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Biologie moléculaire de la cellule	insatur es avec des cha nes d'hydrocarbures avec des liaisons cis-doubles Figure 10 11 L'influence des liaisons cisdouble dans les cha nes d'hydrocarbures. Les doubles liaisons rendent plus difficile l'empaquetage des cha nes, ce qui rend la bicouche lipidique plus difficile geler. De plus, comme les cha nes hydrocarbon es des lipides insatur s sont plus dispers es, les bicouches lipidiques qui les contiennent sont plus minces que les bicouches form es exclusivement de lipides satur s. des cha nes pr nyles de 20 25 atomes de carbone au lieu d'acides gras ; les cha nes pr nyles et d'acides gras sont galement hydrophobes et flexibles (voir les figures 10 20F) ; Chez les arch es thermophiles, les cha nes lipidiques les plus longues recouvrent les deux folioles, ce qui rend la membrane particuli rement stable la chaleur. Ainsi, les bicouches lipidiques peuvent tre construites partir de mol cules ayant des caract ristiques similaires mais des conceptions mol culaires diff rentes. Les membranes plasmiques de la plupart des cellules eucaryotes sont plus vari es que celles des procaryotes et des arch es, non seulement en ce qu'elles contiennent de grandes quantit s de cholest rol, mais aussi un m lange de diff rents phospholipides. L'analyse des lipides membranaires par spectrom trie de masse a r v l que la composition lipidique d'une membrane cellulaire eucaryote typique est beaucoup plus complexe qu'on ne le pensait initialement. Ces membranes contiennent une vari t d concertante de peut- tre 500 2000 esp ces lipidiques diff rentes, m me la simple membrane plasmique d'un globule rouge en contenant bien plus de 150. Bien qu'une partie de cette complexit refl te la variation combinatoire des groupes de t te, la longueur des cha nes d'hydrocarbures et la d saturation des principales classes de phospholipides, certaines membranes contiennent galement de nombreux lipides mineurs structurellement distincts, dont au moins certains ont des fonctions importantes. Les phospholipides d'inositol, par exemple, sont pr sents en petites quantit s dans les membranes cellulaires animales et ont des fonctions cruciales dans le guidage du trafic membranaire et dans la signalisation cellulaire (discut s dans les chapitres 13 et 15, respectivement). Leur synth se et leur destruction locales sont r gul es par un grand nombre d'enzymes, qui cr ent la fois de petites mol cules de signalisation intracellulaire et des sites d'amarrage lipidique sur des membranes qui recrutent des prot ines sp cifiques du cytosol, comme nous le verrons plus loin. Malgr leur fluidit , les bicouches lipidiques peuvent former des domaines de compositions diff rentes Parce qu'une bicouche lipidique est un fluide bidimensionnel, on pourrait s'attendre ce que la plupart des types de mol cules lipidiques qu'elle contient soient bien m lang s et distribu s de mani re al atoire dans leur propre monocouche. Les forces d'attraction de van der Waals entre les queues d'hydrocarbures voisines ne sont pas assez s lectives pour maintenir ensemble des groupes de mol cules de phospholipides. Cependant, avec certains m langes de lipides dans des bicouches artificielles, on peut observer des s gr gations de phase dans lesquelles des lipides sp cifiques se regroupent dans des domaines s par s (Figure 10-12). Il y a eu un long d bat parmi les biologistes cellulaires sur la question de savoir si les mol cules lipidiques de la membrane plasmique des cellules vivantes se s parent de la m me mani re en domaines sp cialis s, appel s radeaux lipidiques. Bien que de nombreux lipides et prot ines membranaires ne soient pas distribu s uniform ment, les s gr gations de phase lipidique grande chelle sont rarement observ es dans les membranes cellulaires vivantes. Au lieu de cela, on observe que des prot ines membranaires et des lipides sp cifiques se concentrent de mani re plus temporaire et dynamique, facilit e par les interactions prot ine-prot ine qui permettent la formation transitoire de r gions membranaires sp cialis es (Figure 10 13). De tels amas peuvent tre de minuscules nanoamas l' chelle de quelques mol cules, ou des assemblages plus grands que l'on peut observer au microscope lectronique, tels que les cav oles impliqu es dans l'endocytose (discut es au chapitre 13). La tendance des m langes de lipides subir une s paration de phase, comme on le voit dans les bicouches artificielles (voir Figure 10-12), peut aider cr er des radeaux dans les cellules vivantes membranes - organisation et concentration des prot ines membranaires pour le transport dans les v sicules membranaires Figure 10 12 S paration lat rale de phase dans les bicouches lipidiques artificielles. (A) les liposomes g ants produits partir d'un m lange 1:1 de phosphatidylcholine et de sphingomy line forment des bicouches uniformes. (B) En revanche, les liposomes produits partir d'un m lange 1:1:1 de phosphatidylcholine, de sphingomy line et de cholest rol forment des bico
Biologie moléculaire de la cellule	uches avec deux phases distinctes. Les liposomes sont color s l'aide de traces d'un colorant fluorescent qui se r partit pr f rentiellement en l'une des deux phases. La taille moyenne des domaines form s dans ces liposomes artificiels g ants est beaucoup plus grande que celle attendue dans les membranes cellulaires, o les radeaux lipidiques (voir texte) peuvent tre aussi petits que quelques nanom tres de diam tre. (A, d'apr s n. Kahya et al., J. Struct. Biol. 147:77 89, 2004. Avec l'autorisation d'elsevier ; B, avec l'aimable autorisation de petra Schwille.) (discut au chapitre 13) ou pour travailler ensemble dans des assemblages de prot ines, par exemple lorsqu'ils convertissent des signaux extracellulaires en signaux intracellulaires (discut au chapitre 15). La plupart des cellules stockent un exc s de lipides dans des gouttelettes lipidiques, partir desquelles ils peuvent tre r cup r s comme l ments constitutifs de la synth se membranaire ou comme source de nourriture. Les cellules adipeuses, ou adipocytes, sont sp cialis es dans le stockage des lipides. Ils contiennent une gouttelette lipidique g ante qui remplit la majeure partie de leur cytoplasme. La plupart des autres cellules ont de nombreuses gouttelettes lipidiques plus petites, le nombre et la taille variant avec l' tat m tabolique de la cellule. Les acides gras peuvent tre lib r s la demande partir de gouttelettes lipidiques et export s vers d'autres cellules par la circulation sanguine. Les gouttelettes lipidiques stockent des lipides neutres, tels que les triacylglyc rols et les esters de cholest rol, qui sont synth tis s partir d'acides gras et de cholest rol par des enzymes dans la membrane du r ticulum endoplasmique. Parce que ces lipides ne contiennent pas de groupes de t te hydrophiles, ils sont exclusivement des mol cules hydrophobes, et s'agr gent donc en gouttelettes tridimensionnelles plut t qu'en bicouches. Les gouttelettes lipidiques sont des organites uniques en ce sens qu'elles sont entour es d'une seule monocouche de phospholipides, qui contient une grande vari t de prot ines. Certaines des prot ines sont des enzymes impliqu es dans le m tabolisme des lipides, mais les fonctions de la plupart sont inconnues. Les gouttelettes lipidiques se forment rapidement lorsque les cellules sont expos es de fortes concentrations d'acides gras. On pense qu'ils se forment partir de r gions discr tes de la membrane du r ticulum endoplasmique o sont concentr es de nombreuses enzymes du m tabolisme des lipides. La figure 10-14 montre un mod le de la fa on dont les gouttelettes lipidiques peuvent se former et acqu rir leur monocouche environnante de phospholipides et de prot ines. l'asym trie de la bicouche lipidique est fonctionnellement importante Les compositions lipidiques des deux monocouches de la bicouche lipidique dans de nombreuses membranes sont tonnamment diff rentes. Dans la membrane des globules rouges humains ( rythrocytes), par exemple, presque toutes les mol cules de phospholipides qui ont la cho-line (CH3)3N+CH2CH2OH dans leur groupe de t te (phosphatidylcholine et Figure 10 13 : mod le d'un domaine de radeau. Les interactions prot ine-prot ine, prot ine-lipide et lipide-lipide faibles se renforcent mutuellement pour r partir les composants en interaction dans les domaines de radeau. le cholest rol, les sphingolipides, les glycolipides, les prot ines ancr es au glycosylphosphatidylinositol (gpI) et certaines prot ines transmembranaires sont enrichis dans ces domaines. Notez qu'en raison de leur composition, les domaines de radeau ont une paisseur de membrane accrue. Nous aborderons plus tard les glycolipides, les prot ines ancr es dans la gpI et les liants aux oligosaccharides. (Adapt de D. lingwood et K. Simons, Science 327:46-50, 2010.) Figure 10 14 : un mod le de formation de gouttelettes lipidiques. Des lipides neutres se d posent entre les deux monocouches de la membrane du r ticulum endoplasmique. L , ils s'agr gent en une gouttelette tridimensionnelle, qui bourgeonne et pince de la membrane du r ticulum endoplasmique comme un organite unique, entour d'une seule monocouche de phospholipides et de prot ines associ es. (Adapt de S. Martin et r.g. parton, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7:373 378, 2006. Avec l'autorisation de Macmillan publishers ltd.) sphingomy line) se trouvent dans la monocouche externe, tandis que presque tous ceux qui contiennent un groupe amino primaire terminal (phosphatidyl thanolamine et phosphatidyls rine) se trouvent dans la monocouche interne (figures 10 15). Parce que la phosphatidyls rine charg e n gativement est situ e dans la monocouche interne, il existe une diff rence significative de charge entre les deux moiti s de la bicouche. Nous discutons au chapitre 12 de la fa on dont les translocateurs de phospholipides li s la membrane g n rent et maintiennent l'asym trie lipidique. L'asym trie lipidique est fonctionnellement importante, en particulier dans la c
Biologie moléculaire de la cellule	onversion des signaux extracellulaires en signaux intracellulaires (discut au chapitre 15). De nombreuses prot ines cytosoliques se lient des groupes sp cifiques de t tes lipidiques trouv s dans la monocouche cytosolique de la bicouche lipidique. L'enzyme prot ine kinase C (PKC), par exemple, qui est activ e en r ponse divers signaux extracellulaires, se lie la face cytosolique de la membrane plasmique, o la phosphatidyls rine est concentr e, et a besoin de ce phospholipide charg n gativement pour son activit . Dans d'autres cas, des groupes sp cifiques de la t te lipidique doivent d'abord tre modifi s pour cr er des sites de liaison la prot ine un moment et un endroit donn s. Un exemple est le phosphatidylinositol (PI), l'un des phospholipides mineurs qui sont concentr s dans la monocouche cytosolique des membranes cellulaires (voir Figure 13-10A-C). Diverses kinases lipidiques peuvent ajouter des groupes phosphate des positions distinctes sur le cycle inositol, cr ant ainsi des sites de liaison qui recrutent des prot ines sp cifiques du cytosol la membrane. Un exemple important d'une telle kinase lipidique est la phosphoinositide 3-kinase (PI 3-kinase), qui est activ e en r ponse des signaux extracellulaires et aide recruter des prot ines de signalisation intracellulaires sp cifiques sur la face cytosolique de la membrane plasmique (voir Figure 15 53). Des kinases lipidiques similaires phosphorylent les phospholipides d'inositol dans les membranes intracellulaires et aident ainsi recruter des prot ines qui guident le transport membranaire. Les phospholipides de la membrane plasmique sont utilis s d'une autre mani re pour convertir les signaux extracellulaires en signaux intracellulaires. La membrane plasmique contient diverses phospholipases qui sont activ es par des signaux extracellulaires pour cliver des mol cules phospholipidiques sp cifiques, g n rant des fragments de ces mol cules qui agissent comme des m diateurs intracellulaires de courte dur e. La phospholipase C, par exemple, clive un phospholipide d'inositol dans la monocouche cytosolique de la membrane plasmique pour g n rer deux fragments, dont l'un reste dans la membrane et aide activer la prot ine kinase C, tandis que l'autre est lib r dans le cytosol et stimule la lib ration de Ca2+ par le r ticulum endoplasmique (voir Figure 15-28). Les animaux exploitent l'asym trie phospholipidique de leurs membranes plasmiques pour distinguer les cellules vivantes des cellules mortes. Lorsque les cellules animales subissent l'apoptose (une forme de mort cellulaire programm e, discut e au chapitre 18), la phosphatidyls rine, qui est normalement confin e la monocouche cytosolique (ou interne) de la bicouche lipidique de la membrane plasmique, se d place rapidement vers la monocouche extracellulaire (ou externe). La phosphatidyls rine expos e la surface cellulaire signale aux cellules voisines, telles que les macrophages, de phagocyter la cellule morte et de la dig rer. On pense que la translocation de la phosphatidyls rine dans les cellules apoptotiques se produit par deux m canismes : 1. Le translocateur phospholipidique qui transporte normalement ce lipide de la monocouche externe la monocouche interne est inactiv . 2. Un scramblase qui transf re des phospholipides de mani re non sp cifique dans les deux sens entre les deux monocouches est activ . Figure 10 15 La distribution asym trique des phospholipides et des glycolipides dans la bicouche lipidique des globules rouges humains. les couleurs utilis es pour les groupes de t te phospholipidiques sont celles introduites dans la figure 10-3. De plus, les glycolipides sont dessin s avec des groupes de t te polaires hexagonaux (bleu). Le cholest rol (non illustr ) est r parti peu pr s galement dans les deux monocouches. Les glycolipides se trouvent la surface de toutes les membranes plasmiques eucaryotesLes mol cules lipidiques contenant du sucre appel es glycolipides ont l'asym trie la plus extr me dans leur membrane Distribution : ces mol cules, que ce soit dans la membrane plasmique ou dans les membranes intracellulaires, se trouvent exclusivement dans la monocouche oppos e au cytosol. Dans les cellules animales, ils sont fabriqu s partir de sphingosine, tout comme la sphingomy line (voir Figure 10-3). Ces mol cules intrigantes ont tendance s'auto-associer, en partie par des liaisons hydrog ne entre leurs sucres et en partie par les forces de van der Waals entre leurs cha nes d'hydrocarbures longues et droites, ce qui les am ne se r partir pr f rentiellement en phases de radeau lipidique (voir Figure 10-13). La distribution asym trique des glycolipides dans la bicouche r sulte de l'ajout de groupes sucre aux mol cules lipidiques dans la lumi re de l'appareil de Golgi. Ainsi, le compartiment dans lequel ils sont fabriqu s est topologiquement quivalent l'ext rieur de la cellule (discut au chapitre 12). Lorsqu'ils sont achemin s vers la membran
Biologie moléculaire de la cellule	e plasmique, les groupes de sucre sont expos s la surface de la cellule (voir Figure 10-15), o ils jouent un r le important dans les interactions de la cellule avec son environnement. Les glycolipides sont probablement pr sents dans toutes les membranes plasmiques des cellules eucaryotes, o ils constituent g n ralement environ 5 % des mol cules lipidiques de la monocouche externe. On les trouve galement dans certaines membranes intracellulaires. Les glycolipides les plus complexes, les gangliosides, contiennent des oligosaccharides avec une ou plusieurs fractions d'acide sialique, qui donnent aux gangliosides une charge n gative nette (Figure 10 16). Les plus abondants des plus de 40 gangliosides diff rents qui ont t identifi s se trouvent dans la membrane plasmique des cellules nerveuses, o les gangliosides constituent 5 10 % de la masse lipidique totale ; On les trouve galement en quantit s beaucoup plus faibles dans d'autres types de cellules. Des indices sur les fonctions des glycolipides proviennent de leur localisation. Dans la membrane plasmique des cellules pith liales, par exemple, les glycolipides sont confin s la surface apicale expos e, o ils peuvent aider prot ger la membrane contre les conditions difficiles qui s'y trouvent fr quemment (telles qu'un faible pH et des concentrations lev es d'enzymes d gradantes). Les glycolipides charg s, tels que les gangliosides, peuvent tre importants en raison de leurs effets lectriques : leur pr sence modifie le champ lectrique travers la membrane et les concentrations d'ions, en particulier Ca2+, la surface de la membrane. Les glycolipides fonctionnent galement dans les processus de reconnaissance cellulaire, Figure 10 16 Mol cules de glycolipides. (A) Le galactoc r broside est appel glycolipide neutre parce que le sucre qui forme son groupe t te n'est pas charg . (B) Un ganglioside contient toujours un ou plusieurs groupuscules d'acide sialique charg s n gativement. Il existe diff rents types d'acide sialique ; dans les cellules humaines, il s'agit principalement de l'acide N-ac tylneuraminique, ou nAnA), dont la structure est illustr e en (c). Alors que chez les bact ries et les plantes, presque tous les glycolipides sont d riv s du glyc rol, comme le sont la plupart des phospholipides, dans les cellules animales, presque tous les glycolipides sont bas s sur la sphingosine, comme c'est le cas pour la sphingomy line (voir Figure 10-3). gal = galactose ; glc = glucose, galnAc = N-ac tylgalactosamine ; Ces trois sucres ne sont pas charg s. dans lequel les prot ines de liaison aux glucides li es la membrane (lectines) se lient aux groupes sucre sur les glycolipides et les glycoprot ines dans le processus d'adh sion cellule-cellule (discut au chapitre 19). Les souris mutantes qui sont d ficientes dans tous leurs gangliosides complexes pr sentent des anomalies du syst me nerveux, notamment une d g n rescence axonale et une my linisation r duite. Certains glycolipides fournissent des points d'entr e pour certaines toxines bact riennes et virus. Le ganglioside GM1 (voir Figure 10-16), par exemple, agit comme un r cepteur de surface cellulaire pour la toxine bact rienne qui cause la diarrh e d bilitante du chol ra. La toxine chol rique ne se lie et ne p n tre que dans les cellules qui ont GM1 leur surface, y compris les cellules pith liales intestinales. Son entr e dans une cellule entra ne une augmentation prolong e de la concentration d'AMP cyclique intracellulaire (discut e au chapitre 15), qui son tour provoque un important efflux de Cl , conduisant la s cr tion de Na+, K+, HCO3 et d'eau dans l'intestin. Les polyomavirus p n trent galement dans la cellule apr s s' tre initialement li s aux gangliosides. Les membranes biologiques sont constitu es d'une double couche continue de mol cules lipidiques dans laquelle les prot ines membranaires sont int gr s. Cette bicouche lipidique est fluide, les mol cules lipidiques individuelles tant capables de diffuser rapidement au sein de leur propre monocouche. Les mol cules lipidiques membranaires sont amphiphiles. Lorsqu'ils sont plac s dans l'eau, ils s'assemblent spontan ment en deux couches, qui forment des compartiments scell s. Bien que les membranes cellulaires puissent contenir des centaines d'esp ces lipidiques diff rentes, la membrane plasmique des cellules animales contient trois classes principales : les phospholipides, le cholest rol et les glycolipides. En raison de leur structure de squelette diff rente, les phospholipides se divisent en deux sous-classes : les phosphoglyc rides et les sphingolipides. Les compositions lipidiques des monocouches internes et externes sont diff rentes, refl tant les diff rentes fonctions des deux faces d'une membrane cellulaire. Diff rents m langes de lipides se trouvent dans les membranes de cellules de diff rents types, ainsi que dans les diff rentes membranes d'une seule cellule eucaryote. Les phospholipides d'inositol sont u
Biologie moléculaire de la cellule	ne classe mineure de phospholipides, qui dans le feuillet cytosolique de la bicouche lipidique de la membrane plasmique joue un r le important dans la signalisation cellulaire : en r ponse aux signaux extracellulaires, des kinases lipidiques sp cifiques phosphorylent les groupes de t te de ces lipides pour former des sites d'amarrage pour les prot ines de signalisation cytosoliques, tandis que les phospholipases sp cifiques clivent certains phospholipides d'inositol pour g n rer de petites mol cules de signalisation intracellulaire. Bien que la bicouche lipidique fournisse la structure de base des membranes biologiques, les prot ines membranaires remplissent la plupart des t ches sp cifiques de la membrane et conf rent donc chaque type de membrane cellulaire ses propri t s fonctionnelles caract ristiques. En cons quence, les quantit s et les types de prot ines dans une membrane sont tr s variables. Dans la membrane de my line, qui sert principalement d'isolant lectrique pour les axones des cellules nerveuses, moins de 25% de la masse membranaire est constitu e de prot ines. En revanche, dans les membranes impliqu es dans la production d'ATP (telles que les membranes internes des mitochondries et des chloroplastes), environ 75% est constitu de prot ines. Une membrane plasmique typique se situe quelque part entre les deux, les prot ines repr sentant environ la moiti de sa masse. Cependant, comme les mol cules lipidiques sont petites par rapport aux mol cules de prot ines, il y a toujours beaucoup plus de mol cules lipidiques que de mol cules prot iques dans les membranes cellulaires environ 50 mol cules lipidiques pour chaque mol cule prot ique dans les membranes cellulaires qui contiennent 50% de prot ines en masse. Les prot ines membranaires varient consid rablement en structure et dans la fa on dont elles s'associent la bicouche lipidique, ce qui refl te leurs diverses fonctions. Les prot ines membranaires peuvent tre associ es la bicouche lipidique de diverses mani res La figure 10-17 montre les diff rentes fa ons dont les prot ines peuvent s'associer la membrane. Comme leurs voisines lipidiques, les prot ines membranaires sont amphiphiles, ayant des r gions hydrophobes et hydrophiles. De nombreuses prot ines membranaires s' tendent travers la bicouche lipidique, et sont donc appel es prot ines transmembranaires, avec une partie de leur masse de chaque c t (Figure 10-17, exemples 1, 2 et 3). Leurs r gions hydrophobes traversent la membrane et interagissent avec les queues hydrophobes des mol cules lipidiques l'int rieur de la bicouche, o elles sont s questr es loin de l'eau. Leurs r gions hydrophiles sont expos es l'eau de chaque c t de la membrane. La fixation covalente d'une cha ne d'acides gras qui s'ins re dans la monocouche cytosolique de la bicouche lipidique augmente l'hydrophobicit de certaines de ces prot ines transmembranaires (voir Figure 10 17, exemple 1). D'autres prot ines membranaires sont enti rement situ es dans le cytosol et sont attach es la monocouche cytosolique de la bicouche lipidique, soit par une h lice amphiphile expos e la surface de la prot ine (Figure 10 17, exemple 4), soit par une ou plusieurs cha nes lipidiques attach es de mani re covalente (Figure 10 17, exemple 5). D'autres prot ines membranaires sont enti rement expos es la surface externe de la cellule, n' tant attach es la bicouche lipidique que par une liaison covalente (via un oligosaccharide sp cifique) un ancrage lipidique dans la monocouche externe de la membrane plasmique (Figure 10-17, exemple 6). Les prot ines li es aux lipides de l'exemple 5 de la figure 10-17 sont fabriqu es sous forme de prot ines solubles dans le cytosol et sont ensuite ancr es la membrane par la fixation covalente du groupe lipidique. Les prot ines de l'exemple 6, cependant, sont fabriqu es sous forme de prot ines membranaires passage unique dans le r ticulum endoplasmique (RE). Alors qu'elle est encore dans le RE, le segment transmembranaire de la prot ine est cliv et une ancre de glycosylphosphatidylinositol (GPI) est ajout e, laissant la prot ine li e la surface non cytosolique de la membrane du RE uniquement par cette ancre (discut e au chapitre 12) ; Les v sicules de transport finissent par livrer la prot ine au plasma membrane (voir le chapitre 13). Contrairement ces exemples, les prot ines associ es la membrane ne s' tendent pas du tout dans l'int rieur hydrophobe de la bicouche lipidique ; elles sont plut t li es l'une ou l'autre face de la membrane par des interactions non covalentes avec d'autres prot ines membranaires (Figure 10-17, exemples 7 et 8). De nombreuses prot ines de ce type peuvent tre lib r es de la membrane par des proc dures d'extraction relativement douces, telles que l'exposition des solutions de force ionique tr s lev e ou faible ou de pH extr me, qui interf rent avec les interactions prot ine-prot ine mais laissent la bicouche lipidique intacte ; Ces
Biologie moléculaire de la cellule	prot ines sont souvent appel es prot ines membranaires p riph riques. Les prot ines transmembranaires et de nombreuses prot ines maintenues dans la bicouche par des groupes lipidiques ou des r gions polypeptidiques hydrophobes qui s'ins rent dans le noyau hydrophobe de la bicouche lipidique ne peuvent pas tre lib r es de ces mani res. Les ancres lipidiques contr lent la localisation membranaire de certaines prot ines de signalisation La fa on dont une prot ine membranaire est associ e la bicouche lipidique refl te la fonction de la prot ine. Seules les prot ines transmembranaires peuvent fonctionner des deux c t s de Figure 10 17 Diverses fa ons dont les prot ines s'associent la bicouche lipidique. On pense que la plupart des prot ines membranaires s' tendent travers la bicouche sous la forme (1) d'une seule h lice , (2) de plusieurs h lices ou (3) d'une feuille de enroul e (un baril ). Certaines de ces prot ines passage unique et passages multiples ont une cha ne d'acides gras attach e de mani re covalente ins r e dans la monocouche lipidique cytosolique (1). Les autres prot ines membranaires ne sont expos es que d'un seul c t de la membrane. (4) Certains d'entre eux sont ancr s la surface cytosolique par une h lice amphiphile qui se r partit dans la monocouche cytosolique de la bicouche lipidique travers la face hydrophobe de l'h lice. (5) D'autres sont attach s la bicouche uniquement par une cha ne lipidique li e de mani re covalente soit une cha ne d'acides gras, soit un groupe pr nyle (voir Figure 10-18) dans la monocouche cytosolique ou, (6) via un agent de liaison oligosaccharide, au phosphatidylinositol dans la monocouche non cytosolique appel e ancre gpI. (7, 8) Enfin, les prot ines associ es la membrane ne sont attach es la membrane que par des interactions non covalentes avec d'autres prot ines membranaires. la mani re dont la structure en (5) est form e est illustr e la figure 10 18, tandis que la mani re dont l'ancre gpI illustr e en (6) est form e est illustr e la figure 12 52. Les d tails de la fa on dont les prot ines membranaires sont associ es la bicouche lipidique sont discut s au chapitre 12. la bicouche ou les mol cules de transport travers elle. Les r cepteurs de surface cellulaire, par exemple, sont g n ralement des prot ines transmembranaires qui lient des mol cules de signal dans l'espace extracellulaire et g n rent diff rents signaux intracellulaires de l'autre c t de la membrane plasmique. Pour transf rer de petites mol cules hydrophiles travers une membrane, une prot ine de transport membranaire doit fournir un chemin permettant aux mol cules de traverser la barri re de perm abilit hydrophobe de la bicouche lipidique ; l'architecture mol culaire des prot ines transmembranaires multipasses (figures 10 17, exemples 2 et 3) est parfaitement adapt e cette t che, comme nous le verrons au chapitre 11. Les prot ines qui ne fonctionnent que d'un seul c t de la bicouche lipidique, en revanche, sont souvent associ es exclusivement la monocouche lipidique ou un domaine prot ique de ce c t . Certaines prot ines de signalisation intracellulaires, par exemple, qui aident relayer les signaux extracellulaires l'int rieur de la cellule, sont li es la moiti cytosolique de la membrane plasmique par un ou plusieurs groupes lipidiques attach s de mani re covalente, qui peuvent tre des cha nes d'acides gras ou des groupes pr nyles (Figure 10 18). Dans certains cas, l'acide myristique, un acide gras satur 14 carbones, est ajout au groupe amino-terminal N-terminal de la prot ine lors de sa synth se sur un ribosome. Tous les membres de la famille Src des prot ines tyrosine kinases cytoplasmiques (discut es au chapitre 15) sont myristoyl s de cette mani re. Cependant, l'attachement la membrane par le biais d'une seule ancre lipidique n'est pas tr s fort, et un deuxi me groupe lipidique est souvent ajout pour ancrer plus fermement les prot ines une membrane. Pour la plupart des kinases Src, la deuxi me modification lipidique est la fixation de l'acide palmitique, un acide gras satur 16 carbones, une cha ne lat rale cyst ine de la prot ine. Cette modification se produit en r ponse un signal extracellulaire et aide recruter les kinases dans la membrane plasmique. Lorsque la voie de signalisation est d sactiv e, l'acide palmitique est limin , ce qui permet la kinase de retourner dans le cytosol. D'autres prot ines de signalisation intracellulaires, telles que les petites GTPases de la famille Ras (discut es au chapitre 15), utilisent une combinaison de groupe pr nyle et de fixation de l'acide palmitique pour recruter les prot ines la membrane plasmique. De nombreuses prot ines se fixent aux membranes de mani re transitoire. Certaines sont des prot ines membranaires p riph riques classiques qui s'associent aux membranes par des interactions prot ine-prot ine r gul es. D'autres subissent une transition de p
Biologie moléculaire de la cellule	rot ine soluble prot ine membranaire par un changement de conformation qui expose un peptide hydrophobe ou une ancre lipidique attach e de mani re covalente. De nombreuses petites GTPases de la famille des prot ines Rab qui r gulent le trafic membranaire intracellulaire (discut es au chapitre 13), par exemple, commutent en fonction du nucl otide li la prot ine. Dans leur tat li au GDP, ils sont solubles et libres dans le cytosol, tandis que dans leur tat li au GTP, leur ancre lipidique est expos e et les attache aux membranes. Il s'agit de Figure 10 18 Fixation des prot ines membranaires par une cha ne d'acides gras ou un groupe pr nyle. La fixation covalente de l'un ou l'autre type de lipide peut aider localiser une prot ine hydrosoluble dans une membrane apr s sa synth se dans le cytosol. (A) Une cha ne d'acides gras (acide myristique) est attach e par une liaison amide une glycine n-terminale. (B) Une cha ne d'acides gras (acide palmitique) est attach e par une liaison thioester une cyst ine. (c) Une cha ne pr nyle (soit farn syle, soit une cha ne g ranylg ranyl plus longue) est attach e par une liaison thio ther un r sidu cyst ine qui est initialement situ quatre r sidus de l'extr mit c-terminale de la prot ine. Apr s la pr nylation, les trois acides amin s terminaux sont cliv s et le nouveau c-terminal est m thyl avant l'insertion de l'ancre dans la membrane (non illustr ). les structures des ancres lipidiques sont illustr es ci-dessous : (D) une ancre myristoyle (d riv e d'une cha ne d'acides gras satur s 14 carbones), (e) une ancre palmitoyle (une cha ne d'acides gras satur s 16 atomes de carbone) et (F) une ancre farn syle (une cha ne d'hydrocarbures insatur s 15 atomes de carbone). Figure 10 19 : un segment d'une cha ne polypeptidique membranaire traversant la bicouche lipidique en tant qu'h lice . Seul le squelette -carbone de la cha ne polypeptidique est repr sent , avec les acides amin s hydrophobes en vert et jaune. Le segment polypeptidique repr sent fait partie du centre de r action photosynth tique bact rien, dont la structure a t d termin e par diffraction des rayons X. (D'apr s les donn es de J. Deisenhofer et al., Nature 318:618-624, 1985, et H. Michel et al., EMBO J. 5:1149-1158, 1986.) des prot ines membranaires un moment et des prot ines solubles l'autre. De telles interactions hautement dynamiques largissent consid rablement le r pertoire des fonctions membranaires. Dans la plupart des prot ines transmembranaires, la cha ne polypeptidique traverse la bicouche lipidique dans une conformation -h lico dale Une prot ine transmembranaire a toujours une orientation unique dans la membrane. Cela refl te la fois la mani re asym trique dont il est ins r dans la bicouche lipidique du RE lors de sa biosynth se (discut e au chapitre 12) et les diff rentes fonctions de ses domaines cytosolique et non cytosolique. Ces domaines sont s par s par les segments membranaires de la cha ne polypeptidique, qui entrent en contact avec l'environnement hydrophobe de la bicouche lipidique et sont compos s en grande partie d'acides amin s avec des cha nes lat rales non polaires. Parce que les liaisons peptidiques elles-m mes sont polaires et parce que l'eau est absente, toutes les liaisons peptidiques de la bicouche sont entra n es former des liaisons hydrog ne les unes avec les autres. La liaison hydrog ne entre les liaisons peptidiques est maximis e si la cha ne polypeptidique forme une h lice r guli re lorsqu'elle traverse la bicouche, et c'est ainsi que la plupart des segments membranaires des cha nes polypeptidiques traversent la bicouche (Figure 10 19). Dans les prot ines transmembranaires passage unique, la cha ne polypeptidique ne se croise qu'une seule fois (voir Figure 10-17, exemple 1), tandis que dans les prot ines transmembranaires passage unique, la cha ne polypeptidique se croise plusieurs fois (voir Figure 10-17, exemple 2). Une autre fa on pour les liaisons peptidiques dans la bicouche lipidique de satisfaire leurs exigences en mati re de liaisons hydrog ne consiste ce que plusieurs brins transmembranaires d'une cha ne polypeptidique soient dispos sous la forme d'une feuille qui est enroul e dans un cylindre (ce que l'on appelle un tonneau ; voir figure 10-17, exemple 3). Cette architecture prot ique est observ e dans le Figure 10 20 Utilisation de graphiques d'hydropathie pour poriner les prot ines dont nous parlerons plus loin. Les progr s de la cristallographie aux rayons X des prot ines membranaires ont permis de d terminer la structure tridimensionnelle de beaucoup d'entre elles. Les structures confirment qu'il est souvent possible de pr dire partir de la s quence d'acides amin s de la prot ine quelles parties de la cha ne polypeptidique s' tendent travers la bicouche lipidique. Les segments contenant environ 20 30 acides amin s, avec un degr lev d'hydrophobie, sont suffisamment longs pour couvrir une bicouche lipi
Biologie moléculaire de la cellule	dique en tant qu'h lice , et ils peuvent souvent tre identifi s dans les graphiques d'hydropathie (Figure 10-20). partir de ces parcelles, on estime qu'environ 30% 0 50 100 0 100 200 Rev. Biochem. 53:595 624, 1984. Avec la permission du nombre d'acides amin s des revues annuelles.) localiser des segments potentiels de membrane -h lico dale dans une cha ne polypeptidique. L' nergie libre n cessaire pour transf rer les segments successifs d'une cha ne polypeptidique d'un solvant non polaire l'eau est calcul e partir de la composition en acides amin s de chaque segment l'aide de donn es obtenues partir de compos s mod les. Ce calcul est effectu pour des segments de taille fixe (g n ralement autour de 10 20 acides amin s), en commen ant par chaque acide amin successif de la cha ne. l' indice d'hydropathie du segment est trac sur l'axe des Y en fonction de sa position dans la cha ne. Une valeur positive indique que de l' nergie libre est n cessaire pour le transfert vers l'eau (c'est- -dire que le segment est hydrophobe), et la valeur attribu e est un indice de la quantit d' nergie n cessaire. Les pics de l'indice d'hydropathie apparaissent aux positions des segments hydrophobes dans la s quence d'acides amin s. Trac s d'hydropathie (A et B) pour deux prot ines membranaires qui sont discut s plus loin dans ce chapitre. La glycophorine (A) a une seule h lice couvrant la membrane et un pic correspondant dans le graphique de l'hydropathie. La bact riorhodopsine (B) pr sente sept h lices de membranaires et sept pics correspondants dans le graphique d'hydropathie. (A, adapt de D. eisenberg, Annu. des prot ines d'un organisme sont des prot ines transmembranaires, ce qui souligne leur importance. Les trac s d'hydropathie ne peuvent pas identifier les segments membranaires d'un baril de , car 10 acides amin s ou moins sont suffisants pour traverser une bicouche lipidique en tant que brin tendu et seule une autre cha ne lat rale d'acides amin s est hydrophobe. La forte volont de maximiser la liaison hydrog ne en l'absence d'eau signifie qu'une cha ne polypeptidique qui p n tre dans la bicouche lipidique est susceptible de la traverser enti rement avant de changer de direction, car la flexion de la cha ne n cessite une perte d'interactions r guli res de liaison hydrog ne. Mais les prot ines transmembranaires multipasses peuvent galement contenir des r gions qui se replient dans la membrane de chaque c t , se comprimant dans les espaces entre les h lices transmembranaires sans entrer en contact avec le noyau hydrophobe de la bicouche lipidique. tant donn que ces r gions n'interagissent qu'avec d'autres r gions polypeptidiques, elles n'ont pas besoin de maximiser les liaisons hydrog ne ; ils peuvent donc avoir une vari t de structures secondaires, y compris des h lices qui ne s' tendent que partiellement travers la bicouche lipidique (Figure 10-21). De telles r gions sont importantes pour la fonction de certaines prot ines membranaires, y compris les prot ines de canaux d'eau et de canaux ioniques, dans lesquelles les r gions contribuent aux parois des pores traversant la membrane et conf rent une sp cificit de substrat aux canaux, comme nous le verrons au chapitre 11. Ces r gions ne peuvent pas tre identifi es dans les graphiques d'hydropathie et ne sont r v l es que par la cristallographie aux rayons X ou la cristallographie lectronique (une technique similaire la diffraction des rayons X mais r alis e sur des r seaux bidimensionnels de prot ines) de la structure tridimensionnelle de la prot ine. les h lices transmembranaires interagissent souvent les unes avec les autres Les h lices transmembranaires de nombreuses prot ines membranaires passage unique ne contribuent pas au repliement des domaines prot iques de chaque c t de la membrane. Par cons quent, il est souvent possible de modifier les cellules pour qu'elles ne produisent que les domaines cytosoliques ou extracellulaires de ces prot ines sous forme de mol cules hydrosolubles. Cette approche s'est av r e inestimable pour l' tude de la structure et de la fonction de ces domaines, en particulier les domaines des prot ines r ceptrices transmembranaires (discut es au chapitre 15). Cependant, une h lice transmembranaire, m me dans une prot ine membranaire passage unique, fait souvent plus que simplement ancrer la prot ine au lipide bicouche. De nombreuses prot ines membranaires passage unique forment des h t rodim res homo des qui sont maintenus ensemble par des interactions non covalentes, mais fortes et tr s sp cifiques, entre les deux h lices transmembranaires ; La s quence des acides amin s hydrophobes de ces h lices contient l'information qui dirige l'interaction prot ine-prot ine. De m me, les h lices transmembranaires dans les prot ines membranaires multipasses occupent des positions sp cifiques dans la structure prot ique repli e qui sont d termin es par les interactions entre les h lices voisine
Biologie moléculaire de la cellule	s. Ces interactions sont cruciales pour la structure et la fonction des nombreux canaux et transporteurs qui d placent les mol cules travers les membranes cellulaires. Dans ces prot ines, les h lices transmembranaires voisines dans la structure repli e de la prot ine prot gent de nombreuses autres h lices transmembranaires des lipides membranaires. Pourquoi, alors, ces h lices prot g es sont-elles n anmoins compos es principalement d'acides amin s hydrophobes ? La r ponse r side dans la mani re dont les prot ines multi-passes sont int gr es dans la membrane lors de leur biosynth se. Comme nous l'expliquons au chapitre 12, les h lices transmembranaires sont ins r es s quentiellement dans la bicouche lipidique par un translocateur prot ique. Apr s avoir quitt le translocateur, chaque h lice est entour e transitoirement de lipides, ce qui n cessite que l'h lice soit hydrophobe. Ce n'est que lorsque la prot ine se replie dans sa structure finale que des contacts sont tablis entre les h lices adjacentes, et que les contacts prot ine-prot ine remplacent certains des contacts prot ine-lipide (Figure 10-22). Les prot ines membranaires multipasses dont les segments transmembranaires sont dispos s en barils plut t qu'en h lices sont relativement rigides et ont donc tendance former facilement des cristaux lorsqu'elles sont isol es. Ainsi, certains d'entre eux ont t parmi les premiers Figure 10 21 Deux courtes h lices dans le canal d'eau de l'aquaporine, chacune d'entre elles ne s' tendant qu' mi-chemin de la bicouche lipidique. Dans la membrane plasmique, quatre monom res, dont l'un est repr sent ici, forment un t tram re. chaque monom re a un pore hydrophile en son centre, ce qui permet aux mol cules d'eau de traverser la membrane en file indienne (voir la figure 11-20 et la vid o 11.6). Les deux courtes h lices color es sont enterr es une interface form e par des interactions prot ine-prot ine. Le m canisme par lequel le canal permet le passage des mol cules d'eau est discut plus en d tail au chapitre 11. Structures prot iques membranaires multipasses d terminer par cristallographie aux rayons X. Le nombre de brins de dans un canon varie consid rablement, allant de 8 brins 22 (figures 10 23). Les prot ines sont abondantes dans les membranes externes des bact ries, des mitochondries et des chloroplastes. Certaines sont des prot ines formant des pores, qui cr ent des canaux remplis d'eau qui permettent de petites mol cules hydrophiles s lectionn es de traverser la membrane. Les porines sont des exemples bien tudi s (exemple 3 dans la figure 10-23C). De nombreux barils en porine sont form s d'une feuille de antiparall le 16 brins enroul e dans une structure cylindrique. Des cha nes lat rales d'acides amin s polaires tapissent le canal aqueux l'int rieur, tandis que des cha nes lat rales non polaires font saillie de l'ext rieur du canon pour interagir avec le noyau hydrophobe de la bicouche lipidique. Les boucles de la cha ne polypeptidique font souvent saillie dans la lumi re du canal, le r tr cissant de sorte que seuls certains solut s peuvent passer. Certaines porines sont donc tr s s lectives : la maltoporine, par exemple, permet pr f rentiellement au maltose et aux oligom res de maltose de traverser la membrane externe d'E. coli. La prot ine FepA est un exemple plus complexe de prot ine de transport en baril (Figure 10 23D). Il transporte les ions fer travers la membrane externe bact rienne. Il est construit partir de 22 brins de , et un grand domaine globulaire remplit compl tement l'int rieur du canon. Les ions fer se lient ce domaine, qui, par un m canisme inconnu, se d place ou change sa conformation pour transf rer le fer travers la membrane. Toutes les prot ines -barrel ne sont pas des prot ines de transport. Certains forment des barils plus petits qui sont compl tement remplis de cha nes lat rales d'acides amin s qui se projettent au centre du baril. Ces prot ines fonctionnent comme des r cepteurs ou des enzymes (figures 10 23A et B) ; Le baril sert d'ancrage rigide, qui maintient la prot ine dans la membrane et oriente les boucles cytosoliques qui forment des sites de liaison pour des mol cules intracellulaires sp cifiques. La plupart des prot ines membranaires multipasses dans les cellules eucaryotes et dans la membrane plasmique bact rienne sont construites partir d'h lices transmembranaires. Les h lices Figure 10 22 tapes du repliement d'une prot ine transmembranaire multipasse. Lorsqu'une h lice transmembranaire nouvellement synth tis e est lib r e dans la bicouche lipidique, elle est initialement entour e de mol cules lipidiques. Au fur et mesure que la prot ine se replie, les contacts entre les h lices d placent certaines des mol cules lipidiques entourant les h lices. Figure 10 23 barils form s de diff rents nombres de brins de . (A) la prot ine OmpA d'E. coli sert de r cepteur un virus bact rien. (B) la prot ine OMplA
Biologie moléculaire de la cellule	d'E. coli est une enzyme (une lipase) qui hydrolyse les mol cules lipidiques. Les acides amin s qui catalysent la r action enzymatique (en rouge) d passent de la surface ext rieure du baril. (c) Une porine de la bact rie Rhodobacter capsulatus forme un pore rempli d'eau travers la membrane externe. Le diam tre du canal est limit par des boucles (en bleu) qui font saillie dans le canal. (D) la prot ine FepA d'E. coli transporte des ions fer. L'int rieur du baril est compl tement rempli par un domaine prot ique globulaire (en bleu) qui contient un site de liaison au fer (non illustr ). Figure 10 24 : une prot ine transmembranaire passage unique. Notez que la cha ne polypeptidique traverse la bicouche lipidique sous la forme d'une h lice droite et que les cha nes oligosaccharidiques et les liaisons disulfure se trouvent toutes sur la surface non cytosolique de la membrane. les groupes sulfhydryles dans le domaine cytosolique de la prot ine ne forment normalement pas de liaisons disulfure car l'environnement r ducteur dans le cytosol maintient ces groupes dans leur forme r duite ( Sh). peuvent glisser les unes contre les autres, permettant des changements conformationnels dans la prot ine qui peuvent ouvrir et fermer des canaux ioniques, transporter des solut s ou transduire des signaux extracellulaires en signaux intracellulaires. Dans les prot ines baril , en revanche, les liaisons hydrog ne lient chaque brin de mani re rigide ses voisins, ce qui rend peu probables les changements de conformation l'int rieur de la paroi du baril. La plupart des prot ines transmembranaires des cellules animales sont glycosyl es. Comme dans les glycolipides, les r sidus de sucre sont ajout s dans la lumi re du RE et de l'appareil de Golgi (discut s dans les chapitres 12 et 13). Pour cette raison, les cha nes d'oligosaccharides sont toujours pr sentes du c t non cytosolique de la membrane. Une autre diff rence importante entre les prot ines (ou les parties de prot ines) des deux c t s de la membrane r sulte de l'environnement r ducteur du cytosol. Cet environnement diminue la probabilit que des liaisons disulfure (S-S) intracha ne ou intercha ne se forment entre les cyst ines du c t cytosolique des membranes. Ces liaisons se forment du c t non cytosolique, o elles peuvent aider stabiliser soit la structure repli e de la cha ne polypeptidique, soit son association avec d'autres cha nes polypeptidiques (Figure 10 24). Parce que la partie extracellulaire de la plupart des prot ines de la membrane plasmique est glycosyl e, les glucides recouvrent largement la surface de toutes les cellules eucaryotes. Ces glucides se pr sentent sous la forme de cha nes d'oligosaccharides li es de mani re covalente aux prot ines membranaires (glycoprot ines) et aux lipides (glycolipides). Ils se pr sentent galement sous la forme de cha nes polysaccharidiques de mol cules de prot oglycanes membranaires int grales. Les prot oglycanes, qui consistent en de longues cha nes polysaccharidiques li es de mani re covalente un noyau prot ique, se trouvent principalement l'ext rieur de la cellule, dans le cadre de la matrice extracellulaire (voir le chapitre 19). Mais, pour certains prot oglycanes, le noyau prot ique s' tend travers la bicouche lipidique ou est attach la bicouche par une ancre de glycosylphosphatidylinositol (GPI). Les termes enveloppe cellulaire ou glycocalyx sont parfois utilis s pour d crire la zone riche en glucides la surface de la cellule. Cette couche de glucides peut tre visualis e par diverses colorations, telles que le rouge de ruth nium (Figure 10 25A), ainsi que par son affinit pour les prot ines de liaison aux glucides appel es lectines, qui peuvent tre marqu es avec un colorant fluorescent ou un autre marqueur visible. Bien que la plupart des groupes de sucre soient li s des mol cules de membrane plasmique, la couche de glucides contient galement des glycoprot ines et des prot oglycanes qui ont t s cr t s dans l'espace extracellulaire puis adsorb s la surface de la cellule (Figure 10 25B). Beaucoup de ces macromol cules adsorb es sont des composants de la matrice extracellulaire, de sorte que la fronti re entre la membrane plasmique et la matrice extracellulaire n'est souvent pas clairement d finie. L'une des nombreuses fonctions de la couche de glucides est de prot ger les cellules contre les dommages m caniques et chimiques ; Il maintient galement diverses autres cellules distance, emp chant ainsi les interactions ind sirables entre cellules. Les cha nes lat rales oligosaccharidiques des glycoprot ines et des glycolipides sont extr mement diverses dans leur arrangement des sucres. Bien qu'ils contiennent g n ralement moins de 15 sucres, les cha nes sont souvent ramifi es et les sucres peuvent tre li s ensemble par divers types de liaisons covalentes, contrairement aux acides amin s d'une cha ne polypeptidique, qui sont tous li s par des liaisons peptidiques identiques.
Biologie moléculaire de la cellule	M me trois sucres peuvent tre assembl s pour former des centaines de trisaccharides diff rents. La diversit et la position expos e des oligosaccharides la surface des cellules les rendent particuli rement bien adapt s pour fonctionner dans des processus sp cifiques de reconnaissance cellulaire. Comme nous l'expliquons au chapitre 19, les lectines li es la membrane plasmique qui reconnaissent des oligosaccharides sp cifiques sur les glycolipides et les glycoprot ines la surface des cellules m dient une vari t de processus transitoires d'adh sion cellule-cellule, y compris ceux qui se produisent dans la recirculation des lymphocytes et les r ponses inflammatoires (voir Figure 19-28). En g n ral, seuls les agents qui perturbent les associations hydrophobes et d truisent la bicouche lipidique peuvent solubiliser les prot ines membranaires. Les plus utiles d'entre eux pour le biochimiste membranaire sont les d tergents, qui sont de petites mol cules amphiphiles de structure variable (Vid o 10.4). Les d tergents sont beaucoup plus solubles dans l'eau que les lipides. Leurs extr mit s polaires (hydrophiles) peuvent tre soit charg es (ioniques), comme dans le dod cylsulfate de sodium (SDS), soit non charg es (non ioniques), comme dans l'octylglucoside et le Triton (Figure 10-26A). faible concentration, les d tergents sont monom res en solution, mais lorsque leur concentration est augment e au-dessus d'un seuil, appel concentration micellaire critique (CMC), ils s'agr gent pour former des micelles (Figure 10-26B-D). Au-dessus de la CMC, les mol cules de d tergent diffusent rapidement dans et hors des micelles, maintenant la concentration de monom re dans la solution constante, quel que soit le nombre de micelles pr sentes. La CMC et le nombre moyen de mol cules de d tergent dans une micelle sont des propri t s caract ristiques de chaque d tergent, mais ils d pendent galement de la temp rature, du pH et de la concentration en sel. Les solutions d tergentes sont donc des syst mes complexes et difficiles tudier. Lorsqu'elles sont m lang es des membranes, les extr mit s hydrophobes des d tergents se lient aux r gions hydrophobes des prot ines membranaires, o elles d placent les mol cules lipidiques avec un collier de mol cules d tergentes. Depuis l'autre extr mit du d tergent Figure 10 25 La couche de glucides la surface de la cellule. (A) Cette micrographie lectronique de la surface d'un lymphocyte color au rouge de ruth nium met l'accent sur l' paisse couche riche en glucides qui entoure la cellule. (B) la couche de glucides est constitu e des cha nes lat rales oligosaccharidiques des glycolipides membranaires et des glycoprot ines membranaires et des cha nes polysaccharidiques des prot oglycanes membranaires. De plus, les glycoprot ines adsorb es et les prot oglycanes adsorb s (non illustr s) contribuent la couche de glucides dans de nombreuses cellules. Notez que tous les glucides se trouvent la surface extracellulaire de la membrane. (A, avec l'aimable autorisation d'Audrey M. glauert et G.M.W. COOK.) Figure 10 26 Structure et fonction des d tergents. (A) les trois d tergents couramment utilis s sont le dod cylsulfate de sodium (SDS), un d tergent anionique, et le triton X-100 et le -octylglucoside, deux d tergents non ioniques. Le triton X-100 est un m lange de compos s dans lequel la r gion entre parenth ses est r p t e entre 9 et 10 fois. La partie hydrophobe de chaque d tergent est indiqu e en jaune et la partie hydrophile est indiqu e en orange. (B) faible concentration, les mol cules de d tergent sont monom res en solution. Lorsque leur concentration augmente au-del de la concentration micellaire critique (cMc), certaines mol cules de d tergent forment des micelles. Notez que la concentration de monom re d tergent reste constante au-dessus de la cMc. (c) Parce qu'elles ont la fois des extr mit s polaires et non polaires, les mol cules de d tergent sont amphiphiles ; et parce qu'ils sont en forme de c ne, ils forment des micelles plut t que des bicouches (voir Figure 10-7). On pense que les micelles de d tergent ont des formes irr guli res et, en raison des contraintes d'emballage, les queues hydrophobes sont partiellement expos es l'eau. (D) le mod le de remplissage d'espace montre la structure d'une micelle compos e de 20 mol cules de -octylglucoside, pr dite par des calculs de dynamique mol culaire. Les groupes de t tes sont repr sent s en rouge et les queues hydrophobes en gris. (B, adapt de G. gunnarsson, B. J nsson et h. Wennerstr m, J. Phys. Chem. 84:3114 3121, 1980 ; c, d'apr s S. Bogusz, r.M. Venable et r.W. pastor, J. Phys. Chem. B 104:5462-5470, 2000.) mol cule est polaire, cette liaison tend mettre les prot ines membranaires en solution sous forme de complexes d tergents-prot ines (Figure 10 27). Habituellement, certaines mol cules lipidiques restent galement attach es la prot ine. Les d tergents ioniques puissants, tels que les SDS, peuvent solubi
Biologie moléculaire de la cellule	liser m me les prot ines membranaires les plus hydrophobes. Cela permet d'analyser les prot ines par lectrophor se sur polyacrylamide SDS (discut e au chapitre 8), une proc dure qui a r volutionn l' tude des prot ines. Cependant, ces d tergents puissants d p lent (d naturent) les prot ines en se liant leurs noyaux hydrophobes internes, rendant ainsi les prot ines inactives et inutilisables pour les tudes fonctionnelles. N anmoins, les prot ines peuvent tre facilement s par es et purifi es sous leur forme d natur e par le SDS. Dans certains cas, l' limination de la SDS permet la prot ine purifi e de se renaturer, avec r cup ration de l'activit fonctionnelle. De nombreuses prot ines membranaires peuvent tre solubilis es puis purifi es sous une forme active l'aide de d tergents doux. Ces d tergents couvrent les r gions hydrophobes sur les segments membranaires qui sont expos s apr s l' limination des lipides, mais ne d plient pas la prot ine. Si la concentration d tergente d'une solution de prot ines membranaires solubilis es est r duite (par dilution, par exemple), les prot ines membranaires ne restent pas solubles. Cependant, en pr sence d'un exc s de mol cules phospholipidiques dans une telle solution, les prot ines membranaires s'incorporent dans de petits liposomes qui se forment spontan ment. De cette fa on, les syst mes de prot ines membranaires fonctionnellement actifs peuvent tre reconstitu s partir de composants purifi s, ce qui constitue un moyen puissant d'analyser les activit s des transporteurs membranaires, des canaux ioniques, des r cepteurs de signalisation, etc. (Figure 10 28). Une telle reconstitution fonctionnelle, par exemple, a fourni la preuve de l'hypoth se selon laquelle les enzymes qui fabriquent ADDITION DE PHOSPHOLIPIDES (m lang s avecFigure 10 27 Solubilisation d'une prot ine membranaire avec un d tergent non ionique doux. Le d tergent perturbe la bicouche lipidique et met la prot ine en solution sous forme de complexes prot ine-lipide-d tergent. Les phospholipides de la membrane sont galement solubilis s par le d tergent, sous forme de micelles lipides-d tergents. Figure 10 28 L'utilisation de d tergents non ioniques doux pour solubiliser, purifier et reconstituer les syst mes prot iques membranaires fonctionnels. Dans cet exemple, les mol cules fonctionnelles de la pompe na+-K+ sont purifi es et incorpor es dans des v sicules phospholipidiques. cette pompe est pr sente dans la membrane plasmique de la plupart des cellules animales, o elle utilise l' nergie de l'hydrolyse Atp pour pomper le na+ hors de la cellule et le K+ vers l'int rieur, comme nous l'avons vu au chapitre 11. L'ATP (ATP synthases) utilise des gradients H+ dans les membranes mitochondriales, chloroplastes et bact riennes pour produire de l'ATP. Les prot ines membranaires peuvent galement tre reconstitu es partir d'une solution d tergente en nanodisques, qui sont de petites plaques de membrane de taille uniforme entour es d'une ceinture de prot ines, qui recouvre le bord expos de la bicouche pour maintenir le patch en solution (Figure 10-29). La ceinture est d riv e de lipoprot ines de haute densit (HDL), qui maintiennent les lipides solubles pour le transport dans le sang. Dans les nanodisques, la prot ine membranaire d'int r t peut tre tudi e dans son environnement lipidique natif et est accessible exp rimentalement partir de les deux c t s de la bicouche, ce qui est utile, par exemple, pour les exp riences de liaison de ligands. Les prot ines contenues dans les nanodisques peuvent galement tre analys es par des techniques de microscopie lectronique particule unique pour d terminer leur structure. Gr ce cette technique qui s'am liore rapidement (discut e au chapitre 9), la structure d'une prot ine membranaire peut tre d termin e haute r solution sans qu'il soit n cessaire que la prot ine d'int r t cristallise en un r seau r gulier, ce qui est souvent difficile r aliser pour les prot ines membranaires. Les d tergents ont galement jou un r le crucial dans la purification et la cristallisation des prot ines membranaires. Le d veloppement de nouveaux d tergents et de nouveaux syst mes d'expression qui produisent de grandes quantit s de prot ines membranaires partir de clones d'ADNc a conduit une augmentation rapide du nombre de structures tridimensionnelles de prot ines membranaires et de complexes prot iques connus, bien qu'ils soient encore peu nombreux par rapport aux structures connues des prot ines hydrosolubles et des complexes prot iques. La bact riorhodopsine est une pompe protons (h+) entra n e par la lumi re qui traverse la bicouche lipidique sous forme de sept h lices. Dans le chapitre 11, nous examinons comment les prot ines transmembranaires multipasses m dient le transport s lectif de petites mol cules hydrophiles travers les membranes cellulaires. Mais une compr hension d taill e du fonctionnement d'une telle prot ine de transport membran
Biologie moléculaire de la cellule	aire n cessite des informations pr cises sur sa structure tridimensionnelle dans la bicouche. La bact riorhodopsine a t la premi re prot ine de transport membranaire dont la structure a t d termin e, et elle est rest e le prototype de nombreuses prot ines membranaires multipasses avec une structure similaire. La membrane violette de l'arch on Halobacterium salinarum est une tache sp cialis e dans la membrane plasmique qui contient une seule esp ce de mol cule prot ique, la bact riorhodopsine (Figure 10-30A). La prot ine fonctionne comme une pompe H+ activ e par la lumi re qui transf re H+ hors de la cellule arch ale. Parce que les mol cules de bact riorhodopsine sont troitement emball es et dispos es en un cristal bidimensionnel plan (figures 10-30B et C), il a t possible de d terminer leur structure tridimensionnelle en combinant la microscopie lectronique et l'analyse par diffraction des lectrons, une proc dure appel e cristallographie lectronique, que nous avons Figure 10 29 Mod le d'une prot ine membranaire reconstitu e en un nanodisque. Lorsque le d tergent est retir d'une solution contenant une prot ine membranaire multipasse, des lipides et une sous-unit prot ique de la lipoprot ine de haute densit (hDl), la prot ine membranaire s'incruste dans une petite partie de la bicouche lipidique, qui est entour e d'une ceinture de la prot ine hDl. Dans de tels nanodisques, les bords hydrophobes de la tache bicouche sont prot g s par la ceinture prot ique, ce qui rend l'assemblage soluble dans l'eau. mentionn pr c demment. Cette m thode a fourni les premi res vues structurelles de nombreuses prot ines membranaires qui se sont av r es difficiles cristalliser partir de solutions d tergentes. Pour la bact riorhodopsine, la structure a ensuite t confirm e et tendue tr s haute r solution par cristallographie aux rayons X. Chaque mol cule de bact riorhodopsine est pli e en sept h lices transmembranaires troitement serr es et contient un seul groupe absorbant la lumi re, ou chromophore (dans ce cas, r tinal), qui donne la prot ine sa couleur violette. Le r tinien est de la vitamine A sous sa forme ald hyde et est identique au chromophore pr sent dans la rhodopsine des cellules photor ceptrices de l' il des vert br s (discut au chapitre 15). La r tine est li e de mani re covalente une cha ne lat rale de lysine de la prot ine bact riorhodopsine. Lorsqu'il est activ par un seul photon de lumi re, le chromophore excit change de forme et provoque une s rie de petits changements conformationnels dans la prot ine, entra nant le transfert d'un H+ de l'int rieur vers l'ext rieur de la cellule (Figure 10 31A). En pleine lumi re, chaque mol cule de bact riorhodopsine peut pomper plusieurs centaines de protons par seconde. Le transfert de protons induit par la lumi re tablit un gradient H+ travers la membrane plasmique, qui son tour entra ne la production d'ATP par une deuxi me prot ine dans la membrane plasmique de la cellule. L' nergie stock e dans le gradient H+ entra ne galement d'autres processus n cessitant de l' nergie dans la cellule. Ainsi, la bact riorhodopsine convertit l' nergie solaire en un gradient H+, qui fournit de l' nergie la cellule arch enne. La structure cristalline haute r solution de la bact riorhodopsine r v le de nombreuses mol cules lipidiques li es des endroits sp cifiques la surface de la prot ine (Figure 10-31B). noyau hydrophobe de la bicouche lipidique (3 nm) Figure 10 30 Plaques de membrane violette, qui contiennent de la bact riorhodopsine chez l'arch on Halobacterium salinarum. (A) ces arch es vivent dans des mares d'eau sal e, o elles sont expos es la lumi re du soleil. Ils ont d velopp une vari t de prot ines activ es par la lumi re, y compris la bact riorhodopsine, qui est une pompe H+ activ e par la lumi re dans la membrane plasmique. (B) les mol cules de bact riorhodopsine dans les plaques membranaires violettes sont troitement regroup es dans des r seaux cristallins bidimensionnels. (c) D tails de la surface mol culaire visualis s par microscopie force atomique. Avec cette technique, des mol cules individuelles de bact riorhodopsine peuvent tre observ es. (D) Aper u de l'emplacement approximatif du monom re de la bact riorhodopsine et des h lices individuelles dans l'image illustr e en (c). (B c, avec l'aimable autorisation de Dieter Oesterhelt ; D, code pDB : 2BrD.) Figure 10 31 La structure tridimensionnelle d'une mol cule de bact riorhodopsine. (Vid o 10.5) (A) la cha ne polypeptidique traverse la bicouche lipidique sept fois comme h lices. L'emplacement du chromophore r tinien (violet) et la trajectoire probable emprunt e par H+ pendant le cycle de pompage activ par la lumi re sont montr s. La premi re tape cl est le passage d'un H+ du chromophore la cha ne lat rale de l'acide aspartique 85 (rouge, situ e c t du chromophore) qui se produit lors de l'absorption d'un photon par le chromophore. Par la suite,
Biologie moléculaire de la cellule	d'autres transferts h+ dans l'ordre num rique indiqu et en utilisant les cha nes lat rales d'acides amin s hydrophiles qui bordent un chemin travers la membrane compl tent le cycle de pompage et ram nent l'enzyme son tat de d part. Code couleur : acide glutamique (orange), acide aspartique (rouge), arginine (bleu). (B) la structure cristalline haute r solution de la bact riorhodopsine montre de nombreuses mol cules lipidiques (jaunes avec des groupes de t te rouges) qui sont troitement li es des endroits sp cifiques de la surface de la prot ine. (A, adapt de H. Luecke et al., Science 286:255-261, 1999. Avec l'autorisation de l'AAAS ; B, d'apr s H. Luecke et al., J. Mol. Biol. 291:899 911, 1999. Avec l'autorisation de la presse acad mique.) On pense que les interactions avec des lipides sp cifiques aident stabiliser de nombreuses prot ines membranaires, qui fonctionnent mieux et se cristallisent parfois plus facilement si certains des lipides restent li s pendant l'extraction au d tergent, ou si des lipides sp cifiques sont rajout s aux prot ines dans les solutions d tergentes. La sp cificit de ces interactions lipides-prot ines aide expliquer pourquoi les membranes eucaryotes contiennent une telle vari t de lipides, avec des groupes de t te qui diff rent en taille, en forme et en charge. Nous pouvons consid rer les lipides membranaires comme constituant un solvant bidimensionnel pour les prot ines de la membrane, tout comme l'eau constitue un solvant tridimensionnel pour les prot ines dans une solution aqueuse : certaines prot ines membranaires ne peuvent fonctionner qu'en pr sence de groupes de t te lipidiques sp cifiques, tout comme de nombreuses enzymes en solution aqueuse n cessitent un ion particulier pour leur activit . La bact riorhodopsine fait partie d'une grande superfamille de prot ines membranaires ayant des structures similaires mais des fonctions diff rentes. Par exemple, la rhodopsine dans les cellules en b tonnets de la r tine des vert br s et de nombreuses prot ines r ceptrices la surface cellulaire qui lient les mol cules de signal extracellulaire sont galement construites partir de sept h lices transmembranaires. Ces prot ines fonctionnent comme des transducteurs de signal plut t que comme des transporteurs : chacune r pond un signal extracellulaire en activant une prot ine de liaison au GTP (prot ine G) l'int rieur de la cellule et elles sont donc appel es r cepteurs coupl s aux prot ines G (RCPG), comme nous le verrons au chapitre 15 (voir Figure 15-6B). Bien que les structures des bact riorhodopsines et des RCPG soient tonnamment similaires, elles ne pr sentent aucune similitude de s quence et appartiennent donc probablement deux branches loign es d'une ancienne famille de prot ines. Une classe apparent e de prot ines membranaires, les channelrhodopsines que les algues vertes utilisent pour d tecter la lumi re, forment des canaux ioniques lorsqu'elles absorbent un photon. Lorsqu'elles ont t modifi es de mani re tre exprim es dans le cerveau des animaux, ces prot ines sont devenues des outils inestimables en neurobiologie car elles permettent de stimuler exp rimentalement des neurones sp cifiques en les mettant en lumi re, comme nous l'expliquons au chapitre 11 (Figure 11-32). Les prot ines membranaires fonctionnent souvent comme de grands complexes De nombreuses prot ines membranaires fonctionnent dans le cadre de complexes plusieurs composants, dont plusieurs ont t tudi s par cristallographie aux rayons X. L'un est un centre de r action photosynth tique bact rien, qui a t le premier complexe prot ique membranaire tre cristallis et analys par diffraction des rayons X. Dans le chapitre 14, nous abordons comment ces complexes photosynth tiques fonctionnent pour capturer l' nergie lumineuse et l'utiliser pour pomper H+ travers la membrane. De nombreux complexes de prot ines membranaires impliqu s dans la photosynth se, le pompage des protons et le transport des lectrons sont encore plus grands que le centre de r action photosynth tique. L' norme complexe photosyst me II des cyanobact ries, par exemple, contient 19 sous-unit s prot iques et bien plus de 60 h lices transmembranaires (voir Figure 14-49). Les prot ines membranaires sont souvent dispos es en grands complexes, non seulement pour r colter diverses formes d' nergie, mais aussi pour transduire, des signaux extracellulaires en signaux intracellulaires (voir le chapitre 15). De nombreuses prot ines membranaires diffusent dans le plan de la membrane Comme la plupart des lipides membranaires, les prot ines membranaires ne culbutent pas (basculement) sur la bicouche lipidique, mais elles tournent autour d'un axe perpendiculaire au plan de la bicouche (diffusion rotationnelle). De plus, de nombreuses prot ines membranaires sont capables de se d placer lat ralement l'int rieur de la membrane (diffusion lat rale). Une exp rience dans laquelle des cellules de souris ont t
Biologie moléculaire de la cellule	fusionn es artificiellement avec des cellules humaines pour produire des cellules hybrides (h t rocaryons) a fourni la premi re preuve directe que certaines prot ines de la membrane plasmique sont mobiles dans le plan de la membrane. Deux anticorps marqu s diff remment ont t utilis s pour distinguer certaines prot ines de la membrane plasmique de la souris et de l'homme. Bien qu'au d but, les prot ines de souris et d'homme aient t confin es leurs propres moiti s de l'h t rocaryon nouvellement form , les deux ensembles de prot ines se sont diffus s et m lang s sur toute la surface cellulaire en environ une demi-heure (Figure 10-32). Les taux de diffusion lat rale des prot ines membranaires peuvent tre mesur s en utilisant la technique de r cup ration de fluorescence apr s photoblanchiment (FRAP). La m thode consiste g n ralement marquer la prot ine membranaire d'int r t avec un groupe fluorescent sp cifique. Cela peut se faire soit avec un ligand fluorescent tel qu'un anticorps marqu au fluorophore qui se lie la prot ine, soit avec la technologie de l'ADN recombinant pour exprimer la prot ine fusionn e une prot ine fluorescente telle que la prot ine fluorescente verte (GFP) (discut e au chapitre 9). Le groupe fluorescent est ensuite blanchi dans une petite zone de membrane par un faisceau laser, et le temps n cessaire pour que les prot ines membranaires adjacentes portant un ligand non blanchi ou GFP diffusent dans la zone blanchie est mesur (Figure 10 33). partir des mesures FRAP, nous pouvons estimer le coefficient de diffusion de la prot ine de surface cellulaire marqu e. Les valeurs des coefficients de diffusion pour diff rentes prot ines membranaires dans diff rentes cellules sont tr s variables, car les interactions avec d'autres prot ines entravent la diffusion des prot ines des degr s divers. Les mesures des prot ines qui sont ainsi entrav es de mani re minimale indiquent que les membranes cellulaires ont une viscosit comparable celle de l'huile d'olive. L'un des inconv nients de la technique FRAP est qu'elle surveille le mouvement de grandes populations de mol cules dans une zone relativement grande de membrane ; On ne peut pas suivre des mol cules de prot ines individuelles. Si une prot ine ne parvient pas migrer dans une zone blanchie, par exemple, on ne peut pas dire si la mol cule est vraiment immobile ou simplement limit e dans son mouvement une tr s petite r gion de membrane, peut- tre par des prot ines cytosquelettiques. Les techniques de suivi des particules uniques surmontent ce probl me en marquant des mol cules membranaires individuelles avec des anticorps coupl s des colorants fluorescents ou de minuscules particules d'or et en suivant leur mouvement par microscopie vid o. En utilisant le suivi particule unique, on peut enregistrer le chemin de diffusion d'une seule mol cule de prot ine membranaire au fil du temps. Les r sultats de toutes ces techniques indiquent que les prot ines de la membrane plasmique diff rent consid rablement dans leurs caract ristiques de diffusion, comme nous le verrons maintenant. Figure 10 32 : une exp rience d montrant la diffusion de prot ines dans la membrane plasmique de cellules hybrides souris-homme. Dans cette exp rience, une souris et une cellule humaine ont t fusionn es pour cr er une cellule hybride, qui a ensuite t color e avec deux anticorps marqu s par fluorescence. Un anticorps (marqu avec un colorant vert) d tecte les prot ines de la membrane plasmique de la souris, l'autre anticorps (marqu avec un colorant rouge) d tecte les prot ines de la membrane plasmique humaine. Lorsque les cellules ont t color es imm diatement apr s la fusion, les prot ines membranaires plasmiques de souris et d'homme se trouvent toujours dans les domaines membranaires provenant respectivement de la souris et de la cellule humaine. Apr s un court laps de temps, cependant, les prot ines de la membrane plasmique se diffusent sur toute la surface cellulaire et se m langent compl tement. (D'apr s l.D. Frye et M. edidine, J. Cell Sci. 7:319-335, 1970. Avec l'autorisation de la compagnie de biologistes.) Figure 10 33 Mesure du taux de diffusion lat rale d'une prot ine membranaire par r cup ration de fluorescence apr s photoblanchiment. Une prot ine d'int r t sp cifique peut tre exprim e sous la forme d'une prot ine de fusion avec une prot ine fluorescente verte (gFp), qui est intrins quement fluorescente. Les mol cules fluorescentes sont blanchies sur une petite zone l'aide d'un faisceau laser. L'intensit de la fluorescence se r tablit mesure que les mol cules blanchies diffusent et que les mol cules non blanchies diffusent dans la zone irradi e (illustr es ici en vues de c t et de dessus). le coefficient de diffusion est calcul partir d'un graphique du taux de r cup ration : plus le coefficient de diffusion de la prot ine membranaire est lev , plus la r cup ration est rapide (Vid o 10.6). les cellules peuvent confiner les
Biologie moléculaire de la cellule	prot ines et les lipides des domaines sp cifiques au sein d'une membrane La reconnaissance que les membranes biologiques sont des fluides bidimensionnels a t une avanc e majeure dans la compr hension de la structure et de la fonction des membranes. Il est devenu clair, cependant, que l'image d'une membrane comme une mer de lipides dans laquelle toutes les prot ines flottent librement est grandement simplifi e. La plupart des cellules confinent les prot ines membranaires des r gions sp cifiques dans une bicouche lipidique continue. Nous avons d j discut de la fa on dont les mol cules de bact riorhodopsine dans la membrane violette d'Halobacterium s'assemblent en grands cristaux bidimensionnels, dans lesquels les mol cules de prot ines individuelles sont relativement fixes les unes par rapport aux autres (voir Figure 10-30). Les complexes ATP synthase dans la membrane mitochondriale interne s'associent galement en longues rang es doubles, comme nous le verrons au chapitre 14 (voir Figure 14-32). Les gros agr gats de ce type se diffusent tr s lentement. Dans les cellules pith liales, telles que celles qui tapissent l'intestin ou les tubules du rein, certaines enzymes de la membrane plasmique et les prot ines de transport sont confin es la surface apicale des cellules, tandis que d'autres sont confin es aux surfaces basale et lat rale (Figure 10-34). Cette distribution asym trique des prot ines membranaires est souvent essentielle au fonctionnement de l' pith lium, comme nous l'expliquons au chapitre 11 (voir Figure 11 11). Les compositions lipidiques de ces deux domaines membranaires sont galement diff rentes, ce qui d montre que les cellules pith liales peuvent emp cher la diffusion des mol cules lipidiques et prot iques entre les domaines. Les barri res mises en place par un type sp cifique de jonction intercellulaire (appel e jonction serr e, discut e au chapitre 19 ; voir Figure 19-18) maintiennent la s paration des mol cules prot iques et lipidiques. De toute vidence, les prot ines membranaires qui forment ces jonctions intercellulaires ne peuvent pas tre autoris es diffuser lat ralement dans les membranes en interaction. Une cellule peut galement cr er des domaines membranaires sans utiliser de jonctions intercellulaires. Comme nous l'avons d j vu, on pense que les interactions prot ine-prot ine r gul es dans les membranes cr ent des domaines de radeau l' chelle nanom trique qui fonctionnent dans la signalisation et le trafic membranaire. Un exemple plus extr me est observ dans le spermatozo de de mammif re, une cellule unique qui se compose de plusieurs parties structurellement et fonctionnellement distinctes recouvertes d'une membrane plasmique continue. Lorsqu'un spermatozo de est examin par microscopie d'immunofluorescence avec une vari t d'anticorps, chacun r agissant avec une mol cule sp cifique de surface cellulaire, la membrane plasmique se compose d'au moins trois domaines distincts (Figure 10 35). Certaines des mol cules membranaires sont capables de diffuser librement dans les limites de leur propre domaine. La nature mol culaire de la cl ture qui emp che les mol cules de Figure 10 34 Comment les mol cules membranaires peuvent tre limit es un domaine membranaire particulier. Dans ce dessin d'une cellule pith liale, la prot ine A (dans le domaine apical de la membrane plasmique) et la prot ine B (dans les domaines basal et lat ral) peuvent diffuser lat ralement dans leurs propres domaines mais sont emp ch es d'entrer dans l'autre domaine, au moins en partie par la jonction cellule-cellule sp cialis e appel e jonction serr e. les mol cules lipidiques de la monocouche externe (extracellulaire) de la membrane plasmique sont galement incapables de diffuser entre les deux domaines ; Les lipides de la monocouche interne (cytosolique), cependant, sont capables de le faire (non illustr ). La lame basale est un mince tapis de matrice extracellulaire qui s pare les feuillets pith liaux des autres tissus (voir le chapitre 19). quitter leur domaine n'est pas connu. De nombreuses autres cellules ont des cl tures membranaires similaires qui limitent la diffusion des prot ines membranaires certains domaines membranaires. La membrane plasmique des cellules nerveuses, par exemple, contient un domaine englobant le corps cellulaire et les dendrites, et un autre englobant l'axone ; On pense qu'une ceinture de filaments d'actine troitement associ s la membrane plasmique la jonction cellule-corps-axone fait partie de la barri re. La figure 10-36 montre quatre fa ons courantes d'immobiliser des prot ines membranaires sp cifiques par le biais d'interactions prot ine-prot ine. le cytosquelette cortical donne aux membranes une force m canique et limite la diffusion des prot ines membranaires Comme le montrent les figures 10-36B et C, une fa on courante dont une cellule restreint la mobilit lat rale de prot ines membranaires sp cifiques est de les attacher des asse
Biologie moléculaire de la cellule	mblages macromol culaires de chaque c t de la membrane. La forme biconcave caract ristique d'un globule rouge (figures 10-37), par exemple, r sulte des interactions de ses prot ines de membrane plasmique avec un cytosquelette sous-jacent, qui consiste principalement en un r seau de la prot ine filamenteuse spectrine. Spectrin est une tige longue, mince et flexible d'environ 100 nm de longueur. En tant que composant principal du cytosquelette des globules rouges, il maintient l'int grit structurelle et la forme de la membrane plasmique, qui est la seule membrane des globules rouges, car la cellule n'a pas de noyau ou d'autres organites. Le cytosquelette de la spectrine est riv la membrane par diverses prot ines membranaires. Le r sultat final est un r seau d formable en forme de filet qui recouvre toute la surface cytosolique de la membrane des globules rouges (Figure 10-38). Ce cytosquelette base de spectrine permet au globule rouge de r sister au stress exerc sur sa membrane lorsqu'il est forc travers des capillaires troits. Les souris et les humains pr sentant des anomalies g n tiques dans la spectrine sont an miques et ont des globules rouges sph riques (au lieu de concaves) et fragiles ; La gravit de l'an mie augmente avec le degr de carence en spectrine. Figure 10 35 Trois domaines dans la membrane plasmique d'un spermatozo de de cobaye. (A) Un dessin du sperme d'un cobaye. (B D) Dans les trois paires de micrographies, les micrographies contraste de phase sont gauche, et la m me cellule est repr sent e avec une coloration par immunofluorescence la surface de la cellule droite. Diff rents anticorps monoclonaux marquent s lectivement les mol cules de surface cellulaire sur (B) la t te ant rieure, (c) la t te post rieure et (D) la queue. (Micrographies avec l'aimable autorisation de Selena Carroll et Diana Myles.) Figure 10 36 Quatre fa ons de restreindre la mobilit lat rale de prot ines sp cifiques de la membrane plasmique. (A) les prot ines peuvent s'auto-assembler en grands agr gats (comme on le voit pour la bact riorhodopsine dans la membrane violette de Halobacterium salinarum) ; ils peuvent tre li s par des interactions avec des assemblages de macromol cules (B) l'ext rieur ou (c) l'int rieur de la cellule ; ou (D) ils peuvent interagir avec des prot ines la surface d'une autre cellule. complexe jonctionnel spectrine dim re actine ankyrine bande 3 glycophorine bande 4.1 100 nm cha ne H2N HOOC lien fexible entre les domaines 106-amino-acide-long domaine r p titif NH2spectrin spectrine t tram re membrane plasmique Un r seau cytosquelettique analogue mais beaucoup plus labor et tr s dynamique existe sous la membrane plasmique de la plupart des autres cellules de notre corps. Ce r seau, qui constitue le cortex de la cellule, est riche en filaments d'actine, qui sont attach s la membrane plasmique de nombreuses fa ons. Le remodelage dynamique du r seau d'actine corticale fournit une force motrice pour de nombreuses fonctions cellulaires essentielles, notamment le mouvement cellulaire, l'endocytose et la formation de structures membranaires plasmiques transitoires et mobiles telles que les filopodes et les lamellopodes de la bande 4.1 Figure 10 38 Le cytosquelette base de spectrine sur la face cytosolique de la membrane plasmique des globules rouges humains. (A) la disposition montr e dans le dessin a t d duite principalement d' tudes sur les interactions des prot ines purifi es in vitro. Les h t rodim res de specttrin (agrandis dans le dessin de droite) sont reli s entre eux en un r seau par des complexes jonctionnels (agrandis dans le dessin de gauche). Chaque h t rodim re de spectrine est constitu de deux cha nes polypeptidiques flexibles, antiparall les et faiblement entrelac es Appel es et les deux cha nes de spectrine sont attach es de mani re non covalente l'une l'autre en plusieurs points, y compris aux deux extr mit s. Les cha nes et sont compos es en grande partie de domaines r p titifs. Deux h t rodim res de la spectrine se rejoignent bout bout pour former des t tram res. Les complexes jonctionnels sont compos s de filaments d'actine courts (contenant 13 monom res d'actine) et de ces prot ines, la bande 4.1, l'adducine et une mol cule de tropomyosine qui d termine probablement la longueur des filaments d'actine. Le cytosquelette est li la membrane par deux prot ines transmembranaires : une prot ine multipasse appel e bande 3 et une prot ine monopasse appel e glycophorine. Les t tram res de la spectrine se lient certaines prot ines de la bande 3 via des mol cules d'ankyrine, et la glycophorine et la bande 3 (non illustr e) via des prot ines de la bande 4.1. (B) la micrographie lectronique montre le cytosquelette du c t cytosolique d'une membrane de globules rouges apr s fixation et coloration n gative. Le maillage du Spectrin a t volontairement tir pour permettre de voir les d tails de sa structure. Dans une cellul
Biologie moléculaire de la cellule	e normale, les mailles montr es seraient beaucoup plus encombr es et n'occuperaient qu'environ un dixi me de cette zone. (B, avec la permission de t. Byers et D. Branton, Proc. Natl Acad. Sci. USA 82:6153 6157, 1985. Avec l'autorisation de l'Acad mie nationale des sciences.) Figure 10-37 : Micrographie lectronique balayage de globules rouges humains. les cellules ont une forme biconcave et n'ont pas de noyau ni d'autres organites (vid o 10.7). (avec l'aimable autorisation de Bernadette Chailley.) discut au chapitre 16. Le cortex des cellules nucl es contient galement des prot ines qui sont structurellement homologues la spectrine et aux autres composants du cytosquelette des globules rouges. Nous discutons du cytosquelette cortical dans les cellules nucl es et de ses interactions avec la membrane plasmique au chapitre 16. Le r seau cytosquelettique cortical restreint la diffusion non seulement des prot ines de la membrane plasmique qui y sont directement ancr es. Parce que les filaments cytosquelettiques sont souvent troitement appos s la surface cytosolique de la membrane plasmique, ils peuvent former des barri res m caniques qui obstruent la libre diffusion des prot ines dans la membrane. Ces barri res divisent la membrane en petits domaines, ou corrals (Figure 10-39A), qui peuvent tre soit permanents, comme dans le spermatozo de (voir Figure 10-35), soit transitoires. Les barri res peuvent tre d tect es lorsque la diffusion de prot ines membranaires individuelles est suivie d'un suivi grande vitesse d'une seule particule. Les prot ines se diffusent rapidement mais sont confin es dans un corral individuel (Figure 10-39B) ; Parfois, cependant, des mouvements thermiques provoquent le d tachement transitoire de quelques filaments corticaux de la membrane, permettant la prot ine de s' chapper dans un corral adjacent. La mesure dans laquelle une prot ine transmembranaire est confin e dans un corral d pend de son association avec d'autres prot ines et de la taille de son domaine cytoplasmique ; Les prot ines avec un grand domaine cytosolique auront plus de mal traverser les barri res cytosquelettiques. Lorsqu'un r cepteur de surface cellulaire se lie ses mol cules de signal extracellulaire, par exemple, de grands complexes prot iques s'accumulent sur le domaine cytosolique du r cepteur, ce qui rend plus difficile pour le r cepteur de s' chapper de son enclos. On pense que le regroupement aide concentrer de tels complexes de signalisation, augmentant ainsi la vitesse et l'efficacit du processus de signalisation (discut au chapitre 15). Les membranes cellulaires prennent de nombreuses formes diff rentes, comme l'illustrent les structures labor es et vari es des protub rances de surface cellulaire et des organites enferm s dans des membranes dans les cellules eucaryotes. Les feuilles plates, les tubules troits, les v sicules rondes, les feuilles fenestr es et les citernes en forme de pain pita font tous partie du r pertoire : souvent, une vari t de formes sera pr sente dans diff rentes r gions d'une m me bicouche continue. La forme de la membrane est contr l e de mani re dynamique, car de nombreux processus cellulaires essentiels, notamment le bourgeonnement des v sicules, le mouvement cellulaire et la division cellulaire, n cessitent des d formations membranaires transitoires labor es. Dans de nombreux cas, la forme de la membrane est influenc e par les forces de pouss e et de traction dynamiques exerc es par les structures cytosquelettiques ou extracellulaires, comme nous le verrons dans les chapitres 13 et 16). Un r le crucial dans la production de ces d formations est jou par les prot ines de flexion de la membrane, qui contr lent la courbure locale de la membrane. Souvent, la dynamique du cytosquelette et les forces prot iques de flexion de la membrane travaillent ensemble. Prot ines de flexion membranaire se fixent des r gions membranaires sp cifiques au besoin et agissent par un ou plusieurs des trois m canismes principaux : 1. Certains ins rent des domaines prot iques hydrophobes ou des ancrages lipidiques attach s dans l'une des folioles d'une bicouche lipidique. Augmenter la surface d'une seule foliole Figure 10 39 Rassemblement des prot ines de la membrane plasmique par des filaments cytosquelettiques corticaux. (A) On pense que les filaments fournissent des barri res de diffusion qui divisent la membrane en petits domaines, ou corrals. (B) le suivi grande vitesse d'une seule particule a t utilis pour suivre le chemin d'une prot ine membranaire unique marqu e par fluorescence d'un type au fil du temps. La trace montre que les mol cules prot iques individuelles (le mouvement de chacune d'entre elles est repr sent par une couleur diff rente) diffusent l'int rieur d'un domaine membranaire troitement d limit et ne s' chappent que rarement dans un domaine voisin. (Adapt de A. Kusumi et al., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 34:351 378, 2005. Avec la permissi
Biologie moléculaire de la cellule	on des revues annuelles.) Figure 10 40 Trois fa ons dont les prot ines de flexion membranaire fa onnent les membranes. Les bicouches lipidiques sont bleues et les prot ines sont vertes. (A) Bicouche sans li e aux prot ines. (B) Une r gion hydrophobe de la prot ine peut s'ins rer comme un coin dans une monocouche pour s parer les groupes de t te lipidiques. Ces r gions peuvent tre soit des h lices amphiphiles, comme indiqu , soit des pingles cheveux hydrophobes. (c) la surface incurv e de la prot ine peut se lier des groupes de t te lipidiques et d former la membrane ou stabiliser sa courbure. (D) Une prot ine peut se lier et regrouper des lipides qui ont de grands groupes de t te et ainsi plier la membrane. (Adapt de W.A. prinz et J.e. hinshaw, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 44:278 291, 2009.) provoque la flexion de la membrane (Figure 10 40B). On pense que les prot ines qui fa onnent le r seau alambiqu de tubules troits du RE fonctionnent de cette mani re. 2. Certaines prot ines de flexion de la membrane forment des chafaudages rigides qui d forment la membrane ou stabilisent une membrane d j courb e (Figure 10 40C). Les prot ines d'enveloppe qui fa onnent les v sicules bourgeonnantes dans le transport intracellulaire entrent dans cette classe. 3. Certaines prot ines de flexion membranaire provoquent le regroupement de lipides membranaires particuliers, induisant ainsi une courbure membranaire. La capacit d'un lipide induire une courbure membranaire positive ou n gative est d termin e par les sections transversales relatives de son groupe de t te et de ses queues d'hydrocarbures. Par exemple, le grand groupe de t te des phosphoinositides rend ces mol cules lipidiques en forme de coin, et leur accumulation dans le domaine d'un feuillet d'une bicouche induit donc une courbure positive (Figure 10 40D). En revanche, les phospholipases qui liminent les groupes de t te lipidiques produisent des mol cules lipidiques de forme inverse qui induisent une courbure n gative. Souvent, diff rentes prot ines de flexion de la membrane collaborent pour obtenir une courbure particuli re, comme dans la formation d'une v sicule de transport bourgeonnante, comme nous le verrons au chapitre 13. Alors que la bicouche lipidique d termine la structure de base des membranes biologiques, les prot ines sont responsables de la plupart des fonctions membranaires, servant de r cepteurs sp cifiques, d'enzymes, de transporteurs, etc. Les prot ines transmembranaires s' tendent travers la bicouche lipidique. Certaines de ces prot ines membranaires sont des prot ines passage unique, dans lesquelles la cha ne polypeptidique traverse la bicouche en une seule h lice. D'autres sont des prot ines multipasses, dans lesquelles la cha ne polypeptidique traverse la bicouche plusieurs fois, soit sous la forme d'une s rie d'h lices , soit sous la forme d'une feuille enroul e en forme de tonneau. Toutes les prot ines responsables du transport des ions et autres petites mol cules hydrosolubles travers la membrane sont des prot ines multipasses. Certaines prot ines membranaires ne couvrent pas la bicouche mais sont plut t attach es de chaque c t de la membrane : certaines sont attach es au c t cytosolique par une h lice amphipathique la surface de la prot ine ou par la fixation covalente d'une ou plusieurs cha nes lipidiques, d'autres sont attach es au c t non cytosolique par une ancre GPI. Certaines prot ines associ es la membrane sont li es par des interactions non covalentes avec la membrane transmembranaire prot ine. Dans la membrane plasmique de toutes les cellules eucaryotes, la plupart des prot ines expos es la surface cellulaire et certaines des mol cules lipidiques de la monocouche lipidique externe ont des cha nes oligosaccharidiques attach es de mani re covalente. Comme les mol cules lipidiques de la bicouche, de nombreuses prot ines membranaires sont capables de diffuser rapidement dans le plan de la membrane. Cependant, les cellules ont des moyens d'immobiliser des prot ines membranaires sp cifiques, ainsi que des moyens de confiner les prot ines membranaires et les mol cules lipidiques des domaines particuliers dans une bicouche lipidique continue. L'association dynamique des prot ines de flexion membranaire conf re aux membranes leurs formes tridimensionnelles caract ristiques. tant donn la composition lipidique tr s complexe des membranes cellulaires, quelles sont les variations au sein des diff rentes membranes d'organites d'une cellule animale ? Quelles sont les cons quences fonctionnelles de ces diff rences, et quels sont les r les des esp ces lipidiques mineures ? La tendance biophysique des lipides se r partir en phases distinctes au sein d'une bicouche lipidique est-elle fonctionnellement utilis e dans les membranes cellulaires ? Si oui, comment est-il r gul et quelles fonctions membranaires contr le-t-il ? quelle fr quence des mol cules lipidiques sp cifiques s'associent-elles
Biologie moléculaire de la cellule	aux prot ines membranaires pour r guler leur fonction ? tant donn que la structure de seulement une infime fraction de toutes les prot ines membranaires a t d termin e, quels nouveaux principes de la structure des prot ines membranaires restent d couvrir ? Quelles d clarations sont vraies ? Expliquez pourquoi ou pourquoi pas. 10 1 Bien que les mol cules lipidiques soient libres de diffuser dans le plan de la bicouche, elles ne peuvent pas basculer sur la bicouche moins que des catalyseurs enzymatiques appel s translocateurs phospholipidiques ne soient pr sents dans la membrane. Alors que tous les glucides de la membrane plasmique sont orient s vers l'ext rieur sur la surface externe de la cellule, tous les glucides des membranes internes sont orient s vers le cytosol. 10 3 Bien que l'on connaisse bien les domaines membranaires avec des compositions prot iques diff rentes, il n'existe actuellement aucun exemple de domaines membranaires dont la composition lipidique diff re. Discutez des probl mes suivants. 10 4 Lorsqu'une bicouche lipidique est d chir e, pourquoi ne se scelle-t-elle pas en formant une coiffe h mi-micelle sur les bords, comme le montre la figure Q10 1 ? joint avec coiffe h mi-micell eFigure Q10 1 Une bicouche lipidique d chir e scell e par une hypoth tique coiffe h micelle (probl me 10 4). 10 5 La margarine est fabriqu e partir d'huile v g tale par un processus chimique. Pensez-vous que ce processus convertit les acides gras satur s en acides gras insatur s, ou vice versa ? Expliquez votre r ponse. 10 7 Les prot ines transmembranaires monom res passage unique couvrent une membrane avec une seule h lice qui a des propri t s chimiques caract ristiques dans la r gion de la bicouche. Laquelle des trois s quences de 20 acides amin s num r es ci-dessous est le candidat le plus probable pour un tel segment transmembranaire ? Expliquez les raisons de votre choix. (Voir le dos du livre pour le code d'acide amin d'une lettre ; FAMILLE VW est un moyen mn motechnique pratique pour les acides amin s hydrophobes.) 10 6 Si un radeau lipidique a g n ralement un diam tre de 70 nm et que chaque mol cule lipidique a un diam tre de 0,5 nm, combien de mol cules lipidiques y aurait-il dans un radeau lipidique compos enti rement de lipides ? raison de 50 mol cules lipidiques par mol cule de prot ine (50 % de prot ines en masse), combien de prot ines y aurait-il dans un radeau typique ? (N gligez la perte de lipide du radeau qui serait n cessaire pour accueillir la prot ine.) 10 8 Vous tudiez la liaison des prot ines au cytoplasmique face de cellules de neuroblastome en culture et ont trouv une m thode qui donne un bon rendement de v sicules l'envers partir de la membrane plasmique. Malheureusement, vos pr parations sont contamin es par des quantit s variables de v sicules l'endroit. Rien de ce que vous avez essay n' vite ce probl me. Un ami vous sugg re de passer vos v sicules sur une colonne d'affinit faite de lectine coupl e des billes solides. Quel est l'int r t de la suggestion de votre ami ? La glycophorine 10-9, une prot ine de la membrane plasmique du globule rouge, existe normalement sous la forme d'un homodim re qui est enti rement maintenu ensemble par des interactions entre ses domaines transmembranaires. Puisque les domaines transmembranaires sont hydrophobes, comment se fait-il qu'ils puissent s'associer si sp cifiquement les uns aux autres ? 10 10 Trois m canismes par lesquels les prot ines de liaison membranaire courbent une membrane sont illustr s aux figures Q10 2A, B et C. Comme on l'a vu, chacune de ces prot ines de flexion de la membrane cytosolique induirait une invagination de la membrane plasmique. Des types similaires de prot ines cytosoliques pourraient-ils induire une saillie de la membrane plasmique (Figure Q10-2D) ? Lesquels ? Expliquez comment ils pourraient fonctionner. Figure Q10 2 Courbure de la membrane plasmique par les prot ines cytosoliques (probl me 10 10). (A) Insertion d'un doigt prot ique dans le feuillet cytosolique de la membrane. (B) Liaison de lipides la surface incurv e d'une prot ine de liaison membranaire. (c) Liaison des prot ines membranaires aux lipides membranaires avec de grands groupes de t te. (D) Un segment de la membrane plasmique montrant une saillie. Bretscher MS (1973) Structure membranaire : quelques principes g n raux. Science 181, 622 629. edidin M (2003) lipides la fronti re : un si cle de bicouches cellule-membrane. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4, 414 418. go i FM (2014) la structure de base et la dynamique des membranes cellulaires : une mise jour du mod le Singer-nicolson. Biochim. Biophys. Acta 1838, 1467-1476. lipowsky r & Sackmann e (eds) (1995) Structure et dynamique des membranes. Amsterdam : elsevier. Singer SJ & nicolson gl (1972) le mod le de mosa que fluide de la structure des membranes cellulaires. Science 175, 720-731. Tanford C (1980) L'effet hydrophobe : formation de mi
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Biologie moléculaire de la cellule	ntroduisons ensuite certains des termes utilis s pour d crire les diff rentes formes de transport membranaire et certaines strat gies pour caract riser les prot ines et les processus impliqu s. Les bicouches lipidiques sans prot ines sont imperm ables aux ions Avec suffisamment de temps, pratiquement n'importe quelle mol cule se diffusera travers une bicouche lipidique sans prot ines le long de son gradient de concentration. Le taux de diffusion varie cependant norm ment, en fonction en partie de la taille de la mol cule mais surtout de sa relative hydrophobicit (solubilit dans l'huile). En g n ral, plus la mol cule est petite et plus elle est hydrophobe, ou non polaire, plus elle se diffusera facilement travers une bicouche lipidique. Les petites mol cules non polaires, telles que l'O2 et le CO2, se dissolvent facilement dans les bicouches lipidiques et diffusent donc rapidement travers eux. De petites mol cules polaires non charg es, telles que l'eau ou l'ur e, diffusent galement travers une bicouche, bien que beaucoup plus lentement (Figure 11 1 et voir la vid o 10.3). En revanche, les bicouches lipidiques sont essentiellement imperm ables aux mol cules charg es (ions), aussi petites soient-elles : la charge et le haut degr d'hydratation de ces mol cules les emp chent d'entrer dans la phase hydrocarbon e de la bicouche (Figure 11 2). Il existe deux grandes classes de prot ines de transport membranaire : les transporteurs et les canaux Comme les bicouches lipidiques synth tiques, les membranes cellulaires permettent aux petites mol cules non polaires de p n trer par diffusion. Cependant, les membranes cellulaires doivent galement permettre le passage de diverses mol cules polaires, telles que les ions, les sucres, les acides amin s, les nucl otides, l'eau et de nombreux m tabolites cellulaires qui ne traversent que tr s lentement les bicouches lipidiques synth tiques. Des prot ines sp ciales de transport membranaire transf rent ces solut s travers les membranes cellulaires. Ces prot ines se pr sentent sous de nombreuses formes et dans tous les types de membranes biologiques. Chaque prot ine ne transporte souvent qu'une esp ce mol culaire sp cifique ou parfois une classe de mol cules (comme les ions, les sucres ou les acides amin s). Des tudes men es dans les ann es 1950 ont r v l que les bact ries pr sentant une mutation monog nique taient incapables de transporter les sucres travers leur membrane plasmique, d montrant ainsi la sp cificit des prot ines de transport membranaire. Nous savons maintenant que les humains pr sentant des mutations similaires souffrent de diverses maladies h r ditaires qui entravent le transport d'un solut ou d'une classe de solut sp cifique dans le rein, l'intestin ou un autre type de cellule. Les personnes atteintes de la cystinurie, par exemple, ne peuvent pas transporter certains acides amin s (y compris la cystine, le dim re li au disulfure de la cyst ine) de l'urine ou de l'intestin vers le Figure 11 1 La perm abilit relative d'une bicouche lipidique synth tique diff rentes classes de mol cules. Plus la mol cule est petite et, surtout, moins elle s'associe fortement l'eau, plus la mol cule se diffuse rapidement travers la bicouche. Figure 11 2 Coefficients de perm abilit pour le passage de diverses mol cules travers des bicouches lipidiques synth tiques. La vitesse d' coulement d'un solut travers la bicouche est directement proportionnelle la diff rence de sa concentration sur les deux c t s de la membrane. En multipliant cette diff rence de concentration (en mol/cm3) par le coefficient de perm abilit (en cm/sec), on obtient le d bit de solut en moles par seconde par centim tre carr de bicouche. Une diff rence de concentration de tryptophane de 10 4 mol/cm3 (10 4 mol / 10 3 L = 0,1 M), par exemple, provoquerait un coulement de 10 4 mol/cm3 10 7 cm/s = 10 11 mol/s travers 1 cm2 de bicouche, ou 6 104 mol cules/s travers 1 m2 de bicouche. sang; L'accumulation de cystine dans l'urine qui en r sulte entra ne la formation de calculs de cystine dans les reins. Toutes les prot ines de transport membranaire qui ont t tudi es en d tail sont des prot ines transmembranaires passages multiples, c'est- -dire que leurs cha nes polypeptidiques traversent plusieurs fois la bicouche lipidique. En formant un chemin tapiss de prot ines travers la membrane, ces prot ines permettent des solut s hydrophiles sp cifiques de traverser la membrane sans entrer en contact direct avec l'int rieur hydrophobe de la bicouche lipidique. Les transporteurs et les canaux sont les deux principales classes de prot ines de transport membranaire (Figure 11 3). Les transporteurs ( galement appel s porteurs ou perm ases) se lient au solut sp cifique transporter et subissent une s rie de changements conformationnels qui exposent alternativement les sites de liaison au solut d'un c t de la membrane, puis de l'autre pour transf re
Biologie moléculaire de la cellule	r le solut travers celle-ci. Les canaux, en revanche, interagissent avec le solut pour tre transport beaucoup plus faiblement. Ils forment des pores continus qui s' tendent travers la bicouche lipidique. Lorsqu'ils sont ouverts, ces pores permettent des solut s sp cifiques (tels que des ions inorganiques de taille et de charge appropri es et, dans certains cas, de petites mol cules, notamment l'eau, le glyc rol et l'ammoniac) de les traverser et donc de traverser la membrane. Il n'est pas surprenant que le transport par les canaux se fasse un rythme beaucoup plus rapide que le transport par l'interm diaire des transporteurs. Bien que l'eau puisse se diffuser lentement travers les bicouches lipidiques synth tiques, les cellules utilisent des prot ines de canal d di es (appel es canaux d'eau, ou aquaporines) qui augmentent consid rablement la perm abilit de leurs membranes l'eau, comme nous le verrons plus loin. Le transport actif est m di par des transporteurs coupl s une source d' nergie Tous les canaux et de nombreux transporteurs permettent aux solut s de traverser la membrane uniquement passivement ( en descente ), un processus appel transport passif. Dans le cas du transport d'une seule mol cule non charg e, la diff rence de concentration des deux c t s de la membrane son gradient de concentration entra ne le transport passif et d termine sa direction (Figure 11 4A). Cependant, si le solut porte une charge nette, son gradient de concentration et la diff rence de potentiel lectrique travers la membrane, le potentiel membranaire, influencent son transport. Le gradient de concentration et le gradient lectrique se combinent pour former une force motrice nette, le gradient lectrochimique, pour chaque solut charg (figures 11-4B). Nous aborderons les gradients lectrochimiques plus en d tail plus loin et au chapitre 14. En fait, presque toutes les membranes plasmiques ont un potentiel lectrique (c'est- -dire une tension) travers elles, l'int rieur tant g n ralement n gatif par rapport l'ext rieur. Ce potentiel favorise l'entr e des ions charg s positivement dans la cellule mais s'oppose l'entr e des ions charg s n gativement (voir Figure 11 4B) ; Il s'oppose galement l'efflux d'ions charg s positivement. Figure 11 3 Transporteurs et prot ines de canal. (A) Un transporteur alterne entre deux conformations, de sorte que le site de liaison du solut soit accessible s quentiellement d'un c t de la bicouche, puis de l'autre. (B) En revanche, une prot ine de canal forme un pore travers la bicouche travers lequel des solut s sp cifiques peuvent diffuser passivement. gradient lectrochimique de concentration avec gradient (sans potentiel membranaire Comme le montre la figure 11-4A, en plus du transport passif, les cellules doivent tre capables de pomper activement certains solut s travers la membrane en amont , contre leurs gradients lectrochimiques. Un tel transport actif est m di par des transporteurs dont l'activit de pompage est directionnelle car il est troitement coupl une source d' nergie m tabolique, telle qu'un gradient d'ions ou une hydrolyse de l'ATP, comme nous le verrons plus loin. Le mouvement transmembranaire des petites mol cules m di par des transporteurs peut tre actif ou passif, tandis que celui m di par des canaux est toujours passif (voir Figure 11 4A). Les bicouches lipidiques sont pratiquement imperm ables la plupart des mol cules polaires. Pour transporter de petites mol cules solubles dans l'eau l'int rieur ou l'ext rieur des cellules ou des compartiments entour s de membranes intracellulaires, les membranes cellulaires contiennent diverses prot ines de transport membranaire, chacune d'entre elles tant responsable du transfert d'un solut particulier ou d'une classe de solut s travers la membrane. Il existe deux classes de prot ines de transport membranaire : les transporteurs et les canaux. Les deux forment des voies prot iques travers la bicouche lipidique. Alors que le mouvement transmembranaire m di par les transporteurs peut tre actif ou passif, le flux de solut travers les prot ines de canal est toujours passif. Le transport actif et passif des ions est influenc par le gradient de concentration de l'ion et le potentiel membranaire, c'est- -dire son gradient lectrochimique. Le processus par lequel un transporteur transf re une mol cule de solut travers la bicouche lipidique ressemble une r action enzyme-substrat et, bien des gards, les transporteurs se comportent comme des enzymes. Cependant, contrairement aux r actions enzymatiques-substrat ordinaires, le transporteur ne modifie pas le solut transport , mais le livre inchang de l'autre c t de la membrane. Chaque type de transporteur poss de un ou plusieurs sites de liaison sp cifiques pour son solut (substrat). Il transf re le solut travers la bicouche lipidique en subissant une Figure 11 4 Diff rentes formes de transport membrana
Biologie moléculaire de la cellule	ire et l'influence de la membrane. Le transport passif le long d'un gradient de concentration (ou d'un gradient lectrochimique, voir B ci-dessous) se produit spontan ment, par diffusion, soit directement travers la bicouche lipidique, soit par des canaux ou des transporteurs passifs. En revanche, le transport actif n cessite un apport d' nergie m tabolique et est toujours m di par des transporteurs qui pompent le solut contre sa concentration ou son gradient lectrochimique. (B) Le gradient lectrochimique d'un solut charg (un ion) affecte son transport. Ce gradient combine le potentiel membranaire et le gradient de concentration du solut . Les gradients lectriques et chimiques peuvent travailler de mani re additive pour augmenter la force motrice d'un ion travers la membrane (au milieu) ou peut travailler l'une contre l'autre ( droite). Figure 11 5 : un mod le de la fa on dont un changement de conformation chez un transporteur m die le mouvement passif d'un solut . Le transporteur est repr sent dans trois tats conformationnels : l' tat ouvert-ext rieur, les sites de liaison du solut sont expos s l'ext rieur ; l' tat occlus, les m mes sites ne sont pas accessibles d'un c t ou de l'autre ; Et l' tat ouvert vers l'int rieur, les sites sont expos s l'int rieur. Les transitions entre les tats se produisent de mani re al atoire. Ils sont compl tement r versibles et ne d pendent pas de l'occupation ou non du site de liaison au solut . Par cons quent, si la concentration de solut est plus lev e l'ext rieur de la bicouche, plus de solut se lie au transporteur dans la conformation ouverte vers l'ext rieur que dans la conformation ouverte vers l'int rieur, et il y a un transport net du solut le long de son gradient de concentration (ou, si le solut est un ion, le long de son gradient lectrochimique). Changements conformationnels qui exposent alternativement le site de liaison au solut d'abord d'un c t de la membrane, puis de l'autre, mais jamais des deux c t s en m me temps. La transition se produit par le biais d'un tat interm diaire dans lequel le solut est inaccessible ou occlus de chaque c t de la membrane (Figure 11 5). Lorsque le transporteur est satur (c'est- -dire lorsque tous les sites de liaison aux solut s sont occup s), le taux de transport est maximal. Ce taux, appel Vmax (V pour vitesse), est caract ristique de la porteuse sp cifique. Vmax mesure la vitesse laquelle le porteur peut basculer entre ses tats conformationnels. De plus, chaque transporteur a une affinit caract ristique pour son solut , refl t e dans le Km de la r action, qui est gale la concentration du solut lorsque la vitesse de transport est gale la moiti de sa valeur maximale (Figure 11-6). Comme pour les enzymes, la liaison du solut peut tre bloqu e soit par des inhibiteurs comp titifs (qui se disputent le m me site de liaison et peuvent ou non tre transport s), soit par des inhibiteurs non comp titifs (qui se lient ailleurs et modifient la structure du transporteur). Comme nous le verrons bient t, il suffit d'une modification relativement mineure du mod le illustr la figure 11-5 pour relier un transporteur une source d' nergie afin de pomper un solut en amont contre son gradient lectrochimique. Les cellules effectuent ce transport actif de trois mani res principales (Figure 11 7) : 1. Les transporteurs coupl s exploitent l' nergie stock e dans les gradients de concentration pour coupler le transport en mont e d'un solut travers la membrane au transport en descente d'un autre. 2. Les pompes entra n es par l'ATP couplent le transport en amont l'hydrolyse de l'ATP. 3. Les pompes r duction de la lumi re ou de l'oxydor duction, qui sont connues chez les bact ries, les arch es, les mitochondries et les chloroplastes, couplent le transport en amont un apport d' nergie de la lumi re, comme avec la bact riorhodopsine (discut e au chapitre 10), ou partir d'une r action d'oxydor duction du taux de transport, comme avec la cytochrome c oxydase (discut e au chapitre 14). Les comparaisons de s quences d'acides amin s et de structures tridimensionnelles sugg rent que, dans de nombreux cas, il existe de fortes similitudes de structure entre les transporteurs qui m dient le transport actif et ceux qui m dient le transport passif. Certains transporteurs bact riens, par exemple, qui utilisent l' nergie stock e dans le gradient H+ travers la membrane plasmique pour entra ner l'absorption active de divers sucres sont structurellement similaires aux transporteurs qui m dient le transport passif du glucose dans la plupart des cellules animales. Cela sugg re une relation volutive entre divers transporteurs. tant donn l'importance des petits m tabolites et des sucres comme sources d' nergie, il n'est pas surprenant que la superfamille des transporteurs soit ancienne. Nous commen ons notre discussion sur le transport membranaire actif en consid rant une classe de transporteur
Biologie moléculaire de la cellule	s coupl s qui sont entra n s par des gradients de concentration ionique. Ces prot ines jouent un r le crucial dans le transport de petits m tabolites travers les membranes de toutes les cellules. Nous aborderons ensuite les pompes entra n es par l'ATP, y compris la pompe Na+-K+ que l'on trouve dans la membrane plasmique de la plupart des cellules animales. Exemples de la troisi me classe d'actifs Les pompes de transport l g res ou redox sont abord es au chapitre 14. Certains transporteurs m dient simplement passivement le mouvement d'un seul solut d'un c t l'autre de la membrane une vitesse d termin e par leur Vmax et leur Figure 11 6 La cin tique de la diffusion simple par rapport la diffusion m di e par un transporteur. Alors que le taux de diffusion et de transport par canal est directement proportionnel la concentration en solut (dans les limites physiques impos es par la surface totale ou le nombre total de canaux disponibles), le taux de diffusion par transporteur atteint un maximum (Vmax) lorsque le transporteur est satur . La concentration du solut , lorsque la vitesse de transport est la moiti de sa valeur maximale, se rapproche de la constante de liaison (Km) du transporteur pour le solut et est analogue au Km d'une enzyme pour son substrat. Le graphique s'applique un transporteur d pla ant un seul solut ; La cin tique du transport coupl de deux ou plusieurs solut s est plus complexe et pr sente un comportement coop ratif. Kilom tre; On les appelle des uniporters. D'autres fonctionnent comme des transporteurs coupl s, dans lesquels le transfert d'un solut d pend strictement du transport d'un second. Le transport coupl implique soit le transfert simultan d'un second solut dans la m me direction, effectu par des symporteurs ( galement appel s co-transporteurs), soit le transfert d'un second solut dans la direction oppos e, effectu par des antiporteurs ( galement appel s changeurs) (Figure 11 8). Le couplage troit entre le transfert de deux solut s permet aux transporteurs coupl s de r colter l' nergie stock e dans le gradient lectrochimique d'un solut , g n ralement un ion inorganique, pour transporter l'autre. De cette fa on, l' nergie libre lib r e lors du mouvement d'un ion inorganique le long d'un gradient lectrochimique est utilis e comme force motrice pour pomper d'autres solut s vers le haut, contre leur gradient lectrochimique. Cette strat gie peut fonctionner dans les deux sens ; Certains transporteurs coupl s fonctionnent comme des symporteurs, d'autres comme des antiporteurs. Dans la membrane plasmique des cellules animales, le Na+ est l'ion co-transport habituel car son gradient lectrochimique fournit une grande force motrice pour le transport actif d'une deuxi me mol cule. Le Na+ qui p n tre dans la cellule pendant le transport coupl est ensuite pomp par une pompe Na+-K+ entra n e par l'ATP dans la membrane plasmique (comme nous le verrons plus loin), qui, en maintenant le gradient Na+, entra ne indirectement le transport coupl . On dit que les transporteurs coupl s entra nement ionique tels que d crits ci-dessus interviennent dans le transport actif secondaire. En revanche, on dit que les pompes entra n es par l'ATP interviennent dans le transport actif primaire, car dans celles-ci, l' nergie libre de l'hydrolyse de l'ATP est utilis e pour entra ner directement le transport d'un solut contre son gradient de concentration. Les cellules pith liales intestinales et r nales contiennent une vari t de symporteurs qui sont entra n s par le gradient Na+ travers la membrane plasmique. Chaque symporter pilot par Na+ est sp cifique pour l'importation d'un petit groupe de sucres ou d'acides amin s apparent s dans la cellule. Parce que le Na+ a tendance se d placer dans la cellule le long de son gradient lectrochimique, le sucre ou l'acide amin est, dans un sens, entra n dans la cellule avec lui. Plus le gradient lectrochimique de Na+ est important, plus le solut est pomp Figure 11 7 Trois fa ons de conduire le transport actif. La mol cule activement transport e est indiqu e en orange et la source d' nergie est indiqu e en rouge. Le transport actif entra n par l'oxydor duction est abord au chapitre 14 (voir les figures 14 18 et 14 19). Figure 11 8 Ce sch ma montre les transporteurs fonctionnant comme des transporteurs coupl s des uniporteurs, des symporteurs et des antiporteurs (vid o 11.1). Figure 11 9 M canisme de transport du glucose aliment par un gradient de Na+. Comme dans le mod le illustr la figure 11-5, le transporteur alterne entre les tats d'ouverture vers l'int rieur et d'ouverture vers l'ext rieur via un tat interm diaire occlus. La liaison du Na+ et du glucose est coop rative, c'est- -dire que la liaison de l'un ou l'autre solut augmente l'affinit de la prot ine pour l'autre. tant donn que la concentration de Na+ est beaucoup plus lev e dans l'espace extracellulaire que dans le cytosol, le gluco
Biologie moléculaire de la cellule	se est plus susceptible de se lier au transporteur dans l'espace extracellulaire. face l' tat. La transition vers l' tat occlus ne se produit que lorsque le Na+ et le glucose sont li s ; Leurs interactions pr cises dans les sites de liaison aux solut s stabilisent l g rement l' tat occlus et rendent ainsi cette transition nerg tiquement favorable. Les fluctuations stochastiques caus es par l' nergie thermique entra nent le transporteur de mani re al atoire dans la conformation ouverte vers l'int rieur ou vers l'ext rieur. S'il s'ouvre vers l'ext rieur, rien n'est r alis , et le processus recommence. Cependant, chaque fois qu'il s'ouvre vers l'int rieur, le Na+ se dissocie rapidement dans l'environnement faible concentration de Na+ du cytosol. La dissociation du glucose est galement renforc e lorsque le Na+ est perdu, en raison de la coop rativit dans la liaison des deux solut s. Le r sultat global est le transport net de Na+ et de glucose dans la cellule. tant donn que l' tat occlus ne se forme pas lorsqu'un seul des solut s est li , le transporteur ne change de conformation que lorsqu'il est compl tement occup ou compl tement vide, assurant ainsi un couplage strict du transport du Na+ et du glucose. dans la cellule (figures 11 9). Les neurotransmetteurs (lib r s par les cellules nerveuses pour signaler les synapses comme nous le verrons plus loin) sont nouveau absorb s par les symporteurs Na+ apr s leur lib ration. Ces transporteurs de neurotransmetteurs sont des cibles m dicamenteuses importantes : les stimulants, tels que la coca ne et les antid presseurs, les inhibent et prolongent ainsi la signalisation par les neurotransmetteurs, qui ne sont pas limin s efficacement. Malgr leur grande vari t , les transporteurs partagent des caract ristiques structurelles qui peuvent expliquer leur fonctionnement et leur volution. Les transporteurs sont g n ralement construits partir de faisceaux de 10 h lices de ou plus qui enjambent la membrane. Les sites de liaison aux solut s et aux ions sont situ s mi-chemin de la membrane, o certaines h lices sont bris es ou d form es et o les cha nes lat rales d'acides amin s et les atomes de squelette polypeptidique forment des sites de liaison aux ions et aux solut s. Dans les conformations ouvertes-int rieures et ouvertes, ces sites de liaison sont accessibles par des passages d'un c t de la membrane mais pas de l'autre. En passant d'une conformation l'autre, la prot ine de transport adopte transitoirement une conformation occluse, dans laquelle les deux passages sont ferm s ; Cela emp che l'ion conducteur et le solut transport de traverser la membrane sans tre accompagn , ce qui puiserait inutilement les r serves d' nergie de la cellule. tant donn que seuls les transporteurs dont les deux types de sites de liaison sont correctement remplis modifient leur conformation, un couplage troit entre le transport d'ions et de solut s est assur . Comme les enzymes, les transporteurs peuvent fonctionner dans le sens inverse si les gradients d'ions et de solut s sont ajust s de mani re appropri e exp rimentalement. Cette sym trie chimique se refl te dans leur structure physique. Les analyses cristallographiques ont r v l que les transporteurs sont construits partir de r p titions invers es : l'empilement des h lices transmembranaires dans une moiti du faisceau d'h lices est structurellement similaire l'empilement dans l'autre moiti , mais les deux moiti s sont invers es dans la membrane l'une par rapport l'autre. Les transporteurs sont donc dits pseudosym triques, et les passages qui s'ouvrent et se ferment de chaque c t de la membrane ont des g om tries troitement similaires, permettant un acc s altern aux sites de liaison aux ions et aux solut s au centre (Figure 11 10). On pense que les deux moiti s ont volu par duplication g nique d'une prot ine anc tre plus petite. Certains autres types de prot ines de transport membranaire importantes sont galement construits partir de r p titions invers es. Des exemples incluent m me des prot ines de canal telles que le canal d'eau aquaporine (discut plus loin) et le canal Sec61 par lequel les polypeptides naissants se d placent dans le r ticulum endoplasmique (discut au chapitre 12). On pense que ces canaux ont volu partir de transporteurs coupl s, dans lesquels les fonctions de d clenchement taient perdues, ce qui leur permettait de s'ouvrir simultan ment vers les deux c t s de la membrane pour fournir un chemin continu travers la membrane. Chez les bact ries, les levures et les plantes, ainsi que dans de nombreux organites de cellules animales entour s de membranes, la plupart des syst mes de transport actif pilot s par des ions d pendent de gradients H+ plut t que Na+, ce qui refl te la pr dominance des pompes H+ dans ces membranes. Un gradient lectrochimique H+ travers la membrane plasmique bact rienne, par exemple, entra ne le transport actif vers l'int rieur de nombr
Biologie moléculaire de la cellule	eux sucres et acides amin s. Les transporteurs dans la membrane plasmique r gulent le pHMes prot ines cytosoliques fonctionnent de mani re optimale un pH particulier. Les enzymes lysosomales, par exemple, fonctionnent mieux au pH faible (~5) trouv dans les lysosomes, tandis que les enzymes cytosoliques fonctionnent mieux au pH proche de la neutralit (~7,2) trouv dans le cytosol. Il est donc crucial que les cellules contr lent le pH de leurs compartiments intracellulaires. La plupart des cellules ont un ou plusieurs types d'antiporteurs induits par le Na+ dans leur membrane plasmique qui aident maintenir le pH cytosolique environ 7,2. Ces transporteurs utilisent l' nergie stock e dans le gradient Na+ pour pomper l'exc s de H+, qui s'infiltre ou est produit dans la cellule par des r actions acidifiantes. Deux m canismes sont utilis s : soit H+ est directement transport hors de la cellule, soit HCO3 est amen dans la cellule pour neutraliser H+ dans le cytosol (selon la r action HCO3 + H+ H2O + CO2). L'un des antiporteurs qui utilise le premier m canisme est un changeur Na+-H+, qui couple un afflux de Na+ un efflux de H+. Un autre, qui utilise une combinaison des deux m canismes, est un changeur Cl--HCO3 - pilot par Na+ qui couple un afflux de Na+ et de HCO3 un efflux de Cl- et H+ (de sorte que le NaHCO3 entre et que le HCl sorte). L' changeur Cl HCO3 pilot par Na+ est deux fois plus efficace que l' changeur Na+ H+ : il pompe un H+ et en neutralise un autre pour chaque Na+ qui p n tre dans la cellule. Si HCO3 est disponible, comme c'est g n ralement le cas, cet antiporteur est le transporteur le plus important r gulant le pH cytosolique. Le pH l'int rieur de la cellule r gule les deux changeurs ; lorsque le pH dans le cytosol baisse, les deux changeurs augmentent leur activit . Un changeur Cl HCO3 ind pendant du Na+ ajuste le pH cytosolique dans le sens inverse. l'instar des transporteurs d pendants du Na+, le pH r gule l' changeur Cl--HCO3 d pendant du Na+, mais l'activit de l' changeur augmente mesure que le cytosol devient trop alcalin. Dans ce cas, le mouvement de HCO3 se fait normalement hors de la cellule, le long de son gradient lectrochimique, ce qui diminue le pH de la Figure 11 10 Les transporteurs sont construits partir de r p titions invers es. (A) LeuT, un symporteur bact rien de leucine/Na+ li aux transporteurs de neurotransmetteurs humains, tels que le transporteur de s rotonine, est montr . Le noyau du transporteur est construit partir de deux faisceaux, chacun compos de cinq h lices (bleue et jaune). Les h lices indiqu es en gris diff rent entre les membres de cette famille de transporteurs et on pense qu'elles jouent des r les r gulateurs, qui sont sp cifiques un transporteur particulier. (B) Les deux faisceaux d'h lice centrale sont emball s dans un arrangement similaire (repr sent par une main, avec l'h lice bris e comme pouce), mais le deuxi me faisceau est invers par rapport au premier. La pseudosym trie structurelle du transporteur refl te sa sym trie fonctionnelle : le transporteur peut travailler dans les deux sens, en fonction de la direction du gradient d'ions. (Adapt de K.R.Vinothkumar et R. Henderson, Q. R v. Biophys. 43:65 158, 2010. Avec l'autorisation de Cambridge University Press. Code PDB : 3F3E.) cytosol. Un changeur de Cl HCO3 ind pendant du Na+ dans la membrane des globules rouges (appel prot ine de bande 3 voir Figure 10 38) facilite la d charge rapide de CO2 (sous forme de HCO3 ) lorsque les cellules passent travers les capillaires du poumon. Le pH intracellulaire n'est pas enti rement r gul par des transporteurs dans la membrane plasmique : des pompes H+ entra n es par l'ATP sont utilis es pour contr ler le pH de nombreux compartiments intracellulaires. Comme nous l'avons vu au chapitre 13, les pompes H+ maintiennent le faible pH dans les lysosomes, ainsi que dans les endosomes et les v sicules s cr toires. Ces pompes H+ utilisent l' nergie de l'hydrolyse de l'ATP pour pomper H+ dans ces organites partir du cytosol. Une distribution asym trique des transporteurs dans les cellules pith liales sous-tend le transport transcellulaire des solut s Dans les cellules pith liales, telles que celles qui absorbent les nutriments de l'intestin, les transporteurs sont r partis de mani re non uniforme dans la membrane plasmique et contribuent ainsi au transport transcellulaire des solut s absorb s. Par l'action des transporteurs dans ces cellules, les solut s sont d plac s travers la couche de cellules pith liales dans le liquide extracellulaire d'o ils passent dans le sang. Comme le montre la figure 11-11, les symporteurs li s au Na+ situ s dans le domaine apical (absorbant) de la membrane plasmique transportent activement les nutriments dans la cellule, cr ant des gradients de concentration substantiels pour ces solut s travers la membrane plasmique. Les uniporteurs dans les domaines basal et lat ral (basolat r
Biologie moléculaire de la cellule	al) permettent aux nutriments de quitter la cellule passivement le long de ces gradients de concentration. Dans bon nombre de ces cellules pith liales, la surface de la membrane plasmique est consid rablement augment e par la formation de milliers de microvillosit s, qui s' tendent sous forme de fines projections en forme de doigts partir de la surface apicale de chaque cellule. De telles microvillosit s peuvent multiplier par 25 la surface d'absorption totale d'une cellule, am liorant ainsi ses capacit s de transport. Comme nous l'avons vu, les gradients d'ions jouent un r le crucial dans la conduite de nombreux processus de transport essentiels dans les cellules. Les pompes ioniques qui utilisent l' nergie de l'hydrolyse de l'ATP tablissent et maintiennent ces gradients, comme nous le verrons ci-dessous. transporteur m diant le transport passif du glucose Figure 11 11 Transport transcellulaire. Le transport transcellulaire du glucose travers une cellule pith liale intestinale d pend de la distribution non uniforme des transporteurs dans la membrane plasmique de la cellule. Le processus montr ici entra ne le transport du glucose de la lumi re intestinale vers le liquide extracellulaire (d'o il passe dans le sang). Le glucose est pomp dans la cellule travers le domaine apical de la membrane par un symporteur de glucose aliment en Na+. Le glucose sort de la cellule (le long de son gradient de concentration) par un mouvement passif travers un uniporteur de glucose dans les domaines membranaires basal et lat ral. Le gradient Na+ l'origine du symport de glucose est maintenu par la pompe Na+-K+ dans les domaines de la membrane plasmique basale et lat rale, ce qui maintient la concentration interne de Na+ un faible niveau (vid o 11.2). Les cellules adjacentes sont reli es par des jonctions serr es imperm ables, qui ont une double fonction dans le processus de transport illustr : elles emp chent les solut s de traverser l' pith lium entre les cellules, ce qui permet de maintenir un gradient de concentration de glucose travers le feuillet cellulaire (voir Figure 19-18). Ils servent galement de barri res de diffusion (cl tures) l'int rieur de la membrane plasmique, qui aident confiner les diff rents transporteurs leurs domaines membranaires respectifs (voir Figure 10-34). Il existe trois classes de pompes entra n es par ATP Les pompes entra n es par l'ATP sont souvent appel es ATPases de transport car elles hydrolysent l'ATP en ADP et en phosphate et utilisent l' nergie lib r e pour pomper des ions ou d'autres solut s travers une membrane. Il existe trois classes principales de pompes entra n es par l'ATP (Figure 11-12), et des repr sentants de chacune se trouvent dans toutes les cellules procaryotes et eucaryotes. 1. Les pompes de type P sont des prot ines transmembranaires multipasses structurellement et fonctionnellement li es. Ils sont appel s de type P car ils se phosphorylent pendant le cycle de pompage. Cette classe comprend de nombreuses pompes ioniques responsables de la mise en place et du maintien des gradients de Na+, K+, H+ et Ca2+ travers les membranes cellulaires. 2. Les transporteurs ABC (ATP-Binding Cassette transporters) diff rent structurellement des ATPases de type P et pompent principalement de petites mol cules travers les membranes cellulaires. Les pompes de type 3.V sont des machines prot ines de type turbine, construites partir de plusieurs sous-unit s diff rentes. Le type V La pompe protons transf re H+ dans des organites tels que les lysosomes, les v sicules synaptiques et les vacuoles de plantes ou de levure (V = vacuolaire), pour acidifier l'int rieur de ces organites (voir Figure 13-37). Structurellement apparent e aux pompes de type V se trouve une famille distincte d'ATPases de type F, plus commun ment appel es ATP synthases car elles fonctionnent normalement en sens inverse : au lieu d'utiliser l'hydrolyse de l'ATP pour piloter le transport de H+, elles utilisent le gradient H+ travers la membrane pour piloter la synth se de l'ATP partir de l'ADP et du phosphate (voir Figure 14-30). Les ATP synthases se trouvent dans la membrane plasmique des bact ries, la membrane interne des mitochondries et la membrane thylako de des chloroplastes. Le gradient H+ est g n r soit pendant les tapes de transport d' lectrons de la phosphorylation oxydative (chez les bact ries a robies et les mitochondries), soit pendant la photosynth se (dans les chloroplastes), soit par la pompe H+ entra n e par la lumi re (bact riorhodopsine) chez Halobacterium. Nous abordons certaines de ces prot ines en d tail au chapitre 14. Pour le reste de cette section, nous nous concentrons sur les pompes de type P et les transporteurs ABC. Une ATPase de type P pompe le Ca2+ dans le r ticulum sarcoplasmique des cellules musculaires Les cellules eucaryotes maintiennent de tr s faibles concentrations de Ca2+ libre dans leur cytosol (~10 7 M) face une concentrati
Biologie moléculaire de la cellule	on extracellulaire de Ca2+ beaucoup plus lev e (~10 3 M). Par cons quent, m me un petit afflux de Ca2+ augmente consid rablement la concentration de Ca2+ libre dans le cytosol, et le flux de Ca2+ le long de son gradient de concentration abrupt en r ponse aux signaux extracellulaires est un moyen de transmettre rapidement ces signaux travers la membrane plasmique (discut au chapitre 15). C'est ainsi que Figure 11 12 Trois types de pompes entra n es par aTP. Comme toute enzyme, toutes les pompes entra n es par l'ATP peuvent fonctionner dans les deux sens, en fonction des gradients lectrochimiques de leurs solut s et du rapport ATP/ADP. Lorsque le rapport ATP/ADP est lev , ils hydrolysent l'ATP ; lorsque le rapport ATP/ADP est faible, ils peuvent synth tiser l'ATP. L'ATPase de type F dans les mitochondries fonctionne normalement dans ce mode inverse pour tirer le meilleur parti de l'ATP de la cellule. important que la cellule maintienne un gradient raide de Ca2+ travers sa membrane plasmique. Les transporteurs de Ca2+ qui pompent activement le Ca2+ hors de la cellule aident maintenir le gradient. L'un d'entre eux est une ATPase Ca2+ de type P ; l'autre est un antiporteur (appel changeur Na+-Ca2+) qui est entra n par le gradient lectrochimique Na+ (discut au chapitre 15). La pompe Ca2+, ou ATPase Ca2+, dans la membrane du r ticulum sarcoplasmique (SR) des cellules musculaires squelettiques est une ATPase de transport de type P bien comprise. Le SR est un type sp cialis de r ticulum endoplasmique qui forme un r seau de sacs tubulaires dans le cytoplasme des cellules musculaires, et il sert de r serve intracellulaire de Ca2+. Lorsqu'un potentiel d'action d polarise la membrane plasmique des cellules musculaires, le Ca2+ est lib r dans le cytosol par le SR par les canaux de lib ration de Ca2+, stimulant le muscle se contracter (discut dans les chapitres 15 et 16). La pompe Ca2+, qui repr sente environ 90 % de la prot ine membranaire du SR, d place le Ca2+ du cytosol vers le SR. Le r ticulum endoplasmique des cellules non musculaires contient une pompe Ca2+ similaire, mais en plus petites quantit s. Des tudes enzymatiques et des analyses des structures tridimensionnelles des interm diaires de transport de la pompe SR Ca2+ et des pompes associ es ont r v l en d tail le m canisme mol culaire des ATPases de transport de type P. Ils ont tous des structures similaires, contenant 10 h lices transmembranaires connect es trois domaines cytosoliques (Figure 11 13). Dans la pompe Ca2+, les cha nes lat rales d'acides amin s qui d passent des h lices transmembranaires forment deux sites de liaison centraux pour le Ca2+. Comme le montre la figure 11-14, dans l' tat non phosphoryl li l'ATP de la pompe, ces sites de liaison ne sont accessibles que du c t cytosolique de la membrane SR. La liaison au Ca2+ d clenche une s rie de changements conformationnels qui ferment le passage vers le cytosol et activent une r action de phosphotransfert dans laquelle le phosphate terminal de l'ATP est transf r un aspartate qui est hautement conserv parmi toutes les ATPases de type P. L'ADP se dissocie ensuite et est remplac par un ATP frais, provoquant un autre changement de conformation qui ouvre un passage vers la lumi re SR par lequel les deux ions Ca2+ sortent. Ils sont remplac s par deux ions H+ et un mol cules d'eau qui stabilisent les sites de liaison Ca2+ vides et ferment le passage vers la lumi re SR. L'hydrolyse de la liaison labile phosphoryl-aspartate ram ne la pompe sa conformation initiale, et le cycle recommence. L'auto-phosphorylation transitoire de la pompe au cours de son cycle est une caract ristique essentielle de toutes les pompes de type P. La pompe membrane plasmique Na+-K+ tablit les gradients Na+ et K+ travers la membrane plasmique La concentration de K+ est g n ralement de 10 30 fois plus lev e l'int rieur des cellules qu' l'ext rieur, alors que l'inverse est vrai pour le Na+ (voir tableau 11-1, p. 598). Une pompe Na+-K+, ou Na+K+ ATPase, pr sente dans la membrane plasmique de pratiquement toutes les cellules animales, maintient Figure 11 13 La structure de la pompe Ca2+ du r ticulum sarcoplasmique. Le mod le en ruban ( gauche), d riv d'analyses cristallographiques aux rayons X, montre la pompe dans son tat phosphoryl et li l'ATP. Les trois domaines cytosoliques globulaires de la pompe le domaine de liaison aux nucl otides (vert fonc ), le domaine activateur (bleu) et le domaine de phosphorylation (rouge), galement illustr s sch matiquement droite changent radicalement de conformation au cours du cycle de pompage. Ces changements modifient leur tour la disposition des h lices transmembranaires, ce qui permet au Ca2+ d' tre lib r de sa cavit de liaison dans la lumi re SR (Vid o 11.3). (Code PDB : 3B9B.) ces diff rences de concentration. Comme la pompe Ca2+, la pompe Na+-K+ appartient la famille des ATPases de type P et fonctionne comme un ant
Biologie moléculaire de la cellule	iporteur entra n par l'ATP, pompant activement le Na+ hors de la cellule contre son fort gradient lectrochimique et pompant le K+ l'int rieur (Figure 11 15). Nous avons mentionn pr c demment que le gradient Na+ produit par la pompe Na+-K+ entra ne le transport de la plupart des nutriments dans les cellules animales et joue galement un r le crucial dans la r gulation du pH cytosolique. Une cellule animale typique consacre pr s d'un tiers de son nergie alimenter cette pompe, et la pompe consomme encore plus d' nergie dans les cellules nerveuses et dans les cellules d di es aux processus de transport, telles que celles formant les tubules r naux. tant donn que la pompe Na+-K+ chasse trois ions charg s positivement hors de la cellule pour deux qu'elle pompe, elle est lectrog ne : elle entra ne un courant lectrique net travers la membrane, tendant cr er un potentiel lectrique, l'int rieur de la cellule tant n gatif par rapport l'ext rieur. Cependant, cet effet lectrog ne de la pompe contribue rarement directement plus de 10 % du potentiel membranaire. Les 90 % restants, comme nous le verrons plus loin, ne d pendent qu'indirectement de la pompe Na+-K+. Figure 11 14 Le cycle de pompage de la pompe Ca2+ du r ticulum sarcoplasmique. Le pompage ionique se d roule par une s rie de changements conformationnels par tapes dans lesquels les mouvements des trois domaines cytosoliques de la pompe [le domaine de liaison aux nucl otides (N), le domaine de phosphorylation (P) et le domaine activateur (A)] sont m caniquement coupl s aux mouvements des h lices transmembranaires. Le mouvement h lico dal ouvre et ferme les passages par lesquels le Ca2+ p n tre partir du cytosol et se lie aux deux sites de liaison au Ca2+ situ s au centre. Les deux Ca2+ sortent ensuite dans la lumi re SR et sont remplac s par deux H+, qui sont transport s dans la direction oppos e. La phosphorylation d pendante du Ca2+ et la d phosphorylation d pendante du H+ de l'acide aspartique sont des tapes universellement conserv es dans le cycle r actionnel de toutes les pompes de type P : elles provoquent les transitions conformationnelles de mani re ordonn e, ce qui permet aux prot ines de faire un travail utile. (Adapt de C. Toyoshima et al., Nature 432:361-368, 2004 et J.V. M ller et al., Q. Rev. Biophys. 43:501 566, 2010.) Figure 11 15 Le fonctionnement de la pompe Na+-K+. Cette ATPase de type P pompe activement le Na+ et le K+ dans une cellule contre leurs gradients lectrochimiques. Elle est structurellement troitement apparent e l'ATPase Ca2+ mais diff re par sa s lectivit pour les ions : pour chaque mol cule d'ATP hydrolys e par la pompe, trois Na+ sont pomp s et deux K+ sont pomp s. Comme dans la pompe Ca2+, un aspartate est phosphoryl et d phosphoryl pendant le cycle de pompage (Vid o 11.4). Les transporteurs ABC constituent la plus grande famille de prot ines de transport membranaire Le dernier type d'ATPase de transport dont nous discutons est la famille des transporteurs ABC, ainsi nomm s parce que chaque membre contient deux domaines ATPase hautement conserv s, ou cassettes de liaison l'ATP, du c t cytosolique de la membrane. La liaison l'ATP rapproche les deux domaines de l'ATPase, et l'hydrolyse de l'ATP conduit leur dissociation (Figure 11 16). Ces mouvements des domaines cytosoliques sont transmis aux segments transmembranaires, entra nant des cycles de changements conformationnels qui exposent alternativement des sites de liaison aux solut s d'un c t de la membrane puis de l'autre, comme nous l'avons vu pour d'autres transporteurs. De cette fa on, les transporteurs ABC r coltent l' nergie lib r e lors de la liaison et de l'hydrolyse de l'ATP pour entra ner le transport des solut s travers la bicouche. Le transport est directionnel vers l'int rieur ou vers l'ext rieur, en fonction du changement conformationnel particulier du site de liaison du solut li l'hydrolyse de l'ATP (voir Figure 11-16). Les transporteurs ABC constituent la plus grande famille de prot ines de transport membranaire et sont d'une grande importance clinique. La premi re de ces prot ines tre caract ris e a t trouv e chez les bact ries. Nous avons d j mentionn que les membranes plasmiques de toutes les bact ries contiennent des transporteurs qui utilisent le gradient H+ travers la membrane pour transporter activement une vari t de nutriments dans la cellule. De plus, les bact ries utilisent des transporteurs ABC pour importer certaines petites mol cules. Chez les bact ries telles que E. coli qui ont des membranes doubles (Figure 11 17), les transporteurs ABC sont situ s dans la membrane interne, et un m canisme auxiliaire fonctionne pour capturer les nutriments et les livrer aux transporteurs (Figure 11 18). Chez E. coli, 78 g nes (un pourcentage tonnant de 5% des g nes de la bact rie) codent pour des transporteurs ABC, et les g nomes animaux en codent un nombre encore plus grand. Bien que l'on p
Biologie moléculaire de la cellule	ense que chaque transporteur est sp cifique une mol cule ou une classe particuli re de mol cules, la vari t des substrats transport s par cette superfamille est grande et comprend des ions inorganiques, des acides amin s, des monoet polysaccharides, des peptides, des lipides, des m dicaments et, dans certains cas, m me des prot ines qui peuvent tre plus grandes que le transporteur lui-m me. Figure 11 16 Transport de petites mol cules par des transporteurs abC typiques. Les transporteurs ABC se composent de plusieurs domaines. Typiquement, deux domaines hydrophobes, chacun constitu de six h lices de couvrant une membrane, forment ensemble la voie de translocation et fournissent une sp cificit de substrat. Deux domaines ATPase font saillie dans le cytosol. Dans certains cas, les deux moiti s du transporteur sont form es par un seul polypeptide, tandis que dans d'autres cas, elles sont form es par deux ou plusieurs polypeptides distincts qui s'assemblent en une structure similaire. Sans liaison l'ATP, le transporteur expose un site de liaison au substrat d'un c t de la membrane. La liaison l'ATP induit un changement de conformation qui expose le site de liaison au substrat du c t oppos ; L'hydrolyse de l'ATP suivie de la dissociation de l'ADP ram ne le transporteur sa conformation initiale. La plupart des transporteurs ABC individuels sont unidirectionnels. (A) Les transporteurs ABC importateurs et exportateurs se trouvent dans des bact ries ; un importateur ABC est montr dans cette caricature. La structure cristalline d'un transporteur bact rien ABC est illustr e la figure 3-76. (B) Chez les eucaryotes, la plupart des transporteurs ABC exportent des substances soit du cytosol vers l'espace extracellulaire, soit du cytosol vers un compartiment intracellulaire li une membrane tel que le r ticulum endoplasmique soit de la matrice mitochondriale vers le cytosol. Les premiers transporteurs eucaryotes ABC identifi s ont t d couverts en raison de leur capacit pomper des m dicaments hydrophobes hors du cytosol. L'un de ces transporteurs est la prot ine multir sistante (MDR), galement appel e glycoprot ine P. Il est pr sent des niveaux lev s dans de nombreuses cellules canc reuses humaines et rend les cellules simultan ment r sistantes une vari t de m dicaments cytotoxiques chimiquement non apparent s qui sont largement utilis s dans la chimioth rapie anticanc reuse. Le traitement avec l'un de ces m dicaments peut entra ner la survie s lective et la prolif ration des cellules canc reuses qui expriment une quantit particuli rement importante du transporteur MDR. Ces cellules pompent les m dicaments hors de la cellule tr s efficacement et sont donc relativement r sistantes aux effets toxiques des m dicaments (film 11.5). La s lection de cellules canc reuses r sistantes un m dicament peut ainsi conduire une r sistance une grande vari t de m dicaments anticanc reux. Certaines tudes indiquent que jusqu' 40 % des cancers humains d veloppent une multir sistance aux m dicaments, ce qui en fait un obstacle majeur dans la lutte contre le cancer. Un ph nom ne connexe et tout aussi sinistre se produit chez le protiste Plasmodium falciparum, qui cause le paludisme. Plus de 200 millions de personnes sont infect es dans le monde par ce parasite, qui reste une cause majeure de d c s humain, tuant pr s d'un million de personnes chaque ann e. Le d veloppement d'une r sistance la chloroquine, un m dicament antipaludique, a entrav la lutte contre le paludisme. Le r sistant P. falciparum a amplifi un g ne codant pour un transporteur ABC qui pompe la chloroquine. Figure 11 17 : une petite section de la double membrane d'une bact rie E. coli. La membrane interne est la membrane plasmique de la cellule. Entre les membranes interne et externe se trouve une couche de peptidoglycane rigide et tr s poreuse, compos e de prot ines et de polysaccharides qui constituent la paroi cellulaire bact rienne. Il est attach aux mol cules de lipoprot ines de la membrane externe et remplit l'espace p riplasmique (seule une petite partie de la couche de peptidoglycane est montr e). Cet espace contient galement une vari t de mol cules de prot ines solubles. Les fils pointill s (en vert) en haut repr sentent les cha nes polysaccharidiques des mol cules sp ciales de lipopolysaccharides qui forment la monocouche externe de la membrane externe ; Pour plus de clart , seules quelques-unes de ces cha nes sont repr sent es. Les bact ries double membrane sont appel es Gram n gatif car elles ne conservent pas le colorant bleu fonc utilis dans la coloration de Gram. Les bact ries membrane unique (mais aux parois cellulaires des peptidoglycanes plus paisses), telles que les staphylocoques et les streptocoques, conservent le colorant bleu et sont donc appel es Gram-positives ; leur membrane unique est analogue la membrane interne (plasma) des bact ries Gram n gatif. Figure 11 18 Le syst me de trans
Biologie moléculaire de la cellule	port auxiliaire associ au transport des aTPases chez les bact ries double membrane. Le solut diffuse travers des prot ines de canal (porines) dans la membrane externe et se lie une prot ine de liaison au substrat p riplasmique qui le livre au transporteur ABC, qui le pompe travers la membrane plasmique. Le peptidoglycane est omis pour plus de simplicit ; Sa structure poreuse permet aux prot ines liant le substrat et aux solut s solubles dans l'eau de se d placer travers lui par diffusion. Dans la plupart des cellules de vert br s, un transporteur ABC dans la membrane du r ticulum endoplasmique (ER) (appel transporteur associ au traitement de l'antig ne, ou transporteur TAP) pompe activement une grande vari t de peptides du cytosol dans la lumi re du RE. Ces peptides sont produits par la d gradation des prot ines dans les prot asomes (voir le chapitre 6). Ils sont transport s du RE la surface de la cellule, o ils sont expos s l'examen par des lymphocytes T cytotoxiques, qui tuent la cellule si les peptides sont d riv s d'un virus ou d'un autre micro-organisme cach dans le cytosol d'une cellule infect e (voir le chapitre 24). Un autre membre de la famille des transporteurs ABC est la prot ine r gulatrice de la conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR), qui a t d couverte gr ce des tudes sur la maladie g n tique commune de la fibrose kystique. Cette maladie est caus e par une mutation du g ne codant pour CFTR, une prot ine de transport Cl dans la membrane plasmique des cellules pith liales. CFTR r gule les concentrations d'ions dans le liquide extracellulaire, en particulier dans les poumons. Un Caucasien sur 27 est porteur d'un g ne codant pour une forme mutante de cette prot ine. Dans 1 sur 2900, les deux copies du g ne sont mut es, provoquant la maladie. Contrairement d'autres transporteurs ABC, la liaison l'ATP et l'hydrolyse dans la prot ine CFTR ne pilotent pas le processus de transport. Au lieu de cela, ils contr lent l'ouverture et la fermeture d'un canal continu, qui fournit un conduit passif permettant au Cl de descendre son gradient lectrochimique. Ainsi, certaines prot ines ABC peuvent fonctionner comme des transporteurs et d'autres comme des canaux ferm s. Les transporteurs lient des solut s sp cifiques et les transf rent travers la bicouche lipidique en subissant des changements de conformation qui exposent alternativement le site de liaison au solut d'un c t de la membrane, puis de l'autre. Certains transporteurs d placent un seul solut vers le bas , tandis que d'autres peuvent agir comme des pompes pour d placer un solut vers le haut contre son gradient lectrochimique, en utilisant l' nergie fournie par l'hydrolyse de l'ATP, par un coulement descendant d'un autre solut (tel que Na+ ou H+), ou par la lumi re pour entra ner la s rie requise de changements conformationnels de mani re ordonn e. Les transporteurs appartiennent un petit nombre de familles de prot ines. Chaque famille a volu partir d'une prot ine ancestrale commune, et ses membres fonctionnent tous selon un m canisme similaire. La famille des ATPases de transport de type P, qui comprennent les pompes Ca2+ et Na+-K+, en est un exemple important ; chacune de ces ATPases se phosphoryle et se d phosphoryle s quentiellement pendant le cycle de pompage. La superfamille des transporteurs ABC est la plus grande famille de prot ines de transport membranaire et est particuli rement importante sur le plan clinique. Il comprend des prot ines responsables de la fibrose kystique, de la r sistance aux m dicaments dans les cellules canc reuses et les parasites responsables du paludisme, et du pompage de peptides d riv s d'agents pathog nes dans le RE pour que les lymphocytes cytotoxiques se r organisent la surface des cellules infect es. Contrairement aux transporteurs, les canaux forment des pores travers les membranes. Une classe de prot ines de canal que l'on trouve chez pratiquement tous les animaux forme des jonctions lacunaires entre les cellules adjacentes ; Chaque membrane plasmique contribue de mani re gale la formation du canal, qui relie le cytoplasme des deux cellules. Ces canaux sont abord s au chapitre 19 et ne seront pas examin s plus en d tail ici. Les jonctions lacunaires et les porines, les canaux dans les membranes externes des bact ries, des mitochondries et des chloroplastes (discut s au chapitre 10), ont des pores relativement grands et permissifs, et il serait d sastreux qu'ils relient directement l'int rieur d'une cellule un espace extracellulaire. En effet, de nombreuses toxines bact riennes font exactement cela pour tuer d'autres cellules (discut au chapitre 24). En revanche, la plupart des canaux de la membrane plasmique des cellules animales et v g tales qui relient le cytosol l'ext rieur de la cellule ont n cessairement des pores troits et hautement s lectifs qui peuvent s'ouvrir et se fermer rapidement. Parce que ces prot ines so
Biologie moléculaire de la cellule	nt sp cifiquement concern es par le transport d'ions inorganiques, elles sont appel es canaux ioniques. En termes d'efficacit du transport, les canaux ioniques ont un avantage sur les transporteurs, en ce sens qu'ils peuvent faire passer jusqu' 100 millions d'ions travers un canal ouvert chaque seconde, un taux 105 fois sup rieur au taux de transport le plus rapide m di par un transporteur connu. Comme nous l'avons vu pr c demment, cependant, les canaux ne peuvent pas tre coupl s une source d' nergie pour effectuer le transport actif, de sorte que le transport qu'ils m diatisent est toujours passif (en descente). Ainsi, la fonction des canaux ioniques est de permettre des ions inorganiques sp cifiques, principalement Na+, K+, Ca2+ ou Cl , de diffuser rapidement le long de leurs gradients lectrochimiques travers la bicouche lipidique. Dans cette section, nous verrons que la capacit de contr ler les flux d'ions travers ces canaux est essentielle pour de nombreuses fonctions cellulaires. Les cellules nerveuses (neurones), en particulier, se sont fait une sp cialit de l'utilisation des canaux ioniques, et nous examinerons comment elles utilisent de nombreux canaux ioniques diff rents pour recevoir, conduire et transmettre des signaux. Avant de discuter des canaux ioniques, cependant, nous consid rons bri vement les canaux d'eau d'aquaporine que nous avons mentionn s pr c demment. Les aquaporines sont perm ables l'eau mais imperm ables aux ions Parce que les cellules sont principalement constitu es d'eau (g n ralement ~70% en poids), le mouvement de l'eau travers les membranes cellulaires est fondamentalement important pour la vie. Les cellules contiennent galement une forte concentration de solut s, y compris de nombreuses mol cules organiques charg es n gativement qui sont confin es l'int rieur de la cellule (les anions dits fixes) et leurs cations associ s qui sont n cessaires l' quilibre de charge. Cela cr e un gradient osmotique, qui est principalement quilibr par un gradient osmotique oppos en raison d'une forte concentration d'ions inorganiques, principalement Na+ et Cl , dans le liquide extracellulaire. La petite force osmotique restante a tendance attirer l'eau dans la cellule, la faisant gonfler jusqu' ce que les forces soient quilibr es. Comme toutes les membranes biologiques sont mod r ment perm ables l'eau (voir la figure 11-2), le volume cellulaire s' quilibre en quelques minutes ou moins en r ponse un gradient osmotique. Pour la plupart des cellules animales, cependant, l'osmose n'a qu'un r le mineur dans la r gulation du volume cellulaire. En effet, la majeure partie du cytoplasme est dans un tat semblable celui d'un gel et r siste de grands changements de volume en r ponse aux changements d'osmolarit . En plus de la diffusion directe de l'eau travers la bicouche lipidique, certaines cellules procaryotes et eucaryotes ont des canaux d'eau, ou aquaporines, int gr s dans leur membrane plasmique pour permettre l'eau de se d placer plus rapidement. Les aquaporines sont particuli rement abondantes dans les cellules animales qui doivent transporter de l'eau des taux lev s, comme les cellules pith liales du rein ou les cellules exocrines qui doivent transporter ou s cr ter de grands volumes de liquides, respectivement (Figure 11-19). Les aquaporines doivent r soudre un probl me qui est oppos celui qui fait face aux canaux ioniques. Pour viter de perturber les gradients d'ions travers les membranes, ils doivent permettre le passage rapide des mol cules d'eau tout en bloquant le passage des ions. La structure tridimensionnelle d'une aquaporine r v le comment elle atteint cette s lectivit remarquable. Les canaux ont un pore troit qui permet aux mol cules d'eau de traverser la membrane en file indienne, en suivant le chemin des oxyg nes carbonyles qui tapissent un c t du pore (Figure 11 20A et B). Des acides amin s hydrophobes tapissent l'autre c t du pore. Le pore est trop troit pour qu'un ion hydrat puisse y entrer, et le co t nerg tique de la d shydratation d'un ion serait norme car la paroi hydrophobe du pore ne peut pas interagir avec un ion d shydrat pour compenser la perte d'eau. Cette conception explique facilement pourquoi les aquaporines ne peuvent pas conduire K+, Figure 11 19 Le r le des aquaporines dans la s cr tion de liquides. Les cellules qui tapissent les canaux des glandes exocrines (comme on le trouve, par exemple, dans le pancr as et le foie, et dans les glandes mammaires, sudoripares et salivaires) s cr tent de grandes quantit s de fluides corporels. Ces cellules sont organis es en feuillets pith liaux dans lesquels leur membrane plasmique apicale fait face la lumi re du canal. Les pompes ioniques et les canaux situ s dans la membrane plasmique basolat rale et apicale d placent les ions (principalement Na+ et Cl ) dans la lumi re canalaire, cr ant un gradient osmotique entre le tissu environnant et le canal.
Biologie moléculaire de la cellule	Les mol cules d'eau suivent rapidement le gradient osmotique par le biais d'aquaporines qui sont pr sentes en fortes concentrations dans les membranes apicales et basolat rales. Ions Na+, Ca2+ ou Cl-. Ces canaux sont galement imperm ables H+, qui est principalement pr sent dans les cellules sous forme de H3O+. Ces ions hydronium se diffusent extr mement rapidement dans l'eau, en utilisant un m canisme de relais mol culaire qui n cessite la formation et la rupture de liaisons hydrog ne entre les mol cules d'eau adjacentes (Figure 11 20C). Les aquaporines contiennent deux asparagines strat giquement plac es, qui se lient l'atome d'oxyg ne de la mol cule d'eau centrale dans la ligne des mol cules d'eau traversant le pore, imposant une bipolarit l'ensemble de la colonne de mol cules d'eau (Figure 11-20C et D). Cela rend impossible pour la s quence de fabrication et de rupture des liaisons hydrog ne (illustr e sur la figure 11-20C) de passer la mol cule d'eau centrale li e l'asparagine. Parce que les deux valences de cet oxyg ne central ne sont pas disponibles pour la liaison hydrog ne, la mol cule d'eau centrale ne peut pas participer un relais H+, et le pore est donc imperm able H+. Nous nous tournons maintenant vers les canaux ioniques, qui font l'objet du reste du chapitre. Deux propri t s importantes distinguent les canaux ioniques des pores aqueux. Tout d'abord, ils montrent une s lectivit ionique, permettant certains ions inorganiques de passer, mais pas d'autres. Cela sugg re que leurs pores doivent tre suffisamment troits par endroits pour forcer les ions p n trants entrer en contact intime avec les parois du canal afin que seuls les ions de taille et de charge appropri es puissent passer. Les ions perm ables doivent se d barrasser de la plupart ou de la totalit des mol cules d'eau qui leur sont associ es pour passer, souvent en file indienne, travers la partie la plus troite du canal, appel e filtre de s lectivit ; cela limite leur vitesse de passage (Figure 11 21). Ainsi, mesure que la concentration ionique augmente, le flux d'ions travers un canal augmente proportionnellement, puis se stabilise (sature) un taux maximal. Figure 11 20 La structure des aquaporines. (A) Sch ma en ruban d'un monom re d'aquaporine. Dans la membrane, les aquaporines forment des t tram res, chaque monom re contenant un pore aqueux en son centre (non illustr ). Chaque canal d'aquaporine passe environ 109 mol cules d'eau par seconde. (B) Une coupe transversale longitudinale travers un monom re d'aquaporine, dans le plan du pore central. Une face du pore est tapiss e d'acides amin s hydrophiles, qui fournissent des liaisons hydrog ne transitoires aux mol cules d'eau ; Ces liaisons aident aligner les mol cules d'eau en transit sur une seule rang e et les orienter lorsqu'elles traversent le pore. (C et D) Un mod le expliquant pourquoi les aquaporines sont imperm ables H+. (C) Dans l'eau, H+ se diffuse extr mement rapidement en tant relay d'une mol cule d'eau l'autre. (D) Les groupes carbonyles (C = O) qui tapissent la face hydrophile du pore alignent les mol cules d'eau, et deux asparagines strat giquement plac es au centre aident attacher une mol cule d'eau centrale de sorte que les deux valences de son oxyg ne soient occup es. Cet arrangement bipolarise toute la ligne des mol cules d'eau, chaque mol cule d'eau agissant comme un accepteur de liaisons hydrog ne de sa voisine interne (film 11.6). (A et B, adapt de R.M. Stroud et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 13:424-431, 2003. Avec l'autorisation d'Elsevier.) Figure 11 21 Un canal ionique typique, qui fluctue entre les conformations ferm es et ouvertes. Le canal ionique montr ici en coupe efficace forme un pore travers la bicouche lipidique uniquement l' tat conformationnel ouvert . Le pore se r tr cit des dimensions atomiques dans une r gion (le filtre de s lectivit ), o la s lectivit ionique du canal est largement d termin e. Une autre r gion du canal forme la porte. Figure 11 22 Le d clenchement des canaux ioniques. Ce sch ma montre plusieurs types de stimuli qui ouvrent des canaux ioniques. Les canaux portes m caniques ont souvent des extensions cytoplasmiques (non illustr es) qui relient le canal au cytosquelette. La deuxi me distinction importante entre les canaux ioniques et les pores aqueux est que les canaux ioniques ne sont pas ouverts en permanence. Au lieu de cela, ils sont cl tur s, ce qui leur permet de s'ouvrir bri vement puis de se refermer. De plus, avec une stimulation prolong e (chimique ou lectrique), la plupart des canaux ioniques entrent dans un tat ferm d sensibilis ou inactiv , dans lequel ils sont r fractaires une ouverture ult rieure jusqu' ce que le stimulus ait t limin , comme nous le verrons plus loin. Dans la plupart des cas, la porte s'ouvre en r ponse un stimulus sp cifique. Comme le montre la figure 11-22, les principaux types de stimuli connus pour pr
Biologie moléculaire de la cellule	ovoquer l'ouverture des canaux ioniques sont une variation de la tension travers la membrane (canaux voltage-d pendants), une contrainte m canique (canaux d clencheurs m caniquement) ou la liaison d'un ligand (canaux d pendants du ligand). Le ligand peut tre soit un m diateur extracellulaire, plus pr cis ment un neurotransmetteur (canaux d pendants de l' metteur), soit un m diateur intracellulaire tel qu'un ion (canaux d pendants des ions) ou un nucl otide (canaux d pendants des nucl otides). De plus, la phosphorylation et la d phosphorylation des prot ines r gulent l'activit de nombreux canaux ioniques ; ce type de r gulation des canaux est abord , ainsi que les canaux ioniques nucl otidiques, au chapitre 15. Plus de 100 types de canaux ioniques ont t identifi s jusqu' pr sent, et de nouveaux sont encore en cours de d couverte, chacun caract ris par les ions qu'il conduit, le m canisme par lequel il est contr l , son abondance et sa localisation dans la cellule et dans des cellules sp cifiques. Les canaux ioniques sont responsables de l'excitabilit lectrique des cellules musculaires et ils m dient la plupart des formes de signalisation lectrique dans le syst me nerveux. Un seul neurone contient g n ralement 10 types ou plus de canaux ioniques, situ s dans diff rents domaines de sa membrane plasmique. Mais les canaux ioniques ne sont pas limit s aux cellules lectriquement excitables. Ils sont pr sents dans toutes les cellules animales et se trouvent dans les cellules v g tales et les micro-organismes : ils propagent la r ponse de fermeture des feuilles de la plante mimosa, par exemple (film 11.7), et permettent la param cie unicellulaire de changer de direction apr s une collision. Les canaux ioniques qui sont perm ables principalement K+ se trouvent dans la membrane plasmique de presque toutes les cellules. Un sous-ensemble important de canaux K+ s'ouvre m me dans une cellule non stimul e ou au repos , et c'est pourquoi on les appelle canaux de fuite K+. Bien que ce terme s'applique de nombreux canaux K+ diff rents, selon le type de cellule, ils ont un objectif commun : en rendant la membrane plasmique beaucoup plus perm able K+ qu'aux autres ions, ils jouent un r le crucial dans le maintien du potentiel membranaire travers toutes les membranes plasmiques, comme nous le verrons ensuite. Le potentiel membranaire dans les cellules animales d pend principalement des canaux de fuite K+ et du gradient K+ travers la membrane plasmique Un potentiel membranaire se produit lorsqu'il y a une diff rence de charge lectrique des deux c t s d'une membrane, en raison d'un l ger exc s d'ions positifs sur les ions n gatifs d'un c t et d'un l ger d ficit de l'autre. De telles diff rences de charge peuvent r sulter la fois d'un pompage lectrog ne actif (voir p. 608) et d'une diffusion passive d'ions. Comme nous l'expliquons au chapitre 14, les pompes lectrog nes H+ dans la membrane interne mitochondriale g n rent la majeure partie du potentiel membranaire travers cette membrane. Les pompes lectrog nes g n rent galement la majeure partie du potentiel lectrique travers la membrane plasmique chez les plantes et les champignons. Dans les cellules animales typiques, cependant, les mouvements passifs des ions contribuent le plus au potentiel lectrique travers la membrane plasmique. Comme expliqu pr c demment, en raison de l'action de la pompe Na+-K+, il y a peu de Na+ l'int rieur de la cellule, et les autres cations inorganiques intracellulaires doivent tre suffisamment abondants pour quilibrer la charge port e par les anions fixes de la cellule les mol cules organiques charg es n gativement qui sont confin es l'int rieur de la cellule. Ce r le d' quilibrage est jou en grande partie par le K+, qui est activement pomp dans la cellule par la pompe Na+K+ et peut galement se d placer librement l'int rieur ou l'ext rieur par les canaux de fuite K+ dans la membrane plasmique. En raison de la pr sence de ces canaux, K+ arrive presque l' quilibre, o une force lectrique exerc e par un exc s de charges n gatives attirant K+ dans la cellule quilibre la tendance de K+ s' chapper le long de son gradient de concentration. Le potentiel membranaire (de la membrane plasmique) est la manifestation de cette force lectrique, et nous pouvons calculer sa valeur d' quilibre partir de la pente du gradient de concentration K+. L'argument suivant peut aider clarifier cela. Supposons qu'initialement il n'y ait pas de gradient de tension travers la membrane plasmique (le potentiel de membrane est nul) mais que la concentration de K+ est lev e l'int rieur de la cellule et faible l'ext rieur. Le K+ aura tendance quitter la cellule par les canaux de fuite du K+, entra n s par son gradient de concentration. Lorsque K+ commence se d placer, chaque ion laisse derri re lui une charge n gative d s quilibr e, cr ant ainsi un champ lectrique, ou potentiel membranaire, qui aura ten
Biologie moléculaire de la cellule	dance s'opposer l'efflux ult rieur de K+. L'efflux net de K+ s'arr te lorsque le potentiel membranaire atteint une valeur laquelle cette force motrice lectrique sur K+ quilibre exactement l'effet de son gradient de concentration, c'est- -dire lorsque le gradient lectrochimique de K+ est nul. Bien que les ions Cl s' quilibrent galement travers la membrane, le potentiel membranaire emp che la plupart de ces ions d'entrer dans la cellule car leur charge est n gative. La condition d' quilibre, dans laquelle il n'y a pas de flux net d'ions travers la membrane plasmique, d finit le potentiel de la membrane au repos pour cette cellule id alis e. Une formule simple mais tr s importante, l' quation de Nernst, quantifie la condition d' quilibre et, comme expliqu dans la partie 11-1, permet de calculer le potentiel th orique de la membrane au repos si l'on conna t le rapport entre les concentrations d'ions internes et externes. Cependant, comme la membrane plasmique d'une cellule r elle n'est pas exclusivement perm able K+ et Cl , le potentiel r el de la membrane au repos n'est g n ralement pas exactement gal celui pr dit par l' quation de Nernst pour K+ ou Cl . Le potentiel de repos ne diminue que lentement lorsque la pompe Na+-K+ est arr t e Le mouvement d'un nombre infime d'ions inorganiques travers la membrane plasmique travers les canaux ioniques suffit configurer le potentiel membranaire. Ainsi, nous pouvons penser que le potentiel membranaire provient de mouvements de charge qui laissent les concentrations d'ions pratiquement inchang es et n'entra nent qu'un tr s l ger cart dans le nombre d'ions positifs et n gatifs des deux c t s de la membrane (Figure 11 23). De plus, ces mouvements de charge sont g n ralement rapides, ne prenant que quelques millisecondes ou moins. Consid rons la modification du potentiel membranaire dans une cellule r elle apr s l'inactivation soudaine de la pompe Na+-K+. Une l g re baisse du potentiel membranaire se produit imm diatement. En effet, la pompe est lectrog ne et, lorsqu'elle est active, elle produit un L'origine de tout ion inorganique travers un canal membranaire est entra n e par le gradient lectrochimique de cet ion. Ce gradient repr sente la combinaison de deux infuences : le gradient de tension et le gradient de concentration de l'ion travers la membrane. Lorsque ces deux ininfluences s' quilibrent l'une l'autre, le gradient lectrochimique de l'ion est nul et il n'y a pas de fow net de l'ion travers le canal. Le gradient de tension (potentiel membranaire) auquel cet quilibre est atteint est appel potentiel d' quilibre pour l'ion. Elle peut tre calcul e partir d'une quation qui sera d riv e ci-dessous, appel e quation de Nernst. L' quation de Nernst est V = RT In Co zF CiV = le potentiel d' quilibre en volts (interne Co et Ci = concentrations ext rieures et int rieures de l'ion, respectivementR = la constante des gaz (8,3 J mol 1 K 1)T = la temp rature absolue (K)F = la constante de Faraday (9,6 104 J V 1 mol 1) z = la valence (charge) de l'ion In = logarithme la base e e L' quation de Nernst est d riv e comme suit : Une mol cule en solution (un solut ) a tendance se d placer d'une r gion de forte concentration une r gion de faible concentration simplement en raison du mouvement al atoire des mol cules, ce qui entra ne leur quilibre. Par cons quent, le mouvement vers le bas d'un gradient de concentration est accompagn d'une variation favorable de l' nergie libre ( G < 0), tandis que le mouvement vers le haut d'un gradient de concentration est accompagn d'une variation d favorable de l' nergie libre ( G > 0). (L' nergie libre est introduite au chapitre 2 et discut e dans le contexte des r actions d'oxydor duction dans le panneau 14-1, p. 765.) La variation d' nergie libre par mole de solut d plac travers la membrane plasmique ( Gconc) est gale RT In Co / Ci. Si le solut est un ion, le d placer dans une cellule travers une membrane dont l'int rieur est une tension V par rapport l'ext rieur provoquera une variation suppl mentaire d' nergie libre (par mole de solut d plac e) de Gvolt = zFV. Au point o les gradients de concentration et de tension s' quilibrent et o la distribution des ions est l' quilibre travers la membrane. Ainsi, et donc, ou, en utilisant la constante qui convertit les logarithmes naturels en base 10, V = 2,3 log10Pour un cation univalent, 2,3 = 58 mV 20oC et 61,5 mV 37oC.Ainsi, pour un tel ion 37oC, V = + 61,5 mV pour Co/ Ci = 10, tandis que V = 0 pour Co / Ci = 1. Le potentiel d' quilibre K+ (VK), par exemple, est de 61,5 log10([K+]o / [K+]i) millivolts ( 89 mV pour une cellule typique, o [K+]o = 5 mM et [K+]i = 140 mM). Chez VK, il n'y a pas de trace nette de K+ travers la membrane. De m me, lorsque le potentiel membranaire a une valeur de 61,5 log10([Na+]o /[Na+]i), le potentiel d' quilibre Na+ (VNa), il n'y a pas de fow net de Na+. Pour tout potentie
Biologie moléculaire de la cellule	l membranaire particulier, VM, la force nette tendant chasser un type particulier d'ion hors de la cellule, est proportionnelle la diff rence entre VM et le potentiel d' quilibre de l'ion : par cons quent, pour K+, c'est VM VK et pour Na+, c'est VM VNa. Lorsqu'il y a un gradient de tension travers la membrane, les ions responsables de celui-ci, les ions positifs sur d'un c t et les ions n gatifs de l'autre sont concentr s en couches minces de chaque c t de la membrane en raison de l'attraction entre les charges lectriques positives et n gatives. Le nombre d'ions qui forment la couche de charge adjacente la membrane est infime par rapport au nombre total l'int rieur de la cellule. Par exemple, le mouvement de 6000 ions Na+ sur 1 m2 de membrane portera une charge suffisante pour d caler le potentiel de membrane d'environ 100 mV. tant donn qu'il y a environ 3 ions 107 Na+ dans une cellule typique (1 m3 de cytoplasme en vrac), un tel mouvement de charge aura g n ralement un effet n gligeable sur les gradients de concentration d'ions travers la membrane. quilibre exact des charges de chaque c t de quelques-uns des ions positifs (rouge) traversent la membrane ; potentiel membranaire = 0 membrane de droite gauche, laissant leur petite contribution directe au potentiel membranaire en pompant trois Na+ pour deux K+ qu'elle pompe (voir Figure 11 15). Cependant, l'arr t de la pompe n'abolit pas la composante majeure du potentiel de repos, qui est g n r e par le m canisme d' quilibre K+ que nous venons de d crire. Cette composante du potentiel membranaire persiste tant que la concentration de Na+ l'int rieur de la cellule reste faible et que la concentration d'ions K+ est lev e, g n ralement pendant de nombreuses minutes. Mais la membrane plasmique est quelque peu perm able tous les petits ions, y compris le Na+. Par cons quent, sans la pompe Na+-K+, les gradients ioniques mis en place par la pompe finiront par s' puiser, et le potentiel membranaire tabli par diffusion travers les canaux de fuite K+ diminuera galement. Lorsque Na+ entre, la cellule finit par atteindre un nouvel tat de repos o Na+, K+ et Cl- sont tous l' quilibre travers la membrane. Le potentiel membranaire dans cet tat est beaucoup plus faible qu'il ne l' tait dans la cellule normale avec une pompe Na+-K+ active. Le potentiel de repos d'une cellule animale varie entre 20 mV et 120 mV, selon l'organisme et le type de cellule. Bien que le gradient K+ ait toujours une influence majeure sur ce potentiel, les gradients des autres ions (et les effets d s quilibrants des pompes ions) ont galement un effet significatif : plus la membrane est perm able pour un ion donn , plus le potentiel de la membrane a tendance tre fortement pouss vers la valeur d' quilibre pour cet ion. Par cons quent, les modifications de la perm abilit d'une membrane aux ions peuvent entra ner des modifications importantes du potentiel membranaire. C'est l'un des principes cl s reliant l'excitabilit lectrique des cellules aux activit s des canaux ioniques. Pour comprendre comment les canaux ioniques s lectionnent leurs ions et comment ils s'ouvrent et se ferment, nous devons conna tre leur structure atomique. Le premier canal ionique tre cristallis et tudi par diffraction des rayons X tait un canal K+ bact rien. Les d tails de sa structure ont r volutionn notre compr hension des canaux ioniques. La structure tridimensionnelle d'un canal k+ bact rien montre comment un canal ionique peut fonctionner Les scientifiques ont t intrigu s par la remarquable capacit des canaux ioniques combiner une s lectivit ionique exquise avec une conductance lev e. Les canaux de fuite K+, par exemple, conduisent K+ 10 000 fois plus vite que Na+, mais les deux ions sont tous deux des sph res sans caract ristiques et ont des diam tres similaires (0,133 nm et 0,095 nm, respectivement). Une substitution d'un seul acide amin dans le pore d'un canal K+ d'une cellule animale peut entra ner une perte de s lectivit ionique et la mort cellulaire. Nous ne pouvons pas expliquer la s lectivit normale de K+ par la taille des pores, car Na+ est plus petit que K+. De plus, le taux de conductance lev est incompatible avec le fait que le canal ait des sites de liaison K+- s lectifs et de haute affinit , car la liaison des ions K+ de tels sites ralentirait consid rablement leur passage. L' nigme a t r solue lorsque la structure d'un canal K+ bact rien a t d termin e par cristallographie aux rayons X. Le canal est constitu de quatre sous-unit s transmembranaires identiques, qui forment ensemble un pore central travers la membrane. Chaque sous-unit contribue deux h lices transmembranaires, qui sont inclin es vers l'ext rieur dans la membrane et forment ensemble un c ne, dont l'extr mit large est tourn e vers l'ext rieur de la Figure 11 23 La base ionique d'un potentiel membranaire. Un petit flux d'ions inorganiques travers un c
Biologie moléculaire de la cellule	anal ionique transporte une charge suffisante pour provoquer un changement important du potentiel membranaire. Les ions qui donnent naissance au potentiel membranaire se trouvent dans une fine couche superficielle (< 1 nm) proche de la membrane, maintenue l par leur l'attraction lectrique vers leurs homologues charg s de mani re oppos e (contre-ions) de l'autre c t de la membrane. Pour une cellule typique, 1 microcoulomb de charge (6 1012 ions monovalents) par centim tre carr de membrane, transf r d'un c t l'autre de la membrane, modifie le potentiel de membrane d'environ 1 V. Cela signifie, par exemple, que dans une cellule sph rique de diam tre 10 m, le nombre d'ions K+ qui doivent s' couler pour modifier le potentiel membranaire de 100 mV n'est que d'environ 1/100 000 du nombre total d'ions K+ dans le cytosol. Cette quantit est si infime que la concentration intracellulaire de K+ reste pratiquement inchang e. 618 Chapitre 11 : Transport membranaire des petites mol cules et propri t s lectriques des membranes Figure 11 24 La structure d'un canal K+ bact rien. (A) Les h lices transmembranaires de seulement deux des quatre sous-unit s identiques sont repr sent es. Du c t cytosolique, le pore (sch matiquement ombr en bleu) s'ouvre sur un vestibule au milieu de la membrane. Le vestibule des pores facilite le transport en permettant aux ions K+ de rester hydrat s m me s'ils sont plus de la moiti de la membrane. Le filtre de s lectivit troit du pore relie le vestibule l'ext rieur de la cellule. Les oxyg nes carbonyl s tapissent les parois du filtre de s lectivit et forment des sites de liaison transitoires pour les ions K+ d shydrat s. Deux ions K+ occupent des sites diff rents dans le filtre de s lectivit , tandis qu'un troisi me ion K+ est situ au centre du vestibule, o il est stabilis par des interactions lectriques avec les extr mit s les plus charg es n gativement des h lices de pores. Les extr mit s des quatre courtes h lices de pores (dont seulement deux sont montr es) pointent pr cis ment vers le centre du vestibule, guidant ainsi les ions K+ dans le filtre de s lectivit (Vid o 11.8). (B) Les liaisons peptidiques ont un dip le lectrique, avec plus de charge n gative accumul e l'oxyg ne de la liaison C=O et l'azote de la liaison N-H. Dans une h lice , les liaisons hydrog ne (rouge) alignent les dip les. En cons quence, chaque h lice a un dip le lectrique le long de son axe, r sultant de la sommation des dip les des liaisons peptidiques individuelles, avec une extr mit C-terminale plus charg e n gativement ( ) et une extr mit N-terminale plus charg e positivement ( +). (A, adapt de D.A. Doyle et al., Science 280:69-77, 1998.) la cellule o les ions K+ sortent du canal (Figure 11 24). La cha ne polypeptidique qui relie les deux h lices transmembranaires forme une h lice courte (l'h lice des pores) et une boucle cruciale qui fait saillie dans la section large du c ne pour former le filtre de s lectivit . Les boucles de s lectivit des quatre sous-unit s forment un pore court, rigide et troit, qui est tapiss par les atomes d'oxyg ne carbonyle de leurs squelettes polypeptidiques. tant donn que les boucles de s lectivit de tous les canaux K+ connus ont des s quences d'acides amin s similaires, il est probable qu'elles forment une structure troitement similaire. La structure du filtre de s lectivit explique la s lectivit ionique du canal. Un ion K+ doit perdre presque toutes ses mol cules d'eau li es pour p n trer dans le filtre, o il interagit la place avec les oxyg nes carbonyl s qui tapissent le filtre ; les oxyg nes sont espac s de mani re rigide la distance exacte pour accueillir un ion K+. Un ion Na+, en revanche, ne peut pas p n trer dans le filtre car les oxyg nes carbonyles sont trop loign s de l'ion Na+ plus petit pour compenser la d pense nerg tique associ e la perte de mol cules d'eau n cessaires l'entr e (Figure 11 25). Des tudes structurales des canaux K+ et d'autres canaux ioniques ont galement indiqu certains principes g n raux de l'ouverture et de la fermeture de ces canaux. Le gate implique le mouvement des h lices dans la membrane de sorte qu'elles obstruent ou ouvrent la voie au mouvement des ions. Selon le type particulier de canal, les h lices s'inclinent, pivotent ou se plient pendant le gating. La structure d'un canal K+ ferm montre qu'en inclinant les h lices internes, le pore se resserre comme un diaphragme son extr mit cytosolique (Figure 11 26). Des cha nes lat rales d'acides amin s hydrophobes volumineuses bloquent la petite ouverture qui reste, emp chant l'entr e des ions. De nombreux autres canaux ioniques fonctionnent sur des principes similaires : les h lices de d clenchement du canal sont coupl es allost riquement des domaines qui forment la voie conductrice d'ions ; Et un changement conformationnel dans la porte en r ponse, par exemple, la liaison d'un ligand ou un potentiel membranaire mod
Biologie moléculaire de la cellule	ifi entra ne un changement conformationnel dans la voie conductrice, soit en l'ouvrant, soit en la bloquant. Tous les organismes, des bact ries unicellulaires aux animaux et plantes multicellulaires, doivent d tecter et r pondre aux forces m caniques de leur environnement externe (telles que le son, le toucher, la pression, les forces de cisaillement et la gravit ) et dans leur environnement interne (comme la pression osmotique et la flexion de la membrane). De nombreuses prot ines sont connues pour tre capables de r pondre de telles forces m caniques, et un grand sous-ensemble de ces prot ines a t identifi comme des canaux m canosensibles possibles, mais tr s peu de prot ines candidates se sont r v l es tre des canaux ioniques activ s m caniquement. L'une des raisons de ce manque de connaissances est que la plupart de ces cha nes sont extr mement rares. Les cellules cili es auditives de la cochl e humaine, par exemple, contiennent des canaux ioniques m caniquement sensibles extraordinairement sensibles, mais on pense que chacune des quelque 15 000 cellules cili es individuelles n'en a qu'un total de 50 100 (film 11.9). Des difficult s suppl mentaires surgissent parce que les m canismes de d clenchement de nombreux types de canaux m canosensibles exigent que les canaux soient int gr s dans des architectures complexes qui n cessitent une fixation la matrice extracellulaire ou au cytosquelette et sont difficiles reconstituer dans le tube essai. L' tude des r cepteurs m canosensibles est un domaine d'investigation actif. Une classe bien tudi e de canaux m canosensibles se trouve dans la membrane plasmique bact rienne. Ces canaux s'ouvrent en r ponse l' tirement m canique de la bicouche lipidique dans laquelle ils sont int gr s. Lorsqu'une bact rie est confront e un environnement externe de faible force ionique (conditions hypotoniques), comme Figure 11 25 Sp cificit K+ du filtre de s lectivit dans un canal K+. Les dessins montrent les ions K+ et Na+ (A) dans le vestibule et (B) dans le filtre de s lectivit du pore, vus en coupe transversale. Dans le vestibule, les ions sont hydrat s. Dans le filtre de s lectivit , ils ont perdu leur eau et les oxyg nes carbonyles sont plac s pour accueillir un ion K+ d shydrat . La d shydratation de l'ion K+ n cessite de l' nergie, qui est pr cis ment quilibr e par l' nergie r cup r e par l'interaction de l'ion avec tous les oxyg nes carbonyles qui servent de mol cules d'eau de substitution. Parce que l'ion Na+ est trop petit pour interagir avec les oxyg nes, il ne peut entrer dans le filtre de s lectivit qu' un co t nerg tique lev . Le filtre s lectionne donc des ions K+ haute sp cificit . (A, adapt de Y. Zhou et al., Nature 414:43-48, 2001. Avec l'autorisation de Macmillan Publishers Ltd.) Figure 11 26 : un mod le de d clenchement d'un canal K+ bact rien. Le canal est visualis en coupe transversale. Pour adopter la conformation ferm e, les quatre h lices transmembranaires internes qui tapissent le pore du c t cytosolique du filtre de s lectivit (voir Figure 11-24) se r organisent pour fermer l'entr e cytosolique du canal. (Adapt de E. Perozo et al., Science 285:73-78, 1999.) (A) FERM (B) OUVERT Figure 11 27 La structure des canaux m canosensibles. Les structures cristallines de MscS dans sa conformation (A) ferm e et (B) ouverte sont repr sent es. Les vues lat rales (panneaux inf rieurs) montrent la prot ine enti re, y compris le grand domaine intracellulaire. Les vues de face (panneaux sup rieurs) ne montrent que les domaines transmembranaires. La structure ouverte occupe plus de surface dans la bicouche lipidique et est nerg tiquement favoris e lorsqu'une membrane est tir e. Cela peut expliquer pourquoi le canal MscS s'ouvre lorsque la pression s'accumule l'int rieur de la cellule. (Codes PDB : 2OAU, 2VV5.) eau de pluie, la cellule gonfle mesure que l'eau s'infiltre en raison d'une augmentation de la pression osmotique. Si la pression atteint des niveaux dangereux, la cellule ouvre des canaux m canosensibles qui permettent aux petites mol cules de s' chapper. Les bact ries qui sont plac es exp rimentalement dans de l'eau douce peuvent rapidement perdre plus de 95 % de leurs petites mol cules de cette mani re, y compris les acides amin s, les sucres et les ions potassium. Cependant, ils gardent leurs macromol cules en s curit l'int rieur et peuvent donc se r tablir rapidement une fois que les conditions environnementales sont revenues la normale. Le d clenchement m canique a t d montr l'aide de techniques biophysiques dans lesquelles la force est exerc e sur des bicouches lipidiques pures contenant les canaux m canosensibles bact riens ; Par exemple, en appliquant une aspiration l'aide d'une micropipette. De telles mesures d montrent que la cellule poss de plusieurs canaux diff rents qui s'ouvrent diff rents niveaux de pression. Le canal m canosensible de faible conductance, appel canal MscS, s'ouvre des pr
Biologie moléculaire de la cellule	essions basses et mod r es (Figure 11 27). Il est compos de sept sous-unit s identiques, qui, l' tat ouvert, forment un pore d'environ 1,3 nm de diam tre, juste assez grand pour laisser passer des ions et de petites mol cules. De grands domaines cytoplasmiques limitent la taille des mol cules qui peuvent atteindre le pore. Le canal m canosensible de grande conductance, appel canal MscL, s'ouvre plus de 3 nm de diam tre lorsque la pression devient si lev e que la cellule peut clater. La fonction d'un neurone d pend de sa structure allong e Les cellules qui font l'usage le plus sophistiqu des canaux sont les neurones. Avant de discuter de la fa on dont ils le font, nous faisons une br ve digression pour d crire comment un neurone typique est organis . La t che fondamentale d'un neurone, ou cellule nerveuse, est de recevoir, de conduire et de transmettre des signaux. Pour remplir ces fonctions, les neurones sont souvent extr mement allong s. Chez l'homme, par exemple, un seul neurone s' tendant de la moelle pini re un muscle du pied peut mesurer jusqu' 1 m tre de long. Chaque neurone est constitu d'un corps cellulaire (contenant le noyau) avec un certain nombre de processus minces rayonnant vers l'ext rieur. Habituellement, un long axone conduit les signaux du corps cellulaire vers une distance Figure 11 28 : un neurone de vert br typique. Les fl ches indiquent la direction dans laquelle les signaux sont transmis. L'axone unique conduit les signaux loin du corps cellulaire, tandis que les dendrites multiples (et le corps cellulaire) re oivent des signaux des axones d'autres neurones. Les terminaisons axonales se terminent sur les dendrites ou le corps cellulaire d'autres neurones ou sur d'autres types de cellules, tels que les cellules musculaires ou glandulaires. cibles, et plusieurs dendrites ramifi es plus courtes s' tendent partir du corps cellulaire comme des antennes, offrant une surface largie pour recevoir des signaux des axones d'autres neurones (Figure 11-28), bien que le corps cellulaire lui-m me re oive galement de tels signaux. Un axone typique se divise son extr mit en plusieurs branches, transmettant son message plusieurs cellules cibles simultan ment. De m me, l' tendue de la ramification des dendrites peut tre tr s grande dans certains cas, suffisante pour recevoir jusqu' 100 000 entr es sur un seul neurone. Malgr l'importance variable des signaux transport s par diff rentes classes de neurones, la forme du signal est toujours la m me, consistant en des changements dans le potentiel lectrique travers la membrane plasmique du neurone. Le signal se propage parce qu'une perturbation lectrique produite dans une partie de la membrane se propage d'autres parties, bien que la perturbation s'affaiblisse mesure que l'on s' loigne de sa source, moins que le neurone ne d pense de l' nergie pour l'amplifier lorsqu'il se d place. Sur de courtes distances, cette att nuation n'a pas d'importance ; En fait, de nombreux petits neurones conduisent leurs signaux de mani re passive, sans amplification. Pour les communications longue distance, cependant, une telle propagation passive est insuffisante. Ainsi, les neurones plus grands utilisent un m canisme de signalisation actif, ce qui est l'une de leurs caract ristiques les plus frappantes. Un stimulus lectrique qui d passe un certain seuil d clenche une explosion d'activit lectrique qui se propage rapidement le long de la membrane plasmique du neurone et est soutenue par une amplification automatique tout au long du processus. Cette onde progressive d'excitation lectrique, connue sous le nom de potentiel d'action, ou influx nerveux, peut transporter un message sans att nuation d'un bout l'autre d'un neurone des vitesses de 100 m tres par seconde ou plus. Les potentiels d'action sont la cons quence directe des propri t s des canaux cationiques voltage-d pendants, comme nous le voyons maintenant. La membrane plasmique de toutes les cellules lectriquement excitables non seulement les neurones, mais aussi les cellules musculaires, endocriniennes et ovules contient des canaux cationiques voltage-d pendants, qui sont responsables de la g n ration des potentiels d'action. Un potentiel d'action est d clench par une d polarisation de la membrane plasmique, c'est- -dire par un d calage du potentiel de la membrane vers une valeur moins n gative l'int rieur. (Nous verrons plus loin comment l'action d'un neurotransmetteur provoque la d polarisation.) Dans les cellules nerveuses et musculaires squelettiques, un stimulus qui provoque une d polarisation suffisante ouvre rapidement les canaux Na+ voltage-d pendants, permettant une petite quantit de Na+ de p n trer dans la cellule le long de son gradient lectrochimique. L'afflux de charge positive d polarise davantage la membrane, ouvrant ainsi plus de canaux Na+, qui admettent plus d'ions Na+, provoquant une d polarisation encore plus pouss e. Ce processus d'aut
Biologie moléculaire de la cellule	o-amplification (un exemple de r troaction positive, discut dans les chapitres 8 et 15) se poursuit jusqu' ce que, en une fraction de milliseconde, le potentiel lectrique dans la r gion locale de la membrane soit pass de sa valeur au repos d'environ 70 mV (dans l'axone g ant du calmar ; environ 40 mV chez l'homme) presque aussi loin que le potentiel d' quilibre Na+ d'environ +50 mV (voir Panneau 11-1, p. 616). ce stade, lorsque la force motrice lectrochimique nette pour l' coulement de Na+ est presque nulle, la cellule arriverait un nouvel tat de repos, avec tous ses canaux Na+ ouverts en permanence, si la conformation ouverte du canal tait stable. Deux m canismes agissent de concert pour sauver la cellule d'un tel spasme lectrique permanent : les canaux Na+ inactivent automatiquement et les canaux K+ voltage-d pendants ouvert pour restaurer le potentiel de la membrane sa valeur n gative initiale. Le canal Na+ est construit partir d'une seule cha ne polypeptidique qui contient quatre domaines structurellement tr s similaires. On pense que ces domaines ont volu par duplication g nique suivie d'une fusion en un seul grand g ne (Figure 11 29A). Chez les bact ries, en fait, le canal Na+ est un t tram re de quatre cha nes polypeptidiques identiques, ce qui soutient cette id e volutive. Chaque domaine contribue au canal central, qui est tr s similaire au canal K+. Chaque domaine contient galement un capteur de tension qui est caract ris par une h lice transmembranaire inhabituelle, S4, qui contient de nombreux acides amin s charg s positivement. Au fur et mesure que la membrane se d polarise, les h lices S4 subissent une force d'attraction lectrostatique qui les attire vers le c t extracellulaire de la membrane plasmique, maintenant charg n gativement. Le changement de conformation qui en r sulte ouvre le canal. La structure d'un canal Na+ voltage-d pendant bact rien donne un aper u de la fa on dont les l ments structurels sont dispos s dans la membrane (figures 11 29B et C). Les canaux Na+ ont galement un m canisme d'inactivation automatique, qui provoque la refermeture rapide des canaux m me si la membrane est encore d polaris e (voir Figure 11 30). Les canaux Na+ restent dans cet tat inactiv , incapables de se rouvrir, jusqu' ce que le potentiel membranaire soit revenu sa valeur n gative initiale. Le temps n cessaire pour qu'un nombre suffisant de canaux Na+ se remettent de l'inactivation afin de soutenir un nouveau potentiel d'action, appel p riode r fractaire, limite Figure 11 29 Mod les structurels de canaux Na+ voltage-d pendants. (A) Le canal dans les cellules animales est construit partir d'une seule cha ne polypeptidique qui contient quatre domaines homologues. Chaque domaine contient deux h lices transmembranaires (vertes) qui entourent le pore central conducteur d'ions. Ils sont s par s par des s quences (en bleu) qui forment le filtre de s lectivit . Quatre h lices suppl mentaires (grises et rouges) dans chaque domaine constituent le capteur de tension. Les h lices S4 (rouges) sont uniques en ce sens qu'elles contiennent une abondance d'arginines charg es positivement. Une porte d'inactivation qui fait partie d'une boucle flexible reliant les troisi me et quatri me domaines agit comme un bouchon qui obstrue le pore dans l' tat inactiv du canal, comme le montre la figure 11-30. (B) Vues lat rales et sup rieures d'une prot ine de canal bact rien homologue montrant sa disposition l'int rieur de la membrane. (C) Une coupe efficace du domaine poreux du canal illustr en (B) montre des portails lat raux, travers lesquels la cavit centrale est accessible partir du noyau hydrophobe de la bicouche lipidique. Dans les cristaux, on a constat que les cha nes acyles lipidiques s'immiscent dans les pores. Ces portes lat rales sont suffisamment grandes pour permettre l'entr e de petits m dicaments hydrophobes bloquant les pores qui sont couramment utilis s comme anesth siques et bloquent la conductance des ions. (Code PDB : 3RVZ.) Figure 11 30 Canaux Na+ et potentiel d'action. (A) Un potentiel d'action est d clench par une br ve impulsion de courant, qui (B) d polarise partiellement la membrane, comme le montre le graphique du potentiel de membrane en fonction du temps. La courbe verte montre comment le potentiel de la membrane se serait simplement d tendu pour revenir la valeur de repos apr s le stimulus de d polarisation initial s'il n'y avait pas eu de canaux Na+ voltage-d pendants dans la membrane. La courbe rouge montre le cours du potentiel d'action caus par l'ouverture et l'inactivation ult rieure des canaux Na+ voltage-d pendants. Les tats des canaux Na+ sont indiqu s en (B). La membrane ne peut pas d clencher un deuxi me potentiel d'action tant que les canaux Na+ ne sont pas revenus de la conformation inactiv e la conformation ferm e ; Jusque-l , la membrane est r fractaire la stimulation. (C) Les trois tats du canal Na+. Lorsque la membr
Biologie moléculaire de la cellule	ane est au repos (fortement polaris e), la conformation ferm e du canal a l' nergie libre la plus faible et est donc la plus stable ; Lorsque la membrane est d polaris e, l' nergie de la conformation ouverte est plus faible, de sorte que le canal a une forte probabilit d'ouverture. Mais l' nergie libre de la conformation inactiv e est encore plus faible ; Par cons quent, apr s une p riode variable al atoire pass e l' tat ouvert, le canal est inactiv . Ainsi, la conformation ouverte correspond un tat m tastable qui ne peut exister que transitoirement lorsque la membrane se d polarise (Vid o 11.10). la cadence de d charge r p titive d'un neurone. Le cycle du stimulus initial au retour au repos initial l' tat prend quelques millisecondes ou moins. Le canal Na+ peut donc exister dans trois tats distincts ferm , ouvert et inactiv qui contribuent la hausse et la baisse du potentiel d'action (Figure 11 30). Cette description d'un potentiel d'action ne s'applique qu' une petite partie de la membrane plasmique. La d polarisation auto-amplifiante du patch, cependant, est suffisante pour d polariser les r gions voisines de la membrane, qui passent ensuite par le m me cycle. De cette fa on, le potentiel d'action balaie comme une onde du site initial de d polarisation sur l'ensemble de la membrane plasmique, comme le montre la figure 11-31. L'utilisation des channelrhodopsines a r volutionn l' tude des circuits neuronaux Les channelrhodopsines sont des canaux ioniques photosensibles qui s'ouvrent en r ponse la lumi re. Ils ont volu en tant que r cepteurs sensoriels dans les algues vertes photosynth tiques pour permettre aux algues de nager vers la lumi re. La structure de la channelrhodopsine ressemble beaucoup celle de la bact riorhodopsine (voir Figure 10 31). Il contient un groupe r tinien li de mani re covalente qui absorbe la lumi re et subit une r action d'isom risation, ce qui d clenche un changement de conformation de la prot ine, ouvrant un canal ionique dans la membrane plasmique. Contrairement la bact riorhodopsine, qui est une pompe protons entra n e par la lumi re, la channelrhodopsine est un canal cationique induit par la lumi re. En utilisant des techniques de g nie g n tique, la channelrhodopsine peut tre exprim e dans pratiquement n'importe quel type de cellule chez les vert br s et les invert br s. Les chercheurs ont d'abord introduit le g ne dans des neurones en culture et ont montr que la lumi re clignotante pouvait maintenant activer la channelrhodopsine et induire les neurones d clencher des potentiels d'action. Parce que la fr quence des flashs lumineux d terminait la fr quence des potentiels d'action, on peut contr ler la fr quence des d charges neuronales avec une pr cision de l'ordre de la milliseconde. Ensuite, les neurobiologistes ont utilis l'approche pour activer des neurones sp cifiques dans le cerveau d'animaux de laboratoire. l'aide d'un minuscule c ble fibre optique implant pr s de l'axone au temps = 0 (d clenchement du potentiel d'action) Figure 11 31 Propagation d'un potentiel d'action le long d'un axone. (A) Les tensions qui seraient enregistr es partir d'un ensemble d' lectrodes intracellulaires plac es intervalles le long de l'axone. (B) Les changements dans les canaux Na+ et les flux de courant (fl ches rouges incurv es) qui donnent lieu un potentiel d'action de d placement. La r gion de l'axone avec une membrane d polaris e est ombr e en bleu. Notez qu'une fois qu'un potentiel d'action a commenc progresser, il doit continuer dans la m me direction, ne s' loignant que du site de d polarisation, car l'inactivation du canal Na+ emp che la d polarisation de se propager vers l'arri re. R gion c r brale pertinente, ils pourraient faire clignoter la lumi re pour activer sp cifiquement les neurones contenant la channelrhodopsine pour d clencher des potentiels d'action. Un groupe de chercheurs a exprim la channelrhodopsine dans un sous-ensemble de neurones de souris que l'on pensait impliqu s dans l'agression : lorsque ces cellules taient activ es par la lumi re, la souris attaquait imm diatement tout ce qui se trouvait dans son environnement, y compris d'autres souris ou m me un gant en caoutchouc gonfl (Figure 11-32) ; Lorsque la lumi re a t teinte, les neurones se sont tus et le comportement de la souris est revenu la normale. Depuis ces tudes pionni res, les chercheurs ont mis au point d'autres canaux et transporteurs d'ions sensibles la lumi re, dont certains peuvent rapidement Figure 11 32 Contr le optog n tique des neurones d'agression chez une souris vivante. Un g ne codant pour la channelrhodopsine a t introduit dans une sous-population de neurones dans l'hypothalamus d'une souris. Lorsque les neurones ont t expos s une lumi re bleue clignotante l'aide d'un minuscule c ble fibre optique implant , les canaux de rhodopsine se sont ouverts, d polarisant et activant les cellules. Lorsque la lumi re a t
Biologie moléculaire de la cellule	allum e, la souris est imm diatement devenue agressive et a attaqu le gant en caoutchouc gonfl ; lorsque la lumi re a t teinte, son comportement est imm diatement revenu la normale (Vid o 11.11). (D'apr s D. Lin et al., Nature 470:221-226, 2011. Avec l'autorisation de Macmillan Publishers Ltd.) Inactiver des neurones sp cifiques. Il est donc maintenant possible d'activer ou d'inhiber transitoirement des neurones sp cifiques dans le cerveau d'animaux veill s avec une pr cision spatiale et temporelle remarquable. De cette fa on, le nouveau domaine en expansion rapide de l'optog n tique r volutionne la neurobiologie, permettant aux neuroscientifiques d'analyser les neurones et les circuits sous-jacents m me aux comportements les plus complexes chez les animaux de laboratoire, y compris les primates non humains. La my linisation augmente la vitesse et l'efficacit de la propagation du potentiel d'action dans les cellules nerveuses Les axones de nombreux neurones vert br s sont isol s par une gaine de my line, ce qui augmente consid rablement la vitesse laquelle un axone peut conduire un potentiel d'action. L'importance de la my linisation est d montr e de fa on spectaculaire par la scl rose en plaques, une maladie d my linisante, dans laquelle le syst me immunitaire d truit les gaines de my line dans certaines r gions du syst me nerveux central ; Dans les r gions touch es, la propagation de l'influx nerveux ralentit consid rablement, voire choue, ce qui entra ne souvent des cons quences neurologiques d vastatrices. La my line est form e par des cellules de soutien non neuronales sp cialis es appel es cellules gliales. Les cellules de Schwann sont les cellules gliales qui my linisent les axones dans les nerfs p riph riques, et les oligodendrocytes le font dans le syst me nerveux central. Ces cellules gliales my linisantes enveloppent couche apr s couche de leur propre membrane plasmique en une spirale serr e autour de l'axone (figures 11-33A et B), isolant ainsi la membrane axonale de sorte que peu de courant peut s' chapper travers elle. La gaine de my line est interrompue au niveau des n uds r guli rement espac s de Ranvier, o presque tous les canaux Na+ de l'axone sont concentr s (Figure 11 33C). Cet arrangement permet un potentiel d'action de se propager le long d'un axone my linis en sautant d'un n ud l'autre, un processus appel conduction saltatoire. Ce type de conduction pr sente deux avantages principaux : les potentiels d'action voyagent beaucoup plus rapidement et l' nergie m tabolique est conserv e car l'excitation active est confin e aux petites r gions de la membrane plasmique axonale aux n uds de Ranvier. Figure 11 33 My linisation. (A) Un axone my linis provenant d'un nerf p riph rique. Chaque cellule de Schwann enroule concentriquement sa membrane plasmique autour de l'axone pour former un segment de gaine de my line d'environ 1 mm de long. Pour plus de clart , les couches membranaires de la my line sont moins compact es qu'elles ne le sont en r alit (voir partie B). (B) Micrographie lectronique d'un nerf dans la patte d'un jeune rat. Deux cellules de Schwann peuvent tre observ es : l'une pr s du fond commence tout juste my liniser son axone ; Celle qui se trouve au-dessus a form une gaine de my line presque mature. (C) Micrographie fluorescence et sch ma d'axones my linis s individuels s par s dans un nerf optique de rat, montrant le confinement des canaux Na+ voltage-d pendants (vert) dans la membrane axonale au n ud de Ranvier. Une prot ine appel e Caspr (rouge) marque les jonctions o la membrane plasmique my linisante des cellules gliales s'appuie troitement sur l'axone de chaque c t du n ud. Les canaux K+ voltage-d pendants (bleu) se localisent dans des r gions de la membrane plasmique axonale bien loign es du n ud. (B, d'apr s Cedric S. Raine, dans Myelin [P. Morell, d.]. New York : Pl num, 1976 ; C, d'apr s M.N. Rasband et P. Shrager, J. Physiol. 525:63-73, 2000. Avec l'autorisation de Blackwell Publishing.) Les membranes plasmiques des neurones et des muscles squelettiques contiennent plusieurs milliers de canaux Na+ voltage-d pendants, et le courant traversant la membrane est la somme des courants qui traversent tous ces canaux. Une micro lectrode intracellulaire peut enregistrer ce courant agr g , comme le montre la figure 11-31A. Remarquablement, cependant, il est galement possible d'enregistrer le courant circulant dans des canaux individuels. L'enregistrement par patch-clamp, d velopp dans les ann es 1970 et 1980, a r volutionn l' tude des canaux ioniques et a permis d'examiner le transport travers un seul canal dans une petite tache de membrane recouvrant l'embouchure d'une micropipette (Figure 11 34). Avec cette technique simple mais puissante, on peut tudier en d tail les propri t s des canaux ioniques dans toutes sortes de types de cellules. Ces travaux ont conduit la d couverte que m me les cellules qui ne sont pas lectriquement
Biologie moléculaire de la cellule	excitables ont g n ralement une vari t de canaux ioniques dans leur membrane plasmique. Beaucoup de ces cellules, comme les levures, sont trop petites pour tre tudi es par la m thode traditionnelle d'empalement de l' lectrophysiologiste avec une micro lectrode intracellulaire. L'enregistrement par patch-clamp indique que les canaux ioniques individuels s'ouvrent de mani re tout ou rien. Par exemple, un canal Na+ voltage-d pendant s'ouvre et se ferme au hasard, mais lorsqu'il est ouvert, le canal a toujours la valeur m me conductance lev e, permettant plus de 1000 ions de passer par milliseconde (Figure 11 35). Par cons quent, le courant agr g traversant la membrane d'une cellule enti re n'indique pas le degr d'ouverture d'un canal individuel typique, mais plut t le nombre total de canaux de sa membrane qui sont ouverts un moment donn . Quelques principes physiques simples nous permettent d'affiner notre compr hension du voltage-gating du point de vue d'un seul canal Na+. L'int rieur du neurone au repos ou de la cellule musculaire a un potentiel lectrique d'environ 40 100 mV plus n gatif que le milieu externe. Bien que cette diff rence de potentiel semble faible, elle existe travers une membrane plasmique d'environ 5 nm d' paisseur, de sorte que le gradient de tension r sultant est d'environ 100 000 V/cm. Les prot ines charg es dans la membrane telles que les canaux Na+ sont ainsi soumises un champ lectrique tr s important qui peut profond ment affecter leur conformation. Chaque conformation peut basculer vers une autre conformation si elle re oit une secousse suffisante par les mouvements thermiques al atoires de l'environnement, et c'est la stabilit relative des conformations ferm es, ouvertes et inactiv es contre le retournement qui est modifi e par les changements dans le potentiel de membrane (voir Figure 11-30C). Les canaux Na+ ne sont pas le seul type de canal cationique voltage-d pendant qui peut g n rer un potentiel d'action. Les potentiels d'action dans certaines cellules musculaires, ovules et endocrines, par exemple, d pendent des canaux Ca2+ voltage-d pendants plut t que des canaux Na+. Retirez la micropipette du verre cellulaire pour d tacher le patch de la micropipette Figure 11 34 La technique de l'enregistrement par patch-clamp. En raison de l' tanch it extr mement troite entre la micropipette et la membrane, le courant ne peut entrer ou sortir de la micropipette qu'en passant par les canaux ioniques de la pi ce de membrane recouvrant sa pointe. Le terme pince est utilis parce qu'un dispositif lectronique est utilis pour maintenir, ou clamp , le potentiel de membrane une valeur d finie tout en enregistrant le courant ionique travers des canaux individuels. Le courant travers ces canaux peut tre enregistr avec le patch toujours attach au reste de la cellule, comme dans (A), ou d tach , comme dans (B). L'avantage du patch d tach est qu'il est facile de modifier la composition de la solution de chaque c t de la membrane pour tester l'effet de divers solut s sur le comportement des canaux. Un patch d tach peut galement tre produit avec l'orientation oppos e, de sorte que la surface cytoplasmique de la membrane fasse face l'int rieur de la pipette. Il existe une quantit surprenante de diversit structurelle et fonctionnelle au sein de chacune des diff rentes classes de canaux cationiques voltage-d pendants, g n r s la fois par plusieurs g nes et par l' pissage alternatif de transcrits d'ARN produits partir du m me g ne. N anmoins, les s quences d'acides amin s des canaux connus Na+, K+ et Ca2+ voltage-d pendants pr sentent des similitudes frappantes, d montrant qu'ils appartiennent tous une grande superfamille de prot ines li es sur le plan de l' volution et de la structure et partagent de nombreux principes de conception. Alors que la levure unicellulaire S. cerevisiae contient un seul g ne qui code pour un canal K+ voltage-d pendant, le g nome du ver C. elegans contient 68 g nes qui codent des canaux K+ diff rents mais apparent s. Cette complexit indique que m me un syst me nerveux simple compos de seulement 302 neurones utilise un grand nombre de canaux ioniques diff rents pour calculer ses r ponses. Les humains qui h ritent de g nes mutants codant pour des canaux ioniques peuvent souffrir de diverses maladies nerveuses, musculaires, c r brales ou cardiaques, selon les cellules dans lesquelles le canal cod par le g ne mutant fonctionne normalement. Des mutations dans les g nes qui codent pour des canaux Na+ voltage-d pendants dans les cellules musculaires squelettiques, par exemple, peuvent provoquer une myotonie, une condition dans laquelle il y a un retard dans la relaxation musculaire apr s une contraction volontaire, provoquant des spasmes musculaires douloureux. Dans certains cas, cela se produit parce que les canaux anormaux ne s'inactivent pas normalement ; en cons quence, l'entr e de Na+ persiste apr s la fin d'un potent
Biologie moléculaire de la cellule	iel d'action et r active plusieurs reprises la d polarisation membranaire et la contraction musculaire. De m me, les mutations qui affectent les canaux Na+ ou K+ dans le cerveau peuvent provoquer l' pilepsie, dans laquelle une d charge synchronis e excessive de grands groupes de neurones provoque des crises d' pilepsie (convulsions ou crises). La combinaison particuli re de canaux ioniques conducteurs de Na+, K+ et Ca2+ qui sont exprim s dans un neurone d termine en grande partie comment la cellule d clenche des s quences r p titives de potentiels d'action. Certaines cellules nerveuses peuvent r p ter des potentiels d'action jusqu' 300 fois par seconde ; d'autres neurones d clenchent de courtes rafales de potentiels d'action s par s par des p riodes de silence ; tandis que d'autres d clenchent rarement plus d'un potentiel d'action la fois. Il existe une diversit remarquable de neurones dans le cerveau. On estime que le cerveau humain contient environ 1011 neurones et 1014 connexions synaptiques. Pour compliquer les choses, les circuits neuronaux sont continuellement sculpt s en r ponse l'exp rience, modifi s au fur et mesure que nous apprenons et stockons des souvenirs, et irr versiblement modifi s par la perte progressive des neurones et de leurs connexions mesure que nous vieillissons. Comment un syst me aussi complexe peut-il tre soumis de tels changements et pourtant continuer fonctionner de mani re stable ? Une th orie mergente sugg re que les neurones individuels sont des dispositifs d'auto-r glage, ajustant constamment l'expression des canaux ioniques et des r cepteurs de neurotransmetteurs afin de maintenir une fonction stable. Comment cela pourrait-il fonctionner ? Les neurones peuvent tre class s en types fonctionnellement diff rents, en partie en fonction de leur propension d clencher des potentiels d'action et de leur mode de d charge. Par exemple, certains neurones d clenchent des potentiels d'action des fr quences lev es, tandis que d'autres se d clenchent rarement. Les propri t s de d charge de chaque type de neurone sont d termin es dans une large mesure par les canaux ioniques exprim s par la cellule. Le nombre de canaux ioniques dans la membrane d'un neurone n'est pas fixe : mesure que les conditions changent, un neurone peut modifier le nombre de canaux d polarisants (Na+ et Ca2+) et hyperpolarisants (K+) et maintenir leurs proportions ajust es afin de maintenir son comportement de d charge caract ristique un exemple remarquable de contr le hom ostatique. Les m canismes mol culaires impliqu s restent un myst re important. Les signaux neuronaux sont transmis de cellule cellule des sites de contact sp cialis s appel s synapses. Le m canisme habituel de transmission est indirect. Les cellules sont Figure 11 35 Mesures de patch-clamp pour un seul canal Na+ voltage-d pendant. Une minuscule plaque de membrane plasmique a t d tach e d'une cellule musculaire embryonnaire de rat, comme dans la figure 11-34. (A) La membrane a t d polaris e par un brusque d calage de potentiel de 90 environ 40 mV. (B) Trois enregistrements actuels de trois exp riences r alis es sur la m me parcelle de membrane. Chaque tape de courant majeure en (B) repr sente l'ouverture et la fermeture d'un seul canal. Une comparaison des trois enregistrements montre que, alors que les dur es d'ouverture et de fermeture des canaux varient consid rablement, la vitesse laquelle le courant circule dans un canal ouvert (sa conductance) est pratiquement constante. Les fluctuations mineures dans les enregistrements actuels proviennent en grande partie du bruit lectrique dans l'appareil d'enregistrement. Le courant circulant dans la cellule, mesur en picoamp res (pA), est repr sent par une d viation vers le bas de la courbe. Par convention, le potentiel lectrique l'ext rieur de la pile est d fini comme z ro. (C) La somme des courants mesur s en 144 r p titions de la m me exp rience. Ce courant agr g est quivalent au courant Na+ habituel que l'on observerait circuler travers une r gion relativement grande de membrane contenant 144 canaux. Une comparaison de (B) et (C) r v le que l' volution temporelle du courant agr g refl te la probabilit qu'un canal individuel soit l' tat ouvert ; Cette probabilit diminue avec le temps mesure que les canaux de la membrane d polaris e adoptent leur conformation inactiv e. (Donn es de J. Patlak et R. Horn, J. Gen. Physiol. 79:333-351, 1982. Avec l'autorisation de The Rockefeller University Press.) Terminaison nerveuse du neurotransmetteur de la cellule pr synaptique dans la v sicule synaptique Figure 11 36 : une synapse chimique. (A) Lorsqu'un potentiel d'action atteint la terminaison nerveuse dans une cellule pr synaptique, il stimule la terminaison lib rer son neurotransmetteur. Les mol cules de neurotransmetteurs sont contenues dans les v sicules synaptiques et sont lib r es l'ext rieur de la cellule lorsque les v sicules fusionnent
Biologie moléculaire de la cellule	avec la membrane plasmique de la terminaison nerveuse. Le neurotransmetteur lib r se lie et ouvre les canaux ioniques d pendants de l' metteur concentr s dans la membrane plasmique de la cellule cible postsynaptique au niveau de la synapse. Les flux d'ions qui en r sultent modifient le potentiel membranaire de la membrane postsynaptique, transmettant ainsi un signal du nerf excit (B) (Vid o 11.12). (B) Une micrographie lectronique section mince de deux synapses terminales nerveuses sur une dendrite d'une cellule postsynaptique. (B, avec l'aimable autorisation de Cedric Raine.) isol lectriquement l'une de l'autre, la cellule pr synaptique tant s par e de la cellule postsynaptique par une fente synaptique troite. Lorsqu'un potentiel d'action arrive au site pr synaptique, la d polarisation de la membrane ouvre des canaux Ca2+ voltage-d pendants qui sont regroup s dans la membrane pr synaptique. L'afflux de Ca2+ d clenche la lib ration dans la fente de petites mol cules de signal appel es neurotransmetteurs, qui sont stock es dans des v sicules synaptiques entour es d'une membrane et lib r es par exocytose (discut e au chapitre 13). Le neurotransmetteur diffuse rapidement travers la fente synaptique et provoque un changement lectrique dans la cellule postsynaptique en se liant et en ouvrant des canaux ioniques d pendants de l' metteur (Figure 11 36). Une fois que le neurotransmetteur a t s cr t , il est rapidement limin : il est soit d truit par des enzymes sp cifiques dans la fente synaptique, soit absorb par la terminaison nerveuse pr synaptique ou par les cellules gliales environnantes. La recapture est m di e par une vari t de neurotransmetteurs d pendants du Na+ (voir Figure 11-8) ; De cette fa on, les neurotransmetteurs sont recycl s, ce qui permet aux cellules de suivre des taux de lib ration lev s. L' limination rapide garantit la pr cision spatiale et temporelle de la signalisation au niveau d'une synapse. Il diminue les chances que le neurotransmetteur influence les cellules voisines, et il nettoie la fente synaptique avant que la prochaine impulsion de neurotransmetteur ne soit lib r e, de sorte que le moment des v nements de signalisation r p t s et rapides peut tre communiqu avec pr cision la cellule postsynaptique. Comme nous le verrons, la signalisation via de telles synapses chimiques est beaucoup plus polyvalente et adaptable que le couplage lectrique direct via des jonctions lacunaires au niveau des synapses lectriques (discut au chapitre 19), qui sont galement utilis es par les neurones, mais dans une moindre mesure. Les canaux ioniques d pendants de l' metteur, galement appel s r cepteurs ionotropes, sont con us pour convertir rapidement les signaux chimiques extracellulaires en signaux lectriques au niveau des synapses chimiques. Les canaux sont concentr s dans une r gion sp cialis e de la membrane plasmique postsynaptique au niveau de la synapse et s'ouvrent transitoirement en r ponse la liaison des mol cules de neurotransmetteurs, produisant ainsi un bref changement de perm abilit dans la membrane (voir Figure 11-36A). Contrairement aux canaux voltage-d pendants responsables des potentiels d'action, les canaux d pendants de l' metteur sont relativement insensibles au potentiel membranaire et ne peuvent donc pas produire par eux-m mes une excitation auto-amplifiante. Au lieu de cela, ils produisent des augmentations locales de la perm abilit , et donc des changements de potentiel membranaire, qui sont class es en fonction de la quantit de neurotransmetteurs lib r s au niveau de la synapse et de la dur e de sa persistance cet endroit. Ce n'est que si la somme des petites d polarisations ce site ouvre un nombre suffisant de canaux cationiques voltage-d pendants proximit qu'un potentiel d'action peut tre d clench . Cela peut n cessiter l'ouverture de canaux ioniques d pendants de l' metteur au niveau de nombreuses synapses proximit de la cellule nerveuse cible. Les canaux ioniques d pendants de l' metteur diff rent les uns des autres de plusieurs mani res importantes. Tout d'abord, en tant que r cepteurs, ils ont des sites de liaison hautement s lectifs pour le neurotransmetteur qui est lib r par la terminaison nerveuse pr synaptique. Deuxi mement, en tant que canaux, ils sont s lectifs dans le type d'ions qu'ils laissent passer travers la membrane plasmique ; Cela d termine la nature de la r ponse postsynaptique. Les neurotransmetteurs excitateurs ouvrent les canaux cationiques, provoquant un afflux de Na+, et dans de nombreux cas de Ca2+, qui d polarise la membrane postsynaptique vers le potentiel seuil de d clenchement d'un potentiel d'action. Les neurotransmetteurs inhibiteurs, en revanche, ouvrent soit les canaux Cl-, soit les canaux K+, ce qui supprime le d clenchement en rendant plus difficile la d polarisation de la membrane postsynaptique par les neurotransmetteurs excitateurs. De nombreux transmetteurs peuvent tre excitateurs ou i
Biologie moléculaire de la cellule	nhibiteurs, selon l'endroit o ils sont lib r s, les r cepteurs auxquels ils se lient et les conditions ioniques qu'ils rencontrent. L'ac tylcholine, par exemple, peut soit exciter, soit inhiber, selon le type de r cepteurs de l'ac tylcholine auxquels elle se lie. Habituellement, cependant, l'ac tylcholine, le glutamate et la s rotonine sont utilis s comme transmetteurs excitateurs, et l'acide -aminobutyrique (GABA) et la glycine sont utilis s comme transmetteurs inhibiteurs. Le glutamate, par exemple, m die la plupart des signaux excitateurs dans le cerveau des vert br s. Nous avons d j vu comment l'ouverture des canaux Na+ ou Ca2+ d polarise une membrane. L'ouverture des canaux K+ a l'effet inverse car le gradient de concentration K+ est dans la direction oppos e : forte concentration l'int rieur de la cellule, faible l'ext rieur. L'ouverture des canaux K+ a tendance maintenir la cellule proche du potentiel d' quilibre pour K+, qui, comme nous l'avons vu pr c demment, est normalement proche du potentiel de membrane au repos car au repos, les canaux K+ sont le principal type de canal ouvert. Lorsque des canaux K+ suppl mentaires s'ouvrent, il devient plus difficile d' loigner la cellule de l' tat de repos. Nous pouvons comprendre l'effet de l'ouverture des canaux Cl de la m me mani re. La concentration de Cl est beaucoup plus lev e l'ext rieur la cellule qu' l'int rieur (voir tableau 11 1, p. 598), mais le potentiel membranaire s'oppose son afflux. En fait, pour de nombreux neurones, le potentiel d' quilibre de Cl- est proche du potentiel de repos, voire plus n gatif. Pour cette raison, l'ouverture des canaux Cl a tendance tamponner le potentiel membranaire ; lorsque la membrane commence se d polariser, des ions Cl plus charg s n gativement p n trent dans la cellule et contrecarrent la d polarisation. Ainsi, l'ouverture des canaux Cl rend plus difficile la d polarisation de la membrane et donc l'excitation de la cellule. Certaines toxines puissantes agissent en bloquant l'action des neurotransmetteurs inhibiteurs : la strychnine, par exemple, se lie aux r cepteurs de la glycine et emp che leur action inhibitrice, provoquant des spasmes musculaires, des convulsions et la mort. Cependant, toute la signalisation chimique du syst me nerveux ne fonctionne pas par le biais de ces canaux ioniques ionotropiques ligand-d pendants. En fait, la plupart des mol cules de neurotransmetteurs s cr t es par les terminaisons nerveuses, y compris une grande vari t de neuropeptides, se lient aux r cepteurs m tabotropiques, qui ne r gulent les canaux ioniques qu'indirectement par l'action de petites mol cules de signal intracellulaire (discut au chapitre 15). Tous les r cepteurs de neurotransmetteurs appartiennent l'une ou l'autre de ces deux grandes classes ionotrope ou m tabotropique sur la base de leurs m canismes de signalisation : 1. Les r cepteurs ionotropiques sont des canaux ioniques et se caract risent par des synapses chimiques rapides. L'ac tylcholine, la glycine, le glutamate et le GABA agissent tous sur les canaux ioniques d pendants de l' metteur, m diant une signalisation excitatrice ou inhibitrice g n ralement imm diate, simple et br ve. 2. Les r cepteurs m tabotropiques sont des r cepteurs coupl s aux prot ines G (discut s au chapitre 15) qui se lient tous les autres neurotransmetteurs (et, de mani re d routante, galement l'ac tylcholine, au glutamate et au GABA). La signalisation m di e par la liaison des ligands aux r cepteurs m tabotropiques a tendance tre beaucoup plus lente et plus complexe que celle des r cepteurs ionotropiques, et ses cons quences durent plus longtemps. Les r cepteurs de l'ac tylcholine la jonction neuromusculaire sont des canaux cationiques excitateurs d pendants de l' metteur Un exemple bien tudi d'un canal ionique d pendant de l' metteur est le r cepteur de l'ac tylcholine des cellules musculaires squelettiques. Ce canal est ouvert transitoirement par l'ac tylcholine lib r e par la terminaison nerveuse au niveau d'une jonction neuromusculaire, la synapse chimique sp cialis e entre un motoneurone et une cellule musculaire squelettique (Figure 11-37). Cette synapse a t tudi e de mani re intensive parce qu'elle est facilement accessible l' tude lectrophysiologique, contrairement la plupart des synapses du syst me nerveux central, c'est- -dire le cerveau et la moelle pini re chez les vert br s. De plus, les r cepteurs de l'ac tylcholine sont dens ment regroup s dans la membrane plasmique des cellules musculaires au niveau d'une jonction neuromusculaire (environ 20 000 r cepteurs de ce type par m2), avec relativement peu de r cepteurs ailleurs dans la m me membrane. Les r cepteurs sont compos s de cinq polypeptides transmembranaires, deux d'un type et trois autres, cod s par quatre g nes distincts (Figure 11-38A). Les quatre g nes sont tonnamment similaires dans leur s quence, ce qui implique qu'ils ont volu partir d'un se
Biologie moléculaire de la cellule	ul g ne ancestral. Les deux polypeptides identiques dans le pentamer contribuent chacun un site de liaison l'ac tylcholine. Lorsque deux mol cules d'ac tylcholine se lient au complexe pentam re, elles induisent un changement de conformation qui ouvre le canal. Avec le ligand li , le canal vacille toujours entre les tats ouvert et ferm , mais il a maintenant une probabilit de 90% d' tre ouvert. Cet tat se poursuit, avec la liaison et la d liaison de l'ac tylcholine, jusqu' ce que l'hydrolyse de l'ac tylcholine libre par l'enzyme ac tylcholinest rase abaisse suffisamment sa concentration la jonction neuromusculaire. Une fois lib r de son neurotransmetteur li , le r cepteur de l'ac tylcholine revient son tat de repos initial. Si la pr sence d'ac tylcholine persiste pendant une p riode prolong e la suite d'une stimulation nerveuse excessive, le canal s'inactive. Normalement, l'ac tylcholine est rapidement hydrolys e et le canal se ferme en environ 1 milliseconde, bien avant qu'une d sensibilisation significative ne se produise. La d sensibilisation se produirait apr s environ 20 millisecondes en pr sence continue d'ac tylcholine. Les cinq sous-unit s du r cepteur de l'ac tylcholine sont dispos es en anneau, formant un canal transmembranaire rempli d'eau qui consiste en un pore troit travers la bicouche lipidique, qui s' largit en vestibules aux deux extr mit s. La liaison l'ac tylcholine ouvre le canal en provoquant la rotation des h lices qui tapissent le pore vers l'ext rieur, perturbant ainsi un anneau d'acides amin s hydrophobes qui bloque le flux d'ions l' tat ferm . Des amas d'acides amin s charg s n gativement chaque extr mit du pore aident exclure les ions n gatifs et encouragent le passage de tout ion positif d'un diam tre inf rieur 0,65 nm (Figure 11 38B). Le trafic de transit normal se compose principalement de Na+ et de K+, ainsi que d'un peu de Ca2+. Ainsi, contrairement aux canaux cationiques voltage-d pendants, tels que le canal K+ discut pr c demment, il y a peu de s lectivit parmi les cations, et les contributions relatives des diff rents cations au courant traversant le canal d pendent principalement de leurs concentrations et des forces lectrochimiques motrices. Lorsque la membrane des cellules musculaires est son potentiel de repos, la force motrice nette de K+ est proche de z ro, car le gradient de tension quilibre presque le gradient de concentration de K+ travers la membrane (voir panneau 11-1, p. 616). Pour Na+, en revanche, le gradient de tension et le gradient de concentration agissent tous deux dans la m me direction pour conduire l'ion dans la cellule. (Il en va de m me pour le Ca2+, mais le Figure 11 37 : Micrographie lectronique balayage faible grossissement d'une jonction neuromusculaire chez une grenouille. La terminaison d'un seul axone sur une cellule musculaire squelettique est repr sent e. (D'apr s J. Desaki et Y. Uehara, J. Neurocytol. 10:101 110, 1981. Avec l'autorisation de Kluwer Academic Publishers.) la concentration extracellulaire de Ca2+ est tellement inf rieure celle de Na+ que le Ca2+ ne contribue que faiblement au courant entrant total.) Par cons quent, l'ouverture des canaux r cepteurs de l'ac tylcholine entra ne un important afflux net de Na+ (un taux de pointe d'environ 30 000 ions par canal chaque milliseconde). Cet afflux provoque une d polarisation membranaire qui signale au muscle de se contracter, comme nous le verrons ci-dessous. Les neurones contiennent de nombreux types de canaux d pendants de l' metteur Les canaux ioniques qui s'ouvrent directement en r ponse aux neurotransmetteurs ac tylcholine, s rotonine, GABA et glycine contiennent des sous-unit s structurellement similaires et forment probablement des pores transmembranaires de la m me mani re que le r cepteur ionotrope de l'ac tylcholine, m me s'ils ont des sp cificit s de liaison aux neurotransmetteurs et des s lectivit s ioniques distinctes. Ces canaux sont tous construits partir de sous-unit s polypeptidiques homologues, qui s'assemblent sous la forme d'un pentam re. Les canaux ioniques glutamate-d pendants sont une exception, en ce sens qu'ils sont construits partir d'une famille distincte de sous-unit s et forment des t tram res ressemblant aux canaux K+ discut s pr c demment (voir Figure 11-24A). Pour chaque classe de canal ionique d pendant de l' metteur, il existe des formes alternatives de chaque type de sous-unit , qui peuvent tre cod es par des g nes distincts ou bien g n r es par l' pissage alternatif de l'ARN d'un seul produit g nique. Les sous-unit s s'assemblent dans diff rentes combinaisons pour former un ensemble extr mement diversifi de sous-types de canaux distincts, avec diff rentes affinit s de ligands, diff rentes conductances de canaux, diff rentes vitesses d'ouverture et de fermeture et diff rentes sensibilit s aux m dicaments et aux toxines. Certains neurones vert br s, par exemple, ont des canaux ioniques ac tylchol
Biologie moléculaire de la cellule	ines qui diff rent de ceux des cellules musculaires en ce qu'ils sont form s de deux sous-unit s d'un type et de trois d'un autre type ; Mais il y a au moins neuf g nes codant pour diff rentes versions du premier type de sous-unit et au moins trois codant pour diff rentes versions de la seconde. Des sous-ensembles de ces neurones remplissant diff rentes fonctions dans le cerveau expriment diff rentes combinaisons de g nes pour ces sous-unit s. En principe, et d j dans une certaine mesure dans la pratique, il est possible de concevoir des m dicaments cibl s sur ces sous-ensembles troitement d finis, influen ant ainsi sp cifiquement des fonctions c r brales particuli res. Les canaux ioniques d pendants de l' metteur sont depuis longtemps des cibles m dicamenteuses importantes. Un chirurgien, par exemple, peut d tendre les muscles pendant la dur e d'une op ration Figure 11 38 : un mod le de la structure du r cepteur de l'ac tylcholine du muscle squelettique. (A) Cinq sous-unit s homologues ( , , , , ) se combinent pour former un pore transmembranaire. Les deux sous-unit s contribuent une site de liaison l'ac tylcholine nich entre des sous-unit s adjacentes. (B) Le pore est tapiss d'un anneau de cinq h lices transmembranaires, une apport e par chaque sous-unit (seules les deux sous-unit s sont repr sent es). Dans sa conformation ferm e, le pore est obstru par les cha nes lat rales hydrophobes de cinq leucines (vertes), une de chaque h lice, qui forment une porte pr s du milieu de la bicouche lipidique. Lorsque l'ac tylcholine se lie aux deux sous-unit s , le canal subit un changement de conformation qui ouvre la porte par une rotation vers l'ext rieur des h lices contenant les leucines occlusives. Des cha nes lat rales charg es n gativement (indiqu es par les signes ) chaque extr mit du pore garantissent que seuls les ions charg s positivement passent par le canal. (Code PDB : 2BG9.) en bloquant les r cepteurs de l'ac tylcholine sur les cellules musculaires squelettiques avec le curare, un m dicament d riv de la plante qui tait l'origine utilis par les Indiens d'Am rique du Sud pour fabriquer des fl ches empoisonn es. La plupart des m dicaments utilis s pour traiter l'insomnie, l'anxi t , la d pression et la schizophr nie exercent leurs effets sur les synapses chimiques, et beaucoup d'entre eux agissent en se liant des canaux d pendant de l' metteur. Les barbituriques, les tranquillisants tels que le Valium et les somnif res tels que l'Ambien, par exemple, se lient aux r cepteurs GABA, potentialisant l'action inhibitrice du GABA en permettant des concentrations plus faibles de ce neurotransmetteur d'ouvrir les canaux Cl-. Notre compr hension croissante de la biologie mol culaire des canaux ioniques devrait nous permettre de concevoir une nouvelle g n ration de drogues psychoactives qui agiront de mani re encore plus s lective pour soulager les mis res de la maladie mentale. En plus des canaux ioniques, de nombreux autres composants de la machinerie de signalisation synaptique sont des cibles potentielles pour les drogues psychoactives. Comme mentionn pr c demment, apr s avoir t lib r s dans la fente synaptique, de nombreux neurotransmetteurs sont limin s par des m canismes de recapture m di s par des symboles induits par Na+. L'inhibition de ces transporteurs prolonge l'effet du neurotransmetteur, renfor ant ainsi la transmission synaptique. De nombreux antid presseurs, y compris le Prozac, inhibent la recapture de la s rotonine ; D'autres inhibent la recapture de la s rotonine et de la noradr naline. Les canaux ioniques sont les unit s mol culaires de base partir desquelles les dispositifs neuronaux de signalisation et de calcul sont construits. Pour donner un aper u de la sophistication de ces dispositifs, nous examinons plusieurs exemples qui d montrent comment les activit s coordonn es de groupes de canaux ioniques vous permettent de bouger, de ressentir et de vous souvenir. La transmission neuromusculaire implique l'activation s quentielle de cinq ensembles diff rents de canaux ioniques Le processus suivant, dans lequel un influx nerveux stimule une cellule musculaire se contracter, illustre l'importance des canaux ioniques pour les cellules lectriquement excitables. Cette r ponse apparemment simple n cessite l'activation s quentielle d'au moins cinq ensembles diff rents de canaux ioniques, le tout en quelques millisecondes (Figure 11-39). 1. Le processus est initi lorsqu'un influx nerveux atteint la terminaison nerveuse et d polarise la membrane plasmique de la terminale. La d polarisation ouvre transitoirement des canaux Ca2+ voltage-d pendants dans cette membrane pr synaptique. Comme la concentration de Ca2+ l'ext rieur des cellules est plus de 1000 fois Figure 11 39 Le syst me de canaux ioniques une jonction neuromusculaire. Ces canaux ioniques sont essentiels pour la stimulation de la contraction musculaire par un influx nerveux. Les dif
Biologie moléculaire de la cellule	f rents canaux sont num rot s dans l'ordre dans lequel ils sont activ s, comme d crit dans le texte. sup rieure la concentration de Ca2+ libre l'int rieur, le Ca2+ s' coule dans la terminaison nerveuse. L'augmentation de la concentration en Ca2+ dans le cytosol de la terminaison nerveuse d clenche la lib ration locale d'ac tylcholine par exocytose dans la fente synaptique. 2. L'ac tylcholine lib r e se lie aux r cepteurs de l'ac tylcholine dans la membrane plasmique des cellules musculaires, ouvrant transitoirement les canaux cationiques qui leur sont associ s. L'afflux de Na+ qui en r sulte provoque une d polarisation membranaire. 3. La d polarisation locale ouvre des canaux Na+ voltage-d pendants dans cette membrane, permettant plus de Na+ d'entrer, ce qui d polarise davantage la membrane. Ceci, son tour, ouvre les canaux Na+ voltage-d pendants voisins et entra ne une d polarisation auto-propag e (un potentiel d'action) qui s' tend l'ensemble de la membrane plasmique (voir Figure 11 31). 4. La d polarisation g n ralis e de la membrane plasmique des cellules musculaires active les canaux Ca2+ voltage-d pendants dans les tubules transversaux (tubules T - discut s au chapitre 16) de cette membrane. 5. Cela provoque son tour l'ouverture transitoire des canaux de lib ration de Ca2+ dans une r gion adjacente de la membrane du r ticulum sarcoplasmique (SR) et la lib ration de Ca2+ stock dans le RS dans le cytosol. Les membranes du tubule T et de la SR sont troitement appos es avec les deux types de canaux r unis dans une structure sp cialis e, dans laquelle l'activation du canal Ca2+ sensible la tension dans la membrane plasmique du tubule T provoque un changement de conformation du canal qui est transmis m caniquement au canal de lib ration de Ca2+ dans la membrane SR, l'ouvrant et permettant au Ca2+ de s' couler de la lumi re de la RS dans le cytoplasme (voir Figure 16 35). L'augmentation soudaine de la concentration cytosolique de Ca2+ provoque la contraction des myofibrilles de la cellule musculaire. Alors que l'initiation de la contraction musculaire par un motoneurone est complexe, une interaction encore plus sophistiqu e des canaux ioniques est n cessaire pour qu'un neurone int gre un grand nombre de signaux d'entr e au niveau de ses synapses et calcule une sortie appropri e, comme nous le voyons maintenant. Dans le syst me nerveux central, un seul neurone peut recevoir des informations de milliers d'autres neurones, et il peut son tour former des synapses avec plusieurs milliers d'autres cellules. Plusieurs milliers de terminaisons nerveuses, par exemple, font des synapses sur un motoneurone moyen de la moelle pini re, couvrant presque enti rement son corps cellulaire et ses dendrites (Figure 11-40). Certaines de ces synapses transmettent des signaux du cerveau ou de la moelle pini re ; D'autres apportent des informations sensorielles provenant des muscles ou de la peau. Le motoneurone doit combiner les informations re ues de toutes ces sources et r agir, soit en d clenchant des potentiels d'action le long de son axone, soit en restant silencieux. Parmi les nombreuses synapses d'un neurone, certaines ont tendance l'exciter, tandis que d'autres l'inhibent. Le neurotransmetteur lib r au niveau d'une synapse excitatrice provoque une petite d polarisation de la membrane postsynaptique appel e potentiel postsynaptique excitateur (PSP excitatrice), tandis que le neurotransmetteur lib r au niveau d'une synapse inhibitrice provoque g n ralement une petite hyperpolarisation appel e PSP inhibitrice. La membrane plasmique des dendrites et du corps cellulaire de la plupart des neurones contient une densit relativement faible de canaux Na+ voltage-d pendants, de sorte qu'une PSP excitatrice individuelle est g n ralement trop petite pour d clencher un potentiel d'action. Au lieu de cela, chaque signal entrant initie une PSP locale, qui diminue avec la distance du site de la synapse. Si les signaux arrivent simultan ment plusieurs synapses dans la m me r gion de l'arbre dendritique, la PSP totale dans ce voisinage sera peu pr s la somme des PSP individuelles, les PSP inhibitrices apportant une contribution n gative au total. Les PSP de chaque quartier se propagent passivement et convergent vers le corps cellulaire. Pour la transmission longue distance, l'amplitude combin e de la PSP est ensuite traduite, ou cod e, dans la fr quence d'activation des potentiels d'action : plus la stimulation (d polarisation) est importante, plus la fr quence des potentiels d'action est lev e. 0,1 millim tre Le calcul neuronal n cessite une combinaison d'au moins trois types de canaux K+ L'intensit de la stimulation qu'un neurone re oit est cod e par ce neurone en fr quence de potentiel d'action pour la transmission longue distance. L'encodage a lieu dans une r gion sp cialis e de la membrane axonale connue sous le nom de segment initial, ou butte axonale, la jonction de l'axone et du c
Biologie moléculaire de la cellule	orps cellulaire (voir Figure 11-40). Cette membrane est riche en canaux Na+ voltage-d pendants ; mais il contient galement au moins quatre autres classes de canaux ioniques trois s lectifs pour K+ et un s lectif pour Ca2+ qui contribuent tous la fonction d'encodage de l'axone. Les trois vari t s de canaux K+ ont des propri t s diff rentes ; nous les appellerons canaux K+ retard s, rapidement inactiv s et activ s par le Ca2+. Pour comprendre la n cessit de plusieurs types de canaux, consid rez d'abord ce qui se passerait si les seuls canaux ioniques voltage-d pendants pr sents dans la cellule nerveuse taient les canaux Na+. En dessous d'un certain seuil de stimulation synaptique, la d polarisation de la membrane du segment initial serait insuffisante pour d clencher un potentiel d'action. Avec une stimulation augmentant progressivement, le seuil serait franchi, les canaux Na+ s'ouvriraient et un potentiel d'action se d clencherait. Le potentiel d'action serait interrompu par l'inactivation des canaux Na+. Avant qu'un autre potentiel d'action puisse se d clencher, ces canaux devraient se remettre de leur inactivation. Mais cela n cessiterait un retour de la tension membranaire une valeur tr s n gative, ce qui ne se produirait pas tant que le fort stimulus d polarisant (des PSP) serait maintenu. Un type de canal suppl mentaire est donc n cessaire pour repolariser la membrane apr s chaque potentiel d'action afin de pr parer la cellule se d clencher nouveau. Les canaux K+ retard s effectuent cette t che, comme nous l'avons vu pr c demment en relation avec la propagation du potentiel d'action (voir Figure 11 31). Ils sont voltage-d pendants, mais en raison de leur cin tique plus lente, ils ne s'ouvrent que pendant la phase descendante du potentiel d'action, lorsque les canaux Na+ sont inactifs. Leur ouverture permet un efflux de K+ qui ram ne la membrane vers le potentiel d' quilibre K+, qui est si n gatif que les canaux Na+ sortent rapidement de leur tat inactiv . La repolarisation de la membrane ferme galement les canaux K+ retard s. Le segment initial est maintenant r initialis de sorte que le stimulus d polarisant de Figure 11 40 : un motoneurone dans la moelle pini re. (A) Plusieurs milliers de terminaisons nerveuses font synapse sur le corps cellulaire et les dendrites. Ceux-ci d livrent des signaux provenant d'autres parties de l'organisme pour contr ler l'activation des potentiels d'action le long de l'axone unique de cette grande cellule. (B) Micrographie fluorescence montrant un corps de cellule nerveuse et ses dendrites color s avec un anticorps fluorescent qui reconna t une prot ine cytosquelettique (verte) qui n'est pas pr sente dans les axones. Des milliers de terminaisons axonales (rouges) d'autres cellules nerveuses (non visibles) font des synapses sur le corps cellulaire et les dendrites ; Les terminaisons sont color es avec un anticorps fluorescent qui reconna t une prot ine dans les v sicules synaptiques. (B, avec l'aimable autorisation d'Olaf Mundigl et Pietro de Camilli.) L'amplitude des entr es synaptiques combin es de la PSP peut d clencher un autre potentiel d'action. De cette fa on, la stimulation soutenue des dendrites et du corps cellulaire conduit une d charge r p titive de l'axone. Cependant, les tirs r p titifs ne suffisent pas en soi. La fr quence de d clenchement doit refl ter l'intensit de la stimulation, et un simple syst me de canaux Na+ et de canaux K+ retard s est inad quat cet effet. En dessous d'un certain seuil de stimulation r guli re, la cellule ne se d clenchera pas du tout ; Au-dessus de ce seuil, il commencera brusquement se d clencher un rythme relativement rapide. Les canaux K+ inactivation rapide r solvent le probl me. Ceux-ci sont galement voltage-d pendants et ouverts lorsque la membrane est d polaris e, mais leur sensibilit la tension sp cifique et leur cin tique d'inactivation sont telles qu'elles agissent pour r duire le taux de d clenchement des niveaux de stimulation qui sont juste au-dessus du seuil requis pour le tir. Ainsi, ils liminent la discontinuit dans la relation entre la cadence de d charge et l'intensit de la stimulation. Le r sultat est une cadence de d charge proportionnelle l'intensit du stimulus d polarisant sur une tr s large plage (Figure 11 41). Le processus d'encodage est g n ralement modul par les deux autres types de canaux ioniques du segment initial qui ont t mentionn s pr c demment : les canaux Ca2+ voltage-d pendants et les canaux K+ activ s par le Ca2+. Ils agissent ensemble pour diminuer la r ponse de la cellule une stimulation immuable et prolong e, un processus appel adaptation. Ces canaux Ca2+ sont similaires aux canaux Ca2+ qui interviennent dans la lib ration de neurotransmetteurs partir des terminaisons axonales pr synaptiques ; ils s'ouvrent lorsqu'un potentiel d'action se d clenche, permettant transitoirement au Ca2+ de p n trer dans le cytosol de l'axone au niveau du
Biologie moléculaire de la cellule	segment initial. Le canal K+ activ par le Ca2+ s'ouvre en r ponse une concentration lev e de Ca2+ au niveau de la face cytoplasmique du canal (Figure 11 42). Des stimuli d polarisants forts et prolong s d clencheront une longue s rie de potentiels d'action, chacun d'entre eux permettant un bref afflux de Ca2+ travers les canaux Ca2+ voltage-d pendants, de sorte que la concentration cytosolique locale de Ca2+ s'accumule progressivement jusqu' un niveau suffisamment lev pour ouvrir les canaux K+ activ s par le Ca2+. tant donn que l'augmentation de la perm abilit de la membrane K+ qui en r sulte rend la membrane plus difficile d polariser, le d lai entre un potentiel d'action et le suivant est augment . De cette fa on, un neurone qui est stimul en continu pendant une p riode prolong e devient progressivement moins r actif au stimulus constant. Une telle adaptation, qui peut galement se produire par d'autres m canismes, permet un neurone en fait, au syst me nerveux en g n ral de r agir de mani re sensible au changement, m me dans un contexte lev de stimulation constante. C'est l'une des strat gies informatiques qui nous aident, par exemple, sentir un l ger contact sur l' paule et ignorer la pression constante de nos v tements. Nous discutons plus en d tail de l'adaptation en tant que caract ristique g n rale des processus de signalisation cellulaire au chapitre 15. D'autres neurones effectuent des calculs diff rents, r agissant leurs entr es synaptiques de multiples fa ons, refl tant les diff rents assortiments de canaux ioniques dans leur membrane. Il existe plusieurs centaines de g nes qui codent pour des canaux ioniques dans le g nome humain, avec plus de 150 codant uniquement pour des canaux voltage-d pendants. Une complexit suppl mentaire est introduite par l' pissage alternatif des transcrits d'ARN et l'assemblage de sous-unit s de canal dans diff rentes combinaisons. De plus, les canaux ioniques sont s lectivement Figure 11 41 L'ampleur du potentiel postsynaptique combin (PSP) se refl te dans la fr quence d'activation des potentiels d'action. Le m lange de PSP excitatrices et inhibitrices produit une PSP combin e au niveau du segment initial. Une comparaison de (A) et (B) montre comment la fr quence de d charge d'un axone augmente avec une augmentation de la PSP combin e, tandis que (C) r sume la relation g n rale. localis diff rents endroits de la membrane plasmique d'un neurone. Certains canaux K+ et Ca2+ sont concentr s dans les dendrites et participent au traitement de l'entr e qu'un neurone re oit. Comme nous l'avons vu, d'autres canaux ioniques sont situ s au niveau du segment initial de l'axone, o ils contr lent l'activation du potentiel d'action ; Et certains canaux ligand-d pendants sont r partis sur le corps cellulaire et, en fonction de leur occupation de ligands, modulent la sensibilit g n rale de la cellule aux entr es synaptiques. La multiplicit des canaux ioniques et leurs emplacements permettent videmment chacun des nombreux types de neurones d'ajuster le comportement lectrique aux t ches particuli res qu'ils effectuent. L'une des propri t s cruciales du syst me nerveux est sa capacit apprendre et se souvenir. Cette propri t d pend en partie de la capacit des synapses individuelles se renforcer ou s'affaiblir en fonction de leur utilisation un processus appel plasticit synaptique. Nous terminons ce chapitre en consid rant un type remarquable de canal ionique qui joue un r le particulier dans certaines formes de plasticit synaptique. Il est situ dans de nombreuses synapses excitatrices du syst me nerveux central, o il est bloqu la fois par la tension et le glutamate, un neurotransmetteur excitateur. C'est aussi le site d'action de la drogue psychoactive phencyclidine, ou poussi re d'ange. La potentialisation long terme (LTP) dans l'hippocampe des mammif res d pend de l'entr e du Ca2+ par les canaux r cepteurs NMDA- Pratiquement tous les animaux peuvent apprendre, mais les mammif res semblent apprendre exceptionnellement bien (du moins c'est ce que nous aimons penser). Dans le cerveau d'un mammif re, la r gion appel e hippocampe joue un r le particulier dans l'apprentissage. Lorsqu'il est d truit des deux c t s du cerveau, la capacit de former de nouveaux souvenirs est en grande partie perdue, bien que les les souvenirs tablis restent. Certaines synapses de l'hippocampe pr sentent une forme frappante de plasticit synaptique lors d'une utilisation r p t e : alors que les potentiels d'action unique occasionnels dans les cellules pr synaptiques ne laissent aucune trace durable, une courte rafale de d charge r p titive provoque une potentialisation long terme (LTP), de sorte que les potentiels d'action unique ult rieurs dans les cellules pr synaptiques voquent une r ponse consid rablement am lior e dans les cellules postsynaptiques. L'effet dure des heures, des jours ou des semaines, selon le nombre et l'intensit
Biologie moléculaire de la cellule	des rafales de tirs r p titifs. Seules les synapses qui ont t activ es pr sentent une LTP ; Les synapses qui sont rest es calmes sur la m me cellule postsynaptique ne sont pas affect es. Cependant, alors que la cellule re oit une rafale de stimulation r p titive via un ensemble de synapses, si un seul potentiel d'action est d livr une autre synapse sa surface, cette derni re synapse subira galement une LTP, m me si un seul potentiel d'action d livr un autre moment ne laisserait pas une telle trace durable. La r gle sous-jacente dans de tels v nements semble tre que la LTP se produit n'importe quelle occasion lorsqu'une cellule pr synaptique se d clenche (une ou plusieurs) un moment o la membrane postsynaptique est fortement d polaris e (soit par une d charge r p titive r cente de la m me cellule pr synaptique, soit par d'autres moyens). Cette r gle refl te le comportement d'une classe particuli re de canaux ioniques dans la membrane postsynaptique. Le glutamate est le principal neurotransmetteur excitateur du syst me nerveux central des mammif res, et les canaux ioniques d pendants du glutamate sont les plus courants de tous les canaux endoss s dans le cerveau. Dans l'hippocampe, comme ailleurs, la majeure partie du courant d polarisant responsable des PSP excitatrices est transport e par des canaux ioniques glutamate-d pendants appel s r cepteurs AMPA, qui fonctionnent de mani re standard (Figure 11 43). Mais le courant a, en outre, un deuxi me composant plus intrigant, qui est m di par une sous-classe distincte de canaux ioniques glutamate-d pendants connus sous le nom de r cepteurs NMDA, ainsi nomm s parce qu'ils sont activ s s lectivement par l'analogue artificiel du glutamate, le N-m thyl-D-aspartate. Les canaux du r cepteur NMDA sont doublement ferm s, ne s'ouvrant que lorsque deux conditions sont remplies simultan ment : le glutamate doit tre li au r cepteur et la membrane doit tre fortement d polaris e. La deuxi me condition est requise pour lib rer le Mg2+ qui bloque normalement le canal de repos. Cela signifie que les r cepteurs NMDA ne sont normalement activ s que lorsque les r cepteurs AMPA sont galement activ s et d polarisent la membrane. Les r cepteurs NMDA sont essentiels pour la LTP. Lorsqu'ils sont bloqu s s lectivement par un inhibiteur sp cifique ou inactiv s g n tiquement, la LTP ne se produit pas, m me si la transmission synaptique ordinaire se poursuit, ce qui indique l'importance des r cepteurs NMDA Figure 11 42 Structure d'un canal K+ activ par Ca2. Le canal contient quatre sous-unit s identiques (qui sont affich es dans des couleurs diff rentes pour plus de clart ). Il est la fois voltageis et Ca2+-gated. La structure repr sent e est un composite des parties cytosoliques et membranaires du canal qui ont t cristallis es s par ment. (Codes PDB : 2R99, 1LNQ.) Figure 11 43 La structure du r cepteur aMPa. Ce r cepteur ionotrope du glutamate (nomm d'apr s l'analogue du glutamate -Amino 3-hydroxy 5-Methyl 4-isoxazole propionic Acid) est le m diateur le plus courant de la transmission synaptique rapide et excitatrice dans le syst me nerveux central (SNC). (Code PDB : 3KG2.) Canaux r cepteurs AMPA, la d polarisation supprime le bloc Mg2+ du canal r cepteur Na+ infux permettant NMDA, qui d polarise (avec le glutamate li ) le postsynaptique permet Ca2+ de p n trer dans la cellule postsynaptique membranaire pour l'induction LTP. Ces animaux pr sentent des d ficits sp cifiques dans leurs capacit s d'apprentissage mais se comportent presque normalement autrement. Comment les r cepteurs NMDA m dient-ils la LTP ? La r ponse est que ces canaux, lorsqu'ils sont ouverts, sont tr s perm ables au Ca2+, qui agit comme un signal intracellulaire dans la cellule postsynaptique, d clenchant une cascade de changements responsables de la LTP. Ainsi, la LTP est pr venue lorsque les niveaux de Ca2+ sont maintenus artificiellement bas dans la cellule postsynaptique en y injectant le ch lateur de Ca2+ EGTA, et la LTP peut tre induite en augmentant artificiellement les niveaux intracellulaires de Ca2+ dans la cellule. Parmi les changements long terme qui augmentent la sensibilit de la cellule postsynaptique au glutamate, il y a l'insertion de nouveaux r cepteurs AMPA dans la membrane plasmique (Figure 11-44). Dans certaines formes de LTP, des changements se produisent galement dans la cellule pr synaptique, de sorte qu'elle lib re plus de glutamate que la normale lorsqu'elle est activ e par la suite. Si les synapses n' taient capables que de LTP, elles deviendraient rapidement satur es et auraient donc une valeur limit e en tant que dispositif de stockage d'informations. En fait, ils pr sentent galement une d pression long terme (LTD), avec pour effet long terme de r duire le nombre de r cepteurs AMPA dans la membrane post-synaptique. Cet exploit est accompli en d gradant les r cepteurs AMPA apr s leur endocytose s lective. tonnamment, la LTD n cessite galement
Biologie moléculaire de la cellule	l'activation des r cepteurs NMDA et une augmentation du Ca2+. Comment le Ca2+ d clenche-t-il des effets oppos s au niveau de la m me synapse ? Il s'av re que ce contr le bidirectionnel de la force synaptique d pend de l'ampleur de l'augmentation du Ca2+ : des niveaux lev s de Ca2+ activent les prot ines kinases et la LTP, tandis que des niveaux modestes de Ca2+ activent les prot ines phosphatases et LTD. Il existe des preuves que les r cepteurs NMDA jouent un r le important dans la plasticit synaptique et l'apprentissage dans d'autres parties du cerveau, ainsi que dans l'hippocampe. De plus, ils jouent un r le crucial dans l'ajustement du mod le anatomique des connexions synaptiques la lumi re de l'exp rience acquise au cours du d veloppement du syst me nerveux. Ainsi, les neurotransmetteurs lib r s au niveau des synapses, en plus de relayer les signaux lectriques transitoires, peuvent galement modifier les concentrations de m diateurs intracellulaires qui entra nent des changements durables dans l'efficacit de la transmission synaptique. Cependant, on ne sait toujours pas comment ces changements durent des semaines, des mois ou toute une vie face au renouvellement normal des constituants cellulaires. Les canaux ioniques forment des pores aqueux travers la bicouche lipidique et permettent aux ions inorganiques de taille et de charge appropri es de traverser la membrane le long de leurs gradients lectrochimiques des taux environ 1000 fois sup rieurs ceux atteints par tout transporteur connu. Les canaux sont bloqu s et s'ouvrent g n ralement de mani re transitoire en r ponse une perturbation sp cifique de la membrane, telle qu'un changement de potentiel membranaire (canaux voltage-d pendants) ou la liaison d'un neurotransmetteur au canal (canaux d pendants de l' metteur). Les canaux de fuite s lectifs K+ jouent un r le important dans la d termination du potentiel de membrane au repos travers la membrane plasmique dans la plupart des cellules animales. l'augmentation du Ca2+ dans le cytosol incite la cellule postsynaptique ins rer de nouveaux r cepteurs AMPA dans la membrane plasmique, augmentant ainsi la sensibilit de la cellule au glutamate Figure 11 44 Les v nements de signalisation dans la potentialisation long terme. Bien que cela ne soit pas d montr , des changements am liorant la transmission peuvent galement se produire dans les terminaisons nerveuses pr synaptiques dans la LTP, qui peuvent tre induits par des signaux r trogrades de la cellule postsynaptique. Les canaux cationiques voltage-d pendants sont responsables de l'amplification et de la propagation des potentiels d'action dans les cellules lectriquement excitables, telles que les neurones et les cellules musculaires squelettiques. Les canaux ioniques d pendants de l' metteur convertissent les signaux chimiques en signaux lectriques Comment les neurones individuels tablissent-ils des signaux au niveau des synapses chimiques ? Les neurotransmetteurs excitateurs, tels que l'ac tylcholine, et maintiennent leurs caract ristiques et glutamate, ouvrent les canaux cationiques d pendant de l' metteur et d polarisent ainsi les propri t s de d charge intrins ques ? membrane postsynaptique vers le niveau seuil pour d clencher un potentiel d'action. Les neurotransmetteurs inhibiteurs, tels que le GABA et la glycine, ouvrent le M me les organismes dot s de canaux Cl ou K+ tr s simples et qui suppriment ainsi l'activation en maintenant les syst mes nerveux m miques postsynaptiques ont des dizaines de brane polaris es. Une sous-classe de canaux ioniques glutamate-d pendants, appel s canaux K+ NMDA-recep-different. Pourquoi est-ce que les canaux tor, est tr s perm able au Ca2+, ce qui peut d clencher les changements long terme importants pour en avoir autant ? dans l'efficacit des synapses (plasticit synaptique) telles que la LTP et la LTD qui seraient impliqu es dans certaines formes d'apprentissage et de m moire. Pourquoi les cellules qui ne sont pas des canaux ioniques lectriquement travaillent-elles ensemble de mani re complexe pour contr ler le comportement des cellules excitables par ions lectriques. Un neurone typique, par exemple, re oit des milliers de canaux excitateurs ? et les entr es inhibitrices, qui se combinent par sommation spatiale et temporelle pour produire un potentiel postsynaptique (PSP) combin au niveau du segment initial de son axone. Comment les souvenirs sont-ils stock s pour une telle ampleur de la PSP se traduit par le taux de d charge des potentiels d'action de plusieurs ann es dans le cerveau humain ? m lange de canaux cationiques dans la membrane du segment initial. Quelles d clarations sont vraies ? Expliquez pourquoi ou pourquoi pas. 11 1 Le transport par les transporteurs peut tre actif ou b. L'action li e de ces deux pompes provoque-t-elle passive, alors que le transport par canaux est toujours passif. d s quilibres dans la concentration de K+ ou le potentiel membranai
Biologie moléculaire de la cellule	re ? Pourquoi ou pourquoi pas ? Les transporteurs 11 2 saturent des concentrations lev es de 11 7 Microvillosit s augmentent la surface de la mol cule transport e intestinale lorsque tous leurs sites de liaison sont des cellules, ce qui permet une absorption plus efficace des nutriments. occup ; canaux, en revanche, ne se lient pas aux Microvillosit s sont repr sent s de profil et en section efficace dans les ions Figure qu'ils transportent et donc le flux d'ions travers un Q11 1. D'apr s les dimensions indiqu es dans la figure, le canal d'estimation ne sature pas. l'augmentation de la surface que fournissent les microvillosit s (pour 11 3 Le potentiel membranaire r sulte des mouvements de la partie de la membrane plasmique en contact avec la charge qui laissent les concentrations ioniques pratiquement inactives de l'intestin) par rapport la surface correspondante d'un fected, ne provoquant qu'un tr s l ger cart dans la cellule num avec une membrane plasmique plate . Des ions positifs et n gatifs sur les deux c t s de la membrane. Discutez des probl mes suivants. 11 4 Ordonner le Ca2+, le CO2, l' thanol, le glucose, l'ARN et le H2O en fonction de leur capacit diffuser travers une bicouche lipidique, en commen ant par celle qui traverse la bicouche le plus facilement. Expliquez votre commande. 11 5 Comment est-il possible que certaines mol cules soient 1 m 0,1 m d' quilibre travers une membrane biologique et pourtant ne pas tre la m me concentration des deux c t s ? Figure Q11 1 Microvillosit s de cellules pith liales intestinales de profil et en coupe efficace (Probl me 11 7). (Panneau de gauche, du Rippel Electron Microscope 11-6 Les transporteurs d'ions sont li s entre eux pas de physique, Dartmouth College ; panneau de droite, de David Burgess.) Cally, mais la suite de leurs actions. Par exemple, les cellules peuvent augmenter leur pH intracellulaire, lorsqu'il devient trop acide, en changeant du Na+ externe contre du H+ interne, en utilisant 11 8 Selon les lois du mouvement de Newton, un ion a antiporteur Na+ H+. Le changement de Na+ interne est ensuite expos un champ lectrique dans un vide qui serait redress l'aide de la pompe Na+-K+. une acc l ration constante de la force motrice lectrique, juste un. Ces deux transporteurs, fonctionnant ensemble, comme un corps tombant dans le vide acc l re constamment en raison de la normalisation des concentrations de H+ et de Na+ l'int rieur de la gravit . Dans l'eau, cependant, un ion se d place vitesse constante. dans un champ lectrique. Pourquoi pensez-vous que c'est le cas ? 21,4 nmFigure Q11 2 Une bille attach e par une cha ne un canal K+ voltage-d pendant (Probl me 11 9). 11 9 Dans un sous-ensemble de canaux K+ voltage-d pendants, l'extr mit N-terminale de chaque sous-unit agit comme une boule attach e qui obstrue l'extr mit cytoplasmique du pore peu de temps apr s son ouverture, inactivant ainsi le canal. Ce mod le boule et cha ne pour l'inactivation rapide des canaux K+ voltage-d pendants a t l gamment soutenu pour le canal shaker K+ de Drosophila melanogaster. (Le canal K+ de la drosophile est nomm d'apr s une forme mutante qui provoque un comportement excitable - m me les mouches anesth si es continuent de se contracter.) La d l tion des acides amin s N-terminaux du canal de l'agitateur normal donne naissance un canal qui s'ouvre en r ponse la d polarisation membranaire, mais reste ouvert au lieu de se fermer rapidement comme le fait le canal normal. Un peptide (MAAVAGLYGLGEDRQHRKKQ) qui correspond l'extr mit N-terminale supprim e peut inactiver le canal ouvert 100 M. La concentration de peptide libre (100 M) n cessaire pour inactiver le canal K+ d fectueux est-elle proche de la concentration locale de la bille attach e sur un canal normal ? Supposons que la balle captiv e puisse explorer un h misph re [volume = (2/3) r3] avec un rayon de 21,4 nm, ce qui correspond la longueur de la cha ne polypeptidique (Figure Q11 2). Calculez la concentration d'une balle dans cet h misph re. Comment cette valeur se compare-t-elle la concentration de peptide libre n cessaire pour inactiver le canal ? 11 10 L'axone g ant du calmar (Figure Q11 3) occupe une position unique dans l'histoire de notre compr hension des potentiels de membrane cellulaire et de l'action nerveuse. Lorsqu'une lectrode est coinc e dans un axone g ant intact, le potentiel membranaire enregistre -70 mV. Lorsque l'axone, suspendu dans un bain d'eau de mer, est stimul pour conduire un influx nerveux, le potentiel membranaire change transitoirement de -70 mV +40 mV. Tableau Q11 1 Composition ionique de l'eau de mer et du cytosol dans l'axone g ant du calmar (Probl me 11 10). Pour les ions univalents et 20 C (293 K), l' quation de Nernst se r duit l'endroit o Co et Ci sont les concentrations l'ext rieur et l'int rieur, respectivement. l'aide de cette quation, calculez le potentiel trav
Biologie moléculaire de la cellule	ers la membrane au repos (1) en supposant qu'il est d uniquement K+ et (2) en supposant qu'il est d uniquement Na+. (Les concentrations de Na+ et de K+ dans le cytosol de l'axone et dans l'eau de mer sont indiqu es dans le tableau Q11 1.) Quel calcul est le plus proche du potentiel de repos mesur ? Quel calcul est le plus proche du potentiel d'action mesur ? Expliquez pourquoi ces hypoth ses se rapprochent des potentiels de repos et d'action mesur s. 11 11 canaux cationiques ac tylcholiniques au niveau de la jonction neuromusculaire s'ouvrent en r ponse l'ac tylcholine lib r e par la terminaison nerveuse et permettent aux ions Na+ de p n trer dans la cellule musculaire, ce qui provoque une d polarisation membranaire et conduit finalement la contraction musculaire. un. Les mesures par patch-clamp montrent que les jeunes muscles du rat ont des canaux cationiques qui r pondent l'ac tylcholine (Figure Q11 4). Combien de types de canaux existe-t-il ? Comment pouvez-vous le savoir ? b. Pour chaque type de canal, calculez le nombre d'ions qui entrent en une milliseconde. (Un amp re est un courant d'un coulomb par seconde ; un pA quivaut 10 12 amp res. Un ion avec une seule charge, comme le Na+, porte une charge de 1,6 10 19 coulombs.) Figure Q11 4 Mesures par patch-clamp des canaux cationiques ac tylcholines dans le muscle du jeune rat (Probl me 11 11). Figure Q11 3 Le calmar Loligo (Probl me 11 10). Ce calmar mesure environ 15 cm de long. Engel A & Gaub HE (2008) Structure et m canique des prot ines membranaires. Annu. R v. Biochem. 77, 127 148. Hille B (2001) Canaux ioniques des membranes excitables, 3e d. Sunderland, MA : Sinauer. Stein WD (2014) Canaux, transporteurs et pompes : une introduction au transport membranaire, 2e d. San Diego, CA : Academic Press. Vinothkumar KR & Henderson R (2010) Structures des prot ines membranaires. Q. R v rend Biophys. 43, 65 158. Principes du transport membranaire Al-Awqati Q (1999) Cent ans de perm abilit membranaire : Overton r gne-t-il encore ? Nat. Cell Biol. 1, E201 E202. Forrest LR & Sansom MS (2000) Simulations membranaires : plus grandes et meilleures ? Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 174 181. Gouaux E & MacKinnon R (2005) Principes du transport s lectif des ions dans les canaux et les pompes. Science 310, 1461-1465. Mitchell P (1977) Processus chimiosmotiques vectoriels. Annu. R v. Biochem. 46, 996 1005.Tanford C (1983) M canisme de couplage d' nergie libre dans le transport actif. Annu. R v. Biochem. 52, 379 409. Almers W & Stirling C (1984) Distribution des prot ines de transport sur les membranes cellulaires animales. J. Membr. Biol. 77, 169 186. Baldwin SA & Henderson PJ (1989) Homologies entre transporteurs de sucre d'eucaryotes et de procaryotes. Annu. Rev. Physiol. 51, 459 471. Doige CA & Ames GF (1993) Syst mes de transport d pendants de l'ATP chez les bact ries et les humains : pertinence pour la mucoviscidose et la multir sistance aux m dicaments. Annu. R v. Microbiol. 47, 291 319. Forrest LR & Rudnick G (2009) Le faisceau de bascule : un m canisme pour le flux de solut coupl aux ions par des transporteurs sym triques. Physiologie 24, 377 386. Gadsby DC (2009) Canaux ioniques et pompes ions : la principale diff rence, en principe. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 344 352. Higgins CF (2007) M canismes mol culaires multiples pour les transporteurs multir sistants. Nature 446, 749 757. Kaback HR, Sahin-T th M & Weinglass AB (2001) L'approche kamikaze du transport membranaire. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 610 620. K hlbrandt W (2004) Biologie, structure et m canisme des ATPases de type P. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 282 295. Lodish HF (1986) Prot ines changeuses d'anions et de transport du glucose : structure, fonction et distribution. Harvey Lect. 82, 19 46. M ller JV, Olesen C, Winther AML & Nissen P (2010) Le Ca2+-ATPase sarcoplasmique : conception d'une pompe chimi-osmotique parfaite. Q. R v rend Biophys. 43, 501 566. Perez C, Koshy C, Yildiz O & Ziegler C (2012) M canisme d'acc s alternatif dans les trim res asym triques conformationnellement du transporteur de b ta ne BetP. Nature 490, 126 130. Rees D, Johnson E & Lewinson O (2009) Transporteurs ABC : le pouvoir de changer. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 218 227. Romero MF & Boron WF (1999) Cotransporteurs lectrog nes Na+/HCO3 : clonage et physiologie. Annu. Rev. Physiol. 61, 699 723. Rudnick G (2011) Voie de perm ation cytoplasmique des transporteurs de neurotransmetteurs. Biochimie 50, 7462 7475. Saier, MH, Jr (2000) M tabolisme vectoriel et volution des syst mes de transport. J. Bacteriol. 182, 5029 5035. Stein WD (2002) Hom ostasie du volume cellulaire : m canismes ioniques et non ioniques. La pompe sodium dans l' mergence des cellules animales. Int. Rev. Cytol. 215, 231 258. Toyoshima C (2009) Comment la Ca2+-ATPase pompe les ions travers la membrane du r ticulum sarcoplasmique. Biochim. Biophys. Acta 1793,
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Biologie moléculaire de la cellule	llule et des relations entre eux, nous organisons conceptuellement les organites en un petit nombre de familles discr tes, discutons de la fa on dont les prot ines sont dirig es vers des organites sp cifiques et expliquons comment les prot ines traversent les membranes des organites. toutes les cellules eucaryotes ont le m me ensemble de base d'organites enferm s dans une membrane De nombreux processus biochimiques vitaux se d roulent dans les membranes ou leur surface. Les enzymes membranaires, par exemple, catalysent le m tabolisme des lipides ; et la phosphorylation oxydative et la photosynth se n cessitent toutes deux une membrane pour coupler le transport de H+ la synth se de l'ATP. En plus de fournir une surface membranaire accrue pour accueillir les r actions biochimiques, les syst mes membranaires intracellulaires forment des compartiments ferm s qui sont s par s du cytosol, cr ant ainsi des espaces aqueux fonctionnellement sp cialis s au sein de la cellule. Dans ces espaces, des sous-ensembles de mol cules (prot ines, r actifs, ions) sont concentr s pour optimiser les r actions biochimiques auxquelles elles participent. Parce que la bicouche lipidique des membranes cellulaires est imperm able la plupart des mol cules hydrophiles, la membrane d'un organite doit contenir des prot ines de transport membranaire pour importer et exporter des m tabolites sp cifiques. Chaque membrane d'organite doit galement disposer d'un m canisme permettant d'importer et d'incorporer dans l'organite les prot ines sp cifiques qui rendent l'organite unique. La comparaison des cellules Le transfert des grains de beaut entre le nUCleUs et le CYTosol Le transfert de proTeines inTo miToChonDria et ChloroplasTs Le reTiCUlUm 642 Chapitre 12 : Compartiments intracellulaires et tri des prot ines du r ticulum endoplasmique avec polyribosomes li s la membrane La figure 12 1 illustre les principaux compartiments intracellulaires communs aux cellules eucaryotes. Le noyau contient le g nome ( l'exception de l'ADN mitochondrial et chloroplastique), et c'est le principal site de synth se de l'ADN et de l'ARN. Le cytoplasme environnant est constitu du cytosol et des organites cytoplasmiques qui y sont suspendus. Le cytosol constitue un peu plus de la moiti du volume total de la cellule, et c'est le principal site de synth se et de d gradation des prot ines. Il effectue galement la majeure partie du m tabolisme interm diaire de la cellule, c'est- -dire les nombreuses r actions qui d gradent certaines petites mol cules et en synth tisent d'autres pour fournir les l ments constitutifs des macromol cules (voir le chapitre 2). Environ la moiti de la surface totale de la membrane d'une cellule eucaryote entoure les espaces labyrinthiques du r ticulum endoplasmique (RE). Le RE rugueux a de nombreux ribosomes li s sa surface cytosolique. Les ribosomes sont des organites qui ne sont pas enferm s dans une membrane ; Ils synth tisent des prot ines membranaires solubles et int grales, dont la plupart sont destin es soit la s cr tion vers l'ext rieur des cellules, soit d'autres organites. Nous verrons que, alors que les prot ines ne sont transport es dans d'autres organites entour s de membranes qu'une fois leur synth se termin e, elles sont transport es dans le RE au fur et mesure de leur synth se. Cela explique pourquoi la membrane du RE est unique en ce sens qu'elle est li e des ribosomes. Le RE produit galement la majeure partie des lipides pour le reste de la cellule et fonctionne comme un stockage pour les ions Ca2+. Les r gions du RE qui n'ont pas de ribosomes li s sont appel es lisse ER. Le RE envoie un grand nombre de ses prot ines et lipides l'appareil de Golgi, qui consiste souvent en des empilements organis s de compartiments en forme de disque appel s citernes de Golgi. L'appareil de Golgi re oit les lipides et les prot ines du RE et les exp die vers diverses destinations, les modifiant g n ralement de mani re covalente en cours de route. Les mitochondries et les chloroplastes g n rent la majeure partie de l'ATP que les cellules utilisent pour piloter les r actions n cessitant un apport d' nergie libre ; Les chloroplastes sont une version sp cialis e des plastes (pr sents dans les plantes, les algues et certains protozoaires), qui peuvent galement avoir d'autres fonctions, telles que le stockage de nourriture ou de mol cules pigmentaires. Les lysosomes contiennent des enzymes digestives qui d gradent les organites intracellulaires d funts, ainsi que les macromol cules et les particules absorb es de l'ext rieur de la cellule par endocytose. Sur le chemin des lysosomes, le mat riel endocytos doit d'abord passer travers une s rie d'organites appel s endosomes. Enfin, les peroxysomes sont de petits compartiments v siculaires qui contiennent des enzymes utilis es dans diverses r actions oxydatives. En g n ral, chaque organite entour d'une membrane remplit le m me ensemble de fonctions de base dans
Biologie moléculaire de la cellule	tous les types de cellules. Mais pour remplir les fonctions sp cialis es des cellules, ces organites varient en abondance et peuvent avoir des propri t s suppl mentaires qui diff rent d'un type de cellule l'autre. En moyenne, les compartiments enferm s dans une membrane occupent ensemble pr s de la moiti du volume d'une cellule (tableau 12 1), et une grande quantit de membrane intracellulaire est n cessaire pour les fabriquer. Dans les cellules h patiques et pancr atiques, par exemple, le Figure 12 1 Les principaux compartiments intracellulaires d'une cellule animale. Le cytosol (gris), le r ticulum endoplasmique, l'appareil de Golgi, le noyau, la mitochondrie, l'endosome, le lysosome et le peroxysome sont des compartiments distincts isol s du reste de la cellule par au moins une membrane s lectivement perm able (voir vid o 9.2). Le r ticulum endoplasmique a une surface totale de membrane qui est, respectivement, 25 fois et 12 fois celle de la membrane plasmique (tableau 12 2). Les organites entour s d'une membrane sont troitement emball s dans le cytoplasme et, en termes de surface et de masse, la membrane plasmique n'est qu'une membrane mineure dans la plupart des cellules eucaryotes (Figure 12 2). L'abondance et la forme des organites entour s de membranes sont r gul es pour r pondre aux besoins de la cellule. Cela est particuli rement apparent dans les cellules qui sont hautement sp cialis es et qui d pendent donc de mani re disproportionn e d'organites sp cifiques. Les plasmocytes, par exemple, qui s cr tent chaque jour leur propre poids en mol cules d'anticorps dans la circulation sanguine, contiennent des quantit s consid rablement amplifi es de RE rugueux, que l'on trouve dans de grandes feuilles plates. Les cellules sp cialis es dans la synth se des lipides largissent galement leur RE, mais dans ce cas, l'organite forme un r seau de tubules alv ol s. De plus, les organites entour s d'une membrane se trouvent souvent des positions caract ristiques dans le cytoplasme. Dans la plupart des cellules, par exemple, l'appareil de Golgi est situ pr s du noyau, tandis que le r seau de tubules du RE s' tend du noyau l'ensemble du cytosol. Ces distributions caract ristiques d pendent des interactions des organites avec le cytosquelette. La localisation de l'appareil RE et de l'appareil de Golgi, par exemple, d pend d'un r seau de microtubules intact ; si les microtubules sont d polym ris s exp rimentalement avec un m dicament, l'appareil de Golgi se fragmente et se disperse dans toute la cellule, et le r seau RE s'effondre vers le centre de la cellule (discut au chapitre 16). La taille, la forme, la composition et l'emplacement sont toutes des caract ristiques importantes et r gul es de ces organites qui contribuent finalement la fonction de l'organite. les origines volutives peuvent aider expliquer les relations topologiques des organites Pour comprendre les relations entre les compartiments de la cellule, il est utile d'examiner comment ils ont pu voluer. On pense que les pr curseurs des premi res cellules eucaryotes taient des cellules relativement simples qui, comme la plupart des cellules bact riennes et arch es, ont une membrane plasmique mais pas de membranes internes. La membrane plasmique de ces cellules assure toutes les fonctions d pendantes de la membrane, y compris le pompage de ions, synth se de l'ATP, s cr tion de prot ines et synth se des lipides. Les cellules eucaryotes typiques d'aujourd'hui sont 10 30 fois plus grandes en dimension lin aire et 1000 10 000 fois plus grandes en volume qu'une bact rie typique telle que E. coli. La profusion de membranes internes peut tre consid r e, en partie, comme une adaptation cette augmentation de taille : la cellule eucaryote a un rapport surface/volume beaucoup plus faible, et sa membrane plasmique a donc probablement une surface trop petite pour soutenir les nombreuses fonctions vitales que les membranes remplissent. Les syst mes membranaires internes tendus d'une cellule eucaryote att nuent ce probl me. L' volution des membranes internes est videmment all e de pair avec la sp cialisation de la fonction membranaire. La figure 12-3 illustre un sch ma hypoth tique de la fa on dont les premi res cellules eucaryotes, avec un noyau et un RE, auraient pu voluer par l'invagination et le pincement de la membrane plasmique d'une cellule ancestrale. Nous verrons que cette relation topologique est valable pour tous les organites impliqu s dans les voies s cr toires et endocytaires, y compris le RE, l'appareil de Golgi, les endosomes, les lysosomes et les peroxysomes. Nous pouvons donc consid rer tous ces organites comme des membres d'un m me compartiment topologiquement quivalent. Comme nous le verrons en d tail dans le chapitre suivant, leur int rieur communique largement entre eux et avec l'ext rieur de la cellule via des v sicules de transport, qui se d tachent d'un organite et fusionnent avec un autre (Figure 12 4). Comm
Biologie moléculaire de la cellule	e d crit au chapitre 14, les mitochondries et les plastes diff rent des autres organites entour s de membranes car ils contiennent leurs propres g nomes. La nature de ces g nomes, et l' troite ressemblance des prot ines de ces organites avec celles de certaines bact ries actuelles, sugg rent fortement que les mitochondries et les plastes ont volu partir de bact ries qui ont t englouties par d'autres cellules avec lesquelles elles vivaient initialement en symbiose (voir figures 1-29 et 1-31) : la membrane interne des mitochondries et des plastes correspond probablement la membrane plasmique d'origine de la bact rie, tandis que la lumi re de ces organites a volu partir du cytosol bact rien. Comme les bact ries dont elles sont issues, les mitochondries et les plastes sont enferm s dans une double membrane et restent isol s du vaste trafic v siculaire qui relie l'int rieur de la plupart des autres organites entour s de membranes les uns aux autres et l'ext rieur de la cellule. Figure 12 2 Micrographie lectronique d'une partie d'une cellule h patique vue en coupe efficace. Des exemples de la plupart des principaux organites intracellulaires sont indiqu s. (Avec l'aimable autorisation de Daniel s. friend.) ARCH ES ET BACT RIENNES) DANS L'ANCIENNE AUGMENTE CONSID RABLEMENT LE G NE HORIZONTAL DE L'ARCH ON ANA ROBIE FACILITE LES TRANSFERTS HORIZONTAUX, ACC L RANT LES TRANSFERTS DE G NES PROCESSUS VOLUTIFS Les sch mas volutifs que nous venons de d crire regroupent les compartiments intracellulaires des cellules eucaryotes en quatre familles distinctes : (1) le noyau et le cytosol, qui communiquent entre eux par des complexes de pores nucl aires et sont donc topologiquement continus (bien que fonctionnellement distincts) ; (2) tous les organites qui fonctionnent dans les voies s cr toires et endocytaires, y compris le RE, l'appareil de Golgi, les endosomes et les lysosomes, les nombreuses classes d'interm diaires de transport tels que les v sicules de transport qui se d placent entre eux et les peroxysomes ; (3) les mitochondries ; et (4) les plastes (chez les plantes seulement). La synth se de toutes les prot ines commence sur les ribosomes du cytosol, l'exception de quelques-unes qui sont synth tis es sur les ribosomes des mitochondries et des plastes. Leur destin ult rieur d pend de leur s quence d'acides amin s, qui peut contenir des signaux de tri qui dirigent leur livraison vers des emplacements en dehors du cytosol ou la surface des organites. Certaines prot ines n'ont pas de signal de tri et restent donc dans le cytosol en tant que r sidentes permanentes. Beaucoup d'autres, cependant, ont des signaux de tri sp cifiques qui dirigent leur transport du cytosol vers le noyau, le RE, les mitochondries, les plastes ou les peroxysomes ; Les signaux de tri peuvent galement diriger le transport des prot ines du RE vers d'autres destinations dans la cellule. Figure 12 3 Une voie sugg r e pour l' volution de la cellule eucaryote et de ses membranes internes, comme discut au chapitre 1, il existe des preuves que le g nome nucl aire d'une cellule eucaryote a volu partir d'une Arch on antique. par exemple, des homologues clairs de l'actine, de la tubuline, des histones et du syst me de r plication de l'ADN nucl aire se trouvent chez les arch es, mais pas chez les bact ries. Ainsi, on pense maintenant que les premi res cellules eucaryotes sont apparues lorsqu'un ancien arch on ana robie a uni ses forces avec une bact rie a robie il y a environ 1,6 milliard d'ann es. comme indiqu , l'enveloppe nucl aire peut provenir d'une invagination de la membrane plasmique de cet ancien arch on une invagination qui prot geait son chromosome tout en permettant l'acc s de l'ADN au cytosol (comme requis pour que l'ADN dirige la synth se des prot ines). Cette enveloppe peut avoir par la suite t compl tement pinc e de la membrane plasmique, de mani re produire un compartiment nucl aire s par entour d'une double membrane. Parce que cette double membrane est p n tr e par des complexes de pores nucl aires, le compartiment nucl aire est topologiquement quivalent au cytosol. En revanche, la lumi re du RE est continue avec l'espace entre les membranes nucl aires interne et externe, et elle est topologiquement quivalente l'espace extracellulaire (voir Figure 12-4). (adapt de J. martijn et T.J.G. ettema, Biochem. Soc. Trans. 41 : 451-457, 2013.) Pour comprendre les principes g n raux selon lesquels les signaux de tri fonctionnent, il est important de distinguer trois fa ons fondamentalement diff rentes dont les prot ines se d placent d'un compartiment un autre. Ces trois m canismes sont d crits ci-dessous, et les tapes de transport auxquelles ils op rent sont d crites la figure 12-5. Nous discutons des deux premiers m canismes (transport portes et transport transmembranaire) dans ce chapitre, et du troisi me (transport v siculaire, fl ches vertes dans les figures 12 5) dans le chapitre 13. 1.
Biologie moléculaire de la cellule	Dans le transport porte, les prot ines et les mol cules d'ARN se d placent entre le cytosol et le noyau travers des complexes de pores nucl aires dans l'enveloppe nucl aire. Les complexes de pores nucl aires fonctionnent comme des portes s lectives qui soutiennent le transport actif de macromol cules sp cifiques et d'assemblages macromol culaires entre les deux espaces topologiquement quivalents, bien qu'ils permettent galement la diffusion libre de mol cules plus petites. 2. Dans la translocation prot ique, les translocateurs de prot ines transmembranaires transportent directement des prot ines sp cifiques travers une membrane du cytosol vers un espace topologiquement distinct. La mol cule de prot ine transport e doit g n ralement se d plier pour serpenter travers le translocateur. C'est de cette mani re que se produit le transport initial de prot ines s lectionn es du cytosol vers la lumi re du RE ou les mitochondries, par exemple. Les prot ines membranaires int grales utilisent souvent les m mes translocateurs, mais ne se d placent que partiellement travers la membrane, de sorte que la prot ine s'int gre dans la bicouche lipidique. 3. Dans le transport v siculaire, les interm diaires de transport entour s d'une membrane, qui peuvent tre de petites v sicules de transport sph riques ou des fragments d'organites plus grands et de forme irr guli re, transportent les prot ines d'un compartiment topologiquement quivalent un autre. Les v sicules et les fragments de transport sont charg s d'une cargaison de mol cules d riv es de la lumi re d'un compartiment lorsqu'elles bourgeonnent et se d tachent de sa membrane ; ils d chargent leur cargaison dans un deuxi me compartiment en fusionnant avec la membrane qui entoure ce compartiment (figures 12 6). Le transfert de prot ines solubles du RE l'appareil de Golgi, par exemple, se produit de cette mani re. Parce que le Figure 12 5 Une feuille de route simplifi e du trafic des prot ines au sein d'une cellule eucaryote. Les prot ines peuvent se d placer d'un compartiment un autre par transport portes (rouge), translocation de prot ines (bleu) ou transport v siculaire (vert). Les signaux de tri qui dirigent le mouvement d'une prot ine donn e travers le syst me, et d terminent ainsi son emplacement final dans la cellule, sont contenus dans la s quence d'acides amin s de chaque prot ine. Le voyage commence par la synth se d'une prot ine sur un ribosome dans le cytosol et, pour de nombreuses prot ines, se termine lorsque la prot ine atteint sa destination finale. d'autres prot ines font la navette entre le noyau et le cytosol. chaque station interm diaire (bo tes), une d cision est prise quant savoir si la prot ine doit tre conserv e dans ce compartiment ou transport e plus loin. Un signal de tri peut diriger la r tention l'int rieur ou la sortie d'un compartiment. Nous nous r f rerons souvent cette figure comme guide dans ce chapitre et le suivant, en mettant en couleur le chemin particulier dont il est question. Figure 12 4 Compartiments topologiquement quivalents dans les voies s cr toires et endocytaires d'une cellule eucaryote. On dit que les compartiments sont topologiquement quivalents s'ils peuvent communiquer entre eux, en ce sens que les mol cules peuvent passer de l'un l'autre sans avoir traverser une membrane. Les espaces topologiquement quivalents sont indiqu s en rouge. (a) Les mol cules peuvent tre transport es d'un compartiment un autre compartiment topologiquement quivalent par des v sicules qui bourgeonnent de l'un et fusionnent avec l'autre. (B) en principe, les cycles de bourgeonnement et de fusion membranaires permettent la lumi re de l'un quelconque des organites montr s de communiquer avec tout autre organite et avec l'ext rieur de la cellule au moyen de v sicules de transport. Les fl ches bleues indiquent l'importance du trafic v siculaire sortant et entrant (abord au chapitre 13). Certains organites, notamment les mitochondries et (dans les cellules v g tales) les plastes, ne participent pas cette communication et sont isol s du trafic v siculaire entre les organites illustr s ici. = transport contr l = transport transmembranaire = transport v siculaire L GENDE : Figure 12 6 Bourgeonnement et fusion des v sicules pendant le transport v siculaire. Les v sicules de transport bourgeonnent d'un compartiment (donneur) et fusionnent avec un autre compartiment topologiquement quivalent (cible). Au cours de ce processus, les composants solubles (points rouges) sont transf r s d'un lumen l'autre. Notez que la membrane est galement transf r e et que l'orientation originale des prot ines et des lipides dans la membrane du compartiment donneur est pr serv e dans la membrane du compartiment cible. Ainsi, les prot ines membranaires conservent leur orientation asym trique, les m mes domaines faisant toujours face au cytosol. Les prot ines transport es ne traversent pas une membrane, le transport
Biologie moléculaire de la cellule	v siculaire ne peut d placer les prot ines qu'entre des compartiments topologiquement quivalents (voir Figure 12 4). Chaque mode de transfert de prot ines est g n ralement guid par des signaux de tri dans la prot ine transport e, qui sont reconnus par des r cepteurs de tri compl mentaires. Si une grande prot ine doit tre import e dans le noyau, par exemple, elle doit poss der un signal de tri que les prot ines r ceptrices reconnaissent pour la guider travers le complexe de pores nucl aires. Si une prot ine doit tre transf r e directement travers une membrane, elle doit poss der un signal de tri que le translocateur reconna t. De m me, si une prot ine doit tre charg e dans un certain type de v sicule ou retenue dans certains organites, un r cepteur compl mentaire dans la membrane appropri e doit reconna tre son signal de tri. s quences de signaux et r cepteurs de tri Diriger les prot ines vers l'adresse correcte de la cellule La plupart des signaux de tri des prot ines impliqu s dans le transport transmembranaire r sident dans une s quence d'acides amin s, g n ralement de 15 60 r sidus. De telles s quences de signaux se trouvent souvent l'extr mit N-terminale de la cha ne polypeptidique, et dans de nombreux cas, des peptidases de signal sp cialis es suppriment la s quence de signal de la prot ine finie une fois le processus de tri termin . Les s quences de signal peuvent galement tre des tirements internes d'acides amin s, qui font toujours partie de la prot ine. De tels signaux sont utilis s dans le transport portes dans le noyau. Les signaux de tri peuvent galement tre compos s de plusieurs s quences internes d'acides amin s qui forment un arrangement tridimensionnel sp cifique d'atomes la surface de la prot ine ; De tels patchs de signaux sont parfois utilis s pour l'importation nucl aire et le transport v siculaire. Chaque s quence de signaux sp cifie une destination particuli re dans la cellule. Les prot ines destin es au transfert initial vers le RE ont g n ralement une s quence de signal leur Nterminus qui comprend typiquement une s quence compos d'environ 5 10 acides amin s hydrophobes. Beaucoup de ces prot ines passeront leur tour du RE l'appareil de Golgi, mais celles qui ont une s quence de signal sp cifique de quatre acides amin s leur extr mit C-terminale sont reconnues comme r sidentes du RE et sont renvoy es au RE. Les prot ines destin es aux mitochondries ont des s quences de signal d'un autre type encore, dans lesquelles les acides amin s charg s positivement alternent avec les acides amin s hydrophobes. Enfin, de nombreuses prot ines destin es aux peroxysomes ont une s quence signal de trois acides amin s caract ristiques leur extr mit C-terminale. Le Tableau 12 3 pr sente quelques s quences de signaux sp cifiques. Des exp riences dans lesquelles le peptide est transf r d'une prot ine une autre par des techniques de g nie g n tique ont d montr l'importance de chacune de ces s quences de signal pour le ciblage des prot ines. Placer la s quence de signal N-terminal du RE au d but d'une prot ine cytosolique, par exemple, redirige la prot ine vers le RE ; l' limination ou la mutation de la s quence signal d'une prot ine du RE provoque sa r tention dans le cytosol. Les s quences de signaux sont donc la fois n cessaires et suffisantes pour le ciblage des prot ines. M me si leurs s quences d'acides amin s peuvent varier consid rablement, les s quences de signal des prot ines ayant la m me destination sont fonctionnellement interchangeables ; Les propri t s physiques, telles que l'hydrophobie, semblent souvent tre plus importantes dans le processus de reconnaissance du signal que la s quence exacte d'acides amin s. Les s quences de signaux sont reconnues par des r cepteurs de tri compl mentaires qui guident les prot ines vers leur destination appropri e, o les r cepteurs d chargent leur cargaison. Les r cepteurs fonctionnent de mani re catalytique : apr s avoir termin un tour de ciblage, ils retournent leur point d'origine pour tre r utilis s. La plupart des r cepteurs de tri des v sicules bourgeonnantes dont le contenu est s lectionn reconnaissent des classes de prot ines plut t qu'une esp ce prot ique individuelle. Ils peuvent donc tre consid r s comme des syst mes de transport public, d di s la livraison de nombreux composants diff rents leur emplacement correct dans la cellule. la plupart des organites ne peuvent pas tre construits de novo : ils n cessitent des informations dans l'organite lui-m me Lorsqu'une cellule se reproduit par division, elle doit dupliquer ses organites, en plus de ses chromosomes. En g n ral, les cellules le font en incorporant de nouvelles mol cules dans les organites existants, les largissant ainsi ; Les organites largis se divisent ensuite et sont distribu s aux deux cellules filles. Ainsi, chaque cellule fille h rite d'un ensemble complet de membranes cellulaires sp cialis es de sa m re. Cet h ritag
Biologie moléculaire de la cellule	e est essentiel car une cellule ne pourrait pas fabriquer de telles membranes partir de z ro. Si le RE tait compl tement retir d'une cellule, par exemple, comment la cellule pourrait-elle le reconstruire ? Comme nous le verrons plus loin, les prot ines membranaires qui d finissent le RE et remplissent bon nombre de ses fonctions sont elles-m mes des produits du RE. Un nouveau RE ne pourrait pas tre r alis sans un RE existant ou, du moins, une membrane qui contient sp cifiquement les translocateurs de prot ines n cessaires l'importation de prot ines s lectionn es dans le RE partir du cytosol (y compris les translocateurs sp cifiques du RE eux-m mes). Il en va de m me pour les mitochondries et les plastes. Ainsi, il semble que l'information n cessaire la construction d'un organite ne r side pas exclusivement dans l'ADN qui sp cifie les prot ines de l'organite. Des informations sous la forme d'au moins une prot ine distincte qui pr existe dans la membrane de l'organite sont galement n cessaires, et ces informations sont transmises de la cellule m re aux cellules filles sous la forme de l'organite lui-m me. On peut supposer que cette information est essentielle la propagation de l'organisation compartimentale de la cellule, tout comme l'information contenue dans l'ADN est essentielle la propagation des s quences de nucl otides et d'acides amin s de la cellule. Cependant, comme nous le verrons plus en d tail au chapitre 13, le RE met un flux constant de v sicules de transport qui n'incorporent qu'un sous-ensemble de prot ines du RE et ont donc une composition diff rente de celle du RE lui-m me. De m me, la membrane plasmique bourgeonne constamment de divers types de v sicules endocytaires sp cialis es. Ainsi, certains organites peuvent se former partir d'autres organites et n'ont pas besoin d' tre h rit s lors de la division cellulaire. Les cellules eucaryotes contiennent des organites entour s d'une membrane intracellulaire qui repr sentent pr s de la moiti du volume total de la cellule. Les principaux pr sents dans toutes les cellules eucaryotes sont le r ticulum endoplasmique, l'appareil de Golgi, noyau, mitochondries, lysosomes, endosomes et peroxysomes ; Les cellules v g tales contiennent galement des plastes tels que les chloroplastes. Ces organites contiennent des ensembles distincts de prot ines, qui interviennent dans la fonction unique de chaque organite. Chaque prot ine d'organite nouvellement synth tis e doit trouver son chemin d'un ribosome dans le cytosol, o la prot ine est fabriqu e, jusqu' l'organite o elle fonctionne. Pour ce faire, il suit une voie sp cifique, guid e par le tri des signaux dans sa s quence d'acides amin s qui fonctionnent soit comme des s quences de signaux, soit comme des patchs de signaux. Les signaux de tri sont reconnus par des r cepteurs de tri compl mentaires, qui d livrent la prot ine l'organite cible appropri . Les prot ines qui fonctionnent dans le cytosol ne contiennent pas de signaux de tri et y restent donc apr s leur synth se. Au cours de la division cellulaire, des organites tels que le RE et les mitochondries sont distribu s chaque cellule fille. Ces organites contiennent des informations n cessaires leur construction, et ils ne peuvent donc pas tre fabriqu s de novo. Le transfert des grains de beaut entre le nUCleUs et le CYTosol L'enveloppe nucl aire renferme l'ADN et d finit le compartiment nucl aire. Cette enveloppe est constitu e de deux membranes concentriques, qui sont p n tr es par des complexes de pores nucl aires (Figure 12 7). Bien que les membranes nucl aires interne et externe soient continues, elles conservent des compositions prot iques distinctes. La membrane nucl aire interne contient des prot ines qui agissent comme des sites de liaison pour les chromosomes et pour la lame nucl aire, un r seau prot ique qui fournit un soutien structurel l'enveloppe nucl aire ; La lame agit galement comme un site d'ancrage pour les chromosomes et le cytosquelette cytoplasmique (via des complexes prot iques qui couvrent l'enveloppe nucl aire). La membrane interne est entour e par la membrane nucl aire externe, qui est continue avec la membrane du RE. Comme la membrane du RE (discut e plus loin), la membrane nucl aire externe est parsem e de ribosomes engag s dans la synth se des prot ines. Les prot ines fabriqu es sur ces ribosomes sont transport es dans l'espace entre les membranes nucl aires interne et externe (l'espace p rinucl aire), qui est continu avec la lumi re du RE (voir Figure 12-7). Le trafic bidirectionnel se produit en continu entre le cytosol et le noyau. Les nombreuses prot ines qui fonctionnent dans le noyau, y compris les histones, les ADN polym rases, les ARN polym rases, les r gulateurs transcriptionnels et les prot ines de traitement de l'ARN, sont import es de mani re s lective dans le compartiment nucl aire partir du cytosol, o elles sont fabriqu es. Dans le m me temps, presque tous les ARN, y
Biologie moléculaire de la cellule	compris les ARNm, les ARNr, les ARNt, les miARN et les snRNA, sont synth tis s dans le compartiment nucl aire, puis export s vers le cytosol. Comme le processus d'importation, le processus d'exportation est s lectif ; Les ARNm, par exemple, ne sont export s qu'apr s avoir t correctement modifi s par des r actions de traitement de l'ARN dans le noyau. Dans certains cas, le processus de transport est complexe. Les prot ines ribosomiques, par exemple, sont fabriqu es dans le cytosol et import es dans le noyau, o elles s'assemblent avec l'ARN ribosomique nouvellement fabriqu en particules. Les particules sont ensuite export es vers le cytosol, o elles s'assemblent en ribosomes. Chacune de ces tapes n cessite un transport s lectif travers l'enveloppe nucl aire. Les complexes de pores nucl aires perforent l'enveloppe nucl aire De grands complexes de pores nucl aires (NPC) labor s perforent l'enveloppe nucl aire chez tous les eucaryotes. Chaque NPC est compos d'un ensemble d'environ 30 prot ines diff rentes, ou nucl oporines. Refl tant le haut degr de sym trie interne, chaque nucl oporine est pr sente en plusieurs copies, ce qui donne 500 1000 mol cules de prot ines dans le NPC enti rement assembl , avec une masse estim e 66 millions de daltons chez la levure et 125 millions de daltons chez les vert br s (Figure 12-8). La plupart des nucl oporines sont compos es de domaines prot iques r p titifs de quelques types diff rents, qui ont volu par duplication g n tique tendue. Certaines des nucl oporines de l' chafaudage (voir Figure 12-8) sont structurellement li es des complexes prot iques de l'enveloppe v siculaire, tels que la clathrine et le coatomer COPII (discut s au chapitre 13), qui fa onnent les v sicules de transport ; et une prot ine est utilis comme un bloc de construction commun dans les PNJ et les couches de v sicules. Ces similitudes sugg rent une origine volutive commune pour les NPC et les couches v siculaires : elles peuvent d river d'un module prot ique pr coce de flexion de la membrane qui a aid fa onner les syst mes membranaires labor s des cellules eucaryotes, et dans les cellules actuelles, stabiliser les courbures membranaires nettes n cessaires la formation d'un pore nucl aire. L'enveloppe nucl aire d'une cellule de mammif re typique contient 3000 4000 NPC, bien que ce nombre varie consid rablement, de quelques centaines dans les cellules gliales pr s de 20 000 dans les neurones de Purkinje. Le trafic total qui passe par chaque PNJ est norme : chaque PNJ peut transporter jusqu' 1000 macromol cules par seconde et peut transporter dans les deux sens en m me temps. On ne sait pas comment il coordonne le flux bidirectionnel des macromol cules pour viter la congestion et les collisions frontales. Chaque NPC contient des passages aqueux, travers lesquels de petites mol cules solubles dans l'eau peuvent se diffuser passivement. Les chercheurs ont d termin la taille effective de ces passages en injectant dans le cytosol des mol cules hydrosolubles marqu es de diff rentes tailles, puis en mesurant leur taux de diffusion dans le noyau. Les petites mol cules (5000 daltons ou moins) se diffusent si rapidement que nous pouvons consid rer l'enveloppe nucl aire comme librement perm able celles-ci. Les grosses prot ines, cependant, se diffusent beaucoup plus lentement, et plus une prot ine est grosse, plus elle passe lentement travers le NPC. Les prot ines de plus de 60 000 daltons ne peuvent pas p n trer par diffusion passive. On pense que cette coupure de taille la diffusion libre r sulte de la structure du NPC (voir Figure 12 8). Les nucl oporines du canal avec des r gions non structur es tendues forment un enchev trement d sordonn (un peu comme un lit de varech dans l'oc an) qui limite la diffusion des grosses macromol cules tout en permettant aux mol cules plus petites de passer. Parce que de nombreuses prot ines cellulaires sont trop grandes pour se diffuser passivement travers les NPC, le compartiment nucl aire et le cytosol peuvent maintenir des compositions prot iques diff rentes. Les ribosomes cytosoliques matures, par exemple, ont un diam tre d'environ 30 nm et ne peuvent donc pas diffuser travers le NPC, limitant la synth se des prot ines au cytosol. Mais comment le noyau exporte-t-il des sous-unit s ribosomales nouvellement fabriqu es ou importe-t-il de grandes mol cules, telles que les ADN polym rases et les ARN polym rases, qui ont des masses mol culaires de sous-unit s de 100 000 200 000 daltons ? Comme nous le verrons ci-dessous, ces mol cules et la plupart des autres mol cules de prot ines et d'ARN transport es se lient des prot ines r ceptrices sp cifiques qui transportent activement de grosses mol cules travers des NPC. M me les petites prot ines comme les histones utilisent fr quemment des m canismes m di s par les r cepteurs pour traverser le NPC, augmentant ainsi l'efficacit du transport. Signaux de localisation nucl aire
Biologie moléculaire de la cellule	Dirigez les prot ines nucl aires vers le noyau Lorsque des prot ines sont extraites exp rimentalement du noyau et r introduites dans le cytosol, m me les tr s grosses prot ines se r accumulent efficacement dans le noyau. Les signaux de tri appel s signaux de localisation nucl aire (NLS) sont responsables de la s lectivit de ce processus actif d'importation nucl aire. Les signaux ont t d finis avec pr cision en utilisant la technologie de l'ADN recombinant pour de nombreuses prot ines nucl aires, ainsi que pour des prot ines qui ne p n trent dans le noyau que de mani re transitoire (Figure 12-9). Dans de nombreuses prot ines nucl aires, les signaux sont constitu s d'une ou deux courtes s quences riches en acides amin s charg s positivement, la lysine et l'arginine (voir tableau 12-3, p. 648), la s quence pr cise variant selon les prot ines. D'autres prot ines nucl aires contiennent des signaux diff rents, dont certains ne sont pas encore caract ris s. Les signaux de localisation nucl aire peuvent tre situ s presque n'importe o dans la s quence d'acides amin s et on pense qu'ils forment des boucles ou des taches la surface de la prot ine. Beaucoup fonctionnent m me lorsqu'ils sont li s sous forme de peptides courts des cha nes lat rales de lysine la surface d'une prot ine cytosolique, ce qui sugg re que la localisation pr cise du signal dans la s quence d'acides amin s d'une prot ine nucl aire n'est pas importante. De plus, tant que l'une des sous-unit s prot iques d'un complexe multicomposant pr sente un signal de localisation nucl aire, l'ensemble du complexe sera import dans le noyau. Figure 12 7 L'enveloppe nucl aire. L'enveloppe double membrane est p n tr e par des pores dans lesquels sont positionn s des complexes de pores nucl aires (non illustr s). La membrane nucl aire externe est continue avec le r ticulum endoplasmique (re). Les ribosomes qui sont normalement li s la surface cytosolique du re membrane et membrane nucl aire externe ne sont pas repr sent es. La lame nucl aire est un r seau de prot ines fibreuses sous-jacent la membrane interne. On peut visualiser le transport des prot ines nucl aires travers les NPC en enrobant les particules d'or d'un signal de localisation nucl aire, en injectant les particules dans le cytosol, puis en suivant leur destin par microscopie lectronique (Figure 12 10). Les particules se lient aux fibrilles en forme de tentacules qui s' tendent des nucl oporines de l' chafaudage sur le bord du NPC dans le cytosol, puis passent par le centre du NPC. Vraisemblablement, les r gions non structur es des nucl oporines qui forment une barri re de diffusion pour les grosses mol cules (mentionn es pr c demment) sont repouss es pour permettre aux particules d'or enrob es de se faufiler. Le transport macromol culaire travers les NPC diff re fondamentalement du transport des prot ines travers les membranes d'autres organites, en ce qu'il se produit (B) 0,1 m membrane nucl aire interne enveloppe nucl aire membrane nucl aire externe 50 nm chafaudage nucl oporines membrane anneau prot ines canal nucl oporines canal r gion d sordonn e des nucl oporines de canal fbrils cytosoliques 0,1 m 0,1 m Figure 12 8 La disposition des CNP dans l'enveloppe nucl aire. (a) chez un npC vert br , les nucl oporines sont dispos es avec une sym trie de rotation octuple. de plus, des tudes au microscope immuno lectronique montrent que les prot ines qui composent la partie centrale du npC sont orient es sym triquement travers l'enveloppe nucl aire, de sorte que les c t s nucl aire et cytosolique semblent identiques. La sym trie rotationnelle octuple et la sym trie transversale double expliquent comment une structure aussi norme peut tre form e partir d'environ 30 prot ines diff rentes : de nombreuses nucl oporines sont pr sentes en 8, 16 ou 32 copies. Sur la base de leur localisation approximative dans la partie centrale du npC, les nucl oporines peuvent tre class es en (1) prot ines cycliques transmembranaires qui couvrent l'enveloppe nucl aire et ancrent le npC l'enveloppe ; (2) des nucl oporines d' chafaudage qui forment des structures en anneaux stratifi s. Certaines nucl oporines d' chafaudage sont des prot ines de flexion de la membrane qui stabilisent la courbure membranaire aigu o l'enveloppe nucl aire est p n tr e ; et (3) les nucl oporines de canal qui tapissent un pore central. En plus des domaines repli s qui ancrent les prot ines des endroits sp cifiques, de nombreuses nucl oporines de canal contiennent des r gions tendues non structur es, o les cha nes polypeptidiques sont intrins quement d sordonn es. Le pore central est rempli d'un maillage enchev tr de ces domaines d sordonn s qui bloque la diffusion passive de grandes macromol cules. Les r gions d sordonn es contiennent un grand nombre de r p titions de ph nylalanine-glycine (fG). les fibrilles d passent la fois du c t cytosolique et du c t nucl aire du npC. Contrairement la doubl
Biologie moléculaire de la cellule	e sym trie transversale du noyau npC, les fibrilles faisant face au cytosol et au noyau sont diff rentes : du c t nucl aire, les fibrilles convergent leur extr mit distale pour former une structure en forme de panier. L'arrangement pr cis des nucl oporines individuelles dans le npC assembl fait encore l'objet d'un d bat intense, car les analyses de r solution atomique ont t entrav es par la taille et la nature flexible du npC, ainsi que par les difficult s purifier des quantit s suffisantes de mat riau homog ne. une combinaison de microscopie lectronique, d'analyses computationnelles et de structures cristallines de sous-complexes de nucl oporine a t utilis e pour d velopper les mod les actuels de l'architecture npC. (B) une micrographie lectronique balayage de la face nucl aire de l'enveloppe nucl aire d'un ovocyte (voir aussi figure 9-52). (C) une micrographie lectronique montrant une vue lat rale de deux npC (supports) ; Notez que les membranes nucl aires interne et externe sont continues sur les bords du pore. (D) une micrographie lectronique montrant des vues de face de npC color s n gativement. La membrane a t limin e par extraction au d tergent. notez que certains des npC contiennent de la mati re en leur centre, que l'on pense tre des macromol cules pi g es en transit travers ces npC. (a, adapt de a. hoelz, e.w. Debler et G. Blobel, Annu. Rev. Biochem. 80:613-643, 2011. Avec l'autorisation des revues annuelles ; B, de m.W. Goldberg et T.D. Allen, J. Cell Biol. 119:1429-1440, 1992. Avec l'autorisation de The rockefeller University press ; C, avec l'aimable autorisation de Werner Franke et Ulrich Scheer ; D, avec l'aimable autorisation de ron milligan.) par un grand pore aqueux expansible, plut t que par un transporteur de prot ines couvrant une ou plusieurs bicouches lipidiques. Pour cette raison, les prot ines nucl aires enti rement repli es peuvent tre transport es dans le noyau par l'interm diaire d'un NPC, et les sous-unit s ribosomiques nouvellement form es sont transport es hors du noyau sous la forme d'une particule assembl e. En revanche, les prot ines doivent tre largement d pli es pour tre transport es dans la plupart des autres organites, comme nous le verrons plus loin. Les r cepteurs d'importation nucl aire se lient la fois aux signaux de localisation nucl aire et aux prot ines npC Pour initier l'importation nucl aire, la plupart des signaux de localisation nucl aire doivent tre reconnus par des r cepteurs d'importation nucl aire, parfois appel s importines, dont la plupart sont cod s par une famille de g nes apparent s. Chaque membre de la famille code pour une prot ine r ceptrice qui peut se lier et transporter le sous-ensemble de prot ines cargo contenant le signal de localisation nucl aire appropri (Figure 12 11A). Les r cepteurs d'importation nucl aire ne se lient pas toujours directement aux prot ines nucl aires. Des prot ines adaptatrices suppl mentaires peuvent former un pont entre les r cepteurs d'importation et les signaux de localisation nucl aire sur les prot ines transporter (Figure 12 11B). Certaines prot ines adaptatrices sont structurellement li es aux r cepteurs d'importation nucl aire, ce qui sugg re une origine volutive commune. En utilisant une vari t de r cepteurs et d'adaptateurs d'importation, les cellules sont capables de reconna tre le large r pertoire de signaux de localisation nucl aire qui sont affich s sur les prot ines nucl aires. Les r cepteurs d'importation sont des prot ines cytosoliques solubles qui se lient la fois au signal de localisation nucl aire sur la prot ine cargo et aux r p titions de ph nylalanine-glycine (FG) dans les domaines non structur s des nucl oporines du canal qui tapissent le pore central. Des r p titions FG sont galement trouv es dans les fibrilles cytoplasmiques et nucl aires. On pense que les r p titions FG dans l'enchev trement non structur du pore font double emploi. Ils interagissent faiblement, ce qui donne la prot ine des propri t s g latineuses qui imposent une barri re de perm abilit aux grandes macromol cules, et ils servent de sites d'amarrage pour les r cepteurs d'importation nucl aire. Des r p titions FG tracent le chemin travers les NPC emprunt s par les r cepteurs d'importation et leurs prot ines cargo li es. Selon un mod le de transport nucl aire, les complexes r cepteur-cargaison se d placent le long de la voie de transport en se liant, se dissociant, puis se liant nouveau des s quences de r p tition FG adjacentes. De cette fa on, les complexes peuvent sauter d'une nucl oporine une autre pour traverser l'int rieur enchev tr du PNJ dans une marche al atoire. Comme les r cepteurs d'importation se lient aux r p titions FG au cours de ce voyage, ils perturberaient l'interaction entre les r p titions et dissoudraient localement la phase gel de l'enchev trement de prot ines qui remplit le pore, permettant le passage du complexe r cepteur-cargaison. Une fois l'int rie
Biologie moléculaire de la cellule	ur du noyau, les r cepteurs d'importation se dissocient de leur cargaison et retournent dans le cytosol. Comme nous le verrons, cette dissociation ne se produit que du c t nucl aire de la NPC et conf re ainsi une directionnalit au processus d'importation. L'exportation nucl aire fonctionne comme l'importation nucl aire, mais l'envers L'exportation nucl aire de grosses mol cules, telles que de nouvelles sous-unit s ribosomiques et des mol cules d'ARN, se fait par le biais de NPC et d pend galement d'un transport s lectif Figure 12 9 La fonction d'un signal de localisation nucl aire. micrographies d'immunofluorescence montrant l'emplacement cellulaire de l'antig ne T du virus sV40 contenant ou manquant une courte s quence qui sert de signal de localisation nucl aire. (a) La prot ine normale de l'antig ne T contient la s quence riche en lysine indiqu e et est import e son site d'action dans le noyau, comme indiqu par la coloration par immunofluorescence avec des anticorps contre l'antig ne T. L'antig ne T avec un signal de localisation nucl aire alt r (une thr onine rempla ant une lysine) reste dans le cytosol. ( partir de D. Kalderon, B. roberts, W. richardson et A. smith, Cell 39:499-509, 1984. Avec l'autorisation d'elsevier.) Figure 12 10 Visualisation de l'importation active via les PNJ. Cette s rie de micrographies lectroniques montre des sph res d'or collo dal (pointes de fl ches) recouvertes de peptides contenant des signaux de localisation nucl aire p n trant dans le noyau par le biais de npC. Les particules d'or ont t inject es dans le cytosol de cellules vivantes, qui ont ensuite t fix es et pr par es pour la microscopie lectronique divers moments apr s l'injection. (a) Les particules d'or sont d'abord observ es proximit des fibrilles cytosoliques des npC. (B, C) On les voit alors au centre des npC, exclusivement sur la face cytosolique. (D) Ils apparaissent ensuite sur le visage nucl aire. Ces particules d'or ont des diam tres beaucoup plus grands que les canaux de diffusion dans le npC et sont import es par transport actif. (extrait de n. pant et U. aebi, Science 273:1729-1732, 1996. Avec l'autorisation de l'aaas.) syst me. Le syst me de transport s'appuie sur des signaux d'exportation nucl aire sur les macromol cules exporter, ainsi que sur des r cepteurs d'exportation nucl aire compl mentaires, ou exportines. Ces r cepteurs se lient la fois au signal d'exportation et aux prot ines NPC pour guider leur cargaison travers le NPC jusqu'au cytosol. De nombreux r cepteurs d'exportation nucl aire sont structurellement li s aux r cepteurs d'importation nucl aire, et ils sont cod s par la m me famille de g nes de r cepteurs de transport nucl aire, ou karyoph rines. Chez la levure, il y a 14 g nes codant pour les caryoph rines ; Dans les cellules animales, le nombre est nettement plus important. Il est souvent impossible de dire, partir de leur seule s quence d'acides amin s, si un membre particulier de la famille fonctionne comme un r cepteur d'importation ou d'exportation nucl aire. Comme on pouvait s'y attendre, les syst mes de transport d'importation et d'exportation fonctionnent de mani re similaire, mais dans des directions oppos es : les r cepteurs d'importation lient leurs mol cules de cargaison dans le cytosol, les lib rent dans le noyau, puis sont export s vers le cytosol pour tre r utilis s, tandis que les r cepteurs d'exportation fonctionnent de mani re oppos e. La GTpase ex cut e impose une Directionnalit au Transport par npC L'importation de prot ines nucl aires par le biais de NPC concentre des prot ines sp cifiques dans le noyau et augmente ainsi l'ordre dans la cellule. La pile alimente ce processus d'ordonnancement en exploitant l' nergie stock e dans les gradients de concentration de la forme li e au GTP de la GTPase monom re Ran, qui est n cessaire la fois pour l'importation et l'exportation nucl aires. Comme d'autres GTPases, Ran est un commutateur mol culaire qui peut exister dans deux tats conformationnels, selon que le GDP ou le GTP est li (discut au chapitre 3). Deux prot ines r gulatrices sp cifiques de Ran d clenchent la conversion entre les deux tats : une prot ine cytosolique activatrice de la GTPase (GAP) d clenche l'hydrolyse du GTP et convertit ainsi Ran-GTP en Ran-GDP, et un facteur d' change de guanine nucl aire (GEF) favorise l' change de GDP pour GTP et convertit ainsi Ran-GDP en Ran-GTP. Parce que Ran-GAP est situ dans le cytosol et que Ran-GEF est situ dans le noyau o il est ancr la chromatine, le cytosol contient principalement du Ran-GDP, et le noyau contient principalement du Ran-GTP (Figure 12-12). Figure 12 11 R cepteurs d'importation nucl aire (importines). (a) Diff rents r cepteurs d'importation nucl aire lient diff rents signaux de localisation nucl aire et donc diff rentes prot ines de cargaison. (B) La prot ine cargo 4 n cessite une prot ine adaptatrice pour se lier son r cepteur d'importation nucl air
Biologie moléculaire de la cellule	e. Les adaptateurs sont structurellement li s aux r cepteurs d'importation nucl aire et reconnaissent les signaux de localisation nucl aire sur les prot ines cargo. Ils contiennent galement un signal de localisation nucl aire qui les lie un r cepteur d'importation, mais ce signal n'est expos que lorsqu'ils sont charg s d'une prot ine cargo. Figure 12 12 La compartimentation du Ran-GDP et du Ran-GTP. la localisation de ran-GDp dans le cytosol et de ran-GTp dans le noyau r sulte de la localisation de deux prot ines r gulatrices de RAN : la prot ine activatrice de la GTpase ran (ran-Gap) est situ e dans le cytosol, et le facteur d' change de nucl otides de guanine r volue (ran-Gef) se lie la chromatine et est donc situ dans le noyau. ran-GDp est import dans le noyau par son propre r cepteur d'importation, qui est sp cifique de la conformation li e GDp de ran. Le r cepteur ran-GDp n'est structurellement pas li la famille principale des r cepteurs de transport nucl aire. cependant, il se lie galement aux r p titions fG dans les nucl oporines du canal npC. 654 Chapitre 12 : Compartiments intracellulaires et tri des prot ines Ce gradient des deux formes conformationnelles de Ran entra ne le transport nucl aire dans la direction appropri e. L'amarrage des r cepteurs d'importation nucl aire aux r p titions FG du c t cytosolique du NPC, par exemple, se produit, que ces r cepteurs soient ou non charg s avec une cargaison appropri e. Importez les r cepteurs, facilit par la liaison r p t e FG-, puis entrez dans le canal. S'ils atteignent le c t nucl aire du complexe de pores, Ran-GTP se lie eux et, si les r cepteurs arrivent charg s de mol cules de chargement, la liaison de Ran-GTP provoque la pour lib rer leur cargaison (figures 12-13A). tant donn que le Ran-GDP dans le cytosol ne se lie pas aux r cepteurs d'importation (ou d'exportation), la d charge ne se produit que du c t nucl aire du NPC. De cette fa on, la localisation nucl aire de Ran-GTP cr e la directionnalit du processus d'importation. Apr s avoir d charg sa cargaison dans le noyau, le r cepteur d'importation vide li Ran-GTP est ramen travers le complexe de pores jusqu'au cytosol. L , Ran-GAP d clenche Ran-GTP pour hydrolyser son GTP li , le convertissant ainsi en Ran-GDP, qui se dissocie du r cepteur. Le r cepteur est alors pr t pour un autre cycle d'importation nucl aire. L'exportation nucl aire se produit par un m canisme similaire, sauf que Ran-GTP dans le noyau favorise la liaison de la cargaison au r cepteur d'exportation, plut t que de favoriser la dissociation de la cargaison. Une fois que le r cepteur d'exportation se d place travers le pore jusqu'au cytosol, il rencontre Ran-GAP, qui induit le r cepteur hydrolyser son GTP en GDP. En cons quence, le r cepteur d'exportation lib re la fois sa cargaison et son Ran-GDP dans le cytosol. Les r cepteurs d'exportation libres sont ensuite renvoy s dans le noyau pour terminer le cycle (Figure 12-13B). Le transport par npC peut tre r gul en contr lant l'acc s aux machines de transport Certaines prot ines contiennent la fois des signaux de localisation nucl aire et des signaux d'exportation nucl aire. Ces prot ines font continuellement la navette entre le noyau et le cytosol. Les taux relatifs de leurs importations et exportations d terminent la localisation l' tat d' quilibre de ces prot ines navettes : si le taux d'importation d passe le taux d'exportation, une prot ine sera situ e principalement dans le noyau ; l'inverse, si le taux d'exportation d passe le taux d'importation, une prot ine sera localis e principalement dans le cytosol. Ainsi, changer le taux d'importation, d'exportation ou les deux peut changer l'emplacement d'une prot ine. Figure 12 13 Comment l'hydrolyse du GTP par Ran dans le cytosol fournit une directionnalit au transport nucl aire. le mouvement travers le npC des r cepteurs de transport nucl aire charg s se produit le long des r p titions fG affich es par certaines prot ines npC. La localisation diff rentielle de ran-GTp dans le noyau et de ran-GDp dans le cytosol fournit une directionnalit (fl ches rouges) la fois l'importation nucl aire (a) et l'exportation nucl aire (B). ran-Gap stimule l'hydrolyse de GTp pour produire ran-GDp du c t cytosolique du npC (voir figure 12-12). Certaines prot ines navettes entrent et sortent continuellement du noyau. Dans d'autres cas, cependant, le transport est strictement contr l . Comme nous l'avons vu au chapitre 7, les cellules contr lent l'activit de certains r gulateurs de transcription en les gardant hors du noyau jusqu' ce qu'ils y soient n cessaires (Figure 12-14). Dans de nombreux cas, les cellules contr lent le transport en r gulant la localisation nucl aire et les signaux d'exportation, en les activant ou en les d sactivant, souvent par phosphorylation d'acides amin s proximit des s quences de signaux (Figure 12 15). D'autres r gulateurs de transcription sont li s des
Biologie moléculaire de la cellule	prot ines cytosoliques inhibitrices qui les ancrent dans le cytosol (par des interactions avec le cytosquelette ou des organites sp cifiques) ou masquent leurs signaux de localisation nucl aire afin qu'ils ne puissent pas interagir avec les r cepteurs d'importation nucl aire. Un stimulus appropri lib re la prot ine r gulatrice du g ne de son ancre cytosolique ou masque, et elle est ensuite transport e dans le noyau. Un exemple important est la prot ine r gulatrice du g ne latent qui contr le l'expression des prot ines impliqu es dans le m tabolisme du cholest rol. La prot ine est fabriqu e et stock e sous une forme inactive sous forme de prot ine transmembranaire dans le RE. Lorsqu'une cellule est priv e de cholest rol, la prot ine est transport e du RE l'appareil de Golgi o elle rencontre des prot ases sp cifiques qui coupent le domaine cytosolique, le lib rant dans le cytosol. Ce domaine est ensuite import dans le noyau, o il active la transcription des g nes n cessaires l'absorption et la synth se du cholest rol (Figure 12 16). Comme nous le verrons en d tail au chapitre 6, les cellules contr lent l'exportation des ARN du noyau de la m me mani re. Les ARNsn, les miARN et les ARNt se lient la m me famille de r cepteurs d'exportation nucl aire que nous venons de voir, et ils utilisent le m me gradient Ran-GTP pour alimenter le processus de transport. En revanche, l'exportation des ARNm hors du noyau utilise un m canisme diff rent. Les ARNm sont export s sous forme de grands assemblages, qui peuvent atteindre 100 millions de daltons (voir Figure 6-37) et peut contenir des centaines de prot ines de quelques dizaines de types diff rents. Ces complexes ribonucl oprot iques d'ARNm (ARNm) s'amarrent d'abord du c t nucl aire de la NPC, o ils sont largement remodel s. Bien que Ran-GTP soit indirectement impliqu dans l'exportation (parce qu'il importe les prot ines qui se lient aux mol cules d'ARNm), on pense que la translocation travers le NPC est entra n e par l'hydrolyse de l'ATP. On ne sait pas comment la directionnalit des exportations est assur e. Il est probable que les nombreuses prot ines accessoires attach es aux fibrilles nucl aires et cytoplasmiques de la NPC jouent un r le important dans le remodelage des mRNP lorsqu'ils traversent les pores, en particulier l' limination des prot ines nucl aires lorsque les mRNP sortent du c t cytosolique de la NPC, garantissant ainsi que le transport est unidirectionnel. Lors de leur entr e dans le cytosol, ces ARNm nucl aires Figure 12 14 Le contr le du transport nucl aire chez l'embryon pr coce de drosophile. L'embryon ce stade est un syncytium, repr sent ici en coupe efficace, avec de nombreux noyaux dans un cytoplasme commun, dispos s autour de la p riph rie, juste sous la membrane plasmique. La prot ine r gulatrice de la transcription Dorsale est produite uniform ment dans tout le cytoplasme p riph rique, mais elle ne peut agir que lorsqu'elle est l'int rieur des noyaux. La prot ine dorsale a t color e avec un anticorps coupl une enzyme qui donne un produit brun, r v lant que la prot ine dorsale est exclue des noyaux de la face dorsale (en haut) de l'embryon, mais qu'elle est concentr e dans les noyaux vers la face ventrale (en bas) de l'embryon. Le trafic r gul de la dorsale dans les noyaux contr le le d veloppement diff rentiel entre le dos et le ventre de l'animal. (Avec l'aimable autorisation de siegfried roth.) Figure 12 15 Le contr le de l'importation nucl aire lors de l'activation des lymphocytes T. Le facteur nucl aire des lymphocytes T activ s (nf-aT) est une prot ine r gulatrice de la transcription qui, dans les lymphocytes T au repos, se trouve dans le cytosol l' tat phosphoryl . Lorsque les lymphocytes T sont activ s par un antig ne tranger (discut au chapitre 24), la concentration intracellulaire de Ca2+ augmente. en cas de Ca2+ lev , la prot ine phosphatase calcineurine se lie nf-aT et le d phosphoryle. La d phosphorylation expose les signaux d'importation nucl aire et bloque un signal d'exportation nucl aire. Le complexe nf-aT et calcineurine est donc import dans le noyau, o nf-aT active la transcription de nombreux g nes n cessaires l'activation des lymphocytes T. La r ponse s'arr te lorsque les niveaux de Ca2+ diminuent, lib rant nf-aT de la calcineurine. la rephosphorylation de nf-aT inactive les signaux d'importation nucl aire et r expose le signal d'exportation nucl aire, provoquant le d placement de nf-aT vers le cytosol. certains des m dicaments immunosuppresseurs les plus puissants, notamment la cyclosporine A et le fK506, inhibent la capacit de la calcineurine d phosphoryler nf-aT et bloquent ainsi l'accumulation nucl aire de nf-aT et l'activation des lymphocytes T (vid o 12.1). Pendant la mitose, l'enveloppe nucl aire se d sassemble La lame nucl aire, situ e du c t nucl aire de la membrane nucl aire interne, est un r seau de sous-unit s prot iques interconnect es appel es lamines nucl ai
Biologie moléculaire de la cellule	res. Les lamines sont une classe sp ciale de prot ines de filaments interm diaires (discut e au chapitre 16) qui polym risent en un r seau bidimensionnel (Figure 12-17). La lame nucl aire donne forme et stabilit l'enveloppe nucl aire, laquelle elle est ancr e par fixation la fois aux NPC et aux prot ines transmembranaires de la membrane nucl aire interne. La lame interagit galement directement avec la chromatine, qui elle-m me interagit avec les prot ines transmembranaires de la membrane nucl aire interne. Avec la lame, ces prot ines de la membrane interne fournissent des liens structurels entre l'ADN et l'enveloppe nucl aire. Lorsqu'un noyau est d mantel pendant la mitose, les NPC et la lame nucl aire se d sassemblent et l'enveloppe nucl aire se fragmente. Le processus de d mant lement est au moins en partie une cons quence de la phosphorylation directe des nucl oporines et des lamines par la prot ine kinase d pendante des cyclines (Cdk) qui est activ e au d but de la mitose (voir le chapitre 17). Au cours de ce processus, certaines prot ines NPC se lient des r cepteurs d'importation nucl aire, qui jouent un r le important dans le r assemblage des NPC la fin de la mitose. Les prot ines membranaires de l'enveloppe nucl aire, qui ne sont plus attach es aux complexes de pores, la lame ou la chromatine, se dispersent dans toute la membrane du RE. La prot ine motrice dyn ine, qui se d place le long des microtubules (discut e au chapitre 16), participe activement l'arrachement de l'enveloppe nucl aire de la chromatine. Ensemble, ces Les processus brisent les barri res qui s parent normalement le noyau et le cytosol, et les prot ines nucl aires qui ne sont pas li es aux membranes ou aux chromosomes se m langent compl tement avec les prot ines du cytosol (Figure 12 18). Plus tard, lors de la mitose, l'enveloppe nucl aire se r assemble la surface des chromosomes filles. En plus de son r le crucial dans le transport nucl aire, la GTPase Ran agit galement comme un marqueur de position de la chromatine pendant la division cellulaire, lorsque les composants nucl aires et cytosoliques se m langent. Parce que Ran-GEF reste li la chromatine lorsque l'enveloppe nucl aire se d compose, les mol cules Ran proches de la chromatine sont principalement dans leur conformation li e au GTP. En revanche, les mol cules Ran plus loign es ont une forte probabilit de rencontrer Ran-GAP, qui est distribu dans tout le cytosol ; ces mol cules Ran sont principalement dans leur conformation li e au GDP. En cons quence, les chromosomes des cellules mitotiques sont entour s d'un nuage de Ran-GTP. Ran-GTP lib re les prot ines NPC proximit des chromosomes des r cepteurs d'importation nucl aire. Les prot ines NPC libres se fixent Figure 12 16 R gulation par r troaction de la biosynth se du cholest rol. sreBp (Sterol Response Element Binding Protein), un r gulateur de transcription latent qui contr le l'expression des enzymes biosynth tiques du cholest rol, est initialement synth tis sous forme de prot ine membranaire du RE. il est ancr dans le RE s'il y a suffisamment de cholest rol dans la membrane par interaction avec une autre prot ine membranaire du RE, appel e sCap (sreBp cleavage activation protein), qui lie le cholest rol. si le site de liaison du cholest rol sur sCap est vide ( de faibles concentrations de cholest rol), sCap change de conformation et est emball avec sreBp dans des v sicules de transport, qui livrent leur cargaison l'appareil de Golgi, o deux prot ases r sidentes de Golgi clivent sreBp pour lib rer son domaine cytosolique de la membrane. Le domaine cytosolique se d place ensuite dans le noyau, o il se lie aux promoteurs des g nes qui codent pour les prot ines impliqu es dans la biosynth se du cholest rol et active leur transcription. De cette fa on, plus de cholest rol est produit lorsque sa concentration tombe en dessous d'un seuil. Figure 12 17 La lame nucl aire. une micrographie lectronique d'une partie de la lame nucl aire d'un ovocyte de x nope pr par e par lyophilisation et ombrage m tallique. La lame est form e par un r seau r gulier de filaments interm diaires sp cialis s. Les lamines ne sont pr sentes que dans les cellules m tazoaires. D'autres prot ines, encore inconnues, peuvent remplir des fonctions similaires chez des esp ces d pourvues de lamines. (Avec l'aimable autorisation d'Ueli aebi.) complexe membrane nucl aire interne membrane nucl aire externe enveloppe nucl aire PHOSPHORYLATION DES LAMINES ET DES PROT INES NPC D PHOSPHORYLATION DES LAMINES FUSION DES CHROMOSOMES ENVELOPP S FUSION DES FRAGMENTS DE L'ENVELOPPE NUCL AIRE Fragment de l'enveloppe nucl aire chromosome dupliqu Chromosome fille Lamles phosphoryl es NOYAU INTERPHASE T LOPHASE PR COCE PROPHASE T LOPHASE TARDIVE Prot ines complexes des pores nucl aires P P P Figure 12 18 La rupture et la reformation de l'enveloppe nucl aire et de la lame pendant la mitose. La phosphorylation des lamelles d clenche l
Biologie moléculaire de la cellule	e d sassemblage la surface des chromosomes, o elles s'assemblent en de nouveaux NPC. Dans le m me temps, les prot ines de la membrane nucl aire interne et les lamines d phosphoryl es se lient nouveau la chromatine. Les membranes du RE s'enroulent autour de groupes de chromosomes jusqu' ce qu'ils forment une enveloppe nucl aire scell e (Vid o 12.2). Au cours de ce processus, les NPC commencent r importer activement des prot ines qui contiennent des signaux de localisation nucl aire. Parce que l'enveloppe nucl aire est initialement troitement appliqu e la surface des chromosomes, le noyau nouvellement form exclut toutes les prot ines, l'exception de celles initialement li es aux chromosomes mitotiques et de celles qui sont import es s lectivement par les NPC. De cette fa on, toutes les autres grandes prot ines, y compris les ribosomes, sont tenues l' cart du noyau nouvellement assembl . Comme nous le verrons au chapitre 17, le nuage de Ran-GTP entourant la chromatine est galement important dans l'assemblage du fuseau mitotique dans une cellule en division. L'enveloppe nucl aire se compose d'une membrane nucl aire interne et d'une membrane nucl aire externe qui sont continues l'une avec l'autre et avec la membrane RE, et l'espace entre la membrane nucl aire interne et externe est continu avec la lumi re du RE. Les mol cules d'ARN, qui sont fabriqu es dans le noyau, et les sous-unit s ribosomiques, qui y sont assembl es, sont export es vers le cytosol ; En revanche, toutes les prot ines qui fonctionnent dans le noyau sont synth tis es dans le cytosol et sont ensuite import es. L'important trafic de mat riaux entre le noyau et le cytosol se produisent travers des complexes de pores nucl aires (NPC), qui fournissent un passage direct travers l'enveloppe nucl aire. Les petites mol cules diffusent passivement travers les NPC, mais les grandes macromol cules doivent tre activement transport es. Les prot ines contenant des signaux de localisation nucl aire sont activement transport es dans le noyau par l'interm diaire de NPC, tandis que les prot ines contenant des signaux d'exportation nucl aire sont transport es hors du noyau vers le cytosol. Certaines prot ines, dont le nucl aire de la lame nucl aire, qui initie la rupture de l'enveloppe nucl aire. La d phosphorylation des lamines inverse le processus. Un cycle analogue de phosphorylation et de d phosphorylation se produit pour certaines nucl oporines et prot ines de la membrane nucl aire interne, et certaines de ces d phosphorylations sont galement impliqu es dans le processus de r assemblage. Comme indiqu , l'enveloppe nucl aire se reforme initialement autour des chromosomes filles individuels en d condensation. Finalement, au fur et mesure que la d condensation progresse, ces structures fusionnent pour former un seul noyau complet. La d gradation mitotique de l'enveloppe nucl aire se produit dans toutes les cellules m tazoaires. Cependant, chez de nombreuses autres esp ces, telles que les levures, l'enveloppe nucl aire reste intacte pendant la mitose et le noyau se divise par fission. r cepteurs d'importation et d'exportation, navette continue entre le cytosol et le noyau. La GTPase monom re Ran fournit la fois l' nergie libre et la directionnalit pour le transport nucl aire. Les cellules r gulent le transport des prot ines nucl aires et des mol cules d'ARN travers les NPC en contr lant l'acc s de ces mol cules la machinerie de transport. L'ARN messager et l'ARN ribosomique nouvellement transcrits sont export s du noyau sous forme de grands complexes ribonucl oprot iques. Parce que les signaux de localisation nucl aire ne sont pas supprim s, les prot ines nucl aires peuvent tre import es plusieurs reprises, comme cela est n cessaire chaque fois que le noyau se r assemble apr s la mitose. Le transfert de proTeines inTo miToChonDria et ChloroplasTs Les mitochondries et les chloroplastes (une forme sp cialis e de plastes dans les algues vertes et les cellules v g tales) sont des organites double membrane. Ils se sp cialisent dans la synth se de l'ATP, en utilisant l' nergie d riv e du transport d' lectrons et de la phosphorylation oxydative dans les mitochondries et de la photosynth se dans les chloroplastes (voir le chapitre 14). Bien que les deux organites contiennent leur propre ADN, des ribosomes et d'autres composants n cessaires la synth se des prot ines, la plupart de leurs prot ines sont cod es dans le noyau cellulaire et import es du cytosol. Chaque prot ine import e doit atteindre le sous-compartiment particulier de l'organite dans lequel elle fonctionne. Il existe diff rents sous-compartiments dans les mitochondries (Figure 12-19A) : l'espace matriciel interne et l'espace intermembranaire, qui est continu avec l'espace des cr tes. Ces compartiments sont form s par les deux membranes mitochondriales concentriques : la membrane interne, qui entoure l'espace matriciel et forme des invaginations tendues ap
Biologie moléculaire de la cellule	pel es cr tes, et la membrane externe, qui est en contact avec le cytosol. Les complexes prot iques fournissent des limites aux jonctions o les cr tes invaginent et divisent la membrane interne en deux domaines : un domaine de la membrane interne entoure l'espace des cr tes et l'autre domaine jouxte la membrane externe. Les chloroplastes ont galement une membrane externe et une membrane interne, qui entourent un espace intermembranaire, et le stroma, qui est l' quivalent chloroplaste de l'espace de la matrice mitochondriale (Figure 12-19B). Ils ont un sous-compartiment suppl mentaire, l'espace thylako de, qui est entour par la membrane thylako de. La membrane thylako de d rive de la membrane interne pendant le d veloppement du plaste et est pinc e pour devenir discontinue avec elle. Chacun des sous-compartiments des mitochondries et des chloroplastes contient un ensemble distinct de prot ines. De nouvelles mitochondries et de nouveaux chloroplastes sont produits par la croissance d'organites pr existants, suivie de la fission (discut e au chapitre 14). La croissance d pend principalement de l'importation de prot ines du cytosol. Les prot ines import es doivent tre transport es successivement travers un certain nombre de membranes et se retrouver l'endroit appropri . Le processus de mouvement des prot ines travers les membranes est appel translocation des prot ines. Cette section explique comment cela se produit. Figure 12 19 Les sous-compartiments des mitochondries et des chloroplastes. contrairement aux cr tes des mitochondries (A), les thylako des des chloroplastes (B) ne sont pas reli s la membrane interne et forment donc un compartiment scell avec un espace interne s par . Les prot ines import es dans les mitochondries sont g n ralement absorb es du cytosol dans les secondes ou les minutes qui suivent leur lib ration par les ribosomes. Ainsi, contrairement la translocation des prot ines dans le RE, qui a souvent lieu en m me temps que la traduction par un ribosome arrim sur la membrane rugueuse du RE (d crite plus loin), les prot ines mitochondriales sont d'abord enti rement synth tis es en tant que prot ines pr curseurs mitochondriales dans le cytosol, puis transloqu es dans les mitochondries par un m canisme post-traductionnel. Une ou plusieurs s quences de signaux dirigent toutes les prot ines pr curseurs mitochondriales vers leur sous-compartiment mitochondrial appropri . De nombreuses prot ines entrant dans l'espace matriciel contiennent une s quence de signal leur N-extr mit qu'une peptidase signal supprime rapidement apr s l'importation. D'autres prot ines import es, y compris toutes les prot ines de la membrane externe et de nombreuses prot ines de la membrane interne et de l'espace intermembranaire, ont des s quences de signal internes qui ne sont pas limin es. Les s quences de signaux sont la fois n cessaires et suffisantes pour l'importation et la localisation correcte des prot ines : lorsque des techniques de g nie g n tique sont utilis es pour relier ces signaux une prot ine cytosolique, les signaux dirigent la prot ine vers le sous-compartiment mitochondrial correct. Les s quences de signal qui dirigent les prot ines pr curseurs dans l'espace de la matrice mitochondriale sont les mieux comprises. Ils forment tous une h lice amphiphile, dans laquelle les r sidus charg s positivement se regroupent d'un c t de l'h lice, tandis que les r sidus hydrophobes non charg s se regroupent du c t oppos . Des prot ines r ceptrices sp cifiques qui initient la translocation des prot ines reconnaissent cette configuration plut t que la s quence pr cise d'acides amin s de la s quence signal (Figure 12 20). Des complexes prot iques multisous-unitaires qui fonctionnent comme des translocateurs de prot ines m dient le mouvement des prot ines travers les membranes mitochondriales. Le complexe TOM transf re des prot ines travers la membrane externe, et deux complexes TIM (TIM23 et TIM22) transf rent des prot ines travers la membrane interne (Figure 12 21). Ces complexes contiennent des composants qui agissent comme des r cepteurs pour les prot ines pr curseurs mitochondriales, et d'autres composants qui forment les canaux de translocation. Le complexe TOM est n cessaire l'importation de toutes les prot ines mitochondriales cod es par noyau. Il transporte initialement leurs s quences de signaux dans l'espace intermembranaire et aide ins rer des prot ines transmembranaires dans la membrane externe. Les prot ines -baril, qui sont particuli rement abondantes dans la membrane externe, sont ensuite transmises un translocateur suppl mentaire, le complexe SAM, qui les aide se replier correctement dans la membrane externe. Le complexe TIM23 transporte certaines prot ines solubles dans l'espace matriciel et aide ins rer des prot ines transmembranaires dans la membrane interne. Le complexe TIM22 m die l'insertion d'une sous-classe de prot ines membranaires internes, y c
Biologie moléculaire de la cellule	ompris le transporteur qui d place l'ADP, l'ATP et le phosphate dans et hors des mitochondries. Un autre translocateur prot ique dans la membrane mitochondriale interne, le complexe OXA, m die l'insertion de Figure 12 20 Une s quence de signal pour l'importation de prot ines mitochondriales. La cytochrome oxydase est un grand complexe multiprot ique situ dans la membrane mitochondriale interne, o elle fonctionne comme l'enzyme terminale dans la cha ne de transport d' lectrons (discut e au chapitre 14). (a) Les 18 premiers acides amin s du pr curseur de la sous-unit iV de cette enzyme servent de s quence de signal pour l'importation de la sous-unit dans la mitochondrie. (B) Lorsque la s quence de signal est repli e en h lice , les acides amin s charg s positivement (rouge) sont regroup s sur une face de l'h lice, tandis que les acides amin s non polaires (vert) sont regroup s principalement sur la face oppos e. Les acides amin s polaires non charg s sont ombr s en orange ; Les atomes d'azote sur les cha nes lat rales de arg et Gln sont color s en bleu. Les s quences de signal qui dirigent les prot ines dans l'espace matriciel ont toujours le potentiel de former une telle h lice amphiphile, qui est reconnue par des prot ines r ceptrices sp cifiques la surface mitochondriale. (C) La structure d'une s quence signal (de l'alcool d shydrog nase, une autre enzyme de la matrice mitochondriale), li e un r cepteur d'importation (gris), comme d termin par r sonance magn tique nucl aire. L'h lice amphiphile se lie avec sa face hydrophobe un sillon hydrophobe dans le r cepteur (code pDB : 1om2). 660 Chapitre 12 : Compartiments intracellulaires et tri des prot ines de la membrane interne qui sont synth tis es dans les mitochondries. Il aide galement ins rer certaines prot ines membranaires internes import es qui sont initialement transport es dans l'espace matriciel par les autres complexes. les prot ines pr curseurs mitochondriales sont import es sous forme de cha nes polypeptidiques d pli es Nous avons appris presque tout ce que nous savons sur le m canisme mol culaire de l'importation de prot ines dans les mitochondries partir d'analyses de syst mes de translocation reconstitu s et acellulaires, dans lesquels des mitochondries purifi es dans un tube essai importent des prot ines pr curseurs mitochondriales radiomarqu es. En modifiant les conditions dans le tube essai, il est possible d' tablir les exigences biochimiques pour l'importation. Les prot ines pr curseurs mitochondriales ne se replient pas dans leurs structures natives apr s avoir t synth tis es ; Au lieu de cela, ils restent d pli s dans le cytosol par le biais d'interactions avec d'autres prot ines. Certaines de ces prot ines en interaction sont des prot ines chaperonnes g n rales de la famille hsp70 (discut es au chapitre 6), tandis que d'autres sont d di es aux prot ines pr curseurs mitochondriales et se lient directement leurs s quences de signal. Toutes les prot ines en interaction aident emp cher les prot ines pr curseurs de s'agr ger ou de se replier spontan ment avant qu'elles ne s'engagent avec le complexe TOM dans la membrane mitochondriale externe. Comme premi re tape du processus d'importation, les r cepteurs d'importation du complexe TOM se lient la s quence de signal de la prot ine pr curseur mitochondriale. Les prot ines en interaction sont ensuite d nud es et la cha ne polypeptidique d pli e est introduite la s quence du signal en premier dans le canal de translocation. En principe, une prot ine pourrait atteindre l'espace de la matrice mitochondriale en traversant les deux membranes en m me temps ou en traversant une la fois. On peut distinguer ces possibilit s en refroidissant un syst me d'importation mitochondriale acellulaire pour arr ter les prot ines une tape interm diaire du processus de translocation. Le r sultat est que les prot ines arr t es ne contiennent plus leur s quence de signal N-terminale, ce qui indique que l'extr mit N-terminale doit se trouver dans l'espace matriciel o se trouve la peptidase signale, mais que la majeure partie de la prot ine peut toujours tre attaqu e de l'ext rieur des mitochondries par des enzymes prot olytiques ajout es de l'ext rieur. De toute vidence, les prot ines pr curseurs peuvent traverser les deux membranes mitochondriales la fois pour entrer dans l'espace matriciel (Figure 12-22). Le complexe TOM transporte d'abord la s quence de signaux travers la membrane externe vers l'espace intermembranaire, o il se lie un complexe TIM, ouvrant le canal dans le complexe. La cha ne polypeptidique est ensuite soit transloqu e dans l'espace de la matrice, soit ins r e dans la membrane interne. Figure 12 21 Les translocateurs de prot ines dans les membranes mitochondriales. Les complexes Tom, Tim, sam et oXa sont des assemblages de prot ines membranaires multim riques qui catalysent la translocation des prot ines travers les membranes mitochond
Biologie moléculaire de la cellule	riales. Les composants prot iques des complexes Tim22 et Tim23 qui bordent le canal d'importation sont structurellement li s, sugg rant une origine volutive commune des deux complexes Tim. du c t de la matrice, le complexe Tim23 est li un complexe prot ique multim rique contenant le hsp70 mitochondrial, qui agit comme une aTpase import e, en utilisant l'hydrolyse de l'aTp pour tirer les prot ines travers le pore. Dans les cellules animales, il existe de subtiles variations dans la composition des sous-unit s des complexes translocateurs pour adapter la machinerie d'importation mitochondriale aux besoins particuliers des types cellulaires sp cialis s. SAM = machines de tri et d'assemblage ; oXa = activit du cytochrome oXidase ; Tim = Translocateur de la membrane mitochondriale interne ; Tom = Translocateur de la membrane externe. mitochondrie. La s quence signal n-terminale de la prot ine pr curseur mitochondriale est reconnue par les r cepteurs du complexe Tom. La prot ine est ensuite transloqu e travers le complexe Tim23 de sorte qu'elle traverse transitoirement les deux membranes mitochondriales (Vid o 12.3). La s quence signal est cliv e par une peptidase signal dans l'espace matriciel pour former la prot ine mature. La s quence de signaux libres est alors rapidement d grad e (non illustr e). Bien que les complexes TOM et TIM travaillent g n ralement ensemble pour d placer les prot ines pr curseurs travers les deux membranes en m me temps, ils peuvent travailler ind pendamment. Dans les membranes externes isol es, par exemple, le complexe TOM peut transloquer la s quence de signal des prot ines pr curseurs travers la membrane. De m me, si la membrane externe est perturb e exp rimentalement dans des mitochondries isol es, le complexe TIM23 expos peut importer efficacement des prot ines pr curseurs dans l'espace matriciel. Hydrolyse aTp et potentiel membranaire Importation de prot ines Drive dans l'espace matriciel Le transport directionnel n cessite de l' nergie, qui, dans la plupart des syst mes biologiques, est fournie par l'hydrolyse de l'ATP. L'hydrolyse de l'ATP alimente l'importation de prot ines mitochondriales deux sites distincts, l'un l'ext rieur des mitochondries et l'autre dans l'espace matriciel. De plus, l'importation de prot ines n cessite une autre source d' nergie, qui est le potentiel membranaire travers la membrane mitochondriale interne (Figure 12 23). La premi re exigence d' nergie se produit au stade initial du processus de translocation, lorsque la prot ine pr curseur d pli e, associ e aux prot ines chaperonnes, interagit avec les r cepteurs d'importation du complexe TOM. Comme nous l'avons vu au chapitre 6, la liaison et la lib ration de polypeptides nouvellement synth tis s partir des prot ines chaperonnes n cessitent l'hydrolyse de l'ATP. Figure 12 23 Le r le de l' nergie dans l'importation de prot ines dans l'espace matriciel mitochondrial. (1) La chaperon cytosolique hsp70 li e est lib r e de la prot ine pr curseur dans une tape qui d pend de l'hydrolyse de l'aTp. apr s l'insertion initiale de la s quence de signal et des parties adjacentes de la cha ne polypeptidique dans le canal de translocation du complexe de Tom, la s quence de signal interagit avec un complexe de Tim. (2) La s quence du signal est ensuite transloqu e dans l'espace de la matrice dans un processus qui n cessite l' nergie du potentiel membranaire travers la membrane interne. (3) La mitochondriale hsp70, qui fait partie d'un complexe aTpase import , se lie aux r gions de la cha ne polypeptidique lorsqu'elles sont expos es dans l'espace matriciel, tirant la prot ine travers le canal de translocation, en utilisant l' nergie de l'hydrolyse aTp. 662 Chapitre 12 : Compartiments intracellulaires et tri des prot ines Une fois que la s quence de signal a travers le complexe TOM et est li e un complexe TIM, la translocation ult rieure travers le canal de translocation TIM n cessite le potentiel membranaire, qui est la composante lectrique du gradient lectrochimique H+ travers la membrane interne (voir Figure 11 4). Le pompage de H+ de l'espace matriciel vers l'espace intermembranaire, entra n par des processus de transport d' lectrons dans la membrane interne (discut s au chapitre 14), maintient le gradient lectrochimique. L' nergie du gradient lectrochimique H+ travers la membrane interne alimente donc non seulement la majeure partie de la synth se de l'ATP de la cellule, mais elle entra ne galement la translocation des s quences de signaux charg s positivement travers les complexes TIM par lectrophor se. Le hsp70 mitochondrial joue galement un r le crucial dans le processus d'importation. Les mitochondries contenant des formes mutantes de la prot ine ne parviennent pas importer des prot ines pr curseurs. Le mitochondrial hsp70 fait partie d'un assemblage prot ique multi-sous-unitaire qui est li au c t matriciel du complexe TIM23 et agit comme un moteur pour
Biologie moléculaire de la cellule	attirer la prot ine pr curseur dans l'espace matriciel. Comme son cousin cytosolique, le hsp70 mitochondrial a une grande affinit pour les cha nes polypeptidiques d pli es, et il se lie troitement une cha ne prot ique import e d s que la cha ne merge du translocateur TIM dans l'espace matriciel. Le hsp70 subit alors un changement de conformation et lib re la cha ne prot ique dans une tape d pendante de l'ATP, exer ant une force de cliquet/traction sur la prot ine import e. Ce cycle nerg tique de liaison et de lib ration ult rieure fournit la force motrice finale n cessaire pour terminer l'importation de prot ines apr s qu'une prot ine a t initialement ins r e dans le complexe TIM23 (voir Figure 12-23). Apr s l'interaction initiale avec la mitochondriale hsp70, de nombreuses prot ines matricielles import es sont transmises une autre prot ine chaperonne, la mitochondriale hsp60. Comme nous l'avons vu au chapitre 6, hsp60 aide les personnes d pli es cha ne polypeptidique plier en la liant et en la lib rant par des cycles d'hydrolyse de l'ATP. Bact ries et mitochondries Utilisez des m canismes similaires pour ins rer des porines dans leur membrane externe La membrane mitochondriale externe, comme la membrane externe des bact ries Gram n gatif (voir Figure 11-17), contient d'abondantes prot ines -baril formant des pores appel es porines, et elle est donc librement perm able aux ions inorganiques et aux m tabolites (mais pas la plupart des prot ines). Contrairement d'autres prot ines de la membrane externe, qui sont ancr es dans la membrane par des r gions transmembranaires -h lico dales, le complexe TOM ne peut pas int grer de porines dans la bicouche lipidique. Au lieu de cela, les porines sont d'abord transport es d pli es dans l'espace intermembranaire, o elles se lient transitoirement des prot ines chaperonnes sp cialis es, qui emp chent les porines de s'agr ger (Figure 12-24A). Ils se lient ensuite au complexe SAM dans la membrane externe, qui les ins re dans la membrane externe et les aide se plier correctement. L'une des sous-unit s centrales du complexe SAM est homologue une prot ine de membrane externe bact rienne qui aide ins rer des prot ines -baril dans la prot ine externe bact rienne Figure 12 24 Int gration des porines dans les membranes mitochondriales et bact riennes externes. (a) apr s translocation travers le complexe Tom dans la membrane mitochondriale externe, les prot ines baril se lient des chaperons dans l'espace intermembranaire. Le complexe sam ins re ensuite la cha ne polypeptidique d pli e dans la membrane externe et aide la cha ne se plier. (B) un complexe Bam structurellement apparent dans la membrane externe des bact ries Gram n gatif catalyse l'insertion et le repliement de la prot ine -baril (voir figure 11-17). membrane de l'espace p riplasmique (l' quivalent de l'espace intermembranaire dans les mitochondries) (Figure 12 24B). Cette voie conserv e pour l'insertion de prot ines -tonneau souligne encore l'origine endosymbiotique des mitochondries. Le transport dans la membrane mitochondriale interne et l'espace intermembranaire se fait par plusieurs voies Le m me m canisme qui transporte les prot ines dans l'espace matriciel l'aide des translocateurs TOM et TIM23 (voir Figure 12-22) m die galement la translocation initiale de nombreuses prot ines destin es la membrane mitochondriale interne ou l'espace intermembranaire. Dans la voie de translocation la plus courante, seule la s quence de signal N-terminale de la prot ine transport e p n tre r ellement dans l'espace matriciel (Figure 12 25A). Une s quence d'acides amin s hydrophobes, strat giquement plac e apr s la s quence de signal N-terminale, agit comme une s quence d'arr t-transfert, emp chant la prot ase prot ine r duite intermembranaire la TRANSLOCATION TRANSVERSALEprot ine d'espace de clivage tre import e SH SH SH SH S RECONNAISSANCE ET OXYDATION PAR Mia40 R OXYDATION PAR LA CHA NE RESPIRATOIRE R DUCTION DE LA MEMBRANE EXTERNE DE Mia40, OXYDATION DU COMPLEXE PROTEINMia40 TOM Figure 12 25 Importation de prot ines du cytosol dans la membrane mitochondriale interne et l'espace intermembranaire. (a) La s quence de signaux n-terminal (rouge) initie l'importation dans l'espace matriciel (voir figure 12 22). une s quence hydrophobe (bleue) qui suit la s quence de signal de ciblage matriciel se lie au translocateur Tim23 (orange) dans la membrane interne et arr te la translocation. Le reste de la prot ine est ensuite aspir dans l'espace intermembranaire travers le translocateur Tom dans la membrane externe, et la s quence hydrophobe est lib r e dans la membrane interne en y ancrant la prot ine. (B) une deuxi me voie d'int gration des prot ines dans la membrane interne d livre d'abord la prot ine compl tement dans l'espace de la matrice. Le clivage de la s quence de signal (rouge) utilis e pour la translocation initiale d masque une s quence de signal hydroph
Biologie moléculaire de la cellule	obe adjacente (bleu) au niveau du nouvel extr mit n-terminale. Ce signal dirige ensuite la prot ine dans la membrane interne, en utilisant la m me voie d pendante d'oXa qui ins re des prot ines cod es par le g nome mitochondrial et traduites dans l'espace matriciel. (C) certaines prot ines solubles de l'espace intermembranaire utilisent galement les voies indiqu es en (a) et (B) avant d' tre lib r es dans l'espace intermembranaire par un second signal peptidase, qui a son site actif dans l'espace intermembranaire et supprime la s quence de signal hydrophobe. (D) certaines prot ines solubles de l'espace intermembranaire sont oxyd es par la prot ine mia40 (mia = mitochondrial, assemblage de l'espace intermembranaire) lors de l'importation. mia40 forme un interm diaire covalent par le biais d'une liaison disulfure intermol culaire, qui aide tirer la prot ine transport e travers le complexe Tom. Le MIA40 est r duit au cours du processus, puis est r oxyd par la cha ne de transport d' lectrons, de sorte qu'il peut catalyser le prochain cycle d'importation. (e) les prot ines membranaires internes multipasses qui fonctionnent comme des transporteurs de m tabolites contiennent des s quences de signaux internes et serpentent travers le complexe de Tom comme une boucle. Ils se lient ensuite aux chaperons dans l'espace intermembranaire, qui guident les prot ines vers le complexe Tim22. Le complexe Tim22 est sp cialis dans l'insertion de prot ines membranaires internes multipasses. translocation suppl mentaire travers la membrane interne. Le reste de la prot ine traverse ensuite la membrane externe travers le complexe TOM dans l'espace intermembranaire ; la s quence de signal est cliv e dans la matrice, et la s quence hydrophobe, lib r e de TIM23, reste ancr e dans la membrane interne. Dans une autre voie de transport vers la membrane interne ou l'espace intermembranaire, le complexe TIM23 transf re initialement la prot ine enti re dans l'espace matriciel (Figure 12 25B). Une peptidase de signal matricielle supprime ensuite la s quence de signal N-terminale, exposant une s quence hydrophobe au niveau du nouvel extr mit N-terminale. Cette s quence de signaux guide la prot ine vers le complexe OXA, qui ins re la prot ine dans la membrane interne. Comme mentionn pr c demment, le complexe OXA est principalement utilis pour ins rer des prot ines qui sont cod es et traduites dans la mitochondrie dans la membrane interne, et seules quelques prot ines import es utilisent cette voie. Les translocateurs troitement li s au complexe OXA se trouvent dans la membrane plasmique des bact ries et dans la membrane thylako de des chloroplastes, o ils ins rent des prot ines membranaires par un m canisme similaire. De nombreuses prot ines qui utilisent ces voies vers la membrane interne y restent ancr es par leur s quence de signal hydrophobe (voir Figure 12 25A,B). D'autres, cependant, sont lib r s dans l'espace intermembranaire par une prot ase qui enl ve l'ancrage membranaire (Figure 12-25C). Beaucoup de ces prot ines cliv es restent attach es la surface externe de la membrane interne en tant que sous-unit s p riph riques de complexes prot iques qui contiennent galement des prot ines transmembranaires. Certaines prot ines de l'espace intermembranaire qui contiennent des motifs de cyst ine sont import es par une voie encore diff rente. Ces prot ines forment une liaison disulfure covalente transitoire avec la prot ine Mia40 (Figure 12 25D). Les prot ines import es sont ensuite lib r es sous une forme oxyd e contenant des liaisons disulfure intracha ne. Mia40 est r duit au cours du processus, puis est r oxyd en passant des lectrons la cha ne de transport d' lectrons dans la membrane mitochondriale interne. De cette fa on, l' nergie stock e dans le potentiel redox dans la cha ne de transport d' lectrons mitochondriales est exploit e pour stimuler l'importation de prot ines. Les mitochondries sont les principaux sites de synth se de l'ATP dans la cellule, mais elles contiennent galement de nombreuses enzymes m taboliques, telles que celles du cycle de l'acide citrique. Ainsi, en plus des prot ines, les mitochondries doivent galement transporter de petits m tabolites travers leurs membranes. Alors que la membrane externe contient des porines, qui rendent la membrane librement perm able de si petites mol cules, la membrane interne n'en contient pas. Au lieu de cela, une famille de transporteurs sp cifiques aux m tabolites transf re un grand nombre de petites mol cules travers la membrane interne. Dans les cellules de levure, ces transporteurs comprennent une famille de 35 prot ines diff rentes, dont les plus abondantes transportent l'ATP, l'ADP et le phosphate. Il s'agit de prot ines transmembranaires multipasses, qui n'ont pas de s quences de signal clivables leurs N-terminaisons, mais contiennent plut t des s quences de signaux internes. Ils traversent le complexe TOM dans la membrane externe, et des
Biologie moléculaire de la cellule	chaperons intermembranaires les guident vers le complexe TIM22, qui les ins re dans la membrane interne par un processus qui n cessite le potentiel membranaire, mais pas le hsp70 mitochondrial ou l'ATP (Figure 12 25E). Une r partition nerg tiquement favorable des r gions transmembranaires hydrophobes dans la membrane interne est susceptible de stimuler ce processus. Deux s quences de signal Diriger les prot ines vers la membrane thylako de dans les chloroplastes Le transport des prot ines dans les chloroplastes ressemble au transport dans les mitochondries. Les deux processus se produisent en post-traduction, utilisent des complexes de translocation distincts dans chaque membrane, n cessitent de l' nergie et utilisent des s quences de signaux N-terminaux amphiphiles qui sont limin es apr s utilisation. l'exception de certaines mol cules chaperonnes, cependant, les composants prot iques qui forment les complexes de translocation diff rent. De plus, alors que les mitochondries exploitent le gradient lectrochimique H+ travers leur membrane interne pour conduire le transport, les chloroplastes, qui ont un gradient lectrochimique H+ travers leur membrane thylako de mais pas leur membrane interne, utilisent l'hydrolyse du GTP et de l'ATP pour alimenter l'importation travers leur double membrane. Les similitudes fonctionnelles peuvent donc r sulter d'une volution convergente, refl tant les exigences communes de la translocation travers une double membrane. Bien que les s quences de signal pour l'importation dans les chloroplastes ressemblent superficiellement celles pour l'importation dans les mitochondries, les m mes cellules v g tales ont la fois des mitochondries et des chloroplastes, de sorte que les prot ines doivent se r partir de mani re appropri e entre les deux organites. Chez les plantes, par exemple, une enzyme bact rienne peut tre dirig e sp cifiquement vers les mitochondries si elle est associ e exp rimentalement une s quence de signal N-terminal d'une prot ine mitochondriale ; la m me enzyme associ e une s quence de signal N-terminale d'une prot ine chloroplastique se retrouve dans les chloroplastes. Ainsi, les r cepteurs d'importation de chaque organite distinguent les diff rentes s quences de signaux. Les chloroplastes ont un compartiment suppl mentaire entour d'une membrane, le thylako de. De nombreuses prot ines chloroplastiques, y compris les sous-unit s prot iques du syst me photosynth tique et de l'ATP synthase (discut es au chapitre 14), sont situ es dans la membrane thylako de. Comme les pr curseurs de certaines prot ines mitochondriales, les pr curseurs de ces prot ines sont transloqu s du cytosol leur destination finale en deux tapes. Tout d'abord, ils traversent la double membrane dans l'espace matriciel (appel stroma dans les chloroplastes), puis ils s'int grent dans la membrane thylako de ou se d placent dans l'espace thylako dien (Figure 12-26A). Les pr curseurs de ces prot ines ont une s quence de signal thylako de hydrophobe suivant la s quence de signal N-terminale du chloroplaste. Une fois que la s quence de signal N-terminale a t utilis e pour importer la prot ine dans le stroma, une peptidase de signal stromal l'enl ve, d masquant la s quence de signal thylako de qui initie le transport Figure 12 26 Translocation des prot ines pr curseurs du chloroplaste dans l'espace thylako de. (a) La prot ine pr curseur contient une s quence de signal chloroplastique n-terminale (en rouge), suivie imm diatement d'une s quence de signal thylako de (en marron). La s quence signal du chloroplaste initie la translocation dans le stroma par un m canisme similaire celui utilis pour la translocation des prot ines pr curseurs mitochondriales dans l'espace matriciel, bien que les complexes translocateurs, ToC et TiC, soient diff rents. La s quence de signal est ensuite cliv e, d masquant la s quence de signal thylako de, qui initie la translocation travers la membrane thylako de. (B) La translocation dans l'espace thylako de ou la membrane thylako de peut se produire par l'une des quatre voies suivantes : (1) une voie Sec, ainsi appel e parce qu'elle utilise des composants qui sont des homologues des prot ines sec, qui m dient la translocation des prot ines travers la membrane plasmique bact rienne (discut e plus loin) ; (2) une voie de type SRP, ainsi appel e parce qu'elle utilise un homologue chloroplaste de la particule de reconnaissance du signal, ou SRP (discut plus loin) ; (3) une voie TAT (twin arginine translocation), ainsi appel e parce que deux arginines sont essentielles dans les s quences de signal qui dirigent les prot ines vers cette voie, qui d pend du gradient h+ travers la membrane thylako de ; et (4) une voie d'insertion spontan e qui ne semble n cessiter aucun translocateur de prot ines. travers la membrane thylako de. Il existe au moins quatre voies par lesquelles les prot ines traversent ou s'int grent dans la membrane thylako de, q
Biologie moléculaire de la cellule	ui se distinguent par leur besoin de diff rents chaperons stromaux et sources d' nergie (Figure 12-26B). Bien que les mitochondries et les chloroplastes aient leurs propres syst mes g n tiques, ils ne produisent qu'une petite proportion de leurs propres prot ines. Au lieu de cela, les deux organites importent la plupart de leurs prot ines du cytosol, en utilisant des m canismes similaires. Dans les deux cas, les prot ines sont transport es l' tat d pli travers les membranes externe et interne simultan ment dans l'espace matriciel ou stroma. L'hydrolyse de l'ATP et un potentiel membranaire travers la membrane interne entra nent la translocation dans les mitochondries, tandis que l'hydrolyse de l'ATP et de l'ATP entra nent la translocation dans les chloroplastes. Les prot ines chaperonnes de la famille cytosolique hsp70 maintiennent les prot ines pr curseurs dans un tat d pli , et un deuxi me ensemble de prot ines hsp70 dans l'espace matriciel ou stroma tire la cha ne polypeptidique dans l'organite. Seules les prot ines qui contiennent une s quence de signal sp cifique sont transloqu es. La s quence de signaux peut soit tre situ e l'extr mit N-terminale et cliv e apr s l'importation, soit tre interne et conserv e. Le transport dans la membrane interne utilise parfois une deuxi me s quence de signal hydrophobe qui est d masqu e lorsque la premi re s quence de signal est retir e. Dans les chloroplastes, l'importation du stroma dans le thylako de peut se faire par plusieurs voies, distingu es par les chaperons et la source d' nergie utilis s. Les peroxysomes diff rent des mitochondries et des chloroplastes bien des gards. Plus particuli rement, ils ne sont entour s que d'une seule membrane et ne contiennent ni ADN ni ribosomes. Ainsi, parce que les peroxysomes n'ont pas de g nome, toutes leurs prot ines sont cod es dans le noyau. Les peroxysomes acqui rent la plupart de ces prot ines par importation s lective du cytosol, bien que certaines d'entre elles p n trent dans la membrane des peroxysomes par le RE. Comme nous ne discutons pas des peroxysomes ailleurs, nous ferons une digression pour examiner certaines des fonctions de cette famille diversifi e d'organites, avant de discuter de leur biosynth se. Pratiquement toutes les cellules eucaryotes ont des peroxysomes. Ils contiennent des enzymes oxydatives, telles que la catalase et l'urate oxydase, des concentrations si lev es que, dans certaines cellules, les peroxysomes se d marquent en micrographie lectronique en raison de la pr sence d'un noyau de prot ine cristallo de (Figure 12-27). Comme les mitochondries, les peroxysomes sont des sites majeurs d'utilisation de l'oxyg ne. Une hypoth se est que les peroxysomes sont un vestige d'un ancien organite qui effectuait tout le m tabolisme de l'oxyg ne chez les anc tres primitifs des cellules eucaryotes. Lorsque l'oxyg ne produit par les bact ries photosynth tiques s'est accumul pour la premi re fois dans l'atmosph re, il aurait t hautement toxique pour la plupart des cellules. Les peroxysomes pourraient avoir abaiss la concentration intracellulaire d'oxyg ne, tout en exploitant sa r activit chimique pour effectuer des r actions d'oxydation utiles. Selon ce point de vue, le d veloppement ult rieur des mitochondries a rendu les peroxysomes largement obsol tes parce que bon nombre des m mes r actions biochimiques qui avaient auparavant t effectu es dans les peroxysomes sans produire d' nergie taient maintenant coupl es la formation d'ATP au moyen de la phosphorylation oxydative. Les r actions d'oxydation op r es par les peroxysomes dans les cellules actuelles pourraient donc tre en partie celles dont les fonctions n'ont pas t reprises par les mitochondries. Peroxysomes Utilisez de l'oxyg ne mol culaire et du peroxyde d'hydrog ne pour effectuer des r actions d'oxydation Les peroxysomes sont ainsi nomm s parce qu'ils contiennent g n ralement une ou plusieurs enzymes qui utilisent l'oxyg ne mol culaire pour liminer les atomes d'hydrog ne de substrats organiques sp cifiques (d sign s ici par R) dans une r action d'oxydation qui produit du peroxyde d'hydrog ne (H2O2) : La catalase utilise le H2O2 g n r par d'autres enzymes de l'organite pour oxyder une vari t d'autres substrats, notamment l'acide formique, le formald hyde et l'alcool, par la r action de peroxydation : H2O2 + R2 R + 2H2O. Ce type de r action d'oxydation est particuli rement important dans les cellules du foie et des reins, o les peroxysomes d toxifient diverses mol cules nocives qui p n trent dans la circulation sanguine. Environ 25% de l' thanol que nous buvons est oxyd en ac tald hyde de cette mani re. De plus, lorsque l'exc s de H2O2 s'accumule dans la cellule, la catalase le convertit en H2O par la r action Une fonction majeure des r actions d'oxydation effectu es dans les peroxysomes est la d composition des mol cules d'acides gras. Le processus, appel oxydation , raccourcit s quentiellement les
Biologie moléculaire de la cellule	cha nes alkyles des acides gras en blocs de deux atomes de carbone la fois, convertissant ainsi les acides gras en ac tyl-CoA. Les peroxysomes exportent ensuite l'ac tyl-CoA vers le cytosol pour tre utilis s dans des r actions de biosynth se. Dans les cellules de mammif res, l'oxydation se produit la fois dans les mitochondries et les peroxysomes ; Dans les cellules de levure et de plante, cependant, cette r action essentielle se produit exclusivement dans les peroxysomes. Une fonction biosynth tique essentielle des peroxysomes animaux est de catalyser les premi res r actions dans la formation des plasmalog nes, qui sont la classe de phospholipides la plus abondante dans la my line (Figure 12-28). Les d ficits plasmalog nes provoquent de profondes anomalies dans la my linisation des axones des cellules nerveuses, ce qui est l'une des raisons pour lesquelles de nombreux troubles peroxysomaux entra nent des maladies neurologiques. Les peroxysomes sont des organites exceptionnellement diversifi s, et m me dans les diff rents types de cellules d'un m me organisme, ils peuvent contenir diff rents ensembles d'enzymes. Ils s'adaptent galement remarquablement aux conditions changeantes. Les levures cultiv es sur du sucre, par exemple, ont peu de petits peroxysomes. Mais lorsque certaines levures sont cultiv es sur du m thanol, de nombreux gros peroxysomes se forment qui oxydent le m thanol ; et lorsqu'ils sont cultiv s sur des acides gras, ils d veloppent de nombreux gros peroxysomes qui d composent les acides gras en ac tyl CoA par oxydation . Les peroxysomes sont galement importants chez les plantes. Deux types de peroxysomes v g taux ont t tudi s de mani re approfondie. L'une est pr sente dans les feuilles, o elle participe la photorespiration (voir le chapitre 14) (Figure 12 29A). L'autre type de peroxysome est pr sent dans les graines en germination, o il convertit les acides gras stock s dans les lipides des graines en sucres n cessaires la croissance de la jeune plante. Parce que cette conversion des graisses en sucres est accomplie par une s rie de r actions connues sous le nom de cycle glyoxylate, ces peroxysomes sont galement appel s glyoxysomes (Figure 12-29B). Dans le cycle glyoxylate, deux mol cules d'ac tylCoA produites par la d gradation des acides gras dans le peroxysome sont utilis es pour fabriquer de l'acide succinique, qui quitte ensuite le peroxysome et est converti en glucose dans le cytosol. Le cycle glyoxylate ne se produit pas dans les cellules animales, et les animaux sont donc incapables de convertir les acides gras des graisses en glucides. une courte s quence de signal Dirige l'importation de prot ines dans les peroxysomes Une s quence sp cifique de trois acides amin s (Ser-Lys-Leu) situ e l'extr mit C de nombreuses prot ines peroxysomiques fonctionne comme un signal d'importation (voir le tableau 12-3, p. 648). D'autres prot ines peroxysomales contiennent une s quence de signal pr s de l'extr mit N-terminale. Si l'une ou l'autre s quence est attach e une prot ine cytosolique, la prot ine est import e dans les peroxysomes. Les signaux d'importation sont d'abord reconnus par les prot ines r ceptrices solubles dans le cytosol. De nombreuses prot ines distinctes, appel es peroxines, participent au processus d'importation, qui est entra n par l'hydrolyse de l'ATP. Un complexe d'au moins six peroxines diff rentes forme un translocateur de prot ines dans la membrane des peroxysomes. M me les prot ines oligom res n'ont pas besoin de se d plier pour tre import es. Pour permettre le passage de ces mol cules de cargaison repli es de mani re compacte, on pense que le pore form par le transporteur est dynamique dans ses dimensions, s'adaptant en taille aux mol cules de cargaison particuli res transporter. cet gard, le m canisme diff re de celui utilis par les mitochondries et les chloroplastes. Un r cepteur d'importation soluble, la peroxine Pex5, reconna t le signal d'importation peroxysomal C-terminal. Il accompagne sa cargaison jusque dans les peroxysomes et, apr s sa lib ration de la cargaison, retourne au cytosol. Apr s Figure 12 27 Micrographie lectronique de trois peroxysomes dans une cellule h patique de rat. Les inclusions paracristallines et denses en lectrons sont compos es principalement de l'enzyme urate oxydase. (Avec l'aimable autorisation de Daniel s. friend.) Figure 12 28 La structure d'un plasmalog ne. Les plasmalog nes sont tr s abondants dans les gaines de my line qui isolent les axones des cellules nerveuses. Ils repr sentent environ 80 90 % des phospholipides de la membrane de my line. En plus d'un groupe de t te d' thanolamine et d'un acide gras longue cha ne attach au m me squelette de phosphate de glyc rol utilis pour les phospholipides, les plasmalog nes contiennent un alcool gras inhabituel qui est attach par une liaison ther (en bas gauche). Figure 12 29 Micrographies lectroniques de deux types de peroxysomes pr
Biologie moléculaire de la cellule	sents dans les cellules v g tales. a) un peroxysome noyau paracristallin dans une cellule m sophylle de feuille de tabac. On pense que son association troite avec les chloroplastes faciliter l' change de mat riaux entre ces organites lors de la photorespiration. La vacuole dans les cellules v g tales est quivalente au lysosome dans les cellules animales. (B) des peroxysomes dans une cellule de cotyl don stockant les graisses d'une graine de tomate 4 jours apr s la germination. Ici, les peroxysomes (glyoxysomes) sont associ s aux gouttelettes lipidiques qui stockent la graisse, refl tant leur r le central dans la mobilisation des graisses et la glucon ogen se pendant la germination des graines. (a, d'apr s S.E. Frederick et E.H. Newcomb, J. Cell Biol. 43:343-353, 1969. Avec l'autorisation de The rockefeller press ; B, de W.p. Wergin, p.J. Gruber et E.H. Newcomb, J. Ultrastruct. 30:533-557, 1970. Avec l'autorisation de la presse universitaire.) En livrant sa cargaison la lumi re des peroxysomes, Pex5 subit une ubiquitylation. Cette modification est n cessaire pour lib rer Pex5 dans le cytosol, o l'ubiquitine est limin e. Une ATPase compos e de Pex1 et de Pex6 exploite l' nergie de l'hydrolyse de l'ATP pour aider lib rer Pex5 des peroxysomes. L'importance de ce processus d'importation et des peroxysomes est d montr e par la maladie humaine h r ditaire du syndrome de Zellweger, dans laquelle un d faut d'importation de prot ines dans les peroxysomes conduit une profonde d ficience peroxysomale. Ces individus, dont les cellules contiennent des peroxysomes vides , pr sentent de graves anomalies dans le cerveau, le foie et les reins, et ils meurent peu de temps apr s la naissance. Une mutation dans le g ne codant pour la peroxine Pex5 provoque une forme de la maladie. Un d faut de Pex7, le r cepteur du signal d'importation N-terminal, provoque une maladie peroxysomale plus b nigne. On a longtemps d battu de la question de savoir si les nouveaux peroxysomes r sultent de ceux pr existants par croissance et fission des organites comme mentionn pr c demment pour les mitochondries et les plastes ou s'ils d rivent en tant que compartiment sp cialis du r ticulum endoplasmique (RE). Certains aspects des deux points de vue sont vrais (figures 12 30). La plupart des prot ines membranaires peroxysomiques sont fabriqu es dans le cytosol et ins r es dans la membrane de Figure 12 30 Un mod le qui explique comment les peroxysomes prolif rent et comment de nouveaux peroxysomes apparaissent. Les v sicules pr curseurs peroxysomales bourgeonnent du RE. Au moins deux prot ines membranaires peroxysomales, Pex3 et Pex15, suivent cette voie. La machinerie qui pilote la r action bourgeonnante et qui s lectionne uniquement les prot ines peroxysomiques pour l'emballage dans ces v sicules d pend de pex19 et d'autres prot ines cytosoliques encore inconnues. Les v sicules pr curseurs peroxysomales peuvent alors fusionner entre elles ou avec des peroxysomes pr existants. La membrane des peroxysomes contient des r cepteurs d'importation et des translocateurs de prot ines qui sont n cessaires l'importation de prot ines peroxysomales fabriqu es sur des ribosomes cytosoliques, y compris de nouvelles copies des r cepteurs d'importation et des composants translocateurs. On peut supposer que les lipides n cessaires la croissance sont galement import s, bien que certains puissent d river directement du RE dans la membrane des v sicules pr curseurs peroxysomales. des peroxysomes pr existants, mais d'autres sont d'abord int gr s dans la membrane du RE, o ils sont emball s dans des v sicules pr curseurs peroxysomaux sp cialis es. Les nouvelles v sicules pr curseurs peuvent alors fusionner les unes avec les autres et commencer importer des prot ines peroxysomales suppl mentaires, en utilisant leur propre machinerie d'importation de prot ines pour se transformer en peroxysomes matures, qui peuvent subir des cycles de croissance et de fission. Les peroxysomes sont sp cialis s dans la r alisation de r actions d'oxydation l'aide d'oxyg ne mol culaire. Ils g n rent du peroxyde d'hydrog ne, qu'ils utilisent des fins oxydatives, et contiennent de la catalase pour d truire l'exc s. Comme les mitochondries et les plastes, les peroxysomes sont des organites auto-r plicatifs. Cependant, comme ils ne contiennent pas d'ADN ou de ribosomes, toutes leurs prot ines sont cod es dans le noyau cellulaire. Certaines de ces prot ines sont transmises aux peroxysomes par l'interm diaire de v sicules pr curseurs peroxysomaux qui bourgeonnent partir du RE, mais la plupart sont synth tis es dans le cytosol et directement import es. Une s quence sp cifique de trois acides amin s pr s de l'extr mit C- de plusieurs de ces derni res prot ines fonctionne comme un signal d'importation de peroxysomes. Le m canisme d'importation des prot ines diff re de celui des mitochondries et des chloroplastes, en ce sens que m me les prot ines oligom res son
Biologie moléculaire de la cellule	t import es du cytosol sans se d plier. Les cellules eucaryotes enDoplasmiC reTiCUlUmAll ont un r ticulum endoplasmique (RE). Sa membrane en constitue g n ralement plus de la moiti de la membrane totale d'une cellule animale moyenne (voir tableau 12-2, p. 643). Le RE est organis en un labyrinthe en forme de filet de tubules ramifi s et de sacs aplatis qui s' tend tout au long du cytosol (Figure 12-31 et vid o 12.4). Les tubules et les sacs s'interconnectent, et leur membrane est continue avec la membrane nucl aire externe ; Le compartiment qu'ils renferment est donc galement continu avec l'espace entre les membranes nucl aires interne et externe. Ainsi, les membranes RE et nucl aires forment une feuille continue renfermant un seul espace interne, appel lumi re RE ou espace cisternal RE, qui occupe souvent plus de 10 % du volume total de la cellule (voir tableau 12-1, p. 643). Comme mentionn au d but de ce chapitre, le RE joue un r le central dans la biosynth se des lipides et des prot ines, et il sert galement de r serve intracellulaire de Ca2+ qui est utilis dans de nombreuses r ponses de signalisation cellulaire (discut au chapitre 15). La membrane RE est le site de production de toutes les prot ines et lipides transmembranaires de la plupart des organites de la cellule, y compris le RE lui-m me, l'appareil de Golgi, les lysosomes, les endosomes, les v sicules s cr toires et la membrane plasmique. La membrane du RE est galement le site o la plupart des lipides des membranes mitochondriales et peroxysomiales sont fabriqu s. De plus, presque toutes les prot ines qui seront s cr t es l'ext rieur de la cellule, ainsi que celles destin es la lumi re du RE, l'appareil de Golgi ou aux lysosomes, sont initialement d livr es la lumi re du RE. Figure 12 31 Micrographies fluorescentes du r ticulum endoplasmique. a) une cellule animale en culture tissulaire qui a t g n tiquement modifi e pour exprimer une prot ine membranaire du RE fusionn e une prot ine fluorescente. Le er s' tend comme un r seau de tubules et de feuillets dans tout le cytosol, de sorte que toutes les r gions du cytosol sont proches d'une partie de la membrane du re. La membrane nucl aire externe, qui est en continuit avec l'er, est galement color e. (B) une partie d'un r seau de RE dans une cellule v g tale vivante qui a t g n tiquement modifi e pour exprimer une prot ine fluorescente dans le RE. (a, avec l'aimable autorisation de Patrick Chitwood et Gia Voeltz ; B, avec l'aimable autorisation de petra Boevink et Chris Hawes.) L'er est structurellement et fonctionnellement diversifi Bien que les diverses fonctions du RE soient essentielles chaque cellule, leur importance relative varie consid rablement d'un type de cellule l'autre. Pour r pondre aux diff rentes exigences fonctionnelles, les diff rentes r gions de la salle d'urgence deviennent hautement sp cialis es. Nous observons une telle sp cialisation fonctionnelle comme des changements spectaculaires dans la structure du RE, et diff rents types de cellules peuvent donc poss der des types de membrane du RE caract ristiques diff rents. L'une des sp cialisations les plus remarquables des RE est l'ER. Les cellules de mammif res commencent importer la plupart des prot ines dans le RE avant la synth se compl te de la cha ne polypeptidique, c'est- -dire que l'importation est un processus co-traductionnel (Figure 12-32A). En revanche, l'importation de prot ines dans les mitochondries, les chloroplastes, les noyaux et les peroxysomes est un processus post-traductionnel (Figure 12-32B). Dans le transport co-traductionnel, le ribosome qui synth tise la prot ine est attach directement la membrane du RE, ce qui permet une extr mit de la prot ine d' tre transloqu e dans le RE pendant que le reste de la cha ne polypeptidique est synth tis . Ces ribosomes li s la membrane recouvrent la surface du RE, cr ant des r gions appel es r ticulum endoplasmique rugueux, ou RE rugueux ; les r gions du RE qui n'ont pas de ribosomes li s sont appel es r ticulum endoplasmique lisse, ou RE lisse (Figure 12 33). La plupart des cellules ont de rares r gions de RE lisse, et le RE est souvent en partie lisse et en partie rugueux. Les zones de RE lisse partir desquelles les v sicules de transport transportant des prot ines et des lipides nouvellement synth tis s se d tachent pour tre transport es vers l'appareil de Golgi sont appel es RE transitionnelle. Dans certaines cellules sp cialis es, le RE lisse est abondant et a des fonctions suppl mentaires. Il est pro minent, par exemple, dans les cellules sp cialis es dans le m tabolisme des lipides, telles que les cellules qui synth tisent des hormones st ro des partir du cholest rol ; le RE lisse expans accueille les enzymes qui fabriquent le cholest rol et le modifient pour former les hormones (voir Figure 12 33B). Le principal type de cellule du foie, l'h patocyte, a galement une quantit substantielle de RE lisse. C'est
Biologie moléculaire de la cellule	le principal site de production de particules de lipoprot ines, qui transportent les lipides via la circulation sanguine vers d'autres parties de la plan te. le corps. Les enzymes qui synth tisent les composants lipidiques des particules sont situ es dans la membrane du RE lisse, qui contient galement des enzymes qui catalysent une s rie de r actions pour d toxifier la fois les m dicaments liposolubles et divers compos s nocifs produits par le m tabolisme. Les r actions de d toxification les plus tudi es sont r alis es par la famille d'enzymes cytochromes P450, qui catalysent une s rie de r actions dans lesquelles des m dicaments ou des m tabolites insolubles dans l'eau qui s'accumuleraient autrement des niveaux toxiques dans les membranes cellulaires sont rendus suffisamment solubles dans l'eau pour quitter la cellule et tre excr t s dans l'urine. tant donn que le RE rugueux ne peut lui seul contenir suffisamment de ces enzymes et d'autres enzymes n cessaires, une partie substantielle de la membrane d'un h patocyte est normalement constitu e d'un RE lisse (voir tableau 12 2). Une autre fonction cruciale du RE dans la plupart des cellules eucaryotes est de s questrer le Ca2+ du cytosol. La lib ration de Ca2+ dans le cytosol partir du RE, et sa recapture ult rieure, se produisent dans de nombreuses r ponses rapides l'extracellulaire Figure 12 32 Translocation co-traductionnelle et post-traductionnelle des prot ines. (a) Les ribosomes se lient la membrane RE lors de la translocation co-traductionnelle. (B) En revanche, les ribosomes cytosoliques terminent la synth se d'une prot ine et la lib rent avant la translocation post-traductionnelle. Dans les deux cas, la prot ine est dirig e vers le RE par une s quence de signal RE (rouge et orange). 200 nm 0,5 m Figure 12 33 Le RE rugueux et lisse. (a) Une micrographie lectronique du RE rugueux dans une cellule exocrine pancr atique qui fabrique et s cr te de grandes quantit s d'enzymes digestives chaque jour. Le cytosol est rempli de feuillets serr s de membrane ER, parsem e de ribosomes. En haut gauche se trouve une partie du noyau et son enveloppe nucl aire ; Notons que la membrane nucl aire externe, qui est en continuit avec le RE, est galement parsem e de ribosomes. (B) abondant et lisse dans une cellule s cr tant des hormones st ro diennes. Cette micrographie lectronique est celle d'une cellule de Leydig s cr tant de la testost rone dans le testicule humain. (C) une reconstruction tridimensionnelle d'une r gion de plus lisse et de plus rugueuse dans une cellule h patique. Le er rugueux forme des empilements orient s de citernes aplaties, chacune ayant un espace lum nal de 20 30 nm de large. La membrane lisse est reli e ces citernes et forme un fin r seau de tubules de 30 60 nm de diam tre. Le er lumen est de couleur verte. (D) une reconstruction tomographique d'une partie du r seau er dans une cellule de levure. Les ribosomes li s la membrane (minuscules sph res sombres) sont visibles la fois dans des feuilles plates et des r gions tubulaires de diam tre irr gulier, d montrant que les ribosomes se lient des membranes RE de courbure diff rente dans ces cellules. (A, avec l'aimable autorisation de Lelio Orci ; B, avec l'aimable autorisation de Daniel s. ami ; C, apr s r.V. Krstic , Ultrastructure de la cellule de mammif re. New York : Springer-Verlag, 1979 ; D, de m. West et al., J. Cell Biol. 193:333-346, 2011. Avec l'autorisation de Rockefeller University Press.) , comme nous l'avons vu au chapitre 15. Une pompe Ca2+ transporte le Ca2+ du cytosol vers la lumi re du RE. Une forte concentration de prot ines de liaison au Ca2+ dans le RE facilite le stockage du Ca2+. Dans certains types de cellules, et peut- tre dans la plupart, des r gions sp cifiques du RE sont sp cialis es pour le stockage du Ca2+. Les cellules musculaires ont un RE lisse abondant et modifi appel r ticulum sarcoplasmique. La lib ration et la recapture de Ca2+ par le r ticulum sarcoplasmique d clenchent respectivement la contraction et la relaxation des myofibrilles chaque cycle de contraction musculaire (voir le chapitre 16). Pour tudier les fonctions et la biochimie du RE, il est n cessaire de l'isoler. Cela peut sembler une t che d sesp r e car le RE est intimement li d'autres composants du cytoplasme. Heureusement, lorsque les tissus ou les cellules sont perturb s par l'homog n isation, le RE se brise en fragments, qui se referment pour former de petites v sicules ferm es (~100 200 nm de diam tre) appel es microsomes. Les microsomes sont relativement faciles purifier. Pour le biochimiste, les microsomes repr sentent de petites versions authentiques du RE, toujours capables de translocation de prot ines, de glycosylation de prot ines (discut es plus loin), d'absorption et de lib ration de Ca2+ et de synth se des lipides. Les microsomes d riv s du RE rugueux sont parsem s de ribosomes et sont appel s microsomes rugueux. Les ribosomes se
Biologie moléculaire de la cellule	trouvent toujours sur la surface externe, de sorte que l'int rieur du microsome est biochimiquement quivalent la lumi re du RE (Figure 12-34A). De nombreuses v sicules de taille similaire des microsomes rugueux, mais d pourvues de ribosomes attach s, se trouvent galement dans les homog nats cellulaires. De tels microsomes lisses sont d riv s en partie de parties lisses du RE et en partie de fragments v sicul s de la membrane plasmique, de l'appareil de Golgi, des endosomes et des mitochondries (le rapport d pendant du tissu). Ainsi, alors que les microsomes rugueux sont clairement d riv s de parties rugueuses de RE, il n'est pas facile de s parer les microsomes lisses d riv s de diff rents organites. Les microsomes lisses pr par s partir de cellules h patiques ou musculaires sont une exception. En raison des quantit s inhabituellement lev es de r ticulum lisse ou sarcoplasmique, respectivement, la plupart des microsomes lisses dans les homog nats de ces tissus sont d riv s du r ticulum lisse ou sarcoplasmique. Les ribosomes attach s aux microsomes rugueux les rendent plus denses que les microsomes lisses. Par cons quent, nous pouvons utiliser la centrifugation quilibre pour s parer les microsomes rugueux et lisses (Figure 12 34B). Les microsomes ont t inestimables pour lucider les aspects mol culaires de la fonction RE, comme nous le verrons ci-dessous. Les s quences de signaux ont t d couvertes pour la premi re fois dans des prot ines import es dans l'environnement approximatif. Le RE capture des prot ines s lectionn es du cytosol au fur et mesure de leur synth se. Ces prot ines sont de deux types : les prot ines transmembranaires, qui ne sont que partiellement transloqu es travers la membrane du RE et s'y incrustent, et les prot ines solubles dans l'eau, qui sont enti rement transloqu es travers la membrane du RE et sont lib r es dans la lumi re du RE. Certaines des prot ines transmembranaires fonctionnent dans le RE, mais beaucoup sont destin es r sider dans la membrane plasmique ou la membrane d'un autre organite. Les prot ines hydrosolubles sont destin es soit la s cr tion, soit la r sidence dans la lumi re du RE ou d'un autre organite. Toutes ces prot ines, quel que soit leur destin ult rieur, sont dirig es vers la membrane du RE par une s quence de signal du RE, qui initie leur translocation par un m canisme commun. Les s quences de signal (et la strat gie de s quence de signal de tri des prot ines) ont t d couvertes pour la premi re fois au d but des ann es 1970 dans les prot ines s cr t es qui sont transloqu es travers la membrane du RE comme premi re tape vers leur ventuelle d charge de la cellule. Dans l'exp rience cl , l'ARNm codant pour une prot ine s cr t e a t traduit par les ribosomes in vitro. Lorsque les microsomes ont t omis de ce syst me acellulaire, la prot ine synth tis e tait l g rement plus grande que la prot ine s cr t e normale. Cependant, en pr sence de microsomes d riv s du RE rugueux, une prot ine de la bonne taille a t produite. Selon l'hypoth se du signal, la diff rence de taille refl te la pr sence initiale d'une s quence de signal qui dirige la prot ine s cr t e Figure 12 34 L'isolement de microsomes rugueux et lisses purifi s partir du RE. (a) Une micrographie lectronique section mince de la fraction rugueuse du RE purifi e montre une abondance de v sicules parsem es de ribosomes. (B) Lorsqu'ils sont s diment s jusqu' l' quilibre par un gradient de saccharose, les deux types de microsomes se s parent l'un de l'autre sur la base de leurs densit s diff rentes. Notez que la fraction lisse contiendra galement des mat riaux non d riv s du RE. (a, avec l'aimable autorisation de George Palade.) Figure 12 35 L'hypoth se du signal. Une vue simplifi e de la translocation des prot ines travers la membrane du RE, telle que propos e l'origine. Lorsque la s quence du signal er merge du ribosome, elle dirige le ribosome vers un translocateur sur la membrane er qui forme un pore dans la membrane travers lequel le polypeptide est transloqu . Une peptidase signal est troitement associ e au translocateur et coupe la s quence du signal pendant la traduction, et la prot ine mature est lib r e dans la lumi re du RE imm diatement apr s la fin de sa synth se. Le translocateur est ferm jusqu' ce que le ribosome soit li , de sorte que la barri re de perm abilit de la membrane er soit maintenue tout moment. la membrane du RE et est ensuite cliv e par une peptidase signal dans la membrane du RE avant que la cha ne polypeptidique ne soit termin e (Figure 12 35). Les syst mes acellulaires dans lesquels les prot ines sont import es dans les microsomes ont fourni des proc dures puissantes pour identifier, purifier et tudier les diff rents composants de la machinerie mol culaire responsable du processus d'importation des RE. une particule de reconnaissance du signal (srp) Dirige la s quence du signal du RE vers un r cepteur sp cifiq
Biologie moléculaire de la cellule	ue dans la membrane rugueuse du RE La s quence du signal du RE est guid e vers la membrane du RE par au moins deux composants : une particule de reconnaissance du signal (SRP), qui circule entre la membrane du RE et le cytosol et se lie la s quence du signal, et un r cepteur SRP dans la membrane du RE. Le SRP est un grand complexe ; dans les cellules animales, il se compose de six cha nes polypeptidiques diff rentes li es une seule petite mol cule d'ARN. Alors que le SRP et le r cepteur SRP ont moins de sous-unit s chez les bact ries, des homologues sont pr sents dans toutes les cellules, ce qui indique que ce m canisme de ciblage des prot ines est apparu t t dans l' volution et a t conserv . Les s quences de signal du RE varient consid rablement dans la s quence d'acides amin s, mais chacune a huit acides amin s non polaires ou plus en son centre (voir le tableau 12-3, p. 648). Comment le SRP peut-il se lier sp cifiquement autant de s quences diff rentes ? La r ponse est venue de la structure cristalline de la prot ine SRP, qui montre que le site de liaison de la s quence de signal est une grande poche hydrophobe tapiss e de m thionines. Parce que les m thionines ont des cha nes lat rales non ramifi es et flexibles, la poche est suffisamment plastique pour accueillir des s quences de signaux hydrophobes de diff rentes s quences, tailles et formes. Le SRP est une structure en forme de b tonnet, qui s'enroule autour de la grande sous-unit ribosomique, avec une extr mit se liant la s quence de signal ER lorsqu'elle merge du ribosome dans le cadre de la cha ne polypeptidique nouvellement form e ; l'autre extr mit bloque le site de liaison du facteur d' longation l'interface entre les grandes et petites sous-unit s ribosomiques (Figure 12 36). Ce bloc arr te la synth se des prot ines d s que le peptide signal a merg du ribosome. La pause transitoire donne probablement au ribosome suffisamment de temps pour se lier la membrane du RE avant la fin de la cha ne polypeptidique, garantissant ainsi que la prot ine n'est pas lib r e dans le cytosol. Cette s curit Figure 12 36 La particule de reconnaissance du signal (SRP). (a) Un SRP de mammif re est un complexe ribonucl oprot ique en forme de b tonnet contenant six sous-unit s prot iques (en marron) et une mol cule d'ARN (en bleu). L'ARN srp forme un squelette qui relie le domaine prot ique contenant la poche de liaison de la s quence de signal au domaine responsable de la traduction en pause. Les structures cristallines de diverses pi ces de srp de diff rentes esp ces sont assembl es ici en un mod le composite pour se rapprocher de la structure d'un srp complet. (B) Le contour tridimensionnel de la srp li e un ribosome a t d termin par cryomicroscopie lectronique. SRP se lie la grande sous-unit ribosomique de sorte que sa poche de liaison la s quence de signal est positionn e pr s du site de sortie de la cha ne polypeptidique en croissance, et son domaine de pause translationnelle est positionn l'interface entre les sous-unit s ribosomiques, o il interf re avec la liaison du facteur d' longation. (C) lorsqu'une s quence de signal merge du ribosome et se lie au srp, un changement conformationnel du srp expose un site de liaison pour le r cepteur srp. (B, adapt de m. halic et al., Nature 427:808 814, 2004. Avec l'autorisation de macmillan publishers ltd.) le dispositif peut tre particuli rement important pour les hydrolases s cr t es et lysosomales, qui pourraient faire des ravages dans le cytosol ; Les cellules qui s cr tent de grandes quantit s d'hydrolases, cependant, prennent la pr caution suppl mentaire d'avoir des concentrations lev es d'inhibiteurs de l'hydrolase dans leur cytosol. La pause garantit galement que de grandes portions d'une prot ine qui pourrait se replier en une structure compacte ne sont pas faites avant d'atteindre le translocateur dans la membrane du RE. Ainsi, contrairement l'importation post-traductionnelle de prot ines dans les mitochondries et les chloroplastes, les prot ines chaperonnes ne sont pas n cessaires pour maintenir la prot ine d pli e. Lorsqu'une s quence de signal se lie, SRP expose un site de liaison pour le r cepteur SRP (voir Figure 12 36B,C), qui est un complexe prot ique transmembranaire dans la membrane rugueuse du RE. La liaison du SRP son r cepteur am ne le complexe SRP-ribosome un translocateur prot ique inoccup dans la m me membrane. Le SRP et le r cepteur SRP sont ensuite lib r s, et le translocateur transf re la cha ne polypeptidique en croissance travers la membrane (Figure 12 37). Ce processus de transfert co-traductionnel cr e deux populations de ribosomes spatialement s par es dans le cytosol. Ribosomes li s la membrane, attach s la Figure 12 37 Comment les s quences de signaux du RE et le SRP dirigent les ribosomes vers la membrane du RE. Le srp et son r cepteur agissent de concert. Le srp se lie la fois la s quence de signal er expos e et au ribo
Biologie moléculaire de la cellule	some, induisant ainsi une pause dans la traduction. Le r cepteur srp dans la membrane du re, qui dans les cellules animales est compos de deux cha nes polypeptidiques diff rentes, se lie au complexe srp-ribosome et le dirige vers le translocateur. Dans une r action mal comprise, le SRP et le r cepteur SRP sont ensuite lib r s, laissant le ribosome li au translocateur dans la membrane du RE. Le translocateur ins re ensuite la cha ne polypeptidique dans la membrane et la transf re travers la bicouche lipidique. tant donn que l'une des prot ines srp et les deux cha nes du r cepteur srp contiennent des domaines de liaison la GTp, on pense que les changements conformationnels qui se produisent pendant les cycles de liaison et d'hydrolyse de la GTp (discut s au chapitre 15) garantissent que la lib ration de la srp ne se produit qu'apr s que le ribosome s'est correctement engag avec le translocateur dans la membrane du re. Le translocateur est ferm jusqu' ce que le ribosome soit li , de sorte que la barri re de perm abilit de la membrane er soit maintenue tout moment. Les ribosomes libres, non attach s une membrane, synth tisent toutes les autres prot ines cod es par le g nome nucl aire. Les ribosomes membranaires et les ribosomes libres sont structurellement et fonctionnellement identiques. Ils ne diff rent que par les prot ines qu'ils fabriquent un moment donn . tant donn que de nombreux ribosomes peuvent se lier une seule mol cule d'ARNm, un polyribosome se forme g n ralement. Si l'ARNm code pour une prot ine avec une s quence de signal RE, le polyribosome se fixe la membrane RE, dirig l par les s quences de signal sur plusieurs cha nes polypeptidiques en croissance. Les ribosomes individuels associ s une telle mol cule d'ARNm peuvent retourner dans le cytosol lorsqu'ils ont termin leur traduction et se m langer avec le pool de ribosomes libres. L'ARNm lui-m me, cependant, reste attach la membrane du RE par une population changeante de ribosomes, chacun tant maintenu transitoirement la membrane par le translocateur (Figure 12-38). La cha ne polypeptidique passe travers un canal aqueux dans le translocateur On a longtemps d battu de la question de savoir si les cha nes polypeptidiques sont transf r es travers la membrane du RE en contact direct avec la bicouche lipidique ou travers un canal dans un translocateur de prot ines. Le d bat s'est termin par l'identification du translocateur, qui s'est av r former un canal rempli d'eau dans la membrane travers un pool commun de sous-unit s ribosomiques dans l'ARNm du cytosol codant pour une prot ine cibl e sur les restes membranaires du RE Figure 12 38 Polyribosomes libres et li s la membrane. (a) Un pool commun de ribosomes synth tise les prot ines qui restent dans le cytosol et celles qui sont transport es dans le RE. La s quence de signal er sur une cha ne polypeptidique nouvellement form e se lie srp, qui dirige le ribosome en traduction vers la membrane er. La mol cule d'ARNm reste li e en permanence au re dans le cadre d'un polyribosome, tandis que les ribosomes qui se d placent le long de celle-ci sont recycl s ; la fin de chaque cycle de synth se prot ique, les sous-unit s ribosomiques sont lib r es et rejoignent le pool commun dans le cytosol. (B) une micrographie lectronique section mince de polyribosomes attach s la membrane ER. Le plan de section certains endroits coupe le er peu pr s parall lement la membrane, donnant une vue de face du motif en forme de rosette des polyribosomes. (B, avec l'aimable autorisation de George Palade.) Figure 12 39 Structure du complexe Sec61. (a) Une vue lat rale ( gauche) et une vue de dessus ( droite, vue du cytosol) de la structure du complexe sec61 de l'arch on Methanococcus jannaschii. La sous-unit sec61 a une structure de r p tition invers e (voir figure 11 10) et est repr sent e en bleu et beige pour indiquer cette pseudo-sym trie ; Les deux sous-unit s plus petites et sont indiqu es en gris. Dans la vue lat rale, certaines h lices l'avant ont t omises pour rendre visible l'int rieur du pore. On pense que la courte h lice jaune forme un bouchon qui scelle le pore lorsque le translocateur est ferm . Pour s'ouvrir, le complexe se r organise pour d placer l'h lice de la fiche l' cart, comme indiqu par la fl che rouge. un anneau de cha nes lat rales d'acides amin s hydrophobes est On pense qu'il forme un diaphragme bien ajust autour de la cha ne polypeptidique de translocation pour emp cher les fuites d'autres mol cules travers la membrane. Le pore du complexe sec61 peut galement s'ouvrir lat ralement au niveau d'une couture lat rale. (B) Des mod les des tats ferm et ouvert du translocateur sont pr sent s en vue de dessus, illustrant comment une s quence de signal (ou un segment transmembranaire) pourrait tre lib r e dans la bicouche lipidique apr s l'ouverture de la couture. (Codes pDB : 1rh5 et 1rhz.) par lequel passe la cha ne poly
Biologie moléculaire de la cellule	peptidique. Le c ur du translocateur, appel complexe Sec61, est construit partir de trois sous-unit s hautement conserv es, des bact ries aux cellules eucaryotes. La structure du complexe Sec61 sugg re que h lices contribu es par la plus grande sous-unit entourent un canal central travers lequel la cha ne polypeptidique traverse la membrane (Figure 12 39). Le canal est ferm par une courte h lice qui est cens e maintenir le translocateur ferm lorsqu'il est inactif et s' carter lorsqu'il est engag dans le passage d'une cha ne polypeptidique. Selon ce point de vue, le pore est un canal dynamique qui ne s'ouvre que transitoirement lorsqu'une cha ne polypeptidique traverse la membrane. Dans un translocateur inactif, il est important de garder le canal ferm , afin que la membrane reste imperm able aux ions, tels que le Ca2+, qui autrement s' chapperaient du RE. Lorsqu'une cha ne polypeptidique se transloque, on pense qu'un anneau de cha nes lat rales d'acides amin s hydrophobes fournit une tanch it flexible pour viter les fuites d'ions. La structure du complexe Sec61 sugg re que le pore peut galement s'ouvrir le long d'une couture sur son c t . En effet, certaines structures du translocateur montrent qu'il est verrouill dans une conformation joint ouvert. Cette ouverture permet un acc s lat ral une cha ne peptidique de translocation dans le noyau hydrophobe de la membrane, un processus important la fois pour la lib ration d'un peptide signal cliv dans la membrane (voir Figure 12-35) et pour l'int gration des prot ines transmembranaires dans la bicouche, comme nous le verrons plus loin. Figure 12 40 Un ribosome (vert) li au translocateur de la prot ine ER (bleu). (a) une reconstruction lat rale du complexe partir d'images au microscope lectronique. (B) une vue du translocateur vu de la lumi re de l' re. Le translocateur contient du sec61, des prot ines accessoires et un d tergent utilis dans la pr paration. Les domaines des prot ines accessoires s' tendent travers la membrane et forment le renflement lumenal. (C) un dessin sch matique d'un ribosome li la membrane attach au translocateur, indiquant l'emplacement du tunnel dans la grande sous-unit ribosomique par laquelle la cha ne polypeptidique en croissance sort du ribosome. L'ARNm (non illustr ) serait situ entre les petites et grandes sous-unit s ribosomiques. (adapt de J.f. m n tret et al., J. Mol. Biol. 348:445 457, 2005. Avec l'autorisation de la presse universitaire.) Dans les cellules eucaryotes, quatre complexes Sec61 forment un grand ensemble de translocateurs qui peut tre visualis sur les ribosomes li s au RE apr s solubilisation d tergente de la membrane du RE (Figure 12 40). Il est probable que cet assemblage comprenne d'autres complexes membranaires qui s'associent au translocateur, tels que des enzymes qui modifient la cha ne polypeptidique en croissance, y compris l'oligosaccharide transf rase et la peptidase signal. L'assemblage d'un translocateur avec ces composants accessoires s'appelle le translocon. Translocation travers la membrane du re Ne n cessite pas toujours un polypeptide continu Allongement de la cha ne Comme nous l'avons vu, la translocation des prot ines dans les mitochondries, les chloroplastes et les peroxysomes se produit apr s la traduction, apr s que la prot ine a t fabriqu e et lib r e dans le cytosol, tandis que la translocation travers la membrane du RE se produit g n ralement pendant la traduction (co-traductionnelle). Cela explique pourquoi les ribosomes sont li s au RE mais pas aux autres organites. Cependant, certaines prot ines compl tement synth tis es sont import es dans le RE, ce qui d montre que la translocation ne n cessite pas toujours une traduction continue. La translocation post-traductionnelle des prot ines est particuli rement fr quente travers la membrane du RE de la levure et la membrane plasmique bact rienne (dont on pense qu'elle est li e au RE sur le plan de l' volution). Pour fonctionner dans la translocation post-traductionnelle, le translocateur ER a besoin de prot ines accessoires qui alimentent la cha ne polypeptidique dans le pore et entra nent la translocation (Figure 12-41). Chez les bact ries, une prot ine motrice de translocation, la SecA ATPase, se fixe sur le c t cytosolique du translocateur, o elle subit des changements conformationnels cycliques entra n s par l'hydrolyse de l'ATP. Chaque fois qu'un ATP est hydrolys , une partie de la prot ine SecA s'ins re dans le pore du translocateur, poussant un court-circuit segment de la prot ine du passager avec lui. En raison de ce m canisme de cliquet, la SecA ATPase pousse progressivement la cha ne polypeptidique de la prot ine transport e travers la membrane. Les cellules eucaryotes utilisent un ensemble diff rent de prot ines accessoires qui s'associent au complexe Sec61. Ces prot ines traversent la membrane du RE et utilisent un petit domaine du c t lumenal de la membrane du RE pour d
Biologie moléculaire de la cellule	poser une prot ine chaperonne de type hsp70 (appel e BiP, pour prot ine de liaison) sur la cha ne polypeptidique lorsqu'elle merge du pore dans la lumi re du RE. Les cycles de liaison et de lib ration de BiP d pendants de l'ATP entra nent une translocation unidirectionnelle, comme d crit pr c demment pour les prot ines mitochondriales hsp70 qui tirent les prot ines travers les membranes mitochondriales. Les prot ines qui sont transport es dans le RE par un m canisme post-traductionnel sont d'abord lib r es dans le cytosol, o elles se lient aux prot ines chaperonnes pour emp cher le repliement, comme nous l'avons vu pr c demment pour les prot ines destin es aux mitochondries et aux chloroplastes. dans les prot ines transmembranaires passage unique, une seule s quence de signal interne du RE reste dans la bicouche lipidique sous la forme d'une h lice couvrant la membrane On pense que la s quence du signal ER dans la cha ne polypeptidique en croissance d clenche l'ouverture du pore dans le translocateur de prot ine Sec61 : une fois que la s quence du signal est lib r e du SRP et que la cha ne en croissance a atteint une longueur suffisante, le CYTOSOL ER LUMEN CYTOSOL ESPACE EXTRACELLULAIRE SecA ATPase SecY complexe Sec62,63,71,72 complexe BiP SRP SRP r cepteur Sec61 complexe ATPADPER s quence de signal Pi+ membrane interne bact rienne (plasma) Figure 12 41 Trois fa ons dont la translocation des prot ines peut tre entra n e travers des translocateurs structurellement similaires. (a) Translocation co-traductionnelle. Le ribosome est amen la membrane par le r cepteur srp et srp, puis s'engage avec le translocateur de la prot ine sec61. La cha ne polypeptidique en croissance est enfil e travers la membrane au fur et mesure de sa fabrication. Aucune nergie suppl mentaire n'est n cessaire, car le seul chemin disponible pour la cha ne de croissance est de traverser la membrane. (B) la translocation post-traductionnelle dans les cellules eucaryotes n cessite un complexe suppl mentaire compos des prot ines sec62, sec63, sec71 et sec72, qui est attach au translocateur sec61 et d pose les mol cules Bip sur la cha ne de translocation lorsqu'elle merge du translocateur dans la lumi re du re. Les cycles de liaison et de lib ration de Bip entra n s par aTp tirent la prot ine dans la lumi re, Un m canisme qui ressemble beaucoup au m canisme d'importation mitochondriale de la figure 12-23. (C) la translocation post-traductionnelle chez les bact ries. La cha ne polypeptidique compl t e est introduite du c t cytosolique dans l'homologue bact rien du complexe sec61 (appel complexe secY chez les bact ries) dans la membrane plasmique par la seca aTpase. Les changements conformationnels induits par l'hydrolyse aTp entra nent un mouvement semblable celui d'un piston dans seca, chaque cycle poussant environ 20 acides amin s de la cha ne prot ique travers le pore du translocateur. La voie secondaire utilis e pour la translocation des prot ines travers la membrane thylako de dans les chloroplastes utilise un m canisme similaire (voir figure 12-26B). Alors que le translocateur sec61, srp et le r cepteur srp se trouvent dans tous les organismes, seca se trouve exclusivement dans les bact ries et le complexe sec62, 63, 71, 72 se trouve exclusivement dans les cellules eucaryotes. (adapt de p. Walter et a.e. Johnson, Annu. Rev. Cell Biol. 10:87-119, 1994. Avec l'autorisation des revues annuelles.) La s quence de signaux se lie un site sp cifique l'int rieur du pore lui-m me, ouvrant ainsi le pore. Une s quence de signal RE est donc reconnue deux fois : d'abord par un SRP dans le cytosol, puis par un site de liaison dans le pore du translocateur de prot ine, o elle sert de signal de d marrage-transfert (ou peptide de d part-transfert) qui ouvre le pore (par exemple, voir la figure 12-35 pour savoir comment cela fonctionne pour une prot ine soluble). La double reconnaissance peut aider s'assurer que seules les prot ines appropri es p n trent dans la lumi re du RE. Lorsqu'elle est li e dans le pore de translocation, une s quence de signal est en contact non seulement avec le complexe Sec61, mais aussi avec le complexe Sec61. qui forme les parois du pore, mais aussi, le long de la couture lat rale, avec le noyau hydrophobe de la bicouche lipidique. Cela a t d montr dans des exp riences de r ticulation chimique dans lesquelles la s quence du signal et les cha nes d'hydrocarbures des lipides ont t li es de mani re covalente. Lorsque la cha ne polypeptidique naissante s'est suffisamment allong e, la peptidase du signal ER a cliv la s quence du signal et l'a lib r e du pore dans la membrane, o elle a t rapidement d grad e en acides amin s par d'autres prot ases dans la membrane ER. Pour lib rer la s quence de signaux dans la membrane, le translocateur s'ouvre lat ralement le long de la couture (voir figures 12-35 et 12-39). Le translocateur est donc ferm dans deux directions : il s'ouvre pou
Biologie moléculaire de la cellule	r former un pore travers la membrane pour laisser les parties hydrophiles des prot ines traverser la bicouche lipidique, et il s'ouvre lat ralement l'int rieur de la membrane pour laisser les parties hydrophobes des prot ines se r partir dans la bicouche lipidique. La porte lat rale du pore est une tape essentielle lors de l'int gration des prot ines transmembranaires. L'int gration des prot ines membranaires n cessite que certaines parties de la cha ne polypeptidique soient transloqu es travers la bicouche lipidique alors que d'autres ne le sont pas. Malgr cette complexit suppl mentaire, tous les modes d'insertion des prot ines membranaires ne sont que des variantes de la s quence d' v nements qui vient d' tre d crite pour le transfert d'une prot ine soluble dans la lumi re du RE. Nous commen ons par d crire les trois fa ons dont les prot ines transmembranaires passage unique (voir Figure 10-17) sont ins r es dans la membrane du RE. Dans le cas le plus simple, une s quence de signal N-terminale initie la translocation, tout comme pour une prot ine soluble, mais un segment hydrophobe suppl mentaire dans la cha ne polypeptidique arr te le processus de transfert avant que toute la cha ne polypeptidique ne soit translocalis e. Ce signal d'arr t-transfert ancre la prot ine dans la membrane apr s que la s quence du signal ER (le signal de d marrage-transfert) a t cliv e et lib r e du translocateur (Figure 12 42). Le m canisme de d clenchement lat ral transf re la s quence d'arr t-transfert dans la bicouche, o elle reste sous la forme d'un seul segment -h lico dal couvrant la membrane, avec l'extr mit N-terminale de la prot ine du c t lum nal de la membrane et l'extr mit C-terminale du c t cytosolique. Dans les deux autres cas, la s quence du signal est interne, plut t qu' l'extr mit N-terminale de la prot ine. Comme pour une s quence de signal RE N-terminale, le SRP se lie une s quence de signal interne en reconnaissant ses caract ristiques hydrophobes -h lico dales. Le SRP am ne le ribosome qui fabrique la prot ine la membrane du RE, et la s quence du signal du RE sert ensuite de signal de transfert de d part qui initie la translocation de la prot ine. Apr s la lib ration du translocateur, la s quence interne de d marrage-transfert reste dans la bicouche lipidique sous la forme d'une seule membrane h lice. Les s quences de d marrage-transfert internes peuvent se lier l'appareil de translocation dans l'une ou l'autre des deux orientations ; celui-ci d termine son tour quel segment de prot ine (celui qui pr c de ou suit la s quence de d marrage-transfert) est d plac travers la membrane dans la lumi re du RE. Dans un cas, la prot ine membranaire r sultante a son extr mit C-terminale du c t lum nal (voie A sur la figure 12-43), tandis que dans l'autre, elle a son extr mit N-terminale sur le c t lum nal (voie B sur la figure 12-43). L'orientation de la s quence de d marrage-transfert d pend de la distribution des acides amin s charg s proximit , comme d crit dans la l gende de la figure. Combinaisons de signaux de transfert de d but et de transfert d'arr t D terminer la topologie des prot ines transmembranaires multipasses Dans les prot ines transmembranaires multipasses, la cha ne polypeptidique passe d'avant en arri re plusieurs reprises travers la bicouche lipidique sous forme d'h lices hydrophobes (voir Figure 10 17). On pense qu'une s quence de signal interne sert de signal de d marrage-transfert dans ces prot ines pour initier la translocation, qui se poursuit jusqu' ce que le translocateur rencontre une s quence d'arr t-transfert ; Dans les prot ines transmembranaires double passe, par exemple, le polypeptide peut ensuite tre lib r dans la bicouche Figure 12 42 Comment une prot ine transmembranaire passage unique avec une s quence de signal ER cliv e est int gr e dans la membrane ER. Dans cette prot ine, le processus de translocation co-traductionnelle est initi par une s quence de signal RE N-terminal (RED) qui fonctionne comme un signal de transfert, ouvrant le translocateur comme dans la figure 12-35. En plus de cette s quence de d marrage-transfert, la prot ine contient galement un arr t-transfert s quence (orange) ; Lorsque cette s quence p n tre dans le translocateur et interagit avec un site de liaison l'int rieur du pore, le translocateur s'ouvre au niveau de la couture et d charge la prot ine lat ralement dans la bicouche lipidique, o la s quence d'arr t-transfert reste pour ancrer la prot ine dans la membrane. (Dans cette figure et les deux figures qui suivent, les ribosomes ont t omis pour plus de clart .) (Figure 12 44). Dans les prot ines multipasses plus complexes, dans lesquelles de nombreuses h lices de hydrophobes s' tendent sur la bicouche, une deuxi me s quence de d marrage-transfert relance la translocation plus bas dans la cha ne polypeptidique jusqu' ce que la s quence d'arr t-transfert suivante provoque la lib rat
Biologie moléculaire de la cellule	ion de polypeptides, et ainsi de suite pour les s quences de d marrage-transfert et d'arr t-transfert suivantes (Figure 12 45 et vid o 12.5). Les s quences de signaux hydrophobes de d marrage-transfert et d'arr t-transfert agissent toutes deux pour fixer la topologie de la prot ine dans la membrane en se verrouillant dans la membrane sous forme d'h lices de couvrant la membrane ; Et ils peuvent le faire dans les deux orientations. Le fait qu'une s quence de signal hydrophobe donn e fonctionne comme une s quence de d marrage-transfert ou d'arr t-transfert doit d pendre de son emplacement dans une cha ne polypeptidique, car sa fonction peut tre commut e en changeant son emplacement dans la prot ine en utilisant des techniques d'ADN recombinant. Ainsi, la distinction entre les s quences de transfert de d part et de transfert d'arr t r sulte principalement de leur ordre relatif dans la cha ne polypeptidique en croissance. Il semble que le SRP commence balayer une cha ne polypeptidique d pli e la recherche de segments hydrophobes son extr mit N-terminale et se dirige vers l'extr mit C, dans la direction o la prot ine est synth tis e. En reconnaissant le premier segment hydrophobe appropri merger du ribosome, le SRP d finit le cadre de lecture pour l'int gration membranaire : apr s que le SRP a initi la translocation, le translocateur reconna t le segment hydrophobe appropri suivant dans la direction du transfert comme une s quence d'arr t-transfert, ce qui fait que la r gion de la cha ne polypeptidique entre les deux est enfil e travers la membrane. Un Figure 12 43 Int gration d'une prot ine transmembranaire passage unique avec une s quence de signal interne dans la membrane du RE. Une s quence de signal interne du RE qui fonctionne comme un signal de d marrage-transfert peut se lier au translocateur de l'une des deux mani res, conduisant une prot ine membranaire qui a soit son C-terminus (voie A), soit son N-terminal (voie B) dans l' re lumen. Les prot ines sont dirig es vers l'une ou l'autre voie par des caract ristiques de la cha ne polypeptidique flanquant la s quence interne de d marrage-transfert : s'il y a plus d'acides amin s charg s positivement imm diatement avant le noyau hydrophobe de la s quence de d marrage-transfert qu'il n'y en a qui le suit, la prot ine membranaire est ins r e dans le translocateur dans l'orientation indiqu e dans la voie A, tandis que s'il y a plus d'acides amin s charg s positivement imm diatement apr s le noyau hydrophobe du d but de transfert s quence qu'il y en a qui la pr c de, la prot ine membranaire est ins r e dans le translocateur dans l'orientation indiqu e dans la voie B. tant donn que la translocation ne peut pas commencer avant qu'une s quence de d marrage-transfert n'apparaisse l'ext rieur du ribosome, la translocation de la partie n-terminale de la prot ine illustr e en (B) ne peut se produire qu'apr s que cette partie a t enti rement synth tis e. notez qu'il existe deux fa ons d'ins rer une prot ine membranaire passage unique dont l'extr mit N-terminale est situ e dans la lumi re du RE : celle illustr e la figure 12-42 et celle illustr e ici (B). Le processus de balayage se poursuit jusqu' ce que toutes les r gions hydrophobes de la prot ine aient t ins r es dans la membrane sous forme d'h lices transmembranaires. Parce que les prot ines membranaires sont toujours ins r es du c t cytosolique du RE de cette mani re programm e, toutes les copies de la m me cha ne polypeptidique auront la m me orientation dans la bicouche lipidique. Cela g n re une membrane RE asym trique dans laquelle les domaines prot iques expos s d'un c t sont diff rents de ceux expos s de l'autre c t . Cette asym trie est maintenue au cours des nombreux v nements de bourgeonnement et de fusion membranaires qui transportent les prot ines fabriqu es dans le RE vers d'autres membranes cellulaires (discut es au chapitre 13). Ainsi, la fa on dont une prot ine nouvellement synth tis e est ins r e dans la membrane du RE d termine galement l'orientation de la prot ine dans toutes les autres membranes. Lorsque les prot ines sont extraites avec un d tergent d'une membrane, puis reconstitu es en v sicules lipidiques artificielles, il en r sulte g n ralement un m lange al atoire d'orientations prot iques l'envers et l'envers. Ainsi, l'asym trie prot ique observ e dans les membranes cellulaires ne semble pas tre une propri t inh rente aux prot ines, mais r sulte plut t uniquement du processus par lequel les prot ines sont ins r es dans la membrane RE partir du cytosol. Figure 12 44 Int gration d'une prot ine transmembranaire double passage avec une s quence de signal interne dans la membrane du RE. Dans cette prot ine, une s quence de signal interne du RE agit comme un signal de transfert de d part (comme dans la figure 12-43) et initie le transfert de la partie C-terminale de la prot ine. un moment donn , apr s qu'une s quence d'arr t-t
Biologie moléculaire de la cellule	ransfert a p n tr dans le translocateur, celui-ci d charge la s quence lat ralement dans la membrane. Figure 12 45 L'insertion de la prot ine membranaire multipasse rhodopsine dans la membrane du RE. La rhodopsine est la prot ine sensible la lumi re dans les cellules photor ceptrices en b tonnets de la r tine des mammif res (discut e au chapitre 15). (a) Un graphique d'hydropathie (voir figure 10-20) identifie sept courtes r gions hydrophobes dans la rhodopsine. (B) La r gion hydrophobe la plus proche de l'extr mit n-terminale sert de s quence de d marrage-transfert qui fait passer la partie n-terminale pr c dente de la prot ine travers la membrane du re. Les s quences hydrophobes subs quentes fonctionnent en alternance comme des s quences de d but-transfert et d'arr t-transfert. Les fl ches vertes indiquent les signaux de d marrage et d'arr t appari s ins r s dans le translocateur. (C) La rhodopsine int gr e finale a son n-terminal situ dans la lumi re er et son C-terminal situ dans le cytosol. Les hexagones bleus repr sentent des oligosaccharides attach s de mani re covalente. er Les prot ines ancr es la queue sont int gr es dans la membrane er par un m canisme sp cial De nombreuses prot ines membranaires importantes sont ancr es dans la membrane par une transmembrane C-terminale, hydrophobe h lice. Ces prot ines ancr es dans la queue du RE comprennent un grand nombre de sous-unit s de prot ines SNARE qui guident le trafic v siculaire (discut au chapitre 13). Lorsqu'une telle prot ine ancr e dans la queue s'ins re dans la membrane du RE partir du cytosol, seuls quelques acides amin s qui suivent l'h lice transmembranaire sur son c t C-terminal sont transloqu s dans la lumi re du RE, tandis que la majeure partie de la prot ine reste dans le cytosol. En raison de la position unique de l'h lice transmembranaire dans la s quence prot ique, la traduction se termine alors que les acides amin s C-terminaux qui formeront l'h lice transmembranaire ne sont pas encore sortis du tunnel de sortie du ribosome. La reconnaissance par le SRP n'est donc pas possible. On a longtemps pens que ces prot ines sont lib r es par le ribosome et que la queue C-terminale hydrophobe se r partit spontan ment dans la membrane du RE. Un tel m canisme ne pourrait cependant pas expliquer pourquoi les prot ines ancr es dans la queue du RE s'ins rent s lectivement dans la membrane du RE et non dans toutes les autres membranes de la cellule. Il est maintenant clair qu'il s'agit d'une machinerie de ciblage sp cialis e aliment e par l'hydrolyse de l'ATP (Figure 12 46). Bien que les composants et les d tails diff rent, ce m canisme de ciblage post-traductionnel est conceptuellement similaire au ciblage prot ique d pendant du SRP (voir Figure 12 37). Cependant, toutes les prot ines ancr es dans la queue ne sont pas ins r es dans le RE. Certaines prot ines contiennent une ancre membranaire C-terminale qui contient des informations de tri suppl mentaires qui dirigent la prot ine vers les mitochondries ou les peroxysomes. La fa on dont ces prot ines y sont tri es reste inconnue. Polypeptides transloqu s Les cha nes se plient et s'assemblent dans la lumi re de l' r rugueux De nombreuses prot ines de la lumi re du RE sont en transit, en route vers d'autres destinations ; D'autres, cependant, y r sident normalement et sont pr sents des concentrations lev es. Ces prot ines r sidentes du RE contiennent un signal de r tention du RE de quatre acides amin s leur extr mit C-terminale qui est responsable de la r tention de la prot ine dans le RE (voir le tableau 12-3, p. 648 ; discut au chapitre 13). Certaines de ces prot ines fonctionnent comme des catalyseurs qui aident les nombreuses prot ines qui sont transloqu es dans la lumi re du RE se replier et s'assembler correctement. Une prot ine r sidente importante du RE est la disulfure isom rase (PDI), qui catalyse l'oxydation des groupes sulfhydryle libres (SH) sur les cyst ines pour former des liaisons disulfure (S-S). Presque toutes les cyst ines dans les domaines prot iques expos s soit l'espace extracellulaire, soit la lumi re des organites dans les voies s cr toires et endocytaires sont li es par disulfure. En revanche, les liaisons disulfure ne se forment que tr s rarement dans les domaines expos s au cytosol, en raison de l'environnement r ducteur qui s'y trouve. Figure 12 46 Le m canisme d'insertion des prot ines ancr es dans la queue. dans cette voie post-traductionnelle pour l'insertion de prot ines membranaires du RE ancr es la queue, un complexe soluble de pr -ciblage capture l'h lice C-terminale hydrophobe apr s qu'elle ait merg du tunnel de sortie ribosomique et l'ait charg e sur l'aTpase Get3. Le complexe r sultant est cibl sur la membrane er par interaction avec le complexe r cepteur Get1 Get2 qui fonctionne comme une machine d'insertion de prot ines membranaires. une fois que Get3 a hydrolys son aTp li , la prot ine ancr e dans la queu
Biologie moléculaire de la cellule	e est lib r e du r cepteur et ins r e dans la membrane du re. La lib ration d'aDp et la liaison renouvel e d'aTp recyclent Get3 dans le cytosol. Une autre prot ine r sidente du RE est la prot ine chaperon BiP. Nous avons d j discut de la fa on dont BiP attire les prot ines post-traductionnellement dans le RE par le biais du translocateur ER Sec61. Comme d'autres chaperons (discut s au chapitre 13), BiP reconna t les prot ines mal repli es, ainsi que les sous-unit s prot iques qui ne se sont pas encore assembl es en leurs complexes oligom res finaux. Pour ce faire, il se lie des s quences d'acides amin s expos es qui seraient normalement enfouies l'int rieur de cha nes polypeptidiques correctement pli es ou assembl es. Un exemple de site de liaison BiP est un tron on d'acides amin s hydrophobes et hydrophiles altern s qui seraient normalement enterr s dans une feuille avec son c t hydrophobe orient vers le noyau hydrophobe de la prot ine repli e. Le BiP li emp che la fois la prot ine de s'agr ger et aide la maintenir dans le RE (et donc hors de l'appareil de Golgi et plus tard des parties de la voie s cr toire). Comme certains autres membres de la famille hsp70 de prot ines chaperonnes, qui se lient aux prot ines d pli es et facilitent leur importation dans les mitochondries et les chloroplastes, BiP hydrolyse l'ATP pour faire la navette entre les tats de liaison de haute et de basse affinit , ce qui lui permet de s'accrocher et de l cher ses prot ines de substrat dans un cycle dynamique. la plupart des prot ines synth tis es dans le RE brut sont glycosyl es par l'ajout d'un oligosaccharide li au N commun L'ajout covalent d'oligosaccharides aux prot ines est l'une des principales fonctions biosynth tiques du RE. Environ la moiti des prot ines solubles et membranaires qui sont trait es dans le RE y compris celles destin es au transport vers l'appareil de Golgi, les lysosomes, la membrane plasmique ou l'espace extracellulaire sont des glycoprot ines qui sont modifi es de cette mani re. De nombreuses prot ines du cytosol et du noyau sont galement glycosyl es, mais pas avec des oligosaccharides : elles portent une modification du sucre beaucoup plus simple, dans laquelle un seul groupe N-ac tylglucosamine est ajout une s rine ou une thr onine de la prot ine. Au cours de la forme la plus courante de glycosylation des prot ines dans le RE, un oligosaccharide pr curseur pr form (compos de N-ac tylglucosamine, de mannose et de glucose, et contenant un total de 14 sucres) est transf r en bloc aux prot ines. Parce que cet oligosaccharide est transf r dans le groupe NH2 cha ne lat rale d'une asparagine dans la prot ine, on dit qu'il est li l'azote ou l'asparagine (Figure 12 47A). Le transfert est catalys par un complexe enzymatique li la membrane, une prot ine avec un site de N-glycosylation Figure 12 47 Glycosylation des prot ines li es l'azote dans le RE rugueux. (a) Presque d s qu'une cha ne polypeptidique p n tre dans la lumi re du RE, elle est glycosyl e sur les acides amin s d'asparagine cibles. L'oligosaccharide pr curseur (repr sent en couleur) n'est attach qu'aux asparagines dans les s quences asnX-ser et asn-X-Thr (o X est n'importe quel acide amin sauf la proline). Ces s quences apparaissent beaucoup moins fr quemment dans les glycoprot ines que dans les prot ines cytosoliques non glycosyl es. De toute vidence, il y a eu une pression s lective contre ces s quences au cours de l' volution des prot ines, probablement parce que la glycosylation trop de sites interf rerait avec le repliement des prot ines. Les cinq sucres de la bo te grise forment la r gion centrale de cet oligosaccharide. Pour de nombreuses glycoprot ines, seuls les sucres de base survivent l'extermination extensive des oligosaccharides qui a lieu dans le Appareil de Golgi. (B) L'oligosaccharide pr curseur est transf r d'une ancre lipidique de dolichol l'asparagine en tant qu'unit intacte dans une r action catalys e par une enzyme oligosaccharyltransf rase transmembranaire. Une copie de cette enzyme est associ e chaque translocateur prot ique dans la membrane du RE. (Le translocateur n'est pas affich .) L'oligosaccharyltransf rase contient 13 h lices transmembranaires et un grand domaine lumineux RE qui contient ses sites de liaison au substrat. L'asparagine se lie un tunnel qui p n tre l'int rieur de l'enzyme. L , le groupe amino de l'asparagine est tordu hors du plan qui stabilise la liaison amide autrement peu r active, l'activant pour une r action avec le dolichol-oligosaccharide. La structure montr e est celle d'un homologue procaryote qui ressemble beaucoup la sous-unit catalytique de l'oligosaccharyle transf rase eucaryote. (code pDB : 3rCe.) l'oligosaccharyltransf rase, dont le site actif est expos du c t lum nal de la membrane du RE ; Cela explique pourquoi les prot ines cytosoliques ne sont pas glycosyl es de cette mani re. Une mol cule lipidique sp ciale app
Biologie moléculaire de la cellule	el e dolichol ancre l'oligosaccharide pr curseur dans la membrane du RE. L'oligosaccharide pr curseur est transf r l'asparagine cible en une seule tape enzymatique imm diatement apr s que cet acide amin ait atteint la lumi re du RE pendant la translocation de la prot ine. L'oligosaccharide pr curseur est li au lipide dolichol par une liaison pyrophosphate de haute nergie, qui fournit l' nergie d'activation qui entra ne la r action de glycosylation (Figure 12 47B). Une copie de l'oligosaccharyl transf rase est associ e chaque translocateur de prot ines, ce qui lui permet de scanner et de glycosyler efficacement les cha nes polypeptidiques entrantes. L'oligosaccharide pr curseur est accumul sucre par sucre sur le lipide dolichol li la membrane, puis est transf r une prot ine. Les sucres sont d'abord activ s dans le cytosol par la formation d'interm diaires nucl otidiques (UDP ou GDP)-sucre, qui donnent ensuite leur sucre (directement ou indirectement) au lipide dans une s quence ordonn e. mi-chemin de ce processus, l'oligosaccharide li aux lipides est retourn , l'aide d'un transporteur, de la face cytosolique la face lum nale de la membrane du RE (Figure 12 48). Toute la diversit des structures d'oligosaccharides li s l'azote sur les glycoprot ines matures r sulte de la modification ult rieure de l'oligosaccharide pr curseur d'origine. Alors qu'ils sont encore dans le RE, trois glucoses (voir Figure 12-47) et un mannose sont rapidement limin s des oligosaccharides de la plupart des glycoprot ines. Nous reviendrons prochainement sur l'importance de la r duction de la glyc mie. Ce rognage ou traitement des oligosaccharides se poursuit dans l'appareil de Golgi, comme nous le verrons au chapitre 13. Les oligosaccharides li s l'azote sont de loin les oligosaccharides les plus courants, se trouvant sur 90% de toutes les glycoprot ines. Moins fr quemment, les oligosaccharides sont li s au groupe hydroxyle sur la cha ne lat rale d'un acide amin s rine, thr onine ou hydroxy-lysine. Un premier sucre de ces oligosaccharides li s l'O est ajout dans le RE et l'oligosaccharide est ensuite prolong dans l'appareil de Golgi (voir Figure 13-32). bicouche lipidique de la membrane RE Figure 12 48 Synth se de l'oligosaccharide, pr curseur li aux lipides, dans la membrane rugueuse du RE. L'oligosaccharide est assembl sucre par sucre sur le lipide porteur dolichol (un polyisopr no de ; voir panneau 2-5, pp. 98-99). Le dolichol est long et tr s hydrophobe : ses 22 unit s cinq atomes de carbone peuvent couvrir plus de trois fois l' paisseur d'une bicouche lipidique, de sorte que l'oligosaccharide attach est fermement ancr dans la membrane. Le premier sucre est li au dolichol par un pont pyrophosphate. Cette liaison haute nergie active l'oligosaccharide pour son transfert ventuel du lipide une cha ne lat rale asparagine d'un polypeptide en croissance sur le c t lum nal du RE rugueux. Comme indiqu , la synth se de l'oligosaccharide commence sur le c t cytosolique de la membrane RE et se poursuit sur la face lumensale apr s que l'interm diaire lipidique (MAN)5(Glcnac)2 est retourn travers la bicouche par un transporteur (ce qui n'est pas repr sent ). Toutes les r actions de transfert de glycosyle ult rieures du c t lumenal du RE impliquent des transferts de dolichol-p-glucose et de dolichol-pmannose ; ces monosaccharides activ s et li s aux lipides sont synth tis s partir du phosphate de dolichol et de l'UDp-glucose ou du GDp-mannose (selon le cas) du c t cytosolique du RE, puis sont retourn s travers la membrane du RE. Glcnac = N-ac tylglucosamine ; homme = mannose ; Glc = glucose. Les oligosaccharides sont utilis s comme marqueurs pour marquer l' tat de repliement des prot ines On a longtemps d battu de la raison pour laquelle la glycosylation est une modification si courante des prot ines qui entrent dans le RE. Une observation particuli rement d routante a t que certaines prot ines n cessitent une glycosylation li e l'N pour un bon repliement dans le RE, mais l'emplacement pr cis des oligosaccharides attach s la surface de la prot ine ne semble pas avoir d'importance. Un indice du r le de la glycosylation dans le repliement des prot ines provient d' tudes sur deux prot ines chaperonnes du RE, appel es calnexine et calr ticuline parce qu'elles ont besoin de Ca2+ pour leurs activit s. Ces chaperons sont des prot ines liant les glucides, ou lectines, qui se lient aux oligosaccharides sur des prot ines incompl tement repli es et les retiennent dans le RE. Comme d'autres chaperons, ils emp chent les prot ines incompl tement repli es de s'agr ger de mani re irr versible. La calnexine et la calr ticuline favorisent galement l'association de prot ines incompl tement repli es avec un autre chaperon RE, qui se lie aux cyst ines qui n'ont pas encore form de liaisons disulfure. La calnexine et la calr ticuline reconnaissent les oligosaccharides li s l'azote qui
Biologie moléculaire de la cellule	contiennent un seul glucose terminal, et ne lient donc les prot ines qu'apr s que deux des trois glucoses de l'oligosaccharide pr curseur ont t limin s lors de la r duction du glucose par les glucosidases du RE. Lorsque le troisi me glucose a t limin , la glycoprot ine se dissocie de son chaperon et peut quitter le RE. Comment, alors, la calnexine et la calr ticuline distinguent-elles les prot ines correctement repli es des prot ines incompl tement repli es ? La r ponse se trouve dans une autre enzyme RE, une glucosyl transf rase qui ajoute constamment un glucose aux oligosaccharides qui ont perdu leur dernier glucose. Cependant, il n'ajoute le glucose qu'aux oligosaccharides qui sont attach s aux prot ines d pli es. Ainsi, une prot ine d pli e subit des cycles continus de r duction du glucose (par la glucosidase) et d'ajout de glucose (par la glucosyltransf rase), maintenant une affinit pour la calnexine et la calr ticuline jusqu' ce qu'elle ait atteint son tat compl tement repli (Figure 12-49). les prot ines mal repli es sont export es du re et d grad es dans le cytosol Malgr toute l'aide des chap rons, de nombreuses mol cules prot iques (plus de 80% pour certaines prot ines) transloqu es dans le RE ne parviennent pas atteindre leur tat correctement repli ou oligom re. Ces prot ines sont export es du RE dans le cytosol, o elles sont d grad es dans les prot asomes (voir le chapitre 6). bien des gards, le m canisme de r trotranslocation est similaire d'autres Figure 12 49 Le r le de la glycosylation li e l'azote dans le repliement des prot ines du RE. La calnexine, une prot ine chaperonne li e la membrane er, se lie des prot ines incompl tement repli es contenant un glucose terminal sur des oligosaccharides li s l'N, pi geant la prot ine dans le re. L' limination du glucose terminal par une glucosidase lib re la prot ine de la calnexine. Une glucosyl transf rase est l'enzyme cruciale qui d termine si la prot ine est correctement repli e ou non : si la prot ine est encore incompl tement repli e, l'enzyme transf re un nouveau glucose de l'UDp-glucose l'oligosaccharide N-li , renouvelant l'affinit de la prot ine pour la calnexine et la conservant dans le RE. Le cycle se r p te jusqu' ce que la prot ine soit compl tement repli e. La calr ticuline fonctionne de la m me mani re, sauf qu'il s'agit d'une prot ine r sidente soluble. Un autre chaperon du RE, ERP57 (non illustr ), collabore avec la calnexine et la calr ticuline pour retenir une prot ine incompl tement repli e dans le RE. ERP57 reconna t les groupes sulfhydryles libres, qui sont un signe de formation incompl te de liaisons disulfure. modes de translocation. Par exemple, comme la translocation dans les mitochondries ou les chloroplastes, les prot ines chaperonnes sont n cessaires pour maintenir la cha ne polypeptidique dans un tat d pli avant et pendant la translocation. De m me, une source d' nergie est n cessaire pour fournir une directionnalit au transport et pour attirer la prot ine dans le cytosol. Enfin, un translocateur est n cessaire. La s lection de prot ines du RE pour la d gradation est un processus difficile : les prot ines mal repli es ou les sous-unit s prot iques non assembl es doivent tre d grad es, mais pas les interm diaires de repliement des prot ines nouvellement fabriqu es. Cette distinction est facilit e par les oligosaccharides li s l'azote, qui servent de des minuteries qui mesurent le temps qu'une prot ine a pass dans le RE. L' lagage lent d'un nez d'homme particulier sur l'arbre oligosaccharide central par une enzyme (une mannosidase) dans le RE cr e une nouvelle structure oligosaccharidique que les lectines ER-lumenal de l'appareil de r trotranslocation reconnaissent. Les prot ines qui se replient et sortent du RE plus rapidement que la mannosidase peuvent liminer son mannose cible, chappant ainsi la d gradation. En plus des lectines dans le RE qui reconnaissent les oligosaccharides, les chaperons et les disulfures isom rases prot iques (enzymes mentionn es pr c demment qui catalysent la formation et la rupture des liaisons S-S) s'associent aux prot ines qui doivent tre d grad es. Les chaperons emp chent les prot ines d pli es de s'agr ger, et les disulfure isom rases brisent les liaisons disulfure qui peuvent s' tre form es de mani re incorrecte, de sorte qu'une cha ne polypeptidique lin aire peut tre transloqu e dans le cytosol. Plusieurs complexes de translocateurs d placent diff rentes prot ines de la membrane ou de la lumi re du RE vers le cytosol. Une caract ristique commune est qu'ils contiennent chacun une enzyme ubiquitine ligase E3, qui attache des marqueurs de polyubiquitine aux prot ines d pli es lorsqu'elles mergent dans le cytosol, les marquant pour la destruction. Aliment e par l' nergie d riv e de l'hydrolyse de l'ATP, une ATPase hexom rique de la famille des AAA-ATPases (voir Figure 6-85) tire la prot ine d pli e travers le translocateur dans le cytoso
Biologie moléculaire de la cellule	l. Une N-glycanase limine ses cha nes d'oligosaccharides en bloc. Guid par son tiquette ubiquitine, le polypeptide d glycosyl est rapidement introduit dans les prot asomes, o il est d grad (Figure 12 50). les prot ines mal repli es dans le re activent une r ponse prot ique d pli e Les cellules surveillent attentivement la quantit de prot ines mal repli es dans divers compartiments. Une accumulation de prot ines mal repli es dans le cytosol, par exemple, d clenche une r ponse de choc thermique (discut e au chapitre 6), qui stimule la transcription des g nes codant pour les chaperons cytosoliques qui aident replier les prot ines. De m me, une accumulation de prot ines mal repli es dans le RE d clenche une r ponse prot ique d pli e, qui comprend une transcription accrue des g nes codant pour les prot ines impliqu es dans la r trotranslocation et la d gradation des prot ines dans le cytosol, les chaperons du RE et de nombreuses autres prot ines qui aident augmenter la capacit de repliement des prot ines du RE. Figure 12 50 L'exportation et la d gradation des prot ines RE mal repli es. Les prot ines solubles mal repli es dans la lumi re du RE sont reconnues et cibl es sur un complexe translocateur dans la membrane du RE. Ils interagissent d'abord dans la lumi re du ciel avec les chaperons, les disulfures isom rases et les lectines. Ils sont ensuite export s dans le cytosol travers le translocateur. Dans le cytosol, ils sont ubiquityl s, d glycosyl s et d grad s dans les prot asomes. Les prot ines membranaires mal repli es suivent un chemin similaire mais utilisent un translocateur diff rent. Comment les prot ines mal repli es dans le RE signalent-elles au noyau ? Il existe trois voies parall les qui ex cutent la r ponse prot ique d pli e (Figure 12-51A). La premi re voie, qui a t initialement d couverte dans les cellules de levure, est particuli rement remarquable. Les prot ines mal repli es dans le RE activent une prot ine kinase transmembranaire dans le RE, appel e IRE1, qui provoque l'oligom risation et la phosphorylation de la kinase. (Certaines kinases r ceptrices de surface cellulaire dans la membrane plasmique sont activ es dans un Figure 12 51 La r ponse des prot ines d pli es. (a) Par trois voies de signalisation intracellulaires parall les, l'accumulation de prot ines mal repli es dans la lumi re du re signale au noyau d'activer la transcription des g nes qui codent pour des prot ines qui aident la cellule faire face aux prot ines mal repli es dans le re. (B) L' pissage r gul de l'ARN est un interrupteur r gulateur cl dans la voie 1 de la r ponse des prot ines d pli es (Vid o 12.6). 1 LES PROT INES MAL REPLI ES DANS LE REE SIGNALENT LA N CESSIT D'AVOIR PLUS DE CHAPERONS DU RE. ILS SE LIENT UNE KINASE TRANSMEMBRANAIRE ET L'ACTIVENT 2 LA KINASE ACTIV E D MASQUE UNE ACTIVIT ENDORIBONUCL ASE 3 L'ENDORIBONUCL ASE COUPE DES MOL CULES D'ARN SP CIFIQUES DEUX POSITIONS, SUPPRIMANT UN R GULATEUR DE TRANSCRIPTION DE L'INTRON 6 P N TRE DANS LE NOYAU ET ACTIVE LES G NES CODANT POUR LES CHAPERONS 7 LES CHAPERONS SONT FABRIQU S DANS LE RE, O ILS AIDENT REPLIER LES PROT INES 4 DEUX EXONS SONT LIGATUR S POUR FORMER UN mRNA actif 5 MARN SONT TRADUITS POUR FORMER UN R GULATEUR DE TRANSCRIPTION de la m me mani re, comme nous l'avons vu au chapitre 15.) L'oligom risation et l'autophosphorylation d'IRE1 activent un domaine endoribonucl ase dans la partie cytosolique de la m me mol cule, qui clive une mol cule d'ARNm cytosolique sp cifique deux positions, excisant un intron. (Il s'agit d'une exception unique la r gle selon laquelle les introns sont piss s alors que l'ARN est encore dans le noyau.) Les exons s par s sont ensuite reli s par une ARN ligase, g n rant un ARNm piss , qui est traduit pour produire une prot ine r gulatrice de transcription active. Cette prot ine active la transcription des g nes codant pour les prot ines qui aident m dier la r ponse prot ique d pli e (Figure 12 51B). Les prot ines mal repli es activent galement une deuxi me kinase transmembranaire dans le RE, PERK, qui inhibe un facteur d'initiation de traduction en le phosphorylant, r duisant ainsi la production de nouvelles prot ines dans toute la cellule. L'une des cons quences de la r duction de la synth se des prot ines est de r duire le flux de prot ines dans le RE, r duisant ainsi la charge de prot ines qui doivent y tre repli es. Certaines prot ines, cependant, sont pr f rentiellement traduites lorsque les facteurs d'initiation de la traduction sont rares (discut au chapitre 7, p. 424), et l'une d'entre elles est un r gulateur de transcription qui aide activer la transcription des g nes codant pour les prot ines actives dans la r ponse prot ique d pli e. Enfin, un troisi me r gulateur de transcription, ATF6, est initialement synth tis sous la forme d'une prot ine RE transmembranaire. Parce qu'il est int gr dans la membrane du RE, il ne peut pas activer la transcription des g nes dans le n
Biologie moléculaire de la cellule	oyau. Cependant, lorsque des prot ines mal repli es s'accumulent dans le RE, la prot ine ATF6 est transport e vers l'appareil de Golgi, o elle rencontre des prot ases qui coupent son domaine cytosolique, qui peut maintenant migrer vers le noyau et aider activer la transcription des g nes codant pour les prot ines impliqu es dans la r ponse prot ique d pli e. (Ce m canisme est similaire celui d crit dans la figure 12-16 pour l'activation du r gulateur de transcription qui contr le la biosynth se du cholest rol.) L'importance relative de chacune de ces trois voies dans la r ponse prot ique d pli e diff re selon les types de cellules, ce qui permet chaque type de cellule d'adapter la r ponse prot ique d pli e ses besoins particuliers. Comme nous l'avons vu au chapitre 10, plusieurs enzymes cytosoliques catalysent l'addition covalente d'une seule cha ne d'acides gras ou d'un groupe pr nyle des prot ines s lectionn es. Les lipides attach s aident diriger et attacher ces prot ines aux membranes cellulaires. Un processus connexe est catalys par des enzymes du RE qui attachent de mani re covalente un ancrage glycosylphosphatidylinositol (GPI) l'extr mit C-terminale de certaines prot ines membranaires destin es la membrane plasmique. Cette liaison se forme dans la lumi re du RE, o , en m me temps, le segment transmembranaire de la prot ine est cliv (Figure 12 52). Un grand nombre de prot ines de la membrane plasmique sont modifi es de cette mani re. Comme ils ne sont fix s l'ext rieur de la membrane plasmique que par leurs ancrages GPI, Figure 12 52 La fixation d'une ancre GPI une prot ine dans le RE. Les prot ines Gpianc es sont cibl es sur la membrane du RE par une s quence de signal n-terminale (non illustr e), qui est supprim e (voir figure 12 42). imm diatement apr s l'ach vement de la synth se prot ique, la prot ine pr curseur reste ancr e dans la membrane du re par une s quence C-terminale hydrophobe de 15 20 acides amin s ; Le reste de la prot ine se trouve dans la lumi re du RE. En moins d'une minute, une enzyme du re lib re la prot ine de son C-terminal membranaire et attache simultan ment le nouveau C-terminal un groupe amino sur un interm diaire Gpi pr assembl . La cha ne sucri re contient un inositol attach au lipide d'o l'ancre Gpi tire son nom. Il est suivi d'une glucosamine et de trois mannoses. Le mannose terminal se lie une phospho thanolamine qui fournit le groupe amino pour attacher la prot ine. Le signal qui sp cifie cette modification est contenu dans la s quence C-terminale hydrophobe et quelques acides amin s adjacents sur le c t lum nal de la membrane re ; Si ce signal est ajout d'autres prot ines, celles-ci sont galement modifi es de cette mani re. En raison de l'ancrage lipidique li de mani re covalente, la prot ine reste li e la membrane, tous ses acides amin s tant expos s initialement sur le c t lum nal du re, puis l'ext rieur de la membrane plasmique. bicouche lipidique de RE phosphatidique ils peuvent en principe tre lib r s des cellules sous forme soluble en r ponse des signaux Figure 12 53 La synth se de la phosphatidylcholine. Comme illustr , cela active une phospholipase sp cifique dans la membrane plasmique. Le phospholipide de trypanosome est synth tis partir de parasites glyc rols, par exemple, utilisent ce m canisme pour liminer leur couche de prot ines de surface 3-phosphate, cytidine-diphosphocholine ancr es GPI lorsqu'ils sont attaqu s par le syst me immunitaire. Les ancres GPI peuvent galement tre (CDp-choline), et les acides gras d livr s utilis s pour diriger les prot ines de la membrane plasmique dans les radeaux lipidiques et ainsi s parer les prot ines de liaison des acides gras cytosoliques vers le RE des autres prot ines membranaires (voir Figure 10 13). prot ine. Le re assemble la plupart des Bicouches lipidiques La membrane du RE est le site de synth se de presque toutes les grandes classes de lipides de la cellule, y compris les phospholipides et le cholest rol, n cessaires la production de nouvelles membranes cellulaires. Le principal phospholipide fabriqu est la phosphatidylcholine, qui peut tre form e en trois tapes partir de choline, de deux acides gras et de phosphate de glyc rol (Figure 12-53). Chaque tape est catalys e par des enzymes dans la membrane du RE, dont les sites actifs font face au cytosol, o se trouvent tous les m tabolites n cessaires. Ainsi, la synth se des phospholipides se produit exclusivement dans le feuillet cytosolique de la membrane du RE. Parce que les acides gras ne sont pas solubles dans l'eau, ils sont guid s de leurs sites de synth se vers le RE par une prot ine de liaison aux acides gras dans le cytosol. Apr s leur arriv e dans la membrane du RE et leur activation par le CoA, les acyltransf rases ajoutent successivement deux acides gras au phosphate de glyc rol pour produire de l'acide phosphatidique. L'acide phosphatidique est suffisamment insoluble dans l'eau
Biologie moléculaire de la cellule	pour rester dans la bicouche lipidique ; Il ne peut pas tre extrait de la bicouche par les prot ines de liaison aux acides gras. C'est donc cette premi re tape qui permet d'agrandir la bicouche lipidique du RE. Les tapes ult rieures d terminent le groupe de t te d'une mol cule lipidique nouvellement form e et donc la nature chimique de la bicouche, mais elles n'entra nent pas de croissance membranaire nette. Les deux autres phospholipides membranaires majeurs, la phosphatidyl thanolamine et la phosphatidyls rine (voir figure 10-3), ainsi que le phosphatidylinositol (PI), sont tous synth tis s de cette mani re. tant donn que la synth se des phospholipides a lieu dans le feuillet cytosolique de la bicouche lipidique du RE, il doit exister un m canisme qui transf re certaines des mol cules de phospholipides nouvellement form es vers le feuillet lumineux de la bicouche. Dans les bicouches lipidiques synth tiques, les lipides ne font pas volte-face de cette mani re (voir Figure 10-10). Dans le RE, cependant, les phospholipides s' quilibrent travers la membrane en quelques minutes, ce qui est pr s de 100 000 fois plus rapide que ce qui peut tre expliqu par une volte-face spontan e. Ce mouvement rapide de la trans-bicouche est m di par une bicouche lipidique asym trique mal caract ris e de translocateur de phospholipides de membrane plasmique appel e scramblase, qui quilibre de mani re non s lective les phospholipides entre les deux feuillets de la bicouche lipidique (Figure 12 54). Ainsi, on pense que les diff rents types de phospholipides sont r partis uniform ment entre les deux feuillets de la membrane du RE. La membrane plasmique contient un type diff rent de translocateur de phospholipides qui appartient la famille des pompes de type P (discut e au chapitre 11). Ces bascules reconnaissent sp cifiquement les phospholipides qui contiennent des groupes amin s libres dans leurs groupes de t te (phosphatidyls rine et phosphatidyl thanolamine voir Figure 10-3) et les transf rent de la foliole extracellulaire au feuillet cytosolique, en utilisant l' nergie de l'hydrolyse de l'ATP. La membrane plasmique a donc une composition phospholipidique tr s asym trique, qui est activement maintenue par les bascules (voir Figure 10 15). La membrane plasmique contient galement une scramblase mais, contrairement la scramblase RE, qui est toujours active, l'enzyme de la membrane plasmique est r gul e et n'est activ e que dans certaines situations, comme dans l'apoptose et dans les plaquettes activ es, o elle agit pour abolir l'asym trie de la bicouche lipidique ; L'exposition r sultante de la phosphatidyls rine la surface des cellules apoptotiques sert de signal aux cellules phagocytaires pour ing rer et d grader la cellule morte. Le RE produit galement du cholest rol et des c ramides (Figure 12-55). Le c ramide est fabriqu en condensant l'acide amin s rine avec un acide gras pour former l'aminoalcool sphingosine (voir Figure 10-3) ; un deuxi me gras L'acide est ensuite ajout de mani re covalente pour former des c ramides. Le c ramide est export vers l'appareil de Golgi, o il sert de pr curseur pour la synth se de deux types de lipides : des cha nes d'oligosaccharides sont ajout es pour former des glycosphingolilipides (glycolipides ; voir figure 10-16), et les groupes de t te de phosphocholine sont transf r s de la phosphatidylcholine d'autres mol cules de c ramide pour former de la sphingomy line (voir le chapitre 10). Ainsi, les glycolipides et la sphingomy line sont produits relativement tard dans le processus de synth se membranaire. Parce qu'ils sont produits par des enzymes dont les sites actifs sont expos s la lumi re de Golgi, ils se trouvent exclusivement dans le feuillet non cytosolique des bicouches lipidiques qui les contiennent. Figure 12 54 Le r le des translocateurs de phospholipides dans la synth se des bicouches lipidiques. (a) tant donn que de nouvelles mol cules lipidiques ne sont ajout es qu' la moiti cytosolique de la bicouche de la membrane du RE et que les mol cules lipidiques ne basculent pas spontan ment d'une monocouche l'autre, un translocateur de phospholipides transmembranaire (appel scramblase) est n cessaire pour transf rer les mol cules lipidiques de la moiti cytosolique la moiti lumenale, de sorte que la membrane se d veloppe comme une bicouche. Le scramblase n'est pas sp cifique des groupes particuliers de phospholipides de t te et quilibre donc les diff rents phospholipides entre les deux monocouches. (B) aliment e par l'hydrolyse de l'aTp, une flippase sp cifique au groupe de t te dans la membrane plasmique retourne activement la phosphatidyls rine et la phosphatidyl thanolamine de mani re directionnelle de l'extracellulaire au feuillet cytosolique, cr ant la bicouche lipidique asym trique caract ristique de la membrane plasmique des cellules animales (voir figure 10-15). Figure 12 55 La structure des c ramides. Comme nous l'avons vu au
Biologie moléculaire de la cellule	chapitre 13, la membrane plasmique et les membranes de l'appareil de Golgi, des lysosomes et des endosomes font toutes partie d'un syst me membranaire qui communique avec le RE au moyen de v sicules de transport, qui transf rent la fois des prot ines et des lipides. Les mitochondries et les plastes, cependant, n'appartiennent pas ce syst me, et ils n cessitent donc des m canismes diff rents pour importer des prot ines et des lipides pour la croissance. Nous avons d j vu qu'ils importent la plupart de leurs prot ines du cytosol. Bien que les mitochondries modifient une partie des lipides qu'elles importent, elles ne synth tisent pas les lipides de novo ; au lieu de cela, leurs lipides doivent tre import s du RE, soit directement, soit indirectement par le biais d'autres membranes cellulaires. Dans les deux cas, des m canismes sp ciaux sont n cessaires pour le transfert. Les d tails de la fa on dont la distribution des lipides entre les diff rentes membranes est catalys e et r gul e ne sont pas connus. On pense que les prot ines porteuses hydrosolubles appel es prot ines changeuses de phospholipides (ou prot ines de transfert de phospholipides) transf rent des mol cules de phospholipides individuelles entre les membranes, fonctionnant un peu comme les prot ines de liaison aux acides gras qui guident les acides gras travers le cytosol (voir Figure 12-54). De plus, les mitochondries sont souvent observ es en juxtaposition troite avec les membranes du RE dans les micrographies lectroniques, et des complexes de jonctions sp cifiques ont t identifi s qui maintiennent le RE et la membrane mitochondriale externe proximit . On pense que ces complexes de jonctions fournissent des m canismes sp cifiques de transfert de lipides d pendants du contact qui op rent entre ces membranes adjacentes. Le vaste r seau RE sert d'usine pour la production de presque tous les lipides de la cellule. De plus, une grande partie de la synth se prot ique de la cellule se produit la surface cytosolique du RE rugueux : pratiquement toutes les prot ines destin es la s cr tion ou au RE lui-m me, l'appareil de Golgi, aux lysosomes, aux endosomes et la membrane plasmique sont d'abord import es dans le RE partir du cytosol. Dans la lumi re du RE, les prot ines se replient et s'oligom risent, des liaisons disulfure se forment et des oligosaccharides li s l'azote sont ajout s. Le mod le de glycosylation li e l'N est utilis pour indiquer l' tendue du repliement des prot ines, de sorte que les prot ines ne quittent le RE que lorsqu'elles sont correctement repli es. Les prot ines qui ne se replient pas ou ne s'oligom risent pas correctement sont retransloqu es dans le cytosol, o elles sont d glycosyl es, polyubiquityl es et d grad es dans les prot asomes. Si les prot ines mal repli es s'accumulent en exc s dans le RE, elles d clenchent une r ponse prot ique d pli e, qui active les g nes appropri s dans le noyau pour aider le RE faire face. Seules les prot ines qui portent une s quence de signal sp ciale du RE sont import es dans le RE. La s quence de signaux est reconnue par une particule de reconnaissance du signal (SRP), qui se lie la fois la cha ne polypeptidique en croissance et au ribosome et les dirige vers une prot ine r ceptrice la surface cytosolique de la membrane rugueuse du RE. Cette liaison la membrane du RE initie le processus de translocation qui enfile une boucle de cha ne polypeptidique travers la membrane du RE travers le pore hydrophile d'un translocateur de prot ines. Les prot ines solubles, destin es la lumi re du RE, la s cr tion ou au transfert la lumi re d'autres organites, passent compl tement dans la lumi re du RE. Les prot ines transmembranaires destin es au RE ou d'autres membranes cellulaires sont transloqu es mi-chemin de la membrane du RE et y restent ancr es par un ou plusieurs segments -h lico daux couvrant la membrane dans leurs cha nes polypeptidiques. Ces parties hydrophobes de la prot ine peuvent agir comme des signaux de transfert de d but ou d'arr t de transfert pendant le processus de translocation. Lorsqu'un polypeptide contient plusieurs signaux altern s de transfert de d but et d'arr t, il passera plusieurs fois d'avant en arri re travers la bicouche en tant que prot ine transmembranaire multipasse. L'asym trie de l'insertion des prot ines et de la glycosylation dans le RE tablit la sidedness des membranes de tous les autres organites que le RE alimente en prot ines membranaires. Comment les r cepteurs d'importation nucl aire n gocient-ils si efficacement l'int rieur enchev tr d'un complexe de pores nucl aires ? Le complexe de pores nucl aires est-il une structure rigide ou peut-il se dilater et se contracter, en fonction de la cargaison transport e ? Les comparaisons de s quences montrent que les s quences de signal d'une prot ine individuelle telle que l'insuline sont assez conserv es entre les esp ces, beaucoup plus que ce quoi on pou
Biologie moléculaire de la cellule	rrait s'attendre d'apr s notre compr hension actuelle selon laquelle tout ce qui compte pour leur fonction sont des caract ristiques structurelles g n rales telles que l'hydrophobie. Quelles autres fonctions les s quences de signaux pourraient-elles avoir pour expliquer leur conservation de s quences volutives ? Comment les polyribosomes sur la membrane du r ticulum endoplasmique sont-ils dispos s de mani re ce que le prochain ribosome initiateur trouve un translocateur inoccup ? Pourquoi la particule de reconnaissance du signal a-t-elle une sous-unit d'ARN indispensable ? Quelles d clarations sont vraies ? Expliquez pourquoi ou pourquoi pas. 12 1 Comme la lumi re du RE, l'int rieur du noyau est topologiquement quivalent l'ext rieur de la cellule. Les ribosomes 12-2 li s au RE et les ribosomes libres, qui sont structurellement et fonctionnellement identiques, ne diff rent que par les prot ines qu'ils fabriquent un moment donn . Pour viter les collisions in vitables qui se produiraient si la circulation dans les deux sens travers un seul pore tait autoris e, les complexes de pores nucl aires sont sp cialis s, de sorte que certains servent de m diateurs pour l'importation tandis que d'autres servent de m diateurs pour l'exportation. Les peroxysomes 12 4 ne se trouvent que dans quelques types sp cialis s de cellules eucaryotes. Discutez des probl mes suivants.12 5 Quel est le devenir d'une prot ine sans signal de tri ? 12 6 Le RE rugueux est le site de synth se de nombreuses classes de prot ines membranaires. Certaines de ces prot ines restent dans le RE, tandis que d'autres sont tri es dans des compartiments tels que l'appareil de Golgi, les lysosomes et les la membrane plasmique. L'une des mesures de la difficult du probl me de tri est le degr de purification qui doit tre atteint pendant le transport partir de l'ER. Les prot ines li es la membrane plasmique sont-elles communes ou rares parmi toutes les prot ines de la membrane du RE ? Quelques consid rations simples permettent de r pondre cette question. Dans une cellule en croissance typique qui se divise une fois toutes les 24 heures, l' quivalent d'une nouvelle membrane plasmique doit traverser le RE chaque jour. Si la membrane du RE fait 20 fois l'aire d'une membrane plasmique, quel est le rapport entre les prot ines de la membrane plasmique et les autres prot ines membranaires du RE ? (Supposons que toutes les prot ines en route vers la membrane plasmique restent dans le RE pendant 30 minutes en moyenne avant d'en sortir, et que le rapport prot ines/lipides dans le RE et les membranes plasmiques est le m me.) Avant que les complexes de pores nucl aires ne soient bien compris, il n' tait pas clair si les prot ines nucl aires se diffusaient passivement dans le noyau et s'y accumulaient en se liant aux r sidents du noyau tels que les chromosomes, ou si elles taient activement import es et accumul es ind pendamment de leur affinit pour les composants nucl aires. Une exp rience classique qui a abord ce probl me a utilis plusieurs formes de nucl oplasmine radioactive, qui est une grande prot ine pentam re impliqu e dans l'assemblage de la chromatine. Dans cette exp rience, soit la prot ine intacte, soit les t tes, les queues ou les t tes avec une seule queue de nucl oplasmine ont t inject es dans le cytoplasme d'un ovocyte de grenouille ou dans le noyau (Figure Q12 1). Toutes les formes de nucl oplasmine, l'exception des t tes, se sont accumul es dans le noyau lorsqu'elles ont t inject es dans le cytoplasme, et toutes les formes ont t retenues dans le noyau lorsqu'elles y ont t inject es. Un. Quelle partie de la mol cule de nucl oplasmine est responsable de la localisation dans le noyau ? cytoplasmine nucl aire de la nucl oplasmine Figure Q12 1 Pr paration cellulaire : injection, lieu d'injection des composants de la nucl oplasmine inject s (probl me 12 7). Les sch mas d'autoradiographie montrent le cytoplasme et le noyau, l'emplacement de la nucl oplasmine tant indiqu par les zones rouges. B. Comment ces exp riences distinguent-elles le transport actif, dans lequel un signal de localisation nucl aire d clenche le transport par le complexe de pores nucl aires, et la diffusion passive, dans laquelle un site de liaison pour un composant nucl aire permet l'accumulation dans le noyau ? En supposant que 32 millions d'octam res d'histones sont n cessaires pour emballer le g nome humain, combien de mol cules de his-tone doivent tre transport es par seconde par complexe de pores nucl aires dans les cellules dont les noyaux contiennent 3000 pores nucl aires et se divisent une fois par jour ? 12 9 Le complexe de pores nucl aires (NPC) cr e une barri re au libre change de mol cules entre le noyau et le cytosol, mais d'une mani re qui reste myst rieuse. Chez la levure, par exemple, le pore central du NPC a un diam tre de 35 nm et mesure 30 nm de long, ce qui est un peu plus petit que son homologue vert br . Malg
Biologie moléculaire de la cellule	r cela, il est suffisamment grand pour accueillir pratiquement tous les composants du cytosol. Pourtant, le pore ne permet une diffusion passive des mol cules que jusqu' environ 40 kd ; L'entr e de tout ce qui est plus grand n cessite l'aide d'un r cepteur d'importation nucl aire. La perm abilit s lective est contr l e par les composants prot iques de la NPC qui ont des queues polaires non structur es s' tendant dans le pore central. Ces queues sont caract ris es par des r p titions p riodiques des acides amin s hydrophobes ph nylalanine (F) et glycine (G). une concentration suffisamment lev e (~50 mM), les domaines de r p tition FG de ces prot ines peuvent former un gel, avec un r seau d'interactions entre les r p titions FG hydrophobes (Figure Q12 2A). Ces gels permettent la diffusion passive de petites mol cules, mais ils emp chent l'entr e de prot ines plus grandes telles que la prot ine fluorescente mCherry fusionn e la prot ine de liaison au maltose (MBP) (Figure Q12 2B). (La fusion avec MBP rend mCherry trop grand pour entrer dans le noyau par diffusion passive.) Cependant, si le r cepteur nucl aire d'importation, l'importine, est fusionn une prot ine similaire, MBP-GFP, la fusion importine-MBP-GFP p n tre facilement dans le gel (figure Q12 2B). Figure Q12 2 : gel fG-repeat et afflux de prot ines dans le noyau (probl me 12 9). (a) Dessin anim du r seau (gel) form par des interactions par paires entre des r p titions fG hydrophobes. pour les r p titions fG S par par 17 acides amin s, comme c'est typique, le maillage form par des cha nes lat rales d'acides amin s tendues correspondrait environ 4 nm sur un c t , ce qui serait assez grand pour tenir compte de la diffusion passive caract ristique des prot ines travers les pores nucl aires. (B) Diffusion de mBp-mCherry et d'importin-mBp-Gfp dans un gel de r p titions fG. Dans chaque groupe, la solution est repr sent e gauche et le gel droite. Les zones claires indiquent les r gions qui contiennent les prot ines fluorescentes. R. Les r p titions FG ne forment des gels in vitro qu' une concentration relativement lev e (50 mM). Cette concentration est-elle raisonnable pour les r p titions FG dans le noyau NPC ? Dans la levure, il y a environ 5000 r p titions FG dans chaque NPC. tant donn les dimensions du pore nucl aire de la levure (35 nm de diam tre et 30 nm de longueur), calculez la concentration de r p titions FG dans le volume cylindrique du pore. Cette concentration est-elle comparable celle utilis e in vitro ? B. Une deuxi me question est de savoir si la diffusion de l'importin-MBP-GFP travers le gel FG-repeat est suffisamment rapide pour tenir compte de l' coulement efficace des mat riaux entre le noyau et le cytosol. D'apr s des exp riences du type de celles illustr es la figure Q12-2B, le coefficient de diffusion (D) de l'importin-MBP-GFP travers le gel de r p tition FG a t d termin environ 0,1 m2/s. L' quation de la diffusion est t = x2/2D, o t est le temps et x la distance. Calculez le temps qu'il faudrait l'importin-MBP-GFP pour diffuser travers un pore nucl aire de levure (30 nm) si le pore tait constitu d'un gel de r p titions FG. Ce temps semble-t-il assez rapide pour les besoins d'une cellule eucaryote ? 12 10 Les composants des complexes TIM, les translocateurs prot iques multi-sous-unitaires dans la membrane interne mitochondriale, sont beaucoup moins abondants que ceux du complexe TOM. Ils ont d'abord t identifi s l'aide d'une astuce g n tique. Le g ne Ura3 de la levure, dont le produit est une enzyme normalement situ e dans le cytosol o il est essentiel la synth se de l'uracile, a t modifi de sorte que la prot ine porte un signal d'importation pour la matrice mitochondriale. Une population de cellules portant le g ne Ura3 modifi la place du g ne normal a ensuite t cultiv e en l'absence d'uracile. La plupart des cellules sont mortes, mais les rares cellules qui se sont d velopp es se sont r v l es d fectueuses pour l'importation mitochondriale. Expliquez comment cette s lection identifie les cellules pr sentant des d fauts dans les composants n cessaires l'importation dans la matrice mitochondriale. Pourquoi les cellules normales avec le g ne Ura3 modifi ne se d veloppent-elles pas en l'absence d'uracile ? Pourquoi les cellules qui ne sont pas adapt es l'importation mitochondriale se d veloppent-elles en l'absence d'uracile ? 12 11 Si l'enzyme dihydrofolate r ductase (DHFR), qui se trouve normalement dans le cytosol, est con ue pour porter une s quence de ciblage mitochondrial son extr mit N-terminale, elle est efficacement import e dans les mitochondries. Si le DHFR modifi est d'abord incub avec du m thotrexate, qui se lie troitement au site actif, l'enzyme reste dans le cytosol. Comment pensez-vous que la liaison du m thotrexate interf re avec l'importation mitochondriale ? Pourquoi les mitochondries ont-elles besoin d'un translocateur sp cial pour importe

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