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Activité comparée de certains médicaments neuroleptiques (hydroxyzine, méprobamate, acépromazine et 7044 R. P. ) dans des psychoses chroniques | WMT16 | Scientific |
Étude des syphilis, gonococcies, chlamydioses et de l'infection HIV chez les adolescents consultant dans les CeGIDD extra hospitaliers du conseil départemental des Bouches-du-Rhône Hugo Magnani To cite this version : Hugo Magnani. Étude des syphilis, gonococcies, chlamydioses et de l'infection HIV chez les adoles- cents consultant dans les CeGIDD extra hospitaliers du conseil départemental des Bouches-du-Rhône. Sciences du Vivant [q-bio]. 2021. dumas-03463395 HAL Id : dumas-03463395 Submitted on 2 Dec 2021 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. Etude des syphilis, gonococcies, chlamydioses et de l'infection HIV chez les adolescents consultant dans les CeGIDD extra hospitaliers du conseil départemental des Bouches-du-Rhône T H E S E Présentée et publiquement soutenue devant LA FACULTÉ DES SCIENCES MEDICALES ET PARAMEDICALES DE MARSEILLE Le 9 Novembre 2021 Par Monsieur Hugo MAGNANI Né le 1er février 1992 à Hyeres (83) Pour obtenir le grade de Docteur en Médecine D. E. S. de MÉDECINE GÉNÉRALE Membres du Jury de la Thèse : Madame le Professeur GENTILE Stéphanie Président Monsieur le Docteur TISSOT-DUPONT Hervé Assesseur Madame le Docteur LAROCHE Hélène Assesseur Monsieur le Docteur ROBERT Jean-Luc Directeur 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Remerciements A mon Président de jury, Madame le Professeur Stéphanie GENTILE Professeur des Universités Épidémiologie, économie de la Santé et prévention Faculté de Médecine de Marseille Aix-Marseille Université Praticien Hospitalier Santé Publique Assistance Publique Hôpitaux de Marseille Vous me faites le grand honneur de juger mon travail et de présider le jury de cette thèse. Veuillez trouver ici la marque de ma gratitude et de mon profond respect. 26 À Monsieur le Docteur Hervé TISSOT-DUPONT Praticien hospitalier Épidémiologie des maladies infectieuses Responsable de l'activité pour la prise en charge des personnes vivant avec le VIH et les hépatites Institut Hospitalo-Universitaire Méditerranée Infection Assistance Publique Hôpitaux de Marseille Vous me faites l'honneur d'accepter de juger ce travail. Soyez assuré de mon profond respect. 27 À Madame le Docteur Hélène LAROCHE Praticien Hospitalier Centre d'Hémato-Immunologie Clinique Centre d'Informations et de soins de l'Immunodéficience Humaine et des hépatites Virales Centre Expert Régional CANCER et VIH Assistance Publique Hôpitaux de Marseille Je vous remercie d'avoir accepté de juger ce travail. Soyez assurée de mon respect et de ma profonde reconnaissance. 28 A mon directeur de Thèse, Monsieur le Dr Jean-Luc ROBERT Médecin spécialiste Dermatologie et vénérologie Responsable du Centre Gratuit d'Information, de Dépistage et de Diagnostic des infections par les virus de l'immunodéficience humaine, des hépatites virales et des infections sexuellement transmissibles de Saint Adrien, Marseille. Merci de m'avoir si bien accueilli en tant qu'interne au CeGIDD, de m'avoir fait part de vos connaissances sur les sujets de la santé sexuelle et des IST, et enfin de m'avoir proposé de diriger ce travail. Cela a été un honneur de travailler avec vous. 29 Je tiens également à exprimer ma reconnaissance : A Monsieur le Professeur Emmanuel CHAZARD, PU-PH de Biostatistique et Informatique Médicale à l'Université de Lille et au CHU de Lille, pour ses supports d'aide à thèse de médecine : la préparation d'une 30 Je tiens à remercier ma famille, mes piliers : - Papa, pour ta faculté à me comprendre même quand je parle peu, et à savoir m'écouter quand je parle plus ; pour tout ce que tu m'as apporté et ce que tu m'apporteras ; - Maman, pour veiller sur chacun de nous 5 et distribuer ton amour sans limite ; - Julien, Olivia, Claire et Stéphan : pour votre soutien et votre amour qui me sont si précieux et qui transparat dans le rire de chacun de mes merveilleuses et merveilleux nièces et neveux ; - Candice et Joceran : petite sœur et petit frère mais maintenant si grands, vous pourrez toujours compter sur moi. Je serai toujours là pour chacun d'entre vous. Je veux remercier mes amis de Toulon, Toulouse, Marseille et d'ailleurs, qui m'ont fait rire, chanté, dansé et m'ont accompagné sur ce long chemin : - Astrid, merci de rire à mes blagues de qualité médiocre et merci pour ton soutien indéfectible ; Bertrand, merci de rendre heureuse cette âme si belle ; - Audrey, pour nos échappées sportives et culturelles, et tes points de vue toujours intéressants sur le monde ; Armel, pour nos récentes virées sportives, j'espère qu'il y en aura d'autres ; - Alicia : nos chemins s'entrecroisent mais semblent ne jamais pouvoir trop s'éloigner ; cela fait mon bonheur, et je compte bien passer encore de nombreux moments à m'émerveiller de tout avec toi ; - Corentin, Carqueirannais VIP, exilé mais pas renié, je suis sûr qu'on se retrouvera vite aux pins penchés autour d'une partie de pétanque ou au sommet du paradis ; - Arthur, Loïc, Steevens, Q, Zine, Valentin : vous avez enchanté mes années lycée et celles qui ont suivi, mes souvenirs avec vous sont parmi les meilleurs ; j'espère vous retrouver vite ; - Simon, Sophie, Florent, Estelle, Adrien, Pierre, Capucine, Tom, Sophie et Sarah David : merci de me faire découvrir tant de choses, des univers qui me sont inconnus et qui prennent toute leur beauté à tes côtés. J'espère que nous en découvrirons beaucoup d'autres ensemble. 31 Sigles ANAES CDAG CeGIDD Agence Nationale d'Accréditation et d'Évaluation en Santé Centre de Dépistage Anonyme et gratuit Centre gratuit d'Information, de Dépistage et de Diagnostic des IST et du VIH Centre de Formation d'Apprentis CFA CIDDIST Centre d'Information, de Dépistage et de Diagnostic des IST CNS CPEF CT ECDC ECS EPGL ERAS FSF HAS HBSC HCE HSH IC95 IFOP INJEP InVS IST KABP MSM NG OMS PANP PCR PrEP RU SIDA SIS SPF TaSP TPE UNESCO Organisation des Nations Unies pour l'Éducation la Science et la Culture VIH WHO Conseil National du Sida et des hépatites virales Centre de Planification et d'Éducation Familiale Chlamydia trachomatis European Centre for Disease Prevention and Control Éducation complète à la sexualité Enquête presse gay et lesbienne Enquête rapport au sexe Femmes ayant des rapports sexuels avec des femmes Haute Autorité de Santé Health Behaviour in School-aged Children Haut conseil à l'égalité entre les femmes et les hommes Hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes Intervalle de confiance à 95% Institut Français d'Opinion Publique Institut National de la Jeunesse et de l'Éducation Populaire Institut de Veille Sanitaire Infections sexuellement transmissibles Knowledge, Attitude, Beliefs and Practices Men who have sex with men (voir HSH) Neisseria gonorrhoeae Organisation Mondiale de la Santé Pénétration anale non protégée Polymerase Chain Reaction Pre-Exposure Prophylaxis Royaume-Uni Syndrome d'immunodéficience acquise Sida Info Service Santé Publique France Treatment as prevention Traitement Post-Exposition Virus de l'immunodéficience humaine World Health Organization (voir OMS) 32 33 Sommaire Remerciements . 26 Sigles . 32 Sommaire . 34 Introduction . 37 Travail bibliographique . 38 1 Épidémiologie . 38 1. 1 Recommandations de dépistage . 38 1. 2 Épidémiologie de l'infection à Chlamydia trachomatis . 39 1. 2. 1 Épidémiologie générale . 39 1. 2. 2 Épidémiologie chez les adolescents . 41 1. 2. 3 Conclusion sur l'épidémiologie de l'infection à C. trachomatis . 46 1. 3 Épidémiologie de l'infection au gonocoque . 46 1. 3. 1 Épidémiologie générale . 46 1. 3. 2 Épidémiologie de l'infection au gonocoque chez les adolescents . 49 1. 3. 3 Conclusion sur l'épidémiologie de l'infection au gonocoque. 51 1. 4 Épidémiologie des syphilis récentes . 52 1. 4. 1 Épidémiologie générale . 52 1. 4. 2 Épidémiologie des syphilis récentes chez les adolescents . 54 1. 4. 3 Conclusion sur l'épidémiologie des syphilis récentes . 55 1. 5 Épidémiologie de l'infection par le VIH . 55 1. 5. 1 Épidémiologie générale . 55 1. 5. 2 Épidémiologie de l'infection par le VIH chez les adolescents . 57 1. 5. 3 Conclusion sur l'épidémiologie de l'infection par le VIH . 59 2 Comportements en matière de sexualité et de prévention . 60 2. 1 L'adolescence . 60 2. 1. 1 Généralités . 60 2. 1. 2 Vulnérabilités . 60 2. 2 Comportements en matière de sexualité . 61 2. 2. 1 Âge aux premiers rapports sexuels . 61 2. 2. 2 Caractéristiques des partenaires et des rapports sexuels . 62 2. 2. 3 Connaissances sur le VIH et les IST . 64 2. 2. 4 Comportements de prévention . 65 34 2. 2. 5 Sources d'informations . 67 2. 2. 6 Éducation à la sexualité . 68 2. 3 Conclusion sur les comportements en matière de sexualité . 69 Matériel et méthodes . 70 1 Design de l'étude . 70 2 Recueil de données . 70 3 Analyse des données . 71 4 Analyse statistique . 71 5 Considérations éthiques . 71 Résultats . 72 1 Chlamydia trachomatis . 72 1. 1 Adolescents (15-19 ans) . 72 1. 1. 1 Comparaisons selon le sexe . 72 1. 1. 2 Comparaisons selon l'orientation sexuelle . 74 1. 2 Adolescents (15-19 ans) versus adultes (20-24 ans et 25 ans et plus) . 75 1. 2. 1 Femmes : comparaison selon l'âge . 76 1. 2. 2 Hommes : comparaisons selon l'âge . 77 1. 2. 3 Comparaisons selon l'âge et l'orientation sexuelle . 79 2 Gonococcies . 81 2. 1 Adolescents (15-19 ans) . 82 2. 1. 1 Comparaisons selon le sexe . 82 2. 1. 2 Comparaisons selon le sexe et l'orientation sexuelle. 83 2. 2 Adolescents (15-19 ans) versus adultes (20-24 ans et 25 ans et plus) . 84 2. 2. 1 Femmes : comparaison selon l'âge . 86 2. 2. 2 Hommes : comparaisons selon l'âge . 87 2. 2. 3 Comparaison selon l'âge et l'orientation sexuelle . 88 3 Syphilis . 91 3. 1 Adolescents (15-19 ans) . 92 3. 2 Adolescents (15-19 ans) versus adultes (20-24 ans et 25 ans et plus) . 93 3. 2. 1 Comparaison selon le sexe et l'âge . 94 4 Infections par le VIH . 96 4. 1 Adolescents (15-19 ans) . 97 4. 2 Adolescents (15-19 ans) versus adultes (20-24 ans et 25 ans et plus) . 99 Discussion . 102 1 Principaux résultats . 102 35 1. 1 Objectif principal . 102 1. 2 Objectifs secondaires . 102 2 Discussion de la méthode et limites de l'étude . 103 3 Discussion des résultats. 105 3. 1 Chlamydia trachomatis . 105 3. 1. 1 Comparaison avec la littérature . 105 3. 1. 2 Interprétation . 106 3. 2 Gonocoque . 107 3. 2. 1 Comparaison avec littérature . 107 3. 2. 2 Interprétation . 107 3. 3 Syphilis. 108 3. 4 Infection par le VIH . 108 4 Perspectives . 109 4. 1 Amélioration de l'offre de dépistage . 109 4. 2 Consultation de l'adolescent et abord de la sexualité . 110 4. 3 Éducation à la sexualité . 111 4. 4 Prevention combinée. 112 Conclusion. 114 Liste des tables . 115 Liste des figures . 118 Références . 121 Serment d'Hippocrate . 129 36 Introduction Les infections sexuellement transmissibles (IST) constituent de par leur fréquence, leurs complications et l'émergence de résistances aux antibiotiques, un problème majeur de santé publique [1, 2]. Ces IST n'épargnent pas les adolescents et les jeunes adultes puisqu'elles sont de fait étroitement liées à la sexualité et ses comportements et que l'âge médian aux premiers rapport sexuels en France se situe autour de 17 ans [3]. Si l'éducation à la sexualité à l'école est une obligation légale depuis 2001, son application reste inégale sur le territoire français : en 2016, 25% des établissements scolaires interrogés déclaraient n'avoir mis en place aucune séance d'éducation à la sexualité [4]. De plus, le manque d'infirmiers scolaires, la concentration des CeGIDD (Centres Gratuits d'Information, de Dépistage et de Diagnostic de l'infection par le VIH et des IST) essentiellement dans les grandes villes et le manque de formation des médecins pour parler de sexualité, en particulier devant un public d'adolescents, sont autant de freins à l'éducation à la sexualité des jeunes [5]. Ce manque d'informations amène les adolescents à se tourner vers d'autres sources, plus ou moins éducatives comme les sites internet sur la sexualité ou la pornographie [4]. L'adolescent aurait du mal à avoir un esprit critique sur ce qu'il voit ou entend, ce qui pourrait mettre en défaut les informations nécessaires à la prévention des IST notamment. La catégorie des jeunes , incluant dans les études épidémiologiques les individus de 15 à 24 ans, est affectée de manière significative par les IST. En effet, c'est dans cette catégorie qu'on retrouve certains des taux d'infections les plus élevés (notamment les taux de diagnostics d'infections à Chlamydia trachomatis et Neisseria gonorrhoeae) [2]. Si la fréquence des IST chez les 15-24 ans est bien décrite, peu d'études en revanche s'intéressent spécifiquement aux adolescents. L'objectif principal de cette étude est de décrire les résultats des tests de dépistage et de diagnostic de quatre IST régulièrement étudiées en santé publique : les chlamydioses, gonococcies, syphilis et infection par le VIH, chez les adolescents. Pour cela, nous avons recensé les cas rapportés dans la tranche d'âge des 15-19 ans parmi les consultants des CeGIDD extra hospitaliers des Bouches-du-Rhône sur la période 2017-2021, et nous les avons comparés en fonction du sexe et de l'orientation sexuelle déclarée. L'objectif secondaire est de comparer ces résultats avec ceux observés dans la tranche d'âge des 20-24 ans et des 25 ans et plus, dans les mêmes CeGIDD et sur la même période. 37 Travail bibliographique 1 Épidémiologie En 2014 en France, les individus de 15 à 24 ans (nommés jeunes ou jeunes adultes dans les études épidémiologiques) rendaient compte de 40% des IST (VIH, syphilis, chlamydiae et gonococcies) rapportées par les réseaux de surveillance [5]. Au niveau européen ils représentaient, en 2013, 67% des cas d'infections à Chlamydia trachomatis, 39% des cas de gonococcies et 14% des cas de syphilis [6]. 1. 1 Recommandations de dépistage En 2003, l'agence nationale d'accréditation et d'évaluation en santé (ANAES, remplacée par la Haute Autorité de Santé (HAS) en 2004) recommandait le dépistage systématique de l'infection à Chlamydia trachomatis de toutes les femmes de moins de 25 ans et des hommes de moins de 30 ans consultant les centres de dépistages. En 2018, ce dépistage a été élargi à la médecine de ville : il est désormais recommandé pour toutes les femmes sexuellement actives de 15 à 25 ans, ainsi que pour les femmes et les hommes de tous âges présentant des facteurs de risque (multipartenariat c'est-à-dire au moins 2 partenaires dans l'année changement récent de partenaire, antécédent d'IST, homme ayant des rapports sexuels avec des hommes (HSH), prostitution) [7]. Par ailleurs, un dépistage combiné systématique de l'infection à Chlamydia trachomatis et de l'infection à Neisseria gonorrhoeae est souhaité. Dans les autres cas, le dépistage de l'infection à Neisseria gonorrhoea et de la syphilis est ciblé parmi les populations à risque. De plus, le dépistage de la syphilis est obligatoire chez les femmes enceintes lors du premier trimestre de grossesse. En France, les recommandations concernant le dépistage du VIH ont été mises à jour en 2017 : la Haute Autorité de Santé (HAS) préconise de proposer un dépistage au moins une fois au cours de leur vie aux individus âgés de 15 à 70 ans. Un renforcement du dépistage dans les populations cibles est également recommandé : tous les 3 mois chez les HSH et tous les ans chez les usagers de drogues intraveineuses et chez les personnes originaires de zones de forte prévalence, notamment d'Afrique sub-saharienne et des Caraïbes [8]. 38 1. 2 Épidémiologie de l'infection à Chlamydia trachomatis 1. 2. 1 Épidémiologie générale Parmi les quatre IST abordées dans cette étude, l'infection à Chlamydia trachomatis (CT) est la plus répandue dans la population générale, aussi bien chez les hommes que chez les femmes. Elle est fréquemment asymptomatique : la proportion de patients asymptomatiques au diagnostic atteint 79% en CeGIDD en 2016 [9]. Chez les hommes, elle peut se compliquer notamment d'une orchi-épididymite, d'une prostatite et d'arthrites. Chez les femmes, elle peut être responsable d'infections génitales hautes et causer des séquelles à long terme : douleurs chroniques, risque de grossesse extra-utérine et d'infertilité tubaire [10]. En France, la surveillance épidémiologique de l'infection à CT était assurée jusqu'en 2019 par un réseau de laboratoires volontaires : Renachla. Depuis le 1er janvier 2019, Renachla est remplacé par une surveillance sous forme d'enquêtes ponctuelles répétées : LaboIST [11]. En 2006, une étude nationale française ( NatChla ) retrouvait une prévalence de l'infection à CT de 1, 6% chez les femmes et de 1, 4% chez les hommes de 18 à 44 ans issus d'un échantillon représentatif de la population générale [12]. Parmi les femmes, la prévalence de l'infection à CT était maximale dans la classe d'âge des 18- 24 ans (3, 6%). Parmi les hommes, elle était comparable chez les 18-24 ans et les 25- 29 ans (respectivement 2, 4% et 2, 7%) [12]. La proportion de jeunes parmi les cas d'infections à CT s'est ensuite accentuée. En effet, les données de Rénachla en 2009 mettaient en évidence l'augmentation de la proportion de sujets âgés de moins de 25 ans parmi les femmes depuis 1997 : 43% en 1997, 56% en 2001, 61% en 2006 puis 70% en 2009. Chez les hommes, la proportion d'individus de moins de 25 ans avait peu varié de 1997 à 2005, puis a augmenté entre 2005 et 2009 (respectivement 28% puis 39% des cas) [13]. Ainsi, sur deux décennies, l'âge médian au diagnostic a baissé dans les deux sexes : il est passé de 25 ans en 1995 à 22 ans en 2013 chez les femmes, et de 30 ans en 1995 à 25 ans en 2013 chez les hommes [14, 15]. L'enquête LaboIST réalisée en 2016 a recueilli auprès de l'ensemble des laboratoires privés et publics français le nombre de diagnostics d'infections à CT. Le taux national de diagnostics a été multiplié par 3, 4 depuis 2012. Les diagnostics prédominaient parmi les femmes. Chez les femmes comme chez les hommes, les jeunes de 15- 24 ans présentaient de loin les taux de diagnostics les plus élevés (table 1) [2]. 39 Table 1. Taux de diagnostics (pour 100 000 habitants) d'infections à Chlamydia trachomatis selon la région, le sexe et l'âge (d'après LaboIST, 2016 [2]) Selon Rénachla en 2016, parmi les femmes, les jeunes de 15-24 ans représentaient 61% des cas d'infections à CT ; chez les hommes, les 15-29 ans représentaient 67% des cas déclarés [9]. Les femmes sont majoritaires dans les cas de chlamydioses déclarées par Rénachla : elles représentaient 60% des cas d'infections rapportées en 2017 [16]. Les Centres Gratuits d'Information, de Dépistage et de Diagnostic (CeGIDD) ont remplacé en 2016 les CDAG (Consultations de Dépistage Anonyme et Gratuit) et les CIDDIST (Centres d'Information, de Dépistage et de Diagnostic des IST). Les CeGIDD sont en majorité des structures hospitalières (72% contre 28% de structures non hospitalières) [17]. Les taux de positivité pour les IST, calculés en rapportant le nombre de tests positifs au nombre total de tests réalisés, y sont plus élevés qu'en population générale. En effet, les CeGIDD accueillent un public plus à risque : hétérosexuels multipartenaires (au moins 2 partenaires dans les 12 derniers mois), hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes (HSH), personnes en situation de précarité, usagers de drogues et travailleurs du sexe [17]. En CeGIDD en 2018, le taux de positivité pour l'infection à CT était de 6, 72%. Il était plus élevé chez les femmes que chez les hommes (respectivement 8, 09% contre 6, 32%, p [18]. L'enquête SurCeGIDD a analysé les caractéristiques sociodémographiques des consultants testés en 2018 [19]. Les taux de positivité les plus élevés pour l'infection à CT étaient observés chez les femmes hétérosexuelles et les HSH (respectivement 8, 35% et 8, 07% pour les consultants nés en France, 8, 86% et 10, 35% pour les consultants nés à l'étranger). Concernant les jeunes adultes, les femmes de moins de 25 ans avaient un taux de positivité plus élevé que leurs anées (respectivement 9, 57% contre 5, 45%). Parmi les 40 hommes, les moins de 30 ans présentaient le taux de positivité le plus élevé (7, 3% contre 4, 61% chez les plus de 30 ans) [18]. Cette tendance observée chez les jeunes se poursuit puisque, selon le bulletin de surveillance des IST de Santé Publique France, l'augmentation globale du nombre de diagnostics enregistrée entre 2017 et 2019 était plus marquée chez ces derniers : 41% chez les femmes de 15 à 24 ans et 45% chez les hommes de 15 à 29 ans (contre 29% dans la population générale) [20]. Cette augmentation pourrait s'expliquer par une augmentation concomitante de l'activité de dépistage ( 34% chez les femmes de moins de 25 ans et 46% chez les hommes de moins de 29 ans) et par des comportements sexuels plus à risque (cf. Comportements en matière de sexualité). 1. 2. 2 Épidémiologie chez les adolescents 1. 2. 2. 1 Proportion d'adolescents parmi les cas d'infections à C. trachomatis Les rapports successifs du réseau Rénachla mettent en évidence la proportion croissante d'adolescents parmi les cas d'infections à CT déclarées. Ainsi, en 1997, les adolescents âgés de 15 à 19 ans représentaient 9, 6% des cas d'infections à CT : 13, 2% chez les femmes et 2, 9% chez les hommes (table 2) [21]. Table 2 : Répartition des cas d'infections à C. trachomatis selon la classe d'âge et le sexe du patient, Rénachla 1997 (d'après Santé Publique France [21]) En 2002, les 15-19 ans représentaient 13, 7% des cas de chlamydioses déclarées : 18, 8% chez les femmes et 3, 3% chez les hommes (table 3) [22]. 41 Table 3. Répartition des cas positifs à C. trachomatis selon la classe d'âge et le sexe, Rénachla 2002 (d'après Goulet V et al [22] ) Puis en 2009, 18% des chlamydioses rapportées concernaient les 15-19 ans : 23% chez les femmes et 6% chez les hommes (figure 2) [13]. Figure 1. Répartition par classe d'âge et par sexe des diagnostics d'infection à C. trachomatis, Rénachla 2009 (d'après Goulet V et al [13]) Enfin en 2015, la part des 15-19 ans semble s'être stabilisée : chez les femmes elle est d'environ 20% et chez les hommes 6, 5% (figure 3) [23]. 42 Figure 2. Distribution des infectons à C. trachomatis par classe d'âge selon le sexe, Rénachla 2015 (d'après Santé Publique France [23]) Une étude espagnole a répertorié l'ensemble des cas de chlamydioses déclarées par les laboratoires et les cliniciens entre 2012 et 2017 en Catalogne ; les adolescents de 13-19 ans représentaient 13, 4% des cas (n 2030/15170) [24] 1. 2. 2. 2 Taux de positivité de l'infection à C. trachomatis chez les adolescents En 2002, l'institut de veille sanitaire a recueilli les données des centres de dépistage anonymes et gratuits (CDAG) sur une période de 2 ans et 7 mois. Les effectifs sont cependant assez faibles. Ainsi, dans les CDAG, parmi les 15-19 ans, le taux de positivité était de 10% (n 35/350) chez les femmes et de 10, 8% (n 9/83) chez les hommes (contre 7, 3% chez les femmes et 8, 5% chez les hommes de 20-24 ans) (table 4) [25]. Table 4. Taux de positivité à C. trachomatis par classe d'âge et par sexe en CDAG, 2002 (d'après Georges S et al [25]) 43 L'enquête SurCeGIDD a analysé les caractéristiques sociodémographiques des consultants des CeGIDD en 2018. Elle mettait en évidence un taux de positivité de 8, 2% chez les filles de moins de 20 ans et de 4, 8% chez les garçons de moins de 20 ans (figure 4) [19]. Figure 3. Proportion de consultants testés et taux de positivité de l'infection à C. trachomatis selon le sexe et l'âge, SurCeGIDD 2018 (d'après Santé Publique France [19]) 1. 2. 2. 3 Prévalence de l'infection à C. trachomatis chez les adolescents En France, quelques études ont estimé la prévalence de l'infection à CT chez les adolescents consultant les centres de prévention, avec des effectifs relativement faibles. En 1999, dans une étude réalisée dans les centres de planification et d'éducation familiale (CPEF) du Val-de-Marne, la prévalence chez les consultantes âgées de 13 à 19 ans était de 8, 2% (n 29/352) (table 5) [26]. Table 5. Prévalence de l'infection à C. trachomatis, CPEF du Val-de-Marne, France, 1999 (d'après Prudhomme et al [26]) Dans une autre étude réalisée dans les CPEF de Seine-Saint-Denis en 2005, on observait une prévalence de l'infections à CT de 10, 7% (n 23/214) chez les consultantes âgées de 13 à 19 ans (versus 11, 4% chez les femmes de 20-25 ans, n 38/332). L'étude n'avait pas pu mettre en évidence de différence significative selon l'âge (table 6) [27]. 44 Table 6. Prévalence de l'infection à C. trachomatis chez les jeunes consultants de 42 CPEF de Seine-Saint-Denis, France, 2005 (d'après Santé Publique France[27]) Une étude réalisée dans un CeGIDD parisien a dépisté pour l'infection à C. trachomatis tous les consultants de sexe masculin âgés de moins de 30 ans, entre avril et décembre 2016. La prévalence s'élevait à 4, 1% (n 3/73) chez les moins de 20 ans (contre 6, 7% chez les 20-24 ans, n 17/254). L'étude n'a pas pu mettre en évidence de différence statistiquement significative selon l'âge (table 7) [28]. Table 7. Prévalence de l'infection à C. trachomatis dans un CeGIDD parisien, 2016 (d'après Rondeau et al [28]) Le Royaume-Uni (RU) présente des caractéristiques démographiques comparables à celles de la France. Le profil épidémiologique des IST et son évolution sont voisins de ceux observés en France, avec notamment une augmentation de la proportion d'infections à CT chez les jeunes [5]. Le système de surveillance britannique jouit cependant d'une forte exhaustivité : il dispose des données de l'ensemble des laboratoires ainsi que de celles de la médecine de ville et hospitalière, qui sont ensuite croisées avec les données sociodémographiques [5]. La prévalence globale chez les 16-44 ans, estimée en 2012 dans une enquête nationale, était proche de celle retrouvée en France en 2006 : 1, 5% [1, 1 ; 2, 0] chez les femmes et 1, 1% [0, 7 ; 1, 6] chez les hommes. Parmi les 16-19 ans, elle était de 3, 8% [2, 2 ; 6, 3] chez les femmes et 0, 3% [0, 1 ; 1, 3] chez les hommes (table 8) [29]. 45 Table 8. Prévalence de l'infection à C. trachomatis selon l'âge, Royaume-Uni, 2012 (d'après Sonnenberg et al [30]) 1. 2. 3 Conclusion sur l'épidémiologie de l'infection à C. trachomatis Les diagnostics d'infections à CT concernent de plus en plus les jeunes de 15-24 ans, reflétant le ciblage du dépistage dans cette catégorie et probablement aussi une progression de l'épidémie, selon Santé Publique France [2]. Les adolescents de 15 à 19 ans représentaient, en 2009, 18% des cas (23% chez les femmes et 6% chez les hommes) : cette proportion est en nette progression depuis la fin des années 1990 mais semble relativement stable depuis 2010. En population générale, au Royaume-Uni, la prévalence chez les adolescents de 16- 19 ans était de 3, 8% chez les femmes et 0, 3% chez les hommes. Le taux de positivité parmi les individus de moins de 20 ans consultant les CeGIDD était de 8, 2% chez les filles et 4, 8% chez les garçons en 2018. 1. 3 Épidémiologie de l'infection au gonocoque 1. 3. 1 Épidémiologie générale La surveillance des infections à Neisseria gonorrhoeae (NG) en France est réalisée grâce aux données des enquêtes LaboIST (qui remplacent le réseau de laboratoires Rénago depuis 2019) et du réseau de cliniciens RésIST (exerçant principalement en CeGIDD) [31]. Les infections à NG sont moins souvent asymptomatiques que les infections à Chlamydia trachomatis : en 2018, 57% des cas déclarés par le réseau RésIST concernaient des patients asymptomatiques [31]. Selon Nguyen É et al, cette caractéristique et son temps d'incubation court en font un bon reflet du comportement sexuel de la population testée : une augmentation de la prévalence des gonococcies indiquerait un relâchement dans les mesures de protection ou un moins bon accès aux soins [32]. Les infections à NG peuvent aussi se compliquer d'infections génitales hautes et facilitent la transmission du VIH [33]. 46 Les gonococcies font l'objet d'une surveillance particulière concernant la sensibilité des souches aux antibiotiques. Au début des années 2000, parallèlement à une forte hausse des cas de gonococcies déclarées chez les hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes (HSH) et chez les hétérosexuels masculins et féminins, une augmentation rapide de la résistance à la ciprofloxacine a amené à revoir les recommandations thérapeutiques et à préconiser la ceftriaxone en première intention [32]. Depuis, deux souches résistantes à la ceftriaxone ont été caractérisées en France : l'une en 2017 et l'autre en 2019 [31]. La proportion de jeunes de 15-24 ans parmi les diagnostics de gonococcies déclarés via Rénago a constamment augmenté, passant de 29% sur la période 2001- 2009 à 47% en 2012 (table 9) [34]. Table 9. Proportion des cas d'infections à C. trachomatis selon le sexe et la classe d'âge, Rénago 2001-2012 (d'après Ruche et al [34]) Par ailleurs, entre 2014 et 2016, le nombre d'infections à NG a connu une forte augmentation tous âges et toutes orientations sexuelles confondus : 127% chez les HSH, 40% chez les hommes hétérosexuels et 20% chez les femmes hétérosexuelles [9, 35]. Cette augmentation a particulièrement concerné les HSH, y compris les jeunes âgés de moins de 25 ans (figure 5) [36]. 47 Figure 4. Évolution du nombre de gonococcies déclarées entre 2004 et 2016 par RésIST (d'après Santé Publique France [35]) En 2016, selon l'enquête LaboIST, le taux national de diagnostic (91/100 000 habitants) a été multiplié par 3, 3 entre 2012 et 2015. Chez les hommes comme chez les femmes, les jeunes de 15-24 ans avaient le taux de diagnostic le plus élevé (table 10) [2]. Table 10. Taux de diagnostics (pour 100 000 habitants) d'infections à gonocoque selon la région, le sexe et l'âge (d'après LaboIST, 2016 [2]) Ainsi, cette tendance se retrouve dans l'âge médian au diagnostic qui a baissé sur les deux dernières décennies : chez les femmes, il est passé de 29 ans en 2002 à 21 ans en 2018 ; chez les hommes, il est passé de 32 ans en 2002 à 29 ans en 2018 [31, 37]. 48 En CeGIDD, entre 2016 et 2018, le nombre d'infections à NG a augmenté de 75%. L'activité de dépistage a aussi augmenté de 75% ; le taux de positivité est donc resté stable à 2, 92%. Il était significativement plus élevé chez les hommes que chez les femmes (respectivement 3, 83% contre 1, 23%, p [18]. Parmi les consultants nés en France, les hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes (HSH) avaient le taux de positivité le plus élevé (9, 35% contre 1, 94% chez les hétérosexuels) [19]. Plus récemment en 2019, le nombre d'infections à NG déclarées par RésIST, à sites constants, a de nouveau augmenté ( 21% par rapport à 2017) [20]. Cela concernait surtout les HSH ( 29%) alors que chez les hétérosexuel. le. s, après une augmentation de 29% entre 2016 et 2018[31], le nombre de cas déclarés était stable en 2019 [20]. Cette augmentation est à pondérer avec l'activité de dépistage qui a également augmenté de 58% globalement entre 2017 et 2019. Cependant, l'augmentation des cas symptomatiques ne permet pas d'écarter une progression de l'épidémie, particulièrement chez les HSH. Ainsi en 2019, les hommes représentaient 86% des cas déclarés, et 74% de l'ensemble des gonococcies concernaient des HSH [20]. 1. 3. 2 Épidémiologie de l'infection au gonocoque chez les adolescents En 2002 d'après les données de Rénago, les adolescents de 15-19 ans représentaient 17, 7% des cas chez les femmes et 2% des cas déclarés chez les hommes (table 11) [37]. Table 11. Proportion d'infections à gonocoque selon le sexe et la classe d'âge, Rénago 2001-2002 (d'après Herida et al [37]) 49 Cette proportion semble plus importante en 2013 d'après les données du réseau RésIST : les adolescents de moins de 20 ans représentaient 27, 8% des cas chez les femmes et 6, 3% des cas de gonococcies déclarées chez les hommes (figure 6) [38]. Figure 5. Distribution des cas de gonococcies par classe d'âge selon le sexe, RésIST 2013 (d'après Santé Publique France [38]) Plus récemment, en Espagne, deux études se sont intéressées aux gonococcies chez les adolescents. Dans une étude réalisée à Barcelone entre 2007 et 2015, parmi les individus âgés de 15 à 24 ans, les femmes de 15-19 ans représentaient 36, 3% (N 45/124) des cas et les hommes de 15-19 ans représentaient 21, 5% (n 109/508) des cas [39]. Une autre étude espagnole a répertorié l'ensemble des gonococcies déclarées en Catalogne entre 2012 et 2017. Les adolescents de 13-19 ans représentaient 7% des cas recensés (n 813/11 566) [24]. En France, l'enquête SurCeGIDD, réalisée en 2018, a analysé les caractéristiques sociodémographiques des personnes diagnostiquées pour une infection à NG en CeGIDD. Les adolescents de moins de 20 ans avaient un taux de positivité d'environ 1, 8% chez les femmes et 2, 1% chez les hommes. Les taux de positivité les plus élevés étaient observés chez les 30-39 ans pour les hommes et chez les moins de 20 ans pour les femmes (figure 7) [19]. 50 Figure 6. Proportion de consultants testés et taux de positivité de l'infection à gonocoque selon le sexe et l'âge, SurCeGIDD 2018 (d'après Santé Publique France [19]) En Europe, en 2018, on observe une distribution similaire en fonction de l'âge : les 20- 24 ans ont le taux de déclaration le plus élevé (112/100 000 habitants) et, chez les adolescents de 15-19 ans, il est plus élevé chez les femmes (66/100 000 habitants) que chez les hommes (47/100 000 habitants) (figure 8) [40]. Figure 7. Distribution des cas de gonococcies pour 100 000 habitants selon l'âge et le sexe en Europe, ECDC 2018 [41] 1. 3. 3 Conclusion sur l'épidémiologie de l'infection au gonocoque Les jeunes, notamment les hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes (HSH), semblent donc de plus en plus impliqués dans les diagnostics de gonococcies. Chez les adolescents, les femmes semblent majoritaires alors que la plupart des diagnostics chez les adultes concernent des hommes. Les 15-19 ans représentaient 17, 7% des diagnostics chez les femmes et 2% des diagnostics chez les hommes en France en 2002. Le taux de positivité de l'infection à NG chez ces adolescents était de 2, 1% chez les garçons et de 1, 8% chez les filles en CeGIDD en 2018. 51 1. 4 Épidémiologie des syphilis récentes 1. 4. 1 Épidémiologie générale Les syphilis récentes correspondent aux cas dont l'évolution est inférieure à un an : elles regroupent les syphilis primaires, secondaires et latentes précoces. L'infection par le Treponema pallidum peut se compliquer de formes graves (neurosyphilis et syphilis congénitale) et facilite la transmission du VIH via les ulcérations et l'inflammation locale qu'elle provoque [42]. En France, les données permettant de suivre l'épidémiologie des syphilis proviennent du réseau RésIST constitué de cliniciens volontaires exerçant pour la majorité en CeGIDD [20]. La proportion d'asymptomatiques parmi les diagnostics était estimée à 45% en 2018[31]. L'épidémie de syphilis a connu une forte recrudescence à partir des années 2000. Cela a concerné essentiellement les hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes (HSH), y compris les jeunes de moins de 25 ans. Ainsi, les données du réseau RésIST montrent la nette augmentation du nombre de cas déclarés chez les HSH de moins de 25 ans entre 2005 et 2015 suivie d'une stabilisation (figure 9). L'évolution du nombre de cas est similaire chez les adultes de 25 ans et plus, avec une forte augmentation chez les HSH dès les années 2000-2001 et jusqu'à 2015 [36]. Figure 8. Évolution du nombre de syphilis déclarées entre 2000 et 2016 par RésIST (d'après Ndeikoundam et al [36]) La syphilis est une IST qui touche majoritairement une population adulte : en 2017, le CNS estimait que 90% des cas de syphilis surviennent chez les individus de plus de 20 ans [5]. Selon Santé Publique France en 2018, parmi les femmes, les classes d'âge les plus représentées étaient les 20-30 ans (47%) puis les moins de 20 ans (19%). Chez les hommes, il s'agissait des 20-30 ans (31%) et des 30-40 ans (28%) [31]. 52 En CeGIDD, le taux de positivité pour la syphilis était de 1, 43% en 2018 (contre 1, 54% en 2017, p 0, 005). Ce taux était 7 fois plus élevé chez les hommes que chez les femmes (respectivement 2, 02% contre 0, 29%) [18]. Il était plus élevé chez les HSH que chez les hommes hétérosexuels et les femmes hétérosexuelles (respectivement 3, 33%, 0, 59% et 0, 17%) [19]. Ainsi les hommes, et surtout les HSH, sont les plus concernés par la syphilis : ils représentaient respectivement 92% et 80% des cas en 2019 selon Santé Publique France [20]. En 2019, après une phase de stabilisation entre 2015 et 2018, le nombre de syphilis déclarées par le réseau RésIST - à sites constants - a baissé de 7% par rapport à 2018, malgré une augmentation de l'activité de dépistage dans le secteur privé ( 22% entre 2017 et 2019) [20]. Cette baisse concerne notamment les HSH, chez qui elle s'est amorcée en 2015 après presque deux décennies d'augmentation [9] ; elle concerne également les hommes hétérosexuels chez qui le nombre de syphilis déclarées avait augmenté de 75% entre 2013 et 2015. Chez les femmes hétérosexuelles, le nombre de syphilis déclarées est stable sur la période 2017-2019, après une augmentation de 85% entre 2013 et 2015 (figure 10) [43]. Figure 9. Évolution du nombre de cas de syphilis récentes déclarées par RésIST selon l'orientation sexuelle, 2012-2019 (d'après Ngangro et al [43]) Concernant les jeunes de 15 -24 ans, le centre européen de prévention et de contrôle des maladies (ECDC) estimait en 2019 qu'ils représentaient 15, 1% de l'ensemble des cas de syphilis en France [41]. Globalement sur les deux dernières décennies, l'âge médian au diagnostic est plutôt stable chez les hommes : il était de 36 ans en 2002-2004 et de 35 ans en 2019. Chez les femmes, il est passé de 31, 5 ans en 2002-2004 à 28 ans en 2019 [20, 44]. 53 1. 4. 2 Épidémiologie des syphilis récentes chez les adolescents En 2013, d'après les données du réseau RésIST, les filles et les garçons de moins de 20 ans représentaient respectivement 19% et 2, 6% de l'ensemble des cas rapportés par le réseau (figure 11) [38]. Figure 10. Distribution des cas de syphilis récentes par classes d'âge selon le sexe, RésIST 2013 (d'après Santé Publique France [38]) Sentis et al [39], ont analysé les caractéristiques sociodémographiques des cas de syphilis déclarés à Barcelone entre 2007 et 2015. Parmi les hommes de 15-24 ans, les adolescents âgés de 15 à 19 ans représentaient 13, 2% des cas (n 31/235). Chez les femmes de 15-24 ans, les 15-19 ans représentaient 19, 4% des cas (n 6/31). Dans l'étude de Vives et al [24], les adolescents âgés de 13 à 19 ans représentaient 1, 8% (117/6539) de l'ensemble des cas de syphilis recensés entre 2012 et 2017 en Catalogne. Parmi ces adolescents, on comptait 78% d'hommes et 61% de HSH. Les taux de positivité pour la syphilis chez les adolescents sont parmi les plus bas. En CeGIDD en 2018, le taux de positivité chez les adolescents de moins de 20 ans est inférieur à 0, 5% dans les deux sexes. Chez les hommes, c'est la catégorie o le taux de positivité était le plus bas (figure 12) [19]. 54 Figure 11. Proportion de consultants testés et taux de positivité pour la syphilis selon le sexe et l'âge, SurCeGIDD 2018 (d'après Santé Publique France [19]) 1. 4. 3 Conclusion sur l'épidémiologie des syphilis récentes La syphilis est une IST qui prédomine chez les hommes et particulièrement les hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes (HSH), et dans les classes d'âge élevé. Comme parmi les adultes de plus de 25 ans, le nombre de cas chez les HSH de moins de 25 ans a fortement augmenté entre 2005 et 2015 avant de se stabiliser. Les adolescents sont minoritairement représentés dans les différentes études. En 2017, 90% des cas concernaient les adultes de plus de 20 ans. Dans une étude catalane, les 15-19 ans représentaient 1, 8% des cas déclarés entre 2012-2017. 1. 5 Épidémiologie de l'infection par le VIH 1. 5. 1 Épidémiologie générale Les données sur l'activité de dépistage et le nombre de d'infections sont issues de l'enquête LaboVIH d'une part et de la déclaration obligatoire réalisées par les biologistes et les cliniciens d'autre part [45]. Le nombre de découvertes de séropositivité a connu une augmentation entre 2003 et 2012 avant de se stabiliser. Cela a particulièrement concerné les jeunes de 15-24 ans chez qui le nombre de découvertes a été multiplié par 2, 7 entre 2003 et 2012 ; par comparaison, il a été multiplié par 1, 3 chez les plus de 25 ans sur la même période [46]. Ensuite, après une période de stabilité entre 2013 et 2017, le nombre de découvertes de séropositivité VIH en 2018 a diminué de 7% par rapport à 2017, malgré une augmentation de l'activité de dépistage [20]. Cependant cette baisse n'a pas concerné toutes les catégories de la population. En effet, si on observe, entre 2013 et 2018, une diminution du nombre de découvertes de séropositivité VIH chez les hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes (HSH) nés en France (-16%) et chez les hétérosexuel. le. s né. e. s en France (-22%), le nombre de découvertes a augmenté chez les HSH nés à l'étranger ( 38%) et il est resté stable sur la même période chez les hétérosexuel. le. s né. e. s à l'étranger. Notons 55 cependant que la baisse observée chez les HSH nés en France ne concerne pas les moins de 25 ans (figure 13) [45]. Figure 12. Évolution du nombre de découverte de séropositivité VIH selon le sexe, l'orientation sexuelle, l'âge et le lieu de naissance, 2010-2018 (d'après Santé Publique France [45]) En 2018, d'après Santé Publique France, 13% des cas de séropositivité étaient observés chez des jeunes de moins de 25 ans. Cette proportion était plus importante chez les HSH que chez les hétérosexuels (respectivement 18% contre 11% des cas avaient moins de 25 ans) [20]. En PACA, la proportion de jeunes de 15-24 ans parmi les découvertes de séropositivité a augmenté entre 2013-2016 et 2018, passant de 9, 8% à 12, 3% (table 12) [47]. Table 12. Distribution des cas de découverte de séropositivité en PACA selon l'âge, 2013-2016, 2017, 2018 (d'après Santé Publique France [47]) En 2018, 65% des découvertes de séropositivité concernaient des hommes. Les HSH représentaient en tout 43% des cas [45]. 56 En CeGIDD en 2018, le taux de positivité des sérologies VIH était de 0, 38% (contre 0, 45% en 2016, p Il était significativement plus élevé chez les hommes que chez les femmes (respectivement 0, 43% contre 0, 30%, p En PACA, le taux de positivité des sérologies VIH était de 0, 29% en 2018 contre 0, 41% en 2016 [18]. D'après les données individuelles de l'enquête SurCeGIDD en 2018, les taux de positivité les plus élevés étaient observés chez les HSH nés en France (0, 87%) et à l'étranger (2, 23%) [19]. 1. 5. 2 Épidémiologie de l'infection par le VIH chez les adolescents En 2013, d'après Lot F et al, les adolescents de 15-17 ans représentaient 0, 66% (n 41/6220) des découvertes de séropositivité VIH ; dans la catégorie des 15-24 ans, ils représentaient 5, 6% des cas (n 41/727). La catégorie des adolescents de 15-17 ans était la seule parmi laquelle les diagnostics de séropositivité prédominaient chez les femmes : elles y représentaient 65% des découvertes. Les HSH représentaient 17, 4% des découvertes chez les 15-17 ans [48]. L'évolution du nombre de découvertes de séropositivité montre une relative stabilité chez les adolescents sur la période 2009-2013, alors qu'une tendance à la hausse est observée chez les homme de 18-24 ans (figure 14) [48]. Figure 13. Évolution du nombre de cas de découvertes de séropositivité VIH chez les jeunes de 18 à 24 ans selon le sexe, et chez les adolescents de 15 à 17 ans, 2003-2013 (d'après Lot F et al [48]) Selon l'ECDC, les adolescents de 15-19 ans représentaient 1, 8% des cas d'infections au VIH rapportées en 2013 en France (figure 15) [41]. 57 Figure 14. Distribution des cas d'infection par le VIH rapportés en 2013 en France selon la classe d'âge (d'après l'atlas des maladies infectieuses, ECDC[41]) Le taux de positivité des sérologies VIH chez les moins de 20 ans consultant en Centre de Dépistage Anonyme et Gratuit (CDAG) entre 2011 et 2015 était estimé à 0, 07% : 0, 04% parmi les filles et 0, 12% parmi les garçons [49]. D'après l'enquête SurCeGIDD, en 2018, les moins de 20 ans avaient le taux de positivité le plus faible chez les hommes comme chez les femmes (figure 16) [19]. Figure 15. Proportion de consultants testés et taux de positivité pour l'infection par le VIH selon le sexe et l'âge, SurCeGIDD 2018 (d'après Santé Publique France [19]) À l'échelle européenne, en 2019 et d'après l'ECDC, le taux de découverte de séropositivités est stable depuis une décennie chez les adolescents de 15-19 ans. Chez les jeunes hommes de 20-24 ans, après une ascension progressive et un pic en 2015, ce taux semble diminuer sensiblement (figure 17) [50]. 58 Figure 16. Évolution des découvertes de séropositivité en Europe chez les hommes et chez les femmes, 2010-2019 (d'après ECDC [50]) 1. 5. 3 Conclusion sur l'épidémiologie de l'infection par le VIH Globalement l'infection au VIH semble concerner essentiellement les adultes de plus de 25 ans, les hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes (HSH) et les personnes nées à l'étranger. La proportion d'adolescents parmi les découvertes de séropositivité semble stable depuis une décennie, de même que le taux de positivité dans cette tranche d'âge. Les adolescents de 15-19 ans représentent une part relativement faible des infections par le VIH : 1, 8% des cas déclarés en 2013 selon l'ECDC. Le taux de positivité en CDAG entre 2011 et 2015 était estimé à 0, 07% chez les 15- 19 ans. En 2013, la catégorie des adolescents était la seule parmi laquelle les découvertes de séropositivité prédominaient chez les femmes. 59 2 Comportements en matière de sexualité et de prévention 2. 1 L'adolescence 2. 1. 1 Généralités L'adolescence est une période de transition qui débute à la puberté et se termine au début de l'âge adulte. Plusieurs définitions lui sont attribuées. Pour l'OMS, l'adolescence s'étend de 10 à 19 ans et est marquée par une vitesse de croissance et de modifications physiques et psychologiques jamais rencontrées depuis la petite enfance [51]. Deux grandes périodes peuvent être distinguées au sein de l'adolescence : une première de 10 à 14 ans et une seconde de 15 à 19 ans [52]. D'autres auteurs, comme le Dr Devernay, situent la fin de l'adolescence entre 17 et 21 ans [53]. Considérant que les adolescents sont le plus souvent envisagés comme les individus âgés de 15 à 19 ans dans les études épidémiologiques, y compris par l'OMS [54], nous avons choisi de nous intéresser à cette tranche d'âge. Au 1er janvier 2021, les adolescents de 15-19 ans représentaient 6, 2% de la population nationale (soit 4, 2 millions d'individus) [55]. 2. 1. 2 Vulnérabilités L'adolescence est marquée par les modifications physiques, cognitives et psychologiques suivantes [52, 53] : Sur le plan physique : o L'acquisition des caractères sexuels secondaires : pilosité pubienne puis axillaire, développement mammaire chez les filles, modification du timbre de la voix et croissance staturale ; o La survenue des premières règles (ménarche) chez les filles ; o La modification de la vulve chez les filles et la croissance de la verge et des testicules chez les garçons. Sur le plan cognitif : o Le développement de la capacité d'abstraction et du raisonnement hypothético-déductif ; o Une réflexion morale plus approfondie ; o La recherche des interactions sociales. Sur le plan psychologique : o Un processus d'individuation et une volonté d'autonomisation avec une tendance à la distance envers les parents ; o Une phase d'expérimentation et de prise de risques afin d'accéder à la construction de l'identité ; o Une augmentation de l'intérêt pour la sexualité ; o Ainsi qu'une dichotomie entre la nécessité d'accompagnement et de liberté marquée par un besoin de plus d'autonomie mais aussi par la recherche d'un milieu familial sécurisant. 60 temps qu'apparaissent L'adolescent est donc dans un processus de construction d'une identité qui implique d'explorer et expérimenter son environnement. L'intérêt pour la sexualité grandit en même les changements physiques, cognitifs et psychologiques, et fait natre chez lui des questionnements légitimes. Les réponses qu'il peut trouver dans sa quête d'informations lui permettront d'affirmer son libre arbitre et d'exister en tant qu'individu propre, avec ses choix personnels (processus de séparation-individuation ) [56]. Ainsi, bien que cette période marque le champ de tous les possibles, il s'agit également d'un moment de prise de risques, durant laquelle les modes de comportement qui s'installent peuvent avoir des effets durables sur les comportements et la santé futurs[51]. 2. 2 Comportements en matière de sexualité 2. 2. 1 Âge aux premiers rapports sexuels En 2016, l'enquête Baromètre Santé a interrogé par téléphone un échantillon de 15 000 personnes âgées de 15 à 75 ans. Les résultats montrent que l'âge médian au premier rapport sexuel est stable en France depuis plus d'une décennie : il est de 17, 0 ans chez les hommes et 17, 6 ans chez les femmes interrogés en 2016 (figure 18)[3]. Chez les hommes homo- et bisexuels, l'âge au premier rapport avec un homme est plus tardif et il est stable depuis plus d'une décennie : il se situe autour de 18 ans d'après l'enquête Presse Gay en 2011 (échantillon de 10 000 hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes interrogés via un questionnaire auto-administré diffusé sur internet) [57]. Si l'écart d'âge au premier rapport sexuel entre filles et garçons s'est réduit au cours du temps, les premiers rapports gardent des particularités selon le sexe. Ainsi, les filles sont moins nombreuses que les garçons à déclarer un premier rapport sexuel avant l'âge de 15 ans (respectivement 6, 9% contre 16, 5%). Elles sont 33, 2% à déclarer une initiation plus tardive (après 19 ans) contre 23, 1% chez les garçons (figure 19). Aucun de ces indicateurs n'a connu d'évolution significative au cours des quatre dernières décennies [3]. L'étude Health Behaviour in School-aged Children (HBSC) interroge, tous les 4 ans, un échantillon de collégiens âgés de 11 à 15 ans via un questionnaire auto-administré. En 2014, la proportion d'adolescents de 4e et 3e ayant déjà eu des rapports sexuels était de 13, 7% en France (contre 17, 8% en 2010, p 0, 003). La proportion d'élèves ayant eu des rapports précoces (avant 13 ans) est restée stable entre 2010 et 2014 (1, 4%) [58]. En 2018, toujours d'après HBSC, 26% des garçons et 9% des filles de 15 ans déclarent avoir déjà eu un rapport sexuel. Par rapport à 2014, ce taux est stable chez les garçons et il est en baisse (-7 points) chez les filles [59]. Notons que la définition du rapport sexuel n'est pas précisée et qu'elle peut être sujette à interprétation : les rapports bucco-génitaux sans pénétration, par exemple, sont-ils 61 considérés comme tels par les répondants ? Nous l'évoquerons dans le chapitre Discussion . Figure 17. Évolution de l'âge médian au premier rapport sexuel en France selon l'année des 18 ans (d'après Santé Publique France [3]) Figure 18. Âge aux premiers rapports sexuels chez les femmes et chez les hommes (d'après l'INJEP [60] 2. 2. 2 Caractéristiques des partenaires et des rapports sexuels Les caractéristiques des partenaires sexuels gardent des particularités selon le sexe des personnes interrogées. Par exemple, selon les données du Baromètre santé 2016, les filles s'initient plus souvent avec un partenaire plus âgé d'au moins deux ans qu'elles (49, 6% versus 19, 2% pour les garçons) [3]. De plus, comparé aux données de 2006 issues de l'enquête Contexte de la sexualité en France réalisée également par téléphone, une plus grande proportion d'adolescents de 18-19 ans a déjà rencontré un partenaire sexuel via internet en 2016 62 : 6, 5% versus 4, 1% chez les femmes et 9, 2% versus 6, 5% chez les hommes. Concernant les 15-17 ans, il n'y a pas de données disponibles en 2006 ; en 2016, ils étaient 2, 0% chez les femmes et 4, 5% chez les hommes à avoir rencontré un partenaire via internet [3]. L'enquête sur les connaissances, attitudes, comportements et perceptions liés au VIH en France (KABP) a interrogé par téléphone un échantillon de 18 000 individus âgés de 18 à 55 ans en 2010. Les hommes déclaraient globalement plus de nouveaux partenaires que les femmes. En effet, ils étaient 10, 6% à rapporter un nouveau partenaire dans l'année et 12, 2% à en déclarer plusieurs ; chez les femmes, ces proportions étaient respectivement de 12, 7% et 4, 4% [61]. De plus, parmi l'ensemble des répondants, le multipartenariat (défini dans l'étude comme le fait d'avoir plusieurs partenaires au cours de l'année), prédominait chez les hommes (13, 5% contre 6, 9% chez les femmes) et était significativement moins rapporté qu'en 1994. Par ailleurs, les moins de 30 ans étaient plus souvent multipartenaires que leurs anés, chez les hommes comme chez les femmes (figure 20) [61]. Figure 19. Évolution de la proportion de multipartenaires au cours des 12 derniers moins selon le sexe et la classe d'âge en le-de-France et en France (d'après Beltzer et al [61]) 63 L'enquête Net Gay Baromètre, en 2009, a interrogé 17 000 hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes (HSH), dont 3 000 jeunes de moins de 25 ans, au sujet de leurs comportements sexuels, via un questionnaire diffusé sur les sites de rencontres gay. Les moins de 25 ans étaient 84, 7% à déclarer au moins un partenaire occasionnel au cours des 12 derniers mois (contre 86, 3% chez les plus de 25 ans, p 0, 0001) et ils étaient moins nombreux que leurs anés à déclarer plus de 10 partenaires dans l'année (28, 6% contre 36, 9%, p 0, 0001) [62]. En 2011, l'enquête Presse Gay mettait en évidence des différences de comportements selon l'âge des répondants et leur génération (définie selon l'année de leurs 18 ans). Là aussi, les moins de 25 ans étaient moins nombreux que leurs anés à déclarer plus de 10 partenaires sur les 12 derniers mois. De plus, à l'âge de 20 ans, les HSH de la jeune génération (qui ont eu 18 ans entre 2004 et 2007), étaient moins nombreux que leurs anés, au même âge, à déclarer plus de 10 partenaires sur les 12 derniers mois[57]. D'autre part, l'impact du sida sur les comportements se répercute dans les pratiques sexuelles déclarées par les participants des études successives. En effet, après une forte baisse de la fréquence des rapports oraux et anaux dans les années 1980 parmi les homosexuels, ces pratiques redeviennent couramment rapportées à partir des années 1990, notamment parmi les jeunes générations [57]. Les jeunes HSH rapportent donc plus fréquemment des rapports sexuels oraux et anaux dès le début de leur vie sexuelle que les générations précédentes au même âge, mais aussi moins de partenaires. Si la comparaison entre les générations est intéressante, les résultats de ces études, dont le recrutement se fait via internet et les sites de rencontres, ne peuvent être extrapolés à l'ensemble de la population HSH. 2. 2. 3 Connaissances sur le VIH et les IST Les données du Baromètre santé 2010 montrent que, si une majorité de jeunes de 15 à 30 ans se dit très bien informée sur le sida (88%), seulement 63, 8% estiment être bien informés sur les IST autres que le VIH [63]. De plus, ce niveau de connaissance semble baisser au fil des générations. En effet, l'étude KABP a mis en évidence en 2010, pour la première fois depuis 1994, une moins bonne connaissance des modes de transmission et de protection du VIH chez les jeunes adultes de 18-30 ans que chez leurs anés [64]. Un élément pour l'expliquer serait que les jeunes interrogés pour cette enquête ont tous commencé leur vie sexuelle après l'arrivée des antirétroviraux et dans un contexte épidémiologique différent de celui des jeunes interrogés dans l'enquête de 1994. De fait, les individus qui ont débuté leur vie sexuelle entre 1981 et 1995 ont été exposés plus longtemps aux campagnes de prévention et à une plus grande visibilité de la maladie. Ils gardent alors, en 2010, de meilleures connaissances sur le VIH que leurs cadets [65]. Par ailleurs, les études KABP successives montrent que le niveau de crainte du sida baisse fortement depuis les années 2000. Paradoxalement, la crainte d'avoir déjà été contaminé est, par contre, en augmentation, [64]. 64 Concernant les plus jeunes, une enquête réalisée par l'Institut Français d'Opinion publique (IFOP) pour Sidaction en 2018 a interrogé 1 000 individus âgés de 15 à 24 ans via un questionnaire auto-administré en ligne. 79% des répondants déclaraient se sentir bien informés sur le VIH : 79% des 15-17 ans et 76% des 18-20 ans [66]. 2. 2. 4 Comportements de prévention 2. 2. 4. 1 Préservatif : usages et représentations L'usage du préservatif au premier rapport est un indicateur important du niveau de protection de la population et des plus jeunes ; véritable code d'entrée indispensable dans la vie sexuelle, il s'est imposé dans les mœurs depuis les années 1980 et l'épidémie de sida. Globalement son utilisation reste très répandue au premier rapport : c'était le cas pour 85% des participants âgés de 15 à 75 ans interrogés dans le cadre de l'étude Baromètre Santé en 2016. Néanmoins, l'usage était moindre parmi les hommes ayant eu leur premier rapport sexuel avant 15 ans : 76% d'entre eux déclaraient l'avoir utilisé à cette occasion [3]. En outre, il faut noter que la confiance envers l'utilité du préservatif est en baisse parmi les participants de l'enquête KABP, en particulier chez les jeunes de 18-30 ans. Ces derniers étaient 77% à penser qu'il est tout à fait efficace pour se protéger du sida en 1994 ; ils ne sont plus que 54, 5% à le penser en 2010 [64]. Cette baisse de confiance se reflète aussi dans l'enquête de l'IFOP réalisée en ligne en 2018, o 47% des jeunes de 15 à 24 ans interrogés considéraient le préservatif masculin comme tout à fait efficace et 48% comme plutôt efficace [66]. Ainsi, l'enquête KABP 2010 montre une diminution de l'utilisation du préservatif lors du dernier rapport sexuel chez les personnes interrogées, là aussi en particulier chez les jeunes âgés de 18 à 30 ans. Ils étaient 34% chez les hommes et 22, 7% chez les femmes à déclarer l'avoir utilisé au dernier rapport sexuel en 2010, contre respectivement 40% et 30, 7% en 1994 [64]. Concernant les adolescents, parmi les participants sexuellement actifs et âgés de 15 ans interrogés dans l'enquête HBSC en 2018, 63% des filles et 62% des garçons déclarent avoir utilisé un préservatif lors du dernier rapport sexuel. Cette proportion est stable chez les filles, alors que les garçons sont moins nombreux à déclarer l'utiliser qu'en 2014 (79% contre 62% en 2018) [59]. Les représentations des adolescents à propos du préservatif et des situations à risque semblent souffrir d'un manque de connaissances. C'est ce que montre un rapport présenté par Sida Info Service (SIS) en 2013 et faisant la synthèse de 9 000 échanges réalisés par téléphone ou chat avec des adolescents de 15 à 19 ans. Ce service d'e-prévention permet aux utilisateurs d'exprimer leurs questionnements en cas de prise de risques, tout en restant anonymes [67]. Il apparaissait que les adolescents de 15-19 ans se protègent moins que les autres utilisateurs. En effet, parmi ceux ayant pris un risque par pénétration, 60, 6% déclaraient de ne pas avoir utilisé de préservatif (contre 51, 2% des 20-24 ans et 45, 4% des 25-29 ans). Les filles semblent plus souvent exposées aux situations à risque d'après ce rapport : elles étaient 83% à rapporter des rapports sans préservatif contre 58, 1% des garçons [67]. Parmi les situations à risque rapportées par les adolescents à SIS, les concernaient des rapports entre personnes de sexe différent et des 65 rapports entre personnes de même sexe (essentiellement masculin). Par ailleurs, les garçons décrivant une prise de risque lors d'un rapport hétérosexuel étaient 16% à évoquer une relation avec une professionnelle du sexe [67]. Parmi les adolescents HSH (homme ayant des rapports sexuels avec des hommes) ayant sollicité SIS en 2013, les pénétrations anales étaient moins souvent protégées par un préservatif que les pénétrations vaginales chez les hétérosexuels (différence de 8 points) [67]. Concernant les HSH, un volet de l'enquête Presse Gays et Lesbiennes (EPGL) a interrogé, en 2011, 6 600 HSH âgés de 15 à 87 ans au sujet des moyens de préventions utilisés en fonction du statut sérologique. Cette étude révélait que l'utilisation du préservatif n'était pas systématique parmi les participants. Ainsi, parmi les HSH qui ignoraient leur statut sérologique, 49, 6% utilisaient le préservatif systématiquement avec un partenaire occasionnel ; parmi les HSH séronégatifs, ils étaient 55%. Chez les séropositifs avec une charge virale non-indétectable ou un antécédent récent d'IST, seulement 13% des répondants utilisaient le préservatif à chaque rapport sexuel avec un partenaire occasionnel. De plus, parmi les 87% restant et n'utilisant donc pas le préservatif, une majorité (65%) ne déclarait aucune stratégie de réduction des risques (comme la séroconvergence entre partenaires). Enfin, l'absence de pratiques de réduction des risques était statistiquement associée à un âge inférieur à 30 ans, à un faible niveau d'éducation et à l'usage de drogues notamment [68]. À l'instar des autres études recrutant les participants HSH via internet et les sites de rencontres, cette étude comporte néanmoins un biais de recrutement qui ne permet pas d'extrapoler les résultats à l'ensemble de la population HSH. En 2014, une nouvelle enquête Net Gay Baromètre a interrogé 17 000 HSH à l'aide d'un questionnaire auto-administré, diffusé via les réseaux sociaux et les applications de rencontre. Parmi eux, 3 600 avaient entre 16 et 24 ans dont 3 231 avaient eu au moins un partenaire occasionnel et avaient pratiqué la pénétration anale. Les 16-24 ans étaient plus nombreux que leurs anés à déclarer au moins une pénétration anale non protégées (PANP) (46% versus 39, 3%), mais aussi des PANP régulières (26, 7% versus 22, 4%) et des PANP avec des partenaires occasionnels de statut sérologique inconnu (30, 3% versus 24, 9%) [69]. Ces comportements à risque tendent à augmenter depuis la dernière enquête. En effet, dans l'enquête Net Gay Baromètre de 2009, les moins de 25 ans étaient 39, 5% (contre 46% en 2014) à déclarer au moins une PANP avec un partenaire occasionnel, et ils étaient 17, 6% à rapporter des PANP régulières (contre 26, 7% en 2014). Contrairement à l'enquête de 2014, ils avaient en outre tendance à être moins nombreux à déclarer des PANP régulières que leurs anés [62]. Enfin en 2019, l'enquête Rapport au sexe, menée par Santé publique France, a analysé l'usage du préservatif lors du dernier rapport avec un partenaire occasionnel chez les HSH en fonction de l'usage ou non de la Prophylaxie Préexposition (PrEP). 20 000 HSH sexuellement actifs âgés de 18 ans et plus ont été interrogés via un questionnaire auto-administré et anonyme proposé sur internet via les réseaux sociaux et les sites de rencontres. Dans cette étude, 54% des HSH non usagers de la PrEP déclaraient avoir utilisé le préservatif lors du dernier rapport sexuel avec un partenaire occasionnel [70, 71]. 66 2. 2. 4. 2 Traitement post-exposition Dans certaines situations de rapport sexuel à risque, le traitement post- exposition (TPE) peut réduire le risque de contamination. Il est d'autant plus efficace que le délai d'initiation est court. Il doit être introduit au mieux dans les 4 heures qui suivent le rapport et au maximum dans les 48 heures [72]. Dans l'enquête de l'IFOP réalisée en 2018, seulement 44% des personnes interrogées âgées de 15 à 24 ans connaissaient le TPE comme moyen de protection contre le VIH[66]. D'après le rapport de Sida Info Service en 2013, parmi les prises de risques déclarées par les adolescents, les deux-tiers avaient eu lieu depuis plus de 48 heures et ne pouvaient donc plus être suivies d'un traitement post-exposition (TPE) [67]. Ainsi, les échanges réalisés entre les adolescents et les conseillers de Sida Info Service ont mis en lumière un manque de connaissances et une certaine vulnérabilité, particulièrement chez les filles, témoignant d'un défaut d'information et de difficultés chez ces adolescents à trouver des interlocuteurs auprès de qui formuler leurs questions. 2. 2. 5 Sources d'informations Selon le Conseil National du Sida et des hépatites virales et le Haut Conseil à l'Égalité entre les femmes et les hommes, la principale source d'information des jeunes en matière de sexualité est l'échange entre pairs. Internet apparat ensuite comme une source d'information privilégiée [4, 5]. En 2010, selon les données du Baromètre santé, les adolescents de 15-19 ans étaient 39% à utiliser internet comme source d'informations sur la santé (contre 50% chez les 20-25 ans) et d'entre eux déclaraient avoir cherché de l'information sur internet plutôt que de consulter un médecin [73]. Les jeunes font donc face à un flux d'informations perçu comme un moyen de s'auto- informer : amis, télévision, autres médias, internet, etc. Si la multiplicité des sources peut apporter une certaine variété dans les informations, elle peut aussi les rendre confuses. La pornographie pourrait notamment véhiculer des informations dénaturées voire humiliantes, en particulier pour les femmes ; par ailleurs, certains forums relayent des messages erronés voire néfastes sur les relations sexuelles et les rapports entre hommes et femmes [4]. Face au développement du numérique comme source d'informations pour les jeunes, Santé Publique France promeut une offre numérique en prévention, à travers différents sites destinés aux jeunes notamment comme le Fil Santé Jeunes ou onsexrprime. fr (ce dernier totalisait plus d'un million de visiteurs uniques en 2015). De plus, certaines associations comme Aides investissent directement les applications de rencontre destinées aux hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes (HSH) afin de délivrer des messages de prévention [5]. Les pairs et internet sont donc des sources d'informations plus ou moins valides mais assez populaires chez les adolescents. L'éducation à la sexualité est ainsi envisagée 67 comme un bon moyen de renforcer leurs connaissances pour leur permettre d'appréhender avec raison et critique les flux d'informations qu'ils reçoivent. 2. 2. 6 Éducation à la sexualité La loi du 4 juillet 2001 relative à l'interruption volontaire de grossesse inscrit, dans le code de l'éducation, l'obligation de dispenser une éducation sexuelle, à raison de trois séances annuelles, dans les écoles, collèges et lycées [74]. Cependant son application reste partielle : d'après le Haut conseil à l'égalité entre les femmes et les hommes (HCE), 25% des écoles n'ont mis en place aucune séance d'éducation à la sexualité et seuls 10 à 21% des élèves du second degré reçoivent le nombre de séances prévues par la loi [4]. Ces lacunes seraient encore plus grande dans les cursus spécifiques comme les centres de formation d'apprentis (CFA) [75]. De plus, selon le Conseil National du sida (CNS), les interventions uniques de deux heures, telles qu'elles sont souvent appliquées une ou deux fois au cours de la scolarité, sont insuffisantes pour aborder efficacement la prévention des IST [5]. Les professionnels de l'Éducation Nationale évoquent des difficultés matérielles et organisationnelles, mais aussi un manque de formation sur les contenus et la pédagogie nécessaires à ce type de séances. Ainsi, les difficultés à aborder la sexualité dans sa diversité à l'école sont des freins à l'éducation sexuelle et à l'apprentissage de la prévention chez les jeunes, notamment chez les homosexuels[5]. Or, le manque d'informations peut favoriser les sentiments de stigmatisation et de rejet. Par ailleurs il a été montré qu'une réaction négative à l'annonce d'une homosexualité ou d'une bisexualité était associée à une plus grande fréquence de dépression, de consommation de drogues et de rapports sexuels non protégés [76]. Les adolescents ont donc besoin d'interlocuteurs compétents et bienveillants, formés pour répondre à leurs questions et pour aborder la sexualité dans sa diversité. Selon le Haut Conseil à l'Égalité entre les femmes et les hommes, en plus de facteurs endogènes à l'Éducation Nationale, les difficultés de mise en place de l'éducation à la sexualité à l'école reflètent un certain blocage de la société tout entière : il existerait en France une difficulté à aborder la sexualité des jeunes. Ce blocage ferait ainsi obstacle à une éducation sexuelle globale et diversifiée qui se limiterait alors à des aspects restrictifs et moralisateurs dont les effets sur la prévention ne sont pas aussi bénéfiques qu'une éducation sexuelle globale [4]. Pourtant, selon une étude menée dans 48 pays par l'UNESCO en 2015, il est bien décrit que l'éducation sexuelle n'entrane pas une plus grande précocité de l'activité sexuelle, et qu'elle a un impact positif sur les comportements sexuels sains et peut accrotre l'utilisation du préservatif. L'éducation complète à la sexualité (ECS) aurait ainsi, de manière clairement établie, un impact positif sur la santé sexuelle et reproductive, en améliorant les connaissances et l'estime de soi, et en contribuant à réduire les IST. L'UNESCO souligne l'importance d'une formation adéquate à fournir aux intervenants pour garantir une ECS de qualité [77]. La qualité de son contenu est importante quand on sait que les stratégies uniquement basées sur l'abstinence ou sur le retard de l'âge au premier rapport, en plus d'être inefficaces, peuvent détourner les jeunes sexuellement actifs de pratiques préventives en renforçant les sentiments d'isolement et de discrimination notamment [75, 78]. De 68 plus, comme le souligne le Dr Althéa N. , les relations sexuelles motivées par la transgression de l'interdit sont rarement vécues positivement [79]. 2. 3 Conclusion sur les comportements en matière de sexualité 50% des adolescents ont donc déjà eu un rapport sexuel avant 17 ans et demi. Cet âge médian ainsi que la proportion d'adolescents ayant eu des rapports sexuels plus précoces sont stables depuis plus d'une décennie. Si actuellement les adolescents ne semblent pas s'initier plus tôt que leurs anés, leur connaissance sur la prévention du VIH et des IST est en baisse, et avec elle la fréquence d'utilisation du préservatif. Ce manque de connaissances amène naturellement les adolescents à se tourner vers des sources d'informations diverses et inégales dans leur contenu. L'éducation à la sexualité, insuffisamment déployée sur le territoire français, apparat comme un bon moyen de leur donner les clés de lecture pour appréhender le flux d'informations relatives à la sexualité. 69 Matériel et méthodes 1 Design de l'étude Il s'agit d'une étude observationnelle avec recueil de données rétrospectif, menée dans les Centres Gratuits d'Information, de Dépistage et de Diagnostic (CeGIDD) des Bouches-du-Rhône. 2 Recueil de données Étaient inclus les tests réalisés pour l'infection à Chlamydia trachomatis et Neisseria gonorrhoeae, les sérologies syphilis et VIH, et les TROD VIH. Les tests ont été réalisés chez les consultants des CeGIDD extra hospitaliers de Marseille, Aix-en-Provence, Aubagne, La Ciotat, Salon-de-Provence, Arles, Gardanne et Vitrolles entre le 1er janvier 2017 au 16 août 2021. Un même consultant a pu être testé plusieurs fois et avoir un résultat négatif ou positif à plusieurs reprises. En effet, l'anonymat des patients est garanti par un numéro d'identification qui peut être différent d'une consultation à une autre, ce qui ne permet pas l'exclusion de tous les doublons. Les tests exclus étaient ceux réalisés chez des personnes transsexuelles. Pour l'ensemble des tests, étaient recueillis : le résultat du test (positif ou négatif), le sexe du patient testé et le sexe des partenaires sexuels déclarés par le patient. Les tests réalisés étaient : - Des recherches simultanées de Chlamydia trachomatis et Neisseiria gonorrhoeae par PCR (polymerase chain reaction) à partir de prélèvements urinaires, urétraux, anaux, pharyngés ou cervicaux, - Des sérologies syphilis avec dosage du VDRL en cas de sérologie positive, - Des TROD et sérologies VIH. En cas de TROD VIH positif, un contrôle sérologique est effectué, suivi d'une confirmation par western blot en cas de positivité. Le contrôle sérologique après TROD positif est effectué soit au CeGIDD, soit en consultation spécialisée. Les groupes d'âges ont été définis selon l'OMS et les standards de la littérature épidémiologique [23, 54] : les adolescents ont été définis comme les individus âgés de 15 à 19 ans et les jeunes adultes comme ceux âgés de 20 à 24 ans. Les consultants ont été classés en plusieurs groupes selon leur orientation sexuelle comportementale, définie par le sexe des partenaires sexuels déclarés par les consultants. Chez les femmes, l'orientation sexuelle a été définie ainsi : - Hétérosexuelle en cas de rapports sexuels exclusivement avec des hommes, 70 - Femme ayant des rapports sexuels avec des femmes (FSF) si au moins rapport a eu lieu avec une autre femme. Chez les hommes, nous avons défini deux groupes : - Les hétérosexuels, qui déclarent des rapports exclusivement avec des femmes, - Les hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes (HSH) si au moins un rapport a eu lieu avec un autre homme. Les caractéristiques des patients sont collectées lors de la consultation par l'infirmier(e) ou le médecin réalisant l'interrogatoire et sont inscrites dans le dossier informatique commun aux CeGIDD du département. 3 Analyse des données Le critère de jugement principal était le taux de positivité. Nous avons calculé la proportion de tests positifs chez les adolescents et le taux de positivité pour chaque IST, en rapportant le nombre de tests positifs au nombre total de tests réalisés dans chaque groupe. Nous avons comparé ces taux de positivité parmi les 15-19 ans en fonction du sexe (filles et garçons) et de l'orientation sexuelle (hétérosexuelles et FSF, filles hétérosexuelles et garçons hétérosexuels, hétérosexuels et HSH). Puis nous les avons comparés avec ceux retrouvés chez les adultes de 20-24 ans et de 25 ans et plus, en fonction du sexe et de l'orientation sexuelle, et selon le même ordre. 4 Analyse statistique Les variables qualitatives sont exprimées en effectif et pourcentage. Les intervalles de confiance des proportions à 95% (IC95) ont été calculés à l'aide d'une loi normale. L'indépendance entre deux variables qualitatives a été testée à l'aide d'un test du Khi. Les tests statistiques sont bilatéraux. Les p valeurs sont considérées comme significatives au seuil de 5%. Les intervalles de confiance sont calculés à 95%. Les analyses statistiques ont été réalisée avec le logiciel XLSTAT (Addinsoft (2020), XLSTAT statistical and data analysis solution, New York, USA). 5 Considérations éthiques L'anonymat des patients est garanti par un numéro d'identification. Cette étude a été réalisée dans le respect de la déclaration d'Helsinki et de la MR-003 de la Commission Nationale Informatique et Libertés (CNIL). 71 Résultats 1 Chlamydia trachomatis 11 300 tests PCR Chlamydia ont été réalisés chez des adolescents de 15 à 19 ans sur la période étudiée, soit 18% de l'ensemble des tests effectués dans les CeGIDD entre 2017 et 2021. Parmi ces adolescents de 15-19 ans, 55% des tests concernent des filles. Chez les adultes de 25 ans et plus en revanche, la majorité des tests sont réalisés chez des hommes (68%) (table 14). Table 13. Répartition des tests C. trachomatis réalisés selon la classe d'âge et le sexe 1. 1 Adolescents (15-19 ans) 1. 1. 1 Comparaisons selon le sexe Nous avons recensé 530 tests positifs chez les 15-19 ans, soit un taux de positivité de 4, 7% (IC95 : [4, 3 ; 5, 1]). Le taux de positivité chez les filles est significativement plus élevé que chez les garçons (respectivement 6, 4% contre 2, 6%, p 72 Âge*sexeNombre de tests selon l'âge (%)Nombre de tests selon le sexe (%)15-19 ans11300 (18%)Femmes6175 (55%)Hommes5124 (45%)Transsexuels1 ( ans21128 (33%)Femmes10724 (51%)Hommes10404 (49%)25 ans et 30657 (49%)Femmes9734 (32%)Hommes20921 (68%)Transsexuels2 ( totale63085 (100%)Femmes26633 (42%)Hommes36449 (58%)Transsexuels3 ( : répartition des tests selon l'âge et le sexe Table 14. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les 15-19 ans selon le sexe Figure 20. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les 15-19 ans selon le sexe Ainsi, parmi les 530 tests positifs recensés chez les adolescents, 396 concernent des filles, qui représentent donc 75% des cas de chlamydioses observées chez les 15-19 ans. Les femmes ne représentent plus que 55% des cas chez les 20-24 ans (n 924/1668) et 23% des cas chez les 25 ans et plus (N 487/2076). Figure 21 Répartition des tests C. trachomatis positifs selon le sexe chez les 15- 19 ans, les 20-24 ans et les 25 ans et plus 73 Chlamydia chez les 15-19 ans : taux de positivité selon le sexe Sexe Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value Femmes 396 5779 6175 6, 4% [5, 8 ; 7, 0] p Hommes 134 4990 5124 2, 6% [2, 2 ; 3, 1] IC95 : intervalle de confiance à 95% 6, 42, 601234567FemmesHommesTAUX DE POSITIVITÉ (%)Chlamydia : taux de positivité selon le sexe 75%25%15-19 ans (N 530)55%45%20-24 ans (N 1668)23%77%25 ans et (N 2076) 1. 1. 2 Comparaisons selon l'orientation sexuelle Parmi les hétérosexuel. le. s de 15-19 ans, les filles ont un taux de positivité significativement plus élevé que les garçons (respectivement 6, 7% contre 2, 4%, p Chez les garçons, les hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes (HSH) ont un taux de positivité significativement plus élevé que les hétérosexuels (respectivement 6, 0% contre 2, 4%, p Table 15. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les 15-19 ans selon l'orientation sexuelle Figure 22. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les 15-19 ans selon l'orientation sexuelle Ainsi, sur 529 tests Chlamydia positifs parmi les 15-19 ans, 73% concernent des femmes hétérosexuelles, 19% des hommes hétérosexuels et 6% des HSH (1 test 74 Chlamydia chez les 15-19 ans : taux de positivité selon le sexe et le type de rapport sexuel Sexe*Type de rapport Positifs Négatifs Total* Taux de positivité IC95 p-value Femmes hétérosexuelles 388 5439 5827 6, 7% [6, 0 ; 7, 3] p 0, 03 FSF 8 243 251 3, 2% [1, 0 ; 5, 4] Femmes hétérosexuelles 388 5439 5827 6, 7% [6, 0 ; 7, 3] p Hommes hétérosexuels 100 4072 4172 2, 4% [1, 9 ; 2, 9] Hommes hétérosexuels 100 4072 4172 2, 4% [1, 9 ; 2, 9] p HSH 33 516 549 6, 0% [4, 0 ; 8, 0] IC95 : intervalle de confiance à 95% FSF : femmes ayant des rapports sexuels avec des femmes HSH : hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes *Non inclus dans cette analyse : les tests réalisés chez des personnes n'ayant déclaré aucun rapport sexuel (N 471), ceux pour qui l'information sur l'orientation sexuelle n'était pas renseignée (N 29) et les transsexuels (N 1) 6, 0%2, 4%6, 7%3, 2%0, 0%1, 0%2, 0%3, 0%4, 0%5, 0%6, 0%7, 0%8, 0%Chlamydia : taux de positivitéChlamydia 15-19 ans : taux de positivité selon le type de rapport sexuelFSFFemmes hétérosexuellesHommes hétérosexuelsHSH positif n'a pas pu être classé en fonction de l'orientation sexuelle du patient à cause de données manquantes, cf. Discussion). Figure 23. Répartition des tests C. trachomatis positifs chez les 15-19 ans selon l'orientation sexuelle 1. 2 Adolescents (15-19 ans) versus adultes (20-24 ans et 25 ans et plus) Sur l'ensemble des tests positifs à Chlamydia trachomatis recensés sur la période étudiée, 12% concernent des adolescents de 15-19 ans. Dans la classe d'âge des 15-24 ans, 24% des tests positifs concernent des consultants de 15-19 ans. Figure 24. Proportion d'adolescents de 15-19 ans parmi les tests C. trachomatis positifs, chez les 15-24 ans et dans la population totale Le taux de positivité est significativement plus élevé chez les adultes de 20-24 ans et de 25 ans et plus, que chez les adolescents (respectivement 7, 9% et 6, 8%, contre 4, 7%, p 75 73%2%19%6%Chlamydia positifs chez les 15-19 ans : répartition selon le type de rapport sexuel (N 529)Femmes hétérosexuellesFSFHommes hétérosexuelsHSH 24%76%N 219815-19 ANS20-24 ANS12%88%N 427415-19 ANS20 ans et Table 16. Taux de positivité des tests C. trachomatis selon l'âge Figure 25. Taux de positivité des tests C. trachomatis selon l'âge 1. 2. 1 Femmes : comparaison selon l'âge Sur l'ensemble des tests positifs à Chlamydia trachomatis chez les femmes, 22% concernent des adolescentes de 15-19 ans. Dans la classe d'âge des femmes de 15- 24 ans, 30% des cas concernent des filles de 15-19 ans. Figure 26. Proportion de filles de 15-19 ans parmi les tests C. trachomatis positifs, chez les femmes de 15-24 ans et l'ensemble des femmes testées 76 Chlamydia : taux de positivité selon l'âge Âge Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value 15-19 ans 530 10770 11300 4, 7% [4, 3 ; 5, 1] p 20-24 ans 1668 19460 21128 7, 9% [7, 5 ; 8, 3] 15-19 ans 530 10770 11300 4, 7% [4, 3 ; 5, 1] p 25 ans et 2076 28581 30657 6, 8% [6, 5 ; 7, 1] IC95 : intervalle de confiance à 95% 4, 77, 94, 76, 80123456789ChlamydiaTaux de positivité (%)Chlamydia : taux de positivité selon l'âge15-19 ans20-24 ans15-19 ans25 ans et 30%70%(N 1320)15-19 ans20-24 ans22%78%(N 1807)15-19 ans20 ans et Le taux de positivité pour l'infection à CT est significativement plus élevé chez les femmes de 20-24 ans que chez les adolescentes 15-19 ans (respectivement 6, 4% contre 8, 6%, p En revanche, les filles de 15-19 ans présentent un taux de positivité plus élevé que les femmes de 25 ans et plus (respectivement 6, 4% contre 5, 0%, p 0, 0002). Table 17. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les femmes selon la classe d'âge Figure 27. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les femmes selon la classe d'âge 1. 2. 2 Hommes : comparaisons selon l'âge Les garçons de 15-19 ans représentent 5% de l'ensemble des cas de chlamydioses recensées. Dans la classe d'âge des hommes de 15-24 ans, 15% des cas concernent des garçons de 15-19 ans. 77 Chlamydia chez les filles : taux de positivité selon l'âge Âge Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value 15-19 ans 396 5779 6175 6, 4% [5, 8 ; 7, 0] p 20-24 ans 924 9800 10724 8, 6% [8, 1 ; 9, 1] 15-19 ans 396 5779 6175 6, 4% [5, 8 ; 7, 0] p 0, 0002 25 ans et 487 9247 9734 5, 0% [4, 6 ; 5, 4] IC95 : intervalle de confiance à 95% 6, 48, 66, 45, 00, 02, 04, 06, 08, 010, 0ChlamydiaTaux de positivité (%)Chlamydia chez les filles : taux de positivité selon l'âge15-19 ans20-24 ans15-19 ans25 ans et Figure 28. Proportion de garçons de 15-19 ans parmi les tests C. trachomatis positifs, chez les hommes de 15-24 ans et l'ensemble des hommes testés Parmi les hommes, le taux de positivité est significativement plus élevé chez les adultes de 20-24 ans et de 25 ans et plus, que chez les adolescents (respectivement 7, 4% et 7, 6%, contre 2, 6%, p Table 18. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les hommes selon la classe d'âge Figure 29. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les hommes selon la classe d'âge 78 15%85%(N 878)15-19 ans20-24 ans5%95%N 246715-19 ans20 ans et Chlamydia chez les hommes : taux de positivité selon l'âge Âge Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value 15-19 ans 134 4990 5124 2, 6% [2, 2 ; 3, 1] p 20-24 ans 744 9660 10404 7, 2% [6, 7 ; 7, 6] 15-19 ans 134 4990 5124 2, 6% [2, 2 ; 3, 1] p 25 ans et 1589 19332 20921 7, 6% [7, 2 ; 8, 0] IC95 : intervalle de confiance à 95% 2, 67, 22, 67, 6012345678ChlamydiaTaux de positivité (%)Chlamydia chez les hommes : taux de positivité selon l'âge15-19 ans20-24 ans15-19 ans25 ans et 1. 2. 3 Comparaisons selon l'âge et l'orientation sexuelle Parmi les femmes hétérosexuelles, le taux de positivité pour l'infection à CT est significativement plus élevé chez les 15-19 ans (respectivement 8, 8% contre 6, 7%, p En revanche, les adolescentes hétérosexuelles de 15-19 ans ont un taux de positivité significativement plus élevé que les femmes hétérosexuelles de 25 ans et plus (respectivement 6, 7% contre 5, 1%, p les 20-24 ans que chez Table 19. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les femmes hétérosexuelles selon la classe d'âge Figure 30. Taux de positivité pour C. trachomatis chez hétérosexuelles par classes d'âge les femmes Parmi les femmes ayant des rapports sexuels avec des femmes (FSF), aucune différence significative n'a pu être mise en évidence entre les adultes et les adolescentes concernant le taux de positivité pour l'infection à CT. 79 Chlamydia chez les femmes hétérosexuelles : taux de positivité selon l'âge Âge Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value 15-19 ans 388 5439 5827 6, 7% [6, 0 ; 7, 3] p 20-24 ans 894 9216 10110 8, 8% [8, 3 ; 9, 4] 15-19 ans 388 5439 5827 6, 7% [6, 0 ; 7, 3] p 25 ans et 468 8696 9164 5, 1% [4, 7 ; 5, 6] IC95 : intervalle de confiance à 95% 6, 78, 86, 75, 10246810Taux de positivité (%)Chlamydia chez les femmes hétérosexuelles : taux de positivité selon l'âge15-19 ans20-24 ans15-19 ans25 ans et Table 20. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les FSF (femmes ayant des rapports sexuels avec des femmes) selon la classe d'âge Le taux de positivité parmi les hommes hétérosexuels est significativement plus élevé chez les adultes de 20-24 ans et de 25 ans et plus, que chez les adolescents (respectivement 6, 5% et 5, 5%, contre 2, 4%, p Table 21. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les hommes hétérosexuels selon la classe d'âge Figure 31. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les hommes hétérosexuels selon la classe d'âge 80 Chlamydia chez les FSF : taux de positivité selon l'âge Âge Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value 15-19 ans 8 243 251 3, 2% [1, 0 ; 5, 4] p 0, 22 20-24 ans 28 520 548 5, 1% [3, 3 ; 7, 0] 15-19 ans 8 243 251 3, 2% [1, 0 ; 5, 4] p 0, 94 25 ans et 18 516 534 3, 4% [1, 8 ; 4, 9] IC95 : intervalle de confiance à 95% FSF : femmes ayant des rapports sexuels avec des femmes Chlamydia chez les hommes hétérosexuels : taux de positivité selon l'âge Âge Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value 15-19 ans 100 4072 4172 2, 4% [1, 9 ; 2, 9] p 20-24 ans 545 7874 8419 6, 5% [5, 9 ; 7, 0] 15-19 ans 100 4072 4172 2, 4% [1, 9 ; 2, 9] p 25 ans et 718 12300 13018 5, 5% [5, 1 ; 5, 9] IC95 : intervalle de confiance à 95% 2, 46, 52, 45, 501234567ChlamydiaTaux de positivité (%)Chlamydia chez les hommes hétérosexuels : taux de positivité selon l'âge15-19 ans20-24 ans15-19 ans25 ans et Il en est de même parmi les HSH : le taux de positivité pour l'infection à CT est significativement plus élevé chez les adultes de 20-24 ans et de 25 ans et plus, que chez les adolescents (respectivement 10, 3% et 11, 1%, contre 6, 0%, p Table 22. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les HSH (hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes) selon la classe d'âge Figure 32. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les HSH selon la classe d'âge 2 Gonococcies La recherche conjointe de Chlamydia trachomatis et Neisseria gonorrhoeae par PCR étant systématique, la répartition des tests selon l'âge et le sexe est la même pour les deux germes. 81 Chlamydia chez les HSH : taux de positivité selon l'âge Âge Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value 15-19 ans 33 516 549 6, 0% [4, 0 ; 8, 0] p 0, 002 20-24 ans 199 1738 1937 10, 3% [8, 9 ; 11, 6] 15-19 ans 33 516 549 6, 0% [4, 0 ; 8, 0] p 0, 0002 25 ans et 870 6973 7843 11, 1% [10, 4 ; 11, 8] IC95 : intervalle de confiance à 95% HSH : hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes 610, 3611, 1024681012Taux de positivité (%)Chlamydia chez les HSH : taux de positivité selon l'âge15-19 ans20-24 ans15-19 ans25 ans et Table 23. Répartition des tests N. gonorrhoeae réalisés selon la classe d'âge et le sexe 2. 1 Adolescents (15-19 ans) 2. 1. 1 Comparaisons selon le sexe Chez les adolescents de 15-19 ans, 182 tests positifs au gonocoque ont été recensés sur la période étudiée, soit un taux de positivité de 1, 6% (IC95 : [1, 4 ; 1, 8]). Aucune différence statistiquement significative n'a pu être mise en évidence entre les filles et les garçons de 15-19 ans. Table 24. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae chez les 15-19 ans selon le sexe Ainsi, parmi les 182 tests positifs au gonocoque chez les adolescents, 54% concernent des filles. Celles-ci ne représentent plus que 28% des cas chez les 20-24 ans et 7% des cas chez les adultes âgés d'au moins 25 ans. 82 Âge*sexeNombre de tests selon l'âge (%)Nombre de tests selon le sexe (%)15-19 ans11300 (18%)Femmes6175 (55%)Hommes5124 (45%)Transsexuels1 ( ans21128 (33%)Femmes10724 (51%)Hommes10404 (49%)25 ans et 30657 (49%)Femmes9734 (32%)Hommes20921 (68%)Transsexuels2 ( totale63085 (100%)Femmes26633 (42%)Hommes36449 (58%)Transsexuels3 ( : répartition des tests selon l'âge et le sexeGonocoque chez les 15-19 ans : taux de positivité selon le sexe Sexe Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value Femmes 99 6076 6175 1, 6% [1, 3 ; 1, 9] p 0, 94 Hommes 83 5041 5124 1, 6% [1, 3 ; 2, 0] IC95 : intervalle de confiance à 95% Figure 33. Répartition des tests N. gonorrhoeae positifs selon le sexe, chez les 15-19 ans, les 20-24 ans et les 25 ans et plus 2. 1. 2 Comparaisons selon le sexe et l'orientation sexuelle Parmi les hétérosexuel. le. s de 15-19 ans, le taux de positivité pour les gonococcies est significativement plus élevé chez les filles que chez les garçons (respectivement 1, 6% contre 0, 6%, p Parmi les garçons de 15-19 ans, les HSH (hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes) ont un taux de positivité significativement plus élevé que les hétérosexuels (respectivement 10, 4% contre 0, 6%, p Table 25. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae chez les 15-19 ans selon l'orientation sexuelle 83 54%46%15-19 ans (N 182)28%72%20-24 ans (N 582)7%93%25 ans et (N 1685)Gonocoque chez les 15-19 ans : taux de positivité selon le sexe et le type de rapport sexuel Sexe*Type de rapport Positifs Négatifs Total* Taux de positivité IC95 p-value Femmes hétérosexuelles 96 5731 5827 1, 6% [1, 3 ; 2, 0] p 0, 80 FSF 3 248 251 1, 2% Femmes hétérosexuelles 96 5731 5827 1, 6% [1, 3 ; 2, 0] p Hommes hétérosexuels 26 4146 4172 0, 6% [0, 4 ; 0, 9] Hommes hétérosexuels 26 4146 4172 0, 6% [0, 4 ; 0, 9] p HSH 57 492 549 10, 4% [7, 8 ; 12, 9] IC95 : intervalle de confiance à 95% FSF : femmes ayant des rapports sexuels avec des femmes HSH : hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes *Non inclus dans cette analyse : les tests réalisés chez des personnes n'ayant déclaré aucun rapport sexuel (N 471), ceux pour qui l'information sur l'orientation sexuelle n'était pas renseignée (N 29) et les transsexuels (N 1) Figure 34. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae chez les 15-19 ans selon l'orientation sexuelle Ainsi, sur les 182 tests positifs au gonocoque recensés chez les 15-19 ans, 53% concernent des filles hétérosexuelles, 31% des HSH et 14% des garçons hétérosexuels. Figure 35. Répartition des tests N. gonorrhoeae positifs chez les 15-19 ans selon l'orientation sexuelle 2. 2 Adolescents (15-19 ans) versus adultes (20-24 ans et 25 ans et plus) Sur l'ensemble des tests positifs à Neisseria gonorrhoeae recensés sur la période étudiée, 7% concernent des adolescents de 15-19 ans. Dans la classe d'âge des 15-24 ans, 24% des tests positifs concernent des personnes de 15-19 ans. 84 10, 4%0, 6%1, 6%1, 2%0, 0%2, 0%4, 0%6, 0%8, 0%10, 0%12, 0%Taux de positivité (%)Gonocoque 15-19 ans : taux de positivité selon le type de rapport sexuelFSFFemmes hétérosexuellesHommes hétérosexuelsHSH53%2%14%31%Gonocoque positifs : répartition selon le type de rapport sexuelFemmes hétérosexuellesFSFHommes hétérosexuelsHSH Figure 36. Proportion d'adolescents de 15-19 ans parmi les tests N. gonorrhoeae positifs recensés chez les 15-24 ans et dans la population totale Le taux de positivité pour l'infection au gonocoque est significativement plus élevé chez les adultes de 20-24 ans et de 25 ans et plus, que chez les adolescents de 15- 19 ans (respectivement 2, 8% et 5, 5%, contre 1, 6%, p Table 26. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae selon la classe d'âge Figure 37. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae selon la classe d'âge 85 24%76%N 76415-19 ans20-24 ans7%93%N 244915-19 ans20 ans et Gonocoque : taux de positivité selon l'âge Âge Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value 15-19 ans 182 11118 11300 1, 6% [1, 4 ; 1, 8] p 20-24 ans 582 20546 21128 2, 8% [2, 5 ; 3, 0] 15-19 ans 182 11118 11300 1, 6% [1, 4 ; 1, 8] p 25 ans et 1685 28972 30657 5, 5% [5, 2 ; 5, 8] IC95 : intervalle de confiance à 95% 1, 62, 81, 65, 50123456GonocoqueTaux de positivité (%)Gonocoque : taux de positivité selon l'âge15-19 ans20-24 ans15-19 ans25 ans et plus 2. 2. 1 Femmes : comparaison selon l'âge Sur l'ensemble des tests positifs au gonocoque chez les femmes, 26% concernent des adolescentes de 15-19 ans. Dans la classe d'âge des femmes de 15-24 ans, 38% des cas concernent des filles de 15-19 ans. Figure 38. Proportion de filles de 15-19 ans parmi les tests N. gonorrhoeae positifs recensés chez les 15-24 ans et dans la population totale Concernant le taux de positivité, aucune différence statistiquement significative n'a pu être mise en évidence entre les femmes 20-24 ans et les adolescentes de 15-19 ans. En revanche, les filles de 15-19 ans ont un taux de positivité significativement plus élevé que les femmes de 25 ans et plus (respectivement 1, 6% contre 1, 2%, p 0, 015). Table 27. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae selon la classe d'âge 86 38%62%N 26215-19 ans20-24 ans26%74%N 37415-19 ans20 ans et Gonocoque chez les filles : taux de positivité selon l'âge Âge Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value 15-19 ans 99 6076 6175 1, 6% [1, 3 ; 1, 9] p 0, 67 20-24 ans 163 10561 10724 1, 5% [1, 3 ; 1, 8] 15-19 ans 99 6076 6175 1, 6% [1, 3 ; 1, 9] p 0, 015 25 ans et 112 9622 9734 1, 2% [0, 9 ; 1, 4] IC95 : intervalle de confiance à 95% Figure 39. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae selon la classe d'âge 2. 2. 2 Hommes : comparaisons selon l'âge Les garçons de 15-19 ans représentent 4% de l'ensemble cas de positivité au gonocoque recensés sur la période. Dans la classe d'âge des hommes de 15-24 ans, 17% des cas concernent des garçons de 15-19 ans. Figure 40. Proportion de garçons de 15-19 ans parmi les tests N. gonorrhoeae positifs recensés chez les 15-24 ans et dans la population totale Parmi les garçons, le taux de positivité est significativement plus élevé chez les adultes de 20-24 ans et de 25 ans et plus, que chez les adolescents de 15-19 ans (respectivement 4, 0% et 7, 5%, contre 1, 6%, p 87 1, 61, 51, 61, 200, 20, 40, 60, 811, 21, 41, 61, 81Taux de positivité (%)Gonocoque chez les femmes : taux de positivité selon l'âge15-19 ans20-24 ans15-19 ans25 ans et 17%83%N 50215-19 ans20-24 ans4%96%N 207515-19 ans20 ans et Table 28. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae chez les hommes selon la classe d'âge Figure 41. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae chez les hommes selon la classe d'âge 2. 2. 3 Comparaison selon l'âge et l'orientation sexuelle Parmi les femmes hétérosexuelles, aucune différence statistiquement significative n'a pu être mise en évidence entre les 15-19 ans et les 20-24 ans concernant le taux de positivité au gonocoque. En revanche, les adolescentes hétérosexuelles de 15-19 ans ont un taux de positivité significativement plus élevé que les femmes hétérosexuelles de 25 ans et plus (respectivement 1, 6% [1, 3 ; 2, 0] contre 1, 1% [0, 8 ; 1, 3], p 0, 002). 88 Gonocoque chez les hommes : taux de positivité selon l'âge Âge Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value 15-19 ans 83 5041 5124 1, 6% [1, 3 ; 2, 0] p 20-24 ans 419 9985 10404 4, 0% [3, 6 ; 4, 4] 15-19 ans 83 5041 5124 1, 6% [1, 3 ; 2, 0] p 25 ans et 1573 19348 20921 7, 5% [7, 2 ; 7, 9] IC95 : intervalle de confiance à 95% 1, 64, 01, 67, 5012345678Taux de positivité (%)Gonocoque chez les hommes : taux de positivité selon l'âge15-19 ans20-24 ans15-19 ans25 ans et Table 29. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae chez les femmes hétérosexuelles selon la classe d'âge Figure 42. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae chez les femmes hétérosexuelles selon la classe d'âge Parmi les femmes ayant des rapports sexuels avec des femmes (FSF), aucune différence significative n'a pu être mise en évidence en fonction de l'âge des consultantes testées. Table 30. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae chez les FSF (femmes ayant des rapports sexuels avec des femmes) selon la classe d'âge 89 Gonocoque chez les femmes hétérosexuelles : taux de positivité selon l'âge Âge Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value 15-19 ans 96 5729 5825 1, 6% [1, 3 ; 2, 0] p 0, 75 20-24 ans 160 9950 10110 1, 6% [1, 3 ; 1, 8] 15-19 ans 96 5729 5825 1, 6% [1, 3 ; 2, 0] p 0, 002 25 ans et 97 9067 9164 1, 1% [0, 8 ; 1, 3] IC95 : intervalle de confiance à 95% 1, 61, 61, 61, 100, 20, 40, 60, 811, 21, 41, 61, 8Taux de positivité (%)Gonocoque chez les femmes hétérosexuelles : taux de positivité selon l'âge15-19 ans20-24 ans15-19 ans25 ans et Gonocoque chez les FSF : taux de positivité selon l'âge Âge Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value 15-19 ans 3 248 251 1, 2% p 0, 38 20-24 ans 3 545 548 0, 5% 15-19 ans 3 248 251 1, 2% p 0, 25 25 ans et 15 519 534 2, 8% [1, 4 ; 4, 2] IC95 : intervalle de confiance à 95% FSF : femmes ayant des rapports sexuels avec des femmes Parmi les hommes hétérosexuels, le taux de positivité au gonocoque est significativement plus élevé chez les adultes de 20-24 ans et de 25 ans et plus, que chez les adolescents de 15-19 ans (respectivement 1, 3% et 1, 5%, contre 0, 6%, p Table 31. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae chez les hommes hétérosexuels selon la classe d'âge Figure 43. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae chez les hommes hétérosexuels selon la classe d'âge Parmi les HSH également, le taux de positivité au gonocoque est plus élevé chez les adultes de 20-24 ans et de 25 ans et plus, que chez les adolescents de 15-19 ans (16% et 17, 5%, contre 10, 4%, p 90 Gonocoque chez les hommes hétérosexuels : taux de positivité selon l'âge Âge Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value 15-19 ans 26 4146 4172 0, 6% [0, 4 ; 0, 9] p 0, 0005 20-24 ans 110 8309 8419 1, 3% [1, 1 ; 1, 5] 15-19 ans 26 4146 4172 0, 6% [0, 4 ; 0, 9] p 25 ans et 200 12818 13018 1, 5% [1, 3 ; 1, 7] IC95 : intervalle de confiance à 95% 0, 61, 30, 61, 500, 20, 40, 60, 811, 21, 41, 6Taux de positivté (%)Gonocoque chez les hommes hétérosexuels : taux de positivité selon l'âge15-19 ans20-24 ans15-19 ans25 ans et Table 32. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae chez les HSH (hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes) selon la classe d'âge Figure 44. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae chez les HSH selon la classe d'âge 3 Syphilis 3954 sérologies syphilis ont été réalisées chez des adolescents de 15-19 ans sur la période étudiée, soit 10% de l'ensemble des sérologies. 91 Gonocoque chez les HSH : taux de positivité selon l'âge Âge Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value 15-19 ans 57 492 549 10, 4% [7, 8 ; 12, 9] p 0, 001 20-24 ans 309 1628 1937 16, 0% [14, 3 ; 17, 6] 15-19 ans 57 492 549 10, 4% [7, 8 ; 12, 9] p 25 ans et 1373 6470 7843 17, 5% [16, 7 ; 18, 3] IC95 : intervalle de confiance à 95% HSH : hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes 10, 41610, 417, 505101520Taux de positivité (%)Gonocoque chez les HSH : taux de positivité selon l'âge15-19 ans20-24 ans15-19 ans25 ans et Table 33. Répartition des sérologies syphilis selon la classe d'âge et le sexe 3. 1 Adolescents (15-19 ans) 7 sérologies syphilis positives ont été recensées chez les 15-19 ans entre 2017 et 2021, soit un taux de positivité de 0, 18% (IC95 : 0, 05 ; 0, 31]). Chez les filles, on observe 1 sérologie syphilis positive : cela concernait une adolescente hétérosexuelle. Chez les garçons, 6 sérologies syphilis sont revenues positives, soit un taux de positivité de 0, 28% (IC95 [0, 06 ; 0, 50]). Parmi eux, 5 adolescents déclarent avoir des relations sexuelles avec des hommes (HSH). Aucune différence statistiquement significative n'a pu être mise en évidence entre les filles et les garçons concernant le taux de positivité (table 35). Parmi les garçons, le taux de positivité chez les HSH est significativement plus élevé que chez les hétérosexuels (respectivement 0, 99% contre 0, 09%, p 0, 01) (table 36). Table 34. Taux de positivité des sérologies syphilis chez les 15-19 ans selon le sexe 92 Syphilis : répartition des sérologies selon l'âge et le sexe Âge*sexe Nombre de tests selon l'âge (%) Nombre de tests selon le sexe (%) 15-19 ans 3954 (10%) Femmes 1804 (46%) Hommes 2150 (54%) 20-24 ans 10879 (27%) Femmes 5018 (46%) Hommes 5861 (54%) 25 ans et 25038 (63%) Femmes 6866 (27%) Hommes 18170 (73%) Transsexuels 2 ( Population totale 39871 (100%) Femmes 13688 (34%) Hommes 26181 (66%) Transsexuels 2 ( Sérologies syphilis chez les 15-19 ans : taux de positivité selon le sexe Sexe Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 P-value Filles 1 1803 1804 0, 06% P 0, 14 Garçons 6 2144 2150 0, 28% [0, 06 ; 0, 50] IC95 : intervalle de confiance à 95% Table 35. Taux de positivité des sérologies syphilis chez les 15-19 ans selon l'orientation sexuelle 3. 2 Adolescents (15-19 ans) versus adultes (20-24 ans et 25 ans et plus) Les adolescents de 15-19 ans représentent 1, 4% (N 7/488) de l'ensemble des cas de syphilis recensés. Dans la classe d'âge des 15-24 ans, ils représentent 9% des cas (N 7/74). Figure 45. Proportion d'adolescents de 15-19 ans parmi les sérologies syphilis positives recensées chez les 15-24 ans et dans la population totale Le taux de positivité est significativement plus élevé chez les adultes de 20-24 ans et de 25 ans et plus, que chez les adolescents (respectivement 0, 62% et 1, 65%, contre 0, 18%, p 93 Syphilis chez les 15-19 ans : taux de positivité selon le type de rapport sexuel Sexe*Type de rapport Positifs Négatifs Total* Taux de positivité IC95 p-value Femmes hétérosexuelles 1 1668 1669 0, 06% p 1, 0 FSF 0 110 110 0, 0% Femmes hétérosexuelles 1 1668 1669 0, 06% p 1, 0 Hommes hétérosexuels 1 1133 1134 0, 09% Hommes hétérosexuels 1 1133 1134 0, 09% p 0, 01 HSH 5 502 507 0, 99% [0, 1 ; 1, 8] IC95 : intervalle de confiance à 95% FSF : femmes ayant des rapports sexuels avec des femmes HSH : hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes *Non inclus dans cette analyse : les tests réalisés chez des personnes n'ayant déclaré aucun rapport sexuel (N 517) et ceux pour qui l'information sur l'orientation sexuelle n'était pas renseignée (N 17). 9%91%N 7415-19 ans20-24 ans1%99%(N 488)15-19 ans20 ans et Table 36. Taux de positivité des sérologies syphilis selon la classe d'âge Figure 46. Taux de positivité des sérologies syphilis selon la classe d'âge 3. 2. 1 Comparaison selon le sexe et l'âge Parmi les femmes, aucune différence significative n'a pu être mise en évidence entre les adultes et les adolescentes concernant le taux de positivité des sérologies syphilis, quelle que soit l'orientation sexuelle déclarée. Table 37. Taux de positivité des sérologies syphilis chez les femmes selon la classe d'âge 94 Syphilis : taux de positivité selon l'âge Âge Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value 15-19 ans 7 3946 3953 0, 18% [0, 05 ; 0, 31] p 0, 001 20-24 ans 67 10812 10879 0, 62% [0, 47 ; 0, 76] 15-19 ans 7 3946 3953 0, 18% [0, 05 ; 0, 31] p 25 ans et 414 24624 25038 1, 65% [1, 50 ; 1, 81] IC95 : intervalle de confiance à 95% Syphilis chez les femmes : taux de positivité selon l'âge Âge Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value 15-19 ans 1 1803 1804 0, 06% p 0, 46 20-24 ans 1 5017 5018 0, 02% 15-19 ans 1 1803 1804 0, 06% p 0, 22 25 ans et 15 6851 6866 0, 22% [0, 11 ; 0, 33] IC95 : intervalle de confiance à 95% Table 38. Taux de positivité des sérologies syphilis chez les femmes hétérosexuelles selon la classe d'âge Table 39. Taux de positivité des sérologies syphilis chez les FSF (femmes ayant des rapports sexuels avec des femmes) selon la classe d'âge Parmi les hommes, le taux de positivité des sérologies syphilis est significativement plus élevé chez les adultes de 20-24 ans et de 25 ans et plus, que chez les adolescents (1, 13% et 2, 2%, contre 0, 28%, p Table 40. Taux de positivité des sérologies syphilis chez les hommes selon la classe d'âge 95 Syphilis chez les femmes hétérosexuelles : taux de positivité selon l'âge Âge Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value 15-19 ans 1 1668 1669 0, 06% p 0, 46 20-24 ans 1 4664 4665 0, 02% 15-19 ans 1 1668 1669 0, 06% p 0, 33 25 ans et 14 6422 6436 0, 22% [0, 10 ; 0, 33] IC95 : intervalle de confiance à 95% Syphilis chez les FSF : taux de positivité selon l'âge Âge Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value 15-19 ans 0 110 110 0, 00% 20-24 ans 0 334 334 0, 00% 15-19 ans 0 110 110 0, 00% p 1, 0 25 ans et 1 405 406 0, 25% IC95 : intervalle de confiance à 95% FSF : femmes ayant des rapports sexuels avec des femmes Syphilis chez les hommes : taux de positivité selon l'âge Âge Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value 15-19 ans 6 2144 2150 0, 28% [0, 06 ; 0, 50] p 0, 0004 20-24 ans 66 5795 5861 1, 13% [0, 86 ; 1, 40] 15-19 ans 6 2144 2150 0, 28% [0, 06 ; 0, 50] p 25 ans et 399 17771 18170 2, 20% [2, 0 ; 2, 4] IC95 : intervalle de confiance à 95% Cependant aucune différence significative n'a pu être mise en évidence entre les hommes hétérosexuels de 15-19 ans et ceux de 20-24 ans ou de 25 ans et plus. Table 41. Taux de positivité des sérologies syphilis chez les hommes hétérosexuels selon la classe d'âge En revanche parmi les HSH, le taux de positivité est plus élevé chez les adultes de 20- 24 ans et de 25 ans et plus, que chez les adolescents (3, 3% et 4, 8%, contre 1, 0%, p Table 42. Taux de positivité des sérologies syphilis chez les HSH selon la classe d'âge 4 Infections par le VIH Au total, 4847 sérologies VIH et 9702 Tests rapides d'orientation diagnostique (TROD) ont été réalisés chez des adolescents de 15-19 ans, soit 11% de l'ensemble des sérologies et 24% de l'ensemble des TROD réalisés sur la période. 96 Syphilis chez les hommes hétérosexuels : taux de positivité selon l'âge Âge Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value 15-19 ans 1 1133 1134 0, 1% p 1, 0 20-24 ans 4 3964 3968 0, 1% 15-19 ans 1 1133 1134 0, 1% p 0, 36 25 ans et 31 10495 10526 0, 3% [0, 19 ; 0, 40] IC95 : intervalle de confiance à 95% Syphilis chez les HSH : taux de positivité selon l'âge Âge Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value 15-19 ans 5 502 507 1, 0% [0, 1 ; 1, 8] p 0, 006 20-24 ans 61 1802 1863 3, 3% [2, 5 ; 4, 1] 15-19 ans 5 502 507 1, 0% [0, 06 ; 0, 50] p 25 ans et 366 7222 7588 4, 8% [0, 1 ; 1, 8] IC95 : intervalle de confiance à 95% HSH : hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes Table 43. Répartition des sérologies VIH réalisées selon la classe d'âge et le sexe Table 44. Répartition des TROD VIH réalisés selon la classe d'âge et le sexe 4. 1 Adolescents (15-19 ans) Un TROD VIH positif et une sérologie VIH (VIH-2) positive ont été recensés chez les adolescents de 15-19 ans ; il s'agit de la même patiente, une fille de 16 ans née en Afrique sub-saharienne et qui déclare des rapports hétérosexuels ayant eu lieu avant son arrivée en France. 97 Âge*sexeNombre de sérologies selon l'âge (%)Nombre de sétologies selon le sexe (%)15-19 ans4847Femmes2371 (49%)Hommes2476 (51%)20-24 ans12459Femmes6066 (49%)Hommes6393 (51%)25 ans et 27688Femmes8213 (30%)Hommes19472 (70%)Transsexuels3 ( totale44994Femmes16650 (37%)Hommes28341 (63%)Transsexuels3 ( : répartition des sérologies selon l'âge et le sexeÂge*sexeNombre de tests selon l'âge (%)Nombre de tests selon le sexe (%)15-19 ans9702Femmes4952 (51%)Hommes4750 (49%)20-24 ans12813Femmes5951 (46%)Hommes6857 (54%)Transsexuels5 ( ans et 17394Femmes5018 (29%)Hommes12374 (71%)Transsexuels2 ( totale39909Femmes15921 (40%)Hommes23981 (60%)Transsexuels7 ( : répartition des TROD selon l'âge et le sexeTROD : Tests rapides d'orientation diagnostique Ainsi le taux de positivité chez les 15-19 ans s'élève à 0, 02% pour les sérologies et 0, 10% pour les TROD. Chez les filles de 15-19 ans, il est de 0, 04% pour les sérologies et de 0, 02% pour les TROD. Aucune différence statistiquement significative n'a pu être mis en évidence entre les filles et les garçons de 15-19 ans (table 45, 46, 47 et 48). Table 45. Taux de positivité des sérologies VIH parmi les 15-19 ans selon le sexe Table 46. Taux de positivité des TROD VIH parmi les 15-19 ans selon le sexe Table 47. Taux de positivité des sérologies VIH parmi les 15-19 ans selon l'orientation sexuelle 98 Sérologies VIH chez les 15-19 ans : taux de positivité selon le sexe Sexe*Type de rapport Positifs Négatifs Total Taux de positivité p-value Filles 1 2370 2371 0, 04% p 0, 49 Garçons 0 2476 2476 0, 00% TROD VIH chez les 15-19 ans : taux de positivité selon le sexe Sexe*Type de rapport Positifs Négatifs Total Taux de positivité p-value Filles 1 4951 4952 0, 02% p 1, 0 Garçons 0 4750 4750 0, 00% TROD : test rapide d'orientation diagnostique Sérologies VIH chez les 15-19 ans : taux de positivité selon le type de rapport sexuel Sexe*Type de rapport Positifs Négatifs Total Taux de positivité Femmes hétérosexuelles 1 2211 2212 0, 05% FSF 0 121 121 0, 00% Hommes hétérosexuels 0 1447 1447 0, 00% HSH 0 510 510 0, 00% *Ne sont pas inclus dans cette analyse les tests réalisés chez des personnes ayant déclaré n'avoir jamais eu de rapport sexuel (N 538) ou pour lesquels l'information sur l'orientation sexuelle n'était pas renseignée (N 19). FSF : femmes ayant des rapports sexuels avec des femmes HSH : hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes Table 48. Taux de positivité des TROD VIH parmi les 15-19 ans selon l'orientation sexuelle 4. 2 Adolescents (15-19 ans) versus adultes (20-24 ans et 25 ans et plus) Le taux de positivité des sérologies VIH est significativement plus élevé chez les adultes de 25 ans et plus que chez les 15-19 ans (respectivement 0, 25% contre 0, 02%, p 0, 001). Aucune différence significative n'a pu être mise en évidence entre les 15-19 ans et les 20-24 ans. Table 49. Taux de positivité des sérologies VIH selon la classe d'âge Parmi les femmes, aucune différence statistiquement significative n'a pu être mise en évidence entre les adolescentes et les adultes concernant le taux de positivité des sérologies (table 51). Aucune sérologie VIH positive et aucun TROD VIH positif n'a été recensé chez les femmes ayant des rapports sexuels avec des femmes (FSF), dans l'ensemble de la population et sur la période étudiée. 99 TROD VIH chez les 15-19 ans : taux de positivité selon le type de rapport sexuel Sexe*Type de rapport Positifs Négatifs Total Taux de positivité Femmes hétérosexuelles 1 4625 4626 0, 02% FSF 0 174 174 0, 00% Hommes hétérosexuels 0 3759 3759 0, 00% HSH 0 514 514 0, 00% TROD : test rapide d'orientation diagnostique *Ne sont pas inclus dans cette analyse : les tests réalisés chez des personnes ayant déclaré n'avoir jamais eu de rapport sexuel (N 595) ou pour lesquels l'information sur l'orientation sexuelle n'était pas renseignée (N 34). FSF : femmes ayant des rapports sexuels avec des femmes HSH : hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes Sérologies VIH : taux de positivité selon l'âge Âge Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value 15-19 ans 1 4846 4847 0, 02% p 0, 06 20-24 ans 17 12442 12459 0, 14% [0, 07 ; 0, 20] 15-19 ans 1 4846 4847 0, 02% p 0, 001 25 ans et 70 27618 27688 0, 25% [0, 19 ; 0, 31] IC95 : intervalle de confiance à 95% Table 50. Taux de positivité des sérologies VIH chez les femmes selon la classe d'âge En revanche parmi les hommes, le taux de positivité est significativement plus élevé chez les adultes de 20-24 ans et de 25 ans et plus, que chez les 15-19 ans. Table 51. Taux de positivité des sérologies VIH chez les hommes selon la classe d'âge Nous n'avons pas pu mettre en évidence de différence statistiquement significative entre les taux de positivité retrouvés chez les adultes et chez les adolescents en fonction de l'orientation sexuelle. Table 52. Taux de positivité des sérologies VIH chez les hommes hétérosexuels selon la classe d'âge 100 Sérologies VIH chez les femmes : taux de positivité selon l'âge Âge Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value 15-19 ans 1 2370 2371 0, 04% p 1, 0 20-24 ans 3 6063 6066 0, 05% 15-19 ans 1 2370 2371 0, 04% p 0, 48 25 ans et 11 8202 8213 0, 13% [0, 05 ; 0, 21] IC95 : intervalle de confiance à 95% Sérologie VIH chez les hommes : taux de positivité selon l'âge Âge Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value 15-19 ans 0 2476 2476 0, 00% p 0, 015 20-24 ans 14 6379 6393 0, 22% [0, 10 ; 0, 34] 15-19 ans 0 2476 2476 0, 00% p 0, 011 25 ans et 59 19413 19472 0, 30% [0, 23 ; 0, 38] IC95 : intervalle de confiance à 95% Sérologie VIH chez les hommes hétérosexuels : taux de positivité selon l'âge Âge Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value 15-19 ans 0 1447 1447 0, 00% p 1, 0 20-24 ans 3 4486 4489 0, 07% 15-19 ans 0 1447 1447 0, 00% p 0, 25 25 ans et 16 11835 11851 0, 14% [0, 07 ; 0, 20] IC95 : intervalle de confiance à 95% Table 53. Taux de positivité des sérologies VIH chez les HSH selon la classe d'âge 101 Sérologie VIH chez les HSH : taux de positivité selon l'âge Âge Positifs Négatifs Total Taux de positivité IC95 p-value 15-19 ans 0 510 510 0, 00% p 0, 14 20-24 ans 11 1858 1869 0, 59% [0, 24 ; 0, 94] 15-19 ans 0 510 510 0, 00% p 0, 11 25 ans et 43 7523 7566 0, 57% [0, 40 ; 0, 74] IC95 : intervalle de confiance à 95% HSH : hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes Discussion 1 Principaux résultats 1. 1 Objectif principal Notre objectif était, d'une part, d'étudier les chlamydioses, gonococcies, syphilis et infection par le VIH recensés chez les adolescents de 15-19 ans dans les CeGIDD des Bouches-du-Rhône entre 2017 et 2021. Ainsi, nous avons calculé des taux de positivité que nous avons comparés en fonction du sexe et de l'orientation sexuelle déclarée par les consultants âgés de 15 à 19 ans. Les filles présentent globalement un taux de positivité plus élevé que les garçons pour les chlamydiae chez les 15-19 ans (6, 4% contre 2, 6%) et parmi elles, les hétérosexuelles sont plus concernées que les femmes ayant des rapports sexuels avec des femmes (FSF). Chez les garçons de 15-19 ans, les hommes ayant des rapports sexuels avec les hommes (HSH) ont le taux de positivité le plus élevé (6, 0%). Toute orientation sexuelle confondue, le taux de positivité pour l'infection au gonocoque ne diffère pas significativement entre les filles et les garçons de 15-19 ans (1, 6%). En revanche, parmi les hétérosexuel. le. s, les filles ont un taux de positivité plus élevé que les garçons (1, 6% contre 0, 6%). Comme pour les chlamydiae, chez les garçons de 15-19 ans, les HSH ont le taux de positivité pour le gonocoque le plus élevé (10, 4%). Enfin, aucune différence statistiquement significative n'a pu être mise en évidence entre les filles et les garçons de 15-19 ans concernant la syphilis et l'infection au VIH. Néanmoins concernant la syphilis, les HSH ont le taux de positivité le plus élevé parmi les garçons. Par ailleurs, sur 7 cas de syphilis chez les 15-19 ans, 5 concernaient des HSH. Une seule sérologie VIH positive a été observée chez les 15-19 ans : il s'agissait d'une consultante hétérosexuelle née en Afrique sub-saharienne et arrivée en France en 2019. 1. 2 Objectifs secondaires Ensuite, nous avons comparé ces données avec celles retrouvées chez les consultants de 20-24 ans et de 25 ans et plus. Ainsi, les adolescents représentent 12% de l'ensemble des tests positifs à Chlamydia trachomatis et 24% des cas dans la classe d'âge 15-24 ans. Chez les hommes, les 15-19 ans ont un taux de positivité pour l'infection à CT plus bas que leurs anés, quelle que soit l'orientation sexuelle. En revanche parmi les femmes hétérosexuelles, les 15-19 ans ont un taux de positivité plus élevé que les 25 102 ans et plus (6, 7% contre 5, 1%). Les jeunes femmes de 20-24 ans ont quant à elles le taux de positivité à CT le plus élevé (8, 6%). Concernant le gonocoque, la proportion d'adolescents de 15-19 ans parmi les tests positifs est de 7% ; elle est de 24% dans la classe d'âge des 15-24 ans. Si parmi les garçons, quelle que soit l'orientation sexuelle, les adultes de 20-24 ans et de 25 ans et plus ont un taux de positivité plus élevé que les adolescents, il n'en est pas de même chez les filles. En effet, les adolescentes hétérosexuelles ont un taux de positivité pour le gonocoque plus élevé que les adultes de 25 ans et plus (1, 6% contre 1, 1%), alors que ce taux ne diffère pas significativement de celui des jeunes adultes de 20-24 ans (1, 6%). Les 15-19 ans représentent 1% de l'ensemble des sérologies syphilis positives recensées. Le taux de positivité des sérologies syphilis est plus élevé chez les hommes adultes (20-24 ans et de 25 ans et plus) que chez les adolescents de 15-19 ans, en particulier parmi les HSH. Sur 88 sérologies VIH positives rapportées pendant la période étudiée, 1 seule concerne les 15-19 ans. Aucune différence significative n'a pu être mise en évidence parmi les filles en fonction de l'orientation sexuelle et de l'âge. Chez les hommes, les hétérosexuels de 20-24 ans et de 25 ans et plus ont un taux de positivité pour le VIH plus élevé que les 15-19 ans. 2 Discussion de la méthode et limites de l'étude Les caractéristiques des consultants des CeGIDD induisent un biais de recrutement qui ne permet pas d'extrapoler les résultats de notre étude à l'ensemble des adolescents français. En effet, comme le montrent les études sur le profil des consultants, la population des CeGIDD est plus exposée aux IST que la population générale [17, 80, 81]. Ainsi, comparativement aux individus testés hors CeGIDD, les consultants sont plus nombreux à être âgés de moins de 30 ans, plus souvent multipartenaires et se perçoivent plus à risque vis-à-vis du VIH que la moyenne [81]. En 2016, Santé Publique France présentait un bilan sur la première activité des CeGIDD : parmi les publics accueillis, 85% appartenaient à une population identifiée comme à risque d'exposition aux IST [17]. Nous ne pouvons donc pas comparer nos résultats aux taux de prévalence retrouvés en population générale. De plus, les taux de positivité présentés dans cette étude ont pour dénominateur le nombre de tests réalisés dans la catégorie étudiée et non le nombre total de consultants. Ce taux ne peut donc pas être comparé à la prévalence qui a été estimée dans les études réalisées prospectivement en testant l'ensemble des consultants. Le taux de positivité représenterait alors une borne supérieure de la prévalence dans les centres de dépistage. Cependant, l'enquête SurCeGIDD réalisée en 2018 utilisait le même critère de jugement, à savoir un taux de positivité, calculé selon la même méthodologie que dans notre étude [19]. Nous comparerons donc nos taux de positivité à ceux observés dans SurCeGIDD. 103 Nous discuterons également la proportion d'adolescents parmi les tests positifs recensés dans cette étude et nous les comparerons à ceux retrouvés dans la littérature (cf. Discussion des résultats). Le recueil d'informations concernant l'activité et l'orientation sexuelle est sujette à un biais d'information. En effet, d'une part, un rapport sexuel peut être compris comme une pénétration uniquement, ou comme un rapport oro-génital, oro-anal ou digito-génital. Par exemple dans notre étude, deux adolescentes ayant un test Chlamydia positif ne déclaraient avoir eu aucun rapport sexuel ; en analysant leur dossier, l'une déclarait en fait un rapport sexuel sans pénétration et l'autre des pénétrations anales non protégées. Ces données ont ainsi pu être corrigées. De plus, parmi l'ensemble des consultants testés, les 15-19 ans étaient plus nombreux que les adultes de 20 ans et plus à déclarer n'avoir jamais eu de rapport sexuel (respectivement 6, 8% contre 0, 3%, p Ceci peut s'expliquer soit par un biais de déclaration, soit par le besoin chez un plus grand nombre d'adolescents de se rassurer malgré l'absence de risque particulier. D'autre part, l'orientation sexuelle est une notion sensible à l'interprétation de chacun, particulièrement parmi les adolescents chez qui, comme nous l'avons évoqué, se développe une identité, en particulier sexuelle. Par ailleurs, un rapport homosexuel masculin, notamment, peut faire l'objet d'une omission volontaire (biais de prévarication), en lien avec une plus grande difficulté à rapporter ce type de rapport sexuel chez les adolescents [48]. Cependant en CeGIDD, l'anonymat des consultants et la formation des professionnels à poser des questions sur la sexualité permettent de réduire l'importance de ces biais. Le terme HSH permet de désigner tous les hommes qui ont des rapports sexuels avec des hommes, sans tenir compte du fait qu'ils se reconnaissent comme homosexuels, bisexuels ou hétérosexuels. Ainsi nous avons défini les catégories des HSH et des FSF (femmes ayant des rapports sexuels avec des femmes) selon ce principe et en accord avec les données disponibles de la littérature [19]. Si l'étude des IST chez les homosexuel. le. s, ou chez les bisexuel. le. s spécifiquement semble intéressante, elle nécessiterait probablement de plus grands effectifs et une définition univoque de l'orientation sexuelle afin de minimiser l'influence de biais de déclaration. Dans cette étude, le recueil rétrospectif des données n'a pas permis de récupérer certaines informations manquantes concernant l'orientation sexuelle. Ainsi, le recueil des tests réalisés en 2017 était incomplet et comportait des données manquantes en lien avec un changement de logiciel survenu cette année-là. De plus, les informations issues des consultations réalisées en 2021 n'ont pas toutes été corrigées au moment de l'étude et comportent également des données manquantes. Chez les adolescents, 128 tests (0, 3%) n'ont pas pu être classés selon l'orientation sexuelle du consultant. Parmi eux, un test chlamydia était positif ; il s'agissait d'un mineur non accompagné, arrivé en France depuis un an et n'ayant déclaré aucun rapport sexuel au cours de sa vie. Le test a été inclus dans le décompte total des chlamydioses parmi les garçons de 15-19 ans mais exclu de l'analyse selon l'orientation sexuelle. Il faut également noter qu'une sérologie syphilis positive a été observée chez un adolescent n'ayant déclaré aucune relation sexuelle. Il était originaire d'une zone de 104 tréponématose endémique et ne présentait aucun symptôme ; la sérologie a été réalisée dans le cadre du bilan effectué chez les migrants primo-arrivants. Nous avons exclu ce test de l'étude. Le recueil rétrospectif a cependant permis d'augmenter la taille de notre échantillon en étendant la période d'étude de 2017 à juillet 2021. Ainsi, 41 103 tests réalisés chez des adolescents de 15-19 ans ont pu être analysés. Notre échantillon était ainsi plus grand que celui d'autres études réalisées en CeGIDD sur des adolescents [2528], mais inférieur à celui de l'enquête SurCeGIDD [19]. Plusieurs arguments nous ont menés à exclure de l'étude les tests réalisés chez les transsexuels. D'une part, leurs effectifs étaient faibles parmi les adolescents (1 test CT et NG) et les adultes (10 tests VIH, 2 tests CT et NG et 2 tests VIH). D'autre part, les données manquantes sur l'orientation sexuelle auraient encore affaibli la significativité des résultats. Enfin l'interprétation de nos résultats doit prendre en compte le fait que les données présentées sont celles d'un nombre de tests réalisés et non de personnes testées. Une même personne peut donc avoir été testée plusieurs fois et avoir eu un résultat positif ou négatif à plusieurs reprises. En effet, un même individu peut consulter plusieurs fois avec un numéro d'identification différent, rendant l'exclusion des doublons difficile et imprécise. Ce biais de confusion lié à l'absence d'identification des patients se retrouve dans d'autres études réalisées à partir des données des CeGIDD, notamment dans l'enquête SurCeGIDD [19]. 3 Discussion des résultats 3. 1 Chlamydia trachomatis 3. 1. 1 Comparaison avec la littérature Dans notre étude, le taux de positivité des chlamydiae parmi les 15-19 ans est de 6, 4% chez les filles et 2, 6% chez les garçons. En 2002 en Centre de Dépistage Anonyme et Gratuit (CDAG), il était de 10% chez les filles et 10, 8% chez les garçons [25] ; cependant les effectifs de cette étude étaient plus faibles puisque 350 femmes et 83 hommes avaient été prélevés contre respectivement 6175 et 5124 dans notre travail. En 2018 dans l'enquête SurCeGIDD, parmi les moins de 20 ans, le taux de positivité était de 8, 2% chez les filles et de 4, 8% chez les garçons. Bien que le nombre de tests réalisés chez les adolescents ne soient pas spécifiés, l'enquête a recensé en tout 76 356 tests Chlamydia trachomatis contre 63 085 dans notre étude. De plus, SurCeGIDD a recueilli les données des CeGIDD à un niveau national, or des différences régionales y sont décrites en termes de fréquence des chlamydioses. Ainsi dans SurCeGIDD, les Départements d'Outre-Mer et l'le-de-France présentaient des taux de positivité plus élevés que le reste de la métropole, tous âges confondus[19]. La proportion d'adolescents parmi les cas infections à CT (22% chez les filles et 5% chez les garçons) semble supérieure à celle retrouvée en 2002 par Rénachla 105 (19% et 3, 3%) mais elle est proche de celle retrouvée en 2009 (respectivement 23% et 6% [13]) [22]. Dans ce travail, les filles de 15-19 ans ont un taux de positivité pour les chlamydiae plus élevé que leurs anées âgées de 25 ans et plus, alors que selon le Baromètre santé, en 2016, 33% des femmes déclaraient un premier rapport sexuel après 19 ans [60]. En revanche, contrairement aux filles, les garçons de 15-19 ans, hétérosexuels et HSH, ont un taux de positivité moins élevé que leurs anés qui semblent donc plus exposés aux infections à Chlamydia trachomatis. La prédominance féminine observée dans la population générale (60% des cas de chlamydioses en 2017 selon Rénachla [16]) se retrouve de manière accentuée chez les adolescents puisque 75% des cas d'infections à CT recensés chez les 15-19 ans dans notre étude concernaient des filles. Comme dans l'étude SurCeGIDD [19] réalisée en 2018, le taux de positivité parmi les 15-19 ans est plus élevé chez les filles que chez les garçons. Cette prédominance féminine, accentuée chez les adolescents, peut trouver plusieurs explications. 3. 1. 2 Interprétation D'une part, les jeunes femmes sont, depuis 2003 et les recommandations de l'agence nationale d'accréditation et d'évaluation en santé, plus sensibilisée au dépistage de l'infection à Chlamydia trachomatis que les garçons [7]. D'autre part, nous avons pu constater dans certaines études (KABP en 2010 [64] et Sida Info Service en 2013 [67]) que les femmes en général et les adolescentes en particulier, déclarent moins souvent avoir utilisé un préservatif au dernier rapport. Par ailleurs, les données du Baromètre santé 2016 [3] nous ont appris qu'elles sont plus nombreuses que les garçons à s'initier avec un partenaire plus âgé d'au moins deux ans qu'elles. Or selon Beltzer N et al dans Enquête de la sexualité en France (2008), les femmes utiliseraient moins fréquemment le préservatif lorsque leur partenaire est plus âgé d'au moins deux ans qu'elles. L'inverse n'était pas vrai : si la femme était plus âgée que son partenaire, il n'y avait pas d'incidence sur les comportements de prévention [82]. L'étude KABP, en 2010, révélait aussi les difficultés rencontrées par les femmes à imposer le préservatif au début des nouvelles relations et lorsque le partenaire ne souhaite pas l'utiliser [61]. Ce constat, mis en lien avec le statut social des femmes dans la société française par Beltzer et al, place les jeunes femmes dans une situation de plus grande vulnérabilité face aux IST. Un autre facteur de vulnérabilité, d'ordre biologique, existerait chez les jeunes femmes : selon Chinsembu et al, la fréquence de l'ectopie cervicale chez les adolescentes favoriserait l'infection à Chlamydia trachomatis et Neisseria gonorrhoeae par l'exposition d'un épithélium cylindrique, plus vulnérable que l'épithélium pavimenteux [83]. Concernant le mode de contamination, le taux de positivité de l'infection à CT plus élevé chez les hétérosexuelles que chez les FSF parmi les filles de 15-19 ans suggère soit un mode transmission essentiellement hétérosexuel, soit une différence 106 de comportements. Parmi les garçons en revanche, le taux de positivité est plus élevé chez les HSH que chez les hétérosexuels ; cela pourrait refléter un plus grand nombre de rapports non protégés parmi les HSH de moins de 20 ans, comme le rapportait Sida Info Service en 2013 [67]. 3. 2 Gonocoque 3. 2. 1 Comparaison avec littérature Dans ce travail, le taux de positivité pour l'infection au gonocoque chez les 15- 19 ans est de 1, 6% chez les filles et les garçons ; il était de 1, 8% chez les filles et 2, 1% chez les garçons de moins de 20 ans dans l'enquête SurCeGIDD qui recensait 70 971 tests au total contre 63 085 dans notre étude. Comme pour les chlamydiae, la comparaison entre les deux études est limitée par le fait que le nombre de tests réalisés chez les 15-19 ans dans l'enquête SurCeGIDD n'est pas connu, et par le caractère national de SurCeGIDD avec l'existence de disparités régionales (cf. 3. 1. 1). Dans notre étude, la proportion d'adolescents parmi les cas de gonococcies est de 26% chez les femmes et 4% chez les hommes. Ces proportions sont supérieures à celles retrouvés par Rénago en 2002 (respectivement 18% et 2%)[37] et semblent comparables avec celles retrouvées par RésIST en 2013 (28% et 6%) [38]. Si les hommes représentent 86% de l'ensemble des cas de gonococcies déclarées en 2019 selon Santé Publique France (SPF) [20], ils représentent un peu moins de la moitié des cas parmi les 15-19 ans dans notre étude. D'après SPF, parmi l'ensemble des consultants des CeGIDD en 2018, les hommes avaient un taux de positivité plus élevé que les femmes [18]. En revanche dans notre étude, parmi les 15-19 ans, les taux de positivité chez les filles et les garçons de 15-19 ans ne diffèrent pas significativement (1, 6% pour les deux sexes). 3. 2. 2 Interprétation Outre la vulnérabilité des jeunes femmes, liée à une plus grande difficulté à imposer le préservatif, à s'initier avec un partenaire plus âgé et à l'ectopie cervicale (cf. 3. 1. 2), ces résultats pourraient trouver une autre explication : la moindre représentation d'HSH parmi les garçons de 15-19 ans infectés par le gonocoque, alors qu'ils sont majoritaires parmi les adultes. Ainsi, dans notre étude, la proportion d'HSH parmi les 15-19 ans ayant un test positif pour le gonocoque est de 31% ; or selon Santé Publique France, les HSH représentaient 74% de l'ensemble des cas de gonococcies rapportées en 2019, tous âges confondus [20]. En effet comme nous l'avons décrit, les HSH s'initient plus tardivement aux rapports sexuels entre hommes (18 ans en médiane [57], alors que l'âge médian au premier rapport est de 17 ans chez les hommes, toute orientation sexuelle confondue [3]). Cependant le taux de positivité plus élevé chez les HSH que chez les hétérosexuels parmi les 15-19 ans dans ce travail suggère que ces premiers rapports restent 107 insuffisamment protégés, comme le révélaient différentes études citées dans le chapitre 2 [68, 69, 84]. Par ailleurs, une étude australienne ayant interrogé, en 2010, 200 HSH âgés de 16 à 20 ans, montrait que 50% des répondants rapportaient avoir surtout des rapports avec des hommes plus âgés (5 ans de différence d'âge en médiane), chez qui la prévalence de l'infection à gonocoque est plus importante [85]. Enfin, il est intéressant de noter que dans notre étude, comme pour Chlamydia trachomatis, les filles de 15-19 ans ont un taux de positivité pour le gonocoque plus élevé que leurs anées de 25 ans et plus. Pourtant, d'après le Baromètre santé, 33% des femmes déclaraient un premier rapport sexuel après 19 ans en 2016 [60]. La vulnérabilité de ces jeunes femmes que nous avons déjà évoquée (cf. 3. 1. 2) pourrait expliquer ces résultats. 3. 3 Syphilis Comme décrit dans la littérature, les adolescents représentent une part minime des syphilis dans notre étude : 1% des cas (N 7/488) concernaient les 15-19 ans. Cependant ils semblent moins représentés que dans d'autres études : en effet en 2013, d'après RésIST [38], les adolescents de moins de 20 ans représentaient 19% des syphilis récentes chez les femmes et 2, 6% des cas chez les hommes, contre respectivement 6% et 1, 3% dans notre étude. Cette sous-représentation des adolescents parmi les syphilis dans notre étude pourrait s'expliquer par un manque d'effectif, au vu de la relative rareté de cette IST. En effet, au total, notre étude a recensé 488 sérologies syphilis positives, dont 471 chez les hommes et 17 chez les femmes. Dans le rapport de RésIST en 2013, les effectifs de cas positifs étaient de 971 chez les hommes et 41 chez les femmes [38]. Le taux de positivité plus élevé retrouvé chez les HSH par rapport aux hétérosexuels parmi les 15-19 ans dans notre étude est concordant avec les données de la littérature et se retrouve dans la population générale. En 2019, les HSH représentaient 80% de l'ensemble des syphilis rapportées par Santé Publique France dans l'ensemble de la population [20] ; dans notre étude, ils étaient concernés dans 5 cas sur 7 chez les adolescents. Ainsi la vulnérabilité des HSH pour la syphilis observée dans la population générale se retrouve chez les adolescents, malgré des effectifs réduits dans cette tranche d'âge. Cela pourrait refléter un niveau de protection insuffisant dans cette population, comme suggéré dans différentes études (cf. Chapitre 2) [68, 69, 84]. 3. 4 Infection par le VIH Les faibles effectifs de séropositivités dans notre étude rendent délicate la comparaison avec les données de la littérature. Cependant la proportion d'adolescents parmi les découvertes de séropositivité VIH semble régulièrement estimée à environ 1%. Ainsi, 1 seul cas a été observé dans ce travail chez les adolescents de 15-19 ans, soit un peu plus de 1% de l'ensemble des séropositivités (N 1/88). En 2013, Lot F et al retrouvaient une proportion de 0, 66% d'adolescents de 15 à 17 ans parmi les 108 découvertes de séropositivité (N 41/6220) [48]. Selon l'ECDC, les 15-19 ans représentaient 1, 8% des cas de séropositivité VIH en France en 2013 [41]. Dans l'étude de Lot F et al, la catégorie des adolescents était la seule parmi laquelle les découvertes de séropositivité prédominaient chez les femmes. Les auteurs l'expliquaient par le poids des contaminations chez les adolescentes nées en Afrique subsaharienne [48]. C'est le cas de la seule adolescente ayant une sérologie VIH positive dans notre étude. La prévalence de l'infection par le VIH en Afrique subsaharienne, la vulnérabilité de ces personnes durant leur parcours migratoire puis à leur arrivée en France expliquent la fréquence des séropositivités observées dans cette population [86]. Enfin, aucun adolescent HSH n'a présenté de sérologie positive dans notre étude. Pourtant les HSH représentaient 43% des découvertes de séropositivité chez les adultes en 2019 [20] et présentaient le taux de positivité le plus élevé en 2018 parmi l'ensemble des consultants des CeGIDD nés en France [19]. Un manque de puissance et un âge médian au premier rapport sexuel avec un autre homme plus tardif que l'âge médian au premier rapport hétérosexuel pourraient expliquer ces résultats. 4 Perspectives 4. 1 Amélioration de l'offre de dépistage La fréquence des tests positifs à Chlamydia trachomatis et Neisseria gonorrhoeae retrouvés dans cette étude parmi les adolescentes confirme la nécessité de ne pas négliger le dépistage de 15-19 ans sexuellement actives, comme le recommande la Haute Autorité de Santé (HAS) pour l'ensemble des femmes de 15-24 ans ayant débuté leur vie sexuelle [7]. De plus, les complications et les séquelles auxquelles sont exposées les adolescentes contaminées (infections génitales hautes, douleurs chroniques, risque de grossesse extra-utérine et troubles de la fertilité) renforcent l'utilité du dépistage dans cette population. Les garçons de 15-19 ans ne sont pas indemnes de ces IST dans notre étude. Le réservoir épidémique qu'ils représentent et la difficulté qui peut exister à rapporter des relations homosexuelles à cet âge-là sont des arguments pour d'une part, les interroger avec soin et tact, et d'autre part leur proposer un test de dépistage. Par ailleurs, selon KABP en 2010, les 18-30 ans semblent plébisciter le dépistage comme moyen de prévention : ils sont 90% à juger ce moyen efficace contre 81% des plus de 30 ans (p [61]. Cependant parmi les HSH, chez qui un dépistage trimestriel de l'infection au VIH est recommandé par la HAS [8], le recours au dépistage dans l'année ne concernait en 2011 que 57% des moins de 30 ans [87]. Il est intéressant de noter que le dépistage en tant que pratique de prévention semble bien intégré parmi les HSH affirmés , fréquentant les lieux communautaires et ayant un nombre important de partenaires (plus de 10 dans les 12 derniers mois), selon l'enquête presse gay (2011). En revanche, les HSH non testés se caractérisent notamment par un moindre sentiment 109 d'appartenance à la communauté gay, un certain éloignement des zones urbaines, un jeune âge (60% avaient moins de 30 ans contre 37% des HSH testés dans l'année) et à une position sociale plus modeste. Si ces HSH non testés sont moins nombreux à déclarer plus de 10 partenaires dans les 12 derniers mois (12, 7% contre 34, 3% chez les HSH testés dans l'année), ils sont 55% à déclarer entre 2 et 10 partenaires et 23% à rapporter au moins une pénétration anale non protégée avec un partenaire occasionnel au cours des 12 derniers mois [88]. Il s'agit donc d'encourager les pratiques de dépistage dans les groupes à risques, notamment parmi les HSH éloignés des zones urbaines et du système de soins. Les campagnes de prévention, le développement des activités de dépistage hors les murs et des autotests pourraient ainsi bénéficier aux personnes chez qui ce moyen de prévention n'a pas été intégré. Les activités hors les murs (HLM) sont des missions facultatives des CeGIDD réalisées en dehors du local par le personnel du centre. Si le nombre total d'actions HLM semble stable en 2019 en PACA, seulement 28% comprenaient une activité de dépistage. De plus, ces activités HLM nécessitent une mobilisation importante du personnel et parfois la fermeture du site principal [89]. Ainsi, donner les moyens aux CeGIDD de développer ces activités permettrait d'atteindre un public plus éloigné du système de soins et proposer un dépistage à un plus grand nombre de personnes. L'éducation sexuelle et la prophylaxie préexposition (PrEP)sont aussi des moyens d'augmenter l'activité de dépistage : nous le développerons dans le chapitre 4. 4. 4. 2 Consultation de l'adolescent et abord de la sexualité Si la consultation de l'adolescent est singulière pas plusieurs aspects, l'abord de la sexualité en particulier ne va pas de soi. D'une part, l'adolescent consulte relativement peu le médecin : 2, 1 fois par an en moyenne pour les garçons et 2, 5 pour les filles. De plus, dans deux-tiers des cas la consultation est sollicitée par les parents et, à 18 ans, 51% des filles et 61% des garçons sont encore accompagnés chez leur médecin [90]. L'abord de la sexualité et de la prévention des IST nécessitent un cadre confidentiel et une attitude non stigmatisante. En cabinet, lorsqu'un adulte référent est présent, un entretien en deux temps un temps avec l'adulte et un temps seul avec l'adolescent peut aider à favoriser l'autonomie et la liberté d'évoquer les sujets souhaités [91]. De plus, une formation de base en santé sexuelle pour les soins de premier recours favoriserait l'abord de la sexualité en consultation. Le déploiement de terrains de stage pour les futurs professionnels de la santé et le développement de diplômes universitaires et de formations continues en santé sexuelle aideraient les médecins à mieux appréhender la prévention en santé sexuelle. Ainsi d'après le Dr Spenatto, le professionnel doit apprendre à se détacher de ses représentations dans l'intérêt du patient qu'il reçoit. D'autant plus que, si l'abord du sujet de la santé sexuelle peut paratre difficile pour le médecin, il l'est probablement plus pour le patient qui est directement concerné, et qui peut ressentir un certain soulagement lorsque le médecin amorce la discussion [92]. 110 privilégiés par l'ensemble Dans ce sens, les CeGIDD, depuis leur création en 2016, ont intégré dans leur activité une mission de prévention globale en santé sexuelle. Néanmoins, ils restent relativement méconnus des jeunes de 15 à 30 ans. Dans une enquête ayant interrogé, en 2016, 2 000 personnes âgées de 15 à 30 ans sur les lieux de consultations de santé sexuelle, seulement 10, 4% des répondant citaient les CeGIDD ; les cabinets médicaux étaient quant à eux les plus cités (24, 6%) [5]. Les médecins généralistes, pourtant, ne semblent pas perçus comme des interlocuteurs adolescents. Ainsi selon la thèse du Dr Lacotte-Marly, si 92% des adolescents pensent que les généralistes peuvent les aider sur le plan de la santé physique, ils ne sont que 55% à le penser pour leurs problèmes sexuels [90]. Dans la thèse des Dr Potey et Torres, parmi les freins perçus par les adolescents pour aborder la sexualité avec leur médecin généraliste, le fait de devoir demander la carte vitale aux parents était cité par 44% des filles et 56% des garçons, et le fait de devoir payer la consultation par 49, 2% des filles et 50, 8% des garçons [93]. Les CeGIDD souffrent donc d'une certaine méconnaissance de la part des adolescents alors même que leur gratuité, leur anonymat et la formation spécifique des professionnels qui y travaillent peuvent faciliter la consultation. Ainsi, en plus d'une formation à proposer aux médecins généralistes, des campagnes d'information sur les activités proposées par les CeGIDD pourraient sensibiliser les plus jeunes. Enfin, une collaboration entre les CeGIDD et les médecins généralistes pourrait amplifier l'offre de prévention et aider les généralistes à mieux cibler le dépistage. des 4. 3 Éducation à la sexualité Les différentes études comportementales pointent la moins bonne connaissance des mesures de prévention chez les jeunes ayant commencé leur vie sexuelle après l'arrivée des antirétroviraux. Cela se traduit par un relâchement des comportements de prévention et notamment une baisse de l'utilisation du préservatif, qui appelle à renforcer les stratégies de prévention. En plus du message apporté par les organismes publics et les médecins, l'École doit fournir une éducation globale à la sexualité, incluant notamment une information sur la prévention des IST [74]. Cependant, comme nous l'avons évoqué, l'éducation à la sexualité dans les établissements scolaires reste insuffisamment déployée en France. Une partie des professionnels de santé qui y interviennent souhaiterait également une meilleure formation pour aborder les questions de santé sexuelle et mettre à jour leurs connaissances sur les IST [5]. Cette formation est essentielle pour apporter aux adolescents une information claire et dépourvue de jugements. En outre, l'éducation complète à la sexualité, telle que promue par l'UNESCO, vise aussi à aborder les normes de genre et leur influence possible sur les inégalités en santé des jeunes [94]. Ainsi, l'abord du consentement et des rapports de pouvoirs chez les adolescents pourrait aider les plus vulnérables (notamment les jeunes femmes et les HSH) à mieux se protéger de situations à risque pour leur santé. Cette éducation complète à la sexualité doit donc se faire dans une approche globale de santé sexuelle (définie comme un état de bien-être physique, émotionnel, mental et social en relation avec la sexualité [95]) pour permettre aux jeunes d'explorer leur sexualité d'une manière saine, positive et sûre. 111 4. 4 Prévention combinée Aujourd'hui, la prévention de l'infection par le VIH s'appuie sur une combinaison de moyens complémentaires au préservatif et au dépistage. Pourtant, il apparat que les jeunes souffrent d'une relative méconnaissance de ces moyens de prévention : en 2018, l'IFOP a réalisé une enquête pour Sidaction auprès de 1 000 Français âgés de 15 à 24 ans. Parmi eux, 44% connaissaient le TPE (traitement post-exposition), 35% le TaSP (treatment as prevention) et 33% la PrEP (prophylaxie pré-exposition) comme moyens de prévention [66]. Malgré le nombre relativement faible de séropositivités VIH observées chez les adolescents, la diffusion d'une information diversifiée sur les moyens de se protéger du VIH semble utile pour leur vie future, en particulier lors de l'entrée à l'âge adulte entre 20 et 24 ans, o le risque semble particulièrement élevé (cf. Épidémiologie). La PrEP, notamment, a fait ses preuves en matière de bénéfices sur la réduction des contaminations au VIH parmi les populations les plus exposées [9698]. Par ailleurs, la PrEP ne se résume pas à la prescription d'un médicament ; celle-ci s'accompagne d'une démarche d'information en prévention et d'une activité de dépistage régulière chez l'usager. En effet, tous les 3 mois, les utilisateurs de la PrEP doivent réaliser un test de dépistage du VIH et des IST. Ces dépistages répétés pourraient entraner, après une augmentation initiale du nombre de cas d'IST bactériennes déclarées, une baisse de l'incidence des IST à mesure que plus de personnes (y compris asymptomatiques) sont traitées et que les chanes de transmission sont rompues [9]. Les critères d'éligibilité à la PrEP, tels que définis par le conseil national du sida (CNS), sont d'une part un âge de plus de 15 ans et d'autre part un haut risque de contracter le VIH. Cela concerne principalement les HSH et les transsexuels avec au moins un des quatre critères suivants : des pénétrations anales sans préservatif avec au moins 2 partenaires sexuels différents dans les 6 derniers mois ; des épisodes d'IST dans les 12 derniers mois ; au moins un recours au TPE dans les 12 derniers mois ; l'usage de drogues lors des rapports sexuels (chemsex). Au cas par cas, d'autres publics peuvent bénéficier de la PrEP : les usagers de drogues intraveineuses avec partage de seringues, les personnes en situation de prostitution et exposées à des rapports sexuels non protégés et les personnes en situation de vulnérabilité et exposées à des rapports sexuels non protégés à haut risque de transmission du VIH [86]. Actuellement seule l'association emtricitabine et fumarate de ténofovir disoproxil (FTC/TDF) est approuvée en Europe pour l'usage de la PrEP. Les données de l'enquête rapport au sexe (ERAS) montrent une augmentation significative de l'usage de la PrEP au dernier rapport sexuel parmi les répondants entre 2017 et 2019 (4, 8% contre 12, 1%) [70]. Cependant, en 2019, ces usagers restent en majorité des personnes avec une situation financière aisée ou confortable (65%), nées en France (92, 5%), fréquentant les lieux de convivialité gays (88%) et d'un âge médian de 35 ans. En revanche, ceux qui pourraient y bénéficier mais n'y ont pas recours sont plus jeunes, moins urbains et moins informés de l'effet préventif du traitement que les usagers [70]. Ainsi, la part des moins de 25 ans parmi les usagers de la PrEP fluctuerait entre 16% et 19% entre 2018 et 2020 [86], alors que, comme nous l'avons développé, le nombre 112 de découvertes parmi les HSH et les hétérosexuels de moins de 25 ans ne baissait pas en 2018, contrairement à leurs anés [45]. Le nombre de découvertes de séropositivité parmi les personnes nées à l'étranger continue d'augmenter selon Santé Publique France, notamment chez les HSH [45]. Si le lieu de la contamination est souvent difficile à établir, l'ANRS estimait en 2015 qu'entre 35% et 49% des migrants d'Afrique subsaharienne séropositifs vivant en le- de-France ont été infectés après leur arrivée en France ; parmi eux, une majorité avait moins de 25 ans [99]. Ils sont pourtant, comme on l'a vu, minoritaires parmi les usagers de la PrEP. L'enjeu est donc de parvenir à atteindre des personnes à risque, chez lesquels la dynamique épidémique semble toujours en progression et qui ont moins d'accès aux soins et aux messages de prévention : il s'agit notamment des jeunes HSH éloignés des zones urbaines et des lieux de sociabilisation communautaires, et des jeunes hommes et femmes né. e. s à l'étranger. L'autorisation récente donnée aux médecins généralistes d'introduire la PrEP permettra probablement sa diffusion au sein du public cible. Une plateforme numérique (FormaPrEP. org), développée avec l'aide de la Société Française de Dermatologie et du Collège de la Médecine Générale, permet de former les médecins généralistes et de les accompagner lors de la primo-prescription et du suivi de la PrEP [100]. Enfin, de nouvelles molécules à longue durée d'action ont été étudiées et pourraient diversifier l'offre de prévention. Il s'agit notamment du cabotegravir, testé dans un essai clinique randomisé chez des HSH et des femmes transgenres à haut risque de contamination. Le cabotegravir, à raison d'une injection intramusculaire tous les 2 mois, semble au moins aussi efficace que l'association FTC/TDF pour prévenir les contaminations au VIH parmi la population étudiée, sans effet adverse majeur rapporté[101]. 113 Conclusion L'objectif de cette étude était d'étudier la fréquence des chlamydioses, gonococcies, des syphilis et des infections par le VIH chez les adolescents. La proportion d'IST et leur taux de positivité, particulièrement pour Chlamydia trachomatis et Neisseria gonorrhoeae, sont significatifs chez les 15-19 ans, notamment parmi les filles et parmi les hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes. Les complications potentielles auxquelles expose notamment l'infection à C. trachomatis parmi les jeunes femmes, renforcent l'utilité du dépistage dans cette population. Une certaine méconnaissance et une moindre utilisation des moyens de prévention de la part des plus jeunes par rapport à leurs anés, en lien avec une moindre exposition aux campagnes de santé publique et une entrée dans la sexualité après l'arrivée des antirétroviraux, pourraient expliquer ces résultats. Cependant, des défaillances du système éducatif français dans le domaine de l'éducation à la sexualité sont également déplorées par les associations. Pourtant, l'éducation complète, globale et diversifiée à la sexualité a fait ses preuves pour permettre aux jeunes de vivre leur sexualité de manière positive et sûre. Par ailleurs, le développement de formations dans le domaine de la santé sexuelle pourrait permettre aux médecins d'aborder le sujet avec plus de facilité et de compétences avec leurs patients, en particulier les plus jeunes. Enfin, les progrès effectués par la science ces dernières décennies offrent aujourd'hui une diversité de moyens de prévention, complémentaires les uns aux autres, en santé sexuelle. La combinaison de ces outils de prévention est prometteuse pour la lutte contre l'infection au VIH et les IST. Néanmoins, leur notoriété est encore insuffisante et un certain nombre de personnes susceptibles d'en bénéficier n'y ont pas encore accès. L'enjeu est donc de rendre plus accessible l'information scientifique, essentielle à la prise de décision autonome et éclairée, et de renforcer la stratégie d' aller vers en prévention en cherchant à atteindre un public notamment plus jeune et plus éloigné du système de soins de santé. 114 Liste des tables Table 1. Taux de diagnostics (pour 100 000 habitants) d'infections à Chlamydia trachomatis selon la région, le sexe et l'âge (d'après LaboIST, 2016 [2]) . 40 Table 2 : Répartition des cas d'infections à C. trachomatis selon la classe d'âge et le sexe du patient, Rénachla 1997 (d'après Santé Publique France [21]). 41 Table 3. Répartition des cas positifs à C. trachomatis selon la classe d'âge et le sexe, Rénachla 2002 (d'après Goulet V et al [22] ) . 42 Table 4. Taux de positivité à C. trachomatis par classe d'âge et par sexe en CDAG, 2002 (d'après Georges S et al [25]) . 43 Table 5. Prévalence de l'infection à C. trachomatis, CPEF du Val-de-Marne, France, 1999 (d'après Prudhomme et al [26]) . 44 Table 6. Prévalence de l'infection à C. trachomatis chez les jeunes consultants de 42 CPEF de Seine-Saint-Denis, France, 2005 (d'après Santé Publique France[27]) . 45 Table 7. Prévalence de l'infection à C. trachomatis dans un CeGIDD parisien, 2016 (d'après Rondeau et al [28]) . 45 Table 8. Prévalence de l'infection à C. trachomatis selon l'âge, Royaume-Uni, 2012 (d'après Sonnenberg et al [30]) . 46 Table 9. Proportion des cas d'infections à C. trachomatis selon le sexe et la classe d'âge, Rénago 2001-2012 (d'après Ruche et al [34]) . 47 Table 10. Taux de diagnostics (pour 100 000 habitants) d'infections à gonocoque selon la région, le sexe et l'âge (d'après LaboIST, 2016 [2]) . 48 Table 11. Proportion d'infections à gonocoque selon le sexe et la classe d'âge, Rénago 2001-2002 (d'après Herida et al [37]). 49 Table 12. Distribution des cas de découverte de séropositivité en PACA selon l'âge, 2013-2016, 2017, 2018 (d'après Santé Publique France [47]) . 56 Table 13. Répartition des tests C. trachomatis réalisés selon la classe d'âge et le sexe . 72 Table 14. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les 15-19 ans selon le sexe . 73 Table 15. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les 15-19 ans selon l'orientation sexuelle . 74 Table 16. Taux de positivité des tests C. trachomatis selon l'âge . 76 Table 17. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les femmes selon la classe d'âge . 77 Table 18. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les hommes selon la classe d'âge . 78 115 Table 19. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les femmes hétérosexuelles selon la classe d'âge . 79 Table 20. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les FSF (femmes ayant des rapports sexuels avec des femmes) selon la classe d'âge . 80 Table 21. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les hommes hétérosexuels selon la classe d'âge . 80 Table 22. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les HSH (hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes) selon la classe d'âge . 81 Table 23. Répartition des tests N. gonorrhoeae réalisés selon la classe d'âge et le sexe . 82 Table 24. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae chez les 15-19 ans selon le sexe . 82 Table 25. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae chez les 15-19 ans selon l'orientation sexuelle . 83 Table 26. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae selon la classe d'âge . 85 Table 27. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae selon la classe d'âge . 86 Table 28. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae chez les hommes selon la classe d'âge . 88 Table 29. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae chez les femmes hétérosexuelles selon la classe d'âge . 89 Table 30. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae chez les FSF (femmes ayant des rapports sexuels avec des femmes) selon la classe d'âge . 89 Table 31. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae chez les hommes hétérosexuels selon la classe d'âge . 90 Table 32. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae chez les HSH (hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes) selon la classe d'âge . 91 Table 33. Répartition des sérologies syphilis selon la classe d'âge et le sexe . 92 Table 34. Taux de positivité des sérologies syphilis chez les 15-19 ans selon le sexe . 92 Table 35. Taux de positivité des sérologies syphilis chez les 15-19 ans selon l'orientation sexuelle . 93 Table 36. Taux de positivité des sérologies syphilis selon la classe d'âge . 94 Table 37. Taux de positivité des sérologies syphilis chez les femmes selon la classe d'âge . 94 Table 38. Taux de positivité des sérologies syphilis chez les femmes hétérosexuelles selon la classe d'âge . 95 Table 39. Taux de positivité des sérologies syphilis chez les FSF (femmes ayant des rapports sexuels avec des femmes) selon la classe d'âge . 95 Table 40. Taux de positivité des sérologies syphilis chez les hommes selon la classe d'âge . 95 116 Table 41. Taux de positivité des sérologies syphilis chez les hommes hétérosexuels selon la classe d'âge . 96 Table 42. Taux de positivité des sérologies syphilis chez les HSH selon la classe d'âge . 96 Table 43. Répartition des sérologies VIH réalisées selon la classe d'âge et le sexe . 97 Table 44. Répartition des TROD VIH réalisés selon la classe d'âge et le sexe . 97 Table 45. Taux de positivité des sérologies VIH parmi les 15-19 ans selon le sexe. 98 Table 46. Taux de positivité des TROD VIH parmi les 15-19 ans selon le sexe . 98 Table 47. Taux de positivité des sérologies VIH parmi les 15-19 ans selon l'orientation sexuelle . 98 Table 48. Taux de positivité des TROD VIH parmi les 15-19 ans selon l'orientation sexuelle . 99 Table 49. Taux de positivité des sérologies VIH selon la classe d'âge . 99 Table 50. Taux de positivité des sérologies VIH chez les femmes selon la classe d'âge . 100 Table 51. Taux de positivité des sérologies VIH chez les hommes selon la classe d'âge . 100 Table 52. Taux de positivité des sérologies VIH chez les hommes hétérosexuels selon la classe d'âge . 100 Table 53. Taux de positivité des sérologies VIH chez les HSH selon la classe d'âge . 101 117 Liste des figures Figure 2. Répartition par classe d'âge et par sexe des diagnostics d'infection à C. trachomatis, Rénachla 2009 (d'après Goulet V et al [13]) . 42 Figure 3. Distribution des infectons à C. trachomatis par classe d'âge selon le sexe, Rénachla 2015 (d'après Santé Publique France [23]) . 43 Figure 4. Proportion de consultants testés et taux de positivité de l'infection à C. trachomatis selon le sexe et l'âge, SurCeGIDD 2018 (d'après Santé Publique France [19]) . 44 Figure 5. Évolution du nombre de gonococcies déclarées entre 2004 et 2016 par RésIST (d'après Santé Publique France [35]) . 48 Figure 6. Distribution des cas de gonococcies par classe d'âge selon le sexe, RésIST 2013 (d'après Santé Publique France [38]) . 50 Figure 7. Proportion de consultants testés et taux de positivité de l'infection à gonocoque selon le sexe et l'âge, SurCeGIDD 2018 (d'après Santé Publique France [19]) . 51 Figure 8. Distribution des cas de gonococcies pour 100 000 habitants selon l'âge et le sexe en Europe, ECDC 2018 [41] . 51 Figure 9. Évolution du nombre de syphilis déclarées entre 2000 et 2016 par RésIST (d'après Ndeikoundam et al [36]) . 52 Figure 10. Évolution du nombre de cas de syphilis récentes déclarées par RésIST selon l'orientation sexuelle, 2012-2019 (d'après Ngangro et al [43]) . 53 Figure 11. Distribution des cas de syphilis récentes par classes d'âge selon le sexe, RésIST 2013 (d'après Santé Publique France [38]) . 54 Figure 12. Proportion de consultants testés et taux de positivité pour la syphilis selon le sexe et l'âge, SurCeGIDD 2018 (d'après Santé Publique France [19]) . 55 Figure 13. Évolution du nombre de découverte de séropositivité VIH selon le sexe, l'orientation sexuelle, l'âge et le lieu de naissance, 2010-2018 (d'après Santé Publique France [45]) . 56 Figure 14. Évolution du nombre de cas de découvertes de séropositivité VIH chez les jeunes de 18 à 24 ans selon le sexe, et chez les adolescents de 15 à 17 ans, 2003- 2013 (d'après Lot F et al [48]) . 57 Figure 15. Distribution des cas d'infection par le VIH rapportés en 2013 en France selon la classe d'âge (d'après l'atlas des maladies infectieuses, ECDC[41]) . 58 Figure 16. Proportion de consultants testés et taux de positivité pour l'infection par le VIH selon le sexe et l'âge, SurCeGIDD 2018 (d'après Santé Publique France [19]) . 58 Figure 17. Évolution des découvertes de séropositivité en Europe chez les hommes et chez les femmes, 2010-2019 (d'après ECDC [50]) . 59 118 Figure 18. Évolution de l'âge médian au premier rapport sexuel en France selon l'année des 18 ans (d'après Santé Publique France [3]). 62 Figure 19. Âge aux premiers rapports sexuels chez les femmes et chez les hommes (d'après l'INJEP [60] . 62 Figure 20. Évolution de la proportion de multipartenaires au cours des 12 derniers moins selon le sexe et la classe d'âge en le-de-France et en France (d'après Beltzer et al [61]) . 63 Figure 21. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les 15-19 ans selon le sexe . 73 Figure 22 Répartition des tests C. trachomatis positifs selon le sexe chez les 15-19 ans, les 20-24 ans et les 25 ans et plus . 73 Figure 23. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les 15-19 ans selon l'orientation sexuelle . 74 Figure 24. Répartition des tests C. trachomatis positifs chez les 15-19 ans selon l'orientation sexuelle . 75 Figure 25. Proportion d'adolescents de 15-19 ans parmi les tests C. trachomatis positifs, chez les 15-24 ans et dans la population totale . 75 Figure 26. Taux de positivité des tests C. trachomatis selon l'âge . 76 Figure 27. Proportion de filles de 15-19 ans parmi les tests C. trachomatis positifs, chez les femmes de 15-24 ans et l'ensemble des femmes testées . 76 Figure 28. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les femmes selon la classe d'âge . 77 Figure 29. Proportion de garçons de 15-19 ans parmi les tests C. trachomatis positifs, chez les hommes de 15-24 ans et l'ensemble des hommes testés . 78 Figure 30. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les hommes selon la classe d'âge . 78 Figure 31. Taux de positivité pour C. trachomatis chez les femmes hétérosexuelles par classes d'âge. 79 Figure 32. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les hommes hétérosexuels selon la classe d'âge . 80 Figure 33. Taux de positivité des tests C. trachomatis chez les HSH selon la classe d'âge . 81 Figure 34. Répartition des tests N. gonorrhoeae positifs selon le sexe, chez les 15-19 ans, les 20-24 ans et les 25 ans et plus . 83 Figure 35. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae chez les 15-19 ans selon l'orientation sexuelle . 84 Figure 36. Répartition des tests N. gonorrhoeae positifs chez les 15-19 ans selon l'orientation sexuelle . 84 Figure 37. Proportion d'adolescents de 15-19 ans parmi les tests N. gonorrhoeae positifs recensés chez les 15-24 ans et dans la population totale . 85 Figure 38. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae selon la classe d'âge . 85 119 Figure 39. Proportion de filles de 15-19 ans parmi les tests N. gonorrhoeae positifs recensés chez les 15-24 ans et dans la population totale . 86 Figure 40. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae selon la classe d'âge . 87 Figure 41. Proportion de garçons de 15-19 ans parmi les tests N. gonorrhoeae positifs recensés chez les 15-24 ans et dans la population totale . 87 Figure 42. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae chez les hommes selon la classe d'âge . 88 Figure 43. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae chez les femmes hétérosexuelles selon la classe d'âge . 89 Figure 44. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae chez les hommes hétérosexuels selon la classe d'âge . 90 Figure 45. Taux de positivité des tests N. gonorrhoeae chez les HSH selon la classe d'âge . 91 Figure 46. Proportion d'adolescents de 15-19 ans parmi les sérologies syphilis positives recensées chez les 15-24 ans et dans la population totale . 93 Figure 47. Taux de positivité des sérologies syphilis selon la classe d'âge . 94 120 Références [1] Mohammed H, Blomquist P, Ogaz D, Duffell S, Furegato M, Checchi M, et al. 100 years of STIs in the UK : a review of national surveillance data. Sex Transm Infect 2018 ; 94 : 553 8. 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Variations du volume et de la densité urinaires au cours du nycthémère chez l'homme normal | WMT16 | Scientific |
Cryoconservation de tissu ovarien chez l'enfant | WMT16 | Scientific |
Pneumopathie d'inhalation récidivante après pose d'un anneau gastrique pour obésité | WMT16 | Scientific |
Votre médecin déterminera quels médicaments sont les plus adaptés pour votre cas. | EMEA_V3 | Medicinal |
Pour les vaccins vivants atténués (par exemple rougeole, oreillons, rubéole ou polio oral), ce délai doit être de 28 jours ; pour les vaccins inactivés (par exemple tétanos, diphtérie, coqueluche ou grippe), ce délai doit être de 14 jours. | EMEA_V3 | Medicinal |
Contexte et hypothèse La myopathie de Bethlem est une myopathie rétractile avec une faiblesse musculaire d'intensité variable et de topographie principalement proximale Les rétractions sont très souvent au premier plan et précèdent fréquemment le déficit musculaire Transmise sur le mode autosomique dominant ou récessif, la myopathie de Bethlem est désormais classée parmi les dystrophies musculaires des ceintures (LGMD D5 et R22 selon le mode d'hérédité) Les symptômes s'aggravent au cours de la vie avec une perte musculaire proximale progressive, un risque accru d'insuffisance respiratoire et une mobilité réduite [ , ] Cette myopathie résulte de mutations dans un des gènes codant l'une des trois chanes du collagène VI (COLVI), un composant de la myomatrice Dans le muscle squelettique, COLVI est produit par les fibroblastes et une question non résolue est de comprendre comment l'altération de COLVI présent à l'extérieur des cellules musculaires conduit à des modifications fonctionnelles dans les fibres musculaires Pour tenter de répondre à cette question, plusieurs modèles de la myopathie ont déjà été générés telles qu'un modèle de souris dont le gène codant la chane 1 du COLVI a été invalidé ou des modèles de poisson zèbre dont l'expression de différentes chanes du COLVI a été transitoirement éteinte par injection de morpholinos Parmi ces modèles, de nombreuses anomalies du muscle ont été reportées, telles qu'en particulier la réduction de force musculaire, l'altération du réticulum sarcoplasmique (RS), une transmission neuromusculaire déficiente et une dysfonction mitochondriale [ ]. Cependant, les modèles souris ne reproduisent pas les mutations retrouvées chez les patients BM et, dans le modèle poisson, l'extinction de l'expression des gènes par l'injection de morpholinos est transitoire alors que la BM est une pathologie qui s'aggrave avec l'âge Afin de contourner ces limites, l'équipe de Florence Ruggiero (IGFL, Lyon) avec laquelle nous collaborons, a contribué à générer une lignée de poisson zèbre portant la mutation la plus fréquemment retrouvée chez les patients BM Cette mutation provoque un saut d'exon 14 dans l'ARNm codant la chane 1 de COLVI (poisson col6a1 ex14 ) Les analyses ultrastructurales chez le poisson col6a1 ex14 ont révélé une désorganisation des myofibrilles, des altérations de la structure du RS et des mitochondries et un mauvais alignement des sarcomères, qui correspondent dans leur majorité aux caractéristiques de la BM Ce projet de thèse fait partie d'un programme de recherche dont l'objectif est d'utiliser le modèle de poisson zèbre col6a1 ex14 afin de déterminer quels sont les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la BM Notre hypothèse de travail est que le COLVI muté perturbe l'excitabilité et/ou l'homéostasie calcique musculaire Cette hypothèse est basée sur le fait que (1) dans le modèle poisson col6a1 ex14 la structure du réticulum sarcoplasmique (RS), qui joue un rôle central dans l'homéostasie calcique, est altérée, (2) les composants de la matrice ont été montrés réguler les canaux ioniques, (3) l'homéostasie calcique est sous le contrôle des canaux ioniques et joue un rôle crucial dans la fonction et la pathogenèse musculaire [ , ] Méthodologie et résultats attendus Sachant que la BM est une maladie progressive, les expériences sont réalisées à partir de fibres musculaires isolées de poisson zèbre sauvages ou col6a1 ex14/- à différents stades de développement, 7-10 jours, 1 mois, 4 mois et 1 an Les cellules musculaires du tronc sont isolées par traitement enzymatique et la technique de patch clamp jusqu'à un mois, puis de silicone clamp sur les animaux de quatre mois ou d'un an, est appliquée sur les fibres de type rapide afin d'enregistrer les courants ioniques en condition de potentiel imposé, en configuration cellule entière ou canal isolé, ou les variations de potentiel en condition de courant imposé En parallèle, l'indicateur calcique indo-1 est dialysé à l'intérieur des cellules afin de mesurer les variations de Ca 2 intracellulaire Etant donné que très peu d'études électrophysiologiques ont été réalisées sur la cellule musculaire de poisson zèbre, le but sera dans un premier temps de caractériser les propriétés des canaux ioniques dans les fibres musculaires de poissons sauvages durant l'activité, au repos et en condition de stress mécanique Plus précisément, les potentiels d'action, les courants résultant de l'ouverture des canaux sodiques et potassiques voltage-dépendants, les courants s'écoulant à travers le sarcolemme au repos et l'activité de canaux susceptibles de présenter une mécano-sensibilité seront enregistrés Les courants générés par le changement de configuration du récepteur des dihydropyridines présent dans la membrane tubulaire musculaire et en charge du contrôle de l'ouverture des canaux calciques du RS seront aussi mesurés Les présentent des exemples de tracés électrophysiologiques obtenus sur des fibres isolées de poissons sauvages Dans un deuxième temps, l'ensemble de ces paramètres seront comparés dans les fibres de poissons mutants à différents âges De récentes expériences immunohistochimiques réalisées par nos collaborateurs ont révélé chez le poisson col6a1 ex14 une diminution de l'expression des canaux impliqués dans la libération de Ca 2 par le RS, appelés récepteurs de la ryanodine de type 1 (RyR1) Ce résultat consolide notre hypothèse sur le fait que la régulation du calcium intracellulaire serait altérée chez le poisson mutant A l'issue d'une première étape qui consistera à mesurer le Ca 2 cytosolique au repos, la libération de Ca 2 du RS induite par la dépolarisation et l'activité des pompes Ca 2 -ATPase du RS responsables de la relaxation musculaire chez le poisson sauvage, le projet de thèse visera à déterminer si ces paramètres sont modifiés chez le poisson col6a1 ex14 La illustre les variations de Ca 2 intracellulaire induites par des dépolarisations d'amplitudes croissantes sur des fibres isolées de poissons sauvages La BM conduit au long terme à la perte de tissu musculaire L'hypothèse actuellement la plus défendue suggère qu'un influx de Ca 2 exacerbé résultant en l'accumulation de Ca 2 cytosolique induit les processus dystrophiques Ainsi, l'entrée de Ca 2 spontanée dans la cellule musculaire au repos ou provoquée par la vidange calcique du RS telle qu'elle est décrite dans les muscles de mammifères sera mesurée à l'aide de la technique à très haute résolution d'extinction de la fluorescence par le Mn 2 en condition de potentiel imposé et comparée chez le poisson mutant à différents âges Devant la rareté des études fonctionnelles menées jusqu'à présent sur la cellule musculaire de poisson zèbre, ce projet de thèse permettra d'une part de constituer une base de données de référence sur les propriétés électrophysiologiques et les mécanismes de régulation du Ca 2 dans ce modèle D'autre part, ce projet devrait aussi contribuer à déterminer si dans la BM l'altération d'une protéine appartenant à la matrice extracellulaire musculaire est responsable (i) d'une réduction de l'excitabilité de la cellule musculaire ou de la libération de Ca 2 induite par la dépolarisation, (ii) d'une surcharge calcique cytosolique, pouvant rendre compte respectivement de la faiblesse musculaire et des phénomènes dystrophiques qui caractérisent la maladie Enfin, en déterminant quelles fonctions musculaires sont altérées dans la maladie, ce projet pourrait conduire à terme à identifier des cibles thérapeutiques pour traiter cette pathologie actuellement incurable Liens d'intérêt Les auteurs déclarent n'avoir aucun lien d'intérêt concernant les données publiées dans cet article. | ISTEX | Scientific |
Tics avec signes électriques d'épilepsie ; guérison par le traitement anticomitial | WMT16 | Scientific |
comme la dapsone, le disopyramide, la quinine, le fentanyl et l' alfentanyl (saquinavir non boosté ) | EMEA_V3 | Medicinal |
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Peut-on traiter 74 % des grossesses extra-utérines par un traitement médical ? A propos d'une série de 202 patientes | WMT16 | Scientific |
Fascicule dédié à Alfred Fessard, professeur honoraire au Collège de France | WMT16 | Scientific |
ARKOGELULES MILLEPERTUIS, gélule - Résumé des caractéristiques du produit. ANSM - Mis à jour le : 04/11/2019 Solvant d'extraction : éthanol 60 % m/m. Rapport drogue/ extrait : 3, 5-6 : 1. Pour une gélule. Pour la liste complète des excipients, voir rubrique 6. 1. ARKOGELULES MILLEPERTUIS est indiqué chez les adultes. Adultes : 2 gélules matin et soir. La prise doit être effectuée de préférence aux mêmes heures. Population pédiatrique L'utilisation de ce médicament est déconseillée chez l'enfant et l'adolescent de moins de 18 ans (voir rubrique 4. 4). Mode d'administration Voie orale. A prendre avec un grand verre d'eau. Durée du traitement La durée du traitement maximale est de 6 semaines. Les premiers effets surviennent dans les 4 premières semaines de traitement. Si les symptômes persistent, un avis médical est nécessaire. En association avec Les anticonvulsivants métabolisés, Les antivitamines K, Les contraceptifs estroprogestatifs et progestatifs, La digoxine, Les immunosuppresseurs, Les inhibiteurs des tyrosine-kinases, Les inhibiteurs de protéases, L'irinotécan, Le télaprévir, La théophylline (et, par extrapolation, aminophylline), Le vérapamil. (Voir rubrique 4. 5) avant de débuter le traitement pour les patients en cours de traitement par d'autres médicaments, en cas de persistance ou d'aggravation des symptômes cliniques ou en cas d'apparition d'idées suicidaires. L'utilisation du millepertuis est déconseillée pendant la grossesse quel qu'en soit le terme et chez la femme en âge de procréer n'utilisant pas de mesure contraceptive (Voir rubrique 4. 6). Durant le traitement avec ce médicament, les expositions prolongées aux radiations UV doivent être évitées. Par ailleurs, bien que les extraits de millepertuis soient utilisés depuis de nombreuses années, il n'existe aucune étude clinique ayant inclus des patients atteints d'insuffisance hépatique ou rénale. Par conséquent, AKOGELULES MILLEPERTUIS doit être utilisé avec prudence chez ces patients et uniquement sous contrôle médical. En I' absence de données dans cette population, l'utilisation chez les enfants et les adolescents de moins de 18 ans est déconseillée. L'induction enzymatique peut persister pendant 1 semaine après I' arrêt de la prise de millepertuis. Associations contre-indiquées (acide valproïque, éthosuximide, felbamate, fosphénytoïne, lamotrigine, oxcarbazépine, phénobarbital, phénytoïne, primidone, retigabine, tiagabine, topiramate, valpromide, zonisamide) : Risque de Diminution des concentrations plasmatiques de l'antivitamine K, en raison de l'effet inducteur enzymatique du millepertuis, avec risque de baisse d'efficacité, voire d'annulation de l'effet, dont les conséquences peuvent être éventuellement graves (évènement thrombotique). En cas d'association fortuite, ne pas interrompre brutalement la prise de millepertuis mais contrôler I'INR avant puis après l'arrêt du millepertuis. estroprogestatifs, progestatifs) : Diminution des concentrations plasmatiques du contraceptif hormonal, en raison de l'effet inducteur enzymatique du millepertuis, avec risque de baisse d'efficacité, voire d'annulation de l'effet dont les conséquences peuvent être éventuellement graves (survenue d'une grossesse). Cette diminution des concentrations plasmatiques peut Diminution de la digoxinémie, en raison de l'effet inducteur enzymatique du millepertuis, avec risque de baisse d'efficacité (ciclosporine, évérolimus, sirolimus, tacrolimus) : Diminution (amprénavir atazanavir, darunavir, fosamprénavir, indinavir, lopinavir nelfinafir, ritonavir saquinavir, tipranavir) : Diminution des concentrations plasmatiques de I'inhibiteur de protéase en raison de I'effet inducteur enzymatique du millepertuis avec risque de baisse d'efficacité voire d'annulation de I'effet, dont les conséquences peuvent être éventuellement graves (baisse de l'efficacité de I'antirétroviral). En cas d'association fortuite, ne pas interrompre brutalement la prise de millepertuis mais contrôler les concentrations plasmatiques (ou I'efficacité) de I'inhibiteur de protéase avant puis après l'arrêt du Millepertuis. (dasatinib, erlotinib, gefitinib, imatinib, lapatinib, pazopanib, sorafenib, sunitinib) : Diminution des concentrations plasmatiques et de l'efficacité de I'inhibiteur de tyrosine kinase, par augmentation de son métabolisme par Ie millepertuis. Diminution des concentrations plasmatiques du métabolite actif de I'irinotécan avec risque d'échec du traitement cytotoxique. Risque de diminution très importante des concentrations de télaprévir. (et, par extrapolation, aminophylline) : Diminution des concentrations plasmatiques de la théophylline, en raison de l effet inducteur enzymatique du millepertuis, avec risque de baisse d'efficacité, voire d'annulation de I'effet, dont les conséquences peuvent être éventuellement graves (survenue d'un trouble ventilatoire obstructif) En cas d'association fortuite ne pas interrompre brutalement la prise de millepertuis mais contrôler les concentrations plasmatiques (ou l'efficacité) du médicament associé avant puis après l'arrêt du millepertuis. Réduction importante des concentrations de vérapamil avec risque de perte de son effet thérapeutique. Associations déconseillées faisant l'objet de précautions d'emploi Associations à prendre en compte Grossesse Compte-tenu des données disponibles, l'utilisation du millepertuis est déconseillée au cours de la grossesse quel qu'en soit le terme et chez la femme susceptible de devenir enceinte n'utilisant pas de mesure contraceptive En effet les données cliniques et animales sont insuffisantes ou ne permettent pas de conclure Certains composants du millepertuis sont susceptibles de diminuer l'efficacité des contraceptifs hormonaux par induction enzymatique hépatique (Voir rubrique 4. 4). Allaitement L'allaitement est déconseillé pendant le traitement. Fertilité Aucune donnée disponible. Les effets indésirables sont répertoriés ci-dessous, en fonction de la nature de l'affection et de leur fréquence. Fréquence indéterminée : état de fatigue ou d'agitation, paresthésie. Déclaration des effets indésirables suspectés La déclaration des effets indésirables suspectés après autorisation du médicament est importante. Elle permet une surveillance continue du rapport bénéfice/risque du médicament. Les professionnels de santé déclarent tout effet indésirable suspecté via le système national de déclaration : Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé (ANSM) et réseau des Centres Régionaux de Pharmacovigilance - Site internet : . En cas de surdosage massif, il faut s'attendre à une sensibilité accrue à la lumière solaire. Par conséquent, une exposition de la peau au soleil ou à toute autre source de rayonnement UV (solarium) devra être évitée pendant une à deux semaines. 5. PROPRIETES PHARMACOLOGIQUES Mécanisme d'action L'extrait sec de millepertuis inhibe la recapture synaptosomique des neurotransmetteurs noradrénaline, sérotonine et dopamine. Un traitement subchronique provoque une régulation négative des récepteurs adrénergiques ; ce qui entraine des changements de comportements dans différents modèles animaux d effet antidépresseur (comme par exemple le test de la nage forcée) de façon similaire aux antidépresseurs de synthèse Les naphtodianthrones (hypéricine, pseudohypéricine), les dérivés de la phloroglucine (hyperforine) et les flavonoïdes contribueraient à l'activité. 6. DONNEES PHARMACEUTIQUES : maltodextrine. : hypromellose, dioxyde de titane (E171), oxyde de fer jaune (E172). 2 ans. Toutes les présentations peuvent ne pas être commercialisées. Pas d'exigences particulières. 34009 358 742 5 2 : 45 gélules en pilulier (PVC brun) operculé avec sachet absorbeur d'oxygène Sans objet. Médicament non soumis à prescription médicale. | BDPM | Medicinal |
Isolement et étude du mode d'action d'une polygalacturonase d'insecte (Pyrrhocoris apterus) | WMT16 | Scientific |
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Eicacité et tolérance du Vedolizumab dans la prise en charge thérapeutique des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin : résultats d'une enquête de cohorte observationnelle Grégoire-Philippe Bessi To cite this version : Grégoire-Philippe Bessi. Eicacité et tolérance du Vedolizumab dans la prise en charge thérapeutique des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin : résultats d'une enquête de cohorte observation- nelle. Médecine humaine et pathologie. 2017. dumas-01584311 HAL Id : dumas-01584311 Submitted on 8 Sep 2017 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. UNIVERSITE DE NICE SOPHIA-ANTIPOLIS FACULTE DE MEDECINE DE NICE Efficacité et Tolérance du VEDOLIZUMAB dans la prise en charge thérapeutique des Maladies Inflammatoires Chroniques de l'Intestin Résultats d'une enquête de cohorte observationnelle T H E S E Présentée et soutenue publiquement à LA FACULTÉ DE MÉDECINE DE NICE Le 4 Avril 2017 Par Monsieur Grégoire-Philippe BESSI Né le 2 Novembre 1988 à Nice Pour obtenir le titre de Docteur en Médecine (Diplôme d'Etat) Hépato-Gastro-Entérologie Membres du Jury : Monsieur le Professeur Xavier HEBUTERNE Président du Jury Monsieur le Professeur Thierry PICHE Assesseur Monsieur le Professeur Stéphane SCHNEIDER Assesseur Monsieur le Docteur Jérôme FILIPPI Assesseur Madame le Docteur Laurianne DE GALLEANI Assesseur 1 2 UNIVERSITÉ NICE-SOPHIA ANTIPOLIS FACULTÉ DE MÉDECINE Liste des professeurs au 1er septembre 2016 à la Faculté de Médecine de Nice Doyen Vice-Doyen Assesseurs M. BAQUÉ Patrick M. BOILEAU Pascal M. ESNAULT Vincent M. CARLES Michel Mme BREUIL Véronique M. MARTY Pierre Conservateur de la bibliothèque Mme DE LEMOS Annelyse Directrice administrative des services Doyens Honoraires Mme CALLEA Isabelle M. AYRAUD Nol M. RAMPAL Patrick M. BENCHIMOL Daniel M. HARTER Michel M. INGLESAKIS Jean-André M. JOURDAN Jacques M. LALANNE Claude-Michel M. LAMBERT Jean-Claude M. LAZDUNSKI Michel M. LEFEBVRE Jean-Claude M. LE BAS Pierre M. LE FICHOUX Yves Mme LEBRETON Elisabeth M. LOUBIERE Robert M. MARIANI Roger M. MASSEYEFF René M. MATTEI Mathieu M. MOUIEL Jean Mme MYQUEL Martine M. OLLIER Amédée M. ORTONNE Jean-Paul M. SAUTRON Jean Baptiste M. SCHNEIDER Maurice M. TOUBOL Jacques M. TRAN Dinh Khiem M VAN OBBERGHEN Emmanuel M. ZIEGLER Gérard Professeurs Honoraires M ALBERTINI Marc M. BALAS Daniel M. BATT Michel M. BLAIVE Bruno M. BOQUET Patrice M. BOURGEON André M. BOUTTÉ Patrick M. BRUNETON Jean-Nol Mme BUSSIERE Françoise M. CAMOUS Jean-Pierre M. CANIVET Bertrand M. CASSUTO Jill-patrice M. CHATEL Marcel M. COUSSEMENT Alain Mme CRENESSE Dominique M. DARCOURT Guy M. DELLAMONICA Pierre M. DELMONT Jean M. DEMARD François M. DOLISI Claude M. FRANCO Alain M. FREYCHET Pierre M. GÉRARD Jean-Pierre M. GILLET Jean-Yves M. GRELLIER Patrick M. GRIMAUD Dominique 3 M. C. A. Honoraire Mlle ALLINE Madeleine M. C. U. Honoraires M. ARNOLD Jacques M. BASTERIS Bernard Mlle CHICHMANIAN Rose-Marie Mme DONZEAU Michèle M. EMILIOZZI Roméo M. FRANKEN Philippe M. GASTAUD Marcel M. GIRARD-PIPAU Fernand M. GIUDICELLI Jean M. MAGNÉ Jacques Mme MEMRAN Nadine M. MENGUAL Raymond M. PHILIP Patrick M. POIRÉE Jean-Claude Mme ROURE Marie-Claire 4 PROFESSEURS CLASSE EXCEPTIONNELLE M. M. M. M. M. Mme M. M. M. M. M. M. M. M. M. M. M. M. Mme M. M. M. M. M. M. M. M. AMIEL Jean BENCHIMOL Daniel BOILEAU Pascal DARCOURT Jacques DESNUELLE Claude EULLER-ZIEGLER Liana FENICHEL Patrick FUZIBET Jean-Gabriel GASTAUD Pierre GILSON Éric HASSEN KHODJA Reda HÉBUTERNE Xavier HOFMAN Paul LACOUR Jean-Philippe LEFTHERIOTIS Georges MARTY Pierre MICHIELS Jean-François MOUROUX Jérôme PAQUIS Véronique PAQUIS Philippe PRINGUEY Dominique QUATREHOMME Gérald RAUCOULES-AIMÉ Marc ROBERT Philippe SANTINI Joseph THYSS Antoine TRAN Albert Urologie (52. 04) Chirurgie Générale (53. 02) Chirurgie Orthopédique et Traumatologique (50. 02) Biophysique et Médecine Nucléaire (43. 01) Biologie Cellulaire (44. 03) Rhumatologie (50. 01) Biologie du Développement et de la Reproduction (54. 05) Médecine Interne (53. 01) Ophtalmologie (55. 02) Biologie Cellulaire (44. 03) Chirurgie Vasculaire (51. 04) Nutrition (44. 04) Anatomie et Cytologie Pathologiques (42. 03) Dermato-Vénéréologie (50. 03) Physiologie- médecine vasculaire Parasitologie et Mycologie (45. 02) Anatomie et Cytologie Pathologiques (42. 03) Chirurgie Thoracique et Cardiovasculaire (51. 03) Génétique (47. 04) Neurochirurgie (49. 02) Psychiatrie d'Adultes (49. 03) Médecine Légale et Droit de la Santé (46. 03) Anesthésie et Réanimation Chirurgicale (48. 01) Psychiatrie d'Adultes (49. 03) O. R. L. (55. 01) Cancérologie, Radiothérapie (47. 02) Hépato Gastro-entérologie (52. 01) 5 PROFESSEURS PREMIERE CLASSE Mme M. M. M. M. Mme M. M. M. M. M. M. M. M. M. M. Mme M. M. M. M. M. Mme M. M. M. M. ASKENAZY-GITTARD Florence BAQUÉ Patrick BARRANGER Emmanuel BÉRARD Étienne BERNARDIN Gilles BLANC-PEDEUTOUR Florence BONGAIN André CASTILLO Laurent DE PERETTI Fernand DRICI Milou-Daniel ESNAULT Vincent FERRARI Émile FERRERO Jean-Marc GIBELIN Pierre GUGENHEIM Jean HANNOUN-LEVI Jean-Michel ICHAI Carole LONJON Michel MARQUETTE Charles-Hugo MOUNIER Nicolas PADOVANI Bernard PRADIER Christian RAYNAUD Dominique ROSENTHAL Éric SCHNEIDER Stéphane STACCINI Pascal THOMAS Pierre Pédopsychiatrie (49. 04) Anatomie - Chirurgie Générale (42. 01) Gynécologie Obstétrique (54. 03) Pédiatrie (54. 01) Réanimation Médicale (48. 02) Cancérologie Génétique (47. 02) Gynécologie-Obstétrique (54. 03) O. R. L. (55. 01) Anatomie-Chirurgie Orthopédique (42. 01) Pharmacologie Clinique (48. 03) Néphrologie (52-03) Cardiologie (51. 02) Cancérologie ; Radiothérapie (47. 02) Cardiologie (51. 02) Chirurgie Digestive (52. 02) Cancérologie ; Radiothérapie (47. 02) Anesthésiologie et Réanimation Chirurgicale (48. 01) Neurochirurgie (49. 02) Pneumologie (51. 01) Cancérologie, Radiothérapie (47. 02) Radiologie et Imagerie Médicale (43. 02) Épidémiologie, Économie de la Santé et Prévention (46. 01) Hématologie (47. 01) Médecine Interne (53. 01) Nutrition (44. 04) Biostatistiques et Informatique Médicale (46. 04) Neurologie (49. 01) 6 PROFESSEURS DEUXIEME CLASSE M. Mme M. M. M. Mlle M. M. M. Mme M. M. M. M. Mlle M. M. M M. M. M. M. M. M. M. Mme M. M. M. BAHADORAN Philippe BAILLIF Stéphanie BENIZRI Emmanuel BENOIT Michel BREAUD Jean BREUIL Véronique CARLES Michel CHEVALIER Nicolas CHEVALLIER Patrick CHINETTI Giulia DELLAMONICA Jean DELOTTE Jérôme FONTAINE Denys FOURNIER Jean-Paul GIORDANENGO Valérie GUÉRIN Olivier IANNELLI Antonio JEAN BAPTISTE Elixène LEVRAUT Jacques PASSERON Thierry PICHE Thierry ROGER Pierre-Marie ROHRLICH Pierre ROUX Christian RUIMY Raymond SACCONI Sabrina SADOUL Jean-Louis TROJANI Christophe VENISSAC Nicolas Cytologie et Histologie (42. 02) Ophtalmologie (55. 02) Chirurgie Générale (53. 02) Psychiatrie (49. 03) Chirurgie Infantile (54-02) Rhumatologie (50. 01) Anesthésiologie Réanimation (48. 01) Endocrinologie, Diabète et Maladies Métaboliques (54. 04) Radiologie et Imagerie Médicale (43. 02) Biochimie-Biologie Moléculaire (44. 01) Réanimation médicale (48. 02) Gynécologie-obstétrique (54. 03) Neurochirurgie (49. 02) Thérapeutique (48-04) Bactériologie-Virologie (45. 01) Gériatrie (48. 04) Chirurgie Digestive (52. 02) Chirurgie vasculaire (51. 04) Anesthésiologie et Réanimation Chirurgicale (48. 01) Dermato-Vénéréologie (50-03) Gastro-entérologie (52. 01) Maladies Infectieuses ; Maladies Tropicales (45. 03) Pédiatrie (54. 01) Rhumatologie (50. 01) Bactériologie-virologie (45. 01) Neurologie (49. 01) Endocrinologie, Diabète et Maladies Métaboliques (54. 04) Chirurgie Orthopédique et Traumatologique (50. 02) Chirurgie Thoracique et Cardiovasculaire (51. 03) 7 PROFESSEUR DES UNIVERSITÉS M. HOFLIGER Philippe Médecine Générale (53. 03) MAITRE DE CONFÉRENCES DES UNIVERSITÉS M. DARMON David Médecine Générale (53. 03) PROFESSEURS AGRÉGÉS Mme Mme LANDI Rebecca ROSE Patricia Anglais Anglais MAITRES DE CONFÉRENCES DES UNIVERSITÉS - PRATICIENS HOSPITALIERS ALUNNI Véronique AMBROSETTI Damien BANNWARTH Sylvie BENOLIEL José BERNARD-POMIER Ghislaine BUREL-VANDENBOS Fanny DOGLIO Alain DOYEN Jérôme FAVRE Guillaume FOSSE Thierry GARRAFFO Rodolphe GIOVANNINI-CHAMI Lisa HINAULT Charlotte HUMBERT Olivier LAMY Brigitte LEGROS Laurence LONG-MIRA Elodie Mme M. Mme M. Mme Mme M. M M M. M. Mme Mme M. Mme Mme Mme Mme MAGNIÉ Marie-Nolle Mme MOCERI Pamela Mme MUSSO-LASSALLE Sandra M. Mme Mme M. M. NAÏMI Mourad POMARES Christelle SEITZ-POLSKI Barbara TESTA Jean TOULON Pierre Médecine Légale et Droit de la Santé (46. 03) Cytologie et Histologie (42. 02) Génétique (47. 04) Biophysique et Médecine Nucléaire (43. 01) Immunologie (47. 03) Anatomie et Cytologie pathologiques (42. 03) Bactériologie-Virologie (45. 01) Radiothérapie (47. 02) Néphrologie (52. 03) Bactériologie-Virologie-Hygiène (45. 01) Pharmacologie Fondamentale (48. 03) Pédiatrie (54. 01) Biochimie et biologie moléculaire (44. 01) Biophysique et Médecine Nucléaire (43. 01) Bactériologie-virologie (45. 01) Hématologie et Transfusion (47. 01) Cytologie et Histologie (42. 02) Physiologie (44. 02) Cardiologie (51. 02) Anatomie et Cytologie pathologiques (42. 03) Biochimie et Biologie moléculaire (44. 01) Parasitologie et mycologie (45. 02) Immunologie (47. 03) Épidémiologie Économie de la Santé et Prévention (46. 01) Hématologie et Transfusion (47. 01) 8 PRATICIEN HOSPITALIER UNIVERSITAIRE M. DURAND Matthieu Urologie (52. 04) PROFESSEURS ASSOCIÉS M. M. M. M. GARDON Gilles GONZALEZ Jean-François PAPA Michel WELLS Michael MAITRES DE CONFÉRENCES ASSOCIÉS Médecine Générale (53. 03) Chirurgie Orthopédique et traumatologie (50. 02) Médecine Générale (53. 03) Anatomie-Cytologie (42. 03) BALDIN Jean-Luc CASTA Céline M Mme Mme MONNIER Brigitte Médecine Générale (53. 03) Médecine Générale (53. 03) Médecine Générale (53. 03) PROFESSEURS CONVENTIONNÉS DE L'UNIVERSITÉ M. M. M. Mme M. M. M. M. M. Médecine Interne Médecine Interne Option Gériatrie Urologie BERTRAND François BROCKER Patrice CHEVALLIER Daniel FOURNIER-MEHOUAS Manuella Médecine Physique et Réadaptation JAMBOU Patrick ODIN Guillaume PEYRADE Frédéric PICCARD Bertrand QUARANTA Jean-François Coordination prélèvements d'organes Chirurgie maxillo-faciale Oncohématologie Psychiatrie Santé Publique 9 REMERCIEMENTS Aux membres du jury A Monsieur le Professeur Xavier HEBUTERNE Vous êtes l'instigateur de ce travail qui m'aura réellement passionné du début à la fin au fil des nombreuses heures que j'aurai pu lui consacrer. Votre dévouement au travail et votre compétence professionnelle sont des exemples à suivre et je suis sincèrement fier d'avoir pu apprendre mon métier à vos côtés au cours de mon internat. A Monsieur le Professeur Thierry PICHE Ta volonté et ta détermination à améliorer l'exercice médical hospitalier est un exemple à suivre. Mais surtout, tu es et resteras celui, qui par son soutien, m'a permis d'obtenir une formation complémentaire indispensable dans le domaine si particulier et si chatoyant de la proctologie et je ne te remercierai jamais assez pour cela. Je suis honoré que tu sièges dans mon jury. A Monsieur le Professeur Stéphane SCHNEIDER Une bonne humeur quasi-permanente, une compétence professionnelle indiscutable et un humour des plus subtils de tous les instants. Ton compte Facebook est un véritable guide du Routard pour toute personne souhaitant faire le tour du monde en moins d'une année. Plaisanterie mise à part, je suis honoré que tu sièges dans mon jury A Monsieur le Docteur Jérôme FILIPPI J'ai mis un certain temps à te tutoyer mais j'y suis finalement arrivé. Cela ne m'a pas empêché d'apprécier ta gentillesse, ta compétence et ton goût pour la pratique sportive de haut niveau. Merci d'avoir accepté de siéger dans mon jury A Madame le Docteur Laurianne DE GALLEANI Ton papa fut le premier ophtalmologue que j'ai consulté et j'avais déjà pu apprécier sa gentillesse et sa compétence. Aujourd'hui, je constate que tu ne déroges en rien à cette tradition familiale. Tu es un modèle de franchise et d'honnêteté. Tu représentes pour moi un véritable exemple professionnel à suivre et je suis sincèrement heureux que tu fasses partie intégrante de mon jury 10 A mes anés A Monsieur le Professeur Albert TRAN, pour votre rigueur, votre capacité à simplifier de manière concise mais toujours efficace tous ces problèmes auxquels nous devons faire face tous les jours. Les quatre mois o nous travaillâmes de concert comptent parmi les plus agréables de mon internat. A Rodolphe ANTY, pour ton enseignement et ta complicité avec tous tes internes A Cécile GOMERCIC, capable de taxer ses internes à coups de gâteaux et de bouteilles de champagne pour chaque première fois que nous effectuons. Je ne réalise pas encore aujourd'hui le nombre de premières fois que tu as pu inventer durant mon stage au STC. Merci de m'avoir fait profiter de ta compétence. A Eve GELSI, pour ta franchise, ton sérieux concernant l'évolution de tous tes internes (le fameux point de fin de stage qui m'a grandement conforté dans mes choix futurs) et ton jeu de mot légendaire (les vitamines pour garder bonne mine , je n'oublie ainsi jamais une vitaminothérapie B1B6) A Kamel ARAB, pour ta gentillesse et ton humour, responsable de nombreux fous rires pendant mes passages en endoscopie. Tu fus la première personne à m'avoir initié à l'endoscopie, toujours dans le calme, sans pression inutile. Je suis vraiment heureux d'avoir travaillé à tes côtés. A Marie-Lise MONTOYA, pour ta gentillesse et ta capacité à toujours rester souriante à tout instant A Anne-Claire FRIN et Delphine OUVRIER pour m'avoir accompagné dans les méandres de la cancérologie digestive A Ludovic EVESQUE, pour son investissement professionnel permanent et son humour ravageur (la blague du Pr Baqué qui m'appelle pour me dire que son patient préféré est aux urgences suite à une mauvaise prescription de ma part est, comment dire, inoubliable ? ) A Geoffroy VANBIERVLIET, pour ta rigueur et ton indiscutable compétence, mais aussi ton humour décapant et ta contagieuse jovialité Au Docteur Franck AMOROS, pour son dévouement auprès des internes, son savoir professionnel et sa capacité à toujours justifier, recommandations et règles médicales à l'appui, toutes vos décisions. Mon savoir médical s'est grandement enrichi à vos côtés. 11 A Sarah GIUDICELLI-BORNARD, pour son extrême gentillesse et ses efforts (malheureusement souvent vains) consacrés à me déstresser. Je suis vraiment heureux d'avoir pu faire ta connaissance. A Lilian BADAN, pour son humour, sa douce folie et en même temps son sérieux professionnel. Je n'oublierai pas tes conseils concernant l'achat de ma future voiture et ceux indispensables à une conduite automobile efficace et rentable. Au Professeur MOUNIER, pour son aide, ô combien indispensable, qui m'a permis, enfin de finaliser ma thèse. Vous êtes un exemple de confraternité. Merci encore. Au Professeur Laurent SIPROUDHIS et toute son équipe (Charlène, Timothée et Alexandre) pour leur gentillesse, leur volonté d'enseigner et de transmettre leur savoir aux jeunes médecins. Il me tarde de débarquer en terre bretonne pour débuter mon stage. Au Docteur SIMON, qui m'a permis de faire mes tous premiers pas de bébé proctologue (et un diagnostic de sinus pilonidal au passage) Au Docteur FABIANI, pour sa compétence unanimement reconnue, mais aussi sa gentillesse. Merci à Abakar MAHAMAT, Daniel BIANCHI, Franck SOUSSI, Anaïs PENEAU Merci à tous les spécialistes d'autres disciplines qui ont contribué à ma formation et m'ont apporté leur aide quand j'en avais besoin Dr CHASSANG, BIRTSWILE, Pr IANELLI, Dr SCHNECK, permettait de me sentir un peu moins seul en garde) : Pr GOUBAUX, Dr SOWKA, Dr COUCORAVAS, Dr PERUS, Dr TRAN, - l'équipe de radiologie : Pr CHEVALIER, Dr BAUDIN, Dr STOLEAR, - l'équipe de chirurgie digestive : Dr RAHILI, Pr BENIZRI, Dr - l'équipe d'Anesthésie Réanimation (dont la rassurante présence me 12 A ma Famille A Maman et Papa, sans lesquels je ne serai pas là o j'en suis aujourd'hui. Vous êtes des modèles de douceur, de bonté, d'intelligence, de droiture et d'honnêteté. Votre amour et votre soutien de tous les instants sont de véritables phares qui guident encore ma vie aujourd'hui. Cette thèse vous est dédié en remerciement de tout ce que vous avez pu faire pour moi. Je vous aime et vous aimerai toujours. A ma grande sœur Delphine et mon grand frère Guillaume, pour votre amour inconditionnel. Vous êtes la définition d'une fratrie aimante et solidaire dont je suis fier de faire partie. Votre ardeur au travail et votre mental à toute épreuve sont de véritables exemples que je m'efforce tant bien que mal de suivre. Je vous aime énormément. A ma nièce Pauline, ma petite Paulinette chérie, affective, adorable, vive et pleine d'esprit. A toute ma belle-famille (Oy, Jimmy, Kévin et Alexis et le petit Gigi ). Mon frère et ma sœur sont heureux avec vous et je ne vous remercierai jamais assez pour ça. Je suis vraiment ravi de vous compter dans ma famille A mes chiens, Othello, Merlin et Egide, de véritables concentrés d'amour à quatre pattes et tellement fidèles. Une petite léchette au retour d'une journée de travail souvent éprouvante et tous les soucis s'envolent. A mes Amis A Alexandre et Arnaud, qui représentent la véritable amitié sincère. Vous êtes mes meilleurs amis et je suis très heureux d'avoir fait votre connaissance au début de mes études. J'assisterai avec plaisir à votre thèse. N'oubliez pas notre promesse de voyage au Japon. A Thibault, mon titi , mon co-interne de promotion qui m'a accompagné tout au long de cet internat souvent difficile. Je fus très heureux quand tu as pu choisir l'hépato-gastro-entérologie à Nice avec moi et je le reste encore aujourd'hui. A toute la bande des copines-chiens des Arènes de Cimiez, profondément gentilles et tellement amusantes. A Caroline, qui sera, j'en suis sûr, la meilleure des ophtalmologues. Restes comme tu es, ne changes rien et ce sera parfait. 13 A mes co-internes ou ex co-internes A Ophélie ANTUNES (j'ai longuement hésité pour savoir dans quelle catégorie j'allais te placer mais je préfère te considérer comme ma co-interne, merci pour ton aide surtout dans mon semestre de cancérologie digestive), Léa LOMBARDI, Clémence CANIVET, Dorsa PISHVAIE, Audrey HASTIER, Clément FORTIER-BEAULIEU, Maude DESCHAMPS, Dann OUIZEMANN et Edouard LARREY et les petits nouveaux Juliette LAVEISSIERE et Adrien NICOLAU. Merci spécial à Daniela AGREFILO (tellement gentille mais surtout coupable par cette même gentillesse de m'avoir converti aux supplices de la gastro-entérologie) Aux non gastro dont j'ai eu le plaisir de faire la connaissance durant mon internat : merci à Leslie, Charlotte et Romain, Anne-Sophie et Marie, Anne- Sophie, Julie (ma co-interne cannoise de souche bordelaise), Anne-Laure (pour m'avoir supporté pendant les consultations de proctologie à Rennes), Julienne (ma co-interne de Besançon en nutrition) et Agnès (de l'unité des soins palliatifs) Aux équipes de soins de Nice et Cannes La vie à l'hôpital étant loin, très loin, d'être un long fleuve tranquille, je souhaitais remercier sincèrement toute personne avec qui j'ai eu du plaisir à venir travailler En bref, merci à toute l'équipe de mon tout premier service le 4eB gastro ainsi que toute l'équipe de l'URC , merci à toute l'équipe du 4eA hépatologie , merci à toute l'équipe du 3eC cancéro , merci à toute l'équipe du STC-USN (et n'oublions pas les diététiciennes), merci à toute l'équipe de l'endo (mention spéciale brancardiers) et merci à toute l'équipe de l'HDJ . Merci aussi à toutes les secrétaires, toutes plus gentilles les unes que les autres : Colette (ma toute première secrétaire dont mon père m'avait déjà vanté l'efficacité professionnelle), Graziella (dite aussi Mortitia Addams ce qui pour moi est un véritable compliment), Roselyne (dite aussi Rose), Brigitte (polyvalente et tellement dévouée au travail, particulièrement présente aux archives, mais qu'y a-t-il donc en bas ? ), Florence (qu'est-ce que j'ai pu rire avec toi ! ), Dominique et Virginie, Corinne (La pizza aux bonbons était bonne j'espère ? ), Véronique (ma secrétaire cannoise, tellement adorable, un vrai petit soleil) et enfin Cathy et Laetitia (à l'humour sarcastique, merci pour ces longues heures de discussion o j'ai pu me rendre compte de mon ignorance télévisuelle et tellement bienvenues au milieu de toutes ces blablas o l'on ne parle que de médecine, vivement la suite de Game of Thrones et Walking Dead) 14 1) Clinique a) Manifestations digestives b) Manifestations générales c) Manifestations extradigestives d) Révélation de la maladie suite à une complication e) Découverte fortuite 2) Epidémiologie a) Incidence en fonction de l'âge b) Incidence en fonction du sexe c) Gradient Nord/Sud 3) Physiopathologie a) Localisations b) Facteurs Génétiques c) Rôle de l'immunité d) Facteurs environnementaux 4) Biologie 5) Endoscopie et Anatomopathologie I) Maladie de CROHN et RCH : Généralités II) Thérapeutiques Actuelles III) Le VEDOLIZUMAB 1) Mécanisme d'action 2) Méthode de Fabrication 3) Indications Thérapeutiques 4) Modalités d'utilisations 5) Précautions d'emploi 6) Objectif de l'étude SOMMAIRE INTRODUCTION MATERIELS ET METHODES I) Design de l'étude II) Les caractéristiques cliniques et démographiques III) La séquence thérapeutique IV) Le suivi V) Critères de jugement VI) Analyses Statistiques 15 I) Caractéristiques des patients à l'inclusion II) Efficacité du VEDOLIZUMAB à S6 III) Efficacité du VEDOLIZUMAB à S14 IV) Efficacité du VEDOLIZUMAB à S54 V) Maintien de la réponse thérapeutique VI) Evolution de la CRP VII) Facteurs prédictifs de réponse au traitement VIII) Optimisation thérapeutique IX) Résultats endoscopiques X) Profil de tolérance I) Quels sont les intérêts de cette étude ? II) Le choix du critère du jugement principal III) le choix des scores d'évaluation cliniques IV) VEDOLIZUMAB et RCH V) VEDOLIZUMAB et CROHN VI) VEDOLIZUMAB et patients naïfs vis-à-vis des anti-TNF VII) Le VEDOLIZUMAB sur le long terme VIII) VEDOLIZUMAB et résultats endoscopiques IX) VEDOLIZUMAB et facteurs prédictifs d'une réponse IX) VEDOLIZUMAB et Grossesse X) VEDOLIZUMAB et Tolérance RESULTATS DISCUSSION thérapeutique CONCLUSION REFERENCES LISTE DES ABREVIATIONS RESUME SERMENT D'HIPPOCRATE 16 INTRODUCTION I) Maladie de CROHN et RCH : Généralités Les maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI) représentent un groupe de maladies idiopathiques caractérisées par une inflammation chronique de l'intestin, évoluant sous formes de poussées d'intensité variable entrecoupées de périodes de rémissions de durée variable et imprévisible. Ce groupe correspond à deux grandes affections : - La Maladie de Crohn (MC) - La Rectocolite Hémorragique (RCH) 1) Clinique Les MICI se révèlent de manière diverse, par l'association de manifestations digestives, générales et parfois extradigestives. Plus rarement, il s'agit d'une complication qui justifie une prise en charge urgente. Exceptionnellement, la maladie se révèle de manière fortuite. a) Manifestations digestives : Le symptôme le plus fréquent est la diarrhée (nombre variable de selles quotidiennes, molles, pâteuses ou plus fran- chement liquides, parfois glairo-sanglantes). Il peut exister une notion d'impériosité, voire d'incontinence fécale, avec des évacuations nocturnes. - La RCH est principalement caractérisée par des rectorragies, anxiogènes et un syndrome rectal associant ténesme (tension douloureuse et inefficace qui accompagne et suscite les efforts de défécation), épreintes (dou- leurs abdominales de type colique s'accompagnant d'une contraction douloureuse et répétitive) et faux besoins (envie impérieuse de déféquer n'aboutissant qu'à l'évacuation de déjections pathologiques afécales). Les douleurs abdominales, de type et d'intensité variable, sont quasi-constantes, parfois soulagées par l'émission de selles, fréquemment nocturnes ce qui les distingue du syndrome de l'intestin irritable. - La MC est principalement caractérisée par des douleurs au niveau de la fosse iliaque droite, augmentées à la palpation profonde (un abcès doit être systématiquement recherché). Un syndrome occlusif (douleurs abdominales, arrêt des matières et des gaz, vomissements et météorisme) peut révéler la maladie ou d'une manière moins marquée de type sub-occlusif : douleurs abdominales, météorisme postprandial, blocage abdominal transitoire cédant brutalement, avec une sensation de gargouillements, des bruits de filtration hydro-aérique et une débâcle diarrhéique réalisant un syndrome de Kœnig faisant suspecter une sténose digestive. Un examen proctologique, à la recherche de lésions anopérinéales, doit être systématiquement réalisée surtout en cas de douleurs anales, ou d'écoulement suspect. 17 Prévalence des principaux signes cliniques digestifs au moment du diagnostic Signes cliniques Fréquence au diagnostic 87 % 85 % 65 % 25 % 18 % 11 % 3 % 78 % 74 % 72 % 59 % 51 % 12 % 10 % Maladie de CROHN Rectocolite Hémorragique Diarrhée Douleurs abdominales Amaigrissement Fissures, fistules, abcès anal Syndrome occlusif Rectorragies, méléna Syndrome dysentérique Diarrhée Rectorragies Douleurs abdominales Amaigrissement Syndrome dysentérique, proctalgie Alternance diarrhée - constipation Vomissements b) Manifestations générales : Elles sont très fréquentes au cours des MICI. L'asthénie, bien que non spécifique, est quasi-constante, parfois très sévère, retentissant sur la qualité de vie des malades. Une carence martiale, une carence en vitamines ou une insuffisance surrénalienne au cours d'un sevrage en corticoïdes doivent être systématiquement recherchées. L'utilisation de scores standardisés pour le médecin et d'outils d'e-santé pour les malades permet d'évaluer régulièrement et de manière relativement fiable cette asthénie et de juger de son évolution au cours de la prise en charge. De manière similaire, un amaigrissement, associé à une sarcopénie (réduction de la masse et de la force musculaire) est quasi-constant dans les formes sévères de la maladie. Il est lié à une réduction des ingesta secondaire à la douleur provoquée par l'alimentation, au manque d'appétit fréquent au cours des poussées mais aussi à un hyper-métabolisme. La fièvre, fréquemment observée, peut être inflammatoire et/ou infectieuse 18 c) Manifestations extradigestives1-2-3-4-5-6-7 : 25 à 30 % des patients 15 20 % 10 % 1 5 % Les principales manifestations extradigestives et leur fréquence de survenue Articulaires - oligo-arthrite périphérique - sacro-iléite isolée - spondylarthrite ankylosante Cutanés - érythème noueux - aphtes buccaux - pyoderma gangrenosum / syndrome de Sweet Oculaires - épisclérite ou uvéite antérieure - sclérite et uvéite postérieure Hépatique - anomalies biologiques hépatiques - cholangite sclérosante primitive Autres - thromboses vasculaires - amylose - pulmonaire - pancréatique 5 10 % 5 10 % 1 3 % 10 30 % 1 5 % 1 % 1 % 1 % 2 4 % 1 7 % 1 % d) Révélation de la maladie par une complication8-9-10 Dans 10% des cas, les MICI se révèlent par un tableau aigu nécessitant une prise en charge médico-chirurgicale en urgence : les principaux tableaux cliniques sont la péritonite par perforation, le syndrome occlusif sévère, l'abcès intra- abdominal, la colite aigu grave et l'hémorragie digestive sévère (très rare) e) Découverte fortuite : de manière rare, dans trois circonstances : mise en évidence d'une inflammation de l'intestin grêle sur un scanner abdominal réalisé pour une autre cause, mise en évidence d'une iléite terminale chez un malade opéré pour une suspicion d'appendicite aigu ou diagnostic d'une RCH au cours d'une coloscopie de dépistage d'un cancer a) Incidence en fonction de l'âge11 : L'incidence maximale est 2) Epidémiologie : On dénombre environ 2, 4 millions de cas en Europe avec plus de 200 000 cas en France avec une augmentation de l'incidence de ces maladies dans le temps. retrouvée chez l'adulte jeune entre 20 et 35 ans. Un deuxième pic est retrouvé plus tard dans la vie, surtout pour la RCH, situé entre 55 et 60 ans. Il existe, des formes pédiatriques (15%) qui sont majoritairement des maladies de l'adolescent (âge moyen : 14 ans). féminine est retrouvée pour la MC (sex-ratio F/H 1, 4) alors qu'aucune différence n'a pu être mise en évidence pour la RCH. b) Incidence en fonction du sexe11 : Une légère prédominance 19 c) Gradient Nord/Sud12-13 : La répartition de ces maladies est très inégale. Elles sont plus fréquentes dans l'hémisphère Nord que dans l'hémisphère Sud (à l'exception notable des populations blanches d'Australie, de Nouvelle-Zélande et d'Afrique du Sud), gradient nord-sud qui se retrouve aussi au sein de l'hémisphère Nord. Il est commun de ce fait de penser que le risque de MICI est lié au développement socio-économique, à l'industrialisation et à l'urbanisation. a) Localisations : la MC peut atteindre n'importe quel segment du tube digestif14-15-16-17-18 ( de la bouche à l'anus ) tandis que la RCH se localise au niveau du rectum, avec une extension possible sur les segments coliques19. Maladie de CROHN Rectocolite Hémorragique 3) Physiopathologie b) Facteurs Génétiques20 : La fréquence des formes familiales de MICI et la concordance de 50-60% pour la MC observée chez des jumeaux monozygotes, illustrent l'importance des facteurs génétiques. Si les deux parents sont atteints, il existe un risque de 30 à 50% à 20 ans de développer la maladie. Les résultats des études d'associations pangénomiques, ont mis en évidence 71 loci à risque dans la MC et 47 dans la RCH (28 loci communs). Le gène CARD15/NOD2 (chromosome 16) participe, par l'intermédiaire de la paroi bactérienne, à la défense de l'organisme en stimulant la réponse immunitaire par la reconnaissance des peptidoglycanes bactériens. c) Rôle de l'immunité21 : Le système immunitaire induit deux types de réponses de défense : la réponse innée et la réponse acquise ou adaptative. La réponse immunitaire innée, non spécifique, mise en œuvre rapidement suite à un stimulus étranger, ne confère pas d'immunité durable (mémoire) mais représente la première ligne de défense contre les infections et permet également le déclenchement de la réponse immunitaire adaptative. Elle est effectrice grâce à de 20 Chez les sujets sains, la tolérance aux bactéries entériques commensales est nombreux types de cellules telles que les cellules épithéliales, les polynucléaires neutrophiles, les cellules dendritiques, les monocytes, les macrophages et les cellules NK ( natural killer ) qui déclenchent l'inflammation par la sécrétion de cytokines, de chimiokines et d'agents antimicrobiens. Cela conduit à la phagocytose des cellules infectées et des micro-organismes, la présentation de l'antigène aux lymphocytes T et le déclenchement de la réponse immunitaire acquise. due aux cellules T régulatrices, aux lymphocytes B, aux LT natural killers, et aux cellules dendritiques qui sécrètent le TNF-, l'interleukine 10, les interférons et ainsi que la prostaglandine J2. Dans les MICI, les patients présentent une activation anormale et exagérée des réponses immunitaires innée et acquise et donc une perte de tolérance vis-à-vis de ces bactéries. Ces mécanismes expliquent les phénomènes d'inflammation chronique de la paroi du tube digestif. d) Facteurs Environnementaux22-23-24 : la prédisposition génétique ne peut, à elle seule, expliquer, la survenue des MICI, l'importance de facteurs environnementaux étant suggérée par l'augmentation d'incidence de la maladie de Crohn au cours des 50 dernières années, l'incidence de la rectocolite hémorragique (RCH) étant stable (si on admet que le patrimoine génétique d'un groupe reste relativement constant dans le temps, l'augmentation d'incidence représente ainsi l'influence des facteurs environnementaux). Ceci est notamment illustré par l'augmentation du risque de développer la maladie dans les populations migrantes, risque augmentant jusqu'à rejoindre celui de la population native . Le tabac a des effets opposés dans la survenue des MICI25-26-27. Dans la RCH, le tabac possède un effet protecteur, probablement dû à la nicotine. L'incidence et la sévérité de la maladie sont environ 2 à 3 fois inférieures dans la population tabagique tandis que dans la MC, le risque de développer la maladie est 2 fois plus élevé chez les fumeurs. L'évolution de la MC est plus sévère, en termes de poussées, de recours aux corticoïdes, aux immunosuppresseurs et à la chirurgie. Les récidives post opératoires sont plus fréquentes. A l'inverse, le sevrage tabagique est bénéfique avec une diminution du nombre des rechutes, du recours à la chirurgie et aux traitements immunosuppresseurs. L'appendicectomie28 a un effet protecteur vis à vis de la RCH, si elle est réalisée avant l'âge de 20 ans. Le rôle de l'alimentation29, même s'il n'est pas encore clairement établi, est soutenu par la fréquence plus élevée des MICI en Europe et Amérique du Nord (consommation de sucres raffinés et de saccharose plus importante et consommation moindre de fibres) et par le bénéfice de certains régimes d'exclusion. Le psychisme : bien que non démontré, le stress semble jouer un rôle non négligeable dans l'apparition d'une MICI et la survenue de poussées. Des évènements marquants de la vie, précédant l'entrée dans la maladie, ont été retrouvés dans plusieurs études. Les médicaments29 : la contraception orale, les anti-inflammatoires non stéroïdiens ont souvent été incriminés sans qu'une relation de causalité ait pu être établi. 21 Les agents infectieux29 : même si une augmentation d'incidence des MICI est observée lors d'épidémies d'agents infectieux spécifiques (rougeole, ), aucune association n'a été clairement démontrée à ce jour. L'amélioration du niveau de vie29 dans les pays industrialisés, pourrait, en réduisant l'exposition aux agents infectieux dans l'enfance induire une fragilité immunitaire chez l'adulte et favoriser la survenue de maladies à mécanisme immunitaire. Dans les MICI, il existe un état de dysbiose responsable d'un effet délétère Le microbiote intestinal30 : Plusieurs centaines d'espèces bactériennes colonisent le tube digestif et exercent des effets physiologiques pour l'hôte : effet de barrière vis-à- vis des pathogènes, modification de la sécrétion de mucus, protection cellulaire (lymphocytes T) et humorale (immunoglobulines), fonction trophique sur la muqueuse (production d'acides gras à chaines courtes), maturation immunitaire par tolérance orale empêchant l'induction d'une réponse immunitaire inappropriée et actions métaboliques (digestion, production de vitamines, métabolisation des acides biliaires, d'hormones, médicaments, pro-inflammatoire en lien avec la survenue et l'entretien des lésions digestives : moindre diversité bactérienne (diminution de certaines espèces de Firmicutes et de Bacteroidetes) et fongique, augmentation de la concentration bactérienne muqueuse (observée au sein des lésions iléocoliques), instabilité du microbiote au cours du temps, dysmétabolose des acides biliaires (responsable d'un effet pro-inflammatoire et carcinogène colique) et des peptides antimicrobiens, défaillance de la barrière intestinale (déficit en défensines). antibiotiques (Métronidazole et Ciprofloxacine) dans le traitement de la pochite et de la récidive post-opératoire de la MC et le rôle protecteur de l'espèce Faecalibacterium prausnitzii (la récidive post-opératoire est plus fréquente si le sujet en est déficitaire) Tout ceci est à mettre en parallèle avec l'efficacité établie de certains 4) Biologie Les prélèvements sanguins peuvent mettre en évidence un syndrome Actuellement, le développement de marqueurs fécaux comme la calprotectine inflammatoire biologique, une anémie ou différentes carences telles une carence martiale. Toutefois, ces signes sont inconstants et le plus souvent retrouvés lors de poussées de la maladie et/ou de maladie insuffisamment contrôlées par la thérapeutique mise en place. Le bilan biologique comprend donc un dosage de la C- reactive protein (CRP) et une numération de la formule sanguine (NFS), un bilan nutritionnel (ferritine, fer sérique, coefficient de saturation de la transferrine, albumine, B12, folates, vitamine D, créatinémie) et un bilan hépatique (ASAT/ALAT, gamma GT, phosphatases alcalines). fécale, permet de suivre de manière non invasive l'activité de la maladie31-32. Enfin, rappelons l'importance de la réalisation de coprocultures à la recherche notamment d'une infection à Clostridium Difficile et d'un dosage quantitatif, par PCR sanguine, du cytomégalovirus (CMV) dans le cas de poussées de la maladie33. 22 5) Endoscopie et Anatomopathologie Les examens endoscopiques ont plusieurs objectifs34-35-36-37 : - permettre le diagnostic positif et éliminer les diagnostics différentiels - évaluer la gravité des lésions notamment dans les poussées sévères - suivre la réponse au traitement (cicatrisation muqueuse) - dépister la dysplasie et le cancer colorectal - bilan pré et post-opératoire - rôle thérapeutique : dilatation d'une sténose, (biopsies) Dans la maladie de CROHN, les lésions endoscopiques les plus évocatrices, habituellement séparées par des intervalles de muqueuse saine en apparence, sont les ulcérations aphtoïdes, les ulcérations en carte de géographie et en rails La suspicion d'une atteinte de l'intestin grêle doit être recherchée par une entéroIRM, la réalisation d'une vidéocapsule ou une entéroscopie double ballon. L'anatomopathologie peut mettre en évidence des pertes de substance muqueuse, des distorsions glandulaires, une infiltration lympho-plasmocytaire du chorion muqueux, voire transmurale, souvent sous forme de nodules lymphoïdes et de manière très évocatrice dans 20 à 30% des cas des granulomes épithélioïdes et gigantocellulaires38 23 24 Dans la RCH, l'atteinte s'étend de manière rétrograde, continue et homogène depuis la jonction anorectale plus ou moins loin vers l'amont et s'interrompant de façon assez brusque avec une limite plutôt nette entre zone pathologique et zone saine. L'existence d'un deuxième foyer inflammatoire caecal péri-appendiculaire est classique. Par définition, l'iléon est indemne de toute lésion (sauf en cas d'iléite de reflux si l'atteinte est pancolique). Sur le plan macroscopique, les lésions observables vont de la muqueuse œdématiée ou granitée masquant les vaisseaux sous-muqueux et pouvant ou non saigner au contact, à une muqueuse recouverte de pus, ulcérée par endroits, saignant spontanément en nappe. Les lésions sont diffuses, sans intervalle de muqueuse saine. Des pseudo-polypes sont retrouvés dans les RCH anciennes. L'anatomopathologie peut mettre en évidence une augmentation de l'infiltrat du chorion, une distorsion sévère de l'architecture cryptique, une diminution forte et diffuse de la densité cryptique, une surface villeuse et une déplétion du mucus39 25 Dérivés Aminosalicylés40 : avec une action anti-inflammatoire locale II) Thérapeutiques actuelles directe sur les muqueuses de l'intestin grêle et du côlon, ils sont utilisés dans le traitement des poussées d'intensité légère à modérée et dans la prévention des rechutes des RCH (peu efficaces dans la MC) Budésonide41 : de la famille des corticoïdes, il exerce une action essentiellement locale, limitée à l'intestin en ne diffusant que faiblement dans la circulation sanguine (donc moins d'effets secondaires par rapport aux autres corticoïdes). Le budésonide est prescrit dans les poussées de maladie de Crohn d'intensité légère ou modérée, affectant l'iléon terminal et/ou le côlon droit. Corticothérapie42 : traitement très efficace des poussées, elle permet une régression rapide des symptômes et une disparition des lésions endoscopiques. Ils ne peuvent être maintenus à dose élevée que sur des périodes assez courtes en raison de leurs effets indésirables et d'une absence d'efficacité au long cours. Ces inconvénients justifient de ne les utiliser que lorsqu'ils sont véritablement indispensables, en tentant de limiter la durée de traitement. L'utilisation des corticoïdes au cours de la maladie de Crohn et de la rectocolite hémorragique est aussi parfois l'occasion de débuter un traitement immunosuppresseur et/ou une biothérapie en traitement d'entretien pour éviter les rechutes de la maladie. Azathioprine/6-mercaptopurine43 : de la famille des immunosuppresseurs, leur réponse thérapeutique est lente (en moyenne 3 mois) et ne peuvent donc être utilisés dans le cadre d'une situation d'urgence. Ils peuvent aussi être prescrits en association avec un traitement par anticorps monoclonal. On parle alors de combothérapie dont les objectifs sont à la fois d'additionner l'effet anti- inflammatoire des deux traitements, et aussi de réduire l'immunisation contre les anticorps monoclonaux grâce à leur effet immunosuppresseur. Ciclosporine44 : de la famille des immunosuppresseurs, la ciclosporine est un inhibiteur de la calcineurine (enzyme impliquée dans la translocation nucléaire d'un facteur de transcription essentiel de l'interleukine 2), inhibant ainsi l'activation et la prolifération des lymphocytes T et la synthèse de cytokines pro-inflammatoires. Il est employé dans des poussées sévères de rectocolite hémorragique, très rarement de maladie de Crohn, en cas de résistance o de contre-indication aux corticoïdes intraveineux et si une intervention chirurgicale n'est pas indispensable en urgence. Méthotrexate45 : de la famille des immunosuppresseurs, il est réservé aux formes les plus évolutives et de traitement difficile des MICI (rechutes fréquentes, poussées sévères, dépendance aux corticoïdes, lésions périnéales sévères, association à l'Infliximab, ). La réponse à ce médicament est lente et ne convient pas pour résoudre une situation urgente Anti-TNF46-47-48-49 : L'Adalimumab, l'Infliximab et le Golimumab sont des anticorps monoclonaux qui neutralisent de façon spécifique une protéine produite en excès au cours des MICI, le TNF qui favorise l'inflammation, en participant à la lutte contre certaines infections. 26 Tandis que l'Adalimumab et le Golimumab sont produits directement à partir de cellules d'origine humaine (anticorps humanisé ), l'Infliximab est issu en partie de cellules de souris (anticorps chimérique ). Ces traitements ont constitué une avancée majeure dans la prise en charge thérapeutique des MICI. Ils peuvent être utilisés en cas de poussées d'intensité modérées à sévères non contrôlées par la corticothérapie et/ou les immunosuppresseurs (ou en cas d'intolérance à ces derniers) et en tant que traitement de fond pour la prévention des rechutes et le contrôle à long terme de la maladie. L'Infliximab est utilisable dans la population pédiatrique ainsi que dans le traitement des fistules compliquant la maladie de Crohn, lorsque les traitements habituels (antibiotiques, drainage chirurgical, immunosuppresseurs) ne sont pas suffisants, ou chez lesquels ces traitements sont mal tolérés ou contre-indiqués. Enfin, le Golimumab, en l'absence d'évaluation dans la MC, ne peut être utilisé que dans le traitement de la RCH. III) Le VEDOLIZUMAB (Entyvio) 1) Mécanisme d'action : Le VEDOLIZUMAB est un immunosuppresseur biologique sélectif, de type anticorps monoclonal humanisé de type IgG1 se liant spécifiquement à l'intégrine 47 exprimée sur un sous-groupe de lymphocytes T auxiliaires à mémoire qui migrent préférentiellement dans le tractus gastro-intestinal. Il représente donc un antagoniste spécifique de l'intégrine 47. En se liant à cette intégrine, le VEDOLIZUMAB inhibe l'adhésion des lymphocytes T à la molécule-1 d'adhérence cellulaire d'adressine de muqueuse (MAdCAM-1)50, principalement exprimée sur les cellules endothéliales intestinales et qui joue un rôle primordial dans l'écotaxie des lymphocytes T vers les tissus du tractus gastro- intestinal. L'action du VEDOLIZUMAB est donc de prévenir l'entrée des lymphocytes dans la lamina propria intestinale et les tissus lymphoïdes associés au tube digestif. La RCH et la MC étant des maladies inflammatoires chroniques à médiation immunologique du tractus gastro-intestinal, le VEDOLIZUMAB réduit donc les phénomènes inflammatoires caractéristiques de ces maladies. inhibe donc pas la fonction51. Le VEDOLIZUMAB ne se lie pas aux intégrines 41 et E7 et n'en 27 La réaction inflammatoire chronique : le rôle de l'intégrine 47 28 Inhibition de la réaction inflammatoire : l'action du VEDOLIZUMAB 29 2) Méthode de fabrication de mise sur le marché (AMM) en 2014 dans les deux indications suivantes : 3) Indications Thérapeutiques : le VEDOLIZUMAB a obtenu l'autorisation - Traitement de la RCH active modérée à sévère chez les patients adultes présentant une réponse insuffisante ou une perte de réponse ou une intolérance à un traitement conventionnel ou par anti-TNF - Traitement de la Maladie de CROHN active modérée à sévère chez les patients adultes présentant une réponse insuffisante ou une perte de réponse ou une intolérance à un traitement conventionnel ou par anti-TNF 30 4) Modalités d'utilisation : identiques pour la RCH et la MC - La séquence d'induction : une perfusion intraveineuse à la dose de 300 mg, administrée une première fois, puis une nouvelle à 2 semaines (S2) et à 6 semaines (S6), associée à une prémédication intraveineuse cortisonique (Hydrocortisone 200 mg) - Le traitement d'entretien : une perfusion de 300 mg toutes les 8 semaines. La fréquence de ces perfusions peut être rapprochée toutes les 4 semaines en cas réponse jugée insuffisante par le médecin responsable. Le VEDOLIZUMAB est administré en milieu hospitalier sous forme d'une perfusion intraveineuse sur une durée de 30 minutes. Lors des deux premières perfusions, une surveillance pendant la perfusion et dans les deux heures qui suivent est exigée. Une heure de surveillance suffit lors des perfusions suivantes. 5) Précautions d'emploi52 : s'assurer de l'absence de contre-indications À l'interrogatoire : - Antécédents d'infections : bactériennes, fongiques et virales (VHB, VHC, varicelle-zona, herpès simplex) - Un risque de tuberculose latente ou active : date de la dernière vaccination (BCG), contact avec des patients tuberculeux, pays d'origine ou séjours prolongés dans un pays endémique, antécédents de traitement de tuberculose latente ou active - Séjour ou voyage en zone tropicale ou dans des régions d'infections endémiques - Antécédent de lupus - Grossesse évolutive - Néoplasie récente - Pathologie démyélinisante (Sclérose en plaques, ) - Insuffisance cardiaque congestive sévère stade III ou IV NYHA 31 À l'examen physique : signes locaux ou généraux d'infection (gingivite, candidose orale ou vaginale, intertrigo, ), foyers infectieux : dentaire, urinaire, cutané, Quel bilan biologique prescrire ? - Connatre le statut immunitaire des patients et identifier les risques avant la mise en route d'un traitement immunosuppresseur : - De façon systématique : Numération de la formule sanguine, CRP, bilan hépatique, électrophorèse des protéines sériques, créatinine et ionogramme sanguin, sérologies VZV, EBV, sérologies VHB, VHC et HIV, béta-HCG (si femme en âge de procréer) - Si contexte particulier : anticorps anti nucléaires et anti-DNA natifs (maladie auto-immune), coproculture avec analyse parasitologique si risque d'infection parasitaire (voyage), sérologie de la strongyloïdose si retour de zone endémique, examen cytobactériologique des urines Rechercher une tuberculose53 : Interrogatoire Intradermoréaction à la tuberculine (ou test interféron-gamma) - - Radiographie pulmonaire - - et/ou Quantiferon (permet de faire la différence entre une infection par Mycobacterium Tuberculosis et une vaccination par le BCG, et reste interprétable même chez le sujet immunodéprimé) Organiser : - Consultation gynécologique : frottis cervical (éliminer HPV et dysplasie) - Bilan dermatologique (rechercher mélanome ou autre, ) Contrôler et mettre à jour les vaccinations - Vaccins antigrippal annuel et anti- pneumococcique tous les 3 à 5 ans recommandés - Vaccin VZV si sérologie négative ou absence de varicelle - Vaccin HPV (Human Papilloma Virus) si jeune fille adolescente - Vaccin hépatite B si non-fait et sérologie négative - Diphtérie-Tétanos-Poliomyélite (DTPolio) 6) Objectif de l'étude : l'objectif de cette étude est d'évaluer, de manière prospective, dans des conditions de vie réelles, l'efficacité et la tolérance, à court et à plus long terme, du VEDOLIZUMAB dans le traitement de la maladie de CROHN et de la RCH et établir les caractéristiques de la population traitée. 32 MATERIELS ET METHODES I) Design de l'étude Il s'agit d'une étude de cohorte observationnelle, unicentrique, prospective, conduite dans le service d'Hépato-Gastro-Entérologie du Centre Hospitalier Universitaire de Nice. Tous les patients adultes présentant une maladie de CROHN ou une RCH avec une réponse insuffisante, ou une perte de réponse, ou une intolérance à un traitement conventionnel ou au moins une ligne d'anti-TNF étaient éligibles à l'inclusion. Une MICI active était définie par un score de Harvey-Bradshaw (HB) 4 pour la maladie de CROHN et un score MAYO clinique 6 pour la RCH. Les consultations médicales dans le cadre du suivi étaient assurées au CHU de Nice ou dans les centres périphériques par le gastro-entérologue en charge du patient. Les perfusions de VEDOLIZUMAB devaient être obligatoirement réalisées dans le service d'Hépato-Gastro-Entérologie au CHU de Nice (Hôpital de Jour Médico-Chirurgical ou hospitalisation complète) Le recrutement des patients s'étendait depuis la 1ère prescription de VEDOLIZUMAB au CHU jusqu'au mois de Juin 2016. Aucun nouveau patient n'était inclus à partir de cette date. La période de suivi de la cohorte était ensuite prolongée jusqu'au mois de Novembre 2016. Un suivi minimal de 6 mois était donc assuré. Chaque patient était étudié jusqu'à la perfusion de la semaine 54 (si le patient avait pu effectuer toutes ces perfusions au moment du recueil des résultats). II) Les caractéristiques cliniques et démographiques de la population de patients étaient recueillies à l'interrogatoire et à l'examen des dossiers médicaux écrits et informatisés. Ces données comprenaient l'âge, le ratio Homme/Femme, le statut tabagique, le type de MICI (CROHN ou RCH) et le nombre respectif de patients, le score Harvey- Bradshaw (CROHN) et Mayo Clinique (RCH) calculée à S0, le nombre de patients avec une expression clinique extra-digestive, la durée d'évolutivité de la MICI (exprimée en années), l'âge au moment du diagnostic, la localisation digestive de la MICI (iléale, iléocolique, digestive haute, anopérinéale, ), le statut chirurgical (chirurgie luminale, anopérinéale, ) et les traitements (5-ASA, Thiopurines, Anti-TNF et nombre de lignes d'anti-TNF, ) antérieurs à la prescription du VEDOLIZUMAB, les traitements concomitants à S0, la CRP à S0 et l'indication du traitement par VEDOLIZUMAB. III) La séquence thérapeutique : les patients bénéficiaient d'une perfusion intraveineuse de VEDOLIZUMAB à la dose de 300 mg selon le schéma d'attaque standard : S0, S2 et S6. Les perfusions étaient ensuite renouvelées toutes les 8 semaines selon le schéma habituel du traitement d'entretien . En cas de réponse clinique insuffisante et/ou du profil particulièrement sévère de la maladie, le médecin responsable était libre d'optimiser le traitement par VEDOLIZUMAB à une dose de 300 mg toutes les 4 semaines. L'utilisation concomitante d'une corticothérapie et/ou d'un immunosuppresseur (azathioprine, 6-mercaptopurine, méthotrexate par voie sous- cutanée ou intramusculaire) était également autorisée. 33 IV) Le Suivi : Tous les patients étaient évalués de manière standardisée lors de chaque perfusion de VEDOLIZUMAB jusqu'à l'arrêt du recueil des données. Le jour de la perfusion, le score Harvey-Bradshaw et le score MAYO Clinique était calculé respectivement pour la maladie de CROHN et la RCH. Tout effet secondaire clinique potentiel était recueilli. Chaque bilan biologique, réalisé obligatoirement avant la perfusion, était analysé avec recueil obligatoire de la C-Reactive Protein (CRP, mg/L). 34 35 V) Critères de Jugement : le critère de jugement principal était la rémission clinique sans corticoïdes évaluée à S6, S14, S22 et S30, S38, S46 et S54. La rémission clinique était définie par un score Harvey-Bradshaw 4 pour la maladie de CROHN et un score MAYO Clinique < 3 avec un score combiné saignement rectal fréquence des selles 1. Les critères de jugement secondaires étaient la rémission clinique, la réponse clinique, la réponse clinique sans corticoïdes, la tolérance, évaluées à S6, S14, S22 et S30, S38, S46 et S54 et le score endoscopique UCEIS pour la RCH. La réponse clinique était définie par la réduction d'au moins 3 points du score Harvey-Bradshaw (CROHN) ou une réduction d'au moins 3 points du score MAYO Clinique (RCH) avec une diminution d'au moins 1 point du sous-score saignement rectal ou un sous-score saignement rectal entre 0 et 1. Les effets secondaires potentiels étaient prospectivement recueillis à l'interrogatoire et/ou rétrospectivement par l'analyse des dossiers médicaux. VI) Analyses Statistiques : Les variables qualitatives, pour la description de la population de l'étude et des paramètres étudiés, étaient exprimés en fréquence et en pourcentage, tandis que les variables quantitatives étaient calculées en moyennes (avec leur écart-type). L'analyse des facteurs prédictifs potentiels concernant la réponse ou non au traitement utilisait le test t concernant des séries non appariées. Une valeur de p inférieure à 0, 05 était considérée comme significative. Les facteurs potentiellement prédictifs étudiés étaient l'âge, le sexe, le type de MICI, la durée d'évolutivité de la MICI à l'initiation du traitement ( l'âge de la maladie ), la prescription d'une corticothérapie à l'initiation du traitement, le nombre de lignes d'anti-TNF antérieures, l'optimisation ou non du traitement (rapprochement des perfusions toutes les 4 semaines et/ou l'ajout d'un immunosuppresseur). Il était différencié trois groupes de répondeurs : les répondeurs précoces (rémission clinique sans corticoïdes atteinte avant la perfusion S14), les répondeurs tardifs (rémission clinique sans corticoïdes atteinte après la perfusion S14) et le groupe des répondeurs au total rémission clinique sans corticoïdes atteinte quel que soit la durée du traitement par Vedolizumab). L'analyse des facteurs prédictifs de réponse au traitement était effectuée sur l'ensemble de la population de patients MICI étudiés sans différenciation entre le groupe CROHN et le groupe RCH , puis séparément selon le type de MICI selon les mêmes paramètres. 36 RESULTATS I) Caractéristiques des patients à l'inclusion Un total de 87 patients étaient potentiellement éligibles. 10 patients étaient exclus car leurs perfusions de VEDOLIZUMAB n'étaient pas réalisées au CHU de Nice 77 patients ont été inclus (34 RCH et 43 maladies de CROHN). L'ensemble des caractéristiques démographiques et cliniques sont regroupées dans le tableau 1 Tableau 1 : Caractéristiques Démographiques et Cliniques des patients à l'inclusion Caractéristiques Age (années) (moyenne écart-type) Ratio H/F n (%) Statut Tabagique n (%) - Non-Fumeurs ou Anciens Fumeurs - Fumeurs Actifs Durée d'évolutivité de la maladie (années) (moyenne écart-type) Manifestions extradigestives n (%) - Cholangite sclérosante primitive - Spondylarthrite Ankylosante Age au moment du diagnostic (années) n (%) 16 ans entre 16 et 40 ans 40 ans Maladie de CROHN Localisation de la maladie n (%) Haute (en amont de D4) Grêlique Iléale (seule) Colique (seule) Iléocolique Atteinte Anopérinéale n (%) Maladie de CROHN (n 43) 42 15 17 / 26 (39/61) 25 (58%) 18 (42%) 18 11 Recto-Colite Hémorragique (n 34) 44 13 17 / 17 (50/50) 29 (85%) 5 (15%) p 0, 44 10 6 1 (2%) 1 (2%) 10 (23%) 30 (68%) 3 (7%) 3 (7%) 2 (5%) 5 (12%) 6 (14%) 26 (60%) 13 (30%) 3 (9%) 0 1 (3%) 21 (62%) 12 (35%) - - - - - - 37 Harvey Bradshaw (moyenne écart-type) Recto-Colite Hémorragique Localisation de la maladie n (%) Rectale Colite gauche Pancolite Score Mayo Clinique (moyenne écart-type) Traitements Antérieurs n (%) 5-Amino-Salicylés Thiopurines Méthotrexate Anti-TNF Aucun 1 seule ligne 2 lignes 3 lignes (Golimumab) Combothérapie (avec anti TNF) Autres Thérapeutiques * Traitements concomitants initiaux n (%) Corticoïdes Immunosuppresseurs Corticoïdes et Immunosuppresseurs Aucun traitement initial CRP (mg/l) (moyenne écart-type) 7 5, 5 - - - - - 0 14 (33%) 35 (81%) 14 (33%) 2 (5%) 15 (35%) 24 (56%) 2 (5%) 10 (23%) 11 (26%) 23 (53%) 5 (12%) 15 (35%) 26, 5 35 3 (9%) 13 (38%) 18 (53%) 6, 4 1, 9 29 (85%) 19 (56%) 11 (32%) 1 (3%) 11 (32%) 18 (53%) 4 (12%) 6 (18%) 14 (41%) 15 (44%) 2 (6%) 3 (9%) 14 (41%) 26 39 0, 41 0, 99 38 Statut Chirurgical avant traitement n (%) Chirurgie Luminale (seule) Chirurgie Anopérinéale (seule) Chirurgie Luminale et Anopérinéale Aucune Chirurgie Indication de la prescription du VEDOLIZUMAB n (%) Echec thérapeutique Intolérance aux thérapeutiques antérieures Immunisation biologique aux anti-TNF Contre-Indication primaire Contre-indication secondaire * 20 (47%) 1 (3%) 2 (5%) 7 (16%) 0 1 (3%) 14 (33%) 32 (94%) 28 (65%) 7 (16%) 5 (12%) 2 (5%) 2 (5%) 27 (79%) 7 (21%) 1 (3%) 1 (3%) 2 (6%) * Ciclosporine, Salazopyrine, Plaquenil, protocole de recherche (anti-IP10), Certolizumab, Mycophénolate Mofétil, Cyclophosphamide * une insuffisance cardiaque et une tuberculose dans le groupe CROHN , un cancer du sein et un cancer vésical dans le groupe RCH, tous dans le cadre d'un traitement par antiTNF 9 patients dans le groupe RCH et 6 patients dans le groupe maladie de CROHN ne présentaient pas une MICI définie comme active . Comparativement aux patients du groupe RCH, les patients du groupe maladie de CROHN avaient en moyenne un âge moins élevé, une plus forte proportion de femmes et de patients tabagiques actifs et une durée d'évolutivité de la maladie plus élevée. Les 2 groupes étaient relativement comparables en ce qui concerne les traitements antérieurs. Plus d'un patient sur deux a déjà bénéficié d'au moins 2 lignes d'anti-TNF et plus de 9 patients sur 10 d'au moins une ligne. Par ailleurs, environ 1 patient sur 5 a antérieurement été traité par combothérapie avec un antiTNF. Le groupe RCH comprenait une plus forte proportion de patients antérieurement traité par d'autres thérapeutiques (Antibiothérapie, Ciclosporine, protocoles de recherche clinique, ). 39 3 patients (2 dans le groupe maladie de CROHN et 1 dans le groupe RCH) étaient naïfs vis-à-vis des anti TNF (1 Sclérose en plaques, 1 Tuberculose et 1 Myélopathie dégénérative). Les patients du groupe maladie de CROHN , comparativement au groupe RCH, ont plus souvent nécessité une prise en charge chirurgicale avant la prescription de VEDOLIZUMAB. A S6, 16 (37%) et 11 (32%) patients étaient en rémission clinique, Dans le groupe RCH, lors de l'introduction du traitement par VEDOLIZUMAB, Tous les patients ont complété le traitement d'induction. Dans le groupe CROHN, lors de l'introduction du traitement par Les 2 groupes restaient comparables concernant la prescription à S0 d'un traitement corticoïde et/ou immunosuppresseur et l'indication de la prescription du VEDOLIZUMAB. II) Efficacité du VEDOLIZUMAB à S6 VEDOLIZUMAB, 1 patient était traité par du METHOTREXATE dans le cadre d'une polyarthrite rhumatoïde et 3 patients poursuivaient un traitement par IMUREL. 3 patients prenaient des 5-ASA par voie systémique, 1 patient était traité par du PLAQUENIL dans le cadre d'un lupus induit par les anti-TNF et 1 patient par du METHOREXATE dans le cadre d'une SEP ancienne. 1 seul patient poursuivait son traitement par IMUREL respectivement dans les groupes maladie de CROHN et RCH . Parmi ceux-ci, 11 (26%) et 5 (15%) respectivement étaient en rémission clinique sans corticoïdes. 22 (51, 2%) et 12 (35, 3%) patient présentaient une réponse clinique dont 14 (33%) et 6 (18%) avec une réponse clinique sans corticoïdes, respectivement dans les groupes maladie de CROHN et RCH . Mayo Clinique à 4, 4 (versus 6, 4 à S0). du traitement d'induction en raison d'une poussée sévère de la maladie ayant nécessité une prise en charge chirurgicale en urgence. III) Efficacité du VEDOLIZUMAB à S14 patients ont interrompu le traitement avant S14 du fait d'une poussée sévère de la maladie ayant nécessité une prise en charge chirurgicale en urgence. toutes les 4 semaines chez 15/41 patients (37%) dans le groupe CROHN et 15/34 patients (44%) dans le groupe RCH Concernant l'ajout d'immunosuppresseurs, dans le groupe CROHN, 1 patient fut optimisé par l'ajout d'IMUREL tandis que dans le groupe RCH, 3 patients furent Le score Harvey-Bradshaw est évalué à 5, 4 (versus 7, 0 à S0) et le score 2 patients (groupe CROHN ) n'ont pu poursuivre le traitement après la fin Sur le total des 77 patients qui ont complété la séquence d'induction, 2 A S10, le traitement par VEDOLIZUMAB était optimisé à une dose de 300 mg 40 A S14, 18 (42%) et 11 (32%) patients étaient en rémission clinique, Le score Harvey-Bradshaw est évalué à 4, 7 (versus 5, 4 à S6 et 7, 0 à S0) et le optimisés par l'ajout d'IMUREL, 1 patient par du METHOTREXATE et 1 patient par du GOLIMUMAB. respectivement dans les groupes maladie de CROHN et RCH . Parmi ceux-ci, 15 (35%) et 9 (27%) respectivement étaient en rémission clinique sans corticoïdes. 22 (51, 2%) et 13 (38, 2%) patient présentaient une réponse clinique dont 18 (42%) et 11 (33%) avec une réponse clinique sans corticoïdes, respectivement dans les groupes maladie de CROHN et RCH . score Mayo Clinique à 4, 3 (versus 4, 4 à S6 et 6, 4 à S0). IV) Efficacité du VEDOLIZUMAB à S54 A S54, dans les groupes CROHN et RCH respectivement, 18 et 9 patients n'avaient pas encore réalisé leur perfusion tandis que 8 et 5 patients ont interrompu le traitement en raison d'une réponse clinique et/ou endoscopique insuffisante. 1 patiente dans le groupe CROHN a arrêté le traitement en raison d'arthralgies invalidantes apparues lors de la mise en place du VEDOLIZUMAB. 1 patiente enceinte dans le groupe RCH a décidé en accord avec le médecin référent de stopper temporairement le traitement dès la grossesse confirmée. Enfin, 1 patient dans le groupe RCH a repris son traitement par REMICADE, stoppé à cause d'un diagnostic de cancer vésical. L'anti-TNF, du fait de son efficacité clinico- endoscopique avant son arrêt, a pu être repris avec l'accord de l'urologue lorsque la BCG thérapie fut terminée. Parmi les patients ayant bénéficié d'une perfusion à S54, le traitement par VEDOLIZUMAB était optimisé à une dose de 300 mg toutes les 4 semaines chez 10/16 patients (63%) dans le groupe CROHN et 13/18 patients (72%) dans le groupe RCH . METHOTREXATE et 2 patients par l'ajout d'IMUREL (à S14 et S22). METHOTREXATE, (respectivement à S14 et S30), 5 patients par l'ajout d'IMUREL (respectivement à S10, S14, S22 et S38). Parmi ceux-ci, 1 patient a arrêté son traitement par IMUREL devant la bonne réponse clinique mais poursuit son traitement par VEDOLIZUMAB toutes les 4 semaines, 1 autre l'arrêté devant un diagnostic de pyélonéphrite obstructive. Le patient optimisé par l'ajout de SIMPONI a arrêté son traitement à S54 devant l'apparition d'arthralgies paradoxales respectivement dans les groupes maladie de CROHN et RCH . Parmi ceux-ci, 9 (36%) et 7 (28%) respectivement étaient en rémission clinique sans corticoïdes. 14 (56, 0%) et 9 (36, 0%) patient présentaient une réponse clinique dont 11 (44%) et 9 (36%) avec une réponse clinique sans corticoïdes, respectivement dans les groupes maladie de CROHN et RCH . Le score Harvey-Bradshaw est évalué à 2, 6 (versus 4, 7 à S14, 5, 4 à S6 et 7, 0 à S0) et le score Mayo Clinique à 3, 5 (versus 4, 3 à S14, 4, 4 à S6 et 6, 4 à S0). A S54, dans le groupe CROHN, 1 patient fut optimisé (à S38) par l'ajout de A S54, dans le groupe RCH , 2 patients étaient optimisés par l'ajout de A S54, 12 (48%) et 11 (28%) patients étaient en rémission clinique, 41 CROHN : REMISSION CLINIQUE HN : REMISSION CLINIQ SANS CORTICOIDES 100. 00% 90. 00% 80. 00% 70. 00% 60. 00% 50. 00% 40. 00% 30. 00% 20. 00% 10. 00% 0. 00% 100. 00% 90. 00% 80. 00% 70. 00% 60. 00% 50. 00% 40. 00% 30. 00% 20. 00% 10. 00% 0. 00% 26% 35% 42% 34% 33% 41% 36% n 43 S6 n 43 S14 n 38 S22 n 32 S30 n 30 S38 n 27 S46 n 25 S54 RCH : REMISSION CLINIQUE H : REMISSION CLINIQ SANS CORTICOIDES 27% 15% 38% 42% 39% 27% 28% n 34 S6 n 34 S14 n 34 S22 n 33 S30 n 28 S38 n 26 S46 n 25 S54 42 100. 00% 90. 00% 80. 00% 70. 00% 60. 00% 50. 00% 40. 00% 30. 00% 20. 00% 10. 00% 0. 00% 100. 00% 90. 00% 80. 00% 70. 00% 60. 00% 50. 00% 40. 00% 30. 00% 20. 00% 10. 00% 0. 00% CROHN : REMISSION CLINIQUE 37% 42% 58% 47% 43% 52% 48% n 43 S6 n 43 S14 n 38 S22 n 32 S30 n 30 S38 n 27 S46 n 25 S54 RCH : REMISSION CLINIQUE 32% 32% 41% 42% 39% 27% 28% n 34 S6 n 34 S14 n 34 S22 n 33 S30 n 28 S38 n 26 S46 n 25 S54 43 CROHN : REPONSE CLINIQUE OHN : REPONSE CLINIQ SANS CORTICOIDES 100. 00% 90. 00% 80. 00% 70. 00% 60. 00% 50. 00% 40. 00% 30. 00% 20. 00% 10. 00% 0. 00% 100. 00% 90. 00% 80. 00% 70. 00% 60. 00% 50. 00% 40. 00% 30. 00% 20. 00% 10. 00% 0. 00% 42% 45% 47% 47% 48% 44% 33% n 43 S6 n 43 S14 n 38 S22 n 32 S30 n 30 S38 n 27 S46 n 25 S54 RCH : REPONSE CLINIQUE CH : REPONSE CLINIQU SANS CORTICOIDES 47% 46% 46% 42% 36% 32% 18% n 34 S6 n 34 S14 n 34 S22 n 33 S30 n 28 S38 n 26 S46 n 25 S54 44 100. 00% 90. 00% 80. 00% 70. 00% 60. 00% 50. 00% 40. 00% 30. 00% 20. 00% 10. 00% 0. 00% 100. 00% 90. 00% 80. 00% 70. 00% 60. 00% 50. 00% 40. 00% 30. 00% 20. 00% 10. 00% 0. 00% CROHN : REPONSE CLINIQUE 82% 51% 51% 63% 60% 59% 56% n 43 S6 n 43 S14 n 38 S22 n 32 S30 n 30 S38 n 27 S46 n 25 S54 RCH : REPONSE CLINIQUE 35% 38% 50% 49% 46% 39% 36% n 34 S6 n 34 S14 n 34 S22 n 33 S30 n 28 S38 n 26 S46 n 25 S54 45 V) Maintien de la réponse thérapeutique Dans le groupe CROHN , sur un total de 22 patients ayant atteint au moins une fois, la rémission clinique sans corticoïdes, aucun patient n'a présenté une perte de la réponse thérapeutique. 3 patients ont atteint la rémission clinique sans corticoïdes mais le maintien de cette rémission n'a pu être étudié au-delà au moment de l'analyse des résultats. CROHN : VEDOLIZUMAB et maintien de la réponse thérapeutique s t n e i t a P 0 0 0 21 19 17 15 13 11 9 7 5 3 1 8 8 8 8 16 16 16 24 24 40 40 40 40 48 48 48 48 32 32 0 10 30 20 40 Nombre de Semaines 50 60 Dans le groupe RCH , sur un total de 15 patients ayant atteint au moins une fois la rémission clinique sans corticoïdes, un seul patient a présenté une perte prolongée de la réponse thérapeutique RCH : VEDOLIZUMAB et maintien de la réponse 24 24 16 16 16 16 16 0 10 s t n e i t a P 15 13 11 9 7 5 3 1 thérapeutique 32 40 40 40 40 20 32 32 32 30 40 50 Nombre de Semaines 46 VI) Evolution de la CRP CRP et Maladie de CROHN i , ) L / g m P R C ( n e t o r P e v i t c a e R - C 27 40 35 30 25 20 15 10 5 0 18 16 11 S0 (n 43) S14 (n 41) S30 (n 27) S54 (n 15) CRP et RCH 19 19 12 26 40 35 30 25 20 15 10 5 0 i , ) L / g m P R C ( n e t o r P e v i t c a e R - C S0 (n 34) S14 (n 34) S30 (n 30) S54 (n 18) 47 VII) Facteurs prédictifs de réponse au traitement Groupes CROHN et RCH (n 77) Répondeurs précoces Répondeurs tardifs Tous Répondeurs Sexe Nombre de lignes Type de MICI Corticothérapie initiale 0, 23 0, 34 0, 47 0, 78 0, 63 0, 69 0, 64 0, 18 0, 08 0, 68 Optimisation 0, 11 0, 0047 Sexe Nombre de lignes Corticothérapie initiale Optimisation Sexe Nombre de lignes Corticothérapie initiale Optimisation Groupe CROHN (n 43) Répondeurs précoces Répondeurs tardifs Tous Répondeurs 0, 83 0, 12 < 0, 0001 0, 34 0, 61 0, 64 0, 42 0, 067 < 0, 0001 0, 71 0, 19 0, 23 Répondeurs précoces 0, 13 0, 59 0, 0498 0, 0447 Groupe RCH (n 34) Répondeurs tardifs 0, 63 0, 086 0, 84 0, 72 Tous Répondeurs 0, 30 0, 30 0, 0975 0, 11 48 Age moyen (années) Durée moyenne d'évolutivité de la maladie (années) CRP moyenne (mg/L) Age moyen (années) Durée moyenne d'évolutivité de la maladie (années) CRP moyenne (mg/L) Age moyen (années) Durée moyenne d'évolutivité de la maladie (années) CRP moyenne (mg/L) p 0, 15 0, 23 0, 15 p 0, 46 0, 10 0, 58 p 0, 18 0, 83 0, 09 Répondeurs 40 14 12 9 Groupes CROHN et RCH (n 77) Non Répondeurs 45 14 15 10 19 23 25 42 Groupe CROHN (n 43) Non Répondeurs 43 14 20 11 Répondeurs 40 15 14 9 22 26 28 40 Groupe RCH (n 34) Non Répondeurs 46 14 10 5 Répondeurs 40 12 9 7 13 19 . 31 45 49 VIII) Optimisation thérapeutique ) % ( n o i t a s i m i t p O 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 34% 20% 10% 0% CROHN : VEDOLIZUMAB et OPTIMISATION THERAPEUTIQUE 60% 48% 66% 63% 44% 46% 42% 10% 2% 12% 6% 11% 7% S 4 l u e s S I S I S 4 l a t o T S 4 l u e s S I S I S 4 l a t o T S 4 l u e s S I S I S 4 l a t o T S 4 13% S I S 4 l a t o T 6% l u e s S I n 14 n 4 n 1 n 19n 14 n 4 n 2 n 20n 13 n 3 n 2 n 18 n 7 n 1 n 2 n 10 S14 (n 41) S22 (n 33) S30 (n 27) S54 (n 16) 4S toutes les 4 semaines IS Immunosuppresseur Dans le groupe CROHN, 2 patients n'ont pu être inclus dans l'analyse des résultats sur le pourcentage d'optimisation car le traitement par le VEDOLIZUMAB a dû être arrêté devant une nette aggravation clinique. Dès le début de la séquence d'induction, 51% (21/41) des patients ont bénéficié d'une optimisation thérapeutique (16 patients par un rapprochement des perfusions toutes les 4 semaines, 4 patients par l'adjonction initial d'un immunosuppresseur et 1 patient par l'association des deux types d'optimisation). Entre la semaine 14 et la semaine 38, 6 patients supplémentaires ont bénéficié d'une optimisation thérapeutique (4 patients par un rapprochement des perfusions toutes les 4 semaines et 2 patients par l'association des 2 types d'optimisation). Aucun patient n'a été optimisé au-delà de la semaine 38. 50 ) % ( n o i t a s i m i t p O 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% RCH : VEDOLIZUMAB et OPTIMISATION THERAPEUTIQUE 72% 63% 39% 33% 45% 50% 43% 24% 21% 26% 24% 20% S 4 S I S 4 l a t o T S 4 S I S 4 l a t o T S 4 S I S 4 l a t o T S 4 S I S 4 l a t o T n 8 n 7 n 15 n 9 n 8 n 17 n 13 n 6 n 19 n 7 n 6 n 13 S14 (n 34) S22 (n 34) S30 (n 30) S54 (n 18) 4S toutes les 4 semaines IS Immunosuppresseur Dans le groupe RCH, tous les patients ont pu être inclus dans l'analyse des résultats. Tous les patients optimisés l'ont été par le rapprochement des perfusions toutes les 4 semaines ou le rapprochement des perfusions toutes les 4 semaines avec l'ajout d'un immunosuppresseur. 1 seul patient, sans avoir bénéficié d'un rapprochement des perfusions, était déjà traité par un immunosuppresseur (Méthotrexate) dans le cadre d'une sclérose en plaques. Dès le début de la séquence d'induction, 44% (15/34) patients ont bénéficié d'une optimisation thérapeutique (8 patients par un rapprochement des perfusions et 7 patients par l'association des deux types d'optimisation). Entre la semaine 14 et la semaine 38, 8 patients supplémentaires ont été optimisés (6 par un rapprochement des perfusions et 2 par l'association des deux types d'optimisation). Aucun patient n'a été optimisé au-delà de la semaine 38. Chez les 9 patients pour lesquels le traitement par VEDOLIZUMAB a été arrêté, 7 d'entre eux ont été optimisés dès le début de la séquence d'induction, 1 patient à partir de la semaine 26 et 1 patient à partir de la semaine 3. 51 IX) Résultats Endoscopiques Dans le groupe RCH, 16/34 (47%) patients ont été réévalués sur le plan endoscopique après initiation du traitement. 10 patients ont présenté une amélioration endoscopique tandis que 5 patients ont confirmé leur situation d'échec clinique par une mauvaise réponse voire une aggravation du score UCEIS (seul 1 patient, malgré une amélioration endoscopique n'a pas poursuivi son traitement devant un tableau clinique très symptomatique) RCH : RESULTATS ENDOSCOPIQUES S I E C U s e r o c S 3 2 7 7 7 6 5 4 4 4 4 8 6 5 2 6 6 3 S6 S14 S22 S46 S30 AVANT S54 S54 APRES 1 1 S54 S70 S70 RCH : RESULTATS ENDOSCOPIQUES 6 5 S I E C U s e r o c S 8 7 7 7 7 6 4 5 5 4 S14 S18 S30 AVANT S38 APRES S54 S70 52 53 (68, 8%) patients sur un total de 77 ont présenté au moins un effet L'analyse des effets indésirables était effectuée chez tout patient ayant X) Profil de Tolérance bénéficié au minimum d'une injection de VEDOLIZUMAB. indésirable dont 23 (30%) avec au moins un effet indésirable sévère. 1 seul patient (1, 30%) a demandé l'arrêt du traitement du fait du caractère sévère des effets indésirables (arthralgies). durant le traitement. 15 (19, 5%), 9 (11, 7%), 11 (14, 3%) ont respectivement présenté au moins un épisode de rhinopharyngite, bronchite et sinusite. 5 à 6% des patients ont présenté au moins un épisode d'angine, de cystite ou de mycose génitale. progressive concomitant à la mise place du traitement n'a été relevé. 6 patients ont constaté une apparition ou une exacerbation d'arthralgies Aucun diagnostic de cancer ou de leuco-encéphalopathie multifocale Patients avec une Maladie Inflammatoire Intestinale (n 77) Evènements* n (%) Effets Indésirables Arthralgies Manifestations cutanées* Céphalées Alopécie Pyrexie Ballonnement/Flatulences Prurit Crises asthme Pathologie hémorroïdaire (non opérée) Réaction au point d'injection Effets Indésirables sévères* Poussée de la maladie Péricardite aigu Poussée SEP Appendicite aigu Etranglement Stomial Effets Indésirables Infectieux Respiratoire / Pneumologique Rhinopharyngite Bronchite Trachéite ORL Sinusite Angine Infection Dentaire Candidose Buccale Otite 53 6 (8%) 4 (5%) 3 (4%) 3 (4%) 2 (3%) 2 (3%) 1 (1%) 1 (1%) 1 (1%) 1 (1%) 7 (9%) 2 (3%) 1 (1%) 1 (1%) 1 (1%) 15 (19%) 9 (12%) 5 (6%) 11 (14%) 5 (6%) 2 (3%) 2 (3%) 1 (1%) 1 (1%) 3 (4%) 4 (5%) 4 (5%) 1 (1%) 1 (1%) 3 (4%) 2 (3%) 2 (3%) 2 (3%) 1 (1%) 1 (1%) 1 (1%) Grippe / Syndrome Grippal Gastro-Intestinal Gastro-Entérite Aigue Uro-Génital Cystite Mycose Génitale Intertrigo Episclérite Effets Indésirables Infectieux sévères* Infection KTN / PICC-LINE * Colite à Clostridium Difficile Abcès anal Pneumopathie Diverticulite Pyélonéphrite obstructive Tout type de Tumeur / Cancer Urinome *Plusieurs effets indésirables chez un même patient étaient définis en tant qu'évènement séparés * 2 psoriasis, 1 folliculite, 1 érythème noueux * Un effet indésirable sévère était défini par tout effet indésirable ayant conduit à l'arrêt du traitement, une hospitalisation, des séquelles cliniques temporaires ou permanentes, une intervention chirurgicale ou le décès. * Un effet indésirable infectieux sévère était défini par tout effet indésirable infectieux ayant conduit à l'arrêt du traitement, une hospitalisation, des séquelles cliniques temporaires ou permanentes, une intervention chirurgicale ou le décès * 1 infection à S. Epidermidis dans le cadre d'une nutrition parentérale, 1 infection à P. aeruginosa, 1 infection KTN 54 En rejoignant ce qui vient d'être souligné, nous avons évalué les Dans cette étude observationnelle, prospective, nous avons évalué, I) Quels sont les intérêts de cette étude ? DISCUSSION dans des conditions de vie réelles, la prescription et l'utilisation de VEDOLIZUMAB. Ceci est notamment illustré par l'inclusion de patients ne présentant pas les critères d'une MICI active mais traités par VEDOLIZUMAB en raison par exemple d'une réaction de type anaphylactique lors d'une perfusion d'anti-TNF ou encore d'une contre-indication absolue aux anti-TNF (Sclérose en plaques, myélopathie dégénérative). Par ailleurs, bien que le caractère monocentrique limite la puissance et l'extrapolation des résultats obtenus, il permet, à l'inverse, de fournir des données collectées au plus près du patient lors de ses différentes hospitalisations en service traditionnel ou en service d'hôpital de jour. Le faible nombre d'investigateurs dans l'étude a permis d'optimiser au maximum la standardisation du recueil des informations. Un autre intérêt majeur de cette étude est de poursuivre la validation des résultats obtenus concernant la prise en charge thérapeutique des MICI par le VEDOLIZUMAB sur une période prolongée. Cela permet de rechercher, en cas d'obtention de la rémission clinique sans corticoïdes, si cette rémission se maintient au cours du temps, et donc de rechercher un éventuel effet perte de réponse qui est parfois observé en cas de traitement par les anti-TNF. résultats endoscopiques chez les patients atteints de RCH afin de déterminer une corrélation entre les réponses (ou les non-réponses) cliniques et endoscopiques. Afin d'optimiser au mieux la prescription du VEDOLIZUMAB, nous avons cherché à établir des facteurs prédictifs d'une réponse thérapeutique. Dans notre étude, le critère de jugement principal était la rémission clinique sans corticoïdes évaluée aux différents intervalles de perfusion. Ceci se justifie par le risque élevé de corticodépendance et la toxicité relative à la corticothérapie au long cours. Ainsi, la rémission clinique sans corticoïdes est aujourd'hui un des objectifs principaux dans la prise en charge thérapeutique des MICI 54 deux mois à partir de la semaine 6 afin de satisfaire deux objectifs : confirmer l'efficacité réelle mais lente du VEDOLIZUMAB et déterminer s'il existe un maintien de cette efficacité sur le long terme. Dans cette optique, nous nous sommes volontairement écartés des études GEMINI 1 et 2 qui en prenant pour objectif la rémission clinique sans corticoïdes à la semaine 6 ont échoué à mettre en évidence une efficacité thérapeutique significativement supérieure à celle du placebo55 - 56. C'est ainsi, que GEMINI 3, sur la base de l'hypothèse que l'action du VEDOLIZUMAB nécessite un temps supérieur à celui des agents anti TNF pour être réellement efficace, a confirmé la supériorité thérapeutique du VEDOLIZUMAB comparativement au placebo à la semaine 1057. II) Le choix du critère de jugement principal Nous avons choisi d'évaluer le critère de jugement principal tous les 55 III) Le choix des scores d'évaluation clinique Une méta-analyse regroupant trois essais contrôlés randomisés IV) VEDOLIZUMAB et RCH L'étude GEMINI 1 étudiait en tant que critère de jugement principal la Dans notre étude, l'évaluation de l'activité clinique était réalisée par l'utilisation des scores Harvey-Bradshaw pour la maladie de CROHN et le score MAYO Clinique pour la RCH. Bien que le score Harvey-Bradshaw n'ait jamais été validé de manière prospective, il est utilisé dans les essais cliniques et est fortement corrélé au score CDAI dont la complexité d'utilisation est incompatible avec une pratique médicale quotidienne58. Ces deux scores ont récemment été recommandé par un consensus basé sur une revue systématique de la littérature et l'agrément d'un collège de spécialistes des MICI54. Ce consensus précise par ailleurs, les critères définissant la rémission et la réponse clinique pour la maladie de CROHN et la RCH. réponse clinique (définie selon les mêmes modalités que notre étude) à la semaine 6 (la fin du traitement d'induction) et la rémission clinique à la semaine 52. Elle retrouvait respectivement un taux de réponse clinique de 47, 1% à la semaine 6 et un taux de rémission clinique entre 40 et 45% selon l'optimisation ou non du VEDOLIZUMAB à la semaine 5255. concluait à une efficacité significativement supérieure du VEDOLIZUMAB comparativement au placebo en termes de rémission clinique et de réponse clinique à la semaine 659. 36%60. sont supérieurs à ceux que nous avons retrouvés. Plusieurs facteurs peuvent rendre compte de cette différence. Dans l'étude GEMINI 1, environ 40% des patients étaient en échec d'au moins un anti- TNF tandis que plus de 50% des patients de notre cohorte étaient en échec d'au moins 2 anti-TNF, ceci soulignant un profil plus sévère de nos malades. Dans la méta-analyse de Jin et al59, seul un des essais menés par Feagan et al utilisait les mêmes définitions que notre étude concernant la rémission et la réponse clinique. semaine 14 respectivement de 54% et 29% ce qui est similaire à nos propres résultats. Nous notons que cette étude concernait une population en échec d'au moins 2 anti-TNF dans 71% des cas61. 49% et 24% dans la même population à la semaine 1461. 31% à la semaine 14 et de 27% à la semaine 5260. semaines 6 et 10 respectivement de 19% et 29% en incluant les patients naïfs et en échec des anti-TNF57. V) VEDOLIZUMAB et CROHN Shelton et al retrouvait un taux de réponse et de rémission clinique à la Amiot et al concluait à un taux de rémission clinique sans corticoïdes à Amiot et al concluait à un taux de rémission clinique sans corticoïdes à De manière globale, l'ensemble des résultats observés dans ces études Shelton et al retrouvait un taux de réponse et de rémission clinique de L'étude GEMINI 3 retrouvait un taux de rémission clinique aux 56 VI) VEDOLIZUMAB et patients naïfs vis-à-vis des anti-TNF Dans notre étude, 2 patients, du fait de contre-indications absolues aux VII) Le VEDOLIZUMAB sur le long terme Il serait particulièrement intéressant de conduire un essai spécifiquement Ces données pourraient inciter à modifier les modalités de prescription du Ces résultats, similaires à ceux de notre étude, soutiennent l'efficacité du VEDOLIZUMAB dans la prise en charge thérapeutique de la maladie de CROHN. anti-TNF (une sclérose en plaques dans le groupe RCH et une myélopathie dégénérative dans le groupe CROHN), ont bénéficié du VEDOLIZUMAB en 1ère ligne de traitement. On note une rémission clinique sans corticoïdes obtenue à partir de la semaine 22 pour un patient et dès la fin du traitement d'induction (semaine 6) pour le 2e patient. Cette rémission s'est maintenue jusqu'à la semaine 54 (les patients n'avaient pas pu être évalués au-delà lorsque cette étude s'est terminée). Ces résultats soutiennent la supériorité de l'efficacité thérapeutique du VEDOLIZUMAB lorsqu'il est utilisé en tant que 1ère ligne thérapeutique (patients naïfs vis-à-vis des anti-TNF) comparativement aux patients en situation d'échec d'un ou plusieurs anti- TNF62. VEDOLIZUMAB telles qu'elles sont définies aujourd'hui dans le cadre de l'AMM en France. dédié à l'étude du rapport coût- efficacité63 thérapeutique des MICI par le VEDOLIZUMAB, est le maintien sur le long terme de la rémission clinique sans corticoïdes lorsque cette dernière est obtenue. En effet, l'analyse de l'efficacité (et de la tolérance) du VEDOLIZUMAB est limité à de courtes périodes dans la grande majorité des études. Parikh et al ont retrouvé ont retrouvé une efficacité maintenue dans le temps statistiquement significative, sur une période de 600 jours environ64. Amiot et al60 retrouvaient une efficacité soutenue, mais avec une tendance à la baisse à partir de la semaine 52, dans la maladie de CROHN. Dans notre étude, 15 patients dans le groupe CROHN et 18 patients dans le groupe RCH ont été évalués à partir de 54 semaines de traitement. 9/15 (60, 0%) CROHN et 7/18 (38, 9%) RCH ont respectivement atteint la rémission clinique sans corticoïdes. 1 patient (dans le groupe CROHN) a atteint cette rémission à partir de la semaine 62 jusqu'à la semaine 70 et 1 patient (dans le groupe RCH) a présenté 1 perte de réponse à partir de la semaine 30. Il est donc important de noter qu'à l'exception de ce dernier, tous les patients en échec du VEDOLIZUMAB à la semaine 54 sont des patients qui n'ont jamais atteint la rémission clinique sans corticoïdes et ce depuis l'initiation du traitement. A l'inverse, tous les patients répondeurs ont maintenu cette réponse de manière prolongée. Seuls 2 patients (CROHN) ont atteint la rémission clinique tardivement (semaine 46) mais cette rémission s'est maintenue jusqu'à la semaine 70. VEDOLIZUMAB. actuellement l'objet d'un suivi prolongé pour confirmer cette hypothèse65-66. C'est pourquoi, les patients répondeurs des études GEMINI 1, 2 et 3 font Ces résultats soutiennent l'hypothèse d'une efficacité à long terme du Une question majeure, actuellement, dans la prise en charge 57 Nous avons donc volontairement restreint l'étude des résultats VIII) VEDOLIZUMAB et résultats endoscopiques IX) VEDOLIZUMAB et facteurs prédictifs de réponse thérapeutique De par leur complexité d'utilisation en pratique courante, il n'a pas été possible d'étudier la réponse endoscopique au traitement par VEDOLIZUMAB dans le cas de la maladie de CROHN67. endoscopiques aux patients souffrant de RCH. Notre étude montre une corrélation entre la réponse clinique et la réponse endoscopique. A notre connaissance, la réponse endoscopique n'a jamais été évalué dans le cadre d'une MICI traitée par le VEDOLIZUMAB. Seuls deux études menées par Feagan et al évaluaient la réponse endoscopique par l'utilisation du score de BARON et du sous-score MAYO. Ces critères sont actuellement obsolètes en comparaison du score UCEIS, validé, simple d'utilisation, reproductible et fiable68. L'absence de traitement antérieur par anti-TNF est un facteur prédictif d'une réponse thérapeutique plusieurs fois démontrée (Dulai et al69 et Feagan et al70 dans une population RCH, Shelton et al61 dans une population CROHN et RCH et Namita et al71 dans une population pédiatrique CROHN et RCH). En conséquence, et en raison du très faible nombre de patients traités par VEDOLIZUMAB naïfs vis-à- vis des anti-TNF dans notre étude, nous nous sommes intéressés au potentiel prédictif du nombre de lignes antérieures d'anti-TNF. Il n'existe pas d'influence de ce nombre de lignes dans la réponse thérapeutique au VEDOLIZUMAB. féminin, l'âge du patient et la durée d'évolutivité de la MICI ne possèdent pas d'influence sur la réponse thérapeutique dans notre étude. thérapeutique obtenue à la semaine 6 (la fin du traitement d'induction) sont associées à une meilleure réponse, ceci ayant été plusieurs fois démontré dans l'étude de Amiot et al60, Dulai et al69 et Shelton et al61. Ces facteurs n'ont donc pas fait l'objet d'une étude de notre part. Dans notre étude, les patients répondeurs ont une CRP moyenne plus basse que les patients non répondeurs mais de manière non significative. Amiot et al60 concluent à un taux de CRP supérieure à 20 mg/L comme étant un facteur prédictif d'une réponse thérapeutique à la semaine 14 de manière significative dans la RCH mais pas dans la maladie de CROHN. Et à l'inverse, Shelton et al61 retrouvent une plus faible probabilité de rémission en cas de CRP initiale supérieure à 8mg/L dans les deux types de MICI. Devant ces résultats, il est donc pour l'instant impossible de conclure sur l'utilisation de la CRP pour monitorer et prédire le devenir des patients. à l'induction du traitement, les résultats sont contradictoires. 2 études s'y sont intéressés. Amiot et al60 concluent à une réponse thérapeutique significativement supérieure chez les patients sans corticoïdes au début de la phase d'induction du VEDOLIZUMAB. Shelton et al61 à l'inverse, ne retrouvent pas le caractère prédictif de ce facteur. Dans notre étude, l'absence de corticothérapie à la phase d'induction dans le groupe CROHN et RCH et les sous-groupes individualisés CROHN et RCH est, de manière significative, un facteur prédictif d'une réponse au traitement. Concernant le rôle prédictif de la présence ou non d'une corticothérapie De manière similaire à l'étude de Shelton et al61, le sexe masculin ou Un faible score d'activité de la maladie à l'induction et une réponse 58 De manière générale, notre étude confirme l'excellent profil de XI) VEDOLIZUMAB et Grossesse X) VEDOLIZUMAB et Tolérance L'étude GEMINI 3 retrouvait 56% d'effets indésirables, 6% d'effets Enfin, il importe de souligner l'influence de l'optimisation thérapeutique, qui, de manière significative, est aussi, dans notre étude, un facteur prédictif d'une réponse au VEDOLIZUMAB sur la totalité des patients étudiés. A notre connaissance, il n'a pas encore été étudié l'influence de cette optimisation dans l'obtention d'un meilleur taux de rémission clinique sans corticoïdes. indésirables définis comme sévères et 2 % d'arrêt du traitement du fait d'effets indésirables jugés trop importants dans le groupe VEDOLIZUMAB , sans différence significative par rapport au groupe placebo 57. Le taux global d'effets indésirables et le taux d'arrêt du traitement sont assez similaires à ceux de notre étude. La principale différence concerne le taux d'effets indésirables définis comme sévères qui sont sensiblement plus élevés dans nos résultats. Toutefois, le mécanisme d'action du VEDOLIZUMAB ne plaide pas en faveur d'une faveur relation causale. En effet, l'hyper sélectivité digestive de ce traitement rend peu probable son imputabilité dans la survenue d'une pyélonéphrite, d'une péricardite aigu, ou d'une poussée de sclérose en plaques 72-73 tolérance du VEDOLIZUMAB. Les principaux effets secondaires, surtout de nature infectieuse respiratoire et ORL, sont très majoritairement bénins. Notre expérience personnelle a montré qu'en cas de survenue d'un épisode infectieux, une simple consultation téléphonique ou chez le médecin généraliste suffisait dans la très grande majorité des cas à traiter efficacement cette complication. de la confirmation de sa grossesse. n'est pas clairement identifié mais la demi-vie est de 25, 5 jours chez les patients non parturientes. De manière similaire aux autres immunoglobulines G, l'hypothèse actuelle est celle d'une augmentation linéaire de la concentration placentaire du VEDOLIZUMAB durant la grossesse. patientes traitées par le VEDOLIZUMAB, 11 patientes ont donné naissance à un bébé en bonne santé. 2 accouchements prématurés ont été rapportés dont 1 cas chez une patiente avec des antécédents de prématurité. 1 enfant est né avec malformation neurologique congénitale : toutefois, l'intégrine 47 n'était que faiblement inhibé au moment de l'organogénèse de la structure neurologique. avaient un antécédent d'avortement spontané)74. Le Groupe d'Etude Thérapeutique des Affections Inflammatoire du Tube Digestif (GETAID) précise que les données scientifiques concernant l'usage du VEDOLIZUMAB en période de procréation ou chez la femme enceinte sont très limitées. Il est donc recommandé d'utiliser une méthode efficace de contraception pendant le traitement chez toute femme en âge de procréer. Toutefois, les études effectuées chez l'animal n'ont pas mis en évidence d'effets néfastes sur la reproduction et sur le développement fœtal. Par précaution, compte-tenu du nombre Enfin, 4 patientes ont présenté un avortement spontané (3 de ces patientes Une patiente (dans le groupe RCH) a dû arrêter le VEDOLIZUMAB lors Dubinski et al ont regroupé les résultats de 6 essais cliniques. Sur 24 Le profil pharmacocinétique du VEDOLIZUMAB durant la grossesse 59 Notre étude confirme l'efficacité et l'excellent profil de tolérance du Ces résultats sont à mettre en parallèle avec l'étude de Sandborn et très limité de cas rapportés, il faut éviter d'utiliser le VEDOLIZUMAB durant la grossesse. CONCLUSION VEDOLIZUMAB dans une population de MICI majoritairement sévères, moyennant une optimisation thérapeutique par rapprochement des perfusions ou ajout d'un immunosuppresseur. Nous avons pu montrer le maintien de la rémission, lorsque cette dernière est obtenue, sur plus d'un an de suivi ainsi que la corrélation entre les réponses (ou l'absence de réponse) clinique et endoscopiques dans la population RCH. al75 qui, dans une population de patients RCH, ont établi qu'une rémission complète (clinico-endoscopique) sous VEDOLIZUMAB améliore significativement le pronostic et la qualité de vie des malades. Les principales limites de notre étude sont l'absence de groupe contrôle, le faible nombre de patients évalués à un an de suivi et le caractère monocentrique des résultats. thérapeutique à part entière dans la prise en charge des maladies inflammatoires du tube digestif. Son efficacité démontrée même dans des populations de patients présentant un profil de maladie sévère et son profil de tolérance ont justifié son intégration de manière quasi-consensuelle dans les algorithmes de prise en charge des RCH et des maladies de CROHN, élaborés par un collège national français de gastro-entérologues spécialistes des MICI. l'arsenal thérapeutique des MICI s'enrichit encore par le VEDOLIZUMAB, particulièrement chez les patients en situation d'échec des anti-TNF. De plus, les perspectives thérapeutiques à venir grâce à l'arrivée de nouvelles molécules dont l'efficacité semble prometteuse représente un espoir réel de transformer significativement le pronostic et surtout la qualité de vie de patients de plus en plus nombreux76-77-78-79-80 Déjà transformé par l'arrivée des anti-TNF dans les années 90, Actuellement, le VEDOLIZUMAB représente une nouvelle arme 60 REFERENCES 1. Karreman MC, Luime JJ, Hazes JM, Weel AE The Prevalence and Incidence of Axial and Peripheral Spondyloarthritis in Inflammatory Bowel Disease : A Systematic Review and Meta-analysis. 2016 J Crohns Colitis. 2016 Nov 4. pii : jjw199. 2. Vavricka SR1, Schoepfer A, Scharl M, Lakatos PL, Navarini A, Rogler G. Extraintestinal Manifestations of Inflammatory Bowel Disease Inflamm Bowel Dis. 2015 Aug ; 21(8) : 1982-92. doi : 10. 1097 3. Thomas AS1, Lin P Ocular manifestations of inflammatory bowel disease. Curr Opin Ophthalmol. 2016 Nov ; 27(6) : 552-560 4. 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Lasch Effects of vedolizumab on health-related quality of life in patients with ulcerative colitis : results from the randomised GEMINI 1 trial 71. Namita Singh MD, Shervin Rabizadeh MD, MBA, Jacqueline Jossen MD, Nanci Pittman MD, Morgan Check MSN, Ghonche Hashemi MSN, Becky L Phan BS, Jeffrey Multi-Center Experience of Vedolizumab Effectiveness in Pediatric Inflammatory Bowel Disease 72. Feagan BG, Greenberg GR, Wild G, et al. Treatment of ulcerative colitis with a humanized antibody to the alpha4beta7 integrin. N Engl J Med 2005 ; 352 : 2499507. 65 73. Fiorino G, Correale C, Fries W, et al. Leukocyte traffic control : a novel therapeutic strategy for inflammatory bowel disease. Expert Rev. Clin. Immunol. 2010 ; 6 : 567 572. 74. Marla Dubinsky ; Uma Mahadevan ; Severine Vermeire ; Brihad Abhyankar ; Karen Lasch Vedolizumab Exposure in Pregnancy : Outcomes From Clinical Studies in Inflammatory Bowel Disease 75. W. Sandborn*1, J. -F. Colombel2, R. Panaccione3, K. Lasch4, R. Mody5, A. Green6, B. Abhyankar7 Deep remission as a predictor of clinical outcomes in vedolizumab- treated patients with ulcerative colitis 76. William J. Sandborn, M. D. , Christopher Gasink, M. D et al. for the CERTIFI Study Group : Ustekinumab Induction and Maintenance Therapy in Refractory Crohn's Disease 77. Jacqueline M Benson, David Perritt, Bernard J Scallon et al. Discovery and mechanism of ustekinumab, a human monoclonal antibody targeting interleukin-12 and interleukin-23 for treatment of immune-mediated disorders MAbs. 2011 Nov- Dec : 3(6) : 535-545 78. Sandborn WJ1, Ghosh S2, Panes J3, Vranic I4, Wang W5, Niezychowski W6 ; Study A3921043 Investigators. A phase 2 study of tofacitinib, an oral Janus kinase inhibitor, in patients with Crohn's disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 2014 Sep ; 12(9) : 1485- 93. e2. doi : 10. 1016/j. cgh. 2014. 01. 029. Epub 2014 Jan 27. 79. Lopez J1, Grinspan A1. Fecal Microbiota Transplantation for Inflammatory Bowel Disease. Gastroenterol Hepatol (N Y). 2016 Jun ; 12(6) : 374-9. 80. Sandborn WJ, Feagan BG et al. Ozanimod Induction and Maintenance Treatment for Ulcerative Colitis. N Engl J Med. 2016 May 5 ; 374(18) : 1754-62. doi : 10. 1056/NEJMoa1513248. 66 LISTE DES ABREVIATIONS MICI : Maladie Inflammatoire Chronique Intestinale MC : Maladie de CROHN, RCH : Recto-Colite Hémorragique NK : Natural Killer , LT : Lymphocytes T TNF : Tumor Necrosis Factor alpha , 5-ASA : Acide 5-Aminosalicylique CRP : C-Reactive Protein ASAT/ALAT : Aspartate Amino Transferase / Alanine Amino Transferase CMV : Cytomégalovirus PCR : Réaction en chane par Polymérase CDEIS : CROHN's Disease Endoscopic Index of Severity UCEIS : Ulcerative Colitis Endoscopic Index of Severity MAdCAM-1 : molécule-1 d'adhérence cellulaire d'adressine de muqueuse IgG : Immunoglobuline G CDR : complementary-determing regions AMM : Autorisation de Mise sur le Marché S : semaine VHB : virus de l'hépatite B, VHC : virus de l'hépatite C, VIH : virus de l'immunodéficience humaine, VZV : virus Varicelle-Zona, HSV : Herpes Virus Simplex, DTPolio : Diphtérie Tétanos Poliomyélite, BCG : Bacille Camille Guérin Ac : Anticorps, Ag : Antigène NYHA : New York Heart Association HB : Harvey-Bradshaw 4S : toutes les 4 semaines, IS : Immunosuppresseur SEP : Sclérose en Plaques KTN : Cathéter Nutritionnel ORL : Oto-Rhino-Laryngologique 67 Nous avons évalué l'efficacité, la tolérance et les modalités d'utilisation du Le VEDOLIZUMAB est une biothérapie, récemment validée, dans la prise en RESUME Introduction charge thérapeutique des MICI. Ce traitement nécessite toutefois des données complémentaires, particulièrement sur le long terme, en rapport avec son utilisation en pratique courante, afin de préciser sa place dans l'arsenal thérapeutique. VEDOLIZUMAB dans le traitement de la maladie de CROHN et de la RCH. Méthodes patients traités par le VEDOLIZUMAB au CHU de Nice étaient inclus. Le VEDOLIZUMAB était administré aux semaines 0, 2 et 6 (schéma d'attaque ) puis toutes les 8 semaines (schéma d'entretien ). Le médecin référent était libre d'optimiser le traitement par le rapprochement des perfusions toutes les quatre semaines et/ou l'ajout d'un immunosuppresseur. L'évaluation portait sur l'efficacité et la survenue d'effets secondaires, à court et à long terme ainsi que les modalités de prescription du VEDOLIZUMAB. Résultats de suivi de 6 mois. Plus de 50% des patients étaient en échec de 2 anti-TNF. Environ 30 à 40% des patients ont atteint la rémission clinique sans corticoïdes à court et à long terme. Un seul patient sur la totalité des répondeurs a été en perte de réponse. L'optimisation thérapeutique et l'absence de corticothérapie à l'induction du traitement étaient significativement associées à une plus grande probabilité de réponse. Aucun autre facteur prédictif d'une réponse thérapeutique n'a pu être mis en évidence. 45% des patients étaient optimisés à la fin de la séquence d'induction et plus de 60% à plus long terme. 30% des patients ont présenté un effet indésirable défini comme sévère mais seul l'un d'entre eux a conduit à l'arrêt du traitement. Conclusion VEDOLIZUMAB avec un profil de tolérance satisfaisant, moyennant une optimisation précoce du traitement, dans une population de patients souffrant d'une MICI souvent sévère. Ces résultats soutiennent l'efficacité à court et à plus long terme du Il s'agissait d'une étude prospective, unicentrique et observationnelle. Tous les 77 patients (43 CROHN et 34 RCH) ont été inclus avec une durée minimale 68 SERMENT D'HIPPOCRATE Au moment d'être admis à exercer la médecine, je promets et je jure d'être fidèle aux lois de l'honneur et de la probité. Mon premier souci sera de rétablir, de préserver ou de promouvoir la santé dans tous ses éléments, physiques et mentaux, individuels et sociaux. Je respecterai toutes les personnes, leur autonomie et leur volonté, sans aucune discrimination selon leur état ou leurs convictions. J'interviendrai pour les protéger si elles sont affaiblies, vulnérables ou menacées dans leur intégrité ou leur dignité. Même sous la contrainte, je ne ferai pas usage de mes connaissances contre les lois de l'humanité. J'informerai les patients des décisions envisagées, de leurs raisons et de leurs conséquences. Je ne tromperai jamais leur confiance et n'exploiterai pas le pouvoir hérité des circonstances pour forcer les consciences. Je donnerai mes soins à l'indigent et à quiconque me les demandera. Je ne me laisserai pas influencer par la soif du gain ou la recherche de la gloire. Admis dans l'intimité des personnes, je tairai les secrets qui me seront confiés. Reçu à l'intérieur des maisons, je respecterai les secrets des foyers et ma conduite ne servira pas à corrompre les mœurs. Je ferai tout pour soulager les souffrances. Je ne prolongerai pas abusivement les agonies. Je ne provoquerai jamais la mort délibérément. Je préserverai l'indépendance nécessaire à l'accomplissement de ma mission. Je n'entreprendrai rien qui dépasse mes compétences. Je les entretiendrai et les perfectionnerai pour assurer au mieux les services qui me seront demandés. J'apporterai mon aide à mes confrères ainsi qu'à leurs familles dans l'adversité. Que les hommes et mes confrères m'accordent leur estime si je suis fidèle à mes promesses ; que je sois déshonoré et méprisé si j'y manque. 69 | HAL | Scientific |
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Le monoxyde de carbone Le monoxyde de carbone (CO) est un composé volatile qui s'échappe dans la fumée de tabac lors d'une combustion incomplète des substances organiques Il est rapidement absorbé par les alvéoles pulmonaires et se lie de façon réversi-ble à l'hémoglobine avec une affinité 200 fois supérieure à celle de l'oxygène pour former la carboxyhémoglobine L'hémoglobine foetale possède une capacité de fixation du CO très largement supérieure à celle de l'hémoglobine Le CO se fixe également sur la myoglobine des cellules musculaires à la place de l'O 2 , réduisant ainsi la performance musculaire, notamment celle du muscle cardiaque Il est possible de doser dans le sang le CO lié à l'hémo-globine Le seuil de positivité pour le tabagisme actif est alors fixé à 1, 7 % La carboxyhémoglobinémie (HbCO) est très bien corrélée chez les fumeurs avec le taux de CO éliminé dans l'air expiré Dans la pratique courante, il est très facile d'utiliser un analyseur de CO : ces petits appareils portables, de prix maintenant abordable, mesurent le CO par méthode électrochimique et expriment la valeur en ppm Une standardisation des conditions de mesure du CO dans l'air expiré est indispensable pour permettre une interprétation fiable des résultats (Tableau 1) La demi-vie du CO est courte (2 à 5 heures), il s'agit donc d'un marqueur de l'imprégnation tabagique des quelques heures précédant la mesure : les valeurs seront normalisées une dizaine d'heures après la dernière cigarette Le taux de CO dans l'air expiré reflète l'importance de l'inhalation de la fumée de tabac, c'est-à-dire également la quantité absorbée de nicotine et de multiples toxiques Les valeurs seuils communément admises sont les suivantes : taux & ; gt ; 10 ppm : fumeur taux & ; lt ; 5 ppm : non-fumeur En cas de taux compris entre 5 et 10 ppm, il est conseillé de revoir avec le patient le contexte tabagique et de rechercher une autre cause de l'élévation de CO (air ambiant ou interférence analytique) Le choix de la valeur seuil de positivité fait l'objet de discussions : pour I Berlin et al. , le meilleur couple sensibilité/ spécificité est obtenu pour un seuil de CO dans l'air expiré fixé à 8 ppm En effet, le taux de faux négatifs (fumeurs considérés à tort comme abstinents) est presque deux fois plus élevé lorsque l'on prend une valeur seuil de CO à 10 ppm plutôt qu'à 8 ppm : 12, 1 % avec un seuil de CO à 10 ppm contre 7, 1 % avec un seuil de CO à 8 ppm Dans un travail récent, nous avons également constaté que le seuil de 8 ppm apportait le meilleur rapport sensiblitité/spécificité Il est important de tenir compte d'un certain nombre de limites dans l'interprétation des résultats de ce dosage : la présence de CO dans l'air ambiant n'est pas spécifi-que de la fumée de tabac puisqu'il est produit par des appareils de chauffage défectueux ou à tirage insuffisant, lors de fuites dans des chauffe-eau, dans les gaz d'échappement, lors d'incendies Il est présent dans les locaux pollués et les pièces enfumées ; la quantité de CO éliminé dans l'air expiré est modifiée par l'état du sujet Ainsi, la valeur du CO dans l'air expiré n'est pas interprétable chez l'insuffisant respiratoire chronique chez lequel il donne des chiffres anormalement bas en raison du défaut d'échange entre le CO sanguin et le CO alvéolaire lié à l'existence d'un volume résiduel important Il en est de même chez les patients atteints d'emphysème chez qui un résultat mesuré de CO dans l'air expiré est en réalité associé à une valeur plus élevée de COHb que chez le sujet sain du fait de la mauvaise diffusion du CO du sang vers les alvéoles pulmonaires L'hyperventilation due par exemple à l'exercice physique entrane une baisse des concentrations en CO dans l'air alvéolaire À l'inverse, l'hypoventilation présente lors du sommeil réduit l'élimination respiratoire du CO Enfin, il peut exister des interférences analytiques : faux-positifs liés à l'hydrogène présent dans l'air expiré, notamment avec les appareils les plus anciens, chez les sujets intolérants au lactose ou en cas de production de gaz intestinaux liée au polyol et à l'isomalt contenu dans certains produits ; faux-positifs liés à l'alcool présent dans l'air expiré en cas de saturation de la membrane qui devient de moins en moins sélective avec le temps Tableau 1 Standardisation de la mesure du CO dans l'air expiré Réaliser la mesure au moins une demi-heure après la dernière cigarette Noter l'écart de temps entre le dosage du CO et la dernière cigarette et prendre en compte ce délai dans l'interprétation du résultat Vérifier le zéro de l'appareil : mesurer la valeur de l'air ambiant ou faire le zéro automatique Faire une inspiration profonde, bloquer la respiration 15 secondes puis expirer de façon lente et la plus prolongée possible à travers l'appareil Attendre la stabilisation de l'appareil avant de noter la valeur en retranchant la valeur du zéro à la mesure En cas de mesures successives, attendre le retour à zéro de l'appareil ce qui nécessite environ une à deux minutes N. B : Il est nécessaire d'être vigilant sur le respect des précautions d'hygiène lors de la manipulation de l'embout buccal et le respect strict de l'utilisation de l'embout en usage unique Les thiocyanates Ce sont des produits de détoxification des cyanures et des composés cyanogènes Ils sont produits à partir du cyanure d'hydrogène et des nitriles formés lors de la combustion de tabac Ils sont métabolisés pour la plus grande partie par la thiosulfate sulfure transférase ou rhodanèse, enzyme localisée principalement dans les mitochondries hépatiques Leur demi-vie d'élimination est de 10 à 14 jours Les thiocyanates sont excrétés dans la salive, la sueur et les urines Cette élimination rénale très lente s'accompagne d'une réabsorp-tion plus importante chez les fumeurs Chez les fumeurs et les non-fumeurs, la concentration en thiocyanates est plus élevée dans la salive (du fait d'une sécrétion active) puis dans les urines et enfin dans le sérum Les thiocyanates peuvent être dosés dans tous les milieux biologiques par une méthode colorimétrique simple et peu coûteuse fondée sur la formation en milieu acide d'un complexe coloré avec les ions ferriques (absorption à 460 nm) décrite par Bowler et adaptée par Densen Différentes études ont montré la très faible sensibilité et le manque de spécificité de ce marqueur ainsi que l'absence de corrélation significative entre les concentrations sériques, salivaires et urinaires On observe une très grande dispersion des résultats aussi bien pour les fumeurs que pour les non-fumeurs avec des coefficients de variation de 40 % Dans une étude personnelle, nous avons constaté l'impossibilité de fixer un seuil entre les valeurs trouvées chez les fumeurs et chez les non-fumeurs Foss et Lund-Larsen décri-vent également un recouvrement des concentrations chez les sujets non-fumeurs et les fumeurs réguliers de moins de dix cigarettes par jour ne permettant en aucun cas l'utilisation des thiocyanates pour l'étude du tabagisme passif et la discrimination des petits fumeurs Par ailleurs, les valeurs moyennes mesurées dans les différents groupes de patients diffèrent d'une étude à l'autre de façon importante Dans ce contexte, il est très difficile de définir des valeurs seuils de positivité Le seuil le plus fréquemment utilisé pour les thiocyanates plasmatiques est de 78-84 mol/L Une autre limite à l'interprétation du dosage des thiocyanates plasmatiques, urinaires ou salivaires est l'existence d'interférences avec les thiocyanates produits à partir de nitriles et autres composés cyanogènes d'origine médica-menteuse ou industrielle et surtout alimentaire, tels le chou, le brocoli, le radis, le manioc, le millet, le maïs, les amandes, ou encore le navet Cependant les habitudes alimentaires européennes ne semblent pas influencer significativement les concentrations salivaires de thiocyanates L'intérêt mis en avant pour le dosage des thiocyanates a été leur longue demi-vie d'élimination La normalisation des taux se fait plusieurs semaines après l'arrêt du tabac, donc de façon plus lente que celle des métabolites de la nicotine Les thiocyanates pourraient ainsi être considérés comme un marqueur du tabagisme des deux à trois semaines précédentes Cependant, du fait de leur manque de spécificité et de sensibilité, ils ont perdu leur intérêt comme marqueur du tabagisme et surtout pour le tabagisme passif Marqueurs spécifiques : nicotine, cotinine et autres métabolites de la nicotine La nicotine est un alcaloïde présent dans la feuille de tabac (10 à 20 mg de nicotine par gramme de tabac séché) Lors de la combustion, elle est retrouvée dans la fumée de tabac, sous forme gazeuse dans le courant principal et sous forme particulaire dans le courant latéral Liposoluble, elle est très rapidement résorbée par diffusion dans les alvéoles pulmonaires Une faible partie est éliminée sans métabolisation dans les urines mais la majeure partie est métabolisée dans le foie par le cytochrome P-450 2A6 et par l'aldéhyde oxydase en divers métabolites dont la cotinine, le nicotine-glucuronide et le nicotine N-oxyde Le taux de conversion de la nicotine en cotinine est d'environ 72 % mais ce taux présente de grandes variations individuelles (de 55 à 92 %) La cotinine est à son tour métabolisée en cotinine-glucuronide, trans-hydroxycotinine et trans-hydroxycotinine glucuronide , la plupart de ces métabolites pouvant être dosés dans les urines Contrairement à certaines idées reçues, il n'existe pas de métabolisme accéléré de la nicotine pouvant expliquer la tolérance et l'escalade de dose observées chez les fumeurs Le métabolisme est identique lorsque la nicotine est absorbée par voie transdermique En revanche, l'insuffisance hépatique est responsable d'une diminution de méta-bolisation de la nicotine et l'insuffisance rénale d'une diminution de l'élimination urinaire des métabolites Il peut exister un apport alimentaire de nicotine à partir de solanacées (tomates, pommes de terre, thé noir. ) mais les quantités sont environ 10 000 fois inférieures à celles présentes dans la fumée de tabac La nicotine et la cotinine se retrouvent dans le plasma, les urines, le lait maternel, la salive, les cheveux, la sueur Chez le fumeur inhalant, le dosage sanguin de la nicotine met en évidence un pic précoce et transitoire de l'ordre de 20 à 40 ng/ml Sa demi-vie est très courte, de 0, 5 à 2 heures La nicotine étant une molécule basique, son excrétion salivaire ou urinaire est fortement dépendante de faibles variations de pH Dans les urines, si le pH est supérieur à 7, la nicotine est sous forme basique, non ionisée, liposoluble et est donc réabsorbée par le tubule rénal À un pH inférieur à 7, elle est sous forme ionisée, non liposoluble et son élimination urinaire est augmentée Les fluctuations plasmatiques liées à la brièveté de sa demi-vie et la variation de l'élimina-tion urinaire en fonction du pH font que le dosage de la nicotine n'est pas le marqueur de choix de l'imprégnation tabagique La cotinine est le marqueur le plus couramment utilisé En effet, la cotinine est lentement éliminée de l'organisme : sa demi-vie varie entre 10 et 37 heures en fonction des sujets et son dosage reflète l'imprégnation tabagique des deux ou trois jours précédents De plus, la cotinine étant une base beaucoup plus faible que la nicotine, les concentrations salivaires ou urinaires sont beaucoup moins dépendantes du pH La cotinine sérique ou plasmatique est considérée comme le meilleur indicateur du niveau d'intoxication tabagique et son taux dans ces milieux biologiques est significativement corrélé à la quantité totale de nicotine absorbée (respectivement : r 0, 82 et p & ; lt ; 0, 001 ; r 0, 919 et p & ; lt ; 0, 0001 ) et plus faiblement au nombre de cigarettes fumées quotidiennement (r 0, 44 ; p 0, 05 pour la cotinine plasmatique) La cotinine salivaire est également un reflet fidèle des apports nicotiniques : un taux de 100 ng/ml de cotinine salivaire correspond en moyenne à un apport de 8 à 12 mg par jour de nicotine La cotinine est un marqueur de l'abstinence tabagique avec une sensibilité de 96-97 % et une spécificité de 99-100 % pour la distinction fumeur/non-fumeur Il est à noter que l'ethnie du patient est à l'origine de différences significatives dans les taux sériques ou salivaires moyens de cotinine en fonction du nombre de cigarettes fumées par jour et que les taux plasmatiques de cotinine varient au cours de la journée chez le fumeur régulier avec un écart moyen de 30 % entre le pic et la vallée Personnellement, nous utilisons le dosage urinaire en raison de son recueil facile et non invasif et des faibles variations du taux de cotinine urinaire au cours du nycthémère Afin de pallier aux variations individuelles de diurèse, il faut établir le rapport cotinine urinaire (en mol/L) sur créatinine urinaire (en mmol/L) Ceci permet de suivre les résultats successifs d'un patient avant et tout au long de son sevrage Cet ajustement des taux de cotinine urinaire à la créatinine urinaire améliore la relation entre cotinine urinaire et cotinine sérique chez le fumeur Bruckert et al ont montré une corrélation (faible) entre les concentrations de cotinine urinaire et le nombre de cigarettes par jour même si d'autres auteurs montrent que la relation entre nombre de cigarettes fumées et concentration en cotinine urinaire cesse d'être linéaire pour tendre vers un plateau à partir de 25 cigarettes par jour La nicotine ou ses métabolites peuvent être dosés dans les liquides biologiques par des méthodes colorimétriques, immunologiques et chromatographiques Il est important de distinguer les méthodes globales dosant l'ensemble des mé-tabolites nicotiniques des méthodes spécifiques de dosage de l'un des composés Quelle que soit la technique utilisée, les prélèvements doivent être conservés au frais afin d'éviter la formation de cotinine hors de l'organisme par déconjugaison du cotinine-glucuronide La méthode colorimétrique Cette Cette méthode permet de doser l'ensemble des métaboli-tes urinaires de la nicotine, exprimés en équivalents cotinine , à l'exception du nicotine-glucuronide et du cotinineglucuronide Cette technique est simple, rapide, peu coûteuse et facilement automatisable Sur le plan toxicologique, la corrélation avec le pouvoir mutagène des urines est meilleure pour les taux obtenus par la méthode de dosage globale par colorimétrie que pour ceux obtenus par des méthodes de dosage plus spécifiques Le principal inconvénient de cette méthode est le seuil de sensibilité de 1250 ng/ml ne permettant son utilisation ni pour l'évaluation du tabagisme occasionnel ou faible ni pour la détection d'un tabagisme passif La littérature montre une bonne corrélation entre le dosage colorimétrique et le dosage spécifique de la cotinine urinaire par HPLC, avec un facteur d'environ 13 entre les deux résultats Une variante de cette méthode utilisant l'acide diéthyl-thiobarbiturique a également été décrite Les méthodes de dosage spécifiques sont de deux types : les méthodes immunologiques et les méthodes chromatographiques Les méthodes immunologiques Test RIA (Radio Immuno Assay) Cette technique utilise un principe de compétition vis-à-vis de leurs anticorps spécifiques entre la nicotine ou la cotinine présentes dans le sérum ou l'urine et une quantité donnée de nicotine ou cotinine marquée par un radio-isotope Dans la technique originale de Langone et al , la gamme d'étalonnage va de 0, 5 à 50 ng/ml pour la nicotine et de 0, 2 à 20 ng/ml pour la cotinine L'inconvénient principal est la réactivité croisée des anticorps anti-nicotine et anti-cotinine avec la trans 3'OHcotinine et le cotinine-glucuronide Test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Le dosage se fait dans des plaques dont les puits sont recouverts de cotinine Un anticorps anti-cotinine est ajouté aux puits ainsi que l'échantillon à tester L'anticorps n'ayant pas réagi avec la cotinine de l'échantillon se lie avec la cotinine fixée dans le puits Une technique analogue existe pour la nicotine Après lavage de la plaque, la quantité d'anticorps lié au puits est révélée par l'ajout d'un second anticorps lié à une peroxydase (lecture à 490 nm) Bjercke et al. , par cette méthode de dosage, décrivent une limite de détection de 5 ng/ml pour la nicotine et de 2 ng/ml pour la cotinine dans la salive Mais cette technique a également été utilisée pour le dosage de cotininurie, avec un seuil de détection à 5 ng/ml Cette méthode est simple, rapide, sensible et spécifique mais coûteuse en réactifs Test EIA (Enzyme Immuno Assay) Cette technique de dosage utilise des réactifs liquides prêts à l'emploi ; elle est fondée sur une réaction de compé-tition entre la cotinine marquée par une enzyme et fournie dans le kit et la cotinine présente dans l'échantillon vis-à-vis d'un anticorps spécifique de la cotinine C'est une méthode simple, généralement automatisable mais coûteuse en réac-tifs Quatre kits existent actuellement mais aucun n'a encore obtenu le marquage CE Ces kits diffèrent par les composés dosés (cotinine et éventuellement certains métabolites de la nicotine), l'enzyme utilisée pour le marquage, la possibilité de réaliser des dosages quantitatifs ou des évaluations qualitatives, leur spécificité et sensibilité (Tableau 2) L'inconvé-nient majeur de ces techniques est de se situer dans un domaine de mesure de faibles concentrations, ce qui impose d'effectuer des dilutions des échantillons biologiques pour les fumeurs fortement dépendants ou traités par des doses fortes de nicotine Inversement pour les très faibles concentrations, une technique de concentration des urines sur microcolonnes a été décrite pour augmenter la sensibilité du dosage : un seuil de quantification de 1 ng/ml a ainsi pu être obtenu, permettant l'utilisation de cette technique pour l'exploration du tabagisme passif Après une extraction solide/liquide et migration sur couche mince, la détection est faite par densitométrie Elle est utilisable pour des concentrations de cotinine et de nicotine comprises entre 50 et 200 ng/ml, ce qui en fait une technique très sensible permettant de quantifier des expositions passives à la fumée de tabac Cependant les dosages en chromatographie couche mince sont peu souvent réalisés par les laboratoires car ils sont longs à mettre en oeuvre et nécessitent une prise d'essai importante Chromatographie gazeuse (CPG) Cette méthode permet le dosage de la nicotine et de la cotinine dans le sérum et dans l'urine Deux types d'extraction ont été décrits : extraction liquide/liquide avec une limite de détection à 0, 16 ng/ml et extraction liquide/solide avec une limite de détection à 2 ng/ml La détection est le plus souvent couplée à la spectrométrie de masse (MS), pour un dosage sensible et spécifique La mise en oeuvre de cette méthode est simple mais très coûteuse Chromatographie liquide haute performance (HPLC) C'est la technique de référence car elle est très sensible et spécifique Cependant, elle est coûteuse en temps de personnel et nécessite un appareillage spécialisé Elle permet le dosage simultané et spécifique dans le sérum ou l'urine de la nicotine, de la cotinine et, selon les techniques, d'autres métabolites comme la trans-3'-hydroxycotinine, le cotinine-N-oxyde et la norcotinine La technique originale utilise une chromatographie en phase inverse avec formation de paires d'ions et détection UV Des interférences analytiques existent notamment avec la caféine mais celles-ci peuvent être éliminées en modifiant les conditions de chromatographie La limite de détection est de 10 ng/ml pour la nicotine et la cotinine dans l'urine et peut descendre jusqu'à 5 ng/ml pour la cotinine sérique Une étude récente réalisée par les membres du groupe de travail mixte Société Française de Biologie Clinique et Société Française de Toxicologie Analytique a permis d'établir des recommandations pour le dosage de la cotininurie par chromatographie liquide couplée à la détection UV après comparaison de différents protocoles Les auteurs décri-vent une gamme de mesure de 150-2500 ng/ml pour le tabagisme actif (simple extraction liquide/liquide en milieu alcalin) et de 0-200 ng/ml pour le tabagisme passif (avec réextraction en milieu acide) Une méthode d'extraction en phase solide a également été décrite pour le dosage de la nicotine, de la cotinine et de la trans-3'-hydroxycotinine dans l'urine Il s'agit d'une technique rapide et fiable qui peut s'appliquer à des échan-tillons provenant aussi bien de fumeurs actifs que passifs Avec ce type d'extraction, Oddoze et al obtiennent une limite de quantification de 0, 5 ng/ml pour la cotinine et 5 ng/ml pour la nicotine Enfin, Tuomi et al ont utilisé une technique HPLC couplée à la spectrométrie de masse pour évaluer l'exposition à la fumée de tabac La limite de détection est de l'ordre de 1 ng/ml pour la cotinine et de 10 ng/ml pour la nicotine et ces seuils sont abaissés en augmentant le volume d'échan-tillon Interprétation des résultats Le dosage de la cotinine donnant des informations sur la consommation de tabac ou de substituts nicotiniques au cours des derniers jours, il est théoriquement important que la consommation, la veille et le jour du dosage, soit représen-tative de la consommation quotidienne annoncée En fait, l'expérience clinique quotidienne montre que les variations d'un jour à l'autre, sur le court terme, chez les fumeurs réguliers de plus de 15 cigarettes par jour, sont toujours très faibles Il est important d'avoir à l'esprit, lors de l'interprétation des résultats, que la quantité de nicotine absorbée pour un même nombre de cigarettes varie d'un individu à l'autre en fonction du type de tabac fumé, de l'intensité de l'inhalation, du nombre de bouffées par cigarette et de leur volume, de la longueur du mégot Ceci souligne l'intérêt d'utiliser les différents marqueurs qui permettent ainsi une mesure objective de l'imprégnation tabagique Cependant, en fonction du contexte dans lequel ces mesures sont réalisées, il peut être nécessaire de les compléter par d'autres informations Autres marqueurs Les alcaloïdes mineurs du tabac comme l'anabasine et l'anatabine ont également été proposés en tant que marqueurs d'utilisation de tabac Ces deux molécules ne sont pas présentes dans les traitements de substitution tabagique et ne sont pas des métabolites de la nicotine ; elles peuvent donc se révéler utiles pour détecter la poursuite d'une consommation tabagique en période de sevrage sous substitution nicotinique L'anabasine et l'anatabine sont dosables dans l'urine par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectromé-trie de masse et ont des demi-vies d'élimination respectivement d'environ 16 et 10 heures Indications et pertinence des différents marqueurs Ces différents marqueurs varient donc par : leur spécificité par rapport au tabac ; la sensibilité de la méthode de dosage utilisée ; la spécificité de la technique de dosage ; la facilité de réalisation du dosage ; la nécessité de disposer d'appareillages spécialisés ; le coût en réactifs ; le temps nécessaire pour réaliser un dosage ; la possibilité d'automatiser la méthode Le clinicien et le biologiste devront donc prendre en compte ces différents éléments pour choisir le marqueur et la méthode de dosage les plus adaptés aux types de patients pris en charge et aux études cliniques qu'ils veulent mener L'intérêt de ces marqueurs biologiques est de quantifier les apports réels de substances toxiques absorbées par le sujet consommant du tabac, ou exposé au tabac Les applications sont multiples : tout d'abord ces marqueurs peuvent être utilisés dans le cadre d'études épidémiologiques, en complément des questionnaires Le choix de la méthode de dosage des différents marqueurs est d'une grande importance car il faut dans ce cas pouvoir traiter un grand nombre d'échantillons dans un temps limité et pour un coût modeste L'application la plus évidente est la validation du statut tabagique : dans les études épidémiologiques générales, il est important de différencier fumeurs, nonfumeurs et non-fumeurs exposés au tabagisme passif et d'étudier la fiabilité des déclarations des sujets Cependant se pose alors le problème des seuils à établir et de la référence à choisir : on ne peut pas se fonder sur la consommation alléguée par les sujets puisque c'est cela même que l'on veut vérifier ! Par ailleurs, dans les études épidémiologiques évaluant les risques du tabagisme, le nombre de cigarettes fumées est un marqueur imprécis de l'importance de celui-ci Or il est nécessaire de le quantifier précisément car le risque est proportionnel à la fois à la durée du tabagisme et à la quantité de tabac consommée ; un autre domaine o ces marqueurs jouent un rôle important est l'étude du tabagisme passif Les méthodes directes (dosage du CO et surtout de la nicotine dans l'air ambiant) devraient être les méthodes de base, mais elles sont parfois difficiles à mettre en pratique Les questionnaires, dans ce cas, sont évidemment imprécis Son intensité peut donc être mesurée par dosage de la cotininurie, à condition d'utiliser une technique suffisamment sensible comme l'HPLC, la CPG ou la RIA : le seuil de discrimination entre fumeurs actifs et passifs varie selon les études, de 20 à 100 ng/ml d'urine et la valeur la plus adéquate semble être 50 ng/ml Les concentrations urinaires en cotinine liées au tabagisme passif sont donc extrêmement faibles, proches des limites de détection analytiques Par ailleurs, lors de la surveillance de la grossesse, le dosage de la cotininurie est un moyen de sensibiliser les femmes enceintes au problème des conséquences du tabagisme sur l'enfant (petit poids à la naissance, problèmes respiratoires ) et de suivre leur statut tabagique au cours de la grossesse On retrouve également la cotinine dans les urines, la salive et les cheveux des nouveaux nés, chez les enfants exposés au tabagisme ainsi que dans le lait maternel Il est à noter que, pour une même exposition au tabagisme passif, les taux de cotinine urinaire observés chez les jeunes enfants sont généralement plus élevés que ceux observés chez les adultes , ce qui s'explique non pas par une diffé-rence de métabolisme mais par une plus forte exposition due à leur incapacité à s'extraire volontairement d'une atmosphère enfumée De plus, il existe une corréla-tion fortement positive entre le taux de cotinine urinaire mesuré chez les enfants et les habitudes tabagiques des parents, notamment celles de la mère Le CO dans l'air expiré permet de suivre le début de sevrage grâce à la visualisation rapide de l'impact de l'arrêt du tabac et est également un témoin d'une reprise ou d'une persistance de consommation de tabac chez un patient traité par substituts nicotiniques ou par un médicament non nicotinique d'aide à l'arrêt du tabac Les faibles sensibilité et spécificité du dosage des thiocyanates ainsi que l'existence d'autres marqueurs plus pertinents ont aujourd'hui fait renoncer à leur emploi L'évaluation de l'élimination urinaire de la cotinine, en revanche, s'avère d'un grand intérêt dans le suivi du sevrage tabagique En cas de non-prescription de substituts nicotiniques, une semaine après l'arrêt, les valeurs deviennent identiques à celles des non-fumeurs et le dosage de la cotininurie en cours de sevrage est un moyen intéressant de motivation des fumeurs Lors d'un sevrage avec substitution, ce dosage permet d'adapter les doses du traitement nicotinique grâce au calcul du taux de substitution, rapport entre l'élimination urinaire de cotinine sous traitement et cette élimination avant traitement Un taux de substitution d'au moins 80 % apparat nécessaire pour obtenir un sevrage confortable , ce qui est l'un des facteurs de succès les plus importants Ces mêmes marqueurs peuvent également être utilisés lors de la prise en charge individualisée d'une démarche de ré-duction de consommation de tabac En effet, en cas de réduc-tion de consommation, les patients ont tendance à modifier leur façon de fumer pour maintenir un taux circulant de nicotine identique Afin d'éviter ce phénomène d'hyperventilation compensatoire, il est intéressant là aussi d'utiliser les dosages de cotininurie et le calcul du taux de substitution Le dosage du CO dans l'air expiré pourra être associé : un excès de CO dans l'air expiré ou une diminution trop faible de ce taux traduit une hyperextraction En compensant la diminution du nombre de cigarettes par un apport en substituts nicotiniques oraux à la demande , le sujet conserve un taux sérique de cotinine comparable Actuellement, l'utilisation des principaux marqueurs biologiques du tabagisme se heurte cependant à un certain nombre de difficultés pratiques : Concernant la mesure du CO dans l'air expiré, tout service de cardiologie ou de pneumologie devrait avoir un CO analyseur pour vérifier les arrêts allégués L'usage d'un tel appareil n'est malheureusement pas encore très répandu, malgré un prix abordable (& ; lt ; 400Q) et une utilisation très simple Pour le dosage de la cotinine, en dehors de la nécessité d'utiliser une technique adaptée à chaque indication et de standardiser les méthodes, l'obstacle majeur actuel reste l'absence de remboursement par la sécurité sociale La prise de conscience grandissante des dangers du tabagisme et l'accroissement de l'intérêt des pouvoirs publics pour ce problème laissent malgré tout envisager, dans un futur proche, une augmentation de l'utilisation de marqueurs du tabagisme dans toutes leurs indications Références | ISTEX | Scientific |
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Effet de l'écologie d'un hôte sur l'évolution de son principal parasitoïde Emilie Dion To cite this version : Emilie Dion. Effet de l'écologie d'un hôte sur l'évolution de son principal parasitoïde. Evolution [q-bio. PE]. Agrocampus - Ecole nationale supérieure d'agronomie de rennes, 2011. Français. tel- 00677607 HAL Id : tel-00677607 Submitted on 8 Mar 2012 HAL is a multi-disciplinary open access L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est archive for the deposit and dissemination of sci- destinée au dépôt et à la diffusion de documents entific research documents, whether they are pub- scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, lished or not. The documents may come from émanant des établissements d'enseignement et de teaching and research institutions in France or recherche français ou étrangers, des laboratoires abroad, or from public or private research centers. publics ou privés. N Ordre : 2011-13 N Série : A-68 THESE / AGROCAMPUS-OUEST Sous le sceau de l'Université Européenne de Bretagne Pour obtenir le diplôme de : DOCTEUR DE L'INSTITUT SUPERIEUR DES SCIENCES AGRONOMIQUES, AGRO-ALIMENTAIRES, HORTICOLES ET DU PAYSAGE Spécialité : Biologie et Agronomie Ecole Doctorale : VIE-AGRO-SANTE Présentée par Emilie DION EFFET DE L'ECOLOGIE D'UN HÔTE SUR L'EVOLUTION DE SON PRINCIPAL PARASITOÏDE Préparée au sein de l'équipe Biologie et génétique des populations d'insectes' UMR 1099 INRA-Agrocampus-Ouest-Université de Rennes1 Bio3P Soutenue le 31 Mai 2011, devant la commission d'examen constituée de : Xavier FAUVERGUE CR, INRA-CNRS-Univ. Nice Sophia-Antipolis Rapporteur Fabrice VAVRE DR, CNRS Univ. Claude Bernard-LYON1 Rapporteur Thierry RIGAUD DR, CNRS Univ. De Bourgogne-Dijon Examinateur Marylène POIRIE PR, INRA-CNRS-Univ. Nice Sophia-Antipolis Examinateur Michel GAUTIER PR, Agrocampus-Ouest-Rennes Examinateur Yannick OUTREMAN MC, Agrocampus-Ouest-Rennes Directeur Jean-Christophe SIMON DR, INRA-Agrocampus-Ouest-Univ. Rennes1 Directeur THESE présentée à AGROCAMPUS-OUEST Pour obtenir le diplôme de : Docteur de l'Institut Supérieur des Sciences Agronomiques, Agro-alimentaires, Horticoles et du Paysage Spécialité : Biologie et Agronomie Ecole Doctorale : Vie-Agro-Santé Par Emilie DION EFFET DE L'ECOLOGIE D'UN HÔTE SUR L'EVOLUTION DE SON PRINCIPAL PARASITOÏDE Préparée au sein de l'équipe Biologie et génétique des populations d'insectes' UMR 1099 INRA-Agrocampus-Ouest-Université de rennes1 Bio3P Mai 2011, devant la commission d'examen constituée de : Xavier FAUVERGUE CR, INRA-CNRS-Univ. Nice Sophia-Antipolis Rapporteur Fabrice VAVRE DR, CNRS Univ. Claude Bernard-LYON1 Rapporteur Thierry RIGAUD DR, CNRS Univ. De Bourgogne-Dijon Examinateur Marylène POIRIE PR, INRA-CNRS-Univ. Nice Sophia-Antipolis Examinateur Michel GAUTIER PR, Agrocampus-Ouest-Rennes Examinateur Yannick OUTREMAN MC, Agrocampus-Ouest-Rennes Directeur Jean-Christophe SIMON DR, INRA-Agrocampus-Ouest-Univ. Rennes1 Directeur Merci Une thèse implique une succession d'événements majeurs qui bousculent la vie. Vous y avez tous participé, parfois involontairement, parfois de votre plein gré. Vous m'avez soutenue, encouragée, et donnée un bon coup de pied o il faut quand c'était nécessaire. Ce travail ne serait rien sans votre soutien. Alors, quand vient le temps des remerciements, une multitude de noms se bouscule dans ma tête. Ce travail a été réalisé au sein de l'UMR BiO3P du Rheu, et au laboratoire ESP à Agrocampus Rennes. Je tiens par conséquent à remercier les directeurs successifs de l'UMR, Didier Andrivon et Jean-Christophe Simon, ainsi que Dominique Ombredane, responsable de ESP, qui m'ont accueillie et m'ont permis de bénéficier d'un environnement de travail riche, agréable et dynamique. J'adresse ensuite mes remerciements à Xavier Fauvergue, Fabrice Vavre, Thierry Rigaud, Marylène Poirié et Michel Gautier qui ont accepté d'être les membres de mon Jury de thèse et d'évaluer ce travail. Un grand merci également aux membres de mon comité de thèse, Jacques Van Alphen, Eric Petit, Manuel Plantegenest, Marylène Poirié, Yvan Rahbé et Solenn Stoeckel, pour leur précieux conseils et éclaircissement. A chacun des comités, je suis ressortie motivée grâce à vous. J'adresse à présent mes plus vifs et sincères remerciements à Yannick Outreman et Jean-Christophe Simon, mes directeurs de thèse. Tant du point de vue scientifique que humain, j'ai vraiment apprécié de travailler avec vous durant ces années. Vos grandes qualités m'on amené chaque fois à plus de rigueur et de précision dans mon travail et à construire mon raisonnement. Certes, ce ne fut pas facile tous les jours (surtout quand tu m'as avouée, Yannick, que tu avais aimé le film Tigre et Dragon ! Fichtre j'ai du mettre des semaines à m'en remettre) mais grâce à vous, j'ai beaucoup grandi (et non, pas en taille, Jean-Christophe ! ) et surtout acquis de l'autonomie. Je dois un grand remerciement aux étudiantes que j'ai co-encadré : Juliane Casquet, Flore Zélé et Sarah Polin. Sans vous, tout ceci n'existerait pas. J'espère avoir pu répondre présent vous en aviez besoin et vous motiver quand vous ne l'étiez plus. Bon vent à vous les filles ! J'ai eu la chance de côtoyer au quotidien de nombreuses personnes dont l'expérience m'a permis d'élargir mes connaissances et d'améliorer mon travail. Merci donc à : *Bernard Chaubet, charmeur de guêpes à l'accent chantant (je sais que tu peux les faire voler en rond dans le sens des aiguilles d'une montre à la voix, et que si tu descends d'une octave, alors là elles se mettent à voler dans le sens inverse). Merci sincèrement pour ton aide aux échantillonnages, aux élevages, à la détermination et pour ta gentillesse. *Lucie Mieuzet. Merci pour ton aide en sourires sur les expérimentations de biologie moléculaire. Robot, plaques 384, pipette multicanal multidistributrice automatique avec airbags de série, GPS intégré et convecteur temporel. pfff trop facile, grâce a toi ! Au fait, j'ai reçu une nouvelle paire d'amorces à tester. Ne fais pas cette tête là, je suis sûre qu'au bout de la 200ème fois, ça va fonctionner ! *Julie Jaquiery. Tu as illuminé mon chemin en analyse de données de génétique des populations. Merci pour ta patience, surtout quand je débarquais toutes les 10 minutes pour une question stupide ( bah ouais mais là Fstat, il veut pas ouvrir mon fichier, j'comprends paaaaaas ). *Caroline Anselme. boah ça fera juste une quinzaine de plaques, je te fais ça en 2 petites heures, entre deux cours ou sinon la nuit prochaine ! . Merci pour ton aide et tout le boulot que tu as abattu concernant le venin. A chacune de nos discussions, j'ai été motivée par ton enthousiasme à toute épreuve et ton dynamisme. *Marylène Poirié. Merci pour cette collaboration que nous avons pu mettre en place et qui, j'en suis sure, perdurera. Merci aussi pour vos encouragements et votre gentillesse. *Francisca Zepeda. J'espère que les Aphidius chiliens répondront à tes questions. Malgré certaines difficultés de langage parfois, nos discussions m'ont beaucoup encouragée. *Anne Le Ralec et Manuel Plantegenest, pour toutes nos discussions parasitoïdes et les idées qui en ont émergé. Je remercie enfin l'ensemble des membres de l'UMR, et de l'équipe insectes en particulier, pour la très bonne ambiance qui y règne. Les pauses café sont célèbres pour leur niveau de réflexion et leur bon goût. Je ne doute pas une seconde que vous perpétuerez la tradition à travers l'humour fin et délicat qui vous caractérise. Je n'oublie pas non plus les membres d'ESP, o l'ambiance est tout aussi conviviale et sympathique (un jour, je les aurai mes poules, Isabelle, un jour). J'ai aussi une pensée pour mes voisins de l'équipe ADSL et plus particulièrement Bruno, Géraldine, Patricia, Jean-Marie, Dominique, Anne-Sophie et Régis. Votre gentillesse, votre disponibilité, votre bonne humeur et votre humour ont été de chauds rayons de soleil. Gégé et Patricia, vous avez pris soin de moi avec de la tendresse, vraiment vous êtes des amours. Je remercie spécialement tous les thésards que j'ai pu côtoyer au cours de ces années, notamment Gal (incroyable mais néanmoins extraordinaire patron de la basse cour), Morgane, Julie Biloute, Christelle (une petite baguette apéro ce midi, les filles ? Ou une crêperie peut être ? ), Aurore (je te passe le relai), Jean, Virgil, Laure, Aude, Prisca, Céline, Stéphane, Stephaniya, Mamadou, Alexander, Muriel, Melen, Benjamin, Charline Je pense aussi à quelques escl heu stagiaires, qui sont Pierre et Chloé. Vous êtes mes derniers co-locataires, et vous avez vraiment contribué à rendre plus légère cette période de rédaction difficile. Alors merci pour toutes les batailles de yaourts et les dénonciations abusives. Et puis un conseil : arrêtez donc les bêtises. Intervertir les touches du clavier, ou agrafer tous les documents du bureau en farandole franchement Vous êtes des petits joueurs ! J'en viens à présent à des remerciements plus personnels car trois ans de thèse, c'est aussi de nombreuses nouvelles amitiés. Très chers Lucie, Marie, Yann. Je vous salue, ô grands matres du jeu. Je n'oublierais pas ces parties endiablées et passionnées de QPUC, toujours dans la convivialité ( Ben Affleck, Aller Ben Affleck, mais c'est Ben Affleck je te dis, mais merde BEN AFFLECK A LA FIN JE TE DIS QUE C'EST CA ! Et voilà, on a perdu sur la vitesse, grrr super, bravo, à cause de toi on passe 3ème alors qu'on aurait pu être premier, non mais trop nul franchement ! ) ou de TLMVPSP, souvent avec enthousiasme ( Litterature Russe pfff bah carré alors ). Merci vraiment à vous trois pour tout ce que nous avons vécu ensemble. Tous nos fous rires, discussions profondes ou complètement superficielles, nos repas animés (souris d'agneau de 7h ou lapin au micro-onde ce midi ? ), resterons de supers moments. Ne changez rien les loulous, vous êtes les meilleurs ! J'espère que nous nous reverrons à Poule-au-pot ou à Bourre-la-reine Stéphane et Amélie, merci pour votre gentillesse et votre humour. Vous m'avez accueillie à bras ouvert et avec le sourire à chaque fois que j'avais besoin de me plaindre. Je n'oublierai pas les prouesses dont vous êtres capables avec vos petits doigts (jeux vidéos fondant au chocolat enfin ! ), et les soirées animées que nous avons passées. Julie, Mo, Chrichri, nous avons beaucoup partagé, souvent nos déboires. Merci pour vos soutiens sans faille et vos conseils. Nico, Cécile, Jean-François, votre sympathie qui m'a été très rafraichissante. Merci à vous, et vive les tomates, j'ai envie de dire Il y a aussi tous ceux qui m'ont rappelé qu'après le boulot, il y a une vie (si si ! ). Je remercie d'abord les Kenshis, les anciens de la promo kyuguillot inclus, pour tout ce que nous avons vécu ensemble. Serge, merci de m'avoir accueillie dans le club. Vous êtes et resterez mon Sensei. Merci à toi Seb pour m'avoir fait aimer le Kendo, et à Fred, Jacques, Eric, et tous les autres pour ces moments géniaux. Un merci particulier à Jenny, pour ces douches torrides oouuuu grrrrr. Grâce à vous tous, j'ai pu assumer mon côté sado- masochiste, car, il faut bien le dire, le Kendo, ce n'est pas pour les fillettes. Merci de m'avoir tirée du bureau pour faire tant de rencontres, et d'avoir accepté mes motivations à pratiquer aléatoires, trop souvent dépendantes des satisfactions ou des déceptions professionnelles. Quoi qu'il en soit, n'oubliez pas mes amis : Well, that's no ordinary rabbit ! That's the most foul, cruel, and bad-tempered you ever set eyes on ! Look, that rabbit's got a vicious streak a mile wide ! It's a killer ! (Monty Python and the Holy Grail, 1975). Je vous laisse méditer ça, et on en reparlera quand votre Lapin sera 8ème Dan (grade obtenu à l'aide de mon seul talent, et non par l'intervention de je ne sais quel vieux sensei japonais gâteux mais néanmoins alerte, Jacques). Membres de la SailorProd, je ne vous oublie pas. Tiphaine, Gale, Adi, Marie et les autres, vous avez toujours répondu présents, même lors des phases critiques. Pardon pour mon silence alors que j'étais noyée dans le travail. Mon Titi, tu m'as beaucoup manqué, allons vite réparer ça ! Et gare à toi si tu ne viens pas nous visiter dans le grand nord. Gale, nous venons vous rejoindre, affute Bert, ça va découper du tronc. Tu m'as promis une conversation scabreuse tonitruante dans un resto chic. J'arrive. Bien évidement, je remercie chaleureusement mes parents, qui m'ont toujours soutenue, confiants et optimistes. Je pense aussi à Chewbacca, Albert, Pouillette, Shiro, Emette, Bruno, Iggy et tous les autres une caresse, une léchouille et c'est reparti ! Enfin, pour terminer en beauté, mes derniers remerciements vont à Ludo. Tu as changé ma vie. Ce manuscrit t'est dédié. Voilà SOMMAIRE INTRODUCTION GENERALE. 1 I. Les interactions interspécifiques. 3 II. Evolution de l'interaction hôte-parasitoïde. 3 III. L'impact des interactions sur la coévolution . 4 IV. La problématique étudiée . 4 V. Organisation du document . 5 Chapitre 1. CONTEXTE GENERAL. 7 I. L'importance des interactions dans les processus évolutifs . 9 1. Un gigantesque réseau d'interactions . 9 Classification des relations entre les espèces . 9 Prédation et parasitisme . 9 2. La coévolution des systèmes antagonistes . 10 Une sélection réciproque . 10 La coévolution entre un hôte et son parasite . 10 Des parasites tueurs' . 11 3. Les insectes parasitoïdes . 11 La diversité des insectes parasitoïdes . 11 Les parasitoïdes, parasites ou prédateurs ? . 11 Des modes de reproduction variés. 13 La coévolution hôte-parasitoïde. 13 II. Ecologie et évolution des interactions hôtes-parasitoïdes . 14 1. Stratégie d'évitement et résistance au parasitisme chez les hôtes. 14 Eviter la rencontre avec le parasitoïde . 14 Eviter l'attaque du parasitoïde. 15 Les coûts des défenses comportementales . 17 Les défenses immunitaires des hôtes . 17 Evolution de la résistance des hôtes. 18 2. Exploitation de l'hôte par le parasitoïde. 19 Les stratégies d'exploitation des hôtes par les parasitoïdes adultes. 19 Les stratégies d'exploitation des hôtes par la larve parasitoïde. 21 Les facteurs de virulence. 22 Evolution de la virulence des parasitoïdes. 23 III. Les hôtes et leur réseau d'interactions. 24 1. Interaction de l'hôte avec sa plante. 24 De la spécialisation alimentaire à la spéciation. 24 Conséquences sur les parasitoïdes : la différenciation associée à l'hôte . 26 Un exemple célèbre : le complexe Rhagoletis pomonella- Diachasma alloeum. . 26 2. Interactions de l'hôte avec des symbiotes. 27 Définitions. 27 Les symbiotes et l'utilisation de la plante par les insectes phytophages. 29 Les symbiotes protecteurs. 29 Les symbiotes manipulateurs de la reproduction . 30 3. Interactions de l'hôte avec des prédateurs . 33 Définition de la prédation. 33 Prédateur et compétiteur : la prédation intraguilde. 33 IV. Conclusion . 36 Chapitre 2. LES MODELES BIOLOGIQUES : LE PUCERON DU POIS ACYRTHOSIPHON PISUM LE PARASITOÏDE APHIDIUS ERVI. 39 I. L'hôte : le puceron du pois Acyrthosiphon pisum . 41 1. Généralités : classification, répartition et biologie . 41 2. Spécialisation alimentaire, génétique et divergences phénotypiques . 43 3. Une riche composition endosymbiotique. 44 4. Les moyens de défense du puceron du pois contre les parasitoïdes . 44 Eviter la rencontre et éviter l'attaque . 45 Les défenses immunitaires . 45 La résistance conférée par les symbiotes. 45 II. Le parasitoïde Aphidius ervi. 47 1. Classification. 47 2. Ecologie et biologie . 48 3. Cycle de vie. 48 La ponte d'un œuf : l'oviposition. 48 Le développement . 48 Le stade adulte. 50 4. La virulence chez A. ervi . 50 Chapitre 3. INFLUENCE DE LA SPECIALISATION D'A. PISUM SUR LA STRUCTURE DES POPULATIONS DE PARASITOÏDES . 53 I. Spécialisation écologique et génétique de l'hôte . 55 1. Objectifs . 55 2. Approche et méthode générale . 56 Plantes hôtes et régions inspectées . 56 Choix des marqueurs génétiques et du type d'analyse . 56 3. résultats : génétique des populations d'A. ervi- Article 1. 57 Chapitre 4. INFLUENCES DES SYMBIOTES SUR L'INTERACTION A. PISUM - A. ERVI . 79 I. . Influences des symbiotes sur les populations de parasitoïdes . 81 1. Objectifs . 81 2. Approche et méthode générale . 81 3. Evolution de la performance des parasitoïdes Article 2 . 82 4. Analyse des facteurs de virulence potentiels. 95 Introduction . 95 Méthodes. 95 Résultats . 96 Discussion et conclusion. 96 5. Evolution des propriétés génétiques des populations sélectionnées-Article 3. 98 II. Influences des symbiotes sur les comportements des hôtes. 118 1. Objectifs . 118 2. Approche et méthode générale . 119 3. Résultats : Interaction négative entre les comportements défensifs et la résistance apportée par les symbiotes-Article 4 . 119 Chapitre 5. DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES . 125 I. Des femelles Aphidius ervi homozygotes. 128 1. Introduction d'une diploïdisation par Wolbachia pipentis ? . 128 2. Origine des femelles homozygotes . 128 II. Aphidius ervi une parasitoïde généraliste disperseur . 129 1. Absence d'une spécialisation parasitaire. 129 A. pisum, un complexe de 11 races d'hôtes. 129 La dispersion et le spectre d'hôte large d'A. ervi limite sa spécialisation . 130 2. Perspectives : influence des autres espèces d'hôte d'A. ervi et évolution d'un parasitoïde spécialiste. 130 Structure des populations de parasitoïdes issues d'espèces d'hôtes différentes . 130 Evolution d'une espèce spécialiste . 131 III. Les symbiotes, un moteur de diversification . 132 1. H. defensa, moteur de diversification chez les pucerons . 132 Des comportements défensifs moindres favorisant le symbiote et son porteur . 132 Les conséquences sur le parasitoïde . 133 Quel est le rôle des prédateurs . 134 2. H. defensa, moteur de diversification chez les parasitoïdes. 134 Le potentiel d'adaptation de parasitoïdes à des hôtes résistants . 134 Des pressions de sélection diffuses dans le milieu naturel . 135 La résistance dans le spectre d'hôte d'Aphidius ervi. 136 Les mécanismes de la virulence d'Aphidius ervi . 136 IV. Aphidius ervi, bon ou mauvais auxiliaire ? . 137 V. Conclusion . 138 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES. 141 FIGURES ET TABLEAUX Liste des figures : Figure 1. 1. Emission de sécrétions corniculaires chez des pucerons attaqués par un parasitoïde- 16 Figure 1. 2. Schéma simplifié de la prédation intraguilde - 34 Figure 2. 1. Structure génétique des populations de pucerons du pois - 42 Figure 2. 2. Représentation schématique des mécanismes de résistance hypothétiques du puceron du pois - 46 Figure 2. 3. Indices de détermination morphologiques d'Aphidius ervi - 47 Figure 2. 4. Cycle biologique d'Aphidius ervi - 49 Figure 2. 5. Représentation schématique de la physiologie virulence d'A. ervi - 51 Figure 4. 1. Déroulement d'évolution expérimental- 82 Figure 4. 2. Etapes de la dissection des femelles parasitoïdes - 96 Figure 4. 3. Expression relative de CLC11, CLC7 et YL16 - 97 Figure 5. 1. Représentation schématique résumant les principales conclusions et perspectives de ce travail de thèse -139 Liste des tableaux Tableau V. 1. Informations sur les introductions d'Aphidius ervi -138 Les figures et tableaux présentés dans les articles ne sont pas décrits dans cette liste. INTRODUCTION GENERALE I. Les interactions interspécifiques Chaque être vivant est confronté au cours de sa vie à de nombreux facteurs environnementaux qui façonnent ses traits d'histoire de vie, comme sa survie ou sa reproduction. Parmi ces facteurs, les espèces partageant son habitat occupent une place déterminante, l'extrême diversité du monde vivant rendant les possibilités d'interactions interspécifiques immenses (Begon et al. , 2006 ; Thomas et al. , 2010). Ainsi, chaque organisme vit en interaction avec une ou plusieurs espèces et est membre d'un réseau complexe d'interactions. La multiplicité des interactions influencent les traits des organismes, exerçant des pressions de sélection sur ses populations. Chaque espèce étant dépendante de la nature et de la diversité des interactions dans lesquelles elle est impliquée, son évolution est en partie liée aux autres espèces avec lesquelles elle interagit (Thompson, 1994). Plusieurs types de relations entre espèces existent. Le parasitisme, notamment, est une interaction positive pour l'un des acteurs et néfaste pour l'autre car le parasite tire profit et inflige des coûts à son hôte, sans pour autant en provoquer la mort (Barber et al. , 2000 ; Combes, 2001). Pourtant, certains parasites infligent à leurs hôtes une mort certaine et programmée. Les insectes parasitoïdes sont les dignes représentants de ces parasites tueurs'. II. Evolution de l'interaction hôte-parasitoïde Les insectes parasitoïdes sont des espèces dont les femelles pondent à l'intérieur ou à la surface de l'hôte (en général, un autre insecte). La larve se développe en se nourrissant des tissus de son hôte, et l'interaction prolongée conduit à la mort de ce dernier. Le cycle des parasitoïdes est donc caractérisé par l'alternance d'une phase libre adulte de recherche et de sélection de l'hôte, et d'une phase de parasitisme obligatoire des stades immatures. Dans une interaction hôte-parasitoïde, les enjeux pour les antagonistes sont capitaux : un parasitoïde a obligatoirement besoin d'un hôte pour la phase immature de son cycle ; pour l'hôte, l'infestation conduit à sa mort. Le parasitoïde adulte doit donc réussir à pondre dans l'hôte et le parasitoïde immature doit surmonter les résistances de cet hôte pour achever son cycle de développement. A l'inverse, l'hôte doit empêcher la femelle parasitoïde de le parasiter, et/ou lutter contre le parasitoïde immature en place s'il veut survivre (Godfray, 1994). L'étude de l'évolution de ce système hôte-parasitoïde est donc étroitement lié à la compréhension des mécanismes de défenses chez l'hôte et de l'évolution des stratégies parasitaires chez les parasitoïdes. Cette interaction entre le plus souvent dans une dynamique coévolutive, o les différentes stratégies d'attaque peuvent être sélectionnés chez le parasitoïde en réponse aux différentes formes de défenses chez l'hôte. III. L'impact des interactions sur la coévolution Dans la littérature, les processus de défense de l'hôte et d'attaque du parasitoïde sont très souvent étudiés dans le cadre d'un face à face entre les deux partenaires' (e. g. Kraaijeveld et al. , 1998 ; Kraaijeveld & Godfray, 2009). Cependant, l'hôte d'un parasitoïde est également le maillon d'un réseau d'interactions interspécifiques : il consomme, il est exposé à des compétiteurs, il peut être la proie d'espèces prédatrices ou héberger des microorganismes. Toutes ces interactions interspécifiques gravitant autour de l'hôte vont affecter ses traits et ses populations. Compte tenu de l'intimité particulière qui caractérise l'interaction hôte-parasitoïde, tout facteur écologique influençant les traits de l'hôte influera les aptitudes du parasitoïde. Le réseau d'interactions d'un insecte hôte aurait dès lors des conséquences profondes sur les populations parasitoïdes. IV. La problématique étudiée Ce travail de thèse a pour objectif d'identifier comment l'écologie d'une espèce hôte de parasitoïde, à travers ses relations avec d'autres organismes, affecte les traits d'histoire de vie de ses parasitoïdes et le fonctionnement de leurs populations. Deux points ont été étudiés dans cette thèse : l'influence, sur les populations de parasitoïdes, de la relation entre (1) son insecte hôte et les ressources alimentaires de cet hôte et (2) son insecte hôte et les microorganismes qu'abritent cet hôte. Des travaux récents ont montré l'existence de conditions particulières dans lesquelles des populations d'insectes phytophages peuvent diverger en sympatrie (e. g. Peccoud et al. , 2009a). Par le biais d'un processus de spécialisation alimentaire, on assiste à la formation de races d'hôtes qui engendre des divergences génétiques et phénotypiques profondes dans les populations sympatriques (Drès & Mallet, 2002). La symbiose est, en outre, largement répandue chez les insectes et des études récentes montrent que certains symbiotes peuvent conférer à l'insecte porteur une résistance aux parasitoïdes (Haine, 2008). Ce travail de thèse propose ainsi dans un premier temps d'identifier les conséquences évolutives et écologiques d'une spécialisation alimentaire chez les insectes phytophages sur les populations de leurs parasitoïdes. Il s'agit de déterminer si la spécialisation alimentaire chez l'hôte n'aurait pas un effet cascade, c'est-à-dire qu'il pourrait générer une spécialisation parasitaire. Dans un second temps, nous étudierons également l'effet de la présence de microorganismes bactériens conférant une résistance aux parasitoïdes à leur porteur sur l'évolution de l'interaction hôte-parasitoïdes. Plus particulièrement, les conséquences de la résistance apportée par ces bactéries symbiotiques sur l'évolution de la virulence et des propriétés génétiques des populations de parasitoïdes ont été étudiées. L'effet de cette résistance conférée par des bactéries sur l'évolution des défenses de l'insecte porteur a également été abordé. Dans nos expérimentations, l'insecte hôte considéré est le puceron du pois, Acyrthosiphon pisum et sont principal ennemi naturel, le parasitoïde Aphidius ervi. Cet aphide est présent sur les légumineuses cultivées (trèfle, luzerne, pois) et sauvages (genêt à balais, lotier, vesce etc. ). Il montre une spécialisation alimentaire sur sa plante et présente des populations génétiquement différenciées. A pisum est donc structuré en races d'hôtes, (Peccoud et al. , 2009a). Cette spécialisation écologique s'accompagne de divergences phénotypiques entre les races et de compositions distinctes en symbiotes secondaires (Frantz et al. , 2009 ; Kunert et al. , 2010). Certains A. pisum peuvent notamment abriter un symbiote secondaire, Hamiltonella defensa, lui conférant une résistance à son principal parasitoïde Aphidius ervi (Oliver et al. , 2003). V. Organisation du document Le présent manuscrit s'articule autour de 5 chapitres. Dans le premier chapitre, une synthèse bibliographique identifie l'importance des interactions dans les processus évolutifs, et particulièrement chez les insectes parasitoïdes et leurs hôtes. Dans ce chapitre, les différentes stratégies défensives chez les hôtes et les stratégies parasitaires chez les parasitoïdes sont abordées. Nous décrivons également les différentes travaux portant sur l'effet du réseau d'interactions d'un insecte hôte sur ses parasitoïdes. Cette partie se termine par le positionnement scientifique de la thèse et ses différents objectifs. Le deuxième chapitre présente les espèces étudiées, le puceron du pois Acyrthosiphon pisum, et son parasitoïde, Aphidius ervi. Le troisième chapitre traite de l'influence de la spécialisation alimentaire du puceron du pois sur le fonctionnement et l'évolution des populations de parasitoïdes. Le quatrième chapitre présente l'influence de la résistance conférée par les symbiotes de l'hôte sur les populations de parasitoïdes et les comportements de défense des hôtes. Tous les résultats des expérimentations sont présentés sous forme d'articles. L'ensemble de nos résultats est ensuite discuté et replacé dans un contexte plus général dans le cinquième chapitre, avant d'aborder les principales perspectives. Cette conclusion identifie l'apport de ces travaux aussi bien sur l'avancement des connaissances scientifiques que sur le plan appliqué. Chapitre 1 CONTEXTE GENERAL I. L'importance des interactions dans les processus évolutifs 1. Un gigantesque réseau d'interactions Classification des relations entre les espèces Tous les organismes interagissent. Ils peuvent partager un environnement commun, convoiter les mêmes ressources, s'entre-aider ou encore utiliser d'autres espèces comme habitat. Ces interactions sont dépendantes de la grande diversité des formes de vie. Chaque espèce évolue ainsi dans un gigantesque réseau d'interactions. En 1991, Cheng propose une classification des interactions entre espèces selon leurs conséquences sur les organismes impliqués. On y distingue les interactions à effet négatif réciproques (la compétition), les interactions bénéfiques pour l'un et néfastes pour l'autre (la prédation et le parasitisme), les interactions à bénéfice réciproque (le mutualisme) et les interactions bénéfiques pour l'un des acteurs et neutres pour l'autre (le commensalisme et la phorésie). Ces interactions entre espèces peuvent aussi être classées selon leur caractère durable (parasitisme), fugace (prédation), indirect (e. g. compétition par exploitation) ou intime (symbioses mutualistes). Une espèce existe ainsi comme membre d'un cortège, composé de prédateurs, parasites, compétiteurs, ou encore mutualistes. Cette multiplicité de relations, bénéfiques, neutres et néfastes, peut influencer, à des degrés variables, la survie et/ou la reproduction des individus composant l'espèce et, de fait, exercer des pressions sélectives sur ses populations. L'incidence d'un cortège sur la valeur adaptative d'une composante spécifique suggère que la trajectoire évolutive d'une espèce serait en partie liée à son réseau d'interactions, passé et contemporain. Prédation et parasitisme L'interaction la plus médiatisée est certainement la prédation. On la retrouve dans de nombreux documentaires animaliers ou livres de vulgarisation. Un premier individu, le prédateur, tue une autre espèce généralement plus petite, sa proie, dans un but alimentaire. Cette interaction revêt un caractère fugace car les prédateurs tuent leur proie immédiatement après l'attaque (Begon et al. , 2006). Le parasitisme est moins connu mais beaucoup plus fréquent : c'est le mode de vie le plus répandu dans le monde vivant avec environ 50% des espèces (microorganismes, protozoaires, métazoaires, helminthes, bactéries, virus, champignons, insectes etc. ) (Poulin & Morand, 2000 ; de Mees & Renaud, 2002). Le parasite vit à l'intérieur ou à la surface de son hôte, sur lequel il exerce une action néfaste. Le parasite utilise généralement les ressources énergétiques de celui qui l'héberge et, à travers les pathologies ou les dérèglements physiologiques, peut affecter à son profit, la croissance ou la survie de cet hôte. Ce phénomène correspond à une association unilatérale, de longue durée (Combes, 2001). 2. La coévolution des systèmes antagonistes Une sélection réciproque Ehrlich et Raven (1964) sont les premiers à utiliser le terme coévolution' en étudiant les processus évolutifs qu'entretiennent les insectes phytophages et leurs plantes hôtes. Cette expression coévolution' autorise une grande variété d'interprétations et a été utilisée différemment par de nombreux auteurs. De nos jours, on parle de coévolution lorsque les évolutions des espèces en interaction s'influencent réciproquement. Un trait chez une première espèce évolue en réponse au trait d'une seconde, qui lui-même est sélectionné en réponse au trait du premier (Futuyma & Slatkin, 1983). Toutes les interactions produisent un ensemble complexe au sein duquel chacun des acteurs peut donc affecter les traits des autres. Les espèces qui interagissent exercent des pressions de sélection les unes sur les autres, impliquant des conséquences variables sur leurs valeurs adaptatives. La survie ou la reproduction sont des traits qui peuvent être particulièrement affectés. (Thompson, 1994). La coévolution entre un hôte et son parasite Tout parasite doit trouver l'hôte adéquat afin de satisfaire sa demande nutritionnelle, ou il meurt. Cette interaction étant très étroite, le parasite est particulièrement touché par les facteurs influençant la vie des hôtes. C'est principalement aux défenses de leurs hôtes auxquelles les parasites se heurtent. Elles peuvent être comportementales ou physiologiques, comme le système immunitaire des vertébrés, la réponse cellulaire des invertébrés, ou encore les défenses induites chez les plantes (Thompson, 1994 ; Combes, 2001). En réaction, le parasite utilise des stratégies d'attaque lui permettant d'exploiter l'hôte, c'est à dire de s'établir et se maintenir dans cet environnement inhospitalier quest son hôte. Dans cette interaction, les intérêts de chacun divergent donc totalement, impliquant une dynamique évolutive entre les deux acteurs, avec une sélection de stratégies de défenses chez l'hôte (comportement, évitement, résistance), et différentes stratégies d'attaques chez le parasite (transmission, mécanismes physiologiques) (Futuyma & Slatkin, 1983). Cette dynamique constante entre les hôtes et les parasites enferme' les acteurs dans un cycle d'évolution sans fin. Il s'agit d'une véritable guerre qui se poursuit aussi longtemps que l'un des deux protagonistes ne disparat pas, donnant lieu à une escalade dans l'invention adaptative (une course aux armements). C'est ce qui est appelé classiquement le principe de la Reine Rouge (Encadré 1). Des parasites tueurs' Certaines espèces présentent un mode de vie intermédiaire entre le parasite et le prédateur. En principe, un prédateur tue sa proie sitôt qu'il entre en contact avec elle. En revanche, l'hôte survit plus ou moins longtemps à la présence d'un parasite (une large tolérance du parasite par son hôte peut être un gage de réussite parasitaire). Certains parasites ont la particularité de provoquer la mort de leur hôte de manière obligatoire. C'est le cas des insectes qualifiés de parasitoïdes (Godfray, 1994). 3. Les insectes parasitoïdes La diversité des insectes parasitoïdes Selon des estimations récentes, les insectes parasitoïdes représentent entre 8 et 20% de l'entomofaune mondiale. La majorité des parasitoïdes sont des hyménoptères ou des diptères (respectivement environ 60 000 et 16 000 espèces décrites) (LaSalle & Gauld, 1992). Certaines espèces font également partie de la famille des coléoptères, lépidoptères, trichoptères, et des strepsiptères (Godfray, 1994). Le nombre d'hôtes pouvant être infestés est variable. Certains parasitoïdes dit généralistes peuvent exploiter plusieurs espèces ; les parasitoïdes dit spécialistes étant des espèces utilisant un nombre très réduite d'hôtes (Stireman et al. , 2006b). Les parasitoïdes, parasites ou prédateurs ? Un insecte parasitoïde diffère d'un parasite dans l'issue de l'interaction avec l'hôte. L'œuf est déposé à l'intérieur d'un hôte (endoparasitoïde) ou à sa surface (ectoparasitoïde) par une femelle adulte à vie libre, qui le recherche activement comme un prédateur. La larve de parasitoïde se développe aux dépens de son hôte qu'elle finit par tuer. Au terme de son développement, un parasitoïde adulte émerge de son hôte. La valeur adaptative d'un parasitoïde dépendra alors de son succès dans ces phases prédatrice' et parasitaire. Les hôtes de parasitoïdes peuvent également être considérés comme intermédiaires entre proie et hôte. Pour éviter d'être tué par un parasitoïde, les hôtes doivent présenter des moyens de défenses classiquement observés chez les espèces proies (éviter d'être attaqué par un prédateur) et chez les espèces hôtes (résister contre le parasite). Cette complexité de l'interaction hôte-parasitoïde implique la nécessité d'une multiplicité d'adaptations pour se défendre d'un parasitoïde ou de contourner les défenses de l'hôte. ENCADRE 1 LA THEORIE DE LA REINE ROUGE Le paléontologue Van Valen a émit l'hypothèse selon laquelle l'adaptation des organismes à l'environnement est remise en question constamment à cause des changements incessants qui le touchent. Selon van Valen (1973), il n'existe pas d'espèces qui auraient plus de chances de réussir que les autres car leur probabilité d'extinction est constante au sein des groupes et indépendante de leur durée de vie. Ce sont les autres espèces qui engendrent ces fluctuations d'environnement, et par les changements évolutifs qu'elles entrainent, exercent de nouvelles pressions de sélection sur les espèces avec lesquelles elles interagissent. Van Valen propose alors la théorie de la Reine Rouge, métaphore issue du roman de Lewis Caroll De l'autre côté du miroir (1872). Alice y est entrainée par la Reine Rouge dans une course effrénée dont elle demande la cause. La reine lui explique alors que le paysage défile, et qu'il faut courir sans cesse pour rester à la même place. Dans cette métaphore, le paysage représente l'environnement subissant des variations incessantes ; la Reine Rouge est l'espèce et la course, l'évolution. Dans un environnement fluctuant (le paysage défilant), l'évolution incessante des espèces leur permet donc d'éviter l'extinction. L'étroitesse des interactions parasitaires et les forces évolutives réciproques importantes qu'elles constituent en font d'excellents candidats pour la théorie de la Reine Rouge. Comme le parasitoïde doit absolument parasiter son hôte pour assurer une descendance, la stratégie adoptée par une femelle dans la recherche et la sélection des hôtes joue un rôle primordial dans sa réussite parasitaire. Le comportement de l'adulte aura donc une influence directe sur son succès reproducteur. Par conséquent, ces comportements peuvent être fortement influencés par la sélection naturelle. Ces caractéristiques font des parasitoïdes un système particulièrement étudié en biologie évolutive et écologie comportementale (Godfray, 1994 ; Hassell, 2000). Des modes de reproduction variés Le déterminisme du sexe est complexe chez ces individus. Selon les espèces, les mâles sont diploïdes (diplo-diploïdie), haploïdes (haplo-diploïdie) ou bien absents (thélotoquie). Chez les diptères, l'individu est issu d'un ovocyte fécondé et possède du matériel génétique paternel et maternel. Comme chez les mammifères, le sexe est déterminé selon les chromosomes sexuels présents, c'est la diplo-diploïdie. Chez les hyménoptères parasitoïdes, le système haplo-diploïde est le plus fréquent. Les mâles sont issus d'ovocytes non fécondés donc haploïdes, et les femelles d'ovocytes fécondés diploïdes. Ce sont les mères qui peuvent choisir le sexe de leur descendant en fécondant, ou non, l'ovocyte au moment de la ponte. Ce mode de reproduction permet une grande flexibilité dans les sex-ratios à l'échelle des populations. Enfin, certaines espèces présentent une reproduction clonale thélytoque : sans accouplement, les mères produisent des œufs diploïdes qui donneront des femelles. 4. La coévolution hôte-parasitoïde L'antagonisme entre un hôte et son parasitoïde est extrême. Dans cette interaction, les enjeux pour les antagonistes sont capitaux : le parasitoïde a obligatoirement besoin dun hôte pour compléter la phase immature de son cycle de vie ; pour l'hôte, l'infestation conduit à la mort. Ces partenaires entretenant une interaction particulièrement étroite, cette situation est particulièrement favorable à l'établissement de processus évolutifs réciproques. Tout changement chez le parasitoïde peut entrainer une sélection chez l'hôte. Toute modification des mécanismes d'infestation du parasitoïde (comportement et virulence) aura des conséquences très importantes sur l'organisme l'hôte. Inversement, tout moyen de défense chez l'hôte peut engendrer des pressions de sélection profondes sur les populations de parasitoïdes. Les stratégies d'évitement et de résistance au parasitisme chez l'hôte ; ainsi que les capacités d'exploitation des parasitoïdes, sont des traits au cœur de la coévolution de ce système. II. Ecologie et évolution des interactions hôtes-parasitoïdes 1. Stratégies d'évitement et résistance au parasitisme chez les hôtes Pour contrer leurs ennemis naturels, les organismes ont développé un large panel de moyens défensifs. Les défenses induites' apparaissent quand l'ennemi est rencontré, alors que les défenses constitutives' sont toujours présentes chez l'individu. Pour se défendre du parasitoïde adulte, l'hôte doit éviter la rencontre de cet ennemi, et en cas de rencontre, éviter l'oviposition. Toutefois, si le parasitoïde parvient à déposer un œuf dans cet hôte, ce dernier peut présenter d'autres moyens de défense pouvant limiter le développement du parasitoïde en place (Gross, 1993). Eviter la rencontre avec le parasitoïde Afin d'éviter la rencontre avec la parasitoïde, l'hôte doit être sensible à tout indice environnemental permettant d'estimer le risque local de parasitisme. Chez un hôte de parasitoïde, une estimation à priori de ce risque est possible par la perception de la présence de l'ennemi naturel, indice direct de risque, ou de l'activité de cet antagoniste, indice indirect de risque. Ces indices indirects peuvent informer l'hôte d'une attaque en cours (perception d'un message d'alarme émis par des congénères) ou passée (rencontre de congénères blessés ou tués). La perception de ces indices peut être visuelle, physique ou encore chimique et semble courante chez les victimes d'ennemis naturels (Peacor, 2003). Pour éviter la détection par le parasitoïde, les hôtes peuvent réduire les indices de leur présence (Vet et al. , 1991). Certaines chenilles se déplacent ainsi fréquemment entre des prises de nourritures courtes. Les mouvements vers un nouveau site permettent de diminuer les risques de rencontre avec des prédateurs (Mauricio & Bower, 1990). Concernant les défenses comportementales vis-à-vis des parasitoïdes, les pucerons sont certainement les organismes hôtes les plus étudiés. Lorsqu'ils sont attaqués, ils émettent par leurs cornicules (structures tubulaires se dressant sur la partie postérieure de leur abdomen) des sécrétions contenant une phéromone d'alarme nommée (E)-farnesene (EBF) (Pickett & Griffith, 1980) (Figure 1. 1. ). Elle est perçue par les autres pucerons présents dont la principale réaction est alors la fuite (par déplacement ou chute) (Goff & Nault, 1974 ; Mondor et al. , 2000). Différents facteurs tels que la densité des ennemis naturels, la qualité de la plante hôte ou l'état physiologique du puceron influence la probabilité de fuite (Losey & Denno, 1998a ; 1998b ; Villagra et al. , 2002). Il existe également des variations dans ces comportements selon l'origine et la couleur du clone (Braendle & Weisser, 2001 ; Kunert et al. , 2010). La perception de cette phéromone peut également entrainer la production croissante de descendants ailés (Sloggett & Weisser, 2002 ; Kunert et al. , 2005). Les hôtes sont également capables d'estimer le risque local de parasitisme lors de la colonisation d'un nouvel habitat. En présence de traces de parasitisme (par exemple, présence de cadavres imputables aux parasitoïdes), les populations de pucerons se dispersent plus sur les plantes de l'environnement. La dilution' de la population dans l'espace pourrait donc réduire la probabilité de perception par l'ennemi et donc, la probabilité de rencontre (Fievet et al. , 2008). La présence de cadavres dans une colonie de pucerons peut également induire une réduction de leur fuite : les pucerons restent à côté de leurs morts. La motivation des parasitoïdes à rester dans une colonie de pucerons diminuant plus rapidement en présence de ces cadavres, le risque d'être parasité est ainsi diminué. Ainsi, en restant proches des cadavres, les pucerons ont moins de chances d'être attaqué par un parasitoïde (Fievet et al. , 2009). Eviter l'attaque du parasitoïde Chez les espèces hôtes, les stratégies limitant l'attaque du parasitoïde sont classées en 5 catégories (Gross, 1993) : (1) les défenses morphologiques (comme l'épaisseur de la cuticule parfois suffisante pour empêcher l'oviposition du parasitoïde (e. g. Gelman et al. , 2005), (2) les comportements de fuite afin de s'extraire du danger (e. g chutes de la plante, ou déplacements des individus), (3) les comportements agressifs pour déstabiliser ou affecter l'ennemi (e. g. mouvements brusques du corps parfois suffisants pour éjecter le parasitoïde), (4) la protection collective (e. g. garde des congénères) et (5) la protection interspécifique. L'attaque peut être évitée de manière active ou passive et elle intervient au contact de l'ennemi (Gross, 1993). Les pucerons en sont de bons exemples car on y retrouve ces 5 catégories de stratégies de défense. Ils développent des défenses individuelles comme des comportements agressifs et/ou des comportements de fuite : l'individu attaqué manifeste des mouvements brusques du corps, donne des coups de patte envers son ennemi ou échappe à l'attaque en fuyant ou en se laissant tomber au sol (Gross, 1993). Chez les quelques espèces aphidiennes eusociales (e. g. Pemphigidés), il existe une caste dite soldat'. Ces individus possèdent une morphologie différenciée, des pattes antérieures renforcées et une ou deux cornes sur le front, et patrouillent autour de la colonie et agressant tout ennemi potentiel (Stern et al. , 1997 ; Fukatsu et al. , 2005). Chez d'autres espèces, la sécurité de la colonie peut être assurée par des fourmis, nourries en échange par les pucerons (Hlldebler & Wilson, 1990). Enfin, un moyen de défense collective des pucerons sont les sécrétions corniculaires. De nature collante, elle peut engluer les organes essentiels du parasitoïde (antenne, ovipositeur) (Figure 1. 1. ). L'ennemi touché par cette sécrétion doit alors investir beaucoup de temps dans le toilettage de l'organe affecté (Wu et al. , 2010). Figure 1. 1. Emission de sécrétions corniculaires chez des pucerons attaqués par un parasitoïde (Photo par B. Chaubet) Les coûts des défenses comportementales L'efficacité de ces comportements de défense peut être contrebalancée par les coûts qu'ils représentent pour l'hôte. L'allocation énergétique associée à la défense peut être importante et peut s'exprimer sous la forme de compromis entre diverses fonctions (e. g. réduction de la fécondité). L'expression de la défense peut également avoir des coûts indirects comme la modification de la nature des interactions avec les espèces. Ces coûts, dits écologiques, se manifestent à travers l'altération d'une interaction avec un mutualiste ou l'intensification d'une interaction avec un antagoniste (Cipollini et al. , 2003 ; Heil & Baldwin, 2002). Par exemple, l'augmentation de la résistance aux parasitoïdes des lignées sélectionnées de larves de drosophiles s'accompagne d'une diminution de leurs capacités compétitives (Kraaijeveld & Godfray, 1997). Chez les pucerons, le comportement de chute s'accompagne d'un risque de dessiccation ou de prédation par des invertébrés terrestres (Roitberg & Myers, 1979 ; Losey & Denno, 1998b). Les comportements induisent aussi des pertes énergétiques ou des réductions du temps alloué à l'activité alimentaire (Nelson, 2007 ; Fievet et al. , 2008). Chez les aphides, la production de sécrétions corniculaires est coûteuse en énergie, réduisant les réserves lipidiques destinées au développement, à la reproduction ou encore à la dispersion (Dillwith et al. , 1993 ; Mondor & Roitberg, 2003 ; Byers, 2005). Les sécrétions corniculaires peuvent également stimuler l'attaque de certains prédateurs ou parasitoïdes (Grasswitz & Paine, 1992 ; Micha & Wyss, 1996 ; Boo et al. , 1998 ; Zhu et al. , 1999 ; Al Abassi et al. , 2000 ; Outreman et al. , 2010). Les défenses immunitaires des hôtes Pour les hôtes tués ou paralysés de manière permanente au moment de l'oviposition, la prévention de l'attaque du parasitoïde est la défense la plus efficace. En revanche, chez certaines espèces de parasitoïde, l'hôte est maintenu en vie une fois l'oviposition effectuée. Dans ce cas, des défenses physiologiques basées sur l'immunité interviennent. Les invertébrés ont développé, au cours de l'évolution, un système de défense inné complexe et efficace. Même si ce système se diffère en de nombreux points à celui des vertébrés, il est tout de même qualifié d'immunitaire'. (Vilmos & Kurucz, 1998). Chez les insectes, les mécanismes de l'immunité sont particulièrement étudiés chez le modèle drosophile (Drosophila melanogaster) dans le cadre de l'interaction avec ses parasitoïdes (Carton et al. , 2008). Le système immunitaire des insectes repose entièrement sur l'immunité innée et s'appuie sur des réponses à la fois cellulaires et humorales qui s'imbriquent étroitement dans le temps lors de l'activation du système immunitaire (Gillespie et al. , 1997 ; Nappi & Ottaviani, 2000). Ces réponses sont initiées par la reconnaissance de motifs moléculaires conservés, présents à la surface de tout organisme étranger comme le parasitoïde immature (Hoffmann & Reichhart, 2002 ; Siva-Jothy et al. , 2005). La forme la plus courante de réponse immunitaire chez les hôtes est l'encapsulation : lorsque des molécules du non-soi sur les œufs de parasitoïdes sont détectées, les hémocytes1 prolifèrent, grandissent, adhèrent les unes aux autres, et s'agrègent autour du corps étranger. Elles forment alors des capsules provoquant l'asphyxie du parasitoïde (Gillespie et al. , 1997). Chez la drosophile, les observations cytologiques et biochimiques de la réponse initiale montrent clairement que l'œuf est tué très peu de temps après l'oviposition, et ceci bien avant sa complète séquestration par la capsule (Russo et al. , 2001). Un mécanisme universel chez les insectes accompagnant l'encapsulation par les hémocytes est le dépôt de mélanine2 sur la surface du parasite (Carton et al. , 2005). La mélanine est synthétisée via la cascade de la phénoloxydase. La mélanine peut être transportée activement vers la cuticule pour participer à sa sclérotisation. Elle est observée au niveau des lésions ou des capsules hémocytaires et intervient donc dans les processus de coagulation et d'encapsulation (Gillespie et al. , 1997). Des molécules cytotoxiques et des enzymes sont générées au cours de la mélanogenèse en réponse à l'infection. Ces facteurs peuvent oxyder les lipides membranaires des parasites et bloquer leur déplacement dans les tissus de l'hôte (Kumar et al. , 2003). Evolution de la résistance des hôtes Le parasitisme constitue une forte pression de sélection et induisent l'évolution des mécanismes de résistance chez les hôtes. Le couple hôte drosophile/parasitoïde Asobara tabida reste le modèle le plus étudié dans l'évolution de la résistance (Kraaijeveld et al. , 1998). Plusieurs approches sont utilisées pour étudier l'évolution de la résistance. Elles se Les hémocytes sont des cellules circulant dans l'hémolymphe des insectes et assurant leur réponse immunitaire cellulaire. La mélanine est un pigment noir responsable de la coloration des téguments dans le règne animal basent sur des comparaisons de facteurs physiologiques de la résistance entre différentes lignées ou espèces proches. Des expérimentations réalisées en conditions contrôlées permettent le suivi des niveaux de résistance des populations d'hôtes soumis à différentes pressions de parasitisme sur plusieurs générations. Une évolution expérimentale des drosophiles soumises à deux parasitoïdes, A. tabida et Leptopilina boulardi ont notamment été effectuées. Les pourcentages d'encapsulation des populations hôtes ont ainsi pu être augmentées de 0, 5% jusqu'à 60% en seulement 5 générations d'hôtes (Kraaijeveld & Godfray, 1997 ; Fellowes et al. 1998). Les larves de drosophiles sélectionnées possèdent beaucoup plus d'hémocytes circulant dans l'hémocœle par rapport aux lignées contrôles (sans pression parasitaire) (Kraaijeveld et al. , 2001). Les hôtes de parasitoïdes présentent ainsi une diversité de stratégies de défense. Ces défenses sont le plus souvent héritables et peuvent ainsi se propager dans la population hôte induisant de fortes pressions de sélections sur les parasitoïdes. Des stratégies permettant leur contournement peuvent alors être favorablement sélectionnées. 2. Exploitation de l'hôte par le parasitoïde Le parasitoïde doit prendre plusieurs décisions comportementales pour son approvisionnement en hôtes. Le choix de la stratégie à adopter dans la répartition de son temps de vie et de son stock d'œufs dans son habitat, et le choix de l'individu à parasiter est très important : chacune de ces décisions aura une incidence directe sur la production de descendants. Par conséquent, ces comportements sont sujets à dimportantes pressions de sélection. Les stratégies d'exploitation de l'hôte sont différentes chez le parasitoïde adulte (étape pré-ovipositionnelle) et chez l'individu immature (étape post-ovipositionnelle). Les stratégies d'exploitation des hôtes par les parasitoïdes adultes La phase libre des parasitoïdes implique une contrainte biologique forte : la femelle adulte doit activement rechercher et sélectionner les hôtes susceptibles de recevoir ses œufs et d'assurer le développement larvaire. Une femelle parasitoïde ne se trouve pas toujours, à l'émergence, à proximité des hôtes à attaquer. Depuis les années 1930, de nombreuses études ont démontré le rôle important des signes olfactifs, visuels ou acoustiques dans la détection des hôtes ou de leur habitat (Godfray, 1994). Ces indices sont directs, c'est-à-dire qu'ils sont émis par les hôtes potentiels ; ou bien indirects, c'est-à-dire issus de l'habitat de l'hôte. Certaines plantes attaquées par des phytophages peuvent émettre des signaux moléculaires volatiles qui attirent les ennemis naturels, dont les parasitoïdes (Vinson, 1999 ; Allison & Hare, 2009). Certains hôtes émettent aussi des signaux chimiques ou kairomones, qui attirent les parasitoïdes. Les mécanismes impliqués sont complexes et parfois très spécifiques. Ils sont associés à de fortes pressions de sélection et des mécanismes adaptatifs subtils : un changement simple d'un groupement de la molécule peut entièrement annuler la reconnaissance par la femelle (Godfray, 1994). La femelle doit s'assurer que l'hôte détecté peut convenir au développement de sa descendance. Il doit s'agir de la bonne espèce, du stade de développement adéquat avec un état physiologique satisfaisant. La femelle examine les caractères externes (forme du corps, couleur, taille) et internes de l'hôte à l'aide de récepteurs situés au niveau des antennes et de l'ovipositeur. La taille de l'hôte est par exemple un facteur important car il reflète de la quantité de ressources disponible pour la larve (Hemerick & Harvey, 1999). Les descendants issus dhôtes plus petits sont généralement de taille réduite, avec des fécondités et longévités plus faibles (Bernstein et al. , 2002 ; Rivero & West, 2002 ; Pelosse et al. , 2007). Chez les parasitoïdes solitaires, seule une larve peut se développer à l'intérieur d'un hôte. Les femelles utilisent alors un marquage externe et/ou interne à l'hôte pour vérifier s'il n'est pas déjà parasité. Cette capacité discriminatoire existe chez de nombreuses espèces mais le superparasitisme est courant dans la nature (Godfray, 1994). Ce comportement peut lui aussi être adaptatif dans certaines conditions. La tendance à superparasiter augmente lorsque l'habitat présente peu d'hôtes ou que la femelle a une faible espérance de vie (van Alphen & Visser, 1990 ; Plantegenest et al. , 2004). La stratégie adoptée par le parasitoïde dans chacune de ses décisions aura une incidence directe sur la production de descendants. L'hypothèse de la sélection naturelle prédit qu'un individu aura le comportement qui lui permet de tirer le meilleur parti des contraintes génétiques et environnementales qui lui sont imposées. Il maximisera ainsi le nombre de copies de ses gènes dans la génération suivante. Ces comportements ne sont que les premières étapes du processus de parasitisme. L'exploitation optimale de l'hôte doit être assurée par la larve qui y est déposée. Les stratégies d'exploitation des hôtes par la larve parasitoïde Le parasitoïde immature doit éviter l'encapsulation par les cellules du système immunitaire de l'hôte. Les parasitoïdes peuvent limiter les interactions avec l'immunité de l'hôte par de l'ectoparasitisme ou le développement dans des stades ou tissus non protégés (par exemple, les organes o l'hémocœle ne circule pas). Les Trichogrammes, par exemple, infestent son hôte lépidoptère au stade œuf, stade présentant que de faibles réponses immunitaires (Poirié et al. , 2009). Chez de nombreux diptères parasitoïdes, les larves construisent une pellicule protectrice autour de leurs corps (e. g. Asgari et al. , 1998). La synchronisation du développement des deux antagonistes est nécessaire pour assurer la survie du parasitoïde. Certains utilisent les hormones de l'hôte pour ajuster leur propre développement. D'autres parasitoïdes perturbent les cycles de développement de leurs hôtes en induisant des mues précoces (ou supplémentaires) ou en le bloquant à un stade immature (Beckage & Gelman, 2004). Les armes du parasitoïde lui permettant de surmonter le système immunitaire et de réguler le développement de l'hôte sont la virulence et les facteurs de régulation. Dans de nombreuses familles de parasitoïdes (Braconidés, Scelionidés ou encore Trichogrammatidés), la membrane séreuse entourant l'embryon du parasitoïde se décompose pour former des cellules individuelles qui grossissent dans le corps de l'hôte mais ne se multiplient pas. Elles sont nommées tératocytes et on peut en dénombrer de 15 à 800 dans un seul hôte en fonction de l'espèce. Le rôle des tératocytes dans les processus de régulation n'a été étudié que chez un nombre limité d'espèces (en général des Braconidés) (Grimaldi et al. , 2006). Plusieurs fonctions ont été proposées. Elles auraient un rôle trophique : elles peuvent être ingérées par le parasitoïde après le prélèvement par ces cellules de substances de l'hémolymphe de l'hôte. Les tératocytes auraient également un rôle important dans la manipulation de la physiologie et de la biochimie de l'hôte pour créer un environnement favorable au développement de la larve. Les tératocytes issus de l'œuf de Cotesia kariyai sécrètent une enzyme qui dégrade les corps gras de l'hôte lépidoptère Pseudaletia separata permettant à la larve de s'en nourrir (Nakamatsu et al. , 2002). Les tératocytes peuvent enfin sécréter des substances qui interférent avec le système immunitaire et participent à l'immunoévasion ou au ralentissement des défenses physiologiques de l'hôte (Beckage & Gelman, 2004 ; Pennachio & Strand, 2006). Par exemple, la cascade de la phénoloxydase dans l'hémolymphe de l'hôte papillon Pieris rapae crucivora est inhibée par l'action des tératocytes du parasitoïde Cotesia glomerata (Kitano et al. , 1990). Les facteurs de virulence Lors de l'oviposition, les femelles injectent des facteurs dits de virulence. Ces molécules sont impliquées dans deux processus : (1) l'évitement, la destruction ou le contournement du système immunitaire de l'hôte ; (2) la régulation à long terme des processus physiologiques de l'hôte dans le but de favoriser le développement du parasitoïde (Thomas et al. , 2009). Enfin, plusieurs espèces détruisent le système immunitaire de l'hôte grâce aux facteurs de virulence produits par les glandes à venin, les ovaires ou par des glandes du tractus génital et injectés par la femelle lors de l'oviposition (Moreau et Guillot, 2005). Le venin est probablement l'outil ancestral de lutte des parasitoïdes et les études sur le sujet sont nombreuses : Beckage & Gelman, 2004 ; Pennachio & Strand, 2006 ; Poirié et al. , 2009. Selon les espèces, les molécules du venin correspondent à des protéines sécrétées, ou à des associations du parasitoïde avec des polydnavirus (notés PDVs pour Disperse DNA Viruses) et des particules d'allure virale (dites VLPs pour Virus-Like Particles) (Dupas et al. , 1996 ; Drezen et al. , 2003 ; Labrosse et al. , 2005). Les protéines sécrétées peuvent influer directement la cascade de la phénoloxydase et/ou les hémocytes chez l'hôte via des phénomènes d'apoptose ou des altérations morphologiques hémocytaires associées à une incapacité à former une capsule autour de l'œuf parasitoïde (Labrosse et al. , 2005). La protéine LbGAP par exemple a été isolée du venin du parasitoïde de drosophile Leptopilina boulardi et entre dans des cellules spécifiques de l'hôte pour interagir avec deux protéines nécessaires à l'encapsulation. En altérant la morphologie de ces cellules, la LbGAP empêche l'immunité de s'exprimer (Colinet et al. , 2008). Certains facteurs du venin ont la capacité de castrer les hôtes. Les ressources allouées à leur reproduction seraient détournées en faveur du développement du parasitoïde. Certaines protéines sécrétées par la larve de parasitoïde en place assurent le transport des acides gras du site de digestion des tissus de l'hôte jusqu'à elle (Falabella et al. , 2005 ; 2007). Les PDV (PolyDnaVirus) et VLP (Virus Like Particles) sont parmi les facteurs de virulence les plus originaux, notamment de par leur nature et leur structure protéique organisée. Les polydnavirus constituent le premier exemple de symbiose virus/eucaryote décrit à ce jour (Espagne et al. , 2004) et sont familles spécifiques (Hyménoptères Braconidés et Ichneumonidés). Les VLP possèdent une structure proche des virus mais sont dépourvues en acides nucléiques. La réplication des PDVs ne se fait que dans certains tissus et à des moments précis du développement du parasitoïde immature. Leur action est ciblée, permettant d'ajuster dans le temps et dans l'espace, les besoins de la larve aux fonctions de l'hôte (Pennachio & Strand, 2006). Les virus peuvent également lutter contre le système immunitaire de l'hôte. Par exemple, les molécules émises par le PDV CiV12 de la guêpe parasitoïde Cotesia inanitus provoquent une métamorphose précoce et un arrêt de développement au stade prépupal de son hôte papillon Spodoptera littoralis (Grossniklaus- Brgin et al. , 1998). Il semble que l'ADN des PDV se soit intégré dans le génome de l'insecte au cours de l'évolution symbiotique entre ces deux acteurs (Drezen et al. , 2003 ; Federici & Bigot, 2003 ; Dupuy et al. , 2006). Ainsi, les rôles respectifs des différents partenaires dans la synthèse des facteurs de virulence et leur maintien restent difficiles à évaluer. Des études, caractérisant les gènes viraux exprimés durant le parasitisme, sont nécessaires pour comprendre comment leurs produits interfèrent avec la physiologie de l'hôte. Evolution de la virulence des parasitoïdes Les parasitoïdes peuvent présenter un spectre d'hôtes plus ou moins large. Il est suggéré que la stratégie de virulence peut conduire à l'évolution de spécificité hôte- parasitoïde. Les espèces koïnobiontes3 devraient donc posséder une gamme d'hôtes plus réduite que les idiobiontes4 dans la mesure o elles doivent évoluer pour surmonter les défenses immunitaire de l'organisme infesté. L'évolution des molécules ou l'acquisition de nouveaux facteurs de virulence chez un parasitoïde devrait donc mener à des altérations des spectres d'hôtes. Plusieurs approches sont aujourd'hui utilisées pour répondre à ces questions. Elles sont particulièrement axées sur les mécanismes, et s'attardent peu à l'échelle des populations. Les recherches concernent, par exemple, l'analyse et la comparaison des facteurs de virulence entre espèces et familles plus ou moins proches. Plusieurs études mesurent également les variabilités intraspécifiques de la virulence (Poirié et al. , 2009). Les parasitoïdes koïnobiontes ne tuent pas directement leurs hôtes au moment de l'oviposition, mais ce dernier meurt au cours du développement de l'individu qui le parasite. La femelle parasitoïde idiobionte tue ou paralyse l'hôte avant d'y pondre son œuf Ces approches permettent l'analyse des pressions de sélection conduisant à des changements dans l'efficacité ou la spécificité des molécules de la virulence. Une telle variabilité due à des modifications de gènes majeurs n'a été décrite que dans peu d'espèces de parasitoïdes (Dupas et al. , 2003 ; Dubuffet et al. , 2007). Chez L. boulardi, deux types de femelles montrent des propriétés de virulence opposées envers les espèces hôtes Drosophila melanogaster et D. yakuba. Ces femelles diffèrent ainsi dans leurs stratégies de virulence qui semblent corrélée avec les variations dans leurs comportements de choix de l'hôte (Dubuffet et al. , 2006 ; Dubuffet et al. , 2008). Une telle corrélation entre traits physiologiques et comportementaux est une des conditions requises dans un modèle de spécialisation par changement d'hôte (Poirié et al. , 2009). III. Les hôtes et leur réseau d'interactions L'hôte d'un parasitoïde se situe dans un réseau d'interactions interspécifiques. Il consomme d'autres espèces, est exposé à des compétiteurs, peut être la proie de plusieurs prédateurs ou peut héberger des microorganismes symbiotiques. Toutes ces interactions vont affecter les traits d'histoire de vie des hôtes et le fonctionnement de leurs populations. Compte tenue de l'intimité particulière entre un parasitoïde et son hôte, tout facteur influençant les caractéristiques de l'hôte influera les aptitudes du parasitoïde. C'est pourquoi, les réseaux d'interactions de l'hôte peuvent modifier le fonctionnement et l'évolution des interactions hôtes-parasitoïdes. 1. Interaction de l'hôte avec sa plante De la spécialisation alimentaire à la spéciation De nombreux insectes hôtes de parasitoïdes sont phytophages. Certains utilisent un nombre limité de plantes hôtes sur lesquelles ils effectuent une grande partie de leur cycle biologique (reproduction, site de ponte) (Feder & Forbes, 2010). Ces phytophages peuvent montrer une forte spécialisation vis-à-vis de leurs plantes hôtes, même lorsqu'elles sont présentes dans un habitat commun (en sympatrie) (Schluter, 2001). De nombreux végétaux présentent des résistances aux phytophages et les herbivores spécialisés sur ces plantes auraient acquis des mécanismes de contournement des résistances permettant leur exploitation (Ridley, 2004). Les phytophages spécialisés ont une forte préférence pour leur plante hôte, car elle est le plus souvent liée à des meilleures performances par rapport à une plante alternative (Gripenberg et al. , 2010 ; Scriber, 2010). Comme les individus spécialisés possèdent une valeur sélective supérieure sur leur plante hôte, la sélection naturelle va favoriser le maintien de cette spécialisation. Les populations de phytophages spécialisées sont dites races d'hôtes ou biotypes'. Ce sont des intermédiaires entre des populations polymorphes et des espèces complètement différenciées (Drès & Mallet, 2002). Cette formation de races d'hôtes, par le biais de la spécialisation alimentaire, engendre des divergences génétiques et phénotypiques profondes dans les populations sympatriques du phytophage. La spécialisation peut être favorisée par un accouplement préférentiel entre les individus d'une même race d'hôte, entrainant un isolement reproducteur (e. g. Emelianov et al. , 2003). Les flux géniques entre populations spécialisées sur des plantes hôtes distinctes sont alors contre sélectionnés. La réduction des flux de gènes augmenterait la divergence entre les biotypes qui pourraient, à terme, devenir des espèces différenciées (Schluter, 2001 ; Funk et al. , 2002). Les populations de phytophages spécialisés peuvent en outre posséder des phénotypes différents. Certaines espèces montrent des spécialisations morphologiques associées à la spécialisation alimentaire. Les populations de Jadera haematoloma (Hemiptera : Rhopalidae) sont structurées en races d'hôtes et possèdent des tailles de rostre adaptées aux fruits dont elles se nourrissent (Caroll & Boyd, 1992). Le puceron du pois A. pisum est aussi un exemple type de différenciation phénotypique en fonction des races d'hôtes. Ces races diffèrent par leur couleur, mode de reproduction, morphe de dispersion et le phénotype des mâles. Les populations d'A. pisum issues du pois (Pisum sativum) et de la fève (Vicia faba) montrent un investissement fort dans la phase sexuée de leur cycle biologique et produisent majoritairement des mâles ailés et aucun puceron de couleur rose n'a encore été relevé chez ces biotypes. A l'inverse, les pucerons issus du trèfle (Trifolium pratense) se reproduisent majoritairement de manière asexuée et produisent des mâles aptères. Les proportions d'individus roses y sont beaucoup plus importantes (Frantz et al. , 2009 ; 2010). Ces traits peuvent affecter les flux de gènes et les migrations entre les populations. Des associations spécifiques entres ces traits peuvent fortement réduire, ou faciliter les divergences écologiques et les différenciations génétiques. Par exemple, la reproduction sexuée (et les recombinaisons chromosomiques), ainsi que la production de mâles ailés favorisent les mélanges de populations. A l'inverse, la reproduction asexuée et les mâles aptères (non dispersants) diminuent les croisements entre populations (Frantz et al. , 2009). Conséquences sur les parasitoïdes : la différenciation associée à l'hôte Dans une situation de spécialisation alimentaire chez un hôte de parasitoïde, les parasitoïdes font face à des populations hôtes localement très structurées et très hétérogènes (tant d'un point de vue génétique que phénotypique). Cette spécialisation alimentaire des hôtes pourrait avoir des effets sur leurs ennemis naturels : elle pourrait entrainer une spécialisation parasitaire des parasitoïdes. Ce phénomène est appelé Effet Cascade' (Stireman et al. , 2006a). La spécialisation chez les parasitoïdes implique une forte fidélité à son hôte et une meilleure performance sur cet hôte. Selon Feder et Forbes (2010), ce processus constituerait un important générateur de biodiversité entomophage : la grande diversité des insectes phytophages aurait facilité la diversification de leurs parasitoïdes. Plusieurs analyses permettent d'illustrer des effets cascades. Des approches fonctionnelles (incluant des études sur le terrain et des expérimentations en laboratoire) démontrent comment l'adaptation et la spécialisation mènent à l'isolement reproducteur et la spéciation (Feder & Forbes, 2010). Le degré de spécialisation des populations peut être notamment évalué par des études de génétique des populations (e. g. Stireman et al. , 2006a ; Kolaczan et al. , 2009). Un exemple célèbre : le complexe Rhagoletis pomonella- Diachasma alloeum Rhagoletis pomonella est un diptère nuisible dont les larves se nourrissent de fruits. La plante hôte d'origine de cette mouche est l'aubépine. Cette espèce a été pour la première fois trouvée sur les pommes au 19ème siècle. Depuis, R. pomonella exploite plusieurs plantes hôtes : cerises, poires, myrtilles, etc. (Bush, 1969). Les individus trouvés sur les diverses plantes constituent des races de mouche différentes. Les femelles préfèrent pondre leurs œufs dans le fruit o elles ont émergé et l'accouplement se fait préférentiellement sur la plante hôte d'origine (Feder et al. , 1994 ; Forbes & Feder, 2006). Les individus sont aussi plus attirés par les composés volatils émis par leur fruit d'origine. Les différentes phénologies des plantes hôtes infestées par R. pomonella constituent des pressions de sélection sur l'éclosion des œufs et sur la diapause des pupes (Feder et al. , 2003). Les larves de la pomme se développent en 40 jours, celles de l'aubépine en 55-60 jours. Cet isolement allochronique accentue l'isolement reproducteur entre les mouches de l'aubépine et des pommes car il rend difficile leur rencontre (Linn et al. , 2003 ; Dambroski et al. , 2005 ; Dambroski & Feder, 2007). Ainsi, il est admis que les différentes adaptations de la mouche à de nouvelles plantes a généré des barrières écologiques réduisant les flux de gènes entre les races et entrainant un phénomène de spéciation (Filchak et al. , 2000). Les mouches R. pomonella sont des hôtes de trois espèces de parasitoïdes hyménoptères Braconidés (Rull et al. , 2009). Les femelles parasitoïdes de Diachasma alloeum examinent la surface des fruits pour détecter la présence d'œufs ou de larves de mouches. Lorsqu'un hôte est trouvé, la femelle procède à l'oviposition au travers du fruit. Cette espèce montre une différenciation génétique et écologique en fonction de la race de R. pomonella. Des marqueurs microsatellites séparent les parasitoïdes issus des mouches de l'aubépine de celles des myrtilles (Forbes et al. , 2009). Tout comme leurs hôtes, les parasitoïdes s'accouplent préférentiellement sur leur fruit d'origine et sont plus attirés par les composés volatils émis par la plante de leur race d'hôte d'origine. Par conséquent, la différenciation des mouches R. pomonella aurait entrainé la différenciation de ses parasitoïdes. A terme, une spéciation des mouches, et de leurs parasitoïdes pourrait être envisagée (Forbes et al. , 2009 ; Feder & Forbes, 2010). La mise en évidence d'un effet cascade est récente (Stireman et al. , 2006a) et les exemples sont encore peu nombreux dans la littérature. Ils illustrent le rôle fondamental de la relation entre un hôte et sa plante sur l'évolution des interactions hôte parasitoïde. 2. Interaction de l'hôte avec des symbiotes Définitions La symbiose est une association hétérospécifique intime et durable entre deux ou plusieurs organismes. Elle est communément restreinte aux associations à bénéfice mutuel et de type obligatoire ; les symbiotes ne pouvant survivre séparément (Thomas et al. , 2010). Paradoxalement, certains organismes peuvent être appelés symbiotes malgré leur effet néfaste sur l'individu porteur. Le terme symbiote peut ainsi apparatre ambigu et la limite entre mutualisme, parasitisme et symbiose parfois très floue. On pourra alors parler de symbiose mutualiste lorsque l'interaction bénéficie aux deux partenaires, et de symbiose parasitaire lorsque le symbiote tire un bénéfice de l'interaction aux dépens de l'individu qui le porte (Thomas et al. , 2009). Les interactions entre le symbiote et son porteur peuvent ainsi se situer sur un continuum entre parasitisme et mutualisme (Haine, 2008). La symbiose est une interaction répandue chez les insectes. Les hôtes de parasitoïdes sont donc susceptibles d'abriter des microorganismes symbiotiques, le plus souvent des virus ou des bactéries (Moran et al. 2005 ; Moran, 2006). Les symbiotes obligatoires sont indispensables à la survie et/ou à la reproduction de l'individu porteur et se transmettent exclusivement verticalement5. Ils ont une origine ancienne car ils sont associés à la lignée de l'hôte depuis une longue période évolutive. Ce type d'association reflète une histoire de co-spéciation, souvent dérivée d'une seule origine, correspondant à un évènement d'infection unique par le symbiote (Pontes & Dale, 2006 ; Clark et al. , 2010). A l'inverse, la présence d'un symbiote facultatif n'est pas considérée essentielle à la survie de l'hôte. Les symbiotes facultatifs sont le plus souvent transmis verticalement. Toutefois, quelques événements de transmission horizontale semblent possibles et permettraient une propagation et un maintien accru dans les populations de leurs hôtes (Moran, 2006). Les symbiotes peuvent avoir une influence directe ou indirecte sur les insectes qui les abritent (Oliver et al. , 2010). L'avantage pour l'hôte est l'acquisition rapide d'un ensemble de gènes apporté par l'organisme symbiotique (Nardon & Grenier, 1993 ; Moran et al. , 2008). Les symbiotes ayant une transmission verticale présentent un taux de transmission intrinsèquement lié à la survie et la reproduction de leurs porteurs (Moran, 2006). Ces organismes symbiotiques devraient ainsi favoriser la fitness du porteur pour assurer leur transmission. Par exemple, ces symbiotes peuvent augmenter la fécondité ou diminuer le taux de mortalité de leurs hôtes. A l'inverse, certains symbiotes ne favorisent pas la fitness des hôtes mais manipulent leur reproduction. En accroissant la production de femelles infectées, ces symbiotes favorisent leur transmission verticale. Même si ces symbiotes induisent des coûts importants à leurs hôtes (Min & Benzer, 1997), la manipulation de la reproduction leur permet une invasion rapide de la population hôte. Les microorganismes se transmettent verticalement des parents à leur descendance et horizontalement d'un hôte à un autre. Les symbiotes et l'utilisation de la plante par les insectes phytophages De nombreuses études ont mis en évidence l'aide nutritionnelle apportée par des symbiotes à leurs insectes hôtes. Certaines bactéries possèdent des fonctions enzymatiques qui permettent la dégradation de la cellulose par leurs hôtes xylophages (e. g. Tokuda & Watanabe, 2007). Des symbiotes obligatoires portent de nombreux gènes de synthèse d'acides aminés essentiels, d'acides gras, de vitamines etc. Ces fonctions sont essentielles au métabolisme de l'insecte porteur (Clark et al. , 2010). Les individus peuvent même parfois abriter plusieurs symbiotes obligatoires qui leur fournissent des nutriments complémentaires. Le symbiote Sulcia muelleri apporte des acides aminés essentiels et le symbiote Baumannia cicadellinicola apporte des vitamines à leur hôte psyllide, Homalodisca coagulata (McCutcheon et al. , 2009). La co-diversification des symbiotes obligatoires et de leurs hôtes a été plusieurs fois démontrée pour une large variété d'insectes (Moran et al. , 2008 ; Clark et al. , 2010 ; Toft & Andersson, 2010). Des mutations dans le génome d'un symbiote peuvent influencer les fonctions métaboliques qui lui sont associées. Ces changements peuvent modifier les aptitudes phénotypiques d'un hôte sur une plante particulière (Moran et al. , 2008 ; Clark et al. , 2010). Clark et al. (2000) et Jousselin et al. (2009) ont montré par exemple que Buchnera et ses pucerons hôtes du genre Uroleucon et Brachycaudus ont subi une co-diversification et une co-spéciation. A travers leur aide nutritionnelle, les symbiotes peuvent donc entrainer la spécialisation de leurs hôtes, et par conséquent, une spécialisation parasitaires de leurs parasitoïdes (effet cascade de la spécialisation). Les symbiotes protecteurs A l'inverse des symbiotes qui se transmettent verticalement, les parasites à transmission horizontale ont tendance à réduire la fitness de leurs hôtes en augmentant leur mortalité (Lively et al. , 2005). Dans un hôte, un conflit peut alors apparatre entre les parasites à transmission horizontale et les symbiotes à transmission verticale. La résolution de ce conflit est possible lorsque les symbiotes confèrent une résistance à leur porteur contre les parasites (Jones et al. , 2007 ; Haine, 2008). Les microorganismes peuvent synthétiser une grande variété de composé actifs qui sont utilisés comme des moyens de défense par leurs hôtes. Les symbiotes peuvent apporter une protection à leur porteurs contre des pathogènes, des parasites, ou même des prédateurs. Parmi les insectes, les symbiotes protecteurs des pucerons sont les plus étudiés et les mieux connus (Oliver et al. , 2010). Ce sont des symbiotes facultatifs et certains peuvent protéger leur porteur contre des champignons pathogènes. Regiella insecticola augmente la survie de son hôte Acyrthosiphon pisum, parasité par le champignon Pandora neoaphidis et diminue la reproduction de ce pathogène (Ferrari et al. , 2004 ; Scarborough et al. , 2005). Les symbiotes peuvent également protéger leur porteur contre des insectes parasitoïdes. Deux symbiotes facultatifs, Serratia symbiotica et Hamiltonella defensa, confèrent une protection à leur puceron hôte, A. pisum, contre les hyménoptères parasitoïdes Aphidius ervi et Aphidius eadyi (Oliver et al. , 2003 ; Oliver et al. , 2006 ; Ferrari et al. , 2004). Des associations symbiotiques particulières dans un même puceron du pois permettent aussi une résistance accrue aux parasitoïdes (Nyabuga et al. , 2010). Chez l'aleurode du tabac Bemisia tabaci, une étude met en évidence une protection conférée par la bactérie symbiotique facultative Rickettsia contre le parasitoïde Eretmocerus mundus (Mahadav et al. , 2008). Enfin, certains symbiotes produisent des composés toxiques qui protègent leurs hôtes contre les prédateurs. Une bactérie du genre Pseudomonas sécrète une toxine nommée pederin qui protège des coléoptères du genre Paederus de la prédation par des araignées loup (Kellner & Dettner, 1996 ; Kellner, 2002). Des symbiotes peuvent ainsi conférer une forte résistance à leurs hôtes contre les parasites. Toute résistance de l'hôte constituera une pression de sélection sur les ennemis du porteur. Les micropartenaires peuvent ainsi jouer un rôle important dans les processus coévolutifs entre espèces antagonistes (Haine, 2008). Les symbiotes manipulateurs de la reproduction A l'inverse des symbiotes décrits auparavant, les espèces symbiotiques qui manipulent la reproduction favorisent leur expansion au dépend de la fitness de leurs hôtes. Cardinium sp. et Wolbachia pipentis sont les symbiotes manipulateurs de la reproduction les plus étudiés. Ils sont présents chez de nombreux arthropodes (Stouthamer et al. , 1999 ; Hunter et al. , 2003 ; Hilgenboecker et al. , 2008) et sont transmis verticalement. Une bactérie du genre Rickettsia peut également manipuler la reproduction de ses hôtes hyménoptères (Giorgini et al. , 2010). Ces symbiotes provoquent des incompatibilités cytoplasmiques entre des souches d'hôtes d'une même espèce (e. g. Fu et al. , 2010), des parthénogénèses chez des hôtes à reproduction sexuée (e. g. Rodriguero et al. , 2010), et d'autres mécanismes biaisant la sex-ratio en faveur des femelles (Stouthamer et al. , 1999 ; Hurst & Jiggins, 2000). Wolbachia sp. , par exemple, est surtout transmise verticalement mais certains transferts horizontaux sont possibles dans les populations naturelles (majoritairement par les ennemis naturels des hôtes ; Jaenike et al. , 2007 ; Raychoudhury et al. , 2009). La manipulation de la reproduction des hôtes en faveur des femelles permet à ces symbiotes d'envahir rapidement la population hôte. Ces symbiotes, agissant sur la reproduction, pourraient provoquer l'émergence de nouvelles espèces. Les incompatibilités entre les mâles et les femelles provoquées par Wolbachia empêchent les croisements entre individus possédant des souches différentes de symbiotes (e. g. Bordenstein & Werren, 2007). Ces incompatibilités peuvent également induire des isolements reproducteurs entre individus d'une même espèce (Vavre et al. , 2009). A terme, les symbiotes manipulateurs de la reproduction pourraient même provoquer des spéciations (Charlat et al. , 2003 ; Vavre et al. , 2009). La manipulation de la reproduction par des symbiotes peut également être observée chez de nombreux hyménoptères parasitoïdes. Le mode de reproduction haplo-diploïde des hyménoptères parasitoïdes les rend plus sensibles à la manipulation de la reproduction (Vavre et al. , 2009). Ces symbiotes sont particulièrement étudiés chez les parasitoïdes de drosophiles (Vavre et al. , 2009), chez les Ptéromalidae du genre Nasonia (Bordenstein & Werren, 2007) et chez les Trichogrammes (Pintureau et al. , 2002). De nombreuses espèces de parasitoïdes de drosophiles peuvent présenter plusieurs souches de Wolbachia. Un seul individu Asobara tabida peut, par exemple, abriter trois souches différentes de cette bactérie (Vavre et al. , 1999). Dans de nombreux cas, la même souche de Wolbachia est trouvée chez la drosophile et son parasitoïde (Vavre et al. , 1999 ; Baldo et al. , 2006). Ces observations suggèrent que les interactions entre l'hôte et son parasitoïde ont favorisé la transmission horizontale de Wolbachia dans les communautés de drosophiles-parasitoïdes. Les Wolbachia montrent une importante diversité phénotypique chez les parasitoïdes de drosophiles. Les bactéries peuvent provoquer une incompatibilité cytoplasmique qui, dans sa forme la plus simple, apparait lors des croisements entre mâles infectés et femelles saines (Poinsot et al. , 2003). Chez Leptopilina clavipes, L. australis et Asobara japonica, Wolbachia induit une parthénogenèse (Werren et al. , 1995 ; Kremer et al. , 2009). La thélytoquie chez L. clavipes est produite par diploïdisation des œufs haploïdes. Ce mécanisme intervient durant l'anaphase de la première mitose somatique et génère des descendants totalement homozygotes (Pannebakker et al. , 2004). Enfin, Wolbachia est impliqué dans l'oogenèse chez Asobara tabida (Dedeine et al. , 2001). Une des souches de Wolbachia semble indispensable chez certaines femelles car sa suppression peut réduire la production d'oocytes jusqu'à complète stérilité (Dedeine et al. , 2001). Au delà de leur rôle dans la reproduction de leur porteur, ces symbiotes peuvent modifier l'interaction hôte-parasitoïde. La dynamique de cette interaction dépend des effets des symbiotes sur la fitness de l'hôte. Les coûts de l'infection par Wolbachia, peuvent se traduire par une diminution de la longévité de la drosophile D. melanogaster (Min & Benzer, 1997), modifiant l'interaction avec son parasitoïde (Vavre et al. , 2009). La parthénogenèse induite peut également avoir des conséquences génétiques importantes sur les hôtes. La duplication des gamètes (mécanisme impliqué dans la parthénogenèse induite par Wolbachia), empêche la recombinaison entre génotypes différents. Par conséquent, le manque de variations génétiques, ou l'absence d'élimination des allèles délétères que permet la reproduction sexuée, peut représenter un handicap dans la course aux armements entre l'hôte et le parasitoïde (Vavre et al. , 2009). Enfin, ces symbiotes peuvent modifier directement l'immunité de leur porteur : les drosophiles Drosophila simulans abritant Wolbachia sont moins résistantes aux parasitoïdes (Fytrou et al. , 2006). D'autres effets sur le phénotype des hôtes ont été décrits principalement chez le puceron du pois. Ces modifications sont dues à des symbiotes facultatifs qui peuvent modifier les performances alimentaires des hôtes (Tsuchida et al. , 2004), leur conférer une tolérance aux hautes températures (Montllor et al. , 2002) ou encore provoquer des variations dans leur couleur (Tsuchida et al. , 2010). L'interaction entre un symbiote et son hôte est particulièrement sujette à évolution. Les symbiotes coévoluent avec leurs hôtes, ou provoquent l'évolution d'individus interagissant avec leurs hôtes. L'influence des symbiotes sur l'interaction entre leurs porteurs et leurs ennemis naturels peut être indirecte, via la favorisation de la fitness de l'hôte ou directe, via une résistance conférée par les symbiotes. 3. Interaction de l'hôte avec des prédateurs Définition de la prédation Un prédateur est un individu d'une espèce tuant, dans un but alimentaire, un individu d'une autre espèce généralement plus petite, la proie. Certains prédateurs sont spécialistes' comptant une seule espèce de proie. D'autres sont des généralistes', comme les coccinelles qui se nourrissent de nombreuses espèces d'hémiptères, coléoptères, hyménoptères, diptères, ou de larves de lépidoptères (Evans, 2009). Lorsqu'un prédateur intervient dans l'interaction hôte-parasitoïde, alors il devient également le prédateur du parasitoïde : le prédateur peut se nourrir de proies parasités par un parasitoïde. Les conséquences sur le parasitoïde sont alors importantes car il entre en compétition avec le prédateur. Sa valeur adaptative ne dépendra donc pas seulement' de l'interaction avec son hôte, mais aussi de ses capacités compétitives vis-à-vis du prédateur. Prédateur et compétiteur : la prédation intraguilde La compétition interspécifique est une interaction entre espèces partageant une ressource commune. De nombreux compétiteurs sont souvent engagés dans des relations prédateurs-proies. Ce mélange entre compétition et prédation est appelé la prédation intraguilde (Holt & Polis, 1997). La ressource partagée est dite proie extraguilde', la proie intraguilde' est celle qui est consommée par le prédateur intraguilde'. La prédation intraguilde peut être bidirectionnelle (les deux membres de la guilde peuvent être des prédateurs intraguilde), ou unidirectionnelle (la proie intraguilde ne peut être prédateur intraguilde) (Rosenheim et al. , 1995) (Figure 1. 2). La prédation intraguilde peut être vue comme une force déstabilisante pour les communautés. Théoriquement, il est difficile d'atteindre un équilibre stable entre les trois espèces mises en jeu (Holt & Polis, 1997). Pour atteindre cet équilibre, la proie intraguilde doit être un compétiteur efficace dans l'exploitation de la ressource partagée. Si la proie intraguilde est moins compétitive que le prédateur, alors la combinaison de la compétition et de la prédation conduit à l'exclusion de cette espèce intermédiaire'. En revanche, si la proie intraguilde est plus compétitive que son prédateur pour l'exploitation de la ressource commune, alors les trois espèces peuvent coexister. Les proies intraguildes étant à la fois compétiteurs, prédateurs et proies, leur valeur sélective n'est pas seulement le fruit de l'interaction simple avec la proie (ou l'hôte) mais elle est également liée à leurs stratégies d'évitement des prédateurs (Borer et al. , 2007 ; Vance-Chalcraft et al. , 2007). (a) Guilde ENNEMI NATUREL 1 ENNEMI NATUREL 2 Prédateur intraguilde Proie intraguilde Proie extraguilde (b) Guilde ENNEMI NATUREL 1 ENNEMI NATUREL 2 Proie extraguilde Figure 1. 2. Schéma simplifié de prédation intraguilde unidirectionnelle (a) et bidirectionnelle (b). Les flèches représentent les relations de prédation ou de parasitisme. Certains facteurs peuvent affecter la stabilité du système. La structure de l'habitat peut réduire les rencontres entre les acteurs. Certaines proies profitent par exemple de refuges fournis par l'environnement, diminuant les rencontres avec les prédateurs. Ces refuges réduisent la force des interaction intraguilde, et facilitent la coexistence des espèces (Janssen et al. , 2007). La présence d'une seconde ressource (proie ou hôte) peut également modifier les interactions intraguildes. Si le prédateur ou la proie intraguilde peut exploiter cette ressource alternative, alors les pressions associées à la prédation intraguilde sont moins importantes (Holt & Huxel, 2007). La prédation intraguilde est très répandue notamment au sein des communautés de parasitoïdes (Rosenheim et al. , 1995 ; Arim & Marquet, 2004). A l'exception des interactions parasitoïde-parasitoïde, la prédation intraguilde est souvent unidirectionnelle. Le prédateur consomme le parasitoïde (proie intraguilde) qui se développe dans son hôte (la proie extraguilde). La prédation intraguilde est ainsi particulièrement étudiée dans le cadre de luttes biologiques contre des ravageurs (Rosenheim et al. , 1995 ; Bampfylde & Lewis, 2007). La consommation du parasitoïde par le prédateur peut avoir un effet important sur l'abondance du ravageur. Si le prédateur consomme exclusivement des proies parasitées, alors, à l'échelle d'une génération, le niveau de contrôle de la population de ravageurs reste similaire à celui atteint avec le parasitoïde seul. A plus long terme, les populations de parasitoïdes sont réduites, car prédatés, entrainant une diminution de la prédation, et une augmentation du nombre de ravageurs (e. g. Snyder & Yves, 2001). Par contre, si le prédateur consomme les deux types de proies (parasitées et non parasitées), ou seulement les proies non parasitées, le niveau de contrôle des ravageurs devient supérieur à celui atteint avec le parasitoïde seul. Plusieurs études ont montré que les parasitoïdes pouvaient détecter des signaux émis par les prédateurs sur la surface des plantes. Ces signaux leur permettraient d'éviter les zones o sont présents ces ennemis, o celles ayant déjà été explorées (e. g. Nakashima & Senoo, 2003 ; Nakashima et al. , 2004). Le parasitoïde Aphidius colemani montre des comportements de recherche de son hôte puceron Myzus persicae différents selon la présence ou non du prédateur (la punaise Macrolophus caliginosus). Lorsque ce dernier est présent, le parasitoïde quitte la colonie d'hôtes beaucoup plus rapidement. Les mécanismes d'évitement du prédateur aurait ainsi été sélectionnés chez les parasitoïdes (Martinou et al. , 2009). IV. Conclusion Les interactions hôtes-parasitoïdes évoluent sous l'influence d'un grand nombre de facteurs. Cette relation peut mener à une véritable course aux armements. Chacun des acteurs développe un panel de stratégies pour répondre aux pressions de sélection induites par l'antagoniste. Ces stratégies sont comportementales, permettant à l'hôte d'éviter son ennemi et d'éviter le parasitisme, ou au contraire, favorisant l'attaque chez le parasitoïde. Les stratégies impliquées sont également physiologiques, le parasitoïde utilisant des facteurs de virulence pour exploiter son hôte, et l'hôte luttant contre son ennemi immature grâce à son système de résistance. Cependant, les hôtes évoluent dans un réseau complexe d'interactions avec de nombreux autres organismes qui peuvent influencer la relation hôte- parasitoïde. A ce jour, l'étude des interactions multipartites (plante/symbiote/hôte/prédateur - parasitoïde) est limitée à un nombre réduit de modèles biologiques. La compréhension de leurs mécanismes et de leurs conséquences écologiques et/ou évolutives reste fragmentaire. Comprendre le rôle des plantes hôtes, des symbiotes ou des prédateurs dans le fonctionnement et l'évolution des interactions hôte-parasitoïde reste un défi très important tant au point de vue fondamental que du point de vue appliqué. Cela pourrait permettre de mieux appréhender l'écologie des organismes ayant des pertinences agronomiques et/ou médicales (Thomas et al. 2009). Les travaux menés au cours de cette thèse permettent la poursuite et l'élargissement des études sur le rôle de l'environnement biotique d'un hôte sur l'écologie évolutive des interactions hôte-parasitoïde. A la lumière des travaux cités, il apparait que le système puceron-parasitoïde soit d'un intérêt très particulier pour étudier le fonctionnement évolutif des interactions hôte-parasitoïde et l'effet de l'écologie de l'hôte sur l'évolution de ces interactions. Les modèles biologiques considérés dans les recherches décrites dans ce manuscrit sont le puceron du pois, Acyrthosiphon pisum, et son principal parasitoïde hyménoptère, Aphidius ervi. Ce puceron est fortement spécialisé à la plante dont il se nourrit, engendrant la formation de races d'hôte (Peccoud et al. , 2009a). En conséquence, il existe de fortes divergences génétiques et phénotypiques dans leurs populations sympatriques. Le puceron du pois peut également abriter des symbiotes facultatifs dont certains confèrent au porteur une résistance aux parasitoïdes (Oliver et al. , 2003). Enfin, le puceron du pois est aussi la proie de nombreux prédateurs. Ce système est par conséquent idéal pour évaluer comment le réseau d'interactions de l'hôte affecte les parasitoïdes. Durant cette thèse, nous avons considéré l'influence de la plante hôte du puceron et des symbiotes qu'il abrite, la prédation intraguilde impliquant ce système ayant déjà été abordée par ailleurs (e. g. Snyder & Yves, 2001 ; Nakashima et al. , 2004 ; Meisner et al. , 2011). Chapitre 2 LES MODELES BIOLOGIQUES : LE PUCERON DU POIS ACYRTHOSIPHON PISUM- LE PARASITOÏDE APHIDIUS ERVI I. L'hôte : le puceron du pois Acyrthosiphon pisum 1. Généralités : classification, répartition et biologie Le genre Acyrthosiphon appartient à la famille des Aphididae, composée de plus de 4000 représentants. Environ 90 espèces du genre sont réparties sur tout le globe, de l'Europe de l'Ouest à l'Asie de l'Est, avec également quelques espèces originaires d'Amérique du Nord. Le puceron du pois Acyrthosiphon pisum est présent sur tous les continents (excepté les régions aux températures extrêmes, polaires notamment) (Eastop, 1971). A. pisum mesure environ 4 mm, sa couleur étant soit verte ou rose. Il est monoécique (c'est-à-dire qu'il effectue tout son cycle biologique sur une seule plante hôte). Ce puceron se caractérise par un polyphénisme de reproduction. Du printemps à l'automne, une vingtaine de générations de parthénogénèse méiotique se succèdent durant lesquelles les femelles vivipares produisent des descendants génétiquement identiques. Cette phase de reproduction asexuée assure une forte croissance des populations aphidiennes. Puis, des femelles parthénogénétiques dites sexupares produisent des femelles et des mâles sexués en réponse aux modifications climatiques et photopériodiques de l'automne (MacKay et al. , 1987). Après rencontre des individus sexués puis fécondation, les œufs sont pondus et passent l'hiver à l'état de diapause, pour donner naissance à des nouvelles fondatrices au début du printemps (Eastop, 1971). Le morphe de dispersion est également un autre exemple de polyphénisme chez les pucerons. Le phénotype de dispersion des femelles parthénogénétiques d'A. pisum (ailées et aptères) dépend de la qualité des conditions environnementales. Lorsqu'elles sont favorables, les populations sont principalement composées d'individus aptères. A l'inverse, un environnement hostile provoque une augmentation de la production de descendants ailés. Les principaux facteurs environnementaux ayant un effet sur le morphe de dispersion sont la qualité de la plante hôte (Sutherland, 1969), le niveau de compétition locale (Johnson, 1965) ou encore la présence d'ennemis naturels (Sloggett & Weisser, 2002). Localisation Figure 2. 1. Structure génétique des populations de pucerons du pois. Les segments horizontaux représentent 1090 individus (génotypes de 14 microsatellites) et les couleurs représentent la proportion d'appartenance à la population inférée. Les génotypes sont ordonnés par plantes puis par localisation comme indiqué sur la barre verticale à gauche. Blanc : Est de la France, noir : Nord-ouest de la France et gris : Allemagne de l'est (d'après Peccoud et al. , 2009a). Au-delà de ses caractéristiques biologiques et écologiques, le puceron du pois a été choisi comme espèce modèle pour la mise au point et le développement d'outils de génomique (Brisson & Stern, 2006 ; Tagu et al. , 2008 ; The International Aphid Genomics Consortium, 2010). 2. Spécialisation alimentaire, génétique et divergences phénotypiques Acyrthosiphon pisum est présent sur une large gamme de plantes hôtes au sein des tribus Trifolieae, Vicieae, Loteae et Genisteae (trèfles, luzernes, mélilots, bugranes, genêts, pois, lotiers etc). Une cinquantaine de plantes hôtes ont été référencées (Eastop, 1971), et plusieurs centaines d'espèces seraient des hôtes potentiels. A. pisum est surtout connu pour être un ravageur de cultures fourragères (van Emden & Harrington, 2007) : ses populations sont très denses dans les parcelles de trèfles (trèfle violet Trifolium pratense et trèfle blanc T. repens), de luzerne cultivée (Medicago sativa), de pois (Pisum sativum) et de fève (Vicia faba). Piqueurs suceurs, ils se nourrissent uniquement de sève, en plantant leur stylet à travers la paroi végétale. A ce jour, 11 races d'hôtes fortement différenciées ont été déterminées dans les populations européennes du puceron du pois. Peccoud et al. (2009a) montrent que ces races présentent une très forte structuration génétique correspondant à leur plante d'origine, mais indépendante de la localisation géographique (Figure 2. 1). Les individus proviennent de plantes cultivées (pois, trèfle violet, fève et luzerne) et sauvages (bugrane, genêt à balai, lotier des marais, mélilot, vesce cracca, luzerne lupuline, lotier corniculé et gesse des prés). A. pisum se caractérise également par une spécialisation alimentaire sur 10 des 13 plantes étudiées. Les populations américaines et européennes montrent de meilleures performances en termes de longévité individuelle et de fécondité sur leur plante hôte d'origine (Via, 1991 ; Sandstrm, 1994 ; Peccoud et al. , 2009a). En conséquence, l'isolement reproducteur entrainé par la spécialisation alimentaire, a favorisé la réduction des flux de gènes entre races d'A. pisum, illustrant un cas de spécialisation écologique en sympatrie. D'autres différences écologiques et phénotypiques entre populations spécialisées ont également été mises en évidence. C'est le cas du mode reproduction, avec des altérations du cycle classique vers une parthénogénèse totale (Frantz et al. , 2006), de la couleur ou encore les comportements de défense (Kunert et al. , 2010). 3. Une riche composition endosymbiotique Toutes les lignées d'Aphididae présentent une symbiose obligatoire avec la - protéobactérie Buchnera aphidicola. Cette interaction forte provient d'une infestation ancestrale par une entérobactérie apparentée à la lignée d'Escherichia coli il y a 100 à 150 millions d'années (Baumann et al. , 1995). Elle est transmise de manière strictement verticale de la mère à la descendance. Incapable de survivre et d'être cultivée hors de son hôte, Buchnera aphidicola vit dans les bactériocytes, cellules géantes spécialisées bordant le tube digestif. Elle fournit au puceron des acides aminés essentiels, absents de la sève élaborée (Liadouze et al. , 1995 ; Douglas, 1998). L'absence de Buchnera provoque un retard de croissance, la mort ou la stérilité de son hôte (Ohtaka & Ishikawa, 1991). Outre ce symbiote primaire, A. pisum peut héberger d'autres symbiotes facultatifs, ou secondaires, également hérités par voie maternelle. A ce jour, 7 ont été identifiés, pouvant infecter ou coinfecter le puceron du pois (Frantz et al. , 2009 ; Guay et al. , 2009 ; Tsuchida et al. , 2010) : Serratia symbiotica, Regiella insecticola, Hamiltonella defensa, Spiroplasma sp. , Rickettsia sp. , PAXS ( Pea Aphid X-type Symbiont ) et Ricketsiella sp. Ces bactéries se situent dans les cellules spécialisées bordant les bactériocytes à Buchnera ou dans la cavité générale. La prévalence des symbiotes facultatifs diffère selon les races d'hôte du puceron : Serratia symbiotica et Rickettsia sp sont fréquents chez les pucerons issus du pois ou de la fève ; R. insecticola se trouve préférentiellement chez la race trèfle ; H. defensa chez la race luzerne et Spiroplasma chez les races trèfle et luzerne (Frantz et al. , 2009). Ces bactéries ont des effets majeurs sur le phénotype de leurs porteurs. Elles peuvent modifier leurs performances alimentaires (Tsuchida et al. , 2004), leur conférer une tolérance aux hautes températures (Montllor et al. , 2002), provoquer des variations dans leur couleur (Tsuchida et al. , 2010), ou encore les protéger contre certains ennemis naturels (Oliver et al. , 2003 ; Scarborough et al. , 2005). Du fait de sa récente découverte, les effets de PAXS restent encore inconnus (Guay et al. , 2009 ; ). 4. Les moyens de défense du puceron du pois contre les parasitoïdes Plusieurs espèces de parasitoïdes utilisent A. pisum comme hôte. Parmi les Aphidiinae, on note Aphidius ervi, Aphidius avenae, Aphidius eadyi, Aphidius smithi, Aphidius urticae, Aphidius picipes, Ephedrus plagiator ou encore Praon barbatum. A. ervi, A. avenae et E. plagiator sont des espèces bien représentées dans l'ouest de la France (Star 1974 ; 1988). Pour éviter de succomber au parasitisme de leurs parasitoïdes, les pucerons présentent des moyens de défense permettant d'éviter la rencontre, d'éviter l'attaque en cas de rencontre du parasitoïde ou encore de résister au parasitoïde immature en place. Eviter la rencontre et éviter l'attaque A la vue de l'ennemi ou d'un congénère attaqué, le puceron du pois peut utiliser plusieurs stratégies. Les défenses comportementales des pucerons étant décrites dans le chapitre 1. II. 1. , elles ne seront donc pas détaillées ici. Les défenses immunitaires Alors que les défenses comportementales interviennent pour éviter le parasitisme, des formes de résistance contre le parasitoïde immature en place existent également chez le puceron du pois. Plusieurs études permettent de mettre en évidence une variation de la résistance au parasitisme chez différents clones d'A. pisum (Henter, 1995 ; Henter & Via, 1995). Toutefois, la résistance au parasitoïde chez les pucerons reste faiblement documentée car elle est peu observée. L'encapsulation, réponse immunitaire classique des insectes contre les parasitoïdes, n'a jamais été signalé chez le puceron du pois (Gerardo et al. , 2010). Certains événements de mélanisation suivant le parasitisme ont été suggérés (Altincicek et al. , 2008) mais le système de résistance d'A. pisum semble limité car dépourvu de certains gènes essentiels aux mécanismes classiques de résistance chez les insectes (Gerardo et al. , 2010). La résistance conférée par des symbiotes La résistance conférée par des symbiotes à leurs porteurs est un phénomène relativement inédit. Parmi les insectes, les symbiotes présents chez les pucerons sont les plus étudiés. Le puceron du pois possédant un système immunitaire limité, leur principale protection contre les parasitoïdes est donc apportée par les symbiotes (Oliver et al. , 2010). La bactérie Hamiltonella defensa fourni à A. pisum une protection aux parasitoïdes A. ervi et A. eadyi, pouvant entrainer un niveau de résistance très élevé chez certains clones (Oliver et al. , 2003 ; 2005 ; Ferrari et al. , 2004 ; Bensadia et al. , 2006). Cette résistance est liée à la présence de bactériophages nommés APSE' (A. pisum Secondary Endosymbiont). Ces virus sont porteurs de gènes homologues à des gènes codant pour des toxines, comme la Shiga-like toxin , la cytolethal distending toxin (CDT) et la YD-repeat toxins (Degnan & Moran, 2008 ; Oliver et al. , 2009). Plus particulièrement, les toxines CDT, décrites chez de nombreux pathogènes, sont des nucléases qui provoquent un arrêt du cycle cellulaire. L'hypothèse admise est que ces toxines provoqueraient un arrêt prématuré du développement du parasitoïde immature (Figure 2. 2). Par ailleurs, la variabilité génétique observée dans le génome du phage expliquerait la variation du degré de résistance conférée par H. defensa (Degnan & Moran, 2008). Figure 2. 2. Représentation schématique des mécanismes hypothétiques de la résistance du puceron du pois porteur de Hamiltonella defensa. Plusieurs autres facteurs peuvent modifier cette résistance apportée par la bactérie. Des pucerons exposés à des fortes températures perdent la résistance (Bensadia et al. , 2006), sauf s'ils sont également infectés par PAXS (Guay et al. , 2009). D'autres associations symbiotiques permettent également une certaine résistance contre les parasitoïdes, comme la co-infection H. defensa-Spiroplasma ou la co-infection Regiella-Spiroplasma (Nyabuga et al. , 2010). Les interactions mises en jeu dans ce modèle de résistance sont donc particulièrement complexes, puisqu'elle serait le produit d'une relation 'phage-bactérie- puceron-parasitoïde'. Les mécanismes moléculaires associés à cette forme de résistance inédite restent en partie méconnus. II. Le parasitoïde : Aphidius ervi 1. Classification Les hyménoptères parasitoïdes représentent un groupe d'espèces constituant potentiellement près de 20% des insectes (LaSalle & Gauld, 1992). Aphidius ervi est membre de la sous-famille des Aphidiinae (super famille des Ichneumonidae et famille des Braconidae (Hagvar & Hofsvang, 1991). Cette sous famille utilise exclusivement les pucerons comme hôtes. Aphidius ervi se distingue morphologiquement des autres espèces de Braconidae par le nombre de segments antennaires, la forme particulière des nervures alaires et la texture dite bosselé de la partie latérale de son pétiole (Star, 1973 ; Marsh, 1977 ; Pungerl, 1983) (Figure 2. 3). Des méthodes d'identification moléculaires par la technique du barcoding permettent également de différencier les espèces d'Aphidius (Derocles, communication personnelle). 0. 1 mm (b) (a) 0. 5 mm Figure 2. 3. Indices de détermination morphologiques d'Aphidius ervi. (a) partie latérale du pétiole à structure bosselée , (b) Nervures allaires (Photos du parasitoïde et de l'aile par B. Chaubet ; image du pétiole en microscopie électronique à balayage extraite de Takada, 2002). 2. Ecologie et Biologie A. ervi est un endoparasitoïde koïnobionte solitaire, ce qui signifie que la femelle parasitoïde pond un œuf à l'intérieur de l'hôte (endoparasitoïde), que cet hôte ne permet le développement à terme que d'un seul individu (parasitoïde solitaire) et qu'enfin l'hôte est maintenu en vie tout au long du développement et ne meurt que lors de la nymphose du parasite. Ainsi, si une femelle pond un œuf dans un hôte déjà parasité (pratique appelée le superparasitisme), les individus surnuméraires sont éliminés. A. ervi est présente un spectre d'hôtes très large : il peut parasiter une vingtaine d'espèces (du genre Acyrthosiphon : A. pisum, A. caraganae, A. nigripes, ou encore le puceron des céréales Sitobion avenae, ou le puceron du pêcher Myzus persicae, etc. ) (Marsh, 1977 ; Star, 1974). Depuis de nombreuses années, A. ervi est un agent de contrôle biologique des populations aphidiennes et a été introduit dans plusieurs pays pour lutter contre ces ravageurs (Angalet & Fuester, 1977 ; Star, 1993 ; Milne, 1999). 3. Cycle de vie Le cycle de vie d'Aphidius ervi est illustré en Figure 2. 4. a. La ponte d'un œuf : l'oviposition Accouplée ou vierge, une femelle peut pondre dans un hôte. A. ervi est une espèce présentant une parthénogénèse arrhénotoque : les femelles sont issues d'œufs fertilisés (diploïdes) alors que les mâles résultent d'œufs non fécondés (haploïdes). Ce cycle de reproduction haplo-diploïde' permet aux femelles de contrôler le sexe de chaque descendant. Après exploration antennaire du puceron, elle courbe son abdomen en-dessous de son thorax et l'allonge entre ses pattes afin d'introduire son ovipositeur dans l'hôte et d'y déposer un œuf (Figure 2. 4. a). Le développement L'œuf d'Aphidius ervi déposé dans l'hémolymphe du puceron est citriforme et mesure environ 90 m de long. Hydropique, il croit par absorption d'éléments nutritifs provenant de l'hôte au travers de l'enveloppe embryonnaire. Le développement larvaire commence 3 jours environ après l'oviposition, comptant 3 stades successifs durant lesquels le parasitoïde consomme progressivement les tissus internes du puceron. (a) (b) Figure 2. 4. Cycle biologique d'Aphidius ervi. (a) Etapes du cycle, j' représentant le nombre de jours pour un développement à 20C. (b) Dimorphisme sexuel : photographie face ventrale du stade adulte d'une femelle en A et d'un mâle en B (photos : F. Zélé). Au terme de cette étape d'environ 10 jours, la larve tisse son cocon à l'intérieur de l'hôte (après l'avoir fixé à sa plante). Lors de la nymphose, seule la cuticule du puceron subsiste, le parasite formant alors une momie. Enfin, à l'issue des 3 jours de stade nymphal, l'imago émerge en pratiquant une ouverture circulaire sur la partie dorsale de la momie. Le cycle complet de l'oviposition à l'émergence de l'adulte dure en moyenne 15 jours à 20C (Figure 2. 4. a) (Hagvar & Hofsvang, 1991). Le stade adulte Les mâles ont des antennes plus longues, un abdomen plus arrondi et des ailes plus courtes que les femelles (Figure 2. 4. b). Généralement après l'émergence, la femelle ne s'accouple qu'une seule fois. Les spermatozoïdes sont stockés dans la spermathèque, lui permettant de féconder les ovocytes qui sont estimés à environ 300 par femelle. Enfin, l'adulte survit entre 10 et 15 jours à 20C. 4. La virulence chez A. ervi Les molécules impliquées dans la virulence d'un parasitoïde ont le plus souvent une origine maternelle. Elles sont contenues dans le venin injecté dans le puceron avec l'œuf lors de l'oviposition. Elles provoquent une castration de l'hôte qui peut être totale lorsque le stade L1 est parasité (Digilio et al. , 1998 ; Digilio et al. , 2000). La -glutamyl transpeptidase (GT) est le facteur responsable de cette castration. Via une altération du métabolisme du glutathion (molécule impliquée dans le maintien cellulaire), il provoque un stress oxydatif qui induirait l'apoptose des cellules à l'apex des ovarioles du puceron du pois (Falabella et al. , 2007). L'effet du venin est parachevé par les tératocytes, cellules dérivant de la membrane séreuse entourant l'œuf du parasitoïde. Alors que le venin agit au niveau de l'ovogenèse, ces cellules provoquent une dégradation des embryons par un mécanisme de digestion (cytolyse) (Falabella et al. , 2000). Les tératocytes d'A. ervi synthétisent deux molécules principales : une Fatty acid-binding protein (FABP) et une énolase. La FABP assurerait le transport dans l'hémolymphe des acides gras générés par la digestion des tissus de l'hôte (Falabella et al. , 2005). L'énolase est une enzyme de la glycolyse associée à des pathologies lorsqu'elle est présente dans l'environnement extracellulaire, notamment à la surface des cellules eucaryotes et procaryotes. Localisée à la surface des tératocytes, de la larve parasitoïde et des embryons du puceron en dégénération, elle jouerait un rôle dans la régulation de la dégradation des tissus de l'hôte par les tératocytes et dans l'immunoévasion du parasitoïde (Falabella et al. , 2009) (Figure 2. 5. ). L'ensemble des altérations provoquées chez le puceron par les molécules du venin et les tératocytes ont pour effets de détourner les ressources de l'hôte au profit du développement du parasitoïde (Falabella et al. , 2000). Les activités cytolytiques des tératocytes sont observées sur des tissus spécifiques et à des temps donnés. Ces contraintes spatiales et temporelles sont essentielles à la survie de l'hôte, car un processus de digestion continu ou brutal pourrait gravement affecter sa physiologie, compromettant le développement progressif du parasitoïde (Pennacchio & Strand, 2006). Figure 2. 5. Représentation schématique de la physiologie de la virulence d'A. ervi. Sont décrits le rôle joué par le venin dans les processus de régulation de l'hôte et les fonctions hypothétiques des molécules émises par les tératocytes (adapté d'après Falabella et al. , 2000 ; 2005 ; 2009). Chapitre 3. INFLUENCE DE LA SPECIALISATION D'A. PISUM SUR LA STRUCTURE DES POPULATIONS DE PARASITOÏDES I. Spécialisation écologique et génétique de l'hôte 1. Objectifs Des travaux récents ont montré l'existence de conditions particulières dans lesquelles les populations de phytophages peuvent diverger en sympatrie (e. g. Peccoud & Simon, 2010). Dans ces conditions, la sélection naturelle favorise les associations entre des gènes affectant la performance sur une plante hôte et la préférence pour cette plante. Les flux géniques entre populations spécialisées sur des plantes hôtes distinctes sont alors contre sélectionnés. Cette formation de races d'hôte , par le biais de la spécialisation alimentaire, engendre des divergences génétiques et phénotypiques profondes dans les populations sympatriques du phytophage (Drès & Mallet, 2002). Le puceron du pois est A. pisum est spécialisé sur 11 espèces de plantes comme le pois, le trèfle ou la luzerne et présente des populations génétiquement différenciées. Cette spécialisation alimentaire est à l'origine d'un isolement reproducteur entre les populations. Les individus spécialisés forment alors des races d'hôte (ou biotypes) (Peccoud et al. , 2009a). Cette spécialisation écologique chez A. pisum s'accompagne de divergences phénotypiques. Les lignées issues du pois et de la fèverole investissent fortement dans la reproduction sexuée et produisent plus de mâles ailés que celles du trèfle et de la luzerne, par exemple (Frantz et al. , 2009). Les comportements de défense contre les ennemis naturels sont aussi différents selon les races (Kunert et al. , 2010). Les populations spécialisées montrent également des compositions distinctes en symbiotes secondaires (Frantz et al. , 2009). Les parasitoïdes du puceron du pois font alors face à des populations hôtes très structurées et hétérogènes. Etant donnée la relation intime entre le parasitoïde et son hôte, la spécialisation alimentaire d'A. pisum pourrait engendrer une structuration génétique des populations sympatriques d'A. ervi. Dans ce cas, la spécialisation alimentaire chez le ravageur aurait un effet cascade : elle génèrerait une spécialisation parasitaire chez ses ennemis et limiterait de fait les échanges de parasitoïdes entre les différents compartiments d'un paysage agricole. Le travail présenté ci-après a pour objectif d'évaluer l'influence de la spécialisation alimentaire du puceron du pois sur la structuration génétique des populations de son parasitoïde A. ervi. Nous identifions si ce trait écologique chez A. pisum génère une spécialisation parasitaire chez ses parasitoïdes (c'est-à-dire, une race de parasitoïdes par biotype aphidien). Afin de mieux identifier les sources de différenciation génétique entre populations de parasitoïdes, les propriétés génétiques des populations sympatriques (entre plantes hôtes) et allopatriques (entre sites) sont comparées. 2. Approche et méthode générale Plantes hôtes et régions inspectées Deux campagnes d'échantillonnage ont été effectuées d'Avril à Aout 2008 et en Juin 2010 sur deux sites principaux distants de 40 kms : Domagné (Ille-et-Vilaine) et le centre INRA du Rheu (Ille-et-Vilaine). Les deux sites présentaient une large variété de légumineuses cultivées et sauvages. Des échantillonnages ont également été effectués en Suisse (près de Lausanne) et dans l'est de la France (Nancy (Meurthe et Moselle), Mulhouse (Haut Rhin), Châlons-en-Champagne (Marne) et Mirecourt (Vosges). L'échantillonnage consistait aux prélèvements de pucerons et de momies. Les pucerons étaient maintenus en laboratoire pour recueillir d'éventuelles momies. Les momies récupérées et échantillonnées étaient isolées dans l'attente de l'émergence du parasitoïde. Après la détermination du parasitoïde émergent, les individus ont été placés dans l'éthanol à 95% puis génotypés. Choix des marqueurs génétiques et du type d'analyse Notre étude portant sur un grand nombre de populations différentes, il était indispensable de disposer de marqueurs suffisamment polymorphes pour les distinguer. Des marqueurs microsatellites développés et utilisés par Hufbauer et al. (2001) pour l'analyse des populations américaines ont donc été considérés. Cependant, le polymorphisme des marqueurs retenus était faible (de 2 allèles pour l'un, à 9 pour le plus polymorphe). Ils présentaient surtout des difficultés d'amplification et de lecture. Par conséquent, de nouveaux marqueurs microsatellites pour A. ervi ont été développés. Parmi une quarantaine de marqueurs testés, douze ont été sélectionnés selon leur facilité d'utilisation, leur profil et leur polymorphisme. La localisation génétique de ces marqueurs reste cependant inconnue. Seules les femelles (diploïdes) ont été considérées dans cette étude. Il est à noter que le développement de ces marqueurs a été relativement long, car les quantités d'ADN d'Aphidius ervi sont particulièrement faibles et leurs qualités mauvaises, que l'extraction ait été effectuée par la méthode du Salting-out, ou avec un Kit. L'ADN fourni à finalement été extrait à partir d'une dizaine d'individus par tube pour satisfaire les exigences de l'expérimentation. Pour ces diverses raisons, nous avons accumulé un retard conséquent lors de la thèse. 3. Résultats : génétique des populations d'A. ervi Article 1 Les résultats de cette étude font l'objet d'un article en préparation : Does high dispersal prevent host-associated differentiation in parasitoid populations of a plant-specialized aphid ? Dion E. ; Simon J-C. & Outreman Y. Does high dispersal prevent host-associated differentiation in parasitoid populations of a plant-specialized aphid ? Dion E. 1, 2, Simon J-C. 1, 3 and Outreman Y. 1, 4 UMR 1099 INRA-Agrocampus Ouest-Université Rennes 1 Biologie des Organismes et des Populations appliquée à la Protection des Plantes , 65, rue de Saint-Brieuc CS 84215, 35042 Rennes Cedex, and BP 35327, 35653 Le Rheu Cedex, France. E-mail : emilie. deguydion@gmail. com E-mail : jean-christophe. simon@rennes. inra. fr E-mail : yannick. outreman@rennes. inra. fr Corresponding author : Yannick Outreman UMR 1099 INRA-Agrocampus Ouest- Université Rennes 1 Biologie des Organismes et des Populations appliquée à la Protection des Plantes' 65, rue de Saint-Brieuc CS 84215, 35042 Rennes Cedex, France. Tel. : 33 2 23 48 55 68 Abstract All organisms interact with a wide range of species, being part of an interaction web which impacts greatly on their evolutionary trajectories. Most insect herbivores have intimate associations with their host plants and frequently exhibit high degrees of host plant specialization. Host races, defined as populations specialized on a restricted number of plants and in partial reproductive isolation, are then reported in many phytophagous insect species. The cascading host-associated differentiation (HAD) hypothesis states that ecological specialization can happen at a higher trophic level, leading to specialization of specialized phytophagous insects' natural enemies. The pea aphid Acyrthosiphon pisum encompasses at least eleven conspecific host races specialized on different Legume species, showing divergent genetic patterns. Here we tested for a genetic HAD in populations of Aphidius ervi, the main insect parasitoid of the pea aphid, sampled from the red-clover and alfalfa races. A. ervi populations were genotyped with newly developed microsatellites markers and their genetic variability and structure assessed. No evidence of HAD in A. ervi has been found : populations from clover and alfalfa races were not genetically different, exploiting indifferently these two A. pisum races. Additionally, we confirmed the great dispersal potential of this parasitoid species, gene flow between populations occurring at very large distances preventing adaptation to local conditions. Those results are also discussed considering A. ervi potential as a biological control agent against aphids. Keywords : cascading host-associated differentiation, microsatellites, host races, parasitoid, biological control, Hamiltonella defensa prevalence Introduction Most of the species are part of complex interaction webs, and engaged in mutualistic or antagonistic interactions with others species (Begon et al. , 2006). All these relationships influence organisms' traits such as survivorship or reproduction, and consequently imply co- evolutionary processes. These interactions between individuals and the environment also affect gene flow between populations that, when strong, can decrease local adaptation and prevent the genetic divergence of local populations. Conversely gene flow may be restricted as well because individuals can show habitat or host fidelity leading to genetically structured population (Fox & Wolf, 2006). Populations may be genetically distinguished based on sufficient differentiation at neutral genetic markers and reveal differences at ecologically important traits. For example, the interaction between some phytophagous insects and their host plant may lead to gene flow reduction between populations specialized on different plants. These specialized populations possess different genetic and reproduction properties, and are called races, or biotypes. They are genetically structured according to their host plant, and this can even happen in sympatry, leading to reproductively isolated entities undergoing speciation (Schluter, 2001 ; Drès & Mallet, 2002). The natural enemies of specialized phytophagous insect populations, such as predators or parasites, thus face very structured and heterogeneous local prey/host populations. Because of the intimate interactions between hosts and parasites, the host-associated differentiation (HAD) may cascade across trophic levels, with HAD in herbivorous insects leading in turn to genotypic and phenotypic divergence in parasite populations (Stireman et al. , 2006). Insect parasitoids are organisms whose larva develops to the detriment of a single host which is generally killed at interaction's end. They are one of the most common natural enemies used in pest management. Useful auxiliaries would have high dispersal rates compared to their hosts, and especially in heterogeneous environments. For a successful biological control by introduction of auxiliaries, it has been recommended to increase their adaptive potential with high population size expected to harbour greater genetic variability, and less inbreeding depression (Kaweki & Ebert, 2004 ; Memmott et al. , 2005 ; Reed et al. , 2003 ; Phillips et al. , 2008). Thus, identifying the factors responsible for genetic differentiation in parasitoid populations is also very important in biological control processes ; as it may provide important information about populations exhibiting local adaptation to environmental conditions or organisms, and gives clues about the efficiency of the biological control processes (Mills & Kean, 2010). Generalist parasitoids are assumed to exploit a wide range of host species on which they may show variations in performances. These differences in parasitoid fitnesses according to host species could lead to adaptation of particular genotypes according to host species (Fry, 1996 ; Vaughn & Antolin, 1998 ; Antolin et al. , 2006 ; Henry et al. , 2008). Another possible evolutionary interaction may occur between parasitoids and their host including evolved host resistance to parasitoid attacks, and parasitoid virulence overcoming host defences (Green et al. , 2000). These examples provide strong evidence for the ability of generalist parasitoids to adapt to pest species ; with the great phytophagous insects' diversity facilitating their parasitoids diversification (Feder & Forbes, 2010). Aphidius ervi (Hymenoptera : Braconidae) is a parasitoid attacking different aphid species from Fabaceae or Poaceae plants, but using mainly the pea aphid Acyrthosiphon pisum as host. Genetic analysis and tests of host plant specificity indicate the existence of at least 11 well-distinguished sympatric pea aphid populations associated with different host plants in Western Europe (Peccoud et al. , 2009a). Furthermore, a high proportion of individuals specialized on alfalfa (Medicago sativa) harbour a particular secondary symbiont, called Hamiltonella defensa which confers their bearer enhanced resistance to parasitoids (Oliver et al. , 2003 ; Ferrari et al. , 2004 ; Oliver et al. , 2005 ; Frantz et al. , 2009). Several studies have shown the A. ervi potential to adapt locally to different aphid species, (A. pisum and A. solani, see Henry et al. , 2008 ; 2010), and also to highly resistant pea aphid populations (Dion et al. , 2011). An A. ervi population of about 1000 individuals originated from France was introduced into North America in 1959 to control the pea aphid (Angalet & Fuester, 1977). In spite of the low number of founders, a mild population bottleneck was recorded when European and American populations were compared (Hufbauer et al. 2004), indicating a good potential of Aphidius ervi to adapt to different A. pisum populations ; and more particularly in a biological control context. The A. ervi-A. pisum relashionship represents an interesting system in both fundamental and applied ecology and evolutionary biology. This parasitoid species allows studying the adaptive potential to specialized hosts and is a particularly interesting for biological control of crop pests (Angalet & Fuester, 1977 ; Henter, 1995). In this study, we examined patterns of genetic variability and structure of Aphidius ervi natural populations from various pea aphid host races. More specifically, we tested for the existence of cascading HAD in the parasitoid populations using newly isolated microsatellite loci. Materials and methods Biological material Mummified Acyrthosiphon pisum (dead aphids with a parasitoid pupa inside) and aphids were collected on four different plants at six different locations in France and Switzerland from May to August 2008 and in May 2010. These sites were : Le Rheu (R) and Domagné (D), situated at the north-west of France, Mulhouse (M), Nancy (N), and Chalons- en-Champagne (C), located at the north-east of France and the last one close to Lausanne (L) in Switzerland. All locations are situated at least 40 Km apart from each other. Individuals were collected in fields of alfalfa (Medicago sativa), red clover (Trifolium pratense), pea (Pisum sativum) and lotus (Lotus corniculatus). Whenever possible, we sampled places where aphid host plants or crops occurred next to one another, and individuals were collected at a minimum of five meters one to each other. Aphids were maintained on broad bean (Vicia fabae) to check their parasitic status. Collected mummies and aphids that mummified were placed in plastic Petri dish until parasitoid emergence (all in climate rooms at 20 1 C, 70 10 % relative humidity and L : D 16 : 8 h photoperiod). Adults emerging were taxonomically assigned to species following Eady (1969) and Nmec & Star (1983), but only A. ervi and the close species A. eadyi were considered. The prevalence of the symbiont Hamiltonella defensa was also calculated in aphid populations. The identification of the secondary symbionts harbored by A. pisum individuals was based on a polymerase chain reaction assay (PCR) with specific nucleotide primers of the 16S rDNA bacterial sequence. The complete symbiotic detection procedure is detailed in Frantz et al. (2009). Parasitoid DNA extraction, PCR and genotyping Both A. ervi and A. eadyi are haplodiploid organisms whereby unfertilized eggs develop as haploid males and fertilized one as diploid females. DNA extractions were carried out from females only, in semideep well trays using the salting out' procedure (Miller et al. , 1988). Total DNA was then suspended in a final volume of 50L of ultrapure water. The Aphidius ervi and Aphidius eadyi genotypes were assessed at 12 newly developed microsatellites loci (Table 1. ). They were obtained by pyrosequencing of enriched DNA libraries as part of the EcoMicro collaborative project (the complete procedure is detailed in Malausa et al. , 2011). The selection of sequences for primer design was done with the program QDD (Meglécz et al. , 2010). We used the M13-tailed primer method (Boutin- Ganache et al. 2001) to label amplicons for visualization on the capillary sequencer. Forward primers were 5-tailed with a 23-basepair M13 sequence. Loci were amplified in a final volume of 10 L polymerase chain reaction (PCR). The reaction mixture contained 2 L of total DNA, 0. 25 M of each primer, 0. 2 mM of a four nucleotide mixture, 1. 25 mM of MgCl2, 0. 25 M of 1 L of PCR Buffer (Promega, Madison, USA) and 0. 25 U of Taq DNA Polymerase (Promega, Madison, USA). The M13 primers were5-fluorescently tagged with HEX, 6-FAM, NED or VIC at 0. 25 M for assessment of allele sizes on a capillary sequencer (describe below). PCR were conducted on S1000 thermal cycler (2008, Bio-Rad Laboratories) using the following cycling conditions : initial denaturation at 94 C for 5 minutes, first cycle of DNA amplification (repeated 20 times) with a denaturation step at 94 C for 20 seconds, hybridization at 55 C for 20 s, elongation at 72 C for 30 s ; second cycle of M13 amplification with 20 repetitions of the following steps : 94 C for 20 s, 53 C for 20 s and 72 C for 30 s. The PCR ends with a final elongation at 72 C for 5 min. Diluted PCR products (1. 2 L on 10 L water) were added to 10 L of high-die formamide containing 0. 7% of 500 LIZ DNA ladder (Applied Biosystems) and electrophoresis was performed in the capillary sequencer ABI 3730 (Applied Biosystems). Allele calls were automatically assigned by GeneMapper (version 3. 7, Applera Corp) and visually checked. Genetic variability and population differentiation Because of the low number of parasitoids emerging from lotus and pea aphid populations in each location, the genetic variability was investigated for A. ervi from alfalfa and clover only. For every population, and each of the twelve loci, number of alleles, allelic richness, and departure from Hardy-Weinberg Equilibrium (by 5000 permutations of alleles among individuals using the inbreeding coefficient FIS as a test statistic) were assessed using FSTAT 2. 9. 4 (Goudet, 2005a). Observed and expected heterozygosities were calculated for each population separately using the software ARLEQUIN 3. 1. 5. 2 (Excoffier et al. , 2005). GENEPOP (Raymond & Rousset, 1995 ; Rousset, 2008) was used to test for linkage disequilibrium (LD) using the Markov Chain probability test (parameters set as follows : dememorization 10, 000 ; number of batches 1000 ; iterations per batch 10, 000) for all locus-by-population combinations, and across all populations using Fisher's method. The presence of null alleles was estimated with the software MICRO-CHECKER 2. 2. 3 (van Oosterhout, 2004). Overall and pairwise FST values were used to quantify differentiation among populations in allele frequencies and were computed with FSTAT 2. 9. 3. 2. Test of host associated differentiation As A. ervi populations were sampled on four different plants, and in seven different locations, we computed hierarchical F-statistics with the package HIERFSTAT (Goudet, 2005b) implemented in R 2. 8. 1 (R Development Core Team, 2008). Pea and lotus populations were considered here as illustrative data only. The overall differentiation of populations was computed at three different levels : among host races (Fhost-total), among sampling sites within host races (Fsite-host) and within sites (Findividuals-site). The significance of genetic differentiation at each level was tested using 10 000 randomizations (de Meeûs & Goudet, 2007). Pairwise FST between host-races populations were calculated and tested for significance in ARLEQUIN 3. 1. 5. 2. To investigate any potential site effect, a locus by locus analysis of molecular variance (AMOVA ; Excoffier et al. , 1992) was performed with ARLEQUIN 3. 1. 5. 2 using the hierarchical model for genotypic data with several groups of populations and no within- individual level. To evaluate the differentiation between sampling site populations, we performed the same hierarchical analyses as described for host biotype populations with the package HIERFSTAT in R, considering the host biotype included in the upper sampling site- level. Pairwise FST were also calculated and tested for significance in ARLEQUIN. Genetic structure In addition to these analyses considering locations or host biotype as de facto populations, we estimated the number of clusters represented by the entire data set with the Bayesian statistical approach implemented in the program STRUCTURE 2. 2 (Pritchard et al. 2000). This method evaluates the most likely structure without any prior information of population membership. Parasitoids from pea and lotus were also added to the samples for this analysis. Ten iterations were performed using a burning period' of 50, 000 iterations with 50, 000 Markov Chain Monte Carlo (MCMC) step, in admixture models with correlated allele frequencies. The analyses were made for a number of cluster K varying from 2 to 20. To identify the most probable number of clusters, we then calculated the logarithm of the mean posterior probability of the data L(K)for each K following Pritchard et al. (2000) method, and also computed the K' value in respect to K as described in Evanno et al. (2005). Wolbachia pipentis detection Following genotyping, 35 females were homozygous at all loci. We tested for the presence of the bacteria Wolbachia pipentis, which is known to be able to induce male genome diploidization and producing homozygous females in several hymenoptera species (Duron et al. , 2008 ; Vavre et al. , 2009). The infection status of those females was checked by specific PCR with nucleotide primers of the 16S sequence, of the FtsZ, wsp and FbpA genes. Primers were used as previously described in Werren et al. (1995) and Kremer et al. (2009). Results Species diversity and abundance Adults emerging from collected mummies included either the two A. pisum parasitoids A. ervi and Aphidius eadyi, or hyperparasitoids (parasitoids of parasitoids). Aphidius ervi was the most abundant on all host races, ranking from 60 to 100% of the total emerged individuals. Aphidius eadyi was represented at a mean of 7% of the total number of emerged individuals (from 0 to 21% according to populations). This species was absent in 6 of the populations studied, mostly on clover. Hyperparasitoids such as some Pteromalidae, or some Dendrocerus species were found in all populations. They appear mostly at the beginning of summer. Finally, the prevalence of H. defensa in A. pisum individuals from alfalfa fields was 66% in average, ranging from 39 to 100% across populations, and was 27% in average, from 10% to 50% in clover populations (Table 2. ). Only 5% of the aphid clones sampled on pea harbored the defensive symbiont. Genetic variability and population differentiation The 12 A. ervi loci were polymorphic in all populations. Allelic richness was similar across populations, varying from 3. 94 to 4. 39 for the alfalfa population and from 4. 03 to 4. 17 for clover populations (Table 2). Significant deviation from Hardy-Weinberg equilibrium was observed in all populations, caused by a high heterozygote deficiency. Surprisingly, 35 individuals from the various populations showed homozygosity at all loci. Seven of the 12 loci (Ae03, Ae16, Ae20, Ae22, Ae29, Ae33 and Ae39) were suspected to show null alleles after analysis by MICRO-CHECKER. Out of 66 possible locus pairs, 3 pairs showed significant genetic disequilibrium (Ae06 and Ae22 ; Ae06 and Ae27, Ae27 and Ae32), all implying Ae06 or Ae27. Linkage disequilibrium was observed for all populations, except those from alfalfa fields in Mulhouse and Lausanne ; and those from clover fields in Le Rheu and Lausanne. As removing both alleles Ae06 and Ae27 caused little changes in parameter estimates, all loci were kept for genetic structure analyses. The overall FST were 0. 002 for populations, with values ranking from -0. 06 to 0. 04 when comparing populations by pairs. Permutations gave all the FST by pair as non significant suggesting a low genetic differentiation between A. ervi populations. Host race and region effects The genetic variance partitioned among host biotypes and among sampling sites was assessed by the analysis of molecular variance (Table 3. ). The within population level explained more than 99% of the variation while variations explained by host biotypes or sampling sites were not significant. This pattern was confirmed by the hierarchical analysis performed with HIERFSTAT, revealing a non significant genetic variation among host biotypes population with a global Fhost-total of 0. 0004 (P value 0. 32), a Fsite-host of 0. 005 (P value 0. 155) while there was significant differentiation at the inner most level with Findividuals- site 0. 29 (P value Pairwise FST values calculated between A. ervi from distinct host biotypes also showed an absence of aphid host associated genetic differentiation (data not showed). The analysis considering the sampling site as the upper level provided similar results : genetic divergence was not significant between sampling sites neither between host biotypes at a lower level (Fsite-total 0. 001, Pvalue 0. 25 ; Fhost-site 0. 004, Pvalue 0. 08). Pairwise FST were also all very low and permutation tests gave all them non significant. Genetic structure Both Pritchard et al. (2000) and Evanno et al. (2005) methods gave both K 3 as the most probable number of clusters. For K 3, 40. 4% of individuals were assigned to one of the clusters with more than 60% probability, and only 5. 3% were assigned with more than 80% probability. These three genetic clusters were associated neither with their host race, nor with the sampling site (Figure 1). Wolbachia pipentis detection With the four primer pairs, there were no amplifications of Wolbachia in the entire set of females homozygous at all loci. Discussion Advances in genetics contributed much to the understanding of the population functioning. Neutral genetic markers are ideal for tracing the movement patterns of organisms, as well as for documenting their ecology, reproduction and evolutionary history (Roderick & Navajas, 2003 ; Gariepy et al. , 2007 ; Lozier et al. , 2008). In particular, microsatellites permit an efficient estimation of genetic variability, structure and movements of the studied species, giving valuable clues regarding the adaptive potential of the populations. The markers we used are new microsatellites designed specifically on Aphidius ervi but working as well on the closely related species Aphidius eadyi. Markers were all polymorphic, ranging from 7 to 17 alleles per locus for the individuals screened. They completed the variability information given by the microsatellites developed for A. ervi by Hufbauer et al. (2001). Six loci showed heterozygote deficiency, which seems to be caused by the presence of null alleles ; or also by a variety of factors including non-random mating and population subdivision. Homozygote excess has been reported previously for A. ervi by Hufbauer et al. (2004) and from other parasitoid hymenoptera (e. g. Kankare et al. , 2005 ; Nyabuga et al. , 2010) where it is usually linked to inbreeding events within populations or related to violations of other assumptions inherent in fulfilling Hardy-Weinberg expectations including migration, selection, genetic drift mutations and severe bottlenecks. Some A. ervi populations deviated from genotypic equilibrium. Ignoring selection and mutation, it can be generated by either inbreeding, drift in small populations or by migration between structured populations (Zayed & Packer, 2007). Inbreeding increases homozygosity which reduces the effective recombination rate, and increases genotypic disequilibrium, while drift can create nonrandom associations between alleles at different loci by chance events in small populations, which may persist for long periods when combined with inbreeding (Fox & Wolf, 2006 ; Zayed & Packer, 2007). Additionally, females showing complete homozygosity influence importantly the populations' genetic diversities, decreasing the observed heterozygosity. It seems unlikely that males (which are haploid) have been integrated accidentally in our analysis because they can be easily differentiated from females. One hypothesis is a production of females by diploidization of unfertilized eggs. This process is generally induced by symbionts that manipulate their host reproduction to enhance their transmission, such as Cardinium sp. or Wolbachia pipentis. These micro-organisms infect numerous arthropods, and particularly parasitoid species (Stouthamer et al. , 1999 ; Hilgenboecker et al. , 2008 ; Giorgini et al. , 2009). The complete homozygosity of the females observed in our study was not due to Wolbachia pipentis as this symbiont has not been detected. Restoration of diploidy without bacterial infection can also happen through several different cytological mechanisms such as gamete duplications (where chromosome sets are all duplicated and one pair randomly become the zygote) or cell fusions (reviewed in Haccou & Schneider, 2004). Another explanation being that some haploid eggs could result in females, such as some Nasonia vitripennis strains in which a few unfertilized eggs developed into gynandromorphs (Beukeboom et al. , 2007). The origin of complete homozygous A. ervi females deserves further studies. Despite the important differentiation between pea aphid-plant biotypes (Peccoud et al. , 2009a), no evidence of parasitoid differentiation according to host biotype has been found. There is lack of statistic support for the genetic clusters determined, as no individuals are strongly assigned and there is no clear biological interpretation for the assignments. Conclusions about clusters and their correspondences with host biotype or locations should thus be conservative. In any case, genetic differentiation across A. ervi is very low or even absent as indicated by non significant FST values. The molecular analysis of variance as well does not support a genetic divergence between A. ervi populations from alfalfa, pea, clover and lotus. As for other Aphidiinae where no host-associated differentiation was found (Bear et al. , 2004 ; Lozier et al. , 2009), Aphidius ervi seems to use indifferently A. pisum from any host plants. Here, we were able to analyze A. ervi populations from four A. pisum host biotypes although 11 pea aphid races have been delineated. The most differentiated aphid races are those from the meadow vetchling Lathyrus pratensis and from the spiny restharrow Ononis spinosa (Peccoud et al. , 2009a). Parasitoids are particularly difficult to find on these biotypes because sometimes the plant itself is hardly found, the aphid load is weak, or the parasitism rate is low. Consequently, we can not exclude that a cascading differentiation exists for parasitoid from other biotypes. Additionally, the divergence from last maternal ancestor of these pea aphid biotypes has been estimated between 8, 000 and 16, 000 years, with a burst of diversification at an estimated 3, 6009, 500 years (Peccoud et al. , 2009b). The recency of this diversification could have let not enough time for parallel parasitoid specialization. Moreover, parasitoids from alfalfa fields are regularly facing host populations with high prevalence of defensive symbionts. The level of resistance confered by the symbiont varies depending on the H. defensa strain, from small reduction in succesfull parasitism to nearly complete protection (Oliver et al. , 2010). Aphid symbiont-mediated resistance is thus likely to exert strong selective pressures on natural populations of parasitoids because they have a particularly intimate relationship with the hosts (Godfray, 1994). There is genetic variation within American populations of Aphidius ervi in the ability to overcome pea aphid resistance, thus an evolutionary response of the parasitoid populations is possible (Henter, 1995 ; Dion et al. , 2011). However, despite the large differences in the selective regimes due to the differences in resistance levels, Hufbauer (2001) showed that parasitoid collected from alfalfa and clover fields do not differ in their ability to overcome host resistance. The author suggests thus there is no evidence parasitoids are adapted to aphids from their home crops, or locally adapted to their home fields. We confirm this conclusion as A. ervi populations from clover or alfalfa do not differ in their genetic properties. It seems that this selection regime is not enough strong and continuous to reduce gene flow between A. ervi populations and to favor their isolation. Moreover, the selection process may be interrupted because A. ervi is generalist. Females can oviposit in many aphid species living on a wide range of plants and presenting variable life history traits or levels of resistance (Marsh, 1977 ; Henry et al. , 2010). Even if a female encounters an important selective barrier (high symbiont-mediated resistance on some alfalfa aphid populations, for example), the transmission of her genes could ever be ensured by reproducing inside an alternative aphid host species. More surprisingly is the absence of geographically structured populations. This is a particularly unexpected result given the high spatial scale of this study as parasitoids were sampled from the Western France to Switzerland, with at least 830 Km apart for the most separated sites. Gene flow among A. ervi populations therefore appears to be high enough to maintain extensive genetic homogeneity on a large geographical scale, preventing adaptations to local conditions. This points out the substantial dispersal abilities of this species. Measuring movement of small insects is quite difficult, but some indirect evidences suggest that parasitic wasps, especially little species such as A. ervi, can disperse through large distances (Godfray, 1994 ; Milne et al. , 1999 ; Hufbauer, 2001 ; Langhof et al. , 2005). Their important mobility also constrains the evolution of adaptation to pea aphid host races (e. g. Strauss, 1997 ; Storfer & Sih, 1998). From our study, it seems that Aphidius ervi is not specialized on a particular pea aphid biotype and shows high dispersal capacities associated with high genetic variability. Its foraging and mating behaviors, which are important clues for biological control success (Mills & Wajnberg, 2008), are well known (e. g. Pennachio et al. , 1994 ; Powell et al. , 1998 ; Battaglia et al. , 2002 ; He & Wang, 2008). Dispersal and genetic diversity are also two factors that may limit the success of a biological control agent. A. ervi has already been introduced in several countries such as North America in 1959 against the pea aphid, in Chili in 1976 against Sitobion avenae or in Australia between 1978 and 1980 to limit the aphid Acyrthosiphon kondoï. The surveys following A. ervi releases confirmed the efficiency of this species because of the control of the target pest in the entire environment and throughout the season, and simultaneous control of target and non target pests (Angalet & Fuester, 1977 ; Star, 1993 ; Milne, 1999). Nowadays, this parasitoid is particularly used in greenhouse pest management (van Emden & Harrington, 2007). Recent research demonstrated the increased capacity of selection lines to parasitize other aphid species ; or to overcome host defenses in controlled laboratory experiments (Henry et al. , 2008 ; Dion et al. , 2011). These results provide insight into a novel technique to enhance the quality of biological control agents through selection designs. These experiments may also help in preadapting the parasitoid to the temperatures or to the spatial structure of the intended foraging environment, and, finally, favor the natural enemy efficiency (Henry et al. , 2010). Acknowledgments We acknowledge Bernard Chaubet for help on parasitoid collection and determination, Lucie Mieuzet for supports on molecular experimentations and pea aphid sampling, and Julie Jaquiery for help on genotyping analysis. Thanks also to Solenn Stoeckel for help with pea aphid collection ; and Frédérique Mahéo for symbiont detection. The authors want to thanks Helene Henri and Fabrice Vavre for the interesting discussions about Wolbachia and for generously providing primers for its detection. Microsatellites development was supported by a grant from the French project INRA AIP BioRessources EcoMicro. This study was supported by the French INRA Santé des Plantes et Environnement (SPE) Department and the French Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche'. Literature cited Angalet, G. W. , Fuester, R. , 1977. The Aphidius parasites of the pea aphid Acyrthosiphon pisum in the eastern half of the United-States of America. Annals of the Entomological Society of America 70, 87-96. Antolin, M. F. , Bjorksten, T. A. , Vaughn, T. T. , 2006. Host-related fitness trade-offs in a presumed generalist parasitoid, Diaeretiella rapae (Hymenoptera : Aphidiidae). Ecological Entomology 31, 242-254. Battaglia, D. , Isidoro, N. , Romani, R. , Bin, F. , Pennacchio, F. , 2002. Mating behaviour of Aphidius ervi (Hymenoptera : Braconidae) : The role of antennae. European Journal of Entomology 99, 451-456. Baer, C. F. , Tripp, D. W. , Bjorksten, T. A. , Antolin, M. F. , 2004. Phylogeography of a parasitoid wasp (Diaeretiella rapae) : no evidence of host-associated lineages. 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He expected heterozygosity ; Ho observed heterozygosity (* heterozygote deficiency). Fluorochromes used for PCR product detection are indicated as Pet (Red), Ned (yellow), Fam (blue) and Vic (green). Total Locus Repeat Allele Primers allele He Ho A. eadyi name unit range number a : CAGTGGACCACAATCACCTG-Pet Ae01 ACA 190-220 7 0, 784 0, 717 yes b : TCATTGTCGGAATTTTGATGA a : TGAGCAACAATCCGAAACTG-Ned Ae03 TC 140-190 17 0, 795 0, 666* yes b : CCAATAATATAAGAGAAGCAAACG a : ACCACCACTATCATCAGC-Pet Ae06 CAT 210-255 16 0, 667 0, 608 yes b : AAAGGTGTGATTCCAAAGTG a : TCCTTTGGTAAATGCTTGGA- Fam Ae08 TGA 125-170 13 0, 858 0, 7 yes b : ATAACAGTGGTGTGCCCCTC a : AACGCCGAAATTTTCATTTG-Vic Ae16 AAC 290-330 10 0, 606 0, 474* yes b : CCAGTGGTTTGTAAATTACTTGATG a : TTGGATCTGCTTGAGGGTCT-Ned Ae20 GAT 110-150 16 0, 834 0, 560* yes b : TCTCCTCTTCTTTCTCTGCTTCA a : TGTACAAGTGACAGTAGTAACAACAA-Fam Ae22 TAG 100-145 16 0, 866 0, 636* yes b : ATAGCAGGCCAGACAATGCT a : AGCACCAAATCAAGCAACAGT-Pet Ae27 AAC 190-220 10 0, 609 0, 571 yes b : CTGGTATTGTTGAATTTGAATGA a : TTCGAACATGTCGTGTCCAT-Pet Ae29 GA 265-300 15 0, 820 0, 644* yes b : CGACTCACACTCACCCTCCT a : GAAAATATAGAGAGGGAGAAAAAGAGAA-Ned Ae32 AG 155-175 9 0, 722 0, 672 yes b : CCATTCAATGACGATACCCC a : TTGCTGTTGTACAATTAGCTGG-Fam Ae33 GTT 100-145 16 0, 812 0, 745 yes b : TCACAAAAATCCATGACTAATAA a : CATCTTCATTATCAACAACAGCA-Fam Ae38 TTG 100-130 10 0, 702 0, 400* yes b : TCAAGAAAATTCAAAAGTATCAAA Table 2. Genetic variability for A. ervi populations from alfalfa and clover races of A. pisum. For each population are given : N, number of individuals collected ; Na the number of alleles ; AR, the allelic richness ; HO and HE the observed and expected heterozygosity, and the FIS. Prevalence of H. defensa is given in brackets next to each location (NA : Non Available). Alfalfa N Na AR Ho He FIS D (57%) 69 9. 33 4, 00 0. 56 0. 73 0. 44 C (NA) 35 8. 17 3. 94 0. 62 0. 71 0. 27 M (91%) 13 5. 83 4. 39 0. 56 0. 73 0. 25 N (45%) 9 6, 00 4. 19 0. 61 0. 72 0. 37 R (100%) 39 7. 83 4. 09 0. 66 0. 74 0. 25 L (39%) 5 4. 33 4. 16 0. 61 0. 78 0. 23 Clover D (50%) 105 10. 08 4. 03 0. 56 0. 73 0. 34 M (40%) 34 8. 50 4. 06 0. 67 0. 74 0. 31 N (NA) 10 6, 00 4. 03 0. 55 0. 73 0. 33 R (NA) 25 8. 33 4. 09 0. 64 0. 75 0. 18 L (10%) 15 6. 92 4. 17 0. 56 0. 78 0. 35 Table 3 Partitioning of the genetic variance among host biotypes and among sampling sites. For each level, are represented : d. f. , the number of freedom degrees ; the sum of squares ; the variance components explained by the given level ; the proportion of variance (in %) explained by the level and the associated P value. Sum of Variance Percentage Parameter Source of variation d. f. P value squares components variation Host Among alfalfa, clover, lotus and pea 3 18. 339 0. 003 0. 069 0. 174 biotype Among sampling sites within host 13 71. 65 0. 031 0. 685 0. 147 biotypes Within populations 664 2927. 903 4. 428 99. 246 0. 027 Location Among sampling sites 7 40. 219 0. 0009 0. 019 0. 389 Among populations within sampling 9 49. 773 0. 0318 0. 713 0. 131 sites Within populations 664 2927. 903 4. 428 99. 246 0. 027 Figures Figure 1. Population structure of A. ervi. Vertical bars represent the individuals (genotypes from 12 microsatellites) and colours represent the proportion of assignment to clusters. Genotypes are classified by plants and then by locations (horizontal bars). Chapitre 4. INFLUENCES DES SYMBIOTES SUR L'INTERACTION A. PISUM - A. ERVI I. Influences des symbiotes sur les populations parasitoïdes 1. Objectifs Les études concernant la résistance des pucerons aux parasitoïdes conférée par les symbiotes portent majoritairement sur ses mécanismes (e. g. Degnan & Moran, 2008 ; Oliver et al. , 2009). Le puceron du pois possède une résistance innée (résistance cellulaire) à priori limitée (Gerardo et al. , 2010) et la résistance aux parasitoïdes est donc principalement liée au symbiote Hamiltonella defensa (Oliver et al. , 2010). Cette forme de résistance peut être particulièrement efficace (Oliver et al. , 2003 ; 2005 ; Ferrari et al. , 2004 ; Bensadia et al. , 2006). Elle est liée à la présence de bactériophages, nommés APSE' (A. pisum Secondary Endosymbiont), porteurs de gènes homologues à des toxines (Degnan & Moran, 2008 ; Oliver et al. , 2009 ; 2010) : les toxines sécrétées par le virus APSE provoqueraient un arrêt prématuré du développement du parasitoïde immature. Dans le génome de ce phage, il existe des variabilités génétiques pouvant être à l'origine des variations du degré de résistance conférée par H. defensa (Degnan & Moran, 2008). Cette résistance conférée par les symbiotes exerce une pression de sélection importante sur les populations de parasitoïdes. Les conséquences évolutives d'une telle résistance restent méconnues. Nous avons analysé l'influence de la présence d'H. defensa chez le puceron du pois sur l'évolution des populations de son principal parasitoïde. Dans le cadre d'une évolution expérimentale, des parasitoïdes ont été exposés, durant 10 générations, soit à des populations de pucerons porteurs du symbiote ou à des populations de pucerons non porteurs. Nous avons suivi l'évolution de la performance des parasitoïdes (taux de parasitisme) au fil des générations. Nous avons également mesuré les propriétés génétiques des populations de parasitoïdes soumises, ou non, à cette forme de résistance. 2. Approche et méthode générale Le déroulement de l'expérimentation est schématisé en Figure 4. 1. Au cours des générations, nous avons suivi la performance des parasitoïdes, le niveau d'expression de certains facteurs de virulence présents dans les glandes à venin des femelles, et les propriétés génétiques des populations de parasitoïdes. Figure 4. 1. Déroulement de l'évolution expérimentale : les manipulations et mesures effectuées sont représentées dans le temps pour chaque génération de parasitoïde, et ce dans un même traitement (D'après F. Zélé). L'article 2 présente l'évolution des performances des parasitoïdes au fil de générations. Par une approche transcriptomique, en collaboration avec M. Poirié (DR INRA Sophia-Antipolis), nous avons analysé l'expression de facteurs de virulence potentiels afin d'aborder la question de l'évolution de la virulence dans notre contexte expérimental. L'article 3 présente l'évolution des propriétés génétiques des deux populations de parasitoïdes au cours des générations. 3. Evolution de la performance des parasitoïdes - Article 2. Cette étude présente les niveaux de résistance de clones aphidiens porteurs d'H. defensa et de clones non porteurs. Nous y détaillons l'évolution expérimentale mise en œuvre et caractérisons l'évolution des taux de parasitisme dans les populations de parasitoïdes exposées et non exposées à la résistance. A la fin de l'évolution expérimentale, nous avons mesuré la capacité des deux populations de parasitoïdes à exploiter des pucerons résistants. Ce travail identifie également des coûts associés à la réponse des parasitoïdes à la résistance liée à H. defensa. Cet article a fait l'objet d'une publication dans la revue Journal of Evolutionary Biology' : Rapid evolution of parasitoids when faced with the symbiont-mediated resistance of their hosts. Dion E. , Zélé F. , Simon J. -C. & Outreman Y. 2011 Journal of Evolutionary Biology 24 : 741-750. doi : 10. 1111/j. 1420-9101. 2010. 02207. x Rapid evolution of parasitoids when faced with the symbiont-mediated resistance of their hosts E. DION*, F. ZÉLÉ* , J. -C. SIMON* & Y. OUTREMAN* *UMR 1099 INRA-Agrocampus Ouest-Université Rennes 1 Biologie des Organismes et des Populations appliquée à la Protection des Plantes', Rennes Cedex, Le Rheu Cedex, France CNRS UMR 2724 Génétique et Evolution des Maladies Infectieuses', IRD, Montpellier, France Keywords : Abstract Acyrthosiphon pisum ; Insects harbour a wild diversity of symbionts that can spread and persist within aphid resistance ; populations by providing benefits to their host. The pea aphid Acyrthosiphon experimental evolution ; pisum maintains a facultative symbiosis with the bacterium Hamiltonella parasitoid adaptation ; defensa, which provides enhanced resistance against the aphid parasitoid secondary symbionts. Aphidius ervi. Although the mechanisms associated with this symbiotic- mediated protection have been investigated thoroughly, little is known about its evolutionary effects on parasitoid populations. We used an experimental evolution procedure in which parasitoids were exposed either to highly resistant aphids harbouring the symbiont or to low innate resistant hosts free of H. defensa. Parasitoids exposed to H. defensa gained virulence over time, reaching the same parasitism rate as those exposed to low aphid innate resistance only. A fitness reduction was associated with this adaptation as the size of parasitoids exposed to H. defensa decreased through generations. This study highlighted the considerable role of symbionts in hostparasite co-evolutionary dynamics. to the host that increases its survival or reproduction Introduction relative to the uninfected congeners may then enhance There is no species living isolated from other organisms, their spread and persistence within the host population. but they rather establish frequently close associations During the last decades, there has been increasing with other species. Symbiosis is the term coined for a evidence for effects of secondary symbionts on host prolonged and intimate relationship between members phenotypes. These include host reproduction manipula- of different species, in which a symbiont' occupies a tion (e. g. Hurst et al. , 1999) and beneficial effects on host habitat provided by a host' (Begon et al. , 2006). Inver- fecundity or survival. In the latter case, recent works on tebrate species possess an extraordinary diversity of diverse invertebrates have revealed in particular that symbiotic microorganisms, especially bacteria (Chaston secondary symbionts can protect their hosts against & Goodrich-Blair, 2010). These symbionts can be classi- microbial diseases, parasites or predators (e. g. Gil-Turnes fied into two distinct groups according to the level of et al. , 1989 ; Gil-Turnes & Fenical, 1992 ; Kellner, 1999 ; dependence on the host. Primary symbionts are neces- Jaenike et al. , 2010). sary for host survival and reproduction, whereas second- Among insects, the symbionts of aphids are perhaps ary (or facultative) symbionts are not essential for their the best studied (Oliver et al. , 2010). In addition to host, although they generally cannot survive outside the their essential nutrient-providing symbiont, Buchnera host environment. aphidicola, aphids may also carry one or more secondary Secondary symbionts are predominantly vertically symbionts. These heritable symbionts exert diverse transmitted (Oliver et al. , 2010), and any effect conferred effects on their host. In the pea aphid Acyrthosiphon pisum, symbionts have an impact on the host ecology Correspondence : Yannick Outreman, UMR 1099 INRA-Agrocampus Ouest- through a wide range of effects, e. g. host plant utilization Université Rennes 1 Biologie des Organismes et des Populations (Tsuchida et al. , 2004), body colour (Tsuchida et al. , appliquée à la Protection des Plantes', 65, rue de Saint-Brieuc CS 84215, 35042 Rennes Cedex, BP 35327, 35653 Le Rheu Cedex, France. 2010), protection against heat stress (Montllor et al. , Tel. : 33 2 23 48 55 68 ; fax : 33 2 23 48 51 70 ; 2002) and enhanced protection against natural enemies e-mail : yannick. outreman@rennes. inra. fr (Oliver et al. , 2003 ; Scarborough et al. , 2005). 2011 THE AUTHORS. J. EVOL. BIOL. 24 (2011) 741750 JOURNAL OF EVOLUTIONARY BIOLOGY 2011 EUROPEAN SOCIETY FOR EVOLUTIONARY BIOLOGY 741 742 E. DION ET AL. Many organisms use aphids as resources, and among in succesfull parasitism to nearly complete protection them, insect parasitoids (i. e. insects whose larvae develop (Oliver et al. , 2010). Given these results, aphid symbiont- by feeding on (ectoparasitoids) or within (endoparasi- mediated resistance is likely to exert strong selective toids) an arthropod host, eventually killing it (Eggleton pressures on natural populations of parasitoids because & Belshaw, 1992) exert a strong pressure on aphid they maintain a particularly intimate relationship with populations. Parasitism rates can reach 70% (Hufbauer, the aphids as a single host harbours the parasitoid's 2002) but resistance to parasitoids exists in pea aphid offspring until maturity (Godfray, 1994). The intimate populations (Henter & Via, 1995 ; Hufbauer & Via, 1999 ; nature of this relationship promotes co-evolutionary Ferrari et al. , 2001). Aphids may counter parasitism with dynamics, while developing adaptation to counter the a combination of several mechanisms. They can resist combined effect of the aphid intrinsic immunity and the to a parasitoid attack through behavioural defences, but symbiont-mediated resistance. once oviposition has occurred, parasitoid eggs face With the use of an experimental evolution approach physiological defences based on host intrinsic immunity under controlled laboratory conditions, we investigated and on symbiosis with bacteria (Henter & Via, 1995 ; the adaptive potential of the aphid parasitoid A. ervi Hufbauer & Via, 1999 ; Le Ralec et al. , 2010). Little work facing either population of aphids harbouring H. defensa, has yet been carried out to characterize the pea aphid combining innate- and symbiont-mediated resistance, or immune response, but recent studies show that this population of aphids without secondary symbiont, pre- species is missing several genes central to insect immune senting only the innate resistance. The possible effects functions, conferring consequently only a partial resis- associated with a potential adaptation to exploit highly tance against parasitism (Gerardo et al. , 2010). Actually, resistant hosts were also estimated by measuring the size A. pisum largely relies on secondary symbionts as far as of the parasitoid along the selection process. protection against parasitoids is concerned. The failure of the parasitoid development is mainly because of the Materials and methods presence of symbiont members of the Enterobacteria- ceae, Serratia symbiotica and especially Hamiltonella defensa Organisms (Oliver et al. , 2003, 2005 ; Ferrari et al. , 2004). H. defensa has been reported to provide protection to A. pisum Twelve green clones of the pea aphid Acyrthosiphon pisum against both Aphidius ervi and Aphidius eadyi parasitoids (Harris) (Hemiptera : Aphididae) were chosen for this (Oliver et al. , 2003, 2005 ; Ferrari et al. , 2004 ; Bensadia study (see Table 1). As secondary symbiont community et al. , 2006), referred to as symbiont-mediated resis- in A. pisum strongly depends on the host biotype (Frantz tance' (Oliver et al. , 2005). This resistance appears to be et al. , 2009), A. pisum clones used in our experiment were largely correlated with the presence of a bacteriophage of chosen among a collection of plant-specialized genotypes H. defensa, A. pisum secondary endosymbiont (APSE) with known secondary symbionts (see Frantz et al. , 2009 ; (Oliver et al. , 2009), which encodes toxins that may be Peccoud et al. , 2009 for details on clone collection and responsible for prematurely arresting the development of symbiotic detection). Four of the 12 clones were free of parasitoid larvae (Degnan & Moran, 2008 ; Oliver et al. , secondary symbionts (i. e. clones called Hamiltonella-free' 2009). The effectiveness and the specificity of the clones). Among them, one was originated from alfalfa symbiont-mediated resistance have been studied in the (Medicago sativa), whereas the others came from spiny pea aphid. For instance, multiple strains of H. defensa restharrow (Onosis spinosa) and meadow vetchling (Lathy- were subsequently examined in a common aphid geno- rus pratensis). The eight other clones, collected on alfalfa, typic background, and all conferred partial protection harboured the secondary symbiont Hamiltonella defensa against A. ervi (Oliver et al. , 2005). Additionally, similar (i. e. clones called Hamiltonella' clones). All aphids were levels of resistance were found for a single strain of maintained on broad bean plants, Vicia faba. H. defensa established in multiple A. pisum clonal back- To favour evolutionary responses, genetically diverse grounds. These empirical studies corroborate the role of starting populations for Aphidius ervi parasitoids were this symbiont in protection against parasitoids. used. The initial culture was obtained by sampling about Although major advances have been made on the 200 A. pisum mummies (i. e. dead aphid containing a mechanisms associated with these symbiotic beneficial parasitoid few days before its emergence) in different effects on the infected host, little is known about their alfalfa fields around Rennes (Western France) in Novem- evolutionary outcomes on the targeted organisms, the ber 2008. Adults emerging from these collected mum- enemies. The frequency of A. pisum infected by H. defensa mies were split and maintained in three distinct Plexiglas varied between aphid populations (Frantz et al. , 2009) cages (40 30 50 cm) containing a high genetic and but an empirical study showed that this frequency symbiotic diversity of red and green pea aphids originat- increased dramatically after repeated exposure to para- ing from six different alfalfa crops, located in two sitism by the A. ervi parasitoid (Oliver et al. , 2008). The cities that are 40 km apart from one another. To limit level of resistance conferred by the symbiont varies genetic drift in the parasitoid populations, immigration depending on the H. defensa strain, from small reduction was simulated by regular addition of newly sampled 2011 THE AUTHORS. J. EVOL. BIOL. 24 (2011) 741750 JOURNAL OF EVOLUTIONARY BIOLOGY 2011 EUROPEAN SOCIETY FOR EVOLUTIONARY BIOLOGY Symbiont effects on hostparasitoid evolution 743 Table 1 List of the pea aphid clones from various French localities tested in the experiment 1. Clone Sampling site Sampling date Host plant Hamiltonella defensa H1 Domagné (West) 2008 Medicago sativa Yes H2 Domagné 2008 Medicago sativa Yes H3 Domagné 2008 Medicago sativa Yes H4 Pacé (West) 2008 Medicago sativa Yes H5 Pacé 2008 Medicago sativa Yes H6 Pacé 2008 Medicago sativa Yes H7 Le Rheu (West) 2008 Medicago sativa Yes H8 Le Rheu 2008 Medicago sativa Yes Hf9 Lusignan (Centre) 1987 Medicago sativa No Hf10 Bugey (East) 2006 Ononis spinosa No Hf11 Bugey 2006 Ononis spinosa No Hf12 Le Rheu 2006 Lathyrus pratensis No individuals or exchanges between the three cages. To first analysis aimed to test the effect of the presence of obtain parasitoids for experiments, mummies were col- H. defensa on effective parasitism rate. In our experimen- lected daily from cultures and placed individually in tal design, several clones harbouring or not harbouring gelatine capsules. Newly emerged females were enclosed the secondary symbiont were tested and this was in plastic tubes (22 1 cm) containing moistened cotton, considered as a random independent variable in our droplets of honey and one male for mating. Females statistical modelling. The effects of the high resistance between 2 and 3 days old were used only once. because of H. defensa (i. e. a fixed independent variable All insect rearing and experiments were performed in with two modalities) on the effective parasitism rate was climate rooms at 20 1 C, 70 10% relative humidity then tested by fitting generalized linear mixed models and L : D 16 : 8 h photoperiod. (GLMM) with binomial errors and a logit-link using the lme4 package (Bates & Maechler, 2009) in R 2. 8. 1 (R Development Core Team, 2008). The second analysis Experiment 1 : Aphid clone resistance measurement consisted of the comparison of the effective parasitism Experimental set-up rate between the different clones containing or not the This experiment aimed to evaluate the level of resistance symbiont. For this purpose, the response variable was to parasitism in the 12 aphid clones to select clones for tested against the aphid clone by using generalized the evolution experiment. Their level of parasitism estimation equations (GEE) that considered repeated resistance was estimated by using a classical parasitism data (e. g. a female attacking 10 successive aphids), with design (modified from Oliver et al. , 2003). Just prior to binomial errors and a logit-link using the geepack package the experiment, the parasitoid females were allowed to (Yan, 2002) in R 2. 8. 1. oviposit in a healthy aphid to provide them an oviposi- tion experience. Any female that did not oviposit within Experiment 2 : Experimental evolution of parasitoid the first 5 min was discarded. The female was then populations exposed to symbiont-mediated introduced in a glass Petri dish containing 15 third-instar resistance aphid larvae of a given clone, placed on a broad bean leaf for an hour. After each oviposition (i. e. the female has Experimental evolution procedure stung one aphid individual with its ovipositor), the The experimental evolution procedure is illustrated in attacked aphid was removed from the experimental Fig. 1. It was performed for 10 parasitoid generations arena and placed on a new broad bean plant. The using two selection treatments that were applied in experiment ended when the parasitoid had attacked exactly the same way except the presence or absence of 10 aphids successively. During the following days, the the symbiont-mediated resistance in host population. A number of parasitoids emerging from the 10 attacked host population consisted here of a broad bean plant aphids was daily counted to determine the effective (about 15 cm height) infested with 32 third-instar aphids parasitism rate (i. e. the number of parasitoids emerging and covered with cellophane bags to avoid their escape. from a given host population). Five replicates were To reduce the aphid genotype effect, a host population carried out for each aphid clone tested. contained either individuals from the four Hamiltonella- free' aphid clones or individuals from four clones chosen Statistical analyses among the nine harbouring H. defensa. The selection of The dependent variable analysed here was the effective these Hamiltonella' clones was based on results from parasitism rate, suggesting that the response was bino- experiment 1. In a host population, each clone was mial (i. e. a parasitoid emerged or not from an aphid). The equally represented (i. e. eight individuals per clone). For 2011 THE AUTHORS. J. EVOL. BIOL. 24 (2011) 741750 JOURNAL OF EVOLUTIONARY BIOLOGY 2011 EUROPEAN SOCIETY FOR EVOLUTIONARY BIOLOGY 744 E. DION ET AL. Initial parasitoid population D0 D0 D4 D4 HP1 HP2 HP3 . HP8 HP1 HP2 HP3 . HP8 G0 H H H H D12D15 D12D15 Parasitoids offspring mating Parasitoids offspring mating D0 D0 D4 D4 HP1 HP2 HP3 . HP8 G1 HP1 HP2 HP3 . HP8 H H H H . . . D12D15 . . D12D15 Parasitoids offspring mating Parasitoids offspring mating D0 D0 D4 D4 HP1 HP2 HP3 . HP8 G10 HP1 HP2 HP3 . HP8 H H H H D12D15 D12D15 Nonexposed parasitoid line Exposed parasitoid line Di : Days since parasitoids introduction : Presence of parasitoids Gi : Parasitoids generation number : Removal of aphid mummies HPi : Host population H : Host population harboring Hamiltonella defensa Fig. 1 Experimental evolution design. each parasitoid generation, eight Hamiltonella-free' and strong selection characterized by the combination of both eight Hamiltonella' host populations were similarly con- innate- and symbiont-mediated resistances. The two stituted and then exposed to parasitoids. Consequently, treatments were both followed during 10 generations. parasitoids faced fixed host populations over time. The experimental evolution procedure consisted in For the initial population of parasitoids used in this introducing four parasitoid females in each host popula- experimental evolution design, 150 mummies were tion. One parasitoid male was also added into the randomly extracted from the initial cultures. All emerg- cellophane bag to ensure mating and females fecunda- ing females were allowed to mate during 1 day and then tion. Parasitoids were allowed to exploit the host popu- split for the two selection treatments : (i) the Nonex- lation for 4 days. After this delay, they were removed posed' parasitoid line was exposed to Hamiltonella-free' from the design and stored in 95 C ethanol for host populations, meaning the wasps were submitted to a subsequent measurements. The host population was low selection exerted by the aphid intrinsic immune then maintained in climate chambers during 20 days responses ; and (ii) the Exposed' parasitoid line was and examined daily to record and extract aphid mum- exposed to Hamiltonella' host populations exerting a mies isolated in gelatine capsules. To minimize the loss 2011 THE AUTHORS. J. EVOL. BIOL. 24 (2011) 741750 JOURNAL OF EVOLUTIONARY BIOLOGY 2011 EUROPEAN SOCIETY FOR EVOLUTIONARY BIOLOGY Symbiont effects on hostparasitoid evolution 745 of genetic diversity because of inbreeding and reduced statistical analyses, the selection treatment was coded as a population size, all parasitoid males and females emerg- factor (i. e. a class-independent variable with two levels) ing from each host population of a selection treatment and the parasitoid generation as a covariate (i. e. a were pooled together during 1 day and 32 females (i. e. continuous independent variable). four females for each of the eight host populations) were The second set of analyses consisted of analysing how randomly chosen to constitute the next generation. This the difference between the two selection treatments experimental procedure was continuously conducted for changed with the parasitoid generation number. Pairwise 10 successive parasitoid generations (from February 2009 comparison between the Nonexposed' and Exposed' to November 2009). parasitoid lines was then made at each parasitoid gener- At each parasitoid generation, the following variables ation with the function esticon' in the doBy' package were measured, as they provide an approximation of the (Hjsgaard, 2009). For each response, graphics repre- fitness components (Roitberg et al. , 2001) : (i) the effec- senting the difference between the mean of both selec- tive parasitism rate represented by the number of tion treatments according to the parasitoid generation parasitoids emerging upon the overall host population number were drawn to illustrate how the two parasitoid (i. e. this was the number of parasitoids emerging from lines differed in time. the 32 aphids) and (ii) the left tibia size of the individuals that had survived, stored in 95 C ethanol. The potential Experiment 3 : Assessment of selection efficiency effects on parasitoid fitness associated with the adapta- tion to the high level of resistance conferred by second- Experimental procedure ary symbionts were estimated by measuring the size of This experiment aimed to assess how the ability of parasitoid females. On the basis of previous works parasitoids to use aphids harbouring H. defensa as hosts (Godfray, 1994 ; Nicol & Mackauer, 1999 ; De Conti et al. , evolved following experimental evolution. Using the 2008), this measurement is a good proxy for parasitoids parasitism design of the first experiment, we measured fecundity, as, in Hymenopteran parasitoids, the repro- the effective parasitism rate of the offspring of both lines ductive fitness in terms of fecundity, parasitism, search- on two Hamiltonella' clones. They were randomly ing rate and longevity is often positively correlated with selected among the four clones used in the experiment the body size (Godfray, 1994 ; He & Wang, 2006). Left 2. For each parasitoid line, 10 females were tested on tibia length was measured under a binocular using the each clone. Archimède software (Microvision Instruments, 1997 2007, Evry, France, on 356 Statistical analyses females for five parasitoid generations (G1, G2, G5, G7 In this analysis, three parasitoid populations were com- and G10). pared : the initial population before the experimental evolution, the offspring of the Nonexposed line' and the Statistical analyses offspring of the Exposed line' after the experimental The first set of analyses consisted of testing the effect of evolution. The effective parasitism rate was then tested the parasitoid generation number and the selection against the aphid clone (i. e. a class-independent variable treatment on each dependent variable. In this experi- with two levels), the parasitoid population (i. e. a class- mental design, some of the response data were corre- independent variable with three levels) and the interac- lated. Concerning the effective parasitism rate, the 32 tion between these two factors by fitting GEE models aphids of one host population were exposed to the same with binomial errors and a logit-link function. four parasitoid females. These data clusters must be considered as if correlation was not taken into account Results then the standard errors of the parameter estimations would not be valid (for details, see Liang & Zeger, 1986). Experiment 1 : Aphid clone resistance measurement The analysis of these dependent variables was then carried out by means of generalized estimating equations Figure 2 represents the effective parasitism rate mea- (GEE) to estimate parameters for correlated data. The sured on the 12 aphid clones tested. The presence of effective parasitism rate was tested against the parasitoid H. defensa in aphids strongly reduced the probability of generation (from 0 to 10), the selection treatment parasitoid emergence (GLMM, v21 10. 55, P < 0. 001). (Nonexposed' vs. Exposed' parasitoids line) and the Overall, 143 parasitoids emerged from the 200 Hamilto- interaction between these two independent variables by nella-free' aphids attacked by A. ervi, whereas only 33 GEE assuming a binomial error and a logit-link function emerged from the 400 Hamiltonella' aphids exposed to using the geepack package (Yan, 2002) in R 2. 8. 1. The the parasitoid wasp. This confirmed that the presence of effect of the parasitoid generation, the selection treat- H. defensa conferred a stronger level of protection against ment and the interaction between these two indepen- A. ervi in this particular set of aphid clones than the single dent variables on the left tibia length of females was innate resistance. Significant difference in parasitism estimated using a standard analysis of variance. For all rates was found between Hamiltonella-free' clones 2011 THE AUTHORS. J. EVOL. BIOL. 24 (2011) 741750 JOURNAL OF EVOLUTIONARY BIOLOGY 2011 EUROPEAN SOCIETY FOR EVOLUTIONARY BIOLOGY 746 E. DION ET AL. 1 B 0. 9 0. 8 Effective parasitism rate 0. 7 A 0. 6 0. 5 0. 4 c Fig. 2 Effective parasitism rate 0. 3 b (mean standard error) of Aphidius ervi 0. 2 females on aphid clones harbouring (open 0. 1 b bars) or not (black bars) Hamiltonella defensa. b b a Columns with different letters are signifi- 0 cantly different (P < 0. 05). *Clones har- H7 H5 H8* H1 H6* H3* H2* H4 Hf11 Hf9 Hf10 Hf12 bouring the secondary symbiont selected Aphid clones for the experimental evolution. (GEE, v23 20. 40, P < 0. 001), and the level of symbiont- 0. 9 (a) mediated resistance varied significantly between aphid 0. 8 Effective parasitism rate clones harbouring the secondary symbiont (GEE, 0. 7 v27 70. 94, P < 0. 001). 0. 6 For the evolution experiment, aphid clones harbouring 0. 5 H. defensa were chosen in such a way that the selection 0. 4 pressure was relatively important, but not too strong to 0. 3 ensure the production of new parasitoid generations. The 0. 2 aphid clones H2, H3, H6 and H8 were then selected to 0. 1 constitute the Hamiltonella' treatment. 0 Parasitoid generation number Experiment 2 : Experimental evolution of parasitoid populations exposed to symbiont-mediated Differential effective parasitism rate (b) resistance 0. 4 * 0. 3 Effective parasitism rate * * 0. 2 * The effective parasitism rate in the two treatments is shown in Fig. 3. The proportion of emerged parasitoids 0. 1 from the host population varied from 0. 2 to 0. 6, and this 0 response fluctuated in the course of the experimental 0. 1 selection producing a high level of variance (Fig. 3a). 0. 2 Neither the parasitoid generation number (GEE : 0. 3 v21 3. 22, P 0. 072) nor the selection treatment (GEE : 0. 4 v21 3. 56, P 0. 059) significantly influenced the mean Parasitoid generation number effective parasitism rate. There was, however, a signifi- cant interaction between the selection treatment and the Fig. 3 (a) The effective parasitism rate for each generation generation number (GEE : interaction term, v21 7. 63, (mean standard errors) of Aphidius ervi females exposed to popu- P 0. 005). Parasitoids from Exposed' lines produced lations of aphids harbouring (white dots, Exposed' parasitoid line) significantly lower offspring when exposed early to or not (black dots, Nonexposed' parasitoid line) Hamiltonella defensa. (b) Differential effective parasitism rate between the two selection Hamiltonella' host populations compared to parasitoids treatments : mean of the Nonexposed' parasitoid line minus the exposed to Hamiltonella-free' host populations. However, mean of the Exposed' parasitoid line. Stars represent significant after a few generations, both parasitoid lines produced differences between both treatment means (see Materials and the same number of offspring in the presence or in the methods) (*P < 0. 001, *P < 0. 01 and *P < 0. 05). absence of H. defensa in host populations. Pairwise com- parisons showed that four generations were sufficient to observe similar parasitism performance between (GEE : v21 12. 4, P < 0. 001), as the parasitism rate in the Exposed' and Nonexposed' parasitoid lines (Fig. 3b). Nonexposed' line was not significantly affected by the This convergence of the parasitism rates was only generation number (GEE : v21 0. 307, P 0. 58). It because of the significant increase in the Exposed' line should be noted that the effective parasitism rate of the 2011 THE AUTHORS. J. EVOL. BIOL. 24 (2011) 741750 JOURNAL OF EVOLUTIONARY BIOLOGY 2011 EUROPEAN SOCIETY FOR EVOLUTIONARY BIOLOGY Symbiont effects on hostparasitoid evolution 747 1000 (a) 0. 6 980 Clone H2 0. 5 Left tibia length (m) 920 0. 4 880 0. 3 0. 2 Effective parasitism rate 0. 1 Parasitoid generation number 0. 3 Clone H6 Differential left tibia length (m) (b) 40 * 0. 2 20 0. 1 40 60 Parasitoid generation number 0 Before experimental After experimental evolution evolution Fig. 4 (a) Length of the left tibia for each generation (mean standard errors) of Aphidius ervi females exposed to populations of aphids harbouring (white dots, Exposed' parasitoid line) or not Fig. 5 Effective parasitism rate (mean standard errors) of the (black dots, Nonexposed' parasitoid line) Hamiltonella defensa. initial Aphidius ervi parasitoid population before the experimental (b) Differential parasitoid left tibia length between the two selection evolution (grey dots), of the Nonexposed' parasitoid line (black treatments : mean of the Nonexposed' parasitoid line minus the dots) and of the Exposed' parasitoid line (white dots) after the mean of the Exposed' parasitoid line. Stars represent significant experimental evolution on the two clones H2 and H6 harbouring differences between both treatment means (see Materials and Hamiltonella defensa. methods) (*P < 0. 001, *P < 0. 01 and *P < 0. 05). Exposed' parasitoid line surpassed the Nonexposed' one Hamiltonella' clones, the statistical model indicated a at the fifth generation. selective response. The Exposed' parasitoid line had more parasitoids successfully emerging from Hamiltonel- Female size la' aphids than both initial parasitoid population and Overall, parasitoids from Exposed' line had similar tibia Nonexposed' parasitoid line (Fig. 5, GEE : v22 6. 52, lengths than those from Nonexposed' line (Fig. 4a, GEE : P 0. 038), and this result did not depend on the aphid v21 1. 19, P 0. 276). The body size, however, declined clone tested (GEE : interaction term, v21 0. 166, towards the end of the experiment in the two lines (GEE : P 0. 920). v21 9. 51, P 0. 002), and it did not depend on the selection treatment (GEE : interaction term, v21 0. 25, Discussion P 0. 618). The analysis of mean difference between the two selection treatments at each parasitoid generation We used experimental evolution to determine whether showed that parasitoids from the Exposed' and Nonex- there was heritable variation for parasitoid response to posed' lines significantly differed in their tibia size after high host protection linked to a combination of symbi- 10 generations of selection (Fig. 4b). After 10 genera- ont- or innate-mediated resistance and whether this tions, the parasitoids exposed to Hamiltonella' host response was associated with changes in fitness compo- populations had smaller left tibias compared with par- nents. Experimental evolution is particularly suited for asitoids exposed to Hamiltonella-free' host populations. the study of adaptation and is also a powerful tool for the detection of fitness trade-offs related to an evolved trait (Fuller et al. , 2005). However, a limitation of experimen- Experiment 3 : Efficiency of selection tal evolution is that not all biological systems are equally to symbiont-mediated resistance suited to these types of studies as in many hostparasite When comparing the effective parasitism rate of parasi- interactions, one or both of the antagonists cannot be toids before and after the experimental evolution on two prevented from evolving : the genotype of either host or 2011 THE AUTHORS. J. EVOL. BIOL. 24 (2011) 741750 JOURNAL OF EVOLUTIONARY BIOLOGY 2011 EUROPEAN SOCIETY FOR EVOLUTIONARY BIOLOGY 748 E. DION ET AL. parasite cannot be preserved over time (Gaba & Ebert, female venom is called c-glutamyl transpeptidase (cGT) 2009). In our context, parthenogenetic reproduction of and triggers the apoptosis of the germaria and ovarioles aphids ensured the transmission and the preservation of cells of the pea aphid (Digilio et al. , 2000 ; Falabella et al. , the same genetic and symbiotic background (Oliver et al. , 2007). At least two different alleles of the cGT have been 2010) and A. ervi parasitoids faced host population of identified (C. Anselme, unpublished). The venom effect the same resistance at each generation. Finally, this is completed by two proteins, FABP and ENO, released by experimental approach allowed us to select parasitoid the teratocytes (cells derived from the parasitoid egg adaptation and demonstrated the important role of membrane). All those putative virulence factors may secondary symbionts in the hostparasite co-evolution- induce host-resource hijacking, favouring the parasitoid ary dynamics. development (Falabella et al. , 2005, 2009). Conse- In this study, measurements of parasitism resistance in quently, the response of the selected female could rely the pea aphid clones showed that the presence of on a variation in the virulence factors in the initial H. defensa explained most of the variations in parasitoid population, traits under directional selection in our protection, validating results from earlier studies (for a experiment, and transmitted by the females to the next review, see Le Ralec et al. , 2010 and Oliver et al. , 2010). generations. Further molecular analysis is needed to Interestingly, the clones infected with the secondary determine the mechanisms associated with this improved symbiont varied in their degree of resistance. One source virulence, for instance, by comparing the venom com- of such variations could be the nature of toxins produced position of the Exposed' parasitoid line that responded to by the different type of APSE bacteriophages harboured the strong selective pressure with Nonexposed' parasit- by H. defensa (Degnan & Moran, 2008). Another expla- oid line that did not respond significantly to the low host nation being that genotype-by-symbiont interactions resistance. exist in the pea aphid host. This is in contradiction with The possibility that improved virulence is accompanied Oliver et al. (2005) who did not find any interaction by some changes in other fitness components is suggested between symbiont isolate and genetic background. How- by a decrease in the size of the left tibia in females ever, in our study, there were significant variations in the exposed to the two types of resistance in aphid popula- resistance of Hamiltonella-free' clones, suggesting int- tions. This proxy for fecundity in hymenopterans (He & erclonal variations in aphid innate resistance compo- Wang, 2006, 2008) decreased in the two treatments at nents. This reinforces Vorburger et al. (2009) suggestion the tenth generation, so noticeable fitness modifications that aphid parasitoids are confronted with two lines of did not occur until parasitoids had spent between 7 and aphid defences : innate defences' and acquired defences' 10 generations on hosts. This delay of the response provided by secondary symbionts, which likely differ excludes the influence of a possible variation in in their effectiveness and specificity. During this first nutritional quality between aphids harbouring or not experiment, we had the opportunity to study the H. defensa as the effect on parasitoid size would have evolution of parasitoids facing two types of resistance : appeared at the first generation. The size reduction was (i) a strong selection pressure because of a combination much lower in parasitoids exposed to Hamiltonella-free' of Hamiltonella-mediated resistance and intrinsic immu- clones than to Hamiltonella' clones, suggesting a cost for nity and (ii) a low selection pressure exerted only by the aphid resistance adaptation in parasitoid populations. The aphid immune response. existence of such trade-offs supports the notion of a Interestingly, this study showed how resistance com- genotypic response of the parasitoids to the selective ponents in insect hosts are potential agents in the agent. Trade-offs associated with the improvement in selection of their parasitoids through changes in fitness host resistance have been largely described in Drosophila over the course of experimental evolution. From the fifth (Kraaijeveld et al. , 1998 ; Vijendravarma et al. , 2009) and parasitoid generation, the population fitness of both also in aphids (Vorburger et al. , 2008), but the costs selection treatments, estimated by the effective parasit- associated with modifications in virulence of parasitoids ism rate, converged. The third experiment confirmed the are less well documented. The possibility of fitness costs beneficial effect of the experimental selection on para- to improved virulence is suggested by our observations sitoid population as Exposed' parasitoid line was more but the study of their ecological and evolutionary able to counter the resistance of the aphids harbouring consequences would be particularly helpful to under- H. defensa compared to the initial parasitoid population. stand the aphid-parasitoid co-evolutionary processes. Our results provide evidence that mechanisms involved Intense selective pressure resulted in diverse adapta- in virulence', defined as wasp's ability to develop within tions in parasitoid strategies to successfully infest a host host and to emerge from it (Henter, 1995 ; Antolin et al. , (Poirié et al. , 2009). Our experimental evolution provides 2006), exist in parasitoid populations. Parasitoid viru- evidence for rapid evolution in A. ervi populations when lence is generally mediated by surface attributes of faced with high aphid resistance and highlights the parasitoid eggs and eggs associated with biological mate- adaptive potential of parasitoid populations (Kraaijeveld rials injected into the host by the wasp (Bensadia et al. , et al. , 2001 ; Henry et al. , 2008 ; Gaba & Ebert, 2009). This 2006). The main bioactive protein isolated from A. ervi experimental work is consistent with previous studies 2011 THE AUTHORS. J. EVOL. BIOL. 24 (2011) 741750 JOURNAL OF EVOLUTIONARY BIOLOGY 2011 EUROPEAN SOCIETY FOR EVOLUTIONARY BIOLOGY Symbiont effects on hostparasitoid evolution 749 revealing the potential of A. ervi populations showing Chaston, J. & Goodrich-Blair, H. 2010. Common trends in H. defensa parasitoid genotype specificities in the aphid mutualism revealed by model associations between inverte- Lysiphlebus fabarum A. ervi system (Vorburger et al. , brates and bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 34 : 4158. 2009), or populations increasing their performances on De Conti, B. F. , Bueno, V. H. P. & Sampaio, M. V. 2008. The parasitoid Praon volucre (Hymenoptera : Braconidae : Aphidii- particular target host species and becoming locally nae) as a potential biological control agent of the aphid adapted to their natal host population (Henry et al. , Uroleucon ambrosiae (Hemiptera : Aphididae) on lettuce in 2008, 2010). Henter (1995) also described the genetic Brazil. Eur. J. Entomol. 105 : 485487. adaptive potential of the parasitoid wasp populations. Degnan, P. H. & Moran, N. A. 2008. Diverse phage-encoded Up to now, 11 pea aphid host plant biotypes have been toxins in a protective insect endosymbiont. Appl. Environ. genetically determined (Peccoud et al. , 2009) and these Microbiol. 74 : 67826791. different races differ in their prevalence of secondary Digilio, M. C. , Isidoro, N. , Tremblay, E. & Pennacchio, F. 2000. symbionts (Frantz et al. , 2009). In nature, they may Host castration by Aphidius ervi venom proteins. J. Insect present a spatial heterogeneity in resistance to A. ervi in Physiol. 46 : 10411050. association with the prevalence of symbionts conferring Eggleton, P. & Belshaw, R. 1992. Insect parasitoids : an evolu- tionary overview. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 337 : 120. resistance. Consequently, the differential resistance lev- Falabella, P. , Perugino, G. , Caccialupi, P. , Riviello, L. , Varricchio, els may lead to the adaptation of particular A. ervi P. , Tranfaglia, A. et al. 2005. A novel fatty acid binding protein genotypes, promoting local specialization and then diver- produced by teratocytes of the aphid parasitoid Aphidius ervi. sification in parasitoid populations (Fry, 1996 ; Laine, Insect Mol. Biol. 14 : 195205. 2009). It remains unclear to what extent host resistance Falabella, P. , Riviello, L. , Caccialupi, P. , Rossodivita, T. , Valente, may affect the population structure or divergence at the M. T. , De Stradis, M. L. et al. 2007. A gamma-glutamyl trans- parasitoid level, and it may trigger codivergence in their peptidase of Aphidius ervi venom induces apoptosis in the parasitoids. However, host-associated differentiation in ovaries of host aphids. Insect Biochem. Mol. Biol. 37 : 453465. parasitoids is increasingly described (Stireman et al. , Falabella, P. , Riviello, L. , De Stradis, M. L. , Stigliano, C. , Varric- 2006 ; Smith et al. , 2007), giving suggestions regarding chio, P. , Grimaldi, A. et al. 2009. Aphidius ervi teratocytes release an extracellular enolase. Insect Biochem. Mol. Biol. 39 : the issues of co-evolutionary processes between hosts 801813. and parasitoids, and maybe explaining the high richness Ferrari, J. , Muller, C. B. , Kraaijeveld, A. R. & Godfray, H. C. J. of the hymenopteran parasitoid group (LaSalle & Gauld, 2001. Clonal variation and covariation in aphid resistance to 1992). parasitoids and a pathogen. Evolution 55 : 18051814. Ferrari, J. , Darby, A. C. , Daniell, T. J. , Godfray, H. C. J. & Douglas, A. E. 2004. Linking the bacterial community in pea aphids Acknowledgments with host-plant use and natural enemy resistance. Ecol. The authors like to thank Caroline Anselme, Marylène Entomol. 29 : 6065. Poirié, Yvan Rahbé and Manuel Plantegenest for all Frantz, A. , Calcagno, V. , Mieuzet, L. , Plantegenest, M. & Simon, stimulating discussions and suggestions about this work. J. C. 2009. Complex trait differentiation between host-popu- lations of the pea aphid Acyrthosiphon pisum (Harris) : implica- Thanks also to Jean Peccoud for help with pea aphid tions for the evolution of ecological specialisation. Biol. J. Linn. collection, Bernard Chaubet for the rearing, Ludovic Soc. 97 : 718727. Guyonvarch for the enormous' technical support, Fry, J. D. 1996. The evolution of host specialization : are trade- Benjamin Agogue and Alan Walton for language correc- offs overrated ? Am. Nat. 148 : S84S107. tions. Two anonymous referees are also acknowledged for Fuller, R. C. , Baer, C. F. & Travis, J. 2005. How and when their constructive comments on an earlier draft. This study selection experiments might actually be useful. Integr. 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Les facteurs de virulence potentiels ont été identifiés sur la base des similarités de séquences ou de fonctions à des facteurs déjà décrits et/ou selon l'abondance des transcrits dans la banque. La confirmation de leur surexpression dans les glandes à venin (par rapport au reste du corps) a été réalisée par RT-PCR quantitative. Neuf gènes candidats, dont deux gènes GT ont été identifiés. Les protéines identifiées auraient des fonctions liées à la castration de l'hôte (GT) et à l'inhibition du système immunitaire du puceron (autres candidats). Méthodes Pou déterminer si la sélection vis-à-vis de la résistance du puceron hôte a un effet au niveau de l'expression des facteurs de virulence des parasitoïdes, nous avons quantifié le taux de transcrits des différents gènes chez les femelles parasitoïdes exposées ou non à la résistance conférée par H. defensa. Pour cela, les glandes et le réservoir à venin des femelles ont été disséqués (Figure 4. 2. ) et l'ARN a été extrait avec le kit RNeasy Plus Micro Kit de Qiagen. Les ARNm ont été rétrotranscrits avec le kit iScript cDNA Synthesis (BioRad). La quantification par PCR quantitative en temps réel a été réalisée avec le système Opticon monitor 2 de BioRad grâce au kit qPCR SYBR MasterMix Plus for SYBR Green I No ROX d'Eurogentec, à l'INRA de Sophia-Antipolis. Des amorces spécifiques des gènes d'intérêt et les conditions optimales de PCR ont été déterminées pour chaque candidat ainsi que pour deux gènes de ménage (RPL19 et RPL23) utilisés pour normaliser les données. Les résultats ont été analysés par la méthode des delta CT à l'aide du logiciel qBase (Hellemans et al. , 2007). A l'issue d'une analyse préliminaire sur des échantillons correspondant aux femelles avant l'évolution expérimentale (G0), et aux femelles des 10ème et 11ème générations exposées ou non à la résistance conférée par le symbiote, trois gènes qui présentaient une variabilité du taux de transcrits ont été sélectionnés pour notre étude. Il s'agit de gènes codant pour un peptide riche en cystéines nommé CL11C1' (rôles potentiels : peptide antimicrobien ou inhibiteur de la mélanisation), et deux protéases à sérine, CL7C1' et YL16' (inhibiteurs potentiels de la mélanisation). Nous avons analysé la quantité de transcrits de ces trois gènes dans les glandes des femelles avant à G0, à G25 (après 25 générations de parasitoïdes exposés ou non à H. defensa), et sur des femelles d'élevage n'ayant subi aucune manipulation durant les 25 générations. Figure 4. 2. : Etapes de la dissection des femelles parasitoïdes. L'appareil reproducteur est d'abord extrait sous loupe binoculaire dans du liquide physiologique de Ringer (1et 2), pour ensuite en isoler le réservoir et la glande à venin (3). Réservoir (a), glandes à venin plurilobées (b), ovaires (c), spermathèque (d), glande de Dufour (e) et ganglion de la chane nerveuse (f). Résultats La quantité de transcrits de CL11C1 est beaucoup plus importante dans les glandes des femelles expérimentées de la G25 que dans les glandes des femelles des populations d'élevage ou de celles prélevées avant l'évolution expérimentale (G0). Le taux de transcrits de CL7C1 est en revanche plus faible en G25 dans les deux lignées de femelles par rapport à la G0. Enfin, le taux de transcrits de YL16 est plus faible chez les femelles expérimentées de la G25. Il n'y a pas de différence significative entre les taux de transcrits de CL11C1 et CL7C1 des femelles exposées et des femelles non exposées au symbiote (Figure 4. 3. ). Discussion et conclusion CL11C1 est le seul gène surexprimé à la 25ème génération de sélection par rapport à la G0. Toutefois, il n'y a pas de différence significative entre les deux traitements, parasitoïdes exposés ou non à H. defensa. b b 3, 0 2, 5 Taux de transcrits 2, 0 (expression relative) 1, 5 a a 1, 0 a 0, 5 c a c b CL11C1 CL7C1 YL16 Avant Evolution Expérimentale Parasitoïdes non exposés à H. defensa (G25) Population en élevage (G25) Parasitoïdes exposés à H. defensa (G25) Figure 4. 3. Expression relative de CLC11, CLC7 et YL16. Les taux de transcrits relatifs sont calculés par rapport au taux de transcrits chez les femelles de la génération 0 (avant sélection expérimentale) choisies comme échantillon de référence (taux de transcrit fixé à 1). Les barres verticales représentent l'erreur standard de la moyenne calculée à partir de trois répétitions biologiques et trois répétitions techniques. Les lettres différentes indiquent des taux d'expression significativement différents à p Le facteur de cette sélection reste donc inconnu, mais plusieurs hypothèses peuvent être formulées : i. Les femelles issues de l'élevage ont été prélevées directement dans la cage alors que les femelles expérimentées ont subi plus de manipulations (prélèvement, isolement). L'expression de CL11C1 pourrait donc être associée à un stress des femelles dû à cette manipulation. ii. Les pucerons possèdent une réponse intrinsèque, qu'ils portent ou non le symbiote. CL11C1 pourrait donc jouer un rôle dans le contournement du système immunitaire de l'hôte. iii. Au cours de cette expérience, les femelles parasitoïdes sont aussi sélectionnées sur des caractères liés au succès parasitaire, comme la capacité à exploiter leurs hôtes (ex. via castration). Il est donc possible que CL11C1 puisse influer sur l'exploitation des ressources de l'hôte. Aucun gène n'étant surexprimé spécifiquement chez les femelles sélectionnées sur les pucerons très résistants, nos résultats n'ont pas permis d'identifier de facteurs de virulence sélectionnés lors de l'exposition aux pucerons porteurs de H. defensa. Des analyses moléculaires supplémentaires et des comparaisons avec des facteurs présents chez une espèce de parasitoïde proche d'A. ervi permettront de préciser les fonctions exactes de ces molécules dans l'exploitation de l'hôte. 5. Evolution des propriétés génétiques des populations sélectionnées- Article 3. Les femelles parasitoïdes issues de l'évolution expérimentale ont été, à chaque génération, conservées afin d'en extraire l'ADN. Nous avons amplifié les marqueurs microsatellites décrits dans le chapitre 3 puis mesuré les variabilités et structures génétiques des populations exposées ou non à la résistance liée au symbiote. Nous avons ainsi comparé les deux populations de parasitoïdes dans le but de détecter les traces de la sélection au niveau génétique. L'évolution des propriétés génétiques des populations de parasitoïdes issus de l'évolution expérimentale fait l'objet d'un article en préparation : Effect of symbiont-mediated resistance on population genetics of experimentally selected parasitoids Dion E. , Zélé F. , Simon J-C. and Outreman Y. Effect of symbiont-mediated resistance on population genetics of experimentally selected parasitoids Dion E. 1, 2, Zélé F. 3, Simon J-C. 1, 4 and Outreman Y. 1, 5 UMR 1099 INRA-Agrocampus Ouest-Université Rennes 1 Biologie des Organismes et des Populations appliquée à la Protection des Plantes , 65, rue de Saint-Brieuc CS 84215, 35042 Rennes Cedex, and BP 35327, 35653 Le Rheu Cedex, France. E-mail : emilie. deguydion@gmail. com CNRS UMR 2724 Génétique et Evolution des Maladies Infectieuses , IRD, 911 Avenue Agropolis, 34394 Montpellier-France. E-mail : flore. zele@ird. fr E-mail : jean-christophe. simon@rennes. inra. fr E-mail : yannick. outreman@rennes. inra. fr Short title : Host symbiont effects on parasitoid population genetics ABSTRACT In host-parasite coevolution, defensive traits are selected in host to overcome parasite virulence, and attacks traits in parasite, to exploit the host. For the coevolution to occur, genetic variations are needed in both host and parasite populations for the traits implied. Identifying coevolution consequences on natural parasite population genetic traits is difficult because of the confounding environmental factors influencing the course of the coevolution. We used an experimental evolution procedure in which parasitoids were exposed either to highly resistant pea aphid hosts ; resistance due to the presence of the facultative symbiont Hamiltonella defensa ; or to low innate resistant hosts free of defensive symbiont. We compared the genetic variability and structure of the populations exposed to high-resistant or low-resistant aphids, and throughout generations. Parasitoid exposed to H. defensa showed a diminution of their allelic variability over generations. At the end of the selection process, the FST between the two parasitoid populations was high and significant, indicating that parasitoids submitted to the symbiont-mediated resistance gained different genetic properties than those exploiting the low-resistant aphid populations. This study highlighted the genetic potential of parasitoid populations to evolve in controlled environment and even with small population size ; giving valuable clues on natural population abilities to evolve when facing high-resistant host species. Keywords : host-parasitoid coevolution, experimental evolution, symbiont-mediated resistance, microsatellites, genetic variability, genetic structure INTRODUCTION Host-parasite coevolution is the reciprocal natural selection on host resistance and parasite infectivity (Thompson, 1994). Models suggest that this form of reciprocal selection may be frequency dependent (Bell & Maynard Smith, 1987) that is, parasites are selected to overcome the resistance of common hosts and reciprocally, hosts are selected to overcome the virulence of common parasites. These evolutionary changes require genetic variations in both host and parasite populations (Woolhouse et al. , 2002 ; Gandon et al. , 2008). Under these conditions, the reciprocal selection may favor specific genetic processes such as selection of particular genes, mutations, or recombination favoring either the parasite fitness or the host one. This process may also be associated to emergence of new alleles increasing the genetic diversity within the population, leading to changes in both host and parasite genotype frequencies in the field (Fox & Wolf, 2006 ; Gandon et al. , 2008). Because the forces of natural selection often vary in space, resident genotypes in each deme would have a higher relative fitness in their local habitat, leading to their local adaptation, and to a higher extent, their possible specialization (Kaweki & Ebert, 2004 ; Laine, 2009). In various host-parasite associations, the evolution of life history traits and the trade off associated have been studied (e. g. Ebert, 2008 ; Dupas et al. , 2009). These evolved traits may however be influenced by a multitude of selective processes that are not directly associated to the coevolutionary interaction, including fluctuating environment or interactions with other organisms (Laine, 2009). Therefore, identifying coevolution consequences on phenotypic or genetic traits is difficult and requires complex study designs (e. g. long-term analysis, Jokela et al. , 2009). The experimental evolution is thus an approach increasingly used, where organisms evolve under controlled conditions with few confounding environmental variations, being a powerful tool for the detection of fitness trade-offs related to an evolved trait (Fuller et al. , 2005 ; Gaba & Ebert, 2009). Experimental evolution has been widely used to study host parasite coevolution in microbial host system, focusing on the phenotypical (resistance, virulence, trade offs etc Lohse et al. , 2006 ; Forde et al. , 2008) and genomic levels (Barrick et al. , 2009) ; whereas the genetic properties of antagonist populations have been rarely followed. Several experimental evolution studies also focused on insects ; more particularly on host-parasitoid interactions characterized by longer generation time, lower population size and more complex responses than microbes. These experiments usually target the evolution of host resistance and the trade offs associated (e. g. Kraaijeveld et al. , 2001 ; Vijendravarma et al. , 2009). The parasitoid Aphidius ervi uses the pea aphid Acyrthosiphon pisum as host, its larva developing by feeding within the host, finally killing it during its developmental period. The parasitoid exerts a high pressure on aphid populations as parasitism rate can reach 70% in some conditions (Hufbauer, 2002). A. pisum can resist physiologically to the development of the parasitoid thanks to a combination of its intrinsic immunity and symbiosis with bacteria (Le Ralec et al. , 2010). However, the pea aphid immune system is a weak barrier conferring only partial resistance to A. ervi (Gerardo et al. , 2010). The failure of the parasitoid development is mainly due to the presence of symbionts members of the Enterobacteriaceae, called Hamiltonella defensa (Oliver et al. , 2003 ; Ferrari et al. , 2004 ; Oliver et al. , 2005 ; Dion et al. , 2011), protection referred to as symbiont-mediated resistance' (Oliver et al. , 2005). Aphid symbiont-mediated resistance is likely to exert strong selective pressures on natural populations of parasitoids because parasitoids have a particularly intimate relationship with their hosts as a single host harbors the parasitoid's offspring until maturity (Godfray, 1994). The intimate nature of this relationship promotes coevolutionary dynamics, while developing adaptation to counter the combined effect of the aphid intrinsic immunity and the symbiont- mediated resistance. The present study aimed to analyze the genetic properties of A. ervi parasitoid populations facing hosts with contrasted levels of resistance. By using an experimental evolution, Dion et al. (2011) investigated the adaptive potential of A. ervi facing either population of aphids harboring H. defensa, combining innate and symbiont mediated resistance, and population of hosts without secondary symbiont, presenting only the innate resistance. Parasitoids exposed to H. defensa increased their parasitism rate through generations, gaining enhanced virulence over time, reaching the same parasitism rate as those exposed to low aphid innate resistance only. In the present study, we followed the genetic properties of the two parasitoid lines described above, with the use of microsatellite molecular markers. Virulence genes are not know yet in Aphidius ervi, so we use neutral markers as they give an objective overview of the population genetic properties. Our objectives were to : (a) evaluate the genetic diversity of the initial parasitoid populations, as the capacity of populations to evolve depends strongly on the genetic variability for the traits responding to the selective pressure, (b) follow the evolution of the genetic variability through the ten parasitoid generations produced and (c) test the influence of the combined intrinsic-H. defensa resistance on the possible genetic segregation in parasitoids populations. MATERIALS AND METHODS Organisms We used eight green clones of the pea aphid Acyrthosiphon pisum (Harris) (Hemiptera : Aphididae). As secondary symbiont community in A. pisum strongly depends on the host biotype (Frantz et al. , 2009), clones were chosen amongst a collection of plant specialized genotypes with known secondary symbionts (see Frantz et al. , 2009 and Peccoud et al. , 2009 for details on clone collection and symbiotic detection). Four of the 8 clones were free of secondary symbionts (i. e. , clones called Hamiltonella-free' clones). Among these clones, one was originated from alfalfa (Medicago sativa), while the others came from spiny restharrow (Onosis spinosa) and meadow vetchling (Lathyrus pratensis). The four other clones, collected on alfalfa harbored the secondary symbiont Hamiltonella defensa (i. e. , clones called Hamiltonella' clones). All aphids were maintained on broad bean Vicia faba. In order to favor evolutionary responses, genetically diverse starting populations of Aphidius ervi parasitoids were used. The initial culture was then obtained by sampling about 200 A. pisum mummies (i. e. dead aphid containing a parasitoid few days before its emergence) in different alfalfa fields around Rennes (Western France) in November 2008. Adults emerging from these collected mummies were split and maintained in three distinct Plexiglas cages (403050 cm) containing a high genetic and symbiotic diversity of red and green pea aphids originating from six different alfalfa crops, located in two cities that are 40km apart from one another. To limit genetic drift in the parasitoid populations, immigration was simulated by individual exchanges between the three cages and regular addition of newly sampled parasitoids. For experiments, we collected mummies each day from cultures and placed it individually in gelatine capsules. Newly emerged females were enclosed in plastic tubes (221 cm) containing moistened cotton, droplets of honey, with one male for mating. Females between two and three days-old were used and only once. All experiments and insect rearing were done in climate rooms at 201C, 7010% relative humidity and L : D 16 : 8h photoperiod. Experimental evolution procedure The experimental evolution was performed for ten parasitoid generations using two selection treatments that were treated in exactly the same way except the presence or absence of the symbiont-mediated resistance in host population. A broad bean plant (about 15 cm height) infested with 32 third-instar aphid individuals constituted the host population. Each plant was covered with cellophane bags to avoid aphid escape. A host population contained either individuals from the four Hamiltonella-free' aphid clones or individuals from the four clones harboring H. defensa, each clone being equally represented (i. e. , eight individuals per clone). For each parasitoid generation, eight Hamiltonella-free' and eight Hamiltonella' host populations were similarly constituted and then exposed to parasitoids which faced fixed host populations over time. From the initial cultures, 150 mummies were randomly extracted and constituted the initial population used in this experimental evolution design. All emerging females were allowed to mate during one day and then split for the two selection treatments : (a) the Non-exposed' parasitoids line, which is exposed to Hamiltonella-free' host populations. Those parasitoids are thus submitted to a low selection exerted by the aphid intrinsic immune responses ; and (b) the Exposed' parasitoids line are exposed to Hamiltonella' host populations, which exert a strong selection characterized by the combination of both innate and symbiont-mediated resistances. Both treatments were followed during ten generations. The experimental evolution procedure consisted in introducing four parasitoid females in each host population. One male was also added into the cellophane bag to ensure female fecundation. Parasitoids were allowed to exploit the host population for four days. After this delay, they were extracted from the design and stocked in 95 ethanol for genetic analyses. The host population was then maintained in climate chambers during 20 days and examined daily to record and extract aphid mummies isolated in gelatine capsules. To minimize loss of genetic diversity due to inbreeding, all parasitoid males and females emerging from each host population of a selection treatment were pooled together during one day and thirty-two females (i. e. , four females for each of the eight host populations) were randomly chosen in order to constitute the next generation. This experimental procedure was continuously conducted for ten successive parasitoid generations (from February 2009 to November 2009). DNA extraction, PCR and genotyping A. ervi individuals from the following generations from both selection treatments were considered : G0 (the initial parasitoid population), G1, G2, G5, G7 and G10 (the last generation produced). A. ervi has a haplodiploid reproduction system where unfertilized eggs develop as haploid males and fertilized one as diploid females. For this study, DNA extraction were carried out from females only, in semi deep well trays using the salting out' procedure (Miller et al. , 1988). Total DNA was suspended in a final volume of 50L of ultrapure water. The genotypes were assessed at 11 microsatellites loci. We used the M13-tailed primer method (Boutin-Ganache et al. 2001) to label amplicons for visualization on the capillary sequencer. Forward primers were 5-tailed with a 23-basepair M13 sequence. Loci were amplified in a final volume of 10 L polymerase chain reaction (PCR). The reaction mixture contained 2 L of total DNA, 0. 25 M of each primer, 0. 2 mM of a four nucleotide mixture, 1. 25 mM of MgCl2, 0. 25 M of 1 L of PCR Buffer (Promega, Madison, USA) and 0. 25 U of Taq DNA Polymerase (Promega, Madison, USA). The M13 primers were5-fluorescently tagged with HEX, 6-FAM, NED or VIC at 0. 25 M for assessment of allele sizes on a capillary sequencer (describe below). PCR were conducted on S1000 thermal cycler (2008, Bio-Rad Laboratories) using the following cycling conditions : initial denaturation at 94 C for 5 minutes, first cycle of DNA amplification (repeated 20 times) with a denaturation step at 94 C for 20 seconds, hybridization at 55 C for 20 s, elongation at 72 C for 30 s ; second cycle of M13 amplification with 20 repetitions of the following steps : 94 C for 20 s, 53 C for 20 s and 72 C for 30 s. The PCR ends with a final elongation at 72 C for 5 min. Diluted PCR products (1. 2 L on 10 L water) were added to 10 L of high-die formamide containing 0. 7% of 500 LIZ DNA ladder (Applied Biosystems) and electrophoresis was performed in the capillary sequencer ABI 3730 (Applied Biosystems). Allele calls were automatically assigned by GeneMapper (version 3. 7, Applera Corp) and visually checked. Genetic variability Individuals from one selection treatment and one generation were considered as a population. Even if the female parasitoids used to launch the experimental evolution came from the same initial population, the G0 Exposed' and G0 Non-Exposed' parasitoid individuals were considered as two different populations for the analyses. Genetic variability was investigated for all populations. For each of the twelve loci, and for each population, the gene diversity, allelic richness, observed and expected heterozygosities and departure from Hardy-Weinberg equilibrium were assessed using FSTAT 2. 9. 4 (Goudet, 2005). The presence of null alleles was estimated for each locus with the software MICROCHECKER 2. 2. 3 (van Oosterhout, 2004). Population differentiation FST values were used to quantify differentiation among populations in allele frequencies. They were computed and tested for significance with FSTAT 2. 9. 4. FST between the two G0 Exposed' and Non-Exposed' lines was also calculated. To investigate the potential effects of the selection treatment and the generation number, a locus by locus analysis of molecular variance (AMOVA ; Excoffier et al. 1992) was performed with the software ARLEQUIN 3. 1. 5. 2 (Excoffier et al. , 2005) using the hierarchical model for genotypic data with several groups of populations and no within-individual level. The generations were considered as within, the treatment being the upper level tested. RESULTS Genetic variability Sample size, allelic richness, observed and expected heterozygosities for each population are presented in Table 1. All microsatellites loci were polymorphic in each of the populations studied. Population sizes ranged from 14 to 25 females according to the success of the genotyping and the number of individuals found at the end of the parasitism step of the experimental evolution. The mean allelic richness is low, ranging from 3. 09 to 4. 66. The two initial populations at G0 showed significant deviation from Hardy-Weinberg equilibrium, with a deficit in heterozygotes. This deficit can also be seen in the last three Exposed' parasitoids from generations G5, G7 and G10, and in all but G5 populations of the Non- Exposed' line (Table 1). The analysis performed by MICROCHECKER indicated there are no loci showing evidence for a null allele. The allelic diversity evolved in different ways according to the analyzed locus (figure 1). In both selection treatments, the loci Ae18, Ae20 and Ae27 presented a decrease in diversity with parasitoid generation number. The diversity was lower at the end of the experimental selection for both loci Ae08 and Ae32 in the Exposed' line, and Ae01 and Ae22for Non- Exposed' line. Some loci showed similar allelic diversities at both G0 and G10 but high frequency variations among the intermediate generations. Some loci presented also an increase in their diversity, such as Ae22 in the Exposed line', and Ae29 in the Non- Exposed' line. By combining the allelic richness at each studied locus, the overall diversity decreased over generations, for both selection lines, starting at about 0. 67 for both initial populations and ending at 0. 61 for the Non-Exposed' line and 0. 52 for the Exposed' line (Figure 2). Population differentiation Table 2 presents the pairwise FST between Non-Exposed' and Exposed' lines. The initial parasitoid population was split into two populations for the two selection treatments. The G0 Exposed' and G0 Non-Exposed' lines were not genetically different, with a non significant FST of 0. 0059. The two populations diverge from each over since the fifth generation, and, at the end of the selection process, the FST between the two lines reach the significant value of 0. 00945. FST between the initial populations and the two selection lines were very variable through generations, increasing or decreasing until G5 with an important modification of the tendency at G7. Overall FST between the initial population and the selected ones increased through generations (Figure 4), the two lines becoming genetically different from the initial population at G10. The final Exposed' line population strongly diverged from the initial population with a FST reaching 0. 0967. At G10, the Non-Exposed' line was also genetically different from the initial population, with a FST of 0. 0323. At the end of the experimental evolution, the Exposed' parasitoids line genetically differed from the Non-Exposed' parasitoids line (Table 2). The FST value between G0 and G10 is significant for the Exposed line for loci Ae03 and Ae06. The FST between G0 and the G5 non exposed population is also significant. Globally, FST between populations vary between loci, and there is also important variation between generations for each locus. The genetic variance partitioned among host treatments (Exposed' and Non-Exposed') and among generations was assessed by the analysis of molecular variance (Table 3. ). The treatment and the generations among treatments explained respectively 2. 2% and 3. 5% of the variations. A significant isolation by selection treatment was found (P value 0. 022). There were also significant variations between generations inside the treatments (P value 0. 036), according to the significant FST calculated between the concerned populations (Table2). DISCUSSION Using an experimental evolution approach, the evolution of genetic properties of populations exposed or not, to high level of host resistance was followed during ten parasitoid generations. During the selection process, females mortality was relatively important. Associated to the loss of data during the genotyping process due to classical technical troubles, this low survival induced low size of studied populations. Despite the limited number of individuals analysed, our study has however showed how the resistance associated to a facultative symbiont may affect the genetic properties of parasitoid populations. Almost every populations presented a heterozygote deficiency. As the detection of null alleles was unsuccessful, this deficit seems to be due to the initial homozygote excess in both G0 Exposed' line and G0 Non-Exposed' line. Despite the high initial number of parasitoids founders, some genetic drift may have occurred in our rearing conditions before the experimental evolution (Cook, 1993). At G0, the selection lines were founded with 32 parasitoid females randomly chosen in parasitoids rearing. At each generation, all offspring produced by the previous generations were then pooled and 32 females among these offspring were randomly sampled. This experimental set-up allowed maintenance of a relatively high genetic diversity : populations not exposed to the symbiont-mediated resistance would not be expected to exhibit reductions in allelic richness (Nei et al. , 1975). There was a differential evolution of the diversity at different loci from both selection lines : the diversity of some loci decreased, while other showed high variations along the parasitoid generation number. For some loci having less efficient amplification than others, the small population size genotyped may have biased the results, leading to stochastic pattern. Globally, in the Non-Exposed' line, the mean population allele diversity shows a light decrease through generations. In this line, there is thus no particular allele selected among over, and rare alleles seem to be maintained throughout the selection process. However, the allelic diversity decreases in the Exposed' line, from 0. 65 in G0 to 0. 52 at the 10th generation. Consequently, some loci were more affected by the selective pressure associated with the high level of host resistance. Dion et al. (2011) demonstrated that parasitoids from this treatment increased their performance on resistant hosts, adapting to the symbiont-mediated resistance. This further suggests an important influence of the selective regime on the genetic diversity in the Exposed' line, where the symbiont-mediated resistance seems to have accelerated the selection of particular allele combinations in parasitoid populations. The changes in allelic diversity for some loci were consistent with the population segregation observed between the Exposed' line and the Non-Exposed' line. After 10 generations of experimental evolution, the genetic properties of the two parasitoid lines strongly differed from their own initial populations. Moreover, those two parasitoid populations were genetically very different from each other after the experimental evolution, the selection treatment being the major force acting on the groups' genetic properties. This difference was not associated to the initial population properties because the initial parasitoids populations were genetically identical. Consequently, the two selection lines evolved to gain different genetic properties under the symbiont-mediated resistance pressure. The intrinsic immunity of the pea aphid is limited, providing only a weak protection (Gerardo et al. , 2010). The host resistance may lead to a variation from small reduction in successful parasitism to nearly complete protection (Oliver et al. , 2010). Hamiltonella' A. pisum clones used here presented a strong resistance against parasitoids (about 90% of parasitism reduction). The intimate nature of the relationship between A. pisum and A. ervi may exert strong selective pressure on parasitoid populations, leading to the segregation of the populations that can be detected with neutral markers. The experimental evolution provided evidence for rapid evolution in A. ervi genetic properties when faced with high aphid resistance, and highlighted the genetic adaptive potential of parasitoid populations. The ability of populations to adaptively respond to selective pressure critically depends upon the availability of genetic diversity. Aphidius ervi is a parasitoid wasp that has been largely used in biological control, against pest species native to Eurasia that feed on alfalfa, clover and other plants (Angalet & Fuester, 1977 ; Star, 1993 ; Milne, 1999). For a successful struggle against pests, it is commonly suggested to increase the probability of local adaptation by maximising the genetic diversity of natural enemies, minimizing inbreeding and releasing natural enemies with as much as possible an important genetic variation inside the population (Reed et al. , 2003 ; Phillips et al. , 2008). Hufbauer et al. (2004) demonstrated that there is significant genetic differentiation between the native European and the introduced American A. ervi populations and recent research demonstrated the increased capacity of selection lines to parasitize other aphid species ; or to overcome host defenses in controlled laboratory experiments (Henry et al. , 2008 ; Dion et al. , 2011). These results associated to the genetic potential to evolve even with small number of individual available as we demonstrated here, provide encouraging clues regarding the possibility for natural A. ervi populations to evolve, and to be a confident candidate for biological control. The experimental evolution of parasitoids A. ervi lead to a selection for females overcoming the high symbiont mediated resistance, with mechanisms involved in virulence', defined as wasp's ability to develop within host and to emerge from it (Dion et al. , 2011). All the putative virulence factors may induce host-resource hijacking, favoring the parasitoid development (Falabella et al. , 2005 ; 2009) ; but precise mechanisms implied in overcoming Hamiltonella defensa mediated resistance remain sparse in Aphidius ervi. Here, genetic changes and segregation between parasitoid populations were detected with neutral markers. Consequently, a promising approach is to identify alleles of loci subjected to be implied in parasitoid virulence. Mutations in their sequences may allow the identification of potentially selected virulence genes in populations facing high host resistance. Following genetic traits with experimental evolution framework has been used in only few studies dealing with host parasite coevolution (Schulte et al. , 2010), or implies microorganisms such as bacteria (Elena & Lenski, 2003 ; Barrick et al. , 2009), but these experiments provide central clues concerning the issues of coevolutionary processes and their mechanisms. 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TABLES AND FIGURES Table 1. Genetic variability presented for the initial parasitoid population (G0) and the generations G1. G2. G5. G7 and G10 from (A) Non-Exposed' line selected and (B) the Exposed line'. For each population are given : N. number of individuals ; AR. the allelic richness ; HO and HE the observed and expected heterozygosity and the result of Hardy Weinberg exact test. (A) 'Non-Exposed' line G0 G1 G2 G5 G7 G10 N 14 16 16 18 23 25 AR 4. 37 3. 09 4. 66 4. 69 4. 16 3. 98 Ho 0. 6 0. 67 0. 67 0. 58 0. 56 0. 56 He 0. 67 0. 68 0. 67 0. 67 0. 65 0. 61 FIS 0. 107 0. 039 -0. 004 0. 142 0. 138 0. 086 HWE (P value) 0. 03 0. 2379 0. 52 0. 012 0. 001 0. 0195 (B) 'Exposed' line G0 G1 G2 G5 G7 G10 N 15 19 21 14 15 23 AR 3. 32 3. 52 3. 95 3. 32 3. 12 3. 72 Ho 0. 54 0. 52 0. 5 0. 52 0. 5 0. 45 He 0. 65 0. 62 0. 59 0. 52 60, 00 0. 52 FIS 0. 160 0. 155 0. 146 0. 003 0. 163 0. 146 HWE (P value) 0. 0109 0. 0028 0. 0013 0. 4566 0. 005 0. 021 Table 2. Pairwise FST values among the 12 populations arranged by selection treatments and generations (from G0 to G10). * means significant differentiation given by randomization test after strict Bonferroni corrections (Goudet. 2005) for P E line' : Exposed' parasitoids line ; NE line' : Non-Exposed' parasitoids line. G0 G1 G2 G5 G7 G10 NE line E line E line E line E line E line G0 E line 0. 0059 0. 0109 0. 0249 0. 0492 0. 0211 0. 0967* G1 NE line -0. 0142 -0. 0007 0. 0315 0. 1025 0. 0478 0. 017 G2 NE line 0. 0148 0. 0358 0. 0643 0. 0526 0. 0391 0. 0484 G5 NE line 0. 0127 0. 0369 0. 0697 0. 0681* 0. 0533* 0. 0714* G7 NE line 0. 0141 0. 027 0. 0458* 0. 0625* 0. 0617 0. 0832* G10 NE line 0. 0323* 0. 0467 0. 0461* 0. 0755* 0. 0681 0. 0945* Table 3. AMOVA analysis partitioning the genetic variance among selection treatments and the generation number. For each level. are represented : d. f. the number of degrees of freedom ; the sum of squares ; the variance components explained by the given level ; the proportion of variance in percentage explained by the given level and the associated P value. Sum of Variance Percentage Source of variation d. f. P value squares components variation Among treatments 1 23. 492 0. 07909 2. 20465 0. 022 Among generations within 5 74. 143 0. 12543 3. 49627 0. 036 treatments within generations 219 1309. 886 3. 38296 94. 29908 0. 057 1 Ae01 1 Ae03 1 Ae06 0, 8 0, 8 0, 8 0, 6 0, 6 0, 6 0, 4 0, 4 0, 4 0, 2 0, 2 0, 2 Ae08 Ae16 Ae18 0, 8 0, 8 0, 8 Allelic diversity 0, 6 0, 6 0, 6 0, 4 0, 4 0, 4 0, 2 0, 2 0, 2 Ae20 Ae22 Ae27 0, 8 0, 8 0, 8 0, 6 0, 6 0, 6 0, 4 0, 4 0, 4 0, 2 0, 2 0, 2 Ae29 1 Ae32 0, 8 0, 8 0, 6 0, 6 0, 4 0, 4 0, 2 0, 2 Generation number Figure 1. Generational trajectories of the allelic diversity for each analyzed locus, for the Non-Exposed' line (open dots) and the Exposed' line (black dots). 0, 75 0, 7 0, 65 Allelic diversity 0, 6 0, 55 0, 5 0, 45 0, 4 Generation number Figure 2. Generational trajectories of the mean allelic diversity for the Non-Exposed' line (open dots) and the Exposed' line (black dots). Vertical bars represent standard errors. 0, 3 0, 3 0, 3 Ae01 Ae03 Ae06 0, 25 0, 25 * 0, 25 * 0, 2 0, 2 0, 2 0, 15 0, 15 0, 15 0, 1 0, 1 0, 1 0, 05 0, 05 0, 05 -0, 05 -0, 05 -0, 05 -0, 1 -0, 1 -0, 1 -0, 15 -0, 15 -0, 15 0, 3 0, 3 0, 3 Population FST in respect to G0 Ae08 Ae16 Ae18 0, 25 0, 25 0, 25 0, 2 0, 2 0, 2 0, 15 0, 15 0, 15 0, 1 0, 1 0, 1 0, 05 0, 05 0, 05 -0, 05 -0, 05 -0, 05 -0, 1 -0, 1 -0, 1 -0, 15 -0, 15 -0, 15 0, 3 0, 3 0, 3 Ae20 Ae22 Ae27 0, 25 0, 25 0, 25 0, 2 0, 2 0, 2 0, 15 0, 15 0, 15 0, 1 0, 1 0, 1 0, 05 0, 05 0, 05 -0, 05 -0, 05 -0, 05 -0, 1 -0, 1 -0, 1 -0, 15 -0, 15 -0, 15 0, 3 0, 3 Ae29 Ae32 0, 25 0, 25 0, 2 0, 2 0, 15 0, 15 0, 1 0, 1 0, 05 0, 05 -0, 05 -0, 05 -0, 1 -0, 1 -0, 15 -0, 15 Generation number Figure 3. Generational trajectories of the population differentiation given by pairwise FST. between the initial population and the Non-Exposed' line (open dots) or the Exposed' line (black dots), for each locus. * means significant differentiation between the given population and the initial one (G0) given by randomization test for P 0, 1 * Populations FST in relation to G0 0, 075 0, 05 0, 025 Generation number Figure 4. Generational trajectories of the population differentiations given by pairwise FST between the initial parasitoids population (G0) and the Exposed' (black dots) or Non- Exposed' (open dots) parasitoids line. * means significant differentiation between the noted population and G0. given by randomization test for P II. Influence des symbiotes sur les comportements des hôtes 1. Objectifs Pour éviter le parasitisme, une espèce hôte peut présenter des moyens de défenses morphologiques, comportementaux, ou physiologiques (Hammill et al. , 2010). Ces moyens sont l'objet de nombreuses études mais la question de leurs interactions reste encore ouverte. Des individus peuvent utiliser simultanément les défenses comportementales et physiologiques bénéficiant ainsi d'une résistance efficace contre l'ennemi (e. g. Mikolajewski et al. , 2010). Au contraire, d'autres individus n'expriment qu'un seul moyen de défense, et font ainsi l'économie du second (compensation de moyens défensifs) (e. g. DeWitt et al. 1999). Les pucerons du pois possèdent plusieurs stratégies de défenses lorsqu'ils sont attaqués par des ennemis naturels (Le Ralec et al. , 2010). A. pisum peut résister contre le parasitoïde adulte par des réactions comportementales, et contre le parasitoïde immature grâce à H. defensa. Les défenses comportementales permettent au puceron d'éviter la rencontre avec l'ennemi, ou d'éviter l'oviposition (Losey & Denno, 1998a ; Braendle & Visser, 2001). H. defensa semble constituer le principal moyen de défense des pucerons contre le parasitoïde immature et peut parfois apporter une protection quasiment complète contre le parasitisme (Oliver et al. , 2010). Cependant, les moyens de défense induisent des coûts. Les stratégies d'évitement du parasitoïde peuvent entraner une réduction de la fécondité et de la survie du puceron (Losey & Denno, 1998b ; Nelson, 2007 ; Fievet et al. , 2008). Les pucerons porteurs du symbiote peuvent également présenter une fécondité et une longévité moindres (J-C. Simon, communication personnelle). Les individus abritant H. defensa qui manifesteraient des comportements défensifs subiraient' les coûts associés aux deux moyens de défenses, réduisant considérablement leur valeur sélective. Une interaction négative entre les défenses comportementales et la résistance conférée par le symbiote peut alors être envisagée : pourquoi éviter le parasitoïde lorsqu'on est résistant ? Nous avons donc analysé l'influence du symbiote sur les comportements de défense des pucerons du pois. Nous avons évalué les comportements de défense des pucerons porteurs et non porteurs de H. defensa. 2. Approche et méthode générale Deux expériences ont été menées. Dans la première expérimentation, les pucerons testés étaient issus soit de clones porteurs d'H. defensa soit de clones non porteurs (3 clones porteurs et 3 clones non porteurs). Dans la seconde, nous avons considéré 4 clones ayant la particularité de présenter des individus abritant le symbiote facultatif et d'autres dépourvus de ce symbiote. Le principe de l'expérience consistait à introduire un parasitoïde dans une colonie composée de 10 A. pisum, porteurs ou non de la bactérie. Le comportement des deux protagonistes était relevé en continu jusqu'au départ du parasitoïde. Plus précisément, nous avons observé les comportements défensifs des pucerons et mesuré le taux de parasitisme efficace : il s'agit du nombre de descendants produits par le parasitoïde divisé par le nombre d'hôtes présents initialement dans la colonie (ici 10). 3. Résultats : Interaction négative entre les comportements défensifs et la résistance apportée par les symbiotes Article 4. Les résultats de cette expérimentation ont conduit à la production d'un article accepté pour publication dans la revue Biology Letters : Symbiont infection affects aphid defensive behaviours. Dion E. , Polin S. E. , Simon J. -C. & Outreman Y. 2011 Biology Letters, In Press. Downloaded from rsbl. royalsocietypublishing. org on April 13, 2011 Symbiont infection affects aphid defensive behaviours Emilie Dion, Sarah Erika Polin, Jean-Christophe Simon and Yannick Outreman Biol. Lett. published online 13 April 2011 doi : 10. 1098/rsbl. 2011. 0249 References This article cites 10 articles, 3 of which can be accessed free #ref-list-1 P Published online 13 April 2011 in advance of the print journal. Subject collections Articles on similar topics can be found in the following collections behaviour (1942 articles) ecology (2309 articles) evolution (2606 articles) Email alerting service Receive free email alerts when new articles cite this article - sign up in the box at the top right-hand corner of the article or click here Advance online articles have been peer reviewed and accepted for publication but have not yet appeared in the paper journal (edited, typeset versions may be posted when available prior to final publication). Advance online articles are citable and establish publication priority ; they are indexed by PubMed from initial publication. Citations to Advance online articles must include the digital object identifier (DOIs) and date of initial publication. To subscribe to Biol. Lett. go to : This journal is 2011 The Royal Society Downloaded from rsbl. royalsocietypublishing. org on April 13, 2011 Biol. Lett. parasitoid protection to the pea aphid, Acyrthosiphon doi : 10. 1098/rsbl. 2011. 0249 pisum [3]. Pea aphids also present a large repertoire of Published online defensive strategies, including morphological, social, Evolutionary biology chemical and behavioural defences [4]. Most prevalent, however, are defensive behaviours like aggressiveness towards the enemy, or escape reactions [5]. These beha- Symbiont infection affects viours are beneficial, because they reduce an aphid's risk of being attacked. However, this benefit is balanced by aphid defensive costs, such as loss of feeding opportunities or lower sur- vival rates, leading to fitness decrements (e. g. [6, 7]). behaviours This balance between costs and benefits associated Emilie Dion, Sarah Erika Polin, with defensive behaviours induces variation for these Jean-Christophe Simon and Yannick Outreman* traits in aphid populations [8]. 1 Here, we investigated the possible influence of UMR 1099 INRA-Agrocampus Ouest-Université Rennes 1 Biologie des Organismes et des Populations appliquée à la Protection des Plantes', H. defensa on the propensity of aphids to defend them- 65 rue de Saint-Brieuc CS 84215, 35042, Rennes Cedex, and BP 35327, selves against enemies. Because aphids harbouring this 35653 Le Rheu Cedex, France symbiont are protected against parasitoids, we hypo- *Author for correspondence ( yannick. outreman@rennes. inra. fr). thesize that behavioural defence pay-offs should Aphids harbour both an obligate bacterial sym- be reduced : defensive responses against parasitoids biont, Buchnera aphidicola, and a wide range of would induce useless fitness decrements in both part- facultative ones. Facultative symbionts can ners. By contrast, defensive behaviours may be the modify morphological, developmental and phys- unique way to avoid parasitism in aphids uninfected iological host traits that favour their spread with H. defensa. Consequently, a reduction in defensive within aphid populations. We experimentally behaviours may be expected in aphids infected with investigated the idea that symbionts may also H. defensa. To test this possible contribution of sym- modify aphid behavioural traits to enhance their transmission. Aphids exhibit many behav- biosis to defensive behavioural variation in insect ioural defences against enemies. Despite their populations, we compared the aggressiveness and benefits, these behaviours have some associated escape responses of aphids infected or not infected costs leading to reduction in aphid reproduction. with H. defensa. Some aphid individuals harbour a facultative symbiont Hamiltonella defensa that provides protection against parasitoids. By analysing 2. MATERIAL AND METHODS aphid behaviours in the presence of parasitoids, (a) Insects we showed that aphids infected with H. defensa Pea aphids were collected in 2008 and 2010 around Rennes (Western exhibited reduced aggressiveness and escape France) in several alfalfa (Medicago sativa) fields since populations specialized on this plant harbour Hamiltonella defensa at a high rate reactions compared with uninfected aphids. The [9]. The genotypes and the symbiotic status of the sampled aphids aphid and the symbiont have both benefited were determined (see [10] and [9] for details on genotyping and from these behavioural changes : both partners symbiont detection, respectively). From these analyses, we selected reduced the fitness decrements associated with 10 aphid genotypes infected or not infected with H. defensa the behavioural defences. Such symbiont- (table 1). Some genotypes were represented by lineages infected or induced changes of behavioural defences may not infected with H. defensa and were considered to have identical genetic backgrounds (i. e. 14 highly polymorphic markers were have consequences for coevolutionary processes used for genotyping, a number sufficient to identify clonal copies between host organisms and their enemies. from distinct genotypes), and just differing by their symbiotic status. The Aphidius ervi parasitoids originated from parasitized Keywords : Acyrthosiphon pisum ; defensive aphids collected in alfalfa fields around Rennes in 2008. Parasitoids behaviours ; symbiont infection ; Hamiltonella defensa ; were reared on a culture of A. pisum feeding on broad bean (Vicia symbiont-mediated phenotype faba). Insects were maintained at 208C under a long-day regime (16 L : 8 D). For the experiments, only second and third-instar larvae of A. pisum were used. To obtain parasitoid females, parasitized aphids were collected from cultures and placed individually in gelatin 1. INTRODUCTION capsules. Newly emerged females were enclosed in plastic tubes An extraordinary number of arthropods harbour var- containing moistened cotton, droplets of honey and one male for ious types of vertically transmitted symbionts. Among mating, and were used once for experiment the day after. insects, symbionts of aphids are perhaps the best studied [1]. In addition to their essential nutrient-pro- (b) Experimental set-up The experiment aimed to measure the influence of the symbiotic viding symbiont Buchnera aphidicola, many aphid status of aphids on their defensive behaviours. Two experimental species also carry one or a few facultative bacterial series were implemented with exactly the same design. In the first symbionts. These symbionts may exert diverse effects series, we compared the defensive behaviours of three aphid geno- types harbouring H. defensa with three genotypes free of facultative on their host, such as plant adaptation, heat tolerance symbionts. In the second series, we more precisely analysed the influ- or parasite resistance (reviewed in [1]). Most of these ence of H. defensa on defensive behaviours of aphids with identical effects are beneficial for the host, thus favouring the genetic backgrounds, by considering four genotypes that each pre- spread and the persistence of symbionts within aphid sented naturally-co-occurring lineages infected or not infected with H. defensa (table 1). populations. In various mutualistic associations, such The procedure consisted of introducing one parasitoid female evidence of symbiont effects concerns morphological, into a cage (20 25 30 cm) containing one broad bean leaf developmental and physiological host traits but rarely (10 cm height) infested with 10 genetically and symbiotically identi- behavioural ones [2]. cal aphids. Observation began when the wasp landed on the leaf and started searching for aphids and ended when it left the leaf. Recent studies on facultative symbionts concern The insect behaviours were recorded using the event-recorder Hamiltonella defensa, a g-proteobacterium that provides The Observer' (Noldus Information Technology, Wageningen, Received 4 March 2011 Accepted 25 March 2011 This journal is q 2011 The Royal Society Downloaded from rsbl. royalsocietypublishing. org on April 13, 2011 2 E. Dion et al. Symbiont effect on aphid behaviour Table 1. Aphid genotypes information and replicates (a) number. 8 * * H. defensa aphid infection number of no. dropping 6 experimental series genotypes status replicates 5 series 1 distinct G1 infected 11 behaviours 4 genetic G2 infected 11 3 background G3 infected 11 2 G4 uninfected 10 G5 uninfected 11 G6 uninfected 12 0 series 2 pairs of G7 infected 11 lineages with uninfected 10 (b) * * identical genetic G8 infected 11 1. 0 rate of rejections owing background uninfected 10 G9 infected 10 0. 8 uninfected 10 G10 infected 10 0. 6 uninfected 10 to aphids aggressiveness 0. 4 0. 2 The Netherlands). When the parasitoid stopped its searching activity after both locating and contacting with an aphid, the event was regarded as an attack by parasitoid. The outcome of an attack was either the aphid acceptance for oviposition or its rejection. Piercing the aphid skin with the ovipositor was counted as an ovipositor inser- tion. Conversely, any attack by a parasitoid that did not lead to a (c) * * stabbing behaviour was counted as a rejection. Here, rejections 14 were owing to aphid aggressive behaviours (i. e. quick motions 12 of legs and/or body repelling the wasp to undertake a stabbing no. ovipositor behaviour) or the parasitoid's decision (without aphid aggressive 10 behaviours). As parasitoid attack could elicit the dropping behaviour, the occurrence of this escape reaction was also recorded. Once the 8 insertions parasitoid left the leaf, all aphids were transferred onto a broad bean plant and followed over four weeks in order to measure the parasitism 6 rate (i. e. proportion of aphids parasitized). This procedure was 4 repeated 148 times (table 1). (c) Statistical analyses 0 The dependent variables analysed were the total number of aphid experimental series 1 experimental series 2 dropping behaviours, the rate of host rejections owing to aphid aggressiveness, the total number of ovipositor insertions and the Figure 1. Effects of infection with H. defensa on (a) the parasitism rate. The analyses consisted of testing the effect of the symbiotic status of aphids on each dependent variable. In both number of A. pisum individuals that dropped off the plant experiments, several genotypes were tested and genotype was con- during colony exploitation by an A. ervi female ; (b) the rate sidered as a random independent variable in our statistical of A. ervi host rejections owing to the aggressiveness of the modelling. Generalized linear mixed models (GLMMs) were fitted attacked aphid ; and (c) the number of A. ervi ovipositor using the lme4 package [11] in R v. 2. 8. 1 [12] and by assuming insertions during colony exploitation. Black bars, aphids har- either a Poisson or Binomial error according to the dependent bouring H. defensa ; open bars, aphids free of facultative variable and a log- and logit-link function, respectively. symbionts. See 2 for description of experimental series 1 (distinct genetic background) and experimental series 2 (identical genetic background). The mean and the standard 3. RESULTS errors are shown. Statistical significance was evaluated by (a) Aphid defensive behaviours the GLMM (*p , 0. 001, *p , 0. 01, *p , 0. 05 and n. s. When faced with parasitoids, the behavioural p . 0. 05). responses of aphids strongly depended on their sym- biotic status. In both experimental series, A. pisum individuals infected with H. defensa were less defensive consequently, ovipositor insertions occurred more than uninfected individuals. The Hamiltonella-free frequently in colonies of H. defensa-infected hosts individuals dropped off the plant more frequently (figure 1c). than the Hamiltonella-infected aphids when confron- ted with parasitoids (figure 1a). Once encountered (b) Parasitism rate by the enemy, the Hamiltonella-free aphids were In the first experimental series, parasitism rates did not more aggressive than the Hamiltonella-infected ones. differ significantly between H. defensa-infected and Consequently, the rate of rejections owing to aphid uninfected aphids. This lack of significance was aggressiveness was significantly higher in colonies of mainly owing to high parasitism variance among H. uninfected individuals (figure 1b). Aphids infected defensa-infected genotypes : while two H. defensa- with H. defensa were more prone to parasitoids and, infected genotypes were strongly resistant (about Biol. Lett. Downloaded from rsbl. royalsocietypublishing. org on April 13, 2011 Symbiont effect on aphid behaviour E. Dion et al. 3 n. s. * the costs associated with defensive behaviours and so 0. 4 favours both host and symbiont. At first sight, the vertically transmitted symbiont 0. 3 H. defensa increases host fitness by conferring resist- parasitism rate ance to parasitoids and reducing costly defensive behaviours. These beneficial effects on the host 0. 2 increase the spread and the persistence of the faculta- tive symbiont within aphid populations. However, 0. 1 these benefits are strongly dependent on the ecological context. While H. defensa confers specific protection 0 against parasitoids, behavioural defences protect experimental series 1 experimental series 2 aphids against a wider range of natural enemies [5]. The reduction of behavioural defences in infected Figure 2. Effect of infection with H. defensa on the parasitism aphids would then increase their susceptibility against rate of A. ervi parasitoids after exploiting a colony of 10 predators and predation may lead to lower prevalence aphids. Black bars, aphids harbouring H. defensa ; open of symbionts in host populations. The interplay bars, aphids free of facultative symbionts. See 2 for descrip- between predation and parasitism pressures would cer- tion of experimental series 1 (distinct genetic background) tainly have a considerable impact on the persistence of and experimental series 2 (identical genetic background). The mean and the standard errors are shown. Statistical sig- symbionts in natural populations. nificance was evaluated by the GLMM (*p , 0. 001, *p , 0. 01, *p , 0. 05 and n. s. p . 0. 05). 5. CONCLUSION 10% of parasitism rate), one genotype presented an Our experiments identified symbiosis as an important intermediate level of symbiont-mediated resistance factor generating behavioural variation in host popu- (about 40% of parasitism rate). In the second exper- lations. As insect symbionts are extremely common, imental series, the rate of parasitism was lowest in we suggest that symbiont-induced changes in insect colonies of H. defensa-infected aphids (figure 2). behaviours may have played a key role in the evolution of ecological interactions in many species. Symbionts may promote evolution in insect enemies by changing host defensive strategies like conferring resistance and 4. DISCUSSION affecting defensive behaviour expressions. Our results indicate that A. pisum individuals infected with H. defensa dropped off the plant less frequently We thank M. Plantegenest for stimulating discussions, Lucie than uninfected individuals and exhibited a reduced Mieuzet and Frédérique Mahéo for genotyping and symbiont detection and Benjamin Agogue for language corrections. aggressiveness towards the enemy. These results were This work was supported by INRA SPE Department and observed irrespective of aphid genetic backgrounds, French Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la supporting the influence of H. defensa on aphid behav- Recherche'. ioural defences. Consequently, we experimentally demonstrated that the presence of defensive symbionts can produce high behavioural variation in their host 1 Oliver, K. M. , Degnan, P. H. , Burke, G. R. & Moran, populations. N. A. 2010 Facultative symbionts in aphids and the We also showed that parasitoids do not benefit from horizontal transfer of ecologically important traits. the reduced defensive behaviours in Hamiltonella- Annu. Rev. Entomol. 55, 247 266. (doi : 10. 1146/ infected aphids : even if the infected aphids are exposed annurev-ento-112408-085305) to parasitoid oviposition more frequently, the sym- 2 Hosokawa, T. , Kikuchi, Y. , Shimada, M. & Fukatsu, T. biont-mediated resistance maintained low parasitism 2008 Symbiont acquisition alters behaviour of stinkbug nymphs. Biol. Lett. 4, 4548. (doi : 10. 1098/rsbl. 2007. rates. The H. defensa infection enables aphids to save 0510) costs associated with the defensive behaviours while 3 Oliver, K. M. , Russell, J. A. , Moran, N. A. & Hunter, protecting the aphid against parasitoids. The factor M. S. 2003 Facultative bacterial symbionts in aphids responsible for this symbiont-mediated behavioural confer resistance to parasitic wasps. Proc. Natl Acad. Sci. variation is obviously unknown. It may be parsimo- USA 100, 18031807. (doi : 10. 1073/pnas. 0335320100) nious to assume that the reduction of defensive 4 Francke, D. L. , Harmon, J. P. , Harvey, C. T. & Ives, A. R. behaviours in infected aphids is an adaptive behaviour- 2008 Pea aphid dropping behavior diminishes foraging al response of aphids rather than a consequence of efficiency of a predatory ladybeetle. Entomol. Exp. Appl. behavioural manipulation by the bacterial symbiont. 127, 118124. (doi : 10. 1111/j. 1570-7458. 2008. 00678. x) In this evolutionary scenario, uninfected individuals 5 Gross, P. 1993 Insect behavioral and morphological defenses against parasitoids. Annu. Rev. Entomol. 38, have been selected for efficient behavioural defences, 251 273. (doi : 10. 1146/annurev. en. 38. 010193. 001343) while the selection has been attenuated in infected 6 Nelson, E. H. 2007 Predator avoidance behavior in aphids. We must also consider that the aphid behav- the pea aphid : costs, frequency, and population con- ioural changes can be a pathological consequence of sequences. Oecologia 151, 2232. (doi : 10. 1007/s00442- symbiont infection and are coincidentally beneficial 006-0573-2) for both partners. Whatever the underlying mechanism 7 Fievet, V. , Lhomme, P. & Outreman, Y. 2008 Predation of this symbiont-mediated phenotype is, it minimizes risk cues associated with killed conspecifics affect the Biol. Lett. Downloaded from rsbl. royalsocietypublishing. org on April 13, 2011 4 E. Dion et al. Symbiont effect on aphid behaviour behavior and reproduction of prey animals. Oikos 117, 10 Peccoud, J. , Ollivier, A. , Plantegenest, M. & Simon, J. C. 13801385. (doi : 10. 1111/j. 2008. 0030-1299. 16629. x) 2009 A continuum of genetic divergence from sympatric 8 Losey, J. E. & Denno, R. F. 1998 The escape response of host races to species in the pea aphid complex. Proc. Natl pea aphids to foliar-foraging predators : factors affecting Acad. Sci. USA 106, 7495 7500. (doi : 10. 1073/pnas. dropping behaviour. Ecol. Entomol. 23, 53 61. (doi : 10. 0811117106) 1046/j. 1365-2311. 1998. 00102. x) 11 Bates, D. , Maechler, M. & Bolcker, B. 2009 Package 9 Frantz, A. , Calcagno, V. , Mieuzet, L. , Plantegenest, M. & lme4 : linear mixed-effects models using S4 classes. See Simon, J. C. 2009 Complex trait differentiation between host-populations of the pea aphid Acyrthosiphon pisum 12 R Development Core Team 2008 R : a language and (Harris) : implications for the evolution of ecological enviroment for statistical computing. Vienna, Austria : R specialisation. Biol. J. Linn. Soc. 97, 718 727. (doi : 10. Foundation for Statistical Computing. See 1111/j. 1095-8312. 2009. 01221. x) R-project. org. Biol. Lett. Chapitre 5 DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES Ces travaux de thèse nous ont permis d'identifier l'effet de l'écologie du puceron du pois, à travers ses relations avec d'autres organismes, sur l'évolution et l'écologie des populations de son principal parasitoïde. Deux relations du réseau d'interactions d'A. pisum ont été étudiées : la relation entre ce puceron et sa plante hôte, et l'interaction qu'il entretient, facultativement, avec une bactérie symbiotique. Ainsi, nos objectifs étaient de : Mesurer l'influence de la spécialisation alimentaire chez A. pisum sur les propriétés génétiques des populations de son parasitoïde A. ervi, afin d'identifier un éventuel effet cascade, c'est-à-dire une spécialisation parasitaire chez le parasitoïde générée par la spécialisation alimentaire chez son hôte, Analyser l'évolution de la virulence des parasitoïdes et des propriétés génétiques de leurs populations lorsqu'ils sont soumis, durant plusieurs générations, à des hôtes porteurs ou non d'un symbiote conférant une résistance, Déterminer l'influence de ce symbiote protecteur sur les comportements de leurs porteurs et les conséquences sur le succès parasitaire des parasitoïdes. Les approches pluridisciplinaires utilisées au cours de la thèse ont généré des résultats permettant une meilleure compréhension du fonctionnement et de l'évolution des populations d'A. ervi et une identification plus précise de ses capacités à limiter les populations de pucerons, ravageurs de cultures. Les conclusions pouvant être tirées de ce travail contribuent à la fois à la connaissance fondamentale et appliquée. I. Des femelles Aphidius ervi homozygotes 1. Induction d'une diploïdisation par Wolbachia pipentis ? Nos résultats révèlent un nombre important de femelles homozygotes sur l'ensemble des loci étudiés. Ces parasitoïdes homozygotes étaient présents dans toutes les populations échantillonnées sur les différentes races d'hôtes du puceron, aussi bien dans l'Est que dans l'Ouest de la France. Les mâles d'Aphidius ervi sont haploïdes, donc homozygotes. Il semble peu probable que certains mâles aient été génotypés accidentellement car les mâles et les femelles se distinguent aisément les uns des autres (chapitre 2 II. 3. ). Nous avons ainsi émis l'hypothèse que des femelles homozygotes auraient été produites à partir d'une diploïdisation d'œufs non fécondés. C'est un processus généralement induit par des symbiotes manipulant la reproduction de leurs hôtes en faveur des femelles, favorisant ainsi leur transmission et leur maintien dans les populations (Chapitre 1. III. 2. ). Ces microorganismes infectent de nombreux arthropodes, et particulièrement des espèces de parasitoïdes (Stouthamer et al. , 1999 ; Hilgenboecker et al. , 2008 ; Giorgini et al. , 2009 ; 2010). Wolbachia pipientis a été détectée chez A. ervi (Medina et al. , 2011). Cependant, aucun des 4 gènes de Wolbachia n'a été amplifié chez les femelles homozygotes de nos échantillons. 2. Origine des femelles homozygotes Wolbachia pipentis n' ayant pas été détectée, il serait intéressant de tester la présence d'autres symbiotes pouvant également induire une diploïdisation des œufs non fécondés. C'est le cas de Cardinium sp. (Giorgini et al. , 2009) ou de Rickettsia sp. présents chez Encarsia hispida et Pnigalio soemius respectivement. La restauration de la diploïdie sans intervention bactérienne peut également se produire par différents mécanismes cytologiques tels que la duplication des gamètes ou la fusion de cellules (Haccou & Schneider, 2004). Beukeboom et al. (2007) ont également détecté des souches de Nasonia vitripennis présentant des individus au phénotype femelle à partir d'œufs non fécondés. Quels que soient les mécanismes impliqués, leur présence dans les populations favorise les déficits d'hétérozygotie et donc une réduction de la variabilité génétique. Notons enfin que cet excès de femelles homozygotes a été détecté dans toutes les études de génétique des populations d'A. ervi, indépendamment des marqueurs microsatellites utilisés (Article 1 ; Article 3 ; Hufbauer et al. , 2004 ; Bilodeau E. , communication personnelle). II. Aphidius ervi, un parasitoïde généraliste disperseur 1. Absence d'une spécialisation parasitaire Bien que les populations de pucerons du pois montrent une forte différenciation génétique et phénotypique selon leur plante hôte (Frantz et al. , 2009 ; Peccoud et al. , 2009a), cette spécialisation écologique n'affecte pas le fonctionnement et l'évolution des populations de son principal parasitoïde. Les femelles d'A. ervi issues des races luzerne et trèfle ne sont pas génétiquement différentes. Une spécialisation parasitaire en cascade est donc exclue pour cette espèce. Cette absence de HAD' est confirmée par des FST très faibles entre les populations, et également par des pourcentages de variances génétiques très faiblement expliqués (et non significatifs) par le facteur plante hôte' (Article 1). Un défaut d'observations ou les caractéristiques du système étudié peuvent expliquer cette absence de structuration. A. pisum, un complexe de 11 races d'hôtes A. pisum forme un complexe de 11 populations sympatriques très différenciées, comptant 8 races d'hôtes et 3 espèces probables. Cela signifie que nous avons suivi une partie seulement des populations de parasitoïdes de pucerons spécialisés. Les biotypes gesse des prés' (Lathyrus pratensis), bugrane épineuse' (Ononis spinosa) et genêt à balai' (Cytisus scoparius) sont les plus différenciés et sont considérés comme à quasi-complète spéciation (Peccoud et al. , 2009a). Lors de nos échantillonnages, il paraissait très difficile de constituer des échantillons de taille raisonnable' de parasitoïdes issus de pucerons exploitant la bugrane épineuse ou la gesse des prés. Par ailleurs, parmi l'ensemble des momies prélevées sur le genêt à balai, seuls 4 individus parasitoïdes ont émergé. Sur ces trois races d'hôtes, l'effet cascade pourraient être plus probable, engendrant des divergences génétiques plus conséquentes dans les populations d'A. ervi. La dispersion et le spectre d'hôte large d'A. ervi limitent sa spécialisation L'absence de structuration géographique, liée à l'absence de spécialisation parasitaire, serait due aux caractéristiques biologiques et écologiques d'A. ervi. D'une part, une distance de plus de 800 km entre les populations de parasitoïdes ne suffit pas à les différencier génétiquement. Ce résultat confirme que cette espèce possède un fort potentiel de dispersion, caractéristique déjà suggérée par plusieurs auteurs (Milne, 1999 ; Hufbauer, 2001). La mobilité de certaines espèces de parasitoïdes permet la colonisation rapide et efficace de nouveaux environnements (e. g. Langhof et al. , 2005 ; Lee et al. , 2007) et facilite l'établissement d'auxiliaires utilisés dans le cadre de programmes de lutte biologique (e. g. Milne, 1999 ; Ayvaz et al. , 2008). Par exemple, Aphidius ervi a été introduit sur la côte Est de l'Australie dans les années 1980 pour contrôler le puceron du pois. Il s'est propagé sur plus de 300 Km en un an et est, à présent, présent sur tout le pays (Milne, 1999). Les flux de gènes importants entre populations de parasitoïdes peuvent donc contraindre leur adaptation locale aux hôtes, et empêcher une différenciation en cascade (e. g. Baer et al. , 2004). D'autre part, l'émergence des races d'hôtes chez le puceron du pois est un phénomène évolutif relativement récent (Peccoud et al. , 2009b). Malgré la forte spécialisation des pucerons pour leur plante hôte, des flux de gènes existent toujours entre les races (Peccoud et al. , 2009a). Aphidius ervi exploite donc des populations hôtes structurées mais qui ne constituent pas encore, ou depuis peu, des espèces différenciées. Aphidius ervi est par ailleurs une espèce généraliste en Europe, et attaque une large variété de pucerons. Leur spectre d'hôtes est composé d'une vingtaine d'espèces aphidiennes présentes sur différentes familles de plantes sauvages ou cultivées (céréales, pommes de terre, légumineuses, astéracées et poacées sauvages) (Star, 1974 ; Star, 1988). Cette caractéristique facilite les flux de gènes de parasitoïdes entre les compartiments d'un paysage. 2. Perspectives : influence des autres espèces d'hôte d'A. ervi et évolution d'un parasitoïde spécialiste Structure des populations de parasitoïde issus d'espèces d'hôtes différentes Etant un parasitoïde généraliste, A. ervi pourrait exploiter différemment d'autres espèces de pucerons présentes sur d'autres plantes hôtes. Si nous avons détecté l'absence de structuration génétique de ce parasitoïde selon les biotypes d'A. pisum, les propriétés génétiques sur les autres espèces de son spectre d'hôtes restent encore inconnues. Aphidius ervi montre des préférences pour son hôte d'origine (Pennachio et al. , 1994), et des études récentes illustrent ses capacités à augmenter ses performances sur une espèce alternative de puceron (espèce différente dont un individu émerge) (Henry et al. , 2008 ; 2010). Dans les systèmes o les génotypes ont des performances différentes sur des hôtes variables, alors la sélection devrait promouvoir leur ségrégation génétique (Fry, 1996 ; Kaweki, 1998 ; Kaweki & Ebert, 2004). Il semble donc intéressant de comparer les caractéristiques génétiques des populations d'A. ervi issues de pucerons des fabacées et de pucerons des céréales. Evolution d'une espèce spécialiste Aphidius ervi est généraliste en Europe, ce qui implique un spectre de pucerons hôtes très large. A l'inverse, les A. ervi japonais sont spécialisés sur le puceron du pois, manifestant de faibles performances sur d'autres espèces aphidiennes qui sont habituellement parasitées en Europe. Des expériences de croisement entre des populations européennes et japonaises montrent un isolement reproducteur partiel entre les deux souches (Takada & Tada, 2000). La réduction des flux de gènes entre les populations est l'indice d'une sélection divergente et constitue une des premières étapes vers la spécialisation (Schluter, 2001 ; Laine, 2009). Il semble ainsi pertinent d'étudier les caractéristiques génétiques et phénotypiques de ces parasitoïdes japonais et les comparer aux populations européennes. Nous pourrions répondre à des interrogations telles que : quelles sont leurs performances sur les différentes espèces de pucerons ? Quelles performances et préférences possèdent les hybrides ? A quel point les populations japonaises sont-elles génétiquement différenciées des européennes ? Sont-elles capables d'évoluer et de s'adapter à un hôte alternatif ? En outre, une espèce proche d'Aphidius ervi, Aphidius eadyi (Hyménoptère, Braconidae) est également d'un intérêt tout particulier car c'est un parasitoïde présent en France possédant un spectre d'hôtes se limitant à deux espèces : A. pisum et Acyrthosiphon caraganae. Jusqu'à présent, A. caraganae n'a jamais été observé dans le bassin rennais (données piège à succion de l'INRA du Rheu). L'étude de ce parasitoïde se justifie particulièrement par sa réponse potentielle en tant que spécialiste aux pressions de sélection imposées par les traits écologiques du puceron du pois. Un parasitoïde spécialiste est plus exposé à la sélection pour une meilleure performance sur son seul hôte. Cela lui permet d'évoluer plus vite qu'un généraliste qui peut exploiter des hôtes au niveau de résistance différents. La spécialisation parasitaire pourrait alors être favorisée (Kaweki, 1998). De ces conclusions découlent ainsi plusieurs interrogations : existe-t-il une différenciation en cascade, donc une spécialisation, des populations d'A. eadyi parasitant une espèce hôte très structurée ? Ces questions sont fondamentales pour identifier les transferts de parasitoïdes dans le paysage et l'évolution de leurs populations selon la dynamique des paysages et les conditions environnementales variables. Prospecter les cultures céréalières pour échantillonner des A. ervi de pucerons des céréales et analyser la structure génétique des populations d'Aphidius eadyi étaient des projets initialement prévus dans la thèse. Malheureusement, les faibles prévalences de ces deux parasitoïdes dans les conditions voulues nous ont conduits à concentrer ce travail sur Aphidius ervi échantillonnés sur des légumineuses. III. Les symbiotes, un moteur de diversification 1. H. defensa, moteur de diversification chez les pucerons Des comportements défensifs moindres favorisant le symbiote et son porteur Pour éviter le parasitisme, A. pisum présente des moyens de défenses comportementaux et physiologiques (immunité innée et présence d'un symbiote secondaire). Nous avons mis en évidence une interaction négative entre ces comportements de défense et la résistance apportée par les symbiotes : les pucerons porteurs de H. defensa se défendent moins. Les hypothèses pouvant expliquer cette interaction négative sont les suivantes : i. Contre sélection des pucerons défensifs Les moyens de défense des pucerons contre les parasitoïdes sont coûteux. Un hôte porteur d'H. defensa manifestant des comportements défensifs accumulerait ainsi leurs coûts associés et présenterait une faible valeur sélective. Les génotypes aphidiens cumulant les moyens de défense subiraient donc de fortes pressions de sélection à la défaveur de cette multiplicité de défenses. ii. Un phénotype étendu des pucerons Les modifications phénotypiques observées chez les pucerons infectés par la bactérie H. defensa pourrait être considérées comme une illustration du concept de phénotype étendu (Dawkins, 1982) : les changements phénotypiques correspondent à l'expression des gènes de la bactérie à travers le phénotype du puceron. Dans ce cas, les gènes de la bactérie seraient responsables de la diminution des réactions défensives de leur porteur, favorisant leur transmission : un puceron manifestant peu de comportements défensifs aura plus de descendants et la bactérie, à transmission verticale, sera alors plus représentée dans la génération suivante. iii. Un effet pathologique Les changements phénotypiques chez les pucerons infectés par H. defensa peuvent être le fruit de conséquences pathologiques de l'infection bactérienne. La présence de la bactérie pourrait handicaper son puceron porteur, affectant ses capacités motrices ou sa perception de stimuli. La modification comportementale de l'hôte parasité serait alors un simple sous- produit physiologique de l'infection bactérienne, engendrant des comportements aberrants', et par conséquent, non issus d'un processus de sélection en faveur de la bactérie (Minchella, 1985). Quel que soit le mécanisme, évolutif ou physiologique, associé à cette interaction négative entre les deux moyens de défense, elle favorise la valeur sélective de la bactérie comme de son porteur, car elle permet une réduction des coûts associés aux comportements défensifs. Par conséquent, la fécondité du puceron est meilleure, ce qui assure la transmission et la persistance d'H. defensa dans la population aphidienne. Oliver et al. (2008) ont notamment déterminé que les fréquences d'A. pisum infectés par H. defensa augmentent de façon spectaculaire après une exposition répétée au parasitisme par A. ervi. A l'inverse, les fréquences de pucerons porteurs du symbiote déclinent en absence de l'ennemi naturel. Ces résultats suggèrent un coût probable pour les pucerons à porter le symbiote en absence de parasitisme, confirmant l'utilisation d'un seul des deux moyens de défense par les individus (compensation des moyens défensifs). Les conséquences sur le parasitoïde Cette interaction négative entre les deux moyens de défense conduit à une divergence phénotypique dans les populations aphidiennes. Une dispersion et une répartition différentes des pucerons défensifs dans les habitats peuvent aussi être attendues : les pucerons défensifs auront tendance à être plus dispersés car ils présentent une plus forte tendance à la fuite. Si la résistance liée au symbiote et les défenses comportementales confèrent un niveau de protection similaire (taux de parasitisme équivalent pour les deux types d'hôtes), les conséquences sur lévolution des populations de parasitoïdes sont en revanche différentes. En réponse aux différentes stratégies de défense des pucerons, des stratégies d'attaques variables peuvent être sélectionnées chez les parasitoïdes. Plusieurs traits peuvent être concernés chez la femelle : la recherche et la détection des hôtes (des pucerons plus dispersés entrainent des concentrations moindres de composés volatiles attirant le parasitoïde ; Powell et al. , 1998), l'inspection des hôtes avant la piqûre (évaluation des conditions physiologiques et du statut parasitaire des hôtes), ou l'oviposition elle-même. Quel est le rôle des prédateurs ? A première vue, la résistance conférée par Hamiltonella defensa favorise la valeur adaptative du puceron porteur car elle permet une réduction des coûts associés aux comportements défensifs. Cependant, ces bénéfices dépendent fortement du contexte écologique. Alors que H. defensa apporte spécifiquement une protection contre le parasitoïde (Oliver et al. , 2003), les comportements défensifs protègent les pucerons contre un large éventail d'ennemis naturels (Gross, 1993). Ainsi, la réduction des défenses comportementales chez les A. pisum abritant le symbiote pourrait réduire leur potentiel défensif vis-à-vis des prédateurs. Une forte prédation entrainerait une diminution de la prévalence des symbiotes protecteurs dans les populations hôtes. Etudier le comportement des pucerons en présence de prédateurs permettrait d'évaluer l'effet de la modification comportementale liée au symbiote sur la survie des pucerons. Notre hypothèse suppose que la fréquence de la résistance conférée par H. defensa dans un habitat particulier serait dépendante de la composition du cortège des ennemis naturels. 2. H. defensa, moteur de diversification chez les parasitoïdes Le potentiel d'adaptation de parasitoïdes à des hôtes résistants Les populations de parasitoïdes peuvent répondre rapidement à la résistance de leurs hôtes par un accroissement de leurs aptitudes à les exploiter (Article 2). Ce gain de performance peut être associé à la sélection de femelles ayant une composition de venin particulière ou certains attributs distincts de l'œuf injecté dans l'hôte. Les populations de parasitoïdes possèdent des variabilités génétiques leur permettant d'évoluer et de se structurer, en conditions contrôlées, selon la résistance des hôtes (Article 3) Cette expérimentation met en évidence le potentiel adaptatif des populations de parasitoïdes exposées à de fortes pressions de sélection. Quels que soient les mécanismes sous-jacents, cette réponse des parasitoïdes démontre le rôle considérable des organismes symbiotiques dans l'évolution des interactions antagonistes. Des pressions de sélection diffuses dans le milieu naturel L'évolution expérimentale est un outil particulièrement efficace pour évaluer l'adaptation de populations et détecter les compromis évolutifs associés à un trait soumis à sélection (Fry, 2003 ; Gaba & Ebert, 2009). Ce type d'expérimentation permet le contrôle de la force de la sélection, des populations impliquées (nombre de réplicats, taille), et des facteurs environnementaux (températures) (Conner, 2003 ; Fuller et al. , 2005). Nous avons suivi l'évolution du face à face entre les deux antagonistes seulement, avec des pressions de sélection contrôlées (niveaux de résistance), fortes, et imposées aux populations de parasitoïdes durant un temps précis. La force de sélection est telle que le gain de performance des femelles soumises aux clones résistants est rapide (Article 2), et génère une ségrégation génétique détectée avec des marqueurs neutres (Articles 3). Cependant, l'environnement expérimental utilisé est éloigné des conditions naturelles. Dans la nature, les populations interagissent avec de nombreux facteurs environnementaux, et les pressions de sélection y sont plus diffuses. L'évolution des antagonistes est donc le produit de toutes les interactions qui les touchent (Wolinska & King, 2009). Hamiltonella defensa est distribuée différemment dans le paysage selon les races d'hôtes pucerons (Frantz et al. , 2009). Les prévalences du symbiote diffèrent même selon l'origine géographique des pucerons (chapitre 3, Article 1). A cela s'ajoutent les différences de comportements défensifs selon les races : les hôtes du trèfle et de la luzerne expriment beaucoup plus de réponses comportementales à la perception de phéromone d'alarme que les biotypes pois (Kunert et al. , 2010). Les A. pisum présentent donc une hétérogénéité spatiale dans leur potentiel défensif vis-à-vis d'A. ervi, hétérogénéité liée à la variabilité des prévalences d'H. defensa et à la variabilité des comportements défensifs exprimés. Théoriquement, la régionalisation des défenses des hôtes pourrait mener à l'adaptation de génotypes particuliers de parasitoïdes et de stratégies de virulence différentes (Fry, 1996 ; Laine, 2009 ; Poirié et al. , 2009, Clark et al. , 2010). Si des divergences génétiques entre populations sélectionnées ont été observées (Article 3), ce n'est pas le cas pour les populations naturelles (Article 1). La multiplicité et l'hétérogénéité des pressions de sélection dans l'environnement naturel (dues aux prédateurs, aux hôtes, aux hyperparasitoïdes, au climat) et limportante mobilité des individus empêche vraisemblablement leur adaptation locale et la divergence selon les niveaux de résistance des hôtes. La résistance dans le spectre d'hôtes d'Aphidius ervi Dans ce document, nous avons présenté les capacités d'A. ervi à évoluer sous la pression d'une forte résistance des hôtes. Si le gain de performance des parasitoïdes est rapide dans des conditions de laboratoire, les divergences génétiques ne sont pas détectées sur des populations naturelles issues du puceron du pois. Il semble donc important d'évaluer les niveaux de résistance des populations hôtes aphidiennes en déterminant la prévalence des symbiotes protecteurs chez les autres espèces hôtes du parasitoïde. Vorburger et al. (2008) ont par exemple mis en évidence que l'infection du puceron M. persicae par H. defensa le protégeait contre Aphidius colemani. Il semble probable que le symbiote confère aussi une résistance à cette espèce contre A. ervi. Caractériser la géographie' de la résistance (par les prévalences des symbiotes) permettrait ainsi d'identifier les forces des pressions de sélection auxquelles sont soumis les parasitoïdes dans les paysages. Cette perspective s'inscrit dans un projet plus global de définition du réseau d'interactions bactériens des pucerons qui est aujourd'hui certainement sous évalué. Selon les bactéries détectées, leurs effets sur les porteurs et les conséquences sur leurs ennemis naturels, nous pourrions comprendre le fonctionnement plus global des communautés de parasitoïdes de pucerons et la manière dont leurs populations peuvent se structurer. Les mécanismes de la virulence d'Aphidius ervi Comprendre comment les populations de parasitoïdes évoluent, c'est également comprendre les mécanismes sous-jacents. La virulence, c'est-à-dire la capacité de l'individu à se développer dans un hôte et d'y émerger (Henter, 1995 ; Antolin et al. , 2006), est sélectionnée chez les parasitoïdes soumis à des hôtes résistants. En plus de la GT déjà connue (Digilio et al. , 1998 ; Digilio et al. , 2000), de nouvelles molécules injectées par les femelles durant l'oviposition ont été identifiées au cours de cette thèse par Caroline Anselme. Leurs fonctions physiologiques exactes et leur régulation chez A. ervi doivent encore être précisées. Certaines ont des rôles éventuels antimicrobiens (Chapitre 4, I. 4. ), moyen de lutte potentiel pour les parasitoïdes contre les symbiotes protecteurs. Le fait que nous n'ayons pas détecté de sélection d'un facteur particulier au cours de l'expérience d'évolution expérimentale ne remet pas en question leur implication dans la virulence des femelles. En effet, les molécules émises par les tératocytes jouent également un rôle important dans le succès parasitaire (Falabella et al. , 2009). On s'attend donc à une évolution de ces composés, malheureusement non suivis lors de notre expérimentation. IV. Aphidius ervi, bon ou mauvais auxiliaire ? Les expérimentations développées au cours de la thèse ont permis de caractériser les capacités d'adaptation d'A. ervi et évaluer son potentiel à réguler les populations aphidiennes. Les auxiliaires de cultures sont supposés avoir un fort potentiel de parasitisme Nos résultats indiquent que les comportements de défense des pucerons et la résistance apportée par la bactérie limitent significativement l'efficacité parasitaire d'A. ervi. Nos expérimentations illustrent toutefois les bonnes capacités de cette espèce à accrotre son succès parasitaire face à des populations hôtes résistantes. La variabilité génétique présente dans les populations de parasitoïdes permettrait une adaptation aux populations hôtes locales. Cette capacité adaptative fait d'Aphidius ervi un bon auxiliaire potentiel. Les conditions contrôlées au laboratoire permettent de tester certaines hypothèses et de proposer des mécanismes. Cependant, les prédictions théoriques ne sont pas toujours validées sur le terrain : même si elle possède des capacités d'adaptation, nous avons montré l'absence de spécialisation parasitaire. Ses importantes aptitudes de dispersion et son caractère généraliste lui permettent d'exploiter, à priori, de nombreuses espèces de pucerons sur de longues distances. Les parasitoïdes Aphidiinae ont été beaucoup utilisés en contrôle biologique pour lutter contre les pucerons. Plus particulièrement, Aphidius ervi a été introduit dans plusieurs pays pour contrôler les pucerons de légumineuses (e. g. A. pisum et A. kondoï) et des céréales (e. g. Sitobion avenae) (Tableau V. 1). Selon van Emden & Harrington (2007), la présence d'A. pisum et d'A. kondoï dans un système mixte de cultures a probablement contribué au succès de la lutte contre les pucerons des céréales au Chili. Le caractère généraliste de cette espèce a ainsi été un atout dans la lutte contre les ravageurs. Tableau V. 1. Informations sur les introductions d'Aphidius ervi (d'après van Emden & Harrington, 2007). Espèces Origines des Pays Cultures Années Etablissement Références cibles parasitoïdes d'introduction Angalet & A. pisum Luzerne, Pois Inde, Europe USA, Canada 1958-1963 oui Fuester, 1977 van Emden A. pisum Légumineuses Europe Argentine 1972-1978 oui & Harrington, A. kondoï Australie, A. kondoï Luzerne Europe Nouvelle 1978-1982 oui Milne, 1999 Zélande S. avenae Céréales France, Iran Chili 1976-1982 oui Star, 1993 La grande mobilité d'A. ervi peut toutefois présenter des désavantages. Si les individus rencontrent un hôte incompatible' (trop résistant, individus trop peu nombreux, conditions environnementales difficiles etc), alors il peut se déplacer aisément et sur des longues distances pour exploiter une autre espèce de puceron. A grande échelle, et dans un système de culture ouvert, l'efficacité d'A. ervi en tant qu'auxiliaire semble diminuée lorsque est visée une espèce précise et localement distribuée. Une utilisation en milieu fermé semble donc plus conseillée. C'est d'ailleurs plutôt le cas aujourd'hui car des entreprises présentes aux Etats-Unis, Grande Bretagne, Belgique, Allemagne et Hollande produisent cette espèce en grand nombre, particulièrement pour le contrôle des pucerons sous serre (Takada & Tada, 2000 ; van Emden & Harrington, 2007). V. Conclusion Les pucerons présentent des caractéristiques biologiques, écologiques et des interactions avec d'autres organismes qui influencent grandement les traits phénotypiques et génétiques de leurs parasitoïdes. Cette thèse a permis la mise en évidence d'aspects spécifiques de linteraction A. pisum-A ervi, et a ouvert de nombreuses perspectives de recherches permettant d'identifier le fonctionnement des populations de parasitoïdes, en fonction des caractéristiques de leurs hôtes. Les conclusions de ce travail ainsi que perspectives qu'il ouvre sont résumés dans la figure 5. 1. Figure 5. 1. Représentation schématique résumant les principales conclusions de ce travail de thèse (en rouge), et ses perspectives (en bleu). REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Les références citées dans les articles ne figurent pas dans cette liste. Al Abassi S, Birkett MA, Pettersson J, Pickett JA, Wadhams LJ, Woodcock CM. 2000. 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This thesis aimed to evaluate the influence of the pea aphid Acyrthosiphon pisum interactions web on the evolution and ecology of its dominant parasitoid Aphidius ervi. The interaction between the pea aphid and its host plant should impact on parasitoid populations because A. pisum populations exhibit host plant specialization, being a complex of genetically and phenotypically distinguished sympatric populations. However, we showed that there is no cascading genetic host-associated differentiation of A. ervi populations, in respect with host races. The parasitoids seem to equally exploit aphids from different host plants. As A. ervi have great dispersal ability and is a generalist species, gene flows are favoured between landscape compartments. Additionally, some pea aphid individuals harbour a facultative symbiont Hamiltonella defensa that provides protection against parasitoids. By analysing aphid behaviours in the presence of parasitoids, we showed that hosts infected with H. defensa exhibited reduced aggressiveness and escape reactions compared with uninfected aphids. The aphid and the symbiont should both benefit from these behavioural changes : both partners reduced the fitness decrements associated with the behavioural defences. We conducted also an experimental evolution procedure, selecting A. ervi on either high-resistant aphid populations harbouring H. Defensa, or low-resistant aphid populations free of H. defensa. The parasitoids performance selected on high-resistant host populations increased through generations. During selection process, host resistance induced a diminution of the allelic variability in A. ervi selected populations, leading to genetic divergence between populations exposed or not to high-resistant hosts. This experimentation highlighted the genetic and adaptive potential of this parasitoid species when faced with the symbiont mediated resistance of their hosts. The results of these studies are then discussed in respect to the fundamental and applied fields associated. Perspectives of this work are also given. Keywords : Parasitoid, host specialisation, symbiont-mediated resistance, behavioural defences, genetic cascading host-associated differentiation, adaptation abilities, experimental evolution, microsatellites Résumé Chaque être vivant interagit avec une ou plusieurs espèces et est membre d'un réseau complexe d'interactions qui influencent les traits des individus, exerçant de fait des pressions sélectives sur leurs populations. Chaque espèce étant dépendante de la nature et de la diversité des interactions dans lesquelles elle est impliquée, son évolution est donc en partie liée aux autres espèces avec lesquelles elle interagit. Un hôte et son parasitoïde vivent dans une dynamique coévolutive, prenant part à une véritable course aux armements', o les différentes stratégies d'attaque peuvent être sélectionnés chez le parasitoïde en réponse aux différentes formes de défenses chez l'hôte. Ce dernier interagit également avec d'autres organismes qui modifient ses traits, impactant les aptitudes du parasitoïde, perturbant leur dynamique coévolutive. L'objectif de ce travail est ainsi d'identifier l'influence du réseau d'interactions du puceron du pois Acyrthosiphon pisum sur l'évolution et l'écologie des populations de son principal parasitoïde Aphidius ervi. Le puceron du pois est lui-même parasite de sa plante hôte, leur coévolution aboutissant à une spécialisation de cet aphide cette espèce hôte végétale. Les populations de pucerons sont donc structurées en races d'hôtes sympatriques, divergeant génétiquement et phénotypiquement. Notre étude montre une absence de structuration génétique des populations de parasitoïdes selon les races d'hôte. A. ervi exploite indifféremment les A. pisum issus de différentes plantes hôtes, excluant la présence d'un effet cascade associé à la spécialisation alimentaire chez ce puceron. La dispersion et le caractère généraliste du parasitoïde semblent favoriser les flux de gènes entre les différents éléments d'un paysage agricole. A. pisum peut également abriter le symbiote Hamiltonella defensa qui lui confère une résistance à A. ervi. Ces microorganismes symbiotiques induisent une réduction des défenses comportementales chez les pucerons porteurs. Cette diminution de l'expression des comportements défensifs favorise à la fois le puceron et son symbiote car elle réduit les coûts associés à ces comportements. Enfin, une évolution expérimentale sur des populations de parasitoïdes soumises à des populations d'hôtes portant H. defensa (résistantes) ou non (sensibles) montre une adaptation des parasitoïdes soumis aux hôtes résistants. Cette adaptation s'accompagne d'une réduction de la variabilité génétique dans les populations exposées à la résistance. On observe également une divergence génétique entre les populations exposées ou non à la résistance conférée par le symbiote, H. defensa. Cette expérimentation met en évidence le potentiel évolutif des populations d'A. ervi et donc leurs capacités d'adaptation face à des pucerons résistants. Les intérêts fondamentaux et appliqués de ces travaux sont discutés et replacés dans un contexte général. Mots clés : Parasitoïde, spécialisation écologique de l'hôte, symbiote protecteur, défenses comportementales, effet cascade, potentiel évolutif, évolution expérimentale, génétique des populations | HAL | Scientific |
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U. F. R DE MEDECINE d'AMIENS Année 2015 - Thèse N115 Thèse pour l'obtention du DIPLOME D'ETAT DE DOCTEUR EN MEDECINE Présentée et soutenue publiquement Le 24/09/2015 Par TOUSSAINT Marie-Adeline Née le 16 mars 1987 à Beauvais PATIENT INTERNAUTE : CHANGEMENT DANS LA RELATION MEDECIN / MALADE ? Le Président du Jury : Mr le Professeur Christian MILLE Président les Juges : Mr le Professeur Vladimir STRUNSKI Mr le Professeur Jean-Luc SCHMIT Mr le Professeur Pierre DUHAUT Mr le Docteur Amar SMAIL Directeur de thèse : Mr le Docteur Dominique ROUSSELIN 1 A Monsieur le Professeur Christian MILLE, Professeur des Universités-Praticien Hospitalier (Pédo-psychiatrie) Pôle Femme - Couple Enfant Je vous remercie d'avoir spontanément accepté de présider cette thèse. A Monsieur le Professeur Vladimir STRUNSKI Professeur des Universités-Praticien Hospitalier (Oto Rhino Laryngologie) Chef du Service ORL et Chirurgie de la face et du cou Pôle des 5 sens Chevalier dans l'Ordre des Palmes Académiques, Vous avez montré de l'enthousiasme pour ce travail et avez accepté de prendre part au jury, soyez en remercié. A Monsieur le Professeur Jean-Luc SCHMIT Professeur des Universités-Praticien Hospitalier (Maladies infectieuses et tropicales) Responsable du service des maladies infectieuses et tropicales Pôle Médico-chirurgical digestif, rénal, infectieux, médecine interne et endocrinologie (D. R. I. M. E) Je vous suis reconnaissante d'avoir accepté de prendre part au jury. 2 A Monsieur le Professeur Pierre DUHAUT Professeur des Universités-Praticien Hospitalier (Médecine Interne) Chef du service de Médecine interne et maladies systémiques Pôle Médico-chirurgical digestif, rénal, infectieux, médecine interne et endocrinologie (D. R. I. M. E) Je vous remercie pour les semaines passées dans votre service et d'avoir accepté de participer à ce jury. A Monsieur le Docteur Amar SMAIL, interniste Merci de m'avoir transmis la passion de ce métier, merci de vos conseils au quotidien dans ma prise en charge des patients, et merci de votre participation à ce jury. Monsieur le Docteur Dominique ROUSSELIN, médecin généraliste A mon directeur, Merci d'avoir accepté cette charge, de m'avoir donné le goût de la médecine générale et de continuer à me conseiller dans ma vie professionnelle. 3 A mes parents, grâce à qui mon rêve est devenu réalité A Matthias, A ma famille, A mes amis, A mes collègues Merci de votre soutien et de votre présence lors de la rédaction de cette thèse 4 Tables des matières I. Introduction . 8 II. Matériel et méthodes . 9 1. Schéma d'étude . . 9 2. Echantillon . 9 3. Nombre de sujets nécessaires . . 9 4. Elaboration des éléments de l'enquête . . 9 5. Distribution des questionnaires . 10 6. Modalités de recueil de données et analyse statistique . 10 III. Résultats . 11 1. Taux de réponses . 11 2. étude socio démographique . 11 a. âge . 12 b. niveau scolaire . 12 3. Perception de l'état de santé . 13 4. Connexion à internet . 14 5. Relation avec le médecin . 15 6. Outils en matière de santé . 16 a. population générale . 16 b. patients estimant avoir une mauvaise relation médecin/malade. 17 7. Internet et santé . 18 a. fréquence de consultation d'internet . 18 b. lieux de recherches . . 19 c. Lien avec une consultation de médecine de ville . 20 d. types de recherche sur internet . . 22 8. Utilité et conséquences des recherches . 23 5 IV. Discussion . 26 1. Méthodologie . 26 2. Résultats . 26 a. nombre de sujets . . 26 b. population . 27 c. relation médecin/malade . 28 d. outils en matière de recherche internet . 28 e. internet et santé . 28 f. utilité et conséquences des recherches . 30 V. Conclusion . 31 Annexes . 32 lettre introductive. 32 questionnaire . 33 Bibliographie . 36 6 I. Introduction Depuis plusieurs années maintenant, internet prend une part prépondérante dans la société française. En 2012, trois personnes sur quatre résidant en France métropolitaine ont utilisé Internet au cours des trois derniers mois et 80% de l'ensemble de la population ont une connection internet à leur domicile. De nombreuses fonctionnalités disponibles sur la toile sont de plus en plus utilisées. Achats mais aussi ventes en ligne sont ainsi de plus en plus sollicités ces dernières années. (1). Internet devenant à l'heure actuelle le principal outil d'information ou de communication. Actuellement, le système de santé français se transforme grâce à la large utilisation de nouveaux outils comme les diverses applications de télémédecine ou la mise en place d'un dossier électronique communiquant bientôt obligatoire. De nombreuses études montrent que cette utilisation d'internet en médecine, est malgré tout ancrée dans la sphère professionnelle notamment en interrogeant les médecins généralistes dans les pays du nord de l'Europe. En France, les médecins généralistes s'accordent d'ailleurs en ce sens, avec 87% d'entre eux utilisant l'outil informatique dans leur pratique et 77% pour les télétransmissions. (2) Mais la majorité restent encore dans une phase d'observation en hésitant à intégrer ce nouvel outil dans leur exercice quotidien. Seulement 10% d'entre eux l'utilisent dans leur pratique quotidienne, et ce principalement via des sociétés savantes ou des outils de formation continue. (2) Le patient internaute est de plus en plus présent (3) : Aux États-Unis, à partir de 5 enquêtes menées en population générale, la proportion de sujets cherchant de l'information en santé sur Internet variait de 31 % à 67, 96 %. L'utilisation d'Internet pour rechercher pour des informations à propos de la santé semble plus fréquente aux États-Unis, variant de 33 % à 53, 5 %. Le Web prend donc une place importante en matière de santé individuelle (4) Le conseil de l'ordre des médecins de son côté essaye de structurer les relations internet/medecin/patient. Il constate notamment un apport dans l'accompagnement et le soutien psychologique des patients mais également dans le dialogue avec leurs médecins, pour construire ainsi une relation constructive. Une proposition a même été lancée pour intégrer dans le cursus universitaire un temps d'apprentissage des outils de communication(5). 7 A l'heure de cette large utilisation d'internet et des sites médicaux par et pour les patients, notre objectif principal est d'évaluer les conséquences de l'outil internet sur la relation médecin/malade Les objectifs secondaires étant d'évaluer la place d'internet en matière de santé ainsi que le profil de patient utilisant internet en matière de santé. 8 II. Matériel et méthodes 1. Schéma d'étude : Etude observationnelle descriptive et analytique auprès des patients de cabinets de médecine générale de l'Oise et de la Somme. 2, Echantillon Pour constituer notre échantillon, nous avons inclu tout patient consultant en médecine générale entre le 1er mai 2015 et le 1er Août 2015 dans un panel de 12 patientèles de médecins généralistes de l'Oise et de la Somme, ainsi que les membres d'une association départementale dans l'Oise, par diffusion par internet via des mails et des réseaux sociaux. 3, Nombre de sujets nécessaires et taille finale de l'échantillon Etaient inclus tous les patients de plus de 18 ans utilisant internet, habitant dans la région et ayant un médecin généraliste. La population de l'Oise et de la Somme étant de 1400000 habitants dont 1000000 de plus de 18 ans, considérant que 80% de cette population consulte internet, avec un intervalle de confiance de 95% et un taux d'erreur estimé à 5% notre échantillon devait être composé de 384 personnes. Tenant compte de la possibilité de non réponse des patients, nous avons envoyé 1000 exemplaires de questionnaires dans les différents cabinets médicaux mais aussi par diffusion sur internet via des forums d'information, des réseaux sociaux et des mails. 4. Elaboration des éléments de l'enquête Le recueil de données s'est effectué par un questionnaire à choix multiples respectant l'anonymat (annexe 2) permettant une systématisation des recherches. Un questionnaire par patient interrogé composés de 19 questions principalement en choix multiples. Elles étaient rédigées en fonction de 4 orientations : définir la population outils d'information en matière de santé internet et santé conséquences des recherche sur internet 9 5. Distribution des questionnaires Notre intention initiale était d'effectuer notre enquête en ligne mais aussi en cabinet afin d'élargir le type de population répondant. Ils étaient remis au patient par les secrétaires. Leur réponse ont été analysées de manière anonyme sans participation des médecins traitants anonyme. 6. Modalités du recueil des données et analyses statistiques Les données ont été regroupées dans un tableau Excel. Chaque question a été rédigée de manière à obtenir une réponse numérique, binaire, ou qualitative. Les questions ont donc été analysées sur le mode quantitatif, binaire ou qualitatif. Dans le cas des réponses à choix multiples, les différentes possibilités de réponse à chaque question étaient traitées une par une sur le mode binaire afin de faciliter l'analyse statistique. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du logiciel EPIINFO 7. L'analyse des variables qualitatives a été exprimée en pourcentage de patients, et les variables quantitatives, par leur moyenne accompagnée de l'écart type, parfois associées à la médiane et aux quartiles. Afin de comparer les variables qualitatives des questions à choix multiples, le test de comparaison du Khi2 a été utilisé lorsque les valeurs attendues étaient supérieures à 5. Si les valeurs attendues étaient inférieures à 5, le test de Fisher était utilisé. Pour comparer les variables quantitatives, le test de Student a été utilisé. 10 III. Résultats 1. Taux de réponses Dans notre étude nous avons obtenu 456 réponses dont 152 par mail et 304 par questionaires papier soit environ 30% de réponses. Les participants étant tous inclus dans l'étude. 2. Etude socio démographique Les participants habitaient principalement l'Oise à hauteur de 81, 4% (369 réponses) et 18, 6% dans la Somme à prédominance féminine (64%). Tableau 1 Tableau 1. Caractéristiques de la population étudiée Population totale 456 % Effectif Sexe Age Niveau scolaire Milieu de vie Homme Femme 18-24ans 25-49ans 50-64ans >65ans < Bac Bac Bac 1 / 2 Bac 3 Bac 4 > ou Bac 5 Rural Semi rural urbain 162 294 45 231 141 39 99 69 75 120 36 57 141 66 249 35, 53 64, 47 9, 87 50, 66 30, 92 8, 55 21, 71 15, 13 16, 45 26, 32 7, 89 12, 5 30, 92 14, 47 54, 61 11 a. âge L'âge moyen de notre population était de 40, 8 ans pour une médiane à 41. Figure 1. Nous avions par la suite procéder à un regroupement par classe d'âge pour faciliter l'étude. homme femme total 60 50 40 30 20 10 0 t e g a n e c r u o P 18-24ans 25-49ans > ou 65ans 50-64ans Figure 1. Répartition homme/femme par classe d'âge b. Le niveau scolaire 21% de notre population déclarait avoir un niveau d'études inférieur au bac, alors que plus de 45% avaient un niveau supérieur à bac 3. En regroupant les bac 4 et 5 les effectifs étaient quasi proportionnels. Figure 2. 21, 71 12, 5 15, 13 16, 45 7, 89 26, 32 bac Bac 1/ 2 Bac 3 Bac 4 >ou bac 5 Figure 2 répartition en pourcentage de la population par niveau scolaire 12 3. Perception de l'état de santé Dans l'ensemble, la population étudiée s'estimait en bonne santé (76% vs 24%). tableau 2. [Une bonne santé reflétant les réponses bonne et excellente, une mauvaise santé les réponses mauvaise et moyenne} Tableau 2. Perception de l'état de santé selon genre, âge, milieu de vie et niveau scolaire mauvaise Perception de l'état de santé moyenne bonne excellente % effectif % effectif % effectif % effectif sexe age homme femme 3 0 1, 85 0 total 108 personnes 25, 93 21, 43 42 63 23, 68% 69 42, 59 174 59, 18 348 personnes 18-24ans 25-49ans 50-64ans >65ans Milieu de vie rural semi-rural urbain Niveau scolaire < bac bac Bac 1 / 2 bac 3 Bac 4 > ou bac 5 0 0 3 0 3 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 2, 13 0 2, 13 0 0 0 0 0 2, 5 0 0 0 51 36 24 30 6 69 42 15 12 15 18 3 0 22, 08 25, 53 46, 15 21, 28 9, 09 27, 71 42, 42 21, 74 16 12, 5 50 5, 26 24 123 87 15 75 39 129 51 36 48 69 15 24 40 53, 25 61, 7 38, 46 53, 19 59, 09 51, 81 51, 52 52, 17 64 57, 5 41, 67 42, 11 48 57 27 57 15 6 33 21 51 6 18 15 33 3 30 29, 63 38, 16 76, 32% 60 24, 68 10, 64 15, 38 23, 4 31, 82 20, 48 6, 06 26, 09 20 27, 5 8, 33 52, 63 13 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 homme femme 30 25 20 15 10 5 0 18 24ans 25-49ans 50-64ans 30 25 20 15 10 5 0 18 24ans 25-49ans 50-64ans mauvais e moy enne bonne exc ell ente mauvaise moyenne bonne excellente moyenne mauvaise bonne excellente 30 20 10 0 t e g a n e c r u o p rural semi rural urbain mauvaise moyenne bonne excellente Figure 3. Perception de l'état de santé en focntion du genre, de l'âge et du milieu de vie Plus précisément, les hommes se considèraient en moins bonne santé que les femmes (p 0, 05) tout comme les personnes plus âgées. On ne retrouvait pas de différence significative pour le milieu de vie. Figure 3. 4. Connexion à internet En moyenne notre population se connectait entre 1 et 3h par jour et principalement au domicile pour 53% des gens interrogés. smartphone TOTAL domicile travail 1-3h >3h 60 50 40 30 20 10 0 Figure 4. Temps de connexion , à internet en fonction de l'appareil utilisé On ne retrouvait pas de différence significative entre les lieux de connexion quelque soit la durée de connexion. Figure 4. 14 5. Relation avec le médecin La relation médecin/malade était qualifiée de bonne dans 92, 1% des cas. Tableau 3. Tableau 3. Qualification de la relation médecin/malade et lien avec la confiance envers le médecin Relation médecin/ malade mauvaise bonne moyenne 30 6, 58% bonne 222 48, 68% excellente 198 43, 42% mauvaise 6 1, 32% Effectif Relation médecin/ malade Ouverte à la communication Fermée à la communication Confiance en votre médecin ? oui non n 426 n 15 96, 60% 60, 00% n 9 n 6 3, 40% 40, 00% p 0, 006 relation ouverte relation fermée total Dans notre population, la relation médecin/malade était décrite comme ouverte à la communication dans 96, 71% des cas. 120 100 80 60 40 20 0 x u a t La relation fermée à la communication etait significativement associée à une non-confiance envers le médecin (p 0, 006), tableau 3 et figure 5. Figure 5. Taux de confiance en son médecin généraliste en fonction de la qualité de la relation médecin/malade oui non avez vous confiance en votre médecin 6. Les outils en matière de santé a. population générale Pour s'informer sur la santé, de manière générale, les outils utilisés étaient surtout 15 les acteurs du monde médical ou paramédical (médecin, pharmacien. ) mais pas de manière significative. P 0, 15, figure 6 1, 2 1 0, 8 0, 6 0, 4 0, 2 0 pharmacien médecin généraliste proches toujours souvent parfois jamais médiane moyenne internet télévision paramédicaux radio Figure 6. Fréquence d'utilisation des outils d'information en matière de santé P 0, 046 1, 2 1 0, 8 0, 6 0, 4 0, 2 0 pharmacien médecin généraliste proches totale bonne moyenne aucune médiane moyenne internet télévision paramédicaux radio Figure 7. Confiance accordée dans les outils d'information en matière de santé La confiance dans ces différents outils était plus importante pour le médecin de famille (p 0, 046) et ce, de manière significative dans la population générale. figure 7 16 b. personnes estimant avoir une mauvaise relation médecin/malade Leurs recherches en matière de santé n'étaient pas significativement différentes de la population générale sauf pour le médecin qui est moins plébisicté qu'avec les autres patients (29, 16% vs 47, 36% - p 0, 01), il n'était pas moins utilisé qu'internet. Tableau 4. Les moyennes de confiance dans les différents outils de recherche ne diffèraient pas non plus de manière significative. Elles sont les mêmes quelque soit le type de relation médecin/malade. De même les patients, (en bonne ou mauvaise relation) ne s'informaient pas plus sur internet que via leur médecin(p 0, 33) tableau 4a ; et la confiance entre les deux ne diffèraient pas de manière significative (p 0, 16). Tableau 4b. Tableau 4. a Moyenne des utilisation des outils de recherche en matière de santé en fonction de la relation médecin/malade Relation avec le médecin (mauvaise et moyenne) (bonne et excellente) Bonne % Mauvaise % Outils de recherches Médecin généraliste Pharmacien Proches internet Radio télévision paramédicaux 29, 16 31, 24 22, 92 27, 08 8, 33 14, 58 29, 17 p 0, 01 0, 05 47, 36 31, 58 24, 01 22, 61 13 18, 09 26, 15 17 Tableau 4. b Moyenne des confiance envers les outils de recherche en matière de santé en fonction de la relation médecin/malade Relation avec le médecin (mauvaise et moyenne) (bonne et excellente) Bonne % Mauvaise % Moyenne de confiance dans les outils de recherches Médecin généraliste Pharmacien Proches internet Radio télévision paramédicaux 7. Internet et santé 47, 92 50 37, 5 27, 08 22, 92 29, 17 45, 84 0, 05 57, 24 43, 42 28, 29 20, 4 16, 61 21, 06 39, 07 a. fréquence de consultation d'internet Pour les patients internautes, les recherches en matière de santé se faisaient principalement moins d'une fois par semaine . (86, 64%) figure 8. 1, 98% 3, 29% 7, 89% < 1 fois par semaine 1 fois par semaine 2-3 fois par semaine > 3 fois par semaine 86, 84% Figure 8. Fréquence des recherches sur internet en matière de santé 18 Malgré tout, les personnes ayant une moins bonne relation médecin/malade se tournaient eux, plus fréquemment sur le net. (p 0, 0046) tableau 5. Tableau 5. Fréquence d'utilisation d'internet en matière de santé en fonction de la relation médecin/malade Relation avec le médecin Mauvaise Bonne (mauvaise et moyenne) (bonne et excellente) Combien de fois par semaine < 1 fois par semaine 1 fois par semaine 2-3fois par semaine > 3fois par semaine 9 2 0 1 75, 00% 16, 67% 0, 00% 8, 33% 123 10 5 2 87, 86% 7, 14% 3, 57% 1, 43% p 0. 0046 b. lieux de la recherche 0, 66% 6, 62% 3, 97% 3, 31% 17, 88% 67, 56% moteur de recherche sites de vulgarisation médicale forum d'information association de patient blog site de parapharmacie autre Figure 9. Lieux de recherches internet en matière de santé Pour leurs recherches, les patients internautes utilisaient comme outil principal le moteur de recherche, et ce qu'il soit proche ou non de son médecin (p 0, 25), figure 9 et tableau 6. 19 Tableau 6. Lieux de recherche sur internet en matière de santé en fonction de la relation médecin/malade Relation avec le médecin Mauvaise Bonne (mauvaise et moyenne) (bonne et excellente) Quels sites ? Moteur de recherche Site de vulgarisation médical Form d'information Association de patients blog Sites de parapharmacie Autres. 8 2 0 1 0 1 0 66, 67% 16, 67% 0, 00% 8, 33% 0, 00% 8, 33% 0, 00% 95 22 8 5 0 9 1 67, 86% 15, 71% 5, 71% 3, 57% 0, 00% 6, 44% 0, 71% 0, 05 c. Lien avec une consultation de médecine de ville 4, 76% 5, 44% 1, 36% 14, 97% 2, 04% sans lien sans lien et avant avant avant et après après sans lien et après 71, 43% Figure 10. Relation entre recherche sur internet et visite chez le médecin Les consultations sur internet étaient sans lien avec une consultation médicale dans plus des 2/3 des cas. (figure 10). 20 Tableau 7. Relation entre recherche sur internet et visite chez le médecin en fonction de la relation médecin/malade Relation avec le médecin Mauvaise Bonne (mauvaise et moyenne) (bonne et excellente) Quand aller sur internet Sans lien avec une consultation Sans lien ou avant une consultation Avant une consultation Avant et après une consultation Après une consultation Sans lien ou après une consultation 8 0 3 0 0 1 66, 67% 0, 00% 25, 00% 0, 00% 0, 00% 8, 33% 97 1 21 2 9 10 69, 29% 0, 71% 15, 00% 1, 43% 6, 43% 7, 14% p 0. 05 Mais en cas de mésentente dans la relation avec le professionnel de santé, la recherche informatique était classiquement réalisée avant de consulter (p 0, 05) tableau 7. 21 d. Type de recherches sur Internet Figure 11. Sujets recherchés sur internet en fonction de la relation médecin/malade mauvaise relation médecin/malade population générale adresse de professionnels de santé diagnostic pour vous explication sur une pathologie témoignages confirmer les dires du médecin P 0, 046 question difficile à aborder renseignement sur un ttt posologie effet indésirable des ttt interactions entre médicament cause à un symptôme 0 explication sur une pathologie ttt contre un symptôme diagnostic pour vos proches prise en charge d'un symptôme contre avis médical signification de termes médicaux renseignement administratifs prix des médicaments ttt en vente sur internet aide à la prise de ttt alternative naturelle aux médicaments adresse de professionnels de santé diagnostic pour vous P 0, 0003 P 0, 002 P 0, 046 0, 1 0, 2 0, 3 0, 4 0, 5 0, 6 0, 7 P 0, 003 P 0, 002 0 0, 1 0, 2 0, 3 0, 4 0, 5 0, 6 0, 7 De manière significative, les patients en mauvaise relation avec leur médecin avaient tendance à faire des démarches plus précises que la population générale : figure 11 22 recherche d'étiologie (41, 66% vs28, 95% - p 0, 046) ou de question difficile à aborder (25% vs 6, 58%- p 0, 0003) en rapport avec des médicaments comme des posologies (24, 8vs9, 93% - p 0, 002) de contre avis médicaux (26, 3% vs 16, 45% - p 0, 003) ou des confirmations des dires du médecin (p 0, 046) à l'inverse elle recherche moins de renseignements administratifs telles les adresses de professionnels de santé, p 0, 002 8. Utilité et conséquences des recherches Pour la plupart, bien qu'ils regardaient sur le net, les patients n'estimaient pas nécessaire d'en parler à leur médecin (62, 5% vs37, 5% p 0, 048) qu'ils soient ou non proche de leur médecin. (62, 5 vs66, 67% -0, 05) tableau 8, Tableau 8. Officialisation au médecin des recherches sur internet en fonction de la relation médecin/malade Relation avec le médecin Mauvaise Bonne (mauvaise et moyenne) (bonne et excellente) Officialisation au médecin Oui non 4 8 33, 33% 66, 67% 53 87 37, 86% 62, 14% 0, 05 Bien que fréquentes, ces recherches favorisaient la confiance envers le médecin traitant (80, 26%vs19, 74%) sauf en cas de mauvaise entente o la fracture a tendance à s'accentuer (p 0, 01). Tableau 9. 23 Tableau 9. Conséquence de l'utilisation d'internet sur la confiance envers le médecin en fonction de la relation médecin/malade Demandes secondaires aux recherches en fonction de la relation médecin/malade Relation avec le médecin Mauvaise Bonne (mauvaise et moyenne) (bonne et excellente) Conséquence sur la relation médecin/malade Moins de confiance Plus de confiance Demandes après utilisation internet Plus de traitement Plus d'examen Plus d'explication 4 8 3 3 30 33, 33% 66, 67% 8, 33% 8, 33% 83, 33% 26 114 42 33 345 18, 57% 81, 43% p 0. 0143 10, 00% 7, 86% 82, 14% p 0, 17 Les patients internautes souhaitaient obtenir des informations sur des sites spécialisés dans le but de fiabiliser leur recherche. (43%vs57%). Malgré tout, le contact du médecin restait privilégié sans passer par internet. (65% vs35% - p 0, 048). Le désir de moins consulter était prépondérant lors des mauvaises relations médecin/malade. (p 0, 0067, tableau 10) à la différence des autres patients . (p 0, 048, Figure 12) Moins consulter le médecin conseil de sites spécialisé p 0, 048 oui non contacter le médecin par internet 0 20 40 60 80 100 Figure 12. Demande et conséquence des recherches sur internet 24 La recherche d'explication était primaire après l'utilisation d'internet. Tableau 10. Conséquence des recherches sur internet en fonction de la relation médecin/malade Relation avec le médecin Mauvaise Bonne (mauvaise et moyenne) (bonne et excellente) 5 8 7 25, 00% 40, 00% 35, 00% 10 61 41 8, 94% 54, 46% 36, 60% P 0, 0067 Désirs après internet Moins consulter Conseil de sites spécialisés Contacter médecin par internet 25 IV. Discussion Lors de cette étude, nous avons cherché à déterminer les conséquences de l'utilisation d'internet sur la relation médecin/malade. Celle-ci variait en fonction de la population interrogée. La relation était favorisée si le patient était déjà en bonne entente et confiance avec son médecin alors qu'elle s'altérait si la confiance n'existait plus. Dans notre étude, il ressort qu'internet est consulté comme un outil d'information au même titre que les autres médias ou que les acteurs du monde médical. Mais le niveau de confiance est nettement supérieure envers les professionnels de santé. On ne retrouve pas de type particulier de patient utilisant internet en matière de santé. La fréquence d'utilisation est la même quelque soit le sexe, le niveau d'études ou la situation géographique. La seule variable intervenant est une fois encore la qualité de la relation médecin/malade. 1. M éthodologie Lors de notre étude, nous avons choisi d'interroger les patients par questionnaire disponible sous 2 formes : papier et web. Ces 2 méthodes se complètent et facilitent l'exploitation des données. Elle permettent d'obtenir un échantillon plus complet puisque diversifiant les âges des répondants. Le choix d'un questionnaire permettait aux participants une certaine liberté d'expression dans la mesure o les questions étaient à choix multiples. La décision de le faire assez court a permis d'obtenir de bons résultats. L'intervention des secrétaires est également essentielle dans la bonne utilisation du questionnaire. Comme pour toute étude avec questionnaire, la barrière de la langue sélectionne forcément la population, et a également un impact sur le taux de réponse. Toutefois, notre sujet utilise des mots simples, facile d'accès à la population générale non initiée aux termes médicaux. 2. Résultats a. nombre de sujets Le nombre total de réponse était de 456 personnes soit un taux de réponses de moins de 50% des questionnaires envoyés. 26 Ce taux peut s'expliquer par 2 paramètres : notre étude a été réalisée en période estivale, durant laquelle le nombre de consultations à tendance à diminuer. le second, du fait d'un recueil de données sur un laps de temps assez restreint. Malgré tout, notre étude a eu le nombre de sujets nécessaires pour que ces résultats soient significatifs. b. la population La population étudiée est superposable à la population majeure picarde que cela soit en terme de genre ou de classe d'âge. Les femmes représentent 64, 5% de notre population soit plus que la population picarde de 51% de femmes selon l'INSEE en 2013(6), Mais ce chiffre est semblable à la population consultant en médecine générale qui est à prédominance féminine. (55 % des consultations concernent des patientes)(7) Cette prédominance s'explique par la fréquence des motifs de consultation liés à la maternité, à la contraception. L'âge moyen de notre étude était de 40, 8 ans soit plus jeune que la moyenne d'âge des consultants en médecine générale. (7) Pour réaliser les classes d'âge, nous nous sommes reportés aux termes de la loi de financement de la sécurité sociale définissant les jeunes actifs, seniors et retraités. (8) Les actifs de 25 à 65 ans sont majoritaires à hauteur de plus de 80% dans notre étude. Ces chiffres s'expliquaient par une tendance à moins consulter pour les moins de 25 ans. Pour les plus de 65 ans, nous demandions des réponses aux personnes utilisant internet, cette classe d'âge est de ce fait moins représentée. (INSEE en 2013 (internet de en , connexion internet à 62 % entre 60 et 74 ans et chute à 23 % à partir de 75 ans )(1) Le niveau scolaire de la population étudiée s'étant de niveau inférieur au bac (21, 71%) à des niveau bac 4/5 (20, 39%) . En terme de perception de l'état de santé, la population étudiée s'estime en bonne santé (76% vs 24%). On ne retrouve pas de différence significative en fonction du milieu de vie. Par contre les hommes se pensent en moins bonne santé que les femmes (21, 43%vs31, 7% ; p Du fait de leur tendance à moins consulter on peut croire que l'état de santé des hommes est plus fragile que pour les femmes. (7) Les personnes plus âgées, elles aussi se 27 définissent en moins bonne santé, élément confirmé par les précédentes études. (7) c. La relation médecin/malade Elle est satisfaisante pour 92, 1% des patients de l'étude, contre 85% sur le plan national (dans une étude de 2010(9) Elle est décrite comme ouverte à la communication dans 96, 71% des cas. La relation fermée à la communication est significativement associée à une non-confiance envers le médecin. (p 0, 06) Les patients peu en confiance avec leur médecin le trouvent peu ouvert à la communication. Ils semblait assez logique d'associer les 2 items. d. Outils en matière de recherche internet En matière de recherche, les outils d'information sont nombreux. (10) Ils passent par le médecin généraliste, le monde paramédical mais aussi les médias et les proches. Contamment le médecin reste plébiscité par les patients (50% d'entre eux) suivi de près des autres professionnels de santé (31%) Ensuite, on retrouve la radio et la TV à moins de 20%, Internet n'est donc pas le moyen privilégié. Lorsque la relation avec le médecin traitant devient conflictuelle, le recours direct à celui-ci est diminué de façon significative (47, 36% vs 29, 16%, p 0, 01) Pour autant, les recherches ne sont pas centrées sur un autre outil en particulier mais partagées sur l'ensemble des outils d'information. Internet n'est donc a priori pas privilégié de manière systématique par rapport au médecin, que cela soit pour les patients mécontents ou pour l'ensemble des patients. (11) e. Internet et santé La connexion a internet en matière de santé est estimée entre 1 et 3 h par jour soit l'équivalent de la connexion pour d'autre sujet. Les recherches sur internet se font pour la population générale, moins d'une fois par semaine (86, 84%). L'exception se produit toujours lorsque la relation avec le médecin est de mauvaise qualité, o la recherche est alors majorée (1 fois par semaine, (16, 67% vs 7, 14%, p 0, 046). 40% de la population estime avoir fréquenté au moins une 28 fois internet pour sa santé dans les 12 derniers mois (12) Les sites de recherche consultés sont les même dans l'ensemble de nos 2 groupes. Le moteur de recherche regroupe la plus grande majorité des demandes (65% - 0, 05), Le recherche dirige vers des sites de vulgarisation médicales. (12) Ce phénomène peut s'expliquer par la facilité d'utilisation des moteurs de recherches mais également sur la simplification des termes employés. En effet, les sites de haut niveau de connaissance utilisent des termes médicaux difficilement accessibles à la population générale. De même, les témoignages, blogs ou associations de patient sont peu nombreux et souvent peu contributifs en cas de recherches élargies. (11) Le lien entre recherche sur internet et consultation est avéré en cas de relation difficile avec le médecin. A l'inverse, la population générale avait tendance à ne pas lier la consultation et internet, que cela soit avant ou après. (25% vs 15% avant de consulter p 0, 05) Ces patient en conflit ont donc tendance à rechercher des informations sur internet avant même de consulter leur médecin traitant. Cette constatation semble d'ailleurs assez logique du fait d'une mauvaise entente ; les réponses ne peuvent être posées de manière sereine. De plus, pour mémoire, en cas de relation difficile, la confiance est également en diminution. des alternatives à la consultation sont donc recherchées. Les recherches sont diverses mais portent essentiellement sur (12). une orientation diagnostique, une recherche étiologique, l'explicatives (traitement ou pathologie) la confirmation de l'utilité d'un traitement, la recherche de témoignages de situation similaire. Ces recherches sont différentes quant il s'agit des patient en conflit avec le médecin. Une alternative à la consultation est plus facilement recherchée (recherche d'étiologie, p 0, 046, question difficile à aborder p 0, 0003), alternative au médecin (moins de recherche d'adresse p 0, 002 ; recherche de posologies ou de traitement p 0, 046) voire une réassurance après consultation ( contre avis médical p 0, 003, confirmer les données du médecin p 0, 046) Ces exemples tendent encore à démontrer que les recherches sur internet ne changent pas fondamentalement la relation médecin/malade mais à se rassurer vis à vis d'elle. 29 Les moins enclins à la relation se retrouvant moins en confiance et cherchent à se rassurer via l'outil informatique. f. Utilité et conséquences des recherches Les patients de notre étude, dans leur ensemble n'estiment nécessaire de parler de leur recherche sur internet à leur médecin, sujet encore difficile à aborder directement au même titre que de l'automédication ou de l'auto diagnostic. (13) Par contre, les recherches avaient plutôt un effet positif pour la population générale avec un renforcement de la confiance envers le médecin (81, 43% vs 66, 67%, p 0, 01), alors qu'elles avaient tendance à majorer le sentiment de perte confiance chez les patients mécontents. Les recherches sur internet ont donc un impact divergent sur la relation médecin/malade en fonction de la relation initiale : elles favorisent la confiance des patients en bonne entente et fracture encore un peu plus celle des mauvaises ententes. Les demandes secondaires sont les mêmes entre les 2 groupes à savoir plus d'explications (82, 14% vs 83, 33% - p 0, 15) Celles-ci passent par une demande de référence de sites spécialisés quand la relation est bonne (54% vs 30% p 0, 005) et par une diminution du nombre de consultation quand la relation est mauvaise (25% vs 8, 94%, p 0, 002) Internet ne se substituait donc pas au médecin mais avait tendance à majorer les questionnements des patients. La demande d'explications et donc d'éducation thérapeutique est primordial actuellement. (14) 30 V. Conclusion Au vue de ces résultats, internet n'a pas un impact unanime sur la population picarde. Il favorise la relation avec le médecin dès lors que celle-ci est déjà positive, alors qu'elle la fragilise si elle est déjà diminuée. L'éducation thérapeutique, déjà très importante au quotidien, se doit d'être encore plus privilégiée. Elle a pour but d'aider les patients dans leur prise en charge mais aussi à domicile. De ce fait la demande de renseignements sur des sites spécialisés semble légitime. Internet ne sera alors plus nié dans la consultation et cette inclusion améliorera encore la relation médecin/malade(14) Internet intervient donc actuellement comme informateur en matière de santé tout comme le médecin ou le pharmacien. Le nier, expose le médecin traitant à un retour à une forme de relation paternaliste avec son patient. Par contre, la communication directe reste encore prépondérante, avec un refus de discuter directement avec le médecin par le bias de l'informatique. L'utilisation d'un 3 intervenant (l'ordinateur) est de trop dans la relation bilatérale entre le médecin et son patient(2) Internet en matière de santé n'est donc qu'un révélateur de relation médecin/malade et il consolidera les bonnes relations et fragilisera jusqu'à stopper les relations altérées. 31 ANNEXE 1 : Lettre d'introduction Monsieur, Madame, Actuellement en dernière année d'internat en médecine générale, la conclusion de mes études tient en un travail scientifique dont la teneur sera sociologique. A l'heure actuelle, internet est devenu une habitude de vie. Si vous êtes internaute, merci de bien vouloir remplir ce questionnaire qui ne vous prendra que 5 minutes. Votre réponse est anonyme et ne sera pas divulguée à votre médecin. Merci à vous 32 ANNEXE 2 : Questionnaire Homme Femme Age : < bac bac bac 1 ou 2 bac 3 bac 4 > ou bac 5 Niveau d'études : Milieu rural (< 2000 hab) semi rural (entre 2000 et 5000) urbain (>5000) Vous vivez en milieu : Comment percevez-vous votre état de santé 0 1 2 3 Médiocre moyenne bonne excellente INTERNET et VOUS O vous connectez vous ? - - - - Domicile, travail, smartphone, cybercafé Durée de connection par jour : - - - Entre 1 et 3h >3h RELATION avec votre MEDECIN Comment la qualifieriez-vous ? 0 1 2 3 Médiocre moyenne bonne excellente Oui Non Est-elle ouverte à la communication ? Faites vous confiance à votre médecin généraliste ? Oui Non 33 OUTILS en matière d'information SANTE Utilisez vous ? 1 réponse par ligne jamais parfois souvent toujours Médecin généraliste Pharmacien Proches Internet radio télévision Paramédicaux (kiné, infirmière) bonne totale Quelles confiance leur accordez vous ? 1 réponse par ligne moyenne aucune Médecin généraliste Pharmacien Proches Internet radio télévision Paramédicaux (kiné, infirmière) aucune moyenne bonne totale Médecin généraliste Pharmacien Proches Internet radio télévision Paramédicaux (kiné, infirmière) Si vous utilisez internet en matière de santé Vous le faites : fois par semaine 1 fois par semaine 2 à 3 fois par semaine >3 fois par semaine Quels sites : plusieurs réponses possibles moteur de recherche Sites de vulgarisation médicaux Forums d'information association de patients Blog site de parapharmacie autres Quand allez-vous chercher des informations sur internet ? Plusieurs réponses possibles avant de consulter après consultation sans lien avec une consultation Pour remplacer une consultation 34 Que recherchez vous ? Plusieurs réponses possibles Un diagnostic pour vous Un diagnostic pour vos proches Des explications sur une pathologie Des témoignages Confirmer les dires du médecin Renseignement sur un médicament Questions difficiles à aborder avec le médecin Des posologies Des effets indésirables de médicaments Des interactions entre médicaments Une cause à un symptôme Des traitement contre un symptôme La prise en charge d'un symptôme Un contre avis médical Des signification de termes médicaux Des renseignements administratifs (sécurité sociale, mutuelle) Le prix des médicaments Un traitement en vente sur internet Des aides à la compréhension de la maladie Des aides à la prise de traitement Des alternatives naturelles aux médicaments Adresse de professionnel de santé SUITE à vos RECHERCHES : Dites-vous à votre médecin que vous avez consulté internet ? oui non Quelles conséquences entrainent-elles sur votre relation médecin/malade ? Moins de confiance en mon médecin plus de confiance Demandez-vous plus d'examen d'explications Un traitement précis ? : 1 seule réponse ET dans le FUTUR Aimeriez vous contacter votre médecin par internet ? Aimeriez vous que votre médecin vous conseille des sites spécialisés ? Pensez vous moins consulter votre médecin ? oui non MERCI de votre PARTICIPATION 35 Bibliographie 1. Gombault, Vincent, division Conditions de vie des ménages, INSEE. Insee - Conditions de vie-Société - L'internet de plus en plus prisé, l'internaute de plus en plus mobile [Internet]. 2013 [cité 26 août 2015]. Disponible sur : 2. Docteur Jacques LUCAS, Vice - Président du CNOM et du Docteur François STEFANI, Vice - Président de la section éthique et déontologie du CNOM. Vers une meilleure intégration d'Internet à la relation médecins-patients | Conseil National de l'Ordre des Médecins [Internet]. 2010 [cité 26 août 2015]. Disponible sur : national. medecin. fr/article/vers-une-meilleure-integration-d%E2%80%99internet-la- relation-medecins-patients-982 3. Murray E, Lo B, Pollack L, Donelan K, Catania J, Lee K, et al. The impact of health information on the Internet on health care and the physician-patient relationship : national U. S. survey among 1. 050 U. S. physicians. J Med Internet Res 2003 ; 5 4. CROSTE Emmanuel. UTILISATION DE L'INTERNET DANS LE CADRE DE L'EXERCICE PROFESSIONNEL [Internet] [thèse]. Bordeaux 2 ; 2005 [cité 2 sept 2015]. Disponible sur : Generale. pdf 5. Service qualité de l'inforamtion médicale - HAS. Le patient internaute, revue de la litterature. In Paris ; 2007 [cité 2 sept 2015]. Disponible sur : sante. fr/portail/upload/docs/application/pdf/patient internaute revue litterature. pdf 6. INSEE et CESER Picardie. Regard sur la parité en Picardie [Internet]. 2013 [cité 2 sept 2015]. Disponible sur : 1 population. pdf 7. DREES - Ministère de la Santé. 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Les cibles moléculaires du récepteur minéralocorticoïde dans le coeur Basile Gravez To cite this version : Basile Gravez. Les cibles moléculaires du récepteur minéralocorticoïde dans le coeur. Physiologie [q-bio. TO]. Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2015. Français. NNT : 2015PA066055. tel-01147139 HAL Id : tel-01147139 Submitted on 29 Apr 2015 HAL is a multi-disciplinary open access L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est archive for the deposit and dissemination of sci- destinée au dépôt et à la diffusion de documents entific research documents, whether they are pub- scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, lished or not. The documents may come from émanant des établissements d'enseignement et de teaching and research institutions in France or recherche français ou étrangers, des laboratoires abroad, or from public or private research centers. publics ou privés. Université Pierre et Marie Curie Ecole doctorale ED394 Physiologie, physiopathologie et thérapeutique UMRS1138 / Récepteur minéralocorticoïde : physiopathologie et innovations thérapeutiques Les cibles moléculaires du récepteur minéralocorticoïde dans le cœur Par Basile GRAVEZ Thèse de doctorat de Physiologie Dirigée par le Docteur Frédéric JAISSER Présentée et soutenue publiquement le 27 février 2015 Devant un jury composé de : Professeur Jacques TEULON Président du jury Docteur Patrick LACOLLEY Rapporteur Docteur Paul MULDER Rapporteur Docteur Claude DELCAYRE Examinateur Docteur Natalia LOPEZ-ANDRES Examinatrice Docteur Frédéric JAISSER Directeur de thèse Université Pierre et Marie Curie Ecole doctorale ED394 Physiologie, physiopathologie et thérapeutique UMRS1138 / Récepteur minéralocorticoïde : physiopathologie et innovations thérapeutiques Les cibles moléculaires du récepteur minéralocorticoïde dans le cœur Par Basile GRAVEZ Thèse de doctorat de Physiologie Dirigée par le Docteur Frédéric JAISSER Présentée et soutenue publiquement le 27 février 2015 Devant un jury composé de : Professeur Jacques TEULON Président du jury Docteur Patrick LACOLLEY Rapporteur Docteur Paul MULDER Rapporteur Docteur Claude DELCAYRE Examinateur Docteur Natalia LOPEZ-ANDRES Examinatrice Docteur Frédéric JAISSER Directeur de thèse Je te dédie cette thèse papa, toi qui ne la liras pas. REMERCIEMENTS Avant d'exposer les résultats de ce travail, je tiens à remercier toutes celles et ceux qui, d'une manière ou d'une autre, ont contribué à sa réalisation : Frédéric JAISSER, mon directeur de thèse, pour m'avoir accepté dans son équipe. Son exigence, ses conseils et sa qualité d'écoute m'ont permis d'effectuer cette thèse dans d'excellentes conditions. Les docteurs Patrick LACOLLEY et Paul MULDER qui ont accepté d'être rapporteurs de ce travail de thèse. Les docteurs Claude DELCAYRE et Natalia LOPEZ-ANDRES qui ont accepté d'être examinateurs de ce travail de thèse (un merci particulier à Natalia pour ta bienveillance et ta gentillesse à mon égard, en espérant que cette lecture ne te fasse pas changer d'avis sur moi). Le professeur Jacques TEULON pour m'avoir fait l'honneur de présider mon jury de thèse. Ces mots sont là pour exprimer toute l'admiration que j'ai pour vous. Je remercie évidemment tous les membres de l'équipe 1 que j'ai eu la chance de côtoyer : Alessandra, Claudine, Clémence, Gwennan, Isabelle Célérier, Isabelle Ricard, Jenny, Maryse, Sonia, Alan, Antoine, Jonatan, JPB et Mathieu (que j'ai eu le plaisir d'encadrer). Merci à vous Brigitte et Sandrine pour votre bonne humeur constante, à Soumaya pour ta douceur et ton aide précieuse, à Cristian le plus génial des Marica, à mes collègues mais néanmoins amis Fouad et Guillaume, à Riccardo, cet italien à qui je tiens tant, à Smaïl qui m'a tout appris et qui continue à m'aider même à plusieurs milliers de kilomètres de moi, et bien sûr à vous Nicolette, pour m'avoir permis de lier avec vous une relation privilégiée. Ces quatre années passées aux Cordeliers m'ont aussi donné l'opportunité de rencontrer (parfois contre leur gré) les autres membres de ce centre scientifique que je salue ici. J'aimerais remercier particulièrement tous les Jeunes Chercheurs des Cordeliers avec qui j'ai pu organiser différents évènements, qui ont contribué à sortir un peu de la vie du labo pour décompresser et à lier de jolies amitiés. Un grand merci à notre cuisinière Charlotte et au meilleur compagnon de boisson jamais connu Ivan. Merci aussi à l'équipe 2 en entier, particulièrement cette fille extraordinaire qu'est Dorinne, Anthony pour ta joie de vivre et ta classe légendaire, et bien sûr Louis et Ludovic qui m'ont appris la différence entre roux et blond vénitien. Sans l'équipe 19, je n'aurais jamais pu faire en temps et en heure plusieurs de mes expériences. Merci surtout à Audrey et Adrien, Claire pour ta simplicité et ton écoute, Laure parce que tu es parfaite (et que tu rigoles à mes blagues ! ) et Lauriane pour ton dynamisme et ta coolitude (mais si ça existe ! ). Et difficile d'oublier Thomas et son opinel. Avant de pouvoir entamer ce travail de thèse, j'ai passé deux années au sein du master BIP o j'ai rencontré des personnes géniales, vécu des soirées dantesques et lié des amitiés sincères. Merci donc à Célia, Clélia, Laura, Mélissa, Antoine (alias touffe même s'il n'en a plus désormais), Antoine (alias toto, toujours présent dans les moments importants), Gatan, Hugues, Tristan et Vasco. Comment exprimer au mieux ce que je pense de maman Garthiga, de sa gentillesse et de son intérêt permanents à mon égard, de ce couple parfait que forme Isa-Belle et Nicolas, de mon amie Marine, avec qui je chante et je parle de tout, de Marion cette femme exceptionnelle, juke-box ambulant à la voix si reconnaissable, de Pauline qui a su rester près de moi, même exilée à Strasbourg, d'Alexandre, qui m'a fait connatre ce master et qui aime comme moi le vrai rock, de Romain certainement la personne la plus généreuse que je connaisse, de Samuel et de son flegme légendaire, son humour dévastateur et son art de l'attaque de , et enfin de Vincent, de sa gentillesse et de son dévouement pour les autres. Merci pour tout. Vraiment ! Merci à toi Renaud, pour ta présence. Tu as toujours été là durant ces cinq années parisiennes et ça, c'est bien ! Un merci simple mais qui veut dire tout, à mon Quentin. Tu es quelqu'un d'extraordinaire. Que dire de ma colocataire Dimitra ! Merci pour le yoga, pour les restes de vos plats que tu me laissais quand je rentrais tard du labo et pour ces moments chaleureux passés dans cet appart'. Et puis, il y a Manale. Mon autre colocataire, mais cet adjectif est peu représentatif de la place particulière que tu as dans mon cœur. Rien de ce que je pourrais écrire ne saurait être à la hauteur de la fierté, et de la chance, que j'ai de faire partie de tes amis. Un grand merci à mes amis de Fougères et de Rennes. Blandine, cette fille pétillante découverte en Grèce et qui est toujours là depuis, Pierre-Axel, mon ami si cher de la fac de médecine, Adeline, Axelle, Carole, Céline, Charlotte (et son rire), Virginie, Benjamin (alias Lover) et Kévin, mes amis de toujours avec qui j'ai grandi. Une pensée particulière pour Guillaume et François, avec qui je n'ai passé que de bons moments et avec qui je compte bien continuer dans ce sens. Merci à toi mon Christophe, qui me supportes depuis si longtemps. Et je te remercie toi Thomas. Pour ton soutien inébranlable, ton humour salvateur et ta présence auprès de ma famille. Tu es et resteras bien plus qu'un ami. Merci bien sûr à toute ma famille. Merci surtout à mon tonton Gérard et à ma tante Kumiko qui m'ont hébergé et materné pendant mes premières années dans cette jungle parisienne et merci à Hyun. Ton satané chat nous a rapprochés, pour mon plus grand plaisir. Merci à toi Mathilde. Pour tout ce que tu me permets de vivre. Je ne sais pas si je te le dis assez souvent. Maintenant c'est écrit pour toujours dans cette thèse. Et je termine ces remerciements par les trois personnes les plus importantes dans ma vie. Ma maman Frédérique, ma sœur Clémentine et mon frère Matthieu. Tout simplement : MERCI. Et basilou il vous aime tous comme un fou, allez allez (à crier en rythme en levant les bras). N. B : je tenais également à ne pas remercier mon pire ennemi de primaire, Philippe Germès. SOMMAIRE REMERCIEMENTS . 3 LISTE DES ABREVIATIONS . 8 LISTE DES ILLUSTRATIONS . 12 PRODUCTIONS SCIENTIFIQUES. 13 AVANT-PROPOS . 14 PARTIE 1 : INTRODUCTION . 15 1. 1 Les pathologies cardiovasculaires . 15 1. 2 Le récepteur minéralocorticoïde . 17 1. 2. 1 Structure du gène codant pour le RM. 17 1. 2. 2 Structure du RM . 19 1. 2. 3 Ligands du RM . 22 1. 2. 3. 1 Hormone minéralocorticoïde aldostérone . 22 1. 2. 3. 2 Hormones glucocorticoïdes . 26 1. 2. 3. 3 Sélectivité de liaison de l'aldostérone au RM . 26 1. 2. 3. 3. 1 Sélectivité enzymatique : 11-hydroxystéroïde déshydrogénase de type 2. 27 1. 2. 3. 3. 2 Autres mécanismes de sélectivité de l'aldostérone au RM . 28 1. 3 Bénéfices de l'inhibition du récepteur minéralocorticoïde en clinique. 29 1. 3. 1 Antagonistes pharmacologiques du RM . 29 1. 3. 2 Effets de l'antagonisme du RM dans l'hypertension . 30 1. 3. 3 Effets de l'antagonisme du RM dans l'insuffisance cardiaque . 30 1. 3. 3. 1 Phénomène d'échappement de l'aldostérone . 30 1. 3. 3. 2 Etude RALES . 31 1. 3. 3. 3 Etude EPHESUS . 32 1. 3. 3. 4 Autres études . 33 1. 3. 4 Effets de l'antagonisme du RM sur l'infarctus du myocarde. 33 1. 3. 5 Effets de l'antagonisme du RM dans les troubles du rythme cardiaque . 34 1. 3. 6 Emergence d'antagonistes non-stéroïdiens . 34 1. 4 Mécanismes d'action du RM. 35 1. 4. 1 Effets non génomiques du RM . 35 1. 4. 2 Effets génomiques du RM . 36 1. 5 Rôle physiopathologique du RM dans le cœur et le rein . 37 1. 5. 1 Effets génomiques classiques du RM dans l'épithélium rénal . 38 1. 5. 2 Effets génomiques du RM cardiaque . 41 1. 5. 2. 1 Blocage pharmacologique du RM in vivo . 42 1. 5. 2. 2 Implication du RM dans les pathologies cardiaques . 43 1. 5. 2. 3 Etude de la signalisation cardiaque du RM in vitro . 44 1. 5. 2. 4 L'apport des modèles transgéniques dans la compréhension de la signalisation du RM . 44 1. 5. 2. 5 Rôle du RM dans les arythmies cardiaques . 47 1. 5. 2. 5. 1 Effets du RM sur les arythmies cardiaques en clinique. 47 1. 5. 2. 5. 2 Effets du RM sur les arythmies cardiaques chez l'animal . 47 1. 6 Objectifs de la thèse . 49 PARTIE 2 : MATERIELS ET METHODES . 51 2. 1 Modèles animaux . 51 2. 1. 1 Surexpression conditionnelle du RM spécifiquement dans les cardiomyocytes . 51 2. 1. 2 Protocoles . 52 2. 1. 2. 1 Effet de l'infusion d'aldostérone sur les souris RM-Cardio . 52 2. 1. 2. 1. 1 Administration du traitement . 52 2. 1. 2. 1. 2 Préparation du cœur . 53 2. 1. 2. 1. 3 Extraction des ARNs totaux, réalisation et analyse du transcriptome . 53 2. 1. 2. 2 Etude des microARNs comme cibles potentielles du RM . 54 2. 1. 2. 2. 1 Extraction des microARNs totaux, et réalisation du miRnome. 54 2. 1. 2. 2. 2 Analyse du miRnome . 54 2. 1. 2. 2. 3 Rétrotranscription et PCR quantitative des microARNs cibles . 55 2. 1. 2. 3 Effets du torasémide in vivo . 56 2. 1. 2. 3. 1 Modèle pharmacologique DOCA-Sel d'excès de minéralocorticoïde . 56 2. 1. 2. 3. 2 Extraction des ARNs totaux et rétrotranscription. 56 2. 1. 2. 3. 3 PCR quantitative . 57 2. 2 Modèles cellulaires . 58 2. 2. 1 Lignées cellulaires . 58 2. 2. 1. 1 Lignée cellulaire H9C2-RM . 58 2. 2. 1. 2 Lignée cellulaire H9C2-RM /MMTV-Luciférase. 59 2. 3 Analyses statistiques . 60 PARTIE 3 : RESULTATS ET DISCUSSIONS . 61 3. 1 Approche pharmacologique . 61 3. 1. 1 Effets in vitro du torasémide sur la signalisation du RM cardiaque . 61 3. 1. 1. 1 Etat de la question . 61 3. 1. 1. 2 Objectif de l'étude . 62 3. 1. 1. 3 Article : The Diuretic Torasemide Does Not Prevent Aldosterone-Mediated Mineralocorticoid Receptor Activation in Cardiomyocytes . 62 3. 1. 1. 4 Conclusions de l'étude et discussion . 65 3. 1. 2 Effets in vivo du torasémide sur la signalisation du RM cardiaque . 67 3. 1. 2. 1 Etat de la question . 67 3. 1. 2. 2 Objectif de l'étude . 67 3. 1. 2. 3 Protocole d'activation du RM in vivo . 68 3. 1. 2. 4 Le torasémide diminue l'expression de certains gènes participant au remodelage de la matrice extracellulaire cardiaque . 69 3. 1. 2. 5 Le torasémide n'intervient pas dans la modulation de l'expression des sous- unités de la NADPH oxydase . 70 3. 1. 2. 6 Conclusions de l'étude et discussion . 71 3. 2 Approche génétique. 72 3. 2. 1 CTGF comme gène candidat de premier choix dans la compréhension de la voie de signalisation du RM cardiaque . 73 3. 2. 1. 1 Etat de la question . 73 3. 2. 1. 2 Objectif de l'étude . 73 3. 2. 1. 3 Article : Aldosterone-Specific Activation of Cardiomyocyte Mineralocorticoid Receptor In Vivo . 74 3. 2. 1. 4 Conclusions de l'étude et discussion . 81 3. 2. 2 Etude transcriptomique cardiaque globale . 82 3. 2. 2. 1 Etat de la question . 82 3. 2. 2. 2 Objectif de l'étude . 83 3. 2. 2. 3 Article : Aldosterone Promotes Cardiac Endothelial Cells Proliferation In Vivo . 83 3. 2. 2. 4 Conclusions de l'étude et discussion . 84 3. 2. 2. 5 Implication du RM dans la prolifération des cellules endothéliales cardiaques induite par l'aldostérone . 85 3. 2. 3 Implications des microARNs dans la voie de signalisation du RM cardiaque . 89 3. 2. 3. 1 Etat de la question . 89 3. 2. 3. 2 Objectif de l'étude . 89 3. 2. 3. 3 Comparaison du miRnome des souris RM-Cardio par rapport à celui de leurs contrôles . 90 3. 2. 3. 4 Pertinence physiopathologique de la modulation du miR-1941-5p par le RM cardiaque . 90 3. 2. 3. 5 Conclusions de l'étude et discussion . 92 PARTIE 4 : DISCUSSION GENERALE . 94 4. 1 Comparaison entre torasémide et spironolactone. 94 4. 2 Cibles moléculaires du RM dans le cœur . 95 4. 2. 1 CTGF . 95 4. 2. 2 Aldostérone et prolifération . 96 4. 2. 3 MicroARNs . 98 PARTIE 5 : PERSPECTIVES . 100 BIBLIOGRAPHIE . 103 ANNEXES . 119 LISTE DES ABREVIATIONS 11-HSD2 : 11-hydroxystéroïde déshydrogénase de type 2 ENaC : Sous-unité du canal épithélial sodique, pour epithelial sodium channel MHC : Chane lourde de la myosine, pour myosin heavy chain ACTH : Hormone adrénocorticotrope, pour adrenocorticotropic hormone Adamts1 : Peptidase avec motifs thrombospondines de type 1, pour A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 1 Adamts4 : Peptidase avec motifs thrombospondines de type 4, pour A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4 ADN : Acide désoxyribonucléique ADNc : Acide désoxyribonucléique complémentaire ADP : Adénosine diphosphate AF : Domaine de régulation de l'activité transcriptionnelle, pour Activation Function Aldo : Aldostérone ANOVA : Test statistique d'analyse de la variance, pour ANalysis Of VAriance ANP : Facteur atrial natriurétique, pour atrial natriuretic peptide ARN : Acide ribonucléique ARNm : Acide ribonucléique messager ARTS : Etude clinique de nom minerAlocorticoid Receptor antagonist Tolerability Study ASCOT-BPLA : Etude Clinique de nom Anglo-Scandinavian Cardiac Outcomes Trial-Blood Pressure Lowering Arm AT1 : Récepteur de l'angiotensine II de type 1 ATP : Adénosine triphosphate ATP1A1 : Gène codant pour la sous-unité 1 de la pompe ionique ATPasique sodium/potassium BNP : Facteur natriurétique de type B, pour brain natriuretic peptide C : Canrénoate de potassium (antagoniste du récepteur minéralocorticoïde) C57BL/6JRj : Lignée congénique de souris de laboratoire Cav-1 : Cavéoline-1 Ccnb1 : Cycline B1 CD4 : Cluster de différentiation de type 4 positif Cdk1 : Kinase dépendante des cyclines de type 1, pour Cyclin-dependent kinase 1 Cdk5 : Kinase dépendante des cyclines de type 5, pour Cyclin-dependent kinase 5 Col I et III : Collagène I et Collagène III CONSENSUS : Etude clinique de nom COoperative North Scandivian ENalapril SUrvival Study CTGF : Facteur de croissance du tissu conjonctif, pour connective tissue growth factor Ctrl : Groupe contrôle ou souris contrôle CYP11B2 : Gène codant pour l'enzyme aldostérone synthase DLA : Domaine de liaison à l'acide désoxyribonucléique DLL : Domaine de liaison du ligand hormonal DMEM/F12 : Milieu de culture cellulaire, pour Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 DNase I : désoxyribonucléase de type I DOCA : Acétate de désoxycorticostérone, pour deoxycorticosterone acetate Dox : Doxycycline ECA : Enzyme de conversion de l'angiotensine ELL : Facteur d'élongation de l'ARN polymérase II, pour eleven-nineteen lysine- rich leukemia EMPHASIS-HF : Etude Clinique de nom Eplerenone in Mild Patients Hospitalization And SurvIval Study in Heart Failure ENaC : Canal épithélial sodique, pour epithelial sodium channel EPHESUS : Etude clinique de nom Eplerenone Post-acute myocardial infarction Heart failure Efficacy and SUrvival Study ERH : Eléments de réponse hormonale ERK1/2 : Kinase ERK1/2, pour extracellular-regulated kinase1/2 ESM : Erreur standard à la moyenne G418 : Antibiotique de la famille des aminoglycosides GILZ-1 : Protéine à domaine leucine zipper induite par les glucocorticoïdes de type 1, pour glucocorticoid-induced leucine zipper protein-1 GPR30 : Récepteur membranaire couplé aux protéines G de type 30, pour G protein- coupled receptor 30 HSP : Protéine de choc thermique, pour Heat Shock Protein HUVEC : Cellules endothéliales humaines issues de veine ombilicale, pour human umbilical vein endothelial cells ICAM-1 : Molécule d'adhérence intercellulaire de type 1, pour intercellular adhesion molecule-1 IKr : Courants potassiques correcteurs, pour rapidly-activating delayed rectifier potassium currents KCNJ3 : Gène codant pour le canal potassique Kir de type 3. 1 KCNJ5 : Gène codant pour le canal potassique Kir de type 3. 4 Kd : Constante de dissociation, pour dissociation constant Ki-67 : Index de prolifération cellulaire Kir3. 1 : Canal potassique Kir de type 3. 1, pour Inward rectifying K channel 3. 1 Kir3. 4 : Canal potassique Kir de type 3. 4, pour Inward rectifying K channel 3. 4 Luc : Luciférase MC2R : Gène codant pour l'hormone adrénocorticotrope MCP1 : Chimiokine attractant les monocytes de type 1, pour monocyte chemoattractant protein 1 miR : Micro-acide ribonucléique miRnome : Etude de l'ensemble des micro-acides ribonucléiques transcrits MMP-2 et -9 : Métalloprotéases matricielles de type 2 et 9, pour matrix-metalloproteinase- 1 and -9 MMTV : Région génique du rétrovirus Mouse Mammary Tumor Virus contenant des éléments de réponse hormonale reconnus par le RM M-SHRSP : Rat spontanément hypertendu et sensible aux accidents vasculaires avec une hypertension très sévère, pour malignant-stroke-prone spontaneously hypertensive Na , K -ATPase : Pompe ionique ATPasique sodium/potassium NADPH oxydase : Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate oxydase sous forme réduite, pour nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase NAS : Néphrectomie-Aldostérone-Sel Nedd4-2 : Protéine de la famille des ubiquitines ligases, pour Neural precursor cell- expressed developmentally downregulated gene 4-member 2 NGFI : Récepteurs nucléaires induits par les facteurs de croissance neuronaux, pour nuclear receptor superfamily/nerve growth factor-induced NR3C2 : Gène codant pour le récepteur minéralocorticoïde, pour Nuclear Receptor sub-family 3 group C member 2 PAI-1 : Inhibiteur de l'activateur du plasminogène de type 1, pour plasminogen activator inhibitor-1 PBS : Tampon phosphate salin, pour phosphate buffer saline PIAS-1 : Protéine de la famille des SUMOs-ligases de type 1, pour protein inhibitor of activated signal transducer and activator of transcription-1 Pu (A et G) : Bases puriques : Adénine et Guanine Py (C et T) : Bases pyrimidiques : Cytosine et Thymine qPCR : Réaction de polymérisation en chaine quantitative, pour quantitative Polymerase Chain Réaction QT et ST : Noms des ondes correspondantes sur un électrocardiogramme RALES : Etude clinique de nom Randomized ALdactone Evaluation Study REMINDER : Etude clinique de nom early eplerenone treatment in patients with acute ST- elevation myocardial infarction without heart failure RG : Récepteur glucocorticoïde RG-Cardio : Souris surexprimant spécifiquement le récepteur glucocorticoïde humain dans les cardiomyocytes Rgs-2 : Protéine de type 2 de la famille des régulateurs de la signalisation via les petites protéines G, pour Regulator of G-protein signalling-2 RISC : Complexe RISC, pour ribonucleic acid-induced silencing complex RM : Récepteur minéralocorticoïde RM-Cardio : Souris surexprimant spécifiquement le récepteur minéralocorticoïde humain dans les cardiomyocytes RMh : Récepteur minéralocorticoïde humain RNase : Ribonucléase SAVE : Etude clinique de nom Survival And Ventricular Enlargement SEN : Signal d'export nucléaire Serpin : Protéases de la famille des serpin, pour serine protease inhibitors Sgk-1 : Sérine/thréonine kinase régulée par le sérum et les glucocorticoïdes de type 1, pour Serum and glucocorticoid-regulated kinase-1 SHRSP : Rat spontanément hypertendu et sensible aux accidents vasculaires, pour stroke-prone spontaneously hypertensive SLN : Signal de localisation nucléaire Spiro ou S : Spironolactone SRAA : Système rénine-angiotensine-aldostérone SRC-1 : Co-activateur de type 1 des récepteurs stéroïdes, pour steroid receptor coactivator-1 SUMOs : Petites protéines permettant la sumoylation, pour Small Ubiquitin-related MOdifiers tetO : Opérateur sensible à la tétracycline TGF- : Facteur profibrosant, pour transforming growth factor- TIMP-1 : Inhibiteur tissulaire des métalloprotéases matricielles de type 1, pour tissue inhibitor of matrix-metalloproteinases-1 TOPCAT : Etude Clinique de nom Treatment Of Preserved Cardiac function heart failure with an Aldosterone AntagonisT Tora ou T : Torasémide Trpc4 : Canal perméable au calcium, pour transient receptor potential cation channel, subfamily C, member 4 tTA : Protéine transactivatrice Ubc : Ubiquitine C VEGF-a : Facteur de croissance de l'endothélium vasculaire de type a, pour vascular endothelial growth factor-a LISTE DES ILLUSTRATIONS Figure 1. Schéma de la structure du récepteur minéralocorticoïde humain . 18 Figure 2. Représentation schématique tridimensionnelle du RM selon ses trois régions principales . 20 Figure 3. Schéma des résidus du RMh pouvant subir des modifications post-traductionnelles . 21 Figure 4. Liaison des hormones corticostéroïdes à leurs récepteurs . 22 Figure 5. Système rénine-angiotensine-aldostérone. 23 Figure 6. Etude RALES : Probabilité de survie chez les patients insuffisants cardiaques sévères . 32 Figure 7. Les différentes cibles du récepteur minéralocorticoïde. . 38 Figure 8. Effets du RM sur l'épithélium du néphron distal . 40 Figure 9. Schéma du modèle murin transgénique surexprimant le RMh spécifiquement dans les cardiomyocytes . 52 Figure 10. Effet du torasémide sur l'expression rénale de la sous-unité du canal épithélial sodique ENaC chez des souris soumises à un modèle d'activation minéralocorticoïde . 69 Figure 11. Effet du torasémide sur l'expression cardiaque de gènes impliqués dans le remodelage matriciel . 70 Figure 12. Effet du torasémide sur l'expression cardiaque des sous-unités de la NADPH oxydase . 71 Figure 13. Immunolocalisation et quantification de Ki-67 sur des coupes de cœur de souris RM-Cardio traitées ou non à l'aldostérone . 86 Figure 14. Immunolocalisation de la cavéoline-1 et du Ki-67 dans des coupes de cœur de souris RM-Cardio traitées à l'aldostérone . 86 Figure 15. Expression cardiaque des gènes codant pour la cycline B1 et la Cdk1 . 87 Figure 16. Schéma représentant le mode d'action du microARN. 89 Figure 17. Les microARNs 1941-5p, 215 et 298 sont les seuls microARNs surexprimés dans le cœur des souris RM-Cardio . 90 Figure 18. Modulation de l'expression du miR-1941-5p dans le cœur de souris surexprimant dans le cardiomyocyte le RM ou le RG . 91 Figure 19. Effet de modèles d'activation minéralocorticoïde sur l'expression cardiaque du miR-1941-5p . 92 Tableau 1. Séquences des amorces oligopeptidiques sens et antisens utilisées chez la souris pour réaliser les PCR quantitative. . 58 Tableau 2. Paramètres physiologiques des souris soumis au modèle DOCA-Sel . 68 PRODUCTIONS SCIENTIFIQUES PUBLICATION Gravez B, Tarjus A, Pelloux V, Ouvrard-Pascaud A, Delcayre C, Samuel J, Clément K, Farman N, Jaisser F, Messaoudi S. Aldosterone Promotes Cardiac Endothelial Cells Proliferation In Vivo. J Am Heart Assoc. 2015 Jan 6 ; 4(1). pii : e001266. doi : 10. 1161/JAHA. 114. 001266. Gravez B, Tarjus A, Jimenez-Canino R, El Moghrabi S, Messaoudi S, Alvarez de la Rosa D, Jaisser F. The Diuretic Torasemide Does Not Prevent Aldosterone-Mediated Mineralocorticoid Receptor Activation In Cardiomyocytes. PLoS One. 2013 ; Sep 9 ; 8(9) : e73737. doi : 10. 1371. Gravez B, Tarjus A, Jaisser F. Mineralocorticoid receptor and cardiac arrhythmia. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2013 ; Jul 29. doi : 10. 1111/1440-1681. 12156. Messaoudi S, Gravez B, Tarjus A, Pelloux V, Ouvrard-Pascaud A, Delcayre C, Samuel J, Launay JM, Sierra-Ramos C, Alvarez de la Rosa D, Clément K, Farman N, Jaisser F. Aldosterone-Specific Activation Of Cardiomyocyte Mineralocorticoid Receptor In Vivo. Hypertension. 2013 ; Feb ; 61 : 361-367. doi : 10. 1161/HYPERTENSIONAHA. 112. 198986. Epub 2013 Jan 7. COMMUNICATIONS ORALES European Council for Cardiovascular Research, Nice 2013. Aldosterone promotes cardiac endothelial cells proliferation and angiogenesis. Physiologie-Pharmacologie et Thérapeutique, Angers 2013. New genes and biological processes regulated by aldosterone-mineralocorticoïd receptor complex in the heart. COMMUNICATIONS ECRITES European Council for Cardiovascular Research, Nice 2013 ; European Section of the Aldosterone Council, Paris 2013 ; ADMIRE COST meeting, Padova 2014. The diuretic torasemide does not prevent aldosterone-mediated mineralocorticoid receptor activation in cardiomyocytes. Printemps de la cardiologie, Marseille 2013 et European Section of the Aldosterone Council, Hanovre 2012. New genes and biological processes regulated by mineralocorticoïd receptor- aldosterone complex in the heart. 33ème journée de l'hypertension artérielle, Paris 2013. Aldosterone promotes cardiac endothelial cells proliferation and angiogenesis. AVANT-PROPOS L'hormone minéralocorticoïde aldostérone en se fixant à son récepteur, le récepteur minéralocorticoïde, module la réabsorption de sodium au niveau du rein. La mise en évidence de l'expression du récepteur minéralocorticoïde dans d'autres tissus comme le cœur et les vaisseaux a permis un regard nouveau sur le rôle physiopathologique de l'aldostérone et de son récepteur. Plusieurs études cliniques ont déjà montré le bénéfice du blocage du récepteur minéralocorticoïde dans le traitement de patients atteints d'insuffisance cardiaque. Ces résultats encourageants, montrant une diminution significative de la mortalité chez les patients, ont suscité un regain d'intérêt pour le récepteur minéralocorticoïde. A ce jour, de nombreuses études expérimentales in vitro et in vivo ont démontré l'importance du complexe aldostérone/récepteur minéralocorticoïde dans les processus de remodelage cardiovasculaire, et dans les phénomènes d'inflammation et de stress oxydatif. Cependant, les mécanismes d'actions impliqués dans les effets délétères de ce complexe, et plus particulièrement dans le système cardiovasculaire, ne sont que partiellement élucidés. Un élément essentiel de la complexité de cette signalisation minéralocorticoïde réside dans la capacité du récepteur à lier avec la même affinité deux types d'hormones : l'aldostérone et les glucocorticoïdes. Ces derniers étant beaucoup plus abondants dans la circulation générale, ils saturent le récepteur minéralocorticoïde. Néanmoins, un système de sélectivité du ligand existe, permettant à l'aldostérone d'activer son récepteur. Cependant, certaines cellules comme les cardiomyocytes, exprimant le récepteur minéralocorticoïde, ne possèdent pas ce mécanisme de sélectivité. Mon travail de thèse a eu pour but d'approfondir les connaissances sur les mécanismes de la signalisation du récepteur minéralocorticoïde cardiaque. Afin de mettre en évidence l'approche et l'intérêt des travaux réalisés au cours de ma thèse, je résumerai tout d'abord dans la première partie de l'introduction l'état actuel des connaissances sur le récepteur minéralocorticoïde et son importance en tant que cible potentielle thérapeutique. La seconde partie de l'introduction traitera plus particulièrement de l'implication du récepteur minéralocorticoïde dans la physiopathologie cardiaque. PARTIE 1 : INTRODUCTION 1. 1 Les pathologies cardiovasculaires L'étude de la santé des populations vise à améliorer la santé d'une population entière. Dans ce contexte, il est nécessaire d'appréhender l'évolution des facteurs influant sur celle-ci au cours du temps. L'une des conséquences mesurables de l'amélioration de l'état de santé des populations est le taux de mortalité et le poids que les maladies y représentent. Ces deux variables font l'objet de projections à long terme et permettent une bonne prédiction de l'état de santé mondial1. A l'horizon 2030, l'espérance de vie dans le monde entier devrait encore augmenter par rapport à aujourd'hui. Alors que le taux de mortalité infantile va diminuer de près de 15%, celui des personnes adultes devrait augmenter significativement, surtout pour les classes d'âge supérieures à 70 ans. L'augmentation du taux de mortalité des personnes adultes malgré l'augmentation de l'espérance de vie et de la qualité de vie peut sembler contre- intuitive. En effet, le vieillissement de la population mondiale entrane une susceptibilité de la population à contracter certaines pathologies, comme les pathologies cardiovasculaires. Actuellement, ces pathologies restent de mauvais pronostics et n'ont pas de thérapies optimales à cause de leurs propriétés multifactorielles. Elles représentent donc un problème majeur de santé publique dont la compréhension des mécanismes reste essentielle et toujours d'actualité. Les pathologies cardiovasculaires, définies comme l'ensemble des troubles affectant le cœur et les vaisseaux, représentent 30% de la mortalité totale mondiale et environ 80% de la mortalité totale dans les pays industrialisés2. Les principales atteintes cardiovasculaires sont les cardiopathies coronariennes (comme l'infarctus du myocarde), les artériopathies périphériques, les maladies cérébrovasculaires (comme l'accident vasculaire cérébral) et les malformations cardiaques congénitales. Les facteurs de risque qui leurs sont associés sont multiples. On peut notamment citer l'hypertension artérielle, le diabète et l'obésité, ainsi que le tabagisme ou la consommation régulière d'alcool. De nombreux mécanismes se mettent en place lors des pathologies cardiovasculaires, qui participent au développement et au maintien de celles-ci. Les mieux décrits sont le remodelage matriciel et électrophysiologique du cœur, le remodelage matriciel rénal, la dysfonction vasculaire, l'hypertension ou encore l'inflammation3. L'insuffisance cardiaque est une des évolutions possibles de ces maladies cardiovasculaires. On parle d'insuffisance cardiaque lorsque le cœur ne peut plus effectuer correctement son travail de pompe. Il n'assure plus le débit sanguin nécessaire aux besoins métaboliques et fonctionnels des différents organes de l'organisme. En 1990, le groupe de Brilla et al. a mis en évidence la présence de fibrose au niveau du ventricule droit chez des rats hypertendus suite à une surcharge minéralocorticoïde 4. La mise en place de fibrose est un élément important du remodelage de la matrice cardiaque. Elle se définit comme une augmentation de la concentration tissulaire en collagène, constituant majeur de la matrice extracellulaire, synthétisé et sécrété par les fibroblastes. Il existe cinq types différents de collagène dans le cœur, dont les collagènes I et III représentent 90% de la totalité. Jusqu'alors la fibrose cardiaque dans les modèles animaux d'hypertension n'était recherchée qu'au niveau du ventricule gauche hypertrophié subissant un remodelage consécutif à l'augmentation de la post-charge. L'observation du groupe de Brilla et al. a montré pour la première fois que la fibrose cardiaque n'est pas seulement induite par des facteurs hémodynamiques mais peut aussi être induite par des facteurs humoraux. Ainsi, le rôle des hormones circulantes a été plus spécifiquement étudié dans la mise en place du remodelage (concernant les vaisseaux et les organes). La même équipe a montré que l'inhibition de l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ECA), enzyme clé de la cascade minéralocorticoïde, réduit le remodelage matriciel et périvasculaire induit dans le cœur par le stress minéralocorticoïde5. Des travaux antérieurs identifiant l'expression du récepteur de l'aldostérone sur des fibroblastes isolés provenant d'aorte de rat6 confortent l'hypothèse selon laquelle des hormones peuvent influencer le remodelage cardiaque. Par la suite, d'autres études expérimentales se sont intéressées aux différents éléments de la cascade minéralocorticoïde, dont certains sont impliqués dans la mise en place et le maintien des pathologies cardiovasculaires. Parmi ceux-ci figurent l'aldostérone et son récepteur, à savoir le récepteur minéralocorticoïde (RM). Parallèlement, des études cliniques ont également montré des effets bénéfiques du blocage du RM sur la survie de patients atteints de pathologies cardiaques comme l'infarctus du myocarde ou l'insuffisance cardiaque. Dès lors, le complexe aldostérone/RM a été considéré comme une cible de choix dont l'activation pourrait expliquer la mise en place et le développement des pathologies cardiovasculaires. La suite de ce chapitre introductif se propose de résumer les données actuelles sur le RM dans le cœur, à travers la présentation des modèles expérimentaux et des essais cliniques ayant permis d'en comprendre sa structure, ses rôles et ses implications physiopathologiques. 1. 2 Le récepteur minéralocorticoïde 1. 2. 1 Structure du gène codant pour le RM Le RM appartient à la superfamille des récepteurs nucléaires, et plus précisément à la famille des récepteurs stéroïdiens (dont font partie également le récepteur aux androgènes, le récepteur glucocorticoïde (RG), le récepteur aux œstrogènes et le récepteur à la progestérone)7. Il agit comme un facteur de transcription dépendant des ligands. Le gène NR3C2 (pour Nuclear Receptor sub-family 3 group C member 2) codant pour le RM, est situé sur le chromosome 4 chez l'homme8. D'une taille approximative de 450 kilobases, il est composé de dix exons séparés les uns des autres par huit introns9, 10. Les deux premiers exons 1 et 1 sont non-codants, les huit autres codent pour une protéine de 984 acides aminés. Ce gène est également retrouvé chez le rat et la souris, et sa structure est très conservée. Situé sur le chromosome 19 chez le rat, NR3C2 possède trois premiers exons non-codants (1, 1 et 1) et code pour une protéine de 981 acides aminés11. Chez la souris, celui-ci est situé sur le chromosome 8 et code une protéine de 978 acides aminés12. Une étude a montré que l'expression du gène codant pour le RM humain (RMh) est contrôlée par deux promoteurs alternatifs, menant à la synthèse d'une même protéine dans la mesure o le codon d'initiation de la traduction est situé dans le deuxième exon. P1 permet la transcription de l'exon 1 et P2 celle de l'exon 1, générant alternativement deux isoformes d'acides ribonucléiques messagers13 (ARNm). Cette même étude indique que ces deux promoteurs sont soumis à des régulations hormonales distinctes. Bien que tous les deux soient sensibles aux glucocorticoïdes, seul P2 répond aux minéralocorticoïdes. Outre cette différence, P1 et P2 ont également des spécificités tissulaires bien distinctes. Alors que P1 est actif dans tous les tissus o le RM s'exprime, l'activité de P2 est 10 fois moins importante que celle de P1 et peut parfois être nulle comme dans le cerveau14. Des mutations du gène codant pour le RM ont également été décrites, notamment chez les patients atteints de pseudohypoaldostéronisme de type I. Ces derniers, qui montrent une résistance aux minéralocorticoïdes se définissant par une concentration plasmatique en potassium élevée (hyperkaliémie), une concentration plasmatique en aldostérone élevée (aldostéronémie) et une concentration plasmatique en sodium faible, peuvent présenter des mutations du gène codant pour le RM. Une dizaine de mutations ont été identifiées, particulièrement dans la région codant pour le domaine de liaison du ligand hormonal, donnant une protéine avec une activité transcriptionnelle diminuée par rapport aux sujets sains15, 16. Figure 1. Schéma de la structure du récepteur minéralocorticoïde humain. Le gène, l'ARN messager et la protéine sont représentés. Le gène codant pour le RMh est composé de dix exons dont les deux premiers ne sont pas traduits (1 et 1). Le codon d'initiation de la traduction AUG est situé 2 paires de bases après le début de l'exon 2, tandis que le codon stop est localisé sur l'exon 9. Le récepteur contient des domaines de régulation de l'activité transcriptionnelle (AF-1a, AF-1b et AF-2), des signaux de localisation nucléaire (SLN0, SLN1 et SLN2) et un signal d'export nucléaire (SEN). N-TERMINALE : région N-terminale ; DLA : domaine de liaison à l'acide désoxyribonucléique ; DLL : domaine de liaison du ligand hormonal. (D'après Viengchareun et al. , Nucl Recept Signal, 2007). Il a été montré également que le gène NR3C2 possède des polymorphismes, concernant un seul nucléotide, situés dans les exons (polymorphismes codants des variants de la protéine) ou dans les régions non traduites du gène (polymorphismes ne modifiant pas la protéine). Certains polymorphismes chez l'homme ont été associés à des risques de développement de maladies cardiovasculaires comme l'hypertension ou l'infarctus du myocarde17. Ainsi, le polymorphisme rs5522 (A/G) n'induit pas de changement de l'expression du RM18. Par contre, il a été montré que les sujets portant l'allèle G présentent moins de risque de développer une hypertension artérielle chronique que ceux portant l'allèle A19. Une autre étude a montré que la diminution de la pression artérielle en réponse à l'ECA est moins importante chez des sujets hypertendus portant l'allèle G que chez ceux portant l'allèle A17. Le polymorphisme de nomenclature rs2070951 (G/C) a également été étudié lors de cette étude. Il est rapporté que les patients portant l'allèle G traités à l'ECA présentent une diminution importante mais non significative de leur pression artérielle par rapport à ceux portant l'allèle C17. De plus, les patients portant l'allèle G montrent une expression diminuée du RM in vitro18, 20 et une augmentation de la pression artérielle et de l'aldostéronémie in vivo par rapport à ceux portant l'allèle C. Le polymorphisme rs5534 (A/G) du gène NR3C2 est associé au risque de survenue d'infarctus du myocarde. En effet, des sujets présentant l'allèle A ont moins de risque de survenue d'infarctus du myocarde que ceux présentant l'allèle G21. Un autre polymorphisme, le S810L, est quant à lui gain de fonction. En effet, le remplacement d'une sérine par une leucine en position 810 altère la spécificité du RM pour l'aldostérone et les glucocorticoïdes, permettant ainsi à d'autres hormones stéroïdes de s'y lier et de l'activer22. Ces différents polymorphismes, en permettant de donner soit une protéine différente, soit la même protéine avec des propriétés différentes, permettraient d'expliquer en partie les différences dans le développement de pathologies cardiovasculaires d'un individu à l'autre. Ces études restent cependant à approfondir. 1. 2. 2 Structure du RM Comme tous les autres récepteurs nucléaires, le RM est organisé selon plusieurs domaines qui se distinguent en termes de structure et de fonction. Ces domaines sont regroupés selon trois régions principales, définies de l'extrémité N-terminale à l'extrémité C- terminale de la manière suivante12, 23, 24 : - la région N-terminale contenant les domaines de régulation de l'activité transcriptionnelle - la région centrale qui est constituée du domaine de liaison à l'acide désoxyribonucléique (ADN ; DLA) - la région C-terminale contenant le domaine de liaison du ligand hormonal (DLL). Ces différents domaines vont permettre au RM d'agir comme un facteur de transcription dépendant des ligands ; tout d'abord par sa liaison à son ligand, puis par sa liaison au gène cible et enfin par sa liaison aux corégulateurs de son activité. Plusieurs motifs s'ajoutent aux différents domaines pour réguler la fonction du RM. Dans la région N- terminale, contenant les domaines de régulation de l'activité transcriptionnelle du RM (AF-1a et AF-1b, pour Activation Function 1a et 1b)25, un signal de localisation nucléaire (SLN) est inclus dans le domaine AF-1b. Des SLN sont également présents dans le DLA et le DLL. Le DLA est constitué de deux motifs en doigts de zinc, nécessaires à la liaison du RM à ses éléments de réponse hormonale au niveau de l'ADN ainsi qu'à sa dimérisation26. Il possède également un motif de signalisation d'export nucléaire (SEN). Au niveau du DLL, il a été montré que des protéines de choc thermique (HSP, pour Heat Shock Protein), y interagissent. Ces HSP permettent de maintenir le RM dans une conformation permettant sa liaison avec son ligand hormonal tout en masquant le SLN situé dans ce domaine. Un domaine de régulation de l'activité transcriptionnelle du RM AF-2 y est également présent. Figure 2. Représentation schématique tridimensionnelle du RM selon ses trois régions principales. La région N-terminale contenant les domaines de régulation de l'activité transcriptionnelle ; la région centrale constituée du domaine de liaison à l'acide désoxyribonucléique ; la région C-terminale contenant le domaine de liaison du ligand hormonal. Le RM peut subir des modifications post-traductionnelles qui permettent de modifier son activité et ainsi de réguler la physiopathologie cellulaire. Les mieux décrites sont la phosphorylation, l'ubiquitination, la sumoylation ou encore l'acétylation27. Celles-ci peuvent agir sur sa dimérisation, sa capacité à se lier à l'ADN ou encore sur le recrutement de ses corégulateurs transcriptionnels. Ainsi, dans les neurones de rat, le RM est phosphorylé sur certains de ses résidus sérine et thréonine via la kinase dépendante des cyclines de type 5 (Cdk5, pour Cyclin-dependent kinase 5)28. Cette kinase phosphoryle ses résidus cibles au niveau de la région N-terminale du RM induisant une baisse de l'activité transcriptionnelle du RM sans pour autant interférer avec sa translocation nucléaire. Une thréonine et une sérine, toutes deux situées dans le DLL et identifiées par analyse protéomique comme des sites potentiels de phosphorylation pourraient être impliquées dans des modifications de la conformation de ce domaine29. De la même manière, 16 sérines ont été montrées en 2013 comme étant des cibles de phosphorylation. Parmi elles, une sérine présente dans le DLL empêche la liaison du RM à son ligand30. La tyrosine en position 73 de la région N-terminale a été montrée comme un site potentiel de phosphorylation, même si peu de résidus tyrosine sont phosphorylés dans le RM31. D'ailleurs, il a été montré qu'une concentration basse d'aldostérone (1 nM) augmente seulement la phosphorylation de résidus sérine, alors qu'une concentration plus forte de 10 nM induit également la phosphorylation de résidus thréonine, alors qu'aucune de ces concentrations n'a d'effet sur les résidus tyrosines32. L'ubiquitine est une petite protéine de 76 acides aminés qui, en se fixant à ses protéines cibles, les entrane vers le protéasome o elles seront dégradées. Le RM est mono-ubiquitiné en condition physiologique alors que l'activation par l'aldostérone induit sa poly-ubiquitination et sa dégradation. Une étude a montré que ces différents états d'ubiquitination sont assurés par la kinase ERK1/2 (pour extracellular-regulated kinase1/2)33. Ce mécanisme semble être essentiel à la régulation de l'activation transcriptionnelle du RM. Les petites protéines SUMOs (pour Small Ubiquitin-related MOdifiers), similaires à l'ubiquitine, peuvent également se lier à certains résidus lysine du RM, surtout dans sa région N-terminale. Ainsi, des études ont montré que la sumoylation diminuait l'activité transcriptionnelle du RM34 alors que d'autres indiquent qu'elle permet le recrutement de certains des co-activateurs du RM35. Une autre modification post-traductionnelle du RM développée ici est l'acétylation. Ce groupement acétyle peut rendre compte de l'inhibition de l'activité du RM. En effet, l'augmentation de la pression artérielle induite par une surcharge minéralocorticoïde chez le rat est inhibée par l'ajout d'un bloqueur des enzymes histones désacétylases36. La régulation du degré d'acétylation du RM semble donc indispensable pour contrôler l'activité du récepteur. Cependant le contexte cellulaire entranant ces modifications est encore méconnu. Figure 3. Schéma des résidus du RMh pouvant subir des modifications post- traductionnelles. Sites de phosphorylation ; VLWHVGXELTXLWLQDWLRQ ; sites de sumoylation ; VLWHV GDFpW\ODWLRQ ; AF-1a, AF-1b et AF-2 : domaines de régulation de l'activité transcriptionnelle ; N-TERMINALE : région N-terminale ; DLA : domaine de liaison à l'ADN ; DLL : domaine de liaison du ligand hormonal (D'après Faresse et al. , J Steroid Biochem Mol Biol, 2014). 1. 2. 3 Ligands du RM Ce récepteur tire son nom de l'hormone minéralocorticoïde aldostérone qu'il lie. Néanmoins, le RM est capable de lier également les glucocorticoïdes, qui forment avec les minéralocorticoïdes, les hormones corticostéroïdes. En effet, la liaison du RM avec ces deux hormones est de même affinité26. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés au cours de ce travail de thèse à la liaison entre le RM et son ligand le plus anciennement étudié, l'aldostérone. Figure 4. Liaison des hormones corticostéroïdes à leurs récepteurs. Le RM a la même affinité pour l'aldostérone et les glucocorticoïdes ; le RG a aussi une affinité équivalente pour ces hormones. Les concentrations plasmatiques physiologiques sont indiquées ainsi que les constantes de dissociation des hormones pour leurs ligands (Kd, pour dissociation constant). 1. 2. 3. 1 Hormone minéralocorticoïde aldostérone L'aldostérone37 est le dernier effecteur du système rénine-angiotensine-aldostérone (SRAA), qui une fois lié à son récepteur, permet de maintenir l'homéostasie sodique au niveau rénal. Le SRAA joue donc un rôle central dans le contrôle de la pression artérielle, de la perfusion tissulaire, de la volémie (régulation du volume extracellulaire) et de la balance hydrosodée. Il est constitué d'une suite d'oligopeptides clivés les uns après les autres grâce à une cascade enzymatique ayant lieu dans le compartiment sanguin. Tout d'abord la rénine, synthétisée au niveau du rein, va cliver l'angiotensinogène hépatique en angiotensine I. Cette dernière va donner naissance à l'angiotensine II via l'ECA, protéase exprimée dans tous les lits vasculaires de l'organisme38. L'angiotensine II, un vasoconstricteur puissant, stimule la synthèse d'aldostérone en se liant à ses récepteurs présents au niveau de la glande surrénale39. Sécrétée dans la circulation sanguine, l'aldostérone se lie, au niveau de ses tissus cibles, à son récepteur et l'active. Le RM joue alors son rôle de facteur de transcription en induisant l'expression de ses gènes cibles, qui font partie de la dernière étape d'activation du SRAA. Figure 5. Système rénine-angiotensine-aldostérone. L'angiotensinogène, synthétisé au niveau du foie, est clivé par la rénine pour donner l'angiotensine I. Cette dernière est clivée à son tour par l'enzyme de conversion de l'angiotensine pour donner l'angiotensine II. L'angiotensine II, un vasoconstricteur puissant, va stimuler la synthèse d'aldostérone en se liant à ses récepteurs au niveau de la glande surrénale. L'aldostérone sécrétée va pouvoir se lier au récepteur minéralocorticoïde. Les flèches bleues sont activatrices, les rouges sont inhibitrices. Suite à leur activation par l'angiotensine II, les glandes surrénales sont le lieu de synthèse de l'aldostérone. Comme toutes les hormones stéroïdiennes, l'aldostérone est produite dans le cortex surrénalien40 (ou glande corticosurrénale), plus particulièrement dans sa zone glomérulaire41. Sa biosynthèse est effectuée à partir du cholestérol et se compose d'une cascade réactionnelle nécessitant quatre enzymes distinctes. L'aldostérone induit au niveau du néphron distal (à savoir le tubule contourné distal et le canal collecteur) la réabsorption du sodium de l'urine primitive vers le milieu intérieur, cette étape étant finement régulée. L'eau est également réabsorbée de façon passive en suivant le gradient de sodium, ce qui maintient constant les volumes extracellulaires, en particulier le volume plasmatique et donc la pression artérielle. Toute perte de volume, comme les hémorragies, les vomissements, les diarrhées, les sudations excessives ou un manque d'apport alimentaire en sel, provoque une stimulation de la synthèse et de la sécrétion d'aldostérone. En revanche, l'état d'apesanteur ou bien l'immersion complète de l'organisme sont accompagnés d'une baisse de sa concentration plasmatique. Les principaux acteurs de la régulation de l'aldostérone sont la concentration plasmatique en potassium (kaliémie), l'angiotensine II et l'hormone adrénocorticotrope (ACTH, pour adrenocorticotropic hormone) dont les mécanismes d'action sont développés ci-après : - la kaliémie : le potassium est un puissant stimulant de la synthèse et de la sécrétion d'aldostérone. L'augmentation de sa concentration plasmatique va agir directement sur la zone glomérulaire42 des glandes surrénales qui vont produire en réponse de l'aldostérone. L'action de cette dernière va permettre en retour d'excréter du potassium dans les urines et donc de maintenir l'homéostasie potassique, créant ainsi une boucle de contrôle. L'augmentation de la kaliémie va induire la dépolarisation de la membrane plasmique des cellules de la zone glomérulaire, conduisant à une entrée de calcium via les canaux de type L et T43. Cette entrée de calcium intracellulaire va entraner l'augmentation d'expression du gène CYP11B2, codant pour la dernière enzyme de la cascade de synthèse de l'aldostérone, l'aldostérone synthase, comme le montre l'utilisation d'un agoniste des canaux calciques sur des cellules H295R provenant de carcinome surrénalien humain44. La calmoduline et les calmodulines kinases I et IV sont les intermédiaires de cette signalisation. Il a été montré dans des cellules H295R contenant le promoteur du gène CYP11B2 que l'inhibition de la calmoduline et des calmodulines kinases I et IV empêche la transcription de ce gène45. Le potassium pourrait ainsi permettre l'entrée de calcium dans les cellules de la zone glomérulaire des glandes surrénales, induisant l'activation de la calmoduline et des calmodulines kinases I et IV45. Finalement, ces dernières activent des facteurs de transcription modulant positivement l'expression de CYP11B2 et donc la synthèse d'aldostérone45. - l'angiotensine II : comme décrit précédemment, cette hormone stimule la synthèse d'aldostérone en induisant l'augmentation de l'expression de l'aldostérone synthase dans les cellules de la zone glomérulaire des glandes surrénales39. En effet, l'angiotensine II, comme le potassium, peut induire l'augmentation de l'expression de CYP11B2 dans les cellules H295R44. L'angiotensine II agit en activant plusieurs voies de signalisation différentes, via son récepteur AT1. L'inhibition de la voie de signalisation des src kinases bloque la synthèse d'aldostérone dans les cellules H295R, montrant que l'action de l'angiotensine II sur l'aldostérone dépend de ces tyrosines kinases cytoplasmiques46. Il a été aussi montré, dans ces mêmes cellules, que les voies de signalisation de la calmoduline et des src kinases, après activation par AT1, induisent une augmentation d'expression de l'aldostérone synthase47. L'inhibition spécifique de ces voies empêche directement ou indirectement l'expression de l'aldostérone synthase par l'intermédiaire de l'inhibition de facteurs de transcription du gène CYP11B248 (faisant partie de la superfamille des récepteurs nucléaires induit par les facteurs de croissance neuronaux ou NGFI, pour nuclear receptor superfamily/nerve growth factor- induced). L'angiotensine II peut également réguler l'expression de la phospholipase C-49. En effet, l'angiotensine II va activer la protéine Gq, qui active à son tour la phospholipase C-, qui à son tour clive le phospho-inositol biphosphate en diacyl-glycérol et en inositol triphosphate50. Ce dernier induit l'augmentation de la concentration intracellulaire en calcium en induisant l'efflux du calcium du réticulum endoplasmique. Le calcium active la voie de signalisation de la calmoduline conduisant à l'augmentation de l'expression du gène CYP11B249, 50. Ces deux acteurs de la régulation de l'aldostérone sont interdépendants, car la production d'aldostérone en réponse à l'angiotensine II dépend de la kaliémie. - l'hormone adrénocorticotrope : cette hormone effectrice de l'axe hypothalamo-hypophysaire peut contribuer, dans une moindre mesure, à la régulation de la synthèse d'aldostérone. Cependant, son rôle reste encore obscur, comme le montrent ses effets opposés sur la synthèse d'aldostérone dans des études chez le rat. En effet, une administration aigu d'ACTH augmente la production d'aldostérone51 alors que de l'ACTH donnée chroniquement diminue la concentration plasmatique de cette hormone52, 53. Malgré ces résultats contradictoires, il est actuellement admis que l'ACTH joue un rôle dans la régulation de la production d'aldostérone chez l'homme. En effet, les mutations du récepteur MC2R de l'ACTH entranent chez les patients des troubles dans la régulation de la balance hydrosodée54. Plus récemment, l'étude des tumeurs de la glande surrénale a permis de mettre en évidence une régulation pathologique de l'aldostérone. Environ 30 à 60% de ces tumeurs présentent une mutation au niveau du gène KCNJ5 codant pour le canal potassique Kir3. 4, pour Inward rectifying K channel. Avec Kir3. 1 codé par KCNJ3, il forme un complexe qui est exprimé dans les cellules de la zone glomérulaire de la glande surrénale, permettant de maintenir leur potentiel membranaire. Une mutation spécifique du gène KCNJ5 induit une surexpression de l'aldostérone synthase et donc augmente la production d'aldostérone55. Dans ces mêmes tumeurs, des mutations entranant des pertes de fonction ont également été décrites. Une mutation du gène ATP1A1 codant pour la sous-unité 1 de la pompe ionique ATPasique sodium/potassium diminue l'affinité du potassium pour la pompe56. Il en résulte une dépolarisation de la cellule permettant la surexpression de l'aldostérone synthase et donc l'augmentation de l'aldostéronémie57. 1. 2. 3. 2 Hormones glucocorticoïdes Les hormones glucocorticoïdes sont les hormones stéroïdes majeures de l'organisme et possèdent des propriétés anti-inflammatoires. A l'instar de l'aldostérone, elles sont synthétisées à partir du cholestérol, dans la zone fasciculaire et réticulaire du cortex surrénalien. Elles sont principalement représentées par le cortisol chez l'homme et la corticostérone chez les rongeurs. Les glucocorticoïdes se lient à leur récepteur spécifique le RG, exprimé de manière ubiquitaire dans l'organisme. Ils peuvent également induire des voies de signalisation différentes à travers leur fixation au RM. Cette propriété du RM à lier ces deux hormones doit être prise en compte dans la compréhension de la signalisation minéralocorticoïde. Plusieurs travaux se sont intéressés à l'effet des glucocorticoïdes sur le complexe aldostérone/RM dans le cœur. Des rats soumis à une surcharge minéralocorticoïde présentent au niveau du cœur une augmentation de la fibrose ainsi que des niveaux d'expression de marqueurs d'inflammation (comme la cyclo-oxygénase-2 ou l'ostéopontine) et de stress oxydatif (comme les sous-unités gp91phox et p22phox de la nicotinamide adénine dinucléotide phosphate oxydase sous forme réduite ou NADPH oxydase, pour nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase)58. Quatre semaines après l'arrêt de la stimulation minéralocorticoïde les augmentations des niveaux d'expression des marqueurs cités ci-dessus sont toujours observées, suggérant un effet minéralocorticoïde dépendant des glucocorticoïdes, majoritaires dans le plasma par rapport à l'aldostérone58. Une autre étude, découlant de la précédente, a montré que l'augmentation des niveaux d'expression de marqueurs d'inflammation et de stress oxydatif est prévenue par le blocage du RM, et non pas du RG, et que l'action des glucocorticoïdes sur le RM semble dépendre du stress oxydatif environnant59. La compilation de ces résultats démontre les multiples signalisations possibles induites par le RM au regard de sa liaison avec l'un ou l'autre de ces corticostéroïdes. La suite de cette introduction se propose de montrer la complexité de la signalisation minéralocorticoïde cardiaque selon son activation par l'aldostérone ou par les glucocorticoïdes. 1. 2. 3. 3 Sélectivité de liaison de l'aldostérone au RM Les glucocorticoïdes se lient avec la même affinité que l'aldostérone au RM et leur concentration plasmatique étant 100 à 1000 fois supérieure à celle de l'aldostérone, les glucocorticoïdes devraient se lier au RM de manière prédominante. Pour permettre à l'aldostérone de se lier à son récepteur, il existe donc des mécanismes de sélectivité minéralocorticoïde qui ont été identifiés. 1. 2. 3. 3. 1 Sélectivité enzymatique : 11-hydroxystéroïde déshydrogénase de type 2 Le mécanisme majeur repose sur l'activité de l'enzyme 11-hydroxystéroïde déshydrogénase de type 2 (11-HSD2). Elle est connue pour empêcher la liaison du cortisol ou de la corticostérone au RM et permet ainsi à l'aldostérone de s'y lier et d'induire ses propres voies de signalisation60. Exprimée dans certaines cellules cibles de l'aldostérone, elle convertit chez l'homme le cortisol en cortisone, métabolite de faible affinité pour le RM61-63 (chez les rongeurs, elle convertit la corticostérone en 11-déshydrocorticostérone). En revanche, la 11-HSD2 est sans effet sur l'aldostérone. La co-expression de la 11-HSD2 et du RM dans la cellule est donc nécessaire pour empêcher la compétition entre les ligands. Elle permet ainsi à l'aldostérone de se fixer au RM, malgré une concentration supérieure en glucocorticoïdes64. Néanmoins, un certain nombre de cellules exprimant le RM présente peu d'expression de la 11-HSD2. C'est le cas par exemple du kératinocyte et du cardiomyocyte65, o la question de la nature du ligand effectivement responsable de l'activation du RM se pose. De nombreux travaux ont été entrepris dans le but de comprendre si cette absence de co-expression empêche l'aldostérone de se lier à son récepteur dans les cellules concernées. La suite de ce chapitre se propose de résumer les expériences effectuées à ce jour au niveau du cœur, pour appréhender cette question qui a été au centre de mon projet de thèse. Des équipes ont analysé les gènes régulés par le complexe aldostérone/RM dans le cœur66, 67 . Dans une étude de 2007, une lignée cellulaire de cardiomyocytes H9C2-RM dérivée de ventricules embryonnaires de rat et transfectée avec le RM, a été traitée avec de l'aldostérone68. L'analyse du transcriptome par puces à oligonucléotides a permis d'identifier plusieurs gènes rapidement et directement induits par l'aldostérone et impliqués dans des phénomènes de remodelage cardiaque ou encore d'inflammation68. Ces travaux ont concerné des gènes précocement induits par l'hormone minéralocorticoïde. Notre laboratoire s'est, quant à lui, focalisé sur la régulation à long terme effectuée par le couple aldostérone/RM in vivo. En utilisant des souris surexprimant spécifiquement le RM ou le RG dans le cardiomyocyte, notre équipe a montré que ces deux récepteurs induisaient l'augmentation ou la diminution d'expression d'un nombre restreint de gènes (comme la lipocaline 2 ou la protéine profibrosante inhibitrice de l'activateur du plasminogène de type 1 ou PAI-1, pour plasminogen activator inhibitor-1)69. Ces gènes sont aussi impliqués dans le remodelage cardiaque, l'inflammation et le tonus vasculaire. Pour approfondir l'exploration de la signalisation et des mécanismes moléculaires du complexe aldostérone/RM dans le cœur, nous avons effectué l'étude par puces à oligonucléotides de transcriptome cardiaque de souris surexprimant spécifiquement le RMh dans les cardiomyocytes (RM-Cardio). Les souris RM- Cardio ont été traitées à l'aldostérone ou aux glucocorticoïdes pendant une semaine. Cette approche nous a permis de mettre en évidence dans le cardiomyocyte des gènes spécifiquement modulés par l'aldostérone ou les glucocorticoïdes via le RM70. Ce travail a été publié et sera présenté dans la partie résultats et discussions (confer chapitre 3. 2). 1. 2. 3. 3. 2 Autres mécanismes de sélectivité de l'aldostérone au RM L'absence de la 11-HSD2 n'empêche donc pas, dans le cardiomyocyte, une voie de signalisation du RM aldostérone dépendante. Par conséquent, cela suggère fortement qu'il existe d'autres mécanismes de sélectivité du RM pour son ligand, qui restent à définir. La grande majorité des glucocorticoïdes circulants sont associés à des protéines. La transcortine est responsable du transport de 80 à 95% d'entre eux, l'albumine se chargeant de la fraction restante71. Des souris invalidées pour le gène codant pour la transcortine apparaissent résistantes à l'action de l'aldostérone. En effet, en réponse à un régime pauvre en sel, l'aldostéronémie est augmentée mais pas l'expression du canal épithélial sodique (ENaC pour epithelial sodium channel), gène cible du complexe aldostérone/RM dans le rein, par rapport aux souris sauvages. Ces résultats suggèrent une fonction intrinsèque de la transcortine permettant aux hormones corticostéroïdes d'agir sur leurs cibles tissulaires72, cependant le mécanisme précis selon lequel la transcortine module la sélectivité minéralocorticoïde reste inconnu. Il a déjà été envisagé qu'un autre type de transporteur, membranaire, pourrait exporter spécifiquement les glucocorticoïdes hors de la cellule pour réduire leur concentration cytoplasmique73. Par ailleurs, le RM peut par lui-même être un acteur de sa sélectivité pour le ligand. En effet, l'aldostérone se dissocie plus lentement du RM que les glucocorticoïdes. Le complexe aldostérone/RM ayant une plus grande stabilité, il pourrait donc être favorisé dans certaines cellules74. Sa dimérisation intervient également, dans la mesure o le RM peut agir sous forme d'homodimères ou bien d'hétérodimères avec le RG75 et faciliter dans l'une des conformations sa liaison à l'aldostérone75. Finalement, un point essentiel de la sélectivité du RM pour l'aldostérone est sa synthèse extra-surrénalienne, comme cela a été décrit dans le cerveau du rat76, de l'homme77 ou dans le cœur78-80. L'aldostérone synthase est en effet exprimée dans le cœur de rats adultes78, dans le cœur humain fœtal79 et dans le cœur humain pathologique80. La synthèse locale d'aldostérone dans le cœur pourrait ainsi augmenter la fraction de RM liée à cette hormone. Malgré ces autres mécanismes de sélectivité minéralocorticoïde, l'importance de la 11-HSD2 est illustrée en pathologie. Les patients atteints du syndrome d'excès apparent de minéralocorticoïdes, provoqué par des mutations inactivatrices de la 11-HSD2, présentent une hypertension sévère, une hypokaliémie et une alcalose, alors que leur aldostéronémie est très basse81-83. La cause de cette maladie est l'activation permanente et inappropriée du RM par les glucocorticoïdes. L'implication du récepteur a été démontrée par l'utilisation d'un de ses antagonistes pharmacologiques, la spironolactone, qui améliore la survie des patients84. 1. 3 Bénéfices de l'inhibition du récepteur minéralocorticoïde en clinique 1. 3. 1 Antagonistes pharmacologiques du RM Aujourd'hui, les antagonistes du RM sont associés aux autres thérapies dans le traitement de certaines pathologies cardiovasculaires85. En effet, le premier effet bénéfique rapporté de ceux-ci est leur capacité à diminuer la pression artérielle86. Cette propriété hypotensive de l'antagonisme du RM s'explique en partie par le blocage de la réabsorption rénale de sodium et la diminution de la volémie. De plus, l'inhibition du RM en clinique présente des avantages thérapeutiques y compris à des doses ne modifiant pas la pression artérielle85. A ce jour, les antagonistes utilisés sont la spironolactone et l'éplérénone, des antagonistes stéroïdiens présentant les mêmes effets thérapeutiques mais des caractéristiques différentes. Leur principal effet secondaire potentiellement dangereux est l'augmentation de la kaliémie, qui lorsqu'elle est trop importante peut entraner des troubles du rythme cardiaque. En effet, la réabsorption rénale de sodium induite par le RM est associée à une excrétion de potassium. Donc, le blocage du RM augmente la concentration plasmatique en potassium. Ainsi, l'utilisation de ces antagonistes nécessite d'une part une bonne sélection des patients et d'autre part un suivi de la kaliémie87, 88. La spironolactone, un antagoniste dit de première génération, est rapidement métabolisée par le foie et exerce ses effets par l'intermédiaire de ses métabolites actifs, majoritairement le 7-thiométhyl-spironolactone et la canrénone88, 89. La spironolactone est peu sélective et peut se lier, en plus du RM, aux récepteurs aux androgènes et à la progestérone, entranant certains effets secondaires indésirables. Chez l'homme, la spironolactone peut être cause de gynécomastie et d'impuissance, alors que la femme peut être sujette à des troubles du cycle menstruel90. L'éplérénone, dit de deuxième génération, est beaucoup plus sélectif que la spironolactone dans la mesure o il ne se lie qu'au RM91. C'est pourquoi il est bien toléré en clinique, comme le montre la fréquence de survenue d'effets indésirables qui est du niveau de celle observée chez les patients traités avec un placebo92. Par contre, son affinité est 100 à 500 fois plus faible que celle de la spironolactone pour le RM91. D'autres antagonistes sont maintenant disponibles, mais encore utilisés dans le cadre d'études expérimentales, comme le RU2831893 ou le canrénoate de potassium94, un dérivé de la spironolactone soluble dans l'eau. Ces molécules, pour bloquer efficacement le RM, sont classiquement utilisées à des concentrations 100 fois plus importantes que l'aldostérone. 1. 3. 2 Effets de l'antagonisme du RM dans l'hypertension La spironolactone a été le premier antagoniste du RM à être utilisé en clinique. En 1966, une étude clinique a montré sa capacité à réduire la pression artérielle chez des patients hypertendus86. Elle est également efficace dans le traitement de l'hypertension résistante, à savoir chez des patients qui ne répondent pas à certains traitements anti-hypertensifs comme les bloqueurs des canaux calciques (étude ASCOT-BPLA, pour Anglo-Scandinavian Cardiac Outcomes Trial-Blood Pressure Lowering Arm)90. L'éplérénone est également un hypotenseur. Il est en effet aussi efficace que les bloqueurs des canaux calciques95, les inhibiteurs de l'ECA96, les bloqueurs des récepteurs à l'angiotensine II97 ou la spironolactone92. 1. 3. 3 Effets de l'antagonisme du RM dans l'insuffisance cardiaque 1. 3. 3. 1 Phénomène d'échappement de l'aldostérone L'utilisation des antagonistes du RM à des fins autres qu'hypotensives a été mise en évidence par le phénomène d'échappement de l'aldostérone. Ce dernier correspond au retour à la normale, voire à l'augmentation, de l'aldostéronémie rapidement après sa baisse suite à l'inhibition du SRAA. En effet, après infarctus du myocarde, les patients traités avec un inhibiteur de l'ECA voient leur aldostéronémie et leur pression systolique ré-augmenter au bout de quatre jours98. Une autre étude a montré que l'inhibition de l'ECA chez des patients insuffisants cardiaques n'empêchait pas la ré-augmentation de l'aldostéronémie au bout de 43 semaines de traitement99. Ce phénomène d'échappement de l'aldostérone lors du blocage du SRAA est impliqué dans les pathologies cardiovasculaires. Ainsi, l'étude clinique SAVE (pour Survival And Ventricular Enlargement) a observé que la concentration plasmatique en aldostérone est corrélée au pronostic vital des patients souffrant de dysfonction ventriculaire gauche consécutive à un infarctus du myocarde100. En effet, les patients ne présentant pas d'évènements cardiovasculaires pendant les deux ans suivant le début de l'étude ont une aldostéronémie plus basse que les patients qui décèdent, ou développent une insuffisance cardiaque sévère ou une combinaison de complications cardiovasculaires pendant la durée de l'étude100. Une autre étude (CONSENSUS, pour COoperative North Scandivian ENalapril SUrvival Study) effectuée sur des patients en insuffisance cardiaque a mis en évidence une corrélation positive entre l'aldostéronémie et le taux de mortalité au cours du traitement101. A la lumière de ces résultats et de cette nouvelle notion d'échappement de l'aldostérone sous blocage de l'ECA, l'intérêt d'une utilisation clinique du blocage du RM a émergé. A la fin des années 1990, de grands essais cliniques ont démontré l'efficacité des antagonistes du RM dans le traitement de l'insuffisance cardiaque. L'importance de leurs résultats dans la compréhension de l'implication du RM en physiopathologie cardiovasculaire est présentée ci-dessous. 1. 3. 3. 2 Etude RALES La première étude clinique à démontrer de manière probante que le blocage du RM améliore le traitement de l'insuffisance cardiaque a été l'étude RALES (pour Randomized ALdactone Evaluation Study) en 1999102. Les patients inclus étaient atteints d'insuffisance cardiaque grave de stade III et IV selon la classification de l'association New-Yorkaise du cœur (qui compte quatre stades au total). En supplément du traitement standard de l'insuffisance cardiaque associant un diurétique de l'anse de Henlé et un inhibiteur de l'ECA, tous les patients ont été traités à la spironolactone. Au bout de deux ans de traitement, l'ajout de spironolactone au traitement standard avait diminué de 31% la mortalité causée par des problèmes cardiaques. Cet effet a été montré comme étant indépendant de l'homéostasie sodique, mais lié au renouvellement de la matrice extracellulaire103. En effet, les patients traités à la spironolactone présentent une diminution des marqueurs de la synthèse des collagènes I et III. Le bénéfice apporté par cet antagoniste pourrait donc être associé à la réduction observée de la fibrose cardiaque103. La spironolactone a également montré des effets bénéfiques sur l'insuffisance cardiaque modérée de stade I et II, o le volume d'éjection ventriculaire est augmenté et la masse du ventricule gauche diminuée chez ces patients comparés aux patients recevant le placebo104. Figure 6. Etude RALES : Probabilité de survie chez les patients insuffisants cardiaques sévères. Le blocage du RM par la spironolactone réduit de 31% le risque de mortalité chez des patients insuffisants cardiaques sévères de stade III et IV selon la classification de l'association New-Yorkaise du cœur (d'après Pitt et al. , N Engl J Med, 1999). 1. 3. 3. 3 Etude EPHESUS En 2003, l'étude EPHESUS (pour Eplerenone Post-acute myocardial infarction Heart failure Efficacy and SUrvival Study) a montré des effets bénéfiques de l'éplérénone sur la mortalité de patients victimes d'un infarctus du myocarde et présentant une dysfonction ventriculaire gauche, avec ou sans insuffisance cardiaque105. Pendant les 16 mois de suivi, le taux de mortalité globale des patients traités à l'éplérénone a été diminué de 15% et le risque de décès d'origine cardiovasculaire de 17%. 1. 3. 3. 4 Autres études L'étude EMPHASIS-HF (pour Eplerenone in Mild Patients Hospitalization And SurvIval Study in Heart Failure) a confirmé les effets bénéfiques de l'inhibition du RM sur le taux de mortalité de patients insuffisants cardiaques, initialement rapportés par l'étude RALES, en utilisant l'éplérénone106. Les patients inclus présentaient une insuffisance cardiaque de stade II. Près de 26% des patients recevant le placebo sont décédés des suites de pathologies cardiovasculaires, contre seulement 18, 3% pour ceux traités avec l'éplérénone. Une étude clinique sur les effets de la spironolactone, réalisée dans six pays différents, a été réalisée récemment chez des patients présentant une insuffisance cardiaque (principalement de stade II et III) avec une fraction d'éjection conservée107. Cette étude, appelée TOPCAT (pour Treatment Of Preserved Cardiac function heart failure with an Aldosterone antagonisT) n'a montré aucun effet bénéfique de l'utilisation de la spironolactone. Cependant les résultats de cette dernière étude restent controversés du fait des populations étudiées. En effet, les critères de sélection des patients n'étaient pas homogènes entre les différents centres d'études et ne reflétaient pas la mortalité globale des patients insuffisants cardiaques à fraction d'éjection conservée108, 109. Une étude à postériori sur la population TOPCAT semble montrer que la spironolactone est efficace pour diminuer le taux de mortalité et le nombre d'hospitalisation des patients américains malades, alors qu'elle n'a aucun effet sur ces paramètres chez les patients européens110. 1. 3. 4 Effets de l'antagonisme du RM sur l'infarctus du myocarde En plus de ses effets bénéfiques observés chez les patients atteints d'insuffisance cardiaque à des stades modérés ou sévères, l'éplérénone s'est révélée être bénéfique dans l'évolution de l'infarctus du myocarde. Faisant suite à EPHESUS, l'étude REMINDER (pour early eplerenone treatment in patients with acute ST-elevation myocardial infarction without heart failure) a montré que l'éplérénone, dès les 24 heures suivant un infarctus du myocarde, améliore de 10% la mortalité de ces patients par rapport aux patients recevant un placebo111. Cet effet est principalement expliqué par la diminution de la concentration plasmatique du facteur natriurétique de type B (BNP, pour brain natriuretic peptide) chez les patients traités à l'éplérénone comparée aux patients recevant le placebo, qui est un marqueur de mauvais pronostic chez les patients victimes d'un infarctus du myocarde112. 1. 3. 5 Effets de l'antagonisme du RM dans les troubles du rythme cardiaque Le blocage du RM en clinique présente également des avantages dans le traitement des troubles du rythme cardiaque ou arythmies. Les patients des études cliniques EPHESUS, EMPHASIS-HF ou REMINDER traités avec l'éplérénone ne présentent pas de différence significative dans le nombre d'apparition d'arythmies cardiaques par rapport aux patients traités avec un placebo. Cependant, une étude clinique a montré en 2010 que le blocage du RM diminue le nombre d'arythmies, ce qui pourrait expliquer en partie la diminution importante du taux de mortalité global chez les patients traités avec un antagoniste du RM dans les études citées ci-dessus113. En effet, la spironolactone est capable de diminuer l'apparition de fibrillation atriale chez les patients comparativement à ceux traités avec un placebo113. D'autres travaux se sont intéressés à cette problématique et seront développés dans le chapitre 1. 5. 2. 5. 1. 3. 6 Emergence d'antagonistes non-stéroïdiens Les études cliniques précédemment citées ne concernent que les effets du blocage du RM chez des patients atteints de pathologies cardiaques. Les antagonistes du RM de première et deuxième génération, bien que globalement bénéfiques, vont empêcher la réabsorption de sodium et augmenter la kaliémie qui peuvent être délétères chez les patients atteints de dysfonctions rénales sévères. Ainsi, de nouveaux antagonistes non-stéroïdiens, dits de troisième génération, sont actuellement en phase d'essai clinique. Ceux-ci sont conçus de façon à ne pas présenter les effets secondaires de type endocrinien des antagonistes stéroïdiens tout en ayant une sélectivité et une efficacité comparables voire plus élevées. L'étude clinique ARTS (pour minerAlocorticoid Receptor antagonist Tolerability Study) a été la première à évaluer les effets d'un de ces antagonistes de troisième génération, la molécule BAY 94-8862, dérivée des dihydropyridines (bloqueurs des canaux calciques). Les patients présentant une insuffisance cardiaque de stade II ou III et une dysfonction rénale modérée ont été traités pendant 4 semaines avec un placebo, la spironolactone ou le BAY 94-8862114. Les patients traités avec le BAY 94-8862 présentent une augmentation de la kaliémie et une diminution de la filtration glomérulaire plus faibles que les patients traités avec la spironolactone114. De plus, il semblerait que le BAY 94-8862 ait une distribution équivalente dans le cœur et dans le rein, alors que la spironolactone est plus abondante dans le rein87, 88. Cette molécule semble donc capable de bloquer le RM, tout en limitant l'hyperkaliémie. Cependant, cette étude demande à être complétée car les effets cardiaques de cette molécule n'ont pas été étudiés, et sa comparaison avec un antagoniste de seconde génération apparat nécessaire. 1. 4 Mécanismes d'action du RM Deux types de mécanismes d'action ont été décrits pour le RM, à savoir des mécanismes génomiques et des mécanismes non génomiques. 1. 4. 1 Effets non génomiques du RM Ceux-ci sont caractérisés par des temps d'action très courts, de l'ordre de quelques secondes à quelques minutes. Ces effets rapides de l'aldostérone peuvent s'exercer via le RM ou via d'autres voies (le blocage du RM n'inhibant pas l'effet de l'aldostérone)115. Ces effets rapides de l'aldostérone peuvent agir par exemple sur le pH et le calcium intracellulaire au niveau des différents tissus cibles de l'hormone116, 117. Plusieurs travaux suggèrent fortement qu'un récepteur membranaire distinct du RM et activé par le RM pourrait rendre compte des effets de l'aldostérone. In vitro, la stimulation d'ERK1/2 par l'aldostérone dans une culture primaire de cellules musculaires lisses vasculaires de rat peut être bloquée aussi bien par un antagoniste du RM que par un antagoniste du récepteur membranaire couplé aux protéines G de type 30 (GPR30, pour G protein-coupled receptor 30)118. Une autre étude a montré que l'aldostérone est capable d'induire l'influx de sodium dans la lignée cellulaire rénale de rat RCCD2 sans être internalisée dans la cellule (l'aldostérone est liée de manière covalente à l'albumine empêchant l'entrée de l'hormone dans la cellule), témoignant que cet effet n'est pas directement induit par le RM32. De plus, le transport intracellulaire de c-src (de la famille des src kinases induisant des voies de signalisation pro-inflammatoires) par des radeaux lipidiques ou par des vésicules d'endocytose cavéoline-dépendantes est modulé par un récepteur activé par l'aldostérone119. Au contraire, d'autres travaux ont contredit l'hypothèse d'un récepteur membranaire pour expliquer les effets non génomiques du RM. En effet, l'éplérénone est capable de bloquer l'augmentation de calcium intracellulaire, induite par l'aldostérone, en quelques minutes dans des artères mésentériques de rat120. En conclusion, les mécanismes non génomiques du RM restent à ce jour encore mal connus. Mon sujet de thèse a porté sur l'étude des gènes cibles dont la transcription est induite par le RM et nous allons développer dans le chapitre suivant les mécanismes d'action génomiques du RM. 1. 4. 2 Effets génomiques du RM Les mécanismes génomiques relèvent de temps d'action de l'ordre de plusieurs heures car ils nécessitent la transcription et la traduction des gènes. L'activité transcriptionnelle du RM est commune aux autres récepteurs nucléaires. Elle peut être décrite en plusieurs étapes faisant intervenir les différents domaines structuraux du RM. La liaison de l'hormone au RM dans le cytoplasme marque le commencement du processus. Cette liaison induit un changement de conformation du récepteur, libérant ses protéines chaperonnes cytoplasmiques121. Le complexe ligand/RM migre dans le noyau et se fixe dans la région promotrice des gènes cibles du RM à ses éléments de réponse hormonale (ERH). Ces ERH sont des séquences spécifiques qui possèdent des motifs particuliers permettant la liaison du complexe ligand/RM à l'ADN122. Une séquence consensus, composée d'un hexanucléotide séparé de trois nucléotides, est retrouvée dans tous les ERH : PuGNACAnnnTGTNCPy (o Pu désigne une base purique à savoir A ou G, et Py désigne une base pyrimidique C ou T)123. Le RM et le RG, bien que partageant les mêmes ERH, modulent des fonctions physiologiques distinctes en régulant l'expression de groupes de gènes identiques et différents. Ce paradoxe apparent s'explique par la capacité des récepteurs à reconnatre des séquences communes mais aussi des séquences spécifiques leur conférant leur spécificité transcriptionnelle. Cette variation de séquence, à partir d'une séquence commune très conservée, permet ainsi d'influencer l'affinité relative du RM pour un ERH particulier124. Une fois positionné sur l'ADN sous sa forme dimérisée, le RM joue son rôle de facteur de transcription. Par l'intermédiaire de ses domaines régulant l'activité transcriptionnelle AF-1 et AF-2, il peut recruter des corégulateurs de la transcription125, 126. Ces derniers agissent de façon séquentielle et combinée, en présentant des effets d'activation ou de répression127. Les co-activateurs décompactent la chromatine favorisant ainsi la mise en place du complexe d'initiation de la transcription. Ils peuvent également participer à l'élongation de la phase de transcription et à sa terminaison, et de plus recruter d'autres corégulateurs127. A l'heure actuelle, une douzaine de corégulateurs interagissant avec le RM sont répertoriés. Le co-activateur de type 1 des récepteurs stéroïdes (SRC-1, pour steroid receptor coactivator-1), de grande affinité pour les récepteurs nucléaires, est présenté comme initiant la transcription des gènes cibles du RM par le recrutement de protéines impliquées dans l'acétylation des histones ou la méthylation des nucléotides induisant le remodelage de la chromatine128. Son variant, SRC-1e, interagit spécifiquement avec la région N-terminale du RM129. L'histone acétylase CBP/p300 recrute l'ARN polymérase II au niveau du domaine AF-2 du RM127 alors que le facteur d'élongation de l'ARN polymérase II (ELL, pour eleven-nineteen lysine-rich leukemia) interagit avec AF- 1130. Ce dernier agit d'ailleurs comme un corépresseur du RG et n'a aucun effet sur l'activité transcriptionnelle des récepteurs aux androgènes et à la progestérone130. Les corépresseurs, au contraire, induisent la condensation de la chromatine et ont pour conséquence d'inhiber la transcription. La protéine SUMO-ligase de type 1 protein inhibitor of activated signal transducer and activator of transcription-1 PIAS-1, en interagissant avec la région N- terminale du RM, inhibe son activité transcriptionnelle (comme décrit précédemment)131. 1. 5 Rôle physiopathologique du RM dans le cœur et le rein L'identification des cellules exprimant spécifiquement le RM a été rendue possible par l'utilisation de techniques permettant de détecter son ARNm, son expression protéique ainsi que sa liaison à l'aldostérone. Les cellules cibles classiques de l'aldostérone exprimant le RM sont les cellules épithéliales du tubule contourné distal et du tubule collecteur rénaux. Les cellules de l'épithélium colique distal et des canaux excréteurs des glandes salivaires et sudoripares s'ajoutent à ces cibles classiques26, 132, 133. Cependant le RM s'exprime également dans d'autres tissus non-épithéliaux. Ces cellules non classiques incluent les cardiomyocytes, les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses, les monocytes circulants et les macrophages, mais également les adipocytes, les kératinocytes, les cellules rétiniennes et certaines cellules neuronales24. Nous développerons plus particulièrement dans les chapitres suivants les voies de signalisation du RM dans le rein (historiquement décrite) et le cœur, et plus particulièrement la voie de signalisation du RM dans le cardiomyocyte. Figure 7. Les différentes cibles du récepteur minéralocorticoïde. L'activation du RM par l'aldostérone ou les glucocorticoïdes induit plusieurs processus biologiques en fonction du tissu concerné. Son activation inappropriée est impliquée dans de nombreuses altérations tissulaires pouvant mener au développement d'hypertension, de résistance à l'insuline ou de pathologies cardiovasculaires. 1. 5. 1 Effets génomiques classiques du RM dans l'épithélium rénal La réponse de l'épithélium rénal à l'aldostérone via son récepteur minéralocorticoïde est très bien décrite au niveau physiologique et au niveau des mécanismes moléculaires. Cette réponse fait suite à une baisse de la volémie, qui en retour active le SRAA et augmente l'aldostéronémie. L'aldostérone contrôle au niveau de l'épithélium rénal le transport transépithélial de sodium. En effet, dans les cellules épithéliales du néphron distal, la liaison de l'aldostérone au RM entrane la translocation nucléaire de ce dernier. Le complexe aldostérone/RM permet l'expression précoce de plusieurs protéines déterminantes dans le maintien de l'homéostasie sodique. Parmi celles-ci, nous pouvons citer : - les trois sous-unités (, et ) du canal épithélial sodique ENaC. Ces trois sous-unités s'assemblent pour former le canal ENaC. Adressé à la membrane apicale, ce canal permet le transport du sodium présent dans l'urine primitive du pôle apical de la cellule épithéliale vers son pôle basal134. - la pompe ionique ATPasique sodium/potassium (Na , K -ATPase). Elle est exprimée à la membrane basale de la cellule épithéliale et transporte le sodium cytoplasmique vers le milieu extracellulaire135. Ce processus s'effectue contre le gradient de concentration ionique qui nécessite de l'énergie sous forme d'adénosine triphosphate ou ATP. Ainsi, la pompe permet la sortie de trois ions sodium, et l'entrée de deux ions potassium. - la sérine/thréonine kinase régulée par les glucocorticoïdes de type 1 (Sgk-1 pour Serum and glucocorticoid-regulated kinase-1). Son activité kinase permet, par phosphorylation inhibitrice, de prévenir l'internalisation et la dégradation du canal ENaC, ce qui a pour conséquence de maintenir son activité136, 137. L'expression de Sgk-1 est rapidement induite par le RM dans l'épithélium rénal et phosphoryle la protéine cytoplasmique de la famille des ubiquitines ligases Nedd4-2 (pour Neural precursor cell-expressed developmentally downregulated gene 4-member 2). La forme phosphorylée de Nedd4-2 est inactive et prévient l'adressage d'ENaC vers le protéasome (via l'ubiquitination)138. Par conséquent, Sgk-1 en empêchant l'internalisation d'ENaC, maintient l'activité de ce canal138-140. De plus, l'activité de Sgk-1 est également régulée. En effet, Sgk-1 possède un motif de localisation vers le réticulum endoplasmique o elle est ubiquitinée et dégradée. L'expression de la protéine à domaine leucine zipper induite par les glucocorticoïdes de type 1 (GILZ-1, pour glucocorticoid-induced leucine zipper protein-1) est aussi précocement induite par le complexe aldostérone/RM. En inhibant ERK1/2, dans des cellules épithéliales rénales de souris, GILZ-1 bloque indirectement le transport d'ENaC vers le protéasome141-143. GILZ-1 peut aussi bloquer la dégradation de Sgk-1 et ainsi favoriser le maintien de l'activité d'ENaC et de la réabsorption de sodium144. La régulation d'ENaC via le complexe aldostérone/RM a également été mise en évidence dans les épithéliums colique, digestif ou pulmonaire145. Des travaux récents ont observé l'expression d'ENaC dans les cellules endothéliales, suggérant que le complexe aldostérone/RM peut aussi réguler ce canal dans l'endothélium146. Cependant, cette modulation semble distincte de celle observée dans l'épithélium rénal dans la mesure o le rôle de Nedd4-2 ou GILZ-1 n'a pas été clairement établi147. Ces protéines induites précocement par le complexe aldostérone/RM permettent la réabsorption de sodium des urines vers le milieu extracellulaire comme le sang. En réponse à cette pression osmotique différente, l'eau suit le mouvement des ions pour maintenir l'équilibre hydrosodé, résultant en une augmentation du volume sanguin et par conséquent une augmentation de la pression sanguine, donc de la pression artérielle. En conclusion, il est désormais reconnu que i) l'expression du RM ne se limite pas aux épithéliums et que ii) sa fonction ne se limite pas au contrôle de l'homéostasie sodique. Après la mise en évidence de son expression dans le cœur et les vaisseaux, les études de ces deux dernières décennies montrent l'implication du RM dans la progression de pathologies cardiaques et vasculaires. Ces nouvelles fonctions du RM, bien que toujours sujettes à débat, semblent indépendantes de son action sur la rétention sodée et des conséquences de celle-ci sur le système cardiovasculaire (augmentation de la volémie, augmentation des résistances périphériques et augmentation de la post-charge cardiaque). Le chapitre suivant se focalise sur le rôle du RM dans l'un des tissus composant ce système ; le tissu cardiaque. Nous analyserons son mécanisme d'action et son implication dans trois processus pathologiques à savoir le remodelage de la matrice, le remodelage électrophysiologique ou encore l'inflammation. Figure 8. Effets du RM sur l'épithélium du néphron distal. Au niveau du néphron distal, la liaison de l'aldostérone au RM va entraner la transcription des gènes codant pour ENaC et pour la pompe Na , K -ATPase, qui vont permettre la réabsorption de sodium à travers l'épithélium rénal. Sgk-1 inhibe la dégradation d'ENaC en inhibant l'action de Nedd4-2, ce qui maintient son activité et participe au transport sodique. De plus, GILZ-1 inhibe ERK1/2 empêchant le transport d'ENaC vers le protéasome. La présence de l'enzyme 11-HSD2 empêche les glucocorticoïdes de se fixer au RM. Les flèches noires sont activatrices et les flèches rouges inhibitrices. ADP : adénosine diphosphate ; ATP : adénosine triphosphate ; ENaC : epithelial sodium channel ; ERH : éléments de réponse hormonale ; ERK1/2 : extracellular-regulated kinase1/2 ; GILZ-1 : glucocorticoid-induced leucine zipper protein-1 ; Nedd4-2 : Neural precursor cell-expressed developmentally downregulated gene 4-member 2 ; Sgk-1 : Serum and glucocorticoid-regulated kinase-1. 1. 5. 2 Effets génomiques du RM cardiaque Dans l'organisme, le cœur est la pompe permettant la circulation du sang dans tous les tissus pour maintenir leur bon fonctionnement. C'est un organe creux musculaire constitué de deux oreillettes et de deux ventricules, séparé en deux circuits distincts droit et gauche. La partie droite reçoit le sang provenant des tissus, pauvre en oxygène. Une fois ré-oxygéné par les poumons, le sang est ensuite éjecté par la partie gauche du cœur vers les tissus périphériques o ils puisent l'oxygène et les nutriments nécessaires à leur fonctionnement. Différents types cellulaires sont présents dans le cœur. Les cellules majoritaires sont les fibroblastes (environ 70%) et les cardiomyocytes (environ 30%), ces derniers représentant près de 80% de la masse totale du cœur. Par conséquent, l'observation de la régulation génique au niveau du cœur reflète principalement celle de gènes exprimés par les cardiomyocytes. D'autres cellules présentes en plus faibles proportions sont les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses. Toutes ces cellules expriment le RM à l'état basal65, 148 . Dans le cœur pathologique, l'inflammation, le stress oxydatif et le remodelage cardiaque induisent la présence de cellules de l'immunité comme les lymphocytes T CD4 (cluster de différentiation de type 4 positif) et les macrophages de type M1 et M2149, 150. Le RM est également exprimé dans ces cellules, principalement dans les cellules présentatrices d'antigène comme les macrophages et les cellules dendritiques, suggérant pour le RM des implications pathologiques multiples selon les tissus et les cellules concernés. En revanche, l'enzyme 11-HSD2 est peu exprimée dans le cardiomyocyte et de ce fait ne semble pas pouvoir produire une activité suffisante pour maintenir la sélectivité de l'aldostérone pour le RM, suggérant un effet glucocorticoïde sur le RM du cardiomyocyte65, 151. De nombreuses études sur l'animal ont montré des effets délétères sur le cœur, après l'administration combinée d'aldostérone et de sel. Inversement, le blocage du RM prévient les effets délétères de l'aldostérone et du sel, particulièrement au niveau du cœur, impliquant le RM au centre de la physiopathologie cardiaque. Plus important, ces résultats suggèrent fortement que l'aldostérone, malgré la présence majoritaire des glucocorticoïdes, se fixe à son récepteur et induit des voies de signalisation cardiaque spécifiques. 1. 5. 2. 1 Blocage pharmacologique du RM in vivo Depuis le début des années 1990, de nombreux modèles expérimentaux de surcharge minéralocorticoïde ont été mis en place pour mimer une activation inappropriée du SRAA. Les plus couramment utilisés sont, le modèle de perfusion d'aldostérone adjoint d'un régime riche en sel et d'une néphrectomie unilatérale (le modèle Néphrectomie-Aldostérone-Sel ou NAS) et ses variantes, le modèle Aldostérone-Sel ou encore le modèle acétate de désoxycorticostérone-Sel (DOCA-Sel, pour deoxycorticosterone acetate), la DOCA étant une hormone précurseur de l'aldostérone. La co-administration d'aldostérone et de sel, associée à une néphrectomie unilatérale, induisent chez le rat une augmentation de la pression artérielle systémique. A cette hypertension s'ajoute de manière indépendante une accumulation de collagène I et III dans la matrice extracellulaire des deux ventricules cardiaques (fibrose interstitielle) ainsi qu'autour des vaisseaux du cœur (fibrose périvasculaire)4, 152, 153 . Ces travaux sont les premiers à avoir identifié le rôle profibrosant de ce modèle dans le ventricule droit, suggérant un effet partiellement indépendant de la pression artérielle (qui n'est pas augmentée dans le ventricule droit). Plus récemment, une étude sur des rats spontanément hypertendus et sensibles aux accidents vasculaires (SHRSP, pour stroke-prone spontaneously hypertensive) a mis en évidence de la fibrose dans les deux ventricules par une forte dose de sel, qui est prévenue par l'éplérénone154. En conclusion, ces différents modèles expérimentaux induisent tous une hypertension, une hypertrophie cardiaque ainsi que le développement de fibrose à la fois dans le ventricule gauche et dans le ventricule droit155. L'utilisation de la spironolactone, en bloquant l'augmentation des taux de collagène I et III dans le cœur156, 157, démontre l'implication du complexe aldostérone/RM dans ces phénomènes de remodelage cardiaque et son rôle dans la physiopathologie cardiaque. L'organisation temporelle de ce remodelage cardiaque ainsi que tous les facteurs associés restent encore méconnus. Cependant, tous les modèles de surcharge minéralocorticoïde sont capables d'induire des phénomènes d'hypertrophie, de fibrose, de stress oxydatif et d'inflammation, tous diminués ou totalement prévenus par l'utilisation d'antagonistes du RM. Dans le modèle NAS chez le rat, l'expression du facteur profibrosant, transforming growth factor- (TGF-), est augmentée et permet d'induire le remodelage cardiaque158. L'inhibition d'un des récepteurs de l'angiotensine II diminue son expression. Le TGF- peut stimuler l'expression de la protéine profibrosante PAI-1, du collagène de type I, et diminuer l'expression de certaines métalloprotéases matricielles (MMPs, pour matrix- metalloproteinases)159. Cette induction par le modèle NAS de fibrose cardiaque est précédée chez le rat par l'augmentation de molécules pro-inflammatoires comme la cyclo-oxygénase-2 et la chimiokine monocyte chemoattractant protein 1 (MCP1)160. L'ajout d'éplérénone, en atténuant l'augmentation de ces molécules, freine la gravité des lésions dans le tissu cardiaque160. De plus, ce modèle NAS chez le rat augmente l'expression de la sous-unité gp91phox de la NADPH oxydase161. La NADPH oxydase est une source majeure d'espèces réactives de l'oxygène, participant à la mise en place de stress oxydatif. En prévenant partiellement l'expression de gp91phox, la spironolactone diminue le stress oxydatif161. 1. 5. 2. 2 Implication du RM dans les pathologies cardiaques Le blocage du RM a également permis de faire avancer les connaissances sur son implication en physiopathologie dans différents modèles expérimentaux de pathologies cardiaques, présentés ci-après. Un traitement à l'éplérénone chez des rats de la lignée Dahl (modèle d'induction d'hypertension après un régime riche en sel ne présentant pas d'augmentation de l'aldostéronémie) prévient l'hypertrophie et l'insuffisance cardiaques, ainsi que l'inflammation des coronaires162. D'autres modèles pathologiques ont rapporté un effet bénéfique de l'éplérénone dans l'évolution des pathologies cardiaques. La fraction d'éjection cardiaque est améliorée chez des souris traitées à l'éplérénone dans un modèle d'infarctus du myocarde . Un modèle d'insuffisance cardiaque chez la souris présente également un ralentissement du développement de la dysfonction ventriculaire gauche après traitement à l'éplérénone164. De la même manière l'hypertrophie et la fibrose ventriculaires, induites par la dysfonction diastolique développée chez les rats de la lignée Dahl, sont prévenues par l'antagoniste165. Des travaux se sont également intéressés à l'activation du RM chez des rats SHRSP. La dénervation sinoaortique, augmentant la variabilité de la pression sans modifier la pression moyenne, entrane la translocation nucléaire du RM dans les cellules vasculaires intracardiaques et les cardiomyocytes. Cette activation du RM participe in vivo aux effets délétères de la variation de pression à savoir, la fibrose, le recrutement de cellules inflammatoires, l'hypertrophie et la diminution de la fraction d'éjection cardiaque, tous ces processus étant prévenus par l'éplérénone166. 1. 5. 2. 3 Etude de la signalisation cardiaque du RM in vitro Toutes ces études ci-dessus résumées concernent la signalisation du RM cardiaque in vivo. Cette approche intégrée rend difficile la compréhension des mécanismes moléculaires spécifiques mis en jeu lors de la fixation du ligand au RM du cardiomyocyte. C'est pourquoi de nombreux travaux se sont intéressés à l'exploration de la signalisation induite par le complexe aldostérone/RM avec l'approche cellulaire. L'aldostérone dans des cultures primaires de cardiomyocytes de rats adultes induit une augmentation du niveau d'expression des MMP-2 et MMP-9 dépendant des espèces réactives de l'oxygène. En effet, l'inhibition de la NADPH oxydase prévient totalement l'effet de l'aldostérone sur les MMP-2 et MMP-9 cardiomyocytaires167. Cependant, cette étude a été réalisée avec des doses d'aldostérone plus de 100 fois supérieures aux doses physiologiques, remettant en question la pertinence des résultats. Néanmoins une étude du remodelage cardiaque lors du vieillissement physiologique réalisée sur des rats jeunes (2 mois) ou adultes (8 ou 30 mois) non traités, semble confirmer in vivo les études in vitro167. Une corrélation est observée entre l'âge et l'augmentation de la NADPH oxydase, de la MMP-2 et de l'aldostéronémie168. L'étude du transcriptome total de cardiomyocytes a également permis d'identifier des gènes directement et spécifiquement régulés par l'aldostérone68. L'ensemble des ARNs de cellules H9C2-RM traitées avec de l'aldostérone à 1 nM a été comparé à celui de cellules non traitées. Plusieurs gènes ont été identifiés comme spécifiquement régulés par l'aldostérone parmi lesquels des gènes impliqués dans le remodelage de la matrice extracellulaire comme Tenascin-X, A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 1 (Adamts1) et PAI-1. Sont aussi modulés positivement des gènes impliqués dans la régulation du tonus vasculaire comme le Regulator of G-protein signalling-2 (Rgs-2) ou encore des gènes impliqués dans les phénomènes inflammatoires comme Orosomucoid-1. Cette étude clé nous a permis d'aborder l'approche pharmacologique développée dans les résultats de ma thèse. 1. 5. 2. 4 L'apport des modèles transgéniques dans la compréhension de la signalisation du RM Pour valider et approfondir les connaissances apportées in vitro et compléter celles provenant des modèles de pathologies cardiaques, plusieurs études sur la signalisation du RM cardiaque ont utilisé les modèles animaux transgéniques. Il est à noter que l'inactivation globale et constitutive du RM est létale dès les premiers jours suivants la naissance, du fait de la fuite sodée rénale sévère. Ce modèle confirme le rôle crucial du RM dans la régulation de la réabsorption rénale de sodium. Différents modèles surexprimant ou inactivant le RM spécifiquement dans un type cellulaire donné ont permis de dissocier les effets tissus- spécifiques du RM. Ils ont aidé à mieux comprendre le rôle spécifique du RM dans chaque type cellulaire o il s'exprime et ainsi de mieux appréhender son rôle global dans le tissu étudié. J'ai choisi de ne présenter ici que les modèles de surexpression et d'inactivation, dans le cardiomyocyte, du RM ou de l'aldostérone synthase, étant ceux permettant de documenter au mieux mon sujet de thèse. Les surexpressions de l'aldostérone synthase169 et du RM170 ne permettent pas à elles seules d'induire la fibrose cardiaque. Ces observations vont dans le même sens que celles effectuées lors de la perfusion unique d'aldostérone (ou de DOCA). Ces hormones seules n'expliquent pas le développement de fibrose cardiaque chez le rat et la souris. Ceci suggère l'intervention d'un ou de plusieurs cofacteurs, comme dans les modèles de surcharge minéralocorticoïde. Il est évident aujourd'hui que l'ajout de sel est nécessaire, même si les mécanismes régissant son action ne sont pas encore élucidés. Des souris hypertendues surexprimant l'aldostérone synthase dans le cardiomyocyte et la rénine dans le foie présentent une hypertrophie cardiaque171, 172. Cette propriété semble impliquer le facteur atrial natriurétique (ANP, pour atrial natriuretic peptide), molécule anti-hypertrophique. En effet, celui-ci n'est pas surexprimé chez ces souris (son expression est semblable aux souris contrôles) et l'ajout d'éplérénone prévient totalement la diminution d'expression de ce peptide, montrant que l'aldostérone inhibe l'expression d'ANP via le RM172. La même équipe a montré que ces mêmes souris transgéniques présentaient une augmentation de molécules pro-inflammatoires et profibrosantes comme TGF-, ainsi qu'une diminution de l'expression de facteurs antifibrosants. L'éplérénone empêche cette diminution d'expression suggérant l'implication du RM dans la modulation des facteurs de régulation de la fibrose cardiaque171. Le modèle surexprimant l'aldostérone synthase dans le cardiomyocyte montre quant à lui une dysfonction vasculaire au niveau des artères coronaires173. L'augmentation de la synthèse de l'aldostérone dans le cardiomyocyte altère les réponses de relaxation indépendante du monoxyde d'azote des artères coronaires en inhibant l'expression de canaux potassiques dépendants du calcium au niveau des cellules musculaires lisses vasculaires173. Par contre, cette augmentation d'aldostérone empêche la réduction de la densité capillaire observée lors d'un diabète de type 1 expérimental174. L'importance de la voie minéralocorticoïde dans la circulation coronaire a également été observée et complétée récemment. Des souris surexprimant le RMh spécifiquement dans les cardiomyocytes présentent une sévère dysfonction de la réponse de relaxation dépendante du monoxyde d'azote dans les artères coronaires. Cet effet délétère est prévenu par le blocage du RM mais aussi par le blocage de la NADPH oxydase175. L'augmentation de l'activité de la NADPH oxydase est en effet observée chez ces souris transgéniques dans les cellules endothéliales coronariennes, suggérant un effet paracrine du cardiomyocyte sur la réactivité vasculaire des coronaires, via la NADPH oxydase. L'inactivation tissu-spécifique du RM a permis également de mieux définir les effets de celui-ci dans la physiopathologie cardiaque. Les souris dépourvues de RM dans les cardiomyocytes présentent une hypertrophie cardiaque et une expression plus forte que chez les contrôles de l'ANP à l'état de base. La sténose de la crosse aortique, modèle d'insuffisance cardiaque, induit un remodelage cardiaque et une diminution de la fraction d'éjection ventriculaire gauche, menant à une dilatation du ventricule et aboutissant à une insuffisance cardiaque. La délétion du RM dans les cardiomyocytes protège des effets délétères de la sténose sur la fonction cardiaque, contrairement à la délétion du récepteur dans le fibroblaste cardiaque176. Cette inactivation du RM dans le cardiomyocyte protège également des effets de l'infarctus du myocarde sur la fonction et le remodelage cardiaques. Une étude a montré qu'après la ligature de la coronaire gauche, entranant un infarctus du myocarde, les souris inactivées pour le RM spécifiquement dans le cardiomyocyte présentent une meilleure fraction d'éjection du ventricule gauche et une zone d'infarctus plus réduite que leurs souris contrôles. La néo-vascularisation plus importante est due à l'expression augmentée du facteur de croissance de l'endothélium vasculaire de type a (VEGF-a, pour vascular endothelial growth factor-a) par rapport aux souris contrôles177. Le remodelage et l'inflammation cardiaques induits par le modèle DOCA-Sel sont également prévenus dans ce modèle transgénique. Une étude a montré chez ces souris soumises au modèle DOCA-Sel une prévention de l'augmentation d'expression de marqueurs pro-fibrosants comme TGF- ainsi qu'une diminution du nombre de macrophages infiltrés dans le tissu par rapport à leurs contrôles178. Cette même équipe a étudié l'effet du modèle DOCA-Sel sur des souris étant inactivées spécifiquement pour le RM dans les monocytes et les macrophages. Ces souris n'ont pas d'altération du recrutement des monocytes et des macrophages vers ces zones inflammatoires induites par le modèle. Par contre, la fibrose cardiaque et l'augmentation de la pression artérielle sont prévenues. Cette étude suggère un nouveau rôle de la signalisation minéralocorticoïde des macrophages dans le cœur sous ces conditions physiopathologiques particulières179. 1. 5. 2. 5 Rôle du RM dans les arythmies cardiaques 1. 5. 2. 5. 1 Effets du RM sur les arythmies cardiaques en clinique Les troubles du rythme cardiaque, ou arythmies, ont pour conséquences des contractions irrégulières, anarchiques et rapides du cœur. A terme, ces troubles peuvent conduire à une insuffisance cardiaque voire même à l'arrêt. Les arythmies peuvent avoir pour origine les oreillettes comme la fibrillation atriale, ou les ventricules comme la fibrillation ventriculaire et les tachycardies ventriculaires et supraventriculaires. Bien que son rôle soit souvent sous-estimé, il est aujourd'hui reconnu que le complexe aldostérone/RM dans le cœur participe à la mise en place de ces arythmies. Une étude clinique en 2006 a mis en évidence une association entre une concentration plasmatique en aldostérone élevée et le développement de fibrillation et de tachycardie ventriculaires chez des patients ayant subi un infarctus du myocarde180. De manière complémentaire, l'administration d'antagonistes pharmacologiques du RM chez ces patients réduit considérablement le développement de tachycardie et de fibrillation ventriculaires181. Le rôle bénéfique des antagonistes du RM et les effets délétères de l'aldostérone ont également été observés dans la fibrillation atriale. Les patients atteints d'hyperaldostéronisme sont plus sujets à la fibrillation atriale que des patients atteints d'hypertension sans hyperaldostéronisme182. Par contre, lors d'une restauration électrique du rythme cardiaque, les patients atteints de fibrillation atriale voient leur aldostéronémie élevée diminuer rapidement183. De plus, l'expression du RM et de la 11- HSD2 dans les oreillettes est augmentée chez ces patients atteints de fibrillation atriale184, 185. Le blocage pharmacologique du RM par la spironolactone entrane chez ces patients une diminution du nombre d'hospitalisations et d'interventions restaurant le rythme cardiaque186. 1. 5. 2. 5. 2 Effets du RM sur les arythmies cardiaques chez l'animal De nombreux travaux expérimentaux se sont intéressés à l'activation du RM et à son implication dans la conduction électrique cardiaque pouvant mener aux arythmies. En effet, l'activation du RM a des conséquences sur le maintien de l'homéostasie calcique cellulaire. L'aldostérone augmente l'activité du canal calcique de type T dans la lignée cellulaire HL-1 de cellules atriales de souris et diminue parallèlement les courants potassiques correcteurs (IKr, pour rapidly-activating delayed rectifier potassium currents)184. Ces effets de l'aldostérone passent au moins par le RM puisque la spironolactone les prévient en partie. L'expression et l'activité de ce canal sont également augmentées dans des cultures primaires de cardiomyocytes de rats nouveau-nés187. Ex vivo, sur des cardiomyocytes de souris188 ou de rats nouveau-nés189, une excellente corrélation positive a été trouvée entre la concentration en aldostérone et l'activité du canal calcique de type L. In vivo, les souris surexprimant le RMh spécifiquement dans les cardiomyocytes présentent un remodelage ionique important170. Le courant potassique Ito diminue alors que celui provenant du canal calcique de type L augmente. Le récepteur à la ryanodine, qui permet la libération de calcium du réticulum sarcoplasmique vers le cytoplasme, est lui aussi modifié par l'activation du complexe aldostérone/RM. Les souris surexprimant le RMh spécifiquement dans les cardiomyocytes ou l'infusion d'aldostérone n'altèrent pas l'expression du récepteur à la ryanodine in vivo190. Par contre, ces modèles entranent une diminution d'expression du complexe d'inhibition du récepteur, responsable de l'ouverture anormale de celui-ci. Cette ouverture permet la fuite de calcium dans le cytoplasme qui joue un rôle important dans la mise en place d'arythmies cardiaques190. L'observation d'une létalité post-natale de plus de 50% chez ces souris transgéniques (sans altération de la structure cardiaque) suggère une mortalité relative à une dysfonction cardiaque, comme l'arythmie170. Bien que ces travaux indiquent un effet délétère de l'aldostérone sur les troubles du rythme cardiaque, ils ne permettent cependant pas de discriminer le rôle propre de l'hormone. Expérimentalement, les antagonistes pharmacologiques du RM sont capables de prévenir partiellement les troubles du rythme cardiaque. Chez des hamsters TO-2 présentant spontanément des tachycardies ventriculaires, le nombre de ces dernières est diminué avec l'éplérénone et la conduction électrique est améliorée191. Cet effet est dû en partie à l'amélioration de la dépression du segment ST et de la diminution de l'intervalle QT, variables composant l'électrocardiogramme191. Après une sténose de la crosse aortique, les souris montrent une diminution de l'expression de la connexine 43 dans les jonctions de type Gap accompagnée d'altérations de la vitesse de conduction. Ce remodelage est prévenu par la spironolactone, et comme l'éplérénone, permet l'amélioration de la vitesse de conduction192. Dans un modèle de fibrillation atriale chez le chien, la spironolactone empêche le développement de l'arythmie. De plus, elle prévient le remodelage des oreillettes ainsi que la fibrose et la mort par apoptose des cardiomyocytes193. Plus en amont du SRAA, un inhibiteur de l'ECA diminue le développement de fibrillation atriale provoquée électriquement chez le chien194. Cependant, l'inhibition de l'ECA semble moins efficace que celle du RM. Une étude clinique a en effet montré que la spironolactone, avec ou sans ajout d'un inhibiteur de l'ECA, diminue de 3 à 6 fois l'apparition d'évènement de fibrillation atriale comparativement aux patients n'ayant pas reçus la spironolactone113. En conclusion, ces études chez l'homme et l'animal soulignent le rôle du complexe aldostérone/RM dans le développement de troubles du rythme cardiaque. Le complexe aldostérone/RM altère la structure des oreillettes et des ventricules ainsi que leurs propriétés électrophysiologiques, et les arythmies atriales et ventriculaires en résultant sont bloquées en partie par l'utilisation d'antagonistes du RM. 1. 6 Objectifs de la thèse Pour mieux appréhender la physiopathologie du RM, notre laboratoire étudie les effets du complexe aldostérone/RM dans les tissus non épithéliaux à l'aide de modèles cellulaires et de modèles animaux transgéniques. Mon travail de thèse s'est intéressé particulièrement à la voie de signalisation cardiaque du RM. Ce travail avait deux objectifs : - l'identification de nouvelles cibles moléculaires du RM dans le cœur - la compréhension des effets physiopathologiques de son activation, dans le but d'identifier des mécanismes sous-tendant les effets bénéfiques des antagonistes pharmacologiques de ce récepteur en pathologie cardiaque. La première partie de ma thèse s'est focalisée sur une approche pharmacologique en étudiant l'effet du diurétique torasémide sur la signalisation du RM cardiaque. Ce travail consistait à montrer si le torasémide pouvait bloquer le RM comme cela avait été proposé précédemment. Ces travaux ont fait l'objet d'une publication en 2013 dont je suis le premier auteur. La seconde et majeure partie de mon travail de thèse a concerné l'étude de nouveaux gènes cibles du RM dans le cœur, à travers une approche génétique en deux temps. Une approche gène candidat à travers une étude détaillée du gène codant pour le facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF, pour connective tissue growth factor), et une approche transcriptomique globale du cœur de souris surexprimant spécifiquement le RMh dans le cardiomyocyte et de leurs souris contrôles. L'approche gène candidat a abouti à une publication en 2013 dont je suis le deuxième auteur. L'approche transcriptomique globale a mis en évidence, quant à elle, un nouveau processus biologique modulé par l'aldostérone dans le cœur. Ce travail, dont je suis le premier auteur, a été publié début 2015. Parallèlement à cette seconde partie de mon travail de thèse, j'ai cherché à identifier des microARNs en tant que nouvelles cibles potentielles du RM dans le cœur. Les microARNs sont des duplex d'ARNs non-codants d'une vingtaine d'oligonucléotides qui se lient aux ARNs messagers et empêchent leurs traductions en protéines (modulations post- transcriptionnelles). Leurs identifications et leurs conséquences physiopathologiques potentielles sont à l'heure actuelle peu abordées dans cette signalisation minéralocorticoïde. PARTIE 2 : MATERIELS ET METHODES L'ensemble des matériels et méthodes employés est détaillé dans chacun des articles présentés dans la partie résultats. Cependant, cette partie se propose de décrire et de détailler les méthodes spécifiques utilisées dans nos approches nous paraissant en ce sens originales, ainsi que les méthodes utilisées concernant les résultats non publiés mais présentés dans la partie 3. 2. 1 Modèles animaux 2. 1. 1 Surexpression conditionnelle du RM spécifiquement dans les cardiomyocytes Les souris surexprimant le RMh spécifiquement dans les cardiomyocytes sont issues du croisement de deux lignées de souris transgéniques : une lignée transactivatrice MHC- tTA qui exprime la protéine transactivatrice tTA sous le contrôle du promoteur de la chane lourde de la myosine (MHC, pour myosin heavy chain), ciblant uniquement les cardiomyocytes ; et une lignée réceptrice tetO-RMh qui exprime le RMh sous la dépendance d'un promoteur minimal dérivé de l'opéron du gène de résistance à la tétracycline d'Escherichia Coli1, composé d'un promoteur minimal cytomégalovirus et de sept opérateurs sensibles à la tétracycline (tetO). Ce modèle transgénique utilise le système d'expression conditionnelle tétracycline tetOFF permettant un contrôle spatial et temporel de l'expression. La protéine transactivatrice tTA est inactive en présence d'un antibiotique dérivé des tétracyclines, la doxycycline (Dox). En absence de Dox, tTA peut se lier au promoteur contenant les tetO pour promouvoir la formation d'un complexe transcriptionnel et l'expression de la protéine d'intérêt RMh contrôlée par le promoteur MHC spécifique du cardiomyocyte. Ce croisement permet d'obtenir dans la descendance, des souris dites double transgéniques dénommées RM-Cardio ayant intégré les deux transgènes, et des souris contrôles représentées par des souris sauvages n'ayant aucun des transgènes ainsi que des souris monotransgéniques ayant la construction réceptrice tetO-RMh ou transactivatrice MHC-tTA. La proportion de chaque génotype est de 25% et l'ajout de Dox (2 mg/mL dilué dans 2% de sucrose pour masquer le goût amer de la Dox) dans l'eau de boisson permet d'éteindre l'expression du transgène. Figure 9. Schéma du modèle murin transgénique surexprimant le RMh spécifiquement dans les cardiomyocytes. Le système tétracycline est un système inductible permettant ici l'expression du gène RMh spécifiquement dans les cardiomyocytes. Seules les souris double transgéniques expriment le transgène, en absence de doxycycline. Si on veut éteindre le transgène, la doxycycline est ajoutée à l'eau de boisson. Dox : doxycycline ; MHC : promoteur du gène codant pour la chane lourde de la myosine, spécifique du cardiomyocyte ; tetO : Opérateur sensible à la tétracycline ; tTA : Protéine transactivatrice. 2. 1. 2 Protocoles 2. 1. 2. 1 Effet de l'infusion d'aldostérone sur les souris RM-Cardio 2. 1. 2. 1. 1 Administration du traitement Des souris mâles de quatre mois RM-Cardio et leurs contrôles sont traitées pendant une semaine soit : - avec de l'aldostérone (Sigma-Aldrich, France) à une dose de 60 g/kg/jour via une mini- pompe osmotique d'un débit de 0, 15 L/heure (Alzet, Etats-Unis). La pose de la mini-pompe osmotique nécessite d'anesthésier l'animal à l'aide d'une injection intrapéritonéale d'un mélange de kétamine et de xylasine (n 6 pour les RM-Cardio et n 9 pour les contrôles) - avec de la corticostérone (Sigma-Aldrich, France) dissoute dans la -cyclodextrine (Sigma- Aldrich, France) et administrée à une dose d'environ 5 mg/kg/jour dans l'eau de boisson dans une bouteille opaque protégeant la solution de la lumière (n 6 pour les deux génotypes) - non traitées (n 7 pour les deux génotypes). A la fin du traitement, les animaux sont pesés et sacrifiés par décapitation. Le sang est récupéré extemporanément puis le cœur est prélevé. 2. 1. 2. 1. 2 Préparation du cœur Les cœurs sont rincés dans du tampon phosphate salin froid à 4C (PBS, pour phosphate buffer saline) puis pesés à l'aide d'une balance de précision. Les oreillettes sont exclues puis les ventricules sont divisés en trois (coupes transversales) ; le milieu est congelé dans un gel O. C. T (CellPath, Royaume-Uni) durcissant à -20C et utilisé pour les études immuno- histologiques tandis que la base et l'apex du cœur sont congelés dans l'azote liquide puis conservés à -80C pour l'étude de l'expression des protéines et des ARNm. 2. 1. 2. 1. 3 Extraction des ARNs totaux, réalisation et analyse du transcriptome Le transcriptome cardiaque par puces à oligonucléotides de cinq à six souris par groupe a été effectué. Les ventricules cardiaques congelés sont broyés à l'aide de tubes à billes Lysing Matrix D (MP Biomedicals, Etats-Unis). L'extraction des ARNs totaux est réalisée à l'aide du kit RNeasy mini, par colonne d'affinité (Qiagen S. A. Courtabœuf, France). Pendant l'extraction, les échantillons sont traités avec la désoxyribonucléase de type I (DNase I set ; Qiagen S. A. Courtabœuf, France) afin d'éviter toute contamination d'ADN génomique. A la fin de l'extraction, les ARNs sont resuspendus dans de l'eau sans trace de ribonucléases (RNase Free water ; Qiagen S. A. Courtabœuf, France), puis dosés au spectrophotomètre à une longueur d'onde de 260 nanomètres (Implen, Allemagne). La qualité et l'intégrité des ARNs sont vérifiées avec le Bioanalyzer 2100 (Agilent technologies, Venissieux, France). Les puces à oligonucléotides sont effectuées en utilisant le kit de souris GE 444K V2 (Agilent Technologies, Etats-Unis) et les étapes de marquage des ARNs, d'hybridation et de révélation suivent les instructions du fabricant. Les résultats des différents transcriptomes sont analysés à l'aide du logiciel Genespring (Agilent Technologies, Etats-Unis), avec une probabilité d'erreur à 1% et un seuil de significativité 1, 5. Une analyse par Gene Ontology via FunNet ( est ensuite effectuée sur les gènes différentiellement exprimés. Ce logiciel permet d'associer de manière significative les transcrits par rapport à un processus biologique donné, en identifiant pour chaque transcrit un ou plusieurs thèmes biologiques caractéristiques. Le système d'annotation est celui fourni par le Gene Ontology Consortium et par le Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. De plus, les gènes différentiellement exprimés sont ensuite inclus dans un réseau moléculaire global développé à partir de la base de donnée du logiciel IPA Ingenuity Systems (Qiagen, S. A. Courtabœuf, France). Le nombre d'interactions que chaque gène peut mettre en place avec d'autres est calculé à l'aide d'un algorithme et représenté sous forme d'un réseau de gènes. 2. 1. 2. 2 Etude des microARNs comme cibles potentielles du RM 2. 1. 2. 2. 1 Extraction des microARNs totaux, et réalisation du miRnome Onze souris (6 souris contrôles et 5 souris RM-Cardio non traitées, confer chapitre 2. 1. 2. 1) ont été utilisées pour réaliser ces expériences sur la modulation des microARNs (miR). Les ventricules cardiaques congelés sont broyés à l'aide de tubes à billes Lysing Matrix D (MP Biomedicals, Etats-Unis). L'extraction des ARNs totaux (majoritairement des ARNm et contenant les microARNs) est réalisée à l'aide du kit RNeasy mini, par colonne d'affinité (Qiagen S. A. Courtabœuf, France). Pendant l'extraction, les échantillons sont traités avec la désoxyribonucléase de type I (DNase I set ; Qiagen S. A. Courtabœuf, France) afin d'éviter toute contamination d'ADN génomique. A la fin de l'extraction, les ARNs sont resuspendus dans de l'eau sans trace de ribonucléases (RNase Free water ; Qiagen S. A. Courtabœuf, France), puis dosés au spectrophotomètre à une longueur d'onde de 260 nm (Implen, Allemagne). Les échantillons sont ensuite purifiés à l'aide du kit Phase Lock Gel (5 Prime, Allemagne), dosés à nouveau puis leur intégrité est vérifiée avec le Bioanalyzer 2100 (Agilent technologies, Venissieux, France). L'étude de l'ensemble des microARNs transcrits (miRnome) pour chaque échantillon est effectué à partir de 600 ng d'ARN total par puces à oligonucléotides (GeneChip miRNA 2. 0 arrays, Affymetrix, Etats-Unis), et les étapes de marquage des ARNs, d'hybridation et de révélation respectent les instructions du fabricant. 2. 1. 2. 2. 2 Analyse du miRnome Cette étape a été réalisée en collaboration avec une équipe au Luxembourg (centre de recherche public de la santé, Luxembourg). Les niveaux d'expression des microARNs sont analysés en utilisant une technique appelée Robust Multi-array Average195 qui permet d'éviter de sélectionner les échantillons faux positifs, ainsi qu'en effectuant une normalisation par quantile pour diminuer au maximum la variabilité entre les échantillons. Par conséquent, seuls les microARNs matures pertinents sont gardés. Etant donné que seuls trois microARNs ont été identifiés comme différentiellement exprimés dans le cœur de souris RM-Cardio par rapport à leurs souris contrôles, une analyse comparative des miRnomes et des transcriptomes correspondants est effectuée par le test du coefficient de corrélation de Pearson. La base de données TargetScan ( est utilisée pour réduire le nombre de faux positifs et pour sélectionner les paires ARNm : microARN montrant un coefficient de corrélation r < -0, 8 et qui sont retrouvées dans les paires ARNm : microARN prédictives. 2. 1. 2. 2. 3 Rétrotranscription et PCR quantitative des microARNs cibles 10 ng d'ARN sont ensuite rétrotranscrits en ADNs complémentaires (ADNc) en utilisant le kit TaqMan MicroRNA Cells-to CT (Life Technologies, Etats-Unis). Ce processus comprend trois étapes : 30 minutes à 16C, suivie de 30 minutes à 42C puis 5 minutes à 85C. L'ADNc produit est le complémentaire d'un seul microARN par réaction. En effet, cette étape nécessite l'utilisation d'amorces oligopeptidiques spécifiques d'une seule cible à la fois. Nous avons utilisé les amorces du miR-1941-5p et du miR-17 qui est exprimé de manière ubiquitaire et servant de contrôle (les amorces oligopeptidiques sont achetées chez Life Technologies mais leurs séquences ne sont pas disponibles). L'ADNc nouvellement synthétisé peut être conservé à -20C. L'amplification semi-quantitative en temps réel (PCR quantitative ou qPCR, pour quantitative Polymerase Chain Réaction) est réalisée à l'aide de l'iCycler (Biorad, Etats-Unis) à partir de 1 ng d'ADNc obtenus après l'étape de rétrotranscription. La qPCR est réalisée avec une dénaturation initiale (95C durant 10 minutes) et 40 cycles de dénaturation (95C durant 15 secondes), d'hybridation et d'élongation (60C durant 1 minute). La polymérisation des amplicons produits est mesurée à la fin de chaque cycle grâce à la fluorescence émise par la sonde TaqMan (kit Universal PCR Master Mix II, No UNG, Life technologies, Etats-Unis). L'efficacité de chaque couple d'amorces est déterminée à l'aide d'une dilution en cascade d'un mélange d'ADNc. Le niveau relatif d'ADNc de chaque échantillon pour le gène d'intérêt est normalisé par rapport à un gène de référence, ici le miR-17, puis normalisé une deuxième fois par rapport au groupe contrôle expérimental. Les variations d'expressions sont exprimées en valeurs relatives. 2. 1. 2. 3 Effets du torasémide in vivo 2. 1. 2. 3. 1 Modèle pharmacologique DOCA-Sel d'excès de minéralocorticoïde Le modèle DOCA-Sel consiste en l'association d'une infusion chronique sous-cutanée de déoxycorticostérone acétate (hormone précurseur de l'aldostérone) et d'un ajout de sodium dans l'eau de boisson. Pour la pose du comprimé de DOCA (Innovative Research, Etats- Unis), les souris sont anesthésiées à l'aide d'une injection intrapéritonéale d'un mélange de kétamine et de xylasine, tondues au niveau de la région scapulaire et déposées sur un tapis chauffant maintenant leur température corporelle à 37C. Le champ opératoire est désinfecté avec de la Bétadine (MEDAPharma, Suède). Une incision latérale est réalisée à travers la peau au niveau de la région scapulaire et le comprimé est placé en sous-cutané et remplacé 1 fois au bout de trois semaines. La peau est refermée à l'aide d'un fil de suture 5/0 (Ethicon, Etats-Unis). Le groupe contrôle est soumis au même protocole, avec pose d'un comprimé placebo de DOCA. Le lendemain de la pose des comprimés, l'eau de boisson est complétée avec 1% de chlorure de sodium et le régime est normal. Les souris sont pesées et sacrifiées au bout de six semaines de traitement. Les souris mâles de quatre mois C57BL/6JRj sont réparties en 4 groupes : - un groupe de souris contrôles avec le comprimé placebo de DOCA (Ctrl, n 8) - un groupe de souris DOCA avec le comprimé de DOCA diffusant une dose constante pendant 21 jours, à partir de 50 mg de composé (DOCA, n 6) - un groupe de souris DOCA avec ajout dans l'eau de boisson de spironolactone (Sigma- Aldrich, France) à une dose de 15 mg/kg/jour (DOCA S, n 7) - un groupe de souris DOCA avec ajout dans l'eau de boisson de torasémide (CEVA, France) à une dose de 1 mg/kg/jour (DOCA T, n 6). 2. 1. 2. 3. 2 Extraction des ARNs totaux et rétrotranscription Le cœur et le rein droit des souris sont préparés (confer chapitre 2. 1. 2. 1. 2) et congelés à -80C. Les organes congelés sont broyés à l'aide de tubes à billes Lysing Matrix D (MP Biomedicals, Etats-Unis). L'extraction des ARNs totaux est réalisée avec le kit RNeasy mini, par colonne d'affinité (Qiagen S. A. Courtabœuf, France). Pendant l'extraction, les échantillons sont traités avec la désoxyribonucléase de type I (DNase I set ; Qiagen S. A. Courtabœuf, France) afin d'éviter toute contamination d'ADN génomique. A la fin de l'extraction, les ARN sont resuspendus dans de l'eau sans trace de ribonucléases (RNase Free water ; Qiagen S. A. Courtabœuf, France), puis dosés au spectrophotomètre (Implen, Allemagne) à une longueur d'onde de 260 nm. Les ARNm sont considérés de bonne qualité si le ratio 260/280 est supérieur à 1, 6. 500 ng d'ARNm sont ensuite rétrotranscrits en ADNc à l'aide de l'enzyme SuperscriptII (Life Technologies, Etats-Unis). L'ADNc produit est conservé à -20C. 2. 1. 2. 3. 3 PCR quantitative L'amplification semi-quantitative en temps réel est réalisée à l'aide de l'iCycler (Biorad, Etats-Unis) à partir de 6 ng d'ADNc obtenus après l'étape de rétrotranscription. La qPCR est réalisée avec une dénaturation initiale (95C durant 10 minutes) et 40 cycles de dénaturation (95C durant 15 secondes), d'hybridation et d'élongation (60C durant 1 minute). La polymérisation des amplicons produits est mesurée à la fin de chaque cycle grâce à la fluorescence émise par l'agent intercalent SYBR Green (Biorad, Etats-Unis). L'efficacité de chaque couple d'amorces est déterminée à l'aide d'une dilution en cascade d'un mélange d'ADNc. Le niveau relatif d'ADNc de chaque échantillon pour le gène d'intérêt est normalisé par rapport à un gène de référence, puis normalisé une deuxième fois par rapport au groupe contrôle expérimental. Les variations d'expressions sont exprimées en valeurs relatives. Les séquences des amorces oligopeptidiques utilisées sont listées dans le Tableau 1. Tableau 1. Séquences des amorces oligopeptidiques sens et antisens utilisées chez la souris pour réaliser les PCR quantitatives. ANP : facteur atrial natriurétique ; Ccnb1 : Cyclin B1 ; Cdk1 : Cyclin-dependent kinase 1 ; Col I : Collagène I ; Col III : Collagène III ; CTGF : connective tissue growth factor ; ENaC : sous-unité du canal épithélial sodique ; Sgk-1 : Serum and glucocorticoid-regulated kinase-1 ; TIMP-1 : tissue inhibitor of matrix- metalloproteinase-1 ; Ubc : Ubiquitine C. 2. 2 Modèles cellulaires 2. 2. 1 Lignées cellulaires 2. 2. 1. 1 Lignée cellulaire H9C2-RM C'est une lignée cellulaire de cardiomyocytes dérivée de ventricules embryonnaires de rat et transfectée de façon stable avec le RM de rat68. Cette lignée H9C2-RM a été développée et caractérisée par nos collaborateurs Aniko et Geza Fejes-Toth et présente des caractéristiques de cardiomyocytes comme l'expression du canal calcique de type L et de la chane lourde de la myosine. Ces cellules sont cultivées dans le milieu DMEM/F12, pour Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12, supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal et un mélange d'antibiotiques (pénicilline-streptomycine, Life Technologies, Etats-Unis) jusqu'à environ 80% de confluence. Les cellules sont ensuite cultivées dans un milieu destéroïdé 24 heures avant les différentes stimulations. Après 24 heures de traitement, les cellules sont grattées de leurs puits et centrifugées 12 secondes à vitesse maximum (Centrifuge 5415R ; Eppendorf, Etats-Unis). Le culot cellulaire est ensuite utilisé pour extraire l'ARN (le procédé est le même que celui expliqué dans les chapitres 2. 1. 2. 1 et 2. 1. 2. 2). 2. 2. 1. 2 Lignée cellulaire H9C2-RM /MMTV-Luciférase La lignée cellulaire H9C2-RM a été transfectée avec une construction contenant le gène codant pour la luciférase sous le contrôle d'une région génique du rétrovirus Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV) contenant des ERH reconnus par le RM196. Cette région génique du rétrovirus MMTV est clonée à l'aide du plasmide pSP72 (Promega) selon les instructions du fabricant. Le plasmide pSVD5Luc (Promega) contenant le gène codant pour la luciférase (Luc) et le site de polyadénylation, possède également la construction contenant la région génique du MMTV, via l'utilisation de deux enzymes de restriction agissant au niveau de sites spécifiques. Cette construction MMTV-Luc est ensuite transfectée dans les cellules H9C2-RM . Environ 3 millions de cellules sont ensemencées dans des plaques de 6 puits (Becton-Dickinson, France) 24 heures avant la transfection. Dans chaque puits, 1 g de la construction MMTV-Luc et 4 L de Reagent Plus (Life Technologies, Etats-Unis) sont incubés 15 minutes à température ambiante dans 100 L d'Optimem (Life Technologies, Etats-Unis) puis 3 L de Lipofectamine sont ajoutés (préalablement diluée dans 100 L d'Optimem). Après une nouvelle incubation de 15 minutes à température ambiante, 800 L d'Optimem sont ajoutés et la réaction se déroule pendant 4 heures. Le milieu réactionnel est remplacé par le milieu de culture complet des cellules H9C2-RM et deux jours après la transfection, les clones résistants à l'antibiotique de la famille des aminoglycosides G418 (Life Technologies, Etats-Unis) sont isolés puis amplifiés. Le clone 23, appelé donc H9C2- RM /MMTV-Luc, a été utilisé dans les études sur l'activité transcriptionnelle du RM. Ces cellules sont cultivées dans le milieu DMEM/F12 supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal et un mélange d'antibiotiques (pénicilline-streptomycine, Life Technologies, Etats-Unis) jusqu'à environ 80% de confluence. Les cellules sont ensuite cultivées dans un milieu destéroïdé 24 heures avant les différentes stimulations. Après 24 heures de traitement, les cellules sont grattées de leurs puits et centrifugées 12 secondes à vitesse maximum (Centrifuge 5415R ; Eppendorf, Etats-Unis). Le culot cellulaire est ensuite utilisé pour extraire l'ARN (le procédé est le même que celui expliqué dans les chapitres 2. 1. 2. 1 et 2. 1. 2. 2). 2. 3 Analyses statistiques Les tests présentés ici sont ceux utilisés pour les résultats présentés dans ma thèse mais non publiés. Les résultats sont exprimés en donnant la valeur moyenne de chaque groupe plus ou moins l'erreur standard à la moyenne (Moyenne ESM). Pour une comparaison de 2 groupes, le test non paramétrique de Mann-Whitney est utilisé. Pour une comparaison de plus de 2 groupes, une analyse de la variance sur les rangs (ANOVA sur les rangs, pour ANalysis Of Variance on ranks) à 1 voie (effet du traitement) ou à 2 voies (effets du génotype et du traitement) suivie des post-tests de Student-Newman-Keuls ou de Dunn's est réalisée. Les différences entre groupes sont considérées significatives lorsque P L'analyse statistique est réalisée à l'aide du logiciel SigmaPlot (V. 11. 0, Etats-Unis). PARTIE 3 : RESULTATS ET DISCUSSIONS 3. 1 Approche pharmacologique 3. 1. 1 Effets in vitro du torasémide sur la signalisation du RM cardiaque 3. 1. 1. 1 Etat de la question Ce travail a été mené dans le cadre d'une collaboration industrielle avec un laboratoire pharmaceutique s'intéressant aux propriétés du torasémide. Ce dernier est un diurétique de la branche ascendante de l'anse de Henlé et du tubule contourné distal, de nom chimique 1- isopropyl-3-[4-(3-méthyl-phénylamino)-pyridine]-urée. Le torasémide, comme le furosémide, inhibe la réabsorption de sodium en bloquant le cotransporteur Na /K /2Cl-, et pourrait également se lier au RM. En effet, une étude a montré que le torasémide diminue la liaison de l'aldostérone à son récepteur cytoplasmique dans des homogénats de reins de rat197. Par ailleurs, le torasémide est également impliqué dans le développement de la fibrose. Chez les patients atteints d'insuffisance cardiaque, il diminue au niveau du cœur l'activité de la protéase clivant l'extrémité C-terminale du procollagène de type I, responsable de la maturation du collagène de type I198. Le torasémide prévient également de manière dose- dépendante l'augmentation de l'expression du collagène III, du TGF- et de l'aldostérone synthase dans un modèle de cardiomyopathie chez le rat199. Il a aussi été montré que le TGF- et l'aldostérone augmentent l'activité de la protéase clivant l'extrémité C-terminale du procollagène de type I in vitro dans des fibroblastes cardiaques de rats nouveau-nés200. L'un des mécanismes proposés expliquant les effets bénéfiques des bloqueurs du RM dans les études cliniques citées précédemment (comme RALES et EPHESUS) est la diminution de la fibrose cardiaque chez les patients insuffisants cardiaques et il a été montré que le torasémide améliore plus efficacement que le furosémide la survie des patients en insuffisance cardiaque de stade II ou III201. Nous nous sommes donc demandé si le torasémide pouvait avoir un effet anti-RM. 3. 1. 1. 2 Objectif de l'étude Ce travail a eu pour objectif d'étudier les effets potentiels du torasémide sur la signalisation du RM dans le cœur. Pour répondre à cette question, nous avons testé sa capacité à bloquer le RM en comparaison à l'effet de la spironolactone, antagoniste bien connu du RM. L'étude s'est appuyée sur une série d'investigations in vitro et a fait l'objet d'une publication en 2013 dont je suis le premier auteur, présentée ci-dessous. 3. 1. 1. 3 Article : The Diuretic Torasemide Does Not Prevent Aldosterone-Mediated Mineralocorticoid Receptor Activation in Cardiomyocytes Les figures et tableaux supplémentaires n'apparaissant pas dans la version publiée de l'article, ceux-ci ont donc été rajoutés à la suite du PDF. The Diuretic Torasemide Does Not Prevent Aldosterone- Mediated Mineralocorticoid Receptor Activation in Cardiomyocytes Basile Gravez1, Antoine Tarjus1, Ruben Jimenez-Canino2, Soumaya El Moghrabi1, Smail Messaoudi1, Diego Alvarez de la Rosa2, Frederic Jaisser1, 3* 1 INSERM Unité 872, Université Pierre et Marie Curie, Team 1, Centre de Recherche des Cordeliers, Paris, France, 2 Department of Physiology and Institute of Biomedical Technologies, Universidad de La Laguna, Tenerife, Spain, 3 Centre d' Investigation Clinique, Institut Lorrain du Coeur et des Vaisseaux, Centre Hospitalier Universitaire de Brabois, Vandoeuvre-lès-Nancy, France Abstract Aldosterone binds to the mineralocorticoid receptor (MR) and exerts pleiotropic effects beyond enhancing renal sodium reabsorption. Excessive mineralocorticoid signaling is deleterious during the evolution of cardiac failure, as evidenced by the benefits provided by adding MR antagonists (MRA) to standard care in humans. In animal models of cardiovascular diseases, MRA reduce cardiac fibrosis. Interestingly diuretics such as torasemide also appear efficient to improve cardiovascular morbidity and mortality, through several mechanisms. Among them, it has been suggested that torasemide could block aldosterone binding to the MR. To evaluate whether torasemide acts as a MRA in cardiomyocytes, we compared its effects with a classic MRA such as spironolactone. We monitored ligand-induced nuclear translocation of MR-GFP and MR transactivation activity in the cardiac-like cell line H9C2 using a reporter gene assay and known endogenous aldosterone- regulated cardiac genes. Torasemide did not modify MR nuclear translocation. Aldosterone-induced MR transactivation activity was reduced by the MRA spironolactone, not by torasemide. Spironolactone blocked the induction by aldosterone of endogenous MR-responsive genes (Sgk-1, PAI-1, Orosomucoid-1, Rgs-2, Serpina-3, Tenascin-X), while torasemide was ineffective. These results show that torasemide is not an MR antagonist ; its association with MRA in heart failure may however be beneficial, through actions on complementary pathways. Citation : Gravez B, Tarjus A, Jimenez-Canino R, El Moghrabi S, Messaoudi S, et al. (2013) The Diuretic Torasemide Does Not Prevent Aldosterone-Mediated Mineralocorticoid Receptor Activation in Cardiomyocytes. PLoS ONE 8(9) : e73737. doi : 10. 1371/journal. pone. 0073737 Editor : Philippe Rouet, I2MC INSERM UMR U1048, France Received May 8, 2013 ; Accepted July 23, 2013 ; Published September 9, 2013 Copyright : 2013 Gravez et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. Funding : This work was supported by grants from INSERM (Institut National pour la Santé et Recherche Médicale), a CEVA company research grant, the Centre de Recherche Industrielle et Technique' and the Ministerio de Economa y Competitividad (Spain), grant BFU2010-16265 to D. A. R. B. G. and A. T. were recipients of PhD grant from the French Ministry of Research. R. J. -C. is supported by a predoctoral fellowship from Cajacanarias (Spain). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript. Competing Interests : As mentioned in the funding sources, this work was partly supported by a grant from the CEVA company. This does not alter the authors' adherence to all the PLOS ONE policies on sharing data and materials. * E-mail : frederic. jaisser@inserm. fr Introduction has been reported for torasemide by the group of Uchida in 1991 : administration of a relatively high dose of torasemide significantly The use of loop diuretics such as furosemide and torasemide is inhibited in vivo binding of aldosterone to its receptor in the classically included in the therapeutic arsenal for the symptomatic cytoplasmic fraction of rat kidney homogenates, whereas furose- treatment of congestive heart failure. The TOrasemide In mide had no effect [5]. This results led to the hypothesis that Congestive heart failure trial (TORIC), showed that torasemide torasemide may also act as a mineralocorticoid receptor antago- had more beneficial effects on mortality and morbidity of patients nist. with CHF than furosemide [1]. Part of the benefit may be related Indeed, inappropriate mineralocorticoid signaling has been to the different pharmacokinetic properties of torasemide, such as shown to play an important role in the progression of cardiovas- the longer half-life, the longer duration of action and the higher cular (CV) disease. Aldosterone (Aldo) is a main regulator of renal bioavailability as compared to furosemide. However it has also sodium reabsorption with an overall effect on volemia and blood been suggested that torasemide has pharmacodynamic properties pressure. Aldo binds to the mineralocorticoid receptor (MR), a beyond its loop diuretic effect. Indeed, torasemide has specific transcription factor of the nuclear receptor family present in the vascular effects as compared to furosemide : it inhibits angiotensin kidney and also in non-epithelial cells [6]. New extra-renal II (AngII)-induced vasoconstriction in the aorta of Spontaneously pathophysiological effects of this hormone have been character- Hypertensive Rats [2] as well as AngII-stimulated vascular smooth ized, extending its actions to the CV system and inappropriate MR muscle cell growth [3]. Torasemide also inhibits thromboxane A2- activation has been shown to promote cardiac fibrosis in induced vasoconstriction in isolated canine artery [4]. Further- experimental models [7]. The Randomized Aldactone Evaluation more, a possible blockade of mineralocorticoid receptor binding of Study (RALES) [8], the Eplerenone PostAcute Myocardial aldosterone (called anti-aldosteronergic effect in the initial paper) Infarction Heart Failure Efficacy and Survival Study (EPHESUS) PLOS ONE | 1 September 2013 | Volume 8 | Issue 9 | e73737 Torasemide and Spironolactone on Cardiomyocytes [9] and Eplerenone in Mild Patients Hospitalization and Survival Cells were then treated for 24 h with aldosterone, spironolactone, Study in Heart Failure (EMPHASIS-HF) [10] clinical trials have the GR antagonist RU 38486 (1026 M ; Sigma) or torasemide, demonstrated that the addition of MR antagonists to standard care alone or in combination. Luciferase activity was assayed according markedly reduced the overall and cardiovascular mortality in to the manufacturers instructions (Dual-LightH Luciferase Assay ; patients with left ventricular systolic dysfunction and mild or Applied Biosystems). severe symptoms of chronic heart failure (HF) or with signs of HF after acute myocardial infarction. The beneficial effects of MR Gene Expression in H9C2-MR Cells antagonists in HF are associated with a reduction of cardiac H9C2-MR cells were treated with various concentrations (as fibrosis [7]. indicated in figure legends) of aldosterone, torasemide and/or In patients with chronic HF, torasemide has been reported to spironolactone and the expression of the MR-modulated genes reduce myocardial fibrosis [1113]. As this effect was not observed was measured using quantitative RT-PCR for Serum- and in furosemide-treated patients, the ability of torasemide to act on glucocorticoid-inducible kinase-1 (Sgk-1), Orosomucoid-1, Ser- myocardial fibrosis might be related to interference with pina-3, Plasminogen Activator Inhibitor-1 (PAI-1), Tenascin-X profibrotic factors such as aldosterone and AngII. and Regulator of G protein signaling-2 (Rgs-2). This putative anti-aldosterone/anti-mineralocorticoid receptor property of torasemide has potential therapeutic outcomes in the Quantitative RT- PCR treatment of HF. From a clinical point of view, it is therefore Total RNA was extracted from cells (4 to 8 wells per condition) important to determine whether torasemide and spironolactone, using TRIZOLH reagent (InVitrogen), according to the manufac- the classical mineralocorticoid receptor antagonist (MRA), have turer's protocol, and DNase-treated. Reverse transcription was similar targets and whether these drugs should be associated to performed with 2 mg of total RNA, random primers (InVitrogen) potentiate their efficacy in the treatment of HF. The aim of this and Superscript II reverse transcriptase (InVitrogen). Transcripts study was to analyze whether torasemide acts as a MRA in levels were analyzed by real time PCR in an iCycler iQ apparatus cardiomyocytes, in comparison with spironolactone. (Bio-Rad Laboratories, Marnes La Coquette, France) with SYBR Green I detection. The reactions were performed in duplicate for Materials and Methods each sample using a qPCR MasterMix Plus SYBR with fluorescein Ligand-induced MR Nuclear Translocation Assay (Eurogentec, Angers, France) with 5 1027 M of each sense and COS-7 is a fibroblast-like cell line derived from monkey kidney antisense primer and 6 ng of cDNA in 15 mL total volume. The tissue classically used for transactivation assays due to the absence thermal cycling parameters were : initial denaturation at 95uC for of endogenous expression of MR or the related glucocorticoid 10 min, followed by 40 cycles at 95uC for 15 sec and 60uC for receptor (GR) [14]. COS-7 cells were obtained from the American 1 min. Relative expression of the mRNA was quantified using the Type Culture Collection and grown in DMEM supplemented with equation described by M. W. Pfaffl [19] : ratio (Etarget) Cttarget(mean 10% FBS. Cells were transiently transfected with a functional control-sample)/( Eref) Ctref(mean control-sample). The mRNA levels were fluorescent variant of the mouse MR (MR-147-GFP) [15] using normalized for b-actin mRNA in samples obtained from cultured jetPRIME (Polyplus Transfection, Illkirch, France) according to cells. Values in control conditions were set as 1 for each gene, and the manufacturers instructions. At the time of transfection, cells fold changes are provided on the figures. The sequences of the grown on coverslips were transferred to medium containing specific primers are detailed in Table S1. charcoal-stripped serum (Lonza, Barcelona, Spain). Forty-eight hours after transfection, cells grown on coverslips were placed Statistical Analysis under an Olympus Fluoview FV1000 confocal microscope with an Results are provided as mean 6 SEM. Differences between imaging chamber pre-heated to 37uC. For imaging experiments, experimental conditions were tested by the Kruskal-Wallis One culture medium was substituted by extracellular saline (1023 mol/ Way Analysis of Variance on Ranks test. The Newman-Keuls liter : NaCl, 137 ; KCl, 4 ; CaCl2, 1. 8 ; MgCl2, 1 ; glucose, 10 ; posthoc test was used to adjust for multiple comparisons HEPES, 10 ; pH 7. 4). Cells were treated or not with 1028 M (SigmaPlot V. 11. 0 software). Values of p, 0. 05 were considered aldosterone, 1026 M torasemide (Sigma, St. Louis, MO) and statistically significant. 1026 M spironolactone (Sigma, St. Louis, MO) and images were acquired every 2 minutes (min) for one hour. Total and nuclear Results fluorescence intensity was analyzed frame by frame in individual cells using the manufacturers software (Olympus). Data processing Effect of Torasemide on MR Translocation into the and curve fitting were performed using Igor Pro (Wavemetrics, Nucleus Lake Oswego, OR). MR is a nuclear transcription factor. Upon ligand binding, MR shuttles from its cytoplasmic localization into the nucleus. We first H9C2-MR Cardiomyocyte Transactivation Assay analyzed the kinetics of ligand-induced MR translocation in COS- H9C2-MR cells is a clonal cell line of cardiomyocytes derived 7 cells transiently transfected with the previously described MR- from the embryonic rat ventricle that stably expresses the MR 147-GFP functional fluorescent variant of MR [15]. It has [16]. H9C2-MR cells (kindly provided by A Fejes-Toth) were previously been shown that under non-stimulated conditions, stably transfected with a MMTV-Luc reporter construct [17] MR is present both in the cytoplasm and the nucleus, but addition (kindly provided by H. Richard-Foy) using lipofectamine 2000 as of aldosterone induces nuclear accumulation of the receptor [20]. previously described [18]. Clone 23, thereafter referred as H9C2- In cells treated with 1028 M aldosterone, cytosolic MR-GFP MR/MMTV-Luc, was selected for further transactivation studies. initiated its translocation to the nucleus within minutes, with a H9C2-MR/MMTV-Luc cells were grown in DMEM/F12 half-maximal translocation time of approximately 18 minutes medium supplemented with 10% fetal bovine serum plus (Figure 1). In cells treated with 1026 M torasemide alone (without antibiotic (penicillin-streptomycin ; Invitrogen, Carlsbad, CA). aldosterone) no translocation of the MR-GFP was detected. 24 h before treatment, cells were grown in steroid-free medium. Spironolactone alone (1026 M), however, induced MR transloca- PLOS ONE | 2 September 2013 | Volume 8 | Issue 9 | e73737 Torasemide and Spironolactone on Cardiomyocytes Figure 1. In vivo kinetics of nuclear translocation of MR in COS- 7 cells. COS-7 cells transfected with GFP-MR were treated with 1028 M aldosterone (Aldo), 1028 M aldosterone 1026 M torasemide (Aldo Tora), 1028 M aldosterone 1026 M spironolactone (Aldo Spiro), 1026 M spironolactone (Spiro) or 1026 M torasemide (Tora), starting at time 0. Individual points represent the average percentage fluorescent intensity of the nucleus vs. total cellular fluorescence (Fn/ Ft) measured in individual cells over the indicated period of time (6 SE, n 16). Data points were fitted to a sigmoid curve. doi : 10. 1371/journal. pone. 0073737. g001 tion but with a much slower rate than aldosterone alone (Figure 1), consistently with previously published reports [20]. Simultaneous addition of 1026 M torasemide and 1028 M aldosterone did not change the kinetics of aldosterone-induced MR-GFP nuclear translocation while spironolactone (1026 M) slowed down aldosterone-induced MR nuclear translocation (Figure 1), indicating that torasemide and spironolactone behave differently, regarding aldo-induced MR nuclear translocation. Effect of Torasemide on Aldosteronemediated MR Transactivation Activity A transactivation assay was set up in the rat H9C2-MR cardiomyocytes cell line expressing moderate levels of rat MR [16]. The system allows rapid and efficient screening of MR- dependent transactivation, using a MMTV promoter construct that includes Hormone Response Elements leading to luciferase expression upon binding of MR to the Hormone Response Elements. In the absence of MR activation, luciferase is not expressed while upon MR activation, luciferase activity is expressed and can be easily detected (Figure 2A). This widely used reporter system allows efficient analysis of molecules with agonist/antagonist activity on the MR. Addition of 1028 M aldosterone induced a 3. 5 fold increase in luciferase activity which was fully inhibited by the MR antagonist spironolactone (1026 M) but not by the GR antagonist RU 38486 (1026 M) indicating specific MR activation by aldosterone in this cellular context (Figure 2B). Spironolactone or RU38486 alone have not effects (Figure 2B). Several concentrations of spironolac- Figure 2. Effect of Torasemide on ligand-dependent transacti- tone or torasemide were then tested for their inhibitory activity of vation activity of MR in H9C2-MR cells. A : The MMTV promoter the aldosterone-mediated MR activation (Figure 2C). 1026 M contains Hormone Response Elements (HRE) ; the promoter sequence spironolactone fully inhibited the MR transactivation induced by was fused to the Luciferase coding sequence. This construct was transfected into H9C2-MR cells. Upon binding of the aldosterone-MR 1028 M aldosterone while torasemide has only a weak inhibitory complexes on HRE, luciferase is transcribed and light emission is effect that was concentration-independent. In order to unmask a enhanced, assessing MR transactivation activity. In the presence of an potential inhibitory effect in the presence of a lower aldosterone PLOS ONE | 3 September 2013 | Volume 8 | Issue 9 | e73737 Torasemide and Spironolactone on Cardiomyocytes MR antagonist, binding of aldosterone to MR is prevented and progresses, heart failure remains a life-threatening disease, luciferase expression is abolished. B : 1028 M aldosterone (Aldo) requiring further improvement of the therapeutic strategies. increased MR transactivation activity (luciferase activity) which was Blocking the mineralocorticoid receptor has been proposed and prevented by a 100-fold excess of the MR antagonist spironolactone validated as an additional tool : clinical studies in patients with (Spiro ; 1026 M) but not by the GR antagonist RU 38486 (RU 38486 ; severe or mild heart failure demonstrated an additional benefit of 1026 M). Each antagonist alone has no effect. Mean 6 SEM (n 8). * p, 0. 05 vs control (Ctrl) ; # p, 0. 05 vs aldosterone. C : 1028 M MRAs administered on the top of standard therapy [810]. The aldosterone (Aldo) increased MR transactivation activity, which was results of these trials led to changes in the therapeutic guidelines fully inhibited by the MR antagonist spironolactone (S) at 10-6 M. [22, 23]. One of the proposed underlying mechanisms explaining Torasemide (T) has a slight antagonist effect independent of its this clinical benefit relies on the decrease of myocardial fibrosis. concentration. Mean 6 SEM (n 4). *p, 0. 05 vs control (Ctrl) ; # p, 0. 05 Indeed targeting cardiac fibrosis would impact the severity of heart vs aldosterone. disease by reducing stiffness, improving cardiac hemodynamics doi : 10. 1371/journal. pone. 0073737. g002 and reducing pro-arrhythmic triggers. Cardiac anti-fibrotic therapy includes MRAs (such as spironolactone or eplerenone) concentration, the effects of spironolactone and torasemide were and, more recently, the diuretic torasemide. Whether MRAs and also tested in the presence of 1029 M aldosterone. In these torasemide act on the same pathways or not needs to be carefully conditions, torasemide has no inhibitory effect at difference with a addressed. Indeed if these therapeutic classes act on different dose-dependent antagonist activity of spironolactone (Figure S1). pathways, it may be useful to use both of them which may lead to additive beneficial effects. Effect of Torasemide on MR-mediated Endogenous Gene It has been proposed that torasemide has some mineralocorti- Expression in H9C2-MR Cells coid receptor antagonist properties and torasemide is considered The MMTV promoter, despite being classically used as a as an anti-aldosterone' compound [5]. In order to test the reporter of MR activation, is distinct from natural targets for the potential MR antagonist property of torasemide, we selected MR in cardiomyocytes. It could therefore be argued that several genes of different functional classes (inflammation, activation/antagonism of MR may be different in a natural cell extracellular matrix remodelling, signalling) that were previously context. We took advantage of our previous work that identifies shown, by ourselves and by others, to be regulated by aldosterone MR-modulated cardiac genes [21] to test the effect of torasemide, in cardiomyocytes [16, 21]. Rgs-2 (Regulator of G protein in comparison to spironolactone, in H9C2-MR cells. We analyzed signaling-2) is a multifunctional signaling regulator and exerts the expression of the Serum- and glucocorticoid- inducible kinase- GTPase-activating protein activities. Many signals that regulate 1, Sgk-1 (regulated by corticosteroid hormones in kidney cells), cardiomyocyte growth, differentiation, and function are mediated Orosomucoid-1 (an inflammatory protein), Serpina-3, PAI-1 and via heterotrimeric G proteins, which are controlled by Rgs Tenascin-X (genes of the extra-cellular matrix remodeling) and proteins [24]. Three aldosterone-regulated genes have close Rgs-2 (Regulator of G protein signaling-2). Torasemide (1026 M) connections with the regulation of the extra-cellular matrix : alone significantly decreased the basal expression (in absence of Plasminogen Activator Inhibitor-1 (PAI-1), a member of the serum and aldosterone) of Orosomucoid-1 and Tenascin-X, which SERPIN family, is the major physiological inhibitor of tissue-type is indeed very weakly expressed in cardiomyocytes in the absence Plasminogen Activator and Urokinase Plasminogen Activator, that of adosterone stimulation (Figure S2). We next tested the activate plasminogen to its active form plasmin and lead to antagonist activity of torasemide. As depicted in Figure 3, in the fibrinolysis. In addition to its serine protease inhibitor function, presence of 1028 M aldosterone, spironolactone partly or fully PAI-1 also alters cell/matrix interactions by binding to vitronectin inhibited aldosterone-induced expression of aldosterone/MR [25] ; Serpina-3 (also named a1-antichymotrypsine) is a serine target genes while torasemide had no effect, even at a high protease inhibitor with multiple functions including maturation of concentration (1026 M). Similar effects were observed when a pro-MMP9 and wound healing, regulation of apoptosis and lower concentration of aldosterone was used (1029 M) (Figure 4) inflammation [26] ; Tenascin-X belongs to the family of matricel- indicating that the absence of antagonist activity of torasemide was lular proteins. These proteins are extracellular matrix proteins that not due to unfavorable competition with a high aldosterone modulate cell-matrix interactions and collagen accumulation and concentration. Interestingly, the potency of spironolactone varies organization, but do not have a direct structural role [27]. among the analyzed target genes : PAI-1, Orosomucoid-1 and Tenascin-X is an essential regulator of collagen deposition by Serpina-3 were inhibited with 10 fold lower spironolactone fibroblasts [28] and is up-regulated during fibrosis after tissue concentration (1028 M) than Sgk-1, Rgs-2 and Tenascin-X injury [27]. Orosomucoid-1 is an acute phase protein that is (Figure 4). We next evaluated whether a torasemide (1026 M) induced by pro-inflammatory cytokines and glucocorticoids [29]. could enhance the sensitivity of MR toward spironolactone in Interestingly, elevated plasma level of Orosomucoid-1 is consid- aldosterone-treated H9C2-MR cells. To this purpose, we treated ered as a cardiovascular risk factor [30]. cells with a low dose of spironolactone (1028 M) that was not The data reported in the present study clearly do not support sufficient to reduce -the increase of gene expression with 1028 M the concept that torasemide acts as an antagonist of the MR. aldosterone. Addition of torasemide did not sensitize the MR to Indeed using different approaches, we showed that torasemide spironolactone as shown by the analysis of aldo-induced gene does not behave as spironolactone, a prototypic MRA : it did not expression of Orosomucoid-1, Sgk-1 and Tenascin-X (Figure S2). affect nuclear translocation of MR nor inhibited aldosterone- induced up-regulation of various mineralocorticoid receptor target Discussion genes in cardiomyocytes. These results are not compatible with the study of Uchida et al. [5] proposing that torasemide acts as a Spectacular progress has been made in the treatment of heart competitive antagonist of aldosterone binding in kidney homog- failure during the last decades. Combining drugs of different enates. A tissue-specific effect of torasemide on MR binding in therapeutic classes such as diuretics, beta-blockers, Angiotensin kidney but not cardiomyocyte is a possibility but, to our Converting Enzyme inhibitors and Angiotensin receptor blockers knowledge, such tissue-specific actions of MR antagonists have led to major clinical benefits on morbidity-mortality. Despite these not been reported. PLOS ONE | 4 September 2013 | Volume 8 | Issue 9 | e73737 Torasemide and Spironolactone on Cardiomyocytes Figure 3. Torasemide does not act as a MR antagonist for the regulation of endogenous genes in H9C2-MR cells in the presence of 1028 M aldosterone. 1028 M aldosterone (Aldo) increased expression of the aldosterone-targets genes Sgk-1, PAI-1, Orosomucoid-1, Rgs-2, Serpina-3 and Tenascin-X. Addition of increasing doses of spironolactone (A S) inhibited aldosterone-induced gene expression. In contrast, increasing concentrations of torasemide (A T) had no antagonistic effect. Mean 6 SEM (n 4). *p, 0. 05 vs control (Ctrl) ; # p, 0. 05 vs aldosterone. doi : 10. 1371/journal. pone. 0073737. g003 From our results and previously published data, spironolactone binding kinetics and ligand-induced co-chaperone release from the not only competes with aldosterone for binding to MR, but it also aporeceptor complex [31]. Therefore, spironolactone is not a induces ligand-dependent conformational changes that uncover classic competitive antagonist of MR. It has been proposed that nuclear localization signals, eliciting MR trafficking to the nucleus. the inhibitory effect of spironolactone on MR is based on the The slower kinetics of this process when compared to aldosterone- induction of an altered receptor conformation, which in turn induced nuclear translocation may reflect differences in ligand disrupts co-activator recruitment [32]. This could be consistent PLOS ONE | 5 September 2013 | Volume 8 | Issue 9 | e73737 Torasemide and Spironolactone on Cardiomyocytes Figure 4. Torasemide does not act as a MR antagonist for the regulation of endogenous genes in H9C2-MR cells in the presence of 1029 M aldosterone. 1029 M aldosterone (Aldo) increased expression of the aldosterone-targets genes Sgk-1, PAI-1, Orosomucoid-1, Rgs-2, Serpina-3 and Tenascin-X. Addition of increasing doses of spironolactone (A S) inhibited aldosterone-induced gene expression. In contrast, increasing concentrations of torasemide (A T) had no antagonistic effect. Mean 6 SEM (n 4). *p, 0. 05 vs control (Ctrl) ; # p, 0. 05 vs aldosterone. doi : 10. 1371/journal. pone. 0073737. g004 with recent data demonstrating that spironolactone behaves as an agonist activity is unknown. It has been proposed that spirono- inverse agonist of MR [33, 34] suggesting that spironolactone lactone can act as an MR agonist in a cell- and promoter-specific beneficial therapeutic actions involve the induction of MR- fashion [35], but the identities of specific target genes that may be dependent effects that are opposite to those induced by natural regulated by spironolactone-MR complexes remain to be eluci- agonists such as aldosterone. The molecular basis for the inverse dated. PLOS ONE | 6 September 2013 | Volume 8 | Issue 9 | e73737 Torasemide and Spironolactone on Cardiomyocytes Torasemide, at micromolar concentrations, has also been balance. This should be analyzed in dedicated experimental and reported to inhibit aldosterone secretion in vitro by adrenal cells clinical studies. from rats, cows and guinea pig upon stimulation by potassium and AngII (among other classical aldosterone secretagogues), while Supporting Information furosemide has no effect on adrenal aldosterone secretion [36]. In human, torasemide has been reported to inhibit transcardiac Figure S1 Effect of Torasemide on Ligand-dependent extraction of aldosterone in patients with congestive heart failure transactivation activity of MR in H9C2-MR cells. 1029 M [37], an effect which might be due to inhibition of local aldosterone (Aldo) increased MR transactivation activity, which aldosterone synthesis, that has been reported to be increased in was fully inhibited by the MR antagonist spironolactone (S) at human heart failure [38]. In vivo however, in both human and 1027 M while torasemide (T) has no effect. Mean 6 SEM (n 4). dogs, torasemide, as other diuretics, increases plasma aldosterone *p, 0. 05 vs control (Ctrl) ; # p, 0. 05 vs aldosterone. levels to compensate sodium loss [39, 40, 41]. Therefore, if MR is (TIF) not properly antagonized, torasemide administration would likely Figure S2 Torasemide did not enhance MR sensitivity increase MR activation through the rise in plasma aldosterone to a low dose of spironolactone for the regulation of levels rather than decrease MR-mediated pathways. endogenous genes in H9C2-MR cells. A low dose of Both torasemide and spironolactone have been shown to be spironolactone (1028 M) did not block aldosterone-induced efficient in patients and in dogs with HF [1, 42]. One can speculate response of Orosomucoid-1, Sgk-1 and Tenascin-X. Torasemide that adding torasemide to spironolactone in HF would be (1026 M) did not confer higher sensitivity to the spironolactone beneficial. Torasemide has a strong diuretic effect and an anti- antagonist when spironolactone and torasemide were combined. fibrotic effect for which a mechanism has been recently proposed : Mean 6 SEM (n 4). *p, 0. 05 vs control (Ctrl). torasemide inhibits procollagen type I carboxy-terminal proteinase (TIF) activation as well as lysyl oxidase expression and collagen cross- linking in patients with heart failure [11, 12], resulting in Table S1 Sequences of the specific primers. Actin : b- normalization of left ventricular stiffness. MRAs act at different actin ; PAI-1 : Plasminogen Activator Inhibitor-1 ; Rgs-2 : Regulator levels : MRAs prevent electrophysiological abnormalities, oxidative of G protein signaling-2 ; Sgk-1 : Serum- and glucocorticoid- stress and extracellular matrix remodeling as well as inflammation inducible kinase-1. [7]. Beneficial additive effects may therefore occur in patients. (TIF) Such therapeutical benefit in HF remains to be addressed. Acknowledgments Perspectives The authors wish to thank Dr Aniko Naray-Fejes-Toth for the H9C2-MR Taken together, these results demonstrate that the diuretic cells. torasemide does not act as a mineralocorticoid receptor antagonist as previously proposed. This suggests that the use of torasemide Author Contributions together with an MR blocker could further enhance the anti- Conceived and designed the experiments : BG SEM FJ. Performed the fibrotic effects of these therapeutics, especially in heart failure. experiments : BG RJC SEM. Analyzed the data : BG SM DAR FJ. This should be particularly considered since torasemide increased Contributed reagents/materials/analysis tools : BG AT RJC SEM. Wrote aldosterone, the ligand of the MR, due to its effects of the renal Na the paper : BG FJ. Obtained permission for use of cell line : FJ DAR. References 1. Cosin J, Diez J (2002) Torasemide in chronic heart failure : results of the TORIC 11. 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Sequences of the specific primers. Actin : -actin ; PAI-1 : Plasminogen Activator Inhibitor-1 ; Rgs-2 : Regulator of G protein signaling-2 ; Sgk-1 : Serum and glucocorticoid-regulated kinase-1. 3. 1. 1. 4 Conclusions de l'étude et discussion Cette étude, en utilisant trois approches différentes, démontre que le torasémide n'agit pas comme un antagoniste du RM. Il a en effet été montré que : - le torasémide n'affecte pas la translocation nucléaire du RM après son activation par l'aldostérone dans la lignée cellulaire de fibroblastes de rein COS-7 - le torasémide n'agit pas sur l'activité transcriptionnelle du RM dans la lignée cellulaire de cardiomyocytes H9C2-RM dérivée de ventricules embryonnaires de rat et transfectée avec le RM - le torasémide ne diminue pas l'expression de gènes cibles endogènes du RM dans cette même lignée de cardiomyocytes. Nos résultats suggèrent que le torasémide n'affecte pas la liaison de l'aldostérone au RM, contrairement à l'observation du groupe d'Uchida et al. 197 démontrant que le torasémide bloque la liaison de l'aldostérone à son récepteur dans des homogénats de rein in vivo. Nos travaux ont été réalisés in vitro sur des cellules COS-7 (pour l'étude de la translocation nucléaire du RM) et des cellules H9C2-RM . Il est donc possible que le blocage du RM par le torasémide soit spécifique d'un type cellulaire donné, bien que de telles propriétés des antagonistes du RM n'aient pas encore été rapportées. L'effet natriurétique du torasémide entrane par compensation une augmentation de l'aldostéronémie in vivo, montrée chez le chien202 et chez des patients en insuffisance cardiaque de stade II ou III203. Le groupe d'Uchida et al. a aussi montré que le torasémide induit une diminution de l'excrétion de potassium dans les urines en comparaison avec le furosémide, compatible avec un effet anti-aldostérone du torasémide197. En réponse à ce diurétique, l'aldostéronémie augmente pour maintenir la balance hydrosodée et l'excrétion de potassium est également induite. Mais si le torasémide empêche les effets de l'aldostérone, la réabsorption sodique via le RM est inhibée et l'augmentation de l'excrétion de potassium pourrait être prévenue. Cependant, nos résultats indiquent clairement que le torasémide ne bloque pas les gènes cibles du complexe aldostérone/RM dans le cœur. Par ailleurs, le torasémide diminue la sécrétion d'aldostérone dans les cellules de la zone glomérulaire des glandes surrénales de rat, de vache ou bien de cochon d'inde, préalablement stimulées par l'angiotensine II ou le potassium204. Au contraire, le furosémide n'exerce aucun effet sur la sécrétion d'aldostérone dans ces cellules. L'ensemble de ces données suggère donc que le torasémide peut non seulement diminuer la fibrose cardiaque et certains marqueurs impliqués dans le remodelage matriciel, mais aussi interférer avec des facteurs humoraux tels que l'aldostérone, sans concerner sa liaison avec le RM. Pour tester l'effet anti-RM du torasémide, nous avons utilisé des gènes connus, dans notre laboratoire, pour être des cibles du complexe aldostérone/RM dans le cardiomyocyte. Ces gènes sont impliqués dans le remodelage de la matrice extracellulaire, étant un phénomène prépondérant dans la mise en place et le maintien de la fibrose. Il est connu que PAI-1, (protéase de la famille des serpin, pour serine protease inhibitors), altère l'interaction cellules - matrice extracellulaire en se liant à la vitronectine205. Une autre serpin, Serpina-3, est impliquée dans la régulation de l'apoptose et de l'inflammation, mais aussi dans la maturation de la protéine précurseur de la MMP-9, la pro-MMP-9206. Nous nous sommes également intéressés à la Tenascin-X, protéine de la matrice extracellulaire modulant l'interaction entre les cellules et la matrice ainsi que le dépôt de collagène dans l'interstitium207. Son rôle dans l'accumulation du collagène est démontré chez des souris déficientes en Tenascin-X qui présentent un contenu en collagène plus faible que chez leurs souris contrôles208. Le statut inflammatoire étant une étape clé dans le développement de la fibrose, l'expression d'Orosomucoid-1 a été également analysée, car cette protéine est induite par des cytokines pro-inflammatoires et les glucocorticoïdes209. Les concentrations de spironolactone (jusqu'à 10-6 M) utilisées se sont montrées efficaces pour bloquer le RM, permettant de comparer ses effets à ceux du torasémide. Ainsi, nous avons montré que dans le cardiomyocyte, le torasémide ne prévient pas l'augmentation par l'aldostérone de gènes impliqués dans la fibrose. En conclusion, nos travaux n'ont pas montré de modulation de gènes, faisant partie de la signalisation minéralocorticoïde, par le torasémide. Par contre, son effet diurétique entrane en retour une augmentation de l'aldostéronémie, il possède des propriétés anti-fibrosantes et il est montré comme bénéfique dans l'évolution de l'insuffisance cardiaque de stade II ou III chez l'homme201. En bloquant le RM cardiaque, la spironolactone agit quant à elle sur plusieurs niveaux comme les paramètres électrophysiologiques, le stress oxydatif, le remodelage de la matrice extracellulaire et l'inflammation. Dans ce contexte, nos résultats suggèrent fortement qu'une association du torasémide et de la spironolactone pourrait être envisageable dans le traitement de l'insuffisance cardiaque. Néanmoins, des études expérimentales et cliniques complémentaires sont souhaitables pour analyser les bénéfices thérapeutiques possibles. 3. 1. 2 Effets in vivo du torasémide sur la signalisation du RM cardiaque 3. 1. 2. 1 Etat de la question Ce travail a été effectué à la suite de l'étude in vitro, pour compléter cette dernière et déterminer l'effet du torasémide dans un système intégré. Pour ce faire, nous avons soumis 27 souris C57BL/6JRj au modèle DOCA-Sel pendant 6 semaines. 3. 1. 2. 2 Objectif de l'étude Le but de ce travail a été de montrer si le torasémide peut diminuer voire prévenir totalement certains effets délétères induits par le modèle DOCA-Sel sur le cœur de souris. L'expression de gènes impliqués dans le remodelage matriciel et le stress oxydatif, dont certains sont spécifiquement induits par la voie de signalisation du RM, a été analysée dans le cœur. Comme dans l'étude in vitro, l'efficacité du blocage du RM par le torasémide a été comparée à celle de la spironolactone. 3. 1. 2. 3 Protocole d'activation du RM in vivo Tableau 2. Paramètres physiologiques des souris soumis au modèle DOCA-Sel. Ctrl : souris contrôles ; DOCA : souris uninéphrectomisées, traitées à la DOCA et avec de la boisson salée ; DOCA S : souris DOCA traitées avec la spironolactone ; DOCA T : souris DOCA traitées avec le torasémide ; *p vs Ctrl ; #p vs DOCA. Le modèle DOCA-Sel seul ou avec l'ajout de spironolactone ou de torasémide ne modifie pas le poids du corps des animaux (Tableau 2). Le modèle DOCA-Sel induit seulement une hypertrophie rénale qui est également présente chez les souris DOCA S. L'expression de la sous-unité du canal épithélial sodique (ENaC), cible du complexe aldostérone/RM au niveau du néphron distal, est doublée chez les souris DOCA par rapport aux souris contrôles et ni la spironolactone, ni le torasémide n'ont d'effet sur cette modulation d'expression (Figure 10). Figure 10. Effet du torasémide sur l'expression rénale de la sous-unité du canal épithélial sodique ENaC chez des souris soumises à un modèle d'activation minéralocorticoïde. Ctrl : souris contrôles ; DOCA : souris uninéphrectomisées, traitées à la DOCA et avec de la boisson salée ; DOCA S : souris DOCA traitées avec la spironolactone ; DOCA T : souris DOCA traitées avec le torasémide. *p vs Ctrl. 3. 1. 2. 4 Le torasémide diminue l'expression de certains gènes participant au remodelage de la matrice extracellulaire cardiaque L'expression relative de l'ARNm de Sgk-1 dans le cœur est augmentée dans le modèle DOCA-Sel comparée aux souris contrôles. Par contre, son expression est diminuée partiellement chez les souris DOCA S ou DOCA T. Les gènes codant pour des protéines influençant le remodelage matriciel cardiaque ont été analysés. Les expressions du collagène III et de l'inhibiteur tissulaire des métalloprotéases matricielles de type 1 (TIMP-1, pour tissue inhibitor of matrix-metalloproteinase-1) sont augmentées chez les souris DOCA par rapport aux souris contrôles, alors qu'elles sont partiellement inhibées chez les souris DOCA S et DOCA T (Figure 11). L'augmentation du collagène I est totalement diminuée chez les souris DOCA T, ou partiellement chez les souris DOCA S. Le facteur anti- hypertrophique ANP172, également produit sous l'effet de l'étirement mécanique de la paroi du cœur210, est augmenté par 5 fois chez les souris DOCA et DOCA S par rapport aux souris contrôles. Par contre, son expression est diminuée de moitié chez les souris DOCA T (Figure 11). Figure 11. Effet du torasémide sur l'expression cardiaque de gènes impliqués dans le remodelage matriciel. Ctrl : souris contrôles ; DOCA : souris uninéphrectomisées, traitées à la DOCA et avec de la boisson salée ; DOCA S : souris DOCA traitées avec la spironolactone ; DOCA T : souris DOCA traitées avec le torasémide. *p vs Ctrl ; #p vs DOCA. 3. 1. 2. 5 Le torasémide n'intervient pas dans la modulation de l'expression des sous-unités de la NADPH oxydase Nous nous sommes intéressés à la modulation de la NADPH oxydase. Ce complexe enzymatique, composé de six sous-unités, catalyse le di-oxygène en espèce réactive de l'oxygène, provoquant ainsi un stress oxydatif dans la cellule. L'expression de ses deux sous- unités transmembranaires (gp91phox ou NOX-2 et p22phox) et d'une de ses-unités cytoplasmiques p47phox ont été quantifiées dans le cœur des souris. Les expressions des sous- unités gp91phox et p47phox sont augmentées chez les souris DOCA par rapport aux souris contrôles. Ces augmentations sont prévenues totalement chez les souris DOCA S, alors que les souris DOCA T ont un niveau d'expression de ces deux sous-unités proche des souris DOCA (Figure 12). Au contraire, l'expression de la sous-unité p22phox n'est affectée dans aucun des groupes étudiés. Figure 12. Effet du torasémide sur l'expression cardiaque des sous-unités de la NADPH oxydase. Ctrl : souris contrôles ; DOCA : souris uninéphrectomisées, traitées à la DOCA et avec de la boisson salée ; DOCA S : souris DOCA traitées avec la spironolactone ; DOCA T : souris DOCA traitées avec le torasémide. *p vs Ctrl. 3. 1. 2. 6 Conclusions de l'étude et discussion Nos résultats obtenus avec le modèle DOCA-Sel chez la souris sont compatibles avec la majorité des études déjà publiées. Si la dose, la durée ou encore le fond génétique peuvent varier, les différentes études rapportent une augmentation de la fibrose cardiaque, de certains marqueurs de l'inflammation et des sous-unités de la NADPH oxydase, avec la DOCA par rapport aux souris contrôles. L'augmentation de l'expression de la sous-unité du canal épithélial sodique, cible du complexe aldostérone/RM au niveau du néphron distal, valide l'efficacité du modèle DOCA-Sel à activer le RM. Ni la spironolactone, ni le torasémide ne sont capables de bloquer l'augmentation d'ENaC. On aurait pu s'attendre à ce que la spironolactone, en bloquant le RM, induise une diminution de l'expression de cette sous- unité. Toutefois, il est probable que l'efficacité de la spironolactone dépende des cibles. Dans ces conditions, certaines pourraient ne pas être inhibées par cette dose d'antagoniste du RM, comme ENaC, alors que d'autres y seraient sensibles comme les sous-unités gp91phox et p47phox de la NADPH oxydase. L'analyse de la modulation des gènes impliqués dans le remodelage et dans le stress oxydatif montre des réponses similaires ou différentielles entre la spironolactone et le torasémide. La spironolactone diminue partiellement l'augmentation de l'expression de Sgk-1, CTGF et des collagènes I et III, connus pour être modulés via le RM. Le torasémide a un effet analogue sur la modulation de l'expression de ces gènes. Au contraire, l'ANP montre un profil de modulation très variable selon les groupes. Nos données montrent que la DOCA entrane une augmentation de l'expression de l'ANP, en réponse à l'augmentation de la pression artérielle, à l'hypertrophie et au remodelage cardiaque induits par le modèle DOCA-Sel. La dose de spironolactone utilisée ne diminue pas l'expression de l'ANP, contrairement au torasémide. Ce dernier pourrait avoir un effet diurétique plus fort que la spironolactone induisant une baisse plus importante de la pression artérielle, ce qui expliquerait l'absence d'augmentation de la masse cardiaque et la diminution de l'expression de l'ANP. Malheureusement, nous n'avons pas mesuré la pression artérielle des animaux. L'analyse de l'expression de la NADPH oxydase est également un bon exemple du possible effet différentiel entre la spironolactone et le torasémide lors d'un stress minéralocorticoïde. En effet, la modulation du stress oxydatif, représenté ici par les sous-unités gp91phox, p22phox et p47phox de la NADPH oxydase apparait spécifique de la signalisation du RM car seule la spironolactone peut l'inhiber. Le traitement à la DOCA induit l'augmentation de l'expression de gp91phox et p47phox, mais ne module pas l'expression de p22phox. Ces résultats sont en accord avec des études faites chez la souris soumises au modèle DOCA-Sel o seule l'expression de gp91phox est augmentée178. Avec l'ajout de spironolactone, l'expression de gp91phox et p47phox est totalement prévenue alors que l'ajout de torasémide n'a aucun effet sur leur expression. Il est à noter le modèle DOCA-Sel chez le rat induit une augmentation de l'expression de la sous-unité p22phox 58, qui est entièrement prévenue par l'éplérénone dans le cœur. En conclusion, ces résultats in vivo ont permis d'élargir nos connaissances sur les propriétés intrinsèques du torasémide et son incapacité à bloquer le RM. Selon la voie de signalisation considérée, le torasémide et la spironolactone peuvent agir de la même manière ou de manière distincte. 3. 2 Approche génétique A la suite de cette approche pharmacologique, nous nous sommes intéressés aux gènes cibles induits spécifiquement par le RM cardiaque, en utilisant des approches in vivo et in vitro. Ce chapitre se compose en deux sous-chapitres : les gènes codants et les gènes non- codants. Les gènes codants ont été étudiés à travers deux approches distinctes, l'approche gène candidat en étudiant le gène codant pour CTGF et une approche globale en étudiant le transcriptome cardiaque de souris. L'étude des gènes non-codants s'est focalisée sur les microARNs. 3. 2. 1 CTGF comme gène candidat de premier choix dans la compréhension de la voie de signalisation du RM cardiaque 3. 2. 1. 1 Etat de la question Il est maintenant bien documenté que le RM est impliqué dans différentes pathologies cardiaques. Bien qu'il soit exprimé dans tous les types cellulaires du cœur, l'enzyme de sélectivité du ligand 11-HSD2 est quant à elle environ 100 fois moins active dans le cardiomyocyte que dans les cellules du néphron distal26. Par conséquent, il semble donc que la liaison de l'aldostérone au RM dans le cardiomyocyte est impossible et que les effets bénéfiques de l'utilisation d'antagonistes du RM, mis en évidence dans les études cliniques comme RALES, EPHESUS et EMPHASIS-HF, résultent plutôt de l'inhibition du complexe glucocorticoïde/RM. Cependant, certains travaux suggèrent que l'aldostérone pourrait se lier au RM dans le cœur et induire l'expression de gènes cibles4, 68. Le débat quant à la nature du ligand activant le RM du cardiomyocyte reste d'actualité. 3. 2. 1. 2 Objectif de l'étude Le but de notre étude a été de rechercher si l'aldostérone active le RM cardiaque in vivo, et plus particulièrement le RM du cardiomyocyte. Pour ce faire, nous avons tiré profit d'une expérience réalisée au laboratoire par un chercheur post-doctorant, le docteur Messaoudi. Celui-ci a traité des souris transgéniques surexprimant spécifiquement le RMh dans les cardiomyocytes et leurs souris contrôles correspondantes avec de l'aldostérone ou de la corticostérone. Après une semaine de traitement, le transcriptome cardiaque global de toutes les souris a été effectué par puces à oligonucléotides, étape à laquelle j'ai participée. En croisant tous les transcriptomes entre eux, nous avons pu montrer que le gène codant pour la protéine CTGF est spécifiquement surexprimé par l'aldostérone et le RM dans le cœur. Ce gène, intervenant dans le remodelage de la matrice extracellulaire, voit son expression augmenter dans le cœur de souris traitées à la DOCA211 (ce que nous avons confirmé, confer chapitre 3. 1. 2). Le gène codant pour CTGF nous parat donc être un candidat de premier choix pour comprendre la voie de signalisation du RM dans le cœur et spécifiquement dans le cardiomyocyte. Cette étude a fait l'objet d'une publication en 2013 dont je suis le deuxième auteur, présentée ci-après. 3. 2. 1. 3 Article : Aldosterone-Specific Activation of Cardiomyocyte Mineralocorticoid Receptor In Vivo Les figures et tableaux supplémentaires n'apparaissant pas dans la version publiée de l'article, ceux-ci ont donc été rajoutés à la suite du PDF. Les tableaux supplémentaires S2 et S3 présentant respectivement la comparaison des transcriptomes des souris contrôles et RM- Cardio non traitées et les résultats des transcriptomes des souris RM-Cardio non traitées et traitées à l'aldostérone, sont mis dans la partie annexes en raison de leur grandeur. Aldosterone-Specific Activation of Cardiomyocyte Mineralocorticoid Receptor In Vivo Smail Messaoudi, Basile Gravez, Antoine Tarjus, Véronique Pelloux, Antoine Ouvrard-Pascaud, Claude Delcayre, Janelise Samuel, Jean-Marie Launay, Catalina Sierra-Ramos, Diego Alvarez de la Rosa, Karine Clément, Nicolette Farman and Fréderic Jaisser Hypertension. 2013 ; 61 : 361-367 ; originally published online January 7, 2013 ; doi : 10. 1161/HYPERTENSIONAHA. 112. 198986 Hypertension is published by the American Heart Association, 7272 Greenville Avenue, Dallas, TX 75231 Copyright 2013 American Heart Association, Inc. All rights reserved. Print ISSN : 0194-911X. Online ISSN : 1524-4563 The online version of this article, along with updated information and services, is located on the World Wide Web at : Data Supplement (unedited) at : Permissions : Requests for permissions to reproduce figures, tables, or portions of articles originally published in Hypertension can be obtained via RightsLink, a service of the Copyright Clearance Center, not the Editorial Office. Once the online version of the published article for which permission is being requested is located, click Request Permissions in the middle column of the Web page under Services. Further information about this process is available in the Permissions and Rights Question and Answer document. Reprints : Information about reprints can be found online at : Subscriptions : Information about subscribing to Hypertension is online at : Downloaded from at INSERM - DISC on November 9, 2014 Aldosterone-Specific Activation of Cardiomyocyte Mineralocorticoid Receptor In Vivo Smail Messaoudi, Basile Gravez, Antoine Tarjus, Véronique Pelloux, Antoine Ouvrard-Pascaud, Claude Delcayre, Janelise Samuel, Jean-Marie Launay, Catalina Sierra-Ramos, Diego Alvarez de la Rosa, Karine Clément, Nicolette Farman, Fréderic Jaisser AbstractInappropriate mineralocorticoid receptor (MR) activation is involved in cardiac diseases. Whether and how aldosterone is involved in the deleterious effects of cardiac mineralocorticoid activation is still unclear. Mice overexpressing MR in cardiomyocytes and their controls were treated for 7 days with aldosterone, and cardiac transcriptome was analyzed. Aldosterone regulated 265 genes in cardiomyocyte-targeted MR overexpression mice. Forty three of these genes were also differentially expressed between untreated cardiomyocyte-targeted MR overexpression and controls mice, thus representing putative aldosterone-regulated genes in cardiomyocytes. Among these genes, we focused on connective tissue growth factor (CTGF). In vivo, in cardiomyocyte-targeted MR overexpression mice, aldosterone (but not corticosterone) induced CTGF expression (mRNA and protein) in cardiomyocytes. Ex vivo, aldosterone induced the binding of mineralocorticoid receptor to CTGF promoter and increased the expression of its transcript. Aldosterone induction of CTGF synthesis in cardiomyocytes seems pathologically relevant as the increase in CTGF observed in a model of heart failure (transverse aortic constriction) in rats was prevented by eplerenone, a mineralocorticoid receptor blocker. This study demonstrates that aldosterone specifically regulates gene expression in cardiomyocytes despite large prevalence of glucocorticoids in plasma. (Hypertension. 2013 ; 61 : 361-367. ) Online Data Supplement Key Words : aldosterone mineralocorticoid receptor gene microarray connective tissue growth factor M ineralocorticoid receptor (MR ; a ligand-dependent transcription factor) cardiac expression is increased in hypertension, 1 myocardial infarction, 2 and diastolic heart the beneficial effects of MR blockade in clinical studies may result from inhibition of glucocorticoids binding to the MR. However, several studies suggest that aldosterone failure. 3 MR antagonism reduces morbidity and mortality in may also activate cardiomyocyte MR : chronic infusion patients with heart failure. 46 Experimentally, MR antagonism of aldosterone induces arrhythmia, alters cardiomyocyte limits the transition to heart failure in models of systolic left calcium current, and impairs the activity of the ryanodine ventricular dysfunction, 7 myocardial infarction, 8 and diastolic receptor. 12, 17 In association with salt and uninephrectomy, dysfunction. 3, 9 aldosterone induces cardiac oxidative stress, inflammation, Although MR is expressed in all cardiac cell types, 10 and fibrosis. 18 Despite this evidence, the question of the cardiomyocyte-MR seemed to play a decisive role in exper- nature of the ligand(s) activating the MR in cardiomyocytes imental models of cardiac diseases : in mice, genetic cardio- remains the subject of debate. myocyte-MR inactivation improves ventricular function and The aim of this study was to question whether aldosterone remodeling in ischemic heart failure, 11 whereas cardiomyo- could activate cardiomyocyte-MR in vivo. To answer cyte-MR overexpression induces arrhythmias, 12 worsens this question, mice with cardiomyocyte-targeted MR angiotensin IIinduced cardiac remodeling, 9 and alters coro- overexpression (MR-Cardio mice) and their controls were nary function. 13 treated with a low dose of aldosterone for a short period (1 MR binds aldosterone and glucocorticoids with an equal week) to favor the identification of primary aldosterone affinity. 14 The MR selectivity for aldosterone is achieved by targets (rather than those involved in compensatory/ the coexpression of the 11-hydroxysteroid dehydrogenase adaptive processes occurring after chronic administration of type 2 (11-HSD2), which inactivates glucocorticoids. 15 aldosterone). We report that a moderate increase in plasma Because 11-HSD2 activity is low in cardiomyocytes, 16 aldosterone concentration can activate MR in cardiomyocytes Received May 22, 2012 ; first decision June 11, 2012 ; revision accepted September 14, 2012. From Inserm U872, Team 1, Pierre and Marie Curie University, Paris, France (S. M. , B. G. , A. T. , N. F. , F. J. ) ; Inserm U872, Team 7, Pierre and Marie Curie University, Paris, France (V. P. , K. C. ) ; UMR 644 Inserm-Université de Rouen, Rouen, France (A. O. -P. ) ; Inserm U942, Paris, France (C. D. , J. S. , J. -M. L. ) ; University of La Laguna, Tenerife, Spain (C. S. -R, D. A. d. l. R. ). The online-only Data Supplement is available with this article at 112. 198986/-/DC1 Correspondence to Frederic Jaisser, Centre de Recherche des Cordeliers, Equipe 1, Escalier E, 1er étage. 15 rue de l'Ecole de Médecine, 75006 Paris, France. E-mail frederic. jaisser@crc. jussieu. fr 2012 American Heart Association, Inc. Hypertension is available at DOI : 10. 1161/HYPERTENSIONAHA. 112. 198986 Downloaded from 361 at INSERM - DISC on November 9, 2014 362 Hypertension February 2013 despite a large excess of endogenous glucocorticoids. In Identification of Aldosterone-Regulated Genes particular, we demonstrate that connective tissue growth in Cardiomyocytes factor (CTGF) is regulated by aldosterone in cardiomyocytes We then adopted a transcriptomic approach to identify genes ex vivo and in vivo. dependent on aldosterone activation of MR in cardiomyo- cytes. To identify the cardiomyocyte-MR sensitive genes, Materials and Methods we analyzed the cardiac transcriptome of MR-Cardio mice Methods are provided in online-only Data Supplement in the Methods compared with Ctrl mice (Figure 2). We found 865 genes section. differentially regulated between Ctrl and MR-Cardio mice (Table S2), 447 upregulated genes and 418 downregulated Results genes. Among these genes, the quantification of genes pre- Aldosterone Treatment dicted to be strongly regulated by MR (Kcnk1 : potassium Aldosterone administration (1 week, 60 g/kg per day) did not channel, subfamily K, member 1 ; and Tnnt3 : Troponin T3) alter body, heart, and kidney weight (Table). Treatment did not was in accordance with microarray predictions (Figure S3A alter MR expression in controls (Ctrl) and MR-Cardio mice and S3B). (Figure S1, available in the online-only Data Supplement). Then, we performed a comparative analysis of cardiac Aldosterone treatment increased aldosteronemia similarly transcriptome of aldosterone-treated MR-Cardio mice and in Ctrl and MR-Cardio mice (4- to 5-fold ; P Table). untreated MR-Cardio mice (Figure 2). Aldosterone regu- Corticosteronemia was decreased in treated Ctrl mice but lated 265 genes in MR-Cardio mice (165 upregulated genes not in MR-Cardio mice (Table). Renal expression of known and 100 downregulated genes ; Table S3). Among these aldosterone target genes was similarly increased in Ctrl and genes, the quantification of genes predicted to be strongly regulated by aldosterone in MR-Cardio mice (Adamts4 : a MR-cardio mice treated with aldosterone ( subunit of the disintegrin-like and metallopeptidase with thrombospon- amiloride-sensitive sodium channel and serum/glucocorticoid din type 1 motif, member 4 ; and Trpc4 : transient recep- regulated kinase 1 ; 25% and 40%, respectively ; P tor potential cation channel, subfamily C, member 4) was attesting for the efficiency of the treatment (Figure S2). in accordance with microarray predictions (Figure S3C Specific MR-Dependent Response to Aldosterone and S3D). Finally, we crossed the list of the genes regulated in To identify potential genes dependent on activation of MR by MR-Cardio mice with that of aldosterone-regulated genes aldosterone in cardiomyocytes, we hypothesized that these and identified 43 (23 up- and 20 downregulated) poten- genes should be dependent on MR expression (ie, genes that tial aldosterone/MR targets in cardiomyocytes (Figure are differentially expressed in the absence of aldosterone S4). Several classes of proteins were represented including treatment in MR-Cardio compared with Ctrl mice) and aldo- secreted growth factors (CTGF and Hgf [hepatocyte growth sterone administration should amplify the regulation of their factor]), ion channels (Kcnmb4 : potassium large conductance expression in MR-Cardio mice. Ca2 -activated channel, subfamily M, member 4 ; Kcnv2 : We recently demonstrated that neutrophil gelatinaseasso- potassium channel, subfamily V, member 2 ; and Cacna1s : ciated lipocalin (Ngal) is a direct target of aldosterone in the Ca2 channel, voltage-dependent, L-type, alpha 1S subunit) heart. 19 To test whether our approach allows the identifica- or cell adhesion molecules (Cdh4Cadherin 4-, and Itgb6 tion of aldosterone-regulated genes in cardiomyocytes, we integrin 6). first studied how aldosterone administration affects cardiac Ngal expression in Ctrl and MR-Cardio mice. As we previ- CTGF Is Regulated by Aldosterone in ously described, 19 Ngal expression (mRNA and protein) was Cardiomyocytes In Vivo upregulated in MR-Cardio mice when compared with Ctrl To assess whether our strategy can identify aldosterone- mice. Aldosterone further enhanced cardiac Ngal expression regulated genes in cardiomyocytes, we selected CTGF, a in MR-cardio mice (Figure 1). In Ctrl mice, as previously pub- growth factor involved in aldosterone/salt-mediated cardiac lished, Ngal was not regulated by aldosterone at the low dose fibrosis. 20 In Ctrl mice, cardiac CTGF expression was not used. 19 Thus, our strategy seems valuable to highlight genes altered by aldosterone at the low dose used (Figure 3) but dependent on MR activation by aldosterone in cardiomyocytes. a higher dose (200 g/kg per day instead of 60 g/kg per Table. General Characteristics Controls Mineralocorticoid Receptor in Cardiomyocytes Parameters Untreated Aldosterone Untreated Aldosterone Body weight, g 27. 50. 9 29. 20. 8 28. 70. 8 30. 10. 5 Heart weight, mg 149. 09. 2 141. 94. 6 151. 14. 4 165. 67. 7 Kidney weight, mg 411. 317. 4 432. 011. 0 420. 718. 7 396. 516. 2 Aldosterone, nmol/L 0. 60. 1 2. 90. 1* 0. 70. 1 2. 80. 1* Corticosterone, nmol/L 261. 453. 6 137. 812. 4* 226. 031. 2 152. 033. 0 *P vs corresponding untreated mice. Downloaded from at INSERM - DISC on November 9, 2014 Messaoudi et al Aldosterone Regulates Cardiomyocyte Genes In Vivo 363 A B Ctrl MR-Cardio A B Ctrl MR-Cardio Aldo Aldo - - Cardiac Ngal(mRNA) NGAL CTGF Ctgf ( mRNA) * # Actin 10 # * Actin Ngal/ 18S-UBC Ctgf/ 18S-UBC 100 CardiacNGAL(Protein) # C 6 C CTGF (Protein) *# 4 # * Ctgf/ 18 8 S-UBC NGAL/Actin Aldo - - 20 A ldo - - 4 # 10 # 2 Ctrl Ctrl 0 0 MR-Cardio MR-Cardio - - Aldo Aldo Figure 1. Neutrophil gelatinaseassociated lipocalin (Ngal) D Ctrl MR-Cardio regulation by aldosterone (aldo) in the heart. A through C, Cardiac Ngal mRNA (A) and protein (B and C) expression was Untreatted increased by aldosterone (aldo) in mineralocorticoid receptor (MR)-cardio mice only. MeanSEM (n 69 mice per condition). *P vs corresponding untreated mice ; #P vs corresponding controls (Ctrl). day) increased CTGF expression in cardiomyocytes (Figure Aldoste erone S6). CTGF mRNA and protein expression was increased in untreated MR-Cardio mice compared with Ctrl mice, and further increased by aldosterone (Figure 3A through 3C). 200m Double immunostaining of cardiac sections with CTGF and vinculin showed that CTGF was produced by cardiomyocytes Figure 3. Ctgf is regulated by aldosterone in cardiomyocytes. A through C, Cardiac Ctgf mRNA (A) and protein (B and in treated and untreated MR-Cardio mice (Figure 3D). C) expression were increased by aldosterone (Aldo) in Cardiac fibrosis was however not increased in our aldosterone mineralocorticoid receptor (MR)-cardio mice only. MeanSEM (n 69 mice per condition). *P vs corresponding untreated administration protocol (Figure S5). mice ; #P vs corresponding controls (Ctrl). D, Double immunolabeling of cardiac sections with vinculin (green) and Ctgf (red). Ctgf was localized in cardiomyocytes of MR-Cardio mice (treated or not with aldosterone). Microarray Control MR-Cardio 865 differentially expressed genes Aldosterone regulation of CTGF expression was further examined ex vivo in the cardiomyocyte cell line H9C2-MR . 447 418 Aldosterone induced a dose-dependent increase in CTGF 424 398 expression that was MR dependent, as spironolactone abol- 23 Supplemental Figure S4 20 ished aldosterone effect (Figure 4A and 4B). Altogether these results strongly suggest that CTGF is a target of aldosterone- 165 100 MR complexes in cardiomyocytes. 265 differentially expressed genes A Ctgf mRNA B Ctgf mRNA Microarray 2 * * * CTGF/ -Actin CTGF/ -Actin MR-Cardio Aldo MR-Cardio # Up-regulated genes Down-regulated genes 1 Figure 2. Strategy to identify aldosterone (aldo)-regulated 0 genes in cardiomyocytes. First, we determined by microarray 0 Aldo(nM) 0 0. 1 1 10 Aldo 10 -8 M - the genes differentially expressed in the absence of treatment Spiro 10 -6 M - - in mineralocorticoid receptor (MR)-Cardio compared with controls (Ctrl) mice (upper part of the figure). Then, we identified Figure 4. Regulation of Ctgf by aldosterone (aldo) ex vivo. by microarray the genes regulated by aldosterone in MR- A, Aldosterone induced an increase of Ctgf mRNA in H9C2- cardio mice (lower part of the figure). Finally, we crossed the mineralocorticoid receptor (MR ) cells at the dose of 10-9M. list of upregulated genes in MR-Cardio mice in the absence MeanSEM (n 6 per condition). *P vs untreated. B, of treatment with those of aldosterone upregulated genes in Spironolactone blocked aldosterone-induced Ctgf mRNA MR-Cardio mice (left part of the figure). We adopted the same increase in H9C2-MR cells. MeanSEM (n 6 per condition). approach with downregulated genes (right part of the figure). *P vs controls (Ctrl) ; #P vs aldo treated cells. Downloaded from at INSERM - DISC on November 9, 2014 364 Hypertension February 2013 CTGF Is Not Regulated by Corticosterone in A -671 0 exon 1 Cardiomyocytes To test whether CTGF was regulated in cardiomyocytes P1 P2 P3 P4 specifically by aldosterone or whether its expression was related to MR activation regardless of the ligand, we treated B C 10 * Control * Luciferase activity Ctrl and MR-Cardio mice with corticosterone for 1 week. 3 8 Aldo MR Binding Corticosterone administration did not alter body, heart, and 6 kidney weight (Table S4). Corticosterone treatment similarly 2 increased corticosteronemia (2- to 3-fold ; P Table S4) 1 and hepatic expression of Sult1d1 (a glucocorticoid regulated gene)21 in Ctrl and MR-cardio mice (P Figure S7). Aldo - P1 P2 P3 P4 Corticosterone also altered cardiac expression of Adamts4 Spiro - - and Trpc4 in MR-Cardio mice (Figure S8). However, cardiac Figure 6. Ctgf is a direct target of mineralocorticoid receptor expression of CTGF (mRNA and protein) was not affected by (MR). A, Schematic representation of mouse Ctgf genomic corticosterone (Figure 5). This result shows that MR regulation fragment used for construct. Arrowheads indicate the of CTGF expression in cardiomyocytes was dependent on approximate location of primers used to analyze chromato- immunoprecipitation (ChIP) products. B, Luciferase activity aldosterone, not on glucocorticoids. mediated by mouse (671/ 284) Ctgf gene fragment in COS-7 cells. Aldosterone increased luciferase activity, an effect blocked CTGF Is a Direct Target of MR by spironolactone. MeanSEM (n 11 per condition). *P To test whether CTGF is a direct target of MR we performed a vs control. C, Quantitative polymerase chain reaction (PCR) analysis of MR binding to the (671/ 284) Ctgf gene fragment. chromato-immunoprecipitation experiment. First, we cotrans- Aldosterone induced MR enrichment in the area of the Ctgf fected COS-7 cells with MR and a fragment of the CTGF promoter covered by primer pair P3. Bars represent the average gene (671/ 284, relative to the transcription start site) fused fold enrichment of each PCR fragment over the value obtained with the irrelevant IgG. MeanSEM (n 3 per condition). *P to luciferase (Figure 6A). Of note, this fragment does not con- vs control. tain any canonical hormone response elements. Aldosterone increased luciferase activity in an MR-dependent manner, Cardiomyocytes CTGF Production in Heart Failure as spironolactone abolished aldosterone effect (Figure 6B). Transfections using an empty vector and MR, or the CTGF To study whether aldosterone/MR may play a role in car- promoter fragment in the absence of MR did not alter lucif- diac pathologies by promoting cardiomyocyte CTGF pro- erase activity on aldosterone treatment (data not shown). We duction, we used a model of heart failure in rat (thoracic then performed chromato-immunoprecipitation analysis in aortic constriction). Thoracic aortic constriction induced COS-7 cells cotransfected with CTGF promoter fragment and cardiac hypertrophy ( 125%, P which was partially MR. MR binding was evaluated using 4 different primer sets prevented by eplerenone, a specific MR blocker (P (Figure 6A). Aldosterone induced MR enrichment (10-fold) Figure S9). Thoracic aortic constriction induced an increase in the area of the CTGF promoter covered by primer pair P3 in CTGF expression in cardiomyocytes, which was pre- (100 bp upstream of the transcription start site of the CTGF vented by eplerenone (Figure 7A and 7B). Therefore in promoter ; Figure 6C), indicating increased binding of MR to this model, MR activation participates to CTGF increase in CTGF promoter when aldosterone activates the receptor. cardiomyocytes. Discussion In this study, we have associated transgenic, pharmacologi- A B Ctrl MR-Cardio cal, and genomic approaches to demonstrate that increased Cort - - Cardiac Ctgf(mRNA) CTGF A B Sham TAC 4 # Actin Cardiac expression of Ctgf - Eplerenone Ctgf/ 18S-UBC C Cardiac CTGF(Protein) Ctgf/18S-UBC # # 1 4 *# CTGF/Actin Eplerenone Cort - - - - Eple Sham TAC 200m Ctrl 0 MR-Cardio Cort - - Figure 7. Ctgf increase in a model of heart failure. A, The cardiac expression of Ctgf mRNA was increased by thoracic Figure 5. Ctgf regulation by corticosterone in the heart. A aortic constriction (TAC) and partially normalized by eplerenone through C, Cardiac Ctgf mRNA (A) and protein (B and C) (eple). B, Double immunolabeling of cardiac sections with expression were not altered by corticosterone (Cort) in both vinculin (green) and Ctgf (red). Ctgf was expressed in the controls (Ctrl) and mineralocorticoid receptor (MR)-cardio mice. cardiomyocytes of rats with TACeplerenone. MeanSEM MeanSEM (n 67). #P vs corresponding Ctrl. (n 46). *P vs sham, #P vs TAC-eple. Downloaded from at INSERM - DISC on November 9, 2014 Messaoudi et al Aldosterone Regulates Cardiomyocyte Genes In Vivo 365 plasma aldosterone concentration can activate cardiomyocyte of aldosterone in patients with systolic heart failure (with MR and regulate specific genes despite the large excess of no differences in median aldosterone concentration between endogenous glucocorticoids. patients with systolic heart failure and those without systolic Our model of MR overexpression, although artificial, heart failure) is associated with an adverse outcome. 27 The mimics a situation common to several cardiac diseases where control of aldosterone plasma concentration (through the cardiac MR expression is enhanced. 13 In these studies, the development and the use of aldosterone-synthase inhibitors cardiac increase in MR expression is 2-fold, but can reach such as the FAD286, 28 which experimentally presents promis- 12-fold in models of hypertension1 (malignant SHR stroke- ing results in treatment of cardiac heart failure) in addition to prone rats). The cardiac MR level in MR-Cardio mice is MR blockers may thus be a complementary strategy to fully therefore high, albeit equivalent to that observed in the block the aldosterone/MR activated pathways in patients with malignant SHR-stroke-prone rats. However, the MR-Cardio elevated aldosteronemia. mouse model allowed for obtaining results that are clinically Corticosterone also regulated the expression of genes in relevant. Indeed, this model highlighted the role of MR in MR-Cardio mice (Adamts4 and Trpc4). We cannot exclude electrophysiological remodeling, and subsequent posterior that these genes were regulated by the stimulation of the glu- studies in nontransgenic models such as rats and rabbits cocorticoid receptor. Interestingly, these genes were also reg- confirmed these findings. 22, 23 Most importantly, MR-Cardio ulated by aldosterone. This shows a high level of complexity mice allowed us to demonstrate that MR triggers cardiac in the regulation of MR activation, suggesting that MR may arrhythmias and particularly promotes ventricular premature regulate differentially the same target according to the nature complexes, 12 suggesting that MR blockers may be effective of the ligand (eg, Adamts4) and that MR can regulate the in the treatment of arrhythmias. This was recently confirmed same target regardless the ligand (eg, Trpc4). Interestingly, by a meta-analysis showing that MR blockers reduced the expression of only few MR-regulated genes in MR-Cardio episodes of ventricular premature complexes and ventricular mice was further enhanced by aldosterone administration. It tachycardia in humans. 24 can be hypothesized that most genes in MR-Cardio mice may It is often argued that circulating concentration of gluco- be regulated by endogenous glucocorticoids occupying MR. corticoids (100- to 1000-fold higher than those of aldoste- A second possibility is that most of the MR-regulated genes rone) preclude MR occupancy by aldosterone in nonprotected in MR-Cardio mice reached a threshold that cannot be fur- tissues and cell types such as cardiomyocytes. However, we ther enhanced. Another possibility is that these genes were identified putative targets of aldosterone in cardiomyocytes, not primary targets of MR but rather genes regulated subse- and we demonstrated that 1 of them, CTGF, was actually quently to the induction of processes after chronic MR acti- regulated by aldosterone via MR in cardiomyocytes in vivo. vation. These genes should be the subjects of further studies, Importantly, this result was obtained with aldosterone alone allowing a better understanding of MR action and regulation (at a dose that does not increase blood pressure) and not in of genes in the heart. a context of salt loading. Therefore, even in cells with low CTGF expression is increased in various heart diseases. 29 11-HSD2 such as cardiomyocytes, aldosterone can acti- Our results suggest that this increase may be induced (at least vate MR, at least in some situations. In classical targets of partly) by aldosterone. It has been demonstrated that aldo- aldosterone such as the distal nephron, 11-HSD2 cannot sterone regulates CTGF expression ex vivo in various cell inactivate all glucocorticoids present in the cell. 25 Therefore, types (fibroblasts, 20 smooth muscle cells, 30 and renal mesan- there must be other mechanisms that contribute to selective gial cells)31 including cardiomyocytes. 32 However, we show MR activation by aldosterone in classic targets and probably here for the first time that CTGF is a direct target of MR, also in nonepithelial tissues. Ligand-sensitive transactivation and that aldosterone (but not corticosterone) increases CTGF efficacy could be one of such mechanisms. Indeed, although expression in cardiomyocytes through the stimulation of car- mineralocorticoids and glucocorticoids bind MRs with diomyocyte-MR in vivo. Mineralocorticoids can also induce equivalent affinity, it has been demonstrated in vitro that the CTGF through other pathways, in the heart, in a serum/glu- aldosterone/MR complex is more stable and is 200-fold more cocorticoid regulated kinase 1dependent manner20 and in the efficient for transactivation than the glucocorticoid/MR com- vasculature, in an oxidative stress-dependent manner. 30 This plex. 26 Subcellular compartmentalization or posttranslational does not mean that these pathways are mutually exclusive, modifications of MRs or both could also be mechanisms and convergent signaling may be involved. that vary MR occupancy by aldosterone or glucocorticoids. Interestingly, although CTGF was increased by aldoste- Pathological situations could also alter these mechanisms. rone in MR-Cardio mice, cardiac fibrosis was not further We report here that increased expression of cardiomyo- enhanced. Along the same line, transgenic overexpression cyte-MR (without change in aldosterone concentration) of CTGF in kidney, liver, and heart did not induce fibrosis. 33 altered the expression of 865 genes. This suggests that the CTGF is thus considered to induce an environment favoring level of cardiac MR expression (threshold effect) plays a fibrogenic stimuli rather than promoting fibrosis by itself. 33 crucial role in MR signaling. Enhanced MR signaling may Therefore, aldosterone may promote fibrosis through the occur in the presence of normal circulating aldosterone con- induction of such molecules that create an environment centration, because of increased local expression of MR. favoring fibrogenic stimuli. This may explain why aldoste- This could explain why MR blockade is so efficient in car- rone alone is not fibrogenic but requires triggers such as diac diseases despite low to normal levels of aldosterone. 4, 5 enhanced sodium intake to induce cardiac fibrosis linked to Moreover, a recent study demonstrates that the highest tertile MR activation. 34 Downloaded from at INSERM - DISC on November 9, 2014 366 Hypertension February 2013 Conclusions 10. Messaoudi S, Jaisser F. Aldosterone and the mineralocorticoid receptor. Eur Heart J Suppl. 2011 ; 13 : B4B9. This study identified genes modulated by aldosterone/MR 11. Fraccarollo D, Berger S, Galuppo P, Kneitz S, Hein L, Schtz G, Frantz in cardiomyocytes despite the absence of 11-HSD2. We S, Ertl G, Bauersachs J. Deletion of cardiomyocyte mineralocorticoid demonstrated that CTGF was regulated by aldosterone and receptor ameliorates adverse remodeling after myocardial infarction. Circulation. 2011 ; 123 : 400408. MR in cardiomyocytes. These findings open new perspectives 12. Ouvrard-Pascaud A, Sainte-Marie Y, Bénitah JP, et al. Conditional min- in the understanding of the role played by aldosterone and eralocorticoid receptor expression in the heart leads to life-threatening cardiomyocyte-MR in cardiac physiology and pathology. arrhythmias. Circulation. 2005 ; 111 : 30253033. 13. Favre J, Gao J, Zhang AD, Remy-Jouet I, Ouvrard-Pascaud A, Dautreaux In particular, they raise the question of MR selectivity B, Escoubet B, Thuillez C, Jaisser F, Richard V. Coronary endothelial dys- mechanisms other than the 11- HSD2 and suggest that the function after cardiomyocyte-specific mineralocorticoid receptor overex- control of aldosterone plasma concentration and the use of pression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2011 ; 300 : H2035H2043. 14. Arriza JL, Weinberger C, Cerelli G, Glaser TM, Handelin BL, Housman aldosterone-synthase inhibitors in addition to MR blockade DE, Evans RM. Cloning of human mineralocorticoid receptor comple- may be beneficial in cardiac diseases. mentary DNA : structural and functional kinship with the glucocorticoid receptor. Science. 1987 ; 237 : 268275. Acknowledgments 15. Funder JW, Pearce PT, Smith R, Smith AI. Mineralocorticoid action : target tissue specificity is enzyme, not receptor, mediated. Science. We thank Dr Aniko Naray-Fejes-Toth for providing the H9C2-MR 1988 ; 242 : 583585. cells and Evelyne Polidano and Régine Merval for animal surgery. 16. Lombès M, Alfaidy N, Eugene E, Lessana A, Farman N, Bonvalet JP. Prerequisite for cardiac aldosterone action. Mineralocorticoid receptor Sources of Funding and 11-hydroxysteroid dehydrogenase in the human heart. Circulation. This work was supported by Institut National pour la Santé et 1995 ; 92 : 175182. Recherche Médicale, and grants from the Agence Nationale pour la 17. Gmez AM, Rueda A, Sainte-Marie Y, et al. 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Pitt B, Zannad F, Remme WJ, Cody R, Castaigne A, Perez A, Palensky 25. Funder JW. Reconsidering the roles of the mineralocorticoid receptor. J, Wittes J. The effect of spironolactone on morbidity and mortality in Hypertension. 2009 ; 53 : 286290. patients with severe heart failure. Randomized Aldactone Evaluation 26. Farman N, Rafestin-Oblin ME. Multiple aspects of mineralocorticoid Study Investigators. N Engl J Med. 1999 ; 341 : 709717. selectivity. Am J Physiol Renal Physiol. 2001 ; 280 : F181F192. 5. Pitt B, Remme W, Zannad F, Neaton J, Martinez F, Roniker B, Bittman 27. Gder G, Bauersachs J, Frantz S, Weismann D, Allolio B, Ertl G, R, Hurley S, Kleiman J, Gatlin M. Eplerenone, a selective aldosterone Angermann CE, Strk S. Complementary and incremental mortality risk blocker, in patients with left ventricular dysfunction after myocardial prediction by cortisol and aldosterone in chronic heart failure. Circulation. infarction. 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Downloaded from at INSERM - DISC on November 9, 2014 Messaoudi et al Aldosterone Regulates Cardiomyocyte Genes In Vivo 367 32. Lee YS, Kim JA, Kim KL, Jang HS, Kim JM, Lee JY, Shin IS, Lee JS, 33. Brigstock DR. Connective tissue growth factor (CCN2, CTGF) and Suh W, Choi JH, Jeon ES, Byun J, Kim DK. Aldosterone upregulates con- organ fibrosis : lessons from transgenic animals. J Cell Commun Signal. nective tissue growth factor gene expression via p38 MAPK pathway and 2010 ; 4 : 14. mineralocorticoid receptor in ventricular myocytes. J Korean Med Sci. 34. Brilla CG, Weber KT. Mineralocorticoid excess, dietary sodium, and 2004 ; 19 : 805811. myocardial fibrosis. J Lab Clin Med. 1992 ; 120 : 893901. Novelty and Significance What Is New ? Summary Aldosterone regulates gene expression in cardiomyocytes in vivo despite Aldosterone regulates gene expression in cardiomyocytes in high plasma glucocorticoid concentration and independently of salt loading. vivo. What Is Relevant ? There must be selectivity mechanisms other than the 11- HSD2 in cardiomyocytes. Control of aldosterone plasma concentration in addition to MR blockade is a strategy to consider. Downloaded from at INSERM - DISC on November 9, 2014 Genes Forward Reward 18S CgC CgC Tag Agg TgA AAT TC TCT Tgg CAA ATg CTT TCg C Adamts4 Tgg ggA ggg CAT CAg CgT gTA T AgC AAg CAg TCg ggC TCC TTC A ENaC Cgg AgT TgC TAA ACT CAA CAT C Tgg AgA CCA gTA CCg gCT Ctgf TgA CCC CTg CgA CCC ACA TAC ACC gAC CCA CCg AAg ACA CAg Kcnk1 ATT ggg ACT TCA CCT Cgg CgC T TgA CAT gCA Cgg TgA CAC gCT MR ggC TAC CAC AgT CTC CCT gA CgT TgA CAA TCT CCA TgT Sgk1 ACg gAC CCA ggT TgA TTT gTT Agg gCA gTT TTg gAA Agg TT Sult1d1 ATg TCA TCA ggC Cgg gCT TCA ACg TTg TgA gCT ACC CAg ggA C Tnnt3 gAA AAA ggC TCT gTC CTC CA CAg AgT TCC TTg gCC TTg TC Trpc4 gAC CTg TCg ATg TgC TgA gA gCT ggA ggA gAA gAC ACT gg Ubc AgC CCA gTg TTA CCA CCA Ag ACC CAA gAA CAA gCA CAA gg Supplemental table S1 : Primers sequence. Adamts4 : A disintegrin-like and metallopeptidase (reprolysin type) with thrombospondin type 1 motif, 4 ; EnaC : sodium channel , nonvoltage-gated 1 alpha ; Ctgf : Connective tissue growth factor ; Kcnk1 : potassium channel, subfamily K, member 1 ; MR : mineralocorticoid receptor ; Sgk1 : Serum and glucocorticoid-regulated kinase 1 ; Sult1d1 : sulfotransferase family 1D, member 1 ; Tnnt3 : troponin T3 ; Trpc4 : transient receptor potential cation channel, subfamily C, member 4 ; Ubc : Ubiquitin C. Ctrl MR-Cardio Untreated Corticosterone Untreated Corticosterone Body weight (g) 27. 5 0. 9 28. 8 1. 0 28. 7 0. 8 30. 3 1. 8 Heart weight (mg) 149. 0 9. 2 138. 3 3. 7 151. 1 4. 4 158. 0 7. 5 Kidney weight (mg) 411. 317. 4 397. 4 10. 7 420. 7 18. 7 392. 0 20. 9 Corticosterone (nM) 0. 6 0. 1 453. 4 76. 4 * 0. 7 0. 1 352. 8 36 * Supplemental table S4 : General characteristics of Corticosterone-treated and non-treated mice. *p vs corresponding untreated mice. Supplemental figure S1 : Cardiac MR expression (mRNA) assessed by Q-PCR. Cardiac MR expression was increased in MR-cardio mice only (treated and untreated). Aldosterone treatment did not alter cardiac MR expression. MeanSEM (n 6 to 9 mice per condition). #p vs corresponding Ctrl. Supplemental figure S2 : In both Ctrl and MR-cardio mice ENaC and Sgk1 renal expression was increased specifically by aldosterone. The expression of these genes was assessed by quantitative real- time PCR. Statistical analysis was performed by 2-way anova test followed by the Holm posthoc test to adjust for multiple comparisons. MeanSEM (n 6 to 9). *p vs corresponding untreated. Supplemental figure S3 : Genes tested to validate MR-regulated genes in MR-Cardio mice (Kcnk1 and Tnnt3) and aldosterone-regulated in MR-Cardio mice (Adamts4 and Trpc4) as predicted by microarrays (up of the panel). The expression of these genes was assessed by quantitative real-time PCR confirmed microarray results (bottom of the panel). Statistical analysis was performed by Kruskal-Wallis test followed by the Holm posthoc test to adjust for multiple comparisons. MeanSEM (n 6 to 9). *p vs corresponding untreated, #p vs corresponding Ctrl. Supplemental figure S4 : Heatmap of Microarray predicted aldosterone- and MR regulated genes in MR-Cardio mice. Genes are classified according to the Fold Change of the genes differing between treated and untreated MR-Cardio mice. The FC retained is 2 and p0. 05. Supplemental figure S5 : Cardiac fibrosis assessment by red sirius. At the basal state, MR-Cardio mice are characterized by a moderate increase in cardiac fibrosis. Aldosterone administration did not further enhance cardiac fibrosis. Sections (4 to 5 per animal, at X10) were observed in microscope and quantified with ImageJ (V 1. 43) software (NIH). N 5 per condition. Magnification X10 (Scale bar 200m). #p vs corresponding Ctrl. Supplemental figure S6 : A-C. Cardiac CTGF mRNA (A) and protein (B-C) expression was increased in non-transgenic mice by aldosterone (Aldo) at the dose of 200g/Kg/d. MeanSEM (n 3 mice per condition). *p (groups were compared with Mann-Whitney test). D. Double immuno- labeling of cardiac sections with vinculin (green) and CTGF (red). CTGF was localized in cardiomyocytes in aldo-treated mice. Scale bar : 50 m (Magnification X40). Supplemental figure S7 : In both Ctrl and MR-cardio mice Sult1d1 hepatic expression was increased by corticosterone. The expression of this gene was assessed by quantitative real-time PCR. Statistical analysis was performed by 2-way anova test followed by the Holm posthoc test to adjust for multiple comparisons. MeanSEM (n 6 to 7 per group). *p vs corresponding untreated. Supplemental figure S8 : Corticosterone did not altered cardiac expression of Kcnk1 and Tnnt3. Adamts4 and Trpc4 were regulated by corticosterone in MR-Cardio mice. Statistical analysis was performed by Kruskal-Wallis test followed by the Holm posthoc test to adjust for multiple comparisons. MeanSEM (n 6 to 7 per group). *p vs corresponding untreated, #p vs corresponding Ctrl. Supplemental figure S9 : Thoracic aortic constriction in rats induced cardiac hypertrophy as revealed by the increase of heart weight / body weight ratio. Eplerenone partially reverses this hypertrophy. Statistical analysis was performed by Kruskal-Wallis test followed by the Holm posthoc test to adjust for multiple comparisons. MeanSEM (n 4 to 6). *p vs sham, #p vs TAC-eple. 3. 2. 1. 4 Conclusions de l'étude et discussion Parmi les 23 gènes identifiés être stimulés par l'aldostérone, le RM, ou le complexe aldostérone/RM, CTGF nous a servi de gène candidat de premier choix pour mieux comprendre la voie de signalisation du RM dans le cœur et dans le cardiomyocyte. Notre étude montre que l'expression de CTGF est augmentée dans le cœur des souris RM-Cardio par rapport à leur souris contrôles, et que l'aldostérone potentialise cet effet. De plus, son expression est : - localisée (par immunofluorescence) spécifiquement au niveau des cardiomyocytes in vivo - augmentée par l'aldostérone (à 10-8 M) - complètement prévenue par la spironolactone (à 10-6 M) in vitro dans les cellules H9C2- RM . Finalement, nous avons montré in vitro que le RM se lie à la région promotrice du gène codant pour CTGF. L'ensemble de ces résultats démontrent que le gène codant pour la protéine CTGF est un gène cible du complexe aldostérone/RM. De plus, cette étude indique, par des approches transgéniques et pharmacologiques, qu'une concentration modérément élevée d'aldostérone est capable d'activer le RM du cardiomyocyte in vivo. Le CTGF est connu pour augmenter l'expression de molécules impliquées dans le remodelage de la matrice extracellulaire comme le collagène I ou PAI-1, après induction par TGF-212. Des travaux ont aussi rapporté l'expression de CTGF dans le cœur, au niveau des fibroblastes et des cardiomyocytes213, 214 et elle est également modulée lors de pathologies cardiovasculaires comme l'infarctus du myocarde215, ou l'hypertension216. Notre étude montre quant à elle que l'expression de CTGF est régulée spécifiquement par l'aldostérone via le RM du cardiomyocyte, dans un modèle d'infusion d'aldostérone seule, et dans des concentrations qui n'affectent pas la pression artérielle. In vivo, l'aldostérone peut donc agir sur son récepteur, alors que l'enzyme de sélectivité 11-HSD2 est peu exprimée. Notre étude renforce le concept selon lequel d'autres mécanismes de sélectivité contribuent à l'activation du RM par l'aldostérone, dans les cibles non classiques o l'activité de la 11-HSD2 est faible217. Par ailleurs, il est probable que la 11-HSD2 soit saturée au niveau du néphron distal ne lui permettant pas d'inactiver tous les glucocorticoïdes présents, ce qui n'empêche pas pour autant la fixation de l'aldostérone. Bien que le RM lie avec la même affinité l'aldostérone et les glucocorticoïdes, il est démontré in vitro que le complexe aldostérone/RM est plus stable et plus efficace pour activer la transcription de gènes que ne l'est le complexe glucocorticoïdes/RM26. Par conséquent, la stabilité de l'interaction entre le RM et son ligand permet d'optimiser l'activité transcriptionnelle du RM dans toutes les cellules o celui-ci s'exprime. Les souris RM-Cardio traitées ou non à l'aldostérone ne développent pas de fibrose cardiaque plus marquée que les souris contrôles. Ceci est aussi observé chez des souris transgéniques dont la surexpression de CTGF dans le cardiomyocyte n'induit pas le développement de fibrose cardiaque par rapport à leurs contrôles218. Il est donc possible que CTGF induise un environnement favorable au développement de la fibrose, plutôt que de stimuler directement celle-ci. L'aldostérone pourrait contribuer à l'apparition de cet environnement profibrosant, mais nécessite des co-activateurs comme le sel pour que la fibrose se développe. Bien qu'artificiel, l'utilisation de ce modèle transgénique murin dans cette étude peut être un modèle reflétant la physiopathologie cardiovasculaire, dans la mesure o une augmentation de l'expression du RM cardiaque est observée dans certaines conditions. Les rats Dahl expriment le RM cardiaque environ 2 fois plus que leurs contrôles165, alors que chez des rats SHRSP dont l'hypertension est très sévère (M-SHRSP, pour malignant-SHRSP), l'expression du RM peut augmenter plus de 10 fois par rapport à leurs contrôles219. Ce modèle transgénique nous a également permis de mettre en évidence l'implication du remodelage ionique cardiaque170, qui est à ce jour une des cibles thérapeutiques utilisée en clinique au cours du traitement des troubles du rythme cardiaque (confer chapitre 1. 5. 2. 5). Allant dans ce sens, une analyse comparative de sept essais cliniques différents a montré un bénéfice du blocage du RM sur les troubles du rythme220. En effet, les antagonistes du RM réduisent de 72% le risque de développer des tachycardies ventriculaires chez les patients atteints de pathologies cardiovasculaires comme l'insuffisance cardiaque ou l'hypertension220. 3. 2. 2 Etude transcriptomique cardiaque globale 3. 2. 2. 1 Etat de la question Les transcriptomes cardiaques effectués chez les souris RM-Cardio et leurs contrôles, traitées ou non à l'aldostérone ou à la corticostérone, ont été à l'origine d'une exploration plus approfondie des gènes différentiellement modulés par les deux ligands du RM dans le cœur. Une analyse par Gene Ontology (permettant d'associer de manière significative les transcrits par rapport à un processus biologique donné) a été effectuée pour chaque condition. La suite de ce chapitre va présenter l'analyse approfondie de la comparaison du transcriptome cardiaque des souris contrôles traitées à l'aldostérone par rapport aux souris contrôles non traitées, puis se terminera par des données préliminaires sur les souris RM-Cardio. 3. 2. 2. 2 Objectif de l'étude Le but de ce travail a consisté à identifier de nouveaux processus biologiques modulés par l'aldostérone, en étudiant plus particulièrement les gènes cibles spécifiquement impliqués dans la signalisation minéralocorticoïde. Le transcriptome des souris contrôles, non traitées ou traitées avec l'aldostérone, nous a permis d'approfondir les effets induits par cette hormone dans le cœur. A partir de l'analyse par Gene Ontology, les gènes dépendants de l'aldostérone ont presque tous pu être reliés à un processus biologique défini, avec une majorité associée aux processus du cycle cellulaire. Nous avons donc recherché si l'aldostérone, via le RM, peut être impliquée dans un processus prolifératif. L'étude présentée ci-dessous, initiée par le docteur Messaoudi et dont je suis le premier auteur, a été publiée début 2015. 3. 2. 2. 3 Article : Aldosterone Promotes Cardiac Endothelial Cells Proliferation In Vivo Aldosterone Promotes Cardiac Endothelial Cell Proliferation In Vivo Basile Gravez, Antoine Tarjus, Véronique Pelloux, Antoine Ouvrard-Pascaud, Claude Delcayre, Janelise Samuel, Karine Clément, Nicolette Farman, Fréderic Jaisser and Smail Messaoudi J Am Heart Assoc. 2015 ; 4 : e001266 ; originally published January 6, 2015 ; doi : 10. 1161/JAHA. 114. 001266 The Journal of the American Heart Association is published by the American Heart Association, 7272 Greenville Avenue, Dallas, TX 75231 Online ISSN : 2047-9980 The online version of this article, along with updated information and services, is located on the World Wide Web at : Subscriptions, Permissions, and Reprints : The Journal of the American Heart Association is an online only Open Access publication. Visit the Journal at for more information. Downloaded from by guest on February 6, 2015 ORIGINAL RESEARCH Aldosterone Promotes Cardiac Endothelial Cell Proliferation In Vivo Basile Gravez, MSc ; Antoine Tarjus, PhD ; Veronique Pelloux, MSc ; Antoine Ouvrard-Pascaud, PhD ; Claude Delcayre, PhD ; Janelise Samuel, MD, PhD ; Karine Clement, MD, PhD ; Nicolette Farman, MD, PhD ; Frederic Jaisser, MD, PhD ; * Smail Messaoudi, PhD* Background-Experimentally, aldosterone in association with NaCl induces cardiac brosis, oxidative stress, and inammation through mineralocorticoid receptor activation ; however, the biological processes regulated by aldosterone alone in the heart remain to be identied. Methods and Results-Mice were treated for 7 days with aldosterone, and then cardiac transcriptome was analyzed. Aldosterone regulated 60 transcripts (51 upregulated and 9 downregulated) in the heart (fold change 1. 5, false discovery rate To identify the biological processes modulated by aldosterone, a gene ontology analysis was performed. The majority of aldosterone- regulated genes were involved in cell division. The cardiac Ki-67 index (an index of proliferation) of aldosterone-treated mice was higher than that of nontreated mice, conrming microarray predictions. Costaining of Ki-67 with vinculin, CD68, a-smooth muscle actin, CD31, or caveolin 1 revealed that the cycling cells were essentially endothelial cells. Aldosterone-induced mineralocorticoid receptordependent proliferation was conrmed ex vivo in human endothelial cells. Moreover, pharmacological-specic blockade of mineralocorticoid receptor by eplerenone inhibited endothelial cell proliferation in a preclinical model of heart failure (transverse aortic constriction). Conclusions-Aldosterone modulates cardiac gene expression and induces the proliferation of cardiac endothelial cells in vivo. ( J Am Heart Assoc. 2015 ; 4 : e001266 doi : 10. 1161/JAHA. 114. 001266) Key Words : aldosterone heart pressure overload proliferation ver the last 2 decades, there has been renewed interest NADPH oxidases. 6 Noticeably, coadministration of NaCl is O in understanding the role of aldosterone and its receptor (the mineralocorticoid receptor [MR]) in cardiovascular func- essential in these models : Aldosterone alone is not sufcient to induce cardiac brosis. tion and disease due to the benecial effects of pharmaco- Beside brosis, aldosterone also alters cardiomyocyte logical MR antagonists in patients with heart failure. 13 calcium channel current, 7 impairs the activity of the ryanodine In animal models, pharmacological blockade of MR receptor, 8 and promotes arrhythmia. 9 In contrast to brosis reverses or prevents the adverse effects of aldosterone on and inammation, the proarrythmogenic properties of aldo- cardiac brosis. 4, 5 Experimentally, chronic infusion of aldo- sterone do not require coadministration of salt or a patho- sterone induces cardiac inammation and brosis indepen- logical environment. This suggests that aldosterone alone dently of increase in blood pressure. 4, 5 Aldosterone also may establish conditions that sensitize cardiac tissue to other induces cardiac oxidative stress, mainly through activation of triggers ; however, the biological processes activated by aldosterone in the heart in the absence of added sodium are far from being fully understood. From the Inserm U1138, Team 1, 15 rue de l'ecole de medecine, Paris, France The aim of this study was to identify new aldosterone- (B. G. , A. T. , N. F. , F. J. , S. M. ) ; INSERM-UMR 1166 Team 6- GH Pitie-Salp^etri ere, 83 Bd de l'h^opital, Paris, France (V. P. , K. C. ) ; UMR 644 Inserm-Universite de regulated biological processes that might contribute to Rouen. 22, Boulevard Gambetta, Rouen, France (A. O. -P. ) ; Inserm U942, 41 cardiac diseases. We used an approach consisting of pange- Boulevard de la chapelle, Paris, France (C. D. , J. S. ). nomic analysis of genes regulated in vivo in the mouse heart *Dr Jaisser and Dr Messaoudi shared senior authorship. after administration of a low dose of aldosterone. Treatment Correspondence to : Smail Messaoudi, PhD, Centre de Recherche des Cordeliers, Equipe 1, Escalier E, 1er etage. 15 rue de l'Ecole de Medecine, duration was short (1 week) to favor the identication of 75006 Paris, France. E-mail : smail. messaoudi@crc. jussieu. fr primary aldosterone targets rather than those involved in Received July 11, 2014 ; accepted November 20, 2014. compensatory or adaptive processes occurring after chronic 2015 The Authors. Published on behalf of the American Heart Association, administration of aldosterone. We report that moderate Inc. , by Wiley Blackwell. This is an open access article under the terms of the increase in plasma aldosterone concentration regulates Creative Commons Attribution-NonCommercial License, which permits use, distribution and reproduction in any medium, provided the original work is cardiac expression of genes involved in proliferation and properly cited and is not used for commercial purposes. promotes proliferation of cardiac endothelial cells (ECs). DOI : 10. 1161/JAHA. 114. 001266 Journal of the American Heart Association 1 Downloaded from by guest on February 6, 2015 Aldosterone and Cardiac Cell Proliferation Gravez et al ORIGINAL RESEARCH Moreover, pharmacological MR antagonism prevents endo- thelial proliferation observed in a rat model of heart failure. Tissue Sampling Hearts were rinsed in cold PBS, weighed, and cut into 2 parts (transversal cut). The apex was frozen for mRNA and protein Materials and Methods extraction. The base was immersed in Tissue-Tek (Sakura Finetek France) and frozen in liquid nitrogen-cooled isopen- Mice tane for morphological studies. Kidneys were rinsed in cold Four-month-old male mice (B6D2) purchased from Janvier-Labs PBS and weighed. All samples were frozen in liquid nitrogen (Le Genest-Saint-Isle, France) were used for this study. The use and kept at 80C. of animals was in accordance with the guidelines of the European Community and approved by our institutional animal care and use committee and thus has been performed in Microarray and Gene Expression Analysis accordance with the ethical standards laid down in the 1964 Five mice per group were used to carry out micro- Declaration of Helsinki and its later amendments. Aldosterone array experiments (1 week aldosterone treatment). Total (A9477 ; Sigma-Aldrich) was resuspended in ethanol, diluted RNA was prepared from ventricle samples with the RNeasy 109 in saline, then infused (60 lg/kg per day) via osmotic Mini Kit (Qiagen), according to the manufacturer's instruc- minipumps (Alzet) (before minipump implantation, mice were tions, and its quality was assessed with the 2100 anesthetized by xylasine or ketamine administration) for 1 week Bioanalyzer (Agilent Technologies). Microarray experiments (n 6 to 9 per group) or 4 weeks (n 8 per group), as described were carried out using the mouse GE 4x44K v2 microarray previously. 10 This allowed a moderate increase in plasma kit (Agilent Technologies). Labeling of the RNAs, hybridiza- aldosterone levels (5-fold increase, 2. 9 nmol/L versus tion (1 animal per array), and scanning of the microarrays 0. 6 nmol/L in control mice). 10 Infusion of the vehicle (ethanol were performed according to the manufacturer's instruc- 10% in saline) had no effects on the parameters studied. tions. Data were analyzed using GeneSpring software (Agilent Technologies). The false discovery rate and fold- change threshold retained were 1% and 1. 5, respectively. Blood Pressure Measurement Quantitative real-time polymerase chain reaction was car- Systolic blood pressure was measured by tail-cuff plethys- ried out, as described previously. 11 Primer sequences are mography in trained conscious mice using a BP-2000 Visitech listed in Table 1. system (Bioseb). Table 1. Primer Sequences Genes Forward Primer Reverse Primer 18S CGCCGCTAGAGGTGAAATTC TCTTGGCAAATGCTTTCGC Ang1 GAAGGGAACCGAGCCTACTC ACCACCAACCTCCTGTTAGC Birc5 GTGACGCCATCATGGGAGCTCC AGGCTCGTTCTCGGTAGGGCAG Ccnb1 TGATTTTGGAGGAGCCATGGCGCTC GCACTCTTGCCTGTAGCTCTTCGC Cdk1 AGTAACGAGCCGAGCCCAGCA TCGGCCTTGCCAGAGCGTTTG Fgf2 GCCAACCGGTACCTTGCTAT GTCCCGTTTTGGATCCGAGT Icam1 TCCGCTACCATCACCGTGTATTC TGGCCTCGGAGACATTAGAGAAC Mcp1 ATCCCAATGAGTAGGCTGGAGAGC CAGAAGTGCTTGAGGTGGTTGTG Neil3 ACCGCCGTTGTGTTCTCCGA TGGAGCGCTTGCCATGTCTGC Pgf TCTGCTGGGAACAACTCA ACA GTGAGACACCTCATCAGGGTAT Tnfa GGGACAGTGACCTGGACTGT AGTGAATTCGGAAAGCCCATT Ubc AGCCCAGTGTTACCACCAAG ACCCAAGAACAAGCACAAGG Vcam CTGGGAAGCTGGAACGAAGT GCCAAACACTTGACCGTGAC Vegf-a AGCAACATCACCATGCAGATCATGC TGAACAAGGCTCACAGTGAACGC Ang1 indicates angiopoietin1 ; Birc5, Baculoviral IAP repeat containing 5 ; Ccnb1, cyclin B1 ; Cdk1, cyclin-dependent kinase 1 ; Fgf2, broblast growth factor 2 ; Icam1, intercellular adhesion molecule 1 ; Mcp1, macrophage chemo-attractant protein 1 ; Neil3, Nei like 3 ; Pgf, placental growth factor ; Tnf-a, tumor necrosis factor a ; UBC, ubiquitin ; Vcam, vascular cell adhesion molecule 1 ; VEGF-a, vascular endothelial growth factor A. DOI : 10. 1161/JAHA. 114. 001266 Journal of the American Heart Association 2 Downloaded from by guest on February 6, 2015 Aldosterone and Cardiac Cell Proliferation Gravez et al ORIGINAL RESEARCH Gene Ontology Analysis CD31 or caveolin 1 staining. Vinculin antibody allowed the 12 identication of cardiomyocyte outlines, whereas a-smooth Gene ontology (GO) analysis was carried using FunNet muscle actin and CD68 antibodies detected smooth muscle ( FunNet integrates experimental cells and macrophages, respectively. A minimum of 5 elds gene expression data and knowledge about the biological per section was recorded at 910 and 920 using a Leica roles of transcripts available in genomic annotation systems. camera equipped with a uorescent Leica DMR (Leica Briey, FunNet performs functional proling of gene expres- Microsystems). The Ki-67 or p-H3 index is dened as the sion data to identify a set of signicant (ie, overrepresented) number of positive Ki-67 or p-H3 nuclei per total nuclei. The biological themes characterizing the analyzed transcripts (ie, numbers of capillaries and positive and total nuclei were cellular processes, pathways, and molecular functions in determined using ImageJ (version 1. 43) software. The capil- which the analyzed transcripts are involved). The options lary density was dened as the number of capillaries per provided with this type of analysis are related to the gene surface unit. annotation systems to be used for functional proling of transcripts and to the type of gene-enrichment computation performed for GO categories (ie, the 3 main conceptual axes of the GO lattice). The annotation systems currently available Culture of Human Umbilical Vein Endothelial Cells in FunNet are those provided by the Gene Ontology Consor- and Aldosterone Treatment tium and the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Human umbilical vein ECs were purchased from ScienCell Research Laboratories (code 8000). Cells were grown in collagen-coated asks with endothelial basal medium 2 Gene Network Building supplemented with endothelial cell growth medium 2 The gene network was generated through the use of Ingenuity (CC3162 ; Lonza). For experiments, cells were transferred Pathway Analysis (Ingenuity Systems). A data set containing into 6-well plates at a conuence of 15%. They were grown in gene identiers and corresponding expression values was serum-free medium 24 hours before stimulation. Aldosterone uploaded into in the application. Each identier was mapped (Sigma-Aldrich) was initially dissolved in ethanol at a concen- to its corresponding object in the Ingenuity Knowledge Base. tration of 10 3 mol/L. Cells were treated with aldosterone The genes, the expression of which was signicantly differ- (10 8 mol/L) or vehicle (containing the same proportion of entially regulated, are called network-eligible molecules and ethanol as treated cells) for 96 hours. Medium was renewed were overlaid onto a global molecular network developed from every 48 hours. To investigate the specicity of action of information contained in the Ingenuity Knowledge Base. aldosterone, the MR antagonist spironolactone (S3378 ; Networks of network-eligible molecules were then algorith- Sigma-Aldrich) was used (dissolved in ethanol) at the nal mically generated based on their connectivity. concentration of 10 6 mol/L. Immunouorescence Cell-Proliferation Assessment Left ventricular frozen 4-lm sections were stained using Cell proliferation was assessed with the quick cell prolifer- primary antibodies against Ki-67 (ab15580 ; Abcam), CD31 ation kit (65475 ; Biorad). Briey, this assay is based on the (550274 ; BD Pharmigen), phospho-histone H3 (p-H3 ; cleavage of the tetrazolium salt WST-1 to formazan by CS9701 ; Cell Signaling), vinculin (V9131 ; Sigma-Aldrich), cellular mitochondrial dehydrogenases. Expansion of viable FITC-coupled caveolin 1 (sc894-FITC ; Santa Cruz Biotechnol- cell numbers results in an increase in the overall activity of ogy), a-smooth muscle actin isoform (ab7817 ; Abcam), and the mitochondrial dehydrogenases in the sample, corre- CD68 (ab53444 ; Abcam). Briey, frozen sections were xed sponding to an increase in formazan dye metabolism. The in 4% paraformaldehyde and then washed with PBS Tween formazan dye produced by the viable cells is measured at an 20. Subsequently, sections were blocked with 5% bovine absorbance of 440 nm using a standard multiwell spectro- serum albumin for 30 minutes and incubated with the photometer. Absorbance is directly proportional to the primary antibody overnight at 4C. After rinsing with PBS, number of cells. the sections were incubated for 1 hour with the appropriate secondary antibody. ECs and cycling or mitotic nuclei were identied with CD31 (or caveolin 1) and Ki-67 or p-H3 Thoracic Aortic Constriction and Eplerenone antibodies, respectively. Because Ki-67 and p-H3 are nuclear Treatment antigens and CD31 and caveolin1 are membrane proteins, Ki- Pressure overload was produced by thoracic aortic constric- 67positive and p-H3positive nuclei are surrounded with tion, as previously described. 10 Briey, 3-week-old male rats DOI : 10. 1161/JAHA. 114. 001266 Journal of the American Heart Association 3 Downloaded from by guest on February 6, 2015 Aldosterone and Cardiac Cell Proliferation Gravez et al ORIGINAL RESEARCH (body weight 60 1 g) were anaesthetized with intraperito- and 1B ; Table 3) were differentially hybridized between neal injection of xylazine (50 mg/kg) and ketamine aldosterone-treated and control mice (fold change of 1. 5- (100 mg/kg). Left ventricle pressure overload was then fold and false discovery rate The microarray data were produced by coarctation of the ascending thoracic aorta with conrmed by quantitative polymerase chain reaction (Fig- a partially occluded Weck Hemoclip. The same procedure ure 1C). was performed on sham-operated animals, but no clip was placed around the aorta. Animals were divided into 4 groups : (1) sham operated (n 5), (2) sham operated plus eplerenone Gene Ontology Analysis (n 4), (3) pressure-overloaded rats (n 5), and (4) pressure- We then performed a GO analysis of the upregulated overloaded rats plus eplerenone (n 6). Animals were kept transcripts to identify the biological processes modulated under identical housing conditions and sacriced after by aldosterone (the number of transcripts downregulated 3 months. Eplerenone (E6657 ; Sigma-Aldrich), a specic was too low to perform a signicant GO analysis). The GO MR blocker, was incorporated in food and available ad analysis was based on National Center for Biotechnology libitum. Information Entrez Gene identier (which allows unambigu- ous identication of transcripts) in a manner that transcripts identied more than once (with different probe names) did Statistics not articially enrich a GO category. Among the 51 The results are reported as mean SEM. The ShapiroWilk aldosterone-upregulated transcripts, 43 have at least 1 GO and Levene tests were used to analyze normality and variance biological process annotation ; therefore, the rate of coverage or homogeneity of residuals, respectively. Statistical analysis was 84%. Aldosterone-regulated cardiac transcripts were was performed by t test or MannWhitney test. For aldoste- overrepresented in GO categories involved in cell prolifera- rone with or without spironolactone treatment on human tion (cell cycle, cell division, mitosis) (Figure 2A). For umbilical vein ECs, we used a 2-factor ANOVA with repeated- example, 66% of aldosterone-regulated transcripts were measure analysis followed by Tukey's post hoc test. For the annotated with the cell cycle GO biological process annota- thoracic aortic constriction experiment, the KruskalWallis tion. Only 0. 04% of the annotated transcripts on the test was performed. The Holm post hoc test was used to microarray (494 of 14 021) were marked with this annota- adjust for multiple comparisons. Statistical analysis was tion, indicating very signicant enrichment of this category performed with SigmaPlot (version 11. 0) software. Values of (P P were considered statistically signicant. Cardiac Proliferation Assessment Results We assessed cell proliferation in cardiac sections of aldoste- rone-treated (1 week) and control mice, probing Ki-67 as a Cardiac Transcriptome marker of cell cycle activity13 and p-H3 as a marker of mitotic One-week low-dose aldosterone infusion without increase in activity14 (Figure 2B). Absolute numbers of Ki-67 antigen- sodium intake did not alter blood pressure, body weight, or labeled cells were consistently higher than those of p-H3 heart weight (Table 2). Transcriptomic analysis was per- labeled cells. Ki-67 protein is present during all active phases formed on cardiac mRNA isolated from aldosterone-treated of the cell cycle (G1, S, G2, and mitosis), whereas histone H3 and control mice. Sixty-ve probes corresponding to 60 is phosphorylated only during mitosis. 13, 14 Aldosterone transcripts (51 upregulated and 9 downregulated) (Figure 1A increased Ki-67 index by 300% (P (Figure 2C). Similar Table 2. General Characteristics of Mice 1 Week 4 Weeks Control (n 6) Aldo (n 9) Control (n 8) Aldo (n 8) Body weight, g 27. 9 0. 4 28. 7 0. 4 33. 9 0. 6 32. 9 0. 2 Heart weight, mg 132. 5 3. 1 136. 9 3. 0 172. 3 5. 4 176. 2 4. 1 Blood pressure, mm Hg 126. 1 3. 1 127. 2 2. 4 127. 3 2. 4 131. 6 1. 8 Values are Mean SEM. Aldo indicates aldosterone. DOI : 10. 1161/JAHA. 114. 001266 Journal of the American Heart Association 4 Downloaded from by guest on February 6, 2015 Aldosterone and Cardiac Cell Proliferation Gravez et al ORIGINAL RESEARCH Control Aldosterone Downregulated genes A B Tcrb-J Disc1 9 Ahcyl2 LOC10105608 Clcnka 6 Gm6899 Dlk1 Il1rn Mid1 Rab13 51 Qpct Emp1 Adamts9 Pole2 Trim59 Lhfpl2 Birc5 Enpep Upregulated genes Kif22 Kif23 6430562O15Rik Downregulated genes 4930427A07Rik Ccnf Ccnb2 Mki67 Birc5 C Ccnb1 Kif4 Mki67 Upregulated genes Cardiac expression of Neil3 Cardiac expression of Birc5 Cdca5 Spag5 As predicted by microarray As predicted by microarray Ccnd1 Ect2 Normalized value Normalized value Kif11 -2. 6 Anln Tpx2 Exo1 Emid2 Birc5 -2 Cdk1 -3. 6 Cenpe Mcm6 Prc1 Kif20b Quantified by Real-time PCR Quantified by Real-time PCR Nusap1 Kif23 Mybl2 Neil 3 Iqgap3 Birc 5 Ccna2 Sgol1 4 * 2 * Kif18b Dtl Relative value Relative value Trmt61b 3 Dssc1 Bub1b 2 1 Lrr1 Kntc1 Melk 1 Fanci Fam64a 0 0 Bub1 Neil3 Control Aldosterone Lgr6 Figure 1. A, Schematic representation of aldosterone-regulated genes, as predicted by microarray analysis. Aldosterone (1-week treatment) regulated 60 genes : 51 were upregulated, and 9 were downregulated (fold change 1. 5, false discovery rate B, Heat map of microarray- predicted aldosterone-regulated genes. Genes are classied according to the fold change of the genes. C, Genes tested to validate aldosterone- regulated genes as predicted by microarrays (top of the panel ; control n 5 and aldosterone n 5). The expression of these genes was assessed by quantitative real-time PCR and conrmed microarray results (bottom of the panel, Ctrl n 6 and Aldo n 9). Statistical analysis was performed using the MannWhitney test. Mean SEM. *P PCR indicates polymerase chain reaction. variation was observed with p-H3 cardiac immunostaining genes through the use of an Ingenuity Pathway Analysis (Figure 2C). system. Among the 60 aldosterone-regulated genes, 28 were eligible to build a network based on the Ingenuity Knowledge Base. Among the genes used to build the network, we focused Master Genes on those interacting with the greatest number of other genes To identify genes possibly involved in aldosterone-induced in the cytoplasmcyclin B1 (Ccnb1), with 10 interactions cardiac cell proliferation, we proceeded to a network analysis. and the nucleicyclin dependent kinase 1 (Cdk1), with 16 The network was generated from the aldosterone-regulated interactions (Figure 2D). These genes play crucial roles in cell DOI : 10. 1161/JAHA. 114. 001266 Journal of the American Heart Association 5 Downloaded from by guest on February 6, 2015 Aldosterone and Cardiac Cell Proliferation Gravez et al ORIGINAL RESEARCH Table 3. Aldosterone-Regulated Genes in the Heart Gene Symbol Reg P Value FC Description Tcrb-J Down 0. 0043 1. 73 Mus musculus rearranged T-cell receptor beta variable region (Vb17a). [X61758] Disc1 Down 0. 0048 1. 74 Disrupted in schizophrenia 1 [ENSMUST00000122389] Ahcyl2 Down 0. 0065 1. 81 S-adenosylhomocysteine hydrolase-like 2 [ENSMUST00000150365] LOC101056086 Down 0. 0069 1. 86 PREDICTED : uncharacterized LOC101056086 (LOC101056086), [XM 003945428] Clcnka Down 0. 0079 1. 90 Chloride channel Ka (Clcnka), TV 1, [NM 024412] Gm6899 Down 0. 007 2. 00 Adult male corpora quadrigemina cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone : B230320C11 product : hypothetical protein, full insert sequence. [AK140159] Dlk1 Down 0. 0069 2. 03 Delta-like 1 homolog (Drosophila), TV 1, [NM 010052] Il1rn Down 0. 0089 2. 08 Interleukin 1 receptor antagonist, TV 2, [NM 001039701] Mid1 Down 0. 0047 2. 21 Midline 1 [ENSMUST00000149258] Rab13 Up 0. 0069 1. 51 Adult male corpora quadrigemina cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone : B230212B15 product : GTP-binding protein rab13 (fragment) homolog [Rattus norvegicus], full insert sequence. [AK080805] Qpct Up 0. 0024 1. 51 Glutaminyl-peptide cyclotransferase (glutaminyl cyclase), [NM 027455] Emp1 Up 0. 0061 1. 55 Epithelial membrane protein 1, [NM 010128] Adamts9 Up 0. 0073 1. 55 A disintegrin-like and metallopeptidase (reprolysin type) with thrombospondin type 1 motif, 9, [NM 175314] Pole2 Up 0. 0049 1. 56 Polymerase (DNA directed), epsilon 2 (p59 subunit), [NM 011133] Trim59 Up 0. 0035 1. 57 Tripartite motif-containing 59, [NM 025863] Lhfpl2 Up 0. 0069 1. 62 Lipoma HMGIC fusion partner-like 2, [NM 172589] Birc5 Up 0. 0061 1. 62 Baculoviral IAP repeat-containing 5, TV 1, [NM 009689] Enpep Up 0. 0047 1. 63 Glutamyl aminopeptidase, [NM 007934] Kif22 Up 0. 0069 1. 65 Kinesin family member 22, [NM 145588] Kif23 Up 0. 0089 1. 68 Kinesin family member 23, [NM 024245] 6430562O15Rik Up 0. 0081 1. 69 Adult male olfactory brain cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone : 6430562O15 product : unclassifiable, full insert sequence. [AK032482] 4930427A07Rik Up 0. 0047 1. 72 RIKEN cDNA 4930427A07 gene, [NM 134041] Ccnf Up 0. 0049 1. 75 Cyclin F, [NM 007634] Ccnb2 Up 0. 0062 1. 77 Cyclin B2, [NM 007630] Mki67 Up 0. 0085 1. 77 Antigen identified by monoclonal antibody Ki 67, [NM 001081117] Birc5 Up 0. 0057 1. 77 Baculoviral IAP repeat-containing 5, TV 3, [NM 001012273] Ccnb1 Up 0. 0067 1. 82 Cyclin B1, [NM 172301] Kif4 Up 0. 0057 1. 83 Kinesin family member 4, [NM 008446] Mki67 Up 0. 0083 1. 84 Antigen identified by monoclonal antibody Ki 67, [NM 001081117] Cdca5 Up 0. 0024 1. 85 Cell division cycle associated 5, [NM 026410] Spag5 Up 0. 0062 1. 88 Sperm associated antigen 5, [NM 017407] Ccnd1 Up 0. 0035 1. 90 Cyclin D1, [NM 007631] Ect2 Up 0. 0074 1. 90 Ect2 oncogene, TV 1, [NM 007900] Kif11 Up 0. 0024 1. 92 Kinesin family member 11, [NM 010615] Anln Up 0. 0073 1. 93 Anillin, actin binding protein, [NM 028390] Tpx2 Up 0. 0079 1. 93 TPX2, microtubule-associated protein homolog (Xenopus laevis), TV 2, [NM 028109] Exo1 Up 0. 0062 1. 93 Exonuclease 1, [NM 012012] Emid2 Up 0. 0065 1. 94 EMI domain containing 2 [ENSMUST00000111103] Birc5 Up 0. 0024 1. 95 Baculoviral IAP repeat-containing 5, TV 3, [NM 001012273] Continued DOI : 10. 1161/JAHA. 114. 001266 Journal of the American Heart Association 6 Downloaded from by guest on February 6, 2015 Aldosterone and Cardiac Cell Proliferation Gravez et al ORIGINAL RESEARCH Table 3. Continued Gene Symbol Reg P Value FC Description Cdk1 Up 0. 0047 1. 98 Cyclin-dependent kinase 1, [NM 007659] Cenpe Up 0. 0064 2. 00 Centromere protein E, [NM 173762] Mcm6 Up 0. 0047 2. 01 Minichromosome maintenance deficient 6 (MIS5 homolog, Saccharomyces pombe) (Saccharomyces cerevisiae), [NM 008567] Prc1 Up 0. 0069 2. 05 Protein regulator of cytokinesis 1, [NM 145150] Kif20b Up 0. 0069 2. 06 Kinesin family member 20B, [NM 183046] Nusap1 Up 0. 0057 2. 08 Nucleolar and spindle associated protein 1, TV 1, [NM 133851] Mybl2 Up 0. 0073 2. 13 Myeloblastosis oncogene-like 2, [NM 008652] Iqgap3 Up 0. 0065 2. 13 IQ motif containing GTPase activating protein 3, [NM 001033484] Ccna2 Up 0. 0047 2. 16 Cyclin A2, [NM 009828] Sgol1 Up 0. 0047 2. 18 Shugoshin-like 1 (Saccharomyces pombe), [NM 028232] Kif18b Up 0. 0089 2. 27 Kinesin family member 18B, [NM 197959] Dtl Up 0. 0003 2. 28 Denticleless homolog (Drosophila), [NM 029766] Trmt61b Up 0. 0035 2. 28 tRNA methyltransferase 61B, TV 2, non-coding RNA [NR 027952] Dscc1 Up 0. 0016 2. 29 Defective in sister chromatid cohesion 1 homolog (Saccharomyces cerevisiae), [NM 183089] Olfr631 Up 0. 0064 2. 46 Olfactory receptor 631, [NM 001271020] Bub1b Up 0. 0003 2. 47 Budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog, beta (Saccharomyces cerevisiae), [NM 009773] Lrr1 Up 0. 0047 2. 59 Leucine rich repeat protein 1, [NM 001081406] Kntc1 Up 0. 0047 2. 76 Kinetochore associated 1, [NM 001042421] Melk Up 0. 0049 2. 92 Maternal embryonic leucine zipper kinase, [NM 010790] Fanci Up 0. 0065 2. 95 Fanconi anemia, complementation group I, [NM 145946] Fam64a Up 0. 0049 2. 95 Family with sequence similarity 64, member A, [NM 144526] Bub1 Up 0. 0061 2. 96 Budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog (Saccharomyces cerevisiae), TV 2, [NM 009772] Neil3 Up 0. 0027 3. 36 Nei like 3 (Escherichia coli), [NM 146208] Lgr6 Up 0. 0065 6. 28 Adult male aorta and vein cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone : A530037C04 product : CDNA FLJ14471 FIS, CLONE MAMMA1001030, WEAKLY SIMILAR TO LUTROPIN-CHORIOGONADOTROPIC HORMONE RECEPTOR homolog [Homo sapiens]. [AK040883] Some genes appear more than 1 time because the different probe corresponding to these genes have been differentially hybridized between aldosterone-treated and control mice. FC indicates absolute fold change ; P, corrected P value ; Reg, regulation ; TV, transcript variant. Accession number : for all the genes, accession number provided is the National Center for Biotechnology Information GenBank accession number, except for Disc1, Ahcyl2, Mid1, and Emid2, which is the Ensembl accession number. cycling and proliferation. Consistent with Ki-67 increased majority of Ki-67positive nuclei were colocalized within index, quantitative polymerase chain reaction conrmed that CD31-positive cells, indicating that most of the activated cells cardiac expression of these genes was signicantly increased were ECs (Figure 4A). Similar results were obtained with by aldosterone (Figure 2E). caveolin 1, another marker of ECs (Figure 4A). P-H3 was also colocalized within caveolin 1positive cells, strengthening our previous observation (Figure 4A). Caveolin 1 specicity for Identication of the Cycling Cells ECs was assessed by double immunostaining of ECs with To identify the cell type that proliferates on aldosterone CD31 and caveolin 1 (Figure 4B). We conclude that aldoste- infusion, we performed double immunostaining of cardiac rone promotes EC proliferation in vivo. sections from aldosterone-treated and control mice. In Cardiac expression of several proangiogenic growth factors aldosterone-treated mice, Ki-67positive nuclei were localized (vascular endothelial growth factor A [VEGFA], placental around the cardiomyocytes that were delineated by vinculin growth factor [PGF], angiopoietin 1 [ANG1], and broblast immunostaining (Figure 3). Very few Ki-67positive nuclei growth factor 2 [FGF2]) was not signicantly altered by colocalized with the a-smooth muscle actin (a smooth muscle aldosterone treatment for 1 week (Figure 4C). Similarly, the cell marker) or CD68 (a macrophage marker) (Figure 3). The expression of proinammatory molecules (tumor necrosis DOI : 10. 1161/JAHA. 114. 001266 Journal of the American Heart Association 7 Downloaded from by guest on February 6, 2015 Aldosterone and Cardiac Cell Proliferation Gravez et al ORIGINAL RESEARCH A Up-regulated transcript GO B Control Aldo 17% DNA Repair 19% Mitotic cell cycle Ki-67 19% Protein phosphorylation 53% Mitosis 58% Cell division 66% Cell cycle 100m Control Aldo C Ki-67 index p-H3 index 6 * ( ) nuclei (%) 4 p-H3 * 100m Ccnb1 Cdk1 * * Relative value Control Aldosterone Figure 2. A, Gene ontology analysis of aldosterone-upregulated genes with FunNet software. Aldosterone-upregulated genes were overrepresented in gene ontology categories involved in cell cycle, proliferation, and mitosis. B, Ki-67 and p-H3 immunolabeling of cardiac sections (4 lm) of aldosterone-treated and control mice. In blue, DAPI-stained nuclei ; in red, Ki-67 positive nuclei. C, Cardiac Ki-67 and p-H3 index quantication. Aldosterone induced an increase in cardiac Ki-67 and p-H3 indexes in mice (control n 6 and aldosterone n 9). D, The network was generated using Ingenuity Pathway Analysis software from the aldosterone-regulated genes. Cyclin B1 (Ccnb1) and cyclin dependent kinase 1 (Cdk1) (highlighted in red) were the most connected genes. E, Cardiac expression of Ccnb1 and Cdk1 genes was increased by aldosterone. Expression of these genes was assessed by quantitative real-time polymerase chain reaction (normalized to 18S and ubiquitin C genes) (control n 6 and aldosterone n 9). Statistical analysis was performed by MannWhitney test. Mean SEM. *P vs controls. Aldo indicates aldosterone ; DAPI, 40 , 6-diamidino-2-phenylindole ; p-H3, phospho-histone H3. DOI : 10. 1161/JAHA. 114. 001266 Journal of the American Heart Association 8 Downloaded from by guest on February 6, 2015 Aldosterone and Cardiac Cell Proliferation Gravez et al ORIGINAL RESEARCH A CD68 Ki-67 Merge -SMA Ki-67 Merge C Vinculin Ki-67 Merge 200m Figure 3. Double immunolabeling of cardiac sections from aldosterone-treated mice. Cardiac sections (4 lm) were labeled with anti-Ki-67 and anti-CD68 (A), a-SMA (B) or vinculin (C) antibodies. Ki-67positive nuclei were localized all around cardiomyocytes in the interstitium. Very few Ki-67positive nuclei colocalized with a-SMA or CD68. a-SMA indicates a-smooth muscle actin. factor a, macrophage chemoattractant protein 1, intercellular Longer treatment (4 weeks) did not alter blood pressure and adhesion molecule 1 [ICAM-1], and vascular cell adhesion body weight (Table 2). The heart was not hypertrophied, but molecule 1) that have been associated with proangiogenic capillary density was signicantly increased, albeit to a limited properties of aldosterone in the retina15 was not altered extent ( 7%, P (Figure 5A and 5B). The expression of (Figure 4C). Ccnb1 and Cdk1 was not altered, whereas Ki-67 index was Aldosterone induction of EC proliferation was further moderately increased ( 38%, P less than after 1 week studied ex vivo in human umbilical vein ECs. Aldosterone treatment [ 300%] [Figure 2C]) (Figure 5C and 5D). Expression (10 8 mol/L) enhanced human umbilical vein EC proliferation of VegfA was increased ( 40%, P whereas expression in a time-dependent manner. This effect was MR dependent of Pgf, Ang1, and Fgf2 was not (Figure 5E). because it was prevented by spironolactone addition (Fig- ure 4D). Endothelial Cell Proliferation in Heart Failure To study whether aldosterone may play a role in cardiac Aldosterone Induces Angiogenesis in the Heart pathologies by promoting EC proliferation, we used a model of To study whether increase in EC proliferation was accompanied heart failure in rat (thoracic aortic constriction) that we by angiogenesis, we analyzed capillary density. No modica- characterized in a previous study. 10 Thoracic aortic constric- tions were detected after 1 week of aldosterone treatment. tion induced an increase in Ki-67 index ( 61%, P that DOI : 10. 1161/JAHA. 114. 001266 Journal of the American Heart Association 9 Downloaded from by guest on February 6, 2015 Aldosterone and Cardiac Cell Proliferation Gravez et al ORIGINAL RESEARCH CD31 KI Ki-67 Merge 200 m Cav-1 Ki-67 Merge 200 m Cav-1 p-H3 Merge 200 m Figure 4. A, Double immunolabeling of cardiac sections from aldosterone-treated mice (1 week). Cardiac sections (4 lm) were labeled with anti-Ki-67 and either anti-CD31 or anti-Cav-1 antibodies. Sections were also colabeled with anti-p-H3 and Cav-1. A very large fraction of Ki-67 positive nuclei colocalized within CD31 and Cav-1positive cells, indicating that most of the activated cells were endothelial cells. P-H3positive nuclei also colocalized within Cav-1 positive cells. B, Double immunolabeling of cardiac sections. Cardiac sections (4 lm) were labeled with anti-CD31 and anti-Cav-1 antibodies. All CD31 ( ) cells are positives for Cav-1 expression, and all Cav-1 ( ) cells are positives for CD31 expression. Cav-1 is thus specic for endothelial cells. C, Cardiac expression of proangiogenic genes (angiopoietin1 [Ang1], broblast growth factor 2 [Fgf2], placental growth factor [Pgf], and vascular endothelial growth factor A [Vegf-a] and pro-inammatory tumor necrosis factor a [Tnf-a], macrophage chemo-attractant protein 1 [Mcp1], vascular cell adhesion molecule 1 [Vcam1], and intercellular adhesion molecule 1 [Icam1]) was not increased by aldosterone. Expression of these genes was assessed by Q-PCR (normalized to 18S and ubiquitin C genes) (control n 6 and aldosterone n 9). Statistical analysis was performed by MannWhitney test. Mean SEM. *P vs controls. D, Assessment of endothelial cells (HUVEC) proliferation. HUVEC were treated with 10 8 mol/L aldosterone (with or without spironolactone 10 6 mol/L) for 48 to 96 hours. Cell number was assessed by measurement of the absorbance of medium at 440 nm after the cleavage of the tetrazolium salt WST-1 to formazan by viable cells. Aldosterone induces an increase in cell number at 96 hours. This effect is abolished by spironolactone (6 wells per condition). Statistical analysis was performed by 2-factor ANOVA with repeated measures, followed by Tukey's post hoc test. Mean SEM. *P vs untreated cells ; P vs spironolactone-treated cells. Aldo indicates aldosterone ; Cav-1 indicates caveolin 1 ; Ctrl, control ; HUVEC, human umbilical vein endothelial cells ; p-H3, phospho-histone H3 ; Q-PCR, quantitative real-time polymerase chain reaction ; spi, spironolactone. was normalized by eplerenone, a specic MR blocker (Figure 6A). Most of the Ki-67positive cells colocalized Discussion within caveolin 1positive cells, indicating that proliferating Using a strategy coupling pharmacological and genomic cells were endothelial (Figure 6B). Consequently, in this approaches, this study demonstrates that a modest increase model of heart failure, MR activation participates in prolifer- in plasma aldosterone concentration that is within the ation of ECs. pathophysiological range induces expression of genes DOI : 10. 1161/JAHA. 114. 001266 Journal of the American Heart Association 10 Downloaded from by guest on February 6, 2015 Aldosterone and Cardiac Cell Proliferation Gravez et al ORIGINAL RESEARCH CD31 Cav-1 Merge 200 m C D Proangiogenic Factors Proinflammatory Factors Wst-1 absorbance 1. 5 * 400 Aldo WST-1 absorbance Relative value 1. 0 Aldo spi 300 Ctrl 0. 5 200 Ang1 Fgf2 Pgf Vegf-a Tnf-a Mcp1 Vcam Icam Control Aldosterone Time (hours) Figure 4. Continued involved in cell cycle and promotes cardiac EC proliferation apparent discrepancies in the literature. Further studies are after 1 week and angiogenesis after 4 weeks. required for a better understanding of the paradoxical The effects of aldosterone on ECs and angiogenesis are angiogenic properties of aldosterone. controversial. In mice, aldosterone impairs ECs sprouting from The pathophysiological consequences of aldosterone- vascular segments. 16 In rats, aldosterone decreased the dependent increase in cardiac EC proliferation are unknown. number of circulating endothelial progenitor cells, 17 and in ECs are crucial for heart function by regulating vascular patients with hyperaldosteronism, the number of circulating permeability, modulating the diameter of blood vessels in endothelial progenitor cells was inversely correlated with response to hemodynamic and hormonal stimuli, regulating plasma aldosterone concentration. 18 Proliferative effects have leukocyte recruitment and adhesion, and preventing blood also been reported in vivo : Aldosterone enhances neovascu- coagulation. 22 Several ex vivo studies demonstrated that larization in an experimental model of ischemia, 19 prevents aldosterone regulates EC functions. In coronary ECs, aldoste- capillary rarefaction in a model of type 1 diabetes, 20 and rone induces the expression of proinammatory molecules as stimulates pathological angiogenesis in the retina. 21 Ex vivo ICAM-1 and promotes leukocyte adhesion. 23 In human umbil- studies suggest that this apparent paradox may be dose ical vein ECs, aldosterone modulates endothelial permeability dependent. At high concentrations (10 5 to 10 6 mol/L, far and endothelial nitric oxide synthase activity. 24 We report in this above pathological conditions), aldosterone attenuated paper that ECs are also sensitive to a low concentration of human endothelial progenitor cell proliferation and angiogen- aldosterone in vivo and that they are targets of aldosterone in esis, whereas lower concentrations (10 9 to 10 8 mol/L, the the heart. By activating ECs and promoting their proliferation, biological range) of aldosterone enhanced endothelial pro- aldosterone may alter the nely tuned complex balance of genitor cell and retinal EC proliferation. 18, 21 Furthermore, at interactions of ECs with their immediate environment and thus pathophysiological concentrations (10 9 to 10 8 mol/L), may sensitize the cardiac tissue to other triggers such as salt, aldosterone increased the formation of tubules by bovine oxidative stress, or increased blood pressure. Furthermore, the retinal ECs in addition to promoting their proliferation. 21 In pathophysiological consequences of aldosterone-induced EC addition to the dose, in vivo treatment duration and proliferation may depend on the environment. In rat, we showed confounding factors (eg, pathologies such as diabetes and that EC proliferation is increased after thoracic aortic constric- heart failure) are parameters that might explain these tion, an effect inhibited by MR blockade. Teekakirikul and DOI : 10. 1161/JAHA. 114. 001266 Journal of the American Heart Association 11 Downloaded from by guest on February 6, 2015 Aldosterone and Cardiac Cell Proliferation Gravez et al ORIGINAL RESEARCH A Capillary density B 650 * Control Aldosterone Cap/mm2 CD31 1 Week 4 Weeks Ki-67 Index Ccnb1 Cdk1 100m Ki-67 nuclei (%) * 1. 5 * Relative value 1. 0 D 0. 5 Control Aldosterone 0 0. 0 E Ki-67 Ang1 Fgf2 Pgf VegfA 1. 5 Relative value 1. 0 200m 0. 5 0. 0 Control Aldosterone Figure 5. A, Capillary density. Aldosterone administration did not alter the number of capillaries after 1 week (control n 6 and aldosterone n 9) of treatment. Longer treatment (4 weeks ; control n 8 and aldosterone n 8) increased capillary density by 7%. Statistical analysis was performed by MannWhitney test. Mean SEM. *P vs corresponding controls. B, Immunolabeling of cardiac sections from untreated and aldosterone-treated mice following 4 weeks of treatment. Cardiac sections (4 lm) were labeled with anti-CD31 antibody. C and D, Cardiac cell proliferation. C, Aldosterone induced an increase in cardiac Ki-67 index in mice after 4 weeks of treatment ; however, cardiac expression of cyclin B1 (Ccnb1) and cyclin dependant kinase 1 (Cdk1) genes was not increased (control n 8 and aldosterone n 8). Statistical analysis was performed by MannWhitney test. Mean SEM. *P vs controls. D, Ki-67 immunolabeling of cardiac sections (4 lm) of untreated and aldosterone-treated mice (4 weeks). In blue, DAPI-stained nuclei ; in red, Ki-67positive nuclei. E, Change in transcript expression after 4 weeks aldosterone infusion. Among the proangiogenic factors tested at 1 week (Ang1, Fgf2, Pgf, and VegfA), only VegfA was increased after 4 weeks of aldosterone treatment (control n 8 and aldosterone n 8). Expression of these genes was assessed by quantitative real-time polymerase chain reaction (normalized to 18S and ubiquitin C genes). Statistical analysis was performed by MannWhitney test. Mean SEM. *P vs controls. Ang1 indicates angiopoietin1 ; Fgf2, broblast growth factor 2 ; Pgf, placental growth factor ; Q-PCR, quantitative real-time polymerase chain reaction ; Vegf-a, vascular endothelial growth factor A. collaborators showed that noncardiomyocyte cell proliferation altered after 1 week of treatment, whereas EC proliferation is involved in the cardiac remodeling occurring in hypertrophic was clearly enhanced (although expression of VegfA was cardiomyopathy, 25 and although the authors did not address increased after 4 weeks, likely to consolidate the newly the question of the cell type that proliferates, they speculated formed capillaries). This suggests that the primary trigger for on cardiac ECs undergoing endothelial-to-mesenchymal trans- aldosterone-induced EC proliferation may not be through formation, a recognized mechanism involved in cardiac bro- proangiogenic growth factors. Direct activation of ECs should sis. 26 EC environment (healthy or pathological) may determine be considered. Indeed, aldosterone acts as a growth-promot- the fate of aldosterone-activated ECs into neocapillaries or ing factor for different cell types (renal mesangial cells29 but broblasts. This hypothesis deserves consideration and needs also vascular smooth muscle cells30 and cardiac broblasts31) further investigation. by promoting the activation of protein kinase signaling The mechanisms underlying the proliferative effect of cascades. 30, 31 It is possible that aldosterone could directly aldosterone on ECs have yet to be established. Aldosterone induce EC proliferation in vivo. Stimulation of inammation enhances the expression of proangiogenic factors such as and oxidative stress, which are known to induce angiogene- VEGFA19 or placental growth factor, a member of VEGF sis, 32 is another mechanism that may be involved. Experi- family. 27 In our study, expression of VegfA and Pgf mRNA and mentally, the proliferation of vessels in a model of oxygen- of other proangiogenic factors (Ang1 and Fgf2)28 was not induced retinopathy has been associated with the proinam- DOI : 10. 1161/JAHA. 114. 001266 Journal of the American Heart Association 12 Downloaded from by guest on February 6, 2015 Aldosterone and Cardiac Cell Proliferation Gravez et al ORIGINAL RESEARCH A Ki-67 index SHAM TAC 5 * # posive Ki-67 nuclei ( %) SHAM Eplerenone TAC Eplerenone Eplerenone - - Sham TAC 100m Cav-1 Ki-67 Merge 100m Figure 6. Cell proliferation in a model of heart failure. A, Ki-67 immunolabeling of cardiac sections (in blue, DAPI [40 , 6-diamidino-2- phenylindole]-stained nuclei ; in red, Ki-67 positive nuclei). TAC induced an increase of Ki-67 index, an effect reversed by eplerenone (sham n 5, sham plus eplerenone n 4, TAC n 5, and TACplus eplerenone n 6). Statistical analysis was performed by KruskalWallis test. The Holm post hoc test was used to adjust for multiple comparisons. Mean ! SEM. *P vs sham, #P vs TAC plus eplerenone. B, Double immunolabeling of cardiac sections from rats with TAC. Cardiac sections were labeled with anti-Ki-67 and Cav-1. A very large fraction of Ki-67 positive nuclei colocalized within Cav-1 positive cells, indicating that most of the activated cells were endothelial cells. Cav-1 indicates caveolin 1 ; TAC, thoracic aortic constriction. matory properties of aldosterone. In this model, TNF-a, MCP- treatment of heart failure, whether of ischemic origin or 1, ICAM-1, and VCAM-1 mRNA levels were increased in the not. 35 The benecial effects of aldosterone blockade are retina. 15 In our study, we did not nd any effect of aldosterone multiple and include antibrotic and antiarrhythmic properties. on the expression of these molecules or pro-oxidative Consequently, it is likely that, in these pathological conditions, enzymes such as NADPH oxidase (data not shown). It is the deleterious effects of aldosterone overwhelm its positive possible that aldosterone may activate distinct angiogenic effects, explaining the benecial effects of aldosterone antag- pathways according to the vascular microenvironment. We onists. This may not be the case in all pathological situations. propose that pathological situations may alter the balance We previously reported that the proangiogenic effects of between deleterious and benecial actions of aldosterone, aldosterone are benecial in diabetic cardiomyopathy. 20 We depending on the pathology and the target organ or tissue. demonstrated that a moderate increase of cardiac aldosterone Angiogenesis is a benecial process in cardiac hypertrophy (similar to what achieved in the present study) prevents the and ischemic heart diseases. 33 In a transgenic model of cardiac capillary rarefaction induced by diabetes, an effect blocked by hypertrophy, decrease in cardiac function was accompanied by the MR antagonist eplerenone. Spironolactone, another MR impaired coronary angiogenesis. 34 Experimentally and clini- antagonist, has been reported to worsen endothelial function in cally, MR antagonists have proven their efcacy in the type 2 diabetic patients. 36 It is possible that in some DOI : 10. 1161/JAHA. 114. 001266 Journal of the American Heart Association 13 Downloaded from by guest on February 6, 2015 Aldosterone and Cardiac Cell Proliferation Gravez et al ORIGINAL RESEARCH pathological situations such as diabetes, such adverse effects with left ventricular dysfunction after myocardial infarction. N Engl J Med. 2003 ; 348 : 13091321. of aldosterone antagonists (besides hyperkalemia) need to be 3. Zannad F, McMurray JJ, Krum H, van Veldhuisen DJ, Swedberg K, Shi H, Vincent taken into account. In contrast, aldosterone-driven angiogen- J, Pocock SJ, Pitt B. Eplerenone in patients with systolic heart failure and mild symptoms. N Engl J Med. 2011 ; 364 : 1121. esis may also be deleterious in pathologies such as cancer, in 4. Brilla CG, Pick R, Tan LB, Janicki JS, Weber KT. Remodeling of the rat right which angiogenesis is essential for tumor growth and metas- and left ventricles in experimental hypertension. Circ Res. 1990 ; 67 : 1355 tasis. Little is known about the involvement of MR and 1364. 5. Sun Y, Zhang J, Lu L, Chen SS, Quinn MT, Weber KT. Aldosterone-induced aldosterone in tumoral angiogenesis. In humans, aldosterone- inammation in the rat heart : role of oxidative stress. Am J Pathol. producing adenoma vascularization is positively associated 2002 ; 161 : 17731781. with aldosterone levels37 whereas eplerenone attenuates 6. Johar S, Cave AC, Narayanapanicker A, Grieve DJ, Shah AM. Aldosterone mediates angiotensin II-induced interstitial cardiac brosis via a Nox2- hepatocellular carcinoma growth and angiogenesis in mice. 38 containing NADPH oxidase. FASEB J. 2006 ; 20 : 15461548. In contrast, in colorectal cancer, decrease in tumoral MR 7. Perrier R, Richard S, Sainte-Marie Y, Rossier BC, Jaisser F, Hummler E, Benitah JP. A direct relationship between plasma aldosterone and cardiac L-type Ca2 expression is associated with increased tumoral angiogene- current in mice. J Physiol. 2005 ; 569 : 153162. sis. 39 Further understanding of the role of aldosterone on 8. Gomez AM, Rueda A, Sainte-Marie Y, Pereira L, Zissimopoulos S, Zhu X, Schaub R, Perrier E, Perrier R, Latouche C, Richard S, Picot MC, Jaisser F, Lai cardiovascular homeostasis is required to identify potential FA, Valdivia HH, Benitah JP. Mineralocorticoid modulation of cardiac ryanodine adverse effects and new therapeutic potential of aldosterone receptor activity is associated with downregulation of FK506-binding proteins. Circulation. 2009 ; 119 : 21792187. antagonists to allow more efcient and safer use of these drugs. 9. Milliez P, Girerd X, Plouin PF, Blacher J, Safar ME, Mourad JJ. Evidence for an This study demonstrates, for the rst time, that aldoste- increased rate of cardiovascular events in patients with primary aldosteron- ism. J Am Coll Cardiol. 2005 ; 45 : 12431248. rone induces cardiac EC cycling in vivo in the heart of normal 10. Messaoudi S, Gravez B, Tarjus A, Pelloux V, Ouvrard-Pascaud A, Delcayre C, mice. These ndings reveal new perspectives on the role Samuel J, Launay JM, Sierra-Ramos C, Alvarez de la Rosa D, Clement K, Farman N, Jaisser F. Aldosterone-specic activation of cardiomyocyte mineralocorti- played by aldosterone in cardiac physiology and pathology coid receptor in vivo. Hypertension. 2013 ; 61 : 361367. and highlight potential benets and concerns with regard to 11. Latouche C, Sainte-Marie Y, Steenman M, Castro Chaves P, Naray-Fejes-Toth pathologies in which benecial or deleterious angiogenesis is A, Fejes-Toth G, Farman N, Jaisser F. 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Hyperaldosteronism is associated with a decrease in number and project SP7#602904) and the CRIT (Centre de Recherche altered growth factor expression of endothelial progenitor cells in rats. Int J Cardiol. 2011 ; 149 : 152156. Industrielle et Technique). Messaoudi received grants from 18. Wu VC, Lo SC, Chen YL, Huang PH, Tsai CT, Liang CJ, Kuo CC, Kuo YS, Lee BC, the Region ^le de France (CODDIM) and Societe Francaise Wu EL, Lin YH, Sun YY, Lin SL, Chen JW, Lin SJ, Wu KD. Endothelial progenitor d'Hypertension Arterielle (SFHTA). cells in primary aldosteronism : a biomarker of severity for aldosterone vasculopathy and prognosis. J Clin Endocrinol Metab. 2011 ; 96 : 31753183. 19. Michel F, Ambroisine ML, Duriez M, Delcayre C, Levy BI, Silvestre JS. Aldosterone enhances ischemia-induced neovascularization through angioten- sin II-dependent pathway. Circulation. 2004 ; 109 : 19331937. Disclosures 20. Messaoudi S, Milliez P, Samuel JL, Delcayre C. 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Des études ont montré auparavant un effet de l'aldostérone sur la prolifération des cellules endothéliales, soit activateur, soit inhibiteur. Chez le rat, une infusion d'aldostérone diminue le nombre de cellules progénitrices des cellules endothéliales (dérivées de la moelle osseuse), et cet effet est bloqué par la spironolactone221. Chez l'homme, les patients atteints d'hyperaldostéronisme primaire possèdent un taux circulant de cellules progénitrices des cellules endothéliales plus faible que celui des patients atteints d'hypertension, et qui est inversement corrélé à l'aldostéronémie222. L'ablation d'une des glandes surrénales, ou un traitement à la spironolactone, induisent une augmentation de ces cellules progénitrices dans la circulation chez ces mêmes patients222. In vitro, l'aldostérone induit la prolifération de cellules endothéliales de rétine bovine223. Ces effets opposés de l'aldostérone peuvent s'expliquer par la concentration d'aldostérone utilisée. En effet, dans les cellules endothéliales de rétine bovine, 10-9 M d'aldostérone entrane leur prolifération et la formation de tubules, premier stade de la création de nouveaux vaisseaux. Au contraire, la diminution du nombre de cellules progénitrices des cellules endothéliales observée chez les patients atteints d'hyperaldostéronisme primaire (l'aldostéronémie pouvant atteindre 10-8 M) est également montrée dans les cellules endothéliales de rétine bovine à des doses d'aldostérone bien supérieures aux doses physiologiques (10-5 M - 10-6 M)222. Il semble donc qu'à des concentrations physiologiques in vivo, l'aldostérone peut induire la prolifération des cellules endothéliales, comme ce que nous avons observé dans notre étude. Les mécanismes impliqués dans l'induction par l'aldostérone de la prolifération des cellules endothéliales cardiaques restent à établir. En effet, nos résultats montrent que la protéine pro-angiogenique VEGF-a (création de nouveaux vaisseaux sanguins) est augmentée dans le cœur des souris après 4 semaines de traitement à l'aldostérone, tandis que la prolifération des cellules endothéliales est observée dès 1 semaine. Sur un modèle d'ischémie de souris (au niveau de la patte droite), l'aldostérone augmente simultanément la néo- vascularisation de la patte et VEGF-a224. Le facteur de croissance placentaire, autre facteur pro-angiogenique induit par l'aldostérone dans des aortes de souris ex-vivo225, n'est cependant pas augmenté dans le cœur des souris traitées 1 à 4 semaines à l'aldostérone. Nos résultats suggèrent donc que les facteurs pro-angiogeniques ne sont pas les premiers mécanismes mis en place au cours de la prolifération des cellules endothéliales, induite par l'aldostérone. Il est possible que la prolifération endothéliale soit activée directement par l'aldostérone. En effet l'aldostérone est connue pour activer certaines MAP kinases, comme ERK1/2 (confer chapitre 1. 4. 1), elles-mêmes impliquées dans les phénomènes de croissance et de prolifération cellulaires118. Dans d'autres types cellulaires, comme les fibroblastes cardiaques226 ou les cellules musculaires lisses vasculaires de rat227, l'aldostérone augmente l'activité des MAP kinases. L'ensemble de ces observations suggèrent que dans nos expériences, l'aldostérone pourrait directement induire in vivo la prolifération des cellules endothéliales cardiaques. 3. 2. 2. 5 Implication du RM dans la prolifération des cellules endothéliales cardiaques induite par l'aldostérone Notre étude n'a pas permis de mettre en évidence les mécanismes impliqués dans la prolifération des cellules endothéliales cardiaques induite par l'aldostérone ni les conséquences physiopathologiques potentielles. Nous avons cependant tiré profit du modèle de souris transgénique RM-Cardio, pour analyser l'effet potentiel du RM dans ce processus biologique. Les résultats présentés dans cette partie ont été effectués avec le Docteur Messaoudi. Les souris RM-Cardio présentent à l'état de base une augmentation de l'index de prolifération Ki-67 dans le cœur par rapport aux souris contrôles. L'aldostérone potentialise cet effet (Figure 13). Figure 13. Immunolocalisation et quantification de Ki-67 sur des coupes de cœur de souris RM-Cardio traitées ou non à l'aldostérone. Les barres vides représentent les souris contrôles, les barres grises représentent les souris RM-Cardio. Echelle : 100 m ; *p vs non traitées ; #p vs Ctrl correspondantes. Nous avons ensuite cherché à identifier le type cellulaire capable de proliférer dans ce tissu. Les souris RM-Cardio traitées à l'aldostérone présentent une augmentation de la prolifération des cellules endothéliales cardiaques (Figure 14). En parallèle, les gènes impliqués dans le cycle cellulaire Cdk1 et Ccnb1 augmentent avec le traitement à l'aldostérone (Figure 15). Figure 14. Immunolocalisation de la cavéoline-1 et du Ki-67 dans des coupes de cœur de souris RM-Cardio traitées à l'aldostérone. La colocalisation des deux marquages montre que les cellules en prolifération sont les cellules endothéliales du cœur. Echelle : 100 m ; Cav-1 : cavéoline-1. Figure 15. Expression cardiaque des gènes codant pour la cycline B1 et la Cdk1. Les expressions des gènes Ccnb1 et Cdk1 induites par l'aldostérone sont plus importantes chez les RM-Cardio par rapport à leurs contrôles. A l'état basal, l'expression de Ccnb1 est augmentée chez les RM-Cardio par rapport à leurs souris contrôles. Ccnb1 : Cycline B1, Cdk1 : Cyclin- dependent kinase, Aldo : aldostérone. *p vs non traitée ; #p vs Ctrl correspondante. De façon intéressante, la prolifération des cellules endothéliales cardiaques et l'expression cardiaque de Ccnb1 sont plus fortes chez les souris RM-Cardio non traitées que chez les souris contrôles. Nos résultats suggèrent donc que la surexpression du RM dans les cardiomyocytes induit la prolifération des cellules endothéliales cardiaques. Etant exprimé en plus grand nombre, le RM induirait une expression quantitativement plus importante de ses cibles et pourrait amplifier l'augmentation de la prolifération des cellules endothéliales qui est activée par l'aldostérone endogène. L'infusion d'aldostérone n'entrane pas une augmentation plus forte de l'expression du marqueur de prolifération Ki-67 chez les souris RM-Cardio par rapport aux souris contrôles traitées, bien qu'elle potentialise l'augmentation de Cdk1 et Ccnb1. Certaines cibles apparaissent donc moins sensibles que d'autres au nombre de complexe aldostérone/RM formé. Néanmoins, il semble que le RM du cardiomyocyte puisse médier, au moins en partie, l'effet de l'aldostérone sur la prolifération des cellules endothéliales cardiaques et sur l'expression cardiaque de gènes impliqués dans le cycle cellulaire. Il est également possible que l'aldostérone induise les effets que nous observons en agissant au niveau du vaisseau via son récepteur exprimé dans les cellules endothéliales cardiaques mais aussi dans les cellules musculaires lisses vasculaires. En effet, une étude a démontré que l'aldostérone induit in vivo la prolifération des cellules musculaires lisses dans des carotides de souris, et cet effet passe par l'augmentation d'expression du récepteur au VEGF-a, via le RM des cellules musculaires lisses228. Pour identifier si l'augmentation de prolifération des cellules endothéliales cardiaques permet la création de nouveaux vaisseaux chez les souris RM-Cardio, une étude préliminaire de notre laboratoire a analysé la densité capillaire cardiaque chez les souris RM-Cardio traitées ou non à l'aldostérone, comparée à leurs souris contrôles. Nous avons observé une diminution de la densité capillaire chez les souris RM-Cardio, indépendamment du traitement. Chez ces souris, la prolifération des cellules endothéliales cardiaques est associée à une diminution du nombre de capillaires. Ces observations, bien que contradictoires, peuvent être rapprochées à un travail collaboratif du laboratoire montrant que ces mêmes souris présentent une sévère dysfonction de la réponse de relaxation dépendante du monoxyde d'azote dans les artères coronaires175. Cette réponse est bloquée par l'ajout de canrénoate de potassium ou de vitamine E et vitamine C (cocktail vitaminique inhibant la voie du stress oxydatif et plus particulièrement la péroxydation des lipides et les espèces réactives de l'oxygène). Par ailleurs, il a été montré que le stress oxydatif et l'inflammation induisent l'angiogenèse in vivo229. Dans un modèle de rétinopathie chez la souris, l'expression des gènes codant pour des molécules pro-inflammatoires comme MCP1 ou VCAM-1 est augmentée par rapport aux souris contrôles230. Un inhibiteur de l'aldostérone synthase prévient leurs augmentations, suggérant que l'aldostérone, via les voies inflammatoires et de stress oxydatif, peut stimuler la néovascularisation caractéristique des rétinopathies diabétiques. Il semble donc que la surexpression du RMh dans le cardiomyocyte induise un effet délétère sur les vaisseaux cardiaques, via le stress oxydatif. Ces souris pourraient s'adapter en augmentant leur nombre de cellules endothéliales cardiaques, sans pour autant entraner la création de nouveaux vaisseaux. Toutefois, il est possible que le RM et l'aldostérone augmentent la prolifération des cellules endothéliales cardiaques et l'angiogenèse chez les souris RM-Cardio mais que d'autres voies prépondérantes ne permettent pas de mettre en évidence ces mécanismes. En conclusion, notre étude montre que l'aldostérone peut induire, à travers l'augmentation de la prolifération des cellules endothéliales cardiaques, des effets n'étant pas nécessairement impliqués dans des processus délétères. La situation pathologique et le tissu considéré apparaissent être des facteurs impliqués dans la balance des effets opposés (bénéfiques contre délétères) de l'aldostérone. 3. 2. 3 Implications des microARNs dans la voie de signalisation du RM cardiaque 3. 2. 3. 1 Etat de la question Les microARNs, non-codants, sont des ARNs simples brins d'une vingtaine d'oligonucléotides qui se lient aux ARNm et empêchent leur traduction en protéines (modulations post-transcriptionnelles ; Figure 16). Figure 16. Schéma représentant le mode d'action du microARN. Le précurseur du microARN, le pre-microARN va être clivé par l'enzyme Dicer au niveau de sa boucle pour donner un duplex double brin microARN : microARN dans le cytoplasme. Ce duplex va donner ensuite un microARN simple brin qui va s'associer à des protéines chaperonnes pour former le complexe RISC (pour RNA-induced silencing complex). Ce complexe va reconnaitre spécifiquement un ARNm cible et permettre soit sa dégradation, soit l'inhibition de sa traduction. ARN : acide ribonucléique ; ARNm : acide ribonucléique messager. Notre étude a cherché à identifier dans le cœur des microARNs spécifiquement régulés par le RM, et a été effectuée en collaboration avec un laboratoire spécialisé dans l'analyse transcriptomique, dirigé par le Docteur Laurent Vallar (Centre de Recherche Public de la Santé, Luxembourg). 3. 2. 3. 2 Objectif de l'étude Le but du travail a été de mettre en évidence un ou plusieurs microARNs modulés par le RM dans le cœur et de comprendre leurs conséquences physiologiques et physiopathologiques. Pour cela, nous avons analysé l'ensemble des microARNs transcrits dans le cœur des souris RM-Cardio non traitées et de leurs contrôles, par puces à oligonucléotides. 3. 2. 3. 3 Comparaison du miRnome des souris RM-Cardio par rapport à celui de leurs contrôles L'analyse des deux miRnomes a montré que 293 microARNs sont différentiellement exprimés entre les souris RM-Cardio et leurs contrôles. Seuls trois sont statistiquement surexprimés dans le cœur des souris RM-Cardio (Figure 17), de nomenclature miR-1941-5p, miR-215 et miR-298. Notre étude s'est focalisée sur le miR1941-5p, étant le plus modulé par la surexpression du RM dans le cœur. Figure 17. Les microARNs 1941-5p, 215 et 298 sont les seuls microARNs surexprimés dans le cœur des souris RM-Cardio. miR : microARNs ; RM-Cardio : souris non traitées surexprimant spécifiquement le RMh dans les cardiomyocytes ; Ctrl : souris contrôles correspondantes. 3. 2. 3. 4 Pertinence physiopathologique de la modulation du miR-1941-5p par le RM cardiaque La première étape a consisté à vérifier que le miR-1941-5p est augmenté in vivo dans les cœurs de souris RM-Cardio par rapport à leurs contrôles. L'expression relative de celui-ci est environ 15 fois plus importante dans le cœur des souris RM-cardio comparée aux contrôles. Il est à noter que dans les souris contrôles, l'expression de ce microARN est pratiquement nulle, l'expression relative ne reflétant donc pas l'expression réelle du miR- 1941-5p dans le cœur des souris RM-Cardio. Cela signifie donc que le miR-1941-5p est exprimé dans le cœur quand la voie de signalisation minéralocorticoïde est activée par la surexpression du RM et suggère que la modulation de l'expression du miR-1941-5p intervient spécifiquement dans un environnement pathologique particulier. Une telle modulation de gènes peut également être retrouvée dans d'autres conditions. Nous avons montré par exemple que l'expression du gène codant pour l'Orosomucoid-1 est également très faible dans les cellules H9C2-RM et l'ajout d'aldostérone l'augmente de plus de 1000 fois (confer chapitre 3. 1. 1). Nous avons observé que le miR-1941-5p n'est pas induit dans le cœur des souris transgéniques surexprimant spécifiquement le RG dans les cardiomyocytes (RG-Cardio), indiquant que le miR-1941-5p est spécifiquement régulé par le RM dans le cœur (Figure 18). Figure 18. Modulation de l'expression du miR-1941-5p dans le cœur de souris surexprimant dans le cardiomyocyte le RM ou le RG. RM-Cardio : souris non traitées surexprimant spécifiquement le RMh dans les cardiomyocytes ; RG-Cardio : souris non traitées surexprimant spécifiquement le RG dans les cardiomyocytes ; Ctrl : souris contrôles correspondantes. *p vs Ctrl. Nous nous sommes ensuite intéressés à la pertinence physiopathologique de la surexpression du miR-1941-5p dans le cœur. Nous n'avons pas observé d'augmentation d'expression du miR-1941-5p dans le cœur de souris soumises à une infusion d'aldostérone seule ou soumises au modèle NAS (Figure 19). Figure 19. Effet de modèles d'activation minéralocorticoïde sur l'expression cardiaque du miR-1941-5p. A : Effet de l'infusion d'aldostérone sur l'expression du miR-1941-5p dans le cœur de souris C57BL/6JRj. Ctrl : souris contrôles non traitées ; Aldo : souris traitées à l'aldostérone ; Aldo C : souris traitées à l'aldostérone et au canrénoate de potassium. B : Effet du modèle NAS sur l'expression du miR-1941-5p dans le cœur de souris C57BL/6JRj ; Ctrl : souris contrôles non traitées ; NAS : souris soumises au modèle NAS. 3. 2. 3. 5 Conclusions de l'étude et discussion Cette étude a montré que le RM module spécifiquement certains microARNs au niveau cardiaque comme le miR-1941-5p. Les microARNs sont impliqués dans des phénomènes biologiques très divers231, 232. A ce jour, il a été identifié dans le cœur plus de 200 microARNs matures. Du fait de leurs rôles en physiologie, leurs dérégulations sont souvent observées dans des pathologies comme les cancers ou les pathologies cardiovasculaires233. Le miR-21 est par exemple surexprimé dans un modèle d'hypertrophie cardiaque chez la souris et dans des cultures de cardiomyocytes de rats nouveau-nés traitées à l'angiotensine II234. Au contraire, le modèle d'insuffisance cardiaque chez des rats ayant subi une sténose de l'aorte montre une diminution du miR-133 par rapport aux rats contrôles235. Les modulations de l'expression des microARNs dans ces nombreux modèles expérimentaux démontrent l'importance de ceux-ci en pathologies cardiovasculaires. Ils sont aujourd'hui des cibles privilégiées de nouvelles stratégies thérapeutiques, permettant leur surexpression ou leur inhibition236. Cependant, les microARNs ne sont pas encore utilisés en clinique en raison du grand nombre d'ARNm dont ils régulent l'expression, du grand nombre de protéines qu'ils modulent et des différents tissus dans lesquels ils agissent. Les connaissances sur le miR-1941-5p restent très peu documentées. Nous avons pu montrer que l'expression du miR-1941-5p est spécifiquement dépendante du RM et non du RG. Au contraire l'expression du miR-215 est environ 2 fois plus importante chez les souris RM-Cardio et RG-Cardio, par rapport aux souris contrôles correspondantes (données non présentées). Nous avons tenté d'appréhender la pertinence physiopathologique de cette surexpression en étudiant la modulation de son expression chez des souris soumises à une infusion d'aldostérone seule ou soumises au modèle NAS. Aucune modification de l'expression du miR-1941-5p n'a cependant été observée. Les cibles potentielles du miR-1941-5p, identifiées in-silico par alignement de séquence, sont disponibles sur une base de données en ligne. Environ 110 ont été répertoriées, et la majorité est représentée par des gènes codant pour des protocadhérines de type . Ces protéines transmembranaires, faisant partie de la superfamille des cadhérines, permettent l'adhérence et la connexion des neurones entre eux. Nous avons croisé le transcriptome cardiaque des souris RM-Cardio avec cette liste des cibles potentielles du miR-1941-5p. Aucun gène dont l'expression est diminuée chez ces souris (par rapport à leurs souris contrôles) n'a cependant été identifié dans la liste des cibles potentielles du miR-1941-5p. Ces observations ne nous ont donc pas permis d'analyser plus avant l'implication du miR-1941-5p dans la voie de signalisation minéralocorticoïde au niveau du cœur. L'étude comparée des miRnomes cardiaques des souris RM-Cardio non traitées et traitées à l'aldostérone pourrait nous permettre d'approfondir les mécanismes de modulation du miR-1941-5p. Ces travaux soulèvent deux questions majeures. Premièrement, le miRnome réalisé sur le cœur entier de souris, ne permet pas d'identifier spécifiquement la cellule (ou les cellules) o le miR-1941-5p s'exprime. Deuxièmement, la fonction de ce microARN dans les effets de l'aldostérone reste à identifier. PARTIE 4 : DISCUSSION GENERALE Mon travail de thèse a consisté à étudier les différentes cibles moléculaires susceptibles d'être régulées par le RM dans le cœur, afin de mieux appréhender l'implication de ce récepteur dans les pathologies cardiovasculaires. La première partie de ma thèse a concerné l'action du torasémide sur la voie de signalisation minéralocorticoïde cardiaque. La seconde partie de ma thèse s'est adressée à l'étude des gènes codants ou non-codants pouvant être des cibles dépendantes du complexe aldostérone/RM dans le cœur, et plus particulièrement dans le cardiomyocyte. 4. 1 Comparaison entre torasémide et spironolactone Dans la première partie de cette thèse, nous avons utilisé la spironolactone, antagoniste bien connu du RM, pour comparer ses effets sur l'activité transcriptionnelle du récepteur par rapport à ceux du torasémide. Cependant, la spironolactone n'agit pas comme un antagoniste compétitif classique du RM. Il a été montré que la spironolactone et l'aldostérone partagent un site commun de liaison au niveau du DLL du RM. La spironolactone peut donc agir comme un antagoniste compétitif en empêchant la liaison entre l'aldostérone et le RM237. Par ailleurs, le groupe de Bonvalet et al. a montré que la spironolactone marquée au tritium se retrouve dans le noyau de cellules du canal collecteur de lapin238. En se liant au DLL, particulièrement dans la région située entre les acides aminés 804 et 874, la spironolactone induit un changement de conformation du RM239. Cette action permet de démasquer un SLN entranant la translocation nucléaire du RM, sans pour autant induire son activité transcriptionnelle. Nos travaux sont en accord avec ces précédentes observations o la spironolactone seule, en absence de ligand, permet la translocation nucléaire du RM au cours du temps. Toutefois, cette translocation est moins rapide qu'avec laldostérone ou la co-administration d'aldostérone et de torasémide. Ce changement de conformation tridimensionnelle induit par la spironolactone modifie les interactions entre le RM et ses corégulateurs transcriptionnels mais également avec ses protéines chaperones cytoplasmiques (modulant la voie de signalisation minéralocorticoïde), comme le montre la dissociation entre HSP90 et le RM237, 240. Une étude chez le rat sur un modèle d'ischémie-reperfusion sur cœur isolé a montré que la spironolactone, en absence de ligand exogène, est capable de diminuer la taille de l'infarctus241. Par conséquent, les auteurs ont proposé que la spironolactone ait certains effets, via le RM, opposés à ceux de l'aldostérone. Ces propriétés sont cohérentes avec les modifications dans le recrutement des partenaires du RM induites par le changement de conformation du récepteur après la liaison avec la spironolactone. Cependant, il n'est toujours pas connu si l'effet agoniste partiel supposé, de la spironolactone sur le RM, module un réseau de gènes dépendant de la voie minéralocorticoïde ou d'une voie de signalisation alternative. 4. 2 Cibles moléculaires du RM dans le cœur 4. 2. 1 CTGF L'étude de ce gène candidat a permis de mieux appréhender la question de la sélectivité du ligand pour le RM au niveau du cardiomyocyte, dans la mesure o CTGF est modulé par l'aldostérone et par son récepteur dans ce type cellulaire, malgré l'absence de 11-HSD2 et la présence de glucocorticoïdes en forte concentration. Le niveau d'expression du RM est également un facteur important à prendre en compte. Nos travaux ont montré qu'une expression 10 fois plus forte du RM (en moyenne) dans le cœur de souris module l'expression de 865 gènes. La voie minéralocorticoide dans le cœur apparat donc suractivée en présence d'une expression plus importante de RM dans le cardiomyocyte, alors que l'aldostéronémie est normale. Ainsi, une concentration plasmatique physiologique d'aldostérone est capable d'induire la voie de signalisation minéralocorticoïde, comme les modèles expérimentaux de surcharge minéralocorticoïde (modèle NAS ou DOCA- Sel par exemple). Les variations de concentration plasmatique en aldostérone et en glucocorticoïdes sont également à discuter. Une étude prédictive chez des patients atteints d'insuffisance cardiaque de stade III ou IV indique que les patients ayant la concentration plasmatique en corticostéroïdes la plus élevée ont un risque de mortalité 3, 4 fois plus élevé que ceux ayant des concentrations plasmatiques sous la valeur médiane242. Nous avons mis en évidence la capacité de la corticostérone, comme l'aldostérone, à moduler l'expression de certains gènes via le RM comme par exemple la peptidase avec motifs thrombospondines de type 4 (Adamts4, pour A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4) et le canal perméable au calcium Trpc4 pour transient receptor potential cation channel, subfamily C, member 4. La corticostérone diminue l'expression d'Adamts4 dans le cœur des souris RM- Cardio alors qu'elle potentialise l'augmentation de l'expression de Trpc4 induite par le RM. Le RM semble donc pouvoir réguler différemment la même cible selon le ligand activateur. En effet, l'expression d'Adamts4 est diminuée par la corticostérone mais augmentée par l'aldostérone chez les souris RM-Cardio. Le RM peut également réguler la même cible de la même manière avec ses deux ligands (comme le montre l'exemple de Trpc4). 4. 2. 2 Aldostérone et prolifération Nous avons montré que l'aldostérone induit la prolifération des cellules endothéliales cardiaques. Les cellules endothéliales peuvent réguler différentes fonctions impliquées dans la physiologie cardiaque, comme la perméabilité vasculaire, la régulation du diamètre des vaisseaux sanguins en réponse à la pression ou aux stimulations hormonales, le recrutement et l'adhérence à l'endothélium des cellules de l'immunité, ainsi que la coagulation sanguine243. Deux types majeurs de cellules endothéliales sont présents dans le cœur ; les cellules endothéliales coronariennes contrôlant la vascularisation de la totalité de l'organe, et les cellules endothéliales des capillaires, à proximité des cardiomyocytes, participant aux effets paracrines entre cellules adjacentes. Dans nos travaux, l'index de prolifération Ki-67 est localisé dans les cellules endothéliales coronariennes et capillaires. Les cellules endothéliales expriment le RM et l'enzyme 11-HSD2 et sont les cibles des effets de l'aldostérone244. L'aldostérone est capable, in vitro, de réguler certaines fonctions endothéliales. Dans une culture primaire de cellules endothéliales humaines provenant d'artères coronaires, l'aldostérone induit l'expression de la molécule d'adhérence intercellulaire de type 1 (ICAM-1, pour intercellular adhesion molecule-1)148. Cette protéine intervient dans l'adhérence des cellules mononuclées du sang aux cellules endothéliales (ces dernières étant activées par des cytokines inflammatoires ou le stress oxydatif) et ainsi permettre leur infiltration dans les tissus lésés245. L'ajout de spironolactone aux cellules endothéliales humaines coronariennes prévient l'augmentation d'ICAM-1 ainsi que l'adhérence et l'infiltration des monocytes, suggérant qu'ICAM-1 est une cible directe du complexe aldostérone/RM148. De plus, une concentration de 10-9 M d'aldostérone altère la perméabilité de cellules endothéliales humaines issues de veine ombilicale (HUVEC, pour human umbilical vein endothelial cells) en induisant une réorganisation du cytosquelette d'actine et des jonctions serrées246. L'aldostérone diminue également la production de monoxyde d'azote par les HUVEC246. Nous avons montré ici que la prolifération des cellules endothéliales cardiaques est induite par l'aldostérone in vivo. Cette étude n'a cependant pas permis d'identifier si cette prolifération est liée à des altérations d'interactions des cellules endothéliales cardiaques avec leur environnement. Un modèle physiopathologique d'insuffisance cardiaque par sténose de l'aorte chez le rat nous a permis de montrer que ceux-ci présentent une augmentation de la prolifération des cellules endothéliales cardiaques. Cet effet passe par la voie de signalisation minéralocorticoïde car l'éplérénone bloque cette augmentation. D'autres travaux suggèrent que la prolifération des cellules endothéliales cardiaques est impliquée en physiopathologie cardiaque. Ainsi, le remodelage cardiaque induit par un modèle de cardiomyopathie hypertrophique chez la souris stimule la prolifération de cellules cardiaques, distinctes des cardiomyocytes247. Cette étude suggère que ces cellules prolifératives vont dériver en fibroblastes selon un processus de transition endothélio-mésenchymateuse, mécanisme reconnu dans la mise en place de la fibrose cardiaque248. Par conséquent, cette transition endothélio-mésenchymateuse semble être favorisée lors du développement de pathologies cardiaques. Il est à noter que l'effet pro-angiogenique de l'aldostérone rapporté dans notre étude pourrait également être observé dans le cœur sain. En conséquence, selon le milieu environnant, l'activation du complexe aldostérone/RM peut avoir des effets bénéfiques sur le cœur, en créant de nouveaux vaisseaux par exemple. Le complexe aldostérone/RM est impliqué dans de nombreux processus délétères au niveau cardiaque comme la mise en place de fibrose, d'hypertrophie ou de troubles du rythme. Comme cela a été montré dans des études cliniques telles que RALES, le blocage du RM prévient la mise en place de ces différents processus. Cependant, les antagonistes bloquent tous les effets de l'aldostérone, délétères et potentiellement bénéfiques (comme la néo-angiogenèse). Le blocage du RM pourrait donc ne pas représenter la thérapeutique la plus appropriée dans certaines situations pathologiques. Les souris surexprimant l'aldostérone synthase spécifiquement dans les cardiomyocytes sont quant à elles protégées de la diminution de la densité capillaire lors de l'induction expérimentale d'un diabète de type 1 174. L'ajout d'éplérénone prévient cet effet bénéfique sur la densité capillaire et peut donc être considéré comme potentiellement délétère dans ce contexte pathologique174. De la même manière, la spironolactone accentue la dysfonction endothéliale de patients atteints de diabète de type 2 en diminuant la réponse vasodilatatrice en réponse à l'acétylcholine249. En conséquence, il semble que les antagonistes du RM puissent être à l'origine d'effets délétères qui s'ajoutent à l'hyperkaliémie dans des pathologies comme le diabète. L'angiogenèse est un facteur important dans le développement tumoral qui peut impliquer l'aldostérone et le RM. Une corrélation positive entre la densité vasculaire et l'aldostéronémie est observée chez des patients atteints de tumeurs des glandes surrénales associées à une surproduction d'aldostérone250. De façon concordante, l'éplérénone ralentit le développement tumoral hépatique en induisant l'apoptose des cellules endothéliales et en bloquant l'augmentation d'expression de la protéine VEGF-a dans un modèle murin de cancer du foie251. Au contraire, la densité microvasculaire de la tumeur est négativement corrélée avec l'expression du RM chez des patients atteints de cancers colorectaux252. Ces observations contradictoires montrent que l'implication du complexe aldostérone/RM dans l'angiogenèse tumorale est peu connue mais semblent indiquer que son rôle dépend du type de cancer et de l'environnement tissulaire. 4. 2. 3 MicroARNs Ce travail a permis de mettre en évidence que le complexe aldostérone/RM module des gènes non-codants comme les microARNs. Nous avons pu identifier et montrer que le miR-1941-5p est régulé spécifiquement par le RM, et pas par le RG, du cardiomyocyte. L'analyse des gènes modulés spécifiquement par le RM a montré que l'expression du gène codant pour la cadhérine 4 est diminuée dans le cœur des souris non traitées surexprimant spécifiquement le RMh dans le cardiomyocyte par rapport à leur souris contrôle. De plus, la protocadhérine 4, membre de la superfamille des cadhérines permettant l'adhérence et l'interconnexion des neurones, pourrait être une cible potentielle du miR-1941- 5p. Ainsi le miR-1941-5p, en empêchant la transcription de son ARNm, pourrait diminuer l'expression de cette protéine. Puisque l'expression du miR-1941-5p est augmentée et l'expression du gène codant pour la cadhérine 4 diminuée chez les souris RM-Cardio, la cadhérine 4 pourrait ainsi représenter une cible (directe ou indirecte) du miR-1941-5p. Finalement, en accord avec ces données sur la souris, des patients atteints d'une cardiomyopathie associée à des arythmies ventriculaires et à de l'insuffisance cardiaque présentent une diminution de l'expression de certaines cadhérines au niveau des jonctions intercellulaires de type desmosome dans le cœur253. Ces différents résultats laissent penser que le miR-1941-5p peut moduler les jonctions intercellulaires en agissant principalement sur les protocadhérines. En induisant le remodelage de ces jonctions, la conduction électrique cardiaque (surtout via les jonctions de type Gap) pourrait être altérée et mener à des troubles du rythme cardiaque si l'effet du miR-1941-5p n'est pas régulé. Dans le contexte pathologique o la voie minéralocorticoïde est suractivée, le complexe aldostérone/RM va donc pouvoir en partie exercer ses effets délétères en augmentant l'expression du miR-1941- 5p. PARTIE 5 : PERSPECTIVES Mon travail de thèse a été dédié à l'étude des cibles moléculaires du récepteur minéralocorticoïde dans le cœur. Par trois approches différentes, nous avons approfondi les connaissances sur des gènes dont l'expression est modulée par le RM. Ce travail a donné lieu à deux publications en 2013 et une en 2015. L'approche pharmacologique avec le torasémide a eu pour but de rechercher si ce diurétique interfère avec la signalisation minéralocorticoïde cardiaque, comparé aux effets de la spironolactone. Nous avons démontré que le torasémide ne peut pas moduler l'expression de gènes impliqués dans les effets délétères du complexe aldostérone/RM. Ce travail a été mené dans le cadre d'une collaboration industrielle avec un laboratoire pharmaceutique s'intéressant aux propriétés potentielles anti-RM du torasémide (première publication en 2013). A ce jour, le torasémide est utilisé pour diminuer la fibrose cardiaque chez les patients atteints d'insuffisance cardiaque, et est impliqué dans la régulation de la volémie de par ses propriétés diurétiques. La spironolactone bloque les effets délétères du complexe aldostérone/RM impliqués dans les pathologies cardiovasculaires. Nos travaux suggèrent qu'une association du torasémide et de la spironolactone pourrait être envisageable dans le traitement de l'insuffisance cardiaque, d'autant plus que l'effet diurétique du torasémide augmente l'aldostéronémie qui entrane en retour une stimulation plus importante du RM. Des études expérimentales et cliniques appropriées seront nécessaires pour analyser les bénéfices thérapeutiques éventuels de cette combinaison. L'approche génétique s'est intéressée aux gènes cibles du complexe aldostérone/RM dans le cœur. A partir d'une étude gène candidat, nous avons identifié le gène CTGF comme spécifiquement induit par l'aldostérone et le RM dans le cardiomyocyte, malgré l'absence de 11-HSD2 et la présence de glucocorticoïdes en forte concentration dans le milieu environnant. D'ailleurs nous avons montré que les glucocorticoïdes (la corticostérone dans notre étude) ne modulent pas l'expression de ce gène, soulignant une sélectivité forte entre l'aldostérone et les glucocorticoïdes pour ce gène dépendant du RM. Ce travail initié par le docteur Messaoudi et auquel j'ai participé, a permis la caractérisation et la modulation du gène CTGF et a fait l'objet d'une seconde publication en 2013 ainsi que d'un éditorial dans le journal Hypertension. Ces travaux ont mis en évidence des effets de l'aldostérone via le RM du cardiomyocyte, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives sur le rôle du complexe aldostérone/RM en pathologie cardiaque. Nos travaux, associés à d'autres études, suggèrent fortement que la 11-HSD2 ne représente donc pas le seul mécanisme de sélectivité permettant à l'aldostérone de se lier au RM, indiquant que l'utilisation d'inhibiteurs de l'aldostérone synthase contrôlant l'aldostéronémie, pourraient être bénéfiques dans le traitement des pathologies cardiaques. L'approche transcriptomique globale, réalisée de façon comparative sur le cœur de souris surexprimant le RMh dans les cardiomyocytes et sur le cœur des souris contrôles, a mis en évidence pour la première fois qu'une augmentation modeste de la concentration plasmatique en aldostérone régule l'expression de gènes impliqués dans le cycle cellulaire et induit la prolifération des cellules endothéliales cardiaques. Ces résultats permettent d'associer l'aldostérone à de nouveaux processus biologiques et à de nouvelles pathologies o l'angiogenèse est impliquée. Les résultats de cette étude ont été publiés début 2015. De plus, nous avons montré que les souris RM-Cardio, sans stimulation préalable par l'aldostérone, présentent une augmentation de l'expression de gènes impliqués dans le cycle cellulaire et une augmentation de la prolifération des cellules endothéliales cardiaques. Cependant, cette approche transcriptomique globale doit être approfondie. En effet, le mécanisme cellulaire sous-tendant cette prolifération des cellules endothéliales cardiaques n'est pas connu. Une analyse plus profonde des gènes régulés par l'aldostérone dans le cœur des souris RM-Cardio serait souhaitable pour mieux comprendre la synergie entre l'hormone et son récepteur. Les conséquences physiopathologiques de la prolifération endothéliale dépendante de l'aldostérone méritent d'être analysées plus finement. Une hypothèse mécanistique possible proposée par notre laboratoire, permettant d'expliquer comment les cardiomyocytes et les cellules endothéliales interagissent, est que la prolifération des cellules endothéliales cardiaques est modulée par un stress oxydatif au niveau du cœur. Cette idée fait suite à deux travaux cités précédemment mettant en évidence un effet du RM du cardiomyocyte sur la fonction vasculaire. En effet, les souris RM-Cardio présentent une dysfonction de la réponse de relaxation dépendante du monoxyde d'azote au niveau des artères coronaires et un inhibiteur du stress oxydatif prévient cette dysfonction175. De plus, le Docteur Messaoudi a montré que la surexpression de l'aldostérone synthase spécifiquement dans le cardiomyocyte protège de la raréfaction du nombre de capillaires, liée au développement du diabète174. Il serait intéressant de voir si les souris RM-Cardio, qui présentent à l'état de base une prolifération des cellules endothéliales cardiaques plus importante que celle de leur contrôle, montrent une protection contre la raréfaction capillaire lors de l'induction d'un diabète de type 1. Finalement, j'ai abordé l'exploration des cibles moléculaires du RM dans le cœur par l'étude des microARNs. Nous avons montré que le miR-1941-5p est spécifiquement régulé par le RM. Nous n'avons pas pu approfondir la pertinence physiopathologique de la surexpression du miR-1941-5p ni déterminer le type cellulaire précis dans lequel il s'exprime. Par conséquent, ce travail est poursuivi dans le cadre du projet européen Fibrotarget dans lequel notre laboratoire est impliqué. En collaboration avec l'équipe du Docteur Thomas Thum (Institute for Molecular and Translational Therapeutic Strategies, Hannover, Germany) l'expression du miR-1941-5p sera étudiée dans chacun des différents types cellulaires cardiaques. BIBLIOGRAPHIE 1. Mathers CD, Loncar D. Projections of global mortality and burden of disease from 2002 to 2030. PLoS medicine. 2006 ; 3 : e442 2. Gaziano TA, Opie LH, Weinstein MC. Cardiovascular disease prevention with a multidrug regimen in the developing world : A cost-effectiveness analysis. Lancet. 2006 ; 368 : 679-686 3. Rock KL, Latz E, Ontiveros F, Kono H. The sterile inflammatory response. Annual review of immunology. 2010 ; 28 : 321-342 4. Brilla CG, Pick R, Tan LB, Janicki JS, Weber KT. Remodeling of the rat right and left ventricles in experimental hypertension. Circulation research. 1990 ; 67 : 1355-1364 5. Jalil JE, Janicki JS, Pick R, Weber KT. 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Ce travail de thèse se propose d'approfondir les connaissances sur les mécanismes de la signalisation cardiaque du RM à travers deux objectifs principaux i) l'identification de nouvelles cibles moléculaires du RM dans le cœur et ii) la compréhension des effets physiopathologiques de son activation. Par une approche pharmacologique, nous avons montré que le diurétique torasémide n'est pas capable de bloquer la voie de signalisation minéralocorticoïde dans la lignée cellulaire de cardiomyocyte transfectée avec le RM, H9C2-RM . L'étude de l'activité transcriptionnelle du RM cardiaque a concerné la majeure partie de ce travail de thèse. Par une approche gène candidat, nous avons mis en évidence que l'expression du gène codant pour le facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF, pour connective tissue growth factor) est augmentée par le RM et que l'aldostérone potentialise cet effet in vivo. Nous avons pu localiser CTGF spécifiquement dans les cardiomyocytes, et une étude in vitro nous a permis d'identifier que le RM se lie au niveau d'éléments de réponse hormonale dans le promoteur du gène codant pour CTGF. Des souris surexprimant le RM humain spécifiquement dans les cardiomyocytes et traitées avec de l'aldostérone ou de la corticostérone ont permis une exploration plus large des gènes différentiellement exprimés par les deux ligands du RM dans le cœur. L'analyse des transcriptomes cardiaques de ces souris et de leurs contrôles montre qu'une augmentation modeste de la concentration plasmatique en aldostérone induit dans le cœur l'expression de gènes impliqués dans le cycle cellulaire comme la Cycline B1 ou sa kinase associée Cdk1 (pour Cyclin-dependent kinase 1). Nous avons montré également que l'aldostérone active la prolifération des cellules endothéliales cardiaques. Mots clés : aldostérone, récepteur minéralocorticoïde, cœur, prolifération, sélectivité minéralocorticoïde, pathologies cardiovasculaires Molecular targets of the mineralocorticoid receptor in heart Abstract : The mineralocorticoid hormone aldosterone binding its receptor, the mineralocorticoid receptor (MR), regulates the renal reabsorption of sodium. Several studies showed the involvement of the aldosterone/MR complex in cardiovascular diseases, even if the activated signalling pathways are still unclear. This thesis work has been established to increase the knowledge on the mechanisms of the cardiac signalling of MR using two main purposes i) the identification of new molecular targets of the MR in the heart and ii) the understanding of the pathophysiological effects of its activation. A pharmacological approach showed that the diuretic torasemide cannot block the mineralocorticoid signalling in the cell line cardiomyocytes transfected with MR, H9C2-MR . The study of the MR's cardiac transactivation activity formed the most important part of this thesis work. We demonstrated with a candidate gene approach that the MR increases the expression of the gene coding the connective tissue growth factor (CTGF) and the aldosterone increases even more this effect in vivo. We found CTGF specifically expressed in cardiomyocytes and we identified in vitro that the MR binds to hormonal responsive elements on the promoter of the gene coding CTGF. In order to investigate the whole genes differentially expressed by the two ligands of MR in the heart, we treated mice with cardiomyocyte-targeted human MR overexpression and their controls with aldosterone or corticosterone. The cardiac transcriptomic analyses show that the majority of aldosterone-regulated genes is involved in cell division as Cyclin B1 or Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1). Also, we identified that aldosterone promotes cardiac endothelial cells proliferation. Keywords : aldosterone, mineralocorticoid receptor, heart, proliferation, mineralocorticoid selectivity, cardiovascular pathologies | HAL | Scientific |
Effet de la formulation La forme sachet a une Cmax légèrement supérieure à celle des gélules, les deux formes ne sont donc pas bioéquivalentes. | EMEA_V3 | Medicinal |
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Autres informations relatives à Kineret : | EMEA_V3 | Medicinal |
Dose quotidienne d'entretien SC (m2) X 50 mg/ m2 La dose d'entretien quotidienne ne devra pas dépasser 70 mg quelle que soit la dose calculée pour le patient. | EMEA_V3 | Medicinal |
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