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Biologie moléculaire de la cellule	e suivante sous le num ro de fraction Regroupez ces fractions et appliquez-les la colonne suivante en dessous Regroupez ces fractions, qui contiennent maintenant la prot ine hautement purifi e Les tiquettes g n tiquement modifi es offrent un moyen facile de purifier les prot ines En utilisant les m thodes de l'ADN recombinant discut es dans les sections suivantes, n'importe quel g ne peut tre modifi pour produire sa prot ine avec une tiquette de reconnaissance sp ciale attach e celle-ci, de sorte que la purification ult rieure de la prot ine est simple et rapide. Souvent, l' tiquette de reconnaissance est elle-m me un d terminant antig nique, ou pitope, qui peut tre reconnu par un anticorps hautement sp cifique. L'anticorps peut ensuite tre utilis pour purifier la prot ine par chromatographie d'affinit ou immunopr cipitation (Figure 8 11). D'autres types de marqueurs sont sp cialement con us pour la purification des prot ines. Par exemple, une s quence r p t e de l'acide amin histidine se lie certains ions m talliques, notamment le nickel et le cuivre. Si des techniques de g nie g n tique sont utilis es pour attacher une courte cha ne d'histidines une extr mit d'une prot ine, la prot ine l g rement modifi e peut tre retenue s lectivement sur une colonne d'affinit contenant des ions nickel immobilis s. La chromatographie d'affinit m tallique peut ainsi tre utilis e pour purifier la prot ine modifi e partir d'un m lange mol culaire complexe. Figure 8 10 Purification des prot ines par chromatographie. R sultats typiques obtenus lorsque trois tapes chromatographiques diff rentes sont utilis es successivement pour purifier une prot ine. Dans cet exemple, un homog nat de cellules a d'abord t fractionn en lui permettant de percoler travers une r sine changeuse d'ions emball e dans une colonne (A). La colonne a t lav e pour liminer tous les contaminants non li s, et les prot ines li es ont ensuite t lu es en versant une solution contenant une concentration de sel augmentant progressivement sur le dessus de la colonne. Les prot ines ayant la plus faible affinit pour la r sine changeuse d'ions passaient directement travers la colonne et taient collect es dans les premi res fractions lu es du fond de la colonne. Les prot ines restantes ont t lu es en s quence en fonction de leur affinit pour la r sine ces prot ines se liant le plus troitement la r sine n cessitant la plus forte concentration de sel pour les liminer. La prot ine d'int r t a t lu e en plusieurs fractions et a t d tect e par son activit enzymatique. Les fractions ayant de l'activit ont t regroup es puis appliqu es sur une colonne de filtration sur gel (B). La position d' lution de la prot ine encore impure a de nouveau t d termin e par son activit enzymatique, et les fractions actives ont t regroup es et purifi es jusqu' homog n it sur une colonne d'affinit (C) contenant un substrat immobilis de l'enzyme. Purification rapide de la prot ine marqu e et de toute prot ine associ e Figure 8 11 Marquage d' pitopes pour la purification des prot ines. En utilisant des techniques standard de g nie g n tique, une courte tiquette peptidique peut tre ajout e une prot ine d'int r t. Si l' tiquette est elle-m me un d terminant antig nique, ou pitope, elle peut tre cibl e par un anticorps appropri , qui peut tre utilis pour purifier la prot ine par immunopr cipitation ou chromatographie d'affinit . Dans d'autres cas, une prot ine enti re est utilis e comme tiquette de reconnaissance. Lorsque les cellules sont modifi es pour synth tiser la petite enzyme glutathion S-transf rase (GST) attach e une prot ine d'int r t, la prot ine de fusion r sultante peut tre purifi e partir du reste du contenu de la cellule avec une colonne d'affinit contenant du glutathion, une mol cule de substrat qui se lie sp cifiquement et troitement la GST. Dans le cadre d'un raffinement suppl mentaire des m thodes de purification l'aide d' tiquettes de reconnaissance, une s quence d'acides amin s qui forme un site de clivage pour une enzyme prot olytique hautement sp cifique peut tre modifi e entre la prot ine choisie et l' tiquette de reconnaissance. tant donn que les s quences d'acides amin s au site de clivage sont tr s rarement trouv es par hasard dans les prot ines, l' tiquette peut ensuite tre cliv e sans d truire la prot ine purifi e. Ce type de clivage sp cifique est utilis dans une m thodologie de purification particuli rement puissante connue sous le nom de marquage de purification par affinit en tandem (TAP-tagging). Ici, une extr mit d'une prot ine est con ue pour contenir deux marqueurs de reconnaissance s par s par un site de clivage de la prot ase. L' tiquette l'extr mit de la construction est choisie pour se lier de mani re irr versible une colonne d'affinit , ce qui permet la colonne d' tre lav e en profondeur pour liminer toutes les prot ines contaminantes. Le clivag
Biologie moléculaire de la cellule	e de la prot ase lib re ensuite la prot ine, qui est ensuite purifi e l'aide de la deuxi me balise. Parce que cette strat gie en deux tapes fournit un degr particuli rement lev de purification des prot ines avec relativement peu d'effort, elle est largement utilis e en biologie cellulaire. Ainsi, par exemple, un ensemble d'environ 6000 souches de levure, chacune avec un g ne diff rent fusionn l'ADN qui code pour une tiquette TAP, a t construit pour permettre toute prot ine de levure d' tre rapidement purifi e. Des syst mes acellulaires purifi s sont n cessaires pour la dissection pr cise des fonctions mol culaires Les syst mes acellulaires purifi s offrent un moyen d' tudier les processus biologiques exempts de toutes les r actions secondaires complexes qui se produisent dans une cellule vivante. Pour rendre cela possible, les homog nats cellulaires sont fractionn s dans le but de purifier chacune des macromol cules individuelles n cessaires pour catalyser un processus biologique d'int r t. Par exemple, les exp riences visant d chiffrer les m canismes de synth se des prot ines ont commenc avec un homog nat cellulaire capable de traduire les mol cules d'ARN en produire des prot ines. Le fractionnement de cet homog nat, tape par tape, a produit son tour les ribosomes, les ARNt et diverses enzymes qui constituent ensemble la machinerie prot ique-synth tique. Une fois que les composants purs individuels taient disponibles, chacun pouvait tre ajout ou conserv s par ment pour d finir son r le exact dans le processus global. L'un des principaux objectifs des biologistes cellulaires est la reconstitution de chaque processus biologique dans un syst me purifi sans cellule. Ce n'est qu'ainsi que nous pouvons d finir tous les composants n cessaires au processus et contr ler leurs concentrations, ce qui est n cessaire pour d terminer leur m canisme d'action pr cis. Bien qu'il reste encore beaucoup faire, une grande partie de ce que nous savons aujourd'hui sur la biologie mol culaire de la cellule a t d couverte par des tudes dans de tels syst mes acellulaires. Ils ont t utilis s, par exemple, pour d chiffrer les d tails mol culaires de la r plication et de la transcription de l'ADN, de l' pissage de l'ARN, de la traduction des prot ines, de la contraction musculaire et du transport des particules le long des microtubules, et de nombreux autres processus qui se produisent dans les cellules. Les populations de cellules peuvent tre analys es biochimiquement en les perturbant et en fractionnant leur contenu, ce qui permet de d velopper des syst mes fonctionnels sans cellules. Des syst mes acellulaires hautement purifi s sont n cessaires pour d terminer les d tails mol culaires de processus cellulaires complexes, et le d veloppement de tels syst mes n cessite une purification extensive de toutes les prot ines et autres composants impliqu s. Les prot ines contenues dans les extraits cellulaires solubles peuvent tre purifi es par chromatographie sur colonne ; Selon le type de matrice de colonne, les prot ines biologiquement actives peuvent tre s par es en fonction de leur poids mol culaire, de leur hydrophobie, de leurs caract ristiques de charge ou de leur affinit pour d'autres mol cules. Dans une purification typique, l' chantillon est pass travers plusieurs colonnes diff rentes tour de r le, les fractions enrichies obtenues partir d'une colonne tant appliqu es la suivante. Les techniques d'ADN recombinant (d crites plus loin) permettent d'attacher des tiquettes de reconnaissance sp ciales aux prot ines, simplifiant ainsi consid rablement leur purification. Les prot ines effectuent la plupart des processus cellulaires : elles catalysent les r actions m taboliques, utilisent l'hydrolyse des nucl otides pour effectuer un travail m canique et servent d' l ments structurels majeurs de la cellule. La grande vari t de structures et de fonctions prot iques a stimul le d veloppement d'une multitude de techniques pour les tudier. Les prot ines poss dent g n ralement une charge nette positive ou n gative, en fonction du m lange d'acides amin s charg s qu'elles contiennent. Un champ lectrique appliqu une solution contenant une mol cule de prot ine provoque la prot ine de migrer un rythme qui d pend de sa charge nette, de sa taille et de sa forme. L'application la plus populaire de cette propri t est l' lectrophor se sur polyacrylamide-gel SDS (SDS-PAGE). Il utilise un gel hautement r ticul de polyacrylamide comme matrice inerte travers laquelle les prot ines migrent. Le gel est pr par par polym risation de monom res ; La taille des pores du gel peut tre ajust e de mani re ce qu'elle soit suffisamment petite pour retarder la migration des mol cules de prot ines d'int r t. Les prot ines sont dissoutes dans une solution qui comprend un puissant d tergent charg n gativement, le dod cylsulfate de sodium ou SDS (Figure 8 12). Parce que ce d tergent se lie aux r gions hy
Biologie moléculaire de la cellule	drophobes des mol cules de prot ines, les faisant se d plier en cha nes polypeptidiques tendues, les mol cules de prot ines individuelles sont lib r es de leurs associations avec d'autres prot ines ou mol cules lipidiques et rendues librement solubles dans la solution d tergente. De plus, un agent r ducteur tel que le -mercapto thanol (voir Figure 8-12) est g n ralement ajout pour rompre toute liaison S-S dans les prot ines, de sorte que tous les polypeptides constitutifs des prot ines multisous-unitaires puissent tre analys s s par ment. Que se passe-t-il lorsqu'un m lange de prot ines solubilis es par SDS est pass travers une plaque de gel de polyacrylamide ? Chaque mol cule de prot ine se lie un grand nombre de mol cules d tergentes charg es n gativement, qui masquent la charge intrins que de la prot ine et la font migrer vers l' lectrode positive lorsqu'une tension est appliqu e. Les prot ines de m me taille ont tendance se d placer travers le gel des vitesses similaires parce que (1) leur structure native est compl tement d pli e par le SDS, de sorte que leurs formes sont identiques, et (2) elles lient la m me quantit de SDS et ont donc la m me quantit de charge n gative. Les prot ines plus grosses, avec plus de charge, sont soumises des forces lectriques plus importantes, mais aussi une tra n e plus importante. En solution libre, les deux effets s'annuleraient, mais, dans le maillage du gel de polyacrylamide, qui agit comme un tamis mol culaire, les grosses prot ines sont beaucoup plus retard es que les petites. En cons quence, un m lange complexe de prot ines est fractionn en une s rie de bandes prot iques discr tes dispos es par ordre de poids mol culaire (Figure 8 13). Les principales prot ines sont facilement d tect es en colorant les prot ines du gel avec un colorant tel que le bleu de Coomassie. M me des prot ines mineures sont observ es dans les gels trait s avec une coloration l'argent, de sorte que aussi peu que 10 ng de prot ines peuvent tre d tect s dans une bande. certaines fins, des prot ines sp cifiques peuvent galement tre marqu es avec un marqueur d'isotopes radioactifs ; L'exposition du gel un film donne lieu une autoradiographie sur laquelle les prot ines marqu es sont visibles (voir figure 8 16). SDS-PAGE est largement utilis car il peut s parer tous les types de prot ines, y compris celles qui sont normalement insolubles dans l'eau, comme les nombreuses prot ines dans les membranes. Et parce que la m thode s pare les polypeptides par taille, elle fournit des informations sur le poids mol culaire et la composition en sous-unit s des prot ines. La figure 8-14 pr sente une photographie d'un gel qui a t utilis pour analyser chacune des tapes successives de la purification d'une prot ine. tant donn que diff rentes prot ines peuvent avoir des tailles, des formes, des masses et des charges globales similaires, la plupart des techniques de s paration telles que l' lectrophor se sur gel de polyacrylamide SDS ou la chromatographie d' change d'ions ne peuvent g n ralement pas s parer toutes les prot ines Figure 8 12 Le d tergent dod cylsulfate de sodium (SDS) et l'agent r ducteur -mercapto thanol. Ces deux produits chimiques sont utilis s pour solubiliser les prot ines pour l' lectrophor se sur polyacrylamide-gel SDS. Le SDS est pr sent ici sous sa forme ionis e. chantillon charg sur une prot ine de gel avec deux sous-unit s de pipette, A et B, reli es par une prot ine de pont sous-unit unique de disulfde Figure 8 13 lectrophor se sur polyacrylamide-gel SDS (SDS-PAGe). (A) Un appareil d' lectrophor se. (B) Les cha nes polypeptidiques individuelles forment un complexe avec des mol cules charg es n gativement de dod cylsulfate de sodium (SDS) et migrent donc en tant que complexe SDS-prot ine charg n gativement travers un gel poreux de polyacrylamide. tant donn que la vitesse de migration dans ces conditions est d'autant plus grande que le polypeptide est petit, cette technique peut tre utilis e pour d terminer le poids mol culaire approximatif d'une cha ne polypeptidique comme A ainsi que la composition en sous-unit s d'une prot ine. Cependant, si la prot ine contient une grande quantit de glucides, elle se d placera anormalement sur le gel et son poids mol culaire apparent sera estim par SDS-PAGE sera trompeuse. D'autres modifications, telles que la phosphorylation, peuvent galement provoquer de petits changements dans la migration d'une prot ine dans le gel. plaque de gel de polyacrylamide dans une cellule ou m me dans un organite. En revanche, l' lectrophor se sur gel bidimensionnelle, qui combine deux proc dures de s paration diff rentes, peut r soudre jusqu' 2000 prot ines sous la forme d'une carte prot ique bidimensionnelle. Dans un premier temps, les prot ines sont s par es par leurs charges intrins ques. L' chantillon est dissous dans un petit volume d'une solution contenant un d tergent non ionique (non charg ), avec du
Biologie moléculaire de la cellule	-mercapto thanol et l'ur e, un r actif d naturant. Cette solution solubilise, d nature et dissocie toutes les cha nes polypeptidiques mais laisse leur charge intrins que inchang e. Les cha nes polypeptidiques sont ensuite s par es dans un gradient de pH par une proc dure appel e focalisation iso lectrique, qui tire parti de la variation de la charge nette sur une mol cule prot ique avec le pH de sa solution environnante. Chaque prot ine a un point iso lectrique caract ristique, le pH auquel la prot ine n'a pas de charge nette et ne migre donc pas dans un champ lectrique. Dans la focalisation iso lectrique, les prot ines sont s par es lectrophor tiquement dans un tube troit de gel de polyacrylamide dans lequel un gradient de pH est tabli par un m lange de tampons sp ciaux. Chaque prot ine se d place vers une position dans le gradient qui Figure 8 14 Analyse d' chantillons de prot ines par lectrophor se sur polyacrylamide SDS. La photographie montre un gel color Coomassie qui a t utilis pour d tecter les prot ines pr sentes aux tapes successives de la purification d'une enzyme. La voie la plus gauche (voie 1) contient le m lange complexe de prot ines dans l'extrait de cellule de d part, et chaque voie suivante analyse les prot ines obtenues apr s un fractionnement chromatographique de l' chantillon de prot ine analys dans la voie pr c dente (voir Figure 8-10). La m me quantit totale de prot ines (10 g) a t charg e sur le gel en haut de chaque voie. Les prot ines individuelles apparaissent normalement sous la forme de bandes pointues et color es par un colorant ; Cependant, une bande s' largit lorsqu'elle contient une grande quantit de prot ines. (Extrait de T. Formosa et B.M. Alberts, J. Biol. Chem. 261:6107 6118, 1986.) masse(daltons)100,00040,00015,000 Figure 8 15 S paration des mol cules de prot ines par des focusing.at iso lectriques pH faible, faible pH (concentration lev e de H+), les groupes d'acide carboxylique prot ique charg s des prot ines ont tendance tre dans l'exemple iso lectrique, -NH3+), donnant la plupart des prot ines point, la prot ine une charge positive nette. pH lev , les groupes et donc aucun groupe acide carboxylique sont n gativement pH lev , charg s ( COO ) et les groupes basiques le feld lectrique ; ont tendance tre non charg es (par exemple, NH2), pour la prot ine donnant la plupart des prot ines une charge n gative nette. montr , la prot ine son pH iso lectrique, une prot ine n'a pas de charge nette de 6,5 puisque les charges positives et n gatives s' quilibrent. Ainsi, lorsqu'un tube contenant un gradient de pH fixe est soumis un fort champ lectrique dans la direction appropri e, chaque esp ce de prot ine migre jusqu' ce qu'elle forme une bande pointue son iso lectrique correspond son point iso lectrique et y reste (Figure 8 15). Il s'agit du pH, comme indiqu . Premi re dimension de l' lectrophor se bidimensionnelle sur polyacrylamide-gel. Dans la deuxi me tape, le gel tubulaire troit contenant les prot ines s par es est nouveau soumis l' lectrophor se, mais dans une direction perpendiculaire la direction utilis e dans la premi re tape. Cette fois, le SDS est ajout , et les prot ines se s parent en fonction de leur taille, comme dans le SDS-PAGE unidimensionnel : le gel tubulaire original est tremp dans du SDS puis plac le long du bord sup rieur d'une plaque de gel de polyacrylamide SDS, travers laquelle chaque cha ne polypeptidique migre pour former un point discret. Il s'agit de la deuxi me dimension de l' lectrophor se bidimensionnelle sur polyacrylamide-gel. Les seules prot ines qui n'ont pas t r solues sont celles qui ont la fois des tailles identiques et des points iso lectriques identiques, une situation relativement rare. M me des traces de chaque cha ne polypeptidique peuvent tre d tect es sur le gel par diverses proc dures de coloration ou par autoradiographie si l' chantillon de prot ine a t initialement marqu avec un radio-isotope (Figure 8 16). La technique a un tel pouvoir de r solution qu'elle peut faire la distinction entre deux prot ines qui ne diff rent que par un seul acide amin charg , ou un seul site de phosphorylation charg n gativement. Des prot ines sp cifiques peuvent tre d tect es par transfert d'anticorps Une prot ine sp cifique peut tre identifi e apr s son fractionnement sur un gel de polyacrylamide en exposant toutes les prot ines pr sentes sur le gel un anticorps sp cifique qui a t marqu avec un isotope radioactif ou un colorant fluorescent. Cette proc dure est normalement effectu e apr s le transfert de toutes les prot ines s par es pr sentes dans la migration 100 50 25SDS (masse molaire en kilodaltons) Figure 8 16 lectrophor se bidimensionnelle sur polyacrylamide-gel. Toutes les prot ines d'une cellule bact rienne E. coli sont s par es dans ce gel, dans lequel chaque point correspond une cha ne polypeptidique diff rente. Les prot ines ont d'abord
Biologie moléculaire de la cellule	t s par es sur la base de leurs points iso lectriques par une focalisation iso lectrique dans la dimension horizontale. Ils ont ensuite t fractionn s en fonction de leur masse mol culaire par lectrophor se de haut en bas en pr sence de SDS. Notez que diff rentes prot ines sont pr sentes en quantit s tr s diff rentes. Les bact ries ont t nourries avec un m lange d'acides amin s marqu s par radio-isotope afin que toutes leurs prot ines soient radioactives et puissent tre d tect es par autoradiographie. (Avec l'aimable autorisation de Patrick O'Farrell.) gel sur une feuille de papier nitrocellulosique ou une membrane en nylon. En pla ant la membrane sur le gel et en chassant les prot ines du gel avec un fort courant lectrique, on transf re la prot ine sur la membrane. La membrane est ensuite tremp e dans une solution d'anticorps marqu s pour r v ler la prot ine d'int r t. Cette m thode de d tection des prot ines est appel e Western blot, ou immunoblot (Figure 8 17). Les m thodes sensibles de Western blot peuvent d tecter de tr s petites quantit s d'une prot ine sp cifique (1 nanogramme ou moins) dans un extrait cellulaire total ou un autre m lange de prot ines h t rog nes. La m thode peut tre tr s utile pour valuer les quantit s d'une prot ine sp cifique dans la cellule ou pour mesurer les changements dans ces quantit s dans diverses conditions. Les mesures hydrodynamiques r v lent la taille et la forme d'un complexe prot ique La plupart des prot ines d'une cellule agissent dans le cadre de complexes plus grands, et la connaissance de la taille et de la forme de ces complexes conduit souvent des informations sur leur fonction. Cette information peut tre obtenue de plusieurs fa ons importantes. Parfois, un complexe peut tre visualis directement l'aide de la microscopie lectronique, comme d crit au chapitre 9. Une approche compl mentaire s'appuie sur les propri t s hydrodynamiques d'un complexe ; c'est- -dire son comportement lorsqu'il se d place dans un milieu liquide. Habituellement, deux mesures distinctes sont effectu es. L'une des mesures est la vitesse d'un complexe lorsqu'il se d place sous l'influence d'un champ centrifuge produit par une ultracentrifugeuse (voir Figure 8 7A). Le coefficient de s dimentation (ou valeur S) obtenu d pend la fois de la taille et de la forme du complexe et ne transmet pas, en soi, d'informations particuli rement utiles. Cependant, une fois qu'une deuxi me mesure hydrodynamique est effectu e, en cartographiant la migration d'un complexe travers une colonne de chromatographie par filtration sur gel (voir figure 8-9B), la forme approximative d'un complexe et sa masse mol culaire peuvent tre calcul es. La masse mol culaire peut galement tre d termin e plus directement l'aide d'une ultracentrifugeuse analytique, un appareil complexe qui permet d'effectuer des mesures d'absorbance des prot ines sur un chantillon soumis des forces centrifuges. Dans cette approche, l' chantillon est centrifug jusqu' ce qu'il atteigne l' quilibre, o la force centrifuge sur un complexe prot ique quilibre exactement sa tendance se diffuser. tant donn que ce point d' quilibre d pend de la masse mol culaire d'un complexe mais pas de sa forme particuli re, la masse mol culaire peut tre calcul e directement. Un probl me fr quent en biologie cellulaire et en biochimie est l'identification d'une prot ine ou d'un ensemble de prot ines obtenues par l'une des proc dures de purification d crites dans les pages pr c dentes. Parce que les s quences g nomiques de la plupart des organismes exp rimentaux sont maintenant connues, des catalogues de toutes les prot ines produites dans ces organismes sont disponibles. La t che d'identification d'une prot ine inconnue (ou d'un ensemble de prot ines inconnues) se r duit donc l'appariement d'une partie de l'acide amin Figure 8 17 Transfert Western. Toutes les prot ines des cellules de tabac en division en culture ont d'abord t s par es par lectrophor se bidimensionnelle sur polyacrylamide-gel. En (A), les positions des prot ines sont r v l es par une coloration prot ique sensible. Dans (B), les prot ines s par es sur un gel identique ont ensuite t transf r es sur une feuille de nitrocellulose et expos es un anticorps qui ne reconna t que les prot ines phosphoryl es sur les r sidus de thr onine pendant la mitose. Les positions des quelques prot ines reconnues par cet anticorps sont r v l es par un deuxi me anticorps li une enzyme. (Extrait de J.A. Traas et al., Plant J. 2:723-732, 1992. Avec l'autorisation de Blackwell Publishing.) Figure 8 18 Le spectrom tre de masse. (A) Les spectrom tres de masse utilis s en biologie contiennent une source d'ions qui g n re des peptides gazeux ou d'autres mol cules dans des conditions qui rendent la plupart des mol cules charg es positivement. Les deux principaux types de sources d'ions sont le MALDI et l' lectron bulisation, comme d crit dans le texte. Les ions sont acc l r s da
Biologie moléculaire de la cellule	ns un analyseur de masse, qui s pare les ions en fonction de leur masse et de leur charge par l'une des trois m thodes principales suivantes : 1. Les analyseurs temps de vol (TOF) d terminent le rapport masse/charge de chaque ion dans le m lange partir de la vitesse laquelle il se d place de la source d'ions au d tecteur. 2. Les filtres de masse quadripolaires contiennent une longue chambre bord e de quatre lectrodes qui produisent des champs lectriques oscillants qui r gissent la trajectoire des ions ; En faisant varier les propri t s du champ lectrique sur une large plage, un spectre d'ions avec des rapports masse/charge sp cifiques est autoris passer travers la chambre jusqu'au d tecteur, tandis que les autres ions sont limin s. 3. Les pi ges ions contiennent des lectrodes en forme de beignet produisant un champ lectrique tridimensionnel qui pi ge tous les ions dans une chambre circulaire ; Les propri t s du champ lectrique peuvent tre modifi es sur une large gamme pour jecter un spectre d'ions sp cifiques vers un d tecteur. (B) La spectrom trie de masse en tandem implique g n ralement deux analyseurs de masse s par s par une chambre de collision contenant un gaz inerte de haute nergie. Le champ lectrique du premier analyseur de masse est ajust pour s lectionner un ion peptidique sp cifique, appel ion pr curseur, qui est ensuite dirig vers la chambre de collision. La collision du peptide avec des mol cules de gaz provoque une fragmentation al atoire du peptide, principalement au niveau des liaisons peptidiques, ce qui donne un m lange tr s complexe de fragments contenant un ou plusieurs acides amin s provenant de l'ensemble du peptide d'origine. Le deuxi me analyseur de masse est ensuite utilis pour mesurer les masses des fragments (appel s ions produits ou fils). Avec l'aide d'un ordinateur, le motif des fragments peut tre utilis pour d duire la s quence d'acides amin s du peptide d'origine. s quences pr sentes dans l' chantillon inconnu avec des g nes catalogu s connus. Cette t che est maintenant effectu e presque exclusivement en utilisant la spectrom trie de masse en conjonction avec des recherches informatiques dans des bases de donn es. Les particules charg es ont une dynamique tr s pr cise lorsqu'elles sont soumises des champs lectriques et magn tiques dans le vide. La spectrom trie de masse exploite ce principe pour s parer les ions en fonction de leur rapport masse/charge (m/z). C'est une technique extr mement sensible. Il n cessite tr s peu de mat riel et est capable de d terminer la masse pr cise des prot ines intactes et des peptides qui en sont d riv s par clivage enzymatique ou chimique. Les masses peuvent tre obtenues avec une grande pr cision, souvent avec une erreur de moins d'une partie sur un million. La spectrom trie de masse est r alis e l'aide d'instruments complexes comportant trois composants principaux (Figure 8 18A). La premi re est la source ionique, qui transforme de minuscules quantit s d'un chantillon peptidique en un gaz contenant des mol cules peptidiques charg es individuellement. Ces ions sont acc l r s par un champ lectrique dans le deuxi me composant, l'analyseur de masse, o des champs lectriques ou magn tiques sont utilis s pour s parer les ions en fonction de leur rapport masse/charge. Enfin, les ions s par s entrent en collision avec un d tecteur, qui g n re un spectre de masse contenant une s rie de pics repr sentant les masses des mol cules de l' chantillon. Il existe de nombreux types de spectrom tres de masse, variant principalement dans la nature de leurs sources d'ions et de leurs analyseurs de masse. L'une des sources d'ions les plus courantes d pend d'une technique appel e d sorption ionisation laser assist e par matrice (MALDI). Dans cette approche, les prot ines de l' chantillon sont d'abord cliv es en peptides courts par une prot ase telle que la trypsine. Ces peptides sont m lang s un acide organique, puis s ch s sur une lame de m tal ou de c ramique. Une br ve rafale laser est dirig e vers l' chantillon, produisant une bouff e gazeuse de peptides ionis s, chacun portant une ou plusieurs charges positives. Dans de nombreux cas, la source d'ions MALDI est coupl e un analyseur de masse appel analyseur temps de vol (TOF), qui est une longue chambre travers laquelle les peptides ionis s sont acc l r s par un champ lectrique vers un d tecteur. Leur masse et leur charge d terminent le temps qu'il leur faut pour atteindre le d tecteur : les gros peptides se d placent plus lentement et les mol cules plus charg es se d placent plus rapidement. En analysant les peptides ionis s qui portent une seule charge, les masses pr cises de peptides pr sentes dans l' chantillon d'origine peuvent tre d termin es. Ces informations sont ensuite utilis es pour effectuer des recherches dans des bases de donn es g nomiques, dans lesquelles les masses de toutes les prot ines et de tous leurs fragments peptidiques pr dits ont t
Biologie moléculaire de la cellule	compil es partir des s quences g nomiques de l'organisme. Une correspondance sans ambigu t avec un cadre de lecture ouvert particulier peut souvent tre faite en connaissant la masse de seulement quelques peptides d riv s d'une prot ine donn e. En utilisant deux analyseurs de masse en tandem (un arrangement connu sous le nom de MS/MS ; Figure 8 18B), il est possible de d terminer directement les s quences d'acides amin s de peptides individuels dans un m lange complexe. L'instrument MALDI-TOF d crit ci-dessus n'est pas id al pour cette m thode. Au lieu de cela, la MS/MS implique g n ralement une source d'ions par lectron bulisation, qui produit un mince flux continu de peptides qui sont ionis s et acc l r s dans le premier analyseur de masse. L'analyseur de masse est g n ralement un pi ge quadripolaire ou ions, qui utilise de grandes lectrodes pour produire des champs lectriques oscillants l'int rieur de la chambre contenant les ions. Ces instruments agissent comme des filtres de masse : le champ lectrique est ajust sur une large plage pour s lectionner un seul ion peptidique et liminer tous les autres dans le m lange peptidique. En spectrom trie de masse en tandem, cet ion unique est ensuite expos un gaz inerte de haute nergie, qui entre en collision avec le peptide, entra nant une fragmentation, principalement au niveau des liaisons peptidiques. Le deuxi me analyseur de masse d termine ensuite les masses des fragments peptidiques, qui peuvent tre utilis es par des m thodes informatiques pour d terminer la s quence d'acides amin s du peptide d'origine et ainsi identifier la prot ine dont il provient. La spectrom trie de masse en tandem est galement utile pour d tecter et cartographier avec pr cision les modifications post-traductionnelles des prot ines, telles que les phosphorylations ou les ac tylations. Parce que ces modifications conf rent une augmentation de masse caract ristique un acide amin , elles sont facilement d tect es lors de l'analyse des fragments de peptide dans le deuxi me analyseur de masse, et le site pr cis de la modification peut souvent tre d duit du spectre des fragments peptidiques. Une puissante technique de spectrom trie de masse bidimensionnelle peut tre utilis e pour d terminer toutes les prot ines pr sentes dans un organite ou un autre m lange complexe de prot ines. Tout d'abord, le m lange de prot ines pr sentes est dig r avec de la trypsine pour produire des peptides courts. Ensuite, ces peptides sont s par s par chromatographie liquide (LC) automatis e haute performance. Chaque fraction peptidique de la colonne chromatographique est inject e directement dans une source d'ions par lectron bulisation sur un spectrom tre de masse en tandem (MS/MS), fournissant la s quence d'acides amin s et les modifications post-traductionnelles pour chaque peptide du m lange. Cette m thode, souvent appel e LC-MS/MS, est utilis e pour identifier des centaines ou des milliers de prot ines dans des m langes complexes de prot ines partir d'organites sp cifiques ou de cellules enti res. Il peut galement tre utilis pour cartographier tous les sites de phosphorylation dans la cellule, ou toutes les prot ines cibl es par d'autres modifications post-traductionnelles telles que l'ac tylation ou l'ubiquitylation. Des ensembles de prot ines en interaction peuvent tre identifi s par des m thodes biochimiques tant donn que la plupart des prot ines de la cellule fonctionnent dans le cadre de complexes avec d'autres prot ines, une fa on importante de commencer caract riser le r le biologique d'une prot ine inconnue est d'identifier toutes les autres prot ines auxquelles elle se lie sp cifiquement. Une m thode cl pour identifier les prot ines qui se lient troitement les unes aux autres est la co-immunopr cipitation. Une prot ine cible sp cifique est immunopr cipit e partir d'un lysat cellulaire l'aide d'anticorps sp cifiques coupl s des billes, comme d crit pr c demment. Si la prot ine cible est suffisamment troitement associ e une autre prot ine lorsqu'elle est captur e par l'anticorps, le partenaire pr cipite galement et peut tre identifi par spectrom trie de masse. Cette m thode est utile pour identifier les prot ines qui font partie d'un complexe l'int rieur des cellules, y compris celles qui n'interagissent que de mani re transitoire, par exemple, lorsque des mol cules de signal extracellulaire stimulent les cellules (voir le chapitre 15). En plus de capturer des complexes prot iques sur des colonnes ou dans des tubes essai, les chercheurs d veloppent des r seaux de prot ines haute densit pour tudier les interactions prot iques. Ces r seaux, qui contiennent des milliers de prot ines ou d'anticorps diff rents rep r s sur des lames de verre ou immobilis s dans de minuscules puits, permettent d'examiner les activit s biochimiques et les profils de liaison d'un grand nombre de prot ines la fois. Par exemple, si l'on incube une prot ine
Biologie moléculaire de la cellule	marqu e par fluorescence avec des r seaux contenant des milliers de prot ines immobilis es, les taches qui restent fluorescentes apr s un lavage intensif contiennent chacune une prot ine qui se lie sp cifiquement la prot ine marqu e. Une fois que deux prot ines, ou une prot ine et une petite mol cule, sont associ es, il devient important de caract riser leur interaction plus en d tail. Les prot ines peuvent s'associer entre elles de mani re plus ou moins permanente (comme les sous-unit s de l'ARN polym rase ou le prot asome), ou s'engager dans des rencontres transitoires qui peuvent ne durer que quelques millisecondes (comme une prot ine kinase et son substrat). Pour comprendre comment une prot ine fonctionne l'int rieur d'une cellule, nous devons d terminer quel point elle se lie troitement d'autres prot ines, quelle vitesse elle se dissocie d'elles et comment les modifications covalentes, les petites mol cules ou d'autres prot ines influencent ces interactions. Comme nous l'avons vu au chapitre 3 (voir les figures 3 44), la mesure dans laquelle deux prot ines interagissent est d termin e par la vitesse laquelle elles s'associent et se dissocient. Ces taux d pendent, respectivement, de la constante de vitesse d'association (kon) et de la constante de vitesse de dissociation (koff). La constante de vitesse cin tique koff est un nombre particuli rement utile car elle fournit des informations pr cieuses sur la dur e pendant laquelle deux prot ines restent li es l'une l'autre. Le rapport des deux constantes cin tiques (kon/koff) donne un autre nombre tr s utile appel la constante d' quilibre (K, galement connue sous le nom de Keq ou Ka), dont l'inverse est la constante de dissociation Kd, plus couramment utilis e. La constante d' quilibre est utile comme indicateur g n ral de l'affinit de l'interaction, et elle peut tre utilis e pour estimer la quantit de complexe li diff rentes concentrations des deux partenaires prot iques, fournissant ainsi des informations sur l'importance de l'interaction aux concentrations de prot ines trouv es l'int rieur de la cellule. Un large ventail de m thodes peut tre utilis pour d terminer les constantes de liaison d'un complexe deux prot ines. Dans une exp rience simple de liaison l' quilibre, deux prot ines sont m lang es une gamme de concentrations, laiss es atteindre l' quilibre, et la quantit de complexe li est mesur e ; La moiti du complexe prot ique sera li e une concentration gale Kd. Les exp riences d' quilibre impliquent souvent l'utilisation de marqueurs radioactifs ou fluorescents sur l'un des partenaires prot iques, associ s des m thodes biochimiques ou optiques pour mesurer la quantit de prot ine li e. Dans une exp rience de liaison cin tique plus complexe, les constantes de vitesse cin tique sont d termin es l'aide de m thodes rapides qui permettent de mesurer en temps r el la formation d'un complexe li dans le temps (pour d terminer kon) ou la dissociation d'un complexe li dans le temps (pour d terminer koff). Les techniques optiques fournissent des mesures de liaison particuli rement rapides, pratiques et pr cises, et dans certains cas, les prot ines n'ont m me pas besoin d' tre marqu es. Certains acides amin s (le tryptophane, par exemple) pr sentent une faible fluorescence qui peut tre d tect e avec des fluorim tres sensibles. Dans de nombreux cas, l'intensit de la fluorescence, ou le spectre d' mission des acides amin s fluorescents situ s dans une interface prot ine-prot ine, changera lorsque deux prot ines s'associent. Lorsque ce changement peut tre d tect par fluorim trie, il fournit une mesure simple et sensible de la liaison aux prot ines qui est utile dans les exp riences d' quilibre et de liaison cin tique. Une technique de liaison optique connexe mais plus largement utile est bas e sur la fluorescence l'anisotropie, une modification de la lumi re polaris e mise par une prot ine marqu e par fluorescence dans les tats li et libre (Figure 8 19). Figure 8 19 Mesure de la liaison avec l'anisotropie de fluorescence. Cette m thode d pend d'une prot ine marqu e par fluorescence qui est clair e par une lumi re polaris e la longueur d'onde appropri e pour l'excitation ; Un fluorim tre est utilis pour mesurer l'intensit et la polarisation de la lumi re mise. Si la prot ine fluorescente est fixe en position et ne tourne donc pas pendant la br ve p riode entre l'excitation et l' mission, la lumi re mise sera polaris e au m me angle que la lumi re d'excitation. Cet effet directionnel est appel anisotropie de fluorescence. Cependant, les mol cules de prot ines en solution tournent ou culbutent rapidement, de sorte qu'il y a une diminution de la quantit de fluorescence anisotrope. Les mol cules plus grosses culbutent un rythme plus lent et ont donc une anisotropie de fluorescence plus lev e. (A) Pour mesurer la liaison entre une petite mol cule et une grande prot ine r ceptrice, la plus petit
Biologie moléculaire de la cellule	e mol cule est marqu e avec un fluorophore. En l'absence de son partenaire de liaison, la mol cule culbute rapidement, ce qui entra ne une faible anisotropie de fluorescence (en haut). Cependant, lorsque la petite mol cule se lie son partenaire plus grand, elle culbute moins rapidement, ce qui entra ne une augmentation de l'anisotropie de fluorescence (en bas). (B) Dans l'exp rience de liaison l' quilibre montr e ici, un petit ligand peptidique fluorescent tait pr sent une faible concentration, et la quantit d'anisotropie de fluorescence (en unit s de millipolarisation, mP) a t mesur e apr s incubation avec diverses concentrations d'un r cepteur prot ique plus grand pour le ligand. D'apr s la courbe hyperbolique qui s'ajuste aux donn es, on peut voir que 50 % de liaison s'est produite environ 10 M, ce qui est gal la constante de dissociation Kd pour l'interaction de liaison. Une autre m thode optique pour sonder les interactions prot iques utilise la prot ine fluorescente verte (discut e en d tail ci-dessous) et ses d riv s de diff rentes couleurs. Dans cette application, deux prot ines d'int r t sont chacune marqu es avec une prot ine fluorescente diff rente, de sorte que le spectre d' mission d'une prot ine fluorescente chevauche le spectre d'absorption de la seconde. Si les deux prot ines sont tr s proches l'une de l'autre ( environ 1 5 nm), l' nergie de la lumi re absorb e est transf r e d'une prot ine fluorescente l'autre. Le transfert d' nergie, appel transfert d' nergie par r sonance de fluorescence (FRET), est d termin en clairant la premi re prot ine fluorescente et en mesurant l' mission de la seconde (voir Figure 9 26). Lorsqu'elle est combin e la microscopie fluorescence, cette m thode peut tre utilis e pour caract riser les interactions prot ine-prot ine des endroits sp cifiques l'int rieur des cellules vivantes (voir le chapitre 9). De petits inhibiteurs chimiques de prot ines sp cifiques ont beaucoup contribu au d veloppement de la biologie cellulaire. Par exemple, la colchicine, un inhibiteur de microtubules, est couramment utilis pour v rifier si les microtubules sont n cessaires un processus biologique donn ; Cela a galement conduit la premi re purification de la tubuline il y a plusieurs d cennies. Dans le pass , ces petites mol cules taient g n ralement des produits naturels ; c'est- -dire qu'ils ont t synth tis s par des cr atures vivantes. Bien que les produits naturels aient t extraordinairement utiles en science et en m decine (voir, par exemple, le tableau 6-4, p. 352), ils agissent sur un nombre limit de processus biologiques. Cependant, le d veloppement r cent de m thodes permettant de synth tiser des centaines de milliers de petites mol cules et d'effectuer des criblages automatis s grande chelle promet d'identifier des inhibiteurs chimiques pour pratiquement tous les processus biologiques. Dans de telles approches, de grandes collections de petits compos s chimiques sont test es simultan ment, soit sur des cellules vivantes, soit dans des tests acellulaires. Une fois qu'un inhibiteur est identifi , il peut tre utilis comme sonde pour identifier, par chromatographie d'affinit ou par d'autres moyens, la prot ine laquelle l'inhibiteur se lie. Cette strat gie g n rale, parfois appel e biologie chimique, a permis d'identifier avec succ s des inhibiteurs de nombreuses prot ines qui effectuent des processus cl s en biologie cellulaire. Un inhibiteur d'une prot ine de kin sine qui fonctionne en mitose, pour Figure 8 20 Inhibiteurs petites mol cules pour manipuler les cellules vivantes. (A) Structure chimique du monastrol, un inhibiteur de la kin sine identifi dans un criblage grande chelle pour les petites mol cules qui perturbent la mitose. (B) Fuseau mitotique normal observ dans une cellule non trait e. Les microtubules sont color s en vert et les chromosomes en bleu. (C) Fuseau monopolaire qui se forme dans les cellules trait es avec monastrol, qui inhibe une prot ine kin sine n cessaire la s paration des p les du fuseau au d but de la mitose. (B et C, d'apr s T.U. Mayer et al., Science 286:971-974, 1999. Avec l'autorisation de l'AAAS.) exemple, a t identifi par ce (figures 8 20). Les inhibiteurs chimiques donnent au biologiste cellulaire un grand contr le sur le moment de l'inhibition, car les m dicaments peuvent tre rapidement ajout s ou retir s des cellules, ce qui permet d'activer ou de d sactiver rapidement la fonction des prot ines. La principale technique qui a t utilis e pour d couvrir la structure tridimensionnelle des mol cules, y compris les prot ines, r solution atomique est la cristallographie aux rayons X. Les rayons X, comme la lumi re, sont une forme de rayonnement lectromagn tique, mais ils ont une longueur d'onde beaucoup plus courte, g n ralement autour de 0,1 nm (le diam tre d'un atome d'hydrog ne de 5 m). Si un faisceau troit de rayons X parall les est dirig vers un chantillon d'
Biologie moléculaire de la cellule	une prot ine pure, la plupart des rayons X le traversent directement. Une petite fraction, cependant, est dispers e par les atomes de l' chantillon. Si l' chantillon est un cristal bien ordonn , les ondes diffus es se renforcent mutuellement en certains points et apparaissent comme des points de diffraction lorsqu'elles sont enregistr es par un d tecteur appropri (Figure 8 21). La position et l'intensit de chaque point dans le motif de diffraction des rayons X contiennent des informations sur l'emplacement des atomes dans le cristal qui lui a donn naissance. D duire la structure tridimensionnelle d'une grande mol cule partir du motif de diffraction de son cristal est une t che complexe qui n'a t r alis e pour une mol cule de prot ine qu'en 1960. Mais ces derni res ann es, l'analyse par diffraction des rayons X est devenue de plus en plus automatis e, et maintenant l' tape la plus lente est probablement la g n ration de cristaux de prot ines appropri s. Cette tape n cessite de grandes quantit s de prot ines tr s pures et implique souvent des ann es d'essais et d'erreurs pour d couvrir les bonnes conditions de cristallisation ; le rythme s'est consid rablement acc l r avec l'utilisation de techniques d'ADN recombinant pour produire des prot ines pures et de techniques robotiques pour tester un grand nombre de conditions de cristallisation. L'analyse du motif de diffraction r sultant produit une carte tridimensionnelle complexe de la densit lectronique. L'interpr tation de cette carte, c'est- -dire la traduction de ses contours en une structure tridimensionnelle, est une proc dure compliqu e qui n cessite la connaissance de la s quence d'acides amin s de la prot ine. En grande partie par essais et erreurs, la s quence et la carte de densit d' lectrons sont corr l es par ordinateur pour donner le meilleur ajustement possible. La fiabilit du mod le atomique final d pend de la r solution des donn es cristallographiques originales : une r solution de 0,5 nm pourrait produire une carte basse r solution du squelette polypeptidique, tandis qu'une r solution de 0,15 nm permet de positionner de mani re fiable tous les atomes non hydrog ne de la mol cule. Un mod le atomique complet est souvent trop complexe pour tre appr ci directement, mais des versions simplifi es qui montrent les caract ristiques structurelles essentielles d'une prot ine peuvent facilement en tre d duites (voir panneau 3-2, pp. 142-143). Les structures tridimensionnelles de dizaines de milliers de prot ines diff rentes ont t d termin es par cristallographie aux rayons X ou par spectroscopie RMN (voir page 461) suffisamment pour permettre de regrouper les structures communes en familles (Vid o 8.1). Ces structures ou repliements prot iques semblent souvent tre plus conserv s au cours de l' volution que ne le sont les s quences d'acides amin s qui les forment (voir Figure 3-13). Les techniques cristallographiques aux rayons X peuvent galement tre appliqu es l' tude des complexes macromol culaires. La m thode a t utilis e, par exemple, pour d terminer la structure du ribosome, une machine grande et complexe compos e de plusieurs ARN et de plus de 50 prot ines (voir Figure 6-62). La d termination a n cessit l'utilisation d'un synchrotron, une source de rayonnement qui g n re des rayons X avec l'intensit n cessaire pour analyser les cristaux de ces grands complexes macromol culaires. faisceau de rayons X Source de rayons X cristaux de prot ines faisceaux diffract s Mod le de diffraction des rayons X obtenu partir de la but e du faisceau de cristaux de prot ines (A) (B) (C)Figure 8 21 Cristallographie aux rayons X. (A) Un faisceau troit de rayons X est dirig vers un cristal bien ordonn (B). On voit ici un cristal prot ique de ribulose bisphosphate carboxylase, une enzyme jouant un r le central dans la fixation du CO2 pendant la photosynth se. Les atomes du cristal diffusent une partie du faisceau, et les ondes diffus es se renforcent mutuellement en certains points et apparaissent comme un motif de taches de diffraction (C). Ce motif de diffraction, associ la s quence d'acides amin s de la prot ine, peut tre utilis pour produire un mod le atomique (D). Le mod le atomique complet est difficile interpr ter, mais cette version simplifi e, d riv e des donn es de diffraction des rayons X, montre clairement les caract ristiques structurelles de la prot ine ( h lices, vertes ; brins, rouges). Les composants illustr s de A D ne sont pas montr s l' chelle. (B, avec l'aimable autorisation de C. Branden; C, avec la permission de J. Hajdu et I. Andersson ; D, adapt de l'original fourni par B. Furugren.) La RMN peut tre utilis e pour d terminer la structure des prot ines en solution La spectroscopie par r sonance magn tique nucl aire (RMN) est largement utilis e depuis de nombreuses ann es pour analyser la structure de petites mol cules, de petites prot ines ou de domaines prot iques. Contrairement la cristal
Biologie moléculaire de la cellule	lographie aux rayons X, la RMN ne d pend pas de la pr sence d'un chantillon cristallin. Il suffit d'un petit volume de solution prot ique concentr e qui est plac e dans un champ magn tique puissant ; En effet, c'est la principale technique qui fournit des preuves d taill es de la structure tridimensionnelle des mol cules en solution. Certains noyaux atomiques, en particulier les noyaux d'hydrog ne, ont un moment magn tique ou un spin, c'est- -dire qu'ils ont une aimantation intrins que, comme une barre magn tique. Le spin s'aligne le long du champ magn tique puissant, mais il peut tre chang en un tat excit mal align en r ponse des impulsions de radiofr quence (RF) de rayonnement lectromagn tique appliqu es. Lorsque les noyaux d'hydrog ne excit s reviennent leur tat align , ils mettent un rayonnement RF, qui peut tre mesur et affich sous forme de spectre. La nature du rayonnement mis d pend de l'environnement de chaque noyau d'hydrog ne, et si un noyau est excit , il influence l'absorption et l' mission du rayonnement par d'autres noyaux qui se trouvent proximit de lui. Il est donc possible, gr ce une laboration ing nieuse de la technique de base de RMN connue sous le nom de RMN bidimensionnelle, de distinguer les signaux des noyaux d'hydrog ne dans diff rents r sidus d'acides amin s, et d'identifier et de mesurer les petits d calages de ces signaux qui se produisent lorsque ces noyaux d'hydrog ne sont suffisamment proches les uns des autres pour interagir. Parce que la taille d'un tel d calage r v le la distance entre la paire d'atomes d'hydrog ne en interaction, la RMN peut fournir des informations sur les distances entre les parties de la mol cule de prot ine. En combinant ces informations avec une connaissance de l'acide amin Figure 8 22 Spectroscopie RMN. Un exemple de donn es provenant d'un appareil de RMN. Ce spectre RMN bidimensionnel est d riv du domaine C-terminal de l'enzyme cellulase. Les taches repr sentent les interactions entre les atomes d'hydrog ne qui sont proches des voisins dans la prot ine et refl tent donc la distance qui les s pare. Des m thodes de calcul complexes, en conjonction avec la s quence d'acides amin s connue, permettent de d river des structures compatibles possibles. Dix structures de l'enzyme, qui satisfont toutes aussi bien aux contraintes de distance, sont superpos es les unes aux autres, ce qui donne une bonne indication de la structure tridimensionnelle probable. (Avec l'aimable autorisation de P. Kraulis.) s quence, il est en principe possible de calculer la structure tridimensionnelle de la prot ine (Figure 8 22). Pour des raisons techniques, la structure de petites prot ines d'environ 20 000 daltons ou moins peut tre d termin e plus facilement par spectroscopie RMN. La r solution diminue mesure que la taille d'une macromol cule augmente. Mais les progr s techniques r cents ont maintenant repouss la limite environ 100 000 daltons, rendant ainsi la majorit des prot ines accessibles l'analyse structurale par RMN. tant donn que les tudes RMN sont r alis es en solution, cette m thode offre galement un moyen pratique de surveiller les modifications de la structure des prot ines, par exemple lors du repliement des prot ines ou lorsque la prot ine se lie une autre mol cule. La RMN est galement largement utilis e pour tudier des mol cules autres que les prot ines et est pr cieuse, par exemple, comme m thode pour d terminer les structures tridimensionnelles des mol cules d'ARN et les cha nes lat rales complexes de glucides des glycoprot ines. Une troisi me m thode majeure pour la d termination de la structure des prot ines, et en particulier de la structure des grands complexes prot iques, est l'analyse de particules uniques par microscopie lectronique. Nous aborderons cette approche au chapitre 9. Apr s avoir discut des m thodes de purification et d'analyse des prot ines, nous nous tournons maintenant vers une situation courante en biologie cellulaire et mol culaire : un chercheur a identifi un g ne important pour un processus biologique mais n'a aucune connaissance directe des propri t s biochimiques de son produit prot ique. Gr ce la prolif ration des s quences de prot ines et d'acides nucl iques qui sont catalogu es dans les bases de donn es g nomiques, la fonction d'un g ne et de sa prot ine cod e peut souvent tre pr dite en comparant simplement sa s quence avec celles de g nes pr c demment caract ris s. Parce que la s quence d'acides amin s d termine la structure des prot ines, et que la structure dicte la fonction biochimique, les prot ines qui partagent une s quence d'acides amin s similaire ont g n ralement la m me structure et remplissent g n ralement des fonctions biochimiques similaires, m me lorsqu'elles se trouvent dans des organismes loign s. En biologie cellulaire moderne, l' tude d'une prot ine nouvellement d couverte commence g n ralement par la recherche de prot ines pr c demment caract ris es
Biologie moléculaire de la cellule	qui sont similaires dans leurs s quences d'acides amin s. La recherche de g nes ou de prot ines similaires dans une collection de s quences connues se fait g n ralement sur Internet, et implique simplement de s lectionner une base de donn es et d'entrer la s quence souhait e. Un programme d'alignement de s quences (le plus populaire est BLAST) analyse la base de donn es la recherche de s quences similaires en faisant glisser la s quence soumise le long des s quences archiv es jusqu' ce qu'un groupe de r sidus s'aligne compl tement ou partiellement (Figure 8 23). De telles comparaisons peuvent pr dire les fonctions de prot ines individuelles, de familles de prot ines ou m me de la plupart du compl ment prot ique d'un organisme nouvellement s quenc . Comme nous l'avons expliqu au chapitre 3, de nombreuses prot ines qui adoptent la m me conformation et qui ont des fonctions apparent es sont trop loign es pour tre identifi es partir d'une comparaison de leurs seules s quences d'acides amin s (voir Figure 3-13). Ainsi, une capacit pr dire de mani re fiable la structure tridimensionnelle d'une prot ine partir de sa s quence d'acides amin s am liorerait notre capacit d duire la fonction des prot ines partir des informations de s quence dans les bases de donn es g nomiques. Ces derni res ann es, des progr s majeurs ont t r alis s dans la pr diction de la structure pr cise d'une prot ine. Ces pr dictions sont bas es, en partie, sur notre connaissance des milliers de structures prot iques qui ont d j t d termin es par la cristallographie aux rayons X et la spectroscopie RMN et, en partie, sur des calculs utilisant notre connaissance des forces physiques agissant sur les atomes. Cependant, il reste un d fi substantiel et important de pr dire les structures de prot ines qui sont grandes ou qui ont plusieurs domaines, ou de pr dire des structures aux tr s hauts niveaux de r solution n cessaires pour aider la d couverte de m dicaments par ordinateur. Bien que la d couverte de s quences et de structures connexes pour une nouvelle prot ine fournisse de nombreux indices sur sa fonction, il est g n ralement n cessaire de tester ces informations par le biais d'exp riences directes. Cependant, les indices g n r s par les comparaisons de s quences orientent g n ralement l'investigateur dans la bonne direction exp rimentale, et leur utilisation est donc devenue l'une des strat gies les plus importantes de la biologie cellulaire moderne. Il existe de nombreuses m thodes pour identifier les prot ines et analyser leurs propri t s biochimiques, leurs structures et leurs interactions avec d'autres prot ines. Les inhibiteurs petites mol cules permettent d' tudier les fonctions des prot ines sur lesquelles ils agissent dans les cellules vivantes. tant donn que les prot ines ayant des structures similaires ont souvent des fonctions similaires, l'activit biochimique d'une prot ine peut souvent tre pr dite en recherchant dans des bases de donn es des prot ines pr c demment caract ris es qui sont similaires dans leurs s quences d'acides amin s. Jusqu'au d but des ann es 1970, l'ADN tait la mol cule biologique la plus difficile analyser pour le biochimiste. Extr mement longue et chimiquement monotone, la cha ne de nucl otides qui forme le mat riel g n tique d'un organisme n'a pu tre examin e qu'indirectement, par s quen age des prot ines ou par analyse g n tique. Aujourd'hui, la situation a compl tement chang . D' tre la macromol cule la plus difficile de la cellule Figure 8 23 R sultats d'une recherche bLAST. Les bases de donn es de s quences peuvent tre consult es pour trouver des s quences d'acides amin s ou d'acides nucl iques similaires. Ici, une recherche de prot ines similaires la prot ine r gulatrice du cycle cellulaire humain Cdc2 (Query) localise le ma s Cdc2 (Sbjct), qui est identique 68 % Cdc2 humain dans sa s quence d'acides amin s. L'alignement commence au r sidu 57 de la prot ine Query, ce qui sugg re que la prot ine humaine a une r gion N-terminale qui est absente de la prot ine de ma s. Les blocs verts indiquent les diff rences de s quence, et la barre jaune r sume les similitudes : lorsque les deux s quences d'acides amin s sont identiques, le r sidu est affich ; Les substitutions d'acides amin s similaires sont indiqu es par un signe plus (+). Un seul petit espace a t introduit, indiqu par la fl che rouge la position 194 dans la s quence de requ te, pour aligner les deux s quences au maximum. Le score d'alignement (Score), qui est exprim en deux types d'unit s diff rentes, prend en compte les p nalit s pour les substitutions et les carts ; Plus le score d'alignement est lev , meilleure est la correspondance. L'importance de l'alignement se refl te dans la valeur de l'attente (E), qui sp cifie la fr quence laquelle on s'attend ce qu'un match aussi bon se produise par hasard. Plus la valeur E est faible, plus la correspondance est significative ; La valeur ext
Biologie moléculaire de la cellule	r mement faible ici (E-111) indique une certaine importance. Il est peu probable que des valeurs E beaucoup plus lev es que 0,1 refl tent une v ritable parent . Par exemple, une valeur E de 0,1 signifie qu'il y a une probabilit de 1 sur 10 qu'une telle correspondance se produise uniquement par hasard. analyser, l'ADN est devenu le plus facile. Il est maintenant possible de d terminer la s quence nucl otidique compl te d'un g nome bact rien ou fongique en quelques heures, et la s quence d'un g nome humain individuel en moins d'une journ e. Une fois que la s quence nucl otidique d'un g nome est connue, n'importe quel g ne individuel peut tre facilement isol , et de grandes quantit s du produit g nique (qu'il s'agisse d'ARN ou de prot ine) peuvent tre fabriqu es, soit en introduisant le g ne dans des bact ries ou des cellules animales et en incitant ces cellules surexprimer le g ne tranger, soit en synth tisant le produit g nique in vitro. De cette fa on, les prot ines et les mol cules d'ARN qui pourraient n' tre pr sentes qu'en quantit s infimes dans les cellules vivantes peuvent tre produites en grandes quantit s pour des analyses biochimiques et structurales. Et cette approche peut galement tre utilis e pour produire de grandes quantit s de prot ines humaines (telles que l'insuline, l'interf ron ou les prot ines de coagulation sanguine) pour une utilisation comme produits pharmaceutiques humains. Comme nous le verrons plus loin dans ce chapitre, il est galement possible pour les scientifiques de modifier un g ne isol et de le transf rer dans la lign e germinale d'un animal ou d'une plante, de mani re devenir une partie fonctionnelle et h r ditaire du g nome de l'organisme. De cette fa on, les r les biologiques de n'importe quel g ne peuvent tre valu s en observant, dans l'ensemble de l'organisme, les r sultats de sa modification. La capacit de manipuler l'ADN avec pr cision dans un tube essai ou un organisme, connue sous le nom de technologie de l'ADN recombinant, a eu un impact consid rable sur tous les aspects de la biologie cellulaire et mol culaire, nous permettant d' tudier r guli rement les cellules et leurs macromol cules d'une mani re inimaginable il y a vingt ans. Au c ur de la technologie se trouvent les manipulations suivantes : 1. Clivage de l'ADN des sites sp cifiques par des nucl ases de restriction, ce qui facilite grandement l'isolement et la manipulation de morceaux individuels d'un g nome. 2. La ligature de l'ADN, qui permet d'assembler de mani re transparente des mol cules d'ADN provenant de sources tr s diff rentes. 3. Le clonage de l'ADN (par l'utilisation de vecteurs de clonage ou de la r action en cha ne par polym rase) dans lequel une partie d'un g nome (souvent un g ne individuel) est purifi e du reste du g nome en le copiant plusieurs reprises pour g n rer plusieurs milliards de mol cules identiques. 4. L'hybridation d'acides nucl iques, qui permet d'identifier n'importe quelle s quence sp cifique d'ADN ou d'ARN avec une grande pr cision et sensibilit gr ce sa capacit se lier s lectivement une s quence d'acide nucl ique compl mentaire. 5. La synth se de l'ADN, qui permet de synth tiser chimiquement des mol cules d'ADN avec n'importe quelle s quence de nucl otides, que la s quence se produise ou non dans la nature. 6. D termination rapide de la s quence des nucl otides de n'importe quelle mol cule d'ADN ou d'ARN. Dans les sections qui suivent, nous d crivons chacune de ces techniques de base qui, ensemble, ont r volutionn l' tude de la biologie cellulaire et mol culaire. Contrairement une prot ine, un g ne n'existe pas en tant qu'entit discr te dans les cellules, mais plut t en tant que petite r gion d'une mol cule d'ADN beaucoup plus longue. Bien que les mol cules d'ADN d'une cellule puissent tre bris es au hasard en petits morceaux par la force m canique, un fragment contenant un seul g ne dans le g nome d'un mammif re ne serait toujours qu'un parmi cent mille fragments d'ADN ou plus, indiscernables dans leur taille moyenne. Comment un tel g ne pourrait-il tre s par de tous les autres ? Parce que toutes les mol cules d'ADN sont constitu es d'un m lange peu pr s gal des quatre m mes nucl otides, elles ne peuvent pas tre facilement s par es, comme le font les prot ines, sur la base de leurs charges diff rentes et de leurs propri t s biochimiques. La solution ce probl me a commenc merger avec la d couverte des nucl ases de restriction. Ces enzymes, qui sont purifi es partir de bact ries, coupent la double h lice de l'ADN des sites sp cifiques d finis par la s quence nucl otidique locale, clivant ainsi une longue mol cule d'ADN double brin en fragments de tailles strictement d finies. Comme de nombreux outils de la technologie de l'ADN recombinant, les nucl ases de restriction ont t d couvertes par des chercheurs essayant de comprendre un ph nom ne biologique intrigant. Il avait t observ que certaines bact rie
Biologie moléculaire de la cellule	s d gradaient toujours l'ADN tranger qui leur tait introduit exp rimentalement. Une recherche du m canisme responsable a r v l une classe alors inattendue de nucl ases bact riennes qui clivent l'ADN des s quences nucl otidiques sp cifiques. L'ADN de la bact rie est prot g du clivage par la m thylation de ces m mes s quences, prot geant ainsi le g nome d'une bact rie contre l'envahissement par l'ADN tranger. Parce que ces enzymes limitent le transfert de l'ADN dans les bact ries, elles ont t appel es nucl ases de restriction. La poursuite de ce casse-t te biologique apparemment obscur a d clench le d veloppement de technologies qui ont chang jamais la fa on dont les biologistes cellulaires et mol culaires tudient les tres vivants. Diff rentes esp ces bact riennes produisent des nucl ases de restriction diff rentes, chacune coupant une s quence nucl otidique diff rente et sp cifique (Figure 8 24). Parce que ces s quences cibles sont courtes g n ralement quatre huit paires de nucl otides de nombreux sites de clivage se produiront, purement par hasard, dans n'importe quelle mol cule d'ADN longue. La raison pour laquelle les nucl ases de restriction sont si utiles en laboratoire est que chaque enzyme coupera toujours une mol cule d'ADN particuli re aux m mes endroits. Ainsi, pour un chantillon donn d'ADN (qui contient de nombreuses mol cules identiques), une nucl ase de restriction particuli re g n rera de mani re fiable le m me ensemble de fragments d'ADN. La taille des fragments r sultants d pend de la longueur des s quences cibles des nucl ases de restriction. Comme le montre la figure 8-24, l'enzyme HaeIII coupe une s quence de quatre paires de nucl otides ; On s'attendrait ce qu'une s quence aussi longue se produise purement par hasard environ une fois toutes les 256 paires de nucl otides (1 sur 44). En comparaison, on s'attendrait ce qu'une nucl ase de restriction avec une s quence cible de huit nucl otides clive l'ADN en moyenne une fois toutes les 65 536 paires de nucl otides (1 sur 48). Cette diff rence de s lectivit de s quence permet de cliver une longue mol cule d'ADN en fragments de la taille la plus adapt e une application donn e. L' lectrophor se sur gel s pare les mol cules d'ADN de diff rentes tailles Les m mes types de m thodes d' lectrophor se sur gel qui se sont av r es si utiles dans l'analyse des prot ines (voir Figure 8-13) peuvent tre appliqu s aux mol cules d'ADN. La proc dure est en fait plus simple que pour les prot ines : parce que chaque nucl otide d'une mol cule d'acide nucl ique porte d j une seule charge n gative (sur le groupe phosphate), il n'est pas n cessaire d'ajouter le d tergent charg n gativement SDS qui est n cessaire pour que les mol cules de prot ines se d placent uniform ment vers l' lectrode positive. Les fragments d'ADN plus gros migrent plus lentement car leur progression est davantage entrav e par la matrice de gel. Pendant plusieurs heures, les fragments d'ADN s' talent sur le gel en fonction de leur taille, formant une chelle de bandes discr tes, chacune compos e d'une collection de mol cules d'ADN de longueur identique (figures 8-25A et B). Pour s parer les mol cules d'ADN de plus de 500 paires de nucl otides, le gel est compos d'une solution dilu e d'agarose (un polysaccharide isol d'algues). Pour les fragments d'ADN de moins de 500 nucl otides de long, des gels de polyacrylamide sp cialement con us permettent de s parer des mol cules dont la longueur diff re par aussi peu qu'un seul nucl otide (voir Figure 8-25C). Figure 8 24 Les nucl ases de restriction clivent l'ADN des s quences nucl otidiques sp cifiques. Comme les prot ines de liaison l'ADN sp cifiques la s quence que nous avons rencontr es au chapitre 7 (voir Figure 7-8), les enzymes de restriction fonctionnent souvent comme des dim res, et la s quence d'ADN qu'elles reconnaissent et clivent est souvent sym trique autour d'un point central. Ici, les deux brins de la double h lice de l'ADN sont coup s des points sp cifiques de la s quence cible (orange). Certaines enzymes, telles que HaeIII, coupent directement la double h lice et laissent deux mol cules d'ADN extr mit mouss e ; avec d'autres, comme EcoRI et HindIII, les coupes sur chaque brin sont d cal es. Ces coupes d cal es g n rent des extr mit s collantes , de courts surplombs monocat naires qui aident les mol cules d'ADN coup es se r unir par le biais d'un appariement de bases compl mentaires. Cette r union des mol cules d'ADN devient importante pour le clonage de l'ADN, comme nous le verrons ci-dessous. Les nucl ases de restriction sont g n ralement obtenues partir de bact ries, et leurs noms refl tent leurs origines : par exemple, l'enzyme EcoRI provient d'Escherichia coli. Il existe actuellement des centaines d'enzymes de restriction diff rentes ; Ils peuvent tre command s aupr s d'entreprises qui les produisent commercialement. Une variante de l' lectrophor se sur gel d'agaros
Biologie moléculaire de la cellule	e, appel e lectrophor se sur gel en champ puls , permet de s parer des mol cules d'ADN extr mement longues, m me celles que l'on trouve dans des chromosomes entiers. L' lectrophor se sur gel ordinaire ne parvient pas s parer les tr s grosses mol cules d'ADN parce que le champ lectrique constant les tire de sorte qu'elles se d placent de bout en premier travers le gel dans des configurations serpentines une vitesse ind pendante de leur longueur. Dans l' lectrophor se sur gel champ puls , en revanche, la direction du champ lectrique change p riodiquement, ce qui oblige les mol cules se r orienter avant de continuer se d placer comme un serpent travers le gel. Cette r orientation prend beaucoup plus de temps pour les mol cules plus grosses, de sorte que les mol cules plus longues se d placent plus lentement que les plus courtes. En cons quence, des chromosomes entiers de bact ries ou de levures se s parent en bandes discr tes dans des gels champ puls et peuvent donc tre tri s et identifi s en fonction de leur taille (Figure 8 25D). Bien qu'un chromosome typique de mammif re de 108 paires de nucl otides soit encore trop long pour tre tri m me de cette mani re, de grands segments de ces chromosomes sont facilement s par s et identifi s si l'ADN chromosomique est d'abord coup avec une nucl ase de restriction s lectionn e pour reconna tre les s quences qui ne se produisent que rarement. Les bandes d'ADN sur les gels d'agarose ou de polyacrylamide sont invisibles moins que l'ADN ne soit marqu ou color d'une mani re ou d'une autre. Une m thode particuli rement sensible de coloration de l'ADN consiste tremper le gel dans le bromure d' thidium, un colorant qui devient fluorescent sous la lumi re ultraviolette lorsqu'il est li l'ADN (voir les figures 8 25B et D). Des m thodes de d tection encore plus sensibles int grent un radio-isotope ou un marqueur chimique dans les mol cules d'ADN avant l' lectrophor se, comme nous le d crirons ensuite. Figure 8 25 Les mol cules d'ADN peuvent tre s par es par taille l'aide de l' lectrophor se sur gel. (A) Illustration sch matique comparant les r sultats de la coupe de la m me mol cule d'ADN (dans ce cas, le g nome d'un virus qui infecte les gu pes) avec deux nucl ases de restriction diff rentes, EcoRI (au milieu) et HindIII ( droite). Les fragments sont alors s par s par lectrophor se sur gel l'aide d'une matrice de gel d'agarose. Parce que les plus gros fragments migrent plus lentement que les plus petits, les bandes les plus basses du gel contiennent les plus petits fragments d'ADN. La taille des fragments peut tre estim e en les comparant un ensemble de fragments d'ADN de tailles connues ( gauche). (B) Photographie d'un gel d'agarose r el montrant des bandes d'ADN qui ont t color es au bromure d' thidium. Un gel de polyacrylamide petits pores a t utilis pour s parer de courtes mol cules d'ADN qui ne diff rent que par un seul nucl otide. Voici les r sultats d'une r action de s quen age did soxy, expliqu s plus loin dans ce chapitre. De gauche droite, les bandes dans les quatre voies ont t produites en ajoutant des nucl otides terminant la cha ne G, A, T et C (voir panneau 8-1). Les mol cules d'ADN ont t marqu es avec du 32P, et l'image montr e a t produite en posant un morceau de film photographique sur le gel et en permettant au 32P d'exposer le film, produisant les bandes sombres observ es lors du d veloppement du film. La technique de l' lectrophor se en champ puls sur gel d'agarose a t utilis e pour s parer les 16 chromosomes diff rents de l'esp ce de levure Saccharomyces cerevisiae, dont la taille varie de 220 000 2,5 millions de paires de nucl otides. L'ADN a t color comme dans (B). Des mol cules d'ADN aussi grandes que 107 paires de nucl otides peuvent tre s par es de cette mani re. (B, d'apr s U. Albrecht et al., J. Gen. Virol. 75:3353-3363, 1994 ; C, avec l'aimable autorisation de Leander Lauffer et Peter Walter ; D, d'apr s D. Vollrath et R.W. Davis, Nucleic Acids Res. 15:7865 7876, 1987. Avec l'autorisation d'Oxford University Press.) 2,5 4 millions 15 7 950 000 6,5 4,3 14 10 11 610 000 2,3 2 3 6 1 220 000 (A) plaque de gel d'agarose (B) (C) (D) Les mol cules d'ADN purifi es peuvent tre sp cifiquement marqu es avec des radio-isotopes ou des marqueurs chimiques in vitro Les ADN polym rases qui synth tisent et r parent l'ADN (discut es au chapitre 5) sont devenues des outils importants dans la manipulation exp rimentale de l'ADN. Parce qu'ils synth tisent des s quences compl mentaires une mol cule d'ADN existante, ils sont souvent utilis s dans le tube essai pour cr er des copies exactes de mol cules d'ADN existantes. Les copies peuvent inclure des nucl otides sp cialement modifi s (Figure 8 26). Pour synth tiser l'ADN de cette mani re, l'ADN polym rase est pr sent e avec une matrice et un pool de pr curseurs nucl otidiques qui contiennent la modification. Tant que la polym rase peut
Biologie moléculaire de la cellule	utiliser ces pr curseurs, elle fabrique automatiquement de nouvelles mol cules modifi es qui correspondent la s quence de la matrice. Les mol cules d'ADN modifi ont de nombreuses utilisations. L'ADN marqu avec le radio-isotope 32P peut tre d tect apr s lectrophor se sur gel en pla ant le gel c t d'un morceau de film photographique (voir Figure 8 25C). Les atomes 32P mettent particules qui exposent le film, produisant un enregistrement visible de chaque bande sur le gel. Alternativement, le gel peut tre scann par un d tecteur qui mesure directement les missions de . D'autres types d'ADN modifi , tels que celui marqu par la digoxig nine (voir Figure 8-26B), sont utiles pour visualiser les mol cules d'ADN dans des cellules enti res, un sujet que nous aborderons plus loin dans ce chapitre. N'importe quel fragment d'ADN peut tre clon . En biologie mol culaire, le terme clonage d'ADN est utilis dans deux sens. Il fait litt ralement r f rence l'acte de faire de nombreuses copies identiques (g n ralement des milliards) d'une mol cule d'ADN l'amplification d'une s quence d'ADN particuli re. Cependant, le terme d crit galement l'isolement d'un segment particulier d'ADN (souvent un g ne particulier) du reste du g nome de la cellule ; le m me terme fragment purifi d'ADN duplex L'ADN polym rase incorpore des nucl otides 32P, ce qui donne une population de mol cules d'ADN radiomarqu es contenant des s quences des deux brins Figure 8 26 M thodes de marquage des mol cules d'ADN in vitro. (A) Une enzyme d'ADN polym rase purifi e peut incorporer des nucl otides radiomarqu s lorsqu'elle synth tise de nouvelles mol cules d'ADN. De cette fa on, des versions radiomarqu es de n'importe quelle s quence d'ADN peuvent tre pr par es en laboratoire. (B) La m thode d crite en (A) est galement utilis e pour produire des mol cules d'ADN non radioactives porteuses d'un marqueur chimique sp cifique qui peut tre d tect avec un anticorps appropri . La base du nucl oside triphosphate montr est un analogue de la thymine, dans lequel le groupe m thyle sur T a t remplac par un bras d'espacement li la digoxig nine, un st ro de v g tal. Un anticorps anti-digoxig nine coupl un marqueur visible tel qu'un colorant fluorescent est ensuite utilis pour visualiser le ADN. D'autres marqueurs chimiques, tels que la biotine, peuvent tre attach s aux nucl otides et utilis s de la m me mani re. Les seules exigences sont que les nucl otides modifi s s'apparient correctement et semblent normaux l'ADN polym rase. circulaire, est utilis parce que cet isolement est g n ralement r alis en faisant de nombreuses copies identiques de l'ADN d'int r t. Nous notons qu'ailleurs dans le livre, le clonage, en particulier lorsqu'il est utilis dans le contexte de la biologie du d veloppement, peut galement faire r f rence la g n ration de nombreuses cellules g n tiquement identiques partir d'une seule cellule ou m me la g n ration d'organismes g n tiquement identiques (voir, par exemple, la figure 7-2). Dans tous les cas, le clonage fait r f rence l'acte de faire de nombreuses copies identiques, et dans cette section, nous utilisons le terme pour d signer des m thodes con ues pour g n rer de nombreuses copies identiques d'un segment d fini d'acide nucl ique. Le clonage de l'ADN peut tre accompli de plusieurs mani res. L'une des plus simples consiste ins rer un fragment particulier d'ADN dans le g nome d'ADN purifi d'un l ment g n tique auto-r pliquant, g n ralement un plasmide. Les vecteurs plasmidiques les plus largement utilis s pour le clonage de g nes sont de petites mol cules circulaires d'ADN double brin d riv es de plasmides naturellement pr sents dans les cellules bact riennes. Ils ne repr sentent g n ralement qu'une fraction mineure de l'ADN total des cellules bact riennes de l'h te, mais en raison de leur petite taille, ils peuvent facilement tre s par s des mol cules d'ADN chromosomique beaucoup plus grandes, qui pr cipitent sous forme de pastille lors de la centrifugation. Pour tre utilis s comme vecteurs de clonage, les cercles d'ADN plasmidique purifi s sont d'abord coup s avec une nucl ase de restriction pour cr er des mol cules d'ADN lin aires. L'ADN cloner est ajout au plasmide coup , puis assembl de mani re covalente l'aide de l'enzyme ADN ligase (Figure 8-27 et Figure 8-28). Comme nous l'avons vu au chapitre 5, cette enzyme est utilis e par la cellule pour assembler les fragments d'Okazaki produits lors de la r plication de l'ADN. Le cercle d'ADN recombinant est r introduit dans les cellules bact riennes qui ont t rendues temporairement perm ables l'ADN. Au fur et mesure que les cellules grandissent et se divisent, doublant en nombre toutes les 30 minutes, les plasmides recombinants se r pliquent galement pour produire une Figure 8 27 L'insertion d'un fragment d'ADN dans un plasmide bact rien avec l'enzyme ADN ligase. Le plasmide est ouvert l'aide d'une nucl ase de res
Biologie moléculaire de la cellule	triction (dans ce cas, celle qui produit des extr mit s d cal es) et est m lang avec le fragment d'ADN cloner (qui a t pr par avec la m me nucl ase de restriction). L'ADN ligase et l'ATP sont ajout s. Les extr mit s d cal es forment une paire de bases, et l'ADN ligase scelle les entailles dans le squelette de l'ADN, produisant une mol cule d'ADN recombinant compl te. Dans les micrographies ci-jointes, l'ADN ins r est color en rouge. (Micrographies avec l'aimable autorisation de Huntington Potter et David Dressler.) Figure 8 28 L'ADN ligase peut assembler deux fragments d'ADN in vitro pour produire des mol cules d'ADN recombinantes. L'ATP fournit l' nergie n cessaire pour refermer le squelette sucre-phosphate de l'ADN (voir Figure 5-12). L'ADN ligase peut facilement joindre deux fragments d'ADN produits par la m me nucl ase de restriction, dans ce cas EcoRI. Notez que les extr mit s d cal es produites par cette enzyme permettent aux extr mit s des deux fragments de s'apparier correctement les bases l'une avec l'autre, facilitant grandement leur rejoindre. L'ADN ligase peut galement tre utilis e pour assembler des fragments d'ADN produits par diff rentes nucl ases de restriction, par exemple, EcoRI et HaeIII. Dans ce cas, avant que les fragments ne subissent une ligature, l'ADN polym rase et un m lange de d soxyribonucl osides triphosphates (dNTP) sont utilis s pour remplir la coupe chelonn e produite par EcoRI. Chaque fragment d'ADN repr sent sur la figure est orient de telle sorte que ses 5 extr mit s soient l'extr mit gauche du brin sup rieur et l'extr mit droite du brin inf rieur, comme indiqu . la culture cellulaire produit des centaines de millions de nouvelles bact ries, un nombre norme de copies de cercles d'ADN contenant l'ADN tranger (Figure 8 29). Une fois que les cellules sont lys es et que l'ADN plasmidique est isol , le fragment d'ADN clon peut tre facilement r cup r en le d coupant de l'ADN plasmidique avec la m me nucl ase de restriction que celle utilis e pour l'ins rer, puis en le s parant de l'ADN plasmidique par lectrophor se sur gel. Ensemble, ces tapes permettent l'amplification et la purification de n'importe quel segment d'ADN du g nome de n'importe quel organisme. Un vecteur plasmidique particuli rement utile est bas sur le plasmide F naturel d'E. coli. Contrairement aux plasmides bact riens plus petits, le plasmide F et son d riv modifi , le chromosome artificiel bact rien (BAC) n'est pr sent que dans une ou deux copies par cellule E. coli. Le fait que les BACs soient conserv s en si petit nombre signifie qu'ils peuvent maintenir de mani re stable de tr s longues s quences d'ADN, jusqu' 1 million de paires de nucl otides. Avec seulement quelques BACs pr sents par bact rie, il est moins probable que les fragments d'ADN clon s soient brouill s par recombinaison avec des s quences port es sur d'autres copies du plasmide. En raison de leur stabilit , de leur capacit accepter de grands inserts d'ADN et de leur facilit de manipulation, les BACs sont maintenant le vecteur privil gi pour la manipulation de gros fragments d'ADN tranger. Comme nous le verrons ci-dessous, les BACs ont jou un r le d terminant dans la d termination de la s quence nucl otidique compl te du g nome humain. Il est souvent utile de d composer un g nome en fragments beaucoup plus petits et de cloner chaque fragment, s par ment, l'aide d'un vecteur plasmidique. Cette approche est utile car elle permet aux scientifiques de travailler avec des morceaux discrets et faciles g rer d'un g nome au lieu de chromosomes entiers et encombrants. Cette strat gie consiste clider l'ADN g nomique en petits morceaux l'aide d'une nucl ase de restriction (ou, dans certains cas, en cisaillant m caniquement l'ADN) et ligaturer l'ensemble de la collection de fragments d'ADN en vecteurs plasmidiques, en utilisant des conditions qui favorisent l'insertion d'un seul fragment d'ADN dans chaque mol cule plasmidique. Ces plasmides recombinants sont ensuite introduits dans E. coli une concentration qui garantit qu'il n'y a pas plus d'une mol cule plasmidique absorb e par chaque bact rie. La collection de mol cules plasmidiques clon es est connue sous le nom de biblioth que d'ADN. tant donn que les fragments d'ADN ont t d riv s directement de l'ADN chromosomique de l'organisme d'int r t, la collection r sultante, appel e biblioth que g nomique, repr sentera l'ensemble du g nome de cet organisme (figures 8 30), r parti sur des dizaines de milliers de colonies bact riennes individuelles. Une strat gie alternative, qui enrichit les g nes codant pour les prot ines, consiste commencer le processus de clonage en s lectionnant uniquement les s quences d'ADN qui sont transcrites en ARNm et correspondent donc aux g nes codant pour les prot ines. Cela se fait en extrayant l'ARNm des cellules, puis en faisant une copie d'ADN de chaque ARNm Figure 8 30 Des banques de g nomique humaine contenan
Biologie moléculaire de la cellule	t des fragments d'ADN repr sentant l'ensemble du g nome humain peuvent tre construites l'aide de nucl ases de restriction et d'ADN ligase. Une telle biblioth que g nomique se compose d'un ensemble de bact ries, chacune portant un fragment diff rent d'ADN humain. Pour simplifier, seuls les fragments d'ADN color s sont affich s dans la biblioth que ; En r alit , tous les diff rents fragments gris seront galement repr sent s. Figure 8 29 Un fragment d'ADN peut tre r pliqu l'int rieur d'une cellule bact rienne. Pour cloner un fragment particulier d'ADN, il est d'abord ins r dans un vecteur plasmidique, comme le montre la figure 8-27. L'ADN plasmidique recombinant qui en r sulte est ensuite introduit dans une bact rie, o il est r pliqu plusieurs millions de fois mesure que la bact rie se multiplie. Pour simplifier, le g nome de la cellule bact rienne n'est pas repr sent . des millions de fragments d'ADN g nomique sont pr sents : ce qu'on appelle l'ADN compl mentaire, ou ADNc. La r action de copie est catalys e par l'enzyme transcriptase inverse des r trovirus, qui synth tise une cha ne d'ADN compl mentaire sur une matrice d'ARN. Les mol cules d'ADNc simple brin synth tis es par la transcriptase inverse sont converties par l'ADN polym rase en mol cules d'ADNc double brin, et ces mol cules sont ins r es dans un plasmide ou un vecteur viral et clon es (Figure 8 31). Chaque clone obtenu de cette mani re est appel un clone d'ADNc, et l'ensemble de la collection de clones d riv s d'une pr paration d'ARNm constitue une banque d'ADNc. La figure 8-32 illustre certaines diff rences importantes entre les clones d'ADN g nomique et les clones d'ADNc. Les clones g nomiques repr sentent un chantillon al atoire de toutes les s quences d'ADN d'un organisme, codantes et non codantes, et, de tr s rares exceptions pr s, sont les m mes quel que soit le type de cellule utilis pour les pr parer. En revanche, les clones d'ADNc ne contiennent que les r gions du g nome qui ont t transcrites en ARNm. Parce que les cellules de diff rents tissus produisent des ensembles distincts de mol cules d'ARNm, une biblioth que d'ADNc distincte est obtenue pour chaque type de cellule utilis e pour pr parer la copie d'ADNc double brin de l'ARNm original Figure 8 31 La synth se de l'ADNc. L'ARNm total est extrait d'un tissu particulier, et l'enzyme transcriptase inverse (voir Figure 5-62) est utilis e pour produire des copies d'ADN (ADNc) des mol cules d'ARNm. Pour simplifier, la copie d'un seul de ces ARNm dans l'ADNc est illustr e. Un oligonucl otide court compl mentaire la queue poly-A l'extr mit 3 de l'ARNm (discut au chapitre 6) est d'abord hybrid l'ARN pour agir comme une amorce pour la transcriptase inverse, qui copie ensuite l'ARN dans une cha ne d'ADN compl mentaire, formant ainsi une h lice hybride ADN-ARN. Le traitement de l'hybride ADN-ARN avec une nucl ase sp cialis e (ARNASE H) qui attaque uniquement l'ARN produit des entailles et des lacunes dans le brin d'ARN. L'ADN polym rase copie ensuite l'ADNc simple brin restant en ADNc double brin. Parce que l'ADN polym rase peut tre synth tis e travers les mol cules d'ARN li es, le fragment d'ARN qui est appari l'extr mit 3 du premier brin d'ADN agit g n ralement comme l'amorce pour la synth se du deuxi me brin, comme indiqu . Tout ARN restant est finalement d grad au cours des tapes de clonage suivantes. En cons quence, les s quences nucl otidiques aux extr mit s 5' des mol cules d'ARNm d'origine sont souvent absentes des banques d'ADNc. Les banques g nomiques sont particuli rement utiles pour d terminer les s quences nucl otidiques d'un g nome entier. Par exemple, pour d terminer la s quence nucl otidique du g nome humain, il a t d compos en environ 100 000 paires de nucl otides, chacun d'entre eux ayant t ins r dans un plasmide BAC et amplifi dans E. coli. La biblioth que g nomique r sultante se composait de dizaines de milliers de colonies bact riennes, chacune contenant un insert d'ADN humain diff rent. La s quence nucl otidique de chaque insert a t d termin e s par ment et la s quence de l'ensemble du g nome a t cousue partir des morceaux. L'avantage le plus important des clones d'ADNc, par rapport aux clones g nomiques, est qu'ils contiennent la s quence codante ininterrompue d'un g ne. Lorsque le but du clonage, par exemple, est de produire la prot ine en grande quantit en exprimant le g ne clon dans une cellule bact rienne ou de levure, il est pr f rable de commencer par l'ADNc. Les banques de g nomique et d'ADNc sont des ressources in puisables, largement partag es entre les chercheurs. Aujourd'hui, de nombreuses biblioth ques de ce type sont galement disponibles aupr s de sources commerciales. Comme l'identit de chaque insert d'une banque est souvent connue (gr ce au s quen age de l'insert), il est souvent possible de commander une r gion particuli re d'un chromosome (ou, dans le cas de l'ADNc, un g ne codant pour une prot
Biologie moléculaire de la cellule	ine sans intron) et de le faire livrer par la poste. Le clonage de l'ADN l'aide de bact ries a r volutionn l' tude des g nomes et est encore largement utilis aujourd'hui. Cependant, il existe un moyen encore plus simple de cloner l'ADN, qui peut tre r alis enti rement in vitro. Nous abordons ci-dessous cette approche, appel e r action en cha ne par polym rase. Cependant, nous devons d'abord examiner une propri t fondamentale et de grande port e de l'ADN et de l'ARN appel e hybridation. Figure 8 32 Les diff rences entre les clones d'ADNc et les clones d'ADN g nomique d riv s de la m me r gion d'ADN. Dans cet exemple, le g ne A est rarement transcrit, tandis que le g ne B est fr quemment transcrit, et les deux g nes contiennent des introns (orange). Dans la biblioth que d'ADN g nomique, les introns et l'ADN non transcrit (gris) sont inclus dans les clones, et la plupart des clones ne contiennent, tout au plus, qu'une partie de la s quence codante d'un g ne (rouge). Dans les clones d'ADNc, les s quences d'intron (jaune) ont t limin es par pissage de l'ARN lors de la formation de l'ARNm (bleu), et une s quence codante continue est donc pr sente dans chaque clone. tant donn que le g ne B est transcrit plus fr quemment que le g ne A dans les cellules partir desquelles la banque d'ADNc a t fabriqu e, il est repr sent beaucoup plus fr quemment que A dans la biblioth que d'ADNc. En revanche, A et B sont repr sent s de mani re gale dans la biblioth que d'ADN g nomique. L'hybridation offre un moyen puissant, mais simple, de d tecter des s quences nucl otidiques sp cifiques Dans des conditions normales, les deux brins d'une double h lice d'ADN sont maintenus ensemble par des liaisons hydrog ne entre les paires de bases compl mentaires (voir Figure 4-3). Mais ces liaisons relativement faibles et non covalentes peuvent tre assez facilement rompues. Une telle d naturation de l'ADN lib rera les deux brins l'un de l'autre, mais ne rompra pas les liaisons covalentes qui relient les nucl otides l'int rieur de chaque brin. Le moyen le plus simple de r aliser cette s paration consiste peut- tre chauffer l'ADN environ 90 C. Lorsque les conditions sont invers es, en abaissant lentement la temp rature, les brins compl mentaires se regroupent facilement pour former une double h lice. Cette hybridation, ou renaturation de l'ADN, est entra n e par la reformation des liaisons hydrog ne entre les paires de bases compl mentaires (Figure 8 33). Nous avons vu dans le chapitre 5 que l'hybridation de l'ADN sous-tend le processus crucial de recombinaison homologue (voir Figure 5-47). Cette capacit fondamentale d'une mol cule d'acide nucl ique simple brin, qu'il s'agisse d'ADN ou d'ARN, former une double h lice avec une mol cule simple brin d'une s quence compl mentaire fournit une technique puissante et sensible pour d tecter des s quences nucl otidiques sp cifiques. Aujourd'hui, il suffit de concevoir une mol cule d'ADN simple brin courte (souvent appel e sonde d'ADN) qui est compl mentaire la s quence nucl otidique d'int r t. tant donn que les s quences nucl otidiques d'un si grand nombre de g nomes sont connues et stock es dans des bases de donn es accessibles au public, il est facile de concevoir une sonde pour s'hybrider n'importe o dans un g nome. Les sondes sont monocat naires, g n ralement de 30 nucl otides de longueur, et sont g n ralement synth tis es chimiquement par un service commercial pour quelques centimes par nucl otide. Une s quence d'ADN de 30 nucl otides ne se produira par hasard qu'une fois tous les 1 1018 nucl otides (430) ; ainsi, m me dans le g nome humain de 3 109 paires de nucl otides, il sera tr s peu probable qu'une sonde d'ADN con ue pour correspondre une s quence particuli re de 30 nucl otides s'hybride par hasard ailleurs sur le g nome. Ceci, bien s r, suppose que la s quence compl mentaire la sonde n'appara t pas plusieurs fois dans le g nome, une condition qui peut tre v rifi e au pr alable en scannant la s quence g nomique in silico ( l'aide d'un ordinateur) et en concevant des sondes qui ne correspondent qu' un seul point. Les conditions d'hybridation peuvent tre r gl es de telle sorte que m me un seul d calage emp chera l'hybridation en s quences quasi-accidents . L'exp rience d'hybridation in situ (latin pour sur place ) illustr e la figure 8-34 permet d'appr cier facilement la sp cificit exquise de l'hybridation des acides nucl iques. Comme nous le verrons tout au long de ce chapitre, l'acide nucl ique Figure 8 34 L'hybridation in situ peut tre utilis e pour localiser des g nes sur des chromosomes isol s. Ici, six sondes d'ADN diff rentes ont t utilis es pour marquer l'emplacement de leurs s quences nucl otidiques compl mentaires sur le chromosome 5 humain, isol d'une cellule mitotique en m taphase (voir Figure 4-59 et Panel 17-1, pp. 980-981). Les sondes d'ADN ont t marqu es avec diff rents groupes chimiques (voir Figure 8-26B) et
Biologie moléculaire de la cellule	sont d tect es l'aide d'anticorps fluorescents sp cifiques ces groupes. L'ADN chromosomique a t partiellement d natur pour permettre aux sondes de s'apparier avec leurs s quences compl mentaires. Les copies maternelle et paternelle du chromosome 5 sont repr sent es, align es c te c te. Chaque sonde produit deux points sur chaque chromosome car les chromosomes subissant une mitose ont d j r pliqu leur ADN ; par cons quent, chaque chromosome contient deux h lices d'ADN identiques. La technique employ e ici est surnomm e FISH, pour hybridation in situ en fluorescence. (Avec l'aimable autorisation de David C. Ward.) Figure 8 33 Une mol cule d'ADN peut subir une d naturation et une renaturation (hybridation). Pour que deux mol cules monocat naires s'hybrident, elles doivent avoir des s quences nucl otidiques compl mentaires qui permettent l'appariement des bases. Dans cet exemple, les brins rouge et orange sont compl mentaires l'un de l'autre, et les brins bleu et vert sont compl mentaires l'un de l'autre. Bien que la d naturation par chauffage soit d montr e, l'ADN peut galement tre renatur apr s avoir t d natur par traitement alcalin. L'hybridation a de nombreuses utilisations en biologie cellulaire et mol culaire moderne ; l'un des plus puissants est le clonage de l'ADN par r action en cha ne par polym rase, comme nous le verrons ensuite. Les banques g nomiques et d'ADNc taient autrefois la seule voie de clonage de g nes et elles sont toujours utilis es pour cloner de tr s gros g nes et pour s quencer des g nomes entiers. Cependant, une m thode puissante et polyvalente pour L'amplification de l'ADN, connue sous le nom de r action en cha ne par polym rase (PCR), offre une approche plus rapide et plus simple du clonage de l'ADN, en particulier dans les organismes dont la s quence g nomique compl te est connue. Aujourd'hui, les s quences g nomiques tant abondantes, la plupart des clonages sont effectu s par PCR. Invent e dans les ann es 1980, la PCR a r volutionn la fa on dont l'ADN et l'ARN sont analys s. La technique peut amplifier n'importe quelle s quence de nucl otides de mani re s lective et est enti rement r alis e dans un tube essai. L' limination du besoin de bact ries rend la PCR pratique et rapide : des milliards de copies d'un nucl otide peuvent tre g n r es en quelques heures. partir d'un g nome entier, la PCR permet l'ADN d'une r gion sp cifi e, s lectionn e par l'exp rimentateur, d' tre consid rablement amplifi , ce qui permet de purifier efficacement cet ADN du reste du g nome, qui reste non amplifi . En raison de son pouvoir d'amplification consid rable des acides nucl iques, la PCR est remarquablement sensible : la m thode peut tre utilis e pour d tecter les traces d'ADN dans une goutte de sang laiss e sur une sc ne de crime ou dans quelques copies d'un g nome viral dans l' chantillon de sang d'un patient. Le succ s de la PCR d pend la fois de la s lectivit de l'hybridation de l'ADN et de la capacit de l'ADN polym rase copier fid lement une matrice d'ADN par des cycles r p t s de r plication in vitro. Comme nous l'avons vu au chapitre 5, cette enzyme ajoute des nucl otides l'extr mit 3 d'un brin d'ADN en croissance (voir Figure 5-4). Pour copier l'ADN, la polym rase a besoin d'une amorce, une courte s quence nucl otidique qui fournit une extr mit 3 partir de laquelle la synth se peut commencer. Pour la PCR, les amorces sont con ues par l'exp rimentateur, synth tis es chimiquement et, en s'hybridant l'ADN g nomique, indiquent la polym rase quelle partie du g nome copier. Comme nous l'avons vu dans la section pr c dente, les amorces d'ADN (essentiellement du m me type de mol cules que les sondes d'ADN, mais sans marqueur radioactif ou fluorescent) peuvent tre con ues pour localiser de mani re unique n'importe quelle position sur un g nome. La PCR est un processus it ratif dans lequel le cycle d'amplification est r p t des dizaines de fois. Au d but de chaque cycle, les deux brins de la matrice d'ADN double brin sont s par s et une amorce diff rente est recuite sur chacun d'eux. Ces amorces marquent les limites droite et gauche de l'ADN amplifier. On laisse ensuite l'ADN polym rase se r pliquer chaque brin ind pendamment (Figure 8 35). Dans Figure 8 35 Une paire d'amorces dirige la synth se d'un segment d'ADN souhait dans un tube essai. Chaque cycle de PCR comprend trois tapes : (1) L'ADN double brin est chauff bri vement pour s parer les deux brins. (2) L'ADN est expos un grand exc s d'une paire d'amorces sp cifiques con ues pour encadrer la r gion de l'ADN amplifier et l' chantillon est refroidi pour permettre aux amorces de s'hybrider en s quences compl mentaires dans les deux brins d'ADN. (3) Ce m lange est incub avec l'ADN polym rase et les quatre d soxyribonucl osides triphosphates afin que l'ADN puisse tre synth tis , partir des deux amorces. Pour amplifier l'ADN, le cycle est r p t plusieurs fois en r chauff
Biologie moléculaire de la cellule	ant l' chantillon pour s parer les brins d'ADN nouvellement synth tis s (voir Figure 8 36). La technique repose sur l'utilisation d'une ADN polym rase sp ciale isol e d'une bact rie thermophile ; cette polym rase est stable des temp ratures beaucoup plus lev es que les ADN polym rases eucaryotes, elle n'est donc pas d natur e par le traitement thermique montr l' tape 1. Il n'est donc pas n cessaire d'ajouter nouveau l'enzyme apr s chaque cycle. Produits du premier cycle Figure 8 36 La PCR utilise des cycles r p t s de s paration, d'hybridation et de synth se des brins pour amplifier l'ADN. Au fur et mesure que la proc dure d crite la figure 8-35 est r p t e, tous les fragments nouvellement synth tis s servent de mod les leur tour. Parce que la polym rase et les amorces restent dans l' chantillon apr s le premier cycle, la PCR consiste simplement chauffer puis refroidir le m me chantillon, dans le m me tube essai, encore et encore. Chaque cycle double la quantit d'ADN synth tis e au cours du cycle pr c dent, de sorte qu'en quelques cycles, l'ADN pr dominant est identique la s quence encadr e par les deux amorces incluses dans la matrice d'origine. Dans l'exemple illustr ici, trois cycles de r action produisent 16 cha nes d'ADN, dont 8 (encadr es en jaune) correspondent exactement l'un ou l'autre brin de la s quence d'origine entre parenth ses. Apr s quatre cycles suppl mentaires, 240 des 256 cha nes d'ADN correspondront exactement la s quence d'origine, et apr s plusieurs cycles suppl mentaires, essentiellement tous les brins d'ADN seront de cette longueur. En r gle g n rale, 20 30 cycles sont effectu s pour cloner efficacement une r gion d'ADN partir de l'ADN g nomique ; le reste du g nome reste non amplifi , et sa concentration est donc n gligeable par rapport celle de la r gion amplifi e (Vid o 8.2). cycles suivants, toutes les mol cules d'ADN nouvellement synth tis es produites par la polym rase servent de mod les pour le prochain cycle de r plication (Figure 8 36). Gr ce ce processus d'amplification it ratif, de nombreuses copies de la s quence originale peuvent tre faites des milliards apr s environ 20 30 cycles. La PCR est maintenant la m thode de choix pour cloner des fragments d'ADN relativement courts (disons moins de 10 000 paires de nucl otides). Chaque cycle ne dure qu'environ cinq minutes, et l'automatisation de l'ensemble de la proc dure permet le clonage acellulaire d'un fragment d'ADN en quelques heures. La matrice originale pour la PCR peut tre soit de l'ADN, soit de l'ARN, de sorte que cette m thode peut tre utilis e pour obtenir soit un clone g nomique (avec des introns et des exons), soit une copie d'ADNc d'un ARNm (Figure 8 37). La m thode PCR est extraordinairement sensible ; il peut d tecter une seule mol cule d'ADN dans un chantillon si au moins une partie de la s quence de cette mol cule est connue. Des traces d'ARN peuvent tre analys es de la m me mani re en les transcrivant d'abord en ADN avec transcriptase inverse. Pour ces raisons, la PCR est fr quemment utilis e pour des utilisations qui vont au-del du simple clonage. Par exemple, il peut tre utilis pour d tecter les agents pathog nes envahissants des stades tr s pr coces de l'infection. Dans ce cas, de courtes s quences compl mentaires un segment du g nome de l'agent infectieux sont utilis es comme amorces et, apr s de nombreux cycles d'amplification, m me quelques copies d'un g nome bact rien ou viral envahissant dans l' chantillon d'un patient peuvent tre d tect es (Figure 8 38). Pour de nombreuses infections, la PCR a remplac l'utilisation d'anticorps contre les mol cules microbiennes pour isoler l'ADN total Isoler le segment total de l'ADN de l'ARNm cloner S quence d'ARNm cloner AJOUTER LA PREMI RE AMORCE, LA TRANSCRIPTASE INVERSE ET LE D SOXYRIBONUCL OSIDE TRIPHOSPHATES S PARER LES BRINS ET AJOUTER LA DEUXI ME AMORCE AMPLIFICATION PCR AVEC LES DEUX AMORCES PR SENTERL'AMPLIFICATION PCR mARN DNA S PARER LES BRINS ET AJOUTER DES AMORCES Les clones g nomiques (A) Clones d'ADNc (B) L'ADN chromosomique d tectent la pr sence de l'envahisseur. Il est galement utilis pour v rifier l'authenticit d'une source de nourriture, par exemple, si un chantillon de b uf provient r ellement d'une vache. Enfin, la PCR est aujourd'hui largement utilis e en m decine l gale. L'extr me sensibilit de la m thode permet aux enqu teurs m dico-l gaux d'isoler l'ADN partir de traces infimes de sang humain ou d'autres tissus afin d'obtenir une empreinte ADN de la personne qui a laiss l' chantillon derri re elle. contr le des particules rares du VIH, l'aide du plasma de sang d'une personne infect eFigure 8 38 La PCR peut tre utilis e pour d tecter la pr sence d'un g nome viral dans un chantillon de sang. En raison de sa capacit amplifier norm ment le signal d'une seule mol cule d'acide nucl ique, la PCR est une m thode extraordinairement sensible pour d tecter des traces
Biologie moléculaire de la cellule	de virus dans un chantillon de sang ou de tissu, sans qu'il soit n cessaire de purifier le virus. Pour le VIH, le virus qui cause le sida, le g nome est une mol cule monocat naire d'ARN, comme illustr ici. En plus du VIH, de nombreux autres virus qui infectent les humains sont maintenant d tect s de cette mani re. Figure 8 37 La PCR peut tre utilis e pour obtenir des clones g nomiques ou d'ADNc. (A) Pour utiliser la PCR pour cloner un segment d'ADN chromosomique, l'ADN g nomique total est d'abord purifi partir des cellules. Des amorces de PCR qui flanquent le tron on d'ADN cloner sont ajout es et de nombreux cycles de PCR sont termin s (voir Figure 8 36). tant donn que seul l'ADN entre les amorces (y compris) est amplifi , la PCR permet d'obtenir de mani re s lective n'importe quel court segment d'ADN chromosomique sous une forme effectivement pure. (B) Pour utiliser la PCR afin d'obtenir un clone d'ADNc d'un g ne, l'ARNm total est d'abord purifi partir des cellules. La premi re amorce est ajout e la population d'ARNm, et la transcriptase inverse est utilis e pour fabriquer un brin d'ADN compl mentaire la s quence d'ARN sp cifique d'int r t. La deuxi me amorce est ensuite ajout e et la mol cule d'ADN est amplifi e par de nombreux cycles de PCR. Figure 8 39 La PCR est utilis e en criminalistique pour distinguer un individu d'un autre. Les s quences d'ADN analys es sont de courtes r p titions en tandem (STR) compos es de s quences telles que CACACA... ou GTGTGT... Les STR se trouvent diverses positions (loci) dans le g nome humain. Le nombre de r p titions dans chaque locus STR est tr s variable dans la population, allant de 4 40 chez diff rents individus. En raison de la variabilit de ces s quences, les individus h ritent g n ralement d'un nombre diff rent de r p titions chaque locus STR de leur m re et de leur p re ; par cons quent, deux individus non apparent s contiennent rarement la m me paire de s quences un locus STR donn . (A) La PCR utilisant des amorces qui reconnaissent des s quences uniques de chaque c t d'un locus STR particulier produit une paire de bandes d'ADN amplifi de chaque individu, une bande repr sentant la variante STR maternelle et l'autre repr sentant la variante STR paternelle. La longueur de l'ADN amplifi , et donc sa position apr s lectrophor se sur gel, d pendra du nombre exact de r p titions au locus. (B) Dans l'exemple sch matique pr sent ici, les trois m mes loci STR sont analys s dans des chantillons de trois suspects (individus A, B et C), produisant six bandes pour chaque individu. Bien que diff rentes personnes puissent avoir plusieurs groupes en commun, le sch ma g n ral est assez distinctif pour chaque personne. Le motif de la bande peut donc servir d'empreinte g n tique pour identifier un individu de mani re presque unique. La quatri me voie (F) contient les produits des m mes amplifications PCR effectu es sur un chantillon d'ADN m dico-l gal hypoth tique, qui aurait pu tre obtenu partir d'un seul cheveu ou d'une minuscule tache de sang laiss e sur une sc ne de crime. Plus il y a de loci examin s, plus on peut tre confiant quant aux r sultats. Lorsque l'on examine la variabilit 5 10 loci STR diff rents, les chances que deux individus al atoires partagent la m me empreinte digitale par hasard sont d'environ une sur 10 milliards. Dans le cas pr sent ici, les individus A et C peuvent tre limin s des enqu tes, tandis que B est un suspect vident. Une approche similaire est couramment utilis e dans les tests de paternit . l'exception peut- tre des jumeaux identiques, la s quence d'ADN du g nome de chaque tre humain diff re de celle de chaque autre personne sur Terre. l'aide de paires d'amorces ciblant des s quences g nomiques connues pour tre tr s variables dans la population humaine, la PCR permet de g n rer une empreinte g n tique distincte pour n'importe quel individu (Figure 8 39). De telles analyses judiciaires peuvent tre utilis es non seulement pour aider identifier ceux qui ont mal agi, mais aussi, tout aussi important, pour disculper ceux qui ont t accus s tort. La plupart des m thodes actuelles de manipulation de l'ADN, de l'ARN et des prot ines reposent sur la connaissance pr alable de la s quence nucl otidique du g nome d'int r t. Mais comment ces s quences ont-elles t d termin es en premier lieu ? Et comment les nouvelles mol cules d'ADN et d'ARN sont-elles s quenc es aujourd'hui ? la fin des ann es 1970, des chercheurs ont mis au point plusieurs strat gies pour d terminer, simplement et rapidement, la s quence nucl otidique de tout fragment d'ADN purifi . Celui qui est devenu le plus largement utilis est appel s quen age did soxy ou s quen age de Sanger (panel 8-1). Cette m thode a t utilis e pour d terminer la s quence nucl otidique de nombreux g nomes, y compris ceux d'E. coli, de mouches des fruits, de vers n matodes, de souris et d'humains. Aujourd'hui, des m thodes moins co teuses et pl
Biologie moléculaire de la cellule	us rapides sont couramment utilis es pour s quencer l'ADN, et des strat gies encore plus efficaces sont en cours de d veloppement (voir la partie 8-1). La s quence de r f rence originale du g nome humain, achev e en 2003, a co t plus d'un milliard de dollars et a n cessit la collaboration de nombreux scientifiques du monde entier pendant 13 ans. Les normes progr s r alis s au cours de la derni re d cennie permettent une seule personne de compl ter le s quen age d'un g nome humain individuel en moins d'une journ e. Les m thodes r sum es dans le panel 8-1 pour le s quen age rapide de l'ADN peuvent galement tre appliqu es l'ARN. Bien que des m thodes soient en cours de d veloppement pour s quencer directement l'ARN, cela se fait le plus souvent en convertissant l'ARN en ADN compl mentaire ( l'aide de la transcriptase inverse) et en utilisant l'une des m thodes d crites pour le s quen age de l'ADN. Il est important de garder l'esprit que bien que les g nomes restent les m mes d'une cellule l'autre et d'un tissu l'autre, l'ARN produit partir du g nome peut varier norm ment. Nous verrons plus loin dans ce chapitre que le s quen age de l'ensemble du r pertoire d'ARN d'une cellule ou d'un tissu (connu sous le nom d'ARN profond le s quen age est un moyen puissant de comprendre comment l'information pr sente dans le g nome est utilis e par diff rentes cellules dans diff rentes circonstances. Dans la section suivante, nous verrons comment le RNA-seq est galement devenu un outil pr cieux pour annoter les g nomes. Pour tre utiles, les s quences g nomiques doivent tre annot es De longues cha nes de nucl otides, premi re vue, ne r v lent rien sur la fa on dont cette information g n tique dirige le d veloppement d'un organisme vivant, ni m me sur les types de mol cules d'ADN, de prot ines et d'ARN produites par un g nome. Le processus d'annotation du g nome tente de marquer tous les g nes (codant ou non pour des prot ines) dans un g nome et d'attribuer un r le chacun. Il cherche galement comprendre des types plus subtils d'informations g nomiques, tels que les s quences cis-r gulatrices qui sp cifient le moment et le lieu o un g ne donn est exprim et si son ARNm subit un pissage alternatif pour produire diff rents isotypes de prot ines. De toute vidence, il s'agit d'une t che ardue, et nous sommes loin de la terminer pour n'importe quelle forme de vie, m me la bact rie la plus simple. Pour de nombreux organismes, nous connaissons le nombre approximatif de g nes et, pour les organismes tr s simples, nous comprenons les fonctions d'environ la moiti de leurs g nes. Dans cette section, nous discutons de mani re g n rale de la fa on dont les g nes sont identifi s dans les s quences g nomiques et des indices que nous pouvons discerner sur leurs r les en inspectant simplement leurs s quences. Plus loin dans le chapitre, nous nous penchons sur le probl me plus difficile de la d termination exp rimentale de la fonction des g nes. Comment commence-t-on donner un sens une s quence g nomique ? La premi re tape consiste g n ralement traduire in silico l'ensemble du g nome en prot ine. Il existe six cadres de lecture diff rents pour tout morceau d'ADN double brin (trois sur chaque brin). Nous avons vu au chapitre 6 qu'une s quence al atoire de nucl otides, lue dans le cadre, PANeL 8 1 : M thodes de s quen age de l'ADN OOCH25 OH3 3 3 OH permet l'extension du brin l'extr mit 3 d soxyribonucl oside triphosphate normal (dNTP) OOCH25 3 H emp che l'extension du brin 3 extr mit de la cha ne terminant le did soxyribonucl oside triphosphate (ddNTP) basebase PPP PPP ATGTCAGTCCAG 3 RESULT TACAGTCAGGTC 5 GCAT ATG GCAT GCAT ATGTCAGTCCAG G s quence de l'amorce d'ADN s quence lue partir du gel 3 CGTATACAGTCAGGTC 5 3 CGTATACAGTCAGGTC 5 5 GCAT 3 GCAT A GCAT ATGTCA GCAT ATGTCAGTCCA GCAT AT GCAT GCAT ATGTCAGT GCAT ATGTC GCAT ATGTCAGTC GCAT ATGTCAGTCC A T C G A C C T G A C T G A T A T C G 3 5 ADD BRANDED DNA PRIMER fragment d'ADN simple brin s quencer T T T A A A A AA AA GG GGG GG CC C C C C ADN POLYM RASE ET DIVISEZ-LE EN 4 TUBES DISTINCTS AJOUTEZ LES QUANTIT S EXC DENTAIRES DE NORMAL dNTP s quence du brin d'ADN d'origine AJOUTER UNE PETITE QUANTIT D'UN DDNTP SE TERMINANT PAR UNE CHA NE CHAQUE TUBE TT C T A T AG T G T C A CC T AAATA G C TT GG C G T AATC A T GG T(B) (A) GCATATG GCATA GCATATGT GCATAT GCATATGTC m lange de produits d'ADN, chacun contenant un ddNTP se terminant par une cha ne tiquet avec un marqueur fuorescent diff rent PRODUITS CHARG S SUR GEL CAPILLAIRE Les produits s par s par lectrophor se sont lus en s quence, le s quen age did soxy, ou s quen age de Sanger (du nom du scientifique qui l'a invent ), utilise l'ADN polym rase, ainsi que des nucl otides sp ciaux de terminaison de cha ne appel s did soxyribonucl osides triphosphates ( gauche), pour faire des copies partielles du fragment d'ADN s quencer. Ces ddNTP sont des d riv s des d soxyribonucl osi
Biologie moléculaire de la cellule	des triphosphates normaux qui n'ont pas le groupe hydroxyle 3 . Lorsqu'ils sont incorpor s dans un brin d'ADN en croissance, ils bloquent l'allongement ult rieur de ce brin. S QUEN AGE DE L'ADN DID SOXY S QUEN AGE MANUEL DID SOXY S QUEN AGE AUTOMATIS Pour d terminer la s quence compl te d'un fragment d'ADN simple brin (gris), l'ADN est d'abord hybrid avec une courte amorce d'ADN (orange) qui est marqu e avec un colorant fuorescent ou un radio-isotope. L'ADN polym rase et un exc s des quatre d soxyribonucl osides triphosphates normaux (bleu A, C, G ou T) sont ajout s l'ADN amorc , qui est ensuite divis en quatre tubes de r action. Chacun de ces tubes re oit une petite quantit d'un did soxyribonucl oside triphosphate (rouge A, C, G ou T). Parce que ceux-ci ne seront incorpor s qu'occasionnellement, chaque r action produit un ensemble de copies d'ADN qui se terminent diff rents points de la s quence. Les produits de ces quatre r actions sont s par s par lectrophor se en quatre voies parall les d'un gel de polyacrylamide ( tiquet ici A, T, C et G). Dans chaque voie, les bandes repr sentent des fragments qui se sont termin s un nucl otide donn mais des positions diff rentes dans l'ADN. En lisant les bandes dans l'ordre, en commen ant par le bas du gel et en lisant sur toutes les voies, la s quence d'ADN du brin nouvellement synth tis peut tre d termin e (voir Figure 8-25C). La s quence, qui est donn e dans la fl che verte droite du gel, est compl mentaire la s quence de l'ADN simple brin gris d'origine. Les machines enti rement automatis es peuvent ex cuter des r actions de s quen age did soxy. (A) La m thode automatis e utilise une quantit excessive de dNTP normaux plus un m lange de quatre ddNTP diff rents se terminant par une cha ne, chacun d'entre eux tant tiquet avec une tiquette fuorescente d'une couleur diff rente. Les produits de r action sont charg s sur un gel capillaire long et mince et s par s par lectrophor se. Une cam ra (non illustr e) lit la couleur de chaque bande pendant qu'elle se d place travers le gel et transmet les donn es un ordinateur qui assemble la s quence. (B) Une infime partie des donn es d'un tel s quen age automatis . Chaque pic color repr sente un nucl otide dans la s quence d'ADN. 5 GCAT 3 CGTA 479S QUEN AGE DES G NOMES ENTIERS S quen age shotgun : Pour d terminer la s quence nucl otidique d'un g nome entier, l'ADN g nomique est d'abord fragment en petits morceaux et une biblioth que g nomique est construite, g n ralement l'aide de plasmides et de bact ries (voir Figure 8 30). Dans le s quen age shotgun, la s quence nucl otidique de dizaines de milliers de clones individuels est d termin e ; La s quence compl te du g nome est ensuite reconstruite en assemblant (in silico) la s quence nucl otidique de chaque clone, en utilisant les chevauchements entre les clones comme guide. La m thode du fusil de chasse fonctionne bien pour les petits g nomes (tels que ceux des virus et des bact ries) qui n'ont pas d'ADN r p titif. TECHNOLOGIES DE S QUEN AGE DE DEUXI ME G N RATION La m thode dideoxy a permis de s quencer les g nomes de l'homme et de la plupart des autres organismes dont il est question dans ce livre. Mais de nouvelles m thodes, d velopp es depuis 2005, ont rendu le s quen age du g nome encore plus rapide et beaucoup moins cher. Avec ces m thodes de s quen age dites de deuxi me g n ration, le co t du s quen age de l'ADN a consid rablement diminu . Il n'est pas surprenant que le nombre de g nomes qui ont t s quenc s ait norm ment augment . Ces m thodes rapides permettent de s quencer plusieurs g nomes en parall le en quelques semaines, ce qui permet aux chercheurs d'examiner des milliers de g nomes humains individuels, de cataloguer la variation des s quences nucl otidiques de personnes du monde entier et de d couvrir les mutations qui augmentent le risque de diverses maladies, du cancer l'autisme. Ces m thodes ont galement permis de d terminer la s quence g nomique d'esp ces disparues, dont l'homme de N andertal et le mammouth laineux. En s quen ant les g nomes de nombreuses esp ces troitement apparent es, ils ont galement permis de comprendre la base mol culaire des v nements volutifs cl s de l'arbre de la vie, tels que les inventions de la multicellularit , de la vision et du langage. La capacit de s quencer rapidement l'ADN a eu des impacts majeurs sur toutes les branches de la biologie et de la m decine ; Il est presque impossible d'imaginer o nous serions sans elle. Clones BAC : La plupart des g nomes v g taux et animaux sont grands (souvent plus de 109 paires de nucl otides) et contiennent de grandes quantit s d'ADN r p titif r parties dans tout le g nome. Parce qu'une s quence nucl otidique d'un fragment d'ADN r p titif chevauchera chaque instance de l'ADN r p t , il est difficile, voire impossible, d'assembler les fragments en un ordre unique uniquement par la m thode du fusil de chasse. Pour contourner ce prob
Biologie moléculaire de la cellule	l me, le g nome humain a d'abord t d compos en tr s grands fragments d'ADN (chacun d'environ 100 000 paires de nucl otides) et clon en BACs (voir p. 469). L'ordre des BACs le long d'un chromosome a t d termin en comparant le mod le des sites de clivage de l'enzyme de restriction dans un clone BAC donn avec celui de l'ensemble du g nome. De cette fa on, un clone BAC donn peut tre cartographi , par exemple, sur le bras gauche du chromosome 3 humain. Autrefois, une collection de clones BAC tait Des milliers de g nomes d'humains individuels ont maintenant t s quenc s et il n'est pas n cessaire de reconstruire minutieusement l'ordre des s quences d'ADN lues chaque fois ; Ils sont simplement assembl s en utilisant l'ordre d termin par le projet original de s quen age du g nome humain. Pour cette raison, le res quen age, le terme utilis lorsque le g nome d'une esp ce est s quenc nouveau (m me s'il peut provenir d'un individu diff rent), est beaucoup plus facile que le s quen age original. s quence un brin de fragments GTTCAGCATTG------GCCATTAGTTCA--- GCCATTAGTTCAGCATTG---s quence originale reconstruite sur la base du chevauchement des s quences s quences de deux fragments AA D B BA B C E C mod le de restriction pour les clones BAC individuels carte de restriction d'un segment du g nome humain sites de clivage pour les nucl ases de restriction A, B, C, D et E obtenues qui couvraient l'ensemble du g nome, chaque taux d'alcool mie individuel a t s quenc par la m thode du fusil de chasse. la fin, les s quences de tous les inserts BAC ont t cousues ensemble en utilisant la connaissance de la position de chaque insert BAC dans le g nome humain. Au total, environ 30 000 clones de BAC ont t s quenc s pour compl ter le g nome humain. fragmentation al atoire copies multiples du g nome 479 Plusieurs m thodes de s quen age de deuxi me g n ration sont maintenant largement utilis es, et nous aborderons deux des plus courantes. Les deux reposent sur la construction de banques de fragments d'ADN qui repr sentent, dans leur int gralit , l'ADN du g nome. Au lieu d'utiliser des cellules bact riennes pour g n rer ces biblioth ques, comme nous l'avons vu sur la figure 8-30), elles sont fabriqu es en utilisant l'amplification PCR de milliards de fragments d'ADN, chacun attach un support solide. L'amplifcation est effectu e de mani re ce que les copies g n r es par la PCR, au lieu de se fomenter dans la solution, restent li es proximit du fragment d'ADN d'origine. Ce processus g n re des grappes de fragments d'ADN, o chaque grappe contient environ 1000 copies identiques d'une petite partie du g nome. Ces amas, dont un milliard peut tre plac dans une seule lame ou plaque, sont ensuite s quenc s en m me temps ; c'est- -dire en parall le. Une m thode, connue sous le nom de s quen age Illumina, est bas e sur la m thode did soxy d crite ci-dessus, mais elle int gre plusieurs innovations. Ici, chaque nucl otide est attach une mol cule fuorescente amovible (une couleur diff rente pour chacune des quatre bases) ainsi qu' un adduit chimique sp cial de terminaison de cha ne : au lieu d'un groupe 3'-OH, comme dans le s quen age did soxy conventionnel, les nucl otides portent un groupe chimique qui bloque l' longation par l'ADN polym rase mais qui peut tre limin chimiquement. Le s quen age est ensuite effectu comme suit : les quatre nucl otides marqu s de mani re fuorescente ainsi que l'ADN polym rase sont ajout s des milliards de grappes d'ADN immobilis es sur une lame. Seul le nucl otide appropri (qui est compl mentaire au nucl otide suivant dans la matrice) est incorpor de mani re covalente chaque grappe ; Les nucl otides non incorpor s sont emport s et une cam ra num rique haute r solution prend une image qui enregistre lequel des quatre nucl otides a t ajout la cha ne chaque cluster. L' tiquette fuorescente et le groupe bloquant 3 -OH sont ensuite limin s par voie enzymatique, lav s et le processus est r p t plusieurs fois. De cette fa on, des milliards de r actions de s quen age sont effectu es simultan ment. En gardant une trace des changements de couleur qui se produisent chaque grappe, la s quence d'ADN repr sent e par chaque tache peut tre lue. Bien que chaque lecture de s quence individuelle soit relativement courte (environ 200 nucl otides), les milliards qui sont effectu s simultan ment peuvent produire plusieurs g nomes humains de s quence en une journ e environ. Principe du s quen age Illumina. Cette r action s'effectue par tapes, sur des milliards de grappes d'ADN la fois. La m thode repose sur une cam ra num rique couleur qui scanne rapidement tous les amas d'ADN apr s chaque cycle d'incorporation de nucl otides modifi s. La s quence d'ADN de chaque grappe est ensuite d termin e par la s quence de changements de couleur qu'elle subit au fur et mesure que la r action d'allongement se d roule par tapes. Chaque cycle d'incorporation de nucl otides modifi
Biologie moléculaire de la cellule	s, d'acquisition d'images et de suppression du bloc 3 et du groupe fuorescent prend moins d'une heure. Chaque grappe de la lame contient de nombreuses copies de diff rents bits al atoires d'un g nome ; lors de la pr paration des amas, une s quence d'ADN (sp cifi e par l'exp rimentateur) est jointe chaque copie de chaque amas, et une amorce compl mentaire cette s quence est utilis e pour commencer la r action d' longation par l'ADN polym rase. 100 m Une diapositive montrant des groupes individuels de mol cules d'ADN g n r es par PCR. Chaque grappe porte environ 1000 mol cules d'ADN identiques ; les quatre couleurs sont produites par l'incorporation de C, G, A ou T, chacune ayant un fuorophore de couleur diff rente. L'image a t prise juste apr s qu'un nucl otide fuorescent ait t incorpor dans chaque cha ne d'ADN en croissance. (D'apr s Illumina Sequencing Overview, 2013.) PPP PP fuor 3 bloc 5 3 incorporation de bloc dans la cha ne de croissance par ADN polym rase P 5 free 3 end P Mod le d'ADN OH fuor bloc supprim cycle suivant pas de photo prise 480 S QUEN AGE IONIQUE TORRENTTM L'AVENIR DU S QUEN AGE DE L'ADN Une autre strat gie largement utilis e pour le s quen age rapide de l'ADN est appel e m thode du torrent ionique. Ici, un g nome est fragment et les fragments individuels sont attach s des billes microscopiques. l'aide de la PCR, chaque fragment d'ADN est ensuite amplifi de sorte que des copies de celui-ci finissent par recouvrir la perle laquelle il tait initialement attach . Ce processus produit une biblioth que de milliards de billes individuelles, chacune recouverte de copies identiques d'un fragment d'ADN particulier. Comme des ufs dans un carton, les perles sont plac es dans des puits individuels sur un r seau pouvant contenir un milliard de perles dans un pouce carr . partir d'une amorce, la synth se de l'ADN est ensuite initi e sur chaque bille. Un ion hydrog ne (H+) est lib r (avec le pyrophosphate) chaque fois qu'un nucl otide est incorpor dans une cha ne d'ADN en croissance (voir Figure 5-3), et la m thode du torrent d'ions est bas e sur ce simple fait. Chacun des quatre nucl otides est lav , un la fois, sur le r seau de billes ; lorsqu'un nucl otide est incorpor dans l'ADN d'une bille donn e, la lib ration d'un ion H+ modifie le pH, qui est enregistr par une puce semi-conductrice plac e sous le r seau de puits. De cette fa on, la s quence d'ADN sur une bille donn e peut tre lue partir du mod le de changements de pH observ s lorsque les nucl otides sont lav s sur eux. l'instar d'un capteur haute r solution dans un appareil photo num rique, l'ion La puce semi-conductrice Torrent peut enregistrer d' normes quantit s d'informations et peut ainsi suivre des milliards de r actions de s quen age parall les. Gr ce cette technologie, il est actuellement possible, l'aide d'une seule puce, de d terminer les s quences nucl otidiques de plusieurs g nomes humains en quelques heures seulement. PPP PP 5 Mod le d'ADN A OH OH H+ Changement de pH d tect volts 1 m Puce de d tection de tension perle de puits recouverte d'un mod le d'ADN Un s quen age de l'ADN par la m thode du torrent d'ions. Des billes, chacune recouverte d'une mol cule d'ADN qui a t amplifi e plusieurs fois, sont plac es dans des puits avec des amorces et de l'ADN polym rase. Comme les nucl otides sont lav s s quentiellement sur les billes, ceux incorpor s par la polym rase provoquent un changement de pH. Dans l'exemple pr sent , un A est incorpor ; ainsi, le mod le doit avoir un T cette position. Au fur et mesure que les quatre nucl otides sont lav s s quentiellement sur les billes, la s quence de l'ADN sur chaque bille peut tre lue par le motif des fuctuations de pH. Des milliards de billes sont surveill es la fois par une puce semi-conductrice sensible la tension plac e sous le r seau de billes. Des m thodes encore plus r centes, potentiellement plus rapides, de s quen age de l'ADN sont en cours de d veloppement. Certaines de ces technologies de troisi me g n ration contournent compl tement les tapes d'amplification de l'ADN et d terminent la s quence de mol cules uniques d'ADN. Dans une technique, une mol cule d'ADN est pouss e travers un minuscule canal, comme un fil dans le chas d'une aiguille. Lorsque la mol cule d'ADN se d place travers le pore, elle g n re des courants lectriques qui d pendent de sa s quence de nucl otides ; Le mod le de courants peut ensuite tre utilis pour d duire la s quence nucl otidique. D'autres m thodes visualisent des mol cules d'ADN uniques l'aide de la microscopie lectronique ou force atomique ; la s quence nucl otidique est lue partir des petites diff rences dans l'"apparence de l'ADN lorsqu'il est scann . Enfin, une autre m thode consiste immobiliser une seule mol cule d'ADN polym rase (avec un mod le) et mesurer le temps de s jour de chacun des quatre nucl otides, qui sont marqu s avec diff rents colorants fuo
Biologie moléculaire de la cellule	rescents amovibles. Les nucl otides qui r sident plus longtemps sur la polym rase (avant que leur colorant ne soit limin ) sont ceux incorpor s par la polym rase. Bien que les deux m thodes que nous avons d crites en d tail (Illumina et torrent ionique) soient aujourd'hui largement utilis es, il est probable que des m thodes plus rapides et moins co teuses continueront tre d velopp es. 2001 2003 2005 2007 2009 2011 2013 2015 100 000 000 10 000 000 1 000 000 100 000 1000 1000 100 100 100 co t en dollars ann es Voici les co ts du s quen age d'un g nome humain, qui taient de 100 millions de dollars en 2001 et d'environ un millier de dollars la fin de 2014. (Donn es de l'Initiative nationale de recherche sur le g nome humain.) 481 (A) sens de lecture pour la s quence des cadres du brin sup rieur de l'ADN 3 sens de lecture pour la s quence du brin inf rieur de l'ADN 500 paires de bases contiennent un codon stop environ tous les 20 acides amin s ; Les r gions codant pour les prot ines, en revanche, contiennent g n ralement des tirements beaucoup plus longs sans codons d'arr t (Figure 8 40). Connus sous le nom de cadres de lecture ouverts (ORF), ceux-ci signifient g n ralement de v ritables g nes codant pour des prot ines. Cette attribution est souvent v rifi e en comparant la s quence d'acides amin s ORF aux nombreuses bases de donn es de prot ines document es d'autres esp ces. Si une correspondance est trouv e, m me si elle est imparfaite, il est tr s probable que l'ORF codera pour une prot ine fonctionnelle (voir Figure 8 23). Cette strat gie fonctionne tr s bien pour les g nomes compacts, o les s quences d'introns sont rares et les ORF s' tendent souvent plusieurs centaines d'acides amin s. Cependant, chez de nombreux animaux et plantes, la taille moyenne des exons est de 150 200 paires de nucl otides (voir Figure 6-31) et des informations suppl mentaires sont g n ralement n cessaires pour localiser sans ambigu t tous les exons d'un g ne. Bien qu'il soit possible de rechercher dans les g nomes des signaux d' pissage et d'autres caract ristiques qui aident identifier les exons (biais de codon, par exemple), l'une des m thodes les plus puissantes consiste simplement s quencer l'ARN total produit partir du g nome dans les cellules vivantes. Comme on peut le voir sur la figure 7-3, ces informations de s quen age de l'ARN, lorsqu'elles sont cartographi es sur la s quence du g nome, peuvent tre utilis es pour localiser avec pr cision tous les introns et exons de g nes complexes. En s quen ant l'ARN total de diff rents types de cellules, il est galement possible d'identifier des cas d' pissage alternatif (voir Figure 6 26). Le s quen age de l'ARN identifie galement les ARN non codants produits par un g nome. Bien que la fonction de certains d'entre eux puisse tre facilement reconnue (ARNt ou snoARN, par exemple), beaucoup ont des fonctions inconnues et d'autres encore n'ont probablement aucune fonction du tout (discut e au chapitre 7, pp. 429-436). L'existence de nombreux ARN non codants et notre relative ignorance de leur fonction sont la principale raison pour laquelle nous ne connaissons que le nombre approximatif de g nes dans le g nome humain. Mais m me pour les g nes codant pour des prot ines qui ont t identifi s sans ambigu t , nous avons encore beaucoup apprendre. Des milliers de g nomes ont t s quenc s, et la g nomique comparative nous a appris que de nombreux Les organismes partagent le m me ensemble de prot ines de base. Cependant, les fonctions d'un tr s grand nombre de prot ines identifi es restent inconnues. Selon l'organisme, environ un tiers des prot ines cod es par un g nome s quenc ne ressemblent clairement aucune prot ine tudi e biochimiquement. Cette observation souligne une limite du domaine mergent de la g nomique : bien que l'analyse comparative des g nomes r v le beaucoup d'informations sur les relations entre les g nes et les organismes, elle ne fournit souvent pas d'informations imm diates sur le fonctionnement de ces g nes, ni sur leurs r les dans la physiologie d'un organisme. Comparaison de l'ensemble Figure 8 40 Trouver les r gions d'une s quence d'ADN qui codent pour une prot ine. (A) N'importe quelle r gion de la s quence d'ADN peut, en principe, coder pour six s quences d'acides amin s diff rentes, car n'importe lequel des trois cadres de lecture diff rents peut tre utilis pour interpr ter la s quence nucl otidique sur chaque brin. Notez qu'une s quence de nucl otides est toujours lue dans la direction 5 3 et code un polypeptide de l'extr mit N-terminale l'extr mit C-terminale. Pour une s quence nucl otidique al atoire lue dans un cadre particulier, un signal d'arr t pour la synth se des prot ines est rencontr , en moyenne, environ une fois tous les 20 acides amin s. Dans cette s quence d' chantillonnage de 48 paires de bases, chacun de ces signaux (codon d'arr t) est color en bleu, et seule la trame de lecture 2 n'a pas de signal
Biologie moléculaire de la cellule	d'arr t. (B) Recherche d'une s quence d'ADN de 1700 paires de bases pour une s quence codant pour une prot ine. L'information est affich e comme en (A), chaque signal d'arr t de la synth se des prot ines tant indiqu par une ligne bleue. De plus, toutes les r gions entre les signaux de d marrage et d'arr t possibles pour la synth se des prot ines (voir pp. 347-349) sont affich es sous forme de barres rouges. Seule l'image de lecture 1 code r ellement pour une prot ine, qui a 475 r sidus d'acides amin s. Le compl ment g n tique de plusieurs bact ries thermophiles, par exemple, ne r v le pas pourquoi ces bact ries se d veloppent des temp ratures sup rieures 70 C. Et l'examen du g nome de la bact rie incroyablement radior sistante Deinococcus radiodurans n'explique pas comment cet organisme peut survivre une explosion de rayonnement qui peut briser le verre. D'autres tudes biochimiques et g n tiques, comme celles d crites dans les autres sections de ce chapitre, sont n cessaires pour d terminer comment les g nes, et les prot ines qu'ils produisent, fonctionnent dans le contexte des organismes vivants. Le clonage de l'ADN permet de produire n'importe quelle prot ine en grandes quantit s Dans la derni re section, nous avons vu comment les g nes codant pour des prot ines peuvent tre identifi s dans les s quences g nomiques. En utilisant le code g n tique (et condition que les limites de l'intron et de l'exon soient connues), la s quence d'acides amin s de toute prot ine cod e dans un g nome peut tre d duite. Comme nous l'avons vu pr c demment, cette s quence peut souvent fournir un indice important sur la fonction de la prot ine si elle s'av re similaire la s quence d'acides amin s d'une prot ine qui a d j t tudi e (voir Figure 8 23). Bien que cette strat gie soit souvent couronn e de succ s, elle ne fournit g n ralement que la fonction biochimique probable de la prot ine ; Par exemple, si la prot ine ressemble une kinase ou une prot ase. Il reste g n ralement l'exp rimentateur de v rifier (ou de r futer) cette attribution et, surtout, de d couvrir la fonction biologique de la prot ine dans l'ensemble de l'organisme ; C'est- -dire, quels attributs de l'organisme la kinase ou la prot ase contribue-t-elle et dans quelles voies mol culaires fonctionne-t-elle ? De nos jours, la plupart des nouvelles prot ines sont d couvertes par le s quen age du g nome, et il reste souvent un grand d fi de d terminer leurs fonctions. Une approche importante pour d terminer la fonction d'un g ne consiste modifier le g ne (ou, dans certains cas, son mode d'expression), remettre la copie modifi e dans la lign e germinale de l'organisme et d duire la fonction du g ne normal par les changements caus s par son alt ration. Diverses techniques de mise en uvre de cette strat gie sont abord es dans la section suivante de ce chapitre. Mais il est tout aussi important d' tudier les propri t s biochimiques et structurelles d'un produit g nique, comme indiqu dans la premi re partie de ce chapitre. L'une des contributions les plus importantes du clonage de l'ADN la biologie cellulaire et mol culaire est la capacit de produire n'importe quelle prot ine, m me les plus rares, en quantit s presque illimit es, tant que le g ne codant pour celle-ci est connu. Une telle production de haut niveau est g n ralement r alis e dans des cellules vivantes l'aide de vecteurs d'expression (Figure 8 41). Il s'agit g n ralement de plasmides qui ont t con us pour produire une grande quantit d'ARNm stable qui peut tre efficacement traduit en prot ines lorsque le plasmide est introduit dans des cellules bact riennes, de levures, d'insectes ou de mammif res. Pour viter que le niveau lev de la prot ine trang re n'interf re avec la croissance de la cellule, le vecteur d'expression est souvent con u pour retarder la synth se de l'ARNm et de la prot ine trang re jusqu' peu de temps avant que les cellules ne soient r colt es et lys es (Figure 8 42). Parce que la prot ine souhait e fabriqu e partir d'un vecteur d'expression est produite l'int rieur d'une cellule, elle doit tre purifi e loin des prot ines de la cellule h te par chromatographie apr s lyse cellulaire ; Mais parce qu'il s'agit d'une esp ce si abondante dans la cellule (souvent 1 10 % de la prot ine cellulaire totale), la purification est g n ralement facile r aliser en seulement quelques tapes. Comme nous l'avons vu dans la premi re partie de ce chapitre, de nombreuses expressions Figure 8 41 Production de grandes quantit s d'une prot ine partir d'une s quence d'ADN codant pour une prot ine clon e dans un vecteur d'expression et introduite dans des cellules. Un vecteur plasmidique a t con u pour contenir un promoteur tr s actif, ce qui provoque la production de quantit s inhabituellement lev es d'ARNm partir d'un g ne codant pour une prot ine adjacente ins r dans le vecteur plasmidique. Selon les caract ristiques du vecteur de clonage
Biologie moléculaire de la cellule	, le plasmide est introduit dans des cellules bact riennes, de levures, d'insectes ou de mammif res, o le g ne ins r est efficacement transcrit et traduit en prot ine. Si le g ne surexprimer n'a pas d'introns (typique des g nes de bact ries, d'arch es et de simples eucaryotes), il peut simplement tre clon partir d'ADN g nomique par PCR. Pour les g nes animaux et v g taux clon s, il est souvent plus pratique d'obtenir le g ne sous forme d'ADNc, soit partir d'une banque d'ADNc (voir Figure 8 32), soit clon directement par PCR partir d'ARN isol de l'organisme (voir Figure 8 37). Alternativement, l'ADN codant pour la prot ine peut tre fabriqu par synth se chimique (voir p. 472). Les vecteurs ont t con us pour ajouter une tiquette mol culaire un groupe de r sidus d'histidine ou une petite prot ine marqueur la prot ine exprim e afin de faciliter la purification par chromatographie d'affinit (voir Figure 8 11). Une vari t de vecteurs d'expression est disponible, chacun con u pour fonctionner dans le type de cellule dans lequel la prot ine doit tre fabriqu e. Cette technologie est galement utilis e pour fabriquer de grandes quantit s de nombreuses prot ines m dicalement utiles, y compris des hormones (telles que l'insuline et les facteurs de croissance) utilis es comme produits pharmaceutiques humains et des prot ines d'enveloppe virale utilis es dans les vaccins. Les vecteurs d'expression permettent galement aux scientifiques de produire de nombreuses prot ines d'int r t biologique en quantit s suffisantes pour des tudes structurales d taill es. Presque toutes les structures prot iques tridimensionnelles d crites dans ce livre sont des prot ines produites de cette mani re. Les techniques d'ADN recombinant permettent donc aux scientifiques de passer facilement d'une prot ine un g ne, et vice versa, de sorte que les fonctions des deux peuvent tre explor es sur plusieurs fronts (Figure 8-43). Le clonage de l'ADN permet de s lectionner une copie de n'importe quelle partie sp cifique d'une s quence d'ADN ou d'ARN parmi les millions d'autres s quences d'une cellule et de la produire en quantit s illimit es sous forme pure. Les s quences d'ADN peuvent tre amplifi es apr s avoir bris l'ADN chromosomique et ins r les fragments d'ADN r sultants dans le chromosome d'un l ment g n tique auto-r plicatif tel qu'un plasmide. La biblioth que d'ADN g nomique qui en r sulte est log e dans des millions de cellules bact riennes, chacune portant un fragment d'ADN clon diff rent. Les cellules individuelles de cette biblioth que qui sont autoris es prolif rer produisent de grandes quantit s d'un seul fragment d'ADN clon . En contournant compl tement les vecteurs de clonage et les cellules bact riennes, la r action en cha ne par polym rase (PCR) permet d'effectuer le clonage de l'ADN directement avec une ADN polym rase et des amorces d'ADN, condition que la s quence d'ADN d'int r t soit d j connue. Les proc dures utilis es pour obtenir des clones d'ADN qui correspondent en s quence aux mol cules d'ARNm sont les m mes, sauf qu'une copie d'ADN de la s quence d'ARNm, appel e ADNc, est d'abord fabriqu e. Contrairement aux clones d'ADN g nomique, les clones d'ADNc n'ont pas de s quences introniques, ce qui en fait les clones de choix pour l'analyse du produit prot ique d'un g ne. Les r actions d'hybridation des acides nucl iques fournissent un moyen sensible de d tecter toute s quence nucl otidique d'int r t. L' norme sp cificit de cette r action d'hybridation permet toute s quence monocat naire de nucl otides marquer avec un radio-isotope ou un produit chimique et utiliser comme sonde pour trouver un brin partenaire compl mentaire, m me dans une cellule ou un extrait cellulaire contenant des millions de s quences d'ADN et d'ARN diff rentes. L'hybridation de l'ADN permet galement d'utiliser la PCR pour amplifier n'importe quelle section de n'importe quel g nome une fois que sa s quence est connue. Direction de l' lectrophor se Figure 8 42 Production de grandes quantit s d'une prot ine l'aide d'un vecteur d'expression plasmidique. Dans cet exemple, un vecteur d'expression qui surproduit une h licase d'ADN a t introduit dans des bact ries. Dans ce vecteur d'expression, la transcription de cette s quence codante est sous le contr le d'un promoteur viral qui ne devient actif qu' une temp rature de 37 C ou plus. La prot ine cellulaire totale, soit partir de bact ries cultiv es 25 C (aucune prot ine h licase fabriqu e), soit apr s un d placement de la m me bact rie 42 C pendant jusqu' 2 heures (la prot ine h licase est devenue l'esp ce prot ique la plus abondante dans le lysat), a t analys e par lectrophor se sur polyacrylamide SDS. (Avec l'aimable autorisation de Jack Barry.) s quence d'un fragment de peptide E. coli ou une autre cellule h te PROTEIN pour produire des amorces d'ADN prot ique pour la PCR Ins rer la r gion codant pour la prot ine du g ne dans le vecteu
Biologie moléculaire de la cellule	r d'expression ( partir d'un clone d'ADNc) Figure 8 43 Les techniques d'ADN recombinant permettent de passer exp rimentalement d'un g ne l'autre et d'une prot ine l'autre. Si un g ne a t identifi ( droite), sa s quence codant pour la prot ine peut tre ins r e dans un vecteur d'expression pour produire de grandes quantit s de la prot ine (voir Figure 8-41), qui peut ensuite tre tudi e biochimiquement ou structurellement. Si une prot ine a t purifi e en fonction de ses propri t s biochimiques, la spectrom trie de masse (voir Figure 8-18) peut tre utilis e pour obtenir une s quence partielle d'acides amin s, qui est utilis e pour rechercher dans une s quence g nomique la s quence nucl otidique correspondante. Le g ne complet peut ensuite tre clon par PCR partir d'un g nome s quenc (voir Figure 8 37). Le g ne peut galement tre manipul et introduit dans des cellules ou des organismes pour tudier sa fonction, un sujet abord dans la section suivante de ce chapitre. La s quence nucl otidique de n'importe quel g nome peut tre d termin e rapidement et simplement en utilisant des techniques hautement automatis es bas es sur plusieurs strat gies diff rentes. La comparaison des s quences g nomiques de diff rents organismes nous permet de retracer les relations volutives entre les g nes et les organismes, et s'est av r e pr cieuse pour d couvrir de nouveaux g nes et pr dire leurs fonctions. Ensemble, ces techniques d'analyse et de manipulation de l'ADN ont permis de s quencer, d'identifier et d'isoler des g nes de n'importe quel organisme d'int r t. Les technologies connexes permettent aux scientifiques de produire les produits prot iques de ces g nes en grandes quantit s n cessaires des analyses d taill es de leur structure et de leur fonction, ainsi qu' des fins m dicales. En fin de compte, on souhaite d terminer comment les g nes et les prot ines qu'ils codent fonctionnent dans l'organisme intact. Bien que cela puisse sembler contre-intuitif, l'un des moyens les plus directs de d couvrir ce que fait un g ne est de voir ce qui arrive l'organisme lorsque ce g ne est manquant. L' tude d'organismes mutants qui ont acquis des changements ou des d l tions dans leurs s quences nucl otidiques est une pratique s culaire en biologie et constitue la base de l'important domaine de la g n tique. Parce que les mutations peuvent perturber les processus cellulaires, les mutants d tiennent souvent la cl pour comprendre la fonction des g nes. Dans l'approche g n tique classique, on commence par isoler les mutants qui ont une apparence int ressante ou inhabituelle : les mouches des fruits aux yeux blancs ou aux ailes boucl es, par exemple. En partant du ph notype, c'est- -dire l'apparence ou le comportement de l'individu, on d termine ensuite le g notype de l'organisme, la forme du g ne responsable de cette caract ristique (panneau 8-2). Aujourd'hui, avec de nombreuses s quences g nomiques disponibles, l'exploration de la fonction des g nes commence souvent par une s quence d'ADN. Ici, le d fi est de traduire la s quence en fonction. Une approche, discut e plus haut dans le chapitre, consiste rechercher dans les bases de donn es des prot ines bien caract ris es qui ont des s quences d'acides amin s similaires la prot ine cod e par un nouveau g ne. partir de l , la prot ine (ou pour les g nes non codants, le mol cule d'ARN) peut tre surexprim e et purifi e et les m thodes d crites dans la premi re partie de ce chapitre peuvent tre utilis es pour tudier sa structure tridimensionnelle et ses propri t s biochimiques. Mais pour d terminer directement la fonction d'un g ne dans une cellule ou un organisme, l'approche la plus efficace consiste tudier les mutants qui sont soit d pourvus du g ne, soit qui expriment une version modifi e de celui-ci. D terminer quels processus cellulaires ont t perturb s ou compromis chez de tels mutants permettra g n ralement de faire la lumi re sur le r le biologique d'un g ne. Dans cette section, nous d crivons plusieurs approches pour d terminer la fonction d'un g ne, partir soit d'un individu ayant un ph notype int ressant, soit partir d'une s quence d'ADN. Nous commen ons par l'approche g n tique classique, qui commence par un criblage g n tique permettant d'isoler les mutants d'int r t, puis nous nous dirigeons vers l'identification du ou des g nes responsables du ph notype observ . Nous d crivons ensuite l'ensemble des techniques que l'on appelle collectivement la g n tique inverse, dans laquelle on commence par un g ne ou une s quence de g nes et on tente de d terminer sa fonction. Cette approche implique souvent des suppositions intelligentes la recherche de s quences similaires dans d'autres organismes ou la d termination du moment et de l'endroit o un g ne est exprim ainsi que la g n ration d'organismes mutants et la caract risation de leur ph notype. Avant l'av nement de la technologie du clonage de g nes, la plupart des g nes taient
Biologie moléculaire de la cellule	identifi s par les anomalies produites lors de la mutation du g ne. En effet, le concept m me du g ne a t d duit de l'h ritabilit de telles anomalies. Cette approche g n tique classique, qui consiste identifier les g nes responsables des ph notypes mutants, est plus facile mettre en uvre chez les organismes qui se reproduisent rapidement et qui se pr tent la manipulation g n tique, tels que les bact ries, les levures, les vers n matodes et les mouches des fruits. Bien que des mutants spontan s puissent parfois tre trouv s en examinant extr mement PANeL 8 2 : Revue de la g n tique classique G NES ET PH NOTYPES G ne : unit fonctionnelle de l'h r dit , correspondant g n ralement au segment d'ADN codant pour une seule prot ine. G nome : ensemble des s quences d'ADN d'un organisme. locus : le site du g ne dans le g nome Type sauvage : le normal, Mutant : diff rent des all les : formes alternatives d'un g ne type naturel type sauvage en raison d'un changement g n tique (une mutation) G NOTYPE : l'ensemble sp cifique d'all les formant le g nome d'un individu PH NOTYPE : le caract re visible de l'all le individuel A est dominant (par rapport a) ; l'all le A est r cessif (par rapport A) Dans l'exemple ci-dessus, le ph notype de l'h t rozygote est le m me que celui de l'un des homozygotes ; Dans les cas o il est diff rent des deux, on dit que les deux all les sont codominants. un chromosome au d but du cycle cellulaire, en phase G1 ; le centrom re barre longue unique repr sente une longue double h lice d'ADN, un chromosome pr s de la fin du cycle cellulaire, en m taphase ; elle est dupliqu e et condens e, compos e de la m re p re de deux chromatides s urs identiques (contenant chacune une double h lice d'ADN) r unies au centrom re. Un ensemble de chromosomes diplo des normaux, comme on le voit dans une m taphase tal e, a pr par une paire d'autosomes en faisant clater une cellule en m taphase et en colorant les chromosomes maternels 1 dispers s. Dans l'exemple sch matiquement pr sent ici, il y a trois paires d'autosomes (chromosomes des deux parents, quel que soit le sexe) et deux chromosomes sexuels : un X de la m re et un Y du p re. Les 2 nombres maternels et les types de d termination du sexe sont variables d'une classe d'organismes l'autre, tout comme le nombre X de paires d'autosomes. Pour simplifier, le cycle n'est montr que pour les chromosomes sexuels d'une paire chromosome/chromosome. M IOSE ET RECOMBINAISON G N TIQUE Plus le chromosome loign est grand, plus il y a de chances qu'ils soient RECOMBINAISON : site de croisement se produisant un site entre eux. Si deux g nes sont ainsi r assortis dans x% des gam tes, on dit qu'ils sont s par s sur un chromosome par une carte g n tique AB distance de x unit s de carte (ou g notype ab gam tes haplo des (ovules ou spermatozo des) x centimorgans). MUTATION PONCTUELLE : correspond un seul site dans le g nome, correspondant une seule paire de nucl otides ou une tr s petite partie d'un seul g ne INVERSION : inverse un segment d'une mutation l tale chromosomique : provoque la mort pr matur e de l'organisme en d veloppement. Mutation conditionnelle : ne produit son effet ph notypique que dans certaines conditions, appel es conditions restrictives. Dans d'autres conditions, les conditions permissives, l'effet n'est pas visible. Pour une mutation sensible la temp rature, la condition restrictive est g n ralement une temp rature lev e, tandis que la condition permissive est une temp rature basse. Mutation de perte de fonction : r duit ou abolit l'activit du g ne. Il s'agit de la classe de mutations la plus courante. Les mutations de perte de fonction sont g n ralement r cessives l'organisme peut g n ralement fonctionner normalement tant qu'il conserve au moins une copie normale du g ne affect . Mutation nulle : Une mutation de perte de fonction qui abolit compl tement l'activit du g ne. DEUX G NES OU UN SEUL ? tant donn deux mutations qui produisent le m me ph notype, comment pouvons-nous savoir s'il s'agit de mutations dans le m me g ne ? Si les mutations sont r cessives (comme elles le sont le plus souvent), la r ponse peut tre trouv e par un test de compl mentation. COMPL MENTATION : MUTATIONS DANS DEUX G NES DIFF RENTS D L TION : supprime un segment d'un chromosome TRANSLOCATION : cassure un segment d'un chromosome et l'attache une autre mutation de gain de fonction : augmente l'activit du g ne ou le rend actif dans des circonstances inappropri es ; Ces mutations sont g n ralement dominantes. Mutation dominante-n gative : Mutation action dominante qui bloque l'activit du g ne, provoquant un ph notype de perte de fonction m me en pr sence d'une copie normale du g ne. Ce ph nom ne se produit lorsque le produit g nique mutant interf re avec la fonction du produit g nique normal. Mutation suppressive : supprime l'effet ph notypique d'une autre mutation, de sorte que le double mutant semble normal. Une mutat
Biologie moléculaire de la cellule	ion suppressive intrag nique se trouve dans le g ne affect par la premi re mutation ; Une mutation suppressive extrag nique r side dans un deuxi me g ne, souvent dont le produit interagit directement avec le produit du FRST. Dans le type de test de compl mentation le plus simple, un individu homozygote pour une mutation est accoupl avec un individu homozygote pour l'autre. Le ph notype de la prog niture donne la r ponse la question. NON-COMPL MENTATION : DEUX MUTATIONS IND PENDANTES DANS LE M ME G NE La prog niture hybride pr sente un ph notype normal : la prog niture hybride pr sente un ph notype mutant : une copie normale de chaque g ne est pr sente aucune copie normale du g ne mut n'est pr sente De grandes populations - des milliers ou des dizaines de milliers d'organismes individuels - Isoler les individus mutants est beaucoup plus efficace si l'on g n re des mutations avec des produits chimiques ou des radiations qui endommagent l'ADN. En traitant des organismes avec de tels mutag nes, un tr s grand nombre d'individus mutants peuvent tre cr s rapidement, puis d pist s pour un d faut d'int r t particulier, comme nous le verrons bient t. Une approche alternative la mutag n se chimique ou par rayonnement est appel e mutagen se insertionnelle. Cette m thode repose sur le fait que l'ADN exog ne ins r au hasard dans le g nome peut produire des mutations si le fragment ins r interrompt un g ne ou ses s quences r gulatrices. L'ADN ins r , dont la s quence est connue, sert ensuite d' tiquette mol culaire qui aide l'identification et au clonage ult rieurs du g ne perturb (Figure 8 44). Chez la drosophile, l'utilisation de l' l ment P transposable pour inactiver les g nes a r volutionn l' tude de la fonction des g nes chez la mouche. Des l ments transposables (voir tableau 5-4, p. 288) ont galement t utilis s pour g n rer des mutations chez les bact ries, les levures, les souris et la plante fleurs Arabidopsis. Les cribles g n tiques identifient les mutants pr sentant des anomalies sp cifiques Une fois qu'une collection de mutants dans un organisme mod le tel qu'une levure ou une mouche a t produite, il faut g n ralement examiner des milliers d'individus pour trouver le ph notype modifi d'int r t. Une telle recherche s'appelle un d pistage g n tique, et plus le g nome est grand, moins il est probable qu'un g ne particulier soit mut . Par cons quent, plus le g nome d'un organisme est grand, plus la t che de d pistage devient importante. Le ph notype recherch peut tre simple ou complexe. Les ph notypes simples sont les plus faciles d tecter : on peut d pister rapidement de nombreux organismes, par exemple, pour d tecter des mutations qui rendent impossible la survie de l'organisme en l'absence d'un acide amin ou d'un nutriment particulier. Des ph notypes plus complexes, tels que des d fauts d'apprentissage ou de comportement, peuvent n cessiter des crans plus labor s (Figure 8 45). Mais m me les criblages g n tiques utilis s pour diss quer des syst mes physiologiques complexes peuvent tre simples dans leur conception, ce qui permet l'examen simultan d'un grand nombre de mutants. titre d'exemple, un cran particuli rement l gant a t con u pour rechercher des g nes impliqu s dans le traitement visuel chez le poisson z bre. La base de cet cran, qui surveille la r ponse des poissons au mouvement, est un changement de comportement. Les poissons de type sauvage ont tendance nager dans la direction d'un mouvement per u, tandis que les mutants pr sentant des d fauts dans leurs syst mes de traitement visuel nagent dans des directions al atoires, un comportement facilement d tect . Un mutant d couvert dans cet cran s'appelle lakritz, qui il manque 80% des cellules ganglionnaires r tiniennes qui aident relayer les signaux visuels de l' il au cerveau. Comme l'organisation cellulaire de la r tine du poisson-z bre est similaire celle de tous les vert br s, l' tude de ces mutants devrait galement fournir des informations sur le traitement visuel chez l'homme. tant donn que les d fauts dans les g nes n cessaires aux processus cellulaires fondamentaux la synth se et le traitement de l'ARN ou le contr le du cycle cellulaire, par exemple sont g n ralement mortels, les fonctions de ces g nes sont souvent tudi es chez les individus atteints de Figure 8 44 Mutant insertionnel du muflier, Antirrhinum. Une mutation dans un seul g ne codant pour une prot ine r gulatrice provoque le d veloppement de pousses feuillues ( gauche) la place des fleurs, qui se produisent dans la plante normale ( droite). La mutation fait que les cellules adoptent un caract re qui serait appropri une autre partie de la plante normale, de sorte qu'au lieu d'une fleur, les cellules produisent une pousse feuillue. (Avec l'aimable autorisation d'Enrico Coen et Rosemary Carpenter.) Figure 8 45 Un ph notype comportemental d tect dans un d pistage g n tique. (A) Les C. elegans de type sauvage se nour
Biologie moléculaire de la cellule	rissent socialement. Les vers migrent jusqu' ce qu'ils rencontrent leurs voisins et commencent se nourrir de bact ries. (B) Les animaux mutants se nourrissent par eux-m mes. (Avec l'aimable autorisation de Cornelia Bargmann, Cellule 94 : couverture, 1998. Avec l'autorisation d'Elsevier.) Les cellules mutantes prolif rent et forment une colonie la temp rature permissive Les cellules mutantes ne parviennent pas prolif rer et forment une colonie aux mutations conditionnelles non permissives. Les individus mutants fonctionnent normalement tant que des conditions permissives pr valent, mais pr sentent une fonction g nique anormale lorsqu'ils sont soumis des conditions non permissives (restrictives). Dans les organismes pr sentant des mutations sensibles la temp rature, par exemple, l'anomalie peut tre activ e et d sactiv e exp rimentalement simplement en modifiant la temp rature ambiante ; ainsi, une cellule contenant une mutation sensible la temp rature dans un g ne essentiel la survie mourra une temp rature non permissive mais prolif rera normalement la temp rature permissive (Figure 8 46). Le g ne sensible la temp rature chez un tel mutant contient g n ralement un point mutation qui provoque un changement subtil dans son produit prot ique ; Par exemple, la prot ine mutante peut fonctionner normalement basse temp rature, mais se d ployer des temp ratures plus lev es. Les mutations sensibles la temp rature taient cruciales pour trouver les g nes bact riens qui codent pour les prot ines n cessaires la r plication de l'ADN. Les mutants ont t identifi s en criblant des populations de bact ries trait es aux mutag nes pour des cellules qui cessent de produire de l'ADN lorsqu'elles sont chauff es de 30 C 42 C. Ces mutants ont ensuite t utilis s pour identifier et caract riser les prot ines de r plication de l'ADN correspondantes (discut es au chapitre 5). De m me, le d pistage de mutations sensibles la temp rature a permis d'identifier de nombreuses prot ines impliqu es dans la r gulation du cycle cellulaire, ainsi que de nombreuses prot ines impliqu es dans le d placement des prot ines par la voie s cr toire chez la levure. Des approches de criblage connexes ont d montr la fonction des enzymes impliqu es dans les principales voies m taboliques des bact ries et des levures (voir le chapitre 2) et ont identifi de nombreux produits g niques responsables du d veloppement ordonn de l'embryon de drosophile (discut au chapitre 21). Les mutations peuvent entra ner une perte ou un gain de fonction prot ique Les mutations g n tiques sont g n ralement class es comme perte de fonction ou gain de fonction . Une mutation de perte de fonction se traduit par un produit g nique qui ne fonctionne pas ou trop peu ; Ainsi, il peut r v ler la fonction normale du g ne. Une mutation de gain de fonction se traduit par un produit g nique qui fonctionne trop, au mauvais moment ou au mauvais endroit, ou qui fonctionne d'une nouvelle mani re (Figure 8 47). Une premi re tape importante dans l'analyse g n tique de toute cellule ou organisme mutant consiste d terminer si la mutation entra ne une perte ou un gain de fonction. Un test standard consiste d terminer si la mutation est dominante ou r cessive. Une mutation dominante est une mutation qui provoque toujours le ph notype mutant en pr sence d'une seule copie du g ne de type sauvage. Une mutation r cessive est une mutation qui n'est plus capable de provoquer le ph notype mutant en pr sence d'une seule copie de type sauvage du g ne. Bien qu'il ait t d crit des cas dans lesquels une mutation de perte de fonction est dominante ou une mutation de gain de fonction est r cessive, dans la grande majorit des cas, les mutations r cessives sont une perte de fonction et les mutations dominantes sont un gain Figure 8 46 D pistage des mutants bact riens ou levures sensibles la temp rature. Les cellules mutag nis es sont conditionn es la temp rature permissive. Ils se divisent et forment des colonies, qui sont transf r es dans deux bo tes de P tri identiques par placage r plique. L'une de ces plaques est incub e la temp rature permissive, l'autre la temp rature non permissive. Les cellules contenant une mutation sensible la temp rature dans un g ne essentiel la prolif ration peuvent se diviser la temp rature normale et permissive, mais ne parviennent pas se diviser la temp rature lev e et non permissive. Les mutations sensibles la temp rature de ce type taient particuli rement utiles pour identifier les g nes n cessaires la r plication de l'ADN, un processus essentiel. Figure 8 47 Mutations g n tiques qui affectent leur produit prot ique de diff rentes mani res. Dans cet exemple, la prot ine de type sauvage a une fonction cellulaire sp cifique d sign e par les rayons rouges. Les mutations qui liminent cette fonction ou l'inactivent des temp ratures plus lev es sont pr sent es. La prot ine mutante cond
Biologie moléculaire de la cellule	itionnelle porte une substitution d'acides amin s (rouge) qui emp che son bon repliement 37 C, mais permet la prot ine de se replier et de fonctionner normalement 25 C. De telles mutations conditionnelles sensibles la temp rature sont particuli rement utiles pour l' tude des g nes essentiels ; L'organisme peut tre cultiv dans la condition permissive, puis tre d plac vers la condition non permissive pour tudier les cons quences de la perte du produit g nique. de la fonction. Il est facile de d terminer si une mutation est dominante ou r cessive. Il suffit d'accoupler un mutant avec un type sauvage pour obtenir des cellules ou des organismes diplo des. La descendance issue de l'accouplement sera h t rozygote pour la mutation. Si le ph notype mutant n'est plus observ , on peut conclure que la mutation est r cessive et qu'il est tr s probable qu'il s'agisse d'une mutation de perte de fonction (voir panneau 8-2). Les tests de compl mentation r v lent si deux mutations se trouvent dans le m me g ne ou dans des g nes diff rents Un d pistage g n tique grande chelle peut r v ler de nombreuses mutations diff rentes qui pr sentent le m me ph notype. Ces d fauts peuvent r sider dans diff rents g nes qui fonctionnent dans le m me processus, ou ils peuvent repr senter diff rentes mutations dans le m me g ne. Les formes alternatives du m me g ne sont connues sous le nom d'all les. La diff rence la plus courante entre les all les est la substitution d'une seule paire de nucl otides, mais diff rents all les peuvent galement porter des d l tions et des substitutions et des duplications. Comment pouvons-nous dire, alors, si deux mutations qui produisent le m me ph notype se produisent dans le m me g ne ou dans des g nes diff rents ? Si les mutations sont r cessives, c'est- -dire si, par exemple, elles repr sentent une perte de fonction d'un g ne particulier, un test de compl mentation peut tre utilis pour d terminer si les mutations tombent dans le m me g ne ou dans des g nes diff rents. Pour tester la compl mentation dans un organisme diplo de, un individu homozygote pour une mutation c'est- -dire qu'il poss de deux all les identiques du g ne mutant en question est accoupl avec un individu homozygote pour l'autre mutation. Si les deux mutations se trouvent dans le m me g ne, la prog niture pr sente le ph notype mutant, car elle n'aura toujours pas de copies normales du g ne en question (Figure 8-48). Si, en revanche, les mutations tombent dans des g nes diff rents, la prog niture r sultante pr sente un ph notype normal, car elle conserve une copie normale (et une copie mutante) de chaque g ne ; Les mutations se compl tent ainsi et r tablissent un ph notype normal. Des tests de compl mentation de mutants identifi s lors de criblages g n tiques ont r v l , par exemple, que 5 g nes diff rents sont n cessaires la levure pour dig rer le sucre galactose, 20 g nes sont n cessaires E. coli pour construire un flagelle fonctionnel, 48 g nes sont impliqu s dans l'assemblage des particules virales du bact riophage T4 et des centaines de g nes sont impliqu s dans le d veloppement d'un ver n matode adulte partir d'un uf f cond . Une fois qu'un ensemble de g nes impliqu s dans un processus biologique particulier a t identifi , l' tape suivante consiste souvent d terminer dans quel ordre les g nes fonctionnent. L'ordre des g nes est peut- tre le plus facile expliquer pour les voies m taboliques, o , par exemple, l'enzyme A est n cessaire pour produire le substrat de l'enzyme B. Dans ce cas, on dirait que le g ne codant pour l'enzyme A agit avant (en amont de) le g ne codant pour l'enzyme B dans la voie. De m me, lorsqu'une prot ine r gule l'activit d'une autre prot ine, on dirait que le premier g ne agit avant le second. L'ordre des g nes peut, dans de nombreux cas, tre d termin uniquement par une analyse g n tique sans aucune connaissance du m canisme d'action des produits g niques impliqu s. Supposons que nous ayons un processus de biosynth se compos d'une s quence d' tapes, de sorte que la r alisation de l' tape B soit conditionn e l'ach vement de l' tape A pr c dente ; et supposons que le g ne A est requis pour l' tape A, et que le g ne B est requis pour l' tape B. Ensuite, une mutation nulle (une mutation qui abolit la fonction) dans le g ne A arr tera le processus l' tape A, que le g ne B soit fonctionnel ou non, tandis qu'une mutation nulle dans le g ne B ne provoquera l'arr t l' tape B que si le g ne A est toujours actif. Dans un tel cas, le g ne A est dit pistatique au g ne B. En comparant les ph notypes des diff rentes combinaisons de mutations, on peut donc d couvrir l'ordre dans lequel les g nes agissent. Ce type d'analyse est appel analyse d' pistasie. titre d'exemple, la voie de s cr tion de prot ines dans la levure a t analys e de cette mani re. Diff rentes mutations dans cette voie provoquent une accumulation aberrante de prot ines dans le r ticulum endoplasmique (
Biologie moléculaire de la cellule	RE) ou dans l'appareil de Golgi. Lorsqu'une cellule de levure est modifi e pour porter la fois une mutation qui bloque le traitement des prot ines dans le RE et une mutation qui bloque le traitement dans l'appareil de Golgi, les prot ines s'accumulent dans le Figure 8 48 Un test de compl mentation peut r v ler que des mutations dans deux g nes diff rents sont responsables du m me ph notype anormal. Lorsqu'un oiseau albinos (blanc) d'une souche est accoupl avec un albinos d'une souche diff rente, la prog niture r sultante (en bas) a une coloration normale. Cette restauration du plumage de type sauvage indique que les deux races blanches manquent de couleur en raison de mutations r cessives dans diff rents g nes. (D'apr s W. Bateson, Mendel's Principles of Heredity, 1 re d. Cambridge, Royaume-Uni : Cambridge University Press, 1913.) l'ER. Cela indique que les prot ines doivent passer par le RE avant d' tre envoy es au Golgi avant la s cr tion (Figure 8 49). proprement parler, une analyse d' pistasie ne peut fournir des informations sur l'ordre des g nes dans une voie que lorsque les deux mutations sont des all les nuls. Lorsque les mutations conservent une fonction partielle, leur Les interactions avec l' pistasie peuvent tre difficiles interpr ter. Parfois, un double mutant pr sentera un ph notype nouveau ou plus s v re que l'un ou l'autre des mutants simples seuls. Ce type d'interaction g n tique est appel ph notype synth tique, et si le ph notype est la mort de l'organisme, on parle de l talit synth tique. Dans la plupart des cas, un ph notype synth tique indique que les deux g nes agissent dans deux voies parall les diff rentes, l'une ou l'autre tant capable de m dier le m me processus cellulaire. Ainsi, lorsque les deux voies sont perturb es chez le double mutant, le processus choue compl tement et le ph notype synth tique est observ . Une fois qu'une collection d'organismes mutants avec des ph notypes int ressants a t obtenue, la t che suivante consiste identifier le ou les g nes responsables du ph notype modifi . Si le ph notype a t produit par mutagen se insertionnelle, la localisation du g ne perturb est assez simple. Les fragments d'ADN contenant l'insertion (un transposon ou un r trovirus, par exemple) sont amplifi s par PCR, et la s quence nucl otidique de l'ADN flanquant est d termin e. Le g ne affect par l'insertion peut ensuite tre identifi par une recherche assist e par ordinateur de la s quence compl te du g nome de l'organisme. Si un produit chimique endommageant l'ADN a t utilis pour g n rer les mutations, l'identification du g ne inactiv est souvent plus laborieuse, mais il existe plusieurs strat gies puissantes. Si la taille du g nome de l'organisme est petite (par exemple, pour les bact ries ou les eucaryotes simples), il est possible de d terminer simplement la s quence du g nome de l'organisme mutant et d'identifier le g ne affect par comparaison avec la s quence de type sauvage. En raison de l'accumulation continue de mutations neutres, il y aura probablement des diff rences entre les deux s quences g nomiques en plus de la mutation responsable du ph notype. Une fa on de prouver qu'une mutation est causale est de r introduire la mutation putative dans un organisme normal et de d terminer si elle provoque ou non le ph notype mutant. Nous verrons comment cela est accompli plus loin dans le chapitre. Les criblages g n tiques dans des organismes exp rimentaux mod les ont connu un succ s spectaculaire dans l'identification des g nes et leur mise en relation avec divers ph notypes, y compris ceux qui sont conserv s entre ces organismes et les humains. Mais comment pouvons-nous tudier les humains directement ? Ils ne se reproduisent pas rapidement, ne peuvent pas tre trait s avec des mutag nes et, s'ils pr sentent un d faut dans un processus essentiel tel que la r plication de l'ADN, ils mourraient bien avant la naissance. Malgr leurs limites par rapport aux organismes mod les, les humains deviennent des sujets de plus en plus attrayants pour les tudes g n tiques. Parce que l'humain Figure 8 49 Utilisation de la g n tique pour d terminer l'ordre de fonction des g nes. Dans les cellules normales, les prot ines s cr toires sont charg es dans des v sicules, qui fusionnent avec la membrane plasmique pour s cr ter leur contenu dans le milieu extracellulaire. Deux mutants, A et B, ne parviennent pas s cr ter de prot ines. Chez le mutant A, les prot ines s cr toires s'accumulent dans le RE. Chez le mutant B, les prot ines s cr toires s'accumulent dans le Golgi. Chez le double mutant AB, les prot ines s'accumulent dans le RE ; cela indique que le g ne d fectueux chez le mutant A agit avant le g ne d fectueux chez le mutant B dans la voie s cr toire. La population est si importante que des mutations spontan es et non l tales sont apparues dans tous les g nes humains, plusieurs reprises. Une proportion substantielle d'entre eux reste dans les g nomes des hu
Biologie moléculaire de la cellule	mains actuels. Les plus d l t res de ces mutations sont d couvertes lorsque les individus mutants attirent l'attention sur eux en cherchant de l'aide m dicale. Gr ce aux progr s r cents qui ont permis le s quen age de g nomes humains entiers moindre co t et rapidement, nous pouvons maintenant identifier ces mutations et tudier leur volution et leur h r dit d'une mani re qui tait impossible il y a encore quelques ann es. En comparant les s quences de milliers de g nomes humains du monde entier, nous pouvons commencer identifier directement les diff rences d'ADN qui distinguent un individu d'un autre. Ces diff rences contiennent des indices sur nos origines volutives et peuvent tre utilis es pour explorer le racines de la maladie. Des blocs li s de polymorphismes ont t transmis par nos anc tres Lorsque nous comparons les s quences de plusieurs g nomes humains, nous constatons que deux individus quelconques diff rent d'environ 1 paire de nucl otides sur 1000. La plupart de ces variations sont courantes et relativement inoffensives. Lorsque deux variantes de s quence coexistent dans la population et que les deux sont communes, les variantes sont appel es polymorphismes. La majorit des polymorphismes sont dus la substitution d'un seul nucl otide, appel s polymorphismes mononucl otidiques ou SNP (Figure 8 50). Le reste est d en grande partie des insertions ou des suppressions, appel es indels lorsque le changement est petit, ou variations du nombre de copies (CNV) lorsqu'il est important. Bien que ces variantes communes puissent tre trouv es dans tout le g nome, elles ne sont pas dispers es au hasard, ni m me ind pendamment. Au lieu de cela, ils ont tendance se d placer en groupes appel s blocs d'haplotypes des combinaisons de polymorphismes h rit s en tant qu'unit . Pour comprendre pourquoi de tels blocs d'haplotypes existent, nous devons consid rer notre histoire volutive. On pense que les humains modernes se sont d velopp s partir d'une population relativement petite peut- tre environ 10 000 individus qui existait en Afrique il y a environ 60 000 ans. Parmi ce petit groupe de nos anc tres, certains individus auront port un ensemble de variantes g n tiques, d'autres un ensemble diff rent. Les chromosomes d'un humain d'aujourd'hui repr sentent une combinaison m lang e de segments de chromosomes de diff rents membres de ce petit groupe ancestral de personnes. Parce que seulement environ deux mille g n rations nous s parent d'eux, de grands segments de ces chromosomes ancestraux sont pass s de parent enfant, sans tre interrompus par les v nements de croisement qui se produisent pendant la m iose. Comme d crit au chapitre 5, seuls quelques croisements se produisent entre chaque ensemble de chromosomes homologues au cours de chaque m iose (voir Figure 5-53). En cons quence, certains ensembles de s quences d'ADN et leurs polymorphismes associ s ont t h rit s dans des groupes li s, avec peu de r arrangement g n tique entre les g n rations. Il s'agit des blocs d'haplotypes. Comme les g nes qui existent sous diff rentes formes all liques, les blocs d'haplotypes se pr sentent galement sous un nombre limit de variantes courantes dans la population humaine, chacune repr sentant une combinaison de polymorphismes d'ADN transmis par un anc tre particulier il y a longtemps. Figure 8 50 Les polymorphismes mononucl otidiques (SNP) sont des sites du g nome o deux ou plusieurs choix alternatifs d'un nucl otide sont courants dans la population. La plupart de ces variations dans le g nome humain se produisent des endroits o elles n'affectent pas de mani re significative la fonction d'un g ne. Les polymorphismes peuvent aider la recherche de mutations associ es la maladie Les mutations qui donnent lieu, de mani re reproductible, des anomalies rares mais clairement d finies, telles que l'albinisme, l'h mophilie ou la surdit cong nitale, peuvent souvent tre identifi es par des tudes sur les familles atteintes. De telles maladies monog niques, ou monog niques, sont souvent appel es mend liennes parce que leur mode de transmission est facile suivre. De plus, les individus qui h ritent de la mutation causale pr senteront l'anomalie ind pendamment des facteurs environnementaux tels que l'alimentation ou l'exercice. Mais pour de nombreuses maladies courantes, les racines g n tiques sont plus complexes. Au lieu d'un seul all le d'un seul g ne, de tels troubles r sultent d'une combinaison de contributions de plusieurs g nes. Et souvent, les facteurs environnementaux ont une forte influence sur la gravit du trouble. Pour ces maladies multig niques, telles que le diab te ou l'arthrite, les tudes de population sont souvent utiles pour traquer les g nes qui augmentent le risque de contracter la maladie. Dans les tudes de population, les chercheurs recueillent des chantillons d'ADN d'un grand nombre de personnes atteintes de la maladie et les comparent des chantillons prove
Biologie moléculaire de la cellule	nant d'un groupe de personnes qui n'ont pas la maladie. Ils recherchent des variants les SNP, par exemple qui sont plus fr quents chez les personnes atteintes de la maladie. tant donn que les s quences d'ADN qui sont proches les unes des autres sur un chromosome ont tendance tre h rit es ensemble, la pr sence de tels SNP pourrait indiquer qu'un all le qui augmente le risque de la maladie pourrait se trouver proximit (Figure 8-51). Bien qu'en principe, la maladie puisse tre caus e par le SNP lui-m me, le coupable est beaucoup plus susceptible d' tre un changement qui est simplement li au SNP dans le cadre d'un bloc d'haplotype. De telles tudes d'association l' chelle du g nome ont t utilis es pour rechercher des g nes qui pr disposent les individus des maladies courantes, notamment le diab te, les maladies coronariennes, la polyarthrite rhumato de et m me la d pression. Pour bon nombre de ces affections, les polymorphismes de l'ADN identifi s n'augmentent que l g rement le risque de maladie. De plus, les facteurs environnementaux (alimentation, exercice, par exemple) jouent un r le important dans l'apparition et la gravit de la maladie. N anmoins, l'identification des g nes affect s par ces polymorphismes conduit une compr hension m caniste de certains de nos troubles les plus courants. La g nomique acc l re la d couverte de mutations rares qui nous pr disposent des maladies graves Les variantes g n tiques qui nous ont jusqu' pr sent permis d'identifier certains des g nes qui augmentent notre risque de maladie sont courantes. Ils sont apparus il y a longtemps dans notre pass volutif et sont maintenant pr sents, sous une forme ou une autre, dans une partie substantielle (1% ou plus) de la population. On pense que de tels polymorphismes expliquent Figure 8 51 Les g nes qui influent sur le risque de d velopper une maladie courante peuvent souvent tre retrac s par liaison avec les SNP. Ici, les mod les de SNP sont compar s entre deux groupes d'individus un ensemble de t moins sains et un ensemble affect par une maladie commune particuli re. Un segment d'un chromosome typique est repr sent . Pour la plupart des sites polymorphes de ce segment, il est al atoire qu'un individu ait une variante SNP (barres verticales rouges) ou une autre (barres verticales bleues) ; Ce m me caract re al atoire est observ la fois pour le groupe t moin et pour les individus touch s. Cependant, dans la partie du chromosome qui est ombrag e en gris plus fonc , un biais est observ : la plupart des individus normaux ont les variantes bleues du SNP, tandis que la plupart des individus touch s ont les variantes rouges du SNP. Cela sugg re que cette r gion contient, ou est proche, d'un g ne qui est g n tiquement li ces variants rouges du SNP et qui pr dispose les individus la maladie. l'aide de t moins soigneusement s lectionn s et de milliers d'individus touch s, cette approche peut aider traquer les g nes li s la maladie, m me s'ils ne conf rent qu'une l g re augmentation du risque de d velopper la maladie. pour environ 90% des diff rences entre le g nome d'une personne et celui d'une autre. Mais lorsque nous essayons de relier ces variantes communes des diff rences de susceptibilit la maladie ou d'autres traits h r ditaires, tels que la taille, nous constatons qu'elles n'ont pas autant de pouvoir pr dictif que nous l'avions pr vu : ainsi, par exemple, la plupart conf rent des augmentations relativement faibles moins du double du risque de d velopper une maladie commune. Contrairement aux polymorphismes, les variantes rares de l'ADN celles beaucoup moins fr quentes chez l'homme que les SNP peuvent avoir des effets importants sur le risque de d velopper certaines maladies courantes. Par exemple, il a t constat qu'un certain nombre de mutations diff rentes de perte de fonction, chacune individuellement rare, augmentent consid rablement la pr disposition l'autisme et la schizophr nie. Beaucoup d'entre elles sont des mutations de novo, qui sont apparues spontan ment dans les cellules germinales de l'un ou l'autre parent. Le fait que ces mutations surviennent spontan ment avec une certaine fr quence pourrait aider expliquer pourquoi ces troubles courants, chacun observ chez environ 1 % de la population, restent parmi nous, m me si les individus touch s laissent peu ou pas de descendance. Ces mutations rares peuvent survenir dans l'un des centaines de g nes diff rents, ce qui pourrait expliquer une grande partie de la variabilit clinique de l'autisme et de la schizophr nie. Parce qu'ils sont maintenus rares par la s lection naturelle, la plupart de ces variantes ayant un effet important sur le risque ne seraient pas d tect es par les tudes d'association l' chelle du g nome. Maintenant que le s quen age de l'ADN est devenu rapide et peu co teux, le moyen le plus efficace et le plus rentable d'identifier ces mutations rares et effet important consiste s quence
Biologie moléculaire de la cellule	r les g nomes des individus affect s, ainsi que ceux de leurs parents et de leurs fr res et s urs en tant que t moins. La g n tique inverse commence avec un g ne connu et d termine les processus cellulaires qui n cessitent sa fonction Comme nous l'avons vu, la g n tique classique commence par un ph notype mutant (ou, dans le cas de l'homme, une gamme de caract ristiques) et identifie les mutations, et par cons quent les g nes, qui en sont responsables. Recombinant La technologie de l'ADN a rendu possible un type diff rent d'approche g n tique, largement utilis chez une vari t d'esp ces g n tiquement traitables. Au lieu de commencer par un organisme mutant et de l'utiliser pour identifier un g ne et sa prot ine, un chercheur peut commencer par un g ne particulier et proc der des mutations dans celui-ci, cr ant des cellules ou des organismes mutants afin d'analyser la fonction du g ne. Parce que cette approche inverse la direction traditionnelle de la d couverte g n tique en passant des g nes aux mutations, plut t que l'inverse elle est commun ment appel e g n tique inverse. Et parce que le g nome de l'organisme est d lib r ment modifi d'une mani re particuli re, cette approche est galement appel e ing nierie du g nome ou dition du g nome. Nous verrons dans ce chapitre que cette approche peut tre tendue la hausse afin de cr er des collections enti res d'organismes, chacun d'entre eux ayant un g ne diff rent modifi . Il existe plusieurs fa ons de modifier un g ne d'int r t. Dans le plus simple, le g ne peut simplement tre supprim du g nome, bien que dans un organisme diplo de, cela n cessite que les deux copies une sur chaque homologue chromosomique soient supprim es. Bien que quelque peu contre-intuitif, l'une des meilleures fa ons de d couvrir la fonction d'un g ne est d'observer les effets de ne pas l'avoir. De tels knock-outs de g nes sont particuli rement utiles si le g ne n'est pas essentiel. Gr ce la g n tique inverse, le g ne en question (m me s'il est essentiel) peut galement tre remplac par un g ne qui s'exprime dans le mauvais tissu ou au mauvais moment du d veloppement ; Ce type de manipulation fournit souvent des indices importants sur le fonctionnement normal du g ne. Par exemple, un g ne d'int r t peut tre modifi pour tre exprim volont par l'exp rimentateur (Figure 8 52). Enfin, les g nes peuvent galement tre modifi s de sorte qu'ils soient exprim s normalement dans la plupart des types de cellules et de tissus, mais supprim s dans certains types de cellules ou tissus s lectionn s par l'exp rimentateur (voir Figure 5-66). Cette approche est particuli rement utile lorsqu'un g ne a des r les diff rents dans diff rents tissus. Il est galement possible d'apporter des modifications plus subtiles un g ne. Il est parfois utile d'apporter de l gers changements la structure d'une prot ine afin de pouvoir commencer diss quer quelles parties d'une prot ine sont importantes pour sa fonction. L'activit d'une enzyme, par exemple, peut tre tudi e en modifiant un seul acide amin dans son site actif. Il est galement possible, gr ce l'ing nierie g nomique, de cr er de nouveaux types de prot ines dans un Figure 8 52 Les g nes modifi s peuvent tre activ s et d sactiv s avec de petites mol cules. Ici, la partie de liaison l'ADN d'une prot ine bact rienne (la t tracycline, Tet, r presseur) a t fusionn e une partie d'un activateur transcriptionnel de mammif re et exprim e dans des cellules de mammif res en culture. Le g ne X modifi , pr sent la place du g ne normal, voit sa r gion de contr le g nique habituelle remplac e par des s quences cis-r gulatrices reconnues par le r presseur de t tracycline. En l'absence de doxycycline (une version particuli rement stable de la t tracycline), le g ne modifi est exprim ; en pr sence de doxycycline, le g ne est d sactiv parce que le m dicament provoque la dissociation du r presseur de t tracycline de l'ADN. Cette strat gie peut galement tre utilis e chez la souris en incorporant les g nes modifi s dans la lign e germinale. Dans de nombreux tissus, le g ne peut tre activ et d sactiv simplement en ajoutant ou en supprimant de la doxycycline de l'eau de l'animal. Si la construction du r presseur de t tracycline est plac e sous le contr le d'une r gion de contr le g nique sp cifique au tissu, le g ne modifi sera activ et d sactiv uniquement dans ce tissu. animal. Par exemple, un g ne peut tre fusionn avec le g ne d'une prot ine fluorescente. Lorsque ce g ne modifi est introduit dans le g nome, la prot ine peut tre suivie dans l'organisme vivant en surveillant sa fluorescence. Les g nes modifi s peuvent tre cr s de plusieurs fa ons. La plus simple est peut- tre de synth tiser chimiquement l'ADN qui compose le g ne. De cette fa on, l'investigateur peut sp cifier n'importe quel type de variante du g ne normal. Il est galement possible de construire des g nes modifi s l'aide de la technologie de l'A
Biologie moléculaire de la cellule	DN recombinant, comme d crit pr c demment dans ce chapitre. Une fois obtenus, les g nes modifi s peuvent tre introduits dans les cellules de diverses mani res. L'ADN peut tre micro-inject dans des cellules de mammif res l'aide d'une micropipette en verre ou introduit par un virus qui a t modifi pour porter des g nes trangers. Dans les cellules v g tales, les g nes sont fr quemment introduits par une technique appel e bombardement de particules : des chantillons d'ADN sont peints sur de minuscules billes d'or, puis litt ralement tir s travers la paroi cellulaire avec un pistolet sp cialement modifi . L' lectroporation est la m thode de choix pour introduire de l'ADN dans les bact ries et certaines autres cellules. Dans cette technique, un bref choc lectrique rend la membrane cellulaire temporairement perm able, permettant l'ADN tranger de p n trer dans le cytoplasme. Pour tre le plus utile possible aux exp rimentateurs, le g ne modifi , une fois introduit dans une cellule, doit se recombiner avec le g nome de la cellule afin que le g ne normal soit remplac . Chez les organismes simples tels que les bact ries et les levures, ce processus se produit haute fr quence en utilisant la machinerie de recombinaison homologue de la cellule, comme d crit au chapitre 5. Dans les organismes plus complexes qui ont des programmes de d veloppement labor s, la proc dure est plus compliqu e car le g ne modifi doit tre introduit dans la lign e germinale, comme nous le d crivons ensuite. Les animaux et les plantes qui ont t g n tiquement modifi s par d l tion ou remplacement de g nes sont appel s organismes transg niques, et tous les g nes trangers ou modifi s ajout s sont appel s transg nes. Nous aborderons les plantes transg niques plus loin dans ce chapitre et, pour l'instant, nous concentrerons notre discussion sur les souris transg niques, car d' normes progr s ont t r alis s dans ce domaine. Si une mol cule d'ADN portant un g ne de souris mut est transf r e dans une cellule de souris, elle s'ins re souvent dans les chromosomes au hasard, mais des m thodes ont t d velopp es pour diriger le g ne mutant pour remplacer le g ne normal par recombinaison homologue. En exploitant ces v nements de ciblage g nique , tout g ne sp cifique peut tre modifi ou inactiv dans une cellule de souris par un remplacement direct du g ne. Dans le cas o les deux copies du g ne d'int r t sont compl tement inactiv es ou supprim es, l'animal r sultant est appel une souris knock-out . La technique est r sum e dans la figure 8-53. SOURIS TRANSG NIQUE AVEC UNE COPIE DU G NE CIBLE REMPLAC E PAR UN G NE ALT R DANS LA LIGN E GERMINALE CELLULES SOMATIQUES DE LA PROG NITURE TEST ES POUR LA PR SENCE D'UN G NE ALT R ET SOURIS S LECTIONN ES LEV ES POUR TESTER LE G NE DANS LES CELLULES GERMINALES PARTENAIRE DE NAISSANCE ET R COLTE EMBRYONS PR COCES HYBRIDES EMBRYON PR COCE PARTIELLEMENT FORM PARTIR DE CELLULES ES INTRODUIRE UN EMBRYON PR COCE HYBRIDE DANS UNE SOURIS PSEUDO-ENCEINTE Embryon pr coce isol en culture version modifi e du g ne cible construit par g nie g n tique INTRODUIRE UN FRAGMENT D'ADN CONTENIR UN G NE ALT R DANS DE NOMBREUSES CELLULES TESTER LA COLONIE RARE DANS LAQUELLE LE FRAGMENT D'ADN A REMPLAC UNE COPIE DU G NE NORMAL LAISSER CHAQUE CELLULE PROLIF RER POUR FORMER UNE COLONIE CELLULES ES AVEC UNE COPIE DU G NE CIBLE REMPLAC E PAR UN G NE MUTANT INJECTE DES CELLULES ES DANS L'EMBRYON PR COCE La capacit de pr parer des souris transg niques d pourvues d'un g ne normal connu a t une avanc e majeure, et la technique a t utilis e pour d terminer les fonctions de nombreux g nes de souris (Figure 8-54). Si le g ne fonctionne au d but du d veloppement, une souris knock-out mourra g n ralement avant d'atteindre l' ge adulte. Ces d fauts l taux peuvent tre soigneusement analys s pour aider d terminer la fonction du g ne manquant. Comme d crit au chapitre 5, un type d'animal transg nique particuli rement utile tire parti d'un syst me de recombinaison sp cifique au site pour exciser et donc d sactiver le g ne cible un endroit particulier ou un moment particulier (voir Figure 5-66). Dans ce cas, le g ne cible dans les cellules souches embryonnaires (ES) est remplac par une version enti rement fonctionnelle du g ne qui est flanqu e d'une paire de courtes s quences d'ADN, appel es sites lox, qui sont reconnues par la prot ine Cre recombinase. Les souris transg niques qui en r sultent sont ph notypiquement normales. Ils sont ensuite accoupl s avec des souris transg niques qui expriment le g ne Cre recombinase sous le contr le d'un promoteur inductible. Dans Figure 8 53 R sum des proc dures utilis es pour effectuer des remplacements de g nes chez la souris. Dans la premi re tape (A), une version modifi e du g ne est introduite dans des cellules souches embryonnaires en culture. Ces cellules sont d crites en d tail au chapitre 22. Seules quelques cellules ES verront leurs g nes normau
Biologie moléculaire de la cellule	x correspondants remplac s par le g ne modifi par un v nement de recombinaison homologue. Ces cellules peuvent tre identifi es par PCR et cultiv es pour produire de nombreux descendants, chacun d'entre eux portant un g ne modifi la place de l'un de ses deux g nes correspondants normaux. Dans l' tape suivante de la proc dure (B), ces cellules ES modifi es sont inject es dans un embryon de souris tr s pr coce ; Les cellules sont incorpor es dans l'embryon en croissance, et une souris produite par un tel embryon contiendra des cellules somatiques (indiqu es en orange) qui portent le g ne modifi . Certaines de ces souris contiendront galement des cellules germinales qui contiennent le g ne alt r ; Lorsqu'elles sont accoupl es avec une souris normale, une partie de la prog niture de ces souris contiendra une copie du g ne modifi dans toutes leurs cellules. Les souris avec le transg ne dans leur lign e germinale sont ensuite lev es pour produire la fois un animal m le et un animal femelle, chacun h t rozygote pour le remplacement du g ne (c'est- -dire qu'elles ont une copie normale et une copie mutante du g ne). Lorsque ces deux souris sont accoupl es (non illustr es), un quart de leur prog niture sera homozygote pour le g ne alt r . les cellules ou tissus sp cifiques dans lesquels Cre est activ , il catalyse la recombinaison entre les s quences lox, excisant un g ne cible et liminant son activit (voir Figure 22 5). Le syst me bact rien CRISPR a t adapt pour modifier les g nomes d'une grande vari t d'esp ces L'une des difficult s rencontr es dans la fabrication de souris transg niques par la proc dure qui vient d' tre d crite est que la mol cule d'ADN introduite (portant le g ne modifi exp rimentalement) s'ins re souvent au hasard dans le g nome, et de nombreuses cellules ES doivent donc tre examin es individuellement pour en trouver une qui a le bon remplacement de g ne. L'utilisation cr ative du syst me CRISPR, d couvert chez les bact ries comme d fense contre les virus, a largement r solu ce probl me. Comme d crit au chapitre 7, le syst me CRISPR utilise une s quence d'ARN guide pour cibler (par appariement de bases compl mentaires) l'ADN double brin, qu'il clive ensuite (voir Figure 7-78). Le g ne codant pour le composant cl de ce syst me, la prot ine bact rienne Cas9, a t transf r dans une vari t d'organismes, o il simplifie consid rablement le processus de fabrication des organismes transg niques (figures 8-55A et B). La strat gie de base est la suivante : la prot ine Cas9 est exprim e dans les cellules ES avec un ARN guide con u par l'exp rimentateur pour cibler un endroit particulier du g nome. Le Cas9 et l'ARN guide s'associent, le complexe est amen la s quence correspondante sur le g nome, et la prot ine Cas9 effectue une rupture double brin. Comme nous l'avons vu au chapitre 5, les cassures double brin sont souvent r par es par recombinaison homologue ; ici, le mod le choisi par la cellule pour r parer les dommages est souvent le g ne alt r , qui est introduit dans les cellules ES par l'exp rimentateur. De cette fa on, le g ne normal peut tre endommag de mani re s lective par le syst me CRISPR et remplac haute efficacit par le g ne modifi exp rimentalement. Le syst me CRISPR a une vari t d'autres utilisations. Sa puissance particuli re r side dans sa capacit cibler Cas9 des milliers de positions diff rentes sur un g nome gr ce des r gles simples d'appariement de bases compl mentaires. Ainsi, si une prot ine Cas9 catalytiquement inactive est fusionn e un activateur ou un r presseur de transcription, il est possible, en principe, d'activer ou de d sactiver n'importe quel g ne (Figure 8 55C et D). Figure 8 54 Des souris transg niques modifi es pour exprimer une h licase d'ADN mutant montrent un vieillissement pr matur . L'h licase, cod e par le g ne Xpd, est impliqu e la fois dans la transcription et la r paration de l'ADN. Par rapport une souris sauvage du m me ge (A), une souris transg nique qui exprime une version d fectueuse de Xpd (B) pr sente de nombreux sympt mes de vieillissement pr matur , notamment l'ost oporose, l' maciation, le grisonnement pr coce, l'infertilit et la r duction de la dur e de vie. La mutation de Xpd utilis e ici alt re l'activit de l'h licase et imite une mutation qui, chez l'homme, provoque la trichothiodystrophie, un trouble caract ris par des cheveux cassants, des anomalies squelettiques et une esp rance de vie tr s r duite. Ces r sultats indiquent qu'une accumulation de dommages l'ADN peut contribuer au processus de vieillissement chez les humains et les souris. (D'apr s J. de Boer et al., Science 296:1276-1279, 2002. Avec l'autorisation de l'AAAS.) Figure 8 55 Utilisation de CRISPR pour tudier la fonction des g nes chez une grande vari t d'esp ces. (A) La prot ine Cas9 (exprim e artificiellement dans l'esp ce d'int r t) se lie un ARN guide, con u par l'exp rimentateur et galement exprim . La portion
Biologie moléculaire de la cellule	d'ARN en bleu clair est n cessaire pour les associations avec Cas9 ; Celui en bleu fonc est sp cifi par l'exp rimentateur pour correspondre une position sur le g nome. La seule autre exigence est que la s quence du g nome adjacent comprenne un court PAM (motif adjacent protospacer) n cessaire au clivage de Cas9. Comme d crit au chapitre 7, cette s quence est la fa on dont le syst me CRISPR chez les bact ries distingue son propre g nome de celui des virus envahisseurs. (B) Lorsqu'il est dirig pour effectuer des cassures double brin, le syst me CRISPR am liore consid rablement la capacit de remplacer un g ne endog ne par un g ne modifi exp rimentalement puisque le g ne modifi est utilis pour r parer la cassure double brin (C, D). En utilisant une forme mutante de Cas9 qui ne peut plus cliver l'ADN, Cas9 peut tre utilis pour activer un g ne normalement dormant (C) ou d sactiver un g ne activement exprim (D). (Adapt de P. Mali et al., Nat. Methods 10:957 963, 2013. Avec l'autorisation de Macmillan Publishers Ltd.) Le syst me CRISPR pr sente plusieurs avantages par rapport aux autres strat gies de manipulation exp rimentale de l'expression des g nes. Tout d'abord, il est relativement facile pour l'exp rimentateur de concevoir l'ARN guide : il suit simplement la convention d'appariement des bases standard. Deuxi mement, il n'est pas n cessaire de modifier le g ne contr ler ; la strat gie CRISPR exploite des s quences d'ADN d j pr sentes dans le g nome. Troisi mement, de nombreux g nes peuvent tre contr l s simultan ment. Cas9 ne doit tre exprim qu'une seule fois, mais de nombreux ARN guides peuvent tre exprim s dans la m me cellule ; Cette strat gie permet l'exp rimentateur d'activer ou de d sactiver tout un ensemble de g nes la fois. L'exportation du syst me CRISPR des bact ries pratiquement tous les autres organismes exp rimentaux (y compris les souris, les poissons-z bres, les vers, les mouches, le riz et le bl ) a r volutionn l' tude de la fonction des g nes. l'instar de la d couverte ant rieure des enzymes de restriction, cette perc e est venue des scientifiques qui tudiaient un ph nom ne fascinant chez les bact ries sans se rendre compte de l' norme impact que ces d couvertes auraient sur tous les aspects de la biologie. De grandes collections de mutations modifi es fournissent un outil pour examiner la fonction de chaque g ne d'un organisme D'importants efforts de collaboration ont permis de produire des biblioth ques compl tes de mutations dans une vari t d'organismes mod les, notamment S. cerevisiae, C. elegans, la drosophile, l'Arabidopsis et m me la souris. L'objectif ultime dans chaque cas est de produire une collection de souches mutantes dans lesquelles chaque g ne de l'organisme a t syst matiquement supprim ou modifi de telle mani re qu'il peut tre perturb sous condition. Les collections de ce type constituent une ressource inestimable pour l' tude de la fonction des g nes l' chelle g nomique. Par exemple, un grand nombre d'organismes mutants peuvent tre d pist s pour un ph notype particulier. Comme les approches g n tiques classiques d crites pr c demment, il s'agit de l'un des moyens les plus puissants d'identifier les g nes responsables d'un ph notype particulier. Contrairement l'approche g n tique classique, cependant, l'ensemble des mutants est pr -con u , de sorte qu'il n'est pas n cessaire de s'appuyer sur des v nements fortuits tels que des mutations spontan es ou des insertions de transposons. De plus, chacune des mutations individuelles de la collection est souvent modifi e pour contenir un code-barres mol culaire distinct sous la forme d'une s quence d'ADN unique con u pour rendre l'identification du g ne modifi rapide et routini re (figure 8-56). Figure 8 56 Cr ation de collections d'organismes mutants avec des codes barres. Une construction de d l tion utiliser chez la levure contient des s quences d'ADN (en rouge) homologues chaque extr mit d'un g ne cible x, un g ne marqueur s lectionnable (en bleu) et une s quence unique de code-barres d'environ 20 paires de nucl otides (en vert). Cet ADN est introduit dans les cellules de levure, o il remplace facilement le g ne cible par recombinaison homologue. Les cellules qui portent un remplacement g nique r ussi sont identifi es par l'expression du g ne marqueur s lectionnable, g n ralement un g ne qui fournit une r sistance un m dicament. En utilisant une collection de telles constructions, chacune sp cifique pour un g ne, une biblioth que de mutants de levure a t construite contenant un mutant pour chaque g ne. Les g nes essentiels ne peuvent pas tre tudi s de cette fa on, car leur d l tion du g nome provoque la mort des cellules. Dans ce cas, le g ne cible est remplac par une version du g ne qui peut tre r gul e par l'exp rimentateur (voir Figure 8 52). Le g ne peut alors tre d sactiv et son effet peut tre surveill avant que les cellules ne meurent.
Biologie moléculaire de la cellule	Figure 8 57 D pistage de la valeur adaptative l' chelle du g nome l'aide d'un grand nombre de mutants de d l tion de levure code-barres. Un grand nombre de mutants de levure, chacun avec un g ne diff rent supprim et pr sent en quantit s gales, est cultiv dans des conditions s lectionn es par l'exp rimentateur. Certains mutants (bleu) se d veloppent normalement, mais d'autres pr sentent une croissance r duite (orange et vert) ou aucune croissance (rouge). La valeur adaptative de chaque mutant est d termin e exp rimentalement de la mani re suivante. Une fois la phase de croissance termin e, l'ADN g nomique (isol du m lange de souches) est purifi et l'abondance relative de chaque mutant est d termin e en quantifiant le niveau du code-barres d'ADN correspondant chaque d l tion. Cela peut se faire en s quen ant l'ADN g nomique regroup ou en l'hybridant des micror seaux (voir Figure 8 64) qui contiennent des oligonucl otides d'ADN compl mentaires chaque code-barres. De cette fa on, la contribution de chaque g ne la croissance dans les conditions sp cifi es peut tre rapidement d termin e. Ce type d' tude a r v l que sur les quelque 6000 g nes codants de la levure, seuls environ 1000 sont essentiels dans des conditions de croissance standard. Chez S. cerevisiae, la t che de g n rer un ensemble complet de 6000 mutants, chacun ne manquant que d'un seul g ne, a t accomplie il y a plusieurs ann es. tant donn que chaque souche mutante a une s quence de code-barres individuelle int gr e dans son g nome, un grand m lange de souches modifi es peut tre cultiv dans diverses conditions de test s lectives telles qu'une privation nutritionnelle, un changement de temp rature ou la pr sence de divers m dicaments et les cellules qui survivent peuvent tre rapidement identifi es par les tiquettes de s quence uniques pr sentes dans leurs g nomes. En valuant la performance de chaque mutant du m lange, on peut commencer discerner quels g nes sont essentiels, utiles ou non pertinents pour la croissance dans les diff rentes conditions (Figure 8 57). Les informations g n r es par l'examen des biblioth ques de mutants peuvent tre consid rables. Par exemple, l' tude d'une vaste collection de mutants chez Mycoplasma genitalium l'organisme dont le g nome est le plus petit connu a permis d'identifier le compl ment minimum de g nes essentiels la vie cellulaire. La croissance dans des conditions de laboratoire n cessite environ les trois quarts des 480 g nes codant pour les prot ines M. genitalium. Environ 100 de ces g nes essentiels ont une fonction inconnue, ce qui sugg re qu'un nombre surprenant de m canismes mol culaires de base qui sous-tendent la vie n'ont pas encore t d couverts. Des collections d'organismes mutants sont galement disponibles pour de nombreuses esp ces animales et v g tales. Par exemple, il est possible de commander , par t l phone ou par e-mail aupr s d'un consortium de chercheurs, un mutant de d l tion ou d'insertion pour presque tous les g nes codants de la drosophile. De m me, il existe un ensemble presque complet de mutants pour la plante mod le Arabidopsis. Et l'adaptation du syst me CRISPR une utilisation chez la souris signifie que, dans un avenir proche, nous pouvons nous attendre pouvoir activer ou d sactiver volont chaque g ne du g nome de la souris. Bien que nous ignorions encore la fonction de la plupart des g nes dans la plupart des organismes, ces technologies permettent une exploration de la fonction des g nes une chelle qui tait inimaginable il y a une dizaine d'ann es. L'interf rence ARN est un moyen simple et rapide de tester la fonction des g nes Bien que l'inactivation (ou l'expression conditionnelle) d'un g ne dans un organisme et l' tude des cons quences soient l'approche la plus puissante pour comprendre les fonctions du g ne, l'interf rence ARN (ARNi, en abr g ), est une approche alternative, particuli rement pratique. Comme nous l'avons vu au chapitre 7, cette m thode exploite un m canisme naturel utilis chez de nombreuses plantes, animaux et champignons pour se prot ger contre les virus et les l ments transposables. La technique introduit dans une cellule ou un organisme une mol cule d'ARN double brin dont la s quence nucl otidique correspond celle d'une partie du g ne inactiver. Une fois l'ARN trait , il s'hybride avec l'ARN du g ne cible (ARNm ou ARN non codant) et r duit son expression par les m canismes illustr s aux figures 7 75. L'ARNi est fr quemment utilis pour inactiver les g nes dans les lign es de culture de cellules de drosophile et de mammif res. En effet, un ensemble de 15 000 mol cules d'ARNi de la drosophile (une pour chaque g ne codant) permet aux chercheurs, en quelques mois, de tester le r le de chaque g ne de mouche dans n'importe quel processus pouvant tre suivi l'aide de cellules cultiv es. L'ARNi a galement t largement utilis pour tudier la fonction des g nes dans des organismes en
Biologie moléculaire de la cellule	tiers, y compris le pool de n matodes de mutants de levure code-barres, chacun supprim pour un g ne diff rent E. coli, exprimant l'ARN double brin, mang par le ver Figure 8 58 La fonction des g nes peut tre test e par interf rence ARN. (A) L'ARN double brin (ARNdb) peut tre introduit dans C. elegans en (1) nourrissant les vers E. coli qui expriment l'ARNdb ou (2) en injectant l'ARNdb directement dans l'intestin de l'animal. (B) Dans un embryon de ver de type sauvage, les pronoyaux de l'ovule et du spermatozo de (pointes de fl ches rouges) se rejoignent dans la moiti post rieure de l'embryon peu de temps apr s la f condation. (C) Dans un embryon dans lequel un g ne particulier a t inactiv par l'ARNi, les pronoyaux ne migrent pas. Cette exp rience a r v l une fonction importante mais jusqu'alors inconnue de ce g ne dans le d veloppement embryonnaire. (B et C, d'apr s P. G nczy et al., Nature 408:331-336, 2000. Avec l'autorisation de Macmillan Publishers Ltd.) C. elegans. Lorsque l'on travaille avec des vers, l'introduction de l'ARN double brin est assez simple : l'ARN peut tre inject directement dans l'intestin de l'animal, ou le ver peut tre nourri avec E. coli modifi pour produire l'ARN (Figure 8 58). L'ARN est amplifi (voir p. 431) et distribu dans tout le corps du ver, o il inhibe l'expression du g ne cible dans diff rents types de tissus. L'ARNi est utilis pour aider attribuer des fonctions l'ensemble des g nes du ver (Figure 8-59). Une technique similaire a galement t appliqu e la souris. Dans ce cas, les mol cules d'ARNi ne sont pas inject es ou donn es la souris ; au contraire, les techniques de l'ADN recombinant sont utilis es pour fabriquer des animaux transg niques qui expriment l'ARNi sous le contr le d'un promoteur inductible. Il s'agit souvent d'un ARN sp cialement con u qui peut se replier sur lui-m me et, gr ce l'appariement des bases, produire une r gion double brin reconnue par la machinerie ARNi. Dans les cas les plus simples, le processus n'inactive que les g nes qui correspondent exactement la s quence ARNi. Selon le promoteur inductible utilis , l'ARNi ne peut tre produit que dans un tissu sp cifique ou un moment particulier du d veloppement, ce qui permet d'analyser en d tail les fonctions des g nes cibles. L'ARNi a rendu la g n tique inverse simple et efficace dans de nombreux organismes, mais il pr sente plusieurs limites potentielles par rapport aux v ritables knock-outs g n tiques. Pour C. elegans chaque puits contient des vers qui ing rent E. coli ; PH NOTYPES R SULTANTS ENREGISTR S ET ANALYS S E. coli exprimant un ARNds diff rent AJOUTER AUX PUITS DANS LA PLAQUE plaque 96 puits Figure 8 59 L'interf rence ARN fournit une m thode pratique pour effectuer des criblages g n tiques l' chelle du g nome. Dans cette exp rience, chaque puits de cette plaque de 96 puits est rempli d'E. coli qui produisent un ARN double brin diff rent. Chaque ARN interf rent correspond la s quence nucl otidique d'un seul g ne de C. elegans, l'inactivant ainsi. Environ 10 vers sont ajout s chaque puits, o ils ing rent les bact ries g n tiquement modifi es. La plaque est incub e pendant plusieurs jours, ce qui donne aux ARN le temps d'inactiver leurs g nes cibles, et aux vers le temps de grandir, de s'accoupler et de produire une prog niture. La plaque est ensuite examin e au microscope, qui peut tre contr l par un robot, afin de rechercher des g nes qui affectent la capacit des vers survivre, se reproduire, se d velopper et se comporter. On voit ici des vers normaux c t de vers qui montrent une capacit de reproduction alt r e en raison de l'inactivation d'un g ne de fertilit particulier. (D'apr s B. Lehner et al., Nat. Genet. 38:896 903, 2006. Avec l'autorisation de Macmillan Publishers Ltd.) raisons inconnues, l'ARNi n'inactive pas efficacement tous les g nes. De plus, au sein d'organismes entiers, certains tissus peuvent tre r sistants l'action de l'ARNi (par exemple, les neurones chez les n matodes). Un autre probl me se pose parce que de nombreux organismes contiennent de grandes familles de g nes, dont les membres pr sentent une similitude de s quence. L'ARNi produit donc parfois des effets hors cible , inactivant des g nes apparent s en plus du g ne cibl . Une strat gie pour viter de tels probl mes consiste utiliser plusieurs petites mol cules d'ARN adapt es diff rentes r gions du m me g ne. En fin de compte, les r sultats de toute exp rience d'ARNi doivent tre consid r s comme un indice solide, mais pas n cessairement comme une preuve de la fonction normale des g nes. Dans la section pr c dente, nous avons vu comment les approches g n tiques peuvent tre utilis es pour valuer la fonction d'un g ne dans des cellules cultiv es ou, mieux encore, dans un organisme intact. Bien que cette information soit cruciale pour comprendre la fonction des g nes, elle ne r v le g n ralement pas les m canismes mol culaires par lesquel
Biologie moléculaire de la cellule	s le produit g nique fonctionne dans la cellule. Par exemple, la g n tique elle seule nous dit rarement tous les endroits de l'organisme o le g ne est exprim , ou comment son expression est contr l e. Il ne r v le pas n cessairement si le g ne agit dans le noyau, le cytosol, la surface de la cellule ou dans l'un des nombreux autres compartiments de la cellule. Et il ne r v le pas comment un produit g nique peut changer d'emplacement ou de mod le d'expression lorsque l'environnement externe de la cellule change. Des informations cl s sur la fonction des g nes peuvent tre obtenues en observant simplement quand et o un g ne est exprim . Une vari t d'approches, la plupart impliquant une forme de Le g nie g n tique, peut facilement fournir ces informations critiques. Comme nous l'avons vu en d tail au chapitre 7, les s quences d'ADN cis-r gulatrices, situ es en amont ou en aval de la r gion codante, contr lent la transcription des g nes. Ces s quences r gulatrices, qui d terminent pr cis ment quand et o le g ne est exprim , peuvent tre facilement tudi es en pla ant un g ne rapporteur sous leur contr le et en introduisant ces mol cules d'ADN recombinant dans les cellules (Figure 8 60). De cette fa on, le mod le d'expression normal d'un g ne peut tre d termin , ainsi que le site de d part 123 pour le mod le d'ARN du g ne X normal S quences d'ADN qui d terminent l'expression du g ne X cellules 123 mod le d'expression du g ne rapporteur Y CONCLUSIONS La s quence cis-r gulatrice 3 active normalement le g ne X dans la cellule B La s quence cis-r gulatrice 2 active normalement le g ne X dans les cellules D, E et F La s quence cis-r gulatrice 1 d sactive normalement le g ne X dans la cellule D Figure 8 60 Utilisation d'une prot ine rapporteure pour d terminer le mod le d'expression d'un g ne. (A) Dans cet exemple, la s quence codante de la prot ine X est remplac e par la s quence codante de la prot ine rapporteuse Y. Les mod les d'expression pour X et Y sont les m mes. (B) Divers fragments d'ADN contenant des s quences cis-r gulatrices candidates sont ajout s en combinaison pour produire des mol cules d'ADN test es codant pour le g ne rapporteur Y. L'expression de ces mol cules d'ADN recombinant est ensuite test e apr s leur introduction dans diff rents types de cellules de mammif res. Les r sultats sont r sum s en (C). Pour les exp riences sur les cellules eucaryotes, deux prot ines rapporteures couramment utilis es sont l'enzyme -galactosidase ( -gal) (voir figure 7-28) et la prot ine fluorescente verte (GFP) (voir figure 9-22). la contribution des s quences cis-r gulatrices individuelles dans l' tablissement de ce mod le (voir aussi Figure 7 29). Les g nes rapporteurs permettent galement de suivre toute prot ine au fil du temps dans les cellules vivantes. Ici, le g ne rapporteur code g n ralement pour une prot ine fluorescente, souvent une prot ine fluorescente verte (GFP), la mol cule qui donne aux m duses luminescentes leur lueur verd tre. La GFP est simplement attach e dans le cadre codant au g ne codant pour la prot ine d'int r t. La prot ine de fusion GFP r sultante se comporte souvent de la m me mani re que la prot ine normale et son emplacement peut tre surveill par microscopie fluorescence, un sujet qui est abord dans le chapitre suivant (voir Figure 9-25). La fusion GFP est devenue une strat gie standard pour suivre non seulement l'emplacement, mais aussi le mouvement de prot ines sp cifiques dans les cellules vivantes. De plus, l'utilisation de plusieurs variantes de la GFP qui deviennent fluorescentes diff rentes longueurs d'onde peut fournir des informations sur la fa on dont diff rentes cellules interagissent dans un tissu vivant (Figure 8-61). L'hybridation in situ peut r v ler l'emplacement des ARNm et des ARN non codants Il est galement possible d'observer directement le moment et le lieu o un produit de l'ARN d'un g ne est exprim par hybridation in situ. Pour les g nes codant pour des prot ines, cette strat gie fournit souvent les m mes informations g n rales que les approches de g nes rapporteurs d crites ci-dessus ; cependant, il est crucial pour les g nes dont le produit final est l'ARN plut t que la prot ine. Nous avons rencontr l'hybridation in situ plus t t dans le chapitre (voir Figure 8-34) ; Il s'appuie sur les principes de base de l'hybridation des acides nucl iques. En r gle g n rale, les tissus sont doucement fix s de sorte que leur ARN est conserv sous une forme expos e qui peut s'hybrider avec une sonde d'ADN ou d'ARN compl mentaire marqu e. De cette fa on, les mod les d'expression diff rentielle des g nes peuvent tre observ s dans les tissus et l'emplacement d'ARN sp cifiques peut tre d termin (Figure 8 62). L'un des avantages de l'hybridation in situ par rapport aux autres approches est qu'il n'est pas n cessaire de proc der au g nie g n tique. Ainsi, il est souvent plus simple et plus rapide et peut tre utilis pour les esp ces g n tiqu
Biologie moléculaire de la cellule	ement intraitables. L'expression de g nes individuels peut tre mesur e l'aide de la RT-PCRA quantitativeBien que les g nes rapporteurs et l'hybridation in situ r v lent avec pr cision les mod les d'expression g nique, ils sont ce n'est pas la m thode la plus puissante pour quantifier les quantit s d'ARN individuels dans les cellules. Nous avons vu que le s quen age de l'ARN peut fournir des informations sur l'abondance relative des diff rentes mol cules d'ARN (voir Figure 7-3). Ici, le nombre de lectures de s quence (bits courts de s quence nucl otidique) est proportionnel l'abondance des esp ces d'ARN. Mais cette m thode est limit e aux ARN Figure 8 61 Les GFP fluorescentes diff rentes longueurs d'onde aident r v ler les connexions que les neurones individuels tablissent dans le cerveau. Cette image montre des neurones de couleurs diff rentes dans une r gion du cerveau d'une souris. Les neurones expriment de mani re al atoire diff rentes combinaisons de GFP de couleurs diff rentes (voir Figure 9-13), ce qui permet de distinguer et de tracer de nombreux neurones individuels au sein d'une population. Ces images ont t obtenues en modifiant g n tiquement les g nes de quatre prot ines fluorescentes diff rentes, chacune flanqu e de sites loxP de recombinaison (voir Figure 5-66), et en les int grant dans la lign e germinale de souris. Lorsqu'ils ont t crois s avec une souris qui produisait la recombinase Cre dans les cellules neuronales, les g nes de la prot ine fluorescente ont t excis s au hasard, produisant des neurones qui expriment de nombreuses combinaisons diff rentes des quatre prot ines fluorescentes. Plus de 100 combinaisons de prot ines fluorescentes peuvent tre produites, ce qui permet aux scientifiques de distinguer un neurone d'un autre. L'apparence tonnante de ces neurones tiquet s a valu ces animaux le surnom color de souris arc-en-ciel . (D'apr s J. Livet et al., Nature 450:56-62, 2007. Avec l'autorisation de Macmillan Publishers Ltd.) Figure 8 62 L'hybridation in situ en ARNm a t utilis e pour g n rer un atlas de l'expression g nique dans le cerveau de la souris. Cette image g n r e par ordinateur montre l'expression de plusieurs ARNm diff rents sp cifiques une zone du cerveau associ e l'apprentissage et la m moire. Des cartes similaires des mod les d'expression de tous les g nes connus dans le cerveau de la souris sont compil es dans le projet d'atlas du cerveau, qui est disponible en ligne. (D'apr s M. Hawrylycz et al., PLoS Comput. Biol. 7 :e1001065, 2011.) Figure 8 63 Les niveaux d'ARN peuvent tre mesur s par RT-PCR quantitative. La fluorescence mesur e est g n r e par un colorant qui n' met une fluorescence que lorsqu'il est li aux produits d'ADN double brin de la RT-PCR (voir Figure 8 36). L' chantillon rouge a une concentration plus lev e de l'ARNm mesur que l' chantillon bleu, car il n cessite moins de cycles de PCR pour atteindre la m me concentration semi-maximale d'ADN double brin. Sur la base de cette diff rence, les quantit s relatives d'ARNm dans les deux chantillons peuvent tre d termin es avec pr cision. qui sont exprim s des niveaux raisonnablement lev s, et il est difficile de quantifier (ou m me d'identifier) des ARN rares. Une m thode plus pr cise est bas e sur les principes de la PCR (Figure 8 63). Appel e RT-PCR quantitative (transcription inverse r action en cha ne par polym rase), cette m thode commence par la population totale de mol cules d'ARN purifi es partir d'un tissu ou d'une culture cellulaire. Il est important qu'aucun ADN ne soit pr sent dans la pr paration ; Il doit tre purifi ou d grad par voie enzymatique. Deux amorces d'ADN qui correspondent sp cifiquement l'ARNm d'int r t sont ajout es, ainsi que la transcriptase inverse, l'ADN polym rase et les quatre d soxyribonucl osides triphosphates n cessaires la synth se de l'ADN. Le premier tour de synth se est la transcription inverse de l'ARN en ADN l'aide de l'une des amorces. Ensuite, une s rie de cycles de chauffage et de refroidissement permet l'amplification de ce brin d'ADN par PCR (voir Figure 8 36). La partie quantitative de cette m thode repose sur une relation directe entre la vitesse laquelle le produit de PCR est g n r et la concentration initiale de l'esp ce d'ARNm d'int r t. En ajoutant la PCR des colorants chimiques qui ne deviennent fluorescents que lorsqu'ils sont li s l'ADN double brin, une simple mesure de fluorescence peut tre utilis e pour suivre la progression de la r action et ainsi d duire avec pr cision la concentration de d part de l'ARNm qui est amplifi . Bien que cela semble compliqu , cette technique quantitative de RT-PCR est relativement rapide et simple r aliser en laboratoire ; c'est actuellement la m thode de choix pour quantifier avec pr cision les niveaux d'ARNm d'un g ne donn . L'analyse des ARNm par micropuce ou RNA-seq fournit un instantan de l'expression des g nes Comme nous l'avons vu au chapitre
Biologie moléculaire de la cellule	7, une cellule n'exprime qu'un sous-ensemble des milliers de g nes disponibles dans son g nome ; De plus, ce sous-ensemble diff re d'un type de cellule un autre ou, dans une m me cellule, d'un l'environnement suivant. Une fa on de d terminer quels g nes sont exprim s par une population de cellules ou un tissu est d'analyser quels ARNm sont produits. Le premier outil qui a permis aux chercheurs d'analyser simultan ment les milliers d'ARN diff rents produits par les cellules ou les tissus a t la puce ADN. D velopp es dans les ann es 1990, les puces ADN sont des lames de microscope en verre qui contiennent des centaines de milliers de fragments d'ADN, chacun d'entre eux servant de sonde pour l'ARNm produit par un g ne sp cifique. De telles puces permettent aux chercheurs de surveiller l'expression de chaque g ne d'un g nome en une seule exp rience. Pour effectuer l'analyse, les ARNm sont extraits de cellules ou de tissus et convertis en ADNc (voir Figure 8 31). Les ADNc sont marqu s par fluorescence et on les laisse s'hybrider aux fragments li s la puce. Un microscope fluorescence automatis d termine ensuite quels ARNm taient pr sents dans l' chantillon d'origine en fonction des positions de r seau auxquelles les ADNc sont li s (Figure 8-64). Bien que les puces soient relativement peu co teuses et faciles utiliser, elles souffrent d'un inconv nient vident : les s quences des chantillons d'ARNm analyser doivent tre connues l'avance et repr sent es par une sonde correspondante sur la puce. Avec le d veloppement de technologies de s quen age am lior es, les chercheurs utilisent de plus en plus le RNA-seq, dont nous avons parl pr c demment, comme une approche plus directe pour cataloguer les ARN produits par une cellule. Par exemple, cette approche peut facilement d tecter l' pissage alternatif de l'ARN, l' dition de l'ARN et les nombreux ARN non codants produits partir d'un g nome complexe. Les micror seaux d'ADN et l'analyse par s quen age de l'ARN ont t utilis s pour examiner tout, des changements dans l'expression des g nes qui font m rir les fraises aux signatures d'expression g nique de diff rents types de cellules canc reuses humaines ; ou du temps de changement (nombre de cycles de PCR) Figure 8 64 Les micror seaux d'ADN sont utilis s pour analyser la production d'ARNm partir d'ARNm partir de milliers d'ARNm diff rents en une seule exp rience. Dans cet exemple, l' chantillon 1 de l' chantillon 2 de l'ARNm est pr lev partir de deux chantillons de cellules diff rents, par exemple, des cellules trait es avec une hormone et des cellules non trait es du m me type, afin de permettre une comparaison directe des g nes sp cifiques exprim s dans les deux conditions. convertir en ADNc, convertir en ADNc, Les ARNm sont convertis en ADNc marqu s avec un fluorescent rouge marqu avec un colorant vert pour un chantillon et un colorant fluorescent vert pour l'autre. Les chantillons marqu s sont m lang s puis autoris s s'hybrider dans la puce ADN. Chaque point microscopique de la puce est une mol cule d'ADN de 50 nucl otides de s quence d finie cr e par synth se chimique et rep r e sur la puce. La s quence d'ADN repr sent e par chaque tache est diff rente, et les centaines de milliers de ces taches sont con ues pour couvrir la s quence du g nome. La s quence d'ADN de chaque point est suivie par ordinateur. Apr s l'incubation, le r seau est lav et la fluorescence est scann e. Seule une petite proportion de la puce ADN, repr sentant 676 g nes, est repr sent e. Les taches rouges indiquent que le g ne de l' chantillon 1 est exprim un niveau plus lev que le g ne correspondant de l' chantillon 2, et les taches vertes indiquent le contraire. Les taches jaunes r v lent des g nes qui sont exprim s des niveaux peu pr s gaux dans les deux chantillons de cellules. L'intensit de la fluorescence fournit une estimation de la quantit d'ARN pr sente partir d'un g ne. Les taches sombres indiquent une expression faible ou nulle du g ne dont la sonde est situ e cette position dans le r seau. qui se produisent au fur et mesure que les cellules progressent dans le cycle cellulaire jusqu' celles form es en r ponse des changements soudains de temp rature. En effet, parce que ces approches permettent la surveillance simultan e d'un grand nombre d'ARN, elles peuvent d tecter des changements subtils dans une cellule, des changements qui pourraient ne pas se manifester dans son apparence ou son comportement ext rieur. Des tudes approfondies de l'expression des g nes fournissent galement des informations utiles pour pr dire la fonction des g nes. Plus t t dans ce chapitre, nous avons vu comment l'identification des partenaires d'interaction d'une prot ine peut fournir des indices sur la fonction de cette prot ine. Un principe similaire s'applique aux g nes : l'information sur le La fonction peut tre d duite en identifiant les g nes qui partagent son mod le d'expressi
Biologie moléculaire de la cellule	on. En utilisant une approche appel e analyse de cluster, on peut identifier des ensembles de g nes qui sont r gul s de mani re coordonn e. Les g nes qui sont activ s ou d sactiv s ensemble dans diff rentes circonstances sont susceptibles de travailler de concert dans la cellule : ils peuvent coder pour des prot ines qui font partie de la m me machine multiprot ique, ou des prot ines qui sont impliqu es dans une activit coordonn e complexe, telle que la r plication de l'ADN ou l' pissage de l'ARN. Caract riser un g ne dont la fonction est inconnue en le regroupant avec des g nes connus qui partagent son comportement transcriptionnel est parfois appel culpabilit par association . Les analyses en grappes ont t utilis es pour analyser les profils d'expression g nique qui sous-tendent de nombreux processus biologiques int ressants, y compris la cicatrisation des plaies chez l'homme (Figure 8-65). Figure 8 65 Utilisation de l'analyse par grappes pour identifier des ensembles de g nes r gul s de mani re coordonn e. Les g nes qui ont le m me mod le d'expression sont susceptibles d' tre impliqu s dans des voies ou des processus communs. Pour effectuer une analyse en grappes, des donn es de s quen age d'ARN ou de micror seaux sont obtenues partir d' chantillons de cellules expos s diverses conditions diff rentes, et les g nes qui pr sentent des changements de coordonn es dans leur mod le d'expression sont regroup s. Dans cette exp rience, des fibroblastes humains ont t priv s de s rum pendant 48 heures ; Le s rum a ensuite t rajout aux cultures au temps 0 et les cellules ont t r colt es pour l'analyse sur micror seau diff rents moments. Sur les 8600 g nes repr sent s ici (chacun repr sent par une fine ligne verticale), un peu plus de 300 ont montr une variation trois fois ou plus dans leurs mod les d'expression en r ponse la r introduction du s rum. Ici, le rouge indique une augmentation de l'expression ; Le vert est une diminution de l'expression. Sur la base des r sultats de nombreuses autres exp riences, les 8600 g nes ont t regroup s en grappes bas es sur des mod les d'expression similaires. Les r sultats de cette analyse montrent que les g nes impliqu s dans la cicatrisation des plaies sont activ s en r ponse au s rum, tandis que les g nes impliqu s dans la r gulation de la progression du cycle cellulaire et la biosynth se du cholest rol sont d sactiv s. (D'apr s M.B. Eisen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 94:14863 14868, 1998. Avec l'autorisation de l'Acad mie nationale des sciences.) Figure 8 66 Immunopr cipitation de la chromatine. Cette m thode permet d'identifier tous les sites d'un g nome qu'un r gulateur de transcription occupe in vivo. L'identit des fragments d'ADN amplifi s et pr cipit s est d termin e par le s quen age de l'ADN. L'immunopr cipitation de la chromatine l' chelle du g nome identifie les sites du g nome occup s par les r gulateurs de transcription Nous avons discut de plusieurs strat gies pour mesurer les niveaux d'ARN individuels dans une cellule et pour surveiller les changements de leurs niveaux en r ponse des signaux externes. Mais cette information ne nous dit pas comment de tels changements sont apport s. Nous avons vu au chapitre 7 que les r gulateurs de transcription, en se liant des s quences cis-r gulatrices dans l'ADN, sont responsables de l' tablissement et de la modification des mod les de transcription. En r gle g n rale, ces prot ines n'occupent pas toutes leurs s quences cis-r gulatrices potentielles dans le g nome dans toutes les conditions. Par exemple, dans certains types de cellules, la prot ine r gulatrice peut ne pas tre exprim e, ou elle peut tre pr sente mais sans prot ine partenaire obligatoire, ou elle peut tre exclue du noyau jusqu' ce qu'un signal appropri soit re u de l'environnement cellulaire. M me si la prot ine est pr sente dans le noyau et est capable de se lier l'ADN, d'autres r gulateurs de transcription ou composants de la chromatine peuvent occuper des s quences d'ADN qui se chevauchent et ainsi occlure certaines de ses s quences cis-r gulatrices dans le g nome. L'immunopr cipitation de la chromatine permet de d terminer exp rimentalement toutes les s quences cis-r gulatrices d'un g nome qui sont occup es par un r gulateur de transcription donn dans un ensemble particulier de conditions (Figure 8 66). Dans cette approche, les prot ines sont r ticu es de mani re covalente l'ADN dans des cellules vivantes, les cellules sont bris es et l'ADN est cisaill m caniquement en petits fragments. Les anticorps dirig s contre un r gulateur de transcription donn sont ensuite utilis s pour purifier l'ADN qui est devenu r ticul de mani re covalente cette prot ine dans la cellule. Cet ADN est ensuite s quenc l'aide des m thodes rapides d crites ci-dessus ; l'emplacement pr cis de chaque fragment d'ADN pr cipit le long du g nome est d termin en comparant sa s quence d'ADN celle de la s quence du g nome enti
Biologie moléculaire de la cellule	er (Figure 8 67). De cette fa on, tous les sites occup s par le r gulateur de transcription dans l' chantillon cellulaire peuvent tre cartographi s travers le g nome de la cellule (voir Figure 7-37). En combinaison avec des informations de micropuce ou de s quen age de l'ARN, l'immunopr cipitation de la chromatine peut identifier la cl R gulateur transcriptionnel charg de sp cifier un mod le particulier d'expression g nique. L'immunopr cipitation de la chromatine peut galement tre utilis e pour d duire les s quences cis-r gulatrices reconnues par un r gulateur de transcription donn . Ici, toutes les s quences d'ADN pr cipit es par le r gulateur sont align es (par ordinateur) et les caract ristiques communes sont tabul es pour produire le spectre des s quences cis-r gulatrices reconnues par la prot ine (voir Figure 7-9A). L'immunopr cipitation de la chromatine est galement utilis e r guli rement pour identifier les positions le long d'un g nome qui sont li es par les diff rents types d'histones modifi es discut s au chapitre 4. Dans ce cas, des anticorps sp cifiques la modification particuli re des histones sont utilis s (voir Figure 8-67). Une variante de la technique peut galement tre utilis e pour cartographier les positions des chromosomes qui sont physiquement proches (voir Figure 4-48). Le profilage des ribosomes r v le quels ARNm sont traduits dans la cellule Dans les sections pr c dentes, nous avons discut de plusieurs fa ons de surveiller les niveaux d'ARN dans la cellule. Mais pour les ARNm, cela ne repr sente qu'une tape dans l'expression du g ne, et nous sommes souvent plus int ress s par le niveau final de la prot ine produite par le g ne. Comme d crit dans la premi re partie de ce chapitre, les m thodes de spectroscopie de masse peuvent tre utilis es pour surveiller les niveaux de toutes les prot ines dans la cellule, y compris les formes modifi es des prot ines. Cependant, si nous voulons comprendre comment la synth se des prot ines est contr l e par la cellule, nous devons consid rer l' tape de traduction de l'expression des g nes. Une approche appel e profilage des ribosomes fournit une carte instantan e de la position des ribosomes sur chaque ARNm de la cellule et identifie ainsi les nombreux autres fragments d'ADN qui constituent le reste des ARNm du g nome qui sont activement traduits. Pour ce faire, l'ARN total d'une lign e cellulaire ou d'un tissu est expos aux ARN dans des conditions o seules les s quences d'ARN couvertes par les ribosomes sont pargn es. Les ARN prot g s sont lib r s par les ribosomes, convertis en ADN, et la s quence nucl otidique de chacun est d termin e (Figure 8 68). Lorsque ces s quences sont cartographi es sur le g nome, la position des ribosomes chez chaque esp ce d'ARNm peut tre d termin e. Le profilage des ribosomes a r v l de nombreux cas o les ARNm sont abondants mais ne sont pas traduits tant que la cellule ne re oit pas un signal externe. Il a galement montr que de nombreux cadres de lecture ouverts (ORF) trop courts pour tre annot s en tant que g nes sont activement traduits et codent probablement pour des prot ines fonctionnelles, bien que tr s petites (Figure 8-69). Enfin, le profilage des ribosomes a r v l la fa on dont les cellules modifient rapidement et globalement leurs mod les de traduction en r ponse des changements soudains de temp rature, de disponibilit des nutriments ou de stress chimique. Nous avons vu que les m thodologies d'acides nucl iques d velopp es au cours des 40 derni res ann es ont compl tement chang la fa on dont la biologie cellulaire et mol culaire est tudi e. Mais ils ont aussi eu un effet profond sur notre vie quotidienne. De nombreux produits pharmaceutiques humains couramment utilis s (insuline, hormone de croissance humaine, facteurs de coagulation sanguine et interf ron, par exemple) sont bas s sur le clonage de g nes humains et l'expression des prot ines cod es en grandes quantit s. Alors que le s quen age de l'ADN continue de baisser en co t, de plus en plus d'individus choisiront de faire s quencer leur g nome ; Cette information peut tre utilis e pour pr dire la susceptibilit aux maladies (souvent avec la possibilit de minimiser cette possibilit par un comportement appropri ) ou pour pr dire la fa on dont un individu r agira un m dicament donn . Les g nomes des cellules tumorales d'un individu peuvent tre s quenc s pour d terminer le meilleur type de traitement anticanc reux. Et les mutations qui causent ou augmentent consid rablement le risque de maladie continuent d' tre identifi es un rythme sans pr c dent. En utilisant les technologies de l'ADN recombinant discut es dans ce chapitre, ces mutations peuvent ensuite tre introduites chez des animaux, tels que des souris, qui peuvent tre tudi s en laboratoire. Les animaux transg niques qui en r sultent, qui imitent souvent certaines des anomalies ph notypiques associ es la maladie chez les patients, peuvent tre utilis
Biologie moléculaire de la cellule	s pour explorer les bases cellulaires et mol culaires de la maladie et pour d pister des m dicaments qui pourraient potentiellement tre utilis s des fins th rapeutiques chez l'homme. Nombre de lectures de s quence Figure 8 67 R sultats de plusieurs immunopr cipitations de la chromatine montrant des prot ines li es la r gion de contr le qui contr lent l'expression du g ne Oct4. Dans cette s rie d'exp riences d'immunopr cipitation de la chromatine, des anticorps dirig s contre un r gulateur de transcription (trois premiers panneaux) ou une modification particuli re d'une histone (quatri me panneau) ont t utilis s pour pr cipiter de l'ADN li et r ticul . L'ADN pr cipit a t s quenc et les positions travers le g nome ont t cartographi es. (Seule la petite partie du g nome de la souris contenant le g ne Oct4 est montr e.) Les r sultats montrent que, dans les cellules souches embryonnaires analys es dans ces exp riences, Oct4 se lie en amont de son propre g ne et que Sox2 et Nanog sont li s proximit . Oct4, Sox2 et Nanog sont des r gulateurs cl s dans les cellules souches embryonnaires (discut s au chapitre 22) et cette exp rience r v le la position sur le g nome par laquelle ils exercent leurs effets sur l'expression d'Oct4. Dans le quatri me panneau, les positions d'une modification d'histones associ e des g nes activement transcrits sont montr es (voir Figure 4 39). Enfin, le panneau inf rieur montre l'ARN produit partir du g ne Oct4 dans les m mes conditions que celles utilis es pour les immunopr cipitations de la chromatine. Notez que les introns et les exons sont relativement faciles identifier partir de ces donn es de s quen age de l'ARN. Figure 8 68 Profilage des ribosomes. ARN AUG UGA AAAAAAAAAAAAAA est purifi partir de cellules et dig r avec une ARNase pour ne laisser que les parties AUG des ARNm qui sont prot g es par un ribosome li . Ces petits morceaux liminent les ribosomes, convertissent l'ARN en ADN et s quencent Bien que nous ayons tendance penser la recherche sur l'ADN recombinant en termes de biologie animale, ces techniques ont galement eu un impact profond sur l' tude des plantes. En fait, certaines caract ristiques des plantes les rendent particuli rement sensibles aux m thodes d'ADN recombinant. Lorsqu'un morceau de tissu v g tal est cultiv dans un milieu st rile contenant des nutriments et des r gulateurs de croissance appropri s, certaines cellules sont stimul es pour prolif rer ind finiment de mani re d sorganis e, produisant une masse de cellules relativement indiff renci es appel e callosit . Si les nutriments et les r gulateurs de croissance sont soigneusement manipul s, on peut induire la formation d'une pousse dans le durillon, et chez de nombreuses esp ces, une toute nouvelle plante peut tre r g n r e partir de telles pousses. Dans un certain nombre de plantes, y compris le tabac, le p tunia, la carotte, la pomme de terre et l'Arabidopsis, une seule cellule d'un tel cal (connue sous le nom de cellule totipotente) peut tre cultiv e en un petit groupe de cellules partir duquel une plante enti re peut tre r g n r e (voir Figure 7-2B). Tout comme les souris mutantes peuvent tre d riv es par la manipulation g n tique de la tige embryonnaire, 200 ORF d couverts par les ribosomes prox rent des paires de nucl otides, les codes d'une prot ine de 20 acides amin s d'ARN prot g (d'une longueur d'environ 20 nucl otides) sont convertis en ADN et s quenc s. Les informations r sultantes sont affich es sous forme de lecture du nombre de s quences le long de chaque position du g nome. Dans le diagramme ci-dessous, les donn es d'un seul g ne, dont l'ARNm est traduit efficacement, sont montr es. Le profilage des ribosomes fournit ce type d'information pour chaque ARNm produit par la cellule. Figure 8 69 Le profilage des ribosomes permet d'identifier de nouveaux g nes. Cette exp rience montre la d couverte d'un g ne jusqu'alors non reconnu, qui code pour une prot ine de seulement 20 acides amin s. En haut, une partie d'un g nome viral avec deux g nes pr alablement annot s. Vous trouverez ci-dessous les r sultats d'une exp rience de profilage des ribosomes, affich s sur la m me section du g nome, apr s que le virus ait t infect dans des cellules humaines. Les r sultats montrent que le g ne de la main gauche n'est pas exprim dans ces conditions, que le g ne de la main droite est exprim des niveaux faibles et qu'un g ne auparavant non reconnu qui se trouve entre eux le long du g nome est exprim des niveaux lev s. 508 Chapitre 8 : Analyse des cellules, des mol cules et des syst mes Des disques de feuilles incub s avec des disques g n tiquement modifi s pr lev s sur des cellules en culture, afin que des plantes transg niques puissent tre cr es partir de cellules v g tales transfect es avec de l'ADN en culture (Figure 8 70). La capacit de produire des plantes transg niques a consid rablement acc l r les progr s dans de nombreux domaines de
Biologie moléculaire de la cellule	la biologie cellulaire v g tale. Il a jou un r le important, par exemple, dans l'isolement des r cepteurs des r gulateurs de croissance et dans la Analyse des m canismes de morphogen se et d'expression des g nes chez les plantes. Ces techniques ont galement ouvert de nombreuses nouvelles possibilit s dans l'agriculture qui pourraient b n ficier la fois l'agriculteur et au consommateur. Ils ont permis, par exemple, de modifier le rapport entre les lipides, l'amidon et les prot ines dans les graines, de conf rer aux plantes une r sistance aux ravageurs et aux virus, et de cr er des plantes modifi es qui tol rent des habitats extr mes tels que les marais salants ou les sols stress s par l'eau. Une vari t de riz a t g n tiquement modifi e pour produire du -carot ne, le pr curseur de la vitamine A. S'il devait remplacer le riz conventionnel, ce riz dor ainsi appel en raison de sa faible couleur jaune pourrait aider att nuer les graves carences en vitamine A, qui causent la c cit chez des centaines de milliers d'enfants dans les pays en d veloppement chaque ann e. La g n tique et le g nie g n tique fournissent des outils puissants pour comprendre la fonction des g nes individuels dans les cellules et les organismes. Dans l'approche g n tique classique, la mutagen se al atoire est coupl e un criblage pour identifier les mutants d ficients dans un processus biologique particulier. Ces mutants sont ensuite utilis s pour localiser et tudier les g nes responsables de ce processus. La fonction des g nes peut galement tre d termin e par des techniques de g n tique inverse. Les m thodes d'ing nierie de l'ADN peuvent tre utilis es pour modifier les g nes et les r ins rer dans les chromosomes d'une cellule afin qu'ils deviennent une partie permanente du g nome. Si la cellule utilis e pour ce transfert de g nes est un ovule f cond (pour un animal) ou une cellule v g tale totipotente en culture, des organismes transg niques peuvent tre produits qui expriment le g ne mutant et le transmettent leur descendance. La capacit de modifier les cellules et les organismes de mani re tr s sp cifique est particuli rement importante pour la biologie cellulaire et mol culaire, ce qui permet de discerner l'effet sur la cellule ou l'organisme d'un changement intentionnel dans une seule prot ine ou mol cule d'ARN. Par exemple, les g nomes peuvent tre modifi s de sorte que l'expression de n'importe quel g ne puisse tre activ e ou d sactiv e par l'exp rimentateur. Figure 8 70 Les plantes transg niques peuvent tre fabriqu es l'aide de techniques d'ADN recombinant optimis es pour les plantes. Un disque est d coup dans une feuille et incub dans une culture d'Agrobacterium qui porte un plasmide recombinant avec la fois un marqueur s lectionnable et un g ne g n tiquement modifi souhait . Les cellules v g tales bless es au bord du disque lib rent des substances qui attirent les bact ries, qui injectent leur ADN dans les cellules v g tales. Seules les cellules v g tales qui absorbent l'ADN appropri et expriment le g ne marqueur s lectionnable survivent, prolif rent et forment une callosit . La manipulation des facteurs de croissance fournis au cal l'incite former des pousses, qui s'enracinent et se d veloppent ensuite en plantes adultes porteuses du g ne modifi . Bon nombre de ces m thodes sont en cours d'expansion pour tudier la fonction des g nes l' chelle du g nome. La g n ration de banques mutantes dans lesquelles chaque g ne d'un organisme a t syst matiquement supprim , perturb ou rendu contr lable par l'exp rimentateur fournit des outils inestimables pour explorer le r le de chaque g ne dans la collaboration mol culaire labor e qui donne naissance la vie. Des technologies telles que le s quen age de l'ARN et les puces ADN peuvent surveiller l'expression de dizaines de milliers de g nes simultan ment, fournissant ainsi des instantan s d taill s et complets des mod les dynamiques d'expression g nique qui sous-tendent les processus cellulaires complexes. Les exp riences quantitatives combin es la th orie math matique marquent le d but de la science moderne. Galil e, Kepler, Newton et leurs contemporains ont fait plus que poser quelques r gles de m canique et offrir une explication des mouvements des plan tes autour du Soleil : ils ont montr comment une approche math matique quantitative pouvait fournir une profondeur et une pr cision de compr hension, au moins pour les syst mes physiques, qui n'avaient jamais t imagin es possibles auparavant. Qu'est-ce qui donne aux math matiques ce pouvoir presque magique d'expliquer le monde naturel, et pourquoi les math matiques ont-elles jou un r le tellement plus important dans les sciences physiques qu'en biologie ? Que doivent savoir les biologistes sur les math matiques ? Les math matiques peuvent tre consid r es comme un outil permettant de d river des cons quences logiques partir de propositions. Il diff re du raisonnement intuit
Biologie moléculaire de la cellule	if ordinaire par son insistance sur une logique rigoureuse et pr cise et le traitement pr cis de l'information quantitative. Si les propositions initiales sont correctes, alors les d ductions qui en sont tir es Les math matiques seront vraies. Le pouvoir surprenant des math matiques provient de la longueur des cha nes de raisonnement que la logique rigoureuse et les arguments math matiques rendent possibles, et du caract re inattendu des conclusions auxquelles on peut arriver, r v lant souvent des liens que l'on n'aurait pas devin s autrement. Inversant l'argument, les math matiques fournissent un moyen de tester des hypoth ses exp rimentales : si le raisonnement math matique partir d'une hypoth se donn e conduit une pr diction qui n'est pas vraie, alors l'hypoth se n'est pas vraie. De toute vidence, les math matiques ne sont pas d'une grande utilit si nous ne pouvons pas formuler nos id es nos hypoth ses initiales sur le syst me donn sous une forme quantitative pr cise. Un difice math matique rig sur un ensemble de propositions branlantes ou, pire encore, vagues ou trop compliqu es est susceptible de nous garer. Pour que les math matiques soient utiles, nous devons concentrer notre analyse sur des sous-syst mes simples dans lesquels nous pouvons choisir des param tres quantitatifs cl s et formuler des hypoth ses bien d finies. Cette approche a t utilis e avec beaucoup de succ s en physique pendant des si cles, mais elle a t moins courante en biologie. Mais les temps changent, et il devient de plus en plus possible pour les biologistes d'exploiter le pouvoir de l'analyse math matique quantitative. Dans cette derni re section de notre chapitre sur les m thodes, nous n'essayons pas d'enseigner aux lecteurs toutes les fa ons dont les math matiques peuvent tre appliqu es avec succ s des probl mes biologiques. Au contraire, nous visons simplement donner une id e de ce que les math matiques et les approches quantitatives peuvent faire pour nous dans la biologie moderne. Nous nous concentrons principalement sur les principes importants que les math matiques nous enseignent sur la dynamique des interactions mol culaires, et sur la fa on dont les math matiques peuvent d voiler des caract ristiques surprenantes et utiles de syst mes complexes contenant de la r troaction. Nous illustrerons ces principes en utilisant la r gulation de l'expression des g nes par des r gulateurs de transcription comme ceux discut s au chapitre 7. Les m mes principes s'appliquent aux syst mes de r gulation post-transcriptionnelle qui r gissent la signalisation cellulaire (chapitre 15), le contr le du cycle cellulaire (chapitre 17) et essentiellement tous les processus cellulaires. La fonction et la r gulation cellulaires d pendent d'interactions transitoires entre des milliers de macromol cules diff rentes dans la cellule. Dans ce livre, nous r sumons souvent ces interactions l'aide de dessins anim s sch matiques. Ces diagrammes sont utiles, mais une image compl te n cessite un niveau de compr hension plus profond et plus quantitatif. Pour valuer de mani re significative l'impact biologique de toute interaction dans la cellule, nous devons savoir en termes pr cis comment les mol cules interagissent, comment elles catalysent les r actions et, surtout, comment les comportements des mol cules changent au fil du temps. Si un dessin anim montre que la prot ine A active la prot ine B, par exemple, nous ne pouvons pas juger de l'importance de cette relation sans d tails quantitatifs sur les concentrations, les affinit s et les comportements cin tiques des prot ines A et B. Commen ons par d finir deux types diff rents d'interactions r gulatrices dans nos caricatures : l'un d signant l'inhibition et l'autre d signant l'activation. Si le produit prot ique du g ne X est un r presseur de transcription qui inhibe l'expression du g ne Z, nous d crivons la relation sous la forme d'une ligne barres rouges ( ) trac e entre les g nes X et Z (Figure 8-71). Si le produit prot ique du g ne Y est un activateur de transcription qui induit l'expression du g ne Z, alors une fl che verte ( ) est trac e entre les g nes Y et Z. La r gulation de l'expression d'un g ne par un autre est plus compliqu e qu'une seule fl che qui les relie, et une compr hension compl te de cette r gulation n cessite que nous d cortiquions les processus biochimiques sous-jacents. La figure 8 72A d crit certaines des tapes biochimiques de l'activation de l'expression g nique par un activateur de transcription. Un g ne codant pour l'activateur, d sign g ne A, produira son produit, la prot ine A, via un interm diaire d'ARN. Cette prot ine A va ensuite se lier pX, le promoteur r gulateur du g ne X, pour former le complexe A :pX. Une fois que le complexe A :pX se forme, il stimule la production d'un transcrit d'ARN qui est ensuite traduit pour produire la prot ine X. Nous nous concentrerons ici sur l'interaction de liaison qui se trouve au c ur de ce syst
Biologie moléculaire de la cellule	me de r gulation : l'interaction entre la prot ine A et le promoteur pX. Toute mol cule de la prot ine A li e pX peut galement se dissocier de celui-ci. Les tapes repr sent es par la fl che d'activation verte dans la figure 8-72A comprennent la fois la liaison de A pX et la dissociation du complexe A :pX pour reformer A et pX, comme illustr A :pX taux de formation complexe = k [A][pX] taux de dissociation complexe = koff [A :pX] l' tat stationnaire : sur [A][pX] = koff [A :pX] G NE X G NE Y Figure 8 71 Diagrammes r sumant les relations biochimiques. Ici, une simple caricature indique que le g ne X r prime le g ne Z ( gauche) tandis que le g ne Y active le g ne Z ( droite). Figure 8 72 Une interaction transcriptionnelle simple. (A) Les g nes A et X produisent chacun une prot ine, le produit du g ne A servant d'activateur de transcription pour stimuler l'expression du g ne X. Comme l'indique la fl che verte, la stimulation d pend en partie de la liaison de la prot ine A la r gion promotrice du g ne X, d sign e par pX. (B) La liaison de la prot ine A au promoteur du g ne est d termin e par les concentrations des deux partenaires de liaison (not es [A] et [pX], en unit s de mol/litre, ou M), la constante de vitesse d'association kon (en unit s de sec 1 M 1) et la constante de vitesse de dissociation koff (en unit s de sec 1). (C) l' tat stationnaire, les taux d'association et de dissociation sont gaux, et la concentration du complexe li est d termin e par l' quation 8-1, dans laquelle les deux constantes de vitesse sont combin es dans la constante d' quilibre K. (D) L' quation 8-2 peut tre d riv e pour calculer la concentration l' tat d' quilibre du complexe li une concentration totale connue du promoteur [pXT]. (E) Le r arrangement de l' quation 8-2 donne l' quation 8-3, qui permet de calculer la fraction du promoteur pX occup e par la prot ine A. par la notation de la figure 8 72B. Cette notation de r action est plus informative que les diagrammes de nos figures, mais a ses propres limites. Supposons que la concentration de A augmente d'un facteur dix en r ponse un apport environnemental. Si A augmente, nous savons intuitivement que A :pX devrait augmenter aussi, mais nous ne pouvons pas d terminer le montant de l'augmentation sans informations suppl mentaires. Nous devons conna tre l'affinit de l'interaction de liaison et les concentrations des composants. Avec ces informations en main, nous pouvons rigoureusement d river la r ponse. Comme nous l'avons vu pr c demment et au chapitre 3 (voir les figures 3 44), nous savons que la formation d'un complexe entre deux partenaires de liaison, tels que A et pX, d pend d'une constante de vitesse kon, qui d crit le nombre de collisions productives qui se produisent par unit de temps et par prot ine une concentration donn e de pX. Le taux de formation complexe est gal au produit de cette constante de vitesse kon et des concentrations de A et pX (voir Figure 8 72B). La dissociation complexe se produit un taux de koff multipli par la concentration du complexe. La constante de vitesse koff peut diff rer d'un ordre de grandeur pour diff rentes s quences d'ADN car elle d pend de la force des liaisons non covalentes form es entre A et pX. Nous nous int ressons principalement la compr hension de la quantit de complexe promoteur li l' quilibre ou l' tat stationnaire, o le taux de formation du complexe est gal au taux de dissociation du complexe. Dans ces conditions, la concentration du complexe promoteur est sp cifi e par une quation simple qui combine les deux constantes de vitesse en une seule constante d' quilibre K = kon/koff ( quation 8 1 ; Figure 8 72C). K est parfois appel la constante d'association, Ka. Plus cette constante K est grande, plus l'interaction entre A et pX est forte (voir figure 3-44). L'inverse de K est la constante de dissociation, Kd. Pour calculer la concentration l' tat d' quilibre du complexe promoteur l'aide de l' quation 8-1, nous devons tenir compte d'une autre complication : A et pX existent sous deux formes, libres en solution et li es l'une l'autre. Dans la plupart des cas, nous connaissons la concentration totale de pX et non les concentrations libres ou li es, nous devons donc trouver un moyen d'utiliser la concentration totale dans nos calculs. Pour ce faire, nous sp cifions d'abord que la concentration totale de pX ([pXT ]) est la somme des concentrations des formes libres ([pX]) et li es ([A :pX]) (Figure 8 72D). Cela conduit une nouvelle quation qui nous permet d'utiliser [pXT ] pour calculer la concentration l' tat d' quilibre du complexe promoteur ([A :pX]) ( quation 8-2, Figure 8-72D). La prot ine A existe galement sous deux formes : libre ([A]) et li e pX ([A :pX]). Dans une cellule, il y a g n ralement une ou deux copies de pX (en supposant qu'il n'y a qu'un seul g ne X par g nome haplo de) et plusieurs copies de A. Par cons quent, nous pouvons supposer san
Biologie moléculaire de la cellule	s risque que, du point de vue de A, [A :pX] est n gligeable par rapport au total [AT]. Cela signifie que [A] [AT ], et nous pouvons simplement ins rer les valeurs de total [AT ] dans l' quation 8-2 sans encourir une erreur appr ciable dans le calcul de [A :pX]. Maintenant, nous sommes pr ts d terminer les effets de l'augmentation de la concentration de R. Supposons que K = 108 M 1, ce qui est une valeur typique pour de nombreuses interactions de ce type. La concentration initiale de A est [AT ] = 10 9 M, et [pXT ] = 10 10 M (en supposant qu'il y a une copie du g ne X dans une cellule de levure haplo de, par exemple, avec un volume d'environ 2 10 14 L). l'aide de l' quation 8-2, nous constatons qu'une multiplication par dix de la concentration de A entra ne une augmentation de 5,5 fois de la quantit du complexe promoteur [A :pX], passant de 0,09 10-10 M 0,5 10-10 M l' tat d' quilibre. Les effets d'une multiplication par dix de la concentration de A varieront consid rablement en fonction de sa concentration de d part par rapport la constante d' quilibre. Ce n'est qu' travers cette approche math matique que nous pouvons parvenir une compr hension approfondie de ce que seront ces effets et de leur impact sur la r ponse biologique. Pour valuer l'impact biologique d'un changement dans les niveaux d'activateur de transcription, il est galement important dans de nombreux cas de d terminer la fraction du promoteur du g ne cible qui est li e par l'activateur, car ce nombre sera directement proportionnel l'activit du promoteur du g ne. Dans notre cas, nous pouvons calculer la fraction du promoteur du g ne X, pX, laquelle la prot ine A est li e en r arrangeant l' quation 8-2 ( quation 8-3, figure 8-72E). Cette fraction peut tre consid r e comme la probabilit que le promoteur pX soit occup , moyenn e dans le temps. Il est galement gal l'occupation moyenne d'une grande population de cellules tout moment dans le temps. Lorsqu'il n'y a pas de prot ine A pr sente, pX est toujours libre, la fraction li e est nulle et la transcription est d sactiv e. Lorsque [A] = 1/K, le promoteur pX a 50 % de chances d' tre occup . Lorsque [A] d passe largement 1/K, la fraction li e est presque gale un, ce qui signifie que pX est enti rement occup et que la transcription est maximale. Les id es les plus importantes et les plus fondamentales pour lesquelles nous, biologistes, d pendons des math matiques concernent le comportement des syst mes de r gulation au fil du temps. C'est le th me central de la dynamique, et c'est pour la solution des probl mes de dynamique que les techniques de calcul ont t d velopp es, par Newton et Leibniz, au XVIIe si cle. Bri vement, le probl me g n ral est le suivant : si l'on nous donne les taux de variation d'un ensemble de variables qui caract risent le syst me un instant donn , comment pouvons-nous calculer son tat futur ? Le probl me devient particuli rement int ressant, et les pr dictions souvent remarquables, lorsque les taux de changement d pendent eux-m mes des valeurs des variables d' tat, comme dans les syst mes r troaction. Revenons l' quation 8-2 (Figure 8-72D), qui nous dit que lorsque [A] change, [A :pX] l' tat stationnaire passera galement une nouvelle concentration que nous pouvons calculer avec pr cision. Cependant, [A :pX] ne passe pas instantan ment cette valeur. Si nous esp rons comprendre en d tail le comportement de ce syst me, nous devons galement nous demander combien de temps il faut [A :pX] pour atteindre sa nouvelle valeur d' tat stationnaire l'int rieur de la cellule. L' quation 8-2 ne peut pas r pondre cette question. Nous avons besoin de calcul. La strat gie la plus courante pour r soudre ce probl me consiste utiliser des quations diff rentielles ordinaires. Les quations qui d crivent les r actions biochimiques ont une pr misse simple : le taux de variation de la concentration de toute esp ce mol culaire X (c'est- -dire d[X]/dt) est donn par l' quilibre entre le taux de son apparition et celui de sa disparition. Pour notre exemple, le taux de variation de la concentration du complexe promoteur li , [A :pX], est d termin par les taux d'assemblage et de d sassemblage du complexe. Nous pouvons incorporer ces taux dans l' quation diff rentielle de la figure 8-73A ( quation 8-4). Lorsque [A] change, l' quation 8-4 peut tre r solue pour g n rer la concentration de [A :pX] en fonction du temps. Notez que lorsque kon [A][pX] = koff [A :pX], alors d[A :pX]/dt = 0 et [A :pX] cesse de changer. ce stade, le syst me a atteint l' tat stable. Le calcul de toutes les valeurs de [A :pX] en fonction du temps, l'aide de l' quation 8-4, nous permet de d terminer la vitesse laquelle [A :pX] atteint sa valeur l' tat d' quilibre. tant donn que cette valeur est atteinte asymptotiquement, il est souvent plus utile de comparer les temps n cessaires pour atteindre 50, 90 ou 99 % de ce nouvel tat d' quilibre. La fa on la
Biologie moléculaire de la cellule	plus simple de d terminer ces valeurs est de r soudre l' quation 8-4 avec une m thode appel e int gration num rique, qui consiste saisir les valeurs de tous les param tres (kon, koff, etc.) puis l'aide d'un ordinateur pour d terminer les valeurs de [A :pX] dans le temps, partir de concentrations initiales donn es de [A] et [pX]. Pour kon = 0,5 107 s 1 M 1, koff = 0,5 10 1 s 1 (K = 108 M 1 comme ci-dessus) et [pXT ] = 10 10 M, il faut environ 5, 20 et 40 secondes [A :pX] pour atteindre 50, 90 et 99 % de la nouvelle valeur l' tat d' quilibre apr s une variation soudaine de [A] d cupl (Figure 8 73B). Ainsi, un saut soudain dans [A] n'a pas d'effets instantan s, comme nous aurions pu le supposer en regardant la caricature de la figure 8-72A. Les quations diff rentielles nous permettent donc de comprendre la dynamique transitoire des r actions biochimiques. Cet outil est essentiel pour parvenir une compr hension approfondie du comportement cellulaire, en partie parce qu'il nous permet de d terminer la d pendance de la dynamique l'int rieur des cellules sur des param tres sp cifiques des mol cules particuli res Figure 8 73 Utilisation d' quations diff rentielles pour tudier la dynamique et le comportement l' tat d' quilibre d'un syst me biologique. (A) L' quation 8-4 est une quation diff rentielle ordinaire pour calculer le taux de variation de la formation du complexe promoteur li en r ponse une variation d'autres composants. (B) Formation de [A :pX] apr s une multiplication par dix de [A], d termin e en r solvant l' quation 8-4. En bleu se trouve la solution correspondant kon = 0,5 107 sec 1, M 1 et koff = 0,5 10 1 sec 1. Dans ce cas, il faut environ 5, 20 et 40 secondes [A :pX] pour atteindre 50, 90 et 99 % de la nouvelle valeur l' tat d' quilibre. Pour la courbe rouge, les valeurs kon et koff sont doubl es et le syst me atteint le m me tat d' quilibre plus rapidement. [A :pX] (multiples de la valeur initiale) impliqu s. Par exemple, si nous doublons les valeurs de kon et de koff, alors l' quation 8 1 (Figure 8 72C) indique que la valeur l' tat stationnaire de [A :pX] ne change pas. Cependant, le temps n cessaire pour atteindre 50 % de cet tat d' quilibre apr s un d cuplement 4,5 3,5 2,5 d[A :pX] = taux de formation de complexes taux de dissociation complexe 1,5 d[A :pX] 0,5 sur [A][pX] koff [A :pX] taux de production de prot ines = .m changement de [A] dans notre exemple passe d'environ 5 secondes 2 secondes (voir Figure 8 73B). Ces informations ne sont accessibles ni partir de dessins anim s ni d' quations d' quilibre. Il s'agit d'un exemple exceptionnellement simple ; Les descriptions math matiques telles que les quations diff rentielles deviennent plus indispensables pour comprendre les interactions biologiques mesure que le nombre d'interactions augmente. L'activit du promoteur et la d gradation des prot ines affectent le taux de changement de la concentration en prot ines Pour mieux comprendre notre syst me de r gulation des g nes, nous devons galement d crire la dynamique de la production de la prot ine X en r ponse aux changements dans la quantit de prot ine A, activatrice de la transcription. Ici encore, nous utilisons une quation diff rentielle ordinaire pour le taux de variation de la concentration de prot ine X, d termin e par l' quilibre entre le taux de production de la prot ine X par l'expression du g ne X et le taux de d gradation de la prot ine. Commen ons par le taux de production de la prot ine X, qui est d termin principalement par l'occupation du promoteur du g ne X par la prot ine A. La liaison et la dissociation d'un r gulateur de transcription au niveau d'un promoteur se produisent g n ralement sur une chelle de temps beaucoup plus rapide que l'initiation de la transcription, ce qui entra ne de nombreux v nements de liaison et de d liaison avant que la transcription ne se poursuive. En cons quence, nous pouvons supposer que la r action de liaison est l' quilibre sur l' chelle de temps de transcription, et nous pouvons calculer l'occupation du promoteur par la prot ine A en utilisant l' quation d' quilibre discut e pr c demment ( quation 8-3, Figure 8-72E). Pour d terminer le taux de transcription, il suffit de multiplier la fraction du promoteur occup e par une constante de vitesse de transcription, , qui repr sente la liaison de l'ARN polym rase et les tapes ult rieures qui conduisent la production d'ARNm et de prot ines (Figure 8 74A). Si chaque mol cule d'ARNm produit, en moyenne, m mol cules de produit prot ique, alors nous pouvons d terminer le taux de production de prot ines en multipliant le taux de transcription par m (Figure 8 74A). Consid rons maintenant les facteurs qui influencent la d gradation de la prot ine X et sa dilution due la croissance cellulaire. La d gradation entra ne g n ralement une baisse exponentielle des niveaux de prot ines et du temps moyen n cessaire pour une prot ine sp cifiq
Biologie moléculaire de la cellule	ue 1,0 0,5Figure 8 74 effet de la dur e de vie de la prot ine sur le moment de la r ponse. (A) quations pour le calcul des taux de transcription du g ne X, de production de prot ine X et de d gradation de la prot ine X, comme expliqu dans le texte. (B) L' quation 8-5 est une quation diff rentielle ordinaire permettant de calculer le taux de variation de la prot ine X en r ponse des modifications d'autres composants. (C) Lorsque le taux de variation de la prot ine X est nul ( tat stationnaire), sa concentration peut tre calcul e l'aide de l' quation 8-6, r v lant une relation directe avec la dur e de vie de la prot ine ( ). (D) La solution de l' quation 8-5 sp cifie la concentration de la prot ine X au fil du temps mesure qu'elle s'approche de sa concentration l' tat d' quilibre. (E) Le temps de r ponse d pend de la dur e de vie de la prot ine. Comme d crit dans le texte, le temps qu'il faut une prot ine pour atteindre un nouvel tat d' quilibre est plus important lorsque la prot ine est plus stable. Ici, la ligne bleue correspond une prot ine dont la dur e de vie est 2,5 fois plus courte que la dur e de vie de la prot ine en rouge. d grad est d fini comme sa dur e de vie moyenne, . Dans notre exemple actuel, le taux de d gradation de la prot ine X d pend de sa dur e de vie moyenne X, qui prend en compte la d gradation active ainsi que sa dilution au fur et mesure de la croissance de la cellule. Le taux de d gradation d pend de la concentration de la prot ine X et est calcul en divisant cette concentration par la dur e de vie (figure 8 74A). Avec les quations des taux de production et de d gradation en main, nous pouvons maintenant g n rer une quation diff rentielle pour d terminer le taux de variation de la prot ine X en fonction du temps ( quation 8-5, figure 8-74B). Cette quation peut tre r solue par les m thodes num riques mentionn es pr c demment. Selon la solution de cette quation, lorsque la transcription commence, la concentration de la prot ine X augmente jusqu' un niveau d' quilibre auquel la concentration de X ne change plus ; c'est- -dire que son taux de variation est nul. Lorsque cela se produit, le r arrangement de l' quation 8-5 donne une quation qui peut tre utilis e pour d terminer la valeur l' tat stationnaire de X, [Xst] ( quation 8-6, figure 8-74C). Un concept important merge des math matiques : la concentration l' tat d' quilibre d'un produit g nique est directement proportionnelle sa dur e de vie. Si la dur e de vie double, la concentration en prot ines double galement. Le temps n cessaire pour atteindre l' tat d' quilibre d pend de la dur e de vie des prot ines Nous pouvons voir dans l' quation 8-6 (voir Figure 8-74C) que lorsque la concentration de la prot ine A augmente, la prot ine X augmente jusqu' une nouvelle valeur l' tat d' quilibre, [Xst]. Mais cela ne peut pas se produire instantan ment. Au lieu de cela, X change dynamiquement en fonction de la solution de son quation de taux diff rentiel ( quation 8-5). La solution de cette quation r v le que la concentration de X dans le temps est li e sa concentration l' tat d' quilibre selon l' quation de la figure 8-74D. Une fois de plus, les math matiques d voilent un concept simple mais important qui n'est pas intuitivement vident : la suite d'une augmentation soudaine de [A], [X] passe un nouvel tat stationnaire un taux exponentiel qui est inversement proportionnel sa dur e de vie ; plus X est d grad rapidement, moins il lui faut de temps pour atteindre sa nouvelle valeur l' tat d' quilibre (Figure 8 74E). Cependant, le temps de r ponse plus rapide a un co t m tabolique plus lev , car les prot ines avec un temps de r ponse rapide doivent tre produites et d grad es un taux lev . Pour les prot ines qui ne sont pas rapidement renouvel es, le temps de r ponse est tr s long et la concentration en prot ines est d termin e principalement par la dilution r sultant de la croissance et de la division cellulaires. Le contr le positif n'est pas le seul m canisme utilis par les cellules pour r guler l'expression de leurs g nes. Comme nous l'avons vu au chapitre 7, les cellules d sactivent activement les g nes, souvent en utilisant des prot ines r pressives de transcription qui se lient des sites sp cifiques sur les g nes cibles, bloquant ainsi l'acc s l'ARN polym rase. Nous pouvons analyser la fonction de ces r presseurs par les m mes m thodes quantitatives d crites ci-dessus pour les activateurs de transcription. Si une prot ine r pressive R se lie la r gion r gulatrice du g ne X et r prime sa transcription, alors la fraction des sites de liaison g nique occup s par le r presseur est sp cifi e par la m me quation que celle que nous avons utilis e pr c demment pour l'activateur de transcription (Figure 8-75A). Dans ce cas, cependant, ce n'est que lorsque l'ADN est libre que l'ARN polym rase peut se lier au promoteur et transcrire le g ne. Ainsi, la quantit d'int r t
Biologie moléculaire de la cellule	est la fraction non li e, qui peut tre consid r e comme la probabilit que le site soit libre, calcul e en moyenne sur plusieurs v nements de liaison et de d liaison. Lorsque la concentration du r presseur est nulle, la fraction non li e est de 1 et le promoteur est pleinement actif ; lorsque la concentration du r presseur d passe largement 1/K, la fraction non li e tend vers z ro. Les figures 8 75B et C comparent ces relations pour un activateur de transcription et un r presseur de transcription. Nous pouvons cr er une quation diff rentielle qui fournit le taux de variation de la prot ine X lorsque les concentrations de r presseur changent ( quation 8-7, figure 8-75D). Comme dans le cas de l'activateur de transcription, la concentration l' tat d' quilibre de la prot ine X augmente mesure que sa dur e de vie augmente, mais elle diminue mesure que la concentration du r presseur de transcription augmente. 1.0 Jusqu' pr sent, nous avons examin des syst mes de r glementation simples comportant seulement quelques composantes. Dans la plupart des syst mes de r gulation complexes qui r gissent les comportements cellulaires, plusieurs Figure 8 75 Comment l'occupation du promoteur d pend de l'affinit de liaison d'une prot ine r gulatrice de transcription. (A) La fraction d'un site de liaison qui est occup e par un r presseur de transcription R est d termin e par une quation similaire celle que nous avons utilis e pour un activateur de transcription (voir Figure 8-72E), sauf que dans le cas d'un r presseur, nous nous int ressons principalement la fraction non li e. (B) Pour un activateur de transcription A, la moiti des promoteurs sont occup s lorsque [A] = 1/KA. L'activit des g nes est proportionnelle cette fraction li e. (C) Pour un r presseur de transcription R, l'activit du g ne est proportionnelle la fraction non li e des promoteurs. Comme indiqu , cette fraction est r duite la moiti de sa valeur maximale lorsque [R]=1/KR. (D) Comme dans le cas de l'activateur de transcription A (voir Figure 8 74), 0,5 0,5 nous pouvons d river des quations pour valuer le moment de la production de la prot ine X en fonction des concentrations du r presseur. Les modules sont li s pour produire des circuits plus grands que nous appelons motifs de r seau, qui peuvent produire des r ponses tonnamment complexes et biologiquement utiles dont les propri t s ne deviennent apparentes que par l'analyse math matique. Un motif de r seau particuli rement courant et important est la boucle de r troaction n gative, qui peut avoir des fonctions radicalement diff rentes selon la fa on dont elle est structur e. Nous prenons comme premier exemple un motif de r seau compos de deux modules li s (Figure 8 76A). Ici, un signal d'entr e initie la transcription du g ne A, qui produit une prot ine A, activatrice de la transcription. Cela active le g ne R, qui synth tise une prot ine r pressive de transcription R. La prot ine R se lie son tour au promoteur du g ne A pour inhiber son expression. Cette organisation cyclique cr e une boucle de r troaction n gative que l'on peut intuitivement comprendre comme un m canisme permettant d'emp cher les prot ines de s'accumuler des niveaux lev s. Mais que pouvons-nous apprendre sur les boucles de r troaction n gatives, et leur valeur en biologie, en utilisant les math matiques pour les mod liser ? La boucle de r troaction n gative de la figure 8-76A peut tre mod lis e l'aide de l' quation 8-7 (voir la figure 8-75D) pour la r pression du g ne A et de l' quation 8-5 (voir la figure 8-74B) pour l'activation du g ne R. Ainsi, pour les prot ines A et R, nous utilisons l'ensemble d' quations diff rentielles (ensemble d' quations 8-8) illustr la figure 8-76B. Les deux quations de cet ensemble sont coupl es, ce qui signifie qu'elles doivent tre r solues ensemble pour d crire d[A] A.mA [A] = R.mR 1 0,5 0 fraction niveau de prot ines l' tat stationnaire Figure 8 76 Un motif simple de r troaction n gative. (A) Le g ne A r gule n gativement sa propre expression en activant le g ne R. Le produit du g ne R est un r presseur de transcription qui inhibe le g ne A. (B) L'ensemble d' quations 8-8 peut tre r solu pour d terminer la dynamique des composants du syst me au fil du temps. (C) Un syst me avec une r troaction n gative (bleu) atteint son tat stationnaire plus rapidement qu'un syst me sans r troaction (rouge). Les graphiques indiquent les niveaux de prot ine A, exprim s en fraction du niveau l' tat d' quilibre. La ligne bleue repr sente la solution de l' quation 8-8, qui comprend la r troaction n gative du g ne A par le r presseur R. La ligne rouge repr sente la solution lorsque le taux de synth se de A a t fix une valeur constante qui n'est pas affect e par le r presseur R. (C) chronom tre le comportement de A et R dans le temps pour n'importe quelle valeur de l'entr e. Comme pr c demment, nous saisissons des valeurs pour les param tres ( R, R, etc.) pu
Biologie moléculaire de la cellule	is l'aide d'un ordinateur pour d terminer les valeurs de [A] et [R] en fonction du temps apr s qu'une entr e soudaine ait activ le g ne A. Les r sultats r v lent plusieurs propri t s importantes de la r troaction n gative. Tout d'abord, de mani re assez surprenante, la r troaction n gative augmente la vitesse de r ponse l'entr e d'activation. Comme le montre la Figure 8 76C, le syst me avec r troaction n gative atteint son nouvel tat stable plus rapidement que le syst me sans r troaction. Deuxi mement, la r troaction n gative est utile pour prot ger les cellules contre les perturbations qui se produisent continuellement dans l'environnement interne de la cellule, soit en raison de variations al atoires dans la naissance et la mort des mol cules, soit en raison de fluctuations de variables environnementales telles que la temp rature et les apports nutritionnels. Imaginons, par exemple, que A, la constante de vitesse de transcription du g ne A, fluctue de 25 % de sa valeur et demandons-nous si et dans quelle mesure les niveaux de prot ine R sont affect s. Les r sultats, pr sent s aux figures 8 77, r v lent qu'une variation de A provoque une variation plus faible de la valeur l' tat d' quilibre de R lorsque le r seau a une r troaction n gative. Une belle chose se produit lorsqu'une boucle de r troaction n gative contient un m canisme de retard qui ralentit le signal de r troaction travers la boucle : plut t que de g n rer un nouvel tat stable comme dans une boucle de r troaction n gative rapide, une boucle retard e g n re des impulsions, ou oscillations, dans les niveaux de ses composants. Cela peut tre observ , par exemple, si le nombre de composants dans une boucle de r troaction n gative augmente, ce qui entra ne des retards dans le temps n cessaire la fin du cycle de signaux. La figure 8-78 compare le comportement de deux motifs de r seau, l'un avec une boucle de r troaction n gative trois tages et l'autre avec une boucle de r troaction n gative cinq tages. En utilisant les m mes param tres cin tiques chaque tape dans les deux boucles, on constate que des oscillations stables se produisent dans la boucle la plus longue, tandis que dans la boucle plus courte, les m mes param tres conduisent une convergence relativement rapide vers un tat stable stable. Les modifications des param tres d'une boucle de r troaction n gative retard e affinit s de liaison, taux de transcription ou stabilit s des prot ines, par exemple peuvent modifier l'amplitude et la p riode des oscillations, fournissant un m canisme remarquablement polyvalent pour g n rer toutes sortes d'oscillateurs qui peuvent tre utilis s diverses fins dans la cellule. En effet, de nombreux oscillateurs naturels, y compris les oscillateurs calciques d crits au chapitre 15 et le r seau de cycles cellulaires d crit au chapitre 17, utilisent la r troaction n gative retard e comme base pour des oscillations biologiquement importantes. Cependant, on ne pense pas que toutes les oscillations observ es dans les cellules aient une fonction. Les oscillations deviennent in vitables dans une voie biochimique tr s complexe et plusieurs composants comme la glycolyse, simplement en raison du grand nombre de boucles de r troaction qui semblent tre n cessaires sa r gulation. Jusqu' pr sent, nous nous sommes concentr s sur la liaison d'un seul r gulateur de transcription un seul site dans un promoteur de g ne. De nombreux promoteurs, cependant, contiennent plusieurs sites de liaison adjacents pour le m me r gulateur de transcription, et il n'est pas rare que ces r gulateurs interagissent les uns avec les autres sur l'ADN pour former des dim res ou des oligom res plus grands. Ces interactions peuvent aboutir une forme coop rative de liaison l'ADN, Figure 8 77 Effet des fluctuations des constantes de vitesse cin tique sur un syst me r troaction n gative par rapport un syst me sans r troaction. Le graphique de gauche repr sente les niveaux de prot ine R apr s un stimulus d'activation soudain, selon le sch ma de r gulation de la figure 8-76A et d termin par la solution de l' quation 8-8 (voir figure 8-76B). Une perturbation a t induite par le changement de A de 4 M/min (ligne rouge) 3 M/min (ligne bleue). Le graphique de droite montre les r sultats lorsque les commentaires n gatifs ont t supprim s. Le syst me avec r troaction n gative s' carte moins de son fonctionnement normal lorsque change que le syst me sans r troaction. Notez que, comme dans la Figure 8-76C, le syst me r troaction n gative atteint galement son tat stationnaire plus rapidement. de sorte que l'affinit de liaison l'ADN augmente des concentrations plus lev es du r gulateur de transcription. La coop rativit produit une r ponse transcriptionnelle plus raide l'augmentation de la concentration du r gulateur que la r ponse qui peut tre g n r e par la liaison d'une prot ine monom re un seul site. Une pente raide Une r ponse transc
Biologie moléculaire de la cellule	riptionnelle de ce type, lorsqu'elle est pr sente en conjonction avec une r troaction positive, est un ingr dient important pour la production de syst mes capables de basculer entre diff rents tats ph notypiques discrets. Pour commencer comprendre comment cela se produit, nous devons modifier nos quations pour inclure la coop rativit . Les v nements de liaison coop ratifs peuvent produire des relations abruptes en forme de S (ou sigmo dales) entre la concentration de prot ine r gulatrice et la quantit li e l'ADN (voir Figure 15-16). Dans ce cas, un nombre appel coefficient de Hill (h) d crit le degr de coop rativit , et nous pouvons inclure ce coefficient dans nos quations de calcul de la fraction li e du promoteur (Figure 8 79A). mesure que le coefficient de Hill augmente, la d pendance de la liaison la concentration en prot ines devient plus forte (Figure 8-79B). En principe, le coefficient de Hill est similaire au nombre de mol cules qui doivent se r unir pour g n rer une r action. En pratique, cependant, la coop rativit est rarement compl te, et le coefficient de Hill n'atteint pas Figure 8 78 Oscillations r sultant d'une r troaction n gative retard e. Un circuit transcriptionnel trois composants (A, B) est moins susceptible d'osciller qu'un circuit transcriptionnel cinq composants (C, D). Le X (bleu clair), le Y (bleu fonc ) et le Z (marron) repr sentent ici les prot ines r gulatrices de la transcription. Pour les simulations en (B) et (D), le syst me a t initi partir de conditions initiales al atoires pour X, Y et Z. Les oscillations sont produites par un retard induit lorsque le signal se propage dans la boucle. Figure 8 79 Comment la liaison coop rative des prot ines r gulatrices de la transcription affecte la fraction des promoteurs li s. (A) La coop rativit est incorpor e dans nos mod les math matiques en incluant un coefficient de Hill (h) dans les quations utilis es pr c demment pour d terminer la fraction du promoteur li (voir les figures 8-72E et 8-75A). Lorsque h est gal 1, les quations montr es ici deviennent identiques aux quations utilis es pr c demment, et il n'y a pas de coop rativit . (B) Le panneau de gauche repr sente un activateur de transcription li de mani re coop rative et le panneau de droite repr sente un r presseur de transcription li de mani re coop rative 0,5. Rappelons de la figure 8-75B que l'activit g nique est proportionnelle l'activateur li (panneau de gauche) ou au r presseur non li (panneau de droite). 1/KR Notez que les graphiques deviennent plus raides mesure que la concentration de Hill (B) en prot ine A et en coefficient R augmente. Nous nous tournons maintenant vers les commentaires positifs et leurs cons quences tr s importantes. Tout d'abord, la r troaction positive peut rendre un syst me bistable, ce qui lui permet de persister dans l'un ou l'autre des deux (ou plus) tats stationnaires alternatifs. L'id e est simple et peut tre transmise en dessinant une analogie avec une bougie, qui peut exister soit dans un tat de br lure, soit dans un tat teint. L' tat de combustion est maintenu par une r troaction positive : la chaleur g n r e par la combustion maintient la flamme allum e. L' tat non clair est maintenu par l'absence de ce signal de r troaction : tant qu'une chaleur suffisante n'a jamais t appliqu e, la bougie restera teinte. Pour le syst me biologique, comme pour la bougie, la bistabilit a un corollaire important : elle signifie que le syst me a une m moire, telle que son tat actuel d pend de son histoire. Si nous commen ons avec le syst me dans un tat Off et que nous augmentons progressivement la concentration de la prot ine activatrice, il arrivera un moment o l'autostimulation deviendra auto-entretenue (la bougie s'allumera) et le syst me se d placera rapidement vers un tat On. Si nous intervenons maintenant pour diminuer le niveau d'activateur, il arrivera un moment o la m me chose se produira en sens inverse, et le syst me reviendra rapidement un tat d'arr t. Mais les points de transition pour l'allumage et l'extinction sont diff rents, et donc l' tat actuel du syst me d pend de la voie par laquelle il a t emprunt dans le pass un ph nom ne appel hyst r sis. Un cas simple de r troaction positive peut tre observ dans un syst me de r gulation dans lequel un r gulateur de transcription active (directement ou indirectement) sa propre expression, comme dans la figure 8-80A. Une r troaction positive peut galement se produire dans un circuit avec de nombreux r presseurs ou activateurs intervenants, tant que l'effet global net des interactions est l'activation (figures 8-80B et C). Pour illustrer comment la r troaction positive peut g n rer des tats stables, concentrons-nous sur une simple boucle de r troaction positive contenant deux r presseurs, X et Y, dont chacun inhibe l'expression de l'autre (Figure 8 81A). Comme nous l'avons vu pr c demment avec l'ensemble d' quations 8-8
Biologie moléculaire de la cellule	(Figure 8-76B), nous pouvons cr er des quations diff rentielles d crivant le taux de variation de [X] et [Y] (Ensemble d' quations 8-9, Figure 8-81B). Nous pouvons modifier davantage ces quations pour inclure la coop rativit en ajoutant des coefficients de Hill. Comme nous l'avons fait pr c demment, nous pouvons ensuite cr er des quations pour calculer les concentrations de [X] et [Y] lorsque le syst me atteint un tat stationnaire (c'est- -dire lorsque (d[X]/dt ) = 0 et (d[Y]/dt ) = 0 ; quations 8-10 et 8-11, figures 8-81C). Les quations 8-10 et 8-11 peuvent tre utilis es pour effectuer une proc dure math matique intrigante appel e analyse nullcline. Ces quations d finissent les relations entre la concentration de X l' tat d' quilibre, [Xst], et la concentration de Y l' tat d' quilibre, [Yst], qui doivent tre satisfaites simultan ment. Nous pouvons ins rer diff rentes valeurs pour [Yst] dans l' quation 8-10, et calculer le [Xst] correspondant pour chacune de ces valeurs. Nous pouvons alors repr senter graphiquement [Xst] en fonction de [Yst]. Ensuite, nous r p tons le processus en faisant varier [Xst] dans l' quation 8-11 pour repr senter graphiquement le [Yst] r sultant. Les intersections de ces deux graphes d terminent les tats stationnaires th oriquement possibles du syst me. Pour les syst mes dans lesquels les coefficients de Hill hX et hY sont beaucoup plus grands que 1, les droites des deux graphiques se coupent trois endroits (Figure 8 81D). Dans d'autres syst mes qui ont la m me disposition de r gulateurs mais des param tres diff rents, il peut n'y avoir qu'une seule intersection, indiquant la pr sence d'une seule Figure 8 80 R troaction positive d'un g ne sur lui-m me par le biais d'interactions li es en s rie. Une s quence d'activateurs et de r presseurs de n'importe quelle longueur peut tre connect e pour produire une boucle de r troaction positive, tant que le signe global est positif. Parce que le n gatif d'un n gatif est positif, non seulement les circuits (A) et (B), mais aussi le circuit (C) cr ent une r troaction positive. = X.mX dt 1 + (KY[Y])hY X = Y.mY G NE Y dt 1 + (KX[X])hX Y (B) concentration de X = X.mX. X = Y.mY. Y Figure 8 81 Une analyse graphique nullcline. (A) X inhibe Y et Y inhibe X, ce qui entra ne une boucle de r troaction positive. (B) L'ensemble d' quations 8-9 peut tre utilis pour d terminer le taux de variation des concentrations des prot ines X et Y. (C) Les quations 8-10 et 8-11 fournissent les concentrations des prot ines X et Y, respectivement, lorsque ces concentrations atteignent la concentration de X l' tat d' quilibre. (D, E) Les courbes bleues (appel es nullclines) sont des trac s de [Xst] calcul s partir de l' quation 8-10 sur une plage de concentrations de [Yst]. Les courbes rouges indiquent les valeurs de [Yst] calcul es partir des quations 8 11 sur une plage de concentrations de [Xst]. l'intersection des deux droites, [X] et [Y] sont l' tat d' quilibre. Pour la parcelle (D), la liaison des deux prot ines leurs promoteurs de g nes cibles tait coop rative (hX et hY beaucoup plus grands que 1), ce qui a entra n la pr sence de multiples intersections des nullclines, ce qui sugg re que le syst me peut assumer plusieurs tats stationnaires discrets. Dans la parcelle (E), la liaison de la prot ine X au promoteur du g ne Y n' tait pas coop rative (hX proche de 1), ce qui a entra n une seule intersection nullcline et donc un seul tat d' quilibre probable. tat d' quilibre. Par exemple, lorsqu'il y a une faible coop rativit de la prot ine X liant au promoteur du g ne Y (c'est- -dire un petit coefficient de Hill, hX, dans l' quation 8-11), le graphique de [Y] est moins courb (Figure 8-81E), et il est moins probable qu'il y ait plusieurs intersections des deux courbes. Nous avons soulign pr c demment que la r troaction positive g n re g n ralement un syst me bistable avec deux tats stationnaires stables. Pourquoi le syst me mod lis dans la figure 8-81D en a-t-il trois ? Cette nigme peut tre expliqu e en r solvant les quations de vitesse de r action (ensemble d' quations 8-9, Figure 8-81B) pour diverses conditions de d part diff rentes de [X] et [Y], en d terminant toutes les valeurs de [X] et [Y] en fonction du temps. D but de la figure 8 82 Analyse de la stabilit des tats stationnaires d'un syst me. (A) Les points pointill s avec chaque ensemble de concentrations initiales de [X] et [Y], ces calculs produisent des droites sont les lignes nulles du syst me repr sent par ce que l'on appelle une trajectoire de points, chacun indiqu par une ligne verte incurv e sur la figure 8-81. Sont galement illustr s les dynamiques 8-82A. Un motif fascinant se d gage : chaque trajectoire se d place travers l'intrigue et des trajectoires (en vert) qui montrent le change s'installe dans l'un des deux tats stationnaires, mais jamais dans le troisi me ( tat stationnaire moyen). au fil du temps dans [X] et [Y], en
Biologie moléculaire de la cellule	commen ant par une vari t , nous concluons que l' tat stationnaire moyen est instable parce qu'il ne peut pas attirer diff rentes concentrations initiales (d termin es par la solution de l' quation de l'ensemble 8-9 ; voir Figure des trajectoires ventuelles. Le syst me n'a donc que deux tats stationnaires stables. Ainsi, les 8-81B). En tra ant [X] en fonction de [Y] chaque nombre d' tats stationnaires stables dans un syst me n'a pas besoin d' tre gal au point temporel du nombre total, nous constatons que, bien qu'il y ait de ses tats stationnaires th oriquement possibles. En fait, les tats stationnaires stables sont g n ralement trois tats stationnaires possibles dans ce syst me, s par s par des tats instables, comme dans notre exemple. Les trajectoires dynamiques ne convergent que lorsque ce syst me adopte un destin en s'installant dans l'un des deux tats stationnaires, fait deux d'entre eux. L' tat stationnaire interm diaire est vit : il est instable, ne pouvant pas avoir la capacit de passer l'autre tat ? La solution num rique de l' quation attire toutes les trajectoires. (B) Imaginez que le syst me est l' tat stationnaire en haut gauche et subit une perturbation (fl ches noires), telle qu'une fluctuation al atoire des taux de production de X et/ou Y. Si la perturbation est faible (fl che 1), le syst me reviendra au m me tat stable. D'autre part, une perturbation qui pousse le syst me au-del de l' tat stationnaire instable (milieu) (fl che 2) le fait basculer vers l' tat stationnaire inf rieur droit. L'ensemble des perturbations qu'un syst me peut supporter sans passer d'un tat stationnaire l'autre est connu sous le nom de r gion de concentration de X concentration de X attraction de cet tat stationnaire. Les s ries 8 et 9 peuvent nouveau fournir une r ponse. Dans la figure 8-82B, nous montrons la solution de cette quation pour deux perturbations de l' tat stationnaire en haut gauche. Pour une petite perturbation, le syst me revient son tat stationnaire d'origine. Mais la perturbation la plus importante fait passer le syst me l' tat stationnaire alternatif. Ainsi, ce syst me peut tre commut d'un tat stable un autre en le soumettant une entr e (ou une perturbation) suffisamment importante pour rendre l'autre tat stable plus attrayant. Plus g n ralement, tout tat stationnaire stable a une r gion d'attraction correspondante, qui peut tre intuitivement consid r e comme la plage de perturbations (de [X] ou [Y] dans cet exemple) pour laquelle les trajectoires dynamiques convergent vers cet tat stationnaire particulier, plut t que de basculer vers l'autre. Le concept de r gion d'attraction a des implications int ressantes pour l'h ritabilit des tats transcriptionnels et les taux de transition entre eux. Si la r gion d'attraction autour d'un tat stationnaire est grande, par exemple, la plupart des cellules de la population adopteront cet tat particulier. De plus, cet tat est susceptible d' tre h rit par les cellules filles, car des perturbations mineures, comme celles r sultant d'une distribution asym trique des mol cules lors de la division cellulaire, seront rarement suffisantes pour induire le passage l'autre tat d' quilibre. On peut s'attendre ce que l'utilisation de la r troaction positive, coupl e la coop rativit , soit assez souvent associ e des syst mes n cessitant une m moire cellulaire stable. La robustesse est une caract ristique importante des r seaux biologiques Les syst mes de r gulation biologique sont expos s des variations fr quentes et parfois extr mes des conditions ext rieures ou des concentrations ou des activit s des composants cl s. La capacit de ces syst mes fonctionner normalement face de telles perturbations est appel e robustesse. Si nous comprenons un syst me complexe au point de pouvoir reproduire son comportement avec un mod le informatique, alors la robustesse du syst me peut tre valu e en d terminant dans quelle mesure sa fonction normale persiste apr s des modifications de divers param tres, tels que les constantes de vitesse et les concentrations de composants. Nous avons d j vu, par exemple, comment la pr sence de r troaction n gative r duit la sensibilit de l' tat stationnaire aux changements de valeurs des param tres du syst me (voir Figure 8 77). Les consid rations de robustesse s'appliquent galement aux comportements dynamiques. Ainsi, par exemple, lorsque nous discutons de la r troaction n gative, nous avons d crit comment le comportement d'un syst me a tendance devenir plus oscillatoire mesure que le nombre de composants qui constituent la boucle de r troaction augmente. Si nous utilisons des valeurs diff rentes des param tres dans des mod les d riv s pour des syst mes comme ceux de la figure 8-78, nous constatons que le syst me avec la boucle la plus longue a tendance pr senter des oscillations stables dans une gamme beaucoup plus large de param tres, ce qui indique que ce syst me
Biologie moléculaire de la cellule	fournit un oscillateur plus robuste. Nous pouvons effectuer des calculs similaires pour d terminer la capacit de diff rents syst mes obtenir une bistabilit robuste r sultant d'une r troaction positive. Ainsi, l'un des avantages des mod les computationnels est qu'ils nous permettent de sonder la robustesse des r seaux biologiques de mani re syst matique et rigoureuse. Deux r gulateurs de transcription qui se lient au m me promoteur de g ne peuvent exercer un contr le combinatoire Jusqu' pr sent, nous avons discut de la fa on dont un r gulateur de transcription peut moduler le niveau d'expression d'un g ne. La plupart des g nes, cependant, sont contr l s par plus d'un type de r gulateur de transcription, fournissant un contr le combinatoire qui permet deux entr es ou plus d'influencer l'expression d'un g ne. Nous pouvons utiliser des m thodes de calcul pour d voiler certaines des caract ristiques r gulatrices importantes des syst mes de contr le combinatoires. Consid rons un g ne dont le promoteur contient des sites de liaison pour deux prot ines r gulatrices, A et R, qui se lient leurs sites individuels ind pendamment. Il existe quatre configurations de liaison possibles (Figure 8 83A). Supposons que A soit un activateur de transcription, R est un r presseur de transcription et que le g ne n'est actif que lorsque A est li et R n'est pas li . Nous avons appris pr c demment que la probabilit que A soit li et la probabilit que R ne soit pas li peuvent tre d termin es par les quations de la figure 8-84A. Le produit de ces deux probabilit s nous donne la probabilit d'activation des g nes. Cet exemple illustre une fonction logique AND NOT (A et non R) (voir Figure 8 83A). L'activation maximale de ce g ne est accomplie lorsque [A] est lev et [R] est nul. Cependant, des niveaux interm diaires d'activation g nique sont galement possibles en fonction des niveaux de A et R ainsi que des affinit s de liaison de [A] et [R] pour leurs sites respectifs (c'est- -dire KA et KR). Lorsque KA KR, m me une petite concentration de [A] est capable de surmonter la r pression par R. Inversement, si KA KR, alors il faut beaucoup plus de [A] pour activer le g ne (Figure 8 84B et C). De nombreuses autres fonctions logiques peuvent r gir la r gulation combinatoire des g nes. Par exemple, une porte logique AND se produit lorsque deux activateurs, A1 et A2, sont tous deux n cessaires la transcription d'un g ne (figures 8-83B et 8-84D). Dans les cellules d'E. coli, le g ne AraJ contr le certains aspects du m tabolisme du sucre arabinose : son expression n cessite deux r gulateurs de transcription, l'un activ par l'arabinose et l'autre activ par la petite mol cule AMPc (Figure 8 84E). KA[A]fraction de A borne = fraction de ne sont pas li s = P(A,R) = . = concentration de R concentration de R concentration de A concentration de A Figure 8 83 Contr le combinatoire de l'expression g nique. Il existe de nombreuses fa ons dont l'expression des g nes peut tre contr l e par deux r gulateurs de transcription. Pour d finir pr cis ment la relation entre les deux entr es et la sortie d'expression g nique, un circuit de r gulation est souvent d crit comme un type sp cifique de porte logique, un terme emprunt la conception de circuits lectroniques. Un exemple simple est la porte logique OR (non illustr e ici), dans laquelle un g ne est contr l par deux activateurs de transcription, et l'un ou l'autre peut activer l'expression g nique. (A) Dans un syst me avec un activateur A et un r presseur R, si la transcription n'est activ e que lorsque A est li et R ne l'est pas, alors le r sultat est une porte logique ET NON. Nous avons vu un exemple de cette logique au chapitre 7 (Figure 7-15). (B) Une porte ET se produit lorsque deux activateurs de transcription, A1 et A2, sont tous deux n cessaires pour activer un g ne. Figure 8 84 Comment la production quantitative d'un g ne d pend la fois de sa logique combinatoire et des affinit s des r gulateurs de transcription. (A) Dans un syst me combinatoire de r gulation g nique tel que celui illustr la figure 8-83A, la fraction des promoteurs li s par l'activateur A et non li s par le r presseur R est d termin e comme indiqu ici. Le produit de ces probabilit s fournit la probabilit , P(A, R), qu'un promoteur de g ne soit actif. (B E) Dans ces quatre panneaux, le rouge indique une expression g nique lev e et le bleu indique une expression g nique faible. (B) et (C) d crivent l'expression g nique du syst me d crit dans le panneau (A). Les deux panneaux montrent comment le syst me se comporte lorsque la concentration relative de la concentration A1 de l'arabinose A2 (mM) S. Kaplan et al., Mol. Cell 29:786 792, 2008.) 0,02 1,3 43 Affinit s des deux transcriptions Les r gulateurs changent comme indiqu au-dessus de chaque panneau. (D) Expression g nique dans un cas o le g ne ne s'active qu' des niveaux lev s des deux entr es activatrices (A1 et A2), comme le montrent
Biologie moléculaire de la cellule	les figures 8 83B. (E) Donn es exp rimentales montrant l'expression mesur e d'un g ne chez E. coli qui est r gul combinatoirement par deux entr es : l'arabinose et l'AMPc. Notez la ressemblance troite avec le panneau (D). (E, adapt de taux de synth se des prot ines taux de synth se des prot ines Imaginons qu'un signal d'entr e soudain active imm diatement un activateur de transcription A et que le m me signal d'entr e induise la synth se beaucoup plus lente d'une prot ine r pressive de transcription R qui agit sur le m me g ne X. Si A et R contr lent l'expression des g nes par une fonction logique AND NOT comme celle d crite ci-dessus, notre intuition nous dit que ce syst me devrait tre capable de g n rer une impulsion de transcription : lorsque A est activ (et que R est absent), la transcription du g ne X va commencer et provoquer une augmentation de la concentration de la prot ine X, mais la transcription s'arr tera lorsque la concentration de R augmentera jusqu' une valeur suffisamment lev e. Les arrangements de ce type sont courants dans la cellule. Chez E. coli, par exemple, les g nes m taboliques du galactose sont r gul s positivement par la prot ine activatrice du catabolite (CAP), qui est activ e des niveaux lev s d'AMPc. Les m mes g nes sont r prim s par la prot ine r pressive GalS, qui est cod e par un g ne dont la transcription est galement activ e par CAP. Ainsi, une augmentation de l'entr e (AMPc) active A (CAP), et la transcription des g nes du galactose commence. Mais l'activation de A provoque galement une accumulation ult rieure de R (GalS), ce qui provoque la r pression des m mes g nes apr s un d lai. Il en r sulte un motif de r troaction incoh rent (Figure 8 85A). La r ponse du motif de pr diction incoh rent variera en fonction des param tres du syst me. Supposons, par exemple, que la prot ine activatrice de la transcription A se lie plus faiblement la r gion r gulatrice du g ne que la prot ine r pressive de transcription R (KA < KR). Dans ce cas, il y aura une explosion transitoire de prot ines synth tis es par le g ne affect (g ne X) en r ponse une entr e d'activation soudaine (Figure 8 85B). En revanche, la production sera plus soutenue si KA est beaucoup plus grande que KR, car la r pression sera trop faible pour surmonter l'activation du g ne (Figure 8-85C). D'autres propri t s de ce r seau, telles que la d pendance de l'amplitude de l'impulsion sur les diff rentes constantes de vitesse du syst me, peuvent tre explor es avec les m mes outils de calcul. Ainsi, notre supposition intuitive sur la fa on dont ce syst me se comporterait n' tait que partiellement correcte ; M me le plus simple des r seaux d pend de forces d'interaction pr cises, d montrant une fois de plus pourquoi les math matiques sont n cessaires pour compl ter les dessins anim s. Chez la bact rie E. coli, l'arabinose, un sucre, n'est consomm que lorsque le sucre pr f r , le glucose, est rare. La strat gie utilis e par les cellules pour valuer la pr sence d'arabinose et l'absence de glucose implique un arrangement de r troaction diff rent de celui qui vient d' tre d crit. Dans ce cas, l' puisement du glucose provoque une augmentation de l'AMPc, qui est d tect e par la prot ine activatrice de la transcription CAP, comme d crit pr c demment. Dans ce cas, cependant, CAP induit galement la synth se d'un second activateur de transcription, AraC. Les deux prot ines activatrices sont n cessaires pour activer les g nes m taboliques de l'arabinose (la fonction logique AND dans la figure 8-83B). Figure 8 85 Comment un motif de r troaction incoh rent peut g n rer une br ve impulsion d'activation g nique en r ponse une entr e soutenue. (A) Sch ma d'un motif de r troaction incoh rent dans lequel l'activateur de transcription A et le r presseur R contr lent l'expression du g ne X en utilisant la logique AND NOT de la figure 8-83A. (B) Lorsque KA KR, ce motif g n re une impulsion d'expression de la prot ine X, de sorte que la sortie redescend m me si l'entr e reste lev e. (C) Lorsqu'il s'agit d'un KA KR, le m me motif r pond une entr e soutenue en g n rant une sortie soutenue. Cette disposition, connue sous le nom de motif coh rent de feed-forward, pr sente les caract ristiques int ressantes illustr es aux figures 8 86. Imaginons que deux activateurs, A1 et A2, soient tous deux n cessaires pour initier la transcription d'un g ne. L'entr e du r seau active A1 directement, mais n'active A2 que par le biais de cette activation A1. Ainsi pour qu'une prot ine soit synth tis e partir de ce g ne, des intrants long terme sont n cessaires qui permettent A1 et A2 d' tre produits sous forme active. Les impulsions d'entr e br ves sont soit ignor es, soit produisent de petites sorties. L'exigence d'une longue entr e est importante si l'on a besoin d'avoir des garanties sur un signal avant qu'un programme cellulaire co teux ne soit d clench . Par exemple, le glucose est le sucre sur lequel les cell
Biologie moléculaire de la cellule	ules E. coli se d veloppent le mieux. Avant que les cellules ne d clenchent le m tabolisme de l'arabinose dans l'exemple ci-dessus, il pourrait tre b n fique de s'assurer que le glucose a t puis (une impulsion CAP soutenue), plut t que d'induire le programme d'arabinose lors d'une fluctuation transitoire du glucose. Le m me r seau peut se comporter diff remment dans diff rentes cellules en raison d'effets stochastiques Jusqu' pr sent, nous avons suppos que toutes les cellules d'une population produisent des comportements identiques si elles contiennent le m me r seau. Il est important, cependant, de tenir compte du fait que les cellules montrent souvent une individualit consid rable dans leurs r ponses. Consid rons une situation dans laquelle une seule cellule m re se divise en deux cellules filles de volume gal. Si la cellule m re n'a qu'une seule mol cule d'une prot ine donn e, alors une seule fille en h ritera. Les filles, bien que g n tiquement identiques, sont d j diff rentes. Cette variabilit est plus prononc e pour les mol cules pr sentes en petit nombre. N anmoins, m me lorsqu'il existe de nombreuses copies d'une prot ine particuli re (ou ARN), il est tr s peu probable que les deux cellules filles se retrouvent avec exactement le m me nombre de mol cules. Ce n'est qu'une illustration d'une caract ristique universelle des cellules : leurs comportements sont souvent stochastiques, ce qui signifie qu'elles pr sentent une variabilit dans leur teneur en prot ines et pr sentent donc des variations dans les ph notypes. En plus de la r partition asym trique des mol cules apr s la division cellulaire, la variabilit peut provenir de nombreuses r actions chimiques. Imaginons, par exemple, que notre cellule m re contienne un circuit de r gulation g nique simple avec une boucle de r troaction positive comme celle illustr e aux figures 8 80B. M me si les deux cellules filles re oivent une copie de ce circuit, y compris une copie de la prot ine activatrice de transcription initiale, il y aura une variabilit dans le temps n cessaire la liaison du promoteur et il sera statistiquement presque impossible pour les g nes des deux cellules filles de s'activer exactement en m me temps. Si le syst me est bistable et situ pr s d'un point de commutation, la variabilit de la r ponse peut faire basculer l'interrupteur dans une seule cellule fille. Deux cellules filles n es identiques peuvent ainsi acqu rir, par hasard, une diff rence spectaculaire de ph notype. Plus g n ralement, les populations isog niques de cellules cultiv es dans le m me environnement pr sentent une diversit de taille, de forme, de position du cycle cellulaire et d'expression g nique. Ces diff rences surviennent parce que les r actions biochimiques n cessitent des collisions probabilistes Figure 8 86 Comment un motif coh rent de r troaction r agit diverses entr es. (A) Sch ma d'un motif coh rent dans lequel les activateurs de transcription A1 et A2 activent ensemble l'expression du g ne X en utilisant la logique ET de la figure 8-83B. (B) La r ponse une br ve entr e peut tre faible (comme illustr ) ou inexistante. Cela permet au motif d'ignorer les fluctuations al atoires de la concentration des mol cules de signalisation. (C) Une entr e prolong e produit une r ponse forte qui peut s' teindre rapidement. entre des mol cules se d pla ant de mani re al atoire, chaque v nement entra nant des changements dans le nombre d'esp ces mol culaires par des quantit s enti res. L'effet amplifi des fluctuations d'un r actif mol culaire, ou les effets combin s des fluctuations de nombreux r actifs mol culaires, s'accumulent souvent sous la forme d'un ph notype observable. Cela peut doter une cellule d'individualit et g n rer une variabilit non g n tique de cellule cellule dans une population. La variabilit non g n tique peut tre tudi e en laboratoire par des mesures unicellulaires de prot ines fluorescentes exprim es partir de g nes sous le contr le d'un promoteur sp cifique. Les cellules vivantes peuvent tre mont es sur une lame et observ es l'aide d'un microscope fluorescence, ce qui r v le la variabilit frappante des niveaux d'expression des prot ines (figures 8-87). Une autre approche consiste utiliser la cytom trie en flux, qui fonctionne en diffusant une suspension dilu e de cellules devant un illuminateur et en mesurant la fluorescence des cellules individuelles lorsqu'elles passent le d tecteur (voir Figure 8 2). Les valeurs de fluorescence peuvent tre utilis es pour construire des histogrammes qui r v lent la variabilit d'un processus dans une population de cellules, avec un histogramme large indiquant une variabilit plus lev e. Plusieurs approches computationnelles peuvent tre utilis es pour mod liser les r actions dans les cellules Nous nous sommes principalement concentr s sur l'utilisation d' quations diff rentielles ordinaires pour mod liser la dynamique de circuits de r gulation simples. Ces mod
Biologie moléculaire de la cellule	les sont dits d terministes, car ils n'int grent pas la variabilit stochastique et produiront toujours le m me r sultat partir d'un ensemble sp cifique de param tres. Comme nous l'avons vu, de tels mod les peuvent fournir des informations utiles, en particulier dans l'analyse m caniste d taill e de petits circuits de r gulation. Cependant, d'autres types d'approches computationnelles sont galement n cessaires pour comprendre la grande complexit du comportement cellulaire. Les mod les stochastiques, par exemple, tentent de rendre compte du probl me tr s important de la variabilit al atoire dans les r seaux mol culaires. Ces mod les ne fournissent pas de pr dictions d terministes sur le comportement des mol cules ; Au lieu de cela, ils incorporent des variations al atoires dans le nombre et les interactions des mol cules, et le but de ces mod les est d'obtenir une meilleure compr hension de la probabilit qu'un syst me existe dans un certain tat au fil du temps. De nombreuses autres strat gies de mod lisation ont t ou sont en cours d' laboration. Les r seaux bool ens sont utilis s pour l'analyse qualitative de r seaux complexes de r gulation de g nes contenant un grand nombre de composants en interaction. Dans ces mod les, chaque mol cule est un n ud qui peut exister l' tat actif ou inactif, affectant ainsi l' tat des n uds auxquels elle est li e. Les mod les de ce type fournissent des informations sur le flux d'informations travers un r seau, et ils nous ont t utiles pour nous aider comprendre le r seau complexe de r gulation des g nes qui contr le le d veloppement pr coce de l'oursin (voir Figure 7-43). Les r seaux bool ens r duisent donc les r seaux complexes une forme hautement simplifi e (et potentiellement impr cise). l'autre extr me, on trouve les simulations bas es sur les agents, dans lesquelles des milliers de mol cules (ou agents ) d'un syst me sont mod lis es individuellement, et leurs comportements probables et leurs interactions les unes avec les autres au fil du temps sont calcul s sur la base de comportements physiques et chimiques pr dits, souvent en tenant compte de la variation stochastique. Les approches bas es sur les agents sont exigeantes en termes de calcul, mais ont le potentiel de g n rer des simulations tr s r alistes de syst mes biologiques r els. Les m thodes statistiques sont essentielles pour l'analyse des donn es biologiques La dynamique, les quations diff rentielles et la mod lisation th orique ne sont pas l'alpha et l'om ga des math matiques. D'autres branches du sujet ne sont pas moins importantes pour les biologistes. Les statistiques les math matiques des processus probabilistes et des ensembles de donn es bruyants sont une partie incontournable de la vie de chaque biologiste. Cela est vrai de deux mani res principales. Tout d'abord, des appareils de mesure imparfaits et d'autres erreurs g n rent du bruit exp rimental dans nos donn es. Deuxi mement, tous les processus biologiques cellulaires d pendent du comportement stochastique des mol cules individuelles, comme nous venons de le voir, et cela se traduit par un bruit biologique dans nos r sultats. Comment, face tout ce bruit, parvenons-nous des conclusions sur la v racit des hypoth ses ? La r ponse est l'analyse statistique, qui montre comment passer d'un niveau de description Figure 8 87 Diff rents niveaux d'expression g nique dans des cellules individuelles au sein d'une population de bact ries E. coli. Pour cette exp rience, deux prot ines rapporteures diff rentes (l'une verte fluorescente, l'autre rouge), contr l es par une copie du m me promoteur, ont t introduites dans l'ensemble des bact ries. Certaines cellules n'expriment qu'une seule copie de g ne et apparaissent donc en rouge ou en vert, tandis que d'autres expriment les deux copies de g nes et apparaissent donc jaunes. Cette exp rience r v le des niveaux variables de fluorescence, indiquant des niveaux variables d'expression g nique au sein d'une population apparemment uniforme de cellules. (D'apr s M.B. Elowitz et al., Science 297:1183-1186, 2002. Avec l'autorisation de l'AAAS.) une autre : d'un ensemble de points de donn es individuels erratiques une description plus simple des principales caract ristiques de ce que nous ne savons pas. Les statistiques nous enseignent que plus nous r p tons nos mesures, plus nous b n ficions de nombreux outils qui ont r volutionn ter et affin les conclusions que nous pouvons en tirer. tant donn de nombreux repeti-DNA technologie ont t d couverts par des tions, il devient possible de d crire nos donn es en termes de variables que les scientifiques qui tudient la biologie de base risent les caract ristiques qui comptent : la valeur moyenne de la variable mesur e, pris en charge des probl mes qui n'avaient pas vident l'ensemble des points de donn es ; l'amplitude du bruit (l' cart-type des applications. Quels sont les meilleurs ensembles de points de donn es) ; l'erreur p
Biologie moléculaire de la cellule	robable dans notre estimation de la valeur moyenne (les strat gies standard pour s'assurer que des technologies aussi cruciales continueront se tromper de la moyenne) ; et, pour les sp cialistes, les d tails de la distribution de probabilit tre d couverts ? D crire la probabilit qu'une mesure individuelle produise une valeur donn e. Pour toutes ces choses, les statistiques fournissent des recettes et des formules quantitatives que les ogistes doivent comprendre s'ils veulent tirer des conclusions rigoureuses sur la base des diminutions et de la quantit de r sultats variables. Les donn es de s quence s'accumulent, comment allons-nous garder une trace et analyser de mani re significative cette grande quantit d'informations ? Quelles nouvelles questions L'analyse math matique quantitative peut apporter une dimension suppl mentaire puissante notre volont de r pondre cette information ? compr hension de la r gulation et de la fonction cellulaires. Les syst mes de r gulation cellulaire d pendent souvent Pouvons-nous d velopper des outils pour analyser les interactions macromol culaires, et l'analyse math matique de la dynamique de chacune des interactions post-transcriptionnelles ces interactions peut r v ler des informations importantes sur l'importance des modifications de liaison sur les prot ines dans les affinit s vivantes et la stabilit des prot ines dans la g n ration de signaux transcriptionnels ou autres. Les syst mes de r gulation emploient souvent des motifs de r seau qui g n rent des comportements utiles : des changements en temps r el ? une boucle de r troaction n gative rapide att nue la r ponse aux signaux d'entr e ; une boucle de r troaction n gative retard e cr e un oscillateur biochimique ; La r troaction positive produit des mod les permettant de d crire avec pr cision les syst mes qui g n rent des impulsions de signal transitoires ou qui ne r pondent qu' des entr es soutenues. Le comportement dynamique de ces motifs de r seau peut tre diss qu en d tail l'aide de r seaux de d termination et pour pr dire une mod lisation math matique ministique et stochastique non d couverte. composants et m canismes ? Quelles d clarations sont vraies ? Expliquez pourquoi ou pourquoi pas. Discutez des probl mes suivants. 8 1 Parce qu'un anticorps monoclonal reconna t un spe-8 7 Une tape courante dans l'isolement de cellules d'un site antig nique cifique ( pitope), il ne se lie qu' l' chantillon sp cifique de tissu animal consiste traiter le tissu avec de la trypsine, prot ine contre laquelle il a t fabriqu . la collag nase et l'EDTA. Pourquoi un tel traitement est-il n cessaire et qu'est-ce que chaque composant accomplit ? Et 8-2 tant donn la marche inexorable de la technologie, pourquoi ce traitement ne tue-t-il pas les cellules ? semble in vitable que la sensibilit de d tection des mol cules soit finalement pouss e au-del du yoctomole 8-8 Tropomyosine, 93 kd, s diments 2,6S, tandis qu'au niveau (10-24 mole). la prot ine 65-kd, l'h moglobine, s dimente 4,3S. (Le coefficient de s dimentation S est une mesure lin aire du taux 8 3 Si chaque cycle de PCR double la quantit d'ADN de s dimentation.) Ces deux prot ines sont dessin es l' chelle synth tis e dans le cycle pr c dent, puis 10 cycles donneront a dans la figure Q8 1. Comment se fait-il que les s diments prot iques les plus grands amplifi s 103 fois, 20 cycles donnent un amplimore 106 fois plus lent que le plus petit ? Pouvez-vous penser une fication, et 30 cycles donneront une amplification de 109 fois. analogie de l'exp rience quotidienne qui pourrait vous aider 8 4 Pour juger de l'importance biologique d'une interaction avec ce probl me ? entre la prot ine A et la prot ine B, nous avons besoin de conna tre des d tails quantitatifs sur leurs concentrations, leurs affinit s et leurs comportements cin tiques. 8 5 Le taux de variation de la concentration de toute esp ce mol culaire X est donn par l' quilibre entre son son taux d'apparition et son taux de disparition. 8 6 Apr s une augmentation soudaine de la transcription, une prot ine avec un taux de d gradation lent atteindra un nouveau niveau d' tat d' quilibre plus rapidement qu'une prot ine avec un taux de d gradation rapide. tropomyosinh moglobineFigure Q8 1 Mod les r duits de tropomyosine et d'h moglobine (Probl me 8 8). La technologie des hybridomes 8-9 permet de g n rer des anticorps monoclonaux contre pratiquement n'importe quelle prot ine. Pourquoi alors le marquage g n tique des prot ines avec des pitopes est-il une technique si couramment utilis e, d'autant plus qu'un marquage d' pitope a le potentiel d'interf rer avec la fonction de la prot ine ? 8 10 Combien de copies d'une prot ine doivent tre pr sentes dans une cellule pour qu'elle soit visible sous forme de bande sur un gel SDS ? Supposons que vous puissiez charger 100 g d'extrait cellulaire sur un gel et que vous puissiez d tecter 10 ng dans une seule bande en colorant le gel l'arge
Biologie moléculaire de la cellule	nt. La concentration de prot ines dans les cellules est d'environ 200 mg/mL, et une cellule de mammif re typique a un volume d'environ 1000 m3 et une bact rie typique un volume d'environ 1 m3. partir de ces param tres, calculez le nombre de copies d'une prot ine de 120 kd qui devraient tre pr sentes dans une cellule de mammif re et dans une bact rie afin de donner une bande d tectable sur un gel. Vous pouvez essayer une estimation de l'ordre de grandeur avant d'effectuer les calculs. 8 11 Vous avez isol les prot ines de deux points adjacents apr s une lectrophor se bidimensionnelle sur polyacrylamide et les avez dig r es avec de la trypsine. Lorsque les masses des peptides ont t mesur es par spectrom trie de masse MALDI-TOF, les peptides des deux prot ines se sont av r s identiques l'exception d'un (Figure Q8 2). Pour ce peptide, les valeurs masse/charge (m/z) diff raient de 80, une valeur qui ne correspond pas une diff rence de s quence d'acides amin s. (Par exemple, l'acide glutamique au lieu de la valine une position donnerait une diff rence m/z d'environ 30.) Pouvez-vous sugg rer une diff rence possible entre les deux peptides qui pourrait expliquer la diff rence m/z observ e ? Masses de peptides mesur es par spectrom trie de masse MALDI-TOF (Probl me 8-11). Seuls les pics num rot s diff rent entre les deux chantillons de prot ines. 8 12 Vous voulez amplifier l'ADN entre les deux tron ons de s quence illustr s la figure Q8 3. Parmi les amorces list es, choisissez la paire qui vous permettra d'amplifier l'ADN par PCR. 8 13 Dans la toute premi re s rie de PCR utilisant l'ADN g nomique, les amorces d'ADN amorcent la synth se qui ne se termine qu' la fin du cycle (ou lorsqu'une fin al atoire de l'ADN est rencontr e). Pourtant, la fin de 20 30 cycles une amplification typique le seul produit visible est d fini pr cis ment par les extr mit s des amorces d'ADN. Dans quel cycle un fragment double brin de la bonne taille est-il g n r pour la premi re fois ? ADN amplifierFigure Q8 3 ADN amplifier et amorces PCR potentielles (Probl me 8 12). 8 14 Expliquer la diff rence entre une mutation de gain de fonction et une mutation dominante n gative. Pourquoi ces deux types de mutation sont-ils g n ralement dominants ? 8 15 Discutez de l'affirmation suivante : Nous n'aurions aucune id e aujourd'hui de l'importance de l'insuline en tant qu'hormone r gulatrice si son absence n' tait pas associ e la maladie humaine du diab te. Ce sont les cons quences dramatiques de son absence qui ont concentr les premiers efforts sur l'identification de l'insuline et l' tude de son r le normal dans la physiologie. 8 16 Vous venez de recevoir les r sultats d'une analyse de s quen age de l'ARN des ARNm du foie. Vous aviez pr vu de compter le nombre de lectures de chaque ARNm pour d terminer l'abondance relative des diff rents ARNm. Mais vous tes perplexe parce que de nombreux ARNm vous ont donn des r sultats comme ceux illustr s dans la figure Q8-4. Comment se fait-il que diff rentes parties d'un ARNm puissent tre repr sent es diff rents niveaux Niveaux? 8 17 Examinez les motifs de r seau dans la figure Q8 5. D cidez lesquels sont des boucles de r troaction n gatives et lesquels sont positifs. Expliquez votre raisonnement. 8 18 Imaginons qu'une perturbation al atoire positionne un syst me bistable pr cis ment la fronti re entre deux tats stables (au niveau du point orange sur la figure Q8 6). Comment le syst me r agirait-il ? Figure Q8 4 : Lectures de s quen age de l'ARN pour un ARNm h patique (probl me 8 16). La structure exonique de l'ARNm est indiqu e, avec des segments codant pour des prot ines indiqu s en bleu clair et des r gions non traduites en bleu fonc . Le nombre de lectures de s quen age est indiqu par la hauteur des lignes verticales au-dessus de l'ARNm. Figure Q8 5 Motifs de r seau compos s d'activateurs et de r presseurs de transcription (Probl me 8 17). 8 19 L'analyse d taill e de la r gion r glementaire de l'op ron du Lac a r v l une complexit surprenante. Au lieu d'un seul site de liaison pour le r presseur Lac, comme on pourrait s'y attendre, il y a trois sites appel s op rateurs : O1, O2 et O3, dispos s le long de l'ADN, comme le montre la figure Q8-7. Pour sonder les fonctions de ces trois sites, vous effectuez une s rie de constructions dans lesquelles diverses combinaisons de sites op rateurs sont pr sentes. Vous examinez leur capacit r primer l'expression de la -galactosidase, en utilisant des formes t tram res (type sauvage) ou dim riques (mutantes) du r presseur Lac. La forme dim rique du r presseur peut se lier un seul op rateur (avec la m me affinit que le t tram re), chaque monom re se liant la moiti du site. Le t tram re, la forme normalement exprim e dans les cellules, peut se lier deux sites simultan ment. Lorsque vous mesurez la r pression de l'expression de la -galactosidase, vous trouvez les r sultats pr sent s dans la figure Q8-7, a
Biologie moléculaire de la cellule	vec des chiffres plus lev s indiquant une r pression plus efficace. concentration de X Figure Q8 6 Perturbations d'un syst me bisstable (Probl me 8 18). Comme le montrent les lignes vertes, apr s la perturbation 1, le syst me revient son tat stable d'origine (point vert gauche), et apr s la perturbation 2, le syst me passe l'autre tat stable (point vert droite). La perturbation 3 d place le syst me vers la limite pr cise entre les deux tats stables (point orange). Un. Quel est le site d'un seul op rateur le plus important pour la r pression ? Comment pouvez-vous le savoir ? b. Les combinaisons de sites op rateurs (figure Q8-7, constructions 1, 2, 3 et 5) augmentent-elles consid rablement la r pression par le r presseur dim rique ? Les combinaisons de sites op rateurs augmentent-elles consid rablement la r pression par le r presseur t tram re ? Si les deux r presseurs se comportent diff remment, expliquez la diff rence. C. Le r presseur de type sauvage se lie tr s faiblement O3 lorsqu'il est seul sur un segment d'ADN. Cependant, si O1 est inclus dans le m me segment d'ADN, le r presseur se lie assez bien O3. Comment est-ce possible ? Figure Q8 7 R pression de la -galactosidase par des r gions promotrices contenant diff rentes combinaisons de sites de liaison du r presseur Lac (Probl me 8 19). La s paration par paire de bases (pb) des trois sites op rateurs est illustr e. Les chiffres de droite se r f rent au niveau de r pression, les chiffres les plus lev s indiquant une r pression plus efficace par les r presseurs dim riques (2-m res) ou t tram res (4-m res). (D'apr s S. Oehler et al., EMBO J. 9:973-979, 1990. Avec la permission de John Wiley and Sons.) Ausubel FM, Brent R, Kingston RE et al. (eds) (2002) Short Protocols in Molecular Biology, 5e d. Nouveau York : Wiley.Brown TA (2007) G nomes 3. New York : Garland Science Publishing. Spector DL, Goldman RD & Leinwand LA (eds) (1998) Cellules : un manuel de laboratoire. Cold Spring Harbor, NY : Cold Spring Harbor Laboratory Press. Watson JD & Berry A (2008) L'ADN : le secret de la vie. New York : Alfred A. Knopf. Watson JD, Myers RM & Caudy AA (2007) ADN recombinant : g nes et g nomes - Un cours de courte dur e, 3e d. Cold Spring Harbor, NY : Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ham RG (1965) Croissance clonale de cellules de mammif res dans un milieu synth tique chimiquement d fini. Proc. Natl Acad. Sci. tats-Unis 53, 288 293. Harlow E et Lane D (1999) Utilisation d'anticorps : un manuel de laboratoire. Cold Spring Harbor, NY : Cold Spring Harbor Laboratory Press. Herzenberg LA, Sweet RG & Herzenberg LA (1976) Tri cellulaire activ par fluorescence. Sci. Am. 234, 108 116. Milstein C (1980) Anticorps monoclonaux. Sci. Am. 243, 66 74.de Duve C & Beaufay H (1981) Une br ve histoire du fractionnement des tissus. J. Cell Biol. 91, 293s 299s. Laemmli UK (1970) Clivage des prot ines structurelles lors de l'assemblage de la t te du bact riophage T4. Nature 227, 680 685. Scopes RK (1994) Purification des prot ines : principes et pratique, 3e d. New York : Springer-Verlag. Simpson RJ, Adams & Golemis EA (2008) M thodes de base en purification et analyse des prot ines : un manuel de laboratoire. Cold Spring Harbor, NY : Cold Spring Harbor Laboratory Press. Wood DW (2014) Nouvelles tendances et conceptions d' tiquettes d'affinit pour la purification des prot ines recombinantes. Curr. Opin. Struct. Biol. 26, 54 61. Choudhary C & Mann M (2010) D codage des r seaux de signalisation par prot omique bas e sur la spectrom trie de masse. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 427 439. Domon B & Aebersold R (2006) Spectrom trie de masse et analyse des prot ines. Science 312, 212 217. Goodrich JA & Kugel JF (2007) Liaison et cin tique pour les biologistes mol culaires. Cold Spring Harbor, NY : Cold Spring Harbor Laboratory Press. Kendrew JC (1961) La structure tridimensionnelle d'une mol cule de prot ine. Sci. Am. 205, 96 111. Knight ZA & Shokat KM (2007) G n tique chimique : l o la g n tique et la pharmacologie se rencontrent. Cellule 128, 425 430. O'Farrell PH (1975) lectrophor se bidimensionnelle haute r solution des prot ines. J. Biol. Chem. 250, 4007 4021. Pollard, TD (2010) Un guide pour des essais de liaison simples et informatifs. Mol. Biol. Cell 21, 4061 4067. W thrich K (1989) D termination de la structure des prot ines en solution par spectroscopie par r sonance magn tique nucl aire. Science 243, 45-50. Cohen S, Chang A, Boyer H & Helling R (1973) Construction de plasmides bact riens biologiquement fonctionnels in vitro. Proc. Natl Acad. Sci. USA 70, 3240 3244. Green MR & Sambrook J (2012) Clonage mol culaire : un manuel de laboratoire, 4e d. Cold Spring Harbor, NY : Cold Spring Harbor Laboratory Press. Consortium international de s quen age du g nome humain (2001) S quen age initial et analyse du g nome humain. Nature 409, 860 921. Jackson D, Symons R & Berg P (1972) M thode biochimique pour
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Biologie moléculaire de la cellule	sible, de nouvelles m thodes contournent intelligemment cette limitation et permettent de cartographier la position de mol cules uniques. En utilisant un faisceau d' lectrons au lieu de la lumi re visible, la microscopie lectronique peut imager l'int rieur des cellules et leurs composants macromol culaires, une r solution presque atomique et en trois dimensions. Ce chapitre se veut un compagnon, plut t qu'une introduction, aux chapitres qui suivent ; Les lecteurs voudront peut- tre s'y r f rer lorsqu'ils rencontreront des applications de la microscopie des probl mes biologiques fondamentaux dans les derni res pages du livre. Regard sur les CeLL la lumi re de MiCrosCope Une cellule animale typique mesure 10 20 m de diam tre, soit environ un cinqui me de la taille du plus petit objet que nous pouvons normalement voir l' il nu. Ce n'est qu'apr s que de bons microscopes optiques sont devenus disponibles au d but du XIXe si cle que Schleiden et Schwann ont propos que tous les tissus v g taux et animaux taient des agr gats de cellules individuelles. Leur proposition de 1838, connue sous le nom de doctrine cellulaire, marque la naissance formelle de la biologie cellulaire. Les cellules animales sont non seulement minuscules, mais elles sont galement incolores et translucides. La d couverte de leurs principales caract ristiques internes d pendait donc du d veloppement, la fin du XIXe si cle, d'une vari t de taches offrant un contraste suffisant pour rendre ces caract ristiques visibles. De m me, le microscope lectronique beaucoup plus puissant introduit au d but des ann es 1940 a n cessit le d veloppement de nouvelles techniques de conservation et de coloration des cellules avant que toute la complexit de leur structure fine interne puisse commencer merger. ce jour, la microscopie s'appuie souvent autant sur les techniques de pr paration de l' chantillon que sur les performances du microscope lui-m me. Dans les discussions qui suivent, nous consid rons donc la fois les instruments et la pr paration des chantillons, en commen ant par le microscope optique. Les images de la figure 9 1 illustrent une progression progressive d'un pouce un groupe d'atomes. Chaque image successive repr sente une multiplication par dix du grossissement. L' il nu peut voir les caract ristiques dans les deux premiers panneaux, le microscope optique nous permet de voir des d tails correspondant environ le quatri me ou cinqui me panneau, et le microscope lectronique nous emm ne vers le septi me ou huiti me panneau. La figure 9 2 montre les tailles de diverses structures cellulaires et subcellulaires et les gammes de tailles que diff rents types de microscopes peuvent visualiser. Regard sur les CeLL la lumi re de MiCrosCope En regardant les CeLL et les MoLeCULes dans l'eLeCtron MiCrosCope 20 mm 2 mm 0,2 mm 20 m 2 m 0,2 m 20 nm 2 nm 0,2 nm le microscope optique peut r soudre les d tails 0,2 m de distance Pendant plus de 100 ans, tous les microscopes ont t limit s par une limitation fondamentale : un type de rayonnement donn ne peut pas tre utilis pour sonder des d tails structurels beaucoup plus petits que sa propre longueur d'onde. Une limite la r solution d'un microscope optique a donc t fix e par la longueur d'onde de la lumi re visible, qui varie d'environ 0,4 m (pour le violet) 0,7 m (pour le rouge profond). Concr tement, les bact ries et les mitochondries, qui mesurent environ 500 nm (0,5 m) de large, sont g n ralement les plus petits objets dont on peut clairement discerner la forme au microscope optique ; Les d tails plus petits sont obscurcis par les effets r sultant de la nature ondulatoire de la lumi re. Pour comprendre pourquoi cela se produit, nous devons suivre le comportement d'un faisceau de lumi re lorsqu'il passe travers les lentilles d'un microscope (Figure 9-3). En raison de sa nature ondulatoire, la lumi re ne suit pas les trajectoires de rayons droits id alis es que l'optique g om trique pr dit. Au lieu de cela, les ondes lumineuses voyagent travers un syst me optique par de nombreuses voies l g rement diff rentes, comme des ondulations dans l'eau, de sorte qu'elles Figure 9 1 Une id e de l' chelle entre les cellules vivantes et les atomes. Chaque diagramme montre une image multipli e par dix dans une progression imaginaire d'un pouce, travers des cellules cutan es, un ribosome, un amas d'atomes faisant partie de l'une des nombreuses mol cules de prot ines de notre corps. Les d tails atomiques des macromol cules biologiques, tels qu'ils sont montr s dans les deux derniers panneaux, sont g n ralement au-del de la puissance du microscope lectronique. Bien que la couleur ait t utilis e ici dans tous les panneaux, ce n'est pas une caract ristique des objets beaucoup plus petits que la longueur d'onde de la lumi re, donc les cinq derniers panneaux devraient vraiment tre en noir et blanc. limite de limite de super-conventionnel 0,1 nm (1 A) Figure 9
Biologie moléculaire de la cellule	2 Pouvoir de r solution. La taille des cellules et de leurs composants est dessin e sur une chelle logarithmique, indiquant la gamme d'objets qui peuvent tre facilement r solus l' il nu et au microscope optique et lectronique. Notons que les nouvelles techniques de microscopie super-r solution, abord es en d tail plus loin, permettent une am lioration de la r solution d'un ordre de grandeur par rapport la microscopie optique conventionnelle. interf rent les uns avec les autres et provoquent des effets de diffraction optique. Si deux trains d'ondes atteignant le m me point par des chemins diff rents sont pr cis ment en phase, avec une cr te correspondant la cr te et au creux correspondant au creux, ils se renforceront mutuellement afin d'augmenter la luminosit . En revanche, si les trains d'ondes sont d phas s, ils interf reront les uns avec les autres de mani re s'annuler partiellement ou totalement (Figure 9 4). L'interaction de la lumi re avec un objet modifie les relations de phase des ondes lumineuses d'une mani re qui produit des effets d'interf rence complexes. fort grossissement, par exemple, l'ombre d'un bord uniform ment clair par une lumi re de longueur d'onde uniforme appara t sous la forme d'un ensemble de lignes parall les (Figure 9 5), tandis que celle d'une tache circulaire appara t sous la forme d'un ensemble d'anneaux concentriques. Pour la m me raison, un seul point vu travers un microscope appara t comme un disque flou, et deux objets ponctuels proches l'un de l'autre donnent des images qui se chevauchent et peuvent fusionner en une seule. Les unit s de longueur suivantes sont couramment utilis es en microscopie : m (microm tre) = 10 6 m NM (nanom tre) = 10 9 m (unit ngstr m) = 10 10 m Figure 9 3 Un microscope optique. (a) Sch ma montrant le trajet de la lumi re dans un microscope compos . La lumi re est focalis e sur l' chantillon par des lentilles dans le condenseur. Une combinaison de lentilles d'objectif, de lentilles tubulaires et de lentilles oculaires est dispos e pour focaliser une image de l' chantillon clair dans l' il. (B) un microscope optique de recherche moderne. (B, avec l'aimable autorisation de Carl Zeiss Microscopy, gmbh.) Bien qu'aucun raffinement des lentilles ne puisse surmonter la limite de diffraction impos e par la nature ondulatoire de la lumi re, d'autres moyens de contourner intelligemment cette limite ont merg , cr ant des techniques d'imagerie dites de superr solution qui peuvent m me d tecter la position de mol cules uniques. La s paration limite laquelle deux objets apparaissent distincts la limite de r solution d pend la fois de la longueur d'onde de la lumi re et de l'ouverture num rique du syst me de lentille utilis . L'ouverture num rique affecte la capacit de collecte de lumi re de l'objectif et est li e la fois l'angle du c ne de lumi re qui peut y p n trer et l'indice de r fraction du milieu dans lequel l'objectif fonctionne ; plus le microscope ouvre l' il, pour ainsi dire, plus il peut voir clairement (figures 9 6). L'indice de r fraction est le rapport entre la vitesse de la lumi re dans le vide et la vitesse de la lumi re dans un milieu transparent particulier. Par exemple, pour l'eau, il est de 1,33, ce qui signifie que la lumi re se d place 1,33 fois plus lentement dans l'eau que dans le vide. Dans les meilleures conditions, avec une lumi re violette (longueur d'onde = 0,4 m) et une ouverture num rique de 1,4, le microscope optique de base peut th oriquement atteindre une limite de r solution d'environ 0,2 m, soit 200 nm. Certains fabricants de microscopes la fin du XIXe si cle ont atteint cette r solution, mais elle est r guli rement gal e dans les microscopes contemporains fabriqu s en usine. Bien qu'il soit possible d'agrandir une image autant que nous le souhaitons, par exemple en la projetant sur un cran, il n'est pas possible, dans un microscope optique conventionnel, de r soudre deux objets au microscope optique qui sont s par s de moins de 0,2 m environ ; Ils appara tront comme un seul objet. Il est toutefois important de faire la distinction entre la r solution et la d tection. Si un petit objet, en dessous de la limite de r solution, met lui-m me de la lumi re, nous pouvons encore tre en mesure de le voir ou de le d tecter. Ainsi, nous pouvons voir un seul microtubule marqu par fluorescence m me s'il est environ dix fois plus mince que la limite de r solution du microscope optique. Cependant, les effets de diffraction le feront appara tre flou et d'au moins 0,2 m d' paisseur (voir Figure 9 16). De la m me mani re, nous pouvons voir les toiles dans le ciel nocturne, m me si leurs diam tres sont bien inf rieurs la r solution angulaire de nos yeux nus : elles apparaissent comme des points de lumi re similaires, l g rement flous, ne diff rant que par leur couleur et leur luminosit . Bruit de photons Cr e des limites suppl mentaires la r solution lorsque les niveaux de lumi r
Biologie moléculaire de la cellule	e sont faibles Toute image, qu'elle soit produite par un microscope lectronique ou par un microscope optique, est faite par des particules lectrons ou photons frappant une sorte de d tecteur. Mais ces particules sont r gies par la m canique quantique, de sorte que les nombres atteignant le d tecteur ne sont pr visibles que dans un sens statistique. Des chantillons finis, collect s par imagerie pendant une p riode de temps limit e (c'est- -dire en prenant un instantan ), montreront une variation al atoire : les instantan s successifs d'une m me sc ne ne seront pas exactement identiques. De plus, chaque m thode de d tection pr sente un certain niveau de signal de fond ou de bruit, ce qui ajoute l'incertitude statistique. Avec un clairage lumineux, correspondant un tr s grand nombre de photons ou d' lectrons, les caract ristiques de l'image Figure 9 4 Brouillage entre ondes lumineuses. Lorsque deux ondes lumineuses se combinent en phase, l'amplitude de l'onde r sultante est plus grande et la luminosit est augment e. Deux ondes lumineuses d phas es s'annulent partiellement et produisent une onde dont l'amplitude, et donc la luminosit , est diminu e. Figure 9 5 Images d'une ar te et d'un point de lumi re. a) les effets d'interf rence, ou franges, observ s fort grossissement lorsque la lumi re d'une longueur d'onde sp cifique passe le bord d'un objet solide plac entre la source lumineuse et l'observateur. (B) l'image d'une source lumineuse ponctuelle. La diffraction l' tale en un motif circulaire complexe, dont la largeur d pend de l'ouverture num rique du syst me optique : plus l'ouverture est petite, plus l'image diffract e est grande (plus floue). Deux sources ponctuelles peuvent tre r solues lorsque le centre de l'image de l'une se trouve sur le premier anneau sombre de l'image de l'autre : cela est utilis pour d finir la limite de r solution. Figure 9 6 Ouverture num rique. Le trajet des rayons lumineux traversant un chantillon transparent au microscope illustre le concept d'ouverture num rique et sa relation avec la limite de r solution. la lentille de l'objectif recueille un c ne de rayons lumineux pour cr er une image, la lentille du condenseur focalise un c ne de rayons lumineux sur chaque point de l' chantillon. R SOLUTION : le pouvoir de r solution du microscope d pend de la largeur du c ne d' clairage et donc la fois du condenseur et de la lentille de l'objectif. Il est calcul l'aide de la formule 0,61 o : = la moiti de la largeur angulaire du c ne de rayons collect s par la lentille de l'objectif partir d'un point typique de la r gion centrale de l' chantillon (puisque la largeur maximale est de 180 , sin a une valeur maximale de 1) n = l'indice de r fraction du milieu (g n ralement de l'air ou de l'huile) s parant l' chantillon des lentilles de l'objectif et du condenseur = la longueur d'onde de la lumi re utilis e ( Pour la lumi re blanche, on suppose g n ralement qu'une FGURE de 0,53 m est utilis e) OUVERTURE NUM RIQUE : n sin dans l'ouverture, plus la r solution est grande et l' quation ci-dessus est appel e l'ouverture num rique plus lumineuse de l'image (la luminosit est importante dans l'objectif et est fonction de sa microscopie lumi re fuoratoire). Cependant, cette capacit d'avancement. Pour les objectifs secs, cela ne peut pas tre tage, n cessite des distances de travail tr s courtes sup rieures 1, mais pour les objectifs immersion dans l'huile, cela peut tre le cas et une tr s petite profondeur de feld. tre aussi lev que 1,4. Plus les chantillons num riques sont lev s, plus la distribution de ces particules au niveau du d tecteur est d termin e. Cependant, avec un plus petit nombre de particules, les d tails structurels de l' chantillon sont obscurcis par les fluctuations statistiques du nombre de particules d tect es dans chaque r gion, ce qui donne l'image un aspect mouchet et limite sa pr cision. Le terme bruit d crit cette variabilit al atoire. Les cellules vivantes sont clairement visibles dans un microscope contraste de phase ou contraste d'interf rence diff rentielle Il existe de nombreuses fa ons de g n rer le contraste dans un chantillon (figures 9 7A). Bien que la fixation et la coloration d'un chantillon puissent g n rer un contraste par la couleur, les microscopistes ont toujours t confront s la possibilit que certains composants de la cellule puissent tre perdus ou d form s lors de la pr paration de l' chantillon. La seule fa on certaine d' viter le probl me est d'examiner les cellules pendant qu'elles sont vivantes, sans les fixer ni les congeler. cette fin, les microscopes optiques dot s de syst mes optiques sp ciaux sont particuli rement utiles. Dans le microscope fond clair normal, la lumi re traversant une cellule en culture forme directement l'image. Un autre syst me, la microscopie fond noir, exploite le fait que les rayons lumineux peuvent tre diffus s dans toutes les directions par
Biologie moléculaire de la cellule	de petits objets sur leur passage. Si un clairage oblique du condenseur est dispos , qui ne p n tre pas directement dans l'objectif, des objets focalis s mais non color s dans une cellule vivante peuvent disperser les rayons, dont certains p n trent ensuite dans l'objectif pour cr er une image lumineuse sur un fond noir (Figure 9 7B). Lorsque la lumi re traverse une cellule vivante, la phase de l'onde lumineuse est modifi e en fonction de l'indice de r fraction de la cellule : une partie relativement paisse ou dense de la cellule, comme un noyau, ralentit la lumi re qui la traverse. Par cons quent, la phase de la lumi re est d cal e par rapport la lumi re qui a travers une r gion adjacente plus mince du cytoplasme (Figure 9-7C). Le microscope contraste de phase et, de mani re plus complexe, le microscope contraste diff rentiel d'interf rence augmentent ces diff rences de phase de sorte que les ondes sont plus proches de la d phasion, produisant des diff rences d'amplitude lorsque les ensembles d'ondes se recombinent, cr ant ainsi une image de la structure de la cellule. Les deux types de microscopie optique sont largement utilis s pour visualiser les cellules vivantes (voir la vid o 17.2). La figure 9-8 compare les images de la m me cellule obtenues par quatre types de microscopie optique. Figure 9 7 Contraste en microscopie optique. (a) La partie color e de la cellule absorbera la lumi re de certaines longueurs d'onde, qui d pendent de la tache, mais permettra d'autres longueurs d'onde de la traverser. On obtient ainsi une image color e de la cellule qui est visible dans le microscope optique fond clair normal. (B) dans le microscope fond noir, les rayons obliques de lumi re focalis s sur l' chantillon ne p n trent pas dans la lentille de l'objectif, mais la lumi re diffus e par les composants de la cellule vivante peut tre collect e pour produire une image lumineuse sur un fond sombre. (C) La lumi re traversant la cellule vivante non color e subit tr s peu de changement d'amplitude, et les d tails structurels ne peuvent pas tre vus m me si l'image est fortement agrandie. La phase de la lumi re, cependant, est modifi e par son passage travers des parties plus paisses ou plus denses de la cellule, et de petites diff rences de phase peuvent tre rendues visibles en exploitant les effets d'interf rence l'aide d'un microscope contraste de phase ou d'un microscope diff rentiel contraste d'interf rence. Le contraste de phase, le contraste d'interf rence diff rentielle et la microscopie fond noir permettent d'observer les mouvements impliqu s dans des processus tels que la mitose et la migration cellulaire. tant donn que de nombreux mouvements cellulaires sont trop lents pour tre vus en temps r el, il est souvent utile de r aliser des vid os timelapse dans lesquelles la cam ra enregistre des images successives s par es par un court d lai, de sorte que lorsque la s rie d'images r sultante est lue une vitesse normale, les v nements apparaissent consid rablement acc l r s. Au cours des derni res ann es, les syst mes d'imagerie lectroniques, ou num riques, et la technologie associ e de traitement d'images, ont eu un impact majeur sur la microscopie optique. Certaines limitations pratiques des microscopes relatives aux imperfections du syst me optique ont t largement surmont es. Les syst mes d'imagerie lectronique ont galement contourn deux limites fondamentales de l' il humain : l' il ne peut pas bien voir dans une lumi re extr mement faible et il ne peut pas percevoir de petites diff rences d'intensit lumineuse sur un fond lumineux. Pour augmenter notre capacit observer les cellules dans ces conditions difficiles, nous pouvons attacher un appareil photo num rique sensible un microscope. Ces cam ras d tectent la lumi re au moyen de dispositifs couplage de charge (CCD) ou de capteurs semi-conducteurs oxyde m tallique compl mentaire (CMOS) haute sensibilit , similaires ceux que l'on trouve dans les appareils photo num riques. Ces capteurs d'image sont 10 fois plus sensibles que l' il humain et peuvent d tecter 100 fois plus de niveaux d'intensit . Il est donc possible d'observer les cellules pendant de longues p riodes des niveaux de lumi re tr s faibles, vitant ainsi les effets n fastes d'une lumi re vive prolong e (et de la chaleur). Ces cam ras faible luminosit sont particuli rement importantes pour observer les mol cules fluorescentes dans les cellules vivantes, comme expliqu ci-dessous. Comme les images produites par les appareils photo num riques sont sous forme lectronique, elles peuvent tre trait es de diff rentes mani res pour extraire des informations latentes. Un tel traitement d'image permet de compenser plusieurs d fauts optiques dans les microscopes. De plus, gr ce au traitement d'image num rique, le contraste peut tre consid rablement am lior pour vaincre Figure 9 8 Quatre types de microscopie optique. Quatre images sont montr es d
Biologie moléculaire de la cellule	e la m me cellule de fibroblaste en culture. Toutes les images peuvent tre obtenues avec la plupart des microscopes modernes en interchangeant des composants optiques. (a) Microscopie fond clair, dans laquelle la lumi re est transmise directement travers l' chantillon. (B) la microscopie contraste de phase, dans laquelle les alt rations de phase de la lumi re transmise travers l' chantillon sont traduites en changements de luminosit . (C) La microscopie diff rentielle-interf rence-contraste, qui met en vidence les bords o il y a un changement brutal de l'indice de r fraction. (D) La microscopie fond noir, dans laquelle l' chantillon est clair de c t et seule la lumi re diffus e est visible. Les limites de l' il dans la d tection de petites diff rences d'intensit lumineuse et les irr gularit s de fond dans le syst me optique peuvent tre soustraites num riquement. Cette proc dure permet de r v ler de petits objets transparents qui taient auparavant impossibles distinguer de l'arri re-plan. les tissus intacts sont g n ralement fix s et sectionn s avant la microscopie Parce que la plupart des chantillons de tissus sont trop pais pour que leurs cellules individuelles puissent tre examin es directement haute r solution, ils sont souvent coup s en tranches transparentes tr s minces, ou sections. Pour pr server les cellules l'int rieur du tissu, elles doivent tre trait es avec un fixateur. Les fixateurs courants comprennent le glutarald hyde, qui forme des liaisons covalentes avec les groupes amin s libres des prot ines, les r ticulant afin qu'ils soient stabilis s et verrouill s en position. Parce que les tissus sont g n ralement mous et fragiles, m me apr s fixation, ils doivent tre soit congel s, soit int gr s dans un support avant d' tre sectionn s. Les supports d'enrobage habituels sont les cires ou les r sines. Sous forme liquide, ces milieux p n trent et entourent la fois le tissu fix ; Ils peuvent ensuite tre durcis (par refroidissement ou par polym risation) pour former un bloc solide, qui est facilement sectionn l'aide d'un microtome. Il s'agit d'une machine dot e d'une lame tranchante, g n ralement en acier ou en verre, qui fonctionne comme une trancheuse viande (figures 9-9). Les coupes (g n ralement de 0,5 10 m d' paisseur) sont ensuite pos es plat sur la surface d'une lame de microscope en verre. Il y a peu de choses dans le contenu de la plupart des cellules (qui sont compos es 70 % d'eau en poids) pour entraver le passage des rayons lumineux. Ainsi, la plupart des cellules l' tat naturel, m me si elles sont fixes et sectionn es, sont presque invisibles dans un microscope optique ordinaire. Nous avons vu que les composants cellulaires peuvent tre rendus visibles par des techniques telles que la microscopie contraste de phase et la microscopie contraste diff rentiel, mais ces m thodes ne nous disent presque rien sur la chimie sous-jacente. Il existe trois approches principales pour travailler avec des coupes de tissus minces qui r v lent des diff rences dans les types de mol cules pr sentes. Tout d'abord, et traditionnellement, les sections peuvent tre color es avec des colorants organiques qui ont une certaine affinit sp cifique pour des composants subcellulaires particuliers. Le colorant h matoxyline, par exemple, a une affinit pour les mol cules charg es n gativement et r v le donc la distribution de l'ADN, de l'ARN et des prot ines acides dans une cellule (Figure 9-10). Cependant, la base chimique de la sp cificit de nombreux colorants n'est pas connue. mouvement du microtome bras ruban de ruban de sections sur lame de verre, teint et mont sous une lamelle de verre Figure 9 9 R alisation de coupes de tissus. Cette illustration montre comment un tissu incrust est sectionn l'aide d'un microtome en vue d'un examen au microscope optique. Deuxi mement, les tissus sectionn s peuvent tre utilis s pour visualiser des mod les sp cifiques d'expression g nique diff rentielle. L'hybridation in situ, dont nous avons parl plus haut (voir la figure 8-34), r v le la distribution cellulaire et l'abondance des mol cules d'ARN sp cifiques exprim es dans du mat riel sectionn ou dans des montages entiers de petits organismes ou organes. Ceci est particuli rement efficace lorsqu'il est utilis en conjonction avec des sondes fluorescentes (Figure 9 11). Une troisi me approche, tr s sensible, g n ralement et largement applicable pour localiser les prot ines d'int r t, d pend galement de l'utilisation de sondes et de marqueurs fluorescents, comme nous l'expliquons ci-dessous. Les mol cules fluorescentes absorbent la lumi re une longueur d'onde et l' mettent une autre longueur d'onde plus longue (Figure 9 12A). Si nous clairons une telle mol cule sa longueur d'onde absorbante, puis que nous la regardons travers un filtre qui ne laisse passer que la lumi re de la longueur d'onde mise, elle brillera sur un fond sombre. Parce que l'arr
Biologie moléculaire de la cellule	i re-plan est sombre, m me une infime quantit de colorant fluorescent brillant peut tre d tect e. En revanche, le m me nombre de mol cules d'un colorant non fluorescent, consid r conventionnellement, serait pratiquement indiscernable parce que l'absorption de la lumi re par les mol cules de la coloration n'entra nerait qu'une faible teinte de couleur dans la lumi re transmise travers cette partie de l' chantillon. Les colorants fluorescents utilis s pour la coloration des cellules sont visualis s l'aide d'un microscope fluorescence. Ce microscope est similaire un microscope optique ordinaire, sauf que la lumi re clairante, provenant d'une source tr s puissante, passe travers deux ensembles de filtres : l'un pour filtrer la lumi re avant qu'elle n'atteigne l' chantillon et l'autre pour Figure 9 10 Coloration des composants cellulaires. (a) Cette section de cellules dans les canaux collecteurs d'urine du rein a t color e l'h matoxyline et l' osine, deux colorants couramment utilis s en histologie. Chaque conduit est constitu de cellules serr es (avec des noyaux color s en rouge) qui forment un anneau. L'anneau est entour d'une matrice extracellulaire, color e en violet. (B) cette section de la racine d'une jeune plante est color e avec deux colorants, la safranine et le vert rapide. Le vert rapide colore les parois cellulaires cellulosiques tandis que la safranine colore les parois cellulaires du xyl me lignifi en rouge vif. (a, d'apr s p.r. Wheater et al., Functional histology, 2e d. Londres : Churchill Livingstone, 1987 ; B, avec l'aimable autorisation de Stephen Grace.) Figure 9 11 Hybridation in situ de l'ARN. comme d crit au chapitre 8 (voir Figure 8-62), il est possible de visualiser la distribution de diff rents ARN dans les tissus en utilisant l'hybridation in situ. Ici, le mod le de transcription de cinq g nes diff rents impliqu s dans la structuration de l'embryon pr coce de la mouche est r v l dans un seul embryon. Chaque sonde d'ARN a t marqu e par fluorescence d'une mani re diff rente, certaines directement et d'autres indirectement ; Les images r sultantes sont affich es chacune dans une couleur diff rente ( faussement color es ) et combin es pour donner une image o diff rentes combinaisons de couleurs repr sentent diff rents ensembles de g nes exprim s. Les g nes dont le mod le d'expression est r v l ici sont Wingless (jaune), engr l (bleu), gastrulation courte (rouge), neuroblastes interm diaires d fectueux (vert) et hom obox sp cifique au muscle (violet). (D'apr s D. kosman et al., Science 305:846, 2004. Avec l'autorisation de l'aaas.) nergie de l' lectronine orbitale Fuorophore mission du photon 3 secondes Barri re Flter : coupe les signaux fuorescents ind sirables, passant l' mission de Fuorescein verte sp cifique entre 520 et 560 nm 2 miroir s parateur de faisceau : r fl chit la lumi re en dessous de 510 nm mais transmet la lumi re au-dessus de 510 nm Figure 9 12 La fluorescence et le microscope fluorescence. (a) Un lectron orbital d'une mol cule de fluorochrome peut tre lev un tat excit suite l'absorption d'un photon. La fluorescence se produit lorsque l' lectron revient son tat fondamental et met un photon de lumi re une longueur d'onde plus longue. Une trop grande exposition la lumi re, ou une lumi re trop vive, peut galement d truire la mol cule de fluorochrome, dans un processus appel photoblanchiment. (B) dans le microscope fluorescence, un ensemble de filtres se compose de deux filtres barri res (1 et 3) et d'un miroir dichro que (s paration du faisceau) (2). Cet exemple montre le jeu de filtres pour la d tection de la mol cule fluorescente fluoresc ine. Les objectifs grande ouverture num rique sont particuli rement importants dans ce type de microscopie car, pour un grossissement donn , la luminosit de l'image fluorescente est proportionnelle la quatri me puissance de l'ouverture num rique Figure 9 14 Diff rentes sondes fluorescentes peuvent tre visualis es dans la m me cellule. dans cette micrographie composite d'une cellule en mitose, trois sondes fluorescentes diff rentes ont t utilis es pour marquer trois composants cellulaires diff rents (Vid o 9.1). Les microtubules fusiformes sont r v l s avec un anticorps fluorescent vert, les centrom res avec un anticorps fluorescent rouge et l'ADN des chromosomes condens s avec le colorant fluorescent bleu Dapi. (Avec l'aimable autorisation de kevin F. sullivan.) (voir Figure 9-13) mais, comme de nombreux fluorochromes organiques, ils s'estompent assez rapidement lorsqu'ils sont clair s en permanence. Des fluorochromes plus stables ont t d velopp s sur la base de la chimie inorganique. De minuscules cristaux de mat riau semi-conducteur, appel s nanoparticules, ou points quantiques, peuvent tre excit s pour devenir fluorescents par un large spectre de lumi re bleue. Leur lumi re mise a une couleur qui d pend de la taille exacte du nanocristal, entre 2 et 10 nm de
Biologie moléculaire de la cellule	diam tre, et de plus, la fluorescence ne s'estompe que lentement avec le temps (Figure 9 15). Ces nanoparticules, lorsqu'elles sont coupl es d'autres sondes comme les anticorps, sont donc id ales pour suivre les mol cules dans le temps. S'ils sont introduits dans une cellule vivante, dans un embryon par exemple, la descendance de cette cellule peut tre suivie plusieurs jours plus tard par leur fluorescence, ce qui permet de suivre les lign es cellulaires. Figure 9 15 Nanoparticules fluorescentes ou points quantiques. (a) Les points quantiques sont de minuscules particules de s l niure de cadmium, un semi-conducteur, avec un rev tement pour les rendre solubles dans l'eau. Ils peuvent tre coupl s des mol cules prot iques telles que des anticorps ou de la streptavidine et, lorsqu'ils sont introduits dans une cellule, se lient une prot ine cible d'int r t. Des points quantiques de diff rentes tailles mettent de la lumi re de diff rentes couleurs plus le point est grand, plus la longueur d'onde est longue mais ils sont tous excit s par la m me lumi re bleue. Les points quantiques peuvent continuer briller pendant des semaines, contrairement la plupart des colorants organiques fluorescents. (B) Dans cette cellule, les microtubules sont marqu s (vert) avec un colorant fluorescent organique (alexa 488), tandis qu'une prot ine nucl aire est color e (rouge) avec des points quantiques li s la streptavidine. Lors d'une exposition continue une forte lumi re bleue, le colorant fluorescent s'estompe rapidement tandis que les points quantiques continuent de briller. (C) dans cette cellule, le mod le d' tiquetage est invers ; Une prot ine nucl aire est marqu e (en vert) avec un colorant fluorescent organique (Alexa 488), tandis que les microtubules sont marqu s (en rouge) avec des points quantiques. Encore une fois, les points quantiques durent bien plus longtemps que le colorant fluorescent. (B et C, d'apr s L. Medintz et al., Nat. Mater. 4:435 446, 2005. Avec l'autorisation de Macmillan publishers Ltd.) Plus loin dans le chapitre, nous aborderons d'autres m thodes de microscopie fluorescence qui peuvent tre utilis es pour surveiller les changements de concentration et d'emplacement de mol cules sp cifiques l'int rieur des cellules vivantes. Les anticorps peuvent tre utilis s pour d tecter des mol cules sp cifiques Les anticorps sont des prot ines produites par le syst me immunitaire des vert br s pour se d fendre contre l'infection (voir le chapitre 24). Elles sont uniques parmi les prot ines en ce sens qu'elles sont fabriqu es sous des milliards de formes diff rentes, chacune avec un site de liaison diff rent qui reconna t une mol cule cible sp cifique (ou antig ne). La sp cificit pr cise de l'antig ne des anticorps en fait des outils puissants pour le biologiste cellulaire. Lorsqu'ils sont marqu s avec des colorants fluorescents, les anticorps sont inestimables pour localiser des mol cules sp cifiques dans les cellules par microscopie fluorescence (Figure 9 16) ; Marqu s avec des particules denses en lectrons telles que des sph res d'or collo dales, ils sont utilis s des fins similaires au microscope lectronique (voir ci-dessous). Les anticorps utilis s en microscopie sont g n ralement soit purifi s partir d'antis rum afin d' liminer tous les anticorps non sp cifiques, soit des anticorps monoclonaux sp cifiques qui ne reconnaissent que la mol cule cible. Lorsque nous utilisons des anticorps comme sondes pour d tecter et analyser des mol cules sp cifiques dans les cellules, nous utilisons fr quemment des m thodes chimiques pour amplifier le signal fluorescent qu'elles produisent. Par exemple, bien qu'une mol cule marqueuse telle qu'un colorant fluorescent puisse tre directement li e un anticorps (l'anticorps primaire), un signal plus fort est obtenu en utilisant un anticorps primaire non marqu , puis en le d tectant avec un groupe d'anticorps secondaires marqu s qui se lient celui-ci (Figure 9 17). Ce processus est appel immunocytochimie indirecte. Certaines m thodes d'amplification utilisent une enzyme comme mol cule marqueur attach e l'anticorps secondaire. L'enzyme phosphatase alcaline, par exemple, en pr sence de produits chimiques appropri s, produit du phosphate inorganique qui son tour anticorps primaire : anticorps secondaires : Figure 9 16 Immunofluorescence. Micrographie lectronique transmission de la p riph rie d'une cellule pith liale en culture montrant la distribution des microtubules et d'autres filaments. (B) la m me zone color e avec des anticorps fluorescents contre la tubuline, la prot ine qui s'assemble pour former des microtubules, en utilisant la technique de l'immunocytochimie indirecte (voir Figure 9-17). Les fl ches rouges indiquent les microtubules individuels qui sont facilement reconnaissables dans les deux images. Notez qu'en raison des effets de diffraction, les microtubules du microscope optique apparaissent 0,2 m de large plut
Biologie moléculaire de la cellule	t qu' leur largeur r elle de 0,025 m. (D'apr s M. osborn, r. Webster et k. Weber, J. Cell Biol. 77 :r27-r34, 1978. Avec l'autorisation de la Rockefeller University Press.) Figure 9 17 Immunocytochimie indirecte. Cette m thode de d tection est tr s sensible car de nombreuses mol cules de l'anticorps secondaire reconnaissent chaque anticorps primaire. L'anticorps secondaire est coupl de mani re covalente une mol cule marqueur qui le rend facilement d tectable. Les mol cules marqueurs couramment utilis es comprennent les sondes fluorescentes (pour la microscopie fluorescence), l'enzyme peroxydase de raifort (pour la microscopie optique conventionnelle ou la microscopie lectronique), les sph res d'or collo dales (pour la microscopie lectronique) et les enzymes phosphatase alcaline ou peroxydase (pour la d tection biochimique). conduit la formation locale d'un pr cipit color . Cela r v le l'emplacement de l'anticorps secondaire et donc l'emplacement du complexe anticorps-antig ne. tant donn que chaque mol cule enzymatique agit de mani re catalytique pour g n rer plusieurs milliers de mol cules de produit, m me de minuscules quantit s d'antig ne peuvent tre d tect es. Bien que l'amplification enzymatique rende sensibles les m thodes li es aux enzymes, la diffusion du pr cipit color loin de l'enzyme limite la r solution spatiale de cette m thode pour la microscopie, et les marqueurs fluorescents sont g n ralement utilis s pour la localisation optique la plus sensible et la plus pr cise. l'imagerie d'objets tridimensionnels complexes est possible avec le microscope optique Pour la microscopie optique ordinaire, comme nous l'avons vu, un tissu doit tre d coup en lames minces pour tre examin ; Plus la section est fine, plus l'image est nette. Puisque l'information sur la troisi me dimension est perdue lors de la section, comment pouvons-nous alors obtenir une image de l'architecture tridimensionnelle d'une cellule ou d'un tissu, et comment pouvons-nous voir la structure microscopique d'un chantillon qui, pour une raison ou une autre, ne peut pas tre d'abord d coup en sections ? Bien qu'un microscope optique soit focalis sur un plan focal particulier l'int rieur d'un chantillon tridimensionnel, toutes les autres parties de l' chantillon, au-dessus et au-dessous du plan de foyer, sont galement clair es et la lumi re provenant de ces r gions contribue l'image sous forme de flou flou . Cela peut rendre tr s difficile l'interpr tation d taill e de l'image et peut conduire ce que la structure fine de l'image soit obscurcie par la lumi re floue. Deux approches distinctes mais compl mentaires r solvent ce probl me : l'une est computationnelle, l'autre optique. Ces m thodes d'imagerie microscopique tridimensionnelle permettent de se concentrer sur un plan choisi dans un chantillon pais tout en rejetant la lumi re provenant des r gions floues au-dessus et en dessous de ce plan. Ainsi, on voit une section optique nette et mince. partir d'une s rie de coupes optiques prises diff rentes profondeurs et stock es dans un ordinateur, une image tridimensionnelle peut tre reconstruite. Les m thodes font pour le microscopiste ce que la tomodensitom trie (TDM) fait (par des moyens diff rents) pour le radiologue qui tudie un corps humain : les deux machines donnent des vues en coupe d taill es de l'int rieur d'une structure intacte. L'approche computationnelle est souvent appel e d convolution d'image. Pour comprendre comment cela fonctionne, rappelez-vous que la nature ondulatoire de la lumi re signifie que le syst me de lentille du microscope produit un petit disque flou comme l'image d'une source lumineuse ponctuelle (voir Figure 9-5), avec un flou accru si la source ponctuelle se trouve au-dessus ou en dessous du plan focal. Cette image floue d'une source ponctuelle est appel e fonction d' talement de points (voir Figure 9 36). L'image d'un objet complexe peut alors tre consid r e comme tant construite en rempla ant chaque point de l' chantillon par un disque flou correspondant, ce qui donne une image globalement floue. Pour d convolution, nous obtenons d'abord une s rie d'images (floues), g n ralement avec une cam ra CCD refroidie ou plus r cemment une cam ra CMOS, focalisant le microscope son tour sur une s rie de plans focaux en fait, une image tridimensionnelle (floue). Le traitement num rique de la pile d'images num riques supprime alors autant de flou que possible. Essentiellement, le programme informatique utilise la fonction d' talement du point mesur e d'une source ponctuelle de lumi re de ce microscope pour d terminer quel aurait t l'effet du flou sur l'image, puis applique un d floutage quivalent (d convolution), transformant l'image tridimensionnelle floue en une s rie de sections optiques nettes, bien que toujours limit es par la limite de diffraction. La figure 9 18 en montre un exemple. le microscope confocal produit des coupes optiques en excluant la l
Biologie moléculaire de la cellule	umi re floue Le microscope confocal obtient un r sultat similaire celui de la d convolution, mais le fait en manipulant la lumi re avant qu'elle ne soit mesur e ; Il s'agit d'une technique analogique plut t que num rique. Les d tails optiques du microscope confocal sont complexes, mais l'id e de base est simple, comme l'illustre la figure 9-19, et les r sultats sont Figure 9 18 D convolution de l'image. une micrographie optique des grands chromosomes polyt nes de la drosophile, color s avec un colorant fluorescent de liaison l'ADN. Le m me champ de vision apr s la d convolution de l'image r v le clairement le motif de bandes sur les chromosomes. Chaque bande a une paisseur d'environ 0,25 m, ce qui se rapproche de la limite de diffraction du microscope optique. (Avec l'aimable autorisation du Laboratoire John Sedat.) Figure 9 19 Le microscope confocal fluorescence. (a) ce sch ma simplifi montre que la disposition de base des composants optiques est similaire celle de la figure 9-12, sauf qu'un laser est utilis pour clairer un petit st nop dont l'image est focalis e en un seul point de l' chantillon tridimensionnel (3D). (B) la fluorescence mise par ce point focal dans l' chantillon est focalis e sur un deuxi me st nop (confocal). (C) la lumi re mise ailleurs dans l' chantillon n'est pas focalis e au niveau du st nop et ne contribue donc pas l'image finale. En balayant le faisceau de lumi re travers l' chantillon, une image bidimensionnelle tr s nette du plan de foyer exact est construite, qui n'est pas significativement un point de focale L' chantillon fluorescent est clair par un point de lumi re focalis partir d'un st nop bien sup rieur ceux obtenus par la microscopie optique conventionnelle (Figure 9 20A et B). Le microscope confocal est g n ralement utilis avec l'optique de fluorescence (voir figures 9 12), mais au lieu d' clairer l'ensemble de l' chantillon en une seule fois, de la mani re habituelle, le syst me optique focalise tout instant un point de lumi re sur un seul point une profondeur sp cifique de l' chantillon. Cela n cessite une source d' clairage ponctuelle qui est g n ralement fournie par un laser dont la lumi re a t transmise travers un st nop . La fluorescence mise par le mat riau clair est collect e par un d tecteur de lumi re appropri et utilis e pour g n rer une image. Une ouverture de st nop est plac e devant le d tecteur, une position confocale avec le st nop clairant, c'est- -dire pr cis ment l o les rayons mis par le point clair de l' chantillon se focalisent. Ainsi, la lumi re de ce point de l' chantillon converge vers cette ouverture et p n tre dans le d tecteur. En revanche, la lumi re provenant de r gions situ es en dehors du plan de foyer du projecteur est galement floue l'ouverture du st nop et est donc largement exclue du d tecteur (voir figure 9 19). Pour construire une image bidimensionnelle, les donn es de chaque point du plan de mise au point sont collect es s quentiellement en balayant le champ de gauche droite selon un motif r gulier de pixels et sont affich es sur un cran d'ordinateur. Bien que cela ne soit pas illustr sur les figures 9 19, le balayage est g n ralement effectu en d viant le faisceau l'aide d'un miroir oscillant plac entre le miroir dichro que et la lentille de l'objectif de telle sorte que le projecteur clairant et le projecteur d grad par la lumi re proviennent d'autres r gions de l' chantillon. Figure 9 20 La microscopie confocale fluorescence produit des coupes optiques claires et des ensembles de donn es tridimensionnelles. les deux premi res micrographies sont du m me embryon intact de drosophile au stade gastrula, qui a t color avec une sonde fluorescente pour les filaments d'actine. (a) L'image conventionnelle, non trait e, est floue par la pr sence de structures fluorescentes au-dessus et au-dessous du plan de foyer. (B) dans l'image confocale, cette information floue est supprim e, ce qui entra ne une coupe optique nette des cellules de l'embryon. (C) une reconstruction tridimensionnelle d'un objet peut tre assembl e partir d'un empilement de telles sections optiques. Dans ce cas, la structure ramifi e complexe du compartiment mitochondrial dans une seule cellule de levure vivante est repr sent e. (a et B, avec l'aimable autorisation de Richard Warn et Peter Shaw ; C, avec l'aimable autorisation de Stefan Hell.) Figure 9 21 Imagerie multiphotonique. La lumi re laser infrarouge cause moins de dommages aux cellules vivantes que la lumi re visible et peut galement p n trer davantage, ce qui permet aux microscopistes de scruter plus profond ment les tissus vivants. L'effet deux photons, dans lequel un fluorochrome peut tre excit par deux photons infrarouges co ncidents au lieu d'un seul photon de haute nergie, nous permet de voir pr s de 0,5 mm l'int rieur du cortex d'un cerveau de souris en direct. un colorant, dont la fluorescence change avec la con
Biologie moléculaire de la cellule	centration en calcium, r v le des synapses actives (jaune) sur les pines dendritiques (rouge) qui changent en fonction du temps ; Dans ce cas, il y a un jour entre chaque image. (Avec l'aimable autorisation de Thomas Oertner et Karel Svoboda.) Le st nop confocal au niveau du d tecteur reste strictement dans le registre. Les variations de conception permettent d sormais la collecte rapide de donn es des fr quences vid o. Le microscope confocal a t utilis pour r soudre la structure de nombreux objets tridimensionnels complexes (Figure 9-20C), y compris les r seaux de fibres cytosquelettiques dans le cytoplasme et les arrangements de chromosomes et de g nes dans le noyau. Les m rites relatifs des m thodes de d convolution et de la microscopie confocale pour la microscopie optique tridimensionnelle d pendent de l' chantillon imag . Les microscopes confocaux ont tendance tre meilleurs pour les chantillons plus pais avec des niveaux lev s de lumi re floue. Ils sont galement g n ralement plus faciles utiliser que les syst mes de d convolution et les sections optiques finales sont visibles rapidement. En revanche, les cam ras CCD ou CMOS refroidies utilis es pour les syst mes de d convolution sont extr mement efficaces pour collecter de petites quantit s de lumi re, et elles peuvent tre utilis es pour cr er des images tridimensionnelles d taill es partir d' chantillons trop faiblement color s ou trop facilement endommag s par la lumi re vive utilis e pour la microscopie confocale. Les deux m thodes, cependant, ont un autre inconv nient ; Ni l'un ni l'autre n'est bon pour faire face des sp cimens tr s pais. Les m thodes de d convolution deviennent rapidement inefficaces partir d'une profondeur d'environ 40 m dans un chantillon, tandis que les microscopes confocaux ne peuvent obtenir des images que jusqu' une profondeur d'environ 150 m. Des microscopes sp ciaux peuvent d sormais tirer parti de la fa on dont les mol cules fluorescentes sont excit es pour sonder encore plus profond ment un chantillon. Les mol cules fluorescentes sont g n ralement excit es par un seul photon de haute nergie, de longueur d'onde plus courte que la lumi re mise, mais elles peuvent en outre tre excit es par l'absorption de deux (ou plus) photons de plus faible nergie, condition qu'ils arrivent tous les deux moins d'une femtoseconde l'un de l'autre. L'utilisation de cette excitation de longueur d'onde plus longue pr sente des avantages importants. En plus de r duire le bruit de fond, la lumi re rouge ou proche infrarouge peut p n trer plus profond ment dans un chantillon. Les microscopes multiphotoniques, construits pour tirer parti de cet effet deux photons, peuvent obtenir des images nettes, parfois m me une profondeur de 250 m l'int rieur d'un chantillon. Ceci est particuli rement pr cieux pour l' tude des tissus vivants, notamment pour l'imagerie de l'activit dynamique des synapses et des neurones juste sous la surface des cerveaux vivants (Figure 9-21). M me les structures cellulaires les plus stables doivent tre assembl es, d sassembl es et r organis es au cours du cycle de vie de la cellule. D'autres structures, souvent normes l' chelle mol culaire, changent, se d placent et se r organisent rapidement au fur et mesure que la cellule m ne ses affaires internes et r agit son environnement. Des pi ces complexes et hautement organis es de la machinerie mol culaire d placent les composants autour de la cellule, contr lant le trafic l'int rieur et l'ext rieur du noyau, d'un organite un autre, et l'int rieur et l'ext rieur de la cellule elle-m me. Diverses techniques ont t d velopp es pour visualiser les composants sp cifiques impliqu s dans de tels ph nom nes dynamiques. Beaucoup de ces m thodes utilisent des prot ines fluorescentes, et elles n cessitent un compromis entre la pr servation structurelle et un marquage efficace. Toutes les mol cules fluorescentes discut es jusqu' pr sent sont fabriqu es l'ext rieur de la cellule, puis introduites artificiellement dans celle-ci. Mais l'utilisation de g nes codant pour des mol cules prot iques qui sont elles-m mes intrins quement fluorescentes permet galement de cr er des organismes et des lign es cellulaires qui fabriquent leurs propres tiquettes visibles, sans l'introduction de mol cules trang res. Ces exhibitionnistes cellulaires affichent leur fonctionnement interne dans des couleurs fluorescentes brillantes. La plus importante parmi les prot ines fluorescentes utilis es ces fins par les biologistes cellulaires est la prot ine fluorescente verte (GFP), isol e de la m duse Aequorea victoria. Cette prot ine est cod e par un seul g ne, qui peut tre clon et introduit dans des cellules d'autres esp ces. La prot ine fra chement traduite n'est pas fluorescente, mais en l'espace d'une heure environ (moins pour certains all les du g ne, plus pour d'autres), elle subit une modification post-traductionnelle auto-catalys
Biologie moléculaire de la cellule	e pour g n rer un fluorochrome efficace, prot g l'int rieur d'une prot ine en forme de tonneau, qui sera d sormais fluorescent lorsqu'il sera clair de mani re appropri e par la lumi re bleue (Figure 9-22). La mutagen se extensive r alis e sur la s quence g n tique d'origine a donn lieu de multiples variantes qui peuvent tre utilis es efficacement dans des organismes allant des animaux et des plantes aux champignons et aux microbes. L'efficacit de la fluorescence a galement t am lior e, et des variantes ont t g n r es avec des spectres d'absorption et d' mission modifi s du bleu-vert, comme la prot ine fluorescente bleue ou BFP, au rouge visible. D'autres prot ines fluorescentes apparent es ont depuis t d couvertes (par exemple, chez les coraux) qui tendent galement la gamme dans la r gion rouge du spectre, comme la prot ine fluorescente rouge ou RFP. L'une des utilisations les plus simples de la GFP est celle d'une mol cule rapporteure, une sonde fluorescente pour surveiller l'expression des g nes. Un organisme transg nique peut tre fabriqu avec la s quence codant pour la GFP plac e sous le contr le transcriptionnel du promoteur appartenant un g ne d'int r t, donnant une lecture directement visible du mod le d'expression du g ne dans l'organisme vivant (Figure 9 23). Dans une autre application, un signal de localisation peptidique peut tre ajout la GFP pour la diriger vers un compartiment cellulaire particulier, tel que le r ticulum endoplasmique ou une mitochondrie, clairant ces organites afin qu'ils puissent tre observ s l' tat vivant (voir Figure 12 31). La s quence codante de l'ADN GFP peut galement tre ins r e au d but ou la fin du g ne pour une autre prot ine, produisant un produit chim rique compos de cette prot ine avec un domaine GFP attach . Dans de nombreux cas, cette prot ine de fusion GFP se comporte de la m me mani re que la prot ine d'origine, r v lant directement son emplacement et ses activit s au moyen de sa fluorescence g n tiquement cod e (Figure 9 24). Il est souvent possible de prouver que la prot ine de fusion GFP est fonctionnellement quivalente la prot ine non marqu e, par exemple en l'utilisant pour sauver un mutant d pourvu de cette prot ine. Le marquage GFP est la mani re la plus claire et la plus sans quivoque de montrer la distribution et la dynamique d'une prot ine dans un organisme vivant (Figure 9-25 et voir la vid o 16.8). Les prot ines fluorescentes sont maintenant exploit es non seulement pour voir o se trouve une prot ine particuli re dans une cellule, mais aussi pour d couvrir ses propri t s cin tiques et pour savoir si elle pourrait interagir avec d'autres mol cules. Nous allons maintenant d crire trois techniques dans lesquelles les prot ines fluorescentes sont utilis es de cette mani re. Tout d'abord, les interactions entre une prot ine et une autre peuvent tre surveill es par le transfert d' nergie de r sonance de fluorescence, galement appel nergie de r sonance de F rster Figure 9 23 Prot ine fluorescente verte (GFP) en tant que rapporteur. Pour cette exp rience, r alis e chez la mouche des fruits, le g ne gFp a t joint ( l'aide de techniques d'ADN recombinant) un promoteur de mouche qui n'est actif que dans un ensemble sp cialis de neurones. Cette image d'un embryon de mouche vivante a t captur e par un microscope fluorescence et montre environ 20 neurones, chacun avec de longues projections (axones et dendrites) qui communiquent avec d'autres cellules (non fluorescentes). Ces neurones sont situ s juste sous la surface de l'animal et lui permettent de ressentir son environnement imm diat. (D'apr s W.B. grueber et al., Curr. Biol. 13:618-626, 2003. Avec l'autorisation d'elsevier.) Figure 9 22 Prot ine fluorescente verte (GFP). la structure de gFp, repr sent e ici sch matiquement, met en vidence Les onze brins qui forment les douelles d'un tonneau. Enfoui l'int rieur du canon se trouve le chromophore actif (vert fonc ) qui se forme post-traductionnellement partir des cha nes lat rales saillantes de trois r sidus d'acides amin s. (Extrait de M. orm et al., Science 273:1392-1395, 1996. Avec l'autorisation de l'aaas.) Figure 9 24 Prot ines marqu es la GFP. Cette cellule vivante d'un plant de tabac exprime des niveaux lev s de prot ine fluorescente verte, fusionn e une prot ine cibl e sur les mitochondries, qui apparaissent donc vertes. On voit les mitochondries se regrouper autour des chloroplastes, dont l'autofluorescence de la chlorophylle les marque en rouge. (Avec l'aimable autorisation d'Olivier Grandjean.) transfert, tous deux abr g s FRET. Dans cette technique, deux mol cules d'int r t sont marqu es chacune avec un fluorochrome diff rent, choisi de mani re ce que le spectre d' mission d'un fluorochrome, le donneur, chevauche le spectre d'absorption de l'autre, l'accepteur. Si les deux prot ines se lient de mani re rapprocher leurs fluorochromes ( moins de 5 nm environ), un fluoroch
Biologie moléculaire de la cellule	rome, lorsqu'il est excit , peut transf rer de l' nergie de la lumi re absorb e directement (par r sonance, non radiative) l'autre. Ainsi, lorsque le complexe est clair la longueur d'onde d'excitation du premier fluorochrome, la lumi re fluorescente est produite la longueur d'onde d' mission du second. Cette m thode peut tre utilis e avec deux variantes spectrales diff rentes de la GFP sous forme de fluorochromes pour surveiller des processus tels que l'interaction des mol cules de signalisation avec leurs r cepteurs, ou des prot ines dans des complexes macromol culaires des endroits sp cifiques l'int rieur des cellules vivantes (Figure 9 26). Le FRET peut tre mesur en quantifiant la r duction de la fluorescence du donneur en pr sence de l'accepteur. Un deuxi me exemple de technique de marquage par fluorescence qui permet d'observer en d tail les prot ines l'int rieur des cellules consiste synth tiser une forme inactive de la mol cule fluorescente d'int r t, l'introduire dans la cellule, puis l'activer soudainement un endroit choisi de la cellule en concentrant un point de lumi re sur celle-ci. Ce processus est appel photoactivation. De nombreux pr curseurs photosensibles inactifs de ce type, souvent appel s mol cules en cage, ont t fabriqu s partir d'une vari t de mol cules fluorescentes. Un microscope peut tre utilis pour focaliser une forte impulsion de lumi re d'un laser sur n'importe quelle petite r gion de la cellule, de sorte que l'exp rimentateur puisse contr ler exactement o et quand la mol cule fluorescente est photoactiv e. La technique nous permet de suivre des processus intracellulaires complexes et rapides, tels que les actions des mol cules de signalisation ou les mouvements des prot ines du cytosquelette. Lorsqu'un marqueur fluorescent photoactivable est attach une prot ine purifi e, il est important que la prot ine modifi e reste biologiquement active : le marquage avec un colorant fluorescent en cage ajoute un groupe volumineux la surface d'une prot ine, ce qui peut facilement modifier les propri t s de la prot ine. Un protocole d' tiquetage satisfaisant est g n ralement trouv par essais et erreurs. Une fois qu'une prot ine marqu e biologiquement active a t produite, elle doit tre introduite dans la cellule vivante o son comportement peut tre suivi. La tubuline marqu e la fluoresc ine en cage, par exemple, peut tre inject e dans une cellule en division, o elle est incorpor e dans les microtubules du fuseau mitotique. Lorsqu'une petite r gion du fuseau est clair e par un laser, la tubuline Figure 9 25 Dynamique du marquage GFP. Cette s quence de micrographies montre un ensemble d'images tridimensionnelles d'un noyau vivant prises sur une p riode de 135 minutes. Les cellules de tabac ont t transform es de mani re stable avec gFp fusionn en une prot ine pissomomale concentr e dans de petits corps nucl aires appel s corps de Cajal (voir Figure 6-46). les corps fluorescents de Cajal, facilement visibles dans une cellule vivante avec la microscopie confocale, sont des structures dynamiques qui se d placent l'int rieur du noyau. (Avec l'aimable autorisation de Kurt Boudonck, Liam Dolan et Peter Shaw.) devient fluorescent, de sorte que son mouvement le long des microtubules fusiformes peut tre facilement suivi (Figure 9 27). Un d veloppement ult rieur de la photoactivation est la d couverte que les g nes codant pour la GFP et les prot ines fluorescentes apparent es peuvent tre modifi s pour produire des variantes de prot ines, g n ralement avec un ou plusieurs changements d'acides amin s, qui ne sont fluorescents que faiblement dans des conditions d'excitation normales, mais peuvent tre induits devenir fluorescents soit plus fortement, soit avec un d calage de couleur (par exemple, du vert au rouge) en les activant avec une forte impulsion de lumi re une longueur d'onde diff rente. En principe, le microscopiste peut alors suivre le local in vivo comportement de toute prot ine qui peut tre exprim e comme une fusion avec l'une de ces variantes de la GFP. Ces prot ines fluorescentes photoactivables g n tiquement cod es permettent d' tudier la dur e de vie et le comportement de n'importe quelle prot ine ind pendamment des autres prot ines nouvellement synth tis es (Figure 9-28). Une troisi me fa on d'exploiter la GFP fusionn e une prot ine d'int r t est connue sous le nom de r cup ration de fluorescence apr s photoblanchiment (FRAP). Ici, on utilise un puissant faisceau de lumi re focalis e provenant d'un laser pour teindre la fluorescence GFP dans une r gion sp cifi e de la cellule, apr s quoi on peut analyser la fa on dont les mol cules de prot ines fluorescentes non blanchies restantes se d placent dans la zone blanchie en fonction du temps. Figure 9 26 Transfert d' nergie de r sonance de fluorescence (FRET). Pour d terminer si (et quand) deux prot ines interagissent l'int rieur d'une cellule, les prot ines sont d'abord pr
Biologie moléculaire de la cellule	oduites sous forme de prot ines de fusion attach es diff rentes variantes de couleur de la prot ine fluorescente verte (gFp). (a) dans cet exemple, la prot ine X est coupl e une prot ine fluorescente bleue, qui est excit e par la lumi re violette (370-440 nm) et met de la lumi re bleue (440-480 nm) ; La prot ine Y est coupl e une prot ine fluorescente verte, qui est excit e par la lumi re bleue (440-480 nm) et met de la lumi re verte (510 nm). (B) si les prot ines X et Y n'interagissent pas, l' clairage de l' chantillon avec une lumi re violette produit une fluorescence partir de la prot ine fluorescente bleue uniquement. (C) Lorsque la prot ine X et la prot ine Y interagissent, le transfert d' nergie par r sonance, Fret, peut maintenant se produire. L' clairage de l' chantillon avec une lumi re violette excite la prot ine fluorescente bleue, qui transf re son nergie la prot ine fluorescente verte, ce qui entra ne une mission de lumi re verte. les fluorochromes doivent tre assez proches les uns des autres, environ 1 5 nm l'un de l'autre, pour que Fret se produise. tant donn que toutes les mol cules de la prot ine X et de la prot ine Y ne sont pas li es en permanence, une partie de la lumi re bleue peut encore tre d tect e. Mais lorsque les deux prot ines commencent interagir, l' mission de la prot ine fluorescente bleue donneuse diminue mesure que l' mission de l'accepteur gFp augmente. Figure 9 27 D termination du flux de microtubules dans le fuseau mitotique avec la fluoresc ine en cage li e la tubuline. un fuseau m taphasique form in vitro partir d'un extrait d' ufs de x nope a incorpor trois marqueurs fluorescents : la tubuline marqu e la rhodamine (rouge) pour marquer tous les microtubules, un colorant bleu de liaison l'ADN qui marque les chromosomes, et la tubuline marqu e la fluoresc ine en cage, qui est galement incorpor e dans tous les microtubules mais est invisible car elle n'est pas fluorescente jusqu' ce qu'elle soit activ e par la lumi re ultraviolette (UV). un faisceau de lumi re UV active, ou d cage , la tubuline marqu e la fluoresc ine en cage localement, principalement juste gauche de la plaque de m taphase. au cours des minutes suivantes, apr s 1,5 minute en (C) et apr s 2,5 minutes en (D), le signal fluoresc ine-tubuline non en cage se d place vers le p le du fuseau gauche, indiquant que la tubuline se d place continuellement vers le p le m me si le fuseau (visualis par la fluorescence de la tubuline marqu e la rhodamine rouge) reste en grande partie inchang . (D'apr s k.e. sawin et t.J. Mitchison, J. Cell Biol. 112:941-954, 1991. Avec l'autorisation de la Rockefeller University Press.) 546 Chapitre 9 : Visualisation des cellules Cette technique est g n ralement r alis e avec un microscope confocal et, comme la photoactivation, peut fournir des donn es quantitatives pr cieuses sur les param tres cin tiques d'une prot ine, tels que les coefficients de diffusion, les taux de transport actif ou les taux de liaison et de dissociation avec d'autres prot ines (Figure 9 29). Une fa on d' tudier la chimie d'une seule cellule vivante consiste ins rer l'extr mit d'une micro lectrode fine, en verre et sensible aux ions, directement l'int rieur de la cellule travers la membrane plasmique. Cette technique est utilis e pour mesurer les concentrations intracellulaires d'ions inorganiques courants, tels que H+, Na+, K+, Cl et Ca2+. Cependant, les micro lectrodes sensibles aux ions ne r v lent la concentration ionique qu'en un seul point d'une cellule, et pour un ion pr sent une tr s faible concentration, comme le Ca2+, leurs r ponses sont lentes et quelque peu erratiques. Ainsi, ces micro lectrodes ne sont pas id ales pour enregistrer les changements rapides et transitoires de la concentration de Ca2+ cytosolique qui jouent un r le important dans la r ponse des cellules aux signaux extracellulaires. De tels changements peuvent tre analys s l'aide d'indicateurs sensibles aux ions, dont l' mission lumineuse refl te la concentration locale de l'ion. Certains de ces indicateurs sont luminescents ( mettant de la lumi re spontan ment), tandis que d'autres sont fluorescents ( mettant de la lumi re lors de l'exposition la lumi re). Figure 9 28 Photoactivation. La photoactivation est l'activation induite par la lumi re d'une mol cule inerte un tat actif. dans cette exp rience, repr sent e sch matiquement en (a), une variante photoactivable de gFp est exprim e dans une cellule animale en culture. (B) Avant l'activation (temps 0 sec), peu ou pas de fluorescence gFp est d tect e dans la r gion s lectionn e (cercle rouge) lorsqu'elle est excit e par la lumi re bleue 488 nm. apr s l'activation du gFp avec une impulsion laser ultraviolette 413 nm, il devient rapidement fluorescent dans la r gion s lectionn e (vert). le mouvement de gFp, lorsqu'il se diffuse hors de cette r gion, peut tre mesur . tant donn que seules les prot ines photoac
Biologie moléculaire de la cellule	tiv es sont fluorescentes l'int rieur de la cellule, le trafic, le renouvellement et les voies de d gradation des prot ines peuvent tre surveill s. (B, d'apr s J. Lippincott-Schwartz et G.H. Patterson, Science 300:87-91, 2003.) Figure 9 29 R cup ration de la fluorescence apr s photoblanchiment (FRAP). une forte impulsion focalis e de lumi re laser teindra, ou blanchira, la fluorescence de gFp. En photoblanchissant s lectivement un ensemble de mol cules de prot ines marqu es par fluorescence dans une r gion d finie d'une cellule, le microscopiste peut surveiller la r cup ration au fil du temps, mesure que les mol cules fluorescentes restantes se d placent dans la r gion blanchie (voir vid o 10.6). (a) L'exp rience pr sent e utilise des cellules de singe en culture qui expriment la galactosyltransf rase, une enzyme qui se recycle constamment entre l'appareil de Golgi et le r ticulum endoplasmique (RE). L'appareil de Golgi dans l'une des deux cellules est photoblanchi de mani re s lective, tandis que la production de nouvelle prot ine fluorescente est bloqu e par le traitement des cellules avec du cycloheximide. La r cup ration, r sultant du d placement de mol cules enzymatiques fluorescentes du RE au Golgi, peut ensuite tre suivie sur une p riode de temps. (B) sch ma de l'exp rience illustr e en (a). (a, d'apr s J. Lippincott-schwartz, Histochem. Cell Biol. 116:97-107, 2001. Avec l'autorisation de Springer-Verlag.) seules mol cules dans le feld fuoresce vanescent Figure 9 32 La microscopie TIRF permet de d tecter des mol cules fluorescentes uniques. (a) La microscopie tirF utilise une lumi re laser excitatrice pour clairer la surface de la lamelle l'angle critique auquel toute la lumi re est r fl chie par l'interface verre-eau. Une partie de l' nergie lectromagn tique s' tend sur une courte distance travers l'interface sous la forme d'une onde vanescente qui n'excite que les mol cules qui sont attach es la lamelle ou qui sont tr s proches de sa surface. (B) La microscopie tirF est utilis e ici pour imager des mol cules individuelles de myosine-gFp (points verts) attach es des filaments d'actine non fluorescents (C), qui sont invisibles mais coll s la surface de la lamelle. (Avec l'aimable autorisation de Dmitry Cherny et Clive R. Bagshaw.) mol cule d'int r t. Ce probl me peut tre r solu par l'utilisation d'une technique optique sp ciale appel e microscopie fluorescence r flexion interne totale (TIRF). Dans un microscope TIRF, la lumi re laser brille sur la surface de la lamelle l'angle critique pr cis auquel la r flexion interne totale se produit (figures 9 32A). En raison de la r flexion interne totale, la lumi re ne p n tre pas dans l' chantillon, et la majorit des mol cules fluorescentes ne sont donc pas clair es. Cependant, l' nergie lectromagn tique s' tend, sous forme de champ vanescent, sur une tr s courte distance au-del de la surface de la lamelle et dans l' chantillon, ne permettant qu'aux mol cules de la couche la plus proche de la surface d' tre excit es. Lorsque ces mol cules deviennent fluorescentes, leur lumi re mise n'est plus en concurrence avec la lumi re floue des mol cules sus-jacentes et peut d sormais tre d tect e. TIRF a permis plusieurs exp riences spectaculaires, par exemple l'imagerie de prot ines motrices uniques se d pla ant le long de microtubules ou de filaments d'actine uniques se formant et se ramifiant. l'heure actuelle, la technique est limit e une couche mince seulement 100-200 nm de la surface de la cellule (figures 9-32B et C). Les mol cules individuelles peuvent tre touch es, imag es et d plac es l'aide de la microscopie force atomique Bien que la technologie TIRF permette de visualiser des mol cules uniques dans certaines conditions, il s'agit strictement d'une m thode d'observation passive. Afin de sonder la fonction mol culaire, il est finalement utile de pouvoir manipuler les mol cules individuelles elles-m mes, et la microscopie force atomique (AFM) fournit une m thode pour le faire. Dans un dispositif AFM, une pointe extr mement petite et pointue, souvent en silicium ou en nitrure de silicium, est fabriqu e l'aide de m thodes de nanofabrication similaires celles utilis es dans l'industrie des semi-conducteurs. L'extr mit de la sonde AFM est fix e un bras cantilever lastique mont sur un syst me de positionnement tr s pr cis qui permet de la d placer sur de tr s petites distances. En plus de cette capacit de mouvement pr cis, l'appareil AFM est capable de collecter des informations sur une vari t de forces qu'il rencontre, y compris l' lectrostatique, l' lectrostatique, l' lectrostatique, l' lectrostatique, l' lectrostatique. et les forces m caniques, qui sont ressenties par son extr mit lorsqu'il se rapproche de la surface ou la touche (figures 9 33A). Lorsque l'AFM a t d velopp , il tait con u comme une technologie d'imagerie pour mesurer l' chelle mol culaire (B) (C) 1000 800 600 400 200 0 0 100
Biologie moléculaire de la cellule	200 300 extension (nm) photodiode laser (d tecteur) d tecteur et lectronique de r troaction bras en porte- -faux lastique AFM pointe d' tirement mol cule attach e au substrat, par exemple, mica (A) 28 nm force (pN) Figure 9 33 Les mol cules uniques peuvent tre imag es et manipul es par microscopie force atomique. a) sch ma des composants cl s d'un microscope force atomique (aFM), montrant la pointe de d tection de force fix e une extr mit d'une seule mol cule de prot ine, comme dans l'exp rience d crite en (D). (B) et (C) un aFM en mode d'imagerie a cr ces images d'une seule mol cule d'ADN h t roduplex avec un dim re de prot ine Muts (r gions blanches plus grandes) li pr s de son centre, au point d'une paire de bases non appari es. Muts est la premi re prot ine qui se lie l'ADN lorsque le processus de r paration des m sappariements est initi (voir Figure 5 19). les plus petits points blancs sont des mol cules uniques de streptavidine, utilis es pour marquer les deux extr mit s de chaque mol cule d'ADN. (D) La titine est une norme mol cule prot ique qui conf re au muscle son lasticit passive (voir Figure 16-34). L'extensibilit de cette prot ine peut tre test e directement l'aide d'une prot ine courte, produite artificiellement, qui contient huit domaines d'immunoglobulines (IG) r p t s partir d'une r gion de la prot ine titin. Dans cette exp rience, la pointe de l'aFM est utilis e pour capter et tirer progressivement une seule mol cule jusqu' ce qu'elle finisse par se rompre. Au fur et mesure qu'une force est appliqu e, chaque domaine IG commence soudainement se d ployer, et la force n cessaire dans chaque cas (environ 200 PN) peut tre enregistr e. La r gion de la courbe force-extension ombr e en vert enregistre le d roulement s quentiel de chacun des huit domaines prot iques. (B et C, d'apr s Y. Jiang et p.e. Marszalek, EMBO J. 30:2881 2893, 2011. r imprim avec la permission de John Wiley & sons ; D, adapt de W.a. Linke et al., J. Struct. Biol. 137:194-205, 2002. Avec l'autorisation d'elsevier.) caract ristiques sur une surface. Lorsqu'elle est utilis e dans ce mode, la sonde est balay e sur la surface, se d pla ant de haut en bas si n cessaire pour maintenir une force d'interaction constante avec la surface, r v lant ainsi tous les objets tels que les prot ines ou d'autres mol cules qui pourraient tre pr sents sur la surface autrement plane (Figure 9 33B et C). Cependant, l'AFM ne se limite pas l'imagerie des surfaces et peut galement tre utilis pour ramasser et d placer des mol cules uniques qui s'adsorbent fortement vers la pointe. Gr ce cette technologie, les propri t s m caniques de mol cules de prot ines individuelles peuvent tre mesur es en d tail. Par exemple, l'AFM a t utilis pour d plier une seule mol cule de prot ine afin de mesurer l' nergie du repliement de domaine (Figure 9 33 D). Les variations de la microscopie optique que nous avons d crites jusqu' pr sent sont toutes limit es par la limite de diffraction classique la r solution d crite pr c demment ; c'est- -dire environ 200 nm (voir Figure 9 6). Pourtant, de nombreuses structures cellulaires, des pores nucl aires aux nucl osomes et aux fosses recouvertes de clathrine, sont beaucoup plus petites que cela et sont donc insolubles par la microscopie optique conventionnelle. Cependant, plusieurs approches sont maintenant disponibles qui contournent la limite impos e par la diffraction de la lumi re et permettent d'imager et de r soudre clairement des objets aussi petits que 20 nm : une am lioration remarquable d'un ordre de grandeur. La premi re de ces approches dites de superr solution, la microscopie illumination structur e (SIM), est une m thode d'imagerie par fluorescence avec une r solution d'environ 100 nm, soit deux fois la r solution de la microscopie conventionnelle en fond clair et confocale. La carte SIM d passe la limite de diffraction en utilisant un motif de lumi re r p ou structur pour clairer l' chantillon. La configuration physique et le fonctionnement du microscope sont assez complexes, mais le principe g n ral peut tre consid r comme similaire la cr ation d'un motif moir , un motif d'interf rence cr en superposant deux grilles avec des angles ou des tailles de maille diff rents (Figure 9-34). De la m me mani re que pour la cr ation d'un motif moir , la grille d' clairage et les caract ristiques de l' chantillon se combinent en un motif d'interf rence, partir duquel les contributions originales haute r solution l'image des caract ristiques au-del de la limite de r solution classique peuvent tre calcul es. L' clairage par une grille signifie que les parties de l' chantillon dans les bandes sombres de la grille ne sont pas clair es et ne sont donc pas imag es, de sorte que l'imagerie est r p t e plusieurs fois (g n ralement trois) apr s avoir translat la grille travers une fraction de l'espacement de la grille entre chaque image. Comme l'effet d'interf r
Biologie moléculaire de la cellule	ence est le plus fort pour les composants d'image proches de la direction des barres de la grille, l'ensemble du processus est r p t avec le motif de la grille tourn sur une s rie d'angles pour obtenir une am lioration quivalente dans toutes les directions. Enfin, la combinaison math matique de toutes ces images s par es par ordinateur cr e une image de superr solution am lior e. La carte SIM est polyvalente car elle peut tre utilis e avec n'importe quel fluorescent colorant ou prot ine, et la combinaison d'images SIM captur es des plans focaux cons cutifs peut cr er des ensembles de donn es tridimensionnels (Figure 9 35). Figure 9 34 Microscopie clairage structur . Le principe, illustr ici, est d' clairer un chantillon avec une lumi re motifs et de mesurer le motif moir . sont repr sent s (a) le motif d'une structure inconnue et (B) un motif connu. (C) Lorsque ceux-ci sont combin s, le motif moir r sultant contient plus d'informations que ce qui est facilement visible dans (a), le motif original. si le motif connu (B) a des fr quences spatiales plus lev es, il en r sultera une meilleure r solution. Cependant, comme les motifs spatiaux qui peuvent tre cr s optiquement sont galement limit s par la diffraction, siM ne peut am liorer la r solution que d'environ un facteur deux. (D'apr s B.o. Leung et k.C. Chou, Appl. Spectrosc. 65:967-980, 2011.) Figure 9 35 La microscopie clairage structur peut tre utilis e pour cr er des donn es tridimensionnelles. Ces projections tridimensionnelles des chromosomes m iotiques au pachyt ne dans une cellule de ma s montrent les l ments lat raux appari s des complexes synapton miques. (a) L'ensemble chromosomique a t color avec un anticorps fluorescent contre la coh sine et est observ ici par microscopie fluorescence conventionnelle. Comme la distance entre les deux l ments lat raux est d'environ 200 nm, la limite de diffraction, les deux l ments lat raux qui composent chaque complexe ne sont pas r solus. (B) dans l'image siM tridimensionnelle, la r solution am lior e permet chaque l ment lat ral, d'environ 100 nm de diam tre, d' tre clairement r solu, et les deux chromosomes peuvent tre clairement vus s'enrouler l'un autour de l'autre. (C) Parce que l'ensemble complet des donn es tridimensionnelles pour l'ensemble du noyau est disponible, le chemin de chaque paire de chromosomes distincte peut tre trac et attribu artificiellement une couleur diff rente. (Avec l'aimable autorisation de C.J. Rachel Wang, Peter Carlton et Zacheus Cande.) se rapproche d'une distribution gaussienne, dont la largeur la moiti de la hauteur maximale dans des conditions id ales est d'environ 200 nm. (C) deux sources ponctuelles distantes d'environ 200 nm Pour contourner la limite de diffraction, les deux autres techniques de superr solution exploitent des aspects de la fonction d' talement des points, une propri t du syst me optique mentionn e pr c demment. La fonction d' talement du point est la distribution de l'intensit lumineuse dans l'image tridimensionnelle et floue qui se forme lorsqu'une seule source ponctuelle de lumi re est mise au point l'aide d'un objectif. Au lieu d' tre identique la source ponctuelle, l'image a une distribution d'intensit qui est approximativement d crite par une distribution gaussienne, qui son tour d termine la r solution du syst me de lentille (Figure 9 36). Deux points qui sont plus proches que la largeur la moiti de la hauteur maximale de cette distribution deviendront difficiles r soudre parce que leurs images se chevauchent trop (voir Figure 9 36C). En microscopie fluorescence, la lumi re d'excitation est focalis e sur un point de l' chantillon par la lentille de l'objectif, qui capture ensuite les photons mis par toute mol cule fluorescente que le faisceau a lev e d'un tat fondamental un tat excit . tant donn que le point d'excitation est flou en fonction de la fonction d' talement du point, les mol cules fluorescentes qui sont plus proches d'environ 200 nm seront imag es comme un seul point flou. Une approche pour augmenter la r solution consiste ramener toutes les mol cules fluorescentes la p riph rie du point d'excitation flou leur tat fondamental, ou un tat o elles ne sont plus fluorescentes de mani re normale, ne laissant que celles au centre m me enregistrer. Cela peut tre fait en pratique en ajoutant un deuxi me faisceau laser tr s brillant qui s'enroule autour du faisceau d'excitation comme un tore. La longueur d'onde et l'intensit de ce deuxi me faisceau sont ajust es de mani re d sactiver les mol cules fluorescentes partout, sauf au centre m me de la fonction d' talement du point, une r gion qui peut tre aussi petite que 20 nm de diam tre (Figure 9-37). Les sondes fluorescentes utilis es doivent appartenir une classe sp ciale photocommutables : leur mission peut tre activ e et d sactiv e de mani re r versible avec des lumi res de diff rentes longueurs d'onde. Au
Biologie moléculaire de la cellule	fur et mesure que l' chantillon est scann avec cet arrangement de lasers, les mol cules fluorescentes sont activ es et d sactiv es, et la fonction d' talement de petits points chaque endroit est enregistr e. La limite de diffraction est d pass e parce que la technique garantit que des mol cules similaires mais tr s rapproch es sont dans l'un des deux tats diff rents, soit fluorescent, soit sombre. Cette approche est appel e STED (microscopie d pl tion par mission stimul e) et divers microscopes utilisant des versions de la m thode g n rale sont maintenant largement utilis s. Des r solutions de 20 nm ont t atteintes en des chantillons biologiques, et une r solution encore plus lev e obtenue avec des chantillons non biologiques (voir figure 9-37). Si une seule mol cule fluorescente est imag e, elle appara t comme un disque flou circulaire, mais si suffisamment de photons ont contribu cette image, le centre math matique pr cis de l'image en forme de disque peut tre d termin tr s pr cis ment, souvent quelques nanom tres pr s. Mais le probl me avec un sp cimen qui contient un grand nombre Figure 9 37 La microscopie superr solution peut tre obtenue en r duisant la taille de la fonction d' talement des points. a) la taille d'un faisceau focalis normal de lumi re excitatrice. (B) un faisceau laser superpos extr mement puissant, une longueur d'onde diff rente et en forme de tore, appauvrit la fluorescence mise partout dans l' chantillon, sauf au centre du faisceau, r duisant la largeur effective de la fonction d' talement du point (C). au fur et mesure que l' chantillon est scann , cette fonction de petit talement de points peut alors construire une image nette dans un processus appel steD (microscopie d pl tion par mission stimul e). (D) v sicules synaptiques dans des neurones vivants cultiv s, marqu es par fluorescence et imag es par microscopie confocale ordinaire, avec une r solution de 260 nm. (e) les m mes v sicules imag es par steD, avec une r solution de 60 nm, ce qui permet de r soudre des v sicules uniques. (F) Usines de r plication marqu es par fluorescence dans le noyau d'une cellule cultiv e, imag es par microscopie confocale ordinaire. (g) les m mes usines de r plication imag es par steD. Des sites de r plication uniques et discrets peuvent tre r solus par steD qui ne peuvent pas tre vus dans l'image confocale. (a, B et C, d'apr s g. Donnert et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 103:11440 11445, 2006. Avec l'autorisation de l'acad mie nationale des sciences ; D et e, d'apr s V. Westphal et al., Science 320:246-249, 2008. Avec l'autorisation de l'aaas ; F et g, de Z. Cseresnyes, U. schwarz et C.M. green, BMC Cell Biol. 10:88, 2009.) des mol cules fluorescentes adjacentes, comme nous l'avons vu pr c demment, c'est qu'elles contribuent chacune l'image des fonctions d' talement de points floues et chevauchantes, ce qui rend la position exacte d'une mol cule impossible r soudre. Une autre fa on de contourner cette limitation est de faire en sorte que seules quelques mol cules clairement s par es deviennent activement fluorescentes un moment donn . La position exacte de chacun d'entre eux peut ensuite tre calcul e, avant d'examiner les ensembles suivants de mol cules. En pratique, cela peut tre r alis en utilisant des lasers pour commuter s quentiellement un sous-ensemble clairsem de mol cules fluorescentes dans un chantillon contenant des marqueurs fluorescents photoactivables ou photocommutables. Les marqueurs sont activ s, par exemple, par l' clairage avec une lumi re proche ultraviolette, qui modifie un petit sous-ensemble de mol cules de sorte qu'elles deviennent fluorescentes lorsqu'elles sont expos es un faisceau d'excitation une autre longueur d'onde. Ceux-ci sont ensuite imag s avant que le blanchiment n' teigne leur fluorescence et qu'un nouveau sous-ensemble ne soit activ . Chaque mol cule met quelques milliers de photons en r ponse l'excitation avant de s' teindre, et le processus de commutation peut tre r p t des centaines, voire des milliers de fois, ce qui permet de d terminer les coordonn es exactes d'un tr s grand nombre de mol cules uniques. L'ensemble complet peut tre combin et affich num riquement sous la forme d'une image dans laquelle l'emplacement calcul de chaque mol cule individuelle est exactement marqu (Figure 9 38). Cette classe de m thodes a t diversement appel e microscopie de localisation photoactiv e (PALM) ou microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM). En d sactivant et en rallumant s quentiellement les fluorophores dans diff rentes r gions de l' chantillon en fonction du temps, toutes les m thodes d'imagerie superr solution d crites ci-dessus permettent la r solution de mol cules beaucoup plus proches les unes des autres que la limite de diffraction de 200 nm. Dans STED, les emplacements des mol cules sont d termin s l'aide de m thodes optiques pour d finir exactement o leur fluorescenc
Biologie moléculaire de la cellule	e sera activ e ou d sactiv e. Dans PALM et STORM, des mol cules fluorescentes individuelles sont activ es et d sactiv es de mani re al atoire sur une p riode de temps, ce qui permet de d terminer avec pr cision leurs positions. Les techniques PALM et STORM ont d pendu des 100 photons 1000 photons 10 000 photons Les cycles successifs d'activation et de blanchiment permettent de d tecter des mol cules fuorescentes uniques bien s par es Le centre exact de chaque mol cule fuorescente est d termin et sa position ajout e la carte (C)une image super-r solution de la structure fuorescente est construite au fur et mesure que les positions de petits groupes successifs de mol cules de 1 m sont ajout es la carte Figure 9 38 Les mol cules fluorescentes uniques peuvent tre localis es avec une grande pr cision. a) D termination de l'exactitude Le centre math matique de l'image floue d'une seule mol cule fluorescente devient plus pr cis mesure que les photons contribuent l'image finale. La fonction d' talement du point d crite dans le texte dicte que la taille de l'image mol culaire est d'environ 200 NM de diam tre, mais dans les chantillons tr s brillants, la position de son centre peut tre localis e un nanom tre pr s. (B) dans ce sp cimen imaginaire, des sous-ensembles clairsem s de mol cules fluorescentes sont bri vement allum s individuellement, puis blanchis. Les positions exactes de toutes ces mol cules bien espac es peuvent tre progressivement construites en une image superr solution. (C) dans cette partie d'une cellule, les microtubules ont t marqu s par fluorescence et imag s en haut dans un microscope tirF (voir figure 9-32) et en dessous, superr solution, dans un microscope paLM. Le diam tre des microtubules dans le panneau inf rieur ressemble maintenant leur taille r elle, environ 25 nm, plut t qu'aux 250 nm de l'image floue en haut. (a, d'apr s a.L. Mcevoy et al., BMC Biol. 8:106, 2010 ; C, avec l'aimable autorisation de Carl Zeiss Ltd.) D veloppement de nouvelles sondes fluorescentes qui pr sentent le comportement de commutation appropri . Toutes ces m thodes sont aujourd'hui tendues pour int grer l'imagerie multicolore, l'imagerie tridimensionnelle (Figure 9-39) et l'imagerie de cellules vivantes en temps r el. La fin du long r gne de la limite de diffraction a certainement revigor la microscopie optique et sa place dans la recherche en biologie cellulaire. De nombreuses techniques de microscope optique sont disponibles pour l'observation des cellules. Les cellules qui ont t fix es et color es peuvent tre tudi es dans un microscope optique conventionnel, tandis que les anticorps coupl s des colorants fluorescents peuvent tre utilis s pour localiser des mol cules sp cifiques dans les cellules dans un microscope fluorescence. Les cellules vivantes peuvent tre observ es l'aide de microscopes contraste de phase, contraste diff rentiel, fond noir ou fond clair. Toutes les formes de microscopie optique sont facilit es par des techniques de traitement d'images num riques, qui am liorent la sensibilit et affinent l'image. La microscopie confocale et la d convolution d'image fournissent toutes deux des sections optiques minces et peuvent tre utilis es pour reconstruire des images tridimensionnelles. Des techniques sont maintenant disponibles pour d tecter, mesurer et suivre presque n'importe quelle mol cule souhait e dans une cellule vivante. Des colorants indicateurs fluorescents peuvent tre introduits pour mesurer les concentrations d'ions sp cifiques dans des cellules individuelles ou dans diff rentes parties d'une cellule. Pratiquement n'importe quelle prot ine d'int r t peut tre g n tiquement modifi e en tant que prot ine de fusion fluorescente, puis imag e dans des cellules vivantes par microscopie fluorescence. Le comportement dynamique et les interactions de nombreuses mol cules peuvent tre suivis dans les cellules vivantes par des variations sur l'utilisation de marqueurs prot iques fluorescents, dans certains cas au niveau de mol cules uniques. Diverses techniques de superr solution permettent de contourner la limite de diffraction et de r soudre des mol cules s par es par des distances aussi petites que 20 nm. Regard sur les CeLL et les MoLeCULes dans l'eLeCtron MiCrosCope La microscopie optique est limit e dans la finesse des d tails qu'elle peut r v ler. Les microscopes utilisant d'autres types de rayonnement, en particulier les microscopes lectroniques, peuvent r soudre des structures beaucoup plus petites que ce qui est possible avec la lumi re visible. Cette r solution plus lev e a un co t : la pr paration de l' chantillon pour la microscopie lectronique est complexe et il est plus difficile d' tre s r que ce que nous voyons dans l'image correspond pr cis ment la structure vivante d'origine. Il est cependant possible d'utiliser une cong lation tr s rapide pour conserver fid lement les structures pour la microscopie lectronique. L'analy
Biologie moléculaire de la cellule	se d'images num riques peut tre utilis e pour reconstruire des objets tridimensionnels en combinant des informations provenant soit de plusieurs particules individuelles, soit de plusieurs vues inclin es d'un seul objet. Ensemble, ces approches tendent la r solution et la port e de la microscopie lectronique au point o nous pouvons imager fid lement les structures des macromol cules individuelles et les complexes qu'elles forment. le microscope lectronique r sout la structure fine de la cellule La relation formelle entre la limite de diffraction la r solution et la longueur d'onde du rayonnement clairant (voir Figure 9-6) est vraie pour toute forme de rayonnement, qu'il s'agisse d'un faisceau de lumi re ou d'un faisceau d' lectrons. Avec les lectrons, cependant, la limite de r solution est tr s faible. La longueur d'onde d'un lectron diminue mesure que sa vitesse augmente. Dans un microscope lectronique avec une tension d'acc l ration de 100 000 V, la longueur d'onde d'un lectron est de 0,004 nm. En th orie, la r solution d'un tel microscope devrait tre d'environ 0,002 nm, soit 100 000 fois celle du microscope optique. Cependant, comme les aberrations d'une lentille lectronique sont beaucoup plus difficiles corriger que celles d'une lentille en verre, le pouvoir de r solution pratique de Les microscopes lectroniques modernes, m me avec un traitement d'image minutieux pour corriger les aberrations de l'objectif, sont d'environ 0,05 nm (0,5 ) (Figure 9 40). En effet, seul le centre m me des lentilles lectroniques peut tre utilis et l'ouverture num rique effective est minuscule. De plus, les probl mes de pr paration des chantillons, de contraste et d'endommagement par les radiations ont g n ralement limit la r solution effective normale des objets biologiques 1 nm (10 ). C'est n anmoins environ 200 fois mieux que la r solution du microscope optique. De plus, les performances des microscopes lectroniques sont am lior es par des sources d' clairage lectronique appel es canons mission de champ. Ces sources tr s lumineuses et coh rentes am liorent consid rablement la r solution obtenue. Dans sa conception g n rale, le microscope lectronique transmission (TEM) est similaire un microscope optique, bien qu'il soit beaucoup plus grand et l'envers (Figure 9 41). 0,14 nm Figure 9 40 La r solution du microscope lectronique. Cette micrographie lectronique transmission d'une monocouche de graph ne r sout les atomes de carbone individuels sous forme de points brillants dans un r seau hexagonal. Le graph ne est un plan atomique isol du graphite et constitue la base des nanotubes de carbone. la distance entre les atomes de carbone li s adjacents est de 0,14 nm (1,4 ). une telle r solution ne peut tre obtenue qu' l'aide d'un microscope lectronique transmission sp cialement con u dans lequel toutes les aberrations de l'objectif sont soigneusement corrig es, et avec des chantillons optimaux ; Il ne peut pas tre r alis avec la plupart des chantillons biologiques conventionnels. (D'apr s a. Dato et al., Chem. Commun. 40:6095 6097, 2009. Avec l'autorisation de la soci t royale de chimie.) La source d' clairage est un filament ou une cathode qui met des lectrons au sommet d'une colonne cylindrique d'environ 2 m de haut. tant donn que les lectrons sont dispers s par des collisions avec les mol cules d'air, l'air doit d'abord tre pomp hors de la colonne pour cr er un vide. Les lectrons sont ensuite acc l r s du filament par une anode voisine et autoris s passer travers un minuscule trou pour former un faisceau d' lectrons qui se d place le long de la colonne. Des bobines magn tiques plac es intervalles le long de la colonne focalisent le faisceau d' lectrons, tout comme les lentilles de verre focalisent la lumi re dans un microscope optique. L' chantillon est plac dans le vide, travers un sas, dans la trajectoire du faisceau d' lectrons. Comme en microscopie optique, l' chantillon est g n ralement color , dans ce cas, avec un mat riau dense en lectrons. Une partie des lectrons traversant l' chantillon est dispers e par des structures color es avec le mat riau forte densit d' lectrons ; Les autres sont focalis s pour former une image, d'une mani re analogue la fa on dont une image est form e dans un microscope optique. L'image peut tre observ e sur un cran phosphorescent ou enregistr e avec un appareil photo num rique haute r solution. Parce que les lectrons diffus s sont perdus du faisceau, les r gions denses de l' chantillon apparaissent dans l'image comme des zones de flux d' lectrons r duit, qui semblent sombres. Dans les premiers jours de son application aux mat riaux biologiques, le microscope lectronique a r v l de nombreuses structures jusqu'alors inimaginables dans les cellules. Mais avant que ces d couvertes ne puissent tre faites, les microscopistes lectroniques ont d mettre au point de nouvelles proc dures pour int grer, coup
Biologie moléculaire de la cellule	er et colorer les tissus. tant donn que l' chantillon est expos un vide tr s pouss au microscope lectronique, les tissus vivants sont g n ralement tu s et pr serv s par fixation, d'abord avec du glutarald hyde, qui r ticule-t-il de mani re covalente les mol cules de prot ines avec leurs voisines, puis avec du t troxyde d'osmium, qui se lie aux bicouches lipidiques et aux prot ines et les stabilise (Figure 9-42). Parce que les lectrons ont un pouvoir de p n tration tr s limit , les tissus fix s doivent normalement tre coup s en sections extr mement minces (25 100 nm d' paisseur, environ 1/200 de l' paisseur d'une seule cellule) avant d' tre observ s. Ceci est r alis en d shydratant l' chantillon, en le impr gnant d'une r sine monom re qui polym rise pour former un bloc solide de plastique, puis en coupant le bloc avec un couteau en verre fin ou en diamant sur un microtome sp cial. Les sections minces r sultantes, exemptes d'eau et d'autres solvants volatils, sont support es sur une petite grille m tallique pour tre observ es au microscope (Figure 9 43). Figure 9 41 Les principales caract ristiques d'un microscope optique et d'un microscope lectronique transmission. Ces dessins mettent l'accent sur les similitudes de la conception globale. Alors que les lentilles du microscope optique sont en verre, celles du microscope lectronique sont des bobines magn tiques. Le microscope lectronique n cessite que l' chantillon soit plac dans le vide. L'encart montre un microscope lectronique transmission en cours d'utilisation. (photographie avec l'aimable autorisation de JeoL Ltd.)Figure 9 42 Deux fixateurs chimiques couramment utilis s pour la microscopie lectronique. Les deux groupes ald hydes r actifs du glutarald hyde lui permettent de r ticuler divers types de mol cules, formant des liaisons covalentes entre elles. Le t troxyde d'osmium forme des complexes r ticul s avec de nombreux compos s organiques et, ce faisant, devient r duit. cette r action est particuli rement utile pour fixer les membranes cellulaires, car les doubles liaisons C=C pr sentes dans de nombreux acides gras r agissent avec le t troxyde d'osmium. Les tapes n cessaires la pr paration du mat riel biologique pour la microscopie lectronique sont difficiles. Comment pouvons-nous tre s rs que l'image de l' chantillon fix , d shydrat et incrust de r sine a un rapport avec le syst me biologique d licat et aqueux pr sent dans la cellule vivante ? Les meilleures approches actuelles de ce probl me d pendent de la cong lation rapide. Si un syst me aqueux est refroidi assez rapidement et une temp rature suffisamment basse, l'eau et les autres composants qu'il contient n'ont pas le temps de se r organiser ou de cristalliser en glace. Au lieu de cela, l'eau est surfondue dans un tat rigide mais non cristallin un verre appel glace vitreuse. Cet tat peut tre obtenu en claquant l' chantillon sur un bloc de cuivre poli refroidi par de l'h lium liquide, en le plongeant ou en le pulv risant avec un jet d'un liquide de refroidissement tel que le propane liquide, ou en le refroidissant haute pression. Certains chantillons rapidement congel s peuvent tre examin s directement au microscope lectronique l'aide d'un porte- chantillon sp cialement refroidi. Dans d'autres cas, le bloc gel peut tre fractur pour r v ler les surfaces int rieures des cellules, ou la glace environnante peut tre sublim e pour exposer les surfaces externes. Cependant, nous voulons souvent examiner les lames minces. Un compromis consiste donc congeler rapidement le tissu, remplacer l'eau par des solvants organiques, enrober le tissu dans de la r sine plastique, et enfin couper des sections et colorer. Bien que techniquement encore difficile, cette approche stabilise et pr serve le tissu dans un tat tr s proche de son tat de vie d'origine (Figure 9 44). La clart de l'image dans une micrographie lectronique d pend de la pr sence d'une gamme de densit s lectroniques contrast es dans l' chantillon. La densit lectronique d pend son tour du num ro atomique des atomes pr sents : plus le num ro atomique est lev , plus les lectrons sont dispers s et plus cette partie de l'image est sombre. Les tissus biologiques sont compos s principalement d'atomes de tr s faible num ro atomique (principalement du carbone, de l'oxyg ne, de l'azote et de l'hydrog ne). Pour les rendre visibles, les tissus sont g n ralement impr gn s (avant ou apr s la section) avec les sels de m taux lourds tels que l'uranium, le plomb et l'osmium. Le degr d'impr gnation, ou coloration , avec ces sels variera pour diff rents constituants cellulaires. Les lipides, par exemple, ont tendance se colorer en noir apr s la fixation de l'osmium, r v lant l'emplacement des membranes cellulaires. Nous avons vu comment les anticorps peuvent tre utilis s en conjonction avec la microscopie fluorescence pour localiser des macromol cules sp cifiques. Une m thode an
Biologie moléculaire de la cellule	alogue : une grille en cuivre immunogold recouverte de carbone et/ou de plastique Figure 9 43 Grille m tallique qui supporte les sections minces d'un chantillon dans un microscope lectronique transmission. Figure 9 44 Coupe mince d'une cellule. Cette fine section est celle d'une cellule de levure qui a t tr s rapidement congel e et la glace vitreuse remplac e par des solvants organiques puis par de la r sine plastique. Le noyau, les mitochondries, la paroi cellulaire, les empilements de Golgi et les ribosomes peuvent tous tre facilement vus dans un tat pr sum aussi r aliste que possible. (Avec l'aimable autorisation d'andrew staehelin.) Microscopie lectronique de 0,5 m : peut tre utilis e au microscope lectronique. La proc dure habituelle consiste incuber une section mince d'abord avec un anticorps primaire sp cifique, puis avec un anticorps secondaire auquel une particule d'or collo dale a t attach e. La particule d'or est dense en lectrons et peut tre vue comme un point noir au microscope lectronique (Figure 9-45). Diff rents anticorps peuvent tre conjugu s des particules d'or de diff rentes tailles, de sorte que plusieurs prot ines peuvent tre localis es dans un seul chantillon. Une complication pour le marquage immuno-or est que les anticorps et les particules d'or collo dal ne p n trent pas dans la r sine utilis e pour l'enrobage ; Par cons quent, ils d tectent les antig nes uniquement la surface de la section. Ceci signifie que la sensibilit de la m thode est faible, car les mol cules d'antig ne dans les parties les plus profondes de la section ne sont pas d tect es. De plus, nous pouvons avoir une fausse impression quant aux structures qui contiennent l'antig ne et celles qui ne le contiennent pas. Une solution consiste tiqueter l' chantillon avant de l'int grer dans du plastique, lorsque les cellules et les tissus sont encore enti rement accessibles aux r actifs de marquage. Les particules d'or extr mement petites, d'environ 1 nm de diam tre, fonctionnent le mieux pour cette proc dure. De telles petites particules d'or ne sont g n ralement pas facilement visibles dans les sections finales, de sorte que de l'argent ou de l'or suppl mentaire est nucl autour des minuscules particules d'or de 1 nm dans un processus chimique tr s similaire au d veloppement photographique. Diff rentes vues d'un m me objet peuvent tre combin es pour donner une reconstruction tridimensionnelle Les sections minces ne parviennent souvent pas transmettre l'arrangement tridimensionnel des composants cellulaires observ s dans un MET, et l'image peut tre tr s trompeuse : une structure lin aire telle qu'un microtubule peut appara tre en coupe comme un objet ponctuel, par exemple, et une coupe travers les parties saillantes d'un seul corps solide de forme irr guli re peut donner l'apparence de deux ou plusieurs objets s par s (Figure 9-46). La troisi me dimension peut tre reconstruite partir de coupes en s rie, mais il s'agit d'un processus long et fastidieux. Cependant, m me les sections minces ont une profondeur significative par rapport la r solution du microscope lectronique, de sorte que l'image TEM peut galement tre trompeuse de mani re oppos e, par la superposition d'objets qui se trouvent des profondeurs diff rentes. Figure 9 45 Localisation des prot ines en microscopie lectronique. La microscopie lectronique ImmunoGold est utilis e ici pour trouver l'emplacement sp cifique de quatre composants prot iques diff rents dans le corps du p le fusiforme de la levure. En haut se trouve une mince section d'un fuseau mitotique de levure montrant les microtubules du fuseau qui traversent le noyau et se connectent chaque extr mit aux corps polaires du fuseau int gr s dans l'enveloppe nucl aire. Un sch ma des composants d'un corps de p le broche unique est pr sent ci-dessous. Sur des sections s par es, des anticorps dirig s contre quatre prot ines diff rentes du corps du p le fusiforme sont utilis s, ainsi que des particules d'or collo dal (points noirs), pour r v ler o se trouve chaque prot ine dans la structure complexe. (Avec l'aimable autorisation de John Kilmartin.) En raison de la grande profondeur de champ des microscopes lectroniques, toutes les parties de l' chantillon tridimensionnel sont nettes, et l'image r sultante est une projection (une superposition de couches) de la structure le long de la direction de visualisation. L'information perdue dans la troisi me dimension peut tre r cup r e si nous avons des vues du m me sp cimen dans de nombreuses directions diff rentes. Les m thodes de calcul de cette technique sont largement utilis es dans les tomodensitogrammes m dicaux. Lors d'une tomodensitom trie, l' quipement d'imagerie est d plac autour du patient pour g n rer les diff rentes vues. Dans la tomographie au microscope lectronique (EM), le support de l' chantillon est inclin dans le microscope, ce qui permet d'obtenir le m me r sultat. De cette fa on
Biologie moléculaire de la cellule	, nous pouvons arriver une reconstruction tridimensionnelle, dans une orientation standard choisie, en combinant diff rentes vues d'un seul objet. Chaque vue individuelle sera tr s bruyante, mais en les combinant en trois dimensions et en prenant une moyenne, le bruit peut tre largement limin . partir de sections plastiques paisses de mat riau incrust , les reconstructions tridimensionnelles, ou tomogrammes, sont largement utilis es pour d crire l'anatomie d taill e de r gions sp cifiques de la cellule, telles que l'appareil de Golgi (Figure 9-47) ou le cytosquelette. De plus en plus, les microscopistes appliquent galement la tomographie EM des coupes congel es et hydrat es non color es, et m me des cellules enti res ou des organites rapidement congel s (Figure 9-48). La microscopie lectronique fournit d sormais un pont robuste entre l' chelle de la mol cule unique et celle de la cellule enti re. images de surfaces Peut tre obtenue par microscopie lectronique balayage Un microscope lectronique balayage (MEB) produit directement une image de la structure tridimensionnelle de la surface d'un chantillon. Le MEB est g n ralement plus petit, plus simple et moins cher qu'un microscope lectronique transmission. Alors que le TEM utilise les lectrons qui ont travers l' chantillon pour former un Figure 9 46 Une reconstruction tridimensionnelle partir de coupes en s rie.Des coupes minces simples au microscope lectronique donnent parfois des impressions trompeuses. Dans cet exemple, la plupart des coupes travers une cellule contenant une mitochondrie ramifi e semblent contenir deux ou trois mitochondries distinctes (comparer Figure 9-44). De plus, les sections 4 et 7 pourraient tre interpr t es comme montrant une mitochondrie en train de se diviser. La v ritable forme tridimensionnelle peut tre reconstruite partir d'un ensemble complet de sections en s rie. Figure 9 47 Tomographie au microscope lectronique (EM). Les chantillons qui ont t rapidement congel s, puis congel s et noy s dans du plastique, conservent leur structure dans un tat tr s proche de leur tat de vie d'origine (film 9.2). Cet exemple montre la structure tridimensionnelle de l'appareil de Golgi partir d'une cellule r nale de rat. Plusieurs sections paisses (250 nm) de la cellule ont t inclin es dans un microscope lectronique haute tension, le long de deux axes diff rents, et environ 160 vues diff rentes ont t enregistr es. Les donn es num riques permettent de visualiser des tranches minces individuelles de l'ensemble complet de donn es tridimensionnelles, ou tomogramme ; par exemple, les tranches en s rie, d'une paisseur de seulement 4 nm chacune, sont illustr es en (a) et (B). Tr s peu de choses changent d'une coupe l'autre, mais en utilisant l'ensemble des donn es et en codant manuellement les membranes (B), on peut obtenir une reconstruction tridimensionnelle compl te, une r solution d'environ 7 nm, du complexe de Golgi complet et de ses v sicules associ es (C). (D'apr s M.s. Ladinsky et al., J.Cell Biol. 144:1135 1149, 1999. Avec la permission des auteurs.) Regard sur les CeLL et les MoLeCULes dans l'eLeCtron MiCrosCope Figure 9 48 Combinaison de la tomographie cryo lectronmicroscope et de la reconstruction particule unique. De petits sp cimens non fix s et rapidement congel s peuvent tre examin s alors qu'ils sont encore congel s. dans cet exemple, les petits noyaux de l'amibe Dictyostelium ont t doucement isol s puis tr s rapidement gel s avant qu'une s rie de vues inclin es ne soient enregistr es l'aide d'une platine de microscope inclinable. ces vues num riques sont combin es par des tomographes eM pour produire un tomogramme tridimensionnel. Deux fines coupes num riques (10 nm) travers ce tomogramme montrent (A) des vues de dessus et (B) des vues lat rales de pores nucl aires individuels (fl ches blanches). (C) dans le mod le tridimensionnel, on voit un rendu de surface des pores (bleu) int gr dans l'enveloppe nucl aire (jaune). partir d'une s rie de tomogrammes, il a t possible d'extraire des ensembles de donn es pour pr s de 300 pores nucl aires distincts, dont les structures ont ensuite pu tre moyenn es l'aide de techniques de reconstruction particule unique. la vue en surface de l'un de ces pores reconstruits est montr e (D) partir de la face nucl aire et (e) en (E) section efficace de 50 nm (comparer avec la figure 12-8). Le complexe de pores est de couleur bleue et le panier nucl aire brun. (D'apr s l'image de M. Beck, le MEB utilise des lectrons qui sont diffus s ou mis par le sp cimen et al., Science 306:1387 1390, 2004. Avec l'autorisation de l'aaas.) Surface. L' chantillon examiner est fix , s ch et recouvert d'une fine couche de m tal lourd. Alternativement, il peut tre rapidement congel , puis transf r dans un tage d' chantillon refroidi pour un examen direct au microscope. Souvent, une partie enti re d'une plante ou un petit animal peut tre
Biologie moléculaire de la cellule	plac au microscope avec tr s peu de pr paration (Figure 9 49). L' chantillon est balay avec un faisceau tr s troit d' lectrons. La quantit d' lectrons diffus s ou mis lorsque ce faisceau primaire bombarde chaque point successif de la surface m tallique est mesur e et utilis e pour contr ler l'intensit d'un second faisceau, qui se d place en synchronisation avec le faisceau primaire et forme une image sur un cran d'ordinateur. Finalement, une image tr s agrandie de la surface dans son ensemble est construite (Figure 9 50). La technique MEB offre une grande profondeur de champ ; de plus, comme la quantit de diffusion des lectrons d pend de l'angle de la surface par rapport au faisceau, l'image pr sente des hautes lumi res et des ombres qui lui donnent un aspect tridimensionnel (voir Figure 9-49 et Figure 9-51). Cependant, seules les caract ristiques de surface peuvent tre examin es, et dans la plupart des formes de MEB, la r solution atteignable n'est pas tr s lev e (environ 10 nm, avec un grossissement effectif allant jusqu' 20 000 fois). Par cons quent, la technique est g n ralement utilis e pour tudier des cellules et des tissus entiers plut t que des organites subcellulaires (voir la vid o 21.3). Des MEB tr s haute r solution ont cependant t d velopp s avec un canon d' mission champ coh rent brillant comme source d' lectrons. Ce type de MEB peut produire des images qui rivalisent avec la r solution possible avec un MET (Figure 9 52). La coloration n gative et la cryomicroscopie lectronique permettent toutes deux de visualiser les macromol cules haute r solution S'ils sont ombrag s avec un m tal lourd pour fournir un contraste, les macromol cules isol es telles que l'ADN ou les grandes prot ines peuvent tre visualis es facilement au microscope lectronique, mais la coloration n gative permet de voir des d tails plus fins. Dans cette technique, les mol cules sont support es sur une fine pellicule de carbone et m lang es une fleur de bl en d veloppement, solution d'un sel de m tal lourd tel que l'ac tate d'uranyle. Une fois que l' chantillon a s ch , ou pointe. Cet pi floral d licat a t rapidement congel , recouvert d'une fine pellicule m tallique, une tr s fine pellicule de sel m tallique recouvre le film de carbone partout sauf o il et examin l' tat congel avec une a t exclu par la pr sence d'une macromol cule adsorb e. Parce que le seM. cette macromol cule de micrographie faible grossissement permet aux lectrons de la traverser beaucoup plus facilement que ne le fait d montre la grande profondeur de champ de la coloration de m tal lourd environnante, une image inverse ou n gative de la mol cule est un seM. (Avec l'aimable autorisation de Kim Findlay.) cr . La coloration n gative est particuli rement utile pour observer de grands agr gats macromol culaires tels que des virus ou des ribosomes, et pour voir la structure des sous-unit s des filaments prot iques (Figure 9-53). L'ombrage et la coloration n gative peuvent fournir des vues de surface contraste lev de petits assemblages macromol culaires, mais la taille des plus petites particules m talliques dans l'ombre ou la coloration utilis e limite la r solution des deux techniques. Une alternative qui nous permet de visualiser directement haute r solution m me les caract ristiques int rieures de structures tridimensionnelles telles que les virus et les organites est la cryomicroscopie lectronique, dans laquelle la cong lation rapide pour former de la glace vitr e est nouveau la cl . Un film tr s mince (environ 100 nm) d'une suspension aqueuse de virus ou d'un complexe macromol culaire purifi est pr par sur une grille de microscope, puis est rapidement congel par Figure 9 50 Le microscope lectronique balayage. dans un seM, l' chantillon est balay par un faisceau d' lectrons focalis sur l' chantillon par les bobines lectromagn tiques qui agissent comme des lentilles. Le d tecteur mesure la quantit d' lectrons diffus s ou mis lorsque le faisceau bombarde chaque point successif de la surface de l' chantillon et contr le l'intensit des points successifs d'une image construite sur un cran. le seM cr e des images saisissantes d'objets tridimensionnels avec une grande profondeur de champ et une r solution comprise entre 3 nm et 20 nm selon l'instrument. (Photo reproduite avec l'aimable autorisation d'Andrew Davies.) Figure 9 51 Microscopie lectronique balayage. a) une micrographie lectronique balayage des st r ocils projet s d'une cellule cili e dans l'oreille interne d'un ouaouaron. titre de comparaison, la m me structure est illustr e par (B) la microscopie optique contraste diff rentiel (Vid o 9.3) et (C) la microscopie lectronique transmission section mince. (Avec l'aimable autorisation de Richard Jacobs et James Hudspeth.) tre plong dans un liquide de refroidissement. Un porte- chantillon sp cial maintient cet chantillon hydrat -160 C dans le vide du microscope, o il peu
Biologie moléculaire de la cellule	t tre visualis directement sans fixation, coloration ou s chage. Contrairement la coloration n gative, dans laquelle ce que nous voyons est l'enveloppe d'exclusion de la coloration autour de la particule, la cryomicroscopie lectronique hydrat e produit une image partir de la structure macromol culaire elle-m me. Cependant, le contraste dans cette image est tr s faible, et pour extraire le maximum d'informations structurelles, des techniques sp ciales de traitement d'image doivent tre utilis es, comme nous le d crivons ci-dessous. Plusieurs images peuvent tre combin es pour augmenter la r solution Comme nous l'avons vu pr c demment (p. 532), le bruit est important en microscopie optique de faibles niveaux de lumi re, mais c'est un probl me particuli rement grave pour la microscopie lectronique de macromol cules non color es. Une mol cule de prot ine peut tol rer une dose de seulement quelques dizaines d' lectrons par nanom tre carr sans dommage, et cette dose est inf rieure de plusieurs ordres de grandeur ce qui est n cessaire pour d finir une image r solution atomique. La solution consiste obtenir des images de nombreuses mol cules identiques, peut- tre des dizaines de milliers d'images individuelles, et les combiner pour produire une image moyenn e, r v lant des d tails structurels cach s par le bruit dans les images originales. Cette proc dure est appel e reconstruction particule unique. Avant de combiner toutes les images individuelles, elles doivent toutefois tre align es les unes avec les autres. Parfois, il est possible d'induire des prot ines et des complexes former des r seaux cristallins, dans lesquels chaque mol cule est maintenue dans la m me orientation dans un r seau r gulier. Dans ce cas, le probl me d'alignement est facilement r solu, et plusieurs structures prot iques ont t d termin es r solution atomique par ce type de cristallographie lectronique. En principe, cependant, les r seaux cristallins ne sont pas absolument n cessaires. l'aide d'un ordinateur, les images num riques de mol cules distribu es de mani re al atoire et non align es peuvent tre trait es et combin es pour produire des reconstructions haute r solution (voir la vid o 13.1). Bien que les structures qui ont une certaine sym trie intrins que rendent la t che d'alignement plus facile et plus pr cise, cette technique a galement t utilis e pour des objets comme les ribosomes, sans sym trie. La figure 9 54 montre la structure de Figure 9 52 Le pore nucl aire. Les enveloppes nucl aires rapidement gel es ont t imag es dans un seM haute r solution, quip d'un canon mission de champ comme source d' lectrons. ces vues de chaque c t d'un pore nucl aire repr sentent la limite de r solution du seM (comparer avec la figure 12 8). (Avec l'aimable autorisation de Martin Goldberg et Terry Allen.) Nous connaissons en d tail de nombreux processus cellulaires, tels que la r plication et la transcription de l'ADN et la traduction de l'ARN, mais serons-nous un jour en mesure de visualiser des processus mol culaires aussi rapides en action dans les cellules ? Serons-nous un jour en mesure d'imager des structures intracellulaires la r solution du microscope lectronique dans des cellules vivantes ? Comment pouvons-nous am liorer les techniques de cristallisation et de cryomicroscopie lectronique particule unique pour obtenir des structures haute r solution de tous les canaux membranaires et transporteurs importants ? Quels nouveaux concepts ces structures pourraient-elles r v ler ? Figure 9 53 Filaments d'actine color s n gativement. Dans cette micrographie lectronique transmission, chaque filament a un diam tre d'environ 8 nm et on voit, en y regardant de plus pr s, qu'il est compos d'une cha ne h lico dale de mol cules d'actine globulaires. (Avec l'aimable autorisation de Roger Craig.) la capside prot ique l'int rieur d'un virus d'immunod ficience humaine (VIH) qui a t d termin e haute r solution par la combinaison de nombreuses particules, de plusieurs vues et d'une mod lisation mol culaire. Une r solution de 0,3 nm a t obtenue par microscopie lectronique, suffisante pour commencer voir les arrangements atomiques internes d'une prot ine et pour rivaliser avec la cristallographie aux rayons X en termes de r solution. Bien qu'il soit peu probable que la microscopie lectronique supplante la cristallographie aux rayons X (discut e au chapitre 8) en tant que m thode de d termination de la structure macromol culaire, elle pr sente des avantages tr s vidents. Tout d'abord, il n'a pas besoin d' prouvettes cristallines. Deuxi mement, il peut traiter des complexes extr mement grands, c'est- -dire des structures qui peuvent tre trop grandes ou trop variables pour cristalliser de mani re satisfaisante. Troisi mement, il permet l'analyse rapide de diff rentes conformations de complexes prot iques. L'analyse de structures macromol culaires grandes et complexes est consid rable
Biologie moléculaire de la cellule	ment facilit e si la structure atomique d'une ou plusieurs des sous-unit s est connue, par exemple gr ce la cristallographie aux rayons X. Les mod les mol culaires peuvent ensuite tre math matiquement ajust s dans l'enveloppe de la structure d termin e une r solution inf rieure l'aide du microscope lectronique (voir figures 16-16D et 16-46). La figure 9-55 montre la structure d'un ribosome avec l'emplacement d'un facteur de lib ration li affich de cette mani re (voir aussi la figure 6-72). La d couverte de la structure d taill e des membranes et des organites n cessite la r solution plus lev e que l'on peut obtenir dans un microscope lectronique transmission. Des macromol cules sp cifiques peuvent tre localis es apr s avoir t marqu es avec de l'or collo dal li des anticorps. Des vues tridimensionnelles de la surface des cellules et des tissus sont obtenues par microscopie lectronique balayage. La forme des mol cules isol es peut tre facilement d termin e par des techniques de microscopie lectronique impliquant une cong lation rapide ou une coloration n gative. La tomographie lectronique et la reconstruction de particules uniques utilisent des manipulations informatiques de donn es obtenues partir de plusieurs images et de plusieurs angles de vue pour produire des reconstructions d taill es de macromol cules et de complexes mol culaires. La r solution obtenue avec ces m thodes signifie que les structures atomiques des individus Figure 9 54 Reconstruction d'une seule particule. la structure de la capside d'un virus d'immunod ficience humaine (hiV) complet a t d termin e par une combinaison de cryomicroscopie lectronique, de d termination de la structure des prot ines et de mod lisation. (a) une seule coupe de 4 nm d'un mod le tomographique eM (voir aussi les figures 9 48) d'une particule hiV intacte avec son enveloppe externe membranaire et sa capside prot ique interne, de forme irr guli re, qui abrite son g nome d'ARN. (B) La microscopie lectronique de sous-unit s de capside qui se sont auto-assembl es dans un tube h lico dal peut tre utilis e pour obtenir une carte de densit lectronique une r solution de 8 nm, dans laquelle les d tails des hexam res sont clairement visibles. (C) En utilisant les coordonn es atomiques connues d'une seule sous-unit de l'hexam re, la structure a t mod lis e dans la carte de densit lectronique de (B). (D) une reconstruction mol culaire de l'ensemble de la capside hiV, bas e sur les structures d taill es illustr es en (a) et (C). Cette capside contient 216 hexam res (bleus) et 12 pentam res (jaunes). (adapt de g. Zhao et al., Nature 497:643-646, 2013. Avec l'autorisation de Macmillan publishers Ltd. C, code pDB : 3J34.) Figure 9 55 Reconstruction d'une seule particule et ajustement d'un mod le mol culaire. Des ribosomes bact riens, avec et sans le facteur de lib ration requis pour la lib ration de peptides par le ribosome, ont t utilis s pour obtenir des cartes de cryomicroscopie tridimensionnelle haute r solution une r solution sup rieure 1 nm. Des images de pr s de 20 000 ribosomes distincts conserv s dans la glace ont t utilis es pour produire des reconstructions particule unique. (a) la sous-unit ribosomique 30s (jaune) et la sous-unit 50s (bleu) peuvent tre distingu es de la densit lectronique suppl mentaire qui peut tre attribu e au facteur de lib ration rF2 (violet). (B) la structure mol culaire connue de rF2 mod lis e dans la densit lectronique de (a). (D'apr s U.B.s. rawat et al., Nature 421:87-90, 2003. Avec l'autorisation de Macmillan publishers Ltd.) Les macromol cules peuvent souvent tre ajust es aux images d riv es par microscopie lectronique. De cette fa on, le TEM est de plus en plus en mesure de combler le foss entre les structures d couvertes par la cristallographie aux rayons X et celles d couvertes au microscope optique. Figure Q9 1 Trajets des rayons lumineux travers des lentilles s ches et immersion dans l'huile (probl me 9 3). Le cercle rouge l'origine des rayons lumineux est le sp cimen. 9 4 La figure Q9 2 montre un sch ma de l' il humain. Les indices de r fraction des composants dans le trajet de la lumi re sont : corn e 1,38, humeur aqueuse 1,33, cristallin 1,41, et Quelles d clarations sont vraies ? Expliquez pourquoi ou pourquoi pas. 9 1 Parce que la double h lice de l'ADN n'a qu'une largeur de 2 nm bien en dessous de la limite de r solution du microscope optique il est impossible de voir les chromosomes dans les cellules vivantes sans colorants sp ciaux. 9 2 Une mol cule fluorescente, ayant absorb un seul photon de lumi re une longueur d'onde, l' met toujours une longueur d'onde plus longue. Discutez des probl mes suivants. 9 3 Les diagrammes de la figure Q9 1 montrent les trajets des rayons lumineux traversant un chantillon avec une lentille s che et une lentille immersion dans l'huile. Expliquez pourquoi les objectifs immersion dans l'huile de
Biologie moléculaire de la cellule	vraient offrir une meilleure r solution. L'air, le verre et l'huile ont des indices de r fraction de 1,00, 1,51 et 1,51, 9 5 Pourquoi les humains voient-ils si mal sous l'eau ? Et pourquoi les lunettes aident-elles ? 9 6 Expliquer la diff rence entre la r solution et le grossissement. 9 7 Les anticorps qui se lient des prot ines sp cifiques sont des outils importants pour d finir l'emplacement des mol cules dans les cellules. La sensibilit de l'anticorps primaire, c'est- -dire l'anticorps qui r agit avec la mol cule cible, est souvent renforc e par l'utilisation d'anticorps secondaires marqu s qui se lient celle-ci. Quels sont les avantages et les inconv nients de l'utilisation d'anticorps secondaires porteurs de marqueurs fluorescents par rapport ceux qui portent des enzymes li es ? 9 8 La figure Q9 3 montre une s rie de prot ines fluorescentes modifi es qui mettent de la lumi re dans une gamme de couleurs. Comment pensez-vous que le m me chromophore peut mettre une fluorescence autant de longueurs d'onde diff rentes ? Figure Q9 3 : un arc-en-ciel de couleurs produites par des prot ines fluorescentes modifi es (probl me 9 8). (Avec l'aimable autorisation de Nathan Shaner, Paul Steinbach et Roger Tsien.) 9 9 Consid rons un d tecteur fluorescent con u pour signaler l'emplacement cellulaire des prot ines tyrosine kinases actives. Une prot ine fluorescente bleue (cyan) (CFP) et une prot ine fluorescente jaune (YFP) ont t fusionn es chaque extr mit d'un domaine prot ique hybride. Le segment de la prot ine hybride tait constitu d'un peptide de substrat reconnu par la prot ine tyrosine kinase Abl et d'un domaine de liaison la phosphotyrosine (Figure Q9 4A). La stimulation du domaine CFP ne provoque pas d' mission par le domaine YFP lorsque les domaines sont 1,3 (probl me 9-4). prot ine de liaison r tine 1,0 humeur vitr e 1,38. O se produit la r fraction principale, c'est- -dire la focalisation principale ? Selon vous, quel r le joue l'objectif 1.2 ? 1.1 L'iris de l' il humain Figure Q9 4 Prot ine rapporteure fluorescente con ue pour d tecter la phosphorylation de la tyrosine (probl me 9 9). (a) Structure du domaine de la prot ine rapporteure. Quatre domaines sont indiqu s : CFp, YFp, peptide de substrat de la tyrosine kinase et un domaine de liaison la phosphotyrosine. (B) Dosage des frettes. YFp/CFp est normalis 1,0 l'instant z ro. Le reporter a t incub en pr sence (ou en absence) d'ABL et d'ATP pendant les heures indiqu es. La fl che indique le moment de l'ajout d'une tyrosine phosphatase. (D'apr s a.Y. ting, k.h. kain, r.L. klemke et r.Y. tsien, Proc. Natl Acad. Sci. USA 98:15003 15008, 2001. Avec l'autorisation de l'acad mie nationale des sciences.) s par . Cependant, lorsque les domaines CFP et YFP sont rapproch s, le transfert d' nergie par r sonance de fluorescence (FRET) permet l'excitation de CFP de stimuler l' mission par YFP. La FRET se manifeste exp rimentalement par une augmentation du rapport d' mission 526 nm par rapport 476 nm (YFP/CFP) lorsque la CFP est excit e par une lumi re de 434 nm. L'incubation de la prot ine rapporteure avec la prot ine tyrosine kinase Abl en pr sence d'ATP a entra n une augmentation des missions de YFP/CFP (Figure Q9 4B). En l'absence d'ATP ou de la prot ine Abl, il n'y a pas eu de FRET. La FRET a galement t limin e par l'ajout d'une tyrosine phosphatase (figures Q9-4B). D crivez du mieux que vous pouvez comment la prot ine rapporteure d tecte la prot ine tyrosine kinase active Abl. Celis Je, Carter n, simons k et al. (eds) (2005) Biologie cellulaire : un manuel de laboratoire, 3e d. san Diego : presse universitaire. (Le volume 3 de cette s rie de quatre volumes couvre les aspects pratiques de la plupart des m thodes actuelles d'imagerie de la lumi re et des lectrons utilis es en biologie cellulaire.) pawley Bp (ed) (2006) handbook of Biological Confocal Microscopy, 3e d. New York : springer science. Wayne r (2014) Microscopie optique et vid o. San Diego : Presse universitaire. Looking at Cells in the Light Microscope adams MC, salmon WC, gupton sL et al. (2003) un syst me de microscope confocal multispectral disque rotatif grande vitesse pour la microscopie moucheture fluorescente de cellules vivantes. M thodes 29, 29 41. agard, Da, hiraoka Y, shaw p & sedat JW (1989) Microscopie fluorescence en trois dimensions. dans Methods in Cell Biology, Vol. 30 : Microscopie fluorescence des cellules vivantes en culture, partie B (DL taylor, Y-L Wang eds). San Diego : Presse universitaire. Burnette Dt, sengupta p, Dai Y et al. (2011) Microscopie de localisation assist e par blanchiment/clignement des yeux pour l'imagerie superr solution l'aide de mol cules fluorescentes standard. Proc. Natl Acad. Sci. tats-Unis 108, 21081 21086. Chalfie M, tu Y, euskirchen G et al. (1994) La prot ine fluorescente verte comme marqueur de l'expression des g nes. Science 263, 802 805. giepmans Bn, adams sr, ellisman Mh
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Biologie moléculaire de la cellule	branes cellulaires. Il est facilement visible en microscopie lectronique, et sa structure bicouche est attribuable exclusivement aux propri t s particuli res du lipide des mol cules, qui s'assemblent spontan ment en bicouches m me dans des conditions artificielles simples. Dans cette section, nous abordons les diff rents types de mol cules lipidiques pr sentes dans les membranes cellulaires et les propri t s g n rales des bicouches lipidiques. les phosphoglyc rides, les sphingolipides et les st rols sont les principaux lipides des membranes cellulaires Les mol cules lipidiques constituent environ 50 % de la masse de la plupart des membranes cellulaires animales, la quasi-totalit du reste tant constitu e de prot ines. Il y a environ 5 106 mol cules lipidiques dans une zone de bicouche lipidique de 1 m 1 m, ou environ 109 mol cules lipidiques dans la membrane plasmique d'une petite cellule animale. Toutes les mol cules lipidiques des membranes cellulaires sont amphiphiles, c'est- -dire qu'elles ont une extr mit hydrophile ( aimant l'eau ) ou polaire et une extr mit hydrophobe ( craignant l'eau ) ou non polaire. Les lipides membranaires les plus abondants sont les phospholipides. Ceux-ci ont un groupe de t te polaire contenant un groupe phosphate et deux queues d'hydrocarbures hydrophobes. Dans les cellules animales, v g tales et bact riennes, les queues sont g n ralement des acides gras et leur longueur peut diff rer (elles contiennent normalement entre 14 et 24 atomes de carbone). Une queue a g n ralement une ou plusieurs liaisons cis-double (c'est- -dire qu'elle est insatur e), tandis que l'autre queue n'en a pas (c'est- -dire qu'elle est satur e). Comme le montre la figure 10-2, chaque liaison cis-double cr e un pli dans la queue. Les diff rences de longueur et de saturation des queues d'acides gras influencent la fa on dont les mol cules de phospholipides s'entassent les unes contre les autres, affectant ainsi la fluidit de la membrane, comme nous le verrons plus loin. Les principaux phospholipides de la plupart des membranes cellulaires animales sont les phosphoglyc rides, qui ont un squelette de glyc rol trois carbones (voir Figure 10-2). Deux acides gras longue cha ne sont li s par des liaisons esters des atomes de carbone adjacents du glyc rol, et le troisi me atome de carbone du glyc rol est attach un groupe phosphate, qui son tour est li l'un des nombreux types de groupe de t te. En combinant plusieurs acides gras et groupes de t te diff rents, les cellules fabriquent de nombreux phosphoglyc rides diff rents. La phosphatidyl thanolamine, la phosphatidyls rine et la phosphatidylcholine sont les plus abondantes dans les membranes cellulaires des mammif res (Figure 10-3A-C). Une autre classe importante de phospholipides sont les sphingolipides, qui sont construits partir de sphingosine plut t que de glyc rol (Figure 10-3D-E). La sphingosine est une longue cha ne acyle avec un groupe amino (NH2) et deux groupes hydroxyles (OH) une extr mit . Dans la sphingomy line, le sphingolipide le plus courant, une queue d'acide gras est attach e au groupe amino et un groupe phosphocholine est attach au groupe hydroxyle terminal. Ensemble, les phospholipides phosphatidylcholine, phosphatidyl thanolamine, phosphatidyls rine et sphingomy line constituent plus de la moiti de la masse lipidique de la plupart des membranes cellulaires de mammif res (voir tableau 10-1, p. 571). Figure 10 2 Les parties d'une mol cule de phospholipide typique. cet exemple est une phosphatidylcholine, repr sent e (A) sch matiquement, (B) par une formule, (c) comme un mod le de remplissage d'espace (Vid o 10.1), et hydrophilicheadhydrophobictails(D) (D) comme un symbole. Figure 10 3 Quatre principaux phospholipides dans les membranes plasmiques de mammif res. Les diff rents groupes de t tes sont repr sent s par des couleurs diff rentes dans les symboles. les mol cules lipidiques illustr es en (A-c) sont des phosphoglyc rides, qui sont d riv s du glyc rol. la mol cule en (D) est la sphingomy line, qui est d riv e de la sphingosine (e) et est donc un sphingolipide. Notez que seule la phosphatidyls rine porte une charge n gative nette, dont nous aborderons l'importance plus loin ; Les trois autres sont lectriquement neutres au pH physiologique, portant une charge positive et une charge n gative. Figure 10 4 La structure du cholest rol. Le cholest rol du groupe de la t te polaire est repr sent (A) par une formule, (B) par un dessin sch matique et (c) sous la forme d'un mod le de remplissage d'espace. Sur leur forme, ils peuvent le faire de deux mani res : ils peuvent former des micelles sph riques, avec les queues vers l'int rieur, ou ils peuvent former des feuilles double couche, ou des bicouches, avec les queues hydrophobes prises en sandwich entre les groupes de t tes hydrophiles (Figure 10 7). Les m mes forces qui poussent les phospholipides former des bicouches offrent galement une propri
Biologie moléculaire de la cellule	t d'auto- tanch it . Une petite d chirure dans la bicouche cr e un bord libre avec de l'eau ; Parce que cela est nerg tiquement d favorable, les lipides ont tendance se r organiser spontan ment pour liminer le bord libre. (Dans les membranes plasmiques eucaryotes, la fusion des v sicules intracellulaires r pare les d chirures plus grosses.) L'interdiction des bords libres a une cons quence profonde : la seule fa on pour une bicouche d' viter d'avoir des bords est de se refermer sur elle-m me et de former un compartiment scell (Figure 10 8). Cette remarquable En plus des phospholipides, les bicouches lipidiques de nombreuses membranes cellulaires contiennent des glycolipides et du cholest rol. Les glycolipides ressemblent des sphingolipides, mais, au lieu d'un groupe de t te li au phosphate, ils ont des sucres attach s. Nous aborderons les glycolipides plus tard. Les membranes plasmiques eucaryotes contiennent des quantit s particuli rement importantes de cholest rol, jusqu' une mol cule pour chaque mol cule de phospholipide. Le cholest rol est un st rol. Il contient une structure cyclique rigide, laquelle est attach un seul groupe hydroxyle polaire et une courte cha ne hydrocarbon e non polaire (Figure 10 4). Les mol cules de cholest rol s'orientent dans la bicouche avec leur groupe hydroxyle pr s des groupes de t te polaire des mol cules phospholipidiques adjacentes (Figure 10 5). La forme et la nature amphiphile des mol cules de phospholipides les am nent former spontan ment des bicouches dans les environnements aqueux. Comme nous l'avons vu au chapitre 2, les mol cules hydrophiles se dissolvent facilement dans l'eau parce qu'elles contiennent des groupes charg s ou des groupes polaires non charg s qui peuvent former soit des interactions lectrostatiques favorables, soit des liaisons hydrog ne avec les mol cules d'eau (Figure 10-6A). Les mol cules hydrophobes, en revanche, sont insolubles dans l'eau parce que tous, ou presque tous, de leurs atomes sont non charg s et non polaires et ne peuvent donc pas former d'interactions nerg tiquement favorables avec les mol cules d'eau. S'ils sont dispers s dans l'eau, ils forcent les mol cules d'eau adjacentes se r organiser en cages glac es qui entourent la mol cule hydrophobe (Figure 10 6B). Parce que ces structures de cage sont plus ordonn es que l'eau environnante, leur formation augmente l' nergie libre. Ce co t d' nergie libre est toutefois minimis si les mol cules hydrophobes (ou les parties hydrophobes des mol cules amphiphiles) se regroupent de sorte que le plus petit nombre de mol cules d'eau est affect . 3 Lorsque des mol cules amphiphiles sont expos es un environnement aqueux, elles se comportent comme on peut s'y attendre d'apr s la discussion ci-dessus. Ils se regroupent spontan ment pour enterrer leurs queues hydrophobes l'int rieur, o ils sont prot g s de l'eau, et ils exposent leurs t tes hydrophiles l'eau. Selon Figure 10 5 Cholest rol dans une bicouche lipidique. Dessin sch matique ( l' chelle) d'une mol cule de cholest rol interagissant avec deux mol cules de phospholipides dans une monocouche d'une bicouche lipidique. Le comportement, fondamental pour la cr ation d'une cellule vivante, d coule directement de la forme et de la nature amphiphile de la mol cule de phospholipide. Une bicouche lipidique poss de galement d'autres caract ristiques qui en font une structure id ale pour les membranes cellulaires. L'un des plus importants d'entre eux est sa fluidit , qui est cruciale pour de nombreuses fonctions membranaires (Vid o 10.2). la bicouche lipidique est un fluide bidimensionnel Vers 1970, les chercheurs ont reconnu pour la premi re fois que des mol cules lipidiques individuelles sont capables de diffuser librement dans le plan d'une bicouche lipidique. La d monstration initiale est venue d' tudes sur des bicouches lipidiques synth tiques (artificielles), qui peuvent tre fabriqu es sous la forme de v sicules sph riques, appel es liposomes (Figure 10-9) ; ou sous la forme de bicouches planes form es travers un trou dans une cloison entre deux compartiments aqueux ou sur un support solide. Diverses techniques ont t utilis es pour mesurer le mouvement de mol cules lipidiques individuelles et de leurs composants. On peut construire une mol cule lipidique, par exemple, avec un colorant fluorescent ou une petite particule d'or attach e son groupe de t te polaire et suivre la diffusion de mol cules individuelles dans une membrane. Alternativement, on peut modifier un groupe de t te lipidique pour porter une tiquette de spin , telle qu'une forme de nitroxide d'empaquetage de mol cules dans l'eau Figure 10 7 Agencement de l'empilement des mol cules amphiphiles dans un environnement aqueux. (A) ces mol cules forment spontan ment des micelles ou des bicouches dans l'eau, selon leur forme. Les mol cules amphiphiles en forme de c ne (au-dessus) forment des micelles, tandis que les mol cules amphiphiles en fo
Biologie moléculaire de la cellule	rme de cylindre telles que les phospholipides (en dessous) forment des bicouches. (B) Une micelle et une bicouche lipidique observ es en coupe efficace. notez que les micelles des mol cules amphiphiles sont consid r es comme beaucoup plus irr guli res que dessin es ici (voir Figure 10 26c). Figure 10 6 Comment les mol cules hydrophiles et hydrophobes interagissent diff remment avec l'eau. (A) Parce que l'ac tone est polaire, elle peut former des liaisons hydrog ne (rouge) et des interactions lectrostatiques favorables (jaune) avec les mol cules d'eau, qui sont galement polaires. Ainsi, l'ac tone se dissout facilement dans l'eau. (B) En revanche, le 2-m thylpropane est enti rement hydrophobe. Parce qu'il ne peut pas former d'interactions favorables avec l'eau, il force les mol cules d'eau adjacentes se r organiser en structures de cage ressemblant de la glace, ce qui augmente l' nergie libre. Ce compos est donc pratiquement insoluble dans l'eau. Le symbole indique une charge n gative partielle, et + indique une charge positive partielle. Les atomes polaires sont repr sent s en couleur et les groupes non polaires sont indiqu s en gris. Bicouche phospholipidique plane avec bords expos s l'eau Figure 10 8 La fermeture spontan e d'une bicouche de phospholipides pour former un compartiment scell . La structure ferm e est stable car elle vite l'exposition des r sidus d'hydrocarbures hydrophobes l'eau, ce qui serait nerg tiquement d favorable. Figure 10 9 Liposomes. (A) Une micrographie lectronique de v sicules phospholipidiques synth tiques non fix es et non color es (liposomes) dans l'eau, qui ont t rapidement congel es la temp rature de l'azote liquide. (B) Un dessin d'un petit liposome sph rique vu en coupe transversale. Les liposomes sont couramment utilis s comme membranes mod les dans les tudes exp rimentales, en particulier pour tudier les prot ines membranaires incorpor es. (A, d'apr s p. Frederik et D. hubert, Methods Enzymol. 391:431 448, 2005. Avec l'autorisation d'elsevier.) groupe (=N O) ; celui-ci contient un lectron non appari dont le spin cr e un signal paramagn tique qui peut tre d tect par spectroscopie par r sonance de spin lectronique (ESR), dont les principes sont similaires ceux de la r sonance magn tique nucl aire (RMN), discut s au chapitre 8. Le mouvement et l'orientation d'un lipide marqu en spin dans une bicouche peuvent tre d duits du spectre ESR. De telles tudes montrent que les mol cules de phospholipides dans les bicouches synth tiques migrent tr s rarement de la monocouche ( galement appel e feuillet) d'un c t celle de l'autre. Ce processus, connu sous le nom de flip-flop , se produit sur une chelle de temps de quelques heures pour n'importe quelle mol cule individuelle, bien que le cholest rol soit une exception cette r gle et puisse basculer rapidement. En revanche, les mol cules lipidiques changent rapidement leur place avec leurs voisines au sein d'une monocouche (~107 fois par seconde). Cela donne lieu une diffusion lat rale rapide, avec un coefficient de diffusion (D) d'environ 10 8 cm2/sec, ce qui signifie qu'une mol cule lipidique moyenne diffuse la longueur d'une grande cellule bact rienne (~2 m) en 1 seconde environ. Ces tudes ont galement montr que les mol cules lipidiques individuelles tournent tr s rapidement autour de leur axe long et ont des cha nes d'hydrocarbures flexibles. Des simulations informatiques montrent que les mol cules lipidiques dans les bicouches synth tiques sont tr s d sordonn es, pr sentant une surface irr guli re de groupes de t tes diversement espac s et orient s la phase aqueuse de part et d'autre de la bicouche (Figure 10 10). Des tudes de mobilit similaires sur des mol cules lipidiques marqu es dans des membranes biologiques isol es et dans des cellules vivantes donnent des r sultats similaires ceux des bicouches synth tiques. Ils d montrent que le composant lipidique d'un La membrane est un liquide bidimensionnel dans lequel les mol cules constitutives sont libres de se d placer lat ralement. Comme dans les bicouches synth tiques, les mol cules de phospholipides individuelles sont normalement confin es dans leur propre monocouche. Cet enfermement cr e un probl me pour leur synth se. Les mol cules de phospholipides sont fabriqu es dans une seule monocouche d'une membrane, principalement dans la monocouche cytosolique de la membrane du r ticulum endoplasmique. Si aucune de ces mol cules nouvellement fabriqu es ne pouvait migrer raisonnablement rapidement vers la monocouche non cytosolique, une nouvelle bicouche lipidique ne pourrait pas tre fabriqu e. Le probl me est r solu par une classe sp ciale de prot ines membranaires appel es translocateurs de phospholipides, ou flippases, qui catalysent le basculement rapide des phospholipides d'une monocouche l'autre, comme nous l'avons vu au chapitre 12. Malgr la fluidit de la bicouche lipidique, les liposomes ne fusionnent pas spon
Biologie moléculaire de la cellule	tan ment les uns avec les autres lorsqu'ils sont en suspension dans l'eau. La fusion ne se produit pas parce que les groupes de t te lipidiques polaires lient des mol cules d'eau qui doivent tre d plac es pour que les bicouches de deux liposomes diff rents fusionnent. La coquille d'hydratation qui maintient les liposomes s par s isole galement les nombreuses membranes internes d'une cellule eucaryote et emp che leur fusion incontr l e, maintenant ainsi l'int grit compartimentale des organites entour s de membranes. Tous les v nements de fusion de la membrane cellulaire Figure 10 10 La mobilit des mol cules de phospholipides dans une bicouche lipidique artificielle. partir d'un mod le de 100 mol cules de phosphatidylcholine dispos es en une bicouche r guli re, un ordinateur a calcul la position de chaque atome apr s 300 picosecondes de temps simul . De ces calculs th oriques, un mod le de la bicouche lipidique merge qui tient compte de presque toutes les propri t s mesurables d'une bicouche lipidique synth tique, y compris son paisseur, le nombre de mol cules lipidiques par surface de membrane, la profondeur de p n tration de l'eau et les irr gularit s des deux surfaces. Notez que les queues d'une monocouche peuvent interagir avec celles de l'autre monocouche, si les queues sont suffisamment longues. (B) les diff rents mouvements d'une mol cule lipidique dans une bicouche. (A, bas sur S.W. chiu et al., Biophys. J. 69:1230-1245, 1995. Avec la permission de la Biophysical Society.) sont catalys s par des prot ines de fusion troitement r gul es, qui forcent les membranes appropri es se rapprocher troitement, expulsant la couche d'eau qui maintient les bicouches s par es, comme nous le verrons au chapitre 13. la fluidit d'une bicouche lipidique d pend de sa composition La fluidit des membranes cellulaires doit tre r gl e avec pr cision. Certains processus de transport membranaire et activit s enzymatiques, par exemple, cessent lorsque la viscosit de la bicouche est augment e exp rimentalement au-del d'un certain seuil. La fluidit d'une bicouche lipidique d pend la fois de sa composition et de sa temp rature, comme le d montrent facilement les tudes sur les bicouches lipidiques synth tiques. Une bicouche synth tique fabriqu e partir d'un seul type de phospholipide passe d'un tat liquide un tat cristallin rigide bidimensionnel (ou gel) une temp rature caract ristique. Ce changement d' tat s'appelle une transition de phase, et la temp rature laquelle il se produit est plus basse (c'est- -dire que la membrane devient plus difficile geler) si les cha nes d'hydrocarbures sont courtes ou ont des doubles liaisons. Une longueur de cha ne plus courte r duit la tendance des queues d'hydrocarbures interagir les unes avec les autres, dans la m me monocouche et dans la monocouche oppos e, et les liaisons cis-double produisent des plis dans les cha nes qui les rendent plus difficiles empaqueter, de sorte que la membrane reste fluide des temp ratures plus basses (Figure 10-11). Les bact ries, les levures et d'autres organismes dont la temp rature fluctue avec celle de leur environnement ajustent la composition en acides gras de leurs lipides membranaires pour maintenir une fluidit relativement constante. Lorsque la temp rature baisse, par exemple, les cellules de ces organismes synth tisent des acides gras avec plus de liaisons cis-doubles, vitant ainsi la diminution de la fluidit bicouche qui r sulterait autrement de la baisse de temp rature. Le cholest rol module les propri t s des bicouches lipidiques. Lorsqu'il est m lang des phospholipides, il am liore les propri t s de barri re de perm abilit de la bicouche lipidique. Le cholest rol s'ins re dans la bicouche avec son groupe hydroxyle pr s des groupes de la t te polaire des phospholipides, de sorte que ses anneaux st ro diens rigides en forme de plaque interagissent avec les r gions des cha nes d'hydrocarbures les plus proches des groupes de la t te polaire et les immobilisent en partie (voir la figure 10-5 et la vid o 10.3). En diminuant la mobilit des premiers groupes CH2 des cha nes de Les mol cules phospholipidiques, le cholest rol, rendent la bicouche lipidique moins d formable dans cette r gion et diminuent ainsi la perm abilit de la bicouche aux petites mol cules hydrosolubles. Bien que le cholest rol resserre l'empaquetage des lipides dans une bicouche, il ne rend pas les membranes moins fluides. Aux concentrations lev es que l'on trouve dans la plupart des membranes plasmiques eucaryotes, le cholest rol emp che galement les cha nes d'hydrocarbures de se rassembler et de cristalliser. Le tableau 10 1 compare les compositions lipidiques de plusieurs membranes biologiques. Notez que les membranes plasmiques bact riennes sont souvent compos es d'un type principal de phospholipides et ne contiennent pas de cholest rol. Chez les arch es, les lipides contiennent g n ralement des cha nes d'hydrocarbures satur es

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