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Biologie moléculaire de la cellule	is s tort par l' pissage. Figure 6 31 Variation des longueurs d'intron et d'exon dans les g nomes de l'homme, du ver et de la mouche. (A) Distribution de la taille des exons. (B) Distribution de la taille des introns. Notez que la longueur de l'exon est beaucoup plus uniforme que la longueur de l'intron. (Adapt de l'International Human Genome Sequencing Consortium, Nature 409:860-921, 2001. Avec l'autorisation de Macmillan Publishers Ltd.) Pourcentage d'introns Pourcentage d'exons 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 <100 100 2000 2000 5000 5000 30 000 >30 000 Longueur des exons (paires de nucl otides) Longueur de l'intron (paires de nucl otides) Bien que cela puisse sembler contre-intuitif premi re vue, la fa on dont un g ne est emball dans la chromatine peut affecter la fa on dont le transcrit de l'ARN de ce g ne est finalement piss . Les nucl osomes ont tendance tre positionn s au-dessus des exons (qui sont, en moyenne, proches de la longueur de l'ADN d'un nucl osome), et il a t propos que ceux-ci agissent comme des ralentisseurs , permettant aux prot ines responsables de la d finition des exons de s'assembler sur l'ARN lorsqu'il merge de la polym rase. De plus, les changements dans la structure de la chromatine sont utilis s pour modifier les mod les d' pissage. Cela peut se produire de deux mani res. Tout d'abord, parce que l' pissage et la transcription sont coupl s, la vitesse laquelle l'ARN polym rase se d place le long de l'ADN peut affecter l' pissage de l'ARN. Par exemple, si la polym rase se d place lentement, le saut d'exon (voir Figure 6-30A) est minimis : l'assemblage de l' pissage initial peut tre termin avant m me qu'un autre choix de site d' pissage n' merge de l'ARN polym rase. Les nucl osomes de la chromatine condens e peuvent provoquer une pause de la polym rase ; le mod le de pauses affecte son tour l' tendue de l'ARN expos un moment donn la machinerie d' pissage. Il existe une deuxi me fa on, plus directe, dont la structure de la chromatine peut affecter l' pissage de l'ARN. Bien que les d tails ne soient pas encore compris, des modifications sp cifiques des histones attirent des composants de l' pissage et, parce que la chromatine transcrite est en troite association avec l'ARN naissant, ces composants d' pissage peuvent facilement tre transf r s l'ARN mergent. De cette fa on, certains types de modifications d'histones peuvent affecter le mod le final d' pissage. Nous avons vu que le choix des sites d' pissage d pend de caract ristiques telles que la force des trois signaux sur l'ARN (les jonctions d' pissage 5 et 3 et le point de branche) pour la machinerie d' pissage, l'assemblage co-transcriptionnel de l' pissage, la structure de la chromatine et la comptabilit qui sous-tend la d finition de l'exon. Nous ne savons pas exactement quel point l' pissage est normalement pr cis car, comme nous le verrons plus tard, il existe plusieurs syst mes de contr le de la qualit qui d truisent rapidement les ARNm dont l' pissage tourne mal. Cependant, nous savons que, par rapport d'autres tapes de l'expression des g nes, l' pissage est exceptionnellement flexible. Ainsi, par exemple, une mutation dans une s quence de nucl otides critique pour l' pissage d'un intron particulier n'emp che pas n cessairement l' pissage de cet intron dans son ensemble. Au lieu de cela, la mutation cr e g n ralement un nouveau mod le d' pissage (Figure 6 33). Le plus souvent, un exon est simplement saut (Figure 6-33B). Dans d'autres cas, la mutation provoque l'utilisation efficace d'une jonction d' pissage cryptique (Figure 6-33C). Apparemment, la machinerie d' pissage a volu pour choisir le meilleur mod le possible de jonctions d' pissage, et si le optimal est endommag par une mutation, il cherchera le meilleur mod le suivant, et ainsi de suite. Cette plasticit inh rente au processus d' pissage de l'ARN sugg re que les changements dans les mod les d' pissage caus s par des mutations al atoires ont jou un r le important dans l' volution des g nes et des organismes. Cela signifie galement que les mutations qui affectent l' pissage peuvent tre gravement pr judiciables l'organisme : en plus de la thalass mie, exemple pr sent la figure 6-33, aberrante Figure 6 32 L'hypoth se de la d finition de l'exon. Selon cette id e, les prot ines SR se lient chaque s quence d'exon dans le pr -ARNm et aident ainsi guider les snRNP vers les limites intron/exon appropri es. Cette d marcation des exons par les prot ines SR se produit de mani re cotranscriptionnelle, en commen ant par le CBC (complexe de liaison la coiffe) l'extr mit 5. Il a t propos qu'un groupe de prot ines connues sous le nom de ribonucl oprot ines nucl aires h t rog nes (hnRNP) puisse s'associer pr f rentiellement avec des s quences d'introns, aidant ainsi l' pissage distinguer les introns des exons. (Adapt de R. Reed, Curr. Opin. Cell Biol. 12:340-345, 2000. Avec l'autorisation d'El
Biologie moléculaire de la cellule	sevier.) L' pissage joue un r le important dans le d veloppement de la fibrose kystique, de la d mence frontotemporale, de la maladie de Parkinson, de la r tinite pigmentaire, de l'amyotrophie spinale, de la dystrophie myotonique, du vieillissement pr matur et du cancer. On a estim que parmi les nombreuses mutations ponctuelles qui causent des maladies humaines h r ditaires, 10 % produisent un pissage aberrant du g ne contenant la mutation. La plasticit de l' pissage de l'ARN signifie galement que la cellule peut facilement r guler le mod le d' pissage de l'ARN. Plus t t dans cette section, nous avons vu que l' pissage alternatif peut donner naissance diff rentes prot ines du m me g ne et qu'il s'agit d'une strat gie courante pour am liorer le potentiel de codage des g nomes. Quelques exemples de l' pissage alternatif sont constitutifs ; c'est- -dire que les ARNm piss s alternativement sont produits en continu par les cellules d'un organisme. Cependant, dans de nombreux cas, la cellule r gule les mod les d' pissage de sorte que diff rentes formes de la prot ine sont produites diff rents moments et dans diff rents tissus (voir Figure 6-26). Dans le chapitre 7, nous reviendrons sur cette question pour discuter de quelques exemples sp cifiques d' pissage r gul de l'ARN. Lorsque l' pissage a t d couvert pour la premi re fois, il a intrigu les biologistes mol culaires. Pourquoi les mol cules d'ARN plut t que les prot ines jouent-elles un r le important dans la reconnaissance des sites d' pissage et dans la chimie de l' pissage ? Pourquoi utilise-t-on un lariat interm diaire plut t que l'alternative apparemment plus simple consistant rassembler les sites d' pissage 5 et 3 en une seule tape, suivie de leur clivage direct et de leur rejoindre ? Les r ponses ces questions refl tent la mani re dont l' pissage a volu . Comme nous l'avons vu bri vement au chapitre 1 (et plus en d tail dans la derni re section de ce chapitre), il est probable que les cellules primitives utilisaient des mol cules d'ARN plut t que des prot ines comme principaux catalyseurs et qu'elles stockaient leur information g n tique dans l'ARN plut t que dans des s quences d'ADN. Les r actions d' pissage catalys es par l'ARN ont probablement jou un r le essentiel dans ces cellules pr coces. titre de preuve, certains introns d'ARN auto- piss s (c'est- -dire des s quences d'intron dans l'ARN dont l' pissage peut se produire en l'absence de prot ines ou de toute autre mol cule d'ARN) subsistent aujourd'hui par exemple, dans les g nes nucl aires de l'ARNr du cili Tetrahymena, dans quelques g nes T4 des bact riophages et dans certains g nes mitochondriaux et chloroplastes. Dans ces cas, la mol cule d'ARN se replie dans une structure tridimensionnelle sp cifique qui rassemble les jonctions intron/exon et catalyse les deux r actions de transest rification. Une s quence d'intron auto- piss e peut tre identifi e dans un tube essai en incubant une mol cule d'ARN pur contenant la s quence d'intron et en observant la r action d' pissage. Parce que la chimie de base de certaines r actions d'auto- pissage est si similaire l' pissage pr -ARNm, il a t propos que le processus beaucoup plus complexe d' pissage pr -ARNm ait volu partir d'une forme plus simple et ancestrale d'auto- pissage de l'ARN. Les enzymes de traitement de l'ARN g n rent l'extr mit 3 des ARNm eucaryotes Nous avons vu que l'extr mit 5' du pr -ARNm produit par l'ARN polym rase II est plafonn e presque d s qu'elle merge de l'ARN polym rase. Ensuite, lorsque la polym rase poursuit son mouvement le long d'un g ne, l' pissage s'assemble sur l'ARN et d limite les limites de l'intron et de l'exon. La longue queue C-terminale de l'ARN polym rase coordonne ces processus en transf rant les composants de coiffage et d' pissage directement l'ARN lorsqu'il merge de l'enzyme. Dans cette section, nous verrons que, lorsque l'ARN polym rase II atteint la fin d'un g ne, un m canisme similaire garantit que l'extr mit 3 du pr -ARNm est trait e de mani re appropri e. La position de l'extr mit 3 de chaque mol cule d'ARNm est sp cifi e par des signaux cod s dans le g nome (Figure 6-34). Ces signaux sont transcrits en ARN au fur et mesure que l'ARN polym rase II se d place travers eux, et ils sont ensuite reconnus (en tant qu'ARN) par une s rie de prot ines de liaison l'ARN et d'enzymes de traitement de l'ARN (Figure 6 35). Deux prot ines multisous-unitaires, appel es CstF (facteur de stimulation de clivage) et CPSF (facteur de sp cificit de clivage et de polyad nylation), sont d'une importance particuli re. s quences d'introns L'ARNm normal est form de trois exons UN CHANGEMENT MONONUCL OTIDIQUE QUI D TRUIT UN SITE D' PISSAGE NORMAL, PROVOQUANT AINSI UN SAUT D'EXON ARNm avec exon 2 manquant CHANGEMENT D'UN SEUL NUCL OTIDE QUI D TRUIT UN SITE D' PISSAGE NORMAL, ACTIVANT AINSI UN SITE D' PISSAGE CRYPTIQUE ARNm avec exon 3 tendu ARNm avec exon suppl mentaire i
Biologie moléculaire de la cellule	ns r entre l'exon 2 et l'exon 3 Figure 6 33 Traitement anormal du transcrit de l'ARN primaire de la -globine chez l'homme atteint de la maladie la thalass mie. Dans les exemples pr sent s, la maladie (une an mie s v re due une synth se aberrante de l'h moglobine) est caus e par des mutations du site d' pissage trouv es dans les g nomes des patients atteints. Les cases bleu fonc repr sentent les trois s quences d'exons normales ; Les lignes rouges relient les sites d' pissage 5 et 3 utilis s. Dans (B), (C) et (D), les cases bleu clair repr sentent les nouvelles s quences nucl otidiques incluses dans la mol cule d'ARNm finale la suite de la mutation indiqu e par la pointe de fl che noire. Notez que lorsqu'une mutation quitte un site d' pissage normal sans partenaire, un exon est saut (B) ou un ou plusieurs sites d' pissage cryptiques anormaux proximit sont utilis s comme site partenaire (C). [Adapt en partie de S.H. Orkin, dans The Molecular Basis of Blood Diseases (G. Stamatoyannopoulos et al., eds.), pp. 106-126. Philadelphie : Saunders, 1987.] d grad dans le noyau Ces deux prot ines voyagent avec la queue de l'ARN polym rase et sont transf r es la s quence de traitement l'extr mit 3 d'une mol cule d'ARN lorsqu'elle merge de l'ARN polym rase. Une fois que CstF et CPSF se lient leurs s quences de reconnaissance sur la mol cule d'ARN mergente, d'autres prot ines s'assemblent avec elles pour cr er l'extr mit 3 de l'ARNm. Tout d'abord, l'ARN est cliv de la polym rase (voir Figure 6-35). Ensuite, une enzyme appel e poly-A polym rase (PAP) ajoute, un la fois, environ 200 nucl otides A l'extr mit 3 produite par le clivage. Le pr curseur nucl otidique de ces ajouts est l'ATP, et le m me type de liaisons 5 3 se forme que dans la synth se conventionnelle de l'ARN. Mais contrairement d'autres ARN polym rases, la poly-A polym rase ne n cessite pas de matrice ; par cons quent, la queue poly-A des ARNm eucaryotes n'est pas directement cod e dans le g nome. Au fur et mesure que la queue poly-A est synth tis e, des prot ines appel es prot ines de liaison poly-A s'assemblent sur elle et, par un m canisme mal compris, aident d terminer la longueur finale de la queue. Apr s que l'extr mit 3 d'une mol cule de pr -ARNm eucaryote a t cliv e, l'ARN polym rase II continue transcrire, dans certains cas pour des centaines de nucl otides. Une fois que le clivage l'extr mit 3 s'est produit, l'ARN nouvellement synth tis qui merge des polym rases n'a pas de chapeau 5 ; cet ARN non prot g est rapidement d grad par une exonucl ase de 5 3 transport e par la queue de la polym rase. Apparemment, c'est cette d gradation continue de l'ARN qui finit par amener l'ARN polym rase rel cher son emprise sur la matrice et mettre fin la transcription. Les ARNm eucaryotes matures sont export s s lectivement du noyau La synth se et le traitement des pr -ARNm eucaryotes se d roulent de mani re ordonn e dans le noyau cellulaire. Mais parmi les pr -ARNm synth tis s, seule une petite fraction l'ARNm mature est d'une utilisation suppl mentaire pour la cellule. La plupart du reste les introns excis s, les ARN bris s et les pr -ARNm trait s de mani re aberrante est non seulement inutile mais potentiellement dangereux. Comment la cellule fait-elle la distinction entre les mol cules d'ARNm matures relativement rares qu'elle souhaite conserver et la quantit crasante de d bris cr s par le traitement de l'ARN ? La r ponse est que, lorsqu'une mol cule d'ARN est trait e, elle perd certaines prot ines et en acquiert d'autres. Par exemple, nous avons vu que l'acquisition de complexes de liaison la coiffe, de complexes de jonction d'exons et de prot ines de liaison poly-A marque l'ach vement de la coiffe, de l' pissage et de l'addition de poly-A, respectivement. Une mol cule d'ARNm correctement compl t e se distingue galement par les prot ines qui lui manquent. Par exemple, la pr sence d'une prot ine snRNP signifierait un pissage incomplet ou aberrant. Ce n'est que lorsque les prot ines pr sentes sur une mol cule d'ARNm signifient collectivement que le traitement a t men bien que l'ARNm est export du noyau vers le cytosol, o il peut tre traduit en prot ine. ARNm mal trait s Figure 6 35 Quelques-unes des principales tapes de la g n ration de l'extr mit 3 d'un ARNm eucaryote. Ce processus est beaucoup plus compliqu que le processus analogue chez les bact ries, o l'ARN polym rase s'arr te simplement un signal de terminaison et lib re la fois l'extr mit 3 de son transcrit et la matrice d'ADN (voir Figure 6-11). Figure 6 34 S quences nucl otidiques consensuelles qui dirigent le clivage et la polyad nylation pour former l'extr mit 3 d'un ARNm eucaryote. Ces s quences sont cod es dans le g nome, et des prot ines sp cifiques les reconnaissent comme de l'ARN apr s avoir t transcrites. Comme le montre la figure 6-35, l'hexam re AAUAAA est li par CPSF et l' l ment riche en G
Biologie moléculaire de la cellule	U au-del du site de clivage sont li s par CstF ; la s quence CA est li e par un troisi me facteur prot ique n cessaire l' tape de clivage. Comme d'autres s quences de nucl otides consensuelles discut es dans ce chapitre (voir Figure 6-12), les s quences montr es dans la figure repr sentent une vari t de signaux de clivage et de polyad nylation individuels. 3 d'une mol cule d'ARNm mature et d'autres d bris d'ARN (s quences d'intron excis es, par exemple) sont retenus dans le noyau, o ils sont finalement d grad s par l'exosome nucl aire, un grand complexe prot ique dont l'int rieur est riche en exonucl ases de 3 5 ARN (Figure 6-36). Les cellules eucaryotes n'exportent donc que des mol cules d'ARN utiles vers le cytoplasme, tandis que les d bris sont limin s dans le noyau. De toutes les prot ines qui s'assemblent sur les mol cules de pr -ARNm lorsqu'elles mergent de la transcription d'ARN polym rases, les plus abondantes sont les hnRNP (prot ines ribonucl aires nucl aires h t rog nes). Certaines de ces prot ines (il y en a environ 30 diff rentes chez l'homme) d roulent les h lices en pingle cheveux dans l'ARN afin que l' pissage et d'autres signaux sur l'ARN puissent tre lus plus facilement. D'autres empaquetent pr f rentiellement l'ARN contenu dans les tr s longues s quences d'introns typiques des organismes complexes (voir Figure 6-31) et celles-ci peuvent jouer un r le important pour distinguer l'ARNm mature des d bris laiss s par le traitement de l'ARN. Les ARNm trait s avec succ s sont guid s travers les complexes de pores nucl aires (NPC), des canaux aqueux dans la membrane nucl aire qui relient directement le nucl oplasme et le cytosol (Figure 6 37). De petites mol cules (moins de 60 000 daltons) peuvent diffuser librement travers ces canaux. Cependant, la plupart des macromol cules dans les cellules, y compris les ARNm complex s avec des prot ines, sont beaucoup trop grosses pour passer dans les canaux sans un processus sp cial. La cellule utilise de l' nergie pour transporter activement ces macromol cules dans les deux sens travers les complexes de pores nucl aires. Comme expliqu en d tail au chapitre 12, les macromol cules sont d plac es travers les complexes de pores nucl aires par des r cepteurs de transport nucl aire, qui, en fonction de l'identit de la macromol cule, l'escortent du noyau au cytoplasme ou vice versa. Pour que l'exportation de l'ARNm se produise, un r cepteur de transport nucl aire sp cifique doit tre charg sur l'ARNm, une tape qui, dans de nombreux organismes, se d roule de concert avec le clivage 3 et la polyad nylation. Une fois qu'il aide d placer une mol cule d'ARN travers le complexe de pores nucl aires, le r cepteur de transport se dissocie de l'ARNm, p n tre nouveau dans le noyau et est ensuite utilis pour exporter une nouvelle mol cule d'ARNm. L'exportation de complexes ARNm-prot ines partir du noyau peut tre facilement observ e au microscope lectronique pour l'ARNm exceptionnellement abondant des g nes de l'anneau de Balbiani de l'insecte. Au fur et mesure que ces g nes sont transcrits, l'ARN nouvellement form est emball par des prot ines, y compris les hnRNP, les prot ines SR et les composants de l' pissage. Ce complexe prot ine-ARN subit une s rie de transitions structurelles, refl tant probablement des v nements de traitement de l'ARN, aboutissant une fibre incurv e (voir Figure 6-37). Cette fibre incurv e se d place travers le nucl oplasme et p n tre dans le complexe de pores nucl aires (avec sa coiffe 5 en premier), puis elle subit une autre s rie de transitions structurelles en se d pla ant travers le pore. Ces observations et d'autres r v lent que les complexes pr -ARNm-prot ine et ARNm-prot ine sont des structures dynamiques qui gagnent et perdent de nombreuses prot ines sp cifiques pendant la synth se, le traitement et l'exportation de l'ARN (Figure 6-38). L'analyse qui vient d' tre d crite a t compl t e par de nouvelles m thodes qui permettent aux chercheurs de suivre le devenir de mol cules d'ARNm plus typiques, qui peuvent L'ARN tel qu'il merge de l'ARN polym rase Figure 6 36 Structure du noyau de l'exosome d'ARN humain. L'ARN est introduit une extr mit du pore central et est d grad par les ARN qui s'associent l'autre extr mit . Neuf sous-unit s prot iques diff rentes (chacune repr sent e par une couleur diff rente) composent cette grande structure annulaire. Les cellules eucaryotes ont la fois un un exosome et un exosome cytoplasmique ; les deux formes comprennent l'exosome central montr ici et des sous-unit s suppl mentaires (y compris des ARN sp cialis s) qui diff rencient les deux formes. L'exosome nucl aire d grade les ARN aberrants avant qu'ils ne soient export s vers le cytosol. Il traite galement certains types d'ARN (par exemple, les ARN ribosomiques) pour produire leur forme finale. La forme cytoplasmique de l'exosome est responsable de la d gradation des ARNm dans le cytosol, et
Biologie moléculaire de la cellule	est donc cruciale pour d terminer la dur e de vie de chaque mol cule d'ARNm. (Code PDB : 2NN6.) Figure 6 37 Transport d'une grosse mol cule d'ARNm travers le complexe de pores nucl aires. (A) La maturation d'une mol cule d'ARNm telle qu'elle est synth tis e par l'ARN polym rase et emball e par une vari t de prot ines nucl aires. Ce dessin d'un ARN d'insecte exceptionnellement grand et abondant, appel ARNm de l'anneau de Balbiani, est bas sur des micrographies au microscope lectronique telles que celle illustr e en (B). (A, adapt de B. Daneholt, Cell 88:585-588, 1997. Avec l'autorisation d'Elsevier ; B, d'apr s B.J. Stevens et H. Swift, J. Cell Biol. 31:55-77, 1966. Avec l'autorisation de The Rockefeller University Press.) tre marqu s par fluorescence et observ s individuellement. Une mol cule d'ARN typique est lib r e de son site de transcription et passe plusieurs minutes se diffuser vers un complexe de pores nucl aires. Pendant ce temps, il est probable que les v nements de traitement de l'ARN se poursuivent et que l'ARN se d barrasse des prot ines pr c demment li es et en acqui re de nouvelles. Une fois arriv l'entr e du pore, l'ARNm pr t l'exportation plane pendant plusieurs secondes, pendant lesquelles le traitement peut se terminer, puis est transport travers le pore tr s rapidement, en dizaines de millisecondes. Certains complexes ARNm-prot ines sont tr s grands, et la fa on dont ils se d placent si rapidement dans les complexes de pores nucl aires reste un myst re. Certaines des prot ines d pos es sur l'ARNm alors qu'il est encore dans le noyau peuvent affecter le destin de l'ARN apr s son transport vers le cytosol. Ainsi, la stabilit d'un ARNm dans le cytosol, l'efficacit avec laquelle il est traduit en prot ine et sa destination finale dans le cytosol peuvent toutes tre d termin es par des prot ines acquises dans le noyau qui restent li es l'ARN apr s qu'il a quitt le noyau. Mais avant de discuter de ce qui arrive aux ARNm dans le cytosol, nous consid rons bri vement comment se produisent la synth se et le traitement de certaines mol cules d'ARN non codantes. Il existe de nombreux types d'ARN non codants produits par les cellules (voir le tableau 6-1, p. 305), mais nous nous concentrons ici sur les ARNr, qui sont d'une importance cruciale pour la traduction des ARNm en prot ines. Les ARN non codants sont galement synth tis s et trait s dans le noyau Seulement quelques pour cent du poids sec d'une cellule de mammif re sont de l'ARN ; de ce nombre, seulement 3 5 % environ sont des ARNm. La majeure partie de l'ARN dans les cellules remplit des fonctions structurelles et catalytiques (voir tableau 6 1). Les ARN les plus abondants dans les cellules sont les ARN ribosomiques (ARNr), qui constituent environ 80 % de l'ARN dans les cellules division rapide. Comme nous le verrons plus loin dans ce chapitre, ces ARN forment le c ur du ribosome. Contrairement aux bact ries, dans lesquelles une seule ARN polym rase synth tise tous les ARN de la cellule, les eucaryotes ont une polym rase distincte et sp cialis e, l'ARN polym rase I, qui est d di e la production d'ARNr. L'ARN polym rase I est structurellement similaire l'ARN polym rase II dont il a t question pr c demment ; cependant, l'absence de queue C-terminale dans la polym rase I aide expliquer pourquoi ses transcrits ne sont ni coiff s ni polyad nyl s. tant donn que plusieurs cycles de traduction de chaque mol cule d'ARNm peuvent fournir une norme amplification dans la production de mol cules de prot ines, de nombreuses prot ines tr s abondantes dans une cellule peuvent tre synth tis es partir de g nes pr sents dans une seule copie par g nome haplo de (voir Figure 6-3). En revanche, les composants de l'ARN du ribosome sont des produits g niques finaux, et une cellule de mammif re en croissance doit synth tiser environ 10 millions de copies de chaque type d'ARN ribosomique dans chaque g n ration cellulaire pour construire ses 10 millions de ribosomes. La cellule ne peut produire des quantit s ad quates d'ARN ribosomiques que parce qu'elle contient plusieurs copies des g nes de l'ARNr qui codent pour les ARN ribosomiques (ARNr). M me E. coli a besoin de sept copies de ses g nes d'ARNr pour r pondre aux besoins de la cellule en ribosomes. Les cellules humaines contiennent environ 200 copies de g nes de l'ARNr par g nome haplo de, r parties Figure 6 38 Illustration sch matique d'une mol cule d'ARNm pr te l'exportation et de son transport travers les pores nucl aires. Comme indiqu , certaines prot ines voyagent avec l'ARNm lorsqu'il se d place dans les pores, tandis que d'autres restent dans le noyau. Le r cepteur d'exportation nucl aire des ARNm est un complexe de prot ines qui se lie une mol cule d'ARNm une fois qu'elle a t correctement piss e et polyad nyl e. Une fois que l'ARNm a t export vers le cytosol, ce r cepteur d'exportation se dissocie de l'ARNm et est r import dans le noyau, o
Biologie moléculaire de la cellule	il peut tre r utilis . La derni re v rification indiqu e ici, appel e d composition m di e par le non-sens, sera d crite plus loin dans le chapitre. en petits groupes sur cinq chromosomes diff rents (voir Figure 4-11), tandis que les cellules du X nope grenouille contiennent environ 600 copies de g nes d'ARNr par g nome haplo de dans un seul groupe sur un chromosome (Figure 6-39). Il existe quatre types d'ARNr eucaryotes, chacun pr sent dans une copie par ribosome. Trois des quatre ARNr (18S, 5.8S et 28S) sont fabriqu s en modifiant chimiquement et en clivant un seul ARNr pr curseur de grande taille (Figure 6 40) ; le quatri me (ARN 5S) est synth tis partir d'un groupe distinct de g nes par une polym rase diff rente, l'ARN polym rase III, et ne n cessite pas de modification chimique. D'importantes modifications chimiques se produisent dans l'ARNr pr curseur de 13 000 nucl otides de long avant que les ARNr ne soient cliv s et assembl s en ribosomes. Il s'agit notamment d'environ 100 m thylations des positions 2'-OH sur les sucres nucl otidiques et de 100 isom risations des nucl otides d'uridine en pseudouridine (Figure 6-41A). Les fonctions de ces modifications ne sont pas comprises en d tail, mais elles aident probablement au repliement et l'assemblage des ARNr finaux, ou modifient subtilement la fonction des ribosomes. Chaque modification est effectu e une position sp cifique dans l'ARNr pr curseur, sp cifi e par des ARN guides , qui se positionnent sur l'ARNr pr curseur par appariement de bases et am nent ainsi une enzyme modifiant l'ARN la position appropri e (Figure 6-41B). D'autres ARN guides favorisent le clivage des ARNr pr curseurs en ARNr matures, probablement en provoquant des changements conformationnels dans l'ARNr pr curseur qui exposent ces sites aux nucl ases. Tous ces ARN guides sont membres d'une grande classe d'ARN appel s petits ARN nucl olaires (ou snoARN), ainsi nomm s parce que ces ARN remplissent leurs fonctions dans un sous-compartiment du noyau appel nucl ole. De nombreux snoARN sont cod s dans 13 000 r gions d grad es de nucl otides de la s quence nucl otidique CLIVAGE ARNr 5.8S ARNr 28S ARNr 5S fabriqu ailleurs incorpor dans une grande sous-unit ribosomique Figure 6 39 Transcription partir de g nes d'ARNr dispos s en tandem, comme on le voit au microscope lectronique. Le mod le d'alternance de g nes transcrits et d'espaceurs non transcrits est facilement visible. La figure 6-10 montre une vue plus fort grossissement des g nes de l'ARNr. (D'apr s V.E. Foe, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 42:723-740, 1978. Avec l'autorisation de Cold Spring Harbor Laboratory Press.) Figure 6 40 La modification chimique et le traitement nucl olytique d'une mol cule d'ARNr pr curseur eucaryote 45S en trois ARN ribosomales distincts. Deux types de modifications chimiques (cod es par couleur comme indiqu dans la figure 6-41) sont apport es l'ARNr pr curseur avant qu'il ne soit cliv . Pr s de la moiti des s quences nucl otidiques de cet ARNr pr curseur sont limin es et d grad es dans le noyau par l'exosome. Les ARNr sont nomm s en fonction de leurs valeurs S , qui font r f rence leur vitesse de s dimentation dans une ultracentrifugeuse. Plus la valeur S est lev e, plus l'ARNr est grand. les introns d'autres g nes, en particulier ceux codant pour les prot ines ribosomiques. Ils sont synth tis s par l'ARN polym rase II et trait s partir de s quences d'introns excis es. Le nucl ole est une usine productrice de ribosomes Le nucl ole est la structure la plus vidente observ e dans le noyau d'une cellule eucaryote lorsqu'elle est observ e au microscope optique. Il a t examin de si pr s par les premiers cytologistes qu'une revue de 1898 aurait pu num rer quelque 700 r f rences. Nous savons maintenant que le nucl ole est le site du traitement des ARNr et de leur assemblage en sous-unit s de ribosomes. Contrairement la plupart des organites majeurs de la cellule, le nucl ole n'est pas li par une membrane (Figure 6-42) ; Au lieu de cela, il s'agit d'un norme agr gat Figure 6 41 Modifications de l'ARNr pr curseur par les ARN guides. (A) Deux modifications covalentes importantes apport es l'ARNr ; Les diff rences par rapport au nucl otide initialement incorpor sont indiqu es par des atomes rouges. La pseudouridine est un isom re de l'uridine ; la base a t tourn e et est attach e au C rouge plut t qu'au N rouge du sucre (comparer avec les figures 6 5B). (B) Comme indiqu , les snoARN d terminent les sites de modification par appariement de bases des s quences compl mentaires sur l'ARNr pr curseur. Les snoRNA sont li s des prot ines, et les complexes sont appel s snoRNP (petites ribonucl oprot ines nucl olaires). Les snoRNP contiennent la fois les s quences guides et les enzymes qui modifient l'ARNr. Figure 6-42 Micrographie lectronique d'une section mince d'un nucl ole dans un fibroblaste humain, montrant ses trois zones distinctes. (A) Vu
Biologie moléculaire de la cellule	e du noyau entier. Vue plus puissante du nucl ole. On pense que la transcription des g nes de l'ARNr a lieu entre le centre fibrillaire et la composante fibrillaire dense et que le traitement des ARNr et leur assemblage dans les deux sous-unit s du ribosome se d roulent vers l'ext rieur de la composante fibrillaire dense vers les composants granulaires environnants. (Avec l'aimable autorisation de E.G. Jordan et J. McGovern.) Figure 6 43 Changements dans l'apparence du nucl ole dans une cellule humaine au cours du cycle cellulaire. Seul le noyau cellulaire est repr sent dans ce sch ma. Dans la plupart des cellules eucaryotes, l'enveloppe nucl aire se d compose pendant la mitose, comme l'indiquent les cercles pointill s. de macromol cules, y compris les g nes de l'ARNr eux-m mes, les ARNr pr curseurs, les ARNr matures, les enzymes de traitement de l'ARNr, les snoRNP, un large ventail de facteurs d'assemblage (y compris les ATPases, les GTPases, les prot ines kinases et les h licases d'ARN), les prot ines ribosomiques et les ribosomes partiellement assembl s. L'association troite de tous ces composants permet l'assemblage des ribosomes de se produire rapidement et en douceur. Diff rents types de mol cules d'ARN jouent un r le central dans la chimie et la structure du nucl ole, ce qui sugg re qu'il pourrait avoir volu partir d'une structure ancienne pr sente dans les cellules domin es par la catalyse de l'ARN. Dans les cellules actuelles, les g nes de l'ARNr jouent un r le important dans la formation du nucl ole. Dans une cellule humaine diplo de, les g nes de l'ARNr sont r partis en 10 groupes, situ s pr s des extr mit s de cinq paires de chromosomes diff rentes (voir Figure 4-11). Pendant l'interphase, ces 10 chromosomes contribuent des boucles d'ADN (contenant les g nes de l'ARNr) au nucl ole ; dans Phase M, lorsque les chromosomes se condensent, le nucl ole se fragmente puis dispara t. Ensuite, dans la partie t lophas e de la mitose, lorsque les chromosomes retournent leur tat semi-dispers , les extr mit s des 10 chromosomes reforment de petits nucl oles, qui fusionnent progressivement en un seul nucl ole (Figure 6-43 et Figure 6-44). Comme on peut s'y attendre, la taille du nucl ole refl te le nombre de ribosomes que la cellule produit. Sa taille varie donc consid rablement d'une cellule l'autre et peut changer dans une seule cellule, occupant 25 % du volume nucl aire total des cellules qui produisent des quantit s inhabituellement lev es de prot ines. L'assemblage des ribosomes est un processus complexe, dont les caract ristiques les plus importantes sont d crites dans la figure 6 45. En plus de son r le central dans la biogen se des ribosomes, le nucl ole est le site o d'autres ARN non codants sont produits et d'autres Des complexes ARN-prot ines sont assembl s. Par exemple, le snRNP U6, qui fonctionne dans l' pissage des pr -ARNm (voir figure 6-28), est compos d'une mol cule d'ARN et d'au moins sept prot ines. Le snRNA U6 est chimiquement modifi par les snoRNA dans le nucl ole avant son assemblage final dans le snRNP U6. D'autres complexes ARN-prot ines importants, y compris la t lom rase (rencontr e au chapitre 5) et la particule de reconnaissance du signal (que nous abordons au chapitre 12), sont assembl s au niveau du nucl ole. Enfin, les ARNt (ARN de transfert) qui transportent les acides amin s pour la synth se des prot ines y sont galement trait s ; comme les g nes de l'ARNr, les g nes codant pour les ARNt sont regroup s dans le nucl ole. Ainsi, le nucl ole peut tre consid r comme une grande usine dans laquelle diff rents ARN non codants sont transcrits, trait s et assembl s avec des prot ines pour former une grande vari t de complexes ribonucl oprot iques. Figure 6 44 Fusion nucl olaire. Ces micrographies optiques de fibroblastes humains cultiv s en culture montrent diff rents stades de fusion nucl olaire. Apr s la mitose, chacun des 10 chromosomes humains qui portent un groupe de g nes d'ARNr commence former un minuscule nucl ole, mais ceux-ci fusionnent rapidement au fur et mesure qu'ils se d veloppent pour former le grand nucl ole unique typique de nombreuses cellules interphasiques. (Avec l'aimable autorisation de E.G. Jordan et J. McGovern.)Le noyau contient une vari t d'agr gats subnucl aires Bien que le nucl ole soit la structure la plus pro minente du noyau, plusieurs autres corps nucl aires ont t observ s et tudi s (figures 6-46). Il s'agit notamment des corps de Cajal (du nom du scientifique qui les a d crits pour la premi re fois en 1906) et des amas de granules interchromatiniens ( galement appel s taches ). Comme le nucl ole, ces autres structures nucl aires sont d pourvues de membranes et sont tr s dynamiques en fonction des besoins de la cellule. Leur assemblage est probablement m di par l'association de domaines prot iques de faible complexit , comme d crit au chapitre 3 (voir Figure 3-36). Leur apparition est le r sultat de l'ass
Biologie moléculaire de la cellule	ociation troite de composants prot iques et ARN impliqu s dans la synth se, l'assemblage et le stockage des macromol cules impliqu es dans l'expression des g nes. Les corps de Cajal sont des sites o les snRNP et les snoRNP subissent leurs derni res tapes de maturation, et o les snRNP sont recycl s et leurs ARN sont r initialis s apr s les r arrangements qui se produisent lors de l' pissage (voir p. 321). En revanche, il a t propos que les grappes de granules d'interchromatine soient des stocks de snRNP enti rement matures et d'autres composants de traitement de l'ARN pr ts tre utilis s dans la production d'ARNm. Les scientifiques ont eu des difficult s d terminer la fonction de ces petites structures subnucl aires, en partie parce que leur apparence peut changer radicalement lorsque les cellules traversent le cycle cellulaire ou r agissent aux changements de leur environnement. En outre Figure 6 45 La fonction du nucl ole dans la synth se des ribosomes et d'autres ribonucl oprot ines. L'ARNr pr curseur de la 45S est emball dans une grande particule de ribonucl oprot ine contenant de nombreuses prot ines ribosomales import es du cytoplasme. Tant que cette particule reste au niveau du nucl ole, des composants s lectionn s sont ajout s et d'autres sont limin s au fur et mesure qu'elle est transform e en sous-unit s ribosomales immatures, grandes et petites. Les deux sous-unit s ribosomiques n'atteignent leur forme fonctionnelle finale qu'apr s avoir t transport es individuellement travers les pores nucl aires dans le cytoplasme. D'autres complexes ribonucl oprot iques, y compris la t lom rase montr e ici, sont galement assembl s dans le nucl ole. Figure 6 46 Visualisation de certains corps nucl aires importants. La prot ine fibrillarine (rouge), un composant de plusieurs snoRNP, est pr sente la fois dans les nucl oles et les corps de Cajal ; Ces derniers sont indiqu s par les fl ches. Les corps de Cajal (mais pas les nucl oles) sont galement mis en vidence par la coloration de l'un de leurs principaux composants, le bobine prot ique ; la superposition des taches snoRNP et coilin appara t rose. Des amas de granules d'interchromatine (vert) ont t mis en vidence en utilisant des anticorps contre une prot ine impliqu e dans l' pissage du pr -ARNm. L'ADN est color en bleu par le colorant DAPI. (D'apr s J.R. Swedlow et A.I. Lamond, Gen. Biol. 2:1-7, 2001. Avec l'autorisation de BioMed Central. Micrographie avec l'aimable autorisation de Judith Sleeman.) La perturbation d'un type particulier de corps nucl aire a souvent peu d'effet sur la viabilit cellulaire. Il semble que la fonction principale de ces agr gats soit de rassembler des composants haute concentration afin d'acc l rer leur assemblage. Par exemple, on estime que l'assemblage du snRNP U4/U6 (voir Figure 6-28) se produit dix fois plus rapidement dans les corps Cajal que ce ne serait le cas si le m me nombre de composants tait dispers dans tout le noyau. Par cons quent, les corps de Cajal semblent dispensables dans de nombreux types de cellules, mais sont absolument n cessaires dans des situations o les cellules doivent prolif rer rapidement, comme dans le d veloppement pr coce des vert br s. Ici, la synth se des prot ines (qui d pend de l' pissage de l'ARN) doit tre particuli rement rapide, et les retards peuvent tre mortels. tant donn la pr dominance des corps nucl aires dans le traitement de l'ARN, on pourrait s'attendre ce que l' pissage pr -ARNm se produise un endroit particulier du noyau, car il n cessite de nombreux composants d'ARN et de prot ines. Cependant, comme nous l'avons vu, l'assemblage des composants d' pissage sur le pr -ARNm est co-transcriptionnel ; Ainsi, l' pissage doit se produire de nombreux endroits le long des chromosomes. Bien qu'une cellule de mammif re typique puisse s'exprimer de l'ordre de 15 000 g nes, la transcription et l' pissage de l'ARN n'ont lieu que dans quelques milliers de sites du noyau. Ces sites sont tr s dynamiques et r sultent probablement de l'association de composants de transcription et d' pissage pour cr er de petites usines, nom donn des agr gats sp cifiques contenant une forte concentration locale de composants s lectionn s qui cr ent des cha nes d'assemblage biochimiques (Figure 6 47). Queue interchromatinienne de l'ARN polym rase Figure 6 47 Mod le d'une usine de production d'ARNm. La production d'ARNm est rendue plus efficace dans le noyau par une agr gation des nombreux composants n cessaires la transcription et au traitement des pr -ARNm, produisant ainsi une usine biochimique sp cialis e. En (A), une prot ine d' chafaudage postul e contient divers composants proximit d'une ARN polym rase transcrite. D'autres composants cl s sont li s directement la queue de l'ARN polym rase, qui sert galement d' chafaudage (voir Figure 6-22), mais pour simplifier, ils ne sont pas illustr s ici. Dans (B), un grand nombre de ces chafaudages ont t rasse
Biologie moléculaire de la cellule	mbl s pour former un agr gat fortement enrichi en nombreux composants n cessaires la synth se et au traitement des pr -ARNm. Un tel mod le d' chafaudage peut tenir compte des plusieurs milliers de sites de transcription et de traitement actifs de l'ARN g n ralement observ s dans le noyau d'une cellule de mammif re, chacun d'entre eux ayant un diam tre d'environ 100 nm et on estime qu'il contient, en moyenne, environ 10 mol cules d'ARN polym rase II en plus de nombreuses autres prot ines. (C) Ici, les usines de production d'ARNm et les usines de r plication de l'ADN ont t visualis es dans la m me cellule de mammif re en incorporant bri vement des nucl otides modifi s diff remment dans chaque acide nucl ique et en d tectant l'ARN et l'ADN produits l'aide d'anticorps, l'un (vert) d tectant l'ADN nouvellement synth tis et l'autre (rouge) d tectant l'ARN nouvellement synth tis . (C, d'apr s D.G. Wansink et al., J. Cell Sci. 107:1449-1456, 1994. Avec la permission de la Compagnie des biologistes.) Des amas de granules, qui contiennent des stocks de composants de traitement de l'ARN, sont souvent observ s c t de ces sites de transcription, comme s'ils taient pr ts reconstituer les r serves. Nous pouvons donc voir le noyau comme organis en sous-domaines, avec des snRNP, des snoRNP et d'autres composants nucl aires se d pla ant entre eux de mani re ordonn e en fonction des besoins de la cellule. Avant que la synth se d'une prot ine particuli re puisse commencer, la mol cule d'ARNm correspondante doit tre produite par transcription. Les bact ries contiennent un seul type d'ARN polym rase (l'enzyme qui effectue la transcription de l'ADN en ARN). Une mol cule d'ARNm est produite apr s que cette enzyme a initi la transcription au niveau d'un promoteur, synth tis l'ARN par longation en cha ne, arr t la transcription au niveau d'un terminateur et lib r la fois la matrice d'ADN et la mol cule d'ARNm termin e. Dans les cellules eucaryotes, le processus de transcription est beaucoup plus complexe, et il existe trois ARN polym rases la polym rase I, II et III qui sont li es volutivement les unes aux autres et la polym rase bact rienne. L'ARN polym rase II synth tise l'ARNm eucaryote. Cette enzyme a besoin d'un ensemble de prot ines suppl mentaires, la fois les facteurs de transcription g n raux et les prot ines activatrices transcriptionnelles sp cifiques, pour initier la transcription sur un mod le d'ADN. Il a besoin d'encore plus de prot ines (y compris des complexes de remodelage de la chromatine et des enzymes modifiant les histones) pour initier la transcription sur ses matrices de chromatine l'int rieur de la cellule. Au cours de la phase d' longation de la transcription, l'ARN naissant subit trois types d' v nements de traitement : un nucl otide sp cial est ajout son extr mit 5 (coiffement), les s quences d'intron sont retir es du milieu de la mol cule d'ARN ( pissage) et l'extr mit 3 de l'ARN est g n r e (clivage et polyad nylation). Chacun de ces processus est initi par des prot ines qui voyagent avec l'ARN polym rase II en se liant des sites sur sa longue queue C-terminale allong e. L' pissage est inhabituel en ce sens que bon nombre de ses tapes cl s sont r alis es par des mol cules d'ARN sp cialis es plut t que par des prot ines. Seuls les ARNm correctement trait s sont pass s travers les complexes de pores nucl aires dans le cytosol, o ils sont traduits en prot ines. Pour de nombreux g nes, c'est l'ARN, plut t que les prot ines, qui est le produit final. Chez les eucaryotes, ces g nes sont g n ralement transcrits soit par l'ARN polym rase I, soit par l'ARN polym rase III. L'ARN polym rase I fabrique les ARN ribosomiques. Apr s leur synth se en tant que grand pr curseur, les ARNr sont chimiquement modifi s, cliv s et assembl s en deux sous-unit s ribosomiques dans le nucl ole une structure subnucl aire distincte qui aide galement traiter certains complexes ARN-prot ines plus petits dans la cellule. D'autres structures subnucl aires (y compris les corps de Cajal et les amas de granules d'interchromatine) sont des sites o les composants impliqu s dans le traitement de l'ARN sont assembl s, stock s et recycl s. La forte concentration de composants dans ces usines garantit que les processus catalys s sont rapides et efficaces. Dans la section pr c dente, nous avons vu que le produit final de certains g nes est une mol cule d'ARN elle-m me, comme les ARN pr sents dans les snRNP et dans les ribosomes. Cependant, la plupart des g nes d'une cellule produisent des mol cules d'ARNm qui servent d'interm diaires sur la voie des prot ines. Dans cette section, nous examinons comment la cellule convertit l'information contenue dans une mol cule d'ARNm en une mol cule prot ique. Cet exploit de traduction a t un grand centre d'attention pour les biologistes la fin des ann es 1950, lorsqu'il a t pos comme le probl me de codage : comment l'information dans une
Biologie moléculaire de la cellule	s quence lin aire de nucl otides dans l'ARN est-elle traduite dans la s quence lin aire d'un ensemble d'unit s chimiquement tr s diff rent les acides amin s dans les prot ines ? Cette question fascinante a suscit une grande excitation. Il s'agissait d'un cryptogramme mis en place par la nature qui, apr s plus de 3 milliards d'ann es d' volution, a finalement pu tre r solu par l'un des produits de l' volution : les tres humains. Et en effet, non seulement le code a t d chiffr tape par tape, mais en l'an 2000, la structure de la machinerie labor e par laquelle les cellules lisent ce code le ribosome a finalement t r v l e dans les moindres d tails. Une s quence d'ARNm est d cod e en ensembles de trois nucl otides Une fois qu'un ARNm a t produit par transcription et traitement, l'information pr sente dans sa s quence nucl otidique est utilis e pour synth tiser une prot ine. La transcription est simple comprendre en tant que moyen de transfert d'information : l'ADN et l'ARN tant chimiquement et structurellement similaires, l'ADN peut agir comme un mod le direct pour la synth se de l'ARN par appariement de bases compl mentaires. Comme le terme transcription l'indique, c'est comme si un message crit la main tait converti, par exemple, en un texte dactylographi . Le langage lui-m me et la forme du message ne changent pas, et les symboles utilis s sont troitement li s. En revanche, la conversion de l'information de l'ARN en prot ine repr sente une traduction de l'information dans une autre langue qui utilise des symboles tr s diff rents. De plus, comme il n'y a que 4 nucl otides diff rents dans l'ARNm et 20 types diff rents d'acides amin s dans une prot ine, cette traduction ne peut pas tre expliqu e par une correspondance directe biunivoque entre un nucl otide dans l'ARN et un acide amin dans la prot ine. La s quence nucl otidique d'un g ne, par l'interm diaire de l'ARNm, est plut t traduite en s quence d'acides amin s d'une prot ine par des r gles connues sous le nom de code g n tique. Ce code a t d chiffr au d but des ann es 1960. La s quence des nucl otides dans la mol cule d'ARNm est lue en groupes cons cutifs de trois. L'ARN est un polym re de quatre nucl otides diff rents, il y a donc 4 4 4 = 64 combinaisons possibles de trois nucl otides : les triplets AAA, AUA, AUG, etc. Cependant, seuls 20 acides amin s diff rents se trouvent couramment dans les prot ines. Soit certains triplets de nucl otides ne sont jamais utilis s, soit le code est redondant et certains acides amin s sont sp cifi s par plus d'un triplet. La deuxi me possibilit est, en fait, la bonne, comme le montre le code g n tique compl tement d chiffr de la figure 6-48. Chaque groupe de trois nucl otides cons cutifs dans l'ARN est appel un codon, et chaque codon sp cifie soit un acide amin , soit un arr t du processus de traduction. Ce code g n tique est utilis universellement dans tous les organismes actuels. Bien que quelques l g res diff rences dans le code aient t trouv es, celles-ci concernent principalement l'ADN des mitochondries. Les mitochondries ont leurs propres syst mes de transcription et de synth se des prot ines qui fonctionnent tout fait ind pendamment de ceux du reste de la cellule, et il est compr hensible que leurs minuscules g nomes aient t capables d'accueillir des modifications mineures du code (discut au chapitre 14). En principe, une s quence d'ARN peut tre traduite dans l'un des trois cadres de lecture diff rents, en fonction de l'endroit o commence le processus de d codage (Figure 6 49). Cependant, un seul des trois cadres de lecture possibles dans un ARNm code pour la prot ine requise. Nous verrons plus loin comment un signal de ponctuation sp cial au d but de chaque message d'ARN d finit le cadre de lecture correct au d but de la synth se des prot ines. Les mol cules d'ARNt associent les acides amin s aux codons de l'ARNm Les codons d'une mol cule d'ARNm ne reconnaissent pas directement les acides amin s qu'ils sp cifient : le groupe de trois nucl otides ne se lie pas, par exemple, directement l'acide amin . Au contraire, la traduction de l'ARNm en prot ine d pend de mol cules adaptatrices qui peuvent reconna tre et se lier la fois au codon et, un autre endroit de leur surface, l'acide amin . Ces adaptateurs sont constitu s d'un ensemble de petites mol cules d'ARN appel es ARN de transfert (ARNt), chacune d'une longueur d'environ 80 nucl otides. Figure 6 48 Le code g n tique. L'abr viation standard d'une lettre pour chaque acide amin est pr sent e sous son abr viation de trois lettres (voir le panneau 3-1, pp. 112-113, pour le nom complet de chaque acide amin et sa structure). Par convention, les codons sont toujours crits avec le nucl otide 5-terminal gauche. Notez que la plupart des acides amin s sont repr sent s par plus d'un codon, et qu'il y a quelques r gularit s dans l'ensemble des codons qui sp cifie chaque acide amin : les codons d'un m me
Biologie moléculaire de la cellule	acide amin ont tendance contenir les m mes nucl otides en premi re et deuxi me positions, et varient en troisi me position. Trois codons ne sp cifient aucun acide amin mais agissent comme des sites de terminaison (codons d'arr t), signalant la fin de la s quence codant pour les prot ines. Un codon, AUG, agit la fois comme un codon d'initiation, signalant le d but d'un message codant pour une prot ine, et aussi comme le codon qui sp cifie la m thionine. Figure 6 49 Les trois cadres de lecture possibles dans la synth se des prot ines. Dans le processus de traduction d'une s quence de nucl otides (en bleu) en une s quence d'acides amin s (en rouge), la s quence de nucl otides d'une mol cule d'ARNm est lue de l'extr mit 5 l'extr mit 3 en ensembles cons cutifs de trois nucl otides. En principe, la m me s quence d'ARN peut donc sp cifier trois s quences d'acides amin s compl tement diff rentes, en fonction du cadre de lecture. En r alit , cependant, un seul de ces cadres de lecture contient le message r el. Figure 6 50 Une mol cule d'ARNt. Un ARNt sp cifique de l'acide amin ph nylalanine (Phe) est repr sent de diff rentes mani res. (A) La structure en tr fle montrant l'appariement de bases compl mentaires (lignes rouges) qui cr e les r gions double h lice de la mol cule. L'anticodon est la s quence de trois nucl otides qui s'apparient un codon dans l'ARNm. L'acide amin correspondant la paire codon/anticodon est attach l'extr mit 3 de l'ARNt. Les ARNt contiennent des bases inhabituelles, qui sont produites par modification chimique apr s la synth se de l'ARNt. Par exemple, les bases not es (pseudouridine (voir figure 6-41) et D (dihydrouridine (voir figure 6-53) sont d riv es de l'uracile. (B et C) Vues de la mol cule en forme de L, bas sur l'analyse de la diffraction des rayons X. Bien que ce sch ma montre l'ARNt de l'acide amin ph nylalanine, tous les autres ARNt ont des structures similaires. (D) L'ic ne de l'ARNt que nous utilisons dans ce livre. (E) La s quence nucl otidique lin aire de la mol cule, cod e par couleur pour correspondre (A), (B) et (C). Nous avons vu plus t t dans ce chapitre que les mol cules d'ARN peuvent se replier en structures tridimensionnelles pr cises, et les mol cules d'ARNt en fournissent un exemple frappant. Quatre courts segments de l'ARNt repli sont double h lice, produisant une mol cule qui ressemble un tr fle lorsqu'elle est dessin e sch matiquement (Figure 6 50). Par exemple, une s quence 5'-GCUC-3' dans une partie d'une cha ne polynucl otidique peut former une association relativement forte avec une s quence 5'-GAGC-3' dans une autre r gion de la m me mol cule. Le tr fle subit d'autres plis pour former une structure compacte en forme de L qui est maintenue ensemble par des liaisons hydrog ne suppl mentaires entre diff rentes r gions de la mol cule (voir les figures 6 50B et C). Deux r gions de nucl otides non appari s situ es chaque extr mit de la mol cule en forme de L sont cruciales pour la fonction de l'ARNt dans la synth se des prot ines. L'une de ces r gions forme l'anticodon, un ensemble de trois nucl otides cons cutifs qui s'apparient au codon compl mentaire d'une mol cule d'ARNm. L'autre est une courte r gion monocat naire l'extr mit 3 de la mol cule ; c'est le site o l'acide amin qui correspond au codon est attach l'ARNt. Nous avons vu plus haut que le code g n tique est redondant ; C'est- -dire que plusieurs codons diff rents peuvent sp cifier un seul acide amin . Cette redondance implique soit qu'il existe plus d'un ARNt pour de nombreux acides amin s, soit que certaines mol cules d'ARNt peuvent s'apparier avec plus d'un codon. En fait, les deux situations se produisent. Certains acides amin s ont plus d'un ARNt, et certains ARNt sont construits de telle sorte qu'ils ne n cessitent un appariement pr cis des bases qu'aux deux premi res positions du codon et peuvent tol rer une discordance (ou oscillation) la troisi me position (Figure 6 51). Cet appariement de bases oscillantes explique pourquoi tant de codons alternatifs pour un acide amin ne diff rent que par leur troisi me nucl otide (voir Figure 6-48). Chez les bact ries, les appariements de bases oscillantes permettent d'ajuster les 20 acides amin s leurs 61 codons avec comme Figure 6 51 Appariement des bases oscillantes entre les codons et les anticodons. Si le nucl otide r pertori dans la premi re colonne est pr sent la troisi me position, ou vacille, du codon, il peut s'apparier avec n'importe lequel des nucl otides num r s dans la deuxi me colonne. Ainsi, par exemple, lorsque l'inosine (I) est pr sente dans la position d'oscillation de l'anticodon de l'ARNt, l'ARNt peut reconna tre l'un des trois codons diff rents chez les bact ries et l'un des deux codons chez les eucaryotes. L'inosine contenue dans les ARNt est form e partir de la d samination de l'ad nosine (voir Figure 6-53), une modification chimique qui a lieu apr s la synth se de l'ARNt.
Biologie moléculaire de la cellule	Les paires de bases non standard, y compris celles fabriqu es avec de l'inosine, sont g n ralement plus faibles que les paires de bases conventionnelles. L'appariement de bases codon-anticodon est plus strict aux positions 1 et 2 du codon, o seules les paires de bases conventionnelles sont autoris es. Les diff rences dans les interactions d'appariement des bases oscillantes entre les bact ries et les eucaryotes r sultent probablement de diff rences structurelles subtiles entre les ribosomes bact riens et eucaryotes, les machines mol culaires qui effectuent la synth se des prot ines. (Adapt de C. Guthrie et J. Abelson, dans La biologie mol culaire de la levure Saccharomyces : m tabolisme et expression des g nes, pp. 487-528. Cold Spring Harbor, New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982.) peu de 31 types de mol cules d'ARNt. Le nombre exact de diff rents types d'ARNt diff re toutefois d'une esp ce l'autre. Par exemple, les humains ont pr s de 500 g nes d'ARNt, et parmi eux 48 anticodons diff rents sont repr sent s. Les ARNt sont modifi s de mani re covalente avant de sortir du noyau Comme la plupart des autres ARN eucaryotes, les ARNt sont modifi s de mani re covalente avant d' tre autoris s sortir du noyau. Les ARNt eucaryotes sont synth tis s par l'ARN polym rase III. Les ARNt bact riens et eucaryotes sont g n ralement synth tis s sous forme d'ARNt pr curseurs plus gros, qui sont ensuite coup s pour produire l'ARNt mature. De plus, certains pr curseurs de l'ARNt (provenant la fois de bact ries et d'eucaryotes) contiennent des introns qui doivent tre piss s dehors. Cette r action d' pissage diff re chimiquement de l' pissage pr -ARNm ; plut t que de g n rer un interm diaire lariat, l' pissage de l'ARNt utilise un m canisme de copier-coller qui est catalys par des prot ines (Figure 6 52). Le rognage et l' pissage n cessitent tous deux que l'ARNt pr curseur soit correctement pli dans sa configuration en tr fle. tant donn que les pr curseurs d'ARNt mal repli s ne seront pas trait s correctement, les r actions de parage et d' pissage servent d' tapes de contr le de la qualit dans la g n ration d'ARNt. Tous les ARNt sont modifi s chimiquement pr s de 1 nucl otide sur 10 dans chaque mol cule d'ARNt mature est une version modifi e d'un ribonucl otide standard G, U, C ou A. Plus de 50 types diff rents de modifications de l'ARNt sont connus ; quelques-uns sont illustr s aux figures 6 53. Certains des nucl otides modifi s, notamment l'inosine, produite par la d samination de l'ad nosine, affectent la conformation et l'appariement des bases de l'anticodon et facilitent ainsi la reconnaissance du codon d'ARNm appropri par la mol cule d'ARNt (voir Figure 6 51). D'autres affectent la pr cision avec laquelle l'ARNt est attach l'acide amin correct. Des enzymes sp cifiques couplent chaque acide amin sa mol cule d'ARNt appropri e Nous avons vu que, pour lire le code g n tique de l'ADN, les cellules fabriquent une s rie d'ARNt diff rents. Nous consid rons maintenant comment chaque mol cule d'ARNt est li e l'acide amin sur 20 qui est son partenaire appropri . La reconnaissance et la fixation de l'acide amin correct d pendent d'enzymes appel es aminoacyl-ARNt synth tases, qui couplent de mani re covalente chaque acide amin son ensemble appropri de mol cules d'ARNt (Figure 6 54 et Figure 6 55). La plupart des cellules ont une enzyme synth tase diff rente pour chaque acide amin (c'est- -dire 20 synth tases en tout) ; l'un attache la glycine tous les ARNt qui reconnaissent les codons de la glycine, un autre attache l'alanine tous les ARNt qui reconnaissent les codons de l'alanine, et ainsi de suite. Cependant, de nombreuses bact ries ont moins de 20 synth tases, et la m me enzyme synth tase est responsable du couplage de plus d'un acide amin aux ARNt appropri s. Dans ces cas, une seule synth tase place l'acide amin identique sur deux types diff rents d'ARNt, dont un seul fait osciller le codon des bases anticodons possibles U A, G ou I C G ou I A U ou I G C ou U codon oscillant les bases anticodons possibles U A, G, ou I C G ou I AU GC Figure 6 52 Structure d'une endonucl ase d' pissage d'ARNt arrim e un ARNt pr curseur. L'endonucl ase (une enzyme quatre sous-unit s) limine l'intron de l'ARNt (bleu fonc , en bas). Une deuxi me enzyme, une ARNt ligase multifonctionnelle (non illustr e), relie ensuite les deux moiti s de l'ARNt. (Avec l'aimable autorisation de Hong Li, Christopher Trotta et John Abelson ; Code PDB : 2A9L.) ribose HHNNNNNCH3CH3ribose HNNOHHHHHribose HNNSOHHdeux groupes m thyle ajout s G (N,N-dim thyl G) deux hydrog nes ajout s U (dihydro U) ribose HNNNNNHHOd samination de A (inosine) soufre remplace l'oxyg ne dans U (4-thiouridine) P P P P a un anticodon qui correspond l'acide amin . Une deuxi me enzyme modifie ensuite chimiquement chaque acide amin mal attach de sorte qu'il correspond maintenant l'anticodon affich par son ARNt li de
Biologie moléculaire de la cellule	mani re covalente. La r action catalys e par la synth tase qui attache l'acide amin l'extr mit 3 de l'ARNt est l'une des nombreuses r actions coupl es l'hydrolyse de l'ATP (voir pp. 64-65), et elle produit une liaison haute nergie entre l'ARNt et l'acide amin . L' nergie de cette liaison est utilis e un stade ult rieur de la synth se des prot ines pour lier l'acide amin de mani re covalente la cha ne polypeptidique en croissance. Les enzymes aminoacyl-ARNt synth tase et les ARNt sont tout aussi importants dans le processus de d codage (Figure 6 56). C'est ce qu'a fait une exp rience men e dans le cadre d'une Figure 6 54 Activation des acides amin s par les enzymes synth tases. Un acide amin est activ pour la synth se des prot ines par une enzyme aminoacyl-ARNt synth tase en deux tapes. Comme indiqu , l' nergie de l'hydrolyse de l'ATP est utilis e pour attacher chaque acide amin sa mol cule d'ARNt dans une liaison haute nergie. L'acide amin est d'abord activ par la liaison de son groupe carboxyle directement l'AMP, formant un acide amin ad nyl ; la liaison de l'AMP, normalement une r action d favorable, est entra n e par l'hydrolyse de la mol cule d'ATP qui donne l'AMP. Sans quitter l'enzyme synth tase, le groupe carboxyle li l'AMP sur l'acide amin est ensuite transf r un groupe hydroxyle sur le sucre l'extr mit 3 de la mol cule d'ARNt. Ce transfert relie l'acide amin par une liaison ester activ e l'ARNt et forme la mol cule finale d'aminoacyl-ARNt. L'enzyme synth tase n'est pas repr sent e sur ce sch ma. Figure 6 53 Quelques-uns des nucl otides inhabituels trouv s dans les mol cules d'ARNt. Ces nucl otides sont produits par modification covalente d'un nucl otide normal apr s qu'il a t incorpor dans une cha ne d'ARN. Deux autres types de nucl otides modifi s sont illustr s la figure 6-41. Dans la plupart des mol cules d'ARNt, environ 10 % des nucl otides sont modifi s (voir Figure 6-50). Comme le montre la figure 6-51, l'inosine est parfois pr sente en position d'oscillation dans l'anticodon de l'ARNt. lequel acide amin (cyst ine) a t chimiquement converti en un acide amin diff rent (alanine) apr s avoir d j t attach son ARNt sp cifique. Lorsque de telles mol cules hybrides d'aminoacyl-ARNt ont t utilis es pour la synth se de prot ines dans un syst me acellulaire, le mauvais acide amin a t ins r chaque point de la cha ne prot ique o cet ARNt a t utilis . Bien que, comme nous le verrons, les cellules disposent de plusieurs m canismes de contr le de la qualit pour viter ce type d'incident, l'exp rience a tabli que le code g n tique est traduit par deux ensembles d'adaptateurs qui agissent de mani re s quentielle. Chacun d'entre eux associe une surface mol culaire une autre avec une grande sp cificit , et c'est leur action combin e qui associe chaque s quence de trois nucl otides de la mol cule d'ARNm, c'est- -dire chaque codon, son acide amin particulier. Plusieurs m canismes travaillant ensemble garantissent qu'une aminoacyl-ARNt synth tase relie l'acide amin correct chaque ARNt. La plupart des enzymes synth tases s lectionnent le bon acide amin par un m canisme en deux tapes. L'acide amin correct a la plus grande affinit pour la poche du site actif de sa synth tase et est donc favoris par rapport aux 19 autres ; En particulier, les acides amin s plus gros que le bon sont exclus du site actif. Cependant, la discrimination pr cise entre deux acides amin s similaires, tels que l'isoleucine et la valine (qui ne diff rent que par une liaison m thyle de l'acide amin l'ARNt, Figure 6 55 La structure de la liaison aminoacyl-ARNt. L'extr mit carboxyle de l'acide amin forme une liaison ester avec le ribose. Parce que l'hydrolyse de cette liaison ester est associ e un changement important et favorable de l' nergie libre, on dit qu'un acide amin ainsi contenu est activ . Dessin sch matique de la structure. L'acide amin est li au nucl otide l'extr mit 3 de l'ARNt (voir Figure 6-50). Structure r elle correspondant la r gion encadr e en (A). Il existe deux grandes classes d'enzymes synth tases : l'une lie directement l'acide amin au groupe 3-OH du ribose, et l'autre le lie initialement au groupe 2-OH. Dans ce dernier cas, une r action de transest rification ult rieure d place l'acide amin en position 3. Comme sur la figure 6-54, le groupe R indique la cha ne lat rale de l'acide amin . Figure 6 56 Le code g n tique est traduit au moyen de deux adaptateurs qui agissent l'un apr s l'autre. Le premier adaptateur est l'aminoacyl-ARNt synth tase, qui couple un acide amin particulier son ARNt correspondant ; le deuxi me adaptateur est la mol cule d'ARNt elle-m me, dont l'anticodon forme des paires de bases avec le codon appropri sur l'ARNm. Une erreur dans l'une ou l'autre des tapes entra nerait l'incorporation du mauvais acide amin dans une cha ne prot ique (vid o 6.6). Dans la s quence d' v nements illus
Biologie moléculaire de la cellule	tr e, l'acide amin tryptophane (Trp) est s lectionn par le codon UGG sur l'ARNm. groupe), est tr s difficile r aliser en une seule tape. Une deuxi me tape de discrimination se produit apr s que l'acide amin a t li de mani re covalente l'AMP (voir Figure 6-54) : lorsque l'ARNt se lie, la synth tase tente de forcer l'acide amin ad nyl dans une deuxi me poche d' dition de l'enzyme. Les dimensions pr cises de cette poche excluent l'acide amin correct, tout en permettant l'acc s des acides amin s troitement apparent s. Dans la poche d' dition, un acide amin est retir de l'AMP (ou de l'ARNt lui-m me si la liaison aminoacyl-ARNt s'est d j form e) par hydrolyse. Cette dition hydrolytique, qui est analogue la relecture exonucl olytique par les ADN polym rases, augmente la pr cision globale de la charge de l'ARNt environ une erreur sur 40 000 couplages (Figure 6-57). L'ARNt synth tase doit galement reconna tre le bon ensemble d'ARNt, et la compl mentarit structurelle et chimique tendue entre la synth tase et l'ARNt permet la synth tase de sonder diverses caract ristiques de l'ARNt (Figure 6 58). La plupart des ARNt synth tases reconnaissent directement l'anticodon de l'ARNt correspondant ; Ces synth tases contiennent trois poches adjacentes de liaison aux nucl otides, chacune d'entre elles tant compl mentaire en forme et en charge un nucl otide de l'anticodon. Pour d'autres synth tases, la s quence nucl otidique du bras acceptant les acides amin s (tige accepteur) est le principal d terminant de la reconnaissance. Dans la plupart des cas, cependant, la synth tase lit les nucl otides plusieurs positions diff rentes sur l'ARNt. Les acides amin s sont ajout s l'extr mit C-terminale d'une cha ne polypeptidique en croissance Apr s avoir vu que chaque acide amin est d'abord coupl des mol cules d'ARNt sp cifiques, nous nous tournons maintenant vers le m canisme qui relie ces acides amin s pour former des prot ines. La r action fondamentale de la synth se des prot ines est la formation d'une liaison peptidique entre le groupe carboxyle la fin d'une cha ne polypeptidique en croissance et un groupe amino libre sur un acide amin entrant. Par cons quent, une prot ine est synth tis e par tapes de son extr mit N-terminale son extr mit C-terminale. Tout au long du processus, l'extr mit carboxyle croissante de la cha ne polypeptidique reste activ e par sa fixation covalente une mol cule d'ARNt (formant un peptidyl-ARNt). Chaque Figure 6 57 dition hydrolytique. Les aminoacyl tRNA synth tases corrigent leurs propres erreurs de couplage par l' dition hydrolytique d'acides amin s mal fix s. Comme d crit dans le texte, l'acide amin correct est rejet par le site d' dition. Le processus de correction d'erreurs effectu par l'ADN polym rase pr sente des similitudes ; cependant, il diff re parce que le processus de retrait d pend fortement d'un mauvais appariement avec le mod le (voir la figure 5 8). (P, site de polym risation ; E, site d' dition.) Figure 6 58 La reconnaissance d'une mol cule d'ARNt par son aminoacyl-ARNt synth tase. Pour cet ARNt (ARNt), des nucl otides sp cifiques dans l'anticodon (bleu fonc ) et le bras acceptant les acides amin s (vert) permettent l'ARNt correct d' tre reconnu par l'enzyme synth tase (jaune-vert). Une mol cule d'ATP li e est jaune. (Avec l'aimable autorisation de Tom Steitz ; Code PDB : 1QRS.) ARNt peptidylique attach l'extr mit C-terminale de la cha ne polypeptidique en croissance, nouvelle mol cule d'ARNt peptidylique attach e l'extr mit C-terminale de la cha ne polypeptidique en croissance. Figure 6 59 L'incorporation d'un acide amin dans une prot ine. Une cha ne polypeptidique se d veloppe par l'ajout progressif d'acides amin s son extr mit C-terminale. La formation de chaque liaison peptidique est nerg tiquement favorable car l'extr mit C-terminale en croissance a t activ e par la fixation covalente d'une mol cule d'ARNt. La liaison peptidyl-ARNt qui active l'extr mit de croissance est r g n r e lors de chaque ajout. Les cha nes lat rales d'acides amin s ont t abr g es en R1, R2, R3 et R4 ; Comme point de r f rence, tous les atomes du deuxi me acide amin de la cha ne polypeptidique sont ombr s en gris. La figure montre l'ajout du quatri me acide amin (rouge) la cha ne de croissance. l'addition perturbe cette liaison covalente haute nergie, mais la remplace imm diatement par une liaison identique sur l'acide amin le plus r cemment ajout (Figure 6 59). De cette fa on, chaque acide amin ajout porte avec lui l' nergie d'activation pour l'ajout de l'acide amin suivant plut t que l' nergie pour sa propre addition un exemple de polym risation de type croissance de la t te d crite dans la figure 2-44. Le message de l'ARN est d cod dans les ribosomes La synth se des prot ines est guid e par l'information port e par les mol cules d'ARNm. Pour maintenir le cadre de lecture correct et assurer la pr ci
Biologie moléculaire de la cellule	sion (environ 1 erreur tous les 10 000 acides amin s), la synth se des prot ines est effectu e dans le ribosome, une machine catalytique complexe compos e de plus de 50 prot ines diff rentes (le prot ines ribosomiques) et plusieurs mol cules d'ARN, les ARN ribosomiques (ARNr). Une cellule eucaryote typique contient des millions de ribosomes dans son cytoplasme (Figure 6 60). Les grandes et petites sous-unit s du ribosome sont assembl es au niveau du nucl ole, o les ARNr nouvellement transcrits et modifi s s'associent aux prot ines ribosomiques qui ont t transport es dans le noyau apr s leur synth se dans le cytoplasme. Ces deux sous-unit s ribosomales sont ensuite export es vers le cytoplasme, o elles s'assemblent pour synth tiser des prot ines. Figure 6 60 Ribosomes dans le cytoplasme d'une cellule eucaryote. Cette micrographie lectronique montre une coupe mince d'une petite r gion du cytoplasme. Les ribosomes apparaissent sous forme de points noirs (fl ches rouges). Certains sont libres dans le cytosol ; d'autres sont attach s aux membranes du r ticulum endoplasmique. 400 nm (avec l'aimable autorisation de Daniel S. Friend.) 70S MW 2 800 000 30S (petite) sous-unit MW 900 000 16S ARNr MW 4 200 000 60S (grande) sous-unit 40S (petite) sous-unit MW 1 400 000 ARNr 28S ARNr 5.8S ARNr 18S MW 2 500 000 MW 1 600 000 Figure 6 61 Une comparaison des ribosomes bact riens et eucaryotes. Malgr les diff rences dans le nombre et la taille de leurs composants ARNr et prot iques, les ribosomes bact riens et eucaryotes ont presque la m me structure et fonctionnent de la m me mani re. Bien que les ARNr 18S et 28S du ribosome eucaryote contiennent de nombreux nucl otides non pr sents chez leurs homologues bact riens, ces nucl otides sont pr sents sous forme d'insertions multiples qui forment des domaines suppl mentaires et laissent la structure de base de l'ARNr en grande partie inchang e. Les ribosomes eucaryotes et bact riens ont des structures et des fonctions similaires, tant compos s d'une grande et d'une petite sous-unit qui s'embo tent pour former un ribosome complet d'une masse de plusieurs millions de daltons (Figure 6 61). La petite sous-unit fournit le cadre sur lequel les ARNt sont adapt s avec pr cision aux codons de l'ARNm, tandis que la grande sous-unit catalyse la formation des liaisons peptidiques qui relient les acides amin s entre eux en une cha ne polypeptidique (voir Figure 6 58). Lorsqu'elles ne synth tisent pas activement des prot ines, les deux sous-unit s du ribosome sont s par es. Ils s'assemblent sur une mol cule d'ARNm, g n ralement pr s de son extr mit 5, pour initier la synth se d'une prot ine. L'ARNm est ensuite tir travers le ribosome, trois nucl otides la fois. Lorsque ses codons p n trent dans le c ur du ribosome, la s quence nucl otidique de l'ARNm est traduite en une s quence d'acides amin s en utilisant les ARNt comme adaptateurs pour ajouter chaque acide amin dans la s quence correcte l'extr mit croissante de la cha ne polypeptidique. Lorsqu'un codon stop est rencontr , le ribosome lib re la prot ine finie et ses deux sous-unit s se s parent nouveau. Ces sous-unit s peuvent ensuite tre utilis es pour d marrer la synth se d'une autre prot ine sur une autre mol cule d'ARNm. Les ribosomes fonctionnent avec une efficacit remarquable : en une seconde, un ribosome eucaryote ajoute 2 acides amin s une cha ne polypeptidique ; Les ribosomes des cellules bact riennes fonctionnent encore plus rapidement, un rythme d'environ 20 acides amin s par seconde. Pour chor graphier les nombreux mouvements coordonn s n cessaires une traduction efficace, un ribosome contient quatre sites de liaison pour les mol cules d'ARN : un pour l'ARNm et trois (appel s site A, site P et site E) sont pour les ARNt (Figure 6-62). Une mol cule d'ARNt n'est maintenue fermement aux sites A et P que si son anticodon Figure 6 62 Les sites de liaison l'ARN dans le ribosome. Chaque ribosome a un site de liaison pour l'ARNm et trois sites de liaison pour l'ARNt : les sites A, P et E (abr viation de l'aminoacyl-ARNt, de l'ARNt peptidylique et de la sortie, respectivement). (A) Un ribosome bact rien vu avec la petite sous-unit l'avant (vert fonc ) et la grande sous-unit l'arri re (vert clair). Les ARNr et les prot ines ribosomiques sont illustr s. Les ARNt sont li s au site E (rouge), au site P (orange) et au site A (jaune). Bien que les trois sites de l'ARNt soient occup s ici, au cours du processus de synth se des prot ines, on pense qu'il n'y a pas plus de deux de ces sites contenant des mol cules d'ARNt la fois (voir la figure 6-64). (B) Grande et petite ribosomique sous-unit s dispos es comme si le ribosome en (A) tait ouvert comme un livre. (C) Le ribosome en (A) pivot de 90 et vu avec la grande sous-unit en haut et la petite sous-unit en bas. (D) Repr sentation sch matique d'un ribosome [dans la m me orientation que (C)], qui sera utilis dans les figures suivantes. (A, B
Biologie moléculaire de la cellule	et C, adapt de M.M. Yusupov et al., Science 292:883-896, 2001. Avec l'autorisation de l'AAAS ; avec l'aimable autorisation d'Albion Baucom et Harry Noller.) forme des paires de bases avec un codon compl mentaire (permettant l'oscillation) sur la mol cule d'ARNm qui est enfil e travers le ribosome (Figure 6 63). Les sites A et P sont suffisamment proches l'un de l'autre pour que leurs deux mol cules d'ARNt soient forc es de former des paires de bases avec des codons adjacents sur la mol cule d'ARNm. Cette caract ristique du ribosome maintient le cadre de lecture correct sur l'ARNm. Une fois la synth se des prot ines amorc e, chaque nouvel acide amin est ajout la cha ne d'allongement dans un cycle de r actions contenant quatre tapes principales : la liaison de l'ARNt ( tape 1), la formation de liaisons peptidiques ( tape 2), la translocation de grandes sous-unit s ( tape 3) et la translocation de petites sous-unit s ( tape 4). la suite des deux tapes de translocation, l'ensemble du ribosome d place trois nucl otides le long de l'ARNm et est positionn pour commencer le cycle suivant. La figure 6-64 illustre ce processus en quatre tapes, commen ant un point o trois acides amin s ont d j t li s ensemble et o il y a une mol cule d'ARNt dans le site P du ribosome, jointe de mani re covalente l'extr mit C-terminale du polypeptide court. l' tape 1, un ARNt portant l'acide amin suivant dans la cha ne se lie au site ribosomique A en formant des paires de bases avec le codon d'ARNm qui y est positionn , de sorte que le site P et le site A contiennent des ARNt li s adjacents. l' tape 2, l'extr mit carboxyle de la cha ne polypeptidique est lib r e de l'ARNt au site P (par rupture de la liaison haute nergie entre l'ARNt et son acide amin ) et jointe au groupe amino libre de l'acide amin li l'ARNt au site A, formant ainsi une nouvelle liaison peptidique. Cette r action centrale de la synth se des prot ines est catalys e par une peptidyl transf rase contenue dans la grande sous-unit ribosomique. l' tape 3, la grande sous-unit se d place par rapport l'ARNm d tenu par la petite sous-unit , d pla ant ainsi les tiges accepteuses des deux ARNt vers les sites E et P de la grande sous-unit . l' tape 4, une autre s rie de changements conformationnels d place la petite sous-unit et son ARNm li exactement trois nucl otides, jectant l'ARNt puis du site E et r initialisant le ribosome afin qu'il soit pr t recevoir le prochain ARNt aminoacyle. L' tape 1 est ensuite r p t e avec un nouvel aminoacyl-ARNt entrant, et ainsi de suite. Ce cycle en quatre tapes est r p t chaque fois qu'un acide amin est ajout la cha ne polypeptidique, mesure que la cha ne se d veloppe de son extr mit amin e son extr mit carboxyle. Le cycle de base de l'allongement des polypeptides illustr dans les figures 6 64 pr sente une caract ristique suppl mentaire qui rend la traduction particuli rement efficace et pr cise. Deux facteurs d'allongement entrent et sortent du ribosome au cours de chaque cycle, chacun hydrolysant le GTP en GDP et subissant des changements de conformation dans le processus. Ces facteurs sont appel s EF-Tu et EF-G chez les bact ries, et EF1 et EF2 chez les eucaryotes. Dans certaines conditions, in vitro, les ribosomes peuvent tre forc s synth tiser des prot ines Figure 6 64 Traduction d'une mol cule d'ARNm. Chaque acide amin ajout l'extr mit croissante d'une cha ne polypeptidique est s lectionn par appariement de bases compl mentaires entre l'anticodon sur sa mol cule d'ARNt attach e et le codon suivant sur la cha ne d'ARNm. tant donn qu'un seul des nombreux types de mol cules d'ARNt d'une cellule peut s'apparier avec chaque codon, le codon d termine l'acide amin sp cifique ajouter la cha ne polypeptidique en croissance. Le cycle en quatre tapes montr est r p t encore et encore pendant la synth se d'une prot ine. l' tape 1, une mol cule d'aminoacyl-ARNt se lie un site A vacant sur le ribosome. l' tape 2, une nouvelle liaison peptidique se forme. l' tape 3, la grande sous-unit se d place par rapport la petite sous-unit , laissant les deux ARNt dans les sites hybrides : P sur la grande sous-unit et A sur la petite, pour l'un ; E sur la grande sous-unit et P sur la petite, pour l'autre. l' tape 4, la petite sous-unit se d place en transportant son ARNm sur une distance de trois nucl otides travers le ribosome. Cela r initialise le ribosome avec un site A enti rement vide, pr t pour la prochaine mol cule d'aminoacyl-ARNt se lier. Comme indiqu , l'ARNm est traduit dans la direction 5 3, et l'extr mit N-terminale d'une prot ine est fabriqu e en premier, chaque cycle ajoutant un acide amin l'extr mit C-terminale de la cha ne polypeptidique (Vid o 6.7 et Vid o 6.8). Figure 6 63 Le trajet de l'ARNm (en bleu) travers la petite sous-unit ribosomique. L'orientation est la m me que celle dans le panneau de droite de la figure 6-62B.
Biologie moléculaire de la cellule	(Avec l'aimable autorisation de Harry F. Noller, d'apr s les donn es de G.Z. Yusupova et al., Cell 106:233-241, 2001. Avec l'autorisation d'Elsevier.) Figure 6 65 Vue d taill e du cycle de traduction. Le sch ma de translation pr sent dans la figure 6-64 a t largi pour montrer les r les des deux facteurs d' longation EF-Tu et EF-G, qui d terminent la translation vers l'avant. Comme expliqu dans le texte, EF-Tu offre des possibilit s de relecture de la correspondance codon-anticodon. De cette fa on, les ARNt mal appari s sont rejet s de mani re s lective et la pr cision de la traduction est am lior e. La liaison d'une mol cule d'EF-G au ribosome et l'hydrolyse ult rieure du GTP conduisent un r arrangement de la structure du ribosome, d pla ant l'ARNm d cod exactement trois nucl otides travers celui-ci (Vid o 6.9). sans l'aide de ces facteurs d' longation et de l'hydrolyse du GTP, mais cette synth se est tr s lente, inefficace et impr cise. Le couplage des changements des facteurs d' longation induits par l'hydrolyse du GTP aux transitions entre les diff rents tats du ribosome acc l re norm ment la synth se des prot ines. Les cycles d'association de facteurs d' longation, d'hydrolyse du GTP et de dissociation garantissent galement que tous ces changements se produisent dans le sens vers l'avant , ce qui permet la traduction de se d rouler efficacement (Figure 6 65). En plus de faire progresser la traduction, EF-Tu augmente sa pr cision. Comme nous l'avons vu au chapitre 3, EF-Tu peut se lier simultan ment au GTP et l'aminoacyl-tR-NAs (voir les figures 3-72 et 3-73), et c'est sous cette forme que l'interaction initiale codon-anticodon se produit dans le site A du ribosome. En raison du changement d' nergie libre associ la formation d'une paire de bases, une correspondance codon-anticodon correcte se liera plus troitement qu'une interaction incorrecte. Cependant, cette diff rence d'affinit est relativement modeste et ne peut elle seule expliquer la grande pr cision de la traduction. Pour augmenter la pr cision de cette r action de liaison, le ribosome et EF-Tu travaillent ensemble de la mani re suivante. Tout d'abord, l'ARNr 16s dans la petite sous-unit du ribosome value la justesse de la correspondance codon-anticodon en se repliant autour de lui et en sondant ses d tails mol culaires (Figure 6-66). Lorsqu'une correspondance correcte est trouv e, l'ARNr se referme troitement autour de la paire codon-anticodon, provoquant un changement de conformation du ribosome qui d clenche l'hydrolyse du GTP par EF-Tu. Ce n'est que lorsque le GTP est hydrolys que EF-Tu rel che son emprise sur l'aminoacyl-ARNt et lui permet d' tre utilis dans la synth se des prot ines. Des correspondances codon-anticodon incorrectes ne d clenchent pas facilement ce changement de conformation, et ces ARNt errants tombent principalement du ribosome avant de pouvoir tre utilis s dans la synth se des prot ines. La relecture ne s'arr te toutefois pas l . Une fois que le GTP est hydrolys et que EF-Tu se dissocie du ribosome, le ribosome a une deuxi me occasion d'emp cher l'ajout d'un acide amin incorrect la cha ne de croissance. Il y a un court d lai pendant que l'acide amin transport par l'ARNt se met en position sur le ribosome. Ce d lai est plus court pour les paires codon-anticodon correctes que incorrectes. De plus, les ARNt mal appari s se dissocient plus rapidement que ceux correctement li s car leur interaction avec le codon est plus faible. Ainsi, la plupart des mol cules d'ARNt mal li es (ainsi qu'un nombre important de mol cules correctement li es) quitteront le ribosome sans tre utilis es pour la synth se des prot ines. Les deux tapes de relecture, agissant en s rie, sont en grande partie responsables de la pr cision de 99,99 % du ribosome dans la traduction de l'ARN en prot ine. M me si le mauvais acide amin passe travers les tapes de relecture d crites ci-dessus et est incorpor dans la cha ne polypeptidique en croissance, il y a encore une autre occasion pour le ribosome de d tecter l'erreur et de fournir une solution, bien qu'elle ne soit pas, proprement parler, une relecture. Une interaction incorrecte entre les codonanticodons dans le site P du ribosome (qui se produirait apr s la mauvaise incorporation) entra ne une augmentation du taux d'erreurs de lecture dans le site A. Des cycles successifs de mauvaise incorporation d'acides amin s finissent par conduire l'arr t pr matur de la prot ine par des facteurs de lib ration, qui sont d crits ci-dessous. Normalement, ces facteurs de lib ration agissent lorsque la traduction d'une prot ine est termin e ; Ici, ils agissent t t. Bien que ce m canisme ne corrige pas l'erreur d'origine, il lib re la prot ine d fectueuse pour la d gradation, garantissant qu'aucune synth se peptidique suppl mentaire n'est gaspill e sur celle-ci. Figure 6 66 Reconnaissance des correspondances codon-anticodon correctes par l'ARNr petite sous-unit
Biologie moléculaire de la cellule	du ribosome. L'interaction entre un nucl otide de l'ARNr petite sous-unit et la premi re paire de nucl otides d'un codon-anticodon correctement appari . Des interactions similaires se forment entre d'autres nucl otides de l'ARNr et les deuxi me et troisi me positions de la paire codon-anticodon. L'ARNr petite sous-unit ne peut former ce r seau de liaisons hydrog ne que lorsqu'un anticodon est correctement adapt un codon. Comme expliqu dans le texte, cette surveillance codon-anticodon par l'ARNr petite sous-unit augmente la pr cision de la synth se des prot ines. (D'apr s J.M. Ogle et al., Science 292:897-902, 2001. Avec l'autorisation de l'AAAS.) De nombreux processus biologiques surmontent les limites inh rentes l'appariement de bases compl mentaires Nous avons vu dans ce chapitre et dans le chapitre pr c dent que la r plication, la r paration, la transcription et la traduction de l'ADN reposent toutes sur l'appariement de bases compl mentaires : G avec C et A avec T (ou U). Cependant, si l'on ne tient compte que de la diff rence de liaison hydrog ne, une correspondance correcte ou incorrecte ne devrait diff rer en affinit que d'un facteur de 10 100 fois. Ces processus ont une pr cision beaucoup plus lev e que celle qui peut tre expliqu e par cette diff rence. Bien que les m canismes utilis s pour extraire une sp cificit suppl mentaire de l'appariement de bases compl mentaires diff rent d'un processus l'autre, deux principes illustr s par le ribosome semblent tre g n raux. Le premier est l'ajustement induit. Nous avons vu qu'avant qu'un acide amin ne soit ajout une cha ne polypeptidique en croissance, le ribosome se replie autour de l'interaction codon-anticodon, et ce n'est que lorsque la correspondance est correcte que ce repliement est termin et que la r action peut se d rouler. Ainsi, l'interaction codon-anticodon est ainsi v rifi e deux fois une fois par l'appariement initial des bases compl mentaires et une seconde fois par le repliement du ribosome, qui d pend de l'exactitude de l'appariement. Ce m me principe d'ajustement induit est observ dans la transcription par l'ARN polym rase ; Ici, un nucl oside triphosphate entrant forme initialement une paire de bases avec la matrice ; ce stade, l'enzyme se replie autour de la paire de bases ( valuant ainsi son exactitude) et, ce faisant, cr e le site actif de l'enzyme. L'enzyme ajoute ensuite de mani re covalente le nucl otide la cha ne de croissance. Parce que leur g om trie est fausse , des paires de bases incorrectes bloquent cet ajustement induit, et elles sont donc susceptibles de se dissocier avant d' tre incorpor es dans la cha ne en croissance. Un deuxi me principe utilis pour augmenter la sp cificit de l'appariement de bases compl mentaires est appel relecture cin tique. Nous avons vu qu'apr s l'appariement initial codon-anticodon et le changement conformationnel du ribosome, le GTP est hydrolys . Cela cr e une tape irr versible et d marre l'horloge sur un d lai pendant lequel l'aminoacyl-ARNt se d place dans la position appropri e pour la catalyse. Pendant ce d lai, les paires codon-anticodon incorrectes qui ont chapp d'une mani re ou d'une autre l'examen de l'ajustement induit ont une probabilit plus lev e de se dissocier que les paires correctes. Il y a deux raisons cela : (1) l'interaction du mauvais ARNt avec le codon est plus faible, et (2) le d lai est plus long pour les correspondances incorrectes que correctes. Dans sa forme la plus g n rale, la relecture cin tique fait r f rence un retard qui commence par une tape irr versible telle que l'hydrolyse de l'ATP ou du GTP, au cours de laquelle un substrat incorrect est plus susceptible de se dissocier qu'un substrat correct. Dans ce cas, la relecture cin tique augmente ainsi la sp cificit de l'appariement de bases compl mentaires au-del de ce qui est possible partir de simples associations thermodynamiques. L'augmentation de la sp cificit produite par la relecture cin tique a un co t nerg tique sous la forme d'une hydrolyse ATP ou GTP. On pense que la relecture cin tique fonctionne dans de nombreux processus biologiques, mais son r le est particuli rement bien compris pour la traduction. La pr cision de la traduction n cessite une d pense d' nergie libre La traduction par le ribosome est un compromis entre les contraintes oppos es de pr cision et de vitesse. Nous avons vu, par exemple, que la pr cision de la traduction (1 erreur pour 104 acides amin s joints) n cessite des d lais chaque fois qu'un nouvel acide amin est ajout une cha ne polypeptidique en croissance, produisant une vitesse globale de traduction de 20 acides amin s incorpor s par seconde dans les bact ries. Les bact ries mutantes avec une alt ration sp cifique de la petite sous-unit ribosomique ont des d lais plus longs et traduisent l'ARNm en prot ine avec une pr cision nettement sup rieure celle-ci ; Cependant, la synth se des prot ines est si len
Biologie moléculaire de la cellule	te chez ces mutants que les bact ries sont peine capables de survivre. Nous avons galement vu que pour atteindre la pr cision observ e de la synth se des prot ines, il faut d penser une grande quantit d' nergie libre ; c'est normal, car, comme nous l'avons vu au chapitre 2, il y a un prix payer pour toute augmentation de l'ordre dans la cellule. Dans la plupart des cellules, la synth se des prot ines consomme plus d' nergie que tout autre processus de biosynth se. Au moins quatre liaisons phosphate haute nergie sont divis es pour former chaque nouvelle liaison peptidique : deux sont consomm es pour charger une mol cule d'ARNt avec un acide amin (voir Figure 6-54), et deux autres tapes d'entra nement dans le cycle des r actions se produisant sur le ribosome pendant la synth se des prot ines lui-m me (voir Figure 6-65). De plus, un suppl ment d' nergie est consomm chaque fois qu'une liaison incorrecte d'acides amin s est hydrolys e par une ARNt synth tase (voir Figure 6-57) et chaque fois qu'un ARNt incorrect p n tre dans le ribosome, d clenche l'hydrolyse du GTP et est rejet (voir Figure 6-65). Pour tre efficace, tout m canisme de relecture doit galement permettre de supprimer une fraction appr ciable des interactions correctes ; Pour cette raison, la relecture est encore plus co teuse en nergie qu'il n'y para t premi re vue. Le ribosome est un ribozyme Le ribosome est un grand complexe compos de deux tiers d'ARN et d'un tiers de prot ines. La d termination, en 2000, de la conformation tridimensionnelle enti re de ses grandes et petites sous-unit s est un triomphe majeur de la biologie structurale moderne. Les r sultats confirment des preuves ant rieures selon lesquelles les ARNr et non les prot ines sont responsables de la structure globale du ribosome, de sa capacit positionner les ARNt sur l'ARNm et de son activit catalytique dans la formation de liaisons peptidiques covalentes. Les ARN ribosomales sont repli s en structures tridimensionnelles tr s compactes et pr cises qui forment le noyau compact du ribosome et d terminent sa forme globale (Figure 6-67). Contrairement aux positions centrales des ARNr, les prot ines ribosomiques sont g n ralement situ es la surface et comblent les lacunes et les crevasses de l'ARN repli (Figure 6 68). Certaines de ces prot ines envoient des r gions tendues de cha ne polypeptidique qui p n trent sur de courtes distances dans des trous dans le noyau de l'ARN (Figure 6-69). Le r le principal des prot ines ribosomiques semble tre de stabiliser la Figure 6 67 Structure des ARNr dans la grande sous-unit d'un ribosome bact rien, d termin e par cristallographie aux rayons X. (A) Conformations tridimensionnelles des ARNr grande sous-unit (5S et 23S) telles qu'elles apparaissent dans le ribosome. L'une des sous-unit s prot iques du ribosome (L1) est galement repr sent e comme point de r f rence, car elle forme une saillie caract ristique sur le ribosome. (B) Sch ma de principe de la structure secondaire de l'ARNr 23S, montrant le vaste r seau d'appariement de bases. La structure a t divis e en six domaines dont les couleurs correspondent celles de (A). Le diagramme de la structure secondaire est fortement sch matis pour repr senter autant que possible la structure en deux dimensions. Pour ce faire, plusieurs discontinuit s dans la cha ne d'ARN ont t introduites, bien qu'en r alit l'ARNr 23S soit une seule mol cule d'ARN. Par exemple, la base du domaine III est continue avec la base du domaine IV m me si un espace appara t dans le diagramme. (Adapt de N. Ban et al., Science 289:905-920, 2000. Avec l'autorisation de l'AAAS.) noyau d'ARN, tout en permettant les changements de conformation de l'ARNr qui sont n cessaires pour que cet ARN catalyse une synth se efficace des prot ines. Les prot ines aident galement l'assemblage initial des ARNr qui constituent le c ur du ribosome. Non seulement les sites de liaison A, P et E des ARNt sont form s principalement par les ARN ribosomiques, mais le site catalytique pour la formation des liaisons peptidiques est galement form par l'ARN, car l'acide amin le plus proche est situ plus de 1,8 nm. Cette d couverte a surpris les biologistes car, contrairement aux prot ines, l'ARN ne contient pas de groupes fonctionnels facilement ionisables qui peuvent tre utilis s pour catalyser des r actions sophistiqu es comme la formation de liaisons peptidiques. De plus, les ions m talliques, qui sont souvent utilis s par les mol cules d'ARN pour catalyser des r actions chimiques (comme nous le verrons plus loin dans le chapitre), n'ont pas t observ s sur le site actif du ribosome. Au lieu de cela, c'est croyait que l'ARNr 23S forme une poche hautement structur e qui, gr ce un r seau de liaisons hydrog ne, oriente pr cis ment les deux r actifs (la cha ne peptidique en croissance et un ARNt aminoacyl) et acc l re ainsi consid rablement leur jonction covalente. Une autre surprise est venue de
Biologie moléculaire de la cellule	la d couverte que l'ARNt dans le site P contribue un groupe OH important au site actif et participe directement la catalyse. Ce m canisme peut garantir que la catalyse ne se produit que lorsque l'ARNt du site P est correctement positionn dans le ribosome. Les mol cules d'ARN qui poss dent une activit catalytique sont appel es ribozymes. Nous avons vu plus haut dans ce chapitre que certains ribozymes fonctionnent dans des r actions d'auto- pissage. Dans la derni re section de ce chapitre, nous examinons ce que la capacit des mol cules d'ARN fonctionner comme des catalyseurs pourrait signifier pour l' volution pr coce des cellules vivantes. Pour l'instant, nous nous contentons de noter qu'il y a de bonnes raisons de soup onner que l'ARN plut t que les mol cules de prot ines ont servi de premiers catalyseurs pour les cellules vivantes. Si c'est le cas, le ribosome, avec son noyau d'ARN, pourrait tre une relique d'une poque ant rieure de l'histoire de la vie, lorsque la synth se des prot ines a volu dans des cellules qui taient presque enti rement dirig es par des ribozymes. Les s quences nucl otidiques dans l'ARNm signalent o commencer la synth se des prot ines Le d but et la fin de la traduction partagent les m mes caract ristiques du cycle d'allongement de la traduction d crit ci-dessus. Le site o la synth se des prot ines commence sur l'ARNm est particuli rement crucial, car il d finit le cadre de lecture pour toute la dur e du message. Une erreur d'un nucl otide dans un sens ou dans l'autre ce stade entra nerait une mauvaise lecture de chaque codon suivant dans le message, ce qui entra nerait une prot ine non fonctionnelle avec une s quence d'acides amin s brouill e. L' tape d'initiation est galement importante car, pour la plupart des g nes, c'est le dernier point auquel la cellule peut d cider si l'ARNm doit tre traduit pour produire une prot ine. La vitesse de cette tape est donc l'un des d terminants de la vitesse laquelle une prot ine particuli re sera synth tis e. Nous verrons au chapitre 7 comment s'op re la r gulation de cette tape. La traduction d'un ARNm commence par le codon AUG, et un ARNt sp cial est n cessaire pour commencer la traduction. Cet ARNt initiateur porte toujours l'acide amin m thionine (chez les bact ries, une forme modifi e de m thionine la formylm thionine est utilis e), avec pour r sultat que toutes les prot ines nouvellement fabriqu es ont la m thionine comme premier acide amin leur N-terminale, l'extr mit d'une prot ine qui est synth tis e en premier. (Cette m thionine est g n ralement limin e plus tard par une prot ase sp cifique.) L'ARNt initiateur est sp cialement reconnu par les facteurs d'initiation car il a une s quence nucl otidique distincte de celle de l'ARNt qui porte normalement la m thionine. Chez les eucaryotes, le complexe initiateur ARNt-m thionine (Met-tRNAi) est d'abord charg dans la petite sous-unit ribosomique avec des prot ines suppl mentaires appel es facteurs d'initiation eucaryotes, ou eIF. De tous les ARNt aminoacyl-tRNA de la cellule, seul l'ARNt initiateur charg de m thionine est capable de se lier troitement la petite sous-unit du ribosome sans que le ribosome complet ne soit pr sent, et contrairement aux autres ARNt, il se lie directement au site P (Figure 6 70). Ensuite, la petite sous-unit ribosomique se lie l'extr mit 5 d'une mol cule d'ARNm, qui est reconnue en vertu de sa coiffe 5 qui a pr c demment li deux facteurs d'initiation, eIF4E et eIF4G (voir Figure 6-38). La petite sous-unit ribosomique se d place ensuite vers l'avant (5 3) le long de l'ARNm, la recherche du premier AUG ; facteurs d'initiation suppl mentaires qui agissent comme aliment s par l'ATP Figure 6 68 : emplacement des composants prot iques de la grande sous-unit ribosomique bact rienne. Les ARNr (5S et 23S) sont repr sent s en bleu et les prot ines de la grande sous-unit en vert. Cette vue est vers l'ext rieur du ribosome ; L'interface avec la petite sous-unit se trouve sur la face oppos e. (Code PDB : 1FFK.) Figure 6 69 Structure de la prot ine l15 dans la grande sous-unit du ribosome bact rien. Le domaine globulaire de la prot ine se trouve la surface du ribosome et une r gion tendue p n tre profond ment dans le noyau d'ARN du ribosome. La prot ine L15 est repr sent e en vert et une partie du noyau de l'ARN ribosomique est indiqu e en bleu. (D'apr s D. Klein, P.B. Moore et T.A. Steitz, J. Mol. Biol. 340:141-177, 2004. Avec l'autorisation d'Academic Press. Code PDB : 1S72.) Figure 6 70 L'initiation de la synth se des prot ines chez les eucaryotes. Seuls trois des nombreux facteurs d'initiation de traduction n cessaires ce processus sont repr sent s. L'initiation efficace de la traduction n cessite galement la queue poly- A de l'ARNm li e par des prot ines de liaison poly-A, qui, leur tour, interagissent avec eIF4G (voir Figure 6 38). De cette fa on, l'appareil de traduction s'assure que les deux extr mit
Biologie moléculaire de la cellule	s de l'ARNm sont intactes avant d'initier la synth se des prot ines. Bien qu'un seul L' v nement d'hydrolyse GTP est illustr dans la figure, une seconde est connue pour se produire sous-unit juste avant que les grandes et petites sous-unit s ribosomiques ne se rejoignent. Dans les deux derni res tapes de l'ARNt initiateur illustr sur la figure, le ribosome a commenc le cycle d' longation standard, li au site P repr sent sur les figures 6 64. Les h licases facilitent ce mouvement. Dans 90 % des ARNm, la traduction commence d s le premier AUG rencontr par la petite sous-unit . ce stade, les facteurs d'initiation se dissocient, permettant la grande sous-unit ribosomique de s'assembler avec le complexe et de compl ter le ribosome. L'ARNt initiateur reste au site P, laissant le site A vacant. La synth se des prot ines est donc pr te commencer (voir Figure 6 70). Les nucl otides entourant imm diatement le site de d part dans les ARNm eucaryotes influencent l'efficacit de la reconnaissance AUG au cours du processus de balayage ci-dessus. Si ce site de reconnaissance diff re consid rablement de la s quence de reconnaissance consensuelle (5'-ACCAUGG-3'), les sous-unit s ribosomales balayage ignoreront parfois la premi re codon AUG dans l'ARNm et passez au deuxi me ou troisi me codon AUG la place. Les cellules utilisent fr quemment ce ph nom ne, connu sous le nom de balayage fuyant , pour produire deux prot ines ou plus, diff rant par leurs N-terminus, partir de la m me mol cule d'ARNm. Ce m canisme permet certains g nes de produire la m me prot ine avec et sans s quence de signal attach e son extr mit N-terminale, par exemple, de sorte que la prot ine est dirig e vers deux compartiments diff rents de la cellule. Les ARNm n'ont pas de 5 capuchons pour signaler au ribosome o commencer chercher le d but de la traduction. Au lieu de cela, chaque ARNm bact rien contient un site sp cifique de liaison au ribosome (appel s quence Shine-Dalgarno, du nom de ses rers discov-DISSOCIATE) qui est situ quelques nucl otides en amont de l'AUG auquel la traduction est Le m canisme de s lection d'un codon de d part chez les bact ries est diff rent. Bacte va commencer. Cette s quence nucl otidique, avec le consensus 5 -AGGAGGU-3 , forme des paires de bases avec l'ARNr 16S de la petite sous-unit ribosomique pour positionner le codon AUG initiateur dans le ribosome. Un ensemble de facteurs d'initiation de la traduction orchestre cette interaction, ainsi que l'assemblage ult rieur de la grande sous-unit ribosomique pour compl ter le ribosome. Contrairement un ribosome eucaryote, un ribosome bact rien peut facilement s'assembler directement sur un codon de d part qui se trouve l'int rieur d'une mol cule d'ARNm, condition qu'un site de liaison au ribosome le pr c de de plusieurs nucl otides. En cons quence, les ARNm bac-aminoacylt riaux sont souvent polycistroniques, c'est- -dire qu'ils codent plusieurs prot ines diff rentes, chacune tant traduite partir de la m me mol cule d'ARNm (Figure 6-71). En revanche, un ARNm eucaryote ne code g n ralement qu'une seule prot ine, ou plus pr cis ment, un seul ensemble de prot ines troitement apparent es. Les codons d'arr t marquent la fin de la traduction La fin du message codant pour la prot ine est signal e par la pr sence de l'un des trois codons d'arr t (UAA, UAG ou UGA) (voir Figure 6 48). Ceux-ci ne sont pas reconnus par un ARNt et ne sp cifient pas d'acide amin , mais signalent plut t au ribosome d'arr ter la traduction. Les prot ines connues sous le nom de facteurs de lib ration se lient tout ribosome avec un codon stop positionn dans le site A, for ant la peptidyl transf rase dans le ribosome catalyser l'ajout d'une mol cule d'eau au lieu d'un acide amin l'ARNt peptidyl (Figure 6-72). Cette r action lib re l'extr mit carboxyle de la cha ne polypeptidique en croissance de son attachement une mol cule d'ARNt, et puisque seulement cela etc. L'attachement maintient normalement le polypeptide en croissance au ribosome, la cha ne prot ique compl te est imm diatement lib r e dans le cytoplasme. Le ribosome lib re ensuite sa mol cule d'ARNm li e et se s pare en grandes et petites sous-unit s. Ces sous-unit s peuvent ensuite s'assembler sur cette mol cule d'ARNm ou une autre mol cule d'ARNm pour commencer un nouveau cycle de synth se des prot ines. Figure 6 71 Structure d'une mol cule d'ARNm bact rienne typique. Contrairement aux ribosomes eucaryotes, qui n cessitent g n ralement une extr mit 5' coiff e sur l'ARNm, les ribosomes procaryotes initient la traduction aux sites de liaison aux ribosomes (s quences de Shine-Dalgarno), qui peuvent tre situ s n'importe o le long d'une mol cule d'ARNm. Cette propri t de leurs ribosomes permet aux bact ries de synth tiser plus d'un type de prot ine partir d'une seule mol cule d'ARNm. Au cours de la translation, le polypeptide naissant se d place travers un grand tunnel rempli d'
Biologie moléculaire de la cellule	eau (environ 10 nm 1,5 nm) dans la grande sous-unit du ribosome. Les parois de ce tunnel, constitu es principalement d'ARNr 23S, sont un patchwork de minuscules surfaces hydrophobes int gr es dans une surface hydrophile plus tendue. Cette structure n'est compl mentaire aucun peptide, et fournit ainsi un rev tement T flon travers lequel une cha ne polypeptidique peut facilement glisser. Les dimensions du tunnel sugg rent que les prot ines naissantes sont en grande partie non structur es lorsqu'elles traversent le ribosome, bien que certaines r gions -h lico dales de la prot ine puissent se former avant de quitter le tunnel du ribosome. Lorsqu'elle quitte le ribosome, une prot ine nouvellement synth tis e doit se replier dans sa conformation tridimensionnelle appropri e pour tre utile la cellule. Plus loin dans ce chapitre, nous verrons comment ce pliage se produit. Mais nous d crivons d'abord plusieurs aspects suppl mentaires du processus de traduction lui-m me. La synth se de la plupart des mol cules de prot ines prend entre 20 secondes et plusieurs minutes. Cependant, pendant cette tr s courte p riode, il est habituel que plusieurs initiations aient lieu sur chaque mol cule d'ARNm traduite. D s que le ribosome pr c dent a traduit suffisamment de la s quence nucl otidique pour s' carter, l'extr mit 5' de l'ARNm est enfil e dans un nouveau ribosome. Les mol cules d'ARNm traduites se trouvent donc g n ralement sous la forme de polyribosomes (ou polysomes) : de grands assemblages cytoplasmiques constitu s de plusieurs ribosomes espac s de 80 nucl otides le long d'une seule mol cule d'ARNm (Figure 6 73). Ces initiations multiples permettent la cellule de fabriquer beaucoup plus de mol cules de prot ines en un temps donn que ce qui serait possible si chaque prot ine devait tre termin e avant que la suivante puisse commencer. Les bact ries et les eucaryotes utilisent tous deux des polysomes, et les deux emploient des strat gies suppl mentaires pour acc l rer le taux global de synth se des prot ines. tant donn que l'ARNm bact rien n'a pas besoin d' tre trait et qu'il est accessible aux ribosomes pendant sa fabrication, les ribosomes peuvent se fixer l'extr mit libre d'une mol cule d'ARNm bact rien et commencer la traduire avant m me que la transcription de cet ARN ne soit termin e, suivant de pr s l'ARN polym rase lorsqu'elle se d place le long de l'ADN. Chez les eucaryotes, comme nous l'avons vu, les extr mit s 5 et 3 de l'ARNm interagissent (voir Figure 6-73A) ; par cons quent, d s qu'un ribosome se dissocie, ses deux sous-unit s sont dans une position optimale pour r initier la traduction sur la m me mol cule d'ARNm. Il existe des variations mineures dans le code g n tique standard Comme nous l'avons vu au chapitre 1, le code g n tique (illustr aux figures 6 48) s'applique aux trois principales branches de la vie, fournissant des preuves importantes de l'ascendance commune de toute vie sur Terre. Bien que rares, il existe des exceptions ce code. Par exemple, Candida albicans, l'agent pathog ne fongique humain le plus r pandu, traduit le codon CUG par s rine, alors que presque tous les autres organismes le traduisent par leucine. Les mitochondries (qui ont leurs propres g nomes et codent une grande partie de leur appareil translationnel) s' cartent souvent du code standard. Par exemple, chez les mitochondries de mammif res, AUA est traduit par m thionine, tandis que dans le Figure 6 72 La phase finale de la synth se des prot ines. La liaison d'un facteur de lib ration un site A portant une but e codon termine la traduction. Le polypeptide termin est lib r et, dans une s rie de r actions qui n cessitent des prot ines suppl mentaires et une hydrolyse du GTP (non illustr ), le ribosome se dissocie en ses deux sous-unit s distinctes. ARN messager Figure 6 73 Un polyribosome. (A) Dessin sch matique montrant comment une s rie de ribosomes peut traduire simultan ment la m me mol cule d'ARNm eucaryote. (B) Micrographie lectronique d'un polyribosome d'une cellule eucaryote (Vid o 6.10). (B, avec la permission de John Heuser.) cytosol de la cellule il se traduit par isoleucine (voir Tableau 14 3, p. 805). Ce type de d viation dans le code g n tique est c bl dans les organismes ou les organites dans lesquels il se produit. Un autre type de variation, parfois appel recodage de traduction, se produit dans de nombreuses cellules. Dans ce cas, d'autres informations sur la s quence nucl otidique pr sentes dans un ARNm peuvent modifier le sens du code g n tique un site particulier de la mol cule d'ARNm. Le code standard permet aux cellules de fabriquer des prot ines en utilisant seulement 20 acides amin s. Cependant, les bact ries, les arch es et les eucaryotes ont leur disposition un vingt-et-uni me acide amin qui peut tre incorpor directement dans une cha ne polypeptidique en croissance par recodage par traduction. La s l nocyst ine, qui est essentielle au fonctionnem
Biologie moléculaire de la cellule	ent efficace d'une vari t d'enzymes, contient un atome de s l nium la place de l'atome de soufre de cyst ine. La s l nocyst ine est produite enzymatiquement partir d'une s rine attach e une mol cule d'ARNt sp ciale qui s'apparie avec le codon UGA, un codon normalement utilis pour signaler un arr t de traduction. Les ARNm des prot ines dans lesquelles la s l nocyst ine doit tre ins r e au niveau d'un codon UGA portent une s quence nucl otidique suppl mentaire proximit dans l'ARNm qui d clenche cet v nement de recodage (Figure 6-74). ajout la croissance de l'ARNt de s ryl-tRN converti en s l nocyst ine L'ARNt de la s l nocyst ine signale que l'UGA pr c dent code pour la s l nocyst ine Figure 6 74 Incorporation de la s l nocyst ine dans une cha ne polypeptidique en croissance. Un ARNt sp cialis est charg en s rine par la s ryltRNA synth tase normale, et la s rine est ensuite convertie enzymatiquement en s l nocyst ine. Une structure d'ARN sp cifique dans l'ARNm (une structure de tige et de boucle avec une s quence nucl otidique particuli re) signale que la s l nocyst ine doit tre ins r e dans le codon UGA voisin. Comme indiqu , cet v nement n cessite la participation d'un facteur de traduction sp cifique de la s l nocyst ine. Apr s l'ajout de s l nocyst ine, la traduction se poursuit jusqu' ce qu'un codon stop conventionnel soit rencontr . Les inhibiteurs de la synth se des prot ines procaryotes sont utiles comme antibiotiques La plupart des antibiotiques les plus efficaces utilis s en m decine moderne sont des compos s fabriqu s par des champignons qui inhibent la synth se des prot ines bact riennes. Les champignons et les bact ries se disputent bon nombre des m mes niches environnementales, et des millions d'ann es de co volution ont abouti ce que les champignons produisent de puissants inhibiteurs bact riens. Certains de ces m dicaments exploitent les diff rences structurelles et fonctionnelles entre les ribosomes bact riens et eucaryotes afin d'interf rer pr f rentiellement avec la fonction des ribosomes bact riens. Ainsi, les humains peuvent prendre de fortes doses de certains de ces compos s sans toxicit excessive. De nombreux antibiotiques se logent dans des poches dans les ARN ribosomiques et interf rent simplement avec le bon fonctionnement du ribosome ; d'autres bloquent des parties sp cifiques du ribosome comme le canal de sortie (Figure 6 75). Le tableau 6-4 num re certains antibiotiques courants de ce type ainsi que plusieurs autres inhibiteurs de la synth se des prot ines, dont certains agissent sur les cellules eucaryotes et ne peuvent donc pas tre utilis s comme antibiotiques. Parce qu'ils bloquent des tapes sp cifiques dans les processus qui m nent de l'ADN la prot ine, de nombreux compos s num r s dans le tableau 6-4 sont utiles pour les tudes de biologie cellulaire. Parmi les m dicaments les plus couramment utilis s dans de telles tudes figurent le chloramph nicol, le cycloheximide et la puromycine, qui inhibent tous sp cifiquement la synth se des prot ines. Dans une cellule eucaryote, par exemple, le chloramph nicol inhibe la synth se des prot ines sur les ribosomes uniquement dans les mitochondries (et dans les chloroplastes chez les plantes), refl tant probablement les origines procaryotes de ces organites (discut au chapitre 14). Le cycloheximide, en revanche, n'affecte que les ribosomes du cytosol. La puromycine est particuli rement int ressante car il s'agit d'un analogue structurel d'une mol cule d'ARNt li e un amino. acide et est donc un autre exemple de mim tisme mol culaire ; le ribosome le confond avec un acide amin authentique et l'incorpore de mani re covalente l'extr mit C-terminale de la cha ne peptidique en croissance, provoquant ainsi la terminaison et la lib ration pr matur es du polypeptide. Comme on pouvait s'y attendre, la puromycine inhibe la synth se des prot ines chez les procaryotes et les eucaryotes. Les m canismes de contr le de la qualit agissent pour emp cher la traduction des ARNm endommag s Chez les eucaryotes, la production d'ARNm implique la fois la transcription et une s rie d' tapes labor es de traitement de l'ARN ; comme nous l'avons vu, ceux-ci ont lieu dans le noyau, s par s des ribosomes, et ce n'est que lorsque le traitement est termin que les ARNm sont transport s vers le cytosol pour tre traduits (voir Figure 6 38). Cependant, ce sch ma n'est pas infaillible, et certains ARNm mal trait s sont envoy s par inadvertance au cytosol. De plus, les ARNm qui taient impeccables lorsqu'ils ont quitt le noyau peuvent tre bris s ou endommag s dans le cytosol. Le danger de Figure 6 75 Sites de liaison des antibiotiques sur le ribosome bact rien. Les petites ( gauche) et les grandes sous-unit s ( droite) du ribosome sont dispos es comme si le ribosome avait t ouvert comme un livre. Les sites de liaison aux antibiotiques sont marqu s par des sph res color es, et les mol cules d'ARNt li es sont indiqu es
Biologie moléculaire de la cellule	en violet (voir Figure 6-62). La plupart des antibiotiques pr sent s se lient directement aux poches form es par les mol cules d'ARN ribosomique. L'hygromycine B induit des erreurs de traduction, la spectinomycine bloque la translocation de l'ARNt peptidylique du site A au site P, et la streptogramine B emp che l'allongement des peptides naissants. Le tableau 6-4 r pertorie les m canismes inhibiteurs des autres antibiotiques illustr s sur la figure. (Adapt de J. Poehlsgaard et S. Douthwaite, Nat. Rev. Microbiol. 3:870 881, 2005. Avec l'autorisation de Macmillan Publishers Ltd.) La traduction d'ARNm endommag s ou incompl tement trait s (qui produiraient des prot ines tronqu es ou autrement aberrantes) est apparemment si importante que la cellule dispose de plusieurs mesures de secours pour viter que cela ne se produise. Pour viter de traduire des ARNm bris s, par exemple, la coiffe 5 et la queue poly-A sont toutes deux reconnues par la machinerie d'initiation de la traduction avant le d but de la traduction (voir Figure 6-70). Le syst me de surveillance de l'ARNm le plus puissant, appel d sint gration de l'ARNm m di e par des non-sens, limine les ARNm d fectueux avant qu'ils ne s' loignent du noyau. Ce m canisme est mis en jeu lorsque la cellule d termine qu'une mol cule d'ARNm a un codon non-sens (stop) (UAA, UAG ou UGA) au mauvais endroit. Cette situation est susceptible de se produire dans une mol cule d'ARNm qui a t mal piss e, car l' pissage aberrant entra nera g n ralement l'introduction al atoire d'un codon non-sens dans le cadre de lecture de l'ARNm, en particulier dans les organismes, tels que les humains, qui ont une grande taille moyenne d'intron (voir Figure 6 31B). Le m canisme de d sint gration de l'ARNm m di par le non-sens commence lorsqu'une mol cule d'ARNm est transport e du noyau au cytosol. Lorsque son extr mit 5 merge d'un pore nucl aire, l'ARNm est rencontr par un ribosome, qui commence le traduire. Au fur et mesure que la traduction se poursuit, les complexes de jonction d'exon (EJC) qui sont li s l'ARNm chaque site d' pissage sont d plac s par le ribosome en mouvement. Le codon stop normal se trouvera dans le dernier exon, de sorte qu'au moment o le ribosome l'atteint et s'arr te, plus aucun EJCs ne sera li l'ARNm. Dans ce cas, l'ARNm passe l'inspection et est lib r dans le cytosol o il peut tre traduit s rieusement (Figure 6 76). Cependant, si le ribosome atteint un codon d'arr t plus t t, lorsque les ECJC restent li s, la mol cule d'ARNm est rapidement d grad e. De cette fa on, le premier tour de traduction permet la cellule de tester la valeur adaptative de chaque mol cule d'ARNm sa sortie du noyau. La d composition m di e par le non-sens a peut- tre t particuli rement importante dans l' volution, permettant aux cellules eucaryotes d'explorer plus facilement de nouveaux g nes form s par des r arrangements de l'ADN, des mutations ou d'autres mod les d' pissage en s lectionnant uniquement les ARNm pour la traduction qui peuvent produire une prot ine compl te. La d composition m di e par le non-sens est galement importante dans les cellules du syst me immunitaire en d veloppement, o les r arrangements tendus de l'ADN qui se produisent (voir Figure 24-28) g n rent souvent de l'ARNm SURVIVE, TRADUCTION EFFICACE UPF d clenche la D GRADATION DE L'ARNM Figure 6 76 D sint gration de l'ARNm m di e par des non-sens. Comme le montre la partie droite, l' chec de l' pissage correct d'un pr -ARNm introduit souvent un codon d'arr t pr matur dans le cadre de lecture de la prot ine. Ces ARNm anormaux sont d truits par le m canisme de d sint gration m di par le non-sens. Pour activer ce m canisme, une mol cule d'ARNm, portant des complexes de jonction d'exons (EJC) pour marquer les pissages r ussis, est d'abord rencontr e par un ribosome qui effectue un cycle de traduction test . Lorsque l'ARNm passe dans le canal troit du ribosome, les EJCs sont d pouill s et les ARNm r ussis sont lib r s pour subir plusieurs cycles de traduction (c t gauche). Cependant, si un codon d'arr t dans le cadre est rencontr avant que l'EJC final ne soit atteint (c t droit), l'ARNm subit une d sint gration m di e par le non-sens, qui est d clench e par les prot ines Upf (en vert) qui se lient chaque EJC. Notez que ce m canisme garantit que la d composition m di e par le non-sens n'est d clench e que lorsque le codon d'arr t pr matur se trouve dans le m me cadre de lecture que celui de la prot ine normale. (Adapt de J. Lykke-Andersen et al., Cell 103:1121 1131, 2000. Avec l'autorisation d'Elsevier.) codons de terminaison pr matur e. Le syst me de surveillance d grade les ARNm produits partir de ces g nes r arrang s, vitant ainsi les effets toxiques potentiels des prot ines tronqu es. La voie de surveillance m di e par les non-sens joue galement un r le important dans l'att nuation des sympt mes de nombreuses maladies humaines h r ditaires. Comme nous l'a
Biologie moléculaire de la cellule	vons vu, les maladies h r ditaires sont g n ralement caus es par des mutations qui g chent la fonction d'une prot ine cl , comme l'h moglobine ou l'un des facteurs de coagulation du sang. Environ un tiers de toutes les maladies g n tiques chez l'homme r sultent de mutations non-sens ou de mutations (telles que les mutations par d calage de cadre ou les mutations de site d' pissage) qui placent des mutations non-sens dans le cadre de lecture du g ne. Chez les individus porteurs d'un g ne mutant et d'un g ne fonctionnel, la d sint gration m di e par le non-sens limine l'ARNm aberrant et emp che ainsi la fabrication d'une prot ine potentiellement toxique. Sans cette protection, les individus porteurs d'un g ne de maladie fonctionnel et d'un g ne mutant souffriraient probablement de sympt mes beaucoup plus graves. Certaines prot ines commencent se replier alors qu'elles sont encore synth tis es Le processus d'expression des g nes n'est pas termin lorsque le code g n tique a t utilis pour cr er la s quence d'acides amin s qui constitue une prot ine. Pour tre utile la cellule, cette nouvelle cha ne polypeptidique doit se replier dans sa conformation tridimensionnelle unique, lier tous les cofacteurs de petites mol cules n cessaires son activit , tre modifi e de mani re appropri e par des prot ines kinases ou d'autres enzymes modifiant les prot ines, et s'assembler correctement avec les autres sous-unit s prot iques avec lesquelles elle fonctionne (Figure 6-77). L'information n cessaire toutes les tapes num r es ci-dessus est finalement contenue dans la s quence d'acides amin s que le ribosome produit lorsqu'il traduit une mol cule d'ARNm en une cha ne polypeptidique. Comme nous l'avons vu au chapitre 3, lorsqu'un Figure 6 77 tapes de la cr ation d'une prot ine fonctionnelle. Comme indiqu , la traduction d'une s quence d'ARNm en une s quence d'acides amin s sur le ribosome n'est pas la fin du processus de formation d'une prot ine. Pour fonctionner, la cha ne polypeptidique termin e doit se replier correctement dans sa conformation tridimensionnelle, lier tous les cofacteurs n cessaires et s'assembler avec ses cha nes prot iques partenaires, le cas ch ant. La formation de liaisons non covalentes est l'origine de ces changements. Comme indiqu , de nombreuses prot ines n cessitent galement des modifications covalentes d'acides amin s s lectionn s. Bien que les modifications les plus fr quentes soient la glycosylation et la phosphorylation des prot ines, plus de 200 types diff rents de modifications covalentes sont connus (voir pp. 165-166). La prot ine se replie en une structure compacte, elle enfouit la plupart de ses r sidus hydrophobes dans un noyau int rieur. De plus, un grand nombre d'interactions non covalentes se forment entre les diff rentes parties de la mol cule. C'est la somme de tous ces arrangements nerg tiquement favorables qui d termine le motif de repliement final de la cha ne polypeptidique, en tant que conformation de l' nergie libre la plus basse (voir pp. 114-115). Au cours de plusieurs millions d'ann es d' volution, la s quence d'acides amin s de chaque prot ine a t s lectionn e non seulement pour la conformation qu'elle adopte, mais aussi pour sa capacit se replier rapidement. Pour certaines prot ines, ce repliement commence imm diatement, lorsque la cha ne prot ique merge du ribosome, en commen ant par le N-terminal fin. Dans ces cas, lorsque chaque domaine prot ique merge du ribosome, il forme en quelques secondes une structure compacte qui contient la plupart des caract ristiques secondaires finales ( h lices et feuillets) align es peu pr s dans la conformation droite (Figure 6-78). Pour certains domaines prot iques, cet tat exceptionnellement dynamique et flexible, appel globule fondu, est le point de d part d'un processus relativement lent dans lequel de nombreux ajustements de la cha ne lat rale se produisent qui finissent par former la structure tertiaire correcte. La synth se d'une prot ine de taille moyenne prend plusieurs minutes, et pour certaines prot ines, une grande partie du processus de repliement est termin e au moment o le ribosome lib re l'extr mit C-terminale d'une prot ine (Figure 6-79). Les chaperons mol culaires aident guider le repliement de la plupart des prot ines La plupart des prot ines ne se replient probablement pas correctement lors de leur synth se et n cessitent une classe sp ciale de prot ines appel es chaperons mol culaires pour ce faire. Les chaperons mol culaires sont utiles pour les cellules car il existe de nombreuses voies de repliement diff rentes disponibles pour une prot ine d pli e ou partiellement repli e. Sans chaperons, certaines de ces voies ne conduiraient pas la forme correctement repli e (et la plus stable) parce que la prot ine deviendrait pi g e cin tiquement dans des structures qui sont hors voie. Certaines de ces configurations hors trajectoire s'agr geraient et seraient laiss e
Biologie moléculaire de la cellule	s comme des impasses irr versibles de structures non fonctionnelles (et potentiellement dangereuses). Modification covalente par glycosylation, phosphorylation, ac tylation, etc. liaison d'autres sous-unit s prot iques Figure 6 78 La structure d'un globule fondu. (A) Une forme globule fondue du cytochrome b562 est plus ouverte et moins ordonn e que la forme repli e finale de la prot ine, illustr e en (B). Notez que le globule fondu contient la majeure partie de la structure secondaire de la forme finale, bien que les extr mit s des h lices soient effiloch es et que l'une des h lices ne soit que partiellement form e. (Avec l'aimable autorisation de Joshua Wand, d'apr s Y. Feng et al., Nat. Struct. Biol. 1:30-35, 1994. Avec l'autorisation de Macmillan Publishers Ltd.) Figure 6 79 Repliement co-traductionnel des prot ines. Une cha ne polypeptidique en croissance acquiert sa structure secondaire et tertiaire lorsqu'elle merge d'un ribosome. Le domaine N-terminal se replie en premier, tandis que le domaine C-terminal est encore en cours de synth se. Cette prot ine n'a pas encore atteint sa conformation finale au moment o elle est lib r e du ribosome. (Modifi de A.N. Fedorov et T.O. Baldwin, J. Biol. Chem. 272:32715 32718, 1997.) Les chaperons mol culaires reconnaissent sp cifiquement les configurations incorrectes et hors voie par leur exposition de surfaces hydrophobes, qui, dans des prot ines correctement repli es, sont g n ralement enterr es l'int rieur. La liaison de ces surfaces hydrophobes expos es les unes aux autres est ce qui provoque l'agr gation irr versible des conformations hors voie. Nous avons vu au chapitre 3 que dans certains cas de maladies humaines h r ditaires, des agr gats se forment et peuvent provoquer des sympt mes graves, voire la mort. Les chaperons emp chent cela de se produire dans les prot ines normales en se liant aux surfaces hydrophobes expos es l'aide de leurs propres surfaces hydrophobes. Comme nous le verrons sous peu, il existe plusieurs types de chaperons ; Une fois li s une prot ine mal repli e, ils finissent par la lib rer d'une mani re qui donne la prot ine une autre chance de se replier correctement. Les cellules utilisent plusieurs types de chaperons De nombreuses chaperons mol culaires sont appel es prot ines de choc thermique (appel es hsp), car elles sont synth tis es en quantit s consid rablement accrues apr s une br ve exposition des cellules une temp rature lev e (par exemple, 42 C pour les cellules qui vivent normalement 37 C). Cela refl te le fonctionnement d'un syst me de r troaction qui r pond une augmentation des prot ines mal repli es (telles que celles produites par des temp ratures lev es) en stimulant la synth se des chaperons qui aident ces prot ines se replier. Il existe plusieurs grandes familles de chaperons mol culaires, dont les prot ines hsp60 et hsp70. Diff rents membres de ces familles fonctionnent dans diff rents organites. Ainsi, comme nous l'avons vu au chapitre 12, les mitochondries contiennent leurs propres mol cules hsp60 et hsp70 qui sont distinctes de celles qui fonctionnent dans le cytosol ; et un hsp70 sp cial (appel BIP) aide replier les prot ines dans le r ticulum endoplasmique. Les prot ines hsp60 et hsp70 travaillent chacune avec leur propre petit ensemble de prot ines associ es lorsqu'elles aident d'autres prot ines se replier. Ces hsp partagent une affinit pour les plaques hydrophobes expos es sur les prot ines incompl tement repli es, et elles hydrolysent l'ATP, se liant et lib rant souvent leur substrat prot ique chaque cycle d'hydrolyse de l'ATP. d'autres gards, les deux types de prot ines hsp fonctionnent diff remment. La machinerie hsp70 agit t t dans la vie de nombreuses prot ines (souvent avant que la prot ine ne quitte le ribosome), chaque monom re de hsp70 se liant une cha ne d'environ quatre ou cinq acides amin s hydrophobes (Figure 6 80). En se liant l'ATP, hsp70 lib re la prot ine dans la solution, ce qui lui permet de se replier. En revanche, les prot ines de type hsp60 forment une grande structure en forme de tonneau qui agit apr s qu'une prot ine a t enti rement synth tis e. Ce type de chaperon, parfois appel chaperonine, forme une chambre d'isolement pour le processus de pliage (Figure 6-81). Pour entrer dans une chambre, une prot ine de substrat est d'abord captur e via l'entr e hydrophobe de la chambre. La prot ine est ensuite lib r e l'int rieur de la chambre, qui est tapiss e de surfaces hydrophiles, et la chambre est scell e avec un couvercle, une tape n cessitant de l'ATP. Ici, le substrat est laiss se replier dans sa conformation finale de mani re isol e, o il n'y a pas d'autres prot ines avec lesquelles s'agr ger. Lorsque l'ATP est hydrolys , le couvercle se d tache et la prot ine du substrat, qu'elle soit pli e ou non, est lib r e de la chambre. Les chaperons illustr s aux figures 6-80 et 6-81 ont souvent besoin de plusieurs cycles d'hydrolyse
Biologie moléculaire de la cellule	de l'ATP pour plier correctement une seule cha ne polypeptidique. Cette nergie est utilis e pour effectuer les mouvements m caniques des machines hsp60 et hsp70, en les convertissant de formes liantes en formes lib ratrices. Tout comme nous l'avons vu pour la transcription, l' pissage et la traduction, la d pense d' nergie libre peut tre utilis e par les cellules pour am liorer la pr cision d'un processus biologique. Dans le cas du repliement des prot ines, l'hydrolyse de l'ATP permet aux chaperons de reconna tre une grande vari t de structures mal repli es, d'arr ter tout autre mauvais repliement et de recommencer le repliement d'une prot ine de mani re ordonn e. Figure 6 80 La famille hsp70 des chaperons mol culaires. Ces prot ines agissent t t, reconnaissant un petit segment d'acides amin s hydrophobes la surface d'une prot ine. Aid es par un ensemble de prot ines hsp40 plus petites (non illustr es), les mol cules hsp70 li es l'ATP saisissent leur prot ine cible, puis hydrolysent l'ATP en ADP, subissant des changements de conformation qui am nent les mol cules hsp70 s'associer encore plus troitement la cible. Apr s la dissociation de hsp40, la reliaison rapide de l'ATP induit la dissociation de la prot ine hsp70 apr s la lib ration de l'ADP. Des cycles r p t s de liaison et de lib ration de hsp aident la prot ine cible se replier. Figure 6 81 La structure et la fonction de la famille hsp60 de chaperons mol culaires. (A) Une prot ine mal repli e est initialement captur e par des interactions hydrophobes avec la surface expos e de l'ouverture. La liaison initiale aide souvent d plier une prot ine mal repli e. La liaison ult rieure de l'ATP et d'une coiffe lib re la prot ine de substrat dans un espace clos, o elle a une nouvelle opportunit de se replier. Apr s environ 10 secondes, l'hydrolyse de l'ATP se produit, affaiblissant la liaison du capuchon. La liaison ult rieure de mol cules d'ATP suppl mentaires jecte la coiffe et la prot ine est lib r e. Comme indiqu , seule la moiti du cylindre sym trique fonctionne sur une prot ine cliente un moment donn . Ce type de chaperon mol culaire est galement connu sous le nom de chaperonine ; il est d sign comme HSP60 dans les mitochondries, TCP1 dans le cytosol des cellules de vert br s et GroEL dans les bact ries. (B) La structure de GroEL li e son chapeau GroES, telle que d termin e par cristallographie aux rayons X. gauche est montr l'ext rieur de la structure en forme de tonneau, et droite une coupe transversale travers son centre. (B, adapt de B. Bukau et A.L. Horwich, Cell 92:351-366, 1998. Avec l'autorisation d'Elsevier.) 10 milles marins Bien que notre discussion ne porte que sur deux types d'accompagnateurs, la cellule en a une vari t d'autres. L' norme diversit des prot ines dans les cellules n cessite probablement un large ventail de chaperons avec des capacit s de surveillance et de correction. Si des acides amin s radioactifs sont ajout s aux cellules pendant une br ve p riode, les prot ines nouvellement synth tis es peuvent tre suivies mesure qu'elles atteignent leur maturit dans leurs formes fonctionnelles finales. Ce type d'exp rience d montre que les prot ines hsp70 agissent en premier, partir du moment o une prot ine est encore synth tis e sur un ribosome, et que les prot ines de type hsp60 n'agissent que plus tard pour aider replier les prot ines termin es. Nous avons vu que la cellule distingue les prot ines mal repli es, qui n cessitent des cycles suppl mentaires de repliement catalys par l'ATP, de celles avec des structures correctes gr ce la reconnaissance des surfaces hydrophobes. Habituellement, si une prot ine a une zone expos e importante d'acides amin s hydrophobes sa surface, c'est anormal : soit elle n'a pas r ussi se replier correctement apr s avoir quitt le ribosome, soit elle a subi un accident qui l'a partiellement d pli e plus tard, soit elle n'a pas r ussi trouver sa sous-unit partenaire normale dans un complexe prot ique plus grand. Une telle prot ine n'est pas seulement inutile pour la cellule, elle peut tre dangereuse. Les prot ines qui se replient rapidement et correctement par elles-m mes n'affichent pas de tels motifs et contournent g n ralement les chaperons. Pour les autres, les chaperons peuvent effectuer une r paration prot ique en leur donnant des chances suppl mentaires de se replier tout en emp chant leur agr gation. La figure 6-82 d crit tous les choix de contr le de la qualit qu'une cellule fait pour une prot ine nouvellement synth tis e difficile plier. Comme indiqu , lorsque les tentatives de repliement d'une prot ine chouent, un m canisme suppl mentaire est appel entrer en jeu qui d truit compl tement la prot ine par prot olyse. Cette voie prot olytique commence par la reconnaissance d'une tache hydrophobe anormale la surface d'une prot ine, et se termine par l'administration de la prot ine enti re une machine de destruction de p
Biologie moléculaire de la cellule	rot ines, une prot ase complexe connue sous le nom de prot asome. Comme d crit ci-dessous, ce processus d pend d'un syst me labor de marquage des prot ines qui remplit galement d'autres fonctions centrales dans la cellule en d truisant certaines prot ines normales. Le prot asome est une prot ase compartiment e avec des sites actifs s questr s La machinerie prot olytique et les chaperons sont en comp tition les uns avec les autres pour reconna tre une prot ine mal repli e. Si une prot ine nouvellement synth tis e se replie rapidement, tout au plus seule une petite fraction de celle-ci est d grad e. En revanche, une prot ine repliement lent est vuln rable la machinerie prot olytique pendant une plus longue p riode, et beaucoup plus de ses mol cules peuvent tre d truites avant que le reste n'atteigne l' tat de repliement appropri . En raison de mutations ou d'erreurs de transcription, d' pissage de l'ARN et de traduction, certaines prot ines ne se replient jamais correctement, et il est particuli rement important que la cellule d truise ces prot ines potentiellement nocives. L'appareil qui d truit d lib r ment les prot ines aberrantes est le prot asome, une prot ase d pendante de l'ATP abondante qui constitue pr s de 1 % des prot ines cellulaires. Figure 6 82 Les processus qui surveillent la qualit des prot ines apr s la synth se des prot ines. Une prot ine nouvellement synth tis e se replie parfois correctement et s'assemble d'elle-m me avec ses prot ines partenaires, auquel cas les m canismes de contr le de la qualit la laissent tranquille. Les prot ines incompl tement repli es sont aid es se replier correctement par des chaperons mol culaires : d'abord par une famille de prot ines hsp70, puis, dans certains cas, par des prot ines de type hsp60. Pour les deux types de chaperons, les prot ines du substrat sont reconnues par une tache anormalement expos e d'acides amin s hydrophobes leur surface. Ces processus de sauvetage des prot ines entrent en concurrence avec un autre m canisme qui, lors de la reconnaissance d'une plaque hydrophobe anormalement expos e, marque la prot ine pour la destruction par le prot asome. L'activit combin e de tous ces processus est n cessaire pour emp cher l'agr gation massive de prot ines dans une cellule, ce qui peut se produire lorsque de nombreuses r gions hydrophobes sur les prot ines s'agglutinent de mani re non sp cifique. Figure 6 83 Le prot asome. (A) Une vue en coupe de la structure du cylindre central 20S, telle que d termin e par cristallographie aux rayons X, avec les sites actifs des prot ases indiqu s par des points rouges. (B) L'ensemble du prot asome, dans lequel le cylindre central (jaune) est compl t par un capuchon 19S (bleu) chaque extr mit . La coiffe complexe ( galement appel e particule r gulatrice) lie s lectivement les prot ines qui ont t marqu es par l'ubiquitine pour la destruction ; il utilise ensuite l'hydrolyse de l'ATP pour d plier ses cha nes polypeptidiques et les faire passer par un canal troit (voir Figure 6-85) dans la chambre int rieure du cylindre 20S pour la digestion en peptides courts. (B, de W. Baumeister et al., Cellule 92:367-380, 1998. Avec l'autorisation d'Elsevier.) Pr sent dans de nombreuses copies dispers es dans le cytosol et le noyau, le prot asome d truit galement les prot ines aberrantes qui ont p n tr dans le r ticulum endoplasmique (RE). Dans ce dernier cas, un syst me de surveillance bas sur le RE d tecte les prot ines qui n'ont pas r ussi se replier ou s'assembler correctement apr s leur entr e dans le RE, et les r trotransf re dans le cytosol pour tre d grad es par le prot asome (discut au chapitre 12). Chaque prot asome est constitu d'un cylindre creux central (le prot asome central 20S) form de plusieurs sous-unit s prot iques qui s'assemblent comme un empilement de quatre cycles heptam riques (Figure 6-83). Certaines des sous-unit s sont des prot ases dont les sites actifs font face la chambre interne du cylindre, les emp chant ainsi de se propager travers la cellule. Chaque extr mit du cylindre est normalement associ e un grand complexe prot ique (le chapeau 19S) qui contient un anneau prot ique six sous-unit s travers lequel les prot ines cibles sont enfil es dans le noyau du prot asome, o elles sont d grad es (Figure 6-84). La r action de filetage, entra n e par l'hydrolyse de l'ATP, d plie les prot ines cibles lorsqu'elles se d placent travers le chapeau, les exposant aux prot ases qui tapissent le noyau du prot asome (Figure 6-85). Les prot ines qui composent la structure annulaire de la coiffe du prot asome appartiennent une grande classe de prot ines unfoldases connues sous le nom de prot ines AAA. Beaucoup d'entre eux fonctionnent comme des hexam res et partagent des caract ristiques m canistes avec les h licases d'ADN d pendantes de l'ATP qui d roulent l'ADN (voir Figure 5-14). (A) (B) prot ine cible de l'ubiquitine avec cha ne de polyubiquitine r
Biologie moléculaire de la cellule	ceptrice Figure 6 84 Digestion processive des prot ines par le prot asome. (A) La coiffe du prot asome reconna t les prot ines marqu es par une cha ne de polyubiquitine (voir Figure 3-70), et les transf re ensuite dans le noyau du prot asome, o elles sont dig r es. un stade pr coce, l'ubiquitine est cliv e de la prot ine du substrat et est recycl e. La translocation dans le noyau du prot asome est m di e par un anneau d'ATPases qui d plient la prot ine du substrat lorsqu'elle est enfil e travers l'anneau et dans le noyau du prot asome. Cet anneau d pli est repr sent sur la figure 6-85). (B) Structure d taill e du chapeau du prot asome. La coiffe comprend un r cepteur de l'ubiquitine, qui maintient une prot ine ubiquityl e en place pendant qu'elle commence tre attir e dans le noyau du prot asome, et une hydrolase d'ubiquitine, qui clive l'ubiquitine de la prot ine condamn e. (A, d'apr s S. Prakash et A. Matouschek, Trends Biochem. Sci. 29:593-600, 2004. Avec l'autorisation d'Elsevier. B, adapt de G.C. Lander et al., Nature 482:186-191, 2012.) Une propri t cruciale du prot asome, et l'une des raisons de la complexit de sa conception, est la processivit de son m canisme : contrairement une prot ase simple qui clive la cha ne polypeptidique d'un substrat une seule fois avant de se dissocier, le prot asome maintient l'ensemble du substrat li jusqu' ce que tout soit converti en peptides courts. On s'attendrait ce qu'une machine aussi efficace que le prot asome soit troitement r glement e ; Il doit notamment tre capable de distinguer les prot ines anormales de celles qui sont correctement repli es. Le capuchon 19S du prot asome agit comme une porte l'entr e du noyau prot olytique interne, et seules les prot ines marqu es pour la destruction sont enfil es travers le chapeau. La marque de destruction est la fixation covalente de la petite prot ine ubiquitine. Comme nous l'avons vu au chapitre 3, la modification de l'ubiquitine des prot ines est utilis e de nombreuses fins dans la cellule. Le type particulier de liaison ubiquitine qui nous int resse ici est une cha ne de mol cules d'ubiquitine li es entre elles au niveau de la lysine 48 (voir Figure 3-69) ; C'est la caract ristique distinctive de l' tiquette ubiquitine qui marque la destruction d'une prot ine dans le prot asome. Un ensemble sp cial de mol cules E3 (voir Figure 3-70B) est responsable de l'ubiquitylation des prot ines d natur es ou mal repli es, ainsi que des prot ines contenant des acides amin s oxyd s ou anormaux. Les prot ines anormales ont tendance pr senter leur surface des s quences d'acides amin s hydrophobes ou des motifs conformationnels qui sont reconnus comme des signaux de d gradation par ces mol cules E3 ; Ces s quences sont enterr es et donc inaccessibles dans la version normale, correctement pli e. Cependant, une voie prot olytique qui reconna t et d truit les prot ines anormales doit tre capable de distinguer les prot ines compl t es qui ont de mauvaises conformations des nombreux polypeptides en croissance sur les ribosomes (ainsi que les polypeptides qui viennent d' tre lib r s des ribosomes) qui n'ont pas encore atteint leur conformation repli e normale. Ce n'est pas un probl me anodin ; Dans l'exercice de son r le principal, le syst me ubiquitine-prot asome d truit probablement de nombreuses mol cules prot iques naissantes et nouvellement form es, non pas parce que ces prot ines sont anormales en tant que telles, mais parce qu'elles ont expos transitoirement des signaux de d gradation qui sont enfouis dans leur tat mature (pli ). L'une des fonctions des m canismes prot olytiques intracellulaires est de reconna tre et d' liminer les prot ines mal repli es ou anormales, comme nous venons de le d crire. En effet, chaque prot ine de la cellule finit par accumuler des dommages et est probablement d grad e par le prot asome. Une autre fonction de ces voies prot olytiques est de conf rer de courtes dur es de vie des prot ines normales sp cifiques dont les concentrations doivent changer rapidement avec les alt rations de l' tat d'une cellule. Certaines de ces prot ines courte dur e de vie se d gradent rapidement tout moment, tandis que beaucoup d'autres ont une dur e de vie conditionnellement courte ; c'est- -dire qu'ils sont m taboliquement stables dans certaines conditions, mais deviennent instables lors d'un changement d' tat de la cellule. Par exemple, les cyclines mitotiques ont une longue dur e de vie tout au long du cycle cellulaire jusqu' leur d gradation soudaine la fin de la mitose, comme expliqu au chapitre 17. Figure 6 85 Une prot ine hexam re unfoldase. (A) La coiffe du prot asome comprend des prot ines (orange) qui reconnaissent et hydrolysent l'ubiquitine et un cycle hexam re (bleu) travers lequel les prot ines ubiquityl es sont enfil es. Le cycle hexam re est form de six sous-unit s, chacune appartenant la famille des prot ines AAA. (B) Mod le de l'activit
Biologie moléculaire de la cellule	de la d pliase d pendante de l'ATP des prot ines AAA. La forme li e l'ATP d'un cycle hexam re de prot ines AAA se lie une prot ine de substrat repli e qui est maintenue en place par son tiquette d'ubiquitine. Un changement de conformation, provoqu par l'hydrolyse de l'ATP, attire le substrat dans le noyau central et sollicite la structure du cycle. ce stade, la prot ine du substrat, qui est tir e, peut se d plier partiellement et p n trer plus loin dans le pore ou elle peut maintenir sa structure et se retirer partiellement. Des substrats prot iques tr s stables peuvent n cessiter des centaines de cycles d'hydrolyse et de dissociation de l'ATP avant d' tre amen s avec succ s travers le cycle prot ique AAA. Une fois d pli e (et d subiquityl e), la prot ine du substrat se d place relativement rapidement dans le pore par cycles successifs d'hydrolyse de l'ATP. (A, adapt de G.C. Lander et al., Nature 482:186-191, 2012 ; B, adapt de R.T. Sauer et al., Cellule 119:9-18, 2004. Avec l'autorisation d'Elsevier.) D masquage de la phosphorylation N par cr ation d'une dissociation des prot ines N-terminale d stabilisante par la prot ine kinase Comment une telle destruction r gul e d'une prot ine est-elle contr l e ? Plusieurs m canismes g n raux sont illustr s aux figures 6 86. Des exemples sp cifiques de chaque m canisme sont examin s dans les chapitres suivants. Dans une classe g n rale de m canismes (Figure 6-86A), l'activit d'une ubiquitine ligase est activ e soit par la phosphorylation de l'E3, soit par une transition allost rique dans une prot ine E3 caus e par sa liaison une mol cule sp cifique, petite ou grande. Par exemple, le complexe favorisant l'anaphase (APC) est une ubiquitine ligase multi-sous-unitaire qui est activ e par l'addition d'une sous-unit chronom tr e par cycle cellulaire la mitose. L'APC activ e provoque alors la d gradation des cyclines mitotiques et de plusieurs autres r gulateurs de la transition m taphase-anaphase (voir Figure 17 15A). Alternativement, en r ponse des signaux intracellulaires ou des signaux de l'environnement, un signal de d gradation peut tre cr dans une prot ine, provoquant son ubiquitylation rapide et sa destruction par le prot asome (Figure 6-86B). Une fa on courante de cr er un tel signal est de phosphoryler un site sp cifique sur une prot ine qui d masque un signal de d gradation normalement cach . Une autre fa on de d masquer un tel signal est la dissociation r gul e d'une sous-unit prot ique. Enfin, de puissants signaux de d gradation peuvent tre cr s par clivant une liaison peptidique unique, condition que ce clivage cr e un nouveau N-terminal reconnu par une prot ine E3 sp cifique comme un r sidu N-terminal d stabilisant . Cette prot ine E3 ne reconna t que certains acides amin s l'extr mit N-terminale d'une prot ine ; ainsi, tous les v nements de clivage prot ique n'entra neront pas la d gradation du fragment C-terminal produit. Chez l'homme, pr s de 80% des prot ines sont ac tyl es sur leur r sidu N-terminal, et l'on sait aujourd'hui que cette modification est reconnue par une enzyme E3 sp cifique, Figure 6 86 Deux fa ons g n rales d'induire la d gradation d'une prot ine sp cifique. (A) L'activation d'une mol cule E3 sp cifique cr e une nouvelle ubiquitine ligase. Les cellules eucaryotes ont de nombreuses mol cules E3 diff rentes, chacune activ e par un signal diff rent. (B) Cr ation d'un signal de d gradation expos dans la prot ine d grader. Ce signal se lie une ubiquitine ligase, provoquant l'ajout d'une cha ne de polyubiquitine une lysine voisine sur la prot ine cible. Les six voies montr es sont connues pour tre utilis es par les cellules pour induire le mouvement de prot ines s lectionn es dans le prot asome. qui dirige l'ubiquitylation de la prot ine et l'envoie au prot asome pour la d gradation. Ainsi, la majorit des prot ines humaines portent leurs propres signaux de destruction. Il a t propos que lorsqu'une prot ine est correctement repli e (et, avant cela, lorsqu'elle est en contact avec un chaperon), cette N-terminale ac tyl e est enfouie et donc inaccessible l'enzyme E3. Selon cette id e, mesure qu'une prot ine vieillit et est endommag e (ou si elle ne se replie pas correctement d s le d part), ce signal de destruction est expos et la prot ine est d truite. De l'ADN la prot ine, il y a de nombreuses tapes Nous avons vu jusqu' pr sent dans ce chapitre que de nombreux types de r actions chimiques sont n cessaires pour produire une prot ine correctement repli e partir de l'information contenue dans un g ne (Figure 6-87). Le niveau final d'une prot ine correctement repli e dans une cellule d pend donc de l'efficacit avec laquelle chacune des nombreuses tapes est effectu e. Nous savons galement maintenant que la cellule consacre d' normes ressources la d gradation s lective des prot ines, en particulier celles qui ne se replient pas correctement ou accumulent des dommages en vieilli
Biologie moléculaire de la cellule	ssant. C'est l' quilibre entre les taux de synth se et de d gradation qui d termine la quantit finale de chaque prot ine dans la cellule. Dans le chapitre suivant, nous verrons que les cellules ont la capacit de modifier les niveaux de leurs prot ines en fonction de leurs besoins. En principe, l'une ou l'ensemble des tapes de la figure 6-87 pourraient tre r gul es pour chaque prot ine individuelle. Comme nous le verrons au chapitre 7, il existe des exemples de r gulation chaque tape, du g ne la prot ine. 5 3 INTRONS D'ADN EXONS INITIATION DE LA TRANSCRIPTION CLIVAGE, POLYAD NYLATION ET TERMINAISON COIFFAGE D'EXPORTATION, PISSAGE D' LONGATION AAAA mRNA NOYAU CYTOSOL capuchon poly-A queue Figure 6 87 La production d'une prot ine par une cellule eucaryote. Le niveau final de chaque prot ine dans une cellule eucaryote d pend de l'efficacit de chaque tape d crite. La traduction de la s quence nucl otidique d'une mol cule d'ARNm en prot ine a lieu dans le cytosol sur un grand assemblage de ribonucl oprot ines appel ribosome. Chaque acide amin utilis pour la synth se des prot ines est d'abord attach une mol cule d'ARNt qui reconna t, par des interactions compl mentaires de paires de bases, un ensemble particulier de trois nucl otides (codons) dans l'ARNm. Lorsqu'un ARNm est enfil dans un ribosome, sa s quence de nucl otides est ensuite lue d'un bout l'autre en ensembles de trois selon le code g n tique. Pour initier la traduction, une petite sous-unit ribosomique se lie la mol cule d'ARNm au niveau d'un codon de d part (AUG) qui est reconnu par une mol cule d'ARNt initiatrice unique. Une grande sous-unit ribosomique se lie ensuite pour compl ter le ribosome et commencer la synth se des prot ines. Au cours de cette phase, les aminoacyl-ARNt, chacun portant un acide : se lient s quentiellement aux codons appropri s de l'ARNm par appariement de bases compl mentaires entre les anticodons de l'ARNt et les codons de l'ARNm. Chaque acide amin est ajout l'extr mit C-terminale du polypeptide en croissance en quatre tapes s quentielles : la liaison aminoacyl-ARNt, suivie de la formation d'une liaison peptidique, suivie de deux tapes de translocation du ribosome. Les facteurs d'allongement utilisent l'hydrolyse GTP la fois pour faire avancer ces r actions et pour am liorer la pr cision de la s lection des acides amin s. La mol cule d'ARNm progresse codon par codon travers le ribosome dans la direction 5 3 jusqu' ce qu'elle atteigne l'un des trois codons d'arr t. Un facteur de lib ration se lie ensuite au ribosome, mettant fin la traduction et lib rant le polypeptide termin . Les ribosomes eucaryotes et bact riens sont troitement li s, malgr des diff rences dans le nombre et la taille de leurs composants ARNr et prot iques. L'ARNr joue un r le dominant dans la traduction, d terminant la structure globale du ribosome, formant les sites de liaison pour les ARNt, faisant correspondre les ARNt aux codons de l'ARNm et cr ant le site actif de l'enzyme peptidyl transf rase qui relie les acides amin s entre eux pendant la traduction. Dans les derni res tapes de la synth se des prot ines, deux types distincts de chaperons mol culaires guident le repliement des cha nes polypeptidiques. Ces chaperons, connus sous le nom de hsp60 et hsp70, reconnaissent les taches hydrophobes expos es sur les prot ines et servent emp cher l'agr gation de prot ines qui entrerait autrement en comp tition avec le repliement des prot ines nouvellement synth tis es dans leurs conformations tridimensionnelles correctes. Ce processus de pro-repliement de la prot ine doit galement rivaliser avec un m canisme de contr le de la qualit labor qui d truit les prot ines avec des plaques hydrophobes anormalement expos es. Dans ce cas, l'ubiquitine est ajout e de mani re covalente une prot ine mal repli e par une ubiquitine ligase, et la cha ne de polyubiquitine r sultante est reconnue par le capuchon d'un prot asome qui d plie la prot ine et l'enfile l'int rieur du prot asome pour la d gradation prot olytique. Un m canisme prot olytique troitement apparent , bas sur des signaux de d gradation sp ciaux reconnus par les ubiquitines ligases, est utilis pour d terminer la dur e de vie de nombreuses prot ines normalement repli es ainsi que pour liminer des prot ines s lectionn es de la cellule en r ponse des signaux sp cifiques. Nous avons vu que l'expression de l'information h r ditaire n cessite une machinerie extraordinairement complexe et proc de de l'ADN la prot ine par l'interm diaire d'un ARN interm diaire. Cette machinerie pr sente un paradoxe central : si les acides nucl iques sont n cessaires pour synth tiser les prot ines et que les prot ines sont n cessaires, leur tour, pour synth tiser les acides nucl iques, comment un tel syst me de composants interd pendants a-t-il pu voir le jour ? L'un d'eux est qu'un monde d'ARN existait sur Terre avant l'apparition des cellules modernes (Figure 6-8
Biologie moléculaire de la cellule	8). Selon cette hypoth se, l'ARN stockait la fois l'information g n tique et catalysait les r actions chimiques dans les cellules primitives. Ce n'est que plus tard dans le temps de l' volution que l'ADN a pris le relais, car le mat riel g n tique et les prot ines sont devenus les principaux catalyseurs et composants structurels des cellules. Si cette id e est correcte, alors la transition hors du monde de l'ARN n'a jamais t compl te ; comme nous l'avons vu dans ce chapitre, l'ARN catalyse encore plusieurs r actions fondamentales dans les cellules modernes, qui peuvent tre consid r es comme des fossiles mol culaires d'un monde ant rieur. form avec DNAFigure 6-88 Time line for the universe, sugg rant l'existence pr coce d'un monde d'ARN de syst mes vivants. L'hypoth se du monde de l'ARN repose sur le fait que, parmi les mol cules biologiques actuelles, l'ARN est unique en ce qu'il est capable d'agir la fois comme un porteur d'information g n tique et comme un ribozyme pour catalyser des r actions chimiques. Dans cette section, nous discutons de ces propri t s de l'ARN et de la fa on dont elles ont pu tre particuli rement importantes dans les cellules pr coces. Nous avons vu dans ce chapitre que l'ARN peut transporter de l'information g n tique dans les ARNm, et nous avons vu dans le chapitre 5 que les g nomes de certains virus sont compos s uniquement d'ARN. Nous avons galement vu que l'appariement de bases compl mentaires et d'autres types de liaisons hydrog ne peuvent se produire entre les nucl otides d'une m me cha ne d'ARN, provoquant le repliement d'une mol cule d'ARN d'une mani re unique d termin e par sa s quence nucl otidique (voir, par exemple, les figures 6-50 et 6-67). La comparaison de nombreuses structures d'ARN a r v l des motifs conserv s, de courts l ments structurels qui sont utilis s maintes reprises comme parties de structures plus grandes (figures 6 89). Les catalyseurs prot iques n cessitent une surface avec des contours et des propri t s chimiques uniques sur laquelle un ensemble donn de substrats peut r agir (voir le chapitre 3). De la m me mani re, une mol cule d'ARN avec une forme repli e appropri e peut servir de catalyseur (Figure 6 90). Comme certaines prot ines, beaucoup de ces ribozymes fonctionnent en positionnant des ions m talliques sur leurs sites actifs. Cette caract ristique leur conf re une gamme d'activit s catalytiques plus large que celle fournie par les groupes chimiques limit s d'une cha ne polynucl otidique. Une grande partie de nos inf rences sur le monde de l'ARN provient d'exp riences dans lesquelles de grands pools de mol cules d'ARN de s quences nucl otidiques al atoires sont g n r s en laboratoire. Les mol cules d'ARN rares ayant une propri t sp cifi e par l'exp rimentateur sont ensuite s lectionn es et tudi es (Figure 6-91). De telles exp riences ont cr des ARN capables de catalyser une grande vari t de r actions biochimiques (tableaux 6 5), avec des augmentations de vitesse de r action inf rieures de quelques ordres de grandeur celles de la Figure 6 89 Quelques l ments communs de la structure de l'ARN. Les interactions conventionnelles et compl mentaires d'appariement de bases sont indiqu es par des chelons rouges dans les parties double h lice de l'ARN. Figure 6 90 Un ribozyme. Cette mol cule d'ARN simple catalyse le clivage d'un second ARN un site sp cifique. Ce ribozyme se trouve int gr dans des g nomes d'ARN plus grands, appel s viro des, qui infectent les plantes. Le clivage, qui se produit dans la nature un endroit loign sur la m me mol cule d'ARN qui contient le ribozyme, est une tape de la r plication du g nome du viro de. Bien que cela ne soit pas illustr sur la figure, la r action n cessite un ion magn sium positionn sur le site actif. (Adapt de T.R. Cech et O.C. Uhlenbeck, Nature 372:39-40, 1994. Avec l'autorisation de Macmillan Publishers Ltd.) Figure 6 91 S lection in vitro d'un ribozyme synth tique. partir d'un grand nombre de mol cules d'acide nucl ique synth tis es en laboratoire, ces mol cules d'ARN rares qui poss dent une activit catalytique sp cifi e peuvent tre isol es et tudi es. Bien qu'un exemple sp cifique (celui d'un ribozyme autophosphorylant) soit pr sent , des variantes de cette proc dure ont t utilis es pour g n rer de nombreux ribozymes num r s dans le tableau 6-5. Au cours de l' tape d'autophosphorylation, les mol cules d'ARN sont maintenues suffisamment dilu es pour emp cher la phosphorylation crois e de mol cules d'ARN suppl mentaires. En r alit , plusieurs r p titions de cette proc dure sont n cessaires pour s lectionner les tr s rares mol cules d'ARN ayant cette activit catalytique. Ainsi, le mat riel initialement lu de la colonne est reconverti en ADN, amplifi plusieurs fois ( l'aide de la transcriptase inverse et de la PCR, comme expliqu au chapitre 8), retranscrit en ARN et soumis des cycles r p t s de s lection. (Adapt de J.R. Lorsch et J.W. Szos
Biologie moléculaire de la cellule	tak, Nature 371:31-36, 1994. Avec l'autorisation de Macmillan Publishers Ltd.) celles des enzymes prot iques les plus rapides. Compte tenu de ces r sultats, il n'est pas clair pourquoi les catalyseurs prot iques sont beaucoup plus nombreux que les ribozymes dans les cellules modernes. Des exp riences ont toutefois montr que les mol cules d'ARN peuvent avoir plus de difficult s que les prot ines se lier des substrats souples et hydrophobes. Dans tous les cas, la disponibilit de 20 types d'acides amin s fournit probablement aux prot ines un plus grand nombre de strat gies catalytiques. Les mol cules d'ARN ont une propri t qui contraste avec celles des polypeptides : elles peuvent guider directement la formation de copies de leur propre s quence. Cette capacit d pend de l'appariement compl mentaire des bases de leurs sous-unit s nucl otidiques, ce qui permet un ARN d'agir comme un mod le pour la formation d'un autre. Comme nous l'avons vu dans ce chapitre et dans le pr c dent, ces m canismes de mod lisation compl mentaires sont au c ur de la r plication et de la transcription de l'ADN dans les cellules modernes. grand nombre de mol cules d'ADN double brin, chacune avec une s quence nucl otidique diff rente g n r e al atoirement Grand groupe de mol cules d'ARN simple brin, chacune avec une s quence nucl otidique diff rente, g n r e al atoirement, seules les rares mol cules d'ARN capables de se phosphoryler incorporent des mol cules de soufre qui ne parviennent pas se lier aux mol cules d'ARN rares qui peuvent catalyser leur propre phosphorylation en utilisant l'ATP comme substrat Mais la synth se efficace de l'ARN par de tels m canismes de mod lisation compl mentaires n cessite des catalyseurs pour favoriser la r action de polym risation : sans catalyseurs, la formation de polym res est lente, sujette aux erreurs et inefficace. Parce que l'ARN poss de toutes les propri t s requises d'une mol cule capable de catalyser une vari t de r actions chimiques, y compris celles qui conduisent sa propre synth se (Figure 6-92), il a t propos que les ARN servaient il y a longtemps de catalyseurs pour la synth se de l'ARN d pendant de la matrice. Bien qu'aucun syst me auto-r plicatif de mol cules d'ARN n'ait t trouv dans la nature, les scientifiques ont fait des progr s significatifs dans leur construction en laboratoire. Bien que de telles d monstrations ne prouvent pas que les mol cules d'ARN auto-r plicatrices sont au c ur de l'origine de la vie sur Terre, elles tabliraient qu'un tel sc nario est plausible. Comment la synth se des prot ines a-t-elle volu ? Les processus mol culaires sous-jacents la synth se des prot ines dans les cellules actuelles semblent inextricablement complexes. Bien que nous comprenions la plupart d'entre eux, ils n'ont pas de sens conceptuel comme le font la transcription, la r paration et la r plication de l'ADN. Il est particuli rement difficile d'imaginer comment la synth se des prot ines a volu car elle est maintenant effectu e par un syst me complexe imbriqu de mol cules de prot ines et d'ARN ; De toute vidence, les prot ines n'auraient pas pu exister avant qu'une premi re version de l'appareil de traduction ne soit d j en place. Aussi attrayante que soit l'id e du monde de l'ARN pour envisager la vie pr coce, elle n'explique pas comment le syst me moderne de synth se des prot ines est apparu. Bien que l'on ne puisse que sp culer sur les origines du code g n tique, plusieurs observations exp rimentales ont fourni des sc narios plausibles. Dans les cellules modernes, certains peptides courts (comme les antibiotiques) sont synth tis s sans le ribosome ; Les enzymes peptidiques synth tases assemblent ces peptides, avec leur s quence appropri e d'acides amin s, sans ARNm pour guider leur synth se. Il est plausible que cette version primitive non cod e de la synth se des prot ines se soit d'abord d velopp e dans le monde de l'ARN, o elle aurait t catalys e par des mol cules d'ARN. Cette id e ne pr sente pas de difficult s conceptuelles car, comme nous l'avons vu, l'ARNr catalyse la formation de liaisons peptidiques dans les cellules actuelles. Cependant, il laisse inexpliqu e comment le code g n tique qui est au c ur de la synth se des prot ines dans les cellules d'aujourd'hui aurait pu appara tre. Nous savons que les ribozymes cr s en laboratoire peuvent effectuer des r actions sp cifiques d'aminoacylation ; c'est- -dire qu'ils peuvent associer des acides amin s sp cifiques des ARNt sp cifiques. Il est donc possible que des adaptateurs de type ARNt, chacun adapt un acide amin sp cifique, aient pu appara tre dans le monde de l'ARN, marquant les d buts d'un code g n tique. Une fois que la synth se cod e des prot ines a volu , la transition vers un monde domin par les prot ines a pu se poursuivre, les prot ines prenant finalement en charge la majorit des t ches catalytiques et structurelles en raison de leur plus grande polyvalence, avec 20 sous
Biologie moléculaire de la cellule	-unit s diff rentes au lieu de 4. Bien que ces id es soient hautement sp culatives, elles sont coh rentes avec les propri t s connues des mol cules d'ARN et de prot ines. Toutes les cellules actuelles utilisent l'ADN comme mat riel h r ditaire Si les sp culations volutionnistes incarn es dans l'hypoth se du monde de l'ARN sont correctes, les cellules primitives auraient fondamentalement diff r des cellules que nous connaissons aujourd'hui en ce que leur information h r ditaire serait stock e dans l'ARN plut t que dans l'ADN (Figure 6-93). Des preuves que l'ARN est apparu avant l'ADN dans l' volution peuvent tre trouv es Figure 6 92 Une mol cule d'ARN capable de catalyser sa propre synth se. Ce processus hypoth tique n cessiterait la fois la catalyse de la production d'un deuxi me brin d'ARN de s quence nucl otidique compl mentaire (non illustr e) et l'utilisation de cette deuxi me mol cule d'ARN comme matrice pour former de nombreuses mol cules d'ARN avec la s quence originale. Les rayons rouges repr sentent le site actif de cette hypoth tique enzyme ARN. Figure 6 93 L'hypoth se selon laquelle l'ARN a pr c d l'ADN et les prot ines dans l' volution. Dans les cellules les plus anciennes, les mol cules d'ARN (ou leurs analogues proches) auraient eu des fonctions g n tiques, structurelles et catalytiques combin es. Dans les cellules actuelles, l'ADN est le d positaire de l'information g n tique, et les prot ines remplissent la grande majorit des fonctions catalytiques dans les cellules. L'ARN fonctionne aujourd'hui principalement comme un interm diaire dans la synth se des prot ines, bien qu'il reste un catalyseur pour un petit nombre de r actions cruciales. 366 Chapitre 6 : Comment les cellules lisent le g nome : de l'ADN la prot ine dans les diff rences chimiques entre eux. Le ribose, comme le glucose et d'autres glucides simples, peut tre form partir de formald hyde (HCHO), un produit chimique simple qui est facilement produit dans des exp riences de laboratoire qui tentent de simuler Comment les relations actuelles ont-elles fait les conditions sur la Terre primitive. Le sucre d soxyribose est plus difficile fabriquer, et dans les cellules actuelles, il est produit partir du ribose dans une r action catalys e par une prot ine pro- voluez ? Comment le code g n tique de l'enzyme t ine, sugg rant que le ribose pr c de le d soxyribose dans les cellules. Vraisemblablement, l'origine ? L'ADN est apparu sur la sc ne plus tard, mais s'est ensuite av r plus appropri que l'ARN en tant que d p t permanent d'informations g n tiques. En particulier, le d soxyribose dans L'information port e dans les g nomes son squelette sucre-phosphate rend les cha nes d'ADN chimiquement plus stables que ne sp cifie les s quences de toutes les cha nes prot iques de l'ARN, de sorte que des longueurs beaucoup plus grandes d'ADN peuvent tre maintenues sans et mol cules d'ARN dans la cellule, rupture. Et il d termine quand et o ces mol cules sont synth tis es. Les autres diff rences entre l'ARN et l'ADN : la structure en double h lice L'ADN et l'utilisation de thymine plut t que d'uracile am liorent encore la stabilit de l'ADN en facilitant la d couverte des nombreux accidents in vitables qui se produisent avec la mol cule ? r parer, comme nous l'avons vu en d tail au chapitre 5 (p. 271-273). Les cellules se donnent beaucoup de mal pour corriger les erreurs dans les processus de r plication, de transcription, d' pissage et de traduction de l'ADN. Y a-t-il des analogues D'apr s notre connaissance des organismes actuels et des mol cules qu'ils contiennent, il semble probable que le d veloppement des m canismes autocatalytiques distinctifs de la s lection des g nes affecter aux syst mes vivants a commenc avec l' volution des familles de mol cules d'ARN exprim es dans un type de cellule donn ? Cela pourrait-il catalyser leur propre r plication. L'ADN a probablement t un ajout tardif : la grande complexit de la transcription car l'accumulation de catalyseurs prot iques a permis des cellules plus efficaces et complexes l'initiation chez les animaux et les plantes refl tent voluer, la double h lice de l'ADN a remplac l'ARN en tant que mol cule plus stable pour stocker une telle strat gie ? l'augmentation des quantit s d'informations g n tiques requises par ces cellules. Quelles d clarations sont vraies ? expliquer pourquoi ou pourquoi pas.6 1 Les cons quences des erreurs de transcription sont moins graves que celles des erreurs de r plication de l'ADN. 6 2 tant donn que les introns sont en grande partie des d chets g n tiques, ils ne forment pas de super-bobines Q6 1 autour d'une ARN polym rase en mouvement (le probl me doit tre retir pr cis ment du transcrit primaire 6 6). lors de l' pissage de l'ARN. 6 3 L'appariement de l'oscillation se produit entre la premi re position 6 7 Vous avez attach une mol cule d'ARN polym rase dans le codon et la troisi me position dans l'anticodon.
Biologie moléculaire de la cellule	une lame de verre et lui ont permis d'initier la transcription sur un ADN matrice qui est attach une bille magn tique comme 6 4 Au cours de la synth se des prot ines, la thermodynamique de la figure Q6 2. Si l'ADN avec son appariement mag-base attach entre les ARNt et les ARNm d finit les mouvements de la bille n tique sup rieure par rapport l'ARN polym rase comme indilimite pour la pr cision avec laquelle les mol cules de prot ines sont cated sur la figure, en Dans quel sens la perle va-t-elle tourner ? fait. 6 5 On pense que les enzymes prot iques sont beaucoup plus nombreuses que le syst me de mesure de la rotation des ribozymes d'ADN dans les cellules modernes, car elles peuvent catalyser l'aimant une plus grande vari t de r actions et toutes l'ont fait (Probl me 6 7). L'aimant acc l re plus vite que n'importe quel ribozyme. maintient la perle la verticale (mais n'interf re pas avec sa rotation de la perle), et les minuscules billes fluorescentes attach es permettent 6 6 Dans quelle direction le long du mod le la direction du mouvement de l'ADN doit tre visualis e sous le L'ARN polym rase de la figure Q6 1 se d place pour avoir un microscope g n ral. L'ARN polym rase est constitu e par les structures super-enroul es qui sont montr es ? Vous attendriez-vous ce que des superbobines soient g n r es si l'ARN poly-ARN la lame de verre. merase taient libres de tourner autour de l'axe de l'ADN au fur et mesure qu'il progressait le long du mod le ? toboggan en verre Figure Q6 3 ARNm piss s alternativement partir du g ne -tropomyosine humaine (probl me 6 8). (A) Exons du g ne -tropomyosine humaine. Les emplacements et les tailles relatives des exons sont indiqu s par les rectangles bleu et rouge, avec les exons alternatifs en rouge. (B) Mod les d' pissage pour quatre ARNm de -tropomyosine. L' pissage est indiqu par des lignes reliant les exons qui sont inclus dans l'ARNm. 6 8 Le g ne humain de la -tropomyosine est alternativement piss pour produire diff rentes formes d'ARNm de la -tropomyosine dans diff rents types de cellules (Figure Q6 3). Pour toutes les formes de l'ARNm, les s quences prot iques cod es par l'exon 1 sont les m mes, tout comme les s quences prot iques cod es par l'exon 10. Les exons 2 et 3 sont des exons alternatifs utilis s dans diff rents ARNm, tout comme les exons 7 et 8. Laquelle des affirmations suivantes sur les exons 2 et 3 est la plus pr cise ? Cette affirmation est-elle galement la plus pr cise pour les exons 7 et 8 ? Expliquez vos r ponses. R. Les exons 2 et 3 doivent avoir le m me nombre de nucl otides. b. Les exons 2 et 3 doivent chacun contenir un nombre entier de codons (c'est- -dire que le nombre de nucl otides divis par 3 doit tre un entier). C. Les exons 2 et 3 doivent chacun contenir un certain nombre de nucl otides qui, lorsqu'ils sont divis s par 3, laissent le m me reste (c'est- -dire 0, 1 ou 2). 6 9 Apr s avoir trait des cellules avec un mutag ne chimique, vous isolez deux mutants. L'un transporte l'alanine et l'autre la m thionine un endroit de la prot ine qui contient normalement de la valine (figure Q6 4). Apr s avoir trait nouveau ces deux mutants avec le mutag ne, vous isolez les mutants de chacun d'eux qui portent maintenant de la thr onine sur le site de la valine d'origine (Figure Q6 4). En supposant que toutes les mutations impliquent des modifications d'un seul nucl otide, d duisez les codons utilis s pour la valine, la m thionine, la thr onine et l'alanine au site affect . Vous attendriez-vous pouvoir isoler les mutants de la valineto-thr onine en une seule tape ? 6 10 Lequel des changements mutationnels suivants pr voyez-vous comme tant le plus d l t re pour la fonction des g nes ? Expliquez vos r ponses. premi re figure Q6 4 Deux cycles de traitement : mutagen se et les acides amin s alt r s une seule position dans la prot ine Val Thr a (probl me 6 9). 1. Insertion d'un seul nucl otide pr s de la fin de la s quence codante. 2. Retrait d'un seul nucl otide pr s du d but de la s quence codante. 3. D l tion de trois nucl otides cons cutifs au milieu de la s quence codante. 4. Substitution d'un nucl otide par un autre au milieu de la s quence codante. 6 11 Les procaryotes et les eucaryotes prot gent tous deux contre les dangers de la traduction d'ARNm bris s. Quels dangers les ARNm partiels repr sentent-ils pour la cellule ? 6 12 Les chaperons mol culaires de type hsp60 et hsp70 partagent une affinit pour les taches hydrophobes expos es sur les prot ines, les utilisant comme indicateurs de repliement incomplet. Pourquoi pensez-vous que les patchs hydrophobes servent de signaux critiques pour l' tat de repliement d'une prot ine ? 6 13 La plupart des prot ines n cessitent des chaperons mol culaires pour aider leur repliement correct. Comment pensez-vous que les chaperons eux-m mes parviennent se plier correctement ? 6 14 Qu'y a-t-il de si sp cial dans l'ARN pour qu'on suppose qu'il s'agit d'u
Biologie moléculaire de la cellule	n pr curseur volutif de l'ADN et des prot ines ? Qu'est-ce qui fait de l'ADN un meilleur mat riau que l'ARN pour le stockage de l'information g n tique ? 6 15 Si une mol cule d'ARN pouvait former une pingle cheveux avec une boucle interne sym trique, comme le montre la figure Q6 5, le compl ment de cet ARN pourrait-il former une structure similaire ? Si c'est le cas, y aurait-il des r gions identiques des deux structures ? Lesquels ? Figure Q6 5 Une pingle cheveux ARN avec 5'-G-C-A C-C-G une boucle interne sym trique (Probl me U 6 15). 6 16 Imaginez un tang chaud sur la Terre primordiale. Des processus fortuits viennent d'assembler une copie unique d'une mol cule d'ARN avec un site catalytique capable d'effectuer la r plication de l'ARN. Cette mol cule d'ARN se replie dans une structure capable de lier les nucl otides selon les instructions d'un mod le d'ARN. Avec un apport ad quat en nucl otides, cette mol cule d'ARN unique sera-t-elle capable de s'utiliser comme mod le pour catalyser sa propre r plication ? Pourquoi ou pourquoi pas ? Atkins JF, Gesteland RF & Cech TR (eds) (2011) Les mondes de l'ARN : des origines de la vie la diversit dans la r gulation des g nes. Cold Spring Harbor, NY : Cold Spring Harbor Laboratory Press. Berg JM, Tymoczko JL et Stryer L (2012) Biochimie, 7e d. New York : WH Freeman. Brown TA (2007) G nomes 3. New York : Garland Science. Darnell J (2011) L'ARN : la mol cule indispensable la vie. Cold Spring Harbor, NY : Cold Spring Harbor Laboratory Press. Hartwell L, Hood L, Goldberg ML et al. (2011) G n tique : des g nes aux g nomes, 4e d. Boston : McGraw Hill. Judson HF (1996) Le huiti me jour de la cr ation, d. 25e anniversaire Cold Spring Harbor, NY : Cold Spring Harbor Laboratory Press. Lodish H, Berk A, Kaiser C et al. (2012) Biologie cellulaire mol culaire, 7e d. New York : WH Freeman. Stent GS (1971) G n tique mol culaire : un r cit introductif. San Francisco : WH Freeman. Le code g n tique (1966) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 31.Le ribosome (2001) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 66. Watson JD, Baker TA, Bell SP et al. (2013) Biologie mol culaire du g ne, 7e d. Menlo Park, CA : Benjamin Cummings. De l'ADN l'ARN Berget SM, Moore C & Sharp PA (1977) Segments piss s l'extr mit 5 de l'ARNm tardif de l'ad novirus 2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 3171 3175. Brenner S, Jacob F & Meselson M (1961) Un interm diaire instable transportant des informations des g nes aux ribosomes pour la synth se des prot ines. Nature 190, 576 581. Chow LT, Gelinas RE, Broker TR et al. (1977) Un arrangement de s quence tonnant aux 5 extr mit s de l'ARN messager de l'ad novirus 2. Cellule 12, 1 8. Conaway CC & Conaway JW (2011) Fonction et r gulation du complexe Mediator. Curr. Opin. Genette. Dev. 21, 225 230. Cooper TA, Wan L & Dreyfuss G (2009) ARN et maladie. Cellule 136, 777 793. Cramer P, Armache KJ, Baumli S et al. (2008) Structure des ARN polym rases eucaryotes. Annu. R v. Biophys. 37, 337 352. Fica SM, Tuttle N, Novak T et al. (2013) L'ARN catalyse l' pissage nucl aire des pr ARNm. Nature 503, 229 234. Grunberg, S, & Hahn, S (2013) Aper u structurel de l'initiation de la transcription par les ARN polym rases II. Tendances Biochem. Sci. 38, 603 611. Grunwald D, Singer RH & Rout M (2011) Dynamique d'exportation nucl aire des complexes TNA-prot ines. Nature 475, 333 341. Kornblihtt AR, Schor IE, Allo M et al. (2013) pissage alternatif : une tape pivot entre la transcription eucaryote et la traduction. Nature 14, 153 165. Liu X, Bushnell DA & Kornberg RD (2012) Transcription de l'ARN polym rase II : structure et m canisme. Biochim. Biophys. Acta 1829, 2 8. Makino DL, Halibach F & Conti E (2013) L'exosome et le prot asome de l'ARN : principes communs de contr le de la d gradation. Nature 14, 654 660. Malik S & Roeder RC (2010) Le complexe co-activateur m diateur m tazoaire en tant que plaque tournante int grative pour la r gulation transcriptionnelle. R v rend Genet. 11, 761 772. Mao YS, Zhang B & Spector DL (2011) Biogen se et fonction des corps nucl aires. Tendances Genet. 27, 295 306. Matera AG & Wang Z (2014) Une journ e dans la vie de l' pissage. Nature 15, 108 121. Matsui T, Segall J, Weil PA & Roeder RG (1980) Plusieurs facteurs n cessaires l'initiation pr cise de la transcription par l'ARN polym rase II purifi e. J. Biol. Chem. 255, 11992 11996. Opalka N, Brown J, Lane WJ et al. (2010) Mod le structurel complet de l'ARN polym rase d'Escherichia coli partir d'une approche hybride. PLoS Biol. 9, 1 16. Ruskin B, Krainer AR, Maniatis T et al. (1984) Excision d'un intron intact en tant que nouvelle structure de lariat lors de l' pissage in vitro du pr -ARNm. Cellule 38, 317 331. Schneider C & Tollervey D (2013) Enfilage du baril de l'exosome d'ARN. Tendances Biochem. Sci. 38, 485 493. Semlow DR & Staley JP (2012) Rester sur le message : assurer la fid lit dans l' pissage pr -ARNm. Tendances Bioc
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Biologie moléculaire de la cellule	cellule h patique partagent le m me g nome. Les longues branches de ce neurone de la r tine lui permettent de recevoir des signaux lectriques de nombreux autres neurones et de les transmettre aux neurones voisins. La cellule h patique, qui est attir e la m me chelle, est impliqu e dans de nombreux processus m taboliques, y compris la digestion et la d sintoxication de l'alcool et d'autres drogues. Ces deux cellules de mammif res contiennent le m me g nome, mais elles expriment des ensembles diff rents d'ARN et de prot ines. (neurone adapt de S. ram n y Cajal, histologie du Syst me nerveux de l'homme et de vertebres, 1909-1911. paris : Maloine ; r imprim , Madrid : C.S.I.C, 1972.) 370 Chapitre 7 : Le contr le de l'expression des g nes produit un t tard normal (Figure 7 2A). Le t tard contient une gamme compl te de cellules diff renci es qui ont d riv leurs s quences d'ADN du noyau de la cellule donneuse d'origine. Ainsi, la cellule donneuse diff renci e ne peut pas avoir perdu de s quences d'ADN importantes. Une conclusion similaire est venue d'exp riences r alis es avec des plantes. Lorsque des morceaux diff renci s de tissu v g tal sont plac s en culture, puis dissoci s en cellules uniques, l'une de ces cellules individuelles peut souvent r g n rer une plante adulte enti re (figures 7 2B). Et le m me principe a t d montr plus r cemment chez les mammif res, notamment les moutons, les bovins, les porcs, les ch vres, les chiens et les souris (Figure 7-2C). Plus r cemment, un s quen age d taill de l'ADN a confirm la conclusion selon laquelle les changements dans l'expression des g nes qui sous-tendent le d veloppement des organismes multicellulaires n'impliquent g n ralement pas de changements dans la s quence d'ADN du g nome. Diff rents types de cellules synth tisent diff rents ensembles d'ARN et de prot ines Comme premi re tape dans la compr hension de la diff renciation cellulaire, nous aimerions savoir combien de diff rences il y a entre un type de cellule et un autre. Bien que nous Figure 7 2 Les cellules diff renci es contiennent toutes les instructions g n tiques n cessaires pour diriger la formation d'un organisme complet. (A) le noyau d'une cellule cutan e d'une grenouille adulte transplant e dans un uf nucl peut donner naissance un t tard entier. La fl che bris e indique que, pour donner au g nome transplant le temps de s'adapter un environnement embryonnaire, une tape de transfert suppl mentaire est n cessaire au cours de laquelle l'un des noyaux est pr lev sur un embryon pr coce qui commence se d velopper et est remis dans un deuxi me ovule nucl . (B) dans de nombreux types de plantes, les cellules diff renci es conservent la capacit de se d diff rencier , de sorte qu'une seule cellule peut former un clone de cellules de descendance qui donne plus tard naissance une plante enti re. (C) Un noyau pr lev dans une cellule diff renci e d'une vache adulte et introduit dans un uf nucl d'une vache diff rente peut donner naissance un veau. Diff rents veaux produits partir d'un m me donneur de cellules diff renci es sont tous des clones du donneur et sont donc g n tiquement identiques. (A, modifi de J.B. Gurdon, Sci. Am. 219:24-35, 1968.) ovule pizootique m iotique non f cond ET CHROMOSOMES ASSOCI S ENLEV S no. de lit n . des lectures (B) d but de la transcription exons introns CELL LINE n'ont toujours pas de r ponse exacte cette question fondamentale, nous pouvons faire plusieurs affirmations g n rales. 1. De nombreux processus sont communs toutes les cellules, et deux cellules d'un m me organisme ont donc de nombreux produits g niques en commun. Il s'agit notamment des prot ines structurelles des chromosomes, de l'ARN et de l'ADN polym rase, des enzymes de r paration de l'ADN, des prot ines et des ARN ribosomiques, des enzymes qui catalysent les r actions centrales du m tabolisme et de nombreuses prot ines qui forment le cytosquelette, comme l'actine (Figure 7-3A). 2. Certains ARN et prot ines sont abondants dans les cellules sp cialis es dans lesquelles ils fonctionnent et ne peuvent pas tre d tect s ailleurs, m me par des tests sensibles. L'h moglobine, par exemple, est exprim e sp cifiquement dans les globules rouges, o elle transporte l'oxyg ne, et l'enzyme tyrosine aminotransf rase (qui d compose la tyrosine dans les aliments) est exprim e dans le foie, mais pas dans la plupart des autres tissus (Figure 7-3B). 3. Des tudes sur le nombre d'ARN diff rents sugg rent qu' un moment donn , une cellule humaine typique exprime 30 60 % de ses quelque 30 000 g nes un certain niveau. Il existe environ 21 000 g nes codant pour des prot ines et environ 9000 g nes d'ARN non codants chez l'homme. Lorsque l'on compare les mod les d'expression de l'ARN dans diff rentes lign es cellulaires humaines, on constate que le niveau d'expression de presque tous les g nes varie d'un type de cellule un autre. Quelques-unes de ces diff rences sont frappantes, c
Biologie moléculaire de la cellule	omme celles de l'h moglobine et de la tyrosine aminotransf rase mentionn es ci-dessus, mais la plupart sont beaucoup plus subtiles. Mais m me les g nes qui sont exprim s dans tous les types de cellules varient g n ralement dans leur niveau d'expression d'un type de cellule l'autre. 4. Bien qu'il existe des diff rences frappantes dans les ARN codants (ARNm) dans les types de cellules sp cialis s, ils sous-estiment toute la gamme des diff rences dans le mod le final de production de prot ines. Comme nous l'expliquons dans ce chapitre, il existe de nombreuses tapes apr s la production d'ARN auxquelles l'expression des g nes peut tre r gul e. Et, comme nous l'avons vu au chapitre 3, les prot ines sont souvent modifi es de mani re covalente apr s avoir t synth tis es. Les diff rences radicales dans l'expression des g nes entre les types de cellules sont donc plus pleinement r v l es par des m thodes qui affichent directement les niveaux de prot ines ainsi que leurs modifications post-traductionnelles (Figure 7-4). Figure 7 3 Diff rences dans les niveaux d'ARN pour deux g nes humains dans sept tissus diff rents. Pour obtenir les donn es d'ARN par la technique connue sous le nom d'ARN-seq (voir p. 447), l'ARN a t collect partir de lign es cellulaires humaines cultiv es en culture, d riv es de chacun des sept tissus indiqu s. Des millions de lectures de s quences ont t obtenues et cartographi es dans le g nome humain en faisant correspondre les s quences d'ARN la s quence DnA du g nome. chaque position le long du g nome, la hauteur de la trace color e est proportionnelle au nombre de lectures de s quence qui correspondent la s quence du g nome ce point. Comme le montre la figure, les s quences d'exons dans les g nes transcrits sont pr sentes des niveaux lev s, refl tant leur pr sence dans les ARNm matures. Les s quences d'intron sont pr sentes des niveaux beaucoup plus bas et refl tent les mol cules pr -mrnA qui n'ont pas encore t piss es, ainsi que les s quences d'intron qui ont t piss es mais pas encore d grad es. (A) le g ne codant pour l'actine polyvalente , un composant majeur du cytosquelette. notez que l'extr mit gauche de l'ARNm -actine mature n'est pas traduite en prot ine. Comme expliqu plus loin dans ce chapitre, de nombreux ARNm ont 5 r gions non traduites qui r gulent leur traduction en prot ines. (B) le m me type de donn es affich es pour l'enzyme tyrosine aminotransf rase, qui est fortement exprim e dans les cellules h patiques mais pas dans les autres types de cellules test s. (informations pour les deux panels de l'Universit de Californie, Santa Cruz, Genome Browser (http://genome.ucsc.edu), qui fournit ce type d'informations pour chaque g ne humain. Voir aussi S. Djebali et al., Nature 489:101-108, 2012.) Des signaux externes peuvent amener une cellule modifier l'expression de ses g nes Bien que les cellules sp cialis es d'un organisme multicellulaire aient des mod les caract ristiques d'expression g nique, chaque cellule est capable de modifier son mod le d'expression g nique en r ponse des signaux extracellulaires. Si une cellule h patique est expos e une hormone glucocortico de, par exemple, la production d'un ensemble de prot ines est consid rablement augment e. Lib r s dans le corps pendant les p riodes de famine ou d'exercice intense, les glucocortico des signalent au foie d'augmenter la production d' nergie partir d'acides amin s et d'autres petites mol cules ; L'ensemble des prot ines dont la production est induite comprend l'enzyme tyrosine aminotransf rase, mentionn e ci-dessus. Lorsque l'hormone n'est plus pr sente, la production de ces prot ines chute son niveau normal et non stimul cellules h patiques. D'autres types de cellules r agissent diff remment aux glucocortico des. Les cellules adipeuses, par exemple, r duisent la production de tyrosine aminotransf rase, tandis que certains autres types de cellules ne r pondent pas du tout aux glucocortico des. Ces exemples illustrent une caract ristique g n rale de la sp cialisation cellulaire : diff rents types de cellules r pondent souvent tr s diff remment au m me signal extracellulaire. D'autres caract ristiques du mod le d'expression g nique ne changent pas et donnent chaque type de cellule son caract re distinctif permanent. L'expression des g nes peut tre r gul e de nombreuses tapes de la voie de l'ADN l'ARN et aux prot ines Si les diff rences entre les diff rents types de cellules d'un organisme d pendent des g nes particuliers que les cellules expriment, quel niveau le contr le de l'expression des g nes s'exerce-t-il ? Comme nous l'avons vu dans le chapitre pr c dent, il y a de nombreuses tapes dans le chemin menant de l'ADN la prot ine. Nous savons maintenant qu'ils peuvent tous tre r glement s en principe. Ainsi, une cellule peut contr ler les prot ines qu'elle fabrique en (1) contr lant quand et quelle fr quence un g ne donn est transcrit (contr le tra
Biologie moléculaire de la cellule	nscriptionnel), (2) contr lant l' pissage et le traitement des transcrits d'ARN (contr le du traitement de l'ARN), (3) s lectionnant quels ARNm termin s sont export s du noyau vers le cytosol et d terminant o ils sont localis s dans le cytosol (transport de l'ARN et contr le de la localisation), (4) s lectionner les ARNm du cytoplasme qui sont traduits par les ribosomes (contr le traductionnel), (5) d stabiliser s lectivement certaines mol cules d'ARNm dans le cytoplasme (contr le de la d gradation de l'ARNm), ou (6) activer, inactiver, d grader ou localiser s lectivement des mol cules prot iques sp cifiques apr s qu'elles aient t fabriqu es (contr le de l'activit prot ique) (Figure 7 5). Pour la plupart des g nes, les contr les transcriptionnels sont primordiaux. Cela a du sens car, de tous les points de contr le possibles illustr s dans la figure 7-5, seul le contr le transcriptionnel garantit que la cellule ne synth tsera pas d'interm diaires superflus. Dans les sections suivantes, nous abordons les composants de l'ADN et des prot ines qui remplissent cette fonction en r gulant l'initiation de la transcription des g nes. Nous reviendrons ensuite sur les autres moyens de r guler l'expression des g nes. Figure 7 4 Diff rences dans les prot ines exprim es par deux tissus humains, (A) le cerveau et (B) le foie. Dans chaque panneau, les prot ines sont affich es l'aide d'une lectrophor se bidimensionnelle sur polyacrylamide-gel (voir pp. 452-454). Les prot ines ont t s par es par le poids mol culaire (de haut en bas) et le point iso lectrique, le pH auquel la prot ine n'a pas de charge nette (de droite gauche). Les taches prot iques artificiellement color es en rouge sont communes aux deux chantillons ; ceux en bleu sont sp cifiques ce tissu. Les diff rences entre les deux chantillons de tissus l'emportent largement sur leurs similitudes : m me pour les prot ines partag es entre les deux tissus, leurs abondances relatives sont g n ralement diff rentes. Notez que cette technique s pare les prot ines la fois par taille et par charge ; Par cons quent, une prot ine qui a plusieurs tats de phosphorylation diff rents appara tra comme une s rie de taches horizontales (voir la partie sup rieure droite du panneau de droite). Seule une petite partie du spectre complet des prot ines est indiqu e pour chaque chantillon. Les m thodes bas es sur la spectrom trie de masse (voir pp. 455-457) fournissent des informations beaucoup plus d taill es, notamment l'identit de chaque prot ine, la position de chaque modification et la nature de la modification. (Avec l'aimable autorisation de Tim Myers et Leigh Anderson, Large Scale Biology Corporation.) Le g nome d'une cellule contient dans sa s quence d'ADN l'information n cessaire la fabrication de plusieurs milliers de mol cules de prot ines et d'ARN diff rentes. Une cellule n'exprime g n ralement qu'une fraction de ses g nes, et les diff rents types de cellules dans les organismes multicellulaires apparaissent parce que diff rents ensembles de g nes sont exprim s. De plus, les cellules peuvent modifier le mod le des g nes qu'elles expriment en r ponse des changements dans leur environnement, tels que des signaux provenant d'autres cellules. Bien que toutes les tapes impliqu es dans l'expression d'un g ne puissent en principe tre r gul es, pour la plupart des g nes, l'initiation de la transcription de l'ARN fournit le point de contr le le plus important. Comment une cellule d termine-t-elle lequel de ses milliers de g nes transcrire ? Le concept le plus important, qui s'applique toutes les esp ces sur Terre, est peut- tre bas sur un groupe de prot ines connu sous le nom de transcription R gulateurs. Ces prot ines reconnaissent des s quences sp cifiques d'ADN (g n ralement de 5 10 paires de nucl otides) qui sont souvent appel es s quences cis-r gulatrices, car elles doivent se trouver sur le m me chromosome (c'est- -dire en cis) que les g nes qu'elles contr lent. Les r gulateurs de transcription se lient ces s quences, qui sont dispers es dans les g nomes, et cette liaison met en mouvement une s rie de r actions qui sp cifient finalement quels g nes doivent tre transcrits et quel rythme. Environ 10 % des g nes codant pour les prot ines de la plupart des organismes sont consacr s aux r gulateurs de transcription, ce qui en fait l'une des plus grandes classes de prot ines de la cellule. Dans la plupart des cas, un r gulateur de transcription donn reconna t sa propre s quence cis-r gulatrice, qui est diff rente de celles reconnues par tous les autres r gulateurs de la cellule. La transcription de chaque g ne est, son tour, contr l e par sa propre collection de s quences cis-r gulatrices. Ceux-ci se trouvent g n ralement proximit du g ne, souvent dans la r gion interg nique directement en amont du point de d part de la transcription du g ne. Bien que quelques g nes soient contr l s par une seule s quence cis-r gulatrice reconnue par un s
Biologie moléculaire de la cellule	eul r gulateur de transcription, la majorit ont des arrangements complexes de s quences cis-r gulatrices, chacune tant reconnue par un r gulateur de transcription diff rent. Ce sont donc les positions, l'identit et l'arrangement des s quences cis-r gulatrices, qui constituent une partie importante de l'information int gr e dans le g nome, qui d terminent en fin de compte le moment et le lieu de transcription de chaque g ne. Nous commen ons notre discussion en d crivant comment les r gulateurs de transcription reconnaissent les s quences cis-r gulatrices. la s quence de nucl otides dans la double h lice de l'ADN peut tre lue par les prot ines Comme nous l'avons vu au chapitre 4, l'ADN d'un chromosome est constitu d'une tr s longue double h lice qui a la fois un sillon majeur et un sillon mineur (Figure 7-6). Les r gulateurs de transcription doivent reconna tre des s quences cis- r gulatrices courtes et sp cifiques l'int rieur Figure 7 5 Six tapes auxquelles l'expression des g nes eucaryotes peut tre contr l e. Les commandes qui fonctionnent aux tapes 1 5 sont abord es dans ce chapitre. L' tape 6, la r gulation de l'activit prot ique, se produit en grande partie par le biais de modifications post-traductionnelles covalentes, notamment la phosphorylation, l'ac tylation et l'ubiquitylation (voir tableau 3-3, p. 165). L' tape 6 a t introduite au chapitre 3 et est ensuite discut e dans de nombreux chapitres du livre. Figure 7 6 Structure en double h lice de l'ADN. Un mod le de DnA remplissant l'espace montrant les rainures majeures et mineures l'ext rieur de la double h lice (voir vid o 4.1). Les atomes sont color s comme suit : carbone, bleu fonc ; azote, bleu clair ; hydrog ne, blanc ; oxyg ne, rouge ; phosphore, jaune. cette structure. Lorsqu'elles ont t d couvertes pour la premi re fois dans les ann es 1960, on pensait que ces prot ines pourraient n cessiter un acc s direct l'int rieur de la double h lice pour distinguer une s quence d'ADN d'une autre. Il est maintenant clair, cependant, que l'ext rieur de la double h lice est parsem d'informations de s quence d'ADN que les r gulateurs de transcription reconnaissent : le bord de chaque paire de bases pr sente un motif distinctif de donneurs de liaisons hydrog ne, d'accepteurs de liaisons hydrog ne et de taches hydrophobes dans les rainures majeures et mineures (Figure 7-7). Parce que le sillon principal est plus large et pr sente plus de caract ristiques mol culaires que le sillon mineur, presque tous les r gulateurs de transcription effectuent la majorit de leurs contacts avec le sillon principal, comme nous le verrons. La reconnaissance mol culaire en biologie repose g n ralement sur un ajustement exact entre les surfaces de deux mol cules, et l' tude des r gulateurs de transcription a fourni certains des exemples les plus clairs de ce principe. Un r gulateur de transcription reconna t une s quence cis-r gulatrice sp cifique parce que la surface de la prot ine est largement compl mentaire aux caract ristiques de surface sp ciales de la double h lice qui affiche cette s quence. Chaque r gulateur de transcription tablit une s rie de contacts avec l'ADN, impliquant des liaisons hydrog ne, des liaisons ioniques et des interactions hydrophobes. Bien que chaque contact individuel soit faible, la vingtaine de contacts qui se forment g n ralement l'interface prot ine-ADN s'additionne pour s'assurer que l'interaction est la fois tr s sp cifiques et tr s fortes (figures 7 et 8). En fait, l'ADN-prot ine Figure 7 7 Comment les diff rentes paires de bases de l'ADN peuvent tre reconnues partir de leurs bords sans qu'il soit n cessaire d'ouvrir la double h lice. Les quatre configurations possibles de paires de bases sont repr sent es, avec les donneurs potentiels de liaisons hydrog ne indiqu s en bleu, les accepteurs potentiels de liaisons hydrog ne en rouge et les liaisons hydrog ne des paires de bases elles-m mes sous la forme d'une s rie de courtes lignes rouges parall les. Les groupes m thyle, qui forment des protub rances hydrophobes, sont repr sent s en jaune, et les atomes d'hydrog ne qui sont attach s aux carbones, et qui ne sont donc pas disponibles pour la liaison hydrog ne, sont blancs. partir du sillon principal, chacune des quatre configurations de paires de bases projette un motif unique de caract ristiques. ( partir de C. Branden et J. Tooze, introduction to protein Structure, 2e d., New York, Garland publishing, 1999.) limite externe sucre-phosphate de l'ADNLes interactions de squelette l'ext rieur de la double h lice comprennent certaines des interactions mol culaires les plus serr es et les plus sp cifiques connues en biologie. Bien que chaque exemple de reconnaissance prot ine-ADN soit unique dans les d tails, des tudes spectroscopiques de cristallographie aux rayons X et de r sonance magn tique nucl aire (RMN) de centaines de r gulateurs de transcription ont r v l que beaucoup d'entre eux contiennent
Biologie moléculaire de la cellule	l'un ou l'autre d'un petit ensemble de motifs structurels de liaison l'ADN (panel 7-1). Ces motifs utilisent g n ralement des h lices ou des feuilles de pour se lier au sillon principal de l'ADN. Les cha nes lat rales d'acides amin s qui s' tendent partir de ces motifs prot iques tablissent les contacts sp cifiques avec l'ADN. Ainsi, un motif structurel donn peut tre utilis pour reconna tre de nombreuses s quences cis-r gulatrices diff rentes en fonction des cha nes lat rales sp cifiques pr sentes. La dim risation des r gulateurs de transcription augmente leur affinit et leur sp cificit pour l'ADN Un monom re d'un r gulateur de transcription typique reconna t environ 6 8 paires de nucl otides d'ADN. Cependant, les prot ines de liaison l'ADN sp cifiques une s quence ne se lient pas troitement une seule s quence d'ADN et rejettent toutes les autres ; ils reconnaissent plut t une gamme de s quences troitement li es, l'affinit de la prot ine pour l'ADN variant en fonction de la correspondance de l'ADN avec la s quence optimale. Par cons quent, les s quences cis-r gulatrices sont souvent repr sent es comme des logos qui affichent la gamme de s quences reconnues par un r gulateur de transcription particulier (Figure 7 9A et B). Dans le chapitre 6, nous avons vu cette m me repr sentation l' uvre pour la liaison de l'ARN polym rase aux promoteurs (voir Figure 6-12). La s quence d'ADN reconnue par un monom re ne contient pas suffisamment d'informations pour tre choisie partir de l'arri re-plan de telles s quences qui se produiraient au hasard dans tout le g nome. Par exemple, on s'attendrait ce qu'une s quence d'ADN exacte six nucl otides se produise par hasard environ une fois tous les 4096 nucl otides (46), et ce que la gamme de s quences six nucl otides d crite par un logo typique se produise par hasard beaucoup plus souvent, peut- tre tous les 1000 nucl otides. De toute vidence, pour un g nome bact rien de 4,6 106 paires de nucl otides, sans parler d'un g nome de mammif re de 3 109 paires de nucl otides, il s'agit d'une information insuffisante pour contr ler avec pr cision la transcription des g nes individuels. Des contributions suppl mentaires la sp cificit de liaison l'ADN doivent donc tre pr sentes. De nombreux r gulateurs de transcription forment des dim res, les deux monom res tablissant des contacts presque identiques avec l'ADN (Figure 7-9C). Cette disposition double la longueur de la s quence cis-r gulatrice reconnue et augmente consid rablement l'affinit et la sp cificit de la liaison du r gulateur de transcription. Parce que la s quence d'ADN Figure 7 8 Liaison d'un r gulateur de transcription une s quence d'ADN sp cifique. gauche, un seul contact est montr entre un r gulateur de transcription et DnA ; de tels contacts permettent la prot ine de lire la s quence DnA. Sur la droite, l'ensemble complet des contacts entre un r gulateur de transcription (un membre de la famille des hom odomaines - voir panneau 7-1) et sa s quence cis-r gulatrice est montr . la partie de liaison l'ADN de la prot ine est longue de 60 acides amin s. Bien que les interactions dans le sillon majeur soient les plus importantes, on voit galement la prot ine entrer en contact la fois avec le sillon mineur et les phosphates dans le squelette DnA sucre-phosphate. (Voir C. Wolberger et al., Cell 67:517-528, 1991.) tryptophane r presseur lambda Cro lambda fragment r presseur CAP fragment ADN ADN 3,4 nm (A) Arg C 3 1 2 N 2 Ser Arg Asn 3 1 (B) Identifi l'origine dans les r gulateurs de transcription bact riens, ce motif a depuis t trouv dans plusieurs centaines de prot ines de liaison l'ADN d'eucaryotes et de procaryotes. Il est construit partir de deux h lices (bleue et rouge) reli es par une courte cha ne tendue d'acides amin s, qui constitue le tour . Les deux h lices sont maintenues un angle fxed, principalement par des interactions entre les deux h lices. L'h lice la plus C- terminale (en rouge) est appel e h lice de reconnaissance parce qu'elle s'enfonce dans le sillon majeur de l'ADN ; ses cha nes lat rales d'acides amin s, qui diff rent d'une prot ine l'autre, jouent un r le important dans la reconnaissance de la s quence d'ADN sp cifique laquelle la prot ine se lie. Toutes les prot ines montr es ici se lient l'ADN sous forme de dim res dans lesquels les deux copies de l'h lice de reconnaissance (en rouge) sont s par es par exactement un tour de l'h lice de l'ADN (3,4 nm) ; ainsi, les deux h lices de reconnaissance du dim re peuvent s'enfoncer dans le sillon majeur de l'ADN. Peu de temps apr s la d couverte des premiers r gulateurs de transcription chez les bact ries, les analyses g n tiques de la drosophile ont conduit la caract risation d'une classe importante de g nes, les g nes de s lection hom tique, qui jouent un r le essentiel dans l'orchestration du d veloppement de la drosophile (voir le chapitre 21). Il a t d montr
Biologie moléculaire de la cellule	plus tard que ces g nes codaient pour des r gulateurs de transcription qui liaient l'ADN par le biais d'un motif structurel appel hom odomaine. Deux vues diff rentes de la m me structure sont pr sent es. (A) L'hom odomaine est pli en trois h lices, qui sont troitement regroup es par des interactions hydrophobes. La partie contenant les h lices 2 et 3 ressemble beaucoup au motif h lice-tour-h lice. (B) L'h lice de reconnaissance (h lice 3, rouge) forme des contacts importants avec le sillon majeur de l'ADN. L'asparagine (Asn) de l'h lice 3, par exemple, entre en contact avec une ad nine, comme le montre la figure 7-8. Un bras flexible attach l'h lice 1 forme des contacts avec des paires de nucl otides dans le sillon mineur. Le motif de la fermeture clair en leucine est nomm en raison de la fa on dont les deux h lices, une de chaque monom re, sont assembl es pour former une courte bobine enroul e. Ces prot ines lient l'ADN comme des dim res o les deux longues h lices sont maintenues ensemble par des interactions entre des cha nes lat rales d'acides amin s hydrophobes (souvent sur les leucines) qui s' tendent d'un c t de chaque h lice. Juste au-del de l'interface de dim risation, les deux h lices se s parent l'une de l'autre pour former une structure en forme de Y, ce qui permet leurs cha nes lat rales d'entrer en contact avec le sillon principal de l'ADN. Le dim re saisit ainsi la double h lice comme une pince linge sur une corde linge. reconnaissance reconnaissance h lice reconnaissance h lice interface de dim risation de l'ADN H LICE-TOUR-H LICE PROT INES HOM ODOMAINE PROT INES LEUCINE ZIPPER PROT INES 376 PANNEAU 7 1 : Motifs structurels communs dans les r gulateurs de transcription Dans les autres motifs de liaison l'ADN pr sent s dans ce panneau, les h lices sont le principal m canisme utilis pour reconna tre des s quences d'ADN sp cifiques. Dans un grand groupe de r gulateurs de transcription, cependant, une feuille bibrin, avec des cha nes lat rales d'acides amin s s' tendant de la feuille vers l'ADN, lit l'information la surface du sillon principal. Comme dans le cas d'une h lice de reconnaissance, ce motif de feuille peut tre utilis pour reconna tre de nombreuses s quences d'ADN diff rentes ; la s quence exacte d'ADN reconnue d pend de la s quence d'acides amin s qui composent la feuille . On voit un r gulateur de transcription qui se lie deux mol cules de S-ad nosylm thionine (rouge). gauche se trouve un dim re de la prot ine ; droite se trouve un sch ma simplifi montrant uniquement la feuille deux brins li e au sillon majeur de l'ADN. Ce groupe de motifs de liaison l'ADN comprend un ou plusieurs atomes de zinc en tant que composants structurels. Tous ces motifs de liaison l'ADN coordonn s au zinc sont appel s fngers de zinc, en r f rence leur apparition dans les premiers dessins sch matiques ( gauche). Ils se r partissent en plusieurs groupes structurels distincts, dont un seul que nous consid rons ici. Il a une structure simple, dans laquelle l'atome de zinc maintient une h lice et une feuille ensemble (au milieu). Ce type de zinc est souvent trouv en grappes avec l'h lice de chaque fleur en contact avec le sillon majeur de l'ADN, formant un tirement presque continu d'h lices le long de ce sillon. De cette fa on, une interaction ADN-prot ine forte et sp cifique est construite par le biais d'une unit structurelle de base r p titive. Trois de ces fngers sont illustr s droite. N C C N C His Cys Zn His N Cys CCGLEHHZnKYKNQRVRRSFKEVLSASCOOHNH2COOHNH2ZnZnZnDNADNA FEUILLE DE RECONNAISSANCE DE L'ADN PROT INES DOIGT DE ZINC 377 Apparent la fermeture clair de leucine, le motif h lice-boucle-h lice consiste en une h lice courte reli e par une boucle (rouge) une seconde h lice plus longue. La fexibilit de la boucle permet une h lice de se replier et de se garer contre l'autre, formant ainsi la surface de dim risation. Comme on l'a vu, cette structure deux h lices se lie la fois l'ADN et la structure deux h lices d'une seconde prot ine pour cr er soit un homodim re, soit un h t rodim re. Deux h lices qui s' tendent partir de l'interface de dim risation tablissent des contacts sp cifiques avec le sillon majeur de l'ADN. Les prot ines CCNNDNAloopHELIX-LOOP-HELIX reconnues par la prot ine sont pass es d'environ 6 paires de nucl otides 12 paires de nucl otides, il y a beaucoup moins d'occurrences al atoires d'appariement S quences. Les h t rodim res sont souvent form s partir de deux r gulateurs de transcription diff rents. Les r gulateurs de transcription peuvent former des h t rodim res avec plus d'une prot ine partenaire ; de cette fa on, le m me r gulateur de transcription peut tre r utilis pour cr er plusieurs sp cificit s distinctes de liaison l'ADN (voir Figure 7-9C). les r gulateurs de transcription se lient en coop ration l'ADN Dans le cas le plus simple, l'ensemble des liaisons non covalentes qui maintienn
Biologie moléculaire de la cellule	ent ensemble les dim res ou h t rodim res ci-dessus est si vaste que ces structures se forment obligatoirement et ne se d sagr gent jamais. Dans ce cas, l'unit de liaison est le dim re ou l'h t rodim re, et la courbe de liaison du r gulateur de transcription (la fraction d'ADN li e en fonction de la concentration prot ique) a une forme exponentielle standard (Figure 7 10A). Dans de nombreux cas, cependant, les dim res et les h t rodim res sont tr s faiblement maintenus ensemble ; ils existent principalement sous forme de monom res en solution, et pourtant des dim res sont observ s sur la s quence d'ADN appropri e. Ici, on dit que les prot ines se lient l'ADN de mani re coop rative, et la courbe d crivant leur liaison est de forme sigmo dale (Figure 7-10B). La liaison coop rative signifie que, sur une gamme de concentrations du r gulateur de transcription, la liaison est plus un ph nom ne de tout ou rien que Figure 7 9 R gulateurs de transcription et s quences cis-r gulatrices. (A) Repr sentation de la s quence cis-r gulatrice de nanog, un membre de la famille des hom odomaines qui est un r gulateur cl dans les cellules souches embryonnaires. cette forme logo (voir figure 6-12) montre que la prot ine peut reconna tre une collection de s quences DnA troitement apparent es et donne la paire de nucl otides pr f r e chaque position. Les s quences cis-r gulatrices sont lues comme de l'ADN double brin, mais un seul brin est g n ralement repr sent dans un logo. (B) repr sentation de la s quence cis-r glementaire sous la forme d'une bo te color e. (C) De nombreux r gulateurs de transcription forment des dim res (homodim res) et des h t rodim res. dans l'exemple pr sent , trois sp cificit s diff rentes de DnAbinding sont form es partir de deux r gulateurs de transcription. Figure 7 10 Occupation d'une s quence cisr gulatrice par un r gulateur de transcription. (A) liaison non coop rative par un h t rodim re stable. (B) Liaison coop rative par des composants d'un h t rodim re qui sont principalement des monom res en solution. la forme de la courbe diff re de celle de (A) car la fraction de prot ine sous une forme capable de se lier DnA (l'h t rodim re) augmente avec l'augmentation de la concentration en prot ines. pour les liaisons non coop ratives ; C'est- -dire qu' la plupart des concentrations de prot ines, la s quence cis-r gulatrice est soit presque vide, soit presque enti rement occup e et se trouve rarement quelque part entre les deux. Une discussion des math matiques derri re la liaison coop rative est donn e au chapitre 8 (voir Figure 8-79A). La structure des nucl osomes favorise la liaison coop rative des r gulateurs de transcription Comme nous venons de le voir, la liaison coop rative des r gulateurs de transcription l'ADN se produit souvent parce que les monom res n'ont qu'une faible affinit les uns pour les autres. Cependant, il existe un deuxi me m canisme indirect de liaison coop rative, qui d coule de la structure nucl otique des chromosomes eucaryotes. En g n ral, les r gulateurs de transcription se lient l'ADN dans les nucl osomes avec une affinit plus faible qu'ils ne le font l'ADN nu. Il y a deux raisons cette diff rence. Tout d'abord, la surface de la s quence cis-r gulatrice reconnue par le r gulateur de transcription peut tre orient e vers l'int rieur du nucl osome, vers le noyau des histones, et donc ne pas tre facilement disponible pour la prot ine r gulatrice. Deuxi mement, m me si la face de la s quence cis-r gulatrice est expos e l'ext rieur du nucl osome, de nombreux r gulateurs de transcription modifient subtilement la conformation de l'ADN lorsqu'ils se lient, et ces changements sont g n ralement oppos s par l'enroulement serr de l'ADN autour du noyau d'histone. Par exemple, de nombreux r gulateurs de transcription induisent une courbure ou une courbure l'ADN lorsqu'ils se lient. Nous avons vu dans le chapitre 4 que le remodelage des nucl osomes peut modifier la structure du nucl osome, permettant aux r gulateurs de transcription d'acc der l'ADN. Cependant, m me sans remodelage, les r gulateurs de transcription peuvent toujours obtenir un acc s limit l'ADN d'un nucl osome. L'ADN l'extr mit d'un nucl osome respire , exposant transitoirement l'ADN et permettant aux r gulateurs de se lier. Cette respiration se produit un rythme beaucoup plus faible au milieu du nucl osome ; par cons quent, les positions o l'ADN sort du nucl osome sont beaucoup plus faciles occuper (Figure 7 11). Ces propri t s du nucl osome favorisent la liaison coop rative de l'ADN par les r gulateurs de transcription. Si une prot ine r gulatrice p n tre dans l'ADN d'un nucl osome et emp che l'ADN de s'enrouler troitement autour du noyau du nucl osome, elle augmentera l'affinit d'un second r gulateur de transcription pour une s quence cis-r gulatrice voisine. Si les deux r gulateurs de transcription interagissent galement l'un avec l'autre (comme d crit ci-d
Biologie moléculaire de la cellule	essus), l'effet de coop ration est encore plus important. Dans certains cas, l'action combin e des prot ines r gulatrices peut ventuellement d placer compl tement le noyau des histones du nucl osome. Figure 7 11 Comment les nucl osomes affectent la liaison des r gulateurs de transcription. s quence cis-r gulatrice respiratoire cette forme ouverte se produit environ 1/20e du temps (A) (B) par rapport son affnit pour l'ADN nu, un r gulateur de transcription typique se liera avec une affnit 20 fois plus faible si sa s quence cis-r gulatrice est situ e pr s de l'extr mit d'un nucl osome un r gulateur de transcription typique se liera avec environ 200 fois moins d'affnit + + r gulateur de transcription noyau d'histones + + + (C) si sa s quence cis-r gulatrice est situ e au milieu d'un nucl osome (D) un r gulateur de transcription peut d stabiliser le nucl osome, facilitant la liaison d'un autre La coop ration entre les r gulateurs de transcription peut devenir beaucoup plus grande lorsque des complexes de remodelage de nucl osomes sont impliqu s. Si un r gulateur de transcription se lie sa s quence cis-r gulatrice et attire un complexe de remodelage de la chromatine, l'action localis e du complexe de remodelage peut permettre un deuxi me r gulateur de transcription de se lier efficacement proximit . De plus, nous avons discut de la fa on dont les r gulateurs de transcription peuvent travailler ensemble par paires ; En r alit , un grand nombre de personnes coop rent souvent en utilisant plusieurs reprises les m mes principes. Une liaison hautement coop rative des r gulateurs de transcription l'ADN explique probablement pourquoi de nombreux sites dans les g nomes eucaryotes qui sont li s par des r gulateurs de transcription sont libres de nucl osomes . Les r gulateurs de transcription reconnaissent de courts segments d'ADN en double h lice de s quence d finie appel s s quences cis-r gulatrices, et d terminent ainsi lesquels des milliers de g nes d'une cellule seront transcrits. Environ 10 % des g nes codant pour les prot ines dans la plupart des organismes produisent des r gulateurs de transcription et contr lent de nombreuses caract ristiques des cellules. Bien que chacun de ces r gulateurs de transcription ait des caract ristiques uniques, la plupart se lient l'ADN en tant qu'homodim res ou h t rodim res et reconnaissent l'ADN travers l'un des quelques motifs structurels. Les r gulateurs de transcription travaillent g n ralement en groupes et lient l'ADN de mani re coop rative, une caract ristique qui a plusieurs m canismes sous-jacents, dont certains exploitent l'empaquetage de l'ADN dans les nucl osomes. Apr s avoir vu comment les r gulateurs de transcription se lient aux s quences cis-r gulatrices int gr es dans le g nome, nous pouvons maintenant discuter de la fa on dont, une fois li es, ces prot ines influencent la transcription des g nes. La situation chez les bact ries est plus simple que chez les eucaryotes (d'une part, la structure de la chromatine n'est pas un probl me), et nous en discutons donc en premier. Ensuite, nous nous tournons vers la situation plus complexe des eucaryotes. le r presseur de tryptophane d sactive les g nes Le g nome de la bact rie E. coli est constitu d'une seule mol cule d'ADN circulaire d'environ 4,6 106 paires de nucl otides. Cet ADN code environ 4300 prot ines, bien que seule une fraction d'entre elles soit fabriqu e un moment donn . Les bact ries r gulent l'expression d'un grand nombre de leurs g nes en fonction des sources de nourriture disponibles dans l'environnement. Par exemple, chez E. coli, cinq g nes codent pour des enzymes qui Fabriquer l'acide amin tryptophane. Ces g nes sont dispos s en grappe sur le chromosome et sont transcrits partir d'un seul promoteur sous la forme d'une longue mol cule d'ARNm ; de tels amas transcrits de mani re coordonn e sont appel s op rons (Figure 7-12). Bien que les op rons soient courants chez les bact ries, ils sont rares chez les eucaryotes, o les g nes sont g n ralement transcrits et r gul s individuellement (voir Figure 7-3). Lorsque les concentrations de tryptophane sont faibles, l'op ron est transcrit ; l'ARNm r sultant est traduit pour produire un ensemble complet d'enzymes biosynth tiques, qui travaillent en tandem pour synth tiser le tryptophane partir de mol cules beaucoup plus simples. Cependant, lorsque le tryptophane est abondant par exemple, lorsque la bact rie se trouve dans l'intestin d'un mammif re qui vient de manger un repas riche en prot ines l'acide amin est import dans la cellule et arr te la production des enzymes, qui ne sont plus n cessaires. S rie d'enzymes du chromosome E. coli n cessaires la biosynth se du tryptophane Figure 7 12 Un groupe de g nes bact riens peut tre transcrit partir d'un seul promoteur. Chacun de ces cinq g nes code pour une enzyme diff rente, et toutes ces enzymes sont n cessaires pour synth tiser l'acide amin tryptophane
Biologie moléculaire de la cellule	partir de mol cules plus simples. les g nes sont transcrits sous la forme d'une seule mol cule d'ARNmr, une caract ristique qui permet de coordonner leur expression. Les grappes de g nes transcrits sous la forme d'une seule mol cule d'ARNmrA sont courantes chez les bact ries. Chacun de ces amas est appel op ron parce que son expression est contr l e par une s quence cis-r gulatrice appel e l'op rateur (vert), situ e l'int rieur du promoteur. (dans cette figure et les suivantes, les blocs jaunes dans le promoteur repr sentent les s quences DnA qui se lient l'arnA polym rase ; voir figure 6-12). D but de la transcription Nous comprenons maintenant exactement comment se produit ce refoulement de l'op ron du tryptophane. l'int rieur du promoteur de l'op ron se trouve une s quence cis-r gulatrice qui est reconnue par un r gulateur de transcription. Lorsque ce r gulateur se lie cette s quence, il bloque l'acc s de l'ARN polym rase au promoteur, emp chant ainsi la transcription de l'op ron (et donc la production des enzymes productrices de tryptophane). Le r gulateur de transcription est connu sous le nom de r presseur de tryptophane et sa s quence cis-r gulatrice est appel e op rateur de tryptophane. Ces composants sont contr l s de mani re simple : le r presseur ne peut se lier l'ADN que s'il a galement li plusieurs mol cules de tryptophane (Figure 7 13). Le r presseur du tryptophane est une prot ine allost rique, et la liaison du tryptophane provoque un changement subtil dans sa structure tridimensionnelle de sorte que la prot ine peut se lier la s quence de l'op rateur. Chaque fois que la concentration de tryptophane libre dans la bact rie diminue, le tryptophane se dissocie du r presseur, le r presseur ne se lie plus l'ADN et l'op ron du tryptophane est transcrit. Le r presseur est donc un dispositif simple qui active et d sactive la production d'un ensemble d'enzymes biosynth tiques en fonction de la disponibilit du produit final de la voie que les enzymes catalysent. La prot ine r pressive du tryptophane elle-m me est toujours pr sente dans la cellule. Le g ne qui le code est transcrit en continu un faible niveau, de sorte qu'une petite quantit de prot ine r pressive est toujours fabriqu e. Ainsi, la bact rie peut r agir tr s rapidement une augmentation ou une baisse de la concentration de tryptophane. Le tryptophane r presseur, comme son nom l'indique, est une prot ine transcriptionnelle r pressive : sous sa forme active, elle d sactive les g nes, ou les r prime. Certains r gulateurs de transcription bact riens font l'inverse : ils activent les g nes. Ces prot ines activatrices transcriptionnelles agissent sur des promoteurs qui, contrairement au promoteur de l'op ron tryptophane, ne sont que marginalement capables de se lier et de positionner l'ARN polym rase par eux-m mes. Cependant, ces promoteurs qui fonctionnent mal peuvent tre rendus enti rement fonctionnels par des prot ines activatrices qui se lient des s quences cis-r gulatrices voisines et entrent en contact avec l'ARN polym rase pour l'aider initier la transcription (Figure 7 14). Figure 7 13 Les g nes peuvent tre d sactiv s par les prot ines r pressives. Si la concentration de tryptophane l'int rieur d'un bact rie est basse ( gauche), l'arnA polym rase (en bleu) se lie au promoteur et transcrit les cinq g nes de l'op ron tryptophane. cependant, si la concentration de tryptophane est lev e ( droite), la prot ine r pressive (vert fonc ) devient active et se lie l'op rateur (vert clair), o elle bloque la liaison de l'arnA polym rase au promoteur. chaque fois que la concentration de tryptophane intracellulaire diminue, le r presseur se d tache de l'ADN, ce qui permet la polym rase de retranscrire l'op ron. Bien qu'il ne soit pas repr sent sur la figure, le r presseur est un dim re stable. Figure 7 14 Les g nes peuvent tre activ s par des prot ines activatrices. Une prot ine activatrice se lie sa s quence cis-r gulatrice sur l'ADN et interagit avec l'arnA polym rase pour l'aider initier la transcription. Sans l'activateur, le promoteur ne parvient pas initier efficacement la transcription. chez les bact ries, la liaison de l'activateur l'ADN est souvent contr l e par l'interaction d'un m tabolite ou d'une autre petite mol cule (triangle rouge) avec la prot ine activatrice. c'est ainsi que fonctionne l'op ron du Lac, comme nous le verrons tout l'heure. Les prot ines activatrices li es l'ADN peuvent augmenter le taux d'initiation de la transcription jusqu' 1000 fois, une valeur compatible avec une interaction relativement faible et non sp cifique entre le r gulateur de transcription et l'ARN polym rase. Par exemple, une variation de 1000 fois de l'affinit de l'ARN polym rase pour son promoteur correspond une variation de G de 18 kJ/mole, qui pourrait tre expliqu e par seulement quelques liaisons faibles et non covalentes. Ainsi, de nombreuses prot ines activatrices fonctionnent sim
Biologie moléculaire de la cellule	plement en fournissant quelques interactions favorables qui aident attirer l'ARN polym rase vers le promoteur. Pour fournir cette assistance, cependant, la prot ine activatrice doit tre li e sa s quence cis-r gulatrice, et cette s quence doit tre positionn e, par rapport au promoteur, de mani re ce que les interactions favorables puissent se produire. Comme le r presseur de tryptophane, les prot ines activatrices doivent souvent interagir avec une deuxi me mol cule pour pouvoir se lier l'ADN. Par exemple, la prot ine activatrice bact rienne CAP doit se lier l'AMP cyclique (AMPc) avant de pouvoir se lier l'ADN. Les g nes activ s par CAP sont activ s en r ponse une augmentation de la concentration intracellulaire d'AMPc, qui augmente lorsque le glucose, la source de carbone pr f r e de la bact rie, n'est plus disponible ; en cons quence, la CAP entra ne la production d'enzymes qui permettent la bact rie de dig rer d'autres sucres. Un activateur et un r presseur contr lent l'op ron du lac Dans de nombreux cas, l'activit d'un seul promoteur est contr l e par plusieurs r gulateurs de transcription diff rents. L'op ron Lac chez E. coli, par exemple, est contr l la fois par le r presseur Lac et l'activateur CAP dont nous venons de parler. L'op ron Lac code pour les prot ines n cessaires l'importation et la digestion du disaccharide lactose. En l'absence de glucose, la bact rie fabrique l'AMPc, qui active CAP pour activer les g nes qui permettent la cellule d'utiliser d'autres sources de carbone, y compris le lactose. Cependant, il serait inutile pour CAP d'induire l'expression de l'op ron Lac si le lactose lui-m me n' tait pas pr sent. Ainsi, le r presseur Lac coupe l'op ron en l'absence de lactose. Cette disposition permet la r gion de contr le de l'op ron Lac d'int grer deux signaux diff rents, de sorte que l'op ron n'est fortement exprim que lorsque deux conditions sont remplies : le glucose doit tre absent et le lactose doit tre pr sent (Figure 7 15). Ce circuit g n tique se comporte donc un peu comme ARN-cis-polym rase r gulatrice-d but du site de liaison de la s quence de transcription pour CAP (promoteur) Figure 7 15 L'op ron Lac est contr l par deux r gulateurs de transcription, le r presseur Lac et le CAP. LacZ, le premier g ne de l'op ron, code pour l'enzyme -galactosidase, qui d compose le lactose en galactose et en glucose. en l'absence de lactose, le r presseur Lac se lie une s quence cisr gulatrice, appel e op rateur Lac, et coupe l'expression de l'op ron (Vid o 7.4). L'ajout de lactose augmente la concentration intracellulaire d'un compos apparent , l'allolactose ; l'allolactose se lie au r presseur lac, ce qui lui fait subir un changement de conformation qui rel che son emprise sur l'op rateur DnA (non repr sent ). lorsque le glucose est absent, l'AMp cyclique (triangle rouge) est produite par la cellule et le CAp se lie l'ADN. Commutateur qui effectue une op ration logique dans un ordinateur. Lorsque le lactose est pr sent ET que le glucose est absent, La cellule ex cute le programme appropri , dans ce cas, la transcription des g nes qui permettent l'absorption et l'utilisation du lactose. Tous les r gulateurs de transcription, qu'ils soient r presseurs ou activateurs, doivent tre li s l'ADN pour exercer leurs effets. De cette fa on, chaque prot ine r gulatrice agit de mani re s lective, ne contr lant que les g nes porteurs d'une s quence cis-r gulatrice qu'elle reconna t. La logique de l'op ron du Lac a d'abord attir l'attention des biologistes il y a plus de 50 ans. Son fonctionnement a t d couvert par une combinaison de g n tique et de biochimie, fournissant certaines des premi res informations sur la fa on dont la transcription est contr l e dans n'importe quel organisme. Nous avons vu que les activateurs de transcription aident l'ARN polym rase initier la transcription et que les r presseurs l'entravent. Cependant, les deux types de prot ines sont tr s similaires l'une l'autre. Par exemple, pour occuper leurs s quences cis-r gulatrices, le r presseur de tryptophane et la prot ine activatrice de la CAP doivent se lier une petite mol cule ; de plus, ils reconnaissent tous deux leurs s quences cis-r gulatrices en utilisant le m me motif structurel (l'h lice-tour-h lice montr e dans le panneau 7-1). En effet, certaines prot ines (par exemple, la prot ine CAP) peuvent agir la fois comme r presseur et activateur, en fonction du placement exact de leur s quence cis-r gulatrice par rapport au promoteur : pour certains g nes, la s quence cis-r gulatrice CAP chevauche le promoteur, et la liaison CAP emp che ainsi l'assemblage de l'ARN polym rase au niveau du promoteur. La plupart des bact ries ont des g nomes petits et compacts, et les s quences cis-r gulatrices qui contr lent la transcription d'un g ne sont g n ralement situ es tr s pr s du point de d part de la transcription. Mais il y a quelques exceptions cette g n ralisation : les
Biologie moléculaire de la cellule	s quences cis-r gulatrices peuvent tre localis es des centaines, voire des milliers de paires de nucl otides partir des g nes bact riens qu'elles contr lent (Figure 7-16). Dans ces cas, l'ADN interm diaire est boucl , ce qui permet une prot ine li e un site loign le long de l'ADN d'entrer en contact avec l'ARN polym rase. Ici, l'ADN agit comme une attache, augmentant consid rablement la probabilit que les prot ines entrent en collision, par rapport la situation o une prot ine est li e l'ADN et l'autre est libre en solution. Nous verrons bri vement que, bien qu'il s'agisse d'une exception chez les bact ries, le bouclage de l'ADN se produit dans la r gulation de presque tous les g nes eucaryotes. Une explication possible de cette diff rence est bas e sur des consid rations volutives. Il a t propos que les commutateurs g n tiques compacts et simples trouv s chez les bact ries ont volu en r ponse de grandes tailles de population o la comp tition pour la croissance exer ait une pression s lective sur les bact ries pour maintenir des g nomes de petite taille. En revanche, il semble y avoir eu peu de pression s lective pour rationaliser les g nomes des organismes multicellulaires. Figure 7 16 Activation transcriptionnelle distance. (A) la prot ine ntrC est un r gulateur de transcription bact rien qui active la transcription en entrant directement en contact avec l'arnA polym rase. (B) l'interaction de la ntrC et de l'arnA polym rase, avec le DnA interm diaire en boucle, peut tre observ e au microscope lectronique. (B, avec l'aimable autorisation de Harrison Echols et Sydney Kustu.) Par rapport la situation chez les bact ries, la r gulation de la transcription chez les eucaryotes implique beaucoup plus de prot ines et des tron ons d'ADN beaucoup plus longs. Cela semble souvent d'une complexit d concertante. Pourtant, bon nombre des m mes principes s'appliquent. Comme chez les bact ries, le moment et le lieu o chaque g ne doit tre transcrit sont sp cifi s par ses s quences cis-r gulatrices, qui sont lues par les r gulateurs de transcription qui se lient elles. Une fois li s l'ADN, les r gulateurs de transcription positifs (activateurs) aident l'ARN polym rase commencer transcrire les g nes, et les r gulateurs n gatifs (r presseurs) bloquent cela de se produire. Chez les bact ries, comme nous l'avons vu, la plupart des interactions entre les r gulateurs de transcription li s l'ADN et les ARN polym rases (qu'elles activent ou r priment la transcription) sont directes. En revanche, ces interactions sont presque toujours indirectes chez les eucaryotes : de nombreuses prot ines interm diaires, y compris les his-tones, agissent entre le r gulateur de transcription li l'ADN et l'ARN polym rase. De plus, dans les organismes multicellulaires, il est courant que des dizaines de r gulateurs de transcription contr lent un seul g ne, avec des s quences cis-r gulatrices r parties sur des dizaines de milliers de paires de nucl otides. Le bouclage de l'ADN permet aux prot ines r gulatrices li es l'ADN d'interagir entre elles et, en fin de compte, avec l'ARN polym rase au niveau du promoteur. Enfin, parce que la quasi-totalit de l'ADN des eucaryotes est compact par des nucl osomes et des structures d'ordre sup rieur, l'initiation de la transcription chez les eucaryotes doit surmonter ce blocage inh rent. Dans les sections suivantes, nous discutons de ces caract ristiques de l'initiation de la transcription chez les eucaryotes, en mettant l'accent sur la fa on dont elles fournissent des niveaux suppl mentaires de contr le que l'on ne trouve pas chez les bact ries. Une r gion eucaryote de contr le des g nes se compose d'un promoteur et de nombreuses s quences cis-r gulatrices Chez les eucaryotes, l'ARN polym rase II transcrit tous les g nes codant pour les prot ines et de nombreux g nes d'ARN non codants, comme nous l'avons vu au chapitre 6. Cette polym rase n cessite cinq facteurs de transcription g n raux (27 sous-unit s au total ; voir tableau 6-3, p. 311), contrairement l'ARN polym rase bact rienne, qui n'a besoin que d'un seul facteur de transcription g n ral (la sous-unit ). Comme nous l'avons vu, l'assemblage par tapes des facteurs de transcription g n raux chez un promoteur eucaryote fournit, en principe, plusieurs tapes auxquelles la cellule peut acc l rer ou ralentir le taux d'initiation de la transcription en r ponse aux r gulateurs de transcription. Parce que les nombreuses s quences cis-r gulatrices qui contr lent l'expression d'un g ne typique sont souvent r parties sur de longues tendues d'ADN, nous utilisons le terme r gion de contr le g nique pour d crire l'ensemble de l' tendue d'ADN impliqu e dans la r gulation et l'initiation de la transcription d'un g ne eucaryote. Cela inclut le promoteur, o les facteurs de transcription g n raux et la polym rase s'assemblent, ainsi que toutes les s quences cis-r gulatrices auxquelles les r gulateurs de tr
Biologie moléculaire de la cellule	anscription se lient pour contr ler la vitesse des processus d'assemblage au niveau du promoteur (Figure 7 17). Chez les animaux et les plantes, il n'est pas rare de trouver les s quences r gulatrices d'un g ne diss min es sur des tron ons d'ADN aussi grands que 100 000 paires de nucl otides. Une partie de cet ADN est transcrite (mais pas traduite), et nous aborderons ces longs ARN non codants (ARNlnc) plus loin dans ce chapitre. Pour l'instant, nous pouvons consid rer une grande partie de cet ADN comme des s quences espaceuses que les r gulateurs de transcription ne reconnaissent pas directement. Il est important de garder l'esprit que, comme dans d'autres r gions des chromosomes eucaryotes, la majeure partie de l'ADN dans les r gions de contr le des g nes est emball e dans des nucl osomes et des formes d'ordre sup rieur de chromatine, compactant ainsi sa longueur totale et modifiant ses propri t s. Dans ce chapitre, nous utiliserons vaguement le terme g ne pour d signer un segment d'ADN qui est transcrit en une mol cule d'ARN fonctionnelle, qui code pour une prot ine ou qui a un r le diff rent dans la cellule (voir Tableau 6-1, p. 305). Cependant, la vision classique d'un g ne inclut galement la r gion de contr le des g nes, car des mutations en celle-ci peuvent produire un ph notype alt r . L' pissage alternatif de l'ARN complique encore la d finition d'un g ne, un point sur lequel nous reviendrons plus tard. Contrairement au petit nombre de facteurs de transcription g n raux, qui sont des prot ines abondantes qui s'assemblent sur les promoteurs de tous les g nes transcrits par la r gion de contr le g nique pour le g ne X Tata Tata promoteur espaceur Coactivateurs d'ADNCor cepteurs de transcription g n raux Facteurs de transcription ARN polym rase II G ne X s quence cis-r gulatrice X M diateur Figure 7 17 La r gion de contr le g nique d'un g ne eucaryote typique. le promoteur est la s quence DnA o s'assemblent les facteurs de transcription g n raux et la polym rase (voir figure 6 15). les s quences cis-r gulatrices sont des sites de liaison pour les r gulateurs de transcription, dont la pr sence sur l'ADN affecte le taux d'initiation de la transcription. Ces s quences peuvent tre situ es c t du promoteur, loin en amont de celui-ci, ou m me l'int rieur des introns ou enti rement en aval du g ne. les tron ons bris s de DnA signifient que la longueur de DnA entre les s quences cis-r gulatrices et le d but de la transcription ARN polym rase II, il existe des milliers de r gulateurs de transcription diff rents consacr s l'activation et la d sactivation de g nes individuels. Chez les eucaryotes, les op rons des ensembles de g nes transcrits en unit sont rares, et, au lieu de cela, chaque g ne est r gul individuellement. Il n'est pas surprenant que la r gulation de chaque g ne soit diff rente dans le d tail de celle de tous les autres g nes, et qu'il soit difficile de formuler des r gles simples pour la r gulation des g nes qui s'appliquent dans tous les cas. Nous pouvons cependant faire quelques g n ralisations sur la fa on dont les r gulateurs de transcription, une fois li s aux r gions de contr le des g nes sur l'ADN, d clenchent la s rie d' v nements qui conduisent l'activation ou la r pression des g nes. Chez les bact ries, nous avons vu que des prot ines telles que le r presseur de tryptophane, le r presseur Lac et la prot ine CAP se lient l'ADN par elles-m mes et affectent directement l'ARN polym rase au niveau du promoteur. Les r gulateurs de transcription eucaryotes, en revanche, s'assemblent g n ralement en groupes au niveau de leurs s quences cis-r gulatrices. Souvent, deux organismes de r glementation ou plus se lient en coop ration, comme nous l'avons vu plus haut dans le chapitre. De plus, une large classe de prot ines multisous-unitaires appel es coactivateurs et co-r presseurs s'assemblent sur l'ADN avec elles. En r gle g n rale, ces coactivateurs et co-r presseurs ne reconnaissent pas eux-m mes des s quences d'ADN sp cifiques ; Ils sont amen s ces s quences par les r gulateurs de transcription. Souvent, les interactions prot ine-prot ine entre les r gulateurs de transcription et entre les r gulateurs et les coactivateurs sont trop faibles pour qu'ils s'assemblent en solution ; cependant, la combinaison appropri e de s quences cis-r gulatrices peut cristalliser l'assemblage de ces complexes sur l'ADN (Figure 7 18). Comme leur nom l'indique, les coactivateurs sont g n ralement impliqu s dans l'activation de la transcription et les co-r presseurs dans sa r pression. Dans les sections suivantes, nous verrons que les coactivateurs et les co-r presseurs peuvent agir de diff rentes mani res pour influencer la transcription apr s avoir t localis s sur le g nome par des r gulateurs de transcription. Comme le montre la figure 7-18, un r gulateur de transcription individuel peut souvent participer plus d'un type de complexe r gulateur. Une prot ine peut fo
Biologie moléculaire de la cellule	nctionner, varier, atteignant parfois des dizaines de milliers de paires de nucl otides en longueur. la bo te TATA est une s quence de reconnaissance DnA pour le facteur de transcription g n ral tfiiD. Comme le montre le panneau inf rieur, le bouclage de l'ADN permet aux r gulateurs de transcription li s l'une de ces positions d'interagir avec les prot ines qui s'assemblent au niveau du promoteur. De nombreux r gulateurs de transcription agissent par l'interm diaire d'un m diateur (d crit au chapitre 6), tandis que certains interagissent directement avec les facteurs de transcription g n raux et l'arnA polym rase. Les r gulateurs de transcription agissent galement en recrutant des prot ines qui modifient la structure chromatinienne du promoteur (non illustr , mais discut ci-dessous). alors que le m diateur et les facteurs de transcription g n raux sont les m mes pour tous les g nes transcrits par l'arnA polym rase ii, les r gulateurs de transcription et l'emplacement de leurs sites de liaison par rapport au promoteur diff rent pour chaque g ne. Par exemple, dans un cas, dans le cadre d'un complexe qui active la transcription et dans un autre cas, dans le cadre d'un complexe qui r prime la transcription. Ainsi, les r gulateurs de transcription eucaryotes individuels fonctionnent comme des parties r gulatrices qui sont utilis es pour construire des complexes dont la fonction d pend de l'assemblage final de tous les composants individuels. Chaque g ne eucaryote est donc r gul par un comit de prot ines, qui doivent toutes tre pr sentes pour exprimer le g ne son juste niveau. Les prot ines activatrices favorisent l'assemblage de l'arnA polym rase au point de d part de la transcription Les s quences cis-r gulatrices auxquelles se lient les prot ines activatrices de la transcription eucaryotes taient l'origine appel es amplificateurs parce que leur pr sence am liorait le taux d'initiation de la transcription. Ce fut une surprise lorsqu'on a d couvert que ces s quences pouvaient se trouver des dizaines de milliers de paires de nucl otides du promoteur ; comme nous l'avons vu, le bouclage de l'ADN, qui n' tait pas tr s appr ci l' poque, peut aujourd'hui expliquer cette observation initialement d routante. Une fois li s l'ADN, comment les assemblages de prot ines activatrices augmentent-ils le taux d'initiation de la transcription ? Dans la plupart des g nes, les m canismes fonctionnent de concert. Leur fonction est la fois d'attirer et de positionner l'ARN polym rase II au niveau du promoteur et de la lib rer afin que la transcription puisse commencer. Certaines prot ines activatrices se lient directement un ou plusieurs des facteurs de transcription g n raux, acc l rant leur assemblage sur un promoteur qui a t amen proximit de cet activateur par le biais d'un bouclage de l'ADN. La plupart des activateurs de transcription, cependant, attirent des coactivateurs qui effectuent ensuite les t ches biochimiques n cessaires pour initier la transcription. L'un des coactivateurs les plus r pandus est le grand complexe prot ique Mediator, compos de plus de 30 sous-unit s. peu pr s de la m me taille que l'ARN polym rase elle-m me, Mediator sert de pont entre les activateurs de transcription li s l'ADN, l'ARN polym rase et les facteurs de transcription g n raux, facilitant leur assemblage au niveau du promoteur (voir Figure 7 17). Les activateurs de la transcription eucaryote dirigent la modification de la structure locale de la chromatine Les facteurs de transcription g n raux eucaryotes et l'ARN polym rase sont incapables, par eux-m mes, de s'assembler sur un promoteur emball dans des nucl osomes. Ainsi, en plus de diriger l'assemblage de la machinerie de transcription au niveau du promoteur, les activateurs de transcription eucaryotes favorisent la transcription en d clenchant des modifications de la structure chromatinienne des promoteurs, rendant l'ADN sous-jacent plus accessible. Les moyens les plus importants de modifier localement la chromatine sont les modifications covalentes des histones, le remodelage des nucl osomes, l' limination des nucl osomes et le remplacement de son ton (discut au chapitre 4). Les activateurs de transcription eucaryotes utilisent ces quatre m canismes : ils attirent donc des coactivateurs qui comprennent des enzymes de modification de son ton, des complexes de remodelage de la chromatine d pendants de l'ATP et des chaperons d'histones, chacun d'entre eux pouvant modifier la structure de la chromatine Figure 7 18 Les r gulateurs de transcription eucaryotes s'assemblent en complexes sur l'ADN. (A) Sept r gulateurs de transcription sont repr sent s. La nature et la fonction du complexe qu'ils forment d pendent des s quences cis-r gulatrices sp cifiques qui amorcent leur assemblage. (B) Certains complexes assembl s activent la transcription des g nes, tandis qu'un autre r prime la transcription. Notez que les prot ines vert clair et vert fon
Biologie moléculaire de la cellule	c sont partag es par des complexes activateurs et r pressifs. les prot ines qui ne se lient pas elles-m mes l'ADN mais s'assemblent sur d'autres r gulateurs de transcription li s l'ADN sont appel es coactivateurs ou co-r presseurs. dans certains cas (en bas droite), des mol cules d'ARN se retrouvent dans ces assemblages. Comme d crit plus loin dans ce chapitre, ces ARN agissent souvent comme des chafaudages pour maintenir ensemble un groupe de prot ines. promoteurs (figures 7 19). Ces alt rations locales de la structure de la chromatine offrent un meilleur acc s l'ADN, facilitant ainsi l'assemblage des facteurs de transcription g n raux au niveau du promoteur. De plus, certaines modifications des histones attirent sp cifiquement ces prot ines vers le promoteur. Ces m canismes travaillent souvent ensemble lors de l'initiation de la transcription (Figure 7 20). Enfin, comme nous l'avons vu plus haut dans ce chapitre, les modifications locales de la chromatine dirig es par un r gulateur transcriptionnel peuvent permettre la liaison de r gulateurs suppl mentaires. Par l'utilisation r p t e de ce principe, de grands assemblages de prot ines peuvent se former sur les r gions de contr le des g nes pour r guler leur transcription. Les alt rations de la structure de la chromatine qui se produisent lors de l'initiation de la transcription peuvent persister pendant des dur es variables. Dans certains cas, d s que le r gulateur de transcription se dissocie de l'ADN, les modifications de la chromatine sont rapidement invers es, restaurant le g ne son tat pr -activ . Cette inversion rapide est particuli rement importante pour les g nes que la cellule doit rapidement activer et d sactiver en r ponse des signaux externes. Dans d'autres cas, la structure modifi e de la chromatine persiste, m me apr s que le r gulateur de transcription qui a dirig son tablissement s'est dissoci de l'ADN. En principe, cette m moire peut s' tendre la g n ration cellulaire suivante car, comme nous l'avons vu au chapitre 4, la structure de la chromatine peut s'auto-renouveler (voir Figure 4 44). Le fait que diff rentes modifications d'histones persistent pendant des temps diff rents fournit la cellule un m canisme qui rend possible la m moire plus long et court terme des mod les d'expression g nique. Un type particulier de modification de la chromatine se produit lorsque l'ARN polym rase II est transcrite par un g ne. Les histones juste devant la polym rase peuvent tre ac tyl es par des enzymes port es par la polym rase, limin es par des chaperons d'histones et d pos es derri re la polym rase en mouvement. Ces histones sont ensuite rapidement d sac tyl es et m thyl es, galement par des complexes qui sont port s par la polym rase, laissant derri re elles des nucl osomes particuli rement r sistants la transcription. Ce processus remarquable semble emp cher la r initiation de la transcription parasite Figure 7 19 Les prot ines activatrices de la transcription eucaryote dirigent les alt rations locales de la structure de la chromatine. Le remodelage des nucl osomes, l' limination des nucl osomes, le remplacement des histones et certains types de modifications des histones favorisent l'initiation de la transcription (voir figure 4-39). ces alt rations augmentent l'accessibilit de l'ADN et facilitent la liaison de l'ARN polym rase et des facteurs de transcription g n raux. Figure 7 20 Modifications successives des histones au cours de l'initiation de la transcription. dans cet exemple, tir du promoteur du g ne de l'interf ron humain, un activateur de transcription se lie l'ADN emball dans la chromatine et attire une histone ac tyltransf rase qui ac tyle la lysine 9 de l'histone H3 et la lysine 8 de l'histone H4. Ensuite, une histone kinase, galement attir e par l'activateur de transcription, phosphoryle la s rine 10 de l'histone H3 mais elle ne peut le faire qu'apr s que la lysine 9 a t ac tyl e. cette modification de la s rine signale l'histone ac tyl transf rase la position ac tyl e K14 de l'histone h3. ensuite, le facteur de transcription g n ral tfiiD et un complexe de remodelage de la chromatine se lient la chromatine pour favoriser les tapes ult rieures de l'initiation de la transcription. tfiiD et le complexe de remodelage reconnaissent tous deux les queues d'histones ac tyl es par le biais d'un bromodomaine, un domaine prot ique sp cialis dans la lecture de cette marque particuli re sur les histones ; Un bromodomaine est port dans une sous-unit de chaque complexe prot ique. L'histone ac tyl transf rase, l'histone kinase et le complexe de remodelage de la chromatine sont tous des coactivateurs. L'ordre des v nements indiqu s'applique un promoteur sp cifique ; Au niveau d'autres g nes, les tapes peuvent se produire dans un ordre diff rent ou des tapes individuelles peuvent tre compl tement omises. (Adapt de t. Agalioti, G. Chen et D. thanos, Cell 111:381 392, 2002. avec la permissio
Biologie moléculaire de la cellule	n d'elsevier.) derri re une polym rase en mouvement, qui, en substance, doit d gager un chemin travers la chromatine pendant qu'elle transcrit. Plus loin dans ce chapitre, lorsque nous discuterons de l'interf rence de l'ARN, les dangers potentiels pour la cellule d'une telle transcription inappropri e deviendront particuli rement vidents. La modification des nucl osomes derri re une ARN polym rase en mouvement joue galement un r le important dans l' pissage de l'ARN (voir p. 323). Dans certains cas, l'initiation de la transcription n cessite qu'un activateur de transcription li l'ADN lib re l'ARN polym rase du promoteur afin de lui permettre de commencer transcrire le g ne. Dans d'autres cas, l'ARN polym rase s'arr te apr s la transcription d'environ 50 nucl otides d'ARN, et un allongement suppl mentaire n cessite un activateur de transcription li derri re elle (Figure 7 21). Ces polym rases en pause sont courantes chez l'homme, o une fraction importante des g nes qui ne sont pas transcrits ont une polym rase en pause situ e juste en aval du promoteur. La lib ration d'ARN polym rase peut se produire de plusieurs mani res. Dans certains cas, l'activateur apporte un complexe de remodelage de la chromatine qui limine un bloc de nucl osome l'ARN polym rase en cours d'allongement. Dans d'autres cas, l'activateur communique avec l'ARN polym rase (g n ralement par l'interm diaire d'un coactivateur), lui signalant d'aller de l'avant. Enfin, comme nous l'avons vu au chapitre 6, l'ARN polym rase a besoin de facteurs d' longation pour tre efficacement transcrite par la chromatine. Dans certains cas, l' tape cl de l'activation des g nes est la charge de ces facteurs sur l'ARN polym rase, qui peut tre dirig e par des activateurs de transcription li s l'ADN. Une fois charg s, ces facteurs permettent la polym rase de se d placer travers les blocs impos s par la structure de la chromatine et de commencer transcrire le g ne s rieusement. Le fait d'avoir de l'ARN polym rase d j pos e sur un promoteur dans les premi res tapes de la transcription contourne l' tape d'assemblage de nombreux composants au niveau du promoteur, qui est souvent lente. Ce m canisme peut donc permettre aux cellules de commencer transcrire un g ne en r ponse rapide un signal extracellulaire. Nous avons vu que des complexes d'activateurs et de coactivateurs de transcription s'assemblent en coop ration sur l'ADN. Nous avons galement vu que ces assemblages peuvent favoriser diff rentes tapes de l'initiation de la transcription. En g n ral, lorsque plusieurs facteurs travaillent ensemble pour am liorer une vitesse de r action, l'effet conjoint n'est pas simplement la somme des am liorations auxquelles chaque facteur contribue lui seul, mais le produit. Si, par exemple, le facteur A abaisse la barri re de l' nergie libre d'une certaine quantit pour une r action et acc l re ainsi la r action de 100 fois, et que le facteur B, en agissant sur un autre aspect de la r action, fait de m me, alors A et B agissant en parall le abaisseront la barri re Figure 7 21 Les activateurs de transcription peuvent agir diff rentes tapes. en plus de (A) la promotion de la liaison r gulateurs de transcription suppl mentaires et (B) l'assemblage de l'ARNA polym rase au niveau des promoteurs, les activateurs de transcription sont souvent n cessaires (C) pour lib rer des ARN polym rases d j assembl es partir des promoteurs ou (D) pour lib rer les mol cules d'ARN polym rase qui se bloquent apr s la transcription d'environ 50 nucl otides d'ARN. Les activit s illustr es la figure 7-19 peuvent affecter chacune de ces quatre tapes. du double et multiplie par 10 000 la r action. M me si A et B fonctionnent simplement en attirant la m me prot ine, l'affinit de cette prot ine pour le site de r action augmente multiplicatellement. Ainsi, les activateurs de transcription pr sentent souvent une synergie transcriptionnelle, o plusieurs prot ines activatrices li es l'ADN travaillant ensemble produisent un taux de transcription beaucoup plus lev que la somme de leurs taux de transcription travaillant seuls (Figure 7 22). Un point important est qu'une prot ine activatrice de transcription doit tre li e l'ADN pour influencer la transcription de son g ne cible. Et le taux de transcription d'un g ne d pend en fin de compte du spectre des prot ines r gulatrices li es en amont et en aval de son site de d but de transcription, ainsi que des prot ines coactivatrices qu'elles apportent l'ADN. Bien que l' tat par d faut de l'ADN eucaryote emball dans les nucl osomes soit r sistant la transcription, les eucaryotes utilisent n anmoins des r gulateurs de transcription pour Figure 7 22 Synergie transcriptionnelle. Cette exp rience compare le taux de transcription produit par trois r gions r gulatrices construites exp rimentalement dans une cellule eucaryote et r v le une synergie transcriptionnelle, un effet plus qu'additif de plusieurs
Biologie moléculaire de la cellule	activateurs travaillant ensemble. Pour plus de simplicit , les coactivateurs ont t omis du diagramme. Une telle synergie transcriptionnelle n'est pas seulement observ e entre diff rents activateurs de transcription d'un m me organisme ; On l'observe galement entre des prot ines activatrices de diff rentes esp ces eucaryotes lorsqu'elles sont introduites exp rimentalement dans la m me cellule. Cette derni re observation refl te le haut degr de conservation de la machinerie responsable de l'initiation de la transcription eucaryote. recrutement de la chromatine masquant la surface d'activation de l'activateur du site de liaison du r presseur recrutement de avec les facteurs de transcription g n raux recrutement des prot ines de m thylation des histones qui se lient aux histones m thyl es Figure 7 23 Six fa ons dont les prot ines r pressives eucaryotes peuvent fonctionner. (A) Les prot ines activatrices et les prot ines r pressives sont en comp tition pour se lier la m me s quence r gulatrice d'ADN DnA. (B) Les deux prot ines se lient l'ADN, mais le r presseur emp che l'activateur de remplir ses fonctions. (C) le r presseur bloque l'assemblage des facteurs de transcription g n raux. (D) le r presseur recrute un complexe de remodelage de la chromatine, qui ram ne l' tat nucl osomique de la r gion promotrice sa forme pr -transcriptionnelle. (e) Le r presseur attire une histone d sac tylase vers le promoteur. Comme nous l'avons vu, l'ac tylation des histones peut stimuler l'initiation de la transcription (voir figure 7-20), et le r presseur inverse simplement cette modification. (f) le r presseur attire une histone m thyl transf rase, qui modifie certaines positions sur les histones en attachant des groupes m thyles ; Les histones m thyl es, leur tour, sont li es par des prot ines qui maintiennent la chromatine sous une forme transcriptionnellement silencieuse. r primer la transcription des g nes. Ces r presseurs de transcription peuvent la fois r duire le taux de transcription en dessous de la valeur par d faut et d sactiver rapidement les g nes qui taient pr c demment activ s. Nous avons vu au chapitre 4 que de grandes r gions du g nome peuvent tre ferm es par l'emballage de l'ADN dans des formes particuli rement r sistantes de chromatine. Cependant, les g nes eucaryotes sont rarement organis s le long du g nome en fonction de leur fonction, et cette strat gie n'est g n ralement pas applicable pour d sactiver un ensemble de g nes qui travaillent ensemble. Au lieu de cela, la plupart des r presseurs eucaryotes agissent g ne par g ne. Contrairement aux r presseurs bact riens, les r presseurs eucaryotes ne sont pas en concurrence directe avec l'ARN polym rase pour l'acc s l'ADN ; ils utilisent plut t un divers autres m canismes, dont certains sont illustr s la figure 7 23. Bien que tous ces m canismes bloquent finalement la transcription par l'ARN polym rase, les r presseurs de transcription eucaryotes agissent g n ralement en apportant des co-r presseurs l'ADN. Comme l'activation de la transcription, la r pression de la transcription peut agir par plus d'un m canisme au niveau d'un g ne cible donn , assurant ainsi une r pression particuli rement efficace. La r pression g n tique est particuli rement importante pour les animaux et les plantes dont la croissance d pend de programmes de d veloppement labor s et complexes. La mauvaise expression d'un seul g ne un moment critique peut avoir des cons quences d sastreuses pour l'individu. Pour cette raison, de nombreux g nes codant pour les prot ines r gulatrices du d veloppement les plus importantes sont maintenus troitement r prim s lorsqu'ils ne sont pas n cessaires. domaine de s quence d'activement Figure 7 24 Sch ma de principe r sumant les propri t s des isolants et des s quences de barri res. (A) les isolants bloquent directionnellement l'action des s quences cis-r gulatrices, tandis que les s quences barri res emp chent la propagation de l'h t rochromatine. La figure 4-41 illustre le fonctionnement probable des s quences de barri res. (B) les prot ines de liaison l'isolant (violet) retiennent la chromatine en boucles, favorisant ainsi des associations s quence-g ne cis-r gulatrices correctes . ainsi, le g ne B est correctement r gul , et les s quences cisr gulatrices du g ne B sont emp ch es d'influencer la transcription du g ne A. Nous avons vu que tous les g nes ont des r gions de contr le, qui dictent quels moments, dans quelles conditions et dans quels tissus le g ne sera exprim . Nous avons galement vu que les r gulateurs de transcription eucaryotes peuvent agir sur de tr s longues tendues d'ADN, avec l'ADN interm diaire boucl . Comment, alors, les r gions de contr le de diff rents g nes sont-elles emp ch es d'interf rer les unes avec les autres ? Par exemple, qu'est-ce qui emp che un r gulateur de transcription li la r gion de contr le d'un g ne de s'enrouler dans la mauvaise direction et d'influencer de mani r
Biologie moléculaire de la cellule	e inappropri e la transcription d'un g ne adjacent ? Pour viter une telle diaphonie, plusieurs types d' l ments d'ADN compartimentent le g nome en domaines r gulateurs discrets. Dans le chapitre 4, nous avons discut des s quences barri res qui emp chent la propagation de l'h t rochromatine dans les g nes qui doivent tre exprim s. Un deuxi me type d' l ment d'ADN, appel isolant, emp che les s quences cis-r gulatrices de se d cha ner et d'activer des g nes inappropri s (Figure 7-24). Les isolants fonctionnent en formant des boucles de chromatine, un effet m di par des prot ines sp cialis es qui les lient (voir figures 4-48 et 7-24B). Les boucles maintiennent un g ne et sa r gion de contr le proximit et aident emp cher la r gion de contr le de d border sur les g nes adjacents. Il est important de noter que ces boucles peuvent tre diff rentes dans diff rents types de cellules, en fonction des prot ines et des structures chromatiniennes particuli res pr sentes. On pense que la distribution des isolants et des s quences barri res dans un g nome le divise en domaines ind pendants de r gulation des g nes et de structure de la chromatine (voir pp. 207-208). Certains aspects de cette organisation peuvent tre visualis s en colorant des chromosomes entiers pour les prot ines sp cialis es qui lient ces l ments d'ADN (Figure 7-25). Figure 7 25 Localisation d'une prot ine de liaison isolante de la drosophile sur les chromosomes polyt nes. Un chromosome polyt ne (discut au chapitre 4) a t color l'iodure de propidium (rouge) pour montrer ses motifs de bandes, les bandes apparaissant rouge vif et les interbandes comme des trous sombres dans le motif (en haut). Les positions sur ce chromosome polyt ne qui sont li es par une prot ine isolante particuli re sont color es en vert vif l'aide d'anticorps dirig s contre la prot ine (en bas). Cette prot ine est pr f rentiellement localis e dans les r gions interbandes, ce qui refl te son r le dans l'organisation des chromosomes en domaines structurels et fonctionnels. Pour plus de commodit , ces deux micrographies du m me chromosome polyt ne sont dispos es comme des images miroirs. (Avec l'aimable autorisation d'Uli laemmli, d'apr s K. Zhao et al., Cell 81:879 889, 1995. avec la permission d'elsevier.) Bien que les chromosomes soient organis s en domaines ordonn s qui d couragent les r gions de contr le d'agir sans discernement, il existe des circonstances particuli res o l'on a constat qu'une r gion de contr le situ e sur un chromosome activait un g ne situ sur un chromosome diff rent. Bien qu'il y ait beaucoup de choses que nous ne comprenons pas sur ce m canisme, il indique l'extr me polyvalence des strat gies de r gulation transcriptionnelle. Les r gulateurs de transcription activent et d sactivent la transcription de g nes individuels dans les cellules. Chez les procaryotes, ces prot ines se lient g n ralement des s quences d'ADN sp cifiques proches du site de d part de l'ARN polym rase et, en fonction de la nature de la prot ine r gulatrice et de l'emplacement pr cis de son site de liaison par rapport au site de d part, activent ou r priment la transcription du g ne. Cependant, la flexibilit de l'h lice de l'ADN permet galement aux prot ines li es des sites distants d'affecter l'ARN polym rase au niveau du promoteur par la boucle de l'ADN interm diaire. La r gulation des g nes eucaryotes sup rieurs est beaucoup plus complexe, proportionnelle une taille de g nome plus grande et la grande vari t de types de cellules qui se forment. Un seul g ne eucaryote est g n ralement contr l par de nombreux r gulateurs de transcription li s des s quences qui peuvent tre des dizaines, voire des centaines de milliers de paires de nucl otides du promoteur qui dirige la transcription du g ne. Les activateurs et les r presseurs eucaryotes agissent par une grande vari t de m canismes, modifiant g n ralement la structure de la chromatine et contr lant l'assemblage des facteurs de transcription g n raux et de l'ARN polym rase au niveau du promoteur. Pour ce faire, ils attirent des coactivateurs et des co-r presseurs, des complexes prot iques qui effectuent les r actions biochimiques n cessaires. Le moment et le lieu de transcription de chaque g ne, ainsi que ses taux de transcription dans diff rentes conditions, sont d termin s par le spectre particulier des r gulateurs de transcription qui se lient la r gion r gulatrice du g ne. Bien que toutes les cellules doivent tre capables d'activer et de d sactiver des g nes en r ponse aux changements de leur environnement, les cellules des organismes multicellulaires ont d velopp cette capacit un degr extr me. En particulier, une fois qu'une cellule d'un organisme multicellulaire s'engage se diff rencier en un type de cellule sp cifique, la cellule maintient ce choix travers de nombreuses g n rations cellulaires ult rieures, ce qui signifie qu'elle se souvient des changements dans l'expression des
Biologie moléculaire de la cellule	g nes impliqu s dans le choix. Ce ph nom ne de m moire cellulaire est une condition pr alable la cr ation de tissus organis s et au maintien de types de cellules diff renci s de mani re stable. En revanche, d'autres changements dans l'expression des g nes chez les eucaryotes, ainsi que la plupart de ces changements chez les bact ries, ne sont que transitoires. Le r presseur de tryptophane, par exemple, d sactive les g nes du tryptophane chez les bact ries uniquement en pr sence de tryptophane ; D s que le tryptophane est retir du milieu, les g nes sont r activ s et les descendants de la cellule n'ont aucun souvenir que leurs anc tres ont t expos s au tryptophane. Dans cette section, nous examinerons non seulement les m canismes de m moire cellulaire, mais aussi comment les dispositifs de r gulation des g nes peuvent tre combin s pour cr er les circuits logiques travers lesquels les cellules int grent des signaux et se souviennent des v nements de leur pass . Nous commen ons par examiner en d tail l'une de ces r gions complexes de contr le des g nes. Nous avons vu que les r gulateurs de transcription peuvent tre positionn s plusieurs endroits le long de longues portions d'ADN et que ces prot ines peuvent mettre en jeu des coactivateurs et des co-r presseurs. Ici, nous discutons de la fa on dont les nombreux r gulateurs de transcription qui sont li s la r gion de contr le d'un g ne peuvent amener le g ne tre transcrit au bon endroit et au bon moment. Prenons l'exemple du g ne Eve (Drosophila Even-skipped), dont l'expression joue un r le important dans le d veloppement de l'embryon de drosophile. Si ce g ne est inactiv par mutation, de nombreuses parties de l'embryon ne se forment pas et l'embryon meurt t t dans le d veloppement. Comme nous l'avons vu au chapitre 21, au stade de d veloppement o Eve commence tre exprim e, l'embryon est une seule cellule g ante contenant plusieurs noyaux dans un cytoplasme commun. Ce cytoplasme contient un m lange de r gulateurs de transcription qui sont r partis de mani re in gale sur toute la longueur de l'embryon, fournissant ainsi des informations de position qui distinguent une partie de l'embryon d'une autre (Figure 7 26). Bien que les noyaux soient initialement identiques, ils commencent rapidement exprimer des g nes diff rents car ils sont expos s diff rents r gulateurs de transcription. Par exemple, le Les noyaux situ s pr s de l'extr mit ant rieure de l'embryon en d veloppement sont expos s un ensemble de r gulateurs de transcription distincts de l'ensemble qui influence les noyaux au milieu ou l'extr mit post rieure de l'embryon. Les s quences d'ADN r gulatrices qui contr lent le g ne Eve ont volu pour lire les concentrations de r gulateurs de transcription chaque position sur la longueur de l'embryon, et elles font en sorte que le g ne Eve est exprim en sept bandes positionn es avec pr cision, chacune initialement large de cinq six noyaux (Figure 7-27). Comment s'effectue cette remarquable prouesse de traitement de l'information ? Bien qu'il reste encore beaucoup apprendre, plusieurs principes g n raux ont merg des tudes sur Eve et d'autres g nes qui sont r gul s de la m me mani re. La r gion r gulatrice du g ne Eve est tr s vaste (environ 20 000 paires de nucl otides). Il est form d'une s rie de modules r gulateurs relativement simples, chacun d'entre eux contenant plusieurs s quences cis-r gulatrices et est responsable de la sp cification d'une bande particuli re d'expression d'Eve le long de l'embryon. Cette organisation modulaire de la r gion de contr le du g ne Eve a t r v l e par des exp riences dans lesquelles un module r gulateur particulier (par exemple, celui sp cifiant la bande 2) est retir de son cadre normal en amont du g ne Eve, plac devant un g ne rapporteur et r introduit dans le g nome de la drosophile. Lorsque l'on examine des embryons en d veloppement d riv s de mouches porteuses de cette construction g n tique, on constate que le g ne rapporteur est exprim pr cis ment la position de la bande 2 (Figure 7 28). Des exp riences similaires r v lent l'existence d'autres modules r gulateurs, chacun d'entre eux sp cifiant d'autres bandes. Figure 7 27 Les sept bandes de la prot ine cod e par le g ne Even-skipped (Eve) dans un embryon de drosophile en d veloppement. Deux heures et demie apr s la f condation, l'ovule a t fix et color avec des anticorps qui reconnaissent la prot ine eve (vert) et des anticorps qui reconnaissent la prot ine g ante (rouge). l o les prot ines eve et Giant sont toutes deux pr sentes, la coloration appara t jaune. ce stade de d veloppement, l' uf contient environ 4000 noyaux. les prot ines eve et giant sont toutes deux situ es dans les noyaux, et les bandes eve ont une largeur d'environ quatre noyaux. le motif de la prot ine Giant est galement illustr dans la figure 7-26. (Avec l'aimable autorisation de Michael Levine.) Figure 7 26 La distribution non u
Biologie moléculaire de la cellule	niforme des r gulateurs de transcription dans un embryon pr coce de drosophile. ce stade, l'embryon est un syncytium ; c'est- -dire que plusieurs noyaux sont contenus dans un cytoplasme commun. Bien que cela ne soit pas montr sur ces dessins, toutes ces prot ines sont concentr es dans les noyaux. la mani re dont ces diff rences sont tablies est examin e au chapitre 21. D but du segment INSERT d but de la transcription Figure 7 28 Exp rience d montrant la construction modulaire de la r gion r gulatrice du g ne Eve. (A) Une section de 480 nucl otides de la r gion r gulatrice d'Eve a t retir e et (B) ins r e en amont d'un promoteur de test qui dirige la synth se de l'enzyme -galactosidase (le produit du g ne LacZ d'E. coli voir figure 7 15). (C, D) lorsque cette construction artificielle a t r introduite dans le g nome d'embryons de drosophile, les embryons (D) ont exprim la -galactosidase (d tectable par coloration histochimique) pr cis ment dans la position de la deuxi me des sept bandes d'Eve (C). -galactosidase est simple d tecter et constitue donc un moyen pratique de surveiller l'expression sp cifi e par une r gion de contr le g nique. Telle qu'elle est utilis e ici, la -galactosidase est dite servir de rapporteur, car elle rapporte l'activit d'une r gion de contr le g nique. (C et D, avec l'aimable autorisation de Stephen Small et Michael Levine.) le g ne de la drosophile Eve est r gul par des contr les combinatoires Une tude d taill e du module r glementaire Stripe 2 a permis de mieux comprendre comment il lit et interpr te les informations de position. Le module contient des s quences de reconnaissance pour deux r gulateurs de transcription (Bicoid et Hunchback) qui activent la transcription d'Eve et pour deux r gulateurs de transcription (Kr ppel et Giant) qui la r priment (Figure 7 29). Les concentrations relatives de ces quatre prot ines d terminent si les complexes prot iques qui se forment au niveau du module de la bande 2 activent la transcription du g ne Eve. Figures 7 30 montre la distribution des quatre r gulateurs de transcription dans la r gion d'un embryon de drosophile o la bande 2 se forme. On pense que l'une ou l'autre des deux prot ines r pressives, lorsqu'elle est li e l'ADN, d sactivera le module de bande 2, tandis que Bicoid et Hunchback doivent se lier pour l'activation maximale de ce module. Ce sch ma r gulateur simple suffit activer le module stripe 2 (et donc l'expression du g ne Eve) uniquement dans les noyaux situ s o les niveaux de Bicoid et de Hunchback sont lev s et o Kr ppel et Giant sont absents une combinaison qui se produit dans une seule r gion de l'embryon pr coce. On ne sait pas exactement comment ces quatre r gulateurs de transcription interagissent avec les coactivateurs et les co-r presseurs pour sp cifier le niveau final de transcription travers la bande, mais le r sultat repose tr s probablement sur la comp tition entre les activateurs et les r presseurs qui agissent par les m canismes d crits dans les figures 7-17, 7-19 et 7-23. L' l ment stripe 2 est autonome, dans la mesure o il sp cifie stripe 2 lorsqu'il est isol de son contexte normal (voir Figure 7 28). On pense que les autres modules de r gulation de bande sont construits de la m me mani re, lisant les informations de position fournies par d'autres combinaisons de r gulateurs de transcription. L'ensemble de la r gion de contr le du g ne Eve se lie plus de 20 r gulateurs de transcription diff rents. Sept combinaisons de r gulateurs (une combinaison pour chaque bande) sp cifient l'expression Eve, tandis que de nombreuses autres combinaisons (toutes celles que l'on trouve dans les r gions interbandes de Figure 7 29 L'unit Eve stripe 2. le segment de la r gion de contr le du g ne Eve identifi dans la figure 7-28 contient des s quences cisr gulatrices pour quatre r gulateurs de transcription. on sait par des exp riences g n tiques que ces quatre prot ines r gulatrices sont responsables de la bonne expression d'Eve dans la bande 2. les mouches qui sont d ficientes dans les deux activateurs de g nes Bicoid et bossu, par exemple, ne parviennent pas exprimer efficacement Eve en bande 2. chez les mouches d ficientes en l'un des deux r presseurs de g nes, Giant et Kr ppel, la bande 2 s' tend et couvre une r gion anormalement large de l'embryon. Comme indiqu , dans certains cas, les sites de liaison des r gulateurs de transcription se chevauchent, et les prot ines peuvent entrer en comp tition pour la liaison l'ADN. par exemple, la liaison de Kr ppel et la liaison de Bicoid au site l'extr me droite s'excluent mutuellement. l'embryon) garder les l ments de la bande silencieux. Une r gion de contr le vaste et complexe est ainsi construite partir d'une s rie de modules plus petits, chacun d'entre eux consistant en un arrangement unique de courtes s quences cis-r gulatrices reconnues par des r gulateurs de transcription sp cifiques. Le g ne Eve lui-m me code
Biologie moléculaire de la cellule	pour un r gulateur de transcription qui, apr s que son mod le d'expression soit mis en place en sept bandes, contr le l'expression d'autres g nes de la drosophile. Au fur et mesure du d veloppement, l'embryon est ainsi subdivis en r gions de plus en plus fines qui finissent par donner naissance aux diff rentes parties du corps de la mouche adulte, comme nous l'avons vu au chapitre 21. Eve illustre les r gions de contr le complexes que l'on trouve chez les plantes et les animaux. Comme le montre cet exemple, les r gions de contr le peuvent r pondre de nombreuses entr es diff rentes, int grer ces informations et produire une sortie spatiale et temporelle complexe au fur et mesure du d veloppement. Cependant, la mani re exacte dont tous ces m canismes fonctionnent ensemble pour produire le r sultat final n'est comprise que dans les grandes lignes (Figure 7-31). L'exemple ci-dessus de la drosophile illustre clairement le pouvoir du contr le combinatoire, mais ce cas est inhabituel en ce que les noyaux sont expos s directement des signaux de position sous la forme de concentrations de r gulateurs de transcription. Dans les embryons de la plupart des autres organismes et chez tous les adultes, les noyaux individuels sont dans des cellules s par es, et l'information extracellulaire (y compris les signaux de position) doit tre transmise travers la membrane plasmique afin de g n rer des signaux dans le cytosol qui font que diff rents r gulateurs de transcription deviennent actifs dans diff rents types de cellules. Certains des diff rents m canismes connus pour tre utilis s pour activer les r gulateurs de transcription sont sch matis s dans la figure 7-32, et dans le chapitre 15, nous discutons comment les signaux extracellulaires d clenchent ces changements. Ensemble neutre d'activation forte de Figure 7 30 Distribution des r gulateurs de transcription charg s de s'assurer que Eve est exprim e en bande 2. les distributions de ces prot ines ont t visualis es en colorant un embryon de drosophile en d veloppement avec des anticorps dirig s contre chacune des quatre prot ines. l'expression d'Eve dans la bande 2 ne se produit qu' la position o les deux activateurs (Bicoid et bossu) sont pr sents et les deux r presseurs (Giant et Kr ppel) sont absents. chez les embryons de mouches d pourvus de Kr ppel, par exemple, la bande 2 s' tend vers l'arri re. de m me, la bande 2 s' tend vers l'arri re si les sites de liaison l'ADN de Kr ppel dans le module de la bande 2 sont inactiv s par mutation (voir aussi les figures 7-26 et 7-27). Figure 7 31 L'int gration de plusieurs entr es au niveau d'un promoteur. Plusieurs ensembles de r gulateurs, de coactivateurs et de co-r presseurs de transcription peuvent travailler ensemble pour influencer l'initiation de la transcription au niveau d'un promoteur, comme ils le font dans le module Eve stripe 2 illustr aux figures 7 29. On ne comprend pas encore en d tail comment la cellule r alise l'int gration de plusieurs entr es, mais il est probable que l'activit transcriptionnelle finale du g ne r sulte d'une comp tition entre les activateurs et les r presseurs qui agissent par les m canismes r sum s dans les figures 7-17, 7-19 et 7-23. Nous avons vu que les r gulateurs de transcription peuvent agir en combinaison pour contr ler l'expression d'un g ne individuel. Il est galement g n ralement vrai que chaque r gulateur de transcription d'un organisme contribue au contr le de nombreux g nes. Ce point est illustr sch matiquement dans la figure 7-33, qui montre comment le contr le g nique combinatoire permet de g n rer une grande complexit biologique m me avec relativement peu de r gulateurs de transcription. En raison du contr le combinatoire, un r gulateur de transcription donn n'a pas n cessairement une fonction unique, simplement d finissable, en tant que commandant d'une batterie particuli re de g nes ou sp cificateur d'un type de cellule particulier. Au contraire, les r gulateurs de transcription peuvent tre assimil s aux mots d'une langue : ils sont utilis s avec des significations diff rentes dans une vari t de contextes et rarement seuls ; C'est la combinaison bien choisie qui transmet l'information qui sp cifie un v nement de r gulation g nique. Le contr le g nique combinatoire fait d pendre l'effet de l'ajout d'un nouveau r gulateur de transcription une cellule de l'histoire pass e de cette cellule, puisque c'est cette histoire qui d termine quels r gulateurs de transcription sont d j pr sents. Ainsi, au cours du d veloppement, une cellule peut accumuler une s rie de r gulateurs de transcription qui n'ont pas besoin de modifier initialement l'expression des g nes. L'ajout des derniers membres de la combinaison requise de r gulateurs de transcription compl tera le message r gulateur et peut entra ner d'importants changements dans l'expression des g nes. L'importance des combinaisons de r gulateurs de transcription pour la sp cification des types c
Biologie moléculaire de la cellule	ellulaires est le plus facilement d montr e par leur capacit , lorsqu'elle est exprim e artificiellement, convertir un type de cellule en un autre. Ainsi, l'expression artificielle de trois r gulateurs de transcription sp cifiques aux neurones dans les cellules h patiques peut convertir les cellules h patiques en cellules nerveuses fonctionnelles (Figure 7 34). Dans certains cas, l'expression d'un seul r gulateur de transcription est suffisante pour convertir un type de cellule en un autre. Par exemple, lorsque le g ne codant pour le r gulateur de transcription MyoD est introduit artificiellement dans des fibroblastes cultiv s partir de tissu conjonctif cutan , les fibroblastes forment des cellules ressemblant des muscles. Comme nous l'avons vu au chapitre 22, les fibroblastes, qui sont d riv s de la m me grande classe de cellules embryonnaires que les cellules musculaires, ont d j accumul bon nombre des autres r gulateurs de transcription n cessaires la Figure 7 32 Quelques fa ons dont l'activit des r gulateurs de transcription est contr l e l'int rieur des cellules eucaryotes. (A) la prot ine n'est synth tis e qu'en cas de besoin et est rapidement d grad e par prot olyse afin qu'elle ne s'accumule pas. (B) Activation par liaison de ligand. (C) Activation par modification covalente. La phosphorylation est montr e ici, mais de nombreuses autres modifications sont possibles (voir tableau 3-3, p. 165). formation d'un complexe entre une prot ine de liaison l'ADN et une prot ine distincte avec un domaine activant la transcription. D masquage d'un domaine d'activation par la phosphorylation d'une prot ine inhibitrice. Stimulation de l'entr e nucl aire par l' limination d'une prot ine inhibitrice qui, autrement, emp che la prot ine r gulatrice de p n trer dans le noyau. (G) lib ration d'un r gulateur de transcription partir d'une bicouche membranaire par prot olyse r gul e. le contr le combinatoire des g nes sp cifiques aux muscles, et l'ajout de MyoD compl te la combinaison unique n cessaire pour diriger les cellules vers le muscle. Un exemple encore plus frappant est l'expression artificielle, au d but du d veloppement, d'un seul r gulateur de transcription de la drosophile (Eyeless) dans des groupes de cellules Figure 7 34 Un petit ensemble de r gulateurs de transcription peut convertir un type de cellule diff renci en un autre. dans cette exp rience, des cellules h patiques (A) cultiv es en culture ont t converties en cellules neuronales (B) via l'expression artificielle de trois r gulateurs de transcription sp cifiques aux nerfs. Les deux types de cellules expriment une prot ine fluorescente rouge artificielle, qui est utilis e pour les visualiser. Cette conversion implique l'activation de nombreux g nes sp cifiques aux nerfs ainsi que la r pression de nombreux g nes sp cifiques au foie. (d'apr s S. Marro et al., Cell Stem Cell 9:374 382, 2011. avec la permission d'Elsevier.) Figure 7 33 L'importance du contr le g n tique combinatoire pour le d veloppement. La combinaison de quelques r gulateurs de transcription peut g n rer de nombreux types de cellules au cours du d veloppement. Dans ce sch ma simple et id alis , une d cision de prendre l'un des deux r gulateurs de transcription diff rents (repr sent s par des cercles num rot s) est prise apr s chaque division cellulaire. Sentant sa position relative dans l'embryon, la cellule fille vers le c t gauche de l'embryon est toujours induite synth tiser la prot ine paire de chaque paire, tandis que la cellule fille vers le c t droit de l'embryon est induite synth tiser la prot ine impaire. La production de chaque r gulateur de transcription est suppos e s'auto-entretenir une fois qu'elle a t initi e (voir Figure 7 39). De cette fa on, gr ce la m moire cellulaire, la sp cification combinatoire finale est construite tape par tape. dans cet exemple purement hypoth tique, cinq r gulateurs de transcription diff rents ont cr huit types de cellules finales (G n). fy avec le g ne Eyeless artificiellement qui devrait normalement former des parties de jambe. Ici, ce changement anormal de l'expression g nique provoque le d veloppement de structures semblables des yeux dans les jambes (Figure 7 35). Des types de cellules sp cialis s peuvent tre reprogramm s exp rimentalement pour devenir des cellules souches pluripotentes La manipulation des r gulateurs de transcription peut galement inciter diverses cellules diff renci es se d diff rencier en cellules souches pluripotentes capables de donner naissance aux diff rents types de cellules du corps, un peu comme les cellules souches embryonnaires (SE) discut es au chapitre 22. Lorsque trois r gulateurs de transcription sp cifiques sont exprim s artificiellement dans des fibroblastes de souris en culture, un certain nombre de cellules deviennent des cellules souches pluripotentes induites (cellules iPS), c'est- -dire des cellules qui ressemblent et se comportent comme les cellul
Biologie moléculaire de la cellule	es ES pluripotentes d riv es d'embryons (Figure 7 36). Cette approche a t adapt e pour produire des cellules iPS partir d'une vari t de types de cellules sp cialis es, y compris des cellules pr lev es sur des humains. Ces cellules iPS humaines peuvent ensuite tre dirig es pour g n rer une population de cellules diff renci es utiliser dans l' tude ou le traitement de la maladie, comme nous l'expliquons au chapitre 22. Bien que l'on ait autrefois pens que la diff renciation cellulaire tait irr versible, il est maintenant clair qu'en manipulant des combinaisons de r gulateurs de transcription ma tres, les types de cellules et les voies de diff renciation peuvent tre facilement modifi s. Combinaisons de r gulateurs de transcription ma tres Sp cifier les types de cellules en contr lant l'expression de nombreux g nes Comme nous l'avons vu dans l'introduction de ce chapitre, les diff rents types de cellules des organismes multicellulaires diff rent norm ment dans les prot ines et les ARN qu'ils expriment. Par exemple, seules les cellules musculaires expriment des types sp ciaux de actine et myosine qui forment le contractile Figure 7 35 L'expression du g ne Eyeless de la drosophile dans les cellules pr curseurs de la patte d clenche le d veloppement d'un il sur la patte. (A) Diagrammes simplifi s montrant le r sultat lorsqu'une larve de mouche des fruits contient soit le g ne Eyeless normalement exprim ( gauche), soit un g ne Eyeless qui est galement exprim artificiellement dans les cellules qui donnent normalement naissance au tissu de la jambe ( droite). (B) photographie d'une jambe anormale qui contient un il mal plac (voir aussi figure 21-2). Le r gulateur de transcription a t nomm Eyeless parce que son inactivation chez des mouches normales provoque la perte d'yeux. (B, avec l'aimable autorisation de Walter Gehring.) Figure 7 36 Une combinaison de r gulateurs de transcription peut induire la d diff renciation d'une cellule diff renci e en une cellule pluripotente. l'expression artificielle d'un ensemble de trois g nes, dont chacun code pour un r gulateur de transcription, peut reprogrammer un fibroblaste en une cellule pluripotente avec des propri t s similaires celles des cellules souches embryonnaires (eS). l'instar des cellules eS, ces cellules souches pluripotentes induites (ipS) peuvent prolif rer ind finiment en culture et peuvent tre stimul es par des mol cules de signal extracellulaire appropri es pour se diff rencier en presque n'importe quel type de cellule pr sent dans le corps. Les r gulateurs de transcription tels que Oct4, Sox2 et Klf4 sont souvent appel s r gulateurs de transcription ma tres car leur expression est suffisante pour d clencher un changement d'identit cellulaire. Les cellules nerveuses doivent fabriquer et assembler toutes les prot ines n cessaires la formation des dendrites et des synapses. Nous avons vu que ces mod les d'expression sp cifiques au type cellulaire sont orchestr s par une combinaison de r gulateurs de transcription ma tres. Dans de nombreux cas, ces prot ines se lient directement aux s quences cis-r gulatrices des g nes sp cifiques ce type de cellule. Ainsi, MyoD se lie directement aux s quences cis-r gulatrices situ es dans les r gions de contr le des g nes sp cifiques du muscle. Dans d'autres cas, les r gulateurs ma tres contr lent l'expression des r gulateurs de transcription en aval qui, leur tour, se lient aux r gions de contr le d'autres g nes sp cifiques au type de cellule et contr lent leur synth se. La sp cification d'un type de cellule particulier implique g n ralement des changements dans l'expression de plusieurs milliers de g nes. Les g nes dont les produits prot iques sont n cessaires dans le type cellulaire sont exprim s des niveaux lev s, tandis que ceux qui ne sont pas n cessaires sont g n ralement r gul s la baisse. Comme on peut l'imaginer, le mod le de liaison entre les r gulateurs ma tres et tous les g nes r gul s peut tre extr mement labor (Figure 7-37). Lorsque nous consid rons que beaucoup de ces g nes r gul s ont des r gions de contr le qui s' tendent sur des dizaines de milliers de paires de nucl otides, la mesure de l'exemple d'Eve discut ci-dessus, nous pouvons commencer appr cier l' norme complexit de la sp cification du type de cellule. Une question en suspens en biologie est de savoir comment l'information d'un g nome est utilis e pour sp cifier un organisme multicellulaire. Bien que nous ayons les grandes lignes de la r ponse, nous sommes loin de comprendre comment un seul type de cellule est compl tement sp cifi , sans parler d'un organisme entier. Les cellules sp cialis es doivent rapidement activer et d sactiver des ensembles de g nes Bien qu'elles conservent g n ralement leur identit , les cellules sp cialis es doivent constamment r agir aux changements de leur environnement. Parmi les changements les plus importants, on trouve les signaux provenant d'autres cellule
Biologie moléculaire de la cellule	s qui coordonnent le comportement de l'ensemble de l'organisme. Beaucoup de ces signaux induisent des changements transitoires dans la transcription des g nes, et nous discutons en d tail de la nature de ces signaux au chapitre 15. Ici, nous examinons comment des types de cellules sp cialis s activent et d sactivent rapidement et de mani re d cisive des groupes de g nes en r ponse leur environnement. M me si le contr le de l'expression g nique est combinatoire, l'effet d'un seul r gulateur de transcription peut toujours tre d cisif pour activer ou d sactiver un g ne particulier, simplement en compl tant la combinaison n cessaire pour activer ou r primer au maximum ce g ne. Cette situation est analogue la composition du dernier num ro d'une serrure combinaison : la serrure s'ouvrira avec seulement cette simple addition si tous les autres num ros ont t pr alablement saisis. Figure 7 37 Une partie du r seau de transcription sp cifiant les cellules souches embryonnaires. (A) Les trois r gulateurs de transcription ma tres de la figure 7 36 sont repr sent s par de grands cercles. Les g nes dont les s quences cis-r gulatrices sont li es par chaque r gulateur dans les cellules souches embryonnaires sont indiqu s par un petit point (repr sentant le g ne) reli par une fine ligne (repr sentant la r action de liaison). Notez que de nombreux g nes cibles sont li s par plus d'un des r gulateurs. (B) les r gulateurs ma tres contr lent leur propre expression. Comme le montre ici, les trois r gulateurs transcriptionnels se lient leurs propres r gions de contr le (indiqu es par des boucles de r troaction), ainsi qu' celles des autres r gulateurs ma tres (indiqu s par des fl ches droites). (Avec l'aimable autorisation de trevor Sorrells, d'apr s les donn es de J. Kim et al., Cell 132:1049-1061, 2008.) De plus, le m me nombre peut compl ter la combinaison de nombreuses serrures diff rentes. De m me, l'ajout d'une prot ine particuli re peut activer de nombreux g nes diff rents. Un exemple est le contr le rapide de l'expression g nique par la prot ine r ceptrice des glucocortico des humains. Pour se lier ses s quences cis-r gulatrices dans le g nome, ce r gulateur de transcription doit d'abord former un complexe avec une mol cule d'une hormone st ro de glucocortico de, comme le cortisol (voir Figure 15 64). Le corps lib re cette hormone pendant les p riodes de famine et d'activit physique intense, et parmi ses autres activit s, il stimule les cellules h patiques pour augmenter la production de glucose partir d'acides amin s et d'autres petites mol cules. Pour r pondre de cette mani re, les cellules h patiques augmentent l'expression de nombreux g nes diff rents qui codent pour des enzymes m taboliques, tels que la tyrosine aminotransf rase, comme nous l'avons vu plus t t dans ce chapitre (voir Figure 7-3). Bien que ces g nes aient tous des r gions de contr le diff rentes et complexes, leur expression maximale d pend de la liaison du complexe r cepteur hormone-glucocortico de sa s quence cis-r gulatrice, qui est pr sente dans la r gion de contr le de chaque g ne. Lorsque le corps s'est r tabli et que l'hormone n'est plus pr sente, l'expression de chacun de ces g nes tombe son niveau normal dans le foie. De cette fa on, un seul r gulateur de transcription peut rapidement contr ler l'expression de nombreux g nes diff rents (Figure 7 38). Les effets du r cepteur des glucocortico des ne se limitent pas aux cellules du foie. Dans d'autres types de cellules, l'activation de ce r gulateur de transcription par l'hormone provoque galement des changements dans les niveaux d'expression de nombreux g nes ; Cependant, les g nes affect s sont g n ralement diff rents de ceux affect s dans les cellules h patiques. Comme nous l'avons vu, chaque type de cellule poss de un ensemble individualis de r gulateurs de transcription et, en raison du contr le combinatoire, ceux-ci influencent de mani re critique l'action du r cepteur des glucocortico des. tant donn que le r cepteur est capable de s'assembler avec de nombreux ensembles diff rents de r gulateurs de transcription sp cifiques au type cellulaire, l'activation de l'hormone produit un spectre diff rent d'effets dans chaque type de cellule. Une fois qu'une cellule s'est diff renci e en un type de cellule particulier, elle restera g n ralement diff renci e et toutes ses cellules de descendance resteront du m me type de cellule. Certaines cellules hautement sp cialis es, y compris les cellules musculaires squelettiques et les neurones, ne se divisent plus jamais une fois qu'elles se sont diff renci es, c'est- -dire qu'elles sont diff renci es en phase terminale (comme nous l'avons vu au chapitre 17). Mais de nombreuses autres cellules diff renci es, telles que le r cepteur en l'absence d'hormone glucocortico de, Figure 7 38 Un seul r gulateur de transcription peut coordonner l'expression de nombreux g nes diff rents. L'action du r cepteur des glucocortico des est i
Biologie moléculaire de la cellule	llustr e sch matiquement. Sur la gauche se trouve une s rie de g nes, chacun d'entre eux ayant divers r gulateurs de transcription li s sa r gion r gulatrice. Cependant, ces prot ines li es ne sont pas suffisantes elles seules pour activer compl tement la transcription. Sur la droite, on voit l'effet de l'ajout d'un r gulateur de transcription suppl mentaire le r cepteur des glucocortico des dans un complexe avec l'hormone glucocortico de qui a une s quence cisr gulatrice dans la r gion de contr le de chaque g ne. Le r cepteur des glucocortico des compl te la combinaison de r gulateurs de transcription n cessaires l'initiation maximale de la transcription, et les g nes sont maintenant activ s comme un ensemble. lorsque l'hormone n'est plus pr sente, le r cepteur des glucocortico des se dissocie de l'ADN et les g nes reviennent leurs niveaux pr -stimul s. les fibroblastes, les cellules musculaires lisses et les cellules h patiques se divisent plusieurs fois au cours de la vie d'un individu. Quand Ils le font, ces types de cellules sp cialis es ne donnent naissance qu' des cellules comme elles : les cellules musculaires lisses ne donnent pas naissance aux cellules h patiques, ni les cellules h patiques aux fibroblastes. Pour qu'une cellule en prolif ration conserve son identit une propri t appel e m moire cellulaire les mod les d'expression g nique responsables de cette identit doivent tre m moris s et transmis ses cellules filles par le biais de divisions cellulaires ult rieures. Ainsi, dans le mod le que nous avons discut dans la figure 7-33, la production de chaque r gulateur de transcription, une fois commenc e, doit tre poursuivie dans les cellules filles de chaque division cellulaire. Comment une telle perp tuation s'accomplit-elle ? Les cellules ont plusieurs fa ons de s'assurer que leurs filles se souviennent de quel type de cellules elles sont. L'une des plus simples et des plus importantes consiste en une boucle de r troaction positive, o un r gulateur de transcription de type cellulaire ma tre active la transcription de son propre g ne, en plus de celle d'autres g nes sp cifiques au type cellulaire. Chaque fois qu'une cellule se divise, le r gulateur est distribu aux deux cellules filles, o il continue stimuler la boucle de r troaction positive, faisant plus d'elle-m me chaque division. La r troaction positive est cruciale pour tablir des circuits autonomes d'expression g nique qui permettent une cellule de s'engager dans un destin particulier, puis de transmettre cette information sa prog niture (Figure 7-39). Comme nous l'avons montr pr c demment dans la figure 7-37B, les r gulateurs ma tres n cessaires pour maintenir la pluripotence des cellules iPS se lient aux s quences cis-r gulatrices dans leurs propres r gions de contr le, fournissant des exemples du type de boucle de r troaction positive. De plus, la plupart de ces r gulateurs cellulaires pluripotents activent galement la transcription d'autres r gulateurs ma tres, ce qui entra ne une s rie complexe de boucles de r troaction indirectes. Par exemple, si A active B et B active A, cela forme une boucle de r troaction positive o A active sa propre expression, bien qu'indirectement. La s rie de boucles de r troaction directes et indirectes observ es dans le circuit iPS est typique d'autres circuits de cellules sp cialis s. Une telle structure de r seau renforce la m moire cellulaire, augmentant la probabilit qu'un mod le particulier d'expression g nique soit transmis travers les g n rations successives. Par exemple, si le niveau de A descend en dessous du seuil critique pour stimuler sa propre synth se, le r gulateur B peut le sauver. Par l'application successive de ce m canisme, une s rie complexe de boucles de r troaction positive entre plusieurs r gulateurs de transcription peut maintenir de mani re stable un tat diff renci travers de nombreuses divisions cellulaires. Figure 7 39 Une boucle de r troaction positive peut cr er de la m moire cellulaire. la prot ine A est un r gulateur de transcription ma tre qui active la transcription de son propre g ne, ainsi que d'autres g nes sp cifiques au type de cellule (non illustr s). Tous les descendants de la cellule d'origine se souviendront donc que la cellule prog nitrice a subi un signal transitoire qui a initi la production de la prot ine A. Les boucles de r troaction positive form es par les r gulateurs de transcription sont probablement le moyen le plus r pandu de s'assurer que les cellules filles se souviennent du type de cellules qu'elles sont cens es tre, et on les trouve dans toutes les esp ces sur Terre. Par exemple, de nombreuses bact ries et eucaryotes unicellulaires forment diff rents types de cellules, et les boucles de r troaction positive sont au c ur des m canismes qui maintiennent leurs types cellulaires travers de nombreux cycles de division cellulaire. Les plantes et les animaux font galement un usage intensi
Biologie moléculaire de la cellule	f des boucles de r troaction de transcription ; Comme nous le verrons plus loin dans le chapitre, ils disposent de m canismes suppl mentaires, plus sp cialis s, pour rendre la m moire cellulaire encore plus forte. Mais d'abord, nous examinons bri vement comment des combinaisons de r gulateurs de transcription et de s quences cis-r gulatrices peuvent tre combin es pour cr er des dispositifs logiques utiles pour la cellule. Les circuits de transcription permettent la cellule d'effectuer des op rations logiques De simples commutateurs de r gulation de g nes peuvent tre combin s pour cr er toutes sortes de dispositifs de contr le, tout comme de simples l ments de commutation lectronique dans un ordinateur peuvent tre li s pour effectuer diff rents types d'op rations. Une analyse des circuits de r gulation des g nes r v le que certains types simples d'arrangements (appel s motifs de r seau) se retrouvent encore et encore dans des cellules d'esp ces tr s diff rentes. Par exemple, les boucles de r troaction positives et n gatives sont communes toutes les cellules (Figure 7 40). Alors que le premier fournit un dispositif de m moire simple, le second est souvent utilis pour maintenir l'expression d'un g ne pr s d'un niveau standard malgr les variations des conditions biochimiques l'int rieur d'une cellule. Supposons, par exemple, qu'un r presseur de transcription La prot ine se lie la r gion r gulatrice de son propre g ne et exerce une forte r troaction n gative, de sorte que la transcription tombe un taux tr s faible lorsque la concentration de la prot ine r pressive est sup rieure une valeur critique (d termin e par son affinit pour son site de liaison l'ADN). La concentration de la prot ine peut alors tre maintenue proche de la valeur critique, car toute circonstance qui provoque une chute en dessous de cette valeur peut entra ner une forte augmentation de la synth se, et toute circonstance qui provoque une augmentation au-dessus de cette valeur entra nera l'arr t de la synth se. De tels ajustements prendront cependant du temps, de sorte qu'un changement brusque des conditions provoquera une perturbation de l'expression des g nes qui est forte mais transitoire. S'il y a un retard dans la boucle de r troaction, il peut en r sulter des oscillations spontan es dans l'expression du g ne (voir Figure 15-18). Les diff rents types de comportement produits par une boucle de r troaction vont d pendre des d tails du syst me ; Par exemple, la fa on dont le r gulateur de transcription se lie sa s quence cis-r gulatrice, son taux de synth se et son taux de d composition. Nous aborderons ces questions en termes quantitatifs et plus en d tail au chapitre 8. Avec deux r gulateurs de transcription ou plus, la gamme possible de comportements du circuit devient plus complexe. Certains virus bact riens contiennent un type commun de circuit deux g nes qui peut basculer entre l'expression d'un g ne et l'expression de l'autre. Un autre arrangement de circuit courant est appel boucle d'anticipation ; une telle boucle peut servir de filtre, r pondant aux signaux d'entr e prolong s, mais sans tenir compte de ceux qui sont brefs (Figure 7 41). Ces diff rents motifs de r seau ressemblent des dispositifs logiques miniatures, et ils peuvent traiter l'information de mani re tonnamment sophistiqu e. Les types simples de dispositifs que nous venons d'illustrer se trouvent imbriqu s dans les cellules eucaryotes, cr ant des circuits extr mement complexes (Figure 7-42). Chaque cellule d'un organisme multicellulaire en d veloppement est quip e d'un contr le tout aussi complexe Figure 7 40 Types courants de motifs de r seau dans les circuits de transcription. A et B repr sentent les r gulateurs de transcription, les fl ches indiquent un contr le de transcription positif, tandis que les lignes avec des barres repr sentent un contr le de transcription n gatif. dans la boucle de r troaction, A et B repr sentent des r gulateurs de transcription qui activent tous deux la transcription du g ne cible Z (voir aussi la figure 8-86). et il doit, en effet, utiliser son syst me complexe de commutateurs de transcription imbriqu s pour calculer comment il devrait se comporter chaque point temporel en r ponse aux nombreuses entr es pass es et pr sentes diff rentes re ues. Nous commen ons peine comprendre comment tudier des r seaux de contr le intracellulaires aussi complexes. En effet, sans de nouvelles approches, coupl es des informations quantitatives beaucoup plus pr cises et compl tes que celles que nous poss dons actuellement, il sera impossible de pr dire le comportement d'un syst me tel que celui illustr dans la figure 7-42. Comme expliqu au chapitre 8, un sch ma lectrique seul ne suffit pas. Figure 7 41 Comment une boucle de r troaction peut mesurer la dur e d'un signal. dans cet exemple th orique, les r gulateurs de transcription A et B sont tous deux n cessaires la transcription de Z, et A ne devient
Biologie moléculaire de la cellule	actif que lorsqu'un signal d'entr e est pr sent. si le signal d'entr e A est bref, A ne reste pas actif assez longtemps pour que B s'accumule, et le g ne Z n'est pas transcrit. (C) si le signal A persiste, B s'accumule, A reste actif et Z est transcrit. Cette disposition permet la pile d'ignorer les fluctuations rapides du signal d'entr e et de ne r pondre qu'aux niveaux persistants. Cette strat gie pourrait tre utilis e, par exemple, pour faire la distinction entre un bruit al atoire et un signal r el. le comportement montr ici a t calcul pour un ensemble particulier de valeurs de param tres d crivant les propri t s quantitatives de A, B et le produit de Z, ainsi que leurs synth ses. Avec des valeurs diff rentes de ces param tres, les boucles de r troaction peuvent en principe effectuer d'autres types de calculs . De nombreuses boucles de r troaction ont t d couvertes dans les cellules, et l'analyse th orique aide les chercheurs discerner et ensuite tester les diff rentes fa ons dont elles peuvent fonctionner (voir figure 8-86). (Adapt de S.S. Shen-Orr et al., Nat. Genet. 31:64 68, 2002. avec l'autorisation de Macmillan publishers ltd.) Figure 7 42 Le circuit g nique extr mement complexe qui sp cifie une partie de l'embryon d'oursin en d veloppement. Chaque petite bo te color e repr sente un g ne diff rent. ceux en jaune codent pour les r gulateurs de transcription et ceux en vert et bleu codent pour les prot ines qui donnent aux cellules du m soderme et de l'endoderme, respectivement, leurs caract ristiques sp cialis es. Les g nes repr sent s en gris sont largement actifs chez la m re et fournissent l' uf les indices n cessaires au bon d veloppement. Comme dans les figures 7 40, les fl ches repr sentent des cas dans lesquels un r gulateur de transcription active la transcription d'un autre g ne. Les lignes se terminant par des barres indiquent des exemples de r pression g n tique. (d'apr s i.S. peter et e.h. Davidson, Nature 474:635-639, 2011. avec la permission de Macmillan publishers ltd.) Les nombreux types de cellules chez les animaux et les plantes sont cr s en grande partie par des m canismes qui font que diff rents ensembles de g nes sont transcrits dans diff rentes cellules. La transcription d'un g ne particulier est g n ralement contr l e par une combinaison de r gulateurs de transcription. Chaque type de cellule d'un organisme eucaryote sup rieur contient un ensemble sp cifique de r gulateurs de transcription qui assurent l'expression des seuls g nes appropri s ce type de cellule. Un r gulateur de transcription donn peut tre actif dans diverses circonstances et est g n ralement impliqu dans la r gulation de nombreux g nes diff rents. tant donn que les cellules animales sp cialis es peuvent conserver leur caract re unique travers de nombreux cycles de division cellulaire, et m me lorsqu'elles sont cultiv es en culture, les m canismes de r gulation des g nes impliqu s dans leur cr ation doivent tre stables une fois tablis et h r ditaires lorsque la cellule se divise. Ces caract ristiques refl tent la m moire de la cellule de son histoire de d veloppement. Les boucles de r troaction positive directes ou indirectes, qui permettent aux r gulateurs de transcription de perp tuer leur propre synth se, constituent le m canisme le plus simple pour la m moire cellulaire. Les circuits de transcription fournissent galement la cellule les moyens d'effectuer d'autres types d'op rations logiques. Des circuits de transcription simples combin s de grands r seaux r gulateurs entra nent des programmes tr s sophistiqu s de d veloppement embryonnaire qui n cessiteront de nouvelles approches pour tre d chiffr s. Jusqu' pr sent, dans ce chapitre, nous avons mis l'accent sur la r gulation de la transcription des g nes par des prot ines qui s'associent directement ou indirectement l'ADN. Cependant, l'ADN lui-m me peut tre modifi de mani re covalente, et certains types d' tats de la chromatine semblent tre h r ditaires. Dans cette section, nous verrons comment ces ph nom nes offrent galement des opportunit s pour la r gulation de l'expression des g nes. la fin de cette section, nous discutons comment, chez la souris et l'homme, un chromosome entier peut tre inactiv par transcription l'aide de tels m canismes, et comment cet tat peut tre maintenu travers de nombreuses divisions cellulaires. Les mod les de m thylation de l'ADN peuvent tre h rit s lorsque les cellules des vert br s se divisent Dans les cellules de vert br s, la m thylation de la cytosine fournit un m canisme par lequel les mod les d'expression g nique peuvent tre transmis aux cellules de descendance. La forme m thyl e de la cytosine, la 5-m thyl cytosine (5-m thyl C), a la m me relation avec la cytosine que la thymine avec l'uracile, et la modification n'a pas non plus d'effet sur l'appariement des bases (Figure 7-43). La m thylation de l'ADN dans l'ADN des vert br s se produit sur les
Biologie moléculaire de la cellule	nucl otides de cytosine (C) en grande partie dans la s quence CG, qui est appari e exactement la m me s quence (dans l'orientation oppos e) sur l'autre brin de l'h lice de l'ADN. Par cons quent, un m canisme simple permet au mod le existant de m thylation de l'ADN d' tre h rit directement par les brins d'ADN filles. Une enzyme appel e m thyl transf rase d'entretien agit pr f rentiellement sur les s quences CG qui sont appari es une s quence CG d j m thyl e. Par cons quent, le mod le de m thylation de l'ADN sur le brin d'ADN parental sert de mod le pour la m thylation du brin d'ADN fille, ce qui fait que ce mod le est h rit directement apr s la r plication de l'ADN (Figure 7 44). Bien que les mod les de m thylation de l'ADN puissent tre maintenus dans les cellules diff renci es par le m canisme illustr la figure 7-44, les mod les de m thylation sont dynamiques au cours du d veloppement des mammif res. Peu de temps apr s la f condation, il y a une vague de d m thylation l' chelle du g nome, lorsque la grande majorit des groupes m thyles sont perdus de l'ADN. Cette d m thylation peut se produire soit par la suppression de l'activit de maintenance de l'ADN m thyl transf rase, entra nant la perte passive de groupes m thyles chaque cycle de r plication de l'ADN, soit par enzymes de d m thylation (voir ci-dessous). Plus tard dans le d veloppement, de nouveaux mod les de m thylation sont tablis par plusieurs m thyltransf rases d'ADN de novo qui sont dirig es vers l'ADN par s quence Figure 7 43 La formation de la 5-m thylcytosine se produit par m thylation d'une base de cytosine dans la double h lice de l'ADN. chez les vert br s, cet v nement est largement confin certains nucl otides de cytosine (C) situ s dans la s quence CG. Les s quences CG sont parfois d sign es comme des s quences CpG, o le p indique une liaison phosphate pour la distinguer d'une paire de bases CG. dans ce chapitre, nous continuerons d'utiliser la nomenclature plus simple CG pour indiquer ce dinucl otide. Figure 7 44 Comment les mod les de m thylation de l'ADN sont fid lement h rit s. dans l'ADN des vert br s, une grande fraction des nucl otides de cytosine dans la s quence CG est m thyl e (voir figure 7 43). En raison de l'existence d'une enzyme m thylante dirig e vers le m thyle (la m thyl transf rase de maintenance), une fois qu'un mod le de m thylation de l'ADN est tabli, ce mod le de m thylation est h rit dans la descendance de l'ADN, comme indiqu . prot ines sp cifiques de liaison l'ADN. Une fois que les nouveaux mod les de m thylation sont tablis, ils peuvent tre propag s par des cycles de r plication de l'ADN par les m thyltransf rases de maintenance. La m thylation de l'ADN a plusieurs utilisations dans les cellules de vert br s. Un r le tr s important est de travailler en conjonction avec d'autres m canismes de contr le de l'expression g nique pour tablir une forme particuli rement efficace de r pression g nique. Cette combinaison de m canismes garantit que les g nes eucaryotes inutiles peuvent tre r prim s des degr s tr s lev s. Par exemple, la vitesse laquelle un g ne de vert br est transcrit peut varier de 106 fois d'un tissu un autre. Les g nes non exprim s des vert br s sont beaucoup moins fuyants en termes de transcription que les g nes bact riens, dans lesquels les plus grandes diff rences connues dans les taux de transcription entre les tats g n tiques exprim s et non exprim s sont d'environ 1000 fois. La m thylation de l'ADN aide r primer la transcription de plusieurs fa ons. Les groupes m thyles sur les cytosines m thyl es se trouvent dans le sillon majeur de l'ADN et interf rent directement avec la liaison des prot ines (r gulateurs de transcription ainsi que les facteurs de transcription g n raux) n cessaires l'initiation de la transcription. De plus, la cellule contient un r pertoire de prot ines qui se lient sp cifiquement l'ADN m thyl . Les mieux caract ris s d'entre eux s'associent des enzymes modifiant les histones, conduisant un tat de chromatine r pressif o la structure de la chromatine et la m thylation de l'ADN agissent en synergie (Figure 7-45). L'une des raisons de l'importance de la m thylation de l'ADN pour l'homme est l'implication g n ralis e de mod les de m thylation de l'ADN incorrects dans la progression du cancer (voir le chapitre 20). Les les riches en CG sont associ es de nombreux g nes chez les mammif res En raison de la fa on dont les enzymes de r paration de l'ADN fonctionnent, les nucl otides C m thyl s dans le g nome des vert br s ont tendance tre limin s au cours de l' volution. La d samination accidentelle d'un C non m thyl donne naissance U (voir Figure 5-38), qui n'est normalement pas pr sent dans l'ADN et est donc facilement reconnu par l'enzyme de r paration de l'ADN, l'uracile ADN glycosylase, excis e, puis remplac e par un C (comme discut au chapitre 5). Mais la d samination accidentelle d'un 5-m thyle C ne p
Biologie moléculaire de la cellule	eut pas tre r par e de cette mani re, car le produit de d samination est un T et est donc indiscernable des autres nucl otides T non mutants de l'ADN. Bien qu'il existe un syst me de r paration sp cial pour liminer ces nucl otides T mutants, de nombreuses d saminations chappent la d tection, de sorte que les nucl otides C du g nome qui sont m thyl s ont tendance muter en T au cours de l' volution. 406 Chapitre 7 : Contr le de l'expression des g nesFigure 7 45 De multiples m canismes contribuent la stabilit des g nes repression.in cet exemple sch matique, les prot ines de lecture et d' criture d'histones (discut es au chapitre 4), sous la direction des r gulateurs de transcription, tablissent une forme r pressive de la chromatine. Une DnA m thylase de novo est attir e par le lecteur d'histones et m thyle les cytosines voisines de l'ADN, qui sont, leur tour, li es par les prot ines de liaison m thylique de l'ADN DnA. Au cours de la r plication de l'ADN DnA, certaines des histones modifi es (point bleu) seront h rit es par un chromosome fille, d'autres par l'autre, et dans chaque fille, elles peuvent induire la reconstruction du m me mod le de modifications de la chromatine (discut e au chapitre 4). Dans le m me temps, le m canisme illustr la figure 7-44 fera en sorte que les deux chromosomes filles h ritent du m me mod le de m thylation. dans les cas o la m thylation de l'ADN stimule l'activit de l' crivain d'histones, les deux m canismes d'h r dit se renforceront mutuellement. ce sch ma peut rendre compte de l'h r dit par les cellules filles des modifications de l'histone et de l'ADN DnA. Cela peut galement expliquer la tendance de certaines modifications de la chromatine se propager le long d'un chromosome (voir figure 4-44). Au cours de l' volution, plus de trois CG sur quatre ont t perdus de cette mani re, laissant les vert br s avec une carence remarquable de ce dinucl otide. Les s quences CG restantes sont tr s in galement r parties dans le g nome ; ils sont pr sents 10 fois leur densit moyenne dans des r gions s lectionn es, appel es lots CG, qui ont une longueur moyenne de 1000 paires de nucl otides. Le g nome humain contient environ 20 000 lots CG et ils incluent g n ralement des promoteurs de g nes. Par exemple, 60 % des g nes codant pour des prot ines humaines ont des promoteurs int gr s dans des lots CG et ceux-ci incluent pratiquement tous les promoteurs des g nes dits de m nage ces g nes qui codent pour les nombreuses prot ines essentielles la viabilit cellulaire et qui sont donc exprim s dans presque toutes les cellules (Figure 7-46). Au cours de l' volution, les lots CG ont t pargn s par le taux de mutation acc l r des s quences CG en vrac parce qu'elles sont rest es non m thyl es dans la lign e germinale (Figure 7-47). Les lots CG restent galement non m thyl s dans la plupart des tissus somatiques, que le g ne associ soit exprim ou non. L' tat non m thyl est maintenu par des prot ines de liaison l'ADN sp cifiques la s quence, dont beaucoup de s quences cis-r gulatrices contiennent un CG. En se liant ces s quences, qui sont r parties sur des lots CG, ils prot gent l'ADN des m thyltransf rases. Ces prot ines recrutent galement des ADN d m thylases, qui convertissent le 5-m thyl C en hydroxy-m thyl C, dont 10 000 paires de nucl otides sont ensuite remplac es par le C soit par la r paration de l'ADN (voir Figure 5-41A), soit, passivement, par plusieurs cycles de r plication de l'ADN. Les lots de CG non m thyl s ont plusieurs propri t s qui les rendent particuli rement adapt s aux promoteurs. Par exemple, certaines des m mes prot ines qui se lient aux lots CG et les prot gent de la m thylation recrutent des enzymes modifiant les histones qui rendent les lots particuli rement favorables aux promoteurs . En cons quence, l'ARN polym rase se trouve souvent li e des promoteurs dans les lots CG, m me lorsque le g ne associ n'est pas activement transcrit. Aux lots CG non m thyl s, l' quilibre entre la polym rase et l'assemblage des nucl osomes penche donc en faveur de la premi re. Des tapes suppl mentaires sont n cessaires pour pousser la polym rase li e transcrire le g ne adjacent, et celles-ci sont dirig es par des r gulateurs de transcription qui se lient aux s quences cis-r gulatrices de l'ADN (souvent bien en amont des lots CG). Ces r gulateurs servent lib rer la polym rase avec les facteurs d'allongement appropri s (voir les figures 7 21C et D). L'empreinte g nomique est bas e sur la m thylation de l'ADN Les cellules de mammif res sont diplo des, contenant un ensemble de g nes h rit s du p re et un ensemble de g nes de la m re. L'expression d'une petite minorit de g nes d pend du fait qu'ils aient t h rit s de la m re ou du p re : lorsque la copie du g ne h rit du p re est active, la copie du g ne h rit de la m re est muette, ou vice versa. Ce ph nom ne est appel empreinte g nomique. Environ 300 g nes sont impri
Biologie moléculaire de la cellule	m s chez l'homme. Parce qu'une seule copie d'un g ne imprim est exprim e, l'empreinte peut d masquer des mutations qui seraient normalement couvertes par l'autre copie fonctionnelle. Par exemple, le syndrome d'Angelman, un trouble du syst me nerveux chez l'homme qui entra ne une r duction des capacit s mentales et de graves troubles de la parole, r sulte d'une d l tion d'un g ne sur un homologue chromosomique et de l'inactivation par empreinte du g ne intact sur l'autre homologue. Le g ne du facteur de croissance analogue l'insuline 2 (Igf 2) chez la souris fournit un exemple bien tudi d'empreinte. Les souris qui n'expriment pas du tout l'Igf 2 naissent la moiti de la taille des souris normales. Cependant, seule la copie paternelle de l'Igf 2 est transcrite, et seule cette copie du g ne compte pour le ph notype. En cons quence, les souris avec un g ne Igf 2 mut d'origine paternelle sont rabougries, tandis que les souris avec un g ne Igf 2 mut d'origine maternelle sont normales. Figure 7 47 Un m canisme pour expliquer la fois la d ficience globale marqu e des s quences CG et leur regroupement en lots CG dans les g nomes des vert br s. Des lignes blanches marquent l'emplacement des dinucl otides CG dans les s quences DnA, tandis que les cercles rouges indiquent la pr sence d'un groupe m thyle sur le dinucl otide CG. Les s quences CG qui se trouvent dans les s quences r gulatrices des g nes transcrits dans les cellules germinales ne sont pas m thyl es et ont donc tendance tre conserv es dans l' volution. Les s quences CG m thyl es, en revanche, ont tendance tre perdues par d samination de 5-m thyl C en t, moins que la s quence CG ne soit critique pour la survie. Figure 7 46 Les lots CG entourant le promoteur dans trois g nes d'entretien domestique de mammif re. Les cases jaunes indiquent l' tendue de chaque le. Comme pour la plupart des g nes chez les mammif res, les exons (rouge fonc ) sont tr s courts par rapport aux introns (rouge clair). (Adapt de A.p. Bird, Trends Genet. 3:342-347, 1987. avec la permission d'Elsevier.) m thylation de la plupart des s quences CG dans la lign e germinale plusieurs millions d'ann es d' volution ARNm ARNM LES DEUX PARENTS EXPRIMENT LE M ME ALL LE DU G NE All le imprim du g ne Aall le exprim du g ne Cellule somatique Cellule somatique LIMINATION DE L'EMPREINTE DANS LES CELLULES GERMINALES, SUIVIE DE LA M IOSE EMPREINTE FEMELLE EMPREINTE M LE TABLIE OVULES TABLIS SPERMATOZO DES LA PROG NITURE DIFF RENT PAR L'ALL LE DU G NE AQUI EST EXPRIM ARNm Chromosome de l'ARNm h rit du p re Figure 7 48 Empreinte dans la souris. La partie sup rieure de la figure montre une paire de chromosomes homologues dans les cellules somatiques de deux souris adultes, un m le et une femelle. Dans cet exemple, les deux souris ont h rit de l'homologue sup rieur de leur p re et de l'homologue inf rieur de leur m re, et la copie paternelle d'un g ne sujet l'empreinte (indiqu e en orange) est m thyl e, emp chant son expression. La copie d'origine maternelle du m me g ne (jaune) est exprim e. Le reste de la figure montre le r sultat d'un croisement entre ces deux souris. Au cours de la formation des cellules germinales, mais avant la m iose, les empreintes sont effac es puis, beaucoup plus tard dans le d veloppement des cellules germinales, elles sont r impos es selon un motif sp cifique au sexe (partie centrale de la figure). dans les ufs produits partir de la femelle, aucun des deux all les du g ne A n'est m thyl . dans les spermatozo des du m le, les deux all les du g ne A sont m thyl s. Au bas de la figure sont pr sent s deux des motifs d'empreinte possibles h rit s par les souris de prog niture ; La souris de gauche a le m me motif d'impression que chacun des parents, tandis que la souris de droite a le motif oppos . si les deux all les du g ne A sont distincts, ces diff rents mod les d'empreinte peuvent provoquer des diff rences ph notypiques chez les souris de descendance, m me si elles portent exactement les m mes s quences DnA des deux all les du g ne A. L'empreinte constitue une exception importante au comportement g n tique classique, et on pense que plusieurs centaines de g nes de souris sont affect s de cette mani re. cependant, la majorit des g nes de souris ne sont pas imprim s, et donc les r gles de l'h r dit mend lienne s'appliquent la majeure partie du g nome de la souris. Dans l'embryon pr coce, les g nes sujets l'empreinte sont marqu s par m thylation selon qu'ils proviennent d'un chromosome de spermatozo de ou d'un ovule. De cette fa on, la m thylation de l'ADN est utilis e comme une marque pour distinguer deux copies d'un g ne qui pourraient tre identiques (Figure 7-48). Parce que les g nes imprim s sont en quelque sorte prot g s de la vague de d m thylation qui a lieu peu de temps apr s la f condation (voir pp. 404-405), cette marque permet aux cellules somatiques de se souvenir de l'origine parentale de chacune des deux copies du
Biologie moléculaire de la cellule	g ne et de r guler leur expression en cons quence. Dans la plupart des cas, l'empreinte m thyle r duit au silence l'expression des g nes voisins. Dans certains cas, cependant, il peut activer l'expression d'un g ne. Dans le cas de l'Igf 2, par exemple, la m thylation d'un l ment isolant sur le chromosome d'origine paternelle bloque sa fonction et permet des s quences cis-r gulatrices distantes d'activer la transcription du g ne Igf 2. Sur le chromosome d'origine maternelle, l'isolant n'est pas m thyl et le g ne Igf 2 n'est donc pas transcrit (Figure 7 49A). D'autres cas d'empreinte impliquent de longs ARN non codants, qui sont d finis comme des mol cules d'ARN de plus de 200 nucl otides de longueur qui ne codent pas pour des prot ines. Nous abordons les ARNlnc de mani re g n rale la fin de ce chapitre ; ici, nous nous concentrons sur le r le d'un ARNlnc sp cifique dans l'empreinte. Dans le cas du g ne Kcnq1, qui code pour un canal calcique voltage-d pendant n cessaire au bon fonctionnement cardiaque, l'ARNlnc est fabriqu partir de l'all le paternel (qui n'est pas m thyl ) mais il n'est pas lib r par l'ARN polym rase, restant plut t son site de synth se sur la matrice d'ADN. Cet ARN recrute son tour des enzymes modifiant les histones et m thylant l'ADN qui dirigent la formation de la chromatine r pressive, qui r duit au silence le g ne codant pour la prot ine associ au chromosome d'origine paternelle (Figure 7-49B). Le g ne d'origine maternelle, en revanche, est immunis contre ces effets car la m thylation sp cifique pr sente par l'empreinte bloque la synth se de l'ARNlnc mais permet la transcription du g ne codant pour la prot ine. Comme Igf 2, la sp cificit de l'empreinte Kcnq1 provient des mod les de m thylation h rit s ; La diff rence r side dans la fa on dont ces motifs provoquent l'expression diff rentielle du g ne imprim . La raison pour laquelle l'impr gnation devrait exister est un myst re. Chez les vert br s, il est limit aux mammif res placentaires, et de nombreux g nes imprim s sont impliqu s dans le d veloppement f tal. L'une d'entre elles est que l'empreinte refl te un terrain d'entente dans la lutte volutive entre les m les pour produire une prog niture plus grande et les femelles pour limiter la taille de la prog niture. Quel que soit son objectif, l'empreinte fournit des preuves surprenantes que des caract ristiques de l'ADN autres que sa s quence de nucl otides peuvent tre h rit es. Nous avons vu que la m thylation de l'ADN et certains types de structure de la chromatine peuvent tre h r ditaires, pr servant les mod les d'expression g nique travers les g n rations cellulaires. L'exemple le plus frappant de cet effet se produit peut- tre chez les mammif res, chez qui une alt ration de la structure chromatinienne d'un chromosome entier peut moduler les niveaux d'expression de la plupart des g nes sur ce chromosome. Figure 7 49 M canismes d'empreinte. Sur les chromosomes h rit s de la femelle, une prot ine appel e CtCf se lie un isolant (voir figure 7-24), bloquant la communication entre les s quences cis-r gulatrices (vert) et le g ne Igf2 (orange). L'Igf2 n'est donc pas exprim partir du chromosome h rit de la m re. En raison de l'empreinte, l'isolant sur le chromosome d riv de l'homme est m thyl (cercles rouges) ; cela inactive l'isolant en bloquant la liaison de la prot ine CtCf, et permet aux s quences cis-r gulatrices d'activer la transcription du g ne Igf2. Dans d'autres exemples d'empreinte, la m thylation bloque simplement l'expression des g nes en interf rant avec la liaison des prot ines n cessaires la transcription d'un g ne. empreinte du g ne Kcnq1 de la souris. Sur le chromosome d'origine maternelle, la synth se de lncrnA est bloqu e par la m thylation de l'ADN (cercles rouges) et le g ne Kcnq1 est exprim . Sur le chromosome d riv du p re, lncrnA est synth tis , reste en place et, en dirigeant les alt rations de la structure de la chromatine, bloque l'expression du g ne Kcnq1. Bien qu'elles se lient directement lncrnA, les enzymes modifiant les histones sont susceptibles d' tre recrut es indirectement, par le biais de prot ines suppl mentaires. Les m les et les femelles diff rent par leurs chromosomes sexuels. Les femmes ont deux chromosomes X, tandis que les hommes ont un chromosome X et un chromosome Y. En cons quence, les cellules femelles contiennent deux fois plus de copies de g nes du chromosome X que les cellules masculines. Chez les mammif res, le contenu des g nes des chromosomes sexuels X et Y diff re radicalement : le chromosome X est grand et contient plus d'un millier de g nes, tandis que le chromosome Y est petit et contient moins de 100 g nes. Les mammif res ont mis au point un m canisme de compensation de dosage pour galiser le dosage des produits g niques du chromosome X entre les m les et les femelles. Le rapport correct entre le chromosome X et les produits g niques auto-certains (chromosomes non sexuels) est soigneusem
Biologie moléculaire de la cellule	ent contr l , et les mutations qui interf rent avec cette compensation posologique sont g n ralement mortelles. Les mammif res obtiennent une compensation posologique par l'inactivation transcriptionnelle de l'un des deux chromosomes X dans les cellules somatiques femelles, un processus connu sous le nom d'inactivation X. la suite de l'inactivation de l'X, deux chromosomes X peuvent coexister dans le m me noyau, expos s la m me transcription diffusible r gulateurs, mais diff rent enti rement dans leur expression. Au d but du d veloppement d'un embryon f minin, lorsqu'il est constitu de quelques centaines de cellules, l'un des deux chromosomes X de chaque cellule devient fortement condens en un type d'h t rochromatine. Le choix initial du chromosome X inactiver, celui h rit de la m re (Xm) ou celui h rit du p re (Xp), est al atoire. Une fois que Xp ou Xm a t inactiv , il reste silencieux tout au long de toutes les divisions cellulaires ult rieures de cette cellule et de sa prog niture, indiquant que l' tat inactif est fid lement maintenu travers de nombreux cycles de r plication de l'ADN et de mitose. Parce que l'inactivation de l'X est al atoire et a lieu apr s que plusieurs centaines de cellules se sont d j form es dans l'embryon, chaque femelle est une mosa que de groupes clonaux de cellules dans lesquelles Xp ou Xm est r duit au silence (Figure 7 50). Ces groupes clonaux sont Xp Xm Xp Xm Xp Xm CONDENSATION D'UN CHROMOSOME X CHOISI AU HASARD H R DIT DIRECTE DU MOD LE DE CONDENSATION CHROMOSOMIQUE H R DIT DIRECTE DU MOD LE DE CONDENSATION CHROMOSOMIQUE Figure 7 50 Inactivation de l'X. l'h r dit clonale chez les mammif res femelles d'un seul Xm actif dans ce clone seul Xp actif dans ce clone condens , inactif Chromosome X. Figure 7 51 Cellules photor ceptrices de la r tine d'une souris femelle montrant des motifs d'inactivation du chromosome X. l'aide de techniques de g nie g n tique (d crites au chapitre 8), la lign e germinale d'une souris a t modifi e de sorte qu'une copie du chromosome X (si elle est active) forme une prot ine fluorescente verte et l'autre une prot ine fluorescente rouge. Les deux prot ines se concentrent dans le noyau et, dans le champ de cellules montr ici, il est clair qu'un seul des deux chromosomes X est actif dans chaque cellule. (D'apr s H. Wu et al., Neuron 81:103 119, 2014. avec la permission d'Elsevier.) distribu es en petits groupes chez l'animal adulte parce que les cellules s urs ont tendance rester proches les unes des autres pendant les derniers stades du d veloppement (Figure 7 51). Par exemple, l'inactivation du chromosome X provoque la coloration orange et noire du pelage en caille de tortue de certaines chattes. Chez ces chats, un chromosome X porte un g ne qui produit une couleur de poil orange, et l'autre chromosome X porte un all le du m me g ne qui donne une couleur de poil noir ; c'est l'inactivation al atoire de l'X qui produit des taches de cellules de deux couleurs distinctes. En revanche, les chats m les de ce stock g n tique sont soit orange uni, soit noir solide, selon le chromosome X qu'ils h ritent de leur m re. Bien que l'inactivation du chromosome X soit maintenue sur des milliers de divisions cellulaires, elle est invers e lors de la formation des cellules germinales, de sorte que tous les ovocytes haplo des contiennent un chromosome X actif et peuvent exprimer des produits g niques li s l'X. Comment un chromosome entier est-il inactiv transcriptionnellement ? L'inactivation du chromosome X est initi e et se propage partir d'un seul site pr s du milieu du chromosome X, le centre d'inactivation X (XIC). Dans le XIC se trouve un ARNlnc transcrit de 20 000 nucl otides (appel Xist), qui est exprim uniquement partir du chromosome X inactif. L'ARN Xist se propage partir du XIC sur l'ensemble du chromosome et dirige le silen age g nique. Bien que nous ne sachions pas exactement comment cela se fait, il s'agit probablement du recrutement d'enzymes modifiant les histones et d'autres prot ines pour former une forme r pressive de chromatine analogue celle de la figure 7-45. Curieusement, environ 10 % des g nes du chromosome X (y compris Xist lui-m me) chappent ce silence et restent actifs. La propagation de l'ARN Xist le long du chromosome X ne se d roule pas de mani re lin aire le long de l'ADN. Au contraire, en commen ant par son site de synth se, il est d'abord transmis la base des boucles d'ADN qui composent le chromosome ; ces raccourcis expliquent comment Xist peut se propager rapidement, par un m canisme de main sur main , le long du chromosome X une fois que le processus d'inactivation commence (Figure 7-52). Cela aide galement expliquer pourquoi l'inactivation ne se propage pas l'autre chromosome X actif. L'empreinte et l'inactivation du chromosome X sont des exemples d'expression g nique monoall lique, o dans un g nome diplo de, une seule des deux copies d'un g ne est exprim e. En plus des
Biologie moléculaire de la cellule	quelque 1000 g nes sur le chromosome X et des quelque 300 g nes qui sont imprim s, il existe 1000 2000 autres g nes humains qui pr sentent une expression monoall lique. Comme pour l'inactivation du chromosome X (mais contrairement l'empreinte), le choix de la copie du g ne exprimer et de celle qui doit tre r duite au silence semble souvent al atoire. Pourtant, une fois le choix fait, il peut persister pour de nombreuses divisions cellulaires. Parce que le choix est souvent fait relativement tard dans le d veloppement, les cellules du m me tissu chez un m me individu peuvent exprimer diff rentes copies d'un g ne donn . En d'autres termes, les tissus somatiques sont souvent des mosa ques, o diff rents clones de cellules ont des mod les d'expression g nique subtilement diff rents. Les m canismes responsables de ce type d'expression monoall lique ne sont pas connus en d tail et son objectif g n ral, le cas ch ant, est mal compris. Plusieurs m canismes diff rents peuvent contribuer un tel h ritage pig n tique, comme nous l'expliquons ci-dessous. Les m canismes pig n tiques garantissent que des mod les stables d'expression g nique peuvent tre transmis aux cellules filles Comme nous l'avons vu, une fois qu'une cellule d'un organisme se diff rencie en un type de cellule particulier, elle reste g n ralement sp cialis e de cette mani re ; S'il se divise, ses filles h ritent du m me caract re sp cialis . Peut- tre que la fa on la plus simple pour une cellule de se souvenir de la transcription de l'ARN Xist L'ARN Xist se propage L'ARN Xist se lie aux histones en modifiant partir d'un chromosome X main sur main et continue de propager son identit est par le biais d'une boucle de r troaction positive dans laquelle un r gulateur de transcription cl active, directement ou indirectement, la transcription de son propre g ne (voir Figure 7-39). Les boucles de r troaction positive imbriqu es du type illustr la figure 7-37 offrent une plus grande stabilit en tamponnant le circuit contre les fluctuations du niveau d'un r gulateur de transcription. Parce que les r gulateurs de transcription sont synth tis s dans le cytosol et diffusent dans tout le noyau, les boucles de r troaction bas es sur ce m canisme affecteront les deux copies d'un g ne dans une cellule diplo de. Cependant, comme nous l'avons vu dans cette section, le profil d'expression d'un g ne sur un chromosome peut diff rer de la copie du m me g ne sur l'autre chromosome (comme dans l'inactivation du chromosome X ou dans l'empreinte), et de telles diff rences peuvent galement tre h rit es par de nombreuses divisions cellulaires. La capacit d'une cellule fille conserver une m moire des mod les d'expression g nique pr sents dans la cellule m re est un exemple d'h r dit pig n tique : une alt ration h r ditaire du ph notype d'une cellule ou d'un organisme qui ne r sulte pas de changements dans la s quence nucl otidique de l'ADN (discut e au chapitre 4). (Malheureusement, le terme pig n tique est parfois utilis pour d signer toutes les modifications covalentes des histones et de l'ADN, qu'elles s'auto-propagent ou non ; beaucoup de ces modifications sont effac es chaque fois qu'une cellule se divise et ne g n rent pas de m moire cellulaire.) Dans la figure 7-53, nous comparons deux m canismes pig n tiques d'autopropagation qui fonctionnent dans le cis, affectant une seule copie chromosomique, et deux m canismes d'autopropagation qui fonctionnent dans le trans, affectant les deux copies chromosomiques d'un g ne. Les cellules peuvent combiner ces m canismes pour s'assurer que les mod les d'expression des g nes sont maintenus et h rit s avec pr cision et fiabilit , sur une p riode allant jusqu' cent ans ou plus, dans notre propre cas. Nous pouvons avoir une id e de la pr valence des changements pig n tiques en comparant des jumeaux identiques. Leurs g nomes ont la m me s quence de nucl otides et, videmment, de nombreuses caract ristiques des jumeaux identiques, telles que leur apparence, sont fortement d termin es par les s quences g nomiques dont ils h ritent. Cependant, lorsque l'on compare l'expression de leurs g nes, la modification des histones et les mod les de m thylation de l'ADN, de nombreuses diff rences sont observ es. Parce que ces diff rences sont grossi rement corr l es non seulement avec l' ge, mais aussi avec le temps que les jumeaux ont pass loin l'un de l'autre, il a t propos que certaines de ces diff rences sont h r ditaires d'une cellule l'autre et sont le r sultat de facteurs environnementaux. Bien que ces tudes n'en soient qu' leurs d buts, l'id e que les v nements environnementaux puissent tre enregistr s de fa on permanente comme des changements pig n tiques dans nos cellules est fascinante et pr sente un d fi important pour la prochaine g n ration de scientifiques en biologie. Figure 7 52 Inactivation du chromosome X de mammif re. L'inactivation du chromosome X commence par la synth se de l'ARN
Biologie moléculaire de la cellule	Xist (transcrit sp cifique de l'inactivation X) partir du locus XiC (centre d'inactivation X) et se d place vers l'ext rieur jusqu'aux extr mit s chromosomiques. Selon le mod le d crit ici, le long ( 20 000 nucl otides) Xist rnA a de nombreux sites de liaison de faible affinit pour les composants structurels des chromosomes et se propage en rel chant son emprise sur une partie du chromosome tout en saisissant une autre. la synth se continue de Xist du centre du chromosome le conduit vers les extr mit s. Comme indiqu , Xist rnA ne se d place pas lin airement le long de l'ADN chromosomique, mais se d place d'abord la base des boucles chromosomiques. il a t propos que les parties de l'ADN chromosomique l'extr mit de longues boucles contiennent les 10% de g nes qui chappent l'inactivation du chromosome X. Les cellules eucaryotes peuvent utiliser des formes h r ditaires de m thylation de l'ADN et des tats h r ditaires de condensation de la chromatine comme m canismes suppl mentaires pour g n rer la m moire cellulaire des mod les d'expression g nique. Un cas particuli rement dramatique impliquant la condensation de la chromatine est l'inactivation d'un chromosome X entier chez les mammif res femelles. La m thylation de l'ADN est l'origine du ph nom ne d'empreinte g nomique chez les mammif res, dans lequel l'expression d'un g ne d pend du fait qu'il ait t h rit de la m re ou du p re. En principe, chaque tape n cessaire au processus d'expression des g nes peut tre contr l e. En effet, on peut trouver des exemples de chaque type de r gulation, et de nombreux g nes sont r gul s par de multiples m canismes. Comme nous l'avons vu, les contr les sur l'initiation de la transcription des g nes sont une forme critique de r gulation pour tous les g nes. Mais d'autres contr les peuvent agir plus tard dans la voie de l'ADN la prot ine pour moduler la quantit de produit g nique qui est fabriqu e et, dans certains cas, pour d terminer la s quence exacte d'acides amin s du produit prot ique. Ces contr les post-transcriptionnels, qui op rent apr s que l'ARN polym rase s'est li e au promoteur du g ne et a commenc la synth se de l'ARN, sont cruciaux pour la r gulation de nombreux g nes. Dans les sections suivantes, nous consid rons les vari t s de r gulation post-transcriptionnelle dans l'ordre temporel, en fonction de la s quence d' v nements qu'une mol cule d'ARN peut conna tre apr s le d but de sa transcription (Figure 7 54). Figure 7 53 Quatre m canismes distincts qui peuvent produire une forme pig n tique d'h r dit dans un organisme. (A) les m canismes pig n tiques qui agissent chez cis. Comme nous l'avons vu dans ce chapitre, une m thylase d'entretien peut propager des mod les sp cifiques de m thylation de la cytosine (voir figure 7-44). Comme nous l'avons vu au chapitre 4, une enzyme modifiant les histones qui r plique la m me modification qui l'attire vers la chromatine peut entra ner l'auto-propagation de la modification (voir figure 4-44). (B) les m canismes pig n tiques qui agissent dans les boucles de r troaction positives, form es par des r gulateurs transcriptionnels, se retrouvent chez toutes les esp ces et sont probablement la forme la plus courante de m moire cellulaire. Comme nous l'avons vu au chapitre 3, certaines prot ines peuvent former des prions qui s'auto-propagent (figures 3 33). Si ces prot ines sont impliqu es dans l'expression des g nes, elles peuvent transmettre des mod les d'expression des g nes aux cellules filles. Figure 7 54 Contr les post-transcriptionnels de l'expression des g nes. Le taux de synth se final d'une prot ine peut, en principe, tre contr l l'une des tapes num r es en lettres majuscules. en outre, l' pissage de l'ARN, l' dition de l'ARN et le recodage de la traduction peuvent galement modifier la s quence des acides amin s dans une prot ine, ce qui permet la cellule de produire plus d'une variante prot ique partir du m me g ne. Seules quelques-unes des tapes d crites ici sont susceptibles d' tre critiques pour la r gulation d'une prot ine particuli re. transcription L'att nuation provoque l'arr t pr matur de certaines mol cules d'ARN On sait depuis longtemps que l'expression de certains g nes est inhib e par l'arr t pr matur de la transcription, un ph nom ne appel att nuation de la transcription. Dans certains de ces cas, la cha ne d'ARN naissante adopte une structure qui la fait interagir avec l'ARN polym rase de mani re interrompre sa transcription. Lorsque le produit g nique est requis, les prot ines r gulatrices se lient la cha ne d'ARN naissante et liminent l'att nuation, permettant la transcription d'une mol cule d'ARN compl te. Un exemple bien tudi d'att nuation de la transcription se produit au cours du cycle de vie du VIH, le virus de l'immunod ficience humaine qui est l'agent causal du syndrome d'immunod ficience acquise, ou sida. Une fois que le g nome du VIH a t int gr dans le g nome de l'h te, l'ADN viral
Biologie moléculaire de la cellule	est transcrit par la ARN polym rase II (voir Figure 5 62). Cependant, cette polym rase termine g n ralement la transcription apr s avoir synth tis les transcrits de plusieurs centaines de nucl otides et ne parvient donc pas transcrire efficacement l'ensemble du g nome viral. Lorsque les conditions de croissance virale sont optimales, une prot ine cod e par le virus appel e Tat, qui se lie une structure sp cifique de l'ARN naissant qui contient une base bomb e , emp che cette fin pr matur e (voir Figure 6-89). Une fois li cette structure d'ARN sp cifique (appel e TAR), Tat assemble plusieurs prot ines de la cellule h te qui permettent l'ARN polym rase de continuer transcrire. Le r le normal d'au moins certaines de ces prot ines est d'emp cher la pause et l'arr t pr matur de l'ARN polym rase lorsqu'elle transcrit des g nes cellulaires normaux. Ainsi, un m canisme cellulaire normal a apparemment t d tourn par le VIH pour permettre la transcription de son g nome d' tre contr l e par une seule prot ine virale. les riboswitches repr sentent probablement des formes anciennes de contr le des g nes Dans le chapitre 6, nous avons discut de l'id e que, avant l'apparition des cellules modernes sur Terre, l'ARN jouait la fois le r le de l'ADN et des prot ines, stockant la fois l'information h r ditaire et catalysant les r actions chimiques (voir pp. 362-366). La d couverte des riboswitches montre que l'ARN peut galement former des dispositifs de contr le. Les riboswitches sont de courtes s quences d'ARN qui changent de conformation en se liant de petites mol cules, telles que les m tabolites. Chaque riboswitch reconna t une petite mol cule sp cifique et le changement de conformation qui en r sulte est utilis pour r guler l'expression des g nes. Les riboswitches sont souvent situ s pr s de l'extr mit 5 des ARNm, et ils se replient pendant que l'ARNm est synth tis , bloquant ou permettant la progression de l'ARN polym rase selon que la petite mol cule r gulatrice est li e ou non (Figure 7-55). Les riboswitches sont particuli rement fr quents chez les bact ries, dans lesquelles ils d tectent les petits m tabolites cl s de la cellule et ajustent l'expression des g nes en cons quence. Leur caract ristique la plus remarquable est peut- tre la sp cificit et l'affinit lev es avec lesquelles chacun ne reconna t que la petite mol cule appropri e ; dans de nombreux cas, chaque caract ristique chimique de la petite mol cule est lue par l'ARN (Figure 7-55C). De plus, les affinit s de liaison observ es sont aussi troites que celles g n ralement observ es entre les petites mol cules et les prot ines. Figure 7 55 Un riboswitch qui r pond la guanine. (A) dans cet exemple de bact ries, le riboswitch contr le l'expression des g nes biosynth tiques de la purine. lorsque les niveaux de guanine dans les cellules sont faibles, une ARN polym rase allong e transcrit les g nes biosynth tiques de la purine, et les enzymes n cessaires la synth se de la guanine sont donc exprim es. (B) lorsque la guanine est abondante, elle se lie au riboswitch, ce qui lui fait subir un changement de conformation qui force l'ARN polym rase terminer la transcription (voir figure 6-11). (C) Guanine (rouge) li e au riboswitch. Seuls les nucl otides qui forment la poche de liaison la guanine sont repr sent s. Il existe de nombreux autres ribocommutateurs, y compris ceux qui reconnaissent la S-ad nosylm thionine, la coenzyme B12, la mononucl otide de flavine, l'ad nine, la lysine et la glycine. (Adapt de M. Mandal et r.r. Breaker, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5:451 463, 2004. avec la permission de Macmillan publishers ltd ; et C.K. vanderpool et S. Gottesman, Mol. Microbiol. 54:1076 1089, 2004. avec la permission de Blackwell publishing.) Figure 7 56 Cinq mod les d' pissage alternatif de l'ARN. dans chaque cas, un seul type de transcrit d'ARN est piss de deux mani res alternatives pour produire deux ARNm distincts (1 et 2). les cases bleu fonc marquent les s quences d'exons 1 qui sont conserv es dans les deux ARNm. les cases bleu clair marquent les s quences possibles de l'exon 2 qui ne sont incluses que dans un seul des ARNm. Les cases sont reli es par des lignes rouges pour indiquer o les s quences Intron (jaunes) sont supprim es. (Adapt de h. Keren et al. Nat. Rev. Genet. 11:345 355, 2010. avec la permission de Macmillan publishers ltd.) Les riboswitches sont peut- tre les exemples les plus conomiques de dispositifs de contr le g n tique, dans la mesure o ils contournent compl tement le besoin de prot ines r gulatrices. Dans l'exemple illustr la figure 7-55, le riboswitch contr le l' longation de la transcription, mais il peut galement r guler d'autres tapes de l'expression des g nes, comme nous le verrons plus loin 1 dans ce chapitre. De toute vidence, des dispositifs de contr le g nique hautement sophistiqu s peuvent tre fabriqu s partir de courtes s quences d'ARN, un fait qui soutient l'hypoth se d'un
Biologie moléculaire de la cellule	monde de l'ARN pr coce. 1 L' pissage alternatif de l'ARN peut produire diff rentes formes d'une prot ine 2 partir du m me g ne Comme nous l'avons vu au chapitre 6 (voir la figure 6-26), l' pissage de l'ARN raccourcit les transcrits de nombreux g nes eucaryotes en supprimant les s quences d'introns du curseur de l'ARNm pr -1. Nous avons galement vu qu'une cellule peut pisser diff remment un transcrit d'ARN et ainsi 2 fabriquer diff rentes cha nes polypeptidiques partir du m me g ne un processus appel pissage alternatif de l'ARN (Figure 7-56). Une proportion importante de g nes animaux (estim e 90 % chez l'homme) produit plusieurs prot ines de cette mani re. Lorsque diff rentes possibilit s d' pissage existent plusieurs positions dans le transcrit, un seul g ne peut produire des dizaines de prot ines diff rentes. Dans un cas extr me, un g ne de la drosophile peut produire jusqu' 38 000 prot ines diff rentes partir d'un seul g ne par pissage alternatif (Figure 7-57), bien que seule une fraction de ces formes ait jusqu' pr sent t observ e exp rimentalement. Si l'on consid re que le g nome de la drosophile comporte environ 14 000 g nes identifi s, il est clair que la complexit prot ique d'un organisme peut largement d passer le nombre de ses g nes. Cet exemple illustre galement les dangers d'assimiler le nombre de g nes la complexit d'un organisme. Par exemple, l' pissage alternatif est rare chez les levures bourgeonnantes unicellulaires, un mod le d' pissage sur 38 016 possibles Figure 7 57 pissage alternatif des transcrits d'ARN du g ne Dscam de la drosophile. Les prot ines DSCAM ont plusieurs fonctions diff rentes. Dans les cellules du syst me immunitaire des mouches, ils m dient la phagocytose des agents pathog nes bact riens. dans les cellules du syst me nerveux, les prot ines DSCAM sont n cessaires au bon c blage des neurones. le mrnA final contient 24 exons, dont quatre (not s A, B, C et D) sont pr sents dans le g ne Dscam sous forme de r seaux d'exons alternatifs. chaque rnA contient 1 des 12 alternatives pour l'exon A (rouge), 1 des 48 alternatives pour l'exon B (vert), 1 des 33 alternatives pour l'exon C (bleu) et 1 des 2 alternatives pour l'exon D (jaune). cette figure ne montre qu'un seul des nombreux mod les d' pissage possibles (indiqu s par la ligne rouge et par l'ARNm mature en dessous). chaque variante de la prot ine DSCAM se replierait en peu pr s la m me structure (principalement une s rie de domaines extracellulaires de type immunoglobuline li s une r gion membranaire ; voir figure 24-48), mais la s quence d'acides amin s des domaines varie en fonction du mod le d' pissage. la diversit des variants du DSCAM contribue la plasticit du syst me immunitaire ainsi qu' la formation de circuits neuronaux complexes ; nous abordons plus en d tail le r le sp cifique des variants DSCAM lorsque nous d crivons le d veloppement du syst me nerveux au chapitre 21. (Adapt de D.l. Black, Cell 103:367 370, 2000. avec la permission d'Elsevier.) mais tr s fr quent chez les mouches. La levure bourgeonnante poss de 6200 g nes, dont seulement environ 300 sont sujets l' pissage, et presque tous n'ont qu'un seul intron. Dire que les mouches n'ont que 2 3 fois plus de g nes que les levures sous-estime grandement la diff rence de complexit de ces deux g nomes. Dans certains cas, l' pissage alternatif de l'ARN se produit parce qu'il y a une ambigu t de la s quence d'intron : le m canisme d' pissage standard pour liminer les s quences d'intron (discut au chapitre 6) est incapable de distinguer clairement entre deux ou plusieurs appariements alternatifs de 5 et 3 sites d' pissage, de sorte que des choix diff rents sont faits par hasard sur diff rents transcrits individuels. Lorsqu'un tel pissage alternatif constitutif se produit, plusieurs versions de la prot ine cod e par le g ne sont fabriqu es dans toutes les cellules dans lesquelles le g ne est exprim . Dans de nombreux cas, cependant, l' pissage alternatif de l'ARN est r gul . Dans les exemples les plus simples, l' pissage r gul est utilis pour passer de la production d'une prot ine non fonctionnelle la production d'une prot ine fonctionnelle (ou l'inverse). La transposase qui catalyse la transposition de l' l ment P de la drosophile, par exemple, est produite sous une forme fonctionnelle dans les cellules germinales et une forme non fonctionnelle dans les cellules somatiques de la mouche, permettant l' l ment P de se propager dans tout le g nome de la mouche sans causer de dommages aux cellules somatiques (voir Figure 5-61). La diff rence dans l'activit des transposons a t attribu e la pr sence d'une s quence d'intron dans l'ARN de la transposase qui n'est limin e que dans les cellules germinales. En plus de permettre de passer de la production d'une prot ine fonctionnelle la production d'une prot ine non fonctionnelle (ou vice versa), la r gulation de l' pissage de l'ARN peut g n rer diff rentes
Biologie moléculaire de la cellule	versions d'une prot ine dans diff rents types de cellules, en fonction des besoins de la cellule. La tropomyosine, par exemple, est produite sous des formes sp cialis es dans diff rents types de cellules (voir Figure 6-26). Formes sp cifiques au type de cellule de nombreux autres Les prot ines sont produites de la m me mani re. L' pissage de l'ARN peut tre r gul soit n gativement, par une mol cule r gulatrice qui emp che la machinerie d' pissage d'acc der un site d' pissage particulier sur l'ARN, soit positivement, par une mol cule r gulatrice qui aide diriger la machinerie d' pissage vers un site d' pissage autrement n glig (Figure 7 58). En raison de la plasticit de l' pissage de l'ARN, le blocage d'un site d' pissage fort expose souvent un site faible et entra ne un mod le d' pissage diff rent. Ainsi, l' pissage d'une mol cule de pr -ARNm peut tre consid r comme un quilibre d licat entre des sites d' pissage concurrents un quilibre qui peut facilement tre renvers par les effets sur l' pissage des prot ines r gulatrices. La d finition d'un g ne a t modifi e depuis la d couverte de l' pissage alternatif de l'ARN La d couverte que les g nes eucaryotes contiennent g n ralement des introns et que leurs s quences codantes peuvent tre assembl es de plus d'une mani re a soulev de nouvelles questions sur la d finition d'un g ne. Un g ne a t clairement d fini pour la premi re fois en termes mol culaires au d but des ann es 1940 partir de travaux sur la g n tique biochimique du champignon Neurospora. Figure 7 58 Contr le n gatif et positif de l' pissage alternatif de l'ARN. dans le contr le n gatif, une prot ine r pressive se lie une s quence sp cifique dans le transcrit premrnA et bloque l'acc s de la machinerie d' pissage une jonction d' pissage. Cela entra ne souvent l'utilisation d'un site d' pissage secondaire, produisant ainsi un mod le d' pissage modifi (voir Figure 7 56). En contr le positif, la machinerie d' pissage est incapable d' liminer efficacement une s quence d'intron particuli re sans l'aide d'une prot ine activatrice. Parce que l'ARN est flexible, les s quences nucl otidiques qui se lient ces activateurs peuvent tre localis es par de nombreuses paires de nucl otides partir des jonctions d' pissage qu'ils contr lent, et ils sont souvent appel s amplificateurs d' pissage, par analogie avec les amplificateurs transcriptionnels mentionn s plus haut dans ce chapitre. Jusque-l , un g ne avait t d fini op rationnellement comme une r gion du g nome qui se s pare en une seule unit au cours de la m iose et donne lieu un trait ph notypique d finissable, comme un il rouge ou blanc chez la drosophile ou une graine ronde ou rid e chez le pois. Les travaux sur Neurospora ont montr que la plupart des g nes correspondent une r gion du g nome qui dirige la synth se d'une seule enzyme. Cela a conduit l'hypoth se qu'un g ne code pour une cha ne polypeptidique. L'hypoth se s'est av r e fructueuse pour les recherches ult rieures ; Au fur et mesure que l'on en apprenait davantage sur le m canisme d'expression des g nes dans les ann es 1960, un g ne a t identifi comme tant le tron on d'ADN qui a t transcrit dans l'ARN codant pour une seule cha ne polypeptidique (ou un seul ARN structurel tel qu'un ARNt ou une mol cule d'ARNr). La d couverte des g nes divis s et des introns la fin des ann es 1970 pouvait tre facilement accommod e par la d finition originale d'un g ne, condition qu'une seule cha ne polypeptidique soit sp cifi e par l'ARN transcrit partir d'une s quence d'ADN. Mais il est maintenant clair que de nombreuses s quences d'ADN dans les cellules eucaryotes sup rieures peuvent produire un ensemble de prot ines distinctes (mais li es) au moyen d'un pissage alternatif de l'ARN. Comment, alors, un g ne peut-il tre d fini ? Dans les cas relativement rares o une seule unit de transcription produit deux prot ines eucaryotes tr s diff rentes, les deux prot ines sont consid r es comme produites par des g nes distincts qui se chevauchent sur le chromosome. Il semble cependant inutilement complexe de consid rer la plupart des variantes prot iques produites par l' pissage alternatif de l'ARN comme tant d riv es de g nes qui se chevauchent. Une alternative plus judicieuse consiste modifier la d finition originale pour compter une s quence d'ADN qui est transcrite comme une seule unit et code pour un ensemble de cha nes polypeptidiques troitement apparent es (isoformes de prot ines) comme un seul g ne codant pour une prot ine. Cette d finition s'applique galement aux s quences d'ADN qui codent pour des variants prot iques produits par des processus post-transcriptionnels autres que l' pissage de l'ARN, tels que le clivage des transcrits et l' dition de l'ARN (voir ci-dessous). Un changement dans le site du clivage du transcrit d'ARN et l'ajout de poly-A peuvent modifier l'extr mit C-terminale d'une prot ine Nous avons vu au chapitre 6 q
Biologie moléculaire de la cellule	ue l'extr mit 3 d'une mol cule d'ARNm eucaryote n'est pas form e par la fin de la synth se de l'ARN par l'ARN polym rase, comme c'est le cas chez les bact ries. Au lieu de cela, il r sulte d'une r action de clivage de l'ARN qui est catalys e par des prot ines suppl mentaires pendant que le transcrit s'allonge (voir Figure 6 34). Une cellule peut contr ler le site de ce clivage de mani re modifier l'extr mit C-terminale de la prot ine r sultante. Dans les cas les plus simples, une variante prot ique est simplement une version tronqu e de l'autre ; Dans de nombreux autres cas, cependant, les sites alternatifs de clivage et de polyad nylation se trouvent dans des s quences d'introns et le mod le d' pissage est ainsi modifi . Ce processus peut produire deux prot ines troitement apparent es ne diff rant que par les s quences d'acides amin s leurs extr mit s C-terminales. Une analyse approfondie des ARN produits partir du g nome humain dans divers types de cellules (voir la figure 7-3) indique que jusqu' 50 % des g nes codant pour des prot ines humaines produisent des esp ces d'ARNm qui diff rent par leur site de polyad nylation. Un exemple bien tudi de polyad nylation r gul e est le passage de la synth se de mol cules d'anticorps li es la membrane des mol cules d'anticorps s cr t es qui se produit au cours du d veloppement des lymphocytes B (voir Figure 24 22). Au d but de l'histoire biologique d'un lymphocyte B, l'anticorps qu'il produit est ancr dans la membrane plasmique, o il sert de r cepteur pour l'antig ne. La stimulation antig nique provoque la multiplication des lymphocytes B et leur d but de s cr tion d'anticorps. La forme s cr t e de l'anticorps est identique la forme membranaire, sauf l'extr mit C-terminale. Dans cette partie de la prot ine, la forme li e la membrane a une longue cha ne d'acides amin s hydrophobes qui traverse la bicouche lipidique de la membrane, tandis que la forme s cr t e a une cha ne beaucoup plus courte d'acides amin s hydrophiles. Le passage d'un anticorps li la membrane un anticorps s cr t est g n r par une modification du site de clivage et de polyad nylation de l'ARN, comme le montre la figure 7-59. Le changement est caus par une augmentation de la concentration d'une sous-unit d'une prot ine (CstF) qui favorise le clivage de l'ARN (voir Figure 6 34). Le premier site de clivage/ajout poly-A rencontr par une ARN polym rase transcrite est sous-optimal et est g n ralement saut dans les lymphocytes B non stimul s, conduisant la production du transcrit d'ARN plus long. Lorsqu'il est activ pour produire des anticorps, le lymphocyte B augmente sa concentration en CstF ; En cons quence, le clivage se produit maintenant au site sous-optimal, et le transcrit le plus court est produit. De cette fa on, un changement de concentration d'un facteur g n ral de traitement de l'ARN a un effet spectaculaire sur l'expression d'un g ne particulier. L' dition de rnA peut changer le sens du message rnA Les m canismes mol culaires utilis s par les cellules sont une source continuelle de surprises. Un exemple est le processus d' dition de l'ARN, qui modifie les s quences nucl otidiques des transcrits d'ARN une fois qu'ils sont synth tis s et modifie ainsi le message cod qu'ils v hiculent. Nous avons vu au chapitre 6 que les mol cules d'ARNt et d'ARNr sont chimiquement modifi es apr s leur synth se : nous nous concentrons ici sur les modifications des ARNm. Chez l'animal, deux principaux types d' dition de l'ARNm se produisent : la d samination de l'ad nine pour produire de l'inosine ( dition A-to-I) et, moins fr quemment, la d samination de la cytosine pour produire de l'uracile ( dition C-to-U), comme le montre la figure 5-43. Parce que ces modifications chimiques modifient les propri t s d'appariement des bases (I s'apparie avec C et U s'apparie avec A), elles peuvent avoir des effets profonds sur la signification de l'ARN. Si la modification se produit dans une r gion codante, elle peut modifier la s quence d'acides amin s de la prot ine ou produire une prot ine tronqu e en cr ant un codon stop pr matur . Les modifications qui se produisent en dehors des s quences codantes peuvent affecter le mod le d' pissage des pr -ARNm, le transport de l'ARNm du noyau au cytosol, l'efficacit avec laquelle l'ARN est traduit, ou l'appariement des bases entre les microARN (miARN) et leurs cibles d'ARNm, une forme de r gulation qui sera discut e plus loin dans le chapitre. Le processus d' dition A-to-I est particuli rement r pandu chez l'homme, o il se produit dans environ 1000 g nes. Des enzymes appel es ADARs (ad nosine d saminases agissant sur l'ARN) effectuent ce type d' dition ; ceux-ci les enzymes reconnaissent une structure d'ARN double brin qui est form e par appariement de bases entre le site modifier et une s quence compl mentaire situ e ailleurs sur la m me mol cule d'ARN, g n ralement dans un intron (Figure 7 60). La structure de l'ARN double brin sp
Biologie moléculaire de la cellule	cifie si l'ARNm doit tre modifi et, le cas ch ant, o la modification doit tre effectu e. Un exemple particuli rement important d' dition A-to-I a lieu dans l'ARNm qui code pour un canal ionique d pendant de l' metteur dans le cerveau. Une seule modification change une glutamine en arginine ; l'acide amin affect se trouve sur la paroi interne du canal, et le changement d' dition modifie la perm abilit au Ca2+ du canal. Les souris mutantes qui ne peuvent pas faire cette modification sont sujettes des crises d' pilepsie et meurent pendant ou peu de temps apr s le sevrage, ce qui montre que l' dition de l'ARN du canal ionique est normalement cruciale pour le bon d veloppement du cerveau. L' dition C-to-U, qui est effectu e par un ensemble diff rent d'enzymes, est galement cruciale chez les mammif res. Par exemple, dans certaines cellules de l'intestin, l'ARNm de l'apolipoprot ine B subit une modification C- -U qui cr e un codon d'arr t pr matur et donc Figure 7 59 La r gulation du site du clivage de l'ARN et de l'ajout de poly-A d termine si une mol cule d'anticorps est s cr t e ou reste li e la membrane. dans les lymphocytes B non stimul s ( gauche), un long transcrit d'ARN est produit, et la s quence d'intron (en jaune) pr s de son extr mit 3 est limin e par pissage de l'ARN pour fournir une mol cule d'ARNm qui code pour une mol cule d'anticorps li e la membrane. Seule une partie du g ne de l'anticorps est repr sent e sur la figure ; le g ne r el et son mrnA s' tendraient plus gauche du diagramme. Apr s stimulation de l'antig ne ( droite), le transcrit de l'ARN est cliv et polyad nyl en amont du site d' pissage 3 de l'intron. En cons quence, une partie de la s quence de l'intron reste sous forme de s quence codante dans le transcrit court et sp cifie la partie C-terminale hydrophile de la mol cule d'anticorps s cr t e (en marron). (Adapt de D. Di Giammartino et al., Mol. Cell 43:853 866, 2011. avec la permission d'elsevier.) Figure 7 60 M canisme d' dition de l'ARN de A I chez les mammif res. Typiquement, une s quence compl mentaire la position de l' dition est pr sente dans un intron, et la structure ARN double brin qui en r sulte attire une enzyme d' dition A- i (ADAr). Dans le cas illustr , la modification est effectu e dans un exon ; dans la plupart des cas, cependant, cela se produit dans les parties non codantes de l'ARNm. l' dition par ADAr a lieu dans le noyau, avant que le pr -mrnA n'ait t enti rement trait . Les souris et les humains ont deux g nes ADAr : ADR1 est exprim dans de nombreux tissus et est n cessaire dans le foie pour le bon d veloppement des globules rouges ; L'ADR2 n'est exprim que dans le cerveau, o il est n cessaire au bon d veloppement du cerveau. pas d' dition, CAA UAA produit une forme plus courte de la prot ine. Dans les cellules du foie, l'enzyme d' dition n'est pas exprim e et l'apolipoprot ine B pleine longueur est produite. Les deux isoformes prot iques ont des propri t s diff rentes, et chacune joue un r le dans le m tabolisme des lipides qui est sp cifique l'organe qui les produit (Figure 7 61). L'existence de l' dition de l'ARN est un myst re. Une id e est qu'il est apparu dans l' volution pour corriger les erreurs dans le g nome. Une autre est qu'il s'agit d'un moyen quelque peu b cl pour la cellule de produire des prot ines subtilement diff rentes partir du m me g ne. Une troisi me possibilit est que l' dition de l'ARN a volu l'origine comme un m canisme de d fense contre les r trovirus et les r trotransposons et a ensuite t adapt e par la cellule pour changer la signification de certains ARNm. En effet, l' dition de l'ARN joue toujours un r le important dans la d fense cellulaire. Certains r trovirus, y compris le VIH, sont largement modifi s apr s avoir infect les cellules. Cette hyper dition cr e de nombreuses mutations n fastes dans le g nome de l'ARN viral et provoque galement la r tention des ARNm viraux dans le noyau, o ils finissent par se d grader. Bien que certains r trovirus modernes se prot gent contre ce m canisme de d fense, l' dition de l'ARN aide probablement contr ler de nombreux virus. Le transport de l'ARN partir du noyau peut tre r gul On a estim que chez les mammif res, seulement environ un vingti me de la masse totale d'ARN synth tis quitte le noyau. Nous avons vu au chapitre 6 que la plupart des mol cules d'ARN de mammif res subissent des traitement et que les fragments d'ARN restants (introns excis s et s quences d'ARN 3 au site de clivage/poly-A) sont d grad s dans le noyau. Les ARN incompl tement trait s et autrement endommag s finissent galement par se d grader dans le cadre du syst me de contr le de la qualit pour la production d'ARN. Comme d crit au chapitre 6, l'exportation des mol cules d'ARN du noyau est retard e jusqu' ce que le traitement soit termin . Cependant, des m canismes qui outrepassent d lib r ment ce point de contr le peuvent tre utilis s pour
Biologie moléculaire de la cellule	r guler l'expression des g nes. Cette strat gie constitue la base de l'un des exemples les mieux compris de transport nucl aire r glement de l'ARNm, qui se produit dans le virus humain du sida, le VIH. Comme nous l'avons vu au chapitre 5, le VIH, une fois l'int rieur de la cellule, dirige la formation d'une copie d'ADN double brin de son g nome, qui est ensuite ins r e dans le g nome de l'h te (voir Figure 5-62). Une fois ins r , l'ADN viral peut tre transcrit sous la forme d'une longue mol cule d'ARN par l'ARN polym rase II de la cellule h te. Ce transcrit est ensuite piss de diff rentes mani res pour produire plus de 30 esp ces diff rentes d'ARNm, qui sont leur tour traduits en une vari t de prot ines diff rentes (Figure 7 62). Afin de fabriquer un virus de descendance, des transcrits viraux entiers et non piss s doivent tre export s du noyau vers le cytosol, o ils sont emball s dans des capsides virales et servent de g nome viral. Ce grand transcrit, ainsi que les ARNm du VIH piss s alternativement que le virus doit d placer vers le cytoplasme pour la synth se des prot ines, portent toujours des introns complets. Le blocage normal de la cellule h te l'exportation nucl aire d'ARN non piss s pose donc un probl me particulier pour le VIH. Figure 7 61 L' dition de l'ARN C- -U produit une forme tronqu e d'apolipoprot ine B. int gr e dans le g nome de l'h te1 000 paires de nucl otides Le blocage est surmont de mani re ing nieuse. Le virus code pour une prot ine (appel e Rev) qui se lie une s quence d'ARN sp cifique (appel e l ment sensible Rev, RRE) situ e dans un inton viral. La prot ine Rev interagit avec un r cepteur d'exportation nucl aire (Crm1), qui dirige le mouvement des ARN viraux travers les pores nucl aires dans le cytosol malgr la pr sence de s quences d'introns. Nous discutons en d tail de la mani re dont les r cepteurs d'exportation fonctionnent au chapitre 12. La r glementation de l'exportation nucl aire par Rev a plusieurs cons quences importantes sur la croissance et la pathogen se du VIH. En plus d'assurer l'exportation nucl aire d'ARN non piss s sp cifiques, il divise l'infection virale en une phase pr coce (au cours de laquelle Rev est traduit partir d'un ARN enti rement piss et tous les ARN viraux contenant des introns sont conserv s dans le noyau et d grad s) et une phase tardive (au cours de laquelle les ARN non piss s sont export s en raison de la fonction Rev). Ce moment aide le virus se r pliquer en fournissant les produits g niques peu pr s dans l'ordre dans lequel ils sont n cessaires (Figure 7 63). La r gulation par Rev et par Tat, la prot ine du VIH qui contrecarre l'arr t pr matur de la transcription (voir p. 414), permet au virus d'atteindre la latence, une condition dans laquelle le g nome du VIH s'est int gr dans le g nome de la cellule h te mais la production de prot ines virales a temporairement cess . Figure 7 62 Le g nome compact du VIH, le virus humain du sida. Les positions des neuf g nes du VIH sont indiqu es en vert. la double ligne rouge indique une copie DnA du g nome viral qui s'est int gr e dans l'ADN h te (en gris). notez que les r gions codantes de nombreux g nes se chevauchent, et que celles de Tat et Rev sont s par es par des introns. la ligne bleue en bas de la figure repr sente le transcrit pr -mrnA de l'ADN viral et montre les emplacements de tous les sites d' pissage possibles (fl ches). Il existe de nombreuses autres fa ons d' pisser le transcrit viral ; par exemple, les mrnAs Env conservent l'intron qui a t piss partir des mrnAs Tat et Rev. L' l ment de r ponse du r gime (RRE) est indiqu par une balle et un b ton bleus. il s'agit d'un tron on d'ARN de 234 nucl otides de long qui se replie en une structure d finie ; rev reconna t une pingle cheveux particuli re dans cette structure plus large. le g ne Gag code pour une prot ine qui est cliv e en plusieurs prot ines plus petites qui forment la capside virale. le g ne Pol code pour une prot ine qui est cliv e pour produire une transcriptase inverse (qui transcrit l'ARN en DnA), ainsi que l'int grase impliqu e dans l'int gration du g nome viral (sous forme d'ADN double brin) dans le g nome de l'h te. le g ne Env code pour les prot ines d'enveloppe (voir figure 5-62). TAT, REV, VIF, VPR, VPU et NEF sont de petites prot ines avec une vari t de fonctions. Par exemple, Rev r gule l'exportation nucl aire (voir Figure 7-63) et TAT r gule l' longation de la transcription travers le g nome viral int gr (voir p. 414). Figure 7 63 R gulation de l'exportation nucl aire par la prot ine Rev du VIH. (A) Au d but de l'infection par le VIH, seuls les ARN enti rement piss s (qui contiennent les s quences codantes pour rev, tat et nef) sont export s du noyau et traduits. (B) Une fois qu'une quantit suffisante de prot ine rev s'est accumul e et a t transport e dans le noyau, les ARN viraux non piss s peuvent tre export s du noyau. Beaucoup de ces ARN sont traduits e
Biologie moléculaire de la cellule	n prot ines, et les transcrits complets sont emball s dans de nouvelles particules virales. Si, apr s son entr e initiale dans une cellule h te, les conditions deviennent d favorables la transcription et la r plication virales, Rev et Tat sont fabriqu s des niveaux trop faibles pour favoriser la transcription et l'exportation de l'ARN non piss s. Cette situation bloque le cycle de croissance virale jusqu' ce que les conditions s'am liorent, apr s quoi les niveaux de Rev et de Tat augmentent et le virus entre dans le cycle de r plication. Certains ARNm sont localis s dans des r gions sp cifiques du cytosol Une fois qu'une mol cule d'ARNm eucaryote nouvellement fabriqu e a travers un pore nucl aire et est entr e dans le cytosol, elle est g n ralement rencontr e par les ribosomes, qui la traduisent en une cha ne polypeptidique (voir Figure 6-8). Une fois que le premier tour de traduction r ussit le test de d sint gration m di par les non-sens (voir Figure 6-76), l'ARNm est g n ralement traduit s rieusement. Si l'ARNm code pour une prot ine destin e tre s cr t e ou exprim e la surface de la cellule, une s quence de signal l'extr mit N-terminale de la prot ine la dirigera vers le r ticulum endoplasmique (RE). Dans ce cas, comme nous l'avons vu au chapitre 12, les composants de l'appareil de tri des prot ines de la cellule reconnaissent la s quence de signal d s qu'elle merge du ribosome et dirigent l'ensemble du complexe du ribosome, de l'ARNm et de la prot ine naissante vers la membrane du RE, o le reste de la cha ne polypeptidique est synth tis . Dans d'autres cas, les ribosomes libres dans le cytosol synth tisent la prot ine enti re, et les signaux dans la cha ne polypeptidique compl te peuvent alors diriger la prot ine vers d'autres sites de la cellule. De nombreux ARNm sont eux-m mes dirig s vers des emplacements intracellulaires sp cifiques avant que leur traduction efficace ne commence, ce qui permet la cellule de positionner ses ARNm proximit des sites o la prot ine cod e est n cessaire. La localisation de l'ARN a t observ e chez de nombreux organismes, y compris les champignons unicellulaires, les plantes et les animaux, et il est probable qu'il s'agisse d'un m canisme courant que les cellules utilisent pour concentrer la production de prot ines de haut niveau sur des sites sp cifiques. Cette strat gie offre galement la cellule d'autres avantages. Il permet par exemple d' tablir des asym tries dans le cytosol de la cellule, une tape cl dans de nombreux stades de d veloppement. L'ARNm localis , associ au contr le traductionnel, permet galement la cellule de r guler l'expression des g nes de mani re ind pendante dans diff rentes r gions. Cette caract ristique est particuli rement importante dans les grandes cellules hautement polaris es telles que les neurones, o elle joue un r le central dans la fonction synaptique. Plusieurs m canismes de localisation de l'ARNm ont t d couverts (Figure 7 64), qui n cessitent tous des signaux sp cifiques dans l'ARNm lui-m me. Ces signaux sont g n ralement concentr s dans la r gion 3' non traduite (UTR), la r gion de l'ARN qui Figure 7 64 M canismes de localisation des ARNm. l'ARNmrA localiser quitte le noyau par les pores nucl aires (en haut). Certains ARNm localis s (sch ma de gauche) se d placent vers leur destination en s'associant des moteurs cytosquelettiques, qui utilisent l' nergie de l'hydrolyse de l'ATP pour d placer les ARNm de mani re unidirectionnelle le long des filaments du cytosquelette (en rouge) (voir Chapitre 16). leur destination, les ARNm sont maintenus en place par des prot ines d'ancrage (en noir). D'autres ARNm diffusent al atoirement travers le cytosol et sont simplement pi g s par les prot ines d'ancrage et leurs sites de localisation (sch ma central). Certains ARNm (sch ma de droite) sont d grad s dans le cytosol moins qu'ils n'aient li , par diffusion al atoire, un complexe prot ique localis qui ancre et prot ge l'ARNm de la d gradation (noir). chaque m canisme n cessite des signaux sp cifiques sur le mrnA, qui sont g n ralement situ s dans le 3 Utr. Des composants suppl mentaires peuvent bloquer la traduction de la mrnA jusqu' ce qu'il soit correctement localis . (Adapt de h.D. lipshitz et C.A. Smibert, Curr. Opin. Genette. Dev. 10:476-488, 2000. avec l'autorisation d'Elsevier.) Figure 7 65 Une exp rience d montrant l'importance de l'UTR 3 dans la localisation des ARNm dans des r gions sp cifiques du cytoplasme. pour cette exp rience, deux ARN diff rents marqu s par fluorescence ont t pr par s en transcrivant de l'ADN in vitro en pr sence de d riv s d'Utp marqu s par fluorescence. Un ARN (marqu avec un fluorochrome rouge) contient la r gion codante de la prot ine poilue de la drosophile et comprend le 3 Utr adjacent (voir figure 6-21). l'autre rnA ( tiquet vert) contient la r gion codante poilue avec le 3 Utr supprim . les deux ARN ont t m lang s et inject s dans un e
Biologie moléculaire de la cellule	mbryon de drosophile un stade de d veloppement o plusieurs noyaux r sident dans un cytoplasme commun (voir figure 7-26). lorsque les ARN fluorescents ont t visualis s 10 minutes plus tard, l'ARN poilu complet (rouge) a t localis sur la face apicale des noyaux (bleu) mais le transcrit manquant le 3 Utr (vert) n'a pas r ussi se localiser. poilu est l'un des nombreux r gulateurs transcriptionnels qui sp cifient des informations de position dans l'embryon de drosophile en d veloppement (discut au chapitre 21), et la localisation de son mrnA (dont cette exp rience a montr qu'elle d pend de son 3'Utr) est essentielle au bon d veloppement de la mouche. (Avec l'aimable autorisation de Simon Bullock et David ish-horowicz.) s' tend du codon stop qui termine la synth se des prot ines jusqu'au d but de la queue poly-A (Figure 7 65). La localisation de l'ARNm est g n ralement coupl e des contr les de traduction pour s'assurer que l'ARNm reste au repos jusqu' ce qu'il soit mis en place. L' uf de drosophile pr sente un exemple particuli rement frappant de localisation de l'ARNm. L'ARNm codant pour le r gulateur de transcription Bicoid est localis par fixation au cytosquelette l'extr mit ant rieure de l' uf en d veloppement. Lorsque la f condation d clenche la traduction de cet ARNm, elle g n re un gradient de la prot ine Bicoid qui joue un r le crucial dans la direction du d veloppement de la partie ant rieure de l'embryon (voir Figure 7 26). De nombreux ARNm dans les cellules somatiques sont galement localis s de la m me mani re. L'ARNm qui code pour l'actine, par exemple, est localis dans le cortex cellulaire riche en filaments d'actine dans les fibroblastes de mammif res au moyen d'un signal UTR 3. Nous avons vu au chapitre 6 que les mol cules d'ARNm sortent du noyau avec de nombreuses marques sous forme de modifications de l'ARN (la coiffe 5 et la queue poly-A 3) et de prot ines li es (complexes exon-jonction, par exemple) qui signifient la r ussite des diff rentes tapes de traitement des pr -ARNm. Comme nous venons de le d crire, le 3' UTR d'un ARNm peut tre consid r comme un code postal qui dirige les ARNm vers diff rents endroits de la cellule. Ci-dessous, nous verrons galement que les ARNm portent des informations sp cifiant leur dur e de vie moyenne dans le cytosol et l'efficacit avec laquelle ils sont traduits en prot ines. Au sens large, les r gions non traduites des ARNm eucaryotes ressemblent aux r gions de contr le transcriptionnel des g nes : leurs s quences nucl otidiques contiennent des informations sp cifiant la fa on dont l'ARN doit tre utilis , et les prot ines interpr tent ces informations en se liant sp cifiquement ces s quences. Ainsi, au-del de la sp cification des s quences d'acides amin s des prot ines, les mol cules d'ARNm sont riches en informations. les 5' et 3' r gions non traduites des mrnAs contr lent leur traduction Une fois qu'un ARNm a t synth tis , l'un des moyens les plus courants de r guler les niveaux de son produit prot ique est de contr ler l' tape qui initie la traduction. M me si les d tails de l'initiation de la traduction diff rent entre les eucaryotes et les bact ries (comme nous l'avons vu au chapitre 6), ils utilisent chacun certaines des m mes strat gies de r gulation de base. Dans les ARNm bact riens, un tron on conserv de nucl otides, la s quence de Shine-Dalgarno, se trouve toujours quelques nucl otides en amont du codon AUG initiateur. Chez les bact ries, les m canismes de contr le de la traduction sont effectu s par des prot ines ou par des mol cules d'ARN, et ils impliquent g n ralement soit l'exposition, soit le blocage de la s quence Shine-Dalgarno (Figure 7 66). Les ARNm eucaryotes ne contiennent pas une telle s quence. Au lieu de cela, comme nous l'avons vu au chapitre 6, le choix d'un codon AUG comme site de d part de traduction est largement d termin par sa proximit avec le capuchon l'extr mit 5 de la mol cule d'ARNm, qui est le site o la petite sous-unit ribosomique se lie l'ARNm et commence rechercher un codon AUG initiateur. Chez les eucaryotes, les r presseurs traductionnels peuvent se lier l'extr mit 5 de l'ARNm et inhiber ainsi l'initiation de la traduction. D'autres r presseurs reconnaissent les s quences nucl otidiques dans l'UTR 3' d'ARNm sp cifiques et diminuent l'initiation de la traduction en interf rant avec la communication entre la coiffe 5' et la queue 3' poly-A, une tape n cessaire une traduction efficace (voir Figure 6-70). Un type particuli rement important de contr le traductionnel chez les eucaryotes repose sur de petits ARN (appel s microARN ou miARN) qui se lient aux ARNm et r duisent la production de prot ines, comme d crit plus loin dans ce chapitre. la phosphorylation d'un facteur d'initiation r gule la synth se des prot ines l' chelle mondiale Les cellules eucaryotes diminuent leur taux global de synth se des prot ines en r ponse diverses situations, notamment la pri
Biologie moléculaire de la cellule	vation de facteurs de croissance ou de nutriments, l'infection par des virus et l'augmentation soudaine de la temp rature. Une grande partie de cette diminution est caus e par la phosphorylation du facteur d'initiation de la traduction eIF2 par des prot ines kinases sp cifiques qui r pondent aux changements de conditions. Le fonctionnement normal d'eIF2 a t d crit au chapitre 6. Il forme un complexe avec le GTP et m die la liaison de l'ARNt initiateur du m thionyle la petite sous-unit ribosomique, qui se lie ensuite l'extr mit 5 de l'ARNm et commence balayer le long de l'ARNm. Lorsqu'un codon AUG est reconnu, la prot ine eIF2 hydrolyse le GTP li au GDP, provoquant un changement conformationnel de la prot ine et la lib rant de la petite sous-unit ribosomique. La grande sous-unit ribosomique rejoint ensuite la petite pour former un ribosome complet qui commence la synth se des prot ines. Figure 7 66 M canismes de contr le de la traduction. Bien que ces exemples proviennent de bact ries, bon nombre des m mes principes fonctionnent chez les eucaryotes. (A) Les prot ines de liaison l'ARN sp cifiques la s quence r priment la traduction de mrnA sp cifiques en bloquant l'acc s du ribosome la s quence Shine-Dalgarno (orange). par exemple, certaines prot ines ribosomales r priment la traduction de leur propre ARN. Ce m canisme permet la cellule de maintenir des quantit s correctement quilibr es des diff rents composants n cessaires la formation des ribosomes. (B) Un thermocapteur rnA ne permet une initiation efficace de la traduction qu' des temp ratures lev es auxquelles la structure tige-boucle a t fondue. Un exemple se produit chez l'agent pathog ne humain Listeria monocytogenes, dans lequel la traduction de ses g nes de virulence augmente 37 C, la temp rature de l'h te. (C) La liaison d'une petite mol cule un riboswitch provoque un r arrangement majeur de l'ARNA formant un ensemble diff rent de structures de boucle de tige. dans la structure li e, la s quence de Shine-Dalgarno (orange) est s questr e et l'initiation de la traduction est ainsi bloqu e. chez de nombreuses bact ries, la S-ad nosylm thionine agit de cette mani re pour bloquer la production des enzymes qui la synth tisent. (D) Un ARN antisens produit ailleurs partir de la base du g nome s'apparie un ARNm sp cifique et bloque sa traduction. De nombreuses bact ries r gulent l'expression des prot ines de stockage du fer de cette mani re. tant donn que eIF2 se lie tr s troitement au GDP, un facteur d' change nucl otidique de guanine (voir p. 157), d sign eIF2B, est n cessaire pour provoquer la lib ration de GDP afin qu'une nouvelle mol cule de GTP puisse se lier et que eIF2 puisse tre r utilis (Figure 7 67A). La r utilisation d'eIF2 est inhib e lorsqu'il est phosphoryl - l'eIF2 phosphoryl se lie eIF2B de mani re inhabituellement troite, inactivant eIF2B. Il y a plus d'eIF2 que d'eIF2B dans les cellules, et m me une fraction d'eIF2 phosphoryl e peut pi ger presque toute l'eIF2B. Cela emp che la r utilisation de l'eIF2 non phosphoryl et ralentit consid rablement la synth se des prot ines (Figure 7 67B). La r gulation du niveau d'eIF2 actif est particuli rement importante dans les cellules de mammif res ; eIF2 fait partie du m canisme qui permet aux cellules d'entrer dans un tat de repos non prolif rant (appel G0) dans lequel le taux de synth se totale des prot ines est r duit environ un cinqui me du taux dans les cellules prolif rantes. initiation AUG Codons En amont de la traduction D but Peut r guler l'initiation de la traduction eucaryote Nous avons vu au chapitre 6 que la traduction eucaryote commence g n ralement la premi re AUG en aval de la 5'end de l'ARNm, qui est le premier AUG rencontr par une petite sous-unit ribosomique balayage. Mais les nucl otides qui entourent imm diatement l'AUG influencent galement l'efficacit de l'initiation de la traduction. Si le site de reconnaissance est suffisamment mauvais, les sous-unit s ribosomales balayage ignorent parfois le premier codon AUG dans l'ARNm et passent au deuxi me ou troisi me codon AUG la place. Ce ph nom ne, connu sous le nom de balayage fuyant , est une strat gie fr quemment utilis e pour produire deux prot ines ou plus troitement apparent es, ne diff rant que par leurs N-terminus, partir du m me ARNm. Une utilisation particuli rement importante de ce m canisme est la production de la m me prot ine avec et sans s quence de signal attach e son N-terminal. Cela permet la prot ine d' tre dirig e vers deux endroits diff rents de la cellule (par exemple, vers les mitochondries et le cytosol). Les cellules peuvent r guler l'abondance relative des isoformes de prot ines produites par le balayage par fuite ; par exemple, une augmentation sp cifique au type de cellule de l'abondance du facteur d'initiation eIF4F favorise l'utilisation de l'AUG le plus proche de l'extr mit 5 de l'ARNm. Un autre type de contr le t
Biologie moléculaire de la cellule	rouv chez les eucaryotes utilise un ou plusieurs cadres de lecture ouverts courts de courts segments d'ADN qui commencent par un codon de d part (ATG) et se terminent par un codon d'arr t, sans codons d'arr t entre les deux qui se trouvent entre l'extr mit 5 de l'ARNm et le d but du g ne. Souvent, les s quences d'acides amin s cod es par ces cadres de lecture ouverts en amont (uORF) ne sont pas importantes ; les uORF remplissent plut t une fonction purement r glementaire. Un uORF pr sent sur une mol cule d'ARNm va g n ralement diminuer la traduction du g ne en aval en pi geant un facteur d' change de nucl otides de guanine, eIF2B EN L'ABSENCE D'eIF2B ACTIF, LE RESTE NON CONSOLID eIF2 RESTE DANS SA Figure 7 67 Le cycle eIF2. (A) le recyclage inactif et GDP-GDP-d'eif2 usag par un facteur d' change nucl otidique de guanine (eif2B). (B) eif2 (B) COMPLEXE INACTIF tarifs en immobilisant eif2B. en provoquant la traduction de l'uORF et la dissociation du ribosome de l'ARNm avant d'atteindre la s quence codant pour la prot ine de bonne foi. Lorsque l'activit d'un facteur de traduction g n ral (tel que l'eIF2 discut ci-dessus) est r duite, on pourrait s'attendre ce que la traduction de tous les ARNm soit r duite de la m me mani re. Contrairement cette attente, cependant, la phosphorylation d'eIF2 peut avoir des effets s lectifs, am liorant m me la traduction d'ARNm sp cifiques contenant des uORF. Cela peut permettre aux cellules, par exemple, de s'adapter la privation de nutriments sp cifiques en arr tant la synth se de toutes les prot ines, l'exception de celles qui sont n cessaires la synth se des nutriments manquants. Les d tails de ce m canisme ont t labor s pour un ARNm de levure sp cifique qui code pour une prot ine appel e Gcn4, un r gulateur de transcription qui active de nombreux g nes codant pour des prot ines importantes pour la synth se des acides amin s. L'ARNm Gcn4 contient plusieurs uORF courts, et lorsque les acides amin s sont abondants, les ribosomes traduisent les uORF et se dissocient g n ralement avant d'atteindre la r gion codante de Gcn4. Une diminution globale de l'activit d'eIF2 provoqu e par une privation d'acides amin s rend plus probable qu'une petite sous-unit ribosomique balayage se d place travers les uORF (sans les traduire) avant d'acqu rir une mol cule d'eIF2 (voir Figure 6 70). Une telle sous-unit ribosomique est alors libre d'initier la traduction sur les s quences Gcn4 r elles. L'augmentation du niveau de ce r gulateur de transcription augmente la production d'enzymes de biosynth se d'acides amin s. Bien qu'environ 90 % des ARNm eucaryotes soient traduits partir du premier AUG en aval de la coiffe 5, certains AUG, comme nous l'avons vu dans la section pr c dente, peuvent tre ignor s pendant le processus de balayage. Dans cette section, nous discutons d'une autre fa on dont les cellules peuvent initier la traduction des positions loign es de l'extr mit 5 de l'ARNm, en utilisant un type sp cialis de s quence d'ARN appel site d'entr e interne du ribosome (IRES). Dans certains cas, deux s quences codant pour des prot ines distinctes sont port es en tandem sur le m me ARNm eucaryote ; la traduction du premier se fait par le m canisme de balayage habituel, et la traduction du second se fait par le biais d'un IRES. Les IRES ont g n ralement une longueur de plusieurs centaines de nucl otides et se replient en structures sp cifiques qui lient un grand nombre, mais pas toutes, des m mes prot ines que celles utilis es pour initier translation normale d pendante de la coiffe 5 (Figure 7 68). En fait, diff rents IRES n cessitent diff rents sous-ensembles de facteurs d'initiation. Cependant, tous contournent la n cessit d'une structure de 5 majuscules et le facteur d'initiation de traduction qui la reconna t, eIF4E. Figure 7 68 Deux m canismes d'initiation de la traduction. (A) le m canisme normal, d pendant de la coiffe, n cessite un ensemble de facteurs d'initiation dont l'assemblage sur le mrnA est stimul par la pr sence d'une coiffe 5' et d'une queue poly- A (voir aussi figure 6-70). (B) le m canisme d pendant d'ireS, observ principalement chez les virus, ne n cessite qu'un sous-ensemble des facteurs initiateurs de traduction normaux, et ceux-ci s'assemblent directement sur l'ireS repli . (Adapt de A. Sachs, Cell 101:243-245, 2000. avec la permission d'Elsevier.) Certains virus utilisent les IRES dans le cadre d'une strat gie visant faire traduire leurs propres mol cules d'ARNm tout en bloquant la traduction normale d pendante de la 5' coiffe des ARNm de l'h te. Lors de l'infection, ces virus produisent une prot ase (cod e dans le g nome viral) qui clive le facteur de traduction de la cellule h te eIF4G, le rendant incapable de se lier eIF4E, le complexe de liaison la coiffe. Cela interrompt la majeure partie de la traduction de la cellule h te et d tourne efficacement la machinerie de traduction vers les s quences IRES pr sentes su
Biologie moléculaire de la cellule	r les ARNm viraux. (L'eIF4G tronqu reste comp tent pour lancer la traduction sur ces sites internes.) Les nombreuses fa ons dont les virus manipulent la machinerie de synth se des prot ines de leur h te leur propre avantage continuent de surprendre les biologistes cellulaires. L' tude de cette course aux armements entre l'homme et les agents pathog nes a conduit de nombreuses connaissances fondamentales sur le fonctionnement de la cellule, et nous reviendrons sur ce sujet plus en d tail au chapitre 23. La plupart des ARNm d'une cellule bact rienne sont tr s instables, avec des demi-vies de moins de quelques minutes. Les exonucl ases, qui se d gradent dans la direction 3 5, sont g n ralement responsables de la destruction rapide de ces ARNm. Parce que ses ARNm sont la fois rapidement synth tis s et d grad s, une bact rie peut s'adapter rapidement aux changements environnementaux. En r gle g n rale, les ARNm dans les cellules eucaryotes sont plus stables. Certains, comme celui codant globine, ont des demi-vies de plus de 10 heures, mais la plupart ont des demi-vies consid rablement plus courtes, g n ralement inf rieures 30 minutes. Les ARNm qui codent pour des prot ines telles que les facteurs de croissance et les r gulateurs de transcription, dont les taux de production doivent changer rapidement dans les cellules, ont des demi-vies particuli rement courtes. Nous avons vu au chapitre 6 que la cellule poss de plusieurs m canismes qui d truisent rapidement les ARN mal trait s ; ici, nous consid rons le devenir de l'ARNm eucaryote normal typique. Deux m canismes g n raux existent pour finalement d truire chaque ARNm fabriqu par la cellule. Les deux commencent par le raccourcissement progressif de la queue poly-A par une exonucl ase, un processus qui commence d s que l'ARNm atteint le cytosol. Au sens large, ce raccourcissement poly-A agit comme une minuterie qui compte la dur e de vie de chaque ARNm. Une fois que la queue poly-A est r duite une longueur critique (environ 25 nucl otides chez l'homme), les deux voies divergent. Dans l'un, la coiffe 5 est retir e (un processus appel d bouchage) et l'ARNm expos est rapidement d grad partir de son extr mit 5. Dans l'autre, l'ARNm continue d' tre d grad de l'extr mit 3, travers la queue poly-A, dans les s quences codantes (Figure 7-69). Presque tous les ARNm sont sujets aux deux types de d sint gration, et les s quences sp cifiques de chaque ARNm d terminent la vitesse laquelle chaque tape se produit et donc la dur e pendant laquelle chaque ARNm persistera dans la cellule et sera capable de produire des prot ines. Les s quences 3' UTR sont particuli rement importantes pour contr ler la dur e de vie de l'ARNm, et elles portent souvent des sites de liaison pour des prot ines sp cifiques qui augmentent ou diminuent le taux de raccourcissement, de d plafonnement ou de d gradation 3- -5. La demi-vie d'un ARNm est galement affect e par l'efficacit de sa traduction. Le raccourcissement et le d bouchage Poly-A sont en concurrence directe avec la machinerie qui traduit l'ARNm ; par cons quent, tous les facteurs qui affectent l'efficacit de traduction d'un ARNm auront tendance avoir l'effet inverse sur sa d gradation (Figure 7 70). Bien que le raccourcissement poly-A contr le la demi-vie de la plupart des ARNm eucaryotes, certains ARNm peuvent tre d grad s par un m canisme sp cialis qui contourne compl tement cette tape. Dans ces cas, des nucl ases sp cifiques clivent l'ARNm l'int rieur, Figure 7 69 Deux m canismes de la d sint gration de l'ARNm eucaryote. Un seuil critique de longueur de queue poly-A induit une d gradation rapide de 3 5, qui peut tre d clench e par la perte des prot ines poly-Abinding. Comme le montre la figure 7-70, une deadenylase s'associe la fois la queue 3 poly-A et la calotte 5, et cette connexion peut tre impliqu e dans la signalisation du d bouchage apr s le raccourcissement poly-A. Bien que les d gradations de 5 3 et de 3 5 soient observ es ici sur des mol cules d'ARN distinctes, ces deux processus peuvent se produire ensemble sur la m me mol cule. (Adapt de C.A. Beelman et R. Parker, Cell 81:179 183, 1995. avec la permission d'elsevier.) Figure 7 70 La concurrence entre le d bouchage efficace d'une extr mit et l' limination de la queue poly-A de l'autre de sorte que les deux moiti s se d gradent rapidement. Les ARNm qui sont d truits de cette mani re portent des s quences nucl otidiques sp cifiques, souvent dans les 3 UTR, qui servent de s quences de reconnaissance pour ces endonucl ases. Cette strat gie rend particuli rement simple la r gulation stricte de la stabilit de ces ARNm en bloquant ou en exposant le site de l'endonucl ase en r ponse des signaux extracellulaires. Par exemple, l'ajout de fer aux cellules diminue la stabilit de l'ARNm qui code pour la prot ine r ceptrice qui se lie la prot ine transf rine, ce qui entra ne une diminution de la production de ce r
Biologie moléculaire de la cellule	cepteur. Cet effet est m di par l'acontase, une prot ine de liaison l'ARN sensible au fer. L'acontase peut se lier l'UTR 3 de l'ARNm du r cepteur de la transferrine et augmenter la production de r cepteurs en bloquant le clivage endonucl olytique de l'ARNm. Lors de l'ajout de fer, l'aconitase est lib r e de l'ARNm, exposant le site de clivage et diminuant ainsi la stabilit de l'ARNm (Figure 7 71). r gulation de la stabilit de l'ARNmrA implique des p-bodies et des granules de stress Nous avons vu dans les chapitres 3 et 6 que de grands agr gats de prot ines et d'acides nucl iques qui travaillent ensemble sont souvent maintenus proximit par des connexions l ches et de faible affinit (voir Figure 3-36). De cette fa on, ils fonctionnent comme des organites m me s'ils ne sont pas entour s de membranes. De nombreux v nements ont t discut s dans la traduction et la d sint gration de l'ARNm pr c dentes. les deux m mes caract ristiques d'une mol cule mrnA : sa coiffe 5 et sa d sint gration 3 poly-A (voir figure 7-69). la deadenylase qui raccourcit la queue poly-A dans la direction 3 5 s'associe la calotte 5. Comme d crit au chapitre 6 (voir figure 6-70), la machinerie d'initiation de la traduction s'associe galement la fois la casquette 5 et la queue poly-A. (Adapt de M. Gao et al., Mol. Cell 5:479 488, 2000. avec la permission d'elsevier.) Figure 7 71 Deux contr les post-traductionnels m di s par le fer. (A) Pendant la carence en fer, la liaison de l'aconitase au 5' Utr de la ferritine mrnA bloque l'initiation de la traduction ; sa liaison l'Utr 3 du r cepteur de la transferrine mrnA bloque un site de clivage de l'endonucl ase et stabilise ainsi l'mrnA. (B) en r ponse une augmentation de la concentration de fer dans le cytosol, une cellule augmente sa synth se de ferritine afin de se lier au fer suppl mentaire et diminue sa synth se des r cepteurs de la transferrine afin d'importer moins de fer travers la membrane plasmique. Les deux r ponses sont m di es par la m me prot ine r gulatrice sensible au fer, l'aconitase, qui reconna t des caract ristiques communes dans une structure en boucle souche dans les ARNm codant pour la ferritine et le r cepteur de la transferrine. L'aconitase se dissocie de l'ARNmr lorsqu'elle se lie au fer. Mais parce que le r cepteur de la transferrine et la ferritine sont r gul s par diff rents types de m canismes, leurs niveaux r pondent de mani re oppos e aux concentrations de fer, m me s'ils sont r gul s par la m me prot ine r gulatrice sensible au fer. , y compris le d bouchage et la d gradation de l'ARN, ont lieu dans des agr gats connus sous le nom de corps Processing ou P-, qui sont pr sents dans le cytosol (Figure 7 72). Bien que de nombreux ARNm finissent par se d grader dans les corps P, certains restent intacts et sont ensuite renvoy s dans le pool d'ARNm en traduction. Pour tre sauv s de cette mani re, les ARNm se d placent des corps P vers un autre type d'agr gat connu sous le nom de granule de stress, qui contient des facteurs d'initiation de traduction, une prot ine de liaison poly-A et de petites sous-unit s ribosomiques. La traduction elle-m me ne se produit pas dans les granules de stress, mais les ARNm peuvent devenir pr ts tre traduits lorsque les prot ines qui leur sont li es dans les corps P sont remplac es par celles des granules de stress. Le mouvement des ARNm entre la traduction active, les corps P et les granules de stress peut tre consid r comme un cycle d'ARNm (Figure 7-73) o la comp tition entre la traduction et la d gradation de l'ARNm est soigneusement contr l e. Ainsi, lorsque l'initiation de la traduction est bloqu e (par la famine, les m dicaments ou la manipulation g n tique), les granules de stress s'agrandissent mesure que de plus en plus d'ARNm non traduits y sont d plac s directement pour tre stock s. De toute vidence, une fois qu'une cellule a fait l'investissement important dans la production d'une mol cule d'ARNm correctement trait e, elle contr le soigneusement son destin ult rieur. De nombreuses tapes de la voie de l'ARN la prot ine sont r gul es par les cellules afin de contr ler l'expression des g nes. La plupart des g nes sont r gul s plusieurs niveaux, en plus d' tre contr l s au stade de l'initiation de la transcription. Les m canismes de r gulation comprennent (1) l'att nuation du transcrit de l'ARN par sa terminaison pr matur e, (2) la s lection alternative du site d' pissage de l'ARN, (3) le contr le de la formation de l'extr mit 3 par clivage et l'addition poly- A, (4) l' dition de l'ARN, (5) le contr le du transport du noyau au cytosol, (6) la localisation des ARNm dans des parties particuli res de la cellule, (7) le contr le de l'initiation de la traduction, et (8) la d gradation r gul e de l'ARNm. La plupart de ces processus de contr le n cessitent la reconnaissance de s quences ou de structures sp cifiques dans la mol cule d'ARN r gul e, une t che effectu e soit
Biologie moléculaire de la cellule	par des prot ines r gulatrices, soit par des mol cules d'ARN r gulatrices. Figure 7 72 Visualisation des corps P. Les cellules humaines ont t color es avec des anticorps contre un composant de l'enzyme de d bouchage de l'ARNm Dcp1a (panneaux de gauche) et contre la prot ine Argonaute (panneaux du milieu). Comme d crit plus loin dans ce chapitre, l'argonaute est un composant cl des voies d'interf rence de l'ARN. L'image fusionn e (panneaux de droite) montre que les deux prot ines co-localisent les p-bodies dans le cytoplasme. (Adapt de J. liu et al., Nat. Cell Biol. 7:719-723, 2005. avec l'autorisation de Macmillan publishers ltd.) Figure 7 73 Destins possibles d'une mol cule d'ARNm. Une mol cule d'ARNmrA lib r e du noyau peut tre activement traduite (au centre), stock e dans des granules de stress ( droite) ou d grad e dans des corps p ( gauche). Au fur et mesure que les besoins de la cellule changent, les mrnAs peuvent tre m lang s d'un pool l'autre, comme indiqu par les fl ches. Dans le chapitre pr c dent, nous avons pr sent le dogme central, selon lequel le flux d'information g n tique proc de de l'ADN la prot ine en passant par l'ARN (Figure 6 1). Mais nous avons vu tout au long de ce livre que les mol cules d'ARN effectuent de nombreuses t ches critiques dans la cellule en plus de servir de transporteurs interm diaires de l'information g n tique. Parmi ces ARN non codants figurent les mol cules d'ARNr et d'ARNt, qui sont responsables de la lecture du code g n tique et de la synth se des prot ines. La mol cule d'ARN dans la t lom rase sert de mod le pour la r plication des extr mit s chromosomiques, les snoARN modifient l'ARN ribosomique et les snRNA effectuent les v nements majeurs de l' pissage de l'ARN. Et nous avons vu dans la section pr c dente que l'ARN Xist joue un r le important dans l'inactivation d'une copie du chromosome X chez les femmes. Une s rie de d couvertes r centes a r v l que les ARN non codants sont encore plus r pandus qu'on ne l'imaginait auparavant. Nous savons maintenant que ces ARN jouent un r le important dans la r gulation de l'expression des g nes et dans la protection du g nome contre les virus et les l ments transposables. Ces ARN nouvellement d couverts font l'objet de cette section. Nous commen ons notre discussion avec un groupe d'ARN courts qui effectuent une interf rence ARN ou ARNi. Ici, de courts ARN simple brin (20 30 nucl otides) servent d'ARN guides qui r organisent et se lient s lectivement par appariement de bases d'autres ARN dans la cellule. Lorsque la cible est un ARNm mature, le petit Les ARN peuvent inhiber sa traduction ou m me catalyser sa destruction. Si la mol cule d'ARN cible est en cours de transcription, le petit ARN non codant peut se lier celle-ci et diriger la formation de certains types de chromatine r pressive sur sa matrice d'ADN attach e (Figure 7 74). Trois classes de petits ARN non codants fonctionnent de cette mani re : les microARN (miARN), les petits ARN interf rents (siARN) et les ARN interagissant avec piwi (piARN) et nous les aborderons tour tour dans les sections suivantes. Bien qu'ils diff rent dans la fa on dont les courts morceaux d'ARN simple brin sont g n r s, les trois types d'ARN courts localisent leurs cibles par l'appariement des bases ARN-ARN, et ils provoquent g n ralement des r ductions de l'expression des g nes. Plus de 1000 microARN diff rents (miARN) sont produits partir du g nome humain, et ceux-ci semblent r guler au moins un tiers de tous les g nes codant pour des prot ines humaines. Une fois fabriqu s, les miARN s'apparient avec des ARNm sp cifiques et affinent leur traduction et leur stabilit . Les pr curseurs des miARN sont synth tis s par l'ARN polym rase II et sont coiff s et polyad nyl s. Ils subissent ensuite un type sp cial de traitement, apr s quoi le miARN (g n ralement de 23 nucl otides de longueur) est assembl avec un ensemble de prot ines pour former un complexe de silen age induit par l'ARN ou RISC. Une fois form , le RISC recherche ses ARNm cibles en recherchant une r pression translationnelle nucl otidique compl mentaire la formation du clivage de l'h t rochromatine de l'ARN cible est en cours de transcription Figure 7 74 Interf rence de l'ARN chez les eucaryotes. Les ARN interf rents simple brin sont g n r s partir d'ARN double brin. ils localisent les ARN cibles par appariement de bases et, ce stade, plusieurs destins sont possibles, comme on le voit. Comme d crit dans le texte, il existe plusieurs types d'interf rences ARN ; la fa on dont l'ARN double brin est produit et trait et le sort final de l'ARN cible d pendent du syst me particulier. s quences (figures 7 75). Cette recherche est grandement facilit e par la prot ine Argonaute, un composant de RISC, qui contient la r gion 5 du miARN de sorte qu'il est positionn de mani re optimale pour l'appariement des bases avec une autre mol cule d'ARN (Figure 7-76). Chez les animaux, l' tendue de l'app
Biologie moléculaire de la cellule	ariement des bases est g n ralement d'au moins sept paires de nucl otides, et cet appariement se produit le plus souvent dans le 3 UTR de l'ARNm cible. Une fois qu'un ARNm a t li par un miARN, plusieurs r sultats sont possibles. Si l'appariement des bases est tendu (ce qui est inhabituel chez l'homme mais courant chez de nombreuses plantes), l'ARNm est cliv (tranch ) par la prot ine argonaute, liminant efficacement la queue poly-A de l'ARNm et l'exposant aux exonucl ases (voir Figure 7 69). Apr s le clivage de l'ARNm, le RISC avec son miARN associ est lib r et il peut rechercher des ARNm suppl mentaires (voir Figure 7 75). Ainsi, un seul miARN peut agir comme catalyseur pour d truire de nombreux ARNm compl mentaires. Ces miARN peuvent donc tre consid r s comme des s quences guides qui mettent en contact des nucl ases destructrices avec des ARNm sp cifiques. Si l'appariement des bases entre le miARN et l'ARNm est moins tendu (comme observ pour la plupart des miARN humains), Argonaute ne tranche pas l'ARNm ; au contraire, la traduction de l'ARNm est r prim e et l'ARNm est transport vers des corps P (voir Figure 7-73) o , s questr des ribosomes, il finit par subir un raccourcissement, un d plafonnement et une d gradation de la queue poly-A. Plusieurs caract ristiques font des miARN des r gulateurs particuli rement utiles de l'expression des g nes. Tout d'abord, un seul miARN peut r guler tout un ensemble d'ARNm diff rents, condition que les ARNm portent une courte s quence commune dans leurs UTR. Cette situation est courante chez l'homme, o un seul miARN peut contr ler des centaines d'ARNm diff rents. Deuxi mement, la r gulation par les miARN peut tre combinatoire. Lorsque l'appariement des bases entre le miARN et l'ARNm ne d clenche pas le clivage, des miARN suppl mentaires se liant au m me ARNm entra nent des r ductions suppl mentaires de sa traduction. Comme nous l'avons vu pr c demment pour les r gulateurs de transcription, le contr le combinatoire largit consid rablement les possibilit s disponibles pour la cellule en liant l'expression g nique une combinaison de diff rents r gulateurs plut t qu' un seul r gulateur. Troisi mement, un miARN occupe relativement peu Figure 7 75 Traitement et m canisme d'action du miARN. le pr curseur miRNA, par compl mentarit entre une partie de sa s quence et une autre, forme une structure double brin. cet ARN est cultiv alors qu'il est encore dans le noyau, puis export vers le cytosol, o il est ensuite cliv par l'enzyme Dicer pour former le mirnA proprement dit. Argonaute, en conjonction avec d'autres composants de riSC, s'associe d'abord aux deux brins du mirnA, puis clive et jette l'un d'entre eux. l'autre brin guide riSC vers des ARNm sp cifiques par appariement de bases. si la correspondance ARN-ARN est tendue, comme on le voit couramment chez les plantes, l'argonaute clive l'ARNm cible, provoquant sa d gradation rapide. chez les mammif res, la correspondance mirnA-mrnA ne s' tend souvent pas au-del d'une courte r gion graine sept nucl otides pr s de l'extr mit 5 du mirnA. cet appariement de bases moins tendu conduit l'inhibition de la traduction, la d stabilisation de l'ARNmr et au transfert de l'ARNmrA vers les corps p, o il finit par se d grader. 3 OH (fin de l'ARN) site actif, montrant 2 atomes Mg2+ n cessaires pour trancher l'espace dans le g nome par rapport une prot ine. En effet, leur petite taille est l'une des raisons pour lesquelles les miARN n'ont t d couverts que r cemment. Bien que nous commencions peine appr cier tout l'impact des miARN, il est clair qu'ils repr sentent une partie importante de l' quipement de la cellule pour r guler l'expression des g nes. Nous abordons des exemples sp cifiques de miARN qui jouent un r le cl dans le d veloppement au chapitre 21. L'interf rence ARN est galement utilis e comme m canisme de d fense cellulaire De nombreuses prot ines qui participent aux m canismes de r gulation des miARN que nous venons de d crire remplissent galement une deuxi me fonction en tant que m canisme de d fense : elles orchestrent la d gradation des mol cules d'ARN trang res, en particulier celles qui se produisent sous forme double brin. De nombreux l ments transposables et virus produisent de l'ARN double brin, au moins transitoirement, au cours de leur cycle de vie, et l'interf rence de l'ARN aide contr ler ces envahisseurs potentiellement dangereux. Comme nous le verrons, cette forme d'ARNi fournit galement aux scientifiques une technique exp rimentale puissante pour d sactiver l'expression de g nes individuels. La pr sence d'ARN double brin dans la cellule d clenche l'ARNi en attirant un complexe prot ique contenant Dicer, la m me nucl ase qui traite les miR-NA (voir Figure 7 75). Cette prot ine clive l'ARN double brin en petits fragments (environ 23 paires de nucl otides) appel s petits ARN interf rents (ARNi). Ces siRNA double brin sont ensuite li s par Argonaute et
Biologie moléculaire de la cellule	d'autres composants de RISC. Comme nous l'avons vu ci-dessus pour les miARN, un brin de l'ARN duplex est ensuite cliv par l'argonaute et jet . La mol cule d'ARNi simple brin qui reste renvoie RISC vers les mol cules d'ARN compl mentaires produites par le virus ou l' l ment transposable. Parce que la correspondance est g n ralement exacte, l'argonaute clive ces mol cules, conduisant leur destruction rapide. Chaque fois que RISC clive une nouvelle mol cule d'ARN, le RISC est lib r ; ainsi, comme nous l'avons vu pour les miARN, une seule mol cule d'ARN peut agir de mani re catalytique pour d truire de nombreux ARN compl mentaires. Certains organismes utilisent un m canisme suppl mentaire qui amplifie encore plus la r ponse ARNi. Dans ces organismes, les ARN polym rases d pendantes de l'ARN utilisent des ARNi comme amorces pour produire des copies suppl mentaires d'ARN double brin qui sont ensuite cliv es en ARNi. Cette amplification garantit que, une fois initi e, l'interf rence de l'ARN peut se poursuivre m me apr s que tout l'ARN double brin initiateur a t d grad ou dilu . Par exemple, il permet aux cellules de descendance de continuer effectuer l'interf rence ARN sp cifique qui a t provoqu e dans les cellules m res. Chez certains organismes, l'activit d'interf rence de l'ARN peut tre propag e par le transfert de fragments d'ARN d'une cellule l'autre. Ceci est particuli rement important chez les plantes (dont les cellules sont reli es par de fins canaux de connexion, comme nous l'avons vu au chapitre 19), car cela permet une plante enti re de devenir r sistante un virus ARN apr s que seules quelques-unes de ses cellules ont t infect es. Au sens large, la r ponse ARNi ressemble certains aspects du syst me immunitaire animal ; Dans les deux cas, un organisme envahisseur suscite une r ponse personnalis e et, gr ce l'amplification des mol cules d'attaque, l'h te devient syst matiquement prot g . Figure 7 76 Prot ine Argonaute humaine portant un miARN. La prot ine est repli e en quatre domaines structurels, chacun indiqu par une couleur diff rente. le mirnA est maintenu sous une forme tendue qui est optimale pour former des paires de bases rnA-rnA. le site actif d'Argonaute qui tranche un rnA cible, lorsqu'il est largement appari en bases avec le miARN, est indiqu en rouge. De nombreuses prot ines Argonaute (trois des quatre prot ines humaines, par exemple) n'ont pas de site catalytique et se lient donc aux ARN cibles sans les trancher. (Adapt de C.D. Kuhn et l. Joshua-tor, Trends Biochem. Sci. 38:263-271, 2013. avec l'autorisation de Cell press.) Nous avons vu que, bien que les miARN et les siARN soient g n r s de mani re l g rement diff rente, ils s'appuient sur les m mes prot ines et recherchent leurs cibles d'une mani re fondamentalement similaire. Parce que les siARN se trouvent chez des esp ces r pandues, on pense qu'ils sont la forme la plus ancienne d'interf rence ARN, les miARN tant un raffinement ult rieur. Ces m canismes de d fense m di s par les siRNA sont cruciaux pour les plantes, les vers et les insectes. Chez les mammif res, un syst me base de prot ines (d crit au chapitre 24) a largement pris en charge la t che de lutter contre les virus. La voie d'interf rence de l'ARNi que nous venons de d crire ne s'arr te pas n cessairement la destruction des mol cules d'ARN cibles. Dans certains cas, la machinerie d'interf rence d'ARN peut galement arr ter s lectivement la synth se des ARN cibles. Pour ce faire, les siRNA courts produits par la prot ine Dicer sont assembl s avec un groupe de prot ines (dont l'Argonaute) pour former le complexe RITS (RNA-induced transcriptional silencing). En utilisant un siRNA simple brin comme s quence guide, ce complexe se lie aux transcrits d'ARN compl mentaires lorsqu'ils mergent d'une ARN polym rase II transcrite (Figure 7 77). Positionn de cette mani re sur le g nome, le complexe RITS attire des prot ines qui modifient de mani re covalente les histones voisines et finissent par diriger la formation de l'h t rochromatine pour emp cher l'initiation de la transcription. Dans certains cas, une ARN polym rase d pendante de l'ARN et une enzyme Dicer sont galement recrut es par le complexe RITS pour g n rer continuellement des siARN suppl mentaires in situ. Cette boucle de r troaction positive assure une r pression continue du g ne cible, m me apr s la disparition des mol cules de siRNA initiatrices. La formation d'h t rochromatine dirig e par l'ARNi est un m canisme de d fense cellulaire important qui limite la propagation des l ments transposables dans les g nomes en maintenant leurs s quences d'ADN sous une forme transcriptionnellement silencieuse. Cependant, ce m me m canisme est galement utilis dans certains processus normaux dans la cellule. Par exemple, dans de nombreux organismes, la machinerie d'interf rence de l'ARN maintient l'h t rochromatine form e autour des centrom res. Les s quences d'ADN centrom rique son
Biologie moléculaire de la cellule	t transcrites dans les deux sens, produisant des transcrits d'ARN compl mentaires qui peuvent s'apparier pour former de l'ARN double brin. Cet ARN double brin d clenche l'ARN Figure 7 77 Interf rence d'ARN dirig e par des siRNA. chez de nombreux organismes, l'ARN double brin peut d clencher la fois la destruction des ARNm compl mentaires ( gauche) et le silen age transcriptionnel ( droite). le changement de structure de la chromatine induit par le complexe li ritS (silen age transcriptionnel induit par l'ARN) ressemble celui de la figure 7-45. et stimule la formation de l'h t rochromatine qui entoure les centrom res, ce qui est n cessaire pour que les centrom res s parent les chromosomes avec pr cision pendant la mitose. Les pirnAs prot gent la ligne germinale des l ments transposables Un troisi me syst me d'interf rence ARN repose sur des piARN (ARN interagissant avec piwi, nomm s d'apr s Piwi, une classe de prot ines apparent es l'argonaute). Les piARN sont fabriqu s sp cifiquement dans la lign e germinale, o ils bloquent le mouvement des l ments transposables. Pr sents dans de nombreux organismes, y compris chez l'homme, les g nes codant pour les piARN sont en grande partie constitu s de fragments de s quence d' l ments transposables. Ces amas de fragments sont transcrits et bris s en piARN courts et simple brin. Le traitement diff re de celui des miARN et des siARN (d'une part, l'enzyme Dicer n'est pas impliqu e), et les piARN r sultants sont l g rement plus longs que les miARN et les siARN ; de plus, ils sont complex s avec des prot ines Piwi plut t qu'Argonaute. Une fois form s, les piARN recherchent des cibles d'ARN par appariement de bases et, tout comme les siARN, r duisent au silence transcriptionnellement les g nes de transposon intacts et d truisent tout ARN (y compris les ARNm) qu'ils produisent. De nombreux myst res entourent les piARN. Plus d'un million d'esp ces de piARN sont cod es dans les g nomes de nombreux mammif res et exprim es dans les testicules, mais seule une petite fraction semble tre dirig e contre les transposons pr sents dans ces g nomes. Les piARN sont-ils des vestiges d'envahisseurs pass s ? Couvrent-ils autant de choses qu'ils sont largement protecteurs pour tout ADN tranger ? Une autre caract ristique curieuse des piARN est que beaucoup d'entre eux (en particulier si l'appariement des bases n'a pas besoin d' tre parfait) devraient, en principe, attaquer les ARNm normaux fabriqu s par l'organisme, mais ils ne le font pas. Il a t propos que ces grands nombres de piARN puissent former un syst me permettant de distinguer les ARN propres des ARN trangers et d'attaquer uniquement ces derniers. Si tel est le cas, il doit y avoir un moyen sp cial pour la cellule d' pargner ses propres ARN. L'une d'entre elles est que les ARN produits au cours de la g n ration pr c dente d'un organisme sont en quelque sorte enregistr s et mis l' cart de l'attaque des piARN dans les g n rations suivantes. L'existence r elle ou non de ce m canisme et, le cas ch ant, son fonctionnement, sont des questions qui d montrent notre compr hension incompl te de toutes les implications de l'interf rence ARN. Bien qu'elle soit probablement apparue comme un m canisme de d fense contre les virus et les l ments transposables, l'interf rence ARN, comme nous l'avons vu, est devenue compl tement int gr e dans de nombreux aspects de la biologie cellulaire normale, allant du contr le de l'expression des g nes la structure des chromosomes. Il a galement t d velopp par les scientifiques en un outil exp rimental puissant qui permet d'inactiver presque n'importe quel g ne en voquant une r ponse ARNi celui-ci. Cette technique, qui peut tre facilement mise en uvre dans des cellules cultiv es et, dans de nombreux cas, dans des animaux et des plantes entiers, a rendu possible de nouvelles approches g n tiques en biologie cellulaire et mol culaire. Nous en discuterons en d tail dans le chapitre suivant o nous couvrirons les m thodes g n tiques modernes utilis es pour tudier les cellules (voir pp. 499-501). L'ARNi a galement un potentiel dans le traitement des maladies humaines. tant donn que de nombreux troubles humains r sultent d'une mauvaise expression des g nes, la capacit de d sactiver ces g nes en introduisant exp rimentalement des mol cules siRNA compl mentaires est tr s prometteuse sur le plan m dical. Bien que le m canisme d'interf rence de l'ARN ait t d couvert il y a quelques d cennies, nous sommes toujours surpris par ses d tails m canistes et par ses vastes implications biologiques. Les bact ries utilisent de petits ARN non codants pour se prot ger des virus Les bact ries constituent la grande majorit de la biomasse terrestre et, sans surprise, les virus qui infectent les bact ries sont beaucoup plus nombreux que les virus v g taux et animaux. Ces virus ont g n ralement des g nomes d'ADN. Une d couverte r cente a r v l que de nombreuses esp ces de bact rie
Biologie moléculaire de la cellule	s (et presque toutes les esp ces d'arch bact ries) utilisent un r f rentiel de petites mol cules d'ARN non codantes pour rechercher et d truire l'ADN des virus envahisseurs. De nombreuses caract ristiques de ce m canisme de d fense, connu sous le nom de syst me CRISPR, ressemblent celles que nous avons vues ci-dessus pour les miARN et les siARN, mais il existe deux diff rences importantes. Tout d'abord, lorsque les bact ries et les arch es sont infect es pour la premi re fois par un virus, elles ont un m canisme qui fait que de courts fragments de cet ADN viral sont int gr s dans leurs g nomes. Ceux-ci servent de vaccinations , en ce sens qu'ils deviennent les mod les pour produire de petits ARN non codants appel s ARNcr (ARN CRISPR) qui d truiront par la suite le virus s'il r infecte les descendants de la cellule d'origine. Cet aspect du syst me CRISPR est similaire en principe l'immunit adaptative chez les mammif res, en ce sens que la cellule porte un enregistrement des expositions pass es qui est utilis pour se prot ger contre les expositions futures. La deuxi me caract ristique distinctive du syst me CRISPR est que ces ARNc sont ensuite associ s des prot ines sp ciales qui leur permettent de rechercher et de d truire des mol cules d'ADN double brin, plut t que des mol cules d'ARN simple brin. Bien que de nombreux d tails de l'immunit m di e par CRISPR restent d couvrir, nous pouvons d crire le processus g n ral en trois tapes (Figure 7-78). Dans le premier, les s quences d'ADN viral sont int gr es dans des r gions sp ciales du g nome bact rien connues sous le nom de loci CRISPR (clustered regularly interspersed short palindromic repeat), du nom de la structure particuli re qui a d'abord attir l'attention des scientifiques. Dans sa forme la plus simple, un locus CRISPR se compose de plusieurs centaines de r p titions d'une s quence d'ADN h te entrecoup es d'une grande collection de s quences (g n ralement de 25 70 paires de nucl otides chacune) d riv es d'expositions ant rieures des virus et d'autres ADN trangers. La s quence virale la plus r cente est toujours int gr e l'extr mit 5 du locus CRISPR, l'extr mit qui est transcrite en premier. Chaque locus porte donc un enregistrement temporel des infections ant rieures. De nombreuses esp ces bact riennes et arch es portent plusieurs grands loci CRISPR dans leur g nome et sont donc immunis es contre un large ventail de virus. Dans la deuxi me tape, le locus CRISPR est transcrit pour produire une longue mol cule d'ARN, qui est ensuite transform s en ARNcr beaucoup plus courts (environ 30 nucl otides). Dans la troisi me tape, les ARNcr complex s avec des prot ines Cas (associ es CRISPR) recherchent des s quences d'ADN viral compl mentaires et dirigent leur destruction par les nucl ases. Bien que structurellement diff rentes, les prot ines Cas sont analogues aux prot ines Argonaute et Piwi discut es ci-dessus : elles contiennent de petits ARN simple brin dans une configuration tendue qui est optimis e, dans ce cas, pour rechercher et former des paires de bases compl mentaires avec l'ADN. Nous avons encore beaucoup apprendre sur l'immunit bas e sur CRISPR chez les bact ries et les arch obact ries. Le m canisme par lequel les s quences virales sont d'abord identifi es et int gr es dans le g nome de l'h te est mal compris, tout comme la fa on dont les ARNc trouvent leurs s quences compl mentaires dans l'ADN double brin. De plus, chez diff rentes esp ces de bact ries et d'arch obact ries, les ARNc sont trait s de diff rentes mani res et, dans certains cas, les ARNc peuvent attaquer les ARN viraux ainsi que les ADN. Nous verrons dans le chapitre suivant que les syst mes CRISPR bact riens ont d j t artificiellement d plac s dans les plantes et les animaux, o ils sont devenus des outils exp rimentaux tr s puissants pour manipuler les g nomes. Figure 7 78 Immunit m di e par CRISPR chez les bact ries et les arch obact ries. Apr s l'infection par un virus (panneau de gauche), un petit morceau de DnA du g nome viral est ins r dans le locus CriSpr. Pour que cela se produise, une petite fraction des cellules infect es doit survivre l'infection virale initiale. les cellules survivantes, ou plus g n ralement leurs descendants, transcrivent le locus CriSpr et traitent le transcrit en ARNcr (panneau du milieu). Lors de la r infection par un virus contre lequel la population a d j t vaccin e , l'ADN viral entrant est d truit par un ARNcr compl mentaire (panneau de droite). pour qu'un syst me CriSpr soit efficace, les crrnAs ne doivent pas d truire le locus CriSpr lui-m me, m me si les crrnAs sont compl mentaires en s quence avec celui-ci. chez de nombreuses esp ces, pour que les ARNcr attaquent une mol cule d'ADN envahissante, il doit y avoir de courtes s quences nucl otidiques suppl mentaires qui sont port es par la mol cule cible. Parce que ces s quences, connues sous le nom de pAM (protospacer adjacent motifs), se
Biologie moléculaire de la cellule	trouvent en dehors des s quences crrnA, le locus CriSpr h te est pargn (voir figure 8-55). longs ARN non codants ont diverses fonctions dans la cellule Dans ce chapitre et les pr c dents, nous avons vu que les mol cules d'ARN non codantes ont de nombreuses fonctions dans la cellule. Pourtant, comme c'est le cas pour les prot ines, il reste de nombreux ARN non codants dont la fonction est encore inconnue. De nombreux ARN de fonction inconnue appartiennent un groupe connu sous le nom d'ARN long non codant (ARNlnc). Ceux-ci sont arbitrairement d finis comme des ARN de plus de 200 nucl otides qui ne codent pas pour une prot ine. Alors que les m thodes se sont am lior es pour d terminer les s quences nucl otidiques de toutes les mol cules d'ARN produites par une lign e cellulaire ou un tissu, le nombre d'ARNlnc (estim 8000 pour le g nome humain, par exemple) a surpris les scientifiques. La plupart des ARNlnc sont transcrits par l'ARN polym rase II et ont 5 coiffes et des queues poly-A, et, dans de nombreux cas, ils sont piss s. Il a t difficile d'annoter les ARNlnc car on sait maintenant que de faibles niveaux d'ARN sont fabriqu s partir de 75 % du g nome humain. On pense que la plupart de ces ARN r sultent du bruit de fond de la transcription et du traitement de l'ARN. Selon cette id e, de tels ARN non fonctionnels n'offrent aucun avantage ou inconv nient l'organisme et sont un sous-produit tol r des mod les complexes d'expression g nique qui doivent tre produits dans les organismes multicellulaires. Pour ces raisons, il est difficile d'estimer le nombre d'ARNlnc susceptibles d'avoir une fonction dans la cellule et de les distinguer de la transcription de fond. Nous avons d j rencontr quelques ARNlnc, notamment l'ARN de la t lom rase (voir Figure 5-33), l'ARN Xist (voir Figure 7-52) et un ARN impliqu dans l'empreinte (voir Figure 7-49). D'autres ARNlnc ont t impliqu s dans le contr le de l'activit enzymatique des prot ines, l'inactivation des r gulateurs de transcription, l'affectation des mod les d' pissage et le blocage de la traduction de certains ARNm. En termes de fonction biologique, l'ARNlnc doit tre consid r comme une expression fourre-tout englobant une grande diversit de fonctions. N anmoins, il existe deux caract ristiques unificatrices des ARNlnc qui peuvent expliquer leurs nombreux r les dans la cellule. La premi re est que les ARNlnc peuvent fonctionner comme des mol cules d'ARN d' chafaudage, tenant ensemble groupes de prot ines pour coordonner leurs fonctions (Figure 7 79A). Nous avons d j vu un exemple dans la t lom rase, o la mol cule d'ARN maintient et organise les composants prot iques. Ces chafaudages base d'ARN sont analogues aux chafaudages prot iques dont nous avons discut au chapitre 3 (voir figure 3-78) et au chapitre 6 (voir figure 6-47). Les mol cules d'ARN sont bien adapt es pour servir d' chafaudages : de petits morceaux de s quence d'ARN, souvent ces portions qui forment des structures en boucle de tige, peuvent servir de sites de liaison pour les prot ines, et ceux-ci peuvent tre enfil s ensemble avec des s quences al atoires d'ARN entre les deux. Cette propri t peut tre l'une des raisons pour lesquelles les ARNlnc montrent relativement peu de conservation de la s quence primaire entre les esp ces. La deuxi me caract ristique cl des ARNlnc est leur capacit servir de s quences guides, se liant des mol cules cibles sp cifiques d'ARN ou d'ADN par appariement de bases. Ce faisant, ils rapprochent troitement l'ADN des prot ines qui leur sont li es Figure 7 79 R les de l'ARN long non codant (ARNlnc). (A) Les lncrnAs peuvent servir d' chafaudages, rassemblant des prot ines qui fonctionnent dans le m me processus. Comme d crit au chapitre 6, les ARN peuvent se replier en structures tridimensionnelles sp cifiques qui sont souvent reconnues par les prot ines. (B) en plus de servir d' chafaudages, les lncrnAs peuvent, par la formation de paires de bases compl mentaires, localiser des prot ines des s quences sp cifiques sur des mol cules d'ARN ou d'ADN DnA. (C) dans certains cas, les lncrnAs n'agissent qu'en cis, par exemple, lorsque l'arnA est maintenu en place par l'arnA polym rase (en haut). D'autres incrnA, cependant, diffusent partir de leurs sites de synth se et agissent donc en trans. (A) IncARNA IncRNA IncRNA ARN L'ARN L'ARN La polym rase contr le la transcription des g nes sur le m me chromosome contr le la transcription des g nes sur d'autres chromosomes, le chromosome A du chromosome A Le chromosome B agit en cisacts dans les s quences trans et ARN (Figure 7 79B). Ce comportement est similaire celui des snoARN (voir Figure 6-41), des ARNcr (voir Figure 7-78) et des miARN (voir Figure 7-75), qui agissent tous de cette mani re pour guider les enzymes prot iques vers des s quences d'acides nucl iques sp cifiques. Dans certains cas, les ARNlnc fonctionnent simplement par appariement de bases, sans apporter d'enzymes ou d'aut
Biologie moléculaire de la cellule	res prot ines. Par exemple, un certain nombre de g nes de lncRNA sont int gr s dans des g nes codant pour des prot ines, mais ils sont transcrits dans la mauvaise direction . Ces ARN antisens peuvent former des paires de bases compl mentaires avec l'ARNm (transcrit dans le bon sens) et bloquer sa traduction en prot ine (voir Figure 7 66D). D'autres ARNlnc antisens s'apparient avec des pr -ARNm au fur et mesure de leur synth se et modifient le mod le d' pissage de l'ARN en masquant les s quences de sites d' pissage. D'autres encore agissent comme des ponges , en appariant des bases avec des miARN et en r duisant ainsi leurs effets. Enfin, nous notons que certains ARNlnc ne peuvent agir qu'en cis ; c'est- -dire qu'ils n'affectent que le chromosome partir duquel ils sont transcrits. Cela se produit facilement lorsque l'ARN transcrit n'a pas encore t lib r des ARN polym rases (Figure 7-79C). De nombreux ARNlnc, cependant, diffusent partir de leur site de synth se et agissent en trans. Bien que les ARNlnc les mieux compris fonctionnent dans le noyau, beaucoup se trouvent dans le cytosol. Les fonctions, le cas ch ant, de la grande majorit de ces ARNlnc cytosoliques restent d couvrir. Les mol cules d'ARN ont de nombreuses utilisations dans la cellule en plus de transporter les informations n cessaires pour sp cifier l'ordre des acides amin s lors de la synth se des prot ines. Bien que nous ayons rencontr des ARN non codants dans d'autres chapitres (ARNt, ARNr, snoARN, par exemple), le nombre d'ARN non codants produits par les cellules a surpris les scientifiques. Une utilisation bien comprise des ARN non codants se produit dans l'interf rence ARN, o les ARN guides (miARN, siARN, piARN) s'apparient avec les ARNm. L'interf rence de l'ARN peut entra ner la destruction ou la r pression translationnelle des ARNm. Il peut galement provoquer l'empaquetage de g nes sp cifiques dans l'h t rochromatine, supprimant ainsi leur transcription. Chez les bact ries et les arch obact ries, l'interf rence de l'ARN est utilis e comme r ponse immunitaire adaptative pour d truire les virus qui les infectent. Une grande famille de grands ARN non codants (ARNlnc) a r cemment t d couverte. Bien que la fonction de la plupart de ces ARN soit inconnue, certains servent d' chafaudages d'ARN pour apporter des prot ines sp cifiques et comment le taux final de transcription d'un g ne est-il sp cifi par les centaines de prot ines qui s'assemblent sur ses r gions de contr le ? serons-nous jamais en mesure de pr dire ce taux partir de l'inspection des s quences DnA des r gions de contr le ? Comment l'ensemble des s quences cisr gulatrices int gr es dans un g nome orchestre-t-il le programme de d veloppement d'un organisme multicellulaire ? Quelle partie de la s quence du g nome humain est fonctionnelle et pourquoi le reste est-il conserv ? lesquels des milliers d'ARN non codants non tudi s ont des fonctions dans la cellule, et quelles sont ces fonctions ? Les introns taient-ils pr sents dans les cellules primitives (et par la suite perdus dans certains organismes), ou sont-ils apparus plus tard ? Les mol cules d'ARN s'associent pour acc l rer les r actions n cessaires. Quelles d clarations sont vraies ? Expliquez pourquoi ou pourquoi pas. 7 1 En ce qui concerne la fa on dont il interagit avec l'ADN, le motif h lice-boucle-h lice est plus troitement li au motif de la fermeture clair de leucine qu'au motif h lice-tour-h lice. 7 2 Une fois que les cellules se sont diff renci es vers leurs formes finales sp cialis es, elles ne modifient plus jamais l'expression de leurs g nes. On pense que 7 3 lots CG sont apparus au cours de l' volution parce qu'ils taient associ s des parties du g nome qui restaient non m thyl es dans la lign e germinale. Dans la plupart des tissus diff renci s, les cellules filles conservent une m moire des mod les d'expression g nique qui taient pr sents dans la cellule m re par des m canismes qui n'impliquent pas de changements dans la s quence de leur ADN g nomique. Discutez des probl mes suivants. 7 5 Une petite partie d'une repr sentation bidimensionnelle de prot ines du cerveau humain est illustr e la figure Q7 1. Ces prot ines ont t s par es en fonction de leur taille dans une dimension et de leur charge lectrique (point iso lectrique) dans l'autre. Toutes les taches de prot ines sur de tels pr sentoirs ne sont pas des produits Figure Q7 1 S paration bidimensionnelle des prot ines du cerveau humain (probl me 7 5). Les prot ines ont t affich es l'aide d'une lectrophor se sur gel bidimensionnelle. Seule une petite partie du spectre prot ique est montr e. (Avec l'aimable autorisation de Tim Myers et Leigh Anderson, Large Scale Biology Corporation.) de diff rents g nes ; Certains repr sentent des formes modifi es d'une prot ine qui migrent vers diff rentes positions. Choisissez quelques ensembles de points qui pourraient repr senter des prot ines qui diff rent p
Biologie moléculaire de la cellule	ar le nombre de phosphates qu'elles transportent. Expliquez la base de votre s lection. 7 6 Les comparaisons des mod les de niveaux d'ARNm entre diff rents types de cellules humaines montrent que le niveau d'expression de presque tous les g nes actifs est diff rent. Les mod les d'abondance de l'ARNm sont si caract ristiques du type de cellule qu'ils peuvent tre utilis s pour d terminer le tissu d'origine des cellules canc reuses, m me si les cellules peuvent avoir m tastas dans diff rentes parties du corps. Par d finition, cependant, les cellules canc reuses sont diff rentes de leurs cellules pr curseurs non canc reuses. Comment pensez-vous alors que les mod les d'expression de l'ARNm pourraient tre utilis s pour d terminer la source tissulaire d'un cancer humain ? 7 7 Quels sont les deux composants fondamentaux d'un interrupteur g n tique ?7 8 Le noyau d'une cellule eucaryote est beaucoup plus grand qu'une bact rie et contient beaucoup plus d'ADN. En tant que En cons quence, un r gulateur de transcription dans une cellule eucaryote doit tre capable de s lectionner son site de liaison sp cifique parmi beaucoup plus de s quences non apparent es qu'un r gulateur de transcription dans une bact rie. Cela pose-t-il des probl mes particuliers pour la r gulation des g nes eucaryotes ? Consid rons la situation suivante. Supposons que le noyau eucaryote et la cellule bact rienne aient chacun une seule copie du m me site de liaison l'ADN. De plus, supposons que le noyau a 500 fois le volume de la bact rie et 500 fois plus d'ADN. Si la concentration du r gulateur de transcription qui se lie au site tait la m me dans le noyau et dans la bact rie, le r gulateur occuperait-il son site de liaison aussi bien dans le noyau eucaryote que dans la bact rie ? Expliquez votre r ponse. 7 9 Certains r gulateurs de transcription se lient l'ADN et font plier la double h lice un angle aigu. De telles prot ines de courbure peuvent affecter l'initiation de la transcription sans entrer en contact direct avec d'autres prot ines. Pouvez-vous concevoir une explication plausible de la fa on dont ces prot ines pourraient fonctionner pour moduler la transcription ? Dessinez un sch ma qui illustre votre explication. Comment se fait-il que des interactions prot ine-prot ine trop faibles pour provoquer l'assemblage des prot ines en solution puissent n anmoins permettre ces m mes prot ines de s'assembler en complexes sur l'ADN ? 7 11 Imaginons les deux situations illustr es la figure Q7 2. Dans la cellule 1, un signal transitoire induit la synth se de la prot ine A, qui est un activateur de transcription qui active de nombreux g nes, y compris le sien. Dans la cellule 2, un signal transitoire induit la synth se de la prot ine R, qui est un r presseur de transcription qui d sactive de nombreux g nes, y compris le sien. Dans quelle situation, le cas ch ant, les descendants de la cellule d'origine se souviendront-ils que la cellule prog nitrice a ressenti le signal transitoire ? Expliquez votre raisonnement. la transcription active la transcription La prot ine activatrice de l'ARNm activateur active la transcription Figure Q7 2 Circuits de r gulation des g nes et m moire cellulaire (probl me 7 11). (A) induction de la synth se de l'activateur de transcription A par un signal transitoire. (B) induction de la synth se du r presseur de transcription r par un signal transitoire. 7 12 Examinez les deux pedigrees illustr s la figure Q7 3. L'un r sulte de la d l tion d'un g ne autosomique empreint de la m re. L'autre pedigree r sulte de la d l tion d'un g ne autosomique imprim par le p re. Dans les deux pedigrees, les individus atteints (symboles rouges) sont h t rozygotes pour la d l tion. Ces personnes sont affect es parce qu'une copie du chromosome porte un g ne imprim et inactif, tandis que l'autre porte une d l tion du g ne. Les symboles jaunes pointill s indiquent les individus qui portent le locus supprim , mais qui ne pr sentent pas le ph notype mutant. Quel pedigree est bas sur l'empreinte paternelle et lequel sur l'empreinte maternelle ? Expliquez votre r ponse. Figure Q7 3 : g n alogies refl tant l'empreinte maternelle et paternelle (probl me 7 12). Dans un pedigree, le g ne est imprim paternellement ; dans l'autre, il est empreint maternellement. Dans les g n rations 3 et 4, un seul des deux parents dans les accouplements indiqu s est repr sent ; L'autre parent est un individu normal qui n'est pas de ce pedigree. Les individus atteints sont repr sent s par des cercles rouges pour les femelles et des carr s rouges pour les m les. Les symboles jaunes pointill s indiquent les individus qui portent la d l tion mais ne pr sentent pas le ph notype. 7 13 Si vous ins rez un g ne de la -galactosidase d pourvu de sa propre r gion de contr le de transcription dans un groupe de g nes piARN chez la drosophile, vous constatez que l'expression de la -galactosidase partir d'une copie normale ailleurs dans le g no
Biologie moléculaire de la cellule	me est fortement inhib e dans les cellules germinales de la mouche. Si le g ne inactif de la -galactosidase est ins r l'ext rieur du groupe de g nes piARN, le g ne normal est correctement exprim . Selon vous, sur quoi se fonde cette observation ? Comment testeriez-vous votre hypoth se ? Brown tA (2007) G nomes 3. New York : Garland Science. pig n tique (2004) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 69. Gilbert Sf (2013) Biologie du d veloppement, 10e d. Sunderland, MA : Sinauer Associates, inc. hartwell l, hood l, Goldberg Ml et al. (2010) G n tique : des g nes aux g nomes, 4e d. Boston : McGraw hill. McKnight Sl & Yamamoto Kr (eds) (1993) r gulation transcriptionnelle. Cold Spring harbor, nY : Presse de laboratoire de Cold Spring Harbor. M canismes de transcription (1998) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 63. ptashne M & Gann A (2002) G nes et signaux. Cold Spring harbor, nY : Presse de laboratoire de Cold Spring Harbor. watson J, Baker t, Bell S et al. (2013) Biologie mol culaire du g ne, 7e d. Menlo park, Californie : Benjamin Cummings. Un aper u du contr le g n tique Davidson eh (2006) le g nome r gulateur : r seaux de r gulation des g nes dans le d veloppement et l' volution. Burlington, MA : elsevier. Gurdon JB (1992) la g n ration de la diversit et du mod le dans le d veloppement animal. Cellule 68, 185 199. Kellis M, Wold B, Synder Mp et al. (2014) D finition des l ments fonctionnels de l'ADN dans le g nome humain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111, 6131 6138. McKnight Sl (1991) Fermetures clair mol culaires dans la r gulation des g nes. Sci. Am. 264, 54 64. pabo CO & Sauer rt (1992) facteurs de transcription : familles structurelles et principes de reconnaissance de l'ADN DnA. Annu. R v. Biochem. 61, 1053 1095. Seeman nC, rosenberg JM & rich A (1976) Reconnaissance sp cifique la s quence des acides nucl iques en double h lice par les prot ines. Proc. Natl. Acad. Sci. tats-Unis 73, 804 808. weirauch Mt & hughes tr (2011) Un catalogue des types de facteurs de transcription eucaryotes, leur origine volutive et la distribution des esp ces. dans Un manuel de facteurs de transcription. New York, nY : Springer publishing Company. Beckwith J (1987) l'op ron : un r cit historique. dans Escherichia coli et Salmonella typhimurium : biologie cellulaire et mol culaire (neidhart fC, ingraham Jl, low KB et al. eds), vol. 2, pp. 1439-1443. Washington, DC : Presse de l'ASM. Gilbert avec M ller-hill B (1967) l'op rateur lac est DnA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 58, 2415. Jacob f & Monod J (1961) M canismes de r gulation g n tique dans la synth se des prot ines. J. Mol. Biol. 3, 318 356. levine M, Cattoglio C & tjian r (2014) Looping Back to Leap Forward : Transcription entre dans une nouvelle re. Cellule 157, 13 25. narlikar GJ, Sundaramoorthy r & Owen-hughes t (2013) M canismes et fonctions des enzymes de remodelage de la chromatine d pendantes de l'Atp. Cellule 154, 490 503. ptashne M (2004) A Genetic Switch : phage and lambda revisited, 3e d. Cold Spring harbor, nY : Cold Spring harbor laboratory press. ptashne M (1967) Liaison sp cifique du r presseur de phage lambda l'ADN lambda. Nature 214, 232-234. St Johnston D & Nusslein-Volhard C (1992) l'origine du motif et de la polarit chez l'embryon de drosophile. Cellule 68, 201 219. turner BM (2014) Signalisation des nucl osomes : un concept volutif. Biochim. Biophys. Acta 1839, 623 626. Alon U (2007) motifs de r seau : th orie et approches exp rimentales. Nature 8, 450-461. Buganim Y, faddah DA & Jaenisch r (2013) M canismes et mod les de reprogrammation des cellules somatiques. R v rend Genet. 14, 427 439. hobert O (2011) R gulation des programmes de diff renciation terminale dans le syst me nerveux. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 681 696. lawrence pA (1992) La fabrication d'une mouche : la g n tique de la conception animale. New York : Blackwell Scientific publications. Bird A (2011) r int grant l'ADN dans la m thylation de l'ADN DnA. Nat. Genet. 43, 1050 1051. Gehring M (2013) Empreinte g nomique : perspectives des plantes. Annu. R v rend Genet. 47, 187 208. lawson hA, Cheverud JM & wolf JB (2013) Empreinte g nomique et effets du parent d'origine sur des traits complexes. G n tique 14, 609 617. lee Jt & Bartolomei MS (2013) Inactivation de l'X, empreinte et longs ARN non codants dans la sant et la maladie. Cellule 152, 1308 1323. li e & Zhang Y (2014) M thylation de l'ADN chez les mammif res. Printemps froid Harb. Perspect. Biol. 6, a019133. DiGiammartino DC, nishida K & Manley Jl (2011) M canismes et cons quences de la polyad nylation alternative. Mol Cell 43, 853 866. Gottesman S & Storz G (2011) R gulateurs bact riens de petits ARN : r les polyvalents et variations en volution rapide. Printemps froid Harb. Perspect. Biol. 3, a003798. hershey JwB, Sonenberg n & Mathews MB (2012) principes de contr le translationnel : un aper u. Printemps froid Harb. Perspect. Biol. 4, a011528. hundle
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Biologie moléculaire de la cellule	r la fa on dont les nombreux composants des cellules travaillent ensemble pour produire les qualit s sp ciales de la vie. Bien que les organites et les grosses mol cules d'une cellule puissent tre visualis s au microscope, comprendre le fonctionnement de ces composants n cessite une analyse biochimique d taill e. La plupart des proc dures biochimiques n cessitent qu'un grand nombre de cellules soient physiquement perturb es pour avoir acc s leurs composants. Si l' chantillon est un morceau de tissu, compos de diff rents types de cellules, des populations cellulaires h t rog nes seront m lang es. Pour obtenir autant d'informations que possible sur les cellules d'un tissu, les biologistes ont mis au point des moyens de dissocier les cellules des tissus et de les s parer en fonction de leur type. Ces manipulations aboutissent une population relativement homog ne de cellules qui peuvent ensuite tre analys es, soit directement, soit apr s que leur nombre ait t consid rablement augment en permettant aux cellules de prolif rer en culture. Les tissus intacts constituent la source de mat riau la plus r aliste, car ils repr sentent les cellules r elles pr sentes dans le corps. La premi re tape pour isoler les cellules individuelles consiste perturber la matrice extracellulaire et les jonctions cellule-cellule qui maintiennent les cellules ensemble. cette fin, un chantillon de tissu est g n ralement trait avec des enzymes prot olytiques (telles que la trypsine et la collag nase) pour dig rer les prot ines de la matrice extracellulaire et avec des agents (tels que l'acide thyl nediaminet traac tique, ou EDTA) qui lient, ou ch latent, le Ca2+ dont d pend l'adh sion intercellulaire. Le tissu peut ensuite tre s par en cellules uniques par une l g re agitation. Pour certaines pr parations biochimiques, la prot ine d'int r t peut tre obtenue en quantit suffisante sans avoir s parer le tissu ou l'organe en types de cellules. Par exemple, la pr paration d'histones partir de thymus de veau, d'actine partir de muscle de lapin ou de tubuline partir de cerveau de vache. Dans d'autres cas, l'obtention de la prot ine souhait e n cessite un enrichissement pour un type de cellule d'int r t sp cifique. Plusieurs approches sont utilis es pour s parer les diff rents types de cellules d'une suspension cellulaire mixte. L'une des techniques de s paration cellulaire les plus sophistiqu es utilise un anticorps coupl un colorant fluorescent pour marquer des cellules sp cifiques. On choisit un anticorps qui se lie sp cifiquement la surface d'un seul type de cellule dans le tissu. Les cellules marqu es peuvent ensuite tre s par es des cellules non marqu es dans un trieur de cellules activ par fluorescence. Dans cette machine remarquable, des cellules individuelles voyageant en file indienne dans un flux fin passent travers un faisceau laser, et la fluorescence de chaque cellule est rapidement mesur e. Une buse vibrante g n re de minuscules gouttelettes, la plupart contenant soit une cellule, soit aucune cellule. Les gouttelettes contenant une seule cellule re oivent automatiquement une charge positive ou n gative au moment de leur formation, selon que la cellule qu'elles contiennent est fluorescente ; Ils sont ensuite d vi s par un fort champ lectrique dans un r cipient appropri . Des amas occasionnels de cellules, d tect s par leur diffusion accrue de la lumi re, sont laiss s non charg s et sont jet s dans un conteneur d chets. De telles machines peuvent s lectionner avec pr cision 1 cellule fluorescente dans un pool de 1000 cellules non marqu es et trier plusieurs milliers de cellules chaque seconde (Figure 8 2). Bien que les mol cules puissent tre extraites de tissus entiers, ce n'est souvent pas le plus pratique ou le plus utile source du mat riel. La complexit des tissus et des organes intacts est un inconv nient inh rent lorsqu'on essaie de purifier des mol cules particuli res. Les cellules cultiv es en culture fournissent une population plus homog ne de cellules partir desquelles extraire du mat riel, et elles sont galement beaucoup plus pratiques travailler en laboratoire. Dans un environnement appropri , la plupart des cellules v g tales et animales peuvent vivre, se multiplier et m me exprimer des propri t s diff renci es dans une bo te de culture. Les cellules peuvent tre observ es en permanence au microscope ou analys es biochimiquement, et les effets de l'ajout ou de la suppression de mol cules sp cifiques, telles que des hormones ou des facteurs de croissance, peuvent tre syst matiquement explor s. On dit parfois que les exp riences r alis es sur des cellules cultiv es sont r alis es in vitro (litt ralement, dans du verre ) pour les comparer aux exp riences utilisant des organismes intacts, qui sont dites r alis es in vivo (litt ralement, dans l'organisme vivant ). Figure 8 1 Vie microscopique. Un chantillon d'"animalcules divers vu par van Leeuwenhoek l'aide de
Biologie moléculaire de la cellule	son microscope simple. (A) Bact ries observ es dans le mat riel qu'il a exhum entre ses dents. Ceux de la figure B, il les a d crits comme nageant d'abord en avant puis en arri re (1692). (B) L'algue verte eucaryote Volvox (1700). (Avec l'aimable autorisation de la Fondation John Innes.) Ces termes peuvent cependant pr ter confusion, car ils sont souvent utilis s dans un sens tr s diff rent par les biochimistes. Dans le laboratoire de biochimie, l'in vitro fait r f rence aux r actions effectu es dans une prouvette en l'absence de cellules vivantes, tandis que l'in vivo fait r f rence toute r action ayant lieu l'int rieur d'une cellule vivante, m me si cette cellule est en culture biologique. La culture tissulaire a commenc en 1907 avec une exp rience destin e r gler une controverse en neurobiologie. L'hypoth se examin e tait connue sous le nom de doctrine neuronale, qui stipule que chaque fibre nerveuse est l'excroissance d'une seule cellule nerveuse et non le produit de la fusion de plusieurs cellules. Pour tester cette affirmation, de petits morceaux de moelle pini re ont t plac s sur du liquide tissulaire coagul dans une chambre chaude et humide et observ s intervalles r guliers au microscope. Apr s environ un jour, on pouvait voir des cellules nerveuses individuelles tendre de longs et minces filaments (axones) dans le caillot. Ainsi, la doctrine neuronale a re u un fort soutien et les bases ont t jet es pour la r volution de la culture cellulaire. Ces exp riences originales sur les fibres nerveuses ont utilis des cultures de petits fragments de tissus appel s explants. Aujourd'hui, les cultures sont plus souvent faites partir de suspensions de cellules dissoci es des tissus. Contrairement aux bact ries, la plupart des cellules tissulaires ne sont pas adapt es la vie en suspension dans un liquide et ont besoin d'une surface solide sur laquelle se d velopper et se diviser. Pour les cultures cellulaires, ce support est g n ralement fourni par la surface d'une bo te de culture en plastique. Cependant, les cellules varient dans leurs besoins, et beaucoup ne prolif rent pas ou ne se diff rencient que si la bo te de culture est recouverte de mat riaux auxquels les cellules aiment adh rer, tels que la polylysine ou les composants de la matrice extracellulaire. Les cultures pr par es directement partir des tissus d'un organisme sont appel es cultures primaires. Ceux-ci peuvent tre r alis s avec ou sans tape de fractionnement initiale pour s parer diff rents types de cellules. Dans la plupart des cas, les cellules des cultures primaires peuvent tre retir es de la bo te de culture et recultiv es plusieurs reprises dans des cultures dites secondaires ; De cette fa on, ils peuvent tre sous-cultiv s (pass s) plusieurs reprises pendant des semaines ou des mois. De telles cellules pr sentent souvent un grand nombre des propri t s diff renci es appropri es leur Figure 8 2 Un trieur de cellules activ par fluorescence. La fluorescence d'une cellule passant travers le faisceau laser est surveill e. Les gouttelettes contenant des cellules uniques re oivent une charge n gative ou positive, selon que la cellule est fluorescente ou non. Les gouttelettes sont ensuite d vi es par un champ lectrique dans des tubes de collecte en fonction de leur charge. Notez que la concentration des cellules doit tre ajust e de mani re ce que la plupart des gouttelettes ne contiennent pas de cellules et s' coulent vers un conteneur d chets avec tous les amas de cellules. Figure 8 3 Micrographies optiques de cellules en culture. (A) Fibroblastes de souris. (B) Les myoblastes de poulet fusionnent pour former des cellules musculaires multinucl es. (C) Cellules nerveuses ganglionnaires r tiniennes de rat purifi es. (D) Cellules de tabac en culture liquide. (A, avec l'aimable autorisation de Daniel Zicha ; B, avec l'aimable autorisation de Rosalind Zalin ; C, d'apr s A. Meyer-Franke et al., Neuron 15:805-819, 1995. Avec l'autorisation d'Elsevier ; D, avec l'aimable autorisation de Gethin Roberts.) origine (Figure 8 3) : les fibroblastes continuent s cr ter du collag ne ; les cellules d riv es du muscle squelettique embryonnaire fusionnent pour former des fibres musculaires qui se contractent spontan ment dans la bo te de culture ; les cellules nerveuses tendent des axones qui sont lectriquement excitables et font des synapses avec d'autres cellules nerveuses ; et les cellules pith liales forment de vastes feuillets avec de nombreuses propri t s d'un pith lium intact. Parce que ces propri t s sont maintenues en culture, elles sont accessibles l' tude d'une mani re qui n'est souvent pas possible dans les tissus intacts. La culture cellulaire ne se limite pas aux cellules animales. Lorsqu'un morceau de tissu v g tal est encapsul 50 m dans un milieu st rile contenant des nutriments et des r gulateurs de croissance appropri s, de nombreuses cellules sont stimul es pour prolif rer in
Biologie moléculaire de la cellule	d finiment de mani re d sorganis e, produisant une masse de cellules relativement indiff renci es appel e callosit . Si les nutriments et les r gulateurs de croissance sont soigneusement manipul s, on peut induire la formation d'une pousse, puis de m rist mes apicaux racinaires dans le cal et, chez de nombreuses esp ces, r g n rer une toute nouvelle plante. l'instar des cellules animales, les cultures de callosit s peuvent tre dissoci es m caniquement en cellules uniques, qui se d velopperont et se diviseront sous forme de culture en suspension (voir Figure 8-3D). Les lign es cellulaires eucaryotes sont une source largement utilis e de cellules homog nes Les cultures cellulaires obtenues en perturbant les tissus ont tendance souffrir d'un probl me : les cellules finissent par mourir. La plupart des cellules de vert br s cessent de se diviser apr s un nombre fini de divisions cellulaires en culture, un processus appel s nescence cellulaire r plicative (discut au chapitre 17). Les fibroblastes humains normaux, par exemple, ne se divisent g n ralement que 25 40 fois en culture avant de s'arr ter. Dans ces cellules, la capacit de prolif ration limit e refl te un raccourcissement et un d capage progressifs des t lom res de la cellule, des s quences d'ADN r p titives et des prot ines associ es qui coiffent les extr mit s de chaque chromosome (voir le chapitre 5). Les cellules somatiques humaines du corps ont d sactiv la production de l'enzyme, appel e t lom rase, qui maintient normalement les t lom res, c'est pourquoi leurs t lom res se raccourcissent chaque division cellulaire. Les fibroblastes humains peuvent souvent tre amen s prolif rer ind finiment en leur fournissant le g ne qui code pour la sous-unit catalytique de la t lom rase ; Dans ce cas, ils peuvent tre multipli s sous la forme d'une lign e cellulaire immortalis e . Certaines cellules humaines, cependant, ne peuvent pas tre immortalis es par cette astuce. Bien que leurs t lom res restent longs, ils cessent toujours de se diviser apr s un nombre limit de divisions, car les conditions de culture provoquent une stimulation mitog ne excessive, ce qui active un m canisme de protection mal compris (discut au chapitre 17) qui arr te la division cellulaire un processus parfois appel choc culturel . Pour immortaliser ces cellules, il faut faire plus qu'introduire de la t lom rase. Il faut galement inactiver les m canismes de protection, ce qui peut tre fait en introduisant certains oncog nes favorisant le cancer (voir le chapitre 20). Contrairement aux cellules humaines, la plupart des cellules de rongeurs n'arr tent pas la production de t lom rase et, par cons quent, leurs t lom res ne se raccourcissent pas chaque division cellulaire. Par cons quent, si le choc culturel peut tre vit , certains types de cellules de rongeurs se diviseront ind finiment en culture. De plus, les cellules de rongeurs subissent souvent des modifications g n tiques spontan es en culture qui inactivent leurs m canismes de protection, produisant ainsi des lign es cellulaires immortalis es. Les lign es cellulaires peuvent souvent tre plus facilement g n r es partir de cellules canc reuses, mais ces cultures, appel es lign es cellulaires transform es, diff rent de celles pr par es partir de cellules normales de plusieurs fa ons. Les lign es cellulaires transform es se d veloppent souvent sans se fixer une surface, par exemple, et elles peuvent prolif rer jusqu' une densit beaucoup plus lev e dans une bo te de culture. Des propri t s similaires peuvent tre induites exp rimentalement dans des cellules normales en les transformant avec un virus ou un produit chimique induisant une tumeur. Les lign es cellulaires transform es qui en r sultent peuvent g n ralement provoquer des tumeurs si elles sont inject es un animal sensible. Les lign es cellulaires transform es et non transform es sont extr mement utiles dans la recherche cellulaire en tant que sources de tr s grand nombre de cellules de type uniforme, d'autant plus qu'elles peuvent tre stock es dans de l'azote liquide -196 C pendant une p riode ind finie et conserver leur viabilit une fois d congel es. Il est important de garder l'esprit, cependant, que la cellule Les lign es diff rent presque toujours de mani re importante de leurs anc tres normaux dans les tissus dont elles sont d riv es. Certaines lign es cellulaires largement utilis es sont num r es dans le tableau 8 1. Diff rentes lignes ont des avantages diff rents ; par exemple, les lign es cellulaires pith liales PtK d riv es du rat 444 Chapitre 8 : Analyse des cellules, des mol cules et des syst mes kangourou, contrairement de nombreux autres types de cellules, restent plates pendant la mitose, ce qui permet d'observer facilement l'appareil mitotique en action. Comme nous le voyons tout au long de ce livre, les anticorps sont des outils particuli rement utiles pour la biologie cellulaire. Leur grande sp cificit
Biologie moléculaire de la cellule	permet une visualisation pr cise des prot ines s lectionn es parmi les milliers que chaque cellule produit g n ralement. Les anticorps sont souvent produits en inoculant des animaux la prot ine d'int r t, puis en isolant les anticorps sp cifiques de cette prot ine dans le s rum de l'animal. Cependant, seules des quantit s limit es d'anticorps peuvent tre obtenues partir d'un seul animal inocul , et les anticorps produits seront un m lange h t rog ne d'anticorps qui reconnaissent une vari t de sites antig niques diff rents sur une macromol cule qui diff re d'un animal l'autre. De plus, les anticorps sp cifiques de l'antig ne ne constitueront qu'une fraction des anticorps pr sents dans le s rum. Une technologie alternative, qui permet la production d'une quantit illimit e d'anticorps identiques et augmente consid rablement la sp cificit et la commodit des m thodes base d'anticorps, est la production d'anticorps monoclonaux par des lign es cellulaires d'hybridomes. Cette technologie, mise au point en 1975, a r volutionn la production d'anticorps utilis s comme outils en biologie cellulaire, ainsi que pour le diagnostic et le traitement de certaines maladies, dont la polyarthrite rhumato de et le cancer. La proc dure n cessite une technologie cellulaire hybride (Figure 8 4) et consiste propager un clone de cellules partir d'un seul lymphocyte B s cr tant des anticorps pour obtenir une pr paration homog ne d'anticorps en grande quantit . Les lymphocytes B ont normalement une dur e de vie limit e en culture, mais les lymphocytes B produisant des anticorps individuels d'une souris immunis e, lorsqu'ils sont fusionn s avec des cellules d riv es d'une lign e cellulaire de lymphocytes B transform e, peuvent donner naissance des hybrides qui ont la fois la capacit de fabriquer un anticorps particulier et la capacit de se multiplier ind finiment en culture. Ces hybridomes se propagent sous forme de clones individuels, chacun d'entre eux fournissant une source permanente et stable d'un seul type d'anticorps monoclonal. Chaque type d'anticorps monoclonal reconna t un seul type de site antig nique, par exemple, un groupe particulier de cinq ou six cha nes lat rales d'acides amin s la surface d'une prot ine. Leur sp cificit uniforme rend les anticorps monoclonaux beaucoup plus utiles que les antis rums conventionnels de nombreuses fins. Un avantage important de la technique de l'hybridome est que des anticorps monoclonaux peuvent tre fabriqu s contre des mol cules qui ne constituent qu'un composant mineur d'un m lange complexe. Dans un antis rum ordinaire fabriqu contre un tel m lange, la proportion de mol cules d'anticorps qui reconnaissent le composant mineur serait trop faible pour tre utile. Mais si les lymphocytes B qui produisent les diff rents composants de cet antis rum sont transform s en hybridomes, il devient possible de cribler des clones d'hybridomes individuels partir du grand m lange pour en s lectionner un qui produit le type d'anticorps monoclonal souhait et pour propager l'hybridome s lectionn SUSPENSION DE DEUX CELLULES Trois clones de cellules hybridesTYPES CENTRIFUG S AVEC UN AGENT DE FUSION AJOUT UN MILIEU S LECTIF FORMATION DE PROLIF RER. CES H T ROCARYONS, DEVIENNENT DES HYBRIDES, QUI SONT DES CELLULES, QUI SONT ENSUITE CULTIV ES PUIS CLON ES Figure 8 4 La production de cellules hybrides. Il est possible de fusionner une cellule avec une autre pour former un h t rocaryon, une cellule combin e avec deux noyaux s par s. En r gle g n rale, une suspension de cellules est trait e avec certains virus inactiv s ou avec du poly thyl ne glycol, chacun d'entre eux modifiant les membranes plasmiques des cellules d'une mani re qui les incite fusionner. Finalement, un h t rocaryon proc de la mitose et produit une cellule hybride dans laquelle les deux enveloppes nucl aires distinctes ont t d sassembl es, permettant tous les chromosomes d' tre r unis dans un seul grand noyau. De telles cellules hybrides peuvent donner naissance des lign es cellulaires hybrides immortelles. Si l'une des cellules parentales provenait d'une lign e cellulaire tumorale, la cellule hybride est appel e hybridome. ind finiment afin de produire cet anticorps en quantit s illimit es. En principe, un anticorps monoclonal peut donc tre fabriqu contre n'importe quelle prot ine d'un chantillon biologique. Une fois qu'un anticorps a t fabriqu , il peut tre utilis pour localiser la prot ine dans les cellules et les tissus, pour suivre son mouvement et pour purifier la prot ine afin d' tudier sa structure et sa fonction. Les tissus peuvent tre dissoci s en leurs cellules constitutives, partir desquelles des types de cellules individuels peuvent tre purifi s et utilis s pour l'analyse biochimique ou pour l' tablissement de cultures cellulaires. De nombreuses cellules animales et v g tales survivent et prolif rent dans une bo te de culture si elles disposent d'un milieu de culture
Biologie moléculaire de la cellule	appropri contenant des nutriments et des mol cules de signal appropri es. Bien que de nombreuses cellules animales cessent de se diviser apr s un nombre fini de divisions cellulaires, les cellules qui ont t immortalis es par des mutations spontan es ou des manipulations g n tiques peuvent tre maintenues ind finiment sous forme de lign es cellulaires. Les cellules d'hybridome sont largement utilis es pour produire des quantit s illimit es d'anticorps monoclonaux uniformes, qui sont utilis s pour d tecter et purifier les prot ines cellulaires, ainsi que pour diagnostiquer et traiter les maladies. Le d fi d'isoler un seul type de prot ine parmi les milliers d'autres prot ines pr sentes dans une cellule est redoutable, mais doit tre surmont afin d' tudier la fonction des prot ines in vitro. Comme nous le verrons plus loin dans ce chapitre, la technologie de l'ADN recombinant peut simplifier norm ment cette t che en incitant les cellules produire de grandes quantit s d'une prot ine donn e, ce qui facilite grandement sa purification. Que la source de la prot ine soit une cellule modifi e ou un tissu naturel, une proc dure de purification commence g n ralement par un fractionnement subcellulaire pour r duire la complexit du mat riau, puis est suivie d' tapes de purification de sp cificit croissante. Pour purifier une prot ine, elle doit d'abord tre extraite de l'int rieur de la cellule. Les cellules peuvent tre bris es de diff rentes mani res : elles peuvent tre soumises un choc osmotique ou des vibrations ultrasoniques, forc es travers un petit orifice ou broy es dans un m langeur. Ces proc dures brisent de nombreuses membranes de la cellule (y compris la membrane plasmique et le r ticulum endoplasmique) en fragments qui se referment imm diatement pour former de petites v sicules ferm es. Cependant, si elles sont effectu es avec soin, les proc dures de perturbation laissent des organites tels que les noyaux, les mitochondries, l'appareil de Golgi, les lysosomes et les peroxysomes en grande partie intacts. La suspension des cellules est ainsi r duite en une bouillie paisse (appel e homog nat ou extrait) qui contient une vari t d'organites entour s de membranes, chacun ayant une taille, une charge et une densit distinctives. condition que le milieu d'homog n isation ait t soigneusement choisi (par essais et erreurs pour chaque organite), les diff rents composants, y compris les v sicules d riv es du r ticulum endoplasmique, appel es microsomes, conservent la plupart de leurs propri t s biochimiques d'origine. Les diff rents composants de l'homog nat doivent ensuite tre s par s. De tels fractionnements de cellules ne sont devenus possibles qu'apr s la mise au point commerciale, au d but des ann es 1940, d'un instrument connu sous le nom d'ultracentrifugeuse pr parative, qui fait tourner des extraits de cellules bris es grande vitesse (figures 8-5). Ce traitement s pare les composants cellulaires en fonction de leur taille et de leur densit : en g n ral, les objets les plus volumineux subissent la plus grande force centrifuge et se d placent le plus rapidement. vitesse relativement faible, de gros composants tels que des noyaux s dimentent pour former une pastille au fond du tube de centrifugation ; une vitesse l g rement plus lev e, une pastille de mitochondries se d pose ; et des vitesses encore plus lev es et avec des p riodes de centrifugation plus longues, les petites v sicules ferm es peuvent d'abord tre collect es, puis les ribosomes (Figure 8 6). Toutes ces fractions sont impures, mais de nombreux contaminants peuvent tre limin s en remettant le granul en suspension et en r p tant plusieurs fois la proc dure de centrifugation. Figure 8 5 L'ultracentrifugeuse pr parative. (A) L' chantillon est contenu dans des tubes qui sont ins r s dans un anneau de trous cylindriques inclin s dans un rotor m tallique. La rotation rapide du rotor g n re d' normes forces centrifuges, qui font que les particules de l' chantillon se s dimentent contre les parois inf rieures des tubes d' chantillon, comme illustr ici. Le vide r duit la friction, emp chant l' chauffement du rotor et permettant au syst me de r frig ration de maintenir l' chantillon 4 C. (B) Certaines m thodes de fractionnement n cessitent un type de rotor diff rent appel rotor godet oscillant. Dans ce cas, les tubes d' chantillonnage sont plac s dans des tubes m talliques sur des charni res qui permettent aux tubes de pivoter vers l'ext rieur lorsque le rotor tourne. Les tubes d' chantillon sont donc horizontaux pendant la rotation, et les chantillons sont s diment s vers le fond, et non vers les c t s, du tube, ce qui permet une meilleure s paration des composants de diff rentes tailles (voir les figures 8-6 et 8-7). La centrifugation est la premi re tape de la plupart des fractionnements, mais elle ne s pare que les composants de taille tr s diff rente. Un degr de s paration plus fin peut tre obtenu
Biologie moléculaire de la cellule	en superposant l'homog nat en une fine bande sur une solution saline qui remplit un tube de centrifugation. Lorsqu'ils sont centrifug s, les diff rents composants du m lange se d placent sous la forme d'une s rie de bandes distinctes travers la solution, chacune une vitesse diff rente, dans un processus appel s dimentation grande vitesse (figures 8 7A). Pour que la proc dure fonctionne efficacement, les bandes doivent tre prot g es du m lange par convection, qui se produirait normalement chaque fois qu'une solution plus dense (par exemple, une solution contenant des organites) se trouve au-dessus d'une solution plus l g re (la solution saline). Ceci est r alis en augmentant la solution dans le tube avec un faible gradient de saccharose pr par par un dispositif de m lange sp cial. Le gradient de densit qui en r sulte, avec l'extr mit dense au fond du tube, maintient chaque r gion de la solution plus dense que toute solution au-dessus, et emp che ainsi le m lange convectif de fausser la s paration. Lorsqu'ils sont s diment s travers des gradients de saccharose, les diff rents composants cellulaires se s parent en bandes distinctes qui peuvent tre collect es individuellement. La vitesse relative laquelle chaque composant s dimente d pend principalement de sa taille et de sa forme, normalement d crite en termes de coefficient de s dimentation, ou valeur S. Les ultracentrifugeuses d'aujourd'hui tournent des vitesses allant jusqu' 80 000 tr/min et produisent des forces allant jusqu' 500 000 fois la gravit . Ces forces normes poussent m me les petites macromol cules, telles que les mol cules d'ARNt et les enzymes simples, s dimenter un rythme appr ciable et tre s par es les unes des autres par leur taille. L'ultracentrifugeuse est galement utilis e pour s parer les composants des cellules en fonction de leur densit flottante, ind pendamment de leur taille et de leur forme. Dans ce cas, le Figure 8 6 Fractionnement des cellules par centrifugation. Une centrifugation r p t e des vitesses de plus en plus lev es fractionnera les homog nats des cellules en leurs composants. En g n ral, plus le composant subcellulaire est petit, plus la force centrifuge n cessaire pour le s dimenter est importante. Les valeurs typiques des diff rentes tapes de centrifugation mentionn es dans la figure sont les suivantes : basse vitesse : 1000 fois gravit pendant 10 minutes vitesse moyenne : 20 000 fois gravit pendant 20 minutes haute vitesse : 80 000 fois gravit pendant 1 heure tr s haute vitesse : 150 000 fois gravit pendant 3 heures Gradient de saccharose raide (par exemple, 5 20 %) L' chantillon est s diment travers un gradient de densit abrupt qui contient une tr s forte concentration de saccharose ou de chlorure de c sium. Chaque composant de la cellule commence descendre le gradient comme dans les figures 8 7A, mais il finit par atteindre une position o la densit de la solution est gale sa propre densit . ce stade, le composant flotte et ne peut pas se d placer plus loin. Une s rie de bandes distinctes est ainsi produite dans le tube de centrifugation, les bandes les plus proches du fond du tube contenant les composants de densit de flottabilit la plus lev e (Figure 8 7B). Cette m thode, appel e s dimentation l' quilibre, est si sensible qu'elle peut s parer les macromol cules qui ont incorpor des isotopes lourds, tels que le 13C ou le 15N, des m mes macromol cules qui contiennent les isotopes communs plus l gers (12C ou 14N). En fait, la m thode au chlorure de c sium a t mise au point en 1957 pour s parer l'ADN marqu de l'ADN non marqu produit apr s l'exposition d'une population croissante de bact ries des pr curseurs nucl otidiques contenant du 15N ; cette exp rience classique a fourni des preuves directes de la r plication semi-conservatrice de l'ADN (voir Figure 5-5). Les extraits cellulaires fournissent des syst mes accessibles pour tudier les fonctions cellulaires L' tude d'organites et d'autres grands composants subcellulaires isol s dans l'ultracentrifugeuse a norm ment contribu notre compr hension des fonctions des diff rents composants cellulaires. Exp riences Sur des mitochondries et des chloroplastes purifi s par centrifugation, par exemple, ont d montr la fonction centrale de ces organites dans la conversion de l' nergie en formes utilisables par la cellule. De m me, des v sicules referm es se sont form es partir de fragments de r ticulum endoplasmique rugueux et lisse Figure 8 7 Comparaison de la s dimentation rapide et de la s dimentation d' quilibre. (A) Dans la s dimentation rapide, les composants subcellulaires s dimentent des vitesses diff rentes selon leur taille et leur forme lorsqu'ils sont superpos s sur une solution contenant du saccharose. Pour stabiliser les bandes s dimentaires contre le m lange convectif caus par de petites diff rences de temp rature ou de concentration de solut , le tube contient un gradient conti
Biologie moléculaire de la cellule	nu et peu profond de saccharose, dont la concentration augmente vers le fond du tube (g n ralement de 5 % 20 % de saccharose). Apr s la centrifugation, les diff rents composants peuvent tre collect s individuellement, le plus simplement en perforant le tube de centrifugation en plastique avec une aiguille et en recueillant les gouttes par le bas, comme illustr ici. (B) Dans la s dimentation d' quilibre, les composants subcellulaires se d placent vers le haut ou vers le bas lorsqu'ils sont centrifug s dans un gradient jusqu' ce qu'ils atteignent une position o leur densit correspond leur environnement. Bien qu'un gradient de saccharose soit montr ici, des gradients plus denses, qui sont particuli rement utiles pour la s paration des prot ines et des acides nucl iques, peuvent tre form s partir du chlorure de c sium. Les bandes finales, l' quilibre, peuvent tre collect es comme en (A). (microsomes) ont t s par s les uns des autres et analys s en tant que mod les fonctionnels de ces compartiments de la cellule intacte. De m me, des extraits cellulaires hautement concentr s, en particulier des extraits d'ovocytes de Xenopus laevis (grenouille africaine griffes), ont jou un r le essentiel dans l' tude de processus complexes et hautement organis s tels que le cycle de division cellulaire, la s paration des chromosomes sur le fuseau mitotique et les tapes de transport v siculaire impliqu es dans le mouvement des prot ines du r ticulum endoplasmique travers l'appareil de Golgi jusqu' la membrane plasmique. Les extraits cellulaires fournissent galement, en principe, la mati re premi re pour la s paration compl te de tous les composants macromol culaires individuels de la cellule. Nous examinons maintenant comment cette s paration est r alis e, en nous concentrant sur les prot ines. Les prot ines sont le plus souvent fractionn es par chromatographie sur colonne, dans laquelle un m lange de prot ines en solution est pass travers une colonne contenant une matrice solide poreuse. Diff rentes prot ines sont retard es des degr s divers par leur interaction avec la matrice, et elles peuvent tre collect es s par ment lorsqu'elles s' coulent du fond de la colonne (Figure 8-8). Selon le choix de la matrice, les prot ines peuvent tre s par es en fonction de leur charge (chromatographie changeuse d'ions), de leur hydrophobicit (chromatographie hydrophobe), de leur taille (chromatographie de filtration sur gel) ou de leur capacit se lier de petites mol cules particuli res ou d'autres macromol cules (chromatographie d'affinit ). De nombreux types de matrices sont disponibles. Les colonnes changeuses d'ions (Figure 8-9A) sont remplies de petites billes qui portent une charge positive ou n gative, de sorte que les prot ines sont fractionn es en fonction de la disposition des charges leur surface. Les colonnes hydrophobes sont remplies de billes d'o d passent des cha nes lat rales hydrophobes, retardant s lectivement les prot ines avec des r gions hydrophobes expos es. Les colonnes de filtration en gel (figures 8 et 9B), qui s parent les prot ines en fonction de leur taille, sont remplies de minuscules billes poreuses : les mol cules suffisamment petites pour p n trer dans les pores s'attardent l'int rieur des billes successives lorsqu'elles passent dans la colonne, tandis que les mol cules plus grosses restent dans la solution qui circule entre les billes et se d placent donc plus rapidement, sortant de la colonne en premier. En plus de fournir appliqu sur le dessus du r servoir de solvant appliqu Figure 8 8 S paration des mol cules par chromatographie sur colonne. L' chantillon, une solution contenant un m lange de diff rentes mol cules, est appliqu au sommet d'une colonne cylindrique de verre ou de plastique remplie d'une matrice solide perm able, telle que la cellulose. Une grande quantit de solvant est ensuite pass e lentement travers le et collect dans des tubes s par s au fur et mesure qu'il merge du fond. tant donn que les diff rents composants de l' chantillon se d placent des vitesses diff rentes dans la colonne, ils sont fractionn s en diff rents tubes. La chromatographie par filtration sur gel, un moyen pratique d'estimer leur taille, permet de s parer les mol cules. La chromatographie d'affinit (figures 8 et 9C) tire parti des interactions de liaison biologiquement importantes qui se produisent la surface des prot ines. Si une mol cule de substrat est coupl e de mani re covalente une matrice inerte telle qu'une bille de polysaccharide, l'enzyme qui op re sur ce substrat sera souvent sp cifiquement retenue par la matrice et pourra ensuite tre lu e (lav e) sous une forme presque pure. De m me, de courts oligonucl otides d'ADN d'une s quence sp cialement con ue peuvent tre immobilis s de cette mani re et utilis s pour purifier les prot ines de liaison l'ADN qui reconnaissent normalement cette s quence de nucl otides dans les chromosomes. Alte
Biologie moléculaire de la cellule	rnativement, des anticorps sp cifiques peuvent tre coupl s une matrice pour purifier les mol cules de prot ines reconnues par les anticorps. En raison de la grande sp cificit de toutes ces colonnes d'affinit , des purifications de 1000 10 000 fois peuvent parfois tre r alis es en un seul passage. Si l'on commence avec un m lange complexe de prot ines, un seul passage travers une colonne d' change d'ions ou une colonne de filtration sur gel ne produit pas de fractions tr s fortement purifi es, puisque ces m thodes augmentent individuellement la proportion d'une prot ine donn e dans le m lange de vingt fois au plus. tant donn que la plupart des prot ines individuelles repr sentent moins de 1/1000 de la prot ine cellulaire totale, il est g n ralement n cessaire d'utiliser successivement plusieurs types de colonnes diff rentes pour atteindre une puret suffisante, la chromatographie d'affinit tant la plus efficace (Figure 8 10). Les inhomog n it s dans les matrices (telles que la cellulose), qui provoquent un coulement in gal du solvant travers la colonne, limitent la r solution de la chromatographie sur colonne conventionnelle. Des r sines de chromatographie sp ciales (g n ralement base de silice) compos es de minuscules sph res (de 3 10 m de diam tre) peuvent tre emball es avec un appareil sp cial pour former un lit de colonne uniforme. Ces colonnes de chromatographie liquide haute performance (HPLC) atteignent un haut degr de r solution. Dans la HPLC, les solut s s' quilibrent tr s rapidement avec l'int rieur des minuscules sph res, et donc les solut s ayant des affinit s diff rentes pour la matrice sont efficacement s par s les uns des autres, m me des d bits tr s rapides. La HPLC est donc la m thode de choix pour s parer de nombreuses prot ines et petites mol cules. L'immunopr cipitation est une variation utile sur le th me de la chromatographie d'affinit . Des anticorps sp cifiques qui reconnaissent la prot ine purifier sont attach s de petites billes d'agarose. Plut t que d' tre emball e dans une colonne, comme dans la chromatographie d'affinit , une petite quantit de billes enrob es d'anticorps est simplement ajout e un extrait de prot ine dans un tube essai et m lang e en suspension pendant une courte p riode de temps, permettant ainsi aux anticorps de se lier la prot ine souhait e. Les billes sont ensuite collect es par centrifugation basse vitesse, et les prot ines non li es dans le surnageant sont limin es. Cette m thode est couramment utilis e pour purifier de petites quantit s d'enzymes partir d'extraits cellulaires pour l'analyse de l'activit enzymatique ou pour l' tude des prot ines associ es. bille avec substrat fix de mani re covalente Figure 8 9 Trois types de matrices utilis es pour la chromatographie. (A) Dans la chromatographie d' change d'ions, la matrice insoluble porte des charges ioniques qui retardent le mouvement des mol cules de charge oppos e. Les matrices utilis es pour s parer les prot ines comprennent la di thylamino thylcellulose (DEAE-cellulose), qui est charg e positivement, et la carboxym thylcellulose (CM-cellulose) et la phosphocellulose, qui sont charg es n gativement. Des matrices analogues base d'agarose ou d'autres polym res sont galement fr quemment utilis es. L'intensit de l'association entre les mol cules dissoutes et la matrice changeuse d'ions d pend la fois de la force ionique et du pH de la solution qui passe dans la colonne, qui peut donc tre modifi syst matiquement (comme dans la figure 8-10) pour obtenir une s paration efficace. (B) Dans la chromatographie par filtration sur gel, les petites billes qui forment la matrice sont inertes mais poreuses. Les mol cules suffisamment petites pour p n trer dans les billes de la matrice sont ainsi retard es et se d placent plus lentement dans la colonne que les plus grandes mol cules qui ne peuvent pas p n trer. Les billes de polysaccharide r ticul (dextran, agarose ou acrylamide) sont disponibles dans le commerce dans une large gamme de tailles de pores, ce qui les rend adapt es au fractionnement de mol cules de diff rentes masses mol culaires, de moins de 500 daltons plus de 5 106 daltons. (C) La chromatographie d'affinit utilise une matrice insoluble qui est li e de mani re covalente un ligand sp cifique, tel qu'une mol cule d'anticorps ou un substrat enzymatique, qui se liera une prot ine sp cifique. Les mol cules enzymatiques qui se lient des substrats immobilis s sur de telles colonnes peuvent tre lu es avec une solution concentr e de la forme libre de la mol cule de substrat, tandis que les mol cules qui se lient des anticorps immobilis s peuvent tre lu es en dissociant le complexe anticorps-antig ne avec des solutions salines concentr es ou des solutions de pH lev ou faible. Des degr s lev s de purification peuvent tre obtenus en un seul passage travers une colonne d'affinit . Regroupez ces fractions et appliquez-les la colonn

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