreta dalle urine una volta distribuita, il recupero urinario in 6 ore raggiunge circa il 20% in caso di somministrazione orale e il 90% in caso di iniezione endovenosa, fenomeni pressoché analoghi a quelli precedentemente pubblicati. È stata osservata una concentrazione maggiore nel rene, che diminuiva gradualmente in base alla diminuzione del livello ematico. Il livello ematico ha raggiunto il suo massimo di circa 3 mug/ml dopo somministrazione orale ad adulti alla dose di 500 mg.
Effetto inotropo negativo della lidocaina in pazienti con malattia coronarica e soggetti normali.L'effetto della somministrazione di lidocaina sulla performance ventricolare sinistra è stato studiato utilizzando la sistolica intervalli di tempo in nove soggetti normali, otto pazienti con angina stabile e 15 pazienti con infarto miocardico acuto. La risposta maggiore negli intervalli di tempo sistolico si è verificata tre minuti dopo l'iniezione endovenosa di lidocaina (100 mg), con valori che tornano al basale da 10 a 15 minuti La somministrazione di lidocaina ha prodotto un significativo prolungamento del periodo di preeiezione (PEP) corretto per la frequenza cardiaca in tutti i gruppi e un prolungamento del rapporto tra PEP e tempo di eiezione ventricolare sinistro (PEP/LVET) nei pazienti con angina. infarto miocardico acuto ha mostrato uno stato iperadrenergico, come mostrato da un breve QS2I basale Il QS I è stato allungato dalla somministrazione di lidocaina in tutti i gruppi, ma questo era più profondo d in quelli con infarto miocardico acuto. Questi cambiamenti negli intervalli di tempo sistolico erano ancora presenti a due ore dopo l'iniezione in sei pazienti con infarto miocardico acuto in cui un'infusione di lidocaina ha seguito il bolo iniziale. L'effetto della somministrazione di lidocaina dopo iniezione endovenosa di propranololo (5 mg) è stato studiato anche in sei soggetti normali. Sebbene la terapia con propranololo abbia prolungato la PEP/LVET, un ulteriore significativo prolungamento ha seguito la successiva iniezione di lidocaina.
Un test del concetto di "malattia depressiva sottostante" nel trattamento degli stati d'ansia.Per testare la validità del concetto degli stati d'ansia che mascheravano una malattia depressiva sottostante, i pazienti diagnosticati clinicamente come affetti da stati d'ansia o di tensione sono stati trattati in doppio cieco casuale per 4 settimane con un ansiolitico puro, lorazepam, o un preparato ansiolitico/antidepressivo, flufenazina con nortriptilina. Le autovalutazioni dei pazienti\' erano molto simili alle valutazioni dei medici\' che mostravano che la flufenazina/nortriptilina era associata a un miglioramento complessivo significativamente maggiore (p inferiore a 0,01), nonché a miglioramenti significativamente maggiori nel gruppo di sintomi specificamente correlati alla depressione (p inferiore a 0,05) Questi risultati suggeriscono che un elemento depressivo è presente in una percentuale apprezzabile di pazienti che si presentano con apparenti stati di ansia, sia antidepressivi che ansiolitici. trattamento è richiesto. I pazienti selezionati sulla base del fatto che erano migliorati in modo soddisfacente alla fine del trattamento di 4 settimane\' sono stati seguiti per altri 3 mesi senza farmaci e il tasso di recidiva è stato del 24%, indipendentemente dal trattamento precedente. Un numero maggiore di pazienti trattati con lorazepam ha dovuto essere escluso dal follow-up a causa del mancato miglioramento, e questi probabilmente rappresentavano la proporzione (19%) di questa popolazione con un apprezzabile elemento depressivo alla loro malattia.
Interferone: effetti sulla risposta immunitaria e sul meccanismo di attivazione della risposta cellulare.La scoperta dell'interferone nel 1957 da parte dei dottori Isaacs e Lindenmann ha portato a importanti revisioni nei concetti delle difese dell'uomo contro le infezioni virali. Esistono almeno due tipi di interferone. Insieme alle loro proprietà antivirali, è stato recentemente dimostrato che esercitano un effetto soppressivo sulla risposta immunitaria umorale e cellulare; colpiscono sia i linfociti B che T. Una varietà di sostanze, inclusi virus, poliribonucleotidi e mitogeni per i linfociti T, sono buoni induttori di interferone. I linfociti T sembrano essere necessari affinché questi induttori esercitino i loro effetti immunosoppressivi. Gli effetti immunosoppressivi degli induttori di interferone suggeriscono che gli interferoni possono essere mediatori degli effetti soppressori dei linfociti T. Nel sistema virale, l'interferone non esercita i suoi effetti antivirali per azione diretta sul virus, ma piuttosto deprime un cel l gene che determina la produzione di una proteina antivirale. Questa proteina antivirale è probabilmente il mediatore dell'inibizione della replicazione del virus. Questa è una complessa sequenza di eventi che si traduce nell'interazione dell'interferone con la membrana cellulare e nella conseguente produzione dello stato antivirale nella cellula. Questa recensione esaminerà le varie fasi di questo processo coinvolto.
I valori di pKa intrinseci dei gruppi funzionali negli enzimi: deduzioni improprie dalla dipendenza dal pH dei parametri allo stato stazionario.Le ipotesi implicite nella sono riassunte le deduzioni fatte dalla dipendenza dal pH delle misurazioni della velocità delle reazioni catalizzate da enzimi e le limitazioni di tali determinazioni sono discusse in modo non algebrico. Sono considerati i seguenti tipi di profilo pH (in ordine crescente di utilità): pH-"attività " curve a [S] o; dipendenze del pH di kcat, Km, kcat/Km e Ki; dipendenze del pH della kmodificazione (mediante reagenti specifici) e dell'etichettatura competitiva (mediante reagenti non specifici); dipendenze del pH di passaggi e l'osservazione diretta di un gruppo di titolazione.
La risposta immunitaria nei ratti cirrotici. Distribuzione dell'antigene, immunità umorale, immunità cellulo-mediata e attività delle cellule soppressorie spleniche.I disturbi immunologici che si verificano come risultato della malattia epatica sono stati studiati in un modello animale di cirrosi. Le cellule fagocitarie mononucleate del fegato normale fagocitano grandi quantità di antigene indipendentemente dal fatto che tale antigene sia iniettato direttamente nel portale o nelle circolazioni sistemiche. Il fegato agisce quindi come un filtra \'in serie\' e \'in parallelo\' con la milza e riduce l'immunogenicità degli antigeni che entrano nell'organismo attraverso una di queste vie. Nei ratti con cirrosi epatica, vi è una riduzione della capacità del fegato di fagocitare il flagellare antigene di Salmonella adelaide. Ciò si traduce in un aumento della stimolazione del tessuto linfoide splenico e in un aumento della risposta anticorpale a questo antigene indipendente dal timo. il timulus alla milza può anche essere responsabile dell'aumentata attività delle cellule soppressorie che è stata dimostrata in questi ratti, e può essere il meccanismo della diminuita risposta immunitaria cellulo-mediata sia in questo modello animale di cirrosi che nello stato di malattia umana. Questi studi suggeriscono che molti dei disturbi immunologici associati alla malattia epatica cronica possono essere il risultato di una cattiva distribuzione dell'antigene che si verifica a causa della ridotta capacità fagocitaria epatica.
Valutazione del detenuto come soggetto nella valutazione della droga.Le ragioni dell'esclusione dei detenuti dagli studi di ricerca sulle droghe si basavano principalmente su una gruppo limitato di parametri di laboratorio che avrebbero potuto essere rilevati utilizzando una semplice batteria di test di screening. Le risposte a un modulo di anamnesi aggiungevano poco alla valutazione sia del prigioniero che dei gruppi di studenti, erano probabilmente molto inaffidabili e potevano essere altrettanto confinate ad alcune domande selezionate riguardanti la storia della droga come una questione di record. Gli studenti hanno dato risposte appropriate a un test di misurazione della scala dell'umore mentre i prigionieri caratteristicamente non lo hanno fatto. A causa di una combinazione di vari fattori istituzionali e sociologici, i prigionieri rappresentano probabilmente un sottogruppo speciale di ricerca volontari il cui stato di salute potrebbe non essere rappresentativo della popolazione "sana" totale. È improbabile che diano risposte accurate o affidabili in situazioni di test che si basano sulla segnalazione degli effetti soggettivi dei farmaci per quanto riguarda la tolleranza o l'effetto farmacologico. Gli studi di farmaci sperimentali in cui la probabilità di un rischio potenziale è significativa dovrebbero essere evitati in tali popolazioni, a meno che la compliance non sia stata valutata adeguatamente.
Studi sulle caratteristiche fisico-chimiche dello stimolatore della migrazione dei polimorfi.Lo stimolatore della migrazione dei polimorfi è un fattore surnatante prodotto dall'interazione tra glucocorticosteroidi e monociti del sangue umano in coltura Studi sulle caratteristiche fisiche di questo fattore mostrano che è solubile e stabile alle alte e basse temperature La sua attività è ridotta dal trattamento acido e alcalino e distrutta dall'enzima proteolitico proteasi Esperimenti di dialisi, ultrafiltrazione e Sephadex G- 100 gel di filtrazione indicano che il peso molecolare dello stimolatore della migrazione polimorfa è compreso tra 12.000 e 15.000. Si suggerisce che questo fattore possa mediare gli effetti antinfiammatori dei glucocorticosteroidi sulle cellule fagocitiche.
Stimolazione del rilascio dell'ormone della crescita mediante l'ormone di rilascio dell'ormone luteinizzante e l'ormone che inibisce il rilascio dell'ormone stimolante i melanociti nel ratto ipofisectomizzato con ipofisi ectopica.La somministrazione intragiugulare di LHRH (0-6 e 1-2 tazze) in ratti ipofisectomizzati che hanno ricevuto innesti renali dell'ipofisi anteriore ha indotto un piccolo ma significativo aumento del GH plasmatico 5 e 10 minuti dopo il trattamento. LHRH, agli stessi livelli di dose, è stato inefficace nei controlli intatti di pari peso. Il MIF, alla dose di 1-2 tazze, ha indotto un leggero aumento del GH 5 min dopo il trattamento nei ratti ipofisectomizzati trapiantati, mentre era inefficace nei controlli intatti. A differenza dei due peptidi ipotalamici, alfa-MSH (0-6 e 1-2 tazze) era inefficace come rilascio di GH sia nei ratti trapiantati che in quelli intatti.
Immunoadsorbenti insolubili delle proteine plasmatiche umane. Produzione e conservazione su larga scala.Metodi per la produzione e la conservazione di grandi volumi di immunoadsorbenti insolubili (per la rimozione di anticorpi non proteine del siero) dal plasma della banca del sangue in eccesso mediante glutaraldeide sono stati valutati con mezzi quantitativi e qualitativi utilizzando rispettivamente 125I radioattivo e immunoelettroforesi Alcuni dei fattori che influenzano le caratteristiche fisiche desiderate e le proprietà di assorbimento degli anticorpi dell'immunoadsorbente studiato sono stati: acidificazione del plasma, concentrazioni variabili di glutaraldeide, aggiunta di piccole quantità di formalina, conservazione in condizioni variabili di temperatura ed esposizione a conservanti allo stato umido e liofilizzato per periodi fino a 2,5 anni. La migliore conservazione delle proprietà anticorpo-adsorbenti (in condizioni di conservazione) è stata ottenuta in lo stato lavato a 4 gradi C, ma si è ottenuta una buona conservazione anche a temperatura ambiente in th e presenza di formalina al 10% e allo stato non lavato a temperatura ambiente in presenza di glutaraldeide non reagita. La liofilizzazione ha distrutto circa il 70% dell'attività di un adsorbente.
Fattori che influenzano le determinazioni del lisozima con il metodo della lysoplate.Sono stati studiati alcuni fattori che influenzano il metodo della lysoplate. Le influenze del pH, della forza ionica e della temperatura di il mezzo gel può essere spiegato considerando l'influenza di questi fattori sulla velocità di diffusione piuttosto che sulle proprietà enzimatiche del lisozima. Sali e proteine presenti in un campione probabilmente influenzano i risultati in modo simile. Anche se il metodo ha un coefficiente di variazione intorno 10% e quindi una precisione accettabile, la sua accuratezza è variabile e dubbia. Il metodo potrebbe essere clinicamente interessante, discriminando gli isoenzimi del lisozima, o rilevando indirettamente proteine associate ad alcuni stati patologici.
Misurazione dei recettori dell'estradiolo nei tumori della mammella umani mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide.1. I recettori specifici dell'estradiolo nei citosol dei tumori della mammella umani sono stati misurati mediante poliacrilammide discontinua elettroforesi su gel 2. Il legame dell'estradiolo alla globulina legante gli ormoni sessuali contaminanti era chiaramente separato da quello dovuto al recettore specifico 3. La quantità di estradiolo legato al recettore era lineare rispetto alla quantità di proteina aggiunta al gel 4. Il picco di radioattività del recettore dell'estradiolo ha mostrato la saturabilità e la specificità caratteristica di un recettore intracellulare. 5. I risultati mostrano che l'elettroforesi su gel di poliacrilammide può essere utilizzata per quantificare specifici recettori dell'estradiolo in presenza di altri componenti che legano ad alta affinità.
[Proprietà reologiche delle secrezioni bronchiali umane: dimostrazione di polipeptidi ricchi di prolina e loro ruolo (autore\'s trad.)].Le secrezioni bronchiali umane erano esaminati per componenti chimici e proprietà reologiche. I polipeptidi ricchi di prolina (PRP) ottenuti mediante trattamento ad ultrasuoni e per contatto con una resina cationica (AG 50WX2) sono stati purificati mediante cromatografia di filtrazione su gel ed elettroforesi ad alta tensione. La composizione chimica di questi componenti ha permesso una classificazione in base al loro contenuto di prolina, glicina, acido glutammico e lisina. Gli esperimenti reologici suggeriscono un ruolo biologico per il PRP nella struttura fibrillare dell'espettorato.
Saggio enzimatico del colesterolo totale nel siero o nel plasma mediante misurazione amperometrica del tasso di esaurimento dell'ossigeno dopo la saponificazione.Un metodo per il dosaggio del colesterolo sierico o plasmatico che coinvolge viene descritta la misurazione amperometrica della velocità di esaurimento dell'ossigeno nell'ossidazione catalizzata dalla colesterolo ossidasi del colesterolo L'idrolisi degli esteri del colesterolo sierico viene effettuata mediante saponificazione di 50 mul di campione con 0,2 ml di KOH etanolico (1,0 mol/1) contenente 0,5 % Triton X-100 per 5 min a 75 gradi C. Il tasso di consumo di ossigeno in un'aliquota di 25 μl di questo viene misurato con un elettrodo di Clark in un analizzatore di glucosio Beckman e il test richiede circa un minuto dopo l'incubazione; i risultati vengono letti digitalmente sullo strumento. La cuvetta dell'analizzatore contiene 1 ml di tampone fosfato 1 M, pH 7,4, con 100 mg di sodio colato/100 ml e 0,1-0,2 U di colesterolo ossidasi.
L'attività della N-acetil-beta-glucosaminidasi nella mola idatiforme.L'attività della N-acetil-beta-glucosaminidasi nella mola idatiforme è due volte maggiore rispetto a quello della placenta a termine. Qualitativamente, gli enzimi dei due tessuti sono simili per quanto riguarda i valori di KM e il pH ottimale. Entrambi gli enzimi contengono anche una nuova forma di isoenzima rilevabile mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide. Tuttavia, l'enzima molare è più suscettibile di denaturazione da calore, presumibilmente dovuta alla presenza in questo tessuto di un livello più elevato dell'isoenzima termolabile forma A. Vengono inoltre presentati dati che indicano che la placenta non è la fonte dell'attività della N-acetil-beta-glucosaminidasi nel siero materno.
Spettrofotometria simultanea di Fe2+ e Cu2+ in siero denaturato con guanidina cloridrato.Mostriamo come gli ioni ferro e rame possono essere misurati contemporaneamente in 0,2 ml di siero dopo aver utilizzato la guanidina cloridrato per provocarne il rilascio dalle proteine Reagenti sensibili per ferro (2,4,6-tripyridyl-s-triazine) e rame (disodio 2,9-dimetil-4,7-difenil-1, 10-fenantrolina disolfonato ) facilitano tale misurazione. Abbiamo eliminato l'interferenza spettrale tra i due complessi metallo-ione mediante l'uso selettivo del pH. I risultati si confrontano bene con quelli ottenuti con metodi accettati in cui le concentrazioni di questi ioni sono misurate indipendentemente.
Lattato deidrogenasi totale e suoi isoenzimi nel siero in presenza di penicillamina e altri composti sulfidrilici.Verso la definizione delle variazioni della lattato deidrogenasi totale (LDH) e nella distribuzione degli isoenzimi LDH come valutata mediante elettroforesi su disco di poliacrilammide, abbiamo inbucato sieri umani e di ratto con vari agenti, in particolare composti sulfidrilici. Anche se gli artefatti erano evidenti quando questi agenti sono stati usati senza una regolazione preliminare del pH, abbiamo visto poca alterazione nell'unità totale quando uno o due volumi di siero sono stati miscelati con un volume di uno qualsiasi dei diversi tioli, in particolare penicillamina, a una concentrazione iniziale di 0,4 mol/litro e pH 7,0-7,5. In queste condizioni, la penicillamina ha causato una perdita di LDH-5 dopo l'incubazione per 1 h a 25 gradi C insieme a piccole diminuzioni della mobilità degli altri quattro isoenzimi verso l'anodo. Una regione zymosan è apparsa sotto l'albumina e l'area del colorante di tracciamento. Con periodi più lunghi di inc ubazione del siero di ratto con penicillamina o alfa-mercaptosuccinato, è stata osservata una nuova banda nello zimogramma appena sopra il picco di LDH-4. Le osservazioni sono discusse in termini di effettori allosterici.
Spettrometria ultravioletta dei trigliceridi sierici mediante un metodo totalmente enzimatico adattato ad un analizzatore centrifugo.Abbiamo descritto un micrometodo per la determinazione dei trigliceridi sierici (triacilgliceroli) con il analizzatore centrifugo Questa tecnica si basa sulla procedura di Bublitz e Kennedy [J. Biol. Chem. 211, 951 (1954)]. L'idrolisi enzimatica richiede 10 min a 30 gradi C. È possibile eseguire ventisei dosaggi di trigliceridi sierici in circa 30 min. La concentrazione e l'assorbanza sono correlate linearmente fino a 5,0 mmol/litro, ma è possibile dosare concentrazioni più elevate modificando leggermente le condizioni. La riproducibilità giornaliera del metodo è stata soddisfacente (CV, da 2,7 a 8,4%). questo metodo e altri due metodi per i trigliceridi, il metodo automatizzato di condensazione Hantzsch e un metodo enzimatico commerciale (Calbiochem), hanno fornito coefficienti di correlazione rispettivamente di 0,976 e 0,990. I risultati non sono influenzati dalla presenza di ADP sierico endogeno, ac piruvico id, fosfatasi o ATPasi.
Caratterizzazione biochimica della fosfatasi acida resistente al tartrato della milza umana con reticoloendoteliosi leucemica come pirofosfatasi.Una fosfatasi acida resistente al tartrato è stata isolata da un milza leucemica umana mediante congelamento-scongelamento in soluzione fisiologica e purificata mediante cromatografia ripetuta su carbossimetilcellulosa L'enzima purificato ha un peso molecolare di 64 000. Catalizza l'idrolisi del pirofosfato inorganico e organico nonché dell'estere fenolico del monoortofosfato, con un'ottima attività tra pH 5 e 6. Tuttavia, non vi è attività verso gli esteri monoortofosfato degli alcoli alifatici. I dati attuali hanno identificato la sua funzione catalitica come una pirofosfatasi, tuttavia ha proprietà diverse dalla pirofosfatasi precedentemente osservata nei normali tessuti animali.
Gamma-glutamiltransferasi: proprietà cinetiche e condizioni di analisi quando la gamma-glutamil-4-nitroanilide e il suo derivato 3-carbossilico sono usati come substrati donatori.È stata studiata la cinetica della gamma-glutamiltransferasi sierica umana (EC 2.3.2.2), con l'uso di glicilglicina come substrato accettore di gamma-glutamil e gamma-glutamil-4-nitroanilide e il suo derivato carbossilico, gamma-glutamil-3-carbossi-4 -nitroanilide, come substrati donatori. L'occorrenza simultanea di gamma-glutamiltransfer e autotransfer è stata stabilita mediante cromatografia discendente su carta. I grafici a doppio rapporto reciproco costante confermano che il meccanismo enzimatico non è sequenziale (ping-pong bi-bi). donatore non è stato trovato e l'inibizione da parte della glicilglicina è stata osservata solo a concentrazioni superiori a quelle di interesse clinico Le costanti cinetiche ottenute dall'analisi di regressione non lineare dei dati di velocità iniziale sono state utilizzate per determinare le concentrazioni di substrato del reagente per il dosaggio di questo enzima. Un'analisi con l'uso di 4 mmol di gamma-glutamil-3-carbossi-4-nitroanilide e 100 mmol di glicilglicina per litro ha prodotto attività equivalenti a quelle dell'analisi con l'uso di 4 mmol di gamma-glutamil-4-nitroanilide e 40 mmol di glicilglicina per litro. Queste concentrazioni del donatore di carbossi e della glicilglicina sono anche "ottimali in termini di costi" e non presentano problemi procedurali quando vengono utilizzate.
Effetti emodinamici del labetalolo, un agente bloccante alfa e beta adrenergico, in soggetti ipertesi.Il labetalolo è stato somministrato a sei soggetti ipertesi in dosi crescenti per sette giorni. È stata osservata una diminuzione della pressione arteriosa e della frequenza cardiaca sia in posizione supina che in piedi senza alcun cambiamento nella gittata cardiaca e pochi effetti collaterali. La tolleranza all'esercizio è stata inalterata dal farmaco, ma la frequenza cardiaca e la risposta della pressione arteriosa all'esercizio sono state significativamente ridotte. la velocità di infusione di isoproterenolo necessaria per produrre tachicardia è stata aumentata di sette volte di 800 mg/die di labetalolo e di dieci volte di 1600 mg/die. Durante la terapia con labetalolo è stato richiesto più del doppio della dose di controllo di fenilefrina per produrre un aumento della pressione arteriosa diastolica riflessa tachicardia ad amile l'ipotensione indotta da nitriti è stata attenuata. Questi studi indingina pectoris.
Diffusione degli acidi grassi nei multistrati di lecitina: idratazione ed effetti del PH.La diffusione del sale sodico degli acidi grassi monocarbossilici, dal formiato allo stearato, ha stato studiato in funzione del contenuto di acqua e del pH nelle fasi lamellari lecitina-acqua. L'evoluzione dei coefficienti di diffusione all'aumentare della lunghezza della catena riflette le diverse localizzazioni degli acidi grassi nel sistema. Dal formiato al butirrato, che sono principalmente ristretti agli idrofili strato della fase, le velocità di diffusione diminuiscono rapidamente. Da butirrato a stearato, gli acidi grassi (ancorati all'interfaccia idrofila-lipofila) subiscono diffusione laterale e quindi la diminuzione di D con l'aumentare della lunghezza della catena è molto più lenta. La diffusione dello stearato è già paragonabile alla diffusione della stessa molecola di lecitina. Le velocità di diffusione dipendono fortemente dall'idratazione della fase e dal pH: è dimostrato che entrambi i parametri controllano la ionizzazione degli acidi grassi. Le variazioni di diffusione sui tassi osservati può essere ascritto al fatto che, a seconda del loro stato di ionizzazione, gli acidi grassi assumono una diversa localizzazione e quindi sperimentano diverse interazioni nel sistema lamellare.
Interazioni di vari 19-nor steroidi con il citocromo microsomiale placentare umano P-450 (P-450hpm).Ciascuno dei sette 19-nor steroidi esposti la capacità di facilitare il legame del monossido di carbonio (CO) al citocromo microsomiale placentare umano P-450 sebbene siano state dimostrate differenze quantitative. In ogni caso la facilitazione era antagonizzata dall'androstenedione.19-Norandrostenedione ha prodotto l'effetto più pronunciato seguito da 19- nortestosterone, nandrolone decanoato, norethandrolone, norgestrel, norethynodrel e noretindrone nell'ordine Tutti gli steroidi studiati hanno prodotto spettri di legame tipici di tipo I quando aggiunti ai microsomi placentari. -capacità sito di legame e un sito di legame a bassa affinità, alta capacità Non sono state osservate correlazioni tra l'affinità per entrambi i siti e la capacità di facilitare il legame di CO al citocromo né sono state osservate od correlazioni tra le massime differenze di assorbanza (circa 390-420 nm) producibili e capacità di facilitazione. Si è quindi concluso che non esistevano relazioni definitive tra la capacità di facilitazione e gli aspetti qualitativi o quantitativi degli spettri di legame degli steroidi. La capacità di facilitare il legame della CO sembrava risiedere nell'assenza di un gruppo chimico sostituito in posizione 10 sulle molecole di steroidi androgeni poiché tutti gli steroidi studiati che possedevano 10-metil o altri gruppi 10-sostituiti non avevano alcun effetto sullo spettro di legame della CO o causato uno spostamento di CO dall'eme ferroso. Al contrario, tutti gli steroidi studiati privi di una sostituzione al C-10 (19-né steroidi) hanno prodotto un effetto facilitante sul legame eme-ligando.
Mutanti stabili di cellule di mammifero che producono in eccesso i primi tre enzimi della biosintesi dei nucleotidi pirimidinici.Dopo esposizione a 0,1 mM di N-fosfonacetil-L-aspartato ( PALA), un inibitore dell'analogo dello stato di transizione dell'aspartato transcarbamilasi, la maggior parte delle cellule di una linea di criceto siriano trasformata da virus delle scimmie 40 (SV40) vengono uccise entro pochi giorni, ma i mutanti resistenti si formano spontaneamente con frequenza 2-5 X 10 (-5) in un processo stocastico non dipendente dalla presenza dell'inibitore. Il fenotipo resistente è stabile per molti mesi in assenza di PALA. Anche altre linee cellulari danno mutanti resistenti, ma con frequenze sostanzialmente inferiori. Selezione seriale con PALA a concentrazioni fino a 25 mM ha prodotto cloni con più di 100 volte l'attività originale dell'aspartato transcarbamilasi. Le attività della carbamil-P sintetasi e della diidroorotasi, che co-purificano con l'aspartato transcarbamilasi come complesso a tre enzimi, aumentano parallelamente a quanto l'attività della transcarbamilasi parteta in ogni clone resistente testato, ma non vi è alcun cambiamento sostanziale nelle attività degli ultimi tre enzimi della via de novo, che non sono in questo complesso. In ciascuno dei tre cloni resistenti testati, vi è un aumento del numero di siti attivi dell'aspartato transcarbamilasi, determinato dalla titolazione con 3H-PALA, che è strettamente parallelo all'aumento dell'attività enzimatica. In un clone resistente testato, non vi è alcun cambiamento nel Ki per PALA o nel Km per carbamil-P. L'unico meccanismo rilevato per raggiungere la resistenza al PALA è un aumento della quantità allo stato stazionario del complesso dei tre enzimi.
L'effetto delle condizioni di fissazione sull'aspetto ultrastrutturale dei granuli di cellule di gastrina nell'antro pilorico gastrico di ratto.L'aspetto ultrastrutturale delle cellule di gastrina (cellule G ) i granuli sono stati studiati dopo diverse procedure di fissazione. Quando il pH di prefissazione è stato variato si è verificata una maggiore conservazione della densità elettronica dei nuclei dei granuli dopo prefissazione acida (pH 5,0 e 6,0) rispetto a dopo prefissazione neutra o alcalina (pH 7,0 e 8,0). di prefissazione a pH 7,3 ha comportato una progressiva perdita di densità elettronica del nucleo del granulo con rigonfiamento e rottura occasionale della membrana limitante. Nei tessuti in cui la maggior parte dei granuli era stata resa elettrotrasparente mediante fissazione, quei granuli che rimanevano a nucleo denso erano preferibilmente situati vicino al Zona del Golgi Questi risultati indicano che la densità elettronica dei granuli delle cellule G è profondamente influenzata dalle condizioni di fissazione e che i granuli immaturi sono più resistenti alla perdita di o f densità del nucleo rispetto ai granuli maturi. Suggeriscono anche che il granulo di gastrina in vivo, come altri granuli polipeptidici, possa avere un nucleo "solido", osmoticamente inattivo.
Analisi dell'inotropo: selettività cronotropa di dobutamina e dopamina in cani anestetizzati e atri isolati di cavia.La selettività inotropa in vivo precedentemente riportata di La dobutamina e la dopamina rispetto all'isoprenalina sono state dimostrate in cani a torace aperto anestetizzati bivagotamizzati. Sono state misurate le risposte della frequenza cardiaca, della tensione ventricolare destra, del dP/dtmax del ventricolo sinistro e della pressione sanguigna. Rispetto all'isoprenalina, la dobutamina e la dopamina erano 1,8 e 2,4 volte superiori attiva nell'aumentare la contrattilità cardiaca rispetto alla frequenza. La selettività inotropa della dopamina ma non quella della dobutamina è stata abolita dal pretrattamento dei cani con sirosingopina. Negli atri isolati di cavia, l'isoprenalina, la dobutamina e la dopamina erano tutte leggermente selettive in termini di frequenza, sebbene ciò fosse inferiore per Negli atri incubati con fenossibenzamina di cavie pretrattate con reserpina solo le curve dose-risposta della dopamina sono state spostate al a destra indica una notevole componente simpaticomimetica indiretta. La selettività inotropa in vivo della dopamina potrebbe quindi essere spiegata sulla base di questa attività indiretta che si manifesta a dosi inferiori nel miocardio dove le riserve di catecolamine sono più abbondanti rispetto al nodo seno-atriale. Tuttavia, si conclude che la selettività inotropa della dobutamina osservata in vivo non è dovuta all'attività indiretta, agli effetti riflessi o a una differenza nei recettori beta che mediano le risposte di frequenza e tensione del cuore. Vengono discusse possibili spiegazioni alternative.
Nuovi zuccheri da lipopolisaccaridi antigenici di batteri: identificazione e sintesi di 3-O-[(R)-1-carbossietil]-L-ramnosio, un componente acido di Shigella dysenteriae lipopolisaccaride di tipo 5.Un nuovo zucchero acido, 3-O-[(R)-1-carbossietil]-L-ramnosio (1), è stato identificato come un costituente del lipopolisaccaride antigenico O di Sh. dysenteriae tipo 5. La struttura di 1 è stata stabilita con metodi fisico-chimici e per sintesi Alchilazione del metil 2,5-di-O-benzil-alfa-L-rhamnofuranoside (6) con (S)- o ( Gli acidi R)-2-cloropropionici, seguita dalla rimozione dei gruppi protettivi, hanno fornito 3-O-[(R)-1-carbossietil]-L-ramnosio (9) e 3-O-[(S)-1-carbossietile ]-L-ramnosio (10), rispettivamente. Le proprietà di 1 coincidono con quelle di 9.
Dissociazione dell'assorbimento del 5-fluorouracile dal pH intracellulare nel carcinosarcoma Walker 256.L'influenza del pH intracellulare (pHi) sul 5-fluorouracile (5- L'assorbimento di FU) è stato studiato in fette di carcinosarcoma Walker 256 e fegato di ratto. L'alterazione del pHi è stata ottenuta mediante l'aggiunta di glucosio da solo o insieme con acido ossamico al mezzo di incubazione. I risultati hanno indicato che l'assorbimento di 5-FU da parte delle fette di tumore era non dipendeva dal pHi, ma era potenziato dalla presenza di glucosio. L'assorbimento di 5-FU da parte di fette di fegato sembrava seguire uno schema prevedibile dal pHi e dal pK del farmaco.
Un metodo radioimmunologico per 1-beta-D-arabinofuranosiluracile che utilizza anticorpi diretti contro 1-beta-D-arabinofuranosylcytosine.Sopra pH 7,0 1-beta -D-arabinofuranosiluracile (ara-U) mostra una marcata cross-reattività pH-dipendente con anticorpi diretti verso la 1-beta-D-arabinofuranosilcitosina. Poiché questo peculiare fenomeno non è stato osservato con altri nucleosidi e nucleotidi finora testati, è probabilmente il risultato del tautomerismo catalizzato da basi di ara-U alla sua forma enolica che lo rende strutturalmente più simile alla 1-beta-D-arabinofuranosilcitosina. Eseguendo il dosaggio radioimmunologico sia a pH 6.2 che a 8.6 abbiamo potuto determinare 1-beta-D-arabinofuranosilcitosina e ara-U contemporaneamente. Questo metodo per il dosaggio ara-U è semplice, abbastanza affidabile e applicabile agli studi sui livelli ematici.
Isolamento e caratterizzazione di una batteriocina prodotta da Bacillus stearothermophilus ceppo NU-10.Colture in brodo di Bacillus stearothermophilus ceppo NU-10 producono una batteriocina che esercita un'attività letale su altri ceppi del batterio. La produzione ottimale avviene durante la fase tardiva massima stazionaria di crescita, a pH neutro e 55-65 gradi C. La batteriocina può essere sostanzialmente purificata da una combinazione di precipitazioni, centrifugazioni e filtrazioni su gel. La termocina è composta da proteine e carboidrati. È parzialmente distrutta dagli enzimi proteolitici ma è resistente a DNasi, RNasi e vari trattamenti chimici. La batteriocina ha un peso molecolare ridotto e mostra una notevole termostabilità.
Metabolismo cerebrale dei carboidrati durante intossicazione acuta da monossido di carbonio.Gli effetti metabolici cerebrali di 2,5, 5, 7,5, 10, 20, 30 e 60 minuti di esposizione all'1% di CO sono stati studiati in ratti leggermente anestetizzati misurando il contenuto corticale cerebrale di intermedi selezionati del ciclo glicolitico e dell'acido citrico, nonché dei fosfati energetici dei tessuti. -6-fosfato e aumenti di fruttosio-1-6-difosfato che indicavano un'attivazione di fosfofruttochinasi ed esochinasi. Il pattern "crossover" tra glucosio-6-fosfato e fruttosio-1,6-difosfato era presente a 5, 7,5 e 10 min, ma non a 20, 30 e 60 min e quindi hanno confermato le precedenti osservazioni secondo cui la rilevazione dell'attivazione della fosfofruttochinasi nell'ipossia cerebrale unifattoriale acuta richiede lo studio dei tessuti durante le prime fasi dell'esposizione sperimentale. la fofruttochinasi si è verificata in assenza di cambiamenti rilevabili nel contenuto tissutale di ATP, ADP, AMP o fosfocreatina e quindi ha suggerito che uno squilibrio dell'omeostasi dell'energia tissutale non è un prerequisito per l'attivazione della glicolisi nell'intossicazione da CO. L'1% di CO ha determinato un aumento del rapporto malato/ossalacetato a 5 minuti, seguito da una diminuzione dell'alfa-chetoglutarato e dell'aspartato a 7,5 minuti, il che ha suggerito uno spostamento nella reazione dell'aspartato aminotransferasi verso il rifornimento di ossalacetato rimosso tramite la reazione della malato deidrogenasi. Successivi aumenti di alfa-chetoglutarato a 10, 20, 30 e 60 min sono stati associati ad aumenti di alanina, indicando un ruolo che contribuisce a uno spostamento secondario della reazione dell'alanina aminotransferasi nel rifornimento di alfa-chetoglutarato. Un confronto dei cambiamenti indotti da CO nelle vie del ciclo glicolitico e dell'acido citrico con quelli osservati nell'ipossiemia acuta non indica differenze qualitative di base nelle risposte metaboliche del tessuto cerebrale alle due condizioni.
Alterazioni del turnover delle catecolamine in aree discrete dell'eminenza mediana del ratto ciclico di 4 e 5 giorni.Utilizzo di microfluorimetria quantitativa in combinazione con tirosina idrossilasi inibizione (H44/68) è stata studiata la concentrazione e il turnover di noradrenalina (NA) e dopamina (DA) nello strato subependimale (SEL) e nella zona a palizzata mediale (MPZ) e laterale (LPZ) dell'eminenza mediana del ratto durante il 4 - e ciclo estrale vaginale di 5 giorni. Variazioni cicliche significative sono state riscontrate solo in SEL e LPZ. Il turnover di NA in SEL era alto nel proestro e basso in tutti gli altri giorni del ciclo estrale di 4 giorni, mentre nell'estro di 5 giorni ciclo il turnover di NA in SEL ha iniziato ad aumentare già dal secondo giorno di diestrous per raggiungere un picco nel pomeriggio di proestrous. In quel periodo anche le concentrazioni di NA in SEL erano aumentate, sebbene significativamente solo nei ratti ciclici di 5 giorni. Il fatturato DA in LPZ è stato basso su proestrous e alto tutti gli altri giorni s in entrambi i ratti ciclici di 4 e 5 giorni. A parte l'eminenza mediana, variazioni cicliche nel metabolismo delle catecolamine sono state riscontrate solo nell'area preottica mediale, dove il turnover di NA era alto su proestro e basso su estro-diestoso. I risultati attuali forniscono ulteriore supporto per l'esistenza di un meccanismo facilitatore noradrenergico e dopaminergico inibitorio nel controllo del rilascio di gonadotropine. Inoltre, si suggerisce che un'accelerazione del turnover reticolo-ipotalamico di NA preceda il ritardo del turnover tubero-infundibolare di DA riscontrato su proestrous e che l'intervallo di tempo tra l'attivazione iniziale di NA e la successiva inattivazione di DA sia più lungo nel 5- che nel 4- ciclo estrale diurno.
Trasporto di GABA e glicina nel SNC di rana: assorbimento ad alta affinità e rilascio di potassio evocato in vitro.Fette di cervello di rana, tetto ottico, midollo e il midollo spinale accumula rapidamente [3H]GABA e [3H]glicina dal mezzo circostante in modo che dopo 10 minuti tessuto:medio si possono ottenere rapporti fino a 113 per GABA (tetto ottico) e 18,5 per glicina (midollo). due distinti sistemi di assorbimento saturabile per ciascun amminoacido nelle 4 aree del SNC I sistemi ad alta affinità (Km apparente: 9-22 muM per GABA; 5-35 muM per glicina) richiedevano ioni sodio nel mezzo ed erano relativamente specifici del substrato. il rilascio di [3H]GABA e [3H]glicina, ma non di L-[3H]leucina, è stato evocato dall'esposizione a un mezzo contenente ioni potassio in una concentrazione di 40 mM. Il processo di rilascio era calcio-dipendente. questi risultati per quanto riguarda i ruoli di GABA e glicina come neurotrasmettitori sia spinali che sopraspinali vengono discussi i livelli del neuroasse degli anfibi.
Resistenza alla tetraciclina in pneumococchi e streptococchi di gruppo A. Rapporto di un gruppo di studio ad hoc sulla resistenza agli antibiotici.In un'indagine nazionale nella primavera del 1975 nella prevalenza della resistenza alla tetraciclina tra pneumococchi e streptococchi di gruppo A isolati, 21 laboratori hanno riportato la sensibilità degli isolati e i dettagli dei pazienti. Complessivamente il 13% dei 1528 pneumococchi isolati era resistente alla tetraciclina, ma c'erano ampie variazioni geografiche. il 6% dei 1515 streptococchi isolati era resistente, e anche in questo caso vi era una notevole variabilità geografica. Un alto livello di resistenza in un organismo non era correlato con un alto livello nell'altro. Per entrambi gli organismi la resistenza era più comune tra i pazienti ricoverati e quelli di età compresa tra 50 La tetraciclina probabilmente non dovrebbe essere il farmaco di scelta nei pazienti sensibili alla penicillina con infezioni da streptococco di gruppo A, ma le variazioni geografiche erano così ampie che decisio ns sul trattamento sono fatti meglio sulla base dei dati di un'indagine locale.
Atenololo, metildopa e clortalidone nell'ipertensione moderata.Il trattamento combinato con basse dosi di diversi farmaci è ampiamente utilizzato per l'ipertensione moderata. Gli effetti dell'atenololo e metildopa a due livelli di dose e in combinazione alle dosi più basse sono stati studiati in pazienti con ipertensione moderata in trattamento continuo con ipertensione moderata in trattamento continuo con clortalidone La riduzione media della pressione sanguigna in piedi ottenuta con atenololo 150 e 300 mg/die è stata di circa 27/17 mm Hg e con metildopa 750 e 1500 mg/die circa 28/14 mm Hg. Il trattamento combinato con atenololo 150 mg/die e metildopa 750 mg/die per quattro settimane ha determinato una riduzione di 38/25 mm Hg. No è stata osservata una differenza tra le due dosi di metildopa. La dose più bassa di atenololo era migliore della dose più bassa di metildopa nel ridurre la pressione diastolica sdraiata e in piedi. Questi risultati mostrano che nei pazienti in trattamento continuo con c hlorthalidone l'aggiunta del solo atenololo o della sola metildopa o di atenololo e metildopa in combinazione è efficace nel trattamento dell'ipertensione moderata.
Esperienza con donatori materni incompatibili per il trapianto di midollo osseo.Il trapianto di midollo nell'anemia aplastica e nella leucemia è stato generalmente limitato ai fratelli che sono stati istocompatibili in entrambi i casi i loci sierologici (A e B) e determinati dai linfociti (D o MLC) del sistema HLA Abbiamo studiato tre pazienti di sesso maschile, due con anemia aplastica e uno con leucemia mieloide acuta, che hanno ricevuto trapianti dalle loro madri istoincompatibili. e riceventi hanno mostrato vari gradi di stimolazione. Un attecchimento definitivo si è verificato in un paziente e un attecchimento transitorio in un altro. L'attecchimento nel terzo paziente non può essere valutato. Nel paziente con attecchimento prolungato, c'era evidenza clinica di grave malattia del trapianto contro l'ospite (GVHD) tuttavia, ciò non è stato suffragato da risultati istologici. Questo studio preliminare suggerisce che l'incompatibilità MLC può essere più un indicatore del rischio di GVHD che del rigetto del midollo osseo. Se è possibile ottenere un controllo più efficace della GVHD, il trapianto di midollo tra individui reattivi alla MLC potrebbe diventare fattibile.
G-6-PD Long Prairie: un nuovo mutante della glucosio-6-fosfato deidrogenasi che mostra una normale sensibilità all'inibizione del NADPH e accompagnato da anemia emolitica non sferocitica.Le proprietà enzimatiche di una nuova variante di glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G-6-PD) (G-6-PD Long Prairie) sono state studiate in un paziente bianco con emolisi cronica non sferocitica. È stato riscontrato che i globuli rossi hanno 2,3 %-7,7% di attività enzimatica normale. L'enzima mutante ha mostrato una marcata instabilità termica, un pH ottimale aumentato, un Km moderatamente diminuito per G-6-P e un maggiore utilizzo di 2-desossiglucosio-6-fosfato e deammino NADP. Il Km per NADP e Ki per NADPH erano entrambi normali. G-6-PD Long Prairie è un'interessante nuova variante di G-6-PD che dimostra che l'emolisi cronica può essere associata a un'attività del G-6-PD moderatamente ridotta nonostante la normale sensibilità all'inibizione da parte del NADPH Sebbene sia stato ipotizzato che una maggiore sensibilità all'inibizione da parte del NADPH riduca l'intracel lular attività enzimatica, con conseguente maggiore suscettibilità all'emolisi in alcune varianti di G-6-PD con attività enzimatica solo moderatamente ridotta, esiste un meccanismo alternativo di emolisi, possibilmente termolabilità enzimatica, in G-6-PD Long Prairie.
Concentrati di complesso protrombinico: materiali potenzialmente trombogenici e indizi sul meccanismo della trombosi in vivo.I fattori che influenzano l'attività coagulante di due diversi concentrati di complessi protrombinici hanno stato studiato utilizzando un saggio in vitro sensibile sviluppato in questo laboratorio. Un concentrato conteneva notevoli quantità di materiale potenzialmente trombogeno, mentre l'altro, che è stato deliberatamente fortificato con antitrombina III ed eparina durante la produzione, è stato giudicato relativamente non trombogeno. il concentrato trombogenico è stato parzialmente identificato ed era dovuto in gran parte alla presenza dei fattori di coagulazione IXa e Xa. Nessuno dei due concentrati conteneva trombina rilevabile. Tuttavia, dopo l'incubazione con calcio o varie poliammine, sono comparse grandi quantità di materiale coagulante aggiuntivo, inclusa la trombina. e l'antitrombina III non solo neutralizzava i materiali trombogenici presenti in il concentrato trombogenico, ma ha anche inibito la generazione de novo di enzimi coagulanti durante l'incubazione con calcio. Viene discussa l'implicazione di questi studi sulla preparazione dei concentrati del complesso protrombinico e sulla suscettibilità dell'ospite alla trombosi durante l'uso clinico di questi concentrati.
Purificazione e proprietà delle fosfatasi acide isolate da Owenia fusiformis.La fosfatasi acida (EC. 3.1.3.2) è stata separata mediante setacciamento molecolare in due frazioni e queste frazioni sono state purificate mediante cromatografia a scambio ionico Sephadex. Uno degli enzimi purificati (frazione II) è stato purificato 830 volte e ha avuto un'attività specifica di 34 unità internazionali per mg di proteina a 37 gradi C e a un pH di 4,9. il valore con p-nitrofenilfosfato come substrato era 9,10(-4) M e gli studi cinetici non hanno mostrato possibilità di controllo mediante transizioni allosteriche e nessun effetto dei metaboliti (aminoacidi) sulla velocità di reazione.
[Natura bifasica del trasporto dipendente dalla luce di C14-alanina nelle cellule di Halobacterium holobium].Carattere bifasico del cambiamento di pH fotoindotto in H. halobium Viene mostrata la sospensione delle cellule R1: nel primo periodo di illuminazione il pH aumenta e solo successivamente diminuisce. L'aumento del pH è accompagnato dall'introduzione di C14-alanina nelle cellule, mentre la diminuzione per la sua resa fino al livello inferiore al "buio " uno (fotoeffetto "negativo"). Il carattere bifasico dei processi di trasporto sembra essere spiegato dal carattere reversibile della pompa protonica della batteriodopsina dipendente dalla luce nelle cellule di H. halobium R1.
Inibizione della sintesi del colesterolo in vitro da parte degli acidi grassi.L'effetto inibitorio di 44 specie di acidi grassi sulla sintesi del colesterolo è stato esaminato con un enzima del fegato di ratto Nel caso degli acidi grassi saturi, l'attività inibitoria aumenta con la lunghezza della catena fino a un massimo a 11-14 atomi di carbonio, dopodiché l'attività diminuisce rapidamente. L'inibizione aumenta con il grado di insaturazione degli acidi grassi. Introduzione di un gruppo idrossi a la posizione alfa degli acidi grassi ha abolito l'inibizione, mentre l'inibizione è stata potenziata dalla presenza di un gruppo ossidrile situato in una posizione intermedia della catena. Acidi grassi a catena ramificata aventi un gruppo metilico al terminale hanno mostrato un'attività molto più elevata rispetto ai corrispondenti acidi grassi saturi a catena lineare con lo stesso numero di atomi di carbonio. Per quanto riguarda il meccanismo di inibizione, è stato scoperto che il tridecanoato inibisce l'acetoacetil-CoA tiolasi in modo specifico senza influenzare l'ot le sue fasi di reazione nella via sintetica del colesterolo. Gli acidi grassi altamente insaturi, arachidonato e linoleato, erano inibitori specifici della 3-idrossi-3-metil-glutaril-CoA sintasi. D'altra parte, il ricinoleato (idrossiacido) e il fitanato (acido a catena ramificata) hanno diminuito la conversione del mevalonato in steroli inibendo uno o più passaggi tra squalene e lanosterolo.
Lipoproteina a densità molto bassa. Dissociazione dell'apolipoproteina C durante la lipolisi indotta dalla lipoproteina lipasi.Il destino dell'apo C nella lipoproteina a densità molto bassa del plasma di ratto (VLDL) ) durante la lipolisi è stato studiato utilizzando VLDL marcato specificamente con apo C marcato con 125I e lipasi lipoproteica del latte bovino purificato. Le incubazioni sono state eseguite in vitro e includevano sistemi contenenti siero e sistemi contenenti albumina. La generazione di acidi grassi liberi è proseguita con il tempo di incubazione nel due sistemi. Tuttavia, è stato potenziato di 1,5-2 volte dalla presenza di siero. L'apo C marcato con 125I equilibrava tra lipoproteine a densità molto bassa e alta (HDL) in entrambi i sistemi anche quando l'enzima non era presente nel mezzo di incubazione, o quando l'incubazione è stata effettuata a 0 gradi C. All'inizio della lipolisi, più apo C marcato con 125I è stato trasferito a HDL e il trasferimento era proporzionale all'entità del rilascio di acidi grassi liberi. Anche l'apo C marcato con 125I era pro rimosso progressivamente da VLDL nel sistema contenente albumina, sebbene nel terreno non fosse presente alcun accettore noto di lipoproteine per l'apo C. L'apo C marcato con 125I è stato recuperato prevalentemente con la frazione media di d maggiore di 1,21 g/ml (60--70%), e in misura minore con quella di d= 1.019--1,21 g/ml. Tuttavia, la relazione tra lipolisi (misurata come rilascio di acidi grassi liberi) e rimozione di apo C marcata con 125I da VLDL era indistinguibile nel sistema contenente l'albumina e nel sistema contenente il siero. Sulla base di queste osservazioni, si ipotizza che la rimozione dell'apo C durante la lipolisi delle VLDL rifletta la natura delle particelle VLDL parzialmente degradate, ed è indipendente dalla presenza di un accettore di lipoproteine all'apo C.
Studi sul metabolismo del beta-carotene e degli apo-beta-carotenoidi nei ratti e nei polli.(1)Le capacità relative delle varie frazioni di fegato di ratto e pollo per ossidare e ridurre la retina e l'8\'-e 12\'-apo-beta-carotenale sono stati studiati ed è stato dimostrato che, mentre il retinale è ossidato esclusivamente dalla frazione solubile, gli apocaroteni sono per lo più ossidati da le frazioni particellari dell'omogenato. (2) L'aggiunta di NAD+ o NADP+ ha attivato marcatamente l'ossidazione degli apocarotenali, ma non del retinale da parte delle frazioni particolate. (3) Quantità considerevoli di retina e 8\'-, 10\'- e 12\'-apo-beta-carotenale sono stati isolati dall'intestino di polli alimentati con beta-carotene e questi apocarotenoidi sono stati definitivamente identificati (4) Quantità significative di 8\'-, 10\'- e 12\'-apo-beta -acidi carotenoici sono stati isolati dall'intestino di ratti trattati con 8\'-apo-beta-carotenale e questi apocarotenoici anche gli acidi sono stati definitivamente identificati. (5) Alla luce di queste osservazioni si suggerisce che durante la conversione in vitamina A, la molecola di beta-carotene sia attaccata contemporaneamente dalla diossigenasi a diversi doppi legami, l'attacco primario essendo al doppio legame centrale e uno schema sperimentale per il viene proposto un meccanismo di conversione.
Studio cinetico dell'interazione lipossigenasi-acido idroperossilinoleico.Interazione della lipossigenasi con l'acido idroperossilinoleico, che è il prodotto di questa reazione enzimatica e agisce come attivatore , è stato studiato cineticamente con il metodo a flusso interrotto di fluorescenza. Le caratteristiche cinetiche sono coerenti con un meccanismo a due fasi che coinvolge un processo di associazione bimolecolare veloce seguito da un processo unimolecolare lento. La costante di dissociazione del processo bimolecolare era 3 (+/-2 ) - 10(-5) M, che era sensibilmente dipendente dalla temperatura e dal pH, in contrasto con la costante di velocità di quest'ultimo processo. L'entalpia e l'entropia di attivazione per il processo unimolecolare sono state stimate in 21 kcal/mol e 20 eu, rispettivamente. La dipendenza dal pH della costante di velocità indicava che un gruppo ionizzabile con pK di circa 8,6 è coinvolto nell'interazione. L'acido linoleico, il substrato della lipossigenasi, e l'acido oleico hanno inibito l'interazione tra l ipossigenasi e l'acido idroperossilinoleico riducendo la velocità. Una serie di alcoli monovalenti saturi ha anche ridotto la velocità dell'interazione all'aumentare della lunghezza della catena degli alcoli, sebbene il metanolo e l'etanolo abbiano aumentato la velocità dell'interazione.
Purificazione e caratterizzazione della colesterolo esterasi dal pancreas suino.Una proteina che catalizza l'idrolisi degli esteri del colesterolo e del p-nitrofenil acetato è stata purificata 200 volte dal pancreas suino. L'enzima è omogeneo come giudicato dall'elettroforesi su gel di poliacrilammide e presenta un peso molecolare di 80.000 come determinato dall'elettroforesi del sodio dodecil solfato e dalla filtrazione su gel. L'attività verso il p-nitrofenilacetato mostra un ampio pH ottimale ed è influenzata da un gruppo con un pKa di 5,5--6,0. L'enzima è completamente inibito dal diisopropilfluorofosfato a concentrazioni fino a 10(-5) M, suggerendo che si tratta di una serina esterasi. È stata osservata un'inibizione parziale con p-cloromercuribenzoato.
Reazioni della neurospora crassa nitrato reduttasi con analoghi del NAD(P).L'assimilazione NADPH-nitrato reduttasi (NADPH:nitrato ossidoriduttasi, EC 1.6. 6.3) da Neurospora crassa è inibito in modo competitivo dal 3-aminopiridina adenina dinucleotide (AAD) e dal 3-aminopiridina adenina dinucleotide fosfato (AADP) che sono analoghi strutturali rispettivamente di NAD e NADP. Il gruppo amminico dell'anello piridinico di AAD(P) può reagire con l'acido nitroso per produrre il derivato del diazonio che può legarsi covalentemente al sito NAD(P). Come risultato dell'attaccamento covalente, l'AAD(P) diazotato provoca l'inattivazione irreversibile tempo-dipendente della nitrato reduttasi. Tuttavia, solo la NADPH- le attività dipendenti della nitrato reduttasi, cioè l'intera NADPH-nitrato reduttasi e le attività NADPH-citocromo c reduttasi, vengono inattivate Le attività ridotte del metil viologeno e FAD-nitrato reduttasi ridotte che non utilizzano NADPH non sono inibite. zione da AADP diazotato è impedita da 1 mM NADP. L'inclusione di 1 muM FAD può anche prevenire l'inattivazione, ma l'effetto FAD differisce dalla protezione NADP in quanto anche dopo la rimozione della FAD esogena mediante dialisi estensiva o cromatografia di filtrazione Sephadex G-25, l'enzima è ancora protetto contro l'inattivazione. La forma protetta di nitrato reduttasi generata dal FAD potrebbe essere nuovamente inattivata se l'enzima fosse trattato con NADPH, dializzato per rimuovere il NADPH e quindi esposto a AADP diazotato. Quando NADP è stato sostituito da NADPH in questo esperimento, l'enzima è rimasto nello stato protetto da FAD. Gli spettri di differenza della nitrato reduttasi inattivato hanno dimostrato la presenza di AADP legato e la titolazione dei gruppi sulfidrilici dell'enzima inattivato ha rivelato che si era verificata una perdita di sulfidrili accessibili. L'ipotesi generata da questi esperimenti è che l'AADP diazotato si leghi al sito NADPH sulla nitrato reduttasi e reagisca con un sulfidrile funzionale nel sito. Il FAD protegge l'enzima dall'inattivazione modificando il sulfidrile. Poiché NADPH inverte questa protezione, sembra che le modifiche che si verificano siano reazioni di ossidoriduzione. Sulla base di questi risultati, si ipotizza che il flusso di elettroni fisiologico nella nitrato reduttasi provenga da NADPH tramite sulfidrili a FAD e quindi il resto dei trasportatori di elettroni come segue: NADPH porta a -SH porta a FAD porta al citocromo b-557 porta a Mo porta a NO-3.
Attività transidrogenasica nel batterio marino Beneckea natriegens.È stato dimostrato che il batterio marino Beneckea natriegens, che è stato precedentemente segnalato per non formare transidrogenasi per sintetizzare una transidrogenasi solubile energeticamente indipendente (NADPH:NADP+ ossidoreduttasi, EC 1.6.1.1), sebbene non sia stata rilevata alcuna attività legata all'energia. La transidrogenasi è indotta al massimo nelle cellule in fase stazionaria e la sua formazione è repressa per il 70-90% sollevando il livello medio di fosfato da 0,33 a 3,3 mM. L'enzima è inibito dall'arsenato, dall'orto e pirofosfato inorganico e da una gamma di composti organici contenenti fosfato, tra cui 2\'-AMP, che è un attivatore di diverse transidrogenasi batteriche.
Influenza degli 8-sostituenti sull'ossidazione dell'ipoxantina e della 6-tiossopurina da parte della xantina ossidasi del latte bovino.1. L'influenza degli 8-sostituenti è stata studiato sulla velocità di ossidazione dell'ipoxantina e della 6-tiossopurina da parte della xantina ossidasi del latte bovino (EC 1.2.3.2) 2. Un gruppo 8-metilico non altera materialmente la velocità di ossidazione dell'ipoxantina, ma un sostituente 8-fenile lo riduce Ciò è attribuito all'inibizione del processo di tautomerizzazione, responsabile dell'attivazione del substrato, prima dell'ossidazione 3. Al contrario, il gruppo 8-fenile in 3-metil-8-fenilipoxantina aumenta la velocità, presumibilmente legandosi a un sito idrofobo vicino al centro enzimatico. 4. Un gruppo 8-fenile in 6-tiossopurina aumenta notevolmente la velocità di ossidazione enzimatica. Probabilmente il sostituente aromatico devia la formazione di anioni verso l'anello imidazolico. Al contrario, la ionizzazione dell'8-metil-6-tiossopurina coinvolge il porzione pirimidinica, rendendo così l'attacco enzimatico alla posizione 2 più difficile.
Purificazione e proprietà dell'aldolasi del muscolo cardiaco di coniglio.Fruttosio difosfato aldolasi (D-fruttosio-1,6-bifosfato D-gliceraldeide-3-fosfato liasi, EC 4.1.2.13) da cuore di coniglio è stata purificata e ottenuta in forma cristallina. I preparati sono omogenei sulla base dell'elettroforesi su gel su disco e dell'ultracentrifugazione. Le proprietà catalitiche e molecolari indicano che si tratta di aldolasi A. È stato fatto un confronto tra aldolasi cardiaca di coniglio e l'enzima muscolare di coniglio. Il coefficiente di sedimentazione, l'energia di attivazione e la costante di Michaelis per Fru-1,6-P2 sono risultati identici ai valori ottenuti per l'enzima muscolare. Come nel caso dell'enzima muscolare, è stato scoperto che l'aldolasi cardiaca ha un ampio pH ottimale, una notevole stabilità in un ampio intervallo di pH e la capacità di formare un intermedio di base di Schiff con diidrossiacetone fosfato dopo riduzione con boroidruro. La scissione dei legami metionilici con CNBr produce lo stesso e modello ottenuto con l'enzima muscolare.
Un'attività isomerizzante cis-trans di Escherichia coli. Isomerizzazione da 2-(2-furyl)-3-cis-(5-nitro-2-furyl) acrilammide (furylfuramide ) al suo isomero trans.La frazione enzimatica solubile derivata dalle cellule di Escherichia coli K-12 JE2100 mostra, oltre alle attività di riduttasi dipendenti da Nadh e NADPH, isomerizzazione cis-trans dipendente da NADH attività verso la 2-(2-furil-3-(5-nitro-2-furil)acrilammide che porta a un cambiamento specifico nella configurazione geometrica del gruppo vinilico in posizione 2 da cis a trans ma non nella direzione inversa. L'azione isomerizzante dei batteri alla furilfuramide era insensibile al dicumarolo e non richiedeva il glutatione per la piena attività. La frazione enzimatica particellare derivata dalle cellule JE2100, sebbene mostrasse una scarsa attività reduttasica verso la furilfuramide in presenza di NADH o NADPH, ha rivelato un'attività isomerizzante in la presenza di NADH.
Ossidazione di derivati metilici di pteridin-4-one, lumazina e relative pteridine da parte della xantina ossidasi del latte bovino.1. Pteridin-4-ones, metilate all'azoto o al carbonio, le lumazine N-metilate e le relative oxopteridine sono state studiate come substrati di una xantina ossidasi del latte bovino altamente purificata (xantina: ossigeno ossidoreduttasi, EC 1.2.3.2) 2. L'enzima può ossidare ad alte velocità sia a vuoto che anionico substrati La variazione dell'attività enzimatica con il pH è principalmente dovuta ai cambiamenti dipendenti dal pH nel centro enzimatico attivo 3. Le xantina ossidasi del latte a diversi stadi di purificazione convertono la pteridin-4-one nel 4,7-dione (composto 13 in questo articolo). 4. La metilazione in C-6 nella parte pirazina aumenta l'attacco enzimatico in C-2 nell'anello pirimidinico. La N-metilazione può aumentare o ridurre i tassi di ossidazione. 5. Per l'ossidazione in C-2, la forma più favorevole del substrato ha un doppio legame in C(2) = N(3). L'attacco a C-7 è fortemente potenziato in strutture recanti un doppio legame in C(6) = C(7). 6. In generale, le pteridine reagiscono con la xantina ossidasi come molecole non idratate. Tuttavia, l'ossidazione dell'8-metillumazina in C-7 può avvenire per deidrogenazione del gruppo 7-CHOH della molecola covalentemente idratata.
Fosfodiesterasi II intestinale di ratto. Proprietà dell'enzima altamente purificato e sua inattivazione da parte dell'acido iodoacetico.Preparazione altamente purificata di fosfodiesterasi II intestinale di ratto (oligonucleato 3\'-nucleotidoidrolasi, EC 3.1.4.18) è stato studiato utilizzando un substrato sintetico, timidina 3\'(2,4-dinitrofenil) fosfato. L'enzima era più attivo tra pH 6.1 e pH 6.7 ed era inibito da Cu2+ e Zn2+ ma non è influenzato da EDTA, Mg2+, Co2+ e Ni2+ La velocità di reazione è diminuita ad alti livelli di enzima a causa dell'inibizione competitiva della deossitimidina 3\'-fosfato, un prodotto di reazione, che ha mostrato un Ki di 2-10(-5) M Il peso molecolare dell'enzima mediante filtrazione su gel era 150 000-170 000. Negli esperimenti di elettrofocalizzazione sono stati riscontrati più picchi di attività a pH 3,4, 4,2-4,5 e 7,2. L'elettroforesi su gel di poliacrilammide della fosfodiesterasi II appena purificata ha mostrato fino a 10 proteine bande nei gel. Se i preparativi fossero conservati a 4 gradi C per qualche tempo sono apparse solo una o due bande. L'indagine sulla reazione della fosfodiesterasi II intestinale di ratto con un numero di possibili substrati della fosfodiesterasi ha indicato che l'enzima richiedeva un residuo nucleosidico 3\'-fosforile per l'inizio dell'idrolisi. Così composti come NAD, ATP, bis-(p-nitrofenil)fosfato, timidina 5\'-(p-nitrofenil)fosfato, glicerilfosforilcolina, guanilil-(2\' porta a 5\')-adenosina e 3\', L'AMP 5\'-ciclico che contiene legami fosfodiestere, tuttavia, non era substrato per l'enzima. L'enzima è stato inibito in modo reversibile dal p-cloromercuribenzoato e dal p-cloromercurifenilsolfonato e inattivato in modo irreversibile dall'acido iodoacetico. L'attività della fosfodiesterasi II è stata ridotta al 50% mediante incubazione con iodoacetato 2.0-10(-3)--5,0-10(-3) M per 20-30 min a 24 gradi C a pH 5,0--6,1. La iodoacetamide non ha avuto effetto. Il grado di inattivazione da parte dello iodoacetato era ridotto dalla presenza di un substrato per l'enzima o, più efficacemente, dalla deossitimidina 3\'-fosfato, un inibitore competitivo. Si conclude che l'acido iodoacetico alchila un residuo essenziale al centro attivo dell'enzima.
Cambiamenti conformazionali indotti da ioni metallici nella fosfatasi alcalina di Escherichia coli.Gli spettri di differenza ultravioletti sono prodotti dal legame di ioni metallici bivalenti ad alcali privi di metallo fosfatasi (EC 3.1.3.1) L'interazione dell'apoproteina con Zn2+, Mn2+, Co2+ e Cd2+, che inducono il legame stretto di uno ione fosfato per dimero, danno variazioni degli spettri ultravioletti nettamente differenti da Ni2+ e Hg2+ che non inducono il legame fosfato Le titolazioni spettrofotometriche a pH alcalino di vari metallo-enzimi rivelano un minor numero di tirosine ionizzabili e una maggiore stabilità alla denaturazione alcalina negli enzimi Zn2+- e Mn2+ rispetto a Ni2+-, Hg2+- e apoenzimi. gli enzimi hanno spettri CD nella regione delle transizioni aromatiche che sono diversi dagli spettri CD degli apoenzimi Ni2+-, Hg2+- Le modificazioni delle arginine con il 2,3-butanedione mostrano che un numero minore di residui di arginina è mod ficato nell'enzima Zn2+ che nell'enzima Hg2+. I dati presentati indicano che la fosfatasi alcalina da Escherichia coli deve avere una conformazione ben definita per legare il fosfato. Alcuni ioni metallici (es. Zn2+, Co2+, Mn2+ e Cd2+), quando interagiscono con l'apoenzima, alterano la conformazione della molecola proteica in modo tale che sia in grado di interagire con le molecole substrato, mentre altri ioni metallici (es. Ni2+ e Hg2+ ) non sono in grado di indurre l'appropriato cambiamento conformazionale dell'apoenzima. Questi risultati suggeriscono un'importante funzione strutturale dei primi due ioni metallici strettamente legati nell'enzima.
Purificazione parziale e proprietà di una proteina chinasi ciclica 3\',5\'-AMP-indipendente dal fegato di ratto.1. Un 3 ciclico La proteina chinasi \',5\'-AMP-indipendente (ATP: proteina fosfotransferasi, EC 2.7.1.37) dal citosol di fegato di ratto è stata parzialmente purificata e caratterizzata. Purificazione mediante precipitazione di (NH4)2SO4, DEAE-cellulosa, Bio Gel A-0.5 m e la cromatografia con fosfato di cellulosa hanno aumentato l'attività specifica di circa 700 volte 2. Un substrato proteico endogeno era strettamente associato alla protein chinasi e non era separabile da questo enzima fino allo stadio di fosfato di cellulosa Dopo la fosforilazione, la cromatografia con Bio Gel A- 0,5 m separavano parzialmente questa fosfoproteina endogena dall'attività enzimatica, questa dissociazione non ha avuto alcun effetto apparente sull'attività chinasica con caseina o fosvitina come substrati, né sul peso molecolare apparente dell'enzima (circa 158.000). 3. Questa proteina chinasi con caseina , fosvitina o en substrato dogeno era totalmente insensibile ai reagenti tiolici, p-idrossimercuribenzoato, 5,5\'-ditiobis(acido 2-nitrobenzoico), iodoacetammide e N-etilmaleimmide. L'enzima non è stato inoltre influenzato dal ciclico 3\',5\'-AMP, inibitore della proteina chinasi termostabile e dalla subunità regolatoria di una proteina chinasi ciclica 3\',5\'-AMP-dipendente.
Effetti delle strutture stereochimiche della tetraidrobiopterina sulla tirosina idrossilasi.1. Quattro isomeri stereochimici della tetraidrobiopterina, ovvero 6-L-eritro-, 6- D-eritro-, 6-L-treo- o 6-D-treo-1,2-diidrossipropiltetraidropterina, sono stati sintetizzati e utilizzati come cofattori per la tirosina idrossilasi (EC 1.14.18. -) purificata dalla frazione solubile di bovino Gli isomeri L-eritro- (il presunto cofattore naturale) e D-treo hanno mostrato una sorprendente somiglianza nelle loro attività di cofattore per la tirosina idrossilasi; anche i restanti due isomeri tetraidrobiopterine, D-eritro e L-treo, avevano isomeri molto simili caratteristiche del cofattore 2. I valori Km degli isomeri L-eritro e D-treo come cofattore sono risultati dipendenti dalle loro concentrazioni Quando le loro concentrazioni erano inferiori a 100 muM, i valori Km degli isomeri L-eritro e D-treo erano piuttosto bassi (circa 20 muM), tuttavia i valori di Km erano nettamente superiori (circa 150 muM) a concentrazioni superiori a 100 muM. Lo stesso comportamento cinetico è stato osservato anche con la tetraidrobiopterina preparata da una fonte naturale (rana toro). Al contrario, il valore Km dell'isomero L-treo o D-eritro è risultato essere indipendente dalla concentrazione ed è rimasto costante per tutta la concentrazione esaminata. 3. I valori di Km della tirosina non hanno mostrato molta differenza (da 20 muM a 30 muM) rispetto alla struttura dei quattro cofattori isomeri. Ad alte concentrazioni la tirosina ha inibito la reazione enzimatica con uno qualsiasi dei quattro cofattori della tetraidrobiopterina. 4. L'ossigeno ad alte concentrazioni era anche inibitorio con uno qualsiasi dei quattro isomeri stereochimici come cofattore. I valori di Km approssimativi per l'ossigeno con le tetraidrobiopterine come cofattore erano 1-5%. 5. Contrariamente ai quattro isomeri della tetraidrobiopterina, quando la 6-metiltetraidropterina o la 6,7-dimetiltetraidropterina sono state usate come cofattore tirosina o ossigeno non hanno inibito la reazione enzimatica ad alte concentrazioni, e i valori di Km verso il cofattore pterina, tirosina e l'ossigeno era significativamente più alto dei valori di Km con le tetraidrobiopterine come cofattore.
Suscettibilità differenziale, struttura-dipendente di poli(A) e RNA alla ribonucleasi pancreatica monomerica e dimerica A.Dimeri reticolati della RNAasi A bovina sono decisamente più efficienti dei monomeri nel degradare l'acido poliadenilico in condizioni di forza ionica e pH, dove il polimero assume una struttura a doppia elica o ordinata a singolo filamento, impilata su basi. L'opposto avviene, cioè, i monomeri di RNAasi A sono decisamente più attivo dei dimeri, quando il poli(A) viene digerito dalle due specie enzimatiche in condizioni in cui la conformazione del polimero è essenzialmente quella di una bobina casuale. Lo stesso schema di eventi si verifica quando l'RNA totale da Escherichia coli o a singolo filamento Gli RNA del batteriofago f2 sus11 vengono utilizzati come substrati in condizioni di forza ionica opposta In presenza di elevate concentrazioni di sale, favorendo la formazione e la stabilità di una struttura secondaria in sequenze autocomplementari di RNA, il ribonucl gli acidi eici vengono degradati a una velocità maggiore dai dimeri rispetto ai monomeri della RNAasi A bovina. Il contrario si verifica in presenza di concentrazioni di sale molto basse, cioè quando gli RNA sono in soluzione presumibilmente come bobine casuali. Queste osservazioni vengono discusse alla luce di un'ipotesi già avanzata per comprendere il meccanismo di degradazione enzimatica delle strutture secondarie dei poliribonucleotidi.
[Radicali addotti idrogeno in timidina e timidina 5\'-monofosfato fotosensibilizzati da proflavina. Protezione da composti solforati (autore\'s trad.)].Ai valori di pH 5 e 9, viene studiata l'influenza di cisteina, cistina, acido 3-mercaptopropionico e S-metilcisteina sull'induzione di radicali addotti H in timidina e timidina 5\'-monofosfato fotosensibilizzato dalla proflavina. I risultati ottenuti indicano tale protezione efficiente è data quando le interazioni elettrostatiche tra i gruppi carichi delle molecole presenti consentono la stretta vicinanza di un tiolo o di un ponte disolfuro e del costituente complesso proflavina - DNA Lo schema proposto per il meccanismo prevede la cattura da parte del protettore di un elettrone o un protone, intermedi indispensabili nella formazione dei radicali addotti H.
Trasporto di protoni mediante vescicole di membrana gastrica.Una frazione di membrana altamente purificata è stata derivata dalla mucosa gastrica di maiale mediante una combinazione di centrifugazione differenziale e in gradiente di densità e libera elettroforesi a flusso. Questa frazione finale è stata arricchita di 35 volte rispetto all'ATPasi insensibile all'ouabaina attivata da cationi. È stato dimostrato che l'anticorpo contro questa frazione è legato alla superficie luminale delle ghiandole gastriche. L'aggiunta di ATP a questa frazione o al gradiente di densità frazione ha provocato l'assorbimento di H + in uno spazio osmoticamente sensibile. Il Km apparente per l'ATP era 1,7-10 (-4) M in assenza di un gradiente K + simile a quello trovato per l'attività dell'ATPasi. La reazione è specifica per l'ATP e richiede cationi in la sequenza K+ maggiore di Rb+ maggiore di Cs+ maggiore di Na+ maggiore di Li+ e inibita da inibitori dell'ATPasi come N,N\'-dicilcloesil-carbodiimmide. Il massimo assorbimento di H+ si verifica con un gradiente esterno di K+ ma il minimo appare t KA si trova in assenza di un gradiente K+. Il pH ottimale per l'assorbimento di H+ è compreso tra 5,8 e 6,2 che corrisponde all'intervallo di pH per la fosforilazione dell'enzima, ma è considerevolmente inferiore al pH massimo della defosforilazione dipendente dal K+. In presenza di un gradiente K+ interno, i protonofori come la tetraclorsalicilanilide aboliscono solo parzialmente il gradiente H+ ma la valinomicina dissipa il 75% del gradiente e la nigericina abolisce il gradiente. Le vescicole hanno quindi una conduttanza K+ bassa ma una conduttanza H+ misurabile, quindi un gradiente K+ può produrre un gradiente H+ in presenza di valinomicina. L'assorbimento e la fuoriuscita spontanea di H+ sono sensibili alla temperatura con una temperatura di transizione simile. L'irradiazione ultravioletta inattiva l'ATPasi e il trasporto protonico alla stessa velocità, circa il doppio della velocità di inattivazione della p-nitrofenilfosfatasi. Si conclude che l'assorbimento di H+ da parte di queste vescicole è probabilmente dovuto a una (H+ + K+)-ATPasi ed è probabilmente non elettrogenico.
Effetto della temperatura e della protonazione sulla conformazione della 2\'-o-metiladenosina. Correlazione dei parametri conformazionali nei nucleosidi purinici.Studi di risonanza magnetica protonica della 2\'-o-metiladenosina in 2H2O sono state effettuate a temperatura e p2H variabili. Gli shift chimici e le costanti di accoppiamento HH sono discusse in termini di conformazione molecolare. Il confronto dei dati con quelli dell'adenosina rivela che 2\'- La O-metilazione ha poca influenza sulla conformazione. A p2H neutro dove la base adenina non è protonata, le molecole favoriscono una conformazione 2\' endo, gauche-gauche. La protonazione della base in posizione N(1) porta ad una diminuzione nel bias 2\' endo, gauche-gauche. I dati per 2\'-O-metiladenosina e adenosina, così come per diversi altri derivati purinici, rivelano la presenza di una correlazione tra il pucker di zucchero e il C(5\ ')-C(4\') distribuzione del conformero che è la inverso della correlazione precedentemente riportata per i derivati pirimidinici.
Ruolo della dissociazione proteica nel trasporto di aminoacidi acidi da parte della cellula tumorale dell'ascite di Ehrlich.Il profilo del pH per l'assorbimento dell'acido L-glutammico dalla cellula tumorale dell'ascite di Ehrlich nasce in gran parte come somma del declino con la caduta del pH di un assorbimento lento, Na+-dipendente da parte del Sistema A, e un aumento dell'assorbimento da parte del Sistema Na+-indipendente L. Quest'ultimo massimizza a circa pH 4,5, dopo circa la curva di titolazione del gruppo carbossilico distale. Questo spostamento nella via di assorbimento è stato verificato da (a) una diminuzione della componente Na+-dipendente, (b) una diminuzione quasi corrispondente della componente inibibile dall'acido 2-(metilammino)-isobutirrico, ( c) un componente ascendente inibito dall'acido 2-amminonorbornan-2-carbossilico Altri amminoacidi riconosciuti come principalmente reattivi con i Sistemi A o L hanno prodotto effetti inibitori corrispondenti con alcune cospicue eccezioni: L'acido 2-amminoisobutirrico e persino la glicina diventano substrati migliori del Sistema L quando il pH si abbassa; quindi la loro azione inibitoria sull'assorbimento dell'acido glutammico non viene persa. I risultati di cui sopra sono stati caratterizzati da relazioni generalmente coerenti tra le concentrazioni di semisaturazione degli amminoacidi interagenti rispetto a: il loro stesso assorbimento, la loro inibizione dell'assorbimento, l'uno con l'altro, e la loro stimolazione trans dell'esodo, l'uno con l'altro. Un piccolo componente Na+-dipendente dell'assorbimento trattenuto dall'acido L-glutammico ma non dall'acido D-glutammico a pH 4,5 è inibibile dalla metionina ma né dall'acido 2-(metilammino)-isobutirrico né dall'aminoacido norbornano. Abbiamo identificato provvisoriamente questo componente con System ASC, che trasporta L-glutammina in tutto l'intervallo di pH studiato. Non è stata rilevata alcuna attività di trasporto specifica per gli amminoacidi anionici e l'acido cisteico inequivocabilmente anionico non ha mostrato né un assorbimento mediato significativo né un'inibizione dell'assorbimento dell'aico glutammico o dell'amminoacido norbornano. Gli amminoacidi dicarbossilici assumono la sequenza, acido aspartico minore dell'acido glutammico minore dell'acido alfa-aminoadipico minore della S-carbossimetilcisteina, nella loro velocità di assorbimento mediato, Na+-indipendente a pH basso. Anche la diiodotirosina e due isomeri dissimili della nitrotirosina mostrano un'accelerazione dell'assorbimento poiché il gruppo fenolato sulla catena laterale viene protonato, un risultato che indica che il gruppo acido non deve essere un gruppo carbossilico e non deve assumere una posizione specifica nello spazio per essere accettato al recettore sito L. La presenza del gruppo carbossilico non sconvolge la normale stereospecificità del Sistema L finché non cade sul beta-carbonio in acido aspartico; anche allora è la presenza del gruppo carbonilico e non del gruppo carbossilico intatto né del suo gruppo ossidrile che annulla la stereospecificità, come dimostrato dall'assenza di normale stereospecificità per acido aspartico e asparagina e la sua presenza in acido glutammico, omoserina e glutammina. D'accordo, l'assorbimento dell'acido aspartico è particolarmente sensibile alla presenza di un gruppo alfa-metilico o di altre strutture che modificano l'orientamento della catena laterale.
Potenziale elettrochimico protonico nei mitocondri di fegato di ratto allo stato stazionario.Delta approssimativamente muH è stato determinato nei mitocondri allo stato stazionario misurando l'entità del delta pH sul distribuzione dell'acetato e del deltapsi sulla distribuzione di K+, tetrafenilfosfonio, Ca2+, Sr2+ e Mn2+ (1) La concentrazione di cationi bivalenti nella matrice è stata calcolata dall'assorbimento totale di cationi, dall'aumento del volume della matrice e dal segnale del sestetto ESR di Mn(H2O)L2+. Il [cat2+]i basato sui dati osmotici è circa cinque volte superiore a quello basato sulle misurazioni della VES. Il [cat2+]i basato sull'assorbimento totale è molto più alto di quello basato sui dati osmotici a basso catione/ rapporti proteici (2) In presenza di acetato 10 mM il deltapsi massimo su Ca2+ è circa 130 mV e su Sr2+ è 95 mV. Deltapsi su Mn2+ è 91 o 109 mV, a seconda che [cat2+-a)i sia calcolato da ESR o dati osmotici. Nelle stesse condizioni, deltapH è di circa 60 mV. Quindi delta circa muH sui cationi bivalenti è compreso tra 151 e 190 mV. (3) Deltapsi su K+, in mitocondri trattati con valinomicina con acetato 10 mM o Pi 2 mM, scende da 200 mV, a basso [K+]0 a quasi zero parallelamente all'aumento di [K+]0. DeltapH è 30 mV a [K+]0 basso e circa 42 mV a 600 muM K+. Quindi il delta scende di circa muH da valori inferiori di 22m mV con l'aumento di [K+]0. (4) Il deltapsi massimo sul trifenilmetilfosfonio è 140 mV. (5) Quando si misura contemporaneamente delta circa muH su cationi bivalenti e su K+, i valori su K+ tendono ad avvicinarsi a quelli su Ca2+ mentre quelli su Sr2+ sono inferiori di circa 50 mV. (6) Si conclude che il potenziale energetico mitocondriale allo stato stazionario è equivalente a un delta di circa muH tra 150 e ca. 190mV.
La fluorescenza ritardata da batterioclorofilla in Chromatium vinosum chromatophores.La fluorescenza ritardata da batterioclorofilla in Chromatium vinosum chromatophores è stata studiata a temperatura ambiente e sotto illuminazioni intermittenti. Il decadimento di fluorescenza ritardata era costituita da due componenti: una veloce decadeva con un tempo di dimezzamento di circa 8 ms, una lenta decadeva parallelamente alla riduzione della batterioclorofilla fotoossidata (P+) con un tempo di dimezzamento di 100-200 ms. della fluorescenza ritardata indicava che era stato stabilito un rapido equilibrio tra l'accettore di elettroni primario e l'accettore secondario. In presenza di o-fenantrolina, l'andamento temporale del decadimento della fluorescenza ritardata era identico a quello della riduzione di P+ nel centro di reazione- ricche particelle subcromatoforiche, sebbene non coincidano necessariamente tra loro nei cromatofori "intatti". L'intensità della componente lenta è stato aumentato e il decadimento è stato accelerato a valori di pH basici. I reagenti che dissipano il gradiente protonico attraverso le membrane dei cromatofori, come il carbonilcianuro m-clorofenilidrazone (CCCP) e la nigericina, hanno accelerato il decadimento del componente lento. Questi effetti sono probabilmente il risultato di cambiamenti nel pH interno delle vescicole cromatoforiche. I reagenti che dissipano il potenziale di membrana come CCCP e valinomicina ne hanno diminuito l'intensità.
Attivazione del proenzima della proteasi acida dal plasma seminale umano.La cinetica e l'entità della conversione del proenzima nella proteasi acida attiva (EC 3.4.23. --) del plasma seminale umano dipendeva dal pH acido. Tra pH 2 e 4, la velocità iniziale di attivazione era del primo ordine rispetto al proenzima. Tra pH 4,5 e 5, la velocità si discostava dal primo ordine con un periodo di latenza iniziale che può essere abolito aggiungendo una quantità in eccesso di proteasi acida o pepsina. L'entità dell'attivazione era completa tra pH 2 e 3 ed è diventata incompleta tra pH 4 e 5. Aggiunta della proteasi acida o pepsina non ha alterato l'entità dell'attivazione agli alti valori di pH Secondo il profilo cromatografico su una colonna Sephadex G-75, i prodotti di attivazione (cioè proteasi acida attiva e un peptide di attivazione) ottenuti a pH 3 e quelli ottenuti a pH 4.5 erano identici Il peso molecolare dell'acti il peptide di vazione ottenuto a pH 3 era 6900; la sua composizione amminoacidica è stata analizzata e confrontata con quelle del proenzima e della proteasi acida. È stata osservata una notevole somiglianza tra la composizione amminoacidica della proteasi acida e quella della pepsina umana. In presenza di una quantità eccessiva di emoglobina, la conversione del proenzima si autoattivava e mostrava un periodo di latenza iniziale. L'aggiunta di proteasi acida non ha modificato la velocità di autoattivazione o il periodo di ritardo.
Sulla specificità della catepsina milza bovina B2.La specificità della catepsina milza bovina B2 è stata studiata mediante alcuni oligo- e polipeptidi naturali, cioè glucagone, melittina, catena dell'insulina A e B, bradichinina, angiotensina I e II, ossitocina ACTH, clupeina e salmina. L'enzima è principalmente una carbossipeptidasi che idrolizza i legami peptidici della maggior parte degli amminoacidi comuni alle proteine. Inoltre, la catepsina B2 mostra amidasi e l'attività esterasi senza richiedere un gruppo carbossilico libero. Il pH ottimale principale è compreso tra 4 e 5, in alcuni casi più alto.
Sui siti catalitici e di legame dell'enteropeptidasi suina.Il sito attivo dell'enteropeptidasi suina (EC 3.4.21.9) è stato studiato per caratterizzare meglio sia siti catalitici che di legame. La partecipazione di una serina e di un residuo di istidina al processo catalitico è stata pienamente confermata e i due residui sono stati localizzati sulla catena leggera dell'enzima. Il sito di legame è risultato essere composto da almeno 2 sottositi S1 e S2. Il sito secondario S1 (simile al sito di legame della tripsina) è responsabile delle interazioni con i piccoli substrati della tripsina e la catena laterale della lisina del tripsinogeno, mentre il sito secondario S2 (probabilmente un cluster di lisina) è responsabile delle interazioni con la sequenza polianionica trovata in tutti i tripsinogeni. Il legame del substrato da parte del sottosito S2 ha portato ad un aumento dell'efficienza del sito catalitico che può essere correlato alla nota elevata specificità dell'enteropeptidasi.
Beta-fruttosidasi del lievito esterno. Etichettatura di affinità del sito attivo.Conduritol-B-epossido, un composto strutturalmente correlato ai substrati del lievito esterno la beta-fruttosidasi (beta-D-fruttofuranoside fruttoidrolasi, EC 3.2.1.26), è un inibitore diretto del sito attivo di questo enzima. L'inattivazione è irreversibile e di primo ordine rispetto al tempo e alla concentrazione dell'inibitore. Dai dati cinetici ottenuti, si conclude che una molecola di inibitore reagisce con una molecola dell'enzima causando l'inattivazione. L'inattivazione è impedita dalla presenza di substrati. La dipendenza dal pH dell'inattivazione mostra che due gruppi dissocianti nell'enzima con valori di pKa 3.05 e 6.8 sono coinvolti in il processo di inattivazione. Si suggerisce che un carbossilato nel sito attivo con pKa 3.05 sia il gruppo reattivo con conduritol-B-epossido.
Eterogeneità molecolare della fosforilasi chinasi del cuore di coniglio.Fosforilasi chinasi (ATP: fosforilasi-b fosfotransferasi, EC 2.7.1.38) da cuore di coniglio, quando presentata all'elettroforesi su Pevikon, si separa in due picchi discreti A e B. I due picchi sono stati analizzati mediante rielettroforesi, cromatografia su DEAE-cellulosa, stabilità termica, inattivazione mediante EGTA (etilenglicole-bis(beta-amminoetil etere)-N,N\ '-acido tetraacetico) e reazione con un antisiero anti-fosforilasi chinasi muscolare. Si può concludere che gli estratti di cuore di coniglio contengono due isoenzimi della fosforilasi chinasi. L'isoenzima più caricato negativamente sembra essere identico all'enzima muscolare. L'altro isoenzima somiglia all'enzima muscolare. enzima epatico ma differisce dalla frazione maggiore di quest'ultimo per la sua carica. È probabile che esistano almeno tre tipi molecolari di fosforilasi chinasi.
Isolamento, purificazione e caratterizzazione della transglutaminasi epidermica bovina.Un enzima reticolante, la transglutaminasi epidermica, è stato isolato dalle proteine solubili dell'epidermide del muso di vacca glabra. Questo coaguli di fibrina stabilizzati da enzimi che li rendono insolubili in acido acetico al 2%. Inoltre ha catalizzato l'incorporazione dell'ammina fluorescente, dansil cadaverina, nella caseina. La transglutaminasi epidermica è stata purificata mediante cromatografia su DEAE-Sephadex A-50, elettroforesi zonale in Pevikon e Sephadex Cromatografia a permeazione di gel G-200. La sostanza altamente purificata, che aveva un'attività specifica di 3267 unità incorporanti ammina/mg per h e un peso molecolare di 55000, si comportava come una singola specie molecolare nell'ultracentrifuga analitica. Aveva un coefficiente di sedimentazione di 4,4 S e migrato come una gamma-globulina a pH 8,6; ha mostrato migrazione anomala in gel di poliacrilammide contenenti sodio dodecilsolfato. L'enzima era dipendente da f ree ioni calcio e un gruppo sulfidrilico ridotto per l'attività. Il Km apparente per la dansyl cadaverina era 1.2 - 10(-4) a pH 7.5. Antisiero monospecifico alla transglutaminasi epidermica bovina precipitato con l'enzima in agar. L'antisiero ha impedito la reticolazione della fibrina ma ha migliorato l'incorporazione di dansil cadaverina nella caseina da parte dell'enzima. L'enzima epidermico differiva biochimicamente e immunochimicamente dalla transglutaminasi plasmatica bovina (fattore XIII).
Determinazione del potenziale redox della deazariboflavina mediante equilibrazione con flavine.Il potenziale redox della deazariboflavina è stato determinato per valori di pH da 5,5 a 9,2 mediante equilibrazione con riboflavina e lumiflavina 3-acetato. La posizione dell'equilibrio con riboflavina è stata misurata spettrofotometricamente e fluorimetricamente; il potenziale di equilibrio con lumiflavina 3-acetato è stato misurato spettrofotometricamente e potenziometricamente. L'Em7 per deazariboflavina è risultato essere - 0,273 +/- 0,003 V contro l'elettrodo standard a idrogeno. L'equilibrio con flavodossina a pH 9,5 e 10,0 è stato utilizzato anche per determinare il potenziale redox della deazariboflavina ad alti valori di pH. Il pK di diidrodeazariboflavina è stato trovato dalla rottura del diagramma potenziale vs pH e dal pH spettrofotometrico titolazione. Il valore di pK ottenuto con entrambi i metodi è 7,00 +/- 0,05. Abbiamo trovato che il borato, un prodotto dell'agente riducente boroidruro, complessato con il ribityl sidechain della deazariboflavina, causando uno spostamento del pK per la forma ridotta a valori di circa 8.
Meccanismo dell'effetto inibitorio di gliossilato più ossalacetato e ossalomalato sull'isocitrato deidrogenasi NADP-specifico.Gli effetti del gliossilato più ossalacetato e dell'ossalomalato su l'isocitrato deidrogenasi legata al NADP (treo-DS-isocitrato:NADP+ ossidoriduttasi (decarbossilante, EC 1.1.1.42) dal cuore di maiale è stata studiata con metodi allo stato stazionario e con tecnica a flusso interrotto. Quando miscele equimolari di gliossilato e ossalacetato sono state premiscelate per diversi periodi di tempo prima dell'aggiunta alla miscela di analisi, l'entità dell'inibizione è aumentata con il tempo di premiscelazione. I risultati hanno indicato che l'inibizione da gliossilato più ossalacetato è causata da un composto formato in un'interazione reversibile tra i due componenti. ossalacetato e ossalomalato hanno influenzato l'enzima in almeno tre modi diversi, inibendo l'enzima in una reazione competitiva nei confronti del substrato isocitrato. la sua inibizione aveva bisogno di un certo tempo per essere pienamente espressa. Il ritardo potrebbe essere eliminato premiscelando l'enzima e l'inibitore con NADP più ione metallico. In secondo luogo, se l'enzima viene premiscelato con NADP più ioni metallici, si verifica un ritardo prima che la velocità di reazione si avvicini a un valore costante dopo l'inizio della reazione con l'isocitrato. È stato scoperto che gli inibitori migliorano questo effetto di NADP più ioni metallici sull'enzima. In terzo luogo, è stato precedentemente dimostrato che l'enzima può essere attivato da agenti complessanti metallici. Il gliossilato più l'ossalacetato e l'ossalomalato sono in grado di formare complessi con ioni metallici e si è scoperto che causano un'attivazione iniziale dell'enzima in determinate condizioni di analisi. La controversia riguardante il meccanismo d'azione dei suddetti inibitori sull'enzima è probabilmente dovuta al fatto che influenzano l'enzima in diversi modi.
Thermoplasma acidophilum: pH intracellulare e concentrazione di potassio.Thermoplasma acidophilum è un micoplasma termofilo a vita libera. Sebbene l'organismo sia privo di una parete cellulare, può crescere in terreno diluito fino a 66 mosM La concentrazione intracellulare di K+ può arrivare fino a 17 mM, ma varia in base all'osmolalità del terreno di coltura Il pH interno può essere misurato sfruttando il fatto che T. acidophilum subisce la lisi quando il pH è regolato alla neutralità. Quindi, attraverso un'analisi appropriata delle curve di titolazione, è possibile concludere che il pH interno è vicino a 5,5. Questo risultato è stato confermato da un secondo tipo di esperimento in cui il pH interno è stato analizzato rompendo il celle in una cella a pressione francese.
Inattivazione acida di enzimi epatici di ratto a vita breve.Le stabilità di nove enzimi del citosol epatico di ratto sono state confrontate a una varietà di valori di pH. Il citosol gli enzimi studiati erano (a) quelli con emivite in vivo di 3 giorni o più: lattato deidrogenasi, arginasi, gliceraldeide fosfato deidrogenasi e alanina aminotransferasi, (b) quelli con emivite in vivo inferiori a 2 giorni; glucochinasi, diidroorotasi, serina deidratasi e tirosina aminotransferasi e (c) catalasi, che ha un'emivita intermedia di 2,5 giorni per la prozione proteica. Tutti gli enzimi erano stabili in vitro a valori di pH neutro e alcalino. Tuttavia, a valori di pH acidi (pH 4) : gli enzimi a vita lunga (a) erano stabili; gli enzimi a vita breve (b) erano completamente inattivati con una eccezione; e la catalasi era parzialmente inattivata. La tirosina aminotransferasi era l'eccezione in quanto è un enzima a vita breve in vivo ma stabile in tutte le condizioni testato in vitro la scoperta che gli enzimi a vita lunga sono stabili in un ambiente acido e gli enzimi a vita breve sono generalmente instabili è stata osservata solo se alcuni ligandi (NAD+, piridossal 5\'-fosfato, Mn2+, amminoacidi) sono stati aggiunti al sistema in vitro. Gli estratti lisosomiali non hanno accelerato la velocità di inattivazione di alcun enzima del citosol nelle soluzioni acide. Questi risultati indicano che se la degradazione degli enzimi intracellulari avviene nei lisosomi, l'inattivazione acida e la denaturazione degli enzimi può essere l'evento iniziale nel determinare le emivite funzionali degli enzimi in vivo.
Stabilizzazione di un complesso acetil-coenzima A carbossilasi da Pseudomonas citronellolis.Utilizzando condizioni stabilizzanti l'acetil-CoA carbossilasi (EC 6.4.1.2) di Pseudomonas citronellolis è stato isolato come un complesso contenente quattro diverse catene polipeptidiche con pesi molecolari di 53 000, 36 000, 33 000 e 25 000. Vengono presentate prove che suggeriscono che queste catene polipeptidiche corrispondono a distinte subunità proteiche di trasporto di biotina carbossilasi, transcarbossilasi e biotina carbossile in analogia con subunità simili di Escherichia coli acetil-CoA carbossilasi, un complesso instabile in vitro.
Effetto del fluoruro di sodio sull'attività della glucosio-6-fosfato deidrogenasi nell'utero di ratto.Somministrazione intrauterina di 50 mumol di NaF al ratto maturo ovariectomizzato provoca un aumento di 2-3 volte dell'attività totale della glucosio-6-fosfato deidrogenasi uterina entro 24 ore La risposta è caratterizzata da un ritardo di 4-6 ore con un effetto massimo da 24 a 36 ore dopo un singolo trattamento. L'attività della glucosio-6-fosfato deidrogenasi uterina continua ad aumentare con la somministrazione giornaliera di NaF per 4 giorni. La risposta indotta da NaF è bloccata dalla precedente somministrazione intrauterina di cicloesimide ma non actinomicina D, suggerendo che l'attività enzimatica aumenta per effetto post-trascrizionale di NaF sulla sintesi enzimatica de novo La misurazione diretta dell'effetto del NaF sulla velocità di incorporazione della [14C] leucina nella glucosio-6-fosfato deidrogenasi uterina immunoprecipitabile indica che il NaF provoca un aumento di 9 volte della velocità di sintesi enzimatica durante l'intervallo da 12 a 16 h dopo il trattamento. L'emivita dell'enzima, misurata dal tasso di perdita di [1-14C] glutammato dalla glucosio-6-fosfato deidrogenasi utreina precedentemente marcato, viene ridotta da 27 a 10 ore da NaF. La risposta del NaF non sembra essere mediata dall'attivazione dell'adenil ciclasi uterina poiché la teofillina non potenzia la risposta e poiché l'applicazione intrauterina di AMP ciclico non imita la risposta. L'aumento dell'attività enzimatica è preceduto da un aumento della velocità di utilizzazione della via dello shunt dell'esoso monofosfato come determinato dal rapporto tra le velocità di ossidazione del glucosio [1-14C] rispetto al glucosio [6-14C] e CO2 da parte dell'utero fette in vitro. L'azione del NaF su questo percorso molto probabilmente deriva dall'inibizione dell'enzima glicolitico, dell'enolasi e dall'aumento dell'utilizzo del percorso può essere il fattore che controlla la sintesi enzimatica. Quando somministrato in combinazione con altri induttori noti della glucosio-6-fosfato deidrogenasi uterina come l'estradiolo e il NADP+, il NaF agisce in sinergia.
Caratterizzazione dell'acetil-CoA sintetasi di Acetobacter aceti.È stato studiato il sistema di attivazione dell'acetato di Acetobacter aceti. L'enzima responsabile, acetil-CoA sintetasi, è stato purificato circa 500 volte da estratti cellulari grezzi ed era puro circa l'85% come giudicato dall'elettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio dodecil solfato. L'enzima purificato ha mostrato un'attività ottimale a pH 7,6 sia in tampone Tris-HCL che fosfato di potassio. nella sua forma più pura, l'enzima era stabile a 4 gradi C ma denaturato al congelamento. I valori di Km per CoA, ATP e acetato sono risultati rispettivamente 0,104 mM, 0,36 mM e 0,25 mM; anche propionato e acrilato sono stati attivati dall'enzima ma non butirrato, isobutirrato o valerato. GTP, UTP, CTP e ADP non hanno potuto sostituire l'ATP nella reazione, e la cisteina o la panteteina non sono riuscite a sostituire il CoA. I requisiti cationici sono stati studiati e dei cationi bivalenti testati, solo Mn2+ potrebbe sostituire significativamente ce Mg2+ nella reazione; K+ e NH4+ stimolano l'attività enzimatica ma inibiscono ad alte concentrazioni; Na+ era un attivatore scadente, ma non inibiva a concentrazioni più elevate. È stato testato l'effetto di un certo numero di glucosio e di altri metaboliti sull'attività enzimatica.
Idrolisi degli esteri del colesterolo del chilo con preparazioni prive di cellule di fegato di ratto.1. L'effetto del pH sull'idrolisi dei chilomicroni e del colesterolo residuo di chilomicroni è stato esaminato l'estere con omogenato di fegato di ratto. L'idrolisi aveva tre pH ottimali, a pH 4,5, a pH 6,0-6,5 e a pH 8,5. Ai due pH ottimali superiori si è verificata un'estesa idrolisi dell'estere del colesterolo senza degradazione simultanea della porzione di triacilglicerolo. 2. Allo stesso modo, i microsomi (a pH 6,5-8,0) e il surnatante di 100.000 X g (a pH 7,5-8,5) hanno idrolizzato in modo efficiente l'estere del colesterolo ma non il triacilglicerolo dei resti di chilomicroni. osservati in membrane plasmatiche isolate 4. A pH 4,5 i lisosomi idrolizzano efficacemente sia l'estere del colesterolo che la porzione di triacilglicerolo dei resti di chilomicroni 5. Vengono tratte tre conclusioni: (a) lo studio fornisce prove contro l'esistenza di un plasma un estere di colesterolo chilomicronico idrolizzante enzimatico legato alla membrana prima o durante la sua penetrazione nella cellula; (b) gli enzimi della linfa cellulare ed eventualmente del reticolo endoplasmatico possono degradare l'estere del colesterolo dei resti di chilomicroni senza precedere l'idrolisi del nucleo di triacilglicerolo; e (c) gli enzimi lisosomiali possono degradare sia l'estere del colesterolo che la porzione di triacilglicerolo dei resti di chilomicroni se questi vengono assorbiti come particelle intere per endocitosi.
Ossidazione di spermidina e spermina nel fegato di ratto: purificazione e proprietà della poliammina ossidasi.Un nuovo enzima responsabile dell'ossidazione di spermidina e spermina è stato trovato nel fegato di ratto Spermidina ha dimostrato di essere degradata a putrescina e 3-aminopropionaldeide, e la spermina da scissione a spermidina e 3-aminopropionaldeide Un singolo enzima che catalizza entrambe le reazioni e designato come poliammina ossidasi è stato purificato 4000 volte all'omogeneità elettroforetica La poliammina ossidasi sembra essere una flavoproteina, contenente flavin adenin dinucleotide (FAD) come gruppo prostetico. Nella reazione si sviluppa perossido di idrogeno e non sono stati trovati altri accettori di elettroni tranne l'ossigeno molecolare. Il peso molecolare dell'enzima era di circa 60 000 e il coefficiente di sedimentazione 4,5 S. L'enzima sembra essere una singola catena polipeptidica poiché non è stata ottenuta alcuna prova di subunità strutturali. La poliammina ossidasi era sensibile t o reagenti del gruppo solfidrilico e carbonilico. Il valore di pH ottimale per l'ossidazione delle poliammine era vicino a 10. Le velocità di reazione erano aumentate da varie aldeidi, specialmente alcune aldeidi aromatiche. La poliammina ossidasi sembra essere localizzata nei perossisomi delle cellule epatiche, sebbene non sia stata definitivamente esclusa l'esistenza di un isoenzima nella frazione citosolica. Non sono stati osservati cambiamenti marcati nell'attività della poliammina ossidasi nel fegato di ratto dopo epatectomia parziale, avvelenamento da tetracloruro di carbonio e dopo trattamento con ormone della crescita o tioacetammide, condizioni note per alterare profondamente il metabolismo e l'accumulo di poliammine.
Purificazione e proprietà di Renilla reniformis luciferase.Luciferasi dall'antozoo celenterato Renilla reniformis (Renilla luciferin:ossigeno 2-ossidoreduttasi (decarbossilante), EC 1.13 1.2.5. ) catalizza l'ossidazione bioluminescente della luciferina Renilla producendo luce (lambdaB 480 nm, QB 5,5%), ossiluciferina e CO2 (Hori, K. , Wampler, JE, Matthews, JC e Cormier, MJ (1973), Biochimica 12, 4463). Usando una combinazione di scambio ionico, setaccio molecolare, scambio sulfidrilico e cromatografia di affinità, la luciferasi è stata purificata, circa 12.000 volte con un recupero del 24%, fino all'omogeneità come giudicata dall'analisi con disco e sodio elettroforesi su gel di dodecil solfato-poliacrilammide, filtrazione su gel e ultracentrifugazione La renilla luciferasi è attiva come monomero a catena polipeptidica singola quasi sferica di 3,5 X 10 (4) dalton con un'attività specifica di 1,8 X 10 (15) hp s-1 mg- 1 e un numero di turnover di 111 mumol min-1 mumol-1 di enzima. Questo enzima ha un alto contenuto di amminoacidi aromatici e idrofobici tale da avere un epsilon280nm 0,1% di 2,1 e un'idrofobicità media di 1200 cal residuo-1. Si ritiene che l'elevata idrofobicità media della luciferasi, che la colloca tra le proteine più idrofobe segnalate, spieghi, almeno in parte, la sua tendenza ad auto-associarsi formando dimeri inattivi e specie di peso molecolare più elevato.
S-adenosilmetionina: proteina-arginina metiltransferasi. Purificazione e meccanismo dell'enzima.Proteina metilasi I (S-adenosilmetionina: proteina-arginina metiltransferasi, EC 2.1.1.23) è stato purificato da cervello di vitello circa 120 volte con una resa del 14%. La preparazione finale è completamente priva di qualsiasi altra metiltransferasi proteina-specifica e proteina del substrato endogeno. L'enzima ha un pH ottimale di 7,2 e un valore pI di 5.1. I valori Km per S-adenosil-L-metionina, istone H4 e una proteina basica ancefalitogenica sono 7,6 X 10 (-6), 2,5 X 10 (-5) e 7,1 X 10 (-5) M, rispettivamente, e il valore Ki per S-adenosil-L-omocisteina è 2,62 X 10(-6) M. L'enzima è altamente specifico per i residui di arginina della proteina e i prodotti finali dopo l'idrolisi della proteina metilata sono NG,NG -di(asimmetrico), NG,N\'G-di(simmetrico) e NG-monometilarginina Il rapporto tra l'incorporazione di [14C]metile in questi derivati mediante preparazione enzimatica razione a vari stadi di purificazione rimane invariata a 40:5:55, indicando fortemente che un singolo enzima è coinvolto nella sintesi dei tre derivati dell'arginina. Il meccanismo cinetico della reazione della proteina metilasi I è stato studiato con l'enzima purificato. I modelli di velocità iniziale convergenti in un punto sull'asse esteso delle ascisse sono stati ottenuti con l'istone H4 o S-adenosil-L-metionina come substrato vario. L'inibizione del prodotto da parte di S-adenosil-L-omocisteina con S-adenosil-L-metionina come substrato variato era competitiva indipendentemente dal fatto che l'enzima fosse o meno saturato con l'istone H4. D'altra parte, quando l'istone H4 è il substrato variabile, l'inibizione non competitiva è stata ottenuta con S-adenosil-L-omocisteina in condizioni in cui l'enzima non è saturato con l'altro substrato, S-adenosil-L-metionina. Questi risultati suggeriscono che il meccanismo della reazione della proteina metilasi I è un meccanismo Bi Bi ordinato sequenziale con S-adenosil-L-metionina come primo substrato, istone H4 come secondo substrato, istone metilato H4 come primo prodotto e S- adenosil-L-omocisteina come secondo prodotto rilasciato.
Effetto degli alcoli sulla struttura e funzione della D-amminoacido ossidasi.Lo spettro di assorbimento della D-amminoacido ossidasi (D- amminoacido:ossigeno ossidoreduttasi (deaminante), EC 1.4.3.3) è stato significativamente perturbato da vari alcoli; sono state osservate tipiche strutture fini nelle bande di assorbimento visibili, accompagnate da spostamenti verso il blu dei picchi. Sia l'intensità della fluorescenza che la polarizzazione della fluorescenza sono state aumentate su l'aggiunta di alcoli, indicando che il coenzima non viene liberato dall'apoenzima ma aumenta l'idrofobicità dell'ambiente della flavina legata all'enzima. -ultravioletto, mentre quello dell'apoenzima nelle regioni vicino e lontano ultravioletto è stato poco modificato, indicando un cambiamento nell'interazione tra il coenzima flavina e la proteina. Sia la velocità massima apparente che l'apparente Micha elis costante dell'enzima sono stati aumentati con l'aggiunta di alcoli. La presenza di alcoli tende a dissociare il dimero di questo enzima nel monomero, ma la dissociazione non spiega completamente l'aumento della velocità massima dell'enzima da parte degli alcoli, perché l'aumento della velocità massima causato dagli alcoli è maggiore di quello atteso dalla dissociazione. Poiché la velocità di formazione dell'intermedio viola è stata diminuita dagli alcoli sia nel dimero che nel monomero, l'aumento della velocità massima potrebbe essere attribuito ad un aumento della velocità di dissociazione del complesso enzima-prodotto. Questo aumento potrebbe essere attribuito al cambiamento conformazionale della proteina, che è probabilmente provocato dalla combinazione di alcoli con l'enzima in un locus diverso da quello per il legame al substrato.
Spettri di rilassamento delle esochinasi di lievito. Isomerizzazione dell'enzima.Gli isoenzimi di esochinasi di lievito P1 e P11 mostrano un processo di rilassamento rapido e dipendente dal pH a 15 gradi C a concentrazioni enzimatiche di 100-474 muM e in un intervallo di pH di 6-8. Il processo è stato rilevato mediante spettroscopia a salto di temperatura di equilibrio utilizzando la sonda indicatrice rosso fenolo. Il valore di 1/tau varia da circa 6 ms-1 a pH 8 per entrambi gli isoenzimi a 50 ms-1 per P1 e 85 ms-1 per P11 a pH 6. I dati sono coerenti con un meccanismo che coinvolge un'isomerizzazione enzimatica accoppiata a una ionizzazione. La costante di velocità diretta per l'isomerizzazione del meccanismo proposto varia tra 3 e 7 ms-1, il rapporto tra la costante di velocità inversa e la Ka di ionizzazione è compreso tra 0,5 e 2 X 10(11) M-1 S-1, il pKa stimato varia tra 5,5 e 6,1. costanti e pKa rappresentano variazioni osservate tra preparazioni dello stesso isoenzima e tra isoenzimi. la velocità di erizzazione è almeno 50 volte più veloce della catalisi in tutte le condizioni e il pKa è inferiore a quello dell'attività di controllo. La velocità di isomerizzazione è invariata per aggiunta di zucchero e ligandi nucleotidici, ma l'ampiezza del processo è perturbata. Questi dati implicano che le forme isomerizzanti e ionizzanti sono sensibili agli eventi nel sito attivo. Questi equilibri tra le forme di esochinasi sono abbastanza veloci e hanno le proprietà giuste per essere importanti per il meccanismo e la regolazione dell'enzima.
Energetica e meccanismo dell'actomiosina adenosina trifosfatasi.Le costanti di velocità sono state determinate per la reazione dell'actina con il sottoframmento 1 (S1), complesso S1-prodotto, meromiosina pesante (HMM) e complesso di prodotti HMM per un intervallo di temperature, pH\' e forze ioniche. Per concentrazioni di actina fino a 10 muM, la velocità di riassociazione del prodotto intermedio era uguale alla velocità del sottoframmento 1 di actomiosina (acto-S1) o acto-HMM adenosina trifosfatasi (ATPasi). Pertanto, in queste condizioni, l'unica via importante per l'idrolisi dell'adenosina trifosfato è attraverso la dissociazione e ricombinazione di S1 o HMM. Le costanti di velocità apparenti per l'associazione di S1 e Il prodotto S1 con l'actina ha mostrato una simile grande dipendenza dalla forza ionica. La reazione del prodotto S1 ha avuto una grande dipendenza dalla temperatura parallela alla velocità dell'acto-S1 ATPasi, mentre la reazione con S1 ha avuto una variazione molto più piccola con la temperatura. costante di velocità per la reazione del prodotto S1 e la sua relazione con l'area di s1 suggerisce che la costante di velocità apparente non misura una semplice reazione di secondo ordine. Un meccanismo plausibile è un rapido equilibrio per la fase di legame, seguito da una transizione (rilascio del prodotto) che aumenta la costante di associazione. Uno stato refrattario potrebbe anche ridurre la costante di velocità apparente di ricombinazione. Un'assegnazione approssimativa delle costanti di equilibrio per la reazione dell'ATPasi acto-S1 è stata effettuata sulla base dell'interpretazione delle prove attuali e delle costanti di equilibrio per l'ATPasi S1.
Stati intermedi dell'actomiosina adenosina trifosfatasi.Le prime fasi cinetiche del sottoframmento 1 dell'actomiosina (acto-S1) adenosina trifosfatasi sono state studiate mediante il monitoraggio simultaneo di fluorescenza e diffusione della luce e anche dall'osservazione del corso temporale della produzione di fosfato. I risultati mostrano che l'aumento della fluorescenza si verifica dopo la dissociazione dell'actomiosina e che il tasso di miglioramento è simile al tasso massimo di miglioramento per S1 da solo, in condizioni simili condizioni di pH e temperatura. Anche la velocità massima del burst di fosfato per acto S1 è approssimativamente la stessa di quella per S1 da sola. Le velocità massime per l'aumento della fluorescenza o la formazione di fosfati sono raggiunte a concentrazioni di adenosina trifosfato molto più basse per acto-S1 rispetto a S1. Viene presentata un'estensione dello schema dell'actomiosina che tiene conto di questi risultati.
Purificazione dell'acido ribonucleico messaggero di adenovirus mediante un sistema polimerico acquoso a due fasi.Un sistema polimerico acquoso contenente il 6,3% (p/p) di destrano e 3,5% (p/p) di poli(etilenglicole) in tampone fosfato 10 mM (pH 8,0) è stato sviluppato per selezionare ibridi RNA-DNA da RNA non ibridato. La fase superiore di questo sistema di fase, che contiene DNA e RNA-DNA ibridi, possono essere utilizzati per purificare l'RNA messaggero di adenovirus sia all'inizio che alla fine del ciclo infettivo. Gli ibridi possono essere fusi mediante calore nella fase superiore e l'RNA messaggero selezionato mediante cromatografia con oligo(dT)cellulosa dopo di che i polimeri e il DNA percolano e l'RNA messaggero poliadenilato viene assorbito nella colonna L'RNA messaggero isolato sembra essere recuperato quasi quantitativamente con una purezza dal 70 al 90% a seconda della concentrazione dell'RNA messaggero specifico nel materiale di partenza Gli RNA messaggeri virali precoci e tardivi sono stati selezionati su i filamenti complementari di adenovir noi DNA secondo questa procedura.
Caratteristiche conformazionali della lubiberina. Proprietà di luminescenza alla temperatura dell'azoto liquido.Le proprietà di luminescenza (fluorescenza e fosforescenza) della luliberina sono state studiate a liquido- temperatura dell'azoto (77 K) in tampone glicolato etilenico al 50% a vari pH\'s. Il calcolo dell'efficienza di trasferimento di energia tra i residui di Trp e Tyr porta ad una valutazione della distanza che separa questi residui. In mezzo alcalino, quando la tirosina è ionizzata, un'efficienza di trasferimento del 100% si verifica da Trp a Tyr- a livello di singoletto e anche da Tyr- a Trp a livello di tripletta indicando che la distanza TRP-Tyr è inferiore a circa 5 A. Quando lubiberin è a pH 7,8 (o 4,5), l'efficienza di trasferimento da Tyr a Trp a livello di singoletto è dell'85-90% che dovrebbe corrispondere ad una distanza tra Trp e Tyr di circa 10-12 A. Questi risultati sono discussi rispetto al ruolo svolto dagli amminoacidi aromatici sia nell'ormone conformazione a e nella potenza biologica dell'ormone. Inoltre, il confronto con i dati ottenuti da studi di fluorescenza o dicroismo circolare a temperatura ambiente permette di dedurre alcune caratteristiche della conformazione della lubiberina. Vengono discusse anche le relazioni struttura-attività nella regione aromatica della lubiberina.
Caratteristiche conformazionali della luliberina. Studi di dicroismo circolare e fluorescenza.Con il dicroismo circolare e la spettroscopia di fluorescenza, la conformazione della luliberina (ormone di rilascio dell'ormone luteinizzante) è stato studiato in varie condizioni di pH e solventi. Sono stati definiti diversi parametri strutturali che sembrano predominanti per il mantenimento dell'ormone in alcune conformazioni privilegiate. Formazione di un legame idrogeno intramolecolare tra CO (His) e NH (Ser) sembra probabile quando si dissolve l'ormone in un solvente organico come il diossano. Il trasferimento di energia è stato dimostrato tra i residui di Tyr e Trp. Il calcolo dell'efficienza del trasferimento di energia a diversi pH\' ci ha permesso di stimare nell'intervallo di 10 A la distanza che separa questi residui. Viene anche fornita la prova di un'interazione di trasferimento di carica tra istidina protonata e triptofano. Questi dati suggeriscono che, quando luliberin ha organizzato str utura (in condizioni ambientali appropriate), il suo modello conformazionale assomiglierebbe a quello della struttura beta-turn in cui esisterebbe una curva beta a livello dei residui aromatici.
Equilibrio di dissociazione protone-dipendente dell'emoglobina. 2. Misurazioni della pressione superficiale in monostrati di emoglobina di cavallo (III).Il peso molecolare dell'emoglobina (III) ) in monostrati su sottosoluzioni acquose è stato determinato misurando la pressione superficiale in funzione della concentrazione superficiale della proteina. L'equilibrio di dissociazione tra emoglobina tetramerica e dimerica (III) è stato determinato per monostrati diffusi e adsorbiti. I risultati sono stati confrontati con analoghi misurazioni in soluzione. Si è riscontrato che il valore numerico e la dipendenza dal pH della costante di dissociazione erano simili sia nella fase di massa che nella fase superficiale della soluzione. Da questi risultati si è concluso che la conformazione nativa dell'emoglobina (III) è trattenuto dopo l'adsorbimento sulla superficie acquosa.
Equilibrio di dissociazione protone-dipendente dell'emoglobina. 1. Uno studio di diffusione della luce a 700 nanometri sulla metemoglobina di cavallo nell'intervallo di pH da 4,8 a 7,2.L'effetto della concentrazione di protoni sulla dissociazione della subunità della metaemoglobina di cavallo è stato studiato a due forze ioniche mediante fotometria a diffusione di luce a 700 nm. La rifrattometria differenziale ha rivelato una leggera ma sistematica diminuzione dell'incremento dell'indice di rifrazione specifico con la diminuzione della concentrazione proteica per soluzioni in equilibrio dialitico con il solvente. Nell'intervallo di pH 4,8-7,2 la dissociazione può essere descritta da un semplice equilibrio tra tetrameri e dimeri. La costante di dissociazione Kd del derivato met risulta essere molto simile a quella degli stati ligati con O2 e CO Dalla pendenza di un grafico di log Kd rispetto a pH, il numero di protoni legati è n = 1,3 +/- 0,1 risultante da un aumento dei valori di pK di due gruppi al momento della dissociazione. Questi due gruppi devono essere identico perché la dissociazione è simmetrica.
Studi sulla digestione e l'assorbimento nell'intestino di suini in accrescimento. Misurazioni del flusso digestivo e del pH.1. Sono stati inseriti 35 suini con singole cannule rientranti nel duodeno, nel digiuno o nell'ileo. Altri ventiquattro suini sono stati utilizzati in una prova di digeribilità convenzionale. 2. Sono stati sviluppati metodi per la raccolta, il campionamento e la restituzione del digestato. 3. Un \' di tipo pratico\ ' dieta e due diete purificate sono state somministrate due volte al giorno 4. Il flusso e il pH del digestato sono stati misurati ogni ora nel duodeno e nel digiuno e ogni 6 ore nell'ileo 5. Nel duodeno e nel digiuno c'erano chiare risposte di flusso a alimentazione, mentre tale effetto non è stato riscontrato nell'ileo dove la portata era molto più bassa e più uniforme rispetto ai precedenti siti 6. Nel duodeno e nel digiuno, ed entro 6 h periodi nell'ileo, vi era una notevole variazione nella portata tra diversi suini entro ogni ora ma c'era una minore variazione nel pH 7. T L'andamento del flusso nel duodeno e nel digiuno era simile per ciascuna delle diete, ma il flusso totale e il pH medio nelle 24 ore differivano significativamente tra le diete. C'erano più digestati con un pH più basso dalla dieta \' di tipo pratico\' rispetto alle diete purificate. 8. Il pH nel duodeno era più alto dopo l'alimentazione e diminuiva con l'aumentare del tempo dopo l'alimentazione. Nel digiuno e nell'ileo il pH variava in un intervallo molto più piccolo che nel duodeno. 9. Le raccolte per periodi di 6 ore sembravano non essere sufficientemente lunghe per prevedere i valori ottenuti in raccolte di 24 ore con ragionevole accuratezza.
Studi sulla digestione dei lipidi nel vitello preruminante. La fonte dell'attività lipolitica nell'abomaso.1. Sono state determinate le attività lipolitica e proteolitica e i valori di pH nelle secrezioni raccolte dalle tasche abomasali innervate e nel contenuto abomasale di vitelli preruminanti dati con diete liquide 2. Nessuna attività lipolitica è stata rilevata nelle secrezioni della tasca raccolte durante 1 h dopo l'alimentazione, sebbene l'attività lipolitica fosse presente nel contenuto abomasale; pepsina (EC 3.4.23.1 ) e renina (EC 3.4.23.4) erano presenti sia nelle secrezioni della sacca che nel contenuto abomasale. I valori di pH delle secrezioni della sacca variavano da 1-2 a 1-8 e quelli del contenuto abomasale da 4-2 a 5-9. 3. Quando la dieta è stata inserita direttamente nella sacca abomasale subito dopo l'alimentazione, i valori di pH della sacca e del contenuto abomasale sono diminuiti in modo simile (cioè da 6-3 a circa 5). L'attività proteasica (U/ml) del contenuto della sacca variava da 0-1 a 0-8 e quello dei contenuti abomasali da 0-1 a 0-2 No lipol l'attività ytica è stata rilevata nel contenuto della sacca, sebbene il contenuto abomasale contenesse da 0-6 a 1-2 U/ml e quando la dieta conteneva grassi del latte come fonte di grassi alimentari è stata riscontrata una notevole lipolisi dei trigliceridi contenenti acidi grassi a catena corta. 4. Si conclude che non vi è alcuna secrezione significativa di enzimi lipolitici da parte della mucosa del fondo e che la lipolisi dei trigliceridi nell'abomaso del vitello preruminante è dovuta principalmente a un enzima lipolitico nella saliva.